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▶ サイミューン セラピューティクス インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-04
(54)【発明の名称】胸腺細胞及びその製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20240927BHJP
A61K 35/26 20150101ALI20240927BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240927BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20240927BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240927BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20240927BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
A61K35/26
A61P35/00
A61P37/02
A61P37/06
A61P31/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024522229
(86)(22)【出願日】2022-10-13
(85)【翻訳文提出日】2024-05-31
(86)【国際出願番号】 US2022046551
(87)【国際公開番号】W WO2023064457
(87)【国際公開日】2023-04-20
(31)【優先権主張番号】63/256,443
(32)【優先日】2021-10-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/296,251
(32)【優先日】2022-01-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/321,136
(32)【優先日】2022-03-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/388,407
(32)【優先日】2022-07-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523483304
【氏名又は名称】サイミューン セラピューティクス インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(74)【代理人】
【識別番号】100221741
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 直子
(74)【代理人】
【識別番号】100114926
【弁理士】
【氏名又は名称】枝松 義恵
(72)【発明者】
【氏名】リム ビン
(72)【発明者】
【氏名】ジェラミ－ナイニ ベフザド
(72)【発明者】
【氏名】ドゥ チュウメイ
(72)【発明者】
【氏名】ワン スタン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065BC01
4B065BD25
4B065BD50
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB42
4C087MA55
4C087MA66
4C087MA67
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZB07
4C087ZB08
4C087ZB26
4C087ZB32
(57)【要約】
本開示は、多能性幹細胞の分化によって胸腺細胞を生成するための方法を提供する。本明細書では、胸腺細胞を含む細胞集団の組成物及び系統も提供される。本開示の方法は、胸腺細胞を維持する方法、及び本開示の胸腺細胞を使用する治療方法も含む。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
多能性幹細胞を胸腺細胞に分化させる方法であって、ａ．前記多能性幹細胞を胚体内胚葉（ＤＥ）細胞に分化させるステップと、
ｂ．前記ＤＥ細胞を培養し、且つ、前記ＤＥ細胞をＢＭＰ阻害物質、ＴＧＦβ阻害物質、ＦＧＦ、アスコルビン酸、又はそれらの組み合わせと接触させるか又はインキュベートすることで前記ＤＥ細胞を前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）細胞に分化させるステップと、
ｃ．前記ＡＦＥ細胞を培養し、且つ、前記前方前腸細胞を腹側咽頭内胚葉（ＶＰＥ）細胞に分化させるステップであって、
ｉ．前記ＡＦＥ細胞を、アスコルビン酸、レチノイン酸、ＦＧＦ、ＴＧＦβ阻害物質、又はそれらの組み合わせを含む第１ ＶＰＥ培地中で接触させるか又はインキュベートすることと、
ｉｉ．前記ＡＦＥ細胞を、ノギン、ＷＮＴ活性化物質、ＦＧＦ、レチノイン酸、アスコルビン酸、又はそれらの組み合わせを含む第２ ＶＰＥ培地中で接触させるか又はインキュベートすることと
を含む、
前記ステップと、
ｄ．前記ＶＰＥ細胞を培養し、且つ、前記ＶＰＥ細胞をアスコルビン酸、ＦＧＦ、ＢＭＰ、ＷＮＴ活性化物質、又はそれらの組み合わせと接触させるか又はインキュベートすることで前記ＶＰＥ細胞を胸腺細胞に分化させるステップと
を含み、
前記胸腺細胞が、胸腺上皮前駆（ＴＥＰ）細胞である、
前記方法。
【請求項2】
前記ＴＥＰをインターロイキン、ＷＮＴ活性化物質、ＲＡＮＫＬ、ＦＧＦ、ＢＭＰ、アスコルビン酸、又はそれらの組み合わせと接触させるか又はインキュベートすることで、前記ＴＥＰが更に、胸腺上皮細胞（ＴＥＣ）に分化する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ＤＥ細胞への多能性幹細胞の分化が、ａ．前記多能性幹細胞を第１成長培地中で接触させるか又は培養することであって、前記第１成長培地がアクチビンＡ、ＰＩ－１０３、ＣＨＩＲ９９０２１、又はそれらの組み合わせを含む、前記接触させるか又は培養することと、
ｂ．前記多能性幹細胞を第２成長培地中で培養して胚体内胚葉細胞を生成することであって、前記第２成長培地がアクチビンＡ、ＢＭＰ阻害物質、ＰＩ－１０３、ＣＨＩＲ９９０２１、又はそれらの組み合わせを含む、前記生成することと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
ステップｃ．ｉ．での前記第１ ＶＰＥ培地が、ＷＮＴ阻害物質を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
ステップｃ．ｉｉ．での前記第２ ＶＰＥ培地が、ＢＭＰ阻害物質、ＳＨＨ阻害物質、又はそれらの組み合わせを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記ＢＭＰ阻害物質が、ＬＤＮ１９３１８９である、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記ＴＧＦβ阻害物質が、ＳＢ４３１５４２である、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記ＦＧＦが、ＦＧＦ８ｂ、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１、ｂＦＧＦ、又はそれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記ＷＮＴ活性化物質が、ＣＨＩＲ９９０２１である、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記ＢＭＰが、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、又はそれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記インターロイキンが、ＩＬ２２である、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記ＷＮＴ阻害物質が、ＩＷＲ－１である、請求項４に記載の方法。
【請求項13】
前記ＢＭＰ阻害物質が、ＬＤＮ１９３１８９である、請求項５に記載の方法。
【請求項14】
前記ＳＨＨ阻害物質が、ＳＡＮＴ－１である、請求項５に記載の方法。
【請求項15】
前記多能性幹細胞、前記ＤＥ細胞、前記ＡＦＥ細胞、前記ＶＰＥ細胞、又は胸腺細胞が、３Ｄ培養物中で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
前記多能性幹細胞、前記ＤＥ細胞、前記ＡＦＥ細胞、前記ＶＰＥ細胞、又は胸腺細胞が、懸濁液中で凝集体として培養される、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
約１５日間～３０日間行われる、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
約１８日間～２５日間行われる、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
前記多能性幹細胞が、約５日間の間に胚体内胚葉細胞に分化する、請求項１に記載の方法。
【請求項20】
前記ＤＥ細胞が、約２日間～３日間の間にＡＦＥ細胞に分化する、請求項１に記載の方法。
【請求項21】
前記ＡＦＥ細胞が、前記第１ ＶＰＥ培地中で約２～４日間培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項22】
前記ＡＦＥ細胞が、前記第２ ＶＰＥ培地中で約２～３日間培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項23】
前記ＶＰＥ細胞が、約３～６日間の間に胸腺細胞に分化する、請求項１に記載の方法。
【請求項24】
前記ＴＥＰが、約４日間の間にＴＥＣに分化する、請求項２に記載の方法。
【請求項25】
請求項１から２４のいずれか１項に記載の方法に従って調製された、胸腺細胞の集団。
【請求項26】
請求項２５に記載の胸腺細胞の集団と、少なくとも１つの賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項27】
対象の状態を治療又は予防する方法であって、前記対象に、請求項２６に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、前記方法。
【請求項28】
前記状態が、前記対象の胸腺の機能の欠如、低下、若しくは異常、免疫不全、がん、自己免疫疾患、感染症、又は移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、に関連する状態である、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記医薬組成物が、非経口経路を介して前記対象に投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項30】
前記医薬組成物が、前記対象の１つ又は複数のリンパ節内に移植又は注射される、請求項２７に記載の方法。
【請求項31】
胸腺細胞の集団におけるＦＯＸＮ１発現を増加させる方法であって、ａ．前記胸腺細胞の集団を凍結するステップと、
ｂ．前記胸腺細胞の集団を解凍するステップと、
ｃ．凍結前の前記胸腺細胞の集団におけるＦＯＸＮ１の発現を測定及び比較し、且つ、前記胸腺細胞の集団を解凍した後のＦＯＸＮ１発現と比較するステップと
を含む、前記方法。
【請求項32】
前記ＦＯＸＮ１発現が、約１０倍～１００倍増加する、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記胸腺細胞の集団が、解凍後に懸濁液中で培養される、請求項３１に記載の方法。
【請求項34】
前記胸腺細胞の集団が、懸濁液中で凝集体として培養される、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記胸腺細胞が、胸腺上皮前駆細胞（ＴＥＰ）、胸腺上皮細胞（ＴＥＣ）、又はそれらの組み合わせを含む、請求項３１から３４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０２１年１０月１５日に出願した米国特許仮出願第６３／２５６，４４３号、２０２２年１月４日に出願した米国特許仮出願第６３／２９６，２５１号、２０２２年３月１８日に出願した米国特許仮出願第６３／３２１，１３６号、及び２０２２年７月１２日に出願した米国特許仮出願第６３／３８８，４０７号の優先権を主張し、それらの全ての内容が参照によって本出願に組み込まれる。
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０２１年１０月１５日に出願した米国特許仮出願第６３／２５６，４４３号、２０２２年１月４日に出願した米国特許仮出願第６３／２９６，２５１号、２０２２年３月１８日に出願した米国特許仮出願第６３／３２１，１３６号、及び２０２２年７月１２日に出願した米国特許仮出願第６３／３８８，４０７号の優先権を主張し、それらの全ての内容が参照によって本出願に組み込まれる。
【0002】
政府資金に関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）アレルギー感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）中小企業イノベーション研究（ＳＢＩＲ）により授与された助成金番号１Ｒ４４ＡＩ１７０２６６－０１の下で、政府の支援を得てなされたものである。政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）アレルギー感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）中小企業イノベーション研究（ＳＢＩＲ）により授与された助成金番号１Ｒ４４ＡＩ１７０２６６－０１の下で、政府の支援を得てなされたものである。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【0003】
背景
胸腺は免疫系において中心的な役割を果たす主要なリンパ器官である。胸腺の微小環境はリンパ球（例えばＴ細胞）のようなエフェクター細胞の成熟の発達のためのユニークな訓練場を提供する。当分野において周知のように、胸腺細胞とエフェクター細胞の間の複雑な相互作用はエフェクター細胞の表現型及び機能性を決めることができる。一部の胸腺細胞－エフェクター細胞相互作用は、胸腺細胞により発現された因子の認識によってエフェクター細胞の生存が促進されるように、調整される。それと対照的に、他の胸腺細胞－エフェクター細胞相互作用はエフェクター細胞の死を引き起こし得る。このような相互作用を制御することで、胸腺は、自己に対する寛容を確立しながら外来侵入者に対して活性化された免疫応答を開始できるエフェクター細胞のレパートリーを確立する上で極めて重要な役割を果たす。
胸腺は免疫系において中心的な役割を果たす主要なリンパ器官である。胸腺の微小環境はリンパ球（例えばＴ細胞）のようなエフェクター細胞の成熟の発達のためのユニークな訓練場を提供する。当分野において周知のように、胸腺細胞とエフェクター細胞の間の複雑な相互作用はエフェクター細胞の表現型及び機能性を決めることができる。一部の胸腺細胞－エフェクター細胞相互作用は、胸腺細胞により発現された因子の認識によってエフェクター細胞の生存が促進されるように、調整される。それと対照的に、他の胸腺細胞－エフェクター細胞相互作用はエフェクター細胞の死を引き起こし得る。このような相互作用を制御することで、胸腺は、自己に対する寛容を確立しながら外来侵入者に対して活性化された免疫応答を開始できるエフェクター細胞のレパートリーを確立する上で極めて重要な役割を果たす。
【0004】
胸腺細胞を生成するための改善された方法、及び機能的な胸腺上皮細胞に分化できる機能的な胸腺細胞が豊富な細胞集団はまだ求められている。
【発明の概要】
【0005】
概要
本開示は、胸腺細胞、胸腺細胞を製造する方法、及び／又は培養物中で胸腺細胞を維持する方法を提供する。
本開示は、胸腺細胞、胸腺細胞を製造する方法、及び／又は培養物中で胸腺細胞を維持する方法を提供する。
【0006】
本開示は、胸腺細胞への多能性幹細胞の分化を誘導するための方法を提供する。かかる方法は、前記多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させる複数のステップを含み得る。ＤＥ細胞は、培養し、且つ、ＢＭＰ阻害物質、ＴＧＦβ阻害物質、ＦＧＦ、アスコルビン酸、及び／又はそれらの組み合わせと接触させるか又はインキュベートすることで前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）細胞に分化することができる。ＡＦＥ細胞は、培養し、且つ、第１ ＶＰＥ培地中、及び／又は第２ ＶＰＥ培地中で培養することで腹側咽頭内胚葉（ＶＰＥ）細胞に分化することができる。前記第１ ＶＰＥ培地は、アスコルビン酸、レチノイン酸、ＦＧＦ、及び／又はＴＧＦβ阻害物質を含み得る。いくつかの実施形態において、第１ ＶＰＥ培地はＷＮＴ阻害物質を更に含み得る。前記第２ ＶＰＥ培地は、ノギン、ＷＮＴ活性化物質、ＦＧＦ、レチノイン酸、及び／又はアスコルビン酸を含み得る。いくつかの実施形態において、前記第２ ＶＰＥ培地は、ＢＭＰ阻害物質、ＳＨＨ阻害物質、又はそれらの組み合わせを更に含み得る。前記ＶＰＥ細胞は、アスコルビン酸、ＦＧＦ、ＢＭＰ、及び／又はＷＮＴ活性化物質と接触させるか又はインキュベートすることで、胸腺上皮前駆細胞（ＴＥＰ）等の胸腺細胞に更に分化することができる。
【0007】
いくつかの実施形態において、前記胸腺細胞は、胸腺上皮前駆細胞（ＴＥＰ）及び／又は胸腺上皮細胞（ＴＥＣ）であり得る。ＴＥＰは更に、インターロイキン、ＷＮＴ活性化物質、ＲＡＮＫＬ、ＦＧＦ、ＢＭＰ、及び／又はアスコルビン酸と培養することで、ＴＥＣに分化することができる。
【0008】
いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は、アクチビンＡ、ＰＩ－１０３、及び／又はＣＨＩＲ９９０２１を含有する第１成長培地中で多能性幹細胞を接触させるか又は培養することで、ＤＥ細胞に分化することができる。ＤＥ細胞への分化は、アクチビンＡ、ＢＭＰ阻害物質、ＰＩ－１０３、及び／又はＣＨＩＲ９９０２１を含有する第２成長培地中で細胞を培養することを更に含み得る。
【0009】
いくつかの実施形態において、ＢＭＰ阻害物質は、ＬＤＮ１９３１８９であり得る。いくつかの実施形態において、前記ＴＧＦβ阻害物質は、ＳＢ４３１５４２であり得る。いくつかの実施形態において、ＦＧＦは、ＦＧＦ８ｂ、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１、ｂＦＧＦ、又はそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、前記ＷＮＴ活性化物質は、ＣＨＩＲ９９０２１であり得る。いくつかの実施形態において、前記ＢＭＰは、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、又はそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、前記インターロイキンはＩＬ２２であり得る。いくつかの実施形態において、前記ＷＮＴ阻害物質は、ＩＷＲ－１であり得る。いくつかの実施形態において、前記ＢＭＰ阻害物質はＬＤＮ１９３１８９であり得る。いくつかの実施形態において、前記ＳＨＨ阻害物質はＳＡＮＴ－１であり得る。
【0010】
本開示の多能性幹細胞、ＤＥ細胞、ＡＦＥ細胞、ＶＰＥ細胞、又は胸腺細胞は、懸濁液中で培養してもよい。いくつかの実施形態において、前記多能性幹細胞、前記ＤＥ細胞、前記ＡＦＥ細胞、前記ＶＰＥ細胞、又は胸腺細胞は、懸濁液中で凝集体として培養してもよい。
【0011】
いくつかの実施形態において、前記多能性幹細胞、前記ＤＥ細胞、前記ＡＦＥ細胞、前記ＶＰＥ細胞、又は胸腺細胞は、固体基質に付着してもよい。いくつかの実施形態において、前記多能性幹細胞、前記ＤＥ細胞、前記ＡＦＥ細胞、前記ＶＰＥ細胞、又は胸腺細胞は、細胞外マトリックスベースの培地を含む固体基質に付着してもよい。
【0012】
本開示の方法は、約１５日間～３０日間行ってもよい。いくつかの実施形態において、前記方法は、約１８日間～２５日間行ってもよい。いくつかの実施形態において、前記多能性幹細胞は、約５日間の間に胚体内胚葉細胞に分化してもよい。いくつかの実施形態において、前記ＤＥ細胞は、約２日間～約３日間の間にＡＦＥ細胞に分化してもよい。いくつかの実施形態において、前記ＡＦＥ細胞は、約２～４日間の間に前記第１ ＶＰＥ培地中でＶＰＥ細胞に分化し、約２日間～３日間の間に前記第２ ＶＰＥ培地中でＶＰＥ細胞に分化してもよい。いくつかの実施形態において、前記ＶＰＥ細胞は、約３日間～１２日間の間に胸腺細胞に分化してもよい。
【0013】
本開示は、本明細書に記載の方法によって生成される胸腺細胞、例えば、ＴＥＰ及びＴＥＣも提供する。
【0014】
本明細書では、インビトロで胸腺細胞を培養する方法も提供される。かかる方法は、ＦＧＦ１０、ＢＭＰ４、ＦＧＦ８ｂ、ＣＨＩＲ９９０２１、及び／又はアスコルビン酸を含む胸腺細胞培地中で前記胸腺細胞を培養又はインキュベートするステップを含み得る。いくつかの実施形態において、前記胸腺細胞培地は、ＦＧＦ７及びＲＡＮＫＬを更に含み得る。前記方法は、懸濁液中で胸腺細胞を培養するステップも含み得る。非限定的な例として、前記胸腺細胞は、懸濁液中で凝集体として培養してもよい。
【0015】
いくつかの実施形態において、本開示は、胸腺細胞の集団におけるＦＯＸＮ１発現を増加させる方法を提供する。かかる方法は、前記胸腺細胞の集団を凍結するステップと、前記胸腺細胞の集団を解凍するステップと、凍結前の前記胸腺細胞の集団におけるＦＯＸＮ１の発現を測定及び比較し、且つ、前記胸腺細胞の集団を解凍した後のＦＯＸＮ１発現と比較するステップと、を含み得る。いくつかの実施形態において、ＦＯＸＮ１の発現は、約１０倍～１００倍増加し得る。前記胸腺細胞の集団は、懸濁液中で凝集体として培養してもよい。
【0016】
本明細書では、本明細書に記載の方法によって調製される胸腺細胞の集団を含む医薬組成物も提供される。本開示は、本開示の医薬組成物を投与することで対象の状態を治療又は予防する方法も提供する。いくつかの実施形態において、前記状態は、対象の胸腺の機能の欠如、低下、若しくは異常に関連する。前記状態は、免疫不全、がん、自己免疫疾患、感染症、又は移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）であり得る。いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、非経口的に投与される。例えば、前記組成物は、対象の１つ又は複数のリンパ節内に移植又は注射してもよい。
【図面の簡単な説明】
【0017】
上記の及び他の目的、特徴及び利点は、添付の図面に示すように、本開示の特定の実施形態の以下の説明から明らかになろう。図面は実物大である必要がなく、代わりに、本開示の様々な実施形態の原理を示すことに重点が置かれる。
【図1】胚体内胚葉（ＤＥ）の主要なバイオマーカー（ＳＯＸ１７及びＦＯＸＡ２）の発現レベルの頻度が増加する培養群１～４（Ｇ１～Ｇ４）を示す。
【図2-1】発生遺伝子の発現に対する成長因子ＢＭＰ４の効果を示す。
【図3-1】マトリゲル上へのプレーティング後のＴＥＣバイオマーカーの分析を示す。
【図4-1】凍結解凍サイクル後のＴＥＣバイオマーカー分析を示す。
【図5A】図５Ａ～５Ｄ：図５Ａは、異なる培養条件でのＨＯＸＡ３発現を示す。図５Ｂは、異なる培養条件でのＰＡＸ１発現を示す。図５Ｃは、異なる培養条件でのＰＳＭＢ１１発現を示す。図５Ｄは、異なる培養条件でのＦＯＸＮ１発現を示す。
【図6A】図６Ａ～６Ｂ：図６Ａは、ココード領域（左パネル）、非コード領域（中央パネル）を標的とするプライマー、及び外因的に発現されたＦＯＸＮ１のＨＡタグ（右パネル）を標的とするプライマーを使用したＦＯＸＮ１の発現を示す。図６Ｂは、トランスフェクション１日後（Ｄ１）又は２日後（Ｄ２）のモックトランスフェクト細胞又はＦＯＸＮ１標的細胞における、ＦＯＸＮ１標的遺伝子の発現を示す。
【図7】ｉＰＳＣ由来胸腺細胞の誘導体におけるＦＯＸＮ１の発現を示す。
【図8】実験２９及び実験３０の、誘導体におけるＦＯＸＮ１の発現を示す。
【図9】細胞を凍結解凍した後の、胸腺細胞におけるＦＯＸＮ１の発現を示す。
【図10A】図１０Ａ～１０Ｅ：図１０Ａ及び図１０Ｂは、胸腺細胞移植を受けたマウスにおけるＣＤ４５陽性細胞中のＣＤ８陽性細胞の百分率を示す。図１０Ｃ、図１０Ｄ及び図１０Ｅは、それぞれ、胸腺細胞移植を受けたマウスにおける異なる造血細胞の３週目、１１～１３週目、１４～１６週目での百分率を示す。
【図11-1】ＧＡＰＤＨに対する、様々なマーカーについてｑＰＣＲによって分析された胸腺細胞の分類された画分を示す。
【図13】末梢血中のＣＤ８＋又はＣＤ４＋細胞の頻度を示すヒストグラムである。
【図14】異なる胸腺細胞集団における様々なレベルのＦＯＸＮ１発現を示す。
【図15】ＶＰＥ段階での、細胞におけるＨＯＸＡ３及びＰａｘ９発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【0018】
詳細な説明
Ｉ、序論
胸腺上皮細胞はＴ細胞分化において重要である。本明細書に記載のように調製された胸腺細胞は、胸腺組織及び胸腺細胞の特性、例えば胸腺関連免疫機能の治療用途への利用を可能にすることができる。例えば、加齢に伴う免疫機能の低下は胸腺細胞の構成成分と機能的能力の変化によって引き起こされることが知られている。加えて、アンドロゲン及びエストロゲンを含む性ホルモンの変化により、胸腺自体は萎縮したり老化したりする。胸腺萎縮の発症は思春期の発症と同時に始まる可能性がある。従って、胸腺上皮細胞の再生は加齢に伴う免疫機能の低下を軽減する組成物及び方法を提供することができる。
Ｉ、序論
胸腺上皮細胞はＴ細胞分化において重要である。本明細書に記載のように調製された胸腺細胞は、胸腺組織及び胸腺細胞の特性、例えば胸腺関連免疫機能の治療用途への利用を可能にすることができる。例えば、加齢に伴う免疫機能の低下は胸腺細胞の構成成分と機能的能力の変化によって引き起こされることが知られている。加えて、アンドロゲン及びエストロゲンを含む性ホルモンの変化により、胸腺自体は萎縮したり老化したりする。胸腺萎縮の発症は思春期の発症と同時に始まる可能性がある。従って、胸腺上皮細胞の再生は加齢に伴う免疫機能の低下を軽減する組成物及び方法を提供することができる。
【0019】
ＩＩ、組成物
細胞
本開示の細胞は、胸腺細胞、エフェクター細胞、多能性幹細胞、それらの集団及びそれらに由来する細胞を制限なく含み得る。
細胞
本開示の細胞は、胸腺細胞、エフェクター細胞、多能性幹細胞、それらの集団及びそれらに由来する細胞を制限なく含み得る。
【0020】
いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、特定の個体又は対象に関して、自家性のもの、同種間のもの、同系間のもの又は異種間のものであり得る。いくつかの実施形態において、胸腺細胞はそれらの臨床応用から最終的に恩恵を受ける対象に関して、自家性のもの、同種間のもの、同系間のもの又は異種間のものであり得る。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は哺乳動物細胞、特に、ヒト細胞であり得る。細胞は、初代細胞又は不死化細胞系であり得る。いくつかの態様において、本開示の細胞は同系細胞源から調製又は由来し得る。本明細書に記載の任意の細胞は該当する細胞型のための当分野既知のマーカーによって特徴付けられ得る。
【0021】
胸腺細胞
胸腺細胞は、胸腺に由来する細胞又は胸腺の細胞になる予定の細胞と関連付けられた１つ又は複数の表現型又は遺伝子型マーカーを有する細胞であり得る。胸腺は、胚性、胎児／胎仔、又は成人胸腺であり得る。
胸腺細胞は、胸腺に由来する細胞又は胸腺の細胞になる予定の細胞と関連付けられた１つ又は複数の表現型又は遺伝子型マーカーを有する細胞であり得る。胸腺は、胚性、胎児／胎仔、又は成人胸腺であり得る。
【0022】
胸腺細胞はＴＥＣであり得るか、又はＴＥＣに由来し得る。胚発生中、ＴＥＣはＣＤ４５発現について陰性で上皮マーカーＥｐＣＡＭについて陽性である非造血細胞に由来し得る。ＴＥＣは皮質胸腺上皮細胞（ｃＴＥＣ）及び／又は髄質胸腺上皮細胞（ｍＴＥＣ）であり得る。ｍＴＥＣはサイトケラチン５（Ｋ５）及びサイトケラチン１４（Ｋ１４）発現を特徴とするが、サイトケラチン８（Ｋ８）発現のレベルが低いのに対して、ｃＴＥＣはＫ８及びＫ１８を発現する。いくつかの実施形態において、胸腺細胞はＫ５及びＫ８（Ｋ５＋Ｋ８＋）の両方とも発現するＴＥＣに由来し得る。いくつかの態様において、Ｋ５＋Ｋ８＋細胞はｍＴＥＣ及び／又はｃＴＥＣの前駆細胞であり得る。ｍＴＥＣは、Ｌｙ５１ではなく、細胞表面のハリエニシダ凝集素－１（ＵＥＡ－１）の発現にも陽性（例えば、ＵＥＡ－１＋Ｌｙ５１－）であり得るが、ｃＴＥＣはＵＥＡ－１－Ｌｙ５１＋であり得る。いくつかの実施形態において、胸腺細胞はｍＴＥＣであり得るか、又はそれに由来し得る。いくつかの実施形態において、ｍＴＥＣは例えばサイトケラチン５、サイトケラチン１４、ＵＥＡ－１、ＣＤ８０、カテプシンＬ、及び／又はカテプシンＳに限定されない高発現のマーカーを有し得る。いくつかの実施形態において、胸腺細胞は、例えばサイトケラチン８、サイトケラチン１８、Ｌｙ５１、ＣＤ２０５、カテプシンＬ及び／又は胸腺特異的セリンプロテアーゼに限定されない高発現のマーカーを有するｃＴＥＣであり得るか又はそれに由来し得る。非限定的な例として、胸腺細胞は、例えばＣＣＬ２５、及び／又はＫＲＴ５のようなマーカーを発現するｃＴＥＣであり得るか又はそれに由来し得る。ｍＴＥＣは、例えばＣＣＬ１９、ＫＲＴ８、及び／又はＡＩＲＥのようなマーカーを発現し得る。
【0023】
いくつかの実施形態において、胸腺細胞は、例えばＦＯＸＮ１、ＰＡＸ９、ＰＡＸ１、ＤＬＩＡ、ＩＳＬ１、ＥＹＡ１、ＳＩＸ１、ＩＬ７、Ｋ５、Ｋ８及びＡＩＲＥのような１つ又は複数のマーカーを発現するＴＥＣであり得るか又はそれに由来し得る。
【0024】
胸腺細胞は、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ． ２０２０ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ． ３６７， Ｉｓｓｕｅ ６４８０（その全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる）に記載の任意の細胞型であり得るか又はそれに由来し得る。例えば、胸腺細胞は、例えばＭＹＯＤ１及びＭＹＯＧ発現筋様細胞（本明細書ではＴＥＣ（ｍｙｏ）という）のような筋様細胞、及び／又はＮＥＵＲＯＤ１、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ－発現ＴＥＣＳ（本明細書ではＴＥＣ（ｎｅｕｒｏ）という）に由来し得る。
【0025】
胸腺細胞は、その全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれるＢａｕｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ． ２０２１ Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １２， １０９６に記載の細胞型に由来し得る。胸腺細胞は、Ｂａｕｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ． ２０２１に記載の「ｃＴＥＣ低」細胞であり得、より低いレベルの機能遺伝子（ＨＬＡクラスＩＩ）及びより多くのＫＩ６７＋－増殖細胞の含有を特徴とし得る。胸腺細胞は、Ｂａｕｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ． ２０２１に記載の「ｍＴＥＣ低」細胞に由来し得、ＣＬＤＮ４の発現、より低いレベルのＨＬＡクラスＩＩ、ＰＳＭＢ１１、ＰＲＳＳ１６、ＣＣＬ２５の発現、及び高いレベルのケモカインＣＣＬ２１を特徴とし得る。胸腺細胞は、Ｂａｕｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ． ２０２１に記載の「ｍＴＥＣ高」細胞であり得るか又はそれに由来し得、ＳＰＩＢ、ＡＩＲＥ、ＦＥＺＦ２、より高いレベルのＨＬＡクラスＩＩの発現を特徴とし得る。胸腺細胞は、Ｂａｕｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ． ２０２１に記載の角質細胞様ｍＴＥＣであり得るか又はそれに由来し得、ＫＲＴ１、及び／又はＩＶＬの発現を特徴とし得る。いくつかの実施形態において、胸腺細胞は、標準的なＴＥＣアイデンティティ遺伝子、例えば、ＦＯＸＮ１、ＰＡＸ９、ＳＩＸ１を発現する、Ｂａｕｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ． ２０２１に記載の未成熟ＴＥＣ（ｉＴＥＣ）であり得るか又はそれに由来し得る。
【0026】
いくつかの実施形態において、胸腺細胞は、例えばＫＲＴ５、ＫＲＴ８、ＡＩＲＥ、ＰＳＭＢ１１、及び／又はＰＲＳＳ１６に限定されない１つ又は複数のマーカーを発現するＴＥＣであり得るか又はそれに由来し得る。
【0027】
いくつかの実施形態において、胸腺細胞は、例えばＡＩＲＥ、ＣＫ５、ＣＫ８、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ２５、ＤＬＬ４、及び／又はＨＬＡ－ＤＲに限定されない１つ又は複数のマーカーを発現するＴＥＣであり得るか又はそれに由来し得る。
【0028】
いくつかの実施形態において、胸腺細胞は、胸腺細胞になる予定の細胞から調製され得る。胚発生中、多能性幹細胞は、段階的分化プロセスを通じて分化して胸腺細胞になり得る。インビトロで、胸腺細胞は以下のステップの１つ又は複数によって胸腺幹に分化する多能性幹細胞の分化によって調製される。ＰＳＣは胚体内胚葉（ＤＥ）に似た細胞に、分化でき、且つ／又は分化するように誘導できる。胚体内胚葉細胞は第３咽頭嚢内胚葉（ＰＰＥ）に似た細胞に、分化でき、且つ／又は分化するように誘導できる。胚体内胚葉及び／又はＰＰＥ細胞は、腹側咽頭内胚葉（ＡＦＥ）に似た細胞に、分化でき、且つ／又は分化するように誘導できる。ＡＦＥは第３咽頭嚢内胚葉（ＰＰＥ）に似た細胞に、分化でき、且つ／又は分化するように誘導できる。胸腺上皮前駆細胞（ＴＥＰＣ）はＰＰＥ細胞から生成できる。ＴＥＣはＴＥＰＣＳから由来することができる。本明細書に記載の細胞型の各々は１つ又は複数のマーカーによって特徴付けられ得る。いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は例えばＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及び／又はＮａｎｏｇに限定されないマーカーの発現増加に関連し得る。いくつかの実施形態において、胚体内胚葉は例えばＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４、及び／又はＣＥＲ１に限定されないマーカーの発現増加に関連し得る。いくつかの実施形態において、前方前腸細胞（ＡＦＥ）は例えばＦＯＸＡ２、ＳＯＸ２、及び／又はＰＡＸ９に限定されないマーカーの発現増加に関連し得る。いくつかの実施形態において、第３咽頭嚢内胚葉細胞は例えばＨＯＸＡ３、ＴＢＸ１、ＰＡＸ９、ＥＹＡ１、ＳＩＸ１、ＰＢＸ１、及び／又はＰＡＸ１に限定されないマーカーの発現増加に関連し得る。いくつかの実施形態において、胸腺上皮前駆細胞は例えばＦＯＸＮ１、ＥＰＣＡＭ、Ｋ５、Ｋ８、及び／又はＨＯＸＡ３に限定されないマーカーの発現増加に関連し得る。いくつかの実施形態において、胸腺細胞はＤＥ細胞、第３ ＰＰＥ細胞、ＡＦＥ細胞、ＴＥＰＣ、及び／又はＴＥＣ細胞に由来し得る。
【0029】
多能性幹細胞（ＰＳＣ）
いくつかの実施形態において、本開示の細胞は多能性幹細胞に由来し得る。
いくつかの実施形態において、本開示の細胞は多能性幹細胞に由来し得る。
【0030】
多能性幹細胞は、３つの胚葉：内胚葉、中胚葉、及び外胚葉のいずれかを生じさせる能力を有する。多能性幹細胞は、例えば、胚性幹細胞、核移植由来胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）等のような幹細胞を含み得る。多能性幹細胞は、（ｉ）自己複製の能力と（ｉｉ）多能性とを含む幹細胞表現型を有し得る。多能性関連遺伝子は、Ｏｃｔ－３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ＧＤＦ３、ＲＥＸＩ、ＦＧＦ４、ＥＳＧＩ、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４、ｈＴＥＲＴ、及びＳＳＥＡＩを含み得るが、それらに限定されない。
【0031】
本明細書に記載の細胞は胚性幹細胞に由来し得る。ＥＳ細胞は、（ａ）自己複製し、（ｂ）生物内の全ての細胞型を産生するように分化し、且つ／又は（ｃ）発生中の生物に由来するというような、細胞を含み得る。ＥＳ細胞は、発生中の生物の胞胚の内部細胞塊に由来し得る。ＥＳ細胞は、発生中の生物の８細胞期から単一割球の除去を含む単一割球生検（ＳＢＢ）によって生成された割球にも由来し得る。ＥＳ細胞は、例えばＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、及び／又はアルカリホスファターゼに限定されないマーカーの発現を特徴とし得る。ＥＳ細胞を生成及び特徴決定する方法は当分野で既知であり、例えば、米国特許第７，０２９，９１３号、ＵＳ５，８４３，７８０、ＵＳ６，２００，８０６に見出すことができる（それぞれの全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。
【0032】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は本開示の細胞の生成にも使用され得る。ｉＰＳＣは、例えば（ａ）自己複製、（ｂ）生物内の細胞の全てのタイプを産生するように分化する能力、及び／又は（ｃ）体細胞由来、に限定されない１つ又は複数の特性を有する細胞を含み得る。ｉＰＳＣは、例えばＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＳＯＸ２、ＯＣＴ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１８、ＴＤＧＦ１、Ｄｎｍｔ３ｂ、ＦｏｘＤ３、ＧＤＦ３、Ｃｙｐ２６ａ１、ＴＥＲＴ、Ｚｐｆ４２に限定されないマーカーを発現し得る。ｉＰＳＣ細胞を生成及び特徴決定する方法は、例えば、米国特許公開番号ＵＳ２００９００４７２６３、ＵＳ２００９００６８７４２、ＵＳ２００９１９１１５９、ＵＳ２００９０２２７０３２、ＵＳ２００９０２４６８７５、及びＵＳ２００９０３０４６４６に見出すことができる（それぞれの全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣは、Ｔ細胞もしくは非Ｔ細胞、Ｂ細胞、あるいは末梢血単核細胞、造血前駆細胞、又は任意の他の体細胞型からの任意の他の細胞に由来し得る。
【0033】
いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は成体幹細胞に由来し得る。成体幹細胞は、対象、例えば対象の内耳、骨髄、間葉、皮膚、脂肪、肝臓、筋肉、及び／又は血液から得られ得る。ＰＳＣは、胎盤又は臍帯由来の胚性幹細胞と、前駆細胞（例えば、内耳、骨髄、間葉、皮膚、脂肪、肝臓、筋肉、及び／又は血液に由来する前駆細胞）をも含み得る。
【0034】
エフェクター細胞
「エフェクター細胞」は、胸腺細胞に接触又は近接すると、シグナル又は細胞死トリガーを実行、開始又は伝播する能力を獲得する任意の細胞又は細胞型を指す。「接触又は近接」とは、細胞内在性又は細胞外来性（例えば、細胞間）シグナル伝達又は他のコミュニケーション又は相互作用を可能にするのに十分な時空間的接近を指し得る。
「エフェクター細胞」は、胸腺細胞に接触又は近接すると、シグナル又は細胞死トリガーを実行、開始又は伝播する能力を獲得する任意の細胞又は細胞型を指す。「接触又は近接」とは、細胞内在性又は細胞外来性（例えば、細胞間）シグナル伝達又は他のコミュニケーション又は相互作用を可能にするのに十分な時空間的接近を指し得る。
【0035】
本明細書に記載のエフェクター細胞は多能性幹細胞に由来し得る。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、胚性幹細胞、造血幹細胞若しくは前駆細胞、骨髄、臍帯血、末梢血、胸腺から単離された細胞に由来し得、又は、幹細胞若しくは前駆細胞は、インビトロで胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化していてもよい。一次組織又はＥＳＣ又はｉＰＳＣからの幹細胞若しくは前駆細胞は、起源的に、ヒト又は非ヒト動物（例えば、マウス）由来であり得る。
【0036】
いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は造血細胞であり得る。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞はリンパ球であり得る。いくつかの実施形態において、リンパ球は、ＣＤ４５陽性リンパ球であり得る。
【0037】
エフェクター細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ８－Ｔ細胞、ＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ７＋ＣＤｌａ＋細胞、ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋細胞、ＣＤ３＋ＴＣＲｇｄ＋細胞、ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋ＣＤ４＋ＣＤ８－細胞、ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋ＣＤ８＋ＣＤ４－細胞、ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋ＣＤ４＋ＣＤ８－ＣＤ４５ＲＯ－ＣＤ４５ＲＡ＋細胞、ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋ＣＤ８＋ＣＤ４－ＣＤ４５ＲＯ－ＣＤ４５ＲＡ＋細胞、ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋ＣＤ４＋ＣＤ８－ＣＤ４５ＲＯ－３０ ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋細胞、ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋ＣＤ８＋ＣＤ４－ＣＤ４５ＲＯ－ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋細胞、ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋ＣＤ４＋ＣＤ８－ＣＤ４５ＲＯ－ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２７＋細胞、ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋ＣＤ８＋ＣＤ４－ＣＤ４５ＲＯＣＤ４５ＲＡ＋細胞、ＣＤ２７＋、ＣＤ３４＋ＣＤ７＋ＣＤ１ａ＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ５＋ＣＤ７＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ５＋ＣＤ７－細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、抗原特異的Ｔ細胞、上皮内リンパ球Ｔ細胞、又は、ＣＤ４５＋、ＣＤＩ ｌｂ＋、ＣＤＩ ｌｂ－、ＣＤ１５＋、ＣＤ１５－、ＣＤ２４＋、ＣＤ２４－、ＣＤＩ １４＋、ＣＤ１１４－、ＣＤ１８２＋、ＣＤ１８２－、ＣＤ４＋、ＣＤ４－、ＣＤ１４＋、ＣＤ１４－、ＣＤｌｌａ＋、ＣＤｌｌａ－、ＣＤ９１＋、ＣＤ９１－、ＣＤ１６＋、ＣＤ１６－、ＣＤ３＋、ＣＤ３－、ＣＤ２５＋、ＣＤ２５－、Ｆｏｘｐ３＋、Ｆｏｘ３ｐ－、ＣＤ８＋、ＣＤ８－、ＣＤ１９＋、ＣＤ１９－、ＣＤ２０＋、ＣＤ２０－、ＣＤ２４＋、ＣＤ２４、ＣＤ３８＋、ＣＤ３８－、ＣＤ２２＋、ＣＤ２２－、ＣＤ６１＋、ＣＤ６１－、ＣＤ１６＋、ＣＤ１６－、ＣＤ５６＋、ＣＤ５６－、ＣＤ３ ｌ＋、ＣＤ３ ｌ－、ＣＤ３０＋、ＣＤ３０－、ＣＤ３８＋、及び／若しくはＣＤ３８－の細胞、及び／又はそれらの組み合わせについて陽性である細胞であり得る。
【0038】
いくつかの実施形態において、エフェクター細胞はＴ細胞であり得る。Ｔ細胞は、培養されたＴ細胞、例えば、一次Ｔ細胞、又は培養されたＴ細胞系からのＴ細胞、例えば、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴｌ等、又は哺乳動物から得られたＴ細胞であり得る。哺乳動物から得られる場合、エフェクター細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、脾臓、又は他の組織若しくは流体に限られない多数の供給源から得られ得る。エフェクター細胞は濃縮又は精製されてもよい。Ｔ細胞は、任意のタイプのＴ細胞であり得、任意の発達段階にあり得、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、例えば、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞毒性Ｔ細胞）、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、末梢血白血球（ＰＢＬ）、腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞を含むが、それらに限定されない。
【0039】
いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、ＣＣＲＸＡ－、ＣＤ３＋、ＣＤ６９－、ＭＨＣ－１＋、ＣＤ６２Ｌ＋、及び／又はＣＣＲ７＋であり得る。
【0040】
エフェクター細胞は、ナイーブＴ細胞（ＴＮ）表現型、セントラルメモリーＴ細胞（ＴｃＭ）表現型、又はエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）表現型を有し得る。ＴＮ、ＴｃＭ及びＴＥＭ細胞の表現型は当分野で既知である。例えば、ＣＣＲ７及びＣＤ６２Ｌは、ＴＮ及びＴｃＭ細胞によって発現されるが、ＴＥＭ細胞によって発現されない。転写因子ＬＥＦｌ、ＦＯＸＰｌ及びＫＬＦ７は、ＴＮ及びＴｃＭ細胞によって発現されるが、ＴＥＭ細胞によって発現されない。ＣＤ４５ＲＯ及びＫＬＲＧｌはＴＮ細胞によって発現されないが、ＴＥＭ細胞によって発現される（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｃａｎｃｅｒ， １２： ６７１－８４ （２０１２））。代替的に又は追加的に、ＴＮ及びＴｃＭ細胞はＴＥＭ細胞と比較してテロメアが長いことを特徴とし得る。
【0041】
いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、ＴＣＲα＋ＴＣＲβ＋細胞であり得る。ＴＣＲα＋ＴＣＲβ＋エフェクター細胞は、アルファ（α）鎖及び／又はベータ（β）鎖を発現する受容体を発現するＴ細胞であり得る。ＴＣＲアルファ及びベータ鎖は、当分野で既知である。
【0042】
エフェクター細胞は更に改変され得る。更なる実施形態において、幹細胞若しくは前駆細胞は、遺伝子改変され得る。例えば、幹細胞若しくは前駆細胞は、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、又はその両方を発現することができる。更なる実施形態において、幹細胞若しくは前駆細胞は、外因性不変ナチュラルキラーＴ細胞（ｉＮＫＴ）関連ＴＣＲを発現し得る。尚更なる実施形態において、幹細胞若しくは前駆細胞は、外因性抗原特異的ＴＣＲを発現するか、又はＴ細胞の分化、増殖又は機能を調節する遺伝子の外因性遺伝子改変を有する。
【0043】
いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇであり得る。Ｔｒｅｇは、ｍＴＥＣのクローン転換によって生成され得、それによってｍＴＥＣにおけるＡｉｒｅの発現により、表面に提示される（即ち、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の）組織特異的抗原の発現が引き起こされる。組織特異的抗原を認識する自己反応性Ｔ細胞は、末梢寛容を媒介できるＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇを生成する（参照によって全体として本明細書に組み込まれるＨｕｓｅｂｙｅ， Ｅｙｓｔｅｉｎ Ｓ．， Ｍａｒｋ Ｓ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ， ａｎｄ Ｏｌｌｅ Ｋａｍｐｅ． “Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｐｏｌｙｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ．” Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３７８．１２ （２０１８）： １１３２－１１４１を参照）。
【0044】
支持細胞
いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、胸腺細胞の生成及び／又は培養物中での胸腺細胞の維持を助ける支持細胞を含み得るか又は該支持細胞と培養され得る。支持細胞の非限定的な例としては、マクロファージ及び樹状細胞（ＤＣ）のような造血非Ｔ細胞前駆細胞、上皮細胞及び線維芽細胞のような非造血細胞、骨格組織の前駆細胞のような間質細胞、骨、軟骨、造血支持間質、及び脂肪細胞のような構成要素を含む。いくつかの実施形態において、支持細胞は、胸腺細胞の増殖、生存、成熟、又は機能を促進する。いくつかの実施形態において、支持細胞は起源的に間葉系由来であり得る。
いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、胸腺細胞の生成及び／又は培養物中での胸腺細胞の維持を助ける支持細胞を含み得るか又は該支持細胞と培養され得る。支持細胞の非限定的な例としては、マクロファージ及び樹状細胞（ＤＣ）のような造血非Ｔ細胞前駆細胞、上皮細胞及び線維芽細胞のような非造血細胞、骨格組織の前駆細胞のような間質細胞、骨、軟骨、造血支持間質、及び脂肪細胞のような構成要素を含む。いくつかの実施形態において、支持細胞は、胸腺細胞の増殖、生存、成熟、又は機能を促進する。いくつかの実施形態において、支持細胞は起源的に間葉系由来であり得る。
【0045】
支持細胞は胸腺微小環境に存在し得る非免疫細胞であり得る。例えば、支持細胞は線維芽細胞、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）、内皮細胞、及び／又はリンパ管内皮細胞であり得る。
【0046】
いくつかの実施形態において、支持細胞は、その全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれるＢａｕｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ． ２０２１ Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １２， １０９６ （２０２１）に記載の神経内分泌細胞（ＢＥＸ１、ＮＥＵＲＯＤ１を発現）、筋肉様筋様細胞（ＭＹＯＤ１、ＤＥＳを発現）、及びミエリン陽性上皮細胞（ＳＯＸ１０、ＭＰＺを発現）であり得る。いくつかの実施形態において、間葉系細胞は、例えばＬＡＭＡ２、ＬＡＭＡ４、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＬＵＭ、ＣＳＰＧ４、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＩＧＦ１、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、ＦＳＴ、ＢＭＰ４、ＳＦＲＰ２、ＷＮＴ５Ａに限定されないマーカーに関連付けられ得る。間葉系細胞は、これらのマーカーの１つ又は複数に対して陽性又は陰性であり得る。いくつかの実施形態において、間葉系細胞は本明細書に記載のいくつかのマーカーについて陽性であり得るが、他のマーカーについて陰性であり得る。
【0047】
いくつかの実施形態において、内皮細胞は、例えばＶＥＧＦＣ、ＰＥＣＡＭ１、ＡＰＬＮＲ、ＰＲＯＸ１、ＬＹＶＥ１、ＡＣＫＲ１、ＳＥＬＥ、ＳＥＬＰ、ＦＮ１、及び／又はＴＧＦＢ１に限定されない１つ又は複数のマーカーに関連付けられ得る。内皮細胞はこれらのマーカーの１つ又は複数に対して陽性又は陰性であり得る。いくつかの実施形態において、内皮細胞は本明細書に記載のいくつかのマーカーについて陽性であり得るが、他のマーカーについて陰性であり得る。
【0048】
三次元培養
いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、三次元培養（３Ｄ）システムで培養できる。３Ｄ培養において、細胞は周囲の細胞外フレームワークで三次元的に培養される。多能性幹細胞、ＤＥ細胞、ＡＦＥ細胞、ＶＰＥ細胞、ＴＥＰ、及び／又はＴＥＣは３Ｄにおいて培養できる。本開示の細胞は、支持足場の有無に関わらず培養することができる。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、足場のない３Ｄ細胞培養物中で培養できる。細胞は、オルガノイド又はスフェロイドとして培養できる。細胞はスフェロイドとして培養できる。スフェロイド培養において、細胞は、細胞の凝集として成長し、三次元構造の丸い細胞クラスターになる。細胞は、丸くて均一な形状であり得る。いくつかの実施形態において、本開示の細胞はオルガノイドとして培養できる。本明細書で使用されるように、オルガノイドという用語は、三次元又は多層構造の生細胞の人工モデルを指し、胸腺細胞以外の細胞、例えば、エフェクター細胞及び支持細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、オルガノイドは秩序構造を形成し得る。
いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、三次元培養（３Ｄ）システムで培養できる。３Ｄ培養において、細胞は周囲の細胞外フレームワークで三次元的に培養される。多能性幹細胞、ＤＥ細胞、ＡＦＥ細胞、ＶＰＥ細胞、ＴＥＰ、及び／又はＴＥＣは３Ｄにおいて培養できる。本開示の細胞は、支持足場の有無に関わらず培養することができる。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、足場のない３Ｄ細胞培養物中で培養できる。細胞は、オルガノイド又はスフェロイドとして培養できる。細胞はスフェロイドとして培養できる。スフェロイド培養において、細胞は、細胞の凝集として成長し、三次元構造の丸い細胞クラスターになる。細胞は、丸くて均一な形状であり得る。いくつかの実施形態において、本開示の細胞はオルガノイドとして培養できる。本明細書で使用されるように、オルガノイドという用語は、三次元又は多層構造の生細胞の人工モデルを指し、胸腺細胞以外の細胞、例えば、エフェクター細胞及び支持細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、オルガノイドは秩序構造を形成し得る。
【0049】
いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、胸腺オルガノイドを含み得る。オルガノイドは、臓器をインビトロで三次元に再現したミニチュアである。胸腺オルガノイドは、ヒト胸腺の生理学及び機能を模倣できる胸腺臓器のインビトロ三次元ミニチュア版であり得る。胸腺オルガノイドの調製方法は、国際特許公開ＷＯ２０１９０６０３３６に記載されており、その全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれる。
【0050】
いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、ＰＳＣ又は前駆細胞を胸腺細胞と培養することで多能性幹細胞又は前駆細胞をリンパ球に分化させることによって、調製され得る。いくつかの実施形態において、胸腺細胞は、Ｎｏｔｃｈリガンドを発現できる。いくつかの実施形態において、Ｎｏｔｃｈリガンドはデルタ様１（ＤＬＬ１）であり得る。いくつかの実施形態において、Ｎｏｔｃｈリガンドはデルタ様４（ＤＬＬ４）である。いくつかの実施形態において、Ｎｏｔｃｈリガンドは、本明細書に記載の又は当分野の、例えば、その全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，７９５，４０４号に記載のものである。本開示のエフェクター細胞は、胸腺オルガノイド細胞培養システムを使用して調製できる。いくつかの実施形態において、本方法は、共培養された幹細胞若しくは前駆細胞及び間質細胞を、Ｆｌｔ－３リガンド及び／又はＩＬ－７及び／又は幹細胞因子／Ｋｉｔリガンド及び／又はトロンボポエチンと接触させることを更に含む。いくつかの実施形態において、幹細胞若しくは前駆細胞をＴ細胞に分化させることは、ａ）Ｎｏｔｃｈリガンドを内因的に又は外因的に発現する支持細胞の選択された集団と、ｂ）幹細胞若しくは前駆細胞の選択された集団とを含む三次元（３Ｄ）細胞凝集体とを、Ｂ－２７（登録商標）サプリメント、異種不含Ｂ－２７（登録商標）サプリメント、ＧＳ２ｌＴＭサプリメント、アスコルビン酸、Ｆｌｔ－３リガンド、ＩＬ－７、又はそれらの組み合わせを含む無血清培地と培養することを含む。国際特許公開ＷＯ２０１７０７５３８９（その全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載の幹細胞又は前駆細胞からリンパ球を生成するための方法のいずれも、本開示に有用であり得る。
【0051】
いくつかの実施形態において、胸腺オルガノイドは、Ｓｅｅｔ ＣＳ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１７；１４（５）：５２１－５３０（その全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載の人工胸腺オルガノイドに基づいたものであり得る。胸腺オルガノイドを調製するために、トリプシン処理によって胸腺細胞を採取し、ＲＰＭＩ１６４０（Ｃｏｒｎｉｎｇ、マナッサス、ＶＡ）、４％Ｂ２７サプリメント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、グランドアイランド、ＮＹ）、ＰＢＳで再構成された３０μＭのＬ－アスコルビン酸２－リン酸セスキマグネシウム塩水和物（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ－Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ウェスト サクラメント、ＣＡ）、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、グランドアイランド、ＮＹ）、５ｎｇ／ｍｌのｒｈＦＬＴ３Ｌ及び５ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ロッキーヒル、ＮＪ）を含み得る無血清培養培地（「ＲＢ２７」）に再懸濁させてもよい。異なる比率の胸腺細胞とエフェクター細胞は、１．５ｍｌエッペンドルフチューブで調製し、スイングバケット遠心機内で４℃にて３００ｇで５分間遠心分離してもよい。上清を注意深く除去し、短時間ボルテックスすることによって細胞ペレットを再懸濁させた。オルガノイドごとに、０．４μｍのＭｉｌｌｉｃｅｌｌトランスウェルインサート（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビルリカ、ＭＡ。カタログ番号ＰＩＣＭ０ＲＧ５０）を、１ウェル当たり１ｍｌのＲＢ２７を含有する６ウェルプレートに配置してもよい。オルガノイドをプレーティングするために、インサートを取り出し、プレートの端に置いて過剰の培地を排出した。細胞スラリーは、１オルガノイド当たり５μｌに調整し、２０μｌピペットチップで吸い上げ、細胞インサート上に穏やかに付着したピペットチップの端に液滴を形成することでプレーティングしてもよい。細胞インサートは、１ｍＬのＲＢ２７を含有するウェルに戻してもよい。培地は、細胞インサートの周囲から吸引し、その後新しいＲＢ２７／サイトカインを含む１ｍｌに交換することによって、３～４日ごとに完全に交換できる。いくつかの実施形態において、オルガノイドは、この方式で最大１０週間、１５週間、２０週間、２５週間、又は３０週間培養してもよい。
【0052】
ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ウシ血清アルブミン／２ｍＭ ＥＤＴＡ）を各ウェルに添加し、１ｍｌ「Ｐ１０００」ピペットによるピペット操作でオルガノイドを簡単に離解し、その後５０μｍナイロンストレーナを通過させることによって、指定された時間にオルガノイド細胞を採取した。いくつかの実験において、ＭＳ５－ｈＤＬＬ１細胞の単一細胞懸濁液を、オルガノイドで使用する前に、指定線量でγ線照射した。
【0053】
胸腺オルガノイドエフェクター細胞の共培養物は、Ｓｅｅｔ ＣＳ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１７；１４（５）：５２１－５３０（その全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載のように調製され得る。胸腺細胞は、７０～８０％コンフルエンスを達成するように、使用の１～２日前に、０．１％ゼラチンでコーティングされた１２ウェルプレートに播種してもよい。培地は単層から吸引され得、１．５×１０４ＦＡＣＳ精製エフェクター細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３－造血細胞）は、ＭＥＭα、２０％ＦＢＳ、３０μＭのＬ－アスコルビン酸、５ｎｇ／ｍｌのｒｈＦＬＴ３Ｌ及び５ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ－７から構成される２ｍｌの培地において胸腺オルガノイドと共にプレーティングされ得る。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、細胞を採取し、５０μｍナイロンストレーナで濾過し、新しい培地において再プレーティングすることによって、４～５日ごとに胸腺オルガノイドに移され得る。コンフルエントになったら、細胞を、新鮮な間質層を含有する複数のウェルに分注した。
【0054】
いくつかの実施形態において、本開示の胸腺細胞は、二重陰性の１４日目Ｔ細胞と組み合わせて、細胞のクラスターを形成することができ、該クラスターはその後「オルガノイド」としてトランスウェルに付着し、気液界面培養条件で維持してもよい。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｔ細胞の成熟を評価するために、数日ごとに培地から採取してもよい。
【0055】
ＩＩＩ、方法
本開示は、多能性幹細胞を胸腺細胞に分化させる方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、人工多能性幹細胞を胸腺細胞に分化させる方法を提供する。
本開示は、多能性幹細胞を胸腺細胞に分化させる方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、人工多能性幹細胞を胸腺細胞に分化させる方法を提供する。
【0056】
いくつかの実施形態において、胸腺細胞へのｉＰＳＣの分化に含まれるステップの１つ又は複数は、ＷＮＴシグナル伝達の活性化を含み得る。非限定的な例として、ＷＮＴシグナル伝達の活性化物質はＣＨＩＲ９９０２１であり得る。
【0057】
いくつかの実施形態において、胸腺細胞へのｉＰＳＣの分化に含まれるステップの１つ又は複数は、ＷＮＴシグナル伝達の阻害を含み得る。非限定的な例として、ＷＮＴシグナル伝達の阻害物質は、ＩＷＲ１（又はＩＷＲ－１）であり得る。
【0058】
いくつかの実施形態において、胸腺細胞へのｉＰＳＣの分化に含まれるステップの１つ又は複数は、ＢＭＰシグナル伝達の阻害を含み得る。いくつかの実施形態において、ＢＭＰシグナル伝達の阻害は、ＢＭＰ経路阻害物質ＬＤＮ１９３１８９を使用して実現し得る。
【0059】
いくつかの実施形態において、胸腺細胞へのｉＰＳＣの分化に含まれるステップの１つ又は複数は、ＳＨＨシグナル伝達の阻害を含み得る。いくつかの実施形態において、ＳＨＨの阻害は、ＳＨＨアンタゴニストのＳＡＮＴ－１を使用して実現される。
【0060】
いくつかの実施形態において、胸腺細胞へのｉＰＳＣの分化に含まれるステップの１つ又は複数は、ＴＧＦβシグナル伝達の阻害を含み得る。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβシグナル伝達の阻害は、ＴＧＦβ阻害物質ＳＢ４３１５４２を使用して実現される。
【0061】
いくつかの実施形態において、胸腺細胞へのｉＰＳＣの分化に含まれるステップの１つ又は複数は、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ）、ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）、ペニシリン－ストレプトマイシン（本明細書では「Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ」ともいう）及び非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）を含有する細胞培養培地を含み得る。
【0062】
胸腺細胞の調製と維持
本明細書では、多能性幹細胞を胸腺細胞に分化させる方法を提供する。かかる方法は、多能性幹細胞を第１成長培地中、第２成長培地中、又はそれらの組み合わせ中で培養することを含み得る。いくつかの実施形態において、第１又は第２成長培地は、ＰＩ－１０３（多標的Ｐ１３Ｋ阻害物質）を含み得る。いくつかの実施形態において、第１成長培地は、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ、ＣＨＩＲ９９０２１、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ）及びノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）を含む。いくつかの態様において、第２成長培地は、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ｂＦＧＦ、アクチビンＡ、ＬＤＮ１９３１８９、ＩＴＳ及びＫＳＲを含む。いくつかの実施形態において、細胞は、ＰＩ－１０３の存在下で培養される。ＰＩ－１０３の濃度は、約１ｎＭ～１０００ｎＭであり得る。１つの実施形態において、ＰＩ－１０３の濃度は５０ｎＭであり得る。
本明細書では、多能性幹細胞を胸腺細胞に分化させる方法を提供する。かかる方法は、多能性幹細胞を第１成長培地中、第２成長培地中、又はそれらの組み合わせ中で培養することを含み得る。いくつかの実施形態において、第１又は第２成長培地は、ＰＩ－１０３（多標的Ｐ１３Ｋ阻害物質）を含み得る。いくつかの実施形態において、第１成長培地は、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ、ＣＨＩＲ９９０２１、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ）及びノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）を含む。いくつかの態様において、第２成長培地は、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ｂＦＧＦ、アクチビンＡ、ＬＤＮ１９３１８９、ＩＴＳ及びＫＳＲを含む。いくつかの実施形態において、細胞は、ＰＩ－１０３の存在下で培養される。ＰＩ－１０３の濃度は、約１ｎＭ～１０００ｎＭであり得る。１つの実施形態において、ＰＩ－１０３の濃度は５０ｎＭであり得る。
【0063】
胚体内胚葉細胞は、更に、培養し、且つ、ＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ－１９３１８９、及びＫＳＲのうちの少なくとも１つと接触させるか又はインキュベートすることで前方前腸細胞に分化することができる。いくつかの実施形態において、前方前腸細胞は、培養し、且つ、ＥＧＦ、レチノイン酸、ＦＧＦ８Ｂ、及びＳＨＨのうちの少なくとも１つと接触させるか又はインキュベートすることで咽頭内胚葉細胞に分化することができる。いくつかの実施形態において、咽頭内胚葉細胞は、培養し、且つ、ＢＭＰ４、ＦＧＦ８ｂ、ＥＧＦ、ＳＡＮＴ、ＣＨＩＲ９９０２１、アスコルビン酸、又はそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つと接触させるか又はインキュベートすることで胸腺上皮細胞に分化することができる。いくつかの実施形態において、分化は、約１４日間～２５日間行われる。例えば、分化は、約１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、又は２５日間行われる。
【0064】
いくつかの実施形態において、本開示は本明細書に記載の１つ又は複数の細胞又は細胞型を調製するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記細胞は胸腺細胞であり得る。
【0065】
公共データベースに蓄積されている一連のデータは初代ヒト及びマウス胸腺の単一細胞トランスクリプトームを提供する（それぞれの全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｂａｕｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ． ２０２１ Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １２， １０９６、Ｋｅｒｎｆｅｌｄ， ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ． ２０１８ Ｊｕｎ １９；４８（６）：１２５８－１２７０．ｅ６、Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ． ２０１９ Ｎｏｖ １９；５１（５）：９３０－９４８．ｅ６を参照）。これは胸腺細胞への本開示の細胞の分化及び／又は成熟を促進する因子を同定するための豊富な材料源を提供する。ｓｃＲＮＡ配列決定データの分析により、本開示では胸腺細胞表現型を促進及び／又は維持し得る潜在的な因子及び／又は支持細胞を同定する。
【0066】
いくつかの実施形態において、本開示の細胞は生物から単離され得る。いくつかの実施形態において、生物は哺乳動物であり得る。哺乳動物細胞はヒト、齧歯動物、ブタ及び／又はウシの供給源のから単離され得る。本開示の細胞のヒト供給源は自家性又は同種間のものであり得る。いくつかの実施形態において、本開示の細胞を含有する組織は本明細書に記載の用途にそのまま採取及び使用され得る。本開示の細胞は胚性、胎児／胎仔、成体生物から得られ得る。いくつかの態様において、生物は生きているものであってもよく、又は死体生物であってもよい。
【0067】
本明細書に記載の細胞は他の細胞型に由来し得る。非限定的な例として、本開示の細胞は多能性幹細胞（ＰＳＣ）に由来し得る。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は前駆細胞に由来し得る。いくつかの実施形態において、本開示の細胞はＰＳＣ及び／又は前駆細胞の分化に由来し得る。
【0068】
いくつかの実施形態において、胸腺細胞はＰＳＣから調製され得る。この点については、本方法は多能性幹細胞を胸腺細胞に分化させるのに十分な条件下で多能性幹細胞を一定期間培養することを含み得る。例えば、本方法は胸腺細胞へのＰＳＣの分化を駆動する因子及び／又は阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養することを含み得る。ＰＳＣを胸腺細胞に分化させる方法は当分野で既知である。ＰＳＣを胸腺細胞に分化させる方法は当分野で既知の分化用の１つ又は複数のパラメーター又はそれらの組み合わせの使用を含み得る。パラメーターは、（ｉ）分化促進因子、（ｉｉ）分化促進阻害物質、（ｉｉｉ）分化促進の継続時間、（ｉｖ）温度、（ｖ）基質、及び／又は（ｖｉ）分化を促進する支持細胞を含むが、それらに限定されない。以下の参考文献に記載のＰＳＣを胸腺細胞に分化させる任意の方法又はパラメーターは本明細書で使用され得、Ｐａｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ． ２０１３ Ａｕｇ １；１３（２）：２１９－２９、Ｓｏｈ ｅｔ ａｌ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． ２０１４ Ｖｏｌ． ２ ｊ ９２５－９３７、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ． ２０１３ Ａｕｇ １；１３（２）：２３０－６、Ｏｋａｂｅ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ． Ｒｅｐｒｏｇ． ２０１５ Ｖｏｌ １７， Ｎｏ． ５、Ｓｕ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ．Ｒｅｐ． ２０１５ ５， ９８８２、Ｏｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０２０ １０：２２４、国際特許公開ＷＯ２０１９０６０３３６、ＷＯ２０２０２０５８５９、ＷＯ２０２０２２００４０、ＷＯ２０１４１３４２１３、ＷＯ２０１０１４３５２９、ＷＯ２０１１１３９６２８、及び中国特許公開ＣＮ２０１１１０１２１２４３を含み、これらそれぞれの全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
【0069】
胚体内胚葉細胞の調製と維持
本開示は、後続で胸腺細胞に分化できる胚体内胚葉細胞の調製方法を提供する。いくつかの実施形態において、胚体細胞は、細胞を二次元培養物又は三次元培養物中で培養することで調製され得る。かかる方法は、多能性幹細胞を第１成長培地中、第２成長培地中、又はそれらの組み合わせ中で培養することを含み得る。いくつかの実施形態において、第１又は第２成長培地は、ＰＩ－１０３（多標的Ｐ１３Ｋ阻害物質）を含み得る。いくつかの実施形態において、第１成長培地は、アクチビンＡ、ＣＨＩＲ９９０２１、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ）、及び／又はノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）を含む。
本開示は、後続で胸腺細胞に分化できる胚体内胚葉細胞の調製方法を提供する。いくつかの実施形態において、胚体細胞は、細胞を二次元培養物又は三次元培養物中で培養することで調製され得る。かかる方法は、多能性幹細胞を第１成長培地中、第２成長培地中、又はそれらの組み合わせ中で培養することを含み得る。いくつかの実施形態において、第１又は第２成長培地は、ＰＩ－１０３（多標的Ｐ１３Ｋ阻害物質）を含み得る。いくつかの実施形態において、第１成長培地は、アクチビンＡ、ＣＨＩＲ９９０２１、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ）、及び／又はノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）を含む。
【0070】
いくつかの態様において、第２成長培地は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、アクチビンＡ、ＬＤＮ１９３１８９、ＩＴＳ及びＫＳＲを含む。いくつかの実施形態において、第２成長培地はＣＨＩＲ９９０２１を含む。
【0071】
いくつかの実施形態において、ＣＨＩＲ９９０２１の濃度は、約０．１μＭ～１００μＭである。いくつかの実施形態において、ＣＨＩＲ９９０２１の濃度は約２μＭ～３μＭである。
【0072】
いくつかの実施形態において、細胞はＰＩ－１０３の存在下で培養される。ＰＩ－１０３の濃度は、約１ｎＭ～１０００ｎＭであり得る。１つの実施形態において、ＰＩ－１０３の濃度は、５０ｎＭであり得る。いくつかの態様において、ＰＩ－１０３の濃度は、２５ｎＭであり得る。いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は、約３～５日間培養され得る。ＰＩ－１０３は１～２日間添加され得る。多能性幹細胞は胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞であり得る。
【0073】
いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は、約３～５日間培養され得る。幹細胞は、第１成長培地中で約１～２日間、第２成長培地中で約２～３日間培養され得る。多能性幹細胞は、第１成長培地中で２日間、第２成長培地中で３日間培養され得る。いくつかの実施形態において、アクチビンＡの濃度は約１００ｎｇ／ｍｌであり得る。いくつかの実施形態において、ＣＨＩＲ９９０２１の濃度は２μＭであり得る。いくつかの実施形態において、ｂＦＧＦの濃度は１０ｎｇ／ｍｌであり得る。いくつかの実施形態において、ＬＤＮ１９３１８９の濃度は２００ｎＭであり得る。いくつかの実施形態において、ＣＨＩＲ９９０２１は約１日間にわたって第２成長培地に添加され得る。
【0074】
本明細書では、多能性幹細胞を胸腺細胞に分化させる方法が提供される。かかる方法は、多能性幹細胞を第１成長培地中、第２成長培地中、又はそれらの組み合わせ中で培養することを含み得る。いくつかの実施形態において、第１又は第２成長培地は、ＰＩ－１０３（多標的Ｐ１３Ｋ阻害物質）を含み得る。いくつかの実施形態において、第１成長培地は、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ、ＣＨＩＲ９９０２１、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ）及びノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）を含む。いくつかの態様において、第２成長培地は、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ｂＦＧＦ、アクチビンＡ、ＬＤＮ１９３１８９、ＩＴＳ及びＫＳＲを含む。いくつかの実施形態において、第２成長培地はＣＨＩＲ９９０２１を含む。いくつかの実施形態において、ＣＨＩＲ９９０２１の濃度は約０．１μＭ～１００μＭである。いくつかの実施形態において、ＣＨＩＲ９９０２１の濃度は２μＭである。いくつかの実施形態において、細胞はＰＩ－１０３の存在下で培養される。ＰＩ－１０３の濃度は約１ｎＭ～１０００ｎＭであり得る。１つの実施形態において、ＰＩ－１０３の濃度は５０ｎＭであり得る。
【0075】
前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）細胞の調製
胚体内胚葉細胞は、更に、培養し、且つ、前方前腸細胞に分化することができる。いくつかの実施形態において、ＡＦＥ細胞は、細胞を二次元培養物又は三次元培養物中で培養することで調製され得る。胚体内胚葉細胞は、ＢＭＰ阻害物質、ＴＧＦβ阻害物質、少なくとも１つのＦＧＦ、及び／又はアスコルビン酸と接触させることで、ＡＦＥ細胞に分化することができる。いくつかの実施形態において、ＡＦＥ細胞へのＤＥ細胞の分化に利用された細胞培養培地は、Ｎ２－サプリメント（ＧＩＢＣＯ、ウォルサム、マサチューセッツ州）、イーグル基本培地（ＢＭＥ）、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（ＧＩＢＣＯ、ウォルサム、マサチューセッツ州）、Ｂ２７（商標）無血清サプリメント、非必須アミノ酸、ＫＳＲ及び／又はＩＴＳを含み得る。
胚体内胚葉細胞は、更に、培養し、且つ、前方前腸細胞に分化することができる。いくつかの実施形態において、ＡＦＥ細胞は、細胞を二次元培養物又は三次元培養物中で培養することで調製され得る。胚体内胚葉細胞は、ＢＭＰ阻害物質、ＴＧＦβ阻害物質、少なくとも１つのＦＧＦ、及び／又はアスコルビン酸と接触させることで、ＡＦＥ細胞に分化することができる。いくつかの実施形態において、ＡＦＥ細胞へのＤＥ細胞の分化に利用された細胞培養培地は、Ｎ２－サプリメント（ＧＩＢＣＯ、ウォルサム、マサチューセッツ州）、イーグル基本培地（ＢＭＥ）、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（ＧＩＢＣＯ、ウォルサム、マサチューセッツ州）、Ｂ２７（商標）無血清サプリメント、非必須アミノ酸、ＫＳＲ及び／又はＩＴＳを含み得る。
【0076】
いくつかの実施形態において、ＢＭＰ阻害物質は、ＬＤＮ１９３１８９であり得る。いくつかの実施形態において、ＬＤＮ１９３１８９の濃度は約０．１ｎＭ～約１０００ｎＭである。いくつかの態様において、ＬＤＮ１９３１８９の濃度は、約１００～２００ｎＭである。
【0077】
いくつかの実施形態において、ＴＧＦβ阻害物質はＳＢ４３１５４２であり得る。いくつかの実施形態において、ＳＢ４３１５４２の濃度は約１μＭ～約１００μＭである。非限定的な例として、ＳＢ４３１５４２の濃度は１０μＭである。
【0078】
いくつかの実施形態において、ＦＧＦは、ＦＧＦ８であり得る。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ８の濃度は約１ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌである。非限定的な例として、ＦＧＦ８ｂの濃度は約２５～５０ｎｇ／ｍｌである。
【0079】
ＤＥ細胞は、約１日間、２日間、３日間、４日間、又は５日間の間にＡＦＥ細胞に分化し得る。
【0080】
腹側咽頭内胚葉（ＶＰＥ）細胞の調製
ＶＰＥ細胞へのＡＦＥの分化は、単一ステッププロセス又はマルチステッププロセスとして行われる。マルチステッププロセスは２ステッププロセスであり得る。第１ステップで、ＡＦＥは、ＶＰＥ１培地中で培養され、第２ステップで、該細胞はＶＰＥ２培地中で培養される。いくつかの実施形態において、ＶＰＥ細胞は、細胞を二次元培養物又は三次元培養物中で培養することで調製され得る。ＶＰＥ１ステップは、細胞を約１日間、２日間、３日間、４日間又は５日間培養することを含み得る。ＶＰＥ２ステップは、細胞を約２日間、３日間、４日間、５日間、又は６日間培養することを含み得る。
ＶＰＥ細胞へのＡＦＥの分化は、単一ステッププロセス又はマルチステッププロセスとして行われる。マルチステッププロセスは２ステッププロセスであり得る。第１ステップで、ＡＦＥは、ＶＰＥ１培地中で培養され、第２ステップで、該細胞はＶＰＥ２培地中で培養される。いくつかの実施形態において、ＶＰＥ細胞は、細胞を二次元培養物又は三次元培養物中で培養することで調製され得る。ＶＰＥ１ステップは、細胞を約１日間、２日間、３日間、４日間又は５日間培養することを含み得る。ＶＰＥ２ステップは、細胞を約２日間、３日間、４日間、５日間、又は６日間培養することを含み得る。
【0081】
いくつかの実施形態において、ＶＰＥ１培地は、レチノイン酸、少なくとも１つのＦＧＦ、ＷＮＴ阻害物質、ＴＧＦβ阻害物質、及び／又はアスコルビン酸を含み得る。
【0082】
いくつかの実施形態において、ＶＰＥ２培地は、ノギン、ＢＭＰ阻害物質、ＷＮＴ活性化物質（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）、少なくとも１つのＦＧＦ、レチノイン酸、ＳＨＨアンタゴニスト、及び／又はアスコルビン酸を含み得る。
【0083】
いくつかの実施形態において、ＦＧＦは、ＦＧＦ８、ＦＧＦ７、及び／又はＦＧＦ１０であり得る。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ８の濃度は約１ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌである。非限定的な例として、ＦＧＦ８ｂの濃度は約２５～５０ｎｇ／ｍｌである。
【0084】
いくつかの実施形態において、ＷＮＴ阻害物質はＩＷＲ１である。ＩＷＲ１の濃度は約０．０１～１０μＭであり得る。非限定的な例として、ＩＷＲ１の濃度は２．５μＭである。
【0085】
いくつかの実施形態において、ＴＧＦβ阻害物質はＳＢ４３１５４２であり得る。いくつかの実施形態において、ＳＢ４３１５４２の濃度は約１μＭ～約１００μＭである。非限定的な例として、ＳＢ４３１５４２の濃度は１０μＭである。
【0086】
いくつかの実施形態において、アスコルビン酸の濃度は約０．１～３０μＭである。非限定的な例として、アスコルビン酸の濃度は１０μＭであり得る。
【0087】
いくつかの実施形態において、ＢＭＰ阻害物質はＬＤＮ１９３１８９であり得る。いくつかの実施形態において、ＬＤＮ１９３１８９の濃度は約０．１ｎＭ～約１０００ｎＭである。いくつかの態様において、ＬＤＮ１９３１８９の濃度は約１００～２００ｎＭである。
【0088】
いくつかの実施形態において、ＳＨＨ阻害物質はＳＡＮＴ－１であり得る。いくつかの実施形態において、ＳＡＮＴ－１の濃度は約０．０１μＭ～約１０μＭである。非限定的な例として、ＳＡＮＴ－１の濃度は０．２５μＭである。
【0089】
いくつかの実施形態において、前方前腸細胞は、ＥＧＦ、レチノイン酸、ＦＧＦ８Ｂ、及び／又はＳＨＨのうちの少なくとも１つと接触させるか又はインキュベートすることで、咽頭内胚葉細胞に培養し且つ分化することができる。
【0090】
いくつかの実施形態において、ＶＰＥ１及び／又はＶＰＥ２培地は、Ｎ２－サプリメント（ＧＩＢＣＯ、ウォルサム、マサチューセッツ州）、イーグル基本培地（ＢＭＥ）、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（ＧＩＢＣＯ、ウォルサム、マサチューセッツ州）、Ｂ２７（商標）無血清サプリメント（ビタミンＡ含有又は非含有）、非必須アミノ酸、ＫＳＲ及び／又はＩＴＳを含み得る。
【0091】
胸腺上皮前駆細胞（ＴＥＰ）細胞の調製
ＴＥＰ細胞へのＶＰＥ細胞の分化は、該細胞をＴＥＰ培地中で培養することで行われ得る。いくつかの実施形態において、ＴＥＰ細胞は、細胞を二次元培養物又は三次元培養物中で培養することで調製され得る。ＴＥＰステップは、細胞を約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、又は６日間培養することを含み得る。
ＴＥＰ細胞へのＶＰＥ細胞の分化は、該細胞をＴＥＰ培地中で培養することで行われ得る。いくつかの実施形態において、ＴＥＰ細胞は、細胞を二次元培養物又は三次元培養物中で培養することで調製され得る。ＴＥＰステップは、細胞を約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、又は６日間培養することを含み得る。
【0092】
いくつかの実施形態において、ＶＰＥ細胞は、ＢＭＰ（例えば、ＢＭＰ４、ＢＭＰ２）、ＷＮＴ活性化物質、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１、少なくとも１つのＦＧＦ、及び／又はアスコルビン酸を使用してＴＥＰ細胞に分化させることができる。
【0093】
いくつかの実施形態において、ＴＥＰ培地は、Ｎ２－サプリメント（ＧＩＢＣＯ、ウォルサム、マサチューセッツ州）、イーグル基本培地（ＢＭＥ）、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（ＧＩＢＣＯ、ウォルサム、マサチューセッツ州）、Ｂ２７（商標）無血清サプリメント（ビタミンＡ含有又は非含有）、非必須アミノ酸、ＫＳＲ及び／又はＩＴＳを含み得る。
【0094】
いくつかの実施形態において、ＢＭＰはＢＭＰ２又はＢＭＰ４であり得る。ＢＭＰの濃度は１ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌであり得る。いくつかの態様において、ＢＭＰの濃度は５０ｎｇ／ｍｌであり得る。
【0095】
いくつかの実施形態において、ＦＧＦはＦＧＦ８、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１、及び／又はＦＧＦ１０であり得る。いくつかの実施形態において、ＦＧＦの濃度は約１ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌである。非限定的な例として、ＦＧＦの濃度は約２５～５０ｎｇ／ｍｌである。
【0096】
いくつかの実施形態において、咽頭内胚葉細胞は、培養し、且つ、ＢＭＰ４、ＦＧＦ８ｂ、ＥＧＦ、ＳＡＮＴ－１（ＳＨＨアンタゴニスト）、ＣＨＩＲ９９０２１、アスコルビン酸、又はそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つと接触させるか又はインキュベートすることで胸腺上皮細胞に分化することができる。
【0097】
胸腺上皮細胞（ＴＥＣ）の調製
ＴＥＰ細胞はインビトロで更にＴＥＣに分化することができる。ＴＥＣへの分化は２Ｄ又は３Ｄ培養物中で行うことができる。いくつかの実施形態において、ＴＥＰの分化は、約２日間、３日間、４日間、５日間又は６日間行われ得る。
ＴＥＰ細胞はインビトロで更にＴＥＣに分化することができる。ＴＥＣへの分化は２Ｄ又は３Ｄ培養物中で行うことができる。いくつかの実施形態において、ＴＥＰの分化は、約２日間、３日間、４日間、５日間又は６日間行われ得る。
【0098】
いくつかの実施形態において、ＴＥＣへのＴＥＰの分化はＴＥＣ培地中で実施される。
【0099】
ＴＥＣ培地は、ＲＡＮＫＬ、インターロイキン、例えば（ＩＬ２２）、少なくとも１つのＦＧＦ、少なくとも１つのＢＭＰ（例えば、ＢＭＰ４）、ＷＮＴ活性化物質、及び／又はアスコルビン酸を含み得る。
【0100】
いくつかの実施形態において、ＲＡＮＫＬの濃度は約１ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌであり得る。いくつかの態様において、ＲＡＮＫＬの濃度は約２０ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍｌであり得る。
【0101】
いくつかの実施形態において、ＦＧＦは、ＦＧＦ８、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１、及び／又はＦＧＦ１０であり得る。いくつかの実施形態において、ＦＧＦの濃度は約１ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌである。非限定的な例として、ＦＧＦの濃度は約２５～５０ｎｇ／ｍｌである。
【0102】
いくつかの実施形態において、インターロイキンの濃度は約１ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌである。非限定的な例として、ＩＬ２２の濃度は約２０ｎｇ／ｍｌである。
【0103】
ＴＥＣ培地は、Ｎ２－サプリメント（ＧＩＢＣＯ、ウォルサム、マサチューセッツ州）、イーグル基本培地（ＢＭＥ）、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（ＧＩＢＣＯ、ウォルサム、マサチューセッツ州）、Ｂ２７（商標）無血清サプリメント（ビタミンＡ含有又は非含有）、非必須アミノ酸、ＫＳＲ及び／又はＩＴＳを含み得る。
【0104】
いくつかの実施形態において、分化は、約１４日間～１７日間行われる。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は凝集体として培養され得る。いくつかの態様において、開示細胞は、細胞外マトリックスベースの培地中、例えば、Ｇｅｌｔｒｅｘ中で培養され得る。
【0105】
エフェクター細胞の調製
本明細書では、エフェクター細胞の調製方法も提供される。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞はリンパ球であり得る。エフェクター細胞は、哺乳動物又は確立された細胞系からの一次細胞から得られ得る。哺乳動物から得られる場合、エフェクター細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、脾臓、又は他の組織若しくは流体に限定されない多数の供給源から得られ得る。エフェクター細胞は濃縮又は精製されてもよい。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞はＴ細胞であり得る。Ｔ細胞は、任意のタイプのＴ細胞であり得、任意の発達段階にあり得、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、例えば、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞毒性Ｔ細胞）、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、末梢血白血球（ＰＢＬ）、腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞を含むが、それらに限定されない。リンパ球を単離及び／又は濃縮する方法は当分野で既知である。哺乳動物又はドナーから得られたリンパ球の集団を濃縮する方法は、分離培地（例えば、ＦＩＣＯＬＬ－ＰＡＱＵＥ（商標）、ＲＯＳＥＴＴＥＳＥＰ（商標）ＨＬＡ総リンパ球濃縮カクテル、又はリンパ球分離培地（ＬＳＡ）（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌカタログ番号０８５０４９４Ｘ）等）の使用、濾過若しくは水簸による細胞サイズ、形状又は密度の分離、免疫磁気分離（例えば、磁気活性化細胞選別システム，ＭＡＣＳ）、蛍光分離（例えば、蛍光活性化細胞選別システム，ＦＡＣＳ）、及び／又はビーズベースのカラム分離に限定されない任意の好適な分離方法によって完了できる。
本明細書では、エフェクター細胞の調製方法も提供される。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞はリンパ球であり得る。エフェクター細胞は、哺乳動物又は確立された細胞系からの一次細胞から得られ得る。哺乳動物から得られる場合、エフェクター細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、脾臓、又は他の組織若しくは流体に限定されない多数の供給源から得られ得る。エフェクター細胞は濃縮又は精製されてもよい。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞はＴ細胞であり得る。Ｔ細胞は、任意のタイプのＴ細胞であり得、任意の発達段階にあり得、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、例えば、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞毒性Ｔ細胞）、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、末梢血白血球（ＰＢＬ）、腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞を含むが、それらに限定されない。リンパ球を単離及び／又は濃縮する方法は当分野で既知である。哺乳動物又はドナーから得られたリンパ球の集団を濃縮する方法は、分離培地（例えば、ＦＩＣＯＬＬ－ＰＡＱＵＥ（商標）、ＲＯＳＥＴＴＥＳＥＰ（商標）ＨＬＡ総リンパ球濃縮カクテル、又はリンパ球分離培地（ＬＳＡ）（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌカタログ番号０８５０４９４Ｘ）等）の使用、濾過若しくは水簸による細胞サイズ、形状又は密度の分離、免疫磁気分離（例えば、磁気活性化細胞選別システム，ＭＡＣＳ）、蛍光分離（例えば、蛍光活性化細胞選別システム，ＦＡＣＳ）、及び／又はビーズベースのカラム分離に限定されない任意の好適な分離方法によって完了できる。
【0106】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のエフェクター細胞は、多能性幹細胞に由来し得る。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、胚性幹細胞、造血幹細胞若しくは前駆細胞、骨髄、臍帯血、末梢血、胸腺から単離された細胞に由来し得、又は幹細胞若しくは前駆細胞は、インビトロで胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化していてもよい。一次組織又はＥＳＣ又はｉＰＳＣからの幹細胞若しくは前駆細胞は、起源的に、ヒト又は非ヒト動物（例えば、マウス）由来であり得る。
【0107】
いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、ＰＳＣ又は前駆細胞を、Ｎｏｔｃｈリガンドを異所的に発現する支持細胞と共に培養することで多能性幹細胞又は前駆細胞をリンパ球に分化させることによって、調製され得る。いくつかの実施形態において、支持細胞は、ＯＰ９細胞であり得る。いくつかの実施形態において、Ｎｏｔｃｈリガンドはデルタ様１（ＤＬＬｌ）である。いくつかの実施形態において、Ｎｏｔｃｈリガンドはデルタ様４（ＤＬＬ４）である。いくつかの実施形態において、Ｎｏｔｃｈリガンドは、本明細書に記載の又は当分野の、例えば、その全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，７９５，４０４号に記載のものである。本開示のエフェクター細胞は、ＯＰ９－ＤＬＬ１を異所的に発現する支持細胞を利用する人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）細胞培養システムを使用して調製され得る。いくつかの実施形態において、本方法は、共培養された幹細胞若しくは前駆細胞及び間質細胞を、Ｆｌｔ－３リガンド及び／又はＩＬ－７及び／又は幹細胞因子／Ｋｉｔリガンド及び／又はトロンボポエチンと接触させることを更に含む。いくつかの実施形態において、幹細胞若しくは前駆細胞をＴ細胞に分化させることは、ａ）外因性Ｎｏｔｃｈリガンドを発現する支持細胞の選択された集団、ｂ）幹細胞若しくは前駆細胞の選択された集団、を含む三次元（３Ｄ）細胞凝集体を、Ｂ－２７（登録商標）サプリメント、異種不含Ｂ－２７（登録商標）サプリメント、ＧＳ２ｌＴＭサプリメント、アスコルビン酸、Ｆｌｔ－３リガンド、ＩＬ－７、又はそれらの組み合わせを含む無血清培地と培養することを含む。国際特許公開ＷＯ２０１７０７５３８９（その全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載の幹細胞又は前駆細胞からリンパ球を生成するための方法のいずれも、本開示に有用であり得る。
【0108】
いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、造血細胞であり得るか又はそれに由来し得る。多能性幹細胞から造血細胞を調製する方法は、例えば、米国特許第９，８３４，７５４号に記載のように、当分野で既知であり、以下のステップの１つ又は複数を含み得る。（ｉ）ヒト多能性幹細胞の集団における造血分化を誘導し、ここでアクチビン／ｎｏｄａｌシグナル伝達は、分化の１日目と４日目の間で阻害され、（ｉｉ）ＣＤ３４及びＣＤ４３の発現に基づいて誘導された集団を選別し、且つ／又は（ｉｉｉ）ＣＤ３４陽性及び／又はＣＤ４３陰性の細胞集団の画分を選択し、ここで選別及び細胞画分選択は、分化の約６日目～１１日目から選択される日に行われる（米国特許第９，８３４，７５４号の全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。
【0109】
いくつかの実施形態において、胸腺細胞及び／又はエフェクター細胞は、胸腺細胞及び／又はエフェクター細胞に由来する細胞外小胞（例えば、エキソソーム）の存在下で培養され得る。胸腺細胞のエキソソームの調製方法は、米国特許公開ＵＳ２０２０２９９６４１（その全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されている。いくつかの実施形態において、エキソソームは、ＤＬＬ１を異所的に発現するように操作された胸腺細胞に由来し得る。
【0110】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞等のようなエフェクター細胞は、他の細胞型の分化に由来し得る。Ｔ細胞分化は、１）中胚葉誘導（約１～４日目）、２）造血特異化（約４～８日目）、３）造血コミットメント及び増大（約８～１０日目）、及び／又は４）Ｔリンパ球分化の４つの段階を含み得る。ＰＳＣ（ｉＰＳＣ又はＥＳＣ）は、中胚葉分化の開始細胞集団として利用できる。これらの細胞は中胚葉細胞に分化できる。中胚葉細胞は、細胞の数が増加し得る造血細胞に更に分化できる。本開示で使用するための細胞培養システムは、中胚葉誘導用の第１細胞培養培地、造血特異化及び増大用の第２細胞培養培地、及びＴリンパ球分化用の第３細胞培養培地を含むが、それらに限定されない。第１細胞培養培地は、ＢＭＰ４（例えば、ヒトＢＭＰ４）及びｂＦＧＦ（例えば、ヒトｂＦＧＦ）を含み得る。ＰＳＣ又はＥＳＣは、開始細胞集団として使用できる。未分化のＰＳＣ又はＥＳＣは、低付着プレートに移して胚様体（ＥＢ）の形成を可能にすることができる。第１段階中のＥＢの形成は、ｈＢＭＰ４の存在下で一晩インキュベートすることで促進できる。そして、ＥＢは、中胚葉誘導を可能にするためにＢＭＰ４及びｂＦＧＦで４日目まで培養してもよい。中胚葉誘導の成否は、例えば、ＫＤＲ＋ＰＤＧＦＲ－細胞の百分率を測定することで、試験することができる。第２細胞培養培地はＶＥＧＦ（例えば、ｈＶＥＧＦ）、及び造血サイトカインのカクテルを含み得る。造血サイトカインのカクテルは、造血特異化のための、ＳＣＦ（例えば、ｈＳＣＦ）、Ｆｌｔ３Ｌ（例えば、ｈＦｌｔ３Ｌ）、少なくとも１つのサイトカイン、及びｂＦＧＦを含み得る。サイトカインは、ＩＬ３、ＩＬ１５、ＩＬ７、ＩＬ１２及びＩＬ２１に限定されないＴｈ１サイトカインであり得る。ＥＢは、造血特異化のための第２細胞培養培地中で約１０日目まで培養してもよい。ＥＢは、ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ４１ａ、ｃ－ｋｉｔ、Ｎｏｔｃｈ１、ＩＬ７Ｒａの発現についてＦＡＣＳよって免疫表現型を分析され得る。いくつかの実施形態において、約日目のＥＢからのＣＤ３４＋細胞は、リンパ球分化のための主要な転写因子、例えば、ＣＤ１２７（ＩＬ７Ｒａ）及びＮｏｔｃｈ１を最高レベルで発現する。第３細胞培養培地は、フィーダー細胞及びＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ及び少なくとも１つのサイトカインを含み得る。サイトカインは、ＩＬ３、ＩＬ１５、ＩＬ７、ＩＬ１２及びＩＬ２１に限定されないＴｈ１サイトカインであり得る。いくつかの実施形態において、約１０日目に、ＥＢは解離でき、造血前駆細胞はフィーダー細胞上に移して、確立された共培養システムにおいてＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ及びＴｈ１サイトカイン（複数可）（例えば、ＩＬ－７）の存在下でＴリンパ球分化を誘導することができる。いくつかの実施形態において、共培養システムは、胸腺細胞及び／又はフィーダー培養物、例えば、ＯＰ９－ＤＬ１１フィーダー細胞を含み得る。
【0111】
いくつかの実施形態において、共培養は、共培養培地を使用して行われ得る。いくつかの実施形態において、共培養培地は、ＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ ＩＩ及びＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）Ｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを含み得る。いくつかの実施形態において、共培養培地は、αＭＥＭ、４％Ｂ２７サプリメント、３０ｕＭのアスコルビン酸、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ７、５０ｎｇ／ｍｌのＦＬＴ３Ｌ、５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、及び／又は１Ｘ Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐを含み得る。いくつかの実施形態において、共培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ビタミンＡ非含有１％Ｂ２７サプリメント、５０μＭのアスコルビン酸、５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ８ｂ、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ、５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１０、２ｕＭのＣＨＩＲ９９０２１、０．１％ＩＴＳ、０．００２５％ＫＳＲ、０．５Ｘ Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ、１ｘ ＮＥＡＡ、１％Ｎ２、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％β－ＭＥ、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ７、５０ｎｇ／ｍｌのＦＬＴ３Ｌ、５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、及び／又は５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦを含み得る。
【0112】
凝集体サイズ
いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、３次元培養物中で培養され得る。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、凝集体又はスフェロイドの形態としてもよい。「スフェロイド」という用語は、細胞のクラスター及び／又は細胞コロニーを指す。スフェロイドは、様々な細胞型、例えば、胸腺細胞、多能性細胞、エフェクター細胞、幹細胞、及び／又は支持細胞から形成できる。スフェロイドは、球状又は不規則な形状としてもよい。スフェロイドは、不均一な細胞集団、細胞型、異なる状態の細胞、例えば増殖細胞、静止細胞、及び壊死細胞を含有し得る。
いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、３次元培養物中で培養され得る。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、凝集体又はスフェロイドの形態としてもよい。「スフェロイド」という用語は、細胞のクラスター及び／又は細胞コロニーを指す。スフェロイドは、様々な細胞型、例えば、胸腺細胞、多能性細胞、エフェクター細胞、幹細胞、及び／又は支持細胞から形成できる。スフェロイドは、球状又は不規則な形状としてもよい。スフェロイドは、不均一な細胞集団、細胞型、異なる状態の細胞、例えば増殖細胞、静止細胞、及び壊死細胞を含有し得る。
【0113】
いくつかの実施形態において、スフェロイド／凝集体のサイズは、調整され得る。例えば、凝集体のサイズが細胞スフェロイド内の酸素分布を決定でき、それにより酸素供給の降順で外側、中間及び内側スフェロイド領域から構成された、それぞれ増殖、静止生存及びアポトーシスのコア特性を示す離散ゾーンが形成されるため、多能性幹細胞における凝集体のサイズは、増大期間中に重要となる可能性がある（その全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれるＬａｎｇａｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ． ２０１６；１１（２））。いくつかの実施形態において、凝集体は、約５０μｍ～５００μｍ、約１００μｍ～１０００μｍ、約２００μｍ～２０００μｍ、約２５０μｍ～２５００μｍ、約３００μｍ～３０００μｍ、約４００μｍ～４０００μｍであり得る。実施形態において、スフェロイド／凝集体のサイズは、２５０μｍであり得る。
【0114】
使用方法
本開示は、対象の状態を治療又は予防する方法を提供する。本方法は、本明細書に記載の細胞集団のいずれか、又は本明細書に記載の細胞集団のいずれかを含む医薬組成物を、対象の状態を治療又は予防するのに有効な量で対象に投与することを含む。状態は、がん、免疫不全、自己免疫病状、感染、又は血液病状であり得る。状態は対象の胸腺の機能の欠如、低下若しくは異常に関連し得る。例えば、状態は、ディジョージ症候群、胸腺腫（Ａ型胸腺腫又はＢ型胸腺腫等）、ＣＨＡＲＧＥ症候群、ＦＯＸＮ１欠損症、ＰＡＸ１欠損症、ＴＢＸ１欠損症、胸腺腫瘍、胸腺萎縮（加齢性胸腺萎縮等）、胸腺嚢胞、胸腺過形成、胸腺低形成、胸腺無形成、胸腺異形成、胸腺放射、重症筋無力症、胸腺がん、又は胸腺過形成、胸腺放射、加齢若しくは感染関連の胸腺機能低下であり得る。
本開示は、対象の状態を治療又は予防する方法を提供する。本方法は、本明細書に記載の細胞集団のいずれか、又は本明細書に記載の細胞集団のいずれかを含む医薬組成物を、対象の状態を治療又は予防するのに有効な量で対象に投与することを含む。状態は、がん、免疫不全、自己免疫病状、感染、又は血液病状であり得る。状態は対象の胸腺の機能の欠如、低下若しくは異常に関連し得る。例えば、状態は、ディジョージ症候群、胸腺腫（Ａ型胸腺腫又はＢ型胸腺腫等）、ＣＨＡＲＧＥ症候群、ＦＯＸＮ１欠損症、ＰＡＸ１欠損症、ＴＢＸ１欠損症、胸腺腫瘍、胸腺萎縮（加齢性胸腺萎縮等）、胸腺嚢胞、胸腺過形成、胸腺低形成、胸腺無形成、胸腺異形成、胸腺放射、重症筋無力症、胸腺がん、又は胸腺過形成、胸腺放射、加齢若しくは感染関連の胸腺機能低下であり得る。
【0115】
特定の実施形態において、本明細書に記載の細胞は、胸腺摘出手術を受けることができる対象を治療するために使用できる。特定の実施形態において、対象は、先天性心疾患を有してもよく、開胸手術を受けていてもよく又は開胸手術を受けている。対象は、胸腺に関連する１つ又は複数の適応症、例えば、重症筋無力症又は胸腺腫を治療するための胸腺摘出術を受けることができる。
【0116】
様々ながんは、本開示の医薬組成物で治療できる。がんは、腫瘍又は血液悪性腫瘍であり得、あらゆるタイプのリンパ腫／白血病、がん腫及び肉腫、例えば肛門、膀胱、胆管、骨、脳、乳房、子宮頸部、結腸／直腸、子宮内膜、食道、目、胆嚢、頭頸部、肝臓、腎臓、喉頭、肺、縦隔（胸）、口、卵巣、膵臓、陰茎、前立腺、皮膚、小腸、胃、脊髄、尾骨、睾丸、甲状腺、子宮に見られたがん又は腫瘍を含むが、それらに限定されない。
【0117】
本開示の細胞、組成物及び医薬組成物は、感染症を治療するために使用できる。感染症は、細菌、ウイルス、原生動物、及び／又は真菌等に限定されない生物によって引き起こされ得る。
【0118】
ＩＶ、医薬組成物
本開示の医薬組成物は、本明細書に記載の１つ又は複数の細胞、及び１つ又は複数の薬学的に又は生理的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を有する組成物を含み得る。かかる組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水等のような緩衝液と、グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトール等のような炭水化物と、タンパク質と、ポリペプチド又はグリシン等のようなアミノ酸と、抗酸化剤と、ＥＤＴＡ又はグルタチオン等のようなキレート剤と、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）と、保存剤と、を含み得る。本開示の組成物は、一態様において静脈内投与用に調製される。
本開示の医薬組成物は、本明細書に記載の１つ又は複数の細胞、及び１つ又は複数の薬学的に又は生理的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を有する組成物を含み得る。かかる組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水等のような緩衝液と、グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトール等のような炭水化物と、タンパク質と、ポリペプチド又はグリシン等のようなアミノ酸と、抗酸化剤と、ＥＤＴＡ又はグルタチオン等のようなキレート剤と、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）と、保存剤と、を含み得る。本開示の組成物は、一態様において静脈内投与用に調製される。
【0119】
いくつかの実施形態において、医薬製剤は、例えば、生理食塩水（約０．９０％ｗ／ｖのＮａＣｌ水溶液、約３００ｍＯｓｍ／ＬのＮａＣｌ水溶液、又は水１リットル当たり約９．０ｇのＮａＣｌ）、ＮＯＲＭＯＳＯＬ Ｒ電解質溶液（Ａｂｂｏｔｔ、シカゴ、ＩＬ）、ＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ Ａ（Ｂａｘｔｅｒ、ディアフィールド、ＩＬ）、約５％のデキストロース水溶液、又は乳酸リンゲル液等、任意の等張担体を含み得る。一実施形態において、薬学的に許容される担体は、ヒト血清アルブミンで補充され得る。
【0120】
ある実施形態において、医薬組成物は、例えば、エンドトキシン、マイコプラズマ、複製コンピテントレンチウイルス（ＲＣＬ）、ｐ２４、ＶＳＶ－Ｇ核酸、ＨＩＶ ｇａｇ、残留抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コーティングビーズ、マウス抗体、プールされたヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養培地成分、ベクターパッケージング細胞又はプラスミド成分、細菌及び真菌から選択された混入物を実質的に含まなくてもよく、例えば、検出可能なレベルの混入物がなくてもよい。
【0121】
緩衝液
いくつかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、１つ又は複数の緩衝剤で調製される。
いくつかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、１つ又は複数の緩衝剤で調製される。
【0122】
例示的な緩衝剤としては、クエン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、リン酸緩衝溶液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプト酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、Ｄ－グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、第二リン酸カルシウム、リン酸、第三リン酸カルシウム、水酸化リン酸カルシウム、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、リン酸二カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、発熱物質を含まない水、等張食塩水、リンガー液、エチルアルコール等、及び／又はそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない。
【0123】
非限定的な例は、ｐＨ７．４のリン酸緩衝製剤、又はｐＨ６．２のクエン酸緩衝製剤等のような水性製剤、３％マンニトールを含有するｐＨ６．２のクエン酸緩衝製剤、４％マンニトール／１％スクロースを含有するｐＨ６．２のクエン酸緩衝製剤等のような凍結乾燥用製剤、又は、その全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれるＲｅｄｄｙらによる米国特許第８８８３７３７号に開示されているプロセスによって調製される製剤を含む。
【0124】
いくつかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、非経口剤形で製剤化される。非経口製剤は、塩、炭水化物及び緩衝剤（例えば、ｐＨ３～９）等のような担体又は賦形剤を含有する水溶液、又は滅菌非水溶液、又は滅菌の、発熱物質を含まない水等のような好適なビヒクルと組み合わせて使用できる乾燥形態であり得る。例えば、本開示の治療薬の水溶液は、例えば、その全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれるＶｌａｈｏｖら（Ｅｎｄｏｃｙｔｅ）による米国特許第７，９１０，５９４号に開示されているように、等張食塩水、５％グルコース又は他の薬学的に許容される液体担体、例えば液体アルコール、グリコール、エステル、及びアミド等を含む。別の例では、本開示の治療薬の水溶液は、その全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれるＬｅａｍｏｎらによるＷＯ２０１１０１４８２１の実施例２３に開示されているような、静脈内投与用のリン酸緩衝製剤（ｐＨ７．４）を含む。非経口剤形は、本開示の治療薬の用量を含む再構成可能な凍結乾燥物の形態としてもよい。当分野で既知の任意の長期放出剤形、例えば、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第４，７１３，２４９号、同第５，２６６，３３３号、及び同第５，４１７，９８２号に記載の生分解性炭水化物マトリックスは利用でき、又は、代替的に、低速ポンプ（例えば、浸透圧ポンプ）を使用できる。
【0125】
栄養素
いくつかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、本明細書に記載の細胞の健康、生存、及び／又は増殖を改善する１つ又は複数の栄養素を含む。
いくつかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、本明細書に記載の細胞の健康、生存、及び／又は増殖を改善する１つ又は複数の栄養素を含む。
【0126】
いくつかの実施形態において、医薬製剤は、ビタミンを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ビオチン、酢酸ＤＬアルファトコフェロール、ＤＬアルファ－トコフェロール、ビタミンＡ、塩化コリン、パントテン酸カルシウム、パントテン酸、葉酸ニコチンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、イノシトール、ビタミンＢ１２のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、若しくは１３種（及びそこから導き出せる任意の値域）を含み、あるいは医薬組成物は、それらの組み合わせ若しくはそれらの塩を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ビオチン、酢酸ＤＬアルファトコフェロール、ＤＬアルファ－トコフェロール、ビタミンＡ、塩化コリン、パントテン酸カルシウム、パントテン酸、葉酸ニコチンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、イノシトール、及びビタミンＢ１２を含む又はそれらから本質的になる。いくつかの実施形態において、ビタミンは、ビオチン、酢酸ＤＬアルファトコフェロール、ＤＬアルファ－トコフェロール、ビタミンＡ、又はそれらの組み合わせ若しくは塩を含む又はそれらから本質的になる。
【0127】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、タンパク質を更に含む。いくつかの実施形態において、タンパク質は、アルブミン若しくはウシ血清アルブミン、ＢＳＡの画分、カタラーゼ、インスリン、トランスフェリン、スーパーオキシドジスムターゼ、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、コルチコステロン、Ｄガラクトース、エタノールアミン、グルタチオン、Ｌ－カルニチン、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン、亜セレン酸ナトリウム、若しくはトリヨード－Ｉ－サイロニン、又はそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数を含む。
【0128】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、アミノ酸、無機イオン、及び／又は単糖を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸は、アルギニン、シスチン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、グルタミン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン、若しくはバリン、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、無機イオンは、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、窒素、若しくはリン、又はそれらの組み合わせ若しくは塩を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、モリブデン、バナジウム、鉄、亜鉛、セレン、銅、若しくはマンガン、又はそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数を更に含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、コルチコステロン、Ｄ－ガラクトース、エタノールアミン、グルタチオン、Ｌ－カルニチン、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン、亜セレン酸ナトリウム、若しくはトリヨード－Ｉ－サイロニン、アミノ酸（アルギニン、シスチン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、グルタミン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン、又はバリン等）、単糖、無機イオン（ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、窒素、及び／又はリン等）若しくはそれらの塩、及び／又はモリブデン、バナジウム、鉄、亜鉛、セレン、銅、若しくはマンガンのうちの１つ又は複数を更に含む。
【0129】
保存剤
例示的な保存剤としては、抗酸化剤、キレート剤、抗微生物性保存剤、抗真菌性保存剤、アルコール保存剤、酸性保存剤、及び／又は他の保存剤を含み得るが、それらに限定されない。例示的な抗酸化剤としては、αトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、及び／又は亜硫酸ナトリウムを含むが、それらに限定されない。例示的なキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、及び／又はエデト酸三ナトリウムを含む。例示的な抗微生物性保存剤としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミドウレア、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、及び／又はチメロサールを含むが、それらに限定されない。例示的な抗真菌性保存剤としては、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、及び／又はソルビン酸を含むが、それらに限定されない。例示的なアルコール保存剤としては、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、フェノール化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシ安息香酸塩、及び／又はフェニルエチルアルコールを含むが、それらに限定されない。例示的な酸性保存剤としては、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、βカロチン、クエン酸、酢酸、デヒドロ酢酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、及び／又はフィチン酸を含むが、それらに限定されない。他の保存剤としては、トコフェロール、酢酸トコフェロール、デテロキシムメシレート、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ｂｕｔｙｌａｔｅｄ ｈｙｄｒｏｘｙｔｏｌｕｅｎｅｄ）（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、ＧＬＹＤＡＮＴ ＰＬＵＳ（登録商標）、ＰＨＥＮＯＮＩＰ（登録商標）、メチルパラベン、ＧＥＲＭＡＬＬ（登録商標）１１５、ＧＥＲＭＡＢＥＮ（登録商標）ＩＩ、ＮＥＯＬＯＮＥ（商標）、ＫＡＴＨＯＮ（商標）、及び／又はＥＵＸＹＬ（登録商標）を含むが、それらに限定されない。
例示的な保存剤としては、抗酸化剤、キレート剤、抗微生物性保存剤、抗真菌性保存剤、アルコール保存剤、酸性保存剤、及び／又は他の保存剤を含み得るが、それらに限定されない。例示的な抗酸化剤としては、αトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、及び／又は亜硫酸ナトリウムを含むが、それらに限定されない。例示的なキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、及び／又はエデト酸三ナトリウムを含む。例示的な抗微生物性保存剤としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミドウレア、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、及び／又はチメロサールを含むが、それらに限定されない。例示的な抗真菌性保存剤としては、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、及び／又はソルビン酸を含むが、それらに限定されない。例示的なアルコール保存剤としては、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、フェノール化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシ安息香酸塩、及び／又はフェニルエチルアルコールを含むが、それらに限定されない。例示的な酸性保存剤としては、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、βカロチン、クエン酸、酢酸、デヒドロ酢酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、及び／又はフィチン酸を含むが、それらに限定されない。他の保存剤としては、トコフェロール、酢酸トコフェロール、デテロキシムメシレート、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ｂｕｔｙｌａｔｅｄ ｈｙｄｒｏｘｙｔｏｌｕｅｎｅｄ）（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、ＧＬＹＤＡＮＴ ＰＬＵＳ（登録商標）、ＰＨＥＮＯＮＩＰ（登録商標）、メチルパラベン、ＧＥＲＭＡＬＬ（登録商標）１１５、ＧＥＲＭＡＢＥＮ（登録商標）ＩＩ、ＮＥＯＬＯＮＥ（商標）、ＫＡＴＨＯＮ（商標）、及び／又はＥＵＸＹＬ（登録商標）を含むが、それらに限定されない。
【0130】
Ｖ、用法・用量
上述した本開示の細胞及び医薬組成物は、全身送達又は局所送達の任意の送達経路によって投与でき、それにより、治療上有効な結果がもたらされる。
上述した本開示の細胞及び医薬組成物は、全身送達又は局所送達の任意の送達経路によって投与でき、それにより、治療上有効な結果がもたらされる。
【0131】
いくつかの実施形態において、胸腺細胞及びエフェクター細胞は、対象の同じ解剖学的位置に共送達され得る。いくつかの実施形態において、胸腺細胞及びエフェクター細胞は、対象の異なる解剖学的位置に送達され得る。
【0132】
いくつかの実施形態において、胸腺細胞及びエフェクター細胞は、同じ送達経路又は異なる送達経路を通じて同時に対象に送達され得る。
【0133】
いくつかの実施形態において、胸腺細胞は、エフェクター細胞の投与前に対象に投与され得る。
【0134】
いくつかの実施形態において、胸腺細胞は、エフェクター細胞の投与後に対象に投与され得る。
【0135】
投与経路の非限定的な例としては、腸内（腸の中へ）、胃腸、硬膜外（硬膜の中へ）、経口（口を介して）、経皮、脳内（脳の中へ）、脳室内（脳室の中へ）、皮膚上（皮膚への塗布）、内皮（皮膚自体の中へ）、皮下（皮膚深部）、鼻投与（鼻を介して）、静脈内（静脈の中へ）、静脈内ボーラス、静脈内持続注入、動脈内（動脈の中へ）、筋肉内（筋肉の中へ）、心臓内（心臓の中へ）、骨内注入（骨髄の中へ）、髄腔内（脊柱管の中へ）、実質内（脳組織の中へ）、腹腔内（腹腔中への注入若しくは注射）、膀胱内注入、硝子体内（眼を介して）、空洞内注射（患部空洞の中へ）、腔内（陰茎基部の中へ）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身分布のためにインタクトな皮膚を介した拡散）、経粘膜（粘膜を介した拡散）、経膣、通気（鼻で吸う）、舌下、口唇下、浣腸、点眼剤（結膜上に）、又は点耳剤、耳介（耳内若しくは耳を介して）、頬（頬に向けて）、結膜、皮膚、歯（１つ又は複数の歯に対して）、電気浸透、子宮頸管内、静脈洞内（ｅｎｄｏｓｉｎｕｓｉａｌ）、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質、腹部内、羊膜内、関節内、胆管内、気管支内、滑液嚢内、軟骨内（軟骨内）、尾側内（馬尾内）、槽内（後小脳延髄槽内）、角膜内（角膜の中で）、歯科、冠内（冠動脈内）、海綿体内（陰茎海綿体の膨張性空間内）、椎間板内（椎間板の中で）、管内（腺管の中で）、十二指腸内（十二指腸の中で）、硬膜内（硬膜の中で若しくは硬膜下）、表皮内（表皮に向けて）、食道内（食道に向けて）、胃内（胃の中で）、歯肉内（歯肉の中で）、回腸内（小腸の末端部の中で）、病変内（局所病変内若しくは病巣への直接導入）、腔内（管腔内）、リンパ管内（リンパ管の中で）、髄質内（骨の髄腔内）、髄膜内（髄膜の中で）、心筋内（心筋の中で）、眼球内（眼内）、卵巣内（卵巣の中で）、心膜内（心膜の中で）、胸膜内（胸膜の中で）、前立腺内（前立腺の中で）、肺内（肺若しくはその気管支内）、洞内（鼻内若しくは眼窩部副鼻腔内）、脊髄内（脊椎の中で）、髄液嚢内（関節の髄液腔内）、腱内（腱の中で）、精巣内（睾丸の中で）、髄腔内（脳脊髄軸の任意のレベルの脳脊髄液内）、胸腔内（胸郭の中で）、細管内（臓器の細管内）、腫瘍内（腫瘍の中で）、鼓室内（中耳内）、脈管内（１つ又は複数の脈管内）、心室内（心室の中で）、イオン導入（電流を用いて、可溶性塩のイオンを身体組織中に移動させる）、洗浄（開放創又は体腔を洗うか、若しくは洗い流す）、喉頭（喉頭の直上）、経鼻胃（鼻を介して胃の中へ）、密封包帯法（包帯で覆い、患部を密封する局所投与）、経眼（外眼部へ）、経口咽頭（口腔及び咽頭に直接）、非経口、経皮、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周、直腸、呼吸器（局所若しくは全身効果のために口若しくは鼻からの吸入により気道内）、球後（橋の後ろ若しくは眼球の後ろ）、軟部組織、クモ膜下、結膜下、粘膜下、局所的、経胎盤（胎盤を介して、若しくは胎盤を横切って）、経気管（気管の壁を介して）、経鼓室（鼓室を介して、若しくは鼓室を横切って）、尿管（尿管に向けて）、尿道（尿道に向けて）、膣、仙骨ブロック、診断、神経ブロック、胆管灌流、心臓灌流、循環光療法又は脊髄を含む。
【0136】
いくつかの実施形態において、本開示の細胞を含有する医薬組成物は、胸腺内に（胸腺の中へ）送達され得る。
【0137】
いくつかの実施形態において、本開示の細胞を含有する医薬組成物は、対象に外科的に配置され得る。非限定的な例として、細胞は、腎臓被膜又は大腿四頭筋に外科的に配置され得る。
【0138】
いくつかの実施形態において、細胞及び医薬組成物は、肝内投与、脾臓内注射又は門脈内注射を介して投与され得る。
【0139】
本明細書に記載の細胞及び医薬組成物は、骨髄への直接注射（本明細書では骨内注入という）によって対象に提供することができる。骨は、脛骨、腓骨、大腿骨、中足骨、下肢の趾節骨、上腕骨、橈骨、尺骨、中手骨、及び／又は上肢の指節骨等の長骨であり得る。
【0140】
非経口投与及び注射剤投与
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞及び医薬組成物は非経口的に投与され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞及び医薬組成物は非経口的に投与され得る。
【0141】
注射用調製物、例えば、滅菌注射用水性又は油性懸濁液は、好適な分散剤、湿潤剤、及び／又は懸濁化剤を使用して公知の技術に従って製剤化され得る。滅菌注射用調製物は、例えば、１，３－ブタンジオール中の溶液等、非経口的に許容される非毒性の希釈剤及び／又は溶媒中の滅菌注射用溶液、懸濁液、及び／又はエマルションであり得る。用いられ得る許容されるビヒクル及び溶媒としては、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、及び等張塩化ナトリウム溶液が挙げられる。滅菌固定油は、従来から溶媒又は懸濁媒体として用いられている。この目的のために、合成モノグリセリド又は合成ジグリセリドを含めて、任意の無刺激の固定油は用いられ得る。オレイン酸等の脂肪酸は注射剤の調製に使用できる。
【0142】
注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過により、及び／又は使用前に滅菌水若しくは他の滅菌注射用媒体中に溶解又は分散できる滅菌固形組成物の形態の滅菌剤を組み込むことにより、滅菌され得る。
【0143】
有効成分の効果を延長させるために、皮下注射又は筋肉内注射からの薬物の吸収を遅らせることが望ましい場合が多い。これは、難水溶性である結晶性又は非晶質の液体懸濁液を使用することにより達成され得る。活性成分の吸収速度は、溶解速度に依存し、溶解速度は、ひいては、結晶のサイズ及び結晶系に依存し得る。あるいは、非経口投与される薬物形態の遅延吸収は、薬物を油性ビヒクルに溶解又は懸濁させることによって達成される。注射可能なデポー形態は、ポリラクチド－ポリグリコリドのような生分解性ポリマー中で、薬物のマイクロカプセル化マトリックスを形成することにより作製される。薬物放出の速度は、ポリマーに対する薬物の比率、及び用いられる具体的なポリマーの性質に応じて制御され得る。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）を含む。デポー注射用製剤は、身体組織と適合可能であるリポソーム又はマイクロエマルジョン中に薬物を捕捉することによって調製される。
【0144】
リンパ節投与
特定の実施形態において、本開示の胸腺細胞及び／又は医薬組成物は、リンパ節内への生着により、対象体内に送達され得る。いくつかの実施形態において、本開示の胸腺細胞及び／又は医薬組成物は、リンパ節において異所性胸腺組織を形成するのに有効な量で対象に送達され得る。特定の実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物は、本開示の細胞及び／又は医薬組成物を対象のリンパ節内に送達して、胸腺細胞がリンパ節に生着し異所性胸腺を産生できるようにするために使用される。特定の実施形態において、異所性胸腺は、対象の胸腺機能を回復させることができ、例えば、正常健康な胸腺臓器が実行できる１つ又は複数の機能を補足又は増強することができる。例えば、異所性胸腺は、Ｔ細胞成長、発達、成熟、選択及び／又は機能を促進することで、身体の免疫調節に関与することができるが、これに限定されない。
特定の実施形態において、本開示の胸腺細胞及び／又は医薬組成物は、リンパ節内への生着により、対象体内に送達され得る。いくつかの実施形態において、本開示の胸腺細胞及び／又は医薬組成物は、リンパ節において異所性胸腺組織を形成するのに有効な量で対象に送達され得る。特定の実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物は、本開示の細胞及び／又は医薬組成物を対象のリンパ節内に送達して、胸腺細胞がリンパ節に生着し異所性胸腺を産生できるようにするために使用される。特定の実施形態において、異所性胸腺は、対象の胸腺機能を回復させることができ、例えば、正常健康な胸腺臓器が実行できる１つ又は複数の機能を補足又は増強することができる。例えば、異所性胸腺は、Ｔ細胞成長、発達、成熟、選択及び／又は機能を促進することで、身体の免疫調節に関与することができるが、これに限定されない。
【0145】
細胞及び医薬組成物が送達できるリンパ節の非限定的な例としては、空腸、膝窩、腋窩、門脈周囲リンパ節、腹部リンパ節、腹腔リンパ節、傍大動脈リンパ節、脾門リンパ節、肝門部リンパ節、左胃リンパ節、右胃リンパ節、左胃大網（ｌｅｆｔ ｇａｓｔｒｏｏｍｅｎｔａｌ）（左胃網（ｌｅｆｔ ｇａｓｔｒｏｅｐｉｐｌｏｉｃ））リンパ節、右胃大網（ｒｉｇｈｔ ｇａｓｔｒｏｏｍｅｎｔａｌ）（右胃網（ｒｉｇｈｔ ｇａｓｔｒｏｅｐｉｐｌｏｉｃ））リンパ節、後腹膜リンパ節、幽門リンパ節（例えば、幽門上リンパ節、幽門下リンパ節、幽門後リンパ節）、膵臓リンパ節（例えば、上膵リンパ節、下膵リンパ節、脾直系（ｓｐｌｅｎｉｃ ｌｉｎｅａｌ）リンパ節）、脾リンパ節、肝リンパ節（例えば、嚢胞リンパ節、孔リンパ節、ウインスロー孔）、膵十二指腸リンパ節（例えば、上膵十二指腸リンパ節、下膵十二指腸リンパ節）、上腸間膜リンパ節、回結腸リンパ節、盲腸前リンパ節、盲腸後リンパ節、虫垂リンパ節、結腸間膜リンパ節（例えば、結腸傍リンパ節、左結腸リンパ節、中結腸リンパ節、右結腸リンパ節、下腸間膜リンパ節、Ｓ状結腸リンパ節、上直腸リンパ節）、総腸骨リンパ節（例えば、内側総腸骨リンパ節、中間総腸骨リンパ節、外側総腸骨リンパ節、大動脈下リンパ節、岬角総腸骨リンパ節）、及び外腸骨リンパ節（例えば、内側外腸骨リンパ節、中間外腸骨リンパ節、外側外腸骨リンパ節、内側裂孔大腿リンパ節、中間裂孔大腿リンパ節、外側裂孔大腿リンパ節、腸骨動脈間リンパ節、閉鎖－外腸骨閉鎖リンパ節）を含む。
【0146】
非限定的な例として、国際特許公開ＷＯ２０２１０２６１９５（その全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載の胸腺組織をリンパ節内に移植するための方法のいずれも本開示に有用であり得る。
【0147】
デポー投与
本明細書に記載のように、いくつかの実施形態において、本開示の医薬組成物を含む細胞及び組成物は、持続放出のためにデポー剤として製剤化される。一般に、特定の臓器又は組織（「標的組織」）は投与の標的とされる。いくつかの実施形態において、局所放出は、生体適合性デバイスの利用により影響される。例えば、生体適合性デバイスは、対象における細胞の拡散を制限できる。
本明細書に記載のように、いくつかの実施形態において、本開示の医薬組成物を含む細胞及び組成物は、持続放出のためにデポー剤として製剤化される。一般に、特定の臓器又は組織（「標的組織」）は投与の標的とされる。いくつかの実施形態において、局所放出は、生体適合性デバイスの利用により影響される。例えば、生体適合性デバイスは、対象における細胞の拡散を制限できる。
【0148】
本開示のいくつかの態様において、細胞、組成物及び医薬組成物は、標的組織内又はその近位に空間的に保持される。標的組織（１つ又は複数の標的細胞を含む）と医薬組成物を、それらが実質的に標的組織内に保持される条件下、即ち組成物の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９、又は９９．９９％超が標的組織内に保持される条件下で、接触させることによって、哺乳動物対象の標的組織に医薬組成物を提供する方法が提供される。例えば、対象に投与された医薬組成物の少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、又は９９．９９％超は、投与後の一定期間存在する。
【0149】
用量及びレジメン
本開示は、本開示に係る細胞、組成物及び医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する方法を提供する。記載される細胞を含む医薬組成物は、疾患、障害、及び／又は状態の予防、治療、管理、又は診断に有効な任意の投与量及び任意の投与経路を使用して対象に投与され得る。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、及び全身状態、疾患の重篤度、特定の組成物、その投与方式、その活動方式等に応じて、対象ごとに変動する。対象は、ヒト、哺乳動物、又は動物であり得る。任意の特定の個体に対する具体的な治療上有効な、予防上有効な、又は適切な診断用量レベルは、治療される障害及び障害の重篤度と、用いられる具体的なペイロードの活性と、用いられる具体的な組成物と、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食事と、投与時間及び投与経路と、を含む様々な要因に依存する。
本開示は、本開示に係る細胞、組成物及び医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する方法を提供する。記載される細胞を含む医薬組成物は、疾患、障害、及び／又は状態の予防、治療、管理、又は診断に有効な任意の投与量及び任意の投与経路を使用して対象に投与され得る。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、及び全身状態、疾患の重篤度、特定の組成物、その投与方式、その活動方式等に応じて、対象ごとに変動する。対象は、ヒト、哺乳動物、又は動物であり得る。任意の特定の個体に対する具体的な治療上有効な、予防上有効な、又は適切な診断用量レベルは、治療される障害及び障害の重篤度と、用いられる具体的なペイロードの活性と、用いられる具体的な組成物と、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食事と、投与時間及び投与経路と、を含む様々な要因に依存する。
【0150】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞、組成物及び／又は医薬組成物の用量は、約１ｘ１０６、１．１ｘ１０６、２ｘ１０６、３．６ｘ１０６、５ｘ１０６、１ｘ１０７、１．８ｘ１０７、２ｘ１０７、５ｘ１０７、１ｘ１０８、２ｘ１０８、３ｘ１０８、又は５ｘ１０８細胞／ｋｇであり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞、組成物及び／又は医薬組成物の用量は、少なくとも約１ｘ１０６、２ｘ１０６、３ｘ１０６、５ｘ１０６、１ｘ１０７、２ｘ１０７、５ｘ１０７、１ｘ１０８、２ｘ１０８、３ｘ１０８、又は５ｘ１０８細胞／ｋｇであり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞、組成物及び／又は医薬組成物の用量は、最大約１ｘ１０６、２ｘ１０６、３．６ｘ１０６、５ｘ１０６、１ｘ１０７、２ｘ１０７、５ｘ１０７、１ｘ１０８、２ｘ１０８、３ｘ１０８、又は５ｘ１０８細胞／ｋｇであり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞、組成物及び／又は医薬組成物の用量は、約１ｘ１０７、２ｘ１０７、５ｘ１０７、１ｘ１０８、２ｘ１０８、３ｘ１０８、５ｘ１０８、１ｘ１０９、２ｘ１０９、又は５ｘ１０９細胞／ｋｇであり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞、組成物及び／又は医薬組成物の用量は、約１ｘ１０７、２ｘ１０７、５ｘ１０７、１ｘ１０８、２ｘ１０８、３ｘ１０８、５ｘ１０８、１ｘ１０９、２ｘ１０９、又は５ｘ１０９細胞／ｋｇであり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞、組成物及び／又は医薬組成物の用量は、約１ｘ１０７、２ｘ１０７、５ｘ１０７、１ｘ１０８、２ｘ１０８、３ｘ１０８、５ｘ１０８、１ｘ１０９、２ｘ１０９、又は５ｘ１０９細胞／ｋｇであり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞、組成物及び／又は医薬組成物の用量は、約１ｘ１０７、１．５ｘ１０７、２ｘ１０７、２．５ｘ１０７、３ｘ１０７、３．５ｘ１０７、４ｘ１０７、５ｘ１０７、１ｘ１０８、１．５ｘ１０８、２ｘ１０８、２．５ｘ１０８、３ｘ１０８、３．５ｘ１０８、４ｘ１０８、５ｘ１０８、１ｘ１０９、２ｘ１０９、又は５ｘ１０９細胞／ｋｇであり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞、組成物及び／又は医薬組成物の用量は、約１～３ｘ１０７から１～３ｘ１０８細胞／ｋｇであり得る。
【0151】
特定の実施形態において、本明細書に記載の細胞又は本開示に係る医薬組成物は、約１０～６００μｌ／部位、５０～約５００μｌ／部位、１００～約４００μｌ／部位、１２０～約３００μｌ／部位、１４０～約２００μｌ／部位、約１６０μｌ／部位で投与され得る。
【0152】
所望の用量は、少なくとも１回、１日３回、１日２回、１日１回、隔日、３日ごと、毎週、隔週、３週間ごと、又は４週間ごとに送達され得る。特定の実施形態において、所望の用量は、複数回投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、又はそれ以上回数の投与）を使用して送達され得る。
【0153】
本開示の細胞の所望の用量は、１回又は複数回投与できる。細胞、組成物及び医薬製剤は、一定期間にわたって設定された頻度で定期的に投与され得るか、又は「連続フロー」として連続的に投与され得る。１日の総用量、即ち２４時間の期間内に投与又は処方される量は、これらの方法のいずれか、又はこれらの方法の組み合わせによって投与され得る。
【0154】
いくつかの実施形態において、細胞の対象への送達により、少なくとも１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１３カ月、１４カ月、１５カ月、１６カ月、１７カ月、１８カ月、１９カ月、２０カ月、２０カ月、２１カ月、２２カ月、２３カ月、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、又は１０年超の治療効果がもたらされる。
【0155】
本開示の細胞は、１つ又は複数の他の治療薬、予防薬、研究薬若しくは診断薬、又は医療処置と、連続的に又は同時に併用できる。一般に、各薬剤は、その薬剤について決定された用量及び／又は時間スケジュールで投与される。いくつかの実施形態において、本開示は、生物学的利用能を向上させ、代謝を減少させ且つ／又は改変し、排泄を阻害し、且つ／又は体内での分布を改変することができる薬剤と併用する医薬組成物、予防組成物、研究組成物、若しくは診断組成物の送達を包含する。
【0156】
例えば、本開示の細胞は、治療標的領域における生物学的利用能を向上させるために対象体内での拡散を制限する生体適合性デバイスとして投与される。本開示の細胞は、局所送達によって投与されてもよい。
【0157】
「前処置レジメン」という用語は、患者が幹細胞移植前に受ける療法の過程を指す。例えば、造血幹細胞移植前に、患者は、たとえ幹細胞が該患者に由来したとしても、幹細胞移植の拒絶反応を予防するために、骨髄破壊的療法、非骨髄破壊的療法、又は強度を下げた前処置を受け得る。前処置レジメンは、細胞毒性物質の投与を伴い得る。前処置レジメンは、免疫抑制、抗体、及び照射も含み得る。他の可能な前処置レジメンとしては、抗体媒介性前処置（例えば、Ｃｚｅｃｈｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．， ３１８ （５８５４） Ｓｃｉｅｎｃｅ １２９６－９ （２００７）、Ｐａｌｃｈａｕｄａｒｉ ｅｔ ａｌ．， ３４（７） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７３８－７４５ （２０１６）、Ｃｈｈａｂｒａ ｅｔ ａｌ．， １０：８（３５１） Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３５１ｒａ１０５ （２０１６）を参照）及びＣＡＲ－Ｔ媒介性前処置（例えば、Ａｒａｉ ｅｔ ａｌ．， ２６（５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １１８１－１１９７ （２０１８）を参照。それらそれぞれは参照によって全体として本明細書に組み込まれる）を含む。前処置レジメンは、移植細胞が生着及び増殖するための場所を体内に有することを可能にするニッチ「空間」を作り出すようにも設計される。造血幹細胞移植では、例えば、前処置レジメンは、移植造血幹細胞が生着するためのニッチ空間を骨髄中に作り出す。前処置レジメン無しでは、移植造血幹細胞は生着することができない。いくつかの実施形態において、対象には、前処置レジメンに続いて本開示の細胞、組成物及び／又は医薬製剤が投与され得る。
【0158】
ＶＩ、定義
発現：本明細書で使用されるように、「発現」及びその文法上の等価物は、マーカーの文脈において、マーカーの産生、及びマーカーのレベル又は量を指す。例えば、細胞におけるマーカーの発現又はマーカーの存在又は細胞がマーカーに対して陽性であるとは、陽性対照レベルと同様のレベルでのマーカーの発現を指す。陽性対照レベルは、マーカーと関連する細胞運命を有することが知られている細胞によって発現されるマーカーのレベルによって決定され得る。同様に、マーカーの発現がない、又は細胞がマーカーに対して陰性であるとは、陰性対照レベルと同様のレベルでのマーカーの発現を指す。陰性対照レベルは、マーカーと関連する細胞運命を持たないことが知られている細胞によって発現されるマーカーのレベルによって決定され得る。そのため、マーカーが存在しないということは、マーカーの発現が検出不可のレベルであることを単に意味するものではなく、特定の場合において、細胞がマーカーを発現している可能性があるが、その発現が陽性対照と比較して低いか、又は陰性対照のそれに類似したレベルであり得る。
発現：本明細書で使用されるように、「発現」及びその文法上の等価物は、マーカーの文脈において、マーカーの産生、及びマーカーのレベル又は量を指す。例えば、細胞におけるマーカーの発現又はマーカーの存在又は細胞がマーカーに対して陽性であるとは、陽性対照レベルと同様のレベルでのマーカーの発現を指す。陽性対照レベルは、マーカーと関連する細胞運命を有することが知られている細胞によって発現されるマーカーのレベルによって決定され得る。同様に、マーカーの発現がない、又は細胞がマーカーに対して陰性であるとは、陰性対照レベルと同様のレベルでのマーカーの発現を指す。陰性対照レベルは、マーカーと関連する細胞運命を持たないことが知られている細胞によって発現されるマーカーのレベルによって決定され得る。そのため、マーカーが存在しないということは、マーカーの発現が検出不可のレベルであることを単に意味するものではなく、特定の場合において、細胞がマーカーを発現している可能性があるが、その発現が陽性対照と比較して低いか、又は陰性対照のそれに類似したレベルであり得る。
【0159】
エフェクター細胞：本明細書で使用されるように、「エフェクター細胞」は、胸腺細胞に接触又は近接すると、シグナル又は細胞細胞死トリガーを実行、開始又は伝播する能力を獲得する任意の細胞又は細胞型を指す。「接触又は近接」とは、細胞内在性又は細胞外来性（例えば、細胞間）シグナル伝達又は他のコミュニケーション又は相互作用を可能にするのに十分な時空間的接近を指す。
【0160】
リンパ球：本明細書で使用されるように、「リンパ球」は、当業者がこの用語を理解するであろう意味及び使用を包含し、更に、リンパ組織又は血液中に存在する、骨髄に由来する１種の免疫細胞を指す。いくつかの実施形態において、リンパ球は胸腺内で成熟する。
【0161】
陰性：本明細書で使用されるように、用語「陰性」（「－」と略す場合がある）は、示された細胞マーカーの発現に関して本明細書で使用される場合、細胞が示された細胞マーカーを検出可能なレベルで発現しないことを意味する。
【0162】
陽性：本明細書で使用されるように、用語「陽性」（「＋」と略す場合がある）は、示された細胞マーカーの発現に関して本明細書で使用される場合、細胞が示された細胞マーカーを検出可能なレベルで発現することを意味し、例えば、低い（ただし検出可能）レベルでの発現及び高い（高）レベルでの発現を含み得る。
【0163】
プレＴ細胞：本明細書で使用されるように、「プレＴ細胞」とは、Ｔ細胞に成熟又は分化できるリンパ球を指す。
【0164】
可溶性因子：本明細書で使用されるように、「可溶性因子」とは細胞表面分子に結合できる又は細胞に取り込むことができる任意のタンパク質又はペプチドを指す。細胞による取り込みは受動拡散、トランスポーター、及び／又はエンドサイトーシスによって行われ得る。
【0165】
胸腺細胞又は起源又は系統：本明細書で使用されるように、「胸腺細胞又は胸腺起源又は胸腺系統」とは、胸腺由来の細胞又は胸腺の細胞になる予定の細胞に関連付けられた１つ又は複数の表現型又は遺伝子型マーカーを有する細胞を指す。本明細書で使用されるように、胸腺は胚性、胎児／胎仔、又は成体胸腺であり得る。
【0166】
変異体：生体分子（例えば、訓練因子又は最終因子）に関して使用される用語「変異体」とは、親分子に関連する又は親分子に由来する生体分子を指す。変異体は、例えば、親分子の改変型、切断型、突然変異型、相同型、又は他の変更型であってもよい。用語変異体はポリヌクレオチド又はポリペプチドのいずれかを説明するために使用できる。
【0167】
本開示の１つ又は複数の実施形態の詳細は以下の添付の説明に記載される。本明細書に記載のものと類似又は同等の任意の材料及び方法は本開示の実施又は試験に用いることができるが、好ましい材料及び方法をここに記載する。本開示の他の特徴、目的、及び利点は、本説明から明らかになろう。本説明において、単数形は、文脈が特に示さない限り、複数形も含む。他に定義されない限り、本説明で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合には、本説明が統制する。
【0168】
本開示を以下の非限定的な例によって更に説明する。
【実施例】
【0169】
実施例１ 多能性幹細胞の調製
１日目に、２５０万の単一ｉＰＳＣを１日目の懸濁液に入れ、ＲＯＣＫ阻害物質Ｙ２７６３２（１０μＭ）を添加した。細胞を７０ＲＰＭでのシェーカー上に置いた。２～３日目に、分化を継続し、２日目及び３日目に培地の半分を毎日新しい培地に交換した。この時点で、スフェロイドの直径は約２５０μｍであった。細胞を７０ＲＰＭでのシェーカー上に置いた。４日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。
１日目に、２５０万の単一ｉＰＳＣを１日目の懸濁液に入れ、ＲＯＣＫ阻害物質Ｙ２７６３２（１０μＭ）を添加した。細胞を７０ＲＰＭでのシェーカー上に置いた。２～３日目に、分化を継続し、２日目及び３日目に培地の半分を毎日新しい培地に交換した。この時点で、スフェロイドの直径は約２５０μｍであった。細胞を７０ＲＰＭでのシェーカー上に置いた。４日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。
【0170】
スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、２５０ｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳを（フード内に）吸引した。３～４ｍｌの予め加温したＡｃｃｕｔａｓｅを１５ｍｌコニカルチューブ内に添加した。チューブをタッピングして凝集体を撹拌し、チューブをインキュベーター内に５～７分間置いた。スフェロイドを１５ｍｌチューブ内で２～３分間ごとに撹拌した。５分間後、１０００μｌのピペットを使用して凝集体を穏やかに撹拌して、スフェロイドを単一細胞に変化させた。７～８ｍｌのＤＭＥＭ－Ｆ１２培地を各１５ｍｌチューブに添加し、スフェロイドを室温にて２５０ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。
【0171】
実施例２ 多能性幹細胞からの胚体内胚葉の生成
２日目に、ｉＰＳＣは４つの異なる群に分けられ、異なる条件について試験される。表１及び表２は、利用される培養培地を示し、表３は試験される様々な培養条件を示す。
２日目に、ｉＰＳＣは４つの異なる群に分けられ、異なる条件について試験される。表１及び表２は、利用される培養培地を示し、表３は試験される様々な培養条件を示す。
【0172】
（表１）培地Ａ
【0173】
（表２）培地Ｂ
【0174】
（表３）プロトコル最適化
【0175】
実施例３ 多能性幹細胞からの胸腺細胞の生成
胚体内胚葉（ＤＥ）へのｉＰＳＣの分化
ＤＥへのｉＰＳＣの分化には、小分子及び成長因子を適切なタイミングで導入する必要がある。分化を実施例２に記載のように又は以下のように行った。１日目に、スフェロイド内のＰＳＣを、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、２μＭのＣＨＩＲ９９０２１、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）を含有する培地Ａ／Ａ５０％／５０％（Ｓｔｅｍ Ｓｃａｌｅ及びＤＭＥＭ－Ｆ１２）中で培養した。２日目及び３日目に、細胞を、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、２μＭのＣＨＩＲ９９０２１、ＩＴＳ（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）（１００Ｘ）を含有するＤＭＥＭ－Ｆ１２中で培養した。４～５日目に、細胞を、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＬＤＮ１９３１８９（１００ｎＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００ｘ）を含有するＤＭＥＭ－Ｆ１２中で培養した。
胚体内胚葉（ＤＥ）へのｉＰＳＣの分化
ＤＥへのｉＰＳＣの分化には、小分子及び成長因子を適切なタイミングで導入する必要がある。分化を実施例２に記載のように又は以下のように行った。１日目に、スフェロイド内のＰＳＣを、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、２μＭのＣＨＩＲ９９０２１、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）を含有する培地Ａ／Ａ５０％／５０％（Ｓｔｅｍ Ｓｃａｌｅ及びＤＭＥＭ－Ｆ１２）中で培養した。２日目及び３日目に、細胞を、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、２μＭのＣＨＩＲ９９０２１、ＩＴＳ（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）（１００Ｘ）を含有するＤＭＥＭ－Ｆ１２中で培養した。４～５日目に、細胞を、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＬＤＮ１９３１８９（１００ｎＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００ｘ）を含有するＤＭＥＭ－Ｆ１２中で培養した。
【0176】
前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）への胚体内胚葉（ＤＥ）の分化を以下のように行った。６～７日目に、細胞を、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、ＬＤＮ１９３１８９（０．１μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）をＤＭＥＭ－Ｆ１２に添加することで調製されたＡＦＥ培地中で培養した。
【0177】
腹側咽頭内胚葉（ＶＰＥ）への前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）の分化を以下のように行った。８～１３日目から、細胞を、レチノイン酸（０．１μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＨＨ（ＳＡＧ）（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００Ｘ）及びＮＥＡＡ（１００Ｘ）をＤＭＥＭ－Ｆ１２に添加することで調製されたＶＰＥ培地中で培養した。
【0178】
胸腺上皮前駆細胞への腹側咽頭内胚葉（ＶＰＥ）の分化を２つのプロトコルのうちの１つを使用して行った。プロトコル１で、１４～１６日目から、細胞を、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＡＮＴ－１（０．２５μＭ）、）、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）、アスコルビン酸（３０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）を含有するＤＭＥＭ－Ｆ１２中で培養した。第２プロトコルで、１４～１６日目に、細胞を、ノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）、アスコルビン酸（３０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）を含有するＤＭＥＭ Ｆ１２中で培養した。１７～２１日目に、細胞を、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＡＮＴ－１（０．２５μＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）、アスコルビン酸（３０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）を含有するＤＭＥＭ－Ｆ１２中で培養した。
【0179】
培地を毎日完全に交換した。細胞を収集し、層流フード内に静置させた。上清を吸引し、新しく調製された培地を添加した。加えて、分化段階間で、細胞をＤＭＥＭ－Ｆ１２で洗浄し、５分間静置させた。
【0180】
実施例４ 細胞系の３Ｄ懸濁培養
分化プロトコルを最適化するために使用される３つの多能性細胞系、即ちヒトＥＳ ＦＯＸＮ１－ＧＦＰレポーター系、ヒトｉＰＳＣ系（Ａ１５８４９ ＧＩＢＣＯ）、及びＧＭＰグレードの治療用ｉＰＳＣ細胞系からの研究グレードのｉＰＳＣ系を、確立した。３つの細胞系全てを、マトリゲル使用のインビトロ３Ｄ培養に適合させた。これら細胞系の多能性を、幹細胞マーカーＴＲＡ－１－６０及びＳＳＥＡ－４の発現についてのフローサイトメトリー分析によって分析した。９５％超の多能性幹細胞はＴＲＡ－１及びＳＳＥＡ－４を発現することが判明した。
分化プロトコルを最適化するために使用される３つの多能性細胞系、即ちヒトＥＳ ＦＯＸＮ１－ＧＦＰレポーター系、ヒトｉＰＳＣ系（Ａ１５８４９ ＧＩＢＣＯ）、及びＧＭＰグレードの治療用ｉＰＳＣ細胞系からの研究グレードのｉＰＳＣ系を、確立した。３つの細胞系全てを、マトリゲル使用のインビトロ３Ｄ培養に適合させた。これら細胞系の多能性を、幹細胞マーカーＴＲＡ－１－６０及びＳＳＥＡ－４の発現についてのフローサイトメトリー分析によって分析した。９５％超の多能性幹細胞はＴＲＡ－１及びＳＳＥＡ－４を発現することが判明した。
【0181】
実施例５ ＤＥ細胞の特徴決定
実施例２に記載の４つの異なる培養条件からＧ１～Ｇ４として得られた胚体内胚葉（ＤＥ）細胞を、ＤＥ細胞のマーカー、即ちＳＯＸ１７及びＦＯＸＡ２について分析した。培養群１（Ｇ１）～４（Ｇ４）は、ＤＥの主要なバイオマーカー（ＳＯＸ１７及びＦｏｘＡ２）の発現レベルが相対的に増加した（図１を参照）。
実施例２に記載の４つの異なる培養条件からＧ１～Ｇ４として得られた胚体内胚葉（ＤＥ）細胞を、ＤＥ細胞のマーカー、即ちＳＯＸ１７及びＦＯＸＡ２について分析した。培養群１（Ｇ１）～４（Ｇ４）は、ＤＥの主要なバイオマーカー（ＳＯＸ１７及びＦｏｘＡ２）の発現レベルが相対的に増加した（図１を参照）。
【0182】
細胞は、ＤＥ細胞に関連するマーカー、即ちＥＰＣＡＭ及びＳＯＸ１７の発現にも陽性であった。Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３及びＧ４の二重陽性細胞の数は、それぞれ、１８．２％、１６．２％、５４．３％、及び６９．６％であった。この試験では、Ｇ４は最も多くの陽性細胞を産生した。
【0183】
スフェロイドの開始サイズを操作したところ、ＤＥ細胞の頻度が９５％超に増加した。
【0184】
実施例６ 様々な成長因子の効果
胸腺細胞へのＤＥ細胞の分化は、ＤＥから胸腺への分化に重要であると知られている因子を添加することで促進できる。第３咽頭嚢からの胸腺前駆細胞の発達及び成熟に重要であると知られているＢＭＰが、その一例である。ＢＭＰの添加タイミングの影響を調べた（図２）。スフェロイドを、ｉＰＳＣ状態からＴＥＰへと分化誘導し、ＢＭＰの添加タイミングを変更した。異なる段階（ＤＥ、ＡＦＥ、ＶＰＥ、早期及び後期ＴＥＰ）でスフェロイドを収集し、異なる段階に関連するバイオマーカーについて分析した。早期及び後期ＴＥＰ段階でＢＭＰの有無による条件を比較した。ＢＭＰはＰＡＸ１及びＰＡＸ９を抑制したが、ＴＢＸ１及びＨＯＸＡ３を上方制御した。
胸腺細胞へのＤＥ細胞の分化は、ＤＥから胸腺への分化に重要であると知られている因子を添加することで促進できる。第３咽頭嚢からの胸腺前駆細胞の発達及び成熟に重要であると知られているＢＭＰが、その一例である。ＢＭＰの添加タイミングの影響を調べた（図２）。スフェロイドを、ｉＰＳＣ状態からＴＥＰへと分化誘導し、ＢＭＰの添加タイミングを変更した。異なる段階（ＤＥ、ＡＦＥ、ＶＰＥ、早期及び後期ＴＥＰ）でスフェロイドを収集し、異なる段階に関連するバイオマーカーについて分析した。早期及び後期ＴＥＰ段階でＢＭＰの有無による条件を比較した。ＢＭＰはＰＡＸ１及びＰＡＸ９を抑制したが、ＴＢＸ１及びＨＯＸＡ３を上方制御した。
【0185】
実施例７ インビトロからインビボへの移行の同等性
本明細書に記載の方法によって生成された胸腺細胞が、インビボ移植で、ｍＴＥＣ及びｃＴＥＣに分化すると予想される。３Ｄのスフェロイドがインビボで上皮シートに広がるか否かを試験するために、スフェロイドをマトリゲル上に接着させ、更に２－Ｄにおいて分化させた。マトリゲル上で４～５日間培養した後、ＴＥＣに関連する遺伝子の発現を調査した。図３に示すように、ＤＬＬ４及びＣＫ８発現が下方制御されたが、ＦＯＸＮ１発現が上方制御された。ＦＯＸＮ１は胸腺分化の重要な制御因子である。
本明細書に記載の方法によって生成された胸腺細胞が、インビボ移植で、ｍＴＥＣ及びｃＴＥＣに分化すると予想される。３Ｄのスフェロイドがインビボで上皮シートに広がるか否かを試験するために、スフェロイドをマトリゲル上に接着させ、更に２－Ｄにおいて分化させた。マトリゲル上で４～５日間培養した後、ＴＥＣに関連する遺伝子の発現を調査した。図３に示すように、ＤＬＬ４及びＣＫ８発現が下方制御されたが、ＦＯＸＮ１発現が上方制御された。ＦＯＸＮ１は胸腺分化の重要な制御因子である。
【0186】
実施例８ ＴＥＰ表現型に対する凍結及び解凍の効果
ＴＥＰは、様々な臨床用途において凍結、解凍、及び再培養が必要である場合がある。胸腺細胞に関連するマーカーの発現を凍結及び解凍後に調査した。
ＴＥＰは、様々な臨床用途において凍結、解凍、及び再培養が必要である場合がある。胸腺細胞に関連するマーカーの発現を凍結及び解凍後に調査した。
【0187】
３Ｄ培養物中で凍結され、解凍され、及び再懸濁されたＴＥＰは、約３～４日間でスフェロイドを再形成できた。後期ＴＥＰ段階に関連する遺伝子の発現を、凍結前、及び解凍後スフェロイド形成後に、比較した。遺伝子、即ちＨＯＸＡ３、ＰＡＸ９、ＥＰＣＡＭ、ＣＸＣＬ１２の発現レベルは、凍結前及び解凍後で同様であることから、ＴＥＰが移植のために凍結、解凍及び再培養できることが分かった（図４を参照）。
【0188】
実施例９ 胸腺細胞バイオマーカー
いくつかの推定マーカーは、ＴＥＰ細胞と関連付けられている。それらは、ＣＤ２０５（Ｍｏｈｔａｓｈａｍｉ Ｍ ｅｔ ａｌ ２０１３ Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２５：６０１及びＣａｍｐｉｎｏｔｉ Ｓ ｅｔ ａｌ ２０２０ Ｎａｔ Ｃｏｍｍ １１：１）、ＥＰＣＡＭ（Ｐａｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ ２０１３ Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １３：２１９）、及びクローディン３及び４（Ｈａｍａｚａｋｉ Ｙ ｅｔ ａｌ ２０１６ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２７１：３８）を含む。
いくつかの推定マーカーは、ＴＥＰ細胞と関連付けられている。それらは、ＣＤ２０５（Ｍｏｈｔａｓｈａｍｉ Ｍ ｅｔ ａｌ ２０１３ Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２５：６０１及びＣａｍｐｉｎｏｔｉ Ｓ ｅｔ ａｌ ２０２０ Ｎａｔ Ｃｏｍｍ １１：１）、ＥＰＣＡＭ（Ｐａｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ ２０１３ Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １３：２１９）、及びクローディン３及び４（Ｈａｍａｚａｋｉ Ｙ ｅｔ ａｌ ２０１６ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２７１：３８）を含む。
【0189】
二重陽性ＣＤ２０５＋／ＥＰＣＡＭ＋細胞は、胸腺中の前駆細胞の定量化に使用されている（Ｃａｍｐｉｎｏｔｉ Ｓ ｅｔ ａｌ ２０２０ Ｎａｔ Ｃｏｍｍ １１：１）。このマーカーの組み合わせは、表現型ＴＥＰを特徴決定するために使用された。
【0190】
ＣＤ２０５／ＥＰＣＡＭ二重染色を使用して分化の早期及び後期段階のＴＥＰを分析したところ、ＣＤ２０５＋／ＥＰＣＡＭ＋細胞の頻度が＜１％から＞２５％に増加したことが見出された。これらのデータは、ＣＤ２０５＋／ＥＰＣＡＭ＋がＴＥＰ細胞のマーカーとして使用できることを示す。
【0191】
実施例１０ Ｔ細胞分化のインビトロアッセイ
ｉＰＳＣ－ＴＥＰのインビトロ機能を、インビボ移植後に観察された機能的出力と比較し且つ相関させるために、Ｔ細胞をＣＤ３４＋ＨＳＣから分化させるインビトロアッセイを開発した。陽性対照として、ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｔ－細胞キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用してＣＤ３４＋ＨＳＣから二重陽性（ＤＮ）プロ－Ｔ細胞を生成し、その後二重陽性ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞に成熟させた。２１日目に、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞の百分率は５．３％であり、２８日目に細胞の４９．４％に増加し、３５日目に５３．２％に増加し、４２日目に８６．８％に増加した。
ｉＰＳＣ－ＴＥＰのインビトロ機能を、インビボ移植後に観察された機能的出力と比較し且つ相関させるために、Ｔ細胞をＣＤ３４＋ＨＳＣから分化させるインビトロアッセイを開発した。陽性対照として、ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｔ－細胞キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用してＣＤ３４＋ＨＳＣから二重陽性（ＤＮ）プロ－Ｔ細胞を生成し、その後二重陽性ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞に成熟させた。２１日目に、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞の百分率は５．３％であり、２８日目に細胞の４９．４％に増加し、３５日目に５３．２％に増加し、４２日目に８６．８％に増加した。
【0192】
実施例１１ 多能性幹細胞からの胸腺細胞の調製
多能性幹細胞から胸腺細胞を調製するためのプロトコルを最適化した。
多能性幹細胞から胸腺細胞を調製するためのプロトコルを最適化した。
【0193】
実験１６Ａ及び１６Ｂ
この実験において、実験１６培地Ａ／Ａを、実験１６培地Ａの添加の有用性を２日前に追加した。実験１６Ａでは、スフェロイドをＤＥ誘導段階で２Ｄ培養培地中のＧｅｌｔｒｅｘに播種したが、実験１６Ｂでは、単一細胞懸濁液をＧｅｌｔｒｅｘ上への播種前に調製した。
この実験において、実験１６培地Ａ／Ａを、実験１６培地Ａの添加の有用性を２日前に追加した。実験１６Ａでは、スフェロイドをＤＥ誘導段階で２Ｄ培養培地中のＧｅｌｔｒｅｘに播種したが、実験１６Ｂでは、単一細胞懸濁液をＧｅｌｔｒｅｘ上への播種前に調製した。
【0194】
１日目に、２５０万の単一ｉＰＳＣを１日目の懸濁液に入れ、ＲＯＣＫ阻害物質Ｙ２７６３２（１０μＭ）を添加した。シェーカーを７０ＲＰＭに設定した。２日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、再び遠心分離した。上清を除去し、１ｍｌの培地を、６ウェルの低接着プレートの各ウェルに添加した。６ウェルプレートの各ウェルに１ｍｌ添加する前に、６ｍｌの実験１６培地Ａを１日経過したｉＰＳＣ凝集体に添加し、穏やかに混合した。
【0195】
胚体内胚葉（ＤＥ）へのｉＰＳＣの分化
ＤＥへのｉＰＳＣの分化には、小分子及び成長因子を適切なタイミングで導入する必要がある。１日目に、細胞を、５０％／５０％（Ｓｔｅｍ Ｓｃａｌｅ及びＤＭＥＭ－Ｆ１２）を含み且つ因子／小分子のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）、ＫＳＲ（０．０５％）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００Ｘ）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）を有する実験１６培地Ａ／Ａで処理した。２～３日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、２μＭのＣＨＩＲ９９０２１、ＩＴＳ（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００Ｘ）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、及びＮＥＡＡ（１００Ｘ）を含む実験１６培地Ａを添加した。４～５日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＬＤＮ１９３１８９（１００ｎＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００Ｘ）及びＮＥＡＡ（１００ｘ）を含む実験１６培地Ｂを添加した。
ＤＥへのｉＰＳＣの分化には、小分子及び成長因子を適切なタイミングで導入する必要がある。１日目に、細胞を、５０％／５０％（Ｓｔｅｍ Ｓｃａｌｅ及びＤＭＥＭ－Ｆ１２）を含み且つ因子／小分子のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）、ＫＳＲ（０．０５％）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００Ｘ）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）を有する実験１６培地Ａ／Ａで処理した。２～３日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、２μＭのＣＨＩＲ９９０２１、ＩＴＳ（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００Ｘ）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、及びＮＥＡＡ（１００Ｘ）を含む実験１６培地Ａを添加した。４～５日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＬＤＮ１９３１８９（１００ｎＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００Ｘ）及びＮＥＡＡ（１００ｘ）を含む実験１６培地Ｂを添加した。
【0196】
前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）への胚体内胚葉（ＤＥ）の分化
６～７日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２を含み且つ因子／小分子のＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、ＬＤＮ１９３１８９（０．１μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００Ｘ）、ビタミンＡ（ＶＩＴ Ａ）非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）、及びＮＥＡＡ（１００Ｘ）を有する実験１６ ＡＦＥ培地を添加した。７日目に、培地を半分のみ交換した。
６～７日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２を含み且つ因子／小分子のＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、ＬＤＮ１９３１８９（０．１μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００Ｘ）、ビタミンＡ（ＶＩＴ Ａ）非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）、及びＮＥＡＡ（１００Ｘ）を有する実験１６ ＡＦＥ培地を添加した。７日目に、培地を半分のみ交換した。
【0197】
腹側咽頭内胚葉（ＶＰＥ）への前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）の分化
８～９日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２を含み且つ因子／小分子のＳＢ４３１５４２（１０ｕＭ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）及びＶＩＴ Ａ非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）を有する実験１６ ＶＰＥ１培地を添加した。９日目に、培地を半分のみ交換した。１０～１１日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、レチノイン酸（０．１μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）、アスコルビン酸（３０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）、及びＶＩＴ Ａ非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）を含有するＶＰＥ２培地を添加した。１１日目に、培地を半分のみ交換した。
８～９日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２を含み且つ因子／小分子のＳＢ４３１５４２（１０ｕＭ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）及びＶＩＴ Ａ非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）を有する実験１６ ＶＰＥ１培地を添加した。９日目に、培地を半分のみ交換した。１０～１１日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、レチノイン酸（０．１μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）、アスコルビン酸（３０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）、及びＶＩＴ Ａ非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）を含有するＶＰＥ２培地を添加した。１１日目に、培地を半分のみ交換した。
【0198】
胸腺上皮前駆細胞（ＴＥＰ）への腹側咽頭内胚葉（ＶＰＥ）の分化
１２～１４日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２を含有し且つ因子／小分子のＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲＲ９９（２μＭ）、アスコルビン酸（３０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）を有する実験１６ ＴＥＰ培地を添加した。１３及び１４日目に、培地を半分のみ交換した。１４～１５日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（３０μＭ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、及びＮＥＡＡ（１００Ｘ）を含有するＴＥＣ１培地を添加した。１６日目に、細胞を凝集体（実験１６Ａ）又は単一細胞（実験１６Ｂ）として、Ｇｅｌｔｒｅｘでコーティングされた２４ウェルプレート上に播種した。１６～２７日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（３０μＭ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）、ＶＩＴ Ａ非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）、Ｎ２（１００Ｘ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１００Ｘ）、及びＢＭＥ（１００Ｘ）を含有するＴＥＣ２培地を添加した。培地を毎日全部交換した。
１２～１４日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２を含有し且つ因子／小分子のＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲＲ９９（２μＭ）、アスコルビン酸（３０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）を有する実験１６ ＴＥＰ培地を添加した。１３及び１４日目に、培地を半分のみ交換した。１４～１５日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（３０μＭ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、及びＮＥＡＡ（１００Ｘ）を含有するＴＥＣ１培地を添加した。１６日目に、細胞を凝集体（実験１６Ａ）又は単一細胞（実験１６Ｂ）として、Ｇｅｌｔｒｅｘでコーティングされた２４ウェルプレート上に播種した。１６～２７日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（３０μＭ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）、ＶＩＴ Ａ非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）、Ｎ２（１００Ｘ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１００Ｘ）、及びＢＭＥ（１００Ｘ）を含有するＴＥＣ２培地を添加した。培地を毎日全部交換した。
【0199】
ＤＥ分化の改善は観察されなかった。凝集体を２Ｄに播種することで、細胞が２Ｄでより良好に成長し、分化がより強力に誘導された。
【0200】
実験１８
この実験では、ＶＰＥ段階で細胞を２Ｄ培養に移すことを試験した。
この実験では、ＶＰＥ段階で細胞を２Ｄ培養に移すことを試験した。
【0201】
懸濁培養におけるｉＰＳＣ系の増大
１日目に、２５０万の単一ｉＰＳＣを１日目の懸濁液に入れ、ＲＯＣＫ阻害物質Ｙ２７６３２（１０μＭ）を添加した。シェーカーを７０ＲＰＭに設定した。２日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、再び遠心分離した。上清を除去し、１ｍｌの培地を６ウェルの低接着プレートの各ウェルに添加した。６ウェルプレートの各ウェルに１ｍｌ添加する前に、６ｍｌの実験１８培地Ａを１日経過したｉＰＳＣ凝集体に添加し、穏やかに混合した。
１日目に、２５０万の単一ｉＰＳＣを１日目の懸濁液に入れ、ＲＯＣＫ阻害物質Ｙ２７６３２（１０μＭ）を添加した。シェーカーを７０ＲＰＭに設定した。２日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、再び遠心分離した。上清を除去し、１ｍｌの培地を６ウェルの低接着プレートの各ウェルに添加した。６ウェルプレートの各ウェルに１ｍｌ添加する前に、６ｍｌの実験１８培地Ａを１日経過したｉＰＳＣ凝集体に添加し、穏やかに混合した。
【0202】
胚体内胚葉（ＤＥ）へのｉＰＳＣの分化
ＤＥへのｉＰＳＣの分化には、小分子及び成長因子を適切なタイミングで導入する必要がある。１日目に、５０％／５０％（Ｓｔｅｍ Ｓｃａｌｅ及びＤＭＥＭ－Ｆ１２）を含む実験１８培地Ａ／Ａを添加した。２～３日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２を含み且つ因子／小分子のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、２μＭのＣＨＩＲ９９０２１、ＩＴＳ（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）を有する実験１８培地Ａを添加した。４～５日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２を含み且つ因子／小分子のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＬＤＮ１９３１８９（１００ｎＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、及びＮＥＡＡ（１００ｘ）を有する実験１８培地Ｂを添加した。
ＤＥへのｉＰＳＣの分化には、小分子及び成長因子を適切なタイミングで導入する必要がある。１日目に、５０％／５０％（Ｓｔｅｍ Ｓｃａｌｅ及びＤＭＥＭ－Ｆ１２）を含む実験１８培地Ａ／Ａを添加した。２～３日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２を含み且つ因子／小分子のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、２μＭのＣＨＩＲ９９０２１、ＩＴＳ（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）を有する実験１８培地Ａを添加した。４～５日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２を含み且つ因子／小分子のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＬＤＮ１９３１８９（１００ｎＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、及びＮＥＡＡ（１００ｘ）を有する実験１８培地Ｂを添加した。
【0203】
前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）への胚体内胚葉（ＤＥ）の分化
６～７日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２を含み且つ因子／小分子のＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、ＬＤＮ１９３１８９（０．１μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＶＩＴ Ａ非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）及びＮＥＡＡ（１００Ｘ）を有する実験１８ ＡＦＥ培地を添加した。７日目に、培地を半分のみ交換した。
６～７日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２を含み且つ因子／小分子のＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、ＬＤＮ１９３１８９（０．１μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＶＩＴ Ａ非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）及びＮＥＡＡ（１００Ｘ）を有する実験１８ ＡＦＥ培地を添加した。７日目に、培地を半分のみ交換した。
【0204】
腹側咽頭内胚葉（ＶＰＥ）への前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）の分化
８日目に、凝集体を、Ｇｅｌｔｒｅｘでコーティングされた２４ウェルプレート上に播種した。８～９日目に、細胞を、ＤＭＥＭ－Ｆ１２を含み且つ因子／小分子のＳＢ４３１５４２（１０ｕＭ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）、ＶＩＴ Ａ非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）を有する実験１８ ＶＰＥ１培地に移した。９日目に、培地を半分のみ交換した。
８日目に、凝集体を、Ｇｅｌｔｒｅｘでコーティングされた２４ウェルプレート上に播種した。８～９日目に、細胞を、ＤＭＥＭ－Ｆ１２を含み且つ因子／小分子のＳＢ４３１５４２（１０ｕＭ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）、ＶＩＴ Ａ非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）を有する実験１８ ＶＰＥ１培地に移した。９日目に、培地を半分のみ交換した。
【0205】
１０～１１日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２を含み且つ因子／小分子のレチノイン酸（０．１μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）、アスコルビン酸（３０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）、ＶＩＴ Ａ非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）を有する実験１８ ＶＰＥ２培地を添加した。１１日目に、培地を半分のみ交換した。
【0206】
胸腺上皮前駆細胞（ＴＥＰ）への腹側咽頭内胚葉（ＶＰＥ）の分化
１２～１４日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２を含有し且つ因子／小分子のＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲＲ９９（２μＭ）、アスコルビン酸（３０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、及びＮＥＡＡ（１００Ｘ）を有する実験１８ ＴＥＰ培地を添加した。１３及び１４日目に、培地を半分のみ交換した。１５～２０日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２を含み且つ因子／小分子のＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（３０μＭ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）及びＮＥＡＡ（１００Ｘ）を有する実験１８ ＴＥＣ１培地を添加した。
１２～１４日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２を含有し且つ因子／小分子のＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲＲ９９（２μＭ）、アスコルビン酸（３０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、及びＮＥＡＡ（１００Ｘ）を有する実験１８ ＴＥＰ培地を添加した。１３及び１４日目に、培地を半分のみ交換した。１５～２０日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２を含み且つ因子／小分子のＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（３０μＭ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）及びＮＥＡＡ（１００Ｘ）を有する実験１８ ＴＥＣ１培地を添加した。
【0207】
２１～２２日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２を含有し且つＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲＲ９９０１（２μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（３０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）、ＶＩＴ Ａ非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）、Ｎ２（１００Ｘ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１００Ｘ）及びＢＭＥ（１００Ｘ）を有する実験１８ ＴＥＣ２培地を添加した。培地を毎日全部交換した。
【0208】
この実験で生成されたＴＥＰは良好なＦＯＸＮ１発現を示した。
【0209】
実験２１及び実験２２
この実験では、ＰＩ－１０３を実験２１／２２培地Ｂに添加する効果を試験した。ＡＦＥ段階で２Ｄ培養へ移行する効果も試験した。
この実験では、ＰＩ－１０３を実験２１／２２培地Ｂに添加する効果を試験した。ＡＦＥ段階で２Ｄ培養へ移行する効果も試験した。
【0210】
懸濁培養におけるｉＰＳＣ系の増大
１日目に、２５０万の単一ｉＰＳＣを１日目の懸濁液に入れ、ＲＯＣＫ阻害物質Ｙ２７６３２（１０μＭ）を添加した。シェーカーを７０ＲＰＭに設定した。２日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、再び遠心分離した。上清を除去し、１ｍｌの培地を６ウェルの低接着プレートの各ウェルに添加した。６ウェルプレートの各ウェルに１ｍｌ添加する前に、６ｍｌの実験２１／２２培地Ａを１日経過したｉＰＳＣ凝集体に添加し、穏やかに混合した。
１日目に、２５０万の単一ｉＰＳＣを１日目の懸濁液に入れ、ＲＯＣＫ阻害物質Ｙ２７６３２（１０μＭ）を添加した。シェーカーを７０ＲＰＭに設定した。２日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、再び遠心分離した。上清を除去し、１ｍｌの培地を６ウェルの低接着プレートの各ウェルに添加した。６ウェルプレートの各ウェルに１ｍｌ添加する前に、６ｍｌの実験２１／２２培地Ａを１日経過したｉＰＳＣ凝集体に添加し、穏やかに混合した。
【0211】
胚体内胚葉（ＤＥ）へのｉＰＳＣの分化
ＤＥへのｉＰＳＣの分化には、小分子及び成長因子を適切なタイミングで導入する必要がある。１～２日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、及び因子／小分子のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、２μＭのＣＨＩＲ９９０２１、ＩＴＳ（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）及びＮＥＡＡ（１００Ｘ）を含む実験２１／２２培地Ａを添加した。３～５日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、及び因子／小分子のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）及びＮＥＡＡ（１００ｘ）を含む実験２１／２２培地Ｂを添加した。実験２２では、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）が除外された。
ＤＥへのｉＰＳＣの分化には、小分子及び成長因子を適切なタイミングで導入する必要がある。１～２日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、及び因子／小分子のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、２μＭのＣＨＩＲ９９０２１、ＩＴＳ（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）及びＮＥＡＡ（１００Ｘ）を含む実験２１／２２培地Ａを添加した。３～５日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、及び因子／小分子のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）及びＮＥＡＡ（１００ｘ）を含む実験２１／２２培地Ｂを添加した。実験２２では、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）が除外された。
【0212】
前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）への胚体内胚葉（ＤＥ）の分化
６日目に、凝集体を、Ｇｅｌｔｒｅｘでコーティングされた２４ウェルプレート上に播種した。６日目に、細胞を、ＤＭＥＭ－Ｆ１２を含む実験２１／２２ＡＦＥ培地＊中で培養し、且つ因子／小分子のＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、アスコルビン酸（３０μＭ）、Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、Ｎ２（１００Ｘ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１００Ｘ）、ＢＭＥ（１００Ｘ）、及びＢＳＡ（０．０５％）を添加した。
６日目に、凝集体を、Ｇｅｌｔｒｅｘでコーティングされた２４ウェルプレート上に播種した。６日目に、細胞を、ＤＭＥＭ－Ｆ１２を含む実験２１／２２ＡＦＥ培地＊中で培養し、且つ因子／小分子のＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、アスコルビン酸（３０μＭ）、Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、Ｎ２（１００Ｘ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１００Ｘ）、ＢＭＥ（１００Ｘ）、及びＢＳＡ（０．０５％）を添加した。
【0213】
腹側咽頭内胚葉（ＶＰＥ）への前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）の分化
９～１０日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、及び因子／小分子のＳＢ４３１５４２（１０ｕＭ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（３０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）、ＶＩＴ Ａ非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１００Ｘ）、ＢＭＥ（１００Ｘ）及びＮ２（１００Ｘ）を含む実験２１／２２ ＶＰＥ１培地を添加した。１０日目に、培地を半分のみ交換した。１１～１２日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、及び因子／小分子のレチノイン酸（０．１μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）、アスコルビン酸（３０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）、ＶＩＴ Ａ非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１００Ｘ）、ＢＭＥ（１００Ｘ）及びＮ２（１００Ｘ）を含有するＶＰＥ２培地を添加した。１２日目に、培地を半分のみ交換した。
９～１０日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、及び因子／小分子のＳＢ４３１５４２（１０ｕＭ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（３０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）、ＶＩＴ Ａ非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１００Ｘ）、ＢＭＥ（１００Ｘ）及びＮ２（１００Ｘ）を含む実験２１／２２ ＶＰＥ１培地を添加した。１０日目に、培地を半分のみ交換した。１１～１２日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、及び因子／小分子のレチノイン酸（０．１μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）、アスコルビン酸（３０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）、ＶＩＴ Ａ非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１００Ｘ）、ＢＭＥ（１００Ｘ）及びＮ２（１００Ｘ）を含有するＶＰＥ２培地を添加した。１２日目に、培地を半分のみ交換した。
【0214】
胸腺上皮前駆細胞（ＴＥＰ）への腹側咽頭内胚葉（ＶＰＥ）の分化
１２～１４日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、及び因子／小分子のＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲＲ９９（２μＭ）、アスコルビン酸（３０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）、ＶＩＴ Ａ非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１００Ｘ）、ＢＭＥ（１００Ｘ）及びＮ２（１００Ｘ）を含有する実験２１／２２ ＴＥＰ培地を添加した。１４及び１５日目に、培地を半分のみ交換した。
１２～１４日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、及び因子／小分子のＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲＲ９９（２μＭ）、アスコルビン酸（３０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）、ＶＩＴ Ａ非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１００Ｘ）、ＢＭＥ（１００Ｘ）及びＮ２（１００Ｘ）を含有する実験２１／２２ ＴＥＰ培地を添加した。１４及び１５日目に、培地を半分のみ交換した。
【0215】
１６～１８日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、及び因子／小分子のＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（３０μＭ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）、ＶＩＴ Ａ非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）、Ｎ２（１００Ｘ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１００Ｘ）及びＢＭＥ（１００Ｘ）を含有する実験２１／２２ ＴＥＣ培地を添加した。培地を毎日全部交換した。
【0216】
ＰＩ－１０３を実験２１／２２培地Ｂに添加することで、ＤＥ分化が強化された。ＡＦＥ段階での２Ｄ培養への移行により、実験１８と比較してＦＯＸＮ１発現がより少なくなった。
【0217】
実験２３
ＶＰＥ段階で３Ｄ培養から２Ｄ培養へ移行する効果を試験した。実験２３培地ＢへのＣＨＩＲ９９０２１添加の影響を試験した。
ＶＰＥ段階で３Ｄ培養から２Ｄ培養へ移行する効果を試験した。実験２３培地ＢへのＣＨＩＲ９９０２１添加の影響を試験した。
【0218】
懸濁培養におけるｉＰＳＣ系の増大
１日目に、２５０万の単一ｉＰＳＣを１日目の懸濁液に入れ、ＲＯＣＫ阻害物質Ｙ２７６３２（１０μＭ）を添加した。シェーカーを７０ＲＰＭに設定した。２日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、再び遠心分離した。上清を除去し、１ｍｌの培地を、６ウェルの低接着プレートの各ウェルに添加した。６ウェルプレートの各ウェルに１ｍｌ添加する前に、６ｍｌの実験２３培地Ａを１日経過したｉＰＳＣ凝集体に添加し、穏やかに混合した。
１日目に、２５０万の単一ｉＰＳＣを１日目の懸濁液に入れ、ＲＯＣＫ阻害物質Ｙ２７６３２（１０μＭ）を添加した。シェーカーを７０ＲＰＭに設定した。２日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、再び遠心分離した。上清を除去し、１ｍｌの培地を、６ウェルの低接着プレートの各ウェルに添加した。６ウェルプレートの各ウェルに１ｍｌ添加する前に、６ｍｌの実験２３培地Ａを１日経過したｉＰＳＣ凝集体に添加し、穏やかに混合した。
【0219】
胚体内胚葉（ＤＥ）へのｉＰＳＣの分化
ＤＥへのｉＰＳＣの分化には、小分子及び成長因子を適切なタイミングで導入する必要がある。１～２日目に、細胞を、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、及び小分子／因子のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、２μＭのＣＨＩＲ９９０２１、ＩＴＳ（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）及びＮＥＡＡ（１００Ｘ）を含む実験２３培地Ａ中で培養した。３～４日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、及び小分子／因子のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＣＨＩＲＲ９９０１（２μＭ）、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）及びＮＥＡＡ（１００ｘ）を含有する実験２３培地Ｂを添加した。
ＤＥへのｉＰＳＣの分化には、小分子及び成長因子を適切なタイミングで導入する必要がある。１～２日目に、細胞を、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、及び小分子／因子のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、２μＭのＣＨＩＲ９９０２１、ＩＴＳ（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）及びＮＥＡＡ（１００Ｘ）を含む実験２３培地Ａ中で培養した。３～４日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、及び小分子／因子のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＣＨＩＲＲ９９０１（２μＭ）、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）及びＮＥＡＡ（１００ｘ）を含有する実験２３培地Ｂを添加した。
【0220】
５日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、及び小分子／因子のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００ｘ）を含有する実験２３培地Ｂを添加した。
【0221】
前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）への胚体内胚葉（ＤＥ）の分化
６日目に、凝集体を、Ｇｅｌｔｒｅｘでコーティングされた２４ウェルプレート上に播種した。６～８日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、及び小分子／因子のＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、ＮＥＡＡ（１００ｘ）、ＶＩＴ Ａ非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）、ＢＭＥ（１００Ｘ）を含有する実験２３ ＡＦＥ培地＊を添加した。
６日目に、凝集体を、Ｇｅｌｔｒｅｘでコーティングされた２４ウェルプレート上に播種した。６～８日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、及び小分子／因子のＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、ＮＥＡＡ（１００ｘ）、ＶＩＴ Ａ非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）、ＢＭＥ（１００Ｘ）を含有する実験２３ ＡＦＥ培地＊を添加した。
【0222】
腹側咽頭内胚葉（ＶＰＥ）への前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）の分化
９日目に、凝集体を、Ｇｅｌｔｒｅｘでコーティングされた２４ウェルプレート上に播種した。９～１０日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、及び小分子／因子のＳＢ４３１５４２（１０ｕＭ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）、ＶＩＴ Ａ非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）、及びＢＭＥ（１００Ｘ）を含有する実験２３ ＶＰＥ１培地を添加した。１０日目に、培地を半分のみ添加した。１１～１２日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、及び小分子／因子のレチノイン酸（０．１μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）、アスコルビン酸（３０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）、ＶＩＴ Ａ非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１００Ｘ）、ＢＭＥ（１００Ｘ）及びＮ２（１００Ｘ）を含有する実験２３ ＶＰＥ２培地を添加した。
９日目に、凝集体を、Ｇｅｌｔｒｅｘでコーティングされた２４ウェルプレート上に播種した。９～１０日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、及び小分子／因子のＳＢ４３１５４２（１０ｕＭ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）、ＶＩＴ Ａ非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）、及びＢＭＥ（１００Ｘ）を含有する実験２３ ＶＰＥ１培地を添加した。１０日目に、培地を半分のみ添加した。１１～１２日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、及び小分子／因子のレチノイン酸（０．１μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）、アスコルビン酸（３０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）、ＶＩＴ Ａ非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１００Ｘ）、ＢＭＥ（１００Ｘ）及びＮ２（１００Ｘ）を含有する実験２３ ＶＰＥ２培地を添加した。
【0223】
胸腺上皮前駆細胞（ＴＥＰ）への腹側咽頭内胚葉（ＶＰＥ）の分化
１３～１６日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、及び小分子／因子のＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲＲ９９（２μＭ）、アスコルビン酸（３０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）、ＶＩＴ Ａ非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１００Ｘ）、ＢＭＥ（１００Ｘ）及びＮ２（１００Ｘ）を含有する実験２３ ＴＥＰ培地を添加した。１４、１５及び１６日目に、培地を半分のみ交換した。１７～２０日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、及び小分子／因子のＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（３０μＭ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）、ＶＩＴ Ａ非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）、Ｎ２（１００Ｘ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１００Ｘ）及びＢＭＥ（１００Ｘ）を含有するＴＥＣ培地を添加した。培地を毎日全部交換した。
１３～１６日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、及び小分子／因子のＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲＲ９９（２μＭ）、アスコルビン酸（３０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）、ＶＩＴ Ａ非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１００Ｘ）、ＢＭＥ（１００Ｘ）及びＮ２（１００Ｘ）を含有する実験２３ ＴＥＰ培地を添加した。１４、１５及び１６日目に、培地を半分のみ交換した。１７～２０日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、及び小分子／因子のＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（３０μＭ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）、ＶＩＴ Ａ非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）、Ｎ２（１００Ｘ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１００Ｘ）及びＢＭＥ（１００Ｘ）を含有するＴＥＣ培地を添加した。培地を毎日全部交換した。
【0224】
実験２３培地ＢへのＣＨＩＲＲ９９の添加は分化を強化することが判明した。
【0225】
実施例１２ ＤＥ分化の最適化
実施例１１に記載の実験２１及び実験２３は、ＤＥへの３Ｄ分化の最適条件を同定するために設計された。実験２３で分化培地にＷｎｔ活性化物質を含めることで、ＤＥへの分化効率は、実験２１及び実験２２でＷｎｔ活性化物質を含めない場合と比較して、増加した。実験２３ではＳｏｘ１７／ＦｏｘＡ２二重陽性細胞がより多かった一方、実験２１及び実験２２ではＳｏｘ１７／ＦｏｘＡ２陰性細胞がより多かった。
実施例１１に記載の実験２１及び実験２３は、ＤＥへの３Ｄ分化の最適条件を同定するために設計された。実験２３で分化培地にＷｎｔ活性化物質を含めることで、ＤＥへの分化効率は、実験２１及び実験２２でＷｎｔ活性化物質を含めない場合と比較して、増加した。実験２３ではＳｏｘ１７／ＦｏｘＡ２二重陽性細胞がより多かった一方、実験２１及び実験２２ではＳｏｘ１７／ＦｏｘＡ２陰性細胞がより多かった。
【0226】
より高いＥＰＣＡＭ／ＦｏｘＡ２二重陽性細胞の発現は、実験２３でより高かった。同様に、ＳＯＸ２／Ｔｒａ１－６０発現は、Ｔｒａ１－６０／ＳＯＸ２二重陰性細胞のレベルでより高かった一方、Ｔｒａ１－６０／Ｓｏｘ２二重陽性細胞の小集団は、実験２１／２２で持続的に観察された（未分化ｉＰＳＣ細胞と思われる）。
【0227】
ＣＸＣＲ４発現は、実験２１及び実験２２と比較して、実験２３ではより低かった。
【0228】
まとめると、多能性状態のｉＰＳＣの分化は実験２３ではより完全であることが判明した。
【0229】
実施例１３ ＴＥＰの２Ｄ培養
スフェロイド（本明細書では「３Ｄ培養物」ともいう）を、３Ｄ条件でｉＰＳＣからＤＥ及びＡＦＥに分化するように誘導した。後続の２Ｄ培養ステップ（即ち、細胞をＧｅｌｔｒｅｘ中で培養）は、最終のＦｏｘＮ１陽性ＴＥＰ細胞への誘導に重要であることが判明した。ｉＰＳＣからＴＥＰへの分化に関連するマーカーの発現を、実施例１１に記載の様々な分化プロトコルについて分化の進行段階で測定した。重要な発生遺伝子をマーカーとして使用したところ、いくつかの条件が重要であると判明した。３ＤでのＡＦＥ誘導による２Ｄへの移行のタイミングと２ＤでのＡＦＥ誘導の比較は、ＶＰＥ１段階での重要なＶＰＥマーカーＨＯＸＡ３（図５Ａ）、Ｐａｘ１（図５Ｂ）及びＰＳＭＢ１１（図５Ｃ）の上方制御によってマークされたように、ｉＰＳＣのＴＥＰへの更なる分化に関して３ＤでのＡＦＥ誘導が２ＤでのＡＦＥ誘導を上回ることを示した。３Ｄの実験２３条件でのＡＦＥは、実験１８の２Ｄ培養でのＡＦＥと比較して、ＶＰＥ１段階までのＨＯＸＡ３、ＰＡＸ１、及びＰＳＭＢ１１の有意に高い発現を示した。
スフェロイド（本明細書では「３Ｄ培養物」ともいう）を、３Ｄ条件でｉＰＳＣからＤＥ及びＡＦＥに分化するように誘導した。後続の２Ｄ培養ステップ（即ち、細胞をＧｅｌｔｒｅｘ中で培養）は、最終のＦｏｘＮ１陽性ＴＥＰ細胞への誘導に重要であることが判明した。ｉＰＳＣからＴＥＰへの分化に関連するマーカーの発現を、実施例１１に記載の様々な分化プロトコルについて分化の進行段階で測定した。重要な発生遺伝子をマーカーとして使用したところ、いくつかの条件が重要であると判明した。３ＤでのＡＦＥ誘導による２Ｄへの移行のタイミングと２ＤでのＡＦＥ誘導の比較は、ＶＰＥ１段階での重要なＶＰＥマーカーＨＯＸＡ３（図５Ａ）、Ｐａｘ１（図５Ｂ）及びＰＳＭＢ１１（図５Ｃ）の上方制御によってマークされたように、ｉＰＳＣのＴＥＰへの更なる分化に関して３ＤでのＡＦＥ誘導が２ＤでのＡＦＥ誘導を上回ることを示した。３Ｄの実験２３条件でのＡＦＥは、実験１８の２Ｄ培養でのＡＦＥと比較して、ＶＰＥ１段階までのＨＯＸＡ３、ＰＡＸ１、及びＰＳＭＢ１１の有意に高い発現を示した。
【0230】
ＦｏｘＮ１＋ＴＥＰへの誘導を２Ｄ条件、即ち、培地を含有するＧｅｌｔｒｅｘでの培養下で観察した（図５Ｄ）。スフェロイドをＧｅｌｔｒｅｘに接着させるか又はスフェロイドを単一細胞に解離しＧｅｌｔｒｅｘ上に再プレーティングすることによって、スフェロイドから２Ｄ培養への移行を実施した。この分析は、スフェロイドをＧｅｌｔｒｅｘに接着させることにより、ＦＯＸＮ１＋ＴＥＰへのより強力で一貫した分化がもたらされることを示した（図５Ｄ）。ＦＯＸＮ１＋ＴＥＰ／ＴＥＣの高発現は、２Ｄ培養条件下でのみ観察された。実験１６では、ＴＥＰの３Ｄ培養は、実験１８のＴＥＰの２Ｄ培養と比較して、ＦＯＸＮ１発現をもたらさなかった。実験１６でＴＥＰを３Ｄ培養から２Ｄ培養に移行したところ、ＦＯＸＮ１発現の誘導が示された。実験１６では、スフェロイドをＧｅｌｔｒｅｘに接着させるか（実験１６Ａ）又はスフェロイドを単一細胞に解離してからＧｅｌｔｒｅｘ上に再プレーティングする（実験１６Ｂ）ことによって、３Ｄスフェロイドを２Ｄ培養条件に移した。図５Ｄに示すように、実験１６Ａの条件では、ＦＯＸＮ１陽性ＴＥＰの強力で一貫した分化がもたらされた。
【0231】
実施例１４ ＦＯＸＮ１の異所性発現
ＴＥＰ分化に対するＦＯＸＮ１の異所性発現の効果を試験した。ＴＥＰをＦＯＸＮ１でトランスフェクトした。ＦＯＸＮ１の発現を、ＦＯＸＮ１のコード領域を標的とするプライマーを使用して測定した。図６Ａに示すように、ＦＯＸＮ１ ｍＲＮＡのトランスフェクションにより、外因性及び内因性ｍＲＮＡ分子を含む高レベルのＦＯＸＮ１ ｍＲＮＡが生成された。３’ＵＴＲを持つｍＲＮＡのみを標的とするプライマーを使用したところ、外因的に発現されたｍＲＮＡによって誘導された内因性ＦＯＸＮ１ ｍＲＮＡの強力な発現が観察された。外因性ｍＲＮＡに付加されたＨＡタグを標的とするプライマーを使用したところ、ＴＥＰにおける外因性ｍＲＮＡの発現が確認された（図６Ａ）。
ＴＥＰ分化に対するＦＯＸＮ１の異所性発現の効果を試験した。ＴＥＰをＦＯＸＮ１でトランスフェクトした。ＦＯＸＮ１の発現を、ＦＯＸＮ１のコード領域を標的とするプライマーを使用して測定した。図６Ａに示すように、ＦＯＸＮ１ ｍＲＮＡのトランスフェクションにより、外因性及び内因性ｍＲＮＡ分子を含む高レベルのＦＯＸＮ１ ｍＲＮＡが生成された。３’ＵＴＲを持つｍＲＮＡのみを標的とするプライマーを使用したところ、外因的に発現されたｍＲＮＡによって誘導された内因性ＦＯＸＮ１ ｍＲＮＡの強力な発現が観察された。外因性ｍＲＮＡに付加されたＨＡタグを標的とするプライマーを使用したところ、ＴＥＰにおける外因性ｍＲＮＡの発現が確認された（図６Ａ）。
【0232】
外因性及び内因性ＦＯＸＮ１ ｍＲＮＡの高発現により、ＦｏｘＮ１の直接標的、例えば、ＣＣＬ２５、ＤＬＬ４が強力に誘導された（図６Ｂ）。
【0233】
実施例１５ 胸腺細胞へのｉＰＳＣの分化
実験２７
懸濁培養におけるｉＰＳＣ系の増大
分化プロトコルを開始する前に、ｉＰＳＣを、直径が約３００～４００マイクロメートルに達するまで、懸濁液中で３～４日間培養した。次に、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用してｉＰＳＣを継代して凝集体を単一細胞に変化させた。２５０万の単一ｉＰＳＣ細胞を６ウェル超低接着プレート中の懸濁液に入れた。ｉＰＳＣを、１０μＭのＲＯＣＫ阻害物質Ｙ２７６３２を含有するｓｔｅｍ ｓｃａｌｅ培地中で３７℃にて培養した。
実験２７
懸濁培養におけるｉＰＳＣ系の増大
分化プロトコルを開始する前に、ｉＰＳＣを、直径が約３００～４００マイクロメートルに達するまで、懸濁液中で３～４日間培養した。次に、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用してｉＰＳＣを継代して凝集体を単一細胞に変化させた。２５０万の単一ｉＰＳＣ細胞を６ウェル超低接着プレート中の懸濁液に入れた。ｉＰＳＣを、１０μＭのＲＯＣＫ阻害物質Ｙ２７６３２を含有するｓｔｅｍ ｓｃａｌｅ培地中で３７℃にて培養した。
【0234】
１ｍｌの上清をプレートから取り出し、１ｍｌの予め加温したｓｔｅｍ ｓｃａｌｅ培地を培養物に添加した。２日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移し、２５０Ｇで５分間遠心分離した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、６ウェル低接着プレートの各ウェルにおいて１ｍｌの培地Ａに再懸濁させた。
【0235】
胚体内胚葉（ＤＥ）へのｉＰＳＣの分化
ＤＥへのｉＰＳＣの分化には、小分子及び成長因子を適切なタイミングで導入する必要がある。１～２日目に、ｉＰＳＣを、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）を添加した培地Ａ（基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、２μＭのＣＨＩＲ９９０２１、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：１００）、ＮＥＡＡ（１：４００））中で培養した。２日目に、１ｍｌの培地を除去し、１ｍｌの新しく調製した培地Ａ＋ＰＩ－１０３を添加した。３～５日目に、培地Ｂ（ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、ＮＥＡＡ（１：４００））及びＰＩ－１０３（２５ｎＭ）を添加した。３日目に、ＣＨＩＲＲ９９０１（２μｍ）を培地Ｂに添加した。３～５日目に、１ｍｌの培地を除去し、１ｍｌの新しく調製した培地を添加した。
ＤＥへのｉＰＳＣの分化には、小分子及び成長因子を適切なタイミングで導入する必要がある。１～２日目に、ｉＰＳＣを、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）を添加した培地Ａ（基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、２μＭのＣＨＩＲ９９０２１、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：１００）、ＮＥＡＡ（１：４００））中で培養した。２日目に、１ｍｌの培地を除去し、１ｍｌの新しく調製した培地Ａ＋ＰＩ－１０３を添加した。３～５日目に、培地Ｂ（ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、ＮＥＡＡ（１：４００））及びＰＩ－１０３（２５ｎＭ）を添加した。３日目に、ＣＨＩＲＲ９９０１（２μｍ）を培地Ｂに添加した。３～５日目に、１ｍｌの培地を除去し、１ｍｌの新しく調製した培地を添加した。
【0236】
前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）への胚体内胚葉（ＤＥ）の分化
６日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０Ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、及びＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）に加えて、因子／小分子のＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１：２００）、Ｎ２（１：１００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）、Ｂ２７（ＲＡ非含有）（１：２００）を含むＡＦＥ培地－２を含有する６ウェル低接着プレート中にプレーティングした。
６日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０Ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、及びＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）に加えて、因子／小分子のＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１：２００）、Ｎ２（１：１００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）、Ｂ２７（ＲＡ非含有）（１：２００）を含むＡＦＥ培地－２を含有する６ウェル低接着プレート中にプレーティングした。
【0237】
腹側咽頭内胚葉（ＶＰＥ）への前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）の分化
８日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを２５０Ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、ＤＭＥＭ－Ｆ１２を含み且つ因子／小分子のＳＢ４３１５４２（１０ｕＭ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１：２００）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）及びＶＩＴ Ａ非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）及びＮＥＡＡ（１：４００）を有する５０μｌのＶＰＥ１ａ培地中に再懸濁させた。そして、スフェロイドをＧｅｌｔｒｅｘ（１：１００）でコーティングされた２４ウェルプレートに添加した。
８日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを２５０Ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、ＤＭＥＭ－Ｆ１２を含み且つ因子／小分子のＳＢ４３１５４２（１０ｕＭ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１：２００）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）及びＶＩＴ Ａ非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）及びＮＥＡＡ（１：４００）を有する５０μｌのＶＰＥ１ａ培地中に再懸濁させた。そして、スフェロイドをＧｅｌｔｒｅｘ（１：１００）でコーティングされた２４ウェルプレートに添加した。
【0238】
９日目に、培地を半分のみ交換した。１０～１１日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、レチノイン酸（０．１μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００Ｘ）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）、ＶＩＴ Ａ非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）及びＮ２（１：１００）を含有するＶＰＥ２ｂ培地を添加した。１０及び１１日目に、等量の新しく作製したＶＰＥ２ｂ培地（５００ｕｌ）を、凝集体を妨げることなく穏やかに添加した。
【0239】
胸腺上皮前駆細胞及び（ＴＥＰ）及び胸腺上皮細胞（ＴＥＣ）への腹側咽頭内胚葉（ＶＰＥ）の分化
この分化ステップについて、ＶＰＥ細胞を、胸腺細胞培地中、例えば、ＴＥＰ培地又はＴＥＣ培地中で培養した。１２～１９日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２を含有し且つ因子／小分子のＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）に加えて、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲＲ９９（２μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１：２００）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）を有する実験２７ ＴＥＰ培地を細胞に添加した。
この分化ステップについて、ＶＰＥ細胞を、胸腺細胞培地中、例えば、ＴＥＰ培地又はＴＥＣ培地中で培養した。１２～１９日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２を含有し且つ因子／小分子のＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）に加えて、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲＲ９９（２μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１：２００）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）を有する実験２７ ＴＥＰ培地を細胞に添加した。
【0240】
１２日目に、等量の新しく作製したＴＥＰ培地を、凝集体を妨げることなく穏やかに添加した。１３～１９日目に、５０％の上清を除去し、新しく調製した実験２７ ＴＥＰ培地を添加した。
【0241】
２０～２３日目にわたって、細胞を、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、及びＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ７／ＫＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＲＡＮＫＬ／ＴＲＡＮＣＥ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲＲ９９（２μＭ）に加えて、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１００Ｘ）、ＶＩＴ Ａ非含有Ｂ２７（０．５Ｘ）、Ｎ２（１００Ｘ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１００Ｘ）、ＢＭＥ（１００Ｘ）及びＮＥＡＡ（１００Ｘ）を含有する実験２７ ＴＥＣ培地に再懸濁させた。
【0242】
実験２９
懸濁培養におけるｉＰＳＣ系の増大
分化プロトコルを開始する前に、ｉＰＳＣを、直径が約３００～４００マイクロメートルに達するまで、懸濁液中で３～４日間培養した。次に、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用してｉＰＳＣを継代して、凝集体を単一細胞に変化させた。２５０万の単一ｉＰＳＣ細胞を、６ウェル超低接着プレート中の懸濁液に入れた。ｉＰＳＣを、１０μＭのＲＯＣＫ阻害物質Ｙ２７６３２を含有するｓｔｅｍ ｓｃａｌｅ培地中で３７℃にて培養した。
懸濁培養におけるｉＰＳＣ系の増大
分化プロトコルを開始する前に、ｉＰＳＣを、直径が約３００～４００マイクロメートルに達するまで、懸濁液中で３～４日間培養した。次に、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用してｉＰＳＣを継代して、凝集体を単一細胞に変化させた。２５０万の単一ｉＰＳＣ細胞を、６ウェル超低接着プレート中の懸濁液に入れた。ｉＰＳＣを、１０μＭのＲＯＣＫ阻害物質Ｙ２７６３２を含有するｓｔｅｍ ｓｃａｌｅ培地中で３７℃にて培養した。
【0243】
１ｍｌの上清をプレートから取り出し、１ｍｌの予め加温したｓｔｅｍ ｓｃａｌｅ培地を培養物に添加した。２日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移し、２５０Ｇで５分間遠心分離した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、６ウェル低接着プレートの各ウェルにおいて１ｍｌの培地Ａに再懸濁させた。
【0244】
胚体内胚葉（ＤＥ）へのｉＰＳＣの分化
ＤＥへのｉＰＳＣの分化には、小分子及び成長因子を適切なタイミングで導入する必要がある。１～２日目に、ｉＰＳＣを培地Ａ（基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、２μＭのＣＨＩＲ９９０２１、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：１００）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、ＮＥＡＡ（１：４００））中で培養した。２日目に、１ｍｌの培地を除去し、１ｍｌの新しく調製した培地を添加した。３～５日目に、細胞を培地Ｂ（ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００），及びＮＥＡＡ（１：４００）でインキュベートした。４～５日目に、１ｍｌの培地Ｂを除去し、１ｍｌの新しく調製した培地Ｂを添加した。
ＤＥへのｉＰＳＣの分化には、小分子及び成長因子を適切なタイミングで導入する必要がある。１～２日目に、ｉＰＳＣを培地Ａ（基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、２μＭのＣＨＩＲ９９０２１、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：１００）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、ＮＥＡＡ（１：４００））中で培養した。２日目に、１ｍｌの培地を除去し、１ｍｌの新しく調製した培地を添加した。３～５日目に、細胞を培地Ｂ（ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００），及びＮＥＡＡ（１：４００）でインキュベートした。４～５日目に、１ｍｌの培地Ｂを除去し、１ｍｌの新しく調製した培地Ｂを添加した。
【0245】
前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）への胚体内胚葉（ＤＥ）の分化
６日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０Ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、ＡＦＥ培地－２を含有する６ウェル低接着プレート（実験２９Ａ）又はＧｅｌｔｒｅｘでコーティングされたプレート（実験２９Ｂ）中にプレーティングした。実験に利用されたＡＦＥ培地は、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＲＡ非含有）（１：２００）、Ｎ２（１：１００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）及びＮＥＡＡ（１：４００）を含有した。７及び８日目に、１ｍｌのＡＦＥ培地を除去し、１ｍｌの新しく調製した培地を添加した。
６日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０Ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、ＡＦＥ培地－２を含有する６ウェル低接着プレート（実験２９Ａ）又はＧｅｌｔｒｅｘでコーティングされたプレート（実験２９Ｂ）中にプレーティングした。実験に利用されたＡＦＥ培地は、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＲＡ非含有）（１：２００）、Ｎ２（１：１００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）及びＮＥＡＡ（１：４００）を含有した。７及び８日目に、１ｍｌのＡＦＥ培地を除去し、１ｍｌの新しく調製した培地を添加した。
【0246】
腹側咽頭内胚葉（ＶＰＥ）への前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）の分化
９日目に、実験２９Ａについて、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０Ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、ＶＰＥ１培地に再懸濁させ、Ｇｅｌｔｒｅｘ（１：１００）でコーティングされた２４ウェルプレート上にプレーティングした。実験２９Ａ及び２９Ｂの両方の細胞とも、９～１０日目から、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＳＢ４３１５４２（１０ｕＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むＶＰＥ１培地中で培養した。９日目に、等量の新しく作製したＶＰＥ１培地（５００ｕｌ）を、凝集体を妨げることなく穏やかに添加した。
９日目に、実験２９Ａについて、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０Ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、ＶＰＥ１培地に再懸濁させ、Ｇｅｌｔｒｅｘ（１：１００）でコーティングされた２４ウェルプレート上にプレーティングした。実験２９Ａ及び２９Ｂの両方の細胞とも、９～１０日目から、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＳＢ４３１５４２（１０ｕＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むＶＰＥ１培地中で培養した。９日目に、等量の新しく作製したＶＰＥ１培地（５００ｕｌ）を、凝集体を妨げることなく穏やかに添加した。
【0247】
１０日目に、５０％の上清を除去し、新しく調製したＶＰＥ１培地（５００ｕｌ）をウェルごとに添加した。１１～１２日目に、培地を、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、ＮＥＡＡ（１：４００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、及びＮ２（１：１００）を含有するＶＰＥ２培地で置き換えた。１１及び１２日目に、等量の新しく作製したＶＰＥ２培地（５００ｕｌ）を、凝集体を妨げることなく穏やかに添加した。
【0248】
胸腺上皮前駆細胞（ＴＥＰ）への腹側咽頭内胚葉（ＶＰＥ）の分化
この分化ステップについて、ＶＰＥ細胞を、胸腺細胞培地、例えば、ＴＥＰ培地又はＴＥＣ培地中で培養した。１３～１８日目に、培地を、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲＲ９９（２μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含有する実験２９ ＴＥＰ培地に置き換えた。１３日目に、等量の新しく作製したＴＥＰ培地（５００ｕｌ）を、凝集体を妨げることなく穏やかに添加した。１４～１８日目に、５０％の上清を除去し、新しく調製したＴＥＰ培地（５００ｕｌ）をウェルごとに添加した。１９～２２日目に、培地を、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ７／ＫＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＲＡＮＫＬ／ＴＲＡＮＣＥ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲＲ９９（２μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）、ＮＥＡＡ（１：４００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１００Ｘ）、及びＢＭＥ（１００Ｘ）を含有するＴＥＣ培地で置き換えた。２０～２２日目に、５０％の上清を除去し、新しく調製したＴＥＣ培地（５００ｕｌ）をウェルごとに添加した。２２日目に、実験２９Ｂ細胞を、単一細胞として、懸濁液（３Ｄ）中及びＧｅｌｔｒｅｘでコーティングされたプレート（２Ｄ）上に再播種した。残りの細胞を凍結した。凍結した実験２９Ｂ細胞を懸濁液中で解凍し、ＴＥＣ培地中で維持した。
この分化ステップについて、ＶＰＥ細胞を、胸腺細胞培地、例えば、ＴＥＰ培地又はＴＥＣ培地中で培養した。１３～１８日目に、培地を、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲＲ９９（２μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含有する実験２９ ＴＥＰ培地に置き換えた。１３日目に、等量の新しく作製したＴＥＰ培地（５００ｕｌ）を、凝集体を妨げることなく穏やかに添加した。１４～１８日目に、５０％の上清を除去し、新しく調製したＴＥＰ培地（５００ｕｌ）をウェルごとに添加した。１９～２２日目に、培地を、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ７／ＫＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＲＡＮＫＬ／ＴＲＡＮＣＥ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲＲ９９（２μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）、ＮＥＡＡ（１：４００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１００Ｘ）、及びＢＭＥ（１００Ｘ）を含有するＴＥＣ培地で置き換えた。２０～２２日目に、５０％の上清を除去し、新しく調製したＴＥＣ培地（５００ｕｌ）をウェルごとに添加した。２２日目に、実験２９Ｂ細胞を、単一細胞として、懸濁液（３Ｄ）中及びＧｅｌｔｒｅｘでコーティングされたプレート（２Ｄ）上に再播種した。残りの細胞を凍結した。凍結した実験２９Ｂ細胞を懸濁液中で解凍し、ＴＥＣ培地中で維持した。
【0249】
実験３０
懸濁培養におけるｉＰＳＣ系の増大
分化プロトコルを開始する前に、ｉＰＳＣを、直径が約３００～４００マイクロメートルに達するまで、懸濁液中で３～４日間培養した。次に、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用してｉＰＳＣを継代して、凝集体を単一細胞に変化させた。２５０万の単一ｉＰＳＣ細胞を、６ウェル超低接着プレート中の懸濁液に入れた。ｉＰＳＣを、１０μＭのＲＯＣＫ阻害物質Ｙ２７６３２を含有するｓｔｅｍ ｓｃａｌｅ培地中で３７℃にて培養した。
懸濁培養におけるｉＰＳＣ系の増大
分化プロトコルを開始する前に、ｉＰＳＣを、直径が約３００～４００マイクロメートルに達するまで、懸濁液中で３～４日間培養した。次に、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用してｉＰＳＣを継代して、凝集体を単一細胞に変化させた。２５０万の単一ｉＰＳＣ細胞を、６ウェル超低接着プレート中の懸濁液に入れた。ｉＰＳＣを、１０μＭのＲＯＣＫ阻害物質Ｙ２７６３２を含有するｓｔｅｍ ｓｃａｌｅ培地中で３７℃にて培養した。
【0250】
１ｍｌの上清をプレートから取り出し、１ｍｌの予め加温したｓｔｅｍ ｓｃａｌｅ培地を培養物に添加した。２日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移し、２５０Ｇで５分間遠心分離した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、６ウェル低接着プレートの各ウェルにおいて１ｍｌの培地Ａに再懸濁させた。
【0251】
胚体内胚葉（ＤＥ）へのｉＰＳＣの分化
ＤＥへのｉＰＳＣの分化には、小分子及び成長因子を適切なタイミングで導入する必要がある。１～２日目に、ｉＰＳＣを培地Ａ（基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、２μＭのＣＨＩＲ９９０２１、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：１００）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、及びＮＥＡＡ（１：４００））中で培養した。３～５日目に、細胞を、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）及びＮＥＡＡ（１：４００）を含有する培地Ｂで処理した。
ＤＥへのｉＰＳＣの分化には、小分子及び成長因子を適切なタイミングで導入する必要がある。１～２日目に、ｉＰＳＣを培地Ａ（基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、２μＭのＣＨＩＲ９９０２１、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：１００）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、及びＮＥＡＡ（１：４００））中で培養した。３～５日目に、細胞を、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）及びＮＥＡＡ（１：４００）を含有する培地Ｂで処理した。
【0252】
前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）への胚体内胚葉（ＤＥ）の分化
６日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０Ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、及びＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）に加えて、因子／小分子のＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１：２００）、Ｎ２（１：１００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）、Ｂ２７（ＲＡ非含有）（１：２００）を含むＡＦＥ培地－２を含有する６ウェル低接着プレート中にプレーティングした。
６日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０Ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、及びＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）に加えて、因子／小分子のＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１：２００）、Ｎ２（１：１００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）、Ｂ２７（ＲＡ非含有）（１：２００）を含むＡＦＥ培地－２を含有する６ウェル低接着プレート中にプレーティングした。
【0253】
腹側咽頭内胚葉（ＶＰＥ）への前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）の分化
９日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０Ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、ＶＰＥ１培地に再懸濁させ、Ｇｅｌｔｒｅｘ（１：１００）でコーティングされた２４ウェルプレート上にプレーティングした。細胞を、９～１１日目から、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＳＢ４３１５４２（１０ｕＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）、ＮＥＡＡ（１：４００）を含むＶＰＥ１培地中で培養した。１０日目に、等量の新しく作製したＶＰＥ１培地（５００μｌ）を、凝集体を妨げることなく穏やかに添加した。１１日目に、５０％の上清を除去し、新しく調製したＶＰＥ１培地（５００ｕｌ）をウェルごとに添加した。１２～１３日目に、培地を除去し、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、ＮＥＡＡ（１：４００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、及び２（１：１００）を含有するＶＰＥ２培地で置き換えた。
９日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０Ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、ＶＰＥ１培地に再懸濁させ、Ｇｅｌｔｒｅｘ（１：１００）でコーティングされた２４ウェルプレート上にプレーティングした。細胞を、９～１１日目から、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＳＢ４３１５４２（１０ｕＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）、ＮＥＡＡ（１：４００）を含むＶＰＥ１培地中で培養した。１０日目に、等量の新しく作製したＶＰＥ１培地（５００μｌ）を、凝集体を妨げることなく穏やかに添加した。１１日目に、５０％の上清を除去し、新しく調製したＶＰＥ１培地（５００ｕｌ）をウェルごとに添加した。１２～１３日目に、培地を除去し、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、ＮＥＡＡ（１：４００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、及び２（１：１００）を含有するＶＰＥ２培地で置き換えた。
【0254】
１３日目に、等量の新しく作製したＶＰＥ２培地（５００μｌ）を、凝集体を妨げることなく穏やかに添加した。
【0255】
胸腺上皮前駆細胞（ＴＥＰ）への腹側咽頭内胚葉（ＶＰＥ）の分化
この分化ステップについて、ＶＰＥ細胞を、胸腺細胞培地、例えば、ＴＥＰ培地又はＴＥＣ培地中で培養した。１４～１６日目に、細胞を、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ７／ＫＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＲＡＮＫＬ／ＴＲＡＮＣＥ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲＲ９９（２μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含む実験３０ ＴＥＰ培地で処理した。１５及び１６日目に、新しいＴＥＰ培地を細胞に添加した。１７～２２日目から、細胞を、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ７／ＫＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＲＡＮＫＬ／ＴＲＡＮＣＥ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲＲ９９（２μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ、（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）、ＮＥＡＡ（１：４００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１００Ｘ）、及びＢＭＥ（１００Ｘ）を含有するＴＥＣ培地で処理した。
この分化ステップについて、ＶＰＥ細胞を、胸腺細胞培地、例えば、ＴＥＰ培地又はＴＥＣ培地中で培養した。１４～１６日目に、細胞を、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ７／ＫＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＲＡＮＫＬ／ＴＲＡＮＣＥ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲＲ９９（２μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含む実験３０ ＴＥＰ培地で処理した。１５及び１６日目に、新しいＴＥＰ培地を細胞に添加した。１７～２２日目から、細胞を、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ７／ＫＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＲＡＮＫＬ／ＴＲＡＮＣＥ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲＲ９９（２μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ、（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）、ＮＥＡＡ（１：４００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１００Ｘ）、及びＢＭＥ（１００Ｘ）を含有するＴＥＣ培地で処理した。
【0256】
１７～２２日目に、５０％の上清を除去し、新しく調製したＴＥＣ培地（５００μｌ）をウェルごとに添加した。２２日目に、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅで処理して単一細胞を調製し、マウスに移植した。
【0257】
実施例１６ ｉＰＳＣ由来胸腺細胞におけるＦＯＸＮ１発現
２Ｄでの細胞培養と懸濁液中の３Ｄ凝集体での細胞培養の比較は、ｉＰＳＣから最適な胸腺細胞集団を得るために調整する必要がある更に別の変数である。他の変数は、異なる段階で培養に利用される成長因子及び小分子を含む。腹側咽頭内胚葉（ＶＰＥ）段階での、３Ｄ凝集体から２Ｄでの培養への移行により、ＨＯＸＡ３、ＰＡＸ９、ＰＡＸ１等のマーカーの発現を促進することができる。ｉＰＳＣ由来胸腺細胞は、異なる誘導体で胸腺細胞マーカーＦＯＸＮ１を発現することが一貫して判明した（図７）。ＧＡＰＤＨに対して正規化された０．００００２５～０．０００１のレベルでＦＯＸＮ１を発現するＴＥＰは、試験された全ての実験で観察された。よって、１６～１８日のプロトコルは、３０日と長くなり得る他のプロトコルと比較して、ＦＯＸＮ１陽性細胞の生成が可能である。
２Ｄでの細胞培養と懸濁液中の３Ｄ凝集体での細胞培養の比較は、ｉＰＳＣから最適な胸腺細胞集団を得るために調整する必要がある更に別の変数である。他の変数は、異なる段階で培養に利用される成長因子及び小分子を含む。腹側咽頭内胚葉（ＶＰＥ）段階での、３Ｄ凝集体から２Ｄでの培養への移行により、ＨＯＸＡ３、ＰＡＸ９、ＰＡＸ１等のマーカーの発現を促進することができる。ｉＰＳＣ由来胸腺細胞は、異なる誘導体で胸腺細胞マーカーＦＯＸＮ１を発現することが一貫して判明した（図７）。ＧＡＰＤＨに対して正規化された０．００００２５～０．０００１のレベルでＦＯＸＮ１を発現するＴＥＰは、試験された全ての実験で観察された。よって、１６～１８日のプロトコルは、３０日と長くなり得る他のプロトコルと比較して、ＦＯＸＮ１陽性細胞の生成が可能である。
【0258】
実施例１７ 成長因子及び培養条件の最適化
実験１６～２３では、ＴＥＰ分化の５日目までのＦＯＸＮ１の発現及び他のマーカーの発現。これらの実験では、ＴＥＰを更に１週間培養することで、ＦＯＸＮ１の下方制御が起こる。ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ１０及びＲＡＮＫＬ等の成長因子は、ＴＥＰからＴＥＣへの後期成熟に重要であることが記載されている。５日を超えたＴＥＰ培養をサポートするためにＴＥＰ培地にＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、ＫＧＦ及びＲＡＮＫＬを添加することを試験した。実験２９及び実験３０でＴＥＰ培地をＦＧＦ７、ＦＧＦ１０及びＲＡＮＫＬで補充することで、ＦＯＸＮ１の発現を維持していながらＴＥＰの培養を５日超えて２週間まで延長した。ｉＰＳＣ由来胸腺細胞産物のスケールアップ製造を促進するために、完全に３Ｄ懸濁液での分化プロトコルを確立できることが重要である。３Ｄ懸濁培養物中でＴＥＰを維持する実現可能性もこれらの実験において調べた。ＴＥＰ段階で、単一細胞を培養プレートから採取し、３Ｄへの凝集体としてＴＥＰ培地に再懸濁させた。異なる実験からのＴＥＰにおけるＦＯＸＮ１発現レベルは図８に示す。Ｅｘｐ２９－ＴＥＰでは、ＦＯＸＮ１発現をＴＥＰ段階の１週目で検出した。ＴＥＰを２Ｄ培養物に再播種した場合、１週間後にＦＯＸＮ１発現が検出されなかったが、２週目までにＦＯＸＮ１が培養物中で検出された。単一細胞ＴＥＰが３Ｄ－凝集体培養物に再懸濁したＥｘｐ２９Ｂ－ＴＥＰ２－３Ｄでは、ＦＯＸＮ１発現は１週間までに既に検出されており、２週目までに更に高くなった。実験３０では、２Ｄ又は３Ｄでの延長培養前でも、同等のＦＯＸＮ１発現が検出された。
実験１６～２３では、ＴＥＰ分化の５日目までのＦＯＸＮ１の発現及び他のマーカーの発現。これらの実験では、ＴＥＰを更に１週間培養することで、ＦＯＸＮ１の下方制御が起こる。ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ１０及びＲＡＮＫＬ等の成長因子は、ＴＥＰからＴＥＣへの後期成熟に重要であることが記載されている。５日を超えたＴＥＰ培養をサポートするためにＴＥＰ培地にＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、ＫＧＦ及びＲＡＮＫＬを添加することを試験した。実験２９及び実験３０でＴＥＰ培地をＦＧＦ７、ＦＧＦ１０及びＲＡＮＫＬで補充することで、ＦＯＸＮ１の発現を維持していながらＴＥＰの培養を５日超えて２週間まで延長した。ｉＰＳＣ由来胸腺細胞産物のスケールアップ製造を促進するために、完全に３Ｄ懸濁液での分化プロトコルを確立できることが重要である。３Ｄ懸濁培養物中でＴＥＰを維持する実現可能性もこれらの実験において調べた。ＴＥＰ段階で、単一細胞を培養プレートから採取し、３Ｄへの凝集体としてＴＥＰ培地に再懸濁させた。異なる実験からのＴＥＰにおけるＦＯＸＮ１発現レベルは図８に示す。Ｅｘｐ２９－ＴＥＰでは、ＦＯＸＮ１発現をＴＥＰ段階の１週目で検出した。ＴＥＰを２Ｄ培養物に再播種した場合、１週間後にＦＯＸＮ１発現が検出されなかったが、２週目までにＦＯＸＮ１が培養物中で検出された。単一細胞ＴＥＰが３Ｄ－凝集体培養物に再懸濁したＥｘｐ２９Ｂ－ＴＥＰ２－３Ｄでは、ＦＯＸＮ１発現は１週間までに既に検出されており、２週目までに更に高くなった。実験３０では、２Ｄ又は３Ｄでの延長培養前でも、同等のＦＯＸＮ１発現が検出された。
【0259】
実施例１８ ＴＥＰを凍結及び解凍する効果
ｉＰＳＣ－ＴＥＰを凍結、解凍、回復させる能力は、ｉＰＳＣ－ＴＥＰの使用と臨床現場への配送をサポートする上で重大なロジスティクス価値を提供する。ｉＰＳＣ－ＴＥＰを凍結及び解凍する実現可能性。実験２９Ｂ ＴＥＰ１細胞の単一細胞懸濁液を凍結し、その後ＴＥＰ培地中で３Ｄ懸濁液として解凍した。１日目に凝集体を観察したところ、そのサイズ及び緻密度が増加した。８日目まで、凝集体の直径は２００～３００μｍに達した。異なる培養条件下のＥｘｐ２９Ｂ ＴＥＰのＦＯＸＮ１発現は図９に示す。３Ｄ凝集体での凍結解凍「Ｅｘｐ２９Ｂ－ＦＴ－ＴＥＰ」細胞は、解凍後８日目にヒト胸腺と同等のレベルでＦＯＸＮ１を発現した。Ｅｘｐ２９Ｂ－ＦＴ－ＴＥＰを３週間の３Ｄでの２９Ｂ－ＴＥＰと比較した。
ｉＰＳＣ－ＴＥＰを凍結、解凍、回復させる能力は、ｉＰＳＣ－ＴＥＰの使用と臨床現場への配送をサポートする上で重大なロジスティクス価値を提供する。ｉＰＳＣ－ＴＥＰを凍結及び解凍する実現可能性。実験２９Ｂ ＴＥＰ１細胞の単一細胞懸濁液を凍結し、その後ＴＥＰ培地中で３Ｄ懸濁液として解凍した。１日目に凝集体を観察したところ、そのサイズ及び緻密度が増加した。８日目まで、凝集体の直径は２００～３００μｍに達した。異なる培養条件下のＥｘｐ２９Ｂ ＴＥＰのＦＯＸＮ１発現は図９に示す。３Ｄ凝集体での凍結解凍「Ｅｘｐ２９Ｂ－ＦＴ－ＴＥＰ」細胞は、解凍後８日目にヒト胸腺と同等のレベルでＦＯＸＮ１を発現した。Ｅｘｐ２９Ｂ－ＦＴ－ＴＥＰを３週間の３Ｄでの２９Ｂ－ＴＥＰと比較した。
【0260】
実施例１９ 胸腺細胞集団のインビボ移植
１～４ｘ１０６のｉＰＳＣ由来ＴＥＰを、２５μＬのＧｅｌｔｒｅｘに懸濁させ、６週齢のヌードマウスの腎被膜下に注射した。３匹の動物には実験１８からのｉＰＳＣ由来胸腺細胞を移植し、８匹の動物には実験２１／２２からの細胞を移植した。３週目、１１週目及び１３週目に移植マウスから血液サンプルを採取し、ｉＰＳＣ－ＴＥＰ移植後マウスの造血細胞数を胎仔胸腺移植マウス及び対照の非移植動物と比較した。図１０Ａに示すように、ＴＥＰを移植したマウスのＣＤ４５細胞のＣＤ８＋％の百分率は、３週目から１３週目及び１６週目まで増加した。全体的に、ＣＤ８＋細胞の百分率は、実験１８で１６週目に、実験２１／２２で１４週目に、対照より高かった。指摘すべきことは、実験２１／２２でＣＤ８＋細胞を示す図１０Ｂに示すマウスの一部には、技術的理由により移植細胞を組み込まなかった２匹のマウスが含まれた点である。ＣＤ４５＋細胞のＣＤ８＋％とは対照的に、ＣＤ４＋細胞、Ｂ２２０＋及びＮＫ１．１＋細胞を含む他の造血細胞集団は、対照と比較して、実験１８及び実験２１／２２で３週目から１１～１３週目及び１４～１６週目まで百分率の数値が増加しなかった（図１０Ｃ、図１０Ｄ及び図１０Ｅ）。これらのデータは併せて、本明細書に記載のｉＰＳＣ由来胸腺細胞がリンパ球新生を促進できることを示す。
１～４ｘ１０６のｉＰＳＣ由来ＴＥＰを、２５μＬのＧｅｌｔｒｅｘに懸濁させ、６週齢のヌードマウスの腎被膜下に注射した。３匹の動物には実験１８からのｉＰＳＣ由来胸腺細胞を移植し、８匹の動物には実験２１／２２からの細胞を移植した。３週目、１１週目及び１３週目に移植マウスから血液サンプルを採取し、ｉＰＳＣ－ＴＥＰ移植後マウスの造血細胞数を胎仔胸腺移植マウス及び対照の非移植動物と比較した。図１０Ａに示すように、ＴＥＰを移植したマウスのＣＤ４５細胞のＣＤ８＋％の百分率は、３週目から１３週目及び１６週目まで増加した。全体的に、ＣＤ８＋細胞の百分率は、実験１８で１６週目に、実験２１／２２で１４週目に、対照より高かった。指摘すべきことは、実験２１／２２でＣＤ８＋細胞を示す図１０Ｂに示すマウスの一部には、技術的理由により移植細胞を組み込まなかった２匹のマウスが含まれた点である。ＣＤ４５＋細胞のＣＤ８＋％とは対照的に、ＣＤ４＋細胞、Ｂ２２０＋及びＮＫ１．１＋細胞を含む他の造血細胞集団は、対照と比較して、実験１８及び実験２１／２２で３週目から１１～１３週目及び１４～１６週目まで百分率の数値が増加しなかった（図１０Ｃ、図１０Ｄ及び図１０Ｅ）。これらのデータは併せて、本明細書に記載のｉＰＳＣ由来胸腺細胞がリンパ球新生を促進できることを示す。
【0261】
実施例２０ ＦＯＸＮを発現するｉＰＳＣ由来ＴＥＰの特徴決定
実験３１によって生成されたＴＥＰを、抗ＥＰＣＡＭ抗体を使用して４つの異なる画分：ＥＰＣＡＭ高、中、低、及び陰性に分類した。分類された画分を、示された様々なマーカーについてｑＰＣＲによって分析した（図１１）。ＦＯＸＮ１はほぼＥＰＣＡＭ高の集団に限られて発現された。ＰＡＸ９、ＳＩＸ１、及びクローディン４を含む、ＴＥＰ発達及び成熟に関与する遺伝子も、ＥＰＣＡＭ高の集団で発現された。ＨＯＸＡ３、ＴＢＸ１及びＤＬＬ４は、優先的にＥＰＣＡＭ低～陰性画分で発現された。
実験３１によって生成されたＴＥＰを、抗ＥＰＣＡＭ抗体を使用して４つの異なる画分：ＥＰＣＡＭ高、中、低、及び陰性に分類した。分類された画分を、示された様々なマーカーについてｑＰＣＲによって分析した（図１１）。ＦＯＸＮ１はほぼＥＰＣＡＭ高の集団に限られて発現された。ＰＡＸ９、ＳＩＸ１、及びクローディン４を含む、ＴＥＰ発達及び成熟に関与する遺伝子も、ＥＰＣＡＭ高の集団で発現された。ＨＯＸＡ３、ＴＢＸ１及びＤＬＬ４は、優先的にＥＰＣＡＭ低～陰性画分で発現された。
【0262】
実施例２１ 胸腺上皮細胞におけるマーカーの頻度
単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑを、本明細書に記載の分化プロトコルを使用して調製されたｉＰＳＣ由来ＴＥＰについて行った。実験７（Ａ～Ｃ）、２１、２２、２３、２７、２９、及び３０からのデータを分析した。実験２１及び実験２３について、技術的再現性を評価するためにサンプルの複製も試験した。実験２９及び実験３０について、３Ｄから２Ｄへのプロトコルバリエーションに加えて、ＴＥＰの凍結解凍（ＦＴ）効果、及び２Ｄへの再プレーティング（Ｅｘｐ３０ＦＴ－２Ｄ）の効果と３Ｄへの再プレーティング（Ｅｘｐ３０ＦＴ－３Ｄ）の効果との比較を試験した。実験２９では、２Ｄへの播種（Ｅｘｐ２９Ｂ－２Ｄ）と３Ｄでの凍結解凍後の再プレーティング（２９ＢＦＴ－３Ｄ）の比較を含めて、Ｅｘｐ２９Ａと２９Ｂの比較を、様々な条件で試験した。これらの実験のうち、移植されたサンプルは、ＦＯＸＮ１高（Ｅｘｐ２９ＢＦＴ－３Ｄ）、ＦＯＸＮ１低（Ｅｘｐ３０、Ｅｘｐ３０ＦＴ－３Ｄ）、及びＦＯＸＮ１－（Ｅｘｐ３０ＦＴ－２Ｄ）であった。
単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑを、本明細書に記載の分化プロトコルを使用して調製されたｉＰＳＣ由来ＴＥＰについて行った。実験７（Ａ～Ｃ）、２１、２２、２３、２７、２９、及び３０からのデータを分析した。実験２１及び実験２３について、技術的再現性を評価するためにサンプルの複製も試験した。実験２９及び実験３０について、３Ｄから２Ｄへのプロトコルバリエーションに加えて、ＴＥＰの凍結解凍（ＦＴ）効果、及び２Ｄへの再プレーティング（Ｅｘｐ３０ＦＴ－２Ｄ）の効果と３Ｄへの再プレーティング（Ｅｘｐ３０ＦＴ－３Ｄ）の効果との比較を試験した。実験２９では、２Ｄへの播種（Ｅｘｐ２９Ｂ－２Ｄ）と３Ｄでの凍結解凍後の再プレーティング（２９ＢＦＴ－３Ｄ）の比較を含めて、Ｅｘｐ２９Ａと２９Ｂの比較を、様々な条件で試験した。これらの実験のうち、移植されたサンプルは、ＦＯＸＮ１高（Ｅｘｐ２９ＢＦＴ－３Ｄ）、ＦＯＸＮ１低（Ｅｘｐ３０、Ｅｘｐ３０ＦＴ－３Ｄ）、及びＦＯＸＮ１－（Ｅｘｐ３０ＦＴ－２Ｄ）であった。
【0263】
１６個のｉＰＳＣ由来ＴＥＣサンプル（１４個の異なる実験）からの１２２，４３６細胞の単一細胞トランスクリプトームをＨａｒｍｏｎｙによって統合し、バッチ効果の除去を確保するためにＵＭＡＰ分析を行った。次に、ＴＥＣ（ＥＰＣＡＭ、ＫＲＴ８、ＦＯＸＮ１、ＩＶＬ等）、及び多能性（ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ）について選択された遺伝子の遺伝子発現分布をプロットした。結果は図１２Ａに示す。ＥＰＣＡＭ及びＫｒｔ－８は殆どの実験で高い百分率で広く発現されたが、その他は、実験全体を通じて異なる頻度で発現される。バイオリンプロットから、ＦＯＸＮ１がＥｘｐ２９ＢＦＴ－３ＤのＴＥＣでより高度に発現され、最も高いｑＰＣＲ発現データと一致することが観察された。Ｅｘｐ２９ＢＦＴ－３Ｄ細胞も、ｍＴＥＣ細胞及び角化様ｍＴＥＣ細胞に特異的な遺伝子であるマーカーＫＲＴ５及びインボルクリン（ＩＶＬ）の最も高い発現を示した。Ｅｘｐ３０ＦＴ－２Ｄ及びＥｘｐ３０ＦＴ－３Ｄは、ｍＴＥＣ細胞に特異的なマーカーであるＣＣＬ２１を発現する細胞が検出された唯一の実験であった。最後に、指摘すべきことは、別のｍＴＥＣマーカーＦＥＺＦ２も、胸腺リンパ球新生活性を持つものを含むｉＰＳＣ－ＴＥＰの一部で高度に発現される点である。
【0264】
図１２Ｂは、ｉＰＳＣ分化胸腺細胞及び胸腺組織サンプルにおけるＦＯＸＮ１＋、ＫＲＴ８＋及びＥＰＣＡＭ＋細胞の百分率の定量化を示す。バイオリンプロット分析と一致して、サンプルＥｘｐ２９ＢＦＴ－３Ｄは、ＦＯＸＮ１＋細胞の頻度が最も高かった。指摘すべきことは、ヒト胸腺において、ＦＯＸＮ１＋細胞のレベルが出生前及び新生児時に最も高く（１０～１５％）、２５歳までに該頻度が２～３％に大幅に減少する点である。
【0265】
実施例２２ 未分化多能性幹細胞の検出限界
Ｅｘｐ２９Ｂ３Ｄサンプル中の多能性遺伝子制御ネットワークの状態を公平に評価するために、このサンプルから分析された７１６６細胞の単一細胞トランスクリプトームを、高品質のバルクＲＮＡ－ｓｅｑ由来の多能性遺伝子管理ネットワーク（胚性幹細胞、ｅｓｃと呼ばれる）及びパネルに示す１３個の他の細胞型の高品質のバルクＲＮＡ－ｓｅｑデータを含むＣｅｌｌＮｅｔ訓練データセットを使用して、分類した。分析によると、ｃＴＥＣ及びｍＴＥＣ細胞以外に、ｉＰＳＣ－ＴＥＰにおける他の主な細胞型は神経内分泌細胞であった。これらのデータは、多能性幹細胞シグネチャを有する細胞を検出するこのアプローチの感度の程度が非常に高いことを示す。加えて、胚性幹細胞ネットワークの活性化状態はｉＰＳＣ細胞において非常に低いようであり、多能性プログラムの全体的な下方制御を示唆している。
Ｅｘｐ２９Ｂ３Ｄサンプル中の多能性遺伝子制御ネットワークの状態を公平に評価するために、このサンプルから分析された７１６６細胞の単一細胞トランスクリプトームを、高品質のバルクＲＮＡ－ｓｅｑ由来の多能性遺伝子管理ネットワーク（胚性幹細胞、ｅｓｃと呼ばれる）及びパネルに示す１３個の他の細胞型の高品質のバルクＲＮＡ－ｓｅｑデータを含むＣｅｌｌＮｅｔ訓練データセットを使用して、分類した。分析によると、ｃＴＥＣ及びｍＴＥＣ細胞以外に、ｉＰＳＣ－ＴＥＰにおける他の主な細胞型は神経内分泌細胞であった。これらのデータは、多能性幹細胞シグネチャを有する細胞を検出するこのアプローチの感度の程度が非常に高いことを示す。加えて、胚性幹細胞ネットワークの活性化状態はｉＰＳＣ細胞において非常に低いようであり、多能性プログラムの全体的な下方制御を示唆している。
【0266】
ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）及びＮａｎｏｇ陽性細胞の百分率を、対数正規化された発現レベルがゼロより高い全ての細胞に基づいて定量化した。全体的に、ＰＯＵ５Ｆ１及びＮＡＮＯＧの発現は、ｉＰＳＣ－ＴＥＰサンプルからの細胞の２％未満であった。
【0267】
実施例２３ インビボ胸腺リンパ球新生活性と移植ｉＰＳＣ由来ＴＥＰのＦＯＸＮ１レベルとの相関
３群のｉＰＳＣ由来ＴＥＰ細胞を、Ｇｅｌｔｒｅｘと共に腎被膜下腔内に移植した：高ＦＯＸＮ１（ＧＡＰＤＨに対して１８～２０倍、ｘ１０４）を有する細胞、低ＦＯＸＮ１（ＧＡＰＤＨに対して５～８倍、ｘ１０４）を有する細胞、及びＦＯＸＮ１について陰性の細胞。対照動物にはＧｅｌｔｒｅｘのみを偽移植した。胸腺リンパ球新生の回復の証拠を、末梢循環における単一陽性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の出現を追跡することによって測定した。図１３は、移植後の異なる時点での動物の末梢血中のＣＤ８＋又はＣＤ４＋細胞の頻度を示すヒストグラムである。ＦＯＸＮ１高ｉＰＳＣ－ＴＥＰ及びより低い程度のＦＯＸＮ１低ｉＰＳＣ－ＴＥＰを移植した動物において、対照動物を大幅に上回るレベルでＣＤ４及びＣＤ８細胞が観察された。ＦＯＸＮ１陰性ｉＰＳＣ由来ＴＥＰは、胸腺リンパ球新生の証拠を示さなかった。よって、データは、ｉＰＳＣ由来ＴＥＰにおける高レベルのＦＯＸＮ１発現と胸腺リンパ球新生を回復する能力との間の正相関を示す。
３群のｉＰＳＣ由来ＴＥＰ細胞を、Ｇｅｌｔｒｅｘと共に腎被膜下腔内に移植した：高ＦＯＸＮ１（ＧＡＰＤＨに対して１８～２０倍、ｘ１０４）を有する細胞、低ＦＯＸＮ１（ＧＡＰＤＨに対して５～８倍、ｘ１０４）を有する細胞、及びＦＯＸＮ１について陰性の細胞。対照動物にはＧｅｌｔｒｅｘのみを偽移植した。胸腺リンパ球新生の回復の証拠を、末梢循環における単一陽性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の出現を追跡することによって測定した。図１３は、移植後の異なる時点での動物の末梢血中のＣＤ８＋又はＣＤ４＋細胞の頻度を示すヒストグラムである。ＦＯＸＮ１高ｉＰＳＣ－ＴＥＰ及びより低い程度のＦＯＸＮ１低ｉＰＳＣ－ＴＥＰを移植した動物において、対照動物を大幅に上回るレベルでＣＤ４及びＣＤ８細胞が観察された。ＦＯＸＮ１陰性ｉＰＳＣ由来ＴＥＰは、胸腺リンパ球新生の証拠を示さなかった。よって、データは、ｉＰＳＣ由来ＴＥＰにおける高レベルのＦＯＸＮ１発現と胸腺リンパ球新生を回復する能力との間の正相関を示す。
【0268】
実施例２４ 一次ヒト胸腺と比較したｉＰＳＣ由来ＴＥＣの亜集団の同一性及び頻度
１６個のｉＰＳＣ由来ＴＥＣサンプル（１４個の異なる実験）からの１２２，４３６細胞の単一細胞トランスクリプトームをＨａｒｍｏｎｙによって統合し、バッチ効果の除去を確保するためにＵＭＡＰ分析を行った。そして、全てのｉＰＳＣ由来ＴＥＰサンプルからのｉＰＳＣ単一細胞トランスクリプトミクスを、Ｂａｕｔｉｓｔａら（Ｂａｕｔｉｓｔａ， Ｊ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １２， １０９６ （２０２１））によって生成されたヒト胸腺細胞の参照単一細胞アトラスに参照マッピングした。Ｓｙｍｐｈｏｎｙによって計算された平均分類スコアを、細胞型ごとに計算した。異なる実験からのサンプル全体にわたってＳｙｍｐｈｏｎｙ予測細胞型の全体的な保存が観察された。例えば、Ｅｘｐ２９ＢＦＴ－３Ｄは、サンプル実験３０及びＥｘｐ３０ＦＴ－３ＤからのｉＰＳＣ由来胸腺細胞と共に、角質細胞様ｍＴＥＣとしての分類スコアが高い細胞を、含有する。
１６個のｉＰＳＣ由来ＴＥＣサンプル（１４個の異なる実験）からの１２２，４３６細胞の単一細胞トランスクリプトームをＨａｒｍｏｎｙによって統合し、バッチ効果の除去を確保するためにＵＭＡＰ分析を行った。そして、全てのｉＰＳＣ由来ＴＥＰサンプルからのｉＰＳＣ単一細胞トランスクリプトミクスを、Ｂａｕｔｉｓｔａら（Ｂａｕｔｉｓｔａ， Ｊ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １２， １０９６ （２０２１））によって生成されたヒト胸腺細胞の参照単一細胞アトラスに参照マッピングした。Ｓｙｍｐｈｏｎｙによって計算された平均分類スコアを、細胞型ごとに計算した。異なる実験からのサンプル全体にわたってＳｙｍｐｈｏｎｙ予測細胞型の全体的な保存が観察された。例えば、Ｅｘｐ２９ＢＦＴ－３Ｄは、サンプル実験３０及びＥｘｐ３０ＦＴ－３ＤからのｉＰＳＣ由来胸腺細胞と共に、角質細胞様ｍＴＥＣとしての分類スコアが高い細胞を、含有する。
【0269】
次に、サンプル全体にわたってＳｙｍｐｈｏｎｙ予測細胞型の百分率を計算した。一般に、全てのサンプルで見つかった最も頻繁な細胞はｃＴＥＣ高、ｃＴＥＣ低、及び神経内分泌細胞であった。ヒト胸腺における最も頻繁な細胞も、ｃＴＥＣ高及びｃＴＥＣ低細胞である。
【0270】
実施例２５ ｉＰＳＣ由来ＴＥＰ移植マウスにおけるリンパ球新生
胎仔胸腺断片又はｉＰＳＣ由来のＴＥＰを６週齢の胸腺欠損ヌードマウスの腎被膜下腔内に移植した。１～４ｘ１０６のｉＰＳＣ由来ＴＥＰを、１５μｌのＧｅｌｔｒｅｘに懸濁させ、６週齢のヌードマウスの腎被膜下に導入した。胎仔胸腺について、Ｅ１３．５胎仔葉を２ＤＧで５日間培養してＴ前駆細胞を枯渇させた。動物の１群において、３つの胎仔葉を断片として各腎被膜に移植した。別の群において、単一細胞懸濁液を２ＤＧ処理胎仔胸腺から調製し、細胞懸濁液として移植した。移植後の異なる時点で、Ｔ、Ｂ及びＮＫ細胞を含む造血細胞のフローサイトメトリー分析のために動物から採血した。ここで、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のデータのみに注目する。胸腺リンパ球新生を再構成できるｉＰＳＣ－ＴＥＰのベンチマークを確立するために、異なるレベルのＦＯＸＮ１を発現するｉＰＳＣ－ＴＥＰ（図１４）を試験した。移植されたマウス胎仔胸腺細胞懸濁液は、６週目に検出可能なＴリンパ球新生を回復したが、胎仔胸腺断片と比較してＣＤ８＋及びＣＤ４＋細胞のレベルが僅かに低かった。ＦＯＸＮ１が高いｉＰＳＣ－ＴＥＰは、６週目あたりから対照動物の１％レベルを上回るＣＤ８及びＣＤ４細胞を示した。ＣＤ８レベルの範囲（２～４％）はＣＤ４（１～２％）より高い。ＦＯＸＮ１低の動物は、バックグラウンドを上回る一定レベルのＣＤ４及びＣＤ８細胞を有するようであった。ＦＯＸＮ１が低いｉＰＳＣ－ＴＥＰによる新規胸腺リンパ球新生は、Ｇｅｌｔｒｅｘ対照動物における外れ値のため決定できなかった。Ｂ細胞（Ｂ２２０）及びＮＫ細胞（ＮＫ１．１）等のような他の造血細胞の頻度は、ヌード対照とｉＰＳＣ－ＴＥＰ移植動物の間で同様であった。
胎仔胸腺断片又はｉＰＳＣ由来のＴＥＰを６週齢の胸腺欠損ヌードマウスの腎被膜下腔内に移植した。１～４ｘ１０６のｉＰＳＣ由来ＴＥＰを、１５μｌのＧｅｌｔｒｅｘに懸濁させ、６週齢のヌードマウスの腎被膜下に導入した。胎仔胸腺について、Ｅ１３．５胎仔葉を２ＤＧで５日間培養してＴ前駆細胞を枯渇させた。動物の１群において、３つの胎仔葉を断片として各腎被膜に移植した。別の群において、単一細胞懸濁液を２ＤＧ処理胎仔胸腺から調製し、細胞懸濁液として移植した。移植後の異なる時点で、Ｔ、Ｂ及びＮＫ細胞を含む造血細胞のフローサイトメトリー分析のために動物から採血した。ここで、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のデータのみに注目する。胸腺リンパ球新生を再構成できるｉＰＳＣ－ＴＥＰのベンチマークを確立するために、異なるレベルのＦＯＸＮ１を発現するｉＰＳＣ－ＴＥＰ（図１４）を試験した。移植されたマウス胎仔胸腺細胞懸濁液は、６週目に検出可能なＴリンパ球新生を回復したが、胎仔胸腺断片と比較してＣＤ８＋及びＣＤ４＋細胞のレベルが僅かに低かった。ＦＯＸＮ１が高いｉＰＳＣ－ＴＥＰは、６週目あたりから対照動物の１％レベルを上回るＣＤ８及びＣＤ４細胞を示した。ＣＤ８レベルの範囲（２～４％）はＣＤ４（１～２％）より高い。ＦＯＸＮ１低の動物は、バックグラウンドを上回る一定レベルのＣＤ４及びＣＤ８細胞を有するようであった。ＦＯＸＮ１が低いｉＰＳＣ－ＴＥＰによる新規胸腺リンパ球新生は、Ｇｅｌｔｒｅｘ対照動物における外れ値のため決定できなかった。Ｂ細胞（Ｂ２２０）及びＮＫ細胞（ＮＫ１．１）等のような他の造血細胞の頻度は、ヌード対照とｉＰＳＣ－ＴＥＰ移植動物の間で同様であった。
【0271】
移植ｉＰＳＣ－ＴＥＰの胸腺リンパ球新生から生成されたＴ細胞の機能的応答を評価するために、脾細胞を屠殺した動物から採取し、サイトカイン放出試験に備えた。細胞をＰＭＡ／イオノマイシンで刺激し、Ｔ細胞活性化シグナルに応答して産生されたサイトカインをフロー染色によって分析した。非刺激条件下で、移植マウスからの脾細胞でバックグラウンド染色レベルが観察された。Ｇｅｌｔｒｅｘ移植からの活性化された脾細胞は、３．６３％の低いレベルでＩＦＮγ＋ＴＮＦα＋産生細胞を示した。対照的に、ｉＰＳＣ由来ＴＥＣ及び胎仔胸腺移植からのＣＤ４＋細胞は、それぞれ、１２．３％及び５．８％のＩＦＮγ＋ＴＮＦα＋産生細胞を示した。ＣＤ８集団におけるＩＦＮγ又はＴＮＦ発現細胞も、Ｇｅｌｔｒｅｘ移植と比較してｉＰＳＣ－ＴＥＣ及び胎仔胸腺移植の両方でより高かった。結論として、ＰＭＡ／イオノマイシン刺激により、対照脾細胞と比較してサイトカインＩＦＮγ及びＴＮＦαがより多く放出された。
【0272】
実施例２６ 胸腺細胞へのｉＰＳＣ細胞の分化（実験３１）
懸濁培養におけるｉＰＳＣ系の増大
０日目に、培養された成熟ｉＰＳＣ（懸濁液中で３～４日間（３Ｄ）、直径３００～４００マイクロメートル）を、予め加温したＡｃｃｕｔａｓｅで処理して凝集体を単一細胞に変化させた。３百万の単一ｉＰＳＣをＲＯＣＫ阻害物質Ｙ２７６３２（１０μＭ）と共に、Ｓｔｅｍ ｓｃａｌｅ培地における６ウェル超低接着プレート中の懸濁液にプレーティングした。１日目に、予め加温したｓｔｅｍ ｓｃａｌｅ培地を培養物に添加した。２日目に、上清及びスフェロイドを１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０Ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。１ｍｌの培地Ａを６ウェル低接着プレートの各ウェルに添加し、プレートを３７℃のインキュベーターでインキュベートした。培地Ａは、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、２μＭのＣＨＩＲ９９０２１、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１：１００）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された。
懸濁培養におけるｉＰＳＣ系の増大
０日目に、培養された成熟ｉＰＳＣ（懸濁液中で３～４日間（３Ｄ）、直径３００～４００マイクロメートル）を、予め加温したＡｃｃｕｔａｓｅで処理して凝集体を単一細胞に変化させた。３百万の単一ｉＰＳＣをＲＯＣＫ阻害物質Ｙ２７６３２（１０μＭ）と共に、Ｓｔｅｍ ｓｃａｌｅ培地における６ウェル超低接着プレート中の懸濁液にプレーティングした。１日目に、予め加温したｓｔｅｍ ｓｃａｌｅ培地を培養物に添加した。２日目に、上清及びスフェロイドを１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０Ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。１ｍｌの培地Ａを６ウェル低接着プレートの各ウェルに添加し、プレートを３７℃のインキュベーターでインキュベートした。培地Ａは、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、２μＭのＣＨＩＲ９９０２１、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１：１００）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された。
【0273】
胚体内胚葉（ＤＥ）へのｉＰＳＣの分化
細胞を１～２日目に培地Ａ中で培養し、３～５日目に培地Ｂ中で培養した。培地Ａは、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、２μＭのＣＨＩＲ９９０２１、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１：１００）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された。培地Ｂは、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、ＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された。
細胞を１～２日目に培地Ａ中で培養し、３～５日目に培地Ｂ中で培養した。培地Ａは、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、２μＭのＣＨＩＲ９９０２１、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１：１００）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された。培地Ｂは、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、ＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された。
【0274】
前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）への胚体内胚葉（ＤＥ）の分化
６日目に、上清及びスフェロイドを１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０Ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、１ｍｌのＡＦＥ培地に再懸濁させ、６ウェル低接着プレート上にプレーティングした。この実験では細胞が凝集体として懸濁液中で保持された。ＡＦＥ培地は、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＲＡ非含有）（１：２００）、Ｎ２（１：１００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、ＮＥＡＡ（１：４００）、ＩＴＳ３６（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）を含むように調製された。
６日目に、上清及びスフェロイドを１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０Ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、１ｍｌのＡＦＥ培地に再懸濁させ、６ウェル低接着プレート上にプレーティングした。この実験では細胞が凝集体として懸濁液中で保持された。ＡＦＥ培地は、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＲＡ非含有）（１：２００）、Ｎ２（１：１００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、ＮＥＡＡ（１：４００）、ＩＴＳ３６（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）を含むように調製された。
【0275】
腹側咽頭内胚葉（ＶＰＥ）への前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）の分化
２４ウェルプレートを、室温にて１時間放置したＧｅｌｔｒｅｘ（１：１００）でコーティングした。９日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０Ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。スフェロイドをＰＢＳ中で洗浄した。２５０μｌのＶＰＥ１培地を、Ｇｅｌｔｒｅｘでコーティングされた各ウェルに添加した。ＶＰＥ１培地は、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＳＢ４３１５４２（１０ｕＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された。１０日目に、等量の新しく作製したＶＰＥ１培地（５００ｕｌ）を、凝集体を妨げることなく穏やかに添加した。１１日目に、５０％の上清を除去し、新しく調製したＶＰＥ１培地（５００ｕｌ）をウェルごとに添加した。
２４ウェルプレートを、室温にて１時間放置したＧｅｌｔｒｅｘ（１：１００）でコーティングした。９日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０Ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。スフェロイドをＰＢＳ中で洗浄した。２５０μｌのＶＰＥ１培地を、Ｇｅｌｔｒｅｘでコーティングされた各ウェルに添加した。ＶＰＥ１培地は、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＳＢ４３１５４２（１０ｕＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された。１０日目に、等量の新しく作製したＶＰＥ１培地（５００ｕｌ）を、凝集体を妨げることなく穏やかに添加した。１１日目に、５０％の上清を除去し、新しく調製したＶＰＥ１培地（５００ｕｌ）をウェルごとに添加した。
【0276】
１２～１３日目に、ＶＰＥ２培地を添加した。ＶＰＥ２培地は、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、ＮＥＡＡ（１：４００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、及びＮ２（１：１００）を含むように調製された。１３日目に、等量の新しく作製したＶＰＥ２培地（５００ｕｌ）を、凝集体を妨げることなく穏やかに添加した。
【0277】
胸腺上皮前駆細胞（ＴＥＰ）への腹側咽頭内胚葉（ＶＰＥ）の分化
１４～１７日目に、細胞をＴＥＰ培地中で培養した。ＴＥＰ培地は、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲＲ９９（２μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された。
１４～１７日目に、細胞をＴＥＰ培地中で培養した。ＴＥＰ培地は、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲＲ９９（２μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された。
【0278】
１５日目に、等量の新しく作製したＴＥＰ培地（５００μｌ）を、凝集体を妨げることなく穏やかに添加した。１６及び１７日目に、５０％の上清を除去し、新しく調製したＴＥＰ培地（５００μｌ）をウェルごとに添加した。
【0279】
細胞を更に胸腺上皮細胞（ＴＥＣ）に分化させるために、上清を除去し、細胞を、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲＲ９９（２μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）、ＮＥＡＡ（１：４００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１００Ｘ）、及びＢＭＥ（１００Ｘ）を含有するＴＥＣ１培地中で培養した。１８及び１９日目に、５０％の上清を除去し、新しく調製したＴＥＣ１培地（５００ｕｌ）をウェルごとに添加した。２０～２２日目に、ＲＡＮＫＬを含有するＴＥＣ２培地を添加した。ＴＥＣ２培地は、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ７／ＫＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＲＡＮＫＬ／ＴＲＡＮＣＥ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲＲ９９（２μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）、ＮＥＡＡ（１：４００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１００Ｘ）、及びＢＭＥ（１００Ｘ）を含むように調製された。
【0280】
２３日目に、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅで処理し、Ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｏｓｏｌ－ＦＲＳ培地を使用して凍結した。
【0281】
実施例２７ 胸腺細胞へのｉＰＳＣ細胞の分化（実験３３）
懸濁培養におけるｉＰＳＣ系の増大
０日目に、成熟Ｆｕｊｉ ｉＰＳ－１０６細胞（懸濁液中で３～４日間、直径３００～４００マイクロメートル）をＡｃｃｕｔａｓｅで処理して、凝集体を単一細胞に変化させた。２５０万の単一ｉＰＳＣを６ウェル超低接着プレート中の懸濁液に入れ、Ｓｔｅｍ ｓｃａｌｅ培地をロック阻害物質Ｙ２７６３２（１０μＭ）と一緒に使用して培養した。１日目に、１ｍｌの上清をプレートから除去し、１ｍｌの予め加温したｓｔｅｍ ｓｃａｌｅ培地を添加した。２日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０Ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、培地Ａに再懸濁させ、培地Ａは、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、２μＭのＣＨＩＲ９９０２１、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：１００）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された。
懸濁培養におけるｉＰＳＣ系の増大
０日目に、成熟Ｆｕｊｉ ｉＰＳ－１０６細胞（懸濁液中で３～４日間、直径３００～４００マイクロメートル）をＡｃｃｕｔａｓｅで処理して、凝集体を単一細胞に変化させた。２５０万の単一ｉＰＳＣを６ウェル超低接着プレート中の懸濁液に入れ、Ｓｔｅｍ ｓｃａｌｅ培地をロック阻害物質Ｙ２７６３２（１０μＭ）と一緒に使用して培養した。１日目に、１ｍｌの上清をプレートから除去し、１ｍｌの予め加温したｓｔｅｍ ｓｃａｌｅ培地を添加した。２日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０Ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、培地Ａに再懸濁させ、培地Ａは、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、２μＭのＣＨＩＲ９９０２１、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：１００）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された。
【0282】
胚体内胚葉（ＤＥ）へのｉＰＳＣの分化
１～２日目に、細胞を、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、２μＭのＣＨＩＲ９９０２１、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：１００）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含有する培地Ａ中で培養した。２日目に、各ウェルからの１ｍｌの上清を１ｍｌの新しく調製した培地Ａで置き換えた。
１～２日目に、細胞を、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、２μＭのＣＨＩＲ９９０２１、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：１００）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含有する培地Ａ中で培養した。２日目に、各ウェルからの１ｍｌの上清を１ｍｌの新しく調製した培地Ａで置き換えた。
【0283】
３日目に、細胞を洗浄し、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＣＨＩＲＲ９９０１（２μＭ）、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、ＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された培地Ｂに再懸濁させた。４～５日目に、各ウェルからの１ｍｌの上清を１ｍｌの新しく調製した培地Ｂ’で置き換えた。培地Ｂ’は、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された。
【0284】
前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）への胚体内胚葉（ＤＥ）の分化
６日目に、２４ウェルプレートを、室温にて１時間放置したＧｅｌｔｒｅｘ（１：１００）でコーティングした。上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０Ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、ＡＦＥ培地に再懸濁させ、Ｇｅｌｔｒｅｘでコーティングされたプレートに移した。ＡＦＥ培地は、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＲＡ非含有）（１：２００）、Ｎ２（１：１００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された。
６日目に、２４ウェルプレートを、室温にて１時間放置したＧｅｌｔｒｅｘ（１：１００）でコーティングした。上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０Ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、ＡＦＥ培地に再懸濁させ、Ｇｅｌｔｒｅｘでコーティングされたプレートに移した。ＡＦＥ培地は、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＲＡ非含有）（１：２００）、Ｎ２（１：１００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された。
【0285】
７日目に、等量の新しく調製したＡＦＥ培地（５００ｕｌ）をウェルごとに添加した。８日目に、５０％の上清を除去し、新しく調製したＡＦＥ培地（５００ｕｌ）をウェルごとに添加した。
【0286】
腹側咽頭内胚葉（ＶＰＥ）への前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）の分化
９～１０日目に、細胞を、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＳＢ４３１５４２（１０ｕＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）、ＮＥＡＡ（１：４００）を含有するＶＰＥ１培地に再懸濁させた。９日目に、等量の新しく作製したＶＰＥ１培地（５００ｕｌ）を、凝集体を妨げることなく穏やかに交換した。１０日目に、等量の新しく調製したＶＰＥ１培地（５００ｕｌ）をウェルごとに添加した。
９～１０日目に、細胞を、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＳＢ４３１５４２（１０ｕＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）、ＮＥＡＡ（１：４００）を含有するＶＰＥ１培地に再懸濁させた。９日目に、等量の新しく作製したＶＰＥ１培地（５００ｕｌ）を、凝集体を妨げることなく穏やかに交換した。１０日目に、等量の新しく調製したＶＰＥ１培地（５００ｕｌ）をウェルごとに添加した。
【0287】
１２日目に、等量の新しく作製したＶＰＥ２培地（５００ｕｌ）を、凝集体を妨げることなく穏やかに交換した。ＶＰＥ２培地は、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、ＮＥＡＡ（１：４００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）を含むように調製された。１３日目に、等量の新しく調製したＶＰＥ２培地（５００ｕｌ）をウェルごとに添加した。
【0288】
胸腺上皮前駆細胞（ＴＥＰ）への腹側咽頭内胚葉（ＶＰＥ）の分化
１４日目に、等量の新しく作製したＴＥＰ培地（５００ｕｌ）を、凝集体を妨げることなく穏やかに添加した。ＴＥＰ培地は、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲＲ９９（２μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含有するように調製された。
１４日目に、等量の新しく作製したＴＥＰ培地（５００ｕｌ）を、凝集体を妨げることなく穏やかに添加した。ＴＥＰ培地は、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲＲ９９（２μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含有するように調製された。
【0289】
１５日目に、等量の新しく調製したＴＥＰ培地（５００μｌ）をウェルごとに添加した。１６～１８日目に、５０％の上清を除去し、新しく調製したＴＥＰ培地（５００ｕｌ）をウェルごとに添加した。
【0290】
１９～２２日目に、ＴＥＣ培地を添加した。ＴＥＣ培地は、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ７／ＫＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＲＡＮＫＬ／ＴＲＡＮＣＥ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲＲ９９（２μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）、ＮＥＡＡ（１：４００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１００Ｘ）及びＢＭＥ（１００Ｘ）を含むように調製された。
【0291】
２２日目に、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅで処理し、Ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｏｓｏｌ－ＦＲＳ培地を使用して凍結した。細胞集団をいくつかの実験条件に応じて分けた。３３ＦＴ１（７．５Ｍ／プレート）では細胞を３Ｄで解凍し、ＴＥＣ培地中で６日間維持した（１日目にはＹ２７－１０ｕＭ）。サバイビン阻害物質（ＹＭ１５５）の様々な濃度及びパルスを評価した。３３ＦＴ２（７．８Ｍ／プレート）では、細胞を３Ｄで解凍し、ＴＥＣ培地中で６日間維持した（１日目にはＹ２７－１０ｕＭ）。サバイビン阻害物質（ＹＭ１５５）の様々な濃度及びパルスを評価した。６日目に、群３及び群４の細胞を選択して５匹の動物に移植した。３３ＦＴ３（５Ｍ／プレート）では、細胞を２Ｄ（Ｇｅｌｔｒｅｘでコーティングされた２４ウェルプレート）で解凍し、ＴＥＣ培地中で５日間維持した（１日目にはＹ２７－１０ｕＭ）。Ｐｌｕｒｉｓｉｎ＃１の様々な濃度及びパルスを評価した。５日目に、それらを３Ｄに再懸濁させ、ＴＥＣ培地中で５日間維持した。５日目に、それらを２０μＭのＰｌｕｒｉｓｉｎ＃１で処理した。３３ＦＴ４（７．６Ｍ／プレート）では、細胞を３Ｄで解凍し、ＴＥＣ培地中で５日間維持した（１日目にはＹ２７－１０ｕＭ）。５日目に、１つの群を２０ｎＭのＹＭ１５５で処理し、別の群をＰｌｕｒｉｓｉｎ＃１で処理した。３３ＦＴ６（８Ｍ／プレート）では、細胞を３Ｄで解凍し、ＴＥＣ培地中で６日間維持した（１日目にはＹ２７－１０ｕＭ）。６日目に、それらを２０μＭのＰｌｕｒｉｓｉｎ＃１で処理し（３６時間）、７日目に５匹の動物に移植した。３３ＦＴ７（７．８Ｍ／プレート）では、細胞を３Ｄで解凍し、ＴＥＣ培地中で６日間維持した（１日目にはＹ２７－１０ｕＭ）。６日目に、それらを２０μＭのＰｌｕｒｉｓｉｎ＃１で処理し（２４時間）、７日目に２匹の動物に移植した。
【0292】
実施例２８ 胸腺細胞へのｉＰＳＣ細胞の分化（実験３７）
懸濁培養におけるｉＰＳＣ系の増大
０日目に、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して成熟ｉＰＳＣ系１８９４５（懸濁液中で３～４日間、直径３００～４００マイクロメートル）を処理して凝集体から単一細胞を調製した。３百万の単一ｉＰＳＣをＲＯＣＫ阻害物質Ｙ２７６３２（１０μＭ）と一緒に、Ｓｔｅｍ ｓｃａｌｅ培地における６ウェル超低接着プレート中の懸濁液に入れた。初日に、１ｍｌの上清をプレートから除去し、１ｍｌの予め加温したＳｔｅｍ ｓｃａｌｅ培地を添加した。２日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移し、６ウェル低接着プレート中の培地Ａに再懸濁させた。
懸濁培養におけるｉＰＳＣ系の増大
０日目に、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して成熟ｉＰＳＣ系１８９４５（懸濁液中で３～４日間、直径３００～４００マイクロメートル）を処理して凝集体から単一細胞を調製した。３百万の単一ｉＰＳＣをＲＯＣＫ阻害物質Ｙ２７６３２（１０μＭ）と一緒に、Ｓｔｅｍ ｓｃａｌｅ培地における６ウェル超低接着プレート中の懸濁液に入れた。初日に、１ｍｌの上清をプレートから除去し、１ｍｌの予め加温したＳｔｅｍ ｓｃａｌｅ培地を添加した。２日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移し、６ウェル低接着プレート中の培地Ａに再懸濁させた。
【0293】
胚体内胚葉（ＤＥ）へのｉＰＳＣの分化
１日目に、細胞をＰＢＳで洗浄し、培地Ａに再懸濁させた。培地Ａは、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、２μＭのＣＨＩＲ９９０２１、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：１００）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された。２日目に、各ウェルからの１ｍｌの上清を１ｍｌの新しく調製した培地Ａで置き換えた。
１日目に、細胞をＰＢＳで洗浄し、培地Ａに再懸濁させた。培地Ａは、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、２μＭのＣＨＩＲ９９０２１、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：１００）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された。２日目に、各ウェルからの１ｍｌの上清を１ｍｌの新しく調製した培地Ａで置き換えた。
【0294】
３日目に、細胞をＰＢＳで洗浄し、培地Ｂに再懸濁させた。培地Ｂは、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＣＨＩＲＲ９９０１（２μＭ）、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された。
【0295】
４～５日目に、各ウェルからの１ｍｌの上清を１ｍｌの新しく調製した培地Ｂで置き換えた。培地Ｂは、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された。
【0296】
前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）への胚体内胚葉（ＤＥ）の分化
２４ウェルプレートを、室温にて１時間放置したＧｅｌｔｒｅｘ（１：１００）でコーティングした。６日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０Ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、ＡＦＥ培地に再懸濁させ、６～８日目から培養した。ＡＦＥ培地は、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＲＡ非含有）（１：２００）、Ｎ２（１：１００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された。
２４ウェルプレートを、室温にて１時間放置したＧｅｌｔｒｅｘ（１：１００）でコーティングした。６日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０Ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、ＡＦＥ培地に再懸濁させ、６～８日目から培養した。ＡＦＥ培地は、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＲＡ非含有）（１：２００）、Ｎ２（１：１００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された。
【0297】
７日目に、等量の新しく調製したＡＦＥ培地（５００μｌ）をウェルごとに添加した。８日目に、５０％の上清を除去し、新しく調製したＡＦＥ培地（５００μｌ）をウェルごとに添加した。
【0298】
腹側咽頭内胚葉（ＶＰＥ）への前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）の分化
９日目に、等量の新しく作製したＶＰＥ１培地（５００ｕｌ）を、凝集体を妨げることなく穏やかに交換した。ＶＰＥ１は、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＳＢ４３１５４２（１０ｕＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された。１０日目に、等量の新しく調製したＶＰＥ１培地（５００μｌ）をウェルごとに添加した。
９日目に、等量の新しく作製したＶＰＥ１培地（５００ｕｌ）を、凝集体を妨げることなく穏やかに交換した。ＶＰＥ１は、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＳＢ４３１５４２（１０ｕＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された。１０日目に、等量の新しく調製したＶＰＥ１培地（５００μｌ）をウェルごとに添加した。
【0299】
１２日目に、等量の新しく作製したＶＰＥ２培地（５００ｕｌ）を、凝集体を妨げることなく穏やかに交換した。ＶＰＥ２培地は、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（０．１μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、ＮＥＡＡ（１：４００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）を含むように調製された。
【0300】
１３日目に、等量の新しく調製したＶＰＥ２培地（５００μｌ）をウェルごとに添加した。
【0301】
胸腺上皮前駆細胞（ＴＥＰ）への腹側咽頭内胚葉（ＶＰＥ）の分化
１４日目に、等量の新しく作製したＴＥＰ培地（５００μｌ）を、凝集体を妨げることなく穏やかに交換した。細胞をＴＥＰ培地中で１４～１８日目から培養した。ＴＥＰ培地は、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲＲ９９（２μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された。１５日目に、等量の新しく調製したＴＥＰ培地（５００ｕｌ）をウェルごとに添加した。１６～１８日目に、５０％の上清を除去し、新しく調製したＴＥＰ培地（５００ｕｌ）をウェルごとに添加した。
１４日目に、等量の新しく作製したＴＥＰ培地（５００μｌ）を、凝集体を妨げることなく穏やかに交換した。細胞をＴＥＰ培地中で１４～１８日目から培養した。ＴＥＰ培地は、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲＲ９９（２μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された。１５日目に、等量の新しく調製したＴＥＰ培地（５００ｕｌ）をウェルごとに添加した。１６～１８日目に、５０％の上清を除去し、新しく調製したＴＥＰ培地（５００ｕｌ）をウェルごとに添加した。
【0302】
１９～２２日目に、細胞をＴＥＣ培地中で培養した。１９日目に、等量の新しく作製したＴＥＣ培地（５００μｌ）を、凝集体を妨げることなく穏やかに交換した。ＴＥＣ培地は、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－２２（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ７／ＫＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＲＡＮＫＬ／ＴＲＡＮＣＥ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲＲ９９（２μＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＶＩＴ Ａ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）、ＮＥＡＡ（１：４００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１００Ｘ）、及びＢＭＥ（１００Ｘ）を含むように調製された。２０日目に、等量の新しく調製したＴＥＣ培地（５００ｕｌ）をＰｌｕｒｉｓｉｎ＃１（２０μＭ）と一緒に添加した（未処理及び処理群）。２１日目に、等量の新しく作製したＴＥＣ培地（５００ｕｌ）を、凝集体を妨げることなく穏やかに交換した。２２日目に、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅで処理し、Ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｏｓｏｌ－ＦＲＳ培地を使用して凍結した。細胞を実験に応じて以下の群に分けた。群３７ＦＴ１（８．８５Ｍ処理及び９．５Ｍ未処理群）を３Ｄで解凍し、ＴＥＣ培地中で６日間維持した（１日目にはＹ２７－１０ｕＭ）。６日目に、細胞を２０μＭのＰｌｕｒｉｓｉｎ＃１で処理し（２４時間）、７日目に４匹の動物に移植した。群３７ＦＴ２（８．８５Ｍ／プレート）を３Ｄで凍結し、ＴＥＣ培地中で６日間維持した（１日目にはＹ２７－１０ｕＭ）。６日目に、細胞を２０μＭのＰｌｕｒｉｓｉｎ＃１で処理し（２４時間）、７日目に８匹の動物に移植した。
【0303】
実施例２９ 胸腺細胞へのｉＰＳＣ細胞の分化（実験４０Ａ、４０Ｂ及び４１）
ｉＰＳＣを以下に記載のように胸腺細胞に分化させた。
ｉＰＳＣを以下に記載のように胸腺細胞に分化させた。
【0304】
懸濁培養におけるｉＰＳ１８９４５系の増大
０日目に、成熟ｉＰＳＣ細胞（懸濁液中で３～４日間、直径３００～４００マイクロメートル）をＡｃｃｕｔａｓｅで処理して凝集体を単一細胞に変化させた。３百万の単一ｉＰＳＣ細胞をＲＯＣＫ阻害物質Ｙ２７６３２（１０μＭ）と一緒に、Ｓｔｅｍ Ｓｃａｌｅ培地における６ウェル超低接着プレート中の懸濁液に入れた。プレートを７０ＲＰＭ、３７℃のシェーカー上に置いた。１日目に、１ｍｌの上清をプレートから除去し、１ｍｌの予め加温したＳｔｅｍ Ｓｃａｌｅ培地を添加した。２日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０Ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、２５０Ｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳを吸引した。培地Ａは、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＣＨＩＲ９９０２１、（２μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：１００）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された。１ｍｌの培地Ａを６ウェル低接着プレートの各ウェルに添加した。
０日目に、成熟ｉＰＳＣ細胞（懸濁液中で３～４日間、直径３００～４００マイクロメートル）をＡｃｃｕｔａｓｅで処理して凝集体を単一細胞に変化させた。３百万の単一ｉＰＳＣ細胞をＲＯＣＫ阻害物質Ｙ２７６３２（１０μＭ）と一緒に、Ｓｔｅｍ Ｓｃａｌｅ培地における６ウェル超低接着プレート中の懸濁液に入れた。プレートを７０ＲＰＭ、３７℃のシェーカー上に置いた。１日目に、１ｍｌの上清をプレートから除去し、１ｍｌの予め加温したＳｔｅｍ Ｓｃａｌｅ培地を添加した。２日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０Ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、２５０Ｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳを吸引した。培地Ａは、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＣＨＩＲ９９０２１、（２μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：１００）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された。１ｍｌの培地Ａを６ウェル低接着プレートの各ウェルに添加した。
【0305】
胚体内胚葉（ＤＥ）へのｉＰＳＣの分化
ＤＥへのｉＰＳＣの分化には、小分子及び成長因子を適切なタイミングで導入する必要がある。１～２日目に、培地Ａを添加した（培地Ａは、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：１００）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された）。３日目に、培地Ｂを添加した（培地Ｂは、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、２μＭのＣＨＩＲＲ９９０２１、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：５００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、ＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された）。４～５日目に、培地Ｂ’を添加した（培地Ｂ’は、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：５００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された）。
ＤＥへのｉＰＳＣの分化には、小分子及び成長因子を適切なタイミングで導入する必要がある。１～２日目に、培地Ａを添加した（培地Ａは、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：１００）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された）。３日目に、培地Ｂを添加した（培地Ｂは、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、２μＭのＣＨＩＲＲ９９０２１、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：５００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、ＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された）。４～５日目に、培地Ｂ’を添加した（培地Ｂ’は、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、ＰＩ－１０３（２５ｎＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：５００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された）。
【0306】
前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）への胚体内胚葉（ＤＥ）の分化
６日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０Ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、２５０Ｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳを吸引した。２５０ｕｌのＡＦＥ培地を、室温にて１時間放置したＧｅｌｔｒｅｘ（１：１００）でコーティングされた２４ウェルプレートの各ウェルに添加した。ＡＦＥ培地は、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：５００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＲＡ非含有）（１：２００）、Ｎ２（１：１００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された。６ｍｌのＡＦＥ培地をＤＥ－凝集体に添加した。凝集体を穏やかに混合し、２５０ｕｌを、ＡＦＥ培地を含有する２４ウェルプレートの各ウェルに添加した。６日目に、培地を新しいＡＦＥ培地で置き換えた。７日目に、５００μＬのＡＦＥ’培地を添加した。ＡＦＥ’培地は、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：５００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＲＡ非含有）（１：２００）、Ｎ２（１：１００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００），及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された。実験４０Ａ及び４０ＢではＡＦＥ’培地中で２日間培養したが、実験４０Ｂでは、細胞をＡＦＥ培地中で３日間培養した。
６日目に、上清をスフェロイドと一緒に１５ｍｌコニカルチューブ内に移した。スフェロイドを室温にて２５０Ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。スフェロイドをＰＢＳで洗浄し、２５０Ｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳを吸引した。２５０ｕｌのＡＦＥ培地を、室温にて１時間放置したＧｅｌｔｒｅｘ（１：１００）でコーティングされた２４ウェルプレートの各ウェルに添加した。ＡＦＥ培地は、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：５００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＲＡ非含有）（１：２００）、Ｎ２（１：１００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された。６ｍｌのＡＦＥ培地をＤＥ－凝集体に添加した。凝集体を穏やかに混合し、２５０ｕｌを、ＡＦＥ培地を含有する２４ウェルプレートの各ウェルに添加した。６日目に、培地を新しいＡＦＥ培地で置き換えた。７日目に、５００μＬのＡＦＥ’培地を添加した。ＡＦＥ’培地は、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＬＤＮ１９３１８９（２００ｎＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：５００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＲＡ非含有）（１：２００）、Ｎ２（１：１００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００），及びＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された。実験４０Ａ及び４０ＢではＡＦＥ’培地中で２日間培養したが、実験４０Ｂでは、細胞をＡＦＥ培地中で３日間培養した。
【0307】
腹側咽頭内胚葉（ＶＰＥ）への前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）の分化
その後、細胞を表４に示すＶＰＥ１培地中で培養した。
その後、細胞を表４に示すＶＰＥ１培地中で培養した。
【0308】
（表４）実験４０Ａ及び実験４０Ｂ用のＶＰＥ１培地
【0309】
１０日目に、実験４０Ａ及び実験４０Ｂについて、等量の新しく作製したＶＰＥ１培地（５００μｌ）を、凝集体を妨げることなく穏やかに添加した。
【0310】
実験４１では、１０日目に、５００μｌの新しく調製したＶＰＥ１培地を凝集体に添加した。
【0311】
実験４１について、ＶＰＥ１培地は、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、オールトランスレチノイン酸（０．１μＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：５００）、ＫＳＲ（０．０５％）、Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ＲＡ非含有）（１：２００）、Ｎ２（１：１００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、ＮＥＡＡ（１：４００）を含むように調製された。
【0312】
ＶＰＥ２培地を表５に示すように各実験で細胞に添加した。
【0313】
（表５）実験４０Ａ、実験４０Ｂ及び実験４１用のＶＰＥ２培地
【0314】
ＶＰＥ段階の終了時のＨＯＸＡ３及びＰＡＸ９発現を測定した。図１５は、実験４１と比較して実験４０Ａ及び実験４０Ｂがより高レベルのＨＯＸＡ３及びＰａｘ９をもたらしたことを示す。
【0315】
胸腺上皮前駆細胞（ＴＥＰ）への腹側咽頭内胚葉（ＶＰＥ）の分化
実験４１について、表６に示すＴＥＰ培地を１３～１７日目に添加した。１４日目に、等量の新しく作製したＴＥＰ培地（５００μｌ）を、凝集体を妨げることなく穏やかに添加した。１５～１７日目に、５０％の上清を除去し、新しく調製したＴＥＰ培地（５００μｌ）をウェルごとに添加した。
実験４１について、表６に示すＴＥＰ培地を１３～１７日目に添加した。１４日目に、等量の新しく作製したＴＥＰ培地（５００μｌ）を、凝集体を妨げることなく穏やかに添加した。１５～１７日目に、５０％の上清を除去し、新しく調製したＴＥＰ培地（５００μｌ）をウェルごとに添加した。
【0316】
（表６）実験４０Ａ、実験４０Ｂ及び実験４１用のＴＥＰ培地
【0317】
１６日目に、等量の新しく調製したＴＥＰ培地（５００μｌ）を、凝集体を妨げることなく穏やかに添加した。１７日目に、５０％の上清を除去し、新しく調製したＴＥＰ培地（５００μｌ）をウェルごとに添加した。
【0318】
１８日目に、凝集体をＴＥＣ培地に移した。ＴＥＣ培地は、基本培地：ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ７／ＫＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＲＡＮＫＬ／ＴＲＡＮＣＥ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ８ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲＲ９９０２１（２μＭ）、ＩＬ－２２（２０ｎＭ）、アスコルビン酸（１０μＭ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（１：１０００）、ＫＳＲ（０．００２５％）、Ｐｅｎ ｓｔｒｅｐ（１：２００）、Ｂ２７（ビタミンＡ非含有）（１：２００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１：１００）、ＢＭＥ（１：１００）、Ｎ２（１：１００）、ＮＥＡＡ（１：４００）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１００Ｘ）、ＢＭＥ（１００Ｘ）を含むように調製された。
【0319】
１９日目に、５０％の上清を除去し、新しく調製したＴＥＣ培地（５００μｌ）をウェルごとに添加した。２０日目に、２０μＭのＰｌｕｒｉＳＩｎ－１（ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ阻害物質）を、新しく調製した培地に添加した。２１日目に、ＰｌｕｒｉＳＩｎ－１非含有ＴＥＣ培地を添加した。２２日目に、細胞を酵素Ａｃｃｕｔａｓｅで処理して、更なる試験及び実験前に凍結された単一細胞を生成した。
【0320】
実施例３０ 胸腺細胞分化プロトコルの再現性
実験３７で分化プロトコルを使用して新たなｉＰＳＣ系を試験した。実験ごとに、ｉＰＳＣ由来ＴＥＰにおけるＦＯＸＮ１発現を、分化の終了時の細胞凍結前に、及び細胞の３Ｄ凝集体への解凍５日後に、測定した。ｉＰＳＣ由来胸腺細胞の凍結前のＦＯＸＮ１発現と比較して、解凍された細胞においてＦＯＸＮ１発現の著しい増加が観察された。この実験は、分化プロトコルがｉＰＳＣ細胞系全体にわたって容易に伝達され、凍結／解凍プロセスによりＦＯＸＮ１発現を一貫して上方制御できることを実証する。
実験３７で分化プロトコルを使用して新たなｉＰＳＣ系を試験した。実験ごとに、ｉＰＳＣ由来ＴＥＰにおけるＦＯＸＮ１発現を、分化の終了時の細胞凍結前に、及び細胞の３Ｄ凝集体への解凍５日後に、測定した。ｉＰＳＣ由来胸腺細胞の凍結前のＦＯＸＮ１発現と比較して、解凍された細胞においてＦＯＸＮ１発現の著しい増加が観察された。この実験は、分化プロトコルがｉＰＳＣ細胞系全体にわたって容易に伝達され、凍結／解凍プロセスによりＦＯＸＮ１発現を一貫して上方制御できることを実証する。
【0321】
実施例３１ ＴＥＰ集団から未分化多能性幹細胞の除去
最終的に未分化多能性細胞が残留する可能性があることは、ｉＰＳＣ由来細胞治療製品において解決すべき重要な安全性問題である。製品中のかかるｉＰＳＣは奇形腫を引き起こし得る。残留ｉＰＳＣを根絶するために、多能性幹細胞を選択的に標的とすると示されている小分子を利用した。サバイビン阻害物質ＹＭ１５５及び、ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ阻害物質ＰｌｕｒｉＳＩｎ－１を試験した。移植前にＹＭ１５５で処理したＴＥＰ集団は、ＹＭ１５５で処理しなかったＴＥＰを移植した動物と比較して、インビボで引き起こす奇形種がより小さかった。
最終的に未分化多能性細胞が残留する可能性があることは、ｉＰＳＣ由来細胞治療製品において解決すべき重要な安全性問題である。製品中のかかるｉＰＳＣは奇形腫を引き起こし得る。残留ｉＰＳＣを根絶するために、多能性幹細胞を選択的に標的とすると示されている小分子を利用した。サバイビン阻害物質ＹＭ１５５及び、ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ阻害物質ＰｌｕｒｉＳＩｎ－１を試験した。移植前にＹＭ１５５で処理したＴＥＰ集団は、ＹＭ１５５で処理しなかったＴＥＰを移植した動物と比較して、インビボで引き起こす奇形種がより小さかった。
【0322】
ＰｌｕｒｉＳＩｎ－１による処理（凝集体における凍結前の１つの２４時間パルス及び凍結後の１つの２４時間パルス）により、ＴＥＰ集団のＯｃｔ４及びＮａｎｏｇ発現は、１パルスのＰｌｕｒｉＳＩｎ－１で処理した集団と比較して、より低かった。しかし、ＰｌｕｒｉＳＩｎ－１の１用量のみでの治療は、別のｉＰＳＣ細胞系がＴＥＰの生成に用いられた場合に、Ｏｃｔ４及びＮａｎｏｇ発現を低下させるのに十分であった。
【0323】
実験２９Ｂからの凍結細胞を５日間にわたって凝集体に解凍し、２週間前にｈｕＣＤ３４＋細胞を移植したＮＳＧ ｄＫＯマウスの腎被膜下に移植する前にＹＭ１５５で２４時間処理した。動物を追跡し、３週間ごとに採血し、ヒト造血細胞（ＣＤ４５）、Ｂ細胞（ＣＤ１９）、骨髄細胞（ＣＤ１９）、Ｔ細胞（ＣＤ３／ＣＤ４及びＣＤ３／ＣＤ８）及び成熟Ｔ細胞受容体（ＴＣＲα及びβ）についてフローサイトメトリーによって末梢血単核球を分析した。全ての動物は、移植５週間後までにヒトＣＤ４５＋造血細胞によるＰＢＭＣの強力な再増殖を示した。ＣＤ３及びＣＤ４又はＣＤ８に二重染色を使用して、末梢血循環における単一陽性Ｔ細胞を測定した。胎仔胸腺を移植した２匹の動物のうちの１匹は、８～９週目の細胞によってＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞を発生した。ｉＰＳＣ由来ＴＥＰを移植した６匹の動物のうちの１匹は、９週目までにＴ細胞を発生し、ＣＤ４のレベルがＣＤ８より僅かに高かった。これらの実験におけるＴ細胞は、成熟α及びβ Ｔ細胞受容体も発現した。対照の偽移植動物は、１３週目でもＴ細胞の基本レベルが１％を下回っていることを示し続けている。
【0324】
同等物と範囲
当業者は、本明細書に記載された本開示による具体的な実施形態に対する多くの同等物を、通常の実験のみを使用して認識するか、又は確認することができる。本開示の範囲は、上記の説明に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲に記載されている通りである。
当業者は、本明細書に記載された本開示による具体的な実施形態に対する多くの同等物を、通常の実験のみを使用して認識するか、又は確認することができる。本開示の範囲は、上記の説明に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲に記載されている通りである。
【0325】
特許請求の範囲において、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」等の冠詞は、特に反対の記載がない限り、又は文脈から明らかでない限り、１つ又は１つ超を意味する場合がある。グループの１つ又は複数のメンバー間の「又は」を含む請求項又は説明は、特に反対の記載がない限り、又は文脈から明らかでない限り、グループメンバーの１つ、１つ超、又は全てが所与の産物又はプロセスに存在するか、用いられているか、又は関連する場合に満たされると考えられる。本開示は、正確にグループの１つのメンバーが所与の産物又はプロセスに存在するか、用いられるか、又は関連する実施形態を含む。本開示は、複数の、又はグループメンバー全体が、所与の産物又はプロセスに存在するか、用いられるか、又は関連する実施形態を含む。
【0326】
「含む」という用語は、オープンであることを意図しており、追加の要素又はステップを許容するが含める必要はないことにも留意されたい。従って、「含む」という用語が本明細書で使用される場合、「からなる」という用語も包含され、開示される。
【0327】
範囲が指定されている場合は、エンドポイントが含まれる。更に、別段の指示がない限り、又は文脈及び当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈が明らかにそうでないとする場合を除いて、本開示の異なる実施形態において記載された範囲内の任意の特定の値又は下位範囲を範囲の下限の単位の１０分の１まで想定することができることを理解されたい。
【0328】
更に、従来技術の範囲内にある本開示の任意の特定の実施形態は、請求項の任意の１つ又は複数から明示的に除外され得ることが理解される。そのような実施形態は、当業者に知られていると見なされるので、除外が本明細書に明示的に記載されていなくても、それらは除外され得る。本開示の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、任意の抗生物質、治療又は活性成分、任意の製造方法、任意の使用方法等）は、理由の如何を問わず、従来技術の存在に関連するか否かに関わらず、任意の１つ又は複数の請求項から除外することができる。
【0329】
使用されている用語は、限定ではなく説明の用語であり、添付の特許請求の範囲内で、より広い側面における本開示の真の範囲及び精神から逸脱することなく変更を加えることができることが理解される。
【0330】
本開示は、いくつかの記載された実施形態に関して、いくらか詳細に、またある程度詳細に説明されてきたが、本開示は、そのような詳細又は実施形態、又は特定の実施形態に限定されるべきではなく、先行技術を考慮してそのような特許請求の範囲の可能な限り広い解釈を提供し、それによって本開示の意図された範囲を効果的に包含するように、添付の特許請求の範囲に対して解釈されるべきである。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図10E】
【図11-1】
【図11-2】
【図11-3】
【図12A】
【図12B】
【図13】
【図14】
【図15】
【国際調査報告】