特表 2024-536533 悪液質の予防及び治療のための伝統的な漢方薬ベースの製剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-04

(54)【発明の名称】悪液質の予防及び治療のための伝統的な漢方薬ベースの製剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/65 20060101AFI20240927BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20240927BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20240927BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240927BHJP

【ＦＩ】

A61K36/65

A61P7/00

A61P21/00

A61P43/00 105

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024522602

(86)(22)【出願日】2022-10-14

(85)【翻訳文提出日】2024-05-10

(86)【国際出願番号】 CN2022125399

(87)【国際公開番号】W WO2023061488

(87)【国際公開日】2023-04-20

(31)【優先権主張番号】63/255,963

(32)【優先日】2021-10-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524141175

【氏名又は名称】ホン， ミン－チー

(74)【代理人】

【識別番号】100091683

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼川 俊雄

(74)【代理人】

【識別番号】100179316

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 寛奈

(72)【発明者】

【氏名】リン， シャン－ウェン

(72)【発明者】

【氏名】リン， チー－シュエ

(72)【発明者】

【氏名】ヤン， リャン－ヨウ

(72)【発明者】

【氏名】チャン， シ－シャン

(72)【発明者】

【氏名】チェン， チン－シ

【テーマコード（参考）】

4C088

【Ｆターム（参考）】

4C088AB58

4C088AC11

4C088BA06

4C088BA10

4C088CA03

4C088CA06

4C088CA08

4C088NA14

4C088ZA94

4C088ZB21

4C088ZC54

(57)【要約】

本発明は、がん患者において悪液質及び筋肉喪失の予防または治療に使用する可能性を有する伝統的な中国医薬品である牡丹皮（Ｍｏｕｔａｎ ｒａｄｉｃｉｓ ｃｏｒｔ；牡丹皮）を開示する。本組成物は、悪液質に対する新規治療剤である。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

がん誘導性悪液質を治療または予防する方法であって、がん誘導性悪液質を有する対象に有効量の組成物を投与することを含み、ここで、前記組成物が、牡丹皮または牡丹皮抽出物を含む、方法。

【請求項2】

前記牡丹皮抽出物が、前記牡丹皮を５０％～１００％メタノールまたは５０％～１００％エタノールに浸漬することによって調製される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記牡丹皮抽出物が、前記牡丹皮を７０％メタノールまたは７０％エタノールに浸漬することによって調製される、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

がん誘導性の骨格筋の重量の減少を治療または予防する方法であって、がん誘導性筋萎縮または筋肉の重量の減少を有する対象に、有効量の組成物を投与することを含み、ここで、前記組成物が、牡丹皮または牡丹皮抽出物を含む、方法。

【請求項5】

前記牡丹皮抽出物が、前記牡丹皮を５０％～１００％メタノールまたは５０％～１００％エタノールに浸漬することによって調製される、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記牡丹皮抽出物が、前記牡丹皮を７０％メタノールまたは７０％エタノールに浸漬することによって調製される、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記組成物が、Ｃｃｌ２１ａ、Ｃｃｌ１２、Ｌｅｐ、Ｋｅｒａ、Ｔｍｅｍ２３３、Ｃｈａｄ、Ｋｙ、Ｃｌｉｐ、Ｍｅｔｔｌ２１ｅ、Ｍｙｌｋ４、Ｋｃｎｇ４、Ｐｌｃｄ４、Ｖｗａ３ｂ、Ｐｌｉｎ１、Ｃａｓｑ１、Ｉｔｇｂ６、Ｔｎｍｄ、Ｓｙｐｌ２、Ｍｓｓ５１、Ｍｅｔｔｌ２１ｃ２７またはそれらの組み合わせを含む筋恒常性関連遺伝子を上方制御して、がん誘導性筋萎縮を軽減する、請求項４に記載の方法。

【請求項8】

前記組成物が、がん誘導性筋萎縮を軽減するために、Ａｌｄｈ８ａ１、Ｌｃｎ２、Ｍｔ２、Ｄｎａｓｅ１、Ｍｔ１、Ｓｌｃ３９ａ１４、Ｎｙｘ、Ｋｒｔ８０、Ｓｅｒｐｉｎａ３ｍ、Ｋｃｎｋ５、Ｃｘｃｌ１３、Ａｄａｍｔｓ２、Ａｍｐｄ３、Ｆａｈ、Ｄｏｃ２ｂ、Ａｃｏｘ２、Ｍｙｏ１ａ、Ｉｔｐｋｃ、Ａｃｓｓ１、Ｉｇｆｂｐ３、またはそれらの組み合わせを含む前記筋恒常性関連遺伝子を下方制御する、請求項４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１０月１５日に提出された米国仮特許出願第６３／２５５，９６３号の利益を主張し、これらはその全体が本明細書に参照により組み込まれる。

【0002】

本発明は、がん患者における腫瘍誘導性筋萎縮及び悪液質を予防または治療するために使用できる、伝統的な中国医学（ＴＣＭ）ベースの作用物質、牡丹皮（ＭＤＰ）（Ｍｏｕｔａｎ ｒａｄｉｃｉｓ ｃｏｒｔ；牡丹皮）を開示する。この作用物質は、企業内のＴＣＭライブラリからのｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ筋萎縮プラットフォームの両方を含む統合された多層戦略を通じて開発されている。

【背景技術】

【0003】

膵癌、胃癌、肺癌、及び結腸癌などの特定のがん種の治療における大きい課題は、がん誘導性の体重減少であり、これは、悪液質の観点から見て、食欲不振、ならびに脂肪組織及び骨格筋量の減少を特徴とする。がん悪液質の定義については明白な統一的見解がないため、以下の５つの特徴のうち少なくとも３つが存在する場合には、悪液質とみなした：筋力低下、疲労、食欲不振または食事摂取制限、低脂肪体重指数、生化学検査の異常（例えば、Ｃ反応性タンパク質の増加、貧血、または血清アルブミンの低下）、さらに浮腫のない５％の体重減少（または１２ヶ月でＢＭＩ＜２０．０ｋｇ／ｍ^２）。その結果、がん悪液質による体重減少は、栄養補給によって回復させ得ず、がん患者の罹患率、死亡率、及び生活の質に深刻な影響を有する。悪液質の多因子病態生理学の理解において、大きく進歩したが、この衰弱性疾患の予防及び／または治療は、医療ニーズとして、依然として満たされていない。

【0004】

現在、悪液質の治療に使用できる承認された標的療法は存在していない。半合成プロゲステロンステロイドであるメゲストロールは、悪液質関連症状を改善するために使用される。

【0005】

さらに、日本において、悪液質患者の疲労及び慢性的な衰弱を軽減するために、免疫系に作用して、炎症及び栄養状態を改善する複数の漢方医薬品（すなわち、多成分生薬抽出物）が一般的に処方されている。より近年では、空腹ホルモンであるグレリン及びグレリン模倣薬が、食欲及び生活の質を高める可能性を鑑みて、大きな注目を集めているが、悪液質の治療への使用を裏付ける臨床的証拠は不足している。

【0006】

悪液質の予防及び／または治療において、低分子標的剤に対するＴＣＭの利点は多岐にわたる。第一に、ＴＣＭの多薬理学（またはネットワーク薬理学）の治療上の有用性は、様々な慢性疾患及び複雑な疾患の治療における長年の歴史によって明らかになっている。第二に、多くのＴＣＭは、疾患の抑制及び予防のために日常的に栄養補助食品として消費されるであろう。第三に、東洋社会では、一般的に、ＴＣＭは、副作用が少ないと考えられており、筋萎縮を伴うがん患者のコンプライアンスが向上する可能性がある。

【発明の概要】

【0007】

上記の技術的状況に鑑み、本発明は、明確な臨床的利益を有する悪液質の治療及び／または予防のためのＴＣＭ組成物、その調製物、及びそれを調製するための方法を提供する。

【0008】

本発明は、がん患者における悪液質の予防または治療に使用できる可能性を有するＴＣＭ、牡丹皮（ＭＤＰ）を開示する。ＭＤＰ抽出物は、ＴＣＭを５０％～１００％のメタノールまたは５０％～１００％のエタノールに浸漬することによって調製される。

【0009】

本発明はまた、腫瘍関連性悪液質を有する対象に有効量の組成物を投与することを含む、がん誘導性悪液質を治療または予防する方法を提供し、ここで、組成物は、牡丹皮または牡丹皮抽出物を含む。ＭＤＰ抽出物は、ＴＣＭを５０％～１００％のメタノールまたは５０％～１００％のエタノールに浸漬することによって調製される。

【0010】

本発明はさらに、がん患者における骨格筋の萎縮を予防するまたは治療するための組成物を提供し、この組成物は、骨格筋における筋恒常性関連遺伝子発現の腫瘍誘導性再プログラミングを逆転させ、それによって骨格筋を消耗から救済する能力によるものであり得る。ＭＤＰ抽出物は、ＴＣＭを５０％～１００％のメタノールまたは５０％～１００％のエタノールに浸漬することによって調製される。

【0011】

本発明はまた、がん誘導性骨格筋量の減少を治療するまたは予防する方法を提供し、本方法は、腫瘍関連骨格筋萎縮を有する対象に有効量の組成物を投与することを含み、これは、骨格筋における筋恒常性関連遺伝子発現の腫瘍誘導性再プログラミングを逆転させ、それによって骨格筋の消耗から救済する能力によるものであり得、この組成物は、牡丹皮または牡丹皮抽出物を含む。抽出物牡丹皮（ＭＤＰ）は、ＴＣＭを５０％～１００％のメタノールまたは５０％～１００％のエタノールに浸漬することによって調製される。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】Ｃ２６ＣＭ誘導性のＣ２Ｃ１２筋管の萎縮に対する異なるＴＣＭの影響を示す。

【図2】２４のＴＣＭ抽出物がＣ２６ＣＭ誘導性のＣ２Ｃ１２筋管の萎縮に対して保護効果がないことを示している。

【図3】Ｃ．エレガンスにおける加齢関連の運動性及び／または全身の収縮に対するＭＤＰ対ＤＲの時間依存的効果を示す。

【図4】経口強制給餌による３つの用量のＭＤＰ（ＭＤＰ－Ｌ、ＭＤＰ－Ｈ、及びＭＤＰ－Ｈ）とビヒクルの、体重（ＡとＢ）及び腫瘍体積（Ｃ）の影響、Ｃ－２６腫瘍担持マウスの後肢筋の保護（Ｄ）の影響、及びＣ－２６腫瘍担持マウスの警戒心及び活動的な表現型（Ｄ）への影響を示す。

【図5】経口強制給餌による１００ｍｇ／ｋｇのＤＲ及びビヒクルの体重（腫瘍なし）に対する影響を示す。

【図6】経口強制給餌によるＭＤＰ１０００ｍｇ／ｋｇ（ＭＤＰ－Ｈ）とビヒクルの投与が、Ｃ－２６腫瘍担持マウスの体重（Ａ及びＢ）、腫瘍体積（Ｃ）、悪液質に関連する骨格筋重量の減少を軽減する能力（Ｄ）、繊維サイズ分布がより小さい断面積にシフトするのを救済する能力（Ｅ）、及び１７日目の前肢の握力の回復（Ｆ）に及ぼす影響を示す重複実験を示す。

【図7】Ｖｅｈにより処置したＣ２６－腫瘍担持マウス及びＭＤＰ－Ｈにより処置したＣ２６腫瘍担持マウスにおける血清ＩＬ－６に対するＭＤＰの影響と、Ｃ２６細胞に対する細胞生存率を示す。

【図8】ショットガン・シークエンシングのバイオインフォマティクス解析を示す。

【図9】ＭＤＰが骨格筋関連遺伝子及びタンパク質の発現に及ぼす影響を示す。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本明細書で使用される場合、「ａ（不定冠詞）」、「ａｎ（不定冠詞）」、「ｔｈｅ（定冠詞）」、「少なくとも１つの」、及び「１つ以上」は、互換的に使用される。

【0014】

一実施形態では、ＤＲ及びＭＤＰは、Ｃ２Ｃ１２筋管の炎症性サイトカイン誘導性萎縮の影響を抑制する能力を示した。

【0015】

一実施形態では、ＭＤＰは、Ｃ．エレガンスの加齢関連の運動能力の低下を改善する。

【0016】

一実施形態では、ＭＤＰは、Ｃ２６腫瘍担持マウスにおける腫瘍誘導性の筋肉の消耗を予防する。

【0017】

一実施形態では、ＭＤＰは、大腿四頭筋及び前脛骨筋などの後肢の筋肉をがん誘導性消耗から保護するのに有効である。

【0018】

一実施形態では、ＭＤＰは、マウスをＣ－２６腫瘍誘導性の体重減少から保護する際のｉｎ ｖｉｖｏ効力を示す。

【0019】

別の実施形態では、ＭＤＰは、悪液質関連の骨格筋重量の減少を軽減する。

【0020】

一実施形態では、ＭＤＰは、悪液質筋肉における繊維サイズ分布がより小さい断面積にシフトするのを救済することができる（Ｐ＜０．０５）。

【0021】

一実施形態では、ＭＤＰは、血清中のＩＬ－６レベルを低下させる。

【0022】

一実施形態では、ＭＤＰは、骨格筋における筋恒常性関連遺伝子発現の腫瘍誘導性再プログラミングを逆転させることによって、抗悪液質効果を発揮する。

【0023】

本発明はまた、がん誘導性悪液質を治療または予防する方法を提供し、本方法は、がん誘導性悪液質を有する対象に有効量の組成物を投与することを含み、ここで、組成物は、牡丹皮または牡丹皮抽出物を含む。

【0024】

本発明はまた、がん誘導性の骨格筋の重量の減少を治療または予防する方法を提供し、本方法は、がん誘導性筋萎縮を有する対象に有効量の組成物を投与することを含み、ここで、組成物は、牡丹皮または牡丹皮抽出物を含む。

【0025】

一実施形態では、牡丹皮抽出物は、牡丹皮を５０％～１００％メタノールまたは５０％～１００％エタノールに浸漬することによって調製される。

【0026】

好ましい実施形態では、牡丹皮抽出物は、牡丹皮を７０％メタノールまたは７０％エタノールに浸漬することによって調製される。

【0027】

実施例
以下の実施例は、非限定的であり、本発明の様々な態様及び特徴を単に代表するものである。

【実施例1】

【0028】

実施例１Ｃ２６ＣＭ誘導性筋管萎縮モデル
実験設計は、図１Ａに示しており、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を２％ウマ血清含有分化培地（ＤＭ）に４日間曝露して、筋管への分化を容易にし、その後、Ｃ２６ＣＭで４日間処置する。この８日間の処置の終了時に、Ｃ２６ＣＭで処置したＣ２Ｃ１２筋管の直径と対照細胞（ＤＭのみを投与）の直径を、光学顕微鏡下で分析し、その差をＣ２６ＣＭ誘導性萎縮の読み取り値として定量化した。筋肉の消耗の発生を遅延させるためのＴＣＭの使用を繰り返すために、個々のＴＣＭ及びＤＭＳＯを、実験の過程全体において、最初から培養培地に添加し、毎日交換し（別の対照としてＨ３～１４）、それぞれを４回繰り返した。示すとおり、Ｃ２６ＣＭは、Ｃ２Ｃ１２筋管に顕著な狭窄を引き起こした（図１Ｂ及び図１Ｃ）。

【0029】

図１に示すとおり、異なるＴＣＭがＣ２６ＣＭ誘導性のＣ２Ｃ１２筋管の萎縮に及ぼす影響を示した。実験設計の概略図を図１Ａに示す。図１Ｂは、その画像である。図１Ｃは、代表的な実験におけるＣ２６ＣＭ誘導性のＣ２Ｃ１２筋管の萎縮に対するヤマノイモ根茎（ＤＲ）、ＭＤＰ、及び他の代表的な３つのＴＣＭの保護効果に関する図１Ｂの画像の２つの定量分析である。バーは、平均±ＳＤ（２つの独立した実験Ｅｘｐｔ＃１及びＥｘｐｔ＃２のデータ）。

【0030】

異なるＴＣＭの抽出物（それぞれ２５及び／または５０μｇ／ｍｌ）の抗萎縮活性を評価した。これらの抽出物としては、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｅ ｒｈｉｚｏｍｅ（ＤＲ；山藥）、ＭＤＰ、Ｓａｍｂｕｃｉ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｒａｄｉｘ ｅｔ ｃａｕｌｉｓ（ＳＣＲＣ；ソクズ）、Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｔａｃｈｙｄｉｓ ｒａｄｉｘ ｅｔ ｒｈｉｚｏｍｅ（ＨＲＲ；倒地蜈蚣）、Ｃｏｎｄｏｎｏｐｓｉｓ ｒａｄｉｘ（ＣＲ；黨參）、Ｐｏｌｙｇｏｎａｔｉ ｏｄｏｒａｔｉ ｒｈｉｚｏｍｅ（玉竹）、Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｅ ｒａｄｉｘ ｅｔ ｒｈｉｚｏｍｅ（甘草）、Ｌｉｌｉｉ ｂｕｌｂｕｓ（百合）、Ｃｉｔｒｉ ｓａｒｃｏｄａｃｔｙｌｉｓ ｆｒｕｃｔｕｓ（佛手）、Ｅｕｒｙａｌｅｓ ｓｅｍｅｎ（ケンジツ）、Ｈｏｒｄｅｉ ｆｒｕｃｔｕｓ ｇｅｒｍｉｎａｔｅｓ（麥芽）、Ｓｉｒａｉｔｉａｅ ｆｒｕｃｔｕｓ（羅漢果）、Ｐｒｕｎｉ ｓｅｍｅｎ（郁李仁）、Ｌｙｃｉｉ ｆｒｕｃｔｕｓ（枸杞子）、Ｐｏｒｉａ（茯苓）、Ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎｉｓ ｒａｄｉｘ（桔梗）、Ｂｏｍｂｙｃｉｓ ｃｈｒｙｓａｌｌｉｄｅｍ（蠶蛹）、Ａｌｐｉｎｉａｅ ｏｘｙｐｈｙｌｌａｅ Ｆｒｕｃｔｕｓ（益智仁）、Ｎｅｌｕｍｂｉｎｉｓ ｓｅｍｅｎ（蓮子）、Ｐｏｌｙｇｏｎａｔｉ ｒｈｉｚｏｍｅ（黄精）、Ｓｅｓａｍｉ ｎｉｇｒｕｍ ｓｅｍｅｎ（黒芝麻）、Ｚｉｚｉｐｈｉ ｓｐｉｎｏｓａｅ ｓｅｍｅｎ（酸棗仁）、Ｃｏｉｃｉｓ ｓｅｍｅｎ（ヨクイニン）、Ｒｕｂｉ ｆｒｕｃｔｕｓ（覆盆子）、Ｇｉｎｓｅｎｇ ｒａｄｉｘ ｅｔ ｒｈｉｚｏｍｅ（人參）、Ａｍｙｎｔｈａｓ ｅｔ ｍｅｔａｐｈｉｒｅ（地龍）、Ａｒｃｔｉｉ ｒａｄｉｘ（牛蒡根）、Ｐｏｒｔｕｌａｃａｅ ｈｅｒｂａ（スベリヒユ）、及びＴｒｉｏｎｙｃｉｓ ｃａｒａｐａｘ（べっ甲）が挙げられる。これらのＴＣＭ抽出物のうち、広く使用されている２つのＴＣＭ、ＤＲ及びＭＤＰは、Ｃ２Ｃ１２筋管をＣ２６ＣＭ誘導性の萎縮から完全に保護するＨ３－１４の能力を共有していることを見出した（筋管萎縮プラットフォームにおけるＣ２６ＣＭ対照と比較して、すべてのＰ＝０．０００２、図１Ｃ）。しかし、他のものは、細胞傷害性であったか、または保護をもたらさなかった。それらの代表的なデータを図１Ｃに示す。

【0031】

他のＴＣＭのデータは、図２に示した。バーは、平均±ＳＤ（Ｎ＝４）。＃１は、ギョクチク（Ｐｏｌｙｇｏｎａｔｉ ｏｄｏｒａｔｉ ｒｈｉｚｏｍａ）であった；＃２は、カンゾウ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｅ ｒａｄｉｘ ｅｔ ｒｈｉｚｏｍｅ）であった；＃３は、ビャクゴウ（Ｌｉｌｉｉ ｂｕｌｂｕｓ）であった；＃４は、Ｃｉｔｒｉ ｓａｒｃｏｄａｃｔｙｌｉｓ ｆｒｕｃｔｕｓであった；＃５は、ケンジツ（Ｅｕｒｙａｌｅｓ ｓｅｍｅｎ）であった；＃６はＨｏｒｄｅｉ ｆｒｕｃｔｕｓの発芽であった；＃７は、ラカンカ（Ｓｉｒａｉｔｉａｅ ｆｒｕｃｔｕｓ）であった；＃８は、Ｐｒｕｎｉ ｓｅｍｅｎであった；＃９は、クコシ（Ｌｙｃｉｉ ｆｒｕｃｔｕｓ）であった；＃１０は、ブクリョウ（Ｐｏｒｉａ）であった；＃１１は、キキョウ（Ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎｉｓ ｒａｄｉｘ）であった；＃１２は、Ｂｏｍｂｙｃｉｓ ｃｈｒｙｓａｌｌｉｄｅｍであった；＃１３は、ヤクチ（Ａｌｐｉｎｉａｅ ｏｘｙｐｈｙｌｌａｅ ｆｒｕｃｔｕｓ）であった；＃１４は、レンニク（Ｎｅｌｕｍｂｉｎｉｓ ｓｅｍｅｎ）であった；＃１５は、オウセイ（Ｐｏｌｙｇｏｎａｔｉ ｒｈｉｚｏｍａ）であった；＃１６は、クロゴマ（Ｓｅｓａｍｉ ｎｉｇｒｕｍ ｓｅｍｅｎ）であった；＃１７は、サンソウニン（Ｚｉｚｉｐｈｉ ｓｐｉｎｏｓａｅ ｓｅｍｅｎ）であった；＃１８は、ヨクイニン（Ｃｏｉｃｉｓ ｓｅｍｅｎ）であった；＃１９は、フクボンシ（Ｒｕｂｉ ｆｒｕｃｔｕｓ）であった；＃２０は、コウジン（Ｇｉｎｓｅｎｇ ｒａｄｉｘ ｅｔ ｒｈｉｚｏｍａ）であった；＃２１は、Ａｍｙｎｔｈａｓ ｅｔ ｍｅｔａｐｈｉｒｅであって；＃２２は、Ａｒｃｔｉｉ ｒａｄｉｘであった；＃２３は、スベリヒユ（Ｐｏｒｔｕｌａｃａｅ ｈｅｒｂａ）であった；＃２４は、ベッコウ（Ｔｒｉｏｎｙｃｉｓ ｃａｒａｐａｘ）であった。

【実施例2】

【0032】

実施例２：Ｃ．エレガンスのＤＲ及びＭＤＰの運動性試験
この線虫Ｃ．エレガンスの表現型アッセイでは、ＭＤＰ及びＤＲを１％ＤＭＳＯ含有水に１０ｍｇ／ｍｌのストック溶液として溶解し、ビヒクル対照に対する個々の溶液１００μｌを、ＯＰ５０菌叢を含む線虫成長培地（ＮＧＭ）寒天プレート（寒天の総容量、１０ｍｌ）に均一に塗布した。溶液が寒天に完全に吸収された後、これらのＯＰ５０プレートを４０分間ＵＶ照射し、その後ＣＦ５１２ワームの同期卵約５０個を播種した。これらのプレートを２５℃でインキュベートし、成虫後１日目から７日目まで１日おきに虫の運動性を測定した。データ、平均±ＳＥＭ。（ｎ＝１７０～４２０）。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．０００１（ｔ検定）。異なる年齢の線虫（１日目、５日目、９日目、１３日目の成虫）を、最初に薬物を含まない溶液でインキュベートし、次にレバミゾールを含む溶液で１０分間インキュベートした。デジタル画像システムを使用して、ＩｍａｇｅＪを用いて線虫の身体の長さを定量化した。データ、平均±ＳＥＭ。（ｎ＞５０）。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．０００１（ｔ検定）。

【0033】

図３Ａに示すとおり、Ｃ．エレガンスにおける加齢関連運動性及び／または全身収縮に対するヤマノイモの根（ＤＲ）の時間依存的効果は、対照（ビヒクル）と比較して差がない。

【0034】

図３Ｂに示すとおり、ＭＤＰは、対照群と比較して、Ｃ．エレガンスの運動性の加齢関連低下を改善することができる。

【0035】

図３Ｃに示すとおり、ＭＤＰの時間依存的効果は、別の実験において、より長い平均余命を伴う運動性（１日目、３日目、５日目、７日目、９日目の身体の曲げ／秒）の並行した保護効果を示した。

【0036】

図３Ｄに示すとおり、ＭＤＰは、筋肉機能における全身収縮（％）の加齢関連低下を顕著に遅延させた（１日目、５日目、９日目、及び１３日目の相対的全身収縮）。

【0037】

まとめると、ＭＤＰは、対照群と比較して、加齢関連の線虫の運動性の低下を改善する独自の能力を呈したが、ＤＲは、その能力は呈さなかった。

【実施例3】

【0038】

実施例３：がん悪液質のＣ２６モデルにおけるＭＤＰの有効性
Ｃ－２６モデルは、腫瘍による過剰なＩＬ－６分泌に関連することが報告されているＣ－２６腫瘍誘導性の体重減少からＣＤ２Ｆ１マウスを保護する能力について、ＭＤＰ及びＤＲのｉｎ ｖｉｖｏでの抗筋肉消耗の有効性を確認するためのものである。

【0039】

最初の一連の実験では、３つの異なる用量（低用量：ＭＤＰ－Ｌ、１００ｍｇ／ｋｇ、中用量：ＭＤＰ－Ｍ、５００ｍｇ／ｋｇ、高用量：ＭＤＰ－Ｈ（１，０００ｍｇ／ｋｇ）を、Ｃ－２６腫瘍細胞を移植する７日前からＣＤ２Ｆ１マウスに１日１回経口強制投与し、１７日目にマウスを屠殺するまで評価した。個々のマウスの体重、腫瘍サイズ、ならびに食物及び水の摂取量は、１日おきに測定した。屠殺時に、後肢の骨格筋を解剖し、重量を測定後に、さらなる分析のために－８０℃で保存した。最初の実験セットを図４に示す。

【0040】

図４は、経口強制投与による３つの用量のＭＤＰ（ＭＤＰ－Ｌ、ＭＤＰ－Ｈ、及びＭＤＰ－Ｈ）、ビヒクル、及び対照（Ｈ３－１４）が、Ｃ－２６腫瘍担持マウスの体重（図４Ａ及び図４Ｂ）及び腫瘍体積（図４Ｃ）に及ぼす影響を示す。ＮＣ、腫瘍のないマウス。腫瘍重量は、１，０００ｍｍ^３が体重１グラムに相当するという仮定に基づいて推定した。グラフの過密を避けるため、Ｓ．Ｄ．バーを示さない。統計解析では、個々の対象に対してランダム切片を使用し、治療と治療日に対して固定効果を有する一般化線形混合効果モデルを使用して、多重比較に対するＴｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ補正を使用して、群間差を検定した。（ａ）対照群との有意差はｐ＜０．０５。（ｂ）ビヒクル群との有意差はｐ＜０．０５。図４Ｄには、Ｃ－２６腫瘍担持マウスの後肢の骨格筋の３つの異なる部分に経口強制投与した３つの用量のＭＤＰ、ビヒクル、及びＨ３－１４の影響を示す。ＮＣ、腫瘍のないマウス。（ａ）及び（ｂ）は、それぞれＮＣ群及びビヒクル群との有意差を示す（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ調整を用いたＤｕｎｎの多重比較検定、ｐ＜０．０５）。図４Ｅは、試験終了時点でのこれら５つの群から１匹の代表的なマウスの写真を示しており、腫瘍負荷が大きいにもかかわらず、覚醒、正常な姿勢、滑らかな毛並み、及び体調の改善によって示されるように、腫瘍担持マウスにおけるＭＤＰ－Ｈ及びＭＤＰ－Ｍの治療効果を示す。

【0041】

図４Ａに示すとおり、ＭＤＰ－Ｈは、Ｃ－２６腫瘍担持マウスの体重減少を改善するのに有効であった。

【0042】

図４Ｂに示すとおり、ＭＤＰ－Ｈは、Ｃ－２６腫瘍担持マウスの体重減少（腫瘍なし）を改善するのに有効であった。

【0043】

図４Ｃに示すとおり、ＭＤＰ－Ｈは、腫瘍成長に対して、非常に小さい腫瘍抑制効果を示した。

【0044】

図４Ｄに示すとおり、ＭＤＰ－Ｍは、Ｃ－２６腫瘍担持マウスの後肢筋を保護するのに有効であった。

【0045】

図４Ｅに示すとおり、ＭＤＰ－Ｍ及びＭＤＰ－Ｈで処置したＣ－２６腫瘍担持マウスは、警戒心及び活動的な表現型を呈した。

【0046】

第２の実験セットでは、経口強制投与による１００ｍｇ／ｋｇのＤＲ及びビヒクルのｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を評価し、その結果を図５に示した。

【0047】

図５は、経口強制投与による１００ｍｇ／ｋｇのＤＲ及びビヒクルが、Ｃ－２６腫瘍担持マウスの体重（腫瘍なし）（図５Ａ）及び腫瘍体積（図５Ｃ）に及ぼす影響を示す（＊Ｐ＜０．０５；ｎ＝３～６）。対照、腫瘍のないマウス。（図５Ｂ）ＤＲの治療効果がないことを示した、試験終了時の各群の代表的なマウスの写真である。（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ対照群とビヒクル群との有意差を示す（多重比較のためのＴｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ補正による一般化線形混合効果モデル）。

【0048】

図５Ａに示すとおり、１００ｍｇ／ｋｇのＤＲは、体重減少を悪化させた。

【0049】

図５Ｂに示すとおり、１００ｍｇ／ｋｇのＤＲは、ビヒクル対照と比較して、物理的外観の悪化を引き起こした。

【0050】

図５Ｃに示すとおり、１００ｍｇ／ｋｇのＤＲは、腫瘍の成長に影響を有しなかった。

【0051】

図６は、経口強制投与による１０００ｍｇ／ｋｇのＭＤＰ（ＭＤＰ－Ｈ）とビヒクルとの比較による、Ｃ－２６腫瘍担持マウスの体重（図６Ａ及び図６Ｂ）、腫瘍体積（図６Ｃ）に対する影響を示す重複実験を示す。ＮＣ、腫瘍のないマウス。腫瘍重量は、１，０００ｍｍ^３が体重１グラムに相当するという仮定に基づいて推定した。グラフの過密を避けるため、Ｓ．Ｄ．バーを示さない。統計分析では、個々の対象に対してランダム切片を使用し、処置と処置日に対して固定効果を有する一般化線形混合効果モデルを使用して、多重比較に対するＴｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ補正を使用して、群間差を検定した。ｐ＜０．０５での対照群との有意差。（ｂ）ｐ＜０．０５でのビヒクル群との有意差。図６Ｄは、－２６腫瘍担持マウスの後肢の骨格筋の３つの異なる部分に対するＭＤＰ－Ｈ及びビヒクルの影響を示す。対照群、腫瘍のないマウス。（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ対照群及びビヒクル群との有意差を示す（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ調整を用いたＤｕｎｎの多重比較検定、ｐ＜０．０５）。図６Ｅは、Ｃ－２６腫瘍担持マウスの筋線維サイズに対するＭＤＰ－Ｈの影響を示す。腓腹筋の筋線維の断面積を頻度ヒストグラムとして表した。処置群ごとに５匹のそれぞれのマウスから採取した腓腹筋の５つの切片を、方法セクションで説明したように分析した。ログランク検定の多重比較を用いたところ、腫瘍担持マウス／ビヒクルマウスと腫瘍担持マウス／ＭＤＰマウスとの筋肉の比較では、統計的有意性（Ｐ＜０．００１）が示された。データは、平均＋／－ＳＥＭとして表す。図６Ｆは、ＭＤＰが握力に及ぼす影響を示す。

【0052】

図６Ａに示すとおり、ＭＤＰ－Ｈは、１７日目の腫瘍負荷において、Ｃ－２６腫瘍誘導性の体重減少からマウスを保護することを示した。

【0053】

図６Ｂに示すとおり、ＭＤＰ－Ｈは、１７日目の腫瘍負荷において、Ｃ－２６腫瘍誘導性の体重減少（腫瘍なし）からマウスを保護することを示した。

【0054】

図６Ｃに示すとおり、ＭＤＰ－Ｈは、１７日目に腫瘍負荷に対して顕著な抑制効果を示さなかった。

【0055】

図６Ｄに示すとおり、ＭＤＰ－Ｈは、悪液質に関連する骨格筋重量の減少を軽減する能力を示した。

【0056】

図６Ｅに示すとおり、ＭＤＰ－Ｈは、ＧＣ筋線維の抗ジストロフィンによる免疫染色及びその後の筋線維直径の定量化により、悪液質筋における線維サイズ分布のより小さな断面積へのシフトから救済することができた（Ｐ＜０．０００１）。

【0057】

図６Ｆに示すとおり、ＭＤＰ－Ｈは、１７日目に前肢の握力を回復させることができた（Ｐ＜０．００１）。

【0058】

図７は、Ｖｅｈ処置群とＭＤＰ－Ｈ処置群のＣ２６腫瘍担持マウスにおける血清ＩＬ－６に対するＭＤＰの影響を示す。統計解析には、ウィルコクソン順位和検定を使用した（ｎ＝５）。図７Ｂには、２５μｇ／ｍＬ及び５０μｇ／ｍＬのＭＤＰが、Ｃ２６細胞培養培地におけるＩＬ－６の産生に及ぼす影響を示し、図７Ｃには、Ｃ２６細胞の生存率を示す。バー、平均±Ｓ．Ｄ．（（Ｂ）と（Ｃ）の３つの独立した実験から得られたデータの場合、＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１。

【0059】

図７Ａに示すとおり、ＭＤＰ－Ｈにより処置したＣ－２６腫瘍担持マウスの平均血清ＩＬ－６（Ｃ－２６腫瘍モデルにおける悪液質の主な原因）レベルは、ビヒクル対照群と比較して低かったが、統計的に有意な差はなかった（Ｐ＝０．０６）。

【0060】

図７Ｂに示すとおり、血清中のＩＬ－６レベルの低下は、２５μｇ／ｍＬ及び５０μｇ／ｍＬのＭＤＰが、Ｃ２６細胞による培養培地へのＩＬ－６の分泌を抑制する独特の能力と関連していた（Ｐ＜０．００１）。

【0061】

図７Ｃに示すとおり、２５μｇ／ｍＬ及び５０μｇ／ｍＬのＭＤＰは、Ｃ２６細胞に対して細胞傷害性でなかった。

【実施例4】

【0062】

実施例４：全トランスクリプトームショットガンシーケンス（ＲＮＡ－ｓｅｑ）解析
全トランスクリプトームショットガンシーケンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）解析は、商業ベンダー（Ｗｅｌｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｔａｉｗａｎ）によって実施された。その後、これらのＲＮＡ－ｓｅｑデータの主成分分析（ＰＣＡ）を行い、これらの群間のトランスクリプトームの変化を調べた。この発現プロファイルのクラスタリングは、ＭＤＰが悪液質骨格筋（Ｔ／Ｖｅｈ）の遺伝子発現プロファイルを非悪液質筋肉（ＴＦ／Ｖｅｈ）のプロファイルと同様の状態にシフトできたことを示唆している。さらに、ＲＮＡ－ｓｅｑデータのペア比較により、個々の群間の遺伝子発現プロファイルの相違を分析した。京都遺伝子ゲノム百科事典（ＫＥＧＧ）ｐａｔｈｗａｙ及びＧｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅナレッジベースは、関連する生物学的シグナル伝達経路について記載している。

【0063】

図８Ａに示すとおり、３つの試験群のＲＮＡ－ｓｅｑデータの２次元投影図。主成分分析軸（Ｄｉｍ１、ｘ軸、Ｄｉｍ２、ｙ軸）は、ＲＮＡ－ｓｅｑデータの全体的な変化を強調して示している。図８Ｂに示すとおり、各黒い点は、変換された遺伝子発現値を表す。Ｔ／Ｖｅｈ対ＴＦ／Ｖｅｈ及びＴ／Ｖｅｈ対Ｔ／ＭＤＰの２つのペア比較のそれぞれにおける、差次的に発現した遺伝子のベン図。

【0064】

図８Ａに示すとおり、主成分分析（ＰＣＡ）プロットは、Ｔ／ＭＤＰ群における変化の２次元投影が、Ｔ／Ｖｅｈ群よりもＴＦ／Ｖｅｈ群の変化により近いことを示している。

【0065】

図８Ｂに示すとおり、ベン図解析では、同じ方向に発現が変化した２つのペア比較（中央部分）によって共有されている、差次的に発現している遺伝子が合計１８４９個あることが明らかになった。

【0066】

上記のバイオインフォマティクス解析では、ＭＤＰが、悪液質骨格筋における筋恒常性に関連する遺伝子の発現を再プログラムする能力があることが実証され、これは、以下の表１－３及び表４－６の最も上方制御された遺伝子と下方制御された遺伝子の上位２０位に反映されている。

【0067】

【表1】

【0068】

【表2】

【0069】

【表3】

【0070】

【表4】

【0071】

【表5】

【0072】

【表6】

【0073】

図９に示すとおり、ＭＤＰが骨格筋関連遺伝子及びタンパク質発現に及ぼす影響。図９Ａに示すとおり、ｑＰＣＲ解析により、ビヒクルにより処置したマウスとＭＤＰ－Ｈにより処置したマウス（各群ｎ＝３）の骨格筋において、５つの上方制御遺伝子（左）及び５つの下方制御遺伝子（右）が示された。上方制御された遺伝子及び下方制御された遺伝子の増加倍数及び発現率は、それぞれＭＤＰ－Ｈにより処置されたマウスの選択された骨格筋関連遺伝子の、ビヒクル対応物に対する相対的発現レベルとして示した。バー、平均＋Ｓ．Ｄ（ｎ＝３）。図９Ｂに示すとおり、ビヒクル及びＭＤＰ－Ｈにより処置したＣ２６腫瘍担持マウス（それぞれＴ／Ｖｅｈ及びＴ／ＭＤＰ－Ｈ）の骨格筋におけるＭｕＲＦ１及びＡｔｒｏｇｉｎ－１のタンパク質発現レベルのウェスタンブロット解析を、ビヒクルで処置した腫瘍のないマウス（ＴＦ／Ｖｅｈ）と比較して、それぞれ示す。定量的ＲＴ－ＰＣＲのフォワードプライマー及びリバースプライマーを次表７に示す。

【0074】

【表7】

【0075】

図９Ａに示すとおり、ｑＰＣＲ解析による上方制御遺伝子及び下方制御遺伝子の発現レベルの変化は、ＲＮＡ－ｓｅｑ解析による変化と一致した。

【0076】

図９Ｂに示すとおり、ＭＤＰ－Ｈは、ウェスタンブロッティング分析により、Ｃ２６腫瘍担持マウスにおけるＡｔｒｏｇｉｎ－１及びＭｕＲＦ１のタンパク質発現を対照群で観察された基底レベルまで抑制するのに有効であった。

【0077】

本発明は、当業者がそれを作製し、使用するために十分詳細に説明し、例示してきたが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な代替、変更、及び改良が明らかであるものとする。

【0078】

当業者であれば、本発明が、目的を実行し、言及された目的及び利点、ならびに本発明に固有のものを得るために十分に適合されていることを容易に理解する。それらを生産するためのプロセス及び方法は、好ましい実施形態の代表的なものであり、例示であり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。その中の修正及び他の使用が、当業者において生じるであろう。これらの修正は、本発明の趣旨に包含され、特許請求の範囲によって定義される。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【配列表】

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【国際調査報告】