特表 2024-536830 単一分子局在化顕微鏡法を使用してサンプルに含まれる単一蛍光分子を局在化するための装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-08

(54)【発明の名称】単一分子局在化顕微鏡法を使用してサンプルに含まれる単一蛍光分子を局在化するための装置

(51)【国際特許分類】

   G02B 21/36 20060101AFI20241001BHJP

   G02B 21/00 20060101ALI20241001BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20241001BHJP

   G02B 21/06 20060101ALI20241001BHJP

【ＦＩ】

G02B21/36

G02B21/00

G01N21/64 E

G02B21/06

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024518506

(86)(22)【出願日】2022-09-28

(85)【翻訳文提出日】2024-04-11

(86)【国際出願番号】 EP2022076901

(87)【国際公開番号】W WO2023052384

(87)【国際公開日】2023-04-06

(31)【優先権主張番号】21306377.9

(32)【優先日】2021-10-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524108721

【氏名又は名称】アビーライト

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ブール，ニコラ

(72)【発明者】

【氏名】カオルシ，バレンティーナ

【テーマコード（参考）】

2G043

2H052

【Ｆターム（参考）】

2G043AA03

2G043EA01

2G043FA02

2G043HA01

2G043HA02

2G043JA03

2G043KA02

2G043KA09

2H052AA09

2H052AB01

2H052AC04

2H052AC09

2H052AC15

2H052AC18

2H052AC21

2H052AC34

2H052AD03

2H052AD34

2H052AF14

2H052AF25

(57)【要約】

本発明は、単一分子局在化顕微鏡法を使用して、サンプルに含まれる単一蛍光分子を局在化するための装置に関する。装置は、既定の放射照度を有する第１の波長の光ビームを使用してサンプルを走査するように構成された走査ユニットと、第２の波長で第１の画像及び第２の画像を取得するように構成された画像取得ユニットと、第２の画像において単一蛍光分子を局在化するように構成された局在化ユニットとを含む。それに加えて、装置は、第１の画像に基づいて、単一蛍光分子の１つ又は複数の局所密度を決定するように構成された決定ユニットと、単一蛍光分子の１つ又は複数の局所密度の各々の既定の関数として、光ビームの１つ又は複数の局所放射照度を計算するように構成された計算ユニットとを含む。走査ユニットは、光ビームの１つ又は複数の局所放射照度を使用してサンプルを走査するようにさらに構成される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

単一分子局在化顕微鏡法を使用して、サンプル（１０２）に含まれる単一蛍光分子を局在化するための装置（１００）であって、
既定の放射照度を有する第１の波長の光ビーム（１２６）を使用して前記サンプルを走査するように構成された走査ユニット（１０４）と、
第２の波長で第１の画像（１１０ａ）及び第２の画像（１１０ｂ）を取得するように構成された画像取得ユニット（１０８）と、
前記第２の画像において前記単一蛍光分子を局在化するように構成された局在化ユニット（１１６）と
を含み、
前記第１の画像に基づいて、前記単一蛍光分子の１つ又は複数の局所密度を決定するように構成された決定ユニット（１１２）と、
前記単一蛍光分子の前記１つ又は複数の局所密度の各々の既定の関数として、前記光ビームの１つ又は複数の局所放射照度を計算するように構成された計算ユニット（１１４）と
を含み、
前記走査ユニットが、前記光ビームの前記１つ又は複数の局所放射照度を使用して前記サンプルを走査するようにさらに構成されることを特徴とする、装置（１００）。

【請求項2】

前記光ビームの前記１つ又は複数の局所放射照度を、所定のタイムフレームにおいて所定の焦点体積内で、平均して、前記単一蛍光分子のうちの１つしか発光しないように適応させる、請求項１に記載の装置。

【請求項3】

前記単一蛍光分子を局在化するための一連の逐次プロセスを実行するように構成された、請求項１又は２に記載の装置であって、逐次プロセスの各々に対して、前記第２の画像が、前記逐次プロセスの前記第１の画像になり、前記走査ユニットが、前記第２の画像から決定された前記１つ又は複数の局所密度のうちの前記１つに基づいて計算された前記１つ又は複数の局所放射照度を使用して前記サンプルを走査するようにさらに構成される、装置。

【請求項4】

前記計算ユニットが、局所放射照度値が蛍光分子の局所密度値と関連付けられるルックアップテーブルに基づいて、前記１つ又は複数の局所放射照度を計算するように構成される、請求項１～３のいずれか一項に記載の装置。

【請求項5】

前記走査ユニットが、前記光ビームの直径を変化させることによって、その前記局所放射照度を変化させるためのズーム（１２４）を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の装置。

【請求項6】

前記決定ユニットが、前記光ビームの軌道を決定するように構成され、前記走査ユニットが、前記軌道に基づいて前記サンプルを走査するように構成され、前記軌道が、前記単一蛍光分子を含む前記サンプルの領域（２１２ａ、２１４ａ、２１６ａ）を含み、前記単一蛍光分子を含まない前記サンプルの領域（２１８ａ）を避ける、請求項１～５のいずれか一項に記載の装置。

【請求項7】

単一分子局在化顕微鏡法を使用して、サンプル（１０２）に含まれる単一蛍光分子を局在化するための方法（３００）であって、
ａ） 既定の放射照度を有する第１の波長の光ビーム（１２６）を使用して前記サンプルを走査することであって、前記第１の波長が、前記蛍光分子の励起波長である、走査することと、
ｂ） 第２の波長で第１の画像（１１０ａ）を取得することであって、前記第２の波長が、前記蛍光分子の発光波長である、取得することと、
ｃ） 前記第１の画像に基づいて、前記単一蛍光分子の１つ又は複数の局所密度を決定することと、
ｄ） 前記単一蛍光分子の前記１つ又は複数の局所密度の各々の既定の関数として、前記光ビームの１つ又は複数の局所放射照度を計算することと、
ｄ） 前記光ビームの前記１つ又は複数の局所放射照度を使用して前記サンプルを走査することと、
ｆ） 前記第２の波長で第２の画像（１１０ｂ）を取得することと、
ｇ） 前記第２の画像において前記単一蛍光分子を局在化することと
を含む、方法（３００）。

【請求項8】

前記光ビームの前記１つ又は複数の局所放射照度を、所定のタイムフレームにおいて所定の焦点体積内で、平均して、前記単一蛍光分子のうちの１つしか発光しないように適応させる、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記ステップｃ）～ｇ）が、逐次的に複数回実行され、前記第２の画像が、ステップｃ）の前記第１の画像になり、逐次的な第２の画像が、前記ステップが実行される逐次時間ごとに得られ、前記プロセスが、前記第２の画像から決定された前記１つ又は複数の局所密度のうちの前記１つに基づいて計算された前記１つ又は複数の局所放射照度を使用して前記サンプルを走査することをさらに含む、請求項７又は８に記載の方法。

【請求項10】

前記１つ又は複数の局所放射照度が、局所放射照度値が蛍光分子の局所密度値と関連付けられるルックアップテーブルに基づいて計算される、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記光ビームの前記１つ又は複数の局所放射照度を使用して前記サンプルを走査することが、前記光ビームの直径を変化させることによって、その前記局所放射照度を変化させることを含む、請求項７～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記光ビームの軌道を決定することと、前記軌道に基づいて前記サンプルを走査することとを含む、請求項７～１１のいずれか一項に記載の方法であって、前記軌道が、前記単一蛍光分子を含む前記サンプルの領域（２１２ａ、２１４ａ、２１６ａ）を含み、前記単一蛍光分子を含まない前記サンプルの領域（２１８ａ）を避ける、方法。

【請求項13】

前記第２の画像及び前記逐次的な第２の画像の各々における前記単一蛍光分子の前記局在化に基づいて、前記単一蛍光分子の最終的な画像（１５０）を再構築することをさらに含む、請求項９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、単一分子局在化顕微鏡法を使用して、単一蛍光分子を局在化するための方法及び装置に関する。

【背景技術】

【0002】

単一分子局在化顕微鏡法（ＳＭＬＭ）は、単一蛍光分子の発光を達成するための分子の確率的発光の遅延に基づく。蛍光分子を含むサンプルは、観察顕微鏡の焦点体積内に、平均して、１回あたり１つの活性分子（発光分子）しか存在しないように調節された放射照度を使用して照射される。ＳＭＬＭによって取得された画像には、点拡がり関数（ＰＳＦ）と呼ばれる画像スポットが存在し、各スポットは、分子の画像を表す。このＰＳＦからは、アルゴリズムを使用してスポットの中心を決定することによって分子の位置を測定することが可能である。この位置は、顕微鏡の回折限界分解能をはるかに上回る精度で決定することができる。この確率的プロセスは、高空間分解能（最高で１０ｎｍ）の最終的な超解像画像を得るために、何万もの画像に対して繰り返される。例えば、Ｌｅｌｅｋ等^１は、異なるタイプの分子標識、ＰＳＦの位置の決定及びＰＳＦの局在化から超解像画像を再構築するためのプロセスなど、ＳＭＬＭの基本原理について説明している。

【0003】

それに加えて、Ｍａｉｌｆｅｒｔ等^２は、ＰＳＦを決定するために使用されるアルゴリズムについて開示している。具体的には、Ｍａｉｌｆｅｒｔ等は、高密度の蛍光分子を有するサンプルに対して、より高い空間分解能を得るように最適化されたアルゴリズムに関するものである。具体的には、アルゴリズムは、超解像画像を再構築する際に不正確な局在化をフィルタリングできるように、各蛍光分子に対する検出の確率及びその局在化の不確かさを評価する。

【0004】

しかし、高空間分解能は分子検出に依存し、その分子検出は単一蛍光分子の密度に依存する。具体的には、密度が高いほど、分子の検出及び局在化が難しくなり、画質も低下する（サンプルドリフト及びオーバーラップＰＳＦなどのアーチファクトに起因する）。それに対して、単一蛍光分子の密度が低いほど、空間分解能が高くなる。

【0005】

さらに、大部分のＳＭＬＭ技法は、サンプルに照射するために、ガウス形状照明を使用する。しかし、ガウス形状照明は、不均一な励起を提供し、利用可能な視野を制限する。Ｍａｕ等^３は、均一な照明を達成するための方法について開示している。そのシステムは、ＡＳＴＥＲ（調節可能な励起領域の適応走査）と呼ばれており、ガウスビームを有するレーザ源を含むものである。ガウスビームは、サンプル面における照明を制御するために、２つのガルバノ走査ミラーにおいて集光される。励起ビームは、後方焦点面においてその位置を維持するが、ガルバノメータの角度回転により、後方焦点面に同様の角度が生じ、それに相当して、サンプル面における位置が異なるようになる。ラスター走査などの特定のパターンを適用することにより、ＡＳＴＥＲシステムは、調節可能な視野における均一な励起を提供することができる。Ｍａｕ等のシステムは、不均一な励起を提供する従来のガウス形状照明を使用するシステムと比較して、より高い精度のＰＳＦ中心の決定、より広い視野及びより優れた効率を可能にする。

【0006】

しかし、大部分の生体サンプルは、不均一な密度の分子を含む。従って、Ｍａｕ等において使用されるシステムなどの均一な照明を使用することにより、サンプルの特定の領域では高空間分解能が得られる一方で、同じサンプルの他の領域では低空間分解能が得られる可能性がある。例えば、高密度の蛍光分子を有するサンプル領域は、低密度の蛍光分子を有する領域よりアーチファクトが多くなり得る。

【0007】

Ｍａｉｌｆｅｒｔ等において開示されるように、密度に従って局在化を適応させ、高い分子密度を有するサンプルのＰＳＦ中心を決定するためのアルゴリズムが開発されている。しかし、密度に従って局在化を適応させるアルゴリズムから得られる空間分解能は、低密度の場合と比べて、高密度の場合の方がまだ低い。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｌｅｌｅｋ ｅｔ．ａｌ，Ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｅｔｈｏｄ Ｐｒｉｍｅｒｓ，ｖｏｌ．１，３９，２０２１

【非特許文献2】Ｍａｉｌｆｅｒｔ ｅｔ．ａｌ，Ａ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｈｉｇｈ－Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｎａｎｏｓｃｏｐｙ Ｓｔｕｄｙ Ｌｅａｄｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ＵＮＬＯＣ，ｖｏｌ．１１３，３，２０１８

【非特許文献3】Ｍａｕ ｅｔ．ａｌ，Ｆａｓｔ ｗｉｄｅｆｉｅｌｄ ｓｃａｎ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｔｕｎａｂｌｅ ａｎｄ ｕｎｉｆｏｒｍ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｓｕｐｅｒ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｏｎ ｌａｒｇｅ ｆｉｅｌｄｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，ｖｏｌ．１２，３０７７，２０２１

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

これらの問題は、特許請求される装置及び方法によって解決又は軽減される。

【0010】

均一な照明の使用及び単一蛍光分子の局在化のための最適化アルゴリズムの使用の代わりに、本発明によれば、照射光ビームの放射照度をサンプルの蛍光分子の密度に適応させる。従って、低分子密度及び高分子密度領域を含むサンプルの場合、低密度領域の分子を局在化するために使用される放射照度は、高密度領域の分子を局在化するために使用される放射照度より低くなる。有利な実施形態によれば、照射光ビームの直径を変更することによって、放射照度を分子密度に適応させ、それにより、走査効率の最適化が可能になる。

【0011】

本発明の第１の態様は、単一分子局在化顕微鏡法を使用して、サンプルに含まれる単一蛍光分子を局在化するための装置であって、既定の放射照度を有する第１の波長の光ビームを使用してサンプルを走査するように構成された走査ユニットと、第２の波長で第１の画像及び第２の画像を取得するように構成された画像取得ユニットと、第２の画像において単一蛍光分子を局在化するように構成された局在化ユニットとを含み、第１の画像に基づいて、単一蛍光分子の１つ又は複数の局所密度を決定するように構成された決定ユニットと、単一蛍光分子の１つ又は複数の局所密度の各々の既定の関数として、光ビームの１つ又は複数の局所放射照度を計算するように構成された計算ユニットとを含み、走査ユニットが、光ビームの１つ又は複数の局所放射照度を使用してサンプルを走査するようにさらに構成されることを特徴とする、装置を提供する。

【0012】

任意選択により、光ビームの１つ又は複数の局所放射照度を、所定のタイムフレームにおいて所定の焦点体積内で、平均して、単一蛍光分子のうちの１つしか発光しないように適応させる。

【0013】

任意選択により、装置は、単一蛍光分子を局在化するための一連の逐次プロセスを実行するように構成され、逐次プロセスの各々に対して、第２の画像は、逐次プロセスの第１の画像になる。

【0014】

任意選択により、計算ユニットは、局所放射照度値が蛍光分子の局所密度値と関連付けられるルックアップテーブルに基づいて、１つ又は複数の局所放射照度を計算するように構成される。

【0015】

任意選択により、走査ユニットは、光ビームの直径を変化させることによって、その局所放射照度を変化させるためのズームを含む。

【0016】

任意選択により、決定ユニットは、光ビームの軌道を決定するように構成され、走査ユニットは、その軌道に基づいてサンプルを走査するように構成され、その軌道は、単一蛍光分子を含むサンプルの領域を含み、単一蛍光分子を含まないサンプルの領域を避ける。

【0017】

本発明の第２の態様は、単一分子局在化顕微鏡法を使用して、サンプルに含まれる単一蛍光分子を局在化するための方法であって、ａ）既定の放射照度を有する第１の波長の光ビームを使用してサンプルを走査することであって、上記第１の波長が、上記蛍光分子の励起波長である、走査することと、ｂ）第２の波長で第１の画像を取得することであって、上記第２の波長が、上記蛍光分子の発光波長である、取得することと、第１の画像に基づいて、単一蛍光分子の１つ又は複数の局所密度を決定することと、ｄ）単一蛍光分子の１つ又は複数の局所密度の各々の既定の関数として、光ビームの１つ又は複数の局所放射照度を計算することと、ｄ）光ビームの１つ又は複数の局所放射照度を使用してサンプルを走査することと、ｆ）第２の波長で第２の画像を取得することと、ｇ）第２の画像において単一蛍光分子を局在化することとを含む、方法を提供する。

【0018】

任意選択により、光ビームの１つ又は複数の局所放射照度を、所定のタイムフレームにおいて所定の焦点体積内で、平均して、単一蛍光分子のうちの１つしか発光しないように適応させる。

【0019】

任意選択により、ステップｃ）～ｇ）は、逐次的に複数回実行され、第２の画像は、ステップｃ）の第１の画像になり、逐次的な第２の画像は、ステップが実行される逐次時間ごとに得られる。

【0020】

任意選択により、１つ又は複数の局所放射照度は、局所放射照度値が蛍光分子の局所密度値と関連付けられるルックアップテーブルに基づいて計算される。

【0021】

任意選択により、光ビームの１つ又は複数の局所放射照度を使用してサンプルを走査することは、光ビームの直径を変化させることによって、その局所放射照度を変化させることを含む。

【0022】

任意選択により、方法は、光ビームの軌道を決定することと、その軌道に基づいてサンプルを走査することとを含み、その軌道は、単一蛍光分子を含むサンプルの領域を含み、単一蛍光分子を含まないサンプルの領域を避ける。

【0023】

任意選択により、方法は、第２の画像及び逐次的な第２の画像の各々における単一蛍光分子の局在化に基づいて、単一蛍光分子の最終的な画像を再構築することをさらに含む。

【0024】

ここでは、添付の図面を参照して、本発明の実施形態について説明する。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】一例による、蛍光分子の状態図である。

【図2】一例による、単一蛍光分子を局在化するための装置の概略図である。

【図3a】一例による、蛍光分子の画像である。

【図3b】一例による、放射照度マッピングの画像である。

【図4】一例による、単一蛍光分子を局在化するための方法のフロー図である。

【発明を実施するための形態】

【0026】

図１に示されるように、蛍光分子は、最初に基底状態Ｓ_０（通常、一重項）にある。それらの蛍光分子は、励起波長で光子を吸収し、励起状態Ｓ_１（一重項多重度）に達し得る。次いで、励起分子は、蛍光光子を放出することによって、又ははるかに低い確率で、比較的長い時間（数ミリ秒～数秒程度）とどまる「暗」三重項状態Ｔへの非放射遷移を経ることによって、その基底状態に戻ることができる。暗状態から基底状態への復帰は、光によって加速することができる。

【0027】

蛍光分子で標識されたサンプルに励起波長で照射すると、そのサンプルは、最初に、強蛍光放射を放出する。しかし、しばらくすると、すべての分子は、暗状態に事実上「閉じ込められる」延いては「オフになる」。その時点では、蛍光発光は断続的にしか起こらず（「明滅する」）、一部の分子は基底状態に戻り、再び発光した（「オン」になった）後に、再びオフになる。

【0028】

ＳＭＬＭでは、画像取得は、初期の激しい発光を伴う一次的な段階の後、この明滅レジームで実行される。

【0029】

本発明及びＡＳＴＥＲ技法によれば、照射ビームは走査されるため、サンプルの所定の領域が照射されるのは、ほんの短い時間（５０μｓ～５００μｓ）である。明滅レジームを達成するには、十分な数の光子が照明時間内にサンプルの領域に到達しなければならず、従って、放射照度は十分に高くなければならない。この光子の数（又は同等に、放射照度値）は、サンプルの領域内の蛍光分子の数に依存する。放射照度が低過ぎる場合は、すべての分子をオフにするほどの十分な光子は存在せず、単一分子状態は達成されない。しかし、より少ない蛍光分子を含むサンプルの領域では、この同じ放射照度で十分であり得る。本発明の方法では、蛍光分子の不均質な密度にもかかわらず、サンプル全体にわたる最適分解能を達成するため、放射照度を局所分子密度に適応させる。

【0030】

図２は、一例による、単一分子局在化顕微鏡法（ＳＭＬＭ）を使用して、サンプル１０２に含まれる単一蛍光分子を局在化するための装置１００の概略図である。

【0031】

サンプル１０２は、例えば、蛍光標識された分子を含む細胞（ニューロンなど）又は組織サンプルで作られたものであり得る。例えば、蛍光分子は、ＳＭＬＭ蛍光色素分子（光応答性、光活性化、光変換、自発的に明滅する又は一時的に明滅する蛍光色素分子など）を使用して標識されたものであり得る。そうすれば、一度標識された蛍光分子は、照明下において、その発光状態がオンとオフとの間で可逆的に遷移する（すなわち、明滅する）。一般に、蛍光分子を含むサンプルは、不均質な密度の蛍光分子を有する。従って、サンプル１０２の特定の領域が高密度の蛍光分子を有する一方で、他の領域は低密度の蛍光分子を有し得る。それに加えて又はその代替として、他の領域は、蛍光分子がない場合がある。

【0032】

図２に示されるように、装置１００は、走査ユニット１０４、画像取得ユニット１０８、決定ユニット１１２、計算ユニット１１４及び局在化ユニット１１６を含む。決定ユニット１１２、計算ユニット１１４及び局在化ユニット１１６の各々は、ハードウェア、ソフトウェア及び／又はそれらの組合せを使用して実装することができる。例えば、ハードウェアデバイスは、これらに限定されないが、プロセッサ、中央処理ユニット（ＣＰＵ）、コントローラ、算数論理ユニット（ＡＬＵ）、デジタル信号プロセッサ、マイクロコンピュータ、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、システムオンチップ（ＳｏＣ）、プログラマブル論理ユニット、マイクロプロセッサ、又は定義された方法で命令に対する応答及び実行が可能な他の任意のデバイスなど、処理回路を使用して実装することができる。ソフトウェアは、要望通りに動作するようにハードウェアデバイスに独立して又は集合的に指示するか又は構成するための、コンピュータプログラム、プログラムコード、命令又はそれらのいくつかの組合せを含み得る。コンピュータプログラム及び／又はプログラムコードは、上記で言及されるハードウェアデバイスの１つ又は複数などの１つ又は複数のハードウェアデバイスによって実施することができる、プログラム若しくはコンピュータ可読命令、ソフトウェアコンポーネント、ソフトウェアモジュール、データファイル、データ構造及び／又は同様のものを含み得る。ハードウェアデバイスがコンピュータ処理デバイス（例えば、ＣＰＵ、コントローラ、ＡＬＵ、デジタル信号プロセッサ、マイクロコンピュータ、マイクロプロセッサなど）である場合は、コンピュータ処理デバイスは、プログラムコードに従って算術演算、論理演算及び入力／出力演算を実行することによってプログラムコードを実行するように構成することができる。また、各ユニットは、１つ又は複数の記憶装置も含み得る。１つ又は複数の記憶装置は、データの格納及び記録が可能な、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、永久大容量記憶装置（ディスクドライブなど）、ソリッドステート（例えば、ＮＡＮＤフラッシュ）デバイス、及び／又は他の任意の同様のデータ記憶メカニズムなど、有形の又は非一時的なコンピュータ可読記憶媒体であり得る。１つ又は複数の記憶装置は、１つ若しくは複数のオペレーティングシステムのため及び／又は本明細書で説明される例示的な実施形態を実施するための、コンピュータプログラム、プログラムコード、命令又はそれらのいくつかの組合せを格納するように構成することができる。コンピュータプログラム、プログラムコード、命令又はそれらのいくつかの組合せは、駆動メカニズムを使用して、別個のコンピュータ可読記憶媒体から１つ若しくは複数の記憶装置及び／又は１つ若しくは複数のコンピュータ処理デバイスにロードすることもできる。そのような別個のコンピュータ可読記憶媒体は、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）フラッシュドライブ、メモリスティック、ブルーレイ／ＤＶＤ／ＣＤ－ＲＯＭドライブ、メモリカード及び／又は他の同様のコンピュータ可読記憶媒体を含み得る。

【0033】

或いは、決定ユニット１１２、計算ユニット１１４及び局在化ユニット１１６の２つ以上のユニットは、同じハードウェア及び／又はソフトウェアによって実装することができる。例えば、以下で説明される機能を実行するために各ユニットに命令を提供することができる単一のコンピュータ記憶媒体によって、決定ユニット１１２、計算ユニット１１４及び局在化ユニット１１６のすべてを実装することができる。

【0034】

走査ユニット１０４は、既定の放射照度を有する第１の波長の光ビーム１２６を使用してサンプル１０２を走査するように構成される。一例では、走査ユニットは、Ｍａｕ等において開示される調節可能な励起領域の適応走査（ＡＳＴＥＲ）システムであり得る。ＡＳＴＥＲシステム１０４は、ガウスビームを使用しながら、均一な励起が得られるようにする。

【0035】

図２に示されるように、ＡＳＴＥＲシステム１０４は、ガウス形状照明プロファイルを有する光ビーム１２６を放出するレーザ１２０を含む。レーザは、サンプル１０２に含まれる分子を標識するために使用された蛍光色素分子の励起波長に相当する第１の波長で放出する。例えば、レーザ１２０は、６３８ｎｍで放出するダイオード励起固体レーザであり得る。レーザ１２０の励起波長を選択するために、励起フィルタ１３２が使用される。この例では、ＡＳＴＥＲシステム１０４は、システムの実用性とコンパクト性のために、複数のミラーを含む。さらに、ＡＳＴＥＲシステム１０４は、光ビーム１２６の直径を変更するための光学ズームとして使用することができる可変アフォーカルシステム１６０を含む。可変アフォーカルシステム１６０の詳細については、図２の挿入図１６０ａに示されている。可変アフォーカルシステム１６０は、－２８ｍｍ～２８ｍｍで変化し得る焦点距離を有する２つの可変焦点液体レンズ１７０ａ、１７０ｂと、１００ｍｍの焦点距離ｆ’_３を有する１つの固定正レンズ１７１とを含む。レンズ１７０ａ、１７０ｂの焦点距離ｆ’_１、ｆ’_２を変更することにより、光ビーム１２６の直径を変化させ、光ビーム１２６の初期の直径の０．１～１０倍の直径を得ることができる。

【0036】

それに加えて、ＡＳＴＥＲシステム１０４は、対物レンズ１４４を含む顕微鏡１４０を含む。また、顕微鏡１０４は、光ビーム１２６が顕微鏡１４４の対物レンズ１４４の後方焦点面１４２において集光されるように、２００ｍｍの焦点距離を有するチューブレンズ１７７も含む。顕微鏡１４０は、例えば、倒立顕微鏡であり得る。顕微鏡は、ＡＳＴＥＲシステム１０４（すなわち、走査ユニット１０４）と以下で説明される画像取得ユニット１０８の両方の一部であり得る。サンプル１０２は、顕微鏡１４２のカバースリップ上に置かれる。

【0037】

さらに、ＡＳＴＥＲシステム１０４は、ガルバノ走査ミラー１２２を含む。ガルバノ走査ミラー１２２は、波形発生器（図示せず）によって制御される。図２には、表現を簡単にするために、ガルバノ走査ミラー１２２が１つだけ示されているが、実際には、２つのガルバノ走査ミラー１２２が使用される。顕微鏡１４０の対物レンズ１４４の後方焦点面１４２と共役な面に配置された２つのガルバノ走査ミラー１２２の間では、ガウス光ビーム１２６（図２に示されるように、不均一な励起を提供する）を集光するため、１００ｍｍの焦点距離を有するレンズ１７２が使用される。具体的には、ガルバノ走査ミラー１２２に適用される角度シフトは、対物レンズ１４４の後方焦点面１４２にも同様の角度シフトを引き起こし、サンプル１０２面における光ビーム１２６の位置シフトを引き起こす。１００ｍｍの焦点距離を有するレンズ１７３は、２つのガルバノ走査ミラー１２２の後に配置される。この構成により、大きなＸ－Ｙエリアを走査するためのコリメートビームを得ることができる。対物レンズ１４４の後方焦点面１４２において光ビーム１２６を集光した後、サンプル１０２における時間的に平均されたフラットトップ励起プロファイルが得られる（図２に示されるように）。従って、ラスター走査又はアルキメデスの螺旋など、定義されたパターンでのガウス光ビーム１２６によるサンプル１０２の高速走査は、全体的に均質な照明を生み出す。

【0038】

さらに、ＡＳＴＥＲシステム１０４は、並進ステージ１３０を含み、並進ステージ１３０は、電動並進ステージなどであり、誘電体ミラー１８０を含む。光ビーム１２６を拡大するため、各々が誘電体ミラー１８０のそれぞれの側に配置される、－５０ｍｍ及び２００ｍｍのそれぞれの焦点距離を有する２つの固定レンズ１７４、１７５が使用される。並進ステージ１３０は、顕微鏡１４０の対物レンズ１４４の後方焦点面１４２における光ビーム１２６の極角の変更を可能にする。従って、並進ステージ１３０は、落射蛍光励起から斜光及び全内部反射蛍光励起に変更するために使用することができ、それらは、ＳＭＬＭでサンプルを研究するために使用される異なるスキームであり、それぞれ異なる極角を使用している。

【0039】

上記で示されるように、ＡＳＴＥＲシステム１０４は、既定の放射照度を有する第１の波長の光ビーム１２６を使用してサンプル１０２を走査するように構成される。蛍光分子のフォトブリーチングを最小限に抑えるため、既定の放射照度は、低放射照度であり得る。例えば、既定の放射照度は、ユーザによって、蛍光分子の推定平均密度に基づいて決定することができる。或いは、既定の放射照度は、蛍光分子の推定平均密度並びに／或いは分子及び／又は蛍光色素分子のタイプと関連付けられた放射照度値を含むルックアップテーブルから抽出することができる。

【0040】

装置１００の画像取得ユニット１０８は、第２の波長で第１の画像１１０ａを取得するように構成される。上記で説明されるように、照明下において、蛍光分子は、励起状態に達し、次いで、蛍光光子を放出することによってその基底状態に戻り、その後、再び励起状態になる。或いは、蛍光分子を走査している際、蛍光分子は、放射を放出することなく暗状態に達し得る。高密度領域で単一分子状態であるには、大部分の分子が「オフ」になる（すなわち、暗状態に閉じ込められる）必要がある。従って、画像取得ユニット１０８は、大部分の蛍光分子が「オフ」である際に画像を取得するように構成される。三重項状態に達する確率は基底状態に達する確率より低いため、走査開始と画像取得との間には遅延がある。遅延は、数百ミリ秒～数秒の範囲である。それに加えて、照明下である程度の時間が経過した後、蛍光分子は、再び励起状態に達する。従って、画像取得ユニット１０８は、大部分の蛍光分子が「オン」に戻る前に画像を取得する。それに加えて、走査ユニット１０４は、蛍光分子が「オン」に戻る前にサンプルの別のエリアを走査する。従って、走査ユニット１０４は、約５０μｓ～５００μｓの時間範囲でサンプルの領域を走査する。

【0041】

画像取得ユニット１０８は、ダイクロイックミラー１０６を含み、ダイクロイックミラー１０６は、画像取得ユニット１０８によってサンプル１０２からの発光を収集できるように、励起波長（走査ユニット１０４から受信される）と発光波長（サンプル１０２から受信される）を分離するために使用される。画像取得ユニット１０８は、カメラ１２８（ｓＣＭＯＳカメラなど）を含み、カメラ１２８は、サンプル１０２が既定の放射照度で走査されている際に第１の画像１１０を取得する。また、画像取得ユニット１０８は、カメラ１２８において光ビーム１２６を集光するための、１８０ｍｍ又は２００ｍｍの焦点距離を有する固定レンズ１７６も含む。第２の波長は、サンプル１０２の分子を標識するために使用された蛍光色素分子の発光波長である。図３ａは、第１の画像１１０ａの例を示す。第１の画像１１０ａは、スポット又は点拡がり関数（ＰＳＦ）を提示しており、各ＰＳＦは、単一蛍光分子を表す。上記で示されるように、サンプル１０２は、不均質な密度の蛍光分子を提示し得る。図３ａは、サンプル１０２が、高密度領域２１２ａ、低密度領域２１４ａ、中間密度領域２１６ａ及び蛍光分子がない領域２１８ａを提示していることを示している。従って、サンプル１０２を走査するために単一の放射照度（事前に定義された放射照度）が使用されるため、サンプル１０２の各領域に対して放射照度が最適化されることはない。従って、第１の画像１１０ａは、オーバーラップＰＳＦを提示し、オーバーラップＰＳＦは、高密度の蛍光分子を有するサンプル１０２の領域において所定の焦点体積（すなわち、視野）内で所定のタイムフレームにおいて同時に発光している蛍光分子のクラスタである。

【0042】

装置１００の決定ユニット１１２は、第１の画像１１０ａに基づいて、単一蛍光分子の１つ又は複数の局所密度を決定するように構成される。具体的には、決定ユニット１１２は、第１の画像１１０ａに示されるように、サンプル１０２の各領域の密度を決定する。例えば、決定ユニット１１２は、第１の画像１１０ａにおける点の分布（ＰＦＳを表す）を決定する。一例では、決定ユニット１１２は、蛍光分子を含む領域である対象の領域（他の領域には蛍光分子がない）を決定することができる。例えば、図３ａに示されるように、ＰＳＦを含む（すなわち、ドットを示す）領域は、対象の領域であり、他の領域（すなわち、暗い領域）は、蛍光分子を含まない。決定ユニット１１２は、対象の領域のサブ領域の密度をさらに決定することができる。例えば、図３ａに示されるように、サブ領域２１２ａ、２１４ａ及び２１６ａは、第１の画像１１０ａの対象の領域のサブ領域であり、その各々は、高密度、低密度及び中間密度の蛍光分子をそれぞれ有する。サンプル１０２の各サブ領域の局所密度の決定に基づいて、決定ユニット１０２は、走査ユニット１０４の光ビーム１２６の軌道を決定することができる。例えば、軌道は、対象の領域のみを含み、且つ蛍光分子を含まない領域を避けるように決定することができる。例えば、軌道は、図３ａに示される領域２１８ａを避けるであろう。

【0043】

装置１００の計算ユニット１１４は、決定ユニット１１２によって決定された単一蛍光分子の１つ又は複数の局所密度の各々の既定の関数として、光ビーム１２６の１つ又は複数の局所放射照度を計算するように構成される。具体的には、計算ユニット１１４は、対象の領域の各サブ領域に対して決定ユニット１１２から決定された密度を受信し、サンプル１１２の各サブ領域（第１の画像１１０ａのサブ領域に相当する）を走査するために使用することができる関連放射照度値を計算することができる。例えば、計算ユニット１１２は、局所放射照度値が蛍光分子の局所密度値と関連付けられるルックアップテーブルに基づいて、各サブ領域の放射照度を計算することができる。或いは、計算ユニットは、各サブ領域の放射照度を計算するために、分析関数を使用することができる。そうすれば、低密度の蛍光分子を有するサブ領域に対して、低放射照度が計算される。同様に、高密度の蛍光分子を有するサブ領域に対して、高放射照度が計算され、中間密度の蛍光分子を有するサブ領域に対して、中間放射照度が計算される。例えば、計算ユニット１１２は、図３ａに示されるサブ領域２１２ａに対して高放射照度を計算し、サブ領域２１６ａに対して中間放射照度を計算し、サブ領域２１４ａに対して低放射照度を計算する。

【0044】

次いで、走査ユニット１０４は、最適化された走査設定を使用することによって、すなわち、計算ユニット１１４によって計算された局所放射照度に基づいて、好ましくは、決定ユニット１１２によって決定された軌道に基づいて、サンプル１０２を走査することができる。具体的には、走査時間を最適化するため、走査ユニット１０４は、サンプル１０２の各サブ領域と関連付けられた放射照度を使用しながら、対象の領域のみを走査する（そして、蛍光分子がない領域を避ける）。具体的には、光ビーム１２６の直径は放射照度が低いほど大きいため、小さな光ビーム１２６を使用する際は、より大きなエリアを走査することが可能である。従って、低密度の蛍光分子を有するサブ領域に対して、走査ユニット１０４は、走査ユニット１０４によって計算された低放射照度でサンプル１０２を走査する。同様に、高密度の蛍光分子を有するサブ領域に対して、走査ユニット１０４は、高放射照度でサンプル１０２を走査し、中間密度の蛍光分子を有するサブ領域に対して、走査ユニット１０４は、中間放射照度でサンプル１０２を走査する。

【0045】

サンプル１０２を走査するための放射照度を変化させるため、走査ユニット１０４は、光ビーム１２６の直径を変化させる。上記で示されるように、ＡＳＴＥＲシステム１０４は、光ビーム１２６の直径を変更するように構成された可変アフォーカルシステム１６０を含む。放射照度を上げるため、可変アフォーカルシステム１６０を使用して、光ビーム１２６の直径を小さくし、放射照度を下げるため、可変アフォーカルシステム１６０を使用して、光ビーム１２６の直径を大きくする。例えば、図３ｂは、サンプル１０２を走査するために使用された放射照度マッピング２２０を示し、放射照度は、図３ａの第１の画像１１０ａに基づいて決定されている。高密度の蛍光分子を有するサブ領域２１２ａを走査するために、小さな直径の光ビーム１２６が使用され、低密度の蛍光分子を有する領域２１４ａを走査するために、小さな直径の光ビーム１２６が使用され、中間密度の蛍光分子を有するサブ領域２１６ａを走査するために、中間サイズの直径の光ビーム１２６が使用される。

【0046】

最適化された走査設定（すなわち、最適化された放射照度及び軌道）を使用してサンプルを走査している間、画像取得ユニット１０８は、次に、第２の画像１１０ｂを取得することができる。第２の画像は、第２の波長で取得される。第１の画像１１０ａと同様に、第２の画像もＰＳＦを提示する。しかし、放射照度をサンプル１０２の各サブ領域の密度に適応させたため、第２の画像は、第１の画像１１０ａより少ないオーバーラップＰＳＦを提示する。言い換えれば、単一蛍光分子状態が達成されている。具体的には、走査ユニット１０４の放射照度を各サブ領域の蛍光分子の密度に適応させることにより、同時に発光している蛍光分子のクラスタを避けることができ、所定の時間に焦点体積内で発光する単一蛍光分子を得ることが可能である。それに加えて、低密度の蛍光分子を有する領域を走査するために大きな光ビーム１２６を使用することのみならず、対象の領域のみを走査し、蛍光分子がない領域を避けることにより、走査効率を高めることが可能である。

【0047】

装置１００の局在化ユニット１１６は、第２の画像において単一蛍光分子を局在化するように構成される。局在化ユニット１１６は、単一蛍光分子を局在化するために第２の画像の各ＰＳＦに対する強度プロファイルを抽出するコンピュータプログラムであり得る。局在化ユニット１１６は、各ＰＳＦの強度プロファイルから単一蛍光分子の局在化を決定するために、ｖｏｎ Ｄｉｅｚｍａｎｎ^４において説明される単一分子局在化方法を使用することができる。具体的には、局在化ユニット１１６は、第２の画像のＰＳＦを分析することができ、第２の画像は、各強度プロファイルにガウスモデルを当てはめ、各蛍光分子の中心の推定値を計算するためのものである。第２の画像は単一分子状態で取得されるため、第２の画像は、高密度の蛍光分子を有する領域でさえ、オーバーラップＰＳＦを提示しない。従って、ＰＳＦを正確に局在化することが可能である。

【0048】

超解像の最終的な画像を得るため、上記で説明される装置１００によって実行されるプロセスは、複数回繰り返すことができる。例えば、プロセスは、数千又は数万回実行することができる。しかし、フォトブリーチングにより、蛍光分子の密度の変動が生じる（蛍光分子を標識するために使用される蛍光色素分子が変化し、それにより、蛍光の退色や蛍光の永久的な消失が生じることに起因する）。従って、プロセスを繰り返す際、上記で説明される装置１００のプロセスが繰り返される度に放射照度を適応させることが必要であり得る。放射照度を適応させるため、第２の画像１１０ｂを第１の画像１１０ａとして使用することによって、逐次プロセスの各々が実行される。具体的には、決定ユニット１１２は、第２の画像１１０ｂに基づいて、単一蛍光分子の局所密度を決定する。次いで、計算ユニット１１４は、第２の画像１１０ｂに基づいて決定された蛍光分子の各局所密度の既定の関数として、走査ユニット１０４の光ビーム１２６の局所放射照度を計算する。さらに、走査ユニット１０４は、第２の画像１１０ｂに基づいて決定された蛍光分子の局所密度に対応する放射照度を使用して、サンプル１０２を走査する。最後に、取得ユニット１０８によって、第３の画像が取得され、局在化ユニット１１６によって、第３の画像において単一蛍光分子が局在化される。逐次プロセスは、第３の画像を使用して第４の画像において蛍光分子を局在化することによってなど、以下同様に、繰り返すことができる。従って、単一蛍光分子を局在化するために、サンプル１０２の数千又は数万の画像が取得され得る。次いで、単一蛍光分子の超解像画像１５０として、局在化をレンダリングすることができる。例えば、局在化ユニットは、第２の画像１１０ｂ、第３の画像、第４の画像．．．第１０００の画像においてなど、単一蛍光分子を局在化するソフトウェアによって実装することができる。ソフトウェアは、局在化の精度と同様のビンサイズで定義されたグリッドを有し得る。各ビンでは、局在化がカウントされてピクセル強度に変換され、そこから超解像画像１５０が再構築される。

【0049】

有利には、上記で説明される反復プロセスにより、第１の画像の取得後のみならず、各走査の後に、放射照度の調整が可能になる。具体的には、放射照度は、新しい画像が取得される度に適応させることができる。そうすれば、新しい画像が取得される度に密度が推定されるため、ＰＳＦの局在化の精度を向上することができる。分子が同時に発光することはないため、密度を数回測定し、放射照度を適応させることで、ＰＳＦの局在化の最適化が保証される。言い換えれば、逐次プロセスを使用することにより、密度の決定がより正確になり、従って、局在化を最適化することができる。

【0050】

別の例では、走査時間は、計算ユニット１１４は、単一蛍光分子の１つ又は複数の局所密度の各々の既定の関数として走査時間を計算するようにさらに構成される。従って、局所密度と関連付けられた計算された放射照度の各々に対して、走査時間を関連付けることができる。結果的に、走査ユニットは、計算された走査時間を使用してサンプルを走査するようにさらに構成することができ、各走査時間は、各局所密度に対する放射照度と関連付けられる。具体的には、密度が高いほど、走査時間が短くなり得る。逆に、密度が小さいほど、走査時間が長くなる。例えば、低密度の分子を有する局所エリアの場合、これらのエリアを走査するために低放射照度が使用される。分子が「オン」になるまでに時間がかかるため、走査時間は長くなり得る。それに対して、密度が大きいほど、サンプル中の分子の数が多くなるため、分子が「オン」になるまでにかかる時間は短くなり得る。言い換えれば、同じ走査時間に対して、高密度の場合は、発光する分子を有する確率は、低密度の場合よりも高くなる。

【0051】

上記では、装置１００は、走査ユニット１０４としてＡＳＴＥＲシステムを用いるものと示され、説明されているが、本発明は、開示される走査ユニット１０４に限定されない。特許請求される発明の保護の範囲を逸脱しない範囲で、他の走査ユニットを使用することができる。

【0052】

図４は、単一分子局在化顕微鏡法を使用して、サンプル１０２に含まれる単一蛍光分子を局在化するための方法３００を描写するフロー図である。例えば、方法３００は、図２を参照して上記で説明される装置１００によって実施することができる。

【0053】

ブロック３０２では、既定の放射照度を有する第１の波長の光ビーム１２６を使用してサンプル１０２が走査され、第１の波長は、蛍光分子の励起波長である。一例では、サンプル１０２は、図２を参照して説明されるＡＳＴＥＲシステム１０４によって走査される。

【0054】

ブロック３０４では、第１の画像１１０ａが第２の波長で取得され、第２の波長は、蛍光分子の発光波長である。第１の画像１１０ａは、サンプル１０２が第１の波長で走査されている間に取得される。

【0055】

ブロック３０６では、第１の画像１１０ａに基づいて、単一蛍光分子の１つ又は複数の局所密度が決定される。例えば、サンプル１０２は、不均質な密度の蛍光分子を有し得、従って、第１の画像１１０ａは、高密度及び低密度の蛍光分子を有する領域並びに／或いは蛍光分子がない領域を提示し得る。一例では、光ビーム１２６の軌道を決定することができる。軌道は、単一蛍光分子を含むサンプル１０２の領域を含み、単一蛍光分子を含まないサンプル１０２の領域を避ける。

【0056】

ブロック３０８では、単一蛍光分子の１つ又は複数の局所密度の各々の既定の関数として、光ビーム１２６の１つ又は複数の局所放射照度が計算される。例えば、１つ又は複数の局所放射照度は、局所放射照度値が蛍光分子の局所密度値と関連付けられるルックアップテーブルに基づいて計算することができる。光ビーム１２６の１つ又は複数の局所放射照度は、所定のタイムフレームにおいて、平均して、蛍光分子のうちの１つしか発光しないように計算される（単一分子状態）。単一分子状態により、ＰＳＦのオーバーラップを防ぐことができる。

【0057】

ブロック３１０では、光ビーム１２６の計算された１つ又は複数の局所放射照度を使用してサンプル１０２が走査される。例えば、高密度の蛍光分子を有するサンプル１０２の領域は、計算された高放射照度を使用することによって走査され、低密度の蛍光分子を有するサンプル１０２の領域は、計算された低放射照度を使用することによって走査される。サンプル１０２は、決定された軌道に基づいて走査することができる。従って、蛍光分子を含むサンプル１０２の領域のみが走査される。それに加えて又はその代替として、１つ又は複数の局所放射照度は、光ビーム１２６の直径を変化させることによって得ることができる。

【0058】

ブロック３１２では、第２の画像１１０ｂが第２の波長で取得される。第２の画像１１０ｂは、光ビーム１２６の計算された１つ又は複数の局所放射照度を使用してサンプルを走査している間に取得される。放射照度は最適化されているため、第２の画像１１０ｂではオーバーラップＰＳＦは最小限に抑えられ、アーチファクトはほとんど見られない。

【0059】

ブロック３１４では、第２の画像において単一蛍光分子が局在化される。第２の画像１１０ｂは単一分子状態で取得されているため、高い精度で単一蛍光分子を局在化することが可能である。

【0060】

方法３００は、超解像画像を得るために、複数回実行することができる。しかし、フォトブリーチングにより、単一蛍光分子の密度の変動が生じる。従って、ブロック３０６～３１４のステップは、逐次的に複数回実行することができ、方法が繰り返される度に、第２の画像１１０ｂは、第１の画像１１０ａになり、単一蛍光分子が局在化する逐次的な第２の画像が得られる。それに加えて、第２の画像及び逐次的な第２の画像の各々における単一蛍光分子の局在化に基づいて、単一蛍光分子の最終的な画像を再構築することができる。

【0061】

図４に関する方法３００によれば、サンプル１０２を走査するために均一な照明を使用する代わりに、蛍光分子の密度に適応させた照明が使用される。結果的に、高密度領域でさえ、単一蛍光状態を達成することが可能である。従って、単一蛍光分子状態を達成することにより、走査効率を高めながら、アーチファクトの少ない画像を取得し、高い精度でＰＳＦを局在化することが可能である。

【0062】

本発明については、好ましい実施形態の助けを借りて詳細に示し、説明してきたが、本発明は、開示される例に限定されない。当業者であれば、特許請求される発明の保護の範囲を逸脱しない範囲で、他の変形形態を推論することができる。例えば、異なるレンズを異なる焦点距離で使用することができる。それに加えて、可変焦点レンズ（具体的には、可変焦点液体レンズ）は重要ではないが、高速ズームを得ることが可能になる。本発明の他の例では、可変減衰器を使用することによって又は光供給源を制御することによって、放射照度を変化させることができる。しかし、放射照度を変化させるためのこれらのさらなる方法は、走査時間を最適化することはできない。別の例では、蛍光分子を含むサンプルの領域のみを走査する代わりに、サンプル全体を走査することができる（例えば、ラスター走査を使用することによって）。さらに、蛍光分子は、図１に提示されるものより複雑なダイナミックスを示し得、例えば、光変換分子であり得る。

【図1】

【図2】

【図3a】

【図3b】

【図4】

【国際調査報告】