特表 2024-536837 ＰＤ－１とＩＬ－２１とを含む融合タンパク質二量体、及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-08

(54)【発明の名称】ＰＤ－１とＩＬ－２１とを含む融合タンパク質二量体、及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20241001BHJP

   C07K 14/54 20060101ALI20241001BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20241001BHJP

   C12N 15/24 20060101ALI20241001BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20241001BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20241001BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241001BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241001BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241001BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241001BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241001BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20241001BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20241001BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241001BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20241001BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00

C07K14/54 ZNA

C07K14/705

C12N15/24

C12N15/12

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K38/17

A61K38/20

A61P35/00

A61P37/04

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024518576

(86)(22)【出願日】2022-09-23

(85)【翻訳文提出日】2024-05-10

(86)【国際出願番号】 KR2022014297

(87)【国際公開番号】W WO2023048516

(87)【国際公開日】2023-03-30

(31)【優先権主張番号】10-2021-0126052

(32)【優先日】2021-09-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】524110425

【氏名又は名称】バイオンシステムズ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ソ ジョン－グン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA43

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA07

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084BA41

4C084CA53

4C084DA12

4C084DC50

4C084NA14

4C084ZB021

4C084ZB022

4C084ZB031

4C084ZB032

4C084ZB091

4C084ZB092

4C084ZB261

4C084ZB262

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA09

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA42

4H045DA02

4H045DA50

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、ＰＤ－１タンパク質とＩＬ－２１タンパク質とを含む融合タンパク質、及びその使用に関する。一実施形態において、ＰＤ－１と、ＩＬ－２１と、長期血清持続性Ｆｃとを含む融合タンパク質はＮＫ細胞等の免疫細胞を活性化し、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期を効果的に延長することができる。したがって、融合タンパク質を有効成分として含む医薬組成物は体内の免疫活性を増強するため、再発患者及び免疫チェックポイント阻害剤処置に奏効しない患者に対する抗癌剤として使用することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＰＤ－１タンパク質とＩＬ－２１タンパク質とを含む融合タンパク質。

【請求項2】

前記ＰＤ－１タンパク質と前記ＩＬ－２１タンパク質とは、リンカーを介して連結されている、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項3】

前記ＰＤ－１タンパク質は、配列番号２、配列番号２１、配列番号３４、又は配列番号１０３のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項4】

前記ＩＬ－２１タンパク質は、配列番号６又は配列番号２２のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項5】

前記リンカーは、免疫グロブリンのＦｃドメインである、請求項２に記載の融合タンパク質。

【請求項6】

前記Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメイン又はその変異体である、請求項５に記載の融合タンパク質。

【請求項7】

前記野生型Ｆｃドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の融合タンパク質。

【請求項8】

前記Ｆｃドメインの変異体は、配列番号１４のアミノ酸配列におけるＱ８１Ｒ、Ｍ１９８Ｌ、Ｌ７９Ｇ、Ｔ１３６Ｗ、Ｑ８１Ｒ／Ｍ１９８Ｌ、Ｌ７９Ｇ／Ｍ１９８Ｌ、又はＱ８１Ｒ／Ｔ１３６Ｗ／Ｍ１９８Ｌの置換を有する、請求項６に記載の融合タンパク質。

【請求項9】

前記Ｆｃドメインの変異体は、配列番号４、配列番号１０、配列番号５０、配列番号８７、配列番号９５、配列番号９９、配列番号１０４、配列番号１０８、配列番号１１２、又は配列番号１１６のアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の融合タンパク質。

【請求項10】

前記Ｆｃドメインの変異体は、前記野生型Ｆｃドメインと比較して延長した半減期を有する、請求項６に記載の融合タンパク質。

【請求項11】

前記融合タンパク質は、以下の構造式Ｉ又は構造式ＩＩ：
Ｎ’－Ａ－［Ｌ_１］ｎ－Ｆｃドメイン－［Ｌ_２］ｍ－Ｂ－Ｃ’ Ｉ
Ｎ’－Ｂ－［Ｌ_１］ｎ－Ｆｃドメイン－［Ｌ_２］ｍ－Ａ－Ｃ’ ＩＩ
（前記構造式Ｉ及び前記構造式ＩＩにおいて、
Ｎ’は、前記融合タンパク質のＮ末端であり、
Ｃ’は、前記融合タンパク質のＣ末端であり、
Ａは、前記ＰＤ－１タンパク質又はその断片であり、
Ｂは、前記ＩＬ－２１タンパク質又はその変異体であり、
Ｌ_１及びＬ_２は、ペプチドリンカーであり、かつ、
ｎ及びｍは、それぞれ独立して０又は１である）からなる、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項12】

Ｌ_１は、配列番号３又は配列番号３８のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーである、請求項１１に記載の融合タンパク質。

【請求項13】

Ｌ_２は、配列番号５、配列番号３９、又は配列番号５７のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーである、請求項１１に記載の融合タンパク質。

【請求項14】

前記融合タンパク質は、前記構造式Ｉからなる、請求項１１に記載の融合タンパク質。

【請求項15】

前記融合タンパク質は、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３２、配列番号３６、配列番号４１、配列番号４４、配列番号５２、配列番号５５、配列番号７６、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８９、配列番号９２、配列番号９７、配列番号１０１、配列番号１０６、配列番号１１０、配列番号１１４、又は配列番号１１８のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項16】

請求項１～１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質が２つ互いに結びついた融合タンパク質二量体。

【請求項17】

前記融合タンパク質二量体は、ホモ二量体である、請求項１６に記載の融合タンパク質二量体。

【請求項18】

請求項１～１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。

【請求項19】

前記ポリヌクレオチドは、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４２、配列番号４５、配列番号５３、配列番号５６、配列番号７７、配列番号８０、配列番号８３、配列番号９０、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０２、配列番号１０７、配列番号１１１、配列番号１１５、又は配列番号１１９のヌクレオチド配列に対して８５％以上の配列同一性を有する、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。

【請求項20】

請求項１８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項21】

請求項２０に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。

【請求項22】

請求項１～１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質又は請求項１６若しくは１７に記載の融合タンパク質二量体を有効成分として含む、癌を未然防止又は処置する医薬組成物。

【請求項23】

前記医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体を更に含む、請求項２２に記載の医薬組成物。

【請求項24】

前記癌は、結腸直腸癌、黒色腫、胃癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臓癌、胆嚢癌、甲状腺癌、喉頭癌、急性骨髄性白血病、脳腫瘍、神経芽腫、網膜芽細胞腫、頭頸部癌、唾液腺癌、及びリンパ腫からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項２３に記載の医薬組成物。

【請求項25】

癌を未然防止又は処置する医薬の製造のための、請求項１６又は１７に記載の融合タンパク質二量体の使用。

【請求項26】

癌を未然防止又は処置するための、請求項１６又は１７に記載の融合タンパク質二量体の使用。

【請求項27】

請求項１６又は１７に記載の融合タンパク質二量体を被験体に投与することを含む、癌を未然防止又は処置する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＰＤ－１タンパク質とＩＬ－２１タンパク質とを含む融合タンパク質、及びその使用に関する。具体的には、本発明は、血中半減期が延長し、かつ免疫増強効力を有する、ＰＤ－１と、ＩＬ－２１と、長期血清持続性Ｆｃとを含む新規の融合タンパク質二量体、及び癌処置のためのその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ＰＤ－１（プログラム死受容体－１）は、近年注目されている免疫チェックポイントである。ＰＤ－１は主にＴ細胞の活性化の制御に関与しており、免疫応答の強度及び持続時間を調節し得る。通常の状況下では、ＰＤ－１は身体組織の自己免疫寛容を媒介及び維持し、炎症応答中に免疫系が過剰活性化して自己組織に損傷を与えるのを防ぎ、それによって自己免疫疾患の発症を防ぐことで、有益な効果をもたらす。しかしながら、病理学的状況では、ＰＤ－１は、腫瘍免疫のプロセス並びに様々な自己免疫疾患の発生及び発症に関与していることが知られている（非特許文献１）。

【0003】

ＰＤ－１は主に活性化されたＴ細胞の表面上で発現されるが、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単核細胞、及び樹状細胞（ＤＣ）上でも発現される。ＰＤ－１のリガンドであるＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２は、腫瘍細胞、活性化されたＢ細胞及びＴ細胞、樹状細胞、並びにマクロファージ上で発現される。ＰＤ－１はこれらのリガンドに結合してＴ細胞のアポトーシスを誘導し、それによって細胞の免疫応答を減弱させる。したがって、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２経路の遮断は、多くの種類の癌に関する研究で調査されている有望な治療的アプローチである（非特許文献２）。

【0004】

一方、ＩＬ－２１（インターロイキン－２１）は、活性化されたＣＤ４^＋Ｔ細胞によって分泌されるサイトカインであり、骨髄からのＮＫ細胞前駆体の成熟を誘導し、特にサイトカイン産生能力及びアポトーシス能力等のＮＫ細胞のエフェクター機能を高めることが報告されている。さらに、ＣＤ８^＋Ｔ細胞のエフェクター機能を高めることにより、免疫系の抗癌応答を促進することが知られている。

【0005】

ＩＬ－２１とその受容体のＩＬ－２１Ｒとの相互作用を通じて、Ｊａｋ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路が活性化され、それによってＴ細胞分化に重要であるＳＴＡＴ３の強力かつ継続的な活性化が誘導される（非特許文献３）。

【0006】

一方、免疫グロブリンのＦｃのＣＨ２－ＣＨ３部分は、抗体の半減期を延長するＦｃＲｎ（保護受容体）結合部位を有する（特許文献１）。ＦｃＲｎは血管内皮細胞において発現されるＭＨＣクラスＩ関連タンパク質であり、ＩｇＧ及びアルブミンに結合する。Ｆｃを有しない、すなわちＦｃＲｎ結合部位を有しない抗体フラグメントは人体内で約２時間～３時間の半減期を有するが、ＦｃＲｎ結合部位を有するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４は人体内で平均３週間の半減期を有し、これは他のタンパク質の半減期よりも長い。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】韓国特許第１０－１９５７４３１号

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Sara Pilotto et al., Anti-cancer Agents Med Chem., 15(3):307-313, 2015

【非特許文献2】Miguel F. Sanmamed et al., Cancer J., 20(4):256-261, 2014

【非特許文献3】Wenjun Ouyang et al., Immunity, 28(4):454-467, 2008

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

したがって、本発明者は、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期が延長され、かつ優れた免疫増強効力を有する抗癌治療剤の開発を研究した。結果として、本発明者らは、ＰＤ－１と、ＩＬ－２１と、長期血清残留性Ｆｃとを含む新規の融合タンパク質が、抗癌活性に影響を与えることなく免疫細胞を活性化し、半減期を延長し得ることを発見し、それにより本発明の完成に至った。

【課題を解決するための手段】

【0010】

上記課題を解決するのに、本発明の一態様において、ＰＤ－１タンパク質とＩＬ－２１タンパク質とを含む融合タンパク質が提供される。

【0011】

本発明の別の態様において、上記融合タンパク質が２つ互いに結びついた融合タンパク質二量体が提供される。

【0012】

本発明の更に別の態様において、上記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。

【0013】

本発明のまた更に別の態様において、上記ポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。

【0014】

本発明のまた更に別の態様において、上記ベクターで形質転換された宿主細胞が提供される。

【0015】

本発明のまた更に別の態様において、上記融合タンパク質又は上記融合タンパク質二量体を有効成分として含む、癌を未然防止又は処置する医薬組成物が提供される。

【0016】

本発明のまた更に別の態様において、癌の処置のための上記融合タンパク質の使用が提供される。

【発明の効果】

【0017】

ＰＤ－１と、ＩＬ－２１と、長期血清残留性Ｆｃとを含む融合タンパク質は、ＰＤ－１及びＩＬ－２１によって免疫細胞を活性化することができるだけでなく、長期血清残留性Ｆｃによってｉｎ ｖｉｖｏ半減期を最長化することもできる。したがって、この融合タンパク質は癌細胞を効果的に攻撃することができるため、癌の処置において有用に使用され得る。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】得られた融合タンパク質（ＢＮＳ００１；ＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（２９）－ＩＬ－２１、ＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（４１）－ＩＬ－２１、及びＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（ｗｔ）－ＩＬ－２１）をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより確認することによって得られた結果を示す図である。

【図2】得られた融合タンパク質（ＢＮＳ００１）の純度をＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析により分析することによって得られた結果を示す図である。

【図3】得られた融合タンパク質（ＢＮＳ００１）の濃度を紫外分光光度計により確認することによって得られた結果を示す図である。

【図4】得られた融合タンパク質（ＢＮＳ００１）の熱力学的安定性を蛍光検出器及びＳＬＳ（静的光散乱）検出器により確認することによって得られた結果を示す図である。

【図5】得られた融合タンパク質（ＢＮＳ００１）の構造安定性をＦＴ－ＩＲ（フーリエ変換赤外分光分析）分光光度計により確認することによって得られた結果を示す図である。

【図6】得られた融合タンパク質（ＢＮＳ００１）の分子量をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法により確認することによって得られた結果を示す図である。

【図7】得られた融合タンパク質（ＢＮＳ００１）とｈＰＤ－Ｌ１（ヒトプログラム細胞死リガンド－１）との間の結合親和性を確認することによって得られた結果を示す図である。

【図8】ｈＰＤ－１タンパク質（ヒトプログラム細胞死タンパク質－１）とｈＰＤ－Ｌ１との間の結合親和性を確認することによって得られた結果を示す図である。

【図9】得られた融合タンパク質（ＢＮＳ００１）とｈＰＤ－Ｌ２（ヒトプログラム細胞死リガンド－２）との間の結合親和性を確認することによって得られた結果を示す図である。

【図10】ｈＰＤ－１タンパク質とｈＰＤ－Ｌ２との間の結合親和性を確認することによって得られた結果を示す図である。

【図11】得られた融合タンパク質（ＢＮＳ００１）とｈＩＬ－２１受容体（ヒトインターロイキン－２１受容体）との間の結合親和性を確認することによって得られた結果を示す図である。

【図12】ｈＩＬ－２１タンパク質とｈＩＬ－２１受容体との間の結合親和性を確認することによって得られた結果を示す図である。

【図13】得られた融合タンパク質（ＢＮＳ００１）とｈＦｃＲｎ受容体（ヒト新生児Ｆｃ受容体）との間の結合親和性を確認することによって得られた結果を示す図である。

【図14】得られた融合タンパク質（ＢＮＳ００１）とＰＤ－Ｌ１との間の結合親和性をＥＬＩＳＡ分析により確認することによって得られた結果を示す図である。

【図15】得られた融合タンパク質（ＢＮＳ００１）とＰＤ－Ｌ２との間の結合親和性をＥＬＩＳＡ分析により確認することによって得られた結果を示す図である。

【図16】得られた融合タンパク質（ＢＮＳ００１）とＩＬ－２１受容体との間の結合親和性をＥＬＩＳＡ分析により確認することによって得られた結果を示す図である。

【図17】得られた融合タンパク質（ＢＮＳ００１）とＦｃＲｎ受容体との間の結合親和性をＬＵＭＩＴ（商標）ＦｃＲｎ結合イムノアッセイ分析により確認することによって得られた結果を示す図である。

【図18】得られた融合タンパク質（ＢＮＳ００１）とＩＬ－２１受容体との間の結合親和性をＰＡＴＨＨＵＮＴＥＲ（商標）ｅＸｐｒｅｓｓ二量体化アッセイ分析により確認することによって得られた結果を示す図である。

【図19】末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、得られた融合タンパク質（ＢＮＳ００１）及びＩＬ－２１のそれぞれによる処理に供し、インキュベートを行った場合に、免疫細胞を含むＰＢＭＣから分泌されたＩＦＮ－γの量をＥＬＩＳＡ分析により測定することによって得られた結果を示す図である。

【図20】得られた融合タンパク質（ＢＮＳ００１）及びＩＬ－２１タンパク質のＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖に対する効果をＦＡＣＳ分析により確認することによって得られた結果を示す図である。

【図21】得られた融合タンパク質（ＢＮＳ００１）及びＩＬ－２１タンパク質のＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖に対する効果をＦＡＣＳ分析により確認することによって得られた結果を示す図である。

【図22a】得られた融合タンパク質（ＢＮＳ００１）及びＩＬ－２１タンパク質のＮＫ細胞の増殖に対する効果をＦＡＣＳ分析により確認することによって得られた結果を示す図である。

【図22b】得られた融合タンパク質（ＢＮＳ００１）及びＩＬ－２１タンパク質のＮＫ細胞の増殖に対する効果をＦＡＣＳ分析により確認することによって得られた結果を示すグラフである。

【図23】得られた融合タンパク質（ＢＮＳ００１）のエフェクターＴ細胞に対する効果をＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１遮断アッセイにより確認することによって得られた結果を示す図である。

【図24】得られた融合タンパク質（ＢＮＳ００１）のエフェクターＴ細胞に対する効果をＰＤ－Ｌ２／ＰＤ－１遮断アッセイにより確認することによって得られた結果を示す図である。

【図25】ホタルルシフェラーゼ及びＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を発現する細胞系統を構築するのに使用されるレンチウイルスベクターマップの概略図である。ここで、ＣＭＶはサイトメガロウイルス由来のプロモーターであり、ＲＳＶは呼吸器合胞体ウイルス由来のプロモーターである。

【図26】本発明において樹立されたホタルルシフェラーゼ及びＧＦＰを発現するヒト黒色腫細胞系統（Ａ３７５－Ｌｕｃ－ＧＦＰ）の発光シグナル（左）及び蛍光シグナル（右）を測定することによって得られた結果を示す図である。

【図27】本発明の一実施形態によるヒト黒色腫細胞系統（Ａ３７５－Ｌｕｃ－ＧＦＰ）において特異的に発現されるＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＰＤ－Ｌ２遺伝子の発現パターン（左）、並びに逆転写ＰＣＲにより免疫細胞を含むＰＢＭＣにおいて特異的に発現されるＰＤ－１遺伝子の発現パターン（右）を確認することによって得られた結果を示す図である。

【図28】ヒト黒色腫細胞系統（Ａ３７５－Ｌｕｃ－ＧＦＰ）と末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）とを共培養したものを、それぞれの濃度での得られた融合タンパク質（ＢＮＳ００１）及びＩＬ－２１のそれぞれによる処理に供し、インキュベートを行った場合に、細胞から分泌されたＩＦＮ－γの量をＥＬＩＳＡ分析により測定することによって得られた結果を示す図である。

【図29】ヒト黒色腫細胞系統（Ａ３７５－Ｌｕｃ－ＧＦＰ）と末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）とを共培養したものを、得られた融合タンパク質（ＢＮＳ００１）での処理に供した場合の、処理時間による癌細胞殺傷効果をルシフェラーゼ活性の測定により分析することによって得られた結果を示す図である。

【図30】ヒト黒色腫細胞系統（Ａ３７５－Ｌｕｃ－ＧＦＰ）と末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）とを共培養したものを、得られた融合タンパク質（ＢＮＳ００１）による処理に４８時間供した場合の、癌細胞殺傷効果をルシフェラーゼ活性の測定により確認することによって得られた結果を示す図である。

【図31】ヒト黒色腫細胞系統（Ａ３７５－Ｌｕｃ－ＧＦＰ）と末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）とを共培養したものを、それぞれの濃度での得られた融合タンパク質（ＢＮＳ００１）による処理に供した場合の、各処理濃度についての癌細胞殺傷効果をルシフェラーゼ活性の測定により分析することによって得られた結果を示す図である。

【図32】癌細胞系統（Ａ３７５－Ｌｕｃ－ＧＦＰ）に特異的な得られた融合タンパク質（ＢＮＳ００１）の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を確認することによって得られた結果を示す図である。

【図33】得られた融合タンパク質（ＢＮＳ００１）の血中濃度をＥＬＩＳＡ分析により測定することによって得られた結果を示す図である。

【図34】正常なＢＡＬＢ／ｃマウス動物モデルにおける融合タンパク質（ＢＮＳ００１）の血中半減期を確認することによって得られた結果を示す図である。

【図35】ヒトＦｃＲｎ ＴＧマウス動物モデルにおける融合タンパク質（ＢＮＳ００１）の血中半減期を確認することによって得られた結果を示す図である。

【図36】マウス由来結腸直腸癌細胞を移植したマウスにおける融合タンパク質（ＢＮＳ００１）の抗癌効果を確認する投与及び実験スケジュールの概略図である。

【図37】マウス由来結腸直腸癌細胞を移植したマウスにおける融合タンパク質（ＢＮＳ００１）による腫瘍抑制効果を確認することによって得られた結果を示す図である。

【図38】マウス由来結腸直腸癌細胞を移植したマウスにおける融合タンパク質（ＢＮＳ００１）による腫瘍抑制効果の統計的有意性を確認することによって得られた結果を示す図である。

【図39】得られた融合タンパク質（ＢＮＳ００１）による癌組織における免疫細胞活性のレベルを確認することによって得られた結果を示す図である。具体的には、これは、マウス由来結腸直腸癌細胞を移植したマウスを融合タンパク質（ＢＮＳ００１）により処理した後の３５日目に摘出された癌組織におけるマクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、ＣＤ４^＋細胞、ＣＤ８^＋細胞、及びＮＫ細胞の活性のレベルをＦＡＣＳにより分析することによって得られた結果を示すグラフである。

【図40】ヒト由来肺癌細胞（Ｈ４６０）を移植したヒト化マウスにおける融合タンパク質（ＢＮＳ００１）の抗癌効果を確認する投与及び実験スケジュールの概略図である。

【図41】ヒト由来肺癌細胞（Ｈ４６０）を移植したヒト化マウスにおける融合タンパク質（ＢＮＳ００１）の投与による腫瘍抑制効果を確認することによって得られた結果を示す図である。

【図42】ヒト由来肺癌細胞（Ｈ４６０）を移植したヒト化マウスにおける融合タンパク質（ＢＮＳ００１）の投与による腫瘍抑制効果の統計的有意性を確認することによって得られた結果を示す図である。

【図43】マウス由来結腸直腸癌細胞（ＭＣ３８）を同種移植したマウスにおける融合タンパク質（ｍＢＮＳ００１）の抗癌効果を確認する投与及び実験スケジュールの概略図である。

【図44】マウス由来結腸直腸癌細胞（ＭＣ３８）を同種移植したマウスにおける融合タンパク質（ｍＢＮＳ００１）の投与による濃度依存性腫瘍抑制効果を確認することによって得られた結果を示す図である。

【図45】腫瘍成長抑制率（％）として計算される、マウス由来結腸直腸癌細胞（ＭＣ３８）を同種移植したマウスにおける融合タンパク質（ｍＢＮＳ００１）の投与による濃度依存性腫瘍抑制効果を示す図である。

【図46】マウス由来結腸直腸癌細胞（ＣＴ－２６）を同種移植したマウスにおける融合タンパク質（ｍＢＮＳ００１）の腫瘍成長抑制有効性を評価する投与及び実験スケジュールの概略図である。

【図47】マウス由来結腸直腸癌細胞（ＣＴ－２６）を同種移植したマウスにおける融合タンパク質（ｍＢＮＳ００１）の腫瘍成長抑制有効性を評価することによって得られた、各群（Ｇ１～Ｇ８）及び各被験体（被験体番号によって示される）についてのプロットの形態での結果を示す図である。

【図48】マウス由来結腸直腸癌細胞（ＣＴ－２６）を同種移植したマウスにおける融合タンパク質（ｍＢＮＳ００１）の投与による腫瘍成長抑制有効性を評価することによって得られた結果を示す図であり、これは、各群（Ｇ１～Ｇ８）についての腫瘍体積を測定することによって得られた結果を示す。

【図49】マウス由来結腸直腸癌細胞（ＣＴ－２６）を同種移植したマウスにおける融合タンパク質（ｍＢＮＳ００１）の投与による腫瘍成長抑制有効性を評価することによって得られた結果を示す図であり、これは、ＢＮＳ００１（ｍＰＤ１－Ｆｃ－ＩＬ－２１）と、市販の抗体の抗ＰＤ１抗体（Ｋｅｙｔｒｕｄａ、MSD）及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ、Roche）との間の統計的有意性を示す。ここで、^＊は、ｐ≦０．０５であり、かつ^＊＊＊は、ｐ≦０．００１である。

【図50】マウス由来結腸直腸癌細胞（ＣＴ－２６）を同種移植したマウスにおける融合タンパク質（ｍＢＮＳ００１）の投与による腫瘍成長抑制有効性を評価することによって得られた結果を示す図であり、これは、ＢＮＳ００１（ｍＰＤ１－Ｆｃ－ＩＬ－２１）と、コントロール（ＰＤ１－Ｆｃ、Ｆｃ－ＩＬ２１、ＰＤ１－Ｆｃ＋Ｆｃ－ＩＬ２１）との間の統計的有意性を示す。ここで、^＊は、ｐ≦０．０５であり、かつ^＊＊＊は、ｐ≦０．００１である。

【図51】マウス由来乳癌細胞（ＥＭＴ－６）を同種移植したマウスにおける融合タンパク質（ｍＢＮＳ００１）の腫瘍成長抑制有効性を評価する投与及び実験スケジュールの概略図である。

【図52】マウス由来乳癌細胞（ＥＭＴ－６）を同種移植したマウスにおける融合タンパク質（ｍＢＮＳ００１）の腫瘍成長抑制有効性を評価することによって得られた、各群（Ｇ１～Ｇ９）及び各被験体（被験体番号によって示される）についてのプロットの形態での結果を示す図である。

【図53】マウス由来乳癌細胞（ＥＭＴ－６）を同種移植したマウスにおける融合タンパク質（ｍＢＮＳ００１）の投与による腫瘍成長抑制有効性を評価することによって得られた結果を示す図であり、これは、各群（Ｇ１～Ｇ９）についての腫瘍体積を測定することによって得られた結果を示す。

【図54】マウス由来乳癌細胞（ＥＭＴ－６）を同種移植したマウスにおける融合タンパク質（ｍＢＮＳ００１；ｍＰＤ１－Ｆｃ－ｍＩＬ－２１）並びに市販の抗体の抗ＰＤ１抗体（Ｋｅｙｔｒｕｄａ、MSD）及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ、Roche）の投与による腫瘍成長抑制有効性を評価することによって得られた結果を示す図である。

【図55】マウス由来乳癌細胞（ＥＭＴ－６）を同種移植したマウスにおける融合タンパク質（ｍＢＮＳ００１；ｍＰＤ１－Ｆｃ－ｍＩＬ－２１）及びコントロール（ＰＤ１－Ｆｃ、Ｆｃ－ＩＬ２１、ＰＤ１－Ｆｃ＋Ｆｃ－ＩＬ２１）試料の投与による腫瘍成長抑制有効性を評価することによって得られた結果を示す図である。

【図56】健康なドナー（ドナー１）から取得されたヒトＰＢＭＣをＰＨＡでの処理により刺激した場合の、ＢＮＳ００１処理により誘導されるＩＦＮ－γ分泌のレベルをＥＬＩＳＡ分析により測定することによって得られた結果を示す図である。

【図57】健康なドナー（ドナー１）から取得されたヒトＰＢＭＣをＰＨＡでの処理により刺激した場合の、ＢＮＳ００１処理により誘導されるＩＦＮ－γ分泌のレベルを各濃度についてＥＬＩＳＡ分析により測定することによって得られた結果を示す図である。

【図58】健康なドナー（ドナー２）から取得されたヒトＰＢＭＣをＰＨＡでの処理により刺激した場合の、ＢＮＳ００１処理により誘導されるＩＦＮ－γ分泌のレベルを各濃度についてＥＬＩＳＡ分析により測定することによって得られた結果を示す図である。

【図59】健康なドナー（ドナー３）から取得されたヒトＰＢＭＣをＰＨＡでの処理により刺激した場合の、ＢＮＳ００１処理により誘導されるＩＦＮ－γ分泌のレベルを各濃度についてＥＬＩＳＡ分析により測定することによって得られた結果を示す図である。

【図60】健康なドナー（ドナー１）から取得されたヒトＰＢＭＣをＰＨＡでの処理により刺激した場合の、免疫活性化マーカーのＣＤ６９、ＣＤ３８、及び４－１ＢＢの発現レベルについてのＦＡＣＳ分析を介したＢＮＳ００１処理により誘導されるＮＫ細胞の活性化のレベルを示す図である。

【図61】健康なドナー（ドナー１）から取得されたヒトＰＢＭＣをＰＨＡでの処理により刺激した場合の、免疫活性化マーカーのＣＤ６９及び２Ｂ４の発現レベルについてのＦＡＣＳ分析を介したＢＮＳ００１処理により誘導されるＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化のレベルを示す図である。

【図62】健康なドナー（ドナー１）から取得されたヒトＰＢＭＣをＰＨＡでの処理により刺激した場合の、免疫活性化マーカーのＣＤ６９の発現レベルについてのＦＡＣＳ分析を介したＢＮＳ００１処理により誘導されるＣＤ４^＋Ｔ細胞の活性化のレベルを示す図である。

【図63】健康なドナー（ドナー１）から取得されたヒトＰＢＭＣをＰＨＡでの処理により刺激した場合の、免疫活性化マーカーのＣＤ６９の発現レベルについてのＦＡＣＳ分析を介したＢＮＳ００１処理により誘導されるＢ細胞の活性化のレベルを示す図である。

【図64】健康なドナー（ドナー１）から取得されたヒトＰＢＭＣをＰＨＡでの処理により刺激した場合の、免疫活性化マーカーのＣＤ６９及びＣＤ３８の発現レベルについてのＦＡＣＳ分析を介した各濃度についてのＢＮＳ００１処理により誘導されるＮＫ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、及びＣＤ４^＋Ｔ細胞のそれぞれの活性化のレベルを示す図である。

【図65】図65ａ及び図65ｂは、健康なドナー（ドナー２）から取得されたヒトＰＢＭＣをＰＨＡでの処理により刺激した場合の、免疫活性化マーカーのＣＤ６９、２Ｂ４、及びＯＸ４０の発現レベルについてのＦＡＣＳ分析を介した各濃度についてのＢＮＳ００１処理により誘導されるＮＫ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、及びＢ細胞のそれぞれの活性化のレベルを示す図である。

【図66】健康なドナー（ドナー３）から取得されたヒトＰＢＭＣをＰＨＡでの処理により刺激した場合の、免疫活性化マーカーのＣＤ６９の発現レベルについてのＦＡＣＳ分析を介した各濃度についてのＢＮＳ００１処理により誘導されるＮＫ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、及びＢ細胞のそれぞれの活性化のレベルを示す図である。

【図67】ＰＢＭＣにおけるＢＮＳ００１融合タンパク質処理によるＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖のレベルをＦＡＣＳ分析により確認することによって得られた結果を示す図である。

【図68】ＰＢＭＣにおけるＢＮＳ００１融合タンパク質処理による各濃度についてのＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖のレベルをＦＡＣＳ分析により確認することによって得られた結果を示す図である。

【図69】ヒト由来結腸直腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）を移植したヒト化マウスにおける融合タンパク質（ＢＮＳ００１）の抗癌効果を確認する投与及び実験スケジュールの概略図である。

【図70】ヒト由来結腸直腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）を移植したヒト化マウスにおける融合タンパク質（ＢＮＳ００１）の投与による濃度依存性腫瘍抑制効果を確認することによって得られた結果を示す図である。

【図71】ヒト由来結腸直腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）を移植したヒト化マウスにおける各濃度についての融合タンパク質（ＢＮＳ００１）の投与に応じた体重変化度を確認することによって得られた結果を示す図である。

【図72】ヒト由来結腸直腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）を移植したヒト化マウスにおける融合タンパク質（ＢＮＳ００１）とコントロール薬物との間の抗癌効果を確認する投与及び実験スケジュールの概略図である。

【図73】ヒト由来結腸直腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）を移植したヒト化マウスにおける、融合タンパク質（ＢＮＳ００１；ＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ－ＩＬ－２１）の投与による腫瘍抑制効果と、比較用コントロールであるＢＮＳ００１Ｄ（ＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ）融合タンパク質及びＢＮＳ００１Ｉ（Ｆｃ－ＩＬ－２１）融合タンパク質の単独又は組合せにおける投与による腫瘍抑制効果とを比較することによって得られた結果を示す図である。

【図74】ヒト由来結腸直腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）を移植したヒト化マウスにおける、融合タンパク質（ＢＮＳ００１；ＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ－ＩＬ－２１）の投与による体重変化度と、比較用コントロールであるＢＮＳ００１Ｄ（ＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ）融合タンパク質及びＢＮＳ００１Ｉ（Ｆｃ－ＩＬ－２１）融合タンパク質の単独又は組合せでの投与による体重変化度とを比較することによって得られた結果を示す図である。

【図75】ヒト由来結腸直腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）を移植したヒト化マウスにおける、融合タンパク質（ＢＮＳ００１）の投与による腫瘍抑制効果と、ポジティブコントロールであるアテゾリズマブ、ペムブロリズマブ、及びアベルマブの投与による腫瘍抑制効果とを比較することによって得られた結果を示す図である。

【図76】ヒト由来結腸直腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）を移植したヒト化マウスにおける、融合タンパク質（ＢＮＳ００１）の投与による体重変化度と、ポジティブコントロールであるアテゾリズマブ、ペムブロリズマブ、及びアベルマブの投与による体重変化度とを比較することによって得られた結果を示す図である。

【図77】ヒト由来肺癌細胞（Ａ５４９）を移植したヒト化マウスにおける融合タンパク質（ＢＮＳ００１）とコントロール薬物との間の抗癌効果を確認する投与及び実験スケジュールの概略図である。

【図78】ヒト由来肺癌細胞（Ａ５４９）を移植したヒト化マウスにおける、融合タンパク質（ＢＮＳ００１）の投与による腫瘍抑制効果と、ポジティブコントロールであるアテゾリズマブ、ペムブロリズマブ、及びアベルマブの投与による腫瘍抑制効果とを比較することによって得られた結果を示す図である。

【図79】ヒト由来肺癌細胞（Ａ５４９）を移植したヒト化マウスにおける、融合タンパク質（ＢＮＳ００１）の投与による体重変化度と、ポジティブコントロールであるアテゾリズマブ、ペムブロリズマブ、及びアベルマブの投与による体重変化度とを比較することによって得られた結果を示す図である。

【図80】ヒト由来乳癌細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）を移植したヒト化マウスにおける融合タンパク質（ＢＮＳ００１）とコントロール薬物との間の抗癌効果を確認する投与及び実験スケジュールの概略図である。

【図81】ヒト由来乳癌細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）を移植したヒト化マウスにおける、融合タンパク質（ＢＮＳ００１）の投与による腫瘍抑制効果と、ポジティブコントロールであるアテゾリズマブ、ペムブロリズマブ、及びアベルマブの投与による腫瘍抑制効果とを比較することによって得られた結果を示す図である。

【図82】ヒト由来乳癌細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）を移植したヒト化マウスにおける、融合タンパク質（ＢＮＳ００１）の投与による体重変化度と、ポジティブコントロールであるアテゾリズマブ、ペムブロリズマブ、及びアベルマブの投与による体重変化度とを比較することによって得られた結果を示す図である。

【図83】ヒト由来肺癌細胞（ＮＣＩ－Ｈ１９７５）を移植したヒト化マウスにおける融合タンパク質（ＢＮＳ００１）とコントロール薬物との間の抗癌効果を確認する投与及び実験スケジュールの概略図である。

【図84】ヒト由来肺癌細胞（ＮＣＩ－Ｈ１９７５）を移植したヒト化マウスにおける、融合タンパク質（ＢＮＳ００１）の投与による腫瘍抑制効果と、ポジティブコントロールであるベバシズマブ及びラムシルマブの投与による腫瘍抑制効果とを比較することによって得られた結果を示す図である。

【図85】ヒト由来肺癌細胞（ＮＣＩ－Ｈ１９７５）を移植したヒト化マウスにおける、融合タンパク質（ＢＮＳ００１）の投与による体重変化度と、ポジティブコントロールであるベバシズマブ及びラムシルマブの投与による体重変化度とを比較することによって得られた結果を示す図である。

【図86】ヒト由来肺癌細胞（ＮＣＩ－Ｈ１９７５）を移植したヒト化マウスにおける、融合タンパク質（ＢＮＳ００１）の投与による腫瘍抑制効果と、ポジティブコントロールであるセツキシマブ及びアミバンタマブの投与による腫瘍抑制効果とを比較することによって得られた結果を示す図である。

【図87】ヒト由来肺癌細胞（ＮＣＩ－Ｈ１９７５）を移植したヒト化マウスにおける、融合タンパク質（ＢＮＳ００１）の投与による体重変化度と、ポジティブコントロールであるセツキシマブ及びアミバンタマブの投与による体重変化度とを比較することによって得られた結果を示す図である。

【図88】融合タンパク質（ＢＮＳ００１）二量体の一実施形態の概略図である。

【発明を実施するための形態】

【0019】

ＰＤ－１タンパク質とＩＬ－２１タンパク質とを含む融合タンパク質
本発明の一態様において、ＰＤ－１タンパク質とＩＬ－２１タンパク質とを含む融合タンパク質が提供される。

【0020】

本明細書において使用される場合、「ＰＤ－１（プログラム細胞死タンパク質１又はプログラム死受容体－１）」という用語は、Ｂ７－ＣＤ２８ファミリーに属する相互抑制受容体の一種であり、ＣＤ２７９としても知られる免疫チェックポイントタンパク質である。ＰＤ－１は、活性化されたＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞、及びマクロファージの表面上で広く発現されている。ＰＤ－１は、そのリガンドであるＰＤ－Ｌ１（プログラム細胞死リガンド－１）又はＰＤ－Ｌ２（プログラム細胞死リガンド－２）に結合すると、ＣＤ３媒介性Ｔ細胞活性化及びＣＤ２８媒介性Ｔ細胞活性化を阻害する細胞内シグナル伝達を誘導する。Ｔ細胞活性化の下方制御はＴ細胞増殖、ＩＦＮ－γ分泌、ＩＬ－２分泌等の減少をもたらす。ＰＤ－１と、そのリガンドである、様々な種類の癌細胞（例えば、黒色腫、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、乳癌、リンパ腫、神経膠腫等）上で発現されることが知られるＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２との間の相互作用はＴ細胞を不活性化し、癌細胞が免疫系による攻撃を回避する機序として機能する。したがって、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２との間の相互作用を遮断すると、腫瘍微小環境内のＴ細胞が活性化されて腫瘍細胞が排除される。

【0021】

本明細書において使用される場合、「ＰＤ－１」、「プログラム細胞死受容体－１」、又は「プログラム細胞死タンパク質－１」という用語は、特段の指定がない限り、哺乳動物、例えば、霊長類（ヒト等）及び齧歯類（マウス及びラット等）を含むあらゆる脊椎動物起源から得られるあらゆる野生型ＰＤ－１を指す。ＰＤ－１を動物細胞から得ることができ、これにはＰＤ－１を産生することができる組換え細胞から取得されたものも含まれる。さらに、ＰＤ－１は野生型ＰＤ－１又はその断片であり得る。

【0022】

ＰＤ－１は２８８個のアミノ酸からなるＩ型膜タンパク質であり、その構造は細胞外ＩｇＶ様ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞質ドメインとからなる。ＰＤ－１のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５００９．２又はＵｎｉＰｒｏｔｋＢ番号Ｑ１５１１６において記載される配列であり得る（マウスＰＤ－１のアミノ酸配列については、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３２８２４．１を参照のこと）。さらに、ＰＤ－１をコードする配列としてのＰＤＣＤ１（プログラム細胞死１）遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５０１８．３に記載される配列のうちＣＤＳ（コーディング配列）に対応するヌクレオチド配列であり得る（マウス配列については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００８７９８．３を参照のこと）。

【0023】

本明細書において使用される場合、「ＰＤ－１タンパク質」という用語は、全長ＰＤ－１又はＰＤ－１断片を指す。本明細書において、ＰＤ－１又はその断片を総称して「ＰＤ－１タンパク質」という用語によって表現する場合がある。ＰＤ－１、ＰＤ－１タンパク質、及びＰＤ－１断片は、例えば、ＰＤ－１のリガンドであるＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２に特異的に結合する。この特異的結合を当業者に知られる方法によって確認することができる。

【0024】

ＰＤ－１のリガンドであるＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２は、癌細胞の表面上に発現されるタンパク質である。ＰＤ－Ｌ１はＢ７－Ｈ１又はＣＤ２７４としても知られており、ＰＤ－Ｌ２はＢ７－ＤＣ又はＣＤ２７３としても知られている。ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２がＴ細胞において存在するＰＤ－１に結合すると、これにより免疫チェックポイント機能が変化してＴ細胞機能が抑制される。言い換えると、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２との間の相互作用によってＴ細胞機能が抑制され、最終的に癌細胞は免疫細胞による攻撃を回避する。

【0025】

本明細書において使用される場合、「ＰＤ－１断片」という用語は、ＰＤ－１の切断形態を指す。さらに、ＰＤ－１断片はＰＤ－１の細胞外ドメインであり得る。ＰＤ－１断片の一実施形態は、ＰＤ－１のシグナル配列であるＮ末端から１番目から２４番目のアミノ酸が除外されたものであり得る。具体的には、ＰＤ－１断片の一実施形態は、配列番号１８の２５番目～２８８番目のアミノ酸からなるタンパク質であり得る。さらに、ＰＤ－１断片の一実施形態は、配列番号１８の２５番目～１７０番目のアミノ酸からなるタンパク質であり得る。さらに、ＰＤ－１断片の一実施形態は、配列番号１８の２５番目～１５０番目のアミノ酸からなるタンパク質であり得る。さらに、ＰＤ－１断片の一実施形態は、配列番号１８の２５番目～１４４番目のアミノ酸からなるタンパク質であり得る。上記の例において、ＰＤ－１断片は配列番号２又は配列番号３４のアミノ酸配列を有し得る。

【0026】

さらに、ＰＤ－１断片の一実施形態は、配列番号２９の２５番目～１６９番目のアミノ酸からなるタンパク質であり得る。上記の例において、ＰＤ－１断片は配列番号２１のアミノ酸配列を有し得る。

【0027】

本明細書において使用される場合、「ＩＬ－２１」又は「インターロイキン－２１」という用語は、主に活性化されたＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＮＫ Ｔ細胞によって産生されるサイトカインである。ＩＬ－２１は一般的なγ鎖サイトカインファミリーに属し、リンパ球の活性化、増殖、分化、及び生存に関与している。さらに、ＩＬ－２１は、その特異的な受容体であるＩＬ－２１Ｒ（インターロイキン－２１受容体）及び一般的なγ鎖受容体からなるヘテロ二量体受容体との相互作用を通じて、Ｊａｋ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路を活性化する。ＩＬ－２１とその受容体のＩＬ－２１Ｒとの間の相互作用によって誘導されるシグナル伝達は、免疫炎症応答を誘導する。ＩＬ－２１は、骨髄由来のＮＫ細胞前駆体の成熟を誘導し、特にサイトカイン産生能力及びアポトーシス能力等のＮＫ細胞のエフェクター機能を高める。さらに、ＩＬ－２１は、脱顆粒及び炎症性サイトカインの分泌を高めることによって細胞傷害活性を誘導するだけでなく、抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の数の拡大及びエフェクター機能も促進し、結果として腫瘍退縮をもたらす。

【0028】

本明細書において使用される場合、「ＩＬ－２１」又は「インターロイキン－２１」という用語は、特段の指定がない限り、哺乳動物、例えば、霊長類（ヒト等）及び齧歯類（マウス及びラット等）を含むあらゆる脊椎動物起源から得られるあらゆる野生型ＩＬ－２１を指す。ＩＬ－２１を動物細胞から得ることができ、これにはＩＬ－２１を産生することができる組換え細胞から取得されたものも含まれる。さらに、ＩＬ－２１は野生型ＩＬ－２１又はその変異体であり得る。

【0029】

ＩＬ－２１は１６２個のアミノ酸からなり、具体的にはアミノ酸残基１（Ｍｅｔ）～アミノ酸残基２９（Ｓｅｒ）の分泌シグナル配列と、アミノ酸残基３０（Ｇｌｎ）～アミノ酸残基１６２（Ｓｅｒ）の成熟ポリペプチドとからなる。ＩＬ－２１のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０６８５７５．１又はＵｎｉＰｒｏｔｋＢ番号Ｑ９ＨＢＥ４において記載される配列であり得る（マウスＩＬ－２１のアミノ酸配列については、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０６８５５４．１を参照のこと）。さらに、ＩＬ－２１をコードする配列としてのＩＬ－２１遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０２１８０３．４に記載される配列のうちＣＤＳ（コーディング配列）に対応するヌクレオチド配列であり得る（マウス配列については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０２１７８２．３を参照のこと）。

【0030】

本明細書において使用される場合、「ＩＬ－２１タンパク質」という用語は、全長ＩＬ－２１、ＩＬ－２１断片、又はＩＬ－２１変異体を指す。本明細書において、ＩＬ－２１、ＩＬ－２１断片、又はそれらの変異体は、総称して「ＩＬ－２１タンパク質」又は「ＩＬ－２１ポリペプチド」という用語によって表現され得る。ＩＬ－２１、ＩＬ－２１タンパク質、ＩＬ－２１ポリペプチド、及びＩＬ－２１変異体は、例えばＩＬ－２１受容体（ＩＬ－２１Ｒ）に特異的に結合する。この特異的結合を当業者に知られる方法によって確認することができる。

【0031】

ＩＬ－２１についての受容体であるＩＬ－２１Ｒは、クラスＩサイトカイン受容体ファミリーに属する膜貫通ＩＬ－２１結合タンパク質である。ＩＬ－２１ＲとＩＬ－２１との相互作用によって誘導されるシグナル伝達はＮＫ細胞及びＴ細胞の増殖及び活性化を誘導し、ＩＮＦ－γの分泌を促進し、最終的には抗癌効果を誘導する。

【0032】

本明細書において使用されるＩＬ－２１という用語の一実施形態は、配列番号１９又は配列番号３０のアミノ酸配列を有し得る。ここで、ＩＬ－２１は成熟形態でもあり得る。具体的には、成熟ＩＬ－２１はシグナル配列を含まない場合があり、配列番号６又は配列番号２２のアミノ酸配列を有し得る。ここで、ＩＬ－２１は、野生型ＩＬ－２１のＮ末端又はＣ末端の一部が切断された野生型ＩＬ－２１の断片を包含する概念として使用され得る。

【0033】

さらに、ＩＬ－２１断片は、配列番号１９又は配列番号３０のアミノ酸配列を有するタンパク質のＮ末端から１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、又は２４個の連続したアミノ酸が切断された形態であり得る。さらに、ＩＬ－２１断片は、配列番号１９又は配列番号３０のアミノ酸配列を有するタンパク質のＣ末端から１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、又は２４個の連続したアミノ酸が切断された形態であり得る。

【0034】

本明細書において使用される場合、「ＩＬ－２１変異体」という用語は、全長ＩＬ－２１又は上記のＩＬ－２１断片におけるアミノ酸の一部が置換された形態を指す。すなわち、ＩＬ－２１変異体は、野生型ＩＬ－２１又はその断片とは異なるアミノ酸配列を有し得る。しかしながら、ＩＬ－２１変異体は、野生型ＩＬ－２１と同等又は類似の活性を有し得る。ここで、「ＩＬ－２１活性」は、例えば、ＩＬ－２１受容体への特異的結合を指し得て、その特異的結合を当業者に知られる方法によって測定することができる。

【0035】

具体的には、ＩＬ－２１変異体を、野生型ＩＬ－２１のアミノ酸の一部の欠失及び／又は置換によって得ることができる。アミノ酸の欠失及び／又は置換により得られるＩＬ－２１変異体の一実施形態を、米国特許第８，０３４，３２６号に開示されるように、配列番号１９のアミノ酸配列における１（Ｍｅｔ）～２９（Ｓｅｒ）の分泌シグナル配列の欠失、及び１３３個のアミノ酸の成熟ペプチドの６６（Ｉｌｅ）～９８（Ｓｅｒ）の領域におけるアミノ酸の欠失及び／又は置換によって得ることができる。ＩＬ－２変異体は、野生型ＩＬ－２１と比較して維持又は改善されたＩＬ－２１活性を特徴とし得る。

【0036】

さらに、リンカー又は担体を介して、ＰＤ－１タンパク質とＩＬ－２１タンパク質とを互いに結びつけることができる。具体的には、リンカー又は担体を介して、ＰＤ－１又はその断片とＩＬ－２１又はその変異体とを互いに結びつけることができる。本明細書において、リンカー及び担体は区別なく使用され得る。

【0037】

リンカーは２つのタンパク質を連結する。リンカーの一実施形態としては、１個～５０個のアミノ酸、アルブミン又はその断片、免疫グロブリンのＦｃドメイン等を挙げることができる。ここで、免疫グロブリンのＦｃドメインは、免疫グロブリンの重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）を含み、かつ免疫グロブリンの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域並びに軽鎖定常領域１（ＣＨ１）を含まないタンパク質を指す。免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＭであり得て、好ましくはＩｇＧ１であり得る。ここで、野生型免疫グロブリンＧ１のＦｃドメインは配列番号１４のアミノ酸配列を有し得る。

【0038】

さらに、免疫グロブリンのＦｃドメインは、Ｆｃドメイン変異体だけでなく野生型Ｆｃドメインであってもよい。さらに、本明細書において使用される場合、「Ｆｃドメイン変異体」という用語は、グリコシル化パターンの点で野生型Ｆｃドメインとは異なるか、野生型Ｆｃドメインと比較して高いグリコシル化を有するか、若しくは野生型Ｆｃドメインと比較して低いグリコシル化を有する形態、又は脱グリコシル化された形態を指し得る。さらに、非グリコシル化Ｆｃドメインもそこに含まれる。Ｆｃドメイン又はその変異体を、培養条件又は宿主の遺伝子操作により、調整された数のシアル酸、フコシル化、又はグリコシル化を有するように適合させることができる。

【0039】

さらに、化学的方法、酵素的方法、及び微生物を使用した遺伝子工学的方法等の慣例的な方法によって、免疫グロブリンのＦｃドメインのグリコシル化を改変することができる。さらに、Ｆｃドメイン変異体は、免疫グロブリンのＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＭのそれぞれのＦｃ領域の混合形態であり得る。さらに、Ｆｃドメイン変異体は、Ｆｃドメインの一部のアミノ酸が他のアミノ酸で置換された形態であり得る。Ｆｃドメイン変異体の一実施形態を、配列番号１４のアミノ酸配列におけるＱ８１Ｒ、Ｍ１９８Ｌ、Ｌ７９Ｇ、Ｔ１３６Ｗ、Ｑ８１Ｒ／Ｍ１９８Ｌ、Ｌ７９Ｇ／Ｍ１９８Ｌ、又はＱ８１Ｒ／Ｔ１３６Ｗ／Ｍ１９８Ｌの置換によって得ることができる。さらに、Ｆｃドメインを更に改変してＩｄｅＳプロテアーゼによる切断を防ぐことができる。例えば、これを配列番号１４のアミノ酸配列におけるＥ３Ｐ、Ｌ４Ｖ、若しくはＬ５Ａの置換、又はＧ６のアミノ酸の欠失によって得ることができる。

【0040】

具体的には、Ｆｃドメイン変異体の一実施形態は、配列番号４、配列番号１０、配列番号５０、配列番号８７、配列番号９５、配列番号９９、配列番号１０４、配列番号１０８、配列番号１１２、又は配列番号１１６のアミノ酸配列を有し得る。

【0041】

アミノ酸置換によるＦｃドメイン変異体の一実施形態は、特許文献１に開示されるように、ＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）への会合及び解離を調節するアミノ酸置換を含むＦｃドメイン変異体であり得る。これには、特に、低ｐＨではＦｃＲｎに対する結合親和性の増加を示し、かつ高ｐＨでは結合親和性の実質的な変化を示さないＦｃ変異体、又はその機能的変異体が含まれ得る。

【0042】

Ｆｃドメイン変異体は、ｐＨ５．６～６．２（好ましくはｐＨ５．８～６．０）での、野生型Ｆｃドメインと比較して１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、若しくは１００％以上増加したＦｃＲｎに対する結合親和性を有し得るか、又はｐＨ５．６～６．２（好ましくはｐＨ５．８～６．０）での、野生型Ｆｃドメインの２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、１０倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、若しくは１００倍以上増加したＦｃＲｎに対する結合親和性を有し得る。

【0043】

ｐＨ７．０～７．８（好ましくはｐＨ７．２～７．６）でのＦｃドメイン変異体のＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）からの解離の程度は、野生型Ｆｃドメインと比較して同じであっても、又は実質的に変化していなくてもよい。

【0044】

さらに、Ｆｃドメイン変異体は、野生型と比較して半減期の延長を特徴とし得る。具体的には、Ｆｃドメイン変異体は、野生型Ｆｃドメインと比較して１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、若しくは１００％以上延長した半減期を有し得るか、又は野生型Ｆｃドメインと比較して２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、若しくは１０倍以上延長した半減期を有し得る。

【0045】

本明細書において使用される場合、「ＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）」又は「新生児Ｆｃ受容体」という用語は、血管内皮細胞において発現されるＭＨＣクラスＩ関連タンパク質であり、ＩｇＧ及びアルブミンに結合する。ＩｇＧとＦｃＲｎとの間の結合はｐＨが弱酸性である場合に強く、中性のｐＨでは結合力が見られないことが特長である。したがって、ピノサイトーシス又はエンドサイトーシスを通じて細胞に侵入するＩｇＧは、ｐＨ６．０の条件下でエンドソーム内にてＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）の一種であるＦｃＲｎに強く結合することにより、分解性リソソーム経路を回避することができる。ＩｇＧは、循環して細胞膜に戻ると、血流中でｐＨ７．４にてＦｃＲｎから急速に解離する。ＦｃＲｎは、この受容体媒介性のリサイクル機構を通じてリソソームにおけるＩｇＧの分解を効果的に妨げ、ＩｇＧの半減期を延ばすことが知られている。

【0046】

本明細書において使用される場合、「Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）」という用語は、ＩｇＧについてのＦｃ受容体を指し、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の３つの主要な型が存在する。Ｆｃ受容体は、免疫グロブリンに結合して、結合した抗体が抗原との結合部位とは独立して様々な生物学的機能を発揮することを可能にする分子であり、様々な細胞及び組織の表面上に分布している。Ｆｃ受容体は、細胞傷害性、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）、サイトカイン等のメディエーターの分泌、食作用、酸化の開始、及び抗体産生の制御に関与している。

【0047】

融合タンパク質は、Ｆｃドメインをリンカー（又は担体）として使用して、ＰＤ－１及びＩＬ－２１タンパク質又はＩＬ－２１及びＰＤ－１がそれぞれリンカー又は担体のＮ末端及びＣ末端に連結された構造を有し得る。ＦｃドメインのＮ末端又はＣ末端とＰＤ－１又はＩＬ－２１との間の連結は、任意にリンカーペプチドによって達成され得る。

【0048】

具体的には、融合タンパク質は、以下の構造式Ｉ又は構造式ＩＩ：
Ｎ’－Ａ－［Ｌ_１］ｎ－Ｆｃドメイン－［Ｌ_２］ｍ－Ｂ－Ｃ’ Ｉ
Ｎ’－Ｂ－［Ｌ_１］ｎ－Ｆｃドメイン－［Ｌ_２］ｍ－Ａ－Ｃ’ ＩＩ
（構造式Ｉ及び構造式ＩＩにおいて、
Ｎ’は、融合タンパク質のＮ末端であり、
Ｃ’は、融合タンパク質のＣ末端であり、
Ａは、ＰＤ－１タンパク質又はその断片であり、
Ｂは、ＩＬ－２１タンパク質又はその変異体であり、
Ｌ_１及びＬ_２は、ペプチドリンカーであり、かつ、
ｎ及びｍは、それぞれ独立して０又は１である）からなっていてよい。

【0049】

好ましくは、融合タンパク質は構造式Ｉからなっていてよい。ＰＤ－１タンパク質及びＩＬ－２１タンパク質はそれぞれ上記の通りである。一実施形態によれば、ＰＤ－１タンパク質は、野生型ＰＤ－１のＮ末端又はＣ末端から約２４個の連続したアミノ酸残基までが切断された断片であり得る。ＩＬ－２１タンパク質は、野生型ＩＬ－２１のＮ末端又はＣ末端から約２４個の連続したアミノ酸残基までが切断された断片であり得る。代替的に、ＩＬ－２１タンパク質は、ＩＬ－２１断片のアミノ酸の一部の欠失及び／又は置換によって得られるＩＬ－２１変異体であり得る。

【0050】

具体的には、融合タンパク質は、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３２、配列番号３６、配列番号４１、配列番号４４、配列番号５２、配列番号５５、配列番号７６、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８９、配列番号９２、配列番号９７、配列番号１０１、配列番号１０６、配列番号１１０、配列番号１１４、又は配列番号１１８のアミノ酸配列を有し得る。別の実施形態によれば、融合タンパク質としては、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３２、配列番号３６、配列番号４１、配列番号４４、配列番号５２、配列番号５５、配列番号７６、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８９、配列番号９２、配列番号９７、配列番号１０１、配列番号１０６、配列番号１１０、配列番号１１４、又は配列番号１１８のアミノ酸配列に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドが挙げられる。ここで、同一性は、例えば相同性パーセントであり、米国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＮソフトウェア等の相同性比較ソフトウェアにより決定することができる。

【0051】

ＰＤ－１タンパク質とＦｃドメインとの間に、ペプチドリンカーＬ_１が含まれていてよい。ペプチドリンカーＬ_１は、５個～８０個の連続したアミノ酸、２０個～６０個の連続したアミノ酸、２５個～５０個の連続したアミノ酸、又は３０個～４０個の連続したアミノ酸からなり得る。一実施形態において、ペプチドリンカーＬ_１は、３０個のアミノ酸からなり得る。さらに、ペプチドリンカーＬ_１は、少なくとも１個のシステインを含み得る。具体的には、ペプチドリンカーＬ_１は、１個、２個、又は３個のシステインを含み得る。さらに、ペプチドリンカーＬ_１は、免疫グロブリンのヒンジに由来し得る。一実施形態において、ペプチドリンカーＬ_１は、配列番号３又は配列番号３８のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーであり得る。

【0052】

ペプチドリンカーＬ_２は、１個～５０個の連続したアミノ酸、３個～３０個の連続したアミノ酸、又は５個～１５個の連続したアミノ酸からなり得る。一実施形態において、ペプチドリンカーＬ_２は、（Ｇ_４Ｓ）ｎ（式中、ｎは１～１０の整数である）であり得る。ここで、（Ｇ_４Ｓ）ｎにおいて、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０であり得る。一実施形態において、ペプチドリンカーＬ_２は、配列番号５、配列番号３９、又は配列番号５７のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーであり得る。

【0053】

本発明の別の態様において、ＰＤ－１タンパク質とＩＬ－２１タンパク質とを含む融合タンパク質が２つ互いに結びついた融合タンパク質二量体が提供される。ＰＤ－１又はその断片とＩＬ－２１又はその変異体とを含む融合タンパク質は上記の通りである。

【0054】

ここで、二量体を構成する融合タンパク質間の結合は、限定されるものではないが、リンカー中に存在するシステインによって形成されるジスルフィド結合によって達成され得る。二量体を構成する融合タンパク質は、互いに同じ又は異なる融合タンパク質であり得る。好ましくは、二量体はホモ二量体であり得る。二量体を構成する融合タンパク質の一実施形態は、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３２、配列番号３６、配列番号４１、配列番号４４、配列番号５２、配列番号５５、配列番号７６、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８９、配列番号９２、配列番号９７、配列番号１０１、配列番号１０６、配列番号１１０、配列番号１１４、又は配列番号１１８のアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。

【0055】

融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明の別の態様において、ＰＤ－１タンパク質とＩＬ－２１タンパク質とを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。具体的には、このポリヌクレオチドは、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４２、配列番号４５、配列番号５３、配列番号５６、配列番号７７、配列番号８０、配列番号８３、配列番号９０、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０２、配列番号１０７、配列番号１１１、配列番号１１５、又は配列番号１１９のヌクレオチド配列を含み得る。ＰＤ－１タンパク質とＩＬ－２１タンパク質とを含む融合タンパク質は上記の通りである。ポリヌクレオチドにおいて、１つ以上のヌクレオチドが、置換、欠失、挿入、又はそれらの組合せによって突然変異されていてよい。ヌクレオチド配列が化学合成によって調製される場合、Engels and Uhlmann（Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988）に記載されるもの等の当該技術分野においてよく知られる合成方法を使用することができる。このような方法としては、トリエステル法、ホスファイト法、ホスホロアミダイト法、及びＨ－ホスフェート法、ＰＣＲ及び他のオートプライマー法、固体支持体上でのオリゴヌクレオチド合成等を挙げることができる。

【0056】

一実施形態によれば、上記ポリヌクレオチドは、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４２、配列番号４５、配列番号５３、配列番号５６、配列番号７７、配列番号８０、配列番号８３、配列番号９０、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０２、配列番号１０７、配列番号１１１、配列番号１１５、又は配列番号１１９に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約１００％の同一性を有する核酸配列を含み得る。

【0057】

上記ポリヌクレオチドは、シグナル配列又はリーダー配列をコードする核酸を更に含み得る。本明細書において使用される場合、「シグナル配列」という用語は、標的タンパク質の分泌を誘導するシグナルペプチドを指す。シグナルペプチドは翻訳された後に、宿主細胞内で切断される。具体的には、シグナル配列は、小胞体（ＥＲ）膜を越えるタンパク質の移行を開始するアミノ酸配列である。一実施形態において、シグナル配列は配列番号１、配列番号２０、又は配列番号９４のアミノ酸配列を有し得る。

【0058】

シグナル配列は、それらの特質について当該技術分野においてよく知られている。このようなシグナル配列は、典型的には１６個～３０個のアミノ酸残基を含み、このようなアミノ酸残基よりも多い又は少ないアミノ酸残基を含んでいてよい。典型的なシグナルペプチドは、３つの領域、すなわち塩基性Ｎ末端領域と、中央の疎水性領域と、より極性の高いＣ末端領域とから構成される。中央の疎水性領域は、膜脂質二重層を通る未成熟ポリペプチドの移行中にシグナル配列を固定化させる４個～１２個の疎水性残基を含む。

【0059】

開始後、シグナル配列は、一般にシグナルペプチダーゼとして知られる細胞酵素によってＥＲの内腔において切断される。ここで、シグナル配列は、ｔＰａ（組織プラスミノーゲン活性化因子）の分泌シグナル配列、ＨＳＶ ｇＤ（単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄのシグナル配列）、又は成長ホルモンであり得る。好ましくは、哺乳動物等を含む高等真核細胞において使用される分泌シグナル配列を使用することができる。さらに、野生型ＰＤ－１及び／又はＩＬ－２１に含まれるシグナル配列を使用しても、又は宿主細胞において高い発現頻度を有するコドンに置き換えられたシグナル配列を使用してもよい。

【0060】

融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有するベクター
本発明の別の態様において、上記ポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。

【0061】

宿主細胞にベクターを導入して、宿主細胞のゲノムと組換えし、宿主細胞のゲノムに挿入することができる。一方で、ベクターは、エピソームとして自律的に複製可能なポリヌクレオチド配列を含む核酸手段として理解される。ベクターとしては、線状核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＲＮＡベクター、ウイルスベクター、及びそれらの類縁体が挙げられる。ウイルスベクターの例としては、限定されるものではないが、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスが挙げられる。

【0062】

具体的には、ベクターとしては、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等、及び商業的に開発されたプラスミド（ｐＵＣ１８、ｐＢＡＤ、ｐＩＤＴＳＡＭＲＴ－ＡＭＰ等）、Ｅ．コリ（E. coli）由来のプラスミド（ｐＹＧ６０１ＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９等）、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）、ファージＤＮＡ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）、動物ウイルスベクター（レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス等）、昆虫ウイルスベクター（バキュロウイルス等）を挙げることができる。ベクターは宿主細胞に応じてタンパク質の様々な発現レベル及び修飾を示すため、目的に応じて最適な宿主細胞を選択し使用することが好ましい。

【0063】

本明細書において使用される場合、「遺伝子発現」又は標的タンパク質の「発現」という用語は、ＤＮＡ配列の転写、ｍＲＮＡ転写物の翻訳、及び融合タンパク質産物又はそれらの断片の分泌を意味すると理解される。有用な発現ベクターは、ＲｃＣＭＶ（Invitrogen、カールスバッド）又はその変異体であり得る。発現ベクターは、哺乳動物細胞における標的遺伝子の連続的な転写を促進するヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターと、転写後のＲＮＡの安定性レベルを高めるウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列とを含み得る。

【0064】

融合タンパク質を発現する形質転換された細胞
本発明の別の態様において、上記ベクターが導入された形質転換された宿主細胞が提供される。

【0065】

形質転換された細胞についての宿主細胞としては、限定されるものではないが、原核細胞、真核細胞、及び哺乳動物、植物、昆虫、真菌、又は細胞を起源とする細胞を挙げることができる。原核細胞の一例として、Ｅ．コリを使用することができる。さらに、真核細胞の一例として、酵母を使用することができる。さらに、哺乳動物細胞については、ＣＨＯ細胞、Ｆ２Ｎ細胞、ＣＳＯ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｂｏｗｅｓ黒色腫細胞、ＨｅＬａ細胞、９１１細胞、ＡＴ１０８０細胞、Ａ５４９細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞等を使用することができる。しかしながら、哺乳動物細胞はこれらに限定されず、哺乳動物宿主細胞として使用可能であることが当業者に知られているあらゆる細胞を使用することができる。

【0066】

さらに、宿主細胞への発現ベクターの導入には、ＣａＣｌ_２沈殿、ＣａＣｌ_２沈殿においてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の還元剤を使用することによって効率を高めたハナハン法、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、プロトプラスト融合、炭化ケイ素繊維を使用した撹拌、アグロバクテリウム媒介形質転換、ＰＥＧを使用した形質転換、デキストラン硫酸媒介形質転換、リポフェクタミン媒介形質転換、及び乾燥／阻害媒介（dry/inhibition-mediated）形質転換等を使用することができる。

【0067】

上記のように、治療剤としての融合タンパク質の特性を最適化するのに、又はあらゆる他の目的のために、融合タンパク質のグリコシル化パターン（例えば、シアル酸、フコシル化、グリコシル化）を、当業者に知られる方法により、宿主細胞が保有するグリコシル化関連遺伝子を操作することによって調整することができる。

【0068】

融合タンパク質を作製する方法
本発明の別の態様において、形質転換された細胞を培養することを含む、ＰＤ－１タンパク質とＩＬ－２１タンパク質とを含む融合タンパク質を作製する方法が提供される。具体的には、この作製方法は、ｉ）形質転換された細胞を培養して培養産物を得ることと、ｉｉ）培養産物から融合タンパク質を回収することとを含み得る。

【0069】

形質転換された細胞の培養を、当該技術分野においてよく知られる方法を使用して実施することができる。具体的には、培養を回分プロセスにおいて行うことも、又は流加プロセス若しくは反復流加プロセスにおいて連続的に行うこともできる。

【0070】

融合タンパク質又はその二量体の使用
本発明の別の態様において、ＰＤ－１タンパク質とＩＬ－２１タンパク質とを含む融合タンパク質又は融合タンパク質が２つ互いに結びついた融合タンパク質二量体を有効成分として含む、癌を未然防止若しくは処置する、及び／又は治療効果（効力）を高める医薬組成物が提供される。

【0071】

ＰＤ－１タンパク質とＩＬ－２１タンパク質とを含む融合タンパク質又は融合タンパク質が２つ互いに結びついた融合タンパク質二量体は上記の通りである。

【0072】

癌は、結腸直腸癌、黒色腫、胃癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臓癌、胆嚢癌、甲状腺癌、喉頭癌、急性骨髄性白血病、脳腫瘍、神経芽腫、網膜芽細胞腫、頭頸部癌、唾液腺癌、及びリンパ腫からなる群から選択され得る。

【0073】

医薬組成物の好ましい投薬量は、患者の状態及び体重、疾患の重症度、薬物の形態、投与の経路及び期間に応じて変動し、当業者によって適宜選択され得る。本発明の癌を処置又は未然防止する医薬組成物において、有効成分が抗癌活性を示すことができる限り、有効成分は、用法、剤形、配合目的等に応じてあらゆる量（有効量）で含まれ得る。その慣例的な有効量は、組成物の総重量に対して０．００１重量％～２０．０重量％の範囲内で決定されることになる。ここで、「有効量」という用語は、抗癌効果を誘導することができる有効成分の量を指す。このような有効量は当業者の通常の知識の範囲内で実験的に決定され得る。

【0074】

本明細書において使用される場合、「処置」という用語は、治療的処置及び予防的処置の両方を表すのに使用され得る。ここで、予防は、被験体の病理学的病態又は疾患が軽減又は緩和されることを表すのに使用され得る。一実施形態において、「処置」という用語は、ヒトを含む哺乳動物における疾患を処置するための適用又はあらゆる投与形態の両方を含む。さらに、この用語には、疾患又は疾患の進行を抑えるか又は遅らせることが含まれ、疾患が部分的若しくは完全に軽減されるように機能障害若しくは機能喪失を回復若しくは修復し、非効率なプロセスを刺激し、又は重篤な疾患を軽減するという意味が含まれる。

【0075】

本明細書において使用される場合、「効力」という用語は、１つ以上のパラメーター、例えば、１年、５年、又は１０年等の或る特定の期間にわたる生存率又は無病生存率によって決定され得る能力を指す。さらに、パラメーターとしては、被験体における少なくとも１つの腫瘍のサイズの抑制を挙げることができる。

【0076】

バイオアベイラビリティ等の薬物動態パラメーター及びクリアランス速度等の根底にあるパラメーターが効力に影響を与える可能性もある。したがって、「効力の増強」（例えば、効力の向上）は、薬物動態パラメーターの増強及び効力の増強によるものである可能性があり、これらは、試験動物若しくはヒト被験体におけるクリアランス速度及び腫瘍成長を比較することによって、又は生存率、再発率、若しくは無病生存率等のパラメーターを比較することによって測定され得る。

【0077】

本明細書において使用される場合、「治療的有効量」又は「薬学的有効量」という用語は、対象となる疾患を未然防止又は処置するのに有効な化合物又は組成物の量であって、医療処置に適用可能な妥当な便益／リスク比で疾患を処置するのに十分であり、かつ有害作用を引き起こさない量を指す。有効量のレベルは、患者の健康状態、疾患の種類及び重症度、薬物の活性、薬物に対する患者の感受性、投与様式、投与時間、投与経路及び排泄速度、処置期間、併用又は同時使用される薬物、並びに医療分野においてよく知られる他の要因を含む要因に応じて決定され得る。一実施形態において、治療的有効量は、癌を処置するのに有効な薬物の量を意味する。

【0078】

ここで、医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体を更に含んでいてよい。薬学的に許容可能な担体は、担体が患者への送達に適した非毒性物質である限り、いかなる担体であってもよい。担体として、蒸留水、アルコール、脂肪、ワックス、及び不活性固体が含まれていてよい。医薬組成物において、薬学的に許容可能なアジュバント（緩衝剤、分散剤）が含まれていてもよい。

【0079】

具体的には、有効成分に加えて薬学的に許容可能な担体を含めることにより、医薬組成物を、当該技術分野において知られる従来の方法を使用して、その投与経路に応じて非経口製剤に調製することができる。ここで、「薬学的に許容可能な」という用語は、担体が、適用（処方）される被験体が適応可能であるよりも大きな毒性を有しないと同時に、有効成分の活性を阻害しないことを意味する。

【0080】

医薬組成物を非経口製剤へと調製する場合、当該技術分野において知られる方法に従って、適切な担体を用いて注射剤、経皮パッチ剤、経鼻吸入剤、又は坐剤の形態の調剤にすることができる。注射剤にする場合には、適切な担体として、滅菌水、エタノール、グリセロール若しくはプロピレングリコール等のポリオール、又はこれらの混合物を使用することができ、好ましくは、リンガー液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、又は注射用トリエタノールアミン及び５％デキストロースを含む滅菌水等の等張液を使用することができる。医薬組成物の製剤化は当該技術分野において知られており、具体的には、Remington's Pharmaceutical Sciences（第19版、1995年）等を参照することができる。この文献は本明細書の一部とみなされる。

【0081】

医薬組成物の好ましい投薬量は、患者の状態、体重、性別、年齢、重症度、及び投与経路に応じて、１日当たり０．０１μｇ／ｋｇ～１０ｇ／ｋｇ、又は０．０１ｍｇ／ｋｇ～１ｇ／ｋｇの範囲であり得る。投薬量を１日１回で投与しても、又は１日数回に分けてもよい。このような投薬量は、いかなる側面においても本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

【0082】

医薬組成物が適用（処方）され得る被験体は哺乳動物及びヒトであり、ここで、ヒトが特に好ましい。有効成分に加えて、本発明の医薬組成物は、抗癌活性を増強又は強化するのに、安全性が既に検証されていて、かつ抗癌活性に関する治療効果を有することが知られているあらゆる化合物又は天然抽出物を更に含んでいてよい。

【0083】

本発明の別の態様において、癌の処置のための、ＰＤ－１タンパク質とＩＬ－２１タンパク質とを含む融合タンパク質の使用が提供される。

【0084】

本発明の別の態様において、癌に対する治療効果を増強するための、ＰＤ－１タンパク質とＩＬ－２１タンパク質とを含む融合タンパク質の使用が提供される。

【0085】

本発明の別の態様において、癌を処置する医薬の製造のための、ＰＤ－１タンパク質とＩＬ－２１タンパク質とを含む融合タンパク質の使用が提供される。

【0086】

本発明の別の態様において、癌を処置する方法、及び／又は癌に対する治療効果を増強する方法であって、ＰＤ－１タンパク質とＩＬ－２１タンパク質とを含む融合タンパク質又は融合タンパク質が２つ互いに結びついた融合タンパク質二量体を被験体に投与することを含む、方法が提供される。

【0087】

被験体は、癌に罹患している個体であり得る。さらに、被験体は哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。ＰＤ－１タンパク質とＩＬ－２１タンパク質とを含む融合タンパク質又は融合タンパク質が２つ互いに結びついた融合タンパク質二量体は上記の通りである。

【0088】

融合タンパク質又は融合タンパク質二量体の投与経路、投薬量、及び投与回数は、患者の状態及び副作用の有無に応じて変動し得るため、融合タンパク質又は融合タンパク質二量体は、様々な様式及び量において被験体に投与され得る。最適な投与方法、投薬量、及び投与回数は、当業者によって適切な範囲において選択され得る。さらに、融合タンパク質又は融合タンパク質二量体を、治療対象の疾患に関して治療効果が知られている他の薬物若しくは生理学的活性物質と組み合わせて投与することも、又は他の薬物との組合せ調剤の形態で製剤化することもできる。

【0089】

融合タンパク質又はその二量体を含む細胞培養培地
本発明の別の態様において、ＰＤ－１タンパク質とＩＬ－２１タンパク質とを含む融合タンパク質又は融合タンパク質が２つ互いに結びついた融合タンパク質二量体を含む細胞培養培地が提供される。

【0090】

ここで、細胞はＴ細胞又はナチュラルキラー細胞であり得る。細胞培養培地は、ＰＤ－１タンパク質とＩＬ－２１タンパク質とを含む融合タンパク質又は融合タンパク質が２つ互いに結びついた融合タンパク質二量体が補充された細胞培養培地であり得る。細胞培養培地は、アミノ酸、糖、無機塩、及びビタミンからなる群から選択されるいずれか１つを含んでいてよい。好ましくは、細胞培養培地は、アミノ酸、糖、無機塩、及びビタミンを全て含み得る。

【0091】

本明細書において使用される場合、「細胞培養培地」という用語は、細胞を培養するのに使用される培地を指し、具体的には、免疫細胞、より具体的にはＣＤ４^＋Ｔ細胞若しくはＣＤ８^＋Ｔ細胞、又はＮＫ細胞を培養する培地を指す。培地は、細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞の成長及び生存に必要とする成分を含むか、又は細胞の成長及び生存を助ける成分を含む。具体的には、これらの成分はビタミン、必須アミノ酸又は非必須アミノ酸、及び微量元素であり得る。培地は、細胞、好ましくは真核細胞、より好ましくはＴ細胞又はＮＫ細胞を培養するのに使用される培地であり得る。

【0092】

発明を実施するための形態
以下で、以下の実施例によって本発明をより詳細に説明する。しかしながら、以下の実施例は、本発明を例示するものであるにすぎず、本発明の範囲はこれらの実施例のみに限定されるものではない。

【0093】

Ｉ．融合タンパク質：ＢＮＳ００１の調製
調製例１．ｈＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（２９）－ｈＩＬ－２１の調製
ヒトＰＤ－１断片と、持続性Ｆｃ（２９）ドメインと、ＩＬ－２１とを含む融合タンパク質を作製するのに、GenScriptの遺伝子合成サービスを通じてポリヌクレオチドを合成した。具体的には、このポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（配列番号１）と、ＰＤ－１断片（配列番号２）と、リンカーが結合されるＩｇヒンジ（配列番号３）と、Ｆｃ（２９）ドメイン（配列番号４）と、リンカー（配列番号５）と、ＩＬ－２１（配列番号６）とをＮ末端からこの順序で含む融合タンパク質（配列番号７）をコードするヌクレオチド配列（配列番号９）を含む。このポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３．４ ＴＯＰＯベクター（Thermo Fisher Scientific）へと導入した。

【0094】

発現ベクターをＣＨＯ細胞（ＥＸＰＩＣＨＯ－Ｓ（商標）、Thermo Fisher Scientific）へと導入して、融合タンパク質を発現させた。ＣＨＯ細胞に発現ベクターをトランスフェクションし、製造業者のＭａｘ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用して１１日間培養した後、培養液を収集し、そこから融合タンパク質を精製した。精製された融合タンパク質（配列番号８）を「ｈＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（２９）－ｈＩＬ－２１」又は「ＢＮＳ００１（２９）」と命名し、それに伴い、ＰＤ－１とＩＬ－２１とを含む融合タンパク質二量体を総称して「ＢＮＳ００１」と命名した。

【0095】

収集した培養液中の融合タンパク質を、プロテインＡ樹脂（KANEKA）を含むアフィニティークロマトグラフィーを使用して１回目の精製に供した。結合した融合タンパク質及び樹脂をＤＰＢＳバッファーで洗浄した後、結合した融合タンパク質のみを０．１Ｍのグリシンバッファー（ｐＨ３．３）で溶出した。溶出された融合タンパク質をＤＰＢＳバッファーに対して１日間透析してバッファーを交換した後、ＨＩＬＯＡＤ（商標）１６／６００ ＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）２００ｐｇカラム（Cytiva）を使用してサイズ排除クロマトグラフィーを行うことにより２回目の精製に供した。単離及び精製された融合タンパク質を、ＮａｎｏＤｒｏｐを使用して定量し、その純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析によって分析した（図１及び図２）。

【0096】

調製例２．ｈＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（４１）－ｈＩＬ－２１の調製
ヒトＰＤ－１断片と、持続性Ｆｃ（４１）ドメインと、ＩＬ－２１とを含む融合タンパク質を作製するのに、GenScriptの遺伝子合成サービスを通じてポリヌクレオチドを合成した。具体的には、このポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（配列番号１）と、ＰＤ－１断片（配列番号２）と、リンカーが結合されるＩｇヒンジ（配列番号３）と、Ｆｃ（４１）ドメイン（配列番号１０）と、リンカー（配列番号５）と、ＩＬ－２１（配列番号６）とをＮ末端からこの順序で含む融合タンパク質（配列番号１１）をコードするヌクレオチド配列（配列番号１３）を含む。このポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３．４ ＴＯＰＯベクター（Thermo Fisher Scientific）へと導入した。

【0097】

発現ベクターをＣＨＯ細胞（ＥＸＰＩＣＨＯ－Ｓ（商標）、Thermo Fisher Scientific）へと導入して、融合タンパク質を発現させた。ＣＨＯ細胞に発現ベクターをトランスフェクションし、製造業者のＭａｘ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用して１１日間培養した後、培養液を収集し、そこから融合タンパク質を精製した。精製された融合タンパク質（配列番号１２）を「ｈＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（４１）－ｈＩＬ－２１」又は「ＢＮＳ００１（４１）」と命名し、それに伴い、ＰＤ－１とＩＬ－２１とを含む融合タンパク質二量体を総称して「ＢＮＳ００１」と命名した。

【0098】

融合タンパク質の精製及び収集を上記調製例１と同様に行った。単離及び精製された融合タンパク質を、ＮａｎｏＤｒｏｐを使用して定量し、その純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析によって分析した（図１及び図２）。

【0099】

調製例３．ｈＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（ｗｔ）－ｈＩＬ－２１の調製
ヒトＰＤ－１断片と、持続性Ｆｃ（ｗｔ）ドメインと、ＩＬ－２１とを含む融合タンパク質を作製するのに、GenScriptの遺伝子合成サービスを通じてポリヌクレオチドを合成した。具体的には、このポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（配列番号１）と、ＰＤ－１断片（配列番号２）と、リンカーが結合されるＩｇヒンジ（配列番号３）と、Ｆｃ（ｗｔ）ドメイン（配列番号１４）と、リンカー（配列番号５）と、ＩＬ－２１（配列番号６）とをＮ末端からこの順序で含む融合タンパク質（配列番号１５）をコードするヌクレオチド配列（配列番号１７）を含む。このポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３．４ ＴＯＰＯベクター（Thermo Fisher Scientific）へと導入した。

【0100】

発現ベクターをＣＨＯ細胞（ＥＸＰＩＣＨＯ－Ｓ（商標）、Thermo Fisher Scientific）へと導入して、融合タンパク質を発現させた。ＣＨＯ細胞に発現ベクターをトランスフェクションし、製造業者のＭａｘ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用して１１日間培養した後、培養液を収集し、そこから融合タンパク質を精製した。精製された融合タンパク質（配列番号１６）を「ｈＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（ｗｔ）－ｈＩＬ－２１」又は「ＢＮＳ００１（ｗｔ）」と命名し、それに伴い、ＰＤ－１とＩＬ－２１とを含む融合タンパク質二量体を総称して「ＢＮＳ００１」と命名した。

【0101】

融合タンパク質の精製及び収集を上記調製例１と同様に行った。単離及び精製された融合タンパク質を、ＮａｎｏＤｒｏｐを使用して定量し、その純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析によって分析した（図１及び図２）。

【0102】

調製例４．ｍＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（２９）－ｍＩＬ－２１の調製
マウスＰＤ－１断片と、持続性Ｆｃ（２９）ドメインと、ＩＬ－２１とを含む融合タンパク質を作製するのに、GenScriptの遺伝子合成サービスを通じてポリヌクレオチドを合成した。具体的には、このポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（配列番号２０）と、ＰＤ－１断片（配列番号２１）と、リンカーが結合されるＩｇヒンジ（配列番号３）と、Ｆｃ（２９）ドメイン（配列番号４）と、リンカー（配列番号５）と、ＩＬ－２１（配列番号２２）とをＮ末端からこの順序で含む融合タンパク質（配列番号２３）をコードするヌクレオチド配列（配列番号２５）を含む。このポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３．４ ＴＯＰＯベクター（Thermo Fisher Scientific）へと導入した。

【0103】

発現ベクターをＣＨＯ細胞（ＥＸＰＩＣＨＯ－Ｓ（商標）、Thermo Fisher Scientific）へと導入して、融合タンパク質を発現させた。ＣＨＯ細胞に発現ベクターをトランスフェクションし、製造業者のＭａｘ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用して１１日間培養した後、培養液を収集し、そこから融合タンパク質を精製した。精製された融合タンパク質（配列番号２４）を「ｍＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（２９）－ｍＩＬ－２１」又は「ｍＢＮＳ００１（２９）」と命名し、それに伴い、ｍＰＤ－１とｍＩＬ－２１とを含む融合タンパク質二量体を総称して「ＢＮＳ００１」と命名した。融合タンパク質の精製及び収集を上記調製例１と同様に行った。

【0104】

調製例５．ｍＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（ｗｔ）－ｍＩＬ－２１の調製
マウスＰＤ－１断片と、持続性Ｆｃ（ｗｔ）ドメインと、ＩＬ－２１とを含む融合タンパク質を作製するのに、GenScriptの遺伝子合成サービスを通じてポリヌクレオチドを合成した。具体的には、このポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（配列番号２０）と、ＰＤ－１断片（配列番号２１）と、リンカーが結合されるＩｇヒンジ（配列番号３）と、Ｆｃ（ｗｔ）ドメイン（配列番号１４）と、リンカー（配列番号５）と、ＩＬ－２１（配列番号２２）とをＮ末端からこの順序で含む融合タンパク質（配列番号２６）をコードするヌクレオチド配列（配列番号２８）を含む。このポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３．４ ＴＯＰＯベクター（Thermo Fisher Scientific）へと導入した。

【0105】

発現ベクターをＣＨＯ細胞（ＥＸＰＩＣＨＯ－Ｓ（商標）、Thermo Fisher Scientific）へと導入して、融合タンパク質を発現させた。ＣＨＯ細胞に発現ベクターをトランスフェクションし、製造業者のＭａｘ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用して１１日間培養した後、培養液を収集し、そこから融合タンパク質を精製した。精製された融合タンパク質（配列番号２７）を「ｍＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（ｗｔ）－ｍＩＬ－２１」又は「ｍＢＮＳ００１（ｗｔ）」と命名し、それに伴い、ＰＤ－１とＩＬ－２１とを含む融合タンパク質二量体を総称して「ＢＮＳ００１」と命名した。融合タンパク質の精製及び収集を上記調製例１と同様に行った。

【0106】

調製例６．ｈＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（２９）－ｍＩＬ－２１の調製
ヒトＰＤ－１断片と、持続性Ｆｃ（２９）ドメインと、マウスＩＬ－２１とを含む融合タンパク質を作製するのに、GenScriptの遺伝子合成サービスを通じてポリヌクレオチドを合成した。具体的には、このポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（配列番号１）と、ＰＤ－１断片（配列番号２）と、リンカーが結合されるＩｇヒンジ（配列番号３）と、Ｆｃ（２９）ドメイン（配列番号４）と、リンカー（配列番号５）と、マウスＩＬ－２１（配列番号２２）とをＮ末端からこの順序で含む融合タンパク質（配列番号３１）をコードするヌクレオチド配列（配列番号３３）を含む。このポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３．４ ＴＯＰＯベクター（Thermo Fisher Scientific）へと導入した。

【0107】

発現ベクターをＣＨＯ細胞（ＥＸＰＩＣＨＯ－Ｓ（商標）、Thermo Fisher Scientific）へと導入して、融合タンパク質を発現させた。ＣＨＯ細胞に発現ベクターをトランスフェクションし、製造業者のＭａｘ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用して１１日間培養した後、培養液を収集し、そこから融合タンパク質を精製した。精製された融合タンパク質（配列番号３２）を「ｈＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（２９）－ｍＩＬ－２１」と命名し、それに伴い、ＰＤ－１とＩＬ－２１とを含む融合タンパク質二量体を総称して「ＢＮＳ００１」と命名した。融合タンパク質の精製及び収集を上記調製例１と同様に行った。

【0108】

調製例７．ｈＰＤ－１ ＥＣＤ－Ｆｃ（２９）－ｈＩＬ－２１の調製
ヒトＰＤ－１断片と、持続性Ｆｃ（２９）ドメインと、ＩＬ－２１とを含む融合タンパク質を作製するのに、GenScriptの遺伝子合成サービスを通じてポリヌクレオチドを合成した。具体的には、このポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（配列番号１）と、ＰＤ－１断片（配列番号３４）と、リンカーが結合されるＩｇヒンジ（配列番号３）と、Ｆｃ（２９）ドメイン（配列番号４）と、リンカー（配列番号５）と、ＩＬ－２１（配列番号６）とをＮ末端からこの順序で含む融合タンパク質（配列番号３５）をコードするヌクレオチド配列（配列番号３７）を含む。このポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３．４ ＴＯＰＯベクター（Thermo Fisher Scientific）へと導入した。

【0109】

発現ベクターをＣＨＯ細胞（ＥＸＰＩＣＨＯ－Ｓ（商標）、Thermo Fisher Scientific）へと導入して、融合タンパク質を発現させた。ＣＨＯ細胞に発現ベクターをトランスフェクションし、製造業者のＭａｘ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用して１１日間培養した後、培養液を収集し、そこから融合タンパク質を精製した。精製された融合タンパク質（配列番号３６）を「ｈＰＤ－１ ＥＣＤ－Ｆｃ（２９）－ｈＩＬ－２１」と命名し、それに伴い、ＰＤ－１とＩＬ－２１とを含む融合タンパク質二量体を総称して「ＢＮＳ００１」と命名した。融合タンパク質の精製及び収集を上記調製例１と同様に行った。

【0110】

調製例８．ｈＩＬ－２１－Ｆｃ（２９）－ｈＰＤ－１ Ｄの調製
ヒトＩＬ－２１断片と、持続性Ｆｃ（２９）ドメインと、ＰＤ－１断片とを含む融合タンパク質を作製するのに、GenScriptの遺伝子合成サービスを通じてポリヌクレオチドを合成した。具体的には、このポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（配列番号２０）と、ＩＬ－２１（配列番号６）と、リンカーが結合されるＩｇヒンジ（配列番号３８）と、Ｆｃ（２９）ドメイン（配列番号４）と、リンカー（配列番号３９）と、ＰＤ－１断片（配列番号２）とをＮ末端からこの順序で含む融合タンパク質（配列番号４０）をコードするヌクレオチド配列（配列番号４２）を含む。このポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３．４ ＴＯＰＯベクター（Thermo Fisher Scientific）へと導入した。

【0111】

発現ベクターをＣＨＯ細胞（ＥＸＰＩＣＨＯ－Ｓ（商標）、Thermo Fisher Scientific）へと導入して、融合タンパク質を発現させた。ＣＨＯ細胞に発現ベクターをトランスフェクションし、製造業者のＭａｘ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用して１１日間培養した後、培養液を収集し、そこから融合タンパク質を精製した。精製された融合タンパク質（配列番号４１）を「ｈＩＬ－２１－Ｆｃ（２９）－ｈＰＤ－１ Ｄ」と命名し、それに伴い、ＰＤ－１とＩＬ－２１とを含む融合タンパク質二量体を総称して「ＢＮＳ００１」と命名した。融合タンパク質の精製及び収集を上記調製例１と同様に行った。

【0112】

調製例９．ｈＩＬ－２１－Ｆｃ（２９）－ｈＰＤ－１ ＥＣＤの調製
ヒトＩＬ－２１断片と、持続性Ｆｃ（２９）ドメインと、ＰＤ－１断片とを含む融合タンパク質を作製するのに、GenScriptの遺伝子合成サービスを通じてポリヌクレオチドを合成した。具体的には、このポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（配列番号２０）と、ＩＬ－２１（配列番号６）と、リンカーが結合されるＩｇヒンジ（配列番号３８）と、Ｆｃ（２９）ドメイン（配列番号４）と、リンカー（配列番号３９）と、ＰＤ－１断片（配列番号３４）とをＮ末端からこの順序で含む融合タンパク質（配列番号４３）をコードするヌクレオチド配列（配列番号４５）を含む。このポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３．４ ＴＯＰＯベクター（Thermo Fisher Scientific）へと導入した。

【0113】

発現ベクターをＣＨＯ細胞（ＥＸＰＩＣＨＯ－Ｓ（商標）、Thermo Fisher Scientific）へと導入して、融合タンパク質を発現させた。ＣＨＯ細胞に発現ベクターをトランスフェクションし、製造業者のＭａｘ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用して１１日間培養した後、培養液を収集し、そこから融合タンパク質を精製した。精製された融合タンパク質（配列番号４４）を「ｈＩＬ－２１－Ｆｃ（２９）－ｈＰＤ－１ ＥＣＤ」と命名し、それに伴い、ＰＤ－１とＩＬ－２１とを含む融合タンパク質二量体を総称して「ＢＮＳ００１」と命名した。融合タンパク質の精製及び収集を上記調製例１と同様に行った。

【0114】

調製例１０．ｈＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（２９，Ｋ）－ｈＩＬ－２１の調製
ヒトＰＤ－１断片と、持続性Ｆｃ（２９，Ｋ）ドメインと、ＩＬ－２１とを含む融合タンパク質を作製するのに、GenScriptの遺伝子合成サービスを通じてポリヌクレオチドを合成した。具体的には、このポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（配列番号１）と、ＰＤ－１断片（配列番号２）と、リンカーが結合されるＩｇヒンジ（配列番号３）と、Ｆｃ（２９，Ｋ）ドメイン（配列番号５０）と、リンカー（配列番号５）と、ＩＬ－２１（配列番号６）とをＮ末端からこの順序で含む融合タンパク質（配列番号５１）をコードするヌクレオチド配列（配列番号５３）を含む。このポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３．４ ＴＯＰＯベクター（Thermo Fisher Scientific）へと導入した。

【0115】

発現ベクターをＣＨＯ細胞（ＥＸＰＩＣＨＯ－Ｓ（商標）、Thermo Fisher Scientific）へと導入して、融合タンパク質を発現させた。ＣＨＯ細胞に発現ベクターをトランスフェクションし、製造業者のＭａｘ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用して１１日間培養した後、培養液を収集し、そこから融合タンパク質を精製した。精製された融合タンパク質（配列番号５２）を「ｈＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（２９，Ｋ）－ｈＩＬ－２１」と命名し、それに伴い、ＰＤ－１とＩＬ－２１とを含む融合タンパク質二量体を総称して「ＢＮＳ００１」と命名した。融合タンパク質の精製及び収集を上記調製例１と同様に行った。

【0116】

調製例１１．ｈＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（２９，Ｋ）－ｍＩＬ－２１の調製
ヒトＰＤ－１断片と、持続性Ｆｃ（２９，Ｋ）ドメインと、マウスＩＬ－２１断片とを含む融合タンパク質を作製するのに、GenScriptの遺伝子合成サービスを通じてポリヌクレオチドを合成した。具体的には、このポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（配列番号１）と、ＰＤ－１断片（配列番号２）と、リンカーが結合されるＩｇヒンジ（配列番号３）と、Ｆｃ（２９，Ｋ）ドメイン（配列番号５０）と、リンカー（配列番号５）と、ＩＬ－２１（配列番号２２）とをＮ末端からこの順序で含む融合タンパク質（配列番号５４）をコードするヌクレオチド配列（配列番号５６）を含む。このポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３．４ ＴＯＰＯベクター（Thermo Fisher Scientific）へと導入した。

【0117】

発現ベクターをＣＨＯ細胞（ＥＸＰＩＣＨＯ－Ｓ（商標）、Thermo Fisher Scientific）へと導入して、融合タンパク質を発現させた。ＣＨＯ細胞に発現ベクターをトランスフェクションし、製造業者のＭａｘ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用して１１日間培養した後、培養液を収集し、そこから融合タンパク質を精製した。精製された融合タンパク質（配列番号５５）を「ｈＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（２９，Ｋ）－ｍＩＬ－２１」と命名し、それに伴い、ＰＤ－１とＩＬ－２１とを含む融合タンパク質二量体を総称して「ＢＮＳ００１」と命名した。融合タンパク質の精製及び収集を上記調製例１と同様に行った。

【0118】

調製例１２．ｈＰＤ－１ ＥＣＤ－Ｆｃ（ｗｔ）－ｈＩＬ－２１の調製
ヒトＰＤ－１断片と、持続性Ｆｃ（ｗｔ）ドメインと、ＩＬ－２１とを含む融合タンパク質を作製するのに、GenScriptの遺伝子合成サービスを通じてポリヌクレオチドを合成した。具体的には、このポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（配列番号１）と、ＰＤ－１断片（配列番号３４）と、リンカーが結合されるＩｇヒンジ（配列番号３）と、Ｆｃ（ｗｔ）ドメイン（配列番号１４）と、リンカー（配列番号５）と、ＩＬ－２１（配列番号６）とをＮ末端からこの順序で含む融合タンパク質（配列番号７５）をコードするヌクレオチド配列（配列番号７７）を含む。このポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３．４ ＴＯＰＯベクター（Thermo Fisher Scientific）へと導入した。

【0119】

発現ベクターをＣＨＯ細胞（ＥＸＰＩＣＨＯ－Ｓ（商標）、Thermo Fisher Scientific）へと導入して、融合タンパク質を発現させた。ＣＨＯ細胞に発現ベクターをトランスフェクションし、製造業者のＭａｘ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用して１１日間培養した後、培養液を収集し、そこから融合タンパク質を精製した。精製された融合タンパク質（配列番号７６）を「ｈＰＤ－１ ＥＣＤ－Ｆｃ（ｗｔ）－ｈＩＬ－２１」と命名し、それに伴い、ＰＤ－１とＩＬ－２１とを含む融合タンパク質二量体を総称して「ＢＮＳ００１」と命名した。融合タンパク質の精製及び収集を上記調製例１と同様に行った。

【0120】

調製例１３．ｈＩＬ－２１－Ｆｃ（ｗｔ）－ｈＰＤ－１ Ｄの調製
ヒトＩＬ－２１断片と、持続性Ｆｃ（ｗｔ）ドメインと、ＰＤ－１断片とを含む融合タンパク質を作製するのに、GenScriptの遺伝子合成サービスを通じてポリヌクレオチドを合成した。具体的には、このポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（配列番号２０）と、ＩＬ－２１（配列番号６）と、リンカーが結合されるＩｇヒンジ（配列番号３８）と、Ｆｃ（ｗｔ）ドメイン（配列番号１４）と、リンカー（配列番号３９）と、ＰＤ－１断片（配列番号２）とをＮ末端からこの順序で含む融合タンパク質（配列番号７８）をコードするヌクレオチド配列（配列番号８０）を含む。このポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３．４ ＴＯＰＯベクター（Thermo Fisher Scientific）へと導入した。

【0121】

発現ベクターをＣＨＯ細胞（ＥＸＰＩＣＨＯ－Ｓ（商標）、Thermo Fisher Scientific）へと導入して、融合タンパク質を発現させた。ＣＨＯ細胞に発現ベクターをトランスフェクションし、製造業者のＭａｘ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用して１１日間培養した後、培養液を収集し、そこから融合タンパク質を精製した。精製された融合タンパク質（配列番号７９）を「ｈＩＬ－２１－Ｆｃ（ｗｔ）－ｈＰＤ－１ Ｄ」と命名し、それに伴い、ＰＤ－１とＩＬ－２１とを含む融合タンパク質二量体を総称して「ＢＮＳ００１」と命名した。融合タンパク質の精製及び収集を上記調製例１と同様に行った。

【0122】

調製例１４．ｈＩＬ－２１－Ｆｃ（ｗｔ）－ｈＰＤ－１ ＥＣＤの調製
ヒトＩＬ－２１断片と、持続性Ｆｃ（ｗｔ）ドメインと、ＰＤ－１断片とを含む融合タンパク質を作製するのに、GenScriptの遺伝子合成サービスを通じてポリヌクレオチドを合成した。具体的には、このポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（配列番号２０）と、ＩＬ－２１（配列番号６）と、リンカーが結合されるＩｇヒンジ（配列番号３８）と、Ｆｃ（ｗｔ）ドメイン（配列番号１４）と、リンカー（配列番号３９）と、ＰＤ－１断片（配列番号３４）とをＮ末端からこの順序で含む融合タンパク質（配列番号８１）をコードするヌクレオチド配列（配列番号８３）を含む。このポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３．４ ＴＯＰＯベクター（Thermo Fisher Scientific）へと導入した。

【0123】

発現ベクターをＣＨＯ細胞（ＥＸＰＩＣＨＯ－Ｓ（商標）、Thermo Fisher Scientific）へと導入して、融合タンパク質を発現させた。ＣＨＯ細胞に発現ベクターをトランスフェクションし、製造業者のＭａｘ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用して１１日間培養した後、培養液を収集し、そこから融合タンパク質を精製した。精製された融合タンパク質（配列番号８２）を「ｈＩＬ－２１－Ｆｃ（ｗｔ）－ｈＰＤ－１ ＥＣＤ」と命名し、それに伴い、ＰＤ－１とＩＬ－２１とを含む融合タンパク質二量体を総称して「ＢＮＳ００１」と命名した。融合タンパク質の精製及び収集を上記調製例１と同様に行った。

【0124】

調製例１５．ｈＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（ｗｔ，Ｋ）－ｈＩＬ－２１の調製
ヒトＰＤ－１断片と、持続性Ｆｃ（ｗｔ，Ｋ）ドメインと、ＩＬ－２１とを含む融合タンパク質を作製するのに、GenScriptの遺伝子合成サービスを通じてポリヌクレオチドを合成した。具体的には、このポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（配列番号１）と、ＰＤ－１断片（配列番号２）と、リンカーが結合されるＩｇヒンジ（配列番号３）と、Ｆｃ（ｗｔ，Ｋ）ドメイン（配列番号８７）と、リンカー（配列番号５）と、ＩＬ－２１（配列番号６）とをＮ末端からこの順序で含む融合タンパク質（配列番号８８）をコードするヌクレオチド配列（配列番号９０）を含む。このポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３．４ ＴＯＰＯベクター（Thermo Fisher Scientific）へと導入した。

【0125】

発現ベクターをＣＨＯ細胞（ＥＸＰＩＣＨＯ－Ｓ（商標）、Thermo Fisher Scientific）へと導入して、融合タンパク質を発現させた。ＣＨＯ細胞に発現ベクターをトランスフェクションし、製造業者のＭａｘ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用して１１日間培養した後、培養液を収集し、そこから融合タンパク質を精製した。精製された融合タンパク質（配列番号８９）を「ｈＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（ｗｔ，Ｋ）－ｈＩＬ－２１」と命名し、それに伴い、ＰＤ－１とＩＬ－２１とを含む融合タンパク質二量体を総称して「ＢＮＳ００１」と命名した。融合タンパク質の精製及び収集を上記調製例１と同様に行った。

【0126】

調製例１６．ｈＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（ｗｔ，Ｋ）－ｍＩＬ－２１の調製
ヒトＰＤ－１断片と、持続性Ｆｃ（ｗｔ，Ｋ）ドメインと、マウスＩＬ－２１断片とを含む融合タンパク質を作製するのに、GenScriptの遺伝子合成サービスを通じてポリヌクレオチドを合成した。具体的には、このポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（配列番号１）と、ＰＤ－１断片（配列番号２）と、リンカーが結合されるＩｇヒンジ（配列番号３）と、Ｆｃ（ｗｔ，Ｋ）ドメイン（配列番号８７）と、リンカー（配列番号５）と、マウスＩＬ－２１断片（配列番号２２）とをＮ末端からこの順序で含む融合タンパク質（配列番号９１）をコードするヌクレオチド配列（配列番号９３）を含む。このポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３．４ ＴＯＰＯベクター（Thermo Fisher Scientific）へと導入した。

【0127】

発現ベクターをＣＨＯ細胞（ＥＸＰＩＣＨＯ－Ｓ（商標）、Thermo Fisher Scientific）へと導入して、融合タンパク質を発現させた。ＣＨＯ細胞に発現ベクターをトランスフェクションし、製造業者のＭａｘ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用して１１日間培養した後、培養液を収集し、そこから融合タンパク質を精製した。精製された融合タンパク質（配列番号９２）を「ｈＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（ｗｔ，Ｋ）－ｍＩＬ－２１」と命名し、それに伴い、ＰＤ－１とＩＬ－２１とを含む融合タンパク質二量体を総称して「ＢＮＳ００１」と命名した。融合タンパク質の精製及び収集を上記調製例１と同様に行った。

【0128】

調製例１７．ｈＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（２９）Ｒ－ｈＩＬ－２１の調製
ヒトＰＤ－１断片と、持続性Ｆｃ（２９）Ｒドメインと、ヒトＩＬ－２１断片とを含む融合タンパク質を作製するのに、Cosmogenetech Co, Ltdの遺伝子クローニングサービスを通じてポリヌクレオチドを合成した。具体的には、このポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（配列番号９４）と、ＰＤ－１断片（配列番号２）と、リンカーが結合されるＩｇヒンジ（配列番号３）と、Ｆｃ（２９）Ｒドメイン（配列番号９５）と、リンカー（配列番号５）と、ＩＬ－２１断片（配列番号６）とをＮ末端からこの順序で含む融合タンパク質（配列番号９６）をコードするヌクレオチド配列（配列番号９８）を含む。このポリヌクレオチドをＵＣＯＥ－ＧＳベクター（Merck KGaA）へと導入した。

【0129】

発現ベクターをＣＨＯ細胞（ＥＸＰＩＣＨＯ－Ｓ（商標）、Thermo Fisher Scientific）へと導入して、融合タンパク質を発現させた。ＣＨＯ細胞に発現ベクターをトランスフェクションし、製造業者のＭａｘ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用して７日間培養した後、培養液を収集し、そこから融合タンパク質を精製した。精製された融合タンパク質（配列番号９７）を「ｈＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（２９）Ｒ－ｈＩＬ－２１」と命名し、それに伴い、ＰＤ－１とＩＬ－２１とを含む融合タンパク質二量体を総称して「ＢＮＳ００１Ｒ」と命名した。

【0130】

収集した培養液中の融合タンパク質を、プロテインＡ樹脂（Cytiva）を含むアフィニティークロマトグラフィーを使用して１回目の精製に供した。結合した融合タンパク質及び樹脂をＤＰＢＳバッファーで洗浄した後、結合した融合タンパク質のみを０．１Ｍのグリシンバッファー（ｐＨ３．３）で溶出した。溶出した融合タンパク質をＤＰＢＳバッファーに対して１日間透析してバッファーを交換した後、ＮａｎｏＤｒｏｐを使用して定量し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行った。

【0131】

調製例１８．ｈＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（２９）ＲＥ－ｈＩＬ－２１の調製
ヒトＰＤ－１断片と、持続性Ｆｃ（２９）ＲＥドメインと、ヒトＩＬ－２１断片とを含む融合タンパク質を作製するのに、Cosmogenetech Co, Ltdの遺伝子クローニングサービスを通じてポリヌクレオチドを合成した。具体的には、このポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（配列番号９４）と、ＰＤ－１断片（配列番号２）と、リンカーが結合されるＩｇヒンジ（配列番号３）と、Ｆｃ（２９）ＲＥドメイン（配列番号９９）と、リンカー（配列番号５）と、ＩＬ－２１断片（配列番号６）とをＮ末端からこの順序で含む融合タンパク質（配列番号１００）をコードするヌクレオチド配列（配列番号１０２）を含む。このポリヌクレオチドをＵＣＯＥ－ＧＳベクター（Merck KGaA）へと導入した。

【0132】

発現ベクターをＣＨＯ細胞（ＥＸＰＩＣＨＯ－Ｓ（商標）、Thermo Fisher Scientific）へと導入して、融合タンパク質を発現させた。ＣＨＯ細胞に発現ベクターをトランスフェクションし、製造業者のＭａｘ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用して７日間培養した後、培養液を収集し、そこから融合タンパク質を精製した。精製された融合タンパク質（配列番号１０１）を「ｈＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（２９）ＲＥ－ｈＩＬ－２１」と命名し、それに伴い、ＰＤ－１とＩＬ－２１とを含む融合タンパク質二量体を総称して「ＢＮＳ００１ＲＥ」と命名した。融合タンパク質の精製及び収集を上記調製例１７と同様に行った。

【0133】

調製例１９．ｈＰＤ－１ｖ Ｄ－Ｆｃ（２９）ＲＥＡ－ｈＩＬ－２１の調製
ヒトＰＤ－１変異体断片と、持続性Ｆｃ（２９）ＲＥＡドメインと、ヒトＩＬ－２１断片とを含む融合タンパク質を作製するのに、Cosmogenetech Co, Ltdの遺伝子クローニングサービスを通じてポリヌクレオチドを合成した。具体的には、このポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（配列番号９４）と、ＰＤ－１ｖ断片（配列番号１０３）と、リンカーが結合されるＩｇヒンジ（配列番号３）と、Ｆｃ（２９）ＲＥＡドメイン（配列番号１０４）と、リンカー（配列番号５）と、ＩＬ－２１断片（配列番号６）とをＮ末端からこの順序で含む融合タンパク質（配列番号１０５）をコードするヌクレオチド配列（配列番号１０７）を含む。このポリヌクレオチドをＵＣＯＥ－ＧＳベクター（Merck KGaA）へと導入した。

【0134】

発現ベクターをＣＨＯ細胞（ＥＸＰＩＣＨＯ－Ｓ（商標）、Thermo Fisher Scientific）へと導入して、融合タンパク質を発現させた。ＣＨＯ細胞に発現ベクターをトランスフェクションし、製造業者のＭａｘ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用して７日間培養した後、培養液を収集し、そこから融合タンパク質を精製した。精製された融合タンパク質（配列番号１０６）を「ｈＰＤ－１ｖ Ｄ－Ｆｃ（２９）ＲＥＡ－ｈＩＬ－２１」と命名し、それに伴い、ＰＤ－１とＩＬ－２１とを含む融合タンパク質二量体を総称して「ＢＮＳ００１ＲＥＡ」と命名した。融合タンパク質の精製及び収集を上記調製例１７と同様に行った。

【0135】

調製例２０．ｈＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（ｗｔ）Ｒ－ｈＩＬ－２１の調製
ヒトＰＤ－１断片と、持続性Ｆｃ（ｗｔ）Ｒドメインと、ヒトＩＬ－２１断片とを含む融合タンパク質を作製するのに、Cosmogenetech Co, Ltdの遺伝子クローニングサービスを通じてポリヌクレオチドを合成した。具体的には、このポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（配列番号９４）と、ＰＤ－１断片（配列番号２）と、リンカーが結合されるＩｇヒンジ（配列番号３）と、Ｆｃ（ｗｔ）Ｒドメイン（配列番号１０８）と、リンカー（配列番号５）と、ＩＬ－２１断片（配列番号６）とをＮ末端からこの順序で含む融合タンパク質（配列番号１０９）をコードするヌクレオチド配列（配列番号１１１）を含む。このポリヌクレオチドをＵＣＯＥ－ＧＳベクター（Merck KGaA）へと導入した。

【0136】

発現ベクターをＣＨＯ細胞（ＥＸＰＩＣＨＯ－Ｓ（商標）、Thermo Fisher Scientific）へと導入して、融合タンパク質を発現させた。ＣＨＯ細胞に発現ベクターをトランスフェクションし、製造業者のＭａｘ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用して７日間培養した後、培養液を収集し、そこから融合タンパク質を精製した。精製された融合タンパク質（配列番号１１０）を「ｈＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（ｗｔ）Ｒ－ｈＩＬ－２１」と命名し、それに伴い、ＰＤ－１とＩＬ－２１とを含む融合タンパク質二量体を総称して「ＢＮＳ００１ｗＲ」と命名した。融合タンパク質の精製及び収集を上記調製例１７と同様に行った。

【0137】

調製例２１．ｈＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（ｗｔ）ＲＥ－ｈＩＬ－２１の調製
ヒトＰＤ－１断片と、持続性Ｆｃ（ｗｔ）ＲＥドメインと、ヒトＩＬ－２１断片とを含む融合タンパク質を作製するのに、Cosmogenetech Co, Ltdの遺伝子クローニングサービスを通じてポリヌクレオチドを合成した。具体的には、このポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（配列番号９４）と、ＰＤ－１断片（配列番号２）と、リンカーが結合されるＩｇヒンジ（配列番号３）と、Ｆｃ（ｗｔ）ＲＥドメイン（配列番号１１２）と、リンカー（配列番号５）と、ＩＬ－２１断片（配列番号６）とをＮ末端からこの順序で含む融合タンパク質（配列番号１１３）をコードするヌクレオチド配列（配列番号１１５）を含む。このポリヌクレオチドをＵＣＯＥ－ＧＳベクター（Merck KGaA）へと導入した。

【0138】

発現ベクターをＣＨＯ細胞（ＥＸＰＩＣＨＯ－Ｓ（商標）、Thermo Fisher Scientific）へと導入して、融合タンパク質を発現させた。ＣＨＯ細胞に発現ベクターをトランスフェクションし、製造業者のＭａｘ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用して７日間培養した後、培養液を収集し、そこから融合タンパク質を精製した。精製された融合タンパク質（配列番号１１４）を「ｈＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（ｗｔ）ＲＥ－ｈＩＬ－２１」と命名し、それに伴い、ＰＤ－１とＩＬ－２１とを含む融合タンパク質二量体を総称して「ＢＮＳ００１ｗＲＥ」と命名した。融合タンパク質の精製及び収集を上記調製例１７と同様に行った。

【0139】

調製例２２．ｈＰＤ－１ｖ Ｄ－Ｆｃ（ｗｔ）ＲＥＡ－ｈＩＬ－２１の調製
ヒトＰＤ－１変異体断片と、持続性Ｆｃ（ｗｔ）ＲＥＡドメインと、ヒトＩＬ－２１断片とを含む融合タンパク質を作製するのに、Cosmogenetech Co, Ltdの遺伝子クローニングサービスを通じてポリヌクレオチドを合成した。具体的には、このポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（配列番号９４）と、ＰＤ－１ｖ断片（配列番号１０３）と、リンカーが結合されるＩｇヒンジ（配列番号３）と、Ｆｃ（ｗｔ）ＲＥＡドメイン（配列番号１１６）と、リンカー（配列番号５）と、ＩＬ－２１断片（配列番号６）とをＮ末端からこの順序で含む融合タンパク質（配列番号１１７）をコードするヌクレオチド配列（配列番号１１９）を含む。このポリヌクレオチドをＵＣＯＥ－ＧＳベクター（Merck KGaA）へと導入した。

【0140】

発現ベクターをＣＨＯ細胞（ＥＸＰＩＣＨＯ－Ｓ（商標）、Thermo Fisher Scientific）へと導入して、融合タンパク質を発現させた。ＣＨＯ細胞に発現ベクターをトランスフェクションし、製造業者のＭａｘ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用して７日間培養した後、培養液を収集し、そこから融合タンパク質を精製した。精製された融合タンパク質（配列番号１１８）を「ｈＰＤ－１ｖ Ｄ－Ｆｃ（ｗｔ）ＲＥＡ－ｈＩＬ－２１」と命名し、それに伴い、ＰＤ－１とＩＬ－２１とを含む融合タンパク質二量体を総称して「ＢＮＳ００１ｗＲＥＡ」と命名した。融合タンパク質の精製及び収集を上記調製例１７と同様に行った。

【0141】

ＩＩ．ＢＮＳ００１融合タンパク質の純度分析
実験例１．ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析
単離及び精製された融合タンパク質の純度を確認するのに、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ実験を行った。ＵＶ検出器を備えたWatersのＡｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣシステムにおいてサイズ排除ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を実施した。カラム（ＴＳＫ Ｇ３０００ ＳＷ_ＸＬ、５μｍのＳＥＣカラム）をTosoh Bioscienceから購入した。１００ｍＭのＮａＰｉ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）を移動相として使用した。１００％のアイソクラティックな移動条件下で０．５ｍＬ／分の流量にて２８０ｎｍの波長での吸光度を経時的に測定することによって、融合タンパク質の純度を分析した（図２）。

【0142】

単離及び精製されたＢＮＳ００１融合タンパク質は、９８％以上の純度を有することが確認された（図２）。

【0143】

ＩＩＩ．ＢＮＳ００１融合タンパク質の濃度分析
実験例２．濃度分析
融合タンパク質を０．２ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ、０．６ｍｇ／ｍＬ、０．８ｍｇ／ｍＬ、及び１．０ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した。ＵＶ吸光度を、紫外分光光度計（Ｌｉｔｔｌｅ ｌｕｎａｔｉｃ、Unchained Labs）を使用して２３０ｎｍ～４００ｎｍの波長範囲で測定した。各濃度の融合タンパク質を０．２ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した後、酸加水分解を行った。加水分解されたアミノ酸を誘導体化し、WatersのＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステムを使用してＵＰＬＣ（超高速液体クロマトグラフィー）を実施した。使用したカラムはＡｃｃＱ－Ｔａｇ Ｕｌｔｒａ ＲＰカラム（２．１ｍｍ×１００ｍｍ、１．７μｍ、１３０Å）であった。使用した移動相Ａは５％のＡｃｃＱ－ｔａｇ Ａ溶媒であり、使用した移動相ＢはＡｃｃＱ－ｔａｇ Ｂ溶媒であり、勾配系を７．５分間にわたって９９．９：０．１から始まり４０．４：５９．６で終わるＡ：Ｂ比を使用して行った。試料注入容量は１μｌであり、流量は０．７ｍＬ／分であり、カラム温度は５５℃であった。データシステムにはＥｎｐｏｗｅｒ ３ソフトウェアが使用され、試料の前処理工程において加えた標準溶液（Ｉ．Ｓ．）にデータをフィッティングさせた。

【0144】

単離及び精製されたＢＮＳ００１融合タンパク質の吸光度に応じて含有量を調べることにより吸光係数を決定した。吸光係数を使用して融合タンパク質の濃度を確認したところ、２．０８ｍｇ／ｍＬ～２．２２ｍｇ／ｍＬの濃度で融合タンパク質が含まれることが確認された（図３）。

【0145】

ＩＶ．ＢＮＳ００１融合タンパク質の物性分析
実験例３．熱力学的安定性分析
単離及び精製された融合タンパク質の熱力学的安定性を確認するのに、蛍光検出器、静的光散乱（ＳＬＳ）検出器、及び動的光散乱（ＤＬＳ）検出器を備えたUNCHAINED LABSのＵＮｃｌｅ分光光度計システムを使用して、Ｔ_ｍ、Ｔ_ａｇｇ、及びＴ_{ｏｎｓｅｔ}の分析を行った。融合タンパク質用のバッファーを、超純水を使用して交換し、タンパク質濃度がUNCHAINED LABSのＬｉｔｔｌｅ Ｌｕｎａｔｉｃ機器を使用した分析に必要とされるタンパク質濃度の１．２５倍となるように試料を調製した。超純水を使用して、調製した試料を１．２５倍に希釈し、製剤化バッファーを５倍に希釈した。調製した試料をＵｎｉ（UNCHAINED LABS）にロードし、１５℃～９５℃の温度にて２６６ｎｍの波長で蛍光検出器及びＳＬＳ検出器を用いてＴ_ｍ、Ｔ_ａｇｇ、及びＴ_{ｏｎｓｅｔ}を測定した。UNCHAINED LABSのソフトウェアＵｎｃｌｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｖ４．０１を使用してデータを分析した。

【0146】

単離及び精製されたＢＮＳ００１融合タンパク質の熱力学的安定性は図４に示されるように測定された。

【0147】

実験例４．構造安定性分析
単離及び精製された融合タンパク質の構造安定性を確認するのに、ＦＴ－ＩＲ分光光度計（ThermoのＮｉｃｏｌｅｔ ＩＳ５０、一回反射型ＡＴＲダイヤモンドクリスタル付属）を使用して、二次構造分析を行った。融合タンパク質濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように試料を調製した。ＦＴ－ＩＲ機器の分析条件を４ｃｍ^－１の位相分解能及び１ｃｍ^－１のデータ間隔に設定し、測定を５００ｃｍ^－１～４０００ｃｍ^－１の範囲において１２８回繰り返した。融合タンパク質の二次構造含量を分析するのに、１７００ｃｍ^－１～１６００ｃｍ^－１の範囲におけるゼロ次ＦＴ－ＩＲスペクトルデータを使用した。このとき、ＡＴＲサンプリングアクセサリーを使用して分析を行ったため、最初に取得されたＦＴ－ＩＲスペクトルデータに対してＡＴＲ補正を行い、補正後に得られた減算スペクトルから２３００ｃｍ^－１での水蒸気バンドを除去した。さらに、最終的なゼロ次ＦＴ－ＩＲスペクトルを、ベースライン補正及び１１点のSavitzky-Golay関数によるフィッティングによって取得した。ＦＴ－ＩＲ分析を通じて得られたゼロ次ＦＴ－ＩＲスペクトルのうち、１７００ｃｍ^－１～１６００ｃｍ^－１の範囲におけるデータを、線形フィット関数を使用して計算して二次微分スペクトルを得た。二次微分スペクトルからピークを抽出し、抽出したピークをガウス関数とフィッティングした。ピークのサイズ及び位置を３％の許容誤差で調整して、最終的に抽出されたスペクトルを取得した。二次構造を波数に応じて二次微分スペクトルから抽出されたピークに割り当て、割り当てられたピークについてピーク面積を計算して各試料中の二次構造含量を計算した。

【0148】

単離及び精製されたＢＮＳ００１融合タンパク質の二次構造分析は図５に示されるように測定された。

【0149】

実験例５．分子量分析
マトリックス支援レーザー脱離／イオン化法飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析によって融合タンパク質の分子量を確認した。ＤＰＢＳ（ｐＨ７．１５）をバッファーとして使用し、融合タンパク質の濃度を１ｍｇ／ｍＬに希釈し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ（商標）５８００システム（AB SCIEX）を使用して測定した。モードとしてはポジティブイオンリニアモードを使用し、標準材料としてＩｇＧ１（電荷＋２、平均７４２４９）及びＩｇＧ１（電荷＋１、平均１４８５００）の混合物を使用した。使用したマトリックスは、１０ｍｇ／ｍＬの濃度のシナピン酸（０．１％のＴＦＡ／３０％のＡＣＮ）であり、ｚｉｐ－ｔｉｐで前処理した後、融合タンパク質試料をマトリックスと１：５の比率で混合し、６つのスポットをプレートに注入した。Ｄａｔａ ｅｘｐｌｏｒｅｒバージョン４．１１（AB SCIEX）を使用してデータを分析し、プログラムにおいて６回蓄積することによってデータを導き出した。２０ｋＤａから２００ｋＤａまでの分子量範囲（ｍ／ｚ）を測定した。

【0150】

単離及び精製されたＢＮＳ００１融合タンパク質のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析は図６に示されるように測定された。

【0151】

Ｖ．ＢＮＳ００１融合タンパク質とリガンド又は受容体との間の速度論的結合親和性の確認
ＢＮＳ００１融合タンパク質とリガンドとの速度論的結合親和性を確認するのに、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（GE Healthcare）を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によって結合親和性を測定した。

【0152】

実験例６．ｈＰＤ－Ｌ１リガンドとＢＮＳ００１融合タンパク質との間の結合親和性の確認
ＰＤ－Ｌ１リガンドをＣ_２Ｈ_３ＮａＯ_２（ｐＨ４．０、ｐＨ５．５）中で３μｇ／ｍＬ～４μｇ／ｍＬに希釈し、ＨＢＳ－ＥＰ（ｐＨ７．４）で事前に活性化したＣＭ５センサーチップ（GE Healthcare）上でアミンカップリングを使用して約１０００ＲＵまで固定化した。ＨＢＳ－ＥＰ（ｐＨ７．４）を用いて０．７８ｎＭから２００ｎＭまでの様々な濃度範囲で調製されたＢＮＳ００１融合タンパク質の希釈溶液を流すことによって、センサーグラムを記録した。ＢＮＳ００１融合タンパク質とＰＤ－Ｌ１リガンドとの間の結合を、３０μｌ／分の流量にて５分間の会合期間及び１０分間の解離期間で測定した。各実行の間に１０ｍＭのＮａＯＨを注入することによってセンサーチップ表面を再生した。データ分析ソフトウェア（Ｖｅｒ３．２）を使用して結合動態を分析し、１：１結合モデルを使用してデータをフィッティングした。

【0153】

結果として、ｈＰＤ－Ｌ１リガンドとＢＮＳ００１融合タンパク質との間の結合親和性は図７に示されるように測定された。

【0154】

実験例７．ｈＰＤ－Ｌ１リガンドとｈＰＤ－１タンパク質との間の結合親和性の確認
ＢＮＳ００１融合タンパク質とｈＰＤ－Ｌ１リガンドとの間の結合親和性の強さを確認するのに、ｈＰＤ－１タンパク質とｈＰＤ－Ｌ１リガンドとの間の結合親和性を比較した。ＰＤ－Ｌ１リガンドをＣ_２Ｈ_３ＮａＯ_２（ｐＨ４．０、ｐＨ５．５）中で３μｇ／ｍＬ～４μｇ／ｍＬに希釈し、ＨＢＳ－ＥＰ（ｐＨ７．４）で事前に活性化したＣＭ５センサーチップ（GE Healthcare）上でアミンカップリングを使用して約１０００ＲＵまで固定化した。ＨＢＳ－ＥＰ（ｐＨ７．４）を用いて０．７８ｎＭから２００ｎＭまでの様々な濃度範囲で調製されたｈＰＤ－１タンパク質の希釈溶液を流すことによって、センサーグラムを記録した。ｈＰＤ－Ｌ１リガンドとｈＰＤ－１タンパク質との間の結合を、３０μｌ／分の流量にて５分間の会合期間及び１０分間の解離期間で測定した。各実行の間に１０ｍＭのＮａＯＨを注入することによってセンサーチップ表面を再生した。データ分析ソフトウェア（Ｖｅｒ３．２）を使用して結合動態を分析し、１：１結合モデルを使用してデータをフィッティングした。

【0155】

結果として、ｈＰＤ－Ｌ１リガンドとｈＰＤ－１タンパク質との間の結合親和性は図８に示されるように測定された。ＢＮＳ００１融合タンパク質とｈＰＤ－Ｌ１リガンドとの間の結合親和性は、ｈＰＤ－１タンパク質とｈＰＤ－Ｌ１リガンドとの間の結合親和性よりもおよそ１０倍高いことが確認された。

【0156】

実験例８．ｈＰＤ－Ｌ２リガンドとＢＮＳ００１融合タンパク質との間の結合親和性の確認
ＰＤ－Ｌ２リガンドをＣ_２Ｈ_３ＮａＯ_２（ｐＨ４．０、ｐＨ５．５）中で３μｇ／ｍＬ～４μｇ／ｍＬに希釈し、ＨＢＳ－ＥＰ（ｐＨ７．４）で事前に活性化したＣＭ５センサーチップ（GE Healthcare）上でアミンカップリングを使用して約１０００ＲＵまで固定化した。ＨＢＳ－ＥＰ（ｐＨ７．４）を用いて０．７８ｎＭから２００ｎＭまでの様々な濃度範囲で調製されたＢＮＳ００１融合タンパク質の希釈溶液を流すことによって、センサーグラムを記録した。ＢＮＳ００１融合タンパク質とＰＤ－Ｌ２リガンドとの間の結合を、３０μｌ／分の流量にて５分間の会合期間及び１０分間の解離期間で測定した。各実行の間に１０ｍＭのＮａＯＨを注入することによってセンサーチップ表面を再生した。データ分析ソフトウェア（Ｖｅｒ３．２）を使用して結合動態を分析し、１：１結合モデルを使用してデータをフィッティングした。

【0157】

結果として、ｈＰＤ－Ｌ２リガンドとＢＮＳ００１融合タンパク質との間の結合親和性は図９に示されるように測定された。

【0158】

実験例９．ｈＰＤ－Ｌ２リガンドとｈＰＤ－１タンパク質との間の結合親和性の確認
ＢＮＳ００１融合タンパク質とｈＰＤ－Ｌ２リガンドとの間の結合親和性の強さを確認するのに、ｈＰＤ－１タンパク質とｈＰＤ－Ｌ２リガンドとの間の結合親和性を比較した。ＰＤ－Ｌ２リガンドをＣ_２Ｈ_３ＮａＯ_２（ｐＨ４．０、ｐＨ５．５）中で３μｇ／ｍＬ～４μｇ／ｍＬに希釈し、ＨＢＳ－ＥＰ（ｐＨ７．４）で事前に活性化したＣＭ５センサーチップ（GE Healthcare）上でアミンカップリングを使用して約１０００ＲＵまで固定化した。ＨＢＳ－ＥＰ（ｐＨ７．４）を用いて０．７８ｎＭから２００ｎＭまでの様々な濃度範囲で調製されたｈＰＤ－１タンパク質の希釈溶液を流すことによって、センサーグラムを記録した。ｈＰＤ－Ｌ２リガンドとｈＰＤ－１タンパク質との間の結合を、３０μｌ／分の流量にて５分間の会合期間及び１０分間の解離期間で測定した。各実行の間に１０ｍＭのＮａＯＨを注入することによってセンサーチップ表面を再生した。データ分析ソフトウェア（Ｖｅｒ３．２）を使用して結合動態を分析し、１：１結合モデルを使用してデータをフィッティングした。

【0159】

結果として、ｈＰＤ－Ｌ２リガンドとｈＰＤ－１タンパク質との間の結合親和性は図１０に示されるように測定された。ＢＮＳ００１融合タンパク質とｈＰＤ－Ｌ２リガンドとの間の結合親和性は、ｈＰＤ－１タンパク質とｈＰＤ－Ｌ２リガンドとの間の結合親和性よりもおよそ１０倍高いことが確認された。

【0160】

実験例１０．ｈＩＬ－２１受容体とＢＮＳ００１融合タンパク質との間の結合親和性の確認
ｈＩＬ－２１受容体をＣ_２Ｈ_３ＮａＯ_２（ｐＨ４．０、ｐＨ５．５）中で３μｇ／ｍＬ～４μｇ／ｍＬに希釈し、ＨＢＳ－ＥＰ（ｐＨ７．４）で事前に活性化したＣＭ５センサーチップ（GE Healthcare）上でアミンカップリングを使用して約１０００ＲＵまで固定化した。ＨＢＳ－ＥＰ（ｐＨ７．４）を用いて０．７８ｎＭから２００ｎＭまでの様々な濃度範囲で調製されたＢＮＳ００１融合タンパク質の希釈溶液を流すことによって、センサーグラムを記録した。ＢＮＳ００１融合タンパク質とｈＩＬ－２１受容体との間の結合を、３０μｌ／分の流量にて５分間の会合期間及び１０分間の解離期間で測定した。各実行の間に１０ｍＭのＮａＯＨを注入することによってセンサーチップ表面を再生した。データ分析ソフトウェア（Ｖｅｒ３．２）を使用して結合動態を分析し、１：１結合モデルを使用してデータをフィッティングした。

【0161】

結果として、ｈＩＬ－２１受容体とＢＮＳ００１融合タンパク質との間の結合親和性は図１１に示されるように測定された。

【0162】

実験例１１．ｈＩＬ－２１受容体とｈＩＬ－２１タンパク質との間の結合親和性の確認
ＢＮＳ００１融合タンパク質とｈＩＬ－２１受容体との間の結合親和性の強さを確認するのに、ｈＩＬ－２１タンパク質とｈＩＬ－２１受容体との間の結合親和性を比較した。ｈＩＬ－２１受容体をＣ_２Ｈ_３ＮａＯ_２（ｐＨ４．０、ｐＨ５．５）中で３μｇ／ｍＬ～４μｇ／ｍＬに希釈し、ＨＢＳ－ＥＰ（ｐＨ７．４）で事前に活性化したＣＭ５センサーチップ（GE Healthcare）上でアミンカップリングを使用して約１０００ＲＵまで固定化した。ＨＢＳ－ＥＰ（ｐＨ７．４）を用いて０．０４ｎＭから５ｎＭまでの様々な濃度範囲で調製されたｈＩＬ－２１タンパク質の希釈溶液を流すことによって、センサーグラムを記録した。ｈＩＬ－２１受容体とｈＩＬ－２１タンパク質との間の結合を、３０μｌ／分の流量にて５分間の会合期間及び１０分間の解離期間で測定した。各実行の間に１０ｍＭのＮａＯＨを注入することによってセンサーチップ表面を再生した。データ分析ソフトウェア（Ｖｅｒ３．２）を使用して結合動態を分析し、１：１結合モデルを使用してデータをフィッティングした。

【0163】

結果として、ｈＩＬ－２１受容体とｈＩＬ－２１タンパク質との間の結合親和性は図１２に示されるように測定された。ＢＮＳ００１融合タンパク質とｈＩＬ－２１受容体との間の結合親和性は、ｈＩＬ－２１タンパク質とｈＩＬ－２１受容体との間の結合親和性よりもおよそ１００倍低いことが確認された。

【0164】

実験例１２．ｈＦｃＲｎ受容体とＢＮＳ００１融合タンパク質との間の結合親和性の確認
ｈＦｃＲｎ受容体をＣ_２Ｈ_３ＮａＯ_２（ｐＨ５．０）中で５μｇ／ｍＬに希釈し、２０ｍＭのリン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．０及びｐＨ７．４）で事前に活性化したＣＭ５センサーチップ（GE Healthcare）上でアミンカップリングを使用して約１０００ＲＵまで固定化した。２０ｍＭのリン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ｐＨ６．０）を用いて０．７８ｎＭから１００ｎＭまでの様々な濃度範囲で調製された融合タンパク質の希釈溶液を流すことによって、センサーグラムを記録した。融合タンパク質との結合を、３０μｌ／分の流量にて４分間の会合期間及び１０分間の解離期間で測定した。各実行の間に５０ｍＭのＮａＯＨを注入することによってセンサーチップ表面を再生した。データ分析ソフトウェア（Ｖｅｒ３．２）を使用して結合動態を分析し、１：１結合モデルを使用してデータをフィッティングした。

【0165】

結果として、ｈＦｃＲｎ受容体とＢＮＳ００１融合タンパク質との間の結合親和性は図１３に示されるように測定された。ＢＮＳ００１融合タンパク質のうち、ＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（２９）－ＩＬ－２１タンパク質及びＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（４１）－ＩＬ－２１タンパク質は、ＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（ｗｔ）－ＩＬ－２１及びＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃタンパク質よりも強いｈＦｃＲｎ受容体に対する結合親和性を有することが確認された。

【0166】

ＶＩ．ＢＮＳ００１融合タンパク質とリガンド又は受容体との間の免疫学的結合親和性の確認
ＢＮＳ００１融合タンパク質とリガンドとの間の結合親和性を確認するのに、免疫学的分析によって結合親和性を測定した。

【0167】

実験例１３．ＥＬＩＳＡ分析によるＢＮＳ００１融合タンパク質とＰＤ－Ｌ１リガンドとの間の結合親和性の確認
１００ｎｇ／ｍＬの濃度の０．１ｍＬのＰＤ－Ｌ１－Ｆｃリガンドを９６ウェルプレート（高結合型プレート、Corning、番号ＣＴ９０１８）上に４℃で１６時間固定化した後、２５０μｌのブロッキングバッファーで室温にて２時間ブロッキングした。ブロッキング後、３００μｌの洗浄バッファーを用いて洗浄プロセスを４回行った。次に、段階希釈したＢＮＳ００１融合タンパク質を５０μｌのアリコートに分けた後、５０μｌの試料希釈物を加えた。２５ｎｇ／ｍＬに希釈した検出抗体（ビオチン化ヤギ抗ヒトＩＬ－２１抗体）を１ウェル当たり５０μｌ加え、室温で２時間反応させた。反応が完了した後、プレートを４００μｌの洗浄バッファーで４回洗浄し、残りの溶液を完全に除去した。ストレプトアビジン－ＨＲＰを１×アッセイバッファーを使用して１：２００の比で希釈したものをウェルに１００μｌ加え、室温で１時間反応させた。反応が完了した後、プレートを４００μｌの洗浄バッファーで４回洗浄し、残りの溶液を完全に除去した。各ウェルを１００μｌのＴＭＢ溶液で処理した後、遮光しながら反応を室温で３０分間行った。反応後、各ウェルに１００μｌの停止溶液を加え、プレートリーダー（波長：４５０ｎｍ）を使用して吸光度を測定した。このとき、各実験を２連で実施した。

【0168】

ＥＬＩＳＡ分析の結果として、ＢＮＳ００１融合タンパク質とＰＤ－Ｌ１リガンドとの間の結合親和性は図１４に示されるように測定された。

【0169】

実験例１４．ＥＬＩＳＡ分析によるＢＮＳ００１融合タンパク質とＰＤ－Ｌ２リガンドとの間の結合親和性の確認
１００ｎｇ／ｍＬの濃度の０．１ｍＬのＰＤ－Ｌ２－Ｆｃリガンドを９６ウェルプレート（高結合型プレート、Corning、番号ＣＴ９０１８）上に４℃で１６時間固定化した後、２５０μｌのブロッキングバッファーで室温にて２時間ブロッキングした。ブロッキング後、３００μｌの洗浄バッファーを用いて洗浄プロセスを４回行った。次に、段階希釈したＢＮＳ００１融合タンパク質を５０μｌのアリコートに分けた後、５０μｌの試料希釈物を加えた。２５ｎｇ／ｍＬに希釈した検出抗体（ビオチン化ヤギ抗ヒトＩＬ－２１抗体）を１ウェル当たり５０μｌ加え、室温で２時間反応させた。反応が完了した後、プレートを４００μｌの洗浄バッファーで４回洗浄し、残りの溶液を完全に除去した。ストレプトアビジン－ＨＲＰを１×アッセイバッファーを使用して１：２００の比で希釈したものをウェルに１００μｌ加え、室温で１時間反応させた。反応が完了した後、プレートを４００μｌの洗浄バッファーで４回洗浄し、残りの溶液を完全に除去した。各ウェルを１００μｌのＴＭＢ溶液で処理した後、遮光しながら反応を室温で３０分間行った。反応後、各ウェルに１００μｌの停止溶液を加え、プレートリーダー（波長：４５０ｎｍ）を使用して吸光度を測定した。このとき、各実験を２連で実施した。

【0170】

ＥＬＩＳＡ分析の結果として、ＢＮＳ００１融合タンパク質とＰＤ－Ｌ２リガンドとの間の結合親和性は図１５に示されるように測定された。

【0171】

実験例１５．ＥＬＩＳＡ分析によるＢＮＳ００１融合タンパク質とＩＬ－２１受容体との間の結合親和性の確認
１００ｎｇ／ｍＬの濃度の０．１ｍＬのＩＬ－２１受容体を９６ウェルプレート（高結合型プレート、Corning、番号ＣＴ９０１８）上に４℃で１６時間固定化した後、２５０μｌのブロッキングバッファーで室温にて２時間ブロッキングした。ブロッキング後、３００μｌの洗浄バッファーを用いて洗浄プロセスを４回行った。次に、段階希釈したＢＮＳ００１融合タンパク質を５０μｌのアリコートに分けた後、５０μｌの試料希釈物を加えた。２５ｎｇ／ｍＬに希釈した検出抗体（ビオチン化ヤギ抗ヒトＰＤ－１抗体）を１ウェル当たり５０μｌ加え、室温で２時間反応させた。反応が完了した後、プレートを４００μｌの洗浄バッファーで４回洗浄し、残りの溶液を完全に除去した。ストレプトアビジン－ＨＲＰを１×アッセイバッファーを使用して１：２００の比で希釈したものをウェルに１００μｌ加え、室温で１時間反応させた。反応が完了した後、プレートを４００μｌの洗浄バッファーで４回洗浄し、残りの溶液を完全に除去した。各ウェルを１００μｌのＴＭＢ溶液で処理した後、遮光しながら反応を室温で３０分間行った。反応後、各ウェルに１００μｌの停止溶液を加え、プレートリーダー（波長：４５０ｎｍ）を使用して吸光度を測定した。このとき、各実験を２連で実施した。

【0172】

ＥＬＩＳＡ分析の結果として、ＢＮＳ００１融合タンパク質とＩＬ－２１受容体との間の結合親和性は図１６に示されるように測定された。

【0173】

実験例１６．ＦｃＲｎ結合イムノアッセイによるＢＮＳ００１融合タンパク質とＦｃＲｎ受容体との間の結合親和性の確認
ＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）に対するエフェクター機能を示し得るＢＮＳ００１融合タンパク質のＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）に対する結合力を測定するのに、PromegaのＬＵＭＩＴ（商標）ＦｃＲｎ結合イムノアッセイキットを使用して分析を行った。ＦｃＲｎはｐＨ依存的な結合力を有することが知られているため、ＢＮＳ００１融合タンパク質を、ｐＨ調整バッファーを使用してｐＨ６．０に調整し、ＦｃＲｎアッセイバッファーを用いてそれぞれの濃度で希釈することによって調製した。キット中のＴｒａｃｅｒ－ＬｇＢｉｔ溶液を各ウェルに２５μｌを分注し、それぞれの濃度で希釈されたＢＮＳ００１融合タンパク質を各ウェルに２５μｌを分注した。その後、キット中のｈＦｃＲｎ－ＳｍＢｉＴ溶液を各ウェルに５０μｌを分注し、室温で１時間反応させ、ＬＵＭＩＴ（商標）ＦｃＲｎ検出試薬を各ウェルに２５μｌ加え、５分間反応させた。反応後、これをＳｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２（BioTek）を使用して分析した。

【0174】

ＬＵＭＩＴ（商標）ＦｃＲｎ結合イムノアッセイ分析の結果として、ＢＮＳ００１融合タンパク質とＦｃＲｎ受容体との間の結合親和性は図１７に示されるように測定された。

【0175】

ＶＩＩ．細胞ベースのアッセイによるＢＮＳ００１融合タンパク質とＩＬ－２１受容体との間の結合親和性の確認
実験例１７．ＢＮＳ００１融合タンパク質とＩＬ－２１受容体との間の細胞ベースの結合親和性の確認
ＩＬ－２１受容体に対するＢＮＳ００１融合タンパク質の結合親和性を、ＰＡＴＨＨＵＮＴＥＲ（商標）ｅＸｐｒｅｓｓ二量体化アッセイキット（Dimerization Assay Kit）（Eurofins）を使用して測定し、液体窒素中で貯蔵されたＰＡＴＨＨＵＮＴＥＲ（商標）ｅＸｐｒｅｓｓ二量体化細胞（Dimerization Cells）を、温めた細胞プレーティング試薬を使用して解凍した。解凍した細胞を９６ウェルプレート（SPL）へと１００μｌずつ分注し、それぞれの濃度のＢＮＳ００１融合タンパク質で処理した後、各ウェルを１１０μｌのＰＡＴＨＨＵＮＴＥＲ（商標）フラッシュ検出試薬（Flash Detection reagent）で処理した。処理後、室温及び暗所の条件で１時間反応を行った。反応後、化学発光をＳｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２（BioTek）を使用して測定した。測定された値に基づいて、融合タンパク質についてのＥＣ_５０（半最大有効濃度、薬物が投与に際して有し得る最大効果の約半分を示す薬物の濃度）値を確認した。

【0176】

ＰＡＴＨＨＵＮＴＥＲ（商標）ｅＸｐｒｅｓｓ二量体化アッセイ測定の結果として、ＢＮＳ００１融合タンパク質とＩＬ－２１受容体との間の結合親和性は図１８に示されるように測定された。

【0177】

ＶＩＩＩ．ＢＮＳ００１融合タンパク質の免疫活性の確認
実験例１８．ＢＮＳ００１融合タンパク質によるＩＦＮ－γ産生の確認
実験例１８．１．ＰＢＭＣの培養
ヒトから分離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を活性培養するのに、ＰＢＭＣを解凍する前日に、Ｔ７５フラスコを、培養培地（１０％のＦＢＳ、２００μｌのペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）中の抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、１μｇ／ｍｌ、Invitrogen）及び抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２、１μｇ／ｍｌ、Invitrogen）で一緒に処理し、４℃で一晩コーティングした。翌日、ＰＢＭＣを３７℃でゆっくり解凍し、１５００ｒｐｍで４℃にて５分間遠心分離し、ＲＰＭＩ１６４０培養培地（１０％のＦＢＳ、２００μｌのペニシリン／ストレプトマイシン、抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体（各１μｇ／ｍｌ））中で再懸濁し、インキュベーター内で３７℃及び５％のＣＯ_２にて培養した。このとき、抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体（各１μｇ／ｍｌ）を用いた又は用いない処理の条件下で、細胞をＢＮＳ００１融合タンパク質及びＩＬ－２１で処理し、インキュベーター内で３日間培養した。

【0178】

実験例１８．２．ＥＬＩＳＡ分析によるヒトＩＦＮ－γ分泌量の確認
上記実験例１８．１において各試料で処理されて培養された細胞の培養上清中に分泌されたヒトＩＦＮ－γの量を、ヒトＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡキット（Biolegend、カタログ番号４３０１０３）を使用して測定した。抗ヒトＩＦＮ－γ抗体をＥＬＩＳＡプレートに加え、４℃で一晩反応させることによりコーティングした。その後、１％のＢＳＡを含むＰＢＳ溶液で室温にて１時間ブロッキングを行った。洗浄バッファー（ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０）で洗浄した後、標準溶液及び各試料を２倍に希釈して加え、次いで室温で２時間反応させた。反応が完了した後、プレートを洗浄し、二次検出抗体を加え、室温で１時間反応させた。洗浄バッファーで洗浄した後、アビジン－ＨＲＰ溶液を加え、室温で３０分間反応させ、基質溶液を加えて室温及び暗所の条件で１５分間呈色反応を誘導した。最後に、Ｈ_２ＳＯ_４を加えて呈色反応を止め、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２（BioTek）を使用して４５０ｎｍで吸光度を測定して、濃度を計算した。

【0179】

結果として、ＢＮＳ００１融合タンパク質で処理された細胞において、ＩＬ－２１タンパク質で処理された細胞と比較して、ＩＦＮ－γ分泌量が統計的に有意に増加することが確認された（図１９）。

【0180】

実験例１９．ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖に対するＢＮＳ００１融合タンパク質の効果の確認
ヒトから分離されたＰＢＭＣを３７℃で解凍し、１５００ｒｐｍで４℃にて５分間遠心分離した。遠心分離後、懸濁液を除去し、ＲＰＭＩ１６４０培養培地（１０％のＦＢＳ、２００μｌのペニシリン／ストレプトマイシン、ＢＮＳ００１融合タンパク質、ＩＬ－２１タンパク質（各１０μｇ／ｍｌ））中で再懸濁し、インキュベーター内で３７℃及び５％のＣＯ_２にて培養した。培養後、ＰＢＭＣを冷ＰＢＳ（Sigma、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、遠心分離した後、１．５ｍｌのマイクロチューブにおいて１００μｌ当たり１０^６個の細胞（１０^６個の細胞／１００μｌ）に到達するようにＰＢＳ（１％のＦＢＳを含む）で再懸濁した。その後、細胞を抗ＣＤ８－ＰＥ－テキサスレッド（１：１００、Invitrogen、カタログ番号ＭＨＣＤ０８１７）で室温にて３０分間染色した。Ｖ字底９６ウェルプレートへと１ウェル当たり３０μｌを分注した後、フローサイトメトリーを使用してＣＤ８^＋Ｔ細胞中の未標識細胞のパーセンテージを測定することによって、これらの細胞の増殖レベルを確認した。

【0181】

結果として、ＢＮＳ００１融合タンパク質は、ＩＬ－２１タンパク質と同程度でＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を活性化することが確認された（図２０）。

【0182】

実験例２０．ＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖に対するＢＮＳ００１融合タンパク質の効果の確認
ヒトから分離されたＰＢＭＣを３７℃で解凍し、１５００ｒｐｍで４℃にて５分間遠心分離した。遠心分離後、懸濁液を除去し、ＲＰＭＩ１６４０培養培地（１０％のＦＢＳ、２００μｌのペニシリン／ストレプトマイシン、ＢＮＳ００１融合タンパク質、ＩＬ－２１タンパク質（各１０μｇ／ｍｌ））中で再懸濁し、インキュベーター内で３７℃及び５％のＣＯ_２にて培養した。培養後、ＰＢＭＣを冷ＰＢＳ（Sigma、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、遠心分離した後、１．５ｍｌのマイクロチューブにおいて１００μｌ当たり１０^６個の細胞（１０^６個の細胞／１００μｌ）に到達するようにＰＢＳ（１％のＦＢＳを含む）で再懸濁した。その後、細胞を抗ＣＤ４－ＰＥ－パシフィックブルー（１０^６個の細胞当たり２μｇ、BioLegend、カタログ番号３４４６２０）で室温にて３０分間染色した。Ｖ字底９６ウェルプレートへと１ウェル当たり３０μｌを分注した後、フローサイトメトリーを使用してＣＤ４^＋Ｔ細胞中の未標識細胞のパーセンテージを測定することによって、これらの細胞の増殖レベルを確認した。

【0183】

結果として、ＢＮＳ００１融合タンパク質は、ＩＬ－２１タンパク質と同程度でＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖を活性化し、ＣＤ４^＋／ＦｏｘＰ３^＋Ｔｒｅｇ細胞の増殖を増加させないことが確認された（図２１）。

【0184】

実験例２１．ＮＫ細胞の増殖に対するＢＮＳ００１融合タンパク質の効果の確認
ヒトから分離されたＰＢＭＣを３７℃でゆっくり解凍し、１５００ｒｐｍで４℃にて５分間遠心分離した。遠心分離後、懸濁液を除去し、ＲＰＭＩ１６４０培養培地（１０％のＦＢＳ、２００μｌのペニシリン／ストレプトマイシン、ＢＮＳ００１融合タンパク質、ＩＬ－２１タンパク質（各１０μｇ／ｍｌ））中で再懸濁し、インキュベーター内で３７℃及び５％のＣＯ_２にて培養した。培養後、ＰＢＭＣを冷ＰＢＳ（Sigma、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、遠心分離した後、１．５ｍｌのマイクロチューブにおいて１００μｌ当たり１０^６個の細胞（１０^６個の細胞／１００μｌ）に到達するようにＰＢＳ（１％のＦＢＳを含む）で再懸濁した。その後、細胞を抗ＣＤ５６－ＰＥ（１０^６個の細胞当たり０．４μｇ、BioLegend、カタログ番号３６２５０８）及び抗ＣＤ１６－ＡＰＣ（１０^６個の細胞当たり５μｌ、BioLegend、カタログ番号３０２０１２）で室温にて３０分間染色した。Ｖ字底９６ウェルプレートへと１ウェル当たり３０μｌを分注した後、フローサイトメトリーを使用してＣＤ５６^＋／ＣＤ１６^＋ＮＫ細胞中の未標識細胞のパーセンテージを測定することによって、これらの細胞の増殖レベルを確認した。

【0185】

結果として、ＢＮＳ００１融合タンパク質は、ＩＬ－２１タンパク質と同程度でＮＫ細胞の増殖を活性化することが確認された（図２２ａ及び図２２ｂ）。

【0186】

実験例２２．Ｔ細胞機能に対するＢＮＳ００１融合タンパク質の効果の確認
実験例２２．１．ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１遮断アッセイ
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断バイオアッセイキット（Promegaのカタログ番号Ｊ１２５２）を使用して実験を行った。

【0187】

液体窒素中で貯蔵されたＰＤ－Ｌ１ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞（標的細胞）を、３７℃の水浴中で１分間解凍し、これらを予め温めた培養培地（ハムＦ１２：１０％のＦＢＳ）中に懸濁することにより調製した。９６ウェルの白色プレート（SPL、カタログ番号３０１９６）へと１ウェル当たり１００μｌを分注し、インキュベーター内で３７℃及び５％のＣＯ_２にて培養した。翌日、プレートを取り出し、９５μｌの培養培地を除去し、２倍で段階希釈されたＢＮＳ００１融合タンパク質、アテゾリズマブ、及びＰＤ－１－Ｆｃを各ウェルに４０μｌ加え、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ／ＰＤ－１細胞（エフェクター細胞）についての調製時間中に、プレートをカバーで覆い、室温で貯蔵した。液体窒素中で貯蔵されたエフェクター細胞を３７℃の水浴中で１分間解凍し、予め温めた培養培地（ハムＦ１２：１０％のＦＢＳ）中に懸濁することにより調製した後、標的細胞及び試料を含むプレートの各ウェルに４０μｌを分注し、インキュベーター内で３７℃及び５％のＣＯ_２にて６時間培養した。

【0188】

反応が完了した後、プレートを取り出し、気泡が発生しないように注意しながらＢｉｏ－Ｇｌｏ試薬を加えた。また、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬を３つの端のウェルに加え、バックグラウンドシグナルを補正するブランクとして使用した。室温で３０分間反応させた後、発光をＳｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２（BioTek）を使用して測定した。

【0189】

結果として、ＢＮＳ００１融合タンパク質は、エフェクターＴ細胞上に発現されたＰＤ－１に結合し、Ｔ細胞の機能を阻害せず、むしろ活性化することが確認された（図２３）。

【0190】

実験例２２．２．ＰＤ－Ｌ２／ＰＤ－１遮断アッセイ
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ２遮断バイオアッセイキット（Promegaのカタログ番号ＣＳ１８７１３１－１）を使用して実験を行った。

【0191】

液体窒素中で貯蔵されたＰＤ－Ｌ２ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞（標的細胞）を、３７℃の水浴中で１分間解凍し、予め温めた培養培地（ハムＦ１２：１０％のＦＢＳ）中に懸濁することにより調製した。９６ウェルの白色プレート（SPL、カタログ番号３０１９６）へと１ウェル当たり１００μｌを分注し、インキュベーター内で３７℃及び５％のＣＯ_２にて培養した。翌日、プレートを取り出し、９５μｌの培養培地を除去し、２倍で段階希釈されたＢＮＳ００１融合タンパク質、アテゾリズマブ、及びＰＤ－Ｌ２－Ｆｃを各ウェルに４０μｌ加え、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ／ＰＤ－１細胞（エフェクター細胞）についての調製時間中に、プレートをカバーで覆い、室温で貯蔵した。液体窒素中で貯蔵されたエフェクター細胞を３７℃の水浴中で１分間解凍し、予め温めた培養培地（ハムＦ１２：１０％のＦＢＳ）中に懸濁することにより調製した後、標的細胞及び試料を含むプレートの各ウェルに４０μｌを分注し、インキュベーター内で３７℃及び５％のＣＯ_２にて６時間培養した。

【0192】

反応が完了した後、プレートを取り出し、気泡が発生しないように注意しながらＢｉｏ－Ｇｌｏ試薬を加えた。また、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬を３つの端のウェルに加え、バックグラウンドシグナルを補正するブランクとして使用した。室温で３０分間反応させた後、発光をＳｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２（BioTek）を使用して測定した。

【0193】

結果として、ＢＮＳ００１融合タンパク質は、エフェクターＴ細胞上に発現されたＰＤ－１に結合し、Ｔ細胞の機能を阻害せず、むしろ活性化することが確認された（図２４）。

【0194】

ＩＸ．ＢＮＳ００１融合タンパク質の抗癌効果の確認
実験例２３．ＢＮＳ００１融合タンパク質の抗癌効果を確認する癌細胞系統の樹立
ヒト黒色腫細胞系統Ａ３７５（ATCC、ＣＲＬ－１６１９）の１×１０^５個の細胞を６ウェルプレートへと分注し、インキュベーター内で３７℃及び５％のＣＯ_２にて培養した。翌日、培養培地を除去した後、ホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）遺伝子及びＧＦＰ遺伝子がトランスフェクションされた２５ＭＯＩ（感染多重度、２５μｌ）のレンチウイルス（Gentarget、カタログ番号ＬＶＰ９１４－Ｇ）（図２５）を加え、４時間培養した。４時間の培養後、０．０５％のトリプシン－ＥＤＴＡ（Gibco）溶液を用いて細胞を回収した後、１５０ｍｍの培養皿（TPP）に移して培養した。培養中に、蛍光顕微鏡で観察しながらＧＦＰ発現細胞のみを選択して培養し、ホタルルシフェラーゼを発現するヒト黒色腫細胞系統であるＡ３７５－Ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞系統を樹立した。

【0195】

Ａ３７５－Ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞系統を、１００μｌの細胞培養液とともに５×１０^５個の細胞（ｎ＝３）で９６ウェルの白色プレート又は黒色プレートに分注した後、半分を１００μｌの細胞培養液で段階希釈した（８点）。１ウェル当たり１００μｌのＢｉｏ－Ｇｌｏ溶液を加えた後、Ｎｅｏ２機器を使用して発光（ルシフェラーゼ）画像又は蛍光（ＧＦＰ）画像を１秒間取得した。Ａ３７５－Ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞系統における細胞数が増加するにつれて、発光シグナル又は蛍光シグナルの強度も増加した（図２６）。

【0196】

実験例２４．ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２を発現する癌細胞に対するＢＮＳ００１融合タンパク質の効果の確認
実験例２４．１ 癌細胞とＰＢＭＣとの共培養
ヒトから分離されたＰＢＭＣを、１．２５μＭの濃度のｍｅｍｂｒａｎｅ－ｄｙｅ（赤色）（Sigma、カタログ番号ＰＫＨ２６）色素と室温で１分間反応させることによって染色した後、同容量のＦＢＳを加えることによって染色反応を止めた。細胞に結合しなかった色素を４００×ｇで１０分間遠心分離して懸濁液を除去し洗浄した後、ＲＰＭＩ１６４０培養培地（１０％のＦＢＳ、２００μｌのペニシリン／ストレプトマイシン）中に再懸濁した。このとき、洗浄プロセスを計３回行った。ＲＰＭＩ１６４０培養培地（１０％のＦＢＳ、２００μｌのペニシリン／ストレプトマイシン）中に再懸濁した後、蛍光を観察した。蛍光染色したＰＢＭＣと樹立した癌細胞系統（Ａ３７５－ｆＬｕｃ－ＧＦＰ）とを共培養するのに、Ａ３７５－ｆＬｕｃ－ＧＦＰ細胞（１×１０^５個）を分注し、蛍光染色されたＰＢＭＣ（１×１０^６個）を６ウェルプレートに分注し、共培養を行った。このとき、抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、１μｇ／ｍｌ、Invitrogen）及び抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２、１μｇ／ｍｌ、Invitrogen）を一緒に用いた又は用いない処理の条件下で、細胞をＢＮＳ００１融合タンパク質（１０μｇ／ｍｌ）で処理し、インキュベーター内で３７℃及び５％のＣＯ_２にて３日間培養した。

【0197】

実験例２４．２．癌細胞とＰＢＭＣとを共培養したものにおけるＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、及びＰＤ－１の遺伝子発現の確認
悪性黒色腫細胞Ａ３７５（ATCC、番号ＣＲＬ－１６１９）及びＰＢＭＣ（ATCC、番号ＰＣＳ－８００－０１１）におけるＰＤ－Ｌ１遺伝子、ＰＤ－Ｌ２遺伝子、及びＰＤ１遺伝子の転写及び翻訳を確認するのに、逆転写ＰＣＲを行った。ＰＢＭＣを抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ、Invitrogen）及び抗ＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍｌ、Invitrogen）で共刺激し、活性培養に使用した。各細胞系統から全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成し（TAKARA、ＲＲ０３６Ａ）、プライマーセット（表１）を使用してＰＣＲを実施して、Ａ３７５及びＰＢＭＣにおけるＰＤ－Ｌ１／Ｌ２及びＰＤ－１に特異的な複製産物（１２０ｂｐ、１７３ｂｐ、２８９ｂｐ）を確認した。

【0198】

【0199】

結果として、悪性黒色腫細胞（Ａ３７５）におけるＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＰＤ－Ｌ２遺伝子に特異的な複製産物、並びに免疫細胞が存在するＰＢＭＣにおけるＰＤ－１に特異的な複製産物（１２０ｂｐ、１７３ｂｐ、及び２８９ｂｐ）が確認された（図２７）。

【0200】

実験例２４．３．ＥＬＩＳＡ分析によるヒトＩＦＮ－γ分泌量の確認
上記実験例２４．１において各試料で処理されて培養された細胞の培養上清中に分泌されたヒトＩＦＮ－γの量を、ヒトＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡキット（Biolegend、カタログ番号４３０１０３）を使用して測定した。抗ヒトＩＦＮ－γ抗体をＥＬＩＳＡプレートに加え、４℃で一晩反応させることによりコーティングした。その後、１％のＢＳＡを含むＰＢＳ溶液で室温にて１時間ブロッキングを行った。洗浄バッファー（ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０）で洗浄した後、標準溶液及び各試料を０．４ｎＭ、１．５ｎＭ、及び７．５ｎＭの濃度に希釈して加え、次いで室温で２時間反応させた。反応が完了した後、プレートを洗浄し、二次検出抗体を加え、室温で１時間反応させた。洗浄バッファーで洗浄した後、アビジン－ＨＲＰ溶液を加え、室温で３０分間反応させた。基質溶液を加えて室温及び暗所の条件で２０分間呈色反応を誘導した。最後に、Ｈ_２ＳＯ_４を加えて呈色反応を止め、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２（BioTek）を使用して４５０ｎｍで吸光度を測定して、濃度を計算した。

【0201】

結果として、ＢＮＳ００１融合タンパク質で処理された細胞において、ＩＬ－２１タンパク質で処理された細胞と比較して、ＩＦＮ－γ分泌量が統計的に有意に増加することが確認された（図２８）。

【0202】

実験例２４．４．癌細胞殺傷効果の確認
免疫細胞活性及び腫瘍細胞殺傷効果を確認するのに、５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、１μｇ／ｍｌ、Invitrogen）及び抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２、１μｇ／ｍｌ、Invitrogen）を用いた又は用いない処理の条件下で、細胞を共培養したものを１０μｇ／ｍｌの濃度のＢＮＳ００１融合タンパク質で処理し、インキュベーター内で３７℃及び５％のＣＯ_２にて７２時間培養した。癌細胞殺傷の程度を定量するのに、２４時間、４８時間、及び７２時間の共培養後、ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬を加え、室温で１０分間反応させた。反応後、ルシフェラーゼ活性をＳｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２（BioTek）を使用して測定した。

【0203】

ＢＮＳ融合タンパク質による処理後の１日目（２４時間）、２日目（４８時間）、及び３日目（７２時間）に測定された癌細胞殺傷の程度は図２９に示されるように測定された。

【0204】

さらに、癌細胞殺傷効果の統計分析のために、ＢＮＳ融合タンパク質による処理後の２日目に測定された癌細胞殺傷の程度を比較した。結果として、ＢＮＳ００１融合タンパク質で処理された細胞において、未処理の細胞と比較して、癌細胞殺傷効果が統計的に有意に増加することが確認された（図３０）。

【0205】

さらに、癌細胞殺傷効果のＥＣ_５０分析のために、様々な濃度のＢＮＳ融合タンパク質による処理後の２日目に測定された癌細胞殺傷の程度を比較した。結果として、ＢＮＳ００１融合タンパク質で処理された細胞において、未処理の細胞と比較して、癌細胞殺傷効果が増加することが確認された（図３１）。

【0206】

実験例２５．ＢＮＳ００１融合タンパク質の癌細胞系統特異的な抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性の確認
Ａ３７５細胞系統を培養培地（ＲＰＭＩ１６４０：１０％のＦＢＳ、抗生物質－抗真菌薬１％）中に懸濁し、９６ウェルの白色プレートに１００μｌ当たり１×１０^４個の細胞の濃度で分注した後、インキュベーター内で一晩培養した。翌日、Ａ３７５細胞が分注されたプレートから９５μｌの培養培地を除去した後、予め調製されたＡＤＣＣアッセイバッファー（ＲＰＭＩ１６４０培養培地、低ＩｇＧ血清０．２５％）を２５μｌずつ加え、エフェクター細胞（ＮＦＡＴ－ｌｕｃ／ＦｃγＲＩＩＩａ）を調製中に室温で培養した。６３０μｌのＡＤＣＣバイオアッセイエフェクター細胞（Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－ｌｕｃ／ＦｃγＲＩＩＩａ）を３．６ｍＬの予め温めたＡＤＣＣアッセイバッファー中に懸濁した後、各ウェルに２５μｌを分注した。２．５倍で段階希釈した２５μｌのＢＮＳ００１融合タンパク質試料で各ウェルを処理した。ウェルプレートの蓋を閉め、インキュベーター内で３７℃及び５％のＣＯ_２にて６時間培養した。インキュベートした後、これを室温で約１５分間保存し、次いで各ウェルを７５μｌのＢＩＯ－ＧＬＯ（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬で処理した。３０分後、ルシフェラーゼ活性をＳｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２（BioTek）を使用して測定した。

【0207】

ＡＤＣＣアッセイのルシフェラーゼ活性は、表面抗原（ＰＤ－Ｌ１／Ｌ２）を有する標的細胞（Ａ３７５）、特異的抗体（ＢＮＳ００１融合タンパク質）、及びＦｃγＲＩＩＩａを発現するエフェクター細胞が存在する場合にのみ結果を得ることができる試験法であり、ＢＮＳ００１融合タンパク質のＡＤＣＣ活性は図３２に示されるように測定された。

【0208】

実験例２６．マウスモデルにおけるＢＮＳ００１融合タンパク質の血中半減期の確認
実験例２６．１．ＥＬＩＳＡ分析を使用したＢＮＳ００１融合タンパク質濃度の定量的測定
血中のＢＮＳ００１融合タンパク質の濃度を定量的に分析するのに、ヒトＰＤ－１ ＥＬＩＳＡキット（Invitrogen、カタログ番号ＢＭＳ２２１４）を使用してＥＬＩＳＡ分析を行った。ＢＮＳ００１融合タンパク質をそれぞれ０．０６２５ｎｇ／ｍＬ、０．１２５ｎｇ／ｍＬ、０．２５ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、及び４ｎｇ／ｍＬの濃度に希釈し、抗ＰＤ－１抗体を固定化したプレート（Invitrogen）の各ウェルに５０μｌを分注した。キットに含まれる試料希釈液及びビオチン化抗ＩＬ－２１検出抗体（R&D）を各ウェルに５０μｌずつ加えた後、室温で２時間反応させた。反応が完了した後、プレートを４００μｌの洗浄バッファー（Invitrogen）で４回洗浄した後、各ウェルに１００μｌのストレプトアビジン－ＨＲＰ（Invitrogen）を分注した。その後、反応を室温で１時間行い、４００μｌの洗浄バッファー（Invitrogen）を用いて洗浄プロセスを４回行った。１００μｌのＴＭＢ基質溶液（Invitrogen）を各ウェルに加えて発色させた。その後、１００μｌの停止溶液（Invitrogen）を加えることによって反応を停止させ、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２（BioTek）を使用して分析した。

【0209】

ＥＬＩＳＡ測定の結果として、ＢＮＳ００１融合タンパク質についての各濃度の場合の線形性及び相関係数は図３３に示されるように測定された。

【0210】

実験例２６．２．正常なＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＢＮＳ００１融合タンパク質の血中半減期の確認
正常なＢＡＬＢ／ｃマウス動物モデルにおいて調製されたＢＮＳ００１融合タンパク質を、計３匹のマウスに１匹のマウス当たり５ｍｇ／ｋｇで尾静脈経由にて投与した。尾静脈経由で注射されたマウスの場合、０分、３０分、１時間、６時間、２４時間、３日、７日、１４日、２１日、２８日、３５日、４２日、及び５０日で血液を経時的に収集した。実験例２６．１に記載されるＥＬＩＳＡ分析を使用して、血漿中でＢＮＳ００１融合タンパク質の濃度分析を実施した。ＰＫＳｏｌｖｅｒを用いてノンコンパートメント解析（ＮＣＡ）を行うことによってＢＮＳ００１融合タンパク質の血中半減期を確認した。

【0211】

ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＢＮＳ００１融合タンパク質についての血中半減期分析の結果は、図３４に示されるように測定された。持続性Ｆｃ変異体であるＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（２９）－ＩＬ－２１融合タンパク質及びＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（４１）－ＩＬ－２１融合タンパク質の血中半減期は、野生型Ｆｃを有するＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（ｗｔ）－ＩＬ－２１融合タンパク質と比較して延長することが判明した。

【0212】

実験例２６．３．ｈＦｃＲｎ ＴＧマウスにおけるＢＮＳ００１融合タンパク質の血中半減期の確認
正常なｈＦｃＲｎ ＴＧマウス動物モデルにおいて調製されたＢＮＳ００１融合タンパク質を、計３匹のマウスに１匹のマウス当たり５ｍｇ／ｋｇで尾静脈経由にて投与した。尾静脈経由で注射されたマウスの場合、０分、３０分、１時間、６時間、２４時間、３日、７日、１４日、２１日、２８日、３５日、４２日、及び５０日で血液を経時的に収集した。実験例２６．１に記載されるＥＬＩＳＡ分析を使用して、血漿中でＢＮＳ００１融合タンパク質の濃度分析を実施した。ＰＫＳｏｌｖｅｒを用いてノンコンパートメント解析（ＮＣＡ）を行うことによってＢＮＳ００１融合タンパク質の血中半減期を確認した。

【0213】

ｈＦｃＲｎ ＴＧマウスにおけるＢＮＳ００１融合タンパク質についての血中半減期分析の結果は、図３５に示されるように測定された。持続性Ｆｃ変異体であるＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（２９）－ＩＬ－２１融合タンパク質及びＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（４１）－ＩＬ－２１融合タンパク質の血中半減期は、野生型Ｆｃを有するＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ（ｗｔ）－ＩＬ－２１融合タンパク質と比較して延長することが判明した。

【0214】

実験例２７．マウス由来結腸直腸癌細胞を同種移植したマウスにおけるＢＮＳ００１融合タンパク質の抗癌効果の確認
実験例２７．１．腫瘍抑制効果の確認
凍結されたマウス腫瘍細胞系統、具体的には結腸直腸癌細胞系統のＣＴ－２６細胞系統の１つのバイアルを、熱失活させた１０％のＦＢＳ（Gibco、１００８２－１４７）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を使用して解凍し、細胞培養フラスコに入れて、インキュベーター内で３７℃及び５％のＣＯ_２にて培養した。インキュベートした後、細胞をＰＢＳで洗浄し、２．５％のトリプシン－ＥＤＴＡ（Gibco、１５０９０）で１０倍に希釈し、次いでそれを加えて細胞を分離した。細胞の分離後、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分間）により上清を除去し、次いで新しい培地を用いて細胞懸濁液を得た。顕微鏡を使用して生存率を調べた後、細胞系統を培地中で１ｍＬ当たり５．０×１０^６個の細胞の濃度に希釈することによって調製した。使用したマウスは５週齢の雄のＢＡＬＢ／ｃマウス（KOATECH）であった。細胞系統を移植する際、これらを１頭当たり５．０×１０^５個の細胞／０．１ｍＬの投薬容量で皮下投与した。癌細胞を移植した後の或る特定の期間後に腫瘍体積を測定した。腫瘍体積がおよそ６０ｍｍ^３～９０ｍｍ^３に達した被験体を分離した後、ＢＮＳ００１融合タンパク質を５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与した。初回投与以降、３日ごとに１回の計４回投与を行った。このとき、ネガティブコントロールとしてＰＢＳを投与し、ポジティブコントロールとして抗ＰＤ－Ｌ１抗体であるアテゾリズマブを５ｍｇ／ｋｇ投与した。抗癌効果を確認するのに、腫瘍サイズを週に２回測定した（図３６）。

【0215】

結果として、ＢＮＳ００１融合タンパク質で処理されたＣＴ－２６癌細胞系統を移植したマウスの腫瘍サイズは、ネガティブコントロール及びポジティブコントロールと比較して有意に減少することが確認された（図３７）。

【0216】

ＢＮＳ００１融合タンパク質が投与された群及びネガティブコントロールが投与された群における腫瘍抑制の統計的有意性を確認した結果として、一部の測定時点で統計的に有意な抑制が観察された（図３８）。

【0217】

実験例２７．２．癌組織における免疫細胞の分析
上記実験例２７．１におけるマウスのうち、１群当たり３匹のマウスのみから摘出された腫瘍を１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地中に入れ、ＦＡＣＳ分析に使用した。癌組織における免疫細胞を分析するのに、癌組織を単一細胞レベルで分離した後、以下の表２に列記される抗体を使用してＴ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、及びマクロファージについて分析を行った。

【0218】

【0219】

結果として、ＢＮＳ００１融合タンパク質が投与された実験群においては、ポジティブコントロール及びネガティブコントロールと比較して、マクロファージ、樹状細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、及びＣＤ８^＋Ｔ細胞が増加した（図３９）。さらに、ＢＮＳ００１融合タンパク質が投与された実験群においては、ポジティブコントロール及びネガティブコントロールと比較して、ＮＫ細胞が有意に増加した（図３９）。

【0220】

実験例２８．ヒト由来肺癌細胞（Ｈ４６０）及びヒト末梢血単核細胞を移植したヒト化マウスにおけるＢＮＳ００１融合タンパク質の抗癌効果の確認
凍結されたヒト腫瘍細胞系統、具体的には肺癌細胞系統のＨ４６０細胞系統の１つのバイアルを、熱失活させた１０％のＦＢＳ（Gibco、１００８２－１４７）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を使用して解凍し、細胞培養フラスコに入れ、インキュベーター内で３７℃及び５％のＣＯ_２にて培養した。インキュベートした後、細胞をＰＢＳで洗浄し、２．５％のトリプシン－ＥＤＴＡ（Gibco、１５０９０）で１０倍に希釈し、次いでそれを加えて細胞を分離した。細胞の分離後、１０００ｒｐｍで５分間の遠心分離により上清を除去し、次いで新しい培地を用いて細胞懸濁液を得た。顕微鏡を使用して生存率を調べた後、細胞系統を培地中で１ｍＬ当たり５．０×１０^７個の細胞の濃度に希釈することによって調製した。さらに、実験例１８．１と同様に、ヒトから分離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を１週間活性培養した。顕微鏡を使用して生存率を調べた後、細胞系統を培地中で１ｍＬ当たり２．５×１０^８個の細胞の濃度に希釈することによって調製した。使用したマウスは６週齢の雄のＮＸＧマウス（Janvier-labs）であった。１週間の馴化プロセスの後、体重を測定し、各群の平均体重が一致するように再び群分けを行った。細胞系統を移植する際、これらを１頭当たり５．０×１０^６個の細胞（Ｈ４６０）／０．１ｍＬ及び２．５×１０^７個の細胞（ｈＰＢＭＣ）／０．１ｍＬの投薬容量で皮下投与した。癌細胞を移植した翌日、マウスを吸入麻酔薬（２％のイソフルラン、Hana Pharm Co., Ltd.）で麻酔し、次いでＢＮＳ００１融合タンパク質を１０ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈に投与した。初回投与以降、３日～４日ごとに１回の計６回投与を行った。このとき、ネガティブコントロールとして生理食塩水（JW Pharmaceutical）を投与し、ポジティブコントロールとしてアテゾリズマブ（Evidentic）、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、又はＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃを１０ｍｇ／ｋｇ投与した。抗癌効果を確認するのに、腫瘍サイズを週に２回測定した（図４０）。

【0221】

結果として、ＢＮＳ００１融合タンパク質で処理されたＨ４６０癌細胞系統を移植したマウスの腫瘍サイズは、ネガティブコントロール及びポジティブコントロールと比較して減少することが確認され（図４１）、この減少は統計的に有意であった(図４２)。

【0222】

Ｘ．同種移植されたマウス腫瘍モデルにおけるｍＢＮＳ００１融合タンパク質の抗癌効力の評価
実験例２９．マウス由来結腸直腸癌細胞（ＭＣ３８）を同種移植したマウスにおけるｍＢＮＳ００１融合タンパク質の抗癌効果の確認
実験例２９．１．ｍＢＮＳ００１融合タンパク質の用量を定めるための試験スケジュールの確立
マウス（ハツカネズミ（Mus musculus））結腸癌の一種であるＣ５７ＢＬ／６マウス由来結腸直腸癌細胞系統であるＭＣ３８細胞を移植した雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、試験物質のｍＢＮＳ００１を様々な用量で単独投与した。その後、実験を行って有効な効果が達成される用量を定めた（図４３）。

【0223】

実験例２９．２．細胞系統の調製
試験に使用する細胞として、ＭＣ３８細胞を解凍し、細胞培養フラスコに入れ、インキュベーター（ＭＣＯ－１７０Ｍ、パナソニック株式会社、日本）内で３７℃及び５％のＣＯ_２にて培養した。トリプシン－ＥＤＴＡ（カタログ番号２５２００－０７２、Thermofisher Scientific、米国）を使用して細胞を懸濁した。遠心分離機を使用して遠心分離（１２５×ｇ、５分間）することにより細胞浮遊液を回収し、新しい培地及び新しいフラスコに移して継代培養した。細胞系統の移植当日、培養された細胞を遠心分離チューブに入れ、次いで収集した。その後、遠心分離（１２５×ｇ、５分間）を行い、上清を捨て、ＰＢＳ（カタログ番号ＭＬ００８－０１、Welgene、韓国）を用いて細胞懸濁液（０．０５ｍＬ当たり５×１０^５個の細胞）を作製し、接種まで氷上で貯蔵した。

【0224】

実験例２９．３．細胞系統の移植
隔離及び馴化の期間終了後の翌日、体重を測定し、次いで調製されたＭＣ３８細胞懸濁液（０．０２５ｍＬ当たり５×１０^５個の細胞）を使い捨てシリンジ（３１Ｇ、カタログ番号３２８８２０、BD、米国）に充填し、動物の右背中に１頭当たり０．０５ｍＬの用量で皮下投与して移植した。細胞系統の移植後、生着及び成長の期間中に、全身症状を１日１回観察した。

【0225】

実験例２９．４．投与方法及び投与回数
静脈内投与の場合、使い捨てシリンジ（３１Ｇ、３２８８２０、BD、米国）を使用して、投与日に応じて計４回投与を行った（表３）。

【0226】

【0227】

実験例２９．５．抗癌効力の評価のためのｍＢＮＳ００１融合タンパク質の用量の決定
上記実験例２９．１及び実験例２９．４の試験スケジュール及び投与方法に従ってｍＢＮＳ００１を投与した結果として、試験物質の投与により用量依存的に腫瘍成長が抑制される傾向が観察された。２０ｍｇ／ｋｇの用量でｍＢＮＳ００１が投与された群において、試験物質投与により腫瘍成長が効果的に抑制されることが確認された（図４４及び図４５）。

【0228】

結果として、ＢＮＳ００１融合タンパク質は、単独で投与した場合、２０ｍｇ／ｋｇ以上の用量で癌の処置に有効であると推定され、それより低い用量であっても用量依存的な効果を有することが確認された。したがって、組合せ処置としてのＢＮＳ００１融合タンパク質を開発する際に、組合せ処置と１０ｍｇ／ｋｇの用量でのＢＮＳ００１融合タンパク質とが一緒に使用される場合、これは、それぞれの試験物質の投与の効果を分析するのに適切な用量であることが判明した。

【0229】

実験例３０．マウス由来結腸直腸癌細胞（ＣＴ－２６）を同種移植したマウスにおけるｍＢＮＳ００１融合タンパク質の抗癌効果の確認
実験例３０．１．ｍＢＮＳ００１融合タンパク質の有効性の評価のための試験スケジュールの確立
試験物質である抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、ｍＰＤ１－Ｆｃ－ｍＩＬ－２１、ｍＰＤ１－Ｆｃ、及びＦｃ－ｍＩＬ－２１を単独で又は組み合わせて、マウス（ハツカネズミ）結腸癌の一種であるＢＡＬＢ／ｃマウス由来の結腸直腸癌細胞系統であるＣＴ－２６細胞を同種移植した雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した。その後、実験を行って試験物質の組合せ処置による腫瘍成長抑制効果を評価した（図４６）。

【0230】

実験例３０．２．細胞系統の調製
試験に使用される細胞としてＣＴ－２６細胞を使用した以外は実験例２９．２と同様にして細胞系統を調製した。

【0231】

実験例３０．３．細胞系統の移植
細胞懸濁液としてＣＴ－２６細胞懸濁液を使用した以外は実験例２９．３と同様にして細胞系統の移植を行った。移植後、生着及び成長の期間中に、全身症状を１日１回観察した。

【0232】

実験例３０．４．投与方法及び投与回数
静脈内投与の場合、使い捨てシリンジ（３１Ｇ、３２８８２０、BD、米国）を使用して、投与日に応じて計４回投与を行った（表４）。

【0233】

【0234】

実験例３０．５．ｍＢＮＳ００１融合タンパク質の腫瘍成長抑制有効性の評価
上記実験例３０．１及び実験例３０．４の試験スケジュール及び投与方法に従ってｍＢＮＳ００１（ｍＰＤ１－Ｆｃ－ｍＩＬ－２１）を投与し、腫瘍成長抑制有効性を評価した。有効性を確認する際、データの選択において、図４７に示されるように箱ひげ図上の外れ値を除外し、Ｎ＝５（被験体の数）であるように、Ｑ１とＱ３との間に位置するデータを選択するか、又はＱ１値若しくはＱ３値に近いデータを選択するか、又は最小値と最大値との間にあるデータを選択した。

【0235】

具体的には、各群ごとに選択されたＮ＝５についての結腸直腸癌に対する抗癌有効性評価の結果（表４）は図４８～図５０にまとめられている。

【0236】

実験例３１．マウス由来乳癌細胞（ＥＭＴ－６）を同種移植したマウスにおけるｍＢＮＳ００１融合タンパク質の抗癌効果の確認
実験例３１．１．ｍＢＮＳ００１融合タンパク質の有効性の評価のための試験スケジュールの確立
試験物質である抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、ｍＰＤ１－Ｆｃ－ｍＩＬ－２１、ｍＰＤ１－Ｆｃ、及びＦｃ－ｍＩＬ－２１を単独で又は組み合わせて、マウス（ハツカネズミ）乳腺の悪性新生物の一種であるＢＡＬＢ／ｃマウス由来の乳癌細胞系統であるＥＭＴ－６細胞を同種移植した雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した。その後、実験を行って試験物質の組合せ処置による腫瘍成長抑制効果を評価した（図５１）。

【0237】

実験例３１．２．細胞系統の調製
試験に使用される細胞としてＥＭＴ－６細胞を使用した以外は実験例２９．２と同様にして細胞系統を調製した。

【0238】

実験例３１．３．細胞系統の移植
細胞懸濁液としてＥＭＴ－６細胞懸濁液を使用した以外は実験例２９．３と同様にして細胞系統の移植を行った。移植後、生着及び成長の期間中に、全身症状を１日１回観察した。

【0239】

実験例３１．４．投与方法及び投与回数
静脈内投与の場合、使い捨てシリンジ（３１Ｇ、３２８８２０、BD、米国）を使用して、投与日に応じて計４回投与を行った（表５）。

【0240】

【0241】

実験例３１．５．ｍＢＮＳ００１融合タンパク質の腫瘍成長抑制有効性の評価
上記実験例３１．１及び実験例３１．４の試験スケジュール及び投与方法に従ってｍＢＮＳ００１（ｍＰＤ１－Ｆｃ－ｍＩＬ－２１）を投与し、腫瘍成長抑制有効性を評価した。有効性を確認する際、データの選択において、図５２に示されるように箱ひげ図上の外れ値を除外し、データを選択して評価した。

【0242】

具体的には、各群ごとの乳癌についての抗癌有効性評価の結果（表５）は図５３～図５５にまとめられている。

【0243】

ＸＩ．ＢＮＳ００１融合タンパク質の作用機序の分析
実験例３２．ＢＮＳ００１融合タンパク質によるＩＦＮ－γ産生の確認
３人の健康なドナー（ドナー１、ドナー２、及びドナー３）から取得されたヒトＰＢＭＣをＰＨＡ（フィトヘマグルチニン）での処理によって刺激した後、ＢＮＳ００１処理によって誘導されるサイトカインＩＦＮ－γ分泌のレベルをＥＬＩＳＡ分析によって確認した。このとき、ｈＩｇＧ、アテゾリズマブ（抗ＰＤ－Ｌ１（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ、Roche））、ＩＬ－２１、及びアテゾリズマブ＋ＩＬ－２１を比較用コントロールとして使用した。

【0244】

結果として、ＢＮＳ００１融合タンパク質で処理されたドナーから取得されたＰＢＭＣにおいて、アテゾリズマブ及びＩＬ－２１で単独又は組み合わせて処理された細胞と比較して、ＩＦＮ－γ分泌量が統計的に有意に増加することが確認された（図５６）。

【0245】

さらに、ドナー１、ドナー２、及びドナー３から取得され、かつＰＨＡで刺激されたヒトＰＢＭＣを、ＢＮＳ００１、ｈＩｇＧ、アテゾリズマブ、及びＩＬ－２１で単独又は組み合わせて様々な濃度にて処理し、ＩＦＮ－γ分泌のレベルを確認した。分析結果を図５７～図５９に示す。

【0246】

具体的には、３人のドナーから取得されたＰＢＭＣにおいて、アテゾリズマブ（抗ＰＤ－Ｌ１）及びＩＬ－２１で単独又は組み合わせて様々な濃度にて処理した場合と比較して、ＢＮＳ００１で処理した場合、ＩＦＮ－γ分泌量が統計的に有意に増加することが確認された。

【0247】

実験例３３．ＢＮＳ００１融合タンパク質によるＰＢＭＣにおける免疫細胞集団の活性の変化の測定
３人の健康なドナーから取得されたヒトＰＢＭＣをＰＨＡでの処理によって刺激した後、ＢＮＳ００１処理によって誘導されたＣＤ４^＋Ｔ細胞集団、ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団、ＮＫ細胞集団、及びＢ細胞集団の活性の変化を確認した。免疫細胞集団の活性の変化については、ＣＤ６９、ＣＤ３８、４－１ＢＢ、２Ｂ４、及びＯＸ４０等の免疫活性化マーカーの発現レベルをマルチカラーフローサイトメトリーによって確認した。このとき、ｈＩｇＧ、アテゾリズマブ（抗ＰＤ－Ｌ１（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ、Roche））、ＩＬ－２１、及びアテゾリズマブ＋ＩＬ－２１を比較用コントロールとして使用した。

【0248】

その結果、ＢＮＳ００１融合タンパク質で処理されたドナーから取得されたＰＢＭＣにおいて、ＮＫ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、及びＢ細胞の活性化が誘導されることが確認された。特に、ＮＫ細胞の活性化が強く誘導されることが確認された（図６０～図６３）。

【0249】

さらに、ドナー１、ドナー２、及びドナー３から取得され、かつＰＨＡで刺激されたヒトＰＢＭＣを、ＢＮＳ００１、ｈＩｇＧ、アテゾリズマブ、及びＩＬ－２１で単独又は組み合わせて様々な濃度にて処理し、ＰＢＭＣにおける免疫細胞集団の活性の変化を測定した。分析結果を図６４～図６６に示す。

【0250】

具体的には、ＢＮＳ００１で処理した場合の３人のドナーから取得されたＰＢＭＣにおいて、アテゾリズマブ（抗ＰＤ－Ｌ１）及びＩＬ－２１で単独又は組み合わせて様々な濃度にて処理した場合と比較して、ＮＫ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、及びＢ細胞の活性化が誘導されることが確認された。特に、免疫細胞集団の中でもＮＫ細胞の活性化が強く誘導されることが確認された。

【0251】

実験例３４．ＢＮＳ００１融合タンパク質によるＣＤ８^＋Ｔ細胞の免疫反応性の測定
ヒトＰＢＭＣ刺激アッセイを実施して、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の免疫反応性を測定した。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）染色を使用して増殖を測定することによって、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の免疫反応性を確認した。このとき、ｈＩｇＧ、アテゾリズマブ（抗ＰＤ－Ｌ１（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ、Roche））、ＩＬ－２１、及びアテゾリズマブ＋ＩＬ－２１を比較用コントロールとして使用した。

【0252】

具体的には、ヒトＰＢＭＣ凍結バイアルを解凍した後、インキュベーター内で３７℃にて４時間静置した。静置したヒトＰＢＭＣをＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）で染色した。ＣＴＶ染色されたＰＢＭＣを９６ウェル丸底プレートにおいて１ウェル当たり１×１０^５個で播種した。ＰＨＡ－ＰをＲＰＭＩ完全培地中で１．５μｇ／ｍｌの最終濃度に希釈し、９６ウェル丸底プレートに加えた。試薬を各条件ごとにＲＰＭＩ完全培地中で段階希釈し、９６ウェル丸底プレートに加えた。３日後、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖をＣＴＶ染色に基づくＦＡＣＳによって分析した。

【0253】

結果として、ＢＮＳ００１融合タンパク質で処理されたＰＢＭＣにおいて、アテゾリズマブ及びＩＬ－２１で単独又は組み合わせて処理された細胞と比較して、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖が活性化されることが確認された（図６７）。

【0254】

具体的には、ＢＮＳ００１で処理されたＰＢＭＣにおいて、アテゾリズマブ（抗ＰＤ－Ｌ１）及びＩＬ－２１で単独又は組み合わせて様々な濃度にて処理された細胞と比較して、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖が活性化されることが確認された（図６８）。

【0255】

ＸＩ．ヒト化マウス腫瘍モデルにおけるＢＮＳ００１融合タンパク質の抗癌効力の評価
実験例３５．ヒト由来結腸直腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）及びヒト末梢血単核細胞を移植したヒト化マウスにおけるＢＮＳ００１融合タンパク質の抗癌効果の確認
実験例３５．１．ＢＮＳ００１融合タンパク質の投薬量による抗癌効果の確認
凍結ヒト腫瘍細胞系統として結腸癌細胞系統であるＨＣＴ１１６細胞系統を使用した以外は実験例２８と同様にして細胞系統を調製した。さらに、実験例１８．１と同様に、ヒトから分離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を１週間活性培養した。顕微鏡を使用して生存率を調べた後、細胞系統を培地中で１ｍＬ当たり２．５×１０^８個の細胞の濃度に希釈することによって調製した。使用したマウスは６週齢の雄のＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｂ２ｍｔｍ１ＵｎｃＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）（ORIENT BIO INC.）であり、ヒト化マウスを構築するのに、ヒト末梢血単核細胞を１頭当たり１×１０^７個の細胞（ｈＰＢＭＣ）／０．１ｍＬの投薬容量で尾静脈へと皮下投与した。ヒト末梢血単核細胞の投与の１４日後にＦＡＣＳ分析により血液中のｈＣＤ４５^＋の発現を測定することによってヒト化マウスを特定した。ヒト化マウスを特定した後、細胞系統ＨＣＴ１１６を移植し、３×１０^６個の細胞の投薬容量で皮下投与した。癌細胞を移植した２日後、マウスを吸入麻酔薬（２％のイソフルラン、Hana Pharm Co., Ltd.）で麻酔し、次いでＢＮＳ００１融合タンパク質（ＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ－ＩＬ－２１）を５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、又は２０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与した。初回投与以降、３日～４日ごとに１回の計４回投与を行った。このとき、ネガティブコントロールとして生理食塩水（JW Pharmaceutical）を投与した。抗癌効果を確認するのに、腫瘍サイズを週に２回測定した（図６９）。

【0256】

結果として、ＢＮＳ００１融合タンパク質で処理されたＨＣＴ１１６癌細胞系統を移植したヒト化マウスの動物実験において、ネガティブコントロール（ビヒクル処理）と比較して、腫瘍サイズは、濃度依存的に統計的に有意に減少することが確認された。特に、抗癌効果は、１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した場合に最良であった（図７０）。

【0257】

一方、ＢＮＳ００１融合タンパク質での処理による体重変化に対する効果は見られないことが確認された（図７１）。

【0258】

実験例３５．２．ＢＮＳ００１融合タンパク質とコントロール薬物との間の抗癌効果の確認
ＨＣＴ１１６細胞系統及びＰＢＭＣを実験例３５．１と同様に調製することによってヒト化マウスを作製した。ＨＣＴ１１６癌細胞をヒト化マウスに移植した２日後、マウスを吸入麻酔薬（２％のイソフルラン、Hana Pharm Co., Ltd.）で麻酔した。その後、ＢＮＳ００１融合タンパク質（ＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ－ＩＬ－２１）を１０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与した。初回投与以降、３日～４日ごとに１回の計４回投与を行った。このとき、ネガティブコントロールとして生理食塩水（JW Pharmaceutical）を投与し、比較用コントロールとしてＢＮＳ００１Ｄ（ＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ）融合タンパク質及びＢＮＳ００１Ｉ（Ｆｃ－ＩＬ－２１）融合タンパク質を単独又は組み合わせて投与した。さらに、ポジティブコントロールとして、市販の抗体のアテゾリズマブ（抗ＰＤ－Ｌ１（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ、Roche））、アベルマブ（抗ＰＤ－Ｌ１（Ｂａｖｅｎｃｉｏ、Merck））、及びペムブロリズマブ（抗ＰＤ－１（Ｋｅｙｔｒｕｄａ、MSD））を投与した。投与した物質の抗癌効果を確認するのに、腫瘍サイズ及び体重を週に２回測定した（図７２）。

【0259】

結果として、ＢＮＳ００１融合タンパク質（ＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ－ＩＬ－２１）で処理されたＨＣＴ１１６癌細胞系統を移植したヒト化マウスの動物実験において、ネガティブコントロールと比較して、腫瘍サイズは統計的に有意に減少することが確認された（図７３及び図７５）。

【0260】

ＢＮＳ００１融合タンパク質を投与した群において、比較用コントロールとしてＢＮＳ００１Ｄ（ＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ）及びＢＮＳ００１Ｉ（Ｆｃ－ＩＬ－２１）を投与した群と比較して、腫瘍サイズが減少することが確認された。さらに、ＢＮＳ００１融合タンパク質を投与した群において、ＢＮＳ００１Ｄ（ＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ）＋ＢＮＳ００１Ｉ（Ｆｃ－ＩＬ－２１）を組み合わせて投与した群と比較して、腫瘍サイズが減少することが確認された（図７３）。

【0261】

さらに、ＢＮＳ００１融合タンパク質を投与した群において、ポジティブコントロールとして使用される市販の抗体のペムブロリズマブ（抗ＰＤ－１（Ｋｅｙｔｒｕｄａ、MSD））及びアベルマブ（抗ＰＤ－Ｌ１（Ｂａｖｅｎｃｉｏ、Merck））を投与した群と比較して、腫瘍サイズが統計的に有意に減少することが確認された。ＢＮＳ００１融合タンパク質を投与した群において、アテゾリズマブ（抗ＰＤ－Ｌ１（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ、Roche））を投与した群と比較して、腫瘍サイズが同等のレベルで減少することが確認された（図７５）。

【0262】

一方、ＢＮＳ００１融合タンパク質での処理による体重変化に対する効果は見られないことが確認された（図７４及び図７６）。

【0263】

実験例３６．ヒト由来肺癌細胞（Ａ５４９）及びヒト末梢血単核細胞を移植したヒト化マウスにおけるＢＮＳ００１融合タンパク質とコントロール薬物との間の抗癌効果の確認
凍結ヒト腫瘍細胞系統として肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞系統であるＡ５４９細胞系統を使用した以外は実験例３５．１と同様にＡ５４９細胞系統及びＰＢＭＣを調製することによってヒト化マウスを作製した。Ａ５４９癌細胞をヒト化マウスに移植した２日後、マウスを吸入麻酔薬（２％のイソフルラン、Hana Pharm Co., Ltd.）で麻酔した。その後、ＢＮＳ００１融合タンパク質（ＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ－ＩＬ－２１）を１０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与した。初回投与以降、３日～４日ごとに１回の計４回投与を行った。このとき、ネガティブコントロールとして生理食塩水（JW Pharmaceutical）を投与し、ポジティブコントロールとして、市販の抗体のアテゾリズマブ（抗ＰＤ－Ｌ１（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ、Roche））、アベルマブ（抗ＰＤ－Ｌ１（Ｂａｖｅｎｃｉｏ、Merck））、及びペムブロリズマブ（抗ＰＤ－１（Ｋｅｙｔｒｕｄａ、MSD））を投与した。投与した物質の抗癌効果を確認するのに、腫瘍サイズ及び体重を週に２回測定した（図７７）。

【0264】

結果として、ＢＮＳ００１融合タンパク質（ＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ－ＩＬ－２１）で処理されたＡ５４９癌細胞系統を移植したヒト化マウスの動物実験において、ネガティブコントロールと比較して、腫瘍サイズは統計的に有意に減少することが確認された。さらに、ＢＮＳ００１融合タンパク質を投与した群において、ポジティブコントロールとして使用される市販の抗体のアテゾリズマブ（抗ＰＤ－Ｌ１（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ、Roche））、ペムブロリズマブ（抗ＰＤ－１（Ｋｅｙｔｒｕｄａ、MSD））、及びアベルマブ（抗ＰＤ－Ｌ１（Ｂａｖｅｎｃｉｏ、Merck））を投与した群と比較して、腫瘍サイズが同等のレベルで減少することが確認された（図７８）。

【0265】

一方、ＢＮＳ００１融合タンパク質での処理による体重変化に対する効果は見られないことが確認された（図７９）。

【0266】

実験例３７．ヒト由来乳癌細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）及びヒト末梢血単核細胞を移植したヒト化マウスにおけるＢＮＳ００１融合タンパク質とコントロール薬物との間の抗癌効果の確認
凍結ヒト腫瘍細胞系統として乳癌（ＴＮＢＣ）細胞系統であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞系統を使用した以外は実験例３５．１と同様にＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞系統及びＰＢＭＣを調製することによってヒト化マウスを作製した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞をヒト化マウスに移植した２日後、マウスを吸入麻酔薬（２％のイソフルラン、Hana Pharm Co., Ltd.）で麻酔した。その後、ＢＮＳ００１融合タンパク質（ＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ－ＩＬ－２１）を１０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与した。初回投与以降、３日～４日ごとに１回の計４回投与を行った。このとき、ネガティブコントロールとして生理食塩水（JW Pharmaceutical）を投与し、ポジティブコントロールとして、市販の抗体のアテゾリズマブ（抗ＰＤ－Ｌ１（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ、Roche））、アベルマブ（抗ＰＤ－Ｌ１（Ｂａｖｅｎｃｉｏ、Merck））、及びペムブロリズマブ（抗ＰＤ－１（Ｋｅｙｔｒｕｄａ、MSD））を投与した。投与した物質の抗癌効果を確認するのに、腫瘍サイズ及び体重を週に２回測定した（図８０）。

【0267】

結果として、ＢＮＳ００１融合タンパク質（ＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ－ＩＬ－２１）で処理されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞系統を移植したヒト化マウスの動物実験において、ネガティブコントロールと比較して、腫瘍サイズは統計的に有意に減少することが確認された。さらに、ＢＮＳ００１融合タンパク質を投与した群において、ポジティブコントロールとして使用される市販の抗体のアテゾリズマブ（抗ＰＤ－Ｌ１（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ、Roche））、ペムブロリズマブ（抗ＰＤ－１（Ｋｅｙｔｒｕｄａ、MSD））、及びアベルマブ（抗ＰＤ－Ｌ１（Ｂａｖｅｎｃｉｏ、Merck））を投与した群と比較して、腫瘍サイズが減少することが確認された（図８１）。

【0268】

一方、ＢＮＳ００１融合タンパク質での処理による体重変化に対する効果は見られないことが確認された（図８２）。

【0269】

実験例３８．ヒト由来肺癌細胞（ＮＣＩ－Ｈ１９７５）及びヒト末梢血単核細胞を移植したヒト化マウスにおけるＢＮＳ００１融合タンパク質とコントロール薬物との間の抗癌効果の確認
凍結ヒト腫瘍細胞系統として肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞系統であるＮＣＩ－Ｈ１９７５（ＥＧＦＲ上のＬ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ二重突然変異）細胞系統を使用した以外は実験例３５．１と同様にＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞系統及びＰＢＭＣを調製することによってヒト化マウスを作製した。ＮＣＩ－Ｈ１９７５癌細胞をヒト化マウスに移植した２日後、マウスを吸入麻酔薬（２％のイソフルラン、Hana Pharm Co., Ltd.）で麻酔した。その後、ＢＮＳ００１融合タンパク質（ＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ－ＩＬ－２１）を１０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与した。初回投与以降、３日～４日ごとに１回の計４回投与を行った。このとき、ネガティブコントロールとして生理食塩水（JW Pharmaceutical）を投与し、ポジティブコントロールとして、市販の抗体のベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ（Ａｖａｓｔｉｎ、Genentech））、ラムシルマブ（抗ＶＥＧＦＲ２（Ｃｙｒａｍｚａ、Lilly））、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ（Ｅｒｂｉｔｕｘ、BMS））、及びアミバンタマブ（抗ＥＧＦＲ／抗ＭＥＴ（Ｒｙｂｒｅｖａｎｔ、Jassen））を投与した。投与した物質の抗癌効果を確認するのに、腫瘍サイズ及び体重を週に２回測定した（図８３）。

【0270】

結果として、ＢＮＳ００１融合タンパク質（ＰＤ－１ Ｄ－Ｆｃ－ＩＬ－２１）で処理されたＮＣＩ－Ｈ１９７５癌細胞系統を移植したヒト化マウスの動物実験において、ネガティブコントロールと比較して、腫瘍サイズは統計的に有意に減少することが確認された（図８４及び図８６）。

【0271】

さらに、ＢＮＳ００１融合タンパク質を投与した群において、ポジティブコントロールとして使用される市販の抗体のラムシルマブ（抗ＶＥＧＦＲ２（Ｃｙｒａｍｚａ、Lilly））及びセツキシマブ（抗ＥＧＦＲ（Ｅｒｂｉｔｕｘ、BMS））を投与した群と比較して、腫瘍サイズが減少することが確認された。さらに、ＢＮＳ００１融合タンパク質を投与した群において、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ（Ａｖａｓｔｉｎ、Genentech））及びアミバンタマブ（抗ＥＧＦＲ／抗ＭＥＴ（Ｒｙｂｒｅｖａｎｔ、Jassen））を投与した群と比較して、腫瘍サイズが同等のレベルで減少することが確認された（図８４及び図８６）。

【0272】

一方、ＢＮＳ００１融合タンパク質での処理による体重変化に対する効果は見られないことが確認された（図８５及び図８７）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22a】

【図22b】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53】

【図54】

【図55】

【図56】

【図57】

【図58】

【図59】

【図60】

【図61】

【図62】

【図63】

【図64】

【図65a】

【図65b】

【図66】

【図67】

【図68】

【図69】

【図70】

【図71】

【図72】

【図73】

【図74】

【図75】

【図76】

【図77】

【図78】

【図79】

【図80】

【図81】

【図82】

【図83】

【図84】

【図85】

【図86】

【図87】

【図88】

【配列表】

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【国際調査報告】