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特表2024-536600ブタＡ型インフルエンザウイルス感染に対して子ブタを防御するためのワクチン
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-04
(54)【発明の名称】ブタＡ型インフルエンザウイルス感染に対して子ブタを防御するためのワクチン
(51)【国際特許分類】
A61K 39/145 20060101AFI20240927BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20240927BHJP
C12N 15/44 20060101ALI20240927BHJP
C07K 14/11 20060101ALI20240927BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20240927BHJP
A61P 31/16 20060101ALI20240927BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240927BHJP
A61K 9/107 20060101ALI20240927BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240927BHJP
A61K 35/74 20150101ALI20240927BHJP
【ＦＩ】
A61K39/145
C12N15/867 Z
C12N15/44
C07K14/11
A61K39/39
A61P31/16
A61K35/76
A61K9/107
A61K48/00
A61K35/74 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024524385
(86)(22)【出願日】2022-10-24
(85)【翻訳文提出日】2024-06-18
(86)【国際出願番号】 EP2022079532
(87)【国際公開番号】W WO2023072805
(87)【国際公開日】2023-05-04
(31)【優先権主張番号】21204364.0
(32)【優先日】2021-10-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】510000976
【氏名又は名称】インターベット インターナショナル ベー． フェー．
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100216839
【弁理士】
【氏名又は名称】大石 敏幸
(74)【代理人】
【識別番号】100228980
【弁理士】
【氏名又は名称】副島 由加里
(74)【代理人】
【識別番号】100151448
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 孝博
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】ナガラジ，バサヴ・ハンガラプラ
(72)【発明者】
【氏名】モグラ－，マーク・エー
(72)【発明者】
【氏名】セーゲルス，ルード・フィリップ・アントゥーン・マリア
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA17
4C076BB15
4C076CC07
4C076CC35
4C076FF70
4C084AA13
4C084MA02
4C084MA55
4C084NA06
4C084ZB33
4C084ZC75
4C085AA03
4C085AA38
4C085BA55
4C085EE01
4C085EE06
4C085FF11
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BC83
4C087CA08
4C087CA12
4C087MA55
4C087NA14
4C087ZB09
4C087ZB33
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA01
4H045DA86
4H045EA31
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、ブタインフルエンザウイルスによる病原性感染に対する子ブタの受動免疫化のための、ＩＡＶ－Ｓの抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子（αＲＰ）ベクターに基づくワクチンの使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
免疫原と薬学的に許容される担体とを含むワクチンであって、該ワクチンが、該ワクチンで能動的に免疫化された雌ブタからの初乳または乳の摂取を介した子ブタの受動免疫化によってブタＡ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ－Ｓ）による病原性感染に対して子ブタを防御する方法における使用のためのワクチンであり、ここで、該免疫原が、ＩＡＶ－Ｓの抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子（αＲＰ）ベクターである、前記ワクチン。
【請求項2】
雌ブタが経産雌ブタまたは未経産雌ブタである、請求項１記載の使用のためのワクチン。
【請求項3】
抗原がＩＡＶ－Ｓ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質である、請求項１または２記載の使用のためのワクチン。
【請求項4】
αＲＰベクターが２以上の別個のＩＡＶ－Ｓ抗原をコードする、前記請求項のいずれか１項記載の使用のためのワクチン。
【請求項5】
ワクチンが、別個のＩＡＶ－Ｓ抗原をコードする２以上の別個のαＲＰベクターを含む、前記請求項のいずれか１項記載の使用のためのワクチン。
【請求項6】
抗原が、Ｓｃｏｔ／９４ Ｈ１Ｎ２、ＥｕｒＡｓｉａｎＡｖｉａｎ Ｈ１Ｎ１、Ｇｅｎｔ１９８４ Ｈ３Ｎ２およびパンデミック（ｐａｎｄｅｍｉｃ）２００９ Ｈ１Ｎ１からなる群から選択される系統に属するＩＡＶ－Ｓ株のものである、前記請求項のいずれか１項記載の使用のためのワクチン。
【請求項7】
ワクチンが、Ｓｃｏｔ／９４ Ｈ１Ｎ２、ＥｕｒＡｓｉａｎＡｖｉａｎ Ｈ１Ｎ１、Ｇｅｎｔ１９８４ Ｈ３Ｎ２およびパンデミック２００９ Ｈ１Ｎ１から選択される２つの系統のＩＡＶ－Ｓ株のＨＡ抗原をコードする第１のαＲＰベクターと、その群の他の２つの系統のＩＡＶ－Ｓ株のＨＡ抗原をコードする第２のαＲＰベクターとを含む、請求項６記載の使用のためのワクチン。
【請求項8】
ワクチンが、系統Ｓｃｏｔ／９４ Ｈ１Ｎ２およびＥｕｒＡｓｉａｎＡｖｉａｎ Ｈ１Ｎ１のＩＡＶ－Ｓ株のＨＡ抗原をコードする第１のαＲＰベクターと、系統Ｇｅｎｔ１９８４ Ｈ３Ｎ２およびパンデミック２００９ Ｈ１Ｎ１のＩＡＶ－Ｓ株のＨＡ抗原をコードする第２のαＲＰベクターとを含む、請求項７記載の使用のためのワクチン。
【請求項9】
薬学的に許容される担体が油と水とのエマルジョンアジュバントを含む、前記請求項のいずれか１項記載の使用のためのワクチン。
【請求項10】
ワクチンを筋肉内投与する、前記請求項のいずれか１項記載の使用のためのワクチン。
【請求項11】
ワクチンが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の抗原を更に含む、前記請求項のいずれか１項記載の使用のためのワクチン。
【請求項12】
ワクチンがクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の抗原を更に含む、前記請求項のいずれか１項記載の使用のためのワクチン。
【請求項13】
雌ブタの能動免疫化による子ブタの受動免疫化によって雌ブタの子ブタ後代をＩＡＶ－Ｓによる病原性感染に対して防御するワクチンの製造のための、ＩＡＶ－Ｓの抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子（αＲＰ）ベクターの使用。
【請求項14】
雌ブタの子ブタ後代をＩＡＶ－Ｓによる病原性感染に対して受動免疫化するための方法であって、該方法は、ＩＡＶ－Ｓの抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子（αＲＰ）ベクターを含むワクチンで雌ブタを能動的に免疫化する、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の全般的分野
本発明は、雌ブタの能動免疫化による後代子ブタの受動免疫化に使用されうるブタＡ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ－Ｓ）ワクチンに関する。
本発明は、雌ブタの能動免疫化による後代子ブタの受動免疫化に使用されうるブタＡ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ－Ｓ）ワクチンに関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
Ａ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）は世界中でヒトおよび動物の健康に著しい負担をもたらす。ＩＡＶは、そのウイルス表面糖タンパク質、赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）に基づいて種々の亜型に分類される。ＩＡＶは家禽、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、海洋哺乳類（例えば、クジラ）、コウモリおよびヒトに感染する。野生の水鳥および浜鳥（アヒル、ガチョウ、ハクチョウおよびカモメ）は自然宿主であり、それらは１６個の異なるＨＡおよび９個の異なるＮＡ亜型に感染しうる（Ｗｅｂｓｔｅｒら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ５６：１５２－１７９，１９９２）。
Ａ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）は世界中でヒトおよび動物の健康に著しい負担をもたらす。ＩＡＶは、そのウイルス表面糖タンパク質、赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）に基づいて種々の亜型に分類される。ＩＡＶは家禽、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、海洋哺乳類（例えば、クジラ）、コウモリおよびヒトに感染する。野生の水鳥および浜鳥（アヒル、ガチョウ、ハクチョウおよびカモメ）は自然宿主であり、それらは１６個の異なるＨＡおよび９個の異なるＮＡ亜型に感染しうる（Ｗｅｂｓｔｅｒら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ５６：１５２－１７９，１９９２）。
【0003】
ブタにおけるＡ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ－Ｓ）は家畜ブタの重大な呼吸器病原体であり、これは、世界中で、特に畜産業に、大きな経済的損失をもたらすことが判明している（Ｈｏｌｔｋａｍｐら，Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｗｉｎｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａｎｓ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，２００７）。それは呼吸器疾患の突然の発症によって特徴づけられ、通常は食欲不振、嗜眠および発熱を伴う。生産動物におけるＩＡＶ－Ｓに関連する臨床合併症に加えて、ヒトへのインフルエンザウイルスの伝染にブタを関連づける公開報告があり（Ｍｙｅｒｓら，Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，２００７；４４（８），１０８４－８，ＫｒｕｅｇｅｒおよびＧｒａｙ，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３７０：２０１－２２５，２０１３）、これは公衆衛生上の重大な脅威であり、ブタ群におけるＩＡＶ－Ｓを抑制する更に大きな動機付けとなる。
【0004】
この問題に対処するために、多数の養豚業者は現在、商業的に入手可能なワクチンを使用してＩＡＶ－Ｓに対してブタにワクチン接種している。しかし、通常のワクチンでＩＡＶ－Ｓを抑制することは困難である。なぜなら、多数の多様なＩＡＶ－Ｓ株が野外で同時に流行し、進化し続けるからである（Ｇａｏら，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ９８（８），２００１－２０１０，２０１７）。ＩＡＶ－Ｓの多様性および突然変異性はウイルスの遺伝子構造によって引き起こされる。他のＡ型インフルエンザウイルスと同様に、ＩＡＶ－Ｓは、８つのＲＮＡセグメント上にコードされる遺伝子と、頻繁な突然変異を導入するゲノム複製機構とを有する。これらの遺伝的特徴は、以前の株への曝露によって誘導される既存の中和抗体からの逃避を含む迅速な適応をＩＡＶ－Ｓが行うことを可能にする。
【0005】
Ａ型インフルエンザウイルスの分類は、ウイルス表面上の２つの主要糖タンパク質であるＨＡおよびＮＡの亜型分類から開始される。ＨＡタンパク質は宿主細胞へのウイルスの結合および融合を媒介する。ノイラミニダーゼは、新たに形成されたウイルス粒子を宿主細胞から切断することによって新たな後代ウイルスが拡散し他の細胞に感染することを可能にすることにより、インフルエンザウイルス複製サイクルの最終段階で機能する酵素である。
【0006】
ヒトＡ型インフルエンザは、通常特定のインフルエンザ流行期に世界中で流行する１つまたは２つの優勢株を有するが、ＩＡＶ－Ｓの更に多数の株が同時に流行し、これらの株は地理的地域によって異なる。同様に、ＩＡＶ－Ｓ株は抗原的にも多様であるが、主として、ＨＡのＨ１またはＨ３亜型、およびＮＡのＮ１またはＮ２亜型を含む。ＩＡＶ－Ｓの各ＨＡおよびＮＡ亜型内には、更なる系統的多様性が存在する。
【0007】
米国のブタ集団においては、Ｈ１の４つの主要系統クラスター（ガンマ、デルタ１、デルタ２、パンデミック）、Ｈ３の２つの主要クラスター（クラスターＩＶおよびヒト様）、Ｎ１の２つの主要クラスター（古典的、パンデミック）、およびＮ２の２つの主要系統クラスター（Ｎ２－１９９８およびＮ２－２００２）が存在する（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒｕｓｅｓ ７（Ｓｕｐｐｌ．４），４２－５１，２０１３；およびＡｎｄｅｒｓｏｎら，ｍＳｐｈｅｒｅ １（６）ｅ００２７５－１６：１－１４（２０１６）を参照されたい）。
【0008】
欧州においては、Ｈ１の３つの主要系統（ユーラシアトリ様、スコットランド／４１０４４０／１９９４様Ｈ１およびパンデミック）、Ｈ３の１つの主要系統（Ｇｅｎｔ／１／１９８４様Ｈ３）、Ｎ１の２つの主要系統、Ｎ２の２つの主要系統、およびＮ２の２つのマイナー系統が存在する（Ｗａｔｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８９：９９２０－９９３１（２０１５）；ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．００８４０－１５）。
【0009】
変異型ＩＡＶ－Ｓ株の連続的出現の結果として、商業的に入手可能な全ウイルス不活化ワクチンは、しばしば、新興ウイルス亜型／クラスターに対して防御せず、ヘテロ亜型チャレンジに対して限定的な防御しかもたらさない。なぜなら、その抗原は、野外で流行している全ての現在の株に適合するわけではないからである（Ｌｅｅら，Ｃａｎ Ｊ Ｖｅｔ Ｒｅｓ ７１（３），２０７－１２，２００７；Ｖｉｎｃｅｎｔら，Ｖａｃｃｉｎｅ ２８（１５），２７８２－２７８７，２０１０）。したがって、そのようなワクチンは、現在流行している株に適合するように定期的に更新される必要がある。
【0010】
子ブタを感染症から予防するための一般的な戦略は、分娩前の妊娠雌ブタおよび／または子ブタ後代に全ウイルス不活化ワクチンでワクチン接種することを含む。ワクチン接種された妊娠雌ブタは、初乳および後続の乳において、その防御を子ブタに伝達する（受動免疫）。実際、子ブタの受動免疫は、その雌親から、または分娩前にワクチン接種された別の雌ブタから得られうる。初乳は、子ブタがそれ自身の能動免疫を獲得するまで生存するのを助ける一連の免疫系成分を含有する。初乳中の抗体レベルは乳中の抗体レベルの６０倍である。これらの抗体の約６５～９０％はＩｇＧ型からなり、これは全身防御をもたらす。子ブタによるこれらのＩｇＧ免疫グロブリンの吸収は選択的ではなく、それらは初乳摂取の２時間後に血漿中に存在し、１２時間でピークに達する。初乳の抗体プロファイルおよび子ブタにおいて誘導される受動的防御は、母体が曝露される抗原と、抗原曝露から分娩までの期間とに左右される。授乳中、ＩｇＧ免疫グロブリンは、子ブタの腸粘膜を保護するように機能するＩｇＡによって徐々に取って代わられる。約３６時間後、腸は抗体および細胞の吸収を終了し、子ブタは胃腸管において乳から受動的粘膜ＩｇＡ抗体を受領し続ける。
【0011】
当技術分野においては、全ウイルス不活化ワクチンに加えて、ブタに使用するための幾つかの他のタイプのワクチンが記載されている（Ｏｐｒｉｅｓｓｎｉｇら，Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｈｅａｌｔｈ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，２０２１，７，１による総説）。大まかに、これらは、全病原体弱毒化生ワクチン、キメラ（弱毒化生または不活化）ワクチン、サブユニットワクチン、哺乳類生ウイルスベクター（複製型または複製欠損型）ワクチン、および核酸に基づくワクチン（ＤＮＡプラスミドまたはｍＲＮＡ）に分類されうる。
【0012】
ＷＯ ２０１９／１２１５１３およびＷＯ ２０１９／１１０４８１は、ＩＡＶ－Ｓに対する子ブタの能動ワクチン接種のための、複製欠損型アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子ベクターの使用を記載している。
【0013】
安全であり、ＩＡＶ－Ｓによる病原性チャレンジに対して有効であり、新興株に抗原的に適合するように迅速に改変されうる、ブタ用の新規方法およびワクチンを開発することが、本発明の目的である。
【発明の概要】
【0014】
発明の概括
本発明の目的を達成するために、免疫原と薬学的に許容される担体とを含むワクチンであって、該ワクチンが、該ワクチンで能動的に免疫化された雌ブタからの初乳または乳の摂取を介した子ブタの受動免疫化によってブタＡ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ－Ｓ）による病原性感染に対して子ブタを防御する方法における使用のためのワクチンであり、該免疫原が、ＩＡＶ－Ｓの抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子（αＲＰ）ベクターである、前記ワクチンを提供する。
本発明の目的を達成するために、免疫原と薬学的に許容される担体とを含むワクチンであって、該ワクチンが、該ワクチンで能動的に免疫化された雌ブタからの初乳または乳の摂取を介した子ブタの受動免疫化によってブタＡ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ－Ｓ）による病原性感染に対して子ブタを防御する方法における使用のためのワクチンであり、該免疫原が、ＩＡＶ－Ｓの抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子（αＲＰ）ベクターである、前記ワクチンを提供する。
【0015】
離乳までは、局所病原体、例えばブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、パルボウイルス、ＰＣＶ２、ロタウイルス、ＴＧＥウイルスに対する子ブタの防御は、主として、乳によって付与される免疫（乳汁免疫）によるものである。この免疫は、経産雌ブタの誘導部位における免疫活性化と、分泌型ＩｇＡの局所産生を伴う乳腺への活性化Ｂ細胞の移行に依存する。経産雌ブタにおいて、免疫活性化は、腸と乳腺との間のリンパ球再循環によってＧＡＬＴ（腸管関連リンパ組織）において、および呼吸器系と乳腺との間のＢ細胞再循環によってＢＡＬＴ（気管支関連リンパ組織）において生じる。
【0016】
ブタの局所粘膜における最適な乳汁免疫のためには、ワクチンにおける免疫化抗原が、全身免疫に加えて、主に腸のリンパ組織（「パイエル板」）に作用することによって局所免疫をも刺激する必要がある。これは、例えば腸および気道における粘膜組織の表面層の直下でＩｇＡの産生をもたらす。ＩｇＡは粘膜の細胞を通過し、分泌成分と称される別の分子に結合する。したがって、それは分泌型ＩｇＡと称され、分泌成分によって互いに連結された２つのＩｇＡ抗体分子から構成される。この組合せはそれらの効力を増強し、それらを腸内酵素による消化に対して抵抗性にし、粘液によってより容易に吸収させる。粘液は腸および気道の内面全体を覆うため、分泌型ＩｇＡは、潜在的に病原性の感染に対する遮蔽物として機能する。
【0017】
本発明は、αＲＰベクターに基づくワクチンが、ＩＡＶ－Ｓと同様に粘膜組織において局所的に複製されるブタ病原体であるＰＥＤＶによる病原性感染に対して子ブタにおける受動的防御をもたらさなかったことが実験で示されているにもかかわらず（実施例３）、対照的に、αＲＰ ＩＡＶ－Ｓベクターに基づくワクチンによる経産雌ブタの能動的ワクチン接種が該経産雌ブタの子ブタにおける受動的防御をもたらした（実施例２）という予想外の知見から生まれたものである。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】未経産雌ブタの初乳、経産雌ブタの血清および子ブタの血清におけるＩＡＶ－Ｓ赤血球凝集抑制（ＨＩ）力価。分娩時に採取された経産雌ブタ初乳（ｎ＝３）、分娩時に採取された経産雌ブタ血清（ｎ＝３）、および１週齢で採取された子ブタ血清（ｎ＝１８～２７）において測定されたユーラシア（Ｅｕｒａｓｉａｎ）トリ（Ｆｒａｎｃｅ／５３－１３００６５）系統ＩＡＶ－Ｓ株特異的ＨＩ力価（ｌｏｇ２）。
【図2】チャレンジの３日後に測定された子ブタの加重肺病変スコアおよび平均±ＳＤ。平均値±ＳＤは、それぞれ３頭の同腹子に属する１４頭（ＩＡＶ－Ｓ ＲＰ＋ＣｏｌｉＣｌｏｓ ＩＭ）、１６頭（ＩＡＶ－Ｓ ＲＰ ＸＳｏｌｖｅ５０ ＩＭ）、１６頭（ＩＡＶ－Ｓ ＲＰ ＸＳｏｌｖｅ５０ ＩＤ）および１５頭（ＰＢＳ＋ＣｏｌｉＣｌｏｓ ＩＭ）の動物に基づくものであった。１群当たり３頭の未経産雌ブタに分娩の６週間前および２週間前にワクチン接種し、後代を４ＷＯＡで感染させ、感染の３日後に解剖して、肺病変スコアを評価した。
【図3】チャレンジの３日後に採取された子ブタ肺組織のＩＡＶ－Ｓ力価および平均±ＳＤ。平均値±ＳＤは、それぞれ３頭の同腹子に属する１４頭（ＩＡＶ－Ｓ ＲＰ＋ＣｏｌｉＣｌｏｓ ＩＭ）、１６頭（ＩＡＶ－Ｓ ＲＰ ＸＳｏｌｖｅ５０ ＩＭ）、１６頭（ＩＡＶ－Ｓ ＲＰ ＸＳｏｌｖｅ５０ ＩＤ）および１５頭（ＰＢＳ＋ＣｏｌｉＣｌｏｓ ＩＭ）の動物に基づくものであった。１群当たり３頭の未経産雌ブタに分娩の６週間前および２週間前にワクチン接種し、後代を４ＷＯＡで感染させ、感染の３日後に解剖して、肺内のウイルス量を測定した。
【図4】ＲＰ－ＰＥＤＶまたはプラセボでワクチン接種された経産雌ブタ血清におけるＰＥＤＶ中和抗体力価。細胞培養馴化ＰＥＤＶ株ＵＳＡ／コロラド／２０１３に対するＦＦＮアッセイを用いて、ＰＥＤＶ中和力価または血清中和力価をＦＦＮ力価として測定した。ＤＰＶ＝ワクチン接種後の日数、ＤＰＦ＝分娩後の日数。点線より下の値はＰＥＤＶ中和活性を有さないとみなされる。
【図5】ＲＰ－ＰＥＤＶまたはプラセボでワクチン接種された経産雌ブタから産まれたブタの血清サンプルにおけるＰＥＤＶ中和抗体力価。細胞培養物馴化ＰＥＤＶ株ＵＳＡ／コロラド／２０１３に対するＦＦＮアッセイを用いて、チャレンジの当日（３～５日齢）に採取されたブタ血清においてＰＥＤＶ中和力価または血清中和力価をＦＦＮ力価として測定した。
【図6】ＰＥＤＶチャレンジによるブタの死亡率。ＲＰ－ＰＥＤＶまたはプラセボでワクチン接種された経産雌ブタから産まれた３～５日齢のブタに、ブタ１頭当たり３ｍＬの総体積の１０６ ＴＣＩＤ５０のＰＥＤＶ／コロラド／２０１３チャレンジ株を胃内接種した。同腹子当たりの感染ブタの死亡率をチャレンジの１４日後まで記録した。同腹子当たりのブタの死亡率が図に示されている。
【0019】
定義
ワクチンは、典型的には薬学的に許容される担体と組合されている、免疫学的に有効な量の感染因子の１以上の抗原を含む動物への投与に適した組成物であり、これは、動物への投与に際して、感染因子による病原性感染に対して動物を防御する免疫応答を誘導する。
ワクチンは、典型的には薬学的に許容される担体と組合されている、免疫学的に有効な量の感染因子の１以上の抗原を含む動物への投与に適した組成物であり、これは、動物への投与に際して、感染因子による病原性感染に対して動物を防御する免疫応答を誘導する。
【0020】
感染因子による病原性感染に対する防御は、動物において防御免疫を得ることを意味し、すなわち、例えば、動物におけるウイルス複製の回数または持続期間を低減することによって、あるいは組織病変の数、強度または重傷度を縮小または低減することによって、あるいは１以上の臨床徴候を予防することによって、その感染因子による感染によって引き起こされる有害な効果の予防、改善または治癒を助けることを意味する。
【0021】
ブタ（ｐｉｇ）または豚（ｓｗｉｎｅ）は、イノシシ科の任意の動物、特にイノシシ属の動物、例えば、野生または家畜のブタ、イノシシ、バビルサまたはイボイノシシを意味する。
【0022】
子ブタは雌ブタの若い後代である。
【0023】
経産雌ブタ（ｓｏｗ）は、一腹の子ブタを既に出産したことのある成体雌ブタである。
【0024】
未経産雌ブタ（ｇｉｌｔ）は、同腹子を未だ出産したことがない若い雌ブタである。
【0025】
初乳は、各同腹子の子ブタを有する経産雌ブタまたは未経産雌ブタによって産生された最初の乳である。
【0026】
本明細書中で用いる能動免疫化は、抗体および免疫細胞の生成をもたらす、外来抗原へのブタの身体の曝露の後のブタの免疫系の刺激である。抗原は感染因子、感染因子の不活化形態または感染因子の免疫原性成分の形態でありうる。
【0027】
本明細書中で用いる受動免疫化は、初乳、好ましくはその後の乳の摂取を介した、新生子ブタ後代への雌ブタの免疫（抗体および／または免疫細胞）の伝達に関するものである。実際には、子ブタ後代の受動免疫は、その雌親から、または分娩前にワクチン接種された別の雌ブタから得られうる。
【0028】
アルファウイルスは、トガウイルス科に属するＲＮＡウイルスの属であり、小さな球形の包膜ポジティブセンスｓｓＲＮＡウイルスである（Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｖｉｒｕｓｅｓ，著者：Ｈｏｗｌｅｙ，ＫｎｉｐｅおよびＷｈｅｌａｎ，ＩＳＢＮ／ＩＳＳＮ ９７８１９７５１１２５４７，２０２０）。
【0029】
本明細書中で用いるアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子（αＲＰ）なる語は、構造タンパク質のための１以上のコード配列を欠く修飾ＲＮＡウイルスゲノムを含むアルファウイルス様粒子であり、該コード配列は、もしそれが存在すれば、例えばＰｕｓｈｋｏら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９，３８９－４０１，１９９７）によって記載されているとおり、同様にアルファウイルスに由来するウイルス構造タンパク質（例えば、カプシドおよび糖タンパク質）内にパッケージングされる、細胞培養または動物宿主における親ウイルスの増殖の成功を可能にするであろう。したがって、αＲＰは動物の宿主細胞に進入し、新たな粒子を形成しうることなく、１ラウンドのウイルスゲノム増幅を行いうる。レプリコン粒子は、必要な構造タンパク質コード配列粒子を欠いているため、感染細胞からは増殖しない（Ｖａｎｄｅｒ Ｖｅｅｎら，２０１２，Ａｎｉｍ．Ｈｅａｌｔｈ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．，ｖｏｌ．１３，ｐ．１－９；およびＫａｍｒｕｄら，２０１０，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９１，１７２３－１７２７も参照されたい）。
【0030】
αＲＰに基づくワクチンを開発するために、幾つかのアルファウイルス種、例えばベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）（Ｐｕｓｈｋｏら，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９，３８９－４０１）、シンドビスウイルス（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら，１９９３，Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌ．６７，６４３９－６４４６）およびセムリキ森林ウイルス（ＬｉｌｊｅｓｔｒｏｍおよびＧａｒｏｆｆ，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９，１３５６－１３６１）が使用されている。
【0031】
αＲＰベクターは、ウイルスゲノム内に挿入された、関心のある抗原をコードする異種核酸分子を含む。αＲＰベクター内に含まれる抗原をコードする核酸分子の転写および翻訳は、後代を産生することなく、αＲＰベクターに感染した細胞における抗原の発現をもたらし、このようにして、異種抗原を感染動物の免疫系に送達し、発現する。核酸分子は、完全なタンパク質をコードする完全な遺伝子またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むことが可能であり、あるいはタンパク質の一部をコードするその断片でありうる。抗原をコードする核酸分子は、アルファウイルスサブゲノムプロモーター、例えば２６Ｓ－アルファウイルスサブゲノムプロモーターから転写され、発現されうる。転写されたレプリコンＲＮＡは、パッケージング細胞株による構造タンパク質の発現によって、または構造タンパク質をコードする１以上の「ヘルパー」ＲＮＡとレプリコンＲＮＡとの、適切な宿主細胞内への同時トランスフェクションによって、ＲＰ内にパッケージングされうる。
【0032】
αＲＰベクターは、そのゲノム内に挿入された、同じまたは異なる関心のある抗原をコードする２以上の異種核酸分子を含みうる。これは幾つかの方法で達成されうる。例えば、そのようなαＲＰベクターは、ポリシストロン性リーディングフレームをコードすることが可能であり、あるいは例えば、別個の追加的なタンパク質の発現を可能にするサブゲノムプロモーターの、１以上の追加的なコピーを使用することによって、別個の遺伝子をコードすることが可能である。
【0033】
αＲＰベクターは、例えば後記の商業的に入手可能なＶＥＥＶに基づくαＲＰベクターのように、既に入手可能のものもあり、あるいは該ベクターは、抗原をコードする異種核酸分子をウイルスレプリコン骨格内に組み込むことによって、周知の技術を用いて作製されうる。
【0034】
本明細書中で用いるＩＡＶ－Ｓの抗原は、ＩＡＶ－Ｓによる病原性感染に対して動物を防御する、ブタにおける免疫応答を誘発しうるタンパク質またはその断片である。
【0035】
ＩＡＶゲノムは、少なくとも１２個のタンパク質をコードする８つのセグメントから構成される。これらのタンパク質のうちの３つ、すなわち、ウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）およびマトリックス２（Ｍ２）タンパク質がウイルスのエンベロープ内に組み込まれる。ＨＡおよび／またはＮＡに基づくワクチンはブタに防御免疫を付与しうる。ＨＡタンパク質は宿主細胞へのインフルエンザビリオンの結合をもたらす。ＩＡＶ－Ｓ ＮＡタンパク質の機能は、宿主細胞上のシアル酸を切断して、新たに生成したビリオンが感染細胞から効率的に遊離することを可能にすることである。膜貫通マトリックス２（Ｍ２）タンパク質はプロトン選択的イオンチャネルであり、Ａ型インフルエンザウイルスの効率的な脱コーティングに必要である（Ｓａｎｄｂｕｌｔｅら，Ｖａｃｃｉｎｅｓ ２０１５，３，２２－７３；ｄｏｉ：１０．３３９０およびＡｇｕｉｌａｒ－Ｙａｎｅｚら，ＰＬＯＳ ＯＮＥ ２０１０；ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１１６９４によるレビューを参照されたい）。
【0036】
ＩＡＶ－Ｓタンパク質抗原のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、公に入手可能な文献および配列データベース、例えばＮＣＢＩ（インフルエンザデータベース）、インフルエンザ研究データベース（ＩＲＤ）またはＧｅｎＢａｎｋ（ＧＢ）から容易に入手されうる。本発明において使用されるＩＡＶ－Ｓ抗原は任意のＩＡＶ－Ｓ（亜）型、系統学的クレード、クラスター、系統、株などのものでありうる。
【0037】
本明細書中で用いる系統なる語は、類似（相同）祖先に遡及される進化樹において（同じ枝上に）一緒に分類されたインフルエンザウイルス赤血球凝集素またはノイラミニダーゼのセットを意味する。これらの分類は欧州の赤血球凝集素およびノイラミニダーゼに関してなされており、米国のウイルスに関する系統学的クラスターと類似しているが、同等ではない。容易に入手可能なソフトウェア、すなわち、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ（Ｓｉｅｖｅｒｓら，２０１１，Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．７，５３９）またはＨ１ ＨＡ配列用のウェブアクセス可能なアノテーションツール（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，ｍＳｐｈｅｒｅ，２０１６，１（６）：ｅ００２７５－１６）を使用し、予め確立された参照配列を使用して、問題のＨＡまたはＮＡ配列の系統学的分析によって、系統の決定が達成されうる。欧州においては、Ｈ１の３つの主要系統（ユーラシアトリ様Ｈ１、スコットランド／４１０４４０／１９９４様Ｈ１およびパンデミック２００９様Ｈ１）、Ｈ３の１つの主要系統（Ｇｅｎｔ／１／１９８４様Ｈ３）、Ｎ１の２つの主要系統（ユーラシアトリ様Ｎ１、パンデミック２００９様Ｎ１）、Ｎ２の２つの主要系統（Ｇｅｎｔ／１／１９８４様Ｎ２、スコットランド／４１０４４０／１９９４様Ｎ２）、およびＮ２の２つのマイナー系統（イタリア／４６７５／２００３様Ｎ２、ヒト季節性様Ｎ２）が存在する。ＩＡＶ－Ｓ分類の規則、および分類を評価するためのツールは、Ｗａｔｓｏｎら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８９，９９２０－９９３１，２０１５，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．００８４０－１５），ｈｔｔｐｓ：／／ｊｏｕｒｎａｌｓ．ａｓｍ．ｏｒｇ／ｄｏｉ／１０．１１２８／ｍＳｐｈｅｒｅ．００２７５－１６、およびｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆｌｕｄｂ．ｏｒｇ／ｂｒｃ／ｈ１ＣｌａｄｅＣｌａｓｓｉｆｉｅｒ．ｓｐｇ？ｍｅｔｈｏｄ＝ＳｈｏｗＣｌｅａｎＩｎｐｕｔＰａｇｅ＆ｄｅｃｏｒａｔｏｒ＝ｉｎｆｌｕｅｎｚａに記載されている。
【0038】
薬学的に許容される担体は、生体適合性媒体、すなわち、担体を含む組成物の投与の後に動物の免疫系に抗原を提示しうる、治療対象において有意な有害反応を誘発しない媒体である。そのような薬学的に許容される担体は、例えば、水および／または任意の他の生体適合性溶媒を含む液体、あるいは固体担体、例えば、凍結乾燥ワクチン（糖および／またはタンパク質に基づくもの）を得るために一般的に使用される固体担体であって、所望によりアジュバントを含んでいてもよいものでありうる。
【0039】
アジュバントは、動物の免疫系に非特異的刺激をもたらしうる化合物または組成物である。アジュバントは、不活化抗原またはサブユニット抗原に基づくワクチンにおいて一般的に使用される。例えば以下のもののような多種多様なアジュバントのタイプおよび組成が存在する：アルミニウム塩、例えば水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム、リポソーム、グルカン、アルギナート、細菌成分、例えば細胞壁成分、鉱油または非鉱油の油と水とのエマルジョン、合成アジュバント、例えば非イオン性ブロックポリマー、ポリアミン、例えばデキストラン硫酸、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（商標）、ピラン、およびサポニン、例えばＱｕｉｌ Ａ（商標）またはＱ－ｖａｃ（商標）。サポニンおよびワクチン成分はＩＳＣＯＭ（商標）と組合されうる。更に、ペプチド、例えばムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、タフトシンがアジュバントとしてしばしば使用される。同様に、ＩＳＡ（商標）組成物（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅ）のような組合せ製品が使用されうる。アジュバント、その使用および効果に関するより詳細な情報は、ハンドブック：ワクチンアジュバント（Ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ）（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．４２，Ｄ．Ｏ’Ｈａｇａｎ編，２０００，Ｈｕｍａｎａ ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，ＩＳＢＮ：０８９６０３７３５５）において見出されうる。ブタにおいて使用されるアジュバントに関する詳細なレビューは、Ｃｈａｒｅｒｎｔａｎｔａｎａｋｕｌ Ｗ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０２０；３８（４３），６６５９－８１を参照されたい。
【0040】
本発明の更に詳細な実施形態
本発明による使用のためのワクチンの１つの実施形態においては、αＲＰはベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）αＲＰである。より詳細な実施形態においては、αＲＰはＴＣ－８３ ＶＥＥ αＲＰである。ＶＥＥ ＴＣ－８３ αＲＰの作製は、例えばＵＳ ９，４４１，２４７およびＵＳ ８，４６０，９１３に記載されている。ＶＥＥに基づくαＲＰワクチンは、以下のものを含むＵＳＤＡによって認可された幾つかのワクチンの基剤でもある：ブタ流行性下痢ワクチン，ＲＮＡ（製品コード１９Ｕ５．Ｐ１）、ブタインフルエンザワクチン，ＲＮＡ（製品コード１９Ａ５．Ｄ０）、トリインフルエンザワクチン，ＲＮＡ（製品コード１９Ｏ５．Ｄ０）および医療用医薬品，ＲＮＡ粒子（製品コード９ＰＰ０．００）。
本発明による使用のためのワクチンの１つの実施形態においては、αＲＰはベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）αＲＰである。より詳細な実施形態においては、αＲＰはＴＣ－８３ ＶＥＥ αＲＰである。ＶＥＥ ＴＣ－８３ αＲＰの作製は、例えばＵＳ ９，４４１，２４７およびＵＳ ８，４６０，９１３に記載されている。ＶＥＥに基づくαＲＰワクチンは、以下のものを含むＵＳＤＡによって認可された幾つかのワクチンの基剤でもある：ブタ流行性下痢ワクチン，ＲＮＡ（製品コード１９Ｕ５．Ｐ１）、ブタインフルエンザワクチン，ＲＮＡ（製品コード１９Ａ５．Ｄ０）、トリインフルエンザワクチン，ＲＮＡ（製品コード１９Ｏ５．Ｄ０）および医療用医薬品，ＲＮＡ粒子（製品コード９ＰＰ０．００）。
【0041】
前記使用のためのワクチンの好ましい実施形態においては、雌ブタは、経産雌ブタまたは未経産雌ブタである。
【0042】
更にもう１つの実施形態においては、雌ブタは２回のワクチン接種を受ける。雌動物への２回のワクチン接種は、初乳の摂取を介して最終的に子ブタに到達する抗体のレベルを増加させることが可能であり、そのような戦略は、成体動物を飼育する日常の実施において重大な問題を引き起こさない。そのような２回接種レジメンにおいては、最初（初回）のワクチン接種は、典型的には、分娩予定日の５～８週間前に行われ、３～４週間後に２回目のワクチン接種によって追加抗原刺激（ブースト）される。
【0043】
更にもう１つの好ましい実施形態においては、雌ブタは妊娠中に免疫化される。
【0044】
抗体レベルを適度な高さに（継続的に）維持するために、雌ブタは妊娠の間に適度なワクチン接種を受うると予想されるが、妊娠中に動物に（少なくとも１回）ワクチン接種することが有用であることが示されている。特に、妊娠雌ブタに分娩前の５～８週間の期間にワクチン接種し、次いで、特に、分娩予定日前の２～６週間の期間に追加免疫ワクチン接種を行うことが有用であることが示されており、どちらの場合も、典型的には、分娩予定日の少なくとも１～３週間前にワクチン接種を受ける。
【0045】
以前の妊娠中に既にワクチン接種を受けている雌ブタの場合、分娩予定日の１～４週間前に１回の再ワクチン接種が行われうる。
【0046】
もう１つの好ましい実施形態においては、前記使用のためのワクチンにおけるαＲＰベクターによってコードされるＩＡＶ－Ｓの抗原はＨＡ抗原である。本明細書中の実施例は、能動的ワクチン接種によって雌ブタにおいて強力な赤血球凝集素抑制（ＨＩ）抗体応答を誘発して、妊娠雌ブタの血清および初乳において高レベルのこれらの抗体を生成させるために、ＩＡＶ－ＳのＨＡ抗原がワクチンにおいて有利に使用されうることを実証している。これらのＨＩ抗体はそれらの後代子ブタに受動的に伝達されて、子ブタ血清において高レベルの（全身性）ＨＩ抗体価をもたらす。重要なことに、母体から獲得された抗体は、肺内のウイルス量と肺病変との両方の低減によって実証されるとおり、子ブタの肺における局所防御をも誘導しうる（乳汁免疫）。
【0047】
本発明の文脈においては、任意のＩＡＶ－ＳのＨＡ抗原が使用可能であり、例えば、当技術分野で開示されているもの、例えば、ＩＡＶ－Ｓ ＨＡ抗原のアミノ酸配列およびそのようなＨＡ抗原をコードするヌクレオチド配列の多数を提供する公に利用可能な配列データベース［ＮＣＢＩ（インフルエンザデータベース）、インフルエンザ研究データベース（ＩＲＤ）またはＧｅｎＢａｎｋ（ＧＢ）］において開示されているものが使用可能である。
【0048】
ＩＡＶ－Ｓ ＨＡの４つの主要系統のいずれかのＨＡ抗原に特に関心が持たれる。これらの系統は、Ｓｃｏｔ／９４ Ｈ１Ｎ２、ＥｕｒＡｓｉａｎＡｖｉａｎ Ｈ１Ｎ１、Ｇｅｎｔ１９８４ Ｈ３Ｎ２およびパンデミック（Ｐａｎｄｅｍｉｃ）２００９ Ｈ１Ｎ１（Ｗａｔｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８９，９９２０－９９３１，２０１５，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．００８４０－１５）と称される。前記使用のためのワクチンはこれらの系統のいずれかからのＨＡ抗原を含みうる。
【0049】
Ｓｃｏｔ／９４系統のＨＡ抗原は任意の株のものであることが可能であり、例えば、Ａ／ブタ／イタリア／３０３３－１／２０１５（Ｈ１Ｎ２）株またはＡ／ブタ／フランス／３５－１４００４１（Ｈ１Ｎ２）株からのものでありうる。好ましい実施形態においては、Ｓｃｏｔ／９４系統のＨＡ抗原はＡ／ブタ／イタリア／３０３３－１／２０１５（Ｈ１Ｎ２）株からのものである。もう１つの好ましい実施形態においては、ＨＡ抗原は、Ｓｃｏｔ／９４参照株Ａ／ブタ／イタリア／３０３３－１／２０１５（Ｈ１Ｎ２）：ＧＢ＃ ＡＬＸ３０１６０．１のＨＡ抗原に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0050】
ＥＡ系統のＨＡ抗原は任意の株のものであることが可能であり、例えば、Ａ／ブタ／デンマーク／１０１０４８－２／２０１１（Ｈ１Ｎ１）株、Ａ／ブタ／イタリア／２８７６２－３／２０１３（Ｈ１Ｎ１）株またはＡ／ブタ／フランス／４４－１２００７０／２０１２（Ｈ１Ｎ１）株からのものでありうる。好ましい実施形態においては、ＥＡ系統のＨＡ抗原はＡ／ブタ／イタリア／２８７６２－３／２０１３（Ｈ１Ｎ１）株からのものである。もう１つの好ましい実施形態においては、ＨＡ抗原は、ＥＡ参照株Ａ／ブタ／イタリア／２８７６２－３／２０１３（Ｈ１Ｎ１）：ＧＢ＃ ＡＫＪ８１６６７．１のＨＡ抗原に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0051】
Ｇｅｎｔ／８４系統のＨＡ抗原は任意の株のものであることが可能であり、Ａ／ブタ／イタリア／２４０８４９／２０１５（Ｈ３Ｎ２）株のものが好ましい。もう１つの好ましい実施形態においては、ＨＡ抗原は、Ｇｅｎｔ／８４参照株Ａ／ブタ／イタリア／２４０８４９／２０１５（Ｈ３Ｎ２）：ＧＢ＃ ＡＬＸ３０４１５．１のＨＡ抗原に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0052】
ｐｄｍ０９系統のＨＡ抗原は任意の株のものであることが可能であり、Ａ／ブタ／イングランド／３７３／２０１０（Ｈ１Ｎ１）株が好ましい。もう１つの好ましい実施形態においては、ＨＡ抗原は、ｐｄｍ０９参照株Ａ／ブタ／イングランド／３７３／２０１０（Ｈ１Ｎ１）：ＧＢ＃ ＡＦＲ７６２０５．１のＨＡ抗原に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0053】
特に好ましい実施形態において、本発明において使用されるＩＡＶ－ＳのＨＡ抗原は、表１（後記）に記載されているＨＡ抗原のいずれかである。
【0054】
１つの実施形態においては、本発明は、２以上の別個のＩＡＶ－Ｓ抗原、特に、別個のＨＡ抗原、より好ましくは、異なる系統からのＨＡ抗原をコードする少なくとも１つのαＲＰベクターを含むことを特徴とする、前記使用のためのワクチンをも提供し、より一層好ましくは、前記の別個のＨＡ抗原は、Ｓｃｏｔ／９４ Ｈ１Ｎ２、ＥｕｒＡｓｉａｎＡｖｉａｎ Ｈ１Ｎ１、Ｇｅｎｔ１９８４ Ｈ３Ｎ２およびパンデミック２００９ Ｈ１Ｎ１の群から選択される系統に属するＩＡＶ－Ｓ株のものである。
【0055】
この実施形態のより詳細な形態においては、ワクチンは、Ｓｃｏｔ／９４ Ｈ１Ｎ２、ＥｕｒＡｓｉａｎＡｖｉａｎ Ｈ１Ｎ１、Ｇｅｎｔ１９８４ Ｈ３Ｎ２およびパンデミック２００９ Ｈ１Ｎ１から選択される２つの系統に属するＩＡＶ－Ｓ株のＨＡタンパク質をコードする第１のαＲＰベクターと、その群の他の２つの系統に属するＩＡＶ－Ｓ株のＨＡタンパク質をコードする第２のαＲＰベクターとを含む。特に、ワクチンは、系統Ｓｃｏｔ／９４ Ｈ１Ｎ２およびＥｕｒＡｓｉａｎＡｖｉａｎ Ｈ１Ｎ１に属するＩＡＶ－Ｓ株のＨＡタンパク質をコードする第１のαＲＰベクターと、系統Ｇｅｎｔ１９８４ Ｈ３Ｎ２およびパンデミック２００９ Ｈ１Ｎ１に属するＩＡＶ－Ｓ株のＨＡタンパク質をコードする第２のαＲＰベクターとを含む。
【0056】
前記の本発明による使用のためのワクチンの更にもう１つの有利な実施形態においては、薬学的に許容される担体は油と水とのエマルジョンアジュバントを含む。実施例は、ワクチン中の抗原の薬学的に許容される担体としての油と水とのエマルジョンアジュバントの存在が雌ブタとその子ブタ後代との両方におけるＨＩ抗体価の生成に正の効果をもたらすことを実証している。
【0057】
エマルジョンは、油が連続的外相である油中水型（Ｗ／Ｏ）エマルジョンでありうる。好ましくは、エマルジョンは、油が分散内相である水中油型（Ｏ／Ｗ）エマルジョンである。乳化剤の適切な種類および濃度の選択によって標準的な乳化技術を用い、そのようなエマルジョンが形成され、安定に維持されうる（“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｙ”，２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ，ＵＳＡ，ＩＳＢＮ：６８３３０６４７２）、およびＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｓｔｏｒｅｔら編，１９９７，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＩＳＢＮ ０４４４８１９６８１）。
【0058】
油と水とのエマルジョンアジュバントは、好ましいＯ／Ｗエマルジョンの形態である場合、エマルジョンとαＲＰベクターとの混合を促進し、例えば、αＲＰベクターを含む水性または凍結乾燥組成物をＯ／Ｗエマルジョンと混合することによって、それが達成される。その場合、約１分間の手での単純な振とうで、それらの２つの水性組成物を適切に混合するのに十分である。
【0059】
より詳細な実施形態においては、油と水とのエマルジョンアジュバントは生分解性の鉱油または非鉱油を含みうる。好ましくは、鉱油は、流動パラフィン油［例えば、Ｄｒａｋｅｏｌ（登録商標）６ＶＲ（Ｐｅｎｒｅｃｏ）、Ｍａｒｃｏｌ（登録商標）５２（Ｅｘｘｏｎ Ｍｏｂｉｌｅ）およびＫｌｅａｒｏｌ（登録商標）（Ｓｏｎｎｅｂｏｒｎ）として一般的に入手可能なＣＡＳ番号：８０４２－４７－５］である。好ましくは、生分解性の非鉱油は、スクアラン、スクアレン、ビタミンＥ、ビタミンＥ－アセタート、オレアートおよびオレイン酸エチルからなる群から選択され、ビタミンＥ－アセタートが最も好ましい。
【0060】
更にもう１つの実施形態においては、油と水とのエマルジョンアジュバントは生分解性の鉱油および／または非鉱油のうちの２以上を含み、好ましくは、油と水とのエマルジョンアジュバントは流動パラフィン油およびビタミンＥ－アセタートを含む。
【0061】
前記使用のためのワクチンにおいて有用なアジュバントの例として、以下のプロプライエタリ（専有的）Ｏ／Ｗアジュバントが挙げられる：（マイクロ）Ｄｉｌｕｖａｃ Ｆｏｒｔｅ（商標）（ｄｌ－α－トコフェリルアセタートのＷ／Ｏエマルジョンに基づく）、ＸＳｏｌｖｅ（商標）［以下の２つのＯ／Ｗエマルジョンアジュバント成分の組合せ：ビタミンＥアセタートに基づくＤｉｌｕｖａｃ Ｆｏｒｔｅ（ＥＰ ３８２．２７１を参照されたい）および流動パラフィン油に基づくＭｉｃｒｏｓｏｌ（商標）（ＷＯ ２００９／１４４．０８８を参照されたい）］、ＳＶＥＡ（商標）（スクアランおよびビタミンＥ－アセタートのＷ／Ｏエマルジョン、ＷＯ ２０１８／１１５．４３５）およびＩｍｐｒａｎＦＬＥＸ（商標）（油中水型アジュバント）。
【0062】
本発明による使用のためのワクチンは、ワクチンの抗原によって誘発される免疫応答を増強する油エマルジョンアジュバントの免疫学的有効量を含む。１つの実施形態においては、ワクチンはワクチンの約１０％～９０％ｖ／ｖの量の油エマルジョンアジュバントを含む。より好ましくは、ワクチンはワクチンの約２０％～８０％ｖ／ｖ、３０～７０％ｖ／ｖまたは更には４０～６０％ｖ／ｖの量の油アジュバントを含む。最も好ましくは、ワクチンはワクチンの約５０％ｖ／ｖの量の油アジュバントを含む。
【0063】
前記使用のためのワクチンは、子ブタ後代がＩＡＶ－Ｓによる病原性感染に対して防御されるように、αＲＰベクターの免疫学的有効量を含む。１つの実施形態においては、ワクチンは約１×１０∧３～約１×１０∧１１のＲＰを含む。より詳細な実施形態においては、ワクチンは約１×１０∧４～約１×１０∧１０のＲＰを含む。より一層詳細な実施形態においては、ワクチンは約１×１０∧５～約１×１０∧９のＲＰを含む。
【0064】
もう１つの実施形態においては、前記使用のためのワクチンは０．０５ｍｌ～３ｍｌの用量で投与される。より詳細な実施形態においては、投与される用量量は０．１ｍｌ～２ｍｌである。更により詳細な実施形態においては、投与される用量は０．２～２ｍｌである。
【0065】
本発明はまた、複数のブタ病原体に対する前記使用のためのワクチンを提供する。例えば、ワクチンはＩＡＶ－Ｓウイルス性および／または細菌性ブタ病原体以外の追加的な不活化、弱毒化またはサブユニット抗原を含みうる。そのようなブタ病原体の例には、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）、ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）、伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥ）、ブタ仮性狂犬病ウイルス（ＰＰＲＶ）、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、ブタロタウイルス（ＰＲＶ）、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤ）、複数の血清型のパスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、サルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（例えば、血清型Ｋ９９、Ｋ８８、９８７ＰまたはＦ４１）、ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ）、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、マイコプラズマ属種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．）［例えば、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）］、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、エリシペラス属種（Ｅｒｙｓｉｐｅｌａｓ ｓｐｐ．）、カンピロバクター属種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）、アクチノバチルス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）およびクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）が含まれる。
【0066】
特に好ましい実施形態においては、ワクチンは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の抗原を更に含む。
【0067】
本発明による使用のためのワクチンのもう１つの実施形態においては、ワクチンはブタのワクチン接種に一般的な経路によって、特に非経口投与によって投与される。これには、皮下注射、筋肉内注射および皮内注射が含まれ、筋肉内注射が好ましい。
【0068】
もう１つの態様においては、本発明は、雌ブタの能動免疫化による子ブタの受動免疫化によって雌ブタの子ブタ後代をＩＡＶ－Ｓによる病原性感染に対して防御するワクチンの製造のための、ＩＡＶ－Ｓの抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子（αＲＰ）ベクターの使用を提供する。この態様の特徴（の組合せ）の全ては前記で概説されているとおりである。
【0069】
更にもう１つの態様においては、本発明は、ＩＡＶ－Ｓの抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子（αＲＰ）ベクターを含むワクチンで雌ブタを能動的に免疫化することによって、雌ブタの子ブタ後代をＩＡＶ－Ｓによる病原性感染に対して受動免疫化するための方法を提供する。この態様の特徴（の組合せ）の全ては前記で概説されているとおりである。
【0070】
次に、以下の特定の実施例を用いて、本発明を更に例示することとする。
【0071】
実施例
実施例１ ＨＡ αＲＰベクターに基づくＩＡＶ－Ｓワクチンの製造
１．多重ＨＡ遺伝子αＲＰベクターの作製
ＨＡ遺伝子およびＮＡ遺伝子を発現させるために使用するＶＥＥレプリコンベクターを、既に記載されているもの（Ｕ．Ｓ．９，４４１，２４７、Ｕ．Ｓ．８，４６０，９１３、ＷＯ ２０１９／１２１５１３およびＷＯ２０１９１１０４８１）に以下の改変を加えて構築した。ＴＣ－８３由来レプリコンベクター「ｐＶＥＫ」を制限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩで消化した。二重遺伝子ＨＡ構築物に関しては、選択されたオープンリーディングフレーム配列をコドン最適化し、隣接するＡｓｃＩおよびＰａｃＩ部位を使用して合成した。更に、前記の２つの合成ＨＡオープンリーディングフレーム間の介在配列は、４７ヌクレオチドの非コード異種配列と、天然ＴＣ－８３サブゲノム（ｓｇ）ＲＮＡプロモーターおよび５’非翻訳ｓｇＲＮＡ領域配列の第２コピーとからなるものであった。これらの二重遺伝子構築物を、単一のｓｇＲＮＡプロモーター配列を有する親ベクターからそれらを区別するために、「ｐＶＤＧ」と命名した。
実施例１ ＨＡ αＲＰベクターに基づくＩＡＶ－Ｓワクチンの製造
１．多重ＨＡ遺伝子αＲＰベクターの作製
ＨＡ遺伝子およびＮＡ遺伝子を発現させるために使用するＶＥＥレプリコンベクターを、既に記載されているもの（Ｕ．Ｓ．９，４４１，２４７、Ｕ．Ｓ．８，４６０，９１３、ＷＯ ２０１９／１２１５１３およびＷＯ２０１９１１０４８１）に以下の改変を加えて構築した。ＴＣ－８３由来レプリコンベクター「ｐＶＥＫ」を制限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩで消化した。二重遺伝子ＨＡ構築物に関しては、選択されたオープンリーディングフレーム配列をコドン最適化し、隣接するＡｓｃＩおよびＰａｃＩ部位を使用して合成した。更に、前記の２つの合成ＨＡオープンリーディングフレーム間の介在配列は、４７ヌクレオチドの非コード異種配列と、天然ＴＣ－８３サブゲノム（ｓｇ）ＲＮＡプロモーターおよび５’非翻訳ｓｇＲＮＡ領域配列の第２コピーとからなるものであった。これらの二重遺伝子構築物を、単一のｓｇＲＮＡプロモーター配列を有する親ベクターからそれらを区別するために、「ｐＶＤＧ」と命名した。
【0072】
以下のレプリコン粒子を構築した。
【表1】
【0073】
【0074】
αＲＰベクターＥＵＳＩＶ－ＫおよびＲＰ ＥＵＳＩＶ－Ｔ８を使用して、２つの二重ＨＡ ＲＰを含む多価ＩＡＶ－Ｓワクチンの免疫原性および有効性を決定した。
【0075】
２．αＲＰベクターに基づくワクチンの製造
バッチ番号ＲＰ ＥＵＳＩＶ－ＫおよびＲＰ ＥＵＳＩＶ－Ｔ８のフェノールレッドを含有するＰＢＳ ０．０１Ｍに溶解したＲＰ粒子を、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓワクチン（ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｏｘｍｅｅｒ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手可能）中、Ｘ－Ｓｏｌｖｅ（登録商標）アジュバント［ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｏｘｍｅｅｒ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手可能な、２１％ ｖ／ｖの非代謝性油Ｍａｒｃｏｌ（登録商標）５２と１．２５％ ｖ／ｖの代謝性油ビタミンＥアセタートとのＯ／Ｗエマルジョン］またはＭｉｃｒｏ Ｄｉｌｕｖａｃ Ｆｏｒｔｅ（登録商標）アジュバント（７．５％の代謝性油ビタミンＥアセタートのＯ／Ｗエマルジョン）と１：１（ｖ／ｖ）で混合した。Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓワクチンは複数の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原（Ｆ４ａｂ／Ｆ４ａｃ／Ｆ５／Ｆ６線毛アドヘシン）およびクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）ＬＴトキソイド抗原を含む。
バッチ番号ＲＰ ＥＵＳＩＶ－ＫおよびＲＰ ＥＵＳＩＶ－Ｔ８のフェノールレッドを含有するＰＢＳ ０．０１Ｍに溶解したＲＰ粒子を、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓワクチン（ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｏｘｍｅｅｒ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手可能）中、Ｘ－Ｓｏｌｖｅ（登録商標）アジュバント［ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｏｘｍｅｅｒ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手可能な、２１％ ｖ／ｖの非代謝性油Ｍａｒｃｏｌ（登録商標）５２と１．２５％ ｖ／ｖの代謝性油ビタミンＥアセタートとのＯ／Ｗエマルジョン］またはＭｉｃｒｏ Ｄｉｌｕｖａｃ Ｆｏｒｔｅ（登録商標）アジュバント（７．５％の代謝性油ビタミンＥアセタートのＯ／Ｗエマルジョン）と１：１（ｖ／ｖ）で混合した。Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓワクチンは複数の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原（Ｆ４ａｂ／Ｆ４ａｃ／Ｆ５／Ｆ６線毛アドヘシン）およびクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）ＬＴトキソイド抗原を含む。
【0076】
実施例２ インフルエンザウイルスに対する子ブタの乳汁／受動免疫防御
この実験は、５０％（ｖ／ｖ）ＸｓｏｌｖｅアジュバントまたはＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓワクチン［マイクロＤｉｌｕｖａｃ Ｆｏｒｔｅ（登録商標）アジュバント］と混合された多重遺伝子ＩＡＶ－Ｓ ＨＡ ＲＮＡ粒子によって誘導される、Ａ型インフルエンザウイルスに対する子ブタの乳汁免疫防御を評価した。
この実験は、５０％（ｖ／ｖ）ＸｓｏｌｖｅアジュバントまたはＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓワクチン［マイクロＤｉｌｕｖａｃ Ｆｏｒｔｅ（登録商標）アジュバント］と混合された多重遺伝子ＩＡＶ－Ｓ ＨＡ ＲＮＡ粒子によって誘導される、Ａ型インフルエンザウイルスに対する子ブタの乳汁免疫防御を評価した。
【0077】
研究デザイン
８～１０頭の子ブタを出産すると予想される１２頭の健康な妊娠中の未経産雌ブタ［クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）Ｃ型および／または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対して未だワクチン接種されておらず、ＩＡＶ－Ｓに対する抗体レベルが無い／低い］を適切な商業的農場から購入した。分娩の６週間前および２週間前に未経産雌ブタの皮内（ｉ．ｄ．）または筋肉内（ｉ．ｍ．）にワクチン接種した（ＲＰ当たり５＊１０６ ＲＰ／用量）：表１。分娩の６週間前および２週間前（分娩の～週間前は～ＷＰＦと表示される）ならびに分娩の当日に全ての未経産雌ブタから血液サンプルを採集して、抗原特異的ＨＩ力価を測定した。また、分娩の当日に初乳サンプルを採集し、分娩の３日後に乳サンプルを採集した。
８～１０頭の子ブタを出産すると予想される１２頭の健康な妊娠中の未経産雌ブタ［クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）Ｃ型および／または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対して未だワクチン接種されておらず、ＩＡＶ－Ｓに対する抗体レベルが無い／低い］を適切な商業的農場から購入した。分娩の６週間前および２週間前に未経産雌ブタの皮内（ｉ．ｄ．）または筋肉内（ｉ．ｍ．）にワクチン接種した（ＲＰ当たり５＊１０６ ＲＰ／用量）：表１。分娩の６週間前および２週間前（分娩の～週間前は～ＷＰＦと表示される）ならびに分娩の当日に全ての未経産雌ブタから血液サンプルを採集して、抗原特異的ＨＩ力価を測定した。また、分娩の当日に初乳サンプルを採集し、分娩の３日後に乳サンプルを採集した。
【0078】
子ブタ：約１週齢（ＷＯＡ）（９０頭）およびチャレンジの当日（８８頭）に全ての子ブタから血液サンプルを採集して、抗原特異的ＨＩ力価を測定した。子ブタが約４ ＷＯＡに達したら、ＩＡＶ－Ｓチャレンジ株Ａ／ブタ／フランス／５３－１３００６５／２０１３（Ｈ１Ｎ１）（５ｍＬのＰＢＳ中、ブタ１頭当たり１０５ ＴＣＩＤ５０）をそれらの気管内（ｉ．ｔ．）に接種した。同腹子当たり最大１０頭の子ブタにチャレンジを行った。チャレンジの当日（すなわち、第０日）ならびにチャレンジの１、２および３日後にブタから鼻腔スワブを採取して、ウイルス排出を測定した。一部の子ブタ（２４頭）をチャレンジの２４時間後に解剖し、残り（６１頭）をチャレンジの７２時間後に解剖した。解剖時に肺病変を記録し、各ブタから６つの肺サンプル（左頭葉、中葉および尾葉からそれぞれ１つ、ならびに３つの対応右肺葉からそれぞれ１つ）を採取して、肺内のウイルス量を測定した。
【表2】
【0079】
実験手順
１．血清および初乳におけるＩＡＶ－Ｓ ＨＩ抗体力価
ワクチン接種されたブタの血清におけるＨＩ力価をモニタリングすることにより、２つの二重ＨＡ遺伝子ＲＰをそれらのインビボ機能に関して試験した。ＨＡ－ＲＰに対して８５％超のアミノ酸同一性を有する４つのＩＡＶ－Ｓ系統からの代表的なＩＡＶ－Ｓ株をＨＩ試験に使用した。表２には、系統および株名の隣に、それぞれのワクチン成分に対するＨＩ力価の定量に使用したＩＡＶ－Ｓ株のクレード分類およびアミノ酸同一性（％）が記載されている。ブタ血清サンプルにおけるＩＡＶ－Ｓ特異的抗体を標準的な方法によるＨＩ試験によって測定した。簡潔に説明すると、非特異的インヒビターを除去するために、血清を過ヨウ素酸塩で前処理した。次いで、前処理した血清を２倍段階希釈し、インフルエンザウイルス株と共にインキュベートした（表２）。インキュベーション工程の後、ニワトリの赤血球を加え、インキュベートし、プレートの赤血球凝集抑制を測定した。赤血球凝集を完全に抑制する最高血清希釈度の逆数をＨＩ力価として割り当て、対数底２（log base 2 value）の値で表した。
１．血清および初乳におけるＩＡＶ－Ｓ ＨＩ抗体力価
ワクチン接種されたブタの血清におけるＨＩ力価をモニタリングすることにより、２つの二重ＨＡ遺伝子ＲＰをそれらのインビボ機能に関して試験した。ＨＡ－ＲＰに対して８５％超のアミノ酸同一性を有する４つのＩＡＶ－Ｓ系統からの代表的なＩＡＶ－Ｓ株をＨＩ試験に使用した。表２には、系統および株名の隣に、それぞれのワクチン成分に対するＨＩ力価の定量に使用したＩＡＶ－Ｓ株のクレード分類およびアミノ酸同一性（％）が記載されている。ブタ血清サンプルにおけるＩＡＶ－Ｓ特異的抗体を標準的な方法によるＨＩ試験によって測定した。簡潔に説明すると、非特異的インヒビターを除去するために、血清を過ヨウ素酸塩で前処理した。次いで、前処理した血清を２倍段階希釈し、インフルエンザウイルス株と共にインキュベートした（表２）。インキュベーション工程の後、ニワトリの赤血球を加え、インキュベートし、プレートの赤血球凝集抑制を測定した。赤血球凝集を完全に抑制する最高血清希釈度の逆数をＨＩ力価として割り当て、対数底２（log base 2 value）の値で表した。
【表3】
【0080】
２．血清および初乳における大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉａ ｃｏｌｉ）に対する抗体価
ワクチン中の大腸菌抗原（Ｋ８８ａｂ、Ｋ８８ａｃ、Ｋ９９、９８７ＰおよびＬＴ型）に対する血清における抗体価を、標準的な手順に従い、ＥＬＩＳＡによって測定した。
ワクチン中の大腸菌抗原（Ｋ８８ａｂ、Ｋ８８ａｃ、Ｋ９９、９８７ＰおよびＬＴ型）に対する血清における抗体価を、標準的な手順に従い、ＥＬＩＳＡによって測定した。
【0081】
３．血清および初乳におけるクロストリジウム・パーフリンジェンスに対する抗体価
クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）Ｃ型ベータ毒素に対する血清における抗体価を、標準的な手順に従い、ＥＬＩＳＡによって測定した。
クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）Ｃ型ベータ毒素に対する血清における抗体価を、標準的な手順に従い、ＥＬＩＳＡによって測定した。
【0082】
４．臨床サンプルにおけるウイルス定量
鼻腔スワブおよび肺組織を、元の鼻腔スワブおよび２０％ 肺組織ホモジネートサンプルの段階希釈によって、感染力価に関して試験した。動物１頭当たり２つの肺ホモジネート（一方は、左頭葉、中葉および尾葉から採取された等量のサンプルをプールすることによって調製されたものであり、他方は、対応する右肺葉から調製されたものである）を試験した。簡潔に説明すると、サンプルをＩＡＶ－Ｓ感染培地で１０倍段階希釈した。各希釈液をコンフルエントＭＤＣＫ単層の３つのレプリケートウェル上に接種した。プレートを３７℃、５％ ＣＯ２で４日間インキュベートし、上清中のウイルスの存在を赤血球凝集によって検出した。ＩＡＶ－Ｓ力価を、Ｓｐｅａｒｍａｎ－Ｋａｒｂｅｒ法を用いて、１ｍＬ当たりのｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０として計算した。
鼻腔スワブおよび肺組織を、元の鼻腔スワブおよび２０％ 肺組織ホモジネートサンプルの段階希釈によって、感染力価に関して試験した。動物１頭当たり２つの肺ホモジネート（一方は、左頭葉、中葉および尾葉から採取された等量のサンプルをプールすることによって調製されたものであり、他方は、対応する右肺葉から調製されたものである）を試験した。簡潔に説明すると、サンプルをＩＡＶ－Ｓ感染培地で１０倍段階希釈した。各希釈液をコンフルエントＭＤＣＫ単層の３つのレプリケートウェル上に接種した。プレートを３７℃、５％ ＣＯ２で４日間インキュベートし、上清中のウイルスの存在を赤血球凝集によって検出した。ＩＡＶ－Ｓ力価を、Ｓｐｅａｒｍａｎ－Ｋａｒｂｅｒ法を用いて、１ｍＬ当たりのｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０として計算した。
【0083】
５．巨視的肺評価
ブタインフルエンザを示す巨視的肺病変を、肺葉当たりの異常肺組織の割合に基づいてスコア化し、加重スコアを、肺葉の相対重量に従い、７つの肺葉のそれぞれに割り当てた。
ブタインフルエンザを示す巨視的肺病変を、肺葉当たりの異常肺組織の割合に基づいてスコア化し、加重スコアを、肺葉の相対重量に従い、７つの肺葉のそれぞれに割り当てた。
【0084】
結果
１．未経産雌ブタの血清、初乳および乳におけるＩＡＶ－Ｓ血球凝集抑制力価
分娩の６週間前および２週間前（ＷＰＦ）ならびに分娩の当日（ＦＤ）に全ての未経産雌ブタから血液サンプルを採取して、抗原特異的ＨＩ力価を測定した。分娩の当日に初乳サンプルを採取し、分娩の３日後に乳サンプルを採取した。試験したＩＡＶ－Ｓワクチン（ＥＵＳＩＶ－Ｔ８およびＥＵＳＩＶ－Ｋに基づくもの）は血清、初乳および乳におけるそれぞれの系統からの全ての代表的な異種株に対してＨＩ力価を誘導した。（未経産雌ブタの血清におけるＩＡＶ－Ｓ ＨＩ力価は８ｌｏｇ２ ＥｕｒＡｓｉａｎ、９ｌｏｇ２ Ｇｅｎｔ８４、１１ｌｏｇ２ パンデミック、５ｌｏｇ２ Ｓｃｏｔ９４ Ｃｌｕ１および７ｌｏｇ２ 対Ｓｃｏｔ９４ Ｃｌｕ２）。未経産雌ブタのＥＵ ＩＡＶ－Ｓ株に関する群ごとの測定された平均ＨＩ力価および標準偏差を図１に示す。一般に、ＩＡＶ－Ｓワクチンは、ＸＳｏｌｖｅ５０アジュバントと混合され適用された場合には、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓアジュバントと混合され適用された場合より高いＨＩ力価を、４つ全てのＩＡＶ－Ｓ株に対して誘導した。更に、筋肉内経路によるＩＡＶ－Ｓワクチンの投与は、筋肉内経路によって投与された場合より高いＨＩ力価を誘導することが観察された。
１．未経産雌ブタの血清、初乳および乳におけるＩＡＶ－Ｓ血球凝集抑制力価
分娩の６週間前および２週間前（ＷＰＦ）ならびに分娩の当日（ＦＤ）に全ての未経産雌ブタから血液サンプルを採取して、抗原特異的ＨＩ力価を測定した。分娩の当日に初乳サンプルを採取し、分娩の３日後に乳サンプルを採取した。試験したＩＡＶ－Ｓワクチン（ＥＵＳＩＶ－Ｔ８およびＥＵＳＩＶ－Ｋに基づくもの）は血清、初乳および乳におけるそれぞれの系統からの全ての代表的な異種株に対してＨＩ力価を誘導した。（未経産雌ブタの血清におけるＩＡＶ－Ｓ ＨＩ力価は８ｌｏｇ２ ＥｕｒＡｓｉａｎ、９ｌｏｇ２ Ｇｅｎｔ８４、１１ｌｏｇ２ パンデミック、５ｌｏｇ２ Ｓｃｏｔ９４ Ｃｌｕ１および７ｌｏｇ２ 対Ｓｃｏｔ９４ Ｃｌｕ２）。未経産雌ブタのＥＵ ＩＡＶ－Ｓ株に関する群ごとの測定された平均ＨＩ力価および標準偏差を図１に示す。一般に、ＩＡＶ－Ｓワクチンは、ＸＳｏｌｖｅ５０アジュバントと混合され適用された場合には、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓアジュバントと混合され適用された場合より高いＨＩ力価を、４つ全てのＩＡＶ－Ｓ株に対して誘導した。更に、筋肉内経路によるＩＡＶ－Ｓワクチンの投与は、筋肉内経路によって投与された場合より高いＨＩ力価を誘導することが観察された。
【0085】
２．子ブタの血清におけるＩＡＶ－Ｓ赤血球凝集抑制力価
約１週齢およびチャレンジの当日（約４ＷＯＡ）に全ての子ブタから血液サンプルを採取した。後代におけるそれぞれの系統からの全ての代表的な異種株に対するＨＩ力価を約１週齢およびチャレンジの当日に測定した。未経産雌ブタの血清におけるＩＡＶ－Ｓ ＨＩ力価の場合と同様に、ＩＡＶ－ＳワクチンＸｓｏｌｖｅ５０アジュバントでワクチン接種された未経産雌ブタの後代は、３つ全ての試験群のなかで、全ての系統に対して最高のＨＩ力価を示し、それに続くものは、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｃｏｌｉｃｌｏｓワクチンと混合されたＩＡＶ－Ｓワクチンの、筋肉内経路による投与を受けた群、およびＸｓｏｌｖｅ５０アジュバントと混合されたＩＡＶ－Ｓワクチンの、皮内経路による投与を受けた群であった。更に、１週齢で採取された血清における抗体力価は、４ＷＯＡで採取された血清のものよりも高かった。１ＷＯＡで測定されたＩＡＶ－Ｓ ＨＩ抗体力価（ＥＡ系統）の要約を図１に示す。
約１週齢およびチャレンジの当日（約４ＷＯＡ）に全ての子ブタから血液サンプルを採取した。後代におけるそれぞれの系統からの全ての代表的な異種株に対するＨＩ力価を約１週齢およびチャレンジの当日に測定した。未経産雌ブタの血清におけるＩＡＶ－Ｓ ＨＩ力価の場合と同様に、ＩＡＶ－ＳワクチンＸｓｏｌｖｅ５０アジュバントでワクチン接種された未経産雌ブタの後代は、３つ全ての試験群のなかで、全ての系統に対して最高のＨＩ力価を示し、それに続くものは、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｃｏｌｉｃｌｏｓワクチンと混合されたＩＡＶ－Ｓワクチンの、筋肉内経路による投与を受けた群、およびＸｓｏｌｖｅ５０アジュバントと混合されたＩＡＶ－Ｓワクチンの、皮内経路による投与を受けた群であった。更に、１週齢で採取された血清における抗体力価は、４ＷＯＡで採取された血清のものよりも高かった。１ＷＯＡで測定されたＩＡＶ－Ｓ ＨＩ抗体力価（ＥＡ系統）の要約を図１に示す。
【0086】
３．血清における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）Ｃ型に対する子ブタにおける抗体力価
子ブタの血清サンプルを、５つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の５つの抗原およびクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）に対する抗体力価に関して、群１および群４（それぞれ、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓと組合されたＩＡＶ－Ｓワクチン、またはＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓワクチンのみを使用した）の約１週齢およびチャレンジの当日に試験した。約１ＷＯＡおよび４ＷＯＡ（チャレンジの当日）に、全ての子ブタから血液サンプルを採取した。
子ブタの血清サンプルを、５つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の５つの抗原およびクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）に対する抗体力価に関して、群１および群４（それぞれ、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓと組合されたＩＡＶ－Ｓワクチン、またはＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓワクチンのみを使用した）の約１週齢およびチャレンジの当日に試験した。約１ＷＯＡおよび４ＷＯＡ（チャレンジの当日）に、全ての子ブタから血液サンプルを採取した。
【0087】
Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓワクチンが単独で又はＩＡＶ－Ｓワクチンと組合せて投与された未経産雌ブタの子ブタの血清サンプルは、その他の実験群と比較された場合、全ての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）型に対する最高の抗体力価を示した。一般に、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓが単独で投与された群と、ＩＡＶ－Ｓワクチンと組合せて投与された群との間で、測定された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗体力価における顕著な差は観察されなかった。更に、１週齢で採取された血清における抗体力価は、４ＷＯＡで採取された血清のものより高かった。
【0088】
Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓワクチンが単独で又はＩＡＶ－Ｓワクチンと組合せて投与された未経産雌ブタの子ブタの血清サンプルは、その他の実験群と比較された場合、全ての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）型に対する最高の抗体力価を示した。一般に、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓが単独で投与された群と、ＩＡＶ－Ｓワクチンと組合せて投与された群との間で、測定されたクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）抗体力価における顕著な差は観察されなかった。更に、１週齢で採取された血清における抗体力価は、４ＷＯＡで採取された血清のものより高かった。
【0089】
４．ＩＡＶ－Ｓチャレンジ後の子ブタにおける肺病変に対する防御
ワクチン接種された未経産雌ブタの４週齢の後代をＩＡＶ－Ｓ ＥＡ系統Ａ／ブタ／フランス／５３－１３００６５／２０１３（Ｈ１Ｎ１）株に気管内感染させ、感染の１日後または３日後に解剖して、ＩＡＶ－Ｓ感染によって誘発された肺病変を評価した。感染の３日後に評価された肺病変スコアを図２に要約する。ＩＡＶ－Ｓワクチンが単独で又はＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓワクチンと組合せて投与された未経産雌ブタの全後代は、ＩＡＶ－Ｓワクチンが接種されなかった群と比較して低いＬＬＳを有することを、データは示した。ＩＡＶ－ＳワクチンがＸＳｏｌｖｅ５０アジュバントと共に筋肉内経路で投与された群（群２）の後代が最低の肺病変スコアを示し、それに続くものは、ＩＡＶ－ＳワクチンがＸｓｏｌｖｅ５０アジュバントと共に皮内経路で投与された群（群３）、またはＩＡＶ－ＳワクチンがＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓと共に投与された群（群１）であった。
ワクチン接種された未経産雌ブタの４週齢の後代をＩＡＶ－Ｓ ＥＡ系統Ａ／ブタ／フランス／５３－１３００６５／２０１３（Ｈ１Ｎ１）株に気管内感染させ、感染の１日後または３日後に解剖して、ＩＡＶ－Ｓ感染によって誘発された肺病変を評価した。感染の３日後に評価された肺病変スコアを図２に要約する。ＩＡＶ－Ｓワクチンが単独で又はＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓワクチンと組合せて投与された未経産雌ブタの全後代は、ＩＡＶ－Ｓワクチンが接種されなかった群と比較して低いＬＬＳを有することを、データは示した。ＩＡＶ－ＳワクチンがＸＳｏｌｖｅ５０アジュバントと共に筋肉内経路で投与された群（群２）の後代が最低の肺病変スコアを示し、それに続くものは、ＩＡＶ－ＳワクチンがＸｓｏｌｖｅ５０アジュバントと共に皮内経路で投与された群（群３）、またはＩＡＶ－ＳワクチンがＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓと共に投与された群（群１）であった。
【0090】
５．ＩＡＶ－Ｓチャレンジ後の子ブタの肺におけるウイルス量の減少
感染の３日後の肺ホモジネートから得られた測定力価データを図３に要約する。ＩＡＶ－Ｓワクチンが単独で又はＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓワクチンと組合せて投与された未経産雌ブタの全後代においては、ＩＡＶ－Ｓワクチンが接種されなかった群と比較して、肺ホモジネートにおけるウイルスのレベルが低いことを、データは示した。ＩＡＶ－ＳワクチンがＸＳｏｌｖｅ５０アジュバントと共に筋肉内経路で投与された群（群２）の後代が肺ホモジネートにおける最低のウイルス量を示し、それに続くものは、ＩＡＶ－ＳワクチンがＸｓｏｌｖｅ５０アジュバントと共に皮内経路で投与された群（群３）、またはＩＡＶ－ＳワクチンがＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓと共に投与された群（群１）であった。
感染の３日後の肺ホモジネートから得られた測定力価データを図３に要約する。ＩＡＶ－Ｓワクチンが単独で又はＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓワクチンと組合せて投与された未経産雌ブタの全後代においては、ＩＡＶ－Ｓワクチンが接種されなかった群と比較して、肺ホモジネートにおけるウイルスのレベルが低いことを、データは示した。ＩＡＶ－ＳワクチンがＸＳｏｌｖｅ５０アジュバントと共に筋肉内経路で投与された群（群２）の後代が肺ホモジネートにおける最低のウイルス量を示し、それに続くものは、ＩＡＶ－ＳワクチンがＸｓｏｌｖｅ５０アジュバントと共に皮内経路で投与された群（群３）、またはＩＡＶ－ＳワクチンがＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓと共に投与された群（群１）であった。
【0091】
結論
ＩＡＶ－Ｓ ＲＰ（ＥＵＳＩＶ－Ｔ８およびＥＵＳＩＶ－Ｋ）ワクチンはそれぞれの系統からの全ての試験された代表的な異種ＩＡＶ－Ｓ株に対して高い血清および初乳ＨＩ力価を誘導した。未経産雌ブタの血清、初乳および子ブタ血清におけるＨＩ力価間の直接的な相関性が観察された。ＩＡＶ－Ｓワクチンは、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓの代わりにＸＳｏｌｖｅ５０アジュバントと混合され適用された場合、４つ全てのＩＡＶ－Ｓ株に対して、より高いＨＩ力価を誘導した。５つ全ての大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉａ ｃｏｌｉ）型およびクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）β毒素に対する、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓによって誘導される抗体力価の大きさは、それがＩＡＶ－Ｓ ＲＰワクチンと組合せて適用された場合、影響を受けなかった。ＩＡＶ－Ｓワクチンの適用の筋肉内経路は、皮内経路と比較して、４つ全ての株に対して、より高いＨＩ力価（血清および初乳の両方において）を誘導した。子ブタの血清において測定されたＨＩ力価は肺における病変およびウイルス量の低減と相関した。
ＩＡＶ－Ｓ ＲＰ（ＥＵＳＩＶ－Ｔ８およびＥＵＳＩＶ－Ｋ）ワクチンはそれぞれの系統からの全ての試験された代表的な異種ＩＡＶ－Ｓ株に対して高い血清および初乳ＨＩ力価を誘導した。未経産雌ブタの血清、初乳および子ブタ血清におけるＨＩ力価間の直接的な相関性が観察された。ＩＡＶ－Ｓワクチンは、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓの代わりにＸＳｏｌｖｅ５０アジュバントと混合され適用された場合、４つ全てのＩＡＶ－Ｓ株に対して、より高いＨＩ力価を誘導した。５つ全ての大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉａ ｃｏｌｉ）型およびクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）β毒素に対する、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓによって誘導される抗体力価の大きさは、それがＩＡＶ－Ｓ ＲＰワクチンと組合せて適用された場合、影響を受けなかった。ＩＡＶ－Ｓワクチンの適用の筋肉内経路は、皮内経路と比較して、４つ全ての株に対して、より高いＨＩ力価（血清および初乳の両方において）を誘導した。子ブタの血清において測定されたＨＩ力価は肺における病変およびウイルス量の低減と相関した。
【0092】
実施例３ ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）に対する子ブタの乳汁／受動免疫防御
この実験は、Ｘｓｏｌｖｅ５０アジュバント中のＰＥＤＶスパイク糖タンパク質遺伝子をコードするＲＮＡ粒子でのワクチン接種によって誘導される、ＰＥＤＶに対する子ブタの乳汁／受動免疫防御を評価した。
この実験は、Ｘｓｏｌｖｅ５０アジュバント中のＰＥＤＶスパイク糖タンパク質遺伝子をコードするＲＮＡ粒子でのワクチン接種によって誘導される、ＰＥＤＶに対する子ブタの乳汁／受動免疫防御を評価した。
【0093】
研究デザイン
ＰＥＤＶスパイク糖タンパク質遺伝子をコードするＲＮＡ粒子（ＶＥＥＶ株ＴＣ－８３由来のレプリコン構築物に基づくアルファウイルスＲＮＡ ＲＰを含む凍結乾燥Ｔ９ ＲＮＡに基づくワクチン）を、血清学的および臨床的にＰＥＤを有さない２４頭の経産雌ブタに、分娩の８、４および２週間前に筋肉内ワクチン接種した。これは、ＵＳ病原性ＰＥＤＶ株ＡＨ２０１２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＣ２１０１４５を参照されたい）のスパイクタンパク質のコード配列を含むように構築された。用量当たり１ｍＬを、使用時に５０％となるようにＸ－Ｓｏｌｖｅと混合した。ブタを３～５日齢でＣＯ／２０１３株（ブタ１頭当たり１０６ ＴＣＩＤ５０）でＩＴチャレンジした。
ＰＥＤＶスパイク糖タンパク質遺伝子をコードするＲＮＡ粒子（ＶＥＥＶ株ＴＣ－８３由来のレプリコン構築物に基づくアルファウイルスＲＮＡ ＲＰを含む凍結乾燥Ｔ９ ＲＮＡに基づくワクチン）を、血清学的および臨床的にＰＥＤを有さない２４頭の経産雌ブタに、分娩の８、４および２週間前に筋肉内ワクチン接種した。これは、ＵＳ病原性ＰＥＤＶ株ＡＨ２０１２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＣ２１０１４５を参照されたい）のスパイクタンパク質のコード配列を含むように構築された。用量当たり１ｍＬを、使用時に５０％となるようにＸ－Ｓｏｌｖｅと混合した。ブタを３～５日齢でＣＯ／２０１３株（ブタ１頭当たり１０６ ＴＣＩＤ５０）でＩＴチャレンジした。
【表4】
【0094】
結果
このワクチンは３回のワクチン接種の後で中等度（８０～１６０）の血清ＰＥＤ中和（ＰＥＤ ＳＮ）力価を誘導した（図４）。ＰＥＤＶ血清中和力価を測定するために、ＦＦＮ（蛍光焦点中和）アッセイが用いられる。ワクチン接種された経産雌ブタから産まれた子ブタは、チャレンジ前の時点で、ＰＥＤチャレンジ株に対するＰＥＤ母体由来抗体（８０～６４０）を有していた（図５）。
このワクチンは３回のワクチン接種の後で中等度（８０～１６０）の血清ＰＥＤ中和（ＰＥＤ ＳＮ）力価を誘導した（図４）。ＰＥＤＶ血清中和力価を測定するために、ＦＦＮ（蛍光焦点中和）アッセイが用いられる。ワクチン接種された経産雌ブタから産まれた子ブタは、チャレンジ前の時点で、ＰＥＤチャレンジ株に対するＰＥＤ母体由来抗体（８０～６４０）を有していた（図５）。
【0095】
【0096】
実施例４ インフルエンザウイルスに対する子ブタの乳汁／受動免疫防御
実施例２に完全に対応して、この実験は、多胎産雌ブタにワクチン接種すること、および受動防御を実証することによって、５０％（ｖ／ｖ）Ｘｓｏｌｖｅアジュバントと混合された多重遺伝子ＩＡＶ－Ｓ ＨＡ ＲＮＡ粒子によって誘導される、Ａ型インフルエンザウイルスに対する子ブタの乳汁免疫防御を評価した。ただし、この場合は、６ＷＯＡにおいて、別のＩＡＶ－Ｓチャレンジ株、すなわち、Ａ／ブタ／ベルギー／１１３／２０１３（Ｈ３Ｎ２）に対する防御を評価した。
実施例２に完全に対応して、この実験は、多胎産雌ブタにワクチン接種すること、および受動防御を実証することによって、５０％（ｖ／ｖ）Ｘｓｏｌｖｅアジュバントと混合された多重遺伝子ＩＡＶ－Ｓ ＨＡ ＲＮＡ粒子によって誘導される、Ａ型インフルエンザウイルスに対する子ブタの乳汁免疫防御を評価した。ただし、この場合は、６ＷＯＡにおいて、別のＩＡＶ－Ｓチャレンジ株、すなわち、Ａ／ブタ／ベルギー／１１３／２０１３（Ｈ３Ｎ２）に対する防御を評価した。
【表6】
【0097】
図７は、チャレンジの１日後または３日後に測定された子ブタの加重肺病変スコア（ＬＬＳ）および平均±ＳＤを示す。平均値±ＳＤは、それぞれ６頭の同腹子に属する１５頭の動物に基づくものであった。１群当たり６頭の経産雌ブタを分娩の６週間前および２週間前にワクチン接種に付し、またはワクチン未接種対照として用いた。産まれた後代に６ＷＯＡでＡ／ブタ／ベルギー／１１３／２０１３（Ｈ３Ｎ２）ＩＡＶ－Ｓに感染させ、感染の１日後または３日後にそれらを解剖して、肺病変スコアを評価した。
【表7】
【0098】
図８は、チャレンジの１日後または３日後に採取された子ブタの肺組織のＩＡＶ－Ｓ力価および平均±ＳＤを示す。平均値±ＳＤは、それぞれ６頭の同腹子に属する１群当たり１５頭の動物に基づくものであった。１群当たり６頭の経産雌ブタを分娩の６週間前および２週間前にワクチン接種に付し、またはワクチン未接種対照として用いた。産まれた後代に６ＷＯＡでＡ／ブタ／ベルギー／１１３／２０１３（Ｈ３Ｎ２）ＩＡＶ－Ｓに感染させ、感染の１日後または３日後にそれらを解剖して、肺内のウイルス量を測定した。
【0099】
チャレンジ株に対する良好な免疫応答および防御が誘導されることは明らかである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【国際調査報告】