▶ エム アイ ピー ダイアグナスティクス リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-08
(54)【発明の名称】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出
(51)【国際特許分類】
C07K 14/165 20060101AFI20241001BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20241001BHJP
G01N 33/569 20060101ALI20241001BHJP
G01N 33/531 20060101ALI20241001BHJP
G01N 33/533 20060101ALI20241001BHJP
【ＦＩ】
C07K14/165
G01N21/64 F ZNA
G01N33/569 L
G01N33/531 A
G01N33/533
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2024517411
(86)(22)【出願日】2022-09-20
(85)【翻訳文提出日】2024-05-17
(86)【国際出願番号】 EP2022076119
(87)【国際公開番号】W WO2023041808
(87)【国際公開日】2023-03-23
(31)【優先権主張番号】21197636.0
(32)【優先日】2021-09-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．プルロニック
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】319016046
【氏名又は名称】エムアイピー ディスカバリー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＭＩＰ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ
(74)【代理人】
【識別番号】100182084
【弁理士】
【氏名又は名称】中道 佳博
(72)【発明者】
【氏名】トムソン，アラン
(72)【発明者】
【氏名】ジョンソン，リアノン
(72)【発明者】
【氏名】チュラク，ジョアンナ
(72)【発明者】
【氏名】ゲレイロ，アントニオ
(72)【発明者】
【氏名】グローヴズ，アリステア
(72)【発明者】
【氏名】カンファロッタ，フランチェスコ
【テーマコード（参考）】
2G043
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G043AA03
2G043BA16
2G043DA02
2G043EA01
2G043EA13
4H045AA10
4H045AA20
4H045BA09
4H045BA11
4H045BA12
4H045BA13
4H045BA14
4H045BA15
4H045BA16
4H045BA17
4H045BA18
4H045BA19
4H045CA01
4H045EA60
(57)【要約】
分子インプリントポリマーは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合ドメインの部分配列に対応するアミノ酸配列からなる鋳型分子に相補的な認識部位を少なくとも１つ含み、アミノ酸配列は長さが５０アミノ酸以下であり、（ｉ）ＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧ、（ｉｉ）ＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳ、（ｉｉｉ）ＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦ、（ｉｖ）ＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣ、（ｖ）ＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦ、（ｖｉ）ＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦ、（ｖｉｉ）ＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰ、（ｖｉｉｉ）ＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱ、および（ｉｘ）ＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧから選択される配列を含む。分子インプリントポリマーを調製する方法も提供される。分子インプリントポリマーと蛍光物質とを含む複合体も提供され、本発明の分子インプリントポリマーおよび複合体を含む組成物も提供される。本発明の分子インプリントポリマー、複合体、および組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出に用いることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合ドメインの部分配列に対応するアミノ酸配列からなる鋳型分子に相補的な認識部位を少なくとも１つ含む分子インプリントポリマーであって、該アミノ酸配列が、長さが５０アミノ酸以下であり、（ｉ）ＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧ、
（ｉｉ）ＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳ、
（ｉｉｉ）ＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦ、
（ｉｖ）ＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣ、
（ｖ）ＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦ、
（ｖｉ）ＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦ、
（ｖｉｉ）ＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰ、
（ｖｉｉｉ）ＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱ、および
（ｉｘ）ＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧ
から選択される配列を含む、分子インプリントポリマー。
【請求項2】
前記配列が、（ｉ）ＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧ、
（ｉｉ）ＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣ、および
（ｉｉｉ）ＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰ
から選択される、請求項１に記載の分子インプリントポリマー。
【請求項3】
前記配列がＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧである、請求項２に記載の分子インプリントポリマー。
【請求項4】
前記ポリマーのサイズが５００ｎｍ未満、好ましくは２５０ｎｍ未満、さらにより好ましくは１００ｎｍ未満である、先行する請求項のいずれかに記載の分子インプリントポリマー。
【請求項5】
（ｉ）Ｎ－フルオレセイニルアクリルアミド、（ｉｉ）アクリルアミド、
（ｉｉｉ）アクリル酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＴＢＡｃ）、
（ｉｖ）３－Ｏ－アクリロイル－１，２：５，６－ビス－Ｏ－イソプロピリデン－Ｄ－グルコフラノース、
（ｖ）メタクリル酸２，２，２－トリフルオロエチル（ＣＦ３）、
（ｖｉ）Ｎ－（３－アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（ＡＰＭＡ）、
（ｖｉｉ）スクアラミドモノマー７（ＳＱ７）、および
（ｖｉｉｉ）Ｎ，Ｎ’－メチレンビス（アクリルアミド）（ＢＩＳ）
からなる群から選択されるモノマーを含む、先行する請求項のいずれかに記載の分子インプリントポリマー。
【請求項6】
前記ポリマーが、Ｎ－フルオレセイニルアクリルアミドおよび／または３－Ｏ－アクリロイル－１，２；５，６－ビス－Ｏ－イソプロピリデン－Ｄ－グルコフラノースを含む、請求項５に記載の分子インプリントポリマー。
【請求項7】
前記ポリマーが、（ｉ）から（ｖｉｉｉ）を全て含む、請求項６に記載の分子インプリントポリマー。
【請求項8】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する認識部位を少なくとも１つ含む分子インプリントポリマーを調製する方法であって、（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合ドメインの部分配列に対応するアミノ酸配列からなる鋳型分子を有する担体物質であって、該鋳型分子が表面に露出するように該担体物質に固定化されている担体物質を提供する工程と、
（ｂ）該表面に接触させて重合性組成物を提供する工程と、
（ｃ）該表面に接触した該重合性組成物の制御重合を行って分子インプリントポリマーを生成する工程と、
（ｄ）該分子インプリントポリマーを該表面から分離する工程と、を含み、
該アミノ酸配列は、長さが５０アミノ酸以下であり、
（ｉ）ＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧ、
（ｉｉ）ＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳ、
（ｉｉｉ）ＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦ、
（ｉｖ）ＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣ、
（ｖ）ＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦ、
（ｖｉ）ＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦ、
（ｖｉｉ）ＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰ、
（ｖｉｉｉ）ＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱ、および
（ｉｘ）ＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧ
から選択される配列を含む、方法。
【請求項9】
前記配列が、（ｘ）ＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧ、
（ｘｉ）ＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣ、および
（ｘｉｉ）ＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰ
から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記配列がＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧである、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記鋳型分子のＮ末端が追加のシステイン残基を含むように改変されている、請求項８から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項12】
前記鋳型分子が、前記システイン残基と前記鋳型の最後の残基との間にグリシン残基を含むように改変されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
（ｉ）請求項１から７のいずれかに記載の分子インプリントポリマーと、（ｉｉ）蛍光物質と、
を含む、複合体。
【請求項14】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出における、（１）請求項１から７のいずれかに記載の分子インプリントポリマー、または（２）請求項１３に記載の複合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための化合物、その製造方法およびそれを含む複合体、ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための組成物に関し、より詳細には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出における前述した事柄の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
２０１９年に起きた新型コロナウイルス、すなわち重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の大流行は、パンデミックを引き起こし、その結果、公衆衛生および経済の両方が世界規模で危機に陥っている。
【0003】
国際社会は、診断検査および抗体検査のいずれもが、それぞれこのウイルスのさらなる伝搬の防止およびこのウイルスの罹患率の理解への鍵となることをすぐに認識したが、信頼でき、安価に製造でき、容易に用いることのできる検査キットの需要は、高いままである。
【0004】
診断検査については、現在、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）に基づく試験が、医療提供者が市民を診断する際に用いる主な手段である。ＲＴ－ＰＣＲ試験は、多くは鼻咽頭スワブによって得られる呼吸器サンプルにおいてウイルスリボ核酸（ＲＮＡ）を検出することで機能する。
【0005】
ＲＴ－ＰＣＲ検査は広く普及しているが、問題がある。ＲＴ－ＰＣＲ試験の実施には多大な労力が必要になり得る。この試験には、高度な技能を持つスタッフが必要であり、例えば標本誤差やサンプルの不適切な取り扱いなどにより、偽陰性の結果が生じ得る。実際には、例えばサンプルのクロスコンタミネーションにより、偽陽性の結果が生じる場合もある。また、この試験は高価であり、結果に関しては所要時間が長い（１日から２日）。
【0006】
迅速抗原試験は、集団検診にも用いられ、個人の都合に合わせて実施できる可搬型で迅速な（１５分から３０分）分析を提供する。しかしながら、この検査は、感度が低く、受容体として抗体を利用しているので狭い温度範囲およびｐＨ範囲でしか機能しないため、普及が制限されている。
【0007】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出に用いられる代替的な受容体として、分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）が提案されている。
【0008】
Ｃｅｎｎａｍｏらは、「Ｐｒｏｏｆ ｏｆ Ｃｏｎｃｅｐｔ ｆｏｒ ａ Ｑｕｉｃｋ ａｎｄ Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｏｎ－Ｓｉｔｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｂｙ Ｐｌａｓｍｏｎｉｃ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｆｉｂｅｒｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ」において、ＭＩＰを連結したプラスチック光ファイバ（ＰＯＦ）ベースの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーの製造について詳述している。ＭＩＰは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質のＳ１サブユニットに対して製造された。
【0009】
Ｐａｒｉｓｉらは、「“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ－ｔｙｐｅ”ｐｌａｓｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ」において、鋳型としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を用いたＭＩＰの調製について述べている。
【0010】
Ｃｕｂｕｋらは、「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｏｎｏｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ ｆｏｒ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ＣＯＶＩＤ－１９ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＭＩＰを製造するための鋳型および適切なモノマーを同定することを目的としたコンピュータによる研究について述べている。
【0011】
国際公開２０２１／１９５６２６（Ａ１）号パンフレットには、ウイルス全体を鋳型として用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＭＩＰを調製することが開示されている。
【0012】
ＭＩＰの製造方法も知られている。例えば、米国特許１０ １８９ ９３４（Ｂ２）号、Ｐｉｌｅｔｓｋｙらによる「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ」、およびＭａｌｉｋらによる「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｖｉｒａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」を参照のこと。
【0013】
ＭＩＰの製造にウイルス全体、Ｓ１サブユニット全体、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤ全体のいずれを用いても、スケーラビリティについて重大な問題が生じる。
【0014】
ＲＴ－ＰＣＲ試験や迅速抗原試験は、ある人が現在ウイルスに感染しているかどうかを証明するために行われるが、抗体試験は、ＲＴ－ＰＣＲ試験や迅速抗原試験とは対照的に、むしろ、ある人がこれまでにそのウイルスに感染したことがあるかどうかを証明するために行われる。抗体試験は、多くは患者の血液サンプルに対して行われ、合成抗原と（存在するのであれば）患者の血液サンプル中の抗体との間の結合の存在を検出することで機能する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0015】
したがって、本発明の一つの目的は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための代替手段を提供することである。さらなる目的は、このような手段によって、現在用いられているポリメラーゼ連鎖反応に基づくアッセイおよび迅速抗原試験に代わる選択肢を提供することである。本発明の具体的な実施形態の目的は、改良された検出手段を提供することを含む。
【課題を解決するための手段】
【0016】
したがって、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合ドメインの部分配列に対応するアミノ酸配列からなる鋳型分子に相補的な認識部位を少なくとも１つ含む分子インプリントポリマーを提供するものであって、アミノ酸配列は、長さが５０アミノ酸以下であり、
（ｉ）ＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧ、
（ｉｉ）ＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳ、
（ｉｉｉ）ＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦ、
（ｉｖ）ＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣ、
（ｖ）ＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦ、
（ｖｉ）ＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦ、
（ｖｉｉ）ＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰ、
（ｖｉｉｉ）ＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱ、および
（ｉｘ）ＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧ
から選択される配列を含む。
（ｉ）ＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧ、
（ｉｉ）ＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳ、
（ｉｉｉ）ＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦ、
（ｉｖ）ＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣ、
（ｖ）ＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦ、
（ｖｉ）ＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦ、
（ｖｉｉ）ＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰ、
（ｖｉｉｉ）ＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱ、および
（ｉｘ）ＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧ
から選択される配列を含む。
【0017】
本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する認識部位を少なくとも１つ含む分子インプリントポリマーを調製する方法も提供し、当該方法は、
（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合ドメインの部分配列に対応するアミノ酸配列からなる鋳型分子を有する担体物質であって、鋳型分子が表面に露出するように担体物質に固定化されている、担体物質を準備する工程と、
（ｂ）重合性組成物を表面に接触させる工程と、
（ｃ）表面に接触した重合性組成物の制御重合を行って分子インプリントポリマーを生成する工程と、
（ｄ）分子インプリントポリマーを表面から分離する工程と、を含む方法であって、
アミノ酸配列は、長さが５０アミノ酸以下であり、
（ｉ）ＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧ、
（ｉｉ）ＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳ、
（ｉｉｉ）ＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦ、
（ｉｖ）ＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣ、
（ｖ）ＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦ、
（ｖｉ）ＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦ、
（ｖｉｉ）ＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰ、
（ｖｉｉｉ）ＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱ、および
（ｉｘ）ＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧ
から選択される配列を含む。
（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合ドメインの部分配列に対応するアミノ酸配列からなる鋳型分子を有する担体物質であって、鋳型分子が表面に露出するように担体物質に固定化されている、担体物質を準備する工程と、
（ｂ）重合性組成物を表面に接触させる工程と、
（ｃ）表面に接触した重合性組成物の制御重合を行って分子インプリントポリマーを生成する工程と、
（ｄ）分子インプリントポリマーを表面から分離する工程と、を含む方法であって、
アミノ酸配列は、長さが５０アミノ酸以下であり、
（ｉ）ＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧ、
（ｉｉ）ＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳ、
（ｉｉｉ）ＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦ、
（ｉｖ）ＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣ、
（ｖ）ＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦ、
（ｖｉ）ＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦ、
（ｖｉｉ）ＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰ、
（ｖｉｉｉ）ＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱ、および
（ｉｘ）ＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧ
から選択される配列を含む。
【0018】
さらに、本発明の分子インプリントポリマーと蛍光物質とを含む複合体が提供される。
【0019】
またさらに、本発明の分子インプリントポリマーまたは複合体を含む組成物が提供される。
【0020】
本発明の分子インプリントポリマー、本発明の複合体、および本発明の組成物は、全て、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出に用いることができる。
【発明を実施するための形態】
【0021】
発明の詳細
本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合ドメインの部分配列に対応するアミノ酸配列からなる鋳型分子に相補的な認識部位を少なくとも１つ含む分子インプリントポリマーを提供するものであって、アミノ酸配列は、長さが５０アミノ酸以下であり、
（ｉ）ＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧ、
（ｉｉ）ＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳ、
（ｉｉｉ）ＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦ、
（ｉｖ）ＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣ、
（ｖ）ＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦ、
（ｖｉ）ＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦ、
（ｖｉｉ）ＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰ、
（ｖｉｉｉ）ＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱ、および
（ｉｘ）ＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧ
から選択される配列を含む。
本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合ドメインの部分配列に対応するアミノ酸配列からなる鋳型分子に相補的な認識部位を少なくとも１つ含む分子インプリントポリマーを提供するものであって、アミノ酸配列は、長さが５０アミノ酸以下であり、
（ｉ）ＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧ、
（ｉｉ）ＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳ、
（ｉｉｉ）ＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦ、
（ｉｖ）ＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣ、
（ｖ）ＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦ、
（ｖｉ）ＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦ、
（ｖｉｉ）ＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰ、
（ｖｉｉｉ）ＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱ、および
（ｉｘ）ＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧ
から選択される配列を含む。
【0022】
分子インプリントにおいては、インプリントしようとしている化合物の存在下、適切な溶媒中で、機能性モノマー（場合によっては架橋性モノマー）を重合させる。インプリントしようとしている化合物は、鋳型と呼ばれる。重合工程の際、モノマーは、静電的相互作用、疎水性相互作用、またはその他の相互作用によって鋳型と相互作用し、これにより、鋳型分子に相補的な、認識部位と呼ばれる結合部位がポリマーに形成される。鋳型を除去した後、ポリマーマトリックスは、鋳型に相補的な認識部位を保持している。この意味での相補的とは、ポリマー中の相互作用基が、鋳型分子および鋳型分子を部分構造として含むその他の分子（すなわち、本発明ではＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）中の相互作用基と相互作用するのに適した位置となるように配置されることを意味する。
【0023】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の配列は公知である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、高密度にグリコシル化されたスパイクタンパク質を利用して、宿主細胞に侵入する。スパイクタンパク質は、ホモ三量体糖タンパク質であって、各モノマーは、Ｓ１およびＳ２という２つのサブユニットを含んでおり、これらのサブユニットはそれぞれ、膜付着および膜融合を媒介するものである。Ｓ１サブユニットの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は、宿主細胞受容体連結に関与していることが示されている。
【0024】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＲＢＤの配列は公知であり、理論的にはその中の任意の配列を鋳型として用いることができるが、後段におけるいくつかの用途においては、標的内の保存されていない配列を鋳型として選択することが有利である。これにより、分子インプリントポリマーが、高い特異性で所望の標的に結合することが確実となる。
【0025】
Ｗｒａｐｐら、２０２０１の補足図５は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質と、その他２つのコロナウイルス株、ＳＡＲＳ－ＣｏＶおよびＲａＴＧ１３のスパイクタンパク質との配列アラインメントを示す。ＲＢＤが強調表示されている。また、異なる株間で保存されている配列および保存されていない配列も強調表示されている。
【0026】
本発明において、分子インプリントポリマーにおける「少なくとも１つの認識部位」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合ドメインの部分構造に対応するアミノ酸配列からなる鋳型分子に相補的であって、アミノ酸配列は、長さが５０アミノ酸以下であり、（ｉ）ＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧ、（ｉｉ）ＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳ、（ｉｉｉ）ＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦ、（ｉｖ）ＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣ、（ｖ）ＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦ、（ｖｉ）ＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦ、（ｖｉｉ）ＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰ、（ｖｉｉｉ）ＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱ、および（ｉｘ）ＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧから選択される配列を含む。
【0027】
分子インプリントポリマーにおける「少なくとも１つの認識部位」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合ドメインの部分構造に対応するアミノ酸配列からなる鋳型分子に相補的であって、アミノ酸配列は、長さが５０アミノ酸以下であり、（ｉ）ＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧ、（ｉｉ）ＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣ、および（ｉｉｉ）ＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰから選択される配列を含むことが好ましい。
【0028】
特に好ましい実施形態において、分子インプリントポリマーにおける「少なくとも１つの認識部位」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合ドメインの部分構造に対応するアミノ酸配列からなる鋳型分子に相補的であって、アミノ酸配列は、長さが５０アミノ酸以下であり、配列ＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧを含む。
【0029】
さらに特に好ましい実施形態において、分子インプリントポリマーにおける「少なくとも１つの認識部位」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合ドメインの部分構造に対応するアミノ酸配列からなる鋳型分子に相補的であって、アミノ酸配列は、長さが５０アミノ酸以下であり、配列ＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰを含む。
【0030】
本発明において、鋳型のサイズは、最大で５０アミノ酸までの範囲である。好ましくは、鋳型は５０アミノ酸よりも短く、より好ましくは、鋳型は３０アミノ酸よりも短く、最も好ましくは、鋳型は２０アミノ酸よりも短く、例えば、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、または１９アミノ酸である。
【0031】
短いペプチド配列を用いることによって（例えば、スパイクタンパク質全体またはＲＢＤ全体の場合とは対照的に）、試薬コストが大幅に削減され、また標的タンパク質の特定領域に対して親和性の高い結合部位が創出されるため、分子インプリントポリマーの単一クローン性が向上する。
【0032】
本発明の分子インプリントポリマーのサイズは、当該分子インプリントポリマーの意図される後段における使用によってかなりの程度まで決定されるであろう。とは言え、好適には、分子インプリントポリマーは、５００ｎｍよりも短いものであり、より好適には、２５０ｎｍよりも短いものであり、さらにより好適には、１００ｎｍよりも短いものであって、９０ｎｍより短くてもよく、さらには７０ｎｍより短くてもよい。
【0033】
本発明は、本発明の分子インプリントポリマーを含む組成物も提供する。好適には、このような組成物における分子インプリントポリマーは、平均サイズが５００ｎｍよりも短いものであり、より好適には、２５０ｎｍよりも短いものであり、さらにより好適には、１００ｎｍよりも短いものであって、９０ｎｍより短くてもよく、さらには７０ｎｍより短くてもよい。
【0034】
分子インプリントポリマーのサイズを求めるための適切な方法としては、ゼータサイザーウルトラ（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｕｌｔｒａ）（マルバーン・パナリティカル社（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ））などを用いた動的光散乱法、ディスク遠心分離、ナノサイト（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ）ＮＳ３００（マルバーン・パナリティカル社）などを用いたナノ粒子軌跡解析法、調整可能抵抗パルスセンシング、原子間力顕微鏡法、および電子顕微鏡法が挙げられる。ナノ粒子軌跡解析法、調整可能抵抗パルスセンシング、原子間力顕微鏡法、および電子顕微鏡法は、単一の分子インプリントポリマーのサイズを求めるのに特に適している。本明細書に示す実施例においては、分子インプリントポリマーのサイズは、ナノサイトＮＳ３００装置を用いて求めた。
【0035】
分子インプリントポリマーに関連してのサイズとは、分子インプリントポリマーの直径のことをいう。
【0036】
分子インプリントポリマーの調製に用いることのできるモノマーとしては、ビニルモノマー、アリルモノマー、アセチレン、アクリル酸塩、メタクリル酸塩、アクリルアミド、メタクリルアミド、クロロアクリル酸塩、イタコン酸塩、トリフルオロメチルアクリル酸塩、アミノ酸の誘導体（例えば、エステルまたはアミド）、ヌクレオシド、ヌクレオチド、および炭水化物が挙げられる。分子インプリントポリマーの安定化に役立つ架橋性モノマーが含まれていてもよい。分子インプリントポリマーを調製するのに適した架橋性モノマーの典型的な例としては、ジメタクリル酸エチレングリコール、トリメタクリル酸トリメチロールプロパン、ジビニルベンゼン、メチレンビスアクリルアミド、エチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’－ビスアクリロイルピペラジン、およびＮ，Ｎ’－メチレンビス（アクリルアミド）（ＢＩＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば、特定の鋳型に適したモノマーおよび架橋性モノマーを選択することができるであろう。あるいは、この選択を支援するために、様々な組み合わせ的計算手法を用いることができるであろう。
【0037】
本発明の好ましい実施形態において、分子インプリントポリマーは、（ｉ）Ｎ－フルオレセイニルアクリルアミド、（ｉｉ）アクリルアミド、（ｉｉｉ）アクリル酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＴＢＡｃ）、（ｉｖ）３－Ｏ－アクリロイル－１，２：５，６－ビス－Ｏ－イソプロピリデン－Ｄ－グルコフラノース、（ｖ）メタクリル酸２，２，２－トリフルオロエチル（ＣＦ３）、（ｖｉ）Ｎ－（３－アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（ＡＰＭＡ）、（ｖｉｉ）スクアラミドモノマー７（ＳＱ７）、および（ｖｉｉｉ）Ｎ，Ｎ’－メチレンビス（アクリルアミド）（ＢＩＳ）からなる群から選択される少なくとも１つのモノマーを含む。より好ましくは、分子インプリントポリマーは、少なくともＮ－フルオレセイニルアクリルアミドおよび／または３－Ｏ－アクリロイル－１，２；５，６－ビス－Ｏ－イソプロピリデン－Ｄ－グルコフラノースを含む。最も好ましくは、分子インプリントポリマーは、（ｉ）から（ｖｉｉｉ）を全て含む。この文脈では、分子インプリントポリマーは、ポリマーであり、特定されたモノマーを含むモノマーの混合物を重合させることで製造される場合には、特定されたモノマーを含むと言われることが理解される。
【0038】
有利には、本発明の分子インプリントポリマーは頑強で、広範囲の温度およびｐＨにおいて機能するが、このことは、貯蔵寿命および貯蔵条件の改善につながり、また、より困難な環境において機能することができるということを意味している。また、本発明の分子インプリントポリマーは、優れた生体適合性を有しており、結合反応速度が速い。
【0039】
本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する認識部位を少なくとも１つ含む分子インプリントポリマーを調製する方法も提供し、当該方法は、
（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合ドメインの部分配列に対応するアミノ酸配列からなる鋳型分子を有する担体物質であって、鋳型分子が表面に露出するように担体物質に固定化されている、担体物質を準備する工程と、
（ｂ）重合性組成物を表面に接触させる工程と、
（ｃ）表面に接触した重合性組成物の制御重合を行って分子インプリントポリマーを生成する工程と、
（ｄ）分子インプリントポリマーを表面から分離する工程と、を含む方法であって、
アミノ酸配列は、長さが５０アミノ酸以下であり、
（ｉ）ＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧ、
（ｉｉ）ＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳ、
（ｉｉｉ）ＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦ、
（ｉｖ）ＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣ、
（ｖ）ＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦ、
（ｖｉ）ＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦ、
（ｖｉｉ）ＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰ、
（ｖｉｉｉ）ＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱ、および
（ｉｘ）ＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧ
から選択される配列を含む。
（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合ドメインの部分配列に対応するアミノ酸配列からなる鋳型分子を有する担体物質であって、鋳型分子が表面に露出するように担体物質に固定化されている、担体物質を準備する工程と、
（ｂ）重合性組成物を表面に接触させる工程と、
（ｃ）表面に接触した重合性組成物の制御重合を行って分子インプリントポリマーを生成する工程と、
（ｄ）分子インプリントポリマーを表面から分離する工程と、を含む方法であって、
アミノ酸配列は、長さが５０アミノ酸以下であり、
（ｉ）ＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧ、
（ｉｉ）ＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳ、
（ｉｉｉ）ＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦ、
（ｉｖ）ＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣ、
（ｖ）ＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦ、
（ｖｉ）ＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦ、
（ｖｉｉ）ＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰ、
（ｖｉｉｉ）ＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱ、および
（ｉｘ）ＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧ
から選択される配列を含む。
【0040】
本方法の利点は、ＭＩＰが、より均一な結合部位親和性分布を有し、鋳型の溶出を向上させて下流における鋳型の浸出を防止する手段を提供する点にある。
【0041】
適切な担体物質としては、ポリマー樹脂、多糖類、ガラス、または金属表面が挙げられる。
【0042】
担体物質は、ビーズ状であってもよいし、繊維状であってもよいし、膜状であってもよいし、毛管状であってもよい。本発明の好ましい実施形態において、担体物質はガラスである。担体物質がガラスビーズ状であることがさらに好ましい。
【0043】
重合性組成物は、重合に必要なモノマーを含有していなければならない。適切なモノマーについては、本明細書の他の箇所において述べる。
【0044】
工程（ｃ）は、制御重合の適用を伴う。制御重合によって分子インプリントポリマーを製造するための様々な技術が、当業者には知られている。
【0045】
制御重合の例としては、制御リビングラジカル重合（ＬＲＰ）などのラジカル重合、リビングアニオン重合、リビングカチオン重合、および制御縮重合が挙げられる。
【0046】
重合は、例えば、加熱、電流の印加（電解重合）、酸化還元触媒の一種（もしくは複数種）、過硫酸塩、または過酸化物の添加、ガンマ線放射を含む放射線照射またはマイクロ波放射、あるいは紫外線または可視光の照射などによって開始させることができ、通常は数分から数時間かかる。本明細書に記載の実施例では、過硫酸塩を用いて重合を開始した。
【0047】
本発明の好ましい実施形態において、重合反応は、合成された分子インプリントポリマーのサイズが比較的小さい段階で終了する。サイズに関する設定については、本明細書の他の箇所において述べる。
【0048】
分子インプリントポリマーが合成されると、これを分離し回収しなければならない。固定化されている鋳型からの高親和性分子インプリントポリマーの分離は、加熱により錯形成を阻害すること、溶液のｐＨを変化させること、イオン強度を変化させること、または尿素、グアニジン、もしくは分子インプリントポリマーよりも強く鋳型と相互作用する物質を添加することによって、行うことができる。
【0049】
本方法の好ましい実施形態において、弱く結合した物質は、分離工程の前に洗浄によって除去される。
【0050】
分子インプリントポリマーが回収されると、これを、例えばクロマトグラフィー、ろ過、および／または電気泳動によって、さらに精製してもよい。
【0051】
本発明の分子インプリントポリマーに関連して上記した理由により、本発明の方法の好ましい実施形態において、アミノ酸配列は、長さが５０アミノ酸以下であり、（ｉ）ＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧ、（ｉｉ）ＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣ、および（ｉｉｉ）ＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰから選択される配列を含む。特に好ましい実施形態において、アミノ酸配列は、長さが５０アミノ酸以下であり、配列ＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧを含む。さらに特に好ましい実施形態において、アミノ酸配列は、長さが５０アミノ酸以下であり、配列ＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰを含む。
【0052】
担体物質に鋳型分子を固定化する方法は、決定的に重要なものではない。しかしながら、いくつかの方法については、鋳型分子の末端の１つにシステイン残基が存在することが有利である。したがって、鋳型分子がもともと末端システイン残基を含んでいないような方法の実施形態については、追加のシステイン残基を含むように鋳型分子のＮ末端を改変することが好ましい。
【0053】
本発明のいくつかの実施形態においては、追加のシステイン残基は、鋳型分子の末端に直接付加されるが、他の実施形態においては、末端のシステインと鋳型分子との間にスペーサーが含まれる。好ましい実施形態では、スペーサーは、グリシン残基を含む。
【0054】
したがって、本発明の特に好ましい実施形態において、鋳型分子は、アミノ酸配列ＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧを含み、システイン（Ｃ）残基とグリシン（Ｇ）残基とを含むようにＮ末端が改変されて、インプリントに用いる分子がＣＧＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧとなる。
【0055】
本発明のいくつかの実施形態においては、鋳型分子は、担体物質に直接付加されるが、他の実施形態においては、担体物質と鋳型分子との間に１つまたは複数のリンカーが含まれる。本発明で用いられる適切なリンカーは、当業者によく知られている。本明細書に示す実施例においては、用いた担体物質はガラスビーズであり、鋳型分子を固定化する前に、（３－アミノプロピル）トリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）を用いてシラン処理された。ＡＰＴＭＳは、ガラスビーズの表面と鋳型分子との間でリンカーとして機能する。本明細書に示す実施例においては、鋳型を固定化する前に、ヨード酢酸ｎ－スクシンイミジル（ＳＩＡ）を用いてＡＰＴＭＳを修飾した。
【0056】
リンカーおよびスペーサーは、立体障害によってもたらされる悪影響を防止するように機能する。
【0057】
本発明の方法の利点は、高速でスケーラブルであり、短い鋳型のみを用いることである。
【0058】
本発明は、さらに、本発明の分子インプリントポリマーと蛍光物質とを含む複合体を提供する。
【0059】
蛍光物質とは、特定の波長、つまり吸収波長または励起波長で光を吸収し、その後、より高い波長、つまり発光波長で発光する能力を有する分子である。
【0060】
可視化の目的で蛍光物質を分子に結合させることは、当該技術分野において一般的である。したがって、このような結合のための方法もよく知られている。例えば、アミノ基、チオール基、または炭水化物基を介して蛍光物質を結合することができる。本明細書に示す実施例においては、分子インプリントポリマーのアミノモノマーが提供するアミン基を介して、蛍光物質を分子インプリントポリマーに結合させた。
【0061】
本発明の複合体には任意の蛍光物質を用いることができるが、後段におけるいくつかの用途、特に診断用途においては、明るく安定した蛍光物質を選択することが有利である。
【0062】
共役ポリマーナノ粒子（ＣＰＮ）（商標）は、生体適合性界面活性剤内に封入された半導体発光ポリマー（ＬＥＰ）コアからなる高蛍光ナノ粒子である。ＣＰＮは、その蛍光が強力であること、すなわち、感度が高く光安定性が高いことにより、診断用途に特に適している。ＣＰＮのサイズは、７０ｎｍから８０ｎｍあたりであり、現在ストリームバイオ社（Ｓｔｒｅａｍ Ｂｉｏ）から入手可能なものは、４２０ｎｍから１１３０ｎｍの発光波長で蛍光を示す。本明細書に示す実施例においては、ＣＰＮ５１０およびＣＰＮ６１０（いずれもストリームバイオ社から入手可能）に本発明の分子インプリントポリマーを結合させた。
【0063】
本発明の好ましい実施形態において、蛍光物質はＣＰＮである。
【0064】
本発明は、本発明の複合体を含む組成物も提供する。
【0065】
本発明の分子インプリントポリマー、複合体、および組成物は、様々な用途に用いられ得る。
【0066】
本発明の分子インプリントポリマー、複合体、および組成物をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出に用いることが具体的に想定されている。分子インプリントポリマー、複合体、および組成物は、例えば、医療現場または診療現場において用いられ得る診断アッセイのようなアッセイに用いられてもよい。このようなアッセイの例としては、ハイスループットスクリーニングに用い得る、ラテラルフローアッセイ（ＬＦＡ）および酵素結合性免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）型のアッセイが挙げられる。本発明の分子インプリントポリマー、複合体、および組成物は、センサーに用いられてもよい。
【0067】
本明細書に示す実施例においては、４％メルカプトウンデカン酸（ＭＵＤＡ）チップ（エタノール中、４％ＭＵＤＡの自己組織化単分子膜で官能化した、ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）ＳＩＡキットＡｕ表面を用いて調製）にナノＭＩＰを共有結合により固定化することによって、ナノＭＩＰ－ＳＰＲセンサーを調製した。熱検出法で用いるために、ナノＭＩＰ官能化スクリーン印刷電極（ＳＰＥ）も調製した。
【0068】
本発明の分子インプリントポリマー、複合体、および組成物は、研究の現場においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するのに用いられてもよい。
【0069】
本発明の分子インプリントポリマー、複合体、および組成物は、医薬として用いられてもよい。
【0070】
本発明の分子インプリントポリマーは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して高い親和性を有することが望ましい。本明細書の文脈における高い親和性とは、分子インプリントポリマーがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する親和性が、「ブランク」分子インプリントポリマーがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する親和性よりも、少なくとも３倍、好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍、高いことを意味する。この文脈でのブランクとは、鋳型の非存在下で形成された分子インプリントポリマーを意味する。
【0071】
結合親和性とは、単一分子とその結合相手との間、例えば本件においては分子インプリントポリマーとその標的であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との間の結合相互作用の強度である。結合親和性は、典型的には、平衡解離定数（ＫＤ）によって測定および報告される。ＫＤ値が小さいほど、２つの分子間の結合親和性は高い。
【0072】
本発明の分子インプリントポリマー、複合体、および組成物をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出に用いる場合、分子インプリントポリマーは、５００ｎＭ未満、好ましくは２５０ｎＭ未満、さらにより好ましくは２００ｎＭ未満のＫＤでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合することが好ましい。
【0073】
ＫＤを測定するのに適した方法としては、例えば、ビアコアシリーズの装置（サイティバ社（Ｃｙｔｉｖａ））またはＭＰ－ＳＰＲナビ装置（バイオナビ社（Ｂｉｏｎａｖｉｓ））を用いて行われ得る表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が挙げられる。
【0074】
次いで、添付の図面を参照しつつ、特定の実施例において本発明をさらに説明する。図面は、以下の通りである。
【図面の簡単な説明】
【0075】
【図6A】図６は、ペプチド１（図６ａ）およびペプチド３（図６ｂ）に対するナノＭＩＰで官能化したスクリーン印刷電極（ＳＰＥ）にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦ８（１ｆｇ／ｍＬから１０ｐｇ／ｍＬ）を含有するＰＢＳを添加した場合の熱伝達法の生データを、Ｒｔｈ対時間でプロットしたものである。
【図6B】図６は、ペプチド１（図６ａ）およびペプチド３（図６ｂ）に対するナノＭＩＰで官能化したスクリーン印刷電極（ＳＰＥ）にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦ８（１ｆｇ／ｍＬから１０ｐｇ／ｍＬ）を含有するＰＢＳを添加した場合の熱伝達法の生データを、Ｒｔｈ対時間でプロットしたものである。
【図7A】図７は、ペプチド１に対するナノＭＩＰで官能化したスクリーン印刷電極（ＳＰＥ）にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質ＲＢＤ（１ｆｇ／ｍＬから１０ｐｇ／ｍＬ）を含有するＰＢＳを添加した場合の熱伝達法の生データを、Ｒｔｈ対時間でプロットしたもの（図７ａ）、およびＲｔｈ値の％変化を、系に注入したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質ＲＢＤの濃度に対してプロットした用量反応曲線（図７ｂ）である。
【図7B】図７は、ペプチド１に対するナノＭＩＰで官能化したスクリーン印刷電極（ＳＰＥ）にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質ＲＢＤ（１ｆｇ／ｍＬから１０ｐｇ／ｍＬ）を含有するＰＢＳを添加した場合の熱伝達法の生データを、Ｒｔｈ対時間でプロットしたもの（図７ａ）、およびＲｔｈ値の％変化を、系に注入したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質ＲＢＤの濃度に対してプロットした用量反応曲線（図７ｂ）である。
【図8A】図８は、ペプチド３に対するナノＭＩＰで官能化したスクリーン印刷電極（ＳＰＥ）にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質ＲＢＤ（１ｆｇ／ｍＬから１０ｐｇ／ｍＬ）を含有するＰＢＳを添加した場合の熱伝達法の生データを、Ｒｔｈ対時間でプロットしたもの（図８ａ）、およびＲｔｈ値の％変化を、系に注入したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質ＲＢＤの濃度に対してプロットした用量反応曲線（図８ｂ）である。
【図8B】図８は、ペプチド３に対するナノＭＩＰで官能化したスクリーン印刷電極（ＳＰＥ）にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質ＲＢＤ（１ｆｇ／ｍＬから１０ｐｇ／ｍＬ）を含有するＰＢＳを添加した場合の熱伝達法の生データを、Ｒｔｈ対時間でプロットしたもの（図８ａ）、およびＲｔｈ値の％変化を、系に注入したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質ＲＢＤの濃度に対してプロットした用量反応曲線（図８ｂ）である。
【図9A】図９は、ペプチド１をインプリントしたナノＭＩＰの、極端な温度およびｐＨに耐える能力を報告するものである。図９ａは、室温、３７℃、および５０℃における、空気中のＡｕ表面上の単独ナノＭＩＰの典型的な原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）による形態像（広範囲像において緑色の枠で表されている）である。図９ｂは、各温度におけるナノＭＩＰの対応する断面プロファイルのプロットを示す。図９ｃは、様々なｐＨレベルにおいて、ＡＦＭ像から得たナノＭＩＰの体積（ｎ＝１２０）を比較する箱ひげ図を示す。図９ｄは、ナノＭＩＰベースのセンサーの臨床基準液（ユニバーサル輸送培地）に対する熱応答とダイエットコカコーラ（ｐＨ＝３．５）に対する熱応答とを比較したものである。図９ｅは、ダイエットコカコーラを試験液として用いた場合に偽陽性の結果を与える市販の迅速抗原試験を示す。
【図9B】図９は、ペプチド１をインプリントしたナノＭＩＰの、極端な温度およびｐＨに耐える能力を報告するものである。図９ａは、室温、３７℃、および５０℃における、空気中のＡｕ表面上の単独ナノＭＩＰの典型的な原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）による形態像（広範囲像において緑色の枠で表されている）である。図９ｂは、各温度におけるナノＭＩＰの対応する断面プロファイルのプロットを示す。図９ｃは、様々なｐＨレベルにおいて、ＡＦＭ像から得たナノＭＩＰの体積（ｎ＝１２０）を比較する箱ひげ図を示す。図９ｄは、ナノＭＩＰベースのセンサーの臨床基準液（ユニバーサル輸送培地）に対する熱応答とダイエットコカコーラ（ｐＨ＝３．５）に対する熱応答とを比較したものである。図９ｅは、ダイエットコカコーラを試験液として用いた場合に偽陽性の結果を与える市販の迅速抗原試験を示す。
【図9C】図９は、ペプチド１をインプリントしたナノＭＩＰの、極端な温度およびｐＨに耐える能力を報告するものである。図９ａは、室温、３７℃、および５０℃における、空気中のＡｕ表面上の単独ナノＭＩＰの典型的な原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）による形態像（広範囲像において緑色の枠で表されている）である。図９ｂは、各温度におけるナノＭＩＰの対応する断面プロファイルのプロットを示す。図９ｃは、様々なｐＨレベルにおいて、ＡＦＭ像から得たナノＭＩＰの体積（ｎ＝１２０）を比較する箱ひげ図を示す。図９ｄは、ナノＭＩＰベースのセンサーの臨床基準液（ユニバーサル輸送培地）に対する熱応答とダイエットコカコーラ（ｐＨ＝３．５）に対する熱応答とを比較したものである。図９ｅは、ダイエットコカコーラを試験液として用いた場合に偽陽性の結果を与える市販の迅速抗原試験を示す。
【図9D】図９は、ペプチド１をインプリントしたナノＭＩＰの、極端な温度およびｐＨに耐える能力を報告するものである。図９ａは、室温、３７℃、および５０℃における、空気中のＡｕ表面上の単独ナノＭＩＰの典型的な原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）による形態像（広範囲像において緑色の枠で表されている）である。図９ｂは、各温度におけるナノＭＩＰの対応する断面プロファイルのプロットを示す。図９ｃは、様々なｐＨレベルにおいて、ＡＦＭ像から得たナノＭＩＰの体積（ｎ＝１２０）を比較する箱ひげ図を示す。図９ｄは、ナノＭＩＰベースのセンサーの臨床基準液（ユニバーサル輸送培地）に対する熱応答とダイエットコカコーラ（ｐＨ＝３．５）に対する熱応答とを比較したものである。図９ｅは、ダイエットコカコーラを試験液として用いた場合に偽陽性の結果を与える市販の迅速抗原試験を示す。
【図9E】図９は、ペプチド１をインプリントしたナノＭＩＰの、極端な温度およびｐＨに耐える能力を報告するものである。図９ａは、室温、３７℃、および５０℃における、空気中のＡｕ表面上の単独ナノＭＩＰの典型的な原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）による形態像（広範囲像において緑色の枠で表されている）である。図９ｂは、各温度におけるナノＭＩＰの対応する断面プロファイルのプロットを示す。図９ｃは、様々なｐＨレベルにおいて、ＡＦＭ像から得たナノＭＩＰの体積（ｎ＝１２０）を比較する箱ひげ図を示す。図９ｄは、ナノＭＩＰベースのセンサーの臨床基準液（ユニバーサル輸送培地）に対する熱応答とダイエットコカコーラ（ｐＨ＝３．５）に対する熱応答とを比較したものである。図９ｅは、ダイエットコカコーラを試験液として用いた場合に偽陽性の結果を与える市販の迅速抗原試験を示す。
【図10A】図１０は、ペプチド１をインプリントしたナノＭＩＰの、様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に対する感度を報告するものであり、当該ナノＭＩＰの感度をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体と比較したものである。図１０ａは、１ｆｇ・ｍＬ－１から１０ｐｇ・ｍＬ－１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤを含有するＰＢＳに曝露した際のナノＭＩＰ官能化ＳＰＥの典型的な熱伝達法のデータを示す。図１０ｂから図１０ｄは、（ｉ）スパイクタンパク質に対するナノＭＩＰセンサーおよび抗体センサーの熱応答（ナノＭＩＰは、アルファ変異体およびデルタ変異体の両方に由来するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対して試験した）（図１０ｂ）、（ｉｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤに対するナノＭＩＰセンサーおよび抗体センサーの熱応答（図１０ｃ）、ならびにｉｉｉ）各ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原とネガティブコントロールであるＯＲＦ８、ＩＬ－６、およびＨＳＡと、に対するナノＭＩＰセンサーの熱応答を示す、典型的な用量反応曲線（エラーバーはＳＤを表す）を示す。ＮＩＰベースのセンサーのスパイクタンパク質に対する応答についても示す（図１０ｄ）。図１０ｅは、本発明のナノＭＩＰのＬｏＤ値を、市販の迅速抗原試験および文献にある最近開発された多数の抗原試験と比較したものである。
【図10B】図１０は、ペプチド１をインプリントしたナノＭＩＰの、様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に対する感度を報告するものであり、当該ナノＭＩＰの感度をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体と比較したものである。図１０ａは、１ｆｇ・ｍＬ－１から１０ｐｇ・ｍＬ－１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤを含有するＰＢＳに曝露した際のナノＭＩＰ官能化ＳＰＥの典型的な熱伝達法のデータを示す。図１０ｂから図１０ｄは、（ｉ）スパイクタンパク質に対するナノＭＩＰセンサーおよび抗体センサーの熱応答（ナノＭＩＰは、アルファ変異体およびデルタ変異体の両方に由来するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対して試験した）（図１０ｂ）、（ｉｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤに対するナノＭＩＰセンサーおよび抗体センサーの熱応答（図１０ｃ）、ならびにｉｉｉ）各ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原とネガティブコントロールであるＯＲＦ８、ＩＬ－６、およびＨＳＡと、に対するナノＭＩＰセンサーの熱応答を示す、典型的な用量反応曲線（エラーバーはＳＤを表す）を示す。ＮＩＰベースのセンサーのスパイクタンパク質に対する応答についても示す（図１０ｄ）。図１０ｅは、本発明のナノＭＩＰのＬｏＤ値を、市販の迅速抗原試験および文献にある最近開発された多数の抗原試験と比較したものである。
【図10C】図１０は、ペプチド１をインプリントしたナノＭＩＰの、様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に対する感度を報告するものであり、当該ナノＭＩＰの感度をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体と比較したものである。図１０ａは、１ｆｇ・ｍＬ－１から１０ｐｇ・ｍＬ－１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤを含有するＰＢＳに曝露した際のナノＭＩＰ官能化ＳＰＥの典型的な熱伝達法のデータを示す。図１０ｂから図１０ｄは、（ｉ）スパイクタンパク質に対するナノＭＩＰセンサーおよび抗体センサーの熱応答（ナノＭＩＰは、アルファ変異体およびデルタ変異体の両方に由来するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対して試験した）（図１０ｂ）、（ｉｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤに対するナノＭＩＰセンサーおよび抗体センサーの熱応答（図１０ｃ）、ならびにｉｉｉ）各ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原とネガティブコントロールであるＯＲＦ８、ＩＬ－６、およびＨＳＡと、に対するナノＭＩＰセンサーの熱応答を示す、典型的な用量反応曲線（エラーバーはＳＤを表す）を示す。ＮＩＰベースのセンサーのスパイクタンパク質に対する応答についても示す（図１０ｄ）。図１０ｅは、本発明のナノＭＩＰのＬｏＤ値を、市販の迅速抗原試験および文献にある最近開発された多数の抗原試験と比較したものである。
【図10D】図１０は、ペプチド１をインプリントしたナノＭＩＰの、様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に対する感度を報告するものであり、当該ナノＭＩＰの感度をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体と比較したものである。図１０ａは、１ｆｇ・ｍＬ－１から１０ｐｇ・ｍＬ－１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤを含有するＰＢＳに曝露した際のナノＭＩＰ官能化ＳＰＥの典型的な熱伝達法のデータを示す。図１０ｂから図１０ｄは、（ｉ）スパイクタンパク質に対するナノＭＩＰセンサーおよび抗体センサーの熱応答（ナノＭＩＰは、アルファ変異体およびデルタ変異体の両方に由来するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対して試験した）（図１０ｂ）、（ｉｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤに対するナノＭＩＰセンサーおよび抗体センサーの熱応答（図１０ｃ）、ならびにｉｉｉ）各ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原とネガティブコントロールであるＯＲＦ８、ＩＬ－６、およびＨＳＡと、に対するナノＭＩＰセンサーの熱応答を示す、典型的な用量反応曲線（エラーバーはＳＤを表す）を示す。ＮＩＰベースのセンサーのスパイクタンパク質に対する応答についても示す（図１０ｄ）。図１０ｅは、本発明のナノＭＩＰのＬｏＤ値を、市販の迅速抗原試験および文献にある最近開発された多数の抗原試験と比較したものである。
【図10E】図１０は、ペプチド１をインプリントしたナノＭＩＰの、様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に対する感度を報告するものであり、当該ナノＭＩＰの感度をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体と比較したものである。図１０ａは、１ｆｇ・ｍＬ－１から１０ｐｇ・ｍＬ－１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤを含有するＰＢＳに曝露した際のナノＭＩＰ官能化ＳＰＥの典型的な熱伝達法のデータを示す。図１０ｂから図１０ｄは、（ｉ）スパイクタンパク質に対するナノＭＩＰセンサーおよび抗体センサーの熱応答（ナノＭＩＰは、アルファ変異体およびデルタ変異体の両方に由来するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対して試験した）（図１０ｂ）、（ｉｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤに対するナノＭＩＰセンサーおよび抗体センサーの熱応答（図１０ｃ）、ならびにｉｉｉ）各ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原とネガティブコントロールであるＯＲＦ８、ＩＬ－６、およびＨＳＡと、に対するナノＭＩＰセンサーの熱応答を示す、典型的な用量反応曲線（エラーバーはＳＤを表す）を示す。ＮＩＰベースのセンサーのスパイクタンパク質に対する応答についても示す（図１０ｄ）。図１０ｅは、本発明のナノＭＩＰのＬｏＤ値を、市販の迅速抗原試験および文献にある最近開発された多数の抗原試験と比較したものである。
【図11A】図１１は、ペプチド１をインプリントしたナノＭＩＰと臨床サンプル由来のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との間の結合を示す。図１１ａは、３Ｄ印刷した添加セルの試作品の概略図であり、１）熱電対用入口、２）官能化ＳＰＥ、３）液体の手動添加を容易にするための底が開いた貯留槽、および４）実験ノイズを減少させるための取り外し可能な蓋、である。図１１ｂは、図１１ａに示す添加セルの写真である。図１１ｃは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（１ｆｇ・ｍＬ－１から１０ｐｇ・ｍＬ－１）の熱検出に試作品の添加セルを用いた際に得られる典型的な用量反応曲線を示す。図１１ｄは、ＣＯＶＩＤ陽性患者およびＣＯＶＩＤ陰性患者（ｎ＝７）由来の臨床サンプルに対するナノＭＩＰセンサーの熱応答を示す。
【図11B】図１１は、ペプチド１をインプリントしたナノＭＩＰと臨床サンプル由来のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との間の結合を示す。図１１ａは、３Ｄ印刷した添加セルの試作品の概略図であり、１）熱電対用入口、２）官能化ＳＰＥ、３）液体の手動添加を容易にするための底が開いた貯留槽、および４）実験ノイズを減少させるための取り外し可能な蓋、である。図１１ｂは、図１１ａに示す添加セルの写真である。図１１ｃは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（１ｆｇ・ｍＬ－１から１０ｐｇ・ｍＬ－１）の熱検出に試作品の添加セルを用いた際に得られる典型的な用量反応曲線を示す。図１１ｄは、ＣＯＶＩＤ陽性患者およびＣＯＶＩＤ陰性患者（ｎ＝７）由来の臨床サンプルに対するナノＭＩＰセンサーの熱応答を示す。
【図11C】図１１は、ペプチド１をインプリントしたナノＭＩＰと臨床サンプル由来のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との間の結合を示す。図１１ａは、３Ｄ印刷した添加セルの試作品の概略図であり、１）熱電対用入口、２）官能化ＳＰＥ、３）液体の手動添加を容易にするための底が開いた貯留槽、および４）実験ノイズを減少させるための取り外し可能な蓋、である。図１１ｂは、図１１ａに示す添加セルの写真である。図１１ｃは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（１ｆｇ・ｍＬ－１から１０ｐｇ・ｍＬ－１）の熱検出に試作品の添加セルを用いた際に得られる典型的な用量反応曲線を示す。図１１ｄは、ＣＯＶＩＤ陽性患者およびＣＯＶＩＤ陰性患者（ｎ＝７）由来の臨床サンプルに対するナノＭＩＰセンサーの熱応答を示す。
【図11D】図１１は、ペプチド１をインプリントしたナノＭＩＰと臨床サンプル由来のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との間の結合を示す。図１１ａは、３Ｄ印刷した添加セルの試作品の概略図であり、１）熱電対用入口、２）官能化ＳＰＥ、３）液体の手動添加を容易にするための底が開いた貯留槽、および４）実験ノイズを減少させるための取り外し可能な蓋、である。図１１ｂは、図１１ａに示す添加セルの写真である。図１１ｃは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（１ｆｇ・ｍＬ－１から１０ｐｇ・ｍＬ－１）の熱検出に試作品の添加セルを用いた際に得られる典型的な用量反応曲線を示す。図１１ｄは、ＣＯＶＩＤ陽性患者およびＣＯＶＩＤ陰性患者（ｎ＝７）由来の臨床サンプルに対するナノＭＩＰセンサーの熱応答を示す。
【図13A】図１３は、ＰＢＳ中におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のアルファ変異体、ベータ変異体、およびガンマ変異体由来のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の、ナノＭＩＰ－ＬＳＰＲセンサーを介した検出を示す。図１３ａは、１０ａＭから１００ｎＭにわたる濃度範囲のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のアルファ変異体について、波長対吸光度でプロットしたＬＳＰＲスペクトルを示す。図１３ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のアルファ変異体、ベータ変異体、およびガンマ変異体の濃度を１０ａＭから１００ｎＭまで変化させた際の、Ａｇ－ＭＩＰ複合体のＬＳＰＲ波長の変化を示す。
【図13B】図１３は、ＰＢＳ中におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のアルファ変異体、ベータ変異体、およびガンマ変異体由来のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の、ナノＭＩＰ－ＬＳＰＲセンサーを介した検出を示す。図１３ａは、１０ａＭから１００ｎＭにわたる濃度範囲のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のアルファ変異体について、波長対吸光度でプロットしたＬＳＰＲスペクトルを示す。図１３ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のアルファ変異体、ベータ変異体、およびガンマ変異体の濃度を１０ａＭから１００ｎＭまで変化させた際の、Ａｇ－ＭＩＰ複合体のＬＳＰＲ波長の変化を示す。
【図14A】図１４は、血清中におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のアルファ変異体、ベータ変異体、およびガンマ変異体由来のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の、ナノＭＩＰ－ＬＳＰＲを介した検出を示す。図１４ａは、１００ｆＭから１００ｎＭにわたる濃度範囲のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のアルファ変異体について、波長対吸光度でプロットしたＬＳＰＲスペクトルを示す。図１４ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のアルファ変異体、ベータ変異体、およびガンマ変異体の濃度を１００ｆＭから１００ｎＭまで変化させた際の、Ａｇ－ＭＩＰ複合体のＬＳＰＲ波長の変化を示す。
【実施例】
【0076】
実施例１：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するナノＭＩＰの合成
インプリントに適したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の３つのペプチドの選択
Ｗｒａｐｐら、２０２０１の補足図５は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質と、その他２つのコロナウイルス株、ＳＡＲＳ－ＣｏＶおよびＲａＴＧ１３のスパイクタンパク質との配列アラインメントを示す。ＲＢＤが強調表示されている。本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶおよびＲａＴＧ１３由来の各配列との間で保存されていないことに基づき、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤ由来のペプチド配列を３つ（ペプチド１：ＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧ、ペプチド２：ＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣ、およびペプチド３：ＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰ）、インプリント用の有力な候補として選択した。
インプリントに適したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の３つのペプチドの選択
Ｗｒａｐｐら、２０２０１の補足図５は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質と、その他２つのコロナウイルス株、ＳＡＲＳ－ＣｏＶおよびＲａＴＧ１３のスパイクタンパク質との配列アラインメントを示す。ＲＢＤが強調表示されている。本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶおよびＲａＴＧ１３由来の各配列との間で保存されていないことに基づき、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤ由来のペプチド配列を３つ（ペプチド１：ＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧ、ペプチド２：ＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣ、およびペプチド３：ＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰ）、インプリント用の有力な候補として選択した。
【0077】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するナノＭＩＰの固相合成
ナノＭＩＰ合成の前に、ペプチド１、ペプチド２、およびペプチド３を、シラン処理したガラスビーズに固定化した。
ナノＭＩＰ合成の前に、ペプチド１、ペプチド２、およびペプチド３を、シラン処理したガラスビーズに固定化した。
【0078】
ペプチドの固定化には末端システインが必要であることに基づき、中国のオントレス社（Ｏｎｔｏｒｅｓ）にペプチド１、ペプチド２、およびペプチド３を注文する際に、ペプチド１のＮ末端にシステイン残基を付加した。また、システインとＮ末端アスパラギンとの間に、スペーサーとして機能するグリシン残基をさらに付加した。したがって、オントレス社から調達されたインプリント用のペプチドは、以下の通りであった。
ペプチド１：ＣＧＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧ
ペプチド２：ＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣ
ペプチド３：ＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰ
ペプチド１：ＣＧＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧ
ペプチド２：ＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣ
ペプチド３：ＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰ
【0079】
ペプチドの固定化を以下のように行った。ガラスビーズ（直径およそ１００μＭ、マイクロビーズＡＧ社（Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ ＡＧ）から調達）を、４ＭのＮａＯＨ中で１０分間煮沸することで活性化した。その後、ガラスビーズをまず脱イオン水で、次にアセトンで洗浄した後、８０℃で２時間乾燥した。次いで、２％ｖ／ｖの（３－アミノプロピル）トリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）を含有するトルエン中でガラスビーズを３時間インキュベートし、アセトンで洗浄して、０．２ｍｇ／ｍｌのヨード酢酸ｎ－スクシンイミジル（ＳＩＡ）を含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４中に２時間置き、アセトニトリルで洗浄した。その後、０．４ｍｇ／ｍｌのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）および０．１ｍｇ／ｍｌのペプチドを含むＰＢＳ、ｐＨ７．４溶液中で最低４時間インキュベートすることで、ガラスビーズの表面に鋳型（ペプチド１、ペプチド２、またはペプチド３）を固定化した。水およびメタノールで洗浄することによって、過剰な鋳型を除去した。
【0080】
ペプチド被覆ガラスビーズを用いて、インプリントナノＭＩＰを以下の通り合成した。モノマー溶液を調製し、１０分間超音波処理し、窒素で５分間パージした。調製したモノマー溶液の一例は、３ｍｇのＮ－フルオレセイニルアクリルアミドと、２４．２ｍｇのアクリルアミドと、３１．７μＬのアクリル酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＴＢＡｃ）と、３６ｍｇの３－Ｏ－アクリロイル－１，２：５，６－ビス－Ｏ－イソプロピリデン－Ｄ－グルコフラノースと、１３．８μＬのメタクリル酸２，２，２－トリフルオロエチル（ＣＦ３）と、３．９ｍｇのＮ－（３－アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（ＡＰＭＡ）と、１．３ｍｇのスクアラミドモノマー７（ＳＱ７）と、９ｍｇのＮ，Ｎ’－メチレンビス（アクリルアミド）（ＢＩＳ））と、を含む。その後、６０ｇのペプチド被覆ガラスビーズが入った２５０ｍｌのデュランフラスコに、１００ｍｌのモノマー溶液を入れた。次いで、６０μＬ／ｍｌのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を含む６０ｍｇ／ｍｌの過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）０．５ｍｌを添加することで重合を開始させ、室温で１時間、重合を行った。その後、ナノ粒子が付着したガラスビーズを他の成分から分離するために、孔隙率が２０μＭのフリットを装着した固相抽出（ＳＰＥ）カートリッジにフラスコの内容物を注ぎ入れた。次いで、およそ２５ｍｌの常温水を用いた洗浄工程を１０回行って、低親和性物質を除去した。この洗浄工程における残液については、毎回廃棄した。その後、６０℃のエタノール１０ｍｌを用いた洗浄工程を９回行って、高親和性ナノＭＩＰをガラスビーズから分離した。この洗浄における残液は、ナノＭＩＰを含有しており、毎回回収した。次いで、ナノＭＩＰをおよそ１０ｍｌまで濃縮し、溶媒を蒸留水に置換した。
【0081】
インプリントしたナノＭＩＰについて、ナノサイトＮＳ３００で算出した平均直径は、５９ｎｍであった。
【0082】
実施例２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドに対するナノＭＩＰの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析
本研究では、ビアコア３０００装置を採用した。
本研究では、ビアコア３０００装置を採用した。
【0083】
表面活性化およびナノＭＩＰの固定化
４％メルカプトウンデカン酸（ＭＵＤＡ）チップ（エタノール中、４％ＭＵＤＡの自己組織化単分子膜で官能化した、ビアコアＳＩＡキットＡｕ表面を用いて調製）にナノＭＩＰ（実施例１のもの）を共有結合により固定化することによって、ナノＭＩＰ－ＳＰＲセンサーを調製した。
４％メルカプトウンデカン酸（ＭＵＤＡ）チップ（エタノール中、４％ＭＵＤＡの自己組織化単分子膜で官能化した、ビアコアＳＩＡキットＡｕ表面を用いて調製）にナノＭＩＰ（実施例１のもの）を共有結合により固定化することによって、ナノＭＩＰ－ＳＰＲセンサーを調製した。
【0084】
さらに詳細には、５μＬ／分の一定流速で水を用いて、装置の準備を行った。チップ調製の間はずっと、ランニングバッファーとして、水を３０μｌ／分の一定流速で用いた。安定したベースラインが達成されるまで、水を流した。Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＤＣ）の混合物（２ｍｇのＥＤＣ＋３ｍｇのＮＨＳを含有する４００ｕＬの水）をセンサー表面全体にわたって注入し（８μＬ／分の流速で８分）、表面の活性化を行った（この混合物によって、チップ表面のカルボキシル末端基がＮ－ヒドロキシ－スクシンイミドエステルに変換される）。その後、チップ上の４つのフローセル全てに、ナノＭＩＰ（５ｎＭ）を注入した（８μＬ／分の流速で８分から１０分）。最後に、炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．２）を注入することで（５μＬ／分から３０μＬ／分の流速で３０分）、未反応ＮＨＳエステルを加水分解した。
【0085】
ナノＭＩＰとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドとの間の相互作用の検出
ＳＰＲにおける検査の前に、ペプチド１、ペプチド２、およびペプチド３のそれぞれをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合した。
ＳＰＲにおける検査の前に、ペプチド１、ペプチド２、およびペプチド３のそれぞれをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合した。
【0086】
ランニングバッファーを水からＰＢＳに切り替えて安定したベースラインが得られたら、ＢＳＡまたはＢＳＡ－ペプチド複合体の希釈物７種（ＰＢＳ中、２．３３ｍｇ／ｍｌ、０．７７７ｍｇ／ｍｌ、２５９ｕｇ／ｍｌ、８６ｕｇ／ｍｌ、２８．８ｕｇ／ｍｌ、９．６ｕｇ／ｍｌ、３．２ｕｇ／ｍｌ）を以下のように注入した（結合フェーズ５分、解離フェーズ４分、２８μｌ／分の流速）。フローセル１にはＢＳＡのみを、フローセル２にはＢＳＡ－ペプチド１を、フローセル３にはＢＳＡ－ペプチド３を、注入した。
【0087】
ペプチド３をインプリントしたナノＭＩＰについては良好な選択性が観察され、ソフトウェアによってＫＤは１６０ｎＭと算出された（データ示さず）。
【0088】
実施例３：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質に対するナノＭＩＰの表面プラズモン共鳴分析
本研究では、ビアコア３０００装置を採用した。
本研究では、ビアコア３０００装置を採用した。
【0089】
表面活性化およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質の固定化
４％メルカプトウンデカン酸（ＭＵＤＡ）チップ（エタノール中、４％ＭＵＤＡの自己組織化単分子膜で官能化した、ビアコアＳＩＡキットＡｕ表面を用いて調製）にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質の組換え体（ネイティブ・アンチゲン・カンパニー社（Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）から調達した全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質組換え体）を共有結合により固定化することによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質－ＳＰＲセンサーを調製した。
４％メルカプトウンデカン酸（ＭＵＤＡ）チップ（エタノール中、４％ＭＵＤＡの自己組織化単分子膜で官能化した、ビアコアＳＩＡキットＡｕ表面を用いて調製）にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質の組換え体（ネイティブ・アンチゲン・カンパニー社（Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）から調達した全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質組換え体）を共有結合により固定化することによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質－ＳＰＲセンサーを調製した。
【0090】
さらに詳細には、５μｌ／分の一定流速で水を用いて、装置の準備を行った。チップ調製の間はずっと、ランニングバッファーとしても、水を３０μｌ／分の一定流速で用いた。安定したベースラインが達成されるまで、水を流した。Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＤＣ）の混合物（２ｍｇのＥＤＣ＋３ｍｇのＮＨＳを含有する４００ｕＬの水）をセンサー表面全体にわたって注入し（８μｌ／分の流速で８分）、表面の活性化を行った（この混合物によって、チップ表面のカルボキシル末端基がＮ－ヒドロキシ－スクシンイミドエステルに変換される）。その後、コントロール（１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）および０．５％プルロニックＦ１２７（ｗ／ｖ））ならびに２通りの異なる濃度のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質の組換え体（６０ｎＭおよび６００ｎＭ）を、それぞれチップ上のフローセル１、フローセル２、およびフローセル３に注入した（８μｌ／分の流速で６分１５秒）。最後に、炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．２）を注入することで（３０μＬ／分の流速で１分）、未反応ＮＨＳエステルを加水分解した。
【0091】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質とナノＭＩＰとの間の相互作用の検出
ランニングバッファーを水からＰＢＳに切り替えて安定したベースラインが得られたら、３０ｎＭ（およびその１：１段階希釈列）のペプチド１をインプリントしたナノＭＩＰを注入した（結合フェーズ５分、解離フェーズ３分、２８μｌ／分の流速）。
ランニングバッファーを水からＰＢＳに切り替えて安定したベースラインが得られたら、３０ｎＭ（およびその１：１段階希釈列）のペプチド１をインプリントしたナノＭＩＰを注入した（結合フェーズ５分、解離フェーズ３分、２８μｌ／分の流速）。
【0092】
【0093】
実施例４：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するナノＭＩＰのＣＰＮへの結合
ペプチド１およびペプチド３をインプリントしたナノＭＩＰを、親水性のキャッピング剤内に封入された半導体発光ポリマーコアを含有する高蛍光性ナノ粒子である、ストリームバイオ社の共役ポリマーナノ粒子（ＣＰＮ）に連結した。用いたＣＰＮは、ＣＰＮ５１０およびＣＰＮ６１０であり、ナノサイト３０００で測定した直径は７０ｎｍから８０ｎｍである。
ペプチド１およびペプチド３をインプリントしたナノＭＩＰを、親水性のキャッピング剤内に封入された半導体発光ポリマーコアを含有する高蛍光性ナノ粒子である、ストリームバイオ社の共役ポリマーナノ粒子（ＣＰＮ）に連結した。用いたＣＰＮは、ＣＰＮ５１０およびＣＰＮ６１０であり、ナノサイト３０００で測定した直径は７０ｎｍから８０ｎｍである。
【0094】
図２は、ペプチド１をインプリントしたナノＭＩＰのＣＰＮ５１０への結合が成功したことを示す。なお、本来の非結合ナノＭＩＰは、主に５９ｎｍであったが、ＣＰＮ５１０に結合すると粒子サイズの有意な変化が見られる（１１９ｎｍにおけるピークを参照のこと）。
【0095】
実施例５：ナノＭＩＰとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質との間の結合のドットブロット分析
異なる濃度（２９０ｎｇ、１４５ｎｇ、７３ｎｇ、３６ｎｇ、１８ｎｇ、９ｎｇ、５ｎｇ、２ｎｇ、１ｎｇ、０．６ｎｇ、０．３ｎｇ、および０．１４ｎｇ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質の組換え体（ネイティブ・アンチゲン・カンパニー社から調達）をニトロセルロース膜上にブロットし、その後、膜を乾燥した。その後、５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ－Ｔ（０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ）に室温で３０分から６０分浸すことで、膜のブロッキングを行った。ブロッキング後、室温で３０分から６０分、５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ－Ｔに溶解した（１）ナノＭＩＰ－ＣＰＮ５１０（ペプチド１をインプリント）、（２）ナノＭＩＰ－ＣＰＮ５１０（ペプチド３をインプリント）、または（３）ＣＰＮ５１０のみ（コントロール）と共に、膜をインキュベートした。次いで、ＰＢＳ－Ｔを用いて、膜の洗浄を５分ずつ３回行った。その後、ＵＶ下で蛍光を観察した。図３に示すように、ナノＭＩＰ－ＣＰＮ５１０（ペプチド１をインプリント）を用いた場合の検出限界は、０．３ｎｇであり、ＣＰＮ５１０のみ（コントロール）を用いた場合よりもかなり低く、このことは、少なくともペプチド１をインプリントしたナノＭＩＰは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質と特異的に相互作用することを示している。
異なる濃度（２９０ｎｇ、１４５ｎｇ、７３ｎｇ、３６ｎｇ、１８ｎｇ、９ｎｇ、５ｎｇ、２ｎｇ、１ｎｇ、０．６ｎｇ、０．３ｎｇ、および０．１４ｎｇ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質の組換え体（ネイティブ・アンチゲン・カンパニー社から調達）をニトロセルロース膜上にブロットし、その後、膜を乾燥した。その後、５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ－Ｔ（０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ）に室温で３０分から６０分浸すことで、膜のブロッキングを行った。ブロッキング後、室温で３０分から６０分、５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ－Ｔに溶解した（１）ナノＭＩＰ－ＣＰＮ５１０（ペプチド１をインプリント）、（２）ナノＭＩＰ－ＣＰＮ５１０（ペプチド３をインプリント）、または（３）ＣＰＮ５１０のみ（コントロール）と共に、膜をインキュベートした。次いで、ＰＢＳ－Ｔを用いて、膜の洗浄を５分ずつ３回行った。その後、ＵＶ下で蛍光を観察した。図３に示すように、ナノＭＩＰ－ＣＰＮ５１０（ペプチド１をインプリント）を用いた場合の検出限界は、０．３ｎｇであり、ＣＰＮ５１０のみ（コントロール）を用いた場合よりもかなり低く、このことは、少なくともペプチド１をインプリントしたナノＭＩＰは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質と特異的に相互作用することを示している。
【0096】
実施例６：ナノＭＩＰとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスとの間の結合のドットブロット分析
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２×１０４ｐｆｕ）を二枚のニトロセルロース膜にブロットした。また、それぞれのニトロセルロース膜には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質の組換え体（ネイティブ・アンチゲン・カンパニー社から調達）７５ｎｇをポジティブコントロールとしてブロットし、培地をネガティブコントロールとしてブロットした。次いで、膜を静置乾燥した。その後、５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ－Ｔ（０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ）に室温で３０分から６０分浸すことで、膜のブロッキングを行った。ブロッキング後、室温で３０分から６０分、５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ－Ｔに溶解したナノＭＩＰ－ＣＰＮ５１０（ペプチド１をインプリント）または（２）ナノＭＩＰ－ＣＰＮ５１０（トロポニンをインプリント）（ネガティブコントロール）と共に、膜をインキュベートした。次いで、ＰＢＳ－Ｔを用いて、膜の洗浄を５分ずつ３回行った。その後、ＵＶ下で蛍光を観察した。図４に示すように、培地をブロットしたニトロセルロース膜の領域では、またはナノＭＩＰ－ＣＰＮ５１０（トロポニンをインプリント）（ネガティブコントロール）と共に膜をインキュベートした場合には、蛍光は観察されなかった。対照的に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびポジティブコントロールであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のいずれに関しても、ナノＭＩＰ－ＣＰＮ５１０（ペプチド１をインプリント）と共にニトロセルロース膜をインキュベートした場合には、蛍光が観察された。このことは、少なくともペプチド１をインプリントしたナノＭＩＰは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と特異的に相互作用することを示している。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２×１０４ｐｆｕ）を二枚のニトロセルロース膜にブロットした。また、それぞれのニトロセルロース膜には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質の組換え体（ネイティブ・アンチゲン・カンパニー社から調達）７５ｎｇをポジティブコントロールとしてブロットし、培地をネガティブコントロールとしてブロットした。次いで、膜を静置乾燥した。その後、５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ－Ｔ（０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ）に室温で３０分から６０分浸すことで、膜のブロッキングを行った。ブロッキング後、室温で３０分から６０分、５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ－Ｔに溶解したナノＭＩＰ－ＣＰＮ５１０（ペプチド１をインプリント）または（２）ナノＭＩＰ－ＣＰＮ５１０（トロポニンをインプリント）（ネガティブコントロール）と共に、膜をインキュベートした。次いで、ＰＢＳ－Ｔを用いて、膜の洗浄を５分ずつ３回行った。その後、ＵＶ下で蛍光を観察した。図４に示すように、培地をブロットしたニトロセルロース膜の領域では、またはナノＭＩＰ－ＣＰＮ５１０（トロポニンをインプリント）（ネガティブコントロール）と共に膜をインキュベートした場合には、蛍光は観察されなかった。対照的に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびポジティブコントロールであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のいずれに関しても、ナノＭＩＰ－ＣＰＮ５１０（ペプチド１をインプリント）と共にニトロセルロース膜をインキュベートした場合には、蛍光が観察された。このことは、少なくともペプチド１をインプリントしたナノＭＩＰは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と特異的に相互作用することを示している。
【0097】
実施例７：（１）ナノＭＩＰと４種類のヒトコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、およびＨＣｏＶ－ＨＫＵ１）との間の結合と、（２）抗体と４種類のヒトコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、およびＨＣｏＶ－ＨＫＵ１）との間の結合とを比較するドットブロット分析
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質（Ｓ１）（ネイティブ・アンチゲン・カンパニー社）、ヒトコロナウイルスＯＣ４３スパイク糖タンパク質（Ｓ１）（ネイティブ・アンチゲン・カンパニー社）、ヒトコロナウイルス２２９Ｅスパイク糖タンパク質（Ｓ１）（ネイティブ・アンチゲン・カンパニー社）、およびヒトコロナウイルスＨＫＵ１スパイク糖タンパク質（Ｓ１）（ネイティブ・アンチゲン・カンパニー社）（０．６ｍｇ／ｍＬ）を０．５μＬずつ、三連でニトロセルロース膜上にブロットし（図５の概略図に示す通り）、その後、膜を乾燥した。次いで、２ｍＬのＢＳＡ（ＰＢＳ中１％）に１時間浸すことで、膜のブロッキングを行った。ブロッキング後、３０分間、（１）ナノＭＩＰ－ＣＦ７７０（ペプチド１をインプリント）ならびに（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（ＲＢＤ）に特異的な３種類のモノクローナル抗体、すなわちＭａｂＲＢＤ１１０６－ＣＦ７７０、ＭａｂＲＢＤ１０７－ＣＦ７７０、およびＭａｂＲＢＤ５３０５－ＣＦ７７０（全てインハウスで調製し、０．０１％ＢＳＡで希釈）と共に膜をインキュベートした。次いで、２ｍＬのＰＢＳＴを用いて、膜を５分間洗浄した。その後、ＵＶ下で蛍光を観察した。図５に示すように、ナノＭＩＰは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質（Ｓ１）に選択的に結合し、ヒトコロナウイルスＯＣ４３スパイク糖タンパク質（Ｓ１）、ヒトコロナウイルス２２９Ｅスパイク糖タンパク質（Ｓ１）、およびヒトコロナウイルスＨＫＵ１スパイク糖タンパク質（Ｓ１）のいずれにも結合しなかった。さらに、ナノＭＩＰは、試験した各抗体に匹敵する選択性と結合性を有することが示された。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質（Ｓ１）（ネイティブ・アンチゲン・カンパニー社）、ヒトコロナウイルスＯＣ４３スパイク糖タンパク質（Ｓ１）（ネイティブ・アンチゲン・カンパニー社）、ヒトコロナウイルス２２９Ｅスパイク糖タンパク質（Ｓ１）（ネイティブ・アンチゲン・カンパニー社）、およびヒトコロナウイルスＨＫＵ１スパイク糖タンパク質（Ｓ１）（ネイティブ・アンチゲン・カンパニー社）（０．６ｍｇ／ｍＬ）を０．５μＬずつ、三連でニトロセルロース膜上にブロットし（図５の概略図に示す通り）、その後、膜を乾燥した。次いで、２ｍＬのＢＳＡ（ＰＢＳ中１％）に１時間浸すことで、膜のブロッキングを行った。ブロッキング後、３０分間、（１）ナノＭＩＰ－ＣＦ７７０（ペプチド１をインプリント）ならびに（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（ＲＢＤ）に特異的な３種類のモノクローナル抗体、すなわちＭａｂＲＢＤ１１０６－ＣＦ７７０、ＭａｂＲＢＤ１０７－ＣＦ７７０、およびＭａｂＲＢＤ５３０５－ＣＦ７７０（全てインハウスで調製し、０．０１％ＢＳＡで希釈）と共に膜をインキュベートした。次いで、２ｍＬのＰＢＳＴを用いて、膜を５分間洗浄した。その後、ＵＶ下で蛍光を観察した。図５に示すように、ナノＭＩＰは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質（Ｓ１）に選択的に結合し、ヒトコロナウイルスＯＣ４３スパイク糖タンパク質（Ｓ１）、ヒトコロナウイルス２２９Ｅスパイク糖タンパク質（Ｓ１）、およびヒトコロナウイルスＨＫＵ１スパイク糖タンパク質（Ｓ１）のいずれにも結合しなかった。さらに、ナノＭＩＰは、試験した各抗体に匹敵する選択性と結合性を有することが示された。
【0098】
実施例８：熱検出法を用いたナノＭＩＰとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質ＲＢＤとの間の結合の分析
熱検出法で用いるためのナノＭＩＰ官能化スクリーン印刷電極（ＳＰＥ）の調製
４－ＡＢＡ（２ｍＭ）および亜硝酸ナトリウム（２ｍＭ）を含有するＨＣＬ水溶液（０．５Ｍ）を調製し、オービタルシェーカー上で１０分間穏やかに混合した。スクリーン印刷電極（ＳＰＥ）を溶液中に浸漬し、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極（アルバテック社（Ａｌｖａｔｅｋ Ｌｔｄ．）、ロムジー、英国）を用いて、１００ｍＶ・ｓ－１において＋０．２Ｖから－０．６Ｖまでサイクリックボルタンメトリーを行った。得られた電極は、ＳＰＥ／４－ＡＢＡと表記するが、脱イオン水で徹底的にすすいで非結合４－ＡＢＡを除去し、窒素を用いて乾燥した。その後、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＤＣ）（１００ｍＭ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（２０ｍＭ）を含有するＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ＝５）と共にインキュベートすることで、カルボキシル基を活性化した。ドロップキャスティングにより、ＳＰＥの作用電極上に８μＬのＥＤＣ／ＮＨＳ溶液を堆積させた。１時間後、電極を脱イオン水ですすぎ、乾燥させて、ＳＰＥ／４－ＡＢＡ／ＥＤＣ＋ＮＨＳ電極を得た。この後、８μＬの所与のナノＭＩＰ溶液（ペプチド１をインプリントしたナノＭＩＰ「Ｐ１Ｃ６」またはペプチド３をインプリントしたナノＭＩＰ「Ｐ３Ｃ６」）を、穏やかに撹拌した後、作用電極上に堆積させた。３時間後、ＳＰＥ／４－ＡＢＡ／ＥＤＣ＋ＮＨＳ／ナノＭＩＰ電極を脱イオン水ですすぎ、穏やかな窒素流で乾燥させた後、使用時までＰＢＳ中にて４℃で保存した。
熱検出法で用いるためのナノＭＩＰ官能化スクリーン印刷電極（ＳＰＥ）の調製
４－ＡＢＡ（２ｍＭ）および亜硝酸ナトリウム（２ｍＭ）を含有するＨＣＬ水溶液（０．５Ｍ）を調製し、オービタルシェーカー上で１０分間穏やかに混合した。スクリーン印刷電極（ＳＰＥ）を溶液中に浸漬し、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極（アルバテック社（Ａｌｖａｔｅｋ Ｌｔｄ．）、ロムジー、英国）を用いて、１００ｍＶ・ｓ－１において＋０．２Ｖから－０．６Ｖまでサイクリックボルタンメトリーを行った。得られた電極は、ＳＰＥ／４－ＡＢＡと表記するが、脱イオン水で徹底的にすすいで非結合４－ＡＢＡを除去し、窒素を用いて乾燥した。その後、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＤＣ）（１００ｍＭ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（２０ｍＭ）を含有するＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ＝５）と共にインキュベートすることで、カルボキシル基を活性化した。ドロップキャスティングにより、ＳＰＥの作用電極上に８μＬのＥＤＣ／ＮＨＳ溶液を堆積させた。１時間後、電極を脱イオン水ですすぎ、乾燥させて、ＳＰＥ／４－ＡＢＡ／ＥＤＣ＋ＮＨＳ電極を得た。この後、８μＬの所与のナノＭＩＰ溶液（ペプチド１をインプリントしたナノＭＩＰ「Ｐ１Ｃ６」またはペプチド３をインプリントしたナノＭＩＰ「Ｐ３Ｃ６」）を、穏やかに撹拌した後、作用電極上に堆積させた。３時間後、ＳＰＥ／４－ＡＢＡ／ＥＤＣ＋ＮＨＳ／ナノＭＩＰ電極を脱イオン水ですすぎ、穏やかな窒素流で乾燥させた後、使用時までＰＢＳ中にて４℃で保存した。
【0099】
ナノＭＩＰ官能化スクリーン印刷電極（ＳＰＥ）を用いたナノＭＩＰとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質ＲＢＤとの間の結合の検出
３Ｄ印刷したフローセルを用いることで、上記のナノＭＩＰ官能化ＳＰＥによる測定を容易に行えるようにした。セルにＳＰＥを実装し、熱電対によって液の温度を測定した（Ｔ２）。各測定には、新しく調製したナノＭＩＰ官能化ＳＰＥを用いた。ｖａｎ Ｇｒｉｎｓｖｅｎらに記載されているような伝熱デバイスにフローセルを接続した。インビボ条件を模倣するように３７．００±０．０２℃に設定されたヒートシンクの温度（銅製のブロック、Ｔ１）を能動的に制御するラボビュー（ＬａｂＶｉｅｗ）ソフトウェアを用いて、このデバイスを操作した。Ｇｅｅｒｅｔｓらに記載されているように、電力抵抗器（２２Ω）に取り付けられた比例・積分・微分（ＰＩＤ）コントローラーによって、シグナルについてのフィードバックを調節した。ＰＩＤパラメータについては、全ての実験において、最適値であるＰ＝１、Ｉ＝１０、およびＤ＝０．２に固定した。
３Ｄ印刷したフローセルを用いることで、上記のナノＭＩＰ官能化ＳＰＥによる測定を容易に行えるようにした。セルにＳＰＥを実装し、熱電対によって液の温度を測定した（Ｔ２）。各測定には、新しく調製したナノＭＩＰ官能化ＳＰＥを用いた。ｖａｎ Ｇｒｉｎｓｖｅｎらに記載されているような伝熱デバイスにフローセルを接続した。インビボ条件を模倣するように３７．００±０．０２℃に設定されたヒートシンクの温度（銅製のブロック、Ｔ１）を能動的に制御するラボビュー（ＬａｂＶｉｅｗ）ソフトウェアを用いて、このデバイスを操作した。Ｇｅｅｒｅｔｓらに記載されているように、電力抵抗器（２２Ω）に取り付けられた比例・積分・微分（ＰＩＤ）コントローラーによって、シグナルについてのフィードバックを調節した。ＰＩＤパラメータについては、全ての実験において、最適値であるＰ＝１、Ｉ＝１０、およびＤ＝０．２に固定した。
【0100】
全ての測定において、フローセルをＰＢＳで満たし、３０分間放置してベースライン温度シグナルを確実に安定化させ、その後、最初にＰＢＳを注入してブランク測定とした。濃度を次第に上昇させていった（０ｐｇ・ｍＬ－１から１０ｐｇ・ｍＬ－１）各標的バイオマーカー（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質ＲＢＤまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦ８（ネガティブコントロールとして））のＰＢＳ溶液（３ｍＬ）を実験に先立って調製し、必要となるまで４℃で保存した。各バイオマーカーの注入については、ＬＳＰ０２－１Ｂデュアルチャネルシリンジ（ロンガープレシジョンポンプ社（Ｌｏｎｇｅｒ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｕｍｐ Ｃｏ．）、河北、中国）ポンプを用いて、２５０μＬ・分－１で１２分かけて行った。各バイオマーカーの注入後、次の注入の前に、システムを３０分間安定させた。実験を通して、ヒートシンクを３７．００℃に保つのに必要な電力で温度勾配（Ｔ１－Ｔ２）を割ることによって、熱抵抗（Ｒｔｈ）を求めた。Ｒｔｈおよび標準偏差（ＳＤ）は、各濃度および最初のＰＢＳの注入それぞれにおけるベースラインシグナルからの６００個のデータポイントの平均を用いて算出された（図６、図７ａ、および図８ａ）。このデータを用いて用量反応曲線を作成し、センサーの線形範囲で３シグマ法を用いて検出限界（ＬｏＤ）を算出した（図７ｂおよび図８ｂ）。グラフ中のエラーバーは、ＳＤ値に関する。図６は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦ８に対する熱応答が非常に限定的であることを示しているが、図７および図８は、ペプチド１およびペプチド３をインプリントしたナノＭＩＰでは、いずれも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質ＲＢＤを用いて良好な応答が観察されたことを示している。
【0101】
実施例９：ナノＭＩＰの頑強さの分析
ペプチド１をインプリントしたＭＩＰの、極端な温度およびｐＨに耐える能力を調査した。
ペプチド１をインプリントしたＭＩＰの、極端な温度およびｐＨに耐える能力を調査した。
【0102】
温度
原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を用いて、吸着されたナノＭＩＰの形態に温度上昇がどのような影響を及ぼすかを、同じナノＭＩＰについて室温、３７℃、および５０℃においてイメージングを行うことによって調べた。
原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を用いて、吸着されたナノＭＩＰの形態に温度上昇がどのような影響を及ぼすかを、同じナノＭＩＰについて室温、３７℃、および５０℃においてイメージングを行うことによって調べた。
【0103】
ＪＰＫ ナノウィザード（Ｎａｎｏｗｉｚａｒｄ） ４ ＸＰ バイオサイエンス（ブルカーナノ社（Ｂｒｕｋｅｒ， Ｎａｎｏ ＧｍｂＨ）、ベルリン、ドイツ）において、ＡＦＭ測定を行った。カンチレバー長が約２２５μｍでバネ定数が約４８Ｎ・ｍ－１であるＰＰＰ－ＮＣＬ－Ｗプローブ（ナノセンサーズ社（Ｎａｎｏｓｅｎｓｏｒｓ）、ヌーシャテル、スイス）を用い、タッピングモードにおいて、空気中での測定を行った。カンチレバー長が約１４０μｍでバネ定数が約０．１Ｎ・ｍ－１であるＭＬＣＴ－Ｅプローブ（ブルカー社、カリフォルニア、米国）を用い、定量イメージング（ＱＩ）モードにおいて、液中での測定を行った。Ａｕ被覆Ｓｉチップを基板として用いた（Ｓｉ－Ｍａｔ社、カウフェリング、ドイツ）。ドロップキャスティングの前に、７５℃に加熱したミリＱ水、アンモニア、および過酸化水素の５：１：１混合物に５分間浸漬することによって、チップを洗浄した。その後、チップをミリＱ水ですすぎ、窒素を用いて乾燥した。ナノＭＩＰ溶液をミリＱ水で約２．５４μｇ・ｍＬ－１に希釈し、Ａｕ被覆表面上でドロップキャスティング（２０μＬ）を行い、ペトリディッシュで最低４時間、周囲条件で乾燥した。高温加熱ステージ（ＨＴＨＳ、ＪＰＫバイオＡＦＭ － ０．１℃の解像度）を温度コントローラーとして用いて、３７℃および５０℃におけるイメージングを容易に行えるようにした。
【0104】
【0105】
ナノＭＩＰの体積は、Ｇｗｙｄｄｉｏｎを用いて算出した。多数の液滴を追跡することによって、室温から５０℃までのナノＭＩＰの平均体積の変化は、最小限（約６％の減少）であったことが明らかになった。
【0106】
したがって、ナノＭＩＰの形態は、比較的広い温度範囲にわたって不変である。
【0107】
最高温度１２１℃で１５分間のオートクレーブに供したナノＭＩＰを用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対してビアコア３０００装置を用いたＳＰＲ結合分析も行った。
【0108】
より詳細には、直後に述べるプロセスにしたがって、４％メルカプトウンデカン酸（ＭＵＤＡ）チップ（エタノール中、４％ＭＵＤＡの自己組織化単分子膜で官能化した、ビアコアＳＩＡキットＡｕ表面を用いて調製）に、調製したナノＭＩＰ（実施例１のもの）をそのまま、または１２１℃でおよそ１５分間オートクレーブした後、共有結合により固定化することによって、２つのナノＭＩＰ－ＳＰＲセンサーを調製した。
【0109】
５μｌ／分の一定流速で水を用いて、装置の準備を行った。チップ調製の間はずっと、ランニングバッファーとして、水を３０μｌ／分の一定流速で用いた。安定したベースラインが達成されるまで、水を流した。Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＤＣ）の混合物（２ｍｇのＥＤＣ＋３ｍｇのＮＨＳを含有する４００ｕＬの水）をセンサー表面全体にわたって注入し（８μＬ／分の流速で８分）、表面の活性化を行った（この混合物によって、チップ表面のカルボキシル末端基がＮ－ヒドロキシ－スクシンイミドエステルに変換される）。その後、チップ上の４つのフローセル全てに、ナノＭＩＰ（５ｎＭ）を注入した（８μＬ／分の流速で８分から１０分）。最後に、炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．２）を注入することで（５μＬ／分から３０μＬ／分の流速で３０分）、未反応ＮＨＳエステルを加水分解した。
【0110】
ランニングバッファーを水からＰＢＳに切り替えて安定したベースラインが得られたら、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質（ネイティブ・アンチゲン・カンパニー社から調達した全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質の組換え体）の希釈物５種（ＰＢＳ中、３０ｍＭ、１５ｍＭ、７．５ｍＭ、３．７５ｍＭ、および１．８８ｍＭ）を、コントロール流路中の適切なコントロールと共に、注入した（結合フェーズ約５分、解離フェーズ少なくとも２分、２８μｌ／分の流速）。その後、２つのチップから得られた結果を重ね合わせ、ソフトウェアでナノＭＩＰのＫＤ値を算出すると、オートクレーブの前後で非常に類似していた（それぞれ、７ｎＭおよび３ｎＭ）が、このことは、高温に曝露した後も結合親和性に影響はないことを実証している。オートクレーブ（滅菌）によって、細菌による劣化なく水中でナノＭＩＰを長期保存することが容易なものとなるので、ナノＭＩＰの貯蔵寿命において非常に有利である。対照的に、抗体では、３７℃を越える温度で親和性が有意に低下する。
【0111】
ｐＨ
ＡＦＭを用いて、様々なｐＨレベルの液体中において吸着されたナノＭＩＰ（ｎ＝１２０）の体積を測定することによって、ナノＭＩＰの極端なｐＨに耐える能力の評価も行った。より具体的には、ＡＦＭの動作条件内で、異なるｐＨレベル（５．５から８．５）の液体中、室温（２３±１℃）においてＱＩ測定を行った。最初の測定は、純粋なミリＱ水（ｐＨ５．５）中で行い、その後アンモニアを添加してｐＨを上昇させた。
ＡＦＭを用いて、様々なｐＨレベルの液体中において吸着されたナノＭＩＰ（ｎ＝１２０）の体積を測定することによって、ナノＭＩＰの極端なｐＨに耐える能力の評価も行った。より具体的には、ＡＦＭの動作条件内で、異なるｐＨレベル（５．５から８．５）の液体中、室温（２３±１℃）においてＱＩ測定を行った。最初の測定は、純粋なミリＱ水（ｐＨ５．５）中で行い、その後アンモニアを添加してｐＨを上昇させた。
【0112】
上記のように、ナノＭＩＰの体積をＧｗｙｄｄｉｏｎを用いて算出したところ、ナノＭＩＰの体積の平均は、ｐＨ５．５からｐＨ８．５までごくわずかしか変化しなかった（約３％の減少）ことが明らかになり、このことは、吸着されたナノＭＩＰの形態が、広いｐＨ範囲にわたって不変であったことを強調するものである（図９ｃ参照）。
【0113】
さらに、開発したナノＭＩＰ試験（実施例１０を参照）の臨床基準液（ユニバーサル輸送培地、ＵＴＭ）に対する熱応答とダイエットコカコーラ（ｐＨ＝３．５）に対する熱応答とを比較した。この結果によって、この２つの液体の熱応答の間には統計的な有意差はないことが実証された（図９ｄを参照）。対照的に、市販の抗体ベースの迅速抗原試験は、ｐＨの変化によって大きな影響を受け、酸性のソフトドリンク（ダイエットコカコーラ）を試験液として用いた場合には、偽陽性の結果が生じる（図９ｅを参照）。
【0114】
実施例１０：熱検出法を用いたナノＭＩＰとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原との間の結合と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原との間の結合との比較
実施例８の手順にしたがって、ナノＭＩＰ官能化スクリーン印刷電極（ＳＰＥ）（ペプチド１をインプリントしたナノＭＩＰを用いた）を製造した。
実施例８の手順にしたがって、ナノＭＩＰ官能化スクリーン印刷電極（ＳＰＥ）（ペプチド１をインプリントしたナノＭＩＰを用いた）を製造した。
【0115】
実施例８の手順にしたがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体官能化ＳＰＥも製造した。
【0116】
ナノＭＩＰ官能化スクリーン印刷電極（ＳＰＥ）またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体官能化スクリーン印刷電極（ＳＰＥ）を用いたナノＭＩＰまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原との間の結合の検出
ナノＭＩＰ官能化ＳＰＥを、３Ｄ印刷した樹脂製フローセルに実装し、ヒートシンクと貯液槽との間に界面を創出することによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原（ネイティブ・アンチゲン・カンパニー社から調達した全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質（アルファ変異体）の組換え体、アベクサ社（Ａｂｂｅｘａ）（ケンブリッジ、英国）から調達したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）（デルタ変異体）の組換え体、または医学研究審議会タンパク質リン酸化およびユビキチン化ユニット（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｂｉｑｕｉｔｙｌａｔｉｏｎ Ｕｎｉｔ）（ダンディー、英国）から得たＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤのいずれか）の熱検出を行った。２つの熱電対によって、ヒートシンクの温度（Ｔ１）および貯液槽の温度（Ｔ２）を１秒おきに測定し、ヒートシンクを３７．００±０．０２℃に保つのに必要な電力で温度勾配（Ｔ１－Ｔ２）を割ることによって、熱抵抗（Ｒｔｈ）を得た。標的がナノＭＩＰに付着すると、固体－液体界面における熱伝達は減少し（温度勾配が大きくなり）、Ｒｔｈの無視できない上昇へとつながった。
ナノＭＩＰ官能化ＳＰＥを、３Ｄ印刷した樹脂製フローセルに実装し、ヒートシンクと貯液槽との間に界面を創出することによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原（ネイティブ・アンチゲン・カンパニー社から調達した全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質（アルファ変異体）の組換え体、アベクサ社（Ａｂｂｅｘａ）（ケンブリッジ、英国）から調達したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）（デルタ変異体）の組換え体、または医学研究審議会タンパク質リン酸化およびユビキチン化ユニット（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｂｉｑｕｉｔｙｌａｔｉｏｎ Ｕｎｉｔ）（ダンディー、英国）から得たＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤのいずれか）の熱検出を行った。２つの熱電対によって、ヒートシンクの温度（Ｔ１）および貯液槽の温度（Ｔ２）を１秒おきに測定し、ヒートシンクを３７．００±０．０２℃に保つのに必要な電力で温度勾配（Ｔ１－Ｔ２）を割ることによって、熱抵抗（Ｒｔｈ）を得た。標的がナノＭＩＰに付着すると、固体－液体界面における熱伝達は減少し（温度勾配が大きくなり）、Ｒｔｈの無視できない上昇へとつながった。
【0117】
全ての実験について、熱測定デバイスは、ラボビューソフトウェアを用いて制御され、電力抵抗器（２２Ω）に取り付けられた比例・積分・微分（ＰＩＤ）コントローラーによって、シグナルについてのフィードバックを調節した。ＰＩＤパラメータは、ノイズを低減するように最適化され、Ｐ＝１、Ｉ＝１３、およびＤ＝０．２に設定された。
【0118】
貯液槽をＰＢＳで満たし、３０分静置して、Ｒｔｈのベースラインシグナルを確実に安定させた。次に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の濃度を次第に上昇させていった（１ｆｇ ｍＬ－１から１０ｐｇ・ｍＬ－１）５種のＰＢＳ溶液（３ｍＬ）を、自動シリンジポンプ（ＬＳＰ０２－１Ｂ、ロンガープレシジョンポンプ社、河北、中国）を用い、２５０μＬ・分－１で１２分かけてフローセルに注入した。次の注入の前に、システムを３０分間安定させた。本実験では、Ｒｔｈの段階的な上昇を示す生の熱データプロットが得られたが、ここでの安定したプラトーは、濃度を上昇させた溶液の注入を表している（図１０ａを参照）。各濃度注入における安定化プラトーの平均および標準偏差（ＳＤ）をとることによって、熱プロットから用量反応曲線（図１０ｂから図１０ｄ）を作成した。線形範囲で３シグマ法（３×基準ＳＤ）を用いて、用量反応曲線から検出限界（ＬｏＤ）値を算出した。
【0119】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体官能化ＳＰＥを用いて、ナノＭＩＰのセンシング性能と抗体受容体のセンシング性能との直接比較を容易なものとした。熱検出結果（図１０ｂを参照）によって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（アルファ変異体）に対する応答は、ナノＭＩＰベースのセンサー（ＬｏＤ＝９．９±２．５ｆｇ・ｍＬ－１）と抗体ベースのセンサー（ＬｏＤ＝８．９±４．１ｆｇ・ｍＬ－１）とで非常に類似していることが明らかとなったが、このことは、スパイクタンパク質に対するナノＭＩＰの特異性が、市販の試験で用いられる抗体に匹敵するということを強調するものである。
【0120】
ナノＭＩＰ受容体のウイルス突然変異を検出する能力についても、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（デルタ変異体）に対する特異性を測定することによって調べた。得られたＬｏＤ（６．１±２．９ｆｇ・ｍＬ－１）がアルファ変異体について得られた値と非常に類似していたので、結果（図１０ｂ）は、ナノＭＩＰセンサーがデルタ変異体を検出するのに有効であったことを示している。このことは、ナノＭＩＰセンサーが、少量のアルファ変異体スパイクタンパク質およびデルタ変異体スパイクタンパク質の両方を同等に検出することができ、新規の変異体が存在することによる試験の有効性の低下に関する継続中の懸念がある潜在的な商業用途に非常に有望であることを実証するものである。
【0121】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤに対する熱応答を測定することによって、ナノＭＩＰ受容体の汎用性についても調べた（図１０ｃを参照）。直接比較を目的として、抗体受容体についても試験した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤについてのＬｏＤ値は、抗体センサー（８５．５±１５．０ｆｇ・ｍＬ－１）と比較して、ナノＭＩＰセンサーでは約２０分の１（３．９±１．０ｆｇ・ｍＬ－１）であった。結果として、このことは、ナノＭＩＰが抗体よりも汎用性が高いことを実証しているが、その理由は、全長スパイクタンパク質についてのＬｏＤは抗体に匹敵するものであったが、ＲＢＤについてのＬｏＤは有意に低かったためである。
【0122】
臨床サンプルにおいてよく見られる干渉物質である３つのネガティブコントロール、オープンリーディングフレーム８（ＯＲＦ８）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を用いて、ナノＭＩＰセンサーの選択性も包括的に試験した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原とナノＭＩＰとの間に高度な結合が生じ、これにより、最も高い濃度（１０ｐｇ・ｍＬ－１）において、スパイクタンパク質（０．２３℃・Ｗ－１）およびＲＢＤ（０．３５℃・Ｗ－１）についてΔＲｔｈ値が大きくなった。対照的に、ネガティブコントロールでは最小限の結合しか生じず、これにより、ＯＲＦ８（０．００℃・Ｗ－１）、ＩＬ－６（０．０６℃・Ｗ－１）、およびＨＳＡ（０．０５℃・Ｗ－１）についてΔＲｔｈ値が有意に低くなった。この結果によって、ナノＭＩＰセンサーの熱応答は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原について、ネガティブコントロールと比較して著しく高いことが実証されたが、このことは、ナノＭＩＰセンサーの選択性が優れていることを強調するものであった。ＳＰＥ（実施例８の手順にしたがって製造されたＮＩＰ官能化ＳＰＥ）に固定化された非インプリントポリマー（ＮＩＰ）を用いて、追加のコントロール実験も行った。ＮＩＰは、重合中に標的エピトープに曝露させないこと以外はナノＭＩＰと同様の合成プロトコルを用いて調製され、よって、標的の結合を容易にする特異的な空洞を有していなかった。スパイクタンパク質に対するナノＭＩＰ官能化ＳＰＥの熱応答は、ＮＩＰ官能化ＳＰＥ（０．０４℃・Ｗ－１）と比較して約６倍大きく、このことは、スパイクタンパク質とナノＭＩＰの空洞との間に特異的な結合が生じていることを示す。
【0123】
図１０ｅは、ナノＭＩＰセンサー、市販の迅速抗原試験、および文献４～１５にある最近開発された多数の抗原試験のＬｏＤ値を示す。以下の表１は、実験の設定のさらなる詳細を示す。ナノＭＩＰセンサーにおけるＬｏＤ値は、市販の迅速抗原試験（２０ｐｇ・ｍＬ－１）の約６０００分の１であった。この著しく低いＬｏＤは、ナノＭＩＰ受容体が、効果的な集団検診を行うのに十分な感度を有する迅速抗原試験を製造するのに役立つ手段となり得ることを強調するものである。さらに、ナノＭＩＰセンサーのＬｏＤは、文献にある最近開発された抗原試験のＬｏＤの中でも最も低い値のうちの１つである。このことは、ナノＭＩＰを用いる熱検出が、極端な温度およびｐＨに耐えることができるというさらなる利点を有しつつ、最近の文献にある最も優れた抗原試験に対抗し得るということを実証するものである。
【0124】
【表1-1】
【0125】
【表1-2】
【0126】
実施例１１：臨床サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するためのナノＭＩＰの使用
３Ｄ印刷した樹脂製添加セルの試作品（図１１ａおよび図１１ｂ）を、使い捨ての部品を用いる臨床分析用に開発した。実施例１０と同様、熱測定デバイスは、ラボビューソフトウェアを用いて制御され、電力抵抗器（２２Ω）に取り付けられた比例・積分・微分（ＰＩＤ）コントローラーによって、シグナルについてのフィードバックを調節した。ＰＩＤパラメータは、ノイズを低減するように最適化され、Ｐ＝１、Ｉ＝１４、およびＤ＝０に設定された。
３Ｄ印刷した樹脂製添加セルの試作品（図１１ａおよび図１１ｂ）を、使い捨ての部品を用いる臨床分析用に開発した。実施例１０と同様、熱測定デバイスは、ラボビューソフトウェアを用いて制御され、電力抵抗器（２２Ω）に取り付けられた比例・積分・微分（ＰＩＤ）コントローラーによって、シグナルについてのフィードバックを調節した。ＰＩＤパラメータは、ノイズを低減するように最適化され、Ｐ＝１、Ｉ＝１４、およびＤ＝０に設定された。
【0127】
添加セルの設計を検証するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含有するＰＢＳを用いて熱検出実験を行った。添加セルセンサーは、スパイクタンパク質に対して良好な熱応答を示し（図１１ｃ）、そのＬｏＤ値（７．０±４．０ｆｇ・ｍＬ－１）は、フローセル設計を用いた場合に得られた結果（９．９±２．５ｆｇ・ｍＬ－１（実施例１０））に非常に類似していた。
【0128】
最初の検証後、ＣＯＶＩＤ陽性（２０回未満のＰＣＲサイクル後に陽性）の患者サンプルおよびＣＯＶＩＤ陰性の患者サンプル（ｎ＝７）を用いて、臨床測定を行った。
【0129】
ＵＴＭおよびＶＰＭ（ウイルス保存培地）を、それぞれ陰性サンプルおよび陽性サンプルの基準液として用いた。測定中、１００μＬの基準液（ＵＴＭ／ＶＰＭ）を貯留槽にピペットで分注し、Ｒｔｈシグナルを１０分間安定させた。その後、基準液をピペットを用いて取り出し、１００μＬのサンプルを添加した。なお、ピペットを用いると、シリンジポンプを用いる場合と比較して、システムへの悪影響（例えば、流れや、気泡の添加）が抑えられる。この場合、サンプル量が喉用スワブおよび鼻用スワブで採取した場合と同等となり（１００μＬ）、測定時間が約１５分に短縮され、装置の操作も簡単であるため、臨床分析に非常に有利である。
【0130】
熱検出の結果（図１１ｄ）は、陽性サンプルの測定中にナノＭＩＰの空洞への特異的結合が生じ、平均ΔＲｔｈ値が大きくなった（０．２７℃・Ｗ－１）ことを示す。対照的に、陰性サンプルの測定時には、ナノＭＩＰに非特異的結合のみが生じ、平均ΔＲｔｈは０．００℃・Ｗ－１となった。ΔＲｔｈ値の全範囲は、陰性サンプル（０．１０℃・Ｗ－１）と比較して陽性サンプル（０．４１℃・Ｗ－１）においてはるかに大きいが、これは、異なるＣＯＶＩＤ陽性患者におけるウイルス量のばらつきによるものである。重要なことには、陰性サンプルにおける最大ΔＲｔｈは、陽性サンプルにおける最小ΔＲｔｈの約４分の１であったため、陽性および陰性の測定値に重複はなかった。このことは、ナノＭＩＰセンサーが、臨床サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出に対して優れた感度および特異性を有していることを強調するものである。さらに、ナノＭＩＰセンサーの測定時間（約１５分）は、市販の迅速抗原試験に匹敵し、これは、潜在的な集団検診への応用には非常に重要である。
【0131】
実施例１２：ナノＭＩＰとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のアルファ変異体、ベータ変異体、およびガンマ変異体との間の結合の分析
ナノＭＩＰの合成
実施例１の手順にしたがって、ナノＭＩＰ合成の前に、ペプチド１をシラン処理したガラスビーズに固定化した。
ナノＭＩＰの合成
実施例１の手順にしたがって、ナノＭＩＰ合成の前に、ペプチド１をシラン処理したガラスビーズに固定化した。
【0132】
ペプチド被覆ガラスビーズを用いて、インプリントナノＭＩＰを以下の通り合成した。モノマー溶液（実施例１を参照）を真空下で脱気し、５分間超音波処理した後、Ｎ２で２０分間パージして、６０ｇのペプチド１被覆ガラスビーズに添加した。過硫酸アンモニウム水溶液（８００μＬ、６０ｍｇ／ｍＬ）およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミン（２４μＬ）（いずれもシグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）製）を添加することによって、重合を開始した。上部空間にＮ２を流し込み、ボトルをスクリューキャップで密閉した。室温で１時間、重合を行った。次に、重合容器の内容物を、フリット（孔隙率２０μｍ）を備えた固相抽出（ＳＰＥ）カートリッジ（６０ｍＬ）に流し入れた。２０℃の蒸留水２０ｍＬを用いた洗浄を合計９回行って、低親和性ナノＭＩＰ、ポリマー、および未反応モノマーを除去した。その後、固相を含むＳＰＥカートリッジを７０℃の水浴に１５分間置いた。あらかじめ６５℃に温めておいた２０ｍＬの蒸留水のアリコートをＳＰＥに注ぎ、高親和性ナノＭＩＰを回収した。これを５回繰り返して、約１００ｍＬの高親和性ナノＭＩＰ水溶液を回収した。大部分のナノ粒子からの潜在的な未反応モノマーの完全な除去を確実に行うために、回収した溶液を濃縮し、スネークスキン（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ）膜（分子量１０ｋＤａカットオフ）を用いて透析を行った。
【0133】
インプリントナノＭＩＰについて、ナノサイトＮＳ３００で算出した平均直径は、６９．３ｎｍであった（図１２）。
【0134】
センサーの組み立て
ペプチド１をインプリントしたナノＭＩＰを製造したら、これを銀ナノ粒子（ＡｇＮＰ）ベースの局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）センサーに一体化した。
ペプチド１をインプリントしたナノＭＩＰを製造したら、これを銀ナノ粒子（ＡｇＮＰ）ベースの局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）センサーに一体化した。
【0135】
より詳細には、５０μｌのナノＭＩＰ原液（ＤＩ水中５μｇ／ｍｌ）をＡｇ－ＬＳＰＲチップ上に分注した。その後、Ａｇチップを加湿チャンバー内に３時間置いて、ナノＭＩＰをＡｇナノ粒子の表面に確実に固定化した。ナノＭＩＰはアミン基を有するため、負のＬＳＰＲのＡｇ表面と正に帯電したナノＭＩＰとの間の静電相互作用（－ＡｇとＮＨ３＋）によって、ナノＭＩＰが表面に結合した。この後、Ａｇ基板をＤＩ水で徹底的にすすいで、電極表面から緩く結合したポリマーを除去した。その後、チップを４℃で保存した。
【0136】
ナノＭＩＰ－ＬＳＰＲセンサーの検出性能
次いで、ＰＢＳ中におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのアルファ変異体、ベータ変異体、およびガンマ変異体のスパイクタンパク質（すべて抗体オンラインから購入：アルファ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質系統Ｂ．１．１．７、製品番号：ＡＢＩＮ６９６３７３８；ベータ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質系統Ｂ．１．３５１、製品番号：ＡＢＩＮ６９６３７３９；ガンマ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質系統Ｐ．１、製品番号：ＡＢＩＮ６９６４４４２）を検出することによって、ナノＭＩＰ－ＬＳＰＲセンサーのＬＳＰＲ性能を評価した。コントロールとして、ヒトコロナウイルス株であるＨＣｏＶＯＣ４３、ＨＫＵ１、およびＨＣｏＶ－２２９Ｅのスパイクタンパク質に対するナノＭＩＰ－ＬＳＰＲセンサーのＬＳＰＲ性能を試験し、ＮＩＰベースのＬＳＰＲセンサーのＬＳＰＲ性能も試験した。
次いで、ＰＢＳ中におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのアルファ変異体、ベータ変異体、およびガンマ変異体のスパイクタンパク質（すべて抗体オンラインから購入：アルファ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質系統Ｂ．１．１．７、製品番号：ＡＢＩＮ６９６３７３８；ベータ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質系統Ｂ．１．３５１、製品番号：ＡＢＩＮ６９６３７３９；ガンマ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質系統Ｐ．１、製品番号：ＡＢＩＮ６９６４４４２）を検出することによって、ナノＭＩＰ－ＬＳＰＲセンサーのＬＳＰＲ性能を評価した。コントロールとして、ヒトコロナウイルス株であるＨＣｏＶＯＣ４３、ＨＫＵ１、およびＨＣｏＶ－２２９Ｅのスパイクタンパク質に対するナノＭＩＰ－ＬＳＰＲセンサーのＬＳＰＲ性能を試験し、ＮＩＰベースのＬＳＰＲセンサーのＬＳＰＲ性能も試験した。
【0137】
図１３に示すように、センサーは、すべてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体の検出に成功した。図１３ａは、様々な濃度のアルファ変異体に結合した際の典型的なＬＳＰＲセンサー応答を、対応する吸光度と共に示す。図１３ｂは、アルファ、ベータ、およびガンマの濃度を１０ａＭから１００ｎＭまで変化させた際の、Ａｇ－ＭＩＰ複合体のＬＳＰＲ波長の変化を示す。
【0138】
波長データを用いた検出限界（ＬＯＤ）は、アルファ、ベータ、およびガンマのそれぞれについて、４６６．３７ｎｍ、４６７．１３ｎｍ、および４６７．７１ｎｍに見出され、これらは、９．７１ｆＭ、７．３２ｆＭ、および８．８１ｐＭに相当する。実験式を用いてＬＯＤを計算したが、これは、ブランク限界（ＬＯＢ）および測定値の標準偏差を用いることを伴い、ここで、ブランクとは、ＭＩＰに対するＰＢＳの影響（タンパク質は含まない）のことをいう（下記参照）。
【0139】
ＬＯＤの算出
ＬＳＰＲセンサーのＬＯＤを得るために、波長変化を式１および式２を用いて算出した後、アルファ変異体、ベータ変異体、ガンマ変異体のスパイクタンパク質の濃度に変換した。
ＬＳＰＲセンサーのＬＯＤを得るために、波長変化を式１および式２を用いて算出した後、アルファ変異体、ベータ変異体、ガンマ変異体のスパイクタンパク質の濃度に変換した。
【0140】
ブランク限界（ＬＯＢ）＝平均ブランク＋１．６４５（ＳＤブランク）（式１）
検出限界（ＬＯＤ）＝ＬＯＢ＋１．６４５（ＳＤ最低濃度）（式２）
検出限界（ＬＯＤ）＝ＬＯＢ＋１．６４５（ＳＤ最低濃度）（式２）
【0141】
ＰＢＳ中のウイルスサンプルの検出に成功した後、臨床的に関連する流体であるヒト血清を用いて同様の実験を行った。特に、１００ｆＭ、１０ｐＭ、１ｎＭ、および１００ｎＭの濃度のアルファスパイクタンパク質、ベータスパイクタンパク質、およびガンマスパイクタンパク質を血清に加え、波長および吸光度の変化を測定した。ＰＢＳを用いた上記の実験の場合と同様に、ヒトコロナウイルス株であるＨＣｏＶＯＣ４３、ＨＫＵ１、およびＨＣｏＶ－２２９Ｅのスパイクタンパク質を用いてコントロール実験も行い、ＮＩＰベースのＬＳＰＲセンサーのＬＳＰＲ性能も試験した。図１４ａは、さまざまな濃度のアルファスパイクタンパク質を加えた血清に対する典型的なＬＳＰＲセンサー応答を示す。図１４ｂは、アルファスパイクタンパク質、ベータスパイクタンパク質、およびガンマスパイクタンパク質の濃度を１０ａＭから１００ｎＭまで変化させた際の、Ａｇ－ＭＩＰ複合体のＬＳＰＲ波長の変化を示す。
【0142】
波長データを用いてアルファおよびベータについて計算したＬＯＤは、４５７．５４ｎｍおよび４６０．４９ｎｍに見出された。これらのＬＯＤ値は、アルファについては１４ｆＭ、ベータについては９４ｆＭの濃度に相当する。ガンマの結合について観測された波長変化の場合、算出されたＬＯＤは１３０ｆＭ（４５７．３７ｎｍ）であった。ＬＯＤ値を求める方法については上述している。なお、ＬＯＤを計算するのに必要なＬＯＢの計算においては、タンパク質を含まない血清における測定値を本実験のブランクサンプルと見なした。
【0143】
ＰＢＳおよび血清での上記の各実験について、コントロールとして用いたヒトコロナウイルスのスパイクタンパク質を含む全てのスパイクタンパク質を、ＰＢＳ／血清を用いて異なる濃度（１０ａＭから１００ｎＭ）で調製または希釈した。濃度が異なる各タンパク質にＡｇ－ＭＩＰ官能化基板を曝露した。これは、５０μｌのサンプルをＡｇ－ＭＩＰ上にドロップキャスティングすることで行った。センサーの表面を所与の濃度に曝露した後、２０分のインキュベーションを行ってタンパク質をＭＩＰに相互作用させた。その後、センサーの表面をＰＢＳで洗浄し（ＰＢＳサンプルおよび血清サンプルのいずれも）、ＬＳＰＲシグナルを測定した。シグナルを取得するために、３０秒間、オーシャンビュー（ｏｃｅａｎ ｖｉｅｗ）ソフトウェア（下記参照）が複数のスペクトルを取得し、ボックスカー幅５で１０個のスペクトルの平均を表示した。その後、ＬＳＰＲスペクトルを保存し、グラフパッドプリズム（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ）ソフトウェアを用いて、波長／吸光度の変化を記録し、分析し、プロットした。
【0144】
分光器ＦＬＡＭＥ－Ｔ－ＸＲ１－ＥＳ、反射プローブＱＲ４００－７－ＳＲ－ＢＸ、ＵＶ－ＶＩＳパッチコネクター、ＤＨ－２０００重水素－タングステンハロゲンランプ（ＤＨ２０００－Ｓ－ＤＵＶ－ＴＴＬ）、ＲＴＬ－Ｔステージ、およびオーシャンビューソフトウェアといったオーシャンオプティクス社（Ｏｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ）から購入した部品からなるインハウスの装置を用いて、ＬＳＰＲシグナルを取得した。ＬＳＰＲスペクトルを取得する前に、ガラススライドを基準として用いて、バックグラウンドノイズをキャンセルするための暗基準シグナルを測定した。このガラススライドは、Ａｇを堆積させた基板と同じであった。この基準基板は、複数の基板のうちの１枚をアセトン中で１時間超音波処理した後、イソプロパノールで拭いて表面を洗浄することで、その基板からＡｇナノ粒子を完全に除去して作成された。生成されたデータは、全て、グラフパッドプリズム９ソフトウェアの組み込み機能を用いて分析およびプロットを行った。
【0145】
実施例１３：２種類のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株由来のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対するナノＭＩＰの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析
本研究では、ビアコアＴ２００装置を採用した。
本研究では、ビアコアＴ２００装置を採用した。
【0146】
表面活性化およびナノＭＩＰの固定化
製造者のガイドラインにしたがってナノＭＩＰ（実施例１のもの）をサイティバ社製のＣＭ５チップ上に共有結合により固定化することによって、ナノＭＩＰ－ＳＰＲセンサーを調製した。
製造者のガイドラインにしたがってナノＭＩＰ（実施例１のもの）をサイティバ社製のＣＭ５チップ上に共有結合により固定化することによって、ナノＭＩＰ－ＳＰＲセンサーを調製した。
【0147】
さらに詳細には、５μＬ／分の一定流速で水を用いて、装置の準備を行った。チップ調製の間はずっと、ランニングバッファーとして、水を５μｌ／分の一定流速で用いた。安定したベースラインが達成されるまで、水を流した。Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＤＣ）の混合物（２ｍｇのＥＤＣ＋３ｍｇのＮＨＳを含有する４００ｕＬの水）をセンサー表面全体にわたって注入し（５μＬ／分の流速で８分）、表面の活性化を行った（この混合物によって、チップ表面のカルボキシル末端基がＮ－ヒドロキシ－スクシンイミドエステルに変換される）。その後、チップ上の複数のフローセルに、ナノＭＩＰ（５ｎＭ）を注入した（５μＬ／分の流速で７分）。最後に、エタノールアミンを水中に注入することによって、未反応のＮＨＳエステルを不活性化した。
【0148】
ナノＭＩＰと２種類のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体由来のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質との間の相互作用の検出
ランニングバッファーを水からＰＢＳに切り替えて安定したベースラインが得られたら、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質の組換え体（ネイティブ・アンチゲン・カンパニー社から調達した全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質の組換え体であり、武漢Ｈｕ１原種またはオミクロン株のいずれか）の希釈物５種（ＰＢＳ中、１．２３ｎＭ、３．７ｎＭ、１１．１１ｎＭ、３３．３３ｎｍＭ、および１００ｎＭ）を、ある溶液から次の溶液への移行のためにのみ生じる最小限の解離時間で順次注入した（５μｌ／分で３０９秒）。その後、結合応答の相対的な大きさを比較することができるように、２つのスパイクタンパク質変異体の結果を重ね合わせた。図１５に示すように、オミクロン株のスパイクタンパク質に変異があってもナノＭＩＰは機能し続け、性能の低下はほんのわずかであった。ＫＤ値を導出する必要はないと考えられた。
ランニングバッファーを水からＰＢＳに切り替えて安定したベースラインが得られたら、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質の組換え体（ネイティブ・アンチゲン・カンパニー社から調達した全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質の組換え体であり、武漢Ｈｕ１原種またはオミクロン株のいずれか）の希釈物５種（ＰＢＳ中、１．２３ｎＭ、３．７ｎＭ、１１．１１ｎＭ、３３．３３ｎｍＭ、および１００ｎＭ）を、ある溶液から次の溶液への移行のためにのみ生じる最小限の解離時間で順次注入した（５μｌ／分で３０９秒）。その後、結合応答の相対的な大きさを比較することができるように、２つのスパイクタンパク質変異体の結果を重ね合わせた。図１５に示すように、オミクロン株のスパイクタンパク質に変異があってもナノＭＩＰは機能し続け、性能の低下はほんのわずかであった。ＫＤ値を導出する必要はないと考えられた。
【0149】
（参考文献）
１．Wrappら、Science 367, 1260－1263 (2020)
２．van Grinsven, B.; Eersels, K.; Peeters, M.; Losada-Perez, P.; Vandenryt, T.; Cleij, T. J.; Wagner, P. The Heat-Transfer Method: A Versatile Low-Cost, Label-Free, Fast, and User-Friendly Readout Platform for Biosensor Applications. ACS Appl. Mater. Interfaces 2014, 6, 13309－13318.
３．Geerets, B.; Peeters, M.; van Grinsven, B.; Bers, K.; de Ceuninck, W.; Wagner, P. Optimizing the Thermal Read-out Technique for MIP-Based Biomimetic Sensors: Towards Nanomolar Detection Limits. Sensors 2013, 13, 9148－9159.
４．Diagnostics Wantai SARS-CoV-2. WANTAI SARS-CoV-2 Ag Rapid Test (Colloidal Gold); 2020.
５．Grant, B. D.; Anderson, C. E.; Williford, J. R.; Alonzo, L. F.; Glukhova, V. A.; Boyle, D. S.; Weigl, B. H.; Nichols, K. P. SARS-CoV-2 Coronavirus Nucleocapsid Antigen Detecting Half-Strip Lateral Flow Assay toward the Development of Point of Care Tests Using Commercially Available Reagents. Anal. Chem. 2020, 92, 11305－11309.
６．Zhang, C.; Zhou, L.; Du, K.; Zhang, Y.; Wang, J.; Chen, L.; Lyu, Y.; Li, J.; Liu, H.; Huo, J.; Li, F.; Wang, J.; Sang, P.; Lin, S.; Xiao, Y.; Zhang, K.; He, K. Foundation and Clinical Evaluation of a New Method for Detecting SARS-CoV-2 Antigen by Fluorescent Microsphere Immunochromatography. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2020, 10, 10.3389/fcimb.2020.553837.
７．Liu, D.; Ju, C.; Han, C.; Shi, R.; Chen, X.; Duan, D.; Yan, J.; Yan, X. Nanozyme Chemiluminescence Paper Test for Rapid and Sensitive Detection of SARS-CoV-2 Antigen. Biosens. Bioelectron. 2021, 173, 10.1016/j.bios.2020.112817.
８．Rahmati, Z.; Roushani, M.; Hosseini, H.; Choobin, H. Electrochemical Immunosensor with Cu2O Nanocube Coating for Detection of SARS-CoV-2 Spike Protein. Microchim. Acta 2021, 188, 10.1007/s00604-021-04762-04769.
９．Raziq, A.; Kidakova, A.; Boroznjak, R.; Reut, J.; Opik, A.; Syritski, V. Development of a Portable MIP-Based Electrochemical Sensor for Detection of SARS-CoV-2 Antigen. Biosens. Bioelectron. 2021, 178, 10.1016/j.bios.2021.113029.
１０．Seo, G.; Lee, G.; Kim, M. J.; Baek, S. H.; Choi, M.; Ku, K. B.; Lee, C. S.; Jun, S.; Park, D.; Kim, H. G.; Kim, S. J.; Lee, J. O.; Kim, B. T.; Park, E. C.; Kim, S. Il. Rapid Detection of COVID-19 Causative Virus (SARS-CoV-2) in Human Nasopharyngeal Swab Specimens Using Field-Effect Transistor-Based Biosensor. ACS Nano 2020, 14, 5135－5142.
１１．Moitra, P.; Alafeef, M.; Alafeef, M.; Alafeef, M.; Dighe, K.; Frieman, M. B.; Pan, D.; Pan, D.; Pan, D. Selective Naked-Eye Detection of SARS-CoV-2 Mediated by N Gene 11 Targeted Antisense Oligonucleotide Capped Plasmonic Nanoparticles. ACS Nano 2020, 14, 7617－7627.
１２．Mavrikou, S.; Moschopoulou, G.; Tsekouras, V.; Kintzios, S. Development of a Portable, Ultra-Rapid and Ultra-Sensitive Cell-Based Biosensor for the Direct Detection of the SARS-CoV-2 S1 Spike Protein Antigen. Sensors 2020, 20, 10.3390/s20113121.
１３．Zhang, M.; Li, X.; Pan, J.; Zhang, Y.; Zhang, L.; Wang, C. Ultrasensitive Detection of SARS-CoV-2 Spike Protein in Untreated Saliva Using SERS-Based Biosensor. Biosens. Bioelectron. 2021, 190, 10.1016/j.bios.2021.113421.
１４．Yakoh, A.; Pimpitak, U.; Rengpipat, S.; Hirankarn, N.; Chailapakul, O.; Chaiyo, S. PaperBased Electrochemical Biosensor for Diagnosing COVID-19: Detection of SARS-CoV-2 Antibodies and Antigen. Biosens. Bioelectron. 2021, 176, 10.1016/j.bios.2020.112912.
１５．Fabiani, L.; Saroglia, M.; Galata, G.; De Santis, R.; Fillo, S.; Luca, V.; Faggioni, G.; D’Amore, N.; Regalbuto, E.; Salvatori, P.; Terova, G.; Moscone, D.; Lista, F.; Arduini, F. Magnetic Beads Combined with Carbon Black-Based Screen-Printed Electrodes for COVID-19: A Reliable and Miniaturized Electrochemical Immunosensor for SARS-CoV2 Detection in Saliva. Biosens. Bioelectron. 2021, 171, 10.1016/j.bios.2020.112686.
１．Wrappら、Science 367, 1260－1263 (2020)
２．van Grinsven, B.; Eersels, K.; Peeters, M.; Losada-Perez, P.; Vandenryt, T.; Cleij, T. J.; Wagner, P. The Heat-Transfer Method: A Versatile Low-Cost, Label-Free, Fast, and User-Friendly Readout Platform for Biosensor Applications. ACS Appl. Mater. Interfaces 2014, 6, 13309－13318.
３．Geerets, B.; Peeters, M.; van Grinsven, B.; Bers, K.; de Ceuninck, W.; Wagner, P. Optimizing the Thermal Read-out Technique for MIP-Based Biomimetic Sensors: Towards Nanomolar Detection Limits. Sensors 2013, 13, 9148－9159.
４．Diagnostics Wantai SARS-CoV-2. WANTAI SARS-CoV-2 Ag Rapid Test (Colloidal Gold); 2020.
５．Grant, B. D.; Anderson, C. E.; Williford, J. R.; Alonzo, L. F.; Glukhova, V. A.; Boyle, D. S.; Weigl, B. H.; Nichols, K. P. SARS-CoV-2 Coronavirus Nucleocapsid Antigen Detecting Half-Strip Lateral Flow Assay toward the Development of Point of Care Tests Using Commercially Available Reagents. Anal. Chem. 2020, 92, 11305－11309.
６．Zhang, C.; Zhou, L.; Du, K.; Zhang, Y.; Wang, J.; Chen, L.; Lyu, Y.; Li, J.; Liu, H.; Huo, J.; Li, F.; Wang, J.; Sang, P.; Lin, S.; Xiao, Y.; Zhang, K.; He, K. Foundation and Clinical Evaluation of a New Method for Detecting SARS-CoV-2 Antigen by Fluorescent Microsphere Immunochromatography. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2020, 10, 10.3389/fcimb.2020.553837.
７．Liu, D.; Ju, C.; Han, C.; Shi, R.; Chen, X.; Duan, D.; Yan, J.; Yan, X. Nanozyme Chemiluminescence Paper Test for Rapid and Sensitive Detection of SARS-CoV-2 Antigen. Biosens. Bioelectron. 2021, 173, 10.1016/j.bios.2020.112817.
８．Rahmati, Z.; Roushani, M.; Hosseini, H.; Choobin, H. Electrochemical Immunosensor with Cu2O Nanocube Coating for Detection of SARS-CoV-2 Spike Protein. Microchim. Acta 2021, 188, 10.1007/s00604-021-04762-04769.
９．Raziq, A.; Kidakova, A.; Boroznjak, R.; Reut, J.; Opik, A.; Syritski, V. Development of a Portable MIP-Based Electrochemical Sensor for Detection of SARS-CoV-2 Antigen. Biosens. Bioelectron. 2021, 178, 10.1016/j.bios.2021.113029.
１０．Seo, G.; Lee, G.; Kim, M. J.; Baek, S. H.; Choi, M.; Ku, K. B.; Lee, C. S.; Jun, S.; Park, D.; Kim, H. G.; Kim, S. J.; Lee, J. O.; Kim, B. T.; Park, E. C.; Kim, S. Il. Rapid Detection of COVID-19 Causative Virus (SARS-CoV-2) in Human Nasopharyngeal Swab Specimens Using Field-Effect Transistor-Based Biosensor. ACS Nano 2020, 14, 5135－5142.
１１．Moitra, P.; Alafeef, M.; Alafeef, M.; Alafeef, M.; Dighe, K.; Frieman, M. B.; Pan, D.; Pan, D.; Pan, D. Selective Naked-Eye Detection of SARS-CoV-2 Mediated by N Gene 11 Targeted Antisense Oligonucleotide Capped Plasmonic Nanoparticles. ACS Nano 2020, 14, 7617－7627.
１２．Mavrikou, S.; Moschopoulou, G.; Tsekouras, V.; Kintzios, S. Development of a Portable, Ultra-Rapid and Ultra-Sensitive Cell-Based Biosensor for the Direct Detection of the SARS-CoV-2 S1 Spike Protein Antigen. Sensors 2020, 20, 10.3390/s20113121.
１３．Zhang, M.; Li, X.; Pan, J.; Zhang, Y.; Zhang, L.; Wang, C. Ultrasensitive Detection of SARS-CoV-2 Spike Protein in Untreated Saliva Using SERS-Based Biosensor. Biosens. Bioelectron. 2021, 190, 10.1016/j.bios.2021.113421.
１４．Yakoh, A.; Pimpitak, U.; Rengpipat, S.; Hirankarn, N.; Chailapakul, O.; Chaiyo, S. PaperBased Electrochemical Biosensor for Diagnosing COVID-19: Detection of SARS-CoV-2 Antibodies and Antigen. Biosens. Bioelectron. 2021, 176, 10.1016/j.bios.2020.112912.
１５．Fabiani, L.; Saroglia, M.; Galata, G.; De Santis, R.; Fillo, S.; Luca, V.; Faggioni, G.; D’Amore, N.; Regalbuto, E.; Salvatori, P.; Terova, G.; Moscone, D.; Lista, F.; Arduini, F. Magnetic Beads Combined with Carbon Black-Based Screen-Printed Electrodes for COVID-19: A Reliable and Miniaturized Electrochemical Immunosensor for SARS-CoV2 Detection in Saliva. Biosens. Bioelectron. 2021, 171, 10.1016/j.bios.2020.112686.
【0150】
（配列の概要）
【0151】
【表2】
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図10E】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図14A】
【図14B】
【図15】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-09-27
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合ドメインの部分配列に対応するアミノ酸配列からなる鋳型分子に相補的な認識部位を少なくとも１つ含む分子インプリントポリマーであって、該アミノ酸配列が、長さが５０アミノ酸以下であり、配列ＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧを含み、
該ポリマーがモノマーとして
（ｉ）Ｎ－フルオレセイニルアクリルアミド、
（ｉｉ）アクリルアミド、
（ｉｉｉ）アクリル酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＴＢＡｃ）、
（ｉｖ）３－Ｏ－アクリロイル－１，２：５，６－ビス－Ｏ－イソプロピリデン－Ｄ－グルコフラノース、
（ｖ）メタクリル酸２，２，２－トリフルオロエチル（ＣＦ３）、
（ｖｉ）Ｎ－（３－アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（ＡＰＭＡ）、
（ｖｉｉ）スクアラミドモノマー７（ＳＱ７）、および
（ｖｉｉｉ）Ｎ，Ｎ’－メチレンビス（アクリルアミド）（ＢＩＳ）
を含む、分子インプリントポリマー。
【請求項2】
前記ポリマーのサイズが５００ｎｍ未満である、請求項１に記載の分子インプリントポリマー。
【請求項3】
前記ポリマーのサイズが２５０ｎｍ未満である、請求項１に記載の分子インプリントポリマー。
【請求項4】
前記ポリマーのサイズが１００ｎｍ未満である、請求項１に記載の分子インプリントポリマー。
【請求項5】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する認識部位を少なくとも１つ含む分子インプリントポリマーを調製する方法であって、（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合ドメインの部分配列に対応するアミノ酸配列からなる鋳型分子を有する担体物質を提供する工程であって、該鋳型分子が表面に露出するように該担体物質に固定化されている工程と、
（ｂ）該表面に接触させて重合性組成物を提供する工程と、
（ｃ）該表面に接触した該重合性組成物の制御重合を行って分子インプリントポリマーを生成する工程と、
（ｄ）該分子インプリントポリマーを該表面および該固定化された鋳型分子から分離する工程と、を含み、
該アミノ酸配列は、長さが５０アミノ酸以下であり、配列ＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧを含み、
該ポリマーは、モノマーとして
（ｉ）Ｎ－フルオレセイニルアクリルアミド、
（ｉｉ）アクリルアミド、
（ｉｉｉ）アクリル酸ｔｅｒｔ－ブチル（ＴＢＡｃ）、
（ｉｖ）３－Ｏ－アクリロイル－１，２：５，６－ｂｉｓ－Ｏ－イソプロピリデン－Ｄ－グルコフラノース、
（ｖ）メタクリル酸２，２，２－トリフルオロエチル（ＣＦ３）、
（ｖｉ）Ｎ－（３－アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（ＡＰＭＡ）、
（ｖｉｉ）スクアラミドモノマー７（ＳＱ７）、および
（ｖｉｉｉ）Ｎ，Ｎ’－メチレンビス（アクリルアミド）（ＢＩＳ）
を含む、方法。
【請求項6】
前記鋳型分子のＮ末端が追加のシステイン残基を含むように改変されている、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記鋳型分子が、前記システイン残基と前記鋳型の最後の残基との間にグリシン残基を含むように改変されている、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
（ｉ）請求項１から４のいずれかに記載の分子インプリントポリマーと、（ｉｉ）蛍光物質と、
を含む、複合体。
【請求項9】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出における、（１）請求項１から４のいずれかに記載の分子インプリントポリマー、または（２）請求項８に記載の複合体の使用。
【国際調査報告】