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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-08
(54)【発明の名称】コロナウイルス融合タンパク質
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20241001BHJP
C12N 15/50 20060101ALI20241001BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241001BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20241001BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241001BHJP
A61K 39/215 20060101ALI20241001BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20241001BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20241001BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20241001BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20241001BHJP
G01N 33/569 20060101ALI20241001BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241001BHJP
C07K 14/165 20060101ALN20241001BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00 ZNA
C12N15/50
C12N15/63 Z
A61K38/02
A61K48/00
A61K39/215
A61K39/39
A61K39/00 H
A61P31/14
A61K9/51
G01N33/569 L
C12N15/62 Z
C07K14/165
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024514688
(86)(22)【出願日】2022-09-07
(85)【翻訳文提出日】2024-04-22
(86)【国際出願番号】 EP2022074845
(87)【国際公開番号】W WO2023036814
(87)【国際公開日】2023-03-16
(31)【優先権主張番号】21306220.1
(32)【優先日】2021-09-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．プルロニック
(71)【出願人】
【識別番号】519437009
【氏名又は名称】ユニベルシテ デ トゥール
(71)【出願人】
【識別番号】521402321
【氏名又は名称】インスティトュート ナシオナル ドゥ ルシェルシェ プル ラグリキュルテュール，ラリマンタスィヨン エ ランヴィロンヌマン
(71)【出願人】
【識別番号】522430970
【氏名又は名称】ユニバーシティ デ リール
(71)【出願人】
【識別番号】521442659
【氏名又は名称】インスティテュート ナショナル デ ラ サンテ エ デ ラ ルシェルシュ メディカル
(71)【出願人】
【識別番号】523416689
【氏名又は名称】センター ホスピタリエ ウニベルシテール デ リール
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】オブリー，ニコラス
(72)【発明者】
【氏名】ブルサン，ファニー
(72)【発明者】
【氏名】ラクリフ，ジネブ
(72)【発明者】
【氏名】ディミア－ポアソン，イザベル
(72)【発明者】
【氏名】エパダウド，マシュー
(72)【発明者】
【氏名】カーペンティア，ロドルフ
(72)【発明者】
【氏名】トウゼ，アントワーヌ
(72)【発明者】
【氏名】メヴェレク，マリー－ノエル
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA65
4C076CC35
4C076FF32
4C076FF34
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA07
4C084AA13
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084BA41
4C084MA24
4C084MA38
4C084NA14
4C084ZB33
4C085AA03
4C085AA38
4C085BA71
4C085BA99
4C085CC21
4C085EE01
4C085FF24
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA01
4H045DA86
4H045EA31
4H045EA53
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、スパイク（Ｓ）タンパク質およびコロナウイルスの核タンパク質（Ｎ）の断片を含む融合タンパク質に関する。本発明はさらに、融合タンパク質を含むワクチン、組成物、医薬組成物または診断キット、コロナウイルスによる感染の診断方法、および融合タンパク質の使用に基づくコロナウイルス感染の予防または治療方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
コロナウイルスのスパイク（Ｓ）タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、およびコロナウイルスの核タンパク質（Ｎ）のアミノ酸配列の少なくとも１つの断片を含み、好ましくは前記コロナウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、融合タンパク質。
【請求項2】
前記スパイクタンパク質が、配列番号１もしくは配列番号１６もしくは配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１もしくは配列番号１６もしくは配列番号１８と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、前記核タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
少なくとも１つの二量体化ドメインおよび／または少なくとも１つの三量体化ドメインをさらに含み、好ましくは、前記三量体化ドメインが配列番号３もしくは配列番号１９の配列を含むかもしくはそれからなり、および／または前記二量体化ドメインが配列番号４もしくは配列番号２０の配列を含むかもしくはそれからなる、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
任意選択で、少なくとも１つのリンカーおよび／または少なくとも１つのフラグペプチドおよび／または少なくとも１つのタグペプチドおよび／または少なくとも１つのトロンビン切断部位をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
配列番号２１、２８、４６、４７、および４８を含むもしくはそれからなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号２１、２８、４６、４７、および４８と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる、請求項１～３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載の少なくとも１つの融合タンパク質と、少なくとも１つのＳタンパク質またはその断片、好ましくは三量体化ドメインをさらに含む少なくとも１つのＳタンパク質との集合によって形成される、ヘテロ多量体融合タンパク質。
【請求項7】
配列番号２１、２８、４６、４７、および４８を含むか、またはこれらからなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号２１、２８、４６、４７および４８と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる少なくとも１つの融合タンパク質、および配列番号１もしくは配列番号１６もしくは配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１もしくは配列番号１６もしくは配列番号１８と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる少なくとも１つのＳタンパク質を含み、好ましくは配列番号２６もしくは配列番号２９のアミノ酸配列、または配列番号２６もしくは配列番号２９と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかそれからなる三量体化ドメインをさらに含む少なくとも１つのＳタンパク質を有する、請求項６に記載のヘテロ多量体融合タンパク質。
【請求項8】
請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または請求項６もしくは請求項７に記載のヘテロ多量体融合タンパク質をコードする核酸分子であって、好ましくはｍＲＮＡ分子である、核酸分子。
【請求項9】
請求項８に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項10】
請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または請求項６もしくは請求項７に記載のヘテロ多量体融合タンパク質、または請求項８に記載の核酸分子を含むかまたはそれと会合したナノ粒子。
【請求項11】
請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項６もしくは請求項７に記載のヘテロ多量体融合タンパク質または請求項８に記載の核酸分子または請求項１０に記載のナノ粒子を含む組成物。
【請求項12】
任意選択でアジュバントと組み合わせる、請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または請求項６もしくは請求項７に記載のヘテロ多量体融合タンパク質、または請求項８に記載の核酸分子、または請求項１０に記載のナノ粒子を含むワクチン。
【請求項13】
請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または請求項６もしくは請求項７に記載のヘテロ多量体融合タンパク質、または請求項８に記載の核酸分子、または請求項１０に記載のナノ粒子と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項14】
医薬品として使用するための、請求項１から５のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または請求項６もしくは請求項７に記載のヘテロ多量体融合タンパク質、または請求項８に記載の核酸分子、または請求項１０に記載のナノ粒子、または請求項１２に記載のワクチン。
【請求項15】
コロナウイルス感染、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染またはＣＯＶＩＤ１９を治療および／または予防するために使用するための、請求項１から５のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または請求項６もしくは請求項７に記載のヘテロ多量体融合タンパク質、または請求項８に記載の核酸分子、または請求項１０に記載のナノ粒子、または請求項１２に記載のワクチン。
【請求項16】
前記融合タンパク質、前記ヘテロ多量体融合タンパク質、前記核酸分子、または前記ナノ粒子が経鼻投与される、請求項１５に記載の使用のための融合タンパク質、ヘテロ多量体融合タンパク質、核酸分子またはナノ粒子。
【請求項17】
請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項６もしくは請求項７に記載のヘテロ多量体融合タンパク質を含む診断キット。
【請求項18】
対象におけるコロナウイルス感染を診断するための方法であって、前記対象からの試料を、請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項６もしくは請求項７に記載のヘテロ多量体融合タンパク質と接触させる工程を含む方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、スパイク（Ｓ）タンパク質およびコロナウイルスの核タンパク質（Ｎ）の断片を含む融合タンパク質に関する。本発明はさらに、融合タンパク質を含むワクチン、組成物、医薬組成物または診断キット、コロナウイルスによる感染の診断方法、および融合タンパク質の使用に基づくコロナウイルス感染の予防または治療方法に関する。
【背景技術】
【0002】
コロナウイルス（ＣｏＶ）は、コロナウイルス科のリボ核酸（ＲＮＡ）ウイルスであり、特に、電子顕微鏡で見られる特有の形態、すなわち、それらのエンベロープの表面から突出するクラブ形状のスパイクに起因する冠状の外観を特徴とする。コロナウイルスは、哺乳動物および鳥類に感染し、広範囲の呼吸器、胃腸、神経および全身の疾患を引き起こす。
【0003】
ヒトコロナウイルスは、最初は、ほとんどの場合、風邪などの軽度の呼吸器感染のみを引き起こすと考えられていた。したがって、４つの流行性ヒトＣｏＶは、ヒト成人における上気道感染の１０％～３０％を占めると推定される。しかしながら、近年、重度の呼吸器疾患を引き起こす２つの高病原性コロナウイルス、すなわち２００３年に最初に同定された重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、および２０１２年に最初に同定された中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）が動物保菌宿主から出現した。
【0004】
２０１９年１２月、中国のＷｕｈａｎ Ｍｕｎｉｃｉｐａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅは、原因不明の新たな感染性呼吸器疾患を同定した。コロナウイルスＲＮＡは一部の患者で迅速に同定され、２０２０年１月に、新たに同定されたヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（以前は２０１９ ｎＣｏＶとして知られていた）の完全なゲノム配列が、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ＆Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，Ｆｕｄａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、上海、中国から公表された。ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２のゲノム配列は、ヒトＳＡＲＳ－ＣｏＶのゲノム配列と８２％のヌクレオチド同一性を有する（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｅｒｇ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ．２０２０；９（１）：２２１－２３６）。さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶについて以前に示したように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ウイルス細胞侵入のための受容体としてＡＣＥ２（アンジオテンシン変換酵素２）を利用する（Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０２０；１８１（２）：２７１－２８０．ｅ８）。
【0005】
症状を示す感染した対象において、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２によって引き起こされる疾患は、「コロナウイルス疾患２０１９」（ＣＯＶＩＤ－１９）と呼ばれている。ＣＯＶＩＤ－１９は、広い臨床スペクトルを有する呼吸器疾患である。罹患した対象の大部分は、軽度または中程度の症状を経験する。ＣＯＶＩＤ－１９は、一般に、頭痛、筋肉痛、疲労、発熱および呼吸器症状（乾性咳、息切れ、および／または胸部圧迫感など）を含む症状を最初に呈する。他の報告された症状には、匂いおよび／または味の喪失が含まれる。一部の対象は、肺炎および急性呼吸不全をもたらし得る重症型のＣＯＶＩＤ－１９を発症する。ＣＯＶＩＤ－１９の合併症には、血栓性合併症、肺塞栓症、心血管不全、腎不全、肝不全、および二次感染が含まれる。
【0006】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して有効なワクチンを作製するための世界的な取り組みがなされており、依然として進行中である。世界保健機関によると、２０２２年８月現在、１９８種のワクチン候補が前臨床開発の最中であり、１７０種が臨床開発の最中である。ウイルスの免疫優性抗原として同定されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイク（Ｓ）タンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して開発された第１世代のワクチンで使用されている。現在、６つのワクチンが欧州医薬品庁によって成人への投与について承認されており、スパイクタンパク質に基づく全不活性化ウイルス、タンパク質、ｍＲＮＡまたはアデノウイルス含有ワクチンのいずれかであり、これらはすべて筋肉内投与される。しかし、スパイクタンパク質は重要な配列可変性を示しており、様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体の出現に至り、現在使用されている異なるワクチンの有効性が疑問視されている。さらに、筋肉内ワクチンは、ウイルスが気道の粘膜を通って生物に入るのに対して、全身性免疫応答を誘発するだけであるという欠点を呈する。誘導された免疫応答のこの特異性は、感染症を発症していないが、依然として気道にウイルスを保有しており、依然として他者を汚染する可能性がある、ワクチン接種された人々によるウイルスの拡散を引き起こすことが示されている。
【0007】
したがって、（ｉ）経時的に出現するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびその複数の変異体などのコロナウイルスによる感染を防ぐことを可能にし、（ｉｉ）全身性免疫応答に加えて、粘膜部位での免疫応答の誘導を可能にする、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルスに対するより強力なワクチンを作り上げる必要性が依然として存在する。
【0008】
核タンパク質（Ｎ）は、コロナウイルスにおいて最も豊富なタンパク質であり、強く免疫原性であり、高度に保存された配列を提示する。したがって、核タンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびその変異体などのコロナウイルスに対する新しいワクチンの設計のための興味深い潜在的な標的である。しかしながら、このタンパク質は、真核細胞において産生することが困難であり、それにより、ワクチン組成物においてそれを使用することを制限する。
【0009】
本発明において、出願人らは、２つの抗原、つまりスパイクタンパク質および核タンパク質の少なくとも断片を含む融合タンパク質を開示し、この融合タンパク質が容易に産生され得、コロナウイルス感染を治療または予防するための第２世代のワクチンを提供し得ることを実証する。さらに、出願人らは、ナノ粒子との融合タンパク質の製剤化およびそれらの鼻腔内投与は、感染症に対して保護し、ウイルスとの遭遇後に強い粘膜および全身性免疫応答をもたらすが、伝染性も抑止するということを実証した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0010】
（非特許文献１）Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｍｅｒｇ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ．２０２０；９（１）：２２１－２３６
（非特許文献２）Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ．２０２０；１８１（２）：２７１－２８０．ｅ８
（非特許文献２）Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ．２０２０；１８１（２）：２７１－２８０．ｅ８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明は、コロナウイルスのスパイク（Ｓ）タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、およびコロナウイルスの核タンパク質（Ｎ）のアミノ酸配列の少なくとも１つの断片を含み、好ましくはコロナウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、融合タンパク質に関する。
【課題を解決するための手段】
【0012】
一実施形態では、スパイクタンパク質が、配列番号１もしくは配列番号１６もしくは配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１もしくは配列番号１６もしくは配列番号１８と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、核タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【0013】
一実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つの二量体化ドメインおよび／または少なくとも１つの三量体化ドメインをさらに含み、好ましくは、防御三量体化ドメインが配列番号３もしくは配列番号１９の配列を含むかもしくはそれからなり、および／または防御二量体化ドメインが配列番号４もしくは配列番号２０の配列を含むかもしくはそれからなる。
【0014】
一実施形態では、融合タンパク質は、任意選択で、リンカーおよび／またはフラグペプチドおよび／またはタグペプチドおよび／またはトロンビン切断部位をさらに含む。一実施形態では、融合タンパク質は、任意選択で、少なくとも１つのリンカーおよび／または少なくとも１つのフラグペプチドおよび／または少なくとも１つのタグペプチドおよび／または少なくとも１つのトロンビン切断部位をさらに含む。
【0015】
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２１、２８、４６、４７、および４８を含むもしくはそれからなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号２１、２８、４６、４７、および４８と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる。
【0016】
本発明はさらに、本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質と、少なくとも１つのＳタンパク質またはその断片、好ましくは三量体化ドメインをさらに含む少なくとも１つのＳタンパク質との集合によって形成されるヘテロ多量体融合タンパク質に関する。一実施形態では、ヘテロ多量体融合タンパク質は、ヘテロ二量体融合タンパク質である。一実施形態では、ヘテロ多量体融合タンパク質はヘテロ三量体融合タンパク質である。一実施形態では、ヘテロ多量体融合タンパク質は、ヘテロ六量体融合タンパク質である。
【0017】
一実施形態では、ヘテロ多量体融合タンパク質は、配列番号２１、２８、４６、４７、および４８を含むか、またはこれらからなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号２１、２８、４６、４７または４８と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる少なくとも１つの融合タンパク質、および配列番号１、配列番号１６もしくは配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１、配列番号１６もしくは配列番号１８と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる少なくとも１つのＳタンパク質を含み、好ましくは配列番号２６もしくは配列番号２９のアミノ酸配列、または配列番号２６もしくは配列番号２９と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかそれからなる三量体化ドメインをさらに含む少なくとも１つのＳタンパク質を有する。
【0018】
本発明はさらに、本明細書に記載の融合タンパク質またはヘテロ多量体融合タンパク質をコードする核酸分子（または少なくとも１つの核酸分子）に関する。好ましくは、前述の核酸分子はｍＲＮＡ分子である。
【0019】
本発明はさらに、本明細書に記載の核酸分子を含む発現ベクターに関する。
【0020】
本発明はさらに、本明細書に記載のベクターを含む宿主細胞に関する。
【0021】
本発明はさらに、本明細書に記載の融合タンパク質または本明細書に記載のヘテロ多量体融合タンパク質または本明細書に記載の核酸分子を含むナノ粒子に関する。本発明はさらに、本明細書に記載の融合タンパク質または本明細書に記載のヘテロ多量体融合タンパク質または本明細書に記載の核酸分子に会合したナノ粒子に関する。
【0022】
本発明はさらに、本明細書に記載の融合タンパク質または本明細書に記載のヘテロ多量体融合タンパク質または本明細書に記載の核酸分子または本明細書に記載のナノ粒子を含む組成物に関する。
【0023】
本発明はさらに、任意選択でアジュバントと組み合わせる、本明細書に記載の融合タンパク質または本明細書に記載のヘテロ多量体融合タンパク質または本明細書に記載の核酸分子または本明細書に記載のナノ粒子を含むワクチンに関する。
【0024】
本発明はさらに、本明細書に記載の融合タンパク質または本明細書に記載のヘテロ多量体融合タンパク質または本明細書に記載の核酸分子または本明細書に記載のナノ粒子と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物に関する。
【0025】
本発明はさらに、医薬品として使用するための、本明細書に記載の融合タンパク質、または本明細書に記載のヘテロ多量体融合タンパク質、または本明細書に記載の核酸分子、または本明細書に記載のナノ粒子、または本明細書に記載のワクチンに関する。
【0026】
本発明はさらに、コロナウイルス感染、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染またはＣＯＶＩＤ１９を治療および／または予防するために使用するための、本明細書に記載の融合タンパク質または本明細書に記載のヘテロ多量体融合タンパク質または本明細書に記載の核酸分子または本明細書に記載のナノ粒子または本明細書に記載のワクチンに関する。
【0027】
一実施形態では、融合タンパク質またはヘテロ多量体融合タンパク質または核酸分子またはナノ粒子は、経鼻投与される。
【0028】
本発明はさらに、本明細書に記載の融合タンパク質または本明細書に記載のヘテロ多量体融合タンパク質を含む診断キットに関する。
【0029】
本発明はさらに、対象におけるコロナウイルス感染を診断するための方法であって、対象からの試料を、本発明の融合タンパク質または本発明のヘテロ多量体融合タンパク質と接触させる工程を含む方法に関する。
【0030】
本発明はさらに、コロナウイルスの核タンパク質（Ｎ）を産生するための方法であって、
ａ）本明細書に記載の核酸分子またはベクターを含む宿主細胞を培養する工程、
ｂ）本明細書に記載の融合タンパク質を回収する工程、
ｃ）工程ｂ）で回収された融合タンパク質を指向性タンパク質分解によって切断し、それによってコロナウイルスの核タンパク質（Ｎ）を放出する工程、および
ｄ）任意選択で、コロナウイルスの核タンパク質（Ｎ）を精製する工程を含む、前述の方法に関する。
ａ）本明細書に記載の核酸分子またはベクターを含む宿主細胞を培養する工程、
ｂ）本明細書に記載の融合タンパク質を回収する工程、
ｃ）工程ｂ）で回収された融合タンパク質を指向性タンパク質分解によって切断し、それによってコロナウイルスの核タンパク質（Ｎ）を放出する工程、および
ｄ）任意選択で、コロナウイルスの核タンパク質（Ｎ）を精製する工程を含む、前述の方法に関する。
【0031】
定義
本発明において、以下の用語は、以下の意味を有する。
本発明において、以下の用語は、以下の意味を有する。
【0032】
数字の前の「約」は、その数字の値のプラスまたはマイナス１０％以下を包含する。「約」という用語が指す値自体がまた、具体的に、また好ましくは開示されているということを理解されたい。
【0033】
「同一性」または「同一」は、２つ以上のアミノ酸配列または２つ以上の核酸配列の配列間の関係において本明細書で使用されている場合、２つ以上のアミノ酸残基または核酸残基の連続の間のマッチ数によって決定される、アミノ酸配列または核酸配列間の配列の関連性の程度を指す。「同一性」は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって対処されるギャップアラインメント（存在する場合）を伴う２つ以上の配列のうちの小さい方の配列間において、同一のマッチのパーセントを測定する。関連するアミノ酸配列または核酸配列の同一性は、公知の方法によって容易に計算することができる。そのような方法には、Ｌｅｓｋ Ａ．Ｍ．（１９８８）．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｓｍｉｔｈ Ｄ．Ｗ．（１９９３）．Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｅ ｐｒｏｊｅｃｔｓ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｇｒｉｆｆｉｎ Ａ．Ｍ．＆Ｇｒｉｆｆｉｎ Ｈ．Ｇ．（１９９４）．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １．Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ Ｇ．（１９８７）．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ：ｔｒｅａｓｕｒｅ ｔｒｏｖｅ ｏｒ ｔｒｉｖｉａｌ ｐｕｒｓｕｉｔ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ：Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ Ｍ．Ｒ．＆Ｄｅｖｅｒｅｕｘ Ｊ．（１９９１）．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｒｉｍｅｒ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ；Ｃａｒｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９８８．ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌ Ｍａｔｈ．４８（５）：１０７３－８２に記載されているものが含まれるが、これらに限定されない。同一性を判定するための好ましい方法は、試験される配列間で最大限一致を与えるように設計される。同一性を判定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を判定するための好ましいコンピュータプログラム方法は、ＧＡＰを含むＧＣＧプログラムパッケージを含む（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２（１ Ｐｔ １）：３８７－９５），ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ａｎｄ ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３－１０）。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）および他の情報源から公的に入手可能である（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４）。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して、同一性を判定することもできる。
【0034】
「薬学的に許容される賦形剤」または「薬学的に許容される担体」は、哺乳動物、好ましくはヒトに投与したときに有害なアレルギー反応または他の不都合な反応を引き起こさない賦形剤または担体を指す。それは、例えば、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などのありとあらゆる溶媒を含む。したがって、薬学的に許容される賦形剤または担体は、任意の種類の非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料または製剤補助剤を示し得る。ヒトへの投与の場合、製剤は、ＦＤＡ（米国食品医薬品局）またはＥＭＡ（欧州医薬品庁）などの規制当局によって要求される無菌性、発熱原性、一般的な安全性および純度の基準を満たすべきである。
【0035】
「タンパク質」は、具体的には、１つまたは複数のペプチドまたはポリペプチド、および任意選択で非ポリペプチド補因子から形成される機能的実体を指す。
【0036】
「対象」は、哺乳動物、好ましくはヒトを指す。一実施形態では、対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルスに曝露されたまたは曝露を受けやすい哺乳動物、好ましくはヒトである。一実施形態では、対象は、コロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス、特にＣＯＤＩＶ－１９によって引き起こされる疾患に罹患している哺乳動物、好ましくはヒトである。一実施形態では、対象は、「患者」、すなわち、医療を受けることを待っているか、医療を受けているか、または医療処置の対象であった／対象である／対象となる哺乳動物、好ましくはヒトである。
【0037】
「Ｔｒｅａｔｉｎｇ（治療する、処置する）」または「Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（治療、処置）」は、治療上の治療、予防的（または防ぐ）処置、または治療上の治療と予防的（または防ぐ）処置の両方を指し、目的は、それを必要とする対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされるＣＯＶＩＤ－１９などのコロナウイルス感染の症状または症候の１つまたは複数を予防、減少、緩和、および／または減速（弱化）することである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされるＣＯＶＩＤ－１９などのコロナウイルス感染の症状には、限定するものではないが、発熱、ならびに呼吸の補助（例えば、補充酸素、非侵襲的換気、侵襲的機械換気、体外膜酸素化（ＥＣＭＯ））を必要とし得る乾性咳および／または呼吸困難などの呼吸器の症状が含まれる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされるＣＯＶＩＤ－１９などのコロナウイルス感染の症候には、限定するものではないが、対象由来の生物学的試料で検出されたウイルス量（ウイルス負荷またはウイルス力価としても知られる）も含まれる。一実施形態では、「ｔｒｅａｔｉｎｇ（治療する、処置する）」または「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（治療、処置）」は、治療での治療を指す。別の実施形態では、「ｔｒｅａｔｉｎｇ（治療する、処置する）」または「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（治療、処置）」は、予防的処置または防ぐ処置を指す。さらに別の実施形態では、「ｔｒｅａｔｉｎｇ（治療する、処置する）」または「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（治療、処置）」は、予防的（または防ぐ）処置および治療上の治療の両方を指す。
【発明を実施するための形態】
【0038】
本発明は、最初に、コロナウイルスのスパイク（Ｓ）タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、およびコロナウイルスの核タンパク質（Ｎ）のアミノ酸配列の少なくとも１つの断片を含む融合タンパク質に関する。一実施形態では、Ｓタンパク質およびＮタンパク質は、同じコロナウイルスに由来する。別の実施形態では、Ｓタンパク質およびＮタンパク質は、別個のコロナウイルスに由来する。本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」という用語は、コロナウイルスのスパイク（Ｓ）タンパク質の少なくとも１つの断片と、コロナウイルスの（好ましくは前述のコロナウイルスの）核タンパク質（Ｎ）の少なくとも１つの断片との融合によって形成されるタンパク質を指す。
【0039】
一実施形態では、コロナウイルスはヒトコロナウイルスである。一実施形態では、コロナウイルスは、アルファコロナウイルスまたはベータコロナウイルス、好ましくはベータコロナウイルスである。
【0040】
アルファコロナウイルスの例としては、限定されないが、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ）、および時にＨＣｏＶ－ＮＨまたはＮｅｗ Ｈａｖｅｎヒトコロナウイルスとしても知られるヒトコロナウイルスＮＬ６３（ＨＣｏＶ－ＮＬ６３）が挙げられる。
【0041】
ベータコロナウイルスの例には、ヒトコロナウイルスＯＣ４３（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３）、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１（ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１）、新規コロナウイルス２０１２またはＨＣｏＶ－ＥＭＣとして以前に知られていた中東呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１またはＳＡＲＳ－クラシックとしても知られている重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、および２０１９－ｎＣｏＶまたは新規コロナウイルス２０１９としても知られている重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が含まれるが、これらに限定されない。
【0042】
一実施形態では、コロナウイルスは、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む群またはそれらからなる群から選択される。一実施形態では、コロナウイルスは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む群またはそれらからなる群から選択される。
【0043】
一実施形態では、コロナウイルスは、ＭＥＲＳコロナウイルス、特に、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）を引き起こすＭＥＲＳ－ＣｏＶである。
【0044】
一実施形態では、コロナウイルスはＳＡＲＳコロナウイルスである。一実施形態では、コロナウイルスが、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）を引き起こすＳＡＲＳ－ＣｏＶ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１とも呼ばれる）またはＣＯＶＩＤ－１９を引き起こすＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。一実施形態では、コロナウイルスは、ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こすＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。
【0045】
本明細書で使用される場合、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」は、中国のＷｕｈａｎで最初に同定されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびその任意の変異体を包含する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異体は、Ｓ（スパイク）タンパク質または糖タンパク質、Ｅ（エンベロープ）タンパク質、Ｍ（膜）タンパク質、およびＮ（核タンパク質）タンパク質として知られるそれらの非構造レプリカーゼポリタンパク質およびそれらの４つの構造タンパク質を含むそれらのタンパク質のいずれかにおける１つまたは複数の変異の存在によって、互いに異なり得る。特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異体は、それらのＳタンパク質において１つまたは複数の変異が存在することによって、互いに異なり得る。
【0046】
米国疾病管理予防センター（ＣＤＣ）によって示されているように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体の例には、限定するものではないが、以下が含まれる。
－アルファ（ＷＨＯ分類表示）、ＶＵＩ－２０２０１２／０１、ＶＯＣ－２０２０１２／０１、２０Ｉ／５０１Ｙ．Ｖ１または口語的に「英国型変異株もしくは英国型変異株または英国変異体」としても知られており、Ｓタンパク質（配列番号１６の配列に基づく）に以下の変異、６９ｄｅｌ、７０ｄｅｌ、１４４ｄｅｌ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、および任意選択でＥ４８４Ｋ、Ｓ４９４Ｐ、および／またはＫ１１９１Ｎを含む、変異体Ｂ．１．１．７。配列番号１に基づく対応する変異は以下の通りである：５７ｄｅｌ、５８ｄｅｌ、１３２ｄｅｌ、Ｎ４８９Ｙ、Ａ５５８Ｄ、Ｄ６０２Ｇ、Ｐ６６９Ｈ、Ｔ７０１Ｉ、Ｓ９６７Ａ、Ｄ１１０３Ｈおよび任意でＥ４７２Ｋ、Ｓ４８２Ｐ、および／またはＫ１１７６Ｎ。
－ベータ（ＷＨＯ分類表示）、２０Ｈ／５０１Ｙ．Ｖ２（旧２０Ｃ／５０１Ｙ．Ｖ２）、または口語で「南アフリカ」変異体としても知られ、Ｓタンパク質における以下の変異を含む、変異体Ｂ．１．３５１（配列番号１６の配列に基づく）：Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、２４１ｄｅｌ、２４２ｄｅｌ、２４３ｄｅｌ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ａ７０１Ｖ。配列番号１に基づく対応する変異は以下の通りである：Ｄ６８Ａ、Ｄ２０３Ｇ、２２９ｄｅｌ、２３０ｄｅｌ、２３１ｄｅｌ、Ｋ４０５Ｎ、Ｅ４７２Ｋ、Ｎ４８９Ｙ、Ｄ６０２Ｇ、Ａ６８６Ｖ、
－ガンマ（ＷＨＯ分類表示）、２０Ｊ／５０１Ｙ．Ｖ３、または口語で「ブラジル型変異株」変異体としても知られ、Ｓタンパク質における以下の変異を含む、変異体Ｐ．１（配列番号１６の配列に基づく）：Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７Ｉ。配列番号１に基づく対応する変異は以下の通りである：Ｌ６Ｆ、Ｔ８Ｎ、Ｐ１４Ｓ、Ｄ１２６Ｙ、Ｒ１７８Ｓ、Ｋ４０５Ｔ、Ｅ４７２Ｋ、Ｎ４８９Ｙ、Ｄ６０２Ｇ、Ｈ６４３Ｙ、Ｔ１０１２Ｉ、
－ゼータ（ＷＨＯ分類表示）、または２０Ｊ、またはブラジルで最初に検出された変異体としても知られ、Ｓタンパク質における以下の変異を含む、変異体Ｐ．２（配列番号１６の配列に基づく）：Ｅ４８４Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｖ１１７６Ｆ、および任意選択でＦ５６５Ｌ。配列番号１に基づく対応する変異は以下の通りである：Ｅ４７３Ｋ、Ｄ６０２Ｇ、Ｖ１１６１Ｆ、および任意選択でＦ５５３Ｌ、
－２０Ａ／４８４Ｑ、または口語で「インド型変異株」としても知られ、Ｓタンパク質における以下の変異を含む、変異体Ｂ．１．６１７（配列番号１６の配列に基づく）：Ｌ４５２Ｒ、Ｅ４８４Ｑ、Ｄ６１４Ｇ。配列番号１に基づく対応する変異は以下の通りである：Ｌ４４０Ｒ、Ｅ４７２Ｑ、Ｄ６０２Ｇ、
－カッパ（ＷＨＯ分類表示）、または２０Ａ／Ｓ：１５４Ｋ、インドで最初に検出された変異体としても知られ、Ｓタンパク質における以下の変異を含む、変異体Ｂ．１．６１７．１（配列番号１６の配列に基づく）：Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５４Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｅ４８４Ｑ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ、Ｑ１０７１Ｈ、および任意選択でＴ９５Ｉ。配列番号１に基づく対応する変異は以下の通りである：Ｇ１３０Ｄ、Ｅ１４２Ｋ、Ｌ４４０Ｒ、Ｅ４７２Ｑ、Ｄ６０２Ｇ、Ｐ６６９Ｒ、Ｑ１０４１Ｈ、および任意選択でＴ８３Ｉ、
－デルタ（ＷＨＯ分類表示）、または２０Ａ／Ｓ：４７８Ｋ、インドで最初に検出された変異体としても知られ、Ｓタンパク質における以下の変異を含む、変異体Ｂ．１．６１７．２（配列番号１６の配列に基づく）：Ｔ１９Ｒ、１５６ｄｅｌ、１５７ｄｅｌ、Ｒ１５８Ｇ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ、Ｄ９５０Ｎ、および任意選択でＧ１４２Ｄ。配列番号１に基づく対応する変異は以下の通りである：Ｔ７Ｒ、１４４ｄｅｌ、１４５ｄｅｌ、Ｒ１４６Ｇ、Ｌ４４０Ｒ、Ｔ４６６Ｋ、Ｄ６０２Ｇ、Ｐ６６９Ｒ、Ｄ９３５Ｎ、および任意選択でＧ１３０Ｄ、
－インドで最初に検出された変異体で、Ｓタンパク質における以下の変異を含む、変異体Ｂ．１．６１７．３（配列番号１６の配列に基づく）：Ｔ１９Ｒ、Ｇ１４２Ｄ、Ｌ４５２Ｒ、Ｅ４８４Ｑ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ、Ｄ９５０Ｎ。配列番号１に基づく対応する変異は以下の通りである：Ｔ７Ｒ、Ｇ１３０Ｄ、Ｌ４４０Ｒ、Ｅ４７２Ｑ、Ｄ６０２Ｇ、Ｐ６６９Ｒ、Ｄ９３５Ｎ、
－イプシロン（ＷＨＯ分類表示）、または２０Ｃ／Ｓ：４５２Ｒとしても知られ、Ｓタンパク質における以下の変異を含む、変異体Ｂ．１．４２７（配列番号１６の配列に基づく）：Ｌ４５２Ｒ、Ｄ６１４Ｇ。配列番号１に基づく対応する変異は以下の通りである：Ｌ４４０Ｒ、Ｄ６０２Ｇ、
－２０Ｃ／Ｓ：４５２Ｒとしても知られ、Ｓタンパク質における以下の変異を含む、変異体Ｂ．１．４２９（配列番号１６の配列に基づく）：Ｓ１３Ｉ、Ｗ１５２Ｃ、Ｌ４５２Ｒ、Ｄ６１４Ｇ。配列番号１に基づく対応する変異は以下の通りである：Ｓ１Ｉ、Ｗ１４０Ｃ、Ｌ４４０Ｒ、Ｄ６０２Ｇ、
－エータ（ＷＨＯ分類表示）、または２０Ａ／Ｓ：４８４Ｋとしても知られ、Ｓタンパク質における以下の変異を含む、変異体Ｂ．１．５２５（配列番号１６の配列に基づく）：Ａ６７Ｖ、６９ｄｅｌ、７０ｄｅｌ、１４４ｄｅｌ、Ｅ４８４Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｑ６７７Ｈ、Ｆ８８８Ｌ。配列番号１に基づく対応する変異は以下の通りである：Ａ５５Ｖ、５７ｄｅｌ、５８ｄｅｌ、１３２ｄｅｌ、Ｅ４７２Ｋ、Ｄ６０２Ｇ、Ｑ６６５Ｈ、Ｆ８７３Ｌ、
－イオタ（ＷＨＯ分類表示）、または２０Ｃ／Ｓ：４８４Ｋとしても知られ、Ｓタンパク質における以下の変異を含む、変異体Ｂ．１．５２６（配列番号１６の配列に基づく）：Ｔ９５Ｉ、Ｄ２５３Ｇ、Ｄ６１４Ｇ、および任意選択で、Ｌ５Ｆ、Ｓ４７７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、および／またはＡ７０１Ｖ。配列番号１に基づく対応する変異は以下の通りである：Ｔ８３Ｉ、Ｄ２４１Ｇ、Ｄ６０２Ｇ、および任意選択で、Ｓ４６５Ｎ、Ｅ４７２Ｋ、および／またはＡ６８６Ｖ、
－２０Ｃとしても知られ、Ｓタンパク質における以下の変異を含む、変異体Ｂ．１．５２６．１（配列番号１６の配列に基づく）：Ｄ８０Ｇ、１４４ｄｅｌ、Ｆ１５７Ｓ、Ｌ４５２Ｒ、Ｄ６１４Ｇ、Ｄ９５０Ｈ、および任意選択でＴ７９１Ｉおよび／またはＴ８５９Ｎ。配列番号１に基づく対応する変異は以下の通りである：Ｄ６８Ｇ、１３２ｄｅｌ、Ｆ１４５Ｓ、Ｌ４４０Ｒ、Ｄ６０２Ｇ、Ｄ９３５Ｈ、および任意選択でＴ７７６Ｉおよび／またはＴ８４４Ｎ。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体の例には、限定するものではないが、以下がさらに含まれる。
－シータ（ＷＨＯ分類表示）としても知られ、Ｓタンパク質における以下の変異を含む、変異体Ｐ．３（配列番号１６の配列に基づく）：Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、
－ラムダ（ＷＨＯ分類表示）としても知られ、Ｓタンパク質における以下の変異を含む、変異体Ｃ．３７（配列番号１６の配列に基づく）：Ｌ４５２Ｑ、Ｆ４９０Ｓ、Ｄ６１４Ｇ、
－ミュー（ＷＨＯ分類表示）としても知られ、Ｓタンパク質における以下の変異を含む、変異体Ｂ．１．６２１（配列番号１６の配列に基づく）：Ｒ３４６Ｋ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、および
－オミクロン（ＷＨＯ分類表示）としても知られ、Ｓタンパク質における以下の変異を含む、変異体Ｂ．１．１．５２９（配列番号１６の配列に基づく）：Ａ６７Ｖ、ｄｅｌ６９－７０、Ｔ９５Ｉ、ｄｅｌ１４２－１４４、Ｙ１４５Ｄ、ｄｅｌ２１１、Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｒ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ｔ５４７Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ７６４Ｋ、Ｄ７９６Ｙ、Ｎ８５６Ｋ、Ｑ９５４Ｈ、Ｎ９６９Ｋ、Ｌ９８１Ｆ。
－アルファ（ＷＨＯ分類表示）、ＶＵＩ－２０２０１２／０１、ＶＯＣ－２０２０１２／０１、２０Ｉ／５０１Ｙ．Ｖ１または口語的に「英国型変異株もしくは英国型変異株または英国変異体」としても知られており、Ｓタンパク質（配列番号１６の配列に基づく）に以下の変異、６９ｄｅｌ、７０ｄｅｌ、１４４ｄｅｌ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、および任意選択でＥ４８４Ｋ、Ｓ４９４Ｐ、および／またはＫ１１９１Ｎを含む、変異体Ｂ．１．１．７。配列番号１に基づく対応する変異は以下の通りである：５７ｄｅｌ、５８ｄｅｌ、１３２ｄｅｌ、Ｎ４８９Ｙ、Ａ５５８Ｄ、Ｄ６０２Ｇ、Ｐ６６９Ｈ、Ｔ７０１Ｉ、Ｓ９６７Ａ、Ｄ１１０３Ｈおよび任意でＥ４７２Ｋ、Ｓ４８２Ｐ、および／またはＫ１１７６Ｎ。
－ベータ（ＷＨＯ分類表示）、２０Ｈ／５０１Ｙ．Ｖ２（旧２０Ｃ／５０１Ｙ．Ｖ２）、または口語で「南アフリカ」変異体としても知られ、Ｓタンパク質における以下の変異を含む、変異体Ｂ．１．３５１（配列番号１６の配列に基づく）：Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、２４１ｄｅｌ、２４２ｄｅｌ、２４３ｄｅｌ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ａ７０１Ｖ。配列番号１に基づく対応する変異は以下の通りである：Ｄ６８Ａ、Ｄ２０３Ｇ、２２９ｄｅｌ、２３０ｄｅｌ、２３１ｄｅｌ、Ｋ４０５Ｎ、Ｅ４７２Ｋ、Ｎ４８９Ｙ、Ｄ６０２Ｇ、Ａ６８６Ｖ、
－ガンマ（ＷＨＯ分類表示）、２０Ｊ／５０１Ｙ．Ｖ３、または口語で「ブラジル型変異株」変異体としても知られ、Ｓタンパク質における以下の変異を含む、変異体Ｐ．１（配列番号１６の配列に基づく）：Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７Ｉ。配列番号１に基づく対応する変異は以下の通りである：Ｌ６Ｆ、Ｔ８Ｎ、Ｐ１４Ｓ、Ｄ１２６Ｙ、Ｒ１７８Ｓ、Ｋ４０５Ｔ、Ｅ４７２Ｋ、Ｎ４８９Ｙ、Ｄ６０２Ｇ、Ｈ６４３Ｙ、Ｔ１０１２Ｉ、
－ゼータ（ＷＨＯ分類表示）、または２０Ｊ、またはブラジルで最初に検出された変異体としても知られ、Ｓタンパク質における以下の変異を含む、変異体Ｐ．２（配列番号１６の配列に基づく）：Ｅ４８４Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｖ１１７６Ｆ、および任意選択でＦ５６５Ｌ。配列番号１に基づく対応する変異は以下の通りである：Ｅ４７３Ｋ、Ｄ６０２Ｇ、Ｖ１１６１Ｆ、および任意選択でＦ５５３Ｌ、
－２０Ａ／４８４Ｑ、または口語で「インド型変異株」としても知られ、Ｓタンパク質における以下の変異を含む、変異体Ｂ．１．６１７（配列番号１６の配列に基づく）：Ｌ４５２Ｒ、Ｅ４８４Ｑ、Ｄ６１４Ｇ。配列番号１に基づく対応する変異は以下の通りである：Ｌ４４０Ｒ、Ｅ４７２Ｑ、Ｄ６０２Ｇ、
－カッパ（ＷＨＯ分類表示）、または２０Ａ／Ｓ：１５４Ｋ、インドで最初に検出された変異体としても知られ、Ｓタンパク質における以下の変異を含む、変異体Ｂ．１．６１７．１（配列番号１６の配列に基づく）：Ｇ１４２Ｄ、Ｅ１５４Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｅ４８４Ｑ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ、Ｑ１０７１Ｈ、および任意選択でＴ９５Ｉ。配列番号１に基づく対応する変異は以下の通りである：Ｇ１３０Ｄ、Ｅ１４２Ｋ、Ｌ４４０Ｒ、Ｅ４７２Ｑ、Ｄ６０２Ｇ、Ｐ６６９Ｒ、Ｑ１０４１Ｈ、および任意選択でＴ８３Ｉ、
－デルタ（ＷＨＯ分類表示）、または２０Ａ／Ｓ：４７８Ｋ、インドで最初に検出された変異体としても知られ、Ｓタンパク質における以下の変異を含む、変異体Ｂ．１．６１７．２（配列番号１６の配列に基づく）：Ｔ１９Ｒ、１５６ｄｅｌ、１５７ｄｅｌ、Ｒ１５８Ｇ、Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ、Ｄ９５０Ｎ、および任意選択でＧ１４２Ｄ。配列番号１に基づく対応する変異は以下の通りである：Ｔ７Ｒ、１４４ｄｅｌ、１４５ｄｅｌ、Ｒ１４６Ｇ、Ｌ４４０Ｒ、Ｔ４６６Ｋ、Ｄ６０２Ｇ、Ｐ６６９Ｒ、Ｄ９３５Ｎ、および任意選択でＧ１３０Ｄ、
－インドで最初に検出された変異体で、Ｓタンパク質における以下の変異を含む、変異体Ｂ．１．６１７．３（配列番号１６の配列に基づく）：Ｔ１９Ｒ、Ｇ１４２Ｄ、Ｌ４５２Ｒ、Ｅ４８４Ｑ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｒ、Ｄ９５０Ｎ。配列番号１に基づく対応する変異は以下の通りである：Ｔ７Ｒ、Ｇ１３０Ｄ、Ｌ４４０Ｒ、Ｅ４７２Ｑ、Ｄ６０２Ｇ、Ｐ６６９Ｒ、Ｄ９３５Ｎ、
－イプシロン（ＷＨＯ分類表示）、または２０Ｃ／Ｓ：４５２Ｒとしても知られ、Ｓタンパク質における以下の変異を含む、変異体Ｂ．１．４２７（配列番号１６の配列に基づく）：Ｌ４５２Ｒ、Ｄ６１４Ｇ。配列番号１に基づく対応する変異は以下の通りである：Ｌ４４０Ｒ、Ｄ６０２Ｇ、
－２０Ｃ／Ｓ：４５２Ｒとしても知られ、Ｓタンパク質における以下の変異を含む、変異体Ｂ．１．４２９（配列番号１６の配列に基づく）：Ｓ１３Ｉ、Ｗ１５２Ｃ、Ｌ４５２Ｒ、Ｄ６１４Ｇ。配列番号１に基づく対応する変異は以下の通りである：Ｓ１Ｉ、Ｗ１４０Ｃ、Ｌ４４０Ｒ、Ｄ６０２Ｇ、
－エータ（ＷＨＯ分類表示）、または２０Ａ／Ｓ：４８４Ｋとしても知られ、Ｓタンパク質における以下の変異を含む、変異体Ｂ．１．５２５（配列番号１６の配列に基づく）：Ａ６７Ｖ、６９ｄｅｌ、７０ｄｅｌ、１４４ｄｅｌ、Ｅ４８４Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｑ６７７Ｈ、Ｆ８８８Ｌ。配列番号１に基づく対応する変異は以下の通りである：Ａ５５Ｖ、５７ｄｅｌ、５８ｄｅｌ、１３２ｄｅｌ、Ｅ４７２Ｋ、Ｄ６０２Ｇ、Ｑ６６５Ｈ、Ｆ８７３Ｌ、
－イオタ（ＷＨＯ分類表示）、または２０Ｃ／Ｓ：４８４Ｋとしても知られ、Ｓタンパク質における以下の変異を含む、変異体Ｂ．１．５２６（配列番号１６の配列に基づく）：Ｔ９５Ｉ、Ｄ２５３Ｇ、Ｄ６１４Ｇ、および任意選択で、Ｌ５Ｆ、Ｓ４７７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、および／またはＡ７０１Ｖ。配列番号１に基づく対応する変異は以下の通りである：Ｔ８３Ｉ、Ｄ２４１Ｇ、Ｄ６０２Ｇ、および任意選択で、Ｓ４６５Ｎ、Ｅ４７２Ｋ、および／またはＡ６８６Ｖ、
－２０Ｃとしても知られ、Ｓタンパク質における以下の変異を含む、変異体Ｂ．１．５２６．１（配列番号１６の配列に基づく）：Ｄ８０Ｇ、１４４ｄｅｌ、Ｆ１５７Ｓ、Ｌ４５２Ｒ、Ｄ６１４Ｇ、Ｄ９５０Ｈ、および任意選択でＴ７９１Ｉおよび／またはＴ８５９Ｎ。配列番号１に基づく対応する変異は以下の通りである：Ｄ６８Ｇ、１３２ｄｅｌ、Ｆ１４５Ｓ、Ｌ４４０Ｒ、Ｄ６０２Ｇ、Ｄ９３５Ｈ、および任意選択でＴ７７６Ｉおよび／またはＴ８４４Ｎ。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体の例には、限定するものではないが、以下がさらに含まれる。
－シータ（ＷＨＯ分類表示）としても知られ、Ｓタンパク質における以下の変異を含む、変異体Ｐ．３（配列番号１６の配列に基づく）：Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、
－ラムダ（ＷＨＯ分類表示）としても知られ、Ｓタンパク質における以下の変異を含む、変異体Ｃ．３７（配列番号１６の配列に基づく）：Ｌ４５２Ｑ、Ｆ４９０Ｓ、Ｄ６１４Ｇ、
－ミュー（ＷＨＯ分類表示）としても知られ、Ｓタンパク質における以下の変異を含む、変異体Ｂ．１．６２１（配列番号１６の配列に基づく）：Ｒ３４６Ｋ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、および
－オミクロン（ＷＨＯ分類表示）としても知られ、Ｓタンパク質における以下の変異を含む、変異体Ｂ．１．１．５２９（配列番号１６の配列に基づく）：Ａ６７Ｖ、ｄｅｌ６９－７０、Ｔ９５Ｉ、ｄｅｌ１４２－１４４、Ｙ１４５Ｄ、ｄｅｌ２１１、Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｒ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ｔ５４７Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ７６４Ｋ、Ｄ７９６Ｙ、Ｎ８５６Ｋ、Ｑ９５４Ｈ、Ｎ９６９Ｋ、Ｌ９８１Ｆ。
【0047】
一実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２変異体は、変異体ＨｅｘａＰｒｏであり、Ｓタンパク質における以下の変異を含む（配列番号１６の配列に基づく）：Ｆ８１７Ｐ、Ａ８９２Ｐ、Ａ８９９Ｐ、Ａ９４２Ｐ、Ｄ９８６Ｐ、Ｋ９８７Ｐ。さらに、ＨｅｘａＰｒｏ変異体は、フリン切断部位（残基ＲＲＡＲ６８２－６８５、配列番号５１）で置換された「ＧＳＡＳ」モチーフ（配列番号５０）を含み、スパイクタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠く。
【0048】
一実施形態では、融合タンパク質は、コロナウイルスのスパイク（Ｓ）タンパク質の少なくとも１つの断片および同じコロナウイルスの核タンパク質（Ｎ）の少なくとも１つの断片を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、コロナウイルスのスパイク（Ｓ）タンパク質の少なくとも１つの断片および別個のコロナウイルスの核タンパク質（Ｎ）の少なくとも１つの断片を含む。
【0049】
コロナウイルスのＳタンパク質の例としては、限定されないが、以下の受託番号によって同定されるタンパク質が挙げられる：ＨＣｏＶ－２２９Ｅ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１５４２３）、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ６Ｑ１Ｓ２）、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ３６３３４）、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ０ＺＭＥ７）、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｋ９Ｎ５Ｑ８）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ５９５９４）、それらの変異体および断片のスパイク糖タンパク質。
【0050】
コロナウイルスのＮタンパク質の例としては、限定されないが、以下の受託番号によって同定されるタンパク質が挙げられる：ＨＣｏＶ－２２９Ｅ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１５１３０）、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ６Ｑ１Ｒ８）、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ３３４６９）、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ５ＭＱＣ６）、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｒ９ＵＭ８７）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ５９５９５）、それらの変異体および断片の核タンパク質。
【0051】
本明細書で使用されるものとしてのタンパク質「変異体」という用語は、典型的には、１つまたは複数の置換、欠失、付加および／または挿入において本明細書に具体的に開示されるタンパク質とは異なるタンパク質である。そのような変異体は、自然に存在してもよく、または例えば、上記のタンパク質配列の１つまたは複数を改変することによって、および／または当技術分野で周知のいくつかの技術のいずれかを使用することによって、合成的に生成されていてもよい。改変は、タンパク質の構造において行われてもよく、望ましい特徴を有する変異体または誘導体タンパク質をコードする機能性分子を依然として得ることができる。
【0052】
タンパク質のアミノ酸配列を変えて、同等の、またはさらには改善された変異体を作製することが所望される場合、当業者は、典型的には、コードするＤＮＡ配列のコドンの１つまたは複数を変更する。例えば、ある特定のアミノ酸は、例えば、細胞表面の受容体に結合するその能力などのその特性を明らかに失うことなく、タンパク質構造の他のアミノ酸で置換され得る。タンパク質の生物学的機能活性を規定するのはタンパク質の結合能力および性質であるため、タンパク質配列、および当然その基礎となるＤＮＡコード配列において特定のアミノ酸配列の置換を行うことができ、それでも同様の特性を有するタンパク質を得ることができる。したがって、ペプチド配列、または前述のタンパク質をコードする対応するＤＮＡ配列において、それらの生物学的有用性または活性を明瞭に失うことなく、様々な変化が行われ得ることが企図されている。多くの場合、タンパク質変異体は、１つまたは複数の保存的置換を含む。「保存的置換」は、アミノ酸が類似の特性を有する別のアミノ酸で置換されたものであり、ペプチド化学の当業者は、ペプチドの二次構造およびヒドロパシーの性質が実質的に変化しないと予想する。したがって、上で概説したように、アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。様々な前述の特徴を考慮する例示的な置換は、当業者に周知であり、アルギニンおよびリジン、グルタミン酸塩およびアスパラギン酸塩、セリンおよびトレオニン、グルタミンおよびアスパラギン、およびバリン、ロイシン、およびイソロイシンを含む。アミノ酸置換は、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の類似性に基づいて、さらに行うことができる。例えば、負に荷電したアミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含み、正に荷電したアミノ酸は、ヒスチジン、リジンおよびアルギニンを含み、同様の親水性値を有する非荷電極性頭部基を有するアミノ酸は、ロイシン、イソロイシンおよびバリン、グリシンおよびアラニン、アスパラギンおよびグルタミン、およびセリン、トレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンを含む。保存的変化を表し得る他のアミノ酸の群は、（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓを含む。
【0053】
変異体はまた、または代替的に、非保存的変化を含み得る。
【0054】
一実施形態では、変異体タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０アミノ酸またはそれ以上の置換、欠失、または付加によって、天然の配列とは異なる。変異体はまた（または代替的に）、例えば、タンパク質の免疫原性、二次構造、およびヒドロパシー性に最小限の影響を及ぼすアミノ酸の欠失または付加によって改変され得る。したがって、一実施形態では、タンパク質の変異体は、前述のタンパク質の配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０のアミノ酸がそれぞれ存在しないか、または任意のアミノ酸で置換されているか、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０のアミノ酸（連続しているかまたは連続していないかのいずれか）が付加されるペプチドである。
【0055】
一実施形態では、タンパク質の変異体は、前述のタンパク質の配列と、Ｃ末端および／またはＮ末端に１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のさらなるアミノ酸とを有するペプチドである。
【0056】
一実施形態では、タンパク質の変異体は、前述のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約７０％の同一性、好ましくは少なくとも約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％またはそれ以上の同一性を示すタンパク質である。
【0057】
一実施形態では、融合タンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイク（Ｓ）タンパク質の少なくとも１つの断片およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の核タンパク質（Ｎ）の少なくとも１つの断片を含む。
【0058】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質は、２つのサブユニット：宿主の受容体アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）を認識して結合する受容体結合ドメインを含むＳ１、および２つの７反復ドメインを介して６つのらせんの束を形成することによってウイルス細胞膜融合を媒介するＳ２から構成される。Ｓタンパク質の参照配列は、配列番号１６に示す通りであり、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｐ０ＤＴＣ２に対応し、２０２０年４月２２日に最後に改変されている。最初に記載されたＳタンパク質（配列番号１６）は、サイズが約１８０～２００ｋＤａ、長さが１２７３アミノ酸であり、細胞外Ｎ末端、ウイルス膜に固定された膜貫通ドメイン、および短い細胞内Ｃ末端セグメントからなる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質は、例えば、配列番号１６の１７、６１、７４、１２２、１４９、１６５、２３４、２８２、３３１、３４３、６０３、６１６、６５７、７０９、７１７、８０１、１０７４、１０９８、１１３４、１１５８、１１７３、または１１９４（またはＳタンパク質変異体の対応する配列）の位置でグリコシル化されたタンパク質などのグリコシル化タンパク質である。
【0059】
最初に記載されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質（配列番号１６）は、Ｎ末端に位置するシグナルペプチド（アミノ酸１～１３）、Ｓ１サブユニット（１４～６８５残基）、およびＳ２サブユニット（６８６～１２７３残基）からなる。最後の２つの領域は、それぞれ受容体の結合および膜の融合を担う。Ｓ１サブユニットは、Ｎ末端ドメイン（１４～３０５残基）および受容体結合ドメイン（ＲＢＤ、３１９～５４１残基）を含む。一方、Ｓ２サブユニットは、融合ペプチド（ＦＰ）（７８８～８０６残基）、ヘプタペプチド反復配列１（ＨＲ１）（９１２～９８４残基）、ＨＲ２（１１６３～１２１３残基）、膜貫通ドメイン（１２１４～１２３４残基）、およびサイトゾルドメイン（１２３５～１２７３残基）を含む。
【0060】
別の実施形態では、Ｓタンパク質は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１６の少なくとも１つの断片を含む。
【0061】
一実施形態では、Ｓタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１の少なくとも１つの断片を含む。
【0062】
一実施形態では、Ｓタンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１８の少なくとも１つの断片を含む。
【0063】
一実施形態では、Ｓタンパク質は、少なくとも１つの三量体化ドメインをさらに含む。少なくとも１つの三量体化ドメインをさらに含むＳタンパク質は、以下でＳｔタンパク質と呼ばれる。したがって、本発明の別の目的は、以下でＳｔタンパク質と呼ばれる少なくとも１つの三量体化ドメインをさらに含むＳタンパク質である。一実施形態では、Ｓｔタンパク質は、配列番号２６または配列番号２９のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる。一実施形態では、Ｓｔタンパク質は、配列番号１または配列番号１６または配列番号１８の少なくとも１つの断片を含む。
【0064】
一実施形態では、Ｓタンパク質は、少なくとも１つの三量体化ドメインおよび少なくとも１つの二量体化ドメインをさらに含む。少なくとも１つの三量体化ドメインおよび少なくとも１つの二量体化ドメインをさらに含むＳタンパク質は、以下でＳｔＦタンパク質と呼ばれる。したがって、本発明の別の目的は、以下でＳｔＦタンパク質と呼ばれる、少なくとも１つの三量体化ドメインおよび少なくとも１つの二量体化ドメインをさらに含むＳタンパク質である。一実施形態では、ＳｔＦタンパク質は、配列番号３０または配列番号４９のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる。一実施形態では、ＳｔＦタンパク質は、配列番号１または配列番号１６または配列番号１８の少なくとも１つの断片を含む。
【0065】
一実施形態では、融合タンパク質は、Ｓタンパク質の変異体、好ましくは配列番号１の変異体、または配列番号１６の変異体の少なくとも１つの断片を含む。
【0066】
一実施形態では、融合タンパク質は、Ｓタンパク質の変異体、好ましくは配列番号１８の変異体の少なくとも１つの断片を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１８のＳタンパク質の変異体の少なくとも１つの断片を含む。
【0067】
一実施形態では、Ｓタンパク質は、少なくとも１つの三量体化ドメインをさらに含む。一実施形態では、Ｓタンパク質は、Ｓタンパク質の変異体、好ましくは配列番号１、配列番号１６、または配列番号１８の変異体の少なくとも１つの断片を含む。一実施形態では、Ｓタンパク質は、配列番号１、配列番号１６、または配列番号１８のＳタンパク質の変異体の少なくとも１つの断片を含む。
【0068】
一実施形態では、Ｓタンパク質は、少なくとも１つの三量体化ドメインおよび少なくとも１つの二量体化ドメインをさらに含む。一実施形態では、Ｓタンパク質は、Ｓタンパク質の変異体、好ましくは配列番号１、配列番号１６、または配列番号１８の変異体の少なくとも１つの断片を含む。一実施形態では、Ｓタンパク質は、配列番号１、配列番号１６、または配列番号１８のＳタンパク質の変異体の少なくとも１つの断片を含む。
【0069】
一実施形態では、Ｓタンパク質の前述の変異体は、上に列挙したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体の１つに見られるＳタンパク質に対応する。
【0070】
一実施形態では、融合タンパク質は、Ｓタンパク質の可溶性部分の少なくとも１つの断片、すなわち膜貫通ドメインも細胞質ドメインも含まないＳタンパク質の断片を含む。
【0071】
一実施形態では、融合タンパク質は、Ｓタンパク質のＳ１ドメインを含む。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸２から６７０、またはその変異体を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１６のアミノ酸１４から６８５、またはその変異体を含む。
【0072】
一実施形態では、融合タンパク質は、Ｓタンパク質のＮ末端ドメインを含む。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸２から２９３、またはその変異体を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１６のアミノ酸１４から３０５、またはその変異体を含む。
【0073】
一実施形態では、融合タンパク質は、Ｓタンパク質の受容体結合ドメインを含む。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸３０７から５２９、またはその変異体を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１６のアミノ酸３１９から５４１、またはその変異体を含む。
【0074】
一実施形態では、融合タンパク質は、Ｓタンパク質のＳ２ドメインを含む。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸６７１から１１９８、またはその変異体を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１６のアミノ酸６８６から１２７３、またはその変異体を含む。
【0075】
一実施形態では、融合タンパク質は、Ｓタンパク質の融合ペプチドを含む。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸７７３から７９１、またはその変異体を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１６のアミノ酸７８８から８０６、またはその変異体を含む。
【0076】
一実施形態では、融合タンパク質は、Ｓタンパク質のヘプタペプチド反復配列１を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸８９７から９６９、またはその変異体を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１６のアミノ酸９１２から９８４、またはその変異体を含む。
【0077】
一実施形態では、融合タンパク質は、Ｓタンパク質のヘプタペプチド反復配列２を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸１１４８から１１９８、またはその変異体を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１６のアミノ酸１１６３から１２１３、またはその変異体を含む。
【0078】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核タンパク質（Ｎ）は、４１９アミノ酸の長さであり、５つのドメイン、つまり予測される内因的に無秩序なＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）（残基１～５０）、ＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）（残基５１～１７４）、予測される無秩序な中央リンカー（ＬＩＮＫ）（残基１７５～２４６）、二量体化ドメイン（残基２４７～３６５）、および予測される無秩序なＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）（残基３６６～４１９）に分割することができる。
【0079】
Ｎタンパク質の参照配列は、配列番号２に示す通りであり、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｐ０ＤＴＣ９に対応し、２０２１年６月２日に最後に改変されている。
【0080】
一実施形態では、Ｎタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列、またはその変異体を含むか、またはこれからなる。
【0081】
Ｎタンパク質の変異体には、以下の変異（配列番号２の配列に基づく）、Ｔ２０５Ｉおよび／またはＤ３９９Ｎを含む配列が含まれるが、これらに限定されない。
【0082】
一実施形態では、融合タンパク質は、Ｎタンパク質のＮ末端ドメインを含む。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸１から５０、またはその変異体を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、Ｎタンパク質のＲＮＡ結合ドメインを含む。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸５１から１７４、またはその変異体を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、Ｎタンパク質の中心リンカーを含む。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸１７５から２４６、またはその変異体を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、Ｎタンパク質の二量体化ドメインを含む。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸２４７から３６５、またはその変異体を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、Ｎタンパク質のＣ末端ドメインを含む。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸３６６から４１９、またはその変異体を含む。
【0083】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列、および配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる。
【0084】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１６のアミノ酸配列、または配列番号１６と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列、および配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる。
【0085】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１８と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列、および配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる。
【0086】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、および配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片を含むか、またはそれらからなる。
【0087】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１６のアミノ酸配列、または配列番号１６と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、および配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片を含むか、またはそれらからなる。
【0088】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１８と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、および配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片を含むか、またはそれらからなる。
【0089】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１または配列番号１６のアミノ酸配列、または配列番号１または配列番号１６と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、および配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片を含むか、またはそれらからなる（Ｎ末端からＣ末端まで）。
【0090】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、および配列番号１または配列番号１６または配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１または配列番号１６または配列番号１８と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片を含むか、またはそれらからなる（Ｎ末端からＣ末端まで）。
【0091】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１８と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、および配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片を含むか、またはそれらからなる（Ｎ末端からＣ末端まで）。
【0092】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、少なくとも１つの三量体化ドメインをさらに含む。前述の三量体化ドメインは、Ｎ末端、Ｃ末端、および／または内部に局在し得る（例えば、Ｓタンパク質とＮタンパク質またはそれらの断片との間）。
【0093】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１もしくは配列番号１６のアミノ酸配列、または配列番号１もしくは配列番号１６と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、少なくとも１つの三量体化ドメイン、および配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片を含むか、またはそれらからなる（Ｎ末端からＣ末端まで）。
【0094】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１８と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、少なくとも１つの三量体化ドメイン、および配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片を含むか、またはそれらからなる（Ｎ末端からＣ末端まで）。
【0095】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、配列番号１または配列番号１６または配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１または配列番号１６または配列番号１８と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、および少なくとも１つの三量体化ドメインを含むか、またはそれらからなる（Ｎ末端からＣ末端まで）。
【0096】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号３の三量体化ドメインを含む。
【0097】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１９の三量体化ドメインを含む。
【0098】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１もしくは配列番号１６のアミノ酸配列、または配列番号１もしくは配列番号１６と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、配列番号３もしくは配列番号１９の少なくとも１つの三量体化ドメイン、および配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片を含むか、またはそれらからなる（Ｎ末端からＣ末端まで）。
【0099】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１８と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、配列番号３の少なくとも１つの三量体化ドメイン、および配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片を含むか、またはそれらからなる（Ｎ末端からＣ末端まで）。
【0100】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１８と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、配列番号１９の少なくとも１つの三量体化ドメイン、および配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片を含むか、またはそれらからなる（Ｎ末端からＣ末端まで）。
【0101】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、配列番号１または配列番号１６または配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１または配列番号１６または配列番号１８と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、および配列番号３もしくは配列番号１９の少なくとも１つの三量体化ドメインを含むか、またはそれらからなる（Ｎ末端からＣ末端まで）。
【0102】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号７もしくは配列番号４１のアミノ酸配列、または配列番号７もしくは配列番号４１と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【0103】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号８もしくは配列番号４２のアミノ酸配列、または配列番号８もしくは配列番号４２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【0104】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、少なくとも１つの二量体化ドメインをさらに含む。前述の二量体化ドメインは、Ｎ末端、Ｃ末端、および／または内部に局在し得る（例えば、Ｓタンパク質とＮタンパク質またはそれらの断片との間）。
【0105】
一実施形態では、二量体化ドメインは、免疫グロブリン（Ｉｇ）断片結晶化可能（Ｆｃ）ドメイン、例えばヒトＩｇ Ｆｃまたは非ヒトＩｇ Ｆｃ（例えば、マウスＩｇ Ｆｃ）などに由来する。一実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメイン、例えばヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインなどである。しかしながら、免疫グロブリンの他のアイソタイプ由来のＦｃドメインを本発明で使用し得る。一実施形態では、Ｆｃドメインは、そのエフェクター機能を改善または抑制する変異を含む。一実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体との相互作用を改善または抑制する変異を含む。一実施形態では、Ｆｃドメインは、輸送を改善または抑制する変異を含む。一実施形態では、Ｆｃドメインは、その補体依存性細胞傷害性を改善または抑制する変異を含む。一実施形態では、Ｆｃドメインは、その抗体依存性細胞傷害性を改善または抑制する変異を含む。一実施形態では、Ｆｃドメインは、その食作用を改善または抑制する変異を含む。
【0106】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１もしくは配列番号１６のアミノ酸配列、または配列番号１もしくは配列番号１６と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、および少なくとも１つの二量体化ドメインを含むか、またはそれらからなる（Ｎ末端からＣ末端まで）。
【0107】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１もしくは配列番号１６のアミノ酸配列、または配列番号１もしくは配列番号１６と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、少なくとも１つの二量体化ドメイン、および配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片を含むか、またはそれらからなる（Ｎ末端からＣ末端まで）。
【0108】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１８と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、および少なくとも１つの二量体化ドメインを含むか、またはそれらからなる（Ｎ末端からＣ末端まで）。
【0109】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１８と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、少なくとも１つの二量体化ドメイン、および配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片を含むか、またはそれらからなる（Ｎ末端からＣ末端まで）。
【0110】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号４の二量体化ドメインを含む。
【0111】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号２０の二量体化ドメインを含む。
【0112】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１もしくは配列番号１６のアミノ酸配列、または配列番号１もしくは配列番号１６と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、および配列番号４もしくは配列番号２０の少なくとも１つの二量体化ドメインの断片を含むか、またはそれらからなる（Ｎ末端からＣ末端まで）。
【0113】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１もしくは配列番号１６のアミノ酸配列、または配列番号１もしくは配列番号１６と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、配列番号４もしくは配列番号２０の少なくとも１つの二量体化ドメイン、および配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片を含むか、またはそれらからなる（Ｎ末端からＣ末端まで）。
【0114】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１８と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、および配列番号４または配列番号２０の少なくとも１つの二量体化ドメインを含むか、またはそれらからなる（Ｎ末端からＣ末端まで）。
【0115】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１８と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、配列番号４の少なくとも１つの二量体化ドメイン、および配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片を含むか、またはそれらからなる（Ｎ末端からＣ末端まで）。
【0116】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１８と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、配列番号２０の少なくとも１つの二量体化ドメイン、および配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片を含むか、またはそれらからなる（Ｎ末端からＣ末端まで）。
【0117】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号９もしくは配列番号４３のアミノ酸配列、または配列番号９もしくは配列番号４３と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【0118】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１０もしくは配列番号４４もしくは配列番号４５のアミノ酸配列、または配列番号１０もしくは配列番号４４もしくは配列番号４５と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【0119】
一実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのリンカーを含む。一実施形態では、融合タンパク質は、Ｓタンパク質をＮタンパク質に連結する少なくとも１つのリンカーを含む。一実施形態では、融合タンパク質は、Ｓタンパク質を二量体化ドメインに連結する少なくとも１つのリンカーを含む。一実施形態では、融合タンパク質は、二量体化ドメインをＮタンパク質に連結する少なくとも１つのリンカーを含む。一実施形態では、融合タンパク質は、Ｓタンパク質を三量体化ドメインに連結する少なくとも１つのリンカーを含む。一実施形態では、融合タンパク質は、三量体化ドメインをＮタンパク質に連結する少なくとも１つのリンカーを含む。一実施形態では、融合タンパク質は、三量体化ドメインを二量体化ドメインに連結する少なくとも１つのリンカーを含む。一実施形態では、融合タンパク質は、トロンビン切断部位を融合タンパク質の少なくとも１つの他の要素に連結する少なくとも１つのリンカーを含む。一実施形態では、融合タンパク質は、タグを融合タンパク質の少なくとも１つの他の要素に連結する少なくとも１つのリンカーを含む。
【0120】
一実施形態では、少なくとも１つのリンカーは、好ましくは２から２０または２から１５アミノ酸の範囲の長さを有する短いオリゴペプチドまたはポリペプチドである。
【0121】
例えば、グリシン－セリン二重鎖は、特に適切なリンカー（ＧＳリンカー）を与える。一実施形態では、少なくとも１つのリンカーは、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーである。Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーの例としては、ＧＳリンカー、Ｇ２Ｓリンカー、Ｇ３Ｓリンカー、Ｇ４Ｓリンカーが挙げられるが、これらに限定されない。Ｇ３Ｓリンカーは、（ＧＧＧＳ）ｎまたは（配列番号１１）ｎとも呼ばれるアミノ酸配列（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎを含み、ｎは１以上の正の整数である（例えば、ｎ＝ｌ、ｎ＝２、ｎ＝３．ｎ＝４、ｎ＝５、ｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９またはｎ＝１０など）。Ｇ３Ｓリンカーの例としては、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１２）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｇ４Ｓリンカーの例としては、ＧＧＧＧＳ（配列番号５）に対応する（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３）に対応する（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４）に対応する（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３、およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１５）に対応する（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４が挙げられるが、これらに限定されない。
【0122】
一実施形態では、少なくとも１つのリンカーは、Ｇｌｙ（Ｇ）リンカーである。一実施形態では、少なくとも１つのリンカーは、Ｇｌｙ／Ｇｌｙ（ＧＧ）リンカーである。
【0123】
一実施形態では、少なくとも１つのリンカーは、（Ｇ４Ｓ）－リンカー（配列番号５）である。
【0124】
一実施形態では、少なくとも１つのリンカーは、（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号１４）である。
【0125】
一実施形態では、少なくとも１つのリンカーは、Ｇｌｙ／Ｓｅｒ／Ｇｌｙ（ＧＳＧ）リンカーである。
【0126】
一実施形態では、少なくとも１つのリンカーは、ＧＧＧＧＳＧリンカー（配列番号２３）である。
【0127】
一実施形態では、少なくとも１つのリンカーは、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡリンカー（配列番号２４）である。
【0128】
一実施形態では、少なくとも１つのリンカーはトロンビン切断部位である。
【0129】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、少なくとも１つのタグ（例えば、１つのタグなど）、例えば、品質管理、濃縮、インビボ追跡などのためのタグなどを含む。前述のタグは、Ｎ末端、Ｃ末端および／または内部に局在し得る。本発明の融合タンパク質に使用され得るタグの例は、当業者に周知である。タグの例としては、ヘマグルチニンタグ、ポリアルギニンタグ、ポリヒスチジンタグ、Ｍｙｃタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｃタグ、Ｓタグ、ＨＡＴタグ、３×Ｆｌａｇタグ、カルモジュリン結合ペプチドタグ、ＳＢＰタグ、キチン結合ドメインタグ、ＧＳＴタグ、マルトース結合タンパク質タグ、蛍光タンパク質タグ、Ｔ７タグ、Ｖ５タグおよびＸｐｒｅｓｓタグが挙げられるが、これらに限定されない。
【0130】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、少なくとも１つのＨｉｓ６タグ（配列番号６）をさらに含む。
【0131】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、少なくとも１つのｃタグ（配列番号２５）をさらに含む。
【0132】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、少なくとも１つのトロンビン切断部位を含む。
【0133】
トロンビン切断部位（例えば、Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ｌｌ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、ｌｌは開裂部位を表す）は、融合タンパク質のトロンビンによる切断、および融合タンパク質の異なる要素の分離を可能にする。
【0134】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、少なくとも１つのＬＶＰＲＧＳトロンビン切断部位（配列番号２２）をさらに含む。
【0135】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓタンパク質の少なくとも１つの断片、少なくとも１つの二量体化ドメイン、少なくとも１つの三量体化ドメイン、およびＮタンパク質の少なくとも１つの断片を含むか、またはそれらからなる。
【0136】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１もしくは配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１もしくは配列番号１８と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、少なくとも１つの三量体化ドメイン、少なくとも１つの二量体化ドメイン、および配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片を含むか、またはそれらからなる。
【0137】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１もしくは配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１もしくは配列番号１８と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、少なくとも１つの三量体化ドメイン、少なくとも１つの二量体化ドメイン、および配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片を含むか、またはそれらからなる（Ｎ末端からＣ末端まで）。
【0138】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１もしくは配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１もしくは配列番号１８と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、配列番号１９の少なくとも１つの三量体化ドメイン、少なくとも１つの二量体化ドメイン、および配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片を含むか、またはそれらからなる。
【0139】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１もしくは配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１もしくは配列番号１８と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、配列番号１９の少なくとも１つの三量体化ドメイン、少なくとも１つの二量体化ドメイン、および配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片を含むか、またはそれらからなる（Ｎ末端からＣ末端まで）。
【0140】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１もしくは配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１もしくは配列番号１８と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、少なくとも１つの三量体化ドメイン、配列番号２０の少なくとも１つの二量体化ドメイン、および配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片を含むか、またはそれらからなる。
【0141】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１もしくは配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１もしくは配列番号１８と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、少なくとも１つの三量体化ドメイン、配列番号２０の少なくとも１つの二量体化ドメイン、および配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片を含むか、またはそれらからなる（Ｎ末端からＣ末端まで）。
【0142】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１もしくは配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１もしくは配列番号１８と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、配列番号１９の少なくとも１つの三量体化ドメイン、配列番号２０の少なくとも１つの二量体化ドメイン、および配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片を含むか、またはそれらからなる。
【0143】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１もしくは配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１もしくは配列番号１８と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、配列番号１９の少なくとも１つの三量体化ドメイン、配列番号２０の少なくとも１つの二量体化ドメイン、および配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片を含むか、またはそれらからなる（Ｎ末端からＣ末端まで）。
【0144】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１もしくは配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１もしくは配列番号１８と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、少なくとも１つのＧＳリンカー、または配列番号２２の少なくとも１つのトロンビン切断部位、配列番号１９の少なくとも１つの三量体化ドメイン、少なくとも１つのＧＳＧリンカー、または配列番号２３のリンカー、配列番号２０の少なくとも１つの二量体化ドメイン、配列番号１４もしくは配列番号２４の少なくとも１つのリンカー、および配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片を含むか、またはそれらからなる。
【0145】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１もしくは配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１もしくは配列番号１８と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、少なくとも１つのＧＳリンカー、または配列番号２２の少なくとも１つのトロンビン切断部位、配列番号１９の少なくとも１つの三量体化ドメイン、少なくとも１つのＧＳＧリンカー、または配列番号２３のリンカー、配列番号２０の少なくとも１つの二量体化ドメイン、配列番号１４もしくは配列番号２４の少なくとも１つのリンカー、および配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片を含むか、またはそれらからなる（Ｎ末端からＣ末端まで）。
【0146】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１８と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、少なくとも１つのＧＳリンカー、配列番号１９の少なくとも１つの三量体化ドメイン、少なくとも１つのＧＳＧリンカー、配列番号２０の少なくとも１つの二量体化ドメイン、配列番号１４の少なくとも１つのリンカー、および配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片を含むか、またはそれらからなる。
【0147】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１８と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片、少なくとも１つのＧＳリンカー、配列番号１９の少なくとも１つの三量体化ドメイン、少なくとも１つのＧＳＧリンカー、配列番号２０の少なくとも１つの二量体化ドメイン、配列番号１４の少なくとも１つのリンカー、および配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つの断片を含むか、またはそれらからなる（Ｎ末端からＣ末端まで）。
【0148】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号２１もしくは配列番号２８もしくは配列番号４６もしくは配列番号４７もしくは配列番号４８のアミノ酸配列、または配列番号２１もしくは配列番号２８もしくは配列番号４６もしくは配列番号４７もしくは配列番号４８と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【0149】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号２１のアミノ酸配列、または配列番号２１と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。
【0150】
一実施形態では、１つのＳタンパク質（またはその少なくとも１つの断片）、三量体化ドメイン、二量体化ドメイン、および１つの核タンパク質（またはその少なくとも１つの断片）を含む本明細書に記載の融合タンパク質は、それらの二量体化ドメインを介して自発的に集合してホモ二量体融合タンパク質を形成し得る。このホモ二量体融合タンパク質は、４つのＳタンパク質、好ましくは三量体化ドメイン（すなわち、Ｓｔ融合タンパク質と呼ばれる）をさらに含む４つのＳタンパク質（またはその断片）とそれらの三量体化ドメインを介してさらに集合して、ヘテロ多量体融合タンパク質を形成し得る。したがって、本発明はさらに、本発明の２つの融合タンパク質および４つのＳタンパク質、好ましくは４つのＳｔ融合タンパク質の集合によって形成されるヘテロ多量体融合タンパク質に関する。
【0151】
一実施形態では、１つのＳタンパク質（またはその少なくとも１つの断片）、三量体化ドメイン、および１つの核タンパク質（またはその少なくとも１つの断片）を含む本明細書に記載の融合タンパク質は、それらの三量体化ドメインを介して自発的に集合してホモ三量体融合タンパク質を形成し得る。したがって、本発明はさらに、本発明の３つの融合タンパク質の集合によって形成されるホモ三量体融合タンパク質に関する。
【0152】
一実施形態では、１つのＳタンパク質、二量体化ドメイン、および１つの核タンパク質を含む本明細書に記載の融合タンパク質は、それらの二量体化ドメインを介して自発的に集合してホモ二量体融合タンパク質を形成し得る。したがって、本発明はさらに、本発明の２つの融合タンパク質の集合によって形成されるホモ二量体融合タンパク質に関する。
【0153】
一実施形態では、本発明のホモ二量体融合タンパク質は、本明細書に記載されるのと同様の融合タンパク質を含む。一実施形態では、本発明のホモ二量体融合タンパク質は、配列番号２１もしくは配列番号２８もしくは配列番号４６もしくは配列番号４７もしくは配列番号４８の配列、または配列番号２１もしくは配列番号２８もしくは配列番号４６もしくは配列番号４７もしくは配列番号４８と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる少なくとも２つ（例えば、２）の融合タンパク質を含む。
【0154】
本発明のヘテロ多量体融合タンパク質の例を図７に表す。左端には、Ｓタンパク質、三量体化ドメイン、二量体化ドメインおよび核タンパク質を含むＳｔＦＮ融合タンパク質が表されている。その次に、Ｓタンパク質および三量体化ドメインを含むＳｔ融合タンパク質が表されている。Ｓｔ融合タンパク質は、ＳｔＦＮ融合タンパク質に含まれるものと同じＳタンパク質、または異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株由来のＳタンパク質のいずれかで構成され得る。右側には、二量体化ドメインを介して集合する２つのＳｔＦＮ融合タンパク質と、三量体化ドメインを介して集合する４つのＳｔ融合タンパク質とから形成されるＳｔ６Ｆ２Ｎ２ヘテロ多量体融合タンパク質が表されている。
【0155】
一実施形態では、４つのＳｔ融合タンパク質は、ＳｔＦＮ融合タンパク質に含まれるＳタンパク質と同様のＳタンパク質を含む。したがって、一実施形態では、ヘテロ多量体融合タンパク質は、１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株由来のＳタンパク質を含む。一実施形態では、４つのＳｔ融合タンパク質は、ＳｔＦＮ融合タンパク質に含まれるＳタンパク質とは異なるＳタンパク質を含む。したがって、一実施形態では、ヘテロ多量体融合タンパク質は、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株由来のＳタンパク質を含む。一実施形態では、ヘテロ多量体融合タンパク質は、少なくとも１、２、３、４または５つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株由来のＳタンパク質を含む。
【0156】
一実施形態では、本発明の少なくとも１つの融合タンパク質および少なくとも１つのＳタンパク質、好ましくは少なくとも１つのＳｔ融合タンパク質は、共にヘテロ多量体融合タンパク質を形成する。したがって、本発明はさらに、本発明の少なくとも１つの融合タンパク質と、少なくとも１つのＳタンパク質、好ましくは少なくとも１つのＳｔ融合タンパク質との集合によって形成されるヘテロ多量体融合タンパク質に関する。一実施形態では、ヘテロ多量体融合タンパク質は、配列番号２１もしくは配列番号２８もしくは配列番号４６もしくは配列番号４７もしくは配列番号４８の配列、または配列番号２１もしくは配列番号２８もしくは配列番号４６もしくは配列番号４７もしくは配列番号４８と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列、および例えば配列番号１、配列番号１６、もしくは配列番号１８の配列もしくはその断片もしくは変異体を有する少なくとも１つのＳタンパク質（例えば、１つまたは２つのＳタンパク質）もしくはその断片、好ましくは少なくとも１つのＳｔ融合タンパク質（例えば、１つまたは２つのＳｔ融合タンパク質）、例えば配列番号２６、もしくは配列番号２９の配列もしくはそれらの断片もしくは変異体などを有するＳｔ融合タンパク質などを含むかまたはそれからなる、少なくとも１つの融合タンパク質を含む。
【0157】
一実施形態では、ヘテロ多量体融合タンパク質は、上記のホモ二量体融合タンパク質および少なくとも１つのＳタンパク質、好ましくは少なくとも１つのＳｔ融合タンパク質から構成される。一実施形態では、少なくとも１つのＳタンパク質またはその断片、好ましくは少なくとも１つのＳｔ融合タンパク質が、三量体化ドメインを介して上記の１つのホモ二量体融合タンパク質と会合して、ヘテロ多量体融合タンパク質を形成する。したがって、一実施形態では、ヘテロ多量体融合タンパク質は、上記の１つのホモ二量体融合タンパク質および少なくとも１つのＳタンパク質またはその断片、好ましくは少なくとも１つのＳｔ融合タンパク質（例えば、１、２、３または４個のＳｔ融合タンパク質）から構成される。
【0158】
一実施形態では、ヘテロ多量体融合タンパク質は、上記のような１つのホモ二量体融合タンパク質および４つのＳタンパク質またはその断片、好ましくは４つのＳｔ融合タンパク質から構成される。一実施形態では、４つのＳタンパク質、好ましくは４つのＳｔ融合タンパク質が、それらの三量体化ドメインを介して上記の１つのホモ二量体融合タンパク質と会合して、ヘテロ多量体融合タンパク質を形成する。したがって、一実施形態では、本発明のヘテロ多量体融合タンパク質は、Ｓタンパク質、三量体化ドメイン、二量体化ドメイン、および核タンパク質を含む少なくとも１つのホモ二量体融合タンパク質、ならびに少なくとも１つのＳタンパク質またはその断片（例えば、１、２、３もしくは４つのＳタンパク質またはその断片）、好ましくはＳタンパク質またはその断片および三量体化ドメインを含む少なくとも１つのＳｔ融合タンパク質（例えば、１、２、３または４個のＳｔ融合タンパク質またはその断片）から構成される。
【0159】
一実施形態では、本発明のヘテロ多量体融合タンパク質は、配列番号２１もしくは配列番号２８もしくは配列番号４６もしくは配列番号４７もしくは配列番号４８の配列、または配列番号２１もしくは配列番号２８もしくは配列番号４６もしくは配列番号４７もしくは配列番号４８と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列、および例えば配列番号１、配列番号１６、もしくは配列番号１８の配列を有する少なくとも１つ（好ましくは４つ）のＳタンパク質もしくはその断片もしくは変異体、好ましくは例えば配列番号２６、もしくは配列番号２９の配列を有する少なくとも１つ（好ましくは４つ）のＳｔ融合タンパク質もしくはそれらの断片もしくは変異体を含むかまたはそれからなる、融合タンパク質から構成される。
【0160】
本発明のヘテロ多量体融合タンパク質の例を図７に示す。この図の右側には、１つのホモ二量体融合タンパク質および４つのＳｔ融合タンパク質から形成されるヘテロ多量体融合タンパク質が示されている。図７に表されているように、４つのＳｔタンパク質は、三量体化ドメインを介して、ホモ二量体融合タンパク質の三量体化ドメインで、ホモ二量体融合タンパク質と集合する。上述のように、ヘテロ多量体融合タンパク質は、同一のＳタンパク質または異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株由来のＳタンパク質を含み得る。
【0161】
ヘテロ多量体融合タンパク質は、いくつかの利点を有する：１）それは、１つの構築物と同時にいくつかの抗原に対するワクチン接種を可能にする異なる抗原（すなわち、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株または変異体由来のＳタンパク質、核タンパク質および任意選択でＳタンパク質）を含む、２）二量体化ドメイン（すなわち、免疫グロブリンのＦｃドメインに由来する）の存在は、構築物の産生および精製を容易にし、またその半減期を増加させる（例えば、Ｆｃドメインの存在に起因するなど）、３）スパイクタンパク質の三次元構造がヘテロ多量体融合タンパク質において保存される、４）ヘテロ多量体融合タンパク質の等電点は、鼻ワクチン接種に最適なナノ粒子におけるその製剤化を可能にする（例えば、７以下の等電点）、５）哺乳動物細胞、特にＣＨＯ細胞におけるその産生、細胞の上清におけるその分泌を可能にする、および６）１つのタンパク質のみの産生（すなわち、分離されたＳおよびＮタンパク質の産生と比較してコストが削減される）。
【0162】
本発明の別の目的は、本発明による融合タンパク質をコードする核酸分子である。一実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸分子はＤＮＡである。一実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸分子はＲＮＡである。
【0163】
一実施形態では、核酸分子が単離される。本明細書で使用される「単離された核酸」は、天然の配列に自然に付随する他のゲノムＤＮＡ配列ならびにタンパク質または複合体、例えば、リボソームおよびポリメラーゼから実質的に分離された核酸を指すことを意図している。この用語は、その自然に存在する環境から除去された核酸配列を包含し、組換えまたはクローニングされたＤＮＡ単離物および化学合成された類似体または異種系によって生物学的に合成された類似体を含む。実質的に純粋な核酸には、単離された形態の核酸が含まれる。もちろん、これは最初に単離された核酸を指し、人の手によって単離された核酸に後で付加される遺伝子または配列を排除するものではない。
【0164】
一実施形態では、単離された核酸分子はメッセンジャーＲＮＡ分子である。一実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号１７の配列を含むかまたはこれからなる。
【0165】
一実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号３１の配列を含む。一実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号３９の配列を含む。一実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号４０の配列を含む。一実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号３２の配列を含む。一実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号３３の配列を含むかまたはこれからなる。一実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号３４の配列を含むかまたはこれからなる。一実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号３５の配列を含むかまたはこれからなる。一実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号３６の配列を含むかまたはこれからなる。一実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号３７の配列を含むかまたはこれからなる。一実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号３８の配列を含むかまたはこれからなる。
【0166】
本発明の別の目的は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターである。
【0167】
本発明の別の目的は、本明細書に記載のヘテロ多量体融合タンパク質をコードする、すなわち本明細書に記載の融合タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸分子と、本明細書に記載のＳタンパク質、好ましくはＳｔ融合タンパク質とを含むベクターである。
【0168】
本発明の別の目的は、２つの部分を含むキットオブパーツであり、第１の部分は、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターを含み、第２の部分は、Ｓタンパク質をコードする、好ましくは本明細書に記載のＳｔ融合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターを含む。
【0169】
一実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸分子はＤＮＡである。一実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸分子はＲＮＡである。
【0170】
本発明で使用され得るベクターの例としては、限定されないが、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、エピソーム、人工染色体、ファージミド、ファージまたはファージ誘導体、ウイルスベクター（例えば、動物ウイルス）、およびコスミドが挙げられる。
【0171】
一実施形態では、前述のベクターは発現ベクターである。「発現ベクター」という用語は、宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進するために、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入することができるビヒクルを意味する。そのようなベクターは、宿主へ投与するときに前述の融合タンパク質の発現を引き起こすまたは導くための調節エレメント、例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどを含み得る。一般に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起源、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、および１つまたは複数の選択可能なマーカーを含む。
【0172】
本発明の別の目的は、前述のベクターを含む単離された宿主細胞である。前述の宿主細胞は、本発明の融合タンパク質の組換え産生のために使用され得る。
【0173】
宿主細胞の例としては、原核細胞または真核細胞（例えば、酵母、昆虫細胞または哺乳動物細胞など）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、宿主細胞は哺乳動物の宿主細胞である。哺乳動物細胞の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胎児腎系統（２９３細胞）、ベビーハムスターの腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ）、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ－Ｓ細胞、ＣＨＯ－ＧＳ細胞、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４）、マウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０－ＡＧ１４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８１；ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８２８７）またはＮＳＯ（ＨＰＡ培養物収集番号８５１１０５０３）、サル腎細胞（ＣＶｌ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ ５細胞、ＦＳ４細胞、ヒト肝癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）、ＰＥＲ．Ｃ６細胞株を含むが、これらに限定されない。これらの宿主細胞のそれぞれにおける使用に適した発現ベクターもまた、当分野で一般に公知である。「宿主細胞」という用語は、一般に培養細胞株を指すことに留意されたい。本発明による融合タンパク質をコードする発現ベクターが導入されたヒト全体は、「宿主細胞」の定義から明示的に除外される。
【0174】
遺伝子を細胞に導入および発現させる方法は、当技術分野で公知である。発現ベクターに関連して、ベクターは、当技術分野における任意の方法によって宿主細胞、例えば哺乳動物、細菌、酵母または昆虫細胞に、容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、または生物学的手段によって、宿主細胞に移入することができる。
【0175】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、膜破壊などが挙げられる。ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を産生する方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと。
【0176】
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法には、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えばヒト細胞に遺伝子を挿入するための最も広く使用されている方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号明細書および第５，５８５，３６２号明細書を参照されたい。
【0177】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段としては、コロイド分散系、例えば、高分子複合体、ナノ粒子（ナノスフェア、ナノカプセル）、ミクロスフェア、ビーズ、および脂質ベースの系、例えば、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームが挙げられる。インビトロおよびインビボで送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
【0178】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質、ヘテロ多量体融合タンパク質、または核酸は、組成物の有効性を高めるために送達システムと共に製剤化される。一実施形態では、本発明の融合タンパク質、ヘテロ多量体融合タンパク質、または核酸は、例えばマルトデキストリン系ナノ粒子などのナノ粒子で製剤化される。
【0179】
したがって、本発明はさらに、本発明の融合タンパク質、ヘテロ多量体融合タンパク質または核酸を（ナノ粒子のコアまたは表面のいずれかに）含むナノ粒子（例えば、限定されないが、マルトデキストリン系ナノ粒子）に関する。本発明はさらに、本発明の融合タンパク質、ヘテロ多量体融合タンパク質または核酸と（ナノ粒子のコアまたは表面のいずれかに）会合したナノ粒子（例えば、限定されないが、マルトデキストリン系ナノ粒子）に関する。
【0180】
微粒子抗原は、賦形剤またはアジュバントの添加とは無関係に、単独の抗原よりも免疫原性が高いことが知られている。したがって、本発明はさらに、限定されないが、本発明の融合タンパク質、ヘテロ多量体融合タンパク質、または核酸との会合によって、抗原を早期分解から保護し、投与前および投与中に抗原を安定化し、粘膜滞留時間を増強し、粘膜細胞（例えば、マルトデキストリン系ナノ粒子）による抗原捕捉を増強するための送達システムとして作用するナノ粒子またはナノキャリアに関する。
【0181】
一実施形態では、送達システムは、参照により本明細書に組み込まれる、仏国特許第２８１５８７０号明細書に記載されているような、ナノ粒子である。一実施形態では、送達システムは、２００ｎｍ未満の直径を有し、自然にまたは化学的に網目状または非網目状である多糖またはオリゴ糖のコアからなり、それに対してカチオン性リガンドが自然にまたは化学的にグラフトされている。一実施形態では、多糖またはオリゴ糖のコアは、限定されないが、デキストラン、デンプン、セルロース、それらの誘導体および置換物、それらの加水分解生成物ならびにそれらの塩およびエステルの群から選択され、好ましくはマルトデキストリンである。コアは、１つまたはいくつかの多糖またはオリゴ糖によって構成され得る。一実施形態では、カチオン性リガンドは、第四級アンモニウム、第二級アミン、および第一級アミンを含むがこれらに限定されない群から選択される。
【0182】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質、ヘテロ多量体融合タンパク質、または核酸の送達システムへの会合は、水溶液における混合によって行われる。一実施形態では、水溶液は、薬学的に許容される賦形剤、アジュバント、塩、および／または緩衝成分をさらに含む。一実施形態では、本発明の融合タンパク質、ヘテロ多量体融合タンパク質、または核酸は、イオン結合または疎水性の結合によって送達システムの内側および／または表面、好ましくは送達システムの表面において会合し得る。
【0183】
本発明の別の目的は、本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質、または本発明による融合タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸分子、または本発明による融合タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸分子を含む少なくとも１つのベクターを含む、それから本質的になる、またはそれからなる組成物である。
【0184】
本発明の別の目的は、本発明による少なくとも１つのヘテロ多量体融合タンパク質を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる組成物である。
【0185】
本発明の別の目的は、本発明による融合タンパク質、または核酸分子、またはヘテロ多量体融合タンパク質を含むかまたはそれと会合した、本明細書に記載の少なくとも１つのナノ粒子を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる組成物である。
【0186】
一実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質と、少なくとも１つのＳタンパク質またはその断片（融合タンパク質に含まれない）とを含む。一実施形態では、組成物に存在する融合タンパク質に含まれないＳタンパク質（またはその断片）は、融合タンパク質に含まれるものと同じである。別の実施形態では、組成物に存在する融合タンパク質に含まれないＳタンパク質（またはその断片）は、融合タンパク質に含まれるものの変異体である。例えば、一実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記載の配列番号１または配列番号１８のアミノ酸配列からなるＳタンパク質（またはその断片）と、配列番号１または配列番号１８の変異体である融合タンパク質に含まれないＳタンパク質（またはその断片）とを含む融合タンパク質を含む。
【0187】
一実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質と、少なくとも１つのＳｔタンパク質（すなわち、三量体化ドメインをさらに含むＳタンパク質）またはその断片とを含む。一実施形態では、組成物に存在するＳｔタンパク質（またはその断片）は、融合タンパク質に含まれるものと同じである。別の実施形態では、組成物に存在するＳｔタンパク質（またはその断片）は、融合タンパク質に含まれるものの変異体である。例えば、一実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記載の配列番号２６または配列番号２９のアミノ酸配列からなるＳｔタンパク質（またはその断片）、および配列番号２６または配列番号２９の変異体であるＳｔタンパク質（またはその断片）を含む融合タンパク質を含む。
【0188】
一実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記載の少なくとも２つの融合タンパク質を含み、少なくとも２つの融合タンパク質のそれぞれは、別個のＳタンパク質（またはその断片）を含む。例えば、一実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記載の配列番号１または配列番号１８のアミノ酸配列からなるＳタンパク質（またはその断片）と、配列番号１または配列番号１８の変異体であるＳタンパク質（またはその断片）を含む別の融合タンパク質とを含む融合タンパク質を含む。一実施形態では、少なくとも２つの融合タンパク質は、異なるＳタンパク質またはその断片を含むが、同じＮタンパク質またはその断片を含む。
【0189】
一実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記載の少なくとも２つの融合タンパク質を含み、少なくとも２つの融合タンパク質のそれぞれは、別個のＳｔタンパク質（またはその断片）を含む。例えば、一実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記載の配列番号２６または配列番号２９のアミノ酸配列からなるＳｔタンパク質（またはその断片）を含む融合タンパク質、および配列番号２６または配列番号２９の変異体であるＳタンパク質を含む別の融合タンパク質（またはその断片）を含む。一実施形態では、少なくとも２つの融合タンパク質は、別個のＳｔタンパク質またはその断片を含むが、同じＮタンパク質またはその断片を含む。
【0190】
一実施形態では、前述の組成物は医薬組成物であり、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。
【0191】
結局のところ、本発明の別の目的は、本発明による少なくとも１つの融合タンパク質、少なくとも１つのヘテロ多量体融合タンパク質、少なくとも１つの核酸分子、または少なくとも１つのベクターを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる医薬組成物である。
【0192】
本発明の別の目的は、本発明による融合タンパク質、または核酸分子、またはヘテロ多量体融合タンパク質を含むかまたはそれと会合した本明細書に記載の少なくとも１つのナノ粒子を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる医薬組成物である。
【0193】
本明細書で使用される場合、組成物に関して「から本質的になる」とは、本発明による少なくとも１つの融合タンパク質、少なくとも１つのヘテロ多量体融合タンパク質、少なくとも１つの核酸分子、または少なくとも１つのベクターが、前述の組成物内に生物学的活性を有する唯一の治療剤または薬剤であることを意味する。
【0194】
本発明の組成物に使用され得る薬学的に許容され得る賦形剤の例としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的なグリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質（例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム）、ポリエチレングリコール、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレン－ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられるが、これらに限定されない。
【0195】
一実施形態では、本発明による医薬組成物は、対象に注射することができる製剤用に薬学的に許容されるビヒクルを含む。これらは、特に等張性の滅菌生理食塩水（リン酸一ナトリウムもしくは二ナトリウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムもしくはマグネシウムクロリドなど、またはこのような塩の混合物）、または場合に応じて滅菌水または生理食塩水を添加すると注射可能な溶液の構成を可能にする乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物であり得る。
【0196】
本発明の別の目的は、本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質、または本発明による融合タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸分子、または本発明による融合タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸分子を含む少なくとも１つのベクターを含む、それから本質的になる、またはそれからなる医薬品である。
【0197】
本発明の別の目的は、本発明による少なくとも１つのヘテロ多量体融合タンパク質を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる医薬品である。
【0198】
本発明の別の目的は、本発明による融合タンパク質、または核酸分子、またはヘテロ多量体融合タンパク質を含む、またはそれらと会合した、本明細書に記載の少なくとも１つのナノ粒子を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる医薬品である。
【0199】
本発明の別の目的は、本発明による少なくとも１つの融合タンパク質、少なくとも１つのヘテロ多量体融合タンパク質、少なくとも１つの核酸分子、または少なくとも１つのベクターを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなるワクチンである。
【0200】
本発明の別の目的は、本発明による融合タンパク質、または核酸分子、またはヘテロ多量体融合タンパク質を含むかまたはそれと会合した本明細書に記載の少なくとも１つのナノ粒子を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるワクチンである。
【0201】
一実施形態では、本発明のワクチンは、本明細書に記載の少なくとも２つの融合タンパク質を含み、少なくとも２つの融合タンパク質のそれぞれは、別個のＳタンパク質（またはその断片）を含む。例えば、一実施形態では、本発明のワクチンは、本明細書に記載の配列番号１のアミノ酸配列からなるＳタンパク質（またはその断片）を含む融合タンパク質、および配列番号１の変異体であるＳタンパク質（またはその断片）を含む別の融合タンパク質を含む。
【0202】
一実施形態では、本発明のワクチンは、本明細書に記載の少なくとも２つの融合タンパク質を含み、少なくとも２つの融合タンパク質のそれぞれは、別個のＳタンパク質（またはその断片）を含む。例えば、一実施形態では、本発明のワクチンは、本明細書に記載の配列番号１８のアミノ酸配列からなるＳタンパク質（またはその断片）を含む融合タンパク質、および配列番号１８の変異体であるＳタンパク質（またはその断片）を含む別の融合タンパク質を含む。
【0203】
一実施形態では、本発明のワクチンは、本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質と、少なくとも１つのＳタンパク質（またはその断片、融合タンパク質に含まれない）とを含む。一実施形態では、ワクチンに存在する融合タンパク質に含まれないＳタンパク質（またはその断片）は、融合タンパク質に含まれるものと同じである。別の実施形態では、ワクチンに存在する融合タンパク質に含まれないＳタンパク質（またはその断片）は、融合タンパク質に含まれるものの変異体である。例えば、一実施形態では、本発明のワクチンは、本明細書に記載の配列番号１または配列番号１８のアミノ酸配列からなるＳタンパク質（またはその断片）と、配列番号１または配列番号１８の変異体である融合タンパク質に含まれないＳタンパク質（またはその断片）とを含む融合タンパク質を含む。
【0204】
一実施形態では、本発明のワクチンは、本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質および少なくとも１つのＳｔタンパク質を含む。一実施形態では、ワクチンに存在するＳｔタンパク質は、融合タンパク質に含まれるものと同じＳタンパク質またはその断片を含む。別の実施形態では、ワクチンに存在するＳｔタンパク質は、融合タンパク質に含まれるものの変異体であるＳタンパク質またはその断片を含む。例えば、一実施形態では、本発明のワクチンは、本明細書に記載の配列番号１または配列番号１８のアミノ酸配列からなるＳタンパク質（またはその断片）と、配列番号１または配列番号１８の変異体であるＳタンパク質またはその断片を含むＳｔタンパク質とを含む融合タンパク質を含む。
【0205】
一実施形態では、本発明のワクチンは、本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質および少なくとも１つのＳｔタンパク質を含む。一実施形態では、ワクチンに存在するＳｔタンパク質は、融合タンパク質に含まれるものと同じである。別の実施形態では、ワクチンに存在するＳｔタンパク質は、融合タンパク質に含まれるものの変異体である。例えば、一実施形態では、本発明のワクチンは、本明細書に記載の配列番号２６または配列番号２９のアミノ酸配列からなるＳｔタンパク質（またはその断片）と、配列番号２６または配列番号２９の変異体であるＳｔタンパク質またはその断片とを含む融合タンパク質を含む。
【0206】
本発明の別の目的は、ワクチンとして使用するための、特にコロナウイルス感染、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を予防するための、またはＣＯＶＩＤ１９の発症を予防するための、本明細書に記載の融合タンパク質である。本発明の別の目的は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染などのコロナウイルス感染を予防するための、またはＣＯＶＩＤ１９の発症を予防するためのワクチンとして使用するための、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子、または本明細書に記載の融合タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸分子を含むベクターである。
【0207】
本発明の別の目的は、ワクチンとして使用するための、特にコロナウイルス感染、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を予防するための、またはＣＯＶＩＤ１９の発症を予防するための、本明細書に記載のヘテロ多量体融合タンパク質である。本発明の別の目的は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染などのコロナウイルス感染を予防するための、またはＣＯＶＩＤ１９の発症を予防するためのワクチンとして使用するための、本明細書に記載のヘテロ多量体融合タンパク質をコードする核酸分子または核酸分子の組み合わせ、または本明細書に記載のヘテロ多量体融合タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸分子を含むベクターである。
【0208】
本発明の別の目的は、ワクチンとして使用するための、特にコロナウイルス感染、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を予防するための、またはＣＯＶＩＤ１９の発症を予防するための、本発明による融合タンパク質、または核酸分子、またはヘテロ多量体融合タンパク質を含むかまたはそれと会合した本明細書に記載のナノ粒子である。
【0209】
一実施形態では、前述のワクチンはアジュバントをさらに含む。本明細書で使用される場合、「アジュバント」は、本発明の融合タンパク質（またはヘテロ多量体融合タンパク質、または核酸分子）の免疫原性を増強する物質である。アジュバントは、免疫応答を高めるために投与されることが多く、当業者に周知である。
【0210】
本発明において使用され得る好適なアジュバントは、限定されないが、アルミニウム塩（ミョウバン）、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよび硫酸アルミニウム、フロイント不完全アジュバント、ミコラート系アジュバント（例えば、トレハロースジミコレート）、水中油型エマルジョン配合物、例えば、界面活性剤Ｔｗｅｅｎ ８０およびＳｐａｎ ８５によって水性緩衝液中で安定化されたスクアレン油の液滴を含有するＭＦ５９、スクアレン系エマルジョンまたはスクアラン系エマルジョン、ＡＳ０アジュバント系、例えば、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および単離および精製サポニン画分（ＱＳ－２１）を含有するＡＳ０１、α－トコフェロール（ビタミンＥ）を含有するスクアレン水中油型エマルジョンアジュバントであるＡＳ０３、アルミニウム塩に吸着されたサルモネラ・ミネソータ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）から抽出された解毒形態のリポ多糖（ＬＰＳ）である３－Ｏ－デサシル－４’－モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）からなるＡＳＯ４、油中水型エマルジョン配合物、例えばＩＳＡ－５１、スクアレン系油中水型アジュバント（例えば、ＩＳＡ－７２０）、サポニンアジュバント、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）、２２ ｍｅｒの一本鎖ＤＮＡであるＣｙｔｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｇｕａｎｏｓｉｎｅ １０１８（ＣｐＧ １０１８）、ペプチドグリカン（すなわち、ムレイン、ムコペプチド、またはＮ－Ｏｐａｃａ、ムラミルジペプチド［ＭＤＰ］、もしくはＭＤＰ類似体などの糖タンパク質である）、ＭＰＬ（モノホスホリルリピドＡ）、プロテオグリカン（例えば、肺炎桿菌から抽出される）、合成リピドＡ類似体、例えばアミノアルキルグルコサミンリン酸化合物（ＡＧＰ）、またはそれらの誘導体もしくは類似体、サイトカイン、例えばインターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８など）、インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロン）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、共刺激分子Ｂ７－１およびＢ７－２、野生型または変異型のいずれかのコレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、または大腸菌熱不安定性毒素（ＬＴ）などの細菌ＡＤＰリボシル化毒素の解毒変異体、植物油（アラキド油など）、リポソーム、プルロニックポリオール、Ｒｉｂｉアジュバント系（例えば、ＧＢ－Ａ－２ １８９ １４１を参照されたい）、および組成物の有効性を増強するための免疫刺激剤として作用する他の物質を含む。
【0211】
対象への投与に使用するために、融合タンパク質、ヘテロ多量体融合タンパク質、ナノ粒子、組成物、医薬組成物、医薬品またはワクチンが製剤化される。
【0212】
一実施形態では、本発明による融合タンパク質、ヘテロ多量体融合タンパク質、ナノ粒子、組成物、医薬組成物、医薬品またはワクチンは、経鼻的に、非経口で、経口で、吸入スプレーによって、直腸で、または埋め込まれたリザーバを介して投与される。
【0213】
一実施形態では、本発明による融合タンパク質、ヘテロ多量体融合タンパク質、ナノ粒子、組成物、医薬組成物、医薬品またはワクチンは、粘膜経路によって投与される（例えば、経鼻的に、経口的に、吸入によって、または直腸的に）。一実施形態では、粘膜経路によって投与される場合、本発明によるナノ粒子、組成物、医薬組成物、医薬品またはワクチンは、粘膜エンハンサーをさらに含む。一実施形態では、粘膜エンハンサーは、本明細書に記載のナノ粒子である。
【0214】
一実施形態では、融合タンパク質、ヘテロ多量体融合タンパク質、ナノ粒子、組成物、医薬組成物、医薬品またはワクチンは、経鼻投与される。経鼻投与に適した形態の例には、スプレー、点鼻薬および鼻軟膏が含まれるが、これらに限定されない。
【0215】
一実施形態では、融合タンパク質、ヘテロ多量体融合タンパク質、ナノ粒子、組成物、医薬組成物、医薬品またはワクチンは、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内および頭蓋内の注射または注入技術を含むがこれらに限定されない注射によって投与される。
【0216】
注射に適した形態の例としては、限定されないが、溶液、例えば滅菌水溶液、ゲル、分散液、エマルジョン、懸濁液、使用前に液体を添加して溶液または懸濁液を調製するために使用するのに適した固体形態、例えば粉末、リポソーム形態などが挙げられる。
【0217】
本発明はさらに、医薬品として使用するための、特に、コロナウイルス感染、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染もしくはＣＯＶＩＤ１９またはその症状を、それを必要とする対象において予防または治療するために使用するための、本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質またはヘテロ多量体融合タンパク質に関する。
【0218】
本発明はさらに、医薬品として使用するための、特に、コロナウイルス感染、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染もしくはＣＯＶＩＤ１９またはその症状の予防もしくは治療を、それを必要とする対象において使用のための、本発明による融合タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸分子、または本発明による融合タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸分子を含む少なくとも１つのベクターに関する。
【0219】
本発明はさらに、医薬品として使用するための、特に、コロナウイルス感染、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染もしくはＣＯＶＩＤ１９またはそれらの症状を、それを必要とする対象において予防または治療するために使用するための、本発明による融合タンパク質、または核酸分子、またはヘテロ多量体融合タンパク質を含むかまたはそれと会合した本明細書に記載の少なくとも１つのナノ粒子に関する。
【0220】
本発明はさらに、コロナウイルスによる感染、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２もしくはＣＯＶＩＤ１９による感染またはその症状を、その予防を必要とする対象において予防する方法であって、本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質、少なくとも１つのヘテロ多量体融合タンパク質、少なくとも１つの核酸分子、少なくとも１つのベクター、少なくとも１つのナノ粒子、または少なくとも１つの組成物、医薬組成物、医薬品もしくはワクチンを対象に投与することを含む方法に関する。
【0221】
本発明の別の目的は、コロナウイルスによる感染、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２もしくはＣＯＶＩＤ１９による感染またはその症状を治療する方法であって、前述の方法が、本明細書に記載の少なくとも１つの融合タンパク質、ヘテロ多量体融合タンパク質、核酸分子、ベクター、ナノ粒子、組成物、医薬組成物、医薬品またはワクチンを対象に投与することを含む方法である。
【0222】
本発明はさらに、医薬品の製造における、特にコロナウイルス感染、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染もしくはＣＯＶＩＤ１９またはその症状の予防または治療のための、それを必要とする対象における、本明細書に記載の融合タンパク質またはヘテロ多量体融合タンパク質の使用に関する。本発明の別の目的は、本発明による融合タンパク質をコードする核酸分子、または本発明による融合タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸分子を含むベクターの、医薬品の製造における、特に、コロナウイルス感染、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染もしくはＣＯＶＩＤ１９の、それを必要とする対象における予防または治療での使用である。本発明はさらに、本発明による融合タンパク質、または核酸分子、またはヘテロ多量体融合タンパク質を含むかまたはそれと会合した本明細書に記載のナノ粒子の、特に、コロナウイルス感染、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染もしくはＣＯＶＩＤ１９、またはその症状の、それを必要とする対象における予防または治療のための医薬品の製造における使用に関する。
【0223】
本発明の別の目的は、対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染などのコロナウイルス感染を診断するための方法であって、本発明による融合タンパク質の使用を含む方法である。
【0224】
本発明の別の目的は、対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染などのコロナウイルス感染を診断するための方法であって、本発明によるヘテロ多量体融合タンパク質の使用を含む方法である。
【0225】
本明細書で使用される「診断」という用語は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染などのコロナウイルス感染の識別などの病理学的状態、疾患または状態の識別を指す。
【0226】
一実施形態では、対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染などのコロナウイルス感染を診断するための方法は、（ａ）対象からの生物学的試料を本発明の融合タンパク質と接触させる工程、（ｂ）生物学的試料に存在する結合パートナーと相互作用する融合タンパク質のレベルを測定する工程、（ｃ）対象がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルスに感染しているかどうかを、工程（ｂ）で測定されたレベルに基づいて評価する工程を含む。一実施形態では、前述の方法はサンドイッチＥＬＩＳＡ法のＥＬＩＳＡ法である。
【0227】
一実施形態では、コロナウイルス感染、例えば、対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を診断するための方法は、（ａ）対象由来の生物学的試料を本発明のヘテロ多量体融合タンパク質と接触させる工程、（ｂ）生物学的試料に存在する結合パートナーと相互作用するヘテロ多量体融合タンパク質のレベルを測定する工程、（ｃ）対象がコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染しているかどうかを、工程（ｂ）において測定されたレベルに基づいて評価する工程を含む。一実施形態では、前述の方法はサンドイッチＥＬＩＳＡ法のＥＬＩＳＡ法である。
【0228】
本明細書で使用される場合、「生物学的試料」は、対象から単離された生物学的試料を指し、限定ではなく例として、対象から得られた体液、細胞試料および／またはホモジネートもしくは可溶化組織などの組織抽出物を含み得る。
【0229】
一実施形態では、本発明は、対象から生物学的試料を得ることを含まない。したがって、一実施形態では、対象からの生物学的試料は、対象から以前に得られた生物学的試料である。前述の生物学的試料は、本明細書に記載されるように使用される前に適切な条件で保存され得る。
【0230】
本発明の別の目的は、本発明による融合タンパク質またはヘテロ多量体融合タンパク質を含む診断キットである。一実施形態では、診断キットは、本発明の診断方法を実施するように適合される。
【0231】
本発明の別の目的は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルスの核タンパク質（Ｎ）を産生する方法である。
【0232】
一実施形態では、コロナウイルスの核タンパク質（Ｎ）、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を産生するための方法は、（ａ）本発明による核酸分子を含む宿主細胞を培養すること、（ｂ）本発明による融合タンパク質を回収すること、（ｃ）工程（ｂ）で回収された融合タンパク質を指向性タンパク質分解によって切断し、それによりコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の核タンパク質（Ｎ）を放出すること、および（ｄ）任意選択で、コロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の核タンパク質（Ｎ）を精製することを含む。
【図面の簡単な説明】
【0233】
【図1】クーマシーブルーで染色した還元条件でのＮタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの写真である。核タンパク質を、そのＨｉｓタグを使用して精製し、いくつかの精製工程を経た後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分析した。精製後のタンパク質収率は２ｍｇ／Ｌを下回っている。ゲルにおいて３つの帯状物が見える。上から下に向かって、夾雑物、核タンパク質、核タンパク質のタンパク質分解形態である。
【図2】クーマシーブルーで染色した還元条件（左）または非還元条件（右）でのＮＦタンパク質（Ｎタンパク質と二量体化ドメイン（Ｆ）との融合）のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの写真である。還元条件および非還元条件の両方で、タンパク質分解されたＮタンパク質の帯状物が可視である。非還元条件では、タンパク質分解されていないＮＦタンパク質の帯状物が見える。精製後のタンパク質収量は４０ｍｇ／Ｌであるが、大部分は核タンパク質のタンパク質分解形態である。
【図3】三量体化ドメイン（ｔ）および／または二量体化ドメイン（Ｆ）、つまりＳｔＮ、ＮＳｔ、ＳＮＦ、ＳＦＮおよびＳｔＦＮを含む、本発明による５つのＳ／Ｎ融合タンパク質のスキームである。
【図4】クーマシーブルーで染色した、変性および還元条件でのＳＦＮ構築物融合タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの写真である。
【図5】クーマシーブルーで染色した、変性および非還元条件のＳｔ６Ｆ２Ｎ２構築物のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの写真であり、ＳｔＦＮ融合タンパク質のストリップおよびＳｔ融合タンパク質のストリップを示す。
【図6】クーマシーブルーで染色した、変性および還元条件のＳｔ６Ｆ２Ｎ２構築物のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの写真であり、ＳｔＦＮ融合タンパク質のストリップおよびＳｔ融合タンパク質のストリップを示す。
【図7】Ｓｔ６Ｆ２Ｎ２ヘテロ多量体融合タンパク質を概略的に表現したものである。左端には、Ｓタンパク質、三量体化ドメイン、二量体化ドメインおよび核タンパク質から構成されるＳｔＦＮ融合タンパク質が示されている。その隣には、Ｓタンパク質および三量体化ドメインから構成されるＳｔ融合タンパク質が表される。Ｓｔ融合タンパク質は、ＳｔＦＮ融合タンパク質に含まれるものと同じＳタンパク質、または異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株由来のＳタンパク質のいずれかで構成され得る。右側には、二量体化ドメインを介して集合する２つのＳｔＦＮ融合タンパク質と、三量体化ドメインを介して集合する４つのＳｔ融合タンパク質とから形成されるＳｔ６Ｆ２Ｎ２ヘテロ多量体融合タンパク質が表されている。
【図8】Ｓｔ３融合タンパク質、Ｓｔ６Ｆ２融合タンパク質、Ｓｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質、および対照として使用した無関係なタンパク質における核タンパク質のサンドイッチＥＬＩＳＡによる検出を示すグラフである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質に対する抗体をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２核タンパク質抗体を検出に使用し、Ｓｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質の検出を可能にした。
【図9】図９Ａ～図９Ｃは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの写真、ナノ粒子を用いて製剤化されたＳｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質を特徴付けるネイティブＰＡＧＥおよびマイクロＢＣＡタンパク質アッセイの写真の組み合わせである。図９Ａは、変性および還元条件におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの写真を示し、図９Ｂは、Ｓｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質（Ｓｔ６Ｆ２Ｎ２）、ナノ粒子単独、ナノ粒子と配合されたＳｔ３融合タンパク質（Ｓ）、ナノ粒子と配合されたＳｔ６Ｆ２融合タンパク質（Ｓ＋）、およびナノ粒子と配合されたＳｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質（ＬＶＴ）のネイティブ－ＰＡＧＥの写真を示す。図９Ｃは、ナノ粒子単独、Ｓｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質（Ｓｔ６Ｆ２Ｎ２）およびナノ粒子を配合したＳｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質（ＬＶＴ）のマイクロＢＣＡタンパク質アッセイによるタンパク質の定量化を示す。
【図10】図１０Ａ～図１０Ｂは、ナノ粒子単独（図１０Ａ）およびナノ粒子と共に製剤化されたＳｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質（図１０Ｂ）を示す透過型電子顕微鏡写真の組み合わせである。矢印は、ナノ粒子の表面に会合した融合タンパク質の例を示す。スケールバーは２００ｎｍである。
【図11】図１１Ａ～図１１Ｅは、免疫化Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の血清における体液性免疫応答を示すグラフの組み合わせである。雌のＢａｌｂ／ｃマウスを、ナノ粒子単独（ＣＴＲＬ）またはナノ粒子を配合したＳｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質（ＬＶＴ）で、鼻腔内経路によって、３週間間隔で２回免疫した。血清ＩｇＧ（図１１Ａ～図１１Ｂ）またはＩｇＡ（図１１Ｃ～図１１Ｄ）抗スパイク（抗Ｓ）を、最後の免疫化の７日後に、特異的ＥＬＩＳＡによって分析した。結果を、単一希釈（１：５０）での４０５ｎｍでの光学密度（図１１Ａ～図１１Ｃ）およびＬｏｇ２力価（図１１Ｂ～図１１Ｄ）として示す。図１１Ｅは、ナノ粒子単独（ＣＴＲＬ）またはナノ粒子を配合したＳｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質（ＬＶＴ）で免疫したマウス由来の血清抗体のＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２中和能を示す。結果を、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２感染率として示す。データをｔ検定およびマンホイットニー検定により分析した（＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図12】図１２Ａ～図１２Ｃは、免疫化Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の粘膜区画における体液性免疫応答分析を示すグラフの組み合わせである。雌のＢａｌｂ／ｃマウスを、ナノ粒子単独（ＣＴＲＬ）またはナノ粒子を配合したＳｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質（ＬＶＴ）で、鼻腔内経路によって、３週間間隔で２回免疫した。鼻（図１２Ａ）、ＢＡＬ（図１２Ｂ）および肺（図１２Ｃ）ＩｇＡ抗スパイク（抗Ｓ）を、最後の免疫化の７日後に特異的ＥＬＩＳＡにより分析した。結果を４０５ｎｍでの光学密度（ＯＤ）で示す。データをｔ検定およびマンホイットニー検定により分析した（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図13】図１３Ａ～図１３Ｈは、免疫化Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎ、ＤｅｌｔａまたはＯｍｉｃｒｏｎ変異体由来のスパイクタンパク質に対する、または核タンパク質に対する脾細胞性免疫応答を示すグラフの組み合わせである。雌のＢａｌｂ／ｃマウスを、ナノ粒子単独（ＣＴＲＬ）またはナノ粒子を配合したＳｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質（ＬＶＴ）で、鼻腔内経路によって、３週間間隔で２回免疫した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎ、ＤｅｌｔａもしくはＯｍｉｃｒｏｎ変異体由来のスパイクタンパク質、または核タンパク質による７２時間の脾細胞刺激後、細胞上清において、ＭＡＣＳＰｌｅｘ Ｃｙｔｏｋｉｎｅキットによって、サイトカインを定量した。図１３ＡはＩＦＮ－γの産生を示し、図１３ＢはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎ変異体由来のスパイクタンパク質で刺激した後のＩＬ－２の産生を示す。図１３ＣはＩＦＮ－γの産生を示し、図１３ＤはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｌｔａ変異体由来のスパイクタンパク質で刺激した後のＩＬ－２の産生を示す。図１３ＥはＩＦＮ－γの産生を示し、図１３ＦはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｏｍｉｃｒｏｎ変異体由来のスパイクタンパク質で刺激した後のＩＬ－２の産生を示す。図１３ＧはＩＦＮ－γの産生を示し、図１３ＦはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からの核タンパク質で刺激した後のＩＬ－２産生を示す。データをｔ検定およびマンホイットニー検定により分析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図14】図１４Ａ～図１４Ｂは、免疫化させたＢａｌｂ／ｃマウスにおける脾細胞免疫応答を示すグラフの組み合わせである。雌のＢａｌｂ／ｃマウスを、ナノ粒子単独（ＣＴＲＬ）またはナノ粒子を配合したＳｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質（ＬＶＴ）で、鼻腔内経路によって、３週間間隔で２回免疫した。脾細胞を表面マーカーについて染色し、フローサイトメトリーによって分析した。図１４Ａは、ＣＤ４＋ＣＤ４４＋細胞のパーセンテージを示す。図１４Ｂは、ＣＤ８＋ＣＤ４４＋細胞のパーセンテージを示す。データを、ｔ検定により分析した（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図15】図１５Ａ～図１５Ｂは、免疫化させたＢａｌｂ／ｃマウスにおける肺細胞免疫応答を示すグラフの組み合わせである。雌のＢａｌｂ／ｃマウスを、ナノ粒子単独（ＣＴＲＬ）またはナノ粒子を配合したＳｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質（ＬＶＴ）で、鼻腔内経路によって、３週間間隔で２回免疫した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎ変異体由来のスパイクタンパク質による７２時間の肺細胞刺激後、細胞の上清において、ＭＡＣＳＰｌｅｘ Ｃｙｔｏｋｉｎｅキットによって、サイトカインを定量した。図１５ＡはＩＦＮ－γを示す。図１５ＢはＩＬ－２を示す。データを、マンホイットニー検定によって分析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【図16】図１６Ａ～図１６Ｄは、免疫化させたＢａｌｂ／ｃマウスにおける肺のＴ細胞の免疫応答を示すグラフの組み合わせである。雌のＢａｌｂ／ｃマウスを、ナノ粒子単独（ＣＴＲＬ）またはナノ粒子を配合したＳｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質（ＬＶＴ）で、鼻腔内経路によって、３週間間隔で２回免疫した。肺細胞を表面のマーカーおよび細胞内サイトカインについて染色し、フローサイトメトリーによって分析した。図１６Ａは、ＣＤ４４＋ＣＤ４＋細胞のパーセンテージを示す。図１６Ｂは、ＣＤ４４＋ＣＤ８＋細胞のパーセンテージを示す。図１６Ｃは、ＩＦＮ－γ＋ＣＤ４＋細胞のパーセンテージを示す。図１６ＤはＩＦＮ－γ＋ＣＤ８＋細胞のパーセンテージを示す。データをｔ検定およびマンホイットニー検定により分析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図17】図１７Ａ～図１７Ｄは、免疫化させたマウスにおける感染後の臨床徴候を示すグラフの組み合わせである。雌のＫ１８－ｈＡＣＥ２マウスを、ナノ粒子単独（ＣＴＲＬ）、ナノ粒子を配合したＳｔ３融合タンパク質（Ｓ）、ナノ粒子を配合したＳｔ６Ｆ２融合タンパク質（Ｓ＋）、またはナノ粒子を配合したＳｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質（ＬＶＴ）による鼻腔内接種によって、３週間間隔で２回免疫化した。２回目の免疫化の１週間後、マウスにＤｅｌｔａ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体（０．８８×１０５ＰＦＵ、２０μｌ）を感染させた。感染後８日目に様々な臨床徴候を測定した。図１７Ａは、感染後０、２、４、６、８および１０日目のマウス体重を示す。図１７Ｂは、感染後８日目に測定されたマウスの呼吸窮迫を示す。図１７Ｃは、感染後８日目に測定されたマウスの脊柱前弯を示す。図１７Ｄは、感染後８日目に測定されたマウスの顔貌を示す。
【図18】図１８Ａ～図１８Ｂは、感染誘発後のマウスの生存を示すグラフの組み合わせである。雌のＫ１８－ｈＡＣＥ２マウスを、ナノ粒子単独（ＣＴＲＬ）、ナノ粒子を配合したＳｔ３融合タンパク質（Ｓ）、ナノ粒子を配合したＳｔ６Ｆ２融合タンパク質（Ｓ＋）、またはナノ粒子を配合したＳｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質（ＬＶＴ）による鼻腔内接種によって、３週間間隔で２回免疫化した。２回目の免疫化の１週間後、マウスにＤｅｌｔａ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体（０．８８×１０５ＰＦＵ、２０μｌ、または５．６×１０５ＰＦＵ、３０μｌ）を感染させた。図１８Ａは、０．８８×１０５ＰＦＵのＤｅｌｔａ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体に感染したマウスの生存を示し、図１８Ｂは、５．６×１０５ＰＦＵのＤｅｌｔａ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したマウスの生存を示す。
【図19】図１９Ａ～図１９Ｃは、免疫化シリアンハムスターからの血清および鼻抗体の中和能を示すグラフの組み合わせである。ハムスターを、ナノ粒子単独（ＣＴＲＬ）またはナノ粒子を配合したＳｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質（ＬＶＴ）で、鼻腔内経路によって、３週間間隔で２回免疫した。中和活性を、ＷｕｈａｎおよびＤｅｌｔａ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２株に対して評価した。図１９Ａは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＷｕｈａｎおよびＤｅｌｔａ株に対する血清抗体の中和力価を示す。図１９Ｂ～図１９Ｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎ株（図１９Ｂ）およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｌｔａ株（図１９Ｃ）に対する鼻洗浄液からの抗体の中和能を、中和のパーセンテージとして示している。
【図20】図２０Ａ～図２０Ｉは、肺におけるウイルス負荷の抑制および鼻粘膜の有意な減少に関連するハムスターの防御を示すグラフの組み合わせである。雄のゴールデンハムスター（ｎ＝３０；４～５週齢）に、ナノ粒子単独（ＣＴＲＬ）、またはナノ粒子を配合したＳｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質（ＬＶＴ）を鼻腔内ワクチン接種し、３週間間隔で２回接種し、さらに５×１０４のＴＣＩＤ５０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎ（図２０Ａ～Ｅ）またはＤｅｌｔａ変異体（図２０Ｆ～Ｉ）で鼻腔内誘発した。図２０Ａおよび図２０Ｆは、０日目と比較した感染後２日目の体重変化率を示す。肺組織（図２０Ｂおよび図２０Ｇ）および篩骨鼻甲介（図２０Ｃおよび図２０Ｈ）を剖検時（感染後２日目）に収集し、ｑＲＴ－ＰＣＲによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出のためにＲＮＡを単離した。ＩＤ Ｇｅｎｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｕｐｌｅｘキット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、ＩＤ Ｖｅｔ）を使用して、ｑＲＴ－ＰＣＲによって判定した内因性ハウスキーピング対照内因性遺伝子（２＾（－ｄｅｌｔａＣｔ））と比較したウイルスＲＮＡの相対的な負荷。１未満の（２＾（－ｄｅｌｔａＣｔ））（点線）は、ウイルスＲＮＡの有意な検出がないことを示す。（図２０Ｄ、図２０Ｅおよび図２０Ｉ）鼻スワブを１日目（図２０Ｄおよび図２０Ｉ）または２日目（図２０Ｅ）に収集し、感染ウイルス力価をＴＣＩＤ５０によって判定した。データを、マンホイットニー検定によって分析した（＊ｐ＜０．０５）。
【図21】図２１Ａ～図２１Ｃは、ＬＶＴワクチン接種による肺における誘発後のウイルス負荷抑止を示すグラフの組み合わせである。雄のゴールデンハムスター（ｎ＝３０；４～５週齢）に、ナノ粒子単独（ＣＴＲＬ）またはナノ粒子を配合したＳｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質（ＬＶＴ）を鼻腔内ワクチン接種し、３週間間隔で２回接種し、さらに５×１０４個のＴＣＩＤ５０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎ（図２１Ｂ）またはＤｅｌｔａ変異体（図２１Ｃ）で鼻腔内誘発した。肺組織を剖検時（感染後２日目）に収集し、組織学のために処理した。図２１Ａの表は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出、スコアリング（０：染色なし、１：細気管支に限定された限局性または多巣性、２：細気管支およびそれらの実質近辺に限定された（組織の５％未満）限局性または多巣性染色、３：実質内に散在する（組織の１０％＜ｘ＜組織の２５％）多巣性染色、４：実質内に深く広がった（組織の＞２５％）多巣性染色）のためにマウスモノクローナル抗Ｎ抗体（クローン１Ｃ７Ｃ７）を使用した肺ウイルス免疫組織化学（ＩＨＣ）を示す。図２１Ｂ～図２１Ｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎ（図２１Ｂ）またはＤｅｌｔａ変異体（図２１Ｃ）による誘発後の肺ウイルスＩＨＣスコアリング定量化を示す。
【図22】ハムスターの鼻腔粘膜を概略的に表したものである。鼻甲介（Ｎｔ）、上顎甲介（Ｍｔ）、篩骨甲介（Ｅｔｈｎｍｏｔｕｒｂｉｎａｔｅｓ）（ＩＩｄ、ＩＩｖ、ＩＩＩ、ＩＶ）および嗅球を、丸で囲んで、矢印で示す。
【図23】図２３Ａ～図２３Ｉは、ＬＶＴによるワクチン接種によってハムスターに付与されるウイルス伝染（伝染性）に対する防御を示す。雄のゴールデンハムスター（ｎ＝１０；４～５週齢）に、ナノ粒子単独（ＣＴＲＬ）またはナノ粒子を配合したＳｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質（ＬＶＴ）を鼻腔内ワクチン接種し、３週間間隔で２回接種し、さらに５×１０４個のＴＣＩＤ５０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｌｔａ変異体で、鼻腔内誘発した。感染後のウイルス伝播に対するワクチン接種の影響を評価するために、ナイーブ雄ゴールデンハムスター（ｎ＝２０；４～５週齢）を、１匹の誘発させた動物について２センチネルの比で、誘発させた動物（感染後１日目から２日目）と、４８時間共に収容した。図２３Ａは、ハムスターの免疫化および誘発に使用される実験プロトコルを概略的に表現したものである。図２３Ｂおよび図２３Ｆは、誘発させた動物における０日目と比較した感染後２日目（図２３Ｂ）またはセンチネル動物における２日目と比較した共収容後３日目（図２３Ｆ）の体重変化率を示す。肺組織（図２３Ｃおよび図２３Ｇ）および篩骨鼻甲介（図２３Ｄおよび図２３Ｈ）を剖検時に、つまり誘発に対して感染後２日目（図２３Ｃおよび図２３Ｄ）、またはセンチネルに対して共収容後３日目（図２３Ｇおよび図２３Ｈ）に収集した。ＲＮＡを、ｑＲＴ－ＰＣＲによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出のために単離した。ＩＤ Ｇｅｎｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｕｐｌｅｘキット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、ＩＤ Ｖｅｔ）を使用して、ｑＲＴ－ＰＣＲによって判定した内因性ハウスキーピング対照内因性遺伝子（２＾（－ｄｅｌｔａＣｔ））と比較したウイルスＲＮＡの相対的な負荷。１未満の（２＾（－ｄｅｌｔａＣｔ））（点線）は、ウイルスＲＮＡの有意な検出がないことを示す。図２３Ｅおよび図２３Ｉは、誘発後２日目の誘発された動物（図２３Ｅ）および共収容後２日目のセンチネル動物（図２３Ｉ）で収集した鼻スワブのＴＣＩＤ５０によって判定された感染性ウイルス力価を示す。データを、マンホイットニー検定によって分析した（＊ｐ＜０．０５）。
【0234】
配列表
【表1】
【実施例】
【0235】
本発明を以下の実施例によってさらに説明する。
【0236】
実施例１：
材料および方法
プラスミド
材料および方法
プラスミド
【0237】
Ｓタンパク質の産生のために、スパイクタンパク質の可溶性三量体型、ならびに配列番号５のＧ４Ｓリンカーおよび配列番号６のヒスチジンタグ（Ｈｉｓ６）を含有するＣ末端に位置するフラグペプチドをコードする構築物を操作した。
【0238】
「可溶性」Ｎタンパク質の産生のために、ＣＨＯ（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）細胞におけるタンパク質の発現のための最適化されたヌクレオチド配列が想到されており、５’末端のシグナル配列をコードする配列、および３’末端の配列番号６に融合した配列番号５に対応するフラグペプチド（ＧＧＧＧＳＨＨＨＨＨＨ）をコードする配列をさらに含む。この配列は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓｄｎａによって作製された。
【0239】
融合タンパク質の概念
【0240】
４つの異なる融合タンパク質が設計されており、図３に示されている。ＳｔＮおよびＮＳｔは、三量体化ドメインおよびＨｉｓ６タグ（配列番号６）を含む。ＳＮＦおよびＳＦＮは、免疫グロブリンＦｃ断片の配列に基づく二量体化ドメインを含む（それにより、精製のための抗Ｆｃ抗体の使用が可能になる）。
【0241】
分子生物学
【0242】
すべての構築物は、アンピシリンに耐性のｐｃＤＮＡ３．４プラスミドで産生されている。タンパク質の分泌のために、シグナル配列をコードする配列がすべてのプラスミド構築物において使用されている。したがって、目的の配列を最初にＰＣＲによって増幅した（Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。次いで、ＰＣＲ産物をアガロースゲルで泳動し、得られた帯状物をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＧｅｌおよびＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ ＮＡＧＥＬ）キットを用いて精製した。次いで、ＮＥＢ Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅの技術（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の最適化されたプロトコルを使用して配列を組み立てた。次に、ＴＧ１コンピテント細菌を新生合成プラスミドで形質転換した。ＰＣＲでのスクリーニング後、プラスミドを単離するために「陽性」の細菌を精製した。次いで、プラスミドを配列決定し、ＤＨ５－α細菌を形質転換するために使用した。その後、作製したプラスミドを回収するためにＭａｘｉＰｒｅｐ（キットＰｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（２５）ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））を行った。
【0243】
細胞の培養
【0244】
キットＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ－ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎキットＧｉｂｃｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して細胞をトランスフェクトし、これを、製造業者のプロトコルおよび適合培養条件に従って、事前に調製した。その後、タンパク質が分泌された培養上清を、１０，０００ｇで１０分間の遠心分離によって回収した。生成されたタンパク質の量の推定は、クーマシーブルー染色に関連する変性および還元条件でＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを使用して行った。
【0245】
精製
【0246】
培養上清を１０，０００ｇで１０分間遠心分離し、０．２μｍフィルターで濾過した。精製はＡＫＴＡ純クロマトグラフィーシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行った。目的のタンパク質は、１つまたはいくつかのクロマトグラフィー技術、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、拡散排除クロマトグラフィーなどを用いて単離することができる。
【0247】
２８０ｎｍでの吸光度の測定を使用して、精製タンパク質を定量した。次いで、タンパク質を濃縮し、０．２μｍフィルターで濾過した。必要な分子量およびεを、プロトパラムプログラム（ＥｘＰＡＳｙ）によって推定した。
【0248】
結果
可溶性および三量体のＳタンパク質は高純度（収率、約５０ｍｇ／Ｌ）で得られたが、細胞内タンパク質であるＮタンパク質は、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞においてより入手困難であった。
可溶性および三量体のＳタンパク質は高純度（収率、約５０ｍｇ／Ｌ）で得られたが、細胞内タンパク質であるＮタンパク質は、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞においてより入手困難であった。
【0249】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核タンパク質（Ｎ）は、核酸の周りにシェルまたはキャプシドを形成するウイルスゲノムパッケージングに不可欠な豊富な構造ＲＮＡ結合タンパク質である。したがって、天然の条件下では、核タンパク質は排泄されることを意図しておらず、したがって、（ｉ）原核生物細胞において適切な立体配座で、（ｉｉ）真核生物細胞において適切な立体配座で十分な量で精製することが困難である。
【0250】
図１に示されるように、ＨｉｓタグにカップリングされたＮタンパク質を含有するプラスミド構築物によるＣＨＯ細胞のトランスフェクションでは、タンパク質精製工程後のＮタンパク質の十分な回収率（＜２ｍｇ／Ｌ）が可能にならない。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルは、天然型の核タンパク質に加えて、夾雑物ならびにタンパク質分解された核タンパク質を示す。
【0251】
同様に、二量体化ドメイン（Ｆ）にカップリングされたＮタンパク質を含有するプラスミド構築物によるＣＨＯ細胞のトランスフェクションは、タンパク質精製後、改善された収率（４０ｍｇ／Ｌ）を可能にするが、得られたＮタンパク質の大部分は、図２のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに示されるように、タンパク質分解される。
【0252】
回収の収率が十分で、タンパク質分解が低減した状態で、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞のＮタンパク質を得るという目的をもって、本発明者らは、驚くべきことに、Ｎタンパク質とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質などの別のタンパク質との融合タンパク質がタンパク質の収率および質の両方を増加させることを可能にすることを実証した。
【0253】
したがって、本発明の融合タンパク質は、図４に見られるように、良好なレベルの純度で、夾雑物が存在しない状態で得ることができる。図４は、精製ＳＦＮ融合タンパク質構築物の変性および還元条件におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。融合タンパク質を、良好な純度を備えるタンパク質Ａを使用して精製した。タンパク質の予想分子量は、還元条件では４１０ｋＤａおよび２０５ｋＤａであり、左側の分子量マーカーと比較することができる。したがって、核タンパク質がスパイクタンパク質に融合されるとき、最終融合タンパク質は、良好な収率、改善された純度、およびタンパク質分解なしで取得することができる。
【0254】
次いで、本出願人らは、２つの構築物（ＳｔＦＮおよびＳｔ）を同時にＥｐｉｘＣＨＯ細胞に同時トランスフェクトする同時トランスフェクション実験を行った。ＳｔＦＮ構築物は、Ｓタンパク質、三量体化ドメイン、Ｆｃ断片、および核タンパク質）を含む。Ｓｔ構築物は、Ｓタンパク質および三量体化ドメインを含む。図５（還元および変性条件でのＳＤＳ－ＰＡＧＥ）に示すように、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製後に２つのタンパク質が回収されている。いかなる理論にも拘束されるつもりはないが、出願人らは、２つのタンパク質がそれらの三量体化ドメインを介して集合するという仮説を立てた。次いで、ヘテロ多量体融合タンパク質は、タンパク質Ａを使用して、単一の工程で精製され得る。図５に示すように、両方のタンパク質が良好なレベルの純度で得られる。
【0255】
実施例２：
材料および方法
プラスミド
材料および方法
プラスミド
【0256】
Ｓタンパク質の産生のために、スパイクタンパク質の可溶性三量体型、ならびに配列番号５のＧ４Ｓリンカーおよび配列番号６のヒスチジンタグ（Ｈｉｓ６）を含有するＣ末端に位置するフラグペプチドをコードする構築物を操作した。
【0257】
「可溶性」Ｎタンパク質の産生のために、ＣＨＯ（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）細胞におけるタンパク質の発現のための最適化されたヌクレオチド配列が想到されており、５’末端のシグナル配列をコードする配列、および３’末端の配列番号６に融合した配列番号５に対応するフラグペプチド（ＧＧＧＧＳＨＨＨＨＨＨ）をコードする配列をさらに含む。この配列は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓｄｎａによって作製された。
【0258】
融合タンパク質の概念
【0259】
ＳｔＦＮ（配列番号２１）と呼ばれる融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に１つのＳタンパク質（配列番号１８）、三量体化ドメイン（配列番号１９）、二量体化ドメイン（配列番号２０）、およびＮタンパク質（配列番号２）を含む。
【0260】
分子生物学
【0261】
すべての構築物は、アンピシリンに耐性のｐｃＤＮＡ３．４プラスミドで産生されている。タンパク質の分泌のために、シグナル配列をコードする配列がすべてのプラスミド構築物において使用されている。したがって、目的の配列を最初にＰＣＲによって増幅した（Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。次いで、ＰＣＲ産物をアガロースゲルで泳動し、得られた帯状物をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＧｅｌおよびＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ ＮＡＧＥＬ）キットを用いて精製した。次いで、ＮＥＢ Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅの技術（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の最適化されたプロトコルを使用して配列を組み立てた。次に、ＴＧ１コンピテント細菌を新生合成プラスミドで形質転換した。ＰＣＲでのスクリーニング後、プラスミドを単離するために「陽性」の細菌を精製した。次いで、プラスミドを配列決定し、ＤＨ５－α細菌を形質転換するために使用した。その後、作製したプラスミドを回収するためにＭａｘｉＰｒｅｐ（キットＰｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（２５）ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））を行った。
【0262】
細胞の培養
【0263】
キットＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ－ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎキットＧｉｂｃｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して細胞をトランスフェクトし、これを、製造業者のプロトコルおよび適合培養条件に従って、事前に調製した。その後、タンパク質が分泌された培養上清を、１０，０００ｇで１０分間の遠心分離によって回収した。生成されたタンパク質の量の推定は、クーマシーブルー染色に関連する変性および還元条件でＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを使用して行った。
【0264】
精製
【0265】
培養上清を１０，０００ｇで１０分間遠心分離し、０．２μｍフィルターで濾過した。精製はＡＫＴＡ純クロマトグラフィーシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行った。目的のタンパク質は、１つまたはいくつかのクロマトグラフィー技術、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、拡散排除クロマトグラフィーなどを用いて単離することができる。
【0266】
２８０ｎｍでの吸光度の測定を使用して、精製タンパク質を定量した。次いで、タンパク質を濃縮し、０．２μｍフィルターで濾過した。必要な分子量およびεを、プロトパラムプログラム（ＥｘＰＡＳｙ）によって推定した。
【0267】
結果
本発明の融合タンパク質は、図６に見られるように、良好なレベルの純度で、夾雑物が存在しない状態で得ることができる。図６は、精製したＳｔ６Ｆ２Ｎ２ヘテロ多量体融合タンパク質構築物の変性および還元条件におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。融合タンパク質を、良好な純度を備えるタンパク質Ａを使用して精製した。Ｓｔ６Ｆ２Ｎ２ヘテロ多量体融合タンパク質の予想される分子量は、還元条件下で４２０ｋＤａおよび２１０ｋＤａであるが、Ｓｔ融合タンパク質の分子量は１４０ｋＤａであり、左側の分子量マーカーと比較することができる。したがって、核タンパク質がスパイクタンパク質に融合されるとき、最終融合タンパク質は、良好な収率、改善された純度、およびタンパク質分解なしで取得することができる。
本発明の融合タンパク質は、図６に見られるように、良好なレベルの純度で、夾雑物が存在しない状態で得ることができる。図６は、精製したＳｔ６Ｆ２Ｎ２ヘテロ多量体融合タンパク質構築物の変性および還元条件におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。融合タンパク質を、良好な純度を備えるタンパク質Ａを使用して精製した。Ｓｔ６Ｆ２Ｎ２ヘテロ多量体融合タンパク質の予想される分子量は、還元条件下で４２０ｋＤａおよび２１０ｋＤａであるが、Ｓｔ融合タンパク質の分子量は１４０ｋＤａであり、左側の分子量マーカーと比較することができる。したがって、核タンパク質がスパイクタンパク質に融合されるとき、最終融合タンパク質は、良好な収率、改善された純度、およびタンパク質分解なしで取得することができる。
【0268】
実施例３：
材料および方法
製造および精製
材料および方法
製造および精製
【0269】
スパイクタンパク質（配列番号２９に対応するＳｔ３）、ヘテロ多量体スパイクタンパク質（配列番号４９に対応するＳｔ６Ｆ２）、およびヘテロ多量体融合タンパク質（配列番号２１および２９に対応するＳｔ６Ｆ２Ｎ２）をＥｘｐｉＣＨＯ細胞で産生し、タンパク質をＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ Ｃ－ｔａｇＸＬおよびＨｉＴｒａｐ ＨＰプロテインＡカラムのいずれかを使用して、クロマトグラフィーアフィニティーによって、上清から精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、抗核タンパク質サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、産生されたタンパク質の抗原性を調べた。平底９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質Ｓ１受容体結合ドメイン抗体（１：１０００、１００－０５８１、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）でコーティングした。Ｓｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質、Ｓｔ３、Ｓｔ６Ｆ２および無関係なタンパク質の連続２倍希釈を行い（３００μｇ／ｍＬから開始）、ウェルに添加した。Ｓｔ６Ｆ２Ｎ２を、抗ＳＡＲＳ ＣＯＶ－２核タンパク質抗体（１：５０００、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、１００－０５８０）、続いてＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）交差吸着Ｆ（ａｂ’）２－ヤギ抗ウサギ、ＡＰ（１：２５００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５４４０９５４）を用いて検出した。各点の光学濃度を４０５ｎｍで読み取った。
【0270】
ワクチン製剤
【0271】
スパイクタンパク質（Ｓｔ３）、ヘテロ多量体スパイクタンパク質（Ｓｔ６Ｆ２）、およびＳｔ６Ｆ２Ｎ２ヘテロ多量体融合タンパク質（Ｓｔ６Ｆ２Ｎ２）を、マルトデキストリン系ナノ粒子と３：１の質量比（ナノ粒子：抗原）で配合して、それぞれＳ配合物（ナノ粒子を配合したＳｔ３）、Ｓ＋配合物（ナノ粒子を配合したＳｔ６Ｆ２）、およびＬＶＴ配合物（ナノ粒子を配合したＳｔ６Ｆ２Ｎ２）を得た。ナノ粒子を抗原と振とう条件下室温で１時間混合した。適切な体積の水を添加して免疫化のための所望の体積を得、使用する４８時間前に、製剤を室温で保存した。ＢＡＬＢ／ｃおよびＫ１８－ｈＡＣＥ２マウスモデルにおける免疫原性および生存実験のために、各マウスに、１０μｇのＳｔ３（Ｓ製剤）と混合した３０μｇのナノ粒子、１０．６μｇのＳｔ６Ｆ２（Ｓ＋製剤）と混合した３１．８μｇのナノ粒子、または１１．８μｇのＳｔ６Ｆ２Ｎ２（ＬＶＴ製剤）と混合した３５．４μｇのナノ粒子を、免疫化するたびに投与した。各製剤は、理論上、等モル量のスパイクタンパク質（７３．６ｐｍｏｌ）を含有する。
【0272】
ハムスターモデルでは、各ハムスターに３０μｇのＳｔ３（Ｓ製剤）と混合した１５０μｇのナノ粒子、または５８．８μｇのＳｔ６Ｆ２Ｎ２（ＬＶＴ製剤）と混合した１７６．４μｇのナノ粒子を投与した。各製剤は、理論上、等モル量のスパイクタンパク質（３６８ｐｍｏｌ）を含有する。
【0273】
電気泳動を行って、天然および還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおける様々な製剤を分析した。ＬＶＴ製剤のＳｔ６Ｆ２Ｎ２タンパク質の定量を、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔによって行った。
【0274】
リンタングステン酸でネガティブ着色した後、透過型電子顕微鏡法によって、ワクチン製剤を分析した。
【0275】
ＢＡＬＢ／ｃ免疫原性実験プロトコル
【0276】
ＣＥＲ Ｊａｎｖｉｅｒから入手した６週齢の雌のＢａｌｂ／ｃマウスを、免疫原性の実験に使用した。示されているように、７匹のマウスの群を、２０μＬのナノ粒子単独（ＣＴＲＬ）またはナノ粒子を配合したＳｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質（ＬＶＴ）で、３週間間隔で、鼻腔内経路によって２回免疫化した。ワクチン製剤の免疫原性を、肺および脾臓における全身および粘膜免疫応答を調べることによって、２回目の投与の１週間後に評価した。
【0277】
スパイク特異的ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体の分析を、血清、鼻、および気管支肺胞洗浄でＥＬＩＳＡによって行い、Ｗｕｈａｎ ｐｉｋｅ変異体由来の２μｇ／ｍＬのＳｔ３でコーティングされた平底９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）での最後の免疫化の１週間後に収集した。ヤギ抗マウスＩｇＧアルカリホスファターゼ（１：５，０００、Ａ３４３８ Ｓｉｇｍａ）およびヤギ抗マウスＩｇＡアルカリホスファターゼコンジュゲート（１：１，０００、Ａ４９３７ Ｓｉｇｍａ）を使用して、結合した抗体を検出した。純粋な鼻洗浄液およびＢＡＬ洗浄液を使用した。エンドポイントの力価を判定するために、血清の連続２倍希釈を行い（１：５０の希釈から開始）、ウェルに添加した。ナイーブマウス（未処置）の試料を陰性対照とした。各試料の光学密度を４０５ｎｍで読み取った。各試料のエンドポイント抗体価は、ナイーブマウスの血清より２．５倍大きいＯＤを生成する最大希釈の逆数として与えられる。血清の中和能を、ｈＡＣＥ２を発現するＶｅｒｏ細胞でのインキュベーションの１時間前に、連続的に希釈した血清試料をＳＡＲＳ－ＣｏＶ２シュードタイプ粒子（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２－ｐｐ）とプレインキュベーションすることによって評価した。ウイルス感染性を感染の３日後に判定した。
【0278】
細胞性免疫応答を最後の免疫化の１週間後に分析した。肺および脾細胞を１０μｇ／ｍＬのＳｔ３（Ｗｕｈａｎ、Ｄｅｌｔａ、およびＯｍｉｃｒｏｎスパイク変異体）または核タンパク質（原核生物系で産生され、ＬＰＳを中和するために５０μｇ／ｍＬのポリメキシンＢで前処理した）で刺激した。上清でのサイトカイン産生を、製造者の説明書に従ってＭｏｕｓｅ ＭＡＣｓＰｌｅｘ ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、７２時間後に分析した。脾臓および肺におけるＴＣＤ４＋およびＴＣＤ８＋リンパ球によるＩＦＮ－γの特異的な産生を調べた。細胞を、ＣＤ４ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＲＥＡｆｉｎｉｔｙ（商標）（ＲＥＡ ６０４）、ＣＤ８ｂ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ、ＰｅｒＣＰ－Ｖｉｏ（登録商標）７００、ＲＥＡｆｉｎｉｔｙ（商標）（ＲＥＡ ７９３）、ＩＦＮ－γＡｎｔｉｂｏｄｙ，ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＲＥＡｆｉｎｉｔｙ（商標）（ＲＥＡ ６３８）、ＣＤ４４ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＲＥＡｆｉｎｉｔｙ（商標）（ＲＥＡ ６６４）で染色した。プレートを、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）１０ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して分析した。
【0279】
Ｃ５７ＢＬ／６－Ｋ１８生存実験プロトコル
【0280】
Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから入手した８週齢の雌のＫ１８－ｈＡＣＥ２マウスを使用して、ワクチン接種後のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する生存を調べた。２４匹のマウスを４つの群に分け、ナノ粒子単独（ＣＴＲＬ）、またはナノ粒子を配合したＳｔ３スパイクタンパク質（Ｓ）、ナノ粒子を配合したＳｔ６Ｆ２融合タンパク質（Ｓ＋）、またはナノ粒子を配合したＳｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質（ＬＶＴ）で免疫した。各群を２０μＬ下で鼻腔内接種により３週間間隔で２回免疫した。２回目の免疫化の１週間後、マウスはＤｅｌｔａ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体（２０μＬへの０．８８×１０５ＰＦＵまたは３０μＬへの５．６×１０５ＰＦＵ）であった。感染の誘発は、イソフルラン麻酔下で、鼻腔内で行った。感染前、マウスの体重を１週間に１回測定した。感染後、体重、臨床徴候（呼吸窮迫、脊柱前弯、しかめた顔貌）および生存を毎日評価した。マウスを、０．８８×１０５ＰＦＵおよび５．６×１０５ＰＦＵの用量について、それぞれ１０日後および８日後に、頸椎脱臼により屠殺した。
【0281】
スパイク特異的ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体の分析を、血清、鼻洗浄でＥＬＩＳＡによって行い、Ｗｕｈａｎスパイク変異体由来の２μｇ／ｍＬのＳｔ３でコーティングされた平底９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）での最後の免疫化の１週間後に収集した。ヤギ抗ハムスターＩｇＧアルカリホスファターゼ（１：５，０００、Ｓａｂ３７７００４８９ Ｓｉｇｍａ）およびウサギ抗ハムスターＩｇＡアルカリホスファターゼコンジュゲート（１：１，２５０、Ｓａｂ ３００５ ＢｒｏｏｋｗｏｏｄＭｅｄｉｃａｌ）を使用して、結合された抗体を検出した。純粋な鼻洗浄液を使用し、各試料の光学密度を４０５ｎｍで読み取った。各血清試料のエンドポイントの抗体価を、マウスモデルにおいて以前に記載されたように判定した。
【0282】
ハムスターの防御／伝染性実験プロトコル
【0283】
４～５週齢の雄のゴールデンハムスターをＪａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓから得た。防御研究のために、８０μＬのナノ粒子単独（ＣＴＲＬ）、またはナノ粒子を配合したＳｔ３スパイクタンパク質（Ｓ）、ナノ粒子を配合したＳｔ６Ｆ２融合タンパク質（Ｓ＋）、またはナノ粒子を配合したＳｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質（ＬＶＴ）で、イソフルラン麻酔下で、鼻腔内経路を介して３週間隔てられた２回の接種のプロトコルに従って、ハムスターを免疫した。感染のために、ハムスターに、イソフルラン麻酔下で８０μＬにおいて５×１０４個のＴＣＩＤ５０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎおよび／またはＤｅｌｔａ変異体を、鼻腔内経路を介して誘発した。体重を毎日モニタリングした。肺および鼻スワブのウイルス負荷をｑＲＴ－ＰＣＲおよびＴＣＩＤ５０によって分析した。免疫組織学による分析のために、肺切片も調製した。
【0284】
直接的な接触（すなわち、個体間の伝染性）によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２伝染に対するワクチン接種の有効性を評価するために、３０匹のハムスターを、同じリタ－に由来する３匹の動物からなる１０の実験群に無作為に分けて、穏やかな共収容を可能にし、実験の４～６日間前にＢＳＬ－３施設で順化させた。５匹のハムスターに予めワクチン接種し、５匹のハムスターを擬似的に処置した（３週間間隔での２回の鼻腔内投与のワクチンまたは擬似）。次いで、すべてのドナーは、ワクチン接種／擬似処置の１週間後に誘発された。感染の２日後、接種した各ハムスターを、清潔なケージで２匹のナイーブハムスターと共収容するために戻した。ハムスターの共収容を４８時間続けた。このようにして、５トリオのワクチン接種／感染ドナー：ナイーブ直接接触が１：２の比、また５トリオの擬似処置／感染ドナー：ナイーブ直接接触が１：２の比で、実験を行った。体重を毎日モニタリングした。肺、嗅粘膜におけるウイルス負荷をｑＲＴ－ＰＣＲによって分析し、鼻スワブをＴＣＩＤ５０によって分析した。免疫組織学による分析のために、肺切片も調製した。
【0285】
肺および嗅粘膜（動物の頭部の片側の篩骨鼻甲介）生検を無菌で取り出して、－８０℃で凍結した。Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ ２４組織ホモジナイザー（Ｂｅｒｔｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、試料を解凍し、溶解マトリックスＭ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）でホモジナイズした。製造業者の指示に従ってＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して上清からさらにＲＮＡを抽出するために、ホモジネートを２０００ｇで１０分間遠心分離した。製造業者の手順に従って、ＩＤ遺伝子ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ Ｄｕｐｌｅｘキット（ＩＤ．Ｖｅｔ、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ ＲＮＡ定量的リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ検出をさらに行った。定量的ＲＴ－ＰＣＲを行い、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ９６ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて分析した。
【0286】
収集した鼻スワブを、ベロ細胞におけるさらなるＴＣＩＤ５０アッセイのために細胞培地において－８０℃で凍結した。Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｏｓｅ ５０ Ａｓｓａｙ（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）システムを用いて、試料を解凍して滴定した。ベロ細胞を感染前日に９６ウェルプレートに１．５×１０４細胞／ウェルで播種した。実験当日、培地でウイルスの連続的な希釈を行い、合計６つのウェルに各連続希釈のウイルスを感染させた（スワブの開始希釈は１：５）。４８時間のインキュベーション後、細胞を４％ＰＦＡで固定し、続いて０．１％のクリスタルバイオレットで染色した。次いで、ＴＣＩＤ５０を、ｌｏｇ（ＴＣＩＤ５０）＝ｌｏｇ（ｄｏ）＋ｌｏｇ（Ｒ）（ｆ＋１）という式を使用して計算した。ここで、ｄｏは陽性ウェルを与える希釈を表し、ｆは移動平均により算出された陽性ウェルの数から導かれる数であり、Ｒは希釈係数である。
【0287】
肺を４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋のために処理し、４μｍの切片を免疫組織化学のために使用した。嗅粘膜については、動物の頭部の半分を４％パラホルムアルデヒドＰＢＳにおいて室温で３日間固定し、次いで、３日間脱灰した（１０％のＥＤＴＡ、４℃でｐＨ７．３）。鼻中隔および内胞を、免疫組織化学（下部参照）後のさらなるウイルスのスコアリングに対する鼻腔の好都合な集中のためのブロックとして選択した。マウスモノクローナル抗体（１Ｃ７Ｃ７）を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核タンパク質を検出した。Ｈｉｓｔｏｆｉｎｅ Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｔａｉｎ Ｍｏｕｓｅ ＭＡＸ ＰＯキットを、二次抗マウスＨＲＰとして使用した（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎｃ）。画像は、ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｄソフトウェアパッケージ（Ｎｉｋｏｎ，Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、東京、日本）によって制御されるＤＳ－Ｒｉ２カメラを備えたＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ８０ｉ顕微鏡を使用してキャプチャした。
【0288】
結果
ワクチン製剤の特性評価
ワクチン製剤の特性評価
【0289】
作製したＳｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質の抗原性を、抗ＮサンドイッチＥＬＩＳＡによって確認した（図８Ａ）。Ｓｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ２抗スパイクおよび抗核タンパク質抗体によって認識された。
【0290】
ワクチン製剤を３：１の比（ナノ粒子：抗原）で調製した。還元ＳＤＳ条件下で、可溶性Ｓｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質およびＬＶＴ製剤において、タンパク質を検出した（図９Ａ）。硝酸銀感受性染色を用いたＮａｔｉｖｅ Ｐａｇｅによる製剤の分析は、ナノ粒子への総タンパク質会合を確認する遊離タンパク質を実証しなかった（図９Ｂ）。可溶性Ｓｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質と比較して、同じ量のタンパク質がＬＶＴ製剤において検出された（図９Ｃ）。
【0291】
【0292】
ワクチン製剤の免疫原性
【0293】
ワクチン製剤の免疫原性を証明するために、雌のＢａｌｂ／ｃマウスを、ナノ粒子単独（ＣＴＲＬ）またはナノ粒子を配合したＳｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質（ＬＶＴ）で、鼻腔内経路によって、３週間間隔で２回免疫した。体液性免疫応答を分析するために、最後の免疫化の７日後に、血清ＩｇＧまたはＩｇＡ抗スパイクタンパク質を、特異的ＥＬＩＳＡによって検出した。対照マウス群と比較して、ＬＶＴ免疫マウスは、有意に高い量の血清ＩｇＧ（図１１Ａ～Ｂ）およびＩｇＡ（図１１Ｃ～Ｄ）抗Ｓ抗体を産生した。血清ＩｇＧおよびＩｇＡエンドポイント抗体力価（Ｌｏｇ２力価）は、それぞれ平均１３．７９および６．５に達した。次いで、血清をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和する能力について評価した。ＣＴＲＬおよびＬＶＴ免疫マウス由来の血清を、ｈＡＣＥ２を発現するベロ細胞と接触させる前に、ＳＡＲＳ Ｃｏｖ－２シュードタイプ粒子とインキュベートした。ＣＴＲＬマウス由来の血清と比較して、免疫化したマウス由来の血清の抗Ｓ抗体は、ウイルス感染を阻害する能力を有していた（図１１Ｃ）。これにより、Ｂａｌｂ／ｃマウスの経鼻免疫が、中和性のＳＡＲＳ Ｃｏｖ－２抗体の産生を可能にした。さらに、ＬＶＴ Ｂａｌｂ／ｃ免疫マウス由来の粘膜区画における体液性免疫応答分析は、ＣＴＲＬマウスと比較して、鼻、気管支肺胞洗浄液および肺における抗Ｓ ＩｇＡの有意な産生を示した（図１２Ａ～図１２Ｃ）。
【0294】
Ｂａｌｂ／ｃ免疫マウスの脾臓免疫細胞の応答を、最後の免疫化の７日後に、スパイクタンパク質および核タンパク質に対して分析した。サイトカインの産生を、脾細胞刺激の７２時間後に、マウスＭＡＣＳＰｌｅｘ Ｃｙｔｏｋｉｎｅキットによって、上清において分析した。Ｗｕｈａｎスパイクタンパク質（図１３Ａ、図１３Ｂ）、Ｄｅｌｔａスパイクタンパク質（図１３Ｃ、図１３Ｄ）またはＯｍｉｃｒｏｎスパイクタンパク質（図１３Ｅ、図１３Ｆ）変異体によるＬＶＴ免疫マウス由来の脾細胞の再刺激は、ＣＴＲＬマウスと比較して、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－２の有意な産生を誘導した。
【0295】
ＩＦＮ－γの核タンパク質誘導の有意な産生による、ＬＶＴ免疫マウス由来の脾細胞の再刺激（図１３Ｇ）。ＣＴＲＬマウス由来のものと比較して、より多くのＩＬ－２がまた、核タンパク質で再刺激したＬＶＴ免疫マウス由来の脾細胞の上清に見出されたが、差は統計学的有意性に達しなかった（図１３Ｈ）。
【0296】
脾臓におけるＴ細胞の細胞応答をさらに調べるために、Ｔ ＣＤ４＋およびＴ ＣＤ８＋細胞を染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ＬＶＴ群とＣＴＲＬ群との間でＴ ＣＤ４＋およびＴ ＣＤ８＋細胞のパーセンテージに差は見られなかったが（データは示さず）、ＬＶＴ群（約２０％）とＣＴＲＬ群（約１５％）との間で活性化ＣＤ４４＋ＣＤ８＋リンパ球のパーセンテージにおいて、有意差が認められた（図１４Ａ）。さらに、ＣＤ４４＋ＣＤ４＋リンパ球の割合も、ＬＶＴ群で有意に高かった（ＣＴＲＬ群の２１％と比較して、ＬＶＴ群では約２７％）（図１４Ｂ）。
【0297】
Ｂａｌｂ／ｃ免疫マウスの細胞免疫応答を肺で分析した。ＩＦＮ－γ（図１５）、ＩＬ－２（図１５Ｂ）の有意な産生が、Ｗｕｈａｎスパイクタンパク質による再刺激後にＬＶＴマウス由来の肺細胞において認められた。核タンパク質による肺細胞の再刺激は、より弱く不均一な応答を誘導することを可能にした（データは示さず）。
【0298】
肺におけるＴ細胞集団の分析は、ＣＴＲＬマウスと比較して、ＬＶＴ免疫マウスにおいて有意に高いパーセンテージのＣＤ４４＋ＣＤ４＋（図１６Ａ）、ＣＤ４４＋ＣＤ８＋（図１６Ｂ）、ＩＦＮ－γ＋ＣＤ４＋（図１６Ｃ）およびＩＦＮ－γ＋ＣＤ８＋（図１６Ｄ）細胞を実証した。
【0299】
この研究により、ワクチン製剤の免疫原性が確認される。鼻での免疫化は、（ｉ）血清、鼻、気管支肺胞洗浄液および肺におけるスパイク特異的体液性免疫応答、ならびに（ｉｉ）様々なスパイクタンパク質変異体由来の核タンパク質およびスパイクに対する全身性および粘膜細胞性免疫応答の誘導を可能にする。
【0300】
生存実験
【0301】
臨床徴候の出現および生存に対するワクチン製剤の効果を評価するために、ヒトＡＣＥ２トランスジェニックマウス（Ｋ１８－ｈＡＣＥ２）を使用した。雌のマウスを、ナノ粒子単独（ＣＴＲＬ）またはナノ粒子を配合したＳｔ３スパイクタンパク質（Ｓ）、ナノ粒子を配合したＳｔ６Ｆ２融合タンパク質（Ｓ＋）、またはナノ粒子を配合したＳｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質（ＬＶＴ）を用いて、鼻腔内接種によって３週間間隔で２回免疫化した。２回目の免疫化の１週間後、マウスにＤｅｌｔａ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体（０．８８×１０５ＰＦＵまたは５．６×１０５ＰＦＵ）を感染させた。
【0302】
Ｄｅｌｔａ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体による感染後、マウスを観察し、毎日体重を測定した。感染の８日後、対照マウス（ＣＴＲＬ）は平均して体重の１５％超減少し、これは極端な体重減少（２０％でのカットオフポイント）を表す（図１７Ａ）。Ｓ＋をワクチン接種したマウスは、平均して体重のほぼ１０％減少し、４／６のマウスが１０％を超えていた。一方、ＳまたはＬＶＴをワクチン接種したマウスは体重を維持し、感染後にそれが回復した。感染後の臨床徴候について、マウスの呼吸、脊柱前弯、および顔貌を評価した。感染の７日後に、１匹の対照マウスが重度の臨床徴候で死亡した（データは示さず）。感染の８日後、重度の呼吸窮迫が２／５の対照マウスで観察された（図１７Ｂ）。ＳおよびＳ＋免疫マウスでは、１群あたり１／６のマウスがわずかな呼吸窮迫を有していた（図１７Ｂ）。ＬＶＴ免疫マウスでは、呼吸窮迫は観察されなかった（図１７Ｂ）。脊柱前弯の観察に関して、対照群では、３／５のマウスが強い脊柱前弯を有し、１／５のマウスが脊柱前弯を有していた（図１７Ｃ）。ＳおよびＳ＋ワクチン接種マウスでは、各群の１／６のマウスで強い脊柱前弯が認識された（図１７Ｃ）。ＬＶＴワクチン接種マウスでは、脊柱前弯は観察されなかった（図１７Ｃ）。顔貌の観察に関して、対照マウスでは、強くしかめた顔貌が２／５のマウスで観察され、１／５のマウスはわずかにしかめた顔貌を有していた（図１７Ｄ）。Ｓ免疫群では、１／６のマウスで、強くしかめた顔貌が観察された（図１７Ｄ）。Ｓ＋免疫群では、１／６のマウスは強くしかめた顔貌を有し、１／６のマウスはわずかにしかめた顔貌を有していた（図１７Ｄ）。正常な顔貌がＬＶＴ免疫化群で観察された（図１７Ｄ）。
【0303】
生存は、この実験における重要なエンドポイントであった。Ｄｅｌｔａ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体の０．８８×１０５ＰＦＵによる感染の８日後、対照群ではマウスの５０％の死亡率が観察された（図１８Ａ）。一方、製剤化されたタンパク質の形態にかかわらず（Ｓ、Ｓ＋、またはＬＶＴ）、全マウスが他の群で生存した。マウスに高用量（Ｄｅｌｔａ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体５．６×１０５ＰＦＵ）を感染させた場合、対照群の死亡率は、感染の８日後に６７％に増加した（図１８Ｂ）。他の群の生存マウスは、１００％のままであった。
【0304】
要約すると、Ｄｅｌｔａ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体による感染後、全対照マウスが相当な量の体重を失い、それらのほとんどは、ワクチン接種マウスと比較して、より有意な臨床徴候を有し、死亡が観察された。ＬＶＴワクチン接種群（Ｓｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質）では、臨床徴候（一部のマウスのわずかな体重減少を除く）および死亡は観察されなかった。
【0305】
これらのデータは、ナノ粒子（ＬＶＴ）を配合したＳｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質によるワクチン接種が、臨床徴候の出現および死亡率に関して、Ｄｅｌｔａ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体による感染からＫ１８－ｈＡＣＥ２マウスを保護することを示す。反対に、ナノ粒子（Ｓ＋）を配合したＳｔ６Ｆ２タンパク質で免疫化したマウスは体重が減少しており、それらはいくつかの臨床徴候を有していた。Ｓ免疫群（ナノ粒子を配合したＳｔ３タンパク質）では、一部のマウスに臨床徴候があった。これらのデータは、スパイクタンパク質に加えてワクチン接種のために核タンパク質を使用することの付加価値を実証する。
【0306】
防御および透過実験
【0307】
ワクチン製剤の防御を、シリアンハムスターモデルで調べた。ハムスターを、ナノ粒子単独（ＣＴＲＬ）、またはナノ粒子を配合したＳｔ６Ｆ２Ｎ２融合タンパク質（ＬＶＴ）で、鼻腔内経路によって、３週間間隔で２回免疫した。
【0308】
体液性免疫応答をマウスモデルと同様に分析したところ、ＬＶＴワクチン接種動物は、血清の抗スパイクＩｇＧ抗体および鼻腔洗浄液の抗スパイクＩｇＡを産生した（データは示さず）。血清および鼻の抗Ｓ抗体は、ＷｕｈａｎおよびＤｅｌｔａ ＳＡＲＳ Ｃｏｖ－２感染を阻害する能力を有していた（図１９Ａ～図１９Ｃ）。
【0309】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゴールデン標準モデル、すなわちシリアンハムスターでの前臨床防御研究により、ＷｕｈａｎまたはＤｅｌｔａ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株のいずれかによる誘発後に動物を防御するＬＶＴワクチンの能力を実証することができた。さらに、この前臨床モデルは、さらなる誘発を受けた動物が接触によって病原体を他の動物に伝達するのを防ぐ、すなわち伝染性を防ぐＬＶＴワクチンの能力を実証することを可能にした。
【0310】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゴールデン標準モデル、すなわちシリアンハムスターでの前臨床防御研究により、ＷｕｈａｎまたはＤｅｌｔａ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株のいずれかによる誘発後に動物を防御するＬＶＴワクチンの能力を実証することができた。ウイルスの誘発後、ほとんどのワクチン接種動物が体重を維持し（図２０Ａおよび図２０Ｆ）、肺の内部にウイルス負荷が存在しないことを示し（図２０Ｂおよび図２０Ｇ）、特にＤｅｌｔａ誘発実験では、鼻腔およびスワブ内部のウイルス負荷のかなりの減少を示した（図２０Ｃ～図２０Ｅ、図２０Ｈ～図２０Ｉ）。これらの結果は、Ｗｕｈａｎ（図２１Ｂ）およびＤｅｌｔａ（図２１Ｃ）感染後の肺および鼻腔の免疫組織学的分析（図２１Ａ）と相関する。一般に、ＬＶＴワクチンは、スパイクタンパク質のみに基づくワクチンと比較して、特に鼻粘膜において局所的に、より堅牢で有意な防御を誘導した。
【0311】
図２２は、ハムスターの鼻腔の粘膜を表しており、鼻甲介（Ｎｔ）、上顎甲介（Ｍｔ）、篩骨甲介（Ｅｔｈｎｍｏｔｕｒｂｉｎａｔｅｓ）（ＩＩｄ、ＩＩｖ、ＩＩＩ、ＩＶ）、および嗅球の位置を示す。
【0312】
ＬＶＴワクチンの第２の重要な特性は、誘発された以前にワクチン接種された動物と、さらに誘発された動物との間の伝染性を無効にする能力である（図２３Ａに記載の実験プロトコル）。ウイルス誘発後、ＬＶＴワクチン接種動物は、ＣＴＲＬ動物と比較して、体重を維持していた（図２３Ｂ）。肺の内部にウイルスが存在しないこと、および鼻甲介内部のウイルス負荷の有意な減少（図２３Ｃ～図２３Ｅ）により、ワクチン接種および誘発した動物が、もはや伝染性ではなくなり、共収容動物への疾患の伝播のリスクが有意に減少する。このようにして、以前にワクチン接種された誘発させた動物と密接に接触しているナイーブ動物（４８時間共収容）は、体重減少の徴候なしに（図２３Ｆ）、肺内部のウイルスの痕跡なしに、および鼻腔内部のウイルス負荷の減少なしに（図２３Ｇ～図２３Ｉ）、病理から効率的に防御される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20-1】
【図20-2】
【図20-3】
【図21】
【図22】
【図23-1】
【図23-2】
【図23-3】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-05-27
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】