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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-04
(54)【発明の名称】核酸結合タンパク質を含む脂質ナノ粒子
(51)【国際特許分類】
A61K 48/00 20060101AFI20240927BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20240927BHJP
A61K 47/12 20060101ALI20240927BHJP
A61K 47/14 20170101ALI20240927BHJP
A61K 47/28 20060101ALI20240927BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20240927BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20240927BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20240927BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20240927BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20240927BHJP
A61P 31/16 20060101ALI20240927BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20240927BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20240927BHJP
A61K 39/12 20060101ALI20240927BHJP
A61K 39/145 20060101ALI20240927BHJP
A61K 39/215 20060101ALI20240927BHJP
A61K 39/235 20060101ALI20240927BHJP
A61K 39/155 20060101ALI20240927BHJP
C12N 15/88 20060101ALI20240927BHJP
C07K 14/11 20060101ALI20240927BHJP
C07K 14/135 20060101ALI20240927BHJP
C07K 14/165 20060101ALI20240927BHJP
C07K 14/075 20060101ALI20240927BHJP
C07K 14/095 20060101ALI20240927BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20240927BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20240927BHJP
【ＦＩ】
A61K48/00
A61K31/7105
A61K47/12
A61K47/14
A61K47/28
A61K47/24
A61K9/14
A61K9/51
A61K47/64
A61P31/12
A61P31/16
A61P31/14
A61K31/713
A61K39/12
A61K39/145
A61K39/215
A61K39/235
A61K39/155
C12N15/88 Z ZNA
C07K14/11
C07K14/135
C07K14/165
C07K14/075
C07K14/095
C07K14/47
C12N15/113 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024520688
(86)(22)【出願日】2022-10-06
(85)【翻訳文提出日】2024-06-03
(86)【国際出願番号】 IB2022059527
(87)【国際公開番号】W WO2023057935
(87)【国際公開日】2023-04-13
(31)【優先権主張番号】2021903192
(32)【優先日】2021-10-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523207227
【氏名又は名称】セキラス インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100219265
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 崇大
(74)【代理人】
【識別番号】100203208
【弁理士】
【氏名又は名称】小笠原 洋平
(74)【代理人】
【識別番号】100216839
【弁理士】
【氏名又は名称】大石 敏幸
(74)【代理人】
【識別番号】100228980
【弁理士】
【氏名又は名称】副島 由加里
(74)【代理人】
【識別番号】100151448
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 孝博
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】ロックマン，スティーブン
(72)【発明者】
【氏名】オン，チ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA65
4C076AA95
4C076CC41
4C076DD41
4C076DD63
4C076DD70
4C076EE59
4C084AA13
4C084NA05
4C084NA06
4C084NA13
4C085BA51
4C085BA55
4C085BA57
4C085BA71
4C085BA77
4C085CC08
4C085DD59
4C085EE01
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA02
4C086MA05
4C086MA41
4C086NA05
4C086NA06
4C086NA13
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045CA01
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA86
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、ＲＮＡを送達するための脂質ナノ粒子及びその使用に関し、脂質ナノ粒子は、ＲＮＡに結合した核酸結合タンパク質またはペプチド（例えば、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチド）をその中に含む。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＲＮＡを送達するための脂質ナノ粒子であって、前記ＲＮＡに結合した核酸結合タンパク質またはペプチドをその中に含む、前記脂質ナノ粒子。
【請求項2】
前記核酸結合タンパク質またはペプチドが、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドである、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項3】
ＲＮＡを送達するための脂質ナノ粒子であって、前記ＲＮＡに結合したＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドをその中に含む、前記脂質ナノ粒子。
【請求項4】
前記ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、脂質化されたＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドである、請求項３に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項5】
ＲＮＡを送達するための脂質ナノ粒子であって、前記ＲＮＡに結合した脂質化された核酸結合タンパク質またはペプチドをその中に含む、前記脂質ナノ粒子。
【請求項6】
ＲＮＡを送達するための脂質ナノ粒子であって、前記ＲＮＡに結合した脂質化されたＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドをその中に含む、前記脂質ナノ粒子。
【請求項7】
前記ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、前記ＲＮＡに結合する前に脂質化される、請求項４に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項8】
前記ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、脂肪酸、イソプレノイド及びそれらの組み合わせからなる群から選択される脂質部分で脂質化される、請求項４に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項9】
前記脂肪酸が、トリグリセリド、リン脂質、またはコレステリルエステルである、請求項８に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項10】
前記ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、Ｎ末端及び／またはＣ末端の求核性側鎖上で脂質化される、請求項４に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項11】
前記求核性側鎖が、システイン、セリン、トレオニン、チロシン及び／またはリジンアミノ酸残基である、請求項１０に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項12】
前記ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、パルミトイル化、ミリストイル化、脂肪酸アシル化、エステル化、プレニル化、またはそれらの組み合わせによって脂質化される、請求項４に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項13】
前記ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、Ｎ末端システインパルミトイル化、Ｎ末端グリシンミリストイル化、リジンＮ－アシル化、Ｃ末端コレステロールエステル化、システインプレニル化、セリンＯ－アシル化、またはそれらの組み合わせによって脂質化される、請求項１２に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項14】
前記プレニル化がファルネシル化またはゲラニルゲラニル化である、請求項９に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項15】
前記脂質部分が、チオエーテル結合、エステル結合、チオエステル結合及び／またはアミド結合によって前記ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドに連結される、請求項８に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項16】
前記ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、化学的脂質化または酵素的脂質化を使用して脂質化される、請求項４に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項17】
前記ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、化学的ライゲーション、クリックケミストリー、発現タンパク質ライゲーション及びそれらの組み合わせからなる群から選択される化学的脂質化を使用して脂質化される、請求項１６に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項18】
前記ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、ソルターゼＡ媒介脂質化、トランスグルタミナーゼ媒介脂質化、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される酵素的脂質化を使用して脂質化される、請求項１６に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項19】
前記酵素的脂質化がｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる、請求項１８に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項20】
前記ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが前記ＲＮＡを封入する、請求項３に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項21】
前記ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、前記ＲＮＡに直接結合する、請求項３に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項22】
前記ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、ａ）前記脂質ナノ粒子の毒性を低減し、及び／または
ｂ）前記ＲＮＡを安定化し、及び／または
ｃ）前記ＲＮＡを分解から保護し、及び／または
ｄ）前記脂質ナノ粒子の核形成を促進し、及び／または
ｅ）１つ以上のＴｏｌｌ様受容体によるシグナル伝達の誘導を阻害する、請求項３に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項23】
前記ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、核局在化シグナル（複数可）を除去し、及び／または核外搬出シグナル（複数可）を導入するように修飾される、請求項３に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項24】
前記ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、ウイルスまたは非ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドである、請求項３に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項25】
前記ウイルスＲＮＡ結合タンパク質が、クラスＩＩＩ、クラスＩＶ、クラスＶ、及び／またはクラスＶＩウイルス由来である、請求項２４に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項26】
前記ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、メタニューモウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、アデノウイルス及びボカウイルスからなる群から選択される呼吸器ウイルスである、請求項２５に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項27】
前記ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、核タンパク質、非構造タンパク質、基質タンパク質、及び／またはヌクレオカプシドタンパク質である、請求項２６に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項28】
前記ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、Ｂ型インフルエンザウイルス由来の非構造（ＮＳ）タンパク質である、請求項２４に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項29】
前記ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、配列番号９～１１のいずれか１つに記載の配列を含む、請求項２４に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項30】
前記非ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、細胞増殖、細胞シグナル伝達及び／または抗ウイルス経路に関連する細胞タンパク質に由来する、請求項２４に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項31】
前記細胞タンパク質が、ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質（ＴＲＢＰ）、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）ＲＮＡ結合タンパク質、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ－３）結合タンパク質、ＴＬＲ－７結合タンパク質、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３０に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項32】
前記細胞タンパク質が、配列番号１～８のいずれか１つに記載の配列を含む、請求項３０に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項33】
前記脂質ナノ粒子が、ＰＥＧ脂質、構造脂質、イオン化可能な脂質及び／または中性脂質をさらに含む、請求項３に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項34】
カチオン性脂質を含まない、請求項３に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項35】
前記ＲＮＡが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及びアンチセンスＲＮＡからなる群から選択される、請求項３に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項36】
前記ｍＲＮＡが自己複製ｍＲＮＡ（ｓａ－ｍＲＮＡ）または従来のＲＮＡ（ｃＲＮＡ）である、請求項３５に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項37】
請求項３に記載の脂質ナノ粒子を含む免疫原性組成物。
【請求項38】
請求項３に記載の脂質ナノ粒子または請求項３７に記載の免疫原性組成物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項39】
治療に使用するための、請求項３に記載の脂質ナノ粒子、請求項３７に記載の免疫原性組成物、または請求項３８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願データ
本出願は、２０２１年１０月６日に出願された「Ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ａ ＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ」と題するオーストラリア特許出願第２０２１９０３１９２号の優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年１０月６日に出願された「Ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ａ ＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ」と題するオーストラリア特許出願第２０２１９０３１９２号の優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表
本出願は、電子形式の配列表とともに出願される。配列表の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、電子形式の配列表とともに出願される。配列表の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0003】
本開示は、ＲＮＡを送達するための脂質ナノ粒子及びその使用に関し、脂質ナノ粒子は、ＲＮＡに結合した核酸結合タンパク質またはペプチド（例えば、ＲＮＡ結合タンパク質）をその中に含む。
【背景技術】
【0004】
核酸ワクチンは、現在進行中の２０１９年重症感染症コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の世界的なパンデミックの原因となっている重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対する核酸ワクチンを含めて、様々な疾患の治療及び予防に対する有望なアプローチとして最近浮上している。
【0005】
ｍＲＮＡワクチンは、宿主細胞の細胞質へのｍＲＮＡの送達に依存しており、そこでｍＲＮＡは抗原タンパク質に転写されて中和抗体の産生を誘発する。しかし、ｍＲＮＡはサイズが大きく、負に帯電しているため、細胞取り込みが妨げられる。したがって、リポソームまたは脂質ナノ粒子などの脂質送達ビヒクルを使用してｍＲＮＡを封入し、血漿中でのＲＮＡの分解を阻害すると同時に、細胞取り込みを促進してｍＲＮＡをｉｎ ｖｉｖｏで効率的に送達する。
【0006】
脂質送達ビヒクルは、通常、カチオン性脂質と、イオン化可能な脂質、中性脂質、コレステロール、及びＰＥＧ化脂質などの他のイオン化可能な脂質成分とから形成される。カチオン性脂質は、１つ以上の炭化水素基を含む親油性領域と、少なくとも１つの正に荷電した極性頭部基を含む親水性領域とを有する両親媒性分子である。カチオン性脂質と核酸は正に荷電した複合体を形成し、核酸が細胞の細胞膜を通過して細胞質に入りやすくなる。
【0007】
しかし、カチオン性脂質のいくつかの有害な細胞毒性効果が知られており、これには、活性酸素種の生成や、人間の不十分な分解による血漿中への蓄積が含まれる。したがって、核酸を分解及び除去から保護し、効果的な細胞内送達及び／またはｍＲＮＡの発現／翻訳を提供することができる新規脂質または特定の脂質組成物を同定することに多くの努力が注がれてきた。さらに、有効量の核酸による治療が患者にとって許容できない毒性及び／またはリスクを伴うことがないよう、これらの脂質－核酸粒子は忍容性が高く、適切な治療指数を提供する必要がある。
【0008】
したがって、ＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドを送達するための改善された脂質ナノ粒子が引き続き必要とされることは、当業者には明らかであろう。
【発明の概要】
【0009】
本開示は、ＲＮＡ結合タンパク質もしくはペプチド、または脂質化されたＲＮＡ結合タンパク質もしくはペプチドを脂質ナノ粒子に組み込むと、関連するＲＮＡの安定性が増加し、及び／または脂質ナノ粒子の核形成が促進され、及び／または脂質ナノ粒子の毒性及び／または有害な副作用が軽減されるという本発明者らの発見に基づいている。本発明者らはまた、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドを脂質ナノ粒子に組み込むことにより、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）刺激／誘導を防ぐことができることを確認した。本発明者らはさらに、核酸結合タンパク質またはペプチド（すなわち、ＲＮＡ結合タンパク質及びＤＮＡ結合タンパク質）を脂質ナノ粒子に組み込むことが保護的であることを確認した。
【0010】
概して、本発明者らによる発見は、核酸結合タンパク質またはペプチドを含む脂質ナノ粒子の基礎を提供する。本発明者らによる発見はまた、脂質化された核酸結合タンパク質またはペプチドを含む脂質ナノ粒子の基礎を提供する。
【0011】
一例では、核酸結合タンパク質またはペプチドは、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドである。一例では、核酸結合タンパク質またはペプチドは、ＲＮＡ結合タンパク質またはＤＮＡ結合タンパク質である。
【0012】
本発明者らの発見は、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドを含む脂質ナノ粒子の基礎を提供する。本発明者らによる発見はさらに、脂質化された核酸結合タンパク質またはペプチドを含む脂質ナノ粒子の基礎を提供する。本発明者らによる発見はまた、脂質化されたＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドを含む脂質ナノ粒子の基礎を提供する。
【0013】
さらに、本発明者らによる発見は、脂質ナノ粒子をワクチンまたは治療薬として使用する方法の基礎を提供する。
【0014】
したがって、本開示は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を送達するための脂質ナノ粒子を提供し、この脂質ナノ粒子は、ＲＮＡに結合した核酸結合タンパク質またはペプチドをその中に含む。
【0015】
したがって、本開示は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を送達するための脂質ナノ粒子を提供し、この脂質ナノ粒子は、ＲＮＡに結合したＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドをその中に含む。
【0016】
一例では、核酸結合タンパク質またはペプチドは、脂質化された核酸結合タンパク質またはペプチドである。一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、脂質化されたＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドである。
【0017】
したがって、本開示は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を送達するための脂質ナノ粒子を提供し、この脂質ナノ粒子は、ＲＮＡに結合した脂質化された核酸結合タンパク質またはペプチドをその中に含む。
【0018】
したがって、本開示は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を送達するための脂質ナノ粒子を提供し、この脂質ナノ粒子は、ＲＮＡに結合した脂質化されたＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドをその中に含む。
【0019】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、ＲＮＡに結合する前に脂質化される。別の例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、ＲＮＡに結合した後に脂質化される。
【0020】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、脂肪酸、イソプレノイド及びそれらの組み合わせからなる群から選択される脂質部分で脂質化される。
【0021】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、脂肪酸で脂質化される。例えば、脂肪酸は、トリグリセリド、リン脂質、またはコレステリルエステルである。一例では、脂肪酸はトリグリセリドである。別の例では、脂肪酸はリン脂質である。さらなる例では、脂肪酸はコレステリルエステルである。
【0022】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、イソプレノイドで脂質化される。例えば、イソプレノイドはイソプレンである。
【0023】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、Ｎ末端及び／またはＣ末端の求核性側鎖上で脂質化される。
【0024】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、求核性側鎖上で脂質化される。例えば、システイン、セリン、トレオニン、チロシン及び／またはリジンアミノ酸残基上で脂質化される。一例では、求核性側鎖はシステイン残基である。別の例では、求核性側鎖はセリン残基である。さらなる例では、求核性側鎖はトレオニン残基である。一例では、求核性側鎖はチロシン残基である。別の例では、求核性側鎖はリジン残基である。
【0025】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、タンパク質またはペプチドのＮ末端で脂質化される。
【0026】
ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドのＮ末端が核局在化シグナル（複数可）（もしくは配列）及び／または核外搬出シグナルを含むことは当業者には明らかであろう。一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、核局在化シグナル（複数可）を除去し、及び／または核外搬出シグナル（複数可）を導入するように修飾される。
【0027】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、核局在化シグナルを除去するように修飾される。別の例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、核局在化シグナル（複数可）を不活性化または除去するように修飾される。例えば、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、核局在化シグナル（複数可）（または配列）を含まない。当業者であれば、核局在化シグナルは、タンパク質表面上に露出した正に荷電したリジンまたはアルギニンの１つ以上の配列であり、核輸送によって細胞核に移入するためのタンパク質をタグ付けすることを理解するであろう。核局在化シグナルを修飾する方法は当業者には明らかであり、及び／または本明細書に記載されている。例えば、核局在化シグナルは脂質化されるか、除去されるか、または不活性化される。一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドのＮ末端の核局在化シグナルが脂質化される。別の例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドのＮ末端の核局在化シグナルが除去される。別の例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドのＮ末端の核局在化シグナルが不活性化される。
【0028】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、核外搬出シグナルを導入するように修飾される。当業者であれば、核外搬出シグナルは、核膜孔複合体を通って細胞核から細胞質に搬出するためのタンパク質を標的とする短いロイシンリッチモチーフであることを理解するであろう。核外搬出シグナルを導入する方法は当業者には明らかであり、及び／または本明細書に記載されている。
【0029】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、タンパク質またはペプチドのＣ末端で脂質化される。
【0030】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、パルミトイル化、ミリストイル化、脂肪酸アシル化、エステル化、プレニル化、またはそれらの組み合わせによって脂質化される。
【0031】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、パルミトイル化によって脂質化される。例えば、Ｎ末端システインパルミトイル化によって脂質化される。
【0032】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、ミリストイル化によって脂質化される。例えば、Ｎ末端グリシンミリストイル化によって脂質化される。
【0033】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、脂肪酸アシル化によって脂質化される。例えば、リジンＮ－アシル化によって脂質化される。別の例では、セリンＯ－アシル化によって脂質化される。
【0034】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、エステル化によって脂質化される。例えば、Ｃ末端コレステロールエステル化によって脂質化される。
【0035】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、プレニル化によって脂質化される。例えば、プレニル化は、ファルネシル化またはゲラニルゲラニル化である。一例では、プレニル化はシステインプレニル化である。
【0036】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、Ｎ末端システインパルミトイル化、Ｎ末端グリシンミリストイル化、リジンＮ－アシル化、Ｃ末端コレステロールエステル化、システインプレニル化、セリンＯ－アシル化、またはそれらの組み合わせによって脂質化される。
【0037】
一例では、脂質部分は、チオエーテル結合、エステル結合、チオエステル結合及び／またはアミド結合によってＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドに連結される。
【0038】
一例では、脂質部分は、チオエーテル結合によってＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドに連結される。
【0039】
一例では、脂質部分は、エステル結合によってＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドに連結される。
【0040】
一例では、脂質部分は、チオエステル結合によってＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドに連結される。
【0041】
一例では、脂質部分は、アミド結合によってＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドに連結される。
【0042】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、化学的脂質化または酵素的脂質化を使用して脂質化される。例えば、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、化学的脂質化を使用して脂質化される。一例では、化学的脂質化は、化学的ライゲーション、クリックケミストリー、発現タンパク質ライゲーション、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。別の例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、酵素的脂質化を使用して脂質化される。例えば、酵素的脂質化は、ソルターゼＡ媒介脂質化、トランスグルタミナーゼ媒介脂質化、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。一例では、酵素的脂質化はｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。例えば、酵素的脂質化はｉｎ ｖｉｖｏで行われる。別の例では、酵素的脂質化はｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。
【0043】
一例では、核酸結合タンパク質またはペプチドは、ＲＮＡに直接結合する。別の例では、核酸結合タンパク質またはペプチドは、ＲＮＡを脂質ナノ粒子に配合する前にＲＮＡに結合する。さらなる例では、核酸結合タンパク質またはペプチドは、ＲＮＡを脂質ナノ粒子に配合した後に脂質ナノ粒子内のＲＮＡに結合し、ここで、核酸結合タンパク質またはペプチドは脂質ナノ粒子内にある。例えば、核酸結合タンパク質またはペプチドは、脂質ナノ粒子に封入されたＲＮＡに結合する。
【0044】
一例では、核酸結合タンパク質またはペプチドは、脂質ナノ粒子の表面上のＲＮＡにさらに結合する。このような状況では、核酸結合タンパク質またはペプチドは、脂質ナノ粒子内及び脂質ナノ粒子の表面上に存在することになる。脂質ナノ粒子の表面上の核酸結合タンパク質またはペプチドは、脂質ナノ粒子内のＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドと同じである必要はない。
【0045】
例えば、脂質ナノ粒子は、その中のＲＮＡに結合した核酸結合タンパク質またはペプチドで形成することができ、次いで、形成された脂質ナノ粒子を核酸結合タンパク質またはペプチドでコーティングして、任意の封入されていない及び／または部分的に封入されたＲＮＡに結合させることができる。
【0046】
一例では、核酸結合タンパク質またはペプチドは、ＲＮＡを封入する。別の例では、核酸結合タンパク質またはペプチドは、ＲＮＡのＮ末端及び／またはＣ末端の求核性側鎖に結合する。一例では、核酸結合タンパク質またはペプチドは、ＲＮＡの求核性側鎖に結合する。別の例では、核酸結合タンパク質またはペプチドは、ＲＮＡのＮ末端及び／またはＣ末端で結合する。例えば、ＲＮＡのＮ末端で結合する。別の例では、ＲＮＡのＣ末端で結合する。例えば、核酸結合タンパク質またはペプチドはＲＮＡを封入しない。
【0047】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドはＲＮＡに直接結合する。別の例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、ＲＮＡを脂質ナノ粒子に配合する前にＲＮＡに結合する。さらなる例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、ＲＮＡを脂質ナノ粒子に配合した後に脂質ナノ粒子内のＲＮＡに結合し、ここで、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは脂質ナノ粒子内にある。例えば、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、脂質ナノ粒子に封入されたＲＮＡに結合する。
【0048】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、脂質ナノ粒子の表面上のＲＮＡにさらに結合する。このような状況では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、脂質ナノ粒子内及び脂質ナノ粒子の表面上に存在することになる。脂質ナノ粒子の表面上のＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、脂質ナノ粒子内のＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドと同じである必要はない。
【0049】
例えば、脂質ナノ粒子は、その中のＲＮＡに結合したＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドで形成することができ、次いで、形成された脂質ナノ粒子をＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドでコーティングして、任意の封入されていない及び／または部分的に封入されたＲＮＡに結合させることができる。
【0050】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、ＲＮＡを封入する。別の例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、ＲＮＡのＮ末端及び／またはＣ末端の求核性側鎖に結合する。一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、ＲＮＡの求核性側鎖に結合する。別の例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、ＲＮＡのＮ末端及び／またはＣ末端で結合する。例えば、ＲＮＡのＮ末端で結合する。別の例では、ＲＮＡのＣ末端で結合する。例えば、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドはＲＮＡを封入しない。
【0051】
一例では、核酸結合タンパク質またはペプチドは、
ａ）脂質ナノ粒子の毒性を軽減し、
ｂ）ＲＮＡを安定化させ、
ｃ）ＲＮＡを分解から保護し、
ｄ）脂質ナノ粒子の核形成を促進し、及び／または
ｅ）１つ以上のＴｏｌｌ様受容体によるシグナル伝達の誘導を阻害する。
ａ）脂質ナノ粒子の毒性を軽減し、
ｂ）ＲＮＡを安定化させ、
ｃ）ＲＮＡを分解から保護し、
ｄ）脂質ナノ粒子の核形成を促進し、及び／または
ｅ）１つ以上のＴｏｌｌ様受容体によるシグナル伝達の誘導を阻害する。
【0052】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、
ａ）脂質ナノ粒子の毒性を軽減し、
ｂ）ＲＮＡを安定化させ、
ｃ）ＲＮＡを分解から保護し、
ｄ）脂質ナノ粒子の核形成を促進し、及び／または
ｅ）１つ以上のＴｏｌｌ様受容体によるシグナル伝達の誘導を阻害する。
ａ）脂質ナノ粒子の毒性を軽減し、
ｂ）ＲＮＡを安定化させ、
ｃ）ＲＮＡを分解から保護し、
ｄ）脂質ナノ粒子の核形成を促進し、及び／または
ｅ）１つ以上のＴｏｌｌ様受容体によるシグナル伝達の誘導を阻害する。
【0053】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、脂質ナノ粒子の毒性を軽減する。
【0054】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、ＲＮＡを安定化する。
【0055】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、ＲＮＡを分解から保護する。
【0056】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、脂質ナノ粒子の核形成を促進する。
【0057】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、１つ以上のＴｏｌｌ様受容体によるシグナル伝達の誘導を阻害する。一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、１つ以上のＴｏｌｌ様受容体によるシグナル伝達の誘導を阻害しない。
【0058】
当業者であれば、ＲＮＡなどの核酸を認識して結合する一連のＴｏｌｌ様受容体、すなわちＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８及びＴＬＲ９を含むエンドソームＴｏｌｌ様受容体が存在することを理解するであろう。これらの受容体の活性化により、炎症性サイトカイン及びＩ型インターフェロン（インターフェロンＩ型）が産生される。
【0059】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、１つ以上のエンドソームＴｏｌｌ様受容体によるシグナル伝達の誘導を阻害する。例えば、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８及びＴＬＲ９からなる群から選択される１つ以数のＴｏｌｌ様受容体によるシグナル伝達の誘導を阻害する。一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、ＴＬＲ３によるシグナル伝達の誘導を阻害する。別の例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、ＴＬＲ７／９によるシグナル伝達の誘導を阻害する。さらなる例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、ＴＬＲ８によるシグナル伝達の誘導を阻害する。
【0060】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、リンカーによって連結された２つのＲＮＡ結合タンパク質またはペプチド（すなわち、第１及び第２のＲＮＡ結合タンパク質またはペプチド）である。例えば、第１及び第２のＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、アミド結合によって共有結合している。本開示は、他の形態の共有結合及び非共有結合を包含する。例えば、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、化学リンカーによって連結することができる。
【0061】
一例では、リンカーは柔軟なリンカー、例えば柔軟なペプチドリンカーである。例えば、第１のＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、柔軟なリンカーを介して第２のＲＮＡ結合タンパク質に連結される。
【0062】
一例では、リンカーはペプチドリンカーである。例えば、第１のＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、リンカーを介して第２のＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドに連結されており、ここで、リンカーは長さが２～３１個のアミノ酸のペプチドリンカーである。一例では、リンカーは配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含み、ここでｎは１～６である。例えば、リンカーは、配列ＳＧＧＧＧＳ（ＧＳ６）または配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＧＳ３１）を含む。別の例では、リンカーは、配列（Ａｌａ）ｎを含み、ここでｎは２～３１である。
【0063】
一例では、リンカーは剛性リンカーである。例えば、剛性リンカーは配列（ＥＡＡＡＫ）ｎを含み、ここで、ｎは１～３である。一例では、剛性リンカーは（ＥＡＡＡＫ）ｎを含み、ここで、ｎは１～１０または約１～１００である。例えば、ｎは少なくとも１、または少なくとも２、または少なくとも３、または少なくとも４、または少なくとも５、または少なくとも６、または少なくとも７、または少なくとも８、または少なくとも９、または少なくとも１０である。一例では、ｎは１００未満である。例えば、ｎは、９０未満、または約８０未満、または約６０未満、または約５０未満、または約４０未満、または約３０未満、または約２０未満、または約１０未満である。
【0064】
一例では、核酸結合タンパク質またはペプチドは、ウイルスまたは非ウイルス核酸結合タンパク質またはペプチドである。例えば、核酸結合タンパク質はウイルス核酸結合タンパク質である。別の例では、核酸結合タンパク質は非ウイルス核酸結合タンパク質である。
【0065】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、ウイルスまたは非ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドである。
【0066】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドはウイルスＲＮＡ結合タンパク質である。例えば、ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、クラスＩＩＩ、クラスＩＶ、クラスＶ、及び／またはクラスＩＶウイルス由来である。一例では、ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドはクラスＩＩＩウイルス由来である。別の例では、ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドはクラスＩＶウイルス由来である。さらなる例では、ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドはクラスＶウイルス由来である。一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドはクラスＶＩウイルス由来である。
【0067】
一例では、ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、メタニューモウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、アデノウイルス及びボカウイルスからなる群から選択される呼吸器ウイルス由来である。
【0068】
一例では、ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドはインフルエンザウイルス由来である。例えば、インフルエンザウイルスはＡ型インフルエンザである。別の例では、インフルエンザウイルスはＢ型インフルエンザである。
【0069】
一例では、ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、呼吸器合胞体ウイルス由来である。
【0070】
一例では、ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、パラインフルエンザウイルス由来である。
【0071】
一例では、ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、メタニューモウイルス由来である。
【0072】
一例では、ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、ライノウイルス由来である。
【0073】
一例では、ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、コロナウイルス由来である。例えば、コロナウイルスは重症急性呼吸器疾患２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ２）である。
【0074】
一例では、ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、アデノウイルス由来である。
【0075】
一例では、ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、ボカウイルス由来である。
【0076】
一例では、ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、核タンパク質、非構造タンパク質、基質タンパク質、及び／またはヌクレオカプシドタンパク質である。例えば、ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは核タンパク質である。別の例では、ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは基質タンパク質である。さらなる例では、ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは核タンパク質である。別の例では、ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは非構造タンパク質である。
【0077】
一例では、ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、配列番号９～１１のいずれか１つに記載の配列を含む。
【0078】
一例では、ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、Ｂ型インフルエンザウイルス由来の非構造（ＮＳ）タンパク質である。例えば、ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、Ｂ型インフルエンザＮＳ１ ＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）である。一例では、ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、Ｂ型インフルエンザＮＳ１ ＲＢＤＡである。別の例では、ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、Ｂ型インフルエンザＮＳ１ ＲＢＤＢである。さらに別の例では、ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、Ｂ型インフルエンザＮＳ１ ＲＢＤＣである。一例では、Ｂ型インフルエンザＮＳ１ ＲＮＡ結合ドメインは全長結合ドメインである。別の例では、Ｂ型インフルエンザＮＳ１ ＲＮＡ結合ドメインは切断型結合ドメインである。さらなる例では、Ｂ型インフルエンザＮＳ１ ＲＮＡ結合ドメインは修飾された結合ドメインである。一例では、Ｂ型インフルエンザＮＳ１ ＲＮＡ結合ドメインは配列番号９に記載されている。別の例では、Ｂ型インフルエンザＮＳ１ ＲＮＡ結合ドメインは配列番号１０に記載されている。さらなる例では、Ｂ型インフルエンザＮＳ１ ＲＮＡ結合ドメインは配列番号１１に記載されている。一例では、Ｂ型インフルエンザＮＳ１ ＲＮＡ結合ドメインは、配列番号１１に記載の第１のＢ型インフルエンザＮＳ１ ＲＮＡ結合ドメイン及び配列番号１０に記載の第２のＢ型インフルエンザＮＳ１ ＲＮＡ結合ドメインを含む修飾された結合ドメインであり、ここで、第１及び第２のＲＮＡ結合ドメインは、適切なリンカーによって連結される。例えば、第１のＢ型インフルエンザＮＳ１ ＲＮＡ結合ドメインの３’末端は、第２のＢ型インフルエンザＮＳ１ ＲＮＡ結合ドメインの５’末端に連結される。
【0079】
一例では、ウイルス核酸結合タンパク質は、ヘパドナウイルス由来である。例えば、ヘパドナウイルスはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）である。
【0080】
一例では、ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは核タンパク質であり、ここで、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドはＲＮＡを封入し、ＲＮＡを安定化し、１つ以上のエンドソームＴｏｌｌ様受容体（例えば、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８及び／またはＴＬＲ９）によるシグナル伝達の誘導を阻害する。
【0081】
一例では、ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドはヌクレオカプシドであり、ここで、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドはＲＮＡを封入し、ＲＮＡを安定化し、１つ以上のエンドソームＴｏｌｌ様受容体（例えば、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８及び／またはＴＬＲ９）によるシグナル伝達の誘導を阻害する。
【0082】
一例では、ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは基質タンパク質であり、ここで、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドはＲＮＡに結合し、ＲＮＡを安定化するが、１つ以上のエンドソームＴｏｌｌ様受容体（例えば、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８及び／またはＴＬＲ９）によるシグナル伝達の誘導を阻害しない。
【0083】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、非ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドである。例えば、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、細胞タンパク質に由来する非ウイルスタンパク質またはペプチドである。一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、細胞増殖、細胞シグナル伝達及び／または抗ウイルス経路に関連する細胞タンパク質に由来する。
【0084】
一例では、細胞タンパク質は、ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質（ＴＲＢＰ）、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）ＲＮＡ結合タンパク質、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ－３）結合タンパク質、ＴＬＲ－７結合タンパク質、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0085】
一例では、細胞タンパク質は、配列番号１～８のいずれか１つに記載の配列を含む。
【0086】
一例では、細胞タンパク質はＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質（ＴＲＢＰ）である。例えば、細胞タンパク質はＴＲＢＰ ＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）２である。一例では、細胞タンパク質はＴＲＢＰ ＲＢＤＡである。別の例では、細胞タンパク質はＴＲＢＰ ＲＢＤＢである。一例では、ＴＲＢＰ ＲＮＡ結合ドメイン２は全長である。例えば、全長ＴＲＢＰ ＲＮＡ結合ドメイン２は、配列番号１に記載されている。別の例では、ＴＲＢＰ ＲＮＡ結合ドメイン２は、切断型結合ドメインである。例えば、切断型ＴＲＢＰ ＲＮＡ結合ドメイン２は、配列番号２に記載されている。
【0087】
一例では、細胞タンパク質は、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）ＲＮＡ結合タンパク質である。例えば、細胞タンパク質は、ＰＫＲ ＲＮＡ結合モチーフ２である。一例では、細胞タンパク質は、ＰＫＲ ＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）である。別の例では、細胞タンパク質はＰＫＲ ＲＢＤＡである。さらなる例では、細胞タンパク質はＰＫＲ ＲＢＤＢである。一例では、ＰＫＲ ＲＮＡ結合モチーフ２は全長結合モチーフである。例えば、全長ＰＫＲ ＲＮＡ結合モチーフ２は、配列番号３に記載されている。別の例では、ＰＫＲ ＲＮＡ結合モチーフ２は、切断型結合モチーフである。例えば、切断型ＰＫＲ ＲＮＡ結合モチーフ２は配列番号４に記載されている。別の例では、切断型ＰＫＲ ＲＮＡ結合モチーフ２は配列番号５に記載されている。
【0088】
一例では、細胞タンパク質はＴＬＲ－３ ｄｓＲＮＡ結合ドメイン１である。例えば、細胞タンパク質はＴＬＲ－３ ｄｓＲＮＡ結合ドメイン１（ロイシンリッチリピート１～３）である。別の例では、細胞タンパク質はＴＬＲ－３ ｄｓＲＮＡ結合ドメイン１（ロイシンリッチリピート１７～１８）である。一例では、ＴＬＲ－３ ｄｓＲＮＡ結合ドメイン１は配列番号６に記載される。さらなる例では、ＴＬＲ－３ ｄｓＲＮＡ結合ドメイン１は配列番号７に記載されている。別の例では、ＴＬＲ－３は、ＴＬＲ－３ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）Ａである。さらに別の例では、ＴＬＲ－３は、ＴＬＲ－３ ＬＲＲＢである。
【0089】
一例では、細胞タンパク質はＴＬＲ－７ ＲＮＡ結合部位である。例えば、細胞タンパク質はＴＬＲ－７ ＲＮＡ結合部位（ロイシンリッチリピート１４～１５）である。一例では、ＴＬＲ－７ ＲＮＡ結合部位は配列番号８に記載されている。別の例では、ＴＬＲ－７はＴＬＲ－７ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）Ａである。
【0090】
一例では、脂質ナノ粒子は、ＰＥＧ脂質、構造脂質及び／または中性脂質をさらに含む。例えば、脂質ナノ粒子は、ＰＥＧ脂質、構造脂質及び中性脂質をさらに含む。別の例では、脂質ナノ粒子は、ＰＥＧ脂質、構造脂質、または中性脂質をさらに含む。一例では、脂質ナノ粒子は、ＰＥＧ脂質、構造脂質、イオン化可能な脂質及び／または中性脂質をさらに含む。例えば、脂質ナノ粒子は、ＰＥＧ脂質、構造脂質、イオン化可能な脂質、及び中性脂質をさらに含む。別の例では、脂質ナノ粒子は、ＰＥＧ脂質、構造脂質、イオン化可能な脂質、または中性脂質をさらに含む。
【0091】
一例では、脂質ナノ粒子は、ＰＥＧ脂質をさらに含む。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0092】
一例では、脂質ナノ粒子は、構造脂質をさらに含む。例えば、構造脂質は、コレステロール、カンペステロール、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0093】
一例では、脂質ナノ粒子は中性脂質をさらに含む。例えば、中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＰＰＣ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0094】
一例では、脂質ナノ粒子は、イオン化可能な脂質をさらに含む。
【0095】
一例では、イオン化可能な脂質は、３－（ジドデシルアミノ）－Ｎ１，Ｎ１，４－トリドデシル－１－ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、Ｎ１－［２－（ジドデシルアミノ）エチル］－Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４－トリドデシル－１，４－ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、１４，２５－ジトリデシル－１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）－２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、（２Ｓ）－２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、２，５－ビス（（９ｚ，１２ｚ）－オクタデカ－９，１２，ジエン－１－イルオキシル）ベンジル－４－（ジメチルアミノ）ブノエート（ＬＫＹ７５０）、８－［（２－ヒドロキシエチル）［６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル］アミノ］－オクタン酸、１－オクチルノニルエステル（ヘプタデカン－９－イル８－［２－ヒドロキシエチル－（６－オキソ－６－ウンデコキシヘキシル）アミノ］オクタノエートとも呼ばれる）（ＳＭ－１０２）、２－ヘキシルデカン酸、１，１’－［［（４－ヒドロキシブチル）イミノ］ジ－６，１－ヘキサンジイル］エステル（（（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート）とも呼ばれる）（ＡＬＣ－０３１５）、４－（ジメチルアミノ）－ブタン酸、（１０Ｚ，１３Ｚ）－１－（９Ｚ，１２Ｚ）－９，１２－オクタデカジエン－１－イル－１０，１３－ノナデカジエン－１－イルエステル（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡまたはＭＣ３）、（（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート））、８－［（２－ヒドロキシエチル）［６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル］アミノ］－オクタン酸、１－オクチルノニルエステル及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0096】
一例では、脂質ナノ粒子はイオン化可能な脂質を含まない。
【0097】
一例では、脂質ナノ粒子はカチオン性脂質を含まない。
【0098】
一例では、脂質ナノ粒子は、約８０ｎｍ～２００ｎｍの平均粒径を有する。例えば、脂質ナノ粒子は、約１００ｎｍ～２００ｎｍの平均粒径を有する。一例では、脂質ナノ粒子は、約１００ｎｍ～１９０ｎｍ、または約１００ｎｍ～１８０ｎｍ、または約１１０ｎｍ～１８０ｎｍ、または約１１０ｎｍ～１５０ｎｍ、または約１１０ｎｍ～１４０ｎｍ、または約１１０ｎｍ～１３０ｎｍの平均粒径を有する。例えば、脂質ナノ粒子は、約１２５ｎｍの平均粒径を有する。一例では、脂質ナノ粒子は、約１５０～２００ｎｍの平均粒径を有する。一例では、脂質ナノ粒子は、約１６０～２００ｎｍの平均粒径を有する。例えば、脂質ナノ粒子は、約１６０ｎｍ、または約１６５ｎｍ、または約１７０ｎｍ、または約１７５ｎｍ、または約１８０ｎｍ、または約１８５ｎｍ、または約１９０ｎｍ、または約２００ｎｍの平均粒径を有する。一例では、平均粒径は、脂質ナノ粒子のＺ平均直径を測定することによって決定される。
【0099】
一例では、脂質ナノ粒子は、約２～約１０の窒素対リン酸比を有する。例えば、脂質ナノ粒子は、約２、または約２．５、または約３、または約３．５、または約４、または約４．５、または約５、または約５．５、または約６、または約６．５、または約７、または約７．５、または約８、または約８．５、または約９、または約９．５、または約１０の窒素対リン酸比を有する。一例では、脂質ナノ粒子は、約３の窒素対リン酸比を有する。別の例では、脂質ナノ粒子は、約４．５の窒素対リン酸比を有する。さらなる例では、脂質ナノ粒子は、約６の窒素対リン酸比を有する。
【0100】
一例では、ＲＮＡの少なくとも５０％が脂質ナノ粒子内に封入される。例えば、ＲＮＡの少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％が脂質ナノ粒子内に封入される。一例では、ＲＮＡの少なくとも８０％が封入される。別の例では、ＲＮＡの少なくとも８５％が封入される。封入効率（または封入パーセント）が、蛍光（例えば、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎを使用して）及び／または電子顕微鏡写真を使用して、本開示の医薬組成物またはｍＲＮＡの脱出または活性を測定することによって決定され得ることは、当業者に明らかであろう。
【0101】
一例では、ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及びアンチセンスＲＮＡからなる群から選択される。
【0102】
一例では、ＲＮＡはｍＲＮＡである。例えば、ｍＲＮＡは、自己複製ｍＲＮＡ（ｓａ－ｍＲＮＡ）または従来のｍＲＮＡ（ｃＲＮＡ）である。一例では、ｍＲＮＡはｓａ－ｍＲＮＡである。別の例では、ｍＲＮＡはｃＲＮＡである。
【0103】
一例では、ＲＮＡはｓｉＲＮＡである。
【0104】
一例では、ＲＮＡはｍｉＲＮＡである。
【0105】
一例では、ＲＮＡはアンチセンスＲＮＡである。
【0106】
本開示はまた、本開示の脂質ナノ粒子を含む免疫原性組成物を提供する。例えば、本開示の組成物は、投与されると、対象において免疫応答を誘導することができる。例えば、組成物の投与は、液性免疫応答及び／または細胞性免疫応答を誘導する。一例では、組成物は対象において液性免疫応答を誘導する。例えば、液性免疫応答は、抗体媒介性免疫応答である。別の例では、組成物は、細胞性免疫応答を誘導する。例えば、細胞性免疫応答には、抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の活性化が含まれる。
【0107】
本開示はまた、本開示の免疫原性組成物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。本開示での使用に適した薬学的に許容される担体は、当業者には明らかであり、及び／または本明細書に記載されている。
【0108】
本開示はまた、治療に使用するための本開示の免疫原性組成物または医薬組成物を提供する。例えば、本開示の免疫原性組成物または医薬組成物は、ワクチンとしての使用に適している。
【0109】
一例では、本開示の免疫原性組成物または医薬組成物は、バイアルで供給される。別の例では、本開示の免疫原性組成物または医薬組成物は、注射器で供給される。
【0110】
一例では、本開示の免疫原性組成物または医薬組成物は、４℃で少なくとも６０日間安定である。別の例では、本開示の免疫原性組成物または医薬組成物は、４℃で少なくとも９０日間安定である。
【0111】
本開示の追加の実施形態は以下のとおりである。
【0112】
１．ＲＮＡを送達するための脂質ナノ粒子であって、前記ＲＮＡに結合したＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドをその中に含む、前記脂質ナノ粒子。
【0113】
２．前記ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、脂質化されたＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドである、１に記載の脂質ナノ粒子。
【0114】
３．ＲＮＡを送達するための脂質ナノ粒子であって、前記ＲＮＡに結合した脂質化されたＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドをその中に含む、前記脂質ナノ粒子。
【0115】
４．前記ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、前記ＲＮＡに結合する前に脂質化される、２または３に記載の脂質ナノ粒子。
【0116】
５．前記ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、脂肪酸、イソプレノイド及びそれらの組み合わせからなる群から選択される脂質部分で脂質化される、２～４のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子。
【0117】
６．前記脂肪酸が、トリグリセリド、リン脂質、またはコレステリルエステルである、５に記載の脂質ナノ粒子。
【0118】
７．前記ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、Ｎ末端及び／またはＣ末端の求核性側鎖上で脂質化される、２～６のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子。
【0119】
８．前記求核性側鎖が、システイン、セリン、トレオニン、チロシン及び／またはリジンアミノ酸残基である、７に記載の脂質ナノ粒子。
【0120】
９．前記ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、パルミトイル化、ミリストイル化、脂肪酸アシル化、エステル化、プレニル化、またはそれらの組み合わせによって脂質化される、２～８のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子。
【0121】
１０．前記ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、Ｎ末端システインパルミトイル化、Ｎ末端グリシンミリストイル化、リジンＮ－アシル化、Ｃ末端コレステロールエステル化、システインプレニル化、セリンＯ－アシル化、またはそれらの組み合わせによって脂質化される、９に記載の脂質ナノ粒子。
【0122】
１１．前記プレニル化がファルネシル化またはゲラニルゲラニル化である、９または１０に記載の脂質ナノ粒子。
【0123】
１２．前記脂質部分が、チオエーテル結合、エステル結合、チオエステル結合及び／またはアミド結合によって前記ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドに連結される、５～１１のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子。
【0124】
１３．前記ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、化学的脂質化または酵素的脂質化を使用して脂質化される、２～１２のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子。
【0125】
１４．前記ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、化学的ライゲーション、クリックケミストリー、発現タンパク質ライゲーション及びそれらの組み合わせからなる群から選択される化学的脂質化を使用して脂質化される、１３に記載の脂質ナノ粒子。
【0126】
１５．前記ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、ソルターゼＡ媒介脂質化、トランスグルタミナーゼ媒介脂質化、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される酵素的脂質化を使用して脂質化される、１３に記載の脂質ナノ粒子。
【0127】
１６．前記酵素的脂質化がｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる、１５に記載の脂質ナノ粒子。
【0128】
１７．前記ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが前記ＲＮＡを封入する、１～１６のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子。
【0129】
１８．前記ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、前記ＲＮＡに直接結合する、１～１７のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子。
【0130】
１９．前記ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、
ａ）前記脂質ナノ粒子の毒性を低減し、及び／または
ｂ）前記ＲＮＡを安定化し、及び／または
ｃ）前記ＲＮＡを分解から保護し、及び／または
ｄ）前記脂質ナノ粒子の核形成を促進し、及び／または
ｅ）１つ以上のＴｏｌｌ様受容体によるシグナル伝達の誘導を阻害する、１～１８のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子。
ａ）前記脂質ナノ粒子の毒性を低減し、及び／または
ｂ）前記ＲＮＡを安定化し、及び／または
ｃ）前記ＲＮＡを分解から保護し、及び／または
ｄ）前記脂質ナノ粒子の核形成を促進し、及び／または
ｅ）１つ以上のＴｏｌｌ様受容体によるシグナル伝達の誘導を阻害する、１～１８のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子。
【0131】
２０．前記ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、核局在化シグナル（複数可）を除去し、及び／または核外搬出シグナル（複数可）を導入するように修飾される、１～１９のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子。
【0132】
２１．前記ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、ウイルスまたは非ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドである、１～２０のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子。
【0133】
２２．前記ウイルスＲＮＡ結合タンパク質が、クラスＩＩＩ、クラスＩＶ、クラスＶ、及び／またはクラスＶＩウイルス由来である、２１に記載の脂質ナノ粒子。
【0134】
２３．前記ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、メタニューモウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、アデノウイルス及びボカウイルスからなる群から選択される呼吸器ウイルスである、２２に記載の脂質ナノ粒子。
【0135】
２４．前記ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、核タンパク質、非構造タンパク質、基質タンパク質、及び／またはヌクレオカプシドタンパク質である、２３に記載の脂質ナノ粒子。
【0136】
２５．前記ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、Ｂ型インフルエンザウイルス由来の非構造（ＮＳ）タンパク質である、２１～２４のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子。
【0137】
２６．前記ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、配列番号９～１１のいずれか１つに記載の配列を含む、２１～２５のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子。
【0138】
２７．前記非ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドが、細胞増殖、細胞シグナル伝達及び／または抗ウイルス経路に関連する細胞タンパク質に由来する、２１に記載の脂質ナノ粒子。
【0139】
２８．前記細胞タンパク質が、ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質（ＴＲＢＰ）、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）ＲＮＡ結合タンパク質、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ－３）結合タンパク質、ＴＬＲ－７結合タンパク質、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、２７に記載の脂質ナノ粒子。
【0140】
２９．前記細胞タンパク質が、配列番号１～８のいずれか１つに記載の配列を含む、２７または２８に記載の脂質ナノ粒子。
【0141】
３０．前記脂質ナノ粒子が、ＰＥＧ脂質、構造脂質、及び／または中性脂質をさらに含む、１～２９のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子。
【0142】
３１．カチオン性脂質を含まない、１～３０のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子。
【0143】
３２．前記ＲＮＡが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及びアンチセンスＲＮＡからなる群から選択される、１～３１のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子。
【0144】
３３．前記ｍＲＮＡが自己複製ｍＲＮＡ（ｓａ－ｍＲＮＡ）または従来のＲＮＡ（ｃＲＮＡ）である、２９に記載の脂質ナノ粒子。
【0145】
３４．１～３３のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子を含む免疫原性組成物。
【0146】
３５．１～３３のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子または３４に記載の免疫原性組成物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【0147】
３６．治療に使用するための、１～３３のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子、３４に記載の免疫原性組成物、または３５に記載の医薬組成物。
【0148】
配列表の鍵
配列番号１ 全長ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質ドメイン２のアミノ酸配列
配列番号２ 切断型ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質ドメイン２のアミノ酸配列
配列番号３ プロテインキナーゼＲ ＲＮＡ結合モチーフ２のアミノ酸配列
配列番号４ 切断型プロテインキナーゼＲ ＲＮＡ結合モチーフ２（＃１）
のアミノ酸配列
配列番号５ 切断型プロテインキナーゼＲ ＲＮＡ結合モチーフ２（＃２）
のアミノ酸配列
配列番号６ Ｔｏｌｌ様受容体３ ｄｓＲＮＡ結合ドメイン１（ロイシンリッチ
リピート１～３）のアミノ酸配列
配列番号７ Ｔｏｌｌ様受容体３ ｄｓＲＮＡ結合ドメイン１（ロイシンリッチ
リピート１７～１８）のアミノ酸配列
配列番号８ Ｔｏｌｌ様受容体７ ＲＮＡ結合部位（ロイシンリッチリピート
１４～１５）のアミノ酸配列
配列番号９ Ｂ型インフルエンザＮＳ１ ＲＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列
配列番号１０ 切断型Ｂ型インフルエンザＮＳ１ ＲＮＡ結合ドメインのアミノ酸
配列
配列番号１１ 改変型Ｂ型インフルエンザＮＳ１ ＲＮＡ結合ドメインのアミノ酸
配列
配列番号１ 全長ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質ドメイン２のアミノ酸配列
配列番号２ 切断型ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質ドメイン２のアミノ酸配列
配列番号３ プロテインキナーゼＲ ＲＮＡ結合モチーフ２のアミノ酸配列
配列番号４ 切断型プロテインキナーゼＲ ＲＮＡ結合モチーフ２（＃１）
のアミノ酸配列
配列番号５ 切断型プロテインキナーゼＲ ＲＮＡ結合モチーフ２（＃２）
のアミノ酸配列
配列番号６ Ｔｏｌｌ様受容体３ ｄｓＲＮＡ結合ドメイン１（ロイシンリッチ
リピート１～３）のアミノ酸配列
配列番号７ Ｔｏｌｌ様受容体３ ｄｓＲＮＡ結合ドメイン１（ロイシンリッチ
リピート１７～１８）のアミノ酸配列
配列番号８ Ｔｏｌｌ様受容体７ ＲＮＡ結合部位（ロイシンリッチリピート
１４～１５）のアミノ酸配列
配列番号９ Ｂ型インフルエンザＮＳ１ ＲＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列
配列番号１０ 切断型Ｂ型インフルエンザＮＳ１ ＲＮＡ結合ドメインのアミノ酸
配列
配列番号１１ 改変型Ｂ型インフルエンザＮＳ１ ＲＮＡ結合ドメインのアミノ酸
配列
【図面の簡単な説明】
【0149】
【図1】ナノルシフェラーゼＲＮＡ（ｎＬｕｃ ＲＮＡ）単独、またはインフルエンザウイルスＲＮＡフリー核タンパク質（ＮＰ：ｎＬｕｃ ＲＮＡ）との組み合わせにおける発光を相対発光量（ＲＬＵ）で測定することにより評価したルシフェラーゼ産生量によって測定したＲＮＡの量を示すウサギ網状赤血球溶解物アッセイのグラフ表示である。
【図2】熱不安定性プロテイナーゼＫ（ＰＫ）及び／またはＲＮａｓｅを使用してまたは使用せずに処理した後の（Ａ）ＮＰ：ｎＬｕｃ ＲＮＡサンプル及び（Ｂ）ｎＬｕｃ ＲＮＡ単独サンプル中のＲＮＡの量のグラフ表示である。
【図3】最大９６時間のインキュベーション後の、（Ａ）４℃、（Ｂ）２４℃、及び（Ｃ）３７℃でのｎＬｕｃ ＲＮＡ単独サンプル及びＮＰ：ｎＬｕｃ ＲＮＡサンプルにおけるｎＬｕｃ ＲＮＡの安定性を示す一連のグラフ表示である。
【図4A】インキュベーション後２時間及び４時間でのｎＬｕｃ ＲＮＡ単独サンプル及びＮＰ：ｎＬｕｃ ＲＮＡサンプルにおけるＴＬＲ３誘導のレベルを示すグラフ表示である。
【図4B】インキュベーション後２時間及び４時間でのｎＬｕｃ ＲＮＡ単独サンプル及びＮＰ：ｎＬｕｃ ＲＮＡサンプルにおけるＴＬＲ３誘導のレベルを示すグラフ表示である。
【図4C】インキュベーション後２時間及び４時間でのｎＬｕｃ ＲＮＡ単独サンプル及びＮＰ：ｎＬｕｃ ＲＮＡサンプルにおけるＴＬＲ８誘導のレベルを示すグラフ表示である。
【図4D】インキュベーション後２時間及び４時間でのｎＬｕｃ ＲＮＡ単独サンプル及びＮＰ：ｎＬｕｃ ＲＮＡサンプルにおけるＴＬＲ８誘導のレベルを示すグラフ表示である。
【図5】（Ａ）ナノルシフェラーゼＲＮＡ（ＲＮＡ）単独、またはＣＯＶＩＤ ＲＮＡフリーヌクレオカプシド（ＲＮＡ＋ＮＰ（ＳＣｏｖ２））との組み合わせにおける発光をＲＬＵで測定することにより評価したルシフェラーゼ産生量によって測定したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドによるＲＮＡ分解の保護、及び（Ｂ）ＣＯＶＩＤ ＲＮＡフリーヌクレオカプシドを使用した場合と使用しない場合のｎＬｕｃ ＲＮＡの色素排除エッセイを示す一連のグラフ表示である。
【図6】遊離ＲＮＡと比較して、ＲＮＡと反応したＲＮＡ結合ペプチドが提供する保護レベルを示すグラフ表示である。破線は、遊離ＲＮＡ及び１００％保護と同等の、ペプチドが存在しない場合の保護レベル（ＬＨＳ）を表す。
【図7A】ＲＮａｓｅ阻害剤なしの場合のＮＰ：ｎＬｕｃ ＲＮＡサンプルにおけるｎＬｕｃ ＲＮＡの発現を示すグラフ表示である。
【図7B】ＲＮａｓｅ阻害剤ありの場合のＮＰ：ｎＬｕｃ ＲＮＡサンプルにおけるｎＬｕｃ ＲＮＡの発現を示すグラフ表示である。
【図7C】ＲＮａｓｅ阻害剤なしの場合のＮＰ：ｎＬｕｃ ＲＮＡサンプルにおけるｎＬｕｃ ＲＮＡの発現を示すグラフ表示である。
【図7D】ＲＮａｓｅ阻害剤ありの場合のＮＰ：ｎＬｕｃ ＲＮＡサンプルにおけるｎＬｕｃ ＲＮＡの発現を示すグラフ表示である。
【図8】ＮＰ：ｎＬｕｃ ＲＮＡ及びｎＬｕｃ ＲＮＡでトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞におけるｎＬｕｃ発現（相対発光量、ＲＬＵとして測定）を示すグラフ表示である。
【図9】脾臓及び肝臓におけるｎＬｕｃ ＲＮＡ発現を示すグラフ表示である。
【図10】ｎＬｕｃ ｍＲＮＡまたはＮＰ－ｎＬｕｃ ｍＲＮＡを配合したＬＮＰの、最大９０日間のインキュベーション後の４℃での経時的な安定性を示すグラフ表示である。
【図11A】０：１．５のＭＣ３：ＰＥＧ比での、ｎＬｕｃ ｍＲＮＡを配合したＬＮＰ、並びにｎＬｕｃ ｍＲＮＡ及び核タンパク質（ＮＰ）を配合したＬＮＰの生体内分布を示すグラフ表示である。
【図11B】５：１．５のＭＣ３：ＰＥＧ比での、ｎＬｕｃ ｍＲＮＡを配合したＬＮＰ、並びにｎＬｕｃ ｍＲＮＡ及び核タンパク質（ＮＰ）を配合したＬＮＰの生体内分布を示すグラフ表示である。
【図11C】１０：１．５のＭＣ３：ＰＥＧ比での、ｎＬｕｃ ｍＲＮＡを配合したＬＮＰ、並びにｎＬｕｃ ｍＲＮＡ及び核タンパク質（ＮＰ）を配合したＬＮＰの生体内分布を示すグラフ表示である。
【図11D】１５：１５のＭＣ３：ＰＥＧ比での、ｎＬｕｃ ｍＲＮＡを配合したＬＮＰ、並びにｎＬｕｃ ｍＲＮＡ及び核タンパク質（ＮＰ）を配合したＬＮＰの生体内分布を示すグラフ表示である。
【図11E】２０：１．５のＭＣ３：ＰＥＧ比での、ｎＬｕｃ ｍＲＮＡを配合したＬＮＰ、並びにｎＬｕｃ ｍＲＮＡ及び核タンパク質（ＮＰ）を配合したＬＮＰの生体内分布を示すグラフ表示である。
【図11F】５０：１．５のＭＣ３：ＰＥＧ比での、ｎＬｕｃ ｍＲＮＡを配合したＬＮＰ、並びにｎＬｕｃ ｍＲＮＡ及び核タンパク質（ＮＰ）を配合したＬＮＰの生体内分布を示すグラフ表示である。
【図12A】窒素対リン酸比を変化させた場合のＬＮＰサイズを示すｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ ＮｕＰを配合したＬＮＰのグラフ表示である。
【図12B】窒素対リン酸比を変化させた場合の封入効率を示すｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ ＮｕＰを配合したＬＮＰのグラフ表示である。
【図12C】窒素対リン酸比を変化させた場合の生体内分布を示すｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ ＮｕＰを配合したＬＮＰのグラフ表示である。
【発明を実施するための形態】
【0150】
概要
本明細書全体を通じて、特に別段の記載がない限り、または文脈上別段の解釈が必要でない限り、単一のステップ、物質の組成物、ステップの群、または物質の組成物の群への言及は、それらのステップ、物質の組成物、ステップの群、または物質の組成物の群のうちの１つ及び複数（すなわち、１つ以上）を包含すると解釈されるものとする。
本明細書全体を通じて、特に別段の記載がない限り、または文脈上別段の解釈が必要でない限り、単一のステップ、物質の組成物、ステップの群、または物質の組成物の群への言及は、それらのステップ、物質の組成物、ステップの群、または物質の組成物の群のうちの１つ及び複数（すなわち、１つ以上）を包含すると解釈されるものとする。
【0151】
当業者であれば、本開示が具体的に記載されたもの以外の変形及び修正を受けやすいことを理解するであろう。本開示にはそのような変形及び修正がすべて含まれることを理解されたい。本発明はまた、本明細書で個別にまたは集合的に言及または示されるステップ、特徴、組成物及び化合物のすべて、並びに上記ステップまたは特徴のあらゆる組み合わせまたは任意の２つ以上を含む。
【0152】
本開示は、本明細書に記載の特定の実施例によって範囲が限定されるものではなく、このような特定の実施例は例示のみを目的としている。機能的に同等の生成物、組成物、及び方法は、明らかに本開示の範囲内にある。
【0153】
本開示の任意の例は、特に別段の記載がない限り、本開示の任意の他の実施例に必要な変更を加えて準用されるものとする。
【0154】
特に別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、（例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、及び生化学の）当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有すると解釈されるものとする。
【0155】
別段の記載がない限り、本開示で使用される組換えタンパク質、細胞培養及び免疫学的技術は、当業者に周知の標準的な手順である。そのような技術は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（ｅｄｉｔｏｒｓ），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ１－４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５ ａｎｄ １９９６）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までのすべての改訂を含む）、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ （ｅｄｉｔｏｒｓ） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）、及びＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（現在までのすべての改訂を含む）などの情報源の文献全体に記載及び説明されている。
【0156】
本明細書における可変領域及びその一部、免疫グロブリン、抗体及びその断片の説明及び定義は、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７ ａｎｄ １９９１、Ｂｏｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４２，３０９－３２０，１９９４、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７，１９８７、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３４２，８７７－８８３，１９８９、及び／またはＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７３，９２７－９４８，１９９７における考察によってさらに明らかにすることができる。
【0157】
本明細書におけるタンパク質または抗体のいかなる考察も、製造及び／または保管中に産生されるタンパク質または抗体のあらゆる変異体を含むことが理解されるであろう。例えば、製造及び／または保管中に、抗体は、（例えば、アスパラギンまたはグルタミン残基で）脱アミド化され、及び／またはグリコシル化が変化し、及び／またはグルタミン残基がピログルタミン酸に変換され、及び／またはＮ末端もしくはＣ末端残基が除去もしくは「クリップ」され、及び／またはシグナル配列の一部またはすべてが不完全に処理され、その結果、抗体の末端に残る可能性がある。特定のアミノ酸配列を含む組成物は、記載もしくはコードされた配列及び／またはその記載もしくはコードされた配列の変異体の異種混合物であり得ることが理解される。
【0158】
「及び／または」、例えば、「Ｘ及び／またはＹ」という用語は、「Ｘ及びＹ」または「ＸまたはＹ」のいずれかを意味すると理解されるべきであり、両方の意味またはいずれかの意味に明確なサポートを提供するものと解釈されるものとする。
【0159】
本明細書全体を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形は、記載された要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群の包含を意味するが、任意の他の要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群の除外は意味しないことが理解されるであろう。
【0160】
本明細書で使用される場合、「に由来する」という用語は、特定の完全体がある特定の供給源から必ずしも直接得られるわけではないが、その供給源から取得することができることを示すと解釈されるものとする。
【0161】
選択された定義
本明細書で使用される場合、「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」という用語は、ナノメートルほど（例えば、１～１，０００ｎｍ）の少なくとも１つの寸法を有し、本明細書に記載される任意の式の化合物を含む脂質ベースの粒子を指すと理解されるものとする。実施形態では、ＬＮＰは、細胞、組織、器官、腫瘍などの所望の標的にポリヌクレオチドを送達するための組成物中に配合される。例えば、脂質ナノ粒子またはＬＮＰは、限定されるものではないが、水性体積が両親媒性脂質二重層（例えば、単一、単層または複数、多層）によって封入されているリポソームまたは小胞、非水性コアを有するミセル様脂質ナノ粒子、及び固体脂質ナノ粒子（固体脂質ナノ粒子は脂質二重層を欠く）から選択することができる。
本明細書で使用される場合、「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」という用語は、ナノメートルほど（例えば、１～１，０００ｎｍ）の少なくとも１つの寸法を有し、本明細書に記載される任意の式の化合物を含む脂質ベースの粒子を指すと理解されるものとする。実施形態では、ＬＮＰは、細胞、組織、器官、腫瘍などの所望の標的にポリヌクレオチドを送達するための組成物中に配合される。例えば、脂質ナノ粒子またはＬＮＰは、限定されるものではないが、水性体積が両親媒性脂質二重層（例えば、単一、単層または複数、多層）によって封入されているリポソームまたは小胞、非水性コアを有するミセル様脂質ナノ粒子、及び固体脂質ナノ粒子（固体脂質ナノ粒子は脂質二重層を欠く）から選択することができる。
【0162】
本明細書で使用される「脂質化された」または「脂質化」という用語は、タンパク質（すなわち、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチド）を１つ以上の脂質で共有結合的に修飾するプロセスを指す。
【0163】
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチド」または「ＲＢＰ」という用語は、二本鎖または一本鎖ＲＮＡに結合し、リボ核タンパク質複合体の形成に関与するタンパク質及びペプチドを指すと理解されるものとする。
【0164】
「タンパク質」という用語は、単一のポリペプチド鎖、すなわち、ペプチド結合によって連結された一連の連続するアミノ酸、または互いに共有結合もしくは非共有結合的に結合している一連のポリペプチド鎖（すなわち、ポリペプチド複合体）を含むと解釈されるものとする。例えば、一連のポリペプチド鎖は、適切な化学物質またはジスルフィド結合を使用して共有結合することができる。非共有結合の例としては、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、及び疎水性相互作用が挙げられる。
【0165】
本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、アミド結合によって連結されたアミノ酸残基から構成される化合物を含むことが意図される。ペプチドは、天然のものでも非天然のものでもよく、リボソームにコードされたものでも合成的に誘導されたものでもよい。通常、ペプチドは、２～２００個のアミノ酸からなる。例えば、ペプチドは、上記範囲（複数可）内の任意の長さを含めて、１０～２０個のアミノ酸または１０～３０個のアミノ酸または１０～４０個のアミノ酸または１０～５０個のアミノ酸または１０～６０個のアミノ酸または１０～７０個のアミノ酸または１０～８０個のアミノ酸または１０～９０個のアミノ酸または１０～１００個のアミノ酸の範囲の長さを有し得る。
【0166】
本明細書で使用される場合、「組換え」という用語は、人工的な遺伝子組換えの産物を意味すると理解されるものとする。
【0167】
本明細書で使用される場合、「自己複製ＲＮＡ」という用語は、異種ＲＮＡ及びタンパク質の発現を可能にするように操作されたＲＮＡウイルスに基づく構築物を指す。自己複製ＲＮＡ（例えば、裸のＲＮＡの形態）は宿主細胞中で増幅することができ、宿主細胞内での所望の遺伝子産物の発現につながる。
【0168】
本明細書で使用される場合、「従来のＲＮＡ」または「ｃＲＮＡ」または「非増幅ＲＮＡ」という用語は、異種ＲＮＡ及びタンパク質の発現を可能にするが、ＲＮＡが宿主細胞中では増幅できない構築物を指す。
【0169】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒトを含む任意の動物、例えば哺乳動物を意味すると解釈されるものとする。例示的な対象としては、ヒト及び非ヒト霊長類が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、対象はヒトである。
【0170】
脂質ナノ粒子
本開示は、ＲＮＡを送達するための脂質ナノ粒子を提供し、脂質ナノ粒子は、ＲＮＡに結合した核酸結合タンパク質またはペプチドを含む。例えば、脂質ナノ粒子は、ＲＮＡに結合した脂質化された核酸結合タンパク質またはペプチドを含む。
本開示は、ＲＮＡを送達するための脂質ナノ粒子を提供し、脂質ナノ粒子は、ＲＮＡに結合した核酸結合タンパク質またはペプチドを含む。例えば、脂質ナノ粒子は、ＲＮＡに結合した脂質化された核酸結合タンパク質またはペプチドを含む。
【0171】
本開示は、ＲＮＡを送達するための脂質ナノ粒子を提供し、脂質ナノ粒子は、ＲＮＡに結合した脂質化されたＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドを含む。
【0172】
核酸結合タンパク質またはペプチド
本開示は、核酸結合タンパク質またはペプチドを含む脂質ナノ粒子を提供する。例えば、本開示は、脂質化された核酸結合タンパク質またはペプチドを含む脂質ナノ粒子を提供する。
本開示は、核酸結合タンパク質またはペプチドを含む脂質ナノ粒子を提供する。例えば、本開示は、脂質化された核酸結合タンパク質またはペプチドを含む脂質ナノ粒子を提供する。
【0173】
一例では、核酸結合タンパク質は、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドである。別の例では、核酸結合タンパク質は、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチド及びＤＮＡ結合タンパク質またはペプチドである。
【0174】
ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチド
本開示は、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドを含む脂質ナノ粒子を提供する。例えば、本開示は、脂質化されたＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドを含む脂質ナノ粒子を提供する。
本開示は、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドを含む脂質ナノ粒子を提供する。例えば、本開示は、脂質化されたＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドを含む脂質ナノ粒子を提供する。
【0175】
ＲＮＡ結合タンパク質は、例えば、ＲＮＡスプライシング、ＲＮＡ編集、ポリアデニル化、搬出、ｍＲＮＡ安定化、ｍＲＮＡ局在化及び翻訳を含めて、共転写及び転写後の遺伝子発現の多くの側面を調節する。ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、二本鎖または一本鎖ＲＮＡに結合し、リボ核タンパク質複合体の形成に関与する。当業者であれば、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドがウイルスまたは非ウイルスタンパク質またはペプチドであり得ることを理解するであろう。
【0176】
非ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチド
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質は、細胞タンパク質に由来する非ウイルスタンパク質またはペプチドである。例えば、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、細胞増殖、細胞シグナル伝達及び／または抗ウイルス経路に関連する細胞タンパク質に由来する。
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質は、細胞タンパク質に由来する非ウイルスタンパク質またはペプチドである。例えば、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、細胞増殖、細胞シグナル伝達及び／または抗ウイルス経路に関連する細胞タンパク質に由来する。
【0177】
非ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、例えば、ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）、Ｋ相同性（ＫＨ）ドメイン（タイプＩ及びタイプＩＩ）、ＲＧＧ（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ）ボックス、Ｓｍドメイン；ＤＥＡＤ／ＤＥＡＨボックス、ＣＣＣＨ型ジンクフィンガー（ＺｎＦ）、二本鎖ＲＮＡ結合モチーフ（ｄｓＲＢＤ）、コールドショックドメイン；Ｐｕｍｉｌｉｏ／ＦＢＦ（ＰＵＦまたはＰｕｍ－ＨＤ）ドメイン及びＰｉｗｉ／Ａｒｇｏｎａｕｔｅ／Ｚｗｉｌｌｅ（ＰＡＺ）ドメインを含めて、ＲＮＡ結合を促進する多数の構造モチーフまたはＲＮＡ結合ドメインを含む。
【0178】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、ＲＮＡ認識モチーフ、Ｋ相同性ドメイン（タイプＩまたはタイプＩＩ）及びＣＣＣＨ型ジンクフィンガーからなる群から選択されるＲＮＡ結合ドメインを含む。
【0179】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、ＲＮＡ認識モチーフを含む。例えば、ＲＮＡ認識モチーフを含むＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、Ａ２ＢＰ１、ＡＣＦ、ＢＯＬＬ、ＢＲＵＮＯＬ４、ＢＲＵＮＯＬ５、ＢＲＵＮＯＬ６、ＣＣＢＬ２、ＣＧＩ－９６、ＣＩＲＢＰ、ＣＮＯＴ４、ＣＰＥＢ２、ＣＰＥＢ３、ＣＰＥＢ４、ＣＰＳＦ７、ＣＳＴＦ２、ＣＳＴＦ２Ｔ、ＣＵＧＢＰ１、ＣＵＧＢＰ２、Ｄ１０Ｓ１０２、ＤＡＺ１、ＤＡＺ２、ＤＡＺ３、ＤＡＺ４、ＤＡＺＡＰ１、ＤＡＺＬ、ＤＮＡＪＣ１７、ＤＮＤ１、ＥＩＦ３Ｓ４、ＥＩＦ３Ｓ９、ＥＩＦ４Ｂ、ＥＩＦ４Ｈ、ＥＬＡＶＬ１、ＥＬＡＶＬ２、ＥＬＡＶＬ３、ＥＬＡＶＬ４、ＥＮＯＸ１、ＥＮＯＸ２、ＥＷＳＲ１、ＦＵＳ、ＦＵＳＩＰ１、Ｇ３ＢＰ、Ｇ３ＢＰ１、Ｇ３ＢＰ２、ＧＲＳＦ１、ＨＮＲＮＰＬ、ＨＮＲＰＡ０、ＨＮＲＰＡ１、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１、ＨＮＲＰＡ３、ＨＮＲＰＡＢ、ＨＮＲＰＣ、ＨＮＲＰＣＬ１、ＨＮＲＰＤ、ＨＮＲＰＤＬ、ＨＮＲＰＦ、ＨＮＲＰＨ１、ＨＮＲＰＨ２、ＨＮＲＰＨ３、ＨＮＲＰＬ、ＨＮＲＰＬＬ、ＨＮＲＰＭ、ＨＮＲＰＲ、ＨＲＮＢＰ１、ＨＳＵ５３２０９、ＨＴＡＴＳＦ１、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＩＧＦ２ＢＰ２、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＬＡＲＰ７、ＭＫＩ６７ＩＰ、ＭＳＩ１、ＭＳＩ２、ＭＳＳＰ－２、ＭＴＨＦＳＤ、ＭＹＥＦ２、ＮＣＢＰ２、ＮＣＬ、ＮＯＬ８、ＮＯＮＯ、Ｐ１４、ＰＡＢＰＣ１、ＰＡＢＰＣ１Ｌ、ＰＡＢＰＣ３、ＰＡＢＰＣ４、ＰＡＢＰＣ５、ＰＡＢＰＮ１、ＰＫＲ、ＰＯＬＤＩＰ３、ＰＰＡＲＧＣ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＰＰＡＲＧＣ１Ｂ、ＰＰＩＥ、ＰＰＩＬ４、ＰＰＲＣ１、ＰＳＰＣ１、ＰＴＢＰ１、ＰＴＢＰ２、ＰＵＦ６０、ＲＡＬＹ、ＲＡＬＹＬ、ＲＡＶＥＲ１、ＲＡＶＥＲ２、ＲＢＭ１０、ＲＢＭ１１、ＲＢＭ１２、ＲＢＭ１２Ｂ、ＲＢＭ１４、ＲＢＭ１５、ＲＢＭ１５Ｂ、ＲＢＭ１６、ＲＢＭ１７、ＲＢＭ１８、ＲＢＭ１９、ＲＢＭ２２、ＲＢＭ２３、ＲＢＭ２４、ＲＢＭ２５、ＲＢＭ２６、ＲＢＭ２７、ＲＢＭ２８、ＲＢＭ３、ＲＢＭ３２Ｂ、ＲＢＭ３３、ＲＢＭ３４、ＲＢＭ３５Ａ、ＲＢＭ３５Ｂ、ＲＢＭ３８、ＲＢＭ３９、ＲＢＭ４、ＲＢＭ４１、ＲＢＭ４２、ＲＢＭ４４、ＲＢＭ４５、ＲＢＭ４６、ＲＢＭ４７、ＲＢＭ４Ｂ、ＲＢＭ５、ＲＢＭ７、ＲＢＭ８Ａ、ＲＢＭ９、ＲＢＭＳ１、ＲＢＭＳ２、ＲＢＭＳ３、ＲＢＭＸ、ＲＢＭＸ２、ＲＢＭＸＬ２、ＲＢＭＹ１Ａ１、ＲＢＭＹ１Ｂ、ＲＢＭＹ１Ｅ、ＲＢＭＹ１Ｆ、ＲＢＭＹ２ＦＰ、ＲＢＰＭＳ、ＲＢＰＭＳ２、ＲＤＢＰ、ＲＮＰＣ３、ＲＮＰＣ４、ＲＮＰＳ１、ＲＯＤ１、ＳＡＦＢ、ＳＡＦＢ２、ＳＡＲＴ３、ＳＥＲＢＰ１、ＳＥＴＤ１Ａ、ＳＦ３Ｂ１４、ＳＦ３Ｂ４、ＳＦＰＱ、ＳＦＲＳ１、ＳＦＲＳ１０、ＳＦＲＳ１１、ＳＦＲＳ１２、ＳＦＲＳ１５、ＳＦＲＳ２、ＳＦＲＳ２Ｂ、ＳＦＲＳ３、ＳＦＲＳ４、ＳＦＲＳ５、ＳＦＲＳ６、ＳＦＲＳ７、ＳＦＲＳ９、ＳＬＩＲＰ、ＳＬＴＭ、ＳＮＲＰ７０、ＳＮＲＰＡ、ＳＮＲＰＢ２、ＳＰＥＮ、ＳＲ１４０、ＳＲＲＰ３５、ＳＳＢ、ＳＹＮＣＲＩＰ、ＴＡＦ１５、ＴＲＢＰ、ＴＨＯＣ４、ＴＩＡ１、ＴＩＡＬ１、ＴＮＲＣ４、ＴＮＲＣ６Ｃ、ＴＲＡ２Ａ、ＴＲＳＰＡＰ１、ＴＵＴ１、Ｕ１ＳＮＲＮＰＢＰ、Ｕ２ＡＦ１、Ｕ２ＡＦ２、ＵＨＭＫ１、ＺＣＲＢ１、ＺＮＦ６３８、ＺＲＳＲ１、及びＺＲＳＲ２からなる群から選択される。
【0180】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、Ｋ相同性ドメインを含む。例えば、Ｋ相同性ドメインはタイプＩドメインである。別の例では、Ｋ相同性ドメインはタイプＩＩドメインである。一例では、Ｋ相同性ドメインを含むＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、ＡＫＡＰ１、ＡＮＫＨＤ１、ＡＮＫＲＤ１７、ＡＳＣＣ１、ＢＩＣＣ１、ＤＤＸ４３，ＤＤＸ５３、ＤＰＰＡ５、ＦＭＲ１、ＦＵＢＰ１、ＦＵＢＰ３、ＦＸＲ１、ＦＸＲ２、ＧＬＤ１、ＨＤＬＢＰ、ＨＮＲＰＫ、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＩＧＦ２ＢＰ２、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＫＨＤＲＢＳ１、ＫＨＤＲＢＳ２、ＫＨＤＲＢＳ３、ＫＨＳＲＰ、ＫＲＲ１、ＭＥＸ３Ａ、ＭＥＸ３Ｂ、ＭＥＸ３Ｃ、ＭＥＸ３Ｄ、ＮＯＶＡ１、ＮＯＶＡ２、ＰＣＢＰ１、ＰＣＢＰ２、ＰＣＢＰ３、ＰＣＢＰ４、ＰＮＯ１、ＰＮＰＴ１、ＱＫＩ、ＳＦ１、及びＴＤＲＫＨからなる群から選択される。
【0181】
一例では、ＲＮＡ結合ドメインは、ＣＣＣＨ型ジンクフィンガードメインを含む。
【0182】
例示的な非ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは当業者には明らかであり、例えば、ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質（ＴＲＢＰ）、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ－３）及びＴｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ）が含まれる。
【0183】
ウイルスＲＮＡ結合タンパク質
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドである。例えば、ＲＮＡ結合タンパク質は、核タンパク質、基質タンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、及び／またはＲＮＡウイルス由来の非構造タンパク質である。
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、ウイルスＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドである。例えば、ＲＮＡ結合タンパク質は、核タンパク質、基質タンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、及び／またはＲＮＡウイルス由来の非構造タンパク質である。
【0184】
表１に示すように、ウイルスがボルティモア分類システムに従って分類されることは当業者には明らかであり、この分類システムは主にウイルスゲノムの転写に基づいている。
【表1】
【0185】
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、ＲＮＡウイルス由来である。例えば、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、クラスＩＩＩ、クラスＩＶ、クラスＶ、及び／またはクラスＩＶウイルス由来である。
【0186】
一例では、ＲＮＡウイルスはクラスＩＩＩウイルス（すなわち、二本鎖ＲＮＡウイルス）である。クラスＩＩＩウイルスには、例えば、Ｄｕｐｌｏｒｎａｖｉｒｉｃｏｔａ門のすべてのウイルス及び（Ｐｉｓｕｖｉｒｉｃｏｔａ門の）Ｄｕｐｌｏｐｉｖｉｒｉｃｅｔｅｓ綱のすべてのウイルスが含まれる。例示的なクラスＩＩＩウイルスとしては、レオウイルス（例えば、オルソレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、またはコルチウイルス）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0187】
一例では、ＲＮＡウイルスはクラスＩＶウイルス（すなわち、ポジティブセンス一本鎖ＲＮＡウイルス）である。クラスＩＶウイルスには、例えば、Ｌｅｎａｒｖｉｒｉｃｏｔａ門、Ｐｉｓｕｖｉｒｉｃｏｔａ門（Ｄｕｐｌｏｐｉｄｉｖｉｒｉｃｅｔｅｓ綱を除く）、及びＫｉｔｒｉｎｏｖｉｒｉｃｏｔａ門のウイルスが含まれる。例示的なクラスＩＶウイルスとしては、トガウイルス（例えば、ルビウイルス、アルファウイルス、またはアルテリウイルス）、フラビウイルス（例えば、ダニ媒介性脳炎（ＴＢＥ）ウイルス、デング（１、２、３または４型）ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、キャサヌル森林病ウイルス、ウエストナイル脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、ポワッサン脳炎ウイルス）、ピコルナウイルス（例えば、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパルナウイルス、パレコウイルス、カルジオウイルス、及びアフトウイルス）、エンテロウイルス（例えば、ポリオウイルス１型、２型または３型、コクサッキーＡウイルス１型～２２型及び２４型、コクサッキーＢウイルス１型～６型、エコーウイルス（ＥＣＨＯ）１型～９型、１１型～２７型及び２９型～３４型、エンテロウイルス６８型～７１型）、ペスチウイルス（例えば、ウシウイルス性下痢症（ＢＶＤＶ）、豚熱（ＣＳＦＶ）またはボーダー病（ＢＤＶ））、カリシウイルス（例えば、ノーウォークウイルス、及びノーウォーク様ウイルス（例えば、ハワイウイルス及びスノーマウンテンウイルス））、コロナウイルス（例えば、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、鶏伝染性気管支炎（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、及び豚伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ））、並びにＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0188】
一例では、ＲＮＡウイルスはクラスＶウイルス（すなわち、ネガティブセンス一本鎖ＲＮＡウイルス）である。クラスＶウイルスには、例えば、Ｎｅｇａｒｎａｖｉｒｉｃｏｔａ門のウイルスが含まれる。例示的なクラスＶウイルスとしては、オルトミクソウイルス（例えば、Ａ型、Ｂ型、及びＣ型インフルエンザ）、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅウイルス（ニューモウイルス（例えば、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、マウス肺炎ウイルス、及び七面鳥鼻気管炎ウイルス）、パラミクソウイルス１～４型（ＰＩＶ）、おたふく風邪、センダイウイルス、シミアンウイルス５、ニパウイルス、ヘニパウイルス、ニューカッスル病ウイルス、モルビリウイルス（例えば、麻疹）、ブニヤウイルス（例えば、カリフォルニア脳炎ウイルス）、フレボウイルス（例えば、リフトバレー熱ウイルス）、ナイロウイルス（例えば、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス）、ラブドウイルス（例えば、リッサウイルス（狂犬病ウイルス）及びベシクロウイルス（ＶＳＶ））、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）及びアレナウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【0189】
一例では、クラスＶ ＲＮＡウイルスは、インフルエンザウイルスである。例えば、Ａ型インフルエンザウイルスである。別の例では、Ｂ型インフルエンザウイルスである。
【0190】
一例では、ＲＮＡウイルスは、クラスＶＩウイルス（すなわち、ライフサイクル中にＤＮＡ中間体を有する一本鎖ＲＮＡウイルス）である。クラスＶＩウイルスには、例えば、Ｒｅｖｔｒａｖｉｒｉｃｅｔｅｓ綱（Ａｒｔｖｅｒｖｉｒｉｃｏｔａ門、Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｉｄａｅを除く）のウイルスが含まれる。例示的なクラスＶＩウイルスとしては、ヘパルナウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ））、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス）、及びレトロウイルス（例えば、オンコウイルス、レンチウイルス、またはスプマウイルス）が挙げられるが、これらに限定されない。一例では、ＲＮＡウイルスはヘパドナウイルスである。例えば、ヘパドナウイルスはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）である。
【0191】
リンカー
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、リンカーを介して連結された第１のＲＮＡ結合タンパク質またはペプチド及び第２のＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドを含む。例えば、リンカーはリンカーペプチドである。
一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、リンカーを介して連結された第１のＲＮＡ結合タンパク質またはペプチド及び第２のＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドを含む。例えば、リンカーはリンカーペプチドである。
【0192】
一例では、リンカーは柔軟なリンカーである。
【0193】
「柔軟な」リンカーは、溶液中で固定構造（二次または三次構造）を有さないアミノ酸配列である。したがって、このような柔軟なリンカーは、様々な立体構造を自由にとることができる。本開示での使用に適した柔軟なリンカーは当該技術分野で公知である。本発明で使用するための柔軟なリンカーの一例は、リンカー配列ＳＧＧＧＧＳ／ＧＧＧＧＳ／ＧＧＧＧＳまたは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３である。柔軟なリンカーの別の例は、アラニンリンカー（例えば、Ａｌａｎ）である。
【0194】
リンカーは、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドとＲＮＡとの相互作用を実質的に妨げない任意のアミノ酸配列を含み得る。柔軟なリンカー配列に好ましいアミノ酸残基としては、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、プロリン、リジン、アルギニン、グルタミン及びグルタミン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【0195】
ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドの間のリンカー配列は、好ましくは５個以上のアミノ酸残基を含む。本開示による柔軟なリンカー配列は、５個以上の残基、好ましくは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個以上の残基からなる。本発明の非常に好ましい実施形態では、柔軟なリンカー配列は、５、７、１０または１６個の残基からなる。
【0196】
一例では、リンカーは剛性リンカーである。「剛性リンカー」（「半剛性リンカー」を含む）とは、制限された柔軟性を有するリンカーを指す。例えば、比較的剛性のリンカーは、配列（ＥＡＡＡＫ）ｎ（式中、ｎは１～３である）を含む。ｎの値は、１～約１０、または約１～１００であり得る。例えば、ｎは少なくとも１、または少なくとも２、または少なくとも３、または少なくとも４、または少なくとも５、または少なくとも６、または少なくとも７、または少なくとも８、または少なくとも９、または少なくとも１０である。一例では、ｎは１００未満である。例えば、ｎは、９０未満、または約８０未満、または約７０未満、または約６０未満、または約５０未満、または約４０未満、または約３０未満、または約２０未満、または約１０未満である。剛性リンカーは、柔軟性を完全に欠く必要はない。
【0197】
結合タンパク質の脂質化
本開示は、脂質化された核酸結合タンパク質またはペプチドを含む脂質ナノ粒子を提供する。
本開示は、脂質化された核酸結合タンパク質またはペプチドを含む脂質ナノ粒子を提供する。
【0198】
本開示は、脂質化されたＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドを含む脂質ナノ粒子を提供する。
【0199】
タンパク質またはペプチドの脂質化が、タンパク質またはペプチド（すなわち、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチド）への脂質部分の共有結合であることは、当業者には明らかであろう。
【0200】
脂質
本開示での使用に適した脂質部分は当業者には明らかであり、例えば、脂肪酸、イソプレノイド及びそれらの組み合わせが含まれる。一例では、脂質部分は、イソプレノイド、トリグリセリド、リン脂質、コレステリルエステル、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
本開示での使用に適した脂質部分は当業者には明らかであり、例えば、脂肪酸、イソプレノイド及びそれらの組み合わせが含まれる。一例では、脂質部分は、イソプレノイド、トリグリセリド、リン脂質、コレステリルエステル、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0201】
イソプレノイド
テルペノイドまたはプレノール脂質としても知られるイソプレノイドは分岐脂質であり、２つ以上の炭化水素単位で構成される有機化合物の一種であり、各単位は特定のパターンで配列された５つの炭素原子からなる。これらの５つの炭素単位はイソプレンと呼ばれ、メバロン酸として知られる一般的な中間体から合成され、メバロン酸自体はアセチル－ＣｏＡから合成される。イソプレノイドは、それらの炭素骨格に結合したヒドロキシルやカルボニルなどの１つ以上の官能性化学基を有してもよく、これらは、イソプレノイドの多様性を構成する。イソプレノイドは、モノテルペン（Ｃ１０Ｈ１６）、セスキテルペン（Ｃ１５Ｈ２４）、ジテルペン（Ｃ２０Ｈ３２）、トリテルペン（Ｃ３０Ｈ４８）、テトラテルペン（Ｃ４０Ｈ６４）、または他のポリテルペン（Ｃ５Ｈ８）ｎとして分類できる。
テルペノイドまたはプレノール脂質としても知られるイソプレノイドは分岐脂質であり、２つ以上の炭化水素単位で構成される有機化合物の一種であり、各単位は特定のパターンで配列された５つの炭素原子からなる。これらの５つの炭素単位はイソプレンと呼ばれ、メバロン酸として知られる一般的な中間体から合成され、メバロン酸自体はアセチル－ＣｏＡから合成される。イソプレノイドは、それらの炭素骨格に結合したヒドロキシルやカルボニルなどの１つ以上の官能性化学基を有してもよく、これらは、イソプレノイドの多様性を構成する。イソプレノイドは、モノテルペン（Ｃ１０Ｈ１６）、セスキテルペン（Ｃ１５Ｈ２４）、ジテルペン（Ｃ２０Ｈ３２）、トリテルペン（Ｃ３０Ｈ４８）、テトラテルペン（Ｃ４０Ｈ６４）、または他のポリテルペン（Ｃ５Ｈ８）ｎとして分類できる。
【0202】
本開示での使用に適したイソプレノイドは、当業者には明らかであり、及び／または本明細書に記載されている。
【0203】
一例では、イソプレノイドはモノテルペンである。例示的なモノテルペンとしては、シトロネロール、シトロネラール、シトラール、ゲラニオール、メトール、プソイドイオノン及びβ－イオノンが挙げられる。
【0204】
一例では、イソプレノイドはセスキテルペンである。例示的なセスキテルペンとしては、カダレン、オイダレン、カジネン及びβ－セリネンが挙げられる。
【0205】
一例では、イソプレノイドはジテルペンである。例示的なジテルペンとしては、フィトール及びアビエチン酸が挙げられる。
【0206】
一例では、イソプレノイドはトリテルペンである。例示的なトリテルペンとしては、スクアレン及びβ－アミリンが挙げられる。
【0207】
一例では、イソプレノイドはテトラテルペンである。例示的なテトラテルペンとしては、カロテノイド（例えば、β－カロテン）及びリコピンが挙げられる。
【0208】
脂肪酸
脂肪酸は、カルボン酸官能基で終端された長鎖炭化水素を含む脂質である。脂肪酸は飽和でも不飽和でもよい。一例では、脂肪酸は、６～２２個の炭素を有する炭素鎖を含む。例示的な脂肪酸としては、パルミチン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、α－リノレン酸、及びステアリン酸が挙げられる。
脂肪酸は、カルボン酸官能基で終端された長鎖炭化水素を含む脂質である。脂肪酸は飽和でも不飽和でもよい。一例では、脂肪酸は、６～２２個の炭素を有する炭素鎖を含む。例示的な脂肪酸としては、パルミチン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、α－リノレン酸、及びステアリン酸が挙げられる。
【0209】
脂肪酸は、自然界に遊離型で存在することはほとんどなく、一般にトリグリセリド、リン脂質、及びコレステリルエステルという３種類の主要なエステルとして存在する。
【0210】
一例では、脂肪酸はトリグリセリドである。トリグリセリドは、エステル結合を介して３つの脂肪酸分子に結合したグリセロールからなるトリエステルである。３つの脂肪酸は同じであっても異なっていてもよい。例示的なトリグリセリドはトリステアリンである。
【0211】
一例では、脂肪酸はリン脂質である。リン脂質は、１つ以上のリン酸基を含む親水性極性頭部基と、２つの脂肪アシル鎖を含む疎水性尾部とを含む複合脂質である。極性頭部基は、グリセロール（すなわち、ホスホグリセリド）またはスフィンゴシン分子（すなわち、ホスホスフィンゴ脂質）を介してホスホジエステル結合によって疎水性部分に結合される。リン脂質は飽和でも不飽和でもよい。例示的なホスホグリセリドとしては、ホスファチジン酸（ホスファチジン酸塩）、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルセリン、ホスホイノシチド（例えば、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールリン酸（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトール二リン酸（ＰＩＰ２）及びホスファチジルイノシトール三リン酸（ＰＩＰ３））、ホスファチジルグリセロール、及びカルジオリピンが挙げられる。例示的なホスホスフィンゴ脂質としては、セラミドホスホリルコリン（スフィンゴミエリン）、セラミドホスホリルエタノールアミン（スフィンゴミエリン）、セラミドホスホリル脂質、ガラクトセレブロシド、グルコセレブロシド、及びラクトシルセラミドが挙げられる。
【0212】
一例では、脂肪酸はコレステリルエステルである。コレステリルエステルは、コレステロールを長鎖脂肪酸でエステル化したものである。例示的なコレステリルエステルとしては、オレイン酸コレステリル、安息香酸コレステリル及びリノール酸コレステリルが挙げられる。
【0213】
脂質化
例示的な脂質化としては、パルミトイル化、ミリストイル化、脂肪酸アシル化、エステル化、プレニル化、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
例示的な脂質化としては、パルミトイル化、ミリストイル化、脂肪酸アシル化、エステル化、プレニル化、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【0214】
パルミトイル化
一例では、脂質部分は、パルミトイル化によってＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドに結合される。
一例では、脂質部分は、パルミトイル化によってＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドに結合される。
【0215】
一例では、パルミトイル化はシステインパルミトイル化（Ｓ－パルミトイル化としても知られる）である。当業者であれば、システインパルミトイル化がタンパク質のシステイン残基への１６炭素パルミトイル基の付加であることを理解するであろう。一例では、パルミトイル基はチオエステル結合を介して付加される。別の例では、パルミトイル基はアミド結合を介して付加される。
【0216】
ミリストイル化
一例では、脂質部分は、ミリストイル化によってＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドに結合される。
一例では、脂質部分は、ミリストイル化によってＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドに結合される。
【0217】
一例では、ミリストイル化はＮ－グリシンミリストイル化である。当業者であれば、Ｎ－グリシンミリストイル化が、アミド結合を介した、タンパク質のＮ末端グリシンへの飽和１４炭素脂肪アシル基であるミリストイルの共翻訳または翻訳後結合を指すことを認識するであろう。
【0218】
一例では、ミリストイル化はリジンミリストイル化である。
【0219】
脂肪酸アシル化
一例では、脂質部分は、脂肪酸アシル化によってＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドに結合される。
一例では、脂質部分は、脂肪酸アシル化によってＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドに結合される。
【0220】
当業者であれば、脂肪酸アシル化がタンパク質へのアシル基の共有結合を含むことを認識するであろう。
【0221】
一例では、脂肪酸アシル化はリジンＮ－アシル化である。当業者であれば、リジンＮ－アシル化が、アセチル－ＣｏＡからタンパク質上のリジン残基のイプシロン（ε）－アミノ基へのアセチル部分の転移を指すことを理解するであろう。
【0222】
エステル化
一例では、脂質部分は、エステル化によってＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドに結合される。
一例では、脂質部分は、エステル化によってＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドに結合される。
【0223】
一例では、エステル化は、Ｃ末端ステロールエステル化、例えばＣ末端コレステロールエステル化である。当業者であれば、Ｃ末端コレステロールエステル化が、少なくとも１つのヒドロキシル（－ＯＨ）基をアルコキシ（－Ｏ－アルキル）基で置換することであることを理解するであろう。
【0224】
プレニル化
一例では、脂質部分は、プレニル化によってＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドに結合される。
一例では、脂質部分は、プレニル化によってＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドに結合される。
【0225】
一例では、プレニル化はシステインプレニル化である。当業者であれば、システインプレニル化が、タンパク質のＣ末端近くのシステイン残基への複数のイソプレン単位の付加であることを理解するであろう。
【0226】
一例では、プレニル化はファルネシル化（すなわち、３つのイソプレン単位の付加）であり、またはプレニル化はゲラニルゲラニル化（すなわち、４つのイソプレン単位の付加）である。
【0227】
一例では、ファルネシル基またはゲラニルゲラニル基とシステイン残基との間の結合はチオエーテル結合である。別の例では、結合は、エステル結合である。さらなる例では、結合はチオエステル結合である。
【0228】
脂質化の方法
脂質修飾は通常、タンパク質またはペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端において、タンパク質またはペプチド（例えば、システイン、セリン、及びリジン）の求核性側鎖で発生する。
脂質修飾は通常、タンパク質またはペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端において、タンパク質またはペプチド（例えば、システイン、セリン、及びリジン）の求核性側鎖で発生する。
【0229】
脂質化の様々な方法は当業者には明らかであり、及び／または本明細書に記載されている。適切な方法には、化学的脂質化または酵素的脂質化が含まれ得る。
【0230】
化学的脂質化
一例では、脂質部分は、化学ライゲーションを使用してＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドに結合される。脂質部分は、アミン、カルボン酸、ヒドラジド、またはマレイミド基を含むことができ、脂質部分は、リジンの第一級アミン基またはシステインのチオール基を介して、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドに化学的に結合することができる。一例では、脂質部分はマレイミド基を含み、脂質部分は、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチド中のスルフヒドリル基とのチオエーテル結合の形成を介してＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドに結合される。一例では、脂質部分はカルボン酸を含み、カルボン酸は、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ）によって活性化される。活性化されたアシルアミノエステルまたはｓｕｌｆｏ－ＮＨＳエステルは、続いてＲＮＡ結合タンパク質またはペプチド中のリジン残基の第一級アミンと反応して、アミド結合を形成する。
一例では、脂質部分は、化学ライゲーションを使用してＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドに結合される。脂質部分は、アミン、カルボン酸、ヒドラジド、またはマレイミド基を含むことができ、脂質部分は、リジンの第一級アミン基またはシステインのチオール基を介して、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドに化学的に結合することができる。一例では、脂質部分はマレイミド基を含み、脂質部分は、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチド中のスルフヒドリル基とのチオエーテル結合の形成を介してＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドに結合される。一例では、脂質部分はカルボン酸を含み、カルボン酸は、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ）によって活性化される。活性化されたアシルアミノエステルまたはｓｕｌｆｏ－ＮＨＳエステルは、続いてＲＮＡ結合タンパク質またはペプチド中のリジン残基の第一級アミンと反応して、アミド結合を形成する。
【0231】
一例では、脂質部分はマレイミド基を含む。例えば、脂質部分は、マレイミド基でキャップされたリン脂質である。一例では、脂質部分は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－マレイミド（ＤＳＰＥ－マレイミド、ＤＳＰＥ－Ｍａｌ）である。
【0232】
一例では、脂質部分は、Ｋｏｌｂ ｅｔ ａｌ．（２００１）、ＷＯ２００３／１０１９７２及びＭａｌｋｏｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００５）に開示されているような様々な「クリックケミストリー」戦略を使用して、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドに結合される。
【0233】
一例では、脂質部分は、発現タンパク質ライゲーションを使用して、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドに結合される。発現タンパク質ライゲーションは、生理的ｐＨの水溶液中での、Ｃ末端チオエステルを有するタンパク質またはペプチドとＮ末端システインを有するタンパク質またはペプチドとの間の化学選択的ライゲーションを含む。一例では、Ｃ末端チオエステルは、遺伝子操作によってＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドに挿入され、脂質部分はＮ末端システイン残基を有するペプチドに融合される。
【0234】
Ｔａｋａｈａｒａ ＆ Ｋａｍｉｙａ（２０２０）に開示されている方法など、当業者に公知の他の化学的脂質化方法を使用してもよい。
【0235】
酵素的脂質化
一例では、脂質部分は、酵素的脂質化を使用してＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドに結合される。酵素的脂質化は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことができる。いくつかの例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、脂質化酵素によって認識されるコンセンサス配列を含むように当業者に公知の技術を使用して遺伝子操作される。
一例では、脂質部分は、酵素的脂質化を使用してＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドに結合される。酵素的脂質化は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことができる。いくつかの例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、脂質化酵素によって認識されるコンセンサス配列を含むように当業者に公知の技術を使用して遺伝子操作される。
【0236】
一例では、脂質部分は、ソルターゼＡ媒介脂質化を使用してＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドに結合される。ソルターゼＡ（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のＳｒｔＡ）は、Ｃａ２＋の存在下で、ペプチド転移反応を介して、分泌タンパク質を細菌の細胞壁ペプチドグリカンに共有結合する。この例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、Ｃ末端にＬＰＸＴＧモチーフ（例えば、ＬＰＥＴＧ）を含むように遺伝子操作され、脂質部分は、求核剤及びオリゴ－グリシンモチーフ（例えば、トリグリシン、テトラグリシンまたはペンタグリシン）を含む。ソルターゼを付加すると、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、ペプチド結合を介して脂質に共有結合される。
【0237】
一例では、脂質部分は、トランスグルタミナーゼ媒介脂質化を使用してＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドに結合される。トランスグルタミナーゼ（例えば、微生物由来トランスグルタミナーゼ：ＭＴＧ）は、Ｃａ２＋の非存在下でペプチドまたはタンパク質中のグルタミン残基とリジン残基の間の反応を触媒し、不可逆的な架橋を形成する。一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、例えばＮ末端またはＣ末端にＭＴＧリジン認識配列（例えば、ＭＲＨＫＧＳ）を含むように遺伝子操作され、脂質部分は、ＭＴＧグルタミン認識配列（例えば、ＬＬＱＧ）を含む。一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドは、例えばＮ末端またはＣ末端にＭＴＧグルタミン認識配列（例えば、ＬＬＱＧまたはＬＱ）を含むように遺伝子操作され、脂質部分は、ＭＴＧリジン認識配列（例えば、ＭＲＨＫＧＳ）を含む。
【0238】
Ｔａｋａｈａｒａ ＆ Ｋａｍｉｙａ（２０２０）に開示されている方法など、当業者に公知の他の酵素的脂質化方法を使用してもよい。
【0239】
追加の脂質
一例では、脂質ナノ粒子は、ＰＥＧ脂質、ステロール構造脂質及び／または中性脂質をさらに含む。一例では、脂質ナノ粒子は、ＰＥＧ脂質、ステロール構造脂質、イオン化可能な脂質及び／または中性脂質をさらに含む。一例では、脂質ナノ粒子はカチオン性脂質を含まない。
一例では、脂質ナノ粒子は、ＰＥＧ脂質、ステロール構造脂質及び／または中性脂質をさらに含む。一例では、脂質ナノ粒子は、ＰＥＧ脂質、ステロール構造脂質、イオン化可能な脂質及び／または中性脂質をさらに含む。一例では、脂質ナノ粒子はカチオン性脂質を含まない。
【0240】
ＰＥＧ脂質
一例では、本開示は、ＰＥＧ化脂質を含む脂質ナノ粒子を提供する。
一例では、本開示は、ＰＥＧ化脂質を含む脂質ナノ粒子を提供する。
【0241】
ＰＥＧ化脂質への言及が、ポリエチレングリコールで修飾された脂質であることは、当業者には明らかであろう。例示的なＰＥＧ化脂質としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、及びＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質及びそれらの組み合わせを含む。
【0242】
中性脂質
一例では、本開示は、中性脂質を含む脂質ナノ粒子を提供する。
一例では、本開示は、中性脂質を含む脂質ナノ粒子を提供する。
【0243】
本開示での使用に適した中性または両性イオン性脂質は当業者には明らかであり、例えば、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ １６．０ ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、及びスフィンゴミエリンが含まれる。脂質は飽和でも不飽和でもよい。
【0244】
構造脂質
一例では、本開示は、構造脂質を含む脂質ナノ粒子を提供する。
一例では、本開示は、構造脂質を含む脂質ナノ粒子を提供する。
【0245】
例示的な構造脂質としては、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、エルゴステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸及びα－トコフェロールが挙げられるが、これらに限定されない。
【0246】
一例では、構造脂質はステロールである。例えば、構造脂質はコレステロールである。別の例では、構造脂質はカンペステロールである。
【0247】
イオン化可能な脂質
一例では、本開示は、イオン化可能な脂質を含む脂質ナノ粒子を提供する。
一例では、本開示は、イオン化可能な脂質を含む脂質ナノ粒子を提供する。
【0248】
本開示での使用に適したイオン化可能な脂質は当業者には明らかであり、例えば、３－（ジドデシルアミノ）－Ｎ１，Ｎ１，４－トリドデシル－１－ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、Ｎ１－［２－（ジドデシルアミノ）エチル］－Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４－トリドデシル－１，４－ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、１４，２５－ジトリデシル－１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）－２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、（２Ｓ）－２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、２，５－ビス（（９ｚ，１２ｚ）－オクタデカ－９，１２，ジエン－１－イルオキシル）ベンジル－４－（ジメチルアミノ）ブノエート（ＬＫＹ７５０）、８－［（２－ヒドロキシエチル）［６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル］アミノ］－オクタン酸、１－オクチルノニルエステル（ヘプタデカン－９－イル８－［２－ヒドロキシエチル－（６－オキソ－６－ウンデコキシヘキシル）アミノ］オクタノエートとも呼ばれる）（ＳＭ－１０２）、２－ヘキシルデカン酸、１，１’－［［（４－ヒドロキシブチル）イミノ］ジ－６，１－ヘキサンジイル］エステル（（（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート）とも呼ばれる）（ＡＬＣ－０３１５）、４－（ジメチルアミノ）－ブタン酸、（１０Ｚ，１３Ｚ）－１－（９Ｚ，１２Ｚ）－９，１２－オクタデカジエン－１－イル－１０，１３－ノナデカジエン－１－イルエステル（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡまたはＭＣ３）、（（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート））、８－［（２－ヒドロキシエチル）［６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル］アミノ］－オクタン酸、１－オクチルノニルエステル及びそれらの組み合わせが含まれる。
【0249】
薬学的に許容される担体
適切には、本開示の脂質ナノ粒子を対象に投与するための組成物または方法において、脂質ナノ粒子は、当該技術分野で理解されているように、薬学的に許容される担体と組み合わされる。したがって、本開示の一例は、本開示の脂質ナノ粒子を薬学的に許容される担体と組み合わせて含む組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。
適切には、本開示の脂質ナノ粒子を対象に投与するための組成物または方法において、脂質ナノ粒子は、当該技術分野で理解されているように、薬学的に許容される担体と組み合わされる。したがって、本開示の一例は、本開示の脂質ナノ粒子を薬学的に許容される担体と組み合わせて含む組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。
【0250】
一般的に、「担体」とは、任意の対象、例えばヒトに安全に投与することができる固体または液体の充填剤、結合剤、希釈剤、封入物質、乳化剤、湿潤剤、溶媒、懸濁剤、コーティングまたは滑沢剤を意味する。特定の投与経路に応じて、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． Ｎ．Ｊ．ＵＳＡ，１９９１）に記載されているように、当該技術分野で公知の様々な許容可能な担体を使用することができる。
【0251】
本開示の脂質ナノ粒子は、予防的または治療的処置のために、非経口投与、局所性投与、経口投与もしくは局所投与、筋肉内投与、エアロゾル投与、または経皮投与に有用である。一例では、脂質ナノ粒子は、筋肉内、皮下または静脈内など、非経口的に投与される。例えば、脂質ナノ粒子は、筋肉内投与される。
【0252】
投与すべき脂質ナノ粒子の製剤化は、投与経路及び選択された製剤（例えば、溶液、エマルジョン、カプセル）に応じて変化する。投与すべき脂質ナノ粒子を含む適切な医薬組成物は、生理学的に許容される担体中で調製することができる。溶液またはエマルジョンの場合、適切な担体としては、例えば、生理食塩水及び緩衝媒体を含めて、水溶液またはアルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖リンゲル液、ブドウ糖及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液または固定油を挙げることができる。様々な適切な水性担体が当業者に公知であり、水、緩衝水、緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）、ブドウ糖溶液及びグリシンが挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、様々な添加剤、保存剤、流体、栄養補給剤または電解質補給剤を挙げることができる（一般に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ，Ｅｄ．１９８０を参照）。組成物は、生理的条件に近づけるために、必要に応じて、ｐＨ調整剤及び緩衝剤並びに毒性調整剤などの薬学的に許容される補助物質（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム及び乳酸ナトリウム）を任意に含むことができる。脂質ナノ粒子は、液体段階で保存することができ、または当該技術分野で公知の凍結乾燥及び再構成技術に従って、保存のために凍結乾燥し、使用前に適切な担体中で再構成することができる。
【0253】
選択された媒体中の活性成分（複数可）（すなわち、ＲＮＡ）の最適濃度は、当業者に公知の手順に従って経験的に決定することができ、また所望の最終的な医薬製剤に依存する。
【0254】
製剤化の際、本開示の組成物は、投与製剤に適合する方法で、かつ治療的／予防的に有効な量で投与される。本開示の脂質ナノ粒子の投与の用量範囲は、所望の効果を生み出すのに十分な量である。例えば、組成物は有効量の封入されたＲＮＡを含む。一例では、組成物は治療有効量のＲＮＡを含む。別の例では、組成物は予防有効量のＲＮＡを含む。
【0255】
用量は副作用を引き起こすほど多量であってはならない。一般に、投与量は、患者の年齢、状態、性別及び疾患の程度によって変化し、これは、当業者によって決定することができる。合併症が発生した場合には、個々の医師が投与量を調整することができる。
【0256】
ＲＮＡ
本開示は、ＲＮＡを送達するための脂質ナノ粒子を提供し、ここで、核酸結合タンパク質またはペプチドがＲＮＡに結合している。例えば、本開示は、ＲＮＡを送達するための脂質ナノ粒子を提供し、ここで脂質化された核酸結合タンパク質またはペプチドがＲＮＡに結合している。
本開示は、ＲＮＡを送達するための脂質ナノ粒子を提供し、ここで、核酸結合タンパク質またはペプチドがＲＮＡに結合している。例えば、本開示は、ＲＮＡを送達するための脂質ナノ粒子を提供し、ここで脂質化された核酸結合タンパク質またはペプチドがＲＮＡに結合している。
【0257】
本開示は、ＲＮＡを送達するための脂質ナノ粒子を提供し、ここで、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドがＲＮＡに結合している。例えば、本開示は、ＲＮＡを送達するための脂質ナノ粒子を提供し、ここで、脂質化されたＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドがＲＮＡに結合している。
【0258】
本開示のＲＮＡは、天然または非天然に存在するＲＮＡであってもよく、あるいは１つ以上の修飾された核酸塩基、ヌクレオシド、またはヌクレオチドを含んでもよい。本開示での使用に適したＲＮＡには、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、及び／またはコード配列もしくは翻訳配列も含まれ得ることは、当業者には明らかであろう。さらに、ＲＮＡは、５’キャップ構造、鎖終結ヌクレオチド、ステムループ（例えば、ヒストンステムループ）、３’テーリング配列（例えば、ポリアデニル化シグナルまたは１つ以上のポリＡテール）を含み得る。
【0259】
本開示の一例では、ＲＮＡは自己複製ｍＲＮＡ（ｓａ－ｍＲＮＡ）である。
【0260】
本開示の一例では、ＲＮＡは従来のｍＲＮＡ（ｃＲＮＡ）である。
【0261】
調製方法
本開示の脂質ナノ粒子の適切な調製方法は、当業者には明らかであり、及び／または本明細書に記載されている。例えば、本開示の脂質ナノ粒子は、製剤化分野で周知のアプローチを使用して作製することができる。例えば、適切なＬＮＰは、ヘリンボーンマイクロミキシング及び２つの流体の流れ（一方は、典型的には水溶液中にメッセンジャーＲＮＡを含有し、もう一方は、典型的にはエタノール中に様々な必要な脂質成分を有する）のＴ字ジャンクション混合を含めて、マイクロ流体工学などの混合プロセスを使用して形成することができる。
本開示の脂質ナノ粒子の適切な調製方法は、当業者には明らかであり、及び／または本明細書に記載されている。例えば、本開示の脂質ナノ粒子は、製剤化分野で周知のアプローチを使用して作製することができる。例えば、適切なＬＮＰは、ヘリンボーンマイクロミキシング及び２つの流体の流れ（一方は、典型的には水溶液中にメッセンジャーＲＮＡを含有し、もう一方は、典型的にはエタノール中に様々な必要な脂質成分を有する）のＴ字ジャンクション混合を含めて、マイクロ流体工学などの混合プロセスを使用して形成することができる。
【0262】
次に、ＬＮＰは、例えばエタノール中約５０ｍＭの濃度で、リン脂質（ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣなど、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬを含む商業的供給源から購入できる）、ＰＥＧ化脂質（ＰＥＧ－ＤＭＧとしても知られる１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロールメトキシポリエチレングリコールなど、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬを含む商業的供給源から購入できる）、及び構造脂質／ステロール（コレステロールなど、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈを含む商業供給源から購入できる）を混合することによって調製することができる。溶液は、保存中、例えば－２０℃で冷蔵する必要がある。様々な脂質を組み合わせて所望のモル比を得て、そして、水及びエタノールで、例えば約５．５ｍＭ～約２５ｍＭの最終的な所望の脂質濃度まで希釈することができる。
【0263】
ＲＮＡ（ｓａ－ｍＲＮＡまたはｃＲＮＡを含むが、これらに限定されない）を含むＬＮＰ組成物は、上記の脂質溶液とＲＮＡを含む溶液とを、例えば、約５：１～約５０：１の脂質成分対ＲＮＡの重量：重量比で混合することによって調製することができる。ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒマイクロ流体システムを使用して、約３ｍｌ／分～約１８ｍｌ／分の流速で脂質溶液をＲＮＡ溶液に迅速に注入して、水対エタノールの比が約１：１～約４：１の懸濁液を生成することができる。
【0264】
ｓａ－ｍＲＮＡまたはｃＲＮＡを含むＬＮＰ組成物の場合、脱イオン水中の１．０ｍｇ／ｍｌ濃度のＲＮＡ溶液を、ｐＨ３～６の５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液で希釈してストック溶液を形成することができる。
【0265】
当該技術分野で知られているように、ＬＮＰ組成物を、ｐＨ６の５０ｍＭクエン酸緩衝液中に１０倍希釈することによってさらに処理し、そして、元の体積に濃縮するまで、３００，０００分子量カットオフ膜（ｍＰＥＳ）を用いてタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）に供することができる。続いて、一例では、クエン酸緩衝液を、１０倍体積の新しい緩衝液によるダイアフィルトレーションを使用して、ｐＨ７．５の２０ｍＭトリス緩衝液、８０ｍＭ塩化ナトリウム、及び３％スクロースを含有する緩衝液と置き換えることができる。ＬＮＰ溶液を、例えば５～１０ｍＬの体積まで濃縮し、０．２ミクロンのＰＥＳシリンジフィルターを使用して濾過し、バイアルに等分し、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＣｏｏｌＣｅｌｌ（登録商標）ＬＸ細胞凍結容器を使用してサンプルが－８０℃に達するまで１℃／分で凍結することができる。サンプルは必要になるまで－８０℃で保存してもよい。
【0266】
上記の方法により、ナノ沈殿と粒子形成が引き起こされる。Ｔ字ジャンクション及び直接注入を含むがこれらに限定されない代替プロセスを使用して、同じナノ沈殿を達成することができる。
【0267】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ製剤の脂質成分は、約２モル％～約２５モル％のリン脂質（中性脂質）、約１８．５モル％～約６０モル％の構造脂質（ステロール）、及び約０．２モル％～約１０モル％のＰＥＧ化脂質を含み、ただし、総モル％は１００％を超えない。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ製剤の脂質成分は、約５モル％～約２０モル％のリン脂質、約３０モル％～約５５モル％の構造脂質、及び約１モル％～約５モル％のＰＥＧ化脂質を含む。特定の実施形態では、脂質成分は、約１０モル％のリン脂質、約４８モル％の構造脂質、及び約２．０モル％のＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態では、リン脂質はＤＯＰＥまたはＤＳＰＣであり得る。他の実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ－ＤＭＧであってもよく、及び／または構造脂質はコレステロールであってもよい。
【0268】
ＬＮＰ内のＲＮＡの封入効率は、少なくとも５０％、例えば、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であり得る。いくつかの実施形態では、封入効率は少なくとも８０％であり得る。特定の実施形態では、封入効率は少なくとも９０％であり得る。
【0269】
本開示の脂質ナノ粒子のアッセイ
当該技術分野で公知の方法及び／または以下に記載の方法を使用して、物理的及び生物学的活性及び／または安定性について本開示の脂質ナノ粒子を容易にスクリーニングする。
当該技術分野で公知の方法及び／または以下に記載の方法を使用して、物理的及び生物学的活性及び／または安定性について本開示の脂質ナノ粒子を容易にスクリーニングする。
【0270】
ＲＮＡ分解の評価
一例では、ＲＮａｓｅによるＲＮＡ分解のレベルが評価される。例えば、ＲＮＡは、単独で、またはＲＮＡ結合タンパク質もしくはペプチドと組み合わせて、ＲＮａｓｅで処理される。
一例では、ＲＮａｓｅによるＲＮＡ分解のレベルが評価される。例えば、ＲＮＡは、単独で、またはＲＮＡ結合タンパク質もしくはペプチドと組み合わせて、ＲＮａｓｅで処理される。
【0271】
一例では、ＲＮＡのレベルは、リアルタイムＰＣＲを使用して、ＲＮＡｓｅ処理済みサンプル及び未処理サンプルにおいて評価される。一例では、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドを含まないＲＮＡサンプルにおけるサイクル閾値（ＣＴ）値は、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドを含むＲＮＡサンプルと比較して増加しており、これは、ＲＮＡ分解を示す。
【0272】
ＲＮＡ翻訳の評価
一例では、ＲＮＡ翻訳は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系を使用して評価される。本開示で使用するのに適した系は当業者には明らかであり、例えばウサギ網状赤血球溶解物アッセイが含まれる。
一例では、ＲＮＡ翻訳は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系を使用して評価される。本開示で使用するのに適した系は当業者には明らかであり、例えばウサギ網状赤血球溶解物アッセイが含まれる。
【0273】
一例では、ウサギ網状赤血球溶解物アッセイが使用される。
【0274】
一例では、ＲＮＡは、ＲＮＡ結合タンパク質またはペプチドの存在下または非存在下で評価される。
【0275】
一例では、ＲＮＡはナノルシフェラーゼＲＮＡ（ｎＬｕｃ ＲＮＡ）であり、ＲＮＡ翻訳の量は、相対発光量（ＲＬＵ）で発光を測定することにより評価したルシフェラーゼ産生量によって測定される。一例では、アッセイは４℃、２４℃及び／または３７℃で行われる。別の例では、アッセイは、サンプルを０時間、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間または９６時間インキュベートした後に行われる。
【0276】
ＴＬＲ誘導の評価
一例では、ＴＬＲ３及び／またはＴＬＲ８誘導のレベルが評価される。例えば、ＲＮＡ単独、またはＲＮＡ結合タンパク質もしくはペプチドと組み合わせたＲＮＡによるＴＬＲ３及び／またはＴＬＲ８誘導のレベルが評価される。一例では、ＴＬＲ３及び／またはＴＬＲ８誘導は、ＴＬＲ誘導ＮｆＫＢレポーターアッセイを使用して評価される。このアッセイでは、ＮｆＫＢは分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）に操作的に連結されている。ＲＮＡは、いずれかの細胞型（条件付き形質導入されたＴＬＲ３または条件付き形質導入されたＴＬＲ８）に導入される。ＴＬＲ受容体の結合は、ＮｆＫＢ活性化を誘導し、ひいてはＳＥＡＰを誘導する。一例では、ＳＥＡＰレベルは、化学反応及び発熱量の読み出しによって決定される。
一例では、ＴＬＲ３及び／またはＴＬＲ８誘導のレベルが評価される。例えば、ＲＮＡ単独、またはＲＮＡ結合タンパク質もしくはペプチドと組み合わせたＲＮＡによるＴＬＲ３及び／またはＴＬＲ８誘導のレベルが評価される。一例では、ＴＬＲ３及び／またはＴＬＲ８誘導は、ＴＬＲ誘導ＮｆＫＢレポーターアッセイを使用して評価される。このアッセイでは、ＮｆＫＢは分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）に操作的に連結されている。ＲＮＡは、いずれかの細胞型（条件付き形質導入されたＴＬＲ３または条件付き形質導入されたＴＬＲ８）に導入される。ＴＬＲ受容体の結合は、ＮｆＫＢ活性化を誘導し、ひいてはＳＥＡＰを誘導する。一例では、ＳＥＡＰレベルは、化学反応及び発熱量の読み出しによって決定される。
【実施例】
【0277】
実施例１：ＲＮａｓｅによる分解からのＲＮＡの保護
ＭＰＨをＲＮａｓｅで処理することによってＲＮＡフリー一価プールハーベスト（ＭＰＨ）を調製した。
ＭＰＨをＲＮａｓｅで処理することによってＲＮＡフリー一価プールハーベスト（ＭＰＨ）を調製した。
【0278】
ＲＮａｓｅ Ａ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＭＰＨ（Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４）を３７℃で１時間、２回処理した。１４０μｌの処理済み及び未処理ＭＰＨ（６０μｌ中に溶出）からＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲを使用して赤血球凝集素（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）ＲＮＡについて試験した。結果は、ＨＡ ＲＮＡのＣＴ値が増加せず、ＮＡ ＲＮＡのＣＴ値がわずかに増加したことを示し（表２、実験１Ａ）、これは、ウイルスＲＮＡの分解が最小限であることを示した。
【0279】
ＲＮａｓｅが不活性である場合には、ＲＮＡの抽出と分析の前に、異なるＲＮａｓｅ（ＲＮａｓｅ ＯＮＥ、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍ４２６１）を使用してＭＰＨを２回処理した。ＨＡ及びＮＡ ＲＮＡの両方のＣＴ値が増加し（表２、実験１Ｂ）、これは、存在するウイルスＲＮＡの量の減少（＜８３倍）を示した。
【0280】
ＲＮａｓｅ ＯＮＥサンプル緩衝液の存在下でＲＮａｓｅ ＯＮＥの用量を減らして使用してＭＰＨ（１８０μｌ）のさらなるサンプルを２回処理した。処理済みサンプルの分析では、用量依存的にＲＮＡ濃度が減少し、ＣＴ値が増加することが示され（表２、実験１Ｃ）、これは、ＭＰＨをＲＮａｓｅ ＯＮＥで処理すると、ＲＮＡの分解レベルが低いことを示した（＜３５倍）。全体として、処理済みＭＰＨにおけるＲＮＡの分解レベルは予想外に低かった。
【0281】
次に、ＭＰＨ（Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４）を、破壊緩衝液の存在下または非存在下でＲＮａｓｅ ＯＮＥで処理した。破壊緩衝液の使用は、ＲＮａｓｅで処理したＭＰＨにおけるウイルスＲＮＡの分解を増加させなかった（表２、実験２）。
【0282】
ＭＰＨをＲＮａｓｅで処理すると、ウイルスＲＮＡのみがわずかに減少し、これは、ＲＮＡをＲＮａｓｅによる分解から保護する可能性を示した。
【表2】
【0283】
実施例２：インフルエンザウイルスからのＲＮＡフリー核タンパク質の精製
透析、濃縮、及び界面活性剤処理を行い、続いてグリセロール段階勾配遠心分離を行ってＮＰ：ＲＮＡ粒子を単離することにより、インフルエンザウイルスからＲＮＡフリー核タンパク質（ＮＰ）を単離した。ＲＮＡフリーＮＰを単離するために、さらなるグリセロール及び塩化セシウム勾配遠心分離工程を実施した。
透析、濃縮、及び界面活性剤処理を行い、続いてグリセロール段階勾配遠心分離を行ってＮＰ：ＲＮＡ粒子を単離することにより、インフルエンザウイルスからＲＮＡフリー核タンパク質（ＮＰ）を単離した。ＲＮＡフリーＮＰを単離するために、さらなるグリセロール及び塩化セシウム勾配遠心分離工程を実施した。
【0284】
実施例３：ＲＮＡフリーＮＰがＲＮＡに結合する
ＲＮＡフリーＮＰがＲＮＡを保護するか否かを評価するために、ＮＰをナノルシフェラーゼｍＲＮＡと組み合わせ、サンプルを４０℃に加熱するか、または室温でインキュベートした後、ＭＯＰＳ－アガロースゲル電気泳動によって分析した。ｍＲＮＡの濃度（２５０ｎｇ）を維持しながら、反応中のＮＰの濃度を増加させると（０から４０００ｎｇ）、検出可能なｍＲＮＡのレベルはより高い分子量にシフトした。
ＲＮＡフリーＮＰがＲＮＡを保護するか否かを評価するために、ＮＰをナノルシフェラーゼｍＲＮＡと組み合わせ、サンプルを４０℃に加熱するか、または室温でインキュベートした後、ＭＯＰＳ－アガロースゲル電気泳動によって分析した。ｍＲＮＡの濃度（２５０ｎｇ）を維持しながら、反応中のＮＰの濃度を増加させると（０から４０００ｎｇ）、検出可能なｍＲＮＡのレベルはより高い分子量にシフトした。
【0285】
１６：１（ＮＰ ４０００Ｎｇ、ｍＲＮＡ ２５０ｎｇ）の比率では、ナノルシフェラーゼｍＲＮＡはゲルに入ることができないようにシフトされた。これらの結果は、ＮＰ濃度が増加すると、ＲＮＡと複合体を形成できるＮＰの量が増加することを示す。
【0286】
ウサギ網状赤血球溶解物をｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系として使用したところ、１６：１（ＮＰ ４０００ｎｇ、ｍＲＮＡ ２５０ｎｇ）の比率では、相対発光量（ＲＬＵ）で発光を測定することにより評価したルシフェラーゼ産生量は、ルシフェラーゼＲＮＡ単独に匹敵するが、４０００ｎｇのＮＰ単独ではシグナルが２～３分の１に減少することが示された（図１）。これらの結果は、ＮＰ濃度が増加した場合、ＲＮＡはｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を阻害することなくＮＰに結合することを示す。
【0287】
実施例４：ＲＮＡフリーＮＰがＲＮＡを分解から保護する
ＲＮＡフリーＮＰがＲＮＡを保護するか否かを評価するために、ＮＰ：ＲＮＡ及びＲＮＡ単独をＲＮａｓｅアッセイで評価した。簡単に説明すると、ＮＰ：ＲＮＡまたはＲＮＡをＲＮａｓｅで処理し、３０℃で５～１０分間インキュベートした。サンプルを、１μｌの熱不安定性プロテイナーゼＫ（ＰＫ、ＮＥＢ Ｐ８１１１Ｓ）を使用してまたは使用せずにさらに処理した。反応物を３７℃で１５～３０分間インキュベートし、続いて６０℃で１０～２０分間インキュベートしてＰＫを不活化した。必要に応じて、１～２μｌのＲＮａｓｉｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｎ２６１１）を添加した。リアルタイムＰＣＲを使用して、処理済みサンプル及び未処理サンプルにおいて存在するＲＮＡのレベルを評価した。
ＲＮＡフリーＮＰがＲＮＡを保護するか否かを評価するために、ＮＰ：ＲＮＡ及びＲＮＡ単独をＲＮａｓｅアッセイで評価した。簡単に説明すると、ＮＰ：ＲＮＡまたはＲＮＡをＲＮａｓｅで処理し、３０℃で５～１０分間インキュベートした。サンプルを、１μｌの熱不安定性プロテイナーゼＫ（ＰＫ、ＮＥＢ Ｐ８１１１Ｓ）を使用してまたは使用せずにさらに処理した。反応物を３７℃で１５～３０分間インキュベートし、続いて６０℃で１０～２０分間インキュベートしてＰＫを不活化した。必要に応じて、１～２μｌのＲＮａｓｉｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｎ２６１１）を添加した。リアルタイムＰＣＲを使用して、処理済みサンプル及び未処理サンプルにおいて存在するＲＮＡのレベルを評価した。
【0288】
図２に示すように、ＲＮａｓｅで処理したＮＰ：ＲＮＡではＣＴ値の増加はなく、これは、ウイルスＲＮＡの分解がないことを示す。対照的に、ＲＮａｓｅ単独で処理したＲＮＡのＣＴ値は有意に増加し（ｐ＝０．０００５）、これは、存在するウイルスＲＮＡの量の減少を示した。これらの結果は、ＮＰの存在下で、ＲＮＡがＲＮａｓｅによる分解から保護されることをさらに確認する。
【0289】
ＮＰを分解するＰＫをＮＰ：ＲＮＡに添加すると、ＣＴ値のわずかな増加が示され、これは、ＲＮＡの分解が最小限であることを示した。ＲＮａｓｅと組み合わせてＰＫを添加すると、ＣＴ値の有意な増加（＜０．０００１）が示され、これは、存在するウイルスＲＮＡの量の減少を示した。これらの結果は、ＮＰの存在下で、ＲＮＡがＲＮａｓｅによる分解から保護されることをさらに確認する。
【0290】
実施例５：ＲＮＡフリーＮＰが４℃、２４℃、及び３７℃でＲＮＡを分解から保護する
ナノルシフェラーゼＲＮＡ（ｎＬｕｃ ＲＮＡ）を保護するＮＰの能力が温度依存性であるか否かを評価するために、ＮＰ：ｎＬｕｃ ＲＮＡ及びｎＬｕｃ ＲＮＡを４℃、２４℃、及び３７℃で最大９６時間インキュベートし、ＲＬＵで発光を測定することによってルシフェラーゼ産生量を評価した。
ナノルシフェラーゼＲＮＡ（ｎＬｕｃ ＲＮＡ）を保護するＮＰの能力が温度依存性であるか否かを評価するために、ＮＰ：ｎＬｕｃ ＲＮＡ及びｎＬｕｃ ＲＮＡを４℃、２４℃、及び３７℃で最大９６時間インキュベートし、ＲＬＵで発光を測定することによってルシフェラーゼ産生量を評価した。
【0291】
図３に示すように、４℃ではＮＰ：ｎＬｕｃ ＲＮＡとｎＬｕｃ ＲＮＡ単独の間でＲＬＵに有意な差はなかった。２４℃では、ＮＰ：ｎＬｕｃ ＲＮＡと比較して、インキュベーション後９６時間でｎＬｕｃ ＲＮＡのＲＬＵに顕著な減少が見られ（ｐ＝０．００３４）、これは、ＮＰにより分解からＲＮＡが保護されていることを示した。３７℃で８時間後、ＮＰ：ｎＬｕｃ ＲＮＡと比較してｎＬｕｃ ＲＮＡのＲＬＵが顕著に減少し、これは、ＮＰによるＲＮＡのさらなる長期保護を実証した。
【0292】
実施例６：ＲＮＡフリーＮＰがＴＬＲ誘導を保護する
ＮＰの存在がｄｓＲＮＡまたはｓｓ ＲＮＡのＲＮＡ誘導、ＴＬＲ３及び／またはＴＬＲ８誘導を阻害するか否かを評価するために、ＴＬＲ誘導ＮｆＫＢレポーターアッセイを使用した。このアッセイでは、ＮｆＫＢは分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）に操作的に連結されている。ＲＮＡは、いずれかの細胞型（条件付き形質導入されたＴＬＲ３または条件付き形質導入されたＴＬＲ８）に導入される。ＴＬＲ受容体の結合は、ＮｆＫＢ活性化を誘導し、ひいてはＳＥＡＰを誘導する。ＳＥＡＰレベルは、化学反応及び発熱量の読み出しによって決定することができる。
ＮＰの存在がｄｓＲＮＡまたはｓｓ ＲＮＡのＲＮＡ誘導、ＴＬＲ３及び／またはＴＬＲ８誘導を阻害するか否かを評価するために、ＴＬＲ誘導ＮｆＫＢレポーターアッセイを使用した。このアッセイでは、ＮｆＫＢは分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）に操作的に連結されている。ＲＮＡは、いずれかの細胞型（条件付き形質導入されたＴＬＲ３または条件付き形質導入されたＴＬＲ８）に導入される。ＴＬＲ受容体の結合は、ＮｆＫＢ活性化を誘導し、ひいてはＳＥＡＰを誘導する。ＳＥＡＰレベルは、化学反応及び発熱量の読み出しによって決定することができる。
【0293】
図４に示すように、ＲＮＡ単独はＴＬＲ３とＴＬＲ８の両方の誘導を刺激し、ＮＰの存在はインキュベーション後２時間及び４時間の両方でＴＬＲ３及びＴＬＲ８の誘導を減少させる。
【0294】
実施例７：ＲＮＡフリーＮＰとマレイミド－ＤＳＰＥ脂質との結合
１０％エタノールの存在下でＮＰ（０．８５ｍｇ／ｍｌ）をＤＳＰＥ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホリルエタノールアミン、８ｍＭ）とともにインキュベートすることにより、ＮＰをマレイミド－ＤＳＰＥと結合させた。標識されたＮＰと標識されていないＮＰを非還元ゲル上で泳動して、タンパク質の分子量を評価し、タンパク質とＮＰの分子量シフトとの結合を確認した。さらに、ＤＳＰＥは懸濁液（すなわち、リポソーム）を形成するため、組成物を遠心分離し、上清を評価した。
１０％エタノールの存在下でＮＰ（０．８５ｍｇ／ｍｌ）をＤＳＰＥ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホリルエタノールアミン、８ｍＭ）とともにインキュベートすることにより、ＮＰをマレイミド－ＤＳＰＥと結合させた。標識されたＮＰと標識されていないＮＰを非還元ゲル上で泳動して、タンパク質の分子量を評価し、タンパク質とＮＰの分子量シフトとの結合を確認した。さらに、ＤＳＰＥは懸濁液（すなわち、リポソーム）を形成するため、組成物を遠心分離し、上清を評価した。
【0295】
その後、脂質化されたＮＰ：ＲＮＡは遠心分離によってプルダウンすることができるが、脂質の存在下（すなわち、ＮＰの存在下ではない）で、ＲＮＡ単独はプルダウンできないことが示された。
【0296】
実施例８：ＣＯＶＩＤヌクレオカプシドがＲＮＡを保護する
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のＲＮＡフリーヌクレオカプシド（ＮＰ（ＳＣｏＶ２））を、インフルエンザウイルスについて上述したように精製した。ｎＬｕｃ ＲＮＡを分解から保護するＮＰ（ＳＣｏＶ２）の能力を、最大１６８時間ＲＬＵで発光を測定することにより評価したルシフェラーゼ産生量を測定することによってｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系で評価した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のＲＮＡフリーヌクレオカプシド（ＮＰ（ＳＣｏＶ２））を、インフルエンザウイルスについて上述したように精製した。ｎＬｕｃ ＲＮＡを分解から保護するＮＰ（ＳＣｏＶ２）の能力を、最大１６８時間ＲＬＵで発光を測定することにより評価したルシフェラーゼ産生量を測定することによってｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系で評価した。
【0297】
図５に示すように、時間の経過とともにｎＬｕｃ ＲＮＡ単独のＲＬＵが減少し、これは、ｎＬｕｃ ＲＮＡの分解を示した。１６：１及び８：１（ｗ／ｗ）でＮＰ（ＳＣｏＶ２）：ｎＬｕｃ ＲＮＡ組成物のＲＬＵがわずかに減少したように見え、これはＲＮＡの分解を示唆したが、各時点でのＮＰ（ＳＣｏＶ２）：ｎＬｕｃ ＲＮＡ物質のＰＣＲ分析により、ＲＮＡが無傷で分解されていないことが確認された。
【0298】
さらに、ＮＰ（ＳＣｏＶ２）に封入されたＲＮＡのアクセス可能性を、リボグリーン色素排除アッセイを使用して評価した。図５Ｂに示すように、ＮＰ（ＳＣｏＶ２）の濃度が増加すると、ｎＬｕｃ ＲＮＡへの色素の結合が妨げられるが、蛍光シグナルに基づくと、１６：１の比率（ＮＰ ４０００ｎｇ、ｍＲＮＡ ２５０ｎｇ）で、依然として色素がＲＮＡにアクセス可能である。これは、ＮＰ（ＳＣｏＶ２）がＲＮＡをコーティングして保護するが、ＲＮＡを完全には封入しないことを示唆する。
【0299】
実施例９：ＲＮＡ結合ペプチドの調製
細胞及びウイルスのタンパク質配列を調べて、ＲＮＡに結合する可能性のあるタンパク質ドメイン及びペプチド配列を同定した。細胞タンパク質からの配列は、細胞増殖、細胞シグナル伝達、及び／または抗ウイルス経路に関連するタンパク質と相関するが、ウイルスタンパク質からの配列は非構造タンパク質及び核タンパク質に由来する。
細胞及びウイルスのタンパク質配列を調べて、ＲＮＡに結合する可能性のあるタンパク質ドメイン及びペプチド配列を同定した。細胞タンパク質からの配列は、細胞増殖、細胞シグナル伝達、及び／または抗ウイルス経路に関連するタンパク質と相関するが、ウイルスタンパク質からの配列は非構造タンパク質及び核タンパク質に由来する。
【0300】
ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質（ＴＲＢＰ）、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ－３）、及びＴＬＲ－７を含む細胞タンパク質に由来する配列からペプチドを設計した（表３）。ウイルスＲＮＡ結合タンパク質には、インフルエンザ由来の核タンパク質及び非構造タンパク質が含まれていた（表４）。
【0301】
ＲＮＡ結合ペプチド配列を、既知の核局在化シグナルを除外するか、またはペプチド結合ＲＮＡが細胞に導入されたときにこの物質の正確な局在化を促進するために核外搬出シグナルを含むように修飾した（表３）。
【表3】
【表4】
【0302】
実施例１０：ＲＮＡ結合ペプチドの存在下における分解からのＲＮＡの保護
ＲＮＡ結合ペプチド（ＲＢＰ）がＲＮＡを保護するか否かを評価するために、リアルタイムＰＣＲを使用してＲＢＰ：ＲＮＡ及びナノルシフェラーゼ（ｎＬｕｃ）ＲＮＡ単独を評価し、ＲＮａｓｅ処理後に残存するｎＬｕｃ ＲＮＡのレベルを示した。評価したＲＢＰは、ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質（ＴＲＢＰ）ドメインＡ及びＢ、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）ドメインＡ及びＢ、インフルエンザ非構造タンパク質（ＮＳ ＲＢＤ）ドメインＡ、Ｂ、及びＣ、Ｔｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ－７）ＴＬＲ－７であった。
ＲＮＡ結合ペプチド（ＲＢＰ）がＲＮＡを保護するか否かを評価するために、リアルタイムＰＣＲを使用してＲＢＰ：ＲＮＡ及びナノルシフェラーゼ（ｎＬｕｃ）ＲＮＡ単独を評価し、ＲＮａｓｅ処理後に残存するｎＬｕｃ ＲＮＡのレベルを示した。評価したＲＢＰは、ＴＡＲ ＲＮＡ結合タンパク質（ＴＲＢＰ）ドメインＡ及びＢ、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）ドメインＡ及びＢ、インフルエンザ非構造タンパク質（ＮＳ ＲＢＤ）ドメインＡ、Ｂ、及びＣ、Ｔｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ－７）ＴＬＲ－７であった。
【0303】
簡単に説明すると、ＲＢＰとＮＬｕｃ ＲＮＡを混合し、３７℃で１時間インキュベートすることによってＲＢＰ：ＲＮＡサンプルを調製した。次に、ＲＢＰ：ＲＮＡ及びＮＬｕｃ ＲＮＡのサンプルを、ＲＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍ４２６Ａ）を使用して、及び使用せずに調製した。ＲＮａｓｅで処理したサンプルを室温で３０分間インキュベートした。リアルタイムＰＣＲを使用して、処理済みサンプル及び未処理サンプルにおいて存在するＲＮＡのレベルを評価した。
【0304】
ＳＹＢＲ－ｇｒｅｅｎ（ＱｕａｎｔｉＮｏｖａ ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＲＴ－ＰＣＲ ｋｉｔ ＃２０８１５２）の存在下でリアルタイムＰＣＲを実施した。
【0305】
ＣＴ値を比較し（表５）、保護率を計算した。図６に示すように、ＮＳ ＲＢＤＣ、ＴＲＢＰ ＲＢＤＡ、及びＴＲＢＰ ＲＢＤＢは、ＲＮａｓｅ分解からＲＮＡを保護するレベルを示した。残りの結合ドメインは、残存ＲＮＡが非ペプチド結合ＲＮＡのレベルを下回ることを示した。
【表5】
【0306】
ＨＢＶ、デング熱、ＲＳＶ、Ａ型インフルエンザも評価した（図７）。データは、ＲＮａｓｅを添加するとＨＢＶ結合がＲＮＡを保護することを示す。しかし、組換えデング熱は、非保護的であるＲＳＶと同様の転写を許可しない。組換えＡ型及びＢ型インフルエンザＮＰは部分的にしか保護しない。
【0307】
実施例１１：ＲＮＡ：ＮＰのｉｎ ｖｉｖｏ発現
ＮＰ：ＲＮＡが細胞内で翻訳され得るか否かを評価するために、Ｈｅｌａ細胞をＮＰ：ＲＮＡまたはｎＬｕｃ ＲＮＡ単独でトランスフェクトした。簡単に説明すると、１０ｎｇ／ウェルのＮＰ：ＲＮＡまたはｎＬｕｃ ＲＮＡをリポフェクタミン３０００とともに細胞に添加した。トランスフェクションの２時間後に細胞を洗浄し、トランスフェクションの２４時間後にＲＬＵで発光を測定することによってｎＬｕｃ産生量を評価した。図８に示すように、ＮＰ：ＲＮＡはＨｅｌａ細胞で発現する。
ＮＰ：ＲＮＡが細胞内で翻訳され得るか否かを評価するために、Ｈｅｌａ細胞をＮＰ：ＲＮＡまたはｎＬｕｃ ＲＮＡ単独でトランスフェクトした。簡単に説明すると、１０ｎｇ／ウェルのＮＰ：ＲＮＡまたはｎＬｕｃ ＲＮＡをリポフェクタミン３０００とともに細胞に添加した。トランスフェクションの２時間後に細胞を洗浄し、トランスフェクションの２４時間後にＲＬＵで発光を測定することによってｎＬｕｃ産生量を評価した。図８に示すように、ＮＰ：ＲＮＡはＨｅｌａ細胞で発現する。
【0308】
図９に示すように、脾臓及び肝臓でもｎＬｕｃ ＲＮＡ発現を測定した。
【0309】
実施例１２：ＮＰ：ｍＲＮＡ ＬＮＰの製剤化
核タンパク質に結合したＲＮＡを使用して、及び使用せずにＬＮＰを調製した。核タンパク質が完全に封入されているか否かを判断するために、様々なＬＮＰ製剤を開発し（表６）、平均サイズ（Ｚ－Ａｖｅ）及び多分散性指数（ＰＤＩ）について分析した（表７）。核タンパク質を使用して、または使用せずＬＮＰを開発し、ＲＮＡをＬＮＰの内部（内部）または表面上（外部）に配置した。
核タンパク質に結合したＲＮＡを使用して、及び使用せずにＬＮＰを調製した。核タンパク質が完全に封入されているか否かを判断するために、様々なＬＮＰ製剤を開発し（表６）、平均サイズ（Ｚ－Ａｖｅ）及び多分散性指数（ＰＤＩ）について分析した（表７）。核タンパク質を使用して、または使用せずＬＮＰを開発し、ＲＮＡをＬＮＰの内部（内部）または表面上（外部）に配置した。
【表6】
【表7】
【0310】
実施例１３：ＮＰ：ＬＮＰ熱安定性
ＮＰ：ＬＮＰ製剤の経時的な安定性を評価するために、ＬＮＰのＺ平均直径を測定することによって注射後６０日及び９０日後に４℃でＬＮＰを評価した。図１０に示すように、ＮＰを含むＬＮＰは４℃で経時的に熱安定性を示した。
ＮＰ：ＬＮＰ製剤の経時的な安定性を評価するために、ＬＮＰのＺ平均直径を測定することによって注射後６０日及び９０日後に４℃でＬＮＰを評価した。図１０に示すように、ＮＰを含むＬＮＰは４℃で経時的に熱安定性を示した。
【0311】
実施例１４：ＬＮＰ ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ生体内分布
０：１．５、１５：１．５及び５０：１の生体内分布を評価するために、ＮＰを含むＬＮＰ製剤及びＮＰを含まないＬＮＰ製剤をマウスに筋肉内注射し、次に、注射後６日目の臓器の生体内分布を、各臓器１ｍｇあたりの発光シグナル（ＲＬＵ）量を測定することによって評価した。
０：１．５、１５：１．５及び５０：１の生体内分布を評価するために、ＮＰを含むＬＮＰ製剤及びＮＰを含まないＬＮＰ製剤をマウスに筋肉内注射し、次に、注射後６日目の臓器の生体内分布を、各臓器１ｍｇあたりの発光シグナル（ＲＬＵ）量を測定することによって評価した。
【0312】
図１１に示すように、ＮＰ：ｍＲＮＡまたはｎＬｕｃ ｍＲＮＡ単独を配合したＬＮＰは、流入リンパ節及び非流入リンパ節、脾臓、肝臓及び筋肉で検出された。ｍＲＮＡ－ＬＮＰと比較した場合、１５：１．５ ＮＰ－ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤を投与されたマウスの流入リンパ節及び非流入リンパ節並びに肝臓でＲＬＵの増加が観察された。
【0313】
ＬＮＰ内の窒素（Ｎ）対リン酸（Ｐ）比（Ｎ／Ｐ）を変更する効果も評価した。図１２に示すように、３、４．５、及び６のＮ／Ｐ比が、ＬＮＰサイズ（Ａ）及び封入効率（Ｂ）に及ぼす影響を評価した。生体内分布に対する影響も評価し、結果を図１２Ｃに示す。すべてのＮ／Ｐ比（３、４．５、及び６）で、他のすべての臓器におけるＬＮＰ－ｍＲＮＡ及びＮｕＰ－ＬＮＰ－ｍＲＮＡの同様の生体内分布が観察された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図11E】
【図11F】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【配列表】
【国際調査報告】