特表 2024-536305 ヒト骨髄由来間葉系幹細胞シートおよびその製造のための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-04

(54)【発明の名称】ヒト骨髄由来間葉系幹細胞シートおよびその製造のための方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0775 20100101AFI20240927BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20240927BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20240927BHJP

   A61L 27/38 20060101ALI20240927BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20240927BHJP

   A61P 19/04 20060101ALI20240927BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240927BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240927BHJP

   A61K 9/70 20060101ALI20240927BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0775

C12N1/00 B

A61K35/28

A61L27/38

A61L27/38 100

A61L27/38 300

A61P13/12

A61P19/04

A61P43/00 107

A61P37/02

A61K9/70

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024519979

(86)(22)【出願日】2022-09-30

(85)【翻訳文提出日】2024-05-30

(86)【国際出願番号】 US2022045435

(87)【国際公開番号】W WO2023056053

(87)【国際公開日】2023-04-06

(31)【優先権主張番号】63/251,144

(32)【優先日】2021-10-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/278,136

(32)【優先日】2021-11-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】399047002

【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデーション

(71)【出願人】

【識別番号】521529927

【氏名又は名称】エスシーエム ライフサイエンス インコーポレーテッド

【氏名又は名称原語表記】ＳＣＭ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100188374

【弁理士】

【氏名又は名称】一宮 維幸

(72)【発明者】

【氏名】岡野 光夫

(72)【発明者】

【氏名】グレインジャー，デビッド・ダブリュー

(72)【発明者】

【氏名】岡 雅俊

(72)【発明者】

【氏名】キム，キョンス

(72)【発明者】

【氏名】亀石 統子

(72)【発明者】

【氏名】ソン，スン・ウク

(72)【発明者】

【氏名】ダン，セリア・エム

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C081

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065BB19

4B065BC50

4B065CA44

4B065CA60

4C076AA71

4C076BB32

4C076CC07

4C076CC17

4C076CC26

4C081AB11

4C081BA12

4C081BA13

4C081CD34

4C081DA02

4C081EA01

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB64

4C087CA04

4C087MA32

4C087MA67

4C087NA14

4C087ZA81

4C087ZA96

4C087ZB07

4C087ZB22

(57)【要約】

本開示は、ヒトｈＢＭＳＣの１つまたは複数の層を含むヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ）シートであって、単一細胞から生成されたヒトクローン性骨髄由来間葉系幹細胞株から調製される、細胞シートを提供する。本開示は、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞シートを製造するための方法であって、細胞培養支持体の基材表面上へコーティングされた温度応答性ポリマー上で、培養液中でｈＢＭＳＣを培養する工程であって、温度応答性ポリマーが、０～８０℃の水中での下限臨界共溶温度を有する、工程と；培養液の温度を下限臨界共溶温度未満に調整し、それによって基材表面が親水性にされ、該表面への細胞シートの接着が弱められる工程と；培養支持体から細胞シートを分離する工程とを含む、方法も提供する。細胞シートは、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）または塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）で処理されてもよい。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ）の１つまたは複数の層を含むヒト骨髄由来間葉系幹細胞シートであって、単一細胞から生成されたヒトクローン性骨髄由来間葉系幹細胞株から調製される、細胞シート。

【請求項2】

細胞シート中のｈＢＭＳＣが、コンフルエントである、請求項１に記載の細胞シート。

【請求項3】

ヒトクローン性骨髄由来間葉系幹細胞株が、細胞シートの調製前に凍結された、請求項１または２に記載の細胞シート。

【請求項4】

ヒトクローン性骨髄由来間葉系幹細胞株が、細胞シートの調製前に凍結されていない、請求項１または２に記載の細胞シート。

【請求項5】

ｈＢＭＳＣから本質的になる、請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞シート。

【請求項6】

細胞シート中の細胞の少なくとも９０％が、ｈＢＭＳＣである、請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞シート。

【請求項7】

細胞シート中のｈＢＭＳＣが、ヒト成長因子（ＨＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）からなる群から選択される１つまたは複数のサイトカインを発現する、請求項１から６のいずれか一項に記載の細胞シート。

【請求項8】

細胞シート中の１つまたは複数のサイトカインの発現が、同等数の細胞を含有するｈＢＭＳＣの懸濁液と比較して増大する、請求項７に記載の細胞シート。

【請求項9】

細胞シートを調製するために使用される細胞培養支持体におけるヒトクローン性骨髄由来間葉系幹細胞株の初期播種細胞密度が、４．５×１０^４～３．４×１０^５細胞／ｃｍ^２である、請求項１から８のいずれか一項に記載の細胞シート。

【請求項10】

請求項１から９のいずれか一項に記載の細胞シートと細胞シートから取り外し可能であるポリマーコーティングされた培養支持体とを含む組成物。

【請求項11】

コンフルエントなヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ）の１つまたは複数の層を含むヒト骨髄由来間葉系幹細胞シートを製造するための方法であって、
ａ）細胞培養支持体の基材表面上へコーティングされた温度応答性ポリマー上で、培養液中でｈＢＭＳＣを培養する工程であって、培養液中のｈＢＭＳＣが、単一細胞から生成されたヒトクローン性骨髄由来間葉系幹細胞株であり、温度応答性ポリマーが、０～８０℃の水中での下限臨界共溶温度を有する、工程と；
ｂ）培養液の温度を下限臨界共溶温度未満に調整し、それによって基材表面が親水性にされ、該表面への細胞シートの接着が弱められる工程と；
ｃ）培養支持体から細胞シートを分離する工程とを含む、方法。

【請求項12】

培養液中のｈＢＭＳＣが、培養する工程（ａ）の前に凍結された、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

培養液中のｈＢＭＳＣが、培養する工程（ａ）の前に凍結されていない、請求項１１に記載の方法。

【請求項14】

培養する工程（ａ）が、培養液に初期細胞播種密度４．５×１０^４～３．４×１０^５細胞／ｃｍ^２でｈＢＭＳＣを添加する工程を含む、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

培養する工程（ａ）の前に複数の二次培養によってｈＢＭＳＣを培養する工程をさらに含む、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

培養する工程（ａ）の前にｈＢＭＳＣの二次培養が、２～１０回実行される、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

ｈＢＭＳＣが、調整する工程（ｂ）の前に温度応答性ポリマー上の培養液中で少なくとも１日間培養される、請求項１１から１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

ｈＢＭＳＣが、温度応答性ポリマー上の培養液中で１～３日間培養される、請求項１１から１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

調整する工程（ｂ）が、培養液中のｈＢＭＳＣがコンフルエントであるときに実行される、請求項１１から１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

請求項１１から１９のいずれか一項に記載の方法によって製造される細胞シート。

【請求項21】

細胞シートを対象に移植する方法であって、請求項１から１０または２０のいずれか一項に記載の細胞シートを対象の組織に適用する工程を含む、方法。

【請求項22】

組織が腎組織である、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

対象が、腎移植を受けている、請求項２１または２２に記載の方法。

【請求項24】

対象が、急性腎傷害を有する、請求項２１または２２に記載の方法。

【請求項25】

対象が、腎尿細管傷害を有する、請求項２１または２２に記載の方法。

【請求項26】

細胞シートを腎組織に適用する工程が、細胞シートから腎臓の柔組織への細胞の遊走をもたらす、請求項２２から２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

細胞シートを腎組織に適用する工程が、細胞シートと接触されない腎臓と比較して、腎臓におけるヒト成長因子（ＨＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）からなる群から選択される１つまたは複数のサイトカインのレベルの増大をもたらす、請求項２２～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

対象における腎線維化を抑制する方法であって、請求項１から１０または２０のいずれか一項に記載の細胞シートを対象の腎組織に適用し、それにより対象における腎線維化を抑制する工程を含む、方法。

【請求項29】

細胞シートを腎組織に適用する工程が、クローン性細胞株ではないｈＢＭＳＣから調製されるｈＢＭＳＣシートより大きな程度で腎線維化を抑制する、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

細胞シート中のｈＢＭＳＣが、対象と同種である、請求項２１から２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

対象が、ヒトである、請求項２１から３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ）の１つまたは複数の層を含む骨髄由来間葉系幹細胞シートであって、単一細胞から生成されたヒトクローン性骨髄由来間葉系幹細胞株から調製され、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）または塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）で処理される、細胞シート。

【請求項33】

細胞シート中のｈＢＭＳＣが、コンフルエントである、請求項３２に記載の細胞シート。

【請求項34】

ｈＢＭＳＣから本質的になる、請求項３２または３３に記載の細胞シート。

【請求項35】

細胞シート中の細胞の少なくとも９０％が、ｈＢＭＳＣである、請求項３２から３４のいずれか一項に記載の細胞シート。

【請求項36】

細胞シート中のｈＢＭＳＣが、ＩＦＮ－γまたはｂＦＧＦで処理されないｈＢＭＳＣシートと比較して、ＨＬＡ－ＤＲ、ＰＤ－Ｌ１、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、インターロイキン１０（ＩＬ－１０）およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ－２）からなる群から選択される１つまたは複数のタンパク質の発現の増大を呈する、請求項３２から３５のいずれか一項に記載の細胞シート。

【請求項37】

請求項３２から２６のいずれか一項に記載の細胞シートと細胞シートから取り外し可能であるポリマーコーティングされた培養支持体とを含む組成物。

【請求項38】

コンフルエントなヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ）の１つまたは複数の層を含むヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ）シートを製造するための方法であって、
ａ）細胞培養支持体の基材表面上へコーティングされた温度応答性ポリマー上で、培養液中でｈＢＭＳＣを培養する工程であって、培養液中のｈＢＭＳＣが、単一細胞から生成されたヒトクローン性骨髄由来間葉系幹細胞株であり、温度応答性ポリマーが、０～８０℃の水中での下限臨界共溶温度を有する、工程と；
ｂ）培養液の温度を下限臨界共溶温度未満に調整し、それによって基材表面が親水性にされ、該表面への細胞シートの接着が弱められる工程と；
ｃ）培養支持体から細胞シートを分離する工程と；
ｄ）インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）または塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含有する培養液中で細胞シートを培養する工程とを含む、方法。

【請求項39】

培養する工程（ａ）が、培養液に初期細胞播種密度４．５×１０^４～３．４×１０^５細胞／ｃｍ^２でｈＢＭＳＣを添加する工程を含む、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

培養する工程（ａ）の前に複数の二次培養によってｈＢＭＳＣを培養する工程をさらに含む、請求項３８または３９に記載の方法。

【請求項41】

培養する工程（ａ）の前にｈＢＭＳＣの二次培養が、２～１０回実行される、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

ｈＢＭＳＣが、調整する工程（ｂ）の前に温度応答性ポリマー上の培養液中で少なくとも１日間培養される、請求項３８から４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

ｈＢＭＳＣが、温度応答性ポリマー上の培養液中で１～３日間培養される、請求項３８から４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

調整する工程（ｂ）が、培養液中のｈＢＭＳＣがコンフルエントであるときに実行される、請求項３８から４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

請求項３８から４４のいずれか一項に記載の方法によって製造される細胞シート。

【請求項46】

細胞シートを対象に移植する方法であって、請求項３２から４１または４５のいずれか一項に記載の細胞シートを対象の組織に適用する工程を含む、方法。

【請求項47】

対象において免疫応答をモジュレートする方法であって、請求項３２から４１または４５のいずれか一項に記載の細胞シートを対象の組織に適用する工程を含む、方法。

【請求項48】

細胞シートを組織に適用する工程が、細胞シートと接触されない組織と比較して、組織におけるＨＬＡ－ＤＲ、ＰＤ－Ｌ１、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、インターロイキン１０（ＩＬ－１０）およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ－２）からなる群から選択される１つまたは複数のタンパク質のレベルの増大をもたらす、請求項４６または４７に記載の方法。

【請求項49】

細胞シート中のｈＢＭＳＣが、対象と同種である、請求項４６から４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

対象がヒトである、請求項４６から４９のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、それぞれの内容が、その全体を参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年１０月１日に出願の米国特許仮出願第６３／２５１，１４４号および２０２１年１１月１１日に出願の米国特許仮出願第６３／２７８，１３６号の優先権を主張する。

【背景技術】

【0002】

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨芽細胞、軟骨細胞、神経細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞および心筋細胞に分化することができる多能性体細胞性幹細胞である（Ｒｅｙｅｓら、２００２、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９；３３７～３４６；Ｔｏｍａら、２００２、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０５、９３～９８；Ｗａｎｇら、２０００、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１２０、９９９～１００５；Ｊｉａｎｇら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ ４１Ｓ、４１～４９）。ＭＳＣの治療的特性は、１）複数および固有の細胞系統に分化し、２）細胞維持、生存および増殖に重要な可溶性生理活性因子の多数を産生し、３）宿主免疫応答をモジュレートし、４）傷害の部位に動員されて損傷を緩和し、治癒を促進するように遊走する本質的能力に由来することが提唱されている［Ｓｑｕｉｌｌａｒｏら、２０１６、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２５（５）、８２９～８４８］。特に、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ）は、免疫調節因子（例えば、インターロイキン－１０：ＩＬ－１０、プロスタグランジンＥ２：ＰＧＥ－２）、抗線維化因子（例えば、肝細胞増殖因子：ＨＧＦ、骨形成タンパク質７：ＢＭＰ－７）、および血管新生因子（例えば、血管内皮成長因子：ＶＥＧＦ、塩基性線維芽細胞成長因子：ｂＦＧＦ）など複数の傍分泌因子を分泌するため、特別関心がある同種細胞供給源である。したがって、ｈＢＭＳＣは、様々な治療的使用の潜在性が大きい。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0003】

ある特定の態様において、本開示は、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ）の１つまたは複数の層を含むヒト骨髄由来間葉系幹細胞シートであって、単一細胞から生成されたヒトクローン性骨髄由来間葉系幹細胞株から調製される、細胞シートに関する。ある特定の実施形態において、細胞シート中のｈＢＭＳＣは、コンフルエントである。ある特定の実施形態において、ヒトクローン性骨髄由来間葉系幹細胞株は、細胞シートの調製前に凍結された。ある特定の実施形態において、ヒトクローン性骨髄由来間葉系幹細胞株は、細胞シートの調製前に凍結されていない。ある特定の実施形態において、細胞シートは、ｈＢＭＳＣから本質的になる。ある特定の実施形態において、細胞シート中の細胞の少なくとも９０％は、ｈＢＭＳＣである。ある特定の実施形態において、細胞シート中のｈＢＭＳＣは、ヒト成長因子（ＨＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）からなる群から選択される１つまたは複数のサイトカインを発現する。ある特定の実施形態において、細胞シート中の１つまたは複数のサイトカインの発現は、同等数の細胞を含有するｈＢＭＳＣの懸濁液と比較して増大する。ある特定の実施形態において、細胞シートを調製するために使用される細胞培養支持体におけるヒトクローン性骨髄由来間葉系幹細胞株の初期播種細胞密度は、４．５×１０^４～３．４×１０^５細胞／ｃｍ^２である。

【0004】

ある特定の態様において、本開示は、本明細書に記載のｈＢＭＳＣ細胞シートと細胞シートから取り外し可能であるポリマーコーティングされた培養支持体とを含む組成物に関する。

【0005】

ある特定の態様において、本開示は、コンフルエントなヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ）の１つまたは複数の層を含むヒト骨髄由来間葉系幹細胞シートを製造するための方法であって、
ａ）細胞培養支持体の基材表面上へコーティングされた温度応答性ポリマー上で、培養液中でｈＢＭＳＣを培養する工程であって、培養液中のｈＢＭＳＣが、単一細胞から生成されたヒトクローン性骨髄由来間葉系幹細胞株であり、温度応答性ポリマーが、０～８０℃の水中での下限臨界共溶温度を有する、工程と；
ｂ）培養液の温度を下限臨界共溶温度未満に調整し、それによって基材表面が親水性にされ、該表面への細胞シートの接着が弱められる工程と；
ｃ）培養支持体から細胞シートを分離する工程とを含む、方法に関する。

【0006】

ある特定の実施形態において、培養液中のｈＢＭＳＣは、培養する工程（ａ）の前に凍結された。ある特定の実施形態において、培養液中のｈＢＭＳＣは、培養する工程（ａ）の前に凍結されていない。ある特定の実施形態において、培養する工程（ａ）は、培養液に初期細胞播種密度４．５×１０^４～３．４×１０^５細胞／ｃｍ^２でｈＢＭＳＣを添加する工程を含む。

【0007】

ある特定の実施形態において、本方法は、培養する工程（ａ）の前に複数の二次培養によってｈＢＭＳＣを培養する工程をさらに含む。ある特定の実施形態において、培養する工程（ａ）の前にｈＢＭＳＣの二次培養が、２～１０回実行される。ある特定の実施形態において、ｈＢＭＳＣは、調整する工程（ｂ）の前に温度応答性ポリマー上の培養液中で少なくとも１日間培養される。ある特定の実施形態において、ｈＢＭＳＣは、温度応答性ポリマー上の培養液中で１～３日間培養される。ある特定の実施形態において、調整する工程（ｂ）は、培養液中のｈＢＭＳＣがコンフルエントであるときに実行される。

【0008】

ある特定の態様において、本開示は、本明細書に記載される方法によって製造されるｈＢＭＳＣシートに関する。
ある特定の態様において、本開示は、細胞シートを対象に移植する方法であって、請求項１から１０または２０のいずれか一項に記載の細胞シートを対象の組織に適用する工程を含む、方法に関する。ある特定の実施形態において、組織は腎組織である。ある特定の実施形態において、対象は腎移植を受けている。ある特定の実施形態において、対象は、急性腎傷害を有する。ある特定の実施形態において、対象は、腎尿細管傷害（ｔｕｂｕｌｅ ｉｎｊｕｒｙ）を有する。ある特定の実施形態において、細胞シートを腎組織に適用する工程は、細胞シートから腎臓の柔組織への細胞の遊走をもたらす。ある特定の実施形態において、細胞シートを腎組織に適用する工程は、細胞シートと接触されない腎臓と比較して、腎臓におけるヒト成長因子（ＨＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）からなる群から選択される１つまたは複数のサイトカインのレベルの増大をもたらす。

【0009】

ある特定の態様において、本開示は、対象における腎線維化を抑制する方法であって、請求項１から１０または２０のいずれか１つの細胞シートを対象の腎組織に適用し、それにより対象における腎線維化を抑制する工程を含む、方法に関する。ある特定の実施形態において、細胞シートを腎組織に適用する工程は、クローン性細胞株ではないｈＢＭＳＣから調製されるｈＢＭＳＣシートより大きな程度で腎線維化を抑制する。ある特定の実施形態において、細胞シート中のｈＢＭＳＣは、対象と同種である。ある特定の実施形態において、対象は、ヒトである。

【0010】

ある特定の態様において、本開示は、骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ）の１つまたは複数の層を含む骨髄由来間葉系幹細胞シートであって、単一細胞から生成されたヒトクローン性骨髄由来間葉系幹細胞株から調製され、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）または塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）で処理される、細胞シートに関する。一部の実施形態において、細胞シート中のｈＢＭＳＣは、コンフルエントである。一部の実施形態において、細胞シートは、ｈＢＭＳＣから本質的になる。一部の実施形態において、細胞シート中の細胞の少なくとも９０％は、ｈＢＭＳＣである。一部の実施形態において、細胞シート中のｈＢＭＳＣは、ＩＦＮ－γまたはｂＦＧＦで処置されていないｈＢＭＳＣシートと比較して、ＨＬＡ－ＤＲ、ＰＤ－Ｌ１、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、インターロイキン１０（ＩＬ－１０）およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ－２）からなる群から選択される１つまたは複数のタンパク質の発現の増大を呈する。ある特定の態様において、本開示は、本明細書に記載の細胞シートと細胞シートから取り外し可能であるポリマーコーティングされた培養支持体とを含む組成物に関する。

【0011】

ある特定の態様において、本開示は、コンフルエントなヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ）の１つまたは複数の層を含むヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ）シートを製造するための方法であって、
ａ）細胞培養支持体の基材表面上へコーティングされた温度応答性ポリマー上で、培養液中でｈＢＭＳＣを培養する工程であって、培養液中のｈＢＭＳＣが、単一細胞から生成されたヒトクローン性骨髄由来間葉系幹細胞株であり、温度応答性ポリマーが、０～８０℃の水中での下限臨界共溶温度を有する、工程と；
ｂ）培養液の温度を下限臨界共溶温度未満に調整し、それによって基材表面が親水性にされ、該表面への細胞シートの接着が弱められる工程と；
ｃ）培養支持体から細胞シートを分離する工程と；
ｄ）インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）または塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含有する培養液中で細胞シートを培養する工程とを含む、方法に関する。

【0012】

一部の実施形態において、培養する工程（ａ）は、培養液に初期細胞播種密度４．５×１０^４～３．４×１０^５細胞／ｃｍ^２でｈＢＭＳＣを添加する工程を含む。一部の実施形態において、本方法は、培養する工程（ａ）の前に複数の二次培養によってｈＢＭＳＣを培養する工程をさらに含む。一部の実施形態において、培養する工程（ａ）の前にｈＢＭＳＣの二次培養が、２～１０回実行される。一部の実施形態において、ｈＢＭＳＣは、調整する工程（ｂ）の前に温度応答性ポリマー上の培養液中で少なくとも１日間培養される。一部の実施形態において、ｈＢＭＳＣは、温度応答性ポリマー上の培養液中で１～３日間培養される。一部の実施形態において、調整する工程（ｂ）は、培養液中のｈＢＭＳＣがコンフルエントであるときに実行される。ある特定の態様において、本開示は、本明細書に記載される方法によって製造される細胞シートに関する。

【0013】

ある特定の態様において、本開示は、細胞シートを対象に移植する方法であって、本明細書に記載の細胞シートを対象の組織に適用する工程を含む、方法に関する。ある特定の態様において、本開示は、対象において免疫応答をモジュレートする方法であって、本明細書に記載の細胞シートを対象の組織に適用する工程を含む、方法に関する。一部の実施形態において、細胞シートを組織に適用する工程は、細胞シートと接触されない組織と比較して、組織におけるＨＬＡ－ＤＲ、ＰＤ－Ｌ１、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、インターロイキン１０（ＩＬ－１０）およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ－２）からなる群から選択される１つまたは複数のタンパク質のレベルの増大をもたらす。一部の実施形態において、細胞シート中のｈＢＭＳＣは、対象と同種である。一部の実施形態において、対象は、ヒトである。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１は、細胞シート製造に使用した複数の細胞株由来のクローン性ＢＭＳＣが、表現型ＭＳＣマーカー（ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５）の陽性（≧９５％）表面抗原発現および常在骨髄／血液細胞（ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５）の陰性発現を呈することを示す。パーセンテージ陽性は、蛍光性アイソタイプ対照の０．５％超として測定された。Ｎ≧２。

【図2】図２は、クローン性ＢＭＳＣシートの調製およびそのサイトカイン産生を示す。複数の細胞株由来の操作されたクローン性ＢＭＳＣシートが、ＴＲＣＤ上で成功裏に調製された。（スケールバー；１ｃｍ）。クローン性ＢＭＳＣシートは、ＨＧＦ、ＶＥＧＦおよびＦＧＦ２などの複数の組織再生サイトカインの遺伝子発現を呈し、不均一な、全ＢＭＳＣシートも同様であった。これらデータは、全ＢＭＳＣシート中の遺伝子発現レベルで正規化された。

【図3】図３は、単一細胞および細胞シートとしての免疫調節性サイトカインの遺伝子発現レベルの比較を示す。単一細胞および細胞シートとしてのＩＬ－１０、ＩＤＯおよびＰＧＥ－２の遺伝子発現レベルの比較が、ｑＰＣＲによって調査された。クローン性ＢＭＳＣの細胞シートの形成により、単一細胞条件と比較して免疫調節性サイトカインの遺伝子発現が有意に増強した。これらデータは、単一細胞の発現レベルで正規化された。

【図4】図４は、ラットＩＲＩモデルにおけるヒトクローン性ＢＭＳＣシートの移植を示。これは、動物研究の概要である。５枚のヒトクローン性ＢＭＳＣシートが、免疫不全ラットの左腎臓に移植され、左腎臓動脈および静脈は、６０分間虚血され、続いて再灌流された。

【図5】図５は、移植されたヒトクローン性ＢＭＳＣシートの生着および遊走を示す。これらは、ＩＲＩ後３日でのラット腎臓におけるヒトフィブロネクチン（ｈＦＮ）染色の画像である。左は、細胞シートの移植がないＩＲＩであり、中央は、腎被膜上へのクローン性ＢＭＳＣシートの移植があるＩＲＩであり、右は、被膜のない腎臓へのクローン性ＢＭＳＣシートの移植があるＩＲＩである。中央および右の画像において、クローン性ＢＭＳＣシートから得られる多くのｈＦＮ陽性細胞が、実質の上に検出され、一部の細胞は、腎実質内に遊走する（矢印）。

【図6】図６は、腎被膜がないラットＩＲＩモデルにおけるヒトクローン性ＢＭＳＣシートの治療的効果を示す。上列は、ＩＲＩ後３日での、天然、ＩＲＩ、および被膜なしクローン性ＢＭＳＣシート移植群の代表的なＰＡＳ染色画像および尿細管傷害スコアを示す。尿細管傷害は、ＩＲＩのみ、およびクローン性ＭＳＣシート群において黒色矢印によって示される。ＩＲＩ群と比較してクローン性ＢＭＳＣシート群のより低い尿細管傷害スコアによって示される通り、クローン性ＢＭＳＣシートはＩＲＩ傷害の初期フェーズを抑制する。下の列は、ＩＲＩ後２８日での、天然、ＩＲＩ、ＷＢ、被膜なしクローン性ＢＭＳＣシート移植群の、線維化領域を示す代表的なＭＴ染色画像およびコラーゲン陽性の青色領域画分のグラフを示す。ＭＴ染色の青色領域は、コラーゲン沈着（黄色矢印）を示す。被膜なしでのクローン性ＢＭＳＣシートの移植は、ＩＲＩおよびＷＢシート群と比較して最も低いコラーゲン陽性青色領域によって示されるように、線維化の阻害能力が最も高いことを示す。

【図7】図７は、腎被膜があるラットＩＲＩモデルにおけるヒトクローン性ＢＭＳＣシートの治療的効果を示す。上列は、ＩＲＩ後３日での、天然、ＩＲＩ、および被膜ありクローン性ＢＭＳＣシート移植群の代表的なＰＡＳ染色画像および尿細管傷害スコアを示す。尿細管傷害は、ＩＲＩのみ、およびクローン性ＭＳＣシート群において黒色矢印によって示される。ＩＲＩ群と比較してクローン性ＢＭＳＣシート群のより低い尿細管傷害スコアによって示される通り、クローン性ＢＭＳＣシートはＩＲＩ傷害の初期フェーズを抑制する。下の列は、ＩＲＩ後２８日での、天然、ＩＲＩ、ＷＢ、被膜ありクローン性ＢＭＳＣシート移植群の、線維化領域を示す代表的なＭＴ染色画像およびコラーゲン陽性の青色領域画分のグラフを示す。ＭＴ染色の領域は、コラーゲン沈着（黄色矢印）を示す。被膜ありでのクローン性ＢＭＳＣシートの移植は、ＩＲＩおよびＷＢシート群と比較して最も低いコラーゲン陽性青色領域によって示されるように、線維化の阻害能力が最も高いことを示す。

【図8】図８は、異なる条件（密度および培養期間）によるクローン性ＢＭＳＣシート製造を示す。クローン性ＢＭＳＣシートを、播種後６時間では初期細胞密度８０万細胞／直径３５ｍｍのＴＲＣＤ、１日では６０万細胞／３５ｍｍのＴＲＣＤ、ならびに３および６日では４０万細胞／直径３５ｍｍのＴＲＣＤからシート形状として分離した。

【図9】図９は、サイトカイン分泌能力と関連する、クローン性ＢＭＳＣ懸濁液およびシートの遺伝子発現レベルを示す。クローン性ＢＭＳＣシートの遺伝子発現レベル（ＨＧＦ、ＩＬ１０、ＶＥＧＦ）が、単一クローン性ＢＭＳＣ懸濁液（ＳＣ）の遺伝子発現レベルと比較された。クローン性ＢＭＳＣシートは、クローン性ＢＭＳＣの単一細胞懸濁液（ＳＣ）と比較して、ＨＧＦ、ＩＬ１０、ＶＥＧＦサイトカイン分泌に関連する遺伝子のより高い発現レベルを示した。さらに、密度１３０万細胞／３５ｍｍのＴＲＣＤで調製されたクローン性ＢＭＳＣシートは、初期細胞密度４０万細胞／３５ｍｍのＴＲＣＤで調製されたクローン性ＢＭＳＣシートの遺伝子発現レベルと比較して、より高い遺伝子発現レベル（ＨＧＦ、ＩＬ１０、ＶＥＧＦ）を表した。

【図10】図１０は、クローン性ＢＭＳＣシートから分泌されるサイトカイン量を示す。異なる初期細胞密度（６０万個、１５０万個、３００万細胞／３５ｍｍのＴＲＣＤ）のクローン性ＢＭＳＣシートから分泌されるサイトカイン量が、検出された。より高い初期細胞密度の群（１５０万個および３００万細胞／３５ｍｍのＴＲＣＤ）は、６０万細胞／３５ｍｍのＴＲＣＤ群と比較して、細胞シートおよび細胞当たり、より多量のサイトカインを分泌した。

【図11】図１１は、凍結細胞における高い初期細胞接着能力を示す。接着した新鮮な細胞および凍結細胞のインキュベーションが、１５分または３０分のインキュベーション後に観察された。凍結細胞は、新鮮な細胞と比較して高い初期および成熟細胞接着能力を示した。（スケールバー；２００μｍ）。

【図12】図１２は、新鮮な細胞および凍結細胞を使用する細胞シート調製を示す。複数の初期播種密度での新鮮な細胞および凍結細胞から操作された細胞シートが、示された。より多数の細胞を含有する細胞シートは、より大きい細胞シート形状を示した。凍結細胞は、新鮮な細胞と比較してより低い初期細胞密度での細胞シート調製を可能にした。（スケールバー；１ｃｍ）。

【図13】図１３は、様々な初期細胞密度の新鮮な細胞または凍結細胞から調製された細胞シートにおけるサイトカイン産生を示す。各細胞シートのサイトカイン産生が、示される。各初期細胞密度で凍結細胞から調製された細胞シートが、新鮮な細胞から調製された細胞シートと同程度のサイトカイン産生を示したことは、凍結細胞が、細胞シート製造の選択肢になりうることを示唆した。特に、凍結細胞は、その高い初期細胞接着能力により速い細胞シート製造を実行するのに有益である。

【図14】図１４は、クローン性ＢＭＳＣシートが、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）に応答して免疫調節性分子の発現を上方調節することを示す。クローン性ＢＭＳＣシートは、２５ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γに曝露した際に、免疫調節性遺伝子の上方調節のピークを呈した。遺伝子発現は、同じ条件下でプライミングしていない対照細胞シートに対して正規化した倍率変化として表された。（試料数；ｎ＝２）。

【図15】図１５は、ＩＦＮ－γを補充して製造された細胞シートが、免疫調節性分子の上方調節を呈することを示す。細胞シートを分離する前に、２５ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γが、２日目に添加された。分離前に２日間プライミングされたクローン性ＢＭＳＣシートは、ＨＬＡ－ＤＲ、ＰＤ－Ｌ１およびＩＤＯの遺伝子発現の有意な増大を呈した。遺伝子発現は、同じ条件下で製造されたプライミングしていない対照細胞シートそれぞれに対して正規化した倍率変化として表された。（試料数；ｎ＝６）。

【図16】図１６は、クローン性ＢＭＳＣシートの免疫調節性遺伝子発現に対するＩＦＮ－γプライミング期間の影響を示す。ＩＦＮ－γプライミング期間の増大は、免疫調節性分子の遺伝子発現のさらなる増大と関連した。ＩＦＮ－γプライミングの４日および６日後に製造されたクローン性ＢＭＳＣシートは、免疫調節性遺伝子（ＨＬＡ－ＤＲ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ、ＩＬ－１０およびＰＧＥ－２）の上方調節を呈し、プライミング６日後に最も高い発現であった。遺伝子発現は、同じ条件下で製造されたプライミングしていない対照細胞シートそれぞれに対して正規化した倍率変化として表された。（試料数；ｎ＝６）。

【図17】図１７は、クローン性ＢＭＳＣシート遺伝子発現に対するＩＦＮ－γプライミング効果の安定性を示す。６日間、４日間、２日間または０日間のいずれかでＩＦＮ－γを補充して製造された細胞シートを、通常の培養条件で４日間再度平板培養（replated）して、ＩＦＮ－γ効果の安定性が分析された。結果は、ＩＦＮ－γの除去後も、クローン性ＢＭＳＣが、ＨＬＡ－ＤＲ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯおよびＩＬ－１０の上方調節された遺伝子発現を呈し続けることを示した。４日間のＩＦＮ－γプライミングで製造されたクローン性細胞シートは、免疫抑制性（ＩＤＯ、ＰＤ－Ｌ１およびＩＬ－１０）分子の最も高い遺伝子発現を呈した。遺伝子発現は、同じ条件下で製造されたプライミングしていない対照細胞シートそれぞれに対して正規化した倍率変化として表された。（試料数；ｎ＝４）。

【図18】図１８は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を補充して製造された細胞シートが、免疫調節性分子の上方調節を呈することを示す。細胞シートを分離する前に、５または８０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦが、２日目に添加された。分離前に２日間プライミングされたクローン性ＢＭＳＣシートは、ＨＬＡ－ＤＲ、ＩＤＯおよびＩＬ－１０の有意な増大を呈した。遺伝子発現は、同じ条件下で製造されたプライミングしていない対照細胞シートそれぞれに対して正規化した倍率変化として表された。（試料数；ｎ＝３）。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本開示は、腎障害を処置するためのヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ）シートの調製および特性について記載する。現在のところ、注射されたＭＳＣ細胞懸濁液は、ＭＳＣの機能および生着能力を損なう酵素を使用して採取されており、その結果組織保持および生存率が低く、治療的特性が最適ではない。本明細書に記載されるシートなど、酵素を用いず、無傷の細胞外基質（ＥＣＭ）および細胞受容体を含む生きたシートとして創出される細胞シートは、非常に改善された保持および生着効率で組織部位に物理的に置かれうる。

【0016】

単一細胞から得られるヒトクローン性骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ）を使用して、温度応答性ポリマーでコーティングされた温度応答性細胞培養ディッシュ（ＴＲＣＤ）中で細胞シートをｉｎ ｖｉｔｒｏ調製した。コンフルエントな細胞シートは、播種後１～３日で形成され、培養物を室温に冷やすことによってＴＲＣＤから分離された。これら方法によって製造されたｈＢＭＳＣシートは、クローン性細胞株ではないｈＢＭＳＣから調製されたｈＢＭＳＣシートより高い程度でラット虚血再灌流傷害モデルにおける腎線維化を抑制した。

【0017】

Ｉ．ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ）
本明細書で使用される用語「ヒト骨髄由来間葉系幹細胞」または「ｈＢＭＳＣ」とは、ヒト骨髄から単離された間葉系幹細胞のことを指す。

【0018】

本明細書で使用される用語「クローン性細胞株」とは、単一細胞から成長したコロニーから生成される細胞株のことを指す。例えば、本明細書で使用される用語「ヒトクローン性骨髄由来間葉系幹細胞株」または「ヒトクローン性ＢＭＳＣ株」とは、単一ｈＢＭＳＣから成長したコロニーから生成されるｈＢＭＳＣ細胞株のことを指す。非クローン性培養ＢＭＳＣは、単一のドナーから得られた場合でも、表面マーカー発現、コロニー形成、分化能力、免疫調節／再生潜在性およびｉｎ ｖｉｖｏ挙動が一定しない非常に多様なＢＭＳＣサブセットで構成される本質的に不均一な集団である。本開示は、ドナーおよび産生される細胞産物間の多様性を排除する合理的なクローン選択によって異質性に対するこの制約を克服し、ＢＭＳＣに基づく療法の治療的効果を増強させるための単一細胞由来コロニーから生成されるヒトクローン性ＢＭＳＣ株について記載する。

【0019】

ヒトクローン性ＢＭＳＣ株を調製するための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第７，７８１，２１１号に記載されており、その全体を参照により本明細書に組み込む。一部の実施形態において、ヒトクローン性ＢＭＳＣ株は、（ｉ）第１の容器中で重力によって生体試料を定着させ、より低密度の細胞の第１の上清を製造する工程と；（ｉｉ）遠心分離を経ることなく第１の上清を第２の容器の成長培地へ直接移し、底部に細胞を定着させ、より低密度の細胞の第２の上清を製造する工程と；（ｉｉｉ）遠心分離を経ることなく第２の上清を第３の容器の成長培地へ直接移し、底部に細胞を定着させ、より低密度の細胞の第３の上清を製造する工程と；（ｉｖ）遠心分離を経ることなく第３の上清を別の容器の成長培地へ直接移し、底部に細胞を定着させ、より低密度の細胞の別の上清を製造する工程と；（ｖ）単一細胞由来コロニーを工程（ｉｖ）の容器の底部に出現させる工程と；（ｖｉ）単一細胞由来コロニーを単離する工程と；（ｖｉｉ）単一細胞由来コロニーからの細胞をさらなる他の容器の成長培地中に展開して、単一細胞由来クローン性骨髄細胞の均一な集団を得る工程とによって骨髄の生体試料から調製されうる。

【0020】

本明細書に記載されるｈＢＭＳＣシートは、いくつかの方法で採取されたｈＢＭＳＣ懸濁液とは異なる。細胞懸濁培養を調製するにはこれら細胞－細胞連結中の接着性タンパク質を破壊して（例えばトリプシン処理による）、培養表面から細胞を採取しなければならないので、ｈＢＭＳＣの懸濁液は、ＥＣＭまたは細胞－細胞連結がない単一細胞を含有する。ｈＢＭＳＣの単一細胞懸濁液とは対照的に、本明細書に記載されるｈＢＭＳＣシートは、細胞シートの形成中に生成されるｈＢＭＳＣの間のＥＣＭと細胞－細胞連結の両方を含有する。無傷のＥＣＭおよび細胞－細胞連結は、宿主生物への移植中における標的組織へのｈＢＭＳＣシートの接着を容易にする。

【0021】

ＩＩ．ｈＢＭＳＣから製造される細胞シート
ある特定の態様において、本開示は、コンフルエントなヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ）の１つまたは複数の層を含むヒト骨髄由来間葉系幹細胞シートであって、単一細胞から生成されたヒトクローン性骨髄由来間葉系幹細胞株から調製される、細胞シートに関する。本明細書で使用される用語「ヒト骨髄由来間葉系幹細胞シート」または「ｈＢＭＳＣシート」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、細胞培養支持体上でヒト骨髄由来間葉系幹細胞を成長させることによって得られる細胞シートのことを指す。本明細書に記載されるｈＢＭＳＣシートは、いかなる酵素処理もなしに温度応答性培養ディッシュ（ＴＲＣＤ）を使用して温度変化により１つまたは複数の層のシートとして採取される。ｈＢＭＳＣシートは、組織様構造、アクチンフィラメント、細胞外基質、細胞間タンパク質および高い細胞生存率を保持することによってそのサイズおよび形状を維持し、その全ては、細胞療法に関連する細胞生存および細胞性機能の改善と関連する。したがって、本明細書に記載される細胞シートは、細胞外基質、細胞接着タンパク質および細胞連結タンパク質を含めた、細胞生存ならびに細胞機能を改善する構造的特徴を含みうる。したがって、本明細書に記載される方法によって調製されるｈＢＭＳＣシートは、他の方法によって製造されるＭＳＣと比較していくつかの有益な特徴を有する。例えば、化学的破壊（タンパク質分解酵素処理）は、幹細胞療法用として採取される細胞に広く使用されている。しかしながら、酵素処理は、細胞外および細胞内タンパク質（細胞－細胞間および細胞－ＥＣＭ連結）を破壊するので、化学的破壊方法は、細胞の組織様構造および細胞－細胞間コミュニケーションを維持することができない。したがって、酵素によるタンパク質切断は、細胞療法に関連する細胞の生存率および細胞性機能を減少させる。

【0022】

一部の実施形態において、細胞シートは、ｈＢＭＳＣからなる。一部の実施形態において、細胞シートは、ｈＢＭＳＣから本質的になる。一部の実施形態において、細胞シート中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％は、ｈＢＭＳＣである。一部の実施形態において、細胞シート中の細胞の１００％は、ｈＢＭＳＣである。

【0023】

ｈＢＭＳＣは、細胞シートの形成またはその特徴を最適化するために、様々な細胞密度で細胞培養支持体中の温度応答性ポリマー上の培養液に添加されうる。例えば、ｈＢＭＳＣ中のサイトカイン発現レベルは、細胞培養支持体（例えばＴＲＣＤ）中のｈＢＭＳＣの初期細胞密度を制御することによって最適化されうる。一部の実施形態において、細胞培養支持体中のｈＢＭＳＣの初期細胞密度を増大させると、サイトカイン発現［例えば、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）およびインターロイキン１０（ＩＬ－１０）のうちの１つまたは複数］が増大する。一部の実施形態において、細胞培養支持体中のｈＢＭＳＣの初期細胞密度を低下させると、サイトカイン発現が低下する。一部の実施形態において、細胞シートの調製に使用される細胞培養支持体中のｈＢＭＳＣの初期細胞密度は、０．５×１０^４／ｃｍ^２～９×１０^５／ｃｍ^２である。一部の実施形態において、細胞培養支持体中のｈＢＭＳＣの初期細胞密度は、少なくとも０．５×１０^４、１×１０^４、２×１０^４、３×１０^４、４×１０^４、５×１０^４、６×１０^４、７×１０^４、８×１０^４、９×１０^４、１×１０^５、２×１０^５、３×１０^５、４×１０^５、５×１０^５、６×１０^５、７×１０^５、８×１０^５または９×１０^５細胞／ｃｍ^２である。これら値のいずれかを使用して、細胞培養支持体中のｈＢＭＳＣの初期細胞密度の範囲を定義してもよい。例えば、一部の実施形態において、細胞培養支持体中の初期細胞密度は、４．５×１０^４～３．４×１０^５細胞／ｃｍ^２（４×１０^５～３×１０^６細胞／直径３５ｍｍのＵｐＣｅｌｌディッシュ、面積８．８ｃｍ^２を有する）である。

【0024】

本明細書に記載されるｈＢＭＳＣシートは、治療的使用のために宿主生物（例えばヒト）の標的組織に移植されうる。標的組織へのｈＢＭＳＣシートの移植は、宿主組織における毛細管の形成（血管新生）、および移植した細胞シートと宿主組織との間の血管形成をもたらしうる。この新毛細管形成は、シートの生着、細胞の生存率および組織再生にとって重要な能力である。加えて、標的組織上のシート内へのこの新たな血管の動員は、移植されたｈＢＭＳＣシートが、傍分泌因子を絶えず分泌して生着をモジュレートすることを示唆する。

【0025】

一部の実施形態において、ｈＢＭＳＣシートは、１つまたは複数のサイトカイン、例えば、１つまたは複数の免疫調節因子［例えば、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）；抗線維化因子（例えば、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）；骨形成タンパク質７（ＢＭＰ－７））、および／または血管新生因子（例えば、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）］を発現する。一部の実施形態において、サイトカインは、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ－２）、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ－７）および塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）から選択される。一部の実施形態において、細胞シート中のサイトカイン（例えば、免疫調節因子、抗線維化因子、または血管新生因子）の発現は、同等数の細胞を含有するｈＢＭＳＣの懸濁液、またはクローン性細胞株でないｈＢＭＳＣから調製される細胞シートと比較して増大する。一部の実施形態において、サイトカイン（例えば、免疫調節因子、抗線維化因子、または血管新生因子）の発現は、同等数の細胞を含有するｈＢＭＳＣの懸濁液、またはクローン性細胞株でないｈＢＭＳＣから調製される細胞シートと比較して低下する。

【0026】

本明細書に記載されるｈＢＭＳＣシートは、宿主生物の標的組織への移植後にサイトカインを発現し続けることができる。一部の実施形態において、細胞シートは、宿主生物の組織（例えば、腎組織）への移植後少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５または３０日間サイトカインを発現する。一部の実施形態において、細胞シートは、宿主生物の組織（例えば、腎組織）への移植後少なくとも１、２、３、４、５または６か月間サイトカインを発現する。

【0027】

現在の幹細胞療法は、注射可能な細胞懸濁液として生検から単離された培養幹細胞をしばしば使用する［Ｂａｙｏｕｓｓｅｆら、２０１２、Ｊ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｒｅｇｅｎ Ｍｅｄ、６（１０）］。注射された細胞懸濁液は、罹病器官または組織内への生着および保持が一般により低い［Ｄｅｖｉｎｅら、２００３年、Ｂｌｏｏｄ、１０１（８）、２９９９～３００１］。採取時の酵素的破壊による幹細胞懸濁液中の無傷のＥＣＭおよび細胞－細胞連結（すなわち、伝達）の消失は、ｉｎ ｖｉｖｏでの幹細胞機能、生着および生存を損ない、ｉｎ ｖｉｖｏでの治療有効性を限定する可能性がある。対照的に、本明細書に記載されるｈＢＭＳＣシートを調製する方法は、内因的な細胞の機能的構造を保っており、移植後の標的組織への細胞シートの付着を改善する。例えば、一部の実施形態において、細胞シートは、宿主生物の組織への移植後少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５または３０日間、宿主生物の標的組織（例えば、腎組織）に付着して残る。一部の実施形態において、細胞シートは、宿主生物の組織への移植後少なくとも１、２、３、４、５または６か月間、宿主生物の標的組織（例えば、腎組織）に付着して残る。

【0028】

ＩＩＩ．ｉｎ ｖｉｔｒｏでｈＢＭＳＣシートを製造するための方法
ある特定の態様において、本開示は、コンフルエントなヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ）の１つまたは複数の層を含むヒト骨髄由来間葉系幹細胞シートを製造するための方法であって、
ａ）細胞培養支持体の基材表面上へコーティングされた温度応答性ポリマー上で、培養液中でｈＢＭＳＣを培養する工程であって、培養液中のｈＢＭＳＣが、単一細胞から生成されたヒトクローン性骨髄由来間葉系幹細胞株であり、温度応答性ポリマーが、０～８０℃の水中での下限臨界共溶温度を有する、工程と；
ｂ）培養液の温度を下限臨界共溶温度未満に調整し、それによって基材表面が親水性にされ、該表面への細胞シートの接着が弱められる工程と；
ｃ）培養支持体から細胞シートを分離する工程とを含む、方法に関する。

【0029】

細胞シートを調製するための一般的な方法は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第８，６４２，３３８号；第８，８８９，４１７号；第９，９８１，０６４号；および第９，１１４，１９２号に記載されており、その全体を、それぞれ参照により本明細書に組み込む。

【0030】

細胞培養支持体の基材をコーティングするために使用される温度応答性ポリマーは、水性溶液中で一般に０℃～８０℃、例えば、１０℃～５０℃、０℃～５０℃、または２０℃～４５℃の範囲の上限または下限臨界共溶温度を有する。

【0031】

温度応答性ポリマーは、ホモポリマーでもコポリマーでもよい。例示的なポリマーは、例えば、特開２１１８６５／１９９０号公報に記載されている。特に、それらは、例えば、（メチル）アクリルアミド化合物［（メチル）アクリルアミドとは、アクリルアミドとメタクリルアミドとの両方のことを指す］、Ｎ－（またはＮ，Ｎ－ジ）アルキル置換（メチル）アクリルアミド誘導体、およびビニルエーテル誘導体などのモノマーのホモまたはコポリマー化によって得られうる。コポリマーの場合、上に記載のモノマーなど、任意の２つ以上のモノマーが、用いられてもよい。さらに、それらのモノマーは、他のモノマーとコポリマー化されてもよく、一方のポリマーが、他方にグラフトされてもよく、２つのポリマーがコポリマー化されてもよく、またはポリマーとコポリマーとの混合物が用いられてもよい。必要に応じて、ポリマーは、その固有の特性を損なわない程度に架橋されてもよい。

【0032】

ポリマーでコーティングされる基材は、ガラス、修飾ガラス、ポリスチレン、ポリ（メチルメタクリラート）、ポリエステルおよびセラミックなど、細胞培養に一般的に使用されるものを含めた任意の型のものでもよい。

【0033】

温度応答性ポリマーで支持体をコーティングする方法は、当技術分野で公知であり、例えば、特開２１１８６５／１９９０号公報に記載されている。特に、そのようなコーティングは、基材および上述のモノマーまたはポリマーを、例えば、電子ビーム（ＥＢ）曝露、γ－線による照射、紫外線による照射、プラズマ処理、コロナ処理または有機ポリマー化反応に供することによって達成されうる。コーティング塗布および練和によって達成される物理的吸着など他の技術が使用されうる。

【0034】

温度応答性ポリマーの適用範囲は、０．４～３．０μｇ／ｃｍ^２、例えば、０．７～２．８μｇ／ｃｍ^２または０．９～２．５μｇ／ｃｍ^２の範囲でありうる。細胞培養支持体の形態構造は、例えば、ディッシュ、マルチプレート、フラスコまたはセルインサートでありうる。

【0035】

培養細胞は、支持体基材上のポリマーが水和し、細胞が分離されうる温度に支持体材料の温度を調整することによって細胞培養支持体から分離および回収されうる。円滑な分離は、細胞シートと支持体との間のギャップに水流を適用することによって実現されうる。細胞シートの分離は、細胞が培養された培養液内または他の等張液中の影響受ける場合があり、いずれも適している。一部の実施形態において、ｈＢＭＳＣは、支持体材料から細胞シートを遊離させるために下限臨界共溶温度未満に培養液の温度を調整する前に、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間または少なくとも７日間温度応答性ポリマー上の培養液中で培養される。一部の実施形態において、ｈＢＭＳＣは、支持体材料から細胞シートを遊離させるために培養液の温度を下限臨界共溶温度未満に調整する前に、温度応答性ポリマー上の培養液中で２日間未満、３日間未満、４日間未満。５日間未満、６日間未満、７日間未満培養される。一部の実施形態において、ｈＢＭＳＣは、支持体材料から細胞シートを遊離させるために培養液の温度を下限臨界共溶温度未満に調整する前に、約１２時間、約２４時間、約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、または約７日間温度応答性ポリマー上の培養液中で培養される。これら値のいずれかを使用して、ｈＢＭＳＣが培養液中で培養される時間の長さの範囲を定義することができる。例えば、一部の実施形態において、ｈＢＭＳＣは、１～２日間、１～３日間または１～４日間培養液中で培養される。

【0036】

特定の実施形態において、温度応答性ポリマーは、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）である。ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）は、水中で３１℃の下限臨界共溶温度を有する。遊離状態にある場合、それは、水中で３１℃を超える温度で脱水を受け、ポリマー鎖は、凝集して混濁を引き起こす。反対に、３１℃以下の温度では、ポリマー鎖は水和して水に溶解し、それによりポリマーからの細胞シートの遊離を引き起こす。特定の実施形態において、このポリマーは、ペトリ皿などの基材の表面を覆い、例えば、化学もしくは物理的グラフトまたは係留によって基材表面上に固定化される。したがって、３１℃を超える温度では、基材表面上のポリマーも脱水するが、ポリマー鎖が、基材表面を覆っており、その上に固定化されているので、基材表面は、ポリマーの脱水により疎水性になる。反対に、３１℃以下の温度では、基材表面上のポリマーは水和するが、ポリマー鎖が、基材表面を覆っており、その上に固定化されているので、基材表面は、ポリマーの脱水により親水性になる。疎水的表面は、細胞の接着および成長に適切な表面であるが、親水性表面は、細胞の接着を阻害し、細胞は、培養液を冷やすことによって簡単に分離される。

【0037】

間葉系幹細胞用の培養液は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第９，８０３，１７６号および第９，７８２，４３９号に記載されており、その全体を、それぞれ参照により本明細書に組み込む。一部の実施形態において、培養液は、ヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を含む。一部の実施形態において、培養液は、アスコルビン酸を含む。一部の実施形態において、培養液は、非ヒト動物から得られる産物（例えばＦＢＳ）を少なくとも１つ含有する。一部の実施形態において、培養液は、ヒトから得られる産物を含有しない。特定の実施形態において、培養液は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ、米国）、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＭｙｃｏＺａｐ Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ（Ｌｏｎｚａ）および抗生物質、例えば、ペニシリンストレプトマイシンのうち１つまたは複数を含む。

【0038】

ｈＢＭＳＣシートは、適用に応じて異なるサイズの範囲で調製されうる。一部の実施形態において、ｈＢＭＳＣシートは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５または２０ｃｍの直径を有する。これら値のいずれかを使用して、ｈＢＭＳＣシートのサイズの範囲を定義してもよい。例えば、一部の実施形態において、ｈＢＭＳＣシートは、１～２０ｃｍ、１～１０ｃｍまたは２～１０ｃｍの直径を有する。一部の実施形態において、ｈＢＭＳＣシートは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０または３００ｃｍ^２の面積を有する。これら値のいずれかを使用して、ｈＢＭＳＣシートのサイズの範囲を定義してもよい。例えば、一部の実施形態において、ｈＢＭＳＣシートは、１～１００ｃｍ^２、３～７０ｃｍ^２または１～３００ｃｍ^２の面積を有する。本明細書に記載される方法は、ｈＢＭＳＣシートの表面積および／または直径が、その厚みより非常に大きいｈＢＭＳＣシートをもたらす。例えば、一部の実施形態において、ｈＢＭＳＣシートの表面積のその厚みに対する比は、少なくとも１０：１、１００：１、１０００：１または１００００：１である。一部の実施形態において、ｈＢＭＳＣシートの直径のその厚みに対する比は、少なくとも１０：１、１００：１、１０００：１または１００００：１である。本明細書に記載されるｈＢＭＳＣシートは、１つまたは複数の層のコンフルエントなヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ）、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０層のｈＢＭＳＣを含む。一部の実施形態において、ｈＢＭＳＣシートは、１、２、３、４または５層未満のｈＢＭＳＣを含む。一部の実施形態において、ｈＢＭＳＣシートは、少なくとも１、２、３、４または５層のｈＢＭＳＣを含む。

【0039】

ＩＶ．ヒト骨髄由来ＭＳＣ（ｈＢＭＳＣ）シートを対象に移植するための方法
本明細書に記載されるｈＢＭＳＣシートは、細胞シートを対象の組織（例えば、腎組織）に適用することによって対象に移植されうる。例えば、以下の実施例２に開示される通り、本明細書に記載される方法によって調製されるｈＢＭＳＣシートの移植は、クローン性細胞株でないｈＢＭＳＣから調製されたｈＢＭＳＣシートと比較して、ラット虚血再灌流傷害モデルにおいて腎線維化を高度に抑制した。

【0040】

したがって、一部の態様において、本開示は、細胞シートを対象に移植する方法であって、本明細書に記載の細胞シートを対象の組織に適用する工程を含む、方法に関する。一部の実施形態において、組織は腎組織である。特定の実施形態において、対象はヒトである。本明細書に記載されるｈＢＭＳＣシートの優位性の１つは、組織に細胞シートを接着するために縫合を必要としないように、細胞シートの細胞外基質が、細胞シートを対象の組織に結合させるための接着剤として作用するということである。支持体膜を使用して、培養表面から遊離した採取されたｈＢＭＳＣシートを対象の組織へ移してもよい。そのような移動のための支持体膜は、例えば、ポリ（ビニリデンジフルオリド）（ＰＶＤＦ）、酢酸セルロースおよびセルロースエステルでありうる。ｈＢＭＳＣシートは、標的組織に容易に接着し、標的組織上へ短期間直接置かれた後に縫合なく自己安定化する。例えば、一部の実施形態において、ｈＢＭＳＣシートは、組織との接触後５、１０、１５、２０、２５または３０分以内に標的組織に接着する。ある特定の実施形態において、細胞シート中のｈＢＭＳＣは、対象と同種である、すなわち、１つまたは複数の座において遺伝子が同一でないような対象と同じ種の異なる個体から単離される。ある特定の既報の場合において、ＭＳＣは、ヒトおよび動物モデルにおいて同種拒絶反応を外観上回避する［Ｊｉａｎｇら、２００５、Ｂｌｏｏｄ、１０５（１０）、４１２０～４１２６］。したがって、本明細書に記載されるｈＢＭＳＣシートは、自家幹細胞処置方法に関連する好ましくない費用および開発阻害要因を回避する既成品として同種細胞療法に使用されうる。

【0041】

一部の実施形態において、ｈＢＭＳＣ細胞シートは、腎移植を受けた対象に移植される。一部の実施形態において、ｈＢＭＳＣ細胞シートは、急性腎傷害を有する対象に移植される。一部の実施形態において、ｈＢＭＳＣ細胞シートは、虚血再灌流傷害を有する対象に移植される。一部の実施形態において、ｈＢＭＳＣ細胞シートは、腎線維化を有する対象に移植される。

【0042】

ある特定の態様において、本開示は、対象において腎線維化（例えば腎皮質の線維化）を抑制する方法であって、本明細書に記載のｈＢＭＳＣ細胞シートを対象の腎組織に適用し、それにより対象において腎線維化（例えば腎皮質の線維化）を抑制する工程を含む、方法に関する。

【0043】

ある特定の態様において、本開示は、対象において腎尿細管傷害を処置する方法であって、本明細書に記載のｈＢＭＳＣ細胞シートを対象の腎組織に適用し、それによって対象における腎尿細管傷害を処置する工程を含む、方法に関する。

【実施例】

【0044】

実施例１．ヒトクローン性ＢＭＳＣの評価およびヒトクローン性ＢＭＳＣシートの調製
ヒトクローン性ＢＭＳＣライブラリを、細分画培養方法を使用してＳＣＭ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ（韓国）によってドナー骨髄から確立した。Ｓｏｎｇ、Ｓ．Ｕ．ら、２００８、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ １７、４５１～４６１、ｄｏｉ：１０．１０８９を参照のこと。単離されたヒトクローン性ＢＭＳＣを、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．１％ ＭｙｃｏＺａｐ Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ（Ｌｏｎｚａ）および１％ペニシリンストレプトマイシンで補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ、米国）中で３７℃、５％ ＣＯ_２インキュベータで培養した。保存されたクローン性ＢＭＳＣを、ＣＤ７３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ３４－、ＣＤ３１－、ＣＤ４５－について試験によって検証した。各クローン性ＢＭＳＣ株を、確立された８継代保存物から回復させ、１，０００～２，０００細胞／ｃｍ^２で１０継代まで培養する。細胞を、酵素的分離によって採集し、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈ Ｆｌｏｗ Ｃｏｒｅでのフローサイトメトリー（ＢＤ Ｃａｎｔｏ）用に単一染色した。

【0045】

図１に示すように、細胞シート製造に使用した複数の細胞株由来のクローン性ＢＭＳＣが、表現型ＭＳＣマーカー（ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５）の陽性（≧９５％）表面抗原発現および常在骨髄／血液細胞（ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５）の陰性発現を呈した。パーセンテージ陽性を、蛍光アイソタイプ対照の０．５％超として測定した。Ｎ≧２。

【0046】

保存されたクローン性ＢＭＳＣを：３系統潜在性（骨形成、脂肪生成の、軟骨形成）、および表面抗原発現（ＣＤ７３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ３４－、ＣＤ３１－、ＣＤ４５－）について試験によって検証した。

【0047】

保存されたクローン性ＢＭＳＣを、二次培養し、３５ｍｍの温度応答性培養ディッシュ（ＴＲＣＤ）上に播種し、１０継代で６日間培養した。異なるクローン性ＢＭＳＣ細胞株を使用するクローン性ＢＭＳＣシートを、室温で細胞培養表面から採取し、ｑＰＣＲを用いて遺伝子発現のレベルでそれらのサイトカイン産生を調査した。

【0048】

図２に示すように、複数の細胞株由来の操作されたクローン性ＢＭＳＣシートが、ＴＲＣＤ上で成功裏に調製された。クローン性ＢＭＳＣシートは、ＨＧＦ、ＶＥＧＦおよびＦＧＦ２などの複数の組織再生サイトカインの遺伝子発現を呈した。不均一な非クローン性ＢＭＳＣ（図２において「全ＢＭＳＣ」）から調製された細胞シートも、類似のレベルのＨＧＦ、ＶＥＧＦおよびＦＧＦ２を産生した。

【0049】

保存したクローン性ＢＭＳＣを二次培養し、１０継代で単一細胞として細胞培養ディッシュから採取した。また、クローン性ＢＭＳＣを、３５ｍｍの温度応答性培養ディッシュ（ＴＲＣＤ）上に播種し、１０継代で６日間培養して細胞シートを調製した。クローン性ＢＭＳＣの複数の細胞株を、単一細胞および細胞シートとしてｑＰＣＲ用に調製してそれらのサイトカイン産生を遺伝子発現レベルで調査した。特に、単一細胞および細胞シートとしてのＩＬ－１０、ＩＤＯおよびＰＧＥ－２の遺伝子発現レベルの比較が、ｑＰＣＲによって調査された。クローン性ＢＭＳＣの細胞シートの形成により、単一細胞と比較して免疫調節性サイトカインの遺伝子発現が有意に増強した。図３を参照のこと。

【0050】

実施例２．ラット腎臓虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）モデルにおけるヒトクローン性ＢＭＳＣシートの移植
イソフルラン麻酔下で、免疫不全ラットの左腎臓から周囲の脂肪を慎重にはぎとり、左腎臓動脈および静脈を、脈管クリップで６０分間固定して血流を遮断した。固定６０分後に、クリップを取り外し、血流を再潅流して腎実質傷害を誘導した。５枚のヒトクローン性ＢＭＳＣシートを、腎被膜のありまたはなしで腎臓表面に移植した。細胞シートの移植後、３日目および２８日目にＩＲＩ腎臓を採取し、分析した。この研究の概要を図４に提供する。

【0051】

ラット腎臓を、ＩＲＩ後３日目に採取し、４％ ＰＦＡ中で固定し、組織学的分析用としてパラフィン包埋した。切片を、ヒトフィブロネクチンに特異的な抗体を使用して免疫標識し、アビジンビオチン化ペルオキシダーゼ複合体を使用して検出した。図５は、ＩＲＩ後３日目のラット腎臓におけるヒトフィブロネクチン（ｈＦＮ）染色の画像を提供する。左は、細胞シートの移植がないＩＲＩであり、中央は、腎被膜（各腎臓の外側表面を覆う薄い膜鞘）上へのクローン性ＢＭＳＣシートの移植があるＩＲＩであり、右は、被膜が除去された腎臓へのクローン性ＢＭＳＣシートの移植があるＩＲＩである。中央および右の画像において、クローン性ＢＭＳＣシートから得られる多くのｈＦＮ陽性細胞が、実質の上に検出され、被膜を含有する腎臓と被膜を除去した腎臓との両方において一部の細胞は、腎実質内に遊走した（矢印）。これら結果は、細胞シート移植が、腎被膜ありまたはなしで成功したことを示す。またこれら結果は、腎被膜が無傷であっても移植された細胞シート由来の細胞が、被膜を通過し、実質に遊走できたことを示す。クローン性ＢＭＳＣ細胞シートから被膜を通って、実質への細胞の遊走は、これらの組織における組織再生サイトカインの分泌を可能にし、組織再生に寄与することになる。

【0052】

ＩＲＩ後３日または２８日に採取され、４％ ＰＦＡ中で固定され、パラフィン包埋されたラット腎臓を、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）およびマッソントリクローム（ＭＴ）で染色して腎線維化を査定した。尿細管傷害の程度を、確立された評価法に基づいて評価した。Ｓｏｌｅｚ，Ｋ．ら、１９７０、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５８．５；および、Ｋｅｌｌｅｈｅｒら、１９８７、Ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ３１．３を参照のこと。要約すると、本発明者らは、尿細管壊死、尿円柱、刷子縁消失、および尿細管拡張の程度を以下の通りに等級分けした：０：＜１０％；０．５：１０～２５％；１：２５～４５％、１．５：４５～７５％および２：＞７５％。青色領域画分をＭＴ染色の画像から測定し、各群においてＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して分析した：天然（被膜あり、傷害なし、およびクローン性ＢＭＳＣ細胞シートなしの健康な正常な腎臓）、ＩＲＩのみ、被膜なし非クローン性ＢＭＳＣ（ＷＢ）シート、被膜なしクローン性ＢＭＳＣシート。

【0053】

図６は、腎臓被膜なしの細胞シート移植を示す。図６において、上列は、ＩＲＩ後３日での、天然、ＩＲＩ、および被膜なしクローン性ＢＭＳＣシート移植群の代表的なＰＡＳ染色画像および尿細管傷害スコアを示す。尿細管傷害は、ＩＲＩのみ、およびクローン性ＭＳＣシート群において黒色矢印によって示される。ＩＲＩ群と比較してクローン性ＢＭＳＣシート群のより低い尿細管傷害スコアによって示される通り、クローン性ＢＭＳＣシートはＩＲＩ傷害の初期フェーズを抑制した。下の列は、ＩＲＩ後２８日での、天然、ＩＲＩ、非クローン性ＢＭＳＣシート（ＷＢ）、被膜なしクローン性ＢＭＳＣシート移植群の線維化領域を示す、代表的なＭＴ染色画像およびコラーゲン陽性画分のグラフを示す。ＭＴ染色の領域は、コラーゲン沈着（矢印）を示す。被膜なしでのクローン性ＢＭＳＣシートの移植は、ＩＲＩおよび非クローン性ＢＭＳＣシート（ＷＢ）群と比較して最も低いコラーゲン染色領域によって示されるように、線維化の阻害が最も高いことを示した。

【0054】

図７は、腎臓被膜ありでのＢＭＳＣシート移植を示す。図７の上列は、ＩＲＩ後３日での、天然、ＩＲＩ、および被膜ありクローン性ＢＭＳＣシート移植群の代表的なＰＡＳ染色画像および尿細管傷害スコアを示す。尿細管傷害は、ＩＲＩのみ、およびクローン性ＭＳＣシート群において黒色矢印によって示される。ＩＲＩ群と比較してクローン性ＢＭＳＣシート群のより低い尿細管傷害スコアによって示される通り、クローン性ＢＭＳＣシートはＩＲＩ傷害の初期フェーズを抑制する。下の列は、ＩＲＩ後２８日での、天然、ＩＲＩ、被膜あり非クローン性ＢＭＳＣシート（ＷＢ）、および被膜ありクローン性ＢＭＳＣシート移植群の線維化領域を示す、代表的なＭＴ染色画像およびコラーゲン陽性青色領域画分のグラフを示す。ＭＴ染色の領域は、コラーゲン沈着（矢印）を示す。被膜ありクローン性ＢＭＳＣシートの移植は、ＩＲＩおよび非クローン性ＢＭＳＣシート（ＷＢ）群と比較して最も低いコラーゲン染色によって示されるように、線維化を阻害する能力が最も高いことを示す。

【0055】

実施例３．異なる培養条件（密度および培養期間）によるクローン性ＢＭＳＣシートの製造およびサイトカイン産生の評価
クローン性ＢＭＳＣを、組織培養ディッシュ上で８～１０継代に拡大した。１０継代の細胞を、密度４０万～７百万細胞／直径３５ｍｍの温度応答性細胞培養ディッシュ（ＴＲＣＤ、ＣｅｌｌＳｅｅｄ Ｉｎｃ．日本国、東京）で、アスコルビン酸（５０ｎｇ／ｍＬ）を含む基本培地に播種した。播種後６時間、１日、３日または６日に細胞を、培養温度を３７℃から室温（ＲＴ）に変化させることによって分離した。図８に示すように、クローン性ＢＭＳＣシートは、播種後６時間では初期細胞密度８０万細胞／３５ｍｍのＴＲＣＤ、１日では６０万細胞／３５ｍｍのＴＲＣＤ、ならびに３および６日では４０万細胞／３５ｍｍのＴＲＣＤからシートとして分離された。

【0056】

クローン性ＢＭＳＣシートを、ＲＴでＴＲＣＤから分離した後に採集した。細胞シートからのトータルＲＮＡを、製造業者のプロトコールにしたがってｔｒｉｚｏｌおよびＰｕｒｅＬｉｎｋ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、米国）を使用して抽出した。ｃＤＮＡを、ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してトータルＲＮＡ １μｇから調製した。ＲＴ－ＰＣＲ分析を、ＴａｐＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｓｔｅｐ Ｏｎｅ機器［Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、米国］を使用して実行した。遺伝子発現レベルを、以下の遺伝子：１）ハウスキーピング遺伝子としてグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ、Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１）、２）ＨＧＦ（Ｈｓ００３７９１４＿ｍ１）、３）ＩＬ１０（Ｈｓ００９６１６２２＿ｍ１）および４）ＶＥＧＦ（Ｈｓ９９９９９０７０＿ｍ１）について評価した。全てのプライマは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって製造された。相対的遺伝子発現レベルを、比較ＣＴ法によって定量化した。遺伝子発現レベルを、ＧＡＰＤＨ発現レベルに対して正規化した。遺伝子発現レベルは、単一細胞懸濁液群（ＳＣ）のレベルと相対的である。

【0057】

クローン性ＢＭＳＣシートの組織再生サイトカイン（ＨＧＦ、ＩＬ１０、ＶＥＧＦ）の遺伝子発現レベルを、単一クローン性ＢＭＳＣ懸濁液（ＳＣ）の遺伝子発現レベルと比較した。図９に示すように、クローン性ＢＭＳＣシートは、クローン性ＢＭＳＣの単一細胞懸濁液（ＳＣ）と比較して、ＨＧＦ、ＩＬ１０およびＶＥＧＦサイトカイン分泌についてより高い遺伝子発現レベルを示した。さらに、密度１３０万細胞／３５ｍｍのＴＲＣＤで調製されたクローン性ＢＭＳＣシートは、初期細胞密度４０万細胞／３５ｍｍのＴＲＣＤで調製されたクローン性ＢＭＳＣシートの遺伝子発現レベルと比較して、より高い遺伝子発現レベル（ＨＧＦ、ＩＬ１０、ＶＥＧＦ）を表した。

【0058】

クローン性ＢＭＳＣシート培地を、新鮮な培地と交換した。試料を、２４時間（３７℃、５．０％ ＣＯ_２）培養した。２４時間の上清（群当たりｎ＝３）を１２００ＲＰＭで５分間遠心分離して、細胞残屑を含まない上清中の可溶性サイトカインを採集した。クローン性ＢＭＳＣシート当たりの分泌される可溶性ＨＧＦ、ＶＥＧ、ＩＬ１０の濃度を、ヒトＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＬ１０ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ、米国）を使用して定量した。サイトカイン量を、細胞シートまたは細胞の数に対して正規化して、細胞シートまたは細胞当たりで分泌されたサイトカイン量を決定した。異なる初期細胞密度（６０万個、１５０万個、３００万細胞／３５ｍｍのＴＲＣＤ）を有するクローン性ＢＭＳＣシートから分泌されるサイトカイン量が、検出された。図１０に示すように、より高い初期細胞密度の群（１５０万個および３００万細胞／３５ｍｍのＴＲＣＤ）は、６０万細胞／３５ｍｍのＴＲＣＤ群と比較して、細胞シートおよび細胞当たり、より多量のサイトカインを分泌した。

【0059】

実施例４．凍結ＢＭＳＣの評価および細胞シートの調製
新鮮なクローン性ＢＭＳＣ（新鮮な細胞）を、９継代（Ｐ９）でトリプシン処理によって細胞培養表面から得た。凍結クローン性ＢＭＳＣ（凍結細胞）を、液体窒素タンク中で、保存されたＰ９クローン性ＢＭＳＣを凍結することによって調製した。新鮮な細胞と凍結細胞との両方を計数し、１０継代細胞として濃度５０００細胞／ｃｍ^２で３５ｍｍ細胞培養ディッシュ上へ播種した。インキュベーション１５または３０分後に、非接着細胞を、ＰＢＳ（－）を使用して洗い流し、接着細胞だけを位相差顕微鏡で観察した。図１１に示すように、凍結細胞は、新鮮な細胞と比較して高い初期および成熟細胞接着能力を示した。（スケールバー；２００μｍ）。新鮮な細胞と凍結細胞との両方を、０．４、１、１．５、および３百万細胞（０．４Ｍ、１．０Ｍ、１．５Ｍ、および３．０Ｍ）で細胞培養ディッシュに播種した。新鮮な細胞または凍結細胞から調製した細胞シートを、１日培養後に採取した。図１２に示すように、より高い初期細胞密度によって、より大きな細胞シートが得られた。凍結細胞は、新鮮な細胞と比較してより低い初期細胞密度での細胞シートの調製を可能にした。（スケールバー；１ｃｍ）。

【0060】

凍結細胞から調製した細胞シートを、コラゲナーゼおよびトリプシン処理によって解離させ、細胞生存率をトリパンブルー染色によって決定した。凍結細胞または新鮮な細胞から調製されたシート由来細胞の生存率が、以下の表１に示される。凍結細胞から調製したシート由来の細胞は、新鮮な細胞から調製したシート由来の細胞が示したように、高い細胞生存率を示した。

【0061】

【表1】

【0062】

新鮮なおよび凍結細胞シートを、初期細胞密度０．４、１、１．５および３百万個（０．４Ｍ、１．０Ｍ、１．５Ｍ、および３．０Ｍ）で調製し、１日培養後に採取した。調製した細胞シートをｑＰＣＲに用いて、そのサイトカイン産生を調査した。図１３に示すように、各初期細胞密度で凍結細胞から調製されたシートが、新鮮な細胞から調製されたシートと同程度のサイトカイン産生を示したことは、凍結細胞が、細胞シート製造の選択肢になりうることを示唆した。特に、凍結細胞ストックは、培養におけるその高い初期細胞接着能力により素早い細胞シート製造を実行するのに有益である。

【0063】

実施例５
クローン性骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）シートは、１０継代目に３５ｍｍのＴＲＣＤ当たり０．４×１０^６細胞を播種することによって製造された。６日目に、細胞シートは分離され、１μｍ細孔の挿入ウェル上へ再播種され、０、０．２５、２．５、２５または５０ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γのいずれかを含有する培地で培養された。２日後、細胞シートは、挿入ウェルから採集され、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析用として加工された。図１４に示すように、クローン性ＢＭＳＣシートは、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）に応じて、免疫調節性分子ＨＬＡ－ＤＲ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ、ＩＬ－１０およびＰＧＥ－２の発現を上方調節する。クローン性ＢＭＳＣシートは、２５ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γに曝露した際に、免疫調節性遺伝子の上方調節のピークを呈した。遺伝子発現は、同じ条件下でプライミングしていない対照細胞シートに対して正規化した倍率変化として表された。（試料数；ｎ＝２）。

【0064】

実施例６
クローン性および全ＢＭＳＣシートは、１０継代目に３５ｍｍのＴＲＣＤ当たり０．４×１０^６細胞を播種することによって製造された。細胞シート培養の４日目に、２５ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γを培養物に添加して、分離前に２日間のプライミングを開始した。細胞シート培養の６日目に、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析用として細胞シートは分離され、加工された。図１５に示すように、ＩＦＮ－γを補充して製造された細胞シートは、免疫調節性分子の上方調節を呈する。細胞シートを分離する前に、２５ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γが、２日間添加された。分離前に２日間プライミングされたクローン性ＢＭＳＣシートは、ＨＬＡ－ＤＲ、ＰＤ－Ｌ１およびＩＤＯの遺伝子発現の有意な増大を呈した。遺伝子発現は、同じ条件下で製造されたプライミングしていない対照細胞シートそれぞれに対して正規化した倍率変化として表された。（試料数；ｎ＝６）。

【0065】

結論：ＩＦＮ－γで４８時間プライミングしたｈＢＭＳＣシートは、細胞シート分離直後にＩＤＯおよびＨＬＡ－ＤＲの上方調節、安定したＰＧＥ－２、ならびにＩＬ－１０の下方調節を呈した。ＩＦＮ－ｙプライミングは、ＩＤＯ遺伝子発現に対して最も大きな効果を有した。ＩＤＯ遺伝子の発現は、Ｔ細胞阻害に関連するので、プライミングした細胞シートは、炎症を減少させるのに有用となりうる。

【0066】

実施例７
クローン性ＢＭＳＣシートは、１０継代目に３５ｍｍのＴＲＣＤ当たり０．４×１０^６細胞を播種することによって製造された。２５ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γが、０日目（播種時）、２日目または４日目のいずれかに培養物に添加された。細胞シート培養の６日目に、ｑＲＴ－ＰＣＲ用として細胞シートは分離され、加工された。図１６に示すように、ＩＦＮ－γプライミング期間の増大は、免疫調節性分子の遺伝子発現のさらなる増大と関連した。ＩＦＮ－γプライミングの４日および６日後に製造されたクローン性ＢＭＳＣシートは、免疫調節性遺伝子（ＨＬＡ－ＤＲ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ、ＩＬ－１０およびＰＧＥ－２）の上方調節を呈し、プライミング６日後に最も高い発現であった。遺伝子発現は、同じ条件下で製造されたプライミングしていない対照細胞シートそれぞれに対して正規化した倍率変化として表された。（試料数；ｎ＝６）。

【0067】

実施例８
クローン性ＢＭＳＣシートは、１０継代目に３５ｍｍのＴＲＣＤ当たり０．４×１０^６細胞を播種することによって製造された。２５ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γが、０日目（播種時）、２日目または４日目のいずれかに培養物に添加された。細胞シート培養の６日目に、細胞シートは分離され、１μｍ細孔挿入ウェル上へ再播種され、標準的な培養培地で培養された。４日後、細胞シートは、挿入ウェルから採集され、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析用として加工された。６日間、４日間、２日間または０日間のいずれかでＩＦＮ－γを補充して製造された細胞シートを、通常の培養条件で４日間再度平板培養して、ＩＦＮ－γ効果の安定性が分析された。結果は、ＩＦＮ－γの除去後も、クローン性ＢＭＳＣが、ＨＬＡ－ＤＲ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯおよびＩＬ－１０の上方調節された遺伝子発現を呈し続けることを示した。図１７を参照のこと。４日間のＩＦＮ－γプライミングで製造されたクローン性細胞シートは、免疫抑制性（ＩＤＯ、ＰＤ－Ｌ１およびＩＬ－１０）分子の最も高い遺伝子発現を呈した。遺伝子発現は、同じ条件下で製造されたプライミングしていない対照細胞シートそれぞれに対して正規化した倍率変化として表された。（試料数；ｎ＝４）。

【0068】

実施例９
クローン性ＢＭＳＣシートは、１０継代目に３５ｍｍのＴＲＣＤ当たり０．４×１０^６細胞を播種することによって製造された。細胞シート培養の４日目に、５または８０ｎｇ／ｍＬいずれかのｂＦＧＦを培養物に添加して、分離前に２日間のプライミングを開始した。細胞シート培養の６日目に、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析用として細胞シートは分離され、加工された。図１８に示すように、ｂＦＧＦを補充して製造された細胞シートは、免疫調節性分子の上方調節を呈する。例えば、分離前に２日間プライミングされたクローン性ＢＭＳＣシートは、ＨＬＡ－ＤＲ、ＩＤＯおよびＩＬ－１０の有意な増大を呈した。遺伝子発現は、同じ条件下で製造されたプライミングしていない対照細胞シートそれぞれに対して正規化した倍率変化として表された。（試料数；ｎ＝３）

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【国際調査報告】