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特表2024-536284ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体及びそれを含むキット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-04
(54)【発明の名称】ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体及びそれを含むキット
(51)【国際特許分類】
C12N 9/12 20060101AFI20240927BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20240927BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20240927BHJP
【ＦＩ】
C12N9/12 ZNA
C12Q1/6869 Z
C12N15/54
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024519869
(86)(22)【出願日】2022-06-29
(85)【翻訳文提出日】2024-03-28
(86)【国際出願番号】 US2022073269
(87)【国際公開番号】W WO2023056113
(87)【国際公開日】2023-04-06
(31)【優先権主張番号】63/249,813
(32)【優先日】2021-09-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524120011
【氏名又は名称】ワイディー バイオラブス カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＹＤ ＢｉｏＬａｂｓ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】４Ｆ．， Ｎｏ． ２， Ｓｅｃ． ２， Ｓｈｅｎｇｙｉ Ｒｄ．， Ｚｈｕｂｅｉ Ｃｉｔｙ， Ｈｓｉｎｃｈｕ Ｃｏｕｎｔｙ ３０２０５８， Ｔａｉｗａｎ
(74)【代理人】
【識別番号】100120031
【弁理士】
【氏名又は名称】宮嶋 学
(74)【代理人】
【識別番号】100120617
【弁理士】
【氏名又は名称】浅野 真理
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(74)【代理人】
【識別番号】100210675
【弁理士】
【氏名又は名称】下山 潤
(72)【発明者】
【氏名】チョン－ヤオ、チェン
(72)【発明者】
【氏名】イー－ウェン、チョン
(72)【発明者】
【氏名】ユイ、ティン、フン
(72)【発明者】
【氏名】ウェン－ティン、チェン
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA13
4B063QR08
4B063QR42
4B063QR62
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】
ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体及びそれを含むキットを提供することを課題とする。
本発明は、ポリヌクレオチドの合成及び核酸鋳型の配列決定を容易にするよう、ヌクレオチド類似体の取り込み効果を向上できるファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体に関する。より具体的に言えば、通常の核酸鋳型及び可逆的ダイターミネーターヌクレオチドを有する前記ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体を利用することにより、ＤＮＡ合成による配列決定法（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ）を効率的に実行し、前記核酸鋳型の配列を正確に決定することができる。
本発明は、ポリヌクレオチドの合成及び核酸鋳型の配列決定を容易にするよう、ヌクレオチド類似体の取り込み効果を向上できるファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体に関する。より具体的に言えば、通常の核酸鋳型及び可逆的ダイターミネーターヌクレオチドを有する前記ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体を利用することにより、ＤＮＡ合成による配列決定法（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ）を効率的に実行し、前記核酸鋳型の配列を正確に決定することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
コンセンサス配列（配列番号１）の３４９位～３６４位、４５０位～４７６位、５９０位～６０８位、７０６位～７３０位、８４３位～８５５位及び９４０位～９５６位にそれぞれ対応するＥｘｏＩモチーフ、ＥｘｏＩＩモチーフ、ＥｘｏＩＩＩモチーフ、Ａモチーフ、Ｂモチーフ及びＣモチーフと、前記ＥｘｏＩモチーフ、前記ＥｘｏＩＩモチーフ及び前記ＥｘｏＩＩＩモチーフからなる群から選択されるモチーフ内の位置にある少なくとも１つのアミノ酸置換と、
前記Ａモチーフ、前記Ｂモチーフ及び前記Ｃモチーフからなる群から選択されるモチーフ内の位置にある少なくとも１つのアミノ酸置換と
を含むファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項2】
配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６及び１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼから修飾される請求項１に記載のファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項3】
前記野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼは、好熱菌（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｇｏ）、好熱菌（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｄ１）、好熱菌属（菌株９°Ｎ－７）のＤＮＡポリメラーゼ（９°Ｎ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ）、好熱菌（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ）、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｍａ）、メタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｃ）、ヒトＤＮＡポリメラーゼδのｐ１２５触媒サブユニット（ｈＰＯＬＤ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＮＡポリメラーゼδの触媒サブユニット（ＳｃｅＰＯＬＤ）、ピロバキュラム・イスランジカム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｉｓ）、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｓｏ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ）のＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｅｃｏ）、バクテリオファージ（大腸菌ファージＲＢ６９のＤＮＡポリメラーゼ（ＲＢ６９）、バクテリオファージ（大腸菌ファージ）Ｔ４のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ４）又はバクテリオファージ（バチルスファージ）Ｐｈｉ２９のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈｉ２９）である請求項２に記載のファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項4】
配列番号１の３５４位に対応するアミノ酸は、Ｄ以外の任意のアミノ酸であり、配列番号１の３５５位に対応するアミノ酸は、Ｉ以外の任意のアミノ酸であり、
配列番号１の３５６位に対応するアミノ酸は、Ｅ以外の任意のアミノ酸であり、
配列番号１の７１５位に対応するアミノ酸は、Ｌ以外の任意のアミノ酸であり、
配列番号１の７１６位に対応するアミノ酸は、Ｙ以外の任意のアミノ酸であり、
配列番号１の７１７位に対応するアミノ酸は、Ｐ以外の任意のアミノ酸である
請求項１に記載のファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項5】
配列番号１の３５４位に対応するアミノ酸は、Ｄ以外の任意のアミノ酸であり、配列番号１の３５５位に対応するアミノ酸は、Ｉ以外の任意のアミノ酸であり、
配列番号１の３５６位に対応するアミノ酸は、Ｅ以外の任意のアミノ酸であり、
配列番号１の７１５位に対応するアミノ酸は、Ｌ以外の任意のアミノ酸であり、
配列番号１の７１６位に対応するアミノ酸は、Ｙ以外の任意のアミノ酸であり、
配列番号１の７１７位に対応するアミノ酸は、Ｐ以外の任意のアミノ酸であり、
配列番号１の８５４位に対応するアミノ酸は、Ａ以外の任意のアミノ酸である
請求項１に記載のファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項6】
配列番号３の野生型アミノ酸配列を含む好熱菌（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｄ１）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号３のＤ１４１は、Ａで置換され、
配列番号１の３５６位に対応する配列番号３のＥ１４３は、Ａで置換され、
配列番号１の７１５位に対応する配列番号３のＬ４０８は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹで置換され、
配列番号１の７１６位に対応する配列番号３のＹ４０９は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩで置換され、
配列番号１の７１７位に対応する配列番号３のＰ４１０は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｓ又はＴで置換される
請求項１に記載のファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項7】
配列番号４の野生型アミノ酸配列を含む好熱菌属（菌株９°Ｎ－７）のＤＮＡポリメラーゼ（９°Ｎ）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号４のＤ１４１は、Ａで置換され、
配列番号１の３５６位に対応する配列番号４のＥ１４３は、Ａで置換され、
配列番号１の７１５位に対応する配列番号４のＬ４０８は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹで置換され、
配列番号１の７１６位に対応する配列番号４のＹ４０９は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩで置換され、
配列番号１の７１７位に対応する配列番号４のＰ４１０は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｓ又はＴで置換される
請求項１に記載のファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項8】
配列番号５の野生型アミノ酸配列を含むパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号５のＤ１４１は、Ａで置換され、
配列番号１の３５６位に対応する配列番号５のＥ１４３は、Ａで置換され、
配列番号１の７１５位に対応する配列番号５のＩ４０９は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹで置換され、
配列番号１の７１６位に対応する配列番号５のＹ４１０は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩで置換され、
配列番号１の７１７位に対応する配列番号５のＰ４１１は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｓ又はＴで置換される
請求項１に記載のファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項9】
配列番号６の野生型アミノ酸配列を含む好熱菌（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号６のＤ１４１は、Ａで置換され、
配列番号１の３５６位に対応する配列番号６のＥ１４３は、Ａで置換され、
配列番号１の７１５位に対応する配列番号６のＬ４１１は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹで置換され、
配列番号１の７１６位に対応する配列番号６のＹ４１２は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩで置換され、
配列番号１の７１７位に対応する配列番号６のＰ４１３は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｓ又はＴで置換される
請求項１に記載のファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項10】
配列番号８の野生型アミノ酸配列を含むメタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｃ）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号８のＤ１９８は、Ａで置換され、
配列番号１の３５６位に対応する配列番号８のＥ２００は、Ａで置換され、
配列番号１の７１５位に対応する配列番号８のＬ４８５は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹで置換され、
配列番号１の７１６位に対応する配列番号８のＹ４８６は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩで置換され、
配列番号１の７１７位に対応する配列番号８のＰ４８７は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｓ又はＴで置換される
請求項１に記載のファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項11】
配列番号１１の野生型アミノ酸配列を含むピロバキュラム・イスランジカム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｉｓ）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号１１のＤ１７１は、Ａで置換され、
配列番号１の３５６位に対応する配列番号１１のＥ１７３は、Ａで置換され、
配列番号１の７１５位に対応する配列番号１１のＭ４２６は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹで置換され、
配列番号１の７１６位に対応する配列番号１１のＹ４２７は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩで置換され、
配列番号１の７１７位に対応する配列番号１１のＰ４２８は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｓ又はＴで置換される
請求項１に記載のファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項12】
配列番号１２の野生型アミノ酸配列を含むスルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｓｏ）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号１２のＤ２３１は、Ａで置換され、
配列番号１の３５６位に対応する配列番号１２のＥ２３３は、Ａで置換され、
配列番号１の７１５位に対応する配列番号１２のＬ５１８は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹで置換され、
配列番号１の７１６位に対応する配列番号１２のＹ５１９は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩで置換され、
配列番号１の７１７位に対応する配列番号１２のＰ５２０は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｓ又はＴで置換される
請求項１に記載のファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項13】
配列番号３の野生型アミノ酸配列を含む好熱菌（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｄ１）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号３のＤ１４１は、Ａで置換され、
配列番号１の３５６位に対応する配列番号３のＥ１４３は、Ａで置換され、
配列番号１の７１５位に対応する配列番号３のＬ４０８は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹで置換され、
配列番号１の７１６位に対応する配列番号３のＹ４０９は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩで置換され、
配列番号１の７１７位に対応する配列番号３のＰ４１０は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｓ又はＴで置換され、
配列番号１の８５４位に対応する配列番号３のＡ４８５は、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＬで置換される
請求項１に記載のファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項14】
配列番号４の野生型アミノ酸配列を含む好熱菌属（菌株９°Ｎ－７）のＤＮＡポリメラーゼ（９°Ｎ）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号４のＤ１４１は、Ａで置換され、
配列番号１の３５６位に対応する配列番号４のＥ１４３は、Ａで置換され、
配列番号１の７１５位に対応する配列番号４のＬ４０８は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹで置換され、
配列番号１の７１６位に対応する配列番号４のＹ４０９は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩで置換され、
配列番号１の７１７位に対応する配列番号４のＰ４１０は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｓ又はＴで置換され、
配列番号１の８５４位に対応する配列番号４のＡ４８５は、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＬで置換される
請求項１に記載のファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項15】
配列番号５の野生型アミノ酸配列を含むパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号５のＤ１４１は、Ａで置換され、
配列番号１の３５６位に対応する配列番号５のＥ１４３は、Ａで置換され、
配列番号１の７１５位に対応する配列番号５のＬ４０９は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹで置換され、
配列番号１の７１６位に対応する配列番号５のＹ４１０は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩで置換され、
配列番号１の７１７位に対応する配列番号５のＰ４１１は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｓ又はＴで置換され、
配列番号１の８５４位に対応する配列番号５のＡ４８６は、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＬで置換される
請求項１に記載のファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項16】
配列番号６の野生型アミノ酸配列を含む好熱菌（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号６のＤ１４１は、Ａで置換され、
配列番号１の３５６位に対応する配列番号６のＥ１４３は、Ａで置換され、
配列番号１の７１５位に対応する配列番号６のＬ４１１は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹで置換され、
配列番号１の７１６位に対応する配列番号６のＹ４１２は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩで置換され、
配列番号１の７１７位に対応する配列番号６のＰ４１３は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｓ又はＴで置換され、
配列番号１の８５４位に対応する配列番号６のＡ４８８は、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＬで置換される
請求項１に記載のファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項17】
配列番号８の野生型アミノ酸配列を含むメタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｃ）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号８のＤ１９８は、Ａで置換され、
配列番号１の３５６位に対応する配列番号８のＥ２００は、Ａで置換され、
配列番号１の７１５位に対応する配列番号８のＬ４８５は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹで置換され、
配列番号１の７１６位に対応する配列番号８のＹ４８６は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩで置換され、
配列番号１の７１７位に対応する配列番号８のＰ４８７は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｓ又はＴで置換され、
配列番号１の８５４位に対応する配列番号８のＡ５６５は、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＬで置換される
請求項１に記載のファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項18】
配列番号１１の野生型アミノ酸配列を含むピロバキュラム・イスランジカム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｉｓ）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号１１のＤ１７１は、Ａで置換され、
配列番号１の３５６位に対応する配列番号１１のＥ１７３は、Ａで置換され、
配列番号１の７１５位に対応する配列番号１１のＭ４２６は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹで置換され、
配列番号１の７１６位に対応する配列番号１１のＹ４２７は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩで置換され、
配列番号１の７１７位に対応する配列番号１１のＰ４２８は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｓ又はＴで置換され、
配列番号１の８５４位に対応する配列番号１１のＡ５０８は、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＬで置換される
請求項１に記載のファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項19】
配列番号１２の野生型アミノ酸配列を含むスルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｓｏ）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号１２のＤ２３１は、Ａで置換され、
配列番号１の３５６位に対応する配列番号１２のＥ２３３は、Ａで置換され、
配列番号１の７１５位に対応する配列番号１２のＬ５１８は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹで置換され、
配列番号１の７１６位に対応する配列番号１２のＹ５１９は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩで置換され、
配列番号１の７１７位に対応する配列番号１２のＰ５２０は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｓ又はＴで置換され、
配列番号１の８５４位に対応する配列番号１２のＡ６０１は、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＬで置換される
請求項１に記載のファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項20】
請求項１～１９のいずれか一項に記載のファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体と、プライマーと、
適した条件下で前記プライマーを取り込むための複数のヌクレオチド類似体と
を含む、合成によるシーケンス反応のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２１年０９月２９日に出願された米国仮出願番号第ＵＳ６３／２４９，８１３号の優先権を主張し、その全内容は、引用により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年０９月２９日に出願された米国仮出願番号第ＵＳ６３／２４９，８１３号の優先権を主張し、その全内容は、引用により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、ポリメラーゼ変異体及びそれを含むキットに関し、特に、合成による核酸配列決定用のファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体及びそれを含むキットに関するが、本発はこれらに限定されない。
【背景技術】
【0003】
次世代シーケンシング（Ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ， ＮＧＳ）技術は、現代の生物学及び生物医学研究といった分野に変革をもたらしている。この革新的な技術の中核は、生化学反応を触媒して鋳型配列に関する情報を取得するＤＮＡポリメラーゼに由来する。ＤＮＡ合成による配列決定（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＳＢＳ）技術は、広く用いられるＮＧＳプラットフォームの１種であり、ポリメラーゼに依存する独自のアプローチに属し、その連続的な配列決定反応により、新たに合成されたＤＮＡ鎖が同時に生成される。
【0004】
通常、ＳＢＳ法のステップは、蛍光レポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）を有するヌクレオチド類似体を取り込む（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）ステップと、蛍光発光により取り込まれたヌクレオチドを同定するステップと、次いで、蛍光団を切断してからポリメラーゼ反応を再開して段階的に配列を決定するステップとを含む。ＳＢＳ法は従来のサンガー法と異なり、異なるサイズの蛍光標識されたＤＮＡ断片が一度の反応で生成するため、電気泳動によりＤＮＡを分離してから蛍光検出を行う必要がある。このＳＢＳ法は、配列決定用の個々のＤＮＡ断片又はクラスターが高密度アレイ上に固定化されるため、サンガージデオキシ法よりも堅牢である。これにより、先にＤＮＡ分離を必要とせずに、各ＤＮＡ断片又はクラスターから発せられるＳＢＳ蛍光シグナルを直接検出できる。さらに、ＳＢＳ法は、多数の並列マイクロアレイチップを使用するだけで、検出を簡単にスケールアップし、全体の配列決定スケールを向上し、ＤＮＡ配列決定のコストを大幅に削減できる。
【0005】
しかしながら、ＳＢＳ法で使用されるヌクレオチドは、変異修飾を受けている。これらのヌクレオチド類似体は、デオキシリボースの３’－ヒドロキシル（３’－ＯＨ）位置に大きな化学保護基を持っているか、核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）上に大きな蛍光分子を持っている可能性がある。ヌクレオチド上の大きな化学修飾に対して、天然に存在する核酸ポリメラーゼには耐性がない。核酸ポリメラーゼの活性部位ポケットは、正常な３’－ＯＨ官能基と核酸塩基を有する正しく一致する典型的なヌクレオチドを収容するため、適切な幾何学的形状にあらかじめ配置されている。ヌクレオチドの３’－ＯＨ官能基を除去する場合、或いは２’，３’－ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）又は３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＮＴＰなどの嵩高い化学官能基で置き換える場合、核酸ポリメラーゼの活性部位ポケット内のヌクレオチド構成が著しく変化し、ヌクレオチドの結合親和性と核酸ポリメラーゼの全体的なＤＮＡ合成効率が低下する。同様に、ヌクレオチド上の核酸塩基又は５’－三リン酸官能基に修飾がある場合、ヌクレオチドと核酸ポリメラーゼの活性部位残基の間の相互作用が破壊され、ポリメラーゼによる核酸合成におけるこれらの修飾ヌクレオチドへの適切な利用ができなくなる。
【0006】
上記事情に鑑みて、急速に変化するＤＮＡポリメラーゼ関連配列決定技術に対処するため、一連のヌクレオチド修飾を継続的に作り出す必要がある。したがって、絶えず変化するＤＮＡ配列決定の化学反応に適合する酵素を探し、設計、又は開発する必要がある。例えば特許文献１では、古細菌の９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ（ファミリーＢポリメラーゼ（Ｐｏｌ））を開示し、それが可逆的ダイターミネーターヌクレオシドの取り込みに適していることを見出した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】米国特許第１１１０４８８８号明細書
【特許文献2】米国特許出願公開第２００９／００２６０８２号明細書
【特許文献3】米国特許出願公開第２００９／０１２７５８９号明細書
【特許文献4】米国特許出願公開第２０１０／０１３７１４３号明細書
【特許文献5】米国特許出願公開第２０１０／０２８２６１７号明細書
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｆｒｏｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：３０５．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｍｉｃｂ．２０１４．００３０５
【非特許文献2】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６，３６００－３６０５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
修飾ヌクレオチド類似体の多様な特性のため、天然に存在する核酸ポリメラーゼは、これらのヌクレオチド類似体を鋳型指向性核酸合成の基質として容易に利用することができない。したがって、オーダーメイドの核酸ポリメラーゼは、様々な合成による核酸配列決定反応への使用でこれらの非典型的なヌクレオチドの有用性を発揮するための必須条件である。
【0010】
本発明者は、修飾ヌクレオチドに対する前記ポリメラーゼの基質親和性を高める上で重要な役割を果たし、ＤＮＡ合成による配列決定におけるヌクレオチド取り込みの効率を向上させるためのファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における新規な位置／領域を発見した。
【課題を解決するための手段】
【0011】
具体的には、本発明の一態様では、コンセンサス配列（配列番号１）の３４９位～３６４位、４５０位～４７６位、５９０位～６０８位、７０６位～７３０位、８４３位～８５５位及び９４０位～９５６位にそれぞれ対応するＥｘｏＩモチーフ、ＥｘｏＩＩモチーフ、ＥｘｏＩＩＩモチーフ、Ａモチーフ、Ｂモチーフ及びＣモチーフと、前記ＥｘｏＩモチーフ、前記ＥｘｏＩＩモチーフ及び前記ＥｘｏＩＩＩモチーフからなる群から選択されるモチーフ内の位置にある少なくとも１つのアミノ酸置換と、前記Ａモチーフ、前記Ｂモチーフ及びＣモチーフからなる群から選択されるモチーフ内の位置にある少なくとも１つのアミノ酸置換とを含むファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体を提供する。
【0012】
本発明の一実施形態によれば、前記ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６及び１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼから修飾される。
【0013】
本発明の一実施形態によれば、前記野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼは、好熱菌（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｇｏ）、好熱菌（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｄ１）、好熱菌属（菌株９°Ｎ－７）のＤＮＡポリメラーゼ（９°Ｎ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ）、好熱菌（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ）、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｍａ）、メタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｃ）、ヒトＤＮＡポリメラーゼδのｐ１２５触媒サブユニット（ｈＰＯＬＤ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＮＡポリメラーゼδの触媒サブユニット（ＳｃｅＰＯＬＤ）、ピロバキュラム・イスランジカム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｉｓ）、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｓｏ）、緑膿菌のＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐａｅ）、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｅｃｏ）、バクテリオファージ（大腸菌ファージ［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｐｈａｇｅ］）ＲＢ６９のＤＮＡポリメラーゼ（ＲＢ６９）、バクテリオファージ（大腸菌ファージ）Ｔ４のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ４）又はバクテリオファージ（バチルスファージ［Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｈａｇｅ］）Ｐｈｉ２９のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈｉ２９）である。
【0014】
本発明の一実施形態によれば、前記ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体において、配列番号１の３５４位に対応するアミノ酸は、Ｄ以外の任意のアミノ酸であり、配列番号１の３５５位に対応するアミノ酸はＩ以外の任意のアミノ酸であり、配列番号１の３５６位に対応するアミノ酸はＥ以外の任意のアミノ酸であり、配列番号１の７１５位に対応するアミノ酸はＬ以外の任意のアミノ酸であり、配列番号１の７１６位に対応するアミノ酸はＹ以外の任意のアミノ酸であり、配列番号１の７１７位に対応するアミノ酸はＰ以外の任意のアミノ酸である。
【0015】
本発明の一実施形態によれば、前記ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体において、配列番号１の３５４位に対応するアミノ酸は、Ｄ以外の任意のアミノ酸であり、配列番号１の３５５位に対応するアミノ酸はＩ以外の任意のアミノ酸であり、配列番号１の３５６位に対応するアミノ酸はＥ以外の任意のアミノ酸であり、配列番号１の７１５位に対応するアミノ酸はＬ以外の任意のアミノ酸であり、配列番号１の７１６位に対応するアミノ酸はＹ以外の任意のアミノ酸であり、配列番号１の７１７位に対応するアミノ酸はＰ以外の任意のアミノ酸であり、配列番号１の８５４位に対応するアミノ酸はＡ以外の任意のアミノ酸である。
【0016】
本発明の一実施形態によれば、前記ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号３の野生型アミノ酸配列を含む好熱菌（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｄ１）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号３のＤ１４１はＡで置換され、配列番号１の３５６位に対応する配列番号３のＥ１４３はＡで置換され、配列番号１の７１５位に対応する配列番号３のＬ４０８はＡ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹで置換され、配列番号１の７１６位に対応する配列番号３のＹ４０９はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩで置換され、配列番号１の７１７位に対応する配列番号３のＰ４１０はＡ、Ｃ、Ｇ、Ｓ又はＴで置換される。
【0017】
本発明の一実施形態によれば、前記ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号４の野生型アミノ酸配列を含む好熱菌属（菌株９°Ｎ－７）のＤＮＡポリメラーゼ（９°Ｎ）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号４のＤ１４１はＡで置換され、配列番号１の３５６位に対応する配列番号４のＥ１４３はＡで置換され、配列番号１の７１５位に対応する配列番号４のＬ４０８はＡ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹで置換され、配列番号１の７１６位に対応する配列番号４のＹ４０９はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩで置換され、配列番号１の７１７位に対応する配列番号４のＰ４１０はＡ、Ｃ、Ｇ、Ｓ又はＴで置換される。
【0018】
本発明の一実施形態によれば、前記ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号５の野生型アミノ酸配列を含むパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号５のＤ１４１はＡで置換され、配列番号１の３５６位に対応する配列番号５のＥ１４３はＡで置換され、配列番号１の７１５位に対応する配列番号５のＩ４０９はＡ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹで置換され、配列番号１の７１６位に対応する配列番号５のＹ４１０はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩで置換され、配列番号１の７１７位に対応する配列番号５のＰ４１１はＡ、Ｃ、Ｇ、Ｓ又はＴで置換される。
【0019】
本発明の一実施形態によれば、前記ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号６の野生型アミノ酸配列を含む好熱菌（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号６のＤ１４１はＡで置換され、配列番号１の３５６位に対応する配列番号６のＥ１４３はＡで置換され、配列番号１の７１５位に対応する配列番号６のＬ４１１はＡ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹで置換され、配列番号１の７１６位に対応する配列番号６のＹ４１２はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩで置換され、配列番号１の７１７位に対応する配列番号６のＰ４１３はＡ、Ｃ、Ｇ、Ｓ又はＴで置換される。
【0020】
本発明の一実施形態によれば、前記ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号８の野生型アミノ酸配列を含むメタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｃ）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号８のＤ１９８はＡで置換され、配列番号１の３５６位に対応する配列番号８のＥ２００はＡで置換され、配列番号１の７１５位に対応する配列番号８のＬ４８５はＡ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹで置換され、配列番号１の７１６位に対応する配列番号８のＹ４８６はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩで置換され、配列番号１の７１７位に対応する配列番号８のＰ４８７はＡ、Ｃ、Ｇ、Ｓ又はＴで置換される。
【0021】
本発明の一実施形態によれば、前記ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号１１の野生型アミノ酸配列を含むピロバキュラム・イスランジカム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｉｓ）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号１１のＤ１７１はＡで置換され、配列番号１の３５６位に対応する配列番号１１のＥ１７３はＡで置換され、配列番号１の７１５位に対応する配列番号１１のＭ４２６はＡ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹで置換され、配列番号１の７１６位に対応する配列番号１１のＹ４２７はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩで置換され、配列番号１の７１７位に対応する配列番号１１のＰ４２８はＡ、Ｃ、Ｇ、Ｓ又はＴで置換される。
【0022】
本発明の一実施形態によれば、前記ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号１２の野生型アミノ酸配列を含むスルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｓｏ）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号１２のＤ２３１はＡで置換され、配列番号１の３５６位に対応する配列番号１２のＥ２３３はＡで置換され、配列番号１の７１５位に対応する配列番号１２のＬ５１８はＡ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹで置換され、配列番号１の７１６位に対応する配列番号１２のＹ５１９はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩで置換され、配列番号１の７１７位に対応する配列番号１２のＰ５２０はＡ、Ｃ、Ｇ、Ｓ又はＴで置換される。
【0023】
本発明の一実施形態によれば、前記ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号３の野生型アミノ酸配列を含む好熱菌（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｄ１）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号３のＤ１４１はＡで置換され、配列番号１の３５６位に対応する配列番号３のＥ１４３はＡで置換され、配列番号１の７１５位に対応する配列番号３のＬ４０８はＡ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹで置換され、配列番号１の７１６位に対応する配列番号３のＹ４０９はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩで置換され、配列番号１の７１７位に対応する配列番号３のＰ４１０はＡ、Ｃ、Ｇ、Ｓ又はＴで置換され、配列番号１の８５４位に対応する配列番号３のＡ４８５はＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＬで置換される。
【0024】
本発明の一実施形態によれば、前記ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号４の野生型アミノ酸配列を含む好熱菌属（菌株９°Ｎ－７）のＤＮＡポリメラーゼ（９°Ｎ）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号４のＤ１４１はＡで置換され、配列番号１の３５６位に対応する配列番号４のＥ１４３はＡで置換され、配列番号１の７１５位に対応する配列番号４のＬ４０８はＡ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹで置換され、配列番号１の７１６位に対応する配列番号４のＹ４０９はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩで置換され、配列番号１の７１７位に対応する配列番号４のＰ４１０はＡ、Ｃ、Ｇ、Ｓ又はＴで置換され、配列番号１の８５４位に対応する配列番号４のＡ４８５はＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＬで置換される。
【0025】
本発明の一実施形態によれば、前記ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号５の野生型アミノ酸配列を含むパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号５のＤ１４１はＡで置換され、配列番号１の３５６位に対応する配列番号５のＥ１４３はＡで置換され、配列番号１の７１５位に対応する配列番号５のＬ４０９はＡ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹで置換され、配列番号１の７１６位に対応する配列番号５のＹ４１０はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩで置換され、配列番号１の７１７位に対応する配列番号５のＰ４１１はＡ、Ｃ、Ｇ、Ｓ又はＴで置換され、配列番号１の８５４位に対応する配列番号５のＡ４８６はＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＬで置換される。
【0026】
本発明の一実施形態によれば、前記ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号６の野生型アミノ酸配列を含む好熱菌（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号６のＤ１４１はＡで置換され、配列番号１の３５６位に対応する配列番号６のＥ１４３はＡで置換され、配列番号１の７１５位に対応する配列番号６のＬ４１１はＡ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹで置換され、配列番号１の７１６位に対応する配列番号６のＹ４１２はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩで置換され、配列番号１の７１７位に対応する配列番号６のＰ４１３はＡ、Ｃ、Ｇ、Ｓ又はＴで置換され、配列番号１の８５４位に対応する配列番号６のＡ４８８はＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＬで置換される。
【0027】
本発明の一実施形態によれば、前記ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号８の野生型アミノ酸配列を含むメタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｃ）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号８のＤ１９８はＡで置換され、配列番号１の３５６位に対応する配列番号８のＥ２００はＡで置換され、配列番号１の７１５位に対応する配列番号８のＬ４８５はＡ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹで置換され、配列番号１の７１６位に対応する配列番号８のＹ４８６はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩで置換され、配列番号１の７１７位に対応する配列番号８のＰ４８７はＡ、Ｃ、Ｇ、Ｓ又はＴで置換され、配列番号１の８５４位に対応する配列番号８のＡ５６５はＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＬで置換される。
【0028】
本発明の一実施形態によれば、前記ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号１１の野生型アミノ酸配列を含むピロバキュラム・イスランジカム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｉｓ）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号１１のＤ１７１はＡで置換され、配列番号１の３５６位に対応する配列番号１１のＥ１７３はＡで置換され、配列番号１の７１５位に対応する配列番号１１のＭ４２６はＡ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹで置換され、配列番号１の７１６位に対応する配列番号１１のＹ４２７はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩで置換され、配列番号１の７１７位に対応する配列番号１１のＰ４２８はＡ、Ｃ、Ｇ、Ｓ又はＴで置換され、配列番号１の８５４位に対応する配列番号１１のＡ５０８はＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＬで置換される。
【0029】
本発明の一実施形態によれば、前記ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号１２の野生型アミノ酸配列を含むスルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｓｏ）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号１２のＤ２３１はＡで置換され、配列番号１の３５６位に対応する配列番号１２のＥ２３３はＡで置換され、配列番号１の７１５位に対応する配列番号１２のＬ５１８はＡ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹで置換され、配列番号１の７１６位に対応する配列番号１２のＹ５１９はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩで置換され、配列番号１の７１７位に対応する配列番号１２のＰ５２０はＡ、Ｃ、Ｇ、Ｓ又はＴで置換され、配列番号１の８５４位に対応する配列番号１２のＡ６０１はＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＬで置換される。
【0030】
本発明の別の態様では、上記のファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体と、プライマーと、適した条件下で前記プライマーを取り込むことで、プライマーに取り込まれたヌクレオチド類似体と相補的な核酸塩基を確認するための複数のヌクレオチド類似体とを含む、合成によるシーケンス反応のためのキットを提供する。
【発明の効果】
【0031】
したがって、本発明は、ポリヌクレオチドの合成及び核酸鋳型の配列決定を容易にするよう、ヌクレオチド類似体の取り込み効果を向上できる特定のファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体に関する。より具体的に言えば、通常の核酸鋳型及び可逆的ダイターミネーターヌクレオチドを有する前記ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体を利用することにより、ＤＮＡ合成による配列決定法を効率的に実行し、前記核酸鋳型の配列を正確に決定することができる。
【0032】
本発明の上記と他の目的、特徴、利点及び実施形態をより明白かつ理解しやすくするため、図面を以下のように説明する。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【図1】一般的なＳＢＳ法の概略図である。
【図2-1】本発明の各種野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＢ）とそれらのコンセンサス配列のアミノ酸配列とのアラインメントを示す概略図である。
【図2-2】本発明の各種野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＢ）とそれらのコンセンサス配列のアミノ酸配列とのアラインメントを示す概略図である。
【図2-3】本発明の各種野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＢ）とそれらのコンセンサス配列のアミノ酸配列とのアラインメントを示す概略図である。
【図2-4】本発明の各種野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＢ）とそれらのコンセンサス配列のアミノ酸配列とのアラインメントを示す概略図である。
【図2-5】本発明の各種野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＢ）とそれらのコンセンサス配列のアミノ酸配列とのアラインメントを示す概略図である。
【図2-6】本発明の各種野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＢ）とそれらのコンセンサス配列のアミノ酸配列とのアラインメントを示す概略図である。
【図2-7】本発明の各種野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＢ）とそれらのコンセンサス配列のアミノ酸配列とのアラインメントを示す概略図である。
【図2-8】本発明の各種野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＢ）とそれらのコンセンサス配列のアミノ酸配列とのアラインメントを示す概略図である。
【図2-9】本発明の各種野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＢ）とそれらのコンセンサス配列のアミノ酸配列とのアラインメントを示す概略図である。
【図2-10】本発明の各種野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＢ）とそれらのコンセンサス配列のアミノ酸配列とのアラインメントを示す概略図である。
【図2-11】本発明の各種野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＢ）とそれらのコンセンサス配列のアミノ酸配列とのアラインメントを示す概略図である。
【図2-12】本発明の各種野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＢ）とそれらのコンセンサス配列のアミノ酸配列とのアラインメントを示す概略図である。
【図2-13】本発明の各種野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＢ）とそれらのコンセンサス配列のアミノ酸配列とのアラインメントを示す概略図である。
【図2-14】本発明の各種野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＢ）とそれらのコンセンサス配列のアミノ酸配列とのアラインメントを示す概略図である。
【図2-15】本発明の各種野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＢ）とそれらのコンセンサス配列のアミノ酸配列とのアラインメントを示す概略図である。
【図2-16】本発明の各種野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＢ）とそれらのコンセンサス配列のアミノ酸配列とのアラインメントを示す概略図である。
【図2-17】本発明の各種野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＢ）とそれらのコンセンサス配列のアミノ酸配列とのアラインメントを示す概略図である。
【図3】本発明の除去可能な３'保護基部分を有する色素標識ヌクレオチド類似体の共通構造を示す図である。
【図4】３’－Ｏ－Ｎ３－ｄＮＴＰの構造を示す図である。
【図5A】Ｎ３－ｄＡＴＰ－リンカー－Ａｔｔｏ５３２、Ｎ３－ｄＣＴＰ－リンカー－Ａｔｔｏ７００、Ｎ３－ｄＧＴＰ－リンカー－Ｃｙ５及びＮ３－ｄＴＴＰ－リンカー－ＲＯＸの構造を示す図である。
【図5B】Ｎ３－ｄＡＴＰ－リンカー－Ａｔｔｏ５３２、Ｎ３－ｄＣＴＰ－リンカー－Ａｔｔｏ７００、Ｎ３－ｄＧＴＰ－リンカー－Ｃｙ５及びＮ３－ｄＴＴＰ－リンカー－ＲＯＸの構造を示す図である。
【図5C】Ｎ３－ｄＡＴＰ－リンカー－Ａｔｔｏ５３２、Ｎ３－ｄＣＴＰ－リンカー－Ａｔｔｏ７００、Ｎ３－ｄＧＴＰ－リンカー－Ｃｙ５及びＮ３－ｄＴＴＰ－リンカー－ＲＯＸの構造を示す図である。
【図5D】Ｎ３－ｄＡＴＰ－リンカー－Ａｔｔｏ５３２、Ｎ３－ｄＣＴＰ－リンカー－Ａｔｔｏ７００、Ｎ３－ｄＧＴＰ－リンカー－Ｃｙ５及びＮ３－ｄＴＴＰ－リンカー－ＲＯＸの構造を示す図である。
【図6】実施例４に記載の反応の結果を示す図である。
【図7】実施例６に記載の反応の結果を示す図である。
【図8】実施例７に記載の反応の結果を示す図である。
【図9】実施例８に記載の反応の結果を示す図である。
【図10】実施例９に記載の反応の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0034】
(配列表に関する記載)
本出願は、電子形式で配列表とともに提出される。該配列表が入ったテキストファイルの名称はＰ２２２２８５ＴＷ－配列表．ＴＸＴ で、２０２２年１０月１２日に作成されるものであり、サイズは２５２ｋｂである。この配列表の関連情報は、その全内容が引用により本明細書に組み込まれる。
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【0035】
（用語）
本明細書で使用される用語は、本発明の範囲内に広く包含され、各用語を使用する特定の文脈で一般に、関連分野における通常の意味を有する。本明細書では、当業者が本発明の関連する説明を理解できるように、本発明を説明するために使用されるいくつかの用語を以下又は本明細書の他の場所で論じられる。同じ文脈では、同じ用語は同じ範囲と意味を持つ。さらに、同じことを表現する方法が複数あるため、本明細書で論じられている用語は代替の用語や同義語に置き換えられることができ、用語が本明細書で指定又は説明されているかどうかは、特別な意味を持たない。本明細書では、ある用語の同義語が提供されているが、１つ以上の同義語の使用は、他の同義語の使用を除外しない。
本明細書で使用される用語は、本発明の範囲内に広く包含され、各用語を使用する特定の文脈で一般に、関連分野における通常の意味を有する。本明細書では、当業者が本発明の関連する説明を理解できるように、本発明を説明するために使用されるいくつかの用語を以下又は本明細書の他の場所で論じられる。同じ文脈では、同じ用語は同じ範囲と意味を持つ。さらに、同じことを表現する方法が複数あるため、本明細書で論じられている用語は代替の用語や同義語に置き換えられることができ、用語が本明細書で指定又は説明されているかどうかは、特別な意味を持たない。本明細書では、ある用語の同義語が提供されているが、１つ以上の同義語の使用は、他の同義語の使用を除外しない。
【0036】
本明細書で使用される場合、「一つ」、及び「前記」の意味は、文脈が別途明確に示さない限り、複数とも解釈することができる。また、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される「中間」及び「内部」という意味は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、「…の中に」を含む。なお、文脈内で特に明記されていない限り、発射体の先端の方向は「上」又は「下」と定義される。また、読者の便宜上、明細書にはタイトル又はサブタイトルが使用されることがあるが、本発明の範囲に影響を与えない。
【0037】
本明細書で使用される「アミノ酸」とは、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に取り込むことができる任意の単量体ユニットを指す。本明細書で使用される「アミノ酸」という用語には、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン酸（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）又はＤ）、システイン（ＣｙＳ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リジン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）といった２０の天然又は遺伝子コードのα－アミノ酸が含まれる。「Ｘ」残基が明確に定義されていない場合、これらのアミノ酸を「任意のアミノ酸」と定義する。
【0038】
本明細書で使用される「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、リボース核酸（ＲＮＡ）若しくはデオキシリボース核酸（ＤＮＡ）ポリマー又はその類似体に相当しうるポリマーを指す。これは、ＲＮＡやＤＮＡのようなヌクレオチドのポリマー、並びに合成型、その修飾（例えば化学的又は生化学的に修飾された）型、及び混合ポリマー（例えばＲＮＡサブユニットとＤＮＡサブユニットの両方を含む）を含む。修飾の例としては、メチル化、類似体での天然ヌクレオチドの１つ以上の置換、無電荷結合のようなヌクレオチド間修飾（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマート等）、懸垂部分（例えばポリペプチド）、挿入剤（例えばアクリジン、ソラーレン等）、キレート剤、アルキル化剤及び修飾結合（例えばアルファアノマー核酸等）が挙げられる。水素結合や他の化学的相互作用を介して指定配列に結合する能力において、ポリヌクレオチドを模倣する合成分子もまた含まれる。核酸の合成型は他の結合（例えばNielsen et al. (Science 254:1497-1500, 1991)に記載されるようなペプチド核酸）を含むことができるが、典型的には、ヌクレオチドモノマーはホスホジエステル結合を介して結合する。核酸には、例えば染色体又は染色体セグメント、ベクター（例えば発現ベクター）、発現カセット、裸のＤＮＡ又はＲＮＡポリマー、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物、オリゴヌクレオチド、プローブ及びプライマーがなりえる。又は核酸はそれらを含むことができる。核酸は例えば、一本鎖、二本鎖、又は三本鎖であることができ、特定の長さに限定されない。他に断りがない限り、特定の核酸配列は、明示された任意の配列に加え、相補的配列を任意に含んでなるか、又はコードする。
【0039】
本明細書で使用される「ＤＮＡ合成による配列決定（ＳＢＳ）」という用語は、ポリメラーゼ依存性の次世代シーケンシング（ＮＧＳ）法を指す。図１に示すように、ＳＢＳ法は主に以下のプロセスを含む：（ｉ）標識（例えば、蛍光レポーター）を有するヌクレオチド類似体の取り込み。任意選択で、標識されたヌクレオチドは、ヌクレオチドをプライマーに添加するとさらなるプライマー伸長を停止させる可逆的な停止特性を含む。（ｉｉ）取り込まれたヌクレオチドの標識（例えば、蛍光発光）による同定。（ｉｉｉ）段階的な配列決定のため、ポリメラーゼ反応の再開に伴う標識（例えば、蛍光団及び／又はターミネーター）の切断。いくつかのＳＢＳ実施形態は、伸長産物へのヌクレオチドの取り込み時に放出されるプロトンの検出を含む。例えば、放出されたプロトンの検出に基づく配列決定方法は、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（米国コネチカット州ギルフォード、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの子会社）から商業的に入手可能な電気検出器及び関連技術、或いは特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５に記載されている配列決定方法及びシステムを使用することができる。上記出願のそれぞれの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0040】
本明細書で使用される「鋳型」という用語は、所望の又は未知の標的ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド或いはポリヌクレオチド模倣物である。場合によっては、用語「標的配列」、「鋳型ポリヌクレオチド」、「標的核酸」、「標的ポリヌクレオチド」、「核酸鋳型」、「配列鋳型」、及びそれらの変形は互換的に使用される。具体的には、「鋳型」という用語は、鋳型依存性又は鋳型指向性の核酸ポリメラーゼの複製を通じてヌクレオチド或いはヌクレオチド類似体から相補的コピーが合成される核酸鎖を指す。従来の定義では、核酸二重らせんに位置する鋳型鎖は「下側」の鎖として描かれ、説明される。同様に、非鋳型鎖は「上側」の鎖として描かれ、説明されることがよくある。「鋳型」鎖は「センス」又は「プラス」鎖とも呼ばれ、非鋳型鎖は「アンチセンス」又は「マイナス」鎖と呼ばれることもある。
【0041】
本明細書で使用する「プライマー」という用語は、核酸ポリメラーゼが核酸鎖を伸長する開始剤として使用する短い一本鎖オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又は修飾核酸類似体を指す。
【0042】
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチドの取り込み」、「類似体の取り込み」、「取り込みヌクレオチド」及び「取り込み類似体」という用語は当業者に知られており、核酸合成のプロセス又は反応を説明するために使用される。したがって、本明細書で使用される「取り込み」という用語は、核酸プライマーの３’－ヒドロキシル末端に１つ以上のヌクレオチド、或いは任意の特定の核酸前駆体を付加することを柔軟に指すことが知られている。例えば、デオキシグアノシン三リン酸 （ｄＧＴＰ）などのヌクレオシド三リン酸は、ＤＮＡ合成時にＤＮＡポリメラーゼに必要な基質或いは前駆体である。ｄＧＴＰが伸長したＤＮＡ鎖に取り込まれると、新しく合成されたＤＮＡのデオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）部分になる。換言すれば、ｄＧＴＰヌクレオチドがＤＮＡのｄＧＭＰ部分に変換されるとき、当業者はｄＧＴＰがＤＮＡに取り込まれたと言えるであろう。
【0043】
本明細書で使用される「ヌクレオチド類似体」という用語は、典型的なヌクレオチドの構造模倣物である化学的に修飾されたヌクレオチド或いは人工ヌクレオチドを示すことが当業者に知られている。これらのヌクレオチド類似体は、核酸ポリメラーゼが合成するための基質として機能することができる。ヌクレオチド類似体は、ヌクレオチドの１つ以上の変更された構成要素（例えば、リン酸骨格、ペントース糖、核酸塩基）を有する場合があり、これらの変更された構成要素は、ヌクレオチドの構造及び配置を変更するだけでなく、他の核酸塩基及び核酸との相互作用にも影響を与える。例えば、変更された核酸塩基を有するヌクレオチド類似体は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡに別の塩基対合及び塩基スタッキング特性を与えることができる。さらに、一例として、塩基での修飾により、イノシン、イノシン、メチル－５－デオキシシチジン、デオキシウリジン、ジメチルアミノ－５－デオキシウリジン、ジアミノ－２，６－プリン又はブロモ－５－デオキシウリジン、及びハイブリダイゼーションを可能にする他の任意の類似体などのさまざまなヌクレオシドが生成される可能性がある。他の例示的な実施形態において、これらの修飾は、糖部分のレベル（例えば、類似体によるデオキシリボースの置換）及び／又はリン酸官能基レベル（例えば、ボロン酸塩、アルキルホスホン酸塩、或いはホスホロチオエート誘導体）で起こり得る。ヌクレオチド類似体モノマーのリン酸官能基は、一リン酸、二リン酸、三リン酸、四リン酸、五リン酸、及び六リン酸からなる群から選択され得る。他のヌクレオチド類似体の例として、除去可能な保護基部分を有するヌクレオチドも含まれる。除去可能な保護基部分の例としては、３’－Ｏ－保護基部分、塩基保護基部分、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。３’－Ｏ－保護基部分の例としては、Ｏ－Ｎ３、Ｏ－アジドメチル、Ｏ－アミン、Ｏ－アリル、Ｏ－フェノキシアセチル、Ｏ－メトキシアセチル、Ｏ－アセチル、Ｏ－（ｐ－トルエン）スルホン酸塩、Ｏ－リン酸塩、Ｏ－硝酸塩、Ｏ－［４－メトキシ］－テトラヒドロチオピラニル、Ｏ－テトラヒドロチオピラニル、Ｏ－［５－メチル］－テトラヒドロフラニル、Ｏ－［２－メチル，４－メトキシ］－テトラヒドロピラニル、Ｏ－［５－メチル］－テトラヒドロピラニル、Ｏ－テトラヒドロチオフラニル、Ｏ－２－ニトロベンジル、Ｏ－メチル及びＯ－アシルが挙げられるが、これらに限定されない。塩基保護基部分の例は、可逆的ダイターミネーターであり得る。可逆的ダイターミネーターの例としては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑの可逆的ダイターミネーター、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑの可逆的ダイターミネーター、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩＸの可逆的ダイターミネーター、Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅの可逆的ダイターミネーター、及びＬａｓｅｒＧｅｎのＬｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓの可逆的ダイターミネーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【0044】
本明細書で使用される場合、「ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＢ）」とは、全ての生命ドメイン及び多数のＤＮＡウイルスにおいて最も一般的な鋳型依存性核酸ポリメラーゼ又はレプリカーゼを指す。ほとんどの核酸ポリメラーゼと同様に、天然のＰｏｌＢは二本鎖プライマー鋳型を必要とし、プライマー末端に遊離の３’－ヒドロキシル（３’－ＯＨ）官能基、４つ全てのヌクレオシド三リン酸 （ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＧＴＰ）、及び触媒作用をもたらす二価カチオン（Ｍｇ２＋又はＭｎ２＋など）を持ち、前述のカチオンは、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ反応を触媒して、プライマーの３’－ＯＨ 末端にヌクレオチドを付加するために使用される。細菌ＰｏｌＩＩや古細菌ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼなどのＰｏｌＢ酵素は、本質的に触媒ポリメラーゼドメインと、核酸複製中に成長するプライマー鎖から誤って取り込まれたヌクレオチドを除去するために使用される３’→５’エキソヌクレアーゼドメイン又はプルーフリーディングドメインを含む複製型と修復型ポリメラーゼである。「３'→５'エキソヌクレアーゼドメイン」という用語は、プライマー又はポリヌクレオチド鎖の３'末端から核酸分解活性を発揮することができるポリメラーゼのアミノ酸配列領域を指す。同様に用語「触媒ポリメラーゼドメイン」は、プライマー又はポリヌクレオチド鎖の３’末端にヌクレオチドを付加することによって触媒ＤＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼ活性を発揮するポリメラーゼのアミノ酸配列領域も指す。
【0045】
現在知られているＰｏｌＢ触媒ポリメラーゼドメインは、均しくヒトの右手の形状に似ており、主要な機能領域がそれぞれ指、手のひら、及び親指のサブドメインとして特徴付けられている。最も保存されている領域は、手のひらのサブドメインであり、触媒作用に必須の残基が含まれている。異なる生命界及びＤＮＡウイルス界に由来する各種ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ間のタンパク質配列アラインメントによりＰｏｌＢポリメラーゼが基本的なエキソヌクレアーゼヌクレアーゼ及びポリメラーゼ機能を有するため、一般に６つの半保存或いは保存されたモチーフ（Ｉ～ＶＩ）を保持していることが明らかになる。最初の３つの配列モチーフ（ＥｘｏＩ、ＥｘｏＩＩ、ＥｘｏＩＩＩ）は、３’→５’エキソヌクレオシドドメインにあり、他の３つのモチーフ（それぞれＡ、Ｂ及びＣモチーフと呼ばれる）はポリメラーゼドメインにある（１９９９年Ｈｏｐｆｎｅｒらは非特許文献２に発表）。
【0046】
本明細書で使用する場合、本発明のＤＮＡポリメラーゼに関して「突然変異体」という用語は、対応する機能的ＤＮＡポリメラーゼと比較して１つ以上のアミノ酸置換を含む、通常は組換え型ポリペプチドを指す。
【0047】
変異ＤＮＡポリメラーゼの文脈では、「異なる配列（例えば、領域、断片、ヌクレオチド又はアミノ酸の位置など）への対応」は、ヌクレオチド又はアミノ酸の位置番号によって番号付けし、その後に配列の同一性百分率を最大化する方法で配列を整列させる慣例に基づいている。「［特定の配列］の［Ｘ］位に対応する」アミノ酸とは、特定の配列に等価なアミノ酸によって整列させる目的のポリペプチド中のアミノ酸を指す。一般に、本明細書に記載されるように、ポリメラーゼの位置に対応するアミノ酸は、ＢＬＡＳＴなどの整列アルゴリズムを使用して決定できる。所定の「対応する領域」内の全ての位置が同一である必要はないので、対応する領域内の一致しない位置を、「対応する位置」と見做してもよい。従って、本明細書で使用する場合に、「特定のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸位置Ｘに対応するアミノ酸位置」は、他のＤＮＡポリラーゼ及び構造相同体及びファミリーでの整列に基づく等価な位置を指している。
【0048】
本明細書で使用される「半保存」という用語は、異なる供給源からの異なるＰｏｌＢの相同位置に、同様の特性を有するアミノ酸残基或いは同じアミノ酸残基を有するポリメラーゼ断片を指す。「保存」という用語は、異なる供給源からの異なるＰｏｌＢのポリメラーゼ断片が相同位置に同じアミノ酸残基を有することを指す。
【0049】
本明細書で使用される「配列番号１のコンセンサス配列」という用語は、異種間ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼの保存されたアミノ酸を含む参照配列を指す。配列番号１のコンセンサス配列は、保存されたアミノ酸を得るため、好熱菌（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｇｏ）、好熱菌（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｄ１）、好熱菌属（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）（菌株９°Ｎ－７）のＤＮＡポリメラーゼ（９°Ｎ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ）、好熱菌（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ）、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｍａ）、メタノサルシナアセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ） のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｃ）、ヒトＤＮＡポリメラーゼδのｐ１２５触媒サブユニット（ｈＰＯＬＤ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＤＮＡポリメラーゼδの触媒サブユニット（ＳｃｅＰＯＬＤ）、ピロバキュラム・イスランジカム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｉｓ）、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｓｏ）、緑膿菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐａｅ）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｅｃｏ）、バクテリオファージ（大腸菌ファージ［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｐｈａｇｅ］）ＲＢ６９ ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＢ６９）、バクテリオファージ（大腸菌ファージ）Ｔ４のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ４）及びバクテリオファージ（バチルスファージ［Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｈａｇｅ］）Ｐｈｉ２９のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈｉ２９）といった１６種類の野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼをアラインメントすることによって生成された仮想配列である。ＥｘｏＩモチーフ、ＥｘｏＩＩモチーフ、ＥｘｏＩＩＩモチーフ、Ａモチーフ、Ｂモチーフ及びＣモチーフの位置は、本発明の配列番号１のコンセンサス配列を用いて本発明者により定義されたものであるため、本発明で定義されるモチーフの位置は先行技術に記載されているものと完全に同じではないことに留意されたい。
【0050】
（目的）
一般的に言えば、ＳＢＳ法で検討され最終的に採用されるＤＮＡポリメラーゼは、次の特性を備えている必要がある。（ｉ）ポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである必要があり、換言すれば、ポリメラーゼは複製用のＤＮＡ鋳型を持っている必要がある。（ｉｉ）ポリメラーゼは、ヌクレオチドを迅速に取り込む必要があり、ヌクレオチド取り込み速度が速いＤＮＡポリメラーゼは、より効率的にＤＮＡ合成を触媒できる。（ｉｉｉ）ポリメラーゼは系統的誤差を最小限に抑えるために高い複製忠実度を備えていなければならず、換言すれば、ポリメラーゼはＤＮＡ鋳型の配列情報を正確に読み取り、ＤＮＡ鋳型に従って正確で一致するヌクレオチドを忠実に取り込むことができなければならない。（ｉｖ）ポリメラーゼは、長く、内因性で、複製可能な連続合成能力（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）を持たなければならない。本明細書で使用される場合、ＤＮＡポリメラーゼの連続合成能力は、プライマー／鋳型（Ｐ／Ｔ）ＤＮＡを使用した複合体形成中に取り込まれるｄＮＴＰ又はヌクレオチド類似体の数によって定義される。（ｖ）ポリメラーゼは、単量体の形で機能することで、より簡単に生成し、さらに修飾することができる（非特許文献１に掲載され、２０１４年にＣｈｅｎ，Ｃ．Ｙ．から発表されたＤＮＡポリメラーゼ駆動ＤＮＡ合成配列決定技術：過去と現在）。
一般的に言えば、ＳＢＳ法で検討され最終的に採用されるＤＮＡポリメラーゼは、次の特性を備えている必要がある。（ｉ）ポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである必要があり、換言すれば、ポリメラーゼは複製用のＤＮＡ鋳型を持っている必要がある。（ｉｉ）ポリメラーゼは、ヌクレオチドを迅速に取り込む必要があり、ヌクレオチド取り込み速度が速いＤＮＡポリメラーゼは、より効率的にＤＮＡ合成を触媒できる。（ｉｉｉ）ポリメラーゼは系統的誤差を最小限に抑えるために高い複製忠実度を備えていなければならず、換言すれば、ポリメラーゼはＤＮＡ鋳型の配列情報を正確に読み取り、ＤＮＡ鋳型に従って正確で一致するヌクレオチドを忠実に取り込むことができなければならない。（ｉｖ）ポリメラーゼは、長く、内因性で、複製可能な連続合成能力（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）を持たなければならない。本明細書で使用される場合、ＤＮＡポリメラーゼの連続合成能力は、プライマー／鋳型（Ｐ／Ｔ）ＤＮＡを使用した複合体形成中に取り込まれるｄＮＴＰ又はヌクレオチド類似体の数によって定義される。（ｖ）ポリメラーゼは、単量体の形で機能することで、より簡単に生成し、さらに修飾することができる（非特許文献１に掲載され、２０１４年にＣｈｅｎ，Ｃ．Ｙ．から発表されたＤＮＡポリメラーゼ駆動ＤＮＡ合成配列決定技術：過去と現在）。
【0051】
したがって、本発明の目的の１つは、ＰｏｌＢ変異体が、ポリヌクレオチドを合成し、関連する核酸鋳型を配列決定する際に、ヌクレオチド類似体の取り込み効率が向上できるように、上記の原理に基づくファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＢ）変異体を提供することである。これらのＰｏｌＢ変異体は、核酸鋳型及びヌクレオチド類似体の存在下で、上述の酵素触媒による核酸合成及び配列決定を効率的に行うことを可能にすることができる。より具体的に言えば、これらのＰｏｌＢ変異体は、通常の核酸鋳型及び可逆的ダイターミネーターヌクレオチドと組み合わせると、上記の酵素触媒による核酸合成及び配列決定を効率的に実行して、関連する核酸鋳型の配列を正確に確認することができる。例えば、ＰｏｌＢ変異体は、修飾されたヌクレオチド類似体の合成及びプライマーの３’末端への取り込みを指示するため、正常な未修飾の核酸鋳型に依存する可能性がある。取り込みに使用されるヌクレオチドは、識別可能な蛍光レポーターを持ち、核酸鋳型のＤＮＡ配列情報の確認に使用されることができる。
【0052】
本発明者は、ＰｏｌＢ変異体が広範な基質特異性を有することを見出した。これは、修飾されたＰｏｌＢ変異体が、鋳型依存性の核酸合成のため、天然に存在するヌクレオチドだけでなく、様々な修飾ヌクレオチドも利用できることを意味する。したがって、これらのＰｏｌＢ変異体は、核酸配列を確認するためのＤＮＡ合成による配列決法におけるヌクレオチドの取り込み効率を高めることができる。
【0053】
（ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体）
したがって、本発明は、配列番号１のコンセンサス配列のアミノ酸配列に基づいて描写されるポリメラーゼ変異体を提供する。配列番号１のコンセンサス配列を比較すると、該ポリメラーゼ変異体は１つ以上の残基に置換変異を有し、置換変異は該配列と同じ位置又は機能的に等価な位置で起こり得ることが分かる。当業者であれば、本明細書に記載されているポリメラーゼ変異体が天然に存在するものではないことを容易に理解するであろう。したがって、本明細書に記載されるポリメラーゼ変異体は、配列番号１のコンセンサス配列に基づいており、１つ以上の残基における置換変異をさらに含む。一実施形態において、置換変異は、配列番号１のコンセンサス配列のアミノ酸と機能的に等価な位置で起こる。「機能的に等価」とは、該ポリメラーゼ変異体が配列番号１のコンセンサス配列のアミノ酸位置でアミノ酸置換を起こり、前述のアミノ酸置換はコンセンサス配列とポリメラーゼ変異体の両方において同じ機能を有することを意味する。
したがって、本発明は、配列番号１のコンセンサス配列のアミノ酸配列に基づいて描写されるポリメラーゼ変異体を提供する。配列番号１のコンセンサス配列を比較すると、該ポリメラーゼ変異体は１つ以上の残基に置換変異を有し、置換変異は該配列と同じ位置又は機能的に等価な位置で起こり得ることが分かる。当業者であれば、本明細書に記載されているポリメラーゼ変異体が天然に存在するものではないことを容易に理解するであろう。したがって、本明細書に記載されるポリメラーゼ変異体は、配列番号１のコンセンサス配列に基づいており、１つ以上の残基における置換変異をさらに含む。一実施形態において、置換変異は、配列番号１のコンセンサス配列のアミノ酸と機能的に等価な位置で起こる。「機能的に等価」とは、該ポリメラーゼ変異体が配列番号１のコンセンサス配列のアミノ酸位置でアミノ酸置換を起こり、前述のアミノ酸置換はコンセンサス配列とポリメラーゼ変異体の両方において同じ機能を有することを意味する。
【0054】
一般的に言えば、２つ以上の異なるポリメラーゼにおける機能的に等価な置換変異は、これらのポリメラーゼのアミノ酸配列における相同なアミノ酸位置で起こる。したがって、特定の変異アミノ酸の特定の機能が既知であるかどうかに関係なく、該変異が「位置的に等価」或いは「相同」である限り、「機能的に等価」として分類できる。配列アラインメント及び／又は分子モデリングに基づいて、２つ以上の異なるポリメラーゼのアミノ酸配列における機能的に等価及び位置的に等価なアミノ酸残基位置を同定することができる。例えば、図２は、１６種類の野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列アラインメントを用いて位置的に等価及び／又は機能的に等価な残基を同定したものを示している。したがって、Ｔｇｏ、Ｋｏｄ１、９°Ｎ、Ｐｆｕ及びＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼの例示的な残基１４１とＭａｃ ＤＮＡポリメラーゼの例示的な残基１９８は、機能的及び位置的に等価である。同様に、Ｔｇｏ、Ｋｏｄ１、９°Ｎ、Ｐｆｕ、及びＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼの例示的な残基１４３とＭａｃポリメラーゼの典型的な残基２００は、機能的及び位置的に等価である。当業者であれば、他のＤＮＡポリメラーゼにおける機能的に等価な残基を同定することもできる。
【0055】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明のファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号１のコンセンサス配列の３４９位～３６４位、４５０位～４７６位、５９０位～６０８位、７０６位～７３０位、８４３位～８５５位及び９４０位～９５６位にそれぞれ対応するＥｘｏＩモチーフ、ＥｘｏＩＩモチーフ、ＥｘｏＩＩＩモチーフ、Ａモチーフ、Ｂモチーフ及びＣモチーフと、ＥｘｏＩモチーフ、ＥｘｏＩＩモチーフ及びＥｘｏＩＩＩモチーフからなる群から選択されるモチーフ内の位置にある少なくとも１つのアミノ酸置換（１個以上のアミノ酸置換、又はアミノ酸置換の組み合わせ）と、Ａモチーフ、Ｂモチーフ及びＣモチーフからなる群から選択されるモチーフ内の位置にある少なくとも１つのアミノ酸置換（１個以上のアミノ酸置換、又はアミノ酸置換の組み合わせ）とを含む。
【0056】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６及び１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼを用いて修飾され、それぞれ好熱菌（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ） のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）（Ｔｇｏ）、好熱菌（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ） ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｄ１）、好熱菌属（菌株９°Ｎ－７）のＤＮＡポリメラーゼ（９°Ｎ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ）、好熱菌（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ）、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｍａ）、メタノサルシナアセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｃ）、ヒトＤＮＡポリメラーゼδのｐ１２５触媒サブユニット（ｈＰＯＬＤ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＤＮＡポリメラーゼδの触媒サブユニット（ＳｃｅＰＯＬＤ）、ピロバキュラム・イスランジカム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｉｓ）、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｓｏ）、緑膿菌のＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐａｅ）、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｅｃｏ）、バクテリオファージ（大腸菌ファージ）ＲＢ６９のＤＮＡポリメラーゼ（ＲＢ６９）、バクテリオファージ（大腸菌ファージ）Ｔ４のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ４）又はバクテリオファージ（バチルスファージ）Ｐｈｉ２９のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈｉ２９）を含む野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼに由来する。
【0057】
本発明のいくつかの実施形態によれば、配列番号１の３５４位に対応するアミノ酸は、Ｄ以外の任意のアミノ酸であり、例えば、前記アミノ酸はＮ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｖ、Ｒ、Ｈ、Ｋ又はＥで置換され得る。配列番号１の３５５位に対応するアミノ酸は、Ｉ以外の任意のアミノ酸であり、例えば、前記アミノ酸はＮ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ又はＥで置換され得る。配列番号１の３５６位に対応するアミノ酸は、Ｅ以外の任意のアミノ酸であり、例えば、前記アミノ酸はＮ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｖ、Ｒ、Ｈ、Ｋ又はＤで置換され得る。配列番号１の７１５位に対応するアミノ酸は、Ｌ又はＭ以外の任意のアミノ酸であり、例えば、前記アミノ酸はＮ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｖ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ又はＥで置換され得る。配列番号１の７１６位に対応するアミノ酸は、Ｙ以外の任意のアミノ酸であり、例えば、前記アミノ酸はＮ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｖ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ又はＥで置換され得る。配列番号１の７１７位に対応するアミノ酸は、Ｐ以外の任意のアミノ酸であり、例えば、前記アミノ酸はＮ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｖ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ又はＥで置換され得る。本発明の好ましい実施形態において、配列番号１の８５４位に対応するアミノ酸は、Ａ以外の任意のアミノ酸であり、例えば、前記アミノ酸はＮ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｖ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ又はＥで置換され得る。
【0058】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号３の野生型アミノ酸配列を有する好熱菌（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｄ１）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号３のＥ１４１はＡで置換され、配列番号１の３５６位に対応する配列番号３のＥ１４３はＡで置換され、配列番号１の７１５位に対応する配列番号３のＬ４０８はＡ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹ、好ましくはＡ、Ｑ又はＹ、より好ましくはＹで置換され、配列番号１の７１６位に対応する配列番号３のＹ４０９はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩ、好ましくはＡで置換され、配列番号１の７１７位に対応する配列番号３のＰ４１０はＡ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｓ又はＴ、好ましくはＦ又はＧ、より好ましくはＧで置換される。特定の実施形態において、配列番号１の８５４位に対応する配列番号３のＡ４８５は、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＬ、好ましくはＥ又はＬ，より好ましくはＬで置換される。
【0059】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号４の野生型アミノ酸配列を有する好熱菌属（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）（菌株９°Ｎ－７）のＤＮＡポリメラーゼ（９°Ｎ）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号４のＤ１４１はＡで置換され、配列番号１の３５６位に対応する配列番号４のＥ１４３はＡで置換され、配列番号１の７１５位に対応する配列番号４のＬ４０８はＡ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹ、好ましくはＡ、Ｑ又はＹ、より好ましくはＹで置換され、配列番号１の７１６位に対応する配列番号４のＹ４０９はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩ、好ましくはＡで置換され、配列番号１の７１７位に対応する配列番号４のＰ４１０はＡ、Ｃ、Ｆ、Ｇ又はＳ或いはＴ、好ましくはＦ又はＧ、より好ましくはＧで置換される。特定の実施形態において、配列番号１の８５４位に対応する配列番号４のＡ４８５は、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＬ、好ましくはＥ又はＬ、より好ましくはＬで置換される。
【0060】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号５の野生型アミノ酸配列を有するパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号５のＤ１４１はＡで置換され、配列番号１の３５６位に対応する配列番号５のＥ１４３はＡで置換され、配列番号１の７１５位に対応する配列番号５のＩ４０９はＡ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹ、好ましくはＡ、Ｑ又はＹ、より好ましくはＹで置換され、配列番号１の７１６位に対応する配列番号５のＹ４１０はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩ、好ましくはＡで置換され、配列番号１の７１７位に対応する配列番号５のＰ４１１はＡ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｓ又はＴ、好ましくはＦ又はＧ、より好ましくはＧで置換される。特定の実施形態において、配列番号１の８５４位に対応する配列番号５のＡ４８６は、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＬ、好ましくはＥ又はＬ、より好ましくはＬで置換される。
【0061】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号６の野生型アミノ酸配列を有する好熱菌（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号６のＤ１４１はＡで置換され、配列番号１の３５６位に対応する配列番号６のＥ１４３はＡで置換され、配列番号１の７１５位に対応する配列番号６のＬ４１１はＡ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹ、好ましくはＡ、Ｑ又はＹ、より好ましくはＹで置換され、配列番号１の７１６位に対応する配列番号６のＹ４１２はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩ、好ましくはＡで置換され、配列番号１の７１７位に対応する配列番号６のＰ４１３はＡ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｓ又はＴ、好ましくはＦ又はＧ、より好ましくはＧで置換される。特定の実施形態において、配列番号１の８５４位に対応する配列番号６のＡ４８８は、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＬ、好ましくはＥ又はＬ、より好ましくはＬで置換される。
【0062】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号８の野生型アミノ酸配列を有するメタノサルシナアセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｃ）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号８のＤ１９８はＡで置換され、配列番号１の３５６位に対応する配列番号８のＥ２００はＡで置換され、配列番号１の７１５位に対応する配列番号８のＬ４８５はＡ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹ、好ましくはＡ、Ｑ又はＹ、より好ましくはＹで置換され、配列番号１の７１６位に対応する配列番号８のＹ４８６はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩ、好ましくはＡで置換され、配列番号１の７１７位に対応する配列番号８のＰ４８７はＡ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｓ又はＴ、好ましくはＦ又はＧ、より好ましくはＧで置換される。特定の実施形態において、配列番号１の８５４位に対応する配列番号８のＡ５６５は、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＬ、好ましくはＥ又はＬ、より好ましくはＬで置換される。
【0063】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号１１の野生型アミノ酸配列を有するピロバキュラム・イスランジカム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｉｓ）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号１１のＤ１７１はＡで置換され、配列番号１の３５６位に対応する配列番号１１のＥ１７３はＡで置換され、配列番号１の７１５位に対応する配列番号１１のＭ４２６はＡ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹ、好ましくはＡ、Ｑ又はＹ、より好ましくはＹで置換され、配列番号１の７１６位に対応する配列番号１１のＹ４２７はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩ、好ましくはＡで置換され、配列番号１の７１７位に対応する配列番号１１のＰ４２８はＡ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｓ又はＴ、好ましくはＦ又はＧ、より好ましくはＧで置換される。特定の実施形態において、配列番号１の８５４位に対応する配列番号１１のＡ５０８は、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＬ、好ましくはＥ又はＬ、より好ましくはＬで置換される。
【0064】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号１２の野生型アミノ酸配列を有するスルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｓｏ）に由来し、配列番号１の３５４位に対応する配列番号１２のＤ２３１はＡで置換され、配列番号１の３５６位に対応する配列番号１２のＥ２３３はＡで置換され、配列番号１の７１５位に対応する配列番号１２のＬ５１８は由Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＹ、好ましくはＡ、Ｑ又はＹ、より好ましくはＹで置換され、配列番号１の７１６位に対応する配列番号１２のＹ５１９はＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩ、好ましくはＡで置換され、配列番号１の７１７位に対応する配列番号１２のＰ５２０はＡ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｓ又はＴ、好ましくはＦ又はＧ、より好ましくはＧで置換される。特定の実施形態において、配列番号１の８５４位に対応する配列番号１２のＡ６０１は、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＬ、好ましくはＥ又はＬ、より好ましくはＬで置換される。
【0065】
（ポリメラーゼの突然変異誘発）
本明細書において、様々な種類の突然変異誘発の技術を任意に使用でき、例えばポリメラーゼを改変して本発明の変異体を生成するか、或いはランダム又は半ランダム突然変異アプローチを使用する。一般に利用可能な突然変異誘発手順は、ポリメラーゼ変異体の作成に使用されることができ、このような突然変異誘発手順には、場合により１つ以上の目的の活性についての突然変異核酸及びポリペプチドの選択が含まれる。使用できる手順には、部位特異的点突然変異導入、ランダム点突然変異誘発、インビトロ又はインビボでの相同組換え（ＤＮＡシャッフリング及びコンビナトリアルオーバーラップＰＣＲ）、ウラシル含有鋳型を使用した突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異導入、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップ付き二本鎖ＤＮＡを使用した突然変異誘発、点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使用した突然変異誘発、制限選択及び制限精製突然変異誘発、欠失突然変異誘発、全遺伝子合成による突然変異誘発、縮重ＰＣＲ、二本鎖切断修復及び当業者に知られている他の多くの方法が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において、様々な種類の突然変異誘発の技術を任意に使用でき、例えばポリメラーゼを改変して本発明の変異体を生成するか、或いはランダム又は半ランダム突然変異アプローチを使用する。一般に利用可能な突然変異誘発手順は、ポリメラーゼ変異体の作成に使用されることができ、このような突然変異誘発手順には、場合により１つ以上の目的の活性についての突然変異核酸及びポリペプチドの選択が含まれる。使用できる手順には、部位特異的点突然変異導入、ランダム点突然変異誘発、インビトロ又はインビボでの相同組換え（ＤＮＡシャッフリング及びコンビナトリアルオーバーラップＰＣＲ）、ウラシル含有鋳型を使用した突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異導入、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップ付き二本鎖ＤＮＡを使用した突然変異誘発、点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使用した突然変異誘発、制限選択及び制限精製突然変異誘発、欠失突然変異誘発、全遺伝子合成による突然変異誘発、縮重ＰＣＲ、二本鎖切断修復及び当業者に知られている他の多くの方法が含まれるが、これらに限定されない。
【0066】
（ＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードする核酸）
本発明のいくつかの実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードする核酸をさらに開示する。特定のアミノ酸は、複数のコドンによってコードされる場合があり、特定の翻訳系（原核細胞又は真核細胞など）はコドンの偏りを示すことがよくあり、つまり異なる生物は、同じアミノ酸をコードするいくつかの同義コドンのうちの１つを好むことがよくある。したがって、本明細書で提案する核酸は場合により「コドン最適化」されており、これは、ポリメラーゼを発現するために使用される特定の翻訳系が好むコドンを含むように核酸が合成されることを意味する。例えば、細菌細胞（又は特定の細菌株）内でポリメラーゼを発現させることが望ましい場合、ポリメラーゼを効率的に発現させるため、該細菌細胞のゲノム内で最も頻繁に見出されるコドンを含むように核酸を合成することができる。真核細胞内でポリメラーゼを発現させることが望ましい場合、同様の戦略を使用することができ、例えば、該核酸には該真核細胞が好むコドンを含めることができる。
本発明のいくつかの実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードする核酸をさらに開示する。特定のアミノ酸は、複数のコドンによってコードされる場合があり、特定の翻訳系（原核細胞又は真核細胞など）はコドンの偏りを示すことがよくあり、つまり異なる生物は、同じアミノ酸をコードするいくつかの同義コドンのうちの１つを好むことがよくある。したがって、本明細書で提案する核酸は場合により「コドン最適化」されており、これは、ポリメラーゼを発現するために使用される特定の翻訳系が好むコドンを含むように核酸が合成されることを意味する。例えば、細菌細胞（又は特定の細菌株）内でポリメラーゼを発現させることが望ましい場合、ポリメラーゼを効率的に発現させるため、該細菌細胞のゲノム内で最も頻繁に見出されるコドンを含むように核酸を合成することができる。真核細胞内でポリメラーゼを発現させることが望ましい場合、同様の戦略を使用することができ、例えば、該核酸には該真核細胞が好むコドンを含めることができる。
【0067】
本明細書に記載の核酸分子はまた、適切な宿主内でそこからコードされるポリメラーゼタンパク質を発現するために適切な発現ベクターに有利に含まれ得る。その後の前記細胞の形質転換やその後の形質転換細胞の選択のため、クローン化されたＤＮＡを適切な発現ベクターに取り込むことは、当業者にとって周知である。この発現ベクターは、プロモーター領域などの調節配列に作動可能に連結されることで、ＤＮＡ断片の発現に影響を与えることができる本明細書に記載の実施形態による核酸を有するベクターを含む。このようなベクターは、本明細書に記載の実施形態によるファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体の発現を提供するため、適切な宿主細胞に形質転換され得る。
【0068】
核酸分子は、成熟タンパク質又はプロ配列（ｐｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有するタンパク質をコードすることができ、後者はまずプレタンパク質上のリーダー配列をコードし、次いで宿主細胞によって切断されて成熟タンパク質を形成する。前記ベクターは、複製起点とヌクレオチドを発現するための任意のプロモーター及び前記プロモーターの任意の調節因子を有するプラスミド、ウイルス又はファージなどのベクターであり得る。前記ベクターは、抗生物質耐性遺伝子などの１つ以上の選択マーカーを含み得る。
【0069】
（ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体を含む組成物）
本発明の一態様は、本明細書に記載のファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体を含む組成物も提供する。前記組成物は、ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体に加えて、他の成分をさらに含んでもよい。例えば、前記組成物には、緩衝液、ヌクレオチド溶液又はこれらの組み合わせが含まれ得る。ヌクレオチド溶液は、標識されたヌクレオチド、合成されたヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド、又はこれらの組み合わせが含まれ得る。本発明の一実施形態によれば、本発明の組成物は、標的核酸のライブラリー（ｌｉｂｒａｒｙ）などの標的核酸を含む。
本発明の一態様は、本明細書に記載のファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体を含む組成物も提供する。前記組成物は、ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体に加えて、他の成分をさらに含んでもよい。例えば、前記組成物には、緩衝液、ヌクレオチド溶液又はこれらの組み合わせが含まれ得る。ヌクレオチド溶液は、標識されたヌクレオチド、合成されたヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド、又はこれらの組み合わせが含まれ得る。本発明の一実施形態によれば、本発明の組成物は、標的核酸のライブラリー（ｌｉｂｒａｒｙ）などの標的核酸を含む。
【0070】
（ＳＢＳ反応用を行うためのキット）
本発明の一態様は、少なくとも１つの本発明に係るファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体と、プライマーと、ポリヌクレオチド鋳型と、適した条件下で前記プライマーを取り込むことで、プライマーの末端に取り込まれたヌクレオチドと相補的な鋳型核酸塩基を確認するためのヌクレオチド類似体とを含む、合成によるシーケンス反応用のキットを提供する。前記キットは、場合により前記ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体及び前記ヌクレオチド溶液に必要な緩衝液や溶液などの他の試薬も含んでもよい。通常、前記キットには、組み立てられた又はパッケージ化されたコンポーネントの使用説明書も含まれる。
本発明の一態様は、少なくとも１つの本発明に係るファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体と、プライマーと、ポリヌクレオチド鋳型と、適した条件下で前記プライマーを取り込むことで、プライマーの末端に取り込まれたヌクレオチドと相補的な鋳型核酸塩基を確認するためのヌクレオチド類似体とを含む、合成によるシーケンス反応用のキットを提供する。前記キットは、場合により前記ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体及び前記ヌクレオチド溶液に必要な緩衝液や溶液などの他の試薬も含んでもよい。通常、前記キットには、組み立てられた又はパッケージ化されたコンポーネントの使用説明書も含まれる。
【0071】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ヌクレオチド溶液は、標識されたヌクレオチドを含む。本発明の特定の実施形態によれば、前記ヌクレオチドは、合成されたヌクレオチドである。本発明の特定の実施形態によれば、前記ヌクレオチドは、化学的に修飾されたヌクレオチドである。特定の実施形態において、修飾ヌクレオチドは、置換基のサイズが天然に存在する３'ヒドロキシル基よりも大きくなるように、３'糖ヒドロキシルに改変された化学官能基を有する。特定の実施形態において、前記修飾ヌクレオチドには、プリン又はピリミジン塩基と、除去可能な３’保護基が共有結合したリボース或いはデオキシリボース糖部分とを含む修飾ヌクレオチド又はヌクレオシド分子が含まれる。特定の実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは直接検出を容易にするため、蛍光標識される。特定の実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、切断可能なリンカーを介して検出可能な標識に結合した塩基を有するヌクレオチド又はヌクレオシドを含む。特定の実施形態において、前記検出可能な標識には蛍光標識が含まれる。
【0072】
（使用方法）
本発明はさらに、（ｉ）上記の実施形態に記載のファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体、（ｉｉ）ＤＮＡ鋳型、（ｉｉｉ）ヌクレオチド溶液といった成分を相互作用させることを含む、ヌクレオチド類似体をＤＮＡに取り込む方法を提供する。本発明の特定の実施形態によれば、該ＤＮＡ鋳型は、ガラス或いはシリコンウェーハ上のクラスター化されたアレイを含む。したがって、多重化、並行した核酸合成及び配列決定を実行して、各種核酸の配列を決定することができる。このＰｏｌＢ変異体駆動のアレイベースの合成による配列決定法は、ＤＮＡ配列決定の全体的なスループットが向上し、ＤＮＡ配列決定の全体的なコストを削減できる。
本発明はさらに、（ｉ）上記の実施形態に記載のファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体、（ｉｉ）ＤＮＡ鋳型、（ｉｉｉ）ヌクレオチド溶液といった成分を相互作用させることを含む、ヌクレオチド類似体をＤＮＡに取り込む方法を提供する。本発明の特定の実施形態によれば、該ＤＮＡ鋳型は、ガラス或いはシリコンウェーハ上のクラスター化されたアレイを含む。したがって、多重化、並行した核酸合成及び配列決定を実行して、各種核酸の配列を決定することができる。このＰｏｌＢ変異体駆動のアレイベースの合成による配列決定法は、ＤＮＡ配列決定の全体的なスループットが向上し、ＤＮＡ配列決定の全体的なコストを削減できる。
【0073】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本明細書に記載のＰｏｌＢ変異体は、酵素、抗体、化学官能基（例えばヌクレオチドの塩基、リン酸部分又は五炭糖上のビオチン、デスチオビオチン又は蛍光団）と共有結合したヌクレオチドコンジュゲート又は類似体を鋳型依存性の合成方法でそれぞれプライマー或いは核酸イニシエーターの３’末端に取り込まれるために使用できる。
【0074】
核酸合成中にＰｏｌＢ変異体によりこれらのヌクレオチド複合体又は類似体を核酸に取り込むとき、同時に酵素、抗体、或いは化学官能基などの所望の成分を配列依存的な方法で新しく合成された核酸に追加する。核酸プローブ及びコンジュゲートを標識又は生成するために使用される一般的な成分は当技術分野で知られており、ヌクレオチド類似体、修飾リンカー（ビオチン、チオール、アジド或いはアミン基など）、蛍光団、酵素及び抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0075】
一方、本発明の実施形態によれば、合成されたヌクレオチドの塩基、リン酸部分又は五炭糖は、修飾されたリンカーを介して酵素、抗体、化学官能基或いは蛍光団と共有結合または非共有結合することにより核酸の合成後修飾を達成できる。したがって、所望の成分を特定の塩基と共有結合又は非共有結合させて、新たに合成されたポリヌクレオチドの３’末端に付加させることができる。塩基特異的コンジュゲートは、核酸鋳型の配列を決定するためのレポーターとして使用できる。
【0076】
また、いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＰｏｌＢ変異体は、合成配列決定法において３’－修飾された可逆的ダイターミネーター（ＲＤＴ）ヌクレオチドを取り込むために使用することができ、ヌクレオチドの糖部分の３’－ヒドロキシル官能基（３’－ＯＨ）に切断可能な化学置換基を持ち、ヌクレオチド塩基上に異なる蛍光スペクトル特性を備えた除去可能な蛍光分子を持つ。ＰｏｌＢ変異体による鋳型指向合成及び個々のＲＤＴヌクレオチドの取り込みは、それぞれＡ、Ｔ、Ｃ、又はＧ塩基の蛍光読み取り値として使用され、関連する核酸鋳型の配列を決定できる。
【実施例】
【0077】
本節では、以下の実施例を通じて本発明の内容をより詳細に説明するが、これらの実施例は例示に過ぎず、当業者であれば容易に種々の変形及び変更を想到することができる。したがって、以下では本発明の様々な実施例について詳細に説明するが、本発明は本明細書に列挙される様々な実施例に限定されない。
【0078】
（実施例１）
各種ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼのタンパク質配列アラインメント、及びコンセンサス配列と変異体の決定
図２は、１６種類の野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＢ）のアミノ酸配列のアラインメント結果を示し、アラインメントされたコンセンサス配列の結果を図の下部に列挙する（配列番号１）。アラインメントされた１６種類の野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼは、好熱菌（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｇｏ、配列番号２）、好熱菌（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｄ１、配列番号３）、好熱菌属（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）（菌株９°Ｎ－７）のＤＮＡポリメラーゼ（９°Ｎ、配列番号４）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ、配列番号５）、好熱菌（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ、配列番号６）、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｍａ、配列番号７）、メタノサルシナアセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｃ、配列番号８）、ヒトＤＮＡポリメラーゼδのｐ１２５触媒サブユニット（ｈＰＯＬＤ、配列番号９）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＤＮＡポリメラーゼδの触媒サブユニット（ＳｃｅＰＯＬＤ、配列番号１０）、ピロバキュラム・イスランジカム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｉｓ、配列番号１１）、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｓｏ、配列番号１２）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐａｅ、配列番号１３）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．Ｃｏｌｉ）のＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｅｃｏ、配列番号１４）、バクテリオファージＲＢ６９のＤＮＡポリメラーゼ（ＲＢ６９、配列番号１５）、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ４、配列番号１６）及びバクテリオファージＰｈｉ２９のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈｉ２９、配列番号１７）であった。
各種ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼのタンパク質配列アラインメント、及びコンセンサス配列と変異体の決定
図２は、１６種類の野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＢ）のアミノ酸配列のアラインメント結果を示し、アラインメントされたコンセンサス配列の結果を図の下部に列挙する（配列番号１）。アラインメントされた１６種類の野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼは、好熱菌（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｇｏ、配列番号２）、好熱菌（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｄ１、配列番号３）、好熱菌属（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）（菌株９°Ｎ－７）のＤＮＡポリメラーゼ（９°Ｎ、配列番号４）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ、配列番号５）、好熱菌（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ、配列番号６）、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｍａ、配列番号７）、メタノサルシナアセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｃ、配列番号８）、ヒトＤＮＡポリメラーゼδのｐ１２５触媒サブユニット（ｈＰＯＬＤ、配列番号９）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＤＮＡポリメラーゼδの触媒サブユニット（ＳｃｅＰＯＬＤ、配列番号１０）、ピロバキュラム・イスランジカム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｉｓ、配列番号１１）、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｓｏ、配列番号１２）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐａｅ、配列番号１３）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．Ｃｏｌｉ）のＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｅｃｏ、配列番号１４）、バクテリオファージＲＢ６９のＤＮＡポリメラーゼ（ＲＢ６９、配列番号１５）、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ４、配列番号１６）及びバクテリオファージＰｈｉ２９のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈｉ２９、配列番号１７）であった。
【0079】
図２（図２－１～２－３４を含む）に示すように、野生型ＰｏｌＢの異なる領域は高度に保存されているが、他の領域は高度に変異している。当業者であれば、本明細書で具体的に同定され論じられる変異以外に、当該突然変異酵素のポリメラーゼ活性を変えることなく、或いは実質的に変えることなく、野生型ＰｏｌＢの可変領域にも変異が起こし得ることを直ちに認識し、理解するであろう。同様に、突然変異酵素のポリメラーゼ活性を変えることなく、或いは実質的に変えることなくＰｏｌＢの保存された残基／位置で保存的突然変異を行うことができる。他の機能的に関連する酵素又は相同体との比較構造分析に基づく酵素工学は、分子生物学の分野において一般的で有用な技術であり、当業者が酵素の触媒活性に対する所定の突然変異の影響を合理的に予測できるようにする。アミノ酸の構造データ及び既知の物理的特性を使用して、当業者は、酵素の本質的な固有の特徴を変えることなく、或いは実質的に変えることなく、本発明に含まれるＤＮＡポリメラーゼなどに対して酵素の突然変異作用を行うことができる。
【0080】
なお、配列番号１のコンセンサス配列の３４９位～３６４位、４５０位～４７６位、５９０位～６０８位、７０６位～７３０位、８４３位～８５５位及び９４０位～９５６位にそれぞれ対応するＥｘｏＩモチーフ、ＥｘｏＩＩモチーフ、ＥｘｏＩＩＩモチーフ、Ａモチーフ、Ｂモチーフ及びＣモチーフは、図２に示すようにマークされている。より具体的に言えば、本発明におけるポリメラーゼ変異体は、これらのモチーフ内の１つ以上の対応残基で置換変異を起こる。
【0081】
（実施例２）
ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体の作成
本明細書に開示される選択的ＰｏｌＢ保存及び半保存領域における保存／コンセンサスアミノ酸の特性に基づき遺伝子合成法及び突然変異誘発技術を使用して例示的なＰｏｌＢ変異体を作成した。例えば、当業者によく知られた手法である部位特異的突然変異誘発手法を採用して、例示的な野生型ＰｏｌＢの保存されたＥｘｏＩモチーフ、ＥｘｏＩＩモチーフ、ＥｘｏＩＩＩモチーフ、Ａモチーフ、Ｂモチーフ及びＣモチーフ領域内のアミノ酸残基を改変する。
ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体の作成
本明細書に開示される選択的ＰｏｌＢ保存及び半保存領域における保存／コンセンサスアミノ酸の特性に基づき遺伝子合成法及び突然変異誘発技術を使用して例示的なＰｏｌＢ変異体を作成した。例えば、当業者によく知られた手法である部位特異的突然変異誘発手法を採用して、例示的な野生型ＰｏｌＢの保存されたＥｘｏＩモチーフ、ＥｘｏＩＩモチーフ、ＥｘｏＩＩＩモチーフ、Ａモチーフ、Ｂモチーフ及びＣモチーフ領域内のアミノ酸残基を改変する。
【0082】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼ変異体を取得するための手順は、一般に３つのステップに分けられる。ステップ１：ＤＮＡポリメラーゼ及びそのエキソヌクレアーゼ欠損（Ｅｘｏ－）変異体の遺伝子合成、ステップ２：所望の領域におけるＤＮＡポリメラーゼ変異体の構築、 ステップ３： ＤＮＡポリメラーゼとその変異体の発現と精製。前記手順で使用される技術は、当業者にはよく知られており、以下でより詳細に説明する。
【0083】
ステップ１では、野生型のイントロンレスＤＮＡポリメラーゼをコードするコドン最適化遺伝子断片がＧｅｎｏｍｉｃｓ ＢｉｏＳｃｉ＆Ｔｅｃｈ．Ｃｏ．Ｌｔｄ．（新北市、台湾）により合成された。３’→５’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｘｏ－と呼ばれる）も同じ供給業者から入手された。本明細書で使用される「Ｅｘｏ－」とは、野生型ＰｏｌＢが配列番号１のＤ３５４位に対応する位置にアラニン（Ｄ３５４Ａ）残基で置換され、配列番号１のＥ３５６に対応する位置にもアラニン残基（Ｅ３５６Ａ）で置換されるという組み合わせ変異を起こることを意味する。
【0084】
ステップ２では、野生型及び３’→５’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をそれぞれＮｄｅＩ部位及びＮｏｔＩ部位を介してｐＥＴ２８ｂベクターにサブクローニングし、組換えプラスミドをＤＮＡ配列決定により確認した。ＰｏｌＢタンパク質骨格上の所望のモチーフ領域にポリメラーゼ変異体を作成するため、部位特異的突然変異誘発を実施した。簡単に言えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（イプスウィッチ、マサチューセッツ州、米国）が販売しているＱ５部位特異的突然変異誘発キットを組換えプラスミドとともに使用して、部位特異的突然変異誘発ＰＣＲを実施してアミノ酸置換を導入した。まず生成物を１％アガロースゲルで分析してアンプリコンのサイズを確認し、次に残りのＰＣＲ反応混合物をＤｐｎＩで３７℃にて１時間処理した。混合物を７０℃でさらに１０分間インキュベートして、ＤｐｎＩ機能を不活性化した。次に、Ｑｉａｇｅｎ社製のＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｗｈａｔｍａｎ、マサチューセッツ州、米国）を使用してＤｐｎＩ処理した ＰＣＲ反応混合物を精製し、Ｔ４ ＰＮＫ及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ混合物を使用して精製したＤＮＡ断片を処理し、さらに再環状化されたＰＣＲ増幅したＤＮＡを大腸菌細胞に形質転換した。その後、Ｑｉａｇｅｎ社製プラスミドミニキット（Ｗｈａｔｍａｎ、マサチューセッツ州、米国）を使用して、プラスミドＤＮＡを大腸菌細胞から抽出した。続いてＤＮＡ配列決定を行い、所望のモチーフ領域内のポリメラーゼ変異体の突然変異誘発配列を確認した。
【0085】
ステップ３では、特定のポリメラーゼ変異体遺伝子を持つプラスミドＤＮＡを含む大腸菌Ａｃｅｌｌａ細胞を、０．５％グルコース及び５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含有した２リットルのＬＢ培地中で３７℃にて増殖させた。細胞密度が６００ナノメートル（ＯＤ６００ｎｍ）での吸光度値約０．６～０．８に達したら、１ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加してタンパク質発現を誘導した。細胞を３７℃でさらに４時間増殖させた後、４℃、７，０００×ｇで１０分間遠心分離することにより回収した。細胞ペレットを、１ｍＭ ベンズアミジン塩酸塩を含む緩衝液Ａ［５０ｍＭ トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ 塩化ナトリウム、０．５ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、５％（ｖ／ｖ）グリセロール］で再懸濁した。細胞溶液を５０ｍｇのリゾチームとともに氷上で１時間インキュベートした後、超音波処理を行って細胞溶解を達成した。４℃、１８，０００ｘｇで２５分間遠心分離することにより、清澄化した細胞溶解液を得た。清澄化された粗細胞抽出物を７０℃で３０分間インキュベートし、その後４℃に冷却した。４℃、１８，０００ｘｇで２５分間遠心分離することにより、より清澄化した熱処理細胞抽出物が得られた。遠心分離後、上清を、塩化ナトリウムを含まない緩衝液Ａで希釈し、ＡＥＫＴＡ精製クロマトグラフィーシステム（Ｃｙｔｉｖａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州マールボロ、米国）の緩衝液Ａであらかじめ平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎカラム（Ｃｙｔｉｖａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州マールボロ、米国）にロードした。緩衝液Ｂ［５０ｍＭ トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）（ｐＨ ８．０）、１Ｍ 塩化ナトリウム、０．５ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、５％（ｖ／ｖ）グリセロール］を使用して、１００ｍＭ～１Ｍ 塩化ナトリウムの直線勾配でタンパク質を溶出した。次いで、カラム画分を１０％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）で分析した。所望のタンパク質を含む画分を保存緩衝液［５０ｍＭ トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）（ｐＨ ７．５）、２５０ｍＭ 塩化ナトリウム、０．５ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、５％（ｖ／ｖ）グリセロール］に対して４℃で一晩プールを透析した。標的タンパク質を含む透析タンパク質画分プールを、Ａｍｉｃｏｎフィルターユニット（分子量カットオフ５０，０００）を使用して濃縮した。濃縮タンパク質プールを等分して、－２０℃で貯蔵した。各変異ポリメラーゼ変異体を、上記と同じ手順で精製した。次に、最終タンパク質濃度の測定を決定するため、ウシ血清アルブミンを標準液として用い、Ｂｉｏ－Ｒａｄタンパク質アッセイ（カリフォルニア州ハーキュリーズ、米国）を用いてブラッドフォード反応（１９７６ 年にＢｒａｄｆｏｒｄにより提案）を行った。
【0086】
（実施例３）
鋳型依存性ＤＮＡ合成アッセイ
本明細書で提供されるＰｏｌＢ変異体は、ＤＮＡ合成による配列決定（ＳＢＳ）試験に適している。ＰｏｌＢ変異体の活性（ヌクレオチド類似体の取り込み）をさらに評価するため、本明細書では修飾ヌクレオチド及び二本鎖プライマー／鋳型（Ｐ／Ｔ）－ＤＮＡを使用した。
鋳型依存性ＤＮＡ合成アッセイ
本明細書で提供されるＰｏｌＢ変異体は、ＤＮＡ合成による配列決定（ＳＢＳ）試験に適している。ＰｏｌＢ変異体の活性（ヌクレオチド類似体の取り込み）をさらに評価するため、本明細書では修飾ヌクレオチド及び二本鎖プライマー／鋳型（Ｐ／Ｔ）－ＤＮＡを使用した。
【0087】
実施例３において、前記修飾ヌクレオチドは、除去可能な保護基部分を有するヌクレオチド類似体である（図３）。より具体的に言えば、前記除去可能な保護基部分は３’－Ｏ－アジドメチルである。より具体的に言えば、前記修飾ヌクレオチドは、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＡＴＰ、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＣＴＰ、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＧＴＰ、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰを含む３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＮＴＰ（図４）である。さらに、前記修飾ヌクレオチドは、Ｎ３－ｄＡＴＰ－リンカー－Ａｔｔｏ５３２（図５Ａ）、Ｎ３－ｄＣＴＰ－リンカー－Ａｔｔｏ７００（図５Ｂ）、Ｎ３－ｄＧＴＰ－リンカー－Ｃｙ５（図５Ｃ）及びＮ３－ｄＴＴＰ－リンカー－ＲＯＸ（図５Ｄ）などの様々な形態の色素と結合している。
【0088】
実施例３において、以下の合成オリゴヌクレオチドを二本鎖プライマー及び鋳型（Ｐ／Ｔ）－ＤＮＡとして使用して、ＰｏｌＢ変異体の鋳型依存性ＤＮＡ合成活性を測定し、
Ｃｙ５－３８ｍｅｒのプライマー：
５’－ＧＣＴＴＧＣＡＣＡＡＧＴＴＣＧＴＴＣＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ－３’（配列番号１８）；
前記オリゴヌクレオチドは、５’末端が蛍光シアニン５（Ｃｙ５）色素で標識される。対応する４５ｍｅｒの鋳型：
５’－ＣＧＴＴＣＣＮＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴＧＡＡＣＧＡＡＣＴＴＧＴＧＣＡＡＧＣ－３’（配列番号１９）、ここで文字「Ｎ」はＡ、Ｔ、Ｃ又はＧを表し；
ＦＡＭ－３８ｍｅｒのプライマー：
５’－ＧＣＴＴＧＣＡＣＡＡＧＴＴＣＧＴＴＣＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ－３’（配列番号２０）
ＦＡＭ－１９ｍｅｒのプライマー：
５’－ＧＣＴＴＧＣＡＣＡＧＧＧＣＣＴＣＧＡＣ－３’（配列番号２１）
Ｃｙ５－３８ｍｅｒのプライマー：
５’－ＧＣＴＴＧＣＡＣＡＡＧＴＴＣＧＴＴＣＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ－３’（配列番号１８）；
前記オリゴヌクレオチドは、５’末端が蛍光シアニン５（Ｃｙ５）色素で標識される。対応する４５ｍｅｒの鋳型：
５’－ＣＧＴＴＣＣＮＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴＧＡＡＣＧＡＡＣＴＴＧＴＧＣＡＡＧＣ－３’（配列番号１９）、ここで文字「Ｎ」はＡ、Ｔ、Ｃ又はＧを表し；
ＦＡＭ－３８ｍｅｒのプライマー：
５’－ＧＣＴＴＧＣＡＣＡＡＧＴＴＣＧＴＴＣＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ－３’（配列番号２０）
ＦＡＭ－１９ｍｅｒのプライマー：
５’－ＧＣＴＴＧＣＡＣＡＧＧＧＣＣＴＣＧＡＣ－３’（配列番号２１）
【0089】
（実施例４）
３’－修飾ヌクレオチドの取り込みに対するエキソヌクレアーゼ欠損ＰｏｌＢ変異体の活性
本実施例において、３’修飾ヌクレオチドの取り込みに対するエキソヌクレアーゼ欠損ＰｏｌＢ変異体（Ｋｏｄ１、Ｐｆｕ、Ｖｅｎｔ、Ｍａｃ、Ｓｓｏ）の活性を、Ｐｏｌ８１２関連活性と比較した。より具体的に言えば、前記３’－修飾ヌクレオチドは、３’－Ｏ－アジドメチルヌクレオチドである。参照ポリメラーゼは、９°Ｎ ポリメラーゼの変異体であるＰｏｌ８１２と呼ばれる市販のポリメラーゼを用いた。
３’－修飾ヌクレオチドの取り込みに対するエキソヌクレアーゼ欠損ＰｏｌＢ変異体の活性
本実施例において、３’修飾ヌクレオチドの取り込みに対するエキソヌクレアーゼ欠損ＰｏｌＢ変異体（Ｋｏｄ１、Ｐｆｕ、Ｖｅｎｔ、Ｍａｃ、Ｓｓｏ）の活性を、Ｐｏｌ８１２関連活性と比較した。より具体的に言えば、前記３’－修飾ヌクレオチドは、３’－Ｏ－アジドメチルヌクレオチドである。参照ポリメラーゼは、９°Ｎ ポリメラーゼの変異体であるＰｏｌ８１２と呼ばれる市販のポリメラーゼを用いた。
【0090】
手順では、１００ｍＭ 塩化ナトリウムを含有する１ｘＴＥ緩衝液［１０ ｍＭ トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）（ｐＨ ８．０）及び１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）］中にＦＡＭ－１９ｍｅｒのプライマーと相補的な２９ｍｅｒのＤＮＡ鋳型をモル比１：１．５でアニーリングすることにより、二本鎖プライマー－鋳型（Ｐ／Ｔ）ＤＮＡを形成した。ＤＮＡアニーリング反応は、Ｂｉｏ－Ｒａｄサーマルサイクラー（カリフォルニア州ハーキュリーズ、米国）で実施され、まずサンプル混合物を９８℃に３分間加熱し、次に徐々に（５℃／３０秒）４℃まで冷却した。
【0091】
ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液［２０ｍＭ トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ 硫酸アンモニウム、１０ｍＭ 塩化カリウム、２ｍＭ 硫酸マグネシウム及び０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル）］に溶解し、５０ ｎＭ二本鎖Ｐ／Ｔ－ＤＮＡ基質及び２００ ｎＭポリメラーゼを含有する１０μｌの反応混合物中で鋳型依存性ＤＮＡ合成アッセイを実施した。１０μＭの３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＡＴＰを加えてＤＮＡ合成反応を開始し、反応混合物を５５℃でインキュベートさせた。等量（１０μｌ）の２部（２ｘ）クエンチ溶液［９５％脱イオンホルムアミド及び２５ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）］を添加することで、２分間のインキュベーション後、前記反応を停止させた。サンプル混合物を９５℃で１０分間変性させた後、８Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｕｒｅａ－ＰＡＧＥ）で分析した。次に、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｔｙｐｈｏｏｎレーザースキャナー（Ｃｙｔｉｖａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，マサチューセッツ州マールボロ、米国）で前記ゲルを画像化することで、前記ＤＮＡ合成反応生成物を観察できた。
【0092】
上記反応の結果を図６に示す。図６中、「Ｓ」は、「二本鎖Ｐ／Ｔ－ＤＮＡ基質」を表し、サンプルの上方への移動度からヌクレオチドの取り込み活性を推測できた。したがって、この結果は、エキソヌクレアーゼ欠損を有するＰｏｌＢのヌクレオチド取り込み活性はいずれもＰｏｌ８１２の活性に匹敵できないことを示した。これにより、エキソヌクレアーゼ欠損は、ＰｏｌＢ酵素に３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＮＴＰを取り込む活性を与えるには十分ではないと結論付けることができた。
【0093】
（実施例５）
３’－修飾ヌクレオチドの取り込みに対する例示的なＰｏｌＢ変異体の活性
本実施例において、エキソヌクレアーゼ欠損ＰｏｌＢ（Ｋｏｄ１、Ｐｆｕ、Ｖｅｎｔ、Ｍａｃ、Ｓｓｏ及び９°Ｎ）変異体が異なる領域でさらに異なるアミノ酸に置換され、その後３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＡＴＰの取り込みに対する活性を評価した。取り込みの効果を評価するために用いられる手順は、上述の節と同じである。
３’－修飾ヌクレオチドの取り込みに対する例示的なＰｏｌＢ変異体の活性
本実施例において、エキソヌクレアーゼ欠損ＰｏｌＢ（Ｋｏｄ１、Ｐｆｕ、Ｖｅｎｔ、Ｍａｃ、Ｓｓｏ及び９°Ｎ）変異体が異なる領域でさらに異なるアミノ酸に置換され、その後３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＡＴＰの取り込みに対する活性を評価した。取り込みの効果を評価するために用いられる手順は、上述の節と同じである。
【0094】
異なるアミノ酸置換形態を有するＰｏｌＢ変異体に対応する活性パフォーマンスの結果を表１に示す。表１において、「＋」は「二本鎖Ｐ／Ｔ－ＤＮＡ基質が１塩基伸長している」ことを表し、「＋／－」は「二本鎖Ｐ／Ｔ－ＤＮＡ基質の１０％未満が伸長している」を表す。「－」は、「ヌクレオチドが取り込まれていない二本鎖Ｐ／Ｔ－ＤＮＡ基質」を表す。表１に基づいて、エキソヌクレアーゼ欠損ＰｏｌＢ変異体は、追加のアミノ酸置換（Ａモチーフ又はＡモチーフとＢモチーフの両方に位置）と組み合わせた場合にのみ、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＡＴＰを取り込むことができると推測できた。また、表１のＭ０４によれば、ＰｏｌＢ変異体は、Ａモチーフ領域でＰｏｌ８１２と同様に置換されている場合、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＡＴＰを取り込むことができないが、このＰｏｌＢ変異体は、Ｌ４８５Ｙ＋Ｙ４８６Ａ＋Ｐ４８７Ｇのアミノ酸置換を有する場合、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＮＴＰ取り込み活性を示すことができる。
【0095】
【表1】
【0096】
（実施例６）
修飾ヌクレオチドを取り込む際の例示的なＰｏｌＢ変異体の効率及び忠実度
ここで、３’－Ｏ－アジドメチルヌクレオチドの取り込みに関する例示的なＰｏｌＢ変異体の効率及び忠実度をＰｏｌ８１２の効率および忠実度と比較した。例示的なＰｏｌＢ変異体の代表として、変異体Ｖ０３（Ｅｘｏ－＋Ｌ４１１Ｙ＋Ｙ４１２Ａ＋Ｐ４１３Ｇ＋Ａ４８８Ｌ付きＶｅｎｔ）及びＭ０３（Ｅｘｏ－＋Ｌ４８５Ｙ＋Ｙ４８６Ａ＋Ｐ４８７Ｇ＋Ａ５６５Ｌ付きＭａｃ）などを本明細書で評価する。
修飾ヌクレオチドを取り込む際の例示的なＰｏｌＢ変異体の効率及び忠実度
ここで、３’－Ｏ－アジドメチルヌクレオチドの取り込みに関する例示的なＰｏｌＢ変異体の効率及び忠実度をＰｏｌ８１２の効率および忠実度と比較した。例示的なＰｏｌＢ変異体の代表として、変異体Ｖ０３（Ｅｘｏ－＋Ｌ４１１Ｙ＋Ｙ４１２Ａ＋Ｐ４１３Ｇ＋Ａ４８８Ｌ付きＶｅｎｔ）及びＭ０３（Ｅｘｏ－＋Ｌ４８５Ｙ＋Ｙ４８６Ａ＋Ｐ４８７Ｇ＋Ａ５６５Ｌ付きＭａｃ）などを本明細書で評価する。
【0097】
実験手順では、１００ｍＭ 塩化ナトリウムを含有する１ｘＴＥ緩衝液［１０ ｍＭ トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）（ｐＨ ８．０）及び１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）］中にＦＡＭ－１９ｍｅｒのプライマーと相補的な２９ｍｅｒのＤＮＡ鋳型をモル比１：１．５でアニーリングすることにより、二本鎖プライマー－鋳型（Ｐ／Ｔ）ＤＮＡを形成した。ＤＮＡアニーリング反応は、Ｂｉｏ－Ｒａｄサーマルサイクラー（カリフォルニア州ハーキュリーズ、米国）で実施され、まずサンプル混合物を９８℃に３分間加熱し、次に徐々に（５℃／３０秒）４℃まで冷却した。
【0098】
ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液［２０ｍＭ トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ 硫酸アンモニウム、１０ｍＭ 塩化カリウム、２ｍＭ 硫酸マグネシウム及び０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル）］に溶解し、５０ ｎＭ二本鎖Ｐ／Ｔ－ＤＮＡ基質及び２００ ｎＭポリメラーゼを含有する１０μｌの反応混合物中で鋳型依存性ＤＮＡ合成アッセイを実施した。１０μＭの３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＡＴＰを加えてＤＮＡ合成反応を開始し、反応混合物を５５℃でインキュベートさせた。等量（１０μｌ）の２ｘクエンチ溶液［９５％ホルムアミド及び２５ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）］を添加することで、それぞれ０．５、１、２及び５分間のインキュベーション後、前記反応を停止させた。サンプル混合物を９５℃で１０分間変性させた後、８Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｕｒｅａ－ＰＡＧＥ）で分析した。次に、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｔｙｐｈｏｏｎレーザースキャナー（Ｃｙｔｉｖａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，マサチューセッツ州マールボロ、米国）で前記ゲルを画像化することで、前記ＤＮＡ合成反応生成物を観察できた。
【0099】
上記反応の結果を図７に示す。図７中、「Ｓ」は、「二本鎖Ｐ／Ｔ－ＤＮＡ基質」を表し、サンプルの上方への移動度から取り込み活性を推測することができる。これにより、結果は、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＡＴＰを取り込む際のＶ０３とＭ０３の両方の効率と忠実度がＰｏｌ８１２の効率と忠実度に匹敵することを示している。それぞれ３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰ、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＣＴＰ、及び３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＧＴＰを使用して得られた他のデータ（図示せず）は、いずれも上記の結果と一致している。したがって、Ａモチーフ及び／又はＢモチーフにおける特定のアミノ酸置換の組み合わせにより、ＰｏｌＢ変異体に３’－Ｏ－Ｎ３ヌクレオチドを組み込む効率と忠実度が向上すると推測できた。
【0100】
（実施例７）
可逆的ダイターミネーターヌクレオチドの取り込みに対する例示的なＰｏｌＢ変異体の活性
本実施例において、可逆的ダイターミネーターヌクレオチド（Ｃｙ５－Ｎ３－ｄＧＴＰ）の取り込みに対する例示的なＰｏｌＢ変異体の活性をＰｏｌ８１２の活性と比較した。例示的なＰｏｌＢ変異体の代表として、エキソヌクレアーゼ欠損ＰｏｌＢ変異体（Ｅｘｏ－付きＫｏｄ１、Ｅｘｏ－付きＰｆｕ、Ｅｘｏ－付きＶｅｎｔ）、変異体Ｐ０３（Ｅｘｏ－＋Ｌ４０９Ｙ＋Ｙ４１０Ａ＋Ｐ４１１Ｇ＋Ａ４８６Ｌ付きＰｆｕ）、変異体Ｋ０３（Ｅｘｏ－＋Ｌ４０８Ｙ＋Ｙ４０９Ａ＋Ｐ４１０Ｇ＋Ａ４８５Ｌ付きＫｏｄ１）、変異体Ｖ０４（Ｅｘｏ－＋Ｌ４１１Ｙ＋Ｙ４１２Ａ＋Ｐ４１３Ｐ＋Ａ４８８Ｌ付きＶｅｎｔ）及び変異体Ｖ０３（Ｅｘｏ－＋Ｌ４１１Ｙ＋Ｙ４１２Ａ＋Ｐ４１３Ｇ＋Ａ４８８Ｌ付きＶｅｎｔ）などを本明細書で評価した。
可逆的ダイターミネーターヌクレオチドの取り込みに対する例示的なＰｏｌＢ変異体の活性
本実施例において、可逆的ダイターミネーターヌクレオチド（Ｃｙ５－Ｎ３－ｄＧＴＰ）の取り込みに対する例示的なＰｏｌＢ変異体の活性をＰｏｌ８１２の活性と比較した。例示的なＰｏｌＢ変異体の代表として、エキソヌクレアーゼ欠損ＰｏｌＢ変異体（Ｅｘｏ－付きＫｏｄ１、Ｅｘｏ－付きＰｆｕ、Ｅｘｏ－付きＶｅｎｔ）、変異体Ｐ０３（Ｅｘｏ－＋Ｌ４０９Ｙ＋Ｙ４１０Ａ＋Ｐ４１１Ｇ＋Ａ４８６Ｌ付きＰｆｕ）、変異体Ｋ０３（Ｅｘｏ－＋Ｌ４０８Ｙ＋Ｙ４０９Ａ＋Ｐ４１０Ｇ＋Ａ４８５Ｌ付きＫｏｄ１）、変異体Ｖ０４（Ｅｘｏ－＋Ｌ４１１Ｙ＋Ｙ４１２Ａ＋Ｐ４１３Ｐ＋Ａ４８８Ｌ付きＶｅｎｔ）及び変異体Ｖ０３（Ｅｘｏ－＋Ｌ４１１Ｙ＋Ｙ４１２Ａ＋Ｐ４１３Ｇ＋Ａ４８８Ｌ付きＶｅｎｔ）などを本明細書で評価した。
【0101】
実験では、１００ｍＭ 塩化ナトリウムを含有する１ｘＴＥ緩衝液［１０ ｍＭ トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）（ｐＨ ８．０）及び１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）］中にＦＡＭ－３８ｍｅｒのプライマーと相補的な４５ｍｅｒのＤＮＡ鋳型をモル比１：１．５でアニーリングすることにより、二本鎖プライマー－鋳型（Ｐ／Ｔ）ＤＮＡを形成した。ＤＮＡアニーリング反応は、Ｂｉｏ－Ｒａｄサーマルサイクラー（カリフォルニア州ハーキュリーズ、米国）で実施され、まずサンプル混合物を９８℃に３分間加熱し、次に徐々に（５℃／３０秒）４℃まで冷却した。
【0102】
ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液［２０ｍＭ トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ 硫酸アンモニウム、１０ｍＭ 塩化カリウム、２ｍＭ 硫酸マグネシウム及び０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル）］に溶解し、５０ ｎＭ二本鎖Ｐ／Ｔ－ＤＮＡ基質及び２００ ｎＭポリメラーゼを含有する１０μｌの反応混合物中で鋳型依存性ＤＮＡ合成アッセイを実施した。１０μＭのＣｙ５－Ｎ３－ｄＧＴＰを加えてＤＮＡ合成反応を開始し、反応混合物を５５℃でインキュベートさせた。等量（１０μｌ）の２ｘクエンチ溶液［９５％ホルムアミド及び２５ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）］を添加することで、５分間のインキュベーション後、前記反応を停止させた。サンプル混合物を９５℃で１０分間変性させた後、８Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｕｒｅａ－ＰＡＧＥ）で分析した。次に、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｔｙｐｈｏｏｎレーザースキャナー（Ｃｙｔｉｖａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，マサチューセッツ州マールボロ、米国）で前記ゲルを画像化することで、前記ＤＮＡ合成反応生成物を観察できた。
【0103】
上記反応の結果を図８に示す。図８中、「Ｃ」は、「対照群（Ｐｏｌ８１２）」を表し、「Ｓ」は「二本鎖Ｐ／Ｔ－ＤＮＡ基質」を表し、「１」は「Ｅｘｏ－付きＰｆｕ」を表し、「２」は「Ｅｘｏ－付きＫｏｄ１」を表し、「３」は「Ｅｘｏ－付きＶｅｎｔ」を表し、「４」は「Ｐ０３」を表し、「５」は「Ｋ０３」を表し、「６」は「Ｖ０４」を表し、「７」は「Ｖ０３」を表す。図８の結果は、エキソヌクレアーゼ欠損ＰｏｌＢ変異体（Ｅｘｏ－付きＫｏｄ１、Ｅｘｏ－付きＰｆｕ、Ｅｘｏ－付きＶｅｎｔ）の活性が均しくＰｏｌ８１２の活性に匹敵できず、組み合わせたアミノ酸置換を有する変異体の優れたパフォーマンスはＰｏｌ８１２に匹敵することを示した。したがって、Ａモチーフ及び／又はＢモチーフにおける特定のアミノ酸置換の組み合わせにより、ＰｏｌＢ変異体に可逆的ダイターミネーターヌクレオチド（Ｃｙ５－Ｎ３－ｄＧＴＰ）を取り込む活性が向上すると推測できた。
【0104】
（実施例８）
可逆的ダイターミネーターヌクレオチドの取り込みに対する例示的なＰｏｌＢ変異体の活性
本実施例において、別の可逆的ダイターミネーターヌクレオチド（Ｃｙ５－Ｎ３－ｄＧＴＰ）の取り込みに対する他の例示的なＰｏｌＢ変異体の活性をＰｏｌ８１２の活性と比較した。例示的なＰｏｌＢ変異体の代表として、変異体Ｉ０１（Ｅｘｏ－＋Ｍ４２６Ｙ＋Ｙ４２７Ａ＋Ｐ４２８Ｇ＋Ａ５０８Ｌ付きＰｉｓ）及び変異体Ｉ０２（Ｅｘｏ－＋Ｍ４２６Ｙ＋Ｙ４２７Ａ＋Ｐ４２８Ｐ＋Ａ５０８Ｌ付きＰｉｓ）などを本明細書で評価した。
可逆的ダイターミネーターヌクレオチドの取り込みに対する例示的なＰｏｌＢ変異体の活性
本実施例において、別の可逆的ダイターミネーターヌクレオチド（Ｃｙ５－Ｎ３－ｄＧＴＰ）の取り込みに対する他の例示的なＰｏｌＢ変異体の活性をＰｏｌ８１２の活性と比較した。例示的なＰｏｌＢ変異体の代表として、変異体Ｉ０１（Ｅｘｏ－＋Ｍ４２６Ｙ＋Ｙ４２７Ａ＋Ｐ４２８Ｇ＋Ａ５０８Ｌ付きＰｉｓ）及び変異体Ｉ０２（Ｅｘｏ－＋Ｍ４２６Ｙ＋Ｙ４２７Ａ＋Ｐ４２８Ｐ＋Ａ５０８Ｌ付きＰｉｓ）などを本明細書で評価した。
【0105】
実験では、１００ｍＭ 塩化ナトリウムを含有する１ｘＴＥ緩衝液［１０ ｍＭ トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）（ｐＨ ８．０）及び１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）］中にＦＡＭ－３８ｍｅｒのプライマーと相補的な４５ｍｅｒのＤＮＡ鋳型をモル比１：１．５でアニーリングすることにより、二本鎖プライマー－鋳型（Ｐ／Ｔ）ＤＮＡを形成した。ＤＮＡアニーリング反応は、Ｂｉｏ－Ｒａｄサーマルサイクラー（カリフォルニア州ハーキュリーズ、米国）で実施され、まずサンプル混合物を９８℃に３分間加熱し、次に徐々に（５℃／３０秒）４℃まで冷却した。
【0106】
ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液［２０ｍＭ トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ 硫酸アンモニウム、１０ｍＭ 塩化カリウム、２ｍＭ 硫酸マグネシウム及び０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル）］に溶解し、５０ ｎＭ二本鎖Ｐ／Ｔ－ＤＮＡ基質及び２００ ｎＭポリメラーゼを含有する１０μｌの反応混合物中で鋳型依存性ＤＮＡ合成アッセイを実施した。１０μＭのＣｙ５－Ｎ３－ｄＧＴＰを加えてＤＮＡ合成反応を開始し、反応混合物を５５℃でインキュベートさせた。等量（１０μｌ）の２ｘクエンチ溶液［９５％ホルムアミド及び２５ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）］を添加することで、５分間のインキュベーション後、前記反応を停止させた。サンプル混合物を９５℃で１０分間変性させた後、８Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｕｒｅａ－ＰＡＧＥ）で分析した。次に、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｔｙｐｈｏｏｎレーザースキャナー（Ｃｙｔｉｖａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，マサチューセッツ州マールボロ、米国）で前記ゲルを画像化することで、前記ＤＮＡ合成反応生成物を観察できた。
【0107】
上記反応の結果を図９に示す。図９中、「Ｓ」は「二本鎖Ｐ／Ｔ－ＤＮＡ基質」を表し、「１」は「Ｐｏｌ８１２」を表し、「２」は「Ｉ０１」を表し、「３」は「Ｉ０２」を表す。図９の結果は、Ａモチーフ及びＢモチーフに位置するアミノ酸置換を組み合わせた変異体がＰｏｌ８１２と同等の活性を発揮することができ、Ｉ０２の活性がＰｏｌ８１２の活性よりもさらに優れていることを示した。したがって、Ａモチーフ及び／又はＢモチーフにおける特定のアミノ酸置換の組み合わせにより、ＰｏｌＢ変異体に可逆的ダイターミネーターヌクレオチド（Ｃｙ５－Ｎ３－ｄＧＴＰ）を取り込む活性が向上すると推測できた。
【0108】
（実施例９）
可逆的ダイターミネーターヌクレオチドの取り込みに対する例示的なＰｏｌＢ変異体の活性
本実施例において、可逆的ダイターミネーターヌクレオチド（Ｎ３－ｄＮＴＰ－リンカー－染料）の取り込みに対する各種例示的なＰｏｌＢ変異体の活性を評価した。本明細書で検査した例示的なＰｏｌＢ変異体の代表：
変異体１：Ｐｏｌ８１２（菌株９°Ｎ）；
変異体２：Ｅｘｏ－＋Ｌ４０８Ｙ＋Ｙ４０９Ａ＋Ｐ４１０Ｇ＋Ａ４８５Ｖ付き９°Ｎ、
変異体３：Ｅｘｏ－＋Ｌ４０８Ｙ＋Ｙ４０９Ａ＋Ｐ４１０Ｇ＋Ａ４８５Ｌ付き９°Ｎ、
変異体４：Ｅｘｏ－＋Ｌ４１１Ｙ＋Ｙ４１２Ａ＋Ｐ４１３Ｇ＋Ａ４８８Ｌ付きＶｅｎｔ、
変異体５：Ｅｘｏ－＋Ｌ４１１Ｙ＋Ｙ４１２Ａ＋Ｐ４１３Ｇ＋Ａ４８８Ｌ＋Ｋ４８０Ｍ付きＶｅｎｔ、
変異体６：Ｅｘｏ－＋Ｌ４０９Ｙ＋Ｙ４１０Ａ＋Ｐ４１１Ｇ＋Ａ４８６Ｌ付きＰｆｕ、
変異体７：Ｅｘｏ－＋Ｌ４０９Ｙ＋Ｙ４１０Ａ＋Ｐ４１１Ｇ＋Ａ４８６Ｌ＋Ｉ４７８Ｍ付きＰｆｕ、
上述のＰｏｌＢ変異体は、Ｎ３－ｄＴＴＰ－リンカー－ＲＯＸ（その構造は図５Ｄに示される）、Ｎ３－ｄＣＴＰ－リンカー－Ａｔｔｏ７００（その構造は図５Ｂに示される）を用いて検査された。
可逆的ダイターミネーターヌクレオチドの取り込みに対する例示的なＰｏｌＢ変異体の活性
本実施例において、可逆的ダイターミネーターヌクレオチド（Ｎ３－ｄＮＴＰ－リンカー－染料）の取り込みに対する各種例示的なＰｏｌＢ変異体の活性を評価した。本明細書で検査した例示的なＰｏｌＢ変異体の代表：
変異体１：Ｐｏｌ８１２（菌株９°Ｎ）；
変異体２：Ｅｘｏ－＋Ｌ４０８Ｙ＋Ｙ４０９Ａ＋Ｐ４１０Ｇ＋Ａ４８５Ｖ付き９°Ｎ、
変異体３：Ｅｘｏ－＋Ｌ４０８Ｙ＋Ｙ４０９Ａ＋Ｐ４１０Ｇ＋Ａ４８５Ｌ付き９°Ｎ、
変異体４：Ｅｘｏ－＋Ｌ４１１Ｙ＋Ｙ４１２Ａ＋Ｐ４１３Ｇ＋Ａ４８８Ｌ付きＶｅｎｔ、
変異体５：Ｅｘｏ－＋Ｌ４１１Ｙ＋Ｙ４１２Ａ＋Ｐ４１３Ｇ＋Ａ４８８Ｌ＋Ｋ４８０Ｍ付きＶｅｎｔ、
変異体６：Ｅｘｏ－＋Ｌ４０９Ｙ＋Ｙ４１０Ａ＋Ｐ４１１Ｇ＋Ａ４８６Ｌ付きＰｆｕ、
変異体７：Ｅｘｏ－＋Ｌ４０９Ｙ＋Ｙ４１０Ａ＋Ｐ４１１Ｇ＋Ａ４８６Ｌ＋Ｉ４７８Ｍ付きＰｆｕ、
上述のＰｏｌＢ変異体は、Ｎ３－ｄＴＴＰ－リンカー－ＲＯＸ（その構造は図５Ｄに示される）、Ｎ３－ｄＣＴＰ－リンカー－Ａｔｔｏ７００（その構造は図５Ｂに示される）を用いて検査された。
【0109】
実験手順では、１００ｍＭ 塩化ナトリウムを含有する１ｘＴＥ緩衝液［１０ ｍＭ トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）（ｐＨ ８．０）及び１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）］中にＦＡＭ－３８ｍｅｒのプライマー／Ｃｙ５－３８ｍｅｒのプライマーと相補的な４５ｍｅｒのＤＮＡ鋳型をモル比１：１．５でアニーリングすることにより、二本鎖プライマー－鋳型（Ｐ／Ｔ）ＤＮＡを形成した。ＤＮＡアニーリング反応は、Ｂｉｏ－Ｒａｄサーマルサイクラー（カリフォルニア州ハーキュリーズ、米国）で実施され、まずサンプル混合物を９８℃に３分間加熱し、次に徐々に（５℃／３０秒）４℃まで冷却した。
【0110】
ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液［２０ｍＭ トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ 硫酸アンモニウム、１０ｍＭ 塩化カリウム、２ｍＭ 硫酸マグネシウム及び０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル）］に溶解し、５０ ｎＭ二本鎖Ｐ／Ｔ－ＤＮＡ基質及び２００ ｎＭポリメラーゼを含有する１０μｌの反応混合物中で鋳型依存性ＤＮＡ合成アッセイを実施した。１０μＭのＮ３－ｄＴＴＰ－リンカー－ＲＯＸ／Ｎ３－ｄＣＴＰ－リンカー－Ａｔｔｏ７００を加えてＤＮＡ合成反応を開始し、反応混合物を５５℃でインキュベートさせた。等量（１０μｌ）の２ｘクエンチ溶液［９５％ホルムアミド及び２５ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）］を添加することで、５分間のインキュベーション後、前記反応を停止させた。サンプル混合物を９５℃で１０分間変性させた後、８Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｕｒｅａ－ＰＡＧＥ）で分析した。次に、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｔｙｐｈｏｏｎレーザースキャナー（Ｃｙｔｉｖａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，マサチューセッツ州マールボロ、米国）で前記ゲルを画像化することで、前記ＤＮＡ合成反応生成物を観察できた。
【0111】
上記反応の結果を図１０に示す。図１０中、「Ｓ」は「二本鎖Ｐ／Ｔ－ＤＮＡ基質」、「１」～「７」は「変異体１」～「変異体７」を表す。図１０の結果は、９°Ｎ菌株に由来するＰｏｌＢ変異体が「ＹＡＧ」アミノ酸置換を持ち、ＡモチーフにＡ４８５置換を有しているが、Ｍ１２９Ａ及びＣ２２３Ｓ 置換を持たず、Ｎ３－ｄＮＴＰ－リンカー－色素の取り込みによって示される活性は、Ａモチーフに「ＡＡＩ」置換を持ち、Ａ４８５、Ｍ１２９Ａ、及びＣ２２３Ｓ置換と組み合わせたＰｏｌ８１２によって示される活性と同等であることを示した。また、図１０の結果は、ＡモチーフとＢモチーフにおける特定のアミノ酸置換の組み合わせにより、異なる菌株に由来するＰｏｌＢ変異体にＮ３－ｄＴＴＰ－リンカー－ＲＯＸ又はＮ３－ｄＣＴＰ－リンカー－Ａｔｔｏ７００を取り込む活性が向上されることを示している。また、ＦＡＭ－３８ｍｅｒのプライマー／Ｎ３－ｄＧＴＰ－リンカー－Ｃｙ５及びＣｙ５－３８ｍｅｒのプライマー／Ｎ３－ｄＡＴＰ－リンカー－Ａｔｔｏ５３２を使用して得られた他のデータ（図示せず）は、いずれも上記の結果と一致している。
【0112】
要するに、本明細書で提供されるファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、ポリヌクレオチドを合成し、関連する核酸鋳型を配列決定するためのヌクレオチド類似体の取り込み効果を向上できる。本発明の具体的実施形態を開示したが、本発明を限定する意図で用いられるものではない。本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者であれば、本発明の原理及び精神から逸脱することなく、多種多様な変形及び修正を加えることができることを理解することができ、したがって、本発明の保護範囲は添付の特許請求の範囲に限定されるものに基づくべきである。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図2-4】
【図2-5】
【図2-6】
【図2-7】
【図2-8】
【図2-9】
【図2-10】
【図2-11】
【図2-12】
【図2-13】
【図2-14】
【図2-15】
【図2-16】
【図2-17】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】
【国際調査報告】