特表 2024-536295 プロバイオティクスエンハンサー及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-04

(54)【発明の名称】プロバイオティクスエンハンサー及びその使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/744 20150101AFI20240927BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20240927BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20240927BHJP

   A61K 47/46 20060101ALI20240927BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20240927BHJP

   A61K 9/12 20060101ALI20240927BHJP

   A61K 9/06 20060101ALI20240927BHJP

   A61K 9/72 20060101ALI20240927BHJP

   A61K 9/02 20060101ALI20240927BHJP

   A61K 9/20 20060101ALI20240927BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240927BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20240927BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20240927BHJP

   A61P 31/10 20060101ALI20240927BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20240927BHJP

   A61P 31/16 20060101ALI20240927BHJP

   A61P 27/16 20060101ALI20240927BHJP

   A61P 11/04 20060101ALI20240927BHJP

   A61P 1/02 20060101ALI20240927BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20240927BHJP

   A61P 11/02 20060101ALI20240927BHJP

   A61P 17/10 20060101ALI20240927BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20240927BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240927BHJP

   A61P 15/02 20060101ALI20240927BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20240927BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20240927BHJP

   A61Q 15/00 20060101ALI20240927BHJP

   A61Q 11/00 20060101ALI20240927BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240927BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20240927BHJP

   A61K 8/99 20170101ALI20240927BHJP

   A61K 8/60 20060101ALI20240927BHJP

   A61K 31/7004 20060101ALI20240927BHJP

   A61K 31/702 20060101ALI20240927BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20240927BHJP

   A23L 33/135 20160101ALI20240927BHJP

【ＦＩ】

A61K35/744

A61K47/26

A61K47/36

A61K47/46

A61K9/14

A61K9/12

A61K9/06

A61K9/72

A61K9/02

A61K9/20

A61P43/00 121

A61P31/00

A61P31/04

A61P31/10

A61P31/14

A61P31/16

A61P27/16

A61P11/04

A61P1/02

A61P11/00

A61P11/02

A61P17/10

A61P17/06

A61P17/00

A61P17/00 101

A61P15/02

A61P7/00

A61P37/08

A61Q15/00

A61Q11/00

A61P25/00

A61Q19/00

A61K8/99

A61K8/60

A61P43/00 111

A61K31/7004

A61K31/702

C12N1/20 A ZNA

A23L33/135

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024519918

(86)(22)【出願日】2022-09-30

(85)【翻訳文提出日】2024-05-28

(86)【国際出願番号】 IB2022059321

(87)【国際公開番号】W WO2023053073

(87)【国際公開日】2023-04-06

(31)【優先権主張番号】2021903132

(32)【優先日】2021-09-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】507324555

【氏名又は名称】ブリス テクノロジーズ リミティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(72)【発明者】

【氏名】ニコラ ジョーンズ

(72)【発明者】

【氏名】ジョン デイビッド ヘイル

(72)【発明者】

【氏名】ジョン タッグ

(72)【発明者】

【氏名】ロヒット ジェイン

(72)【発明者】

【氏名】リーアム カール ハロルド

【テーマコード（参考）】

4B018

4B065

4C076

4C083

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B018LB07

4B018MD85

4B018ME02

4B018MF06

4B065AA49X

4B065AC14

4B065BD35

4B065CA41

4C076AA01

4C076AA03

4C076AA09

4C076AA24

4C076AA29

4C076AA49

4C076AA93

4C076AA94

4C076BB01

4C076BB21

4C076BB22

4C076BB23

4C076BB25

4C076BB27

4C076BB29

4C076BB30

4C076BB31

4C076CC09

4C076CC10

4C076CC14

4C076CC15

4C076CC17

4C076CC18

4C076CC19

4C076CC20

4C076CC31

4C076CC35

4C076DD67

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4C083AD242

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4C083DD08

4C083DD17

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4C083DD31

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4C087ZA81

4C087ZA89

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4C087ZB13

4C087ZB31

4C087ZB33

4C087ZB35

4C087ZC19

4C087ZC75

(57)【要約】

ストレプトコッカス・サリバリウスの阻害プロファイルを改善する方法であって、有効量の補充糖類を含む組成物中でＳ．サリバリウスを製剤化することを含む、方法が本明細書に記載される。ストレプトコッカス・サリバリウス及び補充糖類を含む、組成物、そのような組成物を使用して微生物を阻害する方法、そのような組成物を含む治療用製剤、並びにそのような組成物及び治療用製剤を使用して疾患を処置又は予防する方法も本明細書に記載される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivarius）の阻害プロファイルを改善する方法であって、有効量の補充糖類を含む組成物中で前記Ｓ．サリバリウスを製剤化することを含み、
前記ストレプトコッカス・サリバリウスが、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２、又はそれらの組み合わせであり、
前記補充糖類が、ガラクトース若しくはラフィノース、又はそれらの組み合わせである、方法。

【請求項2】

ストレプトコッカス・サリバリウスにおける１つ以上の遺伝子を上方制御するための方法であって、有効量の補充糖類を含む組成物中で前記Ｓ．サリバリウスを製剤化することを含み、
前記ストレプトコッカス・サリバリウスが、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２、又はそれらの組み合わせであり、
前記補充糖類が、ガラクトース若しくはラフィノース、又はそれらの組み合わせである、方法。

【請求項3】

前記上方制御された遺伝子が、ランチバイオティクスペプチド又はバクテリオシンをコードする、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記上方制御された遺伝子が、クラスＩ又はクラスＩＩランチバイオティクスペプチド又はバクテリオシンをコードする、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記ランチバイオティクスペプチドが、ｓａｌＡ、ｓａｌＢ、ｓａｌ９又はそれらの組み合わせである、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記ランチバイオティクスペプチドが、ｓａｌＡ、ｓａｌＢ、又はそれらの組み合わせである、請求項４又は５に記載の方法。

【請求項7】

前記バクテリオシンが、ｓａｌＱである、請求項４に記載の方法。

【請求項8】

前記上方制御された遺伝子が、ウレアーゼタンパク質のサブユニットをコードする、請求項２に記載の方法。

【請求項9】

前記上方制御された遺伝子が、ｕｒｅＣである、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記上方制御された遺伝子の少なくとも１つが、配列番号１５～２２のいずれか１つに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む若しくはそれからなり、又は前記上方制御された遺伝子の少なくとも１つが、配列番号２３～３０のいずれか１つに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む若しくはそれからなる、請求項２～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記上方制御された遺伝子の少なくとも１つが、配列番号１５～２２のいずれか１つに対して少なくとも７５％の同一性、好ましくは配列番号１５～２２のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む又はそれからなる、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記上方制御された遺伝子の少なくとも１つが、配列番号２３～３０のいずれか１つに対して少なくとも７５％の同一性、好ましくは配列番号２３～３０のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む又はそれからなる、請求項１０又は１１に記載の方法。

【請求項13】

ａ．前記上方制御された遺伝子の少なくとも１つが、配列番号１５若しくは１９に対して少なくとも７０％の同一性を有する、又は配列番号２３若しくは２７に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列を含む若しくはそれからなるｓａｌＡ遺伝子又はその変異体である、
ｂ．前記上方制御された遺伝子の少なくとも１つが、配列番号１６に対して少なくとも７０％の同一性を有する、又は配列番号２４に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列を含む若しくはそれからなるｓａｌＢ遺伝子又はその変異体である、
ｃ．前記上方制御された遺伝子の少なくとも１つが、配列番号１７若しくは２１に対して少なくとも７０％の同一性を有する、又は配列番号２５若しくは２９に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列を含む若しくはそれからなるｓａｌＱ遺伝子又はその変異体である、
ｄ．前記上方制御された遺伝子の少なくとも１つが、配列番号２０に対して少なくとも７０％の同一性を有する、又は配列番号２８に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列を含む若しくはそれからなるｓａｌ９遺伝子又はその変異体である、及び／又は
ｅ．前記上方制御された遺伝子の少なくとも１つが、配列番号１８若しくは２２に対して少なくとも７０％の同一性を有する、又は配列番号２６若しくは３０に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列を含む若しくはそれからなるｕｒｅＣ遺伝子又はその変異体である、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

ストレプトコッカス・サリバリウスによるランチバイオティクスペプチド、バクテリオシン、又はウレアーゼのうちの１つ以上の産生を増加させる方法であって、有効量の補充糖類を含む組成物中で前記Ｓ．サリバリウスを製剤化することを含み、
前記ストレプトコッカス・サリバリウスが、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２、又はそれらの組み合わせであり、
前記補充糖類が、ガラクトース若しくはラフィノース、又はそれらの組み合わせである、方法。

【請求項15】

前記ランチバイオティクスペプチド又はバクテリオシンが、クラスＩ又はクラスＩＩランチバイオティクスペプチド又はバクテリオシンである、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記ランチバイオティクスペプチドが、ｓａｌＡ、ｓａｌＢ、ｓａｌ９、又はそれらの組み合わせである、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記ランチバイオティクスペプチドが、ｓａｌＡ、ｓａｌＢ、又はそれらの組み合わせである、請求項１５又は１６に記載の方法。

【請求項18】

前記バクテリオシンが、ｓａｌＱである、請求項１１に記載の方法。

【請求項19】

配列番号２３～３０のいずれか１つに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドの産生を増加させる、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記ポリペプチドが、配列番号２３～３０のいずれか１つに対して少なくとも７５％の同一性、好ましくは配列番号２３～３０のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

皮膚、歯、口腔、粘膜、及び／又はＥＮＴＲ微生物に対するＳ．サリバリウスの阻害プロファイルを向上させる、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記皮膚、口腔、歯、粘膜、及び／又はＥＮＴＲ微生物が、Ｓ．アウレウス（黄色ブドウ球菌）（S.aureus）種、Ｓ．インターメディウス（S.intermedius）種、Ｓ．サプロフィチカス（腐性ブドウ球菌）（S.saprophyticus）種、Ｍ．カタラーリス（カタル球菌）（M.catarrhalis）種、Ｈ．インフルエンザ（H.influenzae）種、Ｓ．ピオゲネス（化膿連鎖球菌）（S.pyogenes）種、Ｐ．エルギノーザ（緑膿菌）（P.aeruginosa）種、Ｓ．ミュータンス（S.mutans）、Ｓ．ニューモニエ（肺炎連鎖球菌）（S.pneumoniae）種、Ｃ．アクネス（アクネ菌）（C.acnes）種、Ｃ．アルビカンス（カンジダ菌）（C.albicans）種、Ｓ．ソブリヌス（S.sobrinus）種、コリネバクテリウム（Corynebacterim）種、Ｆ．ヌクレアタム（F.nucleatum）種、Ａ．アクチノミセテムコミタンス（A.actinomycetemcomitans）種、Ｐ．ジンジバリス（P.gingivalis）種、タネレラ・フォーサイシア（Tannerella forsythia）種、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）種、Ｐ．インターメディア（P.intermedia）種、プレボテラ（Prevotella）種、Ａ．ビスコサス（A.viscosus）種、Ｓ．エキシミリス（S.equismillis）種、Ｓ．ディスガラクティエ（S.dygalactiae）種、Ｓ．サングイニス（S.sanguis）種、Ｓ．コーニー（S.cohnii）種、Ｂ．インターメディウス（B.intermedius）種、Ａ．パルブラム（A.parvulum）種、Ｅ．サブレウム（E.saburreum）種、Ｅ．スルシ（E.sulci）種、Ｐ．ミクラ（P.micra）種、Ｓ．ムーレイ（S.moorei）種、Ｓ．アガラクティエ（S.agalactiae）種、Ｃ．ミヌティスシムス（C.minutissimus）種、Ｐ．プロピオニカス種、Ｓ．アガラクティエ種、Ｓ．ディスガラクティアエ（S.dysgalactiae）種、Ｓ．シムランス（S.simulans）種、Ｓ．キシローサス（S.xylosus）種、足部白癬感染を引き起こす真菌、Ｓ．サリバリウス（S.salivarius）種、Ｋ１２又はＭ１８以外の種、Ｌ．ラクティス（L.lactis）種、Ｓ．エピデルミディス（表皮ブドウ球菌）（S.epidermidis）種、Ｓ．コンステラータス（S.constellatus）種、Ｋ．ニューモニエ（K.pneumoniae）種、Ａ．バウマニ（A.baumanii）種、又はそれらの任意の２つ以上の任意の組み合わせから選択される、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記微生物が、Ｓ．アウレウスＡ２２２、Ｓ．アウレウス２０、Ｓ．アウレウス１４、Ｓ．アウレウス１９、Ｓ．アウレウスＡ５０４、Ｓ．サプロフィチカスＡＴＣＣ１５３０５、Ｍ．カタラーリスＴＷ１、Ｍ．カタラーリスＴＷ２、Ｈ．インフルエンザＴＷ５、Ｓ．ピオゲネスＭ７６、Ｓ．ピオゲネス７１～６９８、Ｓ．ピオゲネスＦＦ２２、Ｓ．ピオゲネス７１～６７９、Ｓ．ピオゲネスＷ－１、Ｓ．ピオゲネスＭ１７、Ｓ．ピオゲネスＭ５７、Ｓ．ピオゲネスＥＭＭ９２、Ｓ．ピオゲネスＭ６６、Ｓ．ピオゲネスＭ７４、Ｐ．エルギノーザＩ２、Ｓ．ミュータンスＯＭＺ１７５、Ｓ．ニューモニエＤ３９、Ｌ．ラクティスＴ－２１、Ｓ．エピデルミディス１１、Ｓ．コンステラータスＴ－２９、Ｓ．サリバリウス６、Ｓ．サリバリウス１９３、Ｓ．サリバリウス２０Ｐ３、又はそれらの任意の２つ以上の任意の組み合わせから選択される、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記組成物が、少なくとも約０．１重量％の各Ｓ．サリバリウスを含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記組成物が、約０．１～約２０重量％の各Ｓ．サリバリウスを含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記組成物が、少なくとも約１×１０^３ｃｆｕ／ｇの各Ｓ．サリバリウスを含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記組成物が、約１×１０^３～約１×１０^１３ｃｆｕ／ｇの各Ｓ．サリバリウスを含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記組成物が、約２０重量％未満の各補充糖類を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記組成物が、約０．１～約２０重量％の各補充糖類を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記組成物が、口腔、歯、鼻腔、粘膜、局所、又は肺投与のために製剤化される、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記組成物が、徐放性組成物中で製剤化される、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記組成物が、粉末、舐剤、鼻腔スプレー、鼻腔ゲル、点鼻薬、経口ドロップ、経口ゲル、経口スプレー、吸入可能な局所用組成物、チュアブル、メルト、フィルム、グミ、練り歯磨き、歯磨きゲル、ワニス、ムース、マウスウォッシュ、食品（例えばヨーグルト）、クリーム、ゲルスプレー、デオドラント、美容液、ローション、バーム、保湿剤、ペッサリー、又は坐剤に製剤化される、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

皮膚、歯、口腔、粘膜、及び／又はＥＮＴＲ微生物を阻害する方法であって、前記微生物を、ストレプトコッカス・サリバリウス及び有効量の補充糖類を含む、組成物と接触させることを含み、
前記ストレプトコッカス・サリバリウスが、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２、又はそれらの組み合わせであり、
前記補充糖類が、ガラクトース若しくはラフィノース、又はそれらの組み合わせである、方法。

【請求項34】

前記微生物が、Ｓ．アウレウス種、Ｓ．サプロフィチカス種、Ｓ．ミュータンス種、Ｓ．ピオゲネス種、Ｓ．ニューモニエ種から選択されるストレプトコッカス（連鎖球菌）（Streptococcus）又はスタフィロコッカス（ブドウ球菌）（Staphylococcus）細菌であり、前記Ｓ．サリバリウス株が、Ｋ１２である、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記ストレプトコッカス又はスタフィロコッカス細菌が、Ｓ．アウレウスＡ２２２、Ｓ．サプロフィチカスＡＴＣＣ１５３０５、Ｓ．ミュータンスＯＭＺ１７５、Ｓ．コンステラータスＴ－２９、Ｓ．ピオゲネス７１～６９８、及びＳ．ニューモニエＤ３９から選択され、前記Ｓ．サリバリウス株が、Ｋ１２である、請求項３３又は３４に記載の方法。

【請求項36】

前記補充糖類が、ラフィノースであり、前記組成物中に０．５～１５重量％、又は１～１２重量％、又は１．５～１０重量％、又は２～７重量％、又は２．５～５重量％の量で存在する、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記補充糖類が、ガラクトースであり、前記組成物中に０．５～１５重量％、又は１～１２重量％、又は１．５～１０重量％、又は２～７重量％、又は２．５～５重量％の量で存在する、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記細菌が、Ｓ．ピオゲネス種及びＳ．ニューモニエ種から選択され、前記Ｓ．サリバリウス株が、Ｍ１８である、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記細菌が、Ｓ．ピオゲネス７１－６９８及びＳ．ニューモニエＤ３９から選択され、前記Ｓ．サリバリウス株が、Ｍ１８である、請求項３３～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記細菌が、Ｓ．コンステラータス、Ｓ．ミュータンス、及びＳ．サプロフィチカスから選択され、前記Ｓ．サリバリウス株が、Ｍ１８である、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記細菌が、Ｓ．コンステラータスＴ２９、Ｓ．ミュータンスＯＭＺ１７５、及びＳ．サプロフィチカスＡＴＣＣ１５３０５から選択され、前記Ｓ．サリバリウス株が、Ｍ１８である、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記補充糖類が、ラフィノースであり、前記組成物中に０．２５～１０重量％、又は０．５～８重量％、又は０．７５～７重量％、又は１～６重量％、又は１．２５～５重量％の量で存在する、請求項３３～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記補充糖類が、ガラクトースであり、前記組成物中に０．２５～１０重量％、又は０．５～８重量％、又は０．７５～７重量％、又は１～６重量％、又は１．２５～５重量％の量で存在する、請求項３３～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

ストレプトコッカス・サリバリウス、及び前記ストレプトコッカス・サリバリウスの阻害プロファイルを改善するのに使用するための有効量の補充糖類を含む、組成物であって、
前記ストレプトコッカス・サリバリウスが、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２、又はそれらの組み合わせであり、
前記補充糖類が、ガラクトース若しくはラフィノース、又はそれらの組み合わせである、組成物。

【請求項45】

０．１～１重量％、又は０．２～０．８重量％、又は０．２５～０．７５重量％、又は０．５重量％の量のガラクトース、及び０．５～５重量％、又は１～４重量％、又は２～３重量％、又は２．５重量％の量のラフィノースのうちの１つ以上を含む、請求項４４に記載の組成物。

【請求項46】

ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２、及び２～３重量％の量のラフィノースを含む、組成物。

【請求項47】

ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２、及び０．２５～０．７５重量％の量のガラクトースを含む、組成物。

【請求項48】

ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、及び２～３重量％の量のラフィノースを含む、組成物。

【請求項49】

ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、及び０．２５～０．７５重量％の量のガラクトースを含む、組成物。

【請求項50】

ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、及び２～３重量％の量のラフィノースを含む、組成物。

【請求項51】

ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、及び０．２５～０．７５重量％の量のガラクトースを含む、組成物。

【請求項52】

ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、２～３重量％の量のラフィノース、及び０．２５～０．７５重量％の量のガラクトースを含む、組成物。

【請求項53】

ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２、１．２～２．２重量％の量のラフィノース、及び０．７～１．７重量％の量のガラクトースを含む、組成物。

【請求項54】

ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、１．２～２．２重量％の量のラフィノース、及び０．７～１．７重量％の量のガラクトースを含む、組成物。

【請求項55】

ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、１．２～２．２重量％の量のラフィノース、及び０．７～１．７重量％の量のガラクトースを含む、組成物。

【請求項56】

担体；結合剤又は滑沢剤を含む錠剤化助剤；及び香味剤のうちの１つ以上を更に含む、請求項４４～５５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項57】

請求項４４～５６のいずれか一項に記載の組成物を含む、治療用製剤。

【請求項58】

前記治療用製剤が、口腔、歯、経鼻、粘膜、局所、又は肺投与のために製剤化されている、請求項５７に記載の治療用製剤。

【請求項59】

前記治療用製剤が、徐放性組成物である、請求項５７又は５８に記載の治療用製剤。

【請求項60】

前記治療用製剤が、粉末、舐剤、鼻用スプレー、鼻用ゲル、点鼻薬、経口用ドロップ、経口用ゲル、経口用スプレー、吸入可能な局所用組成物、チュアブル、メルト、フィルム、グミ、練り歯磨き、歯磨きゲル、ワニス、ムース、マウスウォッシュ、食品（例えば、ヨーグルト）、クリーム、ゲル、スプレー、デオドラント、美容液、ローション、バーム、保湿剤、ペッサリー、又は坐剤である、請求項５７～５９のいずれか一項に記載の治療用製剤。

【請求項61】

粉末である、請求項６０に記載の治療用製剤。

【請求項62】

舐剤である、請求項６０に記載の治療用製剤。

【請求項63】

疾患又は障害を処置又は予防する方法であって、それを必要とする対象に、請求項４４～５６のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項５７～６２のいずれか一項に記載の治療用製剤を投与することを含む、方法。

【請求項64】

前記疾患又は障害が、口腔、歯、粘膜、皮膚、又はＥＮＴＲ病原体によって引き起こされる、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記疾患又は障害が、病原性ストレプトコッカス又はスタフィロコッカス細菌によって引き起こされる、請求項６３又は６４に記載の方法。

【請求項66】

前記病原性ストレプトコッカス又はスタフィロコッカス細菌が、Ｓ．アウレウス種、Ｓ．サプロフィチカス種、Ｓ．ミュータンス種、Ｓ．ピオゲネス種、及びＳ．ニューモニエ種から選択される、請求項６３～６５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

前記疾患又は障害が、中耳炎、咽喉炎、虫歯、急性咽頭炎、扁桃炎、肺炎、ＣＯＰＤ、歯根膜疾患、歯肉炎、口臭、う蝕、敗血症、髄膜炎、カンジダ症（口腔カンジダ症）、膣炎、体臭、ざ瘡、放線菌症、乾癬、紅斑、蜂巣炎、膿痂疹、アトピー皮膚炎、菌血症、水虫を含む白癬、軟組織感染、紅班、院内紅班、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、及びＲＳＶ、又はそれらの任意の２つ以上の任意の組み合わせから選択される、請求項６３～６６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項68】

ブリス産生Ｓ．サリバリウスに感受性の微生物を阻害する方法であって、それを必要とする対象に、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項５７～６２のいずれか一項に記載の治療用製剤を投与することを含む、方法。

【請求項69】

前記ブリス産生Ｓ．サリバリウスに感受性の微生物が、Ｓ．サリバリウス種、Ｓ．エピデルミディス種、Ｓ．コンステラータス種、及びＬ．ラクティス種から選択される、請求項６８に記載の方法。

【請求項70】

前記ブリス産生Ｓ．サリバリウスに感受性の微生物が、Ｓ．ピオゲネス種、Ｆ．ヌクレアタム種、及びＰ．ジンジバリス種から選択される、請求項６８に記載の方法。

【請求項71】

前記対象が、ヒトである、実施形態６３～７０のいずれか１つに記載の方法。

【請求項72】

医薬の製造におけるストレプトコッカス・サリバリウス及び補充糖類の使用であって、前記医薬が、
（ａ）疾患又は障害の処置若しくは予防、又は
（ｂ）ブリス産生Ｓ．サリバリウスに感受性の微生物の阻害、のためのものであり、
前記ストレプトコッカス・サリバリウスが、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２、又はそれらの組み合わせであり、
前記補充糖類が、ガラクトース若しくはラフィノース、又はそれらの組み合わせである、使用。

【請求項73】

ストレプトコッカス・サリバリウス及び有効量の補充糖類を含む、組成物であって、前記組成物が、
（ａ）疾患又は障害の処置若しくは予防、又は
（ｂ）ブリス産生Ｓ．サリバリウスに感受性の微生物の阻害、における使用のためのものであり、
前記ストレプトコッカス・サリバリウスが、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２、又はそれらの組み合わせであり、
前記補充糖類が、ガラクトース若しくはラフィノース、又はそれらの組み合わせである、組成物。

【請求項74】

前記組成物が、粉末、舐剤、鼻腔スプレー、鼻腔ゲル、点鼻薬、経口ドロップ、経口ゲル、経口スプレー、吸入可能な局所用組成物、チュアブル、メルト、フィルム、グミ、練り歯磨き、歯磨きゲル、ワニス、ムース、マウスウォッシュ、食品（例えば、ヨーグルト）、クリーム、ゲル、スプレー、デオドラント、美容液、ローション、バーム、保湿剤、ペッサリー、又は坐剤である、請求項７３に記載の組成物。

【請求項75】

粉末である、請求項７４に記載の組成物。

【請求項76】

舐剤である、請求項７４に記載の組成物。

【請求項77】

前記組成物が、化粧品である、請求項４４～５６又は７３～７５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項78】

前記組成物が、栄養補助食品である、請求項４４～５６又は７３～７６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項79】

前記組成物が、天然健康製品である、請求項４４～５６又は７３～７６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項80】

前記組成物が、補完薬である、請求項４４～５６又は７３～７６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項81】

ストレプトコッカス・サリバリウス及び有効量の補充糖類を含む、組成物を製造する方法であって、
（ａ）ストレプトコッカス・サリバリウスを補充糖類と組み合わせることと、
（ｂ）混合して均質なブレンドを製造することとを含み、
前記ストレプトコッカス・サリバリウスが、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２、又はそれらの組み合わせであり、
前記補充糖類が、ガラクトース若しくはラフィノース、又はそれらの組み合わせである、方法。

【請求項82】

前記組成物が、舐剤であり、前記方法が、前記均質なブレンドを舐剤化して、前記舐剤を製造する工程を更に含む、請求項８１に記載の方法。

【請求項83】

前記組成物中の前記Ｓ．サリバリウスの阻害プロファイルが、前記補充糖類を欠く組成物と比較して改善される、請求項８１又は８２に記載の方法。

【請求項84】

前記組成物が、
（ａ）疾患又は障害の処置若しくは予防、又は
（ｂ）ブリス産生Ｓ．サリバリウスに感受性の微生物の阻害、における使用のためのものである、請求項８１～８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項85】

疾患又は障害の処置若しくは予防のための、又はブリス産生Ｓ．サリバリウスに感受性の微生物の阻害のための、請求項８１～８４のいずれか一項に記載の方法により製造された組成物の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、広く、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivarius）プロバイオティクスの有効性を増強するための方法、及びそのような方法において有用な組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

プロバイオティクスは、対象によって摂取されるとき、又は対象に投与されるときに様々な健康上の利益を提供し得る生きた微生物である。例えば、ラクトバチルス（Lactobacillus）種及びビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）種は、腸の健康の維持又は改善における使用についてよく知られている。

【0003】

プロバイオティクス市場の拡大により、プロバイオティクス株の有効性を増強する方法にますます焦点が当てられてきている。今日まで、焦点の多くは、プレバイオティクスがどのようにして腸内マイクロバイオームを変化させることができるか、又は腸の健康に有用なプロバイオティクスの有効性を向上させることができるかに当てられてきた。その研究の結果として、腸内プロバイオティクスの増殖又は活性を誘導する様々なプレバイオティクスが特定されている。このようなプレバイオティクスとしては、非消化性繊維化合物、難消化性デンプン、アラビノガラクタン、並びにイヌリン及びガラクトオリゴ糖などのオリゴ糖が挙げられる。

【0004】

プレバイオティクスは、元々、「結腸内の１つ又は限られた数の細菌の増殖及び／又は活性を選択的に刺激することによって宿主に有益な影響を与え、それによってヒトの健康状態を改善する非消化性食品成分」として説明されていた。この定義により、限られた数の炭水化物のみが、結腸に常在する細菌の促進について基準に適合すると考えられた。この説明が着想されて以来、プレバイオティクスは、「胃腸微生物叢の組成及び／又は活性に特異的な変化をもたらし、それによって宿主の健康に利益を与える選択的に発酵された成分」として定義されてきた。しかしながら、現在受け入れられている定義は、口腔内にのみ存在する微生物叢を除外する。

【0005】

国際公開第２０１６１７２６５８号には、大腸又は小腸における有益な細菌の増殖及び／又はコロニー形成を改善するための、糖又は糖アルコールなどのマイクロバイオーム制御因子の使用が記載されている。国際公開第２００４０７４４９６号には、胃腸管において有益な細菌を増加させるための、ガラクトオリゴ糖の使用が記載されている。米国特許出願公開第２０２０００３０３６６号には、イヌリンなどの食物繊維を投与することを含む、胃腸病原性微生物によるコロニー形成を処置又は予防する方法が記載されている。組成物はまた、スクロース、マルトース、ラクトース、フルクトース、ガラクトース、グルコース、ラフィノース、マンノース、リボース、及びトレハロースなどの様々な糖／糖類を含む、プレバイオティクスを含み得る。

【0006】

より最近では、経口適用のためのプロバイオティクス又は経口標的化プロバイオティクスが特定されている。Ｓ．サリバリウスプロバイオティクスは、様々な口腔病原体に対する使用が知られている。例えば、Ｓ．サリバリウスＫ１２株（「Ｋ１２」）は、耳、鼻、及び喉の感染症、例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）によって引き起こされる耳、鼻、及び喉の感染症の予防又は処置における使用について文書化されている。（例えば、Ｂｌｉｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄの国際公開第２００１０２７１４３号を参照）。Ｋ１２はまた、嫌気性細菌によって引き起こされる口臭の処置における使用が知られている（例えば、Ｂｌｉｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄの国際公開第２００５００７１７８号を参照）。Ｓ．サリバリウス株Ｍｉａ（本明細書では「Ｍ１８」）は、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）によって引き起こされるう蝕の処置における使用が知られている（例えば、Ｂｌｉｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄの国際公開第２００３０７０９１９号を参照）。

【0007】

米国特許第２０１９０３３６４２８号には、Ｄ－ツラノース、Ｄ－メレジトース、Ｄ－ラクチトール、ミオイノシトール、及びＮ－アセチル－Ｄ－マンノサミンから選択される糖類を使用して、口腔内の有益な細菌の増殖を選択的に増加させることが記載されている。国際公開第２０１２０６５８１１号には、プロバイオティクス及びプレバイオティクスを含み得る小児用の栄養組成物が記載されている。米国特許出願公開第２０１６０１６６５０１号には、口腔衛生に使用するための、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）を含む口腔用組成物が記載されている。組成物はまた、他のプロバイオティクス株及び賦形剤を含み得る。国際公開第２００７１４４３３４号には、プロバイオティクスラクトバチルス株と、Ｓ．サリバリウスＫ１２などの静菌効果を発揮することができる細菌株とを含む、中耳炎を処置するための組成物が記載されている。組成物は、ラクトースを含む乳児用調整乳の形態であり得る。

【0008】

米国特許出願公開第２０１９０３４３８９９号には、高温で調製された、プレバイオティクスを含むハードキャンディ又はタフィー組成物が記載されている。国際公開第２０１７１２９６３９号には、オリゴ糖を含む乳児用調整乳が記載されている。

【0009】

単糖は、プレバイオティクスとして使用され、エネルギー源として摂取されることによって細菌の増殖を促進することが知られている。細菌は、これらの糖を利用する際、副産物として有機酸を産生し得る。これらの酸は、他の細菌の増殖に対して弱い非選択的阻害効果を有し得る。更に、口腔内で使用される場合、酸性副産物の産生は、環境ｐＨを低下させ、う蝕に進行し得る歯のエナメル質の浸食を引き起こす場合がある。より酸性の環境はまた、Ｓ．ミュータンスなどの有害な歯の病原体の増殖を促進する。

【0010】

ｐＨに有意な影響を及ぼすことなくプロバイオティクスにおける抗菌活性を促進するために、一般的な糖の代替物を特定する必要がある。プロバイオティクスのコロニー形成効力を増強して健康上の利益を与える、一般的な糖の代替物を特定する必要もある。胃腸管以外の領域においてプロバイオティクスの活性を増強することができる組成物も必要とされている。本発明の目的は、これらの必要性のうちの任意の１つ以上を満たすために、及び／又は少なくとも公衆に有用な選択肢を提供するために、何らかの助けになることである。

【0011】

本発明の他の目的は、例としてのみ与えられる以下の説明から明らかになるであろう。

【0012】

本明細書に含まれている文書、作用、材料、デバイス、物品などのいかなる考察も、単に本発明の文脈を提供するためのものである。これらの事項のいずれか又は全てが、優先日前に存在していたことから、従来技術の基礎の一部を形成すること、又は本発明に関連する技術分野における共通の全般的知識であったことを認めるものとして解釈されるべきではない。

【発明の概要】

【0013】

第１の態様では、本発明は、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivarius）の阻害プロファイルを改善する方法であって、有効量の補充糖類を含む組成物中でＳ．サリバリウスを製剤化することを含み、
ストレプトコッカス・サリバリウスが、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２、又はそれらの組み合わせであり、
補充糖類が、ガラクトース若しくはラフィノース、又はそれらの組み合わせである、方法を提供する。

【0014】

第２の態様では、本発明は、ストレプトコッカス・サリバリウスにおける１つ以上の遺伝子を上方制御するための方法であって、有効量の補充糖類を含む組成物中でＳ．サリバリウスを製剤化することを含み、
ストレプトコッカス・サリバリウスが、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２、又はそれらの組み合わせであり、
補充糖類が、ガラクトース若しくはラフィノース、又はそれらの組み合わせである、方法を提供する。

【0015】

第３の態様では、本発明は、皮膚、歯、口腔、粘膜及び／又はＥＮＴ微生物を阻害する方法であって、微生物を、ストレプトコッカス・サリバリウス及び有効量の糖類を含む組成物と接触させることを含み、
ストレプトコッカス・サリバリウスが、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２、又はそれらの組み合わせであり、
補充糖類が、ガラクトース若しくはラフィノース、又はそれらの組み合わせである、方法を提供する。

【0016】

第４の態様では、本発明は、ストレプトコッカス・サリバリウスによるランチバイオティクスペプチド、バクテリオシン、又はウレアーゼのうちの１つ以上の産生を増加させるための方法であって、有効量の補充糖類を含む組成物中でＳ．サリバリウスを製剤化することを含み、
ストレプトコッカス・サリバリウスが、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２、又はそれらの組み合わせであり、
補充糖類が、ガラクトース若しくはラフィノース、又はそれらの組み合わせであり、産生が、補充糖類を欠く組成物と比較して増加する、方法を提供する。

【0017】

第５の態様では、本発明は、ストレプトコッカス・サリバリウス、及びストレプトコッカス・サリバリウスの阻害プロファイルの改善に使用するための有効量の補充糖類を含む、組成物であって、
ストレプトコッカス・サリバリウスが、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２、又はそれらの組み合わせであり、
補充糖類が、ガラクトース若しくはラフィノース、又はそれらの組み合わせである、組成物を提供する。

【0018】

第６の態様では、本発明は、ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２、及び２～３重量％の量のラフィノースを含む、組成物を提供する。

【0019】

第７の態様では、本発明は、ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２、及び０．２５～０．７５重量％の量のガラクトースを含む、組成物を提供する。

【0020】

第８の態様では、本発明は、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、及び２～３重量％の量のラフィノースを含む、組成物を提供する。

【0021】

第９の態様では、本発明は、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、及び０．２５～０．７５重量％の量のガラクトースを含む、組成物を提供する。

【0022】

第１０の態様では、本発明は、ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、及び２～３重量％の量のラフィノースを含む、組成物を提供する。

【0023】

第１１の態様では、本発明は、ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、及び０．２５～０．７５重量％の量のガラクトースを含む、組成物を提供する。

【0024】

第１２の態様では、本発明は、ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、２～３重量％の量のラフィノース、及び０．２５～０．７５重量％の量のガラクトースを含む、組成物を提供する。

【0025】

第１３の態様では、本発明は、ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２、１．２～２．２重量％の量のラフィノース、及び０．７～１．７重量％の量のガラクトースを含む、組成物を提供する。

【0026】

第１４の態様では、本発明は、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、１．２～２．２重量％の量のラフィノース、及び０．７～１．７重量％の量のガラクトースを含む、組成物を提供する。

【0027】

第１５の態様では、本発明は、ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、１．２～２．２重量％の量のラフィノース、及び０．７～１．７重量％の量のガラクトースを含む、組成物を提供する。

【0028】

第１６の態様では、本発明は、第５～第１５の態様のいずれか１つの組成物を含む、治療用製剤を提供する。

【0029】

第１７の態様では、本発明は、疾患又は障害を処置又は予防する方法であって、それを必要とする対象に、第５～第１５の態様のいずれか１つの組成物、又は第１６の態様の治療用製剤を投与することを含む、方法を提供する。

【0030】

第１８の態様では、本発明は、ブリス（Ｂｌｉｓ）産生Ｓ．サリバリウスに感受性の微生物を阻害する方法であって、それを必要とする対象に、第５～第１５の態様のいずれか１つの組成物、又は第１６の態様の治療用製剤を投与することを含む、方法を提供する。

【0031】

第１９の態様では、本発明は、医薬の製造におけるストレプトコッカス・サリバリウス及び補充糖類の使用であって、医薬が、
（ａ）疾患又は障害の処置若しくは予防、又は
（ｂ）ブリス産生Ｓ．サリバリウスに感受性の微生物の阻害、のためのものであり、
ストレプトコッカス・サリバリウスが、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２、又はそれらの組み合わせであり、
補充糖類が、ガラクトース若しくはラフィノース、又はそれらの組み合わせである、使用を提供する。

【0032】

第２０の態様では、本発明は、ストレプトコッカス・サリバリウス、及び有効量の補充糖類を含む、組成物であって、組成物が、
（ａ）疾患又は障害の処置若しくは予防、又は
（ｂ）ブリス産生Ｓ．サリバリウスに感受性の微生物の阻害、における使用のためのものであり、
ストレプトコッカス・サリバリウスが、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２、又はそれらの組み合わせであり、
補充糖類が、ガラクトース若しくはラフィノース、又はそれらの組み合わせである、組成物を提供する。

【0033】

第２１の態様では、本発明は、ストレプトコッカス・サリバリウス及び有効量の補充糖類を含む、組成物を製造する方法であって、
（ａ）ストレプトコッカス・サリバリウスを補充糖類と組み合わせることと、
（ｂ）混合して均質なブレンドを製造することとを含み、
ストレプトコッカス・サリバリウスが、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２、又はそれらの組み合わせであり、
補充糖類が、ガラクトース若しくはラフィノース、又はそれらの組み合わせである、方法を提供する。

【0034】

第２２の態様では、本発明は、疾患又は障害の処置若しくは予防のための、又はブリス産生Ｓ．サリバリウスに感受性の微生物の阻害のための、第２１の態様の方法により製造された組成物の使用に関する。

【0035】

以下の実施形態及び選好は、単独で、又は任意の２つ以上の任意の組み合わせで、上記の態様のいずれかに関連し得る。

【0036】

各種実施形態では、上方制御された遺伝子は、ランチバイオティクスペプチド又はバクテリオシンをコードする。

【0037】

各種実施形態では、上方制御された遺伝子は、クラスＩランチバイオティクスペプチド又はクラスＩＩバクテリオシンをコードする。

【0038】

各種実施形態では、ランチバイオティクスペプチドは、ｓａｌＡ、ｓａｌＢ、ｓａｌ９、又はそれらの組み合わせである。

【0039】

各種実施形態では、ランチバイオティクスペプチドは、ｓａｌＡ、ｓａｌＢ、又はそれらの組み合わせである。

【0040】

各種実施形態では、バクテリオシンは、ｓａｌＱである。

【0041】

各種実施形態では、上方制御された遺伝子は、ウレアーゼタンパク質のサブユニットをコードする。

【0042】

各種実施形態では、ウレアーゼは、ｕｒｅＣである。

【0043】

各種実施形態では、上方制御された遺伝子の少なくとも１つは、配列番号１５～２２のいずれか１つに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む若しくはそれからなり、又は上方制御された遺伝子の少なくとも１つは、配列番号２３～３０のいずれか１つに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む若しくはそれからなる。

【0044】

各種実施形態では、上方制御された遺伝子の少なくとも１つは、配列番号１５～２２のいずれか１つに対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは配列番号１５～２２のいずれか１つに対して少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む又はそれからなる。

【0045】

各種実施形態では、上方制御された遺伝子の少なくとも１つは、配列番号２３～３０のいずれか１つに対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは配列番号２３～３０のいずれか１つに対して少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む又はそれからなる。

【0046】

各種実施形態では、
ａ．上方制御された遺伝子の少なくとも１つが、配列番号１５若しくは１９に対して少なくとも７０％の同一性を有する、又は配列番号２３若しくは２７に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列を含む若しくはそれからなるｓａｌＡ遺伝子又はその変異体であり；
ｂ．上方制御された遺伝子の少なくとも１つが、配列番号１６に対して少なくとも７０％の同一性を有する、又は配列番号２４に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列を含む若しくはそれからなるｓａｌＢ遺伝子又はその変異体であり；
ｃ．上方制御された遺伝子の少なくとも１つが、配列番号１７若しくは２１に対して少なくとも７０％の同一性を有する、又は配列番号２５若しくは２９に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列を含む若しくはそれからなるｓａｌＱ遺伝子又はその変異体であり；
ｄ．上方制御された遺伝子の少なくとも１つが、配列番号２０に対して少なくとも７０％の同一性を有する、又は配列番号２８に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列を含む若しくはそれからなるｓａｌ９遺伝子又はその変異体であり；及び／又は
ｅ．上方制御された遺伝子の少なくとも１つが、配列番号１８若しくは２２に対して少なくとも７０％の同一性を有する、又は配列番号２６若しくは３０に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列を含む若しくはそれからなるｕｒｅＣ遺伝子又はその変異体である。

【0047】

各種実施形態では、ランチバイオティクスペプチド又はバクテリオシンは、クラスＩ又はクラスＩＩランチバイオティクスペプチド又はバクテリオシンである。

【0048】

各種実施形態では、ランチバイオティクスペプチドは、ｓａｌＡ、ｓａｌＢ、ｓａｌ９、又はそれらの組み合わせである。

【0049】

各種実施形態では、ランチバイオティクスペプチドは、ｓａｌＡ、ｓａｌＢ、又はそれらの組み合わせである。

【0050】

各種実施形態では、バクテリオシンは、ｓａｌＱである。

【0051】

各種実施形態では、本方法は、配列番号２３～３０のいずれか１つに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドの産生を増加させる。

【0052】

各種実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２３～３０のいずれか１つに対して少なくとも７５％の同一性、好ましくは配列番号２３～３０のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する。

【0053】

各種実施形態では、本方法は、皮膚、歯、口腔、粘膜、及び／又はＥＮＴＲ微生物に対するＳ．サリバリウスの阻害プロファイルを向上させる。

【0054】

各種実施形態では、皮膚、口腔、歯、粘膜、及び／又はＥＮＴＲ微生物は、スタフィロコッカス・アウレウス（黄色ブドウ球菌）（Staphylococcus aureus）種、スタフィロコッカス・インターメディウス（Staphylococcus intermedius）種、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（腐性ブドウ球菌）（Staphylococcus saprophyticus）種、モラクセラ・カタラーリス（カタル球菌）（Moraxella catarrhalis）種、ヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）種、ストレプトコッカス・ピオゲネス（化膿連鎖球菌）（Streptococcus pyogenes）種、シュードモナス・エルギノーザ（緑膿菌）（Pseudomonas aeruginosa）種、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）種、ストレプトコッカス・ニューモニエ（肺炎連鎖球菌）（Streptococcus pneumoniae）種、キューティバクテリウム・アクネス（アクネ菌）、カンジダ・アルビカンス（カンジダ菌）（Candida albicans）種、ストレプトコッカス・ソブリナス（ソブリヌス菌）（Streptococcus sobrinus）種、コリネバクテリウム（Corynebacterium）種、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）種、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Aggregatibacter actinomycetemcomitans）種、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）種、タネレラ・フォーサイシア（Tannerella forsythia）種、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）種、Ｐ．インターメディア（P.intermedia）種、プレボテラ（Prevotella）種、アクチノマイセス・ビスコサス（Actinomyces viscosus）種、ストレプトコッカス・エキシミリス（Streptococcus equismillis）種、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Streptococcus dygalactiae）種、ストレプトコッカス・サングイニス（Streptococcus sanguis）種、スタフィロコッカス・コーニー（Staphylococcus cohnii）種、Ｂ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ種、アトポビウム・パルブルム（Atopobium parvulum）種、エウバクテリウム・サブレウム（Eubacterium saburreum）種、エウバクテリウム・スルシ（Eubacterium sulci）種、パルビモナス・ミクラ（Parvimonas micra）種、ソロバクテリウム・ムーレイ（Ｓolobacterium moorei）種、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）種、Ｃ．ミヌティスシムス（C.minutissimus）種、プロピオニバクテリウム・プロピオニカス。種、ストレプトコッカス・アガラクティエ種、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ種、ストレプトコッカス・シムランス（Staphylococcus simulans）種、スタフィロコッカス．キシローサス（Staphylococcus xylosus）種、足部白癬感染を引き起こす真菌、Ｓ．サリバリウスＫ１２又はＭ１８以外の種、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）種、スタフィロコッカス・エピデルミディス（表皮ブドウ球菌）（Staphylococcus epidermidis）種、ストレプトコッカス・コンステラータス（Streptococcus constellatus）種、クレブシエラ属ニューモニエ種、アシネトバクター・バウマニ（Acinetobacter baumanii）種、又はそれらの任意の２つ以上の任意の組み合わせから選択される。

【0055】

各種実施形態では、微生物は、Ｓ．アウレウスＡ２２２、Ｓ．アウレウス２０、Ｓ．アウレウス１４、Ｓ．アウレウス１９、Ｓ．アウレウスＡ５０４、Ｓ．サプロフィチカスＡＴＣＣ１５３０５、Ｍ．カタラーリスＴＷ１、Ｍ．カタラーリスＴＷ２、Ｈ．インフルエンザＴＷ５、Ｓ．ピオゲネスＭ７６、Ｓ．ピオゲネス７１～６９８、Ｓ．ピオゲネスＦＦ２２、Ｓ．ピオゲネス７１～６７９、Ｓ．ピオゲネスＷ－１、Ｓ．ピオゲネスＭ１７、Ｓ．ピオゲネスＭ５７、Ｓ．ピオゲネスＥＭＭ９２、Ｓ．ピオゲネスＭ６６、Ｓ．ピオゲネスＭ７４、Ｐ．エルギノーザＩ２、Ｓ．ミュータンスＯＭＺ１７５、Ｓ．ニューモニエＤ３９、Ｌ．ラクティスＴ－２１、Ｓ．エピデルミディス１１、Ｓ．コンステラータスＴ－２９、Ｓ．サリバリウス６、Ｓ．サリバリウス１９３、Ｓ．サリバリウス２０Ｐ３、又はそれらの任意の２つ以上の任意の組み合わせから選択される。

【0056】

各種実施形態では、組成物は、少なくとも約０．１重量％のＳ．サリバリウスを含む。

【0057】

各種実施形態では、組成物は、約０．１～約２０重量％のＳ．サリバリウスを含む。

【0058】

各種実施形態では、組成物は、少なくとも約１×１０^３ｃｆｕ／ｇのＳ．サリバリウスを含む。

【0059】

各種実施形態では、組成物は、約１×１０^３～約１×１０^１３ｃｆｕ／ｇのＳ．サリバリウスを含む。

【0060】

各種実施形態では、組成物は、約２０重量％未満の補充糖類を含む。

【0061】

各種実施形態では、組成物は、約０．１～約２０重量％の補充糖類を含む。

【0062】

各種実施形態では、組成物は、口腔、歯、鼻腔、粘膜、局所、又は肺投与のために製剤化される。

【0063】

各種実施形態では、組成物は、徐放性組成物中で製剤化される。

【0064】

各種実施形態では、組成物は、粉末、舐剤、鼻腔スプレー、鼻腔ゲル、点鼻薬、経口ドロップ、経口ゲル、経口スプレー、吸入可能な局所用組成物、チュアブル、メルト、フィルム、グミ、練り歯磨き、歯磨きゲル、ワニス、ムース、マウスウォッシュ、食品（例えばヨーグルト）、クリーム、ゲルスプレー、デオドラント、美容液、ローション、バーム、保湿剤、ペッサリー、又は坐剤に製剤化される。

【0065】

各種実施形態では、微生物は、Ｓ．アウレウス種、Ｓ．サプロフィチカス種、Ｓ．ミュータンス種、Ｓ．ピオゲネス種、Ｓ．ニューモニエ種から選択されるストレプトコッカス又はスタフィロコッカス細菌であり、Ｓ．サリバリウス株は、Ｋ１２である。

【0066】

各種実施形態では、ストレプトコッカス又はスタフィロコッカス細菌は、Ｓ．アウレウスＡ２２２、Ｓ．サプロフィチカスＡＴＣＣ１５３０５、Ｓ．ミュータンスＯＭＺ１７５、Ｓ．コンステラータスＴ－２９、Ｓ．ピオゲネス７１～６９８、及びＳ．ニューモニエＤ３９から選択され、Ｓ．サリバリウス株は、Ｋ１２である。

【0067】

各種実施形態では、補充糖類は、ラフィノースであり、組成物中に０．５～１５重量％、又は１～１２重量％、又は１．５～１０重量％、又は２～７重量％、又は２．５～５重量％の量で存在する。

【0068】

各種実施形態では、補充糖類は、ガラクトースであり、組成物中に０．５～１５重量％、又は１～１２重量％、又は１．５～１０重量％、又は２～７重量％、又は２．５～５重量％の量で存在する。

【0069】

各種実施形態では、細菌は、Ｓ．ピオゲネス種及びＳ．ニューモニエ種から選択され、Ｓ．サリバリウス株は、Ｍ１８である。

【0070】

各種実施形態では、細菌は、Ｓ．ピオゲネス７１～６９８及びＳ．ニューモニエＤ３９から選択され、Ｓ．サリバリウス株は、Ｍ１８である。

【0071】

各種実施形態では、細菌は、Ｓ．コンステラータス、Ｓ．ミュータンス、及びＳ．サプロフィチカスから選択され、Ｓ．サリバリウス株は、Ｍ１８である。

【0072】

各種実施形態では、細菌は、Ｓ．コンステラータスＴ２９、ＳミュータンスＯＭＺ１７５、及びＳ．サプロフィチカスＡＴＣＣ１５３０５から選択され、Ｓ．サリバリウス株は、Ｍ１８である。

【0073】

各種実施形態では、補充糖類は、ラフィノースであり、組成物中に０．２５～１０重量％、又は０．５～８重量％、又は０．７５～７重量％、又は１～６重量％、又は１．２５～５重量％の量で存在する。

【0074】

各種実施形態では、補充糖類は、ガラクトースであり、組成物中に０．２５～１０重量％、又は０．５～８重量％、又は０．７５～７重量％、又は１～６重量％、又は１．２５～５重量％の量で存在する。

【0075】

各種実施形態では、組成物は、０．１～１重量％、又は０．２～０．８重量％、又は０．２５～０．７５重量％、又は０．５重量％の量のガラクトース、及び０．５～５重量％、又は１～４重量％、又は２～３重量％、又は２．５重量％の量のラフィノースのうちの１つ以上を含む。

【0076】

各種実施形態では、組成物は、約１．７重量％の量のガラクトース及び約１．２５重量％の量のラフィノースのうちの１つ以上を含む。

【0077】

各種実施形態では、組成物は、約０．５重量％の量のガラクトース及び約２．５重量％の量のラフィノースのうちの１つ以上を含む。

【0078】

各種実施形態では、組成物は、２．０重量％、２．１重量％、２．２重量％、２．３重量％、２．４重量％、２．５重量％、２．６重量％、２．７重量％、２．８重量％、２．９重量％、又は３．０重量％の量のラフィノースを含む。

【0079】

各種実施形態では、組成物は、０．１重量％、０．２重量％、０．３重量％、０．４重量％、０．５重量％、０．６重量％、０．７重量％、０．８重量％、０．９重量％、1．０重量％の量のガラクトースを含む。

【0080】

各種実施形態では、組成物は、１．２重量％、１．３重量％、１．４重量％、１．５重量％、１．６重量％、１．７重量％、１．８重量％、１．９重量％、２．０重量％、２．１重量％、又は２．２重量％の量のラフィノースを含む。

【0081】

各種実施形態では、組成物は、０．７重量％、０．８重量％、０．９重量％、１．０重量％、１．１重量％、１．２重量％、１．２５重量％、１．３重量％、１．４重量％、１．５重量％、１．６重量％、又は１．７重量％の量のガラクトースを含む。

【0082】

各種実施形態では、組成物は、担体；結合剤又は滑沢剤を含む錠剤化助剤；及び香味剤のうちの１つ以上を更に含む。

【0083】

各種実施形態では、治療用製剤は、口腔、歯、鼻腔、粘膜、局所、又は肺投与のために製剤化されている。

【0084】

各種実施形態では、治療用製剤は、徐放性組成物である。

【0085】

各種実施形態では、治療用製剤は、粉末、舐剤、鼻腔スプレー、鼻腔ゲル、点鼻薬、経口ドロップ、経口ゲル、経口スプレー、吸入可能な局所用組成物、チュアブル、メルト、フィルム、グミ、練り歯磨き、歯磨きゲル、ワニス、ムース、マウスウォッシュ、食品（例えば、ヨーグルト）、クリーム、ゲル、スプレー、デオドラント、美容液、ローション、バーム、保湿剤、ペッサリー、又は坐剤である。

【0086】

各種実施形態では、治療用製剤は、粉末である。

【0087】

各種実施形態では、治療用製剤は、舐剤である。

【0088】

各種実施形態では、疾患又は障害は、口腔、歯、粘膜、皮膚、又はＥＮＴＲ病原体によって引き起こされる。

【0089】

各種実施形態では、疾患又は障害は、病原性ストレプトコッカス又はスタフィロコッカス細菌によって引き起こされる。

【0090】

各種実施形態では、病原性ストレプトコッカス又はスタフィロコッカス細菌は、Ｓ．アウレウス種、Ｓ．サプロフィチカス種、Ｓ．ミュータンス種、Ｓ．ピオゲネス種、Ｓ．ニューモニエ種から選択される。

【0091】

各種実施形態では、疾患又は障害は、中耳炎、咽喉炎、う蝕、急性咽頭炎、扁桃炎、肺炎、慢性閉塞性肺病（ＣＯＰＤ）、歯根膜炎、歯肉炎、口臭、う蝕、敗血症、髄膜炎、カンジダ症（口腔カンジダ症）、膣炎、体臭、ざ瘡、放線菌症、乾癬、赤痢、蜂巣炎、膿痂疹、アトピー皮膚炎、菌血症、水虫、軟組織感染、紅班、院内感染、紅班、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、及びＲＳＶ、又はそれらの任意の２つ以上の任意の組み合わせから選択される。

【0092】

各種実施形態では、ブリス産生Ｓ．サリバリウスに感受性の微生物は、Ｓ．サリバリウス種、Ｓ．エピデルミディス種、Ｓ．コンステラータス種、及びＬ．ラクティス種から選択される。

【0093】

各種実施形態では、ブリス産生Ｓ．サリバリウスに感受性の微生物は、Ｓ．ピオゲネス種、Ｆ．ヌクレアタム種、及びＰ．ジンジバリス種から選択される。

【0094】

いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒトは、小児である。

【0095】

いくつかの実施形態では、組成物は、化粧品である。

【0096】

いくつかの実施形態では、組成物は、栄養補助食品である。

【0097】

各種実施形態では、組成物は、天然健康製品である。

【0098】

いくつかの実施形態では、組成物は、補完薬である。

【0099】

各種実施形態では、組成物は、舐剤であり、組成物を製造するための方法は、均質なブレンドをプレスして、舐剤を製造する工程を更に含む。

【0100】

各種実施形態では、組成物中のＳ．サリバリウスの阻害プロファイルは、補充糖類を欠く組成物と比較して改善される。

【0101】

各種実施形態では、組成物は、
（ａ）疾患又は障害の処置若しくは予防、又は
（ｂ）ブリス産生Ｓ．サリバリウスに感受性の微生物の阻害、における使用のためのものである。

【0102】

本発明はまた、本出願の明細書で言及又は指示された部分、要素及び特徴で、個別に又は包括的に、当該部分、要素又は特徴の２つ以上の任意の又は全ての組み合わせで構成されると広く言われてもよく、本発明が関連する技術分野で既知の等価物を有する特定の整数が本明細書で言及されている場合、そのような既知の等価物は、個々に記載されている場合と同様に本明細書に組み込まれるとみなされる。

【0103】

本明細書に開示される数の範囲（例えば、１～１０）への言及はまた、その範囲内の全ての有理数（例えば、１、１．１、２、３、３．９、４、５、６、６．５、７、８、９、及び１０）並びにまたその範囲内の有理数の任意の範囲（例えば、２～８、１．５～５．５、及び３．１～４．７）への言及も組み込み、したがって、本明細書に明示的に開示される全ての範囲の全ての部分範囲が、本明細書によって明示的に開示されることが意図される。これらは、具体的に意図されるものの例に過ぎず、列挙された最低値と最高値との間の数値の全ての可能な組み合わせが、同様に本出願において明示的に述べられているとみなされるべきである。

【0104】

本明細書において、特許明細書、他の外部文書、又は他の情報源が参照されている場合、これは概して、本発明の特徴を考察するための文脈を提供する目的のためである。特に明記しない限り、そのような外部文書への言及は、そのような文書又はそのような情報源が、いずれの管轄においても、先行技術であること、又は当該技術分野における共通の全般的知識の一部を形成することを認めるものとして解釈されるべきではない。

【0105】

本発明が関係する当業者には、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲から逸脱することなく、本発明の構成の多くの変更、並びに広く様々な実施形態及び用途が示唆されるであろう。本明細書における開示及び説明は、純粋に例示的なものであり、いかなる意味においても限定することを意図するものではない。

【0106】

本発明は上記のように広く定義されるが、当業者は、本発明がそれに限定されず、本発明が、以下の説明が例を与える実施形態も含むことを理解するであろう。

【図面の簡単な説明】

【0107】

本発明は、添付の図面を参照して説明される。

【0108】

【図1】様々な濃度のガラクトースの存在下で培養された産生生物としてＫ１２を用いて行われた繰延アンタゴニズムアッセイ後のＥＮＴＲ病原体ＺＯＩサイズ（ｍｍ）のサイズの変化を示す。対照条件は（正規化された）０ｍｍに設定され、０からの逸脱はＺＯＩサイズ（ｍｍ）の変化を表す。

【0109】

【図2】様々な濃度のラフィノースの存在下で培養された産生生物としてＫ１２を用いて行われた繰延アンタゴニズムアッセイ後のＥＮＴＲ病原体ＺＯＩサイズ（ｍｍ）のサイズの変化を示す。対照条件は０ｍｍに設定され、０からの逸脱はＺＯＩサイズ（ｍｍ）の変化を表す。

【0110】

【図3】様々な濃度のガラクトースの存在下で培養された産生生物としてＭ１８を用いて行われた繰延アンタゴニズムアッセイ後のＥＮＴＲ病原体ＺＯＩサイズ（ｍｍ）のサイズの変化を示す。対照条件は０ｍｍに設定され、０からの逸脱はＺＯＩサイズ（ｍｍ）の変化を表す。

【0111】

【図4】様々な濃度のラフィノースの存在下で培養された産生生物としてＭ１８を用いて行われた繰延アンタゴニズムアッセイ後のＥＮＴＲ病原体ＺＯＩサイズ（ｍｍ）のサイズの変化を示す。対照条件は０ｍｍに設定され、０からの逸脱はＺＯＩサイズ（ｍｍ）の変化を表す。

【0112】

【図5】皮膚病原体Ｓ．アウレウスＡ２２２に対してラフィノース対糖類（等モル）を使用した、Ｋ１２阻害効果に対する刺激の比較を示す。ラフィノース対（ａ）トリミックス（ラフィノース中に存在する等モル濃度の３つの糖類ガラクトース、グルコース、及びフルクトースの混合物）；（ｂ）個々の糖類；（ｃ）皮膚病原体Ｓ．アウレウスＡ２２２に対してラフィノース対糖類（等モル）を使用した、Ｍ１８阻害効果に対する刺激の比較。ラフィノース対個々の糖類。

【0113】

【図6】歯の病原体Ｓ．ミュータンスＯＭＺ１７５に対してラフィノース対糖類（等モル）を使用した、Ｋ１２阻害効果に対する刺激の比較を示す。ラフィノース対（ａ）トリミックス（等モル濃度の３つの糖類の混合物）；（ｂ）個々の糖類；（ｃ）歯の病原体Ｓ．ミュータンスＯＭＺ１７５に対してラフィノース対糖類（等モル）を使用した、Ｍ１８阻害効果に対する刺激の比較。ラフィノース対個々の糖類。

【0114】

【図7】下気道病原体Ｓ．ニューモニエＤ３９．に対してラフィノース対糖類（等モル）を使用した、Ｋ１２阻害効果に対する刺激の比較を示す。ラフィノース対（ａ）トリミックス（等モル濃度の３つの糖類の混合物）；（ｂ）個々の糖類；（ｃ）下気道病原体Ｓ．ニューモニエＤ３９に対してラフィノース対糖類（等モル）を使用した、Ｍ１８阻害効果に対する刺激の比較。ラフィノース対個々の糖類。

【0115】

【図8】皮膚病原体Ｓ．アウレウスＡ２２２に対してラフィノース対糖類（等重量％）を使用した、Ｋ１２阻害効果に対する刺激の比較を示す。ラフィノース対（ａ）トリミックス（等重量％濃度の３種の糖類の混合物）；（ｂ）個々の糖類；（ｃ）皮膚病原体Ｓ．アウレウスＡ２２２に対してラフィノース対糖類（等重量％）を使用した、Ｍ１８阻害効果に対する刺激の比較。ラフィノース対個々の糖類。

【0116】

【図9】歯の病原体Ｓ．ミュータンスＯＭＺ１７５に対してラフィノース対糖類（等重量％）を使用した、Ｋ１２阻害効果に対する刺激の比較を示す。ラフィノース対（ａ）トリミックス（等重量％濃度の３種の糖類の混合物）；（ｂ）個々の糖類；（ｃ）歯の病原体Ｓ．ミュータンスＯＭＺ１７５に対してラフィノース対糖類（等重量％）を使用した、Ｍ１８阻害効果に対する刺激の比較。ラフィノース対個々の糖類。

【0117】

【図10】ＥＮＴＲ病原体Ｓ．ピオゲネス７１－９６８に対してラフィノース対糖類（等重量％）を使用した、Ｋ１２阻害効果に対する刺激の比較を示す。ラフィノース対（ａ）トリミックス（等重量％濃度の３種の糖類の混合物）；（ｂ）個々の糖類；（ｃ）ＥＮＴＲ病原体Ｓ．ピオゲネス７１－９６８に対してラフィノース対糖類（等重量％）を使用した、Ｍ１８阻害効果に対する刺激の比較。ラフィノース対個々の糖類。

【0118】

【図11】ブリス産生Ｓ．サリバリウスに感受性の微生物Ｓ．コンステラータスＴ２９に対してラフィノース対糖類（等重量％）を使用した、Ｋ１２阻害効果に対する刺激の比較を示す。ラフィノース対（ａ）トリミックス（等重量％濃度の３種の糖類の混合物）；（ｂ）個々の糖類；（ｃ）ブリス産生Ｓ．サリバリウスに感受性の微生物Ｓ．コンステラータスＴ２９に対してラフィノース対糖類（等重量百分率）を使用した、Ｍ１８阻害効果に対する刺激の比較。ラフィノース対個々の糖類。

【0119】

【図12】下気道病原体Ｓ．ニューモニエＤ３９に対してラフィノース対糖類（等重量％）を使用した、Ｋ１２阻害効果に対する刺激の比較を示す。ラフィノース対（ａ）トリミックス（等重量％濃度の３種の糖類の混合物）；（ｂ）個々の糖類；（ｃ）下気道病原体Ｓ．ニューモニエＤ３９に対してラフィノース対糖類（等重量％）を使用した、Ｍ１８阻害効果に対する刺激の比較。ラフィノース対個々の糖類。

【0120】

【図13】ＥＮＴＲ病原体Ｓ．ピオゲネス７１－６９８、歯の病原体Ｓ．ミュータンスＯＭＺ１７５、Ｓ．ニューモニエＤ３９、皮膚病原体Ｓ．サプロフィチカスＡＴＣＣ１５３０５及びＳ．アウレウスＡ２２２、及びブリス産生Ｓ．サリバリウスに感受性の微生物Ｓ．コンステラータスＴ２９に対してラフィノース対糖類（等重量％）を使用した、Ｋ１２阻害効果に対する刺激の比較を示す。ラフィノース対トリミックス（等重量％濃度の３種の糖類の混合物）及び個々の糖類。ラフィノース対（ａ）トリミックス（等重量％濃度の３種の糖類の混合物）；（ｂ）個々の糖類；（ｃ）ブリス産生Ｓ．サリバリウスに感受性の病原体及び微生物の範囲に対してラフィノース対糖類（等重量％）を使用した、Ｍ１８阻害効果に対する刺激の比較。ラフィノース対個々の糖類。

【0121】

【図14】ブリス産生Ｓ．サリバリウスに感受性の微生物；Ｓ．サリバリウス＃６、Ｓ．サリバリウス１９３、Ｓ．サリバリウス２０Ｐ３に対してラフィノース対糖類（等重量％）を使用した、Ｋ１２阻害効果に対する刺激の比較を示す。ラフィノース対トリミックス（等重量％濃度の３種の糖類の混合物）；（ｂ）個々の糖類。

【0122】

【図15】ブリス産生Ｓ．サリバリウスに感受性の微生物；Ｓ．サリバリウス＃６、Ｓ．サリバリウス１９３、Ｓ．サリバリウス２０Ｐ３に対してラフィノース対糖類（等重量％）を使用した、Ｍ１８阻害効果に対する刺激の比較を示す。ラフィノース対トリミックス（等重量％濃度の３種の糖類の混合物）及び個々の糖類。

【0123】

【図16】いくつかの口腔及びＥＮＴＲ病原体Ｓ．ピオゲネス７１～６９８、Ｓ．ピオゲネスＦＦ２２、Ｓ．ピオゲネス７１～６７９、Ｓ．ピオゲネスＷ－１、Ｓ．ピオゲネスＭ１７、Ｓ．ピオゲネスＭ５７、Ｓ．ピオゲネスＥＭＭ９２、Ｓ．ピオゲネスＭ６６、及びＳ．ピオゲネスＭ７４に対してラフィノース対糖類（等重量％）を使用した、Ｋ１２阻害効果に対する刺激の比較を示す。ラフィノース対トリミックス（等重量％濃度の３種の糖類の混合物）及び個々の糖類。

【0124】

【図17】いくつかの口腔及びＥＮＴＲ病原体Ｓ．ピオゲネス７１～６９８、Ｓ．ピオゲネスＦＦ２２、Ｓ．ピオゲネス７１～６７９、Ｓ．ピオゲネスＷ－１、Ｓ．ピオゲネスＭ１７、Ｓ．ピオゲネスＭ５７、Ｓ．ピオゲネスＥＭＭ９２、Ｓ．ピオゲネスＭ６６、及びＳ．ピオゲネスＭ７４に対してラフィノース対糖類（等重量％）を使用した、Ｍ１８阻害効果に対する刺激の比較を示す。ラフィノース対トリミックス（等重量％濃度の３種の糖類の混合物）及び個々の糖類。

【0125】

【図18】いくつかの下気道病原体Ｓ．ディスガラクティアエＢｒｉｓ ２、Ｓ．ディスガラクティアエＴ２７７、Ｓ．ニューモニエＤ３９、Ｓ．ニューモニエＲＸ１、Ｓ．ニューモニエＰＫ８に対してラフィノース対糖類（等重量％）を使用した、Ｋ１２阻害効果に対する刺激の比較を示す。ラフィノース対トリミックス（等重量％濃度の３種の糖類の混合物）及び個々の糖類。

【0126】

【図19】いくつかのＥＮＴＲ／下気道病原体Ｓ．ディスガラクティアエＢｒｉｓ ２、Ｓ．ディスガラクティアエＴ２７７、Ｓ．ニューモニエＤ３９、Ｓ．ニューモニエＲＸ１、Ｓ．ニューモニエＰＫ８に対してラフィノース対糖類（等重量％）を使用した、Ｍ１８阻害効果に対する刺激の比較を示す。ラフィノース対トリミックス（等重量％濃度の３種の糖類の混合物）及び個々の糖類。

【0127】

【図20】いくつかの歯の病原体Ｓ．ミュータンスＯＭＺ１７５、Ｓ．ミュータンスＡＴＣＣ１０４４９、Ｓ．ミュータンスＤ１０、Ｓ．ミュータンスＵＡ１５９、Ｓ．ミュータンスＦＷ７５、Ａ．ビスコサスＴ１４、Ｓ．サングイニスＫ１１、Ｓ．ソブリヌスＯＭＺ１７６に対してラフィノース対糖類（等重量％）を使用した、Ｋ１２阻害効果に対する刺激の比較を示す。ラフィノース対トリミックス（等重量％濃度の３種の糖類の混合物）及び個々の糖類。

【0128】

【図21】いくつかの歯の病原体Ｓ．ミュータンスＯＭＺ１７５、Ｓ．ミュータンスＡＴＣＣ１０４４９、Ｓ．ミュータンスＤ１０、Ｓ．ミュータンスＵＡ１５９、Ｓ．ミュータンスＦＷ７５、Ａ．ビスコサスＴ１４、Ｓ．サングイニスＫ１１、Ｓ．ソブリヌスＯＭＺ１７６に対してラフィノース対糖類（等重量％）を使用した、Ｍ１８阻害効果に対する刺激の比較を示す。ラフィノース対トリミックス（等重量％濃度の３種の糖類の混合物）及び個々の糖類。

【0129】

【図22】いくつかの皮膚病原体Ｓ．コーニー、Ｓ．シムランス、Ｓ．アウレウスＡ２２２、Ｓ．アウレウス２０、Ｓ．アウレウス１９、Ｓ．アウレウス１４．に対してラフィノース対糖類（等重量％）を使用した、Ｋ１２阻害効果に対する刺激の比較を示す。ラフィノース対トリミックス（等重量％濃度の３種の糖類の混合物）及び個々の糖類。

【0130】

【図23】いくつかの皮膚病原体Ｓ．コーニー、Ｓ．シムランス、Ｓ．アウレウスＡ２２２、Ｓ．アウレウス２０、Ｓ．アウレウス１９、Ｓ．アウレウス１４に対してラフィノース対糖類（等重量％）を使用した、Ｍ１８阻害効果に対する刺激の比較を示す。ラフィノース対トリミックス（等重量％濃度の３種の糖類の混合物）及び個々の糖類。

【0131】

【図24】ＥＮＴＲ病原体Ｓ．ピオゲネス７１、Ｓ．ニューモニエＤ３９６９８、歯の病原体Ｓ．ミュータンスＯＭＺ１７５、皮膚病原体Ｓ．サプロフィチカスＡＴＣＣ１５３０５及びＳ．アウレウスＡ２２２、及びブリス産生Ｓ．サリバリウスに感受性の微生物Ｓ．コンステラータスＴ２９に対してラフィノース対糖類（等重量百分率）を使用した、乳製品を含まないＫ１２阻害効果に対する刺激の比較を示す。ラフィノース対トリミックス（等重量％濃度の３種の糖類の混合物）及び個々の糖類。

【0132】

【図25】ＥＮＴＲ病原体Ｓ．ピオゲネス７１～６９８、Ｓ．ニューモニエＤ３９、歯の病原体Ｓ．ＯＭＺ１７５、皮膚病原体Ｓ．サプロフィチカスＡＴＣＣ１５３０５及びＳ．アウレウスＡ２２２、及びブリス産生Ｓ．サリバリウスに感受性の微生物Ｓ．コンステラータスＴ２９に対してラフィノース対糖類（等重量百分率）を使用した、乳製品を含まないＭ１８阻害効果に対する刺激の比較を示す。ラフィノース対トリミックス（等重量％濃度の３種の糖類の混合物）及び個々の糖類。

【0133】

【図26】Ｍ１７ブロス中のＫ１２の増殖の刺激の比較を示す。ラフィノース、ガラクトース、トリミックス（３種の糖類の等重量％濃度の混合物）及び個々の糖類。

【0134】

【図27】口腔及びＥＮＴＲ病原体Ｓ．ピオゲネス７１～６９８、Ｓ．ピオゲネスＦＦ２２、Ｓ．ピオゲネス７１～６７９、Ｓ．ピオゲネスＷ－１、Ｓ．ピオゲネスＭ１７、Ｓ．ピオゲネスＭ５７、Ｓ．ピオゲネスＥＭＭ９２、Ｓ．ピオゲネスＭ６６、及びＳ．ピオゲネスＭ７４に対してラフィノース対糖類（等重量％）を使用した、Ｍ１７ブロス中のＫ１２の増殖の刺激、及び阻害効果の比較を示す。ラフィノース対トリミックス（等重量％濃度の３種の糖類の混合物）及び個々の糖類。

【0135】

【図28】ＥＮＴＲ病原体Ｓ．ピオゲネス７１～６９８、Ｓ．ピオゲネスＭ７４、Ｓ．ピオゲネスＭ６６、Ｓ．ニューモニエＤ３９、歯の病原体Ｓ．ミュータンスＯＭＺ１７５、皮膚病原体Ｓ．サプロフィチカスＡＴＣＣ１５３０５及びＳ．アウレウスＡ２２２、及びブリス産生Ｓ．サリバリウスに感受性の微生物Ｓ．コンステラータスＴ－２９に対してラフィノース対糖類（等重量％）を使用した、Ｍ１７ブロス中のＫ１２の増殖の刺激、及び阻害効果の比較を示す。ラフィノース対トリミックス（３種の糖類の等重量％濃度の混合物）及び個々の糖類グルコース、フルクトース及びガラクトース。

【0136】

【図28A】Ｍ１７ブロス中のＭ１８の増殖の刺激の比較を示す。ラフィノース、ガラクトース、トリミックス（３種の糖類の等重量％濃度の混合物）及び個々の糖類。

【0137】

【図28B】ＥＮＴＲ病原体Ｓ．ピオゲネス７１－６９８、Ｓ．ニューモニエＤ３９、歯の病原体Ｓ．ミュータンスＯＭＺ１７５、皮膚病原体Ｓ．サプロフィチカスＡＴＣＣ１５３０５、及びブリス産生Ｓ．サリバリウスに感受性の微生物Ｓ．コンステラータスＴ－２９に対してラフィノース対糖類（等重量％）を使用した、Ｍ１７ブロス中のＭ１８の増殖の刺激、及び阻害効果の比較を示す。ラフィノース対トリミックス（３種の糖類の等重量％濃度の混合物）及び個々の糖類グルコース、フルクトース及びガラクトース。

【0138】

【図29】ラフィノースを補充したＣＡＢＣａ寒天中で増殖させた場合のＫ１２及びＭ１８ムコイド形態の拡大写真を、ＣＡＢＣａ対照と比較して示す。

【0139】

【図30】ラフィノースを補充したＣＡＢＣａ寒天中で増殖させた場合の、Ｋ１２及びＭ１８（乳製品又は乳製品を含まない）の、ムコイド形態への変化の写真を、ＣＡＢＣａ対照と比較して示す。

【0140】

【図31】細菌増殖を示すＫ１２及びＭ１８産生株ストリーク及びガラススライドの写真を示す。点線の黒い楕円は、トリミックス（等重量％濃度の３つの糖類の混合物）を補充したＣＡＢＣａ及びＣＡＢＣａ対照と比較して、ラフィノースを補充したＣＡＢＣａ寒天中で、より多量の粘液が産生されることを視覚的に示す。

【0141】

【図32】ＥＮＴＲ病原体Ｓ．ピオゲネス７１～６９８、Ｓ．ニューモニエＤ３９、歯の病原体Ｓ．ソブリヌスＯＭＺ１７６、Ｓ．ミュータンスＯＭＺ１７５、皮膚病原体Ｓ．サプロフィチカスＡＴＣＣ１５３０５及びＳ．アウレウスＡ２２２、及びブリス産生Ｓ．サリバリウスに感受性の微生物Ｓ．コンステラータスＴ２９に対しての異なるＳ．サリバリウス株の抗菌活性に対する２．５％ｗ／ｗラフィノースの効果を示す。

【0142】

【図33】ＥＮＴＲ病原体Ｓ．ピオゲネス７１～６９８、Ｓ．ニューモニエＤ３９、歯の病原体Ｓ．ソブリヌスＯＭＺ１７６、Ｓ．ミュータンスＯＭＺ１７５、皮膚病原体Ｓ．サプロフィチカスＡＴＣＣ１５３０５及びＳ．アウレウスＡ２２２、及びブリス産生Ｓ．サリバリウスに感受性の微生物Ｓ．コンステラータスＴ２９に対しての異なるＳ．サリバリウス株の抗菌活性に対する０．５％ｗ／ｗガラクトースの効果を示す。

【0143】

【図34】異なるグラム陰性株Ｆ．ヌクレアタムＡＴＣＣ２５５８６、Ｆ．ヌクレアタムＦＨ２、Ｆ．ヌクレアタムＦＨ３、Ｐ．ジンジバリスＡＴＣＣ３３２７７、Ｐ．ジンジバリスＷ５０、Ｐ．インターメディアＡＴＣＣ２３６１１、口臭に関与する病原体に対してのＳ．サリバリウスＫ１２の抗菌活性に対するラフィノース、ガラクトース、及びそれらの組み合わせの効果を示す。

【0144】

【図35】異なるグラム陰性株Ｆ．ヌクレアタムＡＴＣＣ２５５８６、Ｆ．ヌクレアタムＦＨ２、Ｆ．ヌクレアタムＦＨ３、Ｐ．ジンジバリスＡＴＣＣ３３２７７、Ｐ．ジンジバリスＷ５０、Ｐ．インターメディアＡＴＣＣ２３６１１、口臭に関与する病原体に対してのＳ．サリバリウスＭ１８の抗菌活性に対するラフィノース、ガラクトース、及びそれらの組み合わせの効果を示す。

【0145】

【図36】ＥＮＴＲ病原体Ｓ．ピオゲネス７１～６９８、Ｓ．ニューモニエＤ３９、歯の病原体Ｓ．ソブリヌスＯＭＺ１７５、Ｓ．ミュータンスＯＭＺ１７６、皮膚病原体Ｓ．サプロフィチカスＡＴＣＣ１５３０５及びＳ．アウレウスＡ２２２、及びブリス産生Ｓ．サリバリウスに感受性の微生物Ｓ．コンステラータスＴ２９に対してのＳ．サリバリウスＫ１２凍結乾燥原料の抗菌活性に対するラフィノース、ガラクトース及びそれらの組み合わせの効果を示す。

【0146】

【図37】ＥＮＴＲ病原体Ｓ．ピオゲネス７１～６９８、Ｓ．ニューモニエＤ３９、Ｍ．カタラーリスＴＷ１、歯の病原体Ｓ．ソブリヌスＯＭＺ１７６、Ｓ．ミュータンスＯＭＺ１７５、皮膚病原体Ｓ．サプロフィチカスＡＴＣＣ１５３０５及びＳ．アウレウスＡ２２２、及びブリス産生Ｓ．サリバリウスに感受性の微生物Ｓ．コンステラータスＴ２９に対してのＳ．サリバリウスＭ１８凍結乾燥原料の抗菌活性に対するラフィノース、ガラクトース、及びそれらの組み合わせの効果を示す。

【0147】

【図38】ＥＮＴＲ病原体Ｓ．ピオゲネス７１～６９８、Ｓ．ニューモニエＤ３９、Ｓ．アガラクティエＡＴＣＣ１２３８６、Ｍ．カタラーリスＴＷ１、歯の病原体Ｓ．ソブリヌスＯＭＺ１７６、Ｓ．ミュータンスＯＭＺ１７５、皮膚病原体Ｓ．サプロフィチカスＡＴＣＣ１５３０５及びＳ．アウレウスＡ２２２、及びブリス産生Ｓ．サリバリウスに感受性の微生物Ｓ．コンステラータスＴ２９及びＬ．ラクティスＡＴＣＣ１９４３５に対してのＳ．サリバリウスＫ１２及びＳ．サリバリウスＭ１８凍結乾燥原料の抗菌活性に対するラフィノース、ガラクトース、及びそれらの組み合わせの効果を示す。

【図39】市販の粉末製剤（スプリットプレート法）における病原体Ｓ．ピオゲネス７１～６９８、Ｓ．ピオゲネス７１～６７９、Ｓ．ピオゲネスＨ１３、Ｓ．ピオゲネスＫ２６、Ｓ．ピオゲネスＨ２９、Ｓ．ピオゲネスＷＳ０２、Ｓ．ミュータンスＯＭＺ１７５、Ｓ．ミュータンスＦＷ７５、Ｓ．ソブリヌスＡＴＣＣ２７３５１、Ｓ．サングイニスＫ１１、Ｓ．アガラクティエＡＴＣＣ１２３８６、Ａ．ビスコサスＴ１４、Ａ．ビスコサスＡＴＣＣ１５９８７、Ｓ．コンステラータスＴ２９、Ｓ．ピオゲネスＫ７、Ｓ．ニューモニエＤ３９、Ｓ．ニューモニエＰＫ８、Ｓ．ソブリヌスＯＭＺ１７６、Ｓ．ディスガラクティアエＴ－１４８、Ｓ．ディスガラクティアエＢｒｉｓ ２、Ｓ．ディスガラクティアエＴ２７７、Ｃ．アウリスＡＴＣＣ５１９６６、Ｓ．アウレウス１９に対してのＳ．サリバリウスＫ１２の阻害活性に対する補充糖類の効果を示す。

【0148】

【図40】５つの組成物：０．５％ｗ／ｗガラクトースと組み合わせたＳ．サリバリウスＫ１２含有市販粉末剤形（Ｄａｉｌｙ Ｄｅｆｅｎｓｅ Ｊｕｎｉｏｒ）；２．５％ｗ／ｗラフィノースと組み合わせたＤａｉｌｙ Ｄｅｆｅｎｓｅ Ｊｕｎｉｏｒ；０．５％ｗ／ｗガラクトース及び２．５％ｗ／ｗラフィノースと組み合わせたＤａｉｌｙ Ｄｅｆｅｎｃｅ Ｊｕｎｉｏｒ；Ｓ．サリバリウスＫ１２と組み合わせた市販の乳児用調整乳；Ｓ．サリバリウスＫ１２と組み合わせた全粉乳の抗菌活性の比較を示す。

【0149】

【図41】以下の糖類を固体培地（ＣＡＢＣａ寒天）に添加した、Ｓ．サリバリウスＫ１２中のｓａｌＡの相対的発現を示す。０．５％ｗ／ｗガラクトース；２．５％ｗ／ｗラフィノース；２．５％ｗ／ｗラフィノースと組み合わせた０．５％ｗ／ｗガラクトース；０．５％ｗ／ｗスクロース；２．５％ｗ／ｗスクロース。データ点は、平均（ｎ＝３±ＳＤ）である。データ点は、平均（ｎ＝３±ＳＤ）である。

【0150】

【図42】以下の異なる組み合わせの糖を固体培地（ＣＡＢＣａ寒天）に添加した場合の、Ｓ．サリバリウスＫ１２中のｓａｌＢの相対的発現を示す。０．５％ｗ／ｗガラクトース；２．５％ｗ／ｗラフィノース；２．５％ｗ／ｗラフィノースと組み合わせた０．５％ｗ／ｗガラクトース；０．５％ｗ／ｗスクロース；２．５％ｗ／ｗスクロース。データ点は、平均（ｎ＝３±ＳＤ）である。

【0151】

【図43】以下の異なる組み合わせの補充糖類を固体培地（ＣＡＢＣａ寒天）に添加した場合の、Ｓ．サリバリウスＫ１２中のｓａｌＱの相対的発現を示す。０．５％ｗ／ｗガラクトース；２．５％ｗ／ｗラフィノース；２．５％ｗ／ｗラフィノースと組み合わせた０．５％ｗ／ｗガラクトース；０．５％ｗ／ｗスクロース；２．５％ｗ／ｗスクロース。データ点は、平均（ｎ＝３±ＳＤ）である。

【0152】

【図44】以下の異なる組み合わせの補充糖類を固体培地（ＣＡＢＣａ寒天）に添加した場合の、Ｓ．サリバリウスＫ１２中のウレアーゼ（ｕｒｅＣ）の相対的発現を示す。０．５％ｗ／ｗガラクトース；２．５％ｗ／ｗラフィノース；２．５％ｗ／ｗラフィノースと組み合わせた０．５％ｗ／ｗガラクトース；０．５％ｗ／ｗスクロース；２．５％ｗ／ｗスクロース。データ点は、平均（ｎ＝３±ＳＤ）である。

【0153】

【図45】第１の舐剤を口中に溶解した１時間後、８時間後、及び２４時間後、並びに舐剤を口中に７日間毎日溶解した４８時間後に、補充糖類を含まない（Ｇ１）、ガラクトースを含む（Ｇ２）、ラフィノースを含む（Ｇ３）、並びにラフィノース及びガラクトースを含む（Ｇ４）、Ｓ．サリバリウスＫ１２を含む舐剤を使用する参加者の群から得られた唾液試料中の（総Ｓ．サリバリウスのうちの）Ｓ．サリバリウスＫ１２の平均％を示す。

【発明を実施するための形態】

【0154】

口腔細菌の増殖及び／又は活性を刺激するための糖類、特に単糖類、二糖類、及び三糖類などの消化性糖類の役割は、完全には調査されていない。本発明者らは、口腔プロバイオティクス性能に対するこのような糖類の役割をより良く理解しようとした。

【0155】

グルコースなどの特定の単糖の代謝は、いくつかの細菌において、バクテリオシン遺伝子を含む特定の遺伝子の活性化／転写を抑制するように作用することができる。この効果は、一般的に異化産物抑制として知られている（Ｇｏｒｋｅ ＆ Ｓｔｕｌｋｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００８，６，６１３－６２４を参照）。他の糖が同様の抑制効果を有するかどうかを評価する一方で、本発明者らは、驚くべきことに、増殖培地への特定の他の糖類（ラクトースなど）の補充が反対の効果を有し、ストレプトコッカス・サリバリウスを含むがこれに限定されない細菌種のいくつかの株の阻害範囲を増すことを見出した。

【0156】

定義
以下の定義は、本発明をより良く定義するために、及び本発明の実施における当業者のための指針として提示される。特に指定されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が関係する関連技術分野の当業者に理解されるものと同じ意味を有していると理解されたい。

【0157】

例えば、本明細書で式において使用される全般的な化学的用語及び生物学的用語は、それらの通常の意味を有する。

【0158】

微生物学、分子生物学、及び生化学における一般用語の定義の例は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３^ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃ．Ａ．Ｒｅｄｄｙ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，（２００８）；Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｊｏｓｈｕａ Ｌｅｄｅｒｂｕｒｇ，（ｅｄ．）．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（２０００）；Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｂｙ Ｃｌｉｆｆｓ Ｎｏｔｅｓ，Ｉ．Ｅｄｗａｒｄ Ａｌｃａｍｏ，Ｗｉｌｅｙ，（１９９６）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２ｄ ｅｄ．）（１９９４）；Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ １１ｔｈ ｅｄ．Ｂｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅａｒｓｏｎ Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ，（２００６）；Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｕｎｇｉ：Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ ａｎｄ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（２００４）；Ｇｅｎｅｓ ＩＸ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｊｏｎｅｓ ＆ Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，（２００７）；Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，（１９９４）；及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｒｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５）に見出すことができる。これらの情報源はまた、本発明を実施するために使用され得る標準的な微生物学的、分子生物学、及び生化学のプロトコル及び手順を提供する。

【0159】

本明細書及び特許請求の範囲で使用される「含む（comprising）」という用語は、「少なくとも部分的に～からなる」を意味する。「含む（comprising）」という用語を含む本明細書及び特許請求の範囲における各記述を解釈するとき、それ以外の特徴又はその用語の前にある特徴も存在し得る。「含む（comprise）」、「含まれた（comprised）」及び「含む（comprises）」などの関連用語は、同様に解釈されるべきである。

【0160】

本明細書で使用される場合、「及び／又は」という用語は、「及び」若しくは「又は」、又はその両方を意味する。

【0161】

本明細書で使用される場合、名詞に続く「（ｓ）」は、名詞の複数形及び／又は単数形を意味する。

【0162】

本明細書で使用される「対象」という用語は、ヒト、並びにイヌ、ブタ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ウシ、ニワトリ、魚、並びに他の家畜及び農場動物などの非ヒト動物を含む、動物を指す。

【0163】

本明細書で使用される「処置」という用語は、対象が予防的又は治療的処置を受けていることを指す。予防的処置には、感染の可能性若しくは重症度を予防若しくは低減するため、又は微生物集団を阻害若しくは制御するための処置が含まれる。処置は、対象における微生物集団を阻害又は減少させるためであり得る。処置はまた、感染又はその関連症状の重症度を減少させるために、又は感染若しくはその関連症状を低減若しくは排除するために、感染した対象に提供することができる。処置される対象は、任意の年齢、例えば、乳児、小児、青年期、成人期、又は高齢者であり得る。「患者」、「個体」、又は「宿主」が言及される場合、それは「対象」という用語と同義である。

【0164】

本明細書で使用される場合、「補充糖類」は、細菌種、例えば、Ｓ．サリバリウスの阻害プロファイル及び／又はムコイド特性を改善する糖類である。

【0165】

本明細書で使用される場合、「ストレプトコッカス・サリバリウスの阻害プロファイルを改善する」とは、有効量の補充糖類の非存在下でのＳ．サリバリウスと比較して、阻害の効力を増強すること、及び／又はその阻害活性の範囲を増加させることを意味する。改善は、補充糖類が、他の糖類を含む組成物に添加されても、糖類を含まない組成物に添加されても、観察される。

【0166】

本明細書で使用される場合、「遺伝子（単数又は複数）を上方制御する」という用語は、遺伝子によってコードされた、転写されたＲＮＡの発現レベルを増加させて、ペプチド、バクテリオシン、又はタンパク質を増加させることを意味する。「遺伝子を上方制御する方法」という関連する用語は、遺伝子によってコードされた、転写されたＲＮＡの発現レベルを増加させて、ペプチド、バクテリオシン、又はタンパク質の増加をもたらす方法を意味する。実施形態では、本方法は、上記ペプチド、バクテリオシン、若しくはタンパク質の発現の増加、及び／又は上記ペプチド、バクテリオシン、若しくはタンパク質の産生の増加をもたらす遺伝子によってコードされた、転写されたＲＮＡの発現レベルの増加をもたらす。

【0167】

本明細書で使用される場合、「ムコイド特性の改善」は、Ｓ．サリバリウスの細菌コロニーが、よりムコイド（粘着性粘液様）であり、プロバイオティクスをより基質に付着させることができ、ひいてはコロニー形成の増強を可能にすることを意味する。

【0168】

「ＥＮＴＲ」微生物は、耳、鼻、喉、又は気道の微生物であり、耳（耳に）、鼻（鼻に）、喉、上気道、及び下気道に感染する病原体、並びに耳（耳に）、鼻（鼻に）、喉、上気道、及び下気道にコロニー形成する非病原性微生物を含む。本明細書で使用される「下気道」又は「ＬＲＴ」という用語は、気管、気管支、及び肺を意味する。この用語は、鼻、鼻腔、及び鼻咽頭を意味する「上気道」又は「ＵＲＴ」と対比される。

【0169】

「サリバリシン」は、Ｓ．サリバリウス株によって産生されたバクテリオシン様阻害物質（ＢＬＩＳ）である。したがって、ブリス産生Ｓ．サリバリウスは、サリバリシンを産生するＳ．サリバリウスである。

【0170】

本明細書で使用される「微生物（microbe）」又は「微生物（microorganism）」という用語は、細菌、真菌、ウイルス、又はそれらの組み合わせを指す。同様に、本明細書で使用される「微生物」集団、感染、疾患又は状態という用語は、細菌、ウイルス及び真菌集団、感染、疾患又は状態を含む。微生物は、病原性であっても非病原性（例えば、片利共生的）であってもよい。

【0171】

本明細書で使用される「有効量」という用語は、微生物集団を阻害、低減、若しくは制御するのに、又は患者の中及び／若しくは上での微生物感染に対しての保護、その遅延、低減、安定化、改善、若しくは処置を行うのに有効な量を意味する。有効量はまた、患者に有益な効果を提供するのに十分な量を指す。そのような有益な効果には、検出可能な以下のものが含まれ得る。ＩＦＮ－γの増加、肺におけるＮＦ－κＢ媒介性サイトカイン応答の減少、微生物複製の阻害、及び／又は微生物負荷の減少。この効果は、細菌、真菌若しくはウイルス感染の可能性の医学的に有意な減少、又は微生物感染若しくは関連する症状若しくは二次感染の割合、程度、重症度若しくは長さの医学的若しくは統計学的に有意な減少を提供するのに十分であるべきである。微生物の生存、増殖（growth）、及び／又は増殖（proliferation）の低減が企図される。

【0172】

一実施形態では、本明細書で使用される「統計的に有意な」という用語は、結果又は関係が、偶然以外の何かによって引き起こされる可能性が高いことを指す。結果は、当該技術分野において公知であり使用されている統計的仮説検定を使用して、統計的に有意であることが見出され得る。統計的仮説検定は、当該技術分野で公知の「Ｐ値」を提供し、これは、測定された結果が偶然のみによる確率を表す。５％（０．０５）以下の有意水準が統計的に有意であると考えることは、当該技術分野において概ね受け入れられていると考えられる。

【0173】

「本発明の組成物に感受性の微生物の増殖を阻害する」という語句及び類似の用語は、ＢＬＩＳ産生連鎖球菌株、例えば、Ｓ．サリバリウスに感受性の微生物の少なくとも１つ以上の種の増殖阻害を指す。細菌増殖の阻害は、国際公開第０１／２７１４３号に記載されているようなコロニー形成単位（ＣＦＵ）の標的細菌株の阻害を含む様々な方法によって判定することができる。ウイルス増殖の阻害は、様々な方法によって判定され得るが、ウイルス収量減少アッセイ（ＶＹＲ）、細胞変性効果の観察、又は殺ウイルスアッセイを含み得る。真菌増殖の阻害は、例で記載したように、例えば、繰延アンタゴニズム法（Ｔａｇｇ ａｎｄ Ｂａｎｎｉｓｔｅｒ １９７９；Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １２：３９７を参照されたい）の真菌への適合によって判定することができる。発芽管形成の阻害は、抗真菌活性の別の尺度を提供する（例えば、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ａｎｄ Ｂｒａｕｄｅ（１９５６）Ｃｌｉｎ Ｒｅｓ Ｐｒｏｃ４：４０）。

【0174】

本明細書で使用される「接触させる」という用語は、微生物とブリス組成物との間の直接的接触及び間接的接触の両方を指す。間接的接触は、環境、特に天然環境における微生物のブリス組成物への曝露を含む。

【0175】

本明細書で使用される「組成物」又は「ブリス組成物」は、Ｓ．サリバリウスＫ１２、Ｍ１８、又はそれらの組み合わせを含む組成物若しくは製剤を指すものであり、そのＢＬＩＳ含有自然放出細胞外産物、例えば、サリバリシン又は他の抗菌剤；及び任意選択で担体、希釈剤、又は賦形剤を含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、化粧品、栄養補助食品、天然健康製品、又は補完薬であり得る。栄養補助食品（食品サプリメントとしても知られる）は、通常の食事を補うことが意図される食品であり、ビタミン若しくはミネラル、又は栄養的若しくは生理学的効果を有する他の物質である濃縮栄養素を含有する。天然健康製品は、プロバイオティクス、薬草療法、ビタミン及びミネラル、ホメオパシー薬、伝統的な薬、並びにアミノ酸及び必須脂肪酸を含む。補完薬は、安全性及び品質について評価された薬剤であり、有効性について評価された場合がある。

【0176】

単位「ｃｆｕ／ｇ」は、１グラム当たりのコロニー形成単位を意味する。

【0177】

本明細書で使用される場合、「変異体」という用語は、１つ以上のヌクレオチド又はアミノ酸残基が欠失、置換、又は付加されている、特異的に特定された配列とは異なる遺伝子、ポリヌクレオチド、又はポリペプチド配列を指す。変異体は、天然に存在する対立遺伝子変異体であっても、天然に存在しない変異体であってもよい。変異体は、同じ種由来であっても、他の種由来であってもよく、ホモログ、パラログ、及びオルソログを包含し得る。

【0178】

特定の実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド及びポリペプチドの変異体は、本明細書に開示されるポリヌクレオチド又はポリペプチドの生物学的活性と同じ又は類似の生物学的活性を有する。ポリヌクレオチド及びポリペプチドに関する用語「変異体」は、本明細書で定義されるポリヌクレオチド及びポリペプチドの全ての形態を包含する。

【0179】

発明の方法
第１の態様では、本発明は、Ｓ．サリバリウスの阻害プロファイルを改善する方法であって、有効量の補充糖類を含む組成物中でＳ．サリバリウスを製剤化することを含み、ストレプトコッカス・サリバリウスが、Ｓ．サリバリウスＭ１８、Ｓ．サリバリウスＫ１２、又はそれらの組み合わせであり、補充糖類が、ガラクトース若しくはラフィノース、又はそれらの組み合わせである、方法を提供する。

【0180】

阻害の効力は、阻害された微生物が阻害されている程度である。阻害の効力は、寒天プレート上の対照試料と比較して、阻害領域（ＺＯＩ）のサイズを決定することによって測定され得、これは、Ｔａｇｇ ＪＲ，Ｂａｎｎｉｓｔｅｒ ＬＶ．「Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ」ｂｅｔａ－ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ ｂｙ ｔｈｅｉｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎｅ－ｌｉｋｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９７９ Ｎｏｖ；１２（４）：３９７－４１１に記載されている。より強力な阻害効果は、より大きな阻害領域によって明らかになる。阻害の効力を決定する別の方法は、Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｉｖａｒｉｉｃｉｎ ９ Ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＮＵ１０，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ（２０１３）８（１０）：ｅ７７７５１に記載されているものなどの液体アッセイである。ウイルスの場合、効力は、細胞株実験における試料の毒性濃度対その有効生物活性濃度の比を測定する選択性指数（Selectivity Index、ＳＩ）によって測定することができる。より大きな効力は、対照と比較してより高いＳＩ指数で示される。阻害の効力を決定する他の方法は、当業者にとって明らかである。

【0181】

本明細書で有用なＳ．サリバリウス株は、繰延アンタゴニズムアッセイ（Ｐ型判定－指標株の阻害）によって、又は株がどのサリバリシンを産生するかを決定することによって、少なくとも部分的に特徴付けることができる。これは、Ｔａｇｇ ａｎｄ Ｂａｎｎｉｓｔｅｒ（１９７９）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２：３９７に記載されている。Ｋ１２は、Ｐ型７７７を示し（国際公開第２００１０２７１４３号を参照）、Ｍ１８は、炭酸カルシウムを含む血液寒天上のＰ型６７７、及びトリプチカーゼ大豆酵母抽出物－炭酸カルシウム寒天上のＰ型７７７を示す（国際公開第２００３０７０９１９号を参照）。

【0182】

阻害活性の範囲は、阻害された微生物の数である。各種実施形態では、本発明のＳ．サリバリウスは、有効量の補充糖類の非存在下でＳ．サリバリウスによって阻害されない微生物又は種を阻害する。本出願人は、予想外にも、補充糖類が、Ｓ．サリバリウスの増殖及び阻害活性に影響を及ぼすだけでなく、プロバイオティクスが活性である微生物の範囲を増加させることもできることを見出した。これは、そのようなプロバイオティクスの活性の範囲の変化が報告された最初のものと考えている。上記のように、阻害活性は、寒天プレート上の対照試料と比較して、阻害領域のサイズを決定することによって測定され得る。阻害されていない種は、０の阻害領域又は４．９未満のＳＩ指数を有する。

【0183】

一態様では、本発明はストレプトコッカス．サリバリウス及びＳ・サリバリウスの阻害プロファイルを改善するのに使用するための有効量の補充糖類を含む、組成物であって、Ｓ．サリバリウスが、Ｓ．サリバリウスＭ１８、Ｓ．サリバリウスＫ１２又はそれらの組み合わせであり、補充糖類が、ガラクトース若しくはラフィノース、又はそれらの組み合わせである、組成物を提供する。

【0184】

非病原性細菌を阻害する方法であって、細菌を、Ｓ．サリバリウス及び有効量の補充糖類を含む組成物と接触させることを含み、Ｓ．サリバリウスが、Ｓ．サリバリウスＭ１８、Ｓ．サリバリウスＫ１２、又はそれらの組み合わせであり、補充糖類が、ガラクトース若しくはラフィノース、又はそれらの組み合わせである、方法が本明細書に記載される。各種実施形態では、細菌は、Ｌ．ラクティス、Ｓ．エピデルミディス、及びＳ．コンステラータスから選択される。

【0185】

背景技術で論じたように、単糖は、エネルギー源として摂取されることによって細菌の増殖を促進し、有機酸副産物を産生することが知られており、これは、他の細菌の増殖に対して弱い非選択的阻害効果を有し得る。驚くべきことに、本発明者らは、Ｓ．サリバリウスの改善された阻害プロファイルが、補充糖類のｐＨ効果のみによるものではないことを実証した（実施例４及び６を参照）。理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、改善された阻害プロファイルが、バクテリオシン又は他のコードされた抗菌剤（例えば、非リボソームペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ））の活性の増強によるものであると考える。更に、本発明者らは、ラフィノースが予想外にも細胞の形態に影響を及ぼし、より大きなサイズでよりムコイド（粘着性粘液様）のコロニーをもたらし、プロバイオティクスを基質により接着させることができ、ひいてはコロニー形成の増強を可能にすることを示した（実施例１１参照）。

【0186】

ストレプトコッカス・サリバリウス
Ｓ．サリバリウスは、ヒト口腔に主にコロニー形成するグラム陽性菌であり、優勢な片利共生種である。それらは、プロバイオティクス細菌としての使用について大いに研究されている。２つのＳ．サリバリウス株は、口腔及び歯の健康のために、Ｂｌｉｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄによって商品名ＢＬＩＳ Ｍ１８（商標）及びＢＬＩＳ Ｋ１２（商標）で商品化されている。

【0187】

本発明の方法において使用されるＳ．サリバリウス株の範囲は、当該技術分野において公知である。Ｓ．サリバリウスＫ１２は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ，Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ ｂ，Ｄ－３８１２４，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙに１９９９年１０月８日に寄託され、受託番号ＤＳＭ１３０８４が割り当てられた。Ｓ．サリバリウスＭ１８は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ，Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ ｂ，Ｄ－３８１２４，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙに２００１年１２月１２日に寄託され、受託番号ＤＳＭ１４６８５が割り当てられた。Ｓ．サリバリウスＭ１８は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００３０７０９１９１号に記載されている。

【0188】

バクテリオシンは、産生生物に競合的優位性を与えることができる保存された生物学的ツールとして進化してきた拮抗物質である。バクテリオシンは、密接に関連した種の増殖を阻害するために細菌によって産生されたリボソーム合成抗菌ペプチドである。多様な範囲のバクテリオシンが特定され、４つの主要なクラスに分類されており、これらは更にサブクラスに分けられる。バクテリオシンのクラスは、産生種、作用機序、活性の範囲、及び翻訳後修飾の程度などのパラメータによって決定される。

【0189】

ＢＬＩＳ Ｋ１２（商標）は、クラスＩ及びクラスＩＩに属するバクテリオシン：サリバリシンＡ（配列番号１５及び２３）、サリバリシンＢ（配列番号１６及び２４）、及びサリバリシンＱ（配列番号１７及び２５）（それぞれ、ｓａｌＡ、ｓａｌＢ、及びｓａｌＱ）を産生する。ＢＬＩＳ Ｍ１８（商標）は、クラスＩ及びクラスＩＩに属するバクテリオシン：サリバリシンＡ（配列番号１９及び２７）、サリバリシン９（配列番号２０及び２８）、及びサリバリシンＱ（配列番号２１及び２９）（それぞれ、ｓａｌＡ、ｓａｌ９、及びｓａｌＱ）を産生する。ＳａｌＡ及びＳａｌＢは、グラム陽性Ａ群連鎖球菌（すなわち、ストレプトコッカス・ピオゲネス）に対して高い標的特異性を示す翻訳後修飾ペプチド分子である。ＳａｌＡは、標的膜構造に結合し、構造中に孔を形成して膜の構造的完全性を破壊することによって機能し、最終的に細胞死をもたらす。ＳａｌＢは、標的種の酵素プロセスを阻害することによって機能し、これは細胞死をもたらす重要な細胞プロセスの防止につながる。ｓａｌＱに対して９０％を超える同一性を有するバクテリオシンはまた、「ｂｌｐＵ様カセット」として特徴付けられている（Ｓａｎｔａｇａｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．（Ｓｃｈｏｌ Ｅｄ）２０１８，１０（２），２３８－２４７）。ＢＬＩＳ Ｋ１２（商標）及びＢＬＩＳ Ｍ１８（商標）はまた、クラスＩＩＩバクテリオシンであるサリバリシンＭＰＳの異なるバージョンを産生する。クラスＩＩＩバクテリオシンは、グラム陽性連鎖球菌及び他の細菌種によって発現される保存された構造を標的とする、大きな未修飾の熱不安定性ペプチド分子である。ＢＬＩＳ Ｋ１２（商標）はまた、抗菌ＮＲＰＳを産生する。

【0190】

ウレアーゼタンパク質は、細菌のｐＨホメオスタシスを調節するのに重要であり、細菌が口腔内でウレアーゼタンパク質を産生する場合、ウレアーゼタンパク質は、口及び唾液のｐＨを、より酸性ではなく、より中性のｐＨに調節する効果を有し、これは歯の健康に有益である。ＵｒｅＣは、ｕｒｅＣ遺伝子によってコードされるウレアーゼタンパク質のαサブユニットである。機能的タンパク質はより多くのサブユニットを含むが、タンパク質の発現は、ＢＬＩＳ Ｋ１２（商標）（配列番号１８）及びＢＬＩＳ Ｍ１８（商標）（配列番号２２）のｕｒｅＣ遺伝子に基づいて推測することができる。

【0191】

各種実施形態では、本発明において有用な組成物は、少なくとも０．１重量％のＳ．サリバリウスを含む。

【0192】

各種実施形態では、組成物は、約０．１～約２０重量％のＳ．サリバリウス、例えば、約０．１～約１８重量％、約０．１～約１６重量％、約０．１～約１５重量％、約０．１～約１４重量％、約０．１～約１２重量％、約０．１～約１０重量％、約０．１～約９重量％、約０．１～約８重量％、約０．１～約７重量％、約０．１～約６重量％、約０．１～約５重量％、約０．５～約１８重量％、約０．５～約１６重量％、約０．５～約１５重量％、約０．５～約１４重量％、約０．５～約１２重量％、約０．５～約１０重量％、約０．５～約９重量％、約０．５～約８重量％、約０．５～約７重量％、約０．５～約６重量％、約０．５～約５重量％、約１～約１８重量％、約１～約１６重量％、約１～約１５重量％、約１～約１４重量％、約１～約１２重量％、約１～約１０重量％、約１～約９重量％、約１～約８重量％、約１～約７重量％、約１～約６重量％、又は約１～約５重量％のＳ．サリバリウスを含む。

【0193】

各種実施形態では、組成物は、約１×１０^３～約１×１０^１３ｃｆｕ／ｇのＳ．サリバリウスプロバイオティクス細胞を含む。各種実施形態では、組成物は、約１×１０^４～約１×１０^１２、約１×１０^５～約１×１０^１２、約１×１０^６～約１×１０^１２、約１×１０^７～約１×１０^１２、約１×１０^８～約１×１０^１２、約１×１０^４～約１×１０^１０、約１×１０^５～約１×１０^１０、約１×１０^６～約１×１０^１０、約１×１０^７～約１×１０^１０、約１×１０^８～約１×１０^１０、約１×１０^４～約１×１０^９、約１×１０^５～約１×１０^９、約１×１０^６～約１×１０^９、約１×１０^７～約１×１０^９ｃｆｕ／ｇの量でＳ．サリバリウス細胞を含む。各種実施形態では、産物又は組成物は、約１×１０^９ｃｆｕ／ｇの量でＳ．サリバリウス細胞を含む。

【0194】

各種実施形態では、Ｓ．サリバリウスの複数の株が存在する場合、組成物は、少なくとも０．１重量％のＳ．サリバリウスの各株を含む。

【0195】

各種実施形態では、Ｓ．サリバリウスの複数の株が存在する場合、組成物は、約０．１～約２０重量％のＳ．サリバリウスの各株、例えば、約０．１～約１８重量％、約０．１～約１６重量％、約０．１～約１５重量％、約０．１～約１４重量％、約０．１～約１２重量％、約０．１～約１０重量％、約０．１～約９重量％、約０．１～約８重量％、約０．１～約７重量％、約０．１～約６重量％、約０．１～約５重量％、約０．５～約１８重量％、約０．５～約１６重量％、約０．５～約１５重量％、約０．５～約１４重量％、約０．５～約１２重量％、約０．５～約１０重量％、約０．５～約９重量％、約０．５～約８重量％、約０．５～約７重量％、約０．５～約６重量％、約０．５～約５重量％、約１～約１８重量％、約１～約１６重量％、約１～約１５重量％、約１～約１４重量％、約１～約１２重量％、約１～約１０重量％、約１～約９重量％、約１～約８重量％、約１～約７重量％、約１～約６重量％、又は約１～約５重量％のＳ．サリバリウスの各株を含む。

【0196】

各種実施形態では、Ｓ．サリバリウスの複数の株が存在する場合、組成物は、約１×１０^３～約１×１０^１３ｃｆｕ／ｇのＳ．サリバリウスの各株、例えば、約１×１０^４～約１×１０^１２、約１×１０^５～約１×１０^１２、約１×１０^６～約１×１０^１２、約１×１０^７～約１×１０^１２、約１×１０^８～約１×１０^１２、約１×１０^４～約１×１０^１０、約１×１０^５～約１×１０^１０、約１×１０^６～約１×１０^１０、約１×１０^７～約１×１０^１０、約１×１０^８～約１×１０^１０、約１×１０^４～約１×１０^９、約１×１０^５～約１×１０^９、約１×１０^６～約１×１０^９、約１×１０^７～約１×１０^９ｃｆｕ／ｇのＳ．サリバリウスの各株を含む。

【0197】

補充糖類
試験のために検討された糖類には、単糖類グルコース、フルクトース、及びガラクトース；二糖類スクロース及びラクトース；並びに三糖類ラフィノースを含めた。

【0198】

ラクトースは主に乳糖であり、乳を含まない食事をしている人々又はラクトース不耐症を有する人々にとって好ましい成分ではない。したがって、ラクトースは検討から除外した。

【0199】

上述したように、スクロース及びグルコースは齲蝕原性であり、概して、拮抗的挙動に対して抑制効果を有するとされている（例えば、Ｒｅｉｎｈｏｌｄ＆Ｔｉｔｇｅｍｅｙｅｒ，Ｆｒｉｔｚ．（２００２）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ．２０９．１４１－８；Ｊａｎｋｏｖｉｃ ＆ Ｂｒｕｃｋｎｅｒ，Ｊ Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７；１２（１－２）：１１４－２０を参照）。したがって、これらの糖類も検討から除外した。

【0200】

各種実施形態では、補充糖類は、ガラクトース若しくはラフィノース、又はそれらの組み合わせである。各種実施形態では、補充糖類は、ガラクトースである。各種実施形態では、補充糖類は、ラフィノースである。各種実施形態では、補充糖類は、ガラクトース及びラフィノースの混合物である。

【0201】

Ｄ－ガラクトースは、単糖類の糖である。ラフィノースは、ガラクトース、グルコース、及びフルクトースモノマー単位を含む三糖類である。

【0202】

各種実施形態では、組成物は、２０重量％未満の各補充糖類を含む。各種実施形態では、組成物は、２０重量％未満のガラクトースを含む。各種実施形態では、組成物は、２０重量％未満のラフィノースを含む。各種実施形態では、組成物は、２０重量％未満のガラクトース及びラフィノースの各々を含む。

【0203】

各種実施形態では、組成物は、０．０１～２０重量％の各補充糖類、例えば、約０．０１～約１８重量％、又は約０．０１～約１５重量％、又は約０．０１～約１２重量％、又は約０．０１～約１０重量％、又は約０．０１～約９重量％、又は約０．０１～約８重量％、又は約０．０１～約７重量％、又は約０．０１～約６重量％、又は約０．０１～約５重量％、又は約０．０１～約４重量％、又は約０．１～約２０重量％、又は約０．１～約１８重量％、又は約０．１～約１５重量％、又は約０．１～約１２重量％、又は約０．１～約１０重量％、又は約０．１～約９重量％、又は約０．１～約８重量％、又は約０．１～約７重量％、又は約０．１～約６重量％、又は約０．１～約５重量％、又は約０．１～約４重量％、又は約０．２５～約２０重量％、又は約０．２５～約１８重量％、又は約０．２５～約１５重量％、又は約０．２５～約１２重量％、又は約０．２５～約１０重量％、又は約０．２５～約９重量％、又は約０．２５～約８重量％、又は約０．２５～約７重量％、又は約０．２５～約６重量％、又は約０．２５～約５重量％、又は約０．２５～約４重量％、又は約０．５～約２０重量％、又は約０．５～約１８重量％、又は約０．５～約１５重量％、又は約０．５～約１２重量％、又は約０．５～約１０重量％、又は約０．５～約９重量％、又は約０．５～約８重量％、又は約０．５～約７重量％、又は約０．５～約６重量％、又は約０．５～約５重量％、又は約０．５～約４重量％、又は約１～約２０重量％、又は約１～約１８重量％、又は約１～約１５重量％、又は約１～約１２重量％、又は約１～約１０重量％、又は約１～約９重量％、又は約１～約８重量％、又は約１～約７重量％、又は約１～約６重量％、又は約１～約５重量％、又は約１～約４重量％、又は約１．２５～約２０重量％、又は約１．２５～約１８重量％、又は約１．２５～約１５重量％、又は約１．２５～約１２重量％、又は約１．２５～約１０重量％、又は約１．２５～約９重量％、又は約１．２５～約８重量％、又は約１．２５～約７重量％、又は約１．２５～約６重量％、又は約１．２５～約５重量％、又は約１．２５～約４重量％、又は約２～約２０重量％、又は約２～約１８重量％、又は約２～約１５重量％、又は約２～約１２重量％、又は約２～約１０重量％、又は約２～約９重量％、又は約２～約８重量％、又は約２～約７重量％、又は約２～約６重量％、又は約２～約５重量％、又は約２～約４重量％、又は約２．５～約２０重量％、又は約２．５～約１８重量％、又は約２．５～約１５重量％、又は約２．５～約１２重量％、又は約２．５～約１０重量％、又は約２．５～約９重量％、又は約２．５～約８重量％、又は約２．５～約７重量％、又は約２．５～約６重量％、又は約２．５～約５重量％、又は約２．５～約４重量％の各補充糖類を含む。

【0204】

各種実施形態では、組成物は、０．０１～２０重量％のガラクトース、例えば、約０．０１～約１８重量％、又は約０．０１～約１５重量％、又は約０．０１～約１２重量％、又は約０．０１～約１０重量％、又は約０．０１～約９重量％、又は約０．０１～約８重量％、又は約０．０１～約７重量％、又は約０．０１～約６重量％、又は約０．０１～約５重量％、又は約０．０１～約４重量％、又は約０．１～約２０重量％、又は約０．１～約１８重量％、又は約０．１～約１５重量％、又は約０．１～約１２重量％、又は約０．１～約１０重量％、又は約０．１～約９重量％、又は約０．１～約８重量％、又は約０．１～約７重量％、又は約０．１～約６重量％、又は約０．１～約５重量％、又は約０．１～約４重量％、又は約０．２５～約２０重量％、又は約０．２５～約１８重量％、又は約０．２５～約１５重量％、又は約０．２５～約１２重量％、又は約０．２５～約１０重量％、又は約０．２５～約９重量％、又は約０．２５～約８重量％、又は約０．２５～約７重量％、又は約０．２５～約６重量％、又は約０．２５～約５重量％、又は約０．２５～約４重量％、又は約０．５～約２０重量％、又は約０．５～約１８重量％、又は約０．５～約１５重量％、又は約０．５～約１２重量％、又は約０．５～約１０重量％、又は約０．５～約９重量％、又は約０．５～約８重量％、又は約０．５～約７重量％、又は約０．５～約６重量％、又は約０．５～約５重量％、又は約０．５～約４重量％、又は約１～約２０重量％、又は約１～約１８重量％、又は約１～約１５重量％、又は約１～約１２重量％、又は約１～約１０重量％、又は約１～約９重量％、又は約１～約８重量％、又は約１～約７重量％、又は約１～約６重量％、又は約１～約５重量％、又は約１～約４重量％、又は約１．２５～約２０重量％、又は約１．２５～約１８重量％、又は約１．２５～約１５重量％、又は約１．２５～約１２重量％、又は約１．２５～約１０重量％、又は約１．２５～約９重量％、又は約１．２５～約８重量％、又は約１．２５～約７重量％、又は約１．２５～約６重量％、又は約１．２５～約５重量％、又は約１．２５～約４重量％、又は約２～約２０重量％、又は約２～約１８重量％、又は約２～約１５重量％、又は約２～約１２重量％、又は約２～約１０重量％、又は約２～約９重量％、又は約２～約８重量％、又は約２～約７重量％、又は約２～約６重量％、又は約２～約５重量％、又は約２～約４重量％、又は約２．５～約２０重量％、又は約２．５～約１８重量％、又は約２．５～約１５重量％、又は約２．５～約１２重量％、又は約２．５～約１０重量％、又は約２．５～約９重量％、又は約２．５～約８重量％、又は約２．５～約７重量％、又は約２．５～約６重量％、又は約２．５～約５重量％、又は約２．５～約４重量％のガラクトースを含む。

【0205】

各種実施形態では、組成物は、０．０１～２０重量％のラフィノース、例えば、約０．０１～約１８重量％、又は約０．０１～約１５重量％、又は約０．０１～約１２重量％、又は約０．０１～約１０重量％、又は約０．０１～約９重量％、又は約０．０１～約８重量％、又は約０．０１～約７重量％、又は約０．０１～約６重量％、又は約０．０１～約５重量％、又は約０．０１～約４重量％、又は約０．１～約２０重量％、又は約０．１～約１８重量％、又は約０．１～約１５重量％、又は約０．１～約１２重量％、又は約０．１～約１０重量％、又は約０．１～約９重量％、又は約０．１～約８重量％、又は約０．１～約７重量％、又は約０．１～約６重量％、又は約０．１～約５重量％、又は約０．１～約４重量％、又は約０．２５～約２０重量％、又は約０．２５～約１８重量％、又は約０．２５～約１５重量％、又は約０．２５～約１２重量％、又は約０．２５～約１０重量％、又は約０．２５～約９重量％、又は約０．２５～約８重量％、又は約０．２５～約７重量％、又は約０．２５～約６重量％、又は約０．２５～約５重量％、又は約０．２５～約４重量％、又は約０．５～約２０重量％、又は約０．５～約１８重量％、又は約０．５～約１５重量％、又は約０．５～約１２重量％、又は約０．５～約１０重量％、又は約０．５～約９重量％、又は約０．５～約８重量％、又は約０．５～約７重量％、又は約０．５～約６重量％、又は約０．５～約５重量％、又は約０．５～約４重量％、又は約１～約２０重量％、又は約１～約１８重量％、又は約１～約１５重量％、又は約１～約１２重量％、又は約１～約１０重量％、又は約１～約９重量％、又は約１～約８重量％、又は約１～約７重量％、又は約１～約６重量％、又は約１～約５重量％、又は約１～約４重量％、又は約１．２５～約２０重量％、又は約１．２５～約１８重量％、又は約１．２５～約１５重量％、又は約１．２５～約１２重量％、又は約１．２５～約１０重量％、又は約１．２５～約９重量％、又は約１．２５～約８重量％、又は約１．２５～約７重量％、又は約１．２５～約６重量％、又は約１．２５～約５重量％、又は約１．２５～約４重量％、又は約２～約２０重量％、又は約２～約１８重量％、又は約２～約１５重量％、又は約２～約１２重量％、又は約２～約１０重量％、又は約２～約９重量％、又は約２～約８重量％、又は約２～約７重量％、又は約２～約６重量％、又は約２～約５重量％、又は約２～約４重量％、又は約２．５～約２０重量％、又は約２．５～約１８重量％、又は約２．５～約１５重量％、又は約２．５～約１２重量％、又は約２．５～約１０重量％、又は約２．５～約９重量％、又は約２．５～約８重量％、又は約２．５～約７重量％、又は約２．５～約６重量％、又は約２．５～約５重量％、又は約２．５～約４重量％のラフィノースを含む。

【0206】

各種実施形態では、ガラクトース及びラフィノースの混合物が存在する場合、組成物は、０．０１～２０重量％のガラクトース及びラフィノースの各々、例えば、約０．０１～約１８重量％、又は約０．０１～約１５重量％、又は約０．０１～約１２重量％、又は約０．０１～約１０重量％、又は約０．０１～約９重量％、又は約０．０１～約８重量％、又は約０．０１～約７重量％、又は約０．０１～約６重量％、又は約０．０１～約５重量％、又は約０．０１～約４重量％、又は約０．１～約２０重量％、又は約０．１～約１８重量％、又は約０．１～約１５重量％、又は約０．１～約１２重量％、又は約０．１～約１０重量％、又は約０．１～約９重量％、又は約０．１～約８重量％、又は約０．１～約７重量％、又は約０．１～約６重量％、又は約０．１～約５重量％、又は約０．１～約４重量％、又は約０．２５～約２０重量％、又は約０．２５～約１８重量％、又は約０．２５～約１５重量％、又は約０．２５～約１２重量％、又は約０．２５～約１０重量％、又は約０．２５～約９重量％、又は約０．２５～約８重量％、又は約０．２５～約７重量％、又は約０．２５～約６重量％、又は約０．２５～約５重量％、又は約０．２５～約４重量％、又は約０．５～約２０重量％、又は約０．５～約１８重量％、又は約０．５～約１５重量％、又は約０．５～約１２重量％、又は約０．５～約１０重量％、又は約０．５～約９重量％、又は約０．５～約８重量％、又は約０．５～約７重量％、又は約０．５～約６重量％、又は約０．５～約５重量％、又は約０．５～約４重量％、又は約１～約２０重量％、又は約１～約１８重量％、又は約１～約１５重量％、又は約１～約１２重量％、又は約１～約１０重量％、又は約１～約９重量％、又は約１～約８重量％、又は約１～約７重量％、又は約１～約６重量％、又は約１～約５重量％、又は約１～約４重量％、又は約１．２５～約２０重量％、又は約１．２５～約１８重量％、又は約１．２５～約１５重量％、又は約１．２５～約１２重量％、又は約１．２５～約１０重量％、又は約１．２５～約９重量％、又は約１．２５～約８重量％、又は約１．２５～約７重量％、又は約１．２５～約６重量％、又は約１．２５～約５重量％、又は約１．２５～約４重量％、又は約２～約２０重量％、又は約２～約１８重量％、又は約２～約１５重量％、又は約２～約１２重量％、又は約２～約１０重量％、又は約２～約９重量％、又は約２～約８重量％、又は約２～約７重量％、又は約２～約６重量％、又は約２～約５重量％、又は約２～約４重量％、又は約２．５～約２０重量％、又は約２．５～約１８重量％、又は約２．５～約１５重量％、又は約２．５～約１２重量％、又は約２．５～約１０重量％、又は約２．５～約９重量％、又は約２．５～約８重量％、又は約２．５～約７重量％、又は約２．５～約６重量％、又は約２．５～約５重量％、又は約２．５～約４重量％のガラクトース及びラフィノースの各々を含む。

【0207】

上方制御された遺伝子
一態様では、本発明は、ストレプトコッカス・サリバリウスにおける１つ以上の遺伝子を上方制御するための方法であって、有効量の補充糖類を含む組成物中でＳ．サリバリウスを製剤化することを含み、
ストレプトコッカス・サリバリウスが、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、ストレプトコッカス・サリバリウスＫ１２、又はそれらの組み合わせであり、
補充糖類が、ガラクトース若しくはラフィノース、又はそれらの組み合わせである、方法を提供する。

【0208】

いくつかの実施形態では、上方制御された遺伝子は、クラスＩ若しくはクラスＩＩランチバイオティクスペプチド又はバクテリオシンなどのランチバイオティクスペプチド又はバクテリオシンをコードするポリヌクレオチド配列を含み得る、又はそれからなり得る。例えば、上記のように、ＢＬＩＳ Ｋ１２（商標）は、それぞれｓａｌＡ、ｓａｌＢ、及びｓａｌＱによってコードされるバクテリオシンであるサリバリシンＡ、サリバリシンＢ及びサリバリシンＱを産生する（それぞれ配列番号１５、１６及び１７）。これらのバクテリオシンのペプチド配列は、それぞれ配列番号２３、２４、及び２５に示される。

【0209】

更なる例として、上記のように、ＢＬＩＳ Ｍ１８（商標）は、それぞれｓａｌＡ、ｓａｌ９、及びｓａｌＱによってコードされるバクテリオシンであるサリバリシンＡ、サリバリシン９及びサリバリシンＱを産生する（それぞれ配列番号１９、２０、及び２１）。これらのバクテリオシンのペプチド配列は、それぞれ配列番号２７、２８、及び２９に示される。

【0210】

いくつかの実施形態では、上方制御された遺伝子は、ウレアーゼタンパク質のサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を含み得る、又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、上方制御された遺伝子は、ｕｒｅＣ、例えば、ＢＬＩＳ Ｋ１２（商標）ｕｒｅＣ（配列番号１８）又はＢＬＩＳ Ｍ１８（商標）ｕｒｅＣ（配列番号２２）である。

【0211】

いくつかの実施形態では、上方制御された遺伝子の少なくとも１つは、配列番号１５～２２のいずれか１つに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む若しくはそれからなる、又は上方制御された遺伝子の少なくとも１つは、配列番号２３～３０のいずれか１つに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む若しくはそれからなる。

【0212】

いくつかの実施形態では、上方制御された遺伝子の少なくとも１つは、ｓａｌＡ遺伝子、ｓａｌＢ遺伝子、ｓａｌＱ遺伝子、ｓａｌ９遺伝子、及び／若しくはｕｒｅＣ遺伝子、又はそれらのいずれかの変異体である。

【0213】

これらの遺伝子及びその変異体は、当該技術分野で公知の技術によって容易に特定することができる。例えば、これらの遺伝子は、配列アラインメントツールを用いて、既知のｓａｌＡ、ｓａｌＢ、ｓａｌＱ、ｓａｌ９、若しくはｕｒｅＣ遺伝子に対する、又はｓａｌＡ、ｓａｌＢ、ｓａｌＱ、ｓａｌ９、若しくはｕｒｅＣタンパク質をコードする遺伝子に対する配列類似性によって特定され得る。あるいは、タンパク質をコードする遺伝子は、構造アラインメントを使用して、既知のｓａｌＡ、ｓａｌＢ、ｓａｌＱ、ｓａｌ９、又はｕｒｅＣタンパク質に対する構造類似性によって特定され得る。

【0214】

例えば、これらの遺伝子は、配列データベース（パブリックドメインデータベースとしては、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ、Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ、ＰＩＲなどが挙げられる）を検索するためのパブリックドメイン配列アラインメントアルゴリズム及び配列類似性検索ツールを使用して、当業者に周知のコンピュータベースの方法によって特定され得る。例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９：１－１０及び１１－１６，２００１を参照されたい。類似性検索は、分析される配列（すなわち、クエリ配列）との比較のために、標的配列を読み出しアラインメントする。配列比較アルゴリズムは、アラインメントの各々に全体的スコアを割り当てるためにスコアリングマトリックスを使用する。

【0215】

配列データベースにおいて変異体を特定するのに有用なプログラムの例示的なファミリーは、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ｔＢＬＡＳＴＮ、及びｔＢＬＡＳＴＸを含むＢＬＡＳＴ一式のプログラム（バージョン２．２．５［Ｎｏｖ ２００２］）であり、これらは（ｆｔｐ：Ｉｎｃ．／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）又はＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ３８Ａ，Ｒｏｏｍ ８Ｎ８０５，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ ２０８９４ ＵＳＡから公けに入手可能である。ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、及びＢＬＡＳＴＸを含むアルゴリズムのＢＬＡＳＴファミリーの使用は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７に記載されている。

【0216】

関連配列群の複数の配列アラインメントは、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．（１９９４）ＣＬＵＳＴＡＬＷ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ａｎｄ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ ｃｈｏｉｃｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３－４６８０）ＣＬＵＳＴＡＬ Ｏｍｅｇａ（Ｓｉｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：５３９，ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／）又はＴ－ＣＯＦＦＥＥ（Ｃｅｄｒｉｃ Ｎｏｔｒｅｄａｍｅ，Ｄｅｓｍｏｎｄ Ｇ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｊａａｐ Ｈｅｒｉｎｇａ，Ｔ－Ｃｏｆｆｅｅ：Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｆａｓｔ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００）３０２：２０５－２１７））又はＰＩＬＥＵＰ（これは、漸進的なペアワイズアラインメントを使用する）（Ｆｅｎｇ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．２５，３５１）を用いて実行することができる。

【0217】

モチーフ又はシグネチャー配列を見出すために、パターン認識ソフトウェアアプリケーションが利用可能である。例えば、ＭＥＭＥ（Multiple Em for Motif Elicitation）は、配列のセットにおけるモチーフ及びシグネチャー配列を見出し、ＭＡＳＴ（Motif Alignment and Search Tool）は、これらのモチーフを使用して、クエリ配列における類似又は同じモチーフを特定する。ＭＡＳＴ結果は、適切な統計データ及び見出されたモチーフの視覚的概要とともに一連のアラインメントとして提供される。ＭＥＭＥ及びＭＡＳＴは、カリフォルニア大学サンディエゴ校で開発された。

【0218】

ＰＲＯＳＩＴＥ（Ｂａｉｒｏｃｈ ａｎｄ Ｂｕｃｈｅｒ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，３５８３；Ｈｏｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７，２１５）は、ゲノム又はｃＤＮＡ配列から翻訳された特徴付けられていないタンパク質の機能を特定する方法である。ＰＲＯＳＩＴＥデータベース（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｓｉｔｅ）は、生物学的に重要なパターン及びプロファイルを含み、新しい配列をタンパク質の既知のファミリーに割り当てるために、又はどの既知のドメインが配列中に存在するかを決定するために、適切な計算ツールで使用することができるように設計されている（Ｆａｌｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０，２３５）。Ｐｒｏｓｅａｒｃｈは、所与の配列パターン又はシグネチャーを用いてＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ及びＥＭＢＬデータベースを検索することができるツールである。

【0219】

タンパク質ドメインモデルデータベースの別の例は、Ｐｆａｍである（Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｅｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，２８：４０５－４２０；Ｆｉｎｎら，２０１０，Ｔｈｅ Ｐｆａｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆａｍｉｌｉｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ’，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３８：Ｄ２１１ Ｄ２２２）。「Ｐｆａｍ」は、Ｐｆａｍ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍによって維持され、ｐｆａｍ．ｘｆａｍ．ｏｒｇ／（欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ）を含むいくつかのスポンサー付きワールドワイドウェブサイトで利用可能なタンパク質ドメイン及びタンパク質ファミリーの大きなコレクションを指す。Ｐｆａｍの最新リリースは、Ｐｆａｍ ３５．０（２０２１年１１月）である。Ｐｆａｍドメイン及びファミリーは、複数の配列アラインメント及び隠れマルコフモデル（hidden Markov model；ＨＭＭ）を用いて特定される。Ｐｆａｍ－Ａファミリー又はドメイン割り当ては、タンパク質ファミリーの代表的なメンバーを使用してキュレートされたシードアラインメントによって生成された高品質割り当てであり、シードアラインメントに基づいて隠れマルコフモデルをプロファイルする。（特に明記しない限り、Ｐｆａｍドメイン又はファミリーに対する照会タンパク質のマッチ（一致）は、Ｐｆａｍ－Ａマッチである）。次いで、ファミリーに属する全ての特定された配列を使用して、ファミリーについての完全アラインメントを自動的に生成する（Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ（１９９８）Ｊ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２６，３２０－３２２；Ｂａｔｅｍａｎ（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２６，２６３－２６６；Ｂａｔｅｍａｎ（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２，Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ，Ｄ１３８－Ｄ１４１；Ｆｉｎｎ（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ ３４，Ｄ２４７－２５１；Ｆｉｎｎ（２０１０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ ３８，Ｄ ２１１－２２２）。例えば、上記のウェブサイトを使用してＰｆａｍデータベースにアクセスすることにより、ＨＭＭＥＲ相同性検索ソフトウェア（例えば、ＨＭＭＥＲ２、ＨＭＭＥＲ３、又はより高度なバージョン、ｈｍｍｅｒ．ｏｒｇ）を使用して、タンパク質配列をＨＭＭに対して照会することができる。照会タンパク質をｐｆａｍファミリーにあるものとして（又は特定のＰｆａｍドメインを有するものとして）特定する有意な一致は、ビットスコアがＰｆａｍドメインについての収集閾値以上である一致である。期待値（ｅ値）はまた、照会タンパク質をＰｆａｍに含めるための基準として、又は照会タンパク質が特定のＰｆａｍドメインを有するかどうかを決定するための基準として使用することができ、低いｅ値（１．０よりはるかに小さい、例えば、０．１未満、又は０．０１以下）は、一致が偶然によるものである低い確率を表す。

【0220】

Ｓ．サリバリウス由来の既知の遺伝子のいくつかの具体例を、以下の表に従って本明細書において提供する。

【表1】

【0221】

いくつかの実施形態では、上方制御された遺伝子の少なくとも１つは、配列番号１５～２２のいずれか１つに対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む又はそれからなる。

【0222】

いくつかの実施形態では、上方制御された遺伝子の少なくとも１つは、配列番号２３～３０のいずれか１つに対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む又はそれからなる。

【0223】

いくつかの実施形態では、上方制御された遺伝子の少なくとも１つは、配列番号１５若しくは１９に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む若しくはそれからなる、又は配列番号２３若しくは２７に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする、ｓａｌＡ遺伝子である。

【0224】

いくつかの実施形態は、上方制御された遺伝子の少なくとも１つは、配列番号１６に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む若しくはそれからなる、又は配列番号２４に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする、ｓａｌＢ遺伝子である。

【0225】

いくつかの実施形態では、上方制御された遺伝子の少なくとも１つは、配列番号１７若しくは２１に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む若しくはそれからなる、又は配列番号２５若しくは２９に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする、ｓａｌＱ遺伝子である。

【0226】

いくつかの実施形態では、上方制御された遺伝子の少なくとも１つは、配列番号２０に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む若しくはそれからなる、又は配列番号２８に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする、ｓａｌ９遺伝子である。

【0227】

いくつかの実施形態では、上方制御された遺伝子の少なくとも１つは、配列番号１８若しくは２２に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む若しくはそれからなる、又は配列番号２６若しくは３０に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする、ｕｒｅＣ遺伝子である。

【0228】

ポリヌクレオチド配列同一性の決定
ポリヌクレオチド配列同一性は、以下のようにして決定することができる。対象ポリヌクレオチド配列を、ｂｌ２ｓｅｑのＢＬＡＳＴＮ（ＢＬＡＳＴプログラム一式、バージョン２．２．５［Ｎｏｖ ２００２］）を使用して候補のポリヌクレオチド配列と比較する（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ （１９９９），「Ｂｌａｓｔ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ－ａ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１７４：２４７－２５０）、ＢＬＡＳＴＮはＮＣＢＩ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）から公けに入手可能である。低複雑度部分のフィルタリングがオフにされるべきであることを除いて、ｂｌ２ｓｅｑのデフォルトパラメータが利用される。

【0229】

ポリヌクレオチド配列の同一性は、以下のｕｎｉｘ（登録商標）コマンドラインパラメータを用いて調べることができる。

【0230】

ｂｌ２ｓｅｑ－ｉ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑ１－ｊ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑ２－Ｆ Ｆ－ｐ ｂｌａｓｔｎ

【0231】

パラメータ－ＦＦは、低複雑度セクションのフィルタリングをオフにする。パラメータ－ｐは、配列の対に対する適切なアルゴリズムを選択する。ｂｌ２ｓｅｑプログラムは、行「Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ＝」において同一ヌクレオチドの数及び％の両方として配列同一性を報告する。

【0232】

ポリヌクレオチド配列同一性はまた、グローバル配列アラインメントプログラムを用いて候補ポリヌクレオチド配列と対象ポリヌクレオチド配列との重複の全長にわたって計算され得る（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．及びＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３－４５３）。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズムの完全な実装は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ中のニードルプログラム（Ｒｉｃｅ，Ｐ．Ｌｏｎｇｄｅｎ，Ｉ．及びＢｌｅａｓｂｙ，Ａ．ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｊｕｎｅ ２０００，ｖｏｌ １６，Ｎｏ ６，ｐｐ．２７６－２７７）に見出すことができ、ＥＭＢＯＳＳパッケージは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＥＭＢＯＳＳ／から入手可能である。欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）サーバーはまた、ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎ／においてオンラインで２つの配列間のＥＭＢＯＳＳ－ニードルグローバルアラインメントを実施する機能を提供する。

【0233】

あるいは、末端ギャップにペナルティを課すことなく２つの配列の最適なグローバルアラインメントを計算するＧＡＰプログラムが使用され得る。ＧＡＰは、以下の論文：Ｈｕａｎｇ，Ｘ．（１９９４）Ｏｎ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ １０，２２７－２３５に記載されている。

【0234】

ポリヌクレオチド配列同一性％を計算するための別の方法は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ（Ｊｅａｎｍｏｕｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２３，４０３－５）を使用して比較される配列をアラインメントすることに基づく。

【0235】

本明細書に開示される変異体ポリヌクレオチド又は遺伝子はまた、本明細書に開示される配列とは異なるが、遺伝子コードの縮重の結果として、本明細書に開示されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと同様の活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド又は遺伝子を包含する。ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない配列改変は、「サイレント変異」である。

【0236】

本明細書に開示される変異体ポリヌクレオチド又は遺伝子は、その生物学的活性を有意に改変することなく、コードされたポリペプチド配列中の１つ又はいくつかのアミノ酸の保存的置換を生じる配列改変を含み得る。

【0237】

コードされたポリペプチド配列におけるサイレント変異及び保存的置換による変異体ポリヌクレオチドは、前述のようにｔｂｌａｓｔｘアルゴリズムを介して、ＮＣＢＩ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）のＢＬＡＳＴプログラム一式（バージョン２．２．５［Ｎｏｖ ２００２］）から公けに入手可能なｂｌ２ｓｅｑプログラムを使用して決定され得る。

【0238】

ポリペプチド配列同一性の決定
ポリペプチド配列同一性は、以下のようにして決定することができる。対象ポリペプチド配列は、ＮＣＢＩ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）から公けに入手可能である、ｂｌ２ｓｅｑのＢＬＡＳＴＰ（ＢＬＡＳＴプログラム一式、バージョン２．２．５［Ｎｏｖ ２００２］から）を用いて候補ポリペプチド配列と比較される。低複雑度領域のフィルタリングがオフにされるべきであることを除いて、ｂｌ２ｓｅｑのデフォルトパラメータが利用される。

【0239】

ポリペプチド配列同一性はまた、グローバル配列アラインメントプログラムを使用して、候補ポリペプチド配列と対象ポリペプチド配列との間の重複の全長にわたって計算され得る。ＥＭＢＯＳＳ－ニードル（ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎ／）及びＧＡＰ（Ｈｕａｎｇ，Ｘ．（１９９４）Ｏｎ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔで入手可能。Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ １０，２２７－２３５．）もまた上述したように、ポリペプチド配列同一性を計算するための好適なグローバル配列アラインメントプログラムである。

【0240】

ポリペプチド配列同一性％を計算するための別の方法は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘを使用して比較される配列をアラインメントすることに基づく（Ｊｅａｎｍｏｕｇｉｎ ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２３，４０３－５）。

【0241】

本明細書に開示されるポリペプチド変異体はまた、特異的に特定された配列の１つ以上に対して類似性を示す変異体を包含し、この類似性は、偶然によって生じたと合理的に予想することができなかった配列の機能的等価性を保存する可能性が高い。ポリペプチドに関するそのような配列類似性は、ＮＣＢＩからのＢＬＡＳＴプログラム一式（バージョン２．２．５［Ｎｏｖ ２００２］）からの公けに入手可能なｂｌ２ｓｅｑプログラムを使用して決定することができる（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）。ポリペプチド配列の類似性は、以下のｕｎｉｘ（登録商標）コマンドラインパラメータを用いて調べることができる。

【0242】

ｂｌ２ｓｅｑ－ｉ ｐｅｐｔｉｄｅｓｅｑ１－ｊ ｐｅｐｔｉｄｅｓｅｑ２－Ｆ Ｆ－ｐ ｂｌａｓｔｐ

【0243】

パラメータ－ＦＦは、低複雑度セクションのフィルタリングをオフにする。パラメータ－ｐは、配列の対に対する適切なアルゴリズムを選択する。このプログラムは、配列間の類似性の領域を見出し、そしてこのような各領域について、ランダム配列を含む固定された参照サイズのデータベースにおいて偶然にこのような一致を見ることが予想され得る期待数である「Ｅ値」を報告する。１よりもはるかに小さい小さなＥ値に対しては、これはほぼそのようなランダムマッチの確率である。

【0244】

変異体ポリペプチド配列は、好ましくは、特異的に特定された配列のいずれか１つと比較した場合、１×１０^－１０未満、より好ましくは１×１０^－２０未満、より好ましくは１×１０^－３０未満、より好ましくは１×１０^－４０未満、より好ましくは１×１０^－５０未満、より好ましくは１×１０^－６０未満、より好ましくは１×１０^－７０未満、より好ましくは１×１０^－８０未満、より好ましくは１×１０^－９０未満、最も好ましくは１×１０^－１００未満のＥ値を示す。

【0245】

変異体ポリペプチド配列は、その生物学的活性を有意に改変することなく、記載されるポリペプチド配列の１つ又はいくつかのアミノ酸の保存的置換を含み得る。

【0246】

同一性は、少なくとも２０アミノ酸位置、好ましくは少なくとも５０アミノ酸位置、より好ましくは少なくとも１００アミノ酸位置、より好ましくは少なくとも１００アミノ酸位置の比較ウインドウにわたって、最も好ましくは全長にわたって見出される。

【0247】

阻害された細菌
各種実施形態では、本方法は、病原性及び他の非病原性微生物を含む、皮膚、口腔、歯、粘膜（例えば、口腔、直腸、膣）及び／又はＥＮＴＲ微生物に対するＳ．サリバリウスの阻害プロファイルを向上させる。

【0248】

微生物は、非病原性であり得る。対象は、概して有害ではない、又は対象にとって有益であり得る既存のミクロフローラを有する。このような非病原性ミクロフローラ細菌の例としては、Ｓ．サリバリウス種、例えば、Ｓ．エピデルミディス種、Ｌ．ラクティス種、Ｓ．コンステラータス種が挙げられる。

【0249】

いくつかの実施形態では、そのような非病原性微生物の集団を阻害又は減少させることが有用であり得る。例えば、Ｋ１２又はＭ１８のようなブリス産生Ｓ．サリバリウスとのコロニー形成を促進すること。

【0250】

各種実施形態では、皮膚、口腔、歯、粘膜、及び／又はＥＮＴ微生物は、Ｓ．アウレウス種、Ｓ．インターメディウス種、Ｓ．サプロフィチカス種、Ｍ．カタラーリス種、Ｈ．インフルエンザ種、Ｓ．ピオゲネス種、Ｐ．エルギノーザ種、Ｓ．ミュータンス種、Ｓ．ニューモニエ種、Ｃ．アクネス種、Ｃ．アルビカンス種、Ｓ．ソブリヌス種、コリネバクテリウム種、Ｆ．ヌクレアタム種、Ａ．アクチノミセテムコミタンス種、Ｐ．ジンジバリス種、タネレラ・フォーサイシア種、トレポネーマ・デンティコラ種、Ｐ．インターメディア種、プレボテラ種、Ａ．ビスコサス種、Ｓ．エキシミリス種、Ｓ．ディスガラクティエ種、Ｓ．サングイ二ス種、Ｓ．コーニー種、Ｂ．インターメディウス種、Ａ．パルブラム種、Ｅ．サブレウム種、Ｅ．スルシ種、Ｐ．ミクラ種、Ｓ．ムーレイ種、Ｓ．アガラクティエ種、Ｃ．ミヌティスシムス種、Ｐ．プロピオニカス種、Ｓ．アガラクティエ種、Ｓ．ディスガラクティアエ種、Ｓ．シムランス種、キシローサス種、足部白癬感染を引き起こす真菌、Ｋ１２又はＭ１８以外のＳ．サリバリウス種、Ｌ．ラクティス種、Ｓ．エピデルミディス種、Ｓ．コンステラータス種、又はそれらの任意の２つ以上の任意の組み合わせから選択される。

【0251】

各種実施形態では、口腔及び／又は歯の微生物は、Ｓ．インターメディウス種、Ｍ．カタラーリス種、Ｈ．インフルエンザ種、Ｓ．ピオゲネス種、Ｓ．ミュータンス種、Ｓ．ニューモニエ種、Ｆ．ヌクレアタム種、Ａ．アクチノミセテムコミタンス種、Ｐ．インターメディア種、プレボテラ種、Ａ．ビスコサス種、Ｓ．ソブリヌス種、Ｂ．インターメディア種、Ａ．パルブラム種、Ｅ．サブレウム種、Ｅ．スルシ種、Ｐ．ミクラ種、Ｓ．ムーレイ種、Ｓ．アガラクティエ種、又はそれらの任意の２つ以上の任意の組み合わせから選択される。

【0252】

各種実施形態では、皮膚微生物は、Ｓ．アウレウス種、Ｓ．サプロフィチカス種、Ｓ．ピオゲネス種、Ｃ．アクネス種、Ｃ．アルビカンス種、Ｓ．コーニー種、Ｃ．ミヌティスシムス種、Ｐ．プロピオニカス種、Ｓ．アガラクティエ種、Ｓ．ディスガラクティアエ種、Ｓ．シムランス種、キシローサス種、足部白癬感染を引き起こす真菌、Ｓ．エピデルミディス種、又はそれらの任意の２つ以上の任意の組み合わせから選択される。

【0253】

各種実施形態では、皮膚、口腔、歯、粘膜、及び／又はＥＮＴＲ微生物は、Ｓ．アウレウス種、Ｓ．サプロフィチカス種、Ｍ．カタラーリス種、Ｈ．インフルエンザ種、Ｓ．ピオゲネス種、Ｐ．エルギノーザ種、Ｓ．ミュータンス種、Ｓ．ニューモニエ種、Ｋ１２又はＭ１８以外のＳ．サリバリウス種、Ｌ．ラクティス種、Ｓ．エピデルミディス種、Ｓ．コンステラータス種、又はそれらの任意の２つ以上の組み合わせから選択される。

【0254】

各種実施形態では、皮膚、口腔、歯、粘膜、及び／又はＥＮＴＲ微生物は、Ｓ．アウレウスＡ２２２、Ｓ．アウレウス２０、Ｓ．アウレウス１４、Ｓ．アウレウス１９、Ｓ．アウレウスＡ５０４、Ｓ．アウレウスＡＴＣＣ６５３８、Ｓ．サプロフィチカスＡＴＣＣ１５３０５、Ｍ．カタラーリスＴＷ１、Ｍ．カタラーリスＴＷ２、Ｈ．インフルエンザＴＷ５、Ｓ．ピオゲネスＭ７６、Ｓ．ピオゲネス７１～６９８、Ｓ．ピオゲネスＦＦ２２、Ｓ．ピオゲネス７１～６７９、Ｓ．ピオゲネスＷ－１、Ｓ．ピオゲネスＭ１７、Ｓ．ピオゲネスＭ５７、Ｓ．ピオゲネスＥＭＭ９２、Ｓ．ピオゲネスＭ６６、Ｓ．ピオゲネスＭ７４、Ｐ．エルギノーザＩ２、Ｐ．エルギノーザＡＴＣＣ２７８５３、Ｓ．ミュータンスＯＭＺ１７５、Ｓ．ミュータンスＦＷ７５、Ｓ．ニューモニエＤ３９、Ｓ．ニューモニエＲＸ１、Ｓ．ニューモニエＰＫ８、Ｓ．エキシミリスＢｒｉｓ ２、Ｓ．ディスガラクティエＴ２７７、Ｃ．アクネスＡＴＣ６９１９、Ｓ．サングイニスＫ１１、Ｓ．ソブリヌスＯＭＺ１７６、Ｓ．コーニー、Ｓ．シムランス、Ｌ．ラクティスＴ－２１、Ｓ．エピデルミディス１１、Ｓ．エピデルミディスＥ３０、Ｓ．コンステラータスＴ２９、Ｓ．サリバリウス６、Ｓ．サリバリウス１９３、Ｓ．サリバリウス２０Ｐ３、又はそれらの任意の２つ以上の任意の組み合わせから選択される。

【0255】

各種実施形態では、皮膚、口腔、歯、粘膜、及び／又はＥＮＴＲ微生物は、Ｓ．アウレウスＡ２２２、Ｓ．アウレウス２０、Ｓ．アウレウス１４、Ｓ．アウレウス１９、Ｓ．アウレウスＡ５０４、Ｓ．サプロフィチカスＡＴＣＣ１５３０５、Ｍ．カタラーリスＴＷ１、Ｍ．カタラーリスＴＷ２、Ｈ．インフルエンザＴＷ５、Ｓ．ピオゲネスＭ７６、Ｓ．ピオゲネス７１～６９８、Ｓ．ピオゲネスＦＦ２２、Ｓ．ピオゲネス７１～６７９、Ｓ．ピオゲネスＷ－１、Ｓ．ピオゲネスＭ１７、Ｓ．ピオゲネスＭ５７、Ｓ．ピオゲネスＥＭＭ９２、Ｓ．ピオゲネスＭ６６、Ｓ．ピオゲネスＭ７４、Ｐ．エルギノーザＩ２、Ｓ．ミュータンスＯＭＺ１７５、Ｓ．ニューモニエＤ３９、Ｌ．ラクティスＴ－２１、Ｓ．エピデルミディス１１、Ｓ．コンステラータスＴ－２９、Ｓ．サリバリウス６、Ｓ．サリバリウス１９３、Ｓ．サリバリウス２０Ｐ３、又はそれらの任意の２つ以上の任意の組み合わせから選択される。

【0256】

抗ウイルス活性、特に抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２（Ｃｏｖｉｄ－１９）活性を有するＳ．サリバリウス株は、国際出願番号ＰＣＴ／ＮＺ第２０２１／０５００５４号（Ｂｌｉｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ）に記載されている。呼吸器ウイルスを処置するための予防及び治療用組成物及び方法も記載される。データは、Ｓ．サリバリウスＫ１２、Ｍ１８が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、及び呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対して様々な抗ウイルス活性を有することを示す。したがって、本明細書において阻害される微生物としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、及び呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）などの呼吸器ウイルスも挙げられる。

【0257】

各種実施形態では、皮膚、口腔、歯、粘膜、及び／又はＥＮＴ微生物は、ストレプトコッカス又はスタフィロコッカス細菌である。各種実施形態では、ストレプトコッカス又はスタフィロコッカス細菌は、Ｓ．アウレウス種、Ｓ．サプロフィチカス種、Ｓ．ミュータンス種、Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．ニューモニエ種、Ｓ．コンステラータス種、及びＳ．サリバリウス種から選択される。各種実施形態では、スタフィロコッカス細菌は、Ｓ．アウレウスＡ２２２、Ｓ．サプロフィチカスＡＴＣＣ１５３０５から選択され、ストレプトコッカス細菌は、Ｓ．ミュータンスＯＭＺ１７５、Ｓ．ピオゲネス７１～６９８、Ｓ．ピオゲネスＦＦ２２、Ｓ．ピオゲネス７１～６７９、Ｓ．ピオゲネスＷ－１、Ｓ．ピオゲネスＭ１７、Ｓ．ピオゲネスＭ５７、Ｓ．ピオゲネスＥＭＭ９２、Ｓ．ピオゲネスＭ６６、Ｓ．ピオゲネスＭ７４、Ｓ．ニューモニエＤ３９、Ｓ．サリバリウス種、例えば、Ｓ．サリバリウス６、Ｓ．サリバリウス１９３、Ｓ．サリバリウス２０Ｐ３、及びＳ．コンステラータスＴ－２９から選択される。

【0258】

各種実施形態では、ストレプトコッカス又はスタフィロコッカス細菌は、Ｓ．アウレウス種、Ｓ．サプロフィチカス種、Ｓ．ミュータンス種、Ｓ．サリバリウス種、Ｓ．コンステラータス種、Ｓ．ピオゲネス種、及びＳ．ニューモニエ種、Ｓ．エクイシミリス種、Ｓ．ディスガラクティアエ種から選択され、Ｓ．サリバリウスは、Ｋ１２である。各種実施形態では、スタフィロコッカス細菌は、Ｓ．アウレウスＡ２２２及びＳ．サプロフィチカスＡＴＣＣ１５３０５から選択され、ストレプトコッカス細菌は、Ｓ．ミュータンスＯＭＺ１７５、Ｓ．ピオゲネス７１～６９８、Ｓ．ピオゲネスＦＦ２２、Ｓ．ピオゲネス７１～６７９、Ｓ．ピオゲネスＷ－１、Ｓ．ピオゲネスＭ１７、Ｓ．ピオゲネスＭ５７、Ｓ．ピオゲネスＥＭＭ９２、Ｓ．ピオゲネスＭ６６、Ｓ．ピオゲネスＭ７４、Ｓ．ニューモニエＤ３９、Ｓ．エクイシミリスＢｒｉｓ ２、Ｓ．ディスガラクティアエＴ２７７、Ｓ．サリバリウス種、例えば、Ｓ．サリバリウス６、Ｓ．サリバリウス１９３、Ｓ．サリバリウス２０Ｐ３、及びＳ．コンステラータスＴ－２９から選択され、Ｓ．サリバリウス株は、Ｋ１２である。

【0259】

各種実施形態では、皮膚、口腔、歯、粘膜、及び／又はＥＮＴＲ微生物は、Ｓ．アウレウス種、Ｓ．サプロフィチカス種、Ｌ．ラクティス種、Ｓ．エピデルミディス種、Ｓ．サリバリウス種、Ｍ．カタラーリス種、Ｓ．ミュータンス種、Ｈ．インフルエンザ種、Ｓ．ニューモニエ種、Ｓ．ピオゲネス種、Ｌ．ラクティスＴ－２１、Ｓ．エピデルミディス１１、Ｓ．エピデルミディスＥ３０、及びＳ．コンステラータスＴ－２９から選択され、Ｓ．サリバリウス株は、Ｋ１２であり、補充糖類は、ガラクトースである。

【0260】

各種実施形態では、皮膚、口腔、歯、粘膜、及び／又はＥＮＴＲ微生物は、Ｓ．アウレウスＡ２２２、Ｓ．アウレウス２０、Ｓ．アウレウス１４、Ｓ．アウレウス１９、Ｓ．アウレウスＡ５０４、Ｓ．サプロフィチカスＡＴＣＣ１５３０５、Ｌ．ラクティスＴ－２１、Ｓ．エピデルミディス１１、Ｍ．カタラーリスＴＷ１、Ｍ．カタラーリスＴＷ２、Ｓ．ミュータンスＯＭＺ１７５、Ｈ．インフルエンザ、Ｓ．ニューモニエＤ３９、Ｓ．ピオゲネス７１～６９８、Ｓ．ピオゲネス７１～６９８、Ｓ．ピオゲネスＦＦ２２、Ｓ．ピオゲネス７１～６７９、Ｓ．ピオゲネスＷ－１、Ｓ．ピオゲネスＭ１７、Ｓ．ピオゲネスＭ５７、Ｓ．ピオゲネスＥＭＭ９２、Ｓ．ピオゲネスＭ６６、Ｓ．ピオゲネスＭ７４、Ｌ．ラクティスＴ－２１、Ｓ．エピデルミディス１１、Ｓ．エピデルミディスＥ３０、Ｓ．コンステラータスＴ－２９から選択され、Ｓ．サリバリウス株は、Ｋ１２であり、補充糖類は、ガラクトースである。

【0261】

各種実施形態では、皮膚、口腔、歯、粘膜、及び／又はＥＮＴＲ微生物は、Ｓ．アウレウス種、Ｓ．サプロフィチカス種、Ｌ．ラクティス種、Ｓ．エピデルミディス種から選択され、Ｓ．サリバリウス株は、Ｋ１２であり、補充糖類は、ラフィノースである。

【0262】

各種実施形態では、皮膚、口腔、歯、粘膜及び／又はＥＮＴＲ微生物は、Ｓ．アウレウスＡ２２２、Ｓ．アウレウス２０、Ｓ．アウレウス１４、Ｓ．アウレウス１９、Ｓ．アウレウスＡ５０４、Ｓ．サプロフィチカスＡＴＣＣ１５３０５、Ｓ．ピオゲネス７１～６９８、Ｓ．ピオゲネスＦＦ２２、Ｓ．ピオゲネス７１～６７９、Ｓ．ピオゲネスＷ－１、Ｓ．ピオゲネスＭ１７、Ｓ．ピオゲネスＭ５７、Ｓ．ピオゲネスＥＭＭ９２、Ｓ．ピオゲネスＭ６６、Ｓ．ピオゲネスＭ７４、Ｌ．ラクティスＴ－２１、Ｓ．エピデルミディス１１、Ｓ．サリバリウス６、Ｓ．サリバリウス１９３、及びＳ．サリバリウス２０Ｐ３から選択され、Ｓ．サリバリウス株は、Ｋ１２であり、補充糖類は、ラフィノースである。

【0263】

各種実施形態では、皮膚、口腔、歯、粘膜、及び／又はＥＮＴＲ微生物は、Ｓ．コンステラータス種、Ｓ．ピオゲネス種、Ｓ．ニューモニエ種、Ｓ．サリバリウス種、Ｓ．ミュータンス種、Ｓ．サプロフィチカス種、Ｓ．アウレウス種、Ｍ．カタラーリス種、Ｌ．ラクティス種、Ｈ．インフルエンザ種、Ｐ．エルギノーザ種から選択され、Ｓ．サリバリウス株は、Ｍ１８であり、補充糖類は、ラフィノースである。

【0264】

各種実施形態では、皮膚、口腔、歯、粘膜、及び／又はＥＮＴＲ微生物は、Ｓ．ピオゲネスＭ７６、Ｓ．ニューモニエＤ３９、Ｓ．ミュータンスＯＭＺ１７５、Ｓ．サプロフィチカスＡＴＣＣ１５３０５、Ｓ．アウレウスＡ２２２、Ｍ．カタラーリスＴＷ１、Ｍ．カタラーリスＴＷ２、Ｌ．ラクティスＴ－２１、Ｈ．インフルエンザＴＷ５、Ｐ．エルギノーザＩ２、Ｓ．ピオゲネス７１～６９８、Ｓ．ピオゲネスＦＦ２２、Ｓ．ピオゲネス７１～６７９、Ｓ．ピオゲネスＷ－１、Ｓ．ピオゲネスＭ５７、Ｓ．ピオゲネスＥＭＭ９２、Ｓ．ピオゲネスＭ６６、Ｓ．ピオゲネスＭ７４、Ｓ．コンステラータスＴ－２９、Ｓ．サリバリウス６、Ｓ．サリバリウス１９３、及びＳ．サリバリウス２０Ｐ３から選択され、Ｓ．サリバリウス株は、Ｍ１８であり、補充糖類は、ラフィノースである。

【0265】

各種実施形態では、細菌は、Ｓ．ピオゲネス種及びＳ．ニューモニエ種から選択され、Ｓ．サリバリウス株は、Ｍ１８である。各種実施形態では、細菌は、Ｓ．ピオゲネス７１－６９８及びＳ．ニューモニエＤ３９から選択され、Ｓ．サリバリウス株は、Ｍ１８である。

【0266】

各種実施形態では、微生物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、及びＲＳＶから選択されるウイルスである。

【0267】

疾患の予防若しくは処置又は微生物の阻害
一態様では、本発明は、疾患又は障害を処置又は予防する方法であって、それを必要とする対象に、Ｓ．サリバリウス及び有効量の補充糖類を含む、組成物を投与することを含み、Ｓ．サリバリウスが、Ｓ．サリバリウスＭ１８、Ｓ．サリバリウスＫ１２、又はそれらの組み合わせであり、補充糖類が、ガラクトース若しくはラフィノース、又はそれらの組み合わせである、方法を提供する。

【0268】

一態様では、本発明は、疾患又は障害の処置又は予防のための医薬の製造における、Ｓ．サリバリウス及び補充糖類の使用であって、Ｓ．サリバリウスが、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、Ｓ．サリバリウスＫ１２、又はそれらの組み合わせであり、補充糖類が、ガラクトース若しくはラフィノース、又はそれらの組み合わせである、使用に関する。

【0269】

一態様では、本発明は、Ｓ．サリバリウス及び有効量の補充糖類を含む、疾患又は障害の処置又は予防に使用するための組成物であって、Ｓ．サリバリウスが、Ｓ．サリバリウスＭ１８、Ｓ．サリバリウスＫ１２、又はそれらの組み合わせであり、補充糖類が、ガラクトース若しくはラフィノース、又はそれらの組み合わせである、組成物を提供する。

【0270】

一態様では、本発明は、Ｓ．サリバリウス及び有効量の補充糖類を含む、組成物であって、Ｓ．サリバリウスが、Ｓ．サリバリウスＭ１８、Ｓ．サリバリウスＫ１２、又はそれらの組み合わせであり、補充糖類が、ガラクトース若しくはラフィノース、又はそれらの組み合わせである、組成物を提供する。

【0271】

各種実施形態では、組成物又は治療用製剤は、Ｓ．サリバリウスの阻害プロファイルを改善し、及び／又はムコイド特性を改善する。

【0272】

各種実施形態では、疾患又は障害は、皮膚、口腔、歯、粘膜、又はＥＮＴＲ病原体によって引き起こされる。

【0273】

各種実施形態では、本疾患又は障害は、中耳炎、咽喉炎、う蝕、急性咽頭炎、扁桃炎、肺炎、ＣＯＰＤ、歯周疾患、歯肉炎、口臭、う蝕、敗血症、髄膜炎、膣炎、体臭、ざ瘡、放線菌症、乾癬、紅斑、院内紅斑、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、及びＲＳＶ、カンジダ症（口腔カンジダ症）、水虫、又はそれらの任意の２つ以上の任意の組み合わせである。

【0274】

各種実施形態では、疾患又は障害は、病原性細菌によって引き起こされる。各種実施形態では、疾患又は障害は、病原性ストレプトコッカス細菌によって引き起こされる。

【0275】

各種実施形態では、疾患又は障害は、中耳炎、咽喉炎、う蝕、急性咽頭炎、扁桃炎、肺炎、ＣＯＰＤ、歯周病、歯肉炎、口臭、う蝕、敗血症、髄膜炎、膣炎、体臭、ざ瘡、放線菌症、乾癬、紅斑、蜂巣炎、膿痂疹、アトピー皮膚炎、菌血症、軟組織感染症、紅班、院内紅班、又はそれらの任意の２つ以上の任意の組み合わせである。

【0276】

いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、病原性ウイルスによって引き起こされる。

【0277】

各種実施形態では、疾患又は障害は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、又はＲＳＶである。

【0278】

各種実施形態では、疾患又は障害は、病原性真菌（例えば、酵母又は皮膚真菌症）によって引き起こされる。

【0279】

各種実施形態では、疾患又は障害は、カンジダ症（口腔カンジダ症）、水虫（足白癬）、又は他の白癬感染症である。

【0280】

各種実施形態では、対象は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ウシ、並びに他の家畜及び農場動物を含む、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象は、非ヒト対象である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。各種実施形態では、対象は、乳児、小児、又は成人である。

【0281】

一態様では、本発明はまた、ブリス産生Ｓ．サリバリウスに感受性の微生物を阻害する方法であって、それを必要とする対象に、本発明の組成物又は本発明の治療用製剤を投与することを含む、方法に関する。阻害される微生物は、非病原性微生物、例えば、Ｓ．サリバリウス種、Ｓ．エピデルミディス種、Ｌ．ラクティス種、Ｓ．コンステラータス種であり得る。本発明で使用されるＳ．サリバリウスによる接着及びコロニー形成を促進するために、そのような非病原性微生物サリバリウスの集団を減少させることが望ましい場合がある。

【0282】

原料組成物
凍結乾燥保護剤及び凍結保護剤は、保護機能を有し細胞生存率を維持するために、ブリス産生株を含有する産物（Ｓ．サリバリウス含有産物を含む）を含む。凍結乾燥保護剤は乾燥中に保護機能を有し、一方、凍結保護剤は凍結中に保護機能を有する。同じ組成物が両方の機能を有することができ、別段の指定がない限り、これらの用語は本明細書において互換的に使用される。好適な凍結乾燥保護剤又は凍結保護剤は、当業者に公知である。

【0283】

各種実施形態では、凍結乾燥保護剤は、カゼインナトリウム、ペプトン、脱脂粉乳、乳清タンパク質、トレハロース、グリセロール、ベタイン、スクロース、ガラクトース、グルコース、ラクトース、ラクチトール、マンニトール、マルトデキストリン、クエン酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせから選択され得る。

【0284】

各種実施形態では、凍結乾燥保護剤は、トレハロース、ラクチトール、及びマルトデキストリンの混合物であり得る。

【0285】

各種実施形態では、組成物は、乳製品を含まない。各種実施形態では、組成物は、いかなる乳製品由来成分も含まない。各種実施形態では、凍結乾燥保護剤は、スクロース、クエン酸ナトリウム、及びマルトデキストリン又はトレハロースの混合物であり得る。

【0286】

各種実施形態では、組成物は、粉末であり、例えば、凍結乾燥されたＳ．サリバリウスの粉末と補充糖類の粉末とを混合することによって、又はＳ．サリバリウスと補充糖類とを共凍結乾燥することによって調製された粉末である。本発明者らは、本明細書で調査した補充糖類が、Ｓ．サリバリウスの凍結乾燥原料粉末の安定性に影響を与えないことを見出した（データ未報告）。

【0287】

当業者は、組成物が希釈剤又は流動助剤を含む、他の賦形剤を含んでもよいことを理解するであろう。

【0288】

治療用製剤、例えば、舐剤などにおける原料の使用
組成物は、様々な方法による投与のための治療用製剤に製剤化され得る。「治療用製剤」は、それを必要とする個体の予防的又は治療的処置における使用に適した組成物である。概して、治療用製剤は、Ｓ．サリバリウス株及び上述の補充糖類、並びに薬学的に許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤を含む。

【0289】

一態様では、本発明の組成物は、治療用製剤に製剤化されている。各種実施形態では、組成物又は治療用製剤は、口腔、歯、鼻腔、ＥＮＴＲ、又は局所投与のために製剤化されている。

【0290】

各種実施形態では、治療用製剤は、粉末、舐剤、鼻腔スプレー、鼻腔ゲル、点鼻薬、経口ドロップ、経口ゲル、経口スプレー、吸入可能、エアロゾル、局所用組成物、チュアブル、メルト、フィルム、グミ、練り歯磨き、歯磨きゲル、ワニス、ムース、マウスウォッシュ、食物製品（例えば、ヨーグルト）、クリーム、ゲル、スプレー、デオドラント、美容液、ローション、バーム、モイスチャライザー、ペッサリー又は坐剤である。口腔又はＥＮＴＲにおいて補充糖類のレベルを維持する、徐放性又は持続放出性製品は、いくつかの実施形態では好ましい。

【0291】

口腔内の補充糖類又はＥＮＴＲのレベルを維持する、徐放性又は持続放出性製品は、いくつかの実施形態では好ましい。そのような徐放性又は持続放出性製品は、当該技術分野において公知であり、多層錠剤、遅い又は速い溶解の溶融物、フィルム、チューインガム、ゲル、粘膜接着剤、又は口腔接着剤送達系が含まれる。

【0292】

「許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤」とは、細菌細胞の生存能力又は抽出物の活性と適合性である、Ｓ．サリバリウス株又は抽出物の宿主の、表面への送達のためのビヒクルを意味する。生存連鎖球菌株、特にＳ．サリバリウス菌株及び抽出物の投与における使用に適した許容される担体、希釈剤、及び賦形剤は、当業者に周知であり（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２２ｎｄ，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，２０１３，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡを参照されたい）、本明細書に参照により組み込まれる。好適な担体は概して不活性であり、固体又は液体のいずれであってもよい。

【0293】

各種実施形態では、担体は、薬学的に許容される担体である。このような薬学的に許容される担体は、水性又は非水性の溶液、懸濁液、及びエマルジョンであり得る。生存細菌又は凍結乾燥細菌の投与に適した様々な薬学的に許容される担体は、当該技術分野で周知である（例えば、前出のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ；及び医薬組成物ＬＡＣＴＩＮＥＸａｅ（Ｈｙｎｓｏｎ、Ｗｅｓｔｃｏｔｔ ａｎｄ Ｄｕｎｎｉｎｇ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．米国）、生存乳酸桿菌の経口投与のための市販の製剤を参照されたい）。当該技術分野で公知の好適な固体担体としては、例えば、炭酸マグネシウム；ステアリン酸マグネシウム；セルロース；タルク；糖類、例えばマルトース、フルクトース、スクロース、マンニトール、ラクトース、イソマルト、マルトデキストリン、デンプン；小麦粉；オリゴ糖及び脱脂乳、並びに類似の食用粉末が挙げられるが、これらに限定されない。

【0294】

典型的な希釈剤は、例えば、デンプン；ラクトース；マンニトール；カオリン；リン酸カルシウム又は硫酸カルシウム；塩化ナトリウムなどの無機塩；及び粉末の糖又はセルロースである。

【0295】

治療用製剤はまた、賦形剤、例えば、樹脂；充填剤；結合剤；滑沢剤；溶媒；流動促進剤；崩壊剤；防腐剤；緩衝液香味剤；着色剤；甘味料；及び必要に応じて香料を含み得る。

【0296】

典型的な結合剤としては、デンプン；ゼラチン；糖、例えば、乳糖、果糖、ブドウ糖などが挙げられる。天然及び合成ゴム、例えば、アカシア；アルギネート；ローカストビーンガム；メチルセルロース；ポリビニルピロリジン；トラガカントガム；キサンタンガムなどもまた好都合である。ポリエチレングリコール、エチルセルロース、及びワックスも結合剤として働くことができる。

【0297】

製造中にダイへの粘着を防止するための滑沢剤としては、タルク、シリカ、ステアリン酸マグネシウム及びステアリン酸カルシウム、ポリエチレングリコール、ステアリン酸及び水素化植物油などの滑りやすい固体が挙げられる。

【0298】

崩壊剤は、湿潤時に膨潤して組成物を壊し、連鎖球菌又は抽出物を放出する物質である。崩壊剤としては、デンプン；粘土；セルロース；アルギン及びガム；より具体的には、トウモロコシ及びジャガイモデンプン；メチルセルロース；寒天；ベントナイト；木材セルロース；カチオン交換樹脂；アルギン酸；グアーガム；柑橘類果肉；カルボキシメチルセルロース；粉末のスポンジ；及びラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。

【0299】

気道への送達のために、組成物はまた、吸入による投与のための形態であり得る。吸入製品は、典型的には、粉末若しくは微粒化粉末形態、又は液体形態である。製品は、吸入器、ネブライザー、アトマイザー、又は任意の他の気道への送達について認められているデバイスを使用して、好都合に投与することができる。吸入可能な製品のための担体は、当該技術分野において周知であり、ラクトース、エリトリトール、ソルビトール、及びシクロデキストリンが含まれる。

【0300】

治療用製剤は、製剤中の細菌の生存率を維持し、有効性を増強するための栄養素を更に含有することができる。組成物において有用な更なる成分は、望ましくない生物よりも望ましい細菌の増殖を選択的に増強する薬剤である。

【0301】

各種実施形態では、治療用製剤は、緩衝剤（リン酸緩衝液、クエン酸）、炭酸カルシウム、マルチビタミン、ミネラル（例えば、亜鉛、ビタミンＣ及びＤ）、抗酸化剤（ベリー、例えば、ブラックカラント、ケルセチン、カンゾウ）、フッ化物、キシリトール、酵母抽出物（サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）又はサッカロマイセス・ブラウディ（Saccharomyces Boulardii））、溶解物、抽出物（ビフィドバクテリウム（ビフィズス菌）（Bifidobacterium）、ラクトバチルス（乳酸菌）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ））、及び／又はヨーグルト培養物を含む。

【0302】

各種実施形態では、治療用製剤は、組成物の製造又は活性を促進するための他の強化剤を更に含む。各種実施形態では、強化剤は、炭水化物、例えば、Ｎｕｔｒｉｏｓｅ（登録商標）ＦＢ（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ Ｆｒｅｒｅｓ、フランス、レストロン）、マルトデキストロース、及びラクツロースなどのオリゴ糖；プレバイオティクス剤；還元剤などの化学物質、例えば、システイン及びメルカプトエタノール；並びにマグネシウムなどの金属のイオンから選択される。

【0303】

治療用製剤はまた、香味剤、着色剤、甘味剤（キシリトール、マルトデキストリン、ラカンカ抽出物、ステビア、アスパルテーム）、味覚マスキング剤（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｏｌ（登録商標））、香料、又は産物の有効性を損なうことなく患者に対する産物の遡及力を高め、及び／又は患者のコンプライアンスを高める他の化合物を含有するように製剤化することができる。吸入投与用の治療用製剤の調製方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２２ｎｄ ｅｄ．、前掲、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。

【0304】

局所治療用製剤は、保湿剤などの局所用組成物に従来使用されている他の添加剤を含み得る。当業者であれば、添加剤がプロバイオティクスの生存能力及び有効性に適合する必要があることを更に理解するであろう。そのような添加剤は、治療用製剤の治療、化粧、安定性、及び／又は外観特性を提供若しくは改善し得る。好適な添加剤の例としては、限定されるものではないが、担体（例えば、植物油、トリグリセリド、グリセロール、プロピレングリコール、水、生理食塩水）、界面活性剤、分散剤、乳化剤、阻害活性増強剤、緩衝剤、抗菌剤、プレバイオティクス、香料、抗酸化剤、着色剤、皮膚保護剤、抗老化剤（ヒアルロン酸、セラミド、オリーブスクアレン）、抗菌剤、アルミニウム塩、無機顔料、臭気吸収剤若しくは中和剤、又は日焼け止め剤が挙げられる。そのような添加剤は、局所製剤に典型的な量で本発明の治療用製剤中に含まれ得る。生存細菌又は凍結乾燥細菌の局所適用に適した様々な薬学的に許容される添加剤は、当該技術分野で周知である。

【0305】

組成物を徐放性若しくは持続放出性組成物又は治療用製剤に製剤化することが有利であり得る。各種実施形態では、組成物は、徐放性組成物に製剤化される。各種実施形態では、組成物は、Ｓ．サリバリウス及び補充糖類の即時放出、並びに更なる補充糖類の徐放を提供する二部型組成物で製剤化される。

【0306】

投与方法
読者は、本発明の組成物及び製剤が、治療目的及び非治療目的の両方のために微生物集団を阻害するための広範なプロトコルに従って投与され得ることを理解するであろう。Ｓ．サリバリウスＫ１２及びＭ１８の投与のための当該技術分野で公知の任意のプロトコルが使用され得る。

【0307】

各種実施形態では、治療用製剤は、１日に１回、２回、３回、４回、又は最大１２回経口投与される。各種実施形態では、治療用製剤は、舐剤、粉末、溶融物、マウスウォッシュ（うがい薬）、又は練り歯磨きによって経口投与される。口臭の処置には、クロルヘキシジンうがい薬などのうがい薬又は歯ブラシなどの機械的洗浄で前処置することが推奨される。

【0308】

各種実施形態では、治療用製剤は、必要に応じて頻繁に、通常１日１回又は２回、局所的に投与される。各種実施形態では、組成物は、クリーム、美容液、デオドラント、スプレー、又は保湿剤によって局所的に投与される。投与前に、水、石鹸、又は洗浄製剤で皮膚を前処置することが推奨され得る。

【0309】

各種実施形態では、治療用製剤は、必要に応じて、通常はペッサリー又は坐剤によって、１日１回又は２回、直腸又は膣に投与される。

【0310】

各種実施形態では、治療用製剤は、肺経路を介して、例えばネブライザー又は吸入器によって、必要に応じて頻繁に、通常は１日１回又は２回投与される。

【0311】

治療用製剤は、対象の口腔衛生を改善するのに有用である。例えば、国際公開第２００１０２７１４３号、国際公開第２００２０７０７１９号、及び国際公開第２００５００７１７８号（上記）において特定された状態のいずれかを予防又は処置することによるものであり、これらは全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｓ．サリバリウスＭ１８はまた、歯垢を減少させ、口腔の健康状態及び口腔細菌フローラを支え、う蝕を減少させ、虫歯を予防し、歯肉炎を処置及び予防し、歯周炎を処置及び予防するのに役立つことが知られている（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２，８７５－８８４；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，２０１３，２０１３，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８；Ｄｉ Ｐｉｅｒｒｏ，ｅｔ ａｌ．２０１５．Ｃｌｉｎ Ｃｏｓｍｅｔ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｅｎｔ．；７：１０７－１３；Ｌ Ｓｃａｒｉｙａ，Ｄ．Ｖ．Ｎ．，Ｍ Ｖａｒｇｈｅｓｅ，２０１５．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａ Ｂｉｏ Ｓｃｉ．６，２４２－２５０）。

【0312】

成分を製造する方法
一態様では、本発明は、Ｓ．サリバリウス及び有効量の補充糖類を含む、組成物を製造する方法であって、
（ａ）Ｓ．サリバリウスを補充糖類と組み合わせることと、
（ｂ）混合して均質なブレンドを製造することとを含み、
Ｓ．サリバリウスが、Ｓ．サリバリウスＭ１８、Ｓ．サリバリウスＫ１２、又はそれらの組み合わせであり、
補充糖類が、ガラクトース若しくはラフィノース、又はそれらの組み合わせである、方法を提供する。

【0313】

各種実施形態では、ストレプトコッカス・サリバリウスは、粉末の形態である。各種実施形態では、糖類は、粉末、例えば凍結乾燥粉末の形態である。各種実施形態では、粉末は、Ｓ．サリバリウス及び上述したような凍結乾燥保護剤を含む原料粉末である。

【0314】

各種実施形態では、混合は、ブレンダー内で行われる。各種実施形態では、製品は、次にパッケージングされる。

【0315】

各種実施形態では、賦形剤が、添加される。

【0316】

各種実施形態では、組成物中のＳ．サリバリウスの阻害プロファイルが改善される。

【0317】

各種実施形態では、組成物は、上記で参照した疾患及び障害を含む、疾患又は障害の処置又は予防に使用するためのものである。

【0318】

各種実施形態では、組成物は、ブリス産生Ｓ．サリバリウスに感受性の微生物集団の阻害において使用するためのものである。

【0319】

一態様では、本発明は、疾患又は障害の処置又は予防のための、本発明の方法によって製造された組成物の使用に関する。

【0320】

一態様では、本発明は、ブリス産生Ｓ．サリバリウスに感受性の微生物集団を阻害するための、本発明の方法によって製造された組成物の使用に関する。

【0321】

製剤を製造する方法
一態様では、本発明は、Ｓ．サリバリウス及び有効量の補充糖類を含む、組成物を含む治療用製剤を製造する方法であって、
ａ）賦形剤を混合することと、
ｂ）本発明のＳ．サリバリウス及び補充糖類を含む、組成物を添加することと、
ｃ）ブレンドして、治療用製剤を提供することとを含み、
ストレプトコッカス・サリバリウスが、ストレプトコッカス・サリバリウスＭ１８、Ｓ．サリバリウスＫ１２、又はそれらの組み合わせであり、
補充糖類が、ガラクトース若しくはラフィノース、又はそれらの組み合わせである、方法を提供する。

【0322】

本方法は、治療用製剤を提供するための更なる処理工程を含み得る。当業者は、投与経路及び均質化などのブレンド方法に応じて必要な賦形剤を理解するであろう。

【0323】

各種実施形態では、本発明は、Ｓ．サリバリウス及び有効量の補充糖類を含む、組成物を含む口腔舐剤を製造する方法であって、
ａ）担体、錠剤化助剤（例えば、結合剤、滑沢剤）、及び香味剤を混合することと、
ｂ）本発明のＳ．サリバリウス及び補充糖類を含む、組成物を添加することと、
ｃ）混合物をブレンドすることと、
ｄ）混合物を舐剤化して、舐剤を提供することとを含み、
Ｓ．サリバリウスが、Ｓ．サリバリウスＭ１８、Ｓ．サリバリウスＫ１２、又はそれらの組み合わせであり、
補充糖類が、ガラクトース若しくはラフィノース、又はそれらの組み合わせである、方法を提供する。

【0324】

本発明者らは、本明細書で調査した補充糖類が舐剤中のＳ．サリバリウスの安定性に影響を及ぼさないと判定した（データ未報告）。

【0325】

各種実施形態では、本発明は、Ｓ．サリバリウス及び有効量の補充糖類を含む、組成物を含む経口粉末を製造する方法であって、
ａ）担体、錠剤化助剤（例えば、結合剤、滑沢剤）、及び香味剤を混合することと、
ｂ）本発明のＳ．サリバリウス及び補充糖類を含む、組成物を添加することと、
ｃ）混合物をブレンドして、経口粉末を提供することとを含み、
Ｓ．サリバリウスが、Ｓ．サリバリウスＭ１８、Ｓ．サリバリウスＫ１２、又はそれらの組み合わせであり、
補充糖類が、ガラクトース若しくはラフィノース、又はそれらの組み合わせである、方法を提供する。

【0326】

各種実施形態では、本発明は、Ｓ．サリバリウス及び有効量の補充糖類を含む、組成物を含む局所用組成物を製造する方法であって、
ａ）油ビヒクルと分散剤とを混合することと、
ｂ）本発明のＳ．サリバリウス及び補充糖類を含む、組成物を添加することと、
ｃ）混合物を均質化して、局所用組成物を提供することとを含み、
Ｓ．サリバリウスが、Ｓ．サリバリウスＭ１８、Ｓ．サリバリウスＫ１２、又はそれらの組み合わせであり、
補充糖類が、ガラクトース若しくはラフィノース、又はそれらの組み合わせである、方法を提供する。

【0327】

各種実施形態では、本発明は、ストレプトコッカス・サリバリウス及び有効量の補充糖類を含む、組成物を含むペッサリー又は坐剤を製造する方法であって、
ａ）固体脂質を他の賦形剤と混合することと、
ｂ）本発明のＳ．サリバリウス及び補充糖類を含む、組成物を添加することと、
ｃ）混合物を均質化して、ペッサリー又は坐剤を提供することとを含み、
Ｓ．サリバリウスが、Ｓ．サリバリウスＭ１８、Ｓ．サリバリウスＫ１２、又はそれらの組み合わせであり、
補充糖類が、ガラクトース若しくはラフィノース、又はそれらの組み合わせである、方法を提供する。

【0328】

各種実施形態では、本発明は、Ｓ．サリバリウスと、有効量の補充糖類とを含む、肺投与用の製剤を製造する方法であって、
ａ）任意選択で、乾燥粉末担体を他の賦形剤と混合することと、
ｂ）本発明のＳ．サリバリウス及び補充糖類を含む、組成物を添加することと、
ｃ）混合して、肺投与用の製剤を提供することとを含み、
Ｓ．サリバリウスが、Ｓ．サリバリウスＭ１８、Ｓ．サリバリウスＫ１２、又はそれらの組み合わせであり、
補充糖類が、ガラクトース若しくはラフィノース、又はそれらの組み合わせである、方法を提供する。

【0329】

以下の非限定的な実施例は、本発明を説明するために提供されるものであり、決してその範囲を限定するものではない。

【実施例】

【0330】

材料
以下の培養培地及び糖類は全て、ニュージーランドのＦｏｒｔ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによって供給された：ＣＡＢＫ１２寒天プレート；コロンビア血液寒天ベース（ＣＡＢ）ボトル；０．５％（ｗ／ｖ）ＣａＣＯ_３（ＣＡＢＣａ）を含むコロンビア寒天ベース；０．１％ＣａＣＯ_３及び５％ｖ／ｖヒツジ血液を補充したコロンビア寒天ベース（ｓＢａＣａ）；ヘモフィルス寒天プレートミティス・サリヴァリウス寒天；Ｄ－ガラクトース－ＢＤ Ｄｉｆｃｏ；トッド・ヒューイットブロス（Ｔｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔ Ｂｒｏｔｈ：ＴＨＢ）－ＢＤ Ｄｉｆｃｏ（製造業者の説明書に従って使用）；Ｍ１７ Ｂｒｏｔｈ－ＢＤ Ｄｉｆｃｏ（製造者の説明書に従って使用したが、糖類は添加しなかった）。

【0331】

以下の材料は全て、Ｌａｂ Ｓｕｐｐｌｙ Ｌｔｄ、ニュージーランドによって供給された：炭酸カルシウム（ＣａＣＯ_３）－ＰａｎＲｅａｃ Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ；Ｄ－（＋）グルコース－一水和物－Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ；エタノール（９６％ＡＲグレード）－７０％溶液を作製するために使用前に水で希釈；Ｄ（＋）－グルコース一水和物－Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ、クロロホルム（Ｅｍｓｕｒｅ，ＡＣＳ，ＩＳＯ，Ｒｅａｇ．Ｐｈ Ｅｕｒ）－Ｍｅｒｃｋ。分子生物学用水（ヌクレアーゼを含まない）－ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、１０×Ｔｒｉｓ－酢酸－ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）緩衝液－Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ；塩酸（ＨＣｌ）；

【0332】

Ｄ－（＋）ラフィノース五水和物；Ｄ－（－）フルクトース（両方ともＳｉｇｍａ、ニュージーランド製）；

【0333】

クロロホルム（Ｅｍｓｕｒｅ，ＡＣＳ，ＩＳＯ，Ｒｅａｇ．Ｐｈ Ｅｕｒ）－Ｓｕｐｅｌｃｏ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ニュージーランド）。

【0334】

以下の材料は全てニュージーランドのＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって供給された：ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ；ＴＲＩｚｏｌ試薬；Ｐｈａｓｅｍａｋｅｒチューブ；ＲＮａｓｅＺａｐ；ＴＵＲＢＯ ＤＮＡ－ｆｒｅｅキット；ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ ＶＩＬＯ；ＰｏｗｅｒＴｒａｃｋ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ；１０，０００×ＳＹＢＲ ｓａｆｅ ＤＮＡゲル染色；ＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ ３８４ウェル反応プレート；ＭｉｃｒｏＡｍｐ光学接着フィルム及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）－Ｏｘｏｉｄ

【表2】

【0335】

リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）－ダルベッコＡ－Ｏｘｏｉｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ニュージーランドによって供給され、製造業者の説明書に従って使用される）。ＡｎａｅｒｏＧｅｎサッシェ－Ｏｘｏｉｄ－Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ニュージーランドによって供給。

【0336】

Ｐｒｏｍｅｇａ ＧｏＴａｑ Ｇ２ Ｈｏｔ ｓｔａｒｔ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニュージーランドによって供給。

【0337】

Ｍａｅｓｔｒｏｇｅｎ ＡｃｃｕＲｕｌｅｒ １ ｋｂ ＤＮＡ ＲＴＵラダー、Ｍｅｄｉｒａｙ、ニュージーランドによって供給。

【0338】

Ｓｉｍｉｌａｃ ３６０ Ｔｏｔａｌ Ｃａｒｅ乳児用調整乳（Ａｂｂｏｔｔ Ｇｌｏｂａｌ、米国）を、ｗｗｗ．Ａｍａｚｏｎ．ｃｏｍを介して購入した。全乳粉末（Ａｎｃｈｏｒ Ｂｌｕｅ（商標）粉乳、Ａｎｃｈｏｒ、ニュージーランド）；

【0339】

Ｓ．サリバリウス株Ｋ１２及びＭ１８－Ｂｌｉｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ、ニュージーランドから供給され、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭ）から入手可能；Ｋ１２原料製品（トレハロース／ラクチトール／マルトデキストリンを含むＫ１２粉末）、Ｍ１８原料製品（トレハロース／ラクチトール／マルトデキストリンを含むＭ１８粉末）；Ｋ１２及びＭ１８乳製品を含まない原料製品（スクロース、クエン酸ナトリウム、及びマルトデキストリン凍結乾燥保護剤を含む粉末）；Ｋ１２含有市販粉末製剤、Ｄａｉｌｙ Ｄｅｆｅｎｃｅ Ｊｕｎｉｏｒ（ＤＤＪ）（組成：Ｓ．サリバリウスＫ１２、イソマルト、マルトデキストリン、バニラ香料）、Ｋ１２含有市販舐剤製剤（Ｔｈｒｏａｔ Ｇｕａｒｄ Ｐｒｏ）（組成：Ｓ．サリバリウスＫ１２、イソマルト、錠剤化助剤、天然香料）－全てＢｌｉｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ、ニュージーランド製）；Ｓ．サプロフィチカスＡＴＣＣ１５３０５、Ｓ．ミュータンスＮＣＴＣ１０４４９（ＡＴＣＣ２５１７５）；Ｓ．ミュータンスＵＡ１５９（ＡＴＣＣ７００６１０）；Ｓ．コーニー（ＡＴＣＣ２９９７４）；Ｓ．シムランス（ＡＴＣＣ２７８４８）；Ｃ．アクネス６９１９；Ｆ．ヌクレアタムＡＴＣＣ２５５８６；Ｐ．ジンジバリスＡＴＣＣ３３２７７；Ｐ．ジンジバリスＡＴＣＣ５３９７８；Ｐ．インターメディアＡＴＣＣ２５６１１；Ｓ．サリバリウス（ＡＴＣＣ１３４１９、ＡＴＣＣ２５９２３、及びＡＴＣＣ７０７３）；Ｓ．ソブリヌスＡＴＣＣ２７３５１、Ｓ．アガラクティエＡＴＣＣ１２３８６、Ａ．ビスコサスＡＴＣＣ１５９８７、Ｃ．アウリスＡＴＣＣ５１９６６－全てＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能；Ｍ．カタラーリスＴＷ１及びＴＷ２；Ｌ．ラクティスＴ－２１；Ｓ．ピオゲネスＭ７６；Ｐ．エルギノーザＩ２；Ｈ．インフルエンザＴＷ５；Ｓ．アウレウスＡ２２２；Ｓ．ミュータンスＯＭＺ１７５；Ｓ．ニューモニエＤ３９；Ｓ．ピオゲネス７１－６９８；Ｓ．コンステラータスＴ－２９；Ｓ．ピオゲネスＦＦ２２；Ｓ．ピオゲネスＷ－１；Ｓ．ピオゲネスＭ１７；Ｓ．ピオゲネスＭ５７；Ｓ．ピオゲネスＥＭＭ９２；Ｓ．ピオゲネスＭ６６；Ｓ．ピオゲネスＭ７４；Ｓ．ピオゲネスＨ１３；Ｓ．ピオゲネスＫ２６；Ｓ．ピオゲネスＷＳ０２、Ｓ．ディスガラクティアエＢｒｉｓ ２；Ｓ．ディスガラクティアエＴ２７７；Ｓ．ニューモニエＲＸ１；Ｓ．ニューモニエＰＫ８；Ｓ．ミュータンスＤ１０；Ｓ．ミュータンスＦＷ７５；Ａ．ビスコサスＴ１４；Ｓ．サングイニスＫ１１；Ｓ．アウレウス２０；Ｓ．アウレウス１９；Ｓ．アウレウス１４；Ｆ．ヌクレアタムＦＨ２；Ｆ．ヌクレアタムＦＨ３；Ｓ．サリバリウスＣＮ３４１０；３４Ａ；Ｋ１４；Ｈ２９；Ｓ．ピオゲネスＫ７；Ｓ．ディスガラクティアエＴ－１４８；Ｓ．アウレウス１９－全て発注してＢｌｉｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄから入手可能；Ｓ．ソブリヌスＯＭＺ１７６（ＣＣＵＧ２１０２０）－Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇ（ＣＣＵＧ）から入手可能；Ｓ．ピオゲネス７１－６７９－Ｌｅｗｉｓ Ｗａｎｎａｍａｋｅｒから贈与された標準。

【0340】

方法１－固体培養培地の調製
炭酸カルシウム（ＣａＣＯ_３）を、緩衝剤として調製中に全ての固体培養培地（ＣＡＢ）に添加した。ＣａＣＯ_３は、全ての調製された培養培地中に０．５％（ｗ／ｖ）濃度（ＣＡＢＣａ）で存在した。

【0341】

１８０ｍＬ容量のコロンビア寒天ベース（ＣＡＢ）寒天の既製ボトルを、Ｆｏｒｔ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ニュージーランドに注文した。追加の成分をこれらの１８０ｍＬボトルに添加した。炭水化物をＣＡＢ寒天の別々のボトルに０．１％、０．５％、１．０％、１．５％、及び２．０％（ｗ／ｖ）濃度で添加した。以下の式を使用して、その成分の所望の濃度を達成するために添加する炭水化物（及びＣａＣＯ－_３）の量を決定した。

【0342】

【数1】

【0343】

例えば、既製のＦｏｒｔ Ｒｉｃｈａｒｄ寒天ボトルの１つを使用して、ＣａＣＯ_３及び０．５％（ｗ／ｖ）濃度のガラクトースを含むＣＡＢ寒天ベースを得るために、以下の式が使用される。

【0344】

【数2】

【0345】

正確な方法を使用して、培養培地の無菌性を確保し、また正確な量の任意の添加成分が培養培地に正確に組み込まれることを確保した。成分をきれいなスプーン／スパチュラを用いてそれらの容器から取り出し、きれいな秤量ボートにて天秤上で秤量し、これをミリグラム単位まで測定した。成分を秤量してから、それらをきれいな３０ｍｌ容器に入れ、標識し、密封した。既製のＣＡＢ寒天は、Ｆｏｒｔ Ｒｉｃｈａｒｄから到着したときに固体であり、したがって、幅約３ｃｍ、深さ３ｃｍのクレータを、滅菌メスを使用して寒天に切り込んで、成分を注ぐための空間を作る必要がある。この後、成分をクレータに注入し、１ｍｌの滅菌蒸留水を上部に分注して、成分を寒天に部分的に浸漬した。次いで、空洞を作製するために切り取られた寒天を、クレータ内に戻し、磁気撹拌子をボトルに入れた。次いで、ボトルを１１０℃で１０分間オートクレーブ処理した。ボトルを、５０℃に設定した水浴中に保存した。滅菌ペトリ皿に適切な情報（日付、プレートの内容物、及び添加成分）を標識し、蓋を外したクラスＩＩ生物学的安全フードに入れた。寒天をペトリ皿に注ぐ前に、磁気撹拌子を用いて内容物を１～２分間徹底的に撹拌した。更なる滅菌手段として、生物学的安全キャビネット内でブンゼン炎を点火し、ボトルの内容物をペトリ皿に注いだ。注入の間に何らかの気泡が現れた場合、ブンゼン炎を用いてそれらを弾いた。寒天を５～１０分間放置して凝固させた。１つのプレートを「陰性対照」と標識し、インキュベータに一晩入れて、寒天調製中に混入が起こらないことを確保した。

【0346】

方法２－繰延アンタゴニズムアッセイ
１～２個の産生株コロニーを、新しい綿棒を用いてストックプレートから９００μＬの懸濁溶液に移した。この後、懸濁液をボルテックスし、新しい綿棒を用いて試料を固体培養培地上に接種した。接種は、１．５ｃｍ幅のストリップで寒天プレートを直径方向に横切るストリークであった。次いで、プレートをインキュベートした。インキュベーション後、全ての目に見えるコロニーを寒天表面から拭き取ることによって除去した。次いで、２ｍｌのクロロホルムを４ｃｍ×４ｃｍの布片上に分配し、逆さにした寒天プレートを上に３０分間密封することによって、プレートをクロロホルムで処置した。次いで、プレートをクロロホルム処置した後、３０分間風乾した。次いで、１～２個の指標株コロニーをストックプレートから相補的懸濁溶液に移した。次いで、懸濁液をボルテックスし、試料を同じ寒天表面に接種した。これらの試料を、初期の産生株ストリークに対して垂直方向にストリークした。

【0347】

各指標ストリークは、目的の指標株を含有する対応するストックプレートからの細胞を含有する新しい懸濁液を用いて調製した。新しい綿棒を使用して、指標株懸濁液試料を移した。結果は、指標株コロニー増殖の阻害領域（ＺＯＩ）のその後の（存在する場合）サイズを定性的に検討することによって測定した。陽性結果は、培養培地上の指標コロニー増殖の顕著な減少又は完全な阻害が存在する場合である。陰性結果は、指標株コロニー密度の減少の徴候がない場合である。

【0348】

方法３－用量応答アッセイ
様々な濃度の糖類を含有するＣＡＢＣａ寒天プレートを、方法１に記載の方法に従って調製した。産生株を、新しい綿棒を使用してストック寒天プレートから９００μＬのＴＨＢに移した。プラスチック製スプレッドプレータを約１．２ｃｍ幅に切断し、次いでエタノール中に浸漬し、風乾するに任せて無菌性を確保した。次いで、産生株懸濁液の１００μＬ試料を、寒天表面上に、寒天表面を直径方向に横切る直線で、（約）２０μＬスポットで分注した。スポットは互いに約１．５ｃｍ離して配置した。次いで、プラスチックスプレッダを使用して、スポットを１．５ｃｍ幅のストリップで寒天表面にわたって均一に分布させた。この工程は、均一な産生株ストリークが寒天表面上に接種されることを確保するために行われ、初期接種物濃度のおおよその尺度を提供した。別個のプラスチックスプレッダを、異なる産生株を含有する試料に使用した。寒天表面上に残っている目に見える液体がなくなるまで（約２０分間）、試料を寒天表面に浸したままにした。産生株ストリークの調製後、方法２に従って繰延アンタゴニズムアッセイプロトコルに従った。阻害領域（ＺＯＩ）のサイズをｍｍ単位で測定することによって、結果を記録した。

【0349】

実施例１：Ｋ１２によるＥＮＴＲ微生物の拮抗作用
本実施例は、Ｋ１２及び補充糖類によるＥＮＴＲ微生物の拮抗作用（アンタゴニズム）の誘導を示す。

【0350】

０．１％、１．０％、１．５％、及び２．０％（ｗ／ｖ）濃度のガラクトース及びラフィノースを含有するＣＡＢＣａ寒天プレート上に培養したＢＬＩＳ Ｋ１２（商標）を、方法３に概説したプロトコルに従って、繰延アンタゴニズムアッセイによってそれらの抗微生物活性について試験した。図１及び図２に提示される結果は、耳、鼻、及び喉（ＥＮＴ）微生物指標株の阻害領域サイズの変化を示す。Ｋ１２を様々な濃度のガラクトースの存在下で培養した場合、いくつかのＥＮＴＲ指標株についてのＺＯＩサイズは、対照条件から顕著に増加した（図１）。Ｍ．カタラーリスＴＷ１及びＴＷ２は、様々な濃度のガラクトースにわたってＺＯＩサイズの同様の変化を示す。次いで、ＴＷ１のＺＯＩサイズの変化は、１．５％ガラクトース（ｗ／ｖ）でピークに達し（１２ｍｍ）、次いで２．０％ガラクトース（ｗ／ｖ）で減少する一方、ＴＷ２のＺＯＩサイズの変化は、２．０％ガラクトース（ｗ／ｖ）でピークに達する（１１ｍｍ）。Ｌ．ラクティスＴ－２１のＺＯＩサイズの変化は、培養培地中に存在するガラクトースの濃度に関連して上向きになる傾向がある。

【0351】

Ｓ．ピオゲネスＭ５７のＺＯＩサイズは、ガラクトースの０．１％、１．０％、及び１．５％（ｗ／ｖ）濃度で対照条件から増加する。Ｍ７６のＺＯＩサイズの変化は、ガラクトースの１．５％～２．０％濃度の間でレベル（１１ｍｍ）が維持される。（平均して）最大のＺＯＩ変化を生じるガラクトースの濃度は、２．０％（ｗ／ｖ）である（２％ガラクトースでの平均ＺＯＩ変化＝９．５ｍｍ）。

【0352】

繰延アンタゴニズムアッセイ中に様々な濃度のラフィノースを組み込んだＣＡＢＣａ上でＫ１２を培養した場合、いくつかのＥＮＴ微生物指標株について、対照条件（炭水化物なし）からのＺＯＩサイズの変化が示された（図２）。対照条件から０．１％ラフィノース（ｗ／ｖ）までのＬ．ラクティスのＺＯＩサイズの変化は）は１５ｍｍであった。この大きな増加の後に、１．０％ラフィノース（ｗ／ｖ）で１６ｍｍへの増加が続き（有意により大きな阻害を示す）、次いで、ＺＯＩサイズは、横ばいになり、最終的に２．０％ラフィノース（ｗ／ｖ）で減少する。Ｈ．インフルエンザＴＷ５及びＳ．ピオゲネスＭ７６についてのＺＯＩサイズの変化はまた、１．５％ラフィノース（ｗ／ｖ）でピークに達し、それぞれ１２ｍｍ及び１３ｍｍであった。ＴＷ５のＺＯＩサイズは実際に、２％ラフィノース（ｗ／ｖ）で対照条件と同じ（０ｍｍ）に戻った。Ｍ．カタラーリスＴＷ１及びＴＷ２のＺＯＩサイズは、条件間で非常に類似して変化した（図２）。各株についてのＺＯＩサイズの変化は、本発明者らの試験範囲の終わりにピークに達した（２．０％（ｗ／ｖ）（１３ｍｍ）。（平均で）最大のＺＯＩサイズ変化を生じたガラクトースの濃度は、１．５％ラフィノース（ｗ／ｖ）条件であった（１．５％ラフィノースでの平均ＺＯＩ変化＝１０．３３ｍｍ）。

【0353】

実施例２：Ｍ１８によるＥＮＴＲ微生物の拮抗作用
本実施例は、Ｍ１８及び補充糖類によるＥＮＴＲ微生物の拮抗作用の誘導を示す。

【0354】

０．１％、１．０％、１．５％、及び２．０％（ｗ／ｖ）濃度のガラクトース及びラフィノースを含有するＣＡＢＣａ寒天プレート上に培養したＢＬＩＳ Ｍ１８（商標）を、方法３に概説したプロトコルに従って繰延アンタゴニズムアッセイを行うことにより、それらの抗菌活性について試験した。図３及び図４に提示される結果は、耳、鼻、及び喉（ＥＮＴ）微生物指標株の阻害領域サイズの変化を示す。

【0355】

Ｍ１８を、様々な濃度のガラクトースを組み込んだＣＡＢＣａ上で培養した場合、繰延アンタゴニズムアッセイ中にいくつかのＥＮＴＲ微生物指標株についてＺＯＩサイズのその後の変化があった（図３）。Ｍ．カタラーリス株ＴＷ１及びＴＷ２は両方とも、ガラクトースが１．０％及び１．５％（ｗ／ｖ）濃度対対照条件で培養培地に組み込まれた場合に、それぞれの阻害領域の増加を示した（１２→２３ｍｍ及び１３→２３ｍｍ）。Ｌ．ラクティス及びＳ．ピオゲネスＭ７６の阻害領域は両方とも、ガラクトースが１．５％（ｗ／ｖ）濃度で存在した場合に最大であった（それぞれ９ｍｍ及び１４ｍｍ）。これらは、それらの対照条件ＺＯＩサイズからの顕著な差であった。全ての感受性ＥＮＴＲ指標株は、ガラクトースが２．０％（ｗ／ｖ）濃度で存在する場合、１．５％（ｗ／ｖ）濃度条件と比較して、ＺＯＩサイズの減少を示した。平均して最大のＺＯＩ変化を生じた条件は、１．５％ガラクトース（ｗ／ｖ）条件であった。１．５％ガラクトースでの平均ＺＯＩ変化＝１１．５ｍｍ。

【0356】

Ｍ１８を、様々な濃度のラフィノースを組み込んだＣＡＢＣａ寒天上で培養した場合、ガラクトース条件下でＺＯＩサイズにおいて観察されたものと非常に類似したパターンが現れた。しかしながら、ラフィノース条件では、より多くのＥＮＴＲ指標株がいくらかの阻害を示し、ＺＯＩサイズ（平均）はガラクトース条件下の対応するＺＯＩサイズよりも大きかった。Ｍ．カタラーリス株ＴＷ１及びＴＷ２の阻害領域は、ラフィノースが１．５％（ｗ／ｖ）濃度で存在した場合に、対照条件からのサイズの最大変化を示した（（それぞれ３１ｍｍ）。ガラクトース条件で観察された傾向に反して、Ｌ．ラクティスのＺＯＩサイズは、０．１％（ｗ／ｖ）ラフィノース条件で最大であった（２０ｍｍ）。Ｐ．エルギノーザＩ２のＺＯＩサイズは、ＺＯＩ＝幅１０ｍｍの１．５％（ｗ／ｖ）濃度を除いて、ラフィノース条件のいずれにわたっても対照条件から変化しなかった。Ｈ．インフルエンザＴＷ５のＺＯＩサイズは、１．５％（ｗ／ｖ）ラフィノース条件で最大であった（２６ｍｍ）。ここでもまた、全ての感受性ＥＮＴＲ指標株のＺＯＩサイズは、ラフィノースが２．０％（ｗ／ｖ）濃度で培養培地に組み込まれた場合、幅の顕著な減少を示した（図４）。平均して最大のＺＯＩ変化を生じた条件は、１．５％ラフィノース（ｗ／ｖ）条件であった。１．５％ラフィノースでの平均ＺＯＩ変化＝２２．１６ｍｍ。

【0357】

同じ実験をＫ１２－／－（バクテリオシンをコードするメガプラスミドを有していない株）で行った場合、ＥＮＴＲ指標株のいずれについても阻害領域は形成されなかった。

【0358】

実施例３：トリミックス（３つの糖類の等モル濃度の混合物）及び個々の糖類と比較したラフィノースの活性
本実施例は、Ｋ１２及びＭ１８の刺激効果がラフィノースによるものであり、その個々の構成成分の１つ又は全ての等モル量によるものではないこと、すなわち、ラフィノースが、効果を有する個々の構成成分に代謝されていないことを示す。これに加えて、阻害効果の変化に影響を及ぼし得たアッセイ設計からのｐＨの任意の変化の効果を評価した。

【0359】

１．２ｃｍのストリークを使用したことを除いて、上記の方法３に従って用量応答アッセイを行った。

【0360】

図５～図７は、皮膚、歯、ＥＮＴＲ、病原体に対するＢＬＩＳ Ｋ１２又はＭ１８＋ラフィノース、トリミックス及び個々の糖類の増強された有効性を強調表示している。

【0361】

結論：等モル濃度のラフィノース対トリミックス糖類及び個々の糖類の比較評価は、ラフィノースの存在下で、Ｋ１２が、３つのモノマー糖類の等価な組成物と比較して、皮膚、歯、ＥＮＴＲに関連する微生物に対してより良好な阻害活性を有することを示した。この効果は、ｐＨの低下による阻害効果ではなく、抗菌分子（バクテリオシン又は非リボソームペプチドなど）の産生の増強によって媒介されると思われる。

【0362】

実施例４：トリミックス（等重量％濃度の３つの糖類の混合物）及び個々の糖類と比較したラフィノースの活性
本実施例は、Ｋ１２及びＭ１８の刺激効果がラフィノース及び等重量％量のその個々の糖類の１つ又は全てによること、すなわち、ラフィノースがこの効果を有する個々の糖類に代謝されないことを示す。

【0363】

１．２ｃｍストリークを使用したことを除いて、上記の方法３に従って用量応答アッセイを行った。個々の糖類試験について、産生株ストリークのｐＨを、産生株の増殖後に調節して、酸性条件を変化させた。

【0364】

トリミックス又は個々の糖類のいずれかとしての等重量％量の糖類を超えるラフィノースを含むＫ１２又はＭ１８＋（％ｗ／ｖ）の有効性の増強が、皮膚、歯、下気道疾患由来の代表的な微生物、並びに他のＳ．サリバリウスに対して見られた（図８～図１３）活性をベースライン対照に対して正規化する。

【0365】

実施例５：ラフィノースは、酸産生よりもむしろＫ１２及びＭ１８の抗菌（例えば、バクテリオシン又は非リボソームペプチド）活性を促進する。
本実施例は、これらの微生物のより大きな阻害の刺激が、抗菌分子（バクテリオシン又は非リボソームペプチド）の産生の増加によるものであり、より酸性の（したがって、潜在的に阻害性の）環境へのｐＨの関連する低下によるものではないことを示す。

【0366】

方法：細菌試験株を、炭酸カルシウムを含まないＣｏｌｕｍｂｉａ寒天ベースと同等の寒天上で、ｐＨ４．５～ｐＨ７の範囲の様々なｐＨで増殖する能力について評価した。細菌試験株を、トッド・ヒューイットブロス又は株のための適切な増殖培地のいずれかに懸濁した後、様々なｐＨで、試験プレートにわたって拭き取った。次いで、これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートし、各試験株の細菌増殖を１８時間及び２４時間でモニターした。

【0367】

結果：２４時間で、試験した全ての株はｐＨ７で増殖したが、ｐＨが低下するにつれて、増殖することができる株の数は減少した（表１）。９株のうち３株のみが、ｐＨ５．２５以下で増殖した。これは、トリミックス又は個々の糖類を補充したＣＡＢＣａ上で増殖させたＫ１２又はＭ１８のいずれかによる酸の産生が、試験されている株の増殖を減少させるか、又は完全に阻害し得ることを示す。

【表3】

【0368】

ラフィノースはｐＨの有意な低下（＞５．２５）を誘導しなかったが、Ｋ１２が阻害活性を生じるように誘導するようになることに留意されたい。ラフィノースの存在下で観察されたＫ１２の阻害活性は、ｐＨ効果ではなく、抗菌活性によるものである。

【0369】

実施例６：トリミックス（等重量％濃度の３つの糖類の混合物）及び個々の糖類と比較した、Ｋ１２又はＭ１８によるラフィノースの活性
この実験は、Ｋ１２の阻害範囲が、典型的にはＫ１２によって阻害されない、種及び株に拡張されたことが見出されたことを示す（表２及び表３）。Ｋ１２は、皮膚微生物に対して特異的にラフィノースによって誘導され、膿痂疹、アトピー性皮膚炎などの皮膚適応症に対するＫ１２の潜在的な利益を強調している。

【0370】

使用した方法は実施例４と同じであった。

【0371】

結果：以下の表２は、どの種／株が、ラフィノースと共にインキュベートされたＫ１２由来の阻害分子（例えば、バクテリオシン）に対して感受性になったかを強調する（表２）。例えば２．５％のラフィノースを検討すると、等％（０．８３％、３つの糖類の各々）を含有する。Ｍ１８についても同様の結果が得られた。

【表4】

【0372】

以下の表３に示されるこの効果は、指定％のラフィノース及び等価なトリミックス（質量％による）又は個々の糖類で見られた。

【表5】

【0373】

ラフィノースの存在下でのＫ１２又はＭ１８は、等モル又は等重量％濃度のトリミックス糖類又は糖類単独と比較した場合、増強された効力を示した。

【0374】

ラフィノースの阻害活性は、単純な糖類の代謝による酸産生ではなく、又はそれに加えて、バクテリオシンを産生するＫ１２又はＭ１８の誘導に起因する（口腔における酸産生は、う蝕を引き起こし、Ｓ．ミュータンスなどの耐酸性細菌に安全な適所を提供し得る）。

【0375】

選択的用量関連阻害効果がラフィノースで観察され、このことは、一般的な糖類単独又は組み合わせでの包括的なプレバイオティクス効果ではなく、ラフィノースの特定の用量レベルが、利益を達成するために必要とされることを示唆する。

【0376】

具体的な観察：
・指標株Ｓ．アウレウスＡ２２２は、１．２５、２．５、５、及び１０％ｗ／ｖラフィノースがＫ１２に添加されると、Ｋ１２に非感受性から感受性に変化した。
・指標株Ｓ．ミュータンスＯＭＺ１７５及びＳ．サプロフィチカスＡＴＣＣ１５３０５は、２．５、５、及び１０％ｗ／ｖラフィノースが添加されると、Ｋ１２に非感受性から感受性に変化した。
・指標株Ｓ．ミュータンスＯＭＺ１７５は、０．５、１．２５、２．５、及び５％ｗ／ｖのラフィノースが添加されると、Ｍ１８に非感受性から感受性に変化した。
・指標株Ｓ．コンステラータスＴ－２９、Ｓ．アウレウスＡ２２２、及びＳ．サプロフィチカスＡＴＣＣ１５３０５は、１．２５、２．５、５％ｗ／ｖラフィノースが添加されると、Ｍ１８に対して非感受性から感受性に変化した。

【0377】

Ｋ１２による阻害の増加が、以下について見られた。
・０．５～１０％ｗ／ｖのラフィノースを含むＳ．コンステラータスＴ－２９
・０．５～１０％ｗ／ｖのラフィノースを含むＳ．ピオゲネス
・０．５～１０％ｗ／ｖのラフィノースを含むＳ．ニューモニエ

【0378】

Ｍ１８による阻害の増加が、以下について見られた。
・０．５～１０％ｗ／ｖのラフィノースを含むＳ．ピオゲネス
・０．５～１０％ｗ／ｖのラフィノースを含むＳ．ニューモニエ

【0379】

実施例７Ａ：Ｋ１２又はＭ１８の阻害活性を誘導するラフィノース濃度の効果
本実施例は、増強された阻害効果についてのラフィノースの濃度の効果を示す。１．７、２．５、３．３、５、及び１０％のラフィノース濃度を以下の表４～表７で比較した。

【0380】

表中の空白は、試験の混入物により結果が得られなかった場所である。

【表6】

【表7】

【表8】

【表9】

【0381】

１．７、２．５、３．３、及び５％のラフィノース濃度は全て、試験した指標株の少なくとも７つを阻害することができた。

【0382】

指標株Ｍ．カタラーリスの阻害は表６で見られたが、寒天のｐＨが産生株の増殖後に再調整された表７では見られず、このことから、阻害が産生株による酸の産生によるものであったことが示唆されている。

【0383】

指標株のほとんどについて、阻害の最大領域は、２．５％ラフィノースを補充した寒天プレート上で測定された。

【0384】

実施例７Ｂ：ガラクトース、ガラクトース／ラフィノースの組み合わせの濃度の効果
目的：Ｋ１２及びＭ１８の阻害活性を誘導するガラクトースの濃度の効果を判定すること。

【0385】

方法：０．５％（ｗ／ｖ）炭酸カルシウムをボトル内の固体ＣＡＢ寒天に添加することによって、０．５、１．２５、１．７、２．５、３．３、及び５％ガラクトースを含む又は含まないＣＡＢＣａ寒天プレートを調製し、次いで１１０℃で１０分間オートクレーブ処理することによって融解した。冷却後、濾過滅菌した糖類溶液又は蒸留水を添加して混合し、次いで２０ｍｌをペトリ皿にピペットで移した。

【0386】

トッド・ヒューイットブロス（Todd Hewitt broth：ＴＨＢ）中に懸濁させたＫ１２又はＭ１８原料を使用して、繰延アンタゴニズムアッセイを実施した。これを、約１～２×１０^６ｃｆｕを含有する１．２ｃｍのストリークとして、ＣＡＢＣａ対照又はＣＡＢＣａガラクトース補充試験プレートの中央に広げた。３７℃、５％ＣＯ_２で１８時間増殖させた後、細菌増殖物を除去し、初期のストリーク中の寒天のｐＨを測定し、０．５Ｍ炭酸ナトリウムｐＨ１１を使用してｐＨ６．５～７．５に調整した後、クロロホルム蒸気を使用して寒天表面を滅菌した。細菌試験株をＴＨＢ中に懸濁させた後、初期のストリークに対して垂直にプレートを横切って拭き取った。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で更に１８時間インキュベートした後、各試験株について任意の阻害領域を測定した（ｍｍ）。

【0387】

結果及び結論：驚くべきことに、０．５％ｗ／ｗのガラクトースの濃度でのみ、Ｂｌｉｓ Ｋ１２及びＢｌｉｓ Ｍ１８は、ＥＮＴＲ及び皮膚感染に関与する病原体に対して、増強された阻害活性（効力）及び範囲（病原性株の数）の活性を示した（表８）。これにより、ガラクトースの単なる存在だけでは十分ではあり得ないが、阻害活性を誘導するためには特定の濃度のガラクトースが必要であると結論付けることができる。

【表10】

ｎｒ＝混入により結果なし

【0388】

実施例７Ｃ：Ｋ１２又はＭ１８の阻害活性を誘導するラフィノース及びガラクトースの組み合わせの濃度の効果
この実験は、Ｋ１２及びＭ１８の阻害活性を誘導するラフィノース及びガラクトースの組み合わせの濃度の効果を判定することを目的とした。

【0389】

方法：ＣＡＢＣａ寒天プレートを、ラフィノース及びガラクトースの以下の組み合わせを用いて又は用いずに調製したことを除いて、実施例７Ｂと同様。

【表11】

【0390】

結果：表９に示されるように、様々な病原体に対する活性が、ラフィノース及びガラクトースの重量％の様々な組み合わせについて観察された。

【表12】

実施例８：トリミックス（３つの糖類の等重量％濃度の混合物）及び個々の糖類と比較した、Ｋ１２又はＭ１８によるラフィノース（２．５％）の活性
この実験は、Ｋ１２又はＭ１８の阻害範囲が、典型的にはＫ１２又はＭ１８によって阻害されない、種及び株に拡張されることが見出されたことを示す。ラフィノースのこの濃度は、いくつかのＥＮＴＲ、歯、及び皮膚病原体及びＳ．サリバリウス株を阻害することが見出された。

【0391】

使用した方法は実施例４と同じであった。

【0392】

結果：図１４～図２３は、ＥＮＴＲ、歯、及び皮膚病原体、並びにバクテリオシン産生Ｓ．サリバリウスＫ１２又はＭ１８に感受性の他のＳ．サリバリウス株に対するＫ１２又はＭ１８の阻害効果を示す。

【0393】

実施例９：ラフィノースは、Ｋ１２及びＭ１８が異なる発酵プロセスから供給され、異なる凍結乾燥保護剤混合物を含有する場合、すなわち、乳製品を含まない場合、Ｋ１２及びＭ１８の阻害活性を促進する
この実験は、ラフィノースが、成分供給業者におけるＫ１２の供給源、並びにＫ１２又はＭ１８を収容する異なる凍結乾燥保護剤マトリックスと無関係に、Ｋ１２及びＭ１８の阻害効果を増強することを示す。

【0394】

使用した方法は実施例４に記載されている。産生株ストリークのｐＨを、産生株の増殖後に調整して、全ての試験プレートについて酸性条件を変更した。

【0395】

トリミックス又は個々の糖類のいずれかとして等重量％の糖類を超える、２．５％ｗ／ｗラフィノースを有し乳製品を含まないＫ１２の増強された阻害作用が、皮膚、歯、口腔、ＥＮＴＲ疾患由来の代表的な微生物及び他のＳ．サリバリウス株に対して見られた（図２４～図２５）活性をベースライン対照に対して正規化する。

【0396】

結論：Ｋ１２又はＭ１８と同様に、乳製品を含まないＫ１２又はＭ１８もまた、ラフィノース及びガラクトースの存在下で様々な微生物に対して増強された阻害活性を示した。比較すると、トリミックス又は他の糖類は、同様の阻害効果を示さなかった。

【0397】

実施例１０Ａ：Ｋ１２の増殖及び阻害活性の誘導に対するラフィノース及びガラクトースの効果
本実施例は、ラフィノース及びガラクトースがＫ１２のより大きな細胞数に寄与しないが、それでもなお抗菌効果を増強することを示す。

【0398】

方法：増殖曲線は、Ｍ１７ブロス（対照）［ＢＤ Ｄｉｆｃｏ＃２１８５６１］、又は２．５％ラフィノース［Ｄ－（＋）－ラフィノース五水和物－Ｓｉｇｍａ＃Ｒ０２５０］、２．５％トリミックス、０．８３％若しくは２．５％ガラクトース［Ｄ－ガラクトース－ＢＤ Ｄｉｆｃｏ＃２１６３１０］、０．８３％若しくは２．５％グルコース［Ｄ（＋）－グルコース－一水和物－Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ＃Ａ３６１７］、又は０．８３％若しくは２．５％フルクトース［Ｄ（－）フルクトース－Ｓｉｇｍａ＃Ｆ３５１０］（全てｗ／ｖ）のいずれかを補充したＭ１７ブロス（試験）中の１×１０^５ＣＦＵ／ｍｌの出発培養物としてＫ１２原料を使用して導かれた。次いで、ブロス培養物を、空気中３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートし、次の０、６、及び１８時間の時点で試料を採取し、分光光度計（６００ｎｍの光学濃度（ＯＤ））を使用して細胞数及び光学濃度について分析した。細胞数を決定するために、培養試料の１：１０連続希釈物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ Ａ－Ｏｘｏｉｄ＃ＢＲ００１４Ｇ）中で調製し、次いで各希釈物の２０μｌスポットをＣＡＢＫ１２寒天プレート上に３連でスポットした。次いで、これらを空気中３７℃、５％ＣＯ_２で１８時間インキュベートした。次いで、異なる時点での各培養試料についての細胞数を、１：１０希釈物の各々で増殖したコロニーの数から計算した。

【0399】

結果：
・全ての糖類の組み合わせは、Ｋ１２について同様の細胞数をもたらし、したがって、それらは、最も高い細胞数を与えたグルコースを除いて、いかなる実質的な差異ももたらさなかった（図２６）。
・しかし、これにもかかわらず、グルコースは、いかなるより高い阻害活性ももたらさなかった（異化産物抑制による可能性が高い）。
・驚くべきことに、ラフィノース及びガラクトースの存在下で増殖させたＫ１２は、Ｓ．ピオゲネス株（図２７）又は他の病原体（図２８）に対するより高い阻害活性を示す。
・トリミックス又は別々に供給された個々の糖類のラフィノースは、対照と比較して阻害活性のいかなるより大きな増加ももたらさなかった。

【0400】

実施例１０Ｂ：Ｍ１８の増殖及び阻害活性の誘導に対するラフィノース及びガラクトースの効果
本実施例は、ラフィノース及びガラクトースが、Ｓ．サリバリウスＭ１８のより多くの細胞数に寄与しないが、それでもなお抗菌効果を増強することを示す。

【0401】

方法：増殖曲線は、Ｍ１７ブロス（対照）［ＢＤ Ｄｉｆｃｏ＃２１８５６１］、又は２．５％ラフィノース［Ｄ－（＋）－ラフィノース五水和物－Ｓｉｇｍａ＃Ｒ０２５０］、２．５％トリミックス、０．８３％若しくは２．５％ガラクトース［Ｄ－ガラクトース－ＢＤ Ｄｉｆｃｏ＃２１６３１０］、０．８３％若しくは２．５％グルコース［Ｄ（＋）－グルコース－一水和物－Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ＃Ａ３６１７］、又は０．８３％若しくは２．５％フルクトース［Ｄ（－）フルクトース－Ｓｉｇｍａ＃Ｆ３５１０］（全てｗｖ）のいずれかを補充したＭ１７ブロス（試験）中の１×１０^５ＣＦＵ／ｍｌの出発培養物としてＭ１８原料を使用して導かれた。次いで、ブロス培養物を、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートし、次の０、６、及び１８時間の時点で試料を採取し、細胞数について分析した。細胞数を決定するために、培養試料の１：１０連続希釈物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ Ａ－Ｏｘｏｉｄ＃ＢＲ００１４Ｇ）中で調製し、次いで各希釈物の２０μｌスポットをＣＡＢＫ１２寒天プレート上に３連でスポットした。次いで、これらを３７℃、５％ＣＯ_２で１８時間インキュベートした。次いで、異なる時点での各培養試料についての細胞数を、１：１０希釈物の各々で増殖したコロニーの数から計算した。

【0402】

結果：
・全ての糖類の組み合わせは、Ｍ１８について同様の細胞数をもたらした（図２８Ａ）。
・驚くべきことに、ラフィノース及びガラクトースの存在下で増殖させたＭ１８は、Ｓ．ピオゲネス菌株及び他の微生物に対するより高い阻害活性を示す（図２８Ｂ）。
・トリミックス又は別々に供給された個々の糖類のラフィノースは、対照と比較して阻害活性のいかなるより大きな増加ももたらさなかった。

【0403】

実施例１１：ラフィノース、又は糖類ガラクトース、グルコース、若しくはフルクトースのトリミックス、又は個々の糖類の存在下及び非存在下のいずれかで増殖させたＫ１２及びＭ１８原料産物の細胞形態
この実験の目的は、Ｓ．サリバリウスＫ１２及びＭ１８原料（－）が、ＣＡＢＣａ対照プレート、又は２．５％ラフィノース又は２．５％トリミックス（０．８３％の各糖類：ガラクトース、グルコース、及びフルクトース）又は０．８３％の個々の糖類を補充したＣＡＢＣａ試験プレートのいずれかで増殖させた場合、粘着性のムコイド様コロニーを産生する（対照と比較して）かどうかを判定することであった。

【0404】

乳製品を含まない原料から供給されたＳ．サリバリウスＫ１２及びＭ１８も、ＣＡＢＣａ対照プレート、又は２．５％ラフィノース又は２．５％トリミックス（０．８３％の糖類：ガラクトース、グルコース及びフルクトースの各々）を補充したＣＡＢＣａ試験プレートのいずれかで増殖させた場合の形態変化について分析した。

【0405】

方法：コロンビア血液寒天＋０．５％ＣａＣＯ_３（ＣＡＢＣａ）－１８０ｍｌボトルに、０．９ｇの炭酸カルシウム（ＣａＣＯ_３）ＰａｎＲｅａｃ Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ＃１４１２１２１２１０を、メスを使用して寒天にウェルを調製し、炭酸カルシウム中に傾け、切り取った寒天で覆うことによって、寒天のボトルに添加した。次いで、寒天をオートクレーブ内で１１０℃／１０分間融解させた後、冷却し、よく混合した後、２０ｍｌをペトリ皿にピペットで移した。

【0406】

ＣＡＢＣａ＋ラフィノース（２．５％ｗ／ｖ）－１８０ｍｌボトルに、０．９ｇのＣａＣＯ_３及び４．５ｇ（２．５％）のＤ－（＋）－ラフィノース五水和物（Ｓｉｇｍａ＃Ｒ０２５０）を、メスを使用して寒天にウェルを調製し、炭酸カルシウム中に傾け、切り取った寒天で覆うことによって、寒天のボトルに添加した。次いで、寒天をオートクレーブ内で１１０℃／１０分間融解させた後、冷却し、よく混合した後、２０ｍｌをペトリ皿にピペットで移した。

【0407】

ＣＡＢＣａ＋トリミックス（等重量％濃度の３つの糖類の混合物）。１８０ｍｌボトルに、０．９ｇのＣａＣＯ_３及び１．５ｇ（０．８３％）の各糖類：Ｄ－ガラクトース、Ｄ（＋）－グルコース、及びＤ（－）フルクトースを、メスを使用して寒天にウェルを調製し、カルシウム炭酸塩及び炭水化物中に傾け、切り取った寒天で覆うことによって、寒天のボトルに添加した。次いで、寒天をオートクレーブ内で１１０℃／１０分間融解させた後、冷却し、よく混合した後、２０ｍｌをペトリ皿にピペットで移した。

【0408】

Ｄ－（＋）－ラフィノース五水和物－Ｓｉｇｍａ＃Ｒ０２５０分子量＝５９４．５１ｇ／ｍｏｌ

【0409】

Ｄ－ガラクトース－ＢＤ Ｄｉｆｃｏ＃２１６３１０分子量＝１８０．１６ｇ／ｍｏｌ

【0410】

Ｄ（＋）－グルコース－一水和物－Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ＃Ａ ３６１７１０００分子量＝１９８．１７ｇ／ｍｏｌ

【0411】

Ｄ（－）フルクトース－Ｓｉｇｍａ－＃Ｆ３５１０分子量＝１８０．１６ｇ／ｍｏｌ

【0412】

個々の糖類：０．８３％ｗ／ｖの濃度のガラクトース、グルコース、及びフルクトース、又はこれらの糖類のトリミックスのいずれかを補充した、ＣＡＢＣａ寒天試験プレートを調製した。また、２．５％ｗ／ｖのラフィノースを補充した、ＣＡＢＣａ試験プレートを調製した。全ての試験プレートに０．５％炭酸カルシウムを補充した。また、０．５％ｗ／ｖ炭酸カルシウムを補充したＣＡＢＣａ寒天プレートを、対照プレートとして調製した。

【0413】

凍結乾燥原料：Ｋ１２－１．９４×１０^１１ｃｆｕ／ｇ、乳製品を含まないＫ１２－２．４×１０^１１ｃｆｕ／ｇ、Ｍ１８－２．２×１０^１１ｃｆｕ／ｇ、乳製品を含まないＭ１８－４．２×１０^１１ｃｆｕ／ｇ。

【0414】

希釈物：トッド・ヒューイットブロス（ＴＨＢ）－３０ｇのトッド・ヒューイットブロス粉末（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ＃２７９２４０）＋蒸留水（１０００ｍｌ）、１２１℃／１５分間オートクレーブ処理。

【0415】

産生株の調製：１ｇの原料を小さなストマッカーバッグ内で９ｍｌのＴＨＢに添加して、約１×１０^１０ｃｆｕ／ｍｌの１：１０希釈物を得た。次いで、これをストマッカー装置内で５分間混合した。次いで、ＴＨＢ中で１０^－４ｃｆｕ／ｍｌまで１：１０連続希釈を行った。

【0416】

広げプレート：２０μｌ容量の原料の１０^－４ｃｆｕ／ｍｌ希釈物を、ＣＡＢＣａ対照又はＣＡＢＣａ試験プレートのいずれかに広げた。次いで、これらを３７℃、５％ＣＯ_２で１８時間インキュベートした。次いで、プレートを視覚化し、写真撮影して、形態変化を評価した。

【0417】

繰延アッセイプレート：これらについては、前のように、１００μｌの原料の１０^－３希釈物を、糖類を補充したか又は補充していない試験ＣＡＢＣａプレートの中央に垂直な線で液滴として分注することによって調製し、次いで、カットダウンプラスチックスプレッダを使用して、プレートの中央に１．２ｃｍストリークとして広げた。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で１８時間インキュベートした。

【0418】

原料産生株ストリークを写真撮影し、次いでガラススライドを用いて除去して、細菌塊及び形態を可視化した。

【0419】

結果：広げプレート：Ｓ．サリバリウスＫ１２及びＭ１８を２．５％ｗ／ｖラフィノース上で増殖させた場合、ＣＡＢＣＡ対照プレート上で増殖させた場合よりも大きなムコイドコロニーが見られる。トリミックス（３つの糖類の等重量％濃度の混合物）又は個々の糖類のいずれかを補充したＣＡＢＣａ試験プレート上のＫ１２及びＭ１８コロニーは、ムコイドに見えなかった（図２９）。

【0420】

ＣＡＢＣａ寒天及び２．５％ｗ／ｖラフィノースを補充したＣＡＢＣａ寒天上のＫ１２及びＭ１８コロニーの拡大写真：対照と比較して、Ｓ．サリバリウスＫ１２又はＭ１８（乳製品又は乳製品を含まない）は、大きな粘着性のムコイド様コロニーとして視覚的に現れる。この効果は、２．５％ｗ／ｖトリミックス（３つの糖類の等重量％濃度の０．８３％ｗ／ｖ混合物）及び／又は０．８３％ｗ／ｖの個々の糖類では観察されなかった（図３０）。

【0421】

細菌増殖を示すＫ１２産生株ストリーク及びガラススライドの写真。点線の黒い楕円は、産生された粘液の量を視覚的に示す（図３１）。

【0422】

細菌増殖を示すＭ１８産生株ストリーク及びガラススライドの写真。点線の黒い楕円は、産生された粘液の量を視覚的に示す（図３１）。

【0423】

Ｋ１２及びＭ１８産生株ストリークもまた、２．５％ｗ／ｖラフィノースを補充したＣＡＢＣａ上で増殖させた場合、非常にムコイドに見える（図３１）。

【0424】

実施例１２：抗菌効果（阻害）の誘導はＳ．サリバリウス株により変動する
目的：補充糖類の存在下での抗菌効果の誘導が、全てのＳ．サリバリウス株の固有の特性であるかどうかを判定すること。

【0425】

方法：固体培養培地の調製－０．５％（ｗ／ｖ）炭酸カルシウムをボトル内の固体ＣＡＢ寒天に添加することによって、２．５％ｗ／ｗラフィノース又は０．５％ｗ／ｗガラクトースのいずれかを含む又は含まないＣＡＢ寒天プレートを調製し、次いで１１０℃で１０分間オートクレーブ処理することによって融解した。冷却後、濾過滅菌した糖類溶液又は蒸留水を添加して混合し、次いで２０ｍｌをペトリ皿にピペットで移した。

【0426】

Ｓ．サリバリウス産生株懸濁液を調製し、約６コロニーの各Ｓ．サリバリウス株を、１ｍｌのＴＨＢを含有する別々のチューブに添加し、十分に混合した。

【0427】

繰延アンタゴニズムアッセイ－１００μｌのＳ．サリバリウス産生株懸濁液を、ラフィノース又はガラクトースを補充したか又は補充していないＣＡＢＣａプレート上に、液滴として、試験プレートの中央に垂直線で分注した。次いで、この懸濁液を、カットダウンプラスチックスプレッダを使用してプレートの中央に１．２ｃｍストリークとして広げた。プレートを空気中３７℃、５％ＣＯ_２で１８時間インキュベートした。

【0428】

インキュベーション後、細菌増殖物を、滅菌綿棒を用いて寒天プレートから除去した。次いで、０．５Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ１１）に浸した１ｃｍ幅の濾紙ストリップを寒天プレート上に置いて酸を緩衝し、ｐＨを約ｐＨ６．５～７．５に調整することによって、産生株ストリークのｐＨを調整した。

【0429】

プレートをクロロホルム蒸気で３０分間表面滅菌し、続いて３０分間風乾した。

【0430】

３ｍｌのＴＨＢを含有する別々のチューブに各株の３～９個のコロニー（サイズに応じる）を添加することによって細菌指標懸濁液を調製した。次いで、これらの懸濁液を、産生株ストリークに対して垂直に寒天プレートを横切って拭き取り、次いで、寒天プレートを空気中で３７℃、５％ＣＯ_２で更に１８時間インキュベートした。

【0431】

結果：ＡＴＣＣから入手した株を含む、Ｓ．サリバリウス株をアッセイした。２．５％ｗ／ｗのラフィノース（図３２）又は０．５％ｗ／ｗのガラクトース（図３３）の存在下で増殖させた場合、１つを除くほとんど全ての株は、ＥＮＴ及び皮膚感染に関与する病原体に対する阻害活性を示さなかった。例外は、２．５％ｗ／ｗラフィノースを補充した場合に抗菌活性を有する、Ｋ１２及びＭ１８以外の唯一の他の株であるＳ．サリバリウスＡＴＣＣ７０７３であった。

【0432】

結論：ラフィノース又はガラクトースによるＳ．サリバリウスにおける阻害活性の誘導は、Ｓ．サリバリウスの固有の特性ではない。他のＳ．サリバリウス株にガラクトースを補充すると、Ｋ１２及びＭ１８について観察されたのと同じ阻害効果を誘導しない。Ｓ．サリバリウス株ＡＴＣＣ７０７３を除いて、他のＳ．サリバリウス株にラフィノースを補充すると、Ｋ１２及びＭ１８について観察されたのと同じ阻害効果を誘導しない。

【0433】

実施例１３：口臭を引き起こすことに関与するものを含むグラム陰性病原体に対するＫ１２又はＭ１８における抗菌活性の誘導
この実験の目的は、Ｋ１２又はＭ１８単独によって阻害されず、口臭及び他の歯の感染を引き起こし得るグラム陰性細菌Ｆ．ヌクレアタム、Ｐ．ジンジバリス、及びＰ．インターメディアに対するＫ１２又はＭ１８におけるガラクトース又はラフィノースによる阻害活性の誘導を調査することであった。

【0434】

方法：０．５％（ｗ／ｖ）炭酸カルシウムをボトル内の固体ＣＡＢ寒天に添加することによって、２．５％ｗ／ｗラフィノース、０．５％ｗ／ｗガラクトース、又は両方の糖類の組み合わせを含む又は含まないＣＡＢＣａ寒天プレートを調製し、次いで１１０℃で１０分間オートクレーブ処理することによって融解した。冷却後、濾過滅菌した糖類溶液又は蒸留水を添加して混合し、次いで２０ｍｌをペトリ皿にピペットで移した。

【0435】

ＴＨＢに懸濁したＫ１２又はＭ１８原料を用いて、繰延アンタゴニズムアッセイを行った。これを、約１～２×１０^６ｃｆｕを含有する１．２ｃｍのストリークとして、ＣＡＢＣａ対照又はＣＡＢＣａガラクトース補充試験プレートの中央に広げた。空気中３７℃、５％ＣＯ_２で１８時間増殖させた後、細菌増殖物を除去し、初期のストリーク中の寒天のｐＨを測定し、０．５Ｍ炭酸ナトリウムｐＨ１１を用いてｐＨ６．５～７．５に調整した後、クロロホルム蒸気を用いて寒天表面を滅菌した。細菌試験株をＴＨＢに懸濁し、初期のストリークに垂直にプレートを横切って拭き取り、次いで、プレートを、ａｎａｅｒｏＧｅｎサシェを収容する無酸素ジャー内で、３７℃で４日間インキュベートした。次いで、各試験株についての阻害領域を測定した（ｍｍ）。

【0436】

結果：Ｋ１２は、２．５％ｗ／ｗラフィノース又は２．５％ｗ／ｗラフィノース及び０．５％ｗ／ｗガラクトースの組み合わせのいずれかを補充した場合、口臭を引き起こすグラム陰性細菌の様々な株を阻害することが見出された（図３４）。０．５％ｗ／ｗガラクトース単独の溶液は、試験した口臭に関連する細菌種のいずれに対しても、Ｋ１２において抗菌活性を誘導しなかった。

【0437】

Ｍ１８はまた、２．５％ｗ／ｗラフィノース又は２．５％ｗ／ｗラフィノース及び０．５％ｗ／ｗガラクトースの組み合わせのいずれかを補充した場合に、口臭を引き起こす細菌のいくつかの株を阻害することが見出された（図３５）。

【0438】

実施例１４：Ｋ１２及びＭ１８凍結乾燥原料粉末にガラクトース及びラフィノースを補充した場合の阻害効果
目的：ラフィノース及び／又はガラクトースの存在下でのＫ１２及び／又はＭ１８原料粉末の阻害活性を判定すること

【0439】

方法：使用したラフィノース及びガラクトースの量は、寒天への糖類の吸収を可能にするために、産生株ストリークの領域の大きさに基づいて計算された（４．２５ｇであると計算された）。これに基づいて、０．０２１ｇ（すなわち、４．２５ｇ寒天量の０．５％ｗ／ｗガラクトース）の量のガラクトース、０．１１ｇ（すなわち、２．５％ｗ／ｗ）のラフィノース、並びにガラクトース（０．５％ｗ／ｗ）及びラフィノース（２．５％ｗ／ｗ）の組み合わせ（合計０．１３ｇ）を滅菌容器に秤量した。Ｋ１２及び／又はＭ１８原料を懸濁し、１～２×１０^６ｃｆｕ／１００μｌの濃度まで滅菌蒸留水で希釈した。次いで、１００μｌのＫ１２のみ、Ｍ１８のみ、及びＫ１２＋Ｍ１８の懸濁液を、滅菌スプレッダを使用して、ＣＡＢＣａ寒天プレートの中央に１ｃｍストリークとして広げた。加えて、Ｋ１２のみ、Ｍ１８のみ、及びＫ１２＋Ｍ１８の１００μｌ懸濁液を、上記で秤量したガラクトース及び／又はラフィノース粉末と滅菌撹拌棒を使用して混合した。各混合物の総体積を、ＣＡＢＣａ寒天プレートの中央に大口径チップを用いてピペットで移し、滅菌スプレッダを用いて中央に１ｃｍのストリークとして広げた。全てのプレートを、空気中３７℃、５％ＣＯ_２で１８時間、蓋を上にしてインキュベートした。次いで、顕微鏡スライドを使用して細菌増殖物を除去し、産生株ストリーク領域中の寒天のｐＨを測定し、０．５Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ１１）を使用してｐＨ６．５～７．５に調整した後、クロロホルム蒸気でプレートを表面滅菌した。指標細菌試験株を３ｍｌの滅菌ＴＨＢ中に懸濁し、産生株ストリーク領域に対して垂直にプレートを横切って拭き取った。プレートを空気中３７℃、５％ＣＯ_２で更に１８～２４時間インキュベートした。次いで、各試験生物についての阻害領域を、定規を使用してｍｍ単位で測定した。使用されるラフィノース及びガラクトースの量は、寒天への吸収を可能にするために、産生株ストリークの領域の大きさに基づいて計算された（４．２５ｇであると計算された）。

【0440】

結果：ガラクトース（０．５％ｗ／ｗ）及びラフィノース（２．５％ｗ／ｗ）の両方並びにそれらの組み合わせは、Ｋ１２（図３６）若しくはＭ１８（図３７）又はＫ１２及びＭ１８の組み合わせ（図３８）の凍結乾燥原料粉末において阻害活性を誘導していたことが見出された。

【0441】

実施例１５：Ｓ．サリバリウスＫ１２を含有する市販の粉末製剤（Ｄａｉｌｙ Ｄｅｆｅｎｃｅ Ｊｕｎｉｏｒ）における阻害活性の誘導に対するラフィノース及びガラクトースの効果
目的：市販の粉末製剤Ｄａｉｌｙ Ｄｅｆｅｎｃｅ Ｊｕｎｉｏｒ（組成：Ｓ．サリバリウスＫ１２（１．２５×１０^９（ｃｆｕ／０．８ｇ）、イソマルト、マルトデキストリン、バニラ香料）中のＳ．サリバリウスＫ１２の阻害効果を、添加した補充糖類であるラフィノース及びガラクトースと比較すること。

【0442】

方法：試験用の製剤を以下のように調製した。
１．対照：Ｓ．サリバリウスＫ１２を含有する市販の粉末製剤（Ｄａｉｌｙ Ｄｅｆｅｎｃｅ Ｊｕｎｉｏｒ）
２．ガラクトース０．５％ｗ／ｗを市販の粉末に添加し、徹底的に混合して、均一し混合物を得た。
３．ラフィノース２．５％ｗ／ｗを市販の粉末に添加し、徹底的に混合して、均一な混合物を得た。

【0443】

以下の方法を使用して、粉末製剤の状況下でのＳ．サリバリウスＫ１２の阻害効果を測定した。０．５％炭酸カルシウムを含有する正確に４０ｍＬの５０℃溶融ＣＡＢ寒天（ＣＡＢＣａ）を寒天プレート（１２０×１２０ｍｍ）に注いだ。寒天を冷却して凝固させた後、中央で分割し、寒天ゲルの半分を除去した。他方の半分は、「Ａ」側とマークしたブランク寒天としてプレート上に残した。約０．８ｇの各組み合わせ（（１）ガラクトース、（２）ラフィノース、又は（３）ラフィノース及びガラクトースの組み合わせを有するＤＤＪ粉末）を、１ｍＬの滅菌蒸留水と混合し、ボルテックスして均質な懸濁液を生成した。１００μｌの懸濁液を、寒天の表面（産生株Ｂ側）上に広げるために取っておいた。次いで、残りの懸濁液を２０ｍＬの溶融ＣＡＢＣａ寒天と混合し、混合物を寒天プレートの空の半分に注いで、産生株「Ｂ」側を形成した。１００μＬの取っておいた懸濁液をＢ側の表面上に広げ、プレートを空気中で３７℃、５％ＣＯ_２で１８時間インキュベートした。インキュベーション後、産生株Ｂ側上の細菌増殖物を除去した。産生株側のｐＨを測定し、０．５Ｍ炭酸ナトリウムｐＨ１１の溶液を寒天に浸けることによって６．５～７．５に調整した。プレート表面をクロロホルム蒸気で滅菌した。細菌指標株をＴＨＢに懸濁し、滅菌綿棒を使用して、左（ブランク寒天Ａ側）から右（産生株Ｂ側）に寒天プレートを横切ってストリークした。プレートを再び、空気中で３７℃、５％ＣＯ_２で１８時間インキュベートした。各指標株の阻害領域を、定規を用いて測定した（ｍｍ単位）。結果はまた、小さなコロニー又は完全な阻害領域の存在を確定するために肉眼を用いて読み取った。

【0444】

結果：図３９は、Ｓ．サリバリウスＫ１２の阻害活性が、ラフィノース（２．５％ｗ／ｗ）、ガラクトース（０．５％ｗ／ｗ）、又はそれらの組み合わせ（ラフィノース２．５％ｗ／ｗ＋ガラクトース０．５％ｗ／ｗ）を含有する粉末において、Ｋ１２を単独で含有する市販粉末（対照）と比較して向上したことを示す。

【0445】

実施例１６：米国特許出願公開第２０１９０３４３８９９（Ａ１）号からの製剤の特性
目的：米国特許出願公開第２０１９０３４３８９９号からの先行技術の製剤の製造条件を決定すること。

【0446】

方法：先行技術Ｄ１の実施例１の指図に従って製剤を調製した。簡潔には、液体成分を一緒に混合し、固体成分にゆっくり添加し、融解するまでホットプレート上で約１００℃に加熱した。次いで、混合物を、約６０℃で完全に固化するまで放冷した。

【0447】

結果：米国特許第２０１９０３４３８９９号の実施例１に記載されている製剤を、成分を溶融して、ハードキャンディ又はタフィーの粘稠度を有する製剤を調製することによって調製した。成分を溶融するために、高温（約１００℃）が必要であった。高熱により、５０℃を超える温度がプロバイオティクスにとって有害であるため、Ｓ．サリバリウスは製剤に添加することができなかった。この理由のため、プロバイオティクス、特にＳ．サリバリウスなどの熱感受性プロバイオティクスを完全に失うことなく、溶融段階（約６０℃超）で製剤に添加することは不可能であった。

【0448】

冷却中、十分な均質性を有する製剤へのプロバイオティクスの混合を可能にした製剤の粘稠度は、６０℃以上の温度でのみ維持された。この温度は、約５０℃以上から起こる細胞死を引き起こすことなくプロバイオティクスを添加するには依然として高すぎた。

【0449】

実施例１７：比較例－国際公開第２０１７１２９６３９（Ａ１）号からの製剤
方法：国際公開第２０１７１２９６３９号の実施例１のものと同様組成の粉末の乳幼児用栄養製品（乳児用調整乳）を購入した（Ｓｉｍｉｌａｃ ３６０ Ｔｏｔａｌ Ｃａｒｅ（Ａｂｂｏｔｔ Ｇｌｏｂａｌ）。この製品は、ビタミン、ミネラル、ラクトース、５つのヒトオリゴ糖及び全乳粉末を含有する。

【0450】

調整乳中のＳ．サリバリウスＫ１２における阻害活性の誘導に対する補充糖類の効果を判定するため、Ｓ．サリバリウスＫ１２及び補充糖類を、以下のように乳児用調整乳に添加した。
１．対照：Ｓ．サリバリウスＫ１２を乳児用調整乳粉末に添加し、徹底的に混合して、約１．２５×１０^９ｃｆｕ／ｇのＳ．サリバリウスＫ１２を含有する均一な混合物を得た。
２．ガラクトース０．５％ｗ／ｗ：Ｓ．サリバリウスＫ１２を乳児用調整乳粉末及び０．５％ｗ／ｗガラクトースに添加し、徹底的に混合して、約１．２５×１０^９ｃｆｕ／ｇのＳ．サリバリウスＫ１２を含有する均一な混合物を得た。．
３．ラフィノース２．５％ｗ／ｗ：Ｓ．サリバリウスＫ１２を乳児用調整乳粉末及び２．５％ｗ／ｗラフィノースに添加し、徹底的に混合して、約１．２５×１０^９ｃｆｕ／ｇのＳ．のサリバリウスＫ１２を含有する均一な混合物を得た。

【0451】

阻害活性誘導の測定は、実施例１５と同様に行った。

【0452】

結果：驚くべきことに、実施例１７の対照製剤へのガラクトース又はラフィノースの添加が、対照と比較して阻害活性の低下を示した（表１０）。

【0453】

実施例１８：粉末製剤の抗菌特性の比較
方法：いくつかの組成物の抗菌活性を以下のように試験した。
１．実施例１７の対照製剤；
２．全乳粉末：Ｓ．サリバリウスＫ１２を全乳粉末（Ａｎｃｈｏｒ Ｂｌｕｅ（商標）Ｍｉｌｋ ｐｏｗｄｅｒ、Ａｎｃｈｏｒ、ニュージーランド）に添加し、徹底的に混合して、約１．２５×１０^９ｃｆｕ／ｇのＳ．サリバリウスＫ１２を含有する均一な混合物を得た。

【0454】

粉末製剤の阻害活性誘導の測定は、実施例１５と同様に行った。

【0455】

結果：驚くべきことに、これらの２つの製剤は、ラフィノース、ガラクトース、及びそれらの組み合わせを補充していた市販のＳ．サリバリウスＫ１２ Ｄａｉｌｙ Ｄｅｆｅｎｃｅ Ｊｕｎｉｏｒ粉末製品を含有する実施例１５の３つの製剤と比較して、阻害活性を全く誘導しなかったか、又は有意性が低かった（図４０）。

【表13】

Ａ＝ガラクトース０．５％ｗ／ｗを含有する実施例１７の乳児用調整乳製剤２、Ｂ＝ラフィノース２．５％ｗ／ｗを含有する実施例１７の乳児用調整乳製剤３、－記号は、実施例１７の対照製剤１と比較した活性の低下を示す。

【0456】

実施例１９：有益な遺伝子の上方制御
目的：抗菌性分子をコードする遺伝子、及びガラクトース又はラフィノースの存在下で抗菌効力の向上を引き起こし得るＳ．サリバリウスＫ１２内の他の任意の有益な遺伝子の上方制御を調査すること。

【0457】

方法：０．５％（ｗ／ｖ）炭酸カルシウムをボトル内の固体ＣＡＢ寒天に添加することによって、２．５％ｗ／ｗラフィノース、０．５％ｗ／ｗガラクトース、２．５％ｗ／ｗラフィノースと０．５％ｗ／ｗガラクトース、０．５％ｗ／ｗグルコース、又は２．５％ｗ／ｗグルコースとの組み合わせを含む又は含まないＣＡＢＣａ寒天プレートを調製し、次いで１１０℃で１０分間オートクレーブ処理することによって融解した。冷却後、濾過滅菌した糖類溶液又は蒸留水を添加して混合し、次いで２０ｍｌをペトリ皿にピペットで移した。

【0458】

約１×１０^８ｃｆｕ／ｍｌのＳ．サリバリウスＫ１２原料懸濁液をＰＢＳ中で調製した。１００μｌのこの懸濁液を、対照及び試験寒天プレート上に均一に広げた。プレートを３７℃で、５％ＣＯ_２で約１９時間インキュベートした。

【0459】

各プレートからの細菌増殖物を、滅菌綿棒を使用して収集し、スクリューキャップ付きチューブ内の１ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。次いで、細菌細胞を１３０００ｒｐｍで１分間、４℃で遠心分離することによってペレット化した。上清を除去し、細胞ペレットを１ｍｌのＴＲＩｚｏｌ試薬に再懸濁した。細菌細胞懸濁液を、０．１ｍｍジルコニア／ケイ素ビーズを収容する２ｍｌのスクリューキャップ付きチューブに移した。次いで、これらのチューブを最高速度で５分間ボルテックスして、細菌細胞をビーズビート（bead beat）して溶解させた。チューブを氷上に１分間置き、次いでボルテックス上で再び５分間再ビーズビートした。次いで、チューブを－２０℃で凍結した。

【0460】

溶解した細菌懸濁液を解凍し、０．２ｍｌのクロロホルムを各チューブに添加した。チューブを２～３分間インキュベートし、氷上に保持し、チューブを頻繁に反転させることによって手動でも混合した。次いでビーズを沈降させ、次いで上部の液体懸濁液を相形成チューブに移した。チューブを頻繁に反転させることによって手動で混合しながら、チューブを氷上で５分間インキュベートした。次いで、チューブを１２０００ｒｐｍで、４℃で１５分間遠心分離し、下部（赤色）フェノール－クロロホルム相、中間相、及び上部（透明）水相に分離した。

【0461】

５６０μｌの透明な上部水相を新しいエッペンドルフチューブに移し、次いで－２０℃で再び凍結させた。

【0462】

ＲＮＡ抽出に使用した実験室ベンチ及び他の装置をＲＮａｓｅＺａｐで処置して、あらゆるあり得るＲＮａｓｅを除去した。

【0463】

Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＲＮＡミニキットを用いて、ＴＲＩｚｏｌ試料からＲＮＡを抽出するための製造業者の説明書に従って、以下のようにＴＲＩｚｏｌ解凍懸濁液からＲＮＡを抽出した。

【0464】

６００μｌの７０％エタノールを、解凍した溶解細菌懸濁液の各チューブに添加した。約６００μＬの試料を収集チューブ内のスピンカートリッジに移した。

【0465】

室温で１５秒間、１２０００×ｇで遠心分離した。フロースルーを廃棄し、スピンカートリッジを同じ収集チューブに再挿入した。最後の６００μｌの試料を添加し、スピンカラムを再び遠心分離した。フロースルーを廃棄し、スピンカートリッジを同じ収集チューブに再挿入した。

【0466】

７００μＬの洗浄緩衝液Ｉをスピンカートリッジに添加した。室温で１５秒間、１２０００×ｇで遠心分離した。フロースルー及び収集チューブを廃棄した。スピンカートリッジを新しい収集チューブに挿入した。

【0467】

５００μＬの洗浄緩衝液ＩＩをスピンカートリッジに添加した。

【0468】

室温で１５秒間、１２０００×ｇで遠心分離した。フロースルーを廃棄し、スピンカートリッジを同じ収集チューブに再挿入した。別の５００μＬの洗浄緩衝液ＩＩをスピンカートリッジに添加し、１２０００×ｇで１分間、室温で遠心分離して膜を乾燥させた。収集チューブを廃棄し、スピンカートリッジを新しいエッペンドルフチューブに挿入した。

【0469】

１００μＬのＲＮａｓｅを含まない水を、スピンカートリッジの中心に添加した。室温で１分間インキュベートした。スピンカートリッジをエッペンドルフチューブにより室温で、≧１２０００×ｇで２分間遠心分離して、ＲＮＡを溶出させた。

【0470】

溶出したＲＮＡの濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用して測定した。

【0471】

次いで、抽出したＲＮＡをＤＮａｓｅ処置して、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＴＵＲＢＯ－ＤＮＡ Ｆｒｅｅキットを用いて以下のようにしてあらゆる混入ＤＮＡを除去した。

【0472】

５０μｇ未満のＲＮＡを含有する５０μｌの反応物を調製した。同じ濃度のＲＮＡを各試料の反応物に添加して、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＲＮＡ濃度から計算して、全ての試料にわたるＲＮＡの量を標準化した。エッペンドルフチューブ内の反応物を、必要とされる量のＲＮＡ、５μｌのＴｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ緩衝液、２μｌのＴｕｒｂｏ ＤＮａｓｅと混合し、次いで、全ての試薬を氷上に保ちながら、ヌクレアーゼを含まない水で体積を５０μｌにした。ナノドロップを使用してＤＮａｓｅ処置されたＲＮＡ試料の濃度を測定するときのブランクとして使用するために、非ＲＮＡ対照試料を調製した。エッペンドルフチューブを３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、反応物を１０μｌのＤＮａｓｅ不活性化試薬の添加によって不活性化し、十分に混合した。エッペンドルフチューブを室温で５分間インキュベートし、２～３回反転させて、インキュベーション中に試薬を混合した。試料を１０，０００×ｇで１．５分間遠心分離した。次いで、上清を新しいエッペンドルフチューブに移し、これも遠心分離し、上清を再び新しいエッペンドルフチューブに移した。次いで、ＤＮａｓｅ処置したＲＮＡ試料の濃度を、ブランクとして非ＲＮＡ対照試料を使用して、ナノドロップを使用して測定した。

【0473】

次いで、ＤＮａｓｅ処置したＲＮＡ試料を、ＳａｌＢプライマを使用して、ＰＣＲによって約５００ｐｂのサイズのＤＮＡバンドを生成するＤＮＡ混入物についてチェックした。

【0474】

各ＤＮａｓｅ処置したＲＮＡ試料、Ｓ．サリバリウスＫ１２から抽出されたＤＮＡの陽性対照試料、及びヌクレアーゼを含まない水のみを含有する陰性対照試料について、ＰＣＲ反応物を、０．２ｍｌのＰＣＲチューブ内で調製した。１２．５μｌのＧｏＴａｑ Ｇ２ Ｈｏｔ ｓｔａｒｔ ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ、１μｌのＳａｌＢフォワードプライマ、１μｌのＳａｌＢリバースプライマ、１μｌのＲＮＡ又はＤＮＡ試料のいずれか、及びヌクレアーゼを含まない水を２５μｌの体積まで混合することによって、２５μｌの反応物を調製した。

【0475】

ＰＣＲ増幅は、９４℃で１５分間の初期変性、続いて以下の３０サイクルからなった：変性９５℃で３０秒間；アニーリング４０℃で３０秒間；伸長７３℃で３０秒間。３０サイクル後、９２℃で更に２分間。

【0476】

ＰＣＲ増幅後、１×ＳＹＢＲ ｓａｆｅＤＮＡゲル染色及び１．５ｍｍ幅コームを含有する０．５ｃｍ厚の２％アガロース／１×ＴＡＥゲルを、１０μｌの各ＤＮａｓｅ処置したＲＮＡ試料又は５μｌのＡｃｃｕＲｕｌｅｒ １ ｋｂ ＤＮＡ ＲＴＵラダーのいずれかと共にウェルに充填して、任意の可視化バンドのバンドサイズを決定した。

【0477】

ＤＮａｓｅ処置した試料中にＤＮＡバンドは検出されず、あらゆるＤＮＡ混入物が除去されたことが確認された。

【0478】

次に、ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ ｖｉｌｏマスターミックスを使用して、以下のように製造業者の説明書に従って、ＲＮＡ試料をｃＤＮＡに変換した。

【0479】

最大２．５μｇのＲＮＡを収容する０．２ｍｌのＰＣＲチューブ内で２０μｌの反応物を調製し、全ての試料がチューブ内で同じ濃度のＲＮＡを有するように、添加されたＲＮＡの量を正規化した。各チューブに、４μｌのｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ ｖｉｌｏマスターミックスを添加し、ヌクレアーゼを含まない水で体積を２０μｌにした。各試料について同じ濃度のＲＮＡを含有するが、４μｌのｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ ｖｉｌｏ Ｎｏ ＲＴ対照を添加した二連の反応物セットを調製し、体積もヌクレアーゼを含まない水で２０μｌにした。

【0480】

次いで、ＰＣＲチューブをＰＣＲ装置に入れて、以下のインキュベーションを行った：２５℃で１０分間（プライマアニーリング）、５０℃で１０分間（ＲＮＡを逆転写する）、８５℃で５分間（酵素不活性化する）。

【0481】

次いで、ＣＡＢＣａ対照プレート及び様々な糖類を補充したＣＡＢＣａ上で増殖させたＫ１２原料由来のｃＤＮＡ試料を、以下の遺伝子：ｓａｌＡ、ｓａｌＢ、ｓａｌＱ、及びｕｒｅＣの遺伝子発現のレベルについてｑＰＣＲによって分析した。

【0482】

２μｌのｃＤＮＡ、５μｌのＳＹＢＲグリーンマスターミックス、０．５μｌのフォワードプライマ、０．５μｌのリバースプライマ、及びヌクレアーゼを含まない水を含有する１０μｌのｑＰＣＲ反応物を１０μｌまで調製した。各ｑＰＣＲにおけるｃＤＮＡの希釈は、各プライマセットで最適化した。

【0483】

ｑＰＣＲ法は、以下のサイクルからなった：保持段階：５０℃で２分間、続いて９５℃で１０分間；ＰＣＲ段階：９５℃で１５秒間、続いて６０℃で１分間；融解曲線段階：９５℃で１５秒間、６０℃で１分間、続いて９５℃で１５秒間。

【0484】

相対発現レベルを分析するために、２^{－ΔΔＣｔ}法を使用して、様々な糖をＣＡＢＣａプレート対照と比較して、相対倍数遺伝子発現レベルを決定した。この分析に使用した参照遺伝子は、ｇｙｒＡであった。

【0485】

結果：ｓａｌＡ及びｓａｌＢ遺伝子の両方は、２．５％ｗ／ｗラフィノース、０．５％ｗ／ｗガラクトースのいずれか又は両方の組み合わせが添加された場合、糖なし対照と比較して、Ｋ１２において上方制御された（図４１及び図４２）。興味深いことに、０．５％ｗ／ｗガラクトースは、ｓａｌＡの遺伝子発現の最大増加（約１２０００倍）及びｓａｌＢの最大増加（６４１倍）を引き起こし、続いて２．５％ｗ／ｗラフィノースによって（約５０００倍及び２４１倍）、次いで組み合わせによって（約２４００倍及び１６０倍）を引き起こすと思われた。これらの遺伝子の上方制御は、対照糖グルコースを０．５％ｗ／ｗ（約５０及び２３倍）又は２．５％ｗ／ｗ（５．２及び０．８倍）濃度のいずれかで添加した場合、同程度には起こらなかった。

【0486】

更に、ｓａｌＱは、２．５％ｗ／ｗラフィノース（９３倍）、０．５％ｗ／ｗガラクトース（２０５倍）のいずれか、又は両方の組み合わせ（４５倍）を添加した場合、糖なし対照と比較して上方制御された（図４３）。しかし、ｓａｌＱはまた、２．５％ｗ／ｗグルコース（８１倍）が添加された場合に上方制御されるとみられ、これが全般的な糖効果であり得ることを示す。

【0487】

２．５％ｗ／ｗラフィノース、０．５％ｗ／ｗガラクトースのいずれか、又は両方の組み合わせを培地に添加した場合、ウレアーゼ（ｕｒｅＣ）の上方制御があり、それぞれ２３４倍、２２４倍及び１９１倍の増加で発現した（図４４）。０．５％ｗ／ｗ及び２．５％ｗ／ｗグルコースもまた、それぞれ２２倍及び９６倍のウレアーゼ発現の中程度の増加をもたらした。

【0488】

実施例２０：健康なヒト応募者の口腔におけるＫ１２コロニー形成のレベルの変化
目的：ガラクトース及び／又はラフィノースの、市販Ｓ．サリバリウスＫ１２舐剤製剤（Ｔｈｒｏａｔ Ｇｕａｒｄ Ｐｒｏ、Ｂｌｉｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ニュージーランド））への添加が、７日間１日１回摂取した場合にＫ１２のコロニー形成レベルを変化させるかどうかを判定すること。

【0489】

方法：クロスオーバーを伴わない二重盲検無作為化対照コロニー形成パイロット試験を健康なヒト成人において実施して、ガラクトース又はラフィノースを含まない（対照Ｇ１、Ｓ．サリバリウスＫ１２、イソマルト、錠剤化助剤、及び天然香料を含有、Ｂｌｉｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ニュージーランド））Ｓ．サリバリウスＫ１２を含有する舐剤（約２，５００，０００，０００ｃｆｕ／舐剤）のコロニー形成効力と、ラフィノース２．５％ｗ／ｗ（Ｇ２）、ガラクトース０．５％ｗ／ｗ（Ｇ３）、並びにガラクトース０．５％ｗ／ｗ及びラフィノース２．５％ｗ／ｗの組み合わせ（Ｇ４）を追加で含有する舐剤のコロニー形成効力とを評価する。

【0490】

舐剤Ｇ２～Ｇ４を、Ｓ．サリバリウスＫ１２、イソマルト、錠剤化助剤、及び天然香料と、ラフィノース２．５％ｗ／ｗ（Ｇ２）；ガラクトース０．５％（Ｇ３）；並びにガラクトース０．５％ｗ／ｗ及びラフィノース２．５％ｗ／ｗ（Ｇ４）とをブレンドすることによって調製した。次いで、各ブレンドを打錠機にかけて、舐剤を得た。４群の各舐剤は、約２，５００，０００，０００ｃｆｕ／舐剤を含有するように製剤化した。

【0491】

参加者は、参加者らが健康であり、良好な口腔衛生を実践しており、１８～８０歳であり、抗生物質療法を受けておらず、免疫不全状態ではなく、又は自己免疫疾患の病歴がなく、乳製品に対するアレルギー若しくは感受性を有する人でない場合に、登録された。組み入れ基準に従って、合計２０人の参加者を募集し、４群に分けた。
試験群：Ｋ１２舐剤（２．５Ｂｃｆｕ／舐剤）
Ｇ１：Ｋ１２舐剤（対照）（ｎ＝５）
Ｇ２：ラフィノース（２．５％ｗ／ｗ）を含有するＫ１２舐剤（ｎ＝５）
Ｇ３：ガラクトース（０．５％ｗ／ｗ）を含有するＫ１２舐剤（ｎ＝５）
Ｇ４：ラフィノース（２．５％ｗ／ｗ）及びガラクトース（０．５％ｗ／ｗ）を含有するＫ１２舐剤（ｎ＝５）

【0492】

うがい薬でうがいし（最初の夜のみ）、１時間待ってから唾液試料（試験前試料）を採取するように、参加者に依頼した。次いで、口中で１個の舐剤をゆっくり溶解させるように参加者に依頼した。次いで、舐剤を服用してから１時間後、８時間後、及び２４時間後に更なる唾液試料を採取するように参加者に依頼した。次いで、更に６夜の間、一晩当たり１個の舐剤を服用し、最後の投薬の４８時間後に最終唾液試料を収集するように、参加者に依頼した。

【0493】

微生物サンプリング及び分析：試験中及び試験終了時に、各時点及び各参加者の唾液試料を収容するチューブを収集し、分析するまで冷凍庫（－２０℃）で保管した。

【0494】

唾液試料を、１０^－４に連続希釈して（１００μＬ試料の９００μＬのＰＢＳへの再懸濁の複数の反復）、プレート当たり５０μＬの接種材料を使用して、ミティス・サリヴァリウス（Mitis-Salivariu）寒天プレート（ストレプトコッカス・サリバリウス選択培地）上に播種した。プレートを、空気中３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、Ｋ１２又はＭ１８コロニーを、特定の指標株Ｉ１（マイクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）Ｔ－１８）及びＩ３ストレプトコッカス・コンステラータスＴ－２９）に対するそれらの阻害活性によって区別した。指標株Ｉ１の懸濁液は、３ｍｌのＴＨＢに１コロニーを添加することによって作製し、Ｉ３懸濁液は、３ｍｌのＴＨＢに４コロニーを添加することによって作製した。指標株を、寒天の全表面を覆う血液寒天プレート（ｓＢａＣａ）上で拭き取った。爪楊枝を使用して、ミティス・サリヴァリウス寒天上の唾液試料から増殖したＳ．サリヴァリウス様コロニーを、Ｉ１、次いでＩ３の予め播種した指標ローンにスパイクし、空気中３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。Ｉ１及びＩ３の両方に対して阻害領域を有するコロニーは、ｓａｌＡ及びｓａｌＢ遺伝子の活性を示すので、推定陽性Ｋ１２として特定した。

【0495】

結果
図４５は、補充糖類ガラクトース（Ｇ２）、ラフィノース（Ｇ３）、並びにラフィノース及びガラクトース（Ｇ４）を含む舐剤を使用した参加者の群から得られた唾液試料中の（総Ｓ．サリバリウス中の）Ｓ．サリバリウスＫ１２の平均％が、Ｓ．サリバリウスＫ１２単独（対照Ｇ１）の対照群の平均％よりも高かったことを示す。したがって、補充糖類の存在は、口腔内でのＳ．サリバリウスＫ１２のコロニー形成効率を高めた。

【0496】

補充糖類群では、全ての試料点についての試験前レベルと比較して、ラフィノース（Ｇ３）がコロニー形成の最大増加を示し、次いでガラクトース（Ｇ２）及びラフィノースとガラクトースとの組み合わせ（Ｇ４）であった。総Ｓ．サリバリウス集団中のＳ．サリバリウスＫ１２の％は、ラフィノース群（Ｇ３）の場合より高く維持されている。ラフィノース群におけるレベルは、舐剤摂取の中止後であっても、試験前よりも高く維持され、これは、補充糖類によるＳ．サリバリウスＫ１２の持続の改善を示唆する。

【0497】

本発明の範囲を上述の実施例のみに限定することは意図されていない。当業者によって理解されるように、添付の特許請求の範囲に記載された本発明の範囲から逸脱することなく、多くの変形が可能である。

【表14】

【表15】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図28A】

【図28B】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【配列表】

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【国際調査報告】