特表 2024-536358 抗ＣＤ７９Ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-04

(54)【発明の名称】抗ＣＤ７９Ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/30 20060101AFI20240927BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240927BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240927BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240927BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240927BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240927BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240927BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240927BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240927BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240927BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240927BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240927BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20240927BHJP

【ＦＩ】

C07K16/30 ZNA

C07K16/46

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61P35/00

A61P43/00 111

G01N33/53 B

G01N33/53 Y

C12N15/13

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024520682

(86)(22)【出願日】2022-07-29

(85)【翻訳文提出日】2024-04-04

(86)【国際出願番号】 CN2022108881

(87)【国際公開番号】W WO2023011338

(87)【国際公開日】2023-02-09

(31)【優先権主張番号】202110881474.1

(32)【優先日】2021-08-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519274183

【氏名又は名称】イノベント バイオロジクス（スーチョウ）カンパニー，リミティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(72)【発明者】

【氏名】ウー ウェイウェイ

(72)【発明者】

【氏名】ワン チエ

(72)【発明者】

【氏名】ホー カイチエ

(72)【発明者】

【氏名】リー リー

(72)【発明者】

【氏名】チョウ ショアイシアン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE12

4B064DA05

4B064DA14

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BC01

4B065CA25

4B065CA44

4B065CA46

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA16

4C085BB36

4C085BB41

4C085BB43

4C085BB44

4C085CC01

4C085CC07

4C085DD62

4C085EE01

4C085EE03

4C085GG01

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA24

4H045EA51

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、ＣＤ７９ｂに特異的に結合する抗体並びにＣＤ７９ｂ及びＣＤ３に特異的に結合する二重特異性抗体、抗ＣＤ７９ｂ抗体及び抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体をコードする核酸、核酸を含むベクター、核酸又はベクターを含む宿主細胞、並びに抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

重鎖可変領域ＶＨ及び軽鎖可変領域ＶＬを含む、ＣＤ７９ｂに結合する抗体又はその抗原結合断片であって、
（ｉ）前記ＶＨは、配列番号４に示されるＶＨに含まれる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、配列番号９に示されるＶＬに含まれるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、
又は
（ｉｉ）前記ＶＨは、配列番号１４に示されるＶＨに含まれる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、配列番号１９に示されるＶＬに含まれるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、
抗体又はその抗原結合断片。

【請求項2】

重鎖可変領域ＶＨ及び／又は軽鎖可変領域ＶＬを含む、ＣＤ７９ｂに結合する抗体又はその抗原結合断片であって、
（ｉ）前記ＶＨは、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１は、配列番号１若しくは配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＨＣＤＲ２は、配列番号２若しくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＨＣＤＲ３は、配列番号３若しくは配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる、
及び／又は
（ｉｉ）前記ＶＬは、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１は、配列番号６若しくは配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＬＣＤＲ２は、配列番号７若しくは配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＬＣＤＲ３は、配列番号８若しくは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる、
抗体又はその抗原結合断片。

【請求項3】

重鎖可変領域ＶＨ及び軽鎖可変領域ＶＬを含む、請求項２に記載の抗体又はその抗原結合断片であって、
１）前記ＶＨは、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＨＣＤＲ２は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＨＣＤＲ３は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むか、それからなり、前記ＶＬは、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＬＣＤＲ２は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＬＣＤＲ３は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる、
又は
２）前記ＶＨは相補性決定領域（ＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＨＣＤＲ２は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＨＣＤＲ３は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＶＬは、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＬＣＤＲ２は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＬＣＤＲ３は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる、
抗体又はその抗原結合断片。

【請求項4】

重鎖可変領域ＶＨ及び／又は軽鎖可変領域ＶＬを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片であって、
（ａ）前記重鎖可変領域ＶＨが、
（ｉ）配列番号４若しくは配列番号１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなるか、又は
（ｉｉ）配列番号４若しくは配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなるか、又は
（ｉｉｉ）配列番号４若しくは配列番号１４に示されるアミノ酸配列と比較して、１～１０個のアミノ酸の置換、挿入、若しくは欠失を有するアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる、
及び／あるいは
（ｂ）軽鎖可変領域ＶＬが、
（ｉ）配列番号９若しくは配列番号１９に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなるか、又は
（ｉｉ）配列番号９若しくは配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなるか、又は
（ｉｉｉ）配列番号９若しくは配列番号１９に示されるアミノ酸配列と比較して、１～１０個のアミノ酸の置換、挿入、若しくは欠失を有するアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる、
抗体又はその抗原結合断片。

【請求項5】

（１）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％を有するアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号９に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる軽鎖可変領域ＶＬ、
又は
（２）配列番号１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号１９に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる軽鎖可変領域ＶＬ
を含む、請求項４に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項6】

（１）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる軽鎖可変領域ＶＬ、
又は
（２）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる軽鎖可変領域ＶＬ
を含む、請求項５に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項7】

重鎖及び／又は軽鎖を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片であって、
（ａ）前記重鎖が、
（ｉ）配列番号５若しくは配列番号１５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなるか、
（ｉｉ）配列番号５若しくは配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなるか、又は
（ｉｉｉ）配列番号５若しくは配列番号１５に示されるアミノ酸配列と比較して、１～１０個のアミノ酸の置換、挿入、若しくは欠失を有するアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる、
及び／あるいは
（ｂ）前記軽鎖が、
（ｉ）配列番号１０若しくは配列番号２０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなるか、
（ｉｉ）配列番号１０若しくは配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなるか、又は
（ｉｉｉ）配列番号１０若しくは配列番号２０に示されるアミノ酸配列と比較して、１～１０個のアミノ酸の置換、挿入、若しくは欠失を有するアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる、
抗体又はその抗原結合断片。

【請求項8】

（１）配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる重鎖、及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる軽鎖、
又は
（２）配列番号１５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる重鎖、及び配列番号２０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる軽鎖
を含む、請求項７に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項9】

（１）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる重鎖、及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる軽鎖、
又は
（２）配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる重鎖、及び配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる軽鎖
を含む、請求項８に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項10】

前記抗体が、ＩｇＧ１の形態の抗体である、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項11】

前記抗体が、モノクローナル抗体分子、キメラ抗体分子、ヒト化抗体、若しくはヒト抗体分子、又は二重特異性抗体若しくは多重特異性抗体分子であり、前記抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）若しくは（Ｆａｂ’）_２、単一ドメイン抗体、ダイアボディ（ｄＡｂ）、ラクダ科動物抗体（重鎖抗体）、又は直鎖状抗体のうちの１つである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項12】

第１の重鎖、第１の軽鎖、第２の重鎖、及び第２の軽鎖を含む二重特異性抗体であり、前記第１の重鎖及び前記第１の軽鎖が、ＣＤ７９ｂに結合する抗原部位を含み、好ましくは、前記第２の重鎖及び前記第２の軽鎖が、ＣＤ３に結合する抗原結合部位を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項13】

１）前記第１の軽鎖が、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１が、配列番号６のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＬＣＤＲ２が、配列番号７のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＬＣＤＲ３が、配列番号８を含むか、若しくはそれからなり、前記第１の重鎖が、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１が、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＨＣＤＲ２が、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＨＣＤＲ３が、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記第２の重鎖が、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１が、配列番号３１のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＨＣＤＲ２が、配列番号３２のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＨＣＤＲ３が、配列番号３３を含むか、若しくはそれからなり、前記第２の軽鎖が、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１が、配列番号３６のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＬＣＤＲ２が、配列番号３７のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＬＣＤＲ３が、配列番号３８のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる、
２）前記第１の軽鎖が、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１が、配列番号６のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＬＣＤＲ２が、配列番号７のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＬＣＤＲ３が、配列番号８のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記第１の重鎖が、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１が、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＨＣＤＲ２が、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＨＣＤＲ３が、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記第２の重鎖が、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１が、配列番号４１のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＨＣＤＲ２が、配列番号４２のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＨＣＤＲ３が、配列番号４３のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記第２の軽鎖が、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１が、配列番号４６のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＬＣＤＲ２が、配列番号４７のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＬＣＤＲ３が、配列番号４８のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる、
３）前記第１の軽鎖が、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１が、配列番号１６のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＬＣＤＲ２が、配列番号１７のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＬＣＤＲ３が、配列番号１８のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記第１の重鎖が、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１が、配列番号１１のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＨＣＤＲ２が、配列番号１２のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＨＣＤＲ３が、配列番号１３のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記第２の重鎖が、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１が、配列番号３１のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＨＣＤＲ２が、配列番号３２のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＨＣＤＲ３が、配列番号３３のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記第２の軽鎖が、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１が、配列番号３６のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＬＣＤＲ２が、配列番号３７のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＬＣＤＲ３が、配列番号３８のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる、
４）前記第１の軽鎖が、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１が、配列番号１６のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＬＣＤＲ２が、配列番号１７のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＬＣＤＲ３が、配列番号１８のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記第１の重鎖が、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１が、配列番号１１のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＨＣＤＲ２が、配列番号１２のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＨＣＤＲ３が、配列番号１３のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記第２の重鎖が、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１が、配列番号４１のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＨＣＤＲ２が、配列番号４２のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＨＣＤＲ３が、配列番号４３のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記第２の軽鎖が、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１が、配列番号４６のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＬＣＤＲ２が、配列番号４７のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＬＣＤＲ３が、配列番号４８のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる、
５）前記第１の軽鎖が、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１が、配列番号２６のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＬＣＤＲ２が、配列番号２７のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＬＣＤＲ３が、配列番号２８のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記第１の重鎖が、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１が、配列番号２１のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＨＣＤＲ２が、配列番号２２のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＨＣＤＲ３が、配列番号２３のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記第２の重鎖が、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１が、配列番号３１のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＨＣＤＲ２が、配列番号３２のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＨＣＤＲ３が、配列番号３３のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記第２の軽鎖が、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１が、配列番号３６のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＬＣＤＲ２が、配列番号３７のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＬＣＤＲ３が、配列番号３８のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる、
又は
６）前記第１の軽鎖が、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１が、配列番号２６のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＬＣＤＲ２が、配列番号２７のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＬＣＤＲ３が、配列番号２８のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記第１の重鎖が、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１が、配列番号２１のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＨＣＤＲ２が、配列番号２２のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＨＣＤＲ３が、配列番号２３のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記第２の重鎖が、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１が、配列番号４１のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＨＣＤＲ２が、配列番号４２のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＨＣＤＲ３が、配列番号４３のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記第２の軽鎖が、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１が、配列番号４６のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＬＣＤＲ２が、配列番号４７のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、前記ＬＣＤＲ３が、配列番号４８のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる、
請求項１２に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項14】

１）前記第１の軽鎖が、配列番号９に示されるＶＬを含み、前記第１の重鎖が、配列番号４に示されるＶＨを含み、前記第２の重鎖が、配列番号３４に示されるＶＨを含み、前記第２の軽鎖が、配列番号３９に示されるＶＬを含む、
２）前記第１の軽鎖が、配列番号９に示されるＶＬを含み、前記第１の重鎖が、配列番号４に示されるＶＨを含み、前記第２の重鎖が、配列番号４４に示されるＶＨを含み、前記第２の軽鎖が、配列番号４９に示されるＶＬを含む、
３）前記第１の軽鎖が、配列番号１９に示されるＶＬを含み、前記第１の重鎖が、配列番号１４に示されるＶＨを含み、前記第２の重鎖が、配列番号３４に示されるＶＨを含み、前記第２の軽鎖が、配列番号３９に示されるＶＬを含む、
４）前記第１の軽鎖が、配列番号１９に示されるＶＬを含み、前記第１の重鎖が、配列番号１４に示されるＶＨを含み、前記第２の重鎖が、配列番号４４に示されるＶＨを含み、前記第２の軽鎖が、配列番号４９に示されるＶＬを含む、
５）前記第１の軽鎖が、配列番号２９に示されるＶＬを含み、前記第１の重鎖が、配列番号２４に示されるＶＨを含み、前記第２の重鎖が、配列番号３４に示されるＶＨを含み、前記第２の軽鎖が、配列番号３９に示されるＶＬを含む、
又は
６）前記第１の軽鎖が、配列番号２９に示されるＶＬを含み、前記第１の重鎖が配列番号２４に示されるＶＨを含み、前記第２の重鎖が、配列番号４４に示されるＶＨを含み、前記第２の軽鎖が、配列番号４９に示されるＶＬを含む、
請求項１２又は１３に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項15】

１）前記第１の軽鎖が、配列番号１０を含むか、若しくはそれからなり、前記第１の重鎖が、配列番号５を含むか、若しくはそれからなり、前記第２の重鎖が、配列番号３５を含むか、若しくはそれからなり、前記第２の軽鎖が、配列番号４０を含むか、若しくはそれからなる、
２）前記第１の軽鎖が、配列番号１０を含むか、若しくはそれからなり、前記第１の重鎖が、配列番号５を含むか、若しくはそれからなり、前記第２の重鎖が、配列番号４５を含むか、若しくはそれからなり、前記第２の軽鎖が、配列番号５０を含むか、若しくはそれからなる、
３）前記第１の軽鎖が、配列番号２０の配列を含むか、若しくはそれからなり、前記第１の重鎖が、配列番号１５を含むか、若しくはそれからなり、前記第２の重鎖が、配列番号３５を含むか、若しくはそれからなり、前記第２の軽鎖が、配列番号４０を含むか、若しくはそれからなる、
４）前記第１の軽鎖が、配列番号２０の配列を含むか、若しくはそれからなり、前記第１の重鎖が、配列番号１５を含むか、若しくはそれからなり、前記第２の重鎖が、配列番号４５を含むか、若しくはそれからなり、前記第２の軽鎖が、配列番号５０を含むか、若しくはそれからなる、
５）前記第１の軽鎖が、配列番号３０の配列を含むか、若しくはそれからなり、前記第１の重鎖が、配列番号２５を含むか、若しくはそれからなり、前記第２の重鎖が、配列番号３５を含むか、若しくはそれからなり、前記第２の軽鎖が、配列番号４０を含むか、若しくはそれからなる、
又は
６）前記第１の軽鎖が、配列番号３０の配列を含むか、若しくはそれからなり、前記第１の重鎖が、配列番号２５を含むか、若しくはそれからなり、前記第２の重鎖が、配列番号４５を含むか、若しくはそれからなり、前記第２の軽鎖が、配列番号５０を含むか、若しくはそれからなる、
請求項１２～１４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項16】

請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする、単離された核酸。

【請求項17】

請求項１６に記載の核酸を含むベクターであって、好ましくは発現ベクターである、ベクター。

【請求項18】

請求項１６に記載の核酸又は請求項１７に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項19】

前記宿主細胞が、原核生物又は真核生物であり、好ましくは、前記宿主細胞が、酵母細胞、哺乳動物細胞、又は抗体若しくはその抗原結合断片を調製するのに好適な他の細胞であり、好ましくは、前記哺乳動物細胞が、２９３細胞又はＣＨＯ細胞である、請求項１８に記載の宿主細胞。

【請求項20】

請求項１６に記載の核酸を発現するのに好適な条件下で請求項１８又は１９に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗体又はその抗原結合断片を調製するための方法であって、任意に、前記抗体又はその抗原結合断片を単離することを含み、任意に、前記宿主細胞から前記抗体又はその抗原結合断片を回収することをさらに含む、方法。

【請求項21】

請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片及び追加の物質を含む、免疫複合体。

【請求項22】

請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項２１に記載の免疫複合体、及び任意に医薬補助材料、並びに任意に１つ以上の他の治療薬を含む、医薬組成物。

【請求項23】

腫瘍などのＣＤ７９ｂ及び／又はＣＤ３に関連する疾患又は障害を予防及び／又は治療するための医薬の調製における、請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項２１に記載の免疫複合体、又は請求項２２に記載の医薬組成物の使用。

【請求項24】

１つ以上の治療法と組み合わせて、前記抗体若しくはその抗原結合断片、免疫複合体、又は医薬組成物を投与することができる、請求項２１又は２２に記載の使用。

【請求項25】

前記治療法が、治療モダリティ及び／又は他の治療薬であり、好ましくは、前記治療モダリティが、外科的治療及び／又は放射線療法を含む、請求項２３に記載の使用。

【請求項26】

ＣＤ７９ｂ及び／又はＣＤ３に関連する疾患又は障害を予防及び／又は治療する方法であって、有効量の請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、請求項２１に記載の免疫複合体、又は請求項２２に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。

【請求項27】

試料における抗原ＣＤ７９ｂ及び／又はＣＤ３を検出するための方法であって、
（ａ）前記試料を請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片と接触させることと、
（ｂ）前記抗体又はその抗原結合断片及び前記抗原ＣＤ７９ｂ及び／又はＣＤ３によって形成される複合体を検出することであって、任意に、前記抗体が、検出可能に標識されていることと
を含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は一般に、免疫学及び抗体工学の分野に関する。特に、本発明は、ＣＤ７９ｂ単一特異性抗体並びにＣＤ７９ｂ及びＣＤ３に特異的に結合する新規な二重特異性抗体に関する。さらに、本発明は、抗体をコードする核酸、核酸を含むベクター、核酸又はベクターを含む宿主細胞、及び抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物に関する。さらに、本発明は、疾患の免疫療法、予防、及び／又は診断におけるこれらの抗体、医薬組成物などの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ＣＤ７９ｂは、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、ＣＤ７９ａとヘテロ二量体を形成し、この２つ及び表面グロブリンはＢＣＲ受容体複合体を構成する。ＢＣＲ自体はシグナル伝達ドメインを有さず、抗原がＢＣＲに結合すると、ＣＤ７９ａ／ｂヘテロ二量体が下流のシグナル伝達に関与し、これはＢ細胞全体の機能を維持するために重要である。ＣＤ７９ｂがノックアウトされた後には、Ｂ細胞はプレＢ段階に制限され、さらに発達及び成熟することができないことが研究によって示されている。

【0003】

Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫は、ＮＨＬ症例の約８５％を占める。Ｂ細胞ＮＨＬのファーストライン治療後の再発率は高く（ＤＬＢＣＬのファーストライン治療後の再発率は３０～４０％である）、再発患者は予後不良（ＤＬＢＣＬのＯＳは平均で９～１２ヶ月である）及び限られた後期段階の治療に直面する。一方で、新規の症例並びに再発及び難治性症例の数は毎年膨大であり（中国及び米国の両方で毎年約８万人の新規の症例）、特に中国では年間の死者数が約５万人に達しており、これは米国の２倍超である。ＣＤ７９ｂに対する抗体薬物複合体はＮＨＬ患者において一定の臨床効果を示しているが、一部の患者はそれらに対する耐性を発現しており、ＮＨＬに対する改善された治療法についての患者の大きなニーズは依然として満たされていない。

【0004】

近年、二重特異性抗体ベースの免疫療法が急速に発展し、それらは細胞傷害性細胞及び腫瘍細胞上の表面抗原に同時に結合することができ、したがって細胞傷害性細胞による腫瘍細胞の死滅を媒介する。抗体薬物複合体と比較して、それらは有効性及び安全性の点で一定の利点がある。

【0005】

本発明は、高い標的特異性及び高い親和性でＣＤ７９ｂ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体、特に、腫瘍細胞の表面上に発現するＣＤ７９ｂに結合することによってＴ細胞を腫瘍細胞の周囲に動員させる二重特異性抗体を提供することにより、このニーズを満たす。

【発明の概要】

【0006】

一態様において、本発明は、ＣＤ７９ｂに結合する新規な抗体又はその抗原結合断片に関する。

【0007】

いくつかの実施形態において、本発明は、重鎖可変領域ＶＨ及び／又は軽鎖可変領域ＶＬを含む、ＣＤ７９ｂに結合する抗体又はその抗原結合断片であって、
１）ＶＨは、配列番号４に示されるＶＨに含まれる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬは、配列番号９に示されるＶＬに含まれるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、又は
２）ＶＨは、配列番号１４に示されるＶＨに含まれる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬは、配列番号１９に示されるＶＬに含まれるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、
抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0008】

いくつかの実施形態において、本発明は、重鎖可変領域ＶＨ及び／又は軽鎖可変領域ＶＬを含む、ＣＤ７９ｂに結合する抗体又はその抗原結合断片であって、
（ｉ）ＶＨは、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１は、配列番号１若しくは配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は、配列番号２若しくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は、配列番号３若しくは配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む、
及び／又は
（ｉｉ）ＶＬは、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号６若しくは配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は、配列番号７若しくは配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３は、配列番号８若しくは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む、
抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0009】

いくつかの実施形態において、本発明は、重鎖可変領域ＶＨ及び／又は軽鎖可変領域ＶＬを含む、ＣＤ７９ｂに結合する抗体又はその抗原結合断片であって、
１）ＶＨは、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、ＨＣＤＲ３は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬは、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む；
２）ＶＨは、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬは、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む、
抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0010】

いくつかの実施形態において、本発明は、重鎖可変領域ＶＨ及び／又は軽鎖可変領域ＶＬを含む、ＣＤ７９ｂに結合する抗体又はその抗原結合断片であって、
（ａ）重鎖可変領域ＶＨが、
（ｉ）配列番号４若しくは配列番号１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなるか、又は
（ｉｉ）配列番号４若しくは配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれらからなるか、又は
（ｉｉｉ）配列番号４若しくは配列番号１４に示されるアミノ酸配列と比較して、１つ以上（好ましくは１０個以下、より好ましくは５、４、３、２、若しくは１つ以下）のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的アミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、アミノ酸変化がＣＤＲにおいて起こっていない、
及び／あるいは
（ｂ）軽鎖可変領域ＶＬが、
（ｉ）配列番号９若しくは配列番号１９に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなるか、又は
（ｉｉ）配列番号９若しくは配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれらからなるか、又は
（ｉｉｉ）配列番号９若しくは配列番号１９に示されるアミノ酸配列と比較して、１つ以上（好ましくは１０個以下、より好ましくは５、４、３、２、若しくは１つ以下）のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的アミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、アミノ酸変化がＣＤＲにおいて起こっていない、
抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0011】

いくつかの実施形態において、本発明は、ＣＤ７９ｂに結合する抗体又はその抗原結合断片であって、
１）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号９に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ；
２）配列番号１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ、及び配列番号１９に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ
を含む、抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0012】

いくつかの実施形態において、本発明は、ＣＤ７９ｂに結合する抗体又はその抗原結合断片であって、
１）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ；
２）配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＶＨ及び配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＶＬ
を含む、抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0013】

いくつかの実施形態において、本発明は、重鎖及び／又は軽鎖を含む、ＣＤ７９ｂに結合する抗体又はその抗原結合断片であって、
（ａ）重鎖が、
（ｉ）配列番号５若しくは配列番号１５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなるか、又は
（ｉｉ）配列番号５若しくは配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれらからなるか、又は
（ｉｉｉ）配列番号５若しくは配列番号１５に示されるアミノ酸配列と比較して、１つ以上（好ましくは２０若しくは１０個以下、より好ましくは５、４、３、２、若しくは１つ以下）のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的アミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、アミノ酸変化が重鎖のＣＤＲにおいて起こっておらず、より好ましくは、アミノ酸変化が重鎖可変領域において起こっていない、
及び／あるいは
（ｂ）軽鎖が、
（ｉ）配列番号１０若しくは配列番号２０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなるか、又は
（ｉｉ）配列番号１０若しくは配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれらからなるか、又は
（ｉｉｉ）配列番号１０若しくは配列番号２０に示されるアミノ酸配列と比較して、１つ以上（好ましくは２０若しくは１０個以下、より好ましくは５、４、３、２、若しくは１以下）のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的アミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、アミノ酸変化が軽鎖のＣＤＲにおいて起こっておらず、より好ましくは、アミノ酸変化が軽鎖可変領域において起こっていない、
抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0014】

いくつかの実施形態において、本発明は、ＣＤ７９ｂに結合する抗体又はその抗原結合断片であって、
１）配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖；
２）配列番号１５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号２０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0015】

いくつかの実施形態において、本発明は、ＣＤ７９ｂに結合する抗体又はその抗原結合断片であって、
１）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
２）配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0016】

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のＣＤ７９ｂに結合する抗体又はその抗原結合断片をコードする単離された核酸、核酸を含むベクター、及び核酸又はベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0017】

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のＣＤ７９ｂに結合する抗体又はその抗原結合断片を調製するための方法であって、本明細書に記載の核酸を発現するのに好適な条件下で本明細書に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法を提供する。

【0018】

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のＣＤ７９ｂに結合する抗体又はその抗原結合断片を含む、免疫複合体及び医薬組成物を提供する。

【0019】

いくつかの実施形態において、本発明はまた、腫瘍の予防及び／又は治療のための医薬の調製における、本発明のＣＤ７９ｂに結合する抗体又はその抗原結合断片、免疫複合体、又は医薬組成物の使用を提供する。

【0020】

いくつかの実施形態において、本発明はまた、腫瘍を予防及び／又は治療するための方法であって、有効量の本発明のＣＤ７９ｂに結合する抗体又はその抗原結合断片、免疫複合体、又は医薬組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。

【0021】

本発明はまた、試料におけるＣＤ７９ｂを検出するための方法であって、（ａ）本明細書に記載の抗体又はその抗原結合断片を接触させることと、（ｂ）抗体又はその抗原結合断片及びＣＤ７９ｂによって形成される複合体を検出することとを含む、方法に関する。

【0022】

別の態様において、本発明はまた、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ３の両方を標的化する新規な二重特異性抗体、二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含むベクター、ポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞、並びに個体におけるＣＤ７９ｂ活性に関連する疾患の治療、予防、及び／又は診断における二重特異性抗体の使用を開示する。

【0023】

したがって、一態様において、本発明は、（ｉ）抗ＣＤ７９ｂ抗体又はその断片及び（ｉｉ）抗ＣＤ３抗体又はその断片を含む、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ３の両方に特異的に結合する二重特異性抗体（抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体）を提供する。一実施形態において、本発明は、左右対称である４つのポリペプチド鎖からなる１＋１形式の抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体であって、左半分は第１の軽鎖及び第１の重鎖からなり、右半分は第２の重鎖及び第２の軽鎖からなり、第１の軽鎖及び第１の重鎖はＣＤ７９ｂ又はＣＤ３を標的化する抗体の重鎖及び軽鎖であり、第２の重鎖及び第２の軽鎖はＣＤ３又はＣＤ７９ｂを標的化する抗体の重鎖及び軽鎖である、抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体を提供する。

【0024】

一実施形態において、本発明は、１＋１形式の抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体であって、第１の軽鎖及び第１の重鎖がＣＤ７９ｂに特異的に結合し、第２の重鎖及び第２の軽鎖がＣＤ３に特異的に結合する、抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体を提供する。特定の実施形態において、本明細書で提供される抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体は、第１の軽鎖、第１の重鎖、第２の重鎖、及び第２の軽鎖を含み、第１の軽鎖は、配列番号９、１９、又は２９に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲを含み、第１の重鎖は、配列番号４、１４、又は２４に含まれる３つの重鎖ＣＤＲを含み、第２の重鎖は、配列番号３４又は４４に含まれる３つの重鎖ＣＤＲを含み、第２の軽鎖は、配列番号３９又は４９に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲを含む。

【0025】

特定の実施形態において、本明細書で提供される抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体は、第１の軽鎖、第１の重鎖、第２の重鎖、及び第２の軽鎖を含み、第１の軽鎖及び第１の重鎖はＣＤ７９ｂに結合し、第２の重鎖及び第２の軽鎖はＣＤ３に結合し、
１）第１の軽鎖は、配列番号９に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲを含み、第１の重鎖は、配列番号４に含まれる３つの重鎖ＣＤＲを含み、第２の重鎖は、配列番号３４に含まれる３つの重鎖ＣＤＲを含み、第２の軽鎖は、配列番号３９に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲを含む、
２）第１の軽鎖は、配列番号９に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲを含み、第１の重鎖は、配列番号４に含まれる３つの重鎖ＣＤＲを含み、第２の重鎖は、配列番号４４に含まれる３つの重鎖ＣＤＲを含み、第２の軽鎖は、配列番号４９に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲを含む、
３）第１の軽鎖は、配列番号１９に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲを含み、第１の重鎖は、配列番号１４に含まれる３つの重鎖ＣＤＲを含み、第２の重鎖は、配列番号３４に含まれる３つの重鎖ＣＤＲを含み、第２の軽鎖は、配列番号３９に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲを含む、
４）第１の軽鎖は、配列番号１９に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲを含み、第１の重鎖は、配列番号１４に含まれる３つの重鎖ＣＤＲを含み、第２の重鎖は、配列番号４４に含まれる３つの重鎖ＣＤＲを含み、第２の軽鎖は、配列番号４９に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲを含む、
５）第１の軽鎖は、配列番号２９に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲを含み、第１の重鎖は、配列番号２４に含まれる３つの重鎖ＣＤＲを含み、第２の重鎖は、配列番号３４に含まれる３つの重鎖ＣＤＲを含み、第２の軽鎖は、配列番号３９に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲを含む、又は
６）第１の軽鎖は、配列番号２９に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲを含み、第１の重鎖は、配列番号２４に含まれる３つの重鎖ＣＤＲを含み、第２の重鎖は、配列番号４４に含まれる３つの重鎖ＣＤＲを含み、第２の軽鎖は、配列番号４９に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲを含む。

【0026】

特定の実施形態において、本明細書で提供される抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体は、第１の軽鎖、第１の重鎖、第２の重鎖、及び第２の軽鎖を含み、第１の軽鎖は、配列番号９、１９、又は２９に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲを含み、かつ、配列番号９、１９、又は２９と少なくとも９０％の同一性を有するＶＬを含み、第１の重鎖は、配列番号４、１４、又は２４に含まれる３つの重鎖ＣＤＲを含み、かつ、配列番号４、１４、又は２４と少なくとも９０％の同一性を有するＶＨを含み、第２の重鎖は、配列番号３４又は４４に含まれる３つの重鎖ＣＤＲを含み、かつ、配列番号３４又は４４と少なくとも９０％の同一性を有するＶＨを含み、第２の軽鎖は、配列番号３９又は４９に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲを含み、かつ、配列番号３９又は４９と少なくとも９０％の同一性を有するＶＬを含む。

【0027】

特定の実施形態において、本明細書で提供される抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体は、第１の軽鎖、第１の重鎖、第２の重鎖、及び第２の軽鎖を含み、
１）第１の軽鎖は、配列番号９に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲを含み、かつ、配列番号９と少なくとも９０％の同一性を有するＶＬを含み、第１の重鎖は、配列番号４に含まれる３つの重鎖ＣＤＲを含み、かつ、配列番号４と少なくとも９０％の同一性を有するＶＨを含み、第２の重鎖は、配列番号３４に含まれる３つの重鎖ＣＤＲを含み、かつ、配列番号３４と少なくとも９０％の同一性を有するＶＨを含み、第２の軽鎖は、配列番号３９に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲを含み、かつ、配列番号３９と少なくとも９０％の同一性を有するＶＬを含む、
２）第１の軽鎖は、配列番号９に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲを含み、かつ、配列番号９と少なくとも９０％の同一性を有するＶＬを含み、第１の重鎖は、配列番号４に含まれる３つの重鎖ＣＤＲを含み、かつ、配列番号４と少なくとも９０％の同一性を有するＶＨを含み、第２の重鎖は、配列番号４４に含まれる３つの重鎖ＣＤＲを含み、かつ、配列番号４４と少なくとも９０％の同一性を有するＶＨを含み、第２の軽鎖は、配列番号４９に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲを含み、かつ、配列番号４９と少なくとも９０％の同一性を有するＶＬを含む、
３）第１の軽鎖は、配列番号１９に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲを含み、かつ、配列番号１９と少なくとも９０％の同一性を有するＶＬを含み、第１の重鎖は、配列番号１４に含まれる３つの重鎖ＣＤＲを含み、かつ、配列番号１４と少なくとも９０％の同一性を有するＶＨを含み、第２の重鎖は、配列番号３４に含まれる３つの重鎖ＣＤＲを含み、かつ、配列番号３４と少なくとも９０％の同一性を有するＶＨを含み、第２の軽鎖は、配列番号３９に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲを含み、かつ、配列番号３９と少なくとも９０％の同一性を有するＶＬを含む、
４）第１の軽鎖は、配列番号１９に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲを含み、かつ、配列番号１９と少なくとも９０％の同一性を有するＶＬを含み、第１の重鎖は、配列番号１４に含まれる３つの重鎖ＣＤＲを含み、かつ、配列番号１４と少なくとも９０％の同一性を有するＶＨを含み、第２の重鎖は、配列番号４４に含まれる３つの重鎖ＣＤＲを含み、かつ、配列番号４４と少なくとも９０％の同一性を有するＶＨを含み、第２の軽鎖は、配列番号４９に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲを含み、かつ、配列番号４９と少なくとも９０％の同一性を有するＶＬを含む、
５）第１の軽鎖は、配列番号２９に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲを含み、かつ、配列番号２９と少なくとも９０％の同一性を有するＶＬを含み、第１の重鎖は、配列番号２４に含まれる３つの重鎖ＣＤＲを含み、かつ、配列番号２４と少なくとも９０％の同一性を有するＶＨを含み、第２の重鎖は、配列番号３４に含まれる３つの重鎖ＣＤＲを含み、かつ、配列番号３４と少なくとも９０％の同一性を有するＶＨを含み、第２の軽鎖は、配列番号３９に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲを含み、かつ、配列番号３９と少なくとも９０％の同一性を有するＶＬを含む、又は
６）第１の軽鎖は、配列番号２９に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲを含み、かつ、配列番号２９と少なくとも９０％の同一性を有するＶＬを含み、第１の重鎖は、配列番号２４に含まれる３つの重鎖ＣＤＲを含み、かつ、配列番号２４と少なくとも９０％の同一性を有するＶＨを含み、第２の重鎖は、配列番号４４に含まれる３つの重鎖ＣＤＲを含み、かつ、配列番号４４と少なくとも９０％の同一性を有するＶＨを含み、第２の軽鎖は、配列番号４９に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲを含み、かつ、配列番号４９と少なくとも９０％の同一性を有するＶＬを含む。

【0028】

特定の実施形態において、本明細書で提供される抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体は、第１の軽鎖、第１の重鎖、第２の重鎖、及び第２の軽鎖を含み、
１）第１の軽鎖は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号６のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＬＣＤＲ２は、配列番号７のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＬＣＤＲ３は、配列番号８のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、第１の重鎖は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１は、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＨＣＤＲ３は、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、第２の重鎖は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１は、配列番号３１のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＨＣＤＲ２は、配列番号３２のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＨＣＤＲ３は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、第２の軽鎖は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号３６のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＬＣＤＲ２は、配列番号３７のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＬＣＤＲ３は、配列番号３８のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる、
２）第１の軽鎖は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号６のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＬＣＤＲ２は、配列番号７のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＬＣＤＲ３は、配列番号８のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、第１の重鎖は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１は、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＨＣＤＲ３は、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、第２の重鎖は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１は、配列番号４１のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＨＣＤＲ２は、配列番号４２のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＨＣＤＲ３は、配列番号４３のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、第２の軽鎖は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号４６のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＬＣＤＲ２は、配列番号４７のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＬＣＤＲ３は、配列番号４８のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる、
３）第１の軽鎖は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１８のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、第１の重鎖は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＨＣＤＲ２は、配列番号１２のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＨＣＤＲ３は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、第２の重鎖は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１は、配列番号３１のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＨＣＤＲ２は、配列番号３２のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＨＣＤＲ３は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、第２の軽鎖は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号３６のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＬＣＤＲ２は、配列番号３７のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＬＣＤＲ３は、配列番号３８のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる、
４）第１の軽鎖は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＬＣＤＲ２は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＬＣＤＲ３は、配列番号１８のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、第１の重鎖は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＨＣＤＲ２は、配列番号１２のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＨＣＤＲ３は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、第２の重鎖は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１は、配列番号４１のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＨＣＤＲ２は、配列番号４２のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＨＣＤＲ３は、配列番号４３のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、第２の軽鎖は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号４６のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＬＣＤＲ２は、配列番号４７のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＬＣＤＲ３は、配列番号４８のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる、
５）第１の軽鎖は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号２６のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＬＣＤＲ２は、配列番号２７のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＬＣＤＲ３は、配列番号２８のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、第１の重鎖は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１は、配列番号２１のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＨＣＤＲ３は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、第２の重鎖は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１は、配列番号３１のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＨＣＤＲ２は、配列番号３２のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＨＣＤＲ３は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、第２の軽鎖は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号３６のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＬＣＤＲ２は、配列番号３７のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＬＣＤＲ３は、配列番号３８のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる、
又は
６）第１の軽鎖は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号２６のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＬＣＤＲ２は、配列番号２７のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＬＣＤＲ３は、配列番号２８のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、第１の重鎖は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１は、配列番号２１のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＨＣＤＲ３は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、第２の重鎖は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１は、配列番号４１のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＨＣＤＲ２は、配列番号４２のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＨＣＤＲ３は、配列番号４３のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、第２の軽鎖は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号４６のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＬＣＤＲ２は、配列番号４７のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなり、ＬＣＤＲ３は、配列番号４８のアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる。

【0029】

別の実施形態において、本明細書で提供される抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体は、第１の軽鎖、第１の重鎖、第２の重鎖、及び第２の軽鎖を含み、第１の軽鎖は、配列番号９、１９、又は２９に示されるＶＬを含み、第１の重鎖は、配列番号４、１４、又は２４に示されるＶＨを含み、第２の重鎖は、配列番号３４又は４４に示されるＶＨを含み、第２の軽鎖は、配列番号３９又は４９に示されるＶＬを含む。

【0030】

特定の実施形態において、本明細書で提供される抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体は、第１の軽鎖、第１の重鎖、第２の重鎖、及び第２の軽鎖を含み、
１）第１の軽鎖は、配列番号９に示されるＶＬを含み、第１の重鎖は、配列番号４に示されるＶＨを含み、第２の重鎖は、配列番号３４に示されるＶＨを含み、第２の軽鎖は、配列番号３９に示されるＶＬを含む、
２）第１の軽鎖は、配列番号９に示されるＶＬを含み、第１の重鎖は、配列番号４に示されるＶＨを含み、第２の重鎖は、配列番号４４に示されるＶＨを含み、第２の軽鎖は、配列番号４９に示されるＶＬを含む、
３）第１の軽鎖は、配列番号１９に示されるＶＬを含み、第１の重鎖は、配列番号１４に示されるＶＨを含み、第２の重鎖は、配列番号３４に示されるＶＨを含み、第２の軽鎖は、配列番号３９に示されるＶＬを含む、
４）第１の軽鎖は、配列番号１９に示されるＶＬを含み、第１の重鎖は、配列番号１４に示されるＶＨを含み、第２の重鎖は、配列番号４４に示されるＶＨを含み、第２の軽鎖は、配列番号４９に示されるＶＬを含む、
５）第１の軽鎖は、配列番号２９に示されるＶＬを含み、第１の重鎖は、配列番号２４に示されるＶＨを含み、第２の重鎖は、配列番号３４に示されるＶＨを含み、第２の軽鎖は、配列番号３９に示されるＶＬを含む、
又は
６）第１の軽鎖は、配列番号２９に示されるＶＬを含み、第１の重鎖は、配列番号２４に示されるＶＨを含み、第２の重鎖は、配列番号４４に示されるＶＨを含み、第２の軽鎖は、配列番号４９に示されるＶＬを含む。

【0031】

別の実施形態において、本明細書で提供される抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体は、第１の軽鎖、第１の重鎖、第２の重鎖、及び第２の軽鎖を含み、第１の重鎖及び第２の重鎖は、同じ又は異なるＦＣ領域を含む。別の好ましい実施形態において、第１の重鎖及び第２の重鎖に含まれるＦｃ領域は、相互作用して二重特異性抗体の空間構造を安定化する「ノブ」及び「ホール」構造をそれぞれ有する。

【0032】

特定の実施形態において、本明細書に記載の抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体において、第１の重鎖及び第２の重鎖に含まれる可変領域は、Ｆｃ領域に対して相同又は異種のいずれかである。別の実施形態において、第１の重鎖及び第２の重鎖に含まれる可変領域は、Ｆｃ領域に直接に又はリンカーを介して連結される。特定の実施形態において、リンカーは、当該技術分野で一般的に使用される柔軟なリンカーである。別の実施形態において、リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎであり、ｎ＝１～６、好ましくはｎ＝１、２、３、又は４である。

【0033】

別の態様において、本発明は、第１の軽鎖、第１の重鎖、第２の重鎖、及び第２の軽鎖を含む抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体であって、
１）第１の軽鎖は、配列番号１０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含むか、若しくは配列番号１０からなり、第１の重鎖は、配列番号５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含むか、若しくは配列番号５からなり、第２の重鎖は、配列番号３５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含むか、若しくは配列番号３５からなり、第２の軽鎖は、配列番号４０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含むか、若しくは配列番号４０からなる、
２）第１の軽鎖は、配列番号１０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含むか、若しくは配列番号１０からなり、第１の重鎖は、配列番号５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含むか、若しくは配列番号５からなり、第２の重鎖は、配列番号４５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含むか、若しくは配列番号４５からなり、第２の軽鎖は、配列番号５０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含むか、若しくは配列番号５０からなる、
３）第１の軽鎖は、配列番号２０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含むか、若しくは配列番号２０からなり、第１の重鎖は、配列番号１５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含むか、若しくは配列番号１５からなり、第２の重鎖は、配列番号３５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含むか、若しくは配列番号３５からなり、第２の軽鎖は、配列番号４０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含むか、若しくは配列番号４０からなる、
４）第１の軽鎖は、配列番号２０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含むか、若しくは配列番号２０からなり、第１の重鎖は、配列番号１５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含むか、若しくは配列番号１５からなり、第２の重鎖は、配列番号４５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含むか、若しくは配列番号４５からなり、２の軽鎖は、配列番号５０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含むか、若しくは配列番号５０からなる、
５）第１の軽鎖は、配列番号３０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含むか、若しくは配列番号３０からなり、第１の重鎖は、配列番号２５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含むか、若しくは配列番号２５からなり、第２の重鎖は、配列番号３５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含むか、若しくは配列番号３５からなり、第２の軽鎖は、配列番号４０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含むか、若しくは配列番号４０からなる、
又は
６）第１の軽鎖は、配列番号３０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含むか、若しくは配列番号３０からなり、第１の重鎖は、配列番号２５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含むか、若しくは配列番号２５からなり、第２の重鎖は、配列番号４５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含むか、若しくは配列番号４５からなり、第２の軽鎖は、配列番号５０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含むか、若しくは配列番号５０からなる、
抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体を提供する。

【0034】

一実施形態において、第１の軽鎖の軽鎖可変ドメイン及び第１の重鎖の重鎖可変ドメインが対となってＣＤ７９ｂの抗原認識部位を形成し、第２の重鎖の重鎖可変ドメイン及び第２の軽鎖の軽鎖可変ドメインが対となってＣＤ３の抗原認識部位を形成する。第１の重鎖及び第２の重鎖のそれぞれのＦｃドメインは、相互作用してＦｃ領域を形成する。特定の実施形態において、第１の重鎖及び第２の重鎖のそれぞれのＦｃドメインは、相互作用を安定化する変異、例えば、「ノブ・イン・ホール」変異を含む。

【0035】

一態様において、本発明はまた、本発明の抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド（核酸）、及びポリヌクレオチドを含むベクターを提供し、ベクターは、好ましくは発現ベクターである。

【0036】

別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明はまた、本発明の抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体を作製する方法であって、（ｉ）本発明の抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体の発現に好適な条件下で本発明の宿主細胞を培養するステップ、及び（ｉｉ）本発明の抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体を回収するステップを含む、方法を提供する。

【0037】

一態様において、本発明は、本発明の抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体を含む診断キット及び医薬組成物を提供する。さらに、ＣＤ７９ｂ活性に関連する疾患の治療、予防、及び／又は診断、特に、非ホジキンリンパ腫の治療、予防、及び／又は診断における、本発明の抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体、診断キット、又は医薬組成物の使用が提供される。

【0038】

別の態様において、本発明は、ＣＤ７９ｂ活性に関連する疾患を治療するための方法であって、それを必要とする患者に治療有効量の本発明の抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体又は本発明の医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。好ましくは、疾患は、ＣＤ７９ｂを過剰発現するがんであり、より好ましくは、疾患は、非ホジキンリンパ腫である。

【0039】

特に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、及びその他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。さらに、本明細書に記載される材料、方法、及び実施例は、例示のみを目的とするものであり、限定することを意図したものではない。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、明細書、図面、及び添付の特許請求の範囲から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0040】

以下に詳細に説明する本発明の好ましい実施形態は、以下の図面と併せて読むとよりよく理解されるであろう。本発明を例示する目的で、好ましい実施形態を図面に示す。しかしながら、本発明は図面に示される実施形態の正確な配置及び手段に限定されないと理解すべきである。

【0041】

【図1】図１は、Ｒａｍｏｓ細胞に対するキメラ抗ＣＤ７９ｂ抗体の結合能力を示す。

【図2】図２は、ＢＪＡＢ細胞に対するキメラ抗ＣＤ７９ｂ抗体の結合能力を示す。

【図3】図３は、Ｒａｍｏｓ細胞に対するヒト化抗ＣＤ７９ｂ抗体の結合能を示す。

【図4】図４は、ＢＪＡＢ細胞に対するヒト化抗ＣＤ７９ｂ抗体の結合能を示す。

【図5】図５は、ヒト化抗ＣＤ７９ｂ抗体のＡＤＣＣ活性の検出を示す。

【図6】図６は、ＢＪＡＢ細胞に対する例示的な抗体の結合能力を示す。

【図7】図７は、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞に対する例示的な抗体の結合能力を示す。

【図8】図８は、例示的な抗体によって媒介されるＮＦＡＴシグナルの活性化を示す。

【図9】図９は、例示的な抗体によって媒介されるトＣＤ８＋Ｔ細胞による腫瘍細胞の死滅を示す。

【図10】図１０は、例示的な抗体によるヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化のフローサイトメトリーアッセイを示す。

【図11】図１１は、例示的な抗体によって誘導されるヒトＣＤ８＋Ｔ細胞による腫瘍細胞の死滅の際に放出されるサイトカインＩＦＮ－γの量のフローサイトメトリーアッセイを示す。

【図12】図１２は、例示的な抗体によって誘導されるヒトＣＤ８＋Ｔ細胞による腫瘍細胞の死滅の際に放出されるサイトカインＴＮＦαの量のフローサイトメトリーアッセイを示す。

【図13】図１３は、例示的な抗体によるヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化のフローサイトメトリーアッセイを示す。

【図14】図１４は、例示的な抗体によって促進されるＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を示す。

【図15】図１５は、例示的な抗体によって促進されるＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を示す。

【図16】図１６は、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２腫瘍担持ヒト化マウスモデルにおける例示的な抗体の腫瘍阻害効果を示す。

【図17】図１７は、Ｒａｍｏｓ腫瘍担持ヒト化マウスモデルにおける例示的な抗体の腫瘍阻害効果を示す。

【図18】図１８は、マウスにおける二重特異性抗体のＰＫを示す。

【発明を実施するための形態】

【0042】

Ｉ．定義
本発明を以下に詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬に限定されず、これらは変更されてもよいと理解すべきである。また、本明細書で使用される用語は、本発明の範囲を限定するものではなく、特定の実施形態を説明することのみを意図しており、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されると理解すべきである。他に定義されない限り、本明細書で使用される任意の技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。

【0043】

本明細書を説明する目的で以下の定義が使用されるが、必要に応じて、単数形で使用される用語には複数形も含まれてもよく、その逆も同様である。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図したものではないと理解すべきである。

【0044】

数値と組み合わせて使用される「約」という用語は、指定された数値より５％小さい下限から指定された数値より５％大きい上限までの範囲の数値を包含することを意図する。

【0045】

「及び／又は」という用語は、２つ以上の選択肢を接続するために使用される場合、選択肢のうちのいずれか１つ又は選択肢のうちの２つ以上を指すと理解すべきであることを意味する。

【0046】

「含む（comprise）」又は「含む（include）」という用語は、記載された要素、整数、又はステップが含まれることを意味するが、任意の他の要素、整数、又はステップを除外するものではない。本明細書で使用される「含む（comprise）」又は「含む（include）」という用語はまた、特に指定しない限り、全体が記載された要素、整数、又はステップからなる状況を包含する。例えば、特定の配列を「含む」抗体可変領域に言及する場合、特定の配列からなる抗体可変領域も包含することが意図される。

【0047】

「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、一本鎖抗体、インタクトな抗体、又は所望の抗原結合活性を示すそれらの抗体断片を含むがこれらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。インタクトな抗体は、一般に、少なくとも２つの全長重鎖及び２つの全長軽鎖を含むが、いくつかの場合では、より少ない鎖を含んでもよく、例えば、ラクダの天然抗体は重鎖のみを含んでもよい。

【0048】

「抗原結合断片」という用語（本明細書では「抗体断片」及び「抗原結合部分」と互換的に使用される）は、インタクトな抗体の一部を含み、かつ、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する、インタクトな抗体とは異なる分子を指す。抗原結合断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、ダイアボディ（ｄＡｂ）、直鎖状抗体、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、二価又は二重特異性抗体の抗原結合断片、ラクダ科動物抗体（camelid antibodies）、及び抗原（例えば、ＣＤ７９ｂ及び／又はＣＤ３）に結合する所望の能力を示す他の断片が含まれるが、これらに限定されない。

【0049】

本明細書で使用される「結合」及び「特異的結合」という用語は、抗体の結合効果が抗原に対して選択的であり、望ましくない相互作用又は非特異的相互作用と区別することができることを意味する。抗体が特定の抗原に結合する能力は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、若しくはバイオレイヤー干渉法（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）、又は当該技術分野で既知の従来の結合アッセイによって決定することができる。例えば、抗体がＳＰＲにおいて約１×１０^－７以下のＫＤ、約１×１０^－８以下のＫＤ、約１×１０^－９以下のＫＤ、約１×１０^－１０以下のＫＤ、又は約１×１０^－１１以下のＫＤでＣＤ７９ｂ及び／又はＣＤ３に結合する場合、該抗体は、「ＣＤ７９ｂ及び／又はＣＤ３に特異的に結合する」抗体である。しかしながら、ＣＤ７９ｂ及び／又はＣＤ３に特異的に結合する抗体は、他の種由来のＣＤ７９ｂ及び／又はＣＤ３タンパク質と交差反応性を有してもよい。例えば、ヒトＣＤ７９ｂ及び／又はＣＤ３に特異的な抗体は、いくつかの実施形態において、カニクイザルＣＤ７９ｂ及び／又はＣＤ３と交差反応することができる。交差反応性を決定するための方法には、実施例に記載の方法、及び生物学的光干渉法又はフローサイトメトリーなどの当該技術分野で既知の標準的なアッセイが含まれる。

【0050】

「一本鎖可変断片」又は「ｓｃＦｖ」という用語は、遺伝子操作された小分子抗体である。これは、遺伝子工学により、ＤＮＡレベルで、天然抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）とを（通常は合成リンカーペプチド（又はリンカー）を介して）結合することにより得られる、小分子の組換え抗体である。インタクトな抗体分子と比較して、一本鎖ｓｃＦｖ抗体は、以下の利点、すなわち、インタクトな抗体の可変領域を有し、したがって、元の抗体の抗原特異性及び抗原結合活性が保持される；Ｆｃ領域を有さず、したがって、免疫原性が弱く、ヒトに使用した場合には免疫反応がほとんど起こらない；操作が簡単であり、完全長抗体、ｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体などの新しい特性を有する他の抗原特異的結合分子を調製する際の遺伝子操作成分としての使用に好適であるという利点を有する。

【0051】

「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書では、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語には、天然配列のＦｃ領域及び変異Ｆｃ領域が含まれる。特定の実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は一般に、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボニル末端まで延びる。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在してもよいし又は存在してなくてもよい。特に明記しない限り、Ｆｃ領域又は定常領域のアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５^ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．１９９１に記載される、ＥＵインデックスとも称されるＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる。

【0052】

「ノブインホール」という用語は、本明細書に記載の二重特異性抗体分子の一方のＦｃ鎖上に「ノブ」構造が形成され、他方の鎖上に「ホール」構造が形成されることを意味する。したがって、ホール及びノブは同じ又は同様のサイズであり、２つのＦｃの相互作用時に一方のＦｃのノブが他方のＦｃの対応するホールに配置され、それによってヘテロ多量体の構造が安定するように好適に配置される。（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照のこと）。

【0053】

いくつかの実施形態において、ノブは、当該分野の従来技術に従って、小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖で置換することによって構築することができる。いくつかの実施形態において、ホールは、大きなアミノ酸側鎖をより小さな側鎖で置換することによって構築されてもよい。

【0054】

「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗原への抗体の結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、典型的には類似の構造を有し、各ドメインは４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの相補性決定領域を含む（例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６^ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照のこと）を有する。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を提供するのに十分であり得る。

【0055】

「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ領域」又は「ＣＤＲ」又は「高可変領域」は、配列が非常に可変であり、かつ、構造的に規定されたループ（「超可変ループ」）を形成する及び／又は抗原接触残基（「抗原接触部位」）を含む、抗体可変ドメイン中の領域である。ＣＤＲは、主に抗原エピトープへの結合に関与する。重鎖及び軽鎖のＣＤＲにはＮ末端から順に番号が付けられ、一般にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と称される。抗体の重鎖可変ドメインに位置するＣＤＲはまた、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と称される一方、抗体の軽鎖可変ドメインに位置するＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と称される。軽鎖可変領域又は重鎖可変領域の所与のアミノ酸配列において、そのＣＤＲ配列は、当該技術分野で周知の様々なスキーム、例えば、抗体の三次元構造及びＣＤＲループのトポロジーに基づくＣｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２７３：９２７－９４８（１９９７））、抗体配列の変動に基づくＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（１９８７））、ＡｂＭ（バス大学（University of Bath)））、Ｃｏｎｔａｃｔ（ユニバーシティ・カレッジ・ロンドン（University College London））、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（ＩＭＧＴ）（ワールド・ワイド・ウエブ上のｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／）、並びに多数の結晶構造を使用した親和性伝搬クラスタリングに基づくＮｏｒｔｈ ＣＤＲ定義（Ｎｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｎｅｗ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＤＲ Ｌｏｏｐ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４０６，２２８－２５６，（２０１１））を使用して決定され得る。

【0056】

例えば、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａ番号付けされたＣＤＲ領域は、異なる定義範囲を有する。

【表1】

【0057】

特に明記しない限り、本明細書で使用される「ＣＤＲ」又は「ＣＤＲ配列」という用語には、上記のスキームのいずれか１つによって決定されるＣＤＲ配列が包含される。

【0058】

ＣＤＲはまた、参照ＣＤＲ配列と同じＫａｂａｔ番号付け位置を有することに基づいて決定することができる。特に明記しない限り、本発明における抗体可変領域（重鎖可変領域残基及び軽鎖可変領域残基を含む）の残基位置は、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５^ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））に従って番号付けされた位置である。

【0059】

しかしながら、異なる割り当てシステムに基づく抗体の可変領域のＣＤＲの境界は異なる場合があることに注意する必要がある。すなわち、異なる割り当てシステムによって定義される同じ抗体の可変領域のＣＤＲ配列は異なる。したがって、本発明において定義される特定のＣＤＲ配列を有する抗体の定義に関して、抗体の範囲には、その可変領域配列が特定のＣＤＲ配列を含むが、適用される異なるプロトコル（例えば、異なる割り当てシステム規則又はそれらの組み合わせ）に起因して本発明によって定義される特定のＣＤＲ境界とは異なる特許請求の範囲に属するＣＤＲ境界を有する抗体も包含される。

【0060】

異なる特異性（すなわち、異なる抗原に対する異なる結合部位）を有する抗体は、異なるＣＤＲを有する。しかしながら、ＣＤＲは抗体ごとに異なるが、ＣＤＲ内の限られた数のアミノ酸位置のみが抗原結合に直接関与する。最小の重複領域は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、Ｃｏｎｔａｃｔ、及びＮｏｒｔｈの方法のうちの少なくとも２つを使用して決定することができ、それにより、抗原結合のための「最小結合単位」が提供される。最小結合単位は、ＣＤＲのサブ部分であってもよい。当業者には明らかなように、ＣＤＲ配列の残りの部分の残基は、抗体の構造及びタンパク質の折り畳みによって決定することができる。したがって、本明細書に提示される任意のＣＤＲの変異体も考慮される。例えば、１つのＣＤＲの変異体において、最小結合単位のアミノ酸残基は変化しないままであるが、Ｋａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａに従って定義される残りのＣＤＲ残基は保存的アミノ酸残基に置き換えられてもよい。

【0061】

本明細書で使用される「細胞傷害性薬剤」という用語は、細胞機能を阻害若しくは防止し、及び／又は細胞死若しくは細胞破壊を引き起こす物質を指す。

【0062】

「化学療法剤」という用語には、がんの治療に有用な化合物が含まれる。

【0063】

「小分子薬」という用語は、生物学的プロセスを調節することができる低分子量有機化合物を指す。「小分子」は、１０ｋＤ未満、通常は２ｋＤ未満、好ましくは１ｋＤ未満の分子量を有する分子として定義される。小分子には、無機分子、有機分子、無機成分を含む有機分子、放射性原子を含む分子、合成分子、ペプチド模倣物、及び抗体模倣物が含まれるが、これらに限定されない。治療薬として、小分子は、大きな分子と比較して細胞によく浸透し、分解されにくく、免疫応答を誘導することが少ない。

【0064】

「機能的Ｆｃ領域」という用語は、天然配列のＦｃ領域の「エフェクター機能」を有するＦｃ領域を指す。例示的な「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合、ＣＤＣ、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣ、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、又はＢＣＲ）の下方制御などが含まれる。このようなエフェクター機能は一般に、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と結合していることが必要であり、本明細書に開示されるアッセイなどの様々なアッセイを使用して評価することができる。

【0065】

本明細書に記載される「治療薬」という用語には、化学療法剤、細胞傷害性薬剤、ワクチン、他の抗体、抗感染症活性剤、小分子薬、又は免疫調節剤を含む、腫瘍（例えば、がん）の予防又は治療に有効な任意の物質が包含される。

【0066】

本明細書で使用される「免疫調節剤」という用語は、免疫応答を抑制又は調節する天然又は合成の活性剤又は薬物を指す。免疫応答は、体液性応答又は細胞性応答であり得る。

【0067】

「有効量」という用語は、単回又は複数回の用量で患者に投与した後に治療又は予防を必要とする患者において期待される効果を生ずる、本発明の抗体、その断片、複合体、又は組成物の量又は用量を指す。治療又は予防目的の場合、「有効量」は「治療有効量」及び「予防有効量」に分けることができる。有効量は、当業者である担当医によって、哺乳動物の種、大きさ、年齢、及び全身の健康状態、関与する特定の疾患、疾患の程度又は重症度、個々の患者における反応、投与される特定の抗体、投与様式、投与される製剤のバイオアベイラビリティプロファイル、選択された投与レジメン、並びに任意の併用療法の使用などの様々な要因を考慮することによって容易に決定することができる。

【0068】

一実施形態において、本発明の二重特異性抗体の有効量は、対照と比較して、測定可能なパラメータ（例えば、腫瘍増殖率、腫瘍体積など）を好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約５０％、６０％、又は７０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％又は９０％阻害する。

【0069】

「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は、互換的に使用され、外因性核酸が導入される細胞（このような細胞の子孫を含む）を指す。宿主細胞には「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これには、継代数に関わらず、元の初代形質転換細胞及びこれに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸含有量の点で親細胞と正確に同じでなくてもよく、変異を含んでもよい。最初に形質転換された細胞からスクリーニング又は選択された同じ機能又は生物学的活性を有する変異子孫が本明細書に含まれる。

【0070】

本明細書で使用する場合、「多重特異性」抗体という用語は、各々が同じ抗原の異なるエピトープ又は異なる抗原の異なるエピトープに結合する、少なくとも２つの異なる抗原結合部位を有する抗体を指す。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。一実施形態において、第１の抗原標的（ＣＤ７９ｂ）及び第２の抗原標的（ＣＤ３）に対する結合特異性を有する二重特異性抗体が本明細書に提供される。本発明による抗体構築物が（少なくとも）二重特異性であることを考慮すると、該抗体構築物は、天然に存在せず、天然に存在する生成物とは明らかに異なる。したがって、「二重特異性」抗体又は免疫グロブリンは、異なる特異性を有する少なくとも２つの異なる結合側（binding side）を有する人工ハイブリッド抗体又は免疫グロブリンである。

【0071】

「標的」という用語は、ＣＤ７９ｂ又はＣＤ３を意味する。「第１の標的及び第２の標的」という用語は、ＣＤ７９ｂが第１の標的であり、ＣＤ３が第２の標的である、又はその逆を意味する。

【0072】

「サイトカイン」という用語は、細胞集団によって放出され、別の細胞に対する細胞間メディエーターとして作用するタンパク質の総称である。このようなサイトカインの例には、リンホカイン；モノカイン；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－１α、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１１など、ＩＬ－１２、及びＩＬ－１５；腫瘍壊死因子、例えば、ＴＮＦ－α又はＴＮＦ－β；並びにＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）、及びγ－インターフェロンを含む、他のポリペプチド因子である。本明細書で使用する場合、「サイトカイン」という用語には、天然源由来又は組換え細胞培養物由来のタンパク質、及び天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物（人工合成によって生成される小分子実体を含む）、並びにその薬学的に許容される誘導体及び塩が含まれる。

【0073】

「免疫複合体」という用語は、細胞傷害性薬剤又は標識を含むがこれらに限定されない、１つ以上の他の物質に結合した抗体である。

【0074】

「個体」又は「対象」という用語には、哺乳動物が含まれる。哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ、ヤギ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、並びにげっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、個体又は対象は、ヒトである。

【0075】

「単離された」抗体という用語は、天然環境の成分から分離された抗体を意味する。いくつかの実施形態において、抗体は、例えば電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、及びキャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）によって決定した際に、９５％又は９９％を超える純度まで精製される。抗体純度を評価する方法の総説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，Ｂ８４８：７９－８７（２００７）を参照のこと。

【0076】

配列間の配列同一性の計算は次のように行われる。２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するには、最適な比較のために配列をアラインする（例えば、最適なアラインメントのために第１及び第２のアミノ酸配列又は核酸配列の一方若しくは両方にギャップを導入することができ、又は比較のために非相同配列を破棄することができる）。好ましい一実施形態において、比較のためにアラインされる参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％又は６０％であり、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、また１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置で同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められている場合、分子はこの位置で同一である。

【0077】

２つの配列を比較して配列間の同一性パーセントを計算するために、数学的アルゴリズムを使用することができる。１つの好ましい実施形態において、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（（１９７０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４－４５３；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）を用いて、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックス並びにギャップウェイト１６、１４、１２、１０、８、６、又は４及び長さウェイト１、２、３、４、５、又は６を使用して決定される。別の好ましい実施形態において、２つのヌクレオチド酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）を用いて、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス並びにギャップウェイト４０、５０、６０、７０、又は８０及び長さウェイト１、２、３、４、５、又は６を使用して決定される。特に好ましいパラメータセット（及び特に指定がない限り、使用すべきパラメータセット）は、ギャップペナルティが１２、ギャップ延長ペナルティが４、フレームシフトギャップペナルティが５である、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２スコアマトリックスである。

【0078】

２つのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列間の同一性パーセントはまた、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒアルゴリズム（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ，４：１１－１７）を用いて、ＰＡＭ１２０加重リマインダーテーブル（PAM120 weighted remainder table）、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を使用して決定することができる。

【0079】

さらに又はあるいは、本明細書に記載される核酸配列及びタンパク質配列は、例えば他のファミリーメンバー配列又は関連配列を同定するために、公共データベースに対して検索を行うための「質問配列」としてさらに使用することができる。

【0080】

「医薬補助材料」という用語は、活性物質とともに投与される希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全及び不完全））、賦形剤、担体、安定剤などを指す。

【0081】

「医薬組成物」という用語は、その中に含まれる活性成分の有効な生物学的活性を可能とする形態で存在し、組成物が投与される対象に対して許容できない毒性を有する追加の成分を含まない組成物を指す。

【0082】

「併用療法（combination therapy）」又は「併用療法（combined therapy）」という用語は、がん又は本明細書に記載される感染症を治療するために２つ以上の治療薬が投与されることを意味する。このような投与には、これらの治療薬を実質的に同時に、例えば、一定の割合の活性成分を含む単一のカプセル中で共投与することが含まれる。あるいは、そのような投与には、様々な又は別個の容器中（錠剤、カプセル、粉末、及び液体など）での活性成分の共投与が含まれる。粉末及び／又は液体は、投与前に所望の用量に再構成又は希釈することができる。さらに、そのような投与にはまた、各種類の治療薬をほぼ同時に、又は異なる時間に連続的に使用することが含まれる。いずれの場合でも、治療計レジメンは、本明細書に記載の障害又は症状の治療において医薬の組み合わせの有益な効果を提供するであろう。

【0083】

本明細書で使用する場合、「治療」（又は「治療する」又は「治療すること」）は、既存の症状、障害、状態、又は疾患の進行又は重症度を遅らせる、妨げる、阻止する、軽減する、停止する、低下させる、又は逆転させることを指す。

【0084】

本明細書で使用する場合、「予防」（又は「予防する」又は「予防すること」）には、疾患若しくは障害又は特定の疾患若しくは障害の症状の発症又は進行の阻止が含まれる。いくつかの実施形態において、がんの家族歴を有する対象は、予防レジメンの候補である。一般に、がんに関連して、「予防」（又は「予防する」又は「予防すること」）という用語は、特にがんのリスクがある対象において、がんの徴候又は症状が現れる前に薬物を投与することを指す。

【0085】

本明細書で使用される「ベクター」という用語は、これが結合している別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語には、自己複製核酸構造として機能するベクター、及びベクターが導入される宿主細胞のゲノムに結合するベクターが含まれる。いくつかのベクターは、それらが作動可能に連結されている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。

【0086】

ＩＩ．抗体
本明細書で使用される「ＣＤ７９ｂ」、「標的ＣＤ７９ｂ」、及び「ヒトＣＤ７９ｂ」という用語は、ＣＤ７９ｂ組換えタンパク質を指す。ＣＤ７９ｂの細胞外ドメインは、ＵｎｉＰｒｏｔに従ってアミノ酸２９～１５９からなる。本明細書に記載の「ＣＤ７９ｂに対する抗体」及び「抗ＣＤ７９ｂ抗体」とは、ＣＤ７９ｂに特異的に結合する抗体をいう。一実施形態において、ＣＤ７９ｂに結合する抗体は、１０^－９Ｍ以下、好ましくは１０^－９Ｍ～１０^－１３Ｍの解離定数（Ｋｄ）を有する。一実施形態において、抗ＣＤ７９ｂ抗体は、異なる種、好ましくはヒト由来のＣＤ７９ｂに保存されているＣＤ７９ｂのエピトープに結合する。

【0087】

一実施形態において、本明細書に記載の「抗ＣＤ７９ｂ抗体」は、配列番号４、１４、又は２４のＣＤＲを含む重鎖可変領域、及び配列番号９、１９、又は２９のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む。

【0088】

Ｔ細胞又はＴリンパ球は、細胞性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球のクラスである。Ｔ細胞応答の特異性は、ＴＣＲによる抗原の認識（主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の文脈で提示される）によって媒介される。ＴＣＲの一部として、ＣＤ３受容体複合体は、細胞表面上に存在するＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖、及び２本のＣＤ３ε（イプシロン）鎖を含むタンパク質複合体であり、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞）及びＴヘルパー細胞（ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞）の活性化に関与する。固定化された抗ＣＤ３抗体などによるＴ細胞上のＣＤ３のクラスター化によって、Ｔ細胞の活性化がもたらされ、これはＴ細胞受容体の関与と似ているが、そのクローンの典型的な特異性とは無関係である。

【0089】

ＣＤ３は、すべての成熟Ｔ細胞の膜に結合することが見出されている。この高い特異性及びＴ細胞発生の様々な段階におけるＣＤ３の存在により、ＣＤ３は組織切片中のＴ細胞の有用な免疫組織化学マーカーになる。本発明による抗体構築物は、一般にかつ有利なことに、特異的免疫療法では必要とされない非特異的Ｔ細胞活性化をほとんど示さないことが企図される。これは、副作用のリスクが軽減されることを意味する。

【0090】

本明細書において記載される「抗ＣＤ３抗体」とは、ＣＤ３に結合する抗体を指す。一実施形態において、本明細書に記載の「抗ＣＤ３抗体」は、配列番号３４又は４４のＣＤＲを含む重鎖可変領域及び配列番号３９又は４９のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む。

【0091】

本明細書に記載される「ＣＤ７９ｂ及びＣＤ３に対する二重特異性抗体」、「ＣＤ７９ｂ及びＣＤ３に特異的に結合する二重特異性抗体」、「抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体」、「ＣＤ７９ｂ／ＣＤ３二重特異性抗体」などの用語は、十分な親和性で標的ＣＤ７９ｂ及びＣＤ３に結合することができる二重特異性抗体を指し、二重特異性抗体は、Ｔ細胞を動員し、標的細胞のリダイレクトされた溶解を可能にすることができる。結合したＴ細胞は、継続的に標的細胞を溶解することができ、ペプチド抗原のプロセシング及び提示又はクローンＴ細胞の分化を妨げる免疫回避機構の影響を受けない。一実施形態において、本明細書に記載の「ＣＤ７９ｂ及びＣＤ３に対する二重特異性抗体」は、ＣＤ７９ｂを標的化する配列番号４、１４、又は２４のＣＤＲを含む重鎖可変領域及び配列番号９、１９、又は２９のＣＤＲを含む軽鎖可変領域、並びにＣＤ３を標的化する配列番号３４又は４４のＣＤＲを含む重鎖可変領域及び配列番号３９又は４９のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む。抗体は、ＣＤ７９ｂを発現するがんを標的化する診断薬及び／又は治療薬として使用され得る。

【0092】

本明細書で提供される抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体は、以下の利点を有する。いくつかの実施形態において、異なる抗ＣＤ７９ｂ抗体を異なる親和性を有する抗ＣＤ３抗体と組み合わせることによって形成される本発明の抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体は、抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体によって誘導されるＣＤ８＋Ｔによる腫瘍細胞死滅実験においてＴ細胞活性化の程度及びいくつかのサイトカインの放出レベルを検出ことにより、初期の段階（インビトロスクリーニング段階）においてＣＤ７９ｂ／ＣＤ３二重特異性抗体の有効性及び安全性の包括的な評価を容易にすることができる。インビトロスクリーニング段階において同様の最大死滅レベル及び低いサイトカイン放出レベルを有する異なる分子がインビボ実験及び毒性実験のために選択され、したがって、そのような二重特異性抗体を臨床現場で使用する際のサイトカインストームのリスクを軽減することができる。

【0093】

いくつかの実施形態において、本発明のＣＤ７９ｂ／ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫細胞の表面上のＣＤ７９ｂ及び初代Ｔ細胞の表面上のＣＤ３に同時に結合し、Ｔ細胞によるＣＤ７９ｂ陽性腫瘍細胞の死滅を媒介する。いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、異なるレベルでＣＤ７９ｂを発現しているＢ細胞非ホジキンリンパ腫細胞のＣＤ８＋Ｔによる死滅を用量依存的に誘導することができる。

【0094】

いくつかの実施形態において、本発明の抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３抗体は、ヒトＢ細胞非ホジキンリンパ腫細胞の死滅を媒介し、ＰＢＭＣから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞を用量依存的に活性化する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖能力を増強する。

【0095】

いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、腫瘍増殖の阻害に有効であり、腫瘍増殖阻害は、対照と比較して６７％又はさらには１００％であり得る。

【0096】

本発明の一実施形態において、アミノ酸変化を有する抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３二重特異性抗体が本明細書では包含され、アミノ酸変化は、アミノ酸の置換、挿入、又は欠失を含む。好ましくは、本明細書に記載のアミノ酸変化は、アミノ酸置換、好ましくは保存的置換である。

【0097】

好ましい実施形態において、本明細書に記載されるアミノ酸変化は、ＣＤＲの外側の領域（例えば、ＦＲ）で起こる。より好ましくは、本明細書に記載されるアミノ酸変化は、重鎖可変領域の外側及び／又は軽鎖可変領域の外側の領域で起こる。

【0098】

いくつかの実施形態において、置換は保存的置換である。保存的置換とは、同じクラスの別のアミノ酸によるアミノ酸の置換、例えば、酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸に置換する、塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸に置換する、又は中性アミノ酸を別の中性アミノ酸に置換することを指す。例示的な置換を以下の表に示す。

【表2】

【0099】

特定の実施形態において、置換は、抗体のＣＤＲにおいて起こる。一般に、得られた変異体は、親抗体と比較して特定の生物学的特性（例えば、親和性の増加）の修飾（例えば、改善）がなされており、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持している。例示的な置換変異体は、親和性成熟抗体である。

【0100】

特定の実施形態において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるために変更される。抗体のグリコシル化部位の追加又は欠失は、１つ以上のグリコシル化部位を作り出す又は除去するようにアミノ酸配列を変更することによって好都合に達成することができる。抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合する炭水化物を変更することができる。いくつかの用途では、グリコシル化部位に対する望ましくない修飾を除去すること、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増強するためにフコースモジュールを除去することは有用であり得る（Ｓｈｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，（２００２） ＪＢＣ，２７７：２６７３３を参照のこと）。他の用途では、ガラクトシジル化修飾を行って補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を修飾することができる。

【0101】

特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸修飾を本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入し、それによりＦｃ領域変異体を生成してもよい。Ｆｃ領域変異体は、１つ以上のアミノ酸位置でのアミノ酸修飾（置換など）を含むヒトＦｃ領域配列（ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域など）を含んでもよい。Ｆｃ変異体の例については、米国特許第７，３３２，５８１号、米国特許第６，７３７，０５６号、米国特許第６，７３７，０５６号；ＷＯ２００４／０５６３１２及びＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，９（２）：６５９１－６６０４（２００１）、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６４：４１７８－４１８４（２０００）、米国特許第７，３７１，８２６号、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８－４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；並びにＷＯ９４／２９３５１を参照のこと。

【0102】

特定の実施形態において、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基によって置換される、「スルホＭＡｂ」などのシステイン操作によって修飾された抗体を生成することが必要となり得る。システイン修飾抗体は、例えば米国特許第７，５２１，５４１号に記載のようにして生成することができる。

【0103】

特定の実施形態において、本明細書で提供される抗体は、当該技術分野で既知である容易に入手可能な他の非タンパク質部分を含むようにさらに修飾することができる。抗体の誘導体化に好適な部分には、水溶性ポリマーが含まれるが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、グルカン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキサン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマー）、及びグルカン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（グリセロールなど）、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。

【0104】

ＩＩＩ．本発明の核酸並びにそれを含むベクター及び宿主細胞
一態様において、本発明は、上記の抗ＣＤ７９ｂ抗体、抗ＣＤ３抗体、及び抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３抗体のいずれか、又はその抗原結合断片をコードする核酸を提供する。本発明はまた、ストリンジェントな条件下で上記の核酸にハイブリダイズする核酸、上記の核酸と比較して１つ以上の置換（例えば、保存的置換）、欠失、若しくは挿入を有する核酸、又は上記の核酸と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれ以上の同一性を有する核酸配列を包含する。

【0105】

別の態様において、本発明は、上記の核酸を含むベクターを提供する。好ましい実施形態において、ベクターは、発現ベクターである。本発明が属する技術分野で一般的に使用されるベクターが本発明に適用されてもよいことは当業者によく理解されるところである。

【0106】

一実施形態において、本発明は、核酸又はベクターを含む宿主細胞を提供する。抗体をコードするベクターをクローニング又は発現するのに好適な宿主細胞には、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞が含まれる。一実施形態において、宿主細胞は、真核細胞である。別の実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞又は２９３細胞）、及び抗体又はその抗原結合断片を調製するのに好適な他の細胞から選択される。

【0107】

ＩＶ．医薬組成物
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載の抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片のいずれかを含む組成物を提供し、好ましくは、組成物は、医薬組成物である。一実施形態において、組成物は、医薬補助材料をさらに含む。一実施形態において、組成物（例えば、医薬組成物）は、本発明の抗ＣＤ７９ｂ×ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片と１つ以上の他の治療薬（例えば、化学療法剤、細胞傷害性薬剤、ワクチン、他の抗体、抗感染症活性剤、小分子薬、又は免疫調節剤）との組み合わせを含む。

【0108】

本発明の医薬組成物は、治療される特定の適応症に必要な１つ以上の他の活性成分、好ましくは、互いの活性に悪影響を及ぼさない活性成分をさらに含むことができる。例えば、化学療法剤、細胞傷害性薬剤、ワクチン、他の抗体、抗感染症活性剤、小分子薬、又は免疫調節剤などの他の抗がん活性成分を提供することが望ましい場合もある。活性成分は、意図する目的のために有効な量で好適に組み合わされる。

【実施例】

【0109】

以下の実施例は、本発明の理解を助けるために説明される。実施例は、本発明の保護範囲をいかなる意味でも限定することを意図するものではなく、また、限定するものとして解釈されるべきではなく、当業者であれば、本出願の明細書の記載に従って様々な修正を行うことができる。

【0110】

特に明示しない限り、当該技術分野で既知の化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、遺伝学、免疫学、及び細胞生物学の従来の方法が本発明の実施に使用される。このような方法の説明は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３^ｒｄ Ｅｄ．，２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２^ｎｄ Ｅｄ．，１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄ ｉｎ Ｊｕｌｙ ２００８）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）；Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）；Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、並びにＡｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇなどの専門誌及びモノグラフに見出すことができる。

【0111】

本発明の抗体の分子構造設計
一態様において、本発明は、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫細胞の表面上のＣＤ７９ｂに結合することができる、ＣＤ７９ｂを標的化する単一特異性抗体を設計する。５つの抗ＣＤ７９ｂ抗体（３４Ｆ１、１１Ｇ１０、３８Ｄ９、５４Ｈ６、及び６０Ｄ９）に基づいてヒト化を行い、５つのヒト化抗ＣＤ７９ｂ抗体（ｈｚ３４Ｆ１．１４、ｈｚ１１Ｇ１０．９．ｐ１、ｈｚ３８Ｄ９Ｂ３．１１、ｈｚ５４Ｈ６Ａ３．１３、及びｈｚ６０Ｄ９Ｈ６．２）を得る。

【0112】

別の態様において、本発明は、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫細胞の表面上のＣＤ７９ｂ及びＴ細胞表面のＣＤ３に同時に結合することができる、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ３を同時に標的化するＴ細胞エンゲージャー二重特異性抗体を設計する。３つの抗ＣＤ７９ｂ抗体（３８Ｄ９Ｂ３．１１、１１Ｇ１０．９．ｐ１、及び３４Ｆ１．１４）及び異なる親和性を有する２つの抗ＣＤ３抗体（ｓｐ３４．２４及びｓｐ３４．８７）に基づいて、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ３の両方を標的化する二重特異性抗体を設計した。

【0113】

１＋１形式を有する６つの二重特異性抗体分子（３８Ｄ９Ｂ３．１１／ｓｐ３４．８７、３８Ｄ９Ｂ３．１１／ｓｐ３４．２４、１１Ｇ１０．９．ｐ１／ｓｐ３４．８７、１１Ｇ１０．９．ｐ１／ｓｐ３４．２４、３４Ｆ１．１４／ｓｐ３４．８７、及び３４Ｆ１．１４／ｓｐ３４．２４）を設計する。二重特異性抗体の重鎖の誤対合はＦｃの「ノブ・イン・ホール」技術を使用して解決され、ここで、Ｆｃは、ＩｇＧ１の重鎖定常領域であり、さらに、エフェクター機能を弱めるアミノ酸変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（Ｋａｂａｔの「ＥＵ」番号付けによる）が導入される。

【0114】

実施例１．ハイブリドーマ細胞の調製
免疫化
ＣＤ７９ｂタンパク質（ｓｉｎｏ、カタログ番号２９７５０－Ｈ０８Ｈ）をフロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｆ５８８１）で乳化させ、これを使用してＢａｌｂ／ｃマウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）を免疫化し、２週間後、ＣＤ７９ｂタンパク質をフロイントの不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｆ５５０６）で乳化させ、これを使用して２週間に１回の筋肉内注射（マウス１匹当たりタンパク質５０μｇ）によってマウスを３回免疫化した。

【0115】

細胞融合
血清力価が要件を満たす場合に、マウスの脾臓を採取して、Ｂリンパ球懸濁液を調製した。Ｂリンパ球懸濁液及びＳＰ２／０ミエローマ細胞（ＡＴＣＣ）を１：２～１：１の割合で混合し、電気融合を行った。融合した細胞を電極皿から５０ｍＬ遠沈管に移し、ＨＡＴ含有培地で１～２×１０^４個の細胞／ｍＬに希釈し、細胞懸濁液を９６ウェルプレートに１００μＬ／ｍＬで添加した。融合後７日目にスクリーニング培地を交換し、培養から１０日後に（細胞増殖状態によってはそれ以上後に）、得られた生成物をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって検出し、陽性クローンを選択した。

【0116】

ハイブリドーマ細胞の陽性クローンのスクリーニング（ＦＡＣＳ）
抗ＣＤ７９ｂ抗体を特異的に発現するハイブリドーマ細胞をフローサイトメーター（ＦＡＣＳ）により選択した。検出対象の細胞（Ｒａｍｏｓ）を計数し、１×１０^６個の細胞／ｍＬに希釈し、Ｕ字底９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで添加した。細胞を５００ｇで５分間遠心分離して、細胞培養培地を除去した。９６ウェルプレート中のハイブリドーマ培養上清をＵ字形プレートに１００μＬ／ウェルで添加し、細胞を再懸濁し、氷上で３０分間放置した。懸濁液を５００ｇで５分間遠心分離して上清を除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。５００ｇで５分間遠心分離してＰＢＳを除去し、ＦＩＴＣ標識抗マウスＦａｂ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５－５４５－００６、ＰＢＳで１：５００希釈）を１００μＬ／ウェルで添加し、１００μＬのＰＥ標識抗ヒトＦｃ二次抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４０９３０４）を陽性対照抗体として添加した。得られた混合物を氷上、暗所で３０分間インキュベートした。混合物を５００ｇで５分間遠心分離して上清を除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。細胞を５０μＬの１×ＰＢＳで再懸濁し、懸濁液をＦＡＣＳアッセイのために充填した。陽性クローンをサブクローニングし、モノクローナル細胞を選び出した。

【0117】

陽性ハイブリドーマ細胞のサブクローニング
サブクローニングの手順：培地を２００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに添加した。スクリーニング培地と比較すると、この培地は、ＨＡＴをＨＴ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１０６７－０３０）に置き換えたことを除き、同じ成分を含む。融合によって選択された陽性ウェル中の細胞を細胞懸濁液に調製し、次いで細胞懸濁液を１００μＬ／ウェルで１列目に添加し、次いで、よく混合した後、１列目の細胞懸濁液を１００μＬ／ウェルで２列目に添加し、次いで、よく混合した後、２列目の細胞懸濁液を１００μＬ／ウェルで次の列に添加した。上記の手順を繰り返した。９６ウェルプレートを３０分間放置し、顕微鏡で細胞を観察して計数した。約１００個の細胞を含む対応する体積を２０ｍＬの培地に添加してよく混合し、２００μＬ／ウェルでプレーティングした。１週間後、細胞を顕微鏡で観察し、モノクローナルウェルを同定してマークを付けた。各ウェルの細胞コンフルエンスが５０％以上に達したときに、上記のＦＡＣＳスクリーニング法と同様の方法によって細胞を検出して標的の陽性ウェルを選択し、バイオレイヤー干渉法（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用することによって、得られたハイブリドーマ細胞上清の抗原に対する親和性を検出した。すべての検出結果を表１に示す。

【表3】

【0118】

実施例２．組換えマウス抗体の調製
抗体の軽鎖及び重鎖の遺伝子配列を実施例１で得たハイブリドーマ候補クローンから抽出した。各株の約５×１０^６個の新たに培養した細胞をＲＮＡ抽出のために採取した（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、カタログ番号７４０９８４．２５０）。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを得た。５’末端のＦＲ１領域に位置する塩基配列を用いて上流プライマーを設計し、抗体定常領域又はＦＲ４領域に位置する塩基を用いて下流プライマーを設計し、次いで、増幅を行って抗体軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の遺伝子断片を取得した。遺伝子断片をＴベクター（Ｍｉｇｈｔｙ ＴＡ－ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ、Ｔａｋａｒａ）に連結し、配列決定のためにモノクローンを選び出し、配列決定の結果をＭＥＧＡ７ソフトウェアを使用して分析及び比較した。最後に、抗体の軽鎖可変領域配列及び重鎖可変領域配列の特異性並びに抗体の親和性に従って、組換えマウス抗体を構築した。

【0119】

Ｎａｎｊｉｎｇ Ｖａｚｙｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．の相同リコンビナーゼ（Ｅｘｎａｓｅ（登録商標）ＩＩ、カタログ番号Ｃ１１２－０１）によって、抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の遺伝子断片をそれぞれ、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターに連結し（ＩｇＧ１サブタイプを定常領域として選択した）、抗体軽鎖及び重鎖の発現プラスミドを得た。

【0120】

次いで、同じ抗体の軽鎖プラスミドと重鎖プラスミドとをモル比１：１で混合し、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号２３９６６）によって２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。５～７日間の培養後、細胞生存率が６０％未満になったときに細胞培養上清を回収し、プロテインＡ親和性カラムで精製してモノクローナル抗体を得た。

【0121】

実施例３．バイオレイヤー干渉法により決定される、抗原に対する本発明のキメラ抗体の結合動態
ＣＤ７９ｂへの本発明の抗体の結合についての平衡解離定数（ＫＤ）をバイオレイヤー干渉法（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）によって決定した。従来技術のＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性アッセイを行った（Ｅｓｔｅｐ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂａｓｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｂｉｎｎｉｎｇ”，ＭＡｂｓ，２０１３．５（２）：２７０－８）。

【0122】

簡単に説明すると、ＡＭＱ（Ｐａｌｌ、１５０６０９１）センサーをアッセイバッファー中で３０分間にわたってオフラインで平衡化し、次いで６０秒間にわたってオンラインで平衡化して、ベースラインを確立した。上記で得られた精製抗体をそれぞれ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性アッセイのためにＡＨＱセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）にオンラインで充填した。次いで、抗体を充填したセンサーを抗原ＣＤ７９ｂに曝露した後、センサーをアッセイバッファーに移して解離速度を測定した。ＦｏｒｔｅＢｉｏ分析ソフトウェアを使用して、ＫＤ値を分析した。抗体親和性アッセイの結果を表２に示す。

【表4】

【0123】

実施例４．キメラ抗体及びＢ細胞非ホジキンリンパ腫細胞株の結合アッセイ
本発明の抗体が細胞表面上に発現する抗原に結合することができるかどうかを検証するために、本研究では、フローサイトメトリーを使用してＲａｍｏｓ細胞及びＢＪＡＢ細胞への抗体の結合を検出した、実験プロセスは次の通りである：Ｒａｍｏｓ（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ－１５９６）及びＢＪＡＢ（ＡｄｄｅｘＢｉｏ、ＵＳＡ、カタログ番号Ｃ０００３０１６）を従来の手順に従って継代した。遠心分離及び再懸濁後に細胞を計数し、４×１０^６個の細胞／ｍＬの密度に調整し、充填タンクに注ぎ、マルチチャンネルピペッターを使用して５０μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。勾配希釈した抗体試料５０μＬを各ウェル中の細胞５０μＬに添加し、次いで、混合物をインキュベーター中で５％ＣＯ_２、３７℃で３０分間インキュベートした。混合物を４００ｇで５分間遠心分離し、次いで２００μＬのＰＢＳを添加し、得られた混合物を４００ｇで５分間遠心分離した。この手順を３回繰り返した。ヤギ抗ヒトＩｇＧＰＥ（１：２００）を添加し、混合物を暗所、室温で３０分間インキュベートした。混合物を２００μＬのＰＢＳで２回洗浄し、遠心分離し、次いで１００μＬのＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーターを使用して値を読み取った。値をフィッティングして曲線を取得し、ＥＣ５０値を計算した。

【0124】

上述のアッセイを用いて行った実験において、Ｒａｍｏｓ細胞表面上のＣＤ７９ｂへのキメラ抗体の結合は図１に示され、ＢＪＡＢ細胞表面上のＣＤ７９ｂへのキメラ抗体の結合は図２に示される。

【0125】

実施例５．キメラ抗体のヒト化
実施例２で得られたキメラ抗体を従来方法に従ってヒト化した。したがって、ヒト化抗体ｈｚ３４Ｆ１．１４、ｈｚ１１Ｇ１０．９．ｐ１、ｈｚ３８Ｄ９Ｂ３．１１、ｈｚ５４Ｈ６Ａ３．１３、及びｈｚ６０Ｄ６Ｈ６．２、並びにそれらのＣＤＲ配列、軽鎖可変領域配列及び重鎖可変領域配列、並びに軽鎖及び重鎖アミノ酸配列は実施例９で示される。

【0126】

実施例６．ＦｏｒｔｅＢｉｏによって決定された抗原に対するヒト化抗体の結合動態
ヒトＣＤ７９ｂへの本発明のヒト化抗体の結合の平衡解離定数（ＫＤ）をＦｏｒｔｅＢｉｏによって決定した。アッセイは実施例３と同じであり、データを表３に示す。

【表5】

【0127】

表３に列挙したＣＤ７９ｂに対するヒト化抗体の親和性から分かるように、ヒト化抗体は、ＣＤ７９ｂへの以前のキメラ抗体の結合を実質的に維持した。

【0128】

実施例７．ヒト化抗体及びＢ細胞非ホジキンリンパ腫細胞株の結合アッセイ
Ｒａｍｏｓ及びＢＪＡＢ細胞へのヒト化抗体の結合をフローサイトメトリーによって検出した。アッセイは実施例４と同じとした。Ｒａｍｏｓ細胞表面上のＣＤ７９ｂへのヒト化抗体の結合は図３に示され、ＢＪＡＢ細胞表面上のＣＤ７９ｂへのヒト化抗体の結合は図４に示される。

【0129】

実施例８．抗体媒介性ＡＤＣＣ効果の効果
本実施例では、ＡＤＣＣ効果を媒介し、それによって腫瘍細胞を除去する際の得られた抗体の効果を調べる。本研究では、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＪｕｒｋａｔ－ＡＤＣＣ ＮＦ－ＡＴルシフェラーゼエフェクター細胞株（以下、ＡＤＣＣエフェクター細胞と称される）を使用した。ＮＦ－ＡＴシグナルの活性化を検出することによって抗体のＡＤＣＣ活性を検出した。具体的な実験プロセスは以下の通りである。

【0130】

１）細胞の調製
標的細胞２９３Ｔ－ｈＣＤ７９ｂ及びＡＤＣＣエフェクター細胞を計数した。上清を遠心分離により除去した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、検出培地（５％低ＩｇＧ血清を含む１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ））中に再懸濁した。ＡＤＣＣエフェクター細胞の濃度を２×１０^７個の細胞／ｍＬに調整し、標的細胞の濃度を２×１０^６個の細胞／ｍＬに調整した。２種類の細胞を１：１の比率で混合し、エフェクターと標的との最終的な比率は１０：１であった。
２）プレーティング：混合細胞を５０μＬ／ウェルでプレーティングした。
３）抗体希釈：抗体試料をそれぞれ勾配希釈した。最初のウェル中の最終濃度は３００ｎＭであり、４倍希釈を行って１０個の勾配を得た。５０μＬの抗体を各ウェル中で５０μＬの細胞に添加した。
４）上記の９６ウェルプレートをインキュベーター中で３７℃で７時間インキュベートした。
５）７時間後、９６ウェルプレートを取り出し、解凍したルシフェラーゼアッセイ試薬を１００μＬ／ウェルで添加した。細胞を室温で２０分間インキュベートし、マイクロプレートリーダーを使用して検出した。濃度依存曲線をＧｒａｐｈＰａｄを用いてフィッティングした。

【0131】

図５に示されるように、ヒト化抗体は、ＡＤＣＣの下流のＮＦ－ＡＴシグナル伝達経路を有効に活性化することができる。

【0132】

実施例９．本発明の二重特異性抗体の発現及び精製
表４に示される組み合わせに従って、３つの異なる抗ヒトＣＤ７９ｂクローン３８Ｄ９Ｂ３．１１、１１Ｇ１０．９．ｐ１、及び３４Ｆ１．１４をそれぞれ、２つの異なる抗ヒトＣＤ３クローンＨｚＳＰ３４．８７及びＨｚＳＰ３４．２４と組み合わせて、合計６つの二重特異性抗体３８Ｄ９Ｂ３．１１／ｓｐ３４．８７、３８Ｄ９Ｂ３．１１／ｓｐ３４．２４、１１Ｇ１０．９．ｐ１／ｓｐ３４．８７、１１Ｇ１０．９．ｐ１／ｓｐ３４．２４、３４Ｆ１．１４／ｓｐ３４．８７、及び３４Ｆ１．１４／ｓｐ３４．２４を別々に構築した。二重特異性抗体はそれぞれ、ＨＥＫ２９３細胞中で一過性に発現された。発現の７日後、得られた細胞発酵ブロスを濾過して清澄化し、次いで、捕捉のためにプロテインＡカラム（Ｈｉｔｒａｐ Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ、ＧＥ１１－００３４－９５）を使用してハーフ抗体を得た。Ａ２８０法によってハーフ抗体の濃度を検出した後、ハーフ抗体を１：１のモル比で混合した。適量の還元剤ＧＳＨを添加し、混合物を室温で一晩反応させた。次いで、限外濾過によって還元剤を除去し、反応を停止させた。次いで、ＭｏｎｏＳ陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して精密な精製を行った。溶出液を限外濾過し、バッファーをＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、７００１１－０４４）に交換した。分子量を質量分析法によって決定し、純度をＳＥＣ－ＨＰＬＣによって決定した。ＣＤ７９ｂ．Ａ７ｖ１４ｂ／３８Ｅ４ｖ１は、特許ＵＳ２０１８０３２７４９２号のＣＤ７９ｂ／ＣＤ３二重特異性抗体であり、同じ方法を使用して発現させた。得られた上記７つの二重特異性抗体を以下の実施例で使用した。

【表6】

【0133】

具体的なアミノ酸配列リスト（Ｋａｂａｔ規則によって定義されたＣＤＲ領域）は以下の通りである。

【0134】

３８Ｄ９Ｂ３．１１の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
重鎖ＣＤＲ配列は以下の通りである：
ＨＣＤＲ１（配列番号１）：ＧＹＴＦＴＤＹＳＭＨ；
ＨＣＤＲ２（配列番号２）：ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＳＹＡＤＤＦＫＧ；
ＨＣＤＲ３（配列番号３）：ＧＰＹ；
重鎖可変領域ＶＨ配列（配列番号４）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＳＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＥＴＧＥＰＳＹＡＤＤＦＫＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＹＹＧＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ；
全長重鎖配列（配列番号５）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＳＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＥＴＧＥＰＳＹＡＤＤＦＫＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＹＹＧＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ。
軽鎖ＣＤＲ配列：
ＬＣＤＲ１（配列番号６）：ＫＡＳＱＳＶＤＨＤＶＤＳＹＭＤ；
ＬＣＤＲ２（配列番号７）：ＳＡＳＮＬＥＳ；
ＬＣＤＲ３（配列番号８）：ＱＱＩＮＥＹＰＹＴ；
軽鎖可変領域ＶＬ配列（配列番号９）：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＫＡＳＱＳＶＤＨＤＶＤＳＹＭＤＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＳＡＳＮＬＥＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＩＮＥＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ；
全長軽鎖配列（配列番号１０）：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＫＡＳＱＳＶＤＨＤＶＤＳＹＭＤＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＳＡＳＮＬＥＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＩＮＥＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。

【0135】

１１Ｇ１０．９．ｐ１の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
重鎖ＣＤＲ配列は以下の通りである：
ＨＣＤＲ１（配列番号１１）：ＧＹＴＦＴＤＹＷＶＮ；
ＨＣＤＲ２（配列番号１２）：ＭＩＤＰＳＤＳＥＴＨＹＮＱＭＦＮＤ；
ＨＣＤＲ３（配列番号１３）：ＳＮＹＹ；
重鎖可変領域ＶＨ配列（配列番号１４）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＷＶＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＭＩＤＰＳＤＳＥＴＨＹＮＱＭＦＮＤＲＶＴＭＴＶＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＳＮＹＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ；
全長重鎖配列（配列番号１５）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＷＶＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＭＩＤＰＳＤＳＥＴＨＹＮＱＭＦＮＤＲＶＴＭＴＶＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＳＮＹＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ。
軽鎖ＣＤＲ配列は以下の通りである：
ＬＣＤＲ１（配列番号１６）：ＫＳＳＱＳＬＬＤＳＥＧＫＴＹＬＮ；
ＬＣＤＲ２（配列番号１７）：ＬＶＳＫＬＤＳ；
ＬＣＤＲ３（配列番号１８）：ＧＴＨＦＰＬＴ；
軽鎖可変領域ＶＬ配列（配列番号１９）：
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＥＧＫＴＹＬＮＷＬＬＱＫＰＧＱＳＰＱＳＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ；
全長軽鎖配列（配列番号２０）：
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＥＧＫＴＹＬＮＷＬＬＱＫＰＧＱＳＰＱＳＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。

【0136】

３４Ｆ１．１４の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
重鎖ＣＤＲ配列は以下の通りである：
ＨＣＤＲ１（配列番号２１）：ＧＹＳＦＴＴＹＷＭＮ；
ＨＣＤＲ２（配列番号２２）：ＭＩＤＰＳＤＳＥＴＨＹＮＨＬＦＫＤ；
ＨＣＤＲ３（配列番号２３）：ＡＩＧＹ；
重鎖可変領域ＶＨ配列（配列番号２４）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＴＹＷＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＴＷＭＧＭＩＤＰＳＤＳＥＴＨＹＮＨＬＦＫＤＲＶＴＭＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＡＩＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ；
全長重鎖配列（配列番号２５）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＴＹＷＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＴＷＭＧＭＩＤＰＳＤＳＥＴＨＹＮＨＬＦＫＤＲＶＴＭＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＡＩＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ。
軽鎖ＣＤＲ配列は以下の通りである：
ＬＣＤＲ１（配列番号２６）：ＫＳＳＬＳＬＬＤＳＥＧＫＴＹＬＮ；
ＬＣＤＲ２（配列番号２７）：ＬＶＳＫＬＤＳ；
ＬＣＤＲ３（配列番号２８）：ＷＱＧＴＨＦＰＬＴ；
軽鎖可変領域ＶＬ配列（配列番号２９）：
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＬＳＬＬＤＳＥＧＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＰＬＩＳＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ；
全長軽鎖配列（配列番号３０）：
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＬＳＬＬＤＳＥＧＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＰＬＩＳＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。

【0137】

ＨｚＳＰ３４．８７の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
重鎖ＣＤＲ配列は以下の通りである：
ＨＣＤＲ１（配列番号３１）：ＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮ；
ＨＣＤＲ２（配列番号３２）：ＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤ；
ＨＣＤＲ３（配列番号３３）：ＨＹＮＦＧＱＳＹＶＳＷＦＡＹ；
重鎖可変領域ＶＨ配列（配列番号３４）：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱＡＳＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＳＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＨＹＮＦＧＱＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ；
全長重鎖配列（配列番号３５）：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱＡＳＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＳＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＨＹＮＦＧＱＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ。
軽鎖ＣＤＲ配列は以下の通りである：
ＬＣＤＲ１（配列番号３６）：ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ；
ＬＣＤＲ２（配列番号３７）：ＧＴＮＫＲＡＰ；
ＬＣＤＲ３（配列番号３８）：ＡＬＷＹＳＮＬＷＶ；
軽鎖可変領域ＶＬ配列（配列番号３９）：
ＱＡＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＱＫＰＧＱＡＰＲＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＶＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＤＫＡＡＬＴＬＬＧＡＱＰＥＤＥＡＥＹＹＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＱＧＴＫＬＴＶＬ；
全長軽鎖配列（配列番号４０）：
ＱＡＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＱＫＰＧＱＡＰＲＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＶＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＤＫＡＡＬＴＬＬＧＡＱＰＥＤＥＡＥＹＹＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＱＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ。

【0138】

ＨｚＳＰ３４．２４の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
重鎖ＣＤＲ配列は以下の通りである：
ＨＣＤＲ１（配列番号４１）：ＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮ；
ＨＣＤＲ２（配列番号４２）：ＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤ；
ＨＣＤＲ３（配列番号４３）：ＨＧＮＦＧＱＳＹＶＳＷＦＡＹ；
重鎖可変領域ＶＨ配列（配列番号４４）：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱＡＳＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＳＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＨＧＮＦＧＱＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ；
全長重鎖配列（配列番号４５）：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱＡＳＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＳＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＨＧＮＦＧＱＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ。
軽鎖ＣＤＲ配列は以下の通りである：
ＬＣＤＲ１（配列番号４６）：ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ；
ＬＣＤＲ２（配列番号４７）：ＧＴＮＫＲＡＰ；
ＬＣＤＲ３（配列番号４８）：ＡＬＷＹＳＮＬＷＶ；
軽鎖可変領域ＶＬ配列（配列番号４９）：
ＱＡＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＱＫＰＧＱＡＰＲＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＶＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＤＫＡＡＬＴＬＬＧＡＱＰＥＤＥＡＥＹＹＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＱＧＴＫＬＴＶＬ；
全長軽鎖配列（配列番号５０）：
ＱＡＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＱＫＰＧＱＡＰＲＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＶＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＤＫＡＡＬＴＬＬＧＡＱＰＥＤＥＡＥＹＹＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＱＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ。

【0139】

ＣＤ７９ｂ．Ａ７ｖ１４ｂの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
重鎖ＣＤＲ配列は以下の通りである：
ＨＣＤＲ１（配列番号５１）：ＧＹＴＦＴＴＹＹＭＮ；
ＨＣＤＲ２（配列番号５２）：ＭＩＤＰＳＤＳＥＴＨＹＮＱＫＦＱＧ；
ＨＣＤＲ３（配列番号５３）：ＳＬＡＦ；
重鎖可変領域ＶＨ配列（配列番号５４）：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＭＩＤＰＳＤＳＥＴＨＹＮＱＫＦＱＧＲＡＴＬＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＬＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＳＬＡＦＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ；
全長重鎖配列（配列番号５５）：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＭＩＤＰＳＤＳＥＴＨＹＮＱＫＦＱＧＲＡＴＬＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＬＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＳＬＡＦＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ。
軽鎖ＣＤＲ配列は以下の通りである：
ＬＣＤＲ１（配列番号５６）：ＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮ；
ＬＣＤＲ２（配列番号５７）：ＬＶＳＫＬＤＳ；
ＬＣＤＲ３（配列番号５８）：ＷＱＧＴＨＦＰＱＴ；
軽鎖可変領域ＶＬ配列（配列番号５９）：
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮＷＬＬＱＫＰＧＱＳＰＱＳＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＱＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ；
全長軽鎖配列（配列番号６０）：
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮＷＬＬＱＫＰＧＱＳＰＱＳＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＱＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。

【0140】

３８Ｅ４ｖ１の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
重鎖ＣＤＲ配列は以下の通りである：
ＨＣＤＲ１（配列番号６１）：ＧＦＴＦＴＳＹＹＩＨ；
ＨＣＤＲ２（配列番号６２）：ＷＩＹＰＥＮＤＮＴＫＹＮＥＫＦＫＤ；
ＨＣＤＲ３（配列番号６３）：ＤＧＹＳＲＹＹＦＤＹ；
重鎖可変領域ＶＨ配列（配列番号６４）：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＴＦＴＳＹＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＷＩＹＰＥＮＤＮＴＫＹＮＥＫＦＫＤＲＶＴＩＴＡＤＴＳＴＳＴＡＹＬＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＧＹＳＲＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ；
全長重鎖配列（配列番号６５）：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＴＦＴＳＹＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＷＩＹＰＥＮＤＮＴＫＹＮＥＫＦＫＤＲＶＴＩＴＡＤＴＳＴＳＴＡＹＬＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＧＹＳＲＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ。
軽鎖ＣＤＲ配列は以下の通りである：
ＬＣＤＲ１（配列番号６６）：ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹＬＡ；
ＬＣＤＲ２（配列番号６７）：ＷＴＳＴＲＫＳ；
ＬＣＤＲ３（配列番号６８）：ＫＱＳＦＩＬＲＴ；
軽鎖可変領域ＶＬ配列（配列番号６９）：
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＴＳＴＲＫＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＳＦＩＬＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ；
全長軽鎖配列（配列番号７０）：
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＴＳＴＲＫＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＳＦＩＬＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。

【0141】

ｐｏｌｍａｂの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列：
全長重鎖配列（配列番号７１）：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＳＳＹＷＩＥＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＧＧＤＴＮＹＮＥＩＦＫＧＲＡＴＦＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＲＶＰＩＲＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
全長軽鎖配列（配列番号７２）：
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＳＶＤＹＥＧＤＳＦＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

【0142】

実施例１０．本発明の抗体の親和性アッセイ
表面プラズモン共鳴（ＢｉａｃｏｒｅＴ２００）を使用して、ヒトＣＤ７９ｂ、ヒトＣＤ３、及びカニクイザルＣＤ３に対する本発明の例示的な抗ＣＤ７９ｂ／ＣＤ３抗体の結合動態を決定した。（１）ヒトＣＤ７９ｂ－ｈｉｓに対する抗体の親和性アッセイ（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）：５０ｍＭ Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及び２００ｍＭ １－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を新たに混合し、１０μＬ／分の流速で４２０秒間活性化した。次いで、ヒトＣＤ７９ｂ－Ｈｉｓ抗原を１０ｍＭ酢酸塩（ｐＨ５．０）で希釈し、１μｇ／ｍＬの濃度に希釈した後、抗原溶液をカップリングに供し、値は約５０ＲＵであった。次いで、１Ｍエタノールアミンを１０μＬ／分の流速で４２０秒間注入して、残りの活性化部位をブロッキングした。実験で使用したバッファーはｐＨ７．４のＨＢＳ－ＥＰ＋溶液であり、ハイパフォーマンスモード下で、２倍勾配希釈（０～８０ｎＭ）後に得られた抗体をそれぞれ、濃度に基づく昇順に従って３０μＬ／分の流速でチップのチャネル１、２、３及び４に注入し、１つの濃度の測定に１サイクルを使用し、結合時間は１８０秒であり、解離時間は６００秒であった。（２）ヒトＣＤ３Ｅ及びＣＤ３Ｇ－ビオチン（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）及びサルＣＤ３Ｅ及びＣＤ３Ｇ－ビオチン（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）に対する抗体の親和性アッセイ：５０ｍＭ ＮＨＳ及び２００ｍＭ ＥＤＣを新たに混合し、１０μＬ／分の流速で４２０秒間活性化した。次いで、ストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）タンパク質を１０ｍＭ酢酸塩（ｐＨ４．５）で希釈し、１０μｇ／ｍＬの濃度に希釈した後、抗原溶液をカップリングに供し、値は約３０００ＲＵであった。次いで、１Ｍエタノールアミンを１０μＬ／分の流速で４２０秒間注入して、残りの活性化部位をブロッキングした。ヒトＣＤ３Ｅ及びＣＤ３Ｇビオチンタンパク質並びにサルＣＤ３Ｅ及びＣＤ３Ｇビオチンタンパク質をそれぞれ、ストレプトアビジンタンパク質と結合したチップチャネル上に固定化した。２倍勾配希釈後に得られた抗体（０～１６ｎＭ又は０～４０ｎＭ又は０～２００ｎＭ）をそれぞれ、濃度に基づく昇順に従ってチャネル１、２、３、及び４に注入した。流速３０μＬ／分でチップに注入し、１つの濃度の測定に１サイクルを使用し、結合時間は１８０秒であり、解離時間は３００秒であった。

【0143】

上記のアッセイを使用して行った実験において、ヒトＣＤ７９ｂ－Ｈｉｓに対する３８Ｄ９Ｂ３．１１／ｓｐ３４．８７、３８Ｄ９Ｂ３．１１／ｓｐ３４．２４、１１Ｇ１０．９．ｐ１／ｓｐ３４．８７、１１Ｇ１０．９．ｐ１／ｓｐ３４．２４、３４Ｆ１．１４／ｓｐ３４．８７、３４Ｆ１．１４／ｓｐ３４．２４、及びＣＤ７９ｂ．Ａ７ｖ１４ｂ／３８Ｅ４ｖ１の親和性は表５に示される。ヒトＣＤ３Ｅ及びＣＤ３Ｇ（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）並びにサルＣＤ３Ｅ及びＣＤ３ＧＧに対する３８Ｄ９Ｂ３．１１／ｓｐ３４．８７、３８Ｄ９Ｂ３．１１／ｓｐ３４．２４、１１Ｇ１０．９．ｐ１／ｓｐ３４．８７、１１Ｇ１０．９．ｐ１／ｓｐ３４．２４、３４Ｆ１．１４／ｓｐ３４．８７、３４Ｆ１．１４／ｓｐ３４．２４、及びＣＤ７９ｂ．Ａ７ｖ１４ｂ／３８Ｅ４ｖ１の親和性は表６及び７に示される。

【表7】

【表8】

【表9】

【0144】

実施例１１．本発明の抗ＣＤ７９ｂ／ＣＤ３抗体及びＢ細胞非ホジキンリンパ腫細胞株についての結合アッセイ
フローサイトメトリーにより、ＣＤ７９ｂ陽性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫細胞株に対するＣＤ７９ｂ／ＣＤ３二重特異性抗体の結合能力を検出した。ＢＪＡＢ（ＡｄｄｅｘＢｉｏ、ＵＳＡ、カタログ番号Ｃ０００３０１６）及びＷＳＵ－ＤＬＣＬ２（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｋｅｂａｉ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｔｄ．、カタログ番号ＣＢＰ６０２７３）を従来の手順に従って培養及び継代した。遠心分離及び再懸濁後に細胞を計数し、４×１０^６個の細胞／ｍＬの密度に調整し、充填タンクに注ぎ、マルチチャンネルピペッターを使用して５０μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。勾配希釈した５０μＬの抗体試料を各ウェル中の細胞５０μＬに添加し、混合物をインキュベーター中で５％ＣＯ２、３７で３０分間インキュベートした。混合物を４００ｇで５分間遠心分離し、次いで２００μＬのＰＢＳを添加し、得られた混合物を４００ｇで５分間遠心分離した。この手順を３回繰り返した。ヤギ抗ヒトＩｇＧＰＥ（１：２００）を添加し、混合物を暗所、室温で３０分間インキュベートした。混合物を２００μＬのＰＢＳで２回洗浄し、遠心分離し、次いで１００μＬのＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーターを使用して値を読み取った。値をフィッティングして曲線を取得し、ＥＣ５０値を計算した。

【0145】

上記のアッセイを使用して行った実験において、ＣＤ７９ｂ高発現細胞株であるＢＪＡＢ細胞の表面上のＣＤ７９ｂに対する例示的な抗体の結合は図６に示され、ＣＤ７９ｂ低発現細胞株であるＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞の表面上のＣＤ７９ｂに対する例示的な抗体の結合は図７に示される。

【0146】

実施例１２．本発明の抗ＣＤ７９ｂ／ＣＤ３抗体によるＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ細胞の活性化に関するアッセイ
ＣＤ７９ｂ／ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫細胞の表面上のＣＤ７９ｂ及びＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ細胞の表面上のＣＤ３に同時に結合し、ＣＤ７９ｂ依存性のＣＤ３架橋を介してＮＦＡＴ－Ｌｕｃの下流のシグナル伝達経路を活性化する。本研究では、ルシフェラーゼレポーター遺伝子法に基づき、共培養したＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ細胞及びＣＤ７９ｂ陽性細胞を追加の例示抗体とともに一晩培養した後のルシフェラーゼ発現を検出し、抗体の活性化能を示した。

【0147】

実験方法
アッセイ培地の調製：１０％ＦＢＳ＋９０％ＲＰＭＩ培地１６４０
Ｂｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム検出溶液の調製：Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ７９４０）を解凍し、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ７９４０）とよく混合し、混合物を－４０℃の冷蔵庫中で保存した。
１．ＢＪＡＢ、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２、ＮＵＧＣ４、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ細胞をそれぞれ３００ｇで８分間遠心分離し、上清を捨てた。ＢＪＡＢ細胞及びＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ細胞をそれぞれアッセイ培地に懸濁し、次いで細胞数を計測し、細胞密度を調整し、細胞密度は両方とも６．０×１０^５個であった。腫瘍細胞及びＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ細胞を、後で使用するために１：１の比率で混合した。
２．細胞懸濁液及び勾配希釈した試験抗体を１００μＬ／ウェルで９６ウェル白色細胞培養プレートに添加し、混合物を一晩インキュベートした。
３．Ｂｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステムの検出溶液を取り出し、室温で解凍した。
４．ステップ２でインキュベートした試料を取り出し、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ ルシフェラーゼアッセイシステム検出液を８０μＬ／ウェルで添加した。
５．プレートをマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＩ３）で読み取った。

【0148】

上述のアッセイを用いて行った実験において、例示的な抗体は、用量依存的にＮＦＡＴシグナルを活性化することができ（図８Ａ及び８Ｂを参照のこと）、例示的な抗体は、非標的細胞ＮＵＧＣ４に対して活性化を示さなかった（図８Ｃを参照のこと）。

【0149】

実施例１３．本発明の抗ＣＤ７９ｂ／ＣＤ３抗体によるＢ細胞非ホジキンリンパ腫細胞株の死滅に関するアッセイ
ＣＤ７９ｂ／ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫細胞の表面上のＣＤ７９ｂ及び初代Ｔ細胞の表面上のＣＤ３に同時に結合し、ＣＤ７９ｂ依存性のＣＤ３架橋を介してＴ細胞を活性化し、Ｔ細胞によるＣＤ７９ｂ陽性腫瘍細胞の死滅を媒介する。本研究では、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色法に基づいて、例示的な抗体を共培養したヒトＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ７９ｂ陽性細胞に添加してから４８時間後の腫瘍細胞のＰＩ陽性率を検出し、ＣＤ７９ｂ陽性腫瘍細胞に対するヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の死滅能力を評価した。

【0150】

ＰＢＭＣを液体窒素タンクから取り出し、３７℃で急速解凍し、予熱した１０％ＦＢＳを含む１６４０培地（０．１％ＤＮａｓｅを含む）に滴加し、１０ｍＬの混合溶液を得た。混合溶液を４００ｇで５分間遠心分離し、１０％ＦＢＳを含む１０ｍＬの１６４０培地に再懸濁し、１０μＬのＤＮａｓｅを添加した。混合物を３７℃及び５％ＣＯ_２で２時間放置した。ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞濃縮キットを使用してヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、説明書に従って操作を行った。ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の密度を１０％ＦＢＳを含む１６４０培地を使用して１×１０^６個の細胞／ｍＬに調整し、該細胞をエフェクター細胞として使用した。ＣＤ７９ｂ陽性細胞ＢＪＡＢ及びＷＳＵ－ＤＬＣＬ２を標的細胞として用い、ＮＵＧＣ４を非標的細胞として用いた。細胞を４００ｇで５分間遠心分離し、１０％ＦＢＳを含む１６４０培地に再懸濁し、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｆａｒ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌ染色液（ＴＨＥＲＭＯ ＦＩＳＨＥＲ、Ｃ３４５６４）を添加した。混合物を３０分間インキュベートし、４００ｇで５分間遠心分離し、１０％ＦＢＳを含む１６４０培地に再懸濁し、細胞密度を２×１０^５個の細胞／ｍＬに調整した。腫瘍細胞懸濁液及びヒトＣＤ８＋Ｔ細胞懸濁液を１：５の比率でよく混合し、得られた細胞懸濁液及び勾配希釈した試験抗体を２００μＬ／ウェルで（一般的な）９６ウェル丸底培養プレート（カバー付き）に添加した。細胞を二酸化炭素インキュベーター中に置き、３７℃で４８時間刺激した。細胞を４００ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、ＰＢＳ（１：１０００に希釈したヨウ化プロピジウム溶液を含む）を１００μＬ／ウェルで添加して、細胞を再懸濁した。混合物を４℃で１０分間放置し、フローサイトメーター（ＢＤ、ＦＡＣＳＣＥＬＥＳＴＡ）を使用して値を読み取った。

【0151】

上述のアッセイを使用して行った実験において、例示的な抗体は、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞によるＢＪＡＢ及びＷＳＵ－ＤＬＣＬ２標的細胞の死滅を用量依存的に誘導することができ（図９Ａ及び９Ｂを参照のこと）、例示的な抗体は、非標的細胞ＮＵＧＣ４に対しては死滅を示さなかった（図９Ｃを参照のこと）。

【0152】

実施例１４．本発明の抗ＣＤ７９ｂ／ＣＤ３抗体によるヒトＢ細胞非ホジキンリンパ腫細胞株の死滅の際のＴ細胞活性化及びサイトカイン放出のレベル
本研究では、勾配希釈した例示的な抗体をＢ細胞非ホジキンリンパ腫細胞及びヒトＴ細胞の共インキュベーションシステムに添加し、１８時間後にヒトＴ細胞ＣＤ２５及びＣＤ６９に対して二重陽性である細胞の割合をフローサイトメトリーによって検出して、ヒトＴ細胞及びＣＤ７９ｂ陽性腫瘍細胞の共インキュベーションシステムにおける抗体媒介Ｔ細胞活性化の程度を評価した。マルチサイトカインアッセイキット（ヒトＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７、ＢＤ）を使用することによって様々なサイトカインのレベルを同時に検出し、ヒトＴ細胞及びＣＤ７９ｂ陽性腫瘍細胞の共インキュベーションシステムにおいて、サイトカインを放出するＴ細胞の抗体媒介能力を評価した。

【0153】

実験プロセス
ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化及びサイトカイン放出の検出：
ＰＢＭＣを液体窒素タンクから取り出し、３７℃で急速解凍し、予熱した１０％ＦＢＳを含む１６４０培地（０．１％ＤＮａｓｅを含む）に滴加し、１０ｍＬの混合溶液を得た。混合溶液を４００ｇで５分間遠心分離し、１０％ＦＢＳを含む１６４０培地１０ｍＬに再懸濁し、１０μＬのＤＮａｓｅを添加した。混合物を３７℃及び５％ＣＯ２で２時間放置した。ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞濃縮キットを使用してヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、説明書に従って操作を行った。ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の密度を１０％ＦＢＳを含む１６４０培地を用いて１×１０^６個の細胞／ｍＬに調整し、該細胞をエフェクター細胞として使用した。腫瘍細胞を１０％ＦＢＳを含む１６４０培地に再懸濁し、密度を２×１０^５個の細胞／ｍＬに調整した。腫瘍細胞懸濁液及びヒトＣＤ８＋Ｔ細胞懸濁液を１：１の比率でよく混合し、得られた細胞懸濁液及び勾配希釈した試験抗体を（最高濃度は１００ｎＭである、３倍希釈、１２個の勾配）を２００μＬ／ウェルで（一般的な）９６ウェル丸底培養プレート（カバー付き）に添加した。細胞を二酸化炭素インキュベーター中に置き、３７℃で１８時間刺激した。細胞を４００ｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳ（１：１００希釈したＡＰＣ抗ヒトＣＤ８ａ、ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ６９、及びＰＥ抗ヒトＣＤ２５を含む）を１００μＬ／ウェルで添加して、細胞を再懸濁した。混合物を４℃で３０分間放置し、次いで洗浄し、フローサイトメーター（ＢＤ、ＦＡＣＳＣＥＬＥＳＴＡ）を用いて値を読み取った。一方、上清を回収し、アッセイキット（ヒトＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７キット、ＢＤ）の説明書に従ってサイトカインＴＮＦα及びＩＦＮ－γの含有量を検出した。

【0154】

ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞活性化の検出：
ＰＢＭＣを液体窒素タンクから取り出し、３７℃で急速解凍し、予熱した１０％ＦＢＳを含む１６４０培地（０．１％ＤＮａｓｅを含む）に滴加し、１０ｍＬの混合溶液を得た。混合溶液を４００ｇで５分間遠心分離し、１０％ＦＢＳを含む１６４０培地１０ｍＬに再懸濁し、１０μＬのＤＮａｓｅを添加した。混合物を３７℃及び５％ＣＯ_２で２時間放置した。ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞濃縮キットを使用してヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、説明書に従って操作を行った。ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の密度を１０％ＦＢＳを含む１６４０培地を用いて１×１０^６個の細胞／ｍＬに調整し、該細胞をエフェクター細胞として使用した。腫瘍細胞を１０％ＦＢＳを含む１６４０培地に再懸濁し、密度を２×１０^５個の細胞／ｍＬに調整した。腫瘍細胞懸濁液及びヒトＣＤ４＋Ｔ細胞懸濁液を１：１の比率でよく混合し、得られた細胞懸濁液及び勾配希釈した試験抗体を２００μＬ／ウェルで（一般的な）９６ウェル丸底培養プレート（カバー付き）に添加した。細胞を二酸化炭素インキュベーター中に置き、３７℃で１８時間刺激した。細胞を４００ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、ＰＢＳ（１：１００希釈したＡＰＣ抗ヒトＣＤ４、ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ６９、及びＰＥ抗ヒトＣＤ２５を含む）を１００μＬ／ウェルで添加し、細胞を再懸濁した。混合物を４℃で３０分間放置し、次いで洗浄し、フローサイトメーター（ＢＤ、ＦＡＣＳＣＥＬＥＳＴＡ）を用いて値を読み取った。

【0155】

結果
上述のアッセイを使用して行った実験において、例示的な抗体によって誘導されるＣＤ８＋Ｔ細胞によるＢＪＡＢ細胞の死滅の際のＣＤ８＋活性化の程度が図１０Ａに示され、例示的な抗体によって誘導されるＣＤ８＋Ｔ細胞によるＲａｍｏｓ細胞の死滅の際のＣＤ８＋活性化の程度を図１０Ｂに示され、例示的な抗体によって誘導されるＣＤ８＋Ｔ細胞によるＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞の死滅の際のＣＤ８＋活性化の程度が図１０Ｃに示され、例示的な抗体によって誘導されるＣＤ８＋Ｔ細胞によるＮＵＧＣ４細胞の死滅の際のＣＤ８＋活性化の程度が図１０Ｄに示される。例示的な抗体によって誘導されるＣＤ８＋Ｔ細胞による様々な細胞の死滅の際のＩＦＮ－γ放出のレベルが図１１に示され、例示的な抗体によって誘導されるＣＤ８＋Ｔ細胞による様々な細胞の死滅の際のＴＮＦα放出のレベルが図１２に示される。例示的な抗体によって誘導されるＣＤ４＋Ｔ細胞及びＢＪＡＢ細胞の共インキュベーション中のＣＤ４＋活性化の程度を図１３Ａに示され、例示的な抗体によって誘導されるＣＤ４＋Ｔ細胞及びＲａｍｏｓ細胞の共インキュベーション中のＣＤ４＋活性化の程度が図１３Ｂに示され、例示的な抗体によって誘導されるＣＤ４＋Ｔ細胞及びＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞の共インキュベーション中のＣＤ４＋活性化の程度が図１３Ｃに示され、例示的な抗体によって誘導されるＣＤ４＋Ｔ細胞及びＮＵＧＣ４細胞の共インキュベーション中のＣＤ４＋活性化の程度が図１３Ｄに示される。ＣＤ７９ｂ陽性腫瘍細胞の存在下では、例示的な抗体はすべて、ＰＢＭＣから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞を用量依存的に活性化することができ、Ｔ細胞活性化の程度はＣＤ３に対する親和性とある程度相関する。ＣＤ３に対する親和性が高いほど、Ｔ細胞を活性化する能力が高くなる。

【0156】

実施例１５．例示的な抗体によるヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖能力の促進に関するアッセイ
ＰＢＭＣから単離したＣＤ８＋Ｔ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｆａｒ Ｒｅｄ細胞増殖キットで標識し、標識したヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を腫瘍細胞とともに共培養し、続いて、勾配希釈した例示的な抗体を添加し、９６時間後にＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖をフローサイトメーターを使用して検出した。

【0157】

実験手順
ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の分離：ＰＢＭＣを液体窒素タンクから取り出し、３７℃で急速に解凍し、１０％ＦＢＳを含む１０ｍＬの１６４０培地（０．１％ＤＮａｓｅを含む）に３７℃で滴加した。混合物を２５℃、３００ｇで８分間遠心分離し、上清を除去した。細胞を、Ｔ７５培養フラスコ中、３７℃で、１０％ＦＢＳを含む１６４０培地（０．１％ＤＮａｓｅを含む）に再懸濁し、混合物をインキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ_２で３時間放置した。ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞濃縮キットを使用してヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、説明書に従って操作を行った。ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の密度を１０％ＦＢＳを含む１６４０培地を用いて５×１０^５個の細胞／ｍＬに調整し、該細胞をエフェクター細胞として使用した。腫瘍細胞を１０％ＦＢＳを含む１６４０培地に再懸濁し、密度を１×１０^５個の細胞／ｍＬに調整した。腫瘍細胞懸濁液及びヒトＣＤ８＋Ｔ細胞懸濁液を１：１の比率でよく混合し、得られた細胞懸濁液及び勾配希釈した試験抗体を２００μＬ／ウェルで（一般的な）９６ウェル丸底培養プレート（カバー付き）に添加した。細胞を二酸化炭素インキュベーター中に置き、３７℃で７２時間刺激した。細胞を４００ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、ＰＢＳ（１：１００希釈したＰＥ抗ヒトＣＤ８を含む）を１００μＬ／ウェルで添加して、細胞を再懸濁した。４℃で３０分間放置し、洗浄し、フローサイトメーター（ＢＤ、ＦＡＣＳＣＥＬＥＳＴＡ）を用いて値を読み取った。

【0158】

結果
上述のアッセイを使用して行った実験において、例示的な抗体は、ＣＤ７９ｂ陽性細胞の存在下でインビトロでＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を有効に刺激することができた（図１４Ａ、１４Ｂ、及び１４Ｃを参照のこと）が、例示的な抗体は、ＣＤ７９ｂ陰性ＮＵＧＣ４細胞の存在下でＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ７９ｂ非依存的かつ非特異的な増殖を示さなかった（図１４Ｄを参照のこと）。

【0159】

実施例１６．例示的な抗体によるヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖能力の促進に関するアッセイ
例示的な抗体は、ＣＤ７９ｂ陽性腫瘍細胞の存在下でインビトロでヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を用量依存的に刺激することができたが、例示的な抗体は、ＣＤ７９ｂ陰性ＮＵＧＣ４細胞の存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ７９ｂ非依存的かつ非特異的な増殖を示さなかった。

【0160】

実験手順
ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の分離：ＰＢＭＣを液体窒素タンクから取り出し、３７℃で急速に解凍し、１０％ＦＢＳを含む１０ｍＬの１６４０培地（０．１％ＤＮａｓｅを含む）に３７℃で滴加した。混合物を２５℃、３００ｇで８分間遠心分離し、上清を除去した。細胞を、Ｔ７５培養フラスコ中、３７℃で、１０％ＦＢＳを含む１６４０培地（０．１％ＤＮａｓｅを含む）に再懸濁し、混合物をインキュベーター中で３７℃及び５％ＣＯ_２で３時間放置した。ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞濃縮キットを使用してヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、説明書に従って操作を行った。ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の密度を１０％ＦＢＳを含む１６４０培地を用いて５×１０^５個の細胞／ｍＬに調整し、該細胞をエフェクター細胞として使用した。腫瘍細胞を１０％ＦＢＳを含む１６４０培地に再懸濁し、密度を１×１０^５個の細胞／ｍＬに調整した。腫瘍細胞懸濁液及びヒトＣＤ４＋Ｔ細胞懸濁液を１：１の比率でよく混合し、得られた細胞懸濁液と勾配希釈した試験抗体を２００μＬ／ウェルで（一般的な）９６ウェル丸底培養プレート（カバー付き）に添加した。細胞を二酸化炭素インキュベーター中に置き、３７℃で７２時間刺激した。細胞を４００ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、ＰＢＳ（１：１００希釈したＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ４を含む）を１００μＬ／ウェルで添加して細胞を再懸濁した。４℃で３０分間放置し、洗浄し、フローサイトメーター（ＢＤ、ＦＡＣＳＣＥＬＥＳＴＡ）を用いて値を読み取った。

【0161】

結果
上述のアッセイを使用して行った実験において、例示的な抗体は、ＣＤ７９ｂ陽性細胞の存在下でインビトロでＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を有効に刺激することができた（図１５Ａ、１５Ｂ、及び１５Ｃを参照のこと）が、例示的な抗体は、ＣＤ７９ｂ陰性ＮＵＧＣ４細胞の存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ７９ｂ非依存的かつ非特異的な増殖を示さなかった（図１５Ｄを参照のこと）。

【0162】

実施例１７．動物における本発明の抗ＣＤ７９ｂ／ＣＤ３抗体の有効性アッセイ
本研究では、ＮＯＧマウスのＰＢＭＣモデルにヒトＢ細胞非ホジキンリンパ腫細胞株ＷＳＵ－ＤＬＣｌ２及びＲａｍｏｓ細胞を接種し、例示的な抗体の抗腫瘍効果を測定した。

【0163】

ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２腫瘍担持ヒト化マウスモデルにおける例示的な抗体の抗腫瘍効果
実験手順
雌ＮＯＧマウス（１４～１７ｇ）をＢｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入し、該マウスはＳＰＦグレードであった。到着時にマウスを順応させ、７日間隔離した後、研究を開始した。マウスにＰＢＭＣ細胞を４×１０^６個の細胞／マウス、２００μＬ／マウスの体積で静脈内注射した。ＰＢＭＣ注射後３日目に、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を接種した。ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を従来通りに継代し、遠心分離により回収し、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞をＰＢＳに分散させた。ＮＯＧマウスの右側の背中及び腹部を剃毛し、該マウスにＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を６×１０^６個の細胞／マウス、２００μＬ／細胞の体積で接種した。

【0164】

投与：ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞の接種後８日目に、マウスをグループ分けし（１群あたり８匹のマウス）、マウスの腫瘍体積に従って薬物投与を行った。投与は３～４日毎に１回、計４回行った。マウスの腫瘍体積及び体重を週２回モニタリングした。接種後２２日目に、相対的腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ％）を次式：ＴＧＩ％＝１００％＊（ｈＩｇＧ対照群の腫瘍体積－治療群の腫瘍体積）／（ｈＩｇＧ対照群の腫瘍体積－ｈＩｇＧ対照群の初期腫瘍体積）によって計算し、対照群の初期腫瘍体積は約９０ｍｍ^３であった。腫瘍体積測定：腫瘍の最大長径（Ｌ）及び最大短径（Ｗ）をノギスで測定し、次式：Ｖ＝Ｌ×Ｗ^２／２によって腫瘍体積を算出した。電子天秤を使用してマウスの体重を測定した。研究全体を通じて、腫瘍がエンドポイントに達したとき、又はマウスの体重が２０％以上減少したときにマウスを安楽死させた。腫瘍サイズを得て、腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ％）を計算した。

【0165】

結果
腫瘍増殖曲線は図１６に示されており、例示的な抗体はＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞の増殖を有意に阻害することができた。２２日目に腫瘍サイズを取得し、腫瘍増殖阻害を計算した。例示的な抗体３８Ｄ９Ｂ３．１１／ｓｐ３４．８７、３８Ｄ９Ｂ３．１１／ｓｐ３４．２４、及び１１Ｇ１０．９．ｐ１／ｓｐ３４．２４は、ｈＩｇＧと比較して、それぞれ７８％、９３％、及び６７％の腫瘍増殖阻害を示した。ＣＤ７９ｂ．Ａ７ｖ１４ｂ／３８Ｅ４ｖ１のＴＧＩはわずか３６％であった。さらに、投与したマウス群では有意な体重減少は見られなかった。

【0166】

Ｒａｍｏｓ腫瘍担持ヒト化マウスモデルにおける例示的な抗体の抗腫瘍効果
実験手順
雌ＮＯＧマウス（１４～１７ｇ）をＢｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入し、該マウスはＳＰＦグレードであった。到着時にマウスを順応させ、７日間隔離した後、研究を開始した。ＰＢＭＣ細胞を０．１％ＤＮａｓｅを含む予熱したＲＰＭＩ－１６４０培地で解凍し、次いでＰＢＳに分散させて、細胞濃度２０×１０^６個の細胞／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。マウスにＰＢＭＣ細胞懸濁液を０．２ｍＬ／マウス、すなわち４×１０^６個の細胞／マウスの接種量で静脈内注射した。

【0167】

その後のインビボ実験のために、Ｒａｍｏｓ細胞を従来通りに継代した。ＰＢＭＣ細胞接種から７日後、Ｒａｍｏｓ細胞をＰＢＳ及びマトリゲル（１：１）に分散させ、７．５×１０^６個の細胞／ｍＬの細胞濃度の細胞懸濁液を調製した。ＮＯＧマウスの右背中を剃毛し、該マウスにＲａｍｏｓ細胞懸濁液を０．２ｍＬ／マウス、すなわち１．５×１０^６個の細胞／マウスの接種量で皮下注射した。

【0168】

腫瘍細胞接種から６日後、マウスをグループ分けし（１群あたり６匹）、マウスの腫瘍体積に従って薬物投与を行い、投与は３～４日毎に１回、連続して４回行った。投与様式は腹腔内注射であり、投与体積は１０ｍＬ／ｋｇ／回とした。マウスの腫瘍体積及び体重を週２回モニタリングし、モニタリングを２０日目に終了した。

【0169】

接種後２０日目に、相対的腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ％）を以下の式：ＴＧＩ％＝１００％×（ｈＩｇＧ対照群腫瘍体積－治療群腫瘍体積）／（ｈＩｇＧ対照群腫瘍体積－投与前のｈＩｇＧ対照群腫瘍体積）によって計算した。腫瘍体積測定：腫瘍の最大長径（Ｌ）及び最大短径（Ｗ）をノギスで測定し、腫瘍体積を次式：Ｖ＝Ｌ×Ｗ２／２によって算出した。電子天秤を使用してマウスの体重を測定した。

【0170】

結果
腫瘍増殖曲線は図１７に示されており、例示的な抗体はＲａｍｏｓ細胞の増殖を有意に阻害することができた。２０日目に腫瘍サイズを取得し、腫瘍増殖阻害を計算した。例示的な抗体３８Ｄ９Ｂ３．１１／ｓｐ３４．８７、３８Ｄ９Ｂ３．１１／ｓｐ３４．２４、及び１１Ｇ１０．９．ｐ１／ｓｐ３４．２４は、それぞれ７６％、９０％、及び１００％の腫瘍増殖阻害を示した。ＣＤ７９ｂ．Ａ７ｖ１４ｂ／３８Ｅ４ｖ１のＴＧＩは７７％であり、これは３８Ｄ９Ｂ３．１１／ｓｐ３４．８７のＴＧＩと同様であった。さらに、投与したマウス群では有意な体重減少は見られなかった。

【0171】

実施例１８．動物における本発明の抗ＣＤ７９ｂ／ＣＤ３抗体のＰＫアッセイ
本研究では、３８Ｄ９Ｂ３．１１／ｓｐ３４．８７、３８Ｄ９Ｂ３．１１／ｓｐ３４．２４、及び１１Ｇ１０．９．ｐ１／ｓｐ３４．２４を１０ｍｇ／ｋｇで雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスに尾静脈注射により投与し、雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける薬物動態学的特性を研究した。０．０８３時間、０．５時間、２時間、６時間、２４時間、４８時間、４日、７日、１４日、及び２１日の時点で眼球から血液を採取し、４℃、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、血清を採取した。血清中の抗体の含有量をＥＬＩＳＡによって測定することにより、マウスにおける３８Ｄ９Ｂ３．１１／ｓｐ３４．８７、３８Ｄ９Ｂ３．１１／ｓｐ３４．２４、及び１１Ｇ１０．９．ｐ１／ｓｐ３４．２４の半減期を計算した。結果を図１８に示す。マウスにおける３８Ｄ９Ｂ３．１１／ｓｐ３４．８７、３８Ｄ９Ｂ３．１１／ｓｐ３４．２４、及び１１Ｇ１０．９．ｐ１／ｓｐ３４．２４の半減期は、それぞれ１０．４日、７．３日、及び７．０日であり、３つともすべて、通常のモノクローナル抗体と同様のＰＫを有していた。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

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【国際調査報告】