特表 2024-536753 生物学的製剤の高分子量種を特性評価するためのＮ質量分析法ベースの戦略

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-08

(54)【発明の名称】生物学的製剤の高分子量種を特性評価するためのＮ質量分析法ベースの戦略

(51)【国際特許分類】

   G01N 27/62 20210101AFI20241001BHJP

   G01N 30/88 20060101ALI20241001BHJP

   G01N 30/72 20060101ALI20241001BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20241001BHJP

   C07K 1/24 20060101ALI20241001BHJP

   C07K 1/16 20060101ALI20241001BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241001BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20241001BHJP

   A61P 35/00 20060101ALN20241001BHJP

   A61P 37/02 20060101ALN20241001BHJP

   A61P 31/00 20060101ALN20241001BHJP

   A61P 9/00 20060101ALN20241001BHJP

   A61P 3/00 20060101ALN20241001BHJP

【ＦＩ】

G01N27/62 V

G01N27/62 X

G01N30/88 J

G01N30/72 C

G01N33/68

C07K1/24

C07K1/16

A61K39/395 K

C12N15/09 Z

A61P35/00

A61P37/02

A61P31/00

A61P9/00

A61P3/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024516390

(86)(22)【出願日】2022-09-13

(85)【翻訳文提出日】2024-04-17

(86)【国際出願番号】 US2022043353

(87)【国際公開番号】W WO2023043733

(87)【国際公開日】2023-03-23

(31)【優先権主張番号】63/243,835

(32)【優先日】2021-09-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】507302748

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100188433

【弁理士】

【氏名又は名称】梅村 幸輔

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100214396

【弁理士】

【氏名又は名称】塩田 真紀

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(74)【代理人】

【識別番号】100221741

【弁理士】

【氏名又は名称】酒井 直子

(74)【代理人】

【識別番号】100114926

【弁理士】

【氏名又は名称】枝松 義恵

(72)【発明者】

【氏名】ヤン ユエティエン

(72)【発明者】

【氏名】ワン シュンハイ

【テーマコード（参考）】

2G041

2G045

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

2G041CA01

2G041DA05

2G041FA12

2G041GA09

2G041HA01

2G041HA04

2G041JA02

2G041LA08

2G045DA37

2G045FB06

4C085AA14

4C085CC23

4C085DD32

4C085EE01

4H045AA20

4H045AA30

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA21

(57)【要約】

本発明は、タンパク質特性評価の分野に関し、特に、高分子量種の、特異性が高く、高感度で、包括的な特性評価を可能にするポストカラム変性支援ＳＥＣ－ＭＳ法を使用することを含むワークフローを実行することによる、治療用タンパク質の高分子量種を特性評価するための方法に関する。
【選択図】図３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

関心対象のタンパク質の少なくとも１つの高分子量種を特性評価するための方法であって、
ａ．前記関心対象のタンパク質及び前記少なくとも１つの高分子量種を含む試料を取得することと、
ｂ．前記試料をサイズ排除クロマトグラフィーカラムに接触させることと、
ｃ．溶出液を回収するために前記カラムを洗浄することと、
ｄ．混合物を形成するために前記溶出液に変性溶液を添加することと、
ｅ．前記少なくとも１つの高分子量種を特性評価するために前記混合物を質量分析計に供することと
を含む、方法。

【請求項2】

前記関心対象のタンパク質が、抗体である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記溶出液が、前記少なくとも１つの高分子量種を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

（ｄ）の前記混合物が、紫外線検出にもまた供される、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記質量分析計が、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計である、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記質量分析計が、ネイティブ条件下で作動される、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

（ｅ）を使用して取得された質量スペクトルからの少なくとも１つのピークを、ネイティブ条件下で（ａ）の前記試料のオンラインサイズ排除クロマトグラフィー－質量分析法を行うことによって取得された質量スペクトルと比較することを更に含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記変性溶液が、アセトニトリル、ギ酸、又はアセトニトリルとギ酸との組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記変性溶液が、約６０％ｖ／ｖのアセトニトリルと４％ｖ／ｖのギ酸とを含む、請求項７に記載の方法。

【請求項10】

前記変性溶液が、約６０％ｖ／ｖのアセトニトリルを含む、請求項７に記載の方法。

【請求項11】

前記質量分析計が、ネイティブ条件下で作動される、請求項７に記載の方法。

【請求項12】

（ａ）の前記試料が、（ｂ）の前に加水分解剤を使用して消化される、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記加水分解剤が、プロテアーゼ酵素である、請求項１１に記載の方法。

【請求項14】

前記プロテアーゼ酵素が、ＩｄｅＳである、請求項１１に記載の方法。

【請求項15】

前記質量分析計における（ｄ）の前記混合物の流量が、約１０μＬ／分未満である、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

（ｄ）の前記混合物が、前記質量分析計及び紫外線検出器へと分割される、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

（ｄ）の前記混合物を質量分析計に供する前に、脱溶媒ガスが（ｄ）の前記混合物に添加される、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

前記脱溶媒ガスを（ｄ）の前記混合物に添加するために、マルチノズルエミッタが使用される、請求項１６に記載の方法。

【請求項19】

少なくとも１つの高分子量種が、前記関心対象のタンパク質の非共有結合性高分子量種である、請求項１に記載の方法。

【請求項20】

少なくとも１つの高分子量種が、前記関心対象のタンパク質の非解離性高分子量種である、請求項１に記載の方法。

【請求項21】

（ｅ）を使用して取得された質量スペクトルからの少なくとも１つのピークを、（ａ）の前記試料のオンラインサイズ排除クロマトグラフィー－質量分析法を行うことによって取得された質量スペクトルと比較することを更に含む、請求項１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年９月１４日に出願された米国仮特許出願第６３／２４３，８３５号の優先権及び利益を主張するものであり、これは、参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

分野
本発明は、概して、サイズ排除クロマトグラフィー－質量分析法ワークフローを使用して、治療用タンパク質の高分子量サイズバリアントを特性評価するための方法に関する。

【背景技術】

【0003】

背景
治療用タンパク質は、がん、自己免疫疾患、感染症、及び心臓代謝障害の治療のための重要な薬物として出現し、製薬業界において最も急速に成長している製品セグメントのうちの１つを表している。治療用タンパク質製品は、非常に高い純度基準を満たさなければならない。したがって、治療用タンパク質の薬物開発、生産、保管、及び取り扱いの様々な段階において、不純物の監視が重要になり得る。

【0004】

高分子量（ＨＭＷ）サイズバリアントは、治療用タンパク質試料中に不純物として存在する可能性があり、製品の安全性及び有効性へのその影響のゆえに、注意深く監視され、特性評価される必要がある。最終原薬（ＤＳ）試料中のＨＭＷサイズバリアントの複雑性、及び多くの場合は存在量の少なさから、そのようなＨＭＷ種の特性評価は困難であり、ＨＭＷ種のオフライン濃縮及びそれに続く様々な分析ツールを使用した分析が、従来必要とされている。

【0005】

したがって、当技術分野には、治療用タンパク質製品においてそのようなＨＭＷ種を特性評価するための効率的な方法に対する長年にわたる必要性が存在する。

【発明の概要】

【0006】

概要
本明細書に開示される例示的な実施形態は、質量分析（ＳＥＣ－ＭＳ）法とオンラインで結合されたポストカラム変性支援ネイティブサイズ交換クロマトグラフィーを使用することによって、治療用タンパク質製品中のそのようなＨＭＷ種を特性評価するための方法を提供することによって、上述の需要を満たす。これは、特異性が高く、高感度で、包括的な、ＨＭＷ種の特性評価を、未分画の試料から直接、可能にすることができる。この方法は、インタクトなアセンブリ及び構成サブユニットの両方の正確な質量測定に基づいてＨＭＷ種の高信頼性の特定を提供するのみならず、相互作用性及び位置の詳細な分析も可能にする。加えて、高品質のネイティブ様質量スペクトルに由来する抽出イオンクロマトグラムを使用して、各非共有結合性及び／又は非解離性の複合体の溶出プロファイルが容易に再構築され、複合体ＨＭＷプロファイルの理解を容易にすることができる。この方法は、事前濃縮を必要としないので、治療用タンパク質製品の開発中にＨＭＷ種の迅速かつ詳細な特性評価の両方を提供するために望ましい。

【0007】

本開示は、関心対象のタンパク質の少なくとも１つの高分子量種を特性評価するための方法であって、関心対象のタンパク質及び少なくとも１つの高分子量種を含む試料を取得することと、試料をサイズ排除クロマトグラフィーカラムに接触させることと、溶出液を回収するためにカラムを洗浄することと、混合物を形成するために溶出液に変性溶液を添加することと、少なくとも１つの高分子量種を特性評価するために混合物を質量分析計に供することと、を含む、方法を提供する。

【0008】

この実施形態の一態様では、関心対象のタンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、又はＦｃ融合タンパク質である。

【0009】

この実施形態の一態様では、溶出液は、少なくとも１つの高分子量種を含む。この実施形態の一態様では、混合物は、紫外線検出にもまた供される。

【0010】

この実施形態の一態様では、質量分析計は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計である。この実施形態の特定の態様では、質量分析計は、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計である。

【0011】

この実施形態の一態様では、質量分析計は、ネイティブ条件下で作動される。特定の態様では、方法は、使用して取得された質量スペクトルからの少なくとも１つのピークを、ネイティブ条件下で当該試料のオンラインサイズ排除クロマトグラフィー－質量分析法を行うことによって取得された質量スペクトルと比較することを更に含む。

【0012】

この実施形態の一態様では、変性溶液は、アセトニトリル、ギ酸、又はアセトニトリルと、ギ酸との組み合わせを含む。この実施形態の特定の態様では、変性溶液は、約６０％ｖ／ｖのアセトニトリルと４％ｖ／ｖのギ酸とを含む。この実施形態の別の特定の態様では、変性溶液は、約６０％ｖ／ｖのアセトニトリルを含む。

【0013】

この実施形態の一態様では、質量分析計は、ネイティブ条件下で作動される。

【0014】

この実施形態の一態様では、質量分析計における混合物の流量は、約１０μＬ／分未満である。

【0015】

この実施形態の一態様では、混合物は、質量分析計及び紫外線検出器へと分割される。この実施形態の特定の態様では、脱溶媒ガスを混合物に添加するためにマルチノズルエミッタが使用される。

【0016】

この実施形態の一態様では、（ｄ）の混合物を質量分析計に供する前に、脱溶媒ガスが（ｄ）の混合物に添加される。

【0017】

この実施形態の一態様では、少なくとも１つの高分子量種は、関心対象のタンパク質の非共有結合性高分子量種、又は関心対象のタンパク質の非解離性高分子量種である。

【0018】

この実施形態の一態様では、方法は、質量スペクトルからの少なくとも１つのピークを、当該試料のオンラインサイズ排除クロマトグラフィー－質量分析法を行うことによって取得された質量スペクトルと比較することを更に含む。

【0019】

本開示はまた、関心対象のタンパク質の少なくとも１つの高分子量種を特性評価するための方法であって、関心対象のタンパク質及び少なくとも１つの高分子量種を含む試料を取得することと、消化された試料を形成するために加水分解剤を使用して試料を消化することと、消化された試料をサイズ排除クロマトグラフィーカラムに接触させることと、溶出液を回収するためにカラムを洗浄することと、混合物を形成するために溶出液に変性溶液を添加することと、少なくとも１つの高分子量種を特性評価するために混合物を質量分析計に供することと、を含む、方法を提供する。

【0020】

この実施形態の一態様では、関心対象のタンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、又はＦｃ融合タンパク質である。

【0021】

この実施形態の一態様では、溶出液は、少なくとも１つの高分子量種を含む。この実施形態の一態様では、混合物は、紫外線検出にもまた供される。

【0022】

この実施形態の一態様では、質量分析計は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計である。この実施形態の特定の態様では、質量分析計は、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計である。

【0023】

この実施形態の一態様では、質量分析計は、ネイティブ条件下で作動される。特定の態様では、方法は、質量スペクトルからの少なくとも１つのピークを、ネイティブ条件下で当該試料のオンラインサイズ排除クロマトグラフィー－質量分析法を行うことによって取得された質量スペクトルと比較することを更に含む。

【0024】

この実施形態の一態様では、変性溶液は、アセトニトリル、ギ酸、又はアセトニトリルと、ギ酸との組み合わせを含む。この実施形態の特定の態様では、変性溶液は、約６０％ｖ／ｖのアセトニトリルと４％ｖ／ｖのギ酸とを含む。この実施形態の別の特定の態様では、変性溶液は、約６０％ｖ／ｖのアセトニトリルを含む。

【0025】

この実施形態の一態様では、質量分析計は、ネイティブ条件下で作動される。

【0026】

この実施形態の一態様では、質量分析計における混合物の流量は、約１０μＬ／分未満である。

【0027】

この実施形態の一態様では、混合物は、質量分析計及び紫外線検出器へと分割される。この実施形態の特定の態様では、脱溶媒ガスを混合物に添加するためにマルチノズルエミッタが使用される。

【0028】

この実施形態の一態様では、混合物を質量分析計に供する前に、脱溶媒ガスが混合物に添加される。

【0029】

この実施形態の一態様では、少なくとも１つの高分子量種は、関心対象のタンパク質の非共有結合性高分子量種、又は関心対象のタンパク質の非解離性高分子量種である。

【0030】

この実施形態の一態様では、方法は、質量スペクトルからの少なくとも１つのピークを、当該試料のオンラインサイズ排除クロマトグラフィー－質量分析法を行うことによって取得された質量スペクトルと比較することを更に含む。

【0031】

本開示はまた、少なくとも１つの高分子量種を特性評価するための方法であって、少なくとも２つの関心対象のタンパク質及び少なくとも１つの高分子量種を含む試料を取得することと、試料をサイズ排除クロマトグラフィーカラムに接触させることと、溶出液を回収するためにカラムを洗浄することと、混合物を形成するために溶出液に変性溶液を添加することと、少なくとも１つの高分子量種を特性評価するために混合物を質量分析計に供することと、を含む、方法を提供する。

【0032】

この実施形態の一態様では、関心対象のタンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、又はＦｃ融合タンパク質である。

【0033】

この実施形態の一態様では、溶出液は、少なくとも１つの高分子量種を含む。この実施形態の一態様では、混合物は、紫外線検出にもまた供される。

【0034】

この実施形態の一態様では、質量分析計は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計である。この実施形態の特定の態様では、質量分析計は、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計である。

【0035】

この実施形態の一態様では、質量分析計は、ネイティブ条件下で作動される。特定の態様では、方法は、使用して取得された質量スペクトルからの少なくとも１つのピークを、ネイティブ条件下で当該試料のオンラインサイズ排除クロマトグラフィー－質量分析法を行うことによって取得された質量スペクトルと比較することを更に含む。

【0036】

この実施形態の一態様では、変性溶液は、アセトニトリル、ギ酸、又はアセトニトリルと、ギ酸との組み合わせを含む。この実施形態の特定の態様では、変性溶液は、約６０％ｖ／ｖのアセトニトリルと４％ｖ／ｖのギ酸とを含む。この実施形態の別の特定の態様では、変性溶液は、約６０％ｖ／ｖのアセトニトリルを含む。

【0037】

この実施形態の一態様では、質量分析計は、ネイティブ条件下で作動される。

【0038】

この実施形態の一態様では、質量分析計における混合物の流量が、約１０μＬ／分未満である。

【0039】

この実施形態の一態様では、混合物は、質量分析計及び紫外線検出器へと分割される。この実施形態の特定の態様では、脱溶媒ガスを混合物に添加するためにマルチノズルエミッタが使用される。

【0040】

この実施形態の一態様では、（ｄ）の混合物を質量分析計に供する前に、脱溶媒ガスが（ｄ）の混合物に添加される。

【0041】

この実施形態の一態様では、少なくとも１つの高分子量種は、関心対象のタンパク質の非共有結合性高分子量種、又は関心対象のタンパク質の非解離性高分子量種である。

【0042】

この実施形態の一態様では、方法は、質量スペクトルからの少なくとも１つのピークを、当該試料のオンラインサイズ排除クロマトグラフィー－質量分析法を行うことによって取得された質量スペクトルと比較することを更に含む。

【0043】

この実施形態の一態様では、試料は、サイズ排除クロマトグラフィーカラムに試料を供する前に、加水分解剤を使用して消化される。特定の態様では、加水分解剤は、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の免疫グロブリン分解酵素（ＩｄｅＳ）又はそのバリアントである。

【図面の簡単な説明】

【0044】

【図1】例示的な実施形態を使用して本発明の有効性を表示する。

【図2】治療用タンパク質製品に一般的に存在する不純物の相対量を示す。

【図3】例示的な実施形態による本発明の描写である。

【図4】図４Ａは、例示的な実施形態によって取得された、ネイティブ（黒色トレース）又はＰＣＤ（オレンジ色及び赤色トレース）条件下で取得された、部分的に還元されたｍＡｂ１（破壊された鎖間ジスルフィド結合）の質量スペクトルを示す。図４Ｂは、例示的な実施形態によって取得された、ネイティブ（黒色トレース）又はＰＣＤ（オレンジ色及び赤色トレース）条件下で取得された、ｍＡｂ２二量体の質量スペクトルを示す。

【図5】例示的な実施形態による、ネイティブ（青色トレース）又はＰＣＤ（赤色トレース）条件下で取得された、各ＨＭＷピークについてのＳＥＣ－ＵＶトレース（中央パネル）、ピーク割り当て、及びデコンボリュートされた質量スペクトルを表示するＩｄｅＳ消化後のｍＡｂ３濃縮ＨＭＷ試料のｎＳＥＣ－ＵＶ／ＭＳ分析を示す。

【図6】例示的な実施形態による、ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ消化及び脱グリコシル化濃縮ｍＡｂ３ ＨＭＷ試料と関連付けられたサイズバリアント質量の概要表を示す。

【図7】例示的な実施形態による、ＳＥＣ－ＴＩＣ（左パネル、赤色及び青色トレース）、並びにネイティブ（青色トレース）又はＰＣＤ（赤色トレース）条件下で取得された各ＨＭＷピークについての生の質量スペクトルを表示する、ｂｓＡｂ ＤＳ試料のｎＳＥＣ－ＵＶ／ＭＳ分析を示す。各種の最も豊富な荷電状態（灰色トレース、左パネル）を使用してＸＩＣを生成した。

【図8】例示的な実施形態による、脱グリコシル化ｂｓＡｂ試料と関連付けられたサイズバリアント質量の概要表を示す。

【図9】ＰＣＤ支援ｎＳＥＣ－ＵＶ／ＭＳ分析を使用して、ａ）インタクトなレベル、及びｂ）サブドメインレベル（ＩｄｅＳ消化後）で特性評価されたｍＡｂ４ ＤＳロット１及びロット２のＨＭＷプロファイルを示す。例示的な実施形態による、各ＨＭＷ関連種の溶出プロファイルを表すＵＶプロファイル（黒色トレース）及びＸＩＣ（着色トレース）を示した（ＨＭＷ領域のみが表示されている）。各種の最も豊富な荷電状態を使用してＸＩＣを生成した。

【図10】例示的な実施形態による、インタクトなレベル及びサブドメインレベルにおけるＰＣＤ支援ｎＳＥＣ－ＭＳによってｍＡｂ４ロット１及びロット２ ＤＳ試料中で検出された非解離性二量体種の概要表を示す。

【図11】例示的な実施形態による、ネイティブ（黒色トレース）及びＰＣＤ（赤色トレース）条件の両方の下でｎＳＥＣ－ＭＳを使用した、ａ）Ｔ０の、及びｂ）２５℃で６か月間の、共製剤化ｍＡｂ－Ａ及びｍＡｂ－Ｂ試料中で検出されたＨＭＷ種を示す。各二量体の相対存在量を、デコンボリュートされた質量スペクトルからの積分されたピーク面積を使用して推定し、アノテーションした。

【図12】例示的な実施形態による、Ｔ０の、及び２５℃で６か月間保管した後の、共製剤化ｍＡｂ－Ａ及びｍＡｂ－ＢのネイティブＳＥＣ－ＵＶトレースを示す。

【発明を実施するための形態】

【0045】

詳細な説明
生物学的製剤製品中の生成物関連バリアントの特定及び定量化は、製品の生産及び開発において非常に重要であり得る。そのようなバリアントの特定は、安全で有効な製品を開発するために不可欠であり得る。したがって、そのようなバリアントを特性評価するための堅牢な方法及び／又はワークフローは有益であり得る。

【0046】

治療用タンパク質は、多くの場合、ＨＭＷ凝集体及び低分子量（ＬＭＷ）断片を含む、生成物関連不純物を含有する、ある程度のサイズ不均一性を呈する。これらの種は、多くの場合、製品の製造、出荷、及び保管中の環境ストレスに起因するｍＡｂ分子の化学的及び酵素的分解から生じる（Ｒｏｂｅｒｔｓ ＣＪ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１４：３２（７）：３７２－３８０、Ｃｏｒｄｏｂａ ＡＪ，Ｓｈｙｏｎｇ ＢＪ，Ｂｒｅｅｎ Ｄ，Ｈａｒｒｉｓ ＲＪ．Ｎｏｎ－ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ２００５：８１８（２）：１１５－１２１、Ｘｉａｎｇ Ｔ，Ｌｕｎｄｅｌｌ Ｅ，Ｓｕｎ Ｚ，Ｌｉｕ Ｈ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｎ ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｏｎｄ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ２００７：８５８（１－２）：２５４－２６２）。ＬＭＷ断片は、様々な化学的又は酵素的分解経路（例えば、ポリペプチド結合の鎖間ジスルフィド結合切断などの酸、塩基、及び酵素駆動の加水分解）を介して生成され、ｍＡｂ分子の切断形態をもたらし得る（Ｗａｎｇ Ｓ，Ｌｉｕ ＡＰ，Ｙａｎ Ｙ，Ｄａｌｙ ＴＪ，Ｌｉ Ｎ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｔ－ｒｅｌａｔｅｄ ｌｏｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ ２０１８：１５４（４６８－４７５、Ｖｌａｓａｋ Ｊ，Ｉｏｎｅｓｃｕ Ｒ．Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＭＡｂｓ ２０１１：３（３）：２５３－２６３）。

【0047】

対照的に、ＨＭＷ種の形成は、はるかに複雑なプロセスである。生成されたＨＭＷ形態は、サイズ、立体構造、相互作用性質（共有結合又は非共有結合）、及び会合部位において変動し得る（Ｐａｕｌ Ｒ，Ｇｒａｆｆ－Ｍｅｙｅｒ Ａ，Ｓｔａｈｌｂｅｒｇ Ｈ，Ｌａｕｅｒ ＭＥ，Ｒｕｆｅｒ ＡＣ，Ｂｅｃｋ Ｈ，Ｂｒｉｇｕｅｔ Ａ，Ｓｃｈｎａｉｂｌｅ Ｖ，Ｂｕｃｋｅｌ Ｔ，Ｂｏｅｃｋｌｅ Ｓ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｉｍｅｒｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｒｅｓｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２０１２：２９（８）：２０４７－２０５９）。ストレス条件に加えて、タンパク質一次配列及びその高次構造は、全て、異なる経路を介したその凝集の傾向に寄与する。したがって、一般的な規則を使用して、各分子のタンパク質凝集挙動を予測又は説明することはほとんど不可能である。ＨＭＷ種（可溶性オリゴマーから可視粒子まで）は、望ましくない免疫原性応答を誘発し、及び／又はその薬物動態挙動を変化させることによって、薬物の安全性及び有効性に影響を及ぼし得（Ｎａｒｈｉ ＬＯ，Ｓｃｈｍｉｔ Ｊ，Ｂｅｃｈｔｏｌｄ－Ｐｅｔｅｒｓ Ｋ，Ｓｈａｒｍａ Ｄ．Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ２０１２：１０１（２）：４９３－４９８）、製品ライフサイクル全体にわたるＨＭＷ種の詳細な特性評価、継続的な監視及び制御が必要とされる（Ｐａｒｅｎｋｙ Ａ，Ｍｙｌｅｒ Ｈ，Ａｍａｒａｖａｄｉ Ｌ，Ｂｅｃｈｔｏｌｄ－Ｐｅｔｅｒｓ Ｋ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ Ａ，Ｋｉｒｓｈｎｅｒ Ｓ，Ｑｕａｒｍｂｙ Ｖ．Ｎｅｗ ＦＤＡ ｄｒａｆｔ ｇｕｉｄａｎｃｅ ｏｎ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．ＡＡＰＳ Ｊ ２０１４：１６（３）：４９９－５０３）。加えて、詳細な特性評価によって達成される凝集メカニズムの深い理解は、ＨＭＷ種のリスク評価のためのフレームワークを提供するのみならず、タンパク質工学を通じて低減された凝集傾向を有するタンパク質分子を設計するための洞察ももたらし得る。

【0048】

治療用タンパク質製品におけるＨＭＷサイズバリアントの特性評価は、多くの場合、その複雑さに起因して、多くの分析及び生物物理学的ツールに依存する。沈降速度分析超遠心分離（ＳＶ－ＡＵＣ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の両方は、それらの優れた分解能及び定量性能に起因して、ｍＡｂ ＨＭＷ種を特性評価する際に広く使用されている（Ｌｅｂｏｗｉｔｚ Ｊ，Ｌｅｗｉｓ ＭＳ，Ｓｃｈｕｃｋ Ｐ．Ｍｏｄｅｒｎ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃｉｅｎｃｅ：Ａ ｔｕｔｏｒｉａｌ ｒｅｖｉｅｗ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ２００２：１１（９）：２０６７－２０７９、Ｈｕｇｈｅｓ Ｈ，Ｍｏｒｇａｎ Ｃ，Ｂｒｕｎｙａｋ Ｅ，Ｂａｒｒａｎｃｏ Ｋ，Ｃｏｈｅｎ Ｅ，Ｅｄｍｕｎｄｓ Ｔ，Ｌｅｅ Ｋ．Ａ ｍｕｌｔｉ－ｔｉｅｒｅｄ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｍｏｌｅｃｕｌａｒ－ｗｅｉｇｈｔ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ｉｎ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．ＡＡＰＳ Ｊ ２００９：１１（２）：３３５－３４１）。特に、ＵＶ検出を伴うＳＥＣは、治療用ｍＡｂ製品における可溶性凝集体のレベル及び溶出プロファイルを直接監視するためのバッチリリースアッセイとして通例的に使用される（Ｌｏｗｅ Ｄ，Ｄｕｄｇｅｏｎ Ｋ，Ｒｏｕｅｔ Ｒ，Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ Ｐ，Ｊｅｒｍｕｔｕｓ Ｌ，Ｃｈｒｉｓｔ Ｄ．Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ，ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ａｄｖ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ２０１１：８４４１－６１、Ｚｏｌｌｓ Ｓ，Ｔａｎｔｉｐｏｌｐｈａｎ Ｒ，Ｗｉｇｇｅｎｈｏｒｎ Ｍ，Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ，Ｊｉｓｋｏｏｔ Ｗ，Ｆｒｉｅｓｓ Ｗ，Ｈａｗｅ Ａ．Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ，ｐａｒｔ １：Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ２０１２：１０１（３）：９１４－９３５）。ＨＭＷ種の詳細な解明を可能にし、凝集メカニズムに関する洞察を得るために、ｍＡｂ ＨＭＷ種の濃縮、続いて、他の技術による詳細な特性評価がほとんど常に必要とされる（Ｐａｕｌ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，上記、Ｒｏｕｂｙ Ｇ，Ｔｒａｎ ＮＴ，Ｌｅｂｌａｎｃ Ｙ，Ｔａｖｅｒｎａ Ｍ，Ｂｉｈｏｒｅａｕ Ｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｉｍｅｒｓ ｉｎ ａ ｆｉｎａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ ｄｒｕｇ ｂｙ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｏ ｎａｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．ＭＡｂｓ ２０２０：１２（１）：ｅ１７８１７４３、Ｌｕ Ｃ，Ｌｉｕ Ｄ，Ｌｉｕ Ｈ，Ｍｏｔｃｈｎｉｋ Ｐ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｉｚｅ ｖａｒｉａｎｔｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｅｘｔｒａ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ．ＭＡｂｓ ２０１３：５（１）：１０２－１１３、Ｒｅｍｍｅｌｅ ＲＬ，Ｊｒ．，Ｃａｌｌａｈａｎ ＷＪ，Ｋｒｉｓｈｎａｎ Ｓ，Ｚｈｏｕ Ｌ，Ｂｏｎｄａｒｅｎｋｏ ＰＶ，Ｎｉｃｈｏｌｓ ＡＣ，Ｋｌｅｅｍａｎｎ ＧＲ，Ｐｉｐｅｓ ＧＤ，Ｐａｒｋ Ｓ，Ｆｏｄｏｒ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ａｃｔｉｖｅ ｄｉｍｅｒ ｏｆ ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇｇｒｅｇａｔｅ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ２００６：９５（１）：１２６－１４５、Ｉｗｕｒａ Ｔ，Ｆｕｋｕｄａ Ｊ，Ｙａｍａｚａｋｉ Ｋ，Ｋａｎａｍａｒｕ Ｓ，Ａｒｉｓａｋａ Ｆ．Ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｉｍｅｒｓ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｉｇｇ１ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０１４：１５５（１）：６３－７１、Ｐｌａｔｈ Ｆ，Ｒｉｎｇｌｅｒ Ｐ，Ｇｒａｆｆ－Ｍｅｙｅｒ Ａ，Ｓｔａｈｌｂｅｒｇ Ｈ，Ｌａｕｅｒ ＭＥ，Ｒｕｆｅｒ ＡＣ，Ｇｒａｅｗｅｒｔ ＭＡ，Ｓｖｅｒｇｕｎ Ｄ，Ｇｅｌｌｅｒｍａｎｎ Ｇ，Ｆｉｎｋｌｅｒ Ｃ ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｂ ｄｉｍｅｒｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ ｄｉｍｅｒ ｆｏｒｍｓ ｃｏｍｍｏｎ ｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍａｂｓ．ＭＡｂｓ ２０１６：８（５）：９２８－９４０）。例えば、非還元条件下で実施されるキャピラリー電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ－ＳＤＳ）が、共有結合性及び非共有結合性のＨＭＷ種のレベルを区別及び推定するために使用され得る（Ｒｏｕｂｙ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，上記、Ｒｅｍｍｅｌｅ ＲＬ ｅｔ ａｌ．，上記、Ｐｌａｔｈ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，上記）。更に、還元条件下で作動されるとき、ＣＥ－ＳＤＳは、共有結合性凝集体の形成への分子間ジスルフィド結合スクランブリングからの可能性のある寄与を更に評価することができる。制限酵素消化（例えば、ＩｄｅＳ消化及び制限Ｌｙｓ－Ｃ消化）、続いて、質量分析法（ＭＳ）分析もまた、正確な質量測定に基づいて、サブドメインレベルにおける凝集界面を決定するのに有効であることが証明されている（Ｒｏｕｂｙ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，上記、Ｒｅｍｍｅｌｅ ＲＬ ｅｔ ａｌ．，上記、Ｉｗｕｒａ ｅｔ ａｌ．，上記、Ｐｌａｔｈ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，上記）。最後に、凝集界面及びメカニズムの、ペプチドレベル又は更に残基レベルでの解明を達成するために、タンパク質フットプリント（例えば、水素－重水素交換ＭＳ及びヒドロキシルラジカルフットプリント）及びボトムアップベースの架橋分析などの、より洗練された戦略が、それぞれ、非共有結合性及び共有結合性のＨＭＷ種を調査するために適用され得る（Ｉａｃｏｂ ＲＥ，Ｂｏｕ－Ａｓｓａｆ ＧＭ，Ｍａｋｏｗｓｋｉ Ｌ，Ｅｎｇｅｎ ＪＲ，Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚ ＳＡ，Ｈｏｕｄｅ Ｄ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｈ／ｄｘ－ｍｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ２０１３：１０２（１２）：４３１５－４３２９、Ｚｈａｎｇ Ａ，Ｓｉｎｇｈ ＳＫ，Ｓｈｉｒｔｓ ＭＲ，Ｋｕｍａｒ Ｓ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ＥＪ．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ ｆｒｅｅｚｅ－ｔｈａｗ ｓｔｒｅｓｓｅｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ．Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２０１２：２９（１）：２３６－２５０、Ｙａｎ Ｙ，Ｗｅｉ Ｈ，Ｊｕｓｕｆ Ｓ，Ｋｒｙｓｔｅｋ ＳＲ，Ｊｒ．，Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｃｈｅｎ Ｇ，Ｌｕｄｗｉｇ ＲＴ，Ｔａｏ Ｌ，Ｄａｓ ＴＫ．Ｍａｐｐｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｉｎ ａ ｎｏｎｃｏｖａｌｅｎｔ ｓｉｚｅ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｕｓｉｎｇ ｎａｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ｈｙｄｒｏｇｅｎ－ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ａｎｄ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ２０１７：１０６（１１）：３２２２－３２２９、Ｄｅｐｅｒａｌｔａ Ｇ，Ａｌｖａｒｅｚ Ｍ，Ｂｅｃｈｔｅｌ Ｃ，Ｄｏｎｇ Ｋ，ＭｃＤｏｎａｌｄ Ｒ，Ｌｉｎｇ Ｖ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｉｍｅｒ ｂｙ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌ ｆｏｏｔｐｒｉｎｔｉｎｇ．ＭＡｂｓ ２０１３：５（１）：８６－１０１）。

【0049】

ほぼネイティブ条件下における直接ＭＳ検出とＳＥＣとのオンライン結合（ネイティブＳＥＣ－ＭＳ）は、ｍＡｂ ＨＭＷ種の研究に関して、過去数年間にわたって大きな関心を高めている（Ｒｏｕｂｙ ｅｔ ａｌ．，上記、Ｅｈｋｉｒｃｈ Ａ，Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ－Ａｌｂａ Ｏ，Ｃｏｌａｓ Ｏ，Ｂｅｃｋ Ａ，Ｇｕｉｌｌａｒｍｅ Ｄ，Ｃｉａｎｆｅｒａｎｉ Ｓ．Ｈｙｐｈｅｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｔｏ ｎａｔｉｖｅ ｉｏｎ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ２０１８：１０８６ （１７６－１８３）、Ｈａｂｅｒｇｅｒ Ｍ，Ｌｅｉｓｓ Ｍ，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ ＡＫ，Ｐｅｓｔｅｒ Ｏ，Ｈａｆｅｎｍａｉｒ Ｇ，Ｈｏｏｋ Ｍ，Ｂｏｎｎｉｎｇｔｏｎ Ｌ，Ｗｅｇｅｌｅ Ｈ，Ｈａｉｎｄｌ Ｍ，Ｒｅｕｓｃｈ Ｄ ｅｔ ａｌ．Ｒａｐｉｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｓｉｚｅ－ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｏ ｎａｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．ＭＡｂｓ ２０１６：８（２）：３３１－３３９。

【0050】

タンパク質立体構造及び非共有結合性相互作用を保持することができるＭＳ適合移動相を使用して、ネイティブＳＥＣ－ＭＳ（ｎＳＥＣ－ＭＳ）は、正確な質量測定に基づいて、サイズバリアントの迅速かつ改善された特定を提供することができる。加えて、方法論及び計装の両方における最近の進歩のおかげで、ｎＳＥＣ－ＭＳは、未分画の原薬（ＤＳ）試料から直接的に、非常に低レベルのＨＭＷ種（例えば、０．０１％）を容易に検出し得る高感度の方法となった（Ｙａｎ Ｙ，Ｘｉｎｇ Ｔ，Ｗａｎｇ Ｓ，Ｌｉ Ｎ．Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ａｎｄ ｒｏｂｕｓｔ ｎａｔｉｖｅ ｌｃ－ｍｓ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｉｎｔａｃｔ ｍａｓｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇｓ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ２０２０：３１（１０）：２１７１－２１７９）。これらの顕著な成功にもかかわらず、ｎＳＥＣ－ＭＳ法の適用のみでは、依然としてＨＭＷ種の完全なプロファイルを取得することができない。第一に、非変性法として、ｎＳＥＣ－ＭＳ分析は、共有結合性架橋に起因する明確な質量差が検出されない限り、非共有結合性ＨＭＷ複合体と共有結合性ＨＭＷ複合体との間を区別しない。残念ながら、後者は、大きな複合体に対する不十分なクロマトグラフィー分解能及び質量分解能の両方に起因して、達成することが非常に困難であり得る。例えば、異なるメカニズム（例えば、非共有結合性及び共有結合性の相互作用）によって形成された二量体種は、多くの場合、ＳＥＣ分離中に共溶出され、ＭＳ検出によって平均質量で測定される。したがって、非共有結合性及び共有結合性の二量体種の分布は、ｎＳＥＣ－ＭＳ法によって直接決定することができない。第二に、十分に予想されるオリゴマー種（例えば、二量体、三量体、四量体など）と比較して、非従来型ＨＭＷ種（例えば、追加の軽鎖と複合体化されたｍＡｂ単量体）の信頼性の高い特定は、多くの場合、インタクトな質量測定単独では確立することができない（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，上記、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，上記）。これは、低存在量で存在する大きなＨＭＷ種の質量測定では、多くの場合、質量正確度が低いことが予想されるためであり、曖昧な質量割り当てにつながる可能性がある。

【0051】

これらの課題を克服するために、本発明は、ＳＥＣで分解された非共有結合性ＨＭＷ種を、その後のＭＳ検出のための構成成分へと解離するように最適化された、新しいポストカラム変性支援ｎＳＥＣ－ＭＳ法（ＰＣＤ支援ｎＳＥＣ－ＭＳ）を提供する。結果として、この新しいアプローチは、同一のＳＥＣ分離条件下で、非共有結合性及び非解離性のＨＭＷ種の両方の同時検出を可能にする。加えて、この戦略は、１）非共有結合性ＨＭＷ複合体から解離された構成サブユニットの同一性を確認することと、２）共溶出性の非共有結合性種からの干渉を除去することによって非解離性ＨＭＷ種のより正確な質量測定を達成することと、によって不均一なＨＭＷ種の特定を改善する。更に、制限酵素消化ステップを組み込むことによって、ＰＣＤ支援ｎＳＥＣ－ＭＳ法は、サブドメインレベルにおけるｍＡｂ凝集体の相互作用性質及び相互作用界面の両方を容易に明らかにすることができる。

【0052】

本発明はまた、（ａ）共溶出性の非共有結合性種からの干渉を低減することと、（ｂ）種のサイズを低減することと、によって共有結合性架橋のより正確な測定を提供する。例えば、Ｆａｂ２－Ｆｃ二量体を有する共溶出性種は、未消化及び部分的に消化された種に起因して、干渉を生じ得る。図１の上のパネルを参照されたい。本発明を使用して、未消化種からの干渉信号が、ＩｄｅＳなどのプロテアーゼを使用することによって除去され得る。図１の下のパネルを参照されたい。

【0053】

別段記載されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似又は等価な任意の方法及び材料が、実施又は試験において使用され得るが、特定の方法及び材料がここで記載される。言及される全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0054】

「１つの（ａ）」という用語は、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきであり、「約」及び「およそ」という用語は、当業者によって理解されるように標準的な変動を可能にすると理解されるべきであり、範囲が提供される場合、エンドポイントが含まれる。

【0055】

一部の例示的な実施形態では、本開示は、関心対象のタンパク質の少なくとも１つの高分子量種を特性評価するための方法を提供する。

【0056】

本明細書で使用される場合、「タンパク質」、「治療用タンパク質」又は「関心対象のタンパク質」という用語は、共有結合したアミド結合を有する任意のアミノ酸ポリマーを含む。タンパク質は、当技術分野で概して「ポリペプチド」として知られている１つ以上のアミノ酸ポリマー鎖を含む。「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して連結されたアミノ酸残基、関連する自然に発生する構造バリアント、及び自然には発生しないその合成類似体、関連する自然に発生する構造バリアント、及び自然には発生しないその合成類似体から構成されたポリマーを指す。「合成ペプチド又は合成ポリペプチド」は、自然には発生しないペプチド又はポリペプチドを指す。合成ペプチド又は合成ポリペプチドは、例えば、自動ポリペプチド合成装置を使用して合成することができる。様々な固相ペプチド合成法が知られている。タンパク質は、単一の機能性生体分子を形成するために１つ以上のポリペプチドを含有し得る。タンパク質は、生物治療用タンパク質、研究又は治療に使用される組換えタンパク質、トラップタンパク質及び他のキメラ受容体Ｆｃ融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、及び二重特異性抗体のいずれかを含み得る。別の例示的な態様では、タンパク質は、抗体断片、ナノボディ、組換え抗体キメラ、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモンなどを含むことができる。タンパク質は、昆虫バキュロウイルスシステム、酵母システム（例えば、ピキア種）、哺乳類システム（例えば、ＣＨＯ細胞及びＣＨＯ－Ｋ１細胞のようなＣＨＯ誘導体）などの組換え細胞ベースの生産システムを使用して生産することができる。生物治療用タンパク質及びその生産を考察する総説については、Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ，”（ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．ＧＥＮＥＴ．ＥＮＧ．ＲＥＶ．１４７－１７５（２０１２））を参照されたい。一部の例示的な実施形態では、タンパク質は、修飾、付加物、及び他の共有結合部分を含む。それらの修飾、付加物及び部分としては、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、グリカン（例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、ノイラミン酸、Ｎ－アセチルグルコサミン、フコース、マンノース、及び他の単糖）、ＰＥＧ、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ｍｙｃ－エピトープ、蛍光標識及び他の色素などが挙げられる。タンパク質は、組成及び溶解度に基づいて分類することができるため、球状タンパク質、繊維状タンパク質などの単純タンパク質、核タンパク質、糖タンパク質、ムコタンパク質、色素タンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質、及びリポタンパク質などの複合タンパク質、並びに一次派生タンパク質、及び二次派生タンパク質などの派生タンパク質を含む。

【0057】

一部の例示的な実施形態では、タンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、又はＦｃ融合タンパク質であり得る。

【0058】

本明細書で使用される「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互接続された４つのポリペプチド鎖、すなわち、２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、並びにその多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶ_Ｈと略す）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、及びＣ_Ｈ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶ_Ｌと略す）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（Ｃ_Ｌ１）を含む。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼称されるより保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼称される超可変性領域へと更に細分することができる。各Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは、アミノ末端からカルボキシ末端へ以下の順序で配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。異なる例示的な実施形態では、抗ビッグ－ＥＴ－１抗体（又はその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であり得るか、又は自然に若しくは人工的に修飾され得る。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。本明細書で使用される「抗体」という用語はまた、完全抗体分子の抗原結合断片も含む。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」などの用語は、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の自然に発生する、酵素的に得ることができる、合成の、又は遺伝子操作された、ポリペプチド又は糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合断片は、例えば、タンパク質分解消化又は抗体可変ドメイン及び任意選択的に定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現を含む組換え遺伝子操作技術などの任意の好適な標準技術を使用して、完全抗体分子から得ることができる。かかるＤＮＡは既知であり、かつ／又は、例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリ（例えば、ファージ－抗体ライブラリを含む）から容易に入手可能であるか、又は合成することができる。ＤＮＡを配列決定し、化学的に又は分子生物学技術を使用することによって操作して、例えば、１つ以上の可変及び／若しくは定常ドメインを好適な立体配置に配置するか、又はコドンを導入する、システイン残基を作製する、アミノ酸を修飾する、付加する、若しくは欠失させることなどができる。

【0059】

本明細書で使用される場合、「抗体断片」は、例えば、抗体の抗原結合領域又は可変領域などの、インタクトな抗体の一部分を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｃ断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域、並びにトリアボディ、テトラボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。Ｆｖ断片は、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域の組み合わせであり、ＳｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって接続される組換え一本鎖ポリペプチド分子である。抗体断片は、様々な手段によって産生され得る。例えば、抗体断片は、インタクトな抗体の断片化によって酵素的若しくは化学的に産生されてもよく、かつ／又は部分的な抗体配列をコードする遺伝子から組換えによって産生されてもよい。代替的に、又は追加的に、抗体断片は、全体的に又は部分的に合成的に産生され得る。抗体断片は、任意選択的に、単鎖抗体断片を含み得る。代替的に、又は追加的に、抗体断片は、例えば、ジスルフィド結合によって共に連結された複数の鎖を含み得る。抗体断片は、任意選択的に、多分子複合体を含み得る。

【0060】

本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当技術分野において利用可能な又は既知の任意の手段によって、任意の真核生物、原核生物、又はファージクローンを含む単一のクローンから得ることができる。本開示に関連して有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、及びファージディスプレイ技術、又はそれらの組み合わせの使用を含む、当技術分野で既知の多種多様な技術を使用して、調製することができる。

【0061】

本明細書で使用される「Ｆｃ融合タンパク質」という用語は、そのうちの１つが免疫グロブリン分子のＦｃ部分であり、天然状態では融合されていない、２つ以上のタンパク質の一部又は全部を含む。抗体由来ポリペプチド（Ｆｃドメインを含む）の様々な部分に融合した特定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ ＵＳＡ ８８：１０５３５，１９９１、Ｂｙｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７，１９９０、及びＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．４，ｐａｇｅｓ １０．１９．１－１０．１９．１１，１９９２に記載されている。「受容体Ｆｃ融合タンパク質」は、Ｆｃ部分に結合した受容体の１つ以上の細胞外ドメインのうちの１つ以上を含み、これは、一部の実施形態では、ヒンジ領域、続いて、免疫グロブリンのＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。一部の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、単一のまたは複数のリガンドに結合する２つ以上の別個の受容体鎖を含有する。例えば、Ｆｃ融合タンパク質は、トラップ、例えば、ＩＬ－１トラップ（例えば、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合したＩＬ－１Ｒ１細胞外領域に融合されたＩＬ－１ ＲＡｃＰリガンド結合領域を含有するリロナセプト；米国特許第６，９２７，００４号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照）、又はＶＥＧＦトラップ（例えば、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合されたＶＥＧＦ受容体Ｆｌｋ１のＩｇドメイン３に融合されたＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２を含有するアフリベルセプト、例えば、配列番号１；米国特許第７，０８７，４１１号及び同第７，２７９，１５９号（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照）である。

【0062】

本明細書で使用される場合、「不純物」という用語は、タンパク質バイオ医薬品に存在するあらゆる望ましくないタンパク質を挙げることができる。不純物には、プロセス関連不純物及び生成物関連不純物が含まれ得る。不純物は更に、既知の構造を有するか、部分的に特性評価されるか、又は未特定であり得る。

【0063】

プロセス関連不純物は、製造プロセスから誘導することができ、３つの主要なカテゴリー：細胞基質由来、細胞培養由来、及び下流由来を含むことができる。細胞基質由来の不純物は、宿主生物由来のタンパク質及び核酸（宿主細胞のゲノム、ベクター、又は全ＤＮＡ）を含むが、これらに限定されない。細胞培養由来の不純物は、誘導物質、抗生物質、血清、及び他の培地成分を含むが、これらに限定されない。下流由来の不純物としては、酵素、化学的及び生化学的処理試薬（例えば、臭化シアン、グアニジン、酸化剤及び還元剤）、無機塩（例えば、重金属、ヒ素、非金属イオン）、溶媒、担体、リガンド（例えば、モノクローナル抗体）、並びに他の浸出性物が挙げられるが、これらに限定されない。

【0064】

生成物関連不純物（例えば、前駆体、特定の分解生成物）は、活性、有効性、及び安全性に関して所望の生成物のものと同等の特性を有しない、製造及び／又は保管中に生じる分子バリアントであり得る。そのようなバリアントは、修飾（複数可）のタイプを特定するために、単離及び特性評価におけるかなりの努力を必要とし得る。生成物関連不純物には、切断形態、修飾形態、及び凝集体が含まれ得る。切断形態は、ペプチド結合の切断を触媒する加水分解酵素又は化学物質によって形成される。修飾形態としては、脱アミド化、異性化、ミスマッチＳ－Ｓ連結、酸化、又は改変共役形態（例えば、グリコシル化、リン酸化）が挙げられるが、これらに限定されない。修飾形態はまた、任意の翻訳後修飾形態を含み得る。凝集体には、所望の生成物の二量体及びより高い倍数体が含まれる（Ｑ６Ｂ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｔｅｓｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ａｎｄ Ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ／Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＩＣＨ Ａｕｇｕｓｔ １９９９，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）。

【0065】

図２に示されるように、生成物関連不純物は、治療用タンパク質製品における主要な不純物であり、したがって、慎重な特性評価を必要とする。いくつかの生成物関連不純物又は生成物関連タンパク質バリアントは、結合親和性を損なっている。損なわれた結合親和性は、本明細書において、体内の関心対象のタンパク質の標的又は関心対象のタンパク質のために設計された抗原に対する低減された結合親和性を含む。損なわれた結合親和性は、体内の関心対象のタンパク質の標的又は関心対象のタンパク質のために設計された抗原に対する関心対象のタンパク質の親和性よりも低い任意の親和性であり得る。

【0066】

本明細書で使用される場合、「翻訳後修飾」又は「ＰＴＭ」という一般的な用語は、ポリペプチドがリボソーム合成の間（翻訳時修飾）又はその後（翻訳後修飾）のいずれかで受ける共有結合修飾を指す。ＰＴＭは概して、特定の酵素又は酵素経路によって導入される。多くは、タンパク質骨格内の特定の特徴的なタンパク質配列（シグネチャー配列）の部位で起こる。数百のＰＴＭが記録されており、これらの修飾は、タンパク質の構造又は機能の何らかの側面に常に影響を及ぼす（Ｗａｌｓｈ，Ｇ．“Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”（２０１４）ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．より出版，ＩＳＢＮ：９７８０４７０６６９８５３）。様々な翻訳後修飾としては、切断、Ｎ末端伸長、タンパク質分解、Ｎ末端のアシル化、ビオチン化（ビオチンによるリジン残基のアシル化）、Ｃ末端のアミド化、グリコシル化、ヨウ素化、補欠分子族の共有結合、アセチル化（通常、タンパク質のＮ末端でのアセチル基の付加）、アルキル化（通常、リジン又はアルギニン残基でのアルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル）の付加）、メチル化、アデニル化、ＡＤＰ－リボシル化、ポリペプチド鎖内又はポリペプチド鎖間の共有結合架橋、スルホン化、プレニル化、ビタミンＣ依存性修飾（プロリン及びリジンのヒドロキシル化並びにカルボキシ末端のアミド化）、ビタミンＫ依存性修飾（ビタミンＫは、γ－カルボキシグルタメート（グルタミン酸残基）の形成をもたらすグルタミン酸残基のカルボキシル化における補因子である）、グルタミル化（グルタミン酸残基の共有結合）、グリシル化（共有結合グリシン残基）、グリコシル化（アスパラギン、ヒドロキシリシン、セリン、又はスレオニンのいずれかにグリコシル基を付加し、糖タンパク質をもたらす）、イソプレニル化（ファルネソール及びゲラニルゲラニオールなどのイソプレノイド基の付加）、リポイル化（リポ酸官能基の付加）、ホスホパンテテイニル化（脂肪酸、ポリケチド、非リボソームペプチド、及びロイシンの生合成などにおけるコエンザイムＡからの４’－ホスホパンテテイニル部分の付加）、リン酸化（通常はセリン、チロシン、スレオニン、又はヒスチジンへのリン酸基の付加）、及び硫酸化（通常はチロシン残基への硫酸基の付加）が挙げられるが、これらに限定されない。アミノ酸の化学的性質を変化させる翻訳後修飾としては、シトルリン化（脱イミノ化によるアルギニンからシトルリンへの変換）、及び脱アミド化（グルタミンからグルタミン酸への又はアスパラギンからアスパラギン酸への変換）が挙げられるが、これらに限定されない。構造変化を伴う翻訳後修飾としては、ジスルフィド架橋の形成（２つのシステインアミノ酸の共有結合）及びタンパク質切断（ペプチド結合でのタンパク質の切断）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の翻訳後修飾は、ＩＳＧ化（ＩＳＧ１５タンパク質（インターフェロン活性化遺伝子）への共有結合）、ＳＵＭＯ化（ＳＵＭＯタンパク質（低分子ユビキチン関連修飾因子）への共有結合）、及びユビキチン化（タンパク質へのユビキチンの共有結合）などの他のタンパク質又はペプチドの付加を伴う。ＵｎｉＰｒｏｔによって精選されたＰＴＭのより詳細な統制語彙については、欧州バイオインフォマティクス研究所タンパク質情報リソース、ＳＩＢスイスバイオインフォマティクス研究所、欧州バイオインフォマティクス研究所ＤＲＳ－ドロソマイシン前駆体－ＤＲＯＳＯＰＨＩＬＡ ＭＥＬＡＮＯＧＡＳＴＥＲ（ショウジョウバエ）－ＤＲＳ遺伝子及びタンパク質、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｄｏｃｓ／ｐｔｍｌｉｓｔ（最終訪問日：２０１９年１月１５日）を参照されたい。

【0067】

本明細書で使用される場合、「クロマトグラフィー」という用語は、液体又は気体によって運ばれる化学的混合物が、静止した液相又は固相の周囲又はその上を流れる際の化学物質の分布の差の結果として、複数の成分に分離することができるプロセスを指す。クロマトグラフィーの非限定的な例としては、従来の逆相（ＲＰ）クロマトグラフィー、イオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、及び順相（ＮＰ）クロマトグラフィーが挙げられる。

【0068】

サイズ排除クロマトグラフィー又はゲル濾過は、それらの分子サイズに応じた成分の分離に依存する。分離は、流体中の時間と比較した、物質が多孔質固定相中で費やす時間の量に依存する。分子が細孔内に存在する確率は、分子及び細孔のサイズに依存する。更に、物質が細孔内に貫通する能力は、高分子の拡散移動度によって決定され、この拡散移動度は、小さい高分子ほど高い。非常に大きな高分子は、固定相の細孔に全く貫通しないことがあり、非常に小さな高分子については、貫通の確率は１に近い。より大きな分子サイズの成分は、より迅速に固定相を通過するが、小さな分子サイズの成分は、固定相の細孔を通る経路長がより長く、したがって、固定相中により長く保持される。

【0069】

クロマトグラフィー材料はサイズ排除材料を含むことができ、サイズ排除材料は樹脂又は膜である。サイズ排除のために使用されるマトリックスは、好ましくは、不活性ゲル媒体であり、これは、架橋多糖類（例えば、球状ビーズの形態の架橋されたアガロース及び／又はデキストラン）の複合体であり得る。架橋度は、膨潤したゲルビーズ中に存在する細孔のサイズを決定する。特定のサイズよりも大きい分子は、ゲルビーズに入らず、したがって、最も速くクロマトグラフィーベッドを通って移動する。界面活性剤、タンパク質、ＤＮＡなどのより小さい分子は、それらのサイズ及び形状に依存して種々の程度にゲルビーズに入り、ベッドの通過が遅れる。したがって、分子は、一般に、分子サイズの大きい順に溶出される。

【0070】

ウイルスのサイズ排除クロマトグラフィーに適切な多孔性クロマトグラフィー樹脂は、様々な物理的特性を有するデキストロース、アガロース、ポリアクリルアミド、又はシリカから作製され得る。ポリマーの組み合わせも使用することができる。最も一般的に使用されているものは、商標名「ＳＥＰＨＡＤＥＸ」でＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能である。様々な構築材料からの他のサイズ排除支持体もまた適切であり、例えば、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ５５Ｆ（ポリメタクリレート、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ Ｐａ．）及びＢｉｏ－Ｇｅｌ Ｐ－３０ Ｆｉｎｅ（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）である。

【0071】

本明細書で使用される場合、「混合モードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）」又は「マルチモーダルクロマトグラフィー」という用語は、溶質が２つ以上の相互作用モード又はメカニズムを介して固定相と相互作用するクロマトグラフィー方法を含む。ＭＭＣは、従来の逆相（ＲＰ）、イオン交換（ＩＥＸ）、及び順相クロマトグラフィー（ＮＰ）に代わるか又は補完するツールとして使用され得る。疎水性相互作用、親水性相互作用、及びイオン性相互作用がそれぞれ優勢な相互作用モードであるＲＰ、ＮＰ、及びＩＥＸクロマトグラフィーとは異なり、混合モードクロマトグラフィーは、これらの相互作用モードのうちの２つ以上の組み合わせを採用し得る。混合モードクロマトグラフィー媒体は、単一モードクロマトグラフィーによって再現することができない固有の選択性を提供し得る。混合モードクロマトグラフィーはまた、親和性ベースの方法と比較して、潜在的なコスト節約及び操作の柔軟性を提供し得る。本発明は、サイズ排除ベースの分離を実施することができる混合モードクロマトグラフィーを使用することを含み得る。

【0072】

一部の例示的な実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーから溶出液を取得するために使用される移動相は、揮発性塩を含み得る。一部の特定の実施形態では、移動相は、酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、若しくはギ酸アンモニウム、又はそれらの組み合わせを含み得る。

【0073】

本明細書で使用される場合、「質量分析計」という用語は、特定の分子種を認識し、その正確な質量を測定することができるデバイスを含む。この用語は、ポリペプチド又はペプチドが検出及び／又は特性評価のために溶出され得る任意の分子検出器を含むことを意味する。質量分析計は、３つの主要部分、すなわち、イオン源、質量分析器、及び検出器を含むことができる。イオン源の役割は、気相イオンを生成することである。検体の原子、分子、クラスタは気相に移行され、同時に（エレクトロスプレーイオン化のように）イオン化される。イオン源の選択は、用途に大きく依存する。

【0074】

一部の例示的な実施形態では、エレクトロスプレーイオン化質量分析計は、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計であり得る。

【0075】

本明細書で使用される「ナノエレクトロスプレー」又は「ナノスプレー」という用語は、多くの場合は外部溶媒送達を使用しない、非常に低い溶媒流量、典型的には、数マイクロリットル又は数百ナノリットル／分以下の試料溶液におけるエレクトロスプレーイオン化を指す。ナノエレクトロスプレーを形成するエレクトロスプレー注入セットアップは、静的ナノエレクトロスプレーエミッタ又は動的ナノエレクトロスプレーエミッタを使用することができる。静的ナノエレクトロスプレーエミッタは、長期間にわたって少量の試料（分析物）溶液の連続分析を行う。動的ナノエレクトロスプレーエミッタは、キャピラリーカラム及び溶媒送達システムを使用して、質量分析計による分析の前に混合物に対してクロマトグラフィー分離を行う。

【0076】

本明細書で使用される場合、「質量分析器」という用語は、質量に応じて種、つまり原子、分子、又はクラスタを分離することができるデバイスを含む。高速タンパク質配列決定のために用いられ得る質量分析器の非限定的な例は、飛行時間型（ＴＯＦ）、磁気電気セクタ、四重極質量フィルタ（Ｑ）、四重極イオントラップ（ＱＩＴ）、オービトラップ、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）及び加速器質量分析法（ＡＭＳ）の技術である。

【0077】

一部の例示的な実施形態では、方法に使用される移動相は、質量分析計と適合性がある。

【0078】

一部の例示的な実施形態では、試料は、約１０μｇ～約１００μｇの関心対象のタンパク質を含み得る。

【0079】

一部の例示的な実施形態では、エレクトロスプレーイオン化質量分析計における流量は、約１０ｎＬ／分～約１０００μＬ／分とすることができる。

【0080】

一部の例示的な実施形態では、エレクトロスプレーイオン化質量分析計は、約０．８ｋＶ～約５ｋＶのスプレー電圧を有し得る。

【0081】

一部の例示的な実施形態では、質量分析法は、ネイティブ条件下で実施することができる。

【0082】

本明細書で使用される場合、「ネイティブ条件」又は「ネイティブＭＳ」又は「ネイティブＥＳＩ－ＭＳ」という用語は、分析物中の非共有結合性相互作用を保持する条件下で質量分析法を行うことを含み得る。ネイティブＭＳについての詳細な総説については、総説Ｅｌｉｓａｂｅｔｔａ Ｂｏｅｒｉ Ｅｒｂａ＆Ｃａｒｌｏ Ｐｅｔｏｓａ，Ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｒｏｌｅ ｏｆ ｎａｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｉｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，２４ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ１１７６－１１９２（２０１５）、（Ｈａｏ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｉｇｍｅｎｔ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，５８７ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ １０１２－１０２０（２０１３））を参照されたい。

【0083】

一部の例示的な実施形態では、質量分析計は、タンデム質量分析計であり得る。

【0084】

本明細書で使用される場合、「タンデム質量分析法」という用語は、試料分子についての構造情報が、複数段階の質量選択及び質量分離を使用することによって得られる技術を含む。必要条件は、試料分子が気相に移行され得、インタクトなままイオン化され得ること、及びこれらの分子が、第１の質量選択ステップ後に、いくらかの予測可能かつ制御可能な方式でばらばらになるように誘導され得ることである。多段階ＭＳ／ＭＳ又はＭＳ^ｎは、有意義な情報が得られる限り又はフラグメントイオン信号が検出可能である限り、まず前駆体イオンを選択して分離し（ＭＳ^２）、断片化し、一次断片イオンを分離し（ＭＳ^３）、断片化し、二次断片イオンを分離し（ＭＳ^４）、などによって行うことができる。タンデムＭＳは、様々な分析器の組み合わせで成功裏に行われている。ある特定の用途にどの分析器を組み合わせるかは、感度、選択性、速度だけでなく、サイズ、コスト、可用性など、多くの異なる要因によって決まる。タンデムＭＳ法の２つの主要なカテゴリーは、タンデムインスペース及びタンデムインタイムであるが、タンデムインタイム分析器がスペース内で又はタンデムインスペース分析器と連結されるハイブリッドも存在する。タンデムインスペース質量分析計は、イオン源と、前駆体イオン活性化デバイスと、少なくとも２つの非捕捉質量分析器とを備える。特定のｍ／ｚ分離機能は、機器の１つのセクションにおいてイオンが選択され、中間領域において解離され、次いで、産生イオンがｍ／ｚ分離及びデータ取得のために別の分析器に送られるように設計され得る。タンデムインタイム質量分析計では、イオン源で生成されたイオンを同じ物理デバイス内で捕捉、分離、断片化し、ｍ／ｚ分離することができる。

【0085】

質量分析計によって特定されたペプチドは、インタクトなタンパク質及びそれらの翻訳後修飾の代理代表として使用され得る。それらは、実験的及び理論的ＭＳ／ＭＳデータを相関させることによって、タンパク質特性評価のために使用することができ、後者は、タンパク質配列データベース内の可能なペプチドから生成される。特性評価としては、タンパク質断片のアミノ酸の配列決定、タンパク質配列決定の決定、タンパク質デノヴォ配列決定の決定、翻訳後修飾の位置決定、又は翻訳後修飾若しくは比較可能性分析の特定、あるいはそれらの組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されない。

【0086】

本明細書で使用される場合、「データベース」という用語は、例えば、ＦＡＳＴＡ形式のファイルの形態で、試料中に存在する可能性があるタンパク質配列の編集されたコレクションを指す。関連するタンパク質配列は、研究される種のｃＤＮＡ配列に由来し得る。関連するタンパク質配列を検索するために使用され得る公的データベースは、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ又はＳｗｉｓｓ－ｐｒｏｔによってホストされるデータベースを含んでいた。データベースは、本明細書で「バイオインフォマティクスツール」と称されるものを使用して検索することができる。バイオインフォマティクスツールは、データベース（複数可）中の全ての可能な配列に対して解釈されていないＭＳ／ＭＳスペクトルを検索する能力を提供し、出力として解釈された（アノテーションされた）ＭＳ／ＭＳスペクトルを提供する。かかるツールの非限定的な例は、Ｍａｓｃｏｔ（ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｉｌｌ（ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ）、ＰＬＧＳ（ｗｗｗ．ｗａｔｅｒｓ．ｃｏｍ）、ＰＥＡＫＳ（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．ｃｏｍ）、Ｐｒｏｔｅｉｎｐｉｌｏｔ（ｄｏｗｎｌｏａｄ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／／ｐｒｏｔｅｉｎｐｉｌｏｔ）、Ｐｈｅｎｙｘ（ｗｗｗ．ｐｈｅｎｙｘ－ｍｓ．ｃｏｍ）、Ｓｏｒｃｅｒｅｒ（ｗｗｗ．ｓａｇｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）、ＯＭＳＳＡ（ｗｗｗ．ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｍｓｓａ／）、Ｘ！Ｔａｎｄｅｍ（ｗｗｗ．ｔｈｅｇｐｍ．ｏｒｇ／ＴＡＮＤＥＭ／）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ（ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ／ｍｓｈｏｍｅ．ｈｔｍ）、Ｂｙｏｎｉｃ（ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎｍｅｔｒｉｃｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｂｙｏｎｉｃ）又はＳｅｑｕｅｓｔ（ｆｉｅｌｄｓ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｓｅｑｕｅｓｔ）である。

【0087】

一部の実施形態では、関心対象のタンパク質を含む試料は、試料に還元剤を添加することによって処理することができる。

【0088】

本明細書で使用される場合、「還元すること」という用語は、タンパク質中のジスルフィド架橋の還元を指す。タンパク質を還元するために使用される還元剤の非限定的な例は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β－メルカプトエタノール、エルマン試薬、ヒドロキシルアミン塩酸塩、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ－ＨＣｌ）、又はそれらの組み合わせである。一部の特定の実施形態では、処理は、アルキル化を更に含むことができる。一部の他の特定の例示的な実施形態では、処理は、タンパク質上のスルフヒドリル基のアルキル化を含むことができる。

【0089】

本明細書で使用される場合、「処理すること」又は「同位体的標識すること」という用語は、タンパク質を化学標識することを指すことができる。タンパク質を化学標識する方法の非限定的な例としては、４－ｐｌｅｘ、６－ｐｌｅｘ、及び８－ｐｌｅｘなどの試薬を使用した相対定量化及び絶対定量化のための同重体タグ（ｉＴＲＡＱ）、アミンの還元的脱メチル化、アミンのカルバミル化、タンパク質のＣ末端、又はアミン基若しくはスルフヒドリル基を標識するためのタンパク質の任意のアミン基若しくはスルフヒドリル基上の^１８Ｏ－標識が挙げられる。

【0090】

一部の実施形態では、関心対象のタンパク質を含む試料は、それをクロマトグラフィーカラムに供する前に消化され得る。

【0091】

本明細書で使用される場合、「消化」という用語は、タンパク質の１つ以上のペプチド結合の加水分解を指す。適切な加水分解剤を使用して試料中のタンパク質の消化を行うための複数のアプローチ（例えば、酵素消化又は非酵素消化）が存在する。

【0092】

本明細書で使用される場合、「加水分解剤」という用語は、タンパク質の消化を行うことができる多数の異なる薬剤のうちのいずれか１つ又はそれらの組み合わせを指す。酵素消化を行うことができる加水分解剤の非限定的な例としては、トリプシン、エンドプロテイナーゼＡｒｇ－Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ－Ｎ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ、外膜プロテアーゼＴ（ＯｍｐＴ）、化膿連鎖球菌の免疫グロブリン分解酵素（ＩｄｅＳ）、キモトリプシン、ペプシン、サーモリシン、パパイン、プロナーゼ、及びアルペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｓａｉｔｏｉ）のプロテアーゼが挙げられる。非酵素消化を行うことができる加水分解剤の非限定的な例としては、高温、マイクロ波、超音波、高圧、赤外線、溶媒（非限定的な例はエタノール及びアセトニトリル）、固定化酵素消化（ＩＭＥＲ）、磁性粒子固定化酵素、及びオンチップ固定化酵素が挙げられる。タンパク質消化のための利用可能な技術を考察する最近の総説については、Ｓｗｉｔａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ”（Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３，１２，１０６７－１０７７）を参照されたい。加水分解剤のうちの１つ又はそれらの組み合わせは、配列特異的な様式でタンパク質又はポリペプチドにおけるペプチド結合を切断し、より短いペプチドの予測可能なコレクションを生成することができる。

【0093】

本明細書で提供される方法ステップの数字及び／又は文字での連続した標識は、方法又はその任意の実施形態を特定の指示された順序に限定することを意味しない。

【0094】

特許、特許出願、公開された特許出願、アクセッション番号、技術論文及び学術論文を含む様々な刊行物が、本明細書全体を通して引用される。これらの引用される参考文献の各々は、参照によって、その全体及び全ての目的のために、本明細書に組み込まれる。

【0095】

本開示は、本開示をより詳細に説明するために提供される以下の実施例を参照することによって、より十分に理解されるであろう。それらは、実施例を例示することを意図しており、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

【実施例】

【0096】

材料
脱イオン水を、ＭｉｌｌｉＰａｋ Ｅｘｐｒｅｓｓ ２０フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、カタログ番号ＭＰＧＰ０２００１）を備えたＭｉｌｌｉ－Ｑ一体型浄水システムによって提供した。酢酸アンモニウム（ＬＣ／ＭＳグレード）を、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、製品番号７３５９４）から購入した。ペプチドＮ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、製品番号Ｐ０７０４Ｌ）から購入した。ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標）を、Ｇｅｎｏｖｉｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、製品番号Ａ０－ＦＲ１－２５０）から購入した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＵｌｔｒａＰｕｒｅ１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファ、ｐＨ７．５（参照番号１５５６７－０２７）、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＤＴＴ（ジチオスレイトール、Ｎｏ－Ｗｅｉｇｈ（商標）フォーマット、参照番号Ａ３９２５５）、及びアセトニトリル（ＡＣＮ、Ｏｐｔｉｍａ ＬＣ／ＭＳグレード、製品番号Ａ９５５－４）を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から購入した。ギ酸（ＦＡ、９８～１００％、微量金属分析のためのＳｕｐｒａｐｕｒ）を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、製品番号１．１１６７０．０２５０）から購入した。２－プロパノール（ＩＰＡ、ＨＰＬＣグレード）を、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、製品番号６５－０４４７－４Ｌ）から購入した。

【0097】

試料調製
全てのｍＡｂを、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ．のＣＨＯ細胞内で産生した。ｍＡｂ３濃縮ＨＭＷ試料を、セミ分取スケールＳＥＣカラムを使用してｍＡｂ３ ＤＳ試料からＨＭＷ種を分画することによって生成した。最終濃縮ＨＭＷ試料は、０．７％の三量体、６６．８％の二量体、及び３２．５％の単量体を含有する。脱塩ＳＥＣ－ＭＳ分析の前に、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で２ｍＭのＤＴＴを用いて３７℃で３０分間、ｍＡｂ１を処理して、鎖間ジスルフィド結合のみを還元することによって、限定的な還元を実施した。インタクトなレベル分析のために、濃縮ＨＭＷ試料、個々のＤＳ試料、及び共製剤化ＤＰ試料を含む全てのｍＡｂ試料を、各重鎖ＣＨ２ドメインからＮ－グリカン鎖を除去するために、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中でＰＮＧａｓｅ Ｆ（１０μｇのタンパク質当たり１ＩＵＢミリユニット）を用いて４５℃で１時間処理した。サブドメイン分析のために、脱グリコシル化ｍＡｂ３ ＨＭＷ試料及びｍＡｂ４ ＤＳ試料のアリコートを、各々、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中でＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（１μｇのタンパク質当たり１ＩＵＢミリユニット）を用いて３７℃で１時間、部位特異的消化に供し、Ｆ（ａｂ）’_２及びＦｃ断片を生成した。

【0098】

ＰＣＤ支援ｎＳＥＣ－ＭＳ
ネイティブＳＥＣクロマトグラフィーを、カラム区画が３０℃に設定されているＡｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ２００ ＳＥＣカラム（４．６×３００ｍｍ、１．７μｍ、２００Å、Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を備えるＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＵＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施した。０．２ｍＬ／ｍＬの１５０ｍＭの酢酸アンモニウムのアイソクラティックフローを、タンパク質サイズバリアントを分離及び溶出するために適用した。ポストカラム変性を可能にするために、６０％のＡＣＮ、３６％の水、及び４％のＦＡからなる変性溶液を二次ポンプによって０．２ｍＬ／分の流量で送達し、次いで、ＭＳ検出に供する前に、Ｔミキサを使用してＳＥＣ溶出液（１：１混合）と混合した。オンラインネイティブＭＳ分析を可能にするために、組み合わせられた分析フロー（０．４ｍＬ／分）を、ナノエレクトロスプレーイオン化（ＮＳＩ）－ＭＳ検出用のマイクロフロー（＜１０μＬ／分）と、ＵＶ検出用の残りの高流量とに分割した（図３）。Ｍｉｃｒｏｆｌｏｗ－Ｎａｎｏｓｐｒａｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＭｎＥＳＩ）ソース及びＭｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ Ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ Ｍｕｌｔｉ－ｎｏｚｚｌｅ（Ｍ３）エミッタ（Ｎｅｗｏｍｉｃｓ、Ｂｅｒｋｌｅｙ、ＣＡ）を備えるＴｈｅｒｍｏ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＵＨＭＲ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をネイティブＭＳ分析に使用した。詳細な実験設定及び器具パラメータは、Ｙａｎ Ｙ，Ｘｉｎｇ Ｔ，Ｗａｎｇ Ｓ，Ｌｉ Ｎ．Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ａｎｄ ｒｏｂｕｓｔ ｎａｔｉｖｅ ＬＣ－ＭＳ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｉｎｔａｃｔ ｍａｓｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇｓ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ２０２０：３１（１０）：２１７１－２１７９に説明されており、これは、参照によりその全体が組み込まれる。ＰＣＤを無効化するために、変性溶液の流量をゼロに設定した。部分的に還元されたｍＡｂ１の脱塩ＳＥＣ－ＭＳ分析を、Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ２００ ＳＥＣガードカラム（４．６×３０ｍｍ、１．７μｍ、２００Å）を使用して同様の様式で実施した。

【0099】

データ分析
ネイティブ又はＰＣＤ条件下におけるｎＳＥＣ－ＭＳ分析からのインタクトな質量スペクトルを、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＭｅｔｒｉｃｓからのＩｎｔａｃｔ Ｍａｓｓ（商標）ソフトウェアを使用してデコンボリュートした。

【0100】

実施例１
ＰＣＤ支援ｎＳＥＣ－ＭＳ法
ｍＡｂ ＨＭＷ種のｎＳＥＣ－ＭＳベースの特性評価を改善するために、ＭＳ検出前のＳＥＣ分離後に非共有結合性ＨＭＷ複合体を解離するように、ポストカラム変性（ＰＣＤ）戦略が導入される。この戦略は、構成サブユニットを確認することによって非共有結合性ＨＭＷ複合体の改良された割り当てを可能にするのみならず、共溶出性の非共有結合性種からの干渉を低減することによって非解離性ＨＭＷ種のより正確な質量測定を提供するので、非常に望ましい。

【0101】

高流量（最大０．８ｍＬ／分）に対応し得る上記に説明されたｎＬＣ－ＭＳプラットフォーム（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．（２０２０）、上記）を利用して、ＰＣＤとｎＳＥＣ－ＭＳとの統合は、Ｔミキサを介してｎＳＥＣフロー（０．２ｍＬ／分）にポストカラム変性フロー（０．２ｍＬ／分）を導入すること（図３）によって容易に達成され得る。

【0102】

変性溶媒を、２つの主要な考慮事項に基づいて慎重に選択した。第一に、ポストカラム混合後の最終フローは、依然として、直接ＭＳ検出と高度に適合するべきである。第二に、短い変性時間のため（例えば、ＴミキサからＭＳまで１秒未満）、所望の変性溶媒は、ポストカラム混合直後に非共有結合性相互作用の大部分を破壊することができるべきである。

【0103】

様々なレベルのアセトニトリル（ＡＣＮ）とギ酸（ＦＡ）とを含有する一連の変性溶媒系を評価した後、６０％のＡＣＮ、４％のＦＡ、及び３６％の水からなる最適化された配合物をＰＣＤ適用のために選択した。選択された変性溶媒の有効性を評価するために、ｍＡｂ１（ＩｇＧ４サブクラス）を部分的に還元し（鎖間ジスルフィド結合を破壊し）、短いＳＥＣガードカラム（図４Ａ）を使用してＰＣＤ支援ｎＳＥＣ－ＭＳ分析に供した。２つのＣＨ３ドメイン間、並びにＩｇＧ４分子中の重鎖及び軽鎖のＮ末端領域（ＨＣ及びＬＣ）間の強い鎖間非共有結合性相互作用のため（Ｒｏｓｅ ＲＪ，Ｌａｂｒｉｊｎ ＡＦ，ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｅｍｅｒ ＥＴ，Ｌｏｖｅｒｉｘ Ｓ，Ｌａｓｔｅｒｓ Ｉ，ｖａｎ Ｂｅｒｋｅｌ ＰＨ，ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ ＪＧ，Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ Ｊ，Ｐａｒｒｅｎ ＰＷ，Ｈｅｃｋ ＡＪ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ａｎｄ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｇｇ４ ｈａｌｆ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｂｙ ｎａｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２０１１：１９（９）：１２７４－１２８２）、部分的に還元されたｍＡｂ１は、主にｎＳＥＣ－ＭＳ条件下でインタクトなＨ２Ｌ２複合体として検出された。低レベルのＨＬ、Ｈ２Ｌ、及びＬＣ種のみが観察され、これらは、インソース解離を介して生成された可能性が高かった（図４Ａ、黒色トレース）。対照的に、ＰＣＤ条件（６０％のＡＣＮ／４％のＦＡ）を適用した後、これらの非共有結合性複合体（例えば、Ｈ２Ｌ２、Ｈ２Ｌ、及びＨＬ）を完全に解離し、遊離ＨＣ及びＬＣとして検出した（図４Ａ、赤色トレース）。６０％のＡＣＮのみを含有する代替の変性溶媒もまた試験し、部分的に還元されたｍＡｂ複合体の解離において、同等の有効性を示した（図２Ａ、オレンジ色トレース）。

【0104】

別の例では、ｎＳＥＣ－ＭＳ分析によって検出されたｍＡｂ２二量体種（図４Ｂ、黒色トレース）は、ＰＣＤ（６０％のＡＣＮ／４％のＦＡ）の適用時に単量体へのほぼ完全な解離を示し（図４Ｂ、赤色トレース）、全てではないにしても、二量体種の大部分が非共有結合であったことを示唆した。加えて、折り畳まれていない種に対応する、低レベルの高帯電単量体信号もまた、低ｍ／ｚ領域で観察された。第１の実施例とは異なり、６０％のＡＣＮ単独を含有する代替の変性溶媒の適用は、ｍＡｂ２二量体種の完全な解離につながらず（図４Ｂ、オレンジ色トレース）、低ｐＨ及び有機溶媒の組み合わせが、非共有結合性相互作用を破壊することにおいてより効果的であることを示唆している。その後、開発されたＰＣＤ条件は、迅速かつ効果的な解離が常に達成され得る他の非共有結合系（例えば、抗体－抗原複合体及びウイルスカプシド）にも適用された（データは示さず）。したがって、開発されたＰＣＤ条件は、ｍＡｂ ＨＭＷ複合体に存在する非共有相互作用の大部分を破壊するのに有効であると考えられるが、いくつかの密接に結合した非共有結合性複合体が処理に耐え得ることは依然として可能である。最後に、報告されたｎＬＣ－ＭＳプラットフォーム（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）、上記）を適用すると、ｍＡｂ関連種が、全て、選択されたＰＣＤ条件（６０％のＡＣＮ／４％のＦＡ）下で「ネイティブ様」質量スペクトルを呈したことに留意することが重要である。この特徴は、同じ複合体から同時に解離され、かつ同じＭＳスキャンで検出される複数の種からのスペクトルの重複を低減するので、非常に望ましい。例えば、ＰＣＤ条件下で、解離したＨＣ及びＬＣのＭＳ信号は、最小限の重複を伴うｍ／ｚスケールで十分に単離された（図４Ａ）。加えて、変性条件下における典型的なＥＳＩ－ＭＳスペクトルと比較して、「ネイティブ様」スペクトルは、はるかに少ない荷電状態及びより大きい空間分解能を呈し、それらを解釈及び処理され易くする（例えば、抽出イオンクロマトグラムの生成）。

【0105】

実施例２
濃縮ＨＭＷ種のＰＣＤ支援ｎＳＥＣ－ＭＳ分析
ｍＡｂ ＨＭＷ種の拡張された特性評価は、多くの場合、ＤＳ不均一性特性評価の一部として、プログラム開発の後期段階で必要とされる。制限酵素消化（例えば、ＩｄｅＳ消化）、続いて、インタクトな質量分析が、サブドメインレベルにおける相互作用界面を理解するために、濃縮ＨＭＷ材料に対して頻繁に実施される。この目的のために、二量体種を主に含有するｍＡｂ３濃縮ＨＭＷ試料を、ＰＣＤ支援ｎＳＥＣ－ＭＳ分析に供する前に、ＩｄｅＳ消化を用いて処理した。ＩｄｅＳがＦ（ａｂ）’_２及びＦｃ断片を放出するヒンジ領域の下でｍＡｂ分子を切断するとき、この戦略は、サブドメインレベルにおける二量体相互作用の効果的な特性評価を可能にする。消化されたＨＭＷ試料（図５、中央）のＳＥＣ－ＵＶ分析は、濃縮ＨＭＷ試料中に存在する様々なサブドメイン相互作用の結果として、Ｆ（ａｂ）’_２及びＦｃ単量体に対応する２つの主要なピーク、並びにＨＭＷ関連種に対応する可能性が高い４つの他のピーク（Ｐ１～Ｐ４）を含む、複数の分解されたＵＶピークを呈した。続いて、ｎＳＥＣ－ＭＳ分析からの正確な質量測定を使用して、各ピークの同一性を割り当てた（図５、図６）。ネイティブ複合体のインタクトな質量測定は、凝集状態及び相互作用するパートナー（例えば、Ｐ１におけるＦ（ａｂ）’_２三量体、Ｐ２におけるＦ（ａｂ）’_２二量体、Ｐ３におけるＦ（ａｂ）’_２－Ｆｃヘテロ二量体、及びＰ４におけるＦｃ二量体）を容易に区別することができるが、各種の詳細な解明は、インタクトな質量ベースの割り当てからの相当量の曖昧さに起因して、依然として困難であった。

【0106】

例えば、Ｐ４ｂにおけるＦｃ二量体は、非共有結合性二量体（９５，０１８Ｄａ）の予測された質量と一致する観察された質量（９５，０２３Ｄａ）を呈したが、一方で、Ｐ４ａにおけるＦｃ二量体は、予測された質量と比較しておよそ１４Ｄａの質量増加を呈した（図５）。この質量増加は、おそらくは、非共有結合性複合体内の酸化修飾（＋１６Ｄａ）、又は共有結合性複合体を維持する共有結合性架橋（例えば、２つのヒスチジン残基間の１４Ｄａ）のいずれかの存在に起因し得る。残念ながら、インタクトな複雑なレベルで達成された質量分解能及び正確度は、明確な割り当てにつながることができず、２つの非常に異なるシナリオを区別することができない。同様に、Ｐ３におけるＦ（ａｂ）′_２－Ｆｃヘテロ二量体の確実な解明はまた、非共有結合性及び共有結合性の二量体種の両方の可能性のある共存、並びにＩｄｅＳ消化からの不完全な反応生成物によって複雑化し、これらの全ては、互いの間でわずかな質量差のみを呈することになった。最後に、３つの部分的に分解されたピーク、Ｐ２ａ、Ｐ２ｂ、及びＰ２ｃが、全て、同様の観察された質量（１９６，８６４～１９６，８６７Ｄａ）を有するＦ（ａｂ）’_２二量体種を含有していたことがｎＳＥＣ－ＭＳ分析により容易に確認されたが、ＨＭＷ試料中に存在する見かけ上の不均一なＦ（ａｂ）’_２－Ｆ（ａｂ）’_２相互作用を特性評価するための他の意味のある情報を、この分析から取得することはできなかった。

【0107】

曖昧さを低減し、特性評価を改善するために、ＰＣＤは、相互作用性質に基づいて第２の次元の分離を提供するために、ＳＥＣ後の分離を実行した。例えば、ＰＣＤ条件下では、Ｐ４ａ及びＰ４ｂのＦｃ二量体種について、独特な解離挙動が観察された。Ｐ４ｂにおけるＦｃ二量体は、ネイティブ複合体の観察された質量に基づいて非共有結合性種として既に暫定的に割り当てられていたが、ＰＣＤ条件下でＦｃ／２サブユニットへの完全な解離を受けた。この結果は、Ｐ４ｂにおけるＦｃ二量体の非共有結合性質を確認した。対照的に、Ｐ４ａにおけるＰＣＤの適用は、Ｆｃ／２サブユニット（例えば、非共有結合性Ｆｃ複合体から解離した）及び非解離性Ｆｃ／２二量体種の両方の形成につながった。ネイティブ条件下で検出されるＰ４ａにおけるＦｃ二量体のより大きい質量と一貫して、非解離性Ｆｃ／２二量体はまた、非共有結合性Ｆｃ／２二量体と比較しておよそ１４Ｄａの質量増加も示した。このデルタ質量は、２つのヒスチジン（Ｈｉｓ）残基間で起こる、既に報告されている共有結合性架橋に対応すると提案された（架橋剤質量：１３．９８Ｄａ）（Ｘｕ ＣＦ，Ｃｈｅｎ Ｙ，Ｙｉ Ｌ，Ｂｒａｎｔｌｅｙ Ｔ，Ｓｔａｎｌｅｙ Ｂ，Ｓｏｓｉｃ Ｚ，Ｚａｎｇ Ｌ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｓ ｉｎ ａｎ ｉｇｇ１ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ２０１７：８９（１５）：７９１５－７９２３、Ｐｏｗｅｌｌ Ｔ，Ｋｎｉｇｈｔ ＭＪ，Ｗｏｏｄ Ａ，Ｏ’Ｈａｒａ Ｊ，Ｂｕｒｋｉｔｔ Ｗ．Ｐｈｏｔｏｉｎｄｕｃｅｄ ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｉｎｇ ｏｆ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｔｏ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ ２０２１：１６０（３５－４１））。その後のペプチドマッピング分析はまた、Ｐ４ａにおけるＦｃ二量体に寄与した可能性が高い、Ｆｃ領域からのいくつかのＨｉｓ－Ｈｉｓ架橋ジペプチドも特定した（データは示さず）。Ｐ３ｂにおけるＦ（ａｂ）’_２－Ｆｃ二量体についても同じ共有結合性架橋が観察され、これは、非共有結合性Ｆ（ａｂ）’_２－Ｆｃ二量体と比較して質量が約１４Ｄａ高いことが測定された。ＰＣＤの適用は、この種を、Ｈｉｓ－Ｈｉｓ架橋に起因して、およそ１４Ｄａの質量増加も呈したＦｃ／２サブユニット及び非解離性Ｆ（ａｂ）′_２－Ｆｃ／２複合体に解離することによって、この割り当てを更に確認した。

【0108】

対照的に、Ｐ３ａにおける種は、非共有結合性Ｆ（ａｂ）’_２－Ｆｃ二量体よりもおよそ１８Ｄａ低い観察された質量を示し、ＰＣＤ条件下でＦｃ／２及び相補的なＦｃ／２クリップｍＡｂ種に容易に解離した。したがって、Ｐ３ａにおける種を、１つの重鎖のみが切断された不完全なＩｄｅＳ消化生成物として割り当てた。最後に、インタクトな複合体レベルで同様の観察された質量にもかかわらず、Ｐ２ｂにおけるＦ（ａｂ）’_２二量体は、ＰＣＤ条件下でＰ２ａ及びＰ２ｃにおけるものとは異なる解離挙動を呈した（図５）。具体的には、ＰＣＤを適用すると、Ｐ２ａ及びＰ２ｃにおける二量体種は、ほぼ完全な解離を受け、Ｆ（ａｂ）’_２単量体のみの検出につながった。この観察は、立体構造の差に起因する可能性が高いＳＥＣによって分離された、Ｐ２ａ及びＰ２ｃの両方におけるＦ（ａｂ）’_２二量体の非共有結合性質を示した。対照的に、Ｐ２ｂは、ＰＣＤ条件下で非解離性のままのＦ（ａｂ）’_２二量体の有意な量を示し、「共有結合様」Ｆ（ａｂ）’_２二量体の存在を示唆した。加えて、共溶出性の非共有結合性Ｆ（ａｂ）′_２二量体が解離したため、Ｐ２ｂにおける非解離性二量体のより正確な質量測定が達成され得る。実際、この分析は、Ｐ２ｂにおける非解離性二量体が、非共有結合性二量体よりも低い質量（１９６，８５６Ｄａ）を呈したことを明らかにし（理論質量：１９６，８６５Ｄａ）、負のデルタ質量を有する共有結合性架橋の存在の可能性を示唆する。この共有結合性架橋の特定は、依然として進行中であり、本明細書の範囲外であるが、ＰＣＤ支援ｎＳＥＣ－ＭＳ分析からの情報は、調査を導くために価値がある。

【0109】

実施例３
未分画ＤＳ試料中のＨＭＷ種のＰＣＤ支援ｎＳＥＣ－ＭＳ分析
未分画ｍＡｂ ＤＳ試料からのＨＭＷ種の直接分析は、それほど資源を必要とせず、試料の取り扱いに起因するＨＭＷプロファイルの潜在的な変化（例えば、人工ＨＭＷの形成又は不安定なＨＭＷ種の解離）を排除するので、非常に望ましい。未分画試料からの複雑なＨＭＷ種の解明におけるＰＣＤ支援ｎＳＥＣ－ＭＳ法の適用性を実証するために、ＳＥＣ分離中に複雑なＨＭＷプロファイル（４つの部分的に分解されたＨＭＷピーク）を呈した二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）ＤＳ試料を分析に供した（図７）。２つの同一の軽鎖（ＬＣ）及び２つの異なる重鎖（ＨＣ及びＨＣ^＊）からなるｂｓＡｂ（ＨＨ^＊Ｌ２）ＤＳ試料は、多くの場合、ＨＭＷ種の増加した複雑さに更に寄与し得る低レベルの単一特異性ｍＡｂ不純物（Ｈ２Ｌ２及びＨ^＊２Ｌ２）を含有する。例えば、ｎＳＥＣ－ＭＳ分析は、ｂｓＡｂホモ二量体（ＨＨ^＊Ｌ２×２）と、ｂｓＡｂ及び単一特異性Ｈ^＊２Ｌ２種（図８に示されるデコンボリュートされた質量）からなるヘテロ二量体（ＨＨ^＊Ｌ２＋Ｈ^＊２Ｌ２）と、を含む、ＨＭＷ１及びＨＭＷ２の両方のピークにおける２つの異なる二量体の存在を示した。ヘテロ二量体種の相対存在量は、ＨＭＷ２ピークと比較して、ＨＭＷ１ピークでわずかに高い。ＰＣＤの適用は、ｂｓＡｂ及びＨ^＊２Ｌ２単量体の両方が二量体種から解離し、かつＨＭＷ１及びＨＭＷ２ピークで検出された、これらの割り当てを更に支持した。興味深いことに、ＰＣＤの適用は、結果的に、ＨＭＷ１及びＨＭＷ２ピークの両方におけるヘテロ二量体の完全な解離をもたらし、これらの種の非共有結合性質を示す。対照的に、ＨＭＷ２ピークにおけるｂｓＡｂホモ二量体は、部分解離を受けたが、一方で、ＰＣＤ条件下で、顕著な量がインタクトなままであり、非解離性ｂｓＡｂホモ二量体の存在を示唆している。単量体種は、ＰＣＤ条件下における非共有結合性二量体の解離からのみ生成され得るため、単量体信号（例えば、ｂｓＡｂ単量体及びＨ^＊２Ｌ２単量体）を使用して構築された抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）は、非共有結合性二量体の溶出プロファイルを表すことができる。

【0110】

一方、ＰＣＤ条件下でｂｓＡｂホモ二量体信号を使用して構築されたＸＩＣは、非解離性ｂｓＡｂホモ二量体の溶出プロファイルを表すことができる。この戦略を適用すると、非共有結合性ホモ二量体及び非共有結合性ヘテロ二量体の両方がＨＭＷ１及びＨＭＷ２ピークで溶出するが、一方で、非解離性ｂｓＡｂホモ二量体がＨＭＷ２ピークと整列したピーク頂点を有する広範かつ独特な領域で溶出したことが明らかであった（図７、左パネル）。同様に、正確な質量測定に基づいて、ｎＳＥＣ－ＭＳ分析は、ＨＭＷ３ピークを、ｂｓＡｂ単量体及び２つの余分なＬＣからなる複合体として暫定的に特定した。その後、ＰＣＤの適用は、提案された組成物を確認しただけでなく、２つの余分なＬＣが非解離性二量体として（例えば、おそらく鎖間ジスルフィド結合を介して）存在し、次いで、非共有結合性相互作用を介してｂｓＡｂ分子と会合していることを明らかにした。解離したＬＣ二量体及びｂｓＡｂ単量体のＸＩＣもまた、ＨＭＷ３ピークとのそれらの共溶出を確認し、この割り当てを更に支持した。最後に、正確な質量測定に基づいて、ＨＭＷ４ピークにおける種は、ＣＨ２ドメインにおけるクリッピングに起因して、ｂｓＡｂ単量体及びＦａｂ断片からなる複合体であることが提案された。この種は、ＰＣＤ条件下でインタクトなままであったため、本発明者らは、それが非解離性ｂｓＡｂホモ二量体種の切断に起因する分解生成物であったと考える。

【0111】

未分画ＤＳ試料から直接ＨＭＷ種を解明する能力により、ＰＣＤ支援ｎＳＥＣ－ＭＳ法は、意思決定を容易にするために迅速なターンアラウンドが望まれるプロセス開発の支持において理想的に好適なものとなる。この分野における有用性を試験するために、方法を、次いで、プロセス変更の前後のｍＡｂプログラムのＨＭＷプロファイルの比較可能性を評価するために適用した。ＳＥＣ－ＵＶトレースで実証されるように、プロセス変更の前及び後のｍＡｂ４ ＤＳロットのＨＭＷプロファイルは、概して、ピーク形状のわずかな差異に相当するものであった（図９Ａ、黒色トレース）。ｎＳＥＣ－ＭＳ分析からの正確な質量測定によると、ロット１及びロット２の両方で優勢なＨＭＷピークがｍＡｂ４二量体種として容易に特定された（図９Ａ、黒色トレース）。

【0112】

ＰＣＤの適用は、次いで、両方のＤＳロットにおける非共有結合性二量体（図９Ａ、ＰＣＤ条件下でｍＡｂ４単量体信号のＸＩＣによって表されるマゼンタ色トレース）及び非解離性二量体（図９Ａ、ＰＣＤ条件下で非解離性ｍＡｂ４二量体信号のＸＩＣによって表される青色トレース）の両方の存在を明らかにした。ＨＭＷ種がＵＶピーク及び観察された質量に基づいて一般的に比較可能であると考えられたが、非共有結合性二量体及び非解離性二量体の分布が２つのロット間で大きく異なることは、明らかである。具体的には、ロット２は、有意により高いレベルの非共有結合性二量体種を含有したが、一方で、ロット１は、顕著により高いレベルの非解離性二量体種を含有した。更に、総ＨＭＷ種内の非共有結合性二量体の相対存在量はまた、以下の方程式：

を使用して、ＰＣＤ支援ｎＳＥＣ－ＵＶ／ＭＳ分析から生成されたＵＶピーク面積及びＸＩＣに基づいて推定され得る。

【0113】

式中、ＸＩＣ_二量体及びＸＩＣ_単量体は、それぞれ、二量体溶出及び単量体溶出領域に現れる単量体信号の積分されたＸＩＣピーク面積を表し、ＵＶ_二量体及びＵＶ_単量体は、それぞれ、二量体及び単量体ピークの積分されたＵＶピーク面積を表す。この計算では、非共有結合性二量体は、二量体溶出領域内のＰＣＤ誘発単量体信号を使用して定量化され、実際の単量体信号に対して正規化される。単量体信号のみが使用されたため、異なる種（例えば、二量体対単量体）のＭＳ応答の不一致が緩和され得、より信頼性の高い定量化につながる。

【0114】

この戦略を使用して、総ＨＭＷ種内の非共有結合性二量体の相対存在量は、ロット１及びロット２のＤＳ試料において、それぞれ、約１１％及び約８６％で推定された。加えて、ロット１及びロット２の試料中の非解離性二量体はまた、異なる溶出プロファイルを呈し、ロット２は、より高いレベルの早期溶出性種を示した（図９Ａ、青色トレース）。一貫して、サブドメインレベルにおける二量体相互作用の更なる分析（例えば、ＩｄｅＳ消化後の）（図９Ｂ）はまた、非共有結合性Ｆ（ａｂ）’_２二量体（図９Ｂ、解離したＦ（ａｂ）’_２単量体のＸＩＣによって表されるマゼンタ色トレース）及び非共有結合性Ｆｃ二量体（図９Ｂ、解離したＦｃ／２単量体のＸＩＣによって表される茶色トレース）を含む、ロット２のＤＳ試料中のより高いレベルの非共有結合性複合体を明らかにした。非解離性Ｆ（ａｂ）’_２二量体（図９Ｂ、非解離性Ｆ（ａｂ）’_２二量体のＸＩＣによって表される青色トレース）及び非解離性Ｆ（ａｂ）’_２－Ｆｃヘテロ二量体（図９Ｂ、非解離性Ｆ（ａｂ）’_２－Ｆｃ二量体のＸＩＣによって表されるオレンジ色トレース）を含む非解離性複合体もまた、両方のロットで検出された。具体的には、非解離性Ｆ（ａｂ）’_２二量体は、インタクトなレベル（図９Ａ、青色トレース）で観察されたのと同様の溶出プロファイル（図９Ｂ、青色トレース）を示し、両方のロットで２つの部分的に分離されたピークを示した。一貫して、ロット１と比較して、ロット２は、はるかに高いレベルの早期溶出性の非解離性Ｆ（ａｂ）’_２二量体種（図９Ａ及び図５Ｂ、青色トレース）を示した。続いて、ＰＣＤ条件下で非共有結合性複合体から干渉を除去することによって非解離性複合体の正確な質量測定を達成し、次いで、相互作用の性質を調査するために使用した。

【0115】

非共有結合性Ｆ（ａｂ）’_２二量体の予測される質量と比較して、遅発溶出性の非解離性Ｆ（ａｂ）’_２二量体が一貫しておよそ２０Ｄａの質量減少を呈し、負のデルタ質量を有する共有結合性架橋の潜在的な存在を示唆していることが観察される。対照的に、早期溶出性の非解離性Ｆ（ａｂ）’_２二量体の観察された質量は、非共有結合性二量体の質量と同等であり、それらが小さい共有結合性架橋を介して、又はＰＣＤ条件下で維持された強い非共有結合性相互作用を通じて形成されたことを示唆している。最後に、ロット１及びロット２の両方の非解離性Ｆ（ａｂ）’_２－Ｆｃヘテロ二量体は、１）Ｈｉｓ－Ｈｉｓ架橋を介して形成された可能性が高い［Ｆ（ａｂ）’_２－Ｆｃ］＋１４Ｄａ共有結合性二量体、２）未知の架橋を有する［Ｆ（ａｂ）’_２－Ｆｃ］－３０Ｄａ共有結合性二量体、及び３）不完全なＩｄｅＳ消化（Ｆｃ／２－クリップｍＡｂ）に起因する［Ｆ（ａｂ）’_２－Ｆｃ］－１８Ｄａ複合体を含む３つの異なる種に起因する、広範な溶出プロファイル（図９ｂ、オレンジ色トレース）を呈した（図１０）。合わせると、プロセス変更の結果としての２つのＤＳロット間のＨＭＷプロファイルの差異は、非常に詳細に調べることができ、サブドメインレベルの相互作用の差異に起因し得る。これらの相互作用（特に正確な共有結合性架橋）の完全な理解は、オフライン分画及び更なる特性評価を依然として必要とし得るが、未分画のＤＳ試料の迅速な分析は、プロセス変更からの影響を評価し、リスク評価のためのフレームワークを構築するために必要な情報を提供した。

【0116】

実施例４
共製剤化ｍＡｂ試料中のヘテロ分子間相互作用のＰＣＤ支援ｎＳＥＣ－ＭＳ分析
貯蔵又は安定性条件下における共製剤化ｍＡｂ薬物生成物（ＤＰ）試料（例えば、２つ以上の治療用ｍＡｂを含有する）中に形成されたＨＭＷ種の特性評価は、開発の過程にわたって重要である（Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ ｉｎｄｕｓｔｒｙ：Ｃｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｗｏ ｏｒ ｍｏｒｅ ｎｅｗ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ ｄｒｕｇｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ（ＭＤ）：ＵＳ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ２０１３）。しかしながら、そのような分析は、ホモ及びヘテロ分子間相互作用の両方を伴うこれらの試料に頻繁に存在する非常に複雑なＨＭＷプロファイルに起因する固有の分析上の課題を提示する（Ｋｉｍ Ｊ，Ｋｉｍ ＹＪ，Ｃａｏ Ｍ，Ｄｅ Ｍｅｌ Ｎ，Ａｌｂａｒｇｈｏｕｔｈｉ Ｍ，Ｍｉｌｌｅｒ Ｋ，Ｂｅｅ ＪＳ，Ｗａｎｇ Ｊ，Ｗａｎｇ Ｘ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ．ＭＡｂｓ ２０２０：１２（１）：１７３８６９１）。

【0117】

これらの課題に取り組むために、ＰＣＤ支援ｎＳＥＣ－ＭＳ法の有用性もまた、共製剤化ｍＡｂプログラムの開発を支持するための調査において評価された。一例として、２つのｍＡｂ（ｍＡｂ－Ａ及びｍＡｂ－Ｂ）からなる共製剤化ＤＰ試料を、加速安定条件下で試験した。３つの主要なＨＭＷ種、すなわち、ｍＡｂ－Ａホモ二量体、ｍＡｂ－Ｂホモ二量体、及びｍＡｂ－Ａ／Ｂヘテロ二量体は、それらの異なる分子量に基づいたｎＳＥＣ－ＭＳ分析によって、Ｔ０（ストレスなし、総ＨＭＷ％＝０．７％）及びＴ６ｍ（６か月間２５℃、総ＨＭＷ％＝１．５％）の試料の両方において容易に特定された（図１１、図１２）。デコンボリュートされた質量スペクトルからの積分されたピーク面積を使用して、３つの二量体の相対存在量が推定され得る。興味深いことに、２つのホモ二量体に加えて、低いが顕著なレベルのｍＡｂ－Ａ／Ｂヘテロ二量体がＴ０試料中で容易に検出され（図１１Ａ）、これは、２つのｍＡｂが混合されたときにヘテロ分子間相互作用が自発的に開始された可能性が高かったことを示唆する。２５℃で６か月間保管された後、ｍＡｂ－Ａ／Ｂヘテロ二量体の相対存在量は、有意に増加したが（１１％から３０％）、ｍＡｂ－Ａホモ二量体及びｍＡｂ－Ｂホモ二量体の存在量は、それぞれ、変化しないままか、又は減少した。

【0118】

この観察は、加速安定条件下で、ｍＡｂ－Ａ／Ｂヘテロ二量体がホモ二量体よりも速い速度で成長することを示唆した。加えて、ＰＣＤの適用によると、非解離性二量体種について同じ計算及び比較が行われ得（図１１、赤色トレース）、相互作用性質の高レベルの評価を提供する。例えば、ＰＣＤ条件下では、Ｔ０及びＴ６ｍ試料の両方において、ｍＡｂ－Ｂホモ二量体について相対存在量の顕著な減少が観察され、非共有結合性相互作用が、他の２つの種（例えば、ｍＡｂ－Ａホモ二量体及びｍＡｂ－Ａ／Ｂヘテロ二量体）よりも、ｍＡｂ－Ｂホモ二量体の形成により有意に寄与したことを示唆している。加えて、非解離性ｍＡｂ－Ａ／Ｂヘテロ二量体は、より速い成長速度（２０％～４０％）を呈し、６か月後に最も豊富な非解離性二量体種となったことが観察された。この迅速な分析は、ｍＡｂ－ＡとｍＡｂ－Ｂとの間のヘテロ－分子間相互作用が、加速安定条件下で、おそらく共有結合性架橋又は密接であるが非共有結合性の相互作用を介して有利であったことを示した。この情報は、ヘテロ二量体化に関与する正確な相互作用を解明するための将来の研究を導くために価値があり、したがって、このタイプの相互作用を最小限に抑えるための製剤開発を容易にした。

【0119】

ＨＭＷサイズバリアントの包括的な特性評価は、治療用ｍＡｂの開発中に非常に重要である。本発明のＰＣＤ支援ｎＳＥＣ－ＭＳ法の開発は、改善されたＭＳ特性評価のための非共有結合性ＨＭＷ複合体の効率的な解離を可能にする。具体的には、ＰＣＤの適用は、差分検出を可能にするのみならず、非共有結合性及び非解離性のＨＭＷ種の両方の特定を改善する。構成サブユニットを確認することによって、大きくかつ予想されない非共有結合性ＨＭＷ複合体の特定は、より高い信頼性で達成され得る。共溶出性の非共有結合性種から干渉を除去することによって、非解離性ＨＭＷ複合体のより正確な質量測定を得ることができ、したがって、潜在的な架橋の特定を容易にする。

【0120】

更に、この方法を使用して、各ＨＭＷ複合体の溶出プロファイルは、インタクトなアンサンブル（非解離性種の場合）又は構成サブユニット（非共有結合性種の場合）のいずれかのＸＩＣを使用して容易に再構築され得、これは、特定に更なる信頼性を追加する。優れた感度及び特異性に起因して、この方法は、未分画のＤＳ試料から直接的に複雑なＨＭＷ種を解明するのに非常に効果的であり、迅速なターンアラウンドを必要とするタスクにとって理想的に好適にする。更に、この方法の有用性は、後期開発における詳細なＨＭＷ特性評価、比較可能性評価、及び強制分解試験を含む、異なる用途で実証された。最後に、ｍＡｂ治療フォーマット（例えば、ｂｓＡｂ及び共製剤）の複雑さが増すにつれて、この方法は、ＨＭＷ特性評価と関連付けられた増大する課題に対処するための本発明者らの分析的蓄積に対する貴重な追加物である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【国際調査報告】