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特表2024-536714新たなコロナウイルスワクチンならびにウイルスワクチンをデザインおよび得るための方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-08
(54)【発明の名称】新たなコロナウイルスワクチンならびにウイルスワクチンをデザインおよび得るための方法
(51)【国際特許分類】
C12P 21/02 20060101AFI20241001BHJP
C07K 14/165 20060101ALI20241001BHJP
A61K 39/215 20060101ALI20241001BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20241001BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241001BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20241001BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20241001BHJP
C12N 15/50 20060101ALN20241001BHJP
【ＦＩ】
C12P21/02 C ZNA
C07K14/165
A61K39/215
A61K38/16
A61K48/00
A61P37/04
A61P31/14
C12N15/50
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024513763
(86)(22)【出願日】2022-08-31
(85)【翻訳文提出日】2024-04-26
(86)【国際出願番号】 EP2022074255
(87)【国際公開番号】W WO2023031306
(87)【国際公開日】2023-03-09
(31)【優先権主張番号】21194414.5
(32)【優先日】2021-09-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】504439274
【氏名又は名称】マックス－デルブリュック－ツェントルム フューア モレキュラーレ メディツィン イン デア ヘルムホルツ－ゲマインシャフト
(71)【出願人】
【識別番号】508374139
【氏名又は名称】エー・テー・ハー・チューリッヒ
【氏名又は名称原語表記】ＥＴＨ ＺＵＥＲＩＣＨ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(74)【代理人】
【識別番号】100221545
【弁理士】
【氏名又は名称】白江 雄介
(72)【発明者】
【氏名】デ ラ ロサ，カトリン
(72)【発明者】
【氏名】レベディン，ミハイル
(72)【発明者】
【氏名】ラツヴォール，クリストフ
(72)【発明者】
【氏名】バスケス ガルシア，クララ
(72)【発明者】
【氏名】ジルヴィス，カスパー
(72)【発明者】
【氏名】アイヤー，クラウス
(72)【発明者】
【氏名】シグヴァルダドッティル，インギビョルグ
(72)【発明者】
【氏名】オルソン，シモン
【テーマコード（参考）】
4B064
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG31
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA01
4C084AA02
4C084AA13
4C084BA44
4C084CA01
4C084DC50
4C084MA16
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZB09
4C084ZB33
4C085AA03
4C085BA71
4C085CC08
4C085EE01
4C085GG01
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA01
4H045DA86
4H045EA20
4H045EA31
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、コロナウイルスの突然変異受容体結合ドメイン（ｍＲＢＤ）（ｍＲＢＤ－ＣＯＲＯＮＡ）またはこの断片、およびＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片を含むコロナウイルスの突然変異スパイクタンパク質（ＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅ）またはこの断片に関する。その上、本発明は、ｍＲＢＤ－ＣＯＲＯＮＡもしくはこの断片またはＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含むポリペプチドまたはタンパク質、およびｍＲＢＤ－ＣＯＲＯＮＡもしくはこの断片またはＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。その上、本発明は、本発明による、１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅ、１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質、および／または１つもしくは複数の核酸を含むワクチン組成物に関する。その上、本発明は、対象においてコロナウイルスにより引き起こされる疾患の予防および／または治療における使用のための、本発明による、１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅ、１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質、１つもしくは複数の核酸、および／またはワクチン組成物に関する。その上、本発明は、本発明による、ワクチン組成物用の活性成分をデザインおよび／または得るための方法、ならびにＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤを得るための方法によってデザインおよび／または得られたＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ワクチン組成物用の活性成分をデザインおよび／または得るための方法であって、（ｉ）ウイルスの野生型受容体結合ドメイン（ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ）に１つまたは複数の突然変異を含む、ウイルスの突然変異受容体結合ドメイン（ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤ）またはこの断片を用意する工程と、
（ｉｉ）ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片が
ａ）ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤと比較した、ウイルスの受容体結合ドメインの受容体（ＲＢＤ受容体）（ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体）に対する結合力の低下
を示すかどうかを決定する工程と、
（ｉｉｉ）ａ）が満たされるとき、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を活性成分として選択する工程と
を含む方法。
【請求項2】
（ｉｉ）の工程において、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片が、ｂ）抗ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ中和抗体（ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢ）に対する結合、ならびに
ｃ）適宜、タンパク質および／またはペプチドの安定性
を示すかどうかを決定することと、
（ｉｉｉ）の工程において、ａ）およびｂ）が同時に、ならびに適宜ａ）、ｂ）、およびｃ）が同時に満たされるとき、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を活性成分として選択することと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
（ｉ）の工程が、それぞれがＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤに１つまたは複数の突然変異を含むＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片のライブラリーを用意することを含み、ここで、ライブラリーに含まれるＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片の突然変異が少なくとも部分的に異なり、（ｉｉ）の工程が、
ａ）ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤと比較した、ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体に対する結合力の低下
を示すＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片についてライブラリーをスクリーニングすることにより実施され、
（ｉｉｉ）の工程が、ライブラリーから、ａ）を満たす１つまたは複数のＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を活性成分として選択することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
（ｉｉ）の工程が、ａ）ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤと比較した、ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体に対する結合力の低下、ならびに
ｂ）ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対する結合、ならびに
ｃ）適宜、タンパク質および／またはペプチドの安定性
を示すＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片についてライブラリーをスクリーニングすることにより実施され、
（ｉｉｉ）の工程が、ライブラリーから、ａ）およびｂ）を同時に満たし、ならびに適宜、ｃ）を同時に満たす１つまたは複数のＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を活性成分として選択することを含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項5】
（ｉｉｉ）の工程が、ライブラリーの１つまたは複数のＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片をａ）ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤと比較して、ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体に対する結合力を低下させるこれらの能力、ならびに
ｂ）適宜、ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対して結合するこれらの能力、ならびに
ｃ）さらに適宜、タンパク質および／またはペプチドの安定性を示すこれらの能力
についてスコアリングすることと、
スコアリングに基づいて、ライブラリーから、ａ）についての最高スコア、またはａ）およびｂ）ならびに適宜ｃ）の組合せについての最高スコアを有する１つまたは複数のＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を活性成分として選択することと
をさらに含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項6】
（ｉ）および（ｉｉ）の工程をインビトロで実施し、ならびに／または（ｉｉｉ）の工程におけるスコアリングをインシリコで実施する、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項7】
－ ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤが、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤ、より好ましくは、本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤおよび／またはＭＥＲＳ－ｍＲＢＤであり、－ ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤが、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ、より好ましくは、本発明によるＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ（配列番号１）および／またはＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ（配列番号１９４）であり、
－ ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体が、ＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体、より好ましくは、ＡＣＥ２および／またはＤＰＰ４であり、
－ ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢが、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢ、より好ましくは、本発明によるＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢおよび／またはＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢであり、
－ ＶＩＲＵＳ－ｍＳｐｉｋｅが、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅ、より好ましくは、本発明によるＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅおよび／またはＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅである、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項8】
請求項のいずれかに記載の方法により活性成分として得られたＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片。
【請求項9】
コロナウイルスのＲＢＤ受容体（ＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体）に対する結合力が、コロナウイルスの野生型受容体結合ドメイン（ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ）と比較して低下した、コロナウイルスの突然変異受容体結合ドメイン（ｍＲＢＤ）（ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤ）またはこの断片。
【請求項10】
抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ中和抗体に対する結合を示す、請求項９に記載のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片。
【請求項11】
細胞間融合を減少させる、請求項９または１０に記載のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片。
【請求項12】
細胞性抗原取込みおよび／または受容体内部移行を減少させる、請求項９から１１に記載のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片。
【請求項13】
（Ａ）コロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２型）であり、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の突然変異受容体結合ドメイン（ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤ）またはこの断片であり、
野生型受容体結合ドメインが、ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型受容体結合ドメイン）であり、
ＲＢＤ受容体が、ＡＣＥ２（アンジオテンシン変換酵素２）であるか、あるいは
（Ｂ）コロナウイルスが、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ（中東呼吸器症候群コロナウイルス）であり、
ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤが、ＭＥＲＳ－ＣｏＶの突然変異受容体結合ドメイン（ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤ）またはこの断片であり、
野生型受容体結合ドメインが、ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ（ＭＥＲＳ－ＣｏＶの野生型受容体結合ドメイン）であり、
ＲＢＤ受容体が、ＤＰＰ４（ジペプチジルペプチダーゼ４）である、請求項９から１２に記載のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片。
【請求項14】
（Ａ）ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片が、配列番号１のＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤのＧ１８４、Ｙ１８７、Ｌ１３７、Ｙ１７１、Ｆ１３８、Ｑ１８０、Ｆ１６８、Ｙ１３１もしくはＳ５５から選択される位置におけるアミノ酸残基の１つもしくは複数の置換を含むアミノ酸配列もしくはこの断片を含み、ここで、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片が、置換を除いて、配列番号１に対する８５％以上のアミノ酸配列同一性を有し、および／または（Ｂ）ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片が、配列番号１９４のＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤのＬ１４０、Ｄ１４４、Ｅ１７０、Ｄ１７１もしくはＤ１７３から選択される位置におけるアミノ酸残基の１つもしくは複数の置換を含むアミノ酸配列もしくはこの断片を含み、ここで、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片が、置換を除いて、配列番号１９４に対する８５％以上のアミノ酸配列同一性を有する、請求項９から１３に記載のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片。
【請求項15】
（Ａ）ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片では、－ Ｇ１８４の位置におけるアミノ酸残基の置換が、Ｇ１８４Ａ、Ｇ１８４Ｃ、Ｇ１８４Ｄ、Ｇ１８４Ｅ、Ｇ１８４Ｆ、Ｇ１８４Ｈ、Ｇ１８４Ｉ、Ｇ１８４Ｋ、Ｇ１８４Ｌ、Ｇ１８４Ｍ、Ｇ１８４Ｎ、Ｇ１８４Ｐ、Ｇ１８４Ｑ、Ｇ１８４Ｒ、Ｇ１８４Ｓ、Ｇ１８４Ｔ、Ｇ１８４Ｖ、Ｇ１８４ＷもしくはＧ１８４Ｙから選択され、
－ Ｙ１８７の位置におけるアミノ酸残基の置換が、Ｙ１８７Ａ、Ｙ１８７Ｃ、Ｙ１８７Ｄ、Ｙ１８７Ｅ、Ｙ１８７Ｇ、Ｙ１８７Ｉ、Ｙ１８７Ｋ、Ｙ１８７Ｌ、Ｙ１８７Ｍ、Ｙ１８７Ｎ、Ｙ１８７Ｑ、Ｙ１８７Ｒ、Ｙ１８７Ｓ、Ｙ１８７ＴもしくはＹ１８７Ｖから選択され、
－ Ｌ１３７の位置におけるアミノ酸残基の置換が、Ｌ１３７Ｄ、Ｌ１３７Ｅ、Ｌ１３７Ｋ、Ｌ１３７ＲもしくはＬ１３７Ｙから選択され、
－ Ｙ１７１の位置におけるアミノ酸残基の置換が、Ｙ１７１Ａ、Ｙ１７１Ｃ、Ｙ１７１Ｅ、Ｙ１７１Ｉ、Ｙ１７１Ｋ、Ｙ１７１Ｌ、Ｙ１７１Ｍ、Ｙ１７１Ｎ、Ｙ１７１Ｐ、Ｙ１７１Ｑ、Ｙ１７１Ｒ、Ｙ１７１Ｓ、Ｙ１７１ＴもしくはＹ１７１Ｖから選択され、
－ Ｆ１３８の位置におけるアミノ酸残基の置換が、Ｆ１３８Ａ、Ｆ１３８Ｃ、Ｆ１３８Ｅ、Ｆ１３８Ｇ、Ｆ１３８Ｉ、Ｆ１３８Ｋ、Ｆ１３８Ｎ、Ｆ１３８Ｑ、Ｆ１３８Ｒ、Ｆ１３８Ｓ、Ｆ１３８Ｔ、Ｆ１３８ＷもしくはＦ１３８Ｙから選択され、
－ Ｑ１８０の位置におけるアミノ酸残基の置換が、Ｑ１８０Ｃ、Ｑ１８０Ｄ、Ｑ１８０Ｉ、Ｑ１８０Ｋ、Ｑ１８０ＬもしくはＱ１８０Ｖから選択され、
－ Ｆ１６８の位置におけるアミノ酸残基の置換が、Ｆ１６８Ｃ、Ｆ１６８ＤもしくはＦ１６８Ｅから選択され、
－ Ｙ１３１の位置におけるアミノ酸残基の置換が、Ｙ１３１Ａ、Ｙ１３１Ｃ、Ｙ１３１Ｄ、Ｙ１３１Ｅ、Ｙ１３１Ｆ、Ｙ１３１Ｇ、Ｙ１３１Ｈ、Ｙ１３１Ｉ、Ｙ１３１Ｌ、Ｙ１３１Ｍ、Ｙ１３１Ｎ、Ｙ１３１Ｐ、Ｙ１３１Ｑ、Ｙ１３１Ｓ、Ｙ１３１Ｔ、Ｙ１３１ＶもしくはＹ１３１Ｗから選択され、および／または
－ Ｓ５５の位置におけるアミノ酸残基の置換が、Ｓ５５Ｎであり、ならびに／あるいは
（Ｂ）ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片では、
－ Ｌ１４０の位置におけるアミノ酸残基の置換が、Ｌ１４０Ａであり、
－ Ｄ１４４の位置におけるアミノ酸残基の置換が、Ｄ１４４Ａであり、
－ Ｅ１７０の位置におけるアミノ酸残基の置換が、Ｅ１７０Ｒであり、
－ Ｄ１７１の位置におけるアミノ酸残基の置換が、Ｄ１７１Ｋであり、および／または
－ Ｄ１７３の位置におけるアミノ酸残基の置換が、Ｄ１７３Ｋである、請求項９から１４のいずれかに記載のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片。
【請求項16】
（Ａ）ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片が、配列番号１のＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤのＧ１８４もしくはＬ１３７から選択される位置におけるアミノ酸残基の１つの置換を含むアミノ酸配列もしくはこの断片を含み、ここで、－ Ｇ１８４の位置におけるアミノ酸残基の置換が、Ｇ１８４Ｅ、Ｇ１８４ＲもしくはＧ１８４Ｄから選択され、
－ Ｌ１３７の位置におけるアミノ酸残基の置換が、Ｌ１３７Ｒであり、ならびに／または
（Ｂ）ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片が、配列番号１９４のＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤのＤ１４４およびＤ１７１から選択される位置におけるアミノ酸残基の１つの置換を含むアミノ酸配列もしくはこの断片を含み、ここで、
－ Ｄ１４４の位置におけるアミノ酸残基の置換が、Ｄ１４４Ａであり、
－ Ｄ１７１の位置におけるアミノ酸残基の置換が、Ｄ１７１Ｋである、請求項９から１５のいずれかに記載のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片。
【請求項17】
（Ａ）ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片が、配列番号１５、配列番号１７、配列番号５、配列番号２０、配列番号９、配列番号１６、配列番号１３、配列番号２、配列番号３、配列番号１８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１１、配列番号７または配列番号１０、配列番号５５または配列番号３０から選択されるアミノ酸配列を含み、（Ｂ）ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片が、配列番号１９５または配列番号１９６から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９から１６のいずれかに記載のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片。
【請求項18】
請求項９から１７のいずれかに記載のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片を含む、コロナウイルスの突然変異スパイクタンパク質（ＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅ）またはこの断片。
【請求項19】
請求項９から１７のいずれかに記載のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または請求項１８に記載のＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含むポリペプチドまたはタンパク質。
【請求項20】
－ 請求項９から１７のいずれかに記載のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、－ 請求項１８に記載のＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片、または
－ 請求項１９に記載のポリペプチドもしくはタンパク質
をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項21】
活性成分として、－ 請求項９から１７のいずれかに記載の１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、および／または
－ 請求項１８に記載の１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片、および／または
－ 請求項１９に記載の１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質、および／または
－ 請求項２０に記載の１つもしくは複数の核酸
を含むワクチン組成物。
【請求項22】
対象においてコロナウイルスにより引き起こされる疾患の予防および／または治療における使用のための、請求項９から１７のいずれかに記載の１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、および／または
請求項１８に記載の１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片、および／または
請求項１９に記載の１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質、および／または
請求項２０に記載の１つもしくは複数の核酸、および／または
請求項２１に記載のワクチン組成物。
【請求項23】
対象においてコロナウイルスにより引き起こされる疾患、好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２により引き起こされるＣＯＶＩＤ－１９および／またはＭＥＲＳ－ＣｏＶにより引き起こされるＭＥＲＳの予防および／または治療のための方法であって、請求項９から１７に記載の１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、
請求項１８に記載の１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片、
請求項１９に記載の１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質、
請求項２０に記載の１つもしくは複数の核酸、および／または
請求項２１に記載のワクチン組成物
を対象に投与することを含む方法。
【請求項24】
対象において、好ましくはコロナウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶに対する免疫応答を誘導するための方法であって、請求項９から１７に記載の１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、
請求項１８に記載の１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片、
請求項１９に記載の１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質、
請求項２０に記載の１つもしくは複数の核酸、および／または
請求項２１に記載のワクチン組成物
を対象に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、コロナウイルスの突然変異受容体結合ドメイン（ｍＲＢＤ）（ｍＲＢＤ－ＣＯＲＯＮＡ）またはこの断片、およびＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片を含むコロナウイルスの突然変異スパイクタンパク質（ＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅ）またはこの断片に関する。
【0002】
その上、本発明は、ｍＲＢＤ－ＣＯＲＯＮＡもしくはこの断片またはＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含むポリペプチドまたはタンパク質、およびｍＲＢＤ－ＣＯＲＯＮＡもしくはこの断片またはＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
【0003】
その上、本発明は、本発明による、１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅ、１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質、および／または１つもしくは複数の核酸を含むワクチン組成物に関する。
【0004】
その上、本発明は、対象においてコロナウイルスにより引き起こされる疾患の予防および／または治療における使用のための、本発明による、１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅ、１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質、１つもしくは複数の核酸、および／またはワクチン組成物に関する。
【0005】
その上、本発明は、本発明による、ワクチン組成物用の活性成分をデザインおよび／または得るための方法、ならびにＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤを得るための方法によってデザインおよび／または得られたＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片に関する。
【背景技術】
【0006】
アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の細胞への侵入を媒介する受容体として作用する。膜結合型のＡＣＥ２受容体は、プロテアーゼ、例えば、ＡＤＡＭ１７（腫瘍壊死因子アルファコンバターゼ）およびＴＭＰＲＳＳ２（膜貫通セリンプロテアーゼ亜型）により切断され、これにより可溶性ＡＣＥ２（ｓＡＣＥ２）の細胞外間隙内への排出が促進される。可溶性ＡＣＥ２は、酵素的に活性な型（活性ＡＣＥ２）および酵素的に不活性な型（不活性ＡＣＥ２）で存在する。
【0007】
重要なことには、ウイルスを中和する血清の能力は、中和抗体（ｎＡＢ）に依存する。ＡＣＥ２とスパイクとの相互作用に干渉する抗体の誘導は、免疫応答の中和を生じ、防御免疫を付与するのに重要である。しかし、Ｂ細胞の活性化および強力な抗体の親和性成熟は、抗原、すなわち、スパイクタンパク質またはスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の利用可能性に強く依存する。
【発明の概要】
【0008】
本発明は、可溶性受容体が免疫原に結合することにより、抗原がマスクされることによって液性免疫が妨害されるという発明者らの発見に基づく（図１）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２では、感染および免疫化の間に高濃度のｓＡＣＥ２がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクをマスクし、これにより、ＲＢＤの受容体結合インターフェースであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）への抗体の成熟に結果的に干渉することを示すことができた。高濃度の可溶性受容体および／または高結合親和性により、エピトープのマスキングが増強されることを示すことができた。重要なことには、ＡＣＥ２の結合を阻止する突然変異の導入により、可溶性ＡＣＥ２によるマスキングが抑止され、これによって可溶性受容体存在下でのＲＢＭ結合抗体の産生が助長されることを示すことができた。ワクチンに対する免疫応答が宿主受容体への結合の阻止によって向上し得るため、この発見はワクチン抗原のデザインに特に重要である。
【0009】
ＡＣＥ２と同様に、ウイルスの他の受容体、例として、ＤＰＰ４が排出されることがあり、これはＭＥＲＳ－ＣｏＶコロナウイルスの受容体であり、健常なヒト対象の血中に高濃度で存在する。同様に、他のウイルスもウイルス侵入に受容体を使用し、これも免疫応答に干渉し得る濃度の可溶性バージョンで存在する。
【0010】
一方、特定のワクチン接種／免疫／自然感染によってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する十分な免疫が付与されないことが、個体の５～４０％において認められている。さらに、ＲＢＤに対して産生される抗体は、ウイルススパイクの他の部分に対する抗体よりも急速に減退する（https://www.cell.com/action/showPdf?pii=S0092-8674%2821%2900706-6）。その上、ワクチン接種後に誘発されるメモリーＢ細胞により産生される抗体は、自然感染により誘発される抗体と比較して効力が低いことが示されている（https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.07.29.454333v1.full.pdf）。
【0011】
その上、新たに出現したウイルス変異体は、これらの受容体に対する親和性が向上し得ることが見出されている（図１１）。したがって、本発明者らは、これらの高親和性変異体に基づく将来のワクチンは、ｓＡＣＥ２によるマスキングに対してさらに感受性であり得ると結論づける。新規の変異体に対する同レベルの防御を達成するために、より高親和性の抗体が必要とされる。したがって、可溶性受容体のマスキングを回避するワクチンは、現行のウイルスの進化によって、より高親和性のウイルス株の出現が引き起こされる場合、なお一層重要となる。
【0012】
上記を考慮すると、上述の問題を克服する改良ワクチンに対する差し迫った必要性が存在する。本発明の主要な目的は、このようなワクチンを得るための方法を提供することである。
【0013】
本発明は、上述の目的のすべてが、受容体に対する結合力が低下したコロナウイルスの受容体結合ドメインを免疫化に使用することによって解決可能であるという驚くべき知見に基づく。
【0014】
本発明は、上述の目的のすべてが、１つまたは複数のアミノ酸の置換を有するコロナウイルスの突然変異受容体結合ドメインの使用によって解決可能であるという驚くべき知見にさらに基づく。
【0015】
その上、本発明は、上述の目的のすべてが、それぞれ異なるアミノ酸の置換を有するコロナウイルスの突然変異受容体結合ドメインの組合せの使用によって解決可能であるという驚くべき知見にさらに基づく。
【0016】
本発明は、上述の目的のすべてが、その受容体に対する結合力が低下した受容体結合ドメインをスクリーニングすることにより、ウイルスの受容体結合ドメインをデザインおよび／または得る方法を使用することによって解決可能であるという驚くべき知見にさらに基づく。
【0017】
したがって、本発明では、コロナウイルスのＲＢＤ受容体（ＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体）に対する結合力がコロナウイルスの野生型受容体結合ドメイン（ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ）と比較して低下した、コロナウイルスの突然変異受容体結合ドメイン（ｍＲＢＤ）（ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤ）またはこの断片を提供する。
【0018】
本発明者らは、一部の個体においてｓＡＣＥ２レベルが増加することを示すことができ、この血中濃度を適切に評価するためのアッセイを開発した。その結果として、ｓＡＣＥ２が増加した人は、防御性の低い免疫応答が生じるリスクを有する。ｓＡＣＥ２の放出が増加した個体は同定され、上記の改良ワクチンのデザインから利益を得ることができた。加えて、発明者らは、重症患者において、感染直後にｓＡＣＥ２レベルが増加することを示すことができた。したがって、改良ワクチンは、感染前に重要であるだけでなく、感染直後に投与して防御抗体の発生を促進するときにも特に有用であり得る。
【0019】
したがって、本発明の目的は、対象において、高レベルの可溶性受容体存在下でもコロナウイルスに対して、および／またはマスキング作用が増大したコロナウイルス突然変異体に対して高度に効率的な免疫応答の誘発を可能とする、コロナウイルスの突然変異受容体結合ドメイン（ｍＲＢＤ）（ＣＯＲＯＮＡｍＲＢＤ）を提供することである。本発明のさらなる目的は、このような突然変異受容体結合ドメイン（ｍＲＢＤ）を適時かつ効率的に入手して、ウイルス、特に、新たに出現したウイルス変異体の伝播を阻止し、従来のワクチン接種／免疫および／または自然感染により十分な免疫が付与されていない個体を含む可能な限り多くの個体を防御する方法を提供することである。
【0020】
まとめると、本発明者らは、ヒトおよびマウスの両方において、可溶性ウイルス受容体、特に、可溶性コロナウイルス受容体が、これらの抗原への結合を介して重要なエピトープのマスキングを媒介し、これによって防御抗体応答を障害することを見出した。エピトープマスキングのこの機構は、これまでには抗体についてのみ記載されており、ウイルス受容体については記載されていなかった。
【0021】
本発明者らは、血中のｓＡＣＥ２レベルの増加が重度のＣＯＶＩＤ－１９疾患と関連することを示すことができた。その上、ｓＡＣＥ２レベルが高い患者は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に特異的な抗体力価の著しい低下を示した。したがって、これらの患者は、ＡＣＥ２に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の結合を遮断する能力の著しい低下をも示した。
【0022】
特に、本発明者らは、可溶性受容体が防御免疫応答に干渉するということを初めて示し、機構についての証拠を提供した。
【0023】
その上、本発明者らは、マウスにおいてｓＡＣＥ２が、受容体ＡＣＥ２に対するウイルスの結合を遮断するＲＢＤ特異的抗体を産生するＢ細胞の生成を著しく低下させることを示すことができた（図１）。マウス血清の解析により、免疫に対する抗体応答がそれほど効率的ではないことが確認された。
【0024】
さらに、本発明者らは、インシリコでの算出により、英国および南アフリカにおいてそれぞれ出現したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体Ｂ．１．１．７および５０１．Ｖ２のような突然変異が、マスキング作用を向上させることを示すことができた（図８）。
【0025】
本発明は、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片を含むコロナウイルスの突然変異スパイクタンパク質（ＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅ）またはこの断片を提供する。
【0026】
その上、本発明は、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含むポリペプチドまたはタンパク質を提供する。
【0027】
その上、本発明は、
－ 本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、
－ 本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片、または
－ 本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質
をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
－ 本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、
－ 本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片、または
－ 本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質
をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【0028】
その上、本発明は、活性成分として、
－ 本発明による１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、および／または
－ 本発明による１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片、および／または
－ 本発明による１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質、および／または
－ 本発明による１つもしくは複数の核酸
を含むワクチン組成物を提供する。
－ 本発明による１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、および／または
－ 本発明による１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片、および／または
－ 本発明による１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質、および／または
－ 本発明による１つもしくは複数の核酸
を含むワクチン組成物を提供する。
【0029】
その上、本発明は、対象においてコロナウイルスにより引き起こされる疾患の予防および／または治療における使用のための、
本発明による１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、および／または
本発明による１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片、および／または
本発明による１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質、および／または
本発明による１つもしくは複数の核酸、および／または
本発明によるワクチン組成物
を提供する。
本発明による１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、および／または
本発明による１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片、および／または
本発明による１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質、および／または
本発明による１つもしくは複数の核酸、および／または
本発明によるワクチン組成物
を提供する。
【0030】
その上、本発明は、ワクチン組成物用の活性成分をデザインおよび／または得るための方法であって、
（ｉ）ウイルスの野生型受容体結合ドメイン（ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ）に１つまたは複数の突然変異を含む、ウイルスの突然変異受容体結合ドメイン（ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤ）またはこの断片を用意する工程と、
（ｉｉ）ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片が
ａ）ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤと比較した、ウイルスの受容体結合ドメインの受容体（ＲＢＤ受容体）（ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体）に対する結合力の低下
を示すかどうかを決定する工程と、
（ｉｉｉ）ａ）が満たされるとき、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を活性成分として選択する工程と
を含む方法に関する。
（ｉ）ウイルスの野生型受容体結合ドメイン（ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ）に１つまたは複数の突然変異を含む、ウイルスの突然変異受容体結合ドメイン（ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤ）またはこの断片を用意する工程と、
（ｉｉ）ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片が
ａ）ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤと比較した、ウイルスの受容体結合ドメインの受容体（ＲＢＤ受容体）（ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体）に対する結合力の低下
を示すかどうかを決定する工程と、
（ｉｉｉ）ａ）が満たされるとき、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を活性成分として選択する工程と
を含む方法に関する。
【0031】
その上、本発明は、本発明による、ワクチン組成物用の活性成分をデザインおよび／または得るための方法によって、活性成分として得られたＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を提供する。
【0032】
野生型（ｗｔ）は、天然に存在する種の典型の表現型である。したがって、本発明では、ｗｔＲＢＤは、天然に存在する病原体、すなわち、集団内に拡散することが観察された病原体の任意のＲＢＤである。これは、感染した個体（ヒトまたは動物）から単離され、シーケンシングによりゲノムが定義された。
【0033】
特に、ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤは、天然に存在するウイルスに属し、特に、公式のウイルス変異体としてＷＨＯにより定義されており、注目すべき変異株（Ｖａｒｉａｎｔｓ－ｏｆ－ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＶＯＩ）、懸念される変異株（Ｖａｒｉａｎｔｓ－ｏｆ－ｃｏｎｃｅｒｎ、ＶＯＣ）、ならびに特に懸念されるウイルス（Ｖｉｒｕｓｅｓ－ｏｆ－ｓｐｅｃｉａｌ ｃｏｎｃｅｒｎ）を含む。このような天然に存在するウイルス変異体は、最初に出現したＷｕｈａｎ変異体と比較して変異を包含するため、突然変異体と表されることもある。しかし、本発明では、天然に存在するウイルス、特に、ウイルス変異体は、ｗｔＲＢＤを有する。
【0034】
したがって、ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤは、疾病管理センターのプラットフォーム上ならびに共通リポジトリ、例えば、https://www.ecdc.europa.eu/en、https://www.cdc.gov、https://www.gisaid.org、https://nextstrain.org、https://cov-lineages.orgまたはhttps://microbiologysociety.org上で入手可能なウイルス配列を含む。
【0035】
突然変異体は、突然変異の発現に起因するかまたは生じる新たな遺伝的形質であり、一般には、生物のゲノムまたは染色体のＤＮＡ配列の変化である。したがって、本発明では、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤは、上に定義するこのＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤと比較して遺伝子修飾されており、この受容体に対する結合力の低下がＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤと比較して生じる任意のＶＩＲＵＳ－ＲＢＤである。したがって、特に、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤは、天然に存在する病原体、特に、上に定義するウイルスには属さない。したがって、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤは、ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤとは異なる。集団内で増殖するウイルス変異体は、本明細書に定義するＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤを有し得ない。
【0036】
コロナウイルスの突然変異受容体結合ドメイン（ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤ）
本発明は、コロナウイルスの突然変異受容体結合ドメイン（ｍＲＢＤ）（ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤ）またはこの断片を提供する。
本発明は、コロナウイルスの突然変異受容体結合ドメイン（ｍＲＢＤ）（ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤ）またはこの断片を提供する。
【0037】
特に、本発明は、コロナウイルスのＲＢＤ受容体（ＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体）に対する結合力がコロナウイルスの野生型受容体結合ドメイン（ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ）と比較して低下した、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片を提供する。
【0038】
好ましくは、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、コロナウイルススパイクタンパク質の突然変異受容体結合ドメイン（ｍＲＢＤ）（ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤ）またはこの断片である。
【0039】
好ましくは、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、ペプチドまたはタンパク質、好ましくは、タンパク質である。
【0040】
好ましくは、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、本発明による、ワクチン組成物用の活性成分をデザインおよび／または得るための方法によって、以下に記載する活性成分として得られる。
【0041】
好ましくは、ＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体は、可溶性型および／または膜結合型のＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体、好ましくは、可溶性型のＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体（可溶性ＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体）である。可溶性ＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体は、活性および不活性型の可溶性ＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体を含み得る。
【0042】
ＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体に対するＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片およびＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤの結合力は、当業者に公知の任意の方法により測定することができる。例として、結合力は、例えば、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤを細胞表面上に発現する細胞を、フルオロフォアで直接的もしくは間接的に標識したＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体で染色して、または反対に、ＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体を細胞表面上に発現する細胞を、フルオロフォアで直接的もしくは間接的に標識した可溶性ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくは可溶性ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤで染色して、フローサイトメトリー解析を行い、陽染性細胞を計数することによって決定するか、あるいはＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤまたはＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤのそれぞれのＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体に対するＫｄ（解離定数）またはＥＣ５０（最大結合の５０％における有効濃度）のＥＬＩＳＡの使用による決定によって決定することができる。次いで、結合力の低下が、ＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体に対するＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤの結合力を、ＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体に対するＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤの結合力と比較することにより得られる。
【0043】
好ましくは、結合力は、ＥＣ５０またはＫｄを決定することにより測定し、ここで、ＥＣ５０またはＫｄが高くなると、結合力が低くなることを示す。または、結合力は、フローサイトメトリー解析により測定し、ここで、陽染性細胞数が減少すると結合力が低くなることを示す。したがって、結合力の低下は、好ましくは、ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤとＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体との結合から生じるＥＣ５０、Ｋｄ、および／または陽染性細胞数を、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤとＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体との結合から生じるＥＣ５０、Ｋｄ、および／または陽染性細胞数とそれぞれ比較することによって決定する。ＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体としてＡＣＥ２、コロナウイルスとしてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ならびに対応するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型および突然変異型ＲＢＤ（ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤおよびＳＡＲＳ－ｍＲＢＤ）に基づくＥＣ５０を決定するための例は、実施例４に提示する。ＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体としてＤＰＰ４、コロナウイルスとしてＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ならびにＭＥＲＳ－ＣｏＶの野生型および突然変異型ＲＢＤ（ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤおよびＭＥＲＳ－ｍＲＢＤ）に基づくＥＣ５０を決定するための別の例は、実施例７に提示する。
【0044】
結合力の低下をＥＣ５０またはＫｄの決定により決定する場合、ＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体に対するＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤの結合力の低下は、好ましくは、ＥＣ５０および／またはＫｄの１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらにより好ましくは１０倍以上、なおより好ましくは１００倍以上、なおさらにより好ましくは５００倍以上、および最も好ましくは１０００倍以上の増加によって示す。ワクチン接種による最良の作用を得るために、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤをワクチンとして使用する場合、ＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体に対する結合力は、可能な限り低下させなければならない。したがって、好ましくは、ＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体に対する結合力の低下に関して上限は存在しない。したがって、好ましくは、ＥＣ５０またはＫｄの増加に関して上限は存在しない。とは言え、ＥＣ５０またはＫｄの増加に関する上限は、５００．０００倍以下、より好ましくは１００．０００倍以下、さらにより好ましくは１０．０００倍以下であり得る。ＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体としてＡＣＥ２、コロナウイルスとしてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型および突然変異型ＲＢＤ（ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤおよびＳＡＲＳ－ｍＲＢＤ）に基づくＥＣ５０を決定するための例は、実施例４に提示する。ＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体としてＤＰＰ４、コロナウイルスとしてＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ならびにＭＥＲＳ－ＣｏＶの野生型および突然変異型ＲＢＤ（ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤおよびＭＥＲＳ－ｍＲＢＤ）に基づくＥＣ５０を決定するための別の例は、実施例７に提示する。
【0045】
結合力の低下をフローサイトメトリー解析により決定する場合、ＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体に対するＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤの結合力の低下は、好ましくは、陽染性細胞数の５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、なおより好ましくは９５％以上、およびなおさらにより好ましくは９８％以上の減少によって示す。ワクチン接種による最良の作用を得るために、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤをワクチンとして使用する場合、ＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体に対する結合力は、可能な限り低下させなければならない。したがって、好ましくは、ＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体に対する結合力の低下に関して上限は存在しない。したがって、好ましくは、陽染性細胞の減少に関して上限は存在せず、この減少は１００％でさえあり得る。とは言え、陽染性細胞の減少に関する上限は、１００％以下、より好ましくは、９９％以下であり得る。
【0046】
その上、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、好ましくは、抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ中和抗体（抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢ）に対する結合を示す。すなわち、抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ中和抗体（抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢ）に対する結合力は、好ましくは、維持される。すなわち、ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤと比較して、わずかに中程度に結合力が低下して、結合力が増加するまでの範囲となる。
【0047】
抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢは、クラスＩ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩ、および／もしくはクラスＩＶのような種々の抗体クラスに属し得、ならびに／またはＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤの種々のエピトープに特異的であり得る。抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢは、ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤに対して反応性のモノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢは、組換えにより得ることができる。ポリクローナル抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢは、コロナウイルス感染を経験した免疫対象、例えば、回復期対象および／または例えば、ワクチン接種により免疫化した免疫化対象に由来する血漿または血清から得ることができ、ここで、このような免疫対象は、好ましくは、ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤに免疫学的に反応性である。対象は、好ましくは、脊椎動物、より好ましくは免疫哺乳動物、より好ましくは類人猿、サル、キツネザル、イヌ科動物、例えば、イヌ、オオカミもしくはキツネ、ネコ科動物、例えば、大型もしくは小型のネコ、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスターもしくはウサギ、ウシ科動物、例えば、バッファロー、アンテロープ、ヒツジ、ヤギもしくはウシ、シカ、ウマ、ロバ、クマ、テン、コウモリ、および／またはヒトである。なおより好ましくは、免疫対象は、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ヤギ、ロバ、ウマ、イヌ、ネコ、ヒツジまたはヒト等、最も好ましくは、ヒトである。
【0048】
抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片およびＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤの結合力は、当業者に公知の任意の方法により測定することができる。例として、結合力は、例えば、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤを細胞表面上に発現する細胞を、フルオロフォアで直接的もしくは間接的に標識したモノクローナル抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢで染色して、または反対に、モノクローナル抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢを細胞表面上に発現する細胞を、フルオロフォアで直接的もしくは間接的に標識した可溶性ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくは可溶性ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤで染色して、フローサイトメトリー解析を行い、陽染性細胞を計数することによって決定するか、あるいはモノクローナル抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤおよびＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤのＫｄ（解離定数）もしくはＥＣ５０（最大結合の５０％における有効濃度）のＥＬＩＳＡの使用による決定、またはコロナウイルス感染を経験した免疫対象、例えば、回復期対象および／もしくは例えば、ワクチン接種により免疫化した免疫化対象由来の血漿もしくは血清のポリクローナル抗体のＥＤ５０（血清抗体の５０％が結合する有効希釈度）の決定によって決定することができ、ここで、このような免疫対象は、好ましくは、ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤに免疫学的に反応性である。免疫対象は、上に定義するものである。抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢとして抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ｗｔＲＢＤ中和抗体（抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢ）、コロナウイルスとしてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型および突然変異型ＲＢＤ（ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤおよびＳＡＲＳ－ｍＲＢＤ）に基づくＥＣ５０、Ｋｄ、およびＥＤ５０を決定するための例は、実施例４に提示する。抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢとして抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ｗｔＲＢＤ中和抗体（抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢ）、コロナウイルスとしてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型および突然変異型ＲＢＤ（ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤおよびＳＡＲＳ－ｍＲＢＤ）に基づくＥＣ５０を決定するための例は、実施例４に提示する。抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢとして抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶ－ｗｔＲＢＤ中和抗体（抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢ）、コロナウイルスとしてＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ならびにＭＥＲＳ－ＣｏＶの野生型および突然変異型ＲＢＤ（ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤおよびＭＥＲＳ－ｍＲＢＤ）に基づくＥＣ５０を決定するための別の例は、実施例７に提示する。
【0049】
抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢの結合力をフローサイトメトリー解析、ＥＣ５０、および／またはＫｄにより決定する場合、結合力は、好ましくは、いくつかの異なるモノクローナル抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢ、好ましくは、４つ以上の異なる任意に選択されたモノクローナル抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢの平均結合力である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２および抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに関する実施例４について再び例証すると、抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢであるＣＣ１２．１、Ｐ２Ｃ－１Ｆ１１、ＲＥＧＮ１０９３３、およびＳ３０９の平均ＥＣ５０を、ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤまたはＳＡＲＳ－ｍＲＢＤを考慮して決定する。ＭＥＲＳ－ＣｏＶおよび抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに関する実施例４について再び例証すると、抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢである４Ｃ２ｈ、Ｄ１２、ＬＣＡ６０、およびＭＥＲＳ４Ｖ２の平均ＥＣ５０を決定する。
【0050】
次いで、維持結合力、すなわち、わずかに中程度に結合力が低下し、結合力が増加するまでの範囲の結合力が、抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤの結合力または平均結合力を、抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤの結合力または平均結合力とそれぞれ比較することにより得られる。
【0051】
好ましくは、結合力は、ＥＣ５０またはＫｄを決定することにより測定し、ここで、ＥＣ５０またはＫｄが高くなると、結合力が低くなることを示す。または、結合力は、フローサイトメトリー解析もしくはＥＤ５０の決定により測定し、ここで、それぞれ陽染性細胞数が減少するかまたはＥＤ５０が低下すると、結合力が低くなることを示す。したがって、維持される、すなわち、結合力が、わずかに中程度に結合力が低下し、結合力が増加するまでの範囲であるかどうかは、好ましくは、ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤと抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢとの結合から生じるＥＣ５０、Ｋｄ、陽染性細胞数、および／またはＥＤ５０を、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤと抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢとの結合力から生じるＥＣ５０、Ｋｄ、陽染性細胞数、および／またはＥＤ５０とそれぞれ比較することにより決定する。
【0052】
ＥＣ５０またはＫｄの決定により結合力を決定する場合、抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤの結合力におけるわずかに中程度の低下は、好ましくは、ＥＣ５０および／またはＫｄにおける３倍以下、さらにより好ましくは２倍以下、なおより好ましくは１．５倍以下、およびなおさらにより好ましくは１．２倍以下の増加によって示す。フローサイトメトリー解析またはＥＤ５０の決定により結合力を決定する場合、ＲＢＤ抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤの結合力におけるわずかに中程度の低下は、好ましくは、陽染性細胞数および／またはＥＤ５０における５０％以上、より好ましくは８０％以上、およびさらにより好ましくは９０％以上の低下によって示す。
【0053】
すでに上述のように、ＥＣ５０、Ｋｄまたはフローサイトメトリー解析により結合力を決定するとき、結合力は、好ましくは、上に定義するように平均結合力である。したがって、上に定義する結合力のわずかに中程度の低下は、好ましくは、上に定義する平均結合力のわずかに中程度の低下である。
【0054】
ワクチン接種による最良の作用を得るために、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤをワクチンとして使用する場合、抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対する結合力は、可能な限り高くなければならない。したがって、好ましくは、抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対する結合力の低下は、可能な限り中程度でなければならず、好ましくは、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤに対する抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢの結合力は、好ましくは、低下せず、さらには増加もしない。すなわち、ＥＣ５０およびＫｄは増加せず、ならびに／または陽染性細胞数およびＥＤ５０は低下しない。
【0055】
したがって、ＥＣ５０またはＫｄの決定により結合力を決定する場合、抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤの結合力の増加は、好ましくは、ＥＣ５０および／またはＫｄの１０％以上、より好ましくは２５％以上、なおさらにより好ましくは５０％以上、なおさらにより好ましくは８０％以上、および最も好ましくは９０％以上の低下によって示す。上述のように、ワクチン接種による最良の作用を得るために、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤをワクチンとして使用する場合、抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対する結合力は、可能な限り高くなければならない。したがって、好ましくは、抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対する結合力の増加に関して上限は存在しない。したがって、好ましくは、ＥＣ５０またはＫｄの低下に関して上限は存在せず、この低下は、１００％でさえあり得る。とは言え、ＥＣ５０および／またはＫｄの低下に関する上限は、１００％以下、より好ましくは９９％以下であり得る。
【0056】
フローサイトメトリー解析またはＥＤ５０により結合力を決定する場合、抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤの結合力の増加は、好ましくは、陽染性細胞数および／またはＥＤ５０それぞれの１．１倍以上、より好ましくは１．２倍以上、さらにより好ましくは１．５倍以上、なおさらにより好ましくは２倍以上の増加によって示す。上述のように、ワクチン接種による最良の作用を得るために、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤをワクチンとして使用する場合、抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対する結合力は、可能な限り高くなければならない。したがって、好ましくは、抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対する結合力の増加に関して上限は存在しない。したがって、好ましくは、陽染性細胞および／またはＥＤ５０の増加に関して上限は存在しない。とは言え、陽染性細胞および／またはＥＤ５０の増加に関する上限は、１０．０００倍以下、より好ましくは１．０００倍以下、およびなおより好ましくは１００倍以下であり得る。
【0057】
すでに上述したように、ＥＣ５０、Ｋｄまたはフローサイトメトリー解析により結合力を決定するとき、結合力は、好ましくは、上に定義するように平均結合力である。したがって、上に定義する結合力の増加は、好ましくは、上に定義する平均結合力の増加である。
【0058】
その上、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、細胞間融合を減少させる。
【0059】
細胞間融合の減少は、当業者に公知の任意の方法により測定することができる。例として、細胞間融合は、顕微鏡による細胞イメージングを併用する細胞間融合アッセイによって決定することができる。詳細には、ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤまたはＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤをトランスフェクトしてフルオロフォアで標識した細胞を画像化し、合胞体ならびに核を計数するか、または細胞の直径を比較する。次いで、ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤの細胞間融合をＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤの細胞間融合と比較する、すなわち、合胞体ならびに核の数または細胞の直径を比較することにより細胞間融合の減少が得られる。
【0060】
特に、細胞間融合は、Huang et al., Signal Transduction and Targeted Therapy, (2022) 7:179 (https://www.nature.com/articles/s41392-022-01037-4)による「A robust reporting system for measurement of SARS-CoV-2 spike fusion efficiency」に記載のルシフェラーゼ活性に基づく細胞融合レポーティング系の手段によって、またはBo Mend et al., Nature, Vol 603, 24 March 2022 (https://www.nature.com/articles/s41586-022-04474-x)による「Altered TMPRSS2 usage by SARS-CoV-2 Omicron impacts infectivity and fusogenicity」に記載のＧＦＰ発現融合レポーター細胞のフローサイトメトリーによる解析および蛍光強度分布による定量によって測定することができる。細胞の直径および粒度は、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡またはＦＡＣＳ解析によって前方または側方散乱により決定し得る。
【0061】
細胞間融合の減少を決定するための例は、実施例１２に提示する。
【0062】
細胞間融合の減少は、好ましくは、１細胞あたりの合胞体および／もしくは核の数の減少、または細胞の直径の減少によって示す。
【0063】
細胞間融合の減少を１細胞あたりの核数の減少により決定する場合、細胞間融合の減少は、好ましくは、１細胞あたり核１０個から１細胞あたり核１個の数の減少によって示す。より好ましくは、細胞間融合の減少は、１細胞あたり核１０個未満、好ましくは１細胞あたり核５個未満、より好ましくは１細胞あたり核２個未満によって示される。最も好ましくは、すべての細胞は、１細胞あたり唯一の核を有し、細胞間融合を示さない。
【0064】
細胞間融合の減少を細胞の直径の減少により決定する場合、細胞の平均直径を無処理細胞の平均直径と比較する。細胞間融合の減少は、好ましくは、無処理細胞と比較して１０倍の直径平均値によって示される。より好ましくは、細胞間融合の減少は、無処理細胞と比較して１０倍未満の直径平均値、さらにより好ましくは無処理細胞と比較して５倍未満直径平均値、さらにより好ましくは無処理細胞と比較して２倍未満の直径平均値によって示される。最も好ましくは、すべての細胞が、無処理細胞と同一の直径平均値を有する。融合適格性抗原の表面発現により、ＣＯＶＩＤ－１９による組織損傷の要因となる合胞体の形成を介して副作用が引き起こされ得るため、細胞間融合は、可能な限り減少させなければならない。したがって、この減少に対する制限は存在せず、減少は、１００％でさえあり得る。すなわち、好ましくは、細胞間融合は、完全に阻止される。
【0065】
その上、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、細胞性抗原取込みおよび／または受容体内部移行を減少させる。
【0066】
細胞性抗原取込みならびに受容体内部移行の減少は、当業者に公知の任意の方法により測定することができる。例として、細胞性抗原取込みは、生細胞イメージングまたは生細胞による単一分子顕微鏡によって決定することができる。詳細には、細胞にＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤまたはＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤ完全スパイクをトランスフェクトし、細胞およびスパイクをフルオロフォアで標識し、例として、生細胞による生細胞共焦点顕微鏡、ＦＡＣＳ解析または単一分子顕微鏡によって、細胞を画像化して抗原、すなわち、スパイクの内部移行を経時的に評価する。
【0067】
特に、細胞性抗原取込みならびに受容体内部移行は、Arnauld Serge et al., Integr Biol (Camb), 2011 Jun;3(6):675-83 (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21541374/)による「Quantification of GPCR internalization by single-molecule microscopy in living cells」に記載のように生細胞による単一分子顕微鏡の手段により測定することができる。
【0068】
細胞性抗原取込みの減少ならびに受容体内部移行を決定するための例は、実施例１２に提示する。
【0069】
細胞性抗原取込みの減少は、好ましくは、細胞への結合後に内部移行した蛍光標識スパイクの量の減少によって示す。
【0070】
細胞性抗原取込みおよび受容体内部移行の減少を細胞イメージングにより決定する場合、「蛍光強度平均値」（ＭＦＩ）は、内部移行後に極限の検査条件に対して決定する。このＭＦＩは、陽性対照としてｗｔＲＢＤ／ｗｔ－Ｓｐｉｋｅ、および陰性対照として無ＲＢＤ治療または蛍光標識した無関係のタンパク質を用いた治療と比較する。
【0071】
ｗｔＲＢＤ／ｗｔ－Ｓｐｉｋｅ（陽性対照）の内部移行後の極限の検査条件（インキュベーション時間および抗原量）に対するＭＦＩは、１００％として表す。無ＲＢＤ治療または蛍光標識した無関係のタンパク質を用いた治療（陰性対照）によるＭＦＩは、０％として表す。検査条件に対するＭＦＩパーセンテージは、陽性対照および陰性対照に応じて算出する。
【0072】
好ましくは、細胞性抗原取込みおよび受容体内部移行は、５０％、より好ましくは８０％、およびさらにより好ましくは９０％減少する。
【0073】
細胞性抗原取込みおよび受容体内部移行は、可能な限り減少させなければならない。したがって、この減少に対する制限は存在せず、減少は、１００％でさえあり得る。すなわち、好ましくは、細胞性抗原取込みは、完全に阻止される。とは言え、細胞性抗原取込みおよび受容体内部移行の減少に関する上限は、１００％以下、より好ましくは９９％以下であり得る。
【0074】
好ましくは、コロナウイルスは、コロナウイルス科（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、より好ましくは、ベータコロナウイルス（ｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）属である。
【0075】
さらにより好ましくは、
（Ａ）コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２型）であり、
ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の突然変異受容体結合ドメイン（ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤ）またはこの断片であり、
野生型受容体結合ドメインは、ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型受容体結合ドメイン）であり、
ＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体は、ＡＣＥ２（アンジオテンシン変換酵素２）であり、
好ましくは、抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ中和抗体（抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢ）は、抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢであり、および／または血漿もしくは血清は、上に定義のように免疫対象、例えば、回復期対象に由来し、ここで、このような免疫対象は、好ましくは、ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤに免疫学的に反応性であるか、あるいは
（Ｂ）コロナウイルスは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ（中東呼吸器症候群コロナウイルス）であり、
ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶの突然変異受容体結合ドメイン（ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤ）またはこの断片であり、
野生型受容体結合ドメインは、ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ（ＭＥＲＳ－ＣｏＶの野生型受容体結合ドメイン）であり、
ＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体は、ＤＰＰ４（ジペプチジルペプチダーゼ４）であり、
好ましくは、抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ中和抗体（抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢ）は、抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢであり、および／または血漿もしくは血清は、上に定義のように免疫対象、例えば、回復期対象に由来し、ここで、このような免疫対象は、好ましくは、ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤに免疫学的に反応性である。
（Ａ）コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２型）であり、
ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の突然変異受容体結合ドメイン（ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤ）またはこの断片であり、
野生型受容体結合ドメインは、ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型受容体結合ドメイン）であり、
ＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体は、ＡＣＥ２（アンジオテンシン変換酵素２）であり、
好ましくは、抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ中和抗体（抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢ）は、抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢであり、および／または血漿もしくは血清は、上に定義のように免疫対象、例えば、回復期対象に由来し、ここで、このような免疫対象は、好ましくは、ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤに免疫学的に反応性であるか、あるいは
（Ｂ）コロナウイルスは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ（中東呼吸器症候群コロナウイルス）であり、
ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶの突然変異受容体結合ドメイン（ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤ）またはこの断片であり、
野生型受容体結合ドメインは、ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ（ＭＥＲＳ－ＣｏＶの野生型受容体結合ドメイン）であり、
ＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体は、ＤＰＰ４（ジペプチジルペプチダーゼ４）であり、
好ましくは、抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ中和抗体（抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢ）は、抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢであり、および／または血漿もしくは血清は、上に定義のように免疫対象、例えば、回復期対象に由来し、ここで、このような免疫対象は、好ましくは、ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤに免疫学的に反応性である。
【0076】
したがって、好ましくは、本発明は、（Ａ）ＡＣＥ２に対する結合力がＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤと比較して低下したＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片に関し、および／または本発明は、（Ｂ）ＤＤＰ４に対する結合力がＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤと比較して低下したＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片に関する。
【0077】
（Ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の突然変異受容体結合ドメイン（ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤ）
上述のように、本発明は、好ましくは、（Ａ）ＡＣＥ２に対する結合力がＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤと比較して低下したＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片に関する。
上述のように、本発明は、好ましくは、（Ａ）ＡＣＥ２に対する結合力がＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤと比較して低下したＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片に関する。
【0078】
好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の突然変異受容体結合ドメイン）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の突然変異受容体結合ドメイン（ｍＲＢＤ）（ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤ）またはこの断片である。
【0079】
好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、ペプチドまたはタンパク質、好ましくは、タンパク質である。
【0080】
好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、本発明による、ワクチン組成物用の活性成分をデザインおよび／または得るための方法によって、以下に記載する活性成分として得られる。
【0081】
好ましくは、ＡＣＥ２は、可溶性型および／または膜結合型のＡＣＥ２、好ましくは、可溶性型のＡＣＥ２（ｓＡＣＥ２）である。ｓＡＣＥ２は、活性型および不活性型のｓＡＣＥ２を含み得る。
【0082】
ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片およびＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤのＡＣＥ２に対する結合力は、当業者に公知の任意の方法により測定することができる。例として、結合力は、例えば、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤを細胞表面上に発現する細胞を、フルオロフォアで直接的もしくは間接的に標識したＡＣＥ２で染色して、または反対に、ＡＣＥ２を細胞表面上に発現する細胞を、フルオロフォアで直接的もしくは間接的に標識した可溶性ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくは可溶性ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤで染色して、フローサイトメトリー解析を行い、陽染性細胞を計数することによって決定するか、あるいはＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤまたはＳＡＲＳ－ｍＲＢＤそれぞれのＡＣＥ２に対するＫｄ（解離定数）またはＥＣ５０（最大結合の５０％における有効濃度）のＥＬＩＳＡの使用による決定によって決定することができる。次いで、結合力の低下が、ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤのＡＣＥ２に対する結合力を、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤのＡＣＥ２に対する結合力と比較することにより得られる。
【0083】
好ましくは、結合力は、ＥＣ５０またはＫｄを決定することにより測定し、ここで、ＥＣ５０またはＫｄが高くなると、結合力が低くなることを示す。または、結合力は、フローサイトメトリー解析により測定し、ここで、陽染性細胞数が減少すると結合力が低くなることを示す。したがって、結合力の低下は、好ましくは、ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤとＡＣＥ２との結合から生じるＥＣ５０、Ｋｄ、および／または陽染性細胞数を、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤとＡＣＥ２との結合から生じるＥＣ５０、Ｋｄ、および／または陽染性細胞数とそれぞれ比較することによって決定する。好ましくは、ＡＣＥ２に対するＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤまたはＳＡＲＳ－ｍＲＢＤのＥＣ５０およびＫｄは、実施例４に記載のように決定する。
【0084】
結合力の低下をＥＣ５０またはＫｄの決定により決定する場合、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤのＡＣＥ２に対する結合力の低下は、好ましくは、ＥＣ５０および／またはＫｄの１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらにより好ましくは１０倍以上、なおより好ましくは１００倍以上、なおさらにより好ましくは５００倍以上、および最も好ましくは１０００倍以上の増加によって示す。ワクチン接種による最良の作用を得るために、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤをワクチンとして使用する場合、ＡＣＥ２に対する結合力は、可能な限り低下させなければならない。したがって、好ましくは、ＡＣＥ２に対する結合力の低下に関して上限は存在しない。したがって、好ましくは、ＥＣ５０またはＫｄの増加に関して上限は存在しない。とは言え、ＥＣ５０またはＫｄの増加に関する上限は、５００．０００倍以下、より好ましくは１００．０００倍以下、さらにより好ましくは１０．０００倍以下あり得る。好ましくは、ＡＣＥ２に対するＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤまたはＳＡＲＳ－ｍＲＢＤのＥＣ５０およびＫｄは、実施例４に記載のように決定する。
【0085】
結合力の低下をフローサイトメトリー解析により決定する場合、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤのＡＣＥ２に対する結合力の低下は、好ましくは、陽染性細胞数の５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、なおより好ましくは９５％以上、およびなおさらにより好ましくは９８％以上の減少によって示す。ワクチン接種による最良の作用を得るために、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤをワクチンとして使用する場合、ＡＣＥ２に対する結合力は、可能な限り低下させなければならない。したがって、好ましくは、ＡＣＥ２に対する結合力の低下に関して上限は存在しない。したがって、好ましくは、陽染性細胞の減少に関して上限は存在せず、この減少は１００％でさえあり得る。とは言え、陽染性細胞の減少に関する上限は、１００％以下、より好ましくは、９９％以下であり得る。
【0086】
その上、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、好ましくは、抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ中和抗体（抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢ）に対する結合を示す。すなわち、抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ中和抗体（抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢ）に対する結合力は、好ましくは、維持される。すなわち、ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤと比較して、わずかに中程度に結合力が低下し、結合力が増加するまでの範囲となる。
【0087】
抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢは、クラスＩ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩ、および／もしくはクラスＩＶのような種々の抗体クラスに属し得、ならびに／またはＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤの種々のエピトープに特異的であり得る。抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢは、ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤに対して反応性のモノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢは、組換えにより得ることができる。ポリクローナル抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢは、コロナウイルス感染を経験した免疫対象、例えば、回復期対象および／または例えば、ワクチン接種により免疫化した免疫化対象に由来する血漿または血清から得ることができ、ここで、このような免疫対象は、好ましくは、ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤに免疫学的に反応性である。対象は、好ましくは、脊椎動物、より好ましくは免疫哺乳動物、より好ましくは類人猿、サル、キツネザル、イヌ科動物、例えば、イヌ、オオカミもしくはキツネ、ネコ科動物、例えば、大型もしくは小型のネコ、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスターもしくはウサギ、ウシ科動物、例えば、バッファロー、アンテロープ、ヒツジ、ヤギもしくはウシ、シカ、ウマ、ロバ、クマ、テン、コウモリ、および／またはヒトである。なおより好ましくは、免疫対象は、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ヤギ、ロバ、ウマ、イヌ、ネコ、ヒツジまたはヒト等、最も好ましくは、ヒトである。
【0088】
抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片およびＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤの結合力は、当業者に公知の任意の方法により測定することができる。例として、結合力は、例えば、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤを細胞表面上に発現する細胞を、フルオロフォアで直接的もしくは間接的に標識したモノクローナル抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢで染色して、または反対に、モノクローナル抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢを細胞表面上に発現する細胞を、フルオロフォアで直接的もしくは間接的に標識した可溶性ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくは可溶性ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤで染色して、フローサイトメトリー解析を行い、陽染性細胞を計数することによって決定するか、あるいはモノクローナル抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤおよびＳＡＲＳ－ｍＲＢＤのＫｄ（解離定数）もしくはＥＣ５０（最大結合の５０％における有効濃度）のＥＬＩＳＡの使用による決定、またはコロナウイルス感染を経験した免疫対象、例えば、回復期対象および／もしくは例えば、ワクチン接種により免疫化した免疫化対象由来の血漿もしくは血清のポリクローナル抗体のＥＤ５０（血清抗体の５０％が結合する有効希釈度）の決定によって決定することができ、ここで、このような免疫対象は、好ましくは、ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤに免疫学的に反応性である。免疫対象は、上に定義するものである。好ましくは、抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤまたはＳＡＲＳ－ｍＲＢＤのＥＣ５０、Ｋｄ、およびＥＤ５０は、実施例４に記載のように決定する。
【0089】
抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢの結合力をフローサイトメトリー解析、ＥＣ５０、および／またはＫｄにより決定する場合、結合力は、好ましくは、いくつかの異なるモノクローナル抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢ、好ましくは、４つ以上の異なる任意に選択されたモノクローナル抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢの平均結合力である。好ましくは、４つの異なるモノクローナル抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢは、実施例４に記載のようにＣＣ１２．１、Ｐ２Ｃ－１Ｆ１１、ＲＥＧＮ１０９３３、およびＳ３０９であり、平均結合力は、ＣＣ１２．１、Ｐ２Ｃ－１Ｆ１１、ＲＥＧＮ１０９３３、およびＳ３０９それぞれの平均ＥＣ５０または平均Ｋｄである。
【0090】
次いで、維持結合力、すなわち、わずかに中程度に結合力が低下し、結合力が増加するまでの範囲の結合力が、抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤの結合力または平均結合力を、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤの抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対する結合力または平均結合力とそれぞれ比較することにより得られる。
【0091】
好ましくは、結合力は、ＥＣ５０またはＫｄを決定することにより測定し、ここで、ＥＣ５０またはＫｄが高くなると、結合力が低くなることを示す。または、結合力は、フローサイトメトリー解析もしくはＥＤ５０の決定により測定し、ここで、それぞれ陽染性細胞数が減少するかまたはＥＤ５０が低下すると、結合力が低くなることを示す。したがって、維持される、すなわち、結合力が、わずかに中程度に結合力が低下し、結合力が増加するまでの範囲であるかどうかは、好ましくは、ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤと抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢとの結合から生じるＥＣ５０、Ｋｄ、陽染性細胞数、および／またはＥＤ５０を、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤと抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢとの結合力から生じるＥＣ５０、Ｋｄ、陽染性細胞数、および／またはＥＤ５０とそれぞれ比較することにより決定する。
【0092】
ＥＣ５０またはＫｄの決定により結合力を決定する場合、抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＳＡＲＳ－ｍＲＢＤの結合力におけるわずかに中程度の低下は、好ましくは、ＥＣ５０および／またはＫｄにおける３倍以下、さらにより好ましくは２倍以下、なおより好ましくは１．５倍以下、およびなおさらにより好ましくは１．２倍以下の増加によって示す。フローサイトメトリー解析またはＥＤ５０の決定により結合力を決定する場合、ＲＢＤ抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＳＡＲＳ－ｍＲＢＤの結合力におけるわずかに中程度の低下は、好ましくは、陽染性細胞数および／またはＥＤ５０における５０％以上、より好ましくは８０％以上、およびさらにより好ましくは９０％以上の低下によって示す。
【0093】
すでに上述のように、ＥＣ５０、Ｋｄまたはフローサイトメトリー解析により結合力を決定するとき、結合力は、好ましくは、上に定義するように平均結合力である。したがって、上に定義する結合力のわずかに中程度の低下は、好ましくは、上に定義する平均結合力のわずかに中程度の低下である。
【0094】
ワクチン接種による最良の作用を得るために、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤをワクチンとして使用する場合、抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対する結合力は、可能な限り高くなければならない。したがって、好ましくは、抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対する結合力の低下は、可能な限り中程度でなければならず、好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤに対する抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢの結合力は、好ましくは、低下せず、さらには増加もしない。すなわち、ＥＣ５０およびＫｄは増加せず、ならびに／または陽染性細胞数およびＥＤ５０は低下しない。
【0095】
したがって、ＥＣ５０またはＫｄの決定により結合力を決定する場合、抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＳＡＲＳ－ｍＲＢＤの結合力の増加は、好ましくは、ＥＣ５０および／またはＫｄの１０％以上、より好ましくは２５％以上、なおさらにより好ましくは５０％以上、なおさらにより好ましくは８０％以上、および最も好ましくは９０％以上の低下によって示す。上述のように、ワクチン接種による最良の作用を得るために、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤをワクチンとして使用する場合、抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対する結合力は、可能な限り高くなければならない。したがって、好ましくは、抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対する結合力の増加に関して上限は存在しない。したがって、好ましくは、ＥＣ５０またはＫｄの低下に関して上限は存在せず、この低下は、１００％でさえあり得る。とは言え、ＥＣ５０および／またはＫｄの低下に関する上限は、１００％以下、より好ましくは９９％以下であり得る。
【0096】
フローサイトメトリー解析またはＥＤ５０により結合力を決定する場合、抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＳＡＲＳ－ｍＲＢＤの結合力の増加は、好ましくは、陽染性細胞数および／またはＥＤ５０それぞれの１．１倍以上、より好ましくは１．２倍以上、さらにより好ましくは１．５倍以上、なおさらにより好ましくは２倍以上の増加によって示す。上述のように、ワクチン接種による最良の作用を得るために、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤをワクチンとして使用する場合、抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対する結合力は、可能な限り高くなければならない。したがって、好ましくは、抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対する結合力の増加に関して上限は存在しない。したがって、好ましくは、陽染性細胞および／またはＥＤ５０の増加に関して上限は存在しない。とは言え、陽染性細胞および／またはＥＤ５０の増加に関する上限は、１０．０００倍以下、より好ましくは１．０００倍以下、およびなおより好ましくは１００倍以下であり得る。
【0097】
すでに上述のように、ＥＣ５０、Ｋｄまたはフローサイトメトリー解析により結合力を決定するとき、結合力は、好ましくは、上に定義するように平均結合力である。したがって、上に定義する結合力の増加は、好ましくは、上に定義する平均結合力の増加である。
【0098】
好ましくは、本発明は、
配列番号１のＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤのＧ１８４、Ｙ１８７、Ｌ１３７、Ｙ１７１、Ｆ１３８、Ｑ１８０、Ｆ１６８、Ｙ１３１またはＳ５５から選択される位置にアミノ酸残基の１つまたは複数、好ましくは１～３つ、より好ましくは１つまたは２つ、さらにより好ましくは１つの置換を含むアミノ酸配列またはこの断片
を含み、より好ましくは、これからなる、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片であって、この置換を除いて、配列番号１に対する８５％以上のアミノ酸配列同一性を有する、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片に関する。
配列番号１のＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤのＧ１８４、Ｙ１８７、Ｌ１３７、Ｙ１７１、Ｆ１３８、Ｑ１８０、Ｆ１６８、Ｙ１３１またはＳ５５から選択される位置にアミノ酸残基の１つまたは複数、好ましくは１～３つ、より好ましくは１つまたは２つ、さらにより好ましくは１つの置換を含むアミノ酸配列またはこの断片
を含み、より好ましくは、これからなる、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片であって、この置換を除いて、配列番号１に対する８５％以上のアミノ酸配列同一性を有する、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片に関する。
【0099】
好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、置換を除いて、配列番号１に対する９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、なおさらにより好ましくは９８％以上、および最も好ましくは１００％のアミノ酸配列同一性を有する。
【0100】
配列番号１のＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤは、Ｗｕｈａｎ変異体のＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤである。
【0101】
上に定義する配列番号１のＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤに対するＳＡＲＳ－ｍＲＢＤのアミノ酸配列同一性は、Ｗｕｈａｎ変異体である配列番号１以外のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体のＳＡＲＳ－ＲＢＤを依然として包含することにより、この変異体に対して、または配列番号１と比較したとき、このような変異体に含まれる突然変異、例えば、置換、欠失、および挿入の組合せに対して、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片が適応可能となるように十分低くなければならない。このようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体の例は、
Ｋ９９Ｎ、Ｅ１６６Ｋ、およびＮ１８３Ｙの置換を含むＢ１．３５１（ベータ）、
Ｎ１８３Ｙの置換を含むＢ．１．１．７（アルファ、５０１Ｙ．Ｖ１）、
Ｋ９９Ｔ、Ｅ１６６Ｋ、およびＮ１８３Ｙの置換を含むＰ．１（ガンマ、５０１Ｙ．Ｖ３）、ならびに／または
Ｌ１３４ＲおよびＴ１６０Ｋの置換を含むＢ．１．６１７．２（デルタ）
であり、ここで、各置換の位置は、配列番号１のＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤを考慮して示す。
Ｋ９９Ｎ、Ｅ１６６Ｋ、およびＮ１８３Ｙの置換を含むＢ１．３５１（ベータ）、
Ｎ１８３Ｙの置換を含むＢ．１．１．７（アルファ、５０１Ｙ．Ｖ１）、
Ｋ９９Ｔ、Ｅ１６６Ｋ、およびＮ１８３Ｙの置換を含むＰ．１（ガンマ、５０１Ｙ．Ｖ３）、ならびに／または
Ｌ１３４ＲおよびＴ１６０Ｋの置換を含むＢ．１．６１７．２（デルタ）
であり、ここで、各置換の位置は、配列番号１のＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤを考慮して示す。
【0102】
好ましくは、アミノ酸残基の１つまたは複数の置換は、Ｇ１８４、Ｌ１３７、Ｙ１７１またはＹ１８７から選択され、より好ましくは配列番号１のＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤのＧ１８４、Ｌ１３７またはＹ１８７から選択される位置におけるアミノ酸残基の置換の１～３つ、好ましくは１つまたは２つ、最も好ましくは１つである。
【0103】
より好ましくは、アミノ酸残基の１つまたは複数の置換は、Ｇ１８４もしくはＹ１８７または配列番号１のＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤのＧ１８４もしくはＹ１３７から選択される位置におけるアミノ酸残基の一方または両方、好ましくは一方の置換のである。
【0104】
なおより好ましくは、アミノ酸残基の１つまたは複数の置換は、配列番号１のＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤのＧ１８４の位置におけるアミノ酸残基の置換である。
【0105】
好ましくは、アミノ酸残基の１つまたは複数の置換は、配列番号１９４のＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤのＧ１８４、Ｙ１８７、Ｌ１３７、Ｙ１７１、Ｆ１３８、Ｑ１８０、Ｆ１６８、Ｙ１３１またはＳ５５から選択される位置におけるアミノ酸残基の１つまたは複数、好ましくは１～３つ、より好ましくは１つまたは２つ、さらにより好ましくは１つの置換であり、ここで、
－ Ｇ１８４の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｇ１８４Ａ、Ｇ１８４Ｃ、Ｇ１８４Ｄ、Ｇ１８４Ｅ、Ｇ１８４Ｆ、Ｇ１８４Ｈ、Ｇ１８４Ｉ、Ｇ１８４Ｋ、Ｇ１８４Ｌ、Ｇ１８４Ｍ、Ｇ１８４Ｎ、Ｇ１８４Ｐ、Ｇ１８４Ｑ、Ｇ１８４Ｒ、Ｇ１８４Ｓ、Ｇ１８４Ｔ、Ｇ１８４Ｖ、Ｇ１８４ＷもしくはＧ１８４Ｙから選択され、
－ Ｙ１８７の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｙ１８７Ａ、Ｙ１８７Ｃ、Ｙ１８７Ｄ、Ｙ１８７Ｅ、Ｙ１８７Ｇ、Ｙ１８７Ｉ、Ｙ１８７Ｋ、Ｙ１８７Ｌ、Ｙ１８７Ｍ、Ｙ１８７Ｎ、Ｙ１８７Ｑ、Ｙ１８７Ｒ、Ｙ１８７Ｓ、Ｙ１８７ＴもしくはＹ１８７Ｖから選択され、
－ Ｌ１３７の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｌ１３７Ｄ、Ｌ１３７Ｅ、Ｌ１３７Ｋ、Ｌ１３７ＲおよびＬ１３７Ｙから選択され、
－ Ｙ１７１の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｙ１７１Ａ、Ｙ１７１Ｃ、Ｙ１７１Ｅ、Ｙ１７１Ｉ、Ｙ１７１Ｋ、Ｙ１７１Ｌ、Ｙ１７１Ｍ、Ｙ１７１Ｎ、Ｙ１７１Ｐ、Ｙ１７１Ｑ、Ｙ１７１Ｒ、Ｙ１７１Ｓ、Ｙ１７１ＴもしくはＹ１７１Ｖから選択され、
－ Ｆ１３８の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｆ１３８Ａ、Ｆ１３８Ｃ、Ｆ１３８Ｅ、Ｆ１３８Ｇ、Ｆ１３８Ｉ、Ｆ１３８Ｋ、Ｆ１３８Ｎ、Ｆ１３８Ｑ、Ｆ１３８Ｒ、Ｆ１３８Ｓ、Ｆ１３８Ｔ、Ｆ１３８ＷもしくはＦ１３８Ｙから選択され、
－ Ｑ１８０の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｑ１８０Ｃ、Ｑ１８０Ｄ、Ｑ１８０Ｉ、Ｑ１８０Ｋ、Ｑ１８０ＬもしくはＱ１８０Ｖから選択され、
－ Ｆ１６８の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｆ１６８Ｃ、Ｆ１６８ＤもしくはＦ１６８Ｅから選択され、
－ Ｙ１３１の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｙ１３１Ａ、Ｙ１３１Ｃ、Ｙ１３１Ｄ、Ｙ１３１Ｅ、Ｙ１３１Ｆ、Ｙ１３１Ｇ、Ｙ１３１Ｈ、Ｙ１３１Ｉ、Ｙ１３１Ｌ、Ｙ１３１Ｍ、Ｙ１３１Ｎ、Ｙ１３１Ｐ、Ｙ１３１Ｑ、Ｙ１３１Ｓ、Ｙ１３１Ｔ、Ｙ１３１ＶもしくはＹ１３１Ｗから選択され、ならびに／または
－ Ｓ５５の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｓ５５Ｎである。
－ Ｇ１８４の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｇ１８４Ａ、Ｇ１８４Ｃ、Ｇ１８４Ｄ、Ｇ１８４Ｅ、Ｇ１８４Ｆ、Ｇ１８４Ｈ、Ｇ１８４Ｉ、Ｇ１８４Ｋ、Ｇ１８４Ｌ、Ｇ１８４Ｍ、Ｇ１８４Ｎ、Ｇ１８４Ｐ、Ｇ１８４Ｑ、Ｇ１８４Ｒ、Ｇ１８４Ｓ、Ｇ１８４Ｔ、Ｇ１８４Ｖ、Ｇ１８４ＷもしくはＧ１８４Ｙから選択され、
－ Ｙ１８７の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｙ１８７Ａ、Ｙ１８７Ｃ、Ｙ１８７Ｄ、Ｙ１８７Ｅ、Ｙ１８７Ｇ、Ｙ１８７Ｉ、Ｙ１８７Ｋ、Ｙ１８７Ｌ、Ｙ１８７Ｍ、Ｙ１８７Ｎ、Ｙ１８７Ｑ、Ｙ１８７Ｒ、Ｙ１８７Ｓ、Ｙ１８７ＴもしくはＹ１８７Ｖから選択され、
－ Ｌ１３７の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｌ１３７Ｄ、Ｌ１３７Ｅ、Ｌ１３７Ｋ、Ｌ１３７ＲおよびＬ１３７Ｙから選択され、
－ Ｙ１７１の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｙ１７１Ａ、Ｙ１７１Ｃ、Ｙ１７１Ｅ、Ｙ１７１Ｉ、Ｙ１７１Ｋ、Ｙ１７１Ｌ、Ｙ１７１Ｍ、Ｙ１７１Ｎ、Ｙ１７１Ｐ、Ｙ１７１Ｑ、Ｙ１７１Ｒ、Ｙ１７１Ｓ、Ｙ１７１ＴもしくはＹ１７１Ｖから選択され、
－ Ｆ１３８の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｆ１３８Ａ、Ｆ１３８Ｃ、Ｆ１３８Ｅ、Ｆ１３８Ｇ、Ｆ１３８Ｉ、Ｆ１３８Ｋ、Ｆ１３８Ｎ、Ｆ１３８Ｑ、Ｆ１３８Ｒ、Ｆ１３８Ｓ、Ｆ１３８Ｔ、Ｆ１３８ＷもしくはＦ１３８Ｙから選択され、
－ Ｑ１８０の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｑ１８０Ｃ、Ｑ１８０Ｄ、Ｑ１８０Ｉ、Ｑ１８０Ｋ、Ｑ１８０ＬもしくはＱ１８０Ｖから選択され、
－ Ｆ１６８の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｆ１６８Ｃ、Ｆ１６８ＤもしくはＦ１６８Ｅから選択され、
－ Ｙ１３１の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｙ１３１Ａ、Ｙ１３１Ｃ、Ｙ１３１Ｄ、Ｙ１３１Ｅ、Ｙ１３１Ｆ、Ｙ１３１Ｇ、Ｙ１３１Ｈ、Ｙ１３１Ｉ、Ｙ１３１Ｌ、Ｙ１３１Ｍ、Ｙ１３１Ｎ、Ｙ１３１Ｐ、Ｙ１３１Ｑ、Ｙ１３１Ｓ、Ｙ１３１Ｔ、Ｙ１３１ＶもしくはＹ１３１Ｗから選択され、ならびに／または
－ Ｓ５５の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｓ５５Ｎである。
【0106】
より好ましくは、アミノ酸残基の１つまたは複数の置換は、配列番号１を有するＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤのＧ１８４、Ｌ１３７、Ｙ１７１またはＹ１８７、より好ましくはＧ１８４、Ｌ１３７、またはＹ１８７から選択される位置におけるアミノ酸残基の置換の１～３つ、好ましくは１つまたは２つ、より好ましくは１つであり、ここで、
－ Ｇ１８４の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｇ１８４Ｒ、Ｇ１８４Ｄ、Ｇ１８４Ｙ、Ｇ１８４Ｋ、Ｇ１８４Ｓ、Ｇ１８４Ｐ、Ｇ１８４Ｅ、Ｇ１８４Ａ、Ｇ１８４Ｖ、Ｇ１８４Ｎ、Ｇ１８４Ｑ、Ｇ１８４Ｔ、Ｇ１８４Ｍ、Ｇ１８４ＨまたはＧ１８４Ｌから選択され、
－ Ｌ１３７の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｌ１３７ＲまたはＬ１３７Ｅから選択され、
－ Ｙ１８７の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｙ１８７ＮまたはＹ１８７Ｑから選択され、
－ Ｙ１７１の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｙ１７１ＳまたはＹ１７１Ｔから選択される。
－ Ｇ１８４の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｇ１８４Ｒ、Ｇ１８４Ｄ、Ｇ１８４Ｙ、Ｇ１８４Ｋ、Ｇ１８４Ｓ、Ｇ１８４Ｐ、Ｇ１８４Ｅ、Ｇ１８４Ａ、Ｇ１８４Ｖ、Ｇ１８４Ｎ、Ｇ１８４Ｑ、Ｇ１８４Ｔ、Ｇ１８４Ｍ、Ｇ１８４ＨまたはＧ１８４Ｌから選択され、
－ Ｌ１３７の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｌ１３７ＲまたはＬ１３７Ｅから選択され、
－ Ｙ１８７の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｙ１８７ＮまたはＹ１８７Ｑから選択され、
－ Ｙ１７１の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｙ１７１ＳまたはＹ１７１Ｔから選択される。
【0107】
さらにより好ましくは、アミノ酸残基の１つまたは複数の置換は、配列番号１を有するＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤのＧ１８４もしくはＹ１８７またはＧ１８４もしくはＬ１３７、より好ましくはＧ１８４もしくはＬ１３７から選択される位置におけるアミノ酸残基の一方または両方、なおさらにより好ましくは一方の置換であり、ここで、
－ Ｇ１８４の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｇ１８４Ｒ、Ｇ１８４Ｄ、Ｇ１８４Ｙ、Ｇ１８４Ｋ、Ｇ１８４Ｓ、Ｇ１８４Ｐ、Ｇ１８４Ｅ、Ｇ１８４Ａ、Ｇ１８４Ｖ、Ｇ１８４Ｎ、Ｇ１８４Ｑ、Ｇ１８４Ｔ、Ｇ１８４Ｍ、Ｇ１８４ＨまたはＧ１８４Ｌから選択され、より好ましくはＧ１８４Ｒ、Ｇ５０２ＤまたはＧ１８４Ｅであり、最も好ましくはＧ１８４ＲまたはＧ１８４Ｅであり、
－ Ｌ１３７の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｌ１３７Ｒであり、
－ Ｙ１８７の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｙ１８７Ｎである。
－ Ｇ１８４の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｇ１８４Ｒ、Ｇ１８４Ｄ、Ｇ１８４Ｙ、Ｇ１８４Ｋ、Ｇ１８４Ｓ、Ｇ１８４Ｐ、Ｇ１８４Ｅ、Ｇ１８４Ａ、Ｇ１８４Ｖ、Ｇ１８４Ｎ、Ｇ１８４Ｑ、Ｇ１８４Ｔ、Ｇ１８４Ｍ、Ｇ１８４ＨまたはＧ１８４Ｌから選択され、より好ましくはＧ１８４Ｒ、Ｇ５０２ＤまたはＧ１８４Ｅであり、最も好ましくはＧ１８４ＲまたはＧ１８４Ｅであり、
－ Ｌ１３７の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｌ１３７Ｒであり、
－ Ｙ１８７の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｙ１８７Ｎである。
【0108】
なおさらにより好ましくは、アミノ酸残基の１つもしくは複数の置換は、配列番号１を有するＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤのＧ１８４の位置におけるアミノ酸残基の１つの置換であり、ここで、置換は、Ｇ１８４Ｒ、Ｇ１８４ＤもしくはＧ１８４Ｅ、より好ましくはＧ１８４ＲもしくはＧ１８４Ｅであり、および／またはアミノ酸残基の１つもしくは複数の置換は、配列番号１を有するＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤのＬ１３７の位置におけるアミノ酸残基の１つの置換であり、ここで、置換はＬ１３７Ｒであり、最も好ましくは、置換はＧ１８４ＲもしくはＧ１８４Ｅである。
【0109】
好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３または配列番号９４から選択され、
より好ましくは、
配列番号１５、配列番号１７、配列番号５、配列番号２０、配列番号９、配列番号１６、配列番号１３、配列番号２、配列番号３、配列番号１８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１１、配列番号７、配列番号１０、配列番号５５、配列番号５３、配列番号３０、配列番号３１、配列番号９２または配列番号９３から選択され、
さらにより好ましくは、
配列番号１５、配列番号１７、配列番号５、配列番号２０、配列番号９、配列番号１６、配列番号１３、配列番号２、配列番号３、配列番号１８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１１、配列番号７または配列番号１０、配列番号５５または配列番号３０から選択され、
なおより好ましくは、
配列番号１５、配列番号５、配列番号２、配列番号５５または配列番号３０から選択され、
なおさらにより好ましくは、
配列番号１５、配列番号５、配列番号２、または配列番号５５から選択され、
なおさらにより好ましくは、
配列番号１５、配列番号２、または配列番号５５から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなり、
最も好ましくは、配列番号１５または配列番号２のアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなる。
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３または配列番号９４から選択され、
より好ましくは、
配列番号１５、配列番号１７、配列番号５、配列番号２０、配列番号９、配列番号１６、配列番号１３、配列番号２、配列番号３、配列番号１８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１１、配列番号７、配列番号１０、配列番号５５、配列番号５３、配列番号３０、配列番号３１、配列番号９２または配列番号９３から選択され、
さらにより好ましくは、
配列番号１５、配列番号１７、配列番号５、配列番号２０、配列番号９、配列番号１６、配列番号１３、配列番号２、配列番号３、配列番号１８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１１、配列番号７または配列番号１０、配列番号５５または配列番号３０から選択され、
なおより好ましくは、
配列番号１５、配列番号５、配列番号２、配列番号５５または配列番号３０から選択され、
なおさらにより好ましくは、
配列番号１５、配列番号５、配列番号２、または配列番号５５から選択され、
なおさらにより好ましくは、
配列番号１５、配列番号２、または配列番号５５から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなり、
最も好ましくは、配列番号１５または配列番号２のアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなる。
【0110】
（Ｂ）ＭＥＲＳ－ＣｏＶの突然変異受容体結合ドメイン（ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤ）
上述のように、本発明は、さらに好ましくは、（Ｂ）ＤＤＰ４に対する結合力がＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤと比較して低下したＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片に関する。
上述のように、本発明は、さらに好ましくは、（Ｂ）ＤＤＰ４に対する結合力がＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤと比較して低下したＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片に関する。
【0111】
好ましくは、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤ（ＭＥＲＳ－ＣｏＶの突然変異受容体結合ドメイン）は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質の突然変異受容体結合ドメイン（ｍＲＢＤ）（ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤ）またはこの断片である。
【0112】
好ましくは、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、ペプチドまたはタンパク質、好ましくは、タンパク質である。
【0113】
好ましくは、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、本発明による、ワクチン組成物用の活性成分をデザインおよび／または得るための方法によって、以下に記載する活性成分として得られる。
【0114】
好ましくは、ＤＰＰ４は、可溶性型および／または膜結合型のＤＰＰ４、好ましくは、可溶性型のＤＰＰ４（ｓＤＰＰ４）である。
【0115】
ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片およびＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤのＤＰＰ４に対する結合力は、当業者に公知の任意の方法により測定することができる。例として、結合力は、例えば、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤを細胞表面上に発現する細胞を、フルオロフォアで直接的もしくは間接的に標識したＤＰＰ４で染色して、または反対に、ＤＰＰ４を細胞表面上に発現する細胞を、フルオロフォアで直接的もしくは間接的に標識した可溶性ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくは可溶性ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤで染色して、フローサイトメトリー解析を行い、陽染性細胞を計数することによって決定するか、あるいはＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤまたはＭＥＲＳ－ｍＲＢＤそれぞれのＤＰＰ４に対するＫｄ（解離定数）またはＥＣ５０（最大結合の５０％における有効濃度）のＥＬＩＳＡの使用による決定によって決定することができる。次いで、結合力の低下が、ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤのＤＰＰ４に対する結合力を、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤのＤＰＰ４に対する結合力と比較することにより得られる。
【0116】
好ましくは、結合力は、ＥＣ５０またはＫｄを決定することにより測定し、ここで、ＥＣ５０またはＫｄが高くなると、結合力が低くなることを示す。または、結合力は、フローサイトメトリー解析により測定し、ここで、陽染性細胞数が減少すると結合力が低くなることを示す。したがって、結合力の低下は、好ましくは、ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤとＤＰＰ４との結合から生じるＥＣ５０、Ｋｄ、および／または陽染性細胞数を、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤとＤＰＰ４との結合から生じるＥＣ５０、Ｋｄ、および／または陽染性細胞数とそれぞれ比較することによって決定する。好ましくは、ＤＰＰ４に対するＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤまたはＭＥＲＳ－ｍＲＢＤのＥＣ５０は、実施例７に記載のように決定する。
【0117】
結合力の低下をＥＣ５０またはＫｄの決定により決定する場合、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤのＤＰＰ４に対する結合力の低下は、好ましくは、ＥＣ５０および／またはＫｄの１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらにより好ましくは１０倍以上、なおより好ましくは１００倍以上、なおさらにより好ましくは５００倍以上、および最も好ましくは１０００倍以上の増加によって示す。ワクチン接種による最良の作用を得るために、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤをワクチンとして使用する場合、ＤＰＰ４に対する結合力は、可能な限り低下させなければならない。したがって、好ましくは、ＤＰＰ４に対する結合力の低下に関して上限は存在しない。したがって、好ましくは、ＥＣ５０またはＫｄの増加に関して上限は存在しない。とは言え、ＥＣ５０またはＫｄの増加に関する上限は、５００．０００倍以下、より好ましくは１００．０００倍以下、さらにより好ましくは１０．０００倍以下であり得る。好ましくは、ＤＰＰ４に対するＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤまたはＭＥＲＳ－ｍＲＢＤのＥＣ５０は、実施例７に記載のように決定する。
【0118】
結合力の低下をフローサイトメトリー解析により決定する場合、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤのＤＰＰ４に対する結合力の低下は、好ましくは、陽染性細胞数の５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、なおより好ましくは９５％以上、およびなおさらにより好ましくは９８％以上の減少によって示す。ワクチン接種による最良の作用を得るために、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤをワクチンとして使用する場合、ＤＰＰ４に対する結合力は、可能な限り低下させなければならない。したがって、好ましくは、ＤＰＰ４に対する結合力の低下に関して上限は存在しない。したがって、好ましくは、陽染性細胞の減少に関して上限は存在せず、この減少は１００％でさえあり得る。とは言え、陽染性細胞の減少に関する上限は、１００％以下、より好ましくは、９９％以下であり得る。
【0119】
その上、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、好ましくは、抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ中和抗体（抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢ）に対する結合を示す。すなわち、抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ中和抗体（抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢ）に対する結合力は、好ましくは、維持される。すなわち、ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤと比較して、わずかに中程度に結合力が低下し、結合力が増加するまでの範囲となる。
【0120】
抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢは、クラスＩ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩ、および／もしくはクラスＩＶのような種々の抗体クラスに属し得、ならびに／またはＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤの種々のエピトープに特異的であり得る。抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢは、ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤに対して反応性のモノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢは、組換えにより得ることができる。ポリクローナル抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢは、コロナウイルス感染を経験した免疫対象、例えば、回復期対象および／または例えば、ワクチン接種により免疫化した免疫化対象に由来する血漿または血清から得ることができ、ここで、このような免疫対象は、好ましくは、ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤに免疫学的に反応性である。対象は、好ましくは、脊椎動物、より好ましくは免疫哺乳動物、より好ましくは類人猿、サル、キツネザル、イヌ科動物、例えば、イヌ、オオカミもしくはキツネ、ネコ科動物、例えば、大型もしくは小型のネコ、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスターもしくはウサギ、ウシ科動物、例えば、バッファロー、アンテロープ、ヒツジ、ヤギもしくはウシ、シカ、ウマ、ロバ、クマ、テン、コウモリ、および／またはヒトである。なおより好ましくは、免疫対象は、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ヤギ、ロバ、ウマ、イヌ、ネコ、ヒツジまたはヒト等、最も好ましくは、ヒトである。
【0121】
抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片およびＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤの結合力は、当業者に公知の任意の方法により測定することができる。例として、結合力は、例えば、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤを細胞表面上に発現する細胞を、フルオロフォアで直接的もしくは間接的に標識したモノクローナル抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢで染色して、または反対に、モノクローナル抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢを細胞表面上に発現する細胞を、フルオロフォアで直接的もしくは間接的に標識した可溶性ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくは可溶性ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤで染色して、フローサイトメトリー解析を行い、陽染性細胞を計数することによって決定するか、あるいはモノクローナル抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤおよびＭＥＲＳ－ｍＲＢＤのＫｄ（解離定数）もしくはＥＣ５０（最大結合の５０％における有効濃度）のＥＬＩＳＡの使用による決定、またはコロナウイルス感染を経験した免疫対象、例えば、回復期対象および／もしくは例えば、ワクチン接種により免疫化した免疫化対象由来の血漿もしくは血清のポリクローナル抗体のＥＤ５０（血清抗体の５０％が結合する有効希釈度）の決定によって決定することができ、ここで、このような免疫対象は、好ましくは、ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤに免疫学的に反応性である。免疫対象は、上に定義するものである。好ましくは、抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤまたはＭＥＲＳ－ｍＲＢＤのＥＣ５０は、実施例７に記載のように決定する。
【0122】
抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢの結合力をフローサイトメトリー解析、ＥＣ５０、および／またはＫｄにより決定する場合、結合力は、好ましくは、いくつかの異なるモノクローナル抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢ、好ましくは、４つ以上の異なる任意に選択されたモノクローナル抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢの平均結合力である。好ましくは、４つの異なるモノクローナル抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢは、実施例９に記載のように４Ｃ２ｈ、Ｄ１２、ＬＣＡ６０、およびＭＥＲＳ４Ｖ２であり、平均結合力は、４Ｃ２ｈ、Ｄ１２、ＬＣＡ６０、およびＭＥＲＳ４Ｖ２それぞれの平均ＥＣ５０または平均Ｋｄである。
【0123】
次いで、維持結合力、すなわち、わずかに中程度に結合力が低下し、結合力が増加するまでの範囲の結合力が、抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤの結合力または平均結合力を、抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＭＥＲＳ－ｍＲＢＤの結合力または平均結合力とそれぞれ比較することにより得られる。
【0124】
好ましくは、結合力は、ＥＣ５０またはＫｄを決定することにより測定し、ここで、ＥＣ５０またはＫｄが高くなると、結合力が低くなることを示す。または、結合力は、フローサイトメトリー解析もしくはＥＤ５０の決定により測定し、ここで、それぞれ陽染性細胞数が減少するかまたはＥＤ５０が低下すると、結合力が低くなることを示す。したがって、維持される、すなわち、結合力が、わずかに中程度に結合力が低下し、結合力が増加するまでの範囲であるかどうかは、好ましくは、ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤと抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢとの結合から生じるＥＣ５０、Ｋｄ、陽染性細胞数、および／またはＥＤ５０を、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤと抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢとの結合から生じるＥＣ５０、Ｋｄ、陽染性細胞数、および／またはＥＤ５０とそれぞれ比較することにより決定する。
【0125】
ＥＣ５０またはＫｄの決定により結合力を決定する場合、抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＭＥＲＳ－ｍＲＢＤの結合力におけるわずかに中程度の低下は、好ましくは、ＥＣ５０および／またはＫｄにおける３倍以下、さらにより好ましくは２倍以下、なおより好ましくは１．５倍以下、およびなおさらにより好ましくは１．２倍以下の増加によって示す。フローサイトメトリー解析またはＥＤ５０の決定により結合力を決定する場合、ＲＢＤ抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＭＥＲＳ－ｍＲＢＤの結合力におけるわずかに中程度の低下は、好ましくは、陽染性細胞数および／またはＥＤ５０における５０％以上、より好ましくは８０％以上、およびさらにより好ましくは９０％以上の低下によって示す。
【0126】
すでに上述のように、ＥＣ５０、Ｋｄまたはフローサイトメトリー解析により結合力を決定するとき、結合力は、好ましくは、上に定義するように平均結合力である。したがって、上に定義する結合力のわずかに中程度の低下は、好ましくは、上に定義する平均結合力のわずかに中程度の低下である。
【0127】
ワクチン接種による最良の作用を得るために、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤをワクチンとして使用する場合、抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対する結合力は、可能な限り高くなければならない。したがって、好ましくは、抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対する結合力の低下は、可能な限り中程度でなければならず、好ましくは、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤに対する抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢの結合力は、好ましくは、低下せず、さらには増加もしない。すなわち、ＥＣ５０およびＫｄは増加せず、ならびに／または陽染性細胞数およびＥＤ５０は低下しない。
【0128】
したがって、ＥＣ５０またはＫｄの決定により結合力を決定する場合、抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＭＥＲＳ－ｍＲＢＤの結合力の増加は、好ましくは、ＥＣ５０および／またはＫｄの１０％以上、より好ましくは２５％以上、なおさらにより好ましくは５０％以上、なおさらにより好ましくは８０％以上、および最も好ましくは９０％以上の低下によって示す。上述のように、ワクチン接種による最良の作用を得るために、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤをワクチンとして使用する場合、抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対する結合力は、可能な限り高くなければならない。したがって、好ましくは、抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対する結合力の増加に関して上限は存在しない。したがって、好ましくは、ＥＣ５０またはＫｄの低下に関して上限は存在せず、この低下は、１００％でさえあり得る。とは言え、ＥＣ５０および／またはＫｄの低下に関する上限は、１００％以下、より好ましくは９９％以下であり得る。
【0129】
フローサイトメトリー解析またはＥＤ５０により結合力を決定する場合、抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＭＥＲＳ－ｍＲＢＤの結合力の増加は、好ましくは、陽染性細胞数および／またはＥＤ５０それぞれの１．１倍以上、より好ましくは１．２倍以上、さらにより好ましくは１．５倍以上、なおさらにより好ましくは２倍以上の増加によって示す。上述のように、ワクチン接種による最良の作用を得るために、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤをワクチンとして使用する場合、抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対する結合力は、可能な限り高くなければならない。したがって、好ましくは、抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対する結合力の増加に関して上限は存在しない。したがって、好ましくは、陽染性細胞および／またはＥＤ５０の増加に関して上限は存在しない。とは言え、陽染性細胞および／またはＥＤ５０の増加に関する上限は、１０．０００倍以下、より好ましくは１．０００倍以下、およびなおより好ましくは１００倍以下であり得る。
【0130】
すでに上述のように、ＥＣ５０、Ｋｄまたはフローサイトメトリー解析により結合力を決定するとき、結合力は、好ましくは、上に定義するように平均結合力である。したがって、上に定義する結合力の増加は、好ましくは、上に定義する平均結合力の増加である。
【0131】
好ましくは、本発明は、
配列番号１９４を有するＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤのＬ１４０、Ｄ１４４、Ｅ１７０、Ｄ１７１またはＤ１７３から選択される位置におけるアミノ酸残基の１つまたは複数、好ましくは１～３つ、または２つ、好ましくは１つまたは２つ、より好ましくは１つの置換を含むアミノ酸配列またはこの断片
を含み、より好ましくは、これからなる、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片であって、この置換を除いて、配列番号１９４に対する８５％以上のアミノ酸配列同一性を有する、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片に関する。
配列番号１９４を有するＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤのＬ１４０、Ｄ１４４、Ｅ１７０、Ｄ１７１またはＤ１７３から選択される位置におけるアミノ酸残基の１つまたは複数、好ましくは１～３つ、または２つ、好ましくは１つまたは２つ、より好ましくは１つの置換を含むアミノ酸配列またはこの断片
を含み、より好ましくは、これからなる、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片であって、この置換を除いて、配列番号１９４に対する８５％以上のアミノ酸配列同一性を有する、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片に関する。
【0132】
好ましくは、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、置換を除いて、配列番号１９４に対する９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なおさらにより好ましくは９９％以上、および最も好ましくは１００％のアミノ酸配列同一性を有する。
【0133】
配列番号１９４のＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤは、例として、ＡＧＮ７０９２９．１変異体に見出されるＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤである。
【0134】
上に定義する配列番号１９４のＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤに対するＭＥＲＳ－ｍＲＢＤのアミノ酸配列同一性は、配列番号１９４以外のＭＥＲＳ－ＣｏＶ変異体のＭＥＲＳ－ＲＢＤを依然として包含することにより、この変異体に対して、または配列番号１９４と比較したとき、このような変異体に含まれる突然変異、例えば、置換、欠失、および挿入の組合せに対して、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片が適応可能となるように十分低くなければならない。このようなＭＥＲＳ－ＣｏＶ変異体および／または含まれる突然変異の例は、次のとおりである。
－ Ｓ１サブユニットの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）では、２／８単離株のＴ４２４Ｉの置換および１／８単離株のＳ４５９Ｔの置換。
－ ＲＢＤ／ＲＢＭオーバーラップ（受容体結合モチーフ）領域では、Ｗ５５３Ｒの置換。２／８単離株のＲＢＤ／ＲＢＭオーバーラップ（受容体結合モチーフ）領域に見出された。
－ 融合ペプチドでは、ヘプタドリピート領域１（ＨＲ１）のＱ１００９Ｌおよび膜貫通（ＴＭ）領域のＣ１３１３Ｓ（補足表２Ｂ、Ｓ２サブユニットの置換は、融合ペプチドのＳ９５０Ｔ、ヘプタドリピート領域１（ＨＲ１）のＱ１００９Ｌ、および膜貫通（ＴＭ）領域のＣ１３１３Ｓを含んだ）。
－ ＭＥＲＳ－ＣｏＶ変異体は、次の表に列挙した（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5165220/より検索）。
－ Ｓ１サブユニットの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）では、２／８単離株のＴ４２４Ｉの置換および１／８単離株のＳ４５９Ｔの置換。
－ ＲＢＤ／ＲＢＭオーバーラップ（受容体結合モチーフ）領域では、Ｗ５５３Ｒの置換。２／８単離株のＲＢＤ／ＲＢＭオーバーラップ（受容体結合モチーフ）領域に見出された。
－ 融合ペプチドでは、ヘプタドリピート領域１（ＨＲ１）のＱ１００９Ｌおよび膜貫通（ＴＭ）領域のＣ１３１３Ｓ（補足表２Ｂ、Ｓ２サブユニットの置換は、融合ペプチドのＳ９５０Ｔ、ヘプタドリピート領域１（ＨＲ１）のＱ１００９Ｌ、および膜貫通（ＴＭ）領域のＣ１３１３Ｓを含んだ）。
－ ＭＥＲＳ－ＣｏＶ変異体は、次の表に列挙した（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5165220/より検索）。
【0135】
【表1】
【0136】
ＭＥＲＳ－ＣｏＶ変異体のＭＥＲＳ－ＲＢＤに関する突然変異は、ＭＥＲＳ－Ｓｐｉｋｅタンパク質内の位置を考慮して示すことに言及する。配列番号１９４のＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤの配列は、配列番号２００のＭＥＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅの３６７番目の位置から始まる配列に対応する。したがって、アミノ酸３６６個をＭＥＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅまたはＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅのある特定のアミノ酸位置から除去するとき、この結果はＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤまたはＭＥＲＳ－ｍＲＢＤのアミノ酸位置にそれぞれ対応することとなる。ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ／ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤおよびＭＥＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅ／ＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅにおける対応するアミノ酸位置の選択は、本明細書のさらに下の図の記載の前に提示する表Ｂに示す。
【0137】
好ましくは、アミノ酸残基の１つまたは複数の置換は、配列番号１９４のＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤのＤ１７３、Ｄ１４４またはＤ１７１から選択される位置におけるアミノ酸残基の１～３つ、好ましくは１つまたは２つ、好ましくは１つの置換である。
【0138】
より好ましくは、アミノ酸残基の１つまたは複数の置換は、配列番号１９４のＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤのＤ１４４またはＤ１７１から選択される位置におけるアミノ酸残基の一方または両方、好ましくは一方の置換である。
【0139】
好ましくは、アミノ酸残基の１つまたは複数の置換は、配列番号１９４のＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤのＬ１４０、Ｄ１４４、Ｅ１７０、Ｄ１７１またはＤ１７３から選択される位置におけるアミノ酸残基の１つまたは複数、好ましくは１～３つ、より好ましくは１つまたは２つ、さらにより好ましくは１つの置換であり、ここで、
－ Ｌ１４０の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｌ１４０Ａであり、
－ Ｄ１４４の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ１４４Ａであり、
－ Ｅ１７０の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｅ１７０Ｒであり、
－ Ｄ１７１の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ１７１Ｋであり、および／または
－ Ｄ１７３の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ１７３Ｋである。
－ Ｌ１４０の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｌ１４０Ａであり、
－ Ｄ１４４の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ１４４Ａであり、
－ Ｅ１７０の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｅ１７０Ｒであり、
－ Ｄ１７１の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ１７１Ｋであり、および／または
－ Ｄ１７３の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ１７３Ｋである。
【0140】
より好ましくは、アミノ酸残基の１つまたは複数の置換は、配列番号１９４のＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤのＤ１４４、Ｄ１７１またはＤ１７３から選択される位置におけるアミノ酸残基の１～３つ、好ましくは１つまたは２つ、さらにより好ましくは１つの置換であり、ここで、
－ Ｄ１４４の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ１４４Ａであり、
－ Ｄ１７１の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ１７１Ｋであり、
－ Ｄ１７３の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ１７３Ｋである。
－ Ｄ１４４の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ１４４Ａであり、
－ Ｄ１７１の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ１７１Ｋであり、
－ Ｄ１７３の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ１７３Ｋである。
【0141】
さらにより好ましくは、アミノ酸残基の１つまたは複数の置換は、配列番号１９４のＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤのＤ１４４またはＤ１７１またはＤ１７３から選択される位置におけるアミノ酸残基の一方または両方、好ましくは一方の置換であり、ここで、
－ Ｄ１４４の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ１４４Ａであり、
－ Ｄ１７１の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ１７１Ｋである。
－ Ｄ１４４の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ１４４Ａであり、
－ Ｄ１７１の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ１７１Ｋである。
【0142】
なおより好ましくは、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８または配列番号１９９から選択され、より好ましくは、配列番号１９５または配列番号１９６から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなる。
【0143】
コロナウイルスの突然変異スパイクタンパク質（ＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅ）
本発明は、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片を含むコロナウイルスの突然変異スパイクタンパク質（ＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅ）またはこの断片をさらに提供する。
本発明は、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片を含むコロナウイルスの突然変異スパイクタンパク質（ＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅ）またはこの断片をさらに提供する。
【0144】
好ましくは、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片を含むＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、組換えポリペプチドもしくはタンパク質または化学合成ポリペプチドもしくはタンパク質である。
【0145】
好ましくは、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、ＣＯＲＯＮＡスパイクが、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片を含む、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片を含み、好ましくは、これからなる。
【0146】
好ましくは、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、
－ （Ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の突然変異スパイクタンパク質（ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅ）もしくはこの断片であり、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片は、本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片であるか、または
－ （Ｂ）ＭＥＲＳ－ＣｏＶの突然変異スパイクタンパク質（ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅ）もしくはこの断片であり、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片は、本発明によるＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片である。
－ （Ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の突然変異スパイクタンパク質（ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅ）もしくはこの断片であり、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片は、本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片であるか、または
－ （Ｂ）ＭＥＲＳ－ＣｏＶの突然変異スパイクタンパク質（ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅ）もしくはこの断片であり、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片は、本発明によるＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片である。
【0147】
したがって、好ましくは、本発明は、（Ａ）本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片を含むＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片に関し、および／または
本発明は、（Ｂ）本発明によるＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片を含むＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片に関する。
本発明は、（Ｂ）本発明によるＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片を含むＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片に関する。
【0148】
その上、本発明では、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片について開示する任意の実施形態は、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片に準用して適用可能であることが理解されるはずである。
【0149】
（Ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の突然変異スパイクタンパク質（ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅ）
上述のように、本発明は、好ましくは、本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を含むＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片に関する。
上述のように、本発明は、好ましくは、本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を含むＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片に関する。
【0150】
好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を含むＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、組換えポリペプチドもしくはタンパク質または化学合成ポリペプチドもしくはタンパク質である。
【0151】
好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅが、本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を含む、ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片を含み、好ましくは、これからなる。
【0152】
好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を含むアミノ酸配列またはこの断片、ならびに好ましくは、２Ｐ突然変異および／または無効なフーリン切断部位、より好ましくは、この両方を含み、好ましくは、これからなり、ここで、ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅは、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片ならびに好ましくは２Ｐ突然変異および／または無効なフーリン切断を除いて、配列番号１００に対する８５％以上のアミノ酸配列同一性を有する。
【0153】
ＳＡＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅの２Ｐ突然変異は、配列番号１００のＳＡＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅのＫ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐのアミノ酸残基の置換である。
【0154】
無効なフーリン切断部位は、配列番号１００のＳＡＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅのフーリン切断部位６８２－ＲＲＡＲ－６８５であり、例として、アミノ酸残基の置換、欠失または挿入による突然変異によって、好ましくは、６８２－ＱＱＡＱ－６８５と置換することによって無効とする。
【0155】
好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片ならびに好ましくは２Ｐ突然変異および／または無効なフーリン切断部位を除いて、配列番号１００に対する９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なおさらにより好ましくは９９％以上、および最も好ましくは１００％のアミノ酸配列同一性を有する。
【0156】
その上、本発明では、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片について開示する任意の実施形態は、ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片に準用して適用可能であることが理解されるはずである。
【0157】
好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、
配列番号１００のＳＡＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅのＧ５０２、Ｙ５０５、Ｌ４５５、Ｙ４８９、Ｆ４５６、Ｑ４９８、Ｆ４８６、Ｙ４４９またはＳ３７３から選択される位置におけるアミノ酸残基の１つまたは複数、好ましくは１～３つ、より好ましくは１つまたは２つ、さらにより好ましくは１つの置換を含むアミノ酸配列またはこの断片、ならびに好ましくは、２Ｐ突然変異および／または無効なフーリン切断部位、より好ましくは、この両方
を含み、好ましくは、これからなり、ここで、ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、この置換ならびに好ましくは２Ｐ突然変異および／または無効なフーリン切断を除いて、配列番号１００に対する８５％以上のアミノ酸配列同一性を有する。
配列番号１００のＳＡＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅのＧ５０２、Ｙ５０５、Ｌ４５５、Ｙ４８９、Ｆ４５６、Ｑ４９８、Ｆ４８６、Ｙ４４９またはＳ３７３から選択される位置におけるアミノ酸残基の１つまたは複数、好ましくは１～３つ、より好ましくは１つまたは２つ、さらにより好ましくは１つの置換を含むアミノ酸配列またはこの断片、ならびに好ましくは、２Ｐ突然変異および／または無効なフーリン切断部位、より好ましくは、この両方
を含み、好ましくは、これからなり、ここで、ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、この置換ならびに好ましくは２Ｐ突然変異および／または無効なフーリン切断を除いて、配列番号１００に対する８５％以上のアミノ酸配列同一性を有する。
【0158】
好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、この置換ならびに好ましくは２Ｐ突然変異および／または無効なフーリン切断部位を除いて、配列番号１００に対する９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なおさらにより好ましくは９９％以上、および最も好ましくは１００％のアミノ酸配列同一性を有する。
【0159】
ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片ならびに好ましくは２Ｐ突然変異および／もしくは無効なフーリン切断部位を除く、配列番号１００のＳＡＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅに対するＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片のアミノ酸配列同一性、ならびに／または
置換ならびに好ましくは２Ｐ突然変異および／または無効なフーリン切断部位を除く、配列番号１００のＳＡＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅに対するＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片のアミノ酸配列同一性は、
Ｗｕｈａｎ変異体である配列番号１００以外のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体のＳＡＲＳ－Ｓｐｉｋｅを依然として包含することにより、配列番号１００と比較したとき、このような変異体に含まれる突然変異、例えば、置換、欠失、および挿入の組合せに対して、ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片が適応可能となるように十分低くなければならない。このようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体の例は、
Ｄ６０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｌ２４２Ｈ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４ＧおよびＡ７０１Ｖの置換を含むＢ１．３５１（ベータ）、
Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈの置換ならびにＨ６９／Ｖ７０の欠失および１４４の欠失を含むＢ．１．１．７（アルファ、５０１Ｙ．Ｖ１）、
Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７ＩおよびＶ１１７６Ｆの置換を含むＰ．１（ガンマ、５０１Ｙ．Ｖ３）、ならびに／または
Ｔ１９Ｒ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１ＲおよびＤ９５０Ｎの置換ならびに１５７－１５８の欠失を含むＢ．１．６１７．２（デルタ）
であり、ここで、各置換の位置は、配列番号１００のＳＡＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅを考慮して示す。
置換ならびに好ましくは２Ｐ突然変異および／または無効なフーリン切断部位を除く、配列番号１００のＳＡＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅに対するＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片のアミノ酸配列同一性は、
Ｗｕｈａｎ変異体である配列番号１００以外のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体のＳＡＲＳ－Ｓｐｉｋｅを依然として包含することにより、配列番号１００と比較したとき、このような変異体に含まれる突然変異、例えば、置換、欠失、および挿入の組合せに対して、ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片が適応可能となるように十分低くなければならない。このようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体の例は、
Ｄ６０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｌ２４２Ｈ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４ＧおよびＡ７０１Ｖの置換を含むＢ１．３５１（ベータ）、
Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈの置換ならびにＨ６９／Ｖ７０の欠失および１４４の欠失を含むＢ．１．１．７（アルファ、５０１Ｙ．Ｖ１）、
Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７ＩおよびＶ１１７６Ｆの置換を含むＰ．１（ガンマ、５０１Ｙ．Ｖ３）、ならびに／または
Ｔ１９Ｒ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１ＲおよびＤ９５０Ｎの置換ならびに１５７－１５８の欠失を含むＢ．１．６１７．２（デルタ）
であり、ここで、各置換の位置は、配列番号１００のＳＡＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅを考慮して示す。
【0160】
下線で示すアミノ酸の置換は、それぞれのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体のＳＡＲＳ－ＳｐｉｋｅのＲＢＤに位置する。
【0161】
本発明をよりよく理解するために、配列番号１のＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤの配列は、配列番号１００のＳＡＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅの３１９番目の位置から始まる配列に対応することに言及する。したがって、アミノ酸３１８個をＳＡＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅまたはＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅのある特定のアミノ酸位置から除去するとき、この結果はＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤまたはＳＡＲＳ－ｍＲＢＤのアミノ酸位置にそれぞれ対応することとなる。ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ／ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤおよびＳＡＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅ／ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅにおける対応するアミノ酸位置の選択は、本明細書のさらに下の図の記載の前に提示する表Ａに示す。
【0162】
好ましくは、アミノ酸残基の１つまたは複数の置換は、配列番号１００のＳＡＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅのＧ５０２、Ｌ４５５、Ｙ４８９またはＹ５０５、より好ましくはＧ５０２、Ｌ４５５またはＹ５０５から選択される位置におけるアミノ酸残基の１～３つ、好ましくは１つまたは２つ、最も好ましくは１つの置換である。
【0163】
より好ましくは、アミノ酸残基の１つまたは複数の置換は、配列番号１００のＳＡＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅのＧ５０２もしくはＹ５０５またはＧ５０２もしくはＬ４５５から選択される位置におけるアミノ酸残基の一方または両方、より好ましくは一方の置換である。
【0164】
さらにより好ましくは、アミノ酸残基の１つまたは複数の置換は、配列番号１００のＳＡＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅのＧ５０２の位置におけるアミノ酸残基の置換である。
【0165】
好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片では、
－ Ｇ５０２の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｇ５０２Ａ、Ｇ５０２Ｃ、Ｇ５０２Ｄ、Ｇ５０２Ｅ、Ｇ５０２Ｆ、Ｇ５０２Ｈ、Ｇ５０２Ｉ、Ｇ５０２Ｋ、Ｇ５０２Ｌ、Ｇ５０２Ｍ、Ｇ５０２Ｎ、Ｇ５０２Ｐ、Ｇ５０２Ｑ、Ｇ５０２Ｒ、Ｇ５０２Ｓ、Ｇ５０２Ｔ、Ｇ５０２Ｖ、Ｇ５０２ＷもしくはＧ５０２Ｙから選択され、
－ Ｙ５０５の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｙ５０５Ａ、Ｙ５０５Ｃ、Ｙ５０５Ｄ、Ｙ５０５Ｅ、Ｙ５０５Ｇ、Ｙ５０５Ｉ、Ｙ５０５Ｋ、Ｙ５０５Ｌ、Ｙ５０５Ｍ、Ｙ５０５Ｎ、Ｙ５０５Ｑ、Ｙ５０５Ｒ、Ｙ５０５Ｓ、Ｙ５０５ＴもしくはＹ５０５Ｖから選択され、
－ Ｌ４５５の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｌ４５５Ｄ、Ｌ４５５Ｅ、Ｌ４５５Ｋ、Ｌ４５５ＲおよびＬ４５５Ｙから選択され、
－ Ｙ４８９の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｙ４８９Ａ、Ｙ４８９Ｃ、Ｙ４８９Ｅ、Ｙ４８９Ｉ、Ｙ４８９Ｋ、Ｙ４８９Ｌ、Ｙ４８９Ｍ、Ｙ４８９Ｎ、Ｙ４８９Ｐ、Ｙ４８９Ｑ、Ｙ４８９Ｒ、Ｙ４８９Ｓ、Ｙ４８９ＴもしくはＹ４８９Ｖから選択され、
－ Ｆ４５６の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｆ４５６Ａ、Ｆ４５６Ｃ、Ｆ４５６Ｅ、Ｆ４５６Ｇ、Ｆ４５６Ｉ、Ｆ４５６Ｋ、Ｆ４５６Ｎ、Ｆ４５６Ｑ、Ｆ４５６Ｒ、Ｆ４５６Ｓ、Ｆ４５６Ｔ、Ｆ４５６ＷもしくはＦ４５６Ｙから選択され、
－ Ｑ４９８の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｑ４９８Ｃ、Ｑ４９８Ｄ、Ｑ４９８Ｉ、Ｑ４９８Ｋ、Ｑ４９８ＬもしくはＱ４９８Ｖから選択され、
－ Ｆ４８６の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｆ４８６Ｃ、Ｆ４８６ＤもしくはＦ４８６Ｅから選択され、
－ Ｙ４４９の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｙ４４９Ａ、Ｙ４４９Ｃ、Ｙ４４９Ｄ、Ｙ４４９Ｅ、Ｙ４４９Ｆ、Ｙ４４９Ｇ、Ｙ４４９Ｈ、Ｙ４４９Ｉ、Ｙ４４９Ｌ、Ｙ４４９Ｍ、Ｙ４４９Ｎ、Ｙ４４９Ｐ、Ｙ４４９Ｑ、Ｙ４４９Ｓ、Ｙ４４９Ｔ、Ｙ４４９ＶもしくはＹ４４９Ｗから選択され、ならびに／または
－ Ｓ３７３の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｓ３７３Ｎである。
－ Ｇ５０２の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｇ５０２Ａ、Ｇ５０２Ｃ、Ｇ５０２Ｄ、Ｇ５０２Ｅ、Ｇ５０２Ｆ、Ｇ５０２Ｈ、Ｇ５０２Ｉ、Ｇ５０２Ｋ、Ｇ５０２Ｌ、Ｇ５０２Ｍ、Ｇ５０２Ｎ、Ｇ５０２Ｐ、Ｇ５０２Ｑ、Ｇ５０２Ｒ、Ｇ５０２Ｓ、Ｇ５０２Ｔ、Ｇ５０２Ｖ、Ｇ５０２ＷもしくはＧ５０２Ｙから選択され、
－ Ｙ５０５の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｙ５０５Ａ、Ｙ５０５Ｃ、Ｙ５０５Ｄ、Ｙ５０５Ｅ、Ｙ５０５Ｇ、Ｙ５０５Ｉ、Ｙ５０５Ｋ、Ｙ５０５Ｌ、Ｙ５０５Ｍ、Ｙ５０５Ｎ、Ｙ５０５Ｑ、Ｙ５０５Ｒ、Ｙ５０５Ｓ、Ｙ５０５ＴもしくはＹ５０５Ｖから選択され、
－ Ｌ４５５の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｌ４５５Ｄ、Ｌ４５５Ｅ、Ｌ４５５Ｋ、Ｌ４５５ＲおよびＬ４５５Ｙから選択され、
－ Ｙ４８９の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｙ４８９Ａ、Ｙ４８９Ｃ、Ｙ４８９Ｅ、Ｙ４８９Ｉ、Ｙ４８９Ｋ、Ｙ４８９Ｌ、Ｙ４８９Ｍ、Ｙ４８９Ｎ、Ｙ４８９Ｐ、Ｙ４８９Ｑ、Ｙ４８９Ｒ、Ｙ４８９Ｓ、Ｙ４８９ＴもしくはＹ４８９Ｖから選択され、
－ Ｆ４５６の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｆ４５６Ａ、Ｆ４５６Ｃ、Ｆ４５６Ｅ、Ｆ４５６Ｇ、Ｆ４５６Ｉ、Ｆ４５６Ｋ、Ｆ４５６Ｎ、Ｆ４５６Ｑ、Ｆ４５６Ｒ、Ｆ４５６Ｓ、Ｆ４５６Ｔ、Ｆ４５６ＷもしくはＦ４５６Ｙから選択され、
－ Ｑ４９８の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｑ４９８Ｃ、Ｑ４９８Ｄ、Ｑ４９８Ｉ、Ｑ４９８Ｋ、Ｑ４９８ＬもしくはＱ４９８Ｖから選択され、
－ Ｆ４８６の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｆ４８６Ｃ、Ｆ４８６ＤもしくはＦ４８６Ｅから選択され、
－ Ｙ４４９の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｙ４４９Ａ、Ｙ４４９Ｃ、Ｙ４４９Ｄ、Ｙ４４９Ｅ、Ｙ４４９Ｆ、Ｙ４４９Ｇ、Ｙ４４９Ｈ、Ｙ４４９Ｉ、Ｙ４４９Ｌ、Ｙ４４９Ｍ、Ｙ４４９Ｎ、Ｙ４４９Ｐ、Ｙ４４９Ｑ、Ｙ４４９Ｓ、Ｙ４４９Ｔ、Ｙ４４９ＶもしくはＹ４４９Ｗから選択され、ならびに／または
－ Ｓ３７３の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｓ３７３Ｎである。
【0166】
より好ましくは、アミノ酸残基の１つまたは複数の置換は、配列番号１００を有するＳＡＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅのＧ５０２、Ｌ４５５、Ｙ４８９またはＹ５０５から選択される位置、より好ましくはＧ５０２、Ｌ４５５またはＹ５０５から選択される位置におけるアミノ酸残基の１つ～すべて、好ましくは１つまたは２つ、より好ましくは１つの置換であり、ここで、
－ Ｇ５０２の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｇ５０２Ｒ、Ｇ５０２Ｄ、Ｇ５０２Ｙ、Ｇ５０２Ｋ、Ｇ５０２Ｓ、Ｇ５０２Ｐ、Ｇ５０２Ｅ、Ｇ５０２Ｖ、Ｇ４０２Ａ、Ｇ５０２Ｎ、Ｇ５０２Ｑ、Ｇ５０２Ｔ、Ｇ５０２Ｍ、Ｇ５０２ＨまたはＧ５０２Ｌから選択され、
－ Ｌ４５５の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｌ４５５ＲまたはＬ４５５Ｅから選択され、
－ Ｙ５０５の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｙ５０５ＮおよびＹ５０５Ｑから選択され、
－ Ｙ４８９の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｙ４８９ＳおよびＹ４８９Ｔから選択される。
－ Ｇ５０２の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｇ５０２Ｒ、Ｇ５０２Ｄ、Ｇ５０２Ｙ、Ｇ５０２Ｋ、Ｇ５０２Ｓ、Ｇ５０２Ｐ、Ｇ５０２Ｅ、Ｇ５０２Ｖ、Ｇ４０２Ａ、Ｇ５０２Ｎ、Ｇ５０２Ｑ、Ｇ５０２Ｔ、Ｇ５０２Ｍ、Ｇ５０２ＨまたはＧ５０２Ｌから選択され、
－ Ｌ４５５の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｌ４５５ＲまたはＬ４５５Ｅから選択され、
－ Ｙ５０５の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｙ５０５ＮおよびＹ５０５Ｑから選択され、
－ Ｙ４８９の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｙ４８９ＳおよびＹ４８９Ｔから選択される。
【0167】
さらにより好ましくは、アミノ酸残基の１つまたは複数の置換は、配列番号１００を有するＳＡＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅのＧ５０２もしくはＬ５０５、またはＧ５０２もしくはＬ４５５、より好ましくはＧ５０２もしくはＬ４５５から選択される位置におけるアミノ酸残基の一方または両方、好ましくは一方の置換であり、ここで、
－ Ｇ５０２の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｇ５０２Ｒ、Ｇ５０２Ｄ、Ｇ５０２Ｙ、Ｇ５０２Ｋ、Ｇ５０２Ｓ、Ｇ５０２Ｐ、Ｇ５０２Ｅ、Ｇ５０２Ｖ、Ｇ４０２Ａ、Ｇ５０２Ｎ、Ｇ５０２Ｑ、Ｇ５０２Ｔ、Ｇ５０２Ｍ、Ｇ５０２ＨまたはＧ５０２Ｌから選択され、より好ましくはＧ５０２Ｒ、Ｇ５０２ＤまたはＧ５０２Ｅであり、最も好ましくはＧ５０２ＲまたはＧ５０２Ｅであり、
－ Ｌ４５５の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｌ４５５Ｒであり、
－ Ｙ５０５の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｙ５０５Ｎである。
－ Ｇ５０２の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｇ５０２Ｒ、Ｇ５０２Ｄ、Ｇ５０２Ｙ、Ｇ５０２Ｋ、Ｇ５０２Ｓ、Ｇ５０２Ｐ、Ｇ５０２Ｅ、Ｇ５０２Ｖ、Ｇ４０２Ａ、Ｇ５０２Ｎ、Ｇ５０２Ｑ、Ｇ５０２Ｔ、Ｇ５０２Ｍ、Ｇ５０２ＨまたはＧ５０２Ｌから選択され、より好ましくはＧ５０２Ｒ、Ｇ５０２ＤまたはＧ５０２Ｅであり、最も好ましくはＧ５０２ＲまたはＧ５０２Ｅであり、
－ Ｌ４５５の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｌ４５５Ｒであり、
－ Ｙ５０５の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｙ５０５Ｎである。
【0168】
なおさらにより好ましくは、アミノ酸残基の１つもしくは複数の置換は、配列番号１００を有するＳＡＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅのＧ５０２の位置におけるアミノ酸残基の１つの置換であり、ここで、この置換は、Ｇ５０２Ｒ、Ｇ５０２ＤもしくはＧ５０２Ｅ、より好ましくは、Ｇ５０２ＲもしくはＧ５０２Ｅであり、および／またはアミノ酸残基の１つまたは複数の置換は、配列番号１００を有するＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤのＬ４５５の位置におけるアミノ酸残基の１つの置換であり、ここで、この置換は、Ｌ４５５Ｒであり、最も好ましくは、この置換は、Ｇ５０２ＲまたはＧ５０２Ｅである。
【0169】
好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３または配列番号１９４
から選択され、
より好ましくは、
配列番号１１４、配列番号１０４、配列番号１１９、配列番号１０８、配列番号１１５、配列番号１１２、配列番号１０１、配列番号１１７、配列番号１０２、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１６、配列番号１１０、配列番号１０６、配列番号１０９、配列番号１５４、配列番号１５２、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１９１または配列番号１９２から選択され、
さらにより好ましくは、
配列番号１１４、配列番号１０４、配列番号１１９、配列番号１０８、配列番号１１５、配列番号１１２、配列番号１０１、配列番号１１７、配列番号１０２、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１６、配列番号１１０、配列番号１０６、配列番号１０９、配列番号１５４または配列番号１２９から選択され、
なおより好ましくは、
配列番号１１４、配列番号１０４、配列番号１０１、配列番号１５４または配列番号１２９から選択され、
なおさらにより好ましくは、
配列番号１１４、配列番号１０４、配列番号１０１または配列番号１５４から選択され、
なおさらにより好ましくは、
配列番号１１４、配列番号１０１または配列番号１５４
から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなり、
最も好ましくは、配列番号１１４または配列番号１０１のアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなる。
から選択され、
より好ましくは、
配列番号１１４、配列番号１０４、配列番号１１９、配列番号１０８、配列番号１１５、配列番号１１２、配列番号１０１、配列番号１１７、配列番号１０２、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１６、配列番号１１０、配列番号１０６、配列番号１０９、配列番号１５４、配列番号１５２、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１９１または配列番号１９２から選択され、
さらにより好ましくは、
配列番号１１４、配列番号１０４、配列番号１１９、配列番号１０８、配列番号１１５、配列番号１１２、配列番号１０１、配列番号１１７、配列番号１０２、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１６、配列番号１１０、配列番号１０６、配列番号１０９、配列番号１５４または配列番号１２９から選択され、
なおより好ましくは、
配列番号１１４、配列番号１０４、配列番号１０１、配列番号１５４または配列番号１２９から選択され、
なおさらにより好ましくは、
配列番号１１４、配列番号１０４、配列番号１０１または配列番号１５４から選択され、
なおさらにより好ましくは、
配列番号１１４、配列番号１０１または配列番号１５４
から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなり、
最も好ましくは、配列番号１１４または配列番号１０１のアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなる。
【0170】
（Ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶの突然変異スパイクタンパク質（ＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅ）
上述のように、本発明は、好ましくは、本発明によるＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を含むＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片に関する。
上述のように、本発明は、好ましくは、本発明によるＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を含むＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片に関する。
【0171】
好ましくは、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を含むＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、組換えポリペプチドもしくはタンパク質または化学合成ポリペプチドもしくはタンパク質である。
【0172】
好ましくは、ＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、ＭＥＲＳスパイクが、本発明によるＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を含む、ＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片を含み、好ましくは、これからなる。
【0173】
好ましくは、ＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、本発明によるＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を含むアミノ酸配列またはこの断片、ならびに好ましくは、２Ｐ突然変異および／または無効なフーリン切断部位、より好ましくは、この両方を含み、好ましくは、これからなり、ここで、ＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅは、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片ならびに好ましくは２Ｐ突然変異および／または無効なフーリン切断を除いて、配列番号２００に対する８５％以上のアミノ酸配列同一性を有する。
【0174】
ＭＥＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅの２Ｐ突然変異は、配列番号２００のＭＥＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅのＶ１０６０ＰおよびＬ１０６１Ｐのアミノ酸残基の置換である。
【0175】
無効なフーリン切断部位は、配列番号２００のＭＥＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅのフーリン切断部位７４８－ＲＳＶＲ－７５１であり、例として、アミノ酸残基の置換、欠失または挿入による突然変異によって、好ましくは、７４８－ＡＳＶＧ－７５１と置換することによって無効とする。
【0176】
好ましくは、ＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、ＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片ならびに好ましくは２Ｐ突然変異および／または無効なフーリン切断部位を除いて、配列番号２００に対する９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なおさらにより好ましくは９９％以上、および最も好ましくは１００％のアミノ酸配列同一性を有する。
【0177】
その上、本発明では、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片について開示する任意の実施形態は、ＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片に準用して適用可能であることが理解されるはずである。
【0178】
好ましくは、ＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、
配列番号２００のＭＥＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅのＬ５０６、Ｄ５１０、Ｅ５３６、Ｄ５３７またはＤ５３９から選択される位置におけるアミノ酸残基の１つまたは複数、好ましくは１～３つ、または２つ、好ましくは１つまたは２つ、より好ましくは１つの置換を含むアミノ酸配列またはこの断片
を含み、好ましくは、これからなり、ここで、ＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、この置換を除いて、配列番号２００に対する９０％以上のアミノ酸配列同一性を有する。
配列番号２００のＭＥＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅのＬ５０６、Ｄ５１０、Ｅ５３６、Ｄ５３７またはＤ５３９から選択される位置におけるアミノ酸残基の１つまたは複数、好ましくは１～３つ、または２つ、好ましくは１つまたは２つ、より好ましくは１つの置換を含むアミノ酸配列またはこの断片
を含み、好ましくは、これからなり、ここで、ＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、この置換を除いて、配列番号２００に対する９０％以上のアミノ酸配列同一性を有する。
【0179】
好ましくは、ＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、この置換を除いて、配列番号２００に対する９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上、および最も好ましくは１００％のアミノ酸配列同一性を有する。
【0180】
ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片ならびに好ましくは２Ｐ突然変異および／もしくは無効なフーリン切断部位を除く、配列番号２００のＭＥＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅに対するＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅのアミノ酸配列同一性、ならびに／または
置換ならびに好ましくは２Ｐ突然変異および／もしくは無効なフーリン切断部位を除く、配列番号２００のＭＥＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅに対するＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅのアミノ酸配列同一性
は、配列番号２００以外のＭＥＲＳ－ＣｏＶ変異体のＭＥＲＳ－Ｓｐｉｋｅを依然として包含することにより、この変異体に対して、または配列番号２００と比較したとき、このような変異体に含まれる突然変異、例えば、置換、欠失、および挿入の組合せに対して、ＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅが適応可能となるように十分低くなければならない。このような既存のＭＥＲＳ－ＣｏＶ変異体および／または含まれる突然変異の例は、次のとおりである。
－ Ｓ１サブユニットの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）では、２／８単離株のＴ４２４Ｉの置換および１／８単離株のＳ４５９Ｔの置換。
－ ＲＢＤ／ＲＢＭオーバーラップ（受容体結合モチーフ）領域では、Ｗ５５３Ｒの置換。２／８単離株のＲＢＤ／ＲＢＭオーバーラップ（受容体結合モチーフ）領域に見出された。
－ 融合ペプチドでは、ヘプタドリピート領域１（ＨＲ１）のＱ１００９Ｌおよび膜貫通（ＴＭ）領域のＣ１３１３Ｓ（補足表２Ｂ、Ｓ２サブユニットの置換では、融合ペプチドのＳ９５０Ｔ、ヘプタドリピート領域１（ＨＲ１）のＱ１００９Ｌ、および膜貫通（ＴＭ）領域のＣ１３１３Ｓを含んだ）。
－ ＭＥＲＳ－ＣｏＶ変異体は、次の表に列挙した（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5165220/より検索）。
置換ならびに好ましくは２Ｐ突然変異および／もしくは無効なフーリン切断部位を除く、配列番号２００のＭＥＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅに対するＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅのアミノ酸配列同一性
は、配列番号２００以外のＭＥＲＳ－ＣｏＶ変異体のＭＥＲＳ－Ｓｐｉｋｅを依然として包含することにより、この変異体に対して、または配列番号２００と比較したとき、このような変異体に含まれる突然変異、例えば、置換、欠失、および挿入の組合せに対して、ＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅが適応可能となるように十分低くなければならない。このような既存のＭＥＲＳ－ＣｏＶ変異体および／または含まれる突然変異の例は、次のとおりである。
－ Ｓ１サブユニットの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）では、２／８単離株のＴ４２４Ｉの置換および１／８単離株のＳ４５９Ｔの置換。
－ ＲＢＤ／ＲＢＭオーバーラップ（受容体結合モチーフ）領域では、Ｗ５５３Ｒの置換。２／８単離株のＲＢＤ／ＲＢＭオーバーラップ（受容体結合モチーフ）領域に見出された。
－ 融合ペプチドでは、ヘプタドリピート領域１（ＨＲ１）のＱ１００９Ｌおよび膜貫通（ＴＭ）領域のＣ１３１３Ｓ（補足表２Ｂ、Ｓ２サブユニットの置換では、融合ペプチドのＳ９５０Ｔ、ヘプタドリピート領域１（ＨＲ１）のＱ１００９Ｌ、および膜貫通（ＴＭ）領域のＣ１３１３Ｓを含んだ）。
－ ＭＥＲＳ－ＣｏＶ変異体は、次の表に列挙した（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5165220/より検索）。
【0181】
【表2】
【0182】
本発明をよりよく理解するために、配列番号１９４のＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤの配列は、配列番号２００のＭＥＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅの３６７番目の位置から始まる配列に対応することに言及する。したがって、アミノ酸３６６個をＭＥＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅまたはＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅのある特定のアミノ酸位置から除去するとき、この結果はＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤまたはＭＥＲＳ－ｍＲＢＤのアミノ酸位置にそれぞれ対応することとなる。ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ／ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤおよびＭＥＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅ／ＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅにおける対応するアミノ酸位置の選択は、本明細書のさらに下の図の記載の前に提示する表Ｂに示す。
【0183】
好ましくは、アミノ酸残基の１つまたは複数の置換は、配列番号２００のＭＥＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅのＤ５３９、Ｄ５１０またはＤ５３７から選択される位置におけるアミノ酸残基の１つ～すべて、好ましくは１つまたは２つ、好ましくは１つの置換である。
【0184】
より好ましくは、アミノ酸残基の１つまたは複数の置換は、配列番号２００のＭＥＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅのＤ５１０またはＤ５３７から選択される位置におけるアミノ酸残基の一方または両方、より好ましくは一方の置換である。
【0185】
好ましくは、アミノ酸残基の１つまたは複数の置換は、配列番号２００のＭＥＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅのＬ５０６、Ｄ５１０、Ｅ５３６、Ｄ５３７またはＤ５３９から選択される位置におけるアミノ酸残基の１つまたは複数、好ましくは１～３つ、より好ましくは１つまたは２つ、さらにより好ましくは１つの置換であり、ここで、
－ Ｌ５０６の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｌ５０６Ａであり、
－ Ｄ５１０の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ５１０Ａであり、
－ Ｅ５３６の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｅ５３６Ｒであり、
－ Ｄ５３７の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ５３７Ｋであり、および／または
－ Ｄ５３９の位置におけるアミノ酸残基の置換は、５３９Ｋである。
－ Ｌ５０６の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｌ５０６Ａであり、
－ Ｄ５１０の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ５１０Ａであり、
－ Ｅ５３６の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｅ５３６Ｒであり、
－ Ｄ５３７の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ５３７Ｋであり、および／または
－ Ｄ５３９の位置におけるアミノ酸残基の置換は、５３９Ｋである。
【0186】
より好ましくは、アミノ酸残基の１つまたは複数の置換は、配列番号２００のＭＥＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅのＤ５１０、Ｄ５３７またはＤ５３９から選択される位置におけるアミノ酸残基の１～３つ、好ましくは１つまたは２つ、さらにより好ましくは１つの置換であり、ここで、
－ Ｄ５１０の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ５１０Ａであり、
－ Ｄ５３７の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ５３７Ｋであり、
－ Ｄ５３９の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ５３９Ｋである。
－ Ｄ５１０の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ５１０Ａであり、
－ Ｄ５３７の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ５３７Ｋであり、
－ Ｄ５３９の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ５３９Ｋである。
【0187】
さらにより好ましくは、アミノ酸残基の１つまたは複数の置換は、配列番号２００のＭＥＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅのＤ５１０またはＤ５３７から選択される位置におけるアミノ酸残基の一方または両方、より好ましくは一方の置換であり、ここで、
－ Ｄ５１０の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ５１０Ａであり、
－ Ｄ５３７の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ５３７Ｋである。
－ Ｄ５１０の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ５１０Ａであり、
－ Ｄ５３７の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ５３７Ｋである。
【0188】
なおより好ましくは、ＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４または配列番号２０５から選択され、より好ましくは、配列番号２０１または配列番号２０２から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなる。
【0189】
ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅを含むポリペプチドおよびタンパク質
本発明は、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含むポリペプチドまたはタンパク質にさらに関する。
本発明は、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含むポリペプチドまたはタンパク質にさらに関する。
【0190】
好ましくは、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片またはＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含むポリペプチドおよび／またはタンパク質は、組換えポリペプチドもしくはタンパク質、または化学合成ポリペプチドもしくはタンパク質である。
【0191】
ポリペプチドまたはタンパク質は、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片またはＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片以外の１つまたは複数のさらなるアミノ酸配列を含み得る。このようなさらなるアミノ酸配列は、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片および／またはＣＯＲＯＮＡスパイクもしくはこの断片、局在化シグナル、例えば、分泌シグナル、安定性調節アミノ酸配列、例えば、ポリペプチドまたはタンパク質の能動的および／または受動的分解を促進または阻止する配列、重合ドメイン、例えば、二量体形成または三量体形成ドメイン、スペーサー、リンカー等とは異なるタンパク質のドメインまたは断片であり得る。その上、ポリペプチドまたはタンパク質は、１つまたは複数の修飾を含み得る。
【0192】
好ましくは、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、（Ａ）本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または（Ｂ）本発明によるＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片である。
【0193】
したがって、好ましくは、本発明は、（Ａ）本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含むポリペプチドまたはタンパク質に関する。および／または
本発明は、（Ｂ）本発明によるＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含むポリペプチドまたはタンパク質に関する。
本発明は、（Ｂ）本発明によるＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含むポリペプチドまたはタンパク質に関する。
【0194】
その上、本発明では、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片および／またはＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片について開示する任意の実施形態は、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片またはＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含むポリペプチドまたはタンパク質に準用して適用可能であることが理解されるはずである。
【0195】
（Ａ）ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅを含むポリペプチドおよびタンパク質
上述のように、本発明は、好ましくは、本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含むポリペプチドまたはタンパク質に関する。
上述のように、本発明は、好ましくは、本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含むポリペプチドまたはタンパク質に関する。
【0196】
好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片またはＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含むポリペプチドおよび／またはタンパク質は、組換えポリペプチドもしくはタンパク質または化学合成ポリペプチドもしくはタンパク質である。
【0197】
ポリペプチドおよびタンパク質は、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片またはＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片以外の１つまたは複数のさらなるアミノ酸配列を含み得る。このようなさらなるアミノ酸配列は、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片および／またはＳＡＲＳスパイクもしくはこの断片、局在化シグナル、例えば、サイトゾル局在化シグナルまたは分泌シグナル、安定性調節アミノ酸配列、例えば、ポリペプチドまたはタンパク質の能動的および／または受動的分解を促進または阻止する配列、重合ドメイン、例えば、二量体形成または三量体形成ドメイン、スペーサー、リンカー、タグ、例えば、ＦＬＡＧタグまたはＨｉｓタグ等とは異なるタンパク質のドメインまたは断片であり得る。その上、ポリペプチドまたはタンパク質は、１つまたは複数の修飾、例えば、グリコシル化を含み得る。
【0198】
その上、本発明では、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片および／またはＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片について開示する任意の実施形態は、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片またはＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含むポリペプチドまたはタンパク質に準用して適用可能であることが理解されるはずである。
【0199】
（Ｂ）ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅを含むポリペプチドおよびタンパク質
上述のように、本発明は、好ましくは、本発明によるＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含むポリペプチドまたはタンパク質に関する。
上述のように、本発明は、好ましくは、本発明によるＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含むポリペプチドまたはタンパク質に関する。
【0200】
好ましくは、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片またはＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含むポリペプチドおよび／またはタンパク質は、組換えポリペプチドもしくはタンパク質または化学合成ポリペプチドもしくはタンパク質である。
【0201】
ポリペプチドおよびタンパク質は、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片またはＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片以外の１つまたは複数のさらなるアミノ酸配列を含み得る。このようなさらなるアミノ酸配列は、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片および／またはＭＥＲＳスパイクもしくはこの断片、局在化シグナル、例えば、サイトゾル局在化シグナルまたは分泌シグナル、安定性調節アミノ酸配列、例えば、ポリペプチドまたはタンパク質の能動的および／または受動的分解を促進または阻止する配列、重合ドメイン、例えば、二量体形成または三量体形成ドメイン、スペーサー、リンカー、タグ、例えば、ＦＬＡＧタグまたはＨｉｓタグ等とは異なるタンパク質のドメインまたは断片であり得る。その上、ポリペプチドまたはタンパク質は、１つまたは複数の修飾、例えば、グリコシル化を含み得る。
【0202】
その上、本発明では、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片および／またはＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片について開示する任意の実施形態は、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片またはＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含むポリペプチドまたはタンパク質に準用して適用可能であることが理解されるはずである。
【0203】
核酸
その上、本発明は、
－ 本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片、
－ 本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片、あるいは
－ 本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含む本発明によるポリペプチドまたはタンパク質
をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
その上、本発明は、
－ 本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片、
－ 本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片、あるいは
－ 本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含む本発明によるポリペプチドまたはタンパク質
をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
【0204】
好ましくは、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡである。
【0205】
好ましくは、核酸は、組換え核酸または化学合成核酸である。
【0206】
核酸は、をコードするヌクレオチド配列以外の１つまたは複数のさらなるヌクレオチド配列を含み得る。
【0207】
その上、核酸は、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片またはポリペプチドもしくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列以外の１つまたは複数のさらなる配列を含み得る。このようなさらなるヌクレオチド配列は、転写調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、転写因子結合モチーフまたはＤＮＡポリメラーゼもしくは逆転写酵素結合部位、翻訳調節配列、例えば、リボソーム結合モチーフ、エクソン、イントロン、５’－ｃａｐ、ポリＡテール、局在化シグナル、例えば、コアもしくはサイトゾル局在化シグナル、ハイブリダイゼーションストレッチおよび／または安定性調節配列、例えば、核酸の能動的および／または受動的分解を促進または阻止するヌクレオチド配列、スペーサー、リンカー、タグ、例えば、ＦＬＡＧタグもしくはＨｉｓタグをコードする配列等であり得る。その上、核酸は、修飾、例えば、メチル化を含み得る。
【0208】
より好ましくは、核酸は、好ましくは、
－ 本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片、
－ 本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片、あるいは
－ 本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含む本発明によるポリペプチドまたはタンパク質
をコードする核酸からなる。
－ 本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片、
－ 本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片、あるいは
－ 本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含む本発明によるポリペプチドまたはタンパク質
をコードする核酸からなる。
【0209】
好ましくは、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片は、（Ａ）本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤおよび／もしくは（Ｂ）本発明によるＭＥＲＳ－ｍＲＢＤであり、ならびに／または
好ましくは、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片は、（Ａ）本発明によるＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅおよび／もしくは（Ｂ）本発明によるＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅである。
好ましくは、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片は、（Ａ）本発明によるＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅおよび／もしくは（Ｂ）本発明によるＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅである。
【0210】
したがって、好ましくは、本発明は、（Ａ）
－ 本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片、
－ 本発明によるＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片、あるいは
－ 本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含む本発明によるポリペプチドまたはタンパク質
をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。および／または
本発明は、（Ｂ）
－ 本発明によるＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片、
－ 本発明によるＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片、あるいは
－ 本発明によるＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含む本発明によるポリペプチドまたはタンパク質
をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
－ 本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片、
－ 本発明によるＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片、あるいは
－ 本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含む本発明によるポリペプチドまたはタンパク質
をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。および／または
本発明は、（Ｂ）
－ 本発明によるＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片、
－ 本発明によるＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片、あるいは
－ 本発明によるＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含む本発明によるポリペプチドまたはタンパク質
をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
【0211】
その上、本発明では、
ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片、および／あるいは
ＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片、および／あるいは
ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片またはＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含むポリペプチドまたはタンパク質
について開示する任意の実施形態は、本発明による核酸に準用して適用可能であることが理解されるはずである。
ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片、および／あるいは
ＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片、および／あるいは
ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片またはＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含むポリペプチドまたはタンパク質
について開示する任意の実施形態は、本発明による核酸に準用して適用可能であることが理解されるはずである。
【0212】
（Ａ）核酸
したがって、本発明は、好ましくは、（Ａ）
－ 本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片、
－ 本発明によるＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片、あるいは
－ 本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含む本発明によるポリペプチドまたはタンパク質
をコードするヌクレオチド配列を含み、好ましくは、これからなる核酸に関する。
したがって、本発明は、好ましくは、（Ａ）
－ 本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片、
－ 本発明によるＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片、あるいは
－ 本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含む本発明によるポリペプチドまたはタンパク質
をコードするヌクレオチド配列を含み、好ましくは、これからなる核酸に関する。
【0213】
好ましくは、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡである。
【0214】
好ましくは、核酸は、組換え核酸または化学合成核酸である。
【0215】
核酸は、をコードするヌクレオチド配列以外の１つまたは複数のさらなるヌクレオチド配列を含み得る。
【0216】
その上、核酸は、本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片またはポリペプチドもしくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列以外の１つまたは複数のさらなる配列を含み得る。このようなさらなるヌクレオチド配列は、転写調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、転写因子結合モチーフまたはＤＮＡポリメラーゼもしくは逆転写酵素結合部位、翻訳調節配列、例えば、リボソーム結合モチーフ、エクソン、イントロン、５’－ｃａｐ、ポリＡテール、局在化シグナル、例えば、コアもしくはサイトゾル局在化シグナル、ハイブリダイゼーションストレッチおよび／または安定性調節配列、例えば、核酸の能動的および／または受動的分解を促進または阻止するヌクレオチド配列、スペーサー、リンカー、タグ、例えば、ＦＬＡＧタグもしくはＨｉｓタグをコードする配列等であり得る。その上、核酸は、修飾、例えば、メチル化を含み得る。
【0217】
好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２５７、配列番号２５８または配列番号２６６である。
【0218】
好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２５５、配列番号２５６または配列番号２６５である。
【0219】
その上、本発明では、
ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片、および／あるいは
ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片、および／あるいは
ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片またはＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含むポリペプチドまたはタンパク質
について開示する任意の実施形態は、本発明による核酸に準用して適用可能であることが理解されるはずである。
ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片、および／あるいは
ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片、および／あるいは
ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片またはＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含むポリペプチドまたはタンパク質
について開示する任意の実施形態は、本発明による核酸に準用して適用可能であることが理解されるはずである。
【0220】
（Ｂ）核酸
その上、本発明は、好ましくは、（Ｂ）
－ 本発明によるＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片、
－ 本発明によるＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片、あるいは
－ 本発明によるＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含む本発明によるポリペプチドまたはタンパク質
をコードするヌクレオチド配列を含み、好ましくは、これからなる核酸に関する。
その上、本発明は、好ましくは、（Ｂ）
－ 本発明によるＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片、
－ 本発明によるＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片、あるいは
－ 本発明によるＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含む本発明によるポリペプチドまたはタンパク質
をコードするヌクレオチド配列を含み、好ましくは、これからなる核酸に関する。
【0221】
好ましくは、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡである。
【0222】
好ましくは、核酸は、組換え核酸または化学合成核酸である。
【0223】
核酸は、をコードするヌクレオチド配列以外の１つまたは複数のさらなるヌクレオチド配列を含み得る。
【0224】
その上、核酸は、本発明によるＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、ＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片またはポリペプチドもしくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列以外の１つまたは複数のさらなる配列を含み得る。このようなさらなるヌクレオチド配列は、転写調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、転写因子結合モチーフまたはＤＮＡポリメラーゼもしくは逆転写酵素結合部位、翻訳調節配列、例えば、リボソーム結合モチーフ、エクソン、イントロン、５’－ｃａｐ、ポリＡテール、局在化シグナル、例えば、コアもしくはサイトゾル局在化シグナル、ハイブリダイゼーションストレッチおよび／または安定性調節配列、例えば、核酸の能動的および／または受動的分解を促進または阻止するヌクレオチド配列、スペーサー、リンカー、タグ、例えば、ＦＬＡＧタグもしくはＨｉｓタグをコードする配列等であり得る。その上、核酸は、修飾、例えば、メチル化を含み得る。
【0225】
その上、本発明では、
ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片、および／あるいは
ＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片、および／あるいは
ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片またはＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含むポリペプチドまたはタンパク質
について開示する任意の実施形態は、本発明による核酸に準用して適用可能であることが理解されるはずである。
ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片、および／あるいは
ＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片、および／あるいは
ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片またはＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含むポリペプチドまたはタンパク質
について開示する任意の実施形態は、本発明による核酸に準用して適用可能であることが理解されるはずである。
【0226】
ワクチン組成物および医学的使用
本発明は、活性成分として、
－ 本発明による１つまたは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片、
－ 本発明による１つまたは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片、
－ 本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含む、本発明による１つまたは複数のポリペプチドまたはタンパク質、および／あるいは
－ １つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片または１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、本発明による１つまたは複数の核酸
を含み、好ましくは、これからなるワクチン組成物にさらに関する。
本発明は、活性成分として、
－ 本発明による１つまたは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片、
－ 本発明による１つまたは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片、
－ 本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含む、本発明による１つまたは複数のポリペプチドまたはタンパク質、および／あるいは
－ １つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片または１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、本発明による１つまたは複数の核酸
を含み、好ましくは、これからなるワクチン組成物にさらに関する。
【0227】
好ましくは、ワクチン組成物は、薬学的に許容されるアジュバント、例えば、Ｍａｔｒｉｘ－Ｍ１アジュバント、アルミニウム含有アジュバント、ＭＦ５９、ＡＳ０１、ＡＳ０２、ＡＳ０３、ＡＳ０４、ビロソーム、ＩＳＡ５１、ＣｐＧ ＯＤＮ、担体、希釈剤、脂質ナノ粒子、および／または賦形剤をさらに含む。
【0228】
好ましくは、本発明による１つまたは複数の核酸はｍＲＮＡであり、ワクチンは、脂質ナノ粒子にパッケージングされたｍＲＮＡを含む。
【0229】
好ましくは、ワクチンは、核酸、例えば、ＤＮＡを送達するためにウイルスベクターを使用する。
【0230】
好ましくは、ワクチン組成物は、有効量の活性成分を含む。
【0231】
好ましくは、ワクチン組成物は、対象においてコロナウイルスに対する免疫応答を誘導することが可能である。好ましくは、コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であり、および／またはコロナウイルスは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶである。
【0232】
好ましくは、ワクチン組成物は、対象においてコロナウイルスにより引き起こされる疾患の予防および／または治療用のワクチンである。好ましくは、コロナウイルスにより引き起こされる疾患は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２により引き起こされるＣＯＶＩＤ－１９であり、および／またはコロナウイルスにより引き起こされる疾患は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶにより引き起こされるＭＥＲＳである。
【0233】
その上、本発明は、対象においてコロナウイルスにより引き起こされる疾患の予防および／または治療における使用のための
本発明による１つまたは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片、
本発明による１つまたは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片、
本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含む、本発明による１つまたは複数のポリペプチドまたはタンパク質、
１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片または１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、本発明による１つまたは複数の核酸、ならびに／あるいは
ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤおよびＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅを考慮した上記のワクチン組成物に関する。
本発明による１つまたは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片、
本発明による１つまたは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片、
本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含む、本発明による１つまたは複数のポリペプチドまたはタンパク質、
１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片または１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、本発明による１つまたは複数の核酸、ならびに／あるいは
ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤおよびＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅを考慮した上記のワクチン組成物に関する。
【0234】
好ましくは、ワクチン組成物ならびに／または予防および／もしくは治療における使用では、１つまたは複数は、１～３つ、より好ましくは、１つまたは２つ、およびさらにより好ましくは、２つである。好ましくは、例えば、２つ、３つ以上のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤが存在する場合、例として、種々の置換が存在するため、これらの配列において相互に異なる。同じことが、２つ、３つ以上のＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅ、ポリペプチドもしくはタンパク質、および／または核酸の存在にも当てはまる。
【0235】
好ましくは、ワクチン組成物ならびに／または予防および／もしくは治療における使用について使用する対象という用語では、対象は、脊椎動物、より好ましくは哺乳動物、さらにより好ましくは類人猿、サル、キツネザル、イヌ科動物、例えば、イヌ、オオカミもしくはキツネ、ネコ科動物、例えば、大型もしくは小型のネコ、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスターもしくはウサギ、ウシ科動物、例えば、バッファロー、アンテロープ、ヒツジ、ヤギもしくはウシ、シカ、ウマ、ロバ、クマ、テン、コウモリ、および／またはヒトであり、なおより好ましくは、対象は、ヒトである。
【0236】
好ましくは、ワクチン組成物ならびに／または予防および／もしくは治療における使用では、対象は、コロナウイルスに感染していない、および／またはコロナウイルスに感染している。コロナウイルスに感染していない対象は、それまでにコロナウイルス感染を経験していても、経験していなくてもよい。コロナウイルスに感染している対象は、現在、コロナウイルス感染症にかかっている可能性がある。対象がコロナウイルスに感染していないかまたはコロナウイルスに感染しているかの決定では、当業者に公知の任意の方法を使用し得る。適する方法の例は、ＰＣＲ検査である。
【0237】
好ましくは、ワクチン組成物ならびに／または予防および／もしくは治療における使用では、コロナウイルスにより引き起こされる疾患は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２により引き起こされるＣＯＶＩＤ－１９であり、および／またはコロナウイルスにより引き起こされる疾患は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶにより引き起こされるＭＥＲＳである。
【0238】
好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、本発明において使用する場合、この任意の変異体、例えば、Ｗｕｈａｎ、Ｂ．１．１．７（アルファ、英国）、Ｂ．１．６１７．２（デルタ、インド）、Ｂ．１．３５１（ベータ、南アフリカ）、Ｐ．１（ガンマ、ブラジリア）、および／またはＢ．１．１．２８．、好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＷｕｈａｎ変異体を含む。
【0239】
好ましくは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶは、本発明において使用する場合、この任意の変異体、例えば、ＡＦ８８９３６．１、ＡＦＹ１３３０７．１、ＡＧＧ２２５４２．１、ＡＧＶ０８３７９．１、ＡＧＶ０８５８４．１、ＡＨＩ４８５２８．１、ＡＨＩ４８７３３．１、ＡＨＣ７４０８８．１、ＡＧＶ０８４３８．１、ＡＩＤ５５０９０．１、ＡＩＤ５５０９５．１、ＡＩＤ５５０８７．１、ＡＫＬ５９４０１．１、ＡＬＢ０８３２２．１、ＡＬＢ０８２８９．１、ＡＨＹ２２５４５．１、ＡＨＬ１８０９０．１、ＡＨＸ００７１１．１、ＡＨＸ００７２．１、およびＡＨＹ２２５５５．１を含む。
【0240】
好ましくは、ワクチン組成物ならびに／または予防および／もしくは治療における使用では、
ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、（Ａ）本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または（Ｂ）本発明によるＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片であり、および／あるいは
ＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、（Ａ）本発明によるＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片または（Ｂ）本発明によるＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片である。
ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、（Ａ）本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または（Ｂ）本発明によるＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片であり、および／あるいは
ＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、（Ａ）本発明によるＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片または（Ｂ）本発明によるＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片である。
【0241】
その上、本発明では、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片および／またはＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤもしくはこの断片またはＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅを含むポリペプチドもしくはタンパク質、ならびに／あるいはこれらをコードする核酸について開示する任意の実施形態は、ワクチン組成物に準用して適用可能であることが理解されるはずである。
【0242】
（Ａ）ワクチン組成物および医学的使用
好ましくは、本発明は、（Ａ）活性成分として、
－ 本発明による１つもしくは複数のＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、
－ 本発明による１つもしくは複数のＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片、
－ 本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含む、本発明による１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質、および／あるいは
－ １つもしくは複数のＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、１つもしくは複数のＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片または１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、本発明による１つもしくは複数の核酸
を含み、好ましくは、これからなるワクチン組成物に関する。
好ましくは、本発明は、（Ａ）活性成分として、
－ 本発明による１つもしくは複数のＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、
－ 本発明による１つもしくは複数のＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片、
－ 本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含む、本発明による１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質、および／あるいは
－ １つもしくは複数のＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、１つもしくは複数のＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片または１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、本発明による１つもしくは複数の核酸
を含み、好ましくは、これからなるワクチン組成物に関する。
【0243】
好ましくは、ワクチン組成物（Ａ）は、薬学的に許容されるアジュバント、担体、希釈剤、および／または賦形剤をさらに含む。
【0244】
好ましくは、ワクチン組成物（Ａ）は、有効量の活性成分を含む。
【0245】
好ましくは、ワクチン組成物（Ａ）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答を誘導することが可能である。
【0246】
好ましくは、ワクチン組成物（Ａ）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２により引き起こされるＣＯＶＩＤ－１９の予防および／または治療用のワクチンである。
【0247】
その上、本発明は、好ましくは、対象においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２により引き起こされるＣＯＶＩＤ－１９の予防および／または治療における使用（Ａ）のための
－ 本発明による１つまたは複数のＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片、
－ 本発明による１つまたは複数のＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片、
－ 本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含む、本発明による１つまたは複数のポリペプチドまたはタンパク質、ならびに／あるいは
－ １つもしくは複数のＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、１つもしくは複数のＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片または１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、本発明による１つまたは複数の核酸、ならびに／あるいは
－ ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤおよびＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅを考慮した上記のワクチン組成物に関する。
－ 本発明による１つまたは複数のＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片、
－ 本発明による１つまたは複数のＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片、
－ 本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含む、本発明による１つまたは複数のポリペプチドまたはタンパク質、ならびに／あるいは
－ １つもしくは複数のＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、１つもしくは複数のＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片または１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、本発明による１つまたは複数の核酸、ならびに／あるいは
－ ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤおよびＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅを考慮した上記のワクチン組成物に関する。
【0248】
好ましくは、ワクチン組成物（Ａ）ならびに／または予防および／もしくは治療における使用（Ａ）では、１つまたは複数は、１～３つ、より好ましくは、１つまたは２つ、およびさらにより好ましくは、２つである。好ましくは、例えば、２つ、３つ以上のＳＡＲＳ－ｍＲＢＤが存在する場合、例として、種々の置換が存在するため、これらの配列において相互に異なる。同じことが、２つ、３つ以上のＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅ、ポリペプチドもしくはタンパク質、および／または核酸の存在にも当てはまる。
【0249】
好ましくは、ワクチン組成物（Ａ）ならびに／または予防および／もしくは治療における使用（Ａ）について使用する対象という用語は、脊椎動物、より好ましくは哺乳動物、さらにより好ましくは類人猿、サル、キツネザル、イヌ科動物、例えば、イヌ、オオカミもしくはキツネ、ネコ科動物、例えば、大型もしくは小型のネコ、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスターもしくはウサギ、ウシ科動物、例えば、バッファロー、アンテロープ、ヒツジ、ヤギもしくはウシ、シカ、ウマ、ロバ、クマ、テン、コウモリ、および／またはヒトであり、なおより好ましくは、対象は、ヒトである。
【0250】
好ましくは、ワクチン組成物（Ａ）ならびに／または予防および／もしくは治療における使用（Ａ）では、対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染しておらず、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染していない対象は、それまでにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を経験しているか、または経験していない可能性がある。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している対象は、現在、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症にかかっている可能性がある。対象がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染していないかまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染しているかどうかの決定では、当業者に公知の任意の方法を使用し得る。適する方法の例は、ＰＣＲ検査である。
【0251】
好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、本発明において使用する場合、この任意の変異体、例えば、Ｗｕｈａｎ、Ｂ．１．１．７（アルファ、英国）、Ｂ．１．６１７．２（デルタ、インド）、Ｂ．１．３５１（ベータ、南アフリカ）、Ｐ．１（ガンマ、ブラジリア）、および／またはＢ．１．１．２８．、好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＷｕｈａｎ変異体を含む。
【0252】
好ましくは、１つまたは複数は、２つ以上、より好ましくは１～５つ、さらにより好ましくは２～４つ、およびなおより好ましくは２つである。好ましくは、例えば、２つ以上のＳＡＲＳ－ｍＲＢＤが存在する場合、これらの置換は異なる。同じことが、２つ、３つ以上のＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅ、ポリペプチドもしくはタンパク質、および／または核酸の存在にも当てはまる。
【0253】
より好ましくは、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤのいずれか１つまたは任意の組合せである。
【0254】
さらにより好ましくは、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、配列番号１のＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤのＧ１８４、Ｌ１３７、Ｙ１８７またはＹ１７１、好ましくはＧ１８４、Ｌ１３７またはＹ１８７、さらにより好ましくはＧ１８４またはＬ１３７から選択される位置におけるアミノ酸残基の１つの置換を含むアミノ酸配列またはこの断片を含む１つのＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片である。
【0255】
なおより好ましくは、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、配列番号１のＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤのＧ１８４、Ｌ１３７、Ｙ１８７またはＹ１７１、好ましくはＧ１８４、Ｌ１３７またはＹ１８７、さらにより好ましくはＧ１８４またはＬ１３７から選択される位置におけるアミノ酸残基の置換を含むアミノ酸配列またはこの断片のそれぞれを含む２つ以上のＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片の組合せである。
【0256】
好ましくは、
－ Ｇ１８４の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｇ１８４Ｒ、Ｇ１８４Ｄ、Ｇ１８４Ｙ、Ｇ１８４Ｋ、Ｇ１８４Ｓ、Ｇ１８４Ｐ、Ｇ１８４Ｅ、Ｇ１８４Ａ、Ｇ１８４Ｖ、Ｇ１８４Ｎ、Ｇ１８４Ｑ、Ｇ１８４Ｔ、Ｇ１８４Ｍ、Ｇ１８４ＨまたはＧ１８４Ｌから選択され、より好ましくは、Ｇ１８４Ｒ、Ｇ１８４ＤまたはＧ１８４Ｅ、さらにより好ましくは、Ｇ１８４ＲまたはＧ１８４Ｅであり、なおより好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、配列番号１５、配列番号１７、配列番号５、配列番号２０、配列番号９、配列番号１６、配列番号１３、配列番号２、配列番号３、配列番号１８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１１、配列番号７または配列番号１０から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなり、より好ましくは、配列番号１５、配列番号５または配列番号２を含み、好ましくは、これからなり、最も好ましくは、配列番号１５または配列番号２を含み、好ましくは、これからなり、
－ Ｌ１３７の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｌ１３７ＲまたはＬ１３７Ｅ、より好ましくはＬ１３７Ｒから選択され、なおより好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、配列番号５５または配列番号５３から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなり、最も好ましくは、配列番号５５を含み、好ましくは、これからなり、
－ Ｙ１８７の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｙ１８７ＮまたはＹ１８７Ｑ、より好ましくはＹ１８７Ｎから選択され、なおより好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、配列番号３０または配列番号３１から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなり、最も好ましくは、配列番号３０を含み、好ましくは、これからなり、
－ Ｙ１７１の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｙ１７１ＳまたはＹ１７１Ｔから選択され、なおより好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、配列番号９２または配列番号９３から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなる。
－ Ｇ１８４の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｇ１８４Ｒ、Ｇ１８４Ｄ、Ｇ１８４Ｙ、Ｇ１８４Ｋ、Ｇ１８４Ｓ、Ｇ１８４Ｐ、Ｇ１８４Ｅ、Ｇ１８４Ａ、Ｇ１８４Ｖ、Ｇ１８４Ｎ、Ｇ１８４Ｑ、Ｇ１８４Ｔ、Ｇ１８４Ｍ、Ｇ１８４ＨまたはＧ１８４Ｌから選択され、より好ましくは、Ｇ１８４Ｒ、Ｇ１８４ＤまたはＧ１８４Ｅ、さらにより好ましくは、Ｇ１８４ＲまたはＧ１８４Ｅであり、なおより好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、配列番号１５、配列番号１７、配列番号５、配列番号２０、配列番号９、配列番号１６、配列番号１３、配列番号２、配列番号３、配列番号１８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１１、配列番号７または配列番号１０から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなり、より好ましくは、配列番号１５、配列番号５または配列番号２を含み、好ましくは、これからなり、最も好ましくは、配列番号１５または配列番号２を含み、好ましくは、これからなり、
－ Ｌ１３７の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｌ１３７ＲまたはＬ１３７Ｅ、より好ましくはＬ１３７Ｒから選択され、なおより好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、配列番号５５または配列番号５３から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなり、最も好ましくは、配列番号５５を含み、好ましくは、これからなり、
－ Ｙ１８７の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｙ１８７ＮまたはＹ１８７Ｑ、より好ましくはＹ１８７Ｎから選択され、なおより好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、配列番号３０または配列番号３１から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなり、最も好ましくは、配列番号３０を含み、好ましくは、これからなり、
－ Ｙ１７１の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｙ１７１ＳまたはＹ１７１Ｔから選択され、なおより好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、配列番号９２または配列番号９３から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなる。
【0257】
好ましくは、２つ以上のＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、これらの置換が異なる。
【0258】
なおより好ましくは、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、２つのＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片の組合せであり、ここで、一方は、配列番号１のＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤのＧ１８４Ｅ、Ｇ１８４ＤまたはＧ１８４Ｒ、より好ましくはＧ１８４ＲまたはＧ１８４Ｅの置換を含むアミノ酸配列またはこの断片を含み、他方は、Ｌ１３７Ｒの置換を含むアミノ酸配列またはこの断片を含む。
【0259】
なおさらにより好ましくは、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、２つのＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片の組合せであり、ここで、一方は、配列番号２、配列番号５または配列番号１５、より好ましくは配列番号１５または配列番号２からなり、他方は、配列番号５５からなる。
【0260】
より好ましくは、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、本発明によるＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅのいずれか１つまたは任意の組合せである。
【0261】
さらにより好ましくは、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、配列番号１００のＳＡＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅのＧ５０２、Ｌ４５５、Ｙ５０５またはＹ４８９、好ましくはＧ５０２、Ｌ４５５またはＹ５０５、さらにより好ましくはＧ５０２またはＬ４５５から選択される位置におけるアミノ酸残基の１つの置換を含むアミノ酸配列またはこの断片を含む１つのＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片である。
【0262】
なおより好ましくは、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、配列番号１００のＳＡＲＳ－ｗｔＳｐｉｋｅのＧ５０２、Ｌ４５５、Ｙ５０５またはＹ４８９、好ましくはＧ５０２、Ｌ４５５またはＹ５０５、さらにより好ましくはＧ５０２またはＬ４５５から選択される位置におけるアミノ酸残基の１つの置換を含むアミノ酸配列またはこの断片のそれぞれを含む２つ以上のＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片の組合せであり、ここで、好ましくは、位置におけるアミノ酸残基の置換。
【0263】
好ましくは、
－ Ｇ５０２の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｇ５０２Ｒ、Ｇ５０２Ｄ、Ｇ５０２Ｙ、Ｇ５０２Ｋ、Ｇ５０２Ｓ、Ｇ５０２Ｐ、Ｇ５０２Ｅ、Ｇ５０２Ａ、Ｇ５０２Ｖ、Ｇ５０２Ｎ、Ｇ５０２Ｑ、Ｇ５０２Ｔ、Ｇ５０２Ｍ、Ｇ５０２ＨまたはＧ５０２Ｌ、より好ましくはＧ５０２Ｒ、Ｇ５０２ＤまたはＧ５０２Ｅ、より好ましくはＧ５０２ＲまたはＧ５０２Ｅから選択され、なおより好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、配列番号１１４、配列番号１０４、配列番号１１９、配列番号１０８、配列番号１１５、配列番号１１２、配列番号１０１、配列番号１１７、配列番号１０２、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１６、配列番号１１０、配列番号１０６または配列番号１０９から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなり、より好ましくは、配列番号１１４、配列番号１０４または配列番号１０１を含み、好ましくは、これからなり、最も好ましくは、配列番号１１４または配列番号１０１を含み、好ましくは、これからなり、
－ Ｌ４５５の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｌ４５５ＲまたはＬ４５５Ｅ、より好ましくはＬ４５５Ｒから選択され、なおより好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、配列番号１５４または配列番号１５２から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなり、最も好ましくは、配列番号１５４を含み、好ましくは、これからなり、
－ Ｙ５０５の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｙ５０５ＮまたはＹ５０５Ｑ、より好ましくはＹ５０５Ｎから選択され、なおより好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、配列番号１２９または配列番号１３０から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなり、より好ましくは、配列番号１２９を含み、好ましくは、これからなり、
－ Ｙ４８９の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｙ４８９ＳまたはＹ４８９Ｔから選択され、なおより好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、配列番号１９１または配列番号１９２から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなる。
－ Ｇ５０２の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｇ５０２Ｒ、Ｇ５０２Ｄ、Ｇ５０２Ｙ、Ｇ５０２Ｋ、Ｇ５０２Ｓ、Ｇ５０２Ｐ、Ｇ５０２Ｅ、Ｇ５０２Ａ、Ｇ５０２Ｖ、Ｇ５０２Ｎ、Ｇ５０２Ｑ、Ｇ５０２Ｔ、Ｇ５０２Ｍ、Ｇ５０２ＨまたはＧ５０２Ｌ、より好ましくはＧ５０２Ｒ、Ｇ５０２ＤまたはＧ５０２Ｅ、より好ましくはＧ５０２ＲまたはＧ５０２Ｅから選択され、なおより好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、配列番号１１４、配列番号１０４、配列番号１１９、配列番号１０８、配列番号１１５、配列番号１１２、配列番号１０１、配列番号１１７、配列番号１０２、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１６、配列番号１１０、配列番号１０６または配列番号１０９から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなり、より好ましくは、配列番号１１４、配列番号１０４または配列番号１０１を含み、好ましくは、これからなり、最も好ましくは、配列番号１１４または配列番号１０１を含み、好ましくは、これからなり、
－ Ｌ４５５の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｌ４５５ＲまたはＬ４５５Ｅ、より好ましくはＬ４５５Ｒから選択され、なおより好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、配列番号１５４または配列番号１５２から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなり、最も好ましくは、配列番号１５４を含み、好ましくは、これからなり、
－ Ｙ５０５の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｙ５０５ＮまたはＹ５０５Ｑ、より好ましくはＹ５０５Ｎから選択され、なおより好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、配列番号１２９または配列番号１３０から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなり、より好ましくは、配列番号１２９を含み、好ましくは、これからなり、
－ Ｙ４８９の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｙ４８９ＳまたはＹ４８９Ｔから選択され、なおより好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、配列番号１９１または配列番号１９２から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなる。
【0264】
好ましくは、２つ以上のＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、これらの置換が異なる。
【0265】
なおより好ましくは、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ｍＳＰＩＫＥまたはこの断片は、２つのＳＡＲＳ－ｍＳＰＩＫＥまたはこの断片の組合せであり、ここで、一方は、配列番号１のＳＡＲＳ－ｗｔＳＰＩＫＥのＧ５０２Ｒ、Ｇ５０２ＤまたはＧ５０２Ｅ、より好ましくはＧ５０２ＲまたはＧ５０２Ｅの置換を含むアミノ酸配列またはこの断片を含み、他方は、Ｌ４５５Ｒの置換を含むアミノ酸配列またはこの断片を含む。
【0266】
なおさらにより好ましくは、１つまたは複数のＳＡＲＳ－ｍＳＰＩＫＥまたはこの断片は、２つのＳＡＲＳ－ｍＳＰＩＫＥまたはこの断片の組合せであり、ここで、一方は、配列番号１１４、配列番号１０４または配列番号１０１、より好ましくは配列番号１１４、より好ましくは配列番号１０４または配列番号１１４からなり、他方は、配列番号１５４からなる。
【0267】
より好ましくは、１つもしくは複数のＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、１つもしくは複数のＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片または１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、本発明による１つまたは複数の核酸は、本発明による核酸のいずれか１つまたは任意の組合せである。
【0268】
さらにより好ましくは、本発明による１つもしくは複数の核酸または１つの核酸は、配列番号２５５、配列番号２５６または配列番号２６６、なおより好ましくは配列番号２５５および配列番号２５６の組合せ、または配列番号２５６および配列番号２６６の組合せから選択される。
【0269】
その上、本発明では、
ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片、および／あるいは
ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片、および／あるいは
ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片またはＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅを含むポリペプチドまたはタンパク質、および／あるいは
これらをコードする核酸
について開示する任意の実施形態は、ワクチン組成物（Ａ）ならびに／または予防および／もしくは治療における使用（Ａ）に準用して適用可能であることが理解されるはずである。
ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片、および／あるいは
ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片、および／あるいは
ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片またはＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅを含むポリペプチドまたはタンパク質、および／あるいは
これらをコードする核酸
について開示する任意の実施形態は、ワクチン組成物（Ａ）ならびに／または予防および／もしくは治療における使用（Ａ）に準用して適用可能であることが理解されるはずである。
【0270】
（Ｂ）ワクチン組成物および医学的使用
好ましくは、本発明は、加えてまたはあるいは、（Ｂ）に関する。好ましくは、本発明は、（Ｂ）活性成分として、
－ 本発明による１つもしくは複数のＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、
－ 本発明による１つもしくは複数のＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片、
－ 本発明によるＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含む、本発明による１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質、および／あるいは
－ １つもしくは複数のＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、１つもしくは複数のＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片または１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、本発明による１つもしくは複数の核酸
を含み、好ましくは、これからなるワクチン組成物に関する。
好ましくは、本発明は、加えてまたはあるいは、（Ｂ）に関する。好ましくは、本発明は、（Ｂ）活性成分として、
－ 本発明による１つもしくは複数のＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、
－ 本発明による１つもしくは複数のＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片、
－ 本発明によるＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含む、本発明による１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質、および／あるいは
－ １つもしくは複数のＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、１つもしくは複数のＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片または１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、本発明による１つもしくは複数の核酸
を含み、好ましくは、これからなるワクチン組成物に関する。
【0271】
好ましくは、ワクチン組成物（Ｂ）は、薬学的に許容されるアジュバント、担体、希釈剤、および／または賦形剤をさらに含む。
【0272】
好ましくは、ワクチン組成物（Ｂ）は、有効量の活性成分を含む。
【0273】
好ましくは、ワクチン組成物（Ｂ）は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶに対する免疫応答を誘導することが可能である。
【0274】
好ましくは、ワクチン組成物（Ｂ）は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶにより引き起こされるＭＥＲＳの予防および／または治療用のワクチンである。
【0275】
その上、本発明は、好ましくは、対象においてＭＥＲＳ－ＣｏＶにより引き起こされるＭＥＲＳの予防および／または治療における使用（Ｂ）のための
－ 本発明による１つまたは複数のＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片、
－ 本発明による１つまたは複数のＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片、
－ 本発明によるＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含む、本発明による１つまたは複数のポリペプチドまたはタンパク質、ならびに／あるいは
－ １つもしくは複数のＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、１つもしくは複数のＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片または１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、本発明による１つまたは複数の核酸、ならびに／あるいは
－ ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤおよびＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅを考慮した上記のワクチン組成物に関する。
－ 本発明による１つまたは複数のＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片、
－ 本発明による１つまたは複数のＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片、
－ 本発明によるＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または本発明によるＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含む、本発明による１つまたは複数のポリペプチドまたはタンパク質、ならびに／あるいは
－ １つもしくは複数のＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、１つもしくは複数のＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片または１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、本発明による１つまたは複数の核酸、ならびに／あるいは
－ ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤおよびＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅを考慮した上記のワクチン組成物に関する。
【0276】
好ましくは、ワクチン組成物（Ｂ）ならびに／または予防および／もしくは治療における使用（Ｂ）では、１つまたは複数は、２つ以上、より好ましくは１～５つ、さらにより好ましくは２～４つ、およびなおより好ましくは２つである。好ましくは、例えば、２つ以上のＭＥＲＳ－ｍＲＢＤが存在する場合、例として、種々の置換が存在するため、これらの配列において相互に異なる。同じことが、２つ、３つ以上のＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅ、ポリペプチドもしくはタンパク質、および／または核酸の存在にも当てはまる。
【0277】
好ましくは、ワクチン組成物（Ｂ）ならびに／または予防および／もしくは治療における使用（Ｂ）について使用する対象という用語は、脊椎動物、より好ましくは哺乳動物、より好ましくは類人猿、サル、キツネザル、イヌ科動物、例えば、イヌ、オオカミもしくはキツネ、ネコ科動物、例えば、大型もしくは小型のネコ、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスターもしくはウサギ、ウシ科動物、例えば、バッファロー、アンテロープ、ヒツジ、ヤギもしくはウシ、シカ、ウマ、ロバ、クマ、テン、コウモリ、および／またはヒトであり、なおより好ましくは、対象は、ヒトである。
【0278】
好ましくは、ワクチン組成物（Ｂ）ならびに／または予防および／もしくは治療における使用（Ｂ）では、対象は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶに感染していない、および／またはＭＥＲＳ－ＣｏＶに感染している。ＭＥＲＳ－ＣｏＶに感染していない対象は、それまでにＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染症を経験しているか、または経験していない可能性がある。ＭＥＲＳ－ＣｏＶに感染している対象は、現在、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染症にかかっている可能性がある。対象がＭＥＲＳ－ＣｏＶに感染していないかまたはＭＥＲＳ－ＣｏＶに感染しているかどうかの決定では、当業者に公知の任意の方法を使用し得る。適する方法の例は、ＰＣＲ検査である。
【0279】
好ましくは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶは、本発明において使用する場合、この任意の変異体、例えば、ＡＦ８８９３６．１、ＡＦＹ１３３０７．１、ＡＧＧ２２５４２．１、ＡＧＶ０８３７９．１、ＡＧＶ０８５８４．１、ＡＨＩ４８５２８．１、ＡＨＩ４８７３３．１、ＡＨＣ７４０８８．１、ＡＧＶ０８４３８．１、ＡＩＤ５５０９０．１、ＡＩＤ５５０９５．１、ＡＩＤ５５０８７．１、ＡＫＬ５９４０１．１、ＡＬＢ０８３２２．１、ＡＬＢ０８２８９．１、ＡＨＹ２２５４５．１、ＡＨＬ１８０９０．１、ＡＨＸ００７１１．１、ＡＨＸ００７２．１およびＡＨＹ２２５５５．１を含む。
【0280】
好ましくは、１つまたは複数は、２つ以上、より好ましくは１～５つ、さらにより好ましくは２～４つ、およびなおより好ましくは２つである。好ましくは、例えば、２つ以上のＭＥＲＳ－ｍＲＢＤが存在する場合、例として、種々の置換が存在するため、これらの配列において相互に異なる。同じことが、２つ、３つ以上のＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅ、ポリペプチドもしくはタンパク質、および／または核酸の存在にも当てはまる。
【0281】
より好ましくは、１つまたは複数のＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、本発明によるＭＥＲＳ－ｍＲＢＤのいずれか１つまたは任意の組合せである。
【0282】
さらにより好ましくは、１つまたは複数のＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、配列番号１９４のＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤのＤ１４４、Ｄ１７１またはＤ１７３、好ましくはＤ１４４またはＤ１７１から選択される位置におけるアミノ酸残基の１つの置換を含むアミノ酸配列またはこの断片を含む１つのＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片である。
【0283】
なおより好ましくは、１つまたは複数のＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、配列番号１９４のＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤのＤ１４４、Ｄ１７１またはＤ１７３、好ましくはＤ１４４またはＤ１７１から選択される位置におけるアミノ酸残基の１つの置換を含むアミノ酸配列またはこの断片のそれぞれを含む２つ以上のＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片の組合せである。
【0284】
好ましくは、
－ Ｄ１４４の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ１４４Ａであり、より好ましくは、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、配列番号１９５から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなり、
－ Ｄ１７１の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ１７１Ｋであり、より好ましくは、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、配列番号１９６から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなり、
－ Ｄ１７３の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ１７３Ｋであり、より好ましくは、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、配列番号１９７から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなる。
－ Ｄ１４４の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ１４４Ａであり、より好ましくは、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、配列番号１９５から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなり、
－ Ｄ１７１の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ１７１Ｋであり、より好ましくは、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、配列番号１９６から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなり、
－ Ｄ１７３の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ１７３Ｋであり、より好ましくは、ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、配列番号１９７から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなる。
【0285】
好ましくは、２つ以上のＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、これらの置換が異なる。
【0286】
より好ましくは、１つまたは複数のＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、本発明によるＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅのいずれか１つまたは任意の組合せである。
【0287】
さらにより好ましくは、１つまたは複数のＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、配列番号２００のＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤのＤ５１０、Ｄ５３７またはＤ５３９、好ましくはＤ５１０またはＤ５３７から選択される位置におけるアミノ酸残基の１つの置換を含むアミノ酸配列またはこの断片を含む１つのＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片である。
【0288】
なおより好ましくは、１つまたは複数のＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、配列番号２００のＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤのＤ５１０、Ｄ５３７またはＤ５３９、好ましくはＤ５１０またはＤ５３７から選択される位置におけるアミノ酸残基の１つの置換を含むアミノ酸配列またはこの断片のそれぞれを含む２つ以上のＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片の組合せである。
【0289】
好ましくは、
－ Ｄ５１０の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ５１０Ａであり、より好ましくは、ＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、配列番号２０１から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなり、
－ Ｄ５３７の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ５３７Ｋであり、より好ましくは、ＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、配列番号２０２から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなり、
－ Ｄ５３９の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ５３９Ｋであり、より好ましくは、ＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、配列番号２０３から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなる。
－ Ｄ５１０の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ５１０Ａであり、より好ましくは、ＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、配列番号２０１から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなり、
－ Ｄ５３７の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ５３７Ｋであり、より好ましくは、ＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、配列番号２０２から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなり、
－ Ｄ５３９の位置におけるアミノ酸残基の置換は、Ｄ５３９Ｋであり、より好ましくは、ＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、配列番号２０３から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、これからなる。
【0290】
好ましくは、２つ以上のＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片は、これらの置換が異なる。
【0291】
より好ましくは、１つもしくは複数のＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、１つもしくは複数のＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片または１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む本発明による１つまたは複数の核酸は、本発明による核酸のいずれか１つまたは任意の組合せである。
【0292】
その上、本発明では、
ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片、および／あるいは
ＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片、および／あるいは
ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片またはＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅを含むポリペプチドまたはタンパク質、および／あるいは
これらをコードする核酸
について開示する任意の実施形態は、ワクチン組成物（Ｂ）ならびに／または予防および／もしくは治療における使用（Ｂ）に準用して適用可能であることが理解されるはずである。
ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片、および／あるいは
ＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片、および／あるいは
ＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片またはＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅを含むポリペプチドまたはタンパク質、および／あるいは
これらをコードする核酸
について開示する任意の実施形態は、ワクチン組成物（Ｂ）ならびに／または予防および／もしくは治療における使用（Ｂ）に準用して適用可能であることが理解されるはずである。
【0293】
ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片をデザインおよび／または得るための方法
本発明は、ワクチン組成物用の活性成分をデザインおよび／または得るための方法であって、
（ｉ）ウイルスの野生型受容体結合ドメイン（ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ）に１つまたは複数の突然変異を含む、ウイルスの突然変異受容体結合ドメイン（ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤ）またはこの断片を用意する工程と、
（ｉｉ）ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片が
ａ）ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤと比較した、ウイルスの受容体結合ドメインの受容体（ＲＢＤ受容体）（ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体）に対する結合力の低下
を示すかどうかを決定する工程と、
（ｉｉｉ）ａ）が満たされるとき、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を活性成分として選択する工程と
を含む方法にさらに関する。
本発明は、ワクチン組成物用の活性成分をデザインおよび／または得るための方法であって、
（ｉ）ウイルスの野生型受容体結合ドメイン（ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ）に１つまたは複数の突然変異を含む、ウイルスの突然変異受容体結合ドメイン（ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤ）またはこの断片を用意する工程と、
（ｉｉ）ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片が
ａ）ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤと比較した、ウイルスの受容体結合ドメインの受容体（ＲＢＤ受容体）（ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体）に対する結合力の低下
を示すかどうかを決定する工程と、
（ｉｉｉ）ａ）が満たされるとき、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を活性成分として選択する工程と
を含む方法にさらに関する。
【0294】
好ましくは、方法は、
（ｉｉ）の工程において、（ｉ）の工程において得られたＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片が、
ｂ）抗ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ中和抗体（ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢ）に対する結合、ならびに
ｃ）適宜、タンパク質および／またはペプチドの安定性
を示すかどうかを決定することと、
（ｉｉｉ）の工程において、ａ）およびｂ）が同時に、ならびに適宜ａ）、ｂ）、およびｃ）が同時に満たされるとき、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を活性成分として選択することと
をさらに含む。
（ｉｉ）の工程において、（ｉ）の工程において得られたＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片が、
ｂ）抗ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ中和抗体（ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢ）に対する結合、ならびに
ｃ）適宜、タンパク質および／またはペプチドの安定性
を示すかどうかを決定することと、
（ｉｉｉ）の工程において、ａ）およびｂ）が同時に、ならびに適宜ａ）、ｂ）、およびｃ）が同時に満たされるとき、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を活性成分として選択することと
をさらに含む。
【0295】
好ましくは、（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の工程は、この順序で行う。
【0296】
好ましくは、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、ウイルススパイクタンパク質の突然変異受容体結合ドメイン（ｍＲＢＤ）（ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤ）またはこの断片である。
【0297】
好ましくは、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、ペプチドまたはタンパク質、好ましくは、タンパク質である。
【0298】
好ましくは、ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体またはこの断片は、可溶性型および／または膜結合型のＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体、好ましくは、可溶性型のＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体である。
【0299】
好ましくは、突然変異は、アミノ酸残基の置換である。
【0300】
好ましくは、（ｉｉｉ）の工程における選択は、ａ）またはｂ）を、ａ）またはｂ）のいずれか一方から開始する任意の順序で連続的に行うことにより実施する。より好ましくは、ａ）およびｂ）のうち選択を開始する方を満たすＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、ａ）およびｂ）のうちの残りの１つのいずれか１つに供する。次いで、ａ）またはｂ）のうちの残りの１つを満たすＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を、ａ）およびｂ）を同時に満たすものとして選択する。より好ましくは、（ｉｉｉ）の工程における選択は、ａ）、ｂ）、およびｃ）を、ａ）、ｂ）またはｃ）のいずれか１つから開始する任意の順序で連続的に行うことにより実施する。さらにより好ましくは、ａ）、ｂ）またはｃ）のうち選択を開始する１つを満たすＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、ａ）、ｂ）またはｃ）のうちの残りの２つのいずれか１つに供する。次いで、ａ）、ｂ）またはｃ）の残りの２つのうち一方を満たすＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、ａ）、ｂ）またはｃ）のうちの最後の１つに供する。次いで、ａ）、ｂ）またはｃ）の最後の１つを満たすＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を、ａ）、ｂ）、およびｃ）を同時に満たすものとして選択する。好ましくは、ａ）、ｂ）、および適宜ｃ）は、ａ）、ｂ）、および適宜ｃ）、またはｂ）、ａ）、および適宜ｃ）の順序、より好ましくはａ）、ｂ）、および適宜ｃ）の順序で連続的に行う。
【0301】
好ましくは、（ｉｉ）ｃ）の工程は、インビトロで実施する。タンパク質および／またはペプチドの安定性が示されるかどうかのインビトロでの決定は、当業者に公知の任意の方法により行うことができる。例として、ＥＬＩＳＡにより、適する標準を使用したタンパク質量の検出ならびにタンパク質折畳みの保存の検出が可能な特異的抗体を用いて、タンパク質および／またはペプチドの安定性を測定する。例として、実施例４に記載のようなＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションにより生成されるタンパク質を、培養上清中に生成および分泌させることにより十分なタンパク質収率を、０．５μｇ／ｍｌを超える濃度、好ましくは、これよりも高い濃度で得ることができる。同様に、タンパク質安定性は、細胞表面上でのタンパク質の発現、および特異的蛍光標識抗体による検出の後、ＦＡＣＳ解析によって測定し得る。本発明では、ディープ突然変異スキャニング実験を、遺伝子型対表現型でカップリングするプラットフォーム上で実施し得る（https://www.nature.com/articles/nmeth.3027.pdf）。
【0302】
好ましくは、
（ｉ）の工程は、それぞれがＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤに１つまたは複数の突然変異を含むＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片のライブラリーを用意することを含み、好ましくは、これにより実施し、ここで、ライブラリーに含まれるＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片の突然変異は、少なくとも部分的に異なり、
（ｉｉ）の工程が、
ａ）ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤと比較した、ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体に対する結合力の低下
を示すＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片についてライブラリーをスクリーニングすることにより実施され、
（ｉｉｉ）の工程は、このライブラリーから、ａ）を満たす１つまたは複数のＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を活性成分として選択することを含む。
（ｉ）の工程は、それぞれがＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤに１つまたは複数の突然変異を含むＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片のライブラリーを用意することを含み、好ましくは、これにより実施し、ここで、ライブラリーに含まれるＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片の突然変異は、少なくとも部分的に異なり、
（ｉｉ）の工程が、
ａ）ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤと比較した、ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体に対する結合力の低下
を示すＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片についてライブラリーをスクリーニングすることにより実施され、
（ｉｉｉ）の工程は、このライブラリーから、ａ）を満たす１つまたは複数のＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を活性成分として選択することを含む。
【0303】
より好ましくは、
（ｉｉ）の工程は、
ａ）ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤと比較した、ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体に対する結合力の低下、ならびに
ｂ）ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対する結合、ならびに
ｃ）適宜、タンパク質および／またはペプチドの安定性
を示すＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片についてライブラリーをスクリーニングすることにより実施し、
（ｉｉｉ）の工程は、このライブラリーから、ａ）およびｂ）を同時に満たし、ならびに適宜ａ）、ｂ）、およびｃ）を同時に満たす１つまたは複数のＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を活性成分として選択することを含む。
（ｉｉ）の工程は、
ａ）ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤと比較した、ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体に対する結合力の低下、ならびに
ｂ）ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対する結合、ならびに
ｃ）適宜、タンパク質および／またはペプチドの安定性
を示すＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片についてライブラリーをスクリーニングすることにより実施し、
（ｉｉｉ）の工程は、このライブラリーから、ａ）およびｂ）を同時に満たし、ならびに適宜ａ）、ｂ）、およびｃ）を同時に満たす１つまたは複数のＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を活性成分として選択することを含む。
【0304】
好ましくは、（ｉｉｉ）の工程における選択は、ａ）またはｂ）を、ａ）またはｂ）のいずれか一方から開始する任意の順序で連続的に行うことにより実施する。より好ましくは、ａ）およびｂ）のうち選択を開始する方を満たす１つまたは複数のＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、ａ）およびｂ）のうちの残りの１つのいずれか１つに供する。次いで、ａ）またはｂ）のうちの残りの１つを満たす１つまたは複数のＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を、ａ）およびｂ）を同時に満たすものとして選択する。より好ましくは、（ｉｉｉ）の工程における選択は、ａ）、ｂ）、およびｃ）を、ａ）、ｂ）またはｃ）のいずれか１つから開始する任意の順序で連続的に行うことにより実施する。さらにより好ましくは、ａ）、ｂ）またはｃ）のうち選択を開始する１つを満たす１つまたは複数のＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、ａ）、ｂ）またはｃ）のうちの残りの２つのいずれか１つに供する。次いで、ａ）、ｂ）またはｃ）の残りの２つのうち一方を満たす１つまたは複数のＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、ａ）、ｂ）またはｃ）のうちの最後の１つに供する。次いで、ａ）、ｂ）またはｃ）のうちの最後の１つを満たす１つまたは複数のＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を、ａ）、ｂ）、およびｃ）を同時に満たすものとして選択する。好ましくは、ａ）、ｂ）、および適宜ｃ）は、ａ）、ｂ）、および適宜ｃ）、またはｂ）、ａ）、および適宜ｃ）の順序、より好ましくはａ）、ｂ）、および適宜ｃ）の順序で連続的に行う。
【0305】
（ｉｉ）ｃ）の工程は、インビトロまたはインシリコで、より好ましくは、インビトロで実施し得る。タンパク質および／またはペプチドの安定性を示すＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片についてのインビトロでのライブラリーのスクリーニングは、当業者に公知の任意の方法により行うことができる。例として、安定性は、ディープ突然変異スキャニング実験により測定することができる。例として、ＥＬＩＳＡにより、適する標準を使用したタンパク質量の検出ならびにタンパク質折畳みの保存の検出が可能な特異的抗体を用いて、タンパク質および／またはペプチドの安定性を測定する。例として、実施例４に記載のようなＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションにより生成されるタンパク質を、培養上清中に生成および分泌させることにより十分なタンパク質収率を、０．５μｇ／ｍｌを超える濃度、好ましくは、これよりも高い濃度で得ることができる。同様に、タンパク質安定性は、細胞表面上でのタンパク質の発現、および特異的蛍光標識抗体による検出の後、ＦＡＣＳ解析によって測定し得る。本発明では、ディープ突然変異スキャニング実験を、遺伝子型対表現型でカップリングするプラットフォーム上で実施し得る（https://www.nature.com/articles/nmeth.3027.pdf）。
【0306】
好ましくは、（ｉ）、（ｉｉ）ａ）および（ｉｉ）ｂ）の工程は、インビトロおよび／またはインシリコで、好ましくは、インビトロで実施する。より好ましくは、（ｉ）、（ｉｉ）ａ）および（ｉｉ）ｂ）の工程は、インシリコで実施する。さらにより好ましくは、（ｉ）の工程はインビトロで実施し、（ｉｉ）ａ）および（ｉｉ）ｂ）の工程はインシリコで実施する。なおさらにより好ましくは、（ｉ）、（ｉｉ）ａ）および（ｉｉ）ｂ）の工程は、インビトロで実施する。詳細は、次に記載する。
【0307】
（ｉ）、（ｉｉ）ａ）および／または（ｉｉ）ｂ）の工程をインビトロで実施する場合
ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤに１つまたは複数の突然変異を含むＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、当業者に公知の任意の方法によりインビトロで用意することができる。例として、１つまたは複数の点突然変異を組換えＤＮＡ技術によりＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤに導入することができ、適する任意の発現系、好ましくは、実施例４に記載のようにＨＥＫ２９３発現系によりＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤを発現させることができる。ただし、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤは細胞表面上で発現し、これによりポリペプチド鎖における膜貫通部分をコードするドメインを含む。
ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤに１つまたは複数の突然変異を含むＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、当業者に公知の任意の方法によりインビトロで用意することができる。例として、１つまたは複数の点突然変異を組換えＤＮＡ技術によりＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤに導入することができ、適する任意の発現系、好ましくは、実施例４に記載のようにＨＥＫ２９３発現系によりＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤを発現させることができる。ただし、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤは細胞表面上で発現し、これによりポリペプチド鎖における膜貫通部分をコードするドメインを含む。
【0308】
ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体に対するＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片およびＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤの結合力および結合力の低下は、ＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体に対するＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片およびＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤについて記載のように測定および決定することができる。したがって、ＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体に対するＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片およびＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤについて開示する結合力および結合力の低下に関する任意の開示または実施形態は、本発明による、ワクチン組成物用の活性成分をデザインおよび／または得るための方法において、ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体に対するＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片およびＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤの結合力および結合力の低下の測定に準用して適用可能であることが理解されるはずである。
【0309】
同様に、抗ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片およびＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤの結合は、抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片およびＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤについて記載のように測定および決定することができる。したがって、抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤまたはこの断片およびＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤについて開示する結合に関する任意の開示または実施形態は、本発明による、ワクチン組成物用の活性成分をデザインおよび／または得るための方法において、抗ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片およびＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤの結合の測定に準用して適用可能であることが理解されるはずである。
【0310】
好ましくは、（ｉ）の工程は、それぞれがＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤに１つまたは複数の突然変異を含む、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片のライブラリーを用意することを含み、好ましくは、これにより実施し、ここで、ライブラリーに含まれるＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片は、突然変異が少なくとも部分的に異なる。このようなＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片のライブラリーは、当業者に公知の任意の方法により用意することができる。好ましくは、ライブラリーは、例として、オーバーラップ伸長ＰＣＲ（https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022283613004300?via%3Dihub）、エラープローンＰＣＲ（https://link.springer.com/protocol/10.1385/1-59259-395-X:3）または化学的突然変異誘発（https://academic.oup.com/nar/article/32/4/1448/1038612?login=true）により、１遺伝子あたり厳密に１つのコドンの突然変異を作出する戦略（https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0052031；https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003269713005782?casa_token=d5JPaeUuTwYAAAAA:-F2ChRH8nmjiVhQYPsl1BF4JpK-m_E0CoVBibRWGkDKxCPd7D3IVxW7n-f7rRFCxRPGYJc8Q）と同様に生成することができ、ここで、デザインは、１遺伝子あたり複数のコドンの突然変異に適応させて突然変異の平均的作用を調査し(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4104320/)、プラスミドまたはウイルス、あるいはインビトロによる系、例えば、Ｔ７もしくはＭ１３バクテリオファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ディスプレイ、または最も好ましくは、哺乳動物細胞ディスプレイによりクローニングおよび発現させ得る。
【0311】
ａ）を示すＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片についてのライブラリーのスクリーニングは、当業者に公知の任意の方法により行うことができる。好ましくは、結合力は、例えば、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤもしくはＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤを細胞表面上に発現する細胞を、フルオロフォアで直接的もしくは間接的に標識したＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体で染色して、または反対に、ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体を細胞表面上に発現する細胞を、フルオロフォアで直接的もしくは間接的に標識した可溶性ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤもしくは可溶性ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤで染色してフローサイトメトリー解析を行い、染色細胞を計数して正および／または負の選択を行うことによって決定し、ここで、陽染性細胞数の減少は、結合力の低下を示す。次いで、結合力の低下が、ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体に対するＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤの結合力を、ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体に対するＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤの結合力と比較することにより得られる。結合力をフローサイトメトリー解析により決定する場合、結合力の低下は、好ましくは、ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤとＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体との結合から生じる陽染性細胞数を、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤとＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体との結合から生じる陽染性細胞数と比較することにより決定する。好ましくは、ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体に対するＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤの結合力の低下は、好ましくは、陽染性細胞数の５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、なおより好ましくは９５％以上、およびなおさらにより好ましくは９８％以上の減少によって示す。ワクチン接種による最良の作用を得るために、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤをワクチンとして使用する場合、ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体に対する結合力は、可能な限り低下させなければならない。したがって、好ましくは、ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体に対する結合力の低下に関して上限は存在しない。したがって、好ましくは、陽染性細胞の減少に関して上限は存在せず、この減少は１００％でさえあり得る。とは言え、陽染性細胞の減少に関する上限は、１００％以下、より好ましくは、９９％以下であり得る。
【0312】
ｂ）を示すＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片についてのライブラリーのスクリーニングは、当業者に公知の任意の方法により行うことができる。ｂ）を示すことは、好ましくは、抗ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対する結合力が維持される、すなわち、ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤと比較して、わずかに中程度に結合力が低下し、結合力が増加するまでの範囲となることを意味する。抗ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢは、種々の抗体クラスに属していてもよく、抗ＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢ、抗ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢ、および／または抗ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢについて上記のように準用して定義する。
【0313】
抗ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片およびＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤの結合力は、当業者に公知の任意の方法により測定することができる。好ましくは、結合力は、例えば、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤもしくはＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤを細胞表面上に発現する細胞を、フルオロフォアで直接的もしくは間接的に標識した抗ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢで染色して、または反対に、抗ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢを細胞表面上に発現する細胞を、フルオロフォアで直接的もしくは間接的に標識した可溶性ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤもしくは可溶性ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤで染色してフローサイトメトリー解析を行い、陽染性細胞を計数することによって決定する。抗ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢの結合力をフローサイトメトリー解析により決定する場合、結合力は、好ましくは、いくつかの異なるモノクローナル抗ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢ、好ましくは、４つ以上の異なる任意の選択されたモノクローナル抗ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢの平均結合力である。
【0314】
次いで、維持結合力、すなわち、わずかに中程度に結合力が低下し、結合力が増加するまでの範囲の結合力が、抗ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤの結合力または平均結合力を、抗ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤの結合力または平均結合力とそれぞれ比較することにより得られる。
【0315】
好ましくは、結合力は、フローサイトメトリー解析により測定し、ここで、陽染性細胞数が減少すると結合力が低くなることを示す。したがって、維持された、すなわち、結合力が、わずかに中程度に結合力が低下し、結合力が増加するまでの範囲であるかどうかは、好ましくは、ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤと抗ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢとの結合から生じる陽染性細胞数を、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤと抗ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢとの結合力から生じる陽染性細胞数とそれぞれ比較することにより決定する。
【0316】
結合力をフローサイトメトリー解析により決定する場合、ＲＢＤ抗ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤの結合力におけるわずかに中程度の低下は、好ましくは、陽染性細胞数および／またはＥＤ５０における５０％以上、より好ましくは８０％以上、およびさらにより好ましくは９０％以上の低下によって示す。
【0317】
すでに上述のように、フローサイトメトリー解析により結合力を決定するとき、結合力は、好ましくは、上に定義するように平均結合力である。したがって、上に定義する結合力のわずかに中程度の低下は、好ましくは、上に定義する平均結合力のわずかに中程度の低下である。
【0318】
ワクチン接種による最良の作用を得るために、ＶＩＲＵＳＡ－ｍＲＢＤをワクチンとして使用する場合、抗ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対する結合力は、可能な限り高くなければならない。したがって、好ましくは、抗ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対する結合力の低下は、可能な限り中程度でなければならず、好ましくは、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤに対する抗ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢの結合力は、好ましくは、低下せず、さらには増加もしない。すなわち、陽染性細胞数は低下しない。
【0319】
フローサイトメトリー解析により結合力を決定する場合、抗ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対するＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤの結合力の増加は、好ましくは、陽染性細胞数の１．１倍以上、より好ましくは１．２倍以上、さらにより好ましくは１．５倍以上、なおさらにより好ましくは２倍以上の増加によって示す。上述のように、ワクチン接種による最良の作用を得るために、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤをワクチンとして使用する場合、抗ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対する結合力は、可能な限り高くなければならない。したがって、好ましくは、抗ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対する結合力の増加に関して上限は存在しない。したがって、好ましくは、陽染性細胞の増加に関して上限は存在しない。とは言え、陽染性細胞の増加に関する上限は、１０．０００倍以下、より好ましくは１．０００倍以下、およびなおより好ましくは１００倍以下であり得る。
【0320】
好ましくは、（ｉ）、（ｉｉ）ａ）および／または（ｉｉ）ｂ）の工程は、ディープ突然変異スキャニング実験を使用することにより実施する。
【0321】
好ましくは、（ｉ）、（ｉｉ）ａ）および／または（ｉｉ）ｂ）の３つの工程すべてをインビトロで実施する場合、適宜、（ｉｉ）ｃ）の工程は、上記のようにインビトロでも実施する。
【0322】
（ｉ）の工程をインビトロまたはインシリコで実施し、（ｉｉ）ａ）および（ｉｉ）ｂ）の工程をインシリコで実施する場合
（ｉ）、（ｉｉ）ａ）および／または（ｉｉ）ｂ）の３つの工程すべてを、コンピュータを使用することによりインシリコで実施する場合、ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤに関するデータをコンピュータに提供して生物情報学的解析により処理し、ここで、好ましくは、コンピュータに提供されるデータは、ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤまたはこの断片の結晶構造からのデータである。
（ｉ）、（ｉｉ）ａ）および／または（ｉｉ）ｂ）の３つの工程すべてを、コンピュータを使用することによりインシリコで実施する場合、ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤに関するデータをコンピュータに提供して生物情報学的解析により処理し、ここで、好ましくは、コンピュータに提供されるデータは、ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤまたはこの断片の結晶構造からのデータである。
【0323】
結晶構造のデータを提供するとき、（ｉ）および（ｉｉ）ａ）の工程は、ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体と複合体形成したＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤまたはこの断片の結晶構造のデータを提供すること、およびＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または好ましくは、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片のライブラリーのデータをコンピュータに提供し、データを生物情報学的解析により処理して、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片がａ）を示すかどうかを決定するか、またはより好ましくは、ａ）を示すＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片についてライブラリーのスクリーニングを実施することによって組み合わせる。好ましくは、ａ）が示されるかどうかの決定は、ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体と複合体形成したＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤまたはこの断片の結晶構造に基づいて、ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体に干渉するＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤまたはこの断片のアミノ酸残基を同定し、ａ）を示すものとしてＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤを、好ましくは、干渉するアミノ酸残基に１つまたは複数の突然変異を含むライブラリーのＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤを選択することにより行う。
【0324】
好ましくは、ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤとＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体との複合体に関する結晶構造のデータは、好ましくは、ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体と複合体形成したＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤの１つもしくは複数の実験構造または計算モデル、あるいはＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片に結合するＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体の関連ドメインの結晶構造である。
【0325】
同様に、結晶構造のデータを提供するとき、好ましくは、（ｉ）および（ｉｉ）ｂ）の工程は、抗ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢと複合体形成したＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤまたはこの断片の結晶構造のデータをコンピュータに提供すること、およびＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または好ましくは、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片のライブラリーのデータを提供し、データを生物情報学的解析により処理して、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片がｂ）を示すかどうかを決定するか、またはより好ましくは、ｂ）を示すＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片についてライブラリーのスクリーニングを実施することによって組み合わせる。好ましくは、ｂ）が示されるかどうかの決定は、抗ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢと複合体形成したＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤまたはこの断片の結晶構造に基づいて、抗ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに干渉しないＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤまたはこの断片のアミノ酸残基を同定し、ｂ）を示すものとしてＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤを、好ましくは、干渉しないアミノ酸残基に１つまたは複数の突然変異を含むライブラリーのＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤを選択することにより行う。
【0326】
より好ましくは、干渉しないアミノ酸残基は、ａ）の決定において同定された干渉するアミノ酸残基から選択される。
【0327】
好ましくは、抗ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢとの複合体に関する結晶構造のデータは、好ましくは、抗ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢと複合体形成したＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤの１つもしくは複数の実験構造または計算モデル、あるいはＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片に結合する抗ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢの関連ドメインの結晶構造である。
【0328】
好ましくは、（ｉ）、（ｉｉ）ａ）および／または（ｉｉ）ｂ）の３つの工程すべてを、ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤとＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体との複合体に関する結晶構造のデータを提供することによりインシリコで実施する場合、適宜、（ｉｉ）ｃ）の工程は、上記のようにインビトロで実施する。
【0329】
（ｉ）の工程をインビトロで実施し、（ｉｉ）ａ）および（ｉｉ）ｂ）の工程をインシリコで実施する場合、適宜、（ｉｉ）ｃ）の工程もインシリコで実施し、ここで、好ましくは、（ｉ）の工程は、１つまたは複数のディープ突然変異スキャニング実験を使用することによりインビトロで実施する。好ましくは、（ｉｉ）ａ）および（ｉｉ）ｂ）の工程ならびに適宜（ｉｉ）ｃ）の工程は、コンピュータを使用することによりインシリコで実施し、ここで、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤおよびＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤに関するデータをコンピュータに提供し、生物情報学的解析により処理し、ここで、コンピュータに提供されるデータは、好ましくは、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片およびＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤまたはこの断片の１つまたは複数のディープ突然変異スキャニング実験のデータである。
【0330】
好ましくは、（ｉｉ）ａ）の工程は、１つまたは複数のディープ突然変異スキャニング実験のデータを使用し、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片（クエリ抗原、ｓ）のＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体に対する結合（Ｒｅｎｄｏ（ｓ））を反映する適応度の尺度を用いて実施し、ここで、Ｒｅｎｄｏは、クエリ抗原ｓの解離定数Ｋにおける、例えば、滴定により参照抗原（例えば、野生型）ｒと比較したｌｏｇスケールの差であり、ここで、式は、Ｌｏｇ（Ｋ（ｓ））－Ｌｏｇ（Ｋ（ｒ））である。
【0331】
同様に、（ｉｉ）ｂ）の工程は、１つまたは複数のディープ突然変異スキャニング実験のデータを使用し、１つまたは複数のＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢからのエスケープ（Ｒｎａｂ（ｓ））を反映するＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片（ｓ）の適応度の尺度を用いて実施し、ここで、Ｒｎａｂは、エスケープ率であり、好ましくは、ＦＡＣＳにより定量した場合、総数と比較して結合が低下した数を特定する。
【0332】
好ましくは、（ｉｉ）ｃ）の工程をさらに実施する。（ｉｉ）ｃ）の工程は、１つまたは複数のディープ突然変異スキャニング実験のデータを使用し、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片（ｓ）の安定性（Ｒｓｔａｂ（ｓ））を反映する適応度の尺度を用いて実施する。ここで、Ｒｓｔａｂは、数ｃにおける、例えば、蛍光強度により参照抗原ｒと比較したｌｏｇスケールの差であり、ここで、式は、Ｌｏｇ（ｃ（ｓ））－Ｌｏｇ（ｃ（ｒ））である。
【0333】
さらにより好ましくは、
（ｉｉｉ）の工程は、ライブラリーの１つまたは複数のＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を、
ａ）ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体に対する結合力を低下させるこれらの能力、ならびに
ｂ）適宜、ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対して結合するこれらの能力、ならびに
ｃ）さらに適宜、タンパク質および／またはペプチドの安定性を示すこれらの能力
についてスコアリングすることと、
このスコアリングに基づいて、このライブラリーから、ａ）についての最高スコア、好ましくはａ）およびｂ）の組合せについての最高スコア、ならびにより好ましくはａ）、ｂ）、およびｃ）の組合せについての最高スコアを有する１つまたは複数のＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を活性成分として選択することと
をさらに含む。
（ｉｉｉ）の工程は、ライブラリーの１つまたは複数のＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を、
ａ）ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体に対する結合力を低下させるこれらの能力、ならびに
ｂ）適宜、ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢに対して結合するこれらの能力、ならびに
ｃ）さらに適宜、タンパク質および／またはペプチドの安定性を示すこれらの能力
についてスコアリングすることと、
このスコアリングに基づいて、このライブラリーから、ａ）についての最高スコア、好ましくはａ）およびｂ）の組合せについての最高スコア、ならびにより好ましくはａ）、ｂ）、およびｃ）の組合せについての最高スコアを有する１つまたは複数のＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を活性成分として選択することと
をさらに含む。
【0334】
好ましくは、ａ）、ｂ）、およびｃ）はすべて、相互に等しく重みづけし、例えば、ａ）：ｂ）：ｃ）＝１：１：１である。
【0335】
好ましくは、スコアリングは、コンピュータを使用してインシリコで実施する。好ましくは、スコアリングは、
好ましくは、Ｒｅｎｄｏ（ｓ）、適宜Ｒｎａｂ（ｓ）、およびさらには適宜Ｒｓｔａｂ（ｓ）の正規化データに基づいて、１つまたは複数のＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片をスコアリングすることであって、
Ｓｔｏｔ（ｓ’）＝Ｎｅｎｄｏ（ｓ’）であり、
適宜、Ｓｔｏｔ（ｓ’）＝Ｎｎａｂ（ｓ’）－Ｎｅｎｄｏ（ｓ’）であり、
更には適宜、Ｓｔｏｔ（ｓ’）＝Ｎｓｔａｂ（ｓ’）－Ｎｎａｂ（ｓ’）－Ｎｅｎｄｏ（ｓ’）であり、
式中、
Ｓｔｏｔ（ｓ’）は、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片の総スコアであり、
Ｎｅｎｄｏ（ｓ’）は、ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体に対するＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片（ｓ）の正規化した結合（Ｒｅｎｄｏ（ｓ））であり、
Ｎｎａｂ（ｓ’）は、１つまたは複数のＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢからのＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片の正規化したエスケープ（Ｒｎａｂ（ｓ））であり、
Ｎｓｔａｂ（ｓ’）は、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片の安定性（Ｒｓｔａｂ（ｓ））である、スコアリングすることと、
ライブラリーから、最高スコアＳｔｏｔ（ｓ’）を有する活性成分として使用する１つまたは複数のＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を選択することと
を含む。
好ましくは、Ｒｅｎｄｏ（ｓ）、適宜Ｒｎａｂ（ｓ）、およびさらには適宜Ｒｓｔａｂ（ｓ）の正規化データに基づいて、１つまたは複数のＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片をスコアリングすることであって、
Ｓｔｏｔ（ｓ’）＝Ｎｅｎｄｏ（ｓ’）であり、
適宜、Ｓｔｏｔ（ｓ’）＝Ｎｎａｂ（ｓ’）－Ｎｅｎｄｏ（ｓ’）であり、
更には適宜、Ｓｔｏｔ（ｓ’）＝Ｎｓｔａｂ（ｓ’）－Ｎｎａｂ（ｓ’）－Ｎｅｎｄｏ（ｓ’）であり、
式中、
Ｓｔｏｔ（ｓ’）は、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片の総スコアであり、
Ｎｅｎｄｏ（ｓ’）は、ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体に対するＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片（ｓ）の正規化した結合（Ｒｅｎｄｏ（ｓ））であり、
Ｎｎａｂ（ｓ’）は、１つまたは複数のＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢからのＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片の正規化したエスケープ（Ｒｎａｂ（ｓ））であり、
Ｎｓｔａｂ（ｓ’）は、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片の安定性（Ｒｓｔａｂ（ｓ））である、スコアリングすることと、
ライブラリーから、最高スコアＳｔｏｔ（ｓ’）を有する活性成分として使用する１つまたは複数のＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を選択することと
を含む。
【0336】
好ましくは、１つまたは複数のＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片のスコアリングは、Ｒｅｎｄｏ（ｓ）、Ｒｎａｂ（ｓ）、およびＲｓｔａｂ（ｓ）の正規化に基づき、ここで、好ましくは、Ｒｅｎｄｏ（ｓ）およびＲｓｔａｂ（ｓ）のデータのスコアリング前にＲｓｔａｂ（ｓ）を前選択し、ここで、
ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片のＲｓｔａｂ（ｓ）は、ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤのｅｘｐ（－アルファ）の少なくとも１つの因数でなければならず、
ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片のＲｅｎｄｏ（ｓ）は、ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤのｅｘｐ（－ベータ）の少なくとも１つの因数でなければならず、
ここで、好ましくは、アルファおよびベータの閾値を設定する。アルファおよびベータの閾値により、スコアリングのために考慮すべきＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤの脱安定化の程度および結合強度を制御することができる。
ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片のＲｓｔａｂ（ｓ）は、ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤのｅｘｐ（－アルファ）の少なくとも１つの因数でなければならず、
ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片のＲｅｎｄｏ（ｓ）は、ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤのｅｘｐ（－ベータ）の少なくとも１つの因数でなければならず、
ここで、好ましくは、アルファおよびベータの閾値を設定する。アルファおよびベータの閾値により、スコアリングのために考慮すべきＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤの脱安定化の程度および結合強度を制御することができる。
【0337】
好ましくは、デザインおよび／または得るための方法は、活性成分を得るための方法である。
【0338】
好ましくは、活性成分をデザインおよび／または得るための方法は、ウイルスに対するワクチン組成物用の活性成分をデザインおよび／または得るための方法である。
【0339】
好ましくは、活性成分として、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片または１つもしくは複数のＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片は、
－ １つまたは複数のＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片、および／あるいは
－ ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を含む、ウイルスの１つまたは複数の突然変異スパイクタンパク質（ＶＩＲＵＳ－ｍＳｐｉｋｅ）またはこの断片、および／あるいは
－ ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片またはＶＩＲＵＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含む、１つまたは複数のポリペプチドまたはタンパク質、および／あるいは
－ ・ ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、
・ ＶＩＲＵＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片、または
・ ポリペプチドもしくはタンパク質
をコードする１つまたは複数の核酸
として存在し得る。
－ １つまたは複数のＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片、および／あるいは
－ ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片を含む、ウイルスの１つまたは複数の突然変異スパイクタンパク質（ＶＩＲＵＳ－ｍＳｐｉｋｅ）またはこの断片、および／あるいは
－ ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片またはＶＩＲＵＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片を含む、１つまたは複数のポリペプチドまたはタンパク質、および／あるいは
－ ・ ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、
・ ＶＩＲＵＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片、または
・ ポリペプチドもしくはタンパク質
をコードする１つまたは複数の核酸
として存在し得る。
【0340】
好ましくは、ワクチン組成物用の活性成分をデザインおよび／または得るための方法は、コロナウイルス、より好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２および／またはＭＥＲＳ－ＣｏＶ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、デングウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、黄熱ウイルス、ジカウイルス、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ならびに／またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）から選択されるウイルスに適用可能である。
【0341】
好ましくは、活性成分をデザインおよび／または得るための方法では、
－ ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤは、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤ、Ｃ型肝炎ウイルスｍＲＢＤ、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルスｍＲＢＤ、インフルエンザウイルスｍＲＢＤ、呼吸器合胞体ウイルスｍＲＢＤ、デングウイルスｍＲＢＤ、ヒト免疫不全ウイルスｍＲＢＤ、黄熱ウイルスｍＲＢＤ、ジカウイルスｍＲＢＤ、西ナイルウイルスｍＲＢＤ、日本脳炎ウイルスｍＲＢＤ、ダニ媒介脳炎ウイルスｍＲＢＤ、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ｍＲＢＤ、および／またはサイトメガロウイルスｍＲＢＤであり、より好ましくは、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤは、本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤおよび／またはＭＥＲＳ－ｍＲＢＤであり、
－ ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤは、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ、Ｃ型肝炎ウイルスｗｔＲＢＤ、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルスｗｔＲＢＤ、インフルエンザウイルスｗｔＲＢＤ、呼吸器合胞体ウイルスｗｔＲＢＤ、デングウイルスｗｔＲＢＤ、ヒト免疫不全ウイルスｗｔＲＢＤ、黄熱ウイルスｗｔＲＢＤ、ジカウイルスｗｔＲＢＤ、西ナイルウイルスｗｔＲＢＤ、日本脳炎ウイルスｗｔＲＢＤ、ダニ媒介脳炎ウイルスｗｔＲＢＤ、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ｗｔＲＢＤ、および／またはサイトメガロウイルスｗｔＲＢＤであり、より好ましくは、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤは、本発明によるＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ（配列番号１）および／またはＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ（配列番号１９４）であり、
－ ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体は、ＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体、より好ましくはＡＣＥ２および／またはＤＰＰ４、Ｃ型肝炎ウイルスＲＢＤ受容体、より好ましくはＣＤ８１および／またはＡｐｏＥ、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルスＲＢＤ受容体、より好ましくはＤＣ１６３、インフルエンザウイルスＲＢＤ受容体、より好ましくはシアル酸、呼吸器合胞体ウイルスＲＢＤ受容体、より好ましくはＲＳＶ Ｇタンパク質および／またはＲＳＶ Ｆタンパク質、さらにより好ましくはＣＸ３ＣＲ１、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）、ヌクレオリン、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＣＡＭ－１および／またはインスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）、デングウイルスＲＢＤ受容体、より好ましくはマンノース受容体、Ｆｃガンマ受容体、ＴＩＭ／ＴＡＭ、ヘパリン硫酸、ＤＣ－ＳＩＧＮ、ヒト免疫不全ウイルスＲＢＤ受容体、より好ましくはＣＤ４、黄熱ウイルスＲＢＤ受容体、より好ましくはヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）、ジカウイルスＲＢＤ受容体、より好ましくはホスファチジルセリン受容体、さらにより好ましくはＴ細胞免疫グロブリン（ＴＩＭ）ならびにＴＹＲＯ３、ＡＸＬ、および、ＭＥＲＴＫ（ＴＡＭ）、西ナイルウイルスＲＢＤ受容体、より好ましくはホスファチジルセリン受容体、さらにより好ましくはＴ細胞免疫グロブリン（ＴＩＭ）ならびにＴＹＲＯ３、ＡＸＬおよび、ＭＥＲＴＫ（ＴＡＭ）、日本脳炎ウイルスＲＢＤ受容体、より好ましくはホスファチジルセリン受容体、さらにより好ましくはＴ細胞免疫グロブリン（ＴＩＭ）ならびにＴＹＲＯ３、ＡＸＬおよび、ＭＥＲＴＫ（ＴＡＭ）、ダニ媒介脳炎ウイルスＲＢＤ受容体、より好ましくはホスファチジルセリン受容体、さらにより好ましくはＴ細胞免疫グロブリン（ＴＩＭ）ならびにＴＹＲＯ３、ＡＸＬ、およびＭＥＲＴＫ（ＴＡＭ）、エプスタイン・バーウイルス受容体、より好ましくは補体受容体２（ＣＤ２１）および／またはサイトメガロウイルスＲＢＤ受容体、より好ましくは血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体α（ＰＤＧＦＲα）、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、インテグリンであり、
－ ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢは、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢ、Ｃ型肝炎ウイルスｎＡＢ、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルスｎＡＢ、インフルエンザウイルスｎＡＢ、呼吸器合胞体ウイルスｎＡＢ、デングウイルスｎＡＢ、ヒト免疫不全ウイルスｎＡＢ、黄熱ウイルスｎＡＢ、ジカウイルスｎＡＢ、西ナイルウイルスｎＡＢ、日本脳炎ウイルスｎＡＢ、ダニ媒介脳炎ウイルスｎＡＢ、エプスタイン・バーウイルスｎＡｂ、および／またはサイトメガロウイルスｎＡＢであり、より好ましくは、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢは、本発明によるＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢおよび／またはＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢであり、
－ ＶＩＲＵＳ－ｍＳｐｉｋｅは、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅ、Ｃ型肝炎ウイルスｍＳｐｉｋｅ、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルスｍＳｐｉｋｅ、インフルエンザウイルスｍＳｐｉｋｅ、呼吸器合胞体ウイルスｍＳｐｉｋｅ、デングウイルスｍＳｐｉｋｅ、ヒト免疫不全ウイルスｍＳｐｉｋｅ、黄熱ウイルスｍＳｐｉｋｅ、ジカウイルスｍＳｐｉｋｅ、西ナイルウイルスｍＳｐｉｋｅ、日本脳炎ウイルスｍＳｐｉｋｅ、ダニ媒介脳炎ウイルスｍＳｐｉｋｅ、エプスタイン・バーウイルスｍＳｐｉｋｅ、および／またはサイトメガロウイルスｍＳｐｉｋｅであり、より好ましくは、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅは、本発明によるＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅおよび／またはＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅである。
－ ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤは、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤ、Ｃ型肝炎ウイルスｍＲＢＤ、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルスｍＲＢＤ、インフルエンザウイルスｍＲＢＤ、呼吸器合胞体ウイルスｍＲＢＤ、デングウイルスｍＲＢＤ、ヒト免疫不全ウイルスｍＲＢＤ、黄熱ウイルスｍＲＢＤ、ジカウイルスｍＲＢＤ、西ナイルウイルスｍＲＢＤ、日本脳炎ウイルスｍＲＢＤ、ダニ媒介脳炎ウイルスｍＲＢＤ、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ｍＲＢＤ、および／またはサイトメガロウイルスｍＲＢＤであり、より好ましくは、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤは、本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤおよび／またはＭＥＲＳ－ｍＲＢＤであり、
－ ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤは、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ、Ｃ型肝炎ウイルスｗｔＲＢＤ、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルスｗｔＲＢＤ、インフルエンザウイルスｗｔＲＢＤ、呼吸器合胞体ウイルスｗｔＲＢＤ、デングウイルスｗｔＲＢＤ、ヒト免疫不全ウイルスｗｔＲＢＤ、黄熱ウイルスｗｔＲＢＤ、ジカウイルスｗｔＲＢＤ、西ナイルウイルスｗｔＲＢＤ、日本脳炎ウイルスｗｔＲＢＤ、ダニ媒介脳炎ウイルスｗｔＲＢＤ、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ｗｔＲＢＤ、および／またはサイトメガロウイルスｗｔＲＢＤであり、より好ましくは、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤは、本発明によるＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ（配列番号１）および／またはＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ（配列番号１９４）であり、
－ ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体は、ＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体、より好ましくはＡＣＥ２および／またはＤＰＰ４、Ｃ型肝炎ウイルスＲＢＤ受容体、より好ましくはＣＤ８１および／またはＡｐｏＥ、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルスＲＢＤ受容体、より好ましくはＤＣ１６３、インフルエンザウイルスＲＢＤ受容体、より好ましくはシアル酸、呼吸器合胞体ウイルスＲＢＤ受容体、より好ましくはＲＳＶ Ｇタンパク質および／またはＲＳＶ Ｆタンパク質、さらにより好ましくはＣＸ３ＣＲ１、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）、ヌクレオリン、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＣＡＭ－１および／またはインスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）、デングウイルスＲＢＤ受容体、より好ましくはマンノース受容体、Ｆｃガンマ受容体、ＴＩＭ／ＴＡＭ、ヘパリン硫酸、ＤＣ－ＳＩＧＮ、ヒト免疫不全ウイルスＲＢＤ受容体、より好ましくはＣＤ４、黄熱ウイルスＲＢＤ受容体、より好ましくはヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）、ジカウイルスＲＢＤ受容体、より好ましくはホスファチジルセリン受容体、さらにより好ましくはＴ細胞免疫グロブリン（ＴＩＭ）ならびにＴＹＲＯ３、ＡＸＬ、および、ＭＥＲＴＫ（ＴＡＭ）、西ナイルウイルスＲＢＤ受容体、より好ましくはホスファチジルセリン受容体、さらにより好ましくはＴ細胞免疫グロブリン（ＴＩＭ）ならびにＴＹＲＯ３、ＡＸＬおよび、ＭＥＲＴＫ（ＴＡＭ）、日本脳炎ウイルスＲＢＤ受容体、より好ましくはホスファチジルセリン受容体、さらにより好ましくはＴ細胞免疫グロブリン（ＴＩＭ）ならびにＴＹＲＯ３、ＡＸＬおよび、ＭＥＲＴＫ（ＴＡＭ）、ダニ媒介脳炎ウイルスＲＢＤ受容体、より好ましくはホスファチジルセリン受容体、さらにより好ましくはＴ細胞免疫グロブリン（ＴＩＭ）ならびにＴＹＲＯ３、ＡＸＬ、およびＭＥＲＴＫ（ＴＡＭ）、エプスタイン・バーウイルス受容体、より好ましくは補体受容体２（ＣＤ２１）および／またはサイトメガロウイルスＲＢＤ受容体、より好ましくは血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体α（ＰＤＧＦＲα）、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、インテグリンであり、
－ ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢは、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢ、Ｃ型肝炎ウイルスｎＡＢ、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルスｎＡＢ、インフルエンザウイルスｎＡＢ、呼吸器合胞体ウイルスｎＡＢ、デングウイルスｎＡＢ、ヒト免疫不全ウイルスｎＡＢ、黄熱ウイルスｎＡＢ、ジカウイルスｎＡＢ、西ナイルウイルスｎＡＢ、日本脳炎ウイルスｎＡＢ、ダニ媒介脳炎ウイルスｎＡＢ、エプスタイン・バーウイルスｎＡｂ、および／またはサイトメガロウイルスｎＡＢであり、より好ましくは、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢは、本発明によるＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢおよび／またはＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢであり、
－ ＶＩＲＵＳ－ｍＳｐｉｋｅは、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅ、Ｃ型肝炎ウイルスｍＳｐｉｋｅ、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルスｍＳｐｉｋｅ、インフルエンザウイルスｍＳｐｉｋｅ、呼吸器合胞体ウイルスｍＳｐｉｋｅ、デングウイルスｍＳｐｉｋｅ、ヒト免疫不全ウイルスｍＳｐｉｋｅ、黄熱ウイルスｍＳｐｉｋｅ、ジカウイルスｍＳｐｉｋｅ、西ナイルウイルスｍＳｐｉｋｅ、日本脳炎ウイルスｍＳｐｉｋｅ、ダニ媒介脳炎ウイルスｍＳｐｉｋｅ、エプスタイン・バーウイルスｍＳｐｉｋｅ、および／またはサイトメガロウイルスｍＳｐｉｋｅであり、より好ましくは、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅは、本発明によるＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅおよび／またはＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅである。
【0342】
より好ましくは、活性成分をデザインおよび／または得るための方法では、
－ ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤは、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤ、より好ましくは、本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤおよび／またはＭＥＲＳ－ｍＲＢＤであり、
－ ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤは、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ、より好ましくは、本発明によるＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ（配列番号１）および／またはＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ（配列番号１９４）であり、
－ ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体は、ＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体、より好ましくは、ＡＣＥ２および／またはＤＰＰ４であり、
－ ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢは、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢ、より好ましくは、本発明によるＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢおよび／またはＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢであり、
－ ＶＩＲＵＳ－ｍＳｐｉｋｅは、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅ、より好ましくは、本発明によるＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅおよび／またはＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅである。
－ ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤは、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤ、より好ましくは、本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤおよび／またはＭＥＲＳ－ｍＲＢＤであり、
－ ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤは、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ、より好ましくは、本発明によるＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ（配列番号１）および／またはＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ（配列番号１９４）であり、
－ ＶＩＲＵＳ－ＲＢＤ受容体は、ＣＯＲＯＮＡ－ＲＢＤ受容体、より好ましくは、ＡＣＥ２および／またはＤＰＰ４であり、
－ ＶＩＲＵＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢは、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢ、より好ましくは、本発明によるＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢおよび／またはＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤ－ｎＡＢであり、
－ ＶＩＲＵＳ－ｍＳｐｉｋｅは、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅ、より好ましくは、本発明によるＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅおよび／またはＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅである。
【0343】
その上、本発明では、
ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤ、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤ、および／またはＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片、ならびに／あるいは
ＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅ、ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅ、および／またはＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片、
ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤ、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、またはＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅ、ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅを含むポリペプチドまたはタンパク質、
本発明によるこれらをコードする核酸、
本発明によるこれらを含むワクチン組成物、ならびに／あるいは
予防および／または治療における使用
について開示する任意の実施形態は、ワクチン組成物用の活性成分をデザインおよび／または得るための方法に準用して適用可能であることが理解されるはずである。
ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤ、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤ、および／またはＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片、ならびに／あるいは
ＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅ、ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅ、および／またはＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅまたはこの断片、
ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤ、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、またはＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅ、ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅを含むポリペプチドまたはタンパク質、
本発明によるこれらをコードする核酸、
本発明によるこれらを含むワクチン組成物、ならびに／あるいは
予防および／または治療における使用
について開示する任意の実施形態は、ワクチン組成物用の活性成分をデザインおよび／または得るための方法に準用して適用可能であることが理解されるはずである。
【0344】
その上、本発明は、本発明による、ワクチン組成物用の活性成分をデザインおよび／または得るための方法によって、活性成分として得られたＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片に関する。
【0345】
好ましくは、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤは、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤ、Ｃ型肝炎ウイルスｍＲＢＤ、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルスｍＲＢＤ、インフルエンザウイルスｍＲＢＤ、呼吸器合胞体ウイルスｍＲＢＤ、デングウイルスｍＲＢＤ、ヒト免疫不全ウイルスｍＲＢＤ、黄熱ウイルスｍＲＢＤ、ジカウイルスｍＲＢＤ、西ナイルウイルスｍＲＢＤ、日本脳炎ウイルスｍＲＢＤ、ダニ媒介脳炎ウイルスｍＲＢＤ、エプスタイン・バーウイルスｍＲＢＤ、および／またはサイトメガロウイルスｍＲＢＤであり、より好ましくは、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤは、本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤおよび／またはＭＥＲＳ－ｍＲＢＤである。
【0346】
より好ましくは、ＶＩＲＵＳ－ｍＲＢＤは、本発明によるＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤ、より好ましくは、本発明によるＳＡＲＳ－ｍＲＢＤおよび／またはＭＥＲＳ－ｍＲＢＤである。
【0347】
その上、本発明は、対象においてコロナウイルスにより引き起こされる疾患、好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２により引き起こされるＣＯＶＩＤ－１９および／またはＭＥＲＳ－ＣｏＶにより引き起こされるＭＥＲＳの予防および／または治療のための方法であって、
－ 本発明による１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤ、好ましくはＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはＭＥＲＳ－ｍＲＢＤ、もしくはこの断片、
－ 本発明による１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅ、好ましくはＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅ、もしくはこの断片、
－ 本発明による１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質、
－ 本発明による１つもしくは複数の核酸、および／または
－ 本発明によるワクチン組成物
を対象に投与することを含む方法に関する。
－ 本発明による１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤ、好ましくはＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはＭＥＲＳ－ｍＲＢＤ、もしくはこの断片、
－ 本発明による１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅ、好ましくはＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅ、もしくはこの断片、
－ 本発明による１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質、
－ 本発明による１つもしくは複数の核酸、および／または
－ 本発明によるワクチン組成物
を対象に投与することを含む方法に関する。
【0348】
その上、本発明は、対象において、好ましくはコロナウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶに対する免疫応答を誘導するための方法であって、
－ 本発明による１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤ、好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはＭＥＲＳ－ｍＲＢＤ、もしくはこの断片、
－ 本発明による１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅ、好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅ、もしくはこの断片、
－ 本発明による１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質、
－ 本発明による１つもしくは複数の核酸、および／または
－ 本発明によるワクチン組成物
を対象に投与することを含む方法に関する。
－ 本発明による１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤ、好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはＭＥＲＳ－ｍＲＢＤ、もしくはこの断片、
－ 本発明による１つもしくは複数のＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅ、好ましくは、ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅ、もしくはこの断片、
－ 本発明による１つもしくは複数のポリペプチドもしくはタンパク質、
－ 本発明による１つもしくは複数の核酸、および／または
－ 本発明によるワクチン組成物
を対象に投与することを含む方法に関する。
【0349】
その上、本発明では、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤ／ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤおよび／またはＭＥＲＳ－ｍＲＢＤまたはこの断片、ならびに／あるいはＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅ／ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅおよび／もしくはＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはこの断片、ＣＯＲＯＮＡ－ｍＲＢＤ／ＳＡＲＳ－ｍＲＢＤもしくはＭＥＲＳ－ｍＲＢＤもしくはこの断片、またはＣＯＲＯＮＡ－ｍＳｐｉｋｅ／ＳＡＲＳ－ｍＳｐｉｋｅもしくはＭＥＲＳ－ｍＳｐｉｋｅを含むポリペプチドもしくはタンパク質、これらをコードする核酸、これらを含むワクチン組成物、予防および／または治療における使用、ならびに／あるいはこれらを得るための方法について開示する任意の実施形態は、コロナウイルスにより引き起こされる疾患の予防および／もしくは治療のための方法ならびに／または免疫応答を誘導するための方法に準用して適用可能であることが理解されるはずである。
【0350】
【表3】
【0351】
【表4】
【0352】
本発明は、次の図面および実施例によりさらに例示する。
【図面の簡単な説明】
【0353】
【図1】図１Ａ～Ｇは、ｓＡＣＥ２がｃＡｂ（競合抗体、「ｎＡｂ」に対して同義語とし使用）を分泌するＢ細胞の生成に干渉することをインビボで示す。図１Ａは、ヒト化残基およびＲＢＤフットプリントを有するモデル化マウスＡＣＥ２の構造である。図１Ｂは、ＤｒｏｐＭａｐ解析の免疫化スケジュールおよび時点の概要である。図１Ｃは、ｃＡｂを分泌するＢ細胞の出現頻度を示す。図１Ｄは、ＲＢＤに対するＡＣＥ２の結合遮断のＥＬＩＳＡによる評価を示す。図１Ｅは、図１Ｃのデータの用量応答解析を示す。図１Ｆは、免疫化時のｃＡｂ分泌の比較解析を示す。図１Ｇは、ｍｈＡＣＥ２の有無による完全スパイク免疫化後の脾細胞のＤｒｏｐＭａｐ解析を示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【0354】
注釈：次の実施例では、一部の場合、ＲＢＤのアミノ酸の置換の位置は、Ｓｐｉｋｅ内の位置を考慮して示す。この点については、上の表ＡおよびＢを参照してスパイク内の位置をＲＢＤ内のそれぞれの位置に割り当てる。
［実施例１］
［実施例１］
【0355】
インビボでのマウスモデルにおいてｓＡＣＥ２またはｎＡＢによるＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤのマスキングによってＢ細胞が障害され、抗体が応答する － 図１Ａ～Ｇ
図１Ａ～Ｇ）可溶性ＡＣＥ２は、インビボでＡＣＥ２－ＲＢＤ相互作用に干渉／競合する抗体（ｃＡｂ）を分泌するＢ細胞の生成に干渉する。
図１Ａ～Ｇ）可溶性ＡＣＥ２は、インビボでＡＣＥ２－ＲＢＤ相互作用に干渉／競合する抗体（ｃＡｂ）を分泌するＢ細胞の生成に干渉する。
【0356】
図１Ａ）ヒト化残基を青、ＲＢＤフットプリントを黒で示す、モデル化マウスＡＣＥ２の構造。
【0357】
図１Ｂ）ＤｒｏｐＭａｐ解析の免疫化スケジュールおよび時点の概要。個々の脾細胞を微小液滴に被包して解析し、分泌抗体のＲＢＤへの結合およびｓＡＣＥ２との競合を蛍光再配置により測定した。
【0358】
図１Ｃ）３２日目のｃＡｂを分泌するＢ細胞の出現頻度（ＩｇＧ分泌細胞のパーセンテージとして）を、マスキング有能ｎＡｂ（１８ｐｍｏｌもしくは８６ｐｍｏｌ）またはｍｈＡＣＥ２（４ｐｍｏｌ、３７ｐｍｏｌもしくは９２ｐｍｏｌ）で示されるＲＢＤ（３μｇ／免疫化、１２０ｐｍｏｌ）を使用する免疫化について示す。
【0359】
図１Ｄ）３２日目にマウス血清を採取し、ＲＢＤに対するＡＣＥ２の結合遮断をＥＬＩＳＡにより評価した。相互性血清希釈率に対する光学密度および曲線上面積（ＡＡＣ）の値を示す。
【0360】
図１Ｅ）％ＲＢＭマスキングに対して正規化した場合ｃに示すデータの用量応答傾向。
【0361】
図１Ｆ）２回目の免疫化後４日目（３２日目）および２１日目（４９日目）のｃＡｂ分泌の比較解析。
【0362】
図１Ｇ）ｍｈＡＣＥ２の有無（０ｐｍｏｌ、４ｐｍｏｌまたは９２ｐｍｏｌ）による完全スパイク免疫化（３μｇ／免疫化、１８ｐｍｏｌによる免疫化）後４９日目の脾細胞のＤｒｏｐｍａｐ解析。
【0363】
図１に示すすべての実験では、１条件あたりＮ＝３匹のマウスを使用し、両側独立Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定により統計学的解析を行った（＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、および＊ｐ＜０．０５）。ｃ、ｅ～ｆのグラフでは、出現頻度平均値＋／－ＳＤを示す。
【0364】
この実施例は、実施例５に記載のように実施した。ただし、加えて、ＡＣＥ２による結合能の遮断をマウス血清について決定した。
【0365】
１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ中の血清の段階希釈液をＲＢＤコーティングした９６ウェルプレートに加えた。組換えＲＢＤを高結合９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、＃ＣＬＳ３６９０）上にＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国、ＭＯ）中に４μｇ／ｍｌで＋４℃で一晩固定化した。プレートを１時間、ＰＢＳ中１％のＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社、Ｇｉｂｃｏ、米国、ＭＡ）により室温でブロッキングした。室温でのインキュベーションから１時間後、社内で生成したビオチン化ＡＣＥ２－ｈＦｃｇ１を加えて、１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ中の最終有効濃度７０（ＥＣ７０）とした。室温でもう１時間インキュベートした後、プレートをＡＰ共役ストレプトアビジン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、＃ＳＢＡ－７１００－０４）を１％ＢＳＡ添加ＰＢＳで１：５００に希釈したものとともにインキュベートして、ビオチン化ＡＣＥ２－ｈＦｃｇ１を検出した。これは、血清抗体によりＲＢＤへの結合が阻止されなかったものである。５０％最大ＡＣＥ２遮断能（ＢＤ５０）は、非線形回帰によるＳ字曲線のフィッティングをＲ（ｓｔａｔｓパッケージ）により実施することによって決定した。曲線下面積または曲線上面積は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアにより決定した。非ビオチン化ＡＣＥ２－ｈＦｃｇ１対照の上下のプラトーは、参照として作用した。
［実施例２］
［実施例２］
【0366】
ＡＣＥ２結合が低下したＳＡＲＳ－ｍＲＢＤおよびＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤ特異的ｎＡＢの結合の保存の、生物情報学的解析の使用によるインシリコでの同定 － 図２Ａ、Ｂ、およびＣ
抗原の膜結合受容体または可溶性受容体への結合またはこれによるマスキングがそれぞれ阻止されるため、さらに強力な免疫応答を誘導可能なタンパク質変異抗原またはペプチド抗原を生成するための方法は、特に有用である。その上、抗原は、重要なエピトープが免疫原に特異的な免疫応答の中和を誘発し続けるようにデザインする。
抗原の膜結合受容体または可溶性受容体への結合またはこれによるマスキングがそれぞれ阻止されるため、さらに強力な免疫応答を誘導可能なタンパク質変異抗原またはペプチド抗原を生成するための方法は、特に有用である。その上、抗原は、重要なエピトープが免疫原に特異的な免疫応答の中和を誘発し続けるようにデザインする。
【0367】
「脱マスキング」抗原の生成は、アミノ酸の最小数の交換を抗原に導入して、ヒトまたは動物において発現する受容体に対する結合を阻止する工程を含み、中和抗体または回復期のドナーの血清に対する結合の保存についてスクリーニングする工程を含む。
【0368】
免疫原を選択し、この受容体結合モチーフを、例として、構造的試験または抗原の突然変異誘発により同定する。受容体結合モチーフは、受容体と抗原との直接的結合インターフェースである。適用可能な場合、複数の受容体結合モチーフを同定する。例えば、ＭＥＲＳ－ＣｏＶは、２つの別個のＲＢＭによりＤＰＰ４だけでなくシアル酸も認識する（https://www.pnas.org/content/114/40/E8508）。
【0369】
ＲＢＭのディープ突然変異スキャンを、遺伝子型対表現型でカップリングするプラットフォーム上で実施する（https://www.nature.com/articles/nmeth.3027.pdf）。このようなプラットフォームは、細胞に基づくアッセイを含み、ここで、タンパク質は、プラスミドまたはウイルス、あるいはインビトロによる系、例えば、Ｔ７もしくはＭ１３バクテリオファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、大腸菌ディスプレイ、または最も好ましくは、哺乳動物細胞ディスプレイにより発現させる。抗原の突然変異した変異体の遺伝子ライブラリーは、合成し、適切なプラスミドにクローニングする。突然変異体ライブラリーは、例として、オーバーラップ伸長ＰＣＲ（https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022283613004300?via%3Dihub）、エラープローンＰＣＲ（https://link.springer.com/protocol/10.1385/1-59259-395-X:3）または化学的突然変異誘発（https://academic.oup.com/nar/article/32/4/1448/1038612?login=true）により生成することができる。一部の戦略により、１遺伝子あたり厳密に１つのコドンの突然変異を作出する（https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0052031 ; https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003269713005782?casa_token=d5JPaeUuTwYAAAAA:-F2ChRH8nmjiVhQYPsl1BF4JpK-m_E0CoVBibRWGkDKxCPd7D3IVxW7n-f7rRFCxRPGYJc8Q）。このデザインを、１遺伝子あたり複数のコドンの突然変異に適応させて突然変異の平均的作用を調査することができる（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4104320/）。突然変異誘発は、等しい融解温度を有するプライマーをデザインして、ある特定の突然変異によるバイアスを防ぐことにより強化させることができる（https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1931312817301968）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤでは、ＲＢＤ突然変異体ライブラリーを酵母において発現させることにより、ディープ突然変異スキャニングを適用した（https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867420310035）。酵母発現系は、抗原が受容体結合モチーフ内またはこの付近にグリコシル化を含まない場合に適する。グリコシル化が抗原と宿主受容体との結合に影響する場合、哺乳動物細胞における発現が好ましい。ヒトを対象とするワクチンの生成では、ヒト細胞株が最も好ましい。同様に、ブタを対象とするワクチンの生成では、ブタ細胞株が最も好ましい。
【0370】
ライブラリーのスクリーニングは、突然変異体ライブラリーによる細胞のトランスフェクションまたは形質導入後のフローサイトメトリー細胞選別により実施することができる。抗原を膜発現が可能となる骨格にクローニングし、蛍光レポーター、例えば、ＧＦＰによりタグ化して、（ｉ）抗原発現細胞を前選択し、（ｉｉ）抗原の発現レベルを決定し得る。トランスフェクション条件は、１細胞あたり単一のコード変異体を得ることが好ましい（https://www.jimmunol.org/content/200/11/3825, https://www.jbc.org/article/S0021-9258(20)35531-9/fulltext, https://science.sciencemag.org/content/369/6508/1261）。ＦＡＣＳ選択は、細胞表面上に発現するＲＢＭに結合する可溶性受容体で細胞を染色することにより実施する。可溶性受容体は、フルオロフォアで直接的に標識し得るか、またはストレプトアビジン共役フルオロフォアでビオチン化して染色し得るか、またはｈｉｓタグ、ｓｔｒｅｐタグ、もしくはｍｙｃタグでタグ化した後、タグを検出する二次薬剤で染色し得るかのいずれかである。好ましくは、タンパク質は、Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｇでタグ化し、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ共役フルオロフォアで染色する。さらにより好ましくは、タンパク質は、フルオロフォアで直接的に標識する。第１の工程では、細胞を可溶性受容体で染色し、適する方法、例として、ＦＡＣＳ選別により選別する。可溶性受容体の結合は、ＲＢＭに融合したレポータータンパク質シグナルからの分離が可能となるフルオロフォアにより検出する。細胞は、蛍光レポーター、例えば、ＧＦＰに融合したＲＢＭタンパク質／ペプチドを発現するように正に選択する。その上、細胞は、可溶性受容体に対する結合が消失したものを選択する。
【0371】
可溶性受容体および中和抗体の両方がＲＢＭに結合するため、中和抗体により認識されるエピトープの保存の選択は、好ましくは、可溶性受容体に対する結合が低下したＲＢＭ変異体の選択後に実施する。
【0372】
第２の工程では、可溶性受容体に対する結合が低下した選別細胞を、ＲＢＭを認識する抗体で染色する。これにより、ＲＢＭ突然変異体のサブライブラリーを、中和抗体により結合するエピトープの保存について正に選択する。サブライブラリーの細胞は、１つまたは、より好ましくは、複数の組換え中和抗体で染色する。最も好ましくは、別個のＲＢＭエピトープを標的とする一連の中和抗体の等モル混合物を使用する。最適には、中和抗体は、親和性適合させ、さもなければ、異なる結合力を考慮するように抗体混合物を調整する。中和抗体の和は、ＲＢＭ全体を包含しなければならない。中和抗体は、別個のフルオロフォアまたはビオチンのいずれかで個々に標識して、抗体結合を一括で検出することができる。同様に、抗体結合は、抗体特異的な二次薬剤により検出することができる。組換え中和抗体が入手不可能である場合、スクリーニングは、細胞を回復期のドナー（ヒトまたは免疫化動物）の血清で染色し、結合した抗体を適する二次試薬により検出することによって実施し得る。
【0373】
一過性発現系を使用する場合、別個の組換え中和抗体または回復期血漿の結合は、単回の染色により検査する。安定な発現系を使用する場合、サブライブラリーは、受容体結合の消失について選別後に培養および増殖させ得る。サブライブラリーは、一括でさらに培養し得るか、または例として、単一細胞としてサブクローニングしてモノクローナル細胞株を増殖させ得る。その後、選択されたＲＢＭ突然変異体を安定して発現する細胞を、一連の組換え中和抗体または回復期血清で染色し得る。好ましくは、別個の組換え中和抗体による染色は、複数回の個々の染色により実施する。中和抗体の結合を維持する細胞により発現する突然変異体抗原は、正に選択する。最も好ましくは、突然変異ＲＢＭに対するすべての選択された中和抗体の結合は、保存される。
【0374】
一過性トランスフェクション後に選択された細胞は、第１の染色後／第２の染色および選別前に培地中に直接的に選別する。第２の選別後、細胞を培地中、またはより好ましくは、直接的に溶解緩衝液中に選別する。突然変異ＲＢＭを安定して発現する選択された細胞は、増殖させた後に解析し得る。全ｇＤＮＡまたはより好ましくは、ＲＮＡは、ＲＮＡ抽出キット（Ｑｕｉａｇｅｎ社）またはＧｅｎｅＪＥＴ ＲＮＡ精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）のようなキットにより精製する。目的の標的領域は、全突然変異体ライブラリーに及ぶ突然変異領域に及ぶ遺伝子特異的プライマーにより増幅する。ＲＮＡ抽出では、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社）または高忠実度Ａｃｃｕｓｃｒｉｐｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）のような高忠実度キットを使用して特異的プライマーによりｃＤＮＡを逆転写させる。ＲＢＭの多様化領域は、１つまたは複数の断片を突然変異領域のサイズに応じてＰＣＲにより増幅する。ＰＣＲアンプリコンは、シーケンシングプライマー、ユニークなバーコード、およびフローセル結合配列を含む、ハイスループットシーケンシング、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング用のアダプターと隣接する。アンプリコンは、増幅断片の長さおよび予想突然変異体数に適するように選択されたハイスループットシーケンシングによりシーケンシングする。例として、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＭｉｎｉＳｅｑ、ＭｉＳｅｑ、ＮｅｘｔＳｅｑまたはＨｉＳｅｑ系を使用することができる。
【0375】
転写物におけるＲＢＭ突然変異体の変異体の出現頻度を決定し、選択されたライブラリーにおけるこれらの出現頻度をナイーブベクターライブラリーにおけるこれらの出現頻度と比較することにより、データを解析する。これによって、各変異体についてのインプットから選択までの出現頻度の変化は、受容体結合を抑止する能力および中和抗体結合を保存する能力の尺度として作用する。
【0376】
突然変異体ライブラリーのスクリーニングは、宿主受容体に対する結合が最小である突然変異体の選択および中和抗体に対する結合の保存の基底として作用する。突然変異体ライブラリーのスクリーニングにより入手したデータに加えて、これらの解析は、抗原と複合体形成した受容体の構造情報と組み合わせることができる。その上、解析は、抗原と複合体形成した中和抗体の構造情報と組み合わせることができる。これにより拡張した生物情報学的解析が、最も適する突然変異の同定に役立ち、これによって宿主受容体に対する結合が最小化される一方、中和抗体の保存が最大化される。
【0377】
スクリーニングデータにより、タンパク質の発現／安定性（Ｅ、発現）、受容体に対する親和性（Ｂ、結合）、および中和抗体に対する結合（Ｎ、結合）に関して、ＲＢＭ配列における単一または複数の残基間の関連性がもたらされる。ＲＢＭ変異体は、Ｅは最大となるが、Ｂは最小となり、Ｎは最大となるように選択される。加えて、選択された残基は、受容体抗原構造の物理的インターフェースが著しく異ならなければならない。その上、選択された残基は、抗原と複合体形成した中和抗体のいかなる構造の物理的インターフェースも著しく異なってはならない。最も最適には、選択された残基は、いかなる公知の中和抗体によっても標的とされず、回復期の個体の血清抗体の標的でもない。
【0378】
最も単純なシナリオでは、突然変異体ライブラリーのスキャニングにより、すべての単一突然変異の帰結が明らかとなる。加えて、ライブラリーは、複数の突然変異の作用を組み合わせて試験するように適応され得る。後者に生物情報学的に取り組むために、配列共変動解析による部位間の進化的カップリングを推定し得る。
【0379】
突然変異体ライブラリーのスクリーニングおよび／または生物情報学的スクリーニングによりＲＢＭ突然変異を同定する場合、突然変異体は、ＥＬＩＳＡ結合、または受容体もしくは中和抗体に対する結合力を適切に決定するための他の任意の方法により選択することができる。
【0380】
例として、ＫｄまたはＥＣ５０（最大結合の５０％における有効濃度）により測定可能な可溶性受容体に対するＲＢＭの結合力は、ＫｄまたはＥＣ５０がそれぞれの可溶性受容体の血清濃度または組織濃度を超えるように低下させなければならない。
【0381】
生物情報学的手法
以下は、抗原の安定な一次配列変異体の選択を優先して、中和抗体に対する結合を保存する一方、特異的結合タンパク質に対する結合を低下させるための手順を記載する。この方法は、ディープ突然変異スキャニング実験によるデータに依拠し、この実験では、標的抗原Ａにおける一次配列変異体のライブラリーＳについての適応度（特定の選択アッセイにおいて、ここでは結合および安定性）を測定する。
以下は、抗原の安定な一次配列変異体の選択を優先して、中和抗体に対する結合を保存する一方、特異的結合タンパク質に対する結合を低下させるための手順を記載する。この方法は、ディープ突然変異スキャニング実験によるデータに依拠し、この実験では、標的抗原Ａにおける一次配列変異体のライブラリーＳについての適応度（特定の選択アッセイにおいて、ここでは結合および安定性）を測定する。
【0382】
手順
実験データの記載
手順は、実験による次のインプットに依拠する。
１）適応度の尺度が抗原安定性（Ｒｓｔａｂ）を反映する１つまたは複数のディープ突然変異スキャニング実験。
２）適応度の尺度が１つまたは複数の中和抗体からのエスケープ（Ｒｎａｂ）を反映する１つまたは複数のディープ突然変異スキャニング実験。
３）適応度の尺度が内因性の結合パートナーに対する結合（Ｒｅｎｄｏ）を反映する１つまたは複数のディープ突然変異スキャニング実験。
４）中和抗体と複合体形成した抗原の１つもしくは複数の実験構造または計算モデル。
５）内因性のタンパク質パートナーと複合体形成した抗原またはこの抗原に結合する関連ドメインの１つもしくは複数の実験構造または計算モデル。
実験データの記載
手順は、実験による次のインプットに依拠する。
１）適応度の尺度が抗原安定性（Ｒｓｔａｂ）を反映する１つまたは複数のディープ突然変異スキャニング実験。
２）適応度の尺度が１つまたは複数の中和抗体からのエスケープ（Ｒｎａｂ）を反映する１つまたは複数のディープ突然変異スキャニング実験。
３）適応度の尺度が内因性の結合パートナーに対する結合（Ｒｅｎｄｏ）を反映する１つまたは複数のディープ突然変異スキャニング実験。
４）中和抗体と複合体形成した抗原の１つもしくは複数の実験構造または計算モデル。
５）内因性のタンパク質パートナーと複合体形成した抗原またはこの抗原に結合する関連ドメインの１つもしくは複数の実験構造または計算モデル。
【0383】
注記：実験１～３の配列ライブラリーは、適用範囲が完全に重複していてもしていなくてもよい。実験４および５は適宜となる。
【0384】
実験１～３：これらのデータにより、それぞれの配列ライブラリーＳに対して３つの異なる特性についての適応度の尺度が得られる。それぞれのライブラリーＳによる配列ｓ’の適応度をＲｓｔａｂ（ｓ）、Ｒｎａｂ（ｓ）、およびＲｅｎｄｏ（ｓ）と呼ぶ。適応度の単位は、次のとおりである。
１．Ｒｓｔａｂ－数ｃにおける、例えば、蛍光強度により参照抗原ｒと比較したｌｏｇスケールの差。式：Ｌｏｇ（ｃ（ｓ））－Ｌｏｇ（ｃ（ｒ））。
２．Ｒｎａｂ－総数と比較して低下した結合数を特定するエスケープ率。ＦＡＣＳにより定量する。
３．Ｒｅｎｄｏ－解離定数Ｋにおける、例えば、滴定により参照抗原ｒと比較したｌｏｇスケールの差。式：Ｌｏｇ（Ｋ（ｓ））－Ｌｏｇ（Ｋ（ｒ））。
１．Ｒｓｔａｂ－数ｃにおける、例えば、蛍光強度により参照抗原ｒと比較したｌｏｇスケールの差。式：Ｌｏｇ（ｃ（ｓ））－Ｌｏｇ（ｃ（ｒ））。
２．Ｒｎａｂ－総数と比較して低下した結合数を特定するエスケープ率。ＦＡＣＳにより定量する。
３．Ｒｅｎｄｏ－解離定数Ｋにおける、例えば、滴定により参照抗原ｒと比較したｌｏｇスケールの差。式：Ｌｏｇ（Ｋ（ｓ））－Ｌｏｇ（Ｋ（ｒ））。
【0385】
実験４～５：これらの実験により、原子位置が３次元配位の形態の中和抗体または内因性結合パートナーに関する抗原の空間的構造についての情報が得られる。抗原の任意のアミノ酸残基である構造インターフェースは、０．５ナノメートル以下の内因性パートナーにおける任意の原子に対してある最短距離を有するものと定義する。中和抗体に対する抗原上のエピトープも同一の方法で定義する。一次および二次エピトープは、次のように定義する：一次エピトープは、構造インターフェースと直接的に重複し、二次エピトープは、間接的に重複し、抗体結合により、排除体積作用によってＡＣＥ２結合が妨害され得る。図２Ａでは、構造情報が所与の他のデータと重複しており、このため適宜となることが観察される。
【0386】
前処理および標準化
次の２つの制約に基づいて、実験１～３からデータを選択する。
１．変異体のＲｓｔａｂは、野生型のｅｘｐ（－アルファ）の少なくとも１つの因数でなければならない。
２．変異体のＲｅｎｄｏは、野生型のｅｘｐ（－ベータ）の最大で１つの因数でなければならない。
次の２つの制約に基づいて、実験１～３からデータを選択する。
１．変異体のＲｓｔａｂは、野生型のｅｘｐ（－アルファ）の少なくとも１つの因数でなければならない。
２．変異体のＲｅｎｄｏは、野生型のｅｘｐ（－ベータ）の最大で１つの因数でなければならない。
【0387】
アルファおよびベータの閾値により、スコアリングにおいて考慮したい変異体の脱安定化の程度および結合強度を制御する。推奨値は、これらの解釈とともに表１に提示する。
【0388】
【表5】
【0389】
上に概説される制約を満たす変異体の選択後、最初にサンプル適応度平均値を減算し、次いで、サンプル標準偏差で除算することにより正規化適応度のスコアを計算する。すべての適応度の値を浮動小数点の値にゼロ平均値および単位標準偏差によりマッピングする。対応する正規化適応度のスコアをＮｓｔａｂ（ｓ）、Ｎｎａｂ（ｓ）、およびＮｅｎｄｏ（ｓ）と呼ぶ。
【0390】
スコアの計算
あり得る候補変異体を同定して実験的に検査するために、上に抽出した情報に基づいてスコアを集計する。
あり得る候補変異体を同定して実験的に検査するために、上に抽出した情報に基づいてスコアを集計する。
【0391】
すべての変異体では、定義する場合、実験１および３の測定値により総スコアを計算する一次および二次インターフェースにおいて、総スコアを計算する。
Ｓｔｏｔ（ｓ’）＝Ｎｓｔａｂ（ｓ’）－Ｎｎａｂ（ｓ’）－Ｎｅｎｄｏ（ｓ’）
Ｓｔｏｔ（ｓ’）＝Ｎｓｔａｂ（ｓ’）－Ｎｎａｂ（ｓ’）－Ｎｅｎｄｏ（ｓ’）
【0392】
実験２の欠測値は０に設定する（正規化平均）。一次および二次インターフェースを定義しない場合、上に定義の制約を満たすすべての変異体についてのスコアを計算する。スコアが高ければ、良好と考えられる。
【0393】
ホットスポットの同定
最も高いスコアを有する変異体により座位を選別することによってホットスポットを同定する。負のスコアを有する座位は切り捨てる。ガンマ（範囲０～１）の閾値は、負ではなく最高総スコアを有する座位の除外する割合を表す。ガンマ＝０．４０に設定する。ガンマ＝０．２５は、ヒットは多いが特異的ではなく、ガンマ＝０．７５は、より特異的であるがヒットは少ないことに対応する。
最も高いスコアを有する変異体により座位を選別することによってホットスポットを同定する。負のスコアを有する座位は切り捨てる。ガンマ（範囲０～１）の閾値は、負ではなく最高総スコアを有する座位の除外する割合を表す。ガンマ＝０．４０に設定する。ガンマ＝０．２５は、ヒットは多いが特異的ではなく、ガンマ＝０．７５は、より特異的であるがヒットは少ないことに対応する。
【0394】
変異体ライブラリーの選択
二次検証のための変異体ライブラリーの選択は、２つの戦略：活用および探索により行うことができる。エンドユーザーは、最高ランクを有する座位を十分に探索するか、または上位ランクを有するすべての座位から高いランクの変異体を組み合わせることを決定することができる。
二次検証のための変異体ライブラリーの選択は、２つの戦略：活用および探索により行うことができる。エンドユーザーは、最高ランクを有する座位を十分に探索するか、または上位ランクを有するすべての座位から高いランクの変異体を組み合わせることを決定することができる。
【0395】
最初に探索：各座位から最高ランクの変異体を採用し、次いで活用：その後のライブラリーの各座位に低ランクの変異体を調査することを提案する。
【0396】
インシリコでのコード
import pandas as pd
import numpy as np
import matplotlib as mpl
import matplotlib.pyplot as plt
import matplotlib.patches as patches
#Load data
DMS = pd.read_csv("Deep_Mutational_Scan_RBD_stability_ACE2binding.csv")
dms2 = pd.read_csv("Tableofmutation_antibody-escape_fraction_scores.csv")
# Identify missing sites
missing_sites = np.setdiff1d(np.unique(DMS['site_SARS2'].to_numpy()), np.unique(dms2['site'].to_numpy()), )
print(f"Number of sites missing nAb data, {len(missing_sites)}: "+ str(missing_sites))
missing_sites2 = np.setdiff1d(np.unique(dms2['site'].to_numpy()), np.unique(DMS['site_SARS2'].to_numpy()) )
print(f"Number of sites missing ACE2 data, {len(missing_sites2)}: "+ str(missing_sites2))
# Primary and secondary interfaces determined based on nAb RBD crystal structures:
# 6XC2, 6XCN,6XDG, 6XE1, 6XKQ,7CDI, 7CDJ, 7JMO, 7JMP,7JMW,7JV2,7JV6,7JVA,7JW0,7K90,7LX5.
from itertools import chain
interface_residues = [(443, 463), (469, 507)]
secondary_interface_residues = [(403, 410), (417, 423)]
total_interface_range = list(chain(*[range(*r) for r in interface_residues+secondary_interface_residues]))
# pre-proccessing
antibody_condition, mutation, escape = (dms2['condition'].to_numpy(),dms2['wildtype'].to_numpy()+dms2['site'].to_numpy().astype('str')+dms2['mutation'].to_numpy(), dms2['mut_escape'].to_numpy())
unique_abc = np.unique(antibody_condition)
all_mutations = DMS['mutation'].to_numpy()
all_expression = np.zeros(len(all_mutations)*len(unique_abc))
all_ace_binding = np.zeros(len(all_mutations)*len(unique_abc))
all_escape = np.zeros(len(all_mutations)*len(unique_abc))
j=0
for abc in unique_abc:
idx_condition = antibody_condition==abc
for i,m in enumerate(all_mutations):
candidate=DMS.loc[np.where(DMS['mutation'].to_numpy()==m)[0]]
all_expression[i+j*len(all_mutations)] = candidate['expr_avg'].to_numpy()
all_ace_binding[i+j*len(all_mutations)] = candidate['bind_avg'].to_numpy()
condition_selection = np.where(((mutation==m)*(idx_condition)))[0]
if len(condition_selection)>0:
all_escape[i+j*len(all_mutations)] = escape[condition_selection[0]]
else:
all_escape[i+j*len(all_mutations)] = np.nan
j=j+1
finite_values = ~(~np.isfinite(all_expression)+~np.isfinite(all_ace_binding))
all_expression = all_expression[finite_values]
all_ace_binding = all_ace_binding[finite_values]
all_mutations = np.tile(all_mutations, len(unique_abc))[finite_values]
all_resid = np.array([int(a[1:-1]) for a in all_mutations])
all_escape = all_escape[finite_values]
_all_mutations = DMS['mutation'].to_numpy()
all_conditions = np.concatenate([np.tile(abc, len(_all_mutations)) for abc in unique_abc ])[finite_values]
def standardize(x):
xhat=(x-x[np.isfinite(x)].mean())
return xhat/xhat[np.isfinite(xhat)].std()
def compute_score(expression, escape, binding):
escape_finite = np.isfinite(escape)
escape_impute = np.array(escape)
escape_impute[~escape_finite] = 0.
return expression - binding - escape_impute
#enforce constraints
alpha=0.5
beta=1.0
constraints_fulfilled = ((all_expression>-alpha).astype(int)*(all_ace_binding<-beta).astype(int)).astype(bool)
#compute score on data fulfilling constraints
tot_score=compute_score(standardize(all_expression[constraints_fulfilled]), standardize(all_escape[constraints_fulfilled]), standardize(all_ace_binding[constraints_fulfilled]))
#identify hotspots
mutation_hotspots = {}
for i in np.argsort(tot_score)[::-1]:
y = all_mutations[constraints_fulfilled][i]
resi = all_resid[constraints_fulfilled][i]
if int(y[1:-1]) in total_interface_range:
if mutation_hotspots.get(resi):
mutation_hotspots[resi].append([y, all_expression[constraints_fulfilled][i], all_ace_binding[constraints_fulfilled][i], tot_score[i]])
else:
mutation_hotspots[resi]=[[y, all_expression[constraints_fulfilled][i], all_ace_binding[constraints_fulfilled][i], tot_score[i]]]
# Filtering of low-scoring variants
max_total_scores = np.array([np.max([l[-1] for l in mutation_hotspots[key]]) for key in mutation_hotspots])
argsort_total_scores = np.argsort(max_total_scores)[::-1] # decending scores by index
positive_max_total_scores = max_total_scores[argsort_total_scores]>0.
scores_positive_and_sorted = max_total_scores[argsort_total_scores][positive_max_total_scores]
gamma = 0.40
bisect_res = 1000
score_thres = np.linspace(0,scores_positive_and_sorted[0],bisect_res)[np.argmin([(gamma-np.mean(threshold>scores_positive_and_sorted))**2. for threshold in np.linspace(0,scores_positive_and_sorted[0],bisect_res)])]
print(f"score threshold for gamma={gamma}: ", )
# Diagnostic plot
plt.plot(np.linspace(0,scores_positive_and_sorted[0],bisect_res), [np.mean(threshold>scores_positive_and_sorted) for threshold in np.linspace(0,scores_positive_and_sorted[0],bisect_res)])
plt.vlines([score_thres],ymin=0, ymax=[gamma],color='k')
plt.hlines([gamma],xmin=0, xmax=[score_thres],color='k')
plt.xlabel("score threshold")
plt.ylabel(r"$＼gamma$")
def stringify_top_mutants(mutation_hotspots, key, site_variant_scores):
sorted_hits = np.argsort(site_variants_scores)[::-1]
hits, counts = np.unique([mutation_hotspots[key][yy][0] for yy in sorted_hits], return_counts=True)
return ', '.join([hit+f"({count})" for hit,count in zip(hits,counts) ])
top_mutants=[]
for i,key in enumerate(mutation_hotspots.keys()):
if max_total_scores[i]>score_thres:
site_variants_scores = [variant[-1] for variant in mutation_hotspots[key]]
print(key,'＼t', stringify_top_mutants(mutation_hotspots, key, site_variants_scores),'＼t', np.round(max_total_scores[i],2))
top_mutants.append(mutation_hotspots[key][np.argmax(site_variants_scores)][0])
# generate plot summarizing selected variants in the context of all data and constraints.
fig, ax = plt.subplots(4,1, figsize=(4,12), gridspec_kw={'height_ratios': [2,2,1, 1]},constrained_layout=True )
ax[0].scatter(dms2['site'].to_numpy(), dms2['site_max_escape'].to_numpy(), marker='.',alpha=0.1, label="Site for escape mutations")
for i,ir in enumerate(interface_residues):
if i==0:
ax[0].hlines(1.05, *ir, color='k', lw=5, label="primary nAb interface")
else:
ax[0].hlines(1.05, *ir, color='k', lw=5)
for i,ir in enumerate(secondary_interface_residues):
if i==0:
ax[0].hlines(1.05, *ir, color='r', lw=5, label="secondary nAb interface")
else:
ax[0].hlines(1.05, *ir, color='r', lw=5)
ax[0].vlines(missing_sites, ymin=-0.08, ymax=0.0, color='r',lw=0.7, label="missing site" )
ax[0].set_xlabel("RBD position")
ax[0].set_ylabel("Maximum Escape")
ax[0].legend()
ax[1].scatter(DMS['expr_avg'].to_numpy(),
DMS['bind_avg'].to_numpy(),marker='.',c='k',alpha=0.5)
ax[1].scatter(all_expression[constraints_fulfilled][np.isin(all_mutations[constraints_fulfilled], top_mutants)], all_ace_binding[constraints_fulfilled][np.isin(all_mutations[constraints_fulfilled], top_mutants)],marker='o',c='r',alpha=0.8)
ax[1].set_xlabel("Expression")
ax[1].set_ylabel("ACE2 binding")
rect = patches.Rectangle((-0.5, -5), 1.5, 4.00, linewidth=0, edgecolor='none', facecolor='y', alpha=0.2)
ax[1].add_patch(rect)
ax[3].scatter(DMS['expr_avg'].to_numpy(),
DMS['bind_avg'].to_numpy(),marker='.',c='k',alpha=0.5)
ax[3].scatter(all_expression[constraints_fulfilled][np.isin(all_mutations[constraints_fulfilled], top_mutants)],
all_ace_binding[constraints_fulfilled][np.isin(all_mutations[constraints_fulfilled], top_mutants)],marker='o',c='r',alpha=0.8)
ax[2].scatter(DMS['expr_avg'].to_numpy(),
DMS['bind_avg'].to_numpy(),marker='.',c='k',alpha=0.5)
ax[2].scatter(all_expression[constraints_fulfilled][np.isin(all_mutations[constraints_fulfilled], top_mutants)], all_ace_binding[constraints_fulfilled][np.isin(all_mutations[constraints_fulfilled], top_mutants)],marker='o',c='r',alpha=0.8)
ax[2].set_xlim(-0.5,1)
ax[2].set_ylim(-2.1,-1.2)
ax[2].set_xticklabels([])
ax[3].set_xlim(-0.5,1)
ax[3].set_ylim(-4.85,-4.6)
ax[3].set_xlabel("Expression")
ax[3].set_ylabel("ACE2 binding")
ax[2].set_ylabel("ACE2 binding")
for bm in top_mutants:
_idx = (DMS['mutation']==str(bm)).to_numpy().argmax()
ax[2].annotate(str(bm), (DMS['expr_avg'][_idx], DMS['bind_avg'][_idx] ), va='center', ha='center')
for bm in top_mutants:
_idx = (DMS['mutation']==str(bm)).to_numpy().argmax()
ax[3].annotate(str(bm), (DMS['expr_avg'][_idx], DMS['bind_avg'][_idx] ), va='center', ha='center')
for _,let in zip(ax, ["A","B","C"]):
_.text(-0.2,1.05, let, fontsize=16, transform=_.transAxes)
#plt.tight_layout()
plt.savefig("nAb_RBD_ACE2_DMS_Bloom.pdf")
RBD_WT_AA_Seq=''.join(DMS['wildtype'].to_numpy().reshape(-1,21)[:,0])
# algorithms and functions to generate csv of top-ranked variants
dna2aa = {
'ATA':'I', 'ATC':'I', 'ATT':'I', 'ATG':'M',
'ACA':'T', 'ACC':'T', 'ACG':'T', 'ACT':'T',
'AAC':'N', 'AAT':'N', 'AAA':'K', 'AAG':'K',
'AGC':'S', 'AGT':'S', 'AGA':'R', 'AGG':'R',
'CTA':'L', 'CTC':'L', 'CTG':'L', 'CTT':'L',
'CCA':'P', 'CCC':'P', 'CCG':'P', 'CCT':'P',
'CAC':'H', 'CAT':'H', 'CAA':'Q', 'CAG':'Q',
'CGA':'R', 'CGC':'R', 'CGG':'R', 'CGT':'R',
'GTA':'V', 'GTC':'V', 'GTG':'V', 'GTT':'V',
'GCA':'A', 'GCC':'A', 'GCG':'A', 'GCT':'A',
'GAC':'D', 'GAT':'D', 'GAA':'E', 'GAG':'E',
'GGA':'G', 'GGC':'G', 'GGG':'G', 'GGT':'G',
'TCA':'S', 'TCC':'S', 'TCG':'S', 'TCT':'S',
'TTC':'F', 'TTT':'F', 'TTA':'L', 'TTG':'L',
'TAC':'Y', 'TAT':'Y', 'TAA':'_', 'TAG':'_',
'TGC':'C', 'TGT':'C', 'TGA':'_', 'TGG':'W',
}
aa2dna = { #la
dna2aa[key]:key for key in dna2aa.keys()
}
def translate(seq):
prot=""
for i in range(0,len(seq),3):
prot=prot+dna2aa[seq[i:i+3]]
return prot
# reference sites
RBD_start = 954
RBD_start_Bloom = 954+36
RBD_end = 1623
RBD_end_Bloom = 1623-30
# `wildtype` nucleotide sequence
spike_reference_sequence="ATGTTTGTCTTCCTGGTCCTGCTGCCTCTGGTCTCCTCTCAGTGCGTGAACCTGACTACTAGAACTCAGCTGCCTCCCGCTTACACCAATAGCTTCACCAGGGGCGTGTACTATCCAGACAAGGTGTTTCGCAGCTCCGTGCTGCACTCCACACAGGATCTGTTTCTGCCCTTCTTTTCTAACGTGACCTGGTTCCACGCCATCCACGTGTCCGGCACCAATGGCACAAAGAGGTTCGACAATCCAGTGCTGCCCTTTAACGATGGCGTGTACTTCGCCTCCACCGAGAAGTCTAACATCATCCGCGGCTGGATCTTTGGCACCACACTGGACAGCAAGACACAGTCCCTGCTGATCGTGAACAATGCCACCAACGTGGTCATCAAGGTGTGCGAGTTCCAGTTTTGTAATGATCCTTTCCTGGGCGTGTACTATCACAAGAACAATAAGTCTTGGATGGAGAGCGAGTTTAGGGTGTACTCTAGCGCCAACAATTGCACATTTGAGTATGTGAGCCAGCCATTCCTGATGGACCTGGAGGGCAAGCAGGGCAATTTCAAGAACCTGCGGGAGTTCGTGTTTAAGAATATCGATGGCTACTTCAAAATCTACTCCAAGCACACCCCCATCAACCTGGTGCGGGACCTGCCACAGGGCTTCTCTGCCCTGGAGCCTCTGGTGGATCTGCCAATCGGCATCAACATCACCAGGTTTCAGACACTGCTGGCCCTGCACCGCAGCTACCTGACACCTGGCGACTCCTCTAGCGGATGGACCGCAGGAGCTGCCGCCTACTATGTGGGCTACCTGCAGCCAAGGACCTTCCTGCTGAAGTATAACGAGAATGGCACCATCACAGACGCAGTGGATTGCGCCCTGGACCCCCTGTCTGAGACAAAGTGTACACTGAAGAGCTTTACCGTGGAGAAGGGCATCTACCAGACAAGCAATTTCCGGGTGCAGCCCACCGAGTCCATCGTGAGATTTCCAAATATCACAAACCTGTGCCCCTTTGGCGAGGTGTTCAACGCCACCCGCTTCGCCAGCGTGTATGCCTGGAATAGGAAGCGCATCTCCAACTGCGTGGCCGACTATTCTGTGCTGTACAACTCCGCCTCTTTCAGCACCTTTAAGTGTTACGGCGTGAGCCCTACAAAGCTGAATGACCTGTGCTTTACCAACGTGTATGCCGATTCCTTCGTGATCAGGGGCGACGAGGTGCGCCAGATCGCACCAGGACAGACAGGCAAGATCGCCGACTACAATTATAAGCTGCCCGACGATTTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACTCTAACAATCTGGATAGCAAAGTGGGCGGCAACTACAATTATCTGTACCGGCTGTTTAGAAAGTCTAATCTGAAGCCTTTCGAGAGGGACATCTCCACAGAAATCTACCAGGCCGGCTCTACCCCATGCAATGGCGTGGAGGGCTTTAACTGTTATTTCCCCCTGCAGTCCTACGGCTTCCAGCCTACAAACGGCGTGGGCTATCAGCCATACCGCGTGGTGGTGCTGTCTTTTGAGCTGCTGCACGCACCAGCAACAGTGTGCGGACCTAAGAAGAGCACCAATCTGGTGAAGAACAAGTGCGTGAACTTCAACTTCAACGGCCTGACCGGCACAGGCGTGCTGACCGAGAGCAACAAGAAGTTCCTGCCCTTTCAGCAGTTCGGCCGGGACATCGCAGATACCACAGACGCCGTGCGGGACCCCCAGACCCTGGAGATCCTGGACATCACACCTTGCTCCTTCGGCGGCGTGTCTGTGATCACACCTGGCACCAATACATCCAACCAGGTGGCCGTGCTGTACCAGGACGTGAATTGTACCGAGGTGCCAGTGGCCATCCACGCCGATCAGCTGACCCCCACATGGAGGGTGTATAGCACCGGCTCCAACGTGTTCCAGACACGCGCCGGATGCCTGATCGGAGCAGAGCACGTGAACAATAGCTACGAGTGCGACATCCCCATCGGCGCCGGCATCTGTGCCTCCTATCAGACCCAGACAAACTCCCCTAGGAGAGCCCGGTCTGTGGCCTCCCAGTCTATCATCGCCTACACCATGAGCCTGGGCGCCGAGAACAGCGTGGCCTATTCTAACAATAGCATCGCCATCCCCACCAACTTCACAATCAGCGTGACCACAGAGATCCTGCCTGTGAGCATGACCAAGACATCCGTGGACTGCACAATGTACATCTGTGGCGATTCCACCGAGTGCTCTAACCTGCTGCTGCAGTATGGCTCCTTTTGTACCCAGCTGAATAGAGCCCTGACAGGCATCGCCGTGGAGCAGGACAAGAACACACAGGAGGTGTTCGCCCAGGTGAAGCAAATCTACAAGACCCCCCCTATCAAGGACTTTGGCGGCTTCAACTTCAGCCAGATCCTGCCCGATCCTTCCAAGCCATCTAAGCGGAGCTTTATCGAGGACCTGCTGTTCAACAAGGTGACCCTGGCCGATGCCGGCTTCATCAAGCAGTACGGCGATTGCCTGGGCGACATCGCAGCCCGGGACCTGATCTGCGCCCAGAAGTTTAATGGCCTGACCGTGCTGCCACCCCTGCTGACAGATGAGATGATCGCCCAGTATACATCTGCCCTGCTGGCCGGCACCATCACAAGCGGATGGACCTTCGGCGCAGGAGCCGCCCTGCAGATCCCCTTTGCCATGCAGATGGCCTACAGATTCAACGGCATCGGCGTGACCCAGAATGTGCTGTATGAGAACCAGAAGCTGATCGCCAATCAGTTTAACAGCGCCATCGGCAAGATCCAGGACTCTCTGTCCTCTACAGCCAGCGCCCTGGGCAAGCTGCAGGATGTGGTGAATCAGAACGCCCAGGCCCTGAATACCCTGGTGAAGCAGCTGAGCAGCAACTTCGGCGCCATCTCTAGCGTGCTGAATGACATCCTGAGCCGGCTGGACAAAGTTGAGGCAGAGGTGCAGATCGACCGGCTGATCACAGGCAGACTGCAGTCCCTGCAGACCTACGTGACACAGCAGCTGATCAGGGCAGCAGAGATCAGGGCCTCTGCCAATCTGGCCGCCACCAAGATGAGCGAGTGCGTGCTGGGCCAGTCCAAGAGAGTGGACTTTTGTGGCAAGGGCTACCACCTGATGAGCTTCCCACAGTCCGCCCCCCACGGCGTGGTGTTTCTGCACGTGACCTATGTGCCTGCCCAGGAGAAGAACTTCACCACAGCCCCAGCCATCTGCCACGATGGCAAGGCACACTTTCCCCGGGAGGGCGTGTTCGTGAGCAACGGCACCCACTGGTTTGTGACACAGAGAAATTTCTATGAGCCTCAGATCATCACCACAGACAATACCTTCGTGAGCGGCAACTGTGACGTGGTCATCGGCATCGTGAACAATACCGTGTACGATCCTCTGCAGCCAGAGCTGGACTCTTTTAAGGAGGAGCTGGATAAGTATTTCAAGAACCACACCAGCCCCGACGTGGATCTGGGCGACATCTCTGGCATCAATGCCAGCGTGGTGAACATCCAGAAGGAGATCGACAGGCTGAATGAGGTGGCCAAGAATCTGAACGAGAGCCTGATCGATCTGCAGGAGCTGGGCAAGTATGAGCAGTCCGGCCGCGAGAACCTGTACTTCCAGGGAGGAGGAGGCTCTGGATATATCCCAGAGGCACCTCGGGATGGACAGGCCTACGTGAGAAAAGACGGCGAGTGGGTCCTGCTGAGTACCTTCCTGGGGCATCATCATCATCACCATTAA"
# `2-P variant` nucleotide sequence
spike_reference_sequence_2p="ATGTTTGTCTTCCTGGTCCTGCTGCCTCTGGTCTCCTCTCAGTGCGTGAACCTGACTACTAGAACTCAGCTGCCTCCCGCTTACACCAATAGCTTCACCAGGGGCGTGTACTATCCAGACAAGGTGTTTCGCAGCTCCGTGCTGCACTCCACACAGGATCTGTTTCTGCCCTTCTTTTCTAACGTGACCTGGTTCCACGCCATCCACGTGTCCGGCACCAATGGCACAAAGAGGTTCGACAATCCAGTGCTGCCCTTTAACGATGGCGTGTACTTCGCCTCCACCGAGAAGTCTAACATCATCCGCGGCTGGATCTTTGGCACCACACTGGACAGCAAGACACAGTCCCTGCTGATCGTGAACAATGCCACCAACGTGGTCATCAAGGTGTGCGAGTTCCAGTTTTGTAATGATCCTTTCCTGGGCGTGTACTATCACAAGAACAATAAGTCTTGGATGGAGAGCGAGTTTAGGGTGTACTCTAGCGCCAACAATTGCACATTTGAGTATGTGAGCCAGCCATTCCTGATGGACCTGGAGGGCAAGCAGGGCAATTTCAAGAACCTGCGGGAGTTCGTGTTTAAGAATATCGATGGCTACTTCAAAATCTACTCCAAGCACACCCCCATCAACCTGGTGCGGGACCTGCCACAGGGCTTCTCTGCCCTGGAGCCTCTGGTGGATCTGCCAATCGGCATCAACATCACCAGGTTTCAGACACTGCTGGCCCTGCACCGCAGCTACCTGACACCTGGCGACTCCTCTAGCGGATGGACCGCAGGAGCTGCCGCCTACTATGTGGGCTACCTGCAGCCAAGGACCTTCCTGCTGAAGTATAACGAGAATGGCACCATCACAGACGCAGTGGATTGCGCCCTGGACCCCCTGTCTGAGACAAAGTGTACACTGAAGAGCTTTACCGTGGAGAAGGGCATCTACCAGACAAGCAATTTCCGGGTGCAGCCCACCGAGTCCATCGTGAGATTTCCAAATATCACAAACCTGTGCCCCTTTGGCGAGGTGTTCAACGCCACCCGCTTCGCCAGCGTGTATGCCTGGAATAGGAAGCGCATCTCCAACTGCGTGGCCGACTATTCTGTGCTGTACAACTCCGCCTCTTTCAGCACCTTTAAGTGTTACGGCGTGAGCCCTACAAAGCTGAATGACCTGTGCTTTACCAACGTGTATGCCGATTCCTTCGTGATCAGGGGCGACGAGGTGCGCCAGATCGCACCAGGACAGACAGGCAAGATCGCCGACTACAATTATAAGCTGCCCGACGATTTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACTCTAACAATCTGGATAGCAAAGTGGGCGGCAACTACAATTATCTGTACCGGCTGTTTAGAAAGTCTAATCTGAAGCCTTTCGAGAGGGACATCTCCACAGAAATCTACCAGGCCGGCTCTACCCCATGCAATGGCGTGGAGGGCTTTAACTGTTATTTCCCCCTGCAGTCCTACGGCTTCCAGCCTACAAACGGCGTGGGCTATCAGCCATACCGCGTGGTGGTGCTGTCTTTTGAGCTGCTGCACGCACCAGCAACAGTGTGCGGACCTAAGAAGAGCACCAATCTGGTGAAGAACAAGTGCGTGAACTTCAACTTCAACGGCCTGACCGGCACAGGCGTGCTGACCGAGAGCAACAAGAAGTTCCTGCCCTTTCAGCAGTTCGGCCGGGACATCGCAGATACCACAGACGCCGTGCGGGACCCCCAGACCCTGGAGATCCTGGACATCACACCTTGCTCCTTCGGCGGCGTGTCTGTGATCACACCTGGCACCAATACATCCAACCAGGTGGCCGTGCTGTACCAGGACGTGAATTGTACCGAGGTGCCAGTGGCCATCCACGCCGATCAGCTGACCCCCACATGGAGGGTGTATAGCACCGGCTCCAACGTGTTCCAGACACGCGCCGGATGCCTGATCGGAGCAGAGCACGTGAACAATAGCTACGAGTGCGACATCCCCATCGGCGCCGGCATCTGTGCCTCCTATCAGACCCAGACAAACTCCCCTAGGAGAGCCCGGTCTGTGGCCTCCCAGTCTATCATCGCCTACACCATGAGCCTGGGCGCCGAGAACAGCGTGGCCTATTCTAACAATAGCATCGCCATCCCCACCAACTTCACAATCAGCGTGACCACAGAGATCCTGCCTGTGAGCATGACCAAGACATCCGTGGACTGCACAATGTACATCTGTGGCGATTCCACCGAGTGCTCTAACCTGCTGCTGCAGTATGGCTCCTTTTGTACCCAGCTGAATAGAGCCCTGACAGGCATCGCCGTGGAGCAGGACAAGAACACACAGGAGGTGTTCGCCCAGGTGAAGCAAATCTACAAGACCCCCCCTATCAAGGACTTTGGCGGCTTCAACTTCAGCCAGATCCTGCCCGATCCTTCCAAGCCATCTAAGCGGAGCTTTATCGAGGACCTGCTGTTCAACAAGGTGACCCTGGCCGATGCCGGCTTCATCAAGCAGTACGGCGATTGCCTGGGCGACATCGCAGCCCGGGACCTGATCTGCGCCCAGAAGTTTAATGGCCTGACCGTGCTGCCACCCCTGCTGACAGATGAGATGATCGCCCAGTATACATCTGCCCTGCTGGCCGGCACCATCACAAGCGGATGGACCTTCGGCGCAGGAGCCGCCCTGCAGATCCCCTTTGCCATGCAGATGGCCTACAGATTCAACGGCATCGGCGTGACCCAGAATGTGCTGTATGAGAACCAGAAGCTGATCGCCAATCAGTTTAACAGCGCCATCGGCAAGATCCAGGACTCTCTGTCCTCTACAGCCAGCGCCCTGGGCAAGCTGCAGGATGTGGTGAATCAGAACGCCCAGGCCCTGAATACCCTGGTGAAGCAGCTGAGCAGCAACTTCGGCGCCATCTCTAGCGTGCTGAATGACATCCTGAGCCGGCTGGACCCCCCAGAGGCAGAGGTGCAGATCGACCGGCTGATCACAGGCAGACTGCAGTCCCTGCAGACCTACGTGACACAGCAGCTGATCAGGGCAGCAGAGATCAGGGCCTCTGCCAATCTGGCCGCCACCAAGATGAGCGAGTGCGTGCTGGGCCAGTCCAAGAGAGTGGACTTTTGTGGCAAGGGCTACCACCTGATGAGCTTCCCACAGTCCGCCCCCCACGGCGTGGTGTTTCTGCACGTGACCTATGTGCCTGCCCAGGAGAAGAACTTCACCACAGCCCCAGCCATCTGCCACGATGGCAAGGCACACTTTCCCCGGGAGGGCGTGTTCGTGAGCAACGGCACCCACTGGTTTGTGACACAGAGAAATTTCTATGAGCCTCAGATCATCACCACAGACAATACCTTCGTGAGCGGCAACTGTGACGTGGTCATCGGCATCGTGAACAATACCGTGTACGATCCTCTGCAGCCAGAGCTGGACTCTTTTAAGGAGGAGCTGGATAAGTATTTCAAGAACCACACCAGCCCCGACGTGGATCTGGGCGACATCTCTGGCATCAATGCCAGCGTGGTGAACATCCAGAAGGAGATCGACAGGCTGAATGAGGTGGCCAAGAATCTGAACGAGAGCCTGATCGATCTGCAGGAGCTGGGCAAGTATGAGCAGTCCGGCCGCGAGAACCTGTACTTCCAGGGAGGAGGAGGCTCTGGATATATCCCAGAGGCACCTCGGGATGGACAGGCCTACGTGAGAAAAGACGGCGAGTGGGTCCTGCTGAGTACCTTCCTGGGGCATCATCATCATCACCATTAA"
# Default output:
# 1. Nucleotide sequence RBD
# 2. Nucleotide sequence full spike (with 2-P mutation)
# 3. Aminoacid sequence RBD
# 4. Aminoacid sequence full spike (with 2-P mutation)
#
# return 2 dna seqs, 2 prot seqs
#
def build_sequences(wt_dna_full_spike, wt_dna_full_spike_2p, rbd_variant):
#parse mutation
origin_aa, site, target_aa = rbd_variant[0],int(rbd_variant[1:-1]), rbd_variant[-1]
site_to_dna = (site-1)*3
target_codon = aa2dna[target_aa]
#apply mutation
mutated_seq_ = wt_dna_full_spike[:site_to_dna]+target_codon+wt_dna_full_spike[site_to_dna+3:]
mutated_seq_2p = wt_dna_full_spike_2p[:site_to_dna]+target_codon+wt_dna_full_spike_2p[site_to_dna+3:]
#translate sequences
translated_sequence = translate(mutated_seq_[RBD_start:RBD_end])
translated_sequence_2p = translate(mutated_seq_2p)
return {"Variant_Nucleic_Acid_sequence_RBD": mutated_seq_[RBD_start:RBD_end], "Variant_Nucleic_Acid_sequence_2-P":mutated_seq_2p, "Variant_Amino_Acid_sequence_RBD":translated_sequence, "Variant_Amino_Acid_sequence_2-P":translated_sequence_2p[:-1]}
def aggregate(mut, scor, spike_reference=None, spike_reference_2p=None, thres=0):
out = {}
sequences = {}
for m, s in zip(mut, scor):
if s>thres:
if out.get(m):
out[m].append(s)
else:
out[m]=[s]
_seqs = build_sequences(spike_reference,spike_reference_2p, m)
for key in _seqs.keys():
if sequences.get(key):
sequences[key].append(_seqs[key])
else:
sequences[key]=[_seqs[key]]
for key in out.keys():
out[key] = np.round(np.mean(out[key]),3)
return {**{"mutant":list(out.keys()), "scores":[out[s] for s in out.keys()]}, **sequences}
decending_sort_tot_score = np.argsort(tot_score)[::-1]
mutants = all_mutations[constraints_fulfilled][decending_sort_tot_score]
full_ranking=pd.DataFrame(aggregate(mutants, tot_score[decending_sort_tot_score], spike_reference=spike_reference_sequence, spike_reference_2p=spike_reference_sequence_2p, thres=score_thres))
full_ranking.to_csv("top-variant-ranking_2.csv")
import pandas as pd
import numpy as np
import matplotlib as mpl
import matplotlib.pyplot as plt
import matplotlib.patches as patches
#Load data
DMS = pd.read_csv("Deep_Mutational_Scan_RBD_stability_ACE2binding.csv")
dms2 = pd.read_csv("Tableofmutation_antibody-escape_fraction_scores.csv")
# Identify missing sites
missing_sites = np.setdiff1d(np.unique(DMS['site_SARS2'].to_numpy()), np.unique(dms2['site'].to_numpy()), )
print(f"Number of sites missing nAb data, {len(missing_sites)}: "+ str(missing_sites))
missing_sites2 = np.setdiff1d(np.unique(dms2['site'].to_numpy()), np.unique(DMS['site_SARS2'].to_numpy()) )
print(f"Number of sites missing ACE2 data, {len(missing_sites2)}: "+ str(missing_sites2))
# Primary and secondary interfaces determined based on nAb RBD crystal structures:
# 6XC2, 6XCN,6XDG, 6XE1, 6XKQ,7CDI, 7CDJ, 7JMO, 7JMP,7JMW,7JV2,7JV6,7JVA,7JW0,7K90,7LX5.
from itertools import chain
interface_residues = [(443, 463), (469, 507)]
secondary_interface_residues = [(403, 410), (417, 423)]
total_interface_range = list(chain(*[range(*r) for r in interface_residues+secondary_interface_residues]))
# pre-proccessing
antibody_condition, mutation, escape = (dms2['condition'].to_numpy(),dms2['wildtype'].to_numpy()+dms2['site'].to_numpy().astype('str')+dms2['mutation'].to_numpy(), dms2['mut_escape'].to_numpy())
unique_abc = np.unique(antibody_condition)
all_mutations = DMS['mutation'].to_numpy()
all_expression = np.zeros(len(all_mutations)*len(unique_abc))
all_ace_binding = np.zeros(len(all_mutations)*len(unique_abc))
all_escape = np.zeros(len(all_mutations)*len(unique_abc))
j=0
for abc in unique_abc:
idx_condition = antibody_condition==abc
for i,m in enumerate(all_mutations):
candidate=DMS.loc[np.where(DMS['mutation'].to_numpy()==m)[0]]
all_expression[i+j*len(all_mutations)] = candidate['expr_avg'].to_numpy()
all_ace_binding[i+j*len(all_mutations)] = candidate['bind_avg'].to_numpy()
condition_selection = np.where(((mutation==m)*(idx_condition)))[0]
if len(condition_selection)>0:
all_escape[i+j*len(all_mutations)] = escape[condition_selection[0]]
else:
all_escape[i+j*len(all_mutations)] = np.nan
j=j+1
finite_values = ~(~np.isfinite(all_expression)+~np.isfinite(all_ace_binding))
all_expression = all_expression[finite_values]
all_ace_binding = all_ace_binding[finite_values]
all_mutations = np.tile(all_mutations, len(unique_abc))[finite_values]
all_resid = np.array([int(a[1:-1]) for a in all_mutations])
all_escape = all_escape[finite_values]
_all_mutations = DMS['mutation'].to_numpy()
all_conditions = np.concatenate([np.tile(abc, len(_all_mutations)) for abc in unique_abc ])[finite_values]
def standardize(x):
xhat=(x-x[np.isfinite(x)].mean())
return xhat/xhat[np.isfinite(xhat)].std()
def compute_score(expression, escape, binding):
escape_finite = np.isfinite(escape)
escape_impute = np.array(escape)
escape_impute[~escape_finite] = 0.
return expression - binding - escape_impute
#enforce constraints
alpha=0.5
beta=1.0
constraints_fulfilled = ((all_expression>-alpha).astype(int)*(all_ace_binding<-beta).astype(int)).astype(bool)
#compute score on data fulfilling constraints
tot_score=compute_score(standardize(all_expression[constraints_fulfilled]), standardize(all_escape[constraints_fulfilled]), standardize(all_ace_binding[constraints_fulfilled]))
#identify hotspots
mutation_hotspots = {}
for i in np.argsort(tot_score)[::-1]:
y = all_mutations[constraints_fulfilled][i]
resi = all_resid[constraints_fulfilled][i]
if int(y[1:-1]) in total_interface_range:
if mutation_hotspots.get(resi):
mutation_hotspots[resi].append([y, all_expression[constraints_fulfilled][i], all_ace_binding[constraints_fulfilled][i], tot_score[i]])
else:
mutation_hotspots[resi]=[[y, all_expression[constraints_fulfilled][i], all_ace_binding[constraints_fulfilled][i], tot_score[i]]]
# Filtering of low-scoring variants
max_total_scores = np.array([np.max([l[-1] for l in mutation_hotspots[key]]) for key in mutation_hotspots])
argsort_total_scores = np.argsort(max_total_scores)[::-1] # decending scores by index
positive_max_total_scores = max_total_scores[argsort_total_scores]>0.
scores_positive_and_sorted = max_total_scores[argsort_total_scores][positive_max_total_scores]
gamma = 0.40
bisect_res = 1000
score_thres = np.linspace(0,scores_positive_and_sorted[0],bisect_res)[np.argmin([(gamma-np.mean(threshold>scores_positive_and_sorted))**2. for threshold in np.linspace(0,scores_positive_and_sorted[0],bisect_res)])]
print(f"score threshold for gamma={gamma}: ", )
# Diagnostic plot
plt.plot(np.linspace(0,scores_positive_and_sorted[0],bisect_res), [np.mean(threshold>scores_positive_and_sorted) for threshold in np.linspace(0,scores_positive_and_sorted[0],bisect_res)])
plt.vlines([score_thres],ymin=0, ymax=[gamma],color='k')
plt.hlines([gamma],xmin=0, xmax=[score_thres],color='k')
plt.xlabel("score threshold")
plt.ylabel(r"$＼gamma$")
def stringify_top_mutants(mutation_hotspots, key, site_variant_scores):
sorted_hits = np.argsort(site_variants_scores)[::-1]
hits, counts = np.unique([mutation_hotspots[key][yy][0] for yy in sorted_hits], return_counts=True)
return ', '.join([hit+f"({count})" for hit,count in zip(hits,counts) ])
top_mutants=[]
for i,key in enumerate(mutation_hotspots.keys()):
if max_total_scores[i]>score_thres:
site_variants_scores = [variant[-1] for variant in mutation_hotspots[key]]
print(key,'＼t', stringify_top_mutants(mutation_hotspots, key, site_variants_scores),'＼t', np.round(max_total_scores[i],2))
top_mutants.append(mutation_hotspots[key][np.argmax(site_variants_scores)][0])
# generate plot summarizing selected variants in the context of all data and constraints.
fig, ax = plt.subplots(4,1, figsize=(4,12), gridspec_kw={'height_ratios': [2,2,1, 1]},constrained_layout=True )
ax[0].scatter(dms2['site'].to_numpy(), dms2['site_max_escape'].to_numpy(), marker='.',alpha=0.1, label="Site for escape mutations")
for i,ir in enumerate(interface_residues):
if i==0:
ax[0].hlines(1.05, *ir, color='k', lw=5, label="primary nAb interface")
else:
ax[0].hlines(1.05, *ir, color='k', lw=5)
for i,ir in enumerate(secondary_interface_residues):
if i==0:
ax[0].hlines(1.05, *ir, color='r', lw=5, label="secondary nAb interface")
else:
ax[0].hlines(1.05, *ir, color='r', lw=5)
ax[0].vlines(missing_sites, ymin=-0.08, ymax=0.0, color='r',lw=0.7, label="missing site" )
ax[0].set_xlabel("RBD position")
ax[0].set_ylabel("Maximum Escape")
ax[0].legend()
ax[1].scatter(DMS['expr_avg'].to_numpy(),
DMS['bind_avg'].to_numpy(),marker='.',c='k',alpha=0.5)
ax[1].scatter(all_expression[constraints_fulfilled][np.isin(all_mutations[constraints_fulfilled], top_mutants)], all_ace_binding[constraints_fulfilled][np.isin(all_mutations[constraints_fulfilled], top_mutants)],marker='o',c='r',alpha=0.8)
ax[1].set_xlabel("Expression")
ax[1].set_ylabel("ACE2 binding")
rect = patches.Rectangle((-0.5, -5), 1.5, 4.00, linewidth=0, edgecolor='none', facecolor='y', alpha=0.2)
ax[1].add_patch(rect)
ax[3].scatter(DMS['expr_avg'].to_numpy(),
DMS['bind_avg'].to_numpy(),marker='.',c='k',alpha=0.5)
ax[3].scatter(all_expression[constraints_fulfilled][np.isin(all_mutations[constraints_fulfilled], top_mutants)],
all_ace_binding[constraints_fulfilled][np.isin(all_mutations[constraints_fulfilled], top_mutants)],marker='o',c='r',alpha=0.8)
ax[2].scatter(DMS['expr_avg'].to_numpy(),
DMS['bind_avg'].to_numpy(),marker='.',c='k',alpha=0.5)
ax[2].scatter(all_expression[constraints_fulfilled][np.isin(all_mutations[constraints_fulfilled], top_mutants)], all_ace_binding[constraints_fulfilled][np.isin(all_mutations[constraints_fulfilled], top_mutants)],marker='o',c='r',alpha=0.8)
ax[2].set_xlim(-0.5,1)
ax[2].set_ylim(-2.1,-1.2)
ax[2].set_xticklabels([])
ax[3].set_xlim(-0.5,1)
ax[3].set_ylim(-4.85,-4.6)
ax[3].set_xlabel("Expression")
ax[3].set_ylabel("ACE2 binding")
ax[2].set_ylabel("ACE2 binding")
for bm in top_mutants:
_idx = (DMS['mutation']==str(bm)).to_numpy().argmax()
ax[2].annotate(str(bm), (DMS['expr_avg'][_idx], DMS['bind_avg'][_idx] ), va='center', ha='center')
for bm in top_mutants:
_idx = (DMS['mutation']==str(bm)).to_numpy().argmax()
ax[3].annotate(str(bm), (DMS['expr_avg'][_idx], DMS['bind_avg'][_idx] ), va='center', ha='center')
for _,let in zip(ax, ["A","B","C"]):
_.text(-0.2,1.05, let, fontsize=16, transform=_.transAxes)
#plt.tight_layout()
plt.savefig("nAb_RBD_ACE2_DMS_Bloom.pdf")
RBD_WT_AA_Seq=''.join(DMS['wildtype'].to_numpy().reshape(-1,21)[:,0])
# algorithms and functions to generate csv of top-ranked variants
dna2aa = {
'ATA':'I', 'ATC':'I', 'ATT':'I', 'ATG':'M',
'ACA':'T', 'ACC':'T', 'ACG':'T', 'ACT':'T',
'AAC':'N', 'AAT':'N', 'AAA':'K', 'AAG':'K',
'AGC':'S', 'AGT':'S', 'AGA':'R', 'AGG':'R',
'CTA':'L', 'CTC':'L', 'CTG':'L', 'CTT':'L',
'CCA':'P', 'CCC':'P', 'CCG':'P', 'CCT':'P',
'CAC':'H', 'CAT':'H', 'CAA':'Q', 'CAG':'Q',
'CGA':'R', 'CGC':'R', 'CGG':'R', 'CGT':'R',
'GTA':'V', 'GTC':'V', 'GTG':'V', 'GTT':'V',
'GCA':'A', 'GCC':'A', 'GCG':'A', 'GCT':'A',
'GAC':'D', 'GAT':'D', 'GAA':'E', 'GAG':'E',
'GGA':'G', 'GGC':'G', 'GGG':'G', 'GGT':'G',
'TCA':'S', 'TCC':'S', 'TCG':'S', 'TCT':'S',
'TTC':'F', 'TTT':'F', 'TTA':'L', 'TTG':'L',
'TAC':'Y', 'TAT':'Y', 'TAA':'_', 'TAG':'_',
'TGC':'C', 'TGT':'C', 'TGA':'_', 'TGG':'W',
}
aa2dna = { #la
dna2aa[key]:key for key in dna2aa.keys()
}
def translate(seq):
prot=""
for i in range(0,len(seq),3):
prot=prot+dna2aa[seq[i:i+3]]
return prot
# reference sites
RBD_start = 954
RBD_start_Bloom = 954+36
RBD_end = 1623
RBD_end_Bloom = 1623-30
# `wildtype` nucleotide sequence
spike_reference_sequence="ATGTTTGTCTTCCTGGTCCTGCTGCCTCTGGTCTCCTCTCAGTGCGTGAACCTGACTACTAGAACTCAGCTGCCTCCCGCTTACACCAATAGCTTCACCAGGGGCGTGTACTATCCAGACAAGGTGTTTCGCAGCTCCGTGCTGCACTCCACACAGGATCTGTTTCTGCCCTTCTTTTCTAACGTGACCTGGTTCCACGCCATCCACGTGTCCGGCACCAATGGCACAAAGAGGTTCGACAATCCAGTGCTGCCCTTTAACGATGGCGTGTACTTCGCCTCCACCGAGAAGTCTAACATCATCCGCGGCTGGATCTTTGGCACCACACTGGACAGCAAGACACAGTCCCTGCTGATCGTGAACAATGCCACCAACGTGGTCATCAAGGTGTGCGAGTTCCAGTTTTGTAATGATCCTTTCCTGGGCGTGTACTATCACAAGAACAATAAGTCTTGGATGGAGAGCGAGTTTAGGGTGTACTCTAGCGCCAACAATTGCACATTTGAGTATGTGAGCCAGCCATTCCTGATGGACCTGGAGGGCAAGCAGGGCAATTTCAAGAACCTGCGGGAGTTCGTGTTTAAGAATATCGATGGCTACTTCAAAATCTACTCCAAGCACACCCCCATCAACCTGGTGCGGGACCTGCCACAGGGCTTCTCTGCCCTGGAGCCTCTGGTGGATCTGCCAATCGGCATCAACATCACCAGGTTTCAGACACTGCTGGCCCTGCACCGCAGCTACCTGACACCTGGCGACTCCTCTAGCGGATGGACCGCAGGAGCTGCCGCCTACTATGTGGGCTACCTGCAGCCAAGGACCTTCCTGCTGAAGTATAACGAGAATGGCACCATCACAGACGCAGTGGATTGCGCCCTGGACCCCCTGTCTGAGACAAAGTGTACACTGAAGAGCTTTACCGTGGAGAAGGGCATCTACCAGACAAGCAATTTCCGGGTGCAGCCCACCGAGTCCATCGTGAGATTTCCAAATATCACAAACCTGTGCCCCTTTGGCGAGGTGTTCAACGCCACCCGCTTCGCCAGCGTGTATGCCTGGAATAGGAAGCGCATCTCCAACTGCGTGGCCGACTATTCTGTGCTGTACAACTCCGCCTCTTTCAGCACCTTTAAGTGTTACGGCGTGAGCCCTACAAAGCTGAATGACCTGTGCTTTACCAACGTGTATGCCGATTCCTTCGTGATCAGGGGCGACGAGGTGCGCCAGATCGCACCAGGACAGACAGGCAAGATCGCCGACTACAATTATAAGCTGCCCGACGATTTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACTCTAACAATCTGGATAGCAAAGTGGGCGGCAACTACAATTATCTGTACCGGCTGTTTAGAAAGTCTAATCTGAAGCCTTTCGAGAGGGACATCTCCACAGAAATCTACCAGGCCGGCTCTACCCCATGCAATGGCGTGGAGGGCTTTAACTGTTATTTCCCCCTGCAGTCCTACGGCTTCCAGCCTACAAACGGCGTGGGCTATCAGCCATACCGCGTGGTGGTGCTGTCTTTTGAGCTGCTGCACGCACCAGCAACAGTGTGCGGACCTAAGAAGAGCACCAATCTGGTGAAGAACAAGTGCGTGAACTTCAACTTCAACGGCCTGACCGGCACAGGCGTGCTGACCGAGAGCAACAAGAAGTTCCTGCCCTTTCAGCAGTTCGGCCGGGACATCGCAGATACCACAGACGCCGTGCGGGACCCCCAGACCCTGGAGATCCTGGACATCACACCTTGCTCCTTCGGCGGCGTGTCTGTGATCACACCTGGCACCAATACATCCAACCAGGTGGCCGTGCTGTACCAGGACGTGAATTGTACCGAGGTGCCAGTGGCCATCCACGCCGATCAGCTGACCCCCACATGGAGGGTGTATAGCACCGGCTCCAACGTGTTCCAGACACGCGCCGGATGCCTGATCGGAGCAGAGCACGTGAACAATAGCTACGAGTGCGACATCCCCATCGGCGCCGGCATCTGTGCCTCCTATCAGACCCAGACAAACTCCCCTAGGAGAGCCCGGTCTGTGGCCTCCCAGTCTATCATCGCCTACACCATGAGCCTGGGCGCCGAGAACAGCGTGGCCTATTCTAACAATAGCATCGCCATCCCCACCAACTTCACAATCAGCGTGACCACAGAGATCCTGCCTGTGAGCATGACCAAGACATCCGTGGACTGCACAATGTACATCTGTGGCGATTCCACCGAGTGCTCTAACCTGCTGCTGCAGTATGGCTCCTTTTGTACCCAGCTGAATAGAGCCCTGACAGGCATCGCCGTGGAGCAGGACAAGAACACACAGGAGGTGTTCGCCCAGGTGAAGCAAATCTACAAGACCCCCCCTATCAAGGACTTTGGCGGCTTCAACTTCAGCCAGATCCTGCCCGATCCTTCCAAGCCATCTAAGCGGAGCTTTATCGAGGACCTGCTGTTCAACAAGGTGACCCTGGCCGATGCCGGCTTCATCAAGCAGTACGGCGATTGCCTGGGCGACATCGCAGCCCGGGACCTGATCTGCGCCCAGAAGTTTAATGGCCTGACCGTGCTGCCACCCCTGCTGACAGATGAGATGATCGCCCAGTATACATCTGCCCTGCTGGCCGGCACCATCACAAGCGGATGGACCTTCGGCGCAGGAGCCGCCCTGCAGATCCCCTTTGCCATGCAGATGGCCTACAGATTCAACGGCATCGGCGTGACCCAGAATGTGCTGTATGAGAACCAGAAGCTGATCGCCAATCAGTTTAACAGCGCCATCGGCAAGATCCAGGACTCTCTGTCCTCTACAGCCAGCGCCCTGGGCAAGCTGCAGGATGTGGTGAATCAGAACGCCCAGGCCCTGAATACCCTGGTGAAGCAGCTGAGCAGCAACTTCGGCGCCATCTCTAGCGTGCTGAATGACATCCTGAGCCGGCTGGACAAAGTTGAGGCAGAGGTGCAGATCGACCGGCTGATCACAGGCAGACTGCAGTCCCTGCAGACCTACGTGACACAGCAGCTGATCAGGGCAGCAGAGATCAGGGCCTCTGCCAATCTGGCCGCCACCAAGATGAGCGAGTGCGTGCTGGGCCAGTCCAAGAGAGTGGACTTTTGTGGCAAGGGCTACCACCTGATGAGCTTCCCACAGTCCGCCCCCCACGGCGTGGTGTTTCTGCACGTGACCTATGTGCCTGCCCAGGAGAAGAACTTCACCACAGCCCCAGCCATCTGCCACGATGGCAAGGCACACTTTCCCCGGGAGGGCGTGTTCGTGAGCAACGGCACCCACTGGTTTGTGACACAGAGAAATTTCTATGAGCCTCAGATCATCACCACAGACAATACCTTCGTGAGCGGCAACTGTGACGTGGTCATCGGCATCGTGAACAATACCGTGTACGATCCTCTGCAGCCAGAGCTGGACTCTTTTAAGGAGGAGCTGGATAAGTATTTCAAGAACCACACCAGCCCCGACGTGGATCTGGGCGACATCTCTGGCATCAATGCCAGCGTGGTGAACATCCAGAAGGAGATCGACAGGCTGAATGAGGTGGCCAAGAATCTGAACGAGAGCCTGATCGATCTGCAGGAGCTGGGCAAGTATGAGCAGTCCGGCCGCGAGAACCTGTACTTCCAGGGAGGAGGAGGCTCTGGATATATCCCAGAGGCACCTCGGGATGGACAGGCCTACGTGAGAAAAGACGGCGAGTGGGTCCTGCTGAGTACCTTCCTGGGGCATCATCATCATCACCATTAA"
# `2-P variant` nucleotide sequence
spike_reference_sequence_2p="ATGTTTGTCTTCCTGGTCCTGCTGCCTCTGGTCTCCTCTCAGTGCGTGAACCTGACTACTAGAACTCAGCTGCCTCCCGCTTACACCAATAGCTTCACCAGGGGCGTGTACTATCCAGACAAGGTGTTTCGCAGCTCCGTGCTGCACTCCACACAGGATCTGTTTCTGCCCTTCTTTTCTAACGTGACCTGGTTCCACGCCATCCACGTGTCCGGCACCAATGGCACAAAGAGGTTCGACAATCCAGTGCTGCCCTTTAACGATGGCGTGTACTTCGCCTCCACCGAGAAGTCTAACATCATCCGCGGCTGGATCTTTGGCACCACACTGGACAGCAAGACACAGTCCCTGCTGATCGTGAACAATGCCACCAACGTGGTCATCAAGGTGTGCGAGTTCCAGTTTTGTAATGATCCTTTCCTGGGCGTGTACTATCACAAGAACAATAAGTCTTGGATGGAGAGCGAGTTTAGGGTGTACTCTAGCGCCAACAATTGCACATTTGAGTATGTGAGCCAGCCATTCCTGATGGACCTGGAGGGCAAGCAGGGCAATTTCAAGAACCTGCGGGAGTTCGTGTTTAAGAATATCGATGGCTACTTCAAAATCTACTCCAAGCACACCCCCATCAACCTGGTGCGGGACCTGCCACAGGGCTTCTCTGCCCTGGAGCCTCTGGTGGATCTGCCAATCGGCATCAACATCACCAGGTTTCAGACACTGCTGGCCCTGCACCGCAGCTACCTGACACCTGGCGACTCCTCTAGCGGATGGACCGCAGGAGCTGCCGCCTACTATGTGGGCTACCTGCAGCCAAGGACCTTCCTGCTGAAGTATAACGAGAATGGCACCATCACAGACGCAGTGGATTGCGCCCTGGACCCCCTGTCTGAGACAAAGTGTACACTGAAGAGCTTTACCGTGGAGAAGGGCATCTACCAGACAAGCAATTTCCGGGTGCAGCCCACCGAGTCCATCGTGAGATTTCCAAATATCACAAACCTGTGCCCCTTTGGCGAGGTGTTCAACGCCACCCGCTTCGCCAGCGTGTATGCCTGGAATAGGAAGCGCATCTCCAACTGCGTGGCCGACTATTCTGTGCTGTACAACTCCGCCTCTTTCAGCACCTTTAAGTGTTACGGCGTGAGCCCTACAAAGCTGAATGACCTGTGCTTTACCAACGTGTATGCCGATTCCTTCGTGATCAGGGGCGACGAGGTGCGCCAGATCGCACCAGGACAGACAGGCAAGATCGCCGACTACAATTATAAGCTGCCCGACGATTTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACTCTAACAATCTGGATAGCAAAGTGGGCGGCAACTACAATTATCTGTACCGGCTGTTTAGAAAGTCTAATCTGAAGCCTTTCGAGAGGGACATCTCCACAGAAATCTACCAGGCCGGCTCTACCCCATGCAATGGCGTGGAGGGCTTTAACTGTTATTTCCCCCTGCAGTCCTACGGCTTCCAGCCTACAAACGGCGTGGGCTATCAGCCATACCGCGTGGTGGTGCTGTCTTTTGAGCTGCTGCACGCACCAGCAACAGTGTGCGGACCTAAGAAGAGCACCAATCTGGTGAAGAACAAGTGCGTGAACTTCAACTTCAACGGCCTGACCGGCACAGGCGTGCTGACCGAGAGCAACAAGAAGTTCCTGCCCTTTCAGCAGTTCGGCCGGGACATCGCAGATACCACAGACGCCGTGCGGGACCCCCAGACCCTGGAGATCCTGGACATCACACCTTGCTCCTTCGGCGGCGTGTCTGTGATCACACCTGGCACCAATACATCCAACCAGGTGGCCGTGCTGTACCAGGACGTGAATTGTACCGAGGTGCCAGTGGCCATCCACGCCGATCAGCTGACCCCCACATGGAGGGTGTATAGCACCGGCTCCAACGTGTTCCAGACACGCGCCGGATGCCTGATCGGAGCAGAGCACGTGAACAATAGCTACGAGTGCGACATCCCCATCGGCGCCGGCATCTGTGCCTCCTATCAGACCCAGACAAACTCCCCTAGGAGAGCCCGGTCTGTGGCCTCCCAGTCTATCATCGCCTACACCATGAGCCTGGGCGCCGAGAACAGCGTGGCCTATTCTAACAATAGCATCGCCATCCCCACCAACTTCACAATCAGCGTGACCACAGAGATCCTGCCTGTGAGCATGACCAAGACATCCGTGGACTGCACAATGTACATCTGTGGCGATTCCACCGAGTGCTCTAACCTGCTGCTGCAGTATGGCTCCTTTTGTACCCAGCTGAATAGAGCCCTGACAGGCATCGCCGTGGAGCAGGACAAGAACACACAGGAGGTGTTCGCCCAGGTGAAGCAAATCTACAAGACCCCCCCTATCAAGGACTTTGGCGGCTTCAACTTCAGCCAGATCCTGCCCGATCCTTCCAAGCCATCTAAGCGGAGCTTTATCGAGGACCTGCTGTTCAACAAGGTGACCCTGGCCGATGCCGGCTTCATCAAGCAGTACGGCGATTGCCTGGGCGACATCGCAGCCCGGGACCTGATCTGCGCCCAGAAGTTTAATGGCCTGACCGTGCTGCCACCCCTGCTGACAGATGAGATGATCGCCCAGTATACATCTGCCCTGCTGGCCGGCACCATCACAAGCGGATGGACCTTCGGCGCAGGAGCCGCCCTGCAGATCCCCTTTGCCATGCAGATGGCCTACAGATTCAACGGCATCGGCGTGACCCAGAATGTGCTGTATGAGAACCAGAAGCTGATCGCCAATCAGTTTAACAGCGCCATCGGCAAGATCCAGGACTCTCTGTCCTCTACAGCCAGCGCCCTGGGCAAGCTGCAGGATGTGGTGAATCAGAACGCCCAGGCCCTGAATACCCTGGTGAAGCAGCTGAGCAGCAACTTCGGCGCCATCTCTAGCGTGCTGAATGACATCCTGAGCCGGCTGGACCCCCCAGAGGCAGAGGTGCAGATCGACCGGCTGATCACAGGCAGACTGCAGTCCCTGCAGACCTACGTGACACAGCAGCTGATCAGGGCAGCAGAGATCAGGGCCTCTGCCAATCTGGCCGCCACCAAGATGAGCGAGTGCGTGCTGGGCCAGTCCAAGAGAGTGGACTTTTGTGGCAAGGGCTACCACCTGATGAGCTTCCCACAGTCCGCCCCCCACGGCGTGGTGTTTCTGCACGTGACCTATGTGCCTGCCCAGGAGAAGAACTTCACCACAGCCCCAGCCATCTGCCACGATGGCAAGGCACACTTTCCCCGGGAGGGCGTGTTCGTGAGCAACGGCACCCACTGGTTTGTGACACAGAGAAATTTCTATGAGCCTCAGATCATCACCACAGACAATACCTTCGTGAGCGGCAACTGTGACGTGGTCATCGGCATCGTGAACAATACCGTGTACGATCCTCTGCAGCCAGAGCTGGACTCTTTTAAGGAGGAGCTGGATAAGTATTTCAAGAACCACACCAGCCCCGACGTGGATCTGGGCGACATCTCTGGCATCAATGCCAGCGTGGTGAACATCCAGAAGGAGATCGACAGGCTGAATGAGGTGGCCAAGAATCTGAACGAGAGCCTGATCGATCTGCAGGAGCTGGGCAAGTATGAGCAGTCCGGCCGCGAGAACCTGTACTTCCAGGGAGGAGGAGGCTCTGGATATATCCCAGAGGCACCTCGGGATGGACAGGCCTACGTGAGAAAAGACGGCGAGTGGGTCCTGCTGAGTACCTTCCTGGGGCATCATCATCATCACCATTAA"
# Default output:
# 1. Nucleotide sequence RBD
# 2. Nucleotide sequence full spike (with 2-P mutation)
# 3. Aminoacid sequence RBD
# 4. Aminoacid sequence full spike (with 2-P mutation)
#
# return 2 dna seqs, 2 prot seqs
#
def build_sequences(wt_dna_full_spike, wt_dna_full_spike_2p, rbd_variant):
#parse mutation
origin_aa, site, target_aa = rbd_variant[0],int(rbd_variant[1:-1]), rbd_variant[-1]
site_to_dna = (site-1)*3
target_codon = aa2dna[target_aa]
#apply mutation
mutated_seq_ = wt_dna_full_spike[:site_to_dna]+target_codon+wt_dna_full_spike[site_to_dna+3:]
mutated_seq_2p = wt_dna_full_spike_2p[:site_to_dna]+target_codon+wt_dna_full_spike_2p[site_to_dna+3:]
#translate sequences
translated_sequence = translate(mutated_seq_[RBD_start:RBD_end])
translated_sequence_2p = translate(mutated_seq_2p)
return {"Variant_Nucleic_Acid_sequence_RBD": mutated_seq_[RBD_start:RBD_end], "Variant_Nucleic_Acid_sequence_2-P":mutated_seq_2p, "Variant_Amino_Acid_sequence_RBD":translated_sequence, "Variant_Amino_Acid_sequence_2-P":translated_sequence_2p[:-1]}
def aggregate(mut, scor, spike_reference=None, spike_reference_2p=None, thres=0):
out = {}
sequences = {}
for m, s in zip(mut, scor):
if s>thres:
if out.get(m):
out[m].append(s)
else:
out[m]=[s]
_seqs = build_sequences(spike_reference,spike_reference_2p, m)
for key in _seqs.keys():
if sequences.get(key):
sequences[key].append(_seqs[key])
else:
sequences[key]=[_seqs[key]]
for key in out.keys():
out[key] = np.round(np.mean(out[key]),3)
return {**{"mutant":list(out.keys()), "scores":[out[s] for s in out.keys()]}, **sequences}
decending_sort_tot_score = np.argsort(tot_score)[::-1]
mutants = all_mutations[constraints_fulfilled][decending_sort_tot_score]
full_ranking=pd.DataFrame(aggregate(mutants, tot_score[decending_sort_tot_score], spike_reference=spike_reference_sequence, spike_reference_2p=spike_reference_sequence_2p, thres=score_thres))
full_ranking.to_csv("top-variant-ranking_2.csv")
【0397】
例となるデータインプット
突然変異スキャニング（ＭＳ）データ（https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867420310035
https://science.sciencemag.org/content/sci/early/2021/01/22/science.abf9302.full.pdf）を使用してエスケープ突然変異座位を構造エピトープに相関させた。ｎＡｂ：次の中和抗体のＲＢＤ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構造による一次および二次相互作用エピトープの同定：ＲＥＧＮ１０９３３、ＲＥＧＮ１０９８７（６ＸＤＧ）、Ｃ１４４ ７Ｋ９０、Ｐ２Ｂ－２Ｆ６＆Ｐ２Ｂ－２Ｆ１１（https://www.nature.com/articles/s41467-020-20501-9）、ＣＣ１２．１ ６ＸＣ２、Ｓ２Ｈ１３ ７ＪＶ６、完全スパイク；７ＪＶ２、ＣＣ１２．３ ６ＸＣ４、Ｃ１０５ ６ＸＣＮ、ＣＶ３０ ６ＸＥ１、Ｓ２Ａ４ ７ＪＶＡ、Ｓ３０４ ７ＪＷ０、ＣＶ０７－２５０ ６ＸＫＱ、ＣＯＶＡ１－１６Ｆａｂ７ＪＭＷ、ＣＯＶＡ２－３９ ７ＪＭＰ、ＣＯＶＡ２－０４ ７ＪＭＯＷＮｂ２およびＷＮｂ１０ ７ＬＸ５。
突然変異スキャニング（ＭＳ）データ（https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867420310035
https://science.sciencemag.org/content/sci/early/2021/01/22/science.abf9302.full.pdf）を使用してエスケープ突然変異座位を構造エピトープに相関させた。ｎＡｂ：次の中和抗体のＲＢＤ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構造による一次および二次相互作用エピトープの同定：ＲＥＧＮ１０９３３、ＲＥＧＮ１０９８７（６ＸＤＧ）、Ｃ１４４ ７Ｋ９０、Ｐ２Ｂ－２Ｆ６＆Ｐ２Ｂ－２Ｆ１１（https://www.nature.com/articles/s41467-020-20501-9）、ＣＣ１２．１ ６ＸＣ２、Ｓ２Ｈ１３ ７ＪＶ６、完全スパイク；７ＪＶ２、ＣＣ１２．３ ６ＸＣ４、Ｃ１０５ ６ＸＣＮ、ＣＶ３０ ６ＸＥ１、Ｓ２Ａ４ ７ＪＶＡ、Ｓ３０４ ７ＪＷ０、ＣＶ０７－２５０ ６ＸＫＱ、ＣＯＶＡ１－１６Ｆａｂ７ＪＭＷ、ＣＯＶＡ２－３９ ７ＪＭＰ、ＣＯＶＡ２－０４ ７ＪＭＯＷＮｂ２およびＷＮｂ１０ ７ＬＸ５。
【0398】
例となる結果
以下の結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質の受容体結合ドメインについて上に概説する解析の例となるアウトカムである。閾値：アルファ＝０．５、ベータ＝１．０、ガンマ＝０．４０。
以下の結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質の受容体結合ドメインについて上に概説する解析の例となるアウトカムである。閾値：アルファ＝０．５、ベータ＝１．０、ガンマ＝０．４０。
【0399】
【表6】
【0400】
【表7】
【0401】
図２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤに対する結果の視覚的解析である。公表されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＭ突然変異体スクリーニングおよび公表されている中和抗体構造を使用する生物情報学的解析により、所望の特性のＲＢＭ突然変異体が同定されることを示す。いくつかのアミノ酸位置は、別個の残基に突然変異させて、ＡＣＥ２受容体結合を最小化し、タンパク質発現を最大化し、公表されている中和抗体の結合を最小限に破壊することができる。
【0402】
図２Ａ）別個のＲＢＤ位置（座位、点）についての、結晶構造により同定した一次および二次インターフェース（黒色および灰色の線）と比較した中和抗体（ｎＡｂ）最大エスケープの図示。欠測データは薄い垂線により示す。
【0403】
図２Ｂ）発現（ｘ軸）対ＡＣＥ２結合（ｙ軸）の散布図。すべてのデータは黒点により示す。最高スコアを有する変異体は、各上位座位について、灰点により示す。
【0404】
【0405】
ＡＣＥ２、種々のモノクローナルｎＡＢ、ならびに単一、二重、および三重のアミノ酸置換を有する種々のＳＡＲＳ－ｍＲＢＤの結合力のＥＬＩＳＡの使用によるインビトロでの決定 － 図４Ａ～Ｃ、５Ａ～Ｄ
単一、二重、および三重の別個の点突然変異をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤに導入した。実験は、実施例４に記載のように実施した。
単一、二重、および三重の別個の点突然変異をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤに導入した。実験は、実施例４に記載のように実施した。
【0406】
図３Ａ）ＥＬＩＳＡにより決定した、中和抗体Ｓ３０９に対する結合を保存したすべての突然変異。
【0407】
図３Ｂ）変異体の大多数が、ＥＬＩＳＡにおいてＡＣＥ２に対する結合を大いにまたは完全に抑止した。
【0408】
図３Ｃ）特異性が無関係な陰性対照抗体９Ｂ９は、非特異的結合を除いてＲＢＤ変異体によって結合しない。
【0409】
図３では、略称は次を表す。
ＲＢＤ－Ｌ：ＲＢＤ－Ｌ４５５Ｒ（配列番号５５）
ＲＢＤ－Ｇ４：ＲＢＤ－Ｇ４９６Ｒ（配列番号９５）
ＲＢＤ－Ｇ５：ＲＢＤ－Ｇ５０２Ｒ（配列番号１５）
ＲＢＤ－ＡＧ５：ＲＢＤ－Ａ４７５Ｒ－Ｇ５０２Ｒ（配列番号９６）
ＲＢＤ－Ｇ４Ｇ５：ＲＢＤ－Ｇ４９６Ｒ－Ｇ５０２Ｒ（配列番号９７）
ＲＢＤ－ＡＧ４Ｇ５：ＲＢＤ－Ａ４７５Ｒ－Ｇ４９６Ｒ－Ｇ５０２Ｒ（配列番号９８）
ＲＢＤ－ＬＡＧ４：ＲＢＤ－Ｌ４５５Ｒ－Ａ４７５Ｒ－Ｇ４９６Ｒ（配列番号９９）
ＲＢＤ－Ｌ：ＲＢＤ－Ｌ４５５Ｒ（配列番号５５）
ＲＢＤ－Ｇ４：ＲＢＤ－Ｇ４９６Ｒ（配列番号９５）
ＲＢＤ－Ｇ５：ＲＢＤ－Ｇ５０２Ｒ（配列番号１５）
ＲＢＤ－ＡＧ５：ＲＢＤ－Ａ４７５Ｒ－Ｇ５０２Ｒ（配列番号９６）
ＲＢＤ－Ｇ４Ｇ５：ＲＢＤ－Ｇ４９６Ｒ－Ｇ５０２Ｒ（配列番号９７）
ＲＢＤ－ＡＧ４Ｇ５：ＲＢＤ－Ａ４７５Ｒ－Ｇ４９６Ｒ－Ｇ５０２Ｒ（配列番号９８）
ＲＢＤ－ＬＡＧ４：ＲＢＤ－Ｌ４５５Ｒ－Ａ４７５Ｒ－Ｇ４９６Ｒ（配列番号９９）
【0410】
この実施例は、実施例４に記載のように実施した。ただし、９Ｂ９を対照抗体として使用した。
［実施例４］
［実施例４］
【0411】
ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤおよび種々のＳＡＲＳ－ｍＲＢＤに対するＡＣＥ２および種々のモノクローナルｎＡＢの結合力のＥＬＩＳＡの使用によるインビトロでの決定 － 図４Ａ～Ｆおよび図６、ならびに
ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤおよび種々のＳＡＲＳ－ｍＲＢＤを考慮した種々のモノクローナルｎＡＢおよびＡＣＥ２についてのＥＣ５０値の決定 － 図５
図４では、生物情報学的にスクリーニングしたＲＢＤ突然変異体Ｌ４５５Ｒ（配列番号５５）およびＧ５０２Ｒ（配列番号１５）はＡＣＥ２結合を低下させるが、ＲＢＤ特異的中和抗体の結合は保存されることを実験的に確認する。図６と同様に、ここで、さらなるＧ５０２突然変異体Ｇ５０２Ｄ（配列番号５）、Ｇ５０２Ｙ（配列番号２０）、Ｇ５０２Ｋ（配列番号９）、Ｇ５０２Ｓ（配列番号１６）、Ｇ５０２Ｐ（配列番号１３）、Ｇ５０２Ｅ（配列番号２）、Ｇ５０２Ａ（配列番号３）、Ｇ５０２Ｖ（配列番号１８）、Ｇ５０２Ｎ（配列番号１２）、Ｇ５０２Ｑ（配列番号１４）、Ｇ５０２Ｔ（配列番号１７）、Ｇ５０２Ｍ（配列番号１１）、Ｇ５０２Ｈ（配列番号７）、Ｇ５０２Ｌ（配列番号１０）およびＧ５０２Ｆ（配列番号６）を実験的にスクリーニングした。このＥＬＩＳＡに基づくアッセイのセットアップにおいてＧ５０２ＲがＡＣＥ２結合を完全に抑止する一方、Ｌ４５５ＲはＡＣＥ２結合をそれほど良好には低下させなかった。加えて、Ｇ５０２Ｒ突然変異は、４つの別個のクラス、すなわち、クラスＩ（Ｃ１２．１、Ｐ２Ｃ－１Ｆ１１、ＲＥＧＮ１０９３３、Ｃ１４４）、クラスＩＩ（Ｃ１４４、Ｓ２Ｈ１３、Ｐ２Ｂ－２Ｆ６、ＲＥＧＮ１０９８７）、クラスＩＩＩ（Ｓ３０９）、およびクラスＩＶ（ＥＹ６Ａ）の検査したすべての中和抗体の結合を保存した。Ｇ５０２Ｒ突然変異体では、中和抗体の結合の低下は観察されなかった。その上、ＲＢＤ突然変異体は、対照抗体ＶＲＣ０１（抗ＨＩＶ ＧＰ１４０）または４Ａ８（抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクＮ末端ドメイン）を非特異的には認識しない。ＲＢＤ突然変異体であるＡ４７５Ｒ＋Ｇ４９６Ｒ、Ａ４７５Ｒ、およびＦ４５６Ａは、ＡＣＥ２結合を低下させるが、中和抗体の結合は、Ｌ４５５ＲおよびＧ５０２Ｒほど良好には保存されない。
ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤおよび種々のＳＡＲＳ－ｍＲＢＤを考慮した種々のモノクローナルｎＡＢおよびＡＣＥ２についてのＥＣ５０値の決定 － 図５
図４では、生物情報学的にスクリーニングしたＲＢＤ突然変異体Ｌ４５５Ｒ（配列番号５５）およびＧ５０２Ｒ（配列番号１５）はＡＣＥ２結合を低下させるが、ＲＢＤ特異的中和抗体の結合は保存されることを実験的に確認する。図６と同様に、ここで、さらなるＧ５０２突然変異体Ｇ５０２Ｄ（配列番号５）、Ｇ５０２Ｙ（配列番号２０）、Ｇ５０２Ｋ（配列番号９）、Ｇ５０２Ｓ（配列番号１６）、Ｇ５０２Ｐ（配列番号１３）、Ｇ５０２Ｅ（配列番号２）、Ｇ５０２Ａ（配列番号３）、Ｇ５０２Ｖ（配列番号１８）、Ｇ５０２Ｎ（配列番号１２）、Ｇ５０２Ｑ（配列番号１４）、Ｇ５０２Ｔ（配列番号１７）、Ｇ５０２Ｍ（配列番号１１）、Ｇ５０２Ｈ（配列番号７）、Ｇ５０２Ｌ（配列番号１０）およびＧ５０２Ｆ（配列番号６）を実験的にスクリーニングした。このＥＬＩＳＡに基づくアッセイのセットアップにおいてＧ５０２ＲがＡＣＥ２結合を完全に抑止する一方、Ｌ４５５ＲはＡＣＥ２結合をそれほど良好には低下させなかった。加えて、Ｇ５０２Ｒ突然変異は、４つの別個のクラス、すなわち、クラスＩ（Ｃ１２．１、Ｐ２Ｃ－１Ｆ１１、ＲＥＧＮ１０９３３、Ｃ１４４）、クラスＩＩ（Ｃ１４４、Ｓ２Ｈ１３、Ｐ２Ｂ－２Ｆ６、ＲＥＧＮ１０９８７）、クラスＩＩＩ（Ｓ３０９）、およびクラスＩＶ（ＥＹ６Ａ）の検査したすべての中和抗体の結合を保存した。Ｇ５０２Ｒ突然変異体では、中和抗体の結合の低下は観察されなかった。その上、ＲＢＤ突然変異体は、対照抗体ＶＲＣ０１（抗ＨＩＶ ＧＰ１４０）または４Ａ８（抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクＮ末端ドメイン）を非特異的には認識しない。ＲＢＤ突然変異体であるＡ４７５Ｒ＋Ｇ４９６Ｒ、Ａ４７５Ｒ、およびＦ４５６Ａは、ＡＣＥ２結合を低下させるが、中和抗体の結合は、Ｌ４５５ＲおよびＧ５０２Ｒほど良好には保存されない。
【0412】
図５は、指示する中和抗体またはＡＣＥ２－ｈＦｃｇ１について、結合の５０％が達成されるμｇ／ｍｌでの有効濃度（ＥＣ５０）を示す。図５に示すように、ＥＣ５０値が低ければ、結合親和性が高いことを示す。～は、結合が検出されなかったことを示す。
【0413】
ＡＣＥ２－ｈＦｃｇ１は、組換えヒトＡＣＥ２ Ｑ１８－Ｖ７３９断片をヒトＩｇＧ１－Ｆｃ部分（Ｅ９９－Ｋ３３０部分、ここで、第１のアミノ酸は、Ｊ－ＣＨ１融合物によりコードされるＧである）に融合することによりクローニングした。Ｗｕｈａｎ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体（ＧｅｎＢａｎｋ、ＭＮ９０８９４７．３）のシグナルペプチド貫通アミノ酸Ｍ１－Ｑ１４およびＲ３１９－Ｆ５４１を含むＲＢＤを、Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐタグ配列（ＷＳＨＰＱＦＥＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ）によりＣ末端ヘキサヒスチジンタグの上流で補完し、ｐｃＣＤＮＡ３．１ベクターにクローニングした。アミノ酸ｍＲＢＤ修飾Ｇ５０２Ｒ、Ｌ４５５Ｒ、Ａ４７５Ｒ、Ｇ４９６Ｒ、Ｇ５０２Ｄ、Ｇ５０２Ｙ、Ｇ５０２Ｋ、Ｇ５０２Ｓ、Ｇ５０２Ｐ、Ｇ５０２Ｅ、Ｇ５０２Ｖ、Ｇ５０２Ｎ、Ｇ５０２Ｑ、Ｇ５０２Ｔ、Ｇ５０２Ｍ、Ｇ５０２Ｈ、Ｇ５０２Ｌ、Ｇ５０２ＦをＰＣＲ突然変異誘発により導入して、ＡＣＥ２結合が抑止されたＲＢＤ突然変異体を作出した（T. Zhou et al., 2020b）。同様に、新規のコロナウイルス変異体のＲＢＤ突然変異Ｎ５０１Ｙ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋを生成した。次のモノクローナル抗体の重鎖配列および軽鎖配列を、Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社のＩｇＧ１重鎖およびカッパまたはラムダ軽鎖の発現ベクターにクローニングした：ＥＹ６Ａ（D. Zhou et al., 2020a）、Ｐ２Ｂ－２Ｆ６およびＰ２Ｃ－１Ｆ１１（Ge et al., 2021）、ＲＥＧＮ１０９３３およびＲＥＧＮ１０９８７（Hansen et al., 2020）、ＣＣ１２．１（Rogers et al., 2020）、Ｃ１４４（Robbiani et al., 2020）、ＶＲＣ０１（Wu et al., 2010）、Ｓ２Ｈ１３（Piccoli et al., 2020）、Ｓ３０９（Pinto et al., 2020）、４Ａ８（Chi et al., 2020）。
【0414】
組換えタンパク質の生成では、プラスミドを使用してＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、加湿した８％ＣＯ２のインキュベーター内に３７℃の培養培地中でこれを増殖させた。細胞は、１ｍＬあたり２５０万細胞の密度に増殖させ、ＰＥＩ（細胞懸濁液中４μｇ／ｍＬ）およびＤＮＡ（細胞懸濁液中１２００ｎｇ／ｍｌ）を使用してトランスフェクトし、３日間培養した。上清を回収し、タンパク質をＨｉｓ ＳｐｉｎＴｒａｐカラム（Ｃｙｔｉｖａ社、９５０５６－２９０）またはプロテインＧカラムにより製造者の指示に従って精製した。溶出したタンパク質は、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４遠心分離フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＵＦＣ８０５００８）を５０ｋＤａのカットオフにより使用して、緩衝液交換によりリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に移した。タンパク質濃度は、Ｈｉｓタグ特異的ＥＬＩＳＡにより、マウス抗Ｈｉｓタグ抗体（Ａｂｃａｍ社、＃ａｂ１８１８４）およびアルカリホスファターゼにコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、ｃａｔ＃ＳＢＡ－１０３３－０４）を検出試薬として使用して決定した。タンパク質の生成は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより、マウス抗Ｈｉｓ抗体（Ａｂｃａｍ社、＃ａｂ１８１８４）およびＩＲＤｙｅ８００ＣＷロバ抗マウス抗体（Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、＃９２５－３２２１２）を使用して確認した。
【0415】
組換えＲＢＤは、高結合９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、ＣＬＳ３６９０）上にＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国、ＭＯ）中に４μｇ／ｍｌで、＋４℃で一晩固定化した。プレートは、ＰＢＳ中１％のＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社、Ｇｉｂｃｏ、米国、ＭＡ）により室温で１時間ブロッキングした。組換え抗体およびＡＣＥ２－ｈＦｃｇ１を、１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ中で指示する段階希釈液に希釈し、コーティングしたプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートは、抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼ（ＡＰ）共役抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、ｃａｔ＃２０４０－０４）を１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ中で１：５００に希釈したものにより展開した。４－ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物基質（ＳＩＧＭＡ社、Ｃａｔ ＮｏＳ０９４２－５０ＴＡＢ）を添加した重炭酸緩衝液を加え、４０５ｎｍにおける吸光度をＣｙｔａｔｉｏｎ５デバイス（ＢｉｏＴｅｋ社）により測定した。指示するすべてのインキュベーション工程の間に、プレートは、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０添加ＰＢＳで３回洗浄した。
［実施例５］
［実施例５］
【0416】
ｓＡＣＥ２レベルを制御したマウスモデルを使用する、ＳＡＲＳ－ｗｔＲＢＤまたは種々のＳＡＲＳ－ｍＲＢＤのいずれかによる免疫化後のＢ細胞の出現頻度のインビボでの決定 － 図７
図７は、インビボでの制御マウスモデルにおいて、可溶性ＡＣＥ２によるＲＢＤのマスキングにより、免疫化中、ＲＢＤ－ＡＣＥ２相互作用に干渉する抗体（競合抗体、ｃＡｂ）を産生するＢ細胞の量が減少したことを示す。その上、図７は、ＲＢＤ突然変異体Ｇ５０２Ｒ（配列番号１５）（図７ではＲＢＤ－Ｇ５と省略する）およびＬ４５５Ｒ（配列番号５５）（図７ではＲＢＤ－Ｌと省略する）が、インビボでの免疫化中、可溶性ＡＣＥ２によるＲＢＤのマスキングを抑止可能であることを示す。したがって、導入された突然変異により、ＲＢＤ－ＡＣＥ２相互作用に干渉する抗体を産生するＢ細胞の生成が向上した。その上、図７は、２つのＲＢＤ突然変異体Ｇ５０２ＲおよびＬ４５５Ｒが、可溶性ＡＣＥ２のマスキングを阻止するように１回の免疫化において良好に組み合わせることが可能であることを示す。その上、図７は、ＲＢＤのマスキングが、高頻度のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの抗原であり、治療のために認可された完全スパイクによる免疫化中にも生じることを示す。
図７は、インビボでの制御マウスモデルにおいて、可溶性ＡＣＥ２によるＲＢＤのマスキングにより、免疫化中、ＲＢＤ－ＡＣＥ２相互作用に干渉する抗体（競合抗体、ｃＡｂ）を産生するＢ細胞の量が減少したことを示す。その上、図７は、ＲＢＤ突然変異体Ｇ５０２Ｒ（配列番号１５）（図７ではＲＢＤ－Ｇ５と省略する）およびＬ４５５Ｒ（配列番号５５）（図７ではＲＢＤ－Ｌと省略する）が、インビボでの免疫化中、可溶性ＡＣＥ２によるＲＢＤのマスキングを抑止可能であることを示す。したがって、導入された突然変異により、ＲＢＤ－ＡＣＥ２相互作用に干渉する抗体を産生するＢ細胞の生成が向上した。その上、図７は、２つのＲＢＤ突然変異体Ｇ５０２ＲおよびＬ４５５Ｒが、可溶性ＡＣＥ２のマスキングを阻止するように１回の免疫化において良好に組み合わせることが可能であることを示す。その上、図７は、ＲＢＤのマスキングが、高頻度のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの抗原であり、治療のために認可された完全スパイクによる免疫化中にも生じることを示す。
【0417】
免疫化スキーム：マウスをＲＢＤ（野生型ＲＢＤ［配列番号１］、ＲＢＤ突然変異体Ｇ５０２Ｒ［配列番号１５］、およびＲＢＤ突然変異体Ｌ４５５Ｒ［配列番号５５］）単独またはＲＢＤとｓＡＣＥ２とにより免疫化した。ブースター免疫化後４～２１日に脾臓を解析した。単一細胞技術（ＤｒｏｐＭａｐ）を使用して、単一Ｂ細胞により液滴中に分泌される抗体を解析した。ＲＢＤに結合するＡＣＥ２と競合可能な抗体を産生するＢ細胞のパーセンテージを示す。各条件について、Ｎ＝３匹のマウスを免疫化した。
【0418】
組換えＲＢＤタンパク質は、図４および５に記載のように生成した（実施例４を参照）。
【0419】
組換えｍｈＡＣＥ２は、次の突然変異を野生型Ｓ１９－Ｖ７３９マウスＡＣＥ２断片に導入することにより構築した：Ｌ２０Ｔ、Ｎ２４Ｑ、Ｎ３０Ｄ、Ｎ３１Ｋ、Ｑ３４Ｈ、Ｋ６０Ｑ、Ｓ６３Ｎ、Ｅ６４Ｎ、Ｙ７３Ｌ、Ｅ７４Ｋ、Ｋ７８Ｔ、Ｔ７９Ｌ、Ｓ８２Ｍ、Ｆ８３Ｙ、Ｔ９０Ｎ、Ｐ９１Ｌ、Ｉ９２Ｔ、Ｉ９３Ｖ、Ｓ１０３Ｎ、Ｈ３５３Ｋ、Ｎ３６８Ｄ、Ｒ３８７Ａ。Ｎ末端Ｈｉｓタグを含むＭｕｒａｎＡＣＥ２は、シグナルペプチド（ＳＰ）（ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ）と、ＧＳＳＧＳＳＧＳＳリンカーを介してＡＣＥ２のＮ末端に結合する８つのヒスチジン部分で構成される分子タグ（Ｈｉｓタグ）とを含む哺乳動物発現ｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングした。Ｃ末端Ｈｉｓタグは、ＨＥＫ２９３細胞により発現するＡＤＡＭ１７のようなプロテアーゼにより切断される可能性が高いため、効率的なタンパク質精製には適しないことが実験的に決定された。したがって、Ｈｉｓタグは、ＳＰとＡＣＥ２断片のＮ末端との間に導入した。
【0420】
ＲＢＤにもかかわらず、２－Ｐ突然変異（Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐの置換）を含む野生型完全スパイク（配列番号２５９）を免疫原として使用した。ｐｃＣＤＮＡ３．１ベクターに、Ｗｕｈａｎ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体（ＧｅｎＢａｎｋ、ＭＮ９０８９４７．３）の完全長スパイクＭ１－Ｑ１２０８のクローニング後、プロテアーゼ認識部位、ＧＧＧＳリンカー、三量体形成ドメイン、およびヘキサヒスチジンタグを含むアミノ酸配列ＳＧＲＥＮＬＹＦＱＧＧＧＧＳＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧＨＨＨＨＨＨ＊をクローニングした。
【0421】
【0422】
ＢＡＬＢ／ｃＪＲｊマウス（開始時６～８週齢、すべて雌）をＪａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ社から購入し、実験中、スイス連邦工科大学チューリッヒ校の動物施設で飼育した。２週間の順化後、マウスは、指示する日数（一次免疫化０日目、ブースター免疫化２８日目）、ＲＢＤ－Ｈｉｓ６（最終量３μｇ／免疫化、滅菌ＰＢＳに希釈）を１：１でＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）アジュバント２％（ｖａｃ－ａｌｕ－２５０、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）に少なくとも２時間吸着させたものを使用して免疫化した。指示する場合では、ｍｕｒａｎＡＣＥ２（最終量９．２、１．８または０．３７μｇ／免疫化、滅菌ＰＢＳに希釈）、中和マウスＩｇＧ２ｂ（最終量１３．５、２．７または０．５４μｇ／免疫化、４０５９２－ＭＭ５７、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、滅菌ＰＢＳに希釈）、ＳｕｐｅｒＭｕｒａｎ ＡＣＥ（最終量０．３７μｇ／免疫化、滅菌ＰＢＳに希釈）、ＮｏＭｕｒａｎ ＡＣＥ２（最終量９．２μｇ／免疫化、滅菌ＰＢＳに希釈）、または完全長スパイクタンパク質（最終量３μｇ／免疫化、滅菌ＰＢＳに希釈）を抗原とアジュバントとの混合物に注射直前（１０分未満）に加えた。マウスに、総容量１００μｌの抗原／アジュバント混合物それぞれを腹腔内に免疫化した。すべての免疫化は、三つ組で実施した。ブースト後の指示する時点で、脾臓を回収し、いずれかに記載のようにＩｇＧ－ＳＣを調製して封入した（Bounab et al., 2020）。手短に言えば、Ｂ細胞系列由来の未処理細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社のＰａｎ Ｂ細胞精製キットＩＩを使用して抽出した。細胞は、実験を通じて常に氷上か４℃に維持した。並行して、全血をマウスから採取し、凝固させ、後に血清を精製し、４℃で貯蔵した後、力価を測定した。チューリッヒ州立倫理委員会により、本試験に記載のすべての実験がライセンス番号ＺＨ２１５／１９によって検証および認可された。
【0423】
液滴生成用ポリジメチルシロキサンマイクロ流体チップおよび２Ｄ観察チャンバーをいずれかに記載のように製作し（Bounab et al., 2020）、このアセンブリーを使用して容量およそ５０ｐＬの液滴を生成した。乳濁液を２Ｄ観察チャンバー内に直接的に誘導し、その後、倒立蛍光顕微鏡（Ｔｉ２ Ｅｃｌｉｐｓｅ、Ｎｉｋｏｎ社）上に搭載されたチャンバーの充填を完了し、データを下記のように生成した。
【0424】
Ｂ細胞系列由来の精製した細胞を遠心分離により採取し（４００ｇ、５分、４℃）、再懸濁させて、染色溶液（５μＭのＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔを加えたＨａｎｋｓのＢａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ともにＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）中最終濃度２×１０６細胞／ｍｌとして、解析中、Ｂ細胞を含む液滴の選択を可能とした。封入直前に、細胞を採取し（４００ｇ、５分、４℃）、フェノールレッド不含のＲＰＭＩ１６４０（ｃａｔ．ｎｏ．１１８３５０３０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）からなる液滴培地により１回洗浄した。液滴培地は、５％のＫｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）、０．５％の組換えヒト血清アルブミン（ｃａｔ．ｎｏ．Ａ９９８６、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）、２５ｍＭの２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）ｐＨ７．４、１×ペニシリン－ストレプトマイシン、および０．１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－１２７（すべてＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社により供給）をさらに含んだ。細胞は、液滴培地中に再懸濁させて、０．２～０．４の最終封入物λ（１液滴あたりの細胞数平均値）を得た。すなわち、液滴のおよそ２０～３０％が１個の細胞を含む。
【0425】
常磁性ナノ粒子をこれまでに記載のように調製した（Bounab et al., 2020）。ビーズは数時間前に調製し、ナノ粒子は各測定の前にピペットで滴下することにより完全に再懸濁させた。試薬の最終液滴中濃度は、ｗｔＲＢＤ－Ｈｉｓ６は２５ｎＭ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０ヒトＡＣＥ２－ｈＦｃ（１０１０８－Ｈ０２Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、社内で標識）は２５ｎＭ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗Ｈｉｓ６（ａｂ２３７３３６、Ａｂｃａｍ社）は３０ｎＭ、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識抗ＩｇＧ Ｆｃ（３１５－６０６－０４６、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）は７５ｎＭであった。
【0426】
液滴および封入細胞の画像を、１０倍対物レンズ（ＮＡ０．４５、Ｎｉｋｏｎ社）を使用して取得し、室温でのインキュベーションから１時間後に１０×１０画像のアレイを取得した。これにより、１実験あたりおよそ４～５０’０００液滴の画像化が可能となり、結果として１０～２０’０００細胞が解析された。励起光は、ＬＥＤ源（ＳＯＬＡ ｌｉｇｈｔ ｅｎｇｉｎｅ、Ｌｕｍｅｎｃｏｒ Ｉｎｃ．）により供給され、発光した蛍光は、適切なバンドパスフィルター（ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、Ｃｙ５、およびＣｙ７フィルターセット、すべてＳｅｍｒｏｃｋ社）、室温（２５℃）によるカメラ設定（Ｏｒｃａ Ｆｌａｓｈ４、Ｈａｍａｍａｔｓｕ社）、および周囲酸素濃度を使用して記録した。測定中にビーズの線を垂直に整列させるために（データ解析のため）、２つの強力なネオジム磁石（ＢＺＸ０８２、Ｋ＆Ｊ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ社）を２Ｄ観察チャンバーの両側上に配置した。
【0427】
取得したデータは、カスタムメイドのＭａｔｌａｂスクリプト（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ社、バージョンはhttps://github.com/LCMD-ESPCI/dropmap-analyzerのＧｉｔＨｕｂ上に見出すことができる）を使用して解析した。詳細には、明視野画像を使用して液滴を検出および単離した。ＤＡＰＩ画像を使用して各液滴中の生細胞の存在を確認し、他のすべての蛍光チャネルによりビーズ線への蛍光の再配置を確認した（Bounab et al., 2020）。生じた生データは、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社）にエクスポートし、生細胞を含んだ液滴を選別した。細胞を含む液滴は、抗ＩｇＧの再配置の増加についてさらに選別した（閾値１．３、１．１ｎＭのＩｇＧ１または２．６ｎＭのＩｇＧ２ａ／ｂに対応）。ＩｇＧ分泌細胞の存在が保証された後、同一液滴中のＡｌｅｘａ４８８（ＲＢＤ、抗原）およびＡｌｅｘａ７５０（ＡＣＥ２、競合物）の再配置を解析し、Ａｌｅｘａ４８８／７５０（ＲＢＤ／ＡＣＥ２再配置）の比率を求め、Ａｌｅｘａ４８８の再配置に対してプロットした。この段階では、各サンプルにおいて、ＩｇＧ分泌細胞５０～６００個を選択した。競合する抗体は、ＲＢＤ／ＡＣＥ２再配置の比率がx?（Ａｌｅｘａ４８８再配置空液滴／Ａｌｅｘａ７５０再配置空液滴）＋０．０２よりも高いものとして同定した。この閾値を使用して、ｃＡｂによる較正サンプルはｃＡｂとして確実に同定されたが（９３±８％、Ｎ＝６）、誤って同定されたｃＡｂ数は低いままであった（１．４±０．５％、Ｎ＝６）。他に言及しない場合、個々のマウスの測定において同定したｃＡｂの平均出現頻度を呈示し（Ｎ＝３）、標準偏差を図７に示す。低い出現頻度では、有意差はなかったが、すべての出現頻度の測定値、特には、高ｎＡｂおよび高ｍｕｒａｎＡＣＥ２では、陰性対照実験のレベルを超えた（追加ＲＢＤなし１．１±１．１％）。
［実施例６］
［実施例６］
【0428】
Ｎ５０１Ｙの置換を含む新たに出現したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体についての可溶性ＡＣＥ２によるエピトープマスキングのインシリコでのモデリング － 図８ＡおよびＢ
図８ＡおよびＢは、ＲＢＤのＡＣＥ２マスキングが、新たに出現したウイルス変異体について増加することを示す。
図８ＡおよびＢは、ＲＢＤのＡＣＥ２マスキングが、新たに出現したウイルス変異体について増加することを示す。
【0429】
エピトープマスキングのインシリコでのモデリングは、別個のＡＣＥ２血清濃度下での％ＲＢＤ結合として表された。英国および南アフリカ由来の新たに出現したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスにおいて生じたＮ５０１Ｙ突然変異により親和性が増加し、このためＡＣＥ２によるマスキングも増加した。ここでは３６％のＲＢＤ結合により表されるマスキング作用は、相関性に示すように、親和性（Ｋｄ）の低下とともに増加する。
【0430】
したがって、マスキング能は、受容体に対するＲＢＤの親和性と相関し、親和性が増加した新規の変異体により、低ｓＡＣＥ２血清濃度でマスキングの増加が引き起こされる。
［実施例７］
［実施例７］
【0431】
ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤまたは種々のＭＥＲＳ－ｍＲＢＤのいずれかに対するＤＰＰ４および種々のモノクローナルｎＡＢの結合力のＥＬＩＳＡの使用によるインビトロでの決定 － 図９
図９は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ ＲＢＤ突然変異Ｄ５１０Ａ（配列番号１９５）、Ｅ５３６Ｒ（配列番号１９８）、Ｄ５３７Ｋ（配列番号１９６）、およびＤ５３９Ｋ（配列番号１９７）が、ＤＰＰ４受容体に対する結合を異なる程度まで抑止し、Ｄ５１０およびＤ５３９が最も有効な受容体結合が消失した突然変異となることを示す。その上、図９は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ中和抗体４Ｃ２ｈ、Ｄ１２、ＬＣＡ６０、およびＭＥＲＳ４Ｖ２の結合がＤ５１０Ａにより維持され、ＲＢＤ－Ｄ５１０Ａに対してＲＢＤ－ＷＴと比較して同様に良好に結合することを示す。Ｄ１７１Ｋ突然変異は、結合親和性は低いが、４つの中和抗体のうちの３つを保存した。したがって、Ｄ５１０ＡおよびＤ１７１Ｋ ＲＢＤ突然変異体は、動物の免疫化用に選択された。
図９は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ ＲＢＤ突然変異Ｄ５１０Ａ（配列番号１９５）、Ｅ５３６Ｒ（配列番号１９８）、Ｄ５３７Ｋ（配列番号１９６）、およびＤ５３９Ｋ（配列番号１９７）が、ＤＰＰ４受容体に対する結合を異なる程度まで抑止し、Ｄ５１０およびＤ５３９が最も有効な受容体結合が消失した突然変異となることを示す。その上、図９は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ中和抗体４Ｃ２ｈ、Ｄ１２、ＬＣＡ６０、およびＭＥＲＳ４Ｖ２の結合がＤ５１０Ａにより維持され、ＲＢＤ－Ｄ５１０Ａに対してＲＢＤ－ＷＴと比較して同様に良好に結合することを示す。Ｄ１７１Ｋ突然変異は、結合親和性は低いが、４つの中和抗体のうちの３つを保存した。したがって、Ｄ５１０ＡおよびＤ１７１Ｋ ＲＢＤ突然変異体は、動物の免疫化用に選択された。
【0432】
ヒトＤＰＰ４およびモノクローナル抗体のクローニングでは、タンパク質Ｎ末端の前に、ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳの配列を有するＩｇＨシグナルペプチド（ＳＰ）配列を配置してタンパク質分泌を促進した。非抗体タンパク質は、精製目的のために８×Ｈｉｓタグまたは６×ＨｉｓタグのいずれかをＮまたはＣ末端上に含んだ。Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙクローニングを、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、＃Ｅ２６１１）を製造者の指示に従って使用して実施した。プラスミドの形質転換に化学的に適格な大腸菌を社内で生成し、ＮＥＢ形質転換プロトコル（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、＃Ｅ１６０１）に従って形質転換した。細菌培養物からのプラスミドの単離は、ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、＃Ａ１２２２）およびＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、＃Ａ２４９６）を製造者の指示に従って使用して行った。発現カセットの配列は、ＤＮＡシーケンシング（ＬＧＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＧｍｂＨ）により検証した。
【0433】
ヒトＤＰＰ４のＳ３８－Ｐ７６６断片（Ｕｎｉｐｒｏｔ、Ｐ２７４８７）を含むＮ末端８×Ｈｉｓタグ（ｈＤＰＰ４－Ｎ’Ｈｉｓ）を有する組換えＤＰＰ４の遺伝子は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより合成し、ＳＰを含む哺乳動物発現ｐＳＦベクター（Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社）にＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙを使用してクローニングした。
【0434】
ＭＥＲＳ－ＣｏＶ ＲＢＤアミノ酸Ｇ３７２－Ｌ５８８を、Ｔｗｉｎ Ｓｔｒｅｐタグ配列（ＷＳＨＰＱＦＥＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ）の上流のＧＧＧＳリンカーの前にクローニングし、その後、Ｃ末端８×Ｈｉｓタグが続いた。これを、Ｗｕｈａｎ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体（ＧｅｎＢａｎｋ、ＭＮ９０８９４７．３）のシグナルペプチド貫通アミノ酸Ｍ１－Ｑ１４、ＡｖｉＴａｇ（商標）、およびＧＧリンカーを含む哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１＋に導入した。４つのアミノ酸修飾、Ｄ５１０Ａ、Ｅ５３６Ｒ、Ｄ１７１Ｋ、およびＤ５３９ＫをＰＣＲ突然変異誘発により導入して（表４を参照）、ＤＰＰ４結合が抑止された６つのＲＢＤ突然変異体を、Ｑ５Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、＃Ｅ０５５４）を製造者の指示に従って使用して作出した。
【0435】
【表8】
【0436】
モノクローナル抗体の合成Ｖ（Ｄ）Ｊ挿入断片ＬＣＡ６０、４Ｃ２ｈ、Ｄ１２、およびＭＥＲＳ－４Ｖ２は、オーバーラップＰＣＲにより個々に生成した（表４～５を参照）。ＰＣＲ産物は、ＰｒｏＮｅｘビーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、＃ＮＧ２００２）を製造者の指示に従って使用して回収した。その後、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙを使用して、ＰＣＲ産物を、ＳＰおよびＩｇカッパ定常領域Ｒ１－Ｃ１０７（軽鎖）またはＩｇＧ１ Ｈ定常領域Ａ１－Ｋ３３０（重鎖）を含むｐＳＦ発現ベクターにクローニングした。
【0437】
【表9-1】
【表9-2】
【表9-3】
【0438】
【表10】
【0439】
濃度ＥＬＩＳＡは、同様のサイズの購入した組換えタンパク質を陽性対照として使用して産生されたタンパク質の量の算出を目的とする。本プロジェクトに使用した３つの濃度ＥＬＩＳＡのうちの２つは、ＤＰＰ４－ＥＬＩＳＡ（すべてのヒトＤＰＰ４タンパク質を測定）およびＨｉｓ－ＥＬＩＳＡ（すべてのＨｉｓ含有タンパク質の濃度を測定）である（表６を参照）。
【0440】
最終的には、自製タンパク質のタンパク質濃度は、分光光度計（Ｂｉｏｚｙｍ社、＃３１ＤＳ－１１ＦＸＰＬＵＳ）上で測定した２８０ｎｍにおける吸収を理論的消衰係数間で深く追求することにより推定した（ＥｘｐａｓｙのＰｒｏｔＰａｒａｍツール、スイス生物情報学研究所、表７を参照）。この点を考慮して、９６ウェルハーフエリアプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ＯｎｅＧｍｂＨ、＃６７５０６１）を、ＤＰＰ４濃度ＥＬＩＳＡ用に自製タンパク質の出発濃度１０００ｎｇ／ｍｌによる段階希釈液、またはＨｉｓ濃度ＥＬＩＳＡ用に２００倍希釈サンプルでコーティングした。ＥＬＩＳＡ用標準タンパク質は、表７に示すように同一プレートにコーティングした。コーティングプレートは、４℃で一晩インキュベートした。
【0441】
【表11】
【0442】
【表12】
【0443】
１％Ｔｗｅｅｎ添加ＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）により自動洗浄機（Ｂｉｏｔｅｋ社、ＥＬ４０６）内でプレートを３回洗浄した。１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ２５μｌによりＲＴで１時間プレートをブロッキングした。ＰＢＳ－Ｔでプレートを３回洗浄し、一次抗体（表７）２５μｌを各ウェルに加えてＲＴで１時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔで３回プレートを洗浄し、二次抗体（表７）２５μｌを各ウェルに加えてＲＴで１時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔで３回プレートを洗浄し、４－ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物基質（ｐＮＰＰ）（Ｓｉｇｍａ社、＃Ｓ０４９２－５０ＴＡＢ）５０μｌを加えた。ｐＮＰＰ追加から丁度３０分後に、４０５ｎｍおよび６２０ｎｍにおけるウェルの吸光度を測定した（ＢｉｏＴｅｋ社、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５）。
【0444】
陽性対照において得られた値とこれらの実際の濃度との相関性を使用して、サンプルの濃度を算出した。
【0445】
自製抗体の濃度は、ＥＬＩＳＡを使用して決定する。ヤギ抗ＩｇＧヒト抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、＃２０４０－０４）を使用し、２μｇ／ｍｌの２５μｌを使用してプレートをコーティングする。プレートは、４℃で一晩インキュベートする。
【0446】
ＰＢＳ－Ｔで３回プレートを洗浄し、１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ２５μｌを使用してＲＴで１時間ブロッキングする。ＰＢＳ－Ｔでプレートを３回洗浄し、出発希釈がそれぞれ２００倍および２μｇ／ｍｌのサンプルおよび陽性対照（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、＃０１５０－０１）の段階希釈液２５μｌを加え、ＲＴで１時間インキュベートした。次いで、ＰＢＳ－Ｔで３回プレートを洗浄し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、＃２０４０－０４）２５μｌを加え、ＲＴで１時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔで３回プレートを洗浄し、ｐＮＰＰ（Ｓｉｇｍａ社、＃Ｓ０４９２－５０ＴＡＢ）５０μｌを加えた。ｐＮＰＰ追加から丁度３０分後に、４０５ｎｍおよび６２０ｎｍにおけるウェルの吸光度を測定した（ＢｉｏＴｅｋ社、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５）。
【0447】
ＤＰＰ４に対するＴｗｉｎ Ｓｔｒｅｐタグ化ＭＥＲＳ－ＣｏＶ－ＲＢＤおよびＭＥＲＳ－ＣｏＶスパイクの結合をＥＬＩＳＡにより試験した。９６ウェルハーフエリアプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ ＧｍｂＨ、＃６７５０６１）を、４μｇ／ｍｌの自製ＤＰＰ４ ２５μｌをＰＢＳ中に希釈したものを使用してコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。
【0448】
次いで、１００μｌ／ウェルのＰＢＳ－Ｔで３回プレートを洗浄した（Ｂｉｏｔｅｋ社、ＥＬ４０６）。１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ２５μｌによりＲＴで１時間プレートをブロッキングした。１００μｌ／ウェルのＰＢＳ－Ｔで３回プレートを洗浄し、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ－ＲＢＤまたはＭＥＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質の段階希釈液２５μｌを各ウェルに加え、ＲＴで１時間インキュベートした。段階希釈液は、出発濃度５０μｇ／ｍｌによる３倍希釈によって生成した。ＰＢＳ－Ｔで３回プレートを洗浄し、２μｇ／ｍｌのＡＰ共役ストレプトアビジン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、＃０１５０－０１）２５μｌを各ウェルに加え、ＲＴで１時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔで３回プレートを洗浄し、ｐＮＰＰ（Ｓｉｇｍａ社、＃Ｓ０４９２－５０ＴＡＢ）５０μＬを加えた。ｐＮＰＰ追加から丁度３０分後に、４０５ｎｍおよび６２０ｎｍにおけるウェルの吸光度を測定した（ＢｉｏＴｅｋ社、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５）。
【0449】
４０５ｎｍにおける吸光度の増加は、サンプルのＴｗｉｎ Ｓｔｒｅｐタグ化タンパク質に対するＤＰＰ４結合を示した。
【0450】
ＨＥＫ２９３を、加湿した８％ＣＯ２のインキュベーター内で３７℃の懸濁液中に培養した。タンパク質の生成では、細胞を１ｍｌあたり２×１０６細胞の密度に増殖させ、１ｍｇ／ｍｌのＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、＃２３９６６－１）およびプラスミドＤＮＡ３８μｇを使用してトランスフェクトし、３日間培養した。この後、細胞を４０００ｇによりＲＴで１０分間遠心分離し、上清を採取した。上清は、０．４５μｍのポリエーテルスルホン膜を使用して濾過した。生じた上清からタンパク質を、Ｈｉｓ Ｓｐｉｎ Ｔｒａｐ（商標）カラムにより製造者の指示に従って精製した（Ｃｙｔｉｖａ社、＃９５０５６－２９０）。溶出したタンパク質は、緩衝液交換によりリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に移した。緩衝液交換は、ＲＢＤタンパク質またはｈＤＰＰ４－Ｎ’Ｈｉｓおよびモノクローナル抗体のそれぞれについて、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４遠心分離フィルターユニットを１０ｋＤａまたは５０ｋＤａのカットオフにより使用する（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、＃ＵＦＣ８０１００８、＃ＵＦＣ８０５００８）４０００ｇで４～１４分間の遠心分離による４℃での６回の連続的濃縮工程および希釈工程を含む。タンパク質濃度は、すべてのタンパク質についてＥＬＩＳＡにより決定した。タンパク質の生成は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより確認した。
［実施例１０］
［実施例１０］
【0451】
ＭＥＲＳ－ｗｔＲＢＤまたは種々のＭＥＲＳ－ｍＲＢＤのいずれかの使用による血清由来のヒトＤＰＰ４およびウサギＤＰＰ４のプルダウンアッセイ － 図１０
図１０は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ ＲＢＤ突然変異Ｄ５１０Ａ（配列番号１９５）、Ｄ５３７Ｋ（配列番号１９６）、およびＤ５３９Ｋ（配列番号１９７）が、血清由来のヒトＤＰＰ４およびウサギＤＰＰ４のプルダウンを抑止することを示す。したがって、Ｄ５１０Ａ、Ｄ５３７、およびＤ５３９の突然変異は、血清ＤＰＰ４によるＭＥＲＳ－ＣｏＶ ＲＢＤのマスキング低下に適する。
図１０は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ ＲＢＤ突然変異Ｄ５１０Ａ（配列番号１９５）、Ｄ５３７Ｋ（配列番号１９６）、およびＤ５３９Ｋ（配列番号１９７）が、血清由来のヒトＤＰＰ４およびウサギＤＰＰ４のプルダウンを抑止することを示す。したがって、Ｄ５１０Ａ、Ｄ５３７、およびＤ５３９の突然変異は、血清ＤＰＰ４によるＭＥＲＳ－ＣｏＶ ＲＢＤのマスキング低下に適する。
【0452】
可溶性ＤＰＰ４は、ストレプトアビジン磁気ビーズ（ＩＢＡ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社、＃２－４０９０－０１０）と共役したＭＥＲＳ－ＲＢＤ－ＴｗｉｎＳｔｒｅｐを使用して血清２００μｌからプルダウンした。最初に、ストレプトアビジン磁気ビーズ１２０μｌを１．５ｍｌチューブに配置した。磁気ラックを使用して、ストレプトアビジン磁気ビーズを液体から分離した。液体を除去し、沈殿ビーズを１×洗浄緩衝液（ＩＢＡ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社、＃２－１００３－１００）１ｍｌで２回およびＰＢＳ１ｍｌで２回洗浄した。洗浄後、ビーズをＰＢＳ５０μｌ中に再懸濁させた。
【0453】
タンパク質を含むＴｗｉｎＳｔｒｅｐをストレプトアビジン磁気ビーズと、所望のタンパク質２４μｇを追加し、溶液を３７℃で１時間、１４００ｒｐｍで振盪させながらインキュベートすることにより共役させた（Ｓｔａｒｌａｂ社、＃Ｓ８０１２－００００）。１時間後、ビーズをＰＢＳ１ｍｌで３回洗浄し、磁気ラックを使用して沈殿させ、上清を交換した。ビーズのブロッキングは、ストレプトアビジン磁気ビーズの潜在的空間を占有するのに必要であった。ビーズのブロッキングは、ビーズを１％ＢＳＡ－ＰＢＳ１ｍｌ中にＲＴで１時間、１４００ｒｐｍで振盪させながらインキュベートすることにより行った。
【0454】
ブロッキング工程後、ビーズをＰＢＳ１ｍｌで３回洗浄し、最終的に、ＰＢＳ１２０μｌ中に再懸濁させた。ビーズ１２０μｌを２ｍｌチューブに移した。血清２００μｌを２ｍｌチューブに加えた。２ｍｌチューブは、５０ｍｌチューブ内にペーパータオルとともに配置して内部に確実に安定させた。５０ｍｌチューブは、４℃で一晩、回転させながらインキュベートした。
【0455】
一晩のインキュベーション後、２ｍｌチューブを磁気ラックに配置し、血清を採取してさらに解析する。沈殿ビーズをＰＢＳ１ｍｌで３回洗浄し、貯蔵してさらに解析する。
【0456】
可溶性ＤＰＰ４（ｓＤＰＰ４）の血清における酵素活性は、次のように測定した。
【0457】
第１に、９６ウェルプレート（Ｓｉｇｍａ社、＃Ｍ０８１２－１００ＥＡ）に、血清サンプル１０μＬに、３７℃に予熱したアッセイ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ９．０を３７℃で）８０μｌを添加した。第２に、プレートを３７℃で１５分間インキュベートした。第３に、基質Ｇｌｙ－Ｐｒｏ ｐ－ニトロアニリド（Ｂｉｏｚｏｌ社、＃ＢＡＣ－４０２５６１４．０２５０）をアッセイ緩衝液により５ｍＭの濃度に新鮮に調製した。次いで、基質１０μｌを各サンプルに加え、１５分毎に測定する３７℃で２時間の動態測定においてサンプルを４０５ｎｍの吸光度により測定した（ＢｉｏＴｅｋ社、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５）。吸光度をｐ－ニトロアニリン（ｐＮＡ）の生成およびその後のＤＰＰ４の濃度と関連させるために、ｐＮＡ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ、＃ｓｃ－２７２０００Ａ）および組換えＤＰＰ４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ社、＃Ｄ３４４６）の標準をプレート上に含み、表９および１０に示すように調製した。
【0458】
【表13】
【0459】
【表14】
【0460】
ＤＰＰ４活性アッセイの解析は、全体的にＲＳｔｕｄｉｏを使用して行う。
【0461】
最初に、２つのブランク値の平均値をすべての値から時間依存的に減算する。その後、ゼロ時点での測定値をすべてのサンプルから減算して、サンプル蛍光がさらなる算出に干渉することを回避する。
【0462】
既知濃度のｐ－ニトロアニリン（ｐＮＡ）対４０５ｎｍにおける吸光度の切片なし線形回帰を実施する。本解析用に選択されたデータは、４５分の時点に属するデータである。次いで、そこで得られた勾配を使用して、解析中にすべてのサンプルにより放出されたｐＮＡの量を測定する。
【0463】
次いで、対照ＤＰＰ４サンプルの活性（ｎｍｏｌ ｐＮＡ／分）を解析する。ＤＰＰ４に使用した最高濃度（０．３μｇ／ｍｌ）により、１５～６０分の吸光度の線形増加が示される。したがって、４５～６０分に高濃度ならびに低濃度のＤＰＰ４において最適な基質の切断が生じる。後の時点は、高濃度のＤＰＰ４に最適ではない。最適基質切断とは、ＤＰＰ４の濃度対活性の線形回帰のｒ二乗が０．９６よりも高いことを意味する。しかし、少量のＤＰＰ４を含むサンプルは、後の時点で測定すべきであり、この場合、高濃度の対照ＤＰＰ４サンプルは、最適基質切断が達成されるまで濾過して除外しなければならない。
【0464】
既知濃度のＤＰＰ４対最適基質切断において放出されたｐＮＡの切片なし線形回帰を実施する。勾配を使用して、サンプルにおける活性ＤＰＰ４（ａＤＰＰ４）の濃度を測定する。
［実施例１１］
［実施例１１］
【0465】
インシリコでのスコアリングのインビトロでの検証 － 図１３
図１３では、選択されたＲＢＤ変異体のＡＣＥ２結合の抑止およびｎＡｂエピトープの保存をインビトロで確認する。ｗｔＲＢＤおよび３つの代表的ＲＢＤ変異体を、ＡＣＥ２－ｈＦｃｇ１、クラス１およびクラス２のｎＡｂ（図１３ａ）ならびにクラス３およびクラス４のｎＡｂ（図１３ｂ）に対する結合についてＥＬＩＳＡにより検査した。抗スパイクＮＴＤ４Ａ８抗体ならびに抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶ抗体ＬＣＡ６０は、陰性対照として作用した。残存ｎＡｂ結合数および％ＡＣＥ２結合をＷＴと比較して呈示する。波長４０５ｎｍにおける光学密度ＯＤ。
図１３では、選択されたＲＢＤ変異体のＡＣＥ２結合の抑止およびｎＡｂエピトープの保存をインビトロで確認する。ｗｔＲＢＤおよび３つの代表的ＲＢＤ変異体を、ＡＣＥ２－ｈＦｃｇ１、クラス１およびクラス２のｎＡｂ（図１３ａ）ならびにクラス３およびクラス４のｎＡｂ（図１３ｂ）に対する結合についてＥＬＩＳＡにより検査した。抗スパイクＮＴＤ４Ａ８抗体ならびに抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶ抗体ＬＣＡ６０は、陰性対照として作用した。残存ｎＡｂ結合数および％ＡＣＥ２結合をＷＴと比較して呈示する。波長４０５ｎｍにおける光学密度ＯＤ。
【0466】
インシリコでのスコアリングの知見をインビトロでさらに検証するために、実施例３および実施例４と同様に、再び高スコア（Ｇ５０２Ｅ、総スコア４．７９）および中等スコア（Ｌ４５５Ｒ、総スコア３．０５）のＲＢＤ変異体が評価されたが、無視できるほどのスコアを有する変異体も存在した（Ｅ４８４Ｋ、総スコア－２．９３）。３つすべては、組換えにより生成して、ＡＣＥ２および別個の結合クラスの中和抗体（ｎＡｂ）に対する結合をＥＬＩＳＡにより検査した。
【0467】
したがって、組換えにより発現したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤ、完全スパイクまたはスパイクＮＴＤを高結合９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、＃ＣＬＳ３６９０）上にＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国、ＭＯ）により１０μｇ／ｍｌに希釈して＋４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳ／１％ＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社、Ｇｉｂｃｏ、米国、ＭＡ）により室温で１時間プレートをブロッキングした。血清およびタンパク質は、ＰＢＳ／１％ＢＳＡにより支持する段階希釈液に希釈し、コーティングしたプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートは、抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼ（ＡＰ）共役抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、＃２０４０－０４）または抗ウサギＩｇＧ－ＡＰコンジュゲート抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、＃１１１－０５６－００３）をともにＰＢＳ／１％ＢＳＡにより１：５００に希釈したものを用いて展開した。４－ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物基質（Ｓｉｇｍａ社、＃Ｓ０９４２－５０ＴＡＢ）を含む重炭酸緩衝液を加え、４０５ｎｍにおける吸光度をＣｙｔａｔｉｏｎ５デバイス（Ａｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＴｅｋ社）により測定した。指示するすべてのインキュベーション工程の間に、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０で３回プレートを洗浄した。ＩｇＧ力価（ＥＤ５０）は、非線形回帰によるＳ字曲線のフィッティングをＲ（ｓｔａｔｓパッケージ）により実施することによって決定した。曲線のフィッティングでは、Ｓ３０９（ＲＢＤ）または４Ａ８（ＮＴＤ）参照抗体の上下のプラトーは、それぞれのサンプルすべてに適用した。
【0468】
高スコアの変異体Ｇ５０２Ｅは、ＡＣＥ２結合を完全に抑止し、一方、検査したすべてのｎＡｂの結合は維持した。中等スコアの変異体Ｌ４５５Ｒは、ＡＣＥ２結合を部分的に抑止したが（ＷＴと比較して７１％抑止）、６つのクラス１およびクラス２のｎＡｂのうちの３つ、すなわち、Ｐ２Ｃ－１Ｆ１１２５、ＲＥＧＮ１０９３３２６、およびＣ１４４２７との相互作用も減弱させた。クラス３およびクラス４のｎＡｂは、Ｌ４５５Ｒ突然変異により影響されなかった。低スコアを有する変異体Ｅ４８４Ｋは、受容体結合に著しくは影響せず、一方、６つのクラス１およびクラス２のｎＡｂのうちの３つの結合は、低下または消失した（図１３Ａおよび１３Ｂ）。したがって、インビトロでの結果により、インシリコでのスコアリングが確認される。
【0469】
より広範なＲＢＤ変異体のセットをインビトロでさらに検査するために、クラス１およびクラス２の選択された３つのｎＡｂ、すなわち、ＣＣ１２．１２８、Ｐ２Ｃ－１Ｆ１１２５、およびＲＥＧＮ１０９３３２６に注目した。これらのエピトープは、ＡＣＥ２結合インターフェースと重複する。この結合データは、インシリコでのランキングから得られた勾配スコアを良好に反映した（図１３Ｃ）。
【0470】
実施例４、図６に加えて、顕著な数のＧ５０２アミノ酸交換がインシリコで高スコアを得たため、Ｇ５０２の位置におけるあり得るすべてのアミノ酸交換をインビトロで検査し、ｎＡｂまたはＡＣＥ２結合がわずかに低下したＧ５０２Ｋ、Ｇ５０２Ｌ、およびＧ５０２Ｆを除く、すべての変異体が、高い能力を示した。
［実施例１２］
［実施例１２］
【0471】
受容体結合の消失によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクの膜融合能が低下する － 図１４Ａ、Ｂ
受容体結合の消失が抗原の内部移行に干渉する － 図１４Ｃ、Ｄ
図１４は、（Ａ）三つ組での技術的反復によるＶｅｒｏＥ６合胞体の形成ならびに（Ｂ）二つ組での技術的反復によるＨＥＫ２９３Ｔ細胞間融合現象を示し、２つの位置はそれぞれ４８時間後の拡大率１０倍における画像により決定した。検出した合胞体数および１合胞体あたりの核の平均数は、中央値ならびに７５％および２５％のパーセンタイルを示すバイオリン図により表す。
受容体結合の消失が抗原の内部移行に干渉する － 図１４Ｃ、Ｄ
図１４は、（Ａ）三つ組での技術的反復によるＶｅｒｏＥ６合胞体の形成ならびに（Ｂ）二つ組での技術的反復によるＨＥＫ２９３Ｔ細胞間融合現象を示し、２つの位置はそれぞれ４８時間後の拡大率１０倍における画像により決定した。検出した合胞体数および１合胞体あたりの核の平均数は、中央値ならびに７５％および２５％のパーセンタイルを示すバイオリン図により表す。
【0472】
図１４Ｃおよび図１４Ｄは、１μＭのヘパリン（Ｄ）または培地のみ（Ｃ）で指示する時間にわたって前処理したＶｅｒｏＥ６細胞へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク内部移行動態の生細胞回転ディスク共焦点顕微鏡観察を、最大強度によるＺプロジェクションの代表的画像によって示す。すべての画像では、細胞質はＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）ＣＭＦＤＡにより染色した。すなわち、細胞は緑色で標識し、図１４Ｃ、Ｄでは灰色で示した。スパイクＡＦ６４７タンパク質はマゼンタで標識し、図１４Ｃ、Ｄでは白色で示した。ＨＩＶ－１糖タンパク質ｇｐ１４０ＢＧ５０５は、対照抗原として作用した。
【0473】
融合適格性抗原の表面発現によって、ＣＯＶＩＤ－１９による組織損傷の要因となる合胞体の形成を介して副作用が引き起こされ得る。受容体結合の抑止により融合が効率的に阻止されることを実証するために、膜貫通スパイク変異体を、後にＡＣＥ２－ｅＧＦＰトランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞と混合するＨＥＫ２９３Ｔ細胞、または後にＡＣＥ２を内因的に発現するＶｅｒｏＥ６細胞のいずれかにおいて発現させた。ＶｅｒｏＥ６合胞体形成およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞間融合アッセイを実施した。
【0474】
詳細には、インシリコで決定したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体の膜融合能を決定するために、種々のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク完全長タンパク質をｐＭＡＸ－ＧＦＰレポータープラスミド（カイアシ類ポテリーナ属（Ｐ．ｐｌｕｍａｔａ）由来、Ａ．Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａより寄贈）とともに１：１の比で追加したＰＥＩを三つ組で使用して、ＶｅｒｏＥ６細胞をトランスフェクトした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１完全長スパイクタンパク質は、対照として作用した。４８時間後、細胞をＮｕｃＢｌｕｅ（商標）ＬＩＶＥ／ＲＥＡＤＹ（商標）Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ Ｒｅａｇｅｎｔで染色し、位相差、ＤＡＰＩ、およびＣｙｔａｔｉｏｎ５デバイスのＧＦＰチャネル／フィルターを合胞体形成観察のために使用して画像化した。拡大率１０倍で撮影した写真を画像呈示ならびにＩｍａｇｅＪによる合胞体および核の計数に使用した。各複製を３回計数し、平均を取った。
【0475】
ＨＥＫ２９３細胞を二つ組で播種し、２つの群に分けた。ドナー群は、種々のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２完全長スパイクタンパク質ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１完全長スパイク対照タンパク質をＰＥＩによりトランスフェクトした。アクセプター群は、ヒトＡＣＥ２－ｅＧＦＰプラスミドをＰＥＩによりトランスフェクトした。翌日、両群の細胞を１：１の比率で相互に混合し、２４ウェルプレートに播種した。２４時間後、ＶｅｒｏＥ６細胞について記載のように、細胞を処理して解析した。
【0476】
同等レベルのスパイクタンパク質が細胞表面上に発現したが、Ｇ５０２ＥおよびＧ５０２Ｒは、膜融合活性を完全に抑止し、一方、変異体Ｌ４５５ＲおよびＥ４８４Ｋは、細胞を融合させる能力を低下させた（図１４Ａ、Ｂ）。受容体結合の抑止と同様に、プロリン２つ（２Ｐ）によりスパイクを安定化する置換によって、スパイクの膜融合活性が強力に阻止された。したがって、このデータは、受容体結合の抑止が、ワクチン誘導合胞体形成を回避するための融合前安定化に対する代替戦略となることを示唆する。
【0477】
ＡＣＥ２の内部移行および消失が誘導されるＡＣＥ２受容体に対するスパイク結合により、組織損傷が促進される。したがって、Ｇ５０２Ｅ変異体がスパイクの細胞取込みを抑止可能かどうかに、生細胞イメージングによってさらに取り組んだ。
【0478】
詳細には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２完全スパイクタンパク質およびＲＢＤタンパク質の内部移行を可視化するために、ＶｅｒｏＥ６細胞４０，０００個を８ウェルのＩｂｉｄｉガラス底スライド（Ｉｂｉｄｉ社、＃８０８２７）のウェルに播種した。翌日、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、核をＮｕｃＢｌｕｅ（商標）ＬＩＶＥ／ＲＥＡＤＹ（商標）Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃Ｒ３７６０５）により製造者の指示に従って３７℃で１５分間染色した。もう１回ＰＢＳで洗浄した後、細胞を予熱したＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＣＭＦＤＡ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社、＃Ｃ２９２５、作用濃度８μＭ）で染色し、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、ＣＭＦＤＡ溶液を取り除き、遊離した色素を、ＦＣＳ含有培地を５分間追加することによりクエンチした。もう１回のＰＢＳによる洗浄時に、細胞をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の１０μｇ／ｍｌのＲＢＤ溶液または２０μｇ／ｍｌのスパイク溶液、ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＮＴＤまたはＨＩＶ－１ ｇｐ１４０ ＢＧ５０５単離完全スパイク対照タンパク質でそれぞれ処理した。３７℃で９０分間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ中４％ＰＦＡ＋２０％スクロースにより４℃で２０分間固定した。その後、細胞を洗浄し、ＰＢＳ中に維持した。固定したサンプルの画像をＺｅｉｓｓ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７８０）上で取得した。検出では、光電子増倍管を使用した。この系は、Ｚｅｉｓｓ ＺＥＮ２０１０ソフトウェア（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ社）により制御した。固定したサンプルの単色および多色共焦点イメージングは、シーケンシャルモードで次のフルオロフォア特異的な励起（Ｅｘ．）および発光フィルター（ＥｍＦ．）設定により実施した：Ｈｏｅｃｈｓｔ（Ｅｘ．：４０５ｎｍ、ＥｍＦ．：４１５～４８０ｎｍ）、ＣＭＦＤＡ（Ｅｘ．：４８８ｎｍ、ＥｍＦ．：４９０～５７８ｎｍ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７（Ｅｘ．：６３３ｎｍ、ＥｍＦ．：６３８～７３５ｎｍ）。画像は、ＰＬ ＡＰＯ ＤＩＣ Ｍ２７ ６３×／１．４０ＮＡ油浸対物レンズ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ社）により取得した。細胞の下から上へのｚ－ｓｔａｃｋを８μｍにわたって０．３９μｍの間隔で実施した。ＦＩＪＩソフトウェアを使用してコントラスト調節、ｚプロジェクション、および正投影図を実施した（https://imagej.net/software/fiji/）。各条件は二つ組で実施した。
【0479】
ＲＢＤおよびスパイクタンパク質の吸収のライブイメージングを、ＶｅｒｏＥ６細胞を予熱したＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＣＭＦＤＡ溶液（作用濃度８μＭ）とともに３７℃で３０分間インキュベートすることにより実施した。その後、ＣＭＦＤＡ溶液を取り除き、遊離した色素を、ＦＣＳ含有培地を５分間追加することによりクエンチした。もう１回のＰＢＳによる洗浄時に、細胞を１μＭのブタヘパリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、＃Ｈ３３９３－５０ＫＵ）または培地のいずれかで１時間のみ前処理した。細胞は、１０％のＦＣＳおよび１％のペニシリン－ストレプトマイシンを加えた生細胞イメージング緩衝液Ｆｌｕｏｒｏｂｒｉｔｅ ＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社によるＧｉｂｃｏ、＃Ａ１８９６７０１）中で画像化した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＷＴおよびＧ５０２Ｅの溶液をそれぞれのウェルに加えて最終濃度２０μｇ／ｍｌとした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤ ＷＴおよびＧ５０２Ｅを加えて最終濃度１０μｇ／ｍｌとした。二色発光ライブイメージングを、Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｆｏｃｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｙｏｋｏｇａｗａ ＣＳＵ－Ｘ－１、自動ステージ、および加熱可能な湿潤チャンバーを有するＮｉｋｏｎ ＴｉＥを備えたＮｉｋｏｎ Ｓｐｉｎｎｉｎｇ Ｄｉｓｋ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅにより実施した。この系は、Ｎｉｋｏｎ ＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェア（ＮＩＳ５．０２．０１（ビルド１２７０））により制御した。細胞は、ＯＫＯＬＡＢ系により３７℃および５％ＣＯ２に制御して画像化した。画像取得では４０×ＮＡ０．９５空気対物レンズを、検出ではＥＭＣＣＤカメラ（Ａｎｄｏｒ ＡＵ－８８８）を使用した。画像は、１６ビットフォーマットで、１０２４×１０２４ピクセルおよび合計サイズ１６３×１６３μｍにより取得した。細胞株ＣＭＦＤＡは４８８ｎｍのレーザー（１５０ｍＷ）で、ＡＦ６４７標識タンパク質は６４０ｎｍのレーザー（１００ｍＷ）で励起させた。レーザー出力および露出時間は、１回の実験を通じて同一に維持した。μ－スライド８ウェルガラス底ｌｂｉｄｉチャンバーの各ウェルでは、５種の異なる位置を画像化した。ｚ－ｓｔａｃｋ（１１スライス、０．６μｍステップサイズ）をすべての位置についてＮｉｋｏｎＴｉＺ－Ｄｒｉｖｅを使用して設定した。タイムラプスでは、第１の画像（０分）は、標識タンパク質の追加前に、第２の画像はこの追加直後に、次いで、連続的に３０分毎に少なくとも１２時間取得した。ＦＩＪＩを使用してコントラスト調節、ｚプロジェクション、および時点選択を実施した（https://imagej.net/software/fiji/）。別々に処理したウェルの選択した時点を示す。各条件は、三つ組で実施した。
【0480】
蛍光標識したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク２Ｐタンパク質は、９０分以内にＶｅｒｏＥ６細胞によって吸着させ、内部移行させた（図１４Ｃ）。Ｇ５０２Ｅ変異体は、数時間で著しく減少し、スパイクの取込みを呈した。
【0481】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の単量体ＲＢＤは、細胞性ヘパラン硫酸（ＨＳ）を認識する結合部位を１つ、三量体完全スパイクタンパク質は、９つ保有すると最近報告され、この結合部位は、ウイルスの取込みに寄与し得る。したがって、ヘパリン存在下でのスパイクの内部移行を評価した。実際、ヘパリン処理により、スパイクの取込みならびに蛍光する細胞数が減少した（図１４Ｄ）。同様の結果は、Ｇ５０２Ｅスパイクについて観察された。したがって、Ｇ５０２Ｅ突然変異は、ＡＣＥ２媒介による取込みを消失させ、一方、他の受容体相互作用、例えば、ＨＳを通じてスパイクの部分的内部移行を維持する。まとめると、このデータは、本明細書に開示の方法による抗原デザインが、細胞間融合を阻止し、細胞表面から機能性受容体を除去し、ならびに抗原の取込みを減少させることにより、ワクチンの安全性および有効性に対する肯定的意義を有し得ることを示唆する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図14D】
【配列表】
【国際調査報告】