特表 2024-536816 細胞特異的免疫調節のためのアポリポタンパク質融合タンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-08

(54)【発明の名称】細胞特異的免疫調節のためのアポリポタンパク質融合タンパク質

(51)【国際特許分類】

   A61K 9/51 20060101AFI20241001BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20241001BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20241001BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20241001BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20241001BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241001BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20241001BHJP

   A61K 47/14 20170101ALI20241001BHJP

   A61K 38/19 20060101ALI20241001BHJP

   A61K 38/22 20060101ALI20241001BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20241001BHJP

   A61K 38/21 20060101ALI20241001BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241001BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20241001BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20241001BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20241001BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20241001BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241001BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20241001BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20241001BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20241001BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20241001BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20241001BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20241001BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20241001BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20241001BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241001BHJP

   C07K 14/475 20060101ALN20241001BHJP

   C07K 14/575 20060101ALN20241001BHJP

   C07K 14/54 20060101ALN20241001BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20241001BHJP

   C07K 14/705 20060101ALN20241001BHJP

【ＦＩ】

A61K9/51

C07K19/00 ZNA

C12N15/62 Z

A61K47/24

A61P37/02

A61P43/00 121

A61K47/28

A61K47/14

A61K38/19

A61K38/22

A61K38/20

A61K38/21

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61K39/395 G

A61K39/395 U

A61K38/02

A61K31/7088

A61P43/00 111

A61P43/00 117

A61K45/00

A61K47/64

A61P35/00

A61P29/00

A61P31/00

A61P37/08

A61P37/06

A61P31/04

A61P9/10

A61P25/00

A61P31/14

A61K48/00

C07K14/475

C07K14/575

C07K14/54

C07K16/28

C07K14/705

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024518291

(86)(22)【出願日】2022-09-23

(85)【翻訳文提出日】2024-04-15

(86)【国際出願番号】 EP2022076593

(87)【国際公開番号】W WO2023046931

(87)【国際公開日】2023-03-30

(31)【優先権主張番号】21198622.9

(32)【優先日】2021-09-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523480565

【氏名又は名称】バイオ－トリップ ベーフェー

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100126354

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 尚

(72)【発明者】

【氏名】ヴァン デア メール，ロイ

(72)【発明者】

【氏名】マルダー，ウィレム ジェイ．エム．

(72)【発明者】

【氏名】メルクス，マールテン

(72)【発明者】

【氏名】スヒレイヴル，デービッド ペピジン

(72)【発明者】

【氏名】デ ドレウ，アンネ

(72)【発明者】

【氏名】ホッケ，アイラ マルティン

(72)【発明者】

【氏名】デ ブルーイン，コーエン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA16

4C076AA65

4C076AA95

4C076BB13

4C076CC01

4C076CC03

4C076CC04

4C076CC07

4C076CC11

4C076CC13

4C076CC27

4C076CC29

4C076CC31

4C076CC32

4C076CC35

4C076CC41

4C076DD46

4C076DD63

4C076DD70

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF34

4C076FF68

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA13

4C084AA19

4C084BA03

4C084BA41

4C084BA44

4C084CA53

4C084DA01

4C084DA12

4C084DA13

4C084DA14

4C084DA15

4C084DA16

4C084DA19

4C084DA21

4C084DA25

4C084DB01

4C084DB52

4C084DB53

4C084DB54

4C084DB55

4C084DB56

4C084DB57

4C084DB58

4C084DB59

4C084DB61

4C084DC50

4C084MA02

4C084MA16

4C084MA38

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA11

4C084NA13

4C084ZA02

4C084ZA36

4C084ZB07

4C084ZB08

4C084ZB11

4C084ZB13

4C084ZB26

4C084ZB32

4C084ZB33

4C084ZB35

4C084ZC02

4C084ZC75

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB31

4C085BB36

4C085BB41

4C085BB44

4C085CC22

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE01

4C085EE03

4C085GG02

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA03

4C086MA05

4C086MA38

4C086NA05

4C086NA11

4C086NA13

4C086ZA02

4C086ZA36

4C086ZB07

4C086ZB08

4C086ZB11

4C086ZB13

4C086ZB26

4C086ZB32

4C086ZB33

4C086ZB35

4C086ZC02

4C086ZC75

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA41

4H045DA02

4H045DA04

4H045DA76

4H045EA22

4H045EA28

4H045EA61

4H045FA74

4H045GA15

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、アポリポタンパク質と免疫調節生体分子および／またはリルーティング分子との融合タンパク質に関する。融合タンパク質は、免疫調節生体分子自体のための担体として使用することができ、または脂質ナノ粒子に組み込むことができる。融合タンパク質は、免疫関連障害の治療、またはペイロードを特定の標的部位に標的化する使用を見出している。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

アポリポタンパク質脂質ナノ粒子であって、
アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物および免疫調節生体分子を含む融合タンパク質、および
リン脂質
を含み、
前記免疫調節生体分子が、免疫応答を増強または抑制するタンパク質である、アポリポタンパク質脂質ナノ粒子。

【請求項2】

アポリポタンパク質脂質ナノ粒子であって、
アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物およびリルーティング分子を含む融合タンパク質、および
リン脂質
を含み、
前記リルーティング分子は、その融合タンパク質が、前記アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物が結合したであろう標的とは異なる標的に結合すること、および／またはより高い親和性でその意図された標的に結合することを可能にする分子である、アポリポタンパク質脂質ナノ粒子。

【請求項3】

アポリポタンパク質脂質ナノ粒子であって、
アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、免疫調節生体分子、およびリルーティング分子を含む融合タンパク質、および
リン脂質
を含み、
前記免疫調節生体分子が、免疫応答を増強または抑制するタンパク質であり、
前記リルーティング分子は、その融合タンパク質が、前記アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物が結合したであろう標的とは異なる標的に結合すること、および／またはより高い親和性でその意図された標的に結合することを可能にする分子である、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物。

【請求項4】

請求項１に定義される融合タンパク質、
請求項２に定義される融合タンパク質、および
リン脂質
を含む、アポリポタンパク質脂質ナノ粒子。

【請求項5】

前記アポリポタンパク質脂質ナノ粒子がステロールをさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。

【請求項6】

前記アポリポタンパク質脂質ナノ粒子が、脂質、好ましくはトリグリセリドをさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。

【請求項7】

前記アポリポタンパク質脂質ナノ粒子が、球体、リボンまたはディスクである、請求項１から６のいずれか一項に記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。

【請求項8】

前記融合タンパク質の少なくとも一部が、前記アポリポタンパク質脂質ナノ粒子を取り囲む環境に曝露され、好ましくは前記免疫調節生体分子および／または前記リルーティング分子が、前記アポリポタンパク質脂質ナノ粒子を取り囲む前記環境に曝露される、請求項１から７のいずれか一項に記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。

【請求項9】

前記免疫調節生体分子が、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、成長因子、造血成長因子、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１または３から８のいずれか一項に記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。

【請求項10】

前記サイトカインが、ＩＬ－２サブファミリー、インターフェロンサブファミリー、ＩＬ－１０サブファミリー、ＩＬ－１ファミリー、ＴＧＦβファミリーまたはＩＬ－１７ファミリーおよびそれらの組合せからなる群から選択され、より好ましくは、前記サイトカインが、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－３８およびそれらの組合せからなる群から選択され、かつ／または
前記ケモカインが、ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン、Ｃケモカイン、ＣＸ_３Ｃケモカイン、およびそれらの組合せからなる群から選択され、かつ／または
前記成長因子は、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＣＮＴＦ、ＬＩＦ、エフリン、ＦＧＦ、ＧＤＮＦ、ＨＤＦ、ＨＤＧＦ、ＩＧＦ、ＫＧＦ、ＭＳＦ、ＮＲＧ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ニューロトロフィン、ＰＧＦ、ＰＤＧＦ、ＲＮＬＳ、ＴＣＧＦ、ＴＧＦ、ＴＮＦ、およびＷＮＴ、ならびにそれらの組合せからなる群から選択され、かつ／または
前記造血成長因子が、ＩＬ－３、ＣＳＦ－１（Ｍ－ＣＳＦ）、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、インターロイキンまたはエリスロポエチンのＩＬ－１２ファミリーのメンバー、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項９に記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。

【請求項11】

前記サイトカインがＩＬ－４である、請求項９または１０に記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。

【請求項12】

前記リルーティング分子が、抗体またはその抗原結合断片、リルーティングペプチドまたはリルーティングタンパク質から選択され、好ましくは、前記リルーティングペプチドまたはリルーティングタンパク質が、前記標的に存在する受容体のリガンドである、請求項２から１１のいずれか一項に記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。

【請求項13】

前記抗体またはその抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ_２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｄＡｂ－Ｆｃ、遊離軽鎖抗体、半抗体、二重特異性Ｆａｂ２、Ｆａｂ_３、三重特異性Ｆａｂ３ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、トリアボディ、三重特異性トリアボディ、ミニボディ、ＩｇＧ、ＩｇＮＡＲ、一価ＩｇＧ、Ｖ_ｈＨ、および可変新規抗原受容体（ＶＮＡＲ）からなる群から選択される、請求項１２に記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。

【請求項14】

前記リルーティング分子が、造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）、例えば造血幹細胞（ＨＳＣ）、多分化能前駆（ＭＰＰ）または共通骨髄前駆細胞（ＣＭＰ）に結合することができる、請求項２から１３のいずれか一項に記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。

【請求項15】

前記リルーティング分子が、巨核球、好酸球、好塩基球、赤血球、単球、例えば樹状細胞またはマクロファージ、および好中球からなる群から選択される骨髄系細胞に結合することができる、請求項２から１３のいずれか一項に記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。

【請求項16】

前記リルーティングペプチドがＳＩＲＰαである、請求項１５に記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。

【請求項17】

前記リルーティング分子が、非骨髄系細胞、例えば非骨髄性免疫細胞または内皮細胞に結合することができる、請求項２から１３のいずれか一項に記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。

【請求項18】

前記リルーティング分子が、リンパ球、好ましくはＴ細胞、より好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞に結合することができる、請求項１７に記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。

【請求項19】

前記リルーティング分子が、ＣＤ８に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片であるか、または前記リルーティングペプチドがＰＤ１、ＣＤ４０ＬもしくはＧＰ１２０である、請求項１７に記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。

【請求項20】

前記アポリポタンパク質が、ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＡ－１ Ｍｉｌａｎｏ、ＡｐｏＡ４、ＡｐｏＣ３、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＬ１、ＡｐｏＬ３であるか、または前記アポリポタンパク質模倣物が、ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＡ－１ Ｍｉｌａｎｏ、ＡｐｏＡ４、ＡｐｏＣ３、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＬ１、ＡｐｏＬ３の模倣物である、請求項１から１９のいずれか一項に記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。

【請求項21】

前記アポリポタンパク質脂質ナノ粒子が、ペイロードを含み、好ましくは前記ペイロードが、核酸もしくは核酸類似体、治療薬、バイオロジックまたはそれらの組合せから選択される、請求項１から２０のいずれか一項に記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。

【請求項22】

請求項１から２１のいずれか一項に定義されるアポリポタンパク質脂質ナノ粒子を製造する方法であって、
ａ１）１つまたはそれ以上の単離されたアポリポタンパク質融合タンパク質を得るために、１つまたはそれ以上のアポリポタンパク質融合タンパク質を発現および単離する工程であって、
前記１つまたはそれ以上のアポリポタンパク質融合タンパク質が、
免疫調節生体分子に融合したアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、
リルーティング分子に融合したアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、
免疫調節生体分子およびリルーティング分子に融合したアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、および
それらの組合せ
からなる群から選択される、工程、および／または
ａ２）１つまたはそれ以上のアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物を化学的にコンジュゲートし、前記１つまたはそれ以上のコンジュゲートされたアポリポタンパク質を単離して、１つまたはそれ以上の単離されたコンジュゲートされたアポリポタンパク質を得る工程であって、
前記１つまたはそれ以上のコンジュゲートされたアポリポタンパク質が、
免疫調節生体分子にコンジュゲートされたアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、
リルーティング分子にコンジュゲートされたアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、
免疫調節生体分子およびリルーティング分子にコンジュゲートされたアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、および
それらの組合せ
からなる群から選択される、工程、および
ｂ）工程ａ１で得られた前記１つまたはそれ以上の単離されたアポリポタンパク質融合タンパク質および／または工程ａ２で得られた前記１つまたはそれ以上の単離されたコンジュゲートされたアポリポタンパク質を、リン脂質、ならびに任意選択でステロールおよび／または脂質と組み合わせて、アポリポタンパク質脂質ナノ粒子を得る工程
を含む、方法。

【請求項23】

請求項２２に記載の方法によって得られる、または得ることができるアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。

【請求項24】

請求項１から２１または２３のいずれか一項に記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。

【請求項25】

医薬品として使用するための、請求項１から２１または２３のいずれか一項に記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子、または請求項２４に記載の医薬組成物。

【請求項26】

請求項１から２１または２３のいずれか一項に記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子、または免疫関連障害の治療に使用するための、請求項２４に記載の医薬組成物。

【請求項27】

前記免疫関連障害が、癌、炎症、感染症、自己免疫障害、アレルギー、臓器移植拒絶、および移植片対宿主病（ＧＶＨ）からなる群から選択される、請求項２６に記載の使用のためのアポリポタンパク質脂質ナノ粒子、または請求項２６に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項28】

前記免疫調節生体分子がＩＬ－４であり、前記免疫関連障害が、過剰炎症とそれに続く免疫麻痺の状態であり、好ましくは前記過剰炎症および／または前記免疫麻痺が、例えば、敗血症、心筋梗塞、脳卒中、癌、または多発性硬化症によるＣＯＶＩＤ－１９などの感染症によって引き起こされる、請求項２６に記載の使用のためのアポリポタンパク質脂質ナノ粒子、または請求項２６に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項29】

前記免疫調節生体分子を標的細胞に標的化する際に使用するための、請求項１、３から２１もしくは２３のいずれか一項に記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子または請求項２４に記載の医薬組成物。

【請求項30】

前記免疫調節生体分子を骨髄系細胞に標的化する際に使用するための、請求項１、３から１３、１５、１６、２０、２１もしくは２３のいずれか一項に記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子、または請求項２４に記載の医薬組成物。

【請求項31】

免疫調節生体分子を標的に送達するための、好ましくは前記標的が細胞、組織および／または器官である、請求項１、３から２１または２３のいずれか一項に記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子の使用。

【請求項32】

アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物および免疫調節生体分子を含む融合タンパク質であって、免疫調節生体分子は、前記免疫調節生体分子を骨髄系細胞に標的化する際に使用するための、免疫応答を増強または抑制するタンパク質である、融合タンパク質。

【請求項33】

前記融合タンパク質が、リルーティング分子をさらに含み、前記リルーティング分子が、その融合タンパク質が、前記アポリポタンパク質もしくはアポリポタンパク質模倣物が結合したであろう標的とは異なる標的に結合すること、および／またはより高い親和性でその意図された標的に結合することを可能にする分子であり、好ましくは、前記リルーティング分子が、請求項１５に定義されるリルーティング分子である、請求項３２に記載の使用のための融合タンパク質。

【請求項34】

アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物およびリルーティング分子を含む融合タンパク質であって、リルーティング分子は、融合タンパク質が、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物が結合したであろう標的とは異なる標的に結合すること、および／またはより高い親和性でその意図された標的に結合することを可能にする分子である、融合タンパク質。

【請求項35】

前記リルーティング分子が、請求項１２から１９のいずれか一項に定義されるリルーティング分子である、請求項３４に記載の融合タンパク質。

【請求項36】

前記融合タンパク質が免疫調節生体分子をさらに含み、前記免疫調節生体分子が免疫応答を増強または抑制するタンパク質であり、好ましくは前記免疫調節生体分子が請求項９または１０に定義される免疫調節生体分子である、請求項３４または３５に記載の融合タンパク質。

【請求項37】

請求項３４から３６のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。

【請求項38】

請求項３４から３６のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項３７に記載の核酸と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。

【請求項39】

医薬品として使用するための、請求項３４から３６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項３７に記載の核酸、または請求項３８に記載の医薬組成物。

【請求項40】

免疫関連障害の治療に使用するための、好ましくは、前記免疫関連障害が、癌、炎症、感染症、自己免疫障害、アレルギー、臓器移植拒絶、および移植片対宿主病（ＧＶＨ）からなる群から選択される免疫関連障害である、請求項３４から３６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項３７に記載の核酸、または請求項３８に記載の医薬組成物。

【請求項41】

前記免疫調節生体分子を標的細胞に標的化する際に使用するための、請求項３６に記載の融合タンパク質、請求項３６に記載の融合タンパク質をコードする核酸、または請求項３６に従属する場合、請求項３８に記載の医薬組成物。

【請求項42】

アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物およびインターロイキン－４（ＩＬ－４）を含む融合タンパク質。

【請求項43】

前記融合タンパク質がリルーティング分子をさらに含み、前記リルーティング分子が、その融合タンパク質が、前記アポリポタンパク質もしくはアポリポタンパク質模倣物が結合したであろう標的とは異なる標的に結合すること、および／またはより高い親和性でその意図された標的に結合することを可能にする分子であり、好ましくは、前記リルーティング分子が、請求項１２から１９のいずれか一項に定義されるリルーティング分子である、請求項４２に記載の融合タンパク質。

【請求項44】

前記アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物が請求項２０に定義される、請求項４２または４３に記載の融合タンパク質。

【請求項45】

請求項４２から４４のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。

【請求項46】

請求項４２から４４のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項４５に記載の核酸と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。

【請求項47】

医薬品として使用するための、請求項４２から４４のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項４５に記載の核酸、または請求項４６に記載の医薬組成物。

【請求項48】

免疫関連障害の前記治療に使用するための、請求項４２から４４のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項４５に記載の核酸、または請求項４６に記載の医薬組成物。

【請求項49】

前記免疫関連障害が、過剰炎症とそれに続く免疫麻痺の状態であり、好ましくは、前記過剰炎症および／または前記免疫麻痺が、敗血症、心筋梗塞、脳卒中、癌、または多発性硬化症によるＣＯＶＩＤ－１９などの感染症によって引き起こされる、請求項４８に記載の使用のための融合タンパク質、請求項４８に記載の使用のための核酸、または請求項４８に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項50】

ＩＬ－４を標的細胞に標的化する際に使用するための、請求項４２から４４のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項４５に記載の核酸、または請求項４６に記載の医薬組成物。

【請求項51】

ＩＬ－４を骨髄系細胞に標的化する際に使用するための、請求項４２から４４のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項４５に記載の核酸、または請求項４６に記載の医薬組成物。

【請求項52】

骨髄標的化分子およびＩＬ－４を含む融合タンパク質であって、前記骨髄標的化分子が前記ＩＬ－４を骨髄系細胞に標的化することができる、融合タンパク質。

【請求項53】

前記ＩＬ－４が、配列番号４３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一のアミノ酸配列、またはその環状置換を含むポリペプチドである、請求項５２に記載の融合タンパク質。

【請求項54】

前記骨髄標的化分子が、抗体もしくはその抗原結合断片、骨髄標的化ペプチドまたは骨髄標的化タンパク質から選択され、好ましくは前記骨髄標的化ペプチドまたは骨髄標的化タンパク質が、前記標的に存在する受容体のリガンドである、請求項５２または５３に記載の融合タンパク質。

【請求項55】

前記抗体またはその抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ_２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｄＡｂ－Ｆｃ、遊離軽鎖抗体、半抗体、二重特異性Ｆａｂ２、Ｆａｂ_３、三重特異性Ｆａｂ３ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、トリアボディ、三重特異性トリアボディ、ミニボディ、ＩｇＧ、ＩｇＮＡＲ、一価ＩｇＧ、Ｖ_ｈＨまたはＶＮＡＲから選択される、請求項５４に記載の融合タンパク質。

【請求項56】

請求項５２から５５のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。

【請求項57】

配列番号４４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一の核酸配列を含むか、または、配列番号４３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一の配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含み、骨髄系細胞における標的化発現のための手段をさらに含む核酸であって、
前記手段が、
－前記核酸に作動可能に連結された前記骨髄系細胞における選択的または誘導的発現のためのプロモーター、または
－前記骨髄系細胞において前記核酸を安定的に発現することができる前記核酸を含むウイルス発現ベクター、または
－１つまたはそれ以上のアポリポタンパク質、リン脂質、前記核酸、および任意選択でステロールを含む脂質ナノ粒子
から選択される、核酸。

【請求項58】

請求項５２から５５のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項５６もしくは５７に記載の核酸と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。

【請求項59】

医薬品として使用するための、請求項５２から５５のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項５６もしくは５７に記載の核酸、または請求項５８に記載の医薬組成物。

【請求項60】

免疫関連障害の前記治療に使用するための、請求項５２から５５のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項５６もしくは５７に記載の核酸、または請求項５８に記載の医薬組成物。

【請求項61】

前記免疫関連障害が、過剰炎症とそれに続く免疫麻痺の状態であり、好ましくは、前記過剰炎症および／または前記免疫麻痺が、敗血症、心筋梗塞または脳卒中によるＣＯＶＩＤ－１９などの感染症によって引き起こされる、請求項６０に記載の使用のための融合タンパク質、請求項６０に記載の使用のための核酸、または請求項６０に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項62】

細胞、器官、組織または生物における訓練された免疫の刺激または促進におけるＩＬ－４のインビボ、インビトロまたはエクスビボでの使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、融合タンパク質の分野に関し、より詳細には、免疫関連障害の治療に使用が見出される融合タンパク質に関する。本発明はさらに、融合タンパク質を含む脂質ナノ粒子およびその作製方法に関する。最後に、本発明は、融合タンパク質または脂質ナノ粒子を使用する治療の方法に関する。

【背景技術】

【0002】

多くの有望な治療薬は、身体からの治療薬の急速な除去に起因する循環時間の不足によって妨げられる。例えば、サイトカインは、多くの免疫学的用途において非常に有望な用途を保持し得ることが見出された。しかしながら、体内での非常に短い半減期のために、意図された標的に効果を及ぼすことができないか、または効果を達成するために毒の量が必要であるかのいずれかである。したがって、治療薬の循環半減期を安全に減少させるための改善された方法が必要とされている。

【0003】

さらに、多くの有望な治療薬は、意図された標的部位に到達しないか、または不十分であるか、または望ましくないオフターゲット効果を示すという事実に苛まされている。したがって、治療薬の標的化を改善することがさらに必要とされている。

【0004】

とりわけ、これらの問題は、添付の特許請求の範囲に定義される生成物および方法によって対処される。

【発明の概要】

【0005】

本発明は、アポリポタンパク質が、治療薬の担体として使用することができ、アポリポタンパク質が特定の細胞、組織または器官を標的とするようにさらに修飾され得るという本発明者らの発見に基づく。本発明者らは、サイトカインなどの免疫調節生体分子とアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物との融合タンパク質が、血中での半減期の大幅な延長を示し、それにより、毒性濃度の投与を必要とせずに治療の方式でサイトカインなどの免疫調節生体分子を使用する可能性が開かれることを見出した。さらに、アポリポタンパク質またはその模倣物は、一緒に融合された場合、サイトカインなどの免疫調節生体分子の標的化を可能にすることが理解された。

【0006】

融合タンパク質またはアポリポタンパク質（またはその模倣物）を、それをリルーティング分子に連結することによって意図された標的に向けることが可能であることがさらに認識された。さらに、本発明者らは、予想外にも、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物への免疫調節生体分子および／またはリルーティング分子の融合が、前記免疫調節生体分子および／またはリルーティング分子を脂質ナノ粒子に容易に組み込み、前記免疫調節生体分子および／またはリルーティング分子を前記脂質ナノ粒子を取り囲む環境に曝露することを可能にすることを見出した。このようにすると、アポリポタンパク質（またはその模倣物）または融合タンパク質が、さもなければ到達しないかまたは不十分な到達の細胞、組織または器官に標的化され得るか、またはオフターゲット効果を低減するために使用され得る。

【0007】

融合タンパク質は、そのまま使用され得る、つまりリポタンパク質または脂質ナノ粒子の一部としてではないことを意味する。このようにすると、融合タンパク質は、免疫調節生体分子を標的部位に送達するための担体として役立ち得る。あるいは、融合タンパク質は、脂質ナノ粒子を調製するために使用され得る。

【0008】

本発明の第１の態様は、アポリポタンパク質脂質ナノ粒子であって、
アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物および免疫調節生体分子を含む融合タンパク質、および
リン脂質、を含み、
免疫調節生体分子が、免疫応答を増強または抑制するタンパク質である、アポリポタンパク質脂質ナノ粒子を提供する。

【0009】

本発明のさらなる態様は、アポリポタンパク質脂質ナノ粒子であって、
アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物およびリルーティング分子を含む融合タンパク質、および
リン脂質、を含み、
リルーティング分子は、その融合タンパク質が、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物が結合したであろう標的とは異なる標的に結合すること、および／またはより高い親和性でその意図された標的に結合することを可能にする分子である、アポリポタンパク質脂質ナノ粒子を提供する。

【0010】

本発明のさらなる態様は、アポリポタンパク質脂質ナノ粒子であって、
アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、免疫調節生体分子、およびリルーティング分子を含む融合タンパク質、および
リン脂質、を含み、
免疫調節生体分子が、免疫応答を増強または抑制するタンパク質であり、
リルーティング分子は、その融合タンパク質が、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物が結合したであろう標的とは異なる標的に結合すること、および／またはより高い親和性でその意図された標的に結合することを可能にする分子である、アポリポタンパク質脂質ナノ粒子を提供する。

【0011】

本発明のさらなる態様は、アポリポタンパク質脂質ナノ粒子であって、
アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、および免疫調節生体分子を含む融合タンパク質であって、免疫調節生体分子が免疫応答を増強または抑制するタンパク質である、融合タンパク質、
アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、およびリルーティング分子を含む融合タンパク質であって、リルーティング分子が、その融合タンパク質が、アポリポタンパク質もしくはアポリポタンパク質模倣物が結合したであろう標的とは異なる標的に結合すること、および／またはより高い親和性でその意図された標的に結合することを可能にする分子である、融合タンパク質、および
リン脂質、を含む、アポリポタンパク質脂質ナノ粒子を提供する。

【0012】

本発明のさらなる態様は、本明細書に記載されているアポリポタンパク質脂質ナノ粒子を製造する方法であって、
ａ１）１つまたはそれ以上の単離されたアポリポタンパク質融合タンパク質を得るために、１つまたはそれ以上のアポリポタンパク質融合タンパク質を発現および単離する工程であって、
１つまたはそれ以上のアポリポタンパク質融合タンパク質が、
免疫調節生体分子に融合したアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、
リルーティング分子に融合したアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、
免疫調節生体分子およびリルーティング分子に融合したアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、および
それらの組合せ
からなる群から選択される、工程、および／または
ａ２）１つまたはそれ以上のアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物を化学的にコンジュゲートし、１つまたはそれ以上のコンジュゲートされたアポリポタンパク質を単離して、１つまたはそれ以上の単離されたコンジュゲートされたアポリポタンパク質を得る工程であって、
１つまたはそれ以上のコンジュゲートされたアポリポタンパク質が、
免疫調節生体分子にコンジュゲートされたアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、
リルーティング分子にコンジュゲートされたアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、
免疫調節生体分子およびリルーティング分子にコンジュゲートされたアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、および
それらの組合せ
からなる群から選択される、工程、および
ｂ）工程ａ１で得られた１つまたはそれ以上の単離されたアポリポタンパク質融合タンパク質および／または工程ａ２で得られた１つまたはそれ以上の単離されたコンジュゲートされたアポリポタンパク質を、リン脂質、ならびに任意選択でステロールおよび／または脂質と組み合わせて、アポリポタンパク質脂質ナノ粒子を得る工程
を含む、方法を提供する。

【0013】

本発明のさらなる態様は、本明細書に教示される方法によって得られる、またはそれによって得ることができるアポリポタンパク質脂質ナノ粒子を提供する。

【0014】

本発明のさらなる態様は、本明細書で教示されるアポリポタンパク質脂質ナノ粒子と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。

【0015】

本発明のさらなる態様は、医薬品として使用するための、本明細書で教示されるアポリポタンパク質脂質ナノ粒子または本明細書で教示される医薬組成物を提供する。

【0016】

本発明のさらなる態様は、免疫関連障害の治療に使用するための、本明細書で教示されるアポリポタンパク質脂質ナノ粒子または本明細書で教示される医薬組成物を提供する。

【0017】

本発明のさらなる態様は、前記免疫調節生体分子を標的細胞、好ましくは骨髄系細胞に標的化する際に使用するための、本明細書において教示されるアポリポタンパク質脂質ナノ粒子または本明細書において教示される医薬組成物を提供する。

【0018】

本発明のさらなる態様は、免疫調節生体分子を標的に送達するための、好ましくは標的が細胞、組織および／または器官である、本明細書において教示されるアポリポタンパク質脂質ナノ粒子の使用を提供する。

【0019】

本発明のさらなる態様は、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物および免疫調節生体分子を含む融合タンパク質であって、免疫調節生体分子は、前記免疫調節生体分子を骨髄系細胞に標的化する際に使用するための、免疫応答を増強または抑制するタンパク質である、融合タンパク質を提供する。

【0020】

本発明のさらなる態様は、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物およびリルーティング分子を含む融合タンパク質であって、リルーティング分子は、融合タンパク質が、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物が結合したであろう標的とは異なる標的に結合すること、および／またはより高い親和性でその意図された標的に結合することを可能にする分子である、融合タンパク質を提供する。

【0021】

本発明のさらなる態様は、本明細書において教示されるアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物およびリルーティング分子を含む融合タンパク質をコードする核酸を提供する。

【0022】

本発明のさらなる態様は、本明細書で教示される融合タンパク質、本明細書で教示される核酸、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

【0023】

本発明のさらなる態様は、医薬品として使用するための、本明細書で教示される融合タンパク質、本明細書で教示される核酸、または本明細書で教示される医薬組成物を提供する。

【0024】

本発明のさらなる態様は、免疫関連障害の治療に使用するための本明細書に教示される融合タンパク質、本明細書に教示される核酸または本明細書に教示される医薬組成物を提供し、好ましくは、免疫関連障害は、癌、炎症、感染症、自己免疫障害、アレルギー、臓器移植拒絶および移植片対宿主病（ＧＶＨ）からなる群から選択される免疫関連障害である。

【0025】

さらなる態様は、本明細書に教示される融合タンパク質、本明細書に教示される融合タンパク質をコードする核酸、または免疫調節生体分子を含む場合、本明細書に教示される医薬組成物を提供し、免疫調節生体分子は、前記免疫調節生体分子を標的細胞に標的化する際に使用するための、免疫応答を増強または抑制するタンパク質である。

【0026】

実施例の節によって支持されるように、本発明者らは、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、好ましくはＡｐｏＡ１とＩＬ－４との融合タンパク質が、ＩＬ－４を骨髄区画に標的化することを可能にすることを見出した。彼らが驚いたことに、本発明者らは、ＩＬ－４が同時に炎症を軽減し、特に骨髄区画に標的化された場合に、訓練された免疫を誘導することができることを見出した。したがって、本発明者らは、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、好ましくはＡｐｏＡ１とＩＬ－４との融合タンパク質を使用して、訓練された免疫を促進することによって免疫関連障害を予防することができると結論付けた。さらに、本発明者らは、前記融合タンパク質を骨髄系細胞親和性脂質ナノ粒子に組み込むことによって、自然免疫細胞に対するＩＬ－４の薬物動態学的プロファイルおよびバイオアベイラビリティをさらに改善することができることを見出した。そのようなＩＬ－４融合タンパク質の脂質ナノ粒子への組み込みは、骨髄区画を標的とするその能力を妨げない。

【0027】

したがって、本発明のさらなる態様は、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物およびインターロイキン－４（ＩＬ－４）を含む融合タンパク質を提供する。

【0028】

本発明のさらなる態様は、本明細書において教示されるアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物およびインターロイキン－４（ＩＬ－４）を含む融合タンパク質をコードする核酸を提供する。

【0029】

本発明のさらなる態様は、本明細書において教示されるアポリポタンパク質もしくはアポリポタンパク質模倣物およびインターロイキン－４（ＩＬ－４）を含む融合タンパク質、または本明細書において教示される前記融合タンパク質をコードする核酸、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

【0030】

本発明のさらなる態様は、本明細書において教示されるアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物およびインターロイキン－４（ＩＬ－４）を含む融合タンパク質、本明細書において教示されるそのような融合タンパク質をコードする核酸、または医薬品として使用するためのそのような融合タンパク質もしくは核酸を含む医薬組成物を提供する。

【0031】

本発明のさらなる態様は、本明細書において教示されるアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物およびインターロイキン－４（ＩＬ－４）を含む融合タンパク質、本明細書において教示されるようなそのような融合タンパク質をコードする核酸、または免疫関連障害の治療において使用するためのそのような融合タンパク質もしくは核酸を含む医薬組成物を提供し、好ましくは、免疫関連障害は、過剰炎症とそれに続く免疫麻痺の状態であり、好ましくは、過剰炎症および／または免疫麻痺は、敗血症、心筋梗塞、脳卒中、癌、または多発性硬化症によるＣＯＶＩＤ－１９などの感染症によって引き起こされる。

【0032】

本発明のさらなる態様は、本明細書において教示されるアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物およびインターロイキン－４（ＩＬ－４）を含む融合タンパク質、本明細書において教示されるそのような融合タンパク質をコードする核酸、またはＩＬ－４を標的細胞、好ましくは骨髄系細胞に標的化する際に使用するためのそのような融合タンパク質または核酸を含む医薬組成物を提供する。

【0033】

本発明のさらなる態様は、骨髄標的化分子およびＩＬ－４を含む融合タンパク質であって、骨髄標的化分子がＩＬ－４を骨髄系細胞に標的化することができる融合タンパク質を提供する。

【0034】

本発明のさらなる態様は、本明細書中で教示されるような骨髄標的化分子およびＩＬ－４を含む融合タンパク質をコードする核酸を提供する。

【0035】

本発明のさらなる態様は、配列番号４４と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の核酸配列を含むか、または、配列番号４３と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含み、骨髄系細胞における標的化発現のための手段をさらに含む核酸であって、前記手段が、
－前記核酸に作動可能に連結された前記骨髄系細胞における選択的または誘導的発現のためのプロモーター、または
－前記骨髄系細胞において前記核酸を安定して発現することができる前記核酸を含むウイルス発現ベクター、または
－１つまたはそれ以上のアポリポタンパク質、リン脂質、前記核酸および任意選択でステロールを含む脂質ナノ粒子から選択される核酸を提供する。

【0036】

本発明のさらなる態様は、本明細書において教示される骨髄標的化分子およびＩＬ－４を含む融合タンパク質、または本明細書において教示される前記融合タンパク質をコードする核酸、または本明細書において教示される骨髄系細胞における標的化発現のための手段を含む核酸、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

【0037】

本発明のさらなる態様では、本明細書において教示される骨髄標的化分子およびＩＬ－４を含む融合タンパク質、または本明細書において教示される前記融合タンパク質をコードする核酸、または本明細書において教示される骨髄系細胞における標的化発現のための手段を含む核酸、または医薬品として使用するための本明細書において教示される前記融合タンパク質もしくは核酸を含む医薬組成物。

【0038】

本発明のさらなる態様は、本明細書において教示される骨髄標的化分子およびＩＬ－４を含む融合タンパク質、または本明細書において教示される前記融合タンパク質をコードする核酸、または本明細書において教示される骨髄系細胞における標的化発現のための手段を含む核酸、または免疫関連障害の治療における使用のための、本明細書において教示される前記融合タンパク質もしくは核酸を含む医薬組成物を提供する。

【0039】

本発明のさらなる態様は、細胞、器官、組織または生物における訓練された免疫を刺激または促進する際のＩＬ－４のインビボ、インビトロ、またはエクスビボでの使用を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0040】

【図1】脂質ナノ粒子（球体またはディスク）における例示的なアポリポタンパク質融合の任意選択の集合およびその後の標的細胞への結合の概略的概観を示す。

【0041】

【図2】異なる想定されるアポリポタンパク質およびその後の脂質ナノ粒子における集合の概略的概観を示す。以下の融合タンパク質が示されている（模式的に）：左上には、免疫調節生体分子に融合したアポリポタンパク質とリルーティング分子に融合したアポリポタンパク質の両方が示されている。左下は、免疫調節生体分子に融合したアポリポタンパク質を示す。右上は、リルーティング分子に融合したアポリポタンパク質を示す。右下は、免疫調節生体分子およびリルーティング分子に融合したアポリポタンパク質を示す。

【0042】

【図3-1】異なるアポリポタンパク質融合構築物（ＡｐｏＡ１－ＩＬ１Ｂ、ＡｐｏＡ１－ＩＬ３８、ＡｐｏＡ１－ＩＬ２）の発現および精製を実証するＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。矩形は、所望のタンパク質に対応するバンドを示す。（Ｐ：細胞の残屑を含むペレット、ＳＮ：可溶性タンパク質画分を含む上清、ＦＴ：Ｎｉ－ＮＴＡカラムに適用されたＳＮのフロースルー、Ａ：１０ｍＭのイミダゾールを使用した１回目の洗浄、Ａ５０：５０ｍＭのイミダゾールを使用した２回目の洗浄、Ｅ１：溶出画分１、Ｅ２：溶出画分２、Ｅ３：溶出画分３、Ｅ４：溶出画分４、ＦＷ：５００ｍＭのイミダゾールを使用した最終洗浄。）

【図3-2】異なるアポリポタンパク質融合構築物（ＡｐｏＡ１－ＩＬ１Ｂ、ＡｐｏＡ１－ＩＬ３８、ＡｐｏＡ１－ＩＬ２）の発現および精製を実証するＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。矩形は、所望のタンパク質に対応するバンドを示す。（Ｐ：細胞の残屑を含むペレット、ＳＮ：可溶性タンパク質画分を含む上清、ＦＴ：Ｎｉ－ＮＴＡカラムに適用されたＳＮのフロースルー、Ａ：１０ｍＭのイミダゾールを使用した１回目の洗浄、Ａ５０：５０ｍＭのイミダゾールを使用した２回目の洗浄、Ｅ１：溶出画分１、Ｅ２：溶出画分２、Ｅ３：溶出画分３、Ｅ４：溶出画分４、ＦＷ：５００ｍＭのイミダゾールを使用した最終洗浄。）

【0043】

【図4】４つの脂質ナノ粒子についての動的光散乱測定の結果を示し、そのうちの３つはそれぞれ異なるアポリポタンパク質（ＡｐｏＡ１－ＩＬ１Ｂ、ＡｐｏＡ１－ＩＬ３８、ＡｐｏＡ１－ＩＬ４）を含有し、１つは対照ナノ粒子としてａｐｏＡ１を含有する。平均数直径（濃い灰色）および多分散性指数（ＰｄＩ）（薄い灰色）を、１１日間にわたって、これらのナノ粒子について判定した。

【0044】

【図5】１４７または２７９のいずれかの位置にセリンからシステインへの変異が導入されたａｐｏＡ１の発現および精製を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。矩形は、変異したａｐｏＡ１に対応するバンドを示す。

【0045】

【図6-1】ａｐｏＡ１変異体の四重極飛行時間（Ｑ－ＴｏＦ）の結果を示す。両方のグラフにおいて、クロマトグラムは右上隅にプロットされており、この下にクロマトグラムからのメインピークのｍ／ｚ値がある。デコンボリューションされた質量スペクトルは、所望の突然変異体ａｐｏＡ１タンパク質が存在することを示す。

【図6-2】ａｐｏＡ１変異体の四重極飛行時間（Ｑ－ＴｏＦ）の結果を示す。両方のグラフにおいて、クロマトグラムは右上隅にプロットされており、この下にクロマトグラムからのメインピークのｍ／ｚ値がある。デコンボリューションされた質量スペクトルは、所望の突然変異体ａｐｏＡ１タンパク質が存在することを示す。

【0046】

【図7】１つのＮ末端アジドを含むように修飾されたインターロイキン（ＩＬ）－４のＨＰＬＣ－ＭＳクロマトグラムを示す。クロマトグラムのピークが示すタンパク質に対応する質量を示す。

【0047】

【図8】使用したＩＬ－４、Ｎ末端アジドで修飾されたＩＬ－４（４°Ｃまたは２０°Ｃでの反応）、ＰＥＧ－リンカー含有ＤＢＣＯ基に連結されたａｐｏＡ１、およびアジドを含むように修飾されたＩＬ－４をリンカーおよびＤＢＣＯ基を介してａｐｏＡ１に連結した反応生成物（４°Ｃまたは２０°Ｃでの反応）の純度を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。矩形は、所望のコンジュゲーション生成物に対応するバンドを示す。

【0048】

【図9】市販のＩＬ－４（哺乳動物）、組換え発現されたＩＬ－４（細菌）、組換え発現されたａｐｏＡ１－ＩＬ４融合タンパク質および化学的にコンジュゲートされたａｐｏＡ１－ＩＬ４融合タンパク質の結合を評価するＨＥＫ２９３ ＩＬ－４レポーター細胞アッセイの結果を示す。吸光度は、ＩＬ－４のその受容体への結合レベルに対応する。

【0049】

【図10】化学的ａｐｏＡ１－ＩＬ２融合構築物（右パネル）および組換えａｐｏＡ１－ＩＬ２融合構築物（左パネル）（ａｐｏＡ１－ＩＬ２野生型「ＡｐｏＡ１－ＩＬ２」またはａｐｏＡ１－ＩＬ２変異体「ＡｐｏＡ１－ＩＬ２ｖ４」）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。長方形は、それぞれａｐｏＡ１－ＩＬ２またはａｐｏＡ１－ＩＬ２ｖ４融合構築物に対応するバンドを示す。

【0050】

【図11】極低温透過型電子顕微鏡法（ｃｒｙｏ－ＴＥＭ）を用いたａｐｏＡ１－ＩＬ２融合タンパク質を含む円盤状ナノ粒子の成功裏の製剤化（右パネル）、および動的光散乱（ＤＬＳ）を用いた２１日間のＰＢＳでのナノ粒子サイズおよび安定性の分析（左パネル）を示す。

【0051】

【図12】ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激するａｐｏＡ１－ＩＬ２融合タンパク質の能力を示す。略語：ＰＨＡ、フィトヘマグルチニン。

【0052】

【図13】化学的ａｐｏＡ１－ＩＬ１β融合構築物（右パネル）および組換えａｐｏＡ１－ＩＬ１β融合構築物（左パネル）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。矢印（左パネル）または長方形（右パネル）は、ａｐｏＡ１－ＩＬ１β融合構築物に対応するバンドを示す。

【0053】

【図14】極低温透過型電子顕微鏡法（ｃｒｙｏ－ＴＥＭ）を用いたａｐｏＡ１－ＩＬ１β融合タンパク質を含む円盤状ナノ粒子の成功裏の製剤化（右パネル）、および動的光散乱（ＤＬＳ）を用いた２１日間のＰＢＳでのナノ粒子サイズおよび安定性の分析（左パネル）を示す。

【0054】

【図15】化学的ａｐｏＡ１－ＩＬ３８融合構築物（下のパネル）および組換えａｐｏＡ１－ＩＬ３８融合構築物（上のパネル）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。矢印（上のパネル）または長方形（下のパネル）は、ａｐｏＡ１－ＩＬ３８融合構築物に対応するバンドを示す。

【0055】

【図16】極低温透過型電子顕微鏡法（ｃｒｙｏ－ＴＥＭ）を用いたａｐｏＡ１－ＩＬ３８融合タンパク質を含む円盤状ナノ粒子の成功裏の製剤化（右パネル）、および動的光散乱（ＤＬＳ）を用いた２１日間のＰＢＳでのナノ粒子サイズおよび安定性の分析（左パネル）を示す。

【0056】

【図17-1】ＩＬ４は急性炎症を阻害するが、訓練された免疫を誘導する。（Ａ）インビトロ直接炎症実験の概略図。（Ｂ）ヒト初代単球の２４時間の刺激後のＴＮＦ、ＩＬ６およびＩＬ１Ｒａレベル。（Ｃ）インビトロで訓練された免疫実験の概略図。（Ｄ）β－グルカンで訓練された細胞の再刺激後のＴＮＦおよびＩＬ６レベル。（Ｅ）ＩＬ４で訓練された細胞の再刺激後のＴＮＦおよびＩＬ６レベル。（Ｆ）ＩＬ４で訓練された細胞における解糖（左）およびミトコンドリア（右）代謝のＳｅａｈｏｒｓｅ分析。データを平均±ＳＤとして示す。

【図17-2】ＩＬ４は急性炎症を阻害するが、訓練された免疫を誘導する。（Ａ）インビトロ直接炎症実験の概略図。（Ｂ）ヒト初代単球の２４時間の刺激後のＴＮＦ、ＩＬ６およびＩＬ１Ｒａレベル。（Ｃ）インビトロで訓練された免疫実験の概略図。（Ｄ）β－グルカンで訓練された細胞の再刺激後のＴＮＦおよびＩＬ６レベル。（Ｅ）ＩＬ４で訓練された細胞の再刺激後のＴＮＦおよびＩＬ６レベル。（Ｆ）ＩＬ４で訓練された細胞における解糖（左）およびミトコンドリア（右）代謝のＳｅａｈｏｒｓｅ分析。データを平均±ＳＤとして示す。

【0057】

【図18-1】ＩＬ４誘導性の訓練された免疫を媒介する免疫およびエピジェネティック機構。（Ａ）前述の第一級ＩＬ４シグナル伝達経路の概略的概観。（Ｂ）重要なＩＬ４シグナル伝達経路を遮断しながら、単球の２４時間の刺激後のＴＮＦおよびＩＬ６レベル。（Ｃ）重要なＩＬ４シグナル伝達経路を遮断しながら、ＩＬ４で訓練された細胞の再刺激後のＴＮＦおよびＩＬ６レベル。（Ｄ）再刺激の前後における、ＩＬ４で訓練された細胞のトランスクリプトームのヒートマップ。（Ｅ）ＩＬ４で訓練された免疫における転写因子モチーフ濃縮分析（ヒートマップはｚスコアを示す）。（Ｆ）ＩＬ４で訓練された免疫トランスクリプトームの経路濃縮分析。（Ｇ）ＳＥＴ７メチルトランスフェラーゼインヒビターの存在下でＩＬ４で訓練した細胞の再刺激後のＴＮＦおよびＩＬ６レベル。（Ｈ）ＩＬ４で訓練された細胞におけるＴＮＦのＣｈＩＰ－ｑＰＣＲ ＡＵＣ分析。棒グラフのデータは平均±ＳＤとして提示している。

【図18-2】ＩＬ４誘導性の訓練された免疫を媒介する免疫およびエピジェネティック機構。（Ａ）前述の第一級ＩＬ４シグナル伝達経路の概略的概観。（Ｂ）重要なＩＬ４シグナル伝達経路を遮断しながら、単球の２４時間の刺激後のＴＮＦおよびＩＬ６レベル。（Ｃ）重要なＩＬ４シグナル伝達経路を遮断しながら、ＩＬ４で訓練された細胞の再刺激後のＴＮＦおよびＩＬ６レベル。（Ｄ）再刺激の前後における、ＩＬ４で訓練された細胞のトランスクリプトームのヒートマップ。（Ｅ）ＩＬ４で訓練された免疫における転写因子モチーフ濃縮分析（ヒートマップはｚスコアを示す）。（Ｆ）ＩＬ４で訓練された免疫トランスクリプトームの経路濃縮分析。（Ｇ）ＳＥＴ７メチルトランスフェラーゼインヒビターの存在下でＩＬ４で訓練した細胞の再刺激後のＴＮＦおよびＩＬ６レベル。（Ｈ）ＩＬ４で訓練された細胞におけるＴＮＦのＣｈＩＰ－ｑＰＣＲ ＡＵＣ分析。棒グラフのデータは平均±ＳＤとして提示している。

【0058】

【図19-1】エンジニアリングしたａｐｏＡ１－ＩＬ４融合タンパク質。（Ａ）ａｐｏＡ１ベースの融合タンパク質プラットフォームの概略的概観。（Ｂ）ａｐｏＡ１－ＩＬ４融合タンパク質構造の概略図。（Ｃ）組換え発現されたタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ、および（Ｄ）組換え発現されたタンパク質のウエスタンブロット。内因性ＩＬ４およびａｐｏＡ１に特異的な抗体。（Ｅ）ａｐｏＡ１－ＩＬ４のクロマトグラムおよびＱ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトル。（Ｆ）ＳＰＲを使用したＩＬ４ＲαへのａｐｏＡ１－ＩＬ４結合の動態。（Ｇ）ａｐｏＡ１－ＩＬ４による、ＩＬ４ＲαおよびＩＬ１３Ｒα１を発現するＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞の活性化。データを平均±ＳＤとして示す。

【図19-2】エンジニアリングしたａｐｏＡ１－ＩＬ４融合タンパク質。（Ａ）ａｐｏＡ１ベースの融合タンパク質プラットフォームの概略的概観。（Ｂ）ａｐｏＡ１－ＩＬ４融合タンパク質構造の概略図。（Ｃ）組換え発現されたタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ、および（Ｄ）組換え発現されたタンパク質のウエスタンブロット。内因性ＩＬ４およびａｐｏＡ１に特異的な抗体。（Ｅ）ａｐｏＡ１－ＩＬ４のクロマトグラムおよびＱ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトル。（Ｆ）ＳＰＲを使用したＩＬ４ＲαへのａｐｏＡ１－ＩＬ４結合の動態。（Ｇ）ａｐｏＡ１－ＩＬ４による、ＩＬ４ＲαおよびＩＬ１３Ｒα１を発現するＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞の活性化。データを平均±ＳＤとして示す。

【0059】

【図20-1】ナノ粒子プラットフォームにおけるａｐｏＡ１－ＩＬ４の統合。（Ａ）円盤状（上のパネル）および球状のＩＬ４－ａＮＰ（下のパネル）および（Ｂ）低温ＴＥＭ画像の概略的な表現。（Ｃ）ＩＬ４－ａＮＰサイズの分布および（Ｄ）動的光散乱によって判定される経時的なＩＬ４－ａＮＰの安定性。ＩＬ４－ａＮＰサイズを数平均として報告する。（Ｅ）蛍光標識されたａｐｏＡ１（－ＩＬ４）、または（ＩＬ４－）ａＮＰでインキュベートし、抗ＩＬ４Ｒα抗体で染色したヒト単球の超解像蛍光顕微鏡（ｄＳＴＯＲＭ）画像。タンパク質とＩＬ４Ｒαとの間の共局在は、矢印によって認識することができる。右側の後続の画像では、関心対象の白色領域が拡大されている。データを平均±ＳＤとして示す。

【図20-2】ナノ粒子プラットフォームにおけるａｐｏＡ１－ＩＬ４の統合。（Ａ）円盤状（上のパネル）および球状のＩＬ４－ａＮＰ（下のパネル）および（Ｂ）低温ＴＥＭ画像の概略的な表現。（Ｃ）ＩＬ４－ａＮＰサイズの分布および（Ｄ）動的光散乱によって判定される経時的なＩＬ４－ａＮＰの安定性。ＩＬ４－ａＮＰサイズを数平均として報告する。（Ｅ）蛍光標識されたａｐｏＡ１（－ＩＬ４）、または（ＩＬ４－）ａＮＰでインキュベートし、抗ＩＬ４Ｒα抗体で染色したヒト単球の超解像蛍光顕微鏡（ｄＳＴＯＲＭ）画像。タンパク質とＩＬ４Ｒαとの間の共局在は、矢印によって認識することができる。右側の後続の画像では、関心対象の白色領域が拡大されている。データを平均±ＳＤとして示す。

【0060】

【図21-1】ＩＬ４－ａＮＰの免疫学的インビトロ、インビボおよびエクスビボでの治療評価。（Ａ）インビトロでの直接炎症および訓練された免疫実験の概略的概観。（Ｂ）ＩＬ４－ａＮＰの存在下で単球を２４時間刺激した後のＴＮＦおよびＩＬ６レベル。（Ｃ）ＩＬ４（－ａＮＰ）で訓練された細胞の再刺激後のＴＮＦおよびＩＬ６レベル。（Ｄ）ＩＬ４－ナノ療法を含むマウスのインビボ寛容モデルの概略的概観。（Ｅ）ＩＬ４ｍ－ａＮＰを処置したマウスのＬＰＳ再曝露後の血清ＴＮＦおよびＩＬ６レベル。マン・ホイットニーＵ検定を統計的比較のために使用した。（Ｆ）エクスビボ寛容逆転を含むヒト実験内毒素血症モデルの概略的概観。（Ｇ）ヒト・インビボＬＰＳ寛容化細胞のエクスビボ再刺激後のＴＮＦおよびＩＬ６レベル。（Ｈ）ＴＮＦおよびＩＬ６は、ヒト・インビボＬＰＳ寛容化細胞のエクスビボ再刺激後に倍数増加する。データを平均±ＳＤとして示す。

【図21-2】ＩＬ４－ａＮＰの免疫学的インビトロ、インビボおよびエクスビボでの治療評価。（Ａ）インビトロでの直接炎症および訓練された免疫実験の概略的概観。（Ｂ）ＩＬ４－ａＮＰの存在下で単球を２４時間刺激した後のＴＮＦおよびＩＬ６レベル。（Ｃ）ＩＬ４（－ａＮＰ）で訓練された細胞の再刺激後のＴＮＦおよびＩＬ６レベル。（Ｄ）ＩＬ４－ナノ療法を含むマウスのインビボ寛容モデルの概略的概観。（Ｅ）ＩＬ４ｍ－ａＮＰを処置したマウスのＬＰＳ再曝露後の血清ＴＮＦおよびＩＬ６レベル。マン・ホイットニーＵ検定を統計的比較のために使用した。（Ｆ）エクスビボ寛容逆転を含むヒト実験内毒素血症モデルの概略的概観。（Ｇ）ヒト・インビボＬＰＳ寛容化細胞のエクスビボ再刺激後のＴＮＦおよびＩＬ６レベル。（Ｈ）ＴＮＦおよびＩＬ６は、ヒト・インビボＬＰＳ寛容化細胞のエクスビボ再刺激後に倍数増加する。データを平均±ＳＤとして示す。

【図21-3】ＩＬ４－ａＮＰの免疫学的インビトロ、インビボおよびエクスビボでの治療評価。（Ａ）インビトロでの直接炎症および訓練された免疫実験の概略的概観。（Ｂ）ＩＬ４－ａＮＰの存在下で単球を２４時間刺激した後のＴＮＦおよびＩＬ６レベル。（Ｃ）ＩＬ４（－ａＮＰ）で訓練された細胞の再刺激後のＴＮＦおよびＩＬ６レベル。（Ｄ）ＩＬ４－ナノ療法を含むマウスのインビボ寛容モデルの概略的概観。（Ｅ）ＩＬ４ｍ－ａＮＰを処置したマウスのＬＰＳ再曝露後の血清ＴＮＦおよびＩＬ６レベル。マン・ホイットニーＵ検定を統計的比較のために使用した。（Ｆ）エクスビボ寛容逆転を含むヒト実験内毒素血症モデルの概略的概観。（Ｇ）ヒト・インビボＬＰＳ寛容化細胞のエクスビボ再刺激後のＴＮＦおよびＩＬ６レベル。（Ｈ）ＴＮＦおよびＩＬ６は、ヒト・インビボＬＰＳ寛容化細胞のエクスビボ再刺激後に倍数増加する。データを平均±ＳＤとして示す。

【0061】

【図22】脂質ナノ粒子（ディスク）にアポリポタンパク質とリルーティングタンパク質とを含む例示的なアポリポタンパク質融合物の任意選択の集合の概略的概観を示す。

【0062】

【図23】Ｃｌｅａｒｃｏｌｉ細胞におけるＶＨＨＣＤ８－ａｐｏＡ１融合タンパク質の発現を示す。ＩＭＡＣ精製後にわずかなタンパク質夾雑物が存在する［レーンＥ１］。最も顕著なバンドは、４３．３ｋＤａ（長方形）の分子量を有する融合タンパク質に対応する。

【0063】

【図24】極低温透過型電子顕微鏡（ｃｒｙｏ－ＴＥＭ）を用いたＶＨＨＣＤ８－ａｐｏＡ１融合タンパク質を含む円盤状ナノ粒子の成功裏の製剤化（右パネル）、および動的光散乱（ＤＬＳ）を用いた１４日間のナノ粒子サイズおよび多分散性指数（ＰＤＩ）の分析（左パネル）を示す。

【0064】

【図25】マウス脾細胞（上のパネル：脾細胞由来のＣＤ３＋Ｔ細胞；下のパネル：脾臓からのすべての細胞）における蛍光標識されたＶＨＨＣＤ８－ａｐｏＡ１およびａｐｏＡ１の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。

【0065】

【図26】ＶＨＨＣＤ８－ａｐｏＡ１およびａｐｏＡ１と共に製剤化され、マウス脾細胞の粒子の脂質構造に蛍光色素を含む円盤状および球状ａＮＰの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。

【0066】

【図27-1】静脈内注射後のインビボ薬物動態、生体内分布および安全性プロファイル。（Ａ）ＰＥＴ／ＣＴ ２は、^８９Ｚｒ標識された構築物の注入後２４時間でレンダリングされる。（Ｂ）^８９Ｚｒ標識された構築物の血中半減期（ｎ＝５、２相減衰関数でフィッティング）。（Ｃ）^８９Ｚｒ標識構築物注射２４時間後の組織のエクスビボのガンマ計数（ｎ＝５）、数は標的とクリアランス器官の比を表す。（Ｄ）フローサイトメトリーによって測定した、脾臓および骨髄におけるＤｉＯ標識円盤状ＩＬ４－ａＮＰの細胞型特異的生体内分布。（Ｅ）非ヒト霊長類における^８９Ｚｒ－ＩＬ４－ａＮＰ血中半減期。（Ｆ）非ヒト霊長類に注射した^８９Ｚｒ－ＩＬ４－ａＮＰにおける経時的な器官ＳＵＶ平均（ｎ＝２）。（Ｇ）非ヒト霊長類（ｎ＝２）における^８９Ｚｒ－ＩＬ４－ａＮＰ注射後４８時間の臓器特異的ＳＵＶ平均。（Ｈ）^８９Ｚｒ－ＩＬ４－ａＮＰ注射の４８時間後の非ヒト霊長類のＰＥＴ／ＭＲＩスキャン。データは、必要に応じて、平均±ＳＤとして提示される。

【図27-2】静脈内注射後のインビボ薬物動態、生体内分布および安全性プロファイル。（Ａ）ＰＥＴ／ＣＴ ２は、^８９Ｚｒ標識された構築物の注入後２４時間でレンダリングされる。（Ｂ）^８９Ｚｒ標識された構築物の血中半減期（ｎ＝５、２相減衰関数でフィッティング）。（Ｃ）^８９Ｚｒ標識構築物注射２４時間後の組織のエクスビボのガンマ計数（ｎ＝５）、数は標的とクリアランス器官の比を表す。（Ｄ）フローサイトメトリーによって測定した、脾臓および骨髄におけるＤｉＯ標識円盤状ＩＬ４－ａＮＰの細胞型特異的生体内分布。（Ｅ）非ヒト霊長類における^８９Ｚｒ－ＩＬ４－ａＮＰ血中半減期。（Ｆ）非ヒト霊長類に注射した^８９Ｚｒ－ＩＬ４－ａＮＰにおける経時的な器官ＳＵＶ平均（ｎ＝２）。（Ｇ）非ヒト霊長類（ｎ＝２）における^８９Ｚｒ－ＩＬ４－ａＮＰ注射後４８時間の臓器特異的ＳＵＶ平均。（Ｈ）^８９Ｚｒ－ＩＬ４－ａＮＰ注射の４８時間後の非ヒト霊長類のＰＥＴ／ＭＲＩスキャン。データは、必要に応じて、平均±ＳＤとして提示される。

【図27-3】静脈内注射後のインビボ薬物動態、生体内分布および安全性プロファイル。（Ａ）ＰＥＴ／ＣＴ ２は、^８９Ｚｒ標識された構築物の注入後２４時間でレンダリングされる。（Ｂ）^８９Ｚｒ標識された構築物の血中半減期（ｎ＝５、２相減衰関数でフィッティング）。（Ｃ）^８９Ｚｒ標識構築物注射２４時間後の組織のエクスビボのガンマ計数（ｎ＝５）、数は標的とクリアランス器官の比を表す。（Ｄ）フローサイトメトリーによって測定した、脾臓および骨髄におけるＤｉＯ標識円盤状ＩＬ４－ａＮＰの細胞型特異的生体内分布。（Ｅ）非ヒト霊長類における^８９Ｚｒ－ＩＬ４－ａＮＰ血中半減期。（Ｆ）非ヒト霊長類に注射した^８９Ｚｒ－ＩＬ４－ａＮＰにおける経時的な器官ＳＵＶ平均（ｎ＝２）。（Ｇ）非ヒト霊長類（ｎ＝２）における^８９Ｚｒ－ＩＬ４－ａＮＰ注射後４８時間の臓器特異的ＳＵＶ平均。（Ｈ）^８９Ｚｒ－ＩＬ４－ａＮＰ注射の４８時間後の非ヒト霊長類のＰＥＴ／ＭＲＩスキャン。データは、必要に応じて、平均±ＳＤとして提示される。

【発明を実施するための形態】

【0067】

端点による数値範囲の列挙は、全ての整数、および適切な場合にはそれぞれの範囲内に包含される分数、並びに列挙された端点を含む。これは、「～から～」という表現または「～から～の間」という表現または別の表現によって導入されるかどうかにかかわらず、数値範囲に適用される。本明細書に列挙された任意の数値範囲は、その中に包含される全ての部分範囲を含むことが意図されている。

【0068】

測定可能な値、例えばパラメータ、量、持続時間などを指す場合に本明細書で使用される「約（about）」または「およそ（approximately）」という用語は、指定された値の変動および指定された値からの変動、例えば指定された値の＋／－１０％以下、好ましくは＋／－５％以下、より好ましくは＋／－１％以下、さらにより好ましくは＋／－０．１％以下の変動を、そのような変動が開示された発明において実行するのに適切である限り包含することを意味する。修飾語「約（about）」または「およそ（approximately）」が指す値自体も具体的に、好ましくは開示されていることを理解されたい。

【0069】

さらに、明細書および特許請求の範囲における第１、第２、第３などの用語は、特定されない限り、同様の要素を区別するために使用され、必ずしも連続的または時系列的な順序を説明するためのものではない。そのように使用される用語は、適切な状況下で交換可能であり、本明細書に記載される本発明の実施形態は、本明細書に記載または図示されている以外の順序で動作することができることを理解されたい。

【0070】

本明細書における本発明の背景の議論は、本発明の文脈を説明するために含まれる。これは、言及された材料のいずれかが、特許請求の範囲のいずれかの優先日に、いずれかの国で公開された、公知の、または共通の一般知識の一部であることを認めるものと解釈されるべきではない。

【0071】

本開示を通して、様々な刊行物、特許および公開された特許明細書は、特定の引用によって参照される。本明細書で引用される全ての文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。特に、本明細書で具体的に言及されるそのような文書の教示またはセクションは、参照により組み込まれる。

【0072】

他に定義されない限り、技術用語および科学用語を含む、本明細書の開示で使用されている全ての用語は、本発明が属する当分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。更なる指針によって、本発明の教示をよりよく理解するために用語定義が含まれる。本発明の特定の態様または本発明の特定の実施形態に関連して特定の用語が定義される場合、そのような含意または意味は、他に定義されない限り、本明細書全体にわたって、すなわち本発明の他の態様または実施形態の文脈においても適用されることを意味する。

【0073】

以下の節では、本発明の異なる態様または実施形態がより詳細に定義される。そのように定義された各態様または実施形態は、そうでないことが明確に示されていない限り、任意の他の態様または実施形態と組み合わせることができる。特に、好ましいまたは有利であると示された任意の特徴は、好ましいまたは有利であると示された任意の他の１つまたは複数の特徴と組み合わせることができる。

【0074】

本明細書全体を通して「一実施形態」または「実施形態」への言及は、その実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造、または特性が少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体の様々な箇所における「一実施形態では」または「実施形態では」という語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指しているわけではないが、そうであってもよい。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、１つまたはそれ以上の実施形態において、本開示から当業者に明らかであるように、任意の適切な方法で組み合わせることができる。さらに、本明細書に記載のいくつかの実施形態は、他の実施形態に含まれるいくつかの特徴を含むが、他の特徴を含まないが、異なる実施形態の特徴の組合せは、本発明の範囲内であり、当業者によって理解されるように、異なる実施形態を形成することを意味する。例えば、添付の特許請求の範囲において、特許請求される実施形態のいずれも、任意の組合せで使用することができる。

【0075】

同様に、本発明の例示的な実施形態の説明において、本発明の様々な特徴は、本開示を簡素化し、様々な本発明の態様の１つまたはそれ以上の理解を助ける目的で、単一の実施形態、図、またはその説明にまとめられることがあることを理解されたい。

【0076】

本明細書で使用される場合、単数形の言葉である「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞」への言及は、２つ以上の細胞の組合せなどを含む。

【0077】

本明細書で使用される場合、「および／または」という用語は、記載された事例の１つまたはそれ以上が、単独で、または記載された事例の少なくとも１つと組み合わせて、記載された事例のすべてまで発生し得る状況を指す。例えば、リストが群Ａ、Ｂ、および／またはＣを含むと記載されている場合、リストは、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡとＢの組合せ、ＡとＣの組合せ、ＢとＣの組合せ、またはＡ、Ｂ、およびＣの組合せを含むことができる。

【0078】

本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、抗体の結合部分が結合し得る物質を指す。抗原内の特定の免疫反応性部位は、「エピトープ」（または抗原決定基）として公知である。抗体の標的またはその抗原結合部分は、本明細書で定義されるような抗原を含み得る。

【0079】

本明細書で使用される場合、「少なくとも」特定の値、という用語は、その特定の値以上であることを意味する。例えば、「少なくとも２つ」は、「２つ以上」、すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、．．．などと同じであると理解される。本明細書で使用される場合、「最大の」特定の値、という用語は、その特定の値以下であることを意味する。例えば、「最大５」は、「５以下」、すなわち、５、４、３、．．．．－１０、－１１などと同じであると理解される。「１つまたはそれ以上」または「少なくとも１つ」という用語、例えば１またはそれ以上のメンバーまたはメンバーの群の少なくとも１のメンバーは、さらなる例示によってそれ自体明確であるが、この用語は、とりわけ、当該メンバーのいずれか１、または当該メンバーのいずれか２以上、例えば当該メンバーのいずれか３以上、４以上、５以上、６以上または７以上など、および全員までの当該メンバーへの言及を包含する。別の例では、「１つまたはそれ以上」または「少なくとも１つ」は、１、２、３、４、５、６、７またはそれ以上を指すことができる。

【0080】

本明細書で使用される場合、「含む(comprise)」という単語または「含む(comprises)」もしくは「含む(comprising)」などのその変形は、記載された要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群を含むが、任意の他の要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群を排除するものではないと理解される。「含む」という動詞は、「から本質的になる」および「からなる」という動詞を含む。

【0081】

本明細書で使用される場合、「従来の技術」という用語は、本発明の方法で使用される従来の技術を実施する方法が当業者に明確である状況を指す。分子生物学、生化学、計算化学、細胞の培養、組換えＤＮＡ、バイオインフォマティクス、ゲノミクス、配列決定および関連分野における従来技術の実施は、当業者に周知であり、例えば、以下の文献参考文献：Sambrook et al.,Molecular Cloning.A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989;Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,1987 and periodic updates；および、the series Methods in Enzymology,Academic Press,San Diego。

【0082】

本明細書で使用される場合、「同一性」という用語は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度を指す。一般に、配列は、最高位の一致が得られるように整列される。「同一性」自体は、当分野で認識されている意味を有し、公開されている技術を使用して計算することができる。例えば:(Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ED.,Oxford University Press,New York,1988;Biocomputing:Informatics And Genome Projects,Smith,D.W.,ED.,Academic Press,New York,1993;Computer Analysis Of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,And Griffin,H.G.,EDS.,Humana Press,New Jersey,1994;Sequence Analysis In Molecular Biology,Von Heinje,G.,Academic Press,1987;およびSequence Analysis Primer;Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991)を参照されたい。２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間の同一性を測定するためのいくつかの方法が存在するが、「同一性」という用語は当業者に周知である(Carillo,H.,and Lipton,D.,SIAM J.Applied Math(1988)48:1073)。２つの配列の間における同一性または類似性を求めるために一般に用いられる方法には、Guide To Huge Computers,Martin J.Bishop,ed.,Academic Press,San Diego,1994,and Carillo,H.,and Lipton,D.,Siam J.Applied Math(1988)48:1073に開示される様々な方法が含まれるが、それらに限定されない。同一性および類似性を求めるための様々な方法がコンピュータープログラムにコード化されている。２つの配列の間における同一性および類似性を求めるための典型的なコンピュータープログラム法には、ＧＣＳプログラムパッケージ(Devereux,J.,et al.,Nucleic Acids Research(1984)12(1):387),BLASTP,BLASTN,FASTA(Atschul,S.F.et al.,J.Molec.Biol.(1990)215:403）が含まれるが、それらに限定されない。

【0083】

例示として、特定の配列のポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも例えば９５％「同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、ポリヌクレオチド配列が参照アミノ酸配列の各１００ヌクレオチドにつき最大５つの点突然変異を含み得ることを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列の最大５％のヌクレオチドが欠失され得、および／または別のヌクレオチドで置換され得、および／または参照配列の全ヌクレオチドの最大５％の数のヌクレオチドが参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの突然変異は、参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端の位置、またはそれらの末端の位置の間のどこにでも起こり得、参照配列のヌクレオチド間に個々に、または参照配列内の１つもしくはそれ以上の連続する群に散在する。

【0084】

同様に、配列番号Ｘの参照アミノ酸配列に対して少なくとも例えば９５％「同一性」を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドは、そのアミノ酸配列が配列番号Ｘの参照アミノ酸の各１００アミノ酸当たり最大５つのアミノ酸の変化を含み得ることを除いて、ポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同一であることを意図する。換言すれば、参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参照配列のアミノ酸残基の５％までが欠失もしくは別のアミノ酸で置換されていてもよく、または参照配列の全アミノ酸残基の５％までの数のアミノ酸が参照配列の中に挿入され得る。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置で、またはそれらの末端位置の間のいずれかの場所で起こり得、参照配列の残基の間に個別に、または参照配列内の１つもしくはそれ以上の連続する群に散在し得る。

【0085】

本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、それらの自然な状態から隔てられた生物の成分を使用して行われる実験または測定を指すことができる。

【0086】

本明細書で使用される場合、「エクスビボ」という用語は、自然状態の変化を最小限に抑えながら、外部環境で生物の組織内または組織上で行われる実験または測定を指すことができる。

【0087】

本明細書で使用される場合、「核酸」、「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことを意図している。核酸（分子）は、一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。

【0088】

本明細書で使用される場合、ヌクレオチドを指す場合の「配列」、または「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」もしくは「ポリヌクレオチド配列」という用語は、核酸および／またはポリヌクレオチドの、または核酸および／またはポリヌクレオチド内のヌクレオチドの順序を指す。本発明の文脈の中で、第１の核酸配列は、さらなる核酸配列内に含まれ得るか、またはさらなる核酸配列と重複し得る。

【0089】

本明細書で使用される場合、「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」という用語は、交換可能に使用され、診断、予後診断、または治療が望まれる任意の対象、特に哺乳動物の対象を指す。哺乳動物対象としては、ヒト、飼育動物、家畜、および動物園、競技用またはペット動物、例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、ウシ、クマなどが挙げられる。本明細書で定義されるように、対象は生存していても死亡していてもよい。試料は、死後、すなわち死亡後の対象から採取することができ、および／または試料は、生きている対象から採取することができる。

【0090】

本明細書で使用される場合、交換可能に使用される「治療」、「処置」、「緩和」、「軽減」または「改善」という用語は、治療上の利益を含むがこれに限定されない有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療的利益とは、治療される基礎疾患の根絶または改善または進行の減少（または遅延）を意味する。また、患者が依然として基礎疾患に罹患している可能性があるにもかかわらず、患者において減退の改善または減速または減少が観察されるように、基礎疾患に関連する生理学的症状のうちの１つまたはそれ以上の根絶または改善または進行の減少（または遅延）によって治療上の利益が達成される。

【0091】

本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、輸送することができる核酸分子が、連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子のことを指す。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。「ベクター」という用語はまた、目的の核酸を含有するウイルス粒子（すなわちウイルスベクター）を指し得る。

【0092】

本発明の一部は、著作権保護の対象となる資料（例えば、これらに限定されるわけではないが、図表、機器の写真、または著作権保護が任意の管轄区域で利用可能であり、もしくは利用可能であり得る本提出物の任意の他の態様など）を含む。著作権者は、特許庁の特許ファイルまたは記録に記載されているように、特許文書または特許発明の、いずれかの者によるファクシミリの複製に異議を唱えないが、それ以外の場合は、すべての著作権を留保する。

【0093】

本発明の方法、組成物、使用および他の態様に関する様々な用語は、本明細書および特許請求の範囲を通して使用される。そのような用語は、別段の指示がない限り、本発明が関連する当分野におけるそれらの通常の意味を与えられるべきである。他の具体的に定義された用語は、本明細書で提供される定義と一致する方法で解釈されるべきである。好ましい材料および方法が本明細書に記載されているが、本明細書に記載されているものと類似または等価ないずれかの方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができる。

【0094】

別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

【0095】

本発明は、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物が、治療薬の担体として使用することができ、アポリポタンパク質が特定の細胞、組織または器官を標的とするようにさらに修飾され得るという本発明者らの発見に基づく。本発明者らは、サイトカインとアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物との融合タンパク質が、血中での半減期の大幅な延長を示し、それにより、毒性濃度の投与を必要とせずに、治療の方式でサイトカインを使用する可能性を開くことを見出した。さらに、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物は、骨髄系細胞のような標的細胞、組織および／または器官などに融合された場合にサイトカインの標的化を可能にすることが理解された。本発明者らは、この概念がより広範に適用可能であり、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、成長因子などの広範囲の免疫調節生体分子にも使用できることを認識した。

【0096】

融合タンパク質またはアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物を、リルーティング分子に連結することによって、意図された標的に導くことが可能であることがさらに認識された。このようにすると、アポリポタンパク質（またはアポリポタンパク質模倣物）または融合タンパク質が、さもなければ到達しないかまたは不十分な到達の細胞、組織または器官に標的化され得るか、またはオフターゲット効果を低減するために使用され得る。

【0097】

したがって、第１の態様では、本発明は、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物および免疫調節生体分子を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる融合タンパク質であって、免疫調節生体分子が免疫応答を調節する（例えば、増強または抑制する）タンパク質である融合タンパク質に関する。

【0098】

第２の態様では、本発明は、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物およびリルーティング分子を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる融合タンパク質に関し、リルーティング分子は、アポリポタンパク質に融合されたときに、アポリポタンパク質がリルーティング分子に融合されなかったときに結合するであろう標的とは異なる標的に結合すること、および／またはより高い親和性でその意図された標的に結合することを可能にする分子である。

【0099】

第３の態様では、本発明は、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物ならびに免疫調節生体分子およびリルーティング分子を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる融合タンパク質に関する。

【0100】

融合タンパク質は、免疫調節生体分子および／またはリルーティング分子とのアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物の融合タンパク質であると好都合に表され得る。
融合タンパク質は、そのまま使用され得る、つまりリポタンパク質、脂質またはアポリポタンパク質脂質ナノ粒子の一部としてではないことを意味する。このようにすると、融合タンパク質は、免疫調節生体分子を標的部位に送達するための担体として役立ち得る。あるいは、リルーティング分子を使用して、融合タンパク質を細胞、組織、または器官などの特定の部位に標的化することができる。

【0101】

アポリポタンパク質は、トリグリセリドおよびコレステロールなどの脂質に結合してリポタンパク質を形成するタンパク質である。それらは、血液、脳脊髄液およびリンパで、脂質（および脂溶性ビタミン）を輸送する。リポタンパク質の脂質成分は水に不溶性である。しかしながら、それらの洗剤様（両親媒性）特性のために、アポリポタンパク質およびリン脂質などの他の両親媒性分子は、脂質を取り囲み、それ自体が水溶性であり、したがって水系循環（すなわち、血液、リンパ液）を介して運ばれ得るリポタンパク質粒子を作り出すことができる。リポタンパク質構造の安定化および脂質成分の可溶化に加えて、アポリポタンパク質はリポタンパク質受容体および脂質輸送タンパク質と相互作用し、それによってリポタンパク質の取り込みおよびクリアランスに関与する。

【0102】

脂質の輸送において、アポリポタンパク質は、リポタンパク質粒子の構造成分、細胞表面受容体および脂質輸送タンパク質のリガンド、ならびに酵素の補因子として機能する。異なるリポタンパク質粒子は、異なるクラスのアポリポタンパク質を含み、それらの機能に影響を及ぼす。例えば、アポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ１）は、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）の主要な構造タンパク質成分であるが、他のリポタンパク質に、より少量で存在し、ＨＤＬは他のアポリポタンパク質を含む。

【0103】

本発明は、特定のタイプのアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物（例えば、ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＢまたはＡｐｏＥ）に限定されないことが想定される。したがって、実施形態では、本発明の融合タンパク質のアポリポタンパク質、例えば本発明の第１、第２または第３の態様による融合タンパク質のアポリポタンパク質は、ａｐｏＡ１、ＡｐｏＡ－１ Ｍｉｌａｎｏ、ａｐｏＡ２、ａｐｏＡ４、ａｐｏＡ５、ａｐｏＢ４８、ａｐｏＢ１００、ａｐｏＣ－Ｉ、ａｐｏＣ－ＩＩ、ａｐｏＣ－ＩＩＩ、ａｐｏＣ－ＩＶ、ａｐｏＤ、ａｐｏＥ、ａｐｏＦ、ａｐｏＨ、ａｐｏＬ１、ａｐｏＬ２、ａｐｏＬ３、ａｐｏＬ４、ａｐｏＬ５、ａｐｏＬ６、ａｐｏＬＤ１、ａｐｏＭ、ａｐｏＯ、ａｐｏＯＬ、もしくはそれらの組合せ、またはそれらの模倣物から選択される。例えば、アポリポタンパク質は、ａｐｏＡ１、ＡｐｏＡ－１ Ｍｉｌａｎｏ、ａｐｏＡ２、ａｐｏＡ４、ａｐｏＡ５、ａｐｏＢ４８、ａｐｏＢ１００、ａｐｏＣ－Ｉ、ａｐｏＣ－ＩＩ、ａｐｏＣ－ＩＩＩ、ａｐｏＣ－ＩＶ、ａｐｏＥ、ａｐｏＬ１、ａｐｏＬ２、ａｐｏＬ３、ａｐｏＬ４、ａｐｏＬ５、ａｐｏＬ６、またはそれらの組合せもしくはそれらの模倣物から選択され得る。より好ましくは、アポリポタンパク質は、ａｐｏＡ１、ａｐｏＡ４、ａｐｏＣ３、ａｐｏＤ、ａｐｏＥ、ａｐｏＬ１、ａｐｏＬ３、もしくはそれらの組合せ、またはそれらの模倣物から選択され得る。換言すれば、特定の実施形態において、アポリポタンパク質は、ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＡ－１ Ｍｉｌａｎｏ、ＡｐｏＡ４、ＡｐｏＣ３、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＬ１、ＡｐｏＬ３であるか、またはアポリポタンパク質模倣物が、ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＡ－１ Ｍｉｌａｎｏ、ＡｐｏＡ４、ＡｐｏＣ３、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＬ１、ＡｐｏＬ３の模倣物である。さらにより好ましくは、アポリポタンパク質はＡｐｏＡ１である。

【0104】

特定の実施形態では、アポリポタンパク質はまた、アポリポタンパク質の断片であってもよい。好ましくは、アポリポタンパク質の断片は、アポリポタンパク質の生物学的活性、例えばアポリポタンパク質が脂質ナノ粒子に組み込まれる能力、または免疫調節生体分子を標的、例えば骨髄区画に標的化する能力を保持する。特定の実施形態では、アポリポタンパク質の断片は、少なくとも全長のアポリポタンパク質のＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー１（ＡＢＣＡ１）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー１（ＡＢＣＧ１）および／またはスカベンジャー受容体クラスＢタイプ１（ＳＲ－ＢＩ）結合領域を含み、それによって骨髄系細胞への結合を可能にする。特定の実施形態では、アポリポタンパク質の断片は、全長のアポリポタンパク質の少なくともαヘリックスを含む。これらのヘリックスは、一方の側が親水性（水性環境と相互作用する）であり、他方の側が疎水性（粒子内の脂質と相互作用する）である。

【0105】

ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に関して本明細書を通して使用される「断片」という用語は、一般に、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の一部、例えば典型的にはペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端が切断された形態を表す。好ましくは、断片は、当該ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列長の少なくとも約３０％、例えば少なくとも約５０％または少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、例えば少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、およびさらにより好ましくは少なくとも約９５％またはさらに約９９％を含むことができる。例えば、全長ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の長さを超えない限り、断片は、対応する全長ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の５個以上の連続アミノ酸、または１０個以上の連続アミノ酸、または２０個以上の連続アミノ酸、または３０個以上の連続アミノ酸、例えば４０個以上の連続アミノ酸、例えば５０個以上の連続アミノ酸、例えば６０個以上、７０個以上、８０個以上、９０個以上、１００個以上または２００個以上の連続アミノ酸の配列を含み得る。

【0106】

特定の実施形態では、アポリポタンパク質の断片は、全長のアポリポタンパク質の骨髄結合部分を含む。

【0107】

特定の実施形態では、アポリポタンパク質はまた、アポリポタンパク質の免疫調節生体分子および／またはリルーティング分子への化学的コンジュゲーションを可能にする変異を含むアポリポタンパク質変異体であり得る。特定の実施形態において、アポリポタンパク質はまた、セリンからシステインへの置換を含むアポリポタンパク質変異体、例えば、本明細書の他の箇所に記載されるような配列番号１、７、９または１１によって定められるようなＡｐｏＡ１変異体であり得る。

【0108】

本明細書に記載の異なるタンパク質のペプチド配列、または本明細書に記載の異なるタンパク質をコードする遺伝子の核酸配列は、例えばＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ(http://genome.ucsc.edu/)、Ｅｎｓｅｍｂｌ ｇｅｎｏｍｅ ｂｒｏｗｓｅｒ（https://www.ensembl.org）およびＮＣＢＩ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein）から、当業者にとって、容易に入手可能である。種々のタンパク質または遺伝子のコンセンサス配列は、これらの供給源に容易に由来するが、遺伝子変異および遺伝子の複数のスプライス変異体に起因して一定の変異が存在し得るが、これらに限定されないことが理解される。したがって、特定のタンパク質について言及する場合、これは、遺伝的変異およびスプライス変異体に起因する配列変異を包含すると解釈されるべきである。したがって、特定のタンパク質に言及するときに本明細書で使用される場合、これは、Ｅｎｓｅｍｂｌゲノムブラウザから検索された対応するコンセンサスタンパク質配列、またはＥｎｓｅｍｂｌゲノムブラウザから検索されたコンセンサス核酸（遺伝子）配列、またはＥｎｓｅｍｂｌゲノムブラウザから検索された対応するコンセンサスタンパク質配列と８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一のタンパク質配列、またはＥｎｓｅｍｂｌゲノムブラウザから検索された対応するコンセンサス遺伝子配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一の遺伝子配列、またはＥｎｓｅｍｂｌゲノムブラウザから検索された対応するコンセンサスタンパク質配列と８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一のタンパク質をコードする核酸配列として解釈されるべきである。

【0109】

アポリポタンパク質模倣物は、アポリポタンパク質の機能または構造を模倣する合成ペプチドまたはタンパク質である。いくつかのアポリポタンパク質模倣物が公知であり、例えばWolska et al.(Cells.2021 Mar;10(3):597があるが、その全体が参照により組み込まれる）文献に記載されている異なるａｐｏＡ１、ａｐｏＥおよびａｐｏＣ－ＩＩ模倣物を概説している。例えば、ＡｐｏＡ１模倣ペプチドは、大部分が、細胞からコレステロールを流出させるそれらの能力に基づいて設計されている。このプロセスは特定のタンパク質－タンパク質相互作用に依存することが示されていないので、ほとんどのａｐｏＡ１模倣ペプチドは単に両親媒性ヘリックスであり、実際、多くはａｐｏＡ１と一次アミノ酸相同性を有していない。例示的なＡｐｏＡ１模倣物は、ＡｐｏＡ１模倣物１８Ａ、ＡｐｏＡ１模倣物２ＦおよびＡｐｏＡ１模倣物３７ｐＡであり、これらは、配列番号５１、配列番号５２、および配列番号５３に対応するペプチド配列によって表される。

【0110】

例えば、ａｐｏＥは、いくつかの推定上のアテローム保護機能を有し、多くの異なるタイプのａｐｏＥ系ペプチドが報告されている。これらのペプチドの設計における主な目的の１つは、ａｐｏＢ含有リポタンパク質の肝臓クリアランスを促進することである。ａｐｏＥは脂質に結合した場合にのみその受容体に結合することができるので、これらのペプチドは通常、ａｐｏＥのＮ末端ドメイン由来の受容体結合モチーフだけでなく、ａｐｏＥのＣ末端ドメインまたは他の何らかの配列に基づく脂質結合領域も有する。

【0111】

例えば、ａｐｏＣ－ＩＩ模倣物は、ａｐｏＣ－ＩＩのＬＰＬ活性化ドメインに連結された短縮された第１のヘリックス（１８Ａ）に基づいて、または第１および第２のヘリックスの両方が、リポタンパク質への二重らせん結合を増強するためのアミノ酸置換を伴う天然のａｐｏＣ－ＩＩヘリックスに基づいている模倣物のいずれかで記載されている。

【0112】

したがって、本明細書で使用される場合、アポリポタンパク質模倣物は、それぞれのアポリポタンパク質と構造的および／または機能的特徴を共有する合成タンパク質またはペプチドを指す。例えば、共有される構造的特徴は、ペプチド配列などの一次、二次もしくは三次ペプチド構造、アルファヘリックスもしくはベータシートなどの構造の存在、またはペプチドの三次元構造であり得るか、または機能的特徴は、受容体などの特定の標的への結合における類似性であり得る。好ましくは、アポリポタンパク質は、対応するアポリポタンパク質と同様の様式で脂質に結合することができ、より好ましくは脂質粒子を形成することができる。

【0113】

特定の実施形態では、アポリポタンパク質模倣物は、それぞれのアポリポタンパク質と同じまたは類似の程度で骨髄系細胞に結合することができる。例えば、ＡｐｏＡ１のアポリポタンパク質模倣物は、ＡｐｏＡ１と同じ程度または類似した程度、骨髄系細胞に結合することができる。

【0114】

実施形態において、融合タンパク質は、ＡｐｏＡ１（またはその変異体）、好ましくはヒトＡｐｏＡ１と、免疫調節生体分子および／またはリルーティング分子との融合タンパク質である。

【0115】

例として、ヒトＡｐｏＡ１タンパク質配列は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)アクセッション番号ＮＰ＿００１３０４９４７．１（イソ型１プレプロタンパク質）およびＵｎｉｐｒｏｔ（www.uniprot.org）アクセッション番号Ｐ０２６４７．１の下でアノテーションされる。

【0116】

特定の実施形態において、ＡｐｏＡ１は、野生型ＡｐｏＡ１（例えば、配列番号１によって定義されるようなＡｐｏＡ１のヒト前駆体に由来し、その最初の１８個のアミノ酸がシグナルペプチドを形成する）またはＡｐｏＡ１変異体（例えば、配列番号７、９または１１によって定義される）である。特定の実施形態において、ＡｐｏＡ１は、配列番号７８によって定義される野生型ヒトＡｐｏＡ１である。

【0117】

例えば、ａｐｏＡ１を免疫調節生体分子および／またはリルーティング分子に化学的にコンジュゲートさせるためには、典型的には反応性ハンドルが必要である。したがって、１４７（例えば、配列番号９によって定義される）または２７９（例えば、配列番号１１によって定義される）の位置に、セリンの代わりにシステインを含むａｐｏＡ１変異体は、化学的にコンジュゲート化されたＡｐｏＡ１融合タンパク質を調製するために有用であり得る。

【0118】

実施形態において、ＡｐｏＡ１は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、もしくは配列番号１１と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を有するペプチドであるか、あるいはＡｐｏＡ１は、それを含む、から本質的になる、またはからなり、または、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、または配列番号１２と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはからなる。

【0119】

配列番号３、配列番号７、配列番号９、または配列番号１１によって定義されるＡｐｏＡ１配列は、トロンビン切断部位であるアミノ酸配列ＧＬＶＰＲＧＳＩＤＤ（配列番号７９）をＮ末端に含むことに留意されたい。例えば、配列番号５によって定義されるようなＡｐｏＡ１配列は、Ｎ末端に６Ｈｉｓタグを含み、その後にアミノ酸配列ＧＬＶＰＲＧＳＩＤＤ（配列番号７９）が続く。ここで、トロンビン切断部位は、ペプチドからＮ末端Ｈｉｓタグを除去するために使用することができる。

【0120】

実施形態において、ＡｐｏＡ１は、配列番号７と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を有するペプチドであるか、あるいはＡｐｏＡ１は、それを含む、から本質的になる、またはからなり、配列番号７は、配列番号７の７位にシステインを含む。そのようなＡｐｏＡ１変異体は、本明細書中では「Ｓ１４Ｃ」変異体と称される場合がある。

【0121】

実施形態において、ＡｐｏＡ１は、配列番号９と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を有するペプチドであるか、あるいはＡｐｏＡ１はそれを含む、から本質的になる、またはからなり、配列番号７は、配列番号９の１５０位にシステインを含む。そのようなＡｐｏＡ１変異体は、本明細書では「Ｓ１４７Ｃ」または「Ｓ１５７Ｃ」変異体と称される場合がある。

【0122】

実施形態において、ＡｐｏＡ１は、配列番号１１と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を有するペプチドであるか、あるいはＡｐｏＡ１はそれを含む、から本質的になる、またはからなり、配列番号７は、配列番号１１の２３９位にシステインを含む。そのようなＡｐｏＡ１変異体は、本明細書では「Ｓ２７９Ｃ」または「Ｓ２３９Ｃ」変異体と称される場合がある。

【0123】

実施形態において、融合タンパク質は、ＡｐｏＡ１模倣物と免疫調節生体分子および／またはリルーティング分子との融合タンパク質である。実施形態において、ＡｐｏＡ１模倣物は、配列番号５１、配列番号５２、または配列番号５３と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を有するペプチドであるか、あるいはＡｐｏＡ１模倣物はそれを含む、から本質的になる、またはからなる。

【0124】

実施形態において、融合タンパク質は、ＡｐｏＥと免疫調節生体分子および／またはリルーティング分子との融合タンパク質である。実施形態において、ＡｐｏＥは、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、もしくは配列番号１９と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を有するペプチドであるか、あるいはＡｐｏＥは、それを含む、から本質的になる、またはからなり、または、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、もしくは配列番号２０と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはからなる。

【0125】

本明細書の他の箇所に記載されているように、ＡｐｏＡ１の融合タンパク質は、ＡｐｏＡ１と、サイトカイン、例えば、ＩＬ－１β（ＩＬ－１Ｂ）、ＩＬ－２、ＩＬ－４、またはＩＬ－３８、好ましくはＩＬ－４との融合タンパク質であり得る。

【0126】

したがって、実施形態において、融合タンパク質は、ＡｐｏＡ１（その変異体を含む）とインターロイキン（ＩＬ）－１Ｂ、好ましくはヒトＩＬ－１Ｂとの融合タンパク質である。

【0127】

実施形態において、ＡｐｏＡ１－ＩＬ１Ｂ融合タンパク質は、配列番号２１または８２と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、から本質的になる、またはからなり、または、配列番号２２または配列番号８３と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。

【0128】

実施形態において、融合タンパク質は、ＡｐｏＡ１（その変異体を含む）とＩＬ－２、好ましくはヒトＩＬ－２との融合タンパク質である。

【0129】

実施形態において、ＡｐｏＡ１－ＩＬ２融合タンパク質は、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号５８もしくは配列番号６０と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列有するポリペプチドを含むか、またはそれからなり、または配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号５９または配列番号６１と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むか、もしくはそれからなる。

【0130】

実施形態において、融合タンパク質は、ＡｐｏＡ１（その変異体を含む）とＩＬ－４、好ましくはヒトＩＬ－４との融合タンパク質である。

【0131】

実施形態において、ＡｐｏＡ１－ＩＬ４融合タンパク質は、配列番号３５、配列番号３７もしくは配列番号３９と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、から本質的になる、またはからなり、または、配列番号３６、配列番号３８もしくは配列番号４０と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。

【0132】

実施形態において、融合タンパク質は、ＡｐｏＡ１（その変異体を含む）とＩＬ－３８（ＩＬ１Ｆ１０としても知られる）、好ましくはヒトＩＬ－３８との融合タンパク質である。

【0133】

実施形態において、ＡｐｏＡ１－ＩＬ３８融合タンパク質は、配列番号８０または８４と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、から本質的になる、またはからなり、または、配列番号８１または配列番号８５と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。

【0134】

本明細書の他の箇所に記載されているように、ＡｐｏＡ１はまた、リルーティング分子、例えば、リンパ球、好ましくはＴ細胞、より好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞に結合することができるリルーティング分子などに融合される場合がある。例えば、リルーティング分子は、Woodham A.W.et al.,Nanobody-antigen conjugates elicit HPV-specific antitumor immune responses,Cancer Immunology Research,2018,Vol.6,issue 7に記載されているようなＶＨＨＣＤ８であってもよく、前記の参考文献の補足表１に示されているアミノ酸配列を含む。

【0135】

実施形態において、融合タンパク質は、ＡｐｏＡ１（その変異体を含む）とＶＨＨ８ＣＤ８との融合タンパク質である。

【0136】

実施形態において、ＶＨＨＣＤ８－ａｐｏＡ１融合タンパク質は、配列番号５４または５６と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、から本質的になる、またはからなり、または、配列番号５５または配列番号５７と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。

【0137】

本明細書で使用される場合、アポリポタンパク質融合タンパク質に言及する場合の融合タンパク質は、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物として解釈されるべきであり、免疫調節生体分子および／またはリルーティング分子がそれに共有結合している。共有結合は、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列によるペプチドまたはタンパク質配列のインフレーム符号化によるものであり得る。あるいは、共有結合は、アポリポタンパク質のシステイン残基に形成された、例えばチオエーテル結合などの硫黄結合を介した、アポリポタンパク質への免疫調節生体分子および／またはリルーティング分子の共有結合によるものであり得る。免疫調節生体分子および／またはリルーティング分子および／またはアポリポタンパク質（またはその模倣物）は、アルキン修飾試薬とのその後の（ひずみ促進型）「クリック」（コンジュゲーション）反応に使用することができる、パラ－アジドフェニルアラニンなどの非天然アミノ酸の部位特異的な組み込みを含み得ることが理解される。

【0138】

特定の実施形態では、融合タンパク質は、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物と、前記免疫調節生体分子および／またはリルーティング分子との間に、柔軟性リンカーなどのリンカーを含む。リンカーは、グリシン－セリンリンカー、例えば（ＧＧＳ）ｎ－リンカーであり得、ｎは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０、好ましくは（ＧＧＳ）４－リンカーである。

【0139】

特定の実施形態では、融合タンパク質は、融合タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端などに、１つまたはそれ以上のタグを含み得る。６Ｈｉｓタグまたはｓｔｒｅｐタグなどの１つまたはそれ以上のタグは、融合タンパク質の精製を可能にし得る。

【0140】

前記免疫調節生体分子および／またはリルーティング分子は、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物の任意の部分に共有結合していてもよい。柔軟性リンカーなどのリンカーを使用して、そのような共有結合を可能にすることができる。

【0141】

特定の実施形態では、前記免疫調節生体分子は、前記融合タンパク質の前記アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物のＮ末端またはＣ末端に位置する。

【0142】

特定の実施形態では、前記リルーティング分子は、前記融合タンパク質の前記アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物のＮ末端またはＣ末端に位置する。

【0143】

前記融合タンパク質が免疫調節生体分子およびリルーティング分子を含む特定の実施形態では、前記アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物は、前記免疫調節生体分子および前記リルーティング分子の両方のＮ末端またはＣ末端に位置してもよく、または前記免疫調節生体分子と前記リルーティング分子との間に位置してもよい（例えば、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物のＮ末端またはＣ末端の免疫調節生体分子を用いて）。

【0144】

本明細書で使用される場合、免疫応答は、免疫系によって生物の体内で起こる反応を指す。免疫応答は、先天性免疫応答、適応免疫応答、または補体免疫系であり得る。本明細書で言及される場合、免疫応答には、それだけに限定されないが、炎症促進性分子の分泌、抗炎症分子の分泌、食作用、抗体産生、提示または分泌、抗原提示、免疫細胞の活性化、増殖、抑制または分化、標的への免疫細胞の結合、免疫関連細胞シグナル伝達カスケードの開始、またはそれらの組合せが含まれる。

【0145】

本明細書で使用される場合、免疫調節生体分子は、免疫応答を増強または抑制する分子を指す。生体分子は、先天性免疫応答または適応免疫応答または補体免疫系を干渉、変化、刺激または抑制し得る。生体分子は、タンパク質、ペプチドまたは有機化合物であり得る。化合物は、天然供給源から単離または誘導されてもよく、クローン化または合成されてもよい。免疫調節生体分子の非限定的な例は、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、成長因子ならびに造血成長因子および抗体（またはそれらの抗原結合断片）であるが、当業者はさらなる免疫調節分子を認識し得る。

【0146】

したがって、実施形態では、免疫調節生体分子は、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、成長因子、造血成長因子、抗体もしくはその抗原結合断片、またはそれらの組合せから選択される。

【0147】

実施形態では、免疫調節生体分子はサイトカインであり得る。サイトカインは、約５から２０ｋＤａの小タンパク質であることが当業者に公知であり、細胞シグナル伝達において重要である。例えば、サイトカインは、インターロイキン（ＩＬ）－２サブファミリー、インターフェロン（ＩＦＮ）サブファミリーまたはＩＬ－１０サブファミリーなどの４αヘリックスバンドルファミリーサイトカイン、ＩＬ－１ファミリー、システインノットサイトカイン、例えばトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）ベータファミリー、ＩＬ－１７ファミリーを示すことができる。したがって、サイトカインは、好ましくは、ＩＬ１８、インターロイキン１８結合タンパク質（ＩＬ１８ＢＰ）、インターロイキン１アルファ（ＩＬ１Ａ）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１Ｂ）、インターロイキン１ファミリーメンバー１０（ＩＬ１Ｆ１０）、ＩＬ１Ｆ３／ＩＬ１ＲＡ、ＩＬ１Ｆ５、ＩＬ１Ｆ６、ＩＬ１Ｆ７、ＩＬ１Ｆ８、インターロイキン１受容体様２（ＩＬ１ＲＬ２）、ＩＬ１Ｆ９、ＩＬ３３、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、４－１ＢＢＬ、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー８（ＴＮＦＳＦ８）、分化クラスター４０（ＣＤ４０）リガンド（ＣＤ４０ＬＧ）、ＣＤ７０、ＣＤ９５Ｌ／ＣＤ１７８、エクトディスパシン－Ａ１（ＥＤＡ－Ａ１）、ＴＮＦＳＦ１４、リンホトキシンα（ＬＴＡ）／ＴＮＦＢ、リンホトキシンβ（ＬＴＢ）、ＴＮＦα、ＴＮＦＳＦ１０、ＴＮＦＳＦ１１、ＴＮＦＳＦ１２、ＴＮＦＳＦ１３、ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦＳＦ４、インターフェロンアルファ（ＩＦＮＡ）１、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ７、インターフェロンベータ（ＩＦＮＢ）１、インターフェロンイプシロン（ＩＦＮＥ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮＧ）、インターフェロンゼータ（ＩＦＮＺ）、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ５／ＩＦＮａＧ、ＩＦＮω／ＩＦＮＷ１、カーディオトロフィン様サイトカイン因子１（ＣＬＣＦ１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ＩＬ１１、ＩＬ３１、ＩＬ６、レプチン、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、オノコスタチンＭ（ＯＳＭ）、ＩＬ１０、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２４、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２９、ＴＧＦベータ１／ＴＧＦＢ１、ＴＧＦ－β２／ＴＧＦＢ２、ＴＧＦ－β３／ＴＧＦＢ３を称し得る。好ましい実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－２サブファミリー、インターフェロンサブファミリー、ＩＬ－１０サブファミリー、ＩＬ－１ファミリー、ＴＧＦβファミリー、またはＩＬ－１７ファミリー、またはそれらの組合せから選択され、より好ましくは、サイトカインは、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－３８、またはそれらの組合せから選択される。より好ましくは、サイトカインはＩＬ－４である。

【0148】

特定の実施形態では、サイトカインはヒトサイトカインである。

【0149】

実施形態では、融合タンパク質は、アポリポタンパク質またはその模倣物とＩＬ－１Ｂとの融合タンパク質である。ＩＬ－１Ｂは、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ－１β、ＩＬ１Ｆ２、またはインターロイキン１βとしても公知であり、ヒトにおいてＩＬ１Ｂ遺伝子によってコードされるサイトカインタンパク質である。例として、ヒトＩＬ－１Ｂタンパク質配列は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）アクセッション番号ＮＰ＿０００５６７．１（プロタンパク質）およびＵｎｉｐｒｏｔ（www.uniprot.org）アクセッション番号Ｐ０１５８４．２でアノテーションされている。

【0150】

実施形態では、ＩＬ－１Ｂは、配列番号４５と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を有するか、それを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるペプチド、あるいは配列番号４６と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、それからなるペプチドである。

【0151】

実施形態では、融合タンパク質は、アポリポタンパク質またはその模倣物とＩＬ－２との融合タンパク質である。ＩＬ－２は、ＩＬ２ ＴＣＧＦ、リンホカインまたはインターロイキン２としても公知であり、免疫に関与する白血球の活性を調節するインターロイキンである。例として、ヒトＩＬ－２タンパク質配列は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）アクセッション番号ＮＰ＿０００５７７．２およびＵｎｉｐｒｏｔ（www.uniprot.org）アクセッション番号Ｐ６０５６８．１でアノテーションされている。

【0152】

特定の実施形態では、ＩＬ－２は、野生型ＩＬ－２またはＩＬ－２変異体であり得る。

【0153】

特定の実施形態では、ＩＬ－２は、Wang A.et al.,Science,Site-specific mutagenesis of the human interleukin-2 gene:structure-function analysis of the cysteine residues.,1984,Vol.224,No.4656 or Klein C.et al.,Cergutuzumab amunaleukin(CEA-IL2v),a CEA-targeted IL-2 variant-based immunocytokine for combination cancer immunotherapy:Overcoming limitations of aldesleukin and conventional IL-2-based immunocytokines,OncoImmunology,2017,Volume 6,issue 3,e1277306に記載されているような１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み得る。

【0154】

特定の実施形態では、ＩＬ－２は、以下のアミノ酸置換：Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｌ７２Ｇおよび／またはＣ１２５Ａの１つまたはそれ以上、例えば１つ、２つ、３つまたは４つすべてを含み得る（置換の位置は、成熟ヒトＩＬ－２タンパク質の配列に対して示されている）。配列番号４７によって定義されるヒトＩＬ－２アミノ酸配列（ヒトＩＬ－２前駆体）の最初の２０個のアミノ酸はシグナルペプチドを表し、したがって、ＩＬ－２は、以下のアミノ酸置換、Ｆ６２Ａ、Ｙ６５Ａ、Ｌ９２Ｇおよび／またはＣ１４５Ａのうちの１つまたはそれ以上、例えば１つ、２つ、３つまたは４つすべてを含んでいてもよく、これらの位置は配列番号４７に対して示されることに留意されたい。

【0155】

実施形態では、ＩＬ－２は、配列番号４７と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を有するか、それを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるペプチド、あるいは配列番号４８と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、それからなるペプチドである。

【0156】

実施形態では、融合タンパク質は、アポリポタンパク質またはその模倣物とＩＬ－４との融合タンパク質である。ＩＬ－４は、ＢＳＦ－１、ＩＬ４またはインターロイキン４としても公知であり、ナイーブヘルパーＴ細胞の分化を誘導するサイトカインである。例として、ヒトＩＬ－４タンパク質配列は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）アクセッション番号ＮＰ＿０００５８０．１（アイソフォーム１前駆体）およびＵｎｉｐｒｏｔ（www.uniprot.org）アクセッション番号Ｐ０５１１２．１として注釈が付けられている。

【0157】

実施形態では、ＩＬ－４は、配列番号４３と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を有するか、それを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるペプチド、あるいは配列番号４４と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、それからなるペプチドである。

【0158】

さらなる実施形態において、融合タンパク質は、ＡｐｏＡ１またはその模倣物とＩＬ－４との融合タンパク質である。

【0159】

実施形態では、融合タンパク質は、アポリポタンパク質またはその模倣物とＩＬ－３８との融合タンパク質である。ＩＬ－３８は、ＩＬ３８、ＩＬ１Ｆ１０インターロイキン３８、インターロイキン１ファミリーメンバー１０またはＩＬ１－θとしても公知であり、ヒトではＩＬ１Ｆ１０遺伝子によってコードされるタンパク質である。一例として、ヒトＩＬ－３８タンパク質配列は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）アクセッション番号ＮＰ＿７７５１８４．１およびＵｎｉｐｒｏｔ（www.uniprot.org）アクセッション番号Ｑ８ＷＷＺ１．１でアノテーションされている。実施形態では、ＩＬ－３８は、配列番号４９と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を有するか、それを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるペプチド、あるいは配列番号５０と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、それからなるペプチドである。

【0160】

実施形態では、免疫調節生体分子はケモカインであり得る。ケモカインは、好ましくは、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１（ＣＣＬ１）／ＴＣＡ３、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２／ＭＣＰ－５、ＣＣＬ１３／ＭＣＰ－４、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２／ＭＣＰ－１、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２／ＭＤＣ、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３、Ｃ－Ｃモチーフケモカインリガンド３様３（ＣＣＬ３Ｌ３）、ＣＣＬ４、ＣＣＬ４Ｌ１／ＬＡＧ－１、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、Ｃ－Ｘ３－Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＸ３ＣＬ１）、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＸＣＬ１）、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＣＸＣＬ２／ＭＩＰ－２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７／Ｐｐｂｐ、ＣＸＣＬ９、ＩＬ８／ＣＸＣＬ８、Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＸＣＬ１）、ＸＣＬ２、ＦＡＭ１９Ａ１、ＦＡＭ１９Ａ２、ＦＡＭ１９Ａ３、ＦＡＭ１９Ａ４、およびＦＡＭ１９Ａ５から選択される。別の実施形態において、ケモカインは、ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン、Ｃケモカイン、ＣＸ_３Ｃケモカインまたはそれらの組合せから選択される。

【0161】

実施形態では、免疫調節生体分子はホルモンであり得る。ホルモンは、生理学および行動を調節するために遠隔器官に輸送される多細胞生物におけるシグナル伝達分子であることが、当業者に公知である。実施形態では、ホルモンは、アドレナリン（エピネフリンとしても公知である）、メラトニン、ノルアドレナリン（ノルエピネフリンとしても公知である）、トリヨードチロニン、チロキシン、ドーパミン、プロスタグランジン、ロイコトリエン、プロスタサイクリン、トロンボキサン、アミリン（膵島アミロイドポリペプチドとしても公知である）、抗ミュラー管ホルモン（ミュラー管阻害因子／ホルモンとしても公知である）、アディポネクチン、副腎皮質刺激ホルモン（コルチコトロピンとしても公知である）、アンジオテンチノーゲン、アンジオテンシン、抗利尿ホルモン（バソプレシン、アルギニンバソプレシンとしても公知である）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（心房性レプチンとしても公知である）、脳性ナトリウム利尿ペプチド、カルシトニン、コレコストキニン、コルチコトロピン放出ホルモン、コルチスタチン、エンケファリン、エンドセリン、エリスロポエチン、卵胞刺激ホルモン、ガラニン、胃抑制ポリペプチド、ガストリン、グレリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド－１、ゴナドトロピン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ヘプシジン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒト胎盤ラクトゲン、成長ホルモン、インヒビン、インスリン、インスリン様成長因子（ソマトメジンとしても公知である）、レプチン、リポトロピン、黄体形成ホルモン、メラノサイト刺激ホルモン、モチリン、オレキシン、オステオカルシン、オキシトシン（ピトシンとしても公知である）、膵臓ポリペプチド、副甲状腺ホルモン、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド、プロラクチン（ロイテトロピックホルモンとしても公知である）、プロラクチン放出ホルモン、リラキシン、レニン、セクレチン、ソマトスタチン（成長ホルモン阻害ホルモンまたは成長ホルモン放出阻害ホルモンまたはソマトトロピン放出阻害因子またはソマトトロピン放出阻害ホルモンとしても公知である）、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン（チロトロピンとしても公知である）、チロトロピン放出ホルモン、血管作動性腸ペプチド、グアニリンまたはウログアニリンから選択される。

【0162】

実施形態では、免疫調節生体分子は成長因子であり得る。成長因子は、細胞の増殖、創傷治癒、および場合によっては細胞の分化を刺激することができる、天然に存在する物質として、当業者に公知である。実施形態では、成長因子が、アドレノメデュリン（ＡＭ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ）、自己分泌運動性因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、エフリンＡ１、エフリンＡ２、エフリンＡ３、エフリンＡ４、エフリンＡ５、エフリンＢ１、エフリンＢ２、エフリンＢ３、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、線維成長因子１（ＦＧＦ１）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、線維芽細胞成長因子３（ＦＧＦ３）、線維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ４）、線維芽細胞成長因子５（ＦＧＦ５）、線維芽細胞成長因子６（ＦＧＦ６）、線維芽細胞成長因子７（ＦＧＦ７）、線維芽細胞成長因子８（ＦＧＦ８）、線維芽細胞成長因子９（ＦＧＦ９）、線維芽細胞成長因子１０（ＦＧＦ１０）、線維芽細胞成長因子１１（ＦＧＦ１１）、線維芽細胞成長因子１２（ＦＧＦ１２）、線維芽細胞成長因子１３（ＦＧＦ１３）、線維芽細胞成長因子１４（ＦＧＦ１４）、線維芽細胞成長因子１５（ＦＧＦ１５）、線維芽細胞成長因子１６（ＦＧＦ１６）、線維芽細胞成長因子１７（ＦＧＦ１７）、線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ１８）、線維芽細胞成長因子１９（ＦＧＦ１９）、線維芽細胞成長因子２０（ＦＧＦ２０）、線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）、線維芽細胞成長因子２２（ＦＧＦ２２）、線維芽細胞成長因子２３（ＦＧＦ２３）、ウシ胎児成長因子（ＦＢＳ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニューロン、ペルセフィン、アルテミン、成長分化因子９（ＧＤＦ９）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、肝細胞由来成長因子（ＨＤＧＦ）、インスリン、インスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１）、インスリン様成長因子－２（ＩＧＦ－２）、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、移動刺激因子（ＭＳＦ）、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）、また肝細胞成長因子様タンパク質（ＨＧＦＬＰ）としても公知である、ミオスタチン（ＧＤＦ－８）、ニューレグリン１（ＮＲＧ１）、ニューレグリン２（ＮＲＧ２）、ニューレグリン３（ＮＲＧ３）、ニューレグリン４（ＮＲＧ４）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、ニューロトロフィン－４（ＮＴ－４）、胎盤成長因子（ＰＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、レナラーゼ（ＲＮＬＳ）－抗アポトーシス生存因子、Ｔ細胞成長因子（ＴＣＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、トランスフォーミング成長因子、トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ－α）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ－β）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＷＮＴ６、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１およびＷＮＴ１６から選択される。好ましい実施形態では、成長因子は、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＣＮＴＦ、ＬＩＦ、エフリン、ＦＧＦ、ＧＤＮＦ、ＨＤＦ、ＨＤＧＦ、ＩＧＦ、ＫＧＦ、ＭＳＦ、ＮＲＧ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ニューロトロフィン、ＰＧＦ、ＰＤＧＦ、ＲＮＬＳ、ＴＣＧＦ、ＴＧＦ、ＴＮＦ、ＷＮＴまたはそれらの組合せから選択される。

【0163】

実施形態では、免疫調節生体分子は造血成長因子である。実施形態では、造血成長因子は、ＩＬ－３、コロニー刺激因子１（ＣＳＦ－１（Ｍ－ＣＳＦ））、顆粒球－マクロファージ（ＧＭ）－ＣＳＦ、顆粒球（Ｇ）－ＣＳＦ、インターロイキンもしくはエリスロポエチンのＩＬ－１２ファミリーのメンバーまたはそれらの組合せから選択される。

【0164】

本明細書で使用される場合、標的という用語は、アポリポタンパク質（またはアポリポタンパク質模倣物）または融合タンパク質が優先的に結合する対象を指す。標的は、タンパク質もしくはプロテオグリカン、細胞、細胞型、組織もしくは組織型または器官などの受容体または細胞表面分子を指し得る。

【0165】

特定の実施形態では、前記融合タンパク質を含む融合タンパク質または脂質ナノ粒子は、骨髄系細胞に結合することができる。これは、例えば、骨髄系細胞を標的とするＡｐｏＡ１などのアポリポタンパク質の固有の性質の結果であり得る。本明細書で使用される場合、骨髄系細胞という用語は、顆粒球、単球、赤血球または血小板の前駆細胞に由来する血球を指す。骨髄系細胞は、単球、樹状細胞、組織マクロファージおよび顆粒球を含む免疫系の主要な細胞区画である。本明細書で使用される場合、骨髄区画という用語は、生物中の骨髄系細胞全体を指す。

【0166】

本明細書で使用される場合、リルーティング分子は、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質－免疫調節生体分子融合タンパク質などのタンパク質に融合された場合に、タンパク質が、リルーティング分子に融合されなかった場合に結合するであろう異なる標的に（言い換えれば、それが生来的に結合しているであろう標的とは異なる標的に）結合すること、および／またはより高い親和性でその意図された標的に結合することを可能にする分子を指す。異なる標的への結合はまた、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質－免疫調節生体分子融合タンパク質によって通常結合されるであろう細胞セットの特定のサブセットへの結合を含む、標的細胞の特定のサブセットへの結合を包含し得る。リルーティング分子の非限定的な例は、抗体もしくはその抗原結合断片または抗体断片、リルーティングペプチドもしくはリルーティングタンパク質であり、好ましくは、リルーティングペプチドまたはリルーティングタンパク質は、標的に存在する受容体のリガンドである。

【0167】

アポリポタンパク質は特定のリガンドに結合することが理解される。例えば、異なるリポタンパク質（例えば、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬなど）に見出される異なるアポリポタンパク質は、標的化および結合、したがってリポタンパク質の機能における差異の原因であると考えられる。理論に束縛されることを望むものではないが、アポリポタンパク質の一部は両親媒性の性質を有し、リン脂質および／またはステロールと一緒になって、水性環境において脂質に結合する役割を果たすが、分子の異なる部分は他の分子との相互作用、例えばタンパク質受容体への結合に関与すると考えられる。アポリポタンパク質は、リポタンパク質としてではなく、タンパク質としても循環し得るとさらに仮定される。したがって、（リルーティング分子への融合によって）アポリポタンパク質の結合親和性を改変する可能性は、アポリポタンパク質の標的化または結合を微調整することを可能にするので、興味深い機会を提供する。そのような融合タンパク質のいくつかの用途が想定される。

【0168】

まず、リルーティング分子は、アポリポタンパク質またはリポタンパク質をリルートするために、例えば脂質ホメオスタシスを変化させるために、単に使用され得る。例えば、リルーティング分子を有するアポリポタンパク質融合タンパク質を使用することによって、対象の血液中のＬＤＬまたはＨＤＬ値を変化させることができることが想定され得る。これは、高血中コレステロールレベルなどの脂質障害の治療に利用される可能性がある。

【0169】

第２に、これは、ペイロードを有するリポタンパク質（脂質ナノ粒子）を所定の標的にリルートするために使用され得る。リポタンパク質または脂質ナノ粒子は、医薬化合物などのペイロードを担持する興味深い方法をもたらす。これは、化合物がリポタンパク質／脂質ナノ粒子の脂質コアに溶解され得るので、血液を介した親油性化合物の送達を可能にする。さらなる利点は、リポタンパク質が天然に存在する化合物からなり、したがって免疫系によって天然であると見なされ、医薬化合物による免疫応答の誘発を回避することである。

【0170】

第３に、それは免疫調節生体分子と（単一の融合タンパク質（リルーティング分子と免疫調節生体分子の両方に融合したアポリポタンパク質）として、または２つの異なる融合タンパク質の組合せとして）組み合わされてもよく、かように免疫調節生体分子のリルーティングを可能にする。上記のように、アポリポタンパク質は、本質的に免疫調節生体分子の担体として機能することができる。利点は、それが免疫調節生体分子の除去を大幅に減少させ、治療状況において血液から容易に除去される免疫調節生体分子（例えば、サイトカイン）を使用することを実行可能にすることである。生じ得る１つの問題は、免疫調節生体分子／アポリポタンパク質融合タンパク質が免疫調節生体分子の意図された標的（すなわち、その効果を発揮することが意図される部位、細胞、組織または器官）に到達しないことである。これは、リルーティング分子をさらに含むことによって解決され得る。

【0171】

第４に、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物およびリルーティング分子を含む融合タンパク質は、脂質ナノ粒子を調製することを可能にし、リルーティング分子は、アポリポタンパク質へのその融合の結果として、前記アポリポタンパク質脂質ナノ粒子を取り囲む環境（すなわち水性環境）に曝される。

【0172】

本発明者らによって生成されたデータは、リルーティング分子を使用して、アポリポタンパク質融合タンパク質を異なる標的にうまくリルートすることができることを示唆している。したがって、実施形態において、リルーティング分子は、抗体またはその抗原結合断片、リルーティングペプチドまたはリルーティングタンパク質から選択され、好ましくは、リルーティングペプチドまたはリルーティングタンパク質は、標的に存在する受容体のリガンドである。

【0173】

実施形態において、リルーティング分子は、抗体またはその抗原結合断片であり得る。任意のタイプの抗原結合分子が、原則として、本発明による融合タンパク質のリルーティング分子として使用され得ることが想定される。

【0174】

抗体は、任意の免疫学的結合剤、例えば、限定されないが、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、組換え抗体、トランスジェニック抗体、グラフトされた抗体、および一本鎖抗体などを含む全抗体、または目的の抗原に選択的に結合する１つまたはそれ以上のドメインを含むその任意の融合タンパク質、コンジュゲート、断片または誘導体であり得る。抗体は、全免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、またはこれらのいずれかの免疫学的に有効な断片であり得る。したがって、抗体は、インタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される多価（例えば、２価、３価またはそれ以上）および／または多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体またはそれ以上の特異性抗体）、ならびに所望の生物学的活性（特に、目的の抗原に特異的に結合する能力）を示す限りにおける抗体断片、ならびにそのような断片の多価および／または多重特異性複合体を包含し得る。

【0175】

本明細書を通して使用される「特異的に結合する」または「特異的に相互作用する」という用語は、作用物質が、ランダムまたは無関係な他の分子を実質的に排除し、任意選択で構造的に関連する他の分子を実質的に排除するように、１つまたはそれ以上の所望の分子または分析物に結合するかまたはそれに影響を及ぼすことを意味する。これらの用語は、薬剤がその意図された標的に排他的に結合することを必ずしも必要としない。例えば、作用物質は、結合条件下でのそのような意図された標的に対するその親和性が、非標的分子に対するその親和性よりも少なくとも約２倍大きい、好ましくは少なくとも約５倍大きい、より好ましくは少なくとも約１０倍大きい、さらにより好ましくは少なくとも約２５倍大きい、さらにより好ましくは少なくとも約５０倍大きい、さらにより好ましくは少なくとも約１００倍以上大きい、例えば少なくとも約１０００倍以上大きい、少なくとも約１×１０^４倍以上大きい、または少なくとも約１×１０^５倍以上大きい場合、目的の標的に特異的に結合すると言われ得る。

【0176】

したがって、実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、断片抗原結合領域（Ｆａｂ）、Ｆａｂ_２、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｄＡｂ－Ｆｃ、遊離軽鎖抗体、半抗体、二重特異性Ｆａｂ－２－、Ｆａｂ_３、三重特異性Ｆａｂ３ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、トリアボディ、三重特異性トリアボディ、ミニボディ、ＩｇＧ、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）、一価ＩｇＧ、Ｖ_ｈＨまたは新規抗原受容体の可変ドメイン（ＶＮＡＲ）から選択される。抗体または抗原結合断片はまた、アフィボディ、ＦＮ３ドメイン、ＤＡＲＰｉｎまたはデノボデザインのタンパク質受容体などであるがこれらに限定されない、設計された抗原結合タンパク質であり得る。より低い分子量を有する抗体またはその抗原結合断片は、それらのサイズが小さいために好ましいことが認識され、したがって、好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、Ｖ_ｈＨまたはＶＮＡＲである。

【0177】

実施形態では、リルーティング分子はリルーティングペプチドであり得る。リルーティングペプチドの非限定的な例は、受容体結合ペプチド、リガンド模倣ペプチドである。

【0178】

したがって、実施形態では、リルーティングペプチドは、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）またはシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰａ）から選択される。しかしながら、細胞表面受容体に対する結合特異性を有する任意のペプチドをリルーティング分子として使用することができることが理解される。

【0179】

実施形態では、リルーティング分子は、受容体リガンド、受容体、または相互作用タンパク質などのリルーティングタンパク質であり得る。したがって、実施形態では、リルーティングタンパク質は、ＣＤ４０ＬまたはＧＰ１２０から選択される。ＣＤ４０Ｌは、ＣＤ４０受容体を発現する細胞を標的化するために使用することができる。ＧＰ１２０は、ＣＤ４Ｔ細胞補助受容体に直接結合するために使用することができる。しかしながら、細胞表面受容体に対する結合特異性を有する任意のタンパク質をリルーティング分子として使用することができることが理解される。

【0180】

本明細書で使用される場合、リポタンパク質という用語は、水性環境に分散または溶解した少なくとも１つのアポリポタンパク質および脂質分子の粒子、一般にナノ粒子を指す。

【0181】

本明細書で使用される場合、リルーティングという用語は、融合タンパク質を通常結合する異なる標的に標的化すること、またはアポリポタンパク質の通常の標的の結合を防止すること、またはオフターゲット結合を防止することを指す。例えば、ａｐｏＡ１は、骨髄系細胞上の受容体に結合することが公知であり、したがって、リルーティング分子は、異なる細胞に結合するか、または骨髄系細胞の結合を防止するために使用され得る。換言すれば、リルーティング分子は、非骨髄系細胞に結合し得る、好ましくは特異的に結合し得る。

【0182】

したがって、特定の実施形態において、リルーティング分子は、骨髄系細胞ではないが、骨髄系細胞、例えば造血幹細胞（ＨＳＣ）、多分化能前駆（ＭＰＰ）または共通骨髄前駆細胞（ＣＭＰ）のような造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）に分化し得る細胞に結合することができ、好ましくは特異的に結合することができる。

【0183】

特定の実施形態では、リルーティング分子は、非骨髄性免疫細胞または内皮細胞などの非骨髄系細胞に結合することができ、好ましくは特異的に結合することができる。内皮細胞は、内皮細胞の表面マーカーに結合することができるリルーティング分子の使用によって標的化され得る。例えば、内皮細胞は、第ＶＩＩＩ因子などの第ＶＩＩＩ因子関連抗原に結合することができるリルーティング分子、ＣＤ３１などのＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ－１に結合することができるリルーティング分子、アンジオテンシンなどのアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ／ＣＤ１４３）に結合することができるリルーティング分子、Ｌ－セレクチンなどのＣＤ３４に結合することができるリルーティング分子、またはエンドグリン（ＣＤ１０５）に結合することができるリルーティング分子の使用によって標的化され得る。

【0184】

特定の実施形態では、非骨髄系細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などのリンパ球である。好ましくは、リンパ球はＴ細胞、さらにより好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞である。

【0185】

特定の実施形態では、標的細胞がＴ細胞である場合、リルーティング分子は、ＣＤ８に結合する、好ましくは特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であり得る。例えば、リルーティング分子は、Woodham A.W.et al.,Nanobody-antigen conjugates elicit HPV-specific antitumor immune responses,Cancer Immunology Research,2018,Vol.6,issue 7に記載されているようなＶＨＨＣＤ８であってもよく、前記参考文献の補足表１に示されているようなアミノ酸配列を含む。

【0186】

特定の実施形態では、標的細胞がＴ細胞および／またはＢ細胞である場合、リルーティング分子またはリルーティングペプチドは、ＰＤ１、ＣＤ４０ＬまたはＧＰ１２０であり得る。

【0187】

リルーティングという用語はまた、特定の標的細胞などの特定の標的に対する融合タンパク質の特異性を増加させることを包含し得る。例えば、ａｐｏＡ１は、骨髄系細胞上の受容体に結合することが公知であり、したがって、リルーティング分子は、骨髄系細胞の特定のサブタイプに結合するために使用され得る。

【0188】

したがって、特定の実施形態では、リルーティング分子は、巨核球、好酸球、好塩基球、赤血球、樹状細胞またはマクロファージなどの単球、および好中球からなる群から選択される骨髄系細胞に結合することができ、好ましくは特異的に結合することができる。例えば、リルーティング分子としてのＳＩＲＰａｌｐｈａは、免疫抑制性マクロファージを標的化することを可能にし得る。

【0189】

本明細書に記載のアポリポタンパク質融合タンパク質は、タンパク質または脂質ナノ粒子として使用され得ることが想定される。上記のように、アポリポタンパク質はそのまま循環し得る（リポタンパク質または脂質ナノ粒子に組み込まれていないことを意味する）。この適用は、免疫調節生体分子、例えばＩＬ－４のようなサイトカインを標的部位に送達するのに適し得る。アポリポタンパク質はタンパク質として循環することができるが、インサイチュでリポタンパク質を形成することもできることが公知である。しかしながら、融合タンパク質を脂質ナノ粒子に含めることも有利であり得る。したがって、態様では、本発明は、本明細書の１つまたはそれ以上の融合タンパク質を含む脂質ナノ粒子に関し、脂質ナノ粒子は、リン脂質、および任意選択でステロールをさらに含む。脂質ナノ粒子は、本明細書では「アポリポタンパク質脂質ナノ粒子」と便宜的に表される。融合タンパク質は、免疫調節生体分子とのアポリポタンパク質の融合タンパク質、またはリルーティング分子とのアポリポタンパク質、または免疫調節生体分子およびリルーティング分子とのアポリポタンパク質の融合タンパク質、またはそれらの組合せであり得る。アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質模倣物であってもよい。いかなる仮説にも束縛されるものではないが、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物は、リン脂質および任意選択でステロールと共にナノ粒子の形成を助けるための足場として機能し得ると考えられる。

【0190】

本発明の態様では、脂質ナノ粒子は、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物および免疫調節生体分子を含む融合タンパク質、およびリン脂質を含む。

【0191】

本発明の一態様では、脂質ナノ粒子は、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物およびリルーティング分子を含む融合タンパク質、およびリン脂質を含む。

【0192】

アポリポタンパク質脂質ナノ粒子は、免疫調節生体分子とリルーティング分子の両方を含み得る。これは、免疫調節生体分子とリルーティング分子の両方を含む１つの融合タンパク質を組み込むことによって、または免疫調節生体分子を含むものとリルーティング分子を含むものとの２つの融合タンパク質をアポリポタンパク質脂質ナノ粒子に組み込むことによって達成され得る。

【0193】

したがって、本発明の一態様では、脂質ナノ粒子は、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、免疫調節生体分子、およびリルーティング分子を含む融合タンパク質、およびリン脂質を含む。

【0194】

本発明の一態様では、脂質ナノ粒子は、（ｉ）アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物および免疫調節生体分子を含む融合タンパク質、およびリン脂質、ならびに（ｉｉ）アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物およびリルーティング分子を含む融合タンパク質、およびリン脂質を含む。

【0195】

本明細書で使用される場合、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、リン脂質と、水溶液に可溶性の１つまたはそれ以上のアポリポタンパク質との集合体を指す。粒子は、ステロールおよび／または脂質（例えばトリグリセリド）をさらに含み得る。ＬＮＰがステロールおよび脂質の両方を含む場合、脂質はリン脂質およびステロールによってカプセル化される。したがって、脂質ナノ粒子は、かようにリポソームと構造が異なる。

【0196】

特定の実施形態では、リン脂質は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルグリセロール、またはそれらの組合せから選択される。さらに特定の実施形態では、リン脂質が、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＨＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジラウロイルホスファチジルセリン（ＤＬＰＳ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、ジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、またはそれらの組合せからなる群から選択される。

【0197】

特定の実施形態では、モル重量百分率に基づくアポリポタンパク質（またはアポリポタンパク質模倣物）とリン脂質との比は、１：２５～１：４００、より好ましくは１：５０～１：２００、さらにより好ましくは１：７５～１：１５０である。特定の実施形態では、モル重量百分率に基づく本明細書にて教示されている融合タンパク質とリン脂質との比は、１：２５～１：４００、より好ましくは１：５０～１：２００、さらにより好ましくは１：７５～１：１５０である。

【0198】

特定の実施形態では、重量に基づくアポリポタンパク質（またはアポリポタンパク質模倣物）とリン脂質との比は、３：１～１：１００である。特定の実施形態では、重量に基づくリン脂質に対する本明細書で教示される融合タンパク質の比は、３：１～１：１００である。

【0199】

特定の実施形態では、ステロールが、コレステロール、デスモステロール、スチグマステロール、β－シトステロール、エルゴステロール、ホパノイド、ヒドロキシステロイド、植物ステロール、ステロイド、水素化コレステロール、カンペステロール、動物ステロール、またはそれらの組合せから選択される。

【0200】

ナノ粒子は、さらなるタンパク質またはペイロードなどのさらなる成分を含み得る。したがって、実施形態では、本明細書で定義される脂質ナノ粒子は、脂質をさらに含む。さらなる実施形態では、本明細書で定義される脂質ナノ粒子はペイロードをさらに含む。

【0201】

本明細書で使用される場合、ペイロードという用語は、アポリポタンパク質、リン脂質またはステロールではない、脂質ナノ粒子に含まれる化合物を指す。ペイロードは、例えば、医薬化合物であってもよい。脂質ナノ粒子は、親油性ペイロードに特に適しているが、両親媒性分子にも使用することができる。医薬化合物は、多くの場合、有機化合物、ペプチド、タンパク質、核酸または核酸類似体、バイオロジックまたは脂質である。したがって、実施形態では、脂質ナノ粒子はペイロードをさらに含み、好ましくはペイロードは、核酸または核酸類似体、治療薬、バイオロジックまたはそれらの組合せから選択される。

【0202】

例えば、ペイロードは、核酸または核酸類似体であり得る。例は、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｒＲＮＡまたはｔｓＲＮＡであり得るが、これらに限定されない。核酸類似体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノおよびロックド核酸（ＬＮＡ）、ならびにグリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）およびヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、またはそれらの混合物または組合せであり得る。あるいは、ペイロードは、小分子薬物などの小さな有機化合物であってもよい。一般に、小さな有機化合物が合成される。治療薬は、例えば、化学療法などの抗癌療法薬であり得る。あるいは、ペイロードはバイオロジックであってもよい。本明細書で使用される場合、バイオロジックという用語は、生物学的医療製品としても公知である生物製剤を示すために使用され、生物学的な源で製造された、抽出された、または半合成された任意の薬学的薬物製品であり得る。バイオロジックは、糖、タンパク質、核酸、またはこれらの物質の複雑な組合せから構成され得るか、または生細胞もしくは組織であり得る。

【0203】

特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の融合タンパク質の一部を形成するアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物に加えて、天然（例えば未融合）アポリポタンパク質、アポリポタンパク質模倣物またはそれらの組合せを含む。

【0204】

特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、１０から１００ｎＭ、例えば３０から１００ｎＭの平均サイズを有する。

【0205】

特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、球体、リボンまたはディスク、好ましくは球体またはディスク、より好ましくは球体である。

【0206】

アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物は、脂質ナノ粒子構造の一部を形成する。特定の実施形態では、前記融合タンパク質の少なくとも一部は、前記アポリポタンパク質脂質ナノ粒子を取り囲む環境（すなわち水性環境）に曝露される。典型的には、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物の一部は、前記アポリポタンパク質脂質ナノ粒子を取り囲む環境に曝露される（例えば、図１、図２、および図２２を参照されたい）。さらに、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物への免疫調節生体分子および／またはリルーティング分子の融合は、典型的には、前記免疫調節生体分子および／またはリルーティング分子が前記アポリポタンパク質脂質ナノ粒子を取り囲む環境に完全に曝されることを可能にする（例えば、図１、図２、および図２２を参照されたい）。言い換えれば、免疫調節生体分子および／またはリルーティング分子は、脂質ナノ粒子内に埋め込まれていない。その結果、前記免疫調節生体分子および／または前記リルーティング分子は、自由に動くことができ、その細胞標的化機能などのその天然の機能を発揮することができる。

【0207】

特定の実施形態では、脂質ナノ粒子はペイロードを含み、脂質ナノ粒子は、表面層によって囲まれたコアを含み、コアはペイロードを含み、表面層はアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、リン脂質、免疫調節生体分子および／またはリルーティング分子、ならびに任意選択でステロールを含む。

【0208】

特定の実施形態では、脂質ナノ粒子はリン脂質二重層ではない。
本明細書では、このような脂質ナノ粒子を製造する方法も提供される。したがって、さらなる態様では、本発明は、脂質ナノ粒子を製造する方法、本明細書に教示されるアポリポタンパク質脂質ナノ粒子を製造する方法であって、
ａ１）１つまたはそれ以上の単離されたアポリポタンパク質融合タンパク質を得るために、１つまたはそれ以上のアポリポタンパク質融合タンパク質を発現および単離する工程であって、
１つまたはそれ以上のアポリポタンパク質融合タンパク質が、ＩＬ－４などの免疫調節生体分子に融合したアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、
リルーティング分子に融合したアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、
ＩＬ－４などの免疫調節生体分子に融合したアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、およびリルーティング分子、およびそれらの組合せからなる群から選択される、工程および／または
ａ２）１つまたはそれ以上のアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物を化学的にコンジュゲートし、１つまたはそれ以上のコンジュゲートされたアポリポタンパク質を単離して、１つまたはそれ以上の単離されたコンジュゲートされたアポリポタンパク質を得る工程であって、
１つまたはそれ以上のコンジュゲートされたアポリポタンパク質が、ＩＬ－４などの免疫調節生体分子にコンジュゲートされたアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、
リルーティング分子にコンジュゲートされたアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、
ＩＬ－４などの免疫調節生体分子にコンジュゲートされたアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、およびリルーティング分子、およびそれらの組合せからなる群から選択される工程、および
ｂ）工程ａ１で得られた１つまたはそれ以上の単離されたアポリポタンパク質融合タンパク質および／または工程ａ２で得られた１つまたはそれ以上の単離されたコンジュゲートされたアポリポタンパク質をリン脂質ならびに任意選択でステロールおよび／または脂質と組み合わせて、アポリポタンパク質脂質ナノ粒子を得る工程を含む方法に関する。

【0209】

さらなる態様では、本発明は、本明細書で定義される脂質ナノ粒子を製造する方法であって、
ａ１）単離されたアポリポタンパク質融合タンパク質を得るためにアポリポタンパク質融合タンパク質を発現および単離する工程であって、アポリポタンパク質融合タンパク質が、サイトカインおよび標的化部分に融合したアポリポタンパク質であり、ならびに／またはアポリポタンパク質融合タンパク質が、サイトカインに融合したアポリポタンパク質および／もしくは標的化部分に融合したアポリポタンパク質である、工程、および／または
ａ２）アポリポタンパク質を化学的にコンジュゲートさせ、コンジュゲートされたアポリポタンパク質を単離して、単離されたコンジュゲートされたアポリポタンパク質を得る工程であって、コンジュゲートされたアポリポタンパク質が、サイトカインおよび標的化部分にコンジュゲートされたアポリポタンパク質であり、ならびに／またはコンジュゲートされたアポリポタンパク質が、サイトカインにコンジュゲートされたアポリポタンパク質および／もしくは標的化部分にコンジュゲートされたアポリポタンパク質である、工程、
ｂ）工程ａ１で得られた単離されたアポリポタンパク質融合タンパク質および／または工程ａ２で得られた単離されたコンジュゲートされたアポリポタンパク質をリン脂質、ならびに任意選択でステロールおよび／または脂質と組み合わせて、脂質ナノ粒子を得る工程を含む方法に関する。

【0210】

さらなる態様では、本発明は、本明細書で教示されるアポリポタンパク質脂質ナノ粒子を製造する方法によって得られる、またはそれによって得ることができるアポリポタンパク質脂質ナノ粒子に関する。

【0211】

融合タンパク質は、アポリポタンパク質と免疫調節生体分子および／またはリルーティング分子とのキメラ融合タンパク質として発現され得るか、または免疫調節生体分子および／またはリルーティング分子に化学的にコンジュゲートされ得るか、またはこれらの組合せで産生され得ることが理解される。キメラタンパク質の発現は当業者に公知であり、免疫調節生体分子および／またはリルーティング分子がペプチドまたはタンパク質である場合に使用することができる。例えば、アポリポタンパク質（または模倣物）をコードする配列とインフレームで、例えば、ＣまたはＮ末端配列をコードするヌクレオチドで、免疫調節生体分子および／またはリルーティング分子コード配列をクローニングすることによって、そのようなタンパク質をコードする核酸を作製するために分子技術を使用することは、十分に当業者の知識の範囲内である。キメラタンパク質発現を使用する利点は、発現されるすべてのタンパク質が融合タンパク質であることである。

【0212】

あるいは、化学的コンジュゲーションを使用してもよい。免疫調節生体分子および／またはリルーティング分子のアポリポタンパク質（またはその模倣物）への化学的コンジュゲーションに適した方法は、当業者に公知である。非限定的な例は、ひずみ促進付加環化、アミノリシスおよびマイケル型付加である。例えば、既存のまたは導入されたシステイン残基は、アポリポタンパク質または免疫調節生体分子および／またはリルーティング分子のいずれかに使用され得る。
例えば、本明細書の他の箇所に記載されるように、ＡｐｏＡ１タンパク質は、１４７または２７９の位置にセリンの代わりにシステインを含み得る。システイン残基の導入は、コードするヌクレオチド配列中のヌクレオチドの点突然変異によって、またはシステインをコードするコドンの導入によって達成され得る。化学的コンジュゲーションの利点は、ペプチドまたはタンパク質配列の使用に限定されず、任意の種類の有機分子に適用できることである。

【0213】

融合タンパク質、リン脂質、およびステロールおよび脂質などの任意の成分は、脂質ナノ粒子を得るために迅速に混合され得ることが理解される。任意選択で、本明細書で定義される脂質および／またはペイロードが添加され得る。

【0214】

本発明のさらなる態様は、本明細書で教示される融合タンパク質、本明細書で教示される核酸または本明細書で教示される脂質ナノ粒子、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

【0215】

さらなる態様では、本発明は、医薬品として使用するための、本明細書で定義される融合タンパク質もしくは本明細書で定義される脂質ナノ粒子、または本明細書に記載される方法によって得られるもしくは得ることができる脂質ナノ粒子、または本明細書で定義される核酸、または本明細書で定義される医薬組成物に関する。ナノ粒子に含まれる融合タンパク質（例えば、免疫調節生体分子の作用によって）またはペイロードのいずれかを使用して、対象の症状を治療、改善または緩和することができることが想定される。

【0216】

さらなる態様では、本発明は、免疫関連障害の治療に使用するための、本明細書で定義される融合タンパク質もしくは本明細書で定義される脂質ナノ粒子、または本明細書で定義される方法によって得られるもしくは得ることができる脂質ナノ粒子、または本明細書で定義される核酸、または本明細書で定義される医薬組成物に関する。換言すれば、本発明は、免疫関連障害を、それを必要とする対象において治療する方法であって、治療有効量の本明細書に定義される融合タンパク質もしくは本明細書に定義される脂質ナノ粒子、または本明細書に定義される方法によって得られるもしくは得ることができる脂質ナノ粒子、または本明細書に定義される核酸、または本明細書に定義される医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法に関する。対象の免疫関連障害の治療のための医薬品を製造するための、本明細書で定義される融合タンパク質もしくは本明細書で定義される脂質ナノ粒子、または本明細書で定義される方法によって得られるもしくは得ることができる脂質ナノ粒子、または本明細書で定義される核酸、または本明細書で定義される医薬組成物の使用も本明細書で提供される。

【0217】

本明細書で使用される免疫関連障害は、免疫系が疾患発症において役割を果たす任意の障害を含む。免疫関連障害は、免疫系が抑制されているか、または（過剰に）活性化されている障害を指し得る。免疫関連障害の例は、癌、感染、敗血症、自己免疫性疾患および心血管疾患である。自己免疫性疾患の例は、１型糖尿病、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、乾癬性関節炎、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性狼瘡（ＳＬＥ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、アジソン病、グレーブス病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、自己免疫性血管炎、悪性貧血、およびセリアック病である。

【0218】

したがって、実施形態では、免疫関連障害が、癌、感染、敗血症、１型糖尿病、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、乾癬性関節炎、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性狼瘡（ＳＬＥ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、アジソン病、グレーブス病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、自己免疫性血管炎、悪性貧血、およびセリアック病からなる群から選択される。

【0219】

さらなる特定の実施形態では、免疫関連障害は、癌、炎症、感染症、自己免疫障害、例えば、多発性硬化症、アレルギー、臓器移植拒絶、および移植片対宿主病（ＧＶＨ）からなる群から選択される。

【0220】

予想外にも、本発明者らは、ＩＬ－４が逆説的に炎症を軽減し、特に骨髄区画に標的化された場合に、訓練された免疫を同時に誘導することができることを見出した。多くの炎症性の問題（敗血症、脳卒中および心筋梗塞など）では、過剰炎症と免疫抑制が同時に起こる。したがって、本発明者らは、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、好ましくはＡｐｏＡ１とＩＬ－４との融合タンパク質を使用して、炎症を軽減し、訓練された免疫を促進することを同時に行うことによって免疫関連障害を予防することができると結論付けた。

【0221】

したがって、前記免疫調節生体分子がＩＬ－４である特定の実施形態では、免疫関連障害は、炎症の軽減および／または訓練された免疫の促進から利益を得る疾患である。

【0222】

したがって、前記免疫調節生体分子がＩＬ－４である特定の実施形態では、免疫関連障害は、過剰炎症とそれに続く免疫麻痺の状態であり、好ましくは、過剰炎症および／または免疫麻痺は、敗血症、心筋梗塞、脳卒中、癌、または多発性硬化症によるＣＯＶＩＤ－１９などの感染症によって引き起こされる。

【0223】

前記免疫調節生体分子がＩＬ－４である特定の実施形態では、アポリポタンパク質ナノ粒子または融合タンパク質は、炎症を軽減し、同時に訓練された免疫を誘導する。

【0224】

前記免疫調節生体分子がＩＬ－２である特定の実施形態では、アポリポタンパク質ナノ粒子または融合タンパク質は、Ｔ細胞増殖を刺激するために使用され得る。

【0225】

前記免疫調節生体分子がＩＬ－１βである特定の実施形態では、アポリポタンパク質ナノ粒子または融合タンパク質を使用して、訓練された免疫を誘導することができる。

【0226】

前記免疫調節生体分子がＩＬ－３８である特定の実施形態では、アポリポタンパク質ナノ粒子または融合タンパク質を使用して、訓練された免疫を低下させることができる。

【0227】

さらなる態様では、本発明は、化合物または免疫調節分子を標的に送達する際の、好ましくは標的が細胞、組織および／または器官である、本明細書で定義される融合タンパク質または本明細書で定義される脂質ナノ粒子、または本明細書で定義される方法によって得られるもしくは得ることができる脂質ナノ粒子または本明細書で定義される核酸、または本明細書で定義される医薬組成物の使用に関する。実施形態では、本方法は、エクスビボまたはインビトロ方法である。代替の実施形態では、方法はインビボ方法である。典型的には、アポリポタンパク質またはリルーティング分子は、受容体などの細胞表面タンパク質に結合する。したがって、標的は、受容体、細胞または細胞型（前記タンパク質を発現する）、組織または組織型（前記タンパク質を発現する）または器官（前記タンパク質を発現する）などのタンパク質であり得る。リルーティング分子を選択または適合させることによって、融合タンパク質を異なるタンパク質に標的化することができることが理解される。例えば、リガンドの受容体結合ドメインを使用して、特定の受容体を標的化することができる。あるいは、細胞表面タンパク質の既知の結合パートナーを使用して、融合タンパク質をリルーティングすることができる。

【0228】

さらなる態様では、本発明は、本明細書で定義される融合タンパク質をコードする核酸に関する。核酸は、細胞への安定した組み込みのためのウイルスベクターなどのベクター、または一過性発現を可能にする発現ベクターに含まれ得る。

【0229】

特定の実施形態では、ベクターは、骨髄特異的または増強されたプロモーターまたはプロモーターエレメントを含み、ＩＬ－４の骨髄特異的発現を駆動するためにベクターにおいて使用され得る。適切なプロモーターは当業者に公知であり、非限定的な例は：ｌｙｓＭ、Ｃｓｆ１ｒ、ＣＤ１１ｃ、ＣＸ３ＣＲ１、ランゲリン／ＣＤ２０７、ＭＭＬＶ ＬＴＲ、ビスナウイルスＬＴＲ、ＤＣ－ＳＴＡＭＰ、ヒトＭＳＲ、ＭＳＲ－Ａ、ｈｕＣＤ６８、ＣＤ４、ＣＤ２およびＩｂａ－ＡＩＦ－１（総説については、例えばHume.,Journal of leukocyte biology,Volume89,Issue4,April 2011,Pages 525-538を参照されたい）である。そのようなプロモーターまたはプロモーターエレメントは、細胞を安定してトランスフェクトし、骨髄系細胞における導入遺伝子の特異的発現を可能にするために、例えばレンチウイルスベクターなどのベクターに組み込むことができる。

【0230】

過剰炎症および免疫麻痺を同時に解決するという本発明者らの探求において、本発明者らは、訓練された免疫および寛容におけるインターロイキン（ＩＬ）－４の役割を広く研究した。インビトロで単球に対するその効果を調べると［Czimmerer,Z.et al.The Transcription Factor STAT6 Mediates Direct Repression of Inflammatory Enhancers and Limits Activation of Alternatively Polarized Macrophages.Immunity 48,75-90.e6(2018);Essner,R.,Rhoades,K.,McBride,W.H.,Morton,D.L.&Economou,J.S.IL-4 down-regulates IL-1 and TNF gene expression in human monocytes.J.Immunol.142,3857(1989);Woodward,E.A.,Prele,C.M.,Nicholson,S.E.,Kolesnik,T.B.&Hart,P.H.The anti-inflammatory effects of interleukin-4 are not mediated by suppressor of cytokine signalling-1(SOCS1).Immunology 131,118-127(2010)］、本発明者らは、ＩＬ－４が炎症性プログラムを同時に下方制御し、訓練された免疫を誘導することを発見した。本発明者らは、ＩＬ－４の固有の特性が単球におけるリポ多糖誘導性免疫透析を克服することを可能にすることを見出した。

【0231】

しかしながら、その非特異的な性質および好ましくない薬物動態学的特性のために、ＩＬ－４は骨髄系細胞調節治療薬としては不適切である。これらの制限を克服するために、本発明者らはここで、ＩＬ－４を骨髄区画に送ることが魅力的な治療手段であることを見出した。この概念を支持して、本明細書中の本発明者らは、本明細書中の他の箇所に記載されるように、ＩＬ－４を高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）の主要なタンパク質構成成分であるアポリポタンパク質Ａ－１（ａｐｏＡ１）と結合させる融合タンパク質を記載し、開発した。得られたａｐｏＡ１－ＩＬ－４融合タンパク質は、骨髄系細胞親和性脂質ナノ粒子（ａｐｏＡ１－ＩＬ４ナノ粒子）に容易に組み込まれ、自然免疫細胞に対するＩＬ－４の薬物動態プロファイルおよびバイオアベイラビリティを有意に改善する。本発明者らは、定量的核イメージング技術および血液化学測定を使用して、マウスおよび非ヒト霊長類におけるａｐｏＡ１－ＩＬ－４－ナノ粒子のインビボ挙動および安全性プロファイルを評価した。最後に、本発明者らは、多重翻訳炎症および敗血症モデルにおけるａｐｏＡ１－ＩＬ－４－ナノ粒子の治療可能性を研究し、過剰炎症誘発性免疫麻痺の管理のための新しいパラダイムを制度化した。

【0232】

したがって、本発明者らは、ＩＬ－４が骨髄区画に標的化され得るならば、ＩＬ－４は、訓練された免疫を促進することによって免疫関連障害を予防するために使用され得る有望な新規治療薬であると結論付けた。本明細書の他の箇所に記載されるように、本発明者らは、アポリポタンパク質へのＩＬ－４の共有結合によってこれを達成することができることを実証しているが、骨髄区画の標的化を達成するために少なくとも以下の方法が使用され得ることが想定される。
－本明細書の他の箇所に記載されるアポリポタンパク質へのＩＬ－４の融合、
－骨髄標的化分子へのＩＬ－４の融合、好ましくは骨髄マーカーに結合する抗体もしくはその抗原結合断片、または骨髄区画の標的化を可能にするリガンドもしくはペプチドである骨髄標的化分子へのＩＬ－４の融合、
－骨髄区画内または骨髄区画付近におけるＩＬ－４の標的化発現。

【0233】

したがって、さらなる態様において、本発明は、骨髄標的化分子とＩＬ－４との融合タンパク質に関し、好ましくは、それにおいて骨髄標的化分子がＩＬ－４を骨髄系細胞に標的化することができる。

【0234】

特定の実施形態では、骨髄標的化分子は、化学物質、例えば有機小分子であるか、または生物学的分子、例えば生物学的ポリマー、例えばタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチド、核酸、糖類、多糖類である。好ましくは、前記分子は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドである。

【0235】

上記で詳述したように、本発明は、以下に提供される実験例によってさらに支持される、以下の
－ＩＬ－４は驚くべきことに、訓練された免疫を誘導することができ、ＩＬ－４を免疫関連障害、特に免疫麻痺のための興味深い治療薬にし、また
－注射されたＩＬ－４の好ましくない薬理学的特性は、ＩＬ－４を骨髄区画に標的化することによって回避することができるという知見に基づいている。

【0236】

特定の実施形態では、ＩＬ－４は、配列番号４３と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列、またはその環状置換を含むポリペプチドである。さらなる実施形態では、ＩＬ－４ポリペプチドは、配列番号４４と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一である配列を有する核酸がコードされる。

【0237】

同一の機能を有する融合はまた、環状順列を使用して構築され得ることが理解される。環状順列は、タンパク質間の関係であり、タンパク質は、ペプチド配列中のアミノ酸の順序が変更されている。その結果、異なる連結性を有するが、全体的に同様の三次元形状を有するタンパク質構造が得られる。例えば、第１のタンパク質は配列ａ－ｂ－ｃを有し、順列の後、第２のタンパク質は同じ三次元形状を維持しながら配列ｃ－ａ－ｂを有する。したがって、さらなる実施形態において、ＩＬ－４ポリペプチドは、共に配列番号４３と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一である２つの配列を含む。

【0238】

本明細書で使用される場合、骨髄系細胞を標的化することまたは骨髄区画を標的化することを指す場合の「標的化する」という用語は、骨髄系細胞もしくは骨髄区画に近接させること、または骨髄系細胞もしくは骨髄区画の近傍を濃縮することを意味すると理解されるべきである。これは、平均して（骨髄標的化分子によって）標的化する場合、より多くのＩＬ－４分子が骨髄系細胞または骨髄区画に近接していることを意味する。本明細書において近接とは、例えばその受容体の１つの結合によって、ＩＬ－４が骨髄系細胞と相互作用できるように位置することを意味する。

【0239】

本明細書で使用される場合、骨髄標的化分子は、ＩＬ－４に融合するとＩＬ－４を骨髄系細胞に標的化することを可能にする任意の分子、ただし好ましくはペプチド、タンパク質、またはタンパク質ドメインなどのタンパク質の一部を示すことを意図している。以下でより詳細に説明するように、以下の選択肢、すなわちアポリポタンパク質、抗体またはその抗原結合断片、受容体または膜分子の骨髄系細胞特異的リガンドが骨髄標的化分子として機能することが実証または想定される。

【0240】

本明細書で使用される場合、骨髄系細胞という用語は、顆粒球、単球、赤血球または血小板の前駆細胞に由来する血球を指す。骨髄系細胞は、単球、樹状細胞、組織マクロファージおよび顆粒球を含む免疫系の主要な細胞区画である。本明細書で使用される場合、骨髄区画という用語は、生物中の骨髄系細胞全体を指す。

【0241】

特定の実施形態では、骨髄標的化分子は、抗体またはその抗原結合断片、骨髄標的化ペプチドまたは骨髄標的化タンパク質から選択され、好ましくは、骨髄標的化ペプチドまたは骨髄標的化タンパク質は、標的上に存在する受容体のリガンドである。

【0242】

例えば、骨髄系細胞上に高度に発現されるかまたは排他的に存在する抗原に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を使用することができる。適切な標的は当業者に公知であり、非限定的な例は、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、またはＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ４０もしくはＨＬＡ－ＤＲなどの共刺激分子である。したがって、実施形態では、骨髄標的化ペプチドまたはタンパク質は、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ４０またはＨＬＡ－ＤＲに選択的に結合する抗体またはその抗原結合断片から選択される。

【0243】

特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｄＡｂ－Ｆｃ、遊離軽鎖抗体、半抗体、二重特異性Ｆａｂ－２－、Ｆａｂ３、三重特異性Ｆａｂ－３－ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、トリアボディ、三重特異性トリアボディ、ミニボディ、ＩｇＧ、ＩｇＮＡＲ、一価ＩｇＧ、ＶｈＨまたはＶＮＡＲから選択される。

【0244】

あるいは、骨髄系細胞上に発現される受容体または因子に特異的または主に結合するリガンドまたは補因子を使用してもよく、非限定的な例はＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）およびＦＣドメインであるが、当業者は他の適切なリガンドまたは補因子を知っている。したがって、実施形態では、骨髄標的化分子が骨髄標的化ペプチドまたは骨髄標的化タンパク質であり、骨髄標的化タンパク質または骨髄標的化ペプチドがＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）およびＦＣドメインから選択される。

【0245】

さらなる態様において、本発明は、本明細書中で教示されるような骨髄標的化分子とＩＬ－４との融合タンパク質をコードする核酸に関する。実施形態では、本発明は、配列番号４４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一の核酸配列を有する核酸、または配列番号４３と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸に関する。

【0246】

核酸配列は、本発明による融合タンパク質を発現するために使用することができ、したがって、好ましい実施形態では、核酸は、タンパク質発現ベクターまたはウイルスベクターなどのベクターに含まれる。融合タンパク質は、エクスビボで発現させることができ、例えば、後に対象に投与することができる。あるいは、ベクターは、対象内の細胞を一過性または安定して形質転換するために使用され得る。例えば、肝細胞、線維芽細胞または筋細胞を形質転換して、その後に血液循環中に放出され得る融合タンパク質を発現させて骨髄区画の標的化を可能にすることが特に有益であり得る。本明細書で使用される場合、ベクターという用語は、細胞における遺伝子発現のために設計されたプラスミドまたはウイルスを指す。ベクターは、特定の遺伝子を標的細胞に導入するために使用され、遺伝子によってコードされるタンパク質を産生するためのタンパク質合成のための細胞の機構を操作することができる。ベクターは、エンハンサーおよびプロモーター領域として作用し、発現ベクター上に担持された遺伝子の効率的な転写をもたらす調節配列を含有するように操作される。当業者は、例えば遺伝子の細胞型特異的または誘導的発現（およびその後のタンパク質への翻訳）のためにエンハンサー領域およびプロモーター領域をどのように適合させるかを認識している。

【0247】

骨髄系細胞を標的とする骨髄標的化分子を用いてＩＬ－４融合タンパク質を発現させる代わりに、ＩＬ－４を骨髄系細胞内またはその近くで発現させて、骨髄系細胞へのＩＬ－４の標的化を確実にし得ることがさらに想定される。したがって、さらなる態様は、配列番号４４と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の核酸配列を含むか、または配列番号４３と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含み、骨髄系細胞における標的化発現のための手段をさらに含む核酸であって、前記手段が、
－前記核酸に作動可能に連結された前記骨髄系細胞における選択的または誘導的発現のためのプロモーター、または
－前記骨髄系細胞において前記核酸を安定して発現することができる前記核酸を含むウイルス発現ベクター、または
－１つまたはそれ以上のアポリポタンパク質、リン脂質、前記核酸および任意選択でステロールを含む脂質ナノ粒子から選択される核酸を提供する。

【0248】

例えば、骨髄特異的または増強されたプロモーターまたはプロモーターエレメントをベクターにおいて使用して、ＩＬ－４の骨髄特異的発現を駆動することができる。適切なプロモーターは当業者に公知であり、非限定的なエクザンプケは：ｌｙｓＭ、Ｃｓｆ１ｒ、ＣＤ１１ｃ、ＣＸ３ＣＲ１、ランゲリン／ＣＤ２０７、ＭＭＬＶ ＬＴＲ、ビスナウイルスＬＴＲ、ＤＣ－ＳＴＡＭＰ、ヒトＭＳＲ、ＭＳＲ－Ａ、ｈｕＣＤ６８、ＣＤ４、ＣＤ２およびＩｂａ－ＡＩＦ－１（総説については、例えばHume.,Journal of leukocyte biology,Volume89,Issue4,April 2011,Pages 525-538を参照されたい）である。そのようなプロモーターまたはプローター要素は、例えばレンチウイルスベクターなどのベクターに組み込まれて、細胞を安定してトランスフェクトし、骨髄系細胞における導入遺伝子の特異的発現を可能にすることができる。

【0249】

例えば、改変レトロウイルスなどのウイルスは、骨髄系細胞においてＩＬ－４に特異的に感染し、ＩＬ－４の発現を駆動するために使用され得る。

【0250】

例えば、アポリポタンパク質、コレステロール、およびＩＬ－４をコードするｍＲＮＡを含むリン脂質を含む脂質ナノ粒子を使用して、骨髄系細胞を特異的に標的とし、骨髄系細胞においてｍＲＮＡをタンパク質に翻訳することができる。

【0251】

本発明者らは、特に骨髄区画に標的化された場合、ＩＬ－４が炎症を軽減し、訓練された免疫を誘導することができることを実証した。したがって、さらなる態様は、骨髄標的化分子とＩＬ－４との融合タンパク質、または医薬品として使用するための前記融合タンパク質をコードする核酸を提供する。さらなる態様は、免疫関連障害の治療に使用するための、骨髄標的化ペプチドもしくはタンパク質とＩＬ－４との融合タンパク質、または前記融合タンパク質をコードする核酸を提供し、好ましくは免疫関連障害が、過剰炎症とそれに続く免疫麻痺の状態であり、好ましくは過剰炎症および／または免疫麻痺が、敗血症、心筋梗塞または脳卒中によるＣＯＶＩＤ－１９などの感染症によって引き起こされる。

【0252】

換言すれば、さらなる態様は、骨髄標的化ペプチドまたはタンパク質とＩＬ－４または前記融合タンパク質をコードする核酸との融合タンパク質を投与することを含む、それを必要とする対象を治療する方法を提供し、好ましくは、治療方法は、免疫関連障害を治療する方法である。

【0253】

本発明者らは、ＩＬ－４が訓練された免疫を誘導し得ることを初めて示した。さらに、本発明者らは、生物において骨髄系細胞を標的化することによって、ＩＬ－４（例えば、極端に短い半減期）の好ましくない薬理学的特性を回避することができることを実証している。以下に詳述する実験データは、敗血症、心筋梗塞または脳卒中によるＣＯＶＩＤ－１９などの感染症の場合のような、過剰炎症とそれに続く免疫麻痺の場合の標的治療薬としてのＩＬ－４の使用を実証する。

【0254】

したがって、特定の実施形態では、本明細書で教示される使用のための融合タンパク質または核酸は、炎症を軽減すること、および／または訓練された免疫を刺激または促進することを含む。

【0255】

さらなる態様は、細胞、器官、組織または生物における訓練された免疫を刺激または促進する際のＩＬ－４のインビボ、インビトロまたはエクスビボでの使用を提供する。

【0256】

本発明の広範な一般的範囲から逸脱することなく、上述の態様および／または実施形態に対して多数の変形および／または修正を行うことができることが当業者には理解されよう。本態様および／または実施形態は、したがって、すべての点において単に例示的なものであり、制限的なものではないとみなされるべきである。本発明は、以下の非限定的な実施例を含む。

【0257】

本出願はまた、以下の記述＊に記載されている態様および実施形態を提供する。
記述１＊．アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物と免疫調節生体分子との融合タンパク質であって、免疫調節生体分子が免疫応答を増強または抑制するタンパク質である、融合タンパク質。
記述２＊．アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物とリルーティング分子との融合タンパク質であって、リルーティング分子が、その融合タンパク質が、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物が結合したであろう標的とは異なる標的に結合することを可能にする分子である、融合タンパク質（換言すれば、リルーティング分子は、アポリポタンパク質に融合されたときに、アポリポタンパク質がリルーティング分子に融合されなかったときに結合するであろう標的とは異なる標的に結合することを可能にする分子である）。
記述３＊．アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物と免疫調節生体分子およびリルーティング分子との融合タンパク質。
記述４＊．免疫調節生体分子が、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、成長因子、造血成長因子またはそれらの組合せから選択される、記述１＊から３＊のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
記述５＊．サイトカインが、ＩＬ－２サブファミリー、インターフェロンサブファミリー、ＩＬ－１０サブファミリー、ＩＬ－１ファミリー、ＴＧＦβファミリーもしくはＩＬ－１７ファミリーまたはそれらの組合せから選択され、より好ましくは、サイトカインが、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－３８またはそれらの組合せから選択され、および／または
ケモカインが、ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン、Ｃケモカイン、ＣＸ_３Ｃケモカインまたはそれらの組合せから選択され、および／または
成長因子は、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＣＮＴＦ、ＬＩＦ、エフリン、ＦＧＦ、ＧＤＮＦ、ＨＤＦ、ＨＤＧＦ、ＩＧＦ、ＫＧＦ、ＭＳＦ、ＮＲＧ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ニューロトロフィン、ＰＧＦ、ＰＤＧＦ、ＲＮＬＳ、ＴＣＧＦ、ＴＧＦ、ＴＮＦおよびＷＮＴまたはそれらの組合せから選択され、および／または
造血成長因子が、ＩＬ－３、ＣＳＦ－１（Ｍ－ＣＳＦ）、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、インターロイキンまたはエリスロポエチンのＩＬ－１２ファミリーのメンバー、またはそれらの組合せから選択される、記述４＊に記載の融合タンパク質。
記述６＊．リルーティング分子が、抗体またはその抗原結合断片、リルーティングペプチドまたはリルーティングタンパク質から選択され、好ましくは、リルーティングペプチドまたはリルーティングタンパク質が、標的に存在する受容体のリガンドである、記述１＊から５＊のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
記述７＊．抗体またはその抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ_２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｄＡｂ－Ｆｃ、遊離軽鎖抗体、半抗体、二重特異性Ｆａｂ２、Ｆａｂ_３、三重特異性Ｆａｂ３ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、トリアボディ、三重特異性トリアボディ、ミニボディ、ＩｇＧ、ＩｇＮＡＲ、一価ＩｇＧ、Ｖ_ｈＨまたはＶＮＡＲから選択され、および／または
リルーティングペプチドがＰＤ１またはＳＩＲＰαから選択され、および／または
リルーティングタンパク質が、ＣＤ４０ＬまたはＧＰ１２０から選択される、記述６＊に記載の融合タンパク質。
記述８＊．アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物が、ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＡ４、ＡｐｏＣ３、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＬ１、ＡｐｏＬ３またはそれらの模倣物である、記述＊のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
記述９＊．記述１＊もしくは４＊もしくは５＊もしくは８＊で定義される１つまたはそれ以上の融合タンパク質および／または記述２＊もしくは６＊もしくは７＊もしくは８＊で定義される１つまたはそれ以上の融合タンパク質および／または記述３＊～８＊で定義される１つまたはそれ以上の融合タンパク質を含む脂質ナノ粒子であって、リン脂質およびステロールをさらに含む脂質ナノ粒子。
記述１０＊．脂質ナノ粒子が脂質をさらに含む、記述９＊で定義される脂質ナノ粒子。
記述１１＊．脂質ナノ粒子はペイロードをさらに含み、好ましくはペイロードは、核酸または核酸類似体、治療薬、バイオロジックまたはそれらの組合せから選択される、記述９＊または１０＊に記載の脂質ナノ粒子。
記述１２＊．記述９＊から１１＊のいずれか一項に定義される脂質ナノ粒子を製造する方法であって、
ａ１）単離されたアポリポタンパク質融合タンパク質を得るためにアポリポタンパク質融合タンパク質を発現および単離する工程であって、アポリポタンパク質融合タンパク質が、サイトカインおよび標的化部分に融合したアポリポタンパク質であり、ならびに／またはアポリポタンパク質融合タンパク質が、サイトカインに融合したアポリポタンパク質および／もしくは標的化部分に融合したアポリポタンパク質である、工程、および／または
ａ２）アポリポタンパク質を化学的にコンジュゲートさせ、コンジュゲートされたアポリポタンパク質を単離して、単離されたコンジュゲートされたアポリポタンパク質を得る工程であって、コンジュゲートされたアポリポタンパク質が、サイトカインおよび標的化部分にコンジュゲートされたアポリポタンパク質であり、ならびに／またはコンジュゲートされたアポリポタンパク質が、サイトカインにコンジュゲートされたアポリポタンパク質および／もしくは標的化部分にコンジュゲートされたアポリポタンパク質である、工程、
ｂ）工程ａ１で得られた単離されたアポリポタンパク質融合タンパク質および／または工程ａ２で得られた単離されたコンジュゲートされたアポリポタンパク質をリン脂質、ステロール、ならびに任意選択で脂質と組み合わせて、脂質ナノ粒子を得る工程を含む方法に関する。
記述１３＊．医薬品として使用するための、記述１＊から８＊のいずれか１つに記載の融合タンパク質もしくは記述９＊から１１＊のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子、または記述１２＊の方法によって得られるもしくは得ることができる脂質ナノ粒子。
記述１４＊．免疫関連障害の治療に使用するための、記述１＊から８＊のいずれか１つに記載の融合タンパク質、または記述９＊から１１＊のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子、または記述１２＊の方法によって得られるもしくは得ることができる脂質ナノ粒子。
記述１５＊．標的に化合物を送達する際の、好ましくは標的が細胞、組織、および／または器官である、記述１＊から８＊のいずれか１つに記載の融合タンパク質、または記述９＊から１１＊のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子、または記述１２＊の方法によって得られるもしくは得ることができる脂質ナノ粒子の使用。
記述１６＊．記述１＊～８＊のいずれか１つで定義される融合タンパク質をコードする核酸。

【0258】

本出願はまた、以下の記述に記載されている態様および実施形態を提供する。
記述１．アポリポタンパク質脂質ナノ粒子であって、
アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物および免疫調節生体分子を含む融合タンパク質、および
リン脂質、を含み、
免疫調節生体分子が、免疫応答を増強または抑制するタンパク質である、アポリポタンパク質脂質ナノ粒子。
記述２．アポリポタンパク質脂質ナノ粒子であって、
アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物およびリルーティング分子を含む融合タンパク質、および
リン脂質、を含み、
リルーティング分子は、その融合タンパク質が、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物が結合したであろう標的とは異なる標的に結合すること、および／またはより高い親和性でその意図された標的に結合することを可能にする分子である、アポリポタンパク質脂質ナノ粒子。
記述３．アポリポタンパク質脂質ナノ粒子であって、
アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、免疫調節生体分子、およびリルーティング分子を含む融合タンパク質、および
リン脂質、を含み、
免疫調節生体分子が、免疫応答を増強または抑制するタンパク質であり、
リルーティング分子は、その融合タンパク質が、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物が結合したであろう標的とは異なる標的に結合すること、および／またはより高い親和性でその意図された標的に結合することを可能にする分子である、アポリポタンパク質脂質ナノ粒子。
記述４＊．記述１に定義される融合タンパク質、
記述２に定義される融合タンパク質、および
リン脂質を含む、アポリポタンパク質脂質ナノ粒子。
記述５．アポリポタンパク質脂質ナノ粒子がステロールをさらに含む、記述１から４のいずれか１つに記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。
記述６．アポリポタンパク質脂質ナノ粒子が、脂質、好ましくはトリグリセリドをさらに含む、記述１から５のいずれか１つに記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。
記述７．前記アポリポタンパク質脂質ナノ粒子が、球体、リボンまたはディスクである、記述１から６のいずれか１つに記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。
記述８．前記融合タンパク質の少なくとも一部が、前記アポリポタンパク質脂質ナノ粒子を取り囲む環境に曝露され、好ましくは前記免疫調節生体分子および／または前記リルーティング分子が、前記アポリポタンパク質脂質ナノ粒子を取り囲む前記環境に曝露される、記述１から７のいずれか１つに記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。
記述９．免疫調節生体分子が、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、成長因子、造血成長因子、およびそれらの組合せからなる群から選択される、記述１または３から８のいずれか１つに記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。
記述１０．サイトカインが、ＩＬ－２サブファミリー、インターフェロンサブファミリー、ＩＬ－１０サブファミリー、ＩＬ－１ファミリー、ＴＧＦβファミリーまたはＩＬ－１７ファミリーおよびそれらの組合せからなる群から選択され、より好ましくは、サイトカインが、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－３８およびそれらの組合せからなる群から選択され、および／または
ケモカインが、ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン、Ｃケモカイン、ＣＸ_３Ｃケモカイン、およびそれらの組合せからなる群から選択され、および／または
成長因子は、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＣＮＴＦ、ＬＩＦ、エフリン、ＦＧＦ、ＧＤＮＦ、ＨＤＦ、ＨＤＧＦ、ＩＧＦ、ＫＧＦ、ＭＳＦ、ＮＲＧ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ニューロトロフィン、ＰＧＦ、ＰＤＧＦ、ＲＮＬＳ、ＴＣＧＦ、ＴＧＦ、ＴＮＦ、およびＷＮＴ、ならびにそれらの組合せからなる群から選択され、および／または
造血成長因子が、ＩＬ－３、ＣＳＦ－１（Ｍ－ＣＳＦ）、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、インターロイキンまたはエリスロポエチンのＩＬ－１２ファミリーのメンバー、およびそれらの組合せからなる群から選択される、記述９に記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。
記述１１．サイトカインがＩＬ－４である、記述９または１０に記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。
記述１２．リルーティング分子が、抗体またはその抗原結合断片、リルーティングペプチドまたはリルーティングタンパク質から選択され、好ましくは、リルーティングペプチドまたはリルーティングタンパク質が、標的に存在する受容体のリガンドである、記述２から１１のいずれか１つに記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。
記述１３．抗体またはその抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ_２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｄＡｂ－Ｆｃ、遊離軽鎖抗体、半抗体、二重特異性Ｆａｂ２、Ｆａｂ_３、三重特異性Ｆａｂ３ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、トリアボディ、三重特異性トリアボディ、ミニボディ、ＩｇＧ、ＩｇＮＡＲ、一価ＩｇＧ、Ｖ_ｈＨ、および可変新規抗原受容体（ＶＮＡＲ）からなる群から選択される、記述１２に記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。
記述１４．リルーティング分子が、造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）、例えば造血幹細胞（ＨＳＣ）、多分化能前駆（ＭＰＰ）または共通骨髄前駆細胞（ＣＭＰ）に結合することができる、記述２から１３のいずれか１つに記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。
記述１５．リルーティング分子が、巨核球、好酸球、好塩基球、赤血球、単球、例えば樹状細胞またはマクロファージ、および好中球からなる群から選択される骨髄系細胞に結合することができる、記述２から１３のいずれか１つに記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。
記述１６．リルーティングペプチドがＳＩＲＰαである、記述１５に記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。
記述１７．リルーティング分子が、非骨髄系細胞、例えば非骨髄性免疫細胞または内皮細胞に結合することができる、記述２から１３のいずれか１つに記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。
記述１８．リルーティング分子が、リンパ球、好ましくはＴ細胞、より好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞に結合することができる、記述１７に記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。
記述１９．リルーティング分子が、ＣＤ８に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片であるか、またはリルーティングペプチドがＰＤ１、ＣＤ４０ＬもしくはＧＰ１２０である、記述１７に記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。
記述２０．アポリポタンパク質が、ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＡ－１ Ｍｉｌａｎｏ、ＡｐｏＡ４、ＡｐｏＣ３、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＬ１、ＡｐｏＬ３であるか、またはアポリポタンパク質模倣物が、ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＡ－１ Ｍｉｌａｎｏ、ＡｐｏＡ４、ＡｐｏＣ３、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＬ１、ＡｐｏＬ３の模倣物である、記述１から１９のいずれか１つに記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。
記述２１．アポリポタンパク質脂質ナノ粒子が、ペイロードを含み、好ましくはペイロードが、核酸もしくは核酸類似体、治療薬、生物学的製剤またはそれらの組合せから選択される、記述１から２０のいずれか１つに記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。
記述２２．記述１から２１のいずれか一項に定義されるアポリポタンパク質脂質ナノ粒子を製造する方法であって、
ａ１）１つまたはそれ以上の単離されたアポリポタンパク質融合タンパク質を得るために、１つまたはそれ以上のアポリポタンパク質融合タンパク質を発現および単離する工程であって、
１つまたはそれ以上のアポリポタンパク質融合タンパク質が、免疫調節生体分子に融合したアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、
リルーティング分子に融合したアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、
免疫調節生体分子およびリルーティング分子に融合したアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、およびそれらの組合せ、からなる群から選択される、工程、および／または
ａ２）１つまたはそれ以上のアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物を化学的にコンジュゲートし、１つまたはそれ以上のコンジュゲートされたアポリポタンパク質を単離して、１つまたはそれ以上の単離されたコンジュゲートされたアポリポタンパク質を得る工程であって、
１つまたはそれ以上のコンジュゲートされたアポリポタンパク質が、免疫調節生体分子にコンジュゲートされたアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、
リルーティング分子にコンジュゲートされたアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、
免疫調節生体分子およびリルーティング分子にコンジュゲートされたアポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物、およびそれらの組合せからなる群から選択される、工程、および
ｂ）工程ａ１で得られた１つまたはそれ以上の単離されたアポリポタンパク質融合タンパク質および／または工程ａ２で得られた１つまたはそれ以上の単離されたコンジュゲートされたアポリポタンパク質を、リン脂質、ならびに任意選択でステロールおよび／または脂質と組み合わせて、アポリポタンパク質脂質ナノ粒子を得る工程、を含む、方法。
記述２３．記述２２に記載の方法によって得られる、または得ることができるアポリポタンパク質脂質ナノ粒子。
記述２４．記述１から２１または２３のいずれか１つに記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
記述２５．医薬品として使用するための、記述１から２１または２３のいずれか１つに記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子、または記述２４に記載の医薬組成物。
記述２６．記述１から２１または２３のいずれか１つに記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子、または免疫関連障害の治療に使用するための、記述２４に記載の医薬組成物。
記述２７．免疫関連障害が、癌、炎症、感染症、自己免疫障害、アレルギー、臓器移植拒絶、および移植片対宿主病（ＧＶＨ）からなる群から選択される、記述２６に記載の使用のためのアポリポタンパク質脂質ナノ粒子、または記述２６に記載の使用のための医薬組成物。
記述２８．免疫調節生体分子がＩＬ－４であり、免疫関連障害が、過剰炎症とそれに続く免疫麻痺の状態であり、好ましくは過剰炎症および／または免疫麻痺が、敗血症、心筋梗塞、脳卒中、癌、または多発性硬化症によるＣＯＶＩＤ－１９などの感染症によって引き起こされる、記述２６に記載の使用のためのアポリポタンパク質脂質ナノ粒子または記述２６に記載の使用のための医薬組成物。
記述２９．前記免疫調節生体分子を標的細胞に標的化する際に使用するための、記述１、３から２１もしくは２３のいずれか１つに記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子または記述２４に記載の医薬組成物。
記述３０．前記免疫調節生体分子を骨髄系細胞に標的化する際に使用するための、記述１、３から１３、１５、１６、２０、２１もしくは２３のいずれか１つに記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子、または記述２４に記載の医薬組成物。
記述３１．免疫調節生体分子を標的に送達するための、好ましくは標的が細胞、組織および／または器官である、記述１、３から２１または２３のいずれか１つに記載のアポリポタンパク質脂質ナノ粒子の使用。
記述３２．アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物および免疫調節生体分子を含む融合タンパク質であって、免疫調節生体分子は、前記免疫調節生体分子を骨髄系細胞に標的化する際に使用するための、免疫応答を増強または抑制するタンパク質である、融合タンパク質。
記述３３．融合タンパク質が、リルーティング分子をさらに含み、リルーティング分子が、その融合タンパク質が、アポリポタンパク質もしくはアポリポタンパク質模倣物が結合したであろう標的とは異なる標的に結合すること、および／またはより高い親和性でその意図された標的に結合することを可能にする分子であり、好ましくは、リルーティング分子が、記述１５に定義されるリルーティング分子である、記述３２に記載の使用のための融合タンパク質。
記述３４．アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物およびリルーティング分子を含む融合タンパク質であって、リルーティング分子は、融合タンパク質が、アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物が結合したであろう標的とは異なる標的に結合すること、および／またはより高い親和性でその意図された標的に結合することを可能にする分子である、融合タンパク質。
記述３５．リルーティング分子が、記述１２から１９のいずれか一項に定義されるリルーティング分子である、記述３４に記載の融合タンパク質。
記述３６．融合タンパク質が免疫調節生体分子をさらに含み、免疫調節生体分子が免疫応答を増強または抑制するタンパク質であり、好ましくは免疫調節生体分子が記述９または１０に定義される免疫調節生体分子である、記述３４または３５に記載の融合タンパク質。
記述３７．記述３４から３６のいずれか１つに記載の融合タンパク質をコードする核酸。
記述３８．記述３４から３６のいずれか１つに記載の融合タンパク質または記述３７に記載の核酸と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
記述３９．医薬品として使用するための、記述３４から３６のいずれか１つに記載の融合タンパク質、記述３７に記載の核酸、または記述３８に記載の医薬組成物。
記述４０．免疫関連障害の治療に使用するための、好ましくは、免疫関連障害が、癌、炎症、感染症、自己免疫障害、アレルギー、臓器移植拒絶、および移植片対宿主病（ＧＶＨ）からなる群から選択される免疫関連障害である、記述３４から３６のいずれか１つに記載の融合タンパク質、記述３７に記載の核酸、または記述３８に記載の医薬組成物。
記述４１．前記免疫調節生体分子を標的細胞に標的化する際に使用するための、記述３６に記載の融合タンパク質、記述３６に記載の融合タンパク質をコードする核酸、または記述３６に従属する場合、記述３８に記載の医薬組成物。
記述４２．アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物およびインターロイキン－４（ＩＬ－４）を含む融合タンパク質。
記述４３．融合タンパク質が、リルーティング分子をさらに含み、リルーティング分子が、その融合タンパク質が、アポリポタンパク質もしくはアポリポタンパク質模倣物が結合したであろう標的とは異なる標的に結合すること、および／またはより高い親和性でその意図された標的に結合することを可能にする分子であり、好ましくは、リルーティング分子が、記述１２から１９のいずれか一項に定義されるリルーティング分子である、記述４２に記載の融合タンパク質。
記述４４．アポリポタンパク質またはアポリポタンパク質模倣物が、記述２０に定義されるものである、記述４２または４３に記載の融合タンパク質。
記述４５．記述４２から４４のいずれか１つに記載の融合タンパク質をコードする核酸。
記述４６．記述４２から４４のいずれか１つに記載の融合タンパク質または記述４５に記載の核酸と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
記述４７．医薬品として使用するための、記述４２から４４のいずれか１つに記載の融合タンパク質、記述４５に記載の核酸、または記述４６に記載の医薬組成物。
記述４８．免疫関連障害の治療に使用するための、記述４２から４４のいずれか１つに記載の融合タンパク質、記述４５に記載の核酸、または記述４６に記載の医薬組成物。
記述４９．免疫関連障害が、過剰炎症とそれに続く免疫麻痺の状態であり、好ましくは、過剰炎症および／または免疫麻痺が、敗血症、心筋梗塞、脳卒中、癌、または多発性硬化症によるＣＯＶＩＤ－１９などの感染症によって引き起こされる、記述４８に記載の使用のための融合タンパク質、記述４８に記載の使用のための核酸、または記述４８に記載の使用のための医薬組成物。
記述５０．ＩＬ－４を標的細胞に標的化する際に使用するための、記述４２から４４のいずれか１つに記載の融合タンパク質、記述４５に記載の核酸、または記述４６に記載の医薬組成物。
記述５１．ＩＬ－４を骨髄系細胞に標的化する際に使用するための、記述４２から４４のいずれか１つに記載の融合タンパク質、記述４５に記載の核酸、または記述４６に記載の医薬組成物。
記述５２．骨髄標的化分子およびＩＬ－４を含む融合タンパク質であって、骨髄標的化分子がＩＬ－４を骨髄系細胞に標的化することができる、融合タンパク質。
記述５３．ＩＬ－４は、配列番号４３と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列、またはその環状置換を含むポリペプチドである、記述５２に記載の融合タンパク質。
記述５４．骨髄標的化分子が、抗体もしくはその抗原結合断片、骨髄標的化ペプチドまたは骨髄標的化タンパク質から選択され、好ましくは骨髄標的化ペプチドまたは骨髄標的化タンパク質が、標的に存在する受容体のリガンドである、記述５２または５３に記載の融合タンパク質。
記述５５．抗体またはその抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｄＡｂ－Ｆｃ、遊離軽鎖抗体、半抗体、二重特異性Ｆａｂ－２－、Ｆａｂ３、三重特異性Ｆａｂ－３－ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、トリアボディ、三重特異性トリアボディ、ミニボディ、ＩｇＧ、ＩｇＮＡＲ、一価ＩｇＧ、ＶｈＨまたはＶＮＡＲから選択される、記述５４に記載の融合タンパク質。
記述５６．記述５２から５５のいずれか１つに記載の融合タンパク質をコードする核酸。
記述５７．配列番号４４と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の核酸配列を含むか、または配列番号４３と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含み、骨髄系細胞における標的化発現のための手段をさらに含む核酸であって、前記手段が、
－前記核酸に作動可能に連結された前記骨髄系細胞における選択的または誘導的発現のためのプロモーター、または
－前記骨髄系細胞において前記核酸を安定して発現することができる前記核酸を含むウイルス発現ベクター、または
－１つまたはそれ以上のアポリポタンパク質、リン脂質、前記核酸および任意選択でステロールを含む脂質ナノ粒子から選択される核酸。
記述５８．記述５２から５５のいずれか１つに記載の融合タンパク質または記述５６もしくは５７に記載の核酸と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
記述５９．医薬品として使用するための、記述５２から５５のいずれか１つに記載の融合タンパク質、記述５６または５７に記載の核酸、または記述５８に記載の医薬組成物。
記述６０．免疫関連障害の治療に使用するための、記述５２から５５のいずれか１つに記載の融合タンパク質、記述５６もしくは５７に記載の核酸、または記述５８に記載の医薬組成物。
記述６１．免疫関連障害が、過剰炎症とそれに続く免疫麻痺の状態であり、好ましくは、過剰炎症および／または免疫麻痺が、敗血症、心筋梗塞または脳卒中によるＣＯＶＩＤ－１９などの感染症によって引き起こされる、記述６０に記載の使用のための融合タンパク質、記述６０に記載の使用のための核酸、または記述６０に記載の使用のための医薬組成物。
記述６２．細胞、器官、組織または生物における訓練された免疫の刺激または促進におけるＩＬ－４のインビボ、インビトロまたはエクスビボでの使用。

【0259】

本発明をその特定の実施形態と共に説明してきたが、当業者にとって前述の記述に照らして多くの代替、変更および変形が明らかであることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨および広範な範囲において、以下のような全てのそのような代替物、変更物、および変形物を包含することが意図されている。

【0260】

本発明の本明細書に開示された態様および実施形態は、以下の非限定的な例によってさらに支持される。

【実施例】

【0261】

実施例１．免疫調節生体分子に融合したアポリポタンパク質の融合タンパク質の調製および脂質ナノ粒子への取り込み
材料および方法
ＡｐｏＡ１－Ｓ１４７Ｃ（例えば、配列番号９）およびＡｐｏＡ１－Ｓ２７９Ｃ（例えば、配列番号１１）変異体、ａｐｏＡ１－ＩＬ４融合タンパク質（例えば、配列番号３５）、ａｐｏＡ１－ＩＬ２（例えば、配列番号２３）またはａｐｏＡ１－ＩＬ２ｖ４（例えば、配列番号３１）融合タンパク質、ａｐｏＡ１－ＩＬ１β融合タンパク質（例えば、配列番号２１）およびａｐｏＡ１－ＩＬ３８融合タンパク質（例えば、配列番号８０）のタンパク質発現、精製および特性評価（図１～図９）

【0262】

所望のタンパク質をコードするｐＥＴ－ベクターを含む細菌細胞を、追加のＮａＣｌ（１０ｇ／Ｌ）を添加した４０ｍＬの２ＹＴ培地で増殖させ、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンに形質転換細菌を接種し、一晩増殖させた。翌日、１０ｇ／ＬのＮａＣｌおよび１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有する２ＹＴ培地に一晩培養物を接種し、ＯＤ６００が０．６～０．８に達するまで１５０ｒｐｍで３７°Ｃでインキュベートした。イソプロピルβ－ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．１ｍＭになるように添加した。培養物を２０°Ｃ、１５０ｒｐｍで一晩さらにインキュベートした。細菌を遠心分離を用いてペレット化し、製造業者のプロトコルに従って、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ）が供給された細胞ペレット１グラムにつきＢｕｇｂｕｓｔｅｒ（登録商標）タンパク質抽出試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて溶解した。溶解物を遠心分離し、次いで、目的のタンパク質を含有する得られた上清を、Ｎｉ－ＮＴＡ ＨｉｓＢｉｎｄ（登録商標）Ｒｅｓｉｎ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含むＩＭＡＣカラムで処理した。

【0263】

得られた画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて分析した（試料を試料緩衝液（１：１）と合わせ、Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ（商標）Ｐｒｅｃａｓｔ Ｇｅｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で泳動した。得られたゲルを、クーマシーＧ－２５０染色を使用して染色し、ｄＨ_２Ｏを使用して脱色した。図３、図５）。

【0264】

得られた目的の精製タンパク質を、Ｑ－ＴｏＦを使用してさらに特徴付けた。試料をｄＨ２Ｏ中０．１％ギ酸で０．０１から０．１ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した。ＰＤ Ｓｐｉｎｔｒａｐ（商標）Ｇ－２５カラム（０．５ｍＬ、Ｃｙｔｉｖａ）を使用して濾過した後、試料を、Ｘｅｖｏ Ｇ２四重極飛行時間型質量分析計を備えたＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｉ－Ｃｌａｓｓシステムを使用して測定した。タンパク質をＣ８Ａ逆相カラムによって分離した。ｄＨ２Ｏ中０．１％ギ酸中１５％～７５％アセトニトリルの勾配を使用した。得られたデータを、ＭａｘＥｎｔアルゴリズムを用いてＭａｓｓＬｙｎｘ（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて分析した（図６）。
ＡｐｏＡ１－Ｓ１４７Ｃ（例えば、配列番号９）およびＡｐｏＡ１－Ｓ２７９Ｃ（例えば、配列番号１１）変異体、ａｐｏＡ１－ＩＬ４融合タンパク質（例えば、配列番号３５）、ａｐｏＡ１－ＩＬ２（例えば、配列番号５８）またはａｐｏＡ１－ＩＬ２ｖ４（例えば、配列番号６０）融合タンパク質、ａｐｏＡ１－ＩＬ１β融合タンパク質（例えば、配列番号２１または配列番号８２）およびａｐｏＡ１－ＩＬ３８融合タンパク質（例えば、配列番号８０または配列番号８４）のタンパク質発現、精製および特性評価（図１０～図１６）

【0265】

細菌発現およびタンパク質精製）：実施例２の「細菌発現およびタンパク質精製」の項に記載されるように実施した。

【0266】

細菌溶解およびタンパク質精製：実施例２に記載の「細菌溶解およびタンパク質精製」の項に記載されるように実施した。

【0267】

円盤状脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤
ＨＤＬベースのＬＮＰを製剤化するために、リン脂質、ａｐｏＡ１融合タンパク質およびコレステロールが使用される。円盤状ＬＮＰの場合、融合タンパク質（ＰＢＳ中）を、千鳥型ヘリングボーン微小流体ミキサーを使用して、コレステロールと１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）との混合物（９５％アセトニトリル／５％メタノール中）と１：１０：１００のモル比で混合する。サイズおよび不均一性を評価するために、ナノ生物製剤を含むＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳＰで動的光散乱測定を行った。試料体積１００μＬを透明キュベット（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）にピペットで入れ、これをＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳＰに挿入した。試料は、２５°Ｃの温度で、１回の実行で１０サイクルを、三連で測定した。

【0268】

免疫調節生体分子へのアジド導入およびａｐｏＡ１またはそのシステイン変異体へのコンジュゲーション
ＡｐｏＡ１－ＩＬ４融合物（図１～図９に示されるデータについて）：ＩＬ－４をＤＥＡ緩衝液（５０ｍＭジエタノールアミン、ｐＨ７．５）に緩衝液交換し、０．７５ｍＭまで濃縮した。イミダゾール－１－スルホニルアジド塩酸塩（Ｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍ）をｄＨ２Ｏに溶解し、２０ｍｇ／ｍＬのストック溶液を得た。ｐＨを７に調整した。次いで、これを２２７．５：１のモル比（ＩＬ－４中のアミンあたり１７．５モル当量）でＩＬ－４に添加した。反応混合物を４°Ｃで一晩インキュベートした。ＤＢＣＯ－ＰＥＧ１２－マレイミドリンカー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をＤＭＳＯに溶解した。次いで、溶解したリンカーをａｐｏＡ１ Ｓ２７９Ｃ（０．５ｍＭ）に最終濃度５ｍＭまで添加した。この反応混合物も４°Ｃで一晩インキュベートした。次いで、得られた官能化ＩＬ－４－ＡｚおよびａｐｏＡ１－ＤＢＣＯをＰＢＳ（ｐＨ７．９）に緩衝液交換して、過剰のアジド転移試薬およびＤＢＣＯ－マレイミドリンカーを除去した。溶液を１：２のａｐｏＡ１：ＩＬ－４モル比で一緒に添加し、４°Ｃで一晩インキュベートした。翌日、混合物を、Ｎｉ－ＮＴＡ ＨｉｓＢｉｎｄ（登録商標）Ｒｅｓｉｎ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いたＩＭＡＣカラムで精製した。画分を回収し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて分析した。Ｑ－ＴｏＦ（上記と同じ方法）およびＨＥＫ２９３ ＩＬ－４レポーターアッセイを用いて分析を行った。

【0269】

ＡｐｏＡ１－サイトカイン融合（図１０～図１６に表されるデータについて）：代替において、ＭＱにおけるイミダゾール－１－スルホニルアジド（２ｍｇ／ｍＬ）のストック溶液を調製した。このストックのｐＨを７．５に設定した。ＰＢＳ（ｐＨ＝７．５）中の１００μｇのサイトカインに、一級アミンあたり１７．５モル当量のイミダゾール－１－スルホニルアジドを添加した。反応物を４°Ｃで一晩インキュベートした。一晩のインキュベーション後、過剰のイミダゾール－１－スルホニルアジドを、ＰＤミニトラップＧ－２５脱塩カラム（Ｃｙｔｉｖａ）を使用することによって除去し、得られた生成物を、ＭＳ用ＭａｇＴｒａｎ Ｖ１．０３を使用してＱ－ＴｏＦ ＬＣ－ＭＳ（ＷａｔｅｒｓＭａｓｓＬｙｎｘ ｖ４．１）によって分析した。５倍モル過剰のマレイミド－ＰＥＧ４－ＤＢＣＯリンカーをＡｐｏＡ１またはそのシステイン変異体に添加し、一晩反応させて、ａｐｏＡ１－ＰＥＧ４－ＤＢＣＯ複合体を形成した。過剰なリンカーを、ＭＷＣＯ 10kDaを備えたＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５遠心フィルタユニット（Ｍｅｒｃｋ）を使用して除去した。次いで、ＡｐｏＡ１－ＰＥＧ４－ＤＢＣＯをアジド含有サイトカインと合わせ、室温で４時間または４°Ｃで一晩インキュベートした。得られた生成物をＳＤＳ－ｐａｇｅを用いて分析した。

【0270】

ＨＥＫ２９３ ＩＬ－４レポーターアッセイ
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）をＴ２５培養フラスコに播種し、８０％の細胞密集度に達するまで３７°Ｃで増殖させた。顕微鏡を用いて細胞生存率を確認した。細胞を滅菌ＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理を用いて３７°Ｃで５分間採取した。次いで、各ウェルが５０，０００個の細胞（１８０μL DMEM、１０％のＦＢＳ、１％のＰｅｎ－Ｓｔｒｅｐ）を含むように、細胞を９６ウェルプレートに播種した。各条件について、２倍希釈系列を調製した。希釈系列を、細胞を含むプレートに三重に加えた。次いで、細胞を３７°Ｃで２４時間インキュベートした。ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）溶液を製造者の説明書に従って調製した。別の９６ウェルプレートに、２０μＬの馴化細胞培地を１８０μＬのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）溶液と一緒に添加した。次いで、これを３７°Ｃで３時間インキュベートした。Ｓｐａｒｋ（登録商標）マルチモードマイクロプレートリーダー（Ｔｅｋａｎ）を使用して６３５ｎＭで吸光度を分析した。

【0271】

Ｔ細胞増殖に対するＩＬ２構築物の効果
ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞を、製造業者のプロトコルに従ってＣＦＳＥ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で染色した。インキュベーション後、１００，０００個のＴ細胞を９６ウェル丸底プレートに播種し、ＩＬ２またはＩＬ２構築物で６日間刺激した。Ｔ細胞を採取し、洗浄し、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８について染色し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．）で測定した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＢＤ）を使用して、フローサイトメトリーデータを分析した。市販のＩＬ２は、Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入した。組換えＩＬ２を以下のように調製した。

【0272】

組換えＩＬ－２の細菌発現
ＳＵＭＯ－ＩＬ２構築物をＳｈｕｆｆｌｅ Ｔ７コンピテント大腸菌に形質転換した。５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する４０ｍＬの２ＹＴ培地に細菌を接種し、２５０ｒｐｍおよび３７°Ｃで一晩増殖させて小型培養物を形成した。翌日、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む２ＹＴ培地に小型培養物を接種して大型培養物を形成した。０．６～０．８のＯＤ６００に達するまで、培養物を１５０ｒｐｍおよび３７°Ｃでインキュベートした。次いで、タンパク質発現を誘導するために、ＩＰＴＧを０．１ｍＭの最終濃度まで添加した。培養物を２０°Ｃ、１５０ｒｐｍで一晩さらにインキュベートした。次いで、４°Ｃで１０分間、１０，０００ｘｇで遠心分離することによって細菌ペレットを得た。得られた上清を廃棄した。得られたペレットを、細胞ペレット１グラム当たり１０ｍＬの溶解緩衝液（２０mM Tris、５００mM NaCl、ｐＨ７．９）に再懸濁した。次いで、２５Ｕベンゾナーゼ（登録商標）ヌクレアーゼ（Ｍｅｒｃｋ）を添加した。ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤を、５０ｍＬの抽出緩衝液につき１つ添加した。得られた溶液を、凝集塊が残存しなくなるまで４°Ｃで３０分間撹拌した。次いで、氷上に保ったまま、１５，０００～２０，０００ｐｓｉでＡｖｅｓｔｉｎ Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ Ｃ３を使用して溶液を３回均質化した。次いで、細胞溶解物を４°Ｃで３０分間、２０，０００ｘｇで遠心分離した。得られた上清を４°ＣでＩＭＡＣカラムに適用し、これに予め０．１ＭのＮｉＳＯ４溶液を装入した。すべてのフロースルー画分を回収した。カラムを８カラム体積の緩衝液Ａ（２０mM Tris、５００mM NaCl、１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．９）で洗浄し、次いで８カラム体積の緩衝液Ａ５０（２０mM Tris、５００mM NaCl、５０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．９）で洗浄した。ＳＵＭＯ－ＩＬ２を溶出するために、８カラム体積の緩衝液Ａ５００（２０mM Tris、５００mM NaCl、５００ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．９）をカラムに添加した。得られた画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて分析した。ＳＵＭＯ－ＩＬ２を含有する溶出画分をプールした。ＳＵＭＯヒドロラーゼを、１ｍｇヒドロラーゼ／５００ｍｇタンパク質の比でＳＵＭＯ－ＩＬ２のプール画分に添加した。次いで、溶液を、４°Ｃで一晩穏やかに撹拌しながらＳｎａｋｅｓｋｉｎ（商標）１０ｋＤａカットオフ透析バッグ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して保存緩衝液（２０mM Tris、５００mM NaCl、ｐＨ７．９）に透析した。次いで、得られたタンパク質溶液を４０００ｘｇで２０分間遠心分離し、上清を０．２μＭシリンジフィルターを用いて濾過して凝集したタンパク質を除去した。ＩＭＡＣカラムプロトコルを繰り返し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して画分を再度分析した。ＩＬ２を含む画分が他のタンパク質で汚染されている場合、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて試料を精製した。そうでなければ、ＩＬ２を含有する画分をＰＢＳ（ｐＨ７．９）に緩衝液交換した。ＳＥＣは、ＧＥ Ｈｉｌｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇカラムを備えたＮＧＣ １０ Ｍｅｄｉｕｍ－Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で行った。まず、濾過したＰＢＳ（ｐＨ７．９）を用いてカラムを平衡化し、その後、試料を適用した。回収した画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて分析した。ＩＬ２を含有する画分をプールし、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（商標）１０００分光光度計を使用して最終濃度を決定した。次いで、タンパク質を液体窒素中で急速凍結し、－８０℃で保存した。Ｑ－ｔｏｆおよびＳＰＲを用いて分析を行った。

【0273】

低温透過型電子顕微鏡法（ｃｒｙｏ－ＴＥＭ）：実施例２に記載のように実施した。

【0274】

ＤＬＳによるａＮＰサイズおよび分散度の決定：実施例２に記載のように行った。

【0275】

ＳＤＳ ｐａｇｅ：実施例２に記載のように実施

【0276】

結果
本発明者らの融合タンパク質は、組換え発現によって、または化学的コンジュゲーションによって作製することができる。これまで、本発明者らは、４つの異なる融合タンパク質を組換えで発現させることに成功した。これらは、ａｐｏＡ１－ＩＬ４、ａｐｏＡ１－ＩＬ１Ｂ、ａｐｏＡ１－ＩＬ３８およびａｐｏＡ１－ＩＬ２である。図３に観察され得るように、すべての発現が成功し、純粋なタンパク質が得られた。黒色の長方形は、目的の融合タンパク質を含む溶出画分を示す。

【0277】

次いで、これらの組換え発現タンパク質を使用して、ナノ生物学的ディスクを製剤化した（図４）。ａｐｏＡ１－ＩＬ４およびａｐｏＡ１－ＩＬ３８は１１日間にわたって安定したままであり、ａｐｏＡ１と同様の直径およびＰｄＩを示すことが理解され得る。ＡｐｏＡ１－ＩＬ１ｂもこれを示すが、１１日後、これらのナノ生物製剤は凝集しているようである。

【0278】

ａｐｏＡ１をサイトカイン、ナノボディ、または他の生体分子に化学的にコンジュゲートさせるためには、反応性ハンドルが必要である。したがって、位置１４７のセリンの代わりにシステインを含有するａｐｏＡ１変異体（本明細書では「Ｓ１４７Ｃ」または「Ｓ１５７Ｃ」変異体と呼ばれる）または２７９（本明細書では「Ｓ２７９Ｃ」または「Ｓ２３９Ｃ」変異体と呼ばれる）を作製した。例えば、ａｐｏＡ１変異体は、配列番号９または１１に示されるペプチド配列によって定義され得る。図５に見られるように、これらのタンパク質の発現および精製は成功し、野生型ａｐｏＡ１と同様の収率および純度をもたらした。得られたタンパク質は、四重極飛行時間（Ｑ－ＴｏＦ）を用いてさらに特徴付けられ、タンパク質が純粋であることが示され、正しい質量が見出された（図６）。

【0279】

このａｐｏＡ１変異体へのサイトカインのコンジュゲーションは、マレイミド－ＰＥＧ－ＤＢＣＯリンカーを使用して行うことができ、マレイミドはａｐｏＡ１に結合し、ＤＢＣＯは本発明者らがサイトカインに導入するアジドに結合する。生成物の±９０％がＩＬ－４－Ａｚ（単一アジドが組み込まれたＩＬ－４）からなるまで、ＩＬ－４のＮ末端への単一アジドの導入を最適化した。これを、Ｑ－ＴｏＦ（図７）およびＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図８）を使用して分析した。ＳＤＳ－ｐａｇｅから、ＡｐｏＡ１Ｓ２７９ＣとＩＬ４とのコンジュゲーションの際に、融合タンパク質の予想される分子量に対応して、バンドが約４０ｋＤａに現れることが分かる。これは、本発明者らがＰＥＧ－リンカーを使用してＩＬ４をａｐｏＡ１に化学的にコンジュゲートさせたことを認めさせる（図８）。このコンジュゲーション反応は依然として最適化されているが、本発明者らは既に±２０％の収率を得ている。
次いで、ＨＥＫ２９３ ＩＬ－４レポーターアッセイを使用して、組換え生産された融合タンパク質ならびに化学的ａｐｏＡ１－ＩＬ４コンジュゲートの生物活性を分析した。この細胞株は、完全に活性なＳＴＡＴ６経路を有し、ＳＴＡＴ６誘導性分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を保有している。ここで、ＳＥＡＰの産生は、ＩＬ４のその受容体への結合に関連する。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞は、ＩＬ－４およびＩＬ－１３に応答してＳＥＡＰを産生する。ＩＬ－４結合は、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ比色アッセイを用いてＳＥＡＰの酵素活性を調べることによって定量することができる。

【0280】

図９から分かるように、両方の融合タンパク質は用量依存的効果を発揮し、したがって、両方の融合タンパク質中のＩＬ４は依然として機能的であると結論付けることができる。化学的にコンジュゲートされたａｐｏＡ１－ＩＬ４は、市販の組換えＩＬ－４よりもわずかに少ない予備形成を行い、これは、ａｐｏＡ１とＩＬ－４との融合に起因し得る。これは、受容体へのＩＬ－４の結合をわずかに妨げる可能性がある。しかしながら、化学的にコンジュゲートされたａｐｏＡ１－ＩＬ４は、組換えａｐｏＡ１－ＩＬ４タンパク質よりも良好に機能し、化学的にコンジュゲートされたａｐｏＡ１－ＩＬ４の親和性が、組換え発現されたａｐｏＡ１－ＩＬ４の親和性よりも高い可能性が高いことを示している。

【0281】

ＡｐｏＡ１－ＩＬ２融合タンパク質
ａｐｏＡ１－ＩＬ４化学的および組換え融合タンパク質の産生に加えて、本発明者らはａｐｏＡ１－ＩＬ２融合タンパク質も産生した。ここで、本発明者らは、野生型ＩＬ２またはＩＬ２変異体をａｐｏＡ１に組換え融合した。発現タンパク質およびＩＭＡＣ精製タンパク質のＳＤＳ－ｐａｇｅ分析は、正しいタンパク質が本発明者らの溶出画分に存在することを示した（図１０左パネル）。さらに、本発明者らは、野生型ＩＬ２をａｐｏＡ１に化学的にコンジュゲートさせた。これは、ＳＤＳ－ｐａｇｅ（図１０右パネル）によっても検証された。

【0282】

次に、本発明者らは、ａｐｏＡ１－ＩＬ２融合タンパク質を円盤状脂質ナノ粒子に組み込んで、ＩＬ２－ａＮＰおよびＩＬ２ｖ４－ａＮＰを得た（図１１）。円盤状ナノ粒子の成功裏の製剤化は、低温透過型電子顕微鏡法（ｃｒｙｏ－ＴＥＭ）によって確認された（図１１右パネル）。本発明者らは、動的光散乱（ＤＬＳ）（図１１左パネル）を使用して、２１日間ＰＢＳ中でナノ粒子サイズおよび安定性をさらに分析した。

【0283】

本発明者らは、ａｐｏＡ１－ＩＬ２融合タンパク質がＴ細胞増殖を刺激する能力を評価した。本発明者らの融合タンパク質はＴ細胞増殖を誘導することができることが分かる。特に、本発明者らのａｐｏＡ１－ＩＬ２化学コンジュゲート（図１２中央底部）は、市販のＩＬ２（図１２左上）と同様の程度までＴ細胞増殖を誘導することができる。

【0284】

ＡｐｏＡ１－ＩＬ１β融合タンパク質
本発明者らは、化学的にコンジュゲートされ、組換え発現されたａｐｏＡ１－ＩＬ１β融合タンパク質を作製することによって、本発明者らのライブラリーをさらに拡大した。ここで、本発明者らは、ＩＬ１βをａｐｏＡ１に組換え融合した。発現およびＩＭＡＣ精製タンパク質のＳＤＳ－ｐａｇｅ分析は、約４０ｋＤａのバンドによって示されるように、正しいタンパク質が本発明者らの溶出画分に存在することを示した（図１３の上パネル）。さらに、本発明者らはまた、ＩＬ１βをａｐｏＡ１に化学的にコンジュゲートさせた。これは、ＳＤＳ－ｐａｇｅによっても検証された（図１３下パネル）。

【0285】

次に、本発明者らは、ａｐｏＡ１－ＩＬ１β融合タンパク質を円盤状脂質ナノ粒子に組み込み、ＩＬ１β－ａＮＰを得た。円盤状ナノ粒子の成功裏の製剤化は、低温透過型電子顕微鏡法（ｃｒｙｏ－ＴＥＭ）によって確認された（図１３下パネル）。本発明者らは、動的光散乱（ＤＬＳ）（図１４上パネル）を使用して、２１日間ＰＢＳ中でナノ粒子サイズおよび安定性をさらに分析した。

【0286】

ＡｐｏＡ１－ＩＬ３８融合タンパク質
さらに、本発明者らはまた、ａｐｏＡ１－ＩＬ３８融合タンパク質を化学的にコンジュゲートさせ、組換え発現させた。ここで、本発明者らは、ＩＬ３８をａｐｏＡ１に組換え融合した。発現およびＩＭＡＣ精製タンパク質のＳＤＳ－ｐａｇｅ分析は、約４０ｋＤａのバンドによって示されるように、正しいタンパク質が本発明者らの溶出画分に存在することを示した（図１５の上パネル）。さらに、本発明者らはまた、ＩＬ３８をａｐｏＡ１に化学的にコンジュゲートさせている。これは、ＳＤＳ－ｐａｇｅによっても検証された（図１５下パネル）。

【0287】

次に、本発明者らは、ａｐｏＡ１－ＩＬ３８融合タンパク質を円盤状脂質ナノ粒子に組み込み、ＩＬ３８－ａＮＰを得た。円盤状ナノ粒子の成功裏の製剤化は、低温透過型電子顕微鏡法（ｃｒｙｏ－ＴＥＭ）によって確認された（図１６下パネル））。本発明者らは、動的光散乱（ＤＬＳ）（図１６上パネル）を使用して、２１日間ＰＢＳ中でナノ粒子サイズおよび安定性をさらに分析した。

【0288】

実施例２．ＡｐｏＡ１－ＩＬ－４融合タンパク質およびその脂質ナノ粒子への組み込み
材料および方法
ＰＢＭＣおよび単球の単離：健康なボランティアからのバフィーコート（Ｓａｎｑｕｉｎ）またはＥＤＴＡ全血を、書面によるインフォームドコンセントを得た後に取得した。この材料をカルシウム／マグネシウムを含まないＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ）で少なくとも１：１に希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の上に積層した。６１５×ｇで３０分間の密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）界面を分離した。冷ＰＢＳで３～５回洗浄した後、Ｓｙｓｍｅｘ血液分析装置（ＸＮ－４５０；Ｓｙｓｍｅｘ）を使用してＰＢＭＣ収率および組成を評価した。

【0289】

陰性に選択した単球を、製造者の説明書（ＭＡＣＳ Ｐａｎ単球単離キット、ヒト；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に従って、ＭＡＣＳを使用して得た。単球の収率および純度をＳｙｓｍｅｘ血液分析装置で評価した。

【0290】

いくつかの実験（本文に示す）では、単球を、パーコール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）での高浸透圧密度勾配遠心分離によってＰＢＭＣから代替的に濃縮した。１５０～２００×１０^６個のＰＢＭＣを高浸透圧パーコール溶液（滅菌水中４８．５％のｖ／ｖパーコール、０．１６M NaCl）の上に重層し、５８０×ｇ、室温で１５分間遠心分離した。界面を回収し、冷ＰＢＳで１回洗浄し、ＲＰＭＩに再懸濁した。

【0291】

初代ヒト単球培養：すべての初代ヒト単球／マクロファージを、ＧｌｕｔａＭＡＸ（２ｍＭ；ＧＩＢＣＯ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ；ＧＩＢＣＯ）およびゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ；Ｃｅｎｔｒａｆａｒｍ）をさらに補充したＤｕｔｃｈ修飾（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＰＭＩ－１６４０中で培養した。この媒体は、ＲＰＭＩ＋＋＋とさらに呼ばれる。さらに、細胞培養中に１０％（ｖ／ｖ）ヒトプール血清を培地に添加した（「細胞培養培地」とも呼ばれる）。

【0292】

初代ヒト単球における訓練された免疫のインビトロモデル：初代ヒト単球において訓練された免疫を誘導するために、以前に最適化され公開された方法を使用した（Dominguez-Andres,J.et al.In vitro induction of trained immunity in adherent human monocytes.STAR Protoc 2,100365,doi:10.1016/j.xpro.2021.100365(2021);van Lier,D.,Geven,C.,Leijte,G.P.&Pickkers,P.Experimental human endotoxemia as a model of systemic inflammation.Biochimie 159,99-106,doi:10.1016/j.biochi.2018.06.014(2019)）。簡潔には、単球を平底細胞培養プレートに１時間接着させ、温ＰＢＳで洗浄して、いずれの非接着細胞および細胞残屑をも除去した。次いで、表１に詳述した刺激のいずれか、または培地のみ（「非訓練」対照）で２４時間刺激した（「訓練」）。
表１．初代ヒト単球の刺激およびインビボ実験。

【表1】

【0293】

薬理学的阻害実験のために、単球を、訓練刺激を加える前に、表２に記載される阻害剤の１つと１時間プレインキュベートした。
表２．初代ヒト単球に対する阻害剤。

【表2】

【0294】

最初の２４時間の刺激後、細胞を温ＰＢＳで洗浄し、温かい細胞培養培地を加えた。次いで、単球を静置させ、５日間マクロファージに分化させた。６日目に、訓練された免疫の誘導を評価した。この目的のために、細胞を典型的にはさらに２４時間ＬＰＳで再刺激してサイトカイン産生を誘発した。上清を回収し、さらなる分析まで、例えばＩＬ６およびＴＮＦについてＥＬＩＳＡを用いて－２０°Ｃで保存した。

【0295】

他のほとんどの訓練された免疫読み出し方法では、細胞を以下のように採取した：最初に、細胞を細胞培養インキュベータ内でＶｅｒｓｅｎｅ細胞解離試薬（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で３０分間インキュベートした。次いで、セルスクレーパーを使用して、培養プレートから細胞を除去した。収率を最大にするために、氷冷ＰＢＳを添加した後、培養プレートを２回目に掻き取った。マクロファージを３００×ｇ、４°Ｃで１０分間遠心分離し、下流への適用を続ける前に計数した。

【0296】

インビトロ炎症阻害：単球を平底細胞培養プレートに１時間接着させ、温ＰＢＳで洗浄して、任意の非接着細胞および細胞残屑を除去した。

【0297】

次いで、それらをＩＬ４およびＬＰＳと共に２４時間インキュベートした。最初の２４時間の刺激後、上清を回収し、ＩＬ６およびＴＮＦについてＥＬＩＳＡでさらに分析するまで－２０°Ｃで保存した。

【0298】

初代単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）の生成：実験のために、ｍｏＤＣをマクロファージ（非訓練対照またはＩＬ４訓練）と比較し、ｍｏＤＣを以下のように分化させた。まず、陰性に選択された単球を上記のようにして得た。１時間の接着およびＰＢＳ洗浄後、これらを、ＩＬ４（２５ｎｇ／ｍｌ）およびＧＭ－ＣＳＦ（１０００ ＩＵ／ｍｌ；プレミアムグレード、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）をさらに補充した１０％ ＨＰＳを含むＲＰＭＩ＋＋＋中で培養した。細胞を６日目まで分化させ、３日目に１回の中程度のリフレッシュを行った。６日目に、（上記のように）接着細胞に加えて非接着細胞を採取した。次いで、以下に記載されるように、ｍｏＤＣおよびマクロファージをフローサイトメトリーによる分析に供した。

【0299】

インビボ実験ヒトエンドトキシン血症モデルおよびエクスビボ分析：８人の健康な（病歴、身体検査、および日常的な検査によって確認されるように）男性ボランティアが、Ｒａｄｂｏｕｄ大学医療センターの集中治療室の研究ユニットで行われる実験的エンドトキシン血症実験に参加するための書面によるインフォームドコンセントを提供した。すべての試験手順は、現地の倫理委員会（ＣＭＯ Ａｒｎｈｅｍ－Ｎｉｊｍｅｇｅｎ、登録番号ＮＬ７１２９３．０９１．１９および２０１９－５７３０）によって承認され、ヘルシンキ宣言の最新版に従って実施された。

【0300】

他の箇所に詳細に記載されているように、連続エンドトキシン注入レジメンを使用した（van Lier,D.,Geven,C.,Leijte,G.P.&Pickkers,P.Experimental human endotoxemia as a model of systemic inflammation.Biochimie 159,99-106,doi:10.1016/j.biochi.2018.06.014(2019)）。手短に言えば、対象を研究ユニットに入れ、前肘静脈および橈骨動脈にカニューレを挿入して、流体およびエンドトキシンの投与、ならびに採血および血行動態モニタリングをそれぞれ可能にした。３リードＥＣＧを実験全体を通して連続的に記録した。等張水前処置（１．５L NaCl ０．４５％／グルコース２．５％を、エンドトキシン注入開始前の時間に静脈内投与）後、ボランティアに１ｎｇ／ｋｇ体重のエンドトキシン（大腸菌リポ多糖［ＬＰＳ］型Ｏ１１３、ロット番号９４３３２Ｂ１；Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の負荷用量で静脈内曝露し、続いて直接０．５ｎｇ／ｋｇ／時間で３時間連続注入した。参加者は、エンドトキシン負荷用量後８時間監視され、その後、参加者は研究ユニットから退院した。

【0301】

このプロジェクトでは、負荷用量の投与の１時間前および４時間後の２つの時点で血液試料を得た。陰性に選択した単球を上記のように取得した。細胞を接着させ、組換えヒトＩＬ４、円盤状ＩＬ４－ａＮＰ、ＬＰＳ（初期免疫寛容を評価するため）、または培地のみ（対照として）で２４時間刺激した。ＰＢＳ洗浄後、細胞を培養培地中に４８時間静置し、ＬＰＳでさらに２４時間再刺激した。上清を回収し、－２０°Ｃで保存した。

【0302】

サイトカインおよび乳酸の測定：ＴＮＦ、ＩＬ６およびＩＬ１Ｒａを、デュオセットＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステム）を製造者の説明書に従って使用して細胞培養上清中で測定した。乳酸塩測定のために、蛍光アッセイを使用した。３０μｌの試料、培地対照、または既知の標準を黒色９６ウェルプレートに添加した。次いで、３０μｌの反応混合物（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、西洋ワサビペルオキシダーゼ（０．２Ｕ／ｍｌ）、乳酸オキシダーゼ（２Ｕ／ｍｌ）、Ａｍｐｌｅｘ ｒｅｄ（１００μＭ；Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を添加し、反応物を暗所、室温で２０分間インキュベートした。直後に、蛍光を５３０／２５ｎｍおよび５９０／３５ｎｍで測定した。Ｇｅｎ５ソフトウェア（ｖ３．０３、ＢｉｏＴｅｋ）をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌと併せて使用して、元の試料中のサイトカインおよび乳酸塩濃度を計算した。

【0303】

マクロファージ表面マーカーフローサイトメトリー：マクロファージを上記のように採取し、染色のためにｖ底９６ウェルプレートに移した。細胞を１５００ｒｐｍ、５分間、４°Ｃで遠心分離した。上清を除去し、２００μｌのＰＢＡ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、１％のｗ／ｖのＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ））で細胞を一回洗浄した。

【0304】

１０％ヒトプール血清を補充したＰＢＳ中で４°Ｃで１５分間インキュベートすることによって、Ｆｃ受容体をブロックした。もう一度洗浄した後、表面マーカーおよび生存率を、表３に記載の抗体および生存率色素を使用して、４°Ｃで３０分間、５０μｌの体積で染色した。
表３．初代ヒト単球／マクロファージを用いた実験（およびＭＬＲ実験）のためのフローサイトメトリー抗体。

【表3】

【0305】

２回洗浄した後、細胞を１５０μｌのＰＢＡに再懸濁し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）またはＢＤ ＦＡＣＳＶｅｒｓｅシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定した。単一抗体染色のためにＶｅｒｓａＣｏｍｐ補償ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して補償を行った。生存細胞と熱殺菌細胞との混合物を（製造業者の推奨に従って）生存色素の単一染色に使用した。Ｆｌｏｗｊｏ（ｖ１０．７．１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でデータ分析を行った。我々のゲーティング戦略は以下の通りであった：最初に、必要に応じて時間ゲートを使用した。次いで、後続のＦＳＣ－Ａ／ＳＳＣ－ＡゲートおよびＦＳＣ－Ａ／ＦＳＣ－Ｈゲートを使用して単一細胞事象を選択した。死細胞を、生存性色素陰性集団を選択することによって分析から除去した。幾何平均蛍光強度を表面マーカー発現の尺度として計算した。

【0306】

Ｔ細胞分極読み出し：ＭＬＲ実験のために、採取したマクロファージをその後のＴ細胞分極アッセイに使用した。同種異系ナイーブＴ細胞に、マクロファージごとに１０のＴ細胞の比率でマクロファージを播種した。細胞を、平底９６ウェルプレートにおいて標準的な細胞培養培地で７日間培養した。このモデルでは、ＨＬＡミスマッチはＴ細胞受容体の非特異的活性化を引き起こす。最終日に、細胞をＰＭＡ（２５ｎｇ／ｍＬ）＋イオノマイシン（０．５μｇ／ｍＬ）で、１００ｎｇ／ｍＬのブレフェルジンＡ（ｇｏｌｇｉ－ｐｌｕｇ）の存在下で４時間刺激した。細胞を採取し、２つのフローサイトメトリー抗体パネル（ＣＤ４ Ｔ細胞について１つおよびＣＤ８について１つ；表３も参照されたい）に分けた。細胞を、細胞内サイトカイン染色を可能にするためのＴ細胞の透過化のための追加の工程を用いて、上記と同様の様式で染色した。これは、製造業者の指示に従って、Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ緩衝液セット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して実施した。ゲーティング戦略は上記のものと同様であり、ＣＤ３陽性事象に対する選択を追加した。Ｔ細胞分極の顕著なサイトカインについて陽性の細胞の割合を計算して、Ｔ細胞サブセットの割合を推定した。

【0307】

フローサイトメトリーによるホスホ－ＳＴＡＴ６測定：単球をＲＰＭＩ、ＩＬ４、または異なる濃度のＩＬ４－ａＮＰ（図に示す）で３７°Ｃで２０分間刺激した。細胞をｖ底９６ウェルプレートに移し、染色手順の間氷上に保った。生存率およびＣＤ１４（上記の様式）について染色した後、細胞を、暗所において４°Ｃで４５分間、ｆｉｘ／ｐｅｒｍ緩衝液セット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて固定し、透過処理した。細胞をｐｅｒｍ緩衝液で２回洗浄し、－２０°Ｃで一晩、冷凍庫で冷却した無水メタノール中でインキュベートした。ｐｅｒｍ緩衝液でさらに２回洗浄した後、細胞を、表３に記載の抗体を使用して、４°Ｃ、暗所で４５分間、ホスホ－ＳＴＡＴ６について染色した。細胞をｐｅｒｍ緩衝液でさらに２回洗浄し、最後にＣｙｔｏｆｌｅｘサイトメーターで取得するためにＰＢＡに再懸濁した。ゲーティング戦略は、ＣＤ１４陽性事象に対する選択を加えたマクロファージ表面マーカーに対するものとほぼ同様であった。

【0308】

食作用アッセイ：マクロファージを上記のように採取し、３７℃で１時間ＦＩＴＣ標識カンジダ・アルビカンス（医師Ｍａｒｔｉｎ Ｊａｅｇｅｒ、Ｒａｄｂｏｕｄｕｍｃにより善意で提供）で１：５のＭＯＩでインキュベートした。細胞を氷冷ＰＢＡで２回洗浄し、氷上で維持して食作用を停止させた。細胞を４°Ｃの暗所で３０分間ＣＤ４５（表３）について染色した。２回洗浄した後、トリパンブルーを０．０１％の最終濃度まで添加して、細胞外ＦＩＴＣ－カンジダをクエンチした。次いで、細胞をＣｙｔｏｆｌｅｘフローサイトメーターで取得した。

【0309】

データ分析中、カンジダのみの事象を除去するためにＣＤ４５＋事象を最初に選択した。次いで、単一細胞を上記のようにゲーティングし、各試料中のカンジダ－ＦＩＴＣ陽性マクロファージの割合を計算した。

【0310】

Ｓｅａｈｏｒｓｅ代謝分析：マクロファージを上記のように採取した。細胞をＲＰＭＩ＋＋＋に再懸濁し、一晩較正したカートリッジにウェルあたり１０^５細胞で播種した。１時間接着した後、培地をアッセイ培地（Ａｇｉｌｅｎｔ；下記参照）に交換し、細胞を周囲ＣＯ２レベルで３７°Ｃで１時間インキュベートした。Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ Ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ Ｓｔｒｅｓｓ ＴｅｓｔキットまたはＳｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ Ｃｅｌｌ Ｍｉｔｏ Ｓｔｒｅｓｓ Ｔｅｓｔキット（両方のＡｇｉｌｅｎｔ；製造者の指示に従って測定実施）を用いて、解糖およびミトコンドリア代謝の代用として酸素消費速度（ＯＣＲ）および細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を測定した。

【0311】

ＲＮＡの単離、配列決定および分析：単球またはマクロファージをＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）に溶解し、－８０°Ｃで保存した。ＲＮＡ抽出を、オンカラムＤＮＡｓｅ Ｉ処理（ＲＮａｓｅ不含有；Ｑｉａｇｅｎ）を伴うＲＮｅａｓｙミニカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して行った。予備的品質管理および濃度の測定を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ装置を使用して行った。ＤＮＢｓｅｑプラットフォームを使用したＲＮＡ配列決定のために、試料をＢｅｉｊｉｎｇ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＢＧＩ Ｄｅｎｍａｒｋ）に送った。

【0312】

遺伝子発現レベルを推測するために、ＲＮＡ－ｓｅｑリードを、Ｂｏｗｔｉｅを使用してｈｇ １９ヒトトランスクリプトームにアラインメントした。ＭＭＳＥＱを使用して、ＲＰＫＭとしての遺伝子発現レベルの定量化を行った。リード／転写物を、ＤＥｓｅｑ２を使用して正規化し、ペアワイズ比較を行った。示差的に発現した遺伝子を、２を超える倍数変化およびｐ値＜０．０５、平均ＲＰＫＭ＞１で、ＤＥｓｅｑ２を使用して同定した。ＩＬ４訓練によって上方制御または弱毒化された遺伝子を同定するために、ＲＰＭＩ－ｄ６およびＩＬ４－ｄ６マクロファージを、ＲＰＭＩ－ｄ６＋ＬＰＳおよびＩＬ４－ｄ６＋ＬＰＳ試料とそれぞれ比較した。遺伝子リストを統合し、ＩＬ４－ｄ６＋ＬＰＳ／ＲＰＭＩ－ｄ６＋ＬＰＳに基づいてランク付けした。遺伝子オントロジーおよびＴＦモチーフ分析を、ＨＯＭＥＲ ｆｉｎｄＭｏｔｉｆｓツールを使用して遺伝子プロモーターに対して行った。

【0313】

クロマチン免疫沈降：マクロファージを上記のように採取し、ＲＰＭＩ＋＋＋に再懸濁した。細胞を１％メタノールを含まないホルムアルデヒド中で１０分間固定した。次いで、１２５ｍＭグリシンを添加することによって、反応を３分間クエンチした。固定した細胞を氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、溶解緩衝液（２０mM HEPES、ｐＨ７．６、１％のＳＤＳ、１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＰＩＣ；Ｒｏｃｈｅ））中約１５×１０^６細胞／ｍｌで溶解し、超音波処理し（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ Ｐｉｃｏ、Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）、遠心分離した（１０分、１３０００ｒｐｍ、室温）。

【0314】

クロマチンのアリコートを、６５°Ｃで１時間、０．５×ＴＢＥ緩衝液（０．５ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（Ｑｉａｇｅｎ）を補足）中で脱架橋し、１％アガロースゲル上で泳動させて、２００～８００ｂｐの標的断片サイズを確認した。

【0315】

残りのクロマチンをＣｈＩＰおよび投入試料に分割した。ＣｈＩＰ試料を希釈緩衝液（ＭｉｌｉＱ中１６．７mM Tris、ｐＨ８．０、１．０％のＴｒｉｔｏｎ、１．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１６７mM NaCl、１×ＰＩＣ）で１０倍希釈し、１μｇのＣｈＩＰグレード抗体（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）を添加した。試料を４°Ｃで一晩回転させた。

【0316】

磁性プロテインＡ／Ｇビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）を、０．１５％のＳＤＳおよび０．１％のＢＳＡを補充した希釈緩衝液で２回洗浄した。洗浄したビーズをＣｈＩＰ試料に添加し、４°Ｃで１時間回転させた。続いて、ビーズ結合クロマチンを以下のように洗浄した（５分間回転、４°Ｃ）：低塩洗浄緩衝液（ＭｉｌｌｉＱ中２０mM Tris、ｐＨ８．０、１．０％ Ｔｒｉｔｏｎ、０．１％ ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０mM NaCl）で１回洗浄した。高塩洗浄緩衝液（低塩洗浄緩衝液と同じであるが５００mM NaClを含む）で２回；無塩洗浄緩衝液（ＭｉｌｌｉＱ中２０mM Tris、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で２回。クロマチンを溶出緩衝液（ＭｉｌｌｉＱ中０．1M NaHＣＯ３、１％ ＳＤＳ）中でビーズから２０分間、室温で溶出した。投入試料を溶出緩衝液で１２倍希釈した。ＮａＣｌ（０．２Ｍ）およびプロテイナーゼＫ（０．１ｍｇ／ｍｌ）の添加後、全ての試料を振盪ヒートブロック（６５°Ｃ、１０００ｒｐｍ）で少なくとも４時間脱架橋した。Ｍｉｎｅｌｕｔｅ ＰＣＲ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡ断片を精製した。ＤＮＡ断片をｑＰＣＲによる下流分析まで４°Ｃで保存した。

【0317】

ｑＰＣＲおよび分析：ＣｈＩＰ試料およびインプットについてのｑＰＣＲ分析を以下のように行った。ＳＹＢＲグリーン法を使用して、表４に詳述したプライマーを用いてｑＰＣＲを行った。比較Ｃｔ法を使用して、ＣｈＩＰを入力試料と比較し、陰性対照領域に対する相対存在量を計算した。ＧＡＰＤＨおよびＺＮＦの非翻訳領域を、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３の陰性対照および陽性対照としてそれぞれ使用した。前述のようにＡＵＣ分析のために６つのプライマー対を使用してＴＮＦを調べた（Bekkering,S.et al.Treatment with Statins Does Not Revert Trained Immunity in Patients with Familial Hypercholesterolemia.Cell Metabolism 30,1-2,doi:10.1016/j.cmet.2019.05.014(2019)）。
表４．ＣｈＩＰ－ｑＰＣＲ分析のためのプライマー

【表4】

【0318】

細菌発現およびタンパク質精製：ＣｌｅａｒＣｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｌｕｃｉｇｅｎ）をｐＥＴ２０ｂ（＋）ＡｐｏＡ１－ＩＬ４発現ベクターで形質転換した。形質転換された細菌を、１００μｇ／Ｌのアンピシリンを補充した４０ｍＬの溶原性ブロス（ＬＢ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に接種し、３７°Ｃで一晩増殖させた。その後、一晩培養物を、１００μｇ／Ｌのアンピシリンを補充した２ＹＴ培地（１６ｇ／Ｌのペプトン、１０ｇ／Ｌの酵母エキスおよび１０ｇ／ＬのＮａＣｌ）に接種し、３７°Ｃで増殖させた。６００ｎｍでの吸光度が１．５超に達した時点で、１．０ｍＭのイソプロピルβ－ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えてｐＥＴ２０ｂ（＋）ＡｐｏＡ１－ＩＬ４発現を誘導し、細胞を２０°Ｃで一晩インキュベートした。溶解物の調製および精製の前に、遠心分離によって細胞を採取した。

【0319】

細菌溶解およびタンパク質精製：ＣｌｅａｒＣｏｌｉ細胞を発現するＡｐｏＡ１－ＩＬ４融合タンパク質を、８０００ｒｐｍおよび４°Ｃで１０分間の遠心分離によって採取した。収集した細胞をＰＢＳに再懸濁し、４０００ｒｐｍおよび４°Ｃで１５分間遠心分離した。細胞を、室温で３０分間、シェーカー上で培養物１リットル当たり２０ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｅｒｃｋ）および２０μＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ）を用いて溶解した。細胞溶解物を１８０００ｒｐｍおよび４°Ｃで３０分間遠心分離した。不溶性ペレットを１リットルにつき１０ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒで洗浄し、１８０００ｒｐｍおよび４°Ｃで２０分間遠心分離した。封入体を含むペレットを抽出緩衝液（６Ｍの塩酸グアニジン、５０ｍＭのリン酸カリウムおよび１ｍＭの還元グルタチオン）に再懸濁し、室温で１５分間シェーカー上でインキュベートした。懸濁液を１８０００ｒｐｍおよび４°Ｃで３０分間遠心分離して不溶性画分を除去した。濾過した可溶性画分をニッケルカラムに負荷し、１５カラム容量のＩＭＡＣ洗浄緩衝液で洗浄した。ＡｐｏＡ１－ＩＬ４を、６０ｍＬの直線勾配アンフォールディング（７ｍの尿素、１ｍＭの還元型グルタチオン、０．１ｍＭの酸化型グルタチオン、５０ｍＭのリン酸カリウム、および１００mM NaCl、ｐＨ６．８）を使用して、ニッケルカラムで、２．５ｍＬ／分で、リフォールディング６０ｍＬ（１ｍＭの還元型グルタチオン、０．１ｍＭの酸化型グルタチオン、５０ｍＭのリン酸カリウム、および１００mM NaCl、ｐＨ６．８）にリフォールディングした。リフォールディングされたａｐｏＡ１－ＩＬ４を、０．５Ｍのイミダゾール、２０mM Tris、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．９を用いてカラムから溶出した。溶出液を回収し、濃縮し、さらに精製し、ＰＢＳ保存緩衝液で平衡化したサイズ排除クロマトグラフィー（ＨｉＬｏａｄ １６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ Ｉｎｃｒｅａｓｅ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって緩衝液交換した。画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、プールし、濃縮し、液体窒素中で急速凍結した後、－８０°Ｃで保存した。ＡｐｏＡ１－ＩＬ４の質量を、ＭＳ用のＭａｇＴｒａｎ Ｖ１．０３を使用して、Ｑ－ＴｏＦ ＬＣ－ＭＳ（ＷａｔｅｒｓＭａｓｓＬｙｎｘ ｖ４．１）によって確認した。

【0320】

ａｐｏＡ１－ＩＬ４ｍの哺乳動物発現および精製：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、トランスファーベクターｐＨＲ－ａｐｏＡ１－ＩＬ４ｍを含むｆｕＧＥＮＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で同時トランスフェクトし、ｐＣＭＶＲ８．７４をパッケージングし、ｐＭＤ２．ＧをＯｐｔｉ－ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）中に３７°Ｃで２４時間エンベロープした。細胞をＤＭＥＭ＋２％熱不活性化ＦＢＳで洗浄し、４８時間インキュベートした。ｐＨＲ－ａｐｏＡ１－ＩＬ４ｍを含有するレンチウイルスを得るために、上清を１０００ｒｐｍで遠心分離して、０．４５μｍのＰＥＳシリンジフィルターで濾過した細胞残差を除去し、５０，０００ｇで４°Ｃで２時間遠心分離した。ｐＨＲ－ａｐｏＡ１－ＩＬ４ｍのレンチウイルスを含有するペレットを培地に再懸濁し、液体窒素中で急速凍結し、－８０°Ｃで選別した。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に、ｐＨＲ－ａｐｏＡ１－ＩＬ４ｍ含有レンチウイルスをトランスフェクション培地（ＤＭＥＭ、１０％のＨＩ ＦＢＳ、１ｘポリブレン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ））に２４時間形質導入した。その後、細胞を、Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％ Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐおよび１μｇ／ｍＬのドキシサイクリン（Ｍｅｒｃｋ）を添加した発現培地（ＨＥＫ２９３細胞用５０％ ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）２９３ Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｅｒｃｋ）および５０％ ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、１５０ｒｐｍのシェーカーで３７°Ｃにて３日間培養した。ａｐｏＡ１－ＩＬ４ｍを含む培養上清を４０００ｒｐｍ、４°Ｃで１５分間遠心分離し、０．２２μｍのＰＥＳシリンジフィルターを通して濾過して細胞残屑を除去した。濾過した可溶性画分をＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ ＸＴ ４ｆｌｏｗ ５ｍＬカラム（Ｃｙｔｉｖａ）に装填し、５カラム容量のＷ－ｂｕｆｆｅｒ（１５０mM NaCl、１００mM Tris、１mM EDTA、ｐＨ８）で流速１～２ｍＬ／分で洗浄した。ＡｐｏＡ１－ＩＬ４ｍを、５０ｍＭのビオチンが補充されるＷ緩衝液を用いてカラムから溶出した。溶出液を回収し、濃縮し、液体窒素中で急速凍結した後、－８０°Ｃで保存した。ＡｐｏＡ１－ＩＬ４ｍの質量を、ＭＳ用のＭａｇＴｒａｎ Ｖ１．０３を使用してＱ－ＴｏＦ ＬＣ－ＭＳ（ＷａｔｅｒｓＭａｓｓＬｙｎｘ ｖ４．１）によって確認した。

【0321】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット：ａｐｏＡ１とＩＬ４との融合を確認するために、１００ｎｇのＩＬ４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ａｐｏＡ１およびａｐｏＡ１－ＩＬ４を４～２０％ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に装填した。ゲル電気泳動後、試料をブロットバッファー（１０×ＴＧ緩衝液、２０％メタノール）を含むニトロセルロース膜に移した。その後、膜をブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中５％乳、０．１％のＴｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ））と共に４°Ｃで一晩インキュベートした。ブロットを一次モノクローナル抗体モノクローナル抗ＩＬ４（ＨＩＬ４１、１：２００；ｓｃ－１２７２３、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）および抗ａｐｏＡ１（Ｂ１０、１：１００；ｓｃ－３７６８１８、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に４°Ｃで１時間インキュベートした。一次抗体でのインキュベーション後、膜を洗浄し、ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰコンジュゲート（１：５０００、３１４５７、Ｐｉｅｒｃｅ）でインキュベートした。ＨＲＰコンジュゲート化二次抗体をＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で検出し、Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔゲルイメージャ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて可視化した。

【0322】

表面プラズモン共鳴：Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００ ＳＰＲシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＳＰＲ測定を行った。ヒトＩＬ４受容体アルファ－ＦＣキメラ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）をプロテインＧセンサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定化した。２００ｎＭ～６．２５ｎＭの範囲のａｐｏＡ１－ＩＬ４および２０ｎＭ～０．６５ｎＭの範囲のヒトＩＬ４のｌｏｇ２希釈濃度系列。全ての試料をＨＰＳ－ＥＰ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０mM NaCl、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｐ ２０、ｐＨ７．４）中で調製した。会合を１８０秒間、解離を１８０秒間、流速３０μＬ／分でモニターした。センサーチップをグリシン１．５（１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ１．５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で再生した。１：１結合についての相互作用ＳＰＲデータを適合させることによって、動態を決定した。

【0323】

ヒト胎児腎臓２９３ ＩＬ４レポーター細胞アッセイ：ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ４／ＩＬ１３細胞をＩｎｖｉｖｏＧｅｎから購入した。この細胞株は、完全に活性なＳＴＡＴ６経路を有し、ＳＴＡＴ６誘導性ＳＥＡＰレポーター遺伝子を保有している。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ４／ＩＬ１３細胞は、ＩＬ４およびＩＬ１３に応答してＳＥＡＰを産生する。分泌されたＳＥＡＰのレベルは、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を用いて決定することができる。５×１０^４個の細胞を含有する１０％ ＦＢＳおよび１％ Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐを含む１８０μＬのＤＭＥＭを９６ウェルプレートにウェルあたり添加した。その後、２０μＬの刺激またはビヒクルを加え、細胞を３７°Ｃで２０～２４時間インキュベートした。続いて、ウェルあたり１８０μＬのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅを別の９６ウェルプレート（平底）に添加し、２０μＬの細胞上清を添加した。プレートを３７°Ｃで１～３時間インキュベートし、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋプレートリーダーで６４０ｎＭの吸光度を測定してＳＥＡＰレベルを決定した。

【0324】

配合ナノ粒子：すべてのリン脂質をＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．から購入した。４つの異なるａｐｏＡ１ベースのナノ粒子（ａＮＰ）を配合した。クロロホルム中のストック溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）からの円盤状ａＮＰの場合、ＤＭＰＣ（１３３．５μＬ）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（７．５μＬ）ならびに球状ａＮＰの場合、ＰＯＰＣ（６６．５μＬ）、ＰＨＰＣ（１７．５μＬ）、コレステロール（４．５μＬ）およびトリカプリリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（０．９５６ｇ／ｍＬストックからの２．７９μＬ）をガラスバイアル中で合わせ、真空下で乾燥させた。得られたフィルムをアセトニトリル／メタノール混合物（９５：５％、総体積８００μＬ）に再溶解した。ａｐｏＡ１に基づく製剤には、コレステロール（１５μＬ）を使用した。別途、ＰＢＳ中のａｐｏＡ１タンパク質（６ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、ＰＢＳ中のａｐｏＡ１－ＩＬ４タンパク質（６ｍＬ、０．１７ｍｇ／ｍＬ）またはＰＢＳ中のａｐｏＡ１－ＩＬ４ｍ（６ｍＬ、０．１８ｍｇ／ｍＬ）の溶液を調製した。
両方の溶液を、マイクロ流体ポンプ融合物１００（Ｃｈｅｍｙｘ Ｉｎｃ）を使用して、脂質溶液については０．７５ｍＬ／分の流速およびａｐｏＡ１溶液については６ｍＬ／分の流速でＺｅｏｎｏｒヘリンボーンミキサー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｃｈｉｐｓｈｏｐ、製品コード：１０００００７６）に同時に注入した。得られた溶液を、円盤状用の１０ｋＤａのＭＷＣＯおよび球状ａＮＰのＶｉｖａｓｐｉｎ用の１００ｋＤａのＭＷＣＯのいずれかを用いて４０００ｒｐｍで遠心濾過によって濃縮し、１ｍＬの体積を得た。ＰＢＳ（５ｍＬ）を添加し、溶液を５ｍＬに濃縮した。これを２回繰り返した。洗浄した溶液を約１．５ｍＬに濃縮し、０．２２μｍのＰＥＳシリンジフィルターで濾過して、完成したａＮＰを得た。ａＮＰ試料中のタンパク質濃度をＰｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量した。配合された蛍光ａＮＰに、０．５ｍｇのＤｉＯＣ１８（３）色素（ＤｉＯ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、脂質膜を調製するために使用したクロロホルム溶液に溶解した。

【0325】

ＤＬＳによるａＮＰサイズおよび分散性の決定：ＰＢＳ中の得られたａＮＰ製剤を０．２２μｍのＰＥＳシリンジフィルターを通して濾過し、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ分析装置での動的光散乱によって分析した。値を平均数平均サイズ分布として報告する。

【0326】

放射性標識ａＮＰ：ＩＬ４、ａｐｏＡ１－ＩＬ４およびＩＬ４－ａＮＰを２モル過剰のＤＦＯ－ｐ－ＮＣＳ（ＤＭＳＯ中５ｍｇ／ｍＬ）で２時間インキュベートし、１０ｋＤａのＭＷＣＯ Ｖｉｖａｓｐｉｎ管を用いて３回洗浄していずれの非反応のＤＦＯ－ｐ－ＮＣＳをも除去した。放射性標識のために、ＤＦＯ結合タンパク質およびａＮＰを、サーモミキサーを使用して６００ｒｐｍで１時間、^８９Ｚｒで３７°Ｃでインキュベートし、１０ｋＤａのＭＷＣＯ Ｖｉｖａｓｐｉｎチューブを使用して３回洗浄して、いずれかの非反応の^８９Ｚｒを除去した。

【0327】

ＩＬ４－ａＮＰｓｏの低温透過型電子顕微鏡法（ｃｒｙｏ－ＴＥＭ）：最初に、２００メッシュレーシー炭素支持銅グリッド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の表面を、Ｃｒｅｓｓｉｎｇｔｏｎ ２０８カーボンコーターを使用して４０秒間プラズマ処理した。続いて、３ｍＬのＩＬ４－ａＮＰ試料（約１ｍｇタンパク質／ｍｌ）をグリッド上に適用し、自動化ロボット（ＦＥＩ Ｖｉｔｒｏｂｏｔ Ｍａｒｋ ＩＶ）を使用して液体エタン中でプランジガラス化することによって薄膜にガラス化した。Ｃｒｙｏ－ＴＥＭ画像化を、電界放出銃（ＦＥＧ）、ポストカラムＧａｔａｎ画像化フィルタ（モデル２００２）およびポストＧＩＦ ２ｋ×２ｋ Ｇａｔａｎ ＣＣＤカメラ（モデル７９４）を備えたｃｒｙｏＴＩＴＡＮ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で行った。画像は、６，５００倍（１．６４電子／Ａ^２・ｓの線量率）または２４，０００倍（１１．８電子／Ａ^２・ｓの線量率）のいずれかのゼロ損失エネルギーフィルタリングを用いた明視野ＴＥＭモードで３００ｋＶの加速電圧、および１秒の取得時間で取得した。

【0328】

ヒト単球におけるＩＬ４－ａＮＰとＩＬ４受容体との相互作用の超解像蛍光顕微鏡法：上記のように健常ドナーの末梢血からヒト単球を単離した。細胞培養処理したチャンバー付きカバースリップ（μスライド８ウェル、ＩＢＩＤ）上に、ウェルあたり１００，０００個の単球を播種した。３７°Ｃで２時間インキュベートした後（細胞付着）、細胞を、裸のａｐｏＡ１またはａｐｏＡ１－ＩＬ４、円盤状のａＮＰまたはＩＬ４－ａＮＰ、球状のａＮＰまたはＩＬ４－ａＮＰのいずれかのＣｙ５標識変異体と共に３７°Ｃで２時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、４％のＰＦＡで２０分間固定した。ＩＬ４受容体を、ポリクローナルウサギＩｇＧ１抗ヒトＩＬ４Ｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；１：１００希釈）一次抗体で４°Ｃにて２４時間染色し、続いてヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲート二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；希釈率１：５００）で室温にて１時間染色した。染色した細胞をＰＢＳ中４°Ｃで保存した。直接確率的光学再構成顕微鏡法（ｄＳＴＯＲＭ）のために、画像化の前および間に、細胞をＧＬＯＸＹ画像化緩衝液（ＰＢＳ中４０μｇ／ｍｌカタラーゼ、０．５ｍｇ／ｍｌのグルコースオキシダーゼ、５％のグルコースおよび０．０１Ｍのシステアミン、ｐＨ８．０）に数分間浸漬した。取得は、ＯＮＩ Ｎａｎｏｉｍａｇｅｒ（ＯＮＩ、オックスフォード、英国）を使用して全内部反射蛍光（ＴＩＲＦ）モードで行った。これには、１００×／１．４ＮＡの油浸対物レンズ、ｓＣＭＯＳカメラが装備されており、この研究では、４８８ｎｍ（２００ｍＷ）および６４０ｎｍ（１０００ｍＷ）のレーザを使用した。５０×８０μｍの視野で１０ｍｓの露光時間で１０，０００フレームを取得した。生データを、ＴｈｕｎｄｅｒＳＴＯＲＭソフトウェアを使用して処理し、１０ｎＭの空間分解能で画像を得た。

【0329】

動物モデル：雌のＣ５７ＢＬ／６マウスをＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。非ヒト霊長類研究のために、２匹の雄のカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を使用した。すべての動物を、１２時間の明暗サイクルを有する気候制御された条件に共収容し、水を自由に与えた。マウスには標準固形飼料食を与え、非ヒト霊長類にはＴｅｋｌａｄ Ｇｌｏｂａｌ ２０％ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｄｉｅｔを与えた。動物のケアおよび実験手順は、マウント・シナイのＩｃａｈｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅから承認された施設内プロトコルに基づいた。すべてのマウスを実験群に無作為に割り当てた。

【0330】

マウスおよび非ヒト霊長類における薬物動態および生体内分布：Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、それぞれ^８９Ｚｒ標識ＩＬ４変異体、ＩＬ４（５３．６±６．６μＣｉ）、ａｐｏＡ１－ＩＬ４（３０．１±０．９μＣｉ）、円盤状ＩＬ４－ａＮＰ（１４６．１±４６．５μＣｉ）および球状ＩＬ４－ａＮＰ（１０８．６±１６．９μＣｉ）を静脈内注射した。２匹の非ヒト霊長類に円盤状^８９Ｚｒ標識ＩＬ４－ａＮＰ（１０７９μＣｉおよび６８２μＣｉ）を注射した。所定の時点で、注射後、マウスでは１、２、５、１０、３０分、および１、２、４、８、２４時間、非ヒト霊長類では５、３０、９０分、４８時間で採血し、秤量し、Ｗｉｚａｒｄ^２ ２４８０自動ガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて放射能を測定した。データを放射性崩壊について補正し、血液１グラム当たりの注射用量のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）を計算した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおける非線形二相減衰回帰を使用してデータを当てはめ、式（％速×ｔ_１／２速＋％遅ｔ_１／２）／１００を介して加重血液半減期を計算した。注射２４時間後にマウスにおける生体内分布を測定した。ＰＢＳ灌流後、目的の組織を採取し、秤量し、Ｗｉｚａｒｄ^２ ２４８０自動ガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して放射能を測定した。データを放射性崩壊について補正し、組織１グラム当たりの注射用量のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）を計算した。

【0331】

マウスにおけるａＮＰ生体内分布のＰＥＴ／ＣＴ画像化：Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、それぞれ^８９Ｚｒ標識ＩＬ４変異体、ＩＬ４（５３．６±６．６μＣｉ）、ａｐｏＡ１－ＩＬ４（３０．１±０．９μＣｉ）、円盤状ＩＬ４－ａＮＰ（１４６．１±４６．５μＣｉ）および球状ＩＬ４－ａＮＰ（１０８．６±１６．９μＣｉ）を静脈内注射した。２４時間後、マウスを、約１．０リットル／分の流速でＯ_２中の１．０％イソフルランを使用して麻酔した。ＰＥＴ／ＣＴスキャンは、Ｍｅｄｉｓｏ ｎａｎｏＳｃａｎ ＰＥＴ／ＣＴ（Ｍｅｄｉｓｏ、ブダペスト、ハンガリー）を使用して取得した。全身ＣＴスキャンを実行し（エネルギー、５０ｋＶｐ；電流、１８０μＡｓ；等方性ボクセルサイズ、０．２５ｍｍ）、続いて２０分間のＰＥＴスキャンを実行した。再構成は、Ｍｅｄｉｓｏ ＮｕｃｌｉｎｅソフトウェアからのＴｅｒａＴｏｍｏ ３Ｄ再構成アルゴリズムを使用して弱毒化補正を用いて行った。この一致は、４００ｋｅＶと６００ｋｅＶとの間のエネルギーウインドウによって除外された。ボクセルサイズは０．４ｍｍ幅で等方性であり、再構成は４回の完全な反復、反復ごとに６つのサブセットに適用された。

【0332】

オートラジオグラフィー：放射能分布を決定するために、－２０°Ｃでホスホイメージングプレート（ＢＡＳＭＳ－２３２５、富士フイルム）に対してフィルムカセットに組織を入れた。Ｔｙｐｈｏｏｎ ７０００ＩＰプレートリーダー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、２５ｍｍのピクセル解像度でプレートを読み取った。

【0333】

細胞特異性フローサイトメトリー：細胞特異性のために、マウスにＤｉＯ標識ＩＬ４－ａＮＰを静脈内注射し、これを２４時間循環させた。その後、マウスを屠殺し、前述のように血液、脾臓および骨髄から単一細胞懸濁液を作製した。細胞懸濁液を、抗ＣＤ１１５、抗ＣＤ１１ｂ、抗Ｌｙ６Ｃ、抗Ｌｙ６Ｇ、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ４５、抗ＣＤ１１ｃ、抗ＣＤ３、抗Ｆ４／８０でインキュベートした。生存性染色剤として生／死Ａｑｕａを使用した。その後、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。全てのデータは、Ａｕｒｏｒａ ５Ｌフローサイトメーター（Ｃｙｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得した。ＦＩＴＣチャネル中にジオール－ＩＬ４－ａＮＰが検出された。

【0334】

ＰＥＴ／ＭＲＩ非ヒト霊長類生体内分布：一晩の絶食後、ケタミン（５ｍｇ／ｋｇ）およびデクスメデトミジン（０．００７５～０．０１５ｍｇ／ｋｇ）を使用して非ヒト霊長類を麻酔した。非ヒト霊長類に、約０．１ｍｇ／ｋｇの用量で１．１１４ｍＣｉおよび０．６８２ｍＣｉの円盤状^８９Ｚｒ標識ＩＬ４－ａＮＰを注射した。注入後６０分間行われるような動的ＰＥＴイメージング、および追加の静的ＰＥＴ／ＭＲＩスキャンを注入後１時間および４８時間に行った。さらに、注射の５、３０、および１２０分後、イメージングの最中に採血した。ＰＥＴおよびＭＲＩ画像は、３Ｔ ＰＥ／ＭＲＩシステム（Ｂｉｏｇｒａｐｈ ｍＭＲ、Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｉｎｅｅｒ）を使用して取得した。ａＮＰの注入と同時に開始して、胸部および腹部を覆う１つの寝台位置を使用して動的ＰＥＴイメージングを実施した。ＭＲイメージングパラメータは以下の通りであった：取得平面、冠状面；繰り返し時間、１，０００ｍｓ；エコー時間、７９ｍｓ；スライス数、１４４；平均数、４；０．５×０．５×１．０ｍｍ^３の空間分解能および取得持続時間、４２分および４２秒。動的ＰＥＴ画像取得後、それぞれ１５分の４つの連続した寝台位置を使用して、頭蓋から骨盤まで静的全身ＰＥＴ画像を取得した。寝台につき同時に、１．４個の信号平均、スライスの数１６０、および空間分解能０．６×０．６×１．０ｍｍ^３（取得持続時間、寝台あたり１４分５６秒）のみを使用することを除いて、ＭＲ画像を上記のように取得した。全身ＰＥＴおよびＭＲイメージングも、それぞれ３０分の４つのＰＥＴの寝台位置を使用して、以下のＭＲパラメータ：取得平面、冠状面；繰り返し時間、１，０００ｍｓ；エコー時間、７９ｍｓ；スライス数、２２４；平均数、２；空間分解能０．６×０．６×１．０ｍｍ^３；取得持続時間、２９分および５６秒を用いて、注入後４８時間で実施した。各寝台からの全身ＭＲ画像をスキャナによって共に自動的に照合した。取得後、各寝台からのＰＥＴ生データを再構成し、３回の反復および２４個のサブセットについての点広がり関数（ＰＳＦ）補正を伴う順序サブセット期待値最大化（ＯＳＥＭ）アルゴリズムを有するＳｉｅｍｅｎｓ独自のｅ７ツールを使用してオフラインで一緒に照合した。また、画像には４ｍｍのガウシアンフィルタを適用した。弱毒化には３区画（軟組織、肺および空気）の弱毒化マップを使用した。

【0335】

非ヒト霊長類におけるＩＬ４－ａＮＰ生体内分布のイメージングベースの分析：画像分析を、Ｏｓｉｒｉｘ ＭＤ、バージョン１１．０を使用して行った。全身ＭＲ画像をＰＥＴ画像と融合し、冠状面で分析した。関心領域（ＲＯＩ）を、脾臓、肝臓、腎臓、肺、心臓、小脳、および大脳を含む関心組織上に採取し、それらの全体を追跡し、腰椎の３つの椎骨を使用して骨髄取り込みを決定した。各ＲＯＩについて、平均標準化取り込み値（ＳＵＶ）を計算した。器官あたりの円盤状^８９Ｚｒ標識ＩＬ４－ａＮＰ取り込みを、器官あたりのすべての平均ＳＵＶ値の平均として表した。

【0336】

インビボ寛容性モデル：インビボ寛容性モデルのために、１１週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスを０．１ｍｇ／ｋｇ体重のＬＰＳで腹腔内寛容化した。２４時間および４８時間で、マウスを２００μｇのＩＬ４ｍ－ａＮＰまたはＰＢＳのいずれかで静脈内処置した。その後、マウスに７２時間で腹腔内０．１ｍｇ／ｋｇのＬＰＳ注射で再曝露した。９０分後、マウスを屠殺し、ＥＬＩＳＡのために血液を採取し、血液、脾臓および骨髄から単一細胞懸濁液を作製した。染色プロトコル。ＥＬＩＳＡのための血液試料を室温で３０分間凝固させた。４°Ｃで１０分間、１０００×ｇで遠心分離した後、血清を採取した。マウスＴＮＦおよびＩＬ６ ＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を製造業者のプロトコルに従って実施した。動物のケアおよび実験手順は、Ｎｉｊｍｅｇｅｎ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅから承認された施設内プロトコルに基づいた。

【0337】

統計分析：特に明記しない限り、データを平均＋／－ＳＤとして示す。グラフ中の個々のデータ点は生物学的反復であり、技術的反復ではない。データ点の数が図から明確に識別できない場合、ｎが図の凡例に示される。特に明記しない限り、統計分析はＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｖ９、Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェア）で行った。初代ヒト単球を用いた訓練された免疫および急性刺激実験のために、（ペア、ノンパラメトリック）ウィルコクソンの符号順位検定を使用した。ＲＮＡ配列決定分析のための統計的方法は上記に記載されている。０．０５未満の両側Ｐ値を統計学的に有意とみなした。図中の統計的有意性は以下のように示される：＊＝Ｐ＜０．０５、＊＊＝Ｐ＜０．０１、＊＊＊＝Ｐ＜０．００１、ＮＳ＝Ｐ≧０．０５。

【0338】

データおよびコードの可用性：データは、Ｌｅａｄ Ｃｏｎｔａｃｔへの要求に応じて入手可能である。生のＲＮＡ配列決定データは、受託番号ＧＳＥ１８５４３３としてＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓに寄託されている。

【0339】

結果
ＩＬ４は急性炎症を阻害するが、訓練された免疫を誘導する
骨髄系細胞免疫学との関連において、ＩＬ４は主にその抗炎症特性で公知である。したがって、本発明者らは、最初に、初代ヒト単球における炎症に対するＩＬ４のいくつかの公知の阻害効果を検証した（図１７Ａ）。本発明者らは、ＩＬ４（２５ｎｇ／ｍＬ）の存在下または非存在下で、Ｐｅｒｃｏｌｌ富化単球をＬＰＳで２４時間刺激した。予想されるように、ＩＬ４は、炎症促進性サイトカイン腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびＩＬ６の分泌を強力に阻害した（図１７Ｂ）。興味深いことに、ＩＬ４処理細胞は、対照と比較して有意に多くのＩＬ－１Ｒａを分泌した（図１７Ｂ）。活性化骨髄系細胞において解糖が上方制御されるので、本発明者らは、ＩＬ４または培地対照で処理した、別様には刺激していない単球における乳酸産生を測定した。本発明者らは、ＩＬ４がわずかではあるが有意に低いベースライン乳酸産生を見出し（データは示さず）、その急性抗炎症特性を確認した。

【0340】

これらの抗炎症特性に基づいて、本発明者らは、ＩＬ４が訓練された免疫の誘導も阻害し得ると仮定した（図１７Ｃ）。この仮説を試験するために、単球を、プロトタイプの訓練された免疫刺激であるβ－グルカンで２４時間訓練し、続いて刺激を洗浄し、培養培地中で５日間の休止期間を設けた。６日目に、本発明者らは、細胞をＬＰＳでさらに２４時間再刺激し、ＴＮＦおよびＩＬ６を測定した（図１７Ｄ）。β－グルカンは予想通りに訓練された免疫を誘導したが、最初の２４時間のＩＬ４の添加は訓練効果を阻害しなかった（図１７Ｄ）。本発明者らの初期の仮説に反して、単球をＩＬ４単独に２４時間曝露すると、６日目に訓練された免疫表現型が誘導された（図１７Ｅ）。炎症促進性サイトカインの産生の増強に加えて、ＩＬ４で訓練された細胞は、ベースラインでより多くの乳酸を産生した（データは示さず）。ＩＬ４で訓練された細胞は、非訓練対照と比較して、加熱殺菌したカンジダ・アルビカンスを貪食する効果がわずかに低かった（データは示さず）。まとめると、本発明者らのデータは、ＩＬ４が、代謝免疫学的レベルおよび機能的免疫学的レベルの両方で、炎症を阻害し、訓練された免疫を誘導することを実証している。

【0341】

これらの観察によって勇気づけられて、本発明者らは、ＩＬ４誘導性の訓練された免疫後の代謝変化を包括的に研究した。この目的のために、本発明者らは、ＩＬ４で訓練された細胞および非刺激対照の解糖および酸化代謝を調べるためにＳｅａｈｏｒｓｅ代謝フラックス分析を使用した。０日目のＩＬ４訓練は、６日目に測定された代謝パラメータに顕著な影響を及ぼし（図１７Ｆ）、より高い基礎解糖に向かう傾向があり、オリゴマイシン誘発最大解糖能の有意な増加があった（図１７Ｆ左パネル）。さらに、ベースラインおよびＦＣＣＰによって引き起こされた最大呼吸数の両方が、ＩＬ４訓練によって有意に増加した（図１７Ｆ右パネル）。

【0342】

次いで、本発明者らは、フローサイトメトリーを使用して、単球／マクロファージのＩＬ４活性化に一般的に関連するいくつかのパラメータを測定した（データは示さず）。ＩＬ４訓練は、６日目にＣＤ１４発現の強い下方制御を引き起こした。対照的に、ＣＤ２００Ｒおよび特にＣＤ２０６は、０日目のＩＬ４活性化に続いて６日目に有意に増強された。ＣＤ８０はＩＬ４の訓練によってわずかに増加したが、これらの他のナイーブマクロファージでは全体的な発現は依然として低かった。単球由来樹状細胞（ＩＬ４＋ＧＭ－ＣＳＦを用いて分化させたｍｏＤＣ）もＣＤ１４を下方制御し、一方でＣＤ１ｃを強く上方制御することが公知である。ＩＬ４で訓練された細胞は、訓練されていない細胞よりもわずかに多いＣＤ１ｃを発現したが、ｍｏＤＣよりもはるかに少なかった（データは示さず）。これらの結果は、ＩＬ４が、古典的なＩＬ４免疫学的機能から公知である特徴を組み込んだ訓練された免疫のプログラムを誘導することを示している。

【0343】

ＩＬ４誘導性の訓練された免疫を媒介する免疫およびエピジェネティック機構
ＩＬ４のシグナル伝達機構：ＩＲＳ－２／ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ軸およびＳＴＡＴ６シグナル伝達経路が十分に記載されている（図１８Ａ）。本発明者らは、ＩＬ４による急性炎症の阻害および訓練された免疫誘導の両方についてこれらの経路の役割を調べるために薬理学的阻害実験を行った。ＰＩ３ＫまたはｍＴＯＲ（それぞれウォルトマンニンまたはトリン－１を使用）の阻害は、急性炎症に対するＩＬ４の効果を無効にしなかったが、訓練された免疫応答を減少させた（図１８Ｂ、図１８Ｃ、データは示されていない）。ＴＮＦ産生およびＩＬ６産生の増加によって測定されるＩＬ４訓練は、トリン－１の存在下で有意に鈍った（図１８Ｃ、データは示さず）。対照的に、ＳＴＡＴ６阻害剤ＡＳ１５１７４９９は、急性炎症応答におけるサイトカイン産生を部分的に回復させたが、ＩＬ４による訓練された免疫誘導には影響を及ぼさなかった（図１８Ｂおよび図１８Ｃ）。したがって、ＩＬ４とその受容体との結合の下流で誘導される各シグナル伝達経路は、異なる機能を有する：ＩＬ４は、ＳＴＡＴ６を介してその既知の急性抗炎症機能を発揮するが、同時に、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ（これまで知られていない炎症促進効果）を介して訓練された免疫を誘導する。

【0344】

ＩＬ４訓練によって誘導される分子プログラムについての洞察を得るために、本発明者らは、６日目のＬＰＳ再刺激の前後の両方で、ナイーブおよびＩＬ４訓練マクロファージについてトランスクリプトミクス分析を行った。全体として、１４０個の遺伝子がＩＬ４で訓練されたマクロファージにおいてより強く誘導された（「上方制御された」）のに対して、２４９個の遺伝子は弱毒化された（図１８Ｄ）。とりわけ、上方制御された遺伝子は、訓練された免疫に関与することが公知であるＩＬ６およびＩＬ１２Ｂなどの炎症促進性サイトカインであった。顕著な弱毒化遺伝子の中には、それぞれリンパ球輸送およびサイトカインシグナル伝達の抑制に重要なＣＣＬ１９およびＳＯＣＳ２があった。

【0345】

本発明者らは次に、トランスクリプトームプロファイルへのさらなる洞察を得るために、転写因子（ＴＦ）モチーフ濃縮分析（図１８Ｅ）および遺伝子オントロジー／経路濃縮分析（図１８Ｆ）を行った。ＩＬ４で訓練されたマクロファージにおいて上方制御された遺伝子のプロモーターは、ＡＴＦ２／ＡＴＦ７、ＰＰＡＲαおよびＳＴＡＴ５などのＴＦによって認識されるモチーフについて高度に濃縮されたが、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ）モチーフは特に枯渇していた。このパターンは、ＴＡＴＡ－ｂｏｘ、ＮＦκＢ－ｐ６５、ＮＦκＢ－ｐ６５－ＲｅｌおよびＦＲＡ２を除いて、非罹患遺伝子および弱毒化遺伝子についてはほとんど逆であった：これらのモチーフは、弱毒化遺伝子プロモーターにおいて高度に濃縮されたが、非罹患遺伝子および上方制御された遺伝子の両方において減少した（図１８Ｅ）。遺伝子オントロジー（生物学的プロセス；ＢＰおよび分子機能；ＭＦ）およびＫＥＧＧ経路濃縮は、免疫学的活性が上方制御（例えば、ＢＰ「生物に対する応答」、ＫＥＧＧ「ＴＮＦシグナル伝達」）および弱毒化（例えば、ＢＰ「免疫応答」、ＭＦ「サイトカイン活性」）遺伝子セットの両方に存在することを示した（図１８Ｆ）。本発明者らは、ＩＬ４、ＬＰＳ、またはＩＬ４とＬＰＳとを組み合わせた単離直後に刺激した単球に対して同様のトランスクリプトーム分析を行い、ＩＬ４に対する急性抗炎症性トランスクリプトーム応答を確認した（データは示さず）。まとめると、これらのデータは、急性抗炎症効果およびＩＬ４によって引き起こされる長期訓練された免疫応答の両方における特異的な転写プログラムを明らかにする。

【0346】

本発明者らはその後、エピジェネティックリプログラミング、特にヒストン１修飾の重要性および存在を調査した。抗アレルギー薬シプロヘプタジン、ＳＥＴ７（ＳＥＴ９としても公知である）ヒストン２メチルトランスフェラーゼ阻害剤の添加は、ＩＬ４による訓練された免疫の誘導を無効にした（図１８Ｇ）。ＳＥＴ７は、訓練された免疫の重要なエピジェネティックメディエーターとして以前に記載されている。さらに、本発明者らは、ＩＬ４誘導性の訓練された免疫において、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）－ｑＰＣＲ分析を使用して、ＴＮＦのＨ３Ｋ９ｍｅ３媒介抑制を評価した。プライマー対の曲線下面積（ＡＵＣ）分析を使用すると、ＩＬ４誘導性の訓練された免疫においてＨ３Ｋ９ｍｅ３の６の減少が示されたが、これは統計学的有意性に達しなかった（図１８Ｈ、データは示さず）。まとめると、これらのデータは、エピジェネティックなリプログラミングがＩＬ４誘導性の訓練された免疫にとって重要であり、その特徴であることを示している。

【0347】

脂質ナノ粒子に組み込まれるａｐｏＡ１－ＩＬ４融合タンパク質の開発
訓練された免疫を同時に誘導しながら急性炎症を阻害するその独特の能力にもかかわらず、組換えＩＬ４の臨床的翻訳は、その不利な薬物動態学的特性によって妨げられる。この制限を克服するために、本発明者らは、脂質ナノ粒子に容易に組み込まれてＩＬ４含有ナノ粒子（ＩＬ４－ａＮＰ）を生じるａｐｏＡ１ベースの融合タンパク質を開発した。ＡｐｏＡ１ベースのナノ粒子（ａＮＰ）は、造血器官に本質的に蓄積し、骨髄系細胞およびそれらの前駆細胞を効率的に標的化する（Schrijver,D.P.et al.in Advanced Therapeutics Vol.4 2100083-2100083(John Wiley&Sons,Ltd,2021;van Leent,M.M.T.et al.Regulating trained immunity with nanomedicine.Nature Reviews Materials 7,46 465-481,doi:10.1038/s41578-021-00413-w(2022)）（図１９Ａ）。具体的には、本発明者らは、可撓性リンカーを介して接続され、Ｎ末端に位置する６ｈｉｓタグおよびＣ末端にあるｓｔｒｅｐタグの２つの精製タグに隣接するヒトａｐｏＡ１およびヒトＩＬ４（ａｐｏＡ１－ＩＬ４）からなる融合タンパク質を設計した（図１９Ｂ）。本発明者らは、ａｐｏＡ１－ＩＬ４の性質および純度を確認するために分子特性評価技術を使用した。各精製タンパク質試料に対してドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を行うことにより、本発明者らは、２５ｋＤａ（ａｐｏＡ１）、１８ｋＤａ（ＩＬ４）および３７ｋＤａ（ａｐｏＡ１－ＩＬ４）の分子量を有するタンパク質の存在を確認し（図１９Ｃ）、一方、ウエスタンブロットは、ａｐｏＡ１およびＩＬ４の存在を示した（図１９Ｄ）。その両親媒性特性のために、ａｐｏＡ１からなるタンパク質は、予想よりもゲル上での泳動が低い。これらの観察結果は、ａｐｏＡ１の４７５８２．５７Ｄａの予想分子量に対応する４７５７６．０３Ｄａの単一の質量ピークを示す四重極飛行時間型（Ｑ－ＴＯＦ）質量分析によって裏付けられた（図１９Ｅ）。

【0348】

ａｐｏＡ１－ＩＬ４を脂質ナノ粒子に組み込む前に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）およびＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ４／ＩＬ１３（ＨＥＫ－ＩＬ４）レポーター細胞を使用する生物物理学的な細胞分析を実施して、精製およびリフォールディングプロセス後の生物学的活性の保存を決定した。本発明者らは、ＳＰＲを使用したヒトＩＬ４受容体アルファ（ＩＬ４Ｒα）に対するａｐｏＡ１－ＩＬ４の平衡解離定数Ｋｄが４．５ｎＭ±１．１ｎＭであると決定した（図１９Ｆ）。ＨＥＫ－ＩＬ４細胞は、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードするＩＬ４Ｒα／ＳＴＡＴ６誘導性レポーター遺伝子を保有しており、これは、その培養ウェルへのａｐｏＡ１－ＩＬ４の導入時に顕著に産生された。これは、ａｐｏＡ１－ＩＬ４の生物学的活性を示している（図１９Ｇ）。ａｐｏＡ１との融合はＩＬ４の生物物理学的特性を有意に変化させ、脂質ナノ粒子への組み込みを可能にしたが、その受容体への結合は０．２８±０．１ｎＭのｋｄで保存された（データは示さず）。要約すると、本発明者らは、抽出、精製、およびリフォールディング後にＩＬ４の生物学的活性を保存し、ａｐｏＡ１を介した脂質ナノ粒子への統合のための望ましい物理化学的特徴を含むａｐｏＡ１－ＩＬ４融合タンパク質を開発した。

【0349】

脂質ナノ粒子へのａｐｏＡ１－ＩＬ４の組み込み
ＩＬ４の薬物動態特性および骨髄系細胞へのバイオアベイラビリティを改善するために、本発明者らは、脂質ナノ粒子にａｐｏＡ１－ＩＬ４融合タンパク質を組み込んでＩＬ４－ａＮＰを得た。ナノ材料の組成を変えることにより、異なるサイズおよび形態のナノ粒子を得た（図２０Ａ）。円盤状および球状ナノ粒子の成功裏の製剤化は、低温透過型電子顕微鏡法（ｃｒｙｏ－ＴＥＭ）によって確認された（図２０Ｂ）。本発明者らはさらに、動的光散乱（ＤＬＳ）を用いて１４日間ＰＢＳ中でナノ粒子サイズおよび安定性を分析した（図２０Ｃおよび図２０Ｄ）。ＩＬ４－ａＮＰは１４日間安定したままであり、本発明者らの従来のａＮＰと比較して同様のサイズおよび安定性を有する（データは示さず）。従来のａＮＰは、Schrijver,D.P.et al.in Advanced Therapeutics Vol.4 2100083-2100083）に記載されているようなアポリポタンパク質を含む。

【0350】

次に、本発明者らは、ＩＬ４－ａＮＰと初代ヒト単球との相互作用を調べた。直接確率的光学再構成顕微鏡法（ｄＳＴＯＲＭ）分析により、膜上のＩＬ４Ｒαの発現が明らかになった。さらに、裸のａｐｏＡ１、裸のａｐｏＡ１－ＩＬ４、およびＩＬ４－ａＮＰの結合は、細胞表面を覆う縁によって確認された。膜の拡大断面に注目すると、本発明者らは、裸のａｐｏＡ１－ＩＬ４およびＩＬ４－ａＮＰがＩＬ４Ｒαと会合し、細胞表面に濃縮された共クラスターを形成することを見出したが、本発明者らは裸のａｐｏＡ１および従来のａＮＰについては観察しなかった（図２０Ｅ）。まとめると、本発明者らのＤＬＳサイズ安定性アッセイ、ｃｒｙｏＴＥＭおよびｄＳＴＯＲＭ分析は、脂質ナノ粒子にａｐｏＡ１－ＩＬ４融合タンパク質を組み込むことにより、生物学的に機能的なＩＬ４－ａＮＰが得られることを明らかにした。

【0351】

マウスにおけるＩＬ４、ａｐｏＡ１－ＩＬ４およびＩＬ４－ａＮＰ製剤の研究
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける薬物動態および生体内分布を調べるために、本発明者らは、４つの異なるＩＬ４治療薬、すなわち組換えＩＬ４；裸のａｐｏＡ１－ＩＬ４融合タンパク質；ならびにジルコニウム－８９（^８９Ｚｒ）を含む円盤状および球状のＩＬ４－ａＮＰのタンパク質成分を放射性標識した。これらの実験は、マウスにおいて生物学的活性を示さないＩＬ４のヒト変異体を用いて行ったことに留意されたい。静脈内投与の２４時間後のコンピュータ断層撮影（ＰＥＴ／ＣＴ）イメージングを用いた陽電子放射断層撮影法は、^８９Ｚｒ－ＩＬ４および^８９Ｚｒ－ａｐｏＡ１－ＩＬ４が主に腎臓および肝臓に蓄積したことを示した。対照的に、肝臓および腎臓に蓄積することに加えて、^８９Ｚｒ－ＩＬ４－ａＮＰは、脾臓および骨髄を含む免疫細胞に富む器官において比較的多量に蓄積した（図２７Ａ）。本発明者らは、エクスビボのガンマカウンティングを行って、それらのナノ材料の血中半減期および主要器官における取り込みを決定し（図２７Ｂおよび図２７Ｃ）、本発明者らはオートラジオグラフィーによって裏付けた（データは示さず）。標的器官（骨髄＋脾臓）／クリアランス器官（腎臓＋肝臓）による取り込み比の比較は、非製剤化融合タンパク質および裸のＩＬ４と比較して、ＩＬ４－ａＮＰ製剤の取り込み比の有意な増加を示した（データは示さず）。次に、本発明者らは、フローサイトメトリーを使用して、標的器官における細胞型特異的生体内分布を測定した。Ｄｉｏ標識円盤状ＩＬ４－ａＮＰは、脾臓および骨髄の両方において骨髄系細胞、最も顕著には単球および好中球に蓄積するが、リンパ球とは相互作用しない（またはわずかにしか相互作用しない）（図２７Ｄ）。造血器官におけるその好ましい（および骨髄特異的な）取り込みに基づいて、本発明者らは、非ヒト霊長類におけるさらなる研究ならびに炎症および敗血症の翻訳モデルのために円盤状ＩＬ４－ａＮＰ製剤を選択した。

【0352】

ＩＬ４－ａＮＰ免疫療法は、非ヒト霊長類において好ましい取り込みプロファイルを示す
ＩＬ４－ａＮＰ免疫療法の臨床翻訳能を評価するために、本発明者らは、非ヒト霊長類におけるそれらの生体内分布および安全性を決定した。２匹の非ヒト霊長類に^８９Ｚｒ－ＩＬ４－ａＮＰを静脈内注射した。それらのインビボ挙動を、磁気共鳴画像法（ＰＥＴ／ＭＲＩ）と組み合わせた完全に統合された三次元ＰＥＴを使用してインビボで研究した。注射後、動的ＰＥＴ／ＭＲＩ（データは示さず）は、肝臓、腎臓（データは示さず）、脾臓および骨髄におけるＩＬ４－ａＮＰの急速な蓄積を実証した（図２７Ｅ～図２７Ｈ）。本発明者らのマウスデータによれば、脳および心臓を含む非標的器官において、ＩＬ４－ａＮＰの望ましくない取り込みは観察されなかった（データは示さず）。まとめると、ＩＬ４－ａＮＰの好ましい生体内分布および安全性プロファイルを実証するこれらの結果は、種全体に保持され、この免疫療法の翻訳の可能性を裏付けている。

【0353】

ＩＬ４－ａＮＰ療法はインビトロおよびインビボで免疫学的障害を解消する
天然のＩＬ４が同時に急性炎症応答を弱め、訓練された免疫のプログラムを誘導することを確立した後、本発明者らは、インビトロで単球に対するＩＬ４－ａＮＰの効果を評価した（図２１Ａ）。本発明者らは、インビトロの実験のための用量を、裸のＩＬ４と比較した、初代ヒト単球におけるホスホ－ＳＴＡＴ６誘導の効率に基づいた（データは示さず）。実際、ＩＬ４－ａＮＰ（２００ｎｇ／ｍＬの裸のＩＬ４のモル当量）は、ＬＰＳ刺激単球のＴＮＦおよびＩＬ６産生を有意に減少させ（図２１Ｂ）、一方、６日目の単球の長期応答性を増強した（図２１Ｃ）。これらのデータは、ＩＬ４－ａＮＰが、ＩＬ４と同様に、急性炎症を抑制し、インビトロで訓練された免疫を誘導することを示している。本発明者らのインビボ体内分布データは、ＩＬ４－ａＮＰが骨髄系細胞を特異的に標的化することを示しているが（図２７Ｄ）、ＩＬ４誘導性の訓練された免疫は、抗原提示細胞であるマクロファージの表面マーカー発現を変化させる（データは示さず）。これは、やがてＴ細胞活性化中の分極信号に影響を及ぼし得る。Ｔ細胞に対するＩＬ４－ａＮＰのこれらの潜在的な間接的効果を調べるために、同種異系ナイーブＴ細胞をＩＬ４で訓練されたマクロファージの存在下で培養した。このモデルでは、ＨＬＡミスマッチは抗原非特異的Ｔ細胞の活性化および分極を引き起こす。訓練されたマクロファージと対照との間で、Ｔ細胞サブタイプ、Ｔｈ１（ＣＤ４＋ＩＦＮγＨｉｇｈ＋）、Ｔｈ２（ＣＤ４＋ＩＬ４＋）、Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＩＬ１０＋）、Ｔｈ１７（ＣＤ４＋ＩＬ１７＋）および細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋グランザイムＢ＋パーフォリン＋）の存在量に有意差は観察されなかった（データは示さず）。まとめると、これらの知見は、ＩＬ４訓練がＴ細胞応答を間接的にゆがめる能力を示さないことを示しており、主に骨髄特異的な効果を示唆している。

【0354】

敗血症患者は、過剰炎症応答と免疫麻痺の両方を経験し、治療上のパラドックスを作り出す可能性がある。訓練された免疫の誘導は、免疫寛容を逆転させるために理論的に使用することができるが、これはインビボモデルには解釈されていない。１つの理由は、ヒトＩＬ４がマウスにおいて生物学的活性を示さないことである。したがって、本発明者らは、ＩＬ４ｍ－ａＮＰを得るための脂質との製剤化のためのヒトａｐｏＡ１およびマウスＩＬ４からなるキメラ融合タンパク質を設計および産生した。ここで、本発明者らは、ＩＬ４ｍ－ａＮＰがマウスにおいてＬＰＳ誘導性寛容を逆転させることができるかどうかを調べた。その目的のために、本発明者らは、Ｃ５７Ｂ／６マウスにＬＰＳ（０．１ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射して、免疫麻痺またはＰＢＳ（対照として）を誘導した。本発明者らは、ＬＰＳ処置の２４時間後および４８時間後にＩＬ４ｍ－ａＮＰ（２００μｇ／用量）を静脈内投与した。本発明者らは、最初の曝露の７２時間後にＬＰＳ（０．１ｍｇ／ｋｇ）の別の腹腔内注射でマウスに再曝露した（図２１Ｄ）。実際、ＩＬ４ｍ－ａＮＰによる処置は、寛容化マウスのＬＰＳ再曝露後の血清ＩＬ６濃度の有意な（ｐ＝０．００７９）増加によって示されるように、先天性免疫応答を改善した（図２１Ｅ）。一部のマウスのＴＮＦレベルは明らかに上昇していたが、治療応答の不均一性のために統計的有意性は達成されなかった（ｐ＝０．１５０８）（図２１Ｅ）。まとめると、本発明者らのインビトロおよびインビボデータは、ＩＬ４－ａＮＰが寛容性を低下させ得ることを実証している。

【0355】

ヒト内毒素血症モデル
本発明者らがそのマウスモデルにおいて寛容逆転を観察した後、本発明者らは、ヒト臨床免疫透析をより厳密に模倣するモデルを用いてこれらの結果を実証した。本発明者らは、敗血症の過剰炎症表現型および免疫麻痺表現型の両方の特徴を捉える全身性炎症の標準化された制御モデルである実験的ヒト内毒素血症を受けている健常個体から血液を得た（図２１Ｆ）。この制御されたヒトモデルでは、ＬＰＳが健常志願者に静脈内投与され、全身性炎症反応がもたらされ、その後、循環単球の寛容化がもたらされ、この現象はまた敗血症誘導性免疫麻痺において観察される。ＬＰＳ投与開始前および４時間後に採血した。ＬＰＳ投与後に単離された単球は、ＬＰＳへの即時の再曝露時に不十分なサイトカイン産生を示し、寛容化を示した（データは示さず）。ＬＰＳ曝露されたボランティアからの耐性単球を、エクスビボでＩＬ４またはＩＬ４－ａＮＰのいずれかに２４時間曝露した場合、３日目にＬＰＳで再刺激すると、ＴＮＦ産生の有意な改善を示したが、ＩＬ６の産生は示さなかった（図２１Ｇ（濃度）、２１Ｈ（倍数変化）、データは示されていない）。対照的に、非処理単球は完全に耐性のままであった。まとめると、これらのデータは、ＩＬ４およびＩＬ４－ａＮＰがエクスビボでＬＰＳ耐性を少なくとも部分的に逆転させる能力を強調している。

【0356】

考察
ＩＬ４は一般に抗炎症性サイトカインであると考えられているが、単球／マクロファージ機能に対するその長期効果は不明である。本発明者らは当初、ＩＬ３７およびＩＬ３８と同様に、ＩＬ４が訓練された免疫を阻害すると予想した。驚くべきことに、本発明者らは、急性炎症に対するその既知の阻害効果に加えて、サイトカイン産生応答性の増加によって評価されるように、ＩＬ４が訓練された免疫を誘導することを観察した。ＩＬ４による訓練された免疫の誘導は予想外であったが、本発明者らの観察は、訓練された免疫における中心的な機構であるＩＬ４のｍＴＯＲ５シグナル伝達カスケードの活性化と一致している。本発明者らはその後、ＩＬ４曝露前の長期効果、ならびに実験的内毒素血症によって誘導される免疫寛容を逆転させるＩＬ４の能力を調査した。これに関連して、結果は、抗炎症性ＳＴＡＴ６依存性細胞プログラムが細胞のＩＬ４への急性曝露中に優勢であるが、これが長期訓練された免疫のｍＴＯＲ駆動プログラムに経時的に移行することを実証している。ＩＬ４訓練は、サイトカイン産生の増強、エピジェネティック再配線、代謝活性の増加、および再刺激時のトランスクリプトーム応答の変化を含む、訓練された免疫を説明するために典型的に使用されるすべてのパラメータに適合する。これらの所見は、Ｓａｎｄｅｒらによって２０１７年に提案されたものなど、単球分化の動的およびタイミング依存性モデルについての証拠の増加と一致している。（Sander,J.et al.Cellular Differentiation of Human Monocytes Is Regulated by Time-Dependent 7 Interleukin-4 Signaling and the Transcriptional Regulator NCOR2.Immunity 47,1051-1066 e1012,8 doi:10.1016/j.immuni.2017.11.024(2017)）

【0357】

宿主防御を改善することが報告されている訓練された免疫プログラムを誘導しながら同時に急性炎症を抑制するＩＬ４の独特の能力は、重度の感染症を治療するために潜在的に使用することができる。例えば、敗血症とＣＯＶＩＤ－１９の両方は調節不全の免疫応答を特徴とし、（日和見）二次感染に対する過剰炎症応答の管理と宿主防御応答の改善の両方を必要とする治療上のパラドックスを作り出す。ＩＬ４の固有の特徴を利用するために、本発明者らは、ナノ粒子タンパク質工学戦略を開発し、それにより、このサイトカインの好ましくないインビボ薬物動態特性を克服した。本発明者らは、訓練された免疫のモデルにおいて以前に観察されたように、本発明者らのａＮＰ戦略がＩＬ４の血中半減期および生体内分布プロファイルを有利に変化させ、骨髄および脾臓などの骨髄系細胞に富む器官における好中球および単球特異的蓄積の上昇をもたらすことを実証した。ヒトＩＬ４－ａＮＰを用いて生体内分布を研究したが、本発明者らは、インビボ有効性を評価するためにマウス変異体ＩＬ４ｍ－ａＮＰをさらに開発した。実際に、本発明者らは、ＬＰＳ誘導性サイトカインストームマウスモデルにおいてＩＬ４ナノ粒子の免疫隔離復帰効果を実証した。データは、ＩＬ４ｍ－ａＮＰで処置したマウスの血清中のＩＬ６レベルの有意な増加およびＴＮＦ濃度の増加に向かう明確な傾向を伴って先天性免疫応答が回復したことを実証しているが、同時の過剰炎症および免疫麻痺を特徴とする様々な免疫媒介疾患におけるＩＬ４ナノ粒子療法の可能性を拡大するためには、本格的な用量範囲調査研究が必要である。有望なことに、ヒト融合タンパク質を使用して、本発明者らは、ＩＬ４－ａＮＰが、臨床免疫麻痺を模倣するヒトモデルから得られた細胞の免疫寛容を逆転させることができることを示した。

【0358】

本発明者らは、それらのサイトカインナノ粒子プラットフォームが、敗血症誘導性過剰炎症後の免疫麻痺、ならびに他の骨髄指向性用途において使用され得ると予想している。癌はまた、局所的な腫瘍促進性炎症および抗腫瘍応答（しばしば骨髄系細胞によって媒介される）の同時抑制を特徴とするので、免疫腫瘍学的適用が考慮され得る。心筋梗塞および脳卒中はまた、無菌炎症とそれに続く免疫麻痺によって特徴付けられ、重篤な外傷患者は同様の免疫麻痺状態に罹患する。これらのすべての状況において、炎症の軽減および免疫麻痺の克服は、患者の回復および二次感染の予防に有益であり得る。本発明者らのＩＬ４－ａＮＰプラットフォームは、これらすべての状態を治療するための極めて重要な治療様式に発展する可能性を秘めている。

【0359】

実施例３．リルーティング分子に融合したアポリポタンパク質の融合タンパク質およびその脂質ナノ粒子への組み込み
材料および方法
ＶＨＨＣＤ８－ａｐｏＡ１融合タンパク質の発現および精製：ｐＥＴ２０ｂ－ＶＨＨＣＤ８－ａｐｏＡ１プラスミドおよびｐＤｉｓｃｏｎＴｕｎｅプラスミドで形質転換したＣｌｅａｒＣｏｌｉ細胞の小型培養を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地で開始した。翌日、４０ｍＬの小型培養物を１リットルの２ＹＴ培地で希釈して大型培養を開始し、ラムノースを５０μＭの最終濃度で添加して、ｐＤｉｓｃｏｎＴｕｎｅプラスミド上でＴ７リゾチームを誘導した。培養物を、０．６～０．８のＯＤ６００まで３７℃および１５０ｒｐｍで増殖させ、次いで、イソプロピルβ－ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．１ｍＭの最終濃度で添加して発現を誘導した。誘導した培養物を１８℃および１５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。誘導された細菌培養物をペレット化し、細胞を溶解緩衝液（２０mM Tris、５００mM NaCl、ｐＨ７．９）に再懸濁した。ベンゾナーゼヌクレアーゼ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）および５０ｍＬ細胞懸濁液あたり１つのｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）ＥＤＴＡ非含有Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ錠剤（Ｒｏｃｈｅ）を添加し、細胞懸濁液を撹拌しながら４°Ｃでインキュベートした。続いて、懸濁液を、Ａｖｅｓｔｉｎ Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ Ｃ３を使用して１５０００～２００００ｐｓｉで３回均質化した。細胞溶解物を常に氷上に保った。溶解後、細胞溶解物を遠心分離して不溶性細胞残屑をペレット化し、上清を固定化ニッケルイオンを含有するＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｍｅｔａｌ Ｃｈｅｌａｔｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＩＭＡＣ）カラムに流した。カラムを８カラム体積の緩衝液Ａ（２０mM Tris、５００mM NaCl、１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．９）で洗浄し、次いで８カラム体積の緩衝液Ａ５０（２０mM Tris、５００mM NaCl、５０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．９）で洗浄した。ＶＨＨＣＤ８－ａｐｏＡ１を溶出するために、８カラム体積の緩衝液Ａ５００（２０mM Tris、５００mM NaCl、５００ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．９）をカラムに添加した。精製工程の全ての画分を回収し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。精製したＶＨＨＣＤ８－ＡｐｏＡ１を含有する画分の緩衝液を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓ（Ａｍｉｃｏｎ）を使用してＰＢＳに変更した。ＶＨＨＣＤ８－ａｐｏＡ１を保存するために、アリコートを液体窒素中で急速凍結し、－７０℃で保存した。

【0360】

ＶＨＨＣＤ８－ａｐｏＡ１融合タンパク質は、配列番号５４によって定義される配列を有するか、またはシステインを含むａｐｏＡ１とＶＨＨＣＤ８との間のリンカーを含む配列番号５５によって定義される配列によってコードされる。

【0361】

ＳＤＳ－ｐａｇｅ：実施例２で説明したように実行される。

【0362】

ａＮＰ製剤：実施例２の「ナノ粒子の製剤化」の項に記載されるように実施した。

【0363】

ＤＬＳ：実施例２に記載のように実施した。

【0364】

Ｃｒｙｏ－ＴＥＭ：実施例２に記載のように実施した。

【0365】

マウス脾細胞におけるＶＨＨＣＤ８－ａｐｏＡ１のインビトロ結合：脾臓をマウスから得て、小片に切断し、７０μｍストレーナー（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で複数回引っ張らせて脾細胞懸濁液を得た。細胞を１５００ｒｐｍで１０分間スピンダウンし、上清を除去し、細胞を２ｍＬの１×赤血球溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）に溶解した。懸濁液を室温で５分間インキュベートし、１０ｍＬのＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）培地（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を添加し、細胞を再び１５００ｒｐｍで１０分間スピンダウンした。次いで、細胞をＲＰＭＩ培地に再溶解し、９６ウェルプレートに１５０，０００細胞／ウェルで播種した。

【0366】

ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中のスルホ－シアニン５－マレイミド（Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ）を５倍モル過剰で添加することによってタンパク質を標識した。混合物を室温で２時間撹拌した。過剰な色素を、ＰＤミニトラップＧ－２５脱塩カラム（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して除去した。蛍光標識されたａＮＰを、円盤状配合物については６．４μｇのＤｉＩを、球状配合物については２１μｇのＤｉＩを加えることによって配合した（実施例２の「ナノ粒子の製剤化」の節を参照のこと）。蛍光標識された融合タンパク質またはａＮＰおよび対照をウェルに加え、４°Ｃ（タンパク質の場合）または３７°Ｃ（ａＮＰの場合）で３０分間インキュベートし、その後、細胞を採取し、洗浄し、ＣＤ３およびＣＤ４について染色し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ）で測定した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＢＤ）を使用して、フローサイトメトリーデータを分析した。
結果

【0367】

ＶＨＨＣＤ８－ａｐｏＡ１融合タンパク質は、Ｃｌｅａｒｃｏｌｉ細胞での発現に成功した。ＩＭＡＣ精製後に軽微なタンパク質夾雑物が存在した［レーンＥ１］（図２３）。最も顕著なバンドは、４３．３ｋＤａの分子量を有する融合タンパク質に対応する（図２３）。正しい質量は、後で質量分析によって確認された（データは示さず）。
ＶＨＨＣＤ８－ａｐｏＡ１を組み込んで円盤状アポリポタンパク質ナノ粒子を製剤化した。動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して、粒子のサイズおよび多分散性指数（ＰＤＩ）を決定した。粒子のサイズは７日間安定したままであった（図２４（左パネル））。１４日目に、サイズはわずかに増加した（図２４（左パネル））。ＰＤＩは１４日間安定したままであった（図２４（左パネル））。ナノ粒子のＣｒｙｏ－ＴＥＭ画像は、予想される円盤形状を示した（図２４（右パネル））

【0368】

ＶＨＨＣＤ８－ａｐｏＡ１およびａｐｏＡ１を蛍光標識し、続いてマウス脾細胞に添加した。ＶＨＨＣＤ８－ａｐｏＡ１融合タンパク質については、平均蛍光強度（ＭＦＩ）の用量依存的増加が観察され、ＣＤ８受容体への融合タンパク質の結合を示した（図２５；下パネル）。ａｐｏＡ１条件はこの用量依存的挙動を示さず、対照試料と同様のＭＦＩを有した。

【0369】

円盤状および球状のａＮＰを、ＶＨＨＣＤ８－ａｐｏＡ１およびａｐｏＡ１を用いて配合した。蛍光色素を粒子の脂質構造に組み込んだ。マウス脾細胞をナノ粒子でインキュベートした。両方のＶＨＨＣＤ８－ａｐｏＡ１粒子は、ＭＦＩの用量依存的増加を示し、ＣＤ８受容体へのナノ粒子の結合を示した（図２６）。円盤状ナノ粒子は、球状ナノ粒子よりも大きな増加を示した。ａｐｏＡ１ナノ粒子条件では、ＭＦＩの増加は観察されなかった。

【0370】

配列表
本特許出願は、対応する配列表と共に出願され、その全体が参照により組み込まれる。以下は、配列の概要およびそれらの簡単な説明である。

【表5-1】

【表5-2】

【表5-3】

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17-1】

【図17-2】

【図18-1】

【図18-2】

【図19-1】

【図19-2】

【図20-1】

【図20-2】

【図21-1】

【図21-2】

【図21-3】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27-1】

【図27-2】

【図27-3】

【配列表】

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【国際調査報告】