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特表2024-536851単子葉植物種子から切除された胚外植片を形質転換するための組成物及び方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-08
(54)【発明の名称】単子葉植物種子から切除された胚外植片を形質転換するための組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
A01H 1/00 20060101AFI20241001BHJP
A01H 6/46 20180101ALI20241001BHJP
【ＦＩ】
A01H1/00 A
A01H6/46
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024518721
(86)(22)【出願日】2022-09-26
(85)【翻訳文提出日】2024-05-22
(86)【国際出願番号】 US2022077024
(87)【国際公開番号】W WO2023049898
(87)【国際公開日】2023-03-30
(31)【優先権主張番号】63/248,921
(32)【優先日】2021-09-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】501231613
【氏名又は名称】モンサント テクノロジー エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100216839
【弁理士】
【氏名又は名称】大石 敏幸
(74)【代理人】
【識別番号】100228980
【弁理士】
【氏名又は名称】副島 由加里
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】アルセノールト，ジャスティン
(72)【発明者】
【氏名】チェン，ユロン
(72)【発明者】
【氏名】カン，ビュン－グク
(72)【発明者】
【氏名】カンプフ，ジェニファー
(72)【発明者】
【氏名】マーティネル，ブライアン・ジェイ
(72)【発明者】
【氏名】モラー，ロレーナ・ビー
(72)【発明者】
【氏名】サルタリコス，メアリー・アン
(72)【発明者】
【氏名】シュラワト，アショーク
(72)【発明者】
【氏名】スッバラオ，シュブハ
(72)【発明者】
【氏名】ウィリアムズ，エドワード・ジェイ
(72)【発明者】
【氏名】イェ，シュドン
(57)【要約】
本発明は、単子葉植物種子から切除された胚外植片の形質転換を向上するための新規な組成物及び方法を提供し、これは、外植片の調製、外植片の再水和、Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌の接種及び共培養、出芽誘導、拡大出芽誘導、または遺伝子改変植物もしくは植物部分の再生のうちの１つ以上の工程を含み得る。本明細書で提供される方法は、異種ポリヌクレオチドを含むＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌を胚外植片に接種することによって、胚外植片の少なくとも１つの植物細胞を異種ポリヌクレオチドで形質転換することを含み得る。本明細書で提供される方法は、形質転換または編集された植物細胞または外植片から遺伝子改変植物または植物部分を再生する方法も含む。
【選択図】図８
【選択図】図８
【特許請求の範囲】
【請求項1】
遺伝子改変単子葉植物または植物部分を作出する方法であって、分裂組織を含む単子葉植物種子胚外植片の少なくとも１つの細胞を異種ポリヌクレオチド分子で形質転換する能力を有するＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌を含む接種培地を、前記胚外植片に接種することによって、前記少なくとも１つの細胞に前記異種ポリヌクレオチド分子を導入することと、
前記胚外植片を共培養培地と接触させて前記Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌と共培養することと、
第１のオーキシン及び第１のサイトカイニンを含む第１の出芽誘導培地と接触させて前記胚外植片を培養することと、
前記第１のオーキシンまたは第２のオーキシン、及び前記第１のサイトカイニンまたは第２のサイトカイニンを含む第２の出芽誘導培地と接触させて前記胚外植片を培養することと、
前記胚外植片から前記遺伝子改変単子葉植物または植物部分を再生することと、を含む、前記方法。
【請求項2】
前記植物部分がシュートまたは根である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記胚外植片が、前記第１の出芽誘導培地と接触して約２日～約１４日、または約６日～約８日の範囲の期間にわたって培養される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記胚外植片が、前記第１の出芽誘導培地と接触して約２０℃～約４０℃、約２５℃～約３０℃、約３０℃～約４０℃、約３０℃～約３７℃、及び約３３℃～約３５℃からなる群から選択される範囲の温度で培養される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記第１の出芽誘導培地が、高いサイトカイニン対オーキシン比を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記第１の出芽誘導培地の前記第１のオーキシンが、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）、４－アミノ－３，５，６－トリクロロピコリン酸（ピクロラム）、インドール－３－酢酸（ＩＡＡ）、インドール－３－酪酸（ＩＢＡ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、４－クロロフェノキシ酢酸またはｐ－クロロ－フェノキシ酢酸（４－ＣＰＡまたはｐＣＰＡ）、２，４，５－トリクロロフェノキシ酢酸（２，４，５－Ｔ）、２，３，５－トリヨード安息香酸（ＴＩＢＡ）、フェニル酢酸（ＰＡＡ）、及び３，６－ジクロロ－２－メトキシ－安息香酸（ジカンバ）からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記第１の出芽誘導培地の前記第１のオーキシンが、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記第１の出芽誘導培地の前記第１のオーキシンが、４－アミノ－３，５，６－トリクロロピコリン酸（ピクロラム）である、請求項６に記載の方法。
【請求項9】
前記第１の出芽誘導培地の前記第１のオーキシンの濃度が、約０．０２ｍｇ／Ｌ～約２５ｍｇ／Ｌであるか、または約１ｍｇ／Ｌ～約２ｍｇ／Ｌである、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記第１の出芽誘導培地の前記第１のサイトカイニンが、６－ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、チジアズロン（ＴＤＺ）、カイネチン、ゼアチン、ジフェニル尿素（ＤＰＵ）、６－（γ，γ－ジメチルアリルアミノ）プリン（２ｉＰ）、及びメタ－トポリンからなる群から選択される、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記第１の出芽誘導培地の前記第１のサイトカイニンが、６－ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記第１の出芽誘導培地の前記第１のサイトカイニンが、チジアズロン（ＴＤＺ）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記第１の出芽誘導培地の前記第１のサイトカイニンの濃度が、約０．１ｍｇ／Ｌ～約５０ｍｇ／Ｌの範囲内である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記第１のサイトカイニンがＢＡＰであり、前記第１の出芽誘導培地の前記ＢＡＰの濃度が約１０ｍｇ／Ｌである、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記第１のサイトカイニンがＴＤＺであり、前記第１の出芽誘導培地の前記ＴＤＺの濃度が約２ｍｇ／Ｌである、請求項１３に記載の方法。
【請求項16】
前記第１の出芽誘導培地が固体培地である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
前記胚外植片が、前記第２の出芽誘導培地と接触して約４日～約２８日、または約７日～約１４日の範囲の期間にわたって培養される、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
前記胚外植片が、前記第２の出芽誘導培地と接触して約２０℃～約３２℃、約２５℃～約２９℃、または約２７℃～約２８℃の範囲の温度で培養される、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
前記第２の出芽誘導培地が、高いサイトカイニン対オーキシン比を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
前記第２の出芽誘導培地が、ａ）前記第１のオーキシン及び前記第１のサイトカイニン；
ｂ）前記第１のオーキシン及び前記第２のサイトカイニン；
ｃ）前記第２のオーキシン及び前記第１のサイトカイニン；または
ｄ）前記第２のオーキシン及び前記第２のサイトカイニンを含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
前記第２の出芽誘導培地の前記第１のオーキシンまたは前記第２のオーキシンが、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）、４－アミノ－３，５，６－トリクロロピコリン酸（ピクロラム）、インドール－３－酢酸（ＩＡＡ）、インドール－３－酪酸（ＩＢＡ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、４－クロロフェノキシ酢酸またはｐ－クロロ－フェノキシ酢酸（４－ＣＰＡまたはｐＣＰＡ）、２，４，５－トリクロロフェノキシ酢酸（２，４，５－Ｔ）、２，３，５－トリヨード安息香酸（ＴＩＢＡ）、フェニル酢酸（ＰＡＡ）、及び３，６－ジクロロ－２－メトキシ－安息香酸（ジカンバ）からなる群から選択される、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記第２の出芽誘導培地の前記第１のオーキシンまたは前記第２のオーキシンが、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記第２の出芽誘導培地の前記第１のオーキシンまたは前記第２のオーキシンが、４－アミノ－３，５，６－トリクロロピコリン酸（ピクロラム）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項24】
前記第２の出芽誘導培地の前記第１のサイトカイニンまたは前記第２のサイトカイニンが、６－ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、チジアズロン（ＴＤＺ）、カイネチン、ゼアチン、ジフェニル尿素（ＤＰＵ）、６－（γ，γ－ジメチルアリルアミノ）プリン（２ｉＰ）、及びメタ－トポリンからなる群から選択される、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
前記第２の出芽誘導培地の前記第１のサイトカイニンまたは前記第２のサイトカイニンが、６－ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）である、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記第２の出芽誘導培地の前記第１のサイトカイニンまたは前記第２のサイトカイニンが、チジアズロン（ＴＤＺ）である、請求項２４に記載の方法。
【請求項27】
前記第２の出芽誘導培地が、４－アミノ－３，５，６－トリクロロピコリン酸（ピクロラム）及びチジアズロン（ＴＤＺ）、または２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）及びチジアズロン（ＴＤＺ）を含む、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
前記第２の出芽誘導培地の前記第１のサイトカイニンまたは前記第２のサイトカイニンの濃度が、約０．１ｍｇ／Ｌ～約５０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約２５ｍｇ／Ｌ、または約２ｍｇ／Ｌ～約１０ｍｇ／Ｌの範囲内である、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項29】
前記第１のサイトカイニンもしくは前記第２のサイトカイニンがＴＤＺであり、前記第２の出芽誘導培地のＴＤＺの濃度が約２ｍｇ／Ｌである；または前記第１のサイトカイニンもしくは第２のサイトカイニンがＢＡＰであり、前記第２の出芽誘導培地のＢＡＰの濃度が約１０ｍｇ／Ｌである、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記第２の出芽誘導培地の前記第１のオーキシンまたは前記第２のオーキシンの濃度が、約０．０１ｍｇ／Ｌ～約２５ｍｇ／Ｌ、約０．０２ｍｇ／Ｌ～約１０ｍｇ／Ｌ、または約１ｍｇ／Ｌ～約２ｍｇ／Ｌである、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
前記第２の出芽誘導培地が固体培地である、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項32】
前記異種ポリヌクレオチド分子が選別マーカー遺伝子を含み、前記第２の出芽誘導培地が選択剤を含み、前記選別マーカー遺伝子が植物に前記選択剤に対する耐性を与える、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項33】
前記選択剤が、カナマイシン、パロモマイシン、ハイグロマイシンＢ、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、グリホサート、グルホシネート、ホスフィノトリシン、ブロモキシニル、ビアラホス、ジカンバ、イミダゾリノン、及びスルホニル尿素からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記第１の出芽誘導培地が前記第１のオーキシンを含み、前記第２の出芽誘導培地が前記第２のオーキシンを含み、かつ前記第１のオーキシンが前記第２のオーキシンとは異なる、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項35】
前記第１の出芽誘導培地が前記第１のサイトカイニンを含み、前記第２の出芽誘導培地が前記第２のサイトカイニンを含み、かつ前記第１のサイトカイニンが前記第２のサイトカイニンとは異なる、請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項36】
前記第１の出芽誘導培地の前記第１のサイトカイニンが６－ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）であり、前記第２の出芽誘導培地の前記第２のサイトカイニンがチジアズロン（ＴＤＺ）である、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項37】
前記第１の出芽誘導培地の前記第１のオーキシンが２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）であり、前記第２の出芽誘導培地の前記第２のオーキシンが４－アミノ－３，５，６－トリクロロピコリン酸（ピクロラム）である、請求項１～３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項38】
前記第２の出芽誘導培地が前記第２のオーキシン及び前記第２のサイトカイニンを含み、前記第２のオーキシンが４－アミノ－３，５，６－トリクロロピコリン酸（ピクロラム）であり、４－アミノ－３，５，６－トリクロロピコリン酸（ピクロラム）の濃度が約０．１ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌまたは約０．５ｍｇ／Ｌ～約４ｍｇ／Ｌの範囲内であり、前記第２のサイトカイニンがチジアズロン（ＴＤＺ）であり、前記第２の出芽誘導培地のチジアズロン（ＴＤＺ）の濃度が約０．５ｍｇ／Ｌ～約１５ｍｇ／Ｌまたは約１ｍｇ／Ｌ～約４ｍｇ／Ｌの範囲内である、請求項１～３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項39】
前記第１のオーキシンが２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）であり、前記第１の出芽誘導培地の２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）の濃度が約０．１ｍｇ／Ｌ～約１０ｍｇ／Ｌまたは約０．１ｍｇ／Ｌ～約４ｍｇ／Ｌの範囲内であり、前記第１の出芽誘導培地の前記第１のサイトカイニンが６－ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）であり、前記第１の出芽誘導培地の６－ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）の濃度が約１ｍｇ／Ｌ～約２５ｍｇ／Ｌまたは約２ｍｇ／Ｌ～約２０ｍｇ／Ｌの範囲内である、請求項１～３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項40】
前記遺伝子改変単子葉植物が、トウモロコシ植物、コムギ植物、イネ植物、オオムギ植物、芝草植物、またはソルガム植物である、請求項１～３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項41】
前記遺伝子改変単子葉植物がトウモロコシ植物である、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
前記遺伝子改変単子葉植物がコムギ植物である、請求項４０に記載の方法。
【請求項43】
前記胚外植片が発芽せず、生存可能であり、遺伝子形質転換の能力を維持する条件下で、前記胚外植片が単子葉植物種子から調製される、請求項１～４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項44】
前記胚外植片が調製される前記単子葉植物種子が、約３％～約２５％の範囲の内部含水量を有する、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
前記胚外植片が乾燥成熟トウモロコシ種子胚外植片である、または前記胚外植片が前記異種ポリヌクレオチド分子を導入する前に約３％～約２５％の範囲の内部含水量を有する、請求項１～４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項46】
前記胚外植片が、根を欠く胚軸の頂端部分から構成され、前記トウモロコシ種子の残りの部分が、前記胚外植片から実質的に除去されている、請求項１～４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項47】
前記Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌が、ａ）Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｂｒｕｃｅｌｌａｃｅａｅ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、及びＸａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ細菌；または
ｂ）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、及びＡｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ細菌
からなる群から選択される、請求項１～４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項48】
前記Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌がＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍであり、前記接種培地中のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのＯＤ６６０が約０．５～約２．０の範囲内である、請求項１～４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項49】
前記接種培地中のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのＯＤ６６０が約０．７５～約１．２５の範囲内であるか、または約１．０である、請求項４８に記載の方法。
【請求項50】
前記胚外植片が、約１５℃～約２５℃または約２０℃の温度で共培養される、請求項１～４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項51】
前記胚外植片が、約２日～約１０日、または約５日～約７日の範囲の期間にわたって共培養される、請求項１～５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項52】
前記共培養培地がオーキシンまたはサイトカイニンを含まない、請求項１～５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項53】
前記共培養培地が界面活性剤を含まない、請求項１～５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項54】
前記共培養培地が、前記共培養培地で湿らせた紙基材と接触されている、請求項１～５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項55】
前記共培養培地が、前記少なくとも１つの細胞を前記異種ポリヌクレオチド分子で形質転換する能力のある第２のＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌を含む、請求項１～５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項56】
前記Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌と前記第２のＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌が同じ種である、請求項５５に記載の方法。
【請求項57】
前記第２のＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌がＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍであり、前記共培養培地中のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのＯＤ６６０が約０．５～約２．０の範囲内である、請求項５５または請求項５６に記載の方法。
【請求項58】
前記共培養培地中のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのＯＤ６６０が、約０．７５～約１．２５の範囲内であるか、または約１．０である、請求項５７に記載の方法。
【請求項59】
前記遺伝子改変単子葉植物または植物部分が、約２０℃～約３２℃、約２５℃～約２９℃、または約２７℃～約２８℃の範囲の温度で再生培地と接触して再生される、請求項１～５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項60】
前記遺伝子改変単子葉植物または植物部分が、約２０日～約５０日または約２８日～約４２日の範囲の期間にわたって前記再生培地と接触して再生される、請求項１～５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項61】
前記再生培地が低い塩濃度を有する、請求項１～６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項62】
前記再生培地がオーキシンまたはサイトカイニンを含まない、請求項１～６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項63】
前記再生培地が界面活性剤を含まない、請求項１～６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項64】
前記異種ポリヌクレオチド分子が選別マーカー遺伝子を含み、前記再生培地が選択剤を含み、前記選別マーカー遺伝子が植物に前記選択剤に対する耐性を与える、請求項１～６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項65】
前記選択剤が、カナマイシン、パロモマイシン、ハイグロマイシンＢ、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、グリホサート、グルホシネート、ホスフィノトリシン、ブロモキシニル、ビアラホス、ジカンバ、イミダゾリノン、及びスルホニル尿素からなる群から選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項66】
前記再生培地が固体培地である、請求項１～６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項67】
前記遺伝子改変単子葉植物または植物部分が非キメラである、請求項１～６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項68】
前記胚外植片及び前記遺伝子改変単子葉植物または植物部分が、カルス組織培養物を作出することなく培養され、再生される、請求項１～６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項69】
前記異種ポリヌクレオチド分子が、目的の遺伝子、またはガイドＲＮＡもしくは部位指向的ヌクレアーゼをコードする１つ以上の発現カセットを含む、請求項１～６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項70】
前記接種培地中で前記胚外植片に力処理を適用することをさらに含む、請求項１～６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項71】
前記遺伝子改変植物から遺伝子改変植物部分を調製することをさらに含む、請求項１～７０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年９月２７日に出願された米国仮出願第６３／２４８，９２１号の優先権を主張するものであり、その開示全体は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年９月２７日に出願された米国仮出願第６３／２４８，９２１号の優先権を主張するものであり、その開示全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、単子葉植物種子から切除された胚外植片の遺伝子改変を向上するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【0003】
トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、及びソルガムなどの単子葉植物は重要な作物であり、世界の多くの地域で主な食料源となっている。バイオテクノロジー手法は、植物の遺伝子改変を通じて新しい形質を作り出すことによってこれらの作物を改良するために使用されており、これは、多くの場合、向上した形質または特徴を有する遺伝子改変植物または植物部分を作出するためにポリヌクレオチド分子を植物細胞に送達することに依存している。しかしながら、当該技術分野においては、植物、特に単子葉植物を遺伝子改変するための改良された方法であって、カルス培養の使用に依存せず、より効率的に実施でき、植物生殖質にあまり依存しない方法が引き続き必要とされている。
【0004】
本明細書に記載される発明は、単子葉植物種子から切除された胚外植片の改良された形質転換、及びカルス培養を使用せずに遺伝子改変植物またはそれに由来する植物部分を再生するための、当該技術分野における課題及び制限の多くを克服する新規な組成物及び方法を提供する。
【発明の概要】
【0005】
一態様では、本開示は、遺伝子改変単子葉植物または植物部分を作出する方法であって、分裂組織を含む単子葉植物種子胚外植片の少なくとも１つの細胞を異種ポリヌクレオチド分子で形質転換する能力を有するＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌を含む接種培地を、胚外植片に接種することによって、該少なくとも１つの細胞に異種ポリヌクレオチド分子を導入することと、胚外植片を共培養培地と接触させてＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌と共培養することと、第１のオーキシン及び第１のサイトカイニンを含む第１の出芽誘導（ｂｕｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）培地と接触させて胚外植片を培養することと、第１のオーキシンまたは第２のオーキシン及び第１のサイトカイニンまたは第２のサイトカイニンを含む第２の出芽誘導培地と接触させて胚外植片を培養することと、胚外植片から遺伝子改変単子葉植物または植物部分を再生することとを含む。一実施形態では、植物部分はシュートまたは根である。別の実施形態では、遺伝子改変単子葉植物は、トウモロコシ植物、コムギ植物、イネ植物、オオムギ植物、芝草植物、またはソルガム植物である。さらに別の実施形態では、遺伝子改変単子葉植物はトウモロコシ植物である。なおさらに別の実施形態では、遺伝子改変単子葉植物はコムギ植物である。ある特定の実施形態では、Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌は、ａ）Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｂｒｕｃｅｌｌａｃｅａｅ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ及びＸａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ細菌；またはｂ）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ及びＡｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ細菌からなる群から選択される。一実施形態では、Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍであり、接種培地中のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのＯＤ６６０は、約０．５～約２．０である。ある特定の実施形態では、Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍであり、接種培地中のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのＯＤ６６０は、約０．７５～約１．２５であるか、または約１．０である。別の実施形態では、遺伝子改変単子葉植物または植物部分は非キメラである。さらに別の実施形態では、胚外植片及び遺伝子改変単子葉植物または植物部分は、カルス組織培養物を作出することなく培養され、再生される。なおさらに別の実施形態では、異種ポリヌクレオチド分子は、目的の遺伝子、またはガイドＲＮＡもしくは部位指向的ヌクレアーゼをコードする１つ以上の発現カセットを含む。特定の実施形態では、本開示は、接種培地中の胚外植片に力処理を適用することをさらに含む、遺伝子改変単子葉植物または植物部分を作出する方法を提供する。
【0006】
別の態様では、本開示は、第１のオーキシン及び第１のサイトカイニンを含む出芽誘導培地（または第１の出芽誘導培地）である。一実施形態では、胚外植片は、第１の出芽誘導培地と接触して約２日～約１４日、または約６日～約８日の範囲の期間にわたって培養される。別の実施形態では、胚外植片は、第１の出芽誘導培地と接触して約２０℃～約４０℃、約２５℃～約３０℃、約３０℃～約４０℃、約３０℃～約３７℃、及び約３３℃～約３５℃からなる群から選択される範囲の温度で培養される。さらに別の実施形態では、第１の出芽誘導培地は、高いサイトカイニン対オーキシン比を含む。第１の出芽誘導培地において使用され得るオーキシンの非限定的な例としては、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）、４－アミノ－３，５，６－トリクロロピコリン酸（ピクロラム）、インドール－３－酢酸（ＩＡＡ）、インドール－３－酪酸（ＩＢＡ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、４－クロロフェノキシ酢酸またはｐ－クロロ－フェノキシ酢酸（４－ＣＰＡまたはｐＣＰＡ）、２，４，５－トリクロロフェノキシ酢酸（２，４，５－Ｔ）、２，３，５－トリヨード安息香酸（ＴＩＢＡ）、フェニル酢酸（ＰＡＡ）、及び３，６－ジクロロ－２－メトキシ－安息香酸（ジカンバ）が挙げられる。一実施形態では、第１の出芽誘導培地の第１のオーキシンの濃度は、約０．０２ｍｇ／Ｌ～約２５ｍｇ／Ｌであるか、または約１ｍｇ／Ｌ～約２ｍｇ／Ｌである。第１の出芽誘導培地で使用され得るサイトカイニンの非限定的な例としては、６－ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、チジアズロン（ＴＤＺ）、カイネチン、ゼアチン、ジフェニル尿素（ＤＰＵ）、６－（γ，γ－ジメチルアリルアミノ）プリン（２ｉＰ）、及びメタ－トポリンが挙げられる。別の実施形態では、第１の出芽誘導培地の第１のサイトカイニンの濃度は、約０．１ｍｇ／Ｌ～約５０ｍｇ／Ｌの範囲内である。さらに別の実施形態では、第１のサイトカイニンはＢＡＰであり、第１の出芽誘導培地のＢＡＰの濃度は約１０ｍｇ／Ｌである。なおさらに別の実施形態では、第１のサイトカイニンはＴＤＺであり、第１の出芽誘導培地のＴＤＺの濃度は約２ｍｇ／Ｌである。一実施形態では、第１の出芽誘導培地は固体培地である。
【0007】
さらに別の態様では、本開示は、第１のオーキシンまたは第２のオーキシン、及び第１のサイトカイニンまたは第２のサイトカイニンを含む第２の出芽誘導培地（または拡大出芽誘導培地）を提供する。一実施形態では、胚外植片は、第２の出芽誘導培地と接触して約４日～約２８日、または約７日～約１４日の範囲の期間にわたって培養される。別の実施形態では、胚外植片は、第２の出芽誘導培地と接触して約２０℃～約３２℃、約２５℃～約２９℃、または約２７℃～約２８℃の範囲の温度で培養される。さらに別の実施形態では、第２の出芽誘導培地は、高いサイトカイニン対オーキシン比を含む。なおさらに別の実施形態では、第２の出芽誘導培地は、ａ）第１のオーキシン及び第１サイトカイニン；ｂ）第１のオーキシン及び第２のサイトカイニン；ｃ）第２のオーキシン及び第１のサイトカイニン；またはｄ）第２のオーキシン及び第２のサイトカイニンを含む。第２の出芽誘導培地において第１または第２のオーキシンとして使用され得るオーキシンの非限定的な例としては、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）、４－アミノ－３，５，６－トリクロロピコリン酸（ピクロラム）、インドール－３－酢酸（ＩＡＡ）、インドール－３－酪酸（ＩＢＡ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、４－クロロフェノキシ酢酸またはｐ－クロロ－フェノキシ酢酸（４－ＣＰＡまたはｐＣＰＡ）、２，４，５－トリクロロフェノキシ酢酸（２，４，５－Ｔ）、２，３，５－トリヨード安息香酸（ＴＩＢＡ）、フェニル酢酸（ＰＡＡ）、及び３，６－ジクロロ－２－メトキシ－安息香酸（ジカンバ）が挙げられる。具体的な実施形態では、第２の出芽誘導培地の第１のオーキシンまたは第２のオーキシンの濃度は、約０．０１ｍｇ／Ｌ～約２５ｍｇ／Ｌ、約０．０２ｍｇ／Ｌ～約１０ｍｇ／Ｌ、または約１ｍｇ／Ｌ～約２ｍｇ／Ｌである。第２の出芽誘導培地の第１のサイトカイニンまたは第２のサイトカイニンとして使用され得るサイトカイニンの非限定的な例としては、６－ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、チジアズロン（ＴＤＺ）、カイネチン、ゼアチン、ジフェニル尿素（ＤＰＵ）、６－（γ，γ－ジメチルアリルアミノ）プリン（２ｉＰ）、及びメタ－トポリンが挙げられる。一実施形態では、第２の出芽誘導培地の第１のサイトカイニンまたは第２のサイトカイニンの濃度は、約０．１ｍｇ／Ｌ～約５０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約２５ｍｇ／Ｌ、または約２ｍｇ／Ｌ～約１０ｍｇ／Ｌの範囲内である。なおさらに別の実施形態では、第２の出芽誘導培地は、４－アミノ－３，５，６－トリクロロピコリン酸（ピクロラム）及びチジアズロン（ＴＤＺ）、または２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）及びチジアズロン（ＴＤＺ）を含む。一実施形態では、第１のサイトカイニンまたは第２のサイトカイニンはＴＤＺであり、第２の出芽誘導培地のＴＤＺの濃度は約２ｍｇ／Ｌである。別の実施形態では、第１のサイトカイニンまたは第２のサイトカイニンはＢＡＰであり、第２の出芽誘導培地のＢＡＰの濃度は約１０ｍｇ／Ｌである。さらに別の実施形態では、第２の出芽誘導培地は固体培地である。一実施形態では、異種ポリヌクレオチド分子は選別マーカー遺伝子を含み、第２の出芽誘導培地は選択剤を含み、選別マーカー遺伝子は植物に選択剤に対する耐性を与える。選択剤の非限定的な例としては、カナマイシン、パロモマイシン、ハイグロマイシンＢ、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、グリホサート、グルホシネート、ホスフィノトリシン、ブロモキシニル、ビアラホス、ジカンバ、イミダゾリノン、及びスルホニル尿素が挙げられる。
【0008】
なおさらに別の態様では、本開示は、第１のオーキシン及び第１のサイトカイニンを含む第１の出芽誘導培地、ならびに第１のオーキシンまたは第２のオーキシン及び第１のサイトカイニンまたは第２のサイトカイニンを含む第２の出芽誘導培地を接触させて胚外植片を培養することを含む方法を提供する。一実施形態では、第１の出芽誘導培地は第１のオーキシンを含み、第２の出芽誘導培地は第２のオーキシンを含み、第１のオーキシンは第２のオーキシンとは異なる。別の実施形態では、第１の出芽誘導培地は第１のサイトカイニンを含み、第２の出芽誘導培地は第２のサイトカイニンを含み、第１のサイトカイニンは第２のサイトカイニンとは異なる。さらに別の実施形態では、第１の出芽誘導培地の第１のサイトカイニンは６－ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）であり、第２の出芽誘導培地の第２のサイトカイニンはチジアズロン（ＴＤＺ）である。なおさらに別の実施形態では、第１の出芽誘導培地の第１のオーキシンは２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）であり、第２の出芽誘導培地の第２のオーキシンは４－アミノ－３，５，６－トリクロロピコリン酸（ピクロラム）である。一実施形態では、第２の出芽誘導培地は第２のオーキシン及び第２のサイトカイニンを含み、第２のオーキシンは４－アミノ－３，５，６－トリクロロピコリン酸（ピクロラム）であり、４－アミノ－３，５，６－トリクロロピコリン酸（ピクロラム）の濃度は約０．１ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌまたは約０．５ｍｇ／Ｌ～約４ｍｇ／Ｌの範囲内であり；そして第２のサイトカイニンはチジアズロン（ＴＤＺ）であり、第２の出芽誘導培地のチジアズロン（ＴＤＺ）の濃度は約０．５ｍｇ／Ｌ～約１５ｍｇ／Ｌまたは約１ｍｇ／Ｌ～約４ｍｇ／Ｌの範囲内である。別の実施形態では、第１のオーキシンは２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）であり、第１の出芽誘導培地の２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）の濃度は約０．１ｍｇ／Ｌ～約１０ｍｇ／Ｌまたは約０．１ｍｇ／Ｌ～約４ｍｇ／Ｌであり、第１の出芽誘導培地の第１のサイトカイニンは６－ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）であり、第１の出芽誘導培地の６－ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）の濃度は約１ｍｇ／Ｌ～約２５ｍｇ／Ｌまたは約２ｍｇ／Ｌ～約２０ｍｇ／Ｌの範囲内である。
【0009】
一態様では、本開示は、本明細書に記載の組成物及び方法に従って使用するための胚外植片を提供する。一実施形態では、胚外植片は、胚外植片が発芽せず、生存可能であり、遺伝子形質転換の能力を維持する条件下で、単子葉植物種子から調製される。別の実施形態では、胚外植片が調製される単子葉植物種子は、約３％～約２５％の範囲の内部含水量を有する。さらに別の実施形態では、胚外植片は、乾燥成熟トウモロコシ種子胚外植片である。なおさらに別の実施形態では、胚外植片は、異種ポリヌクレオチド分子を導入する前に約３％～約２５％の範囲の内部含水量を有する。一実施形態では、胚外植片は根を欠く胚軸の頂端部分から構成され、トウモロコシ種子の残りの部分は胚外植片から実質的に除去されている。
【0010】
別の態様では、本開示は、胚外植片をＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌と共培養する方法を提供する。一実施形態では、胚外植片は約１５℃～約２５℃または約２０℃の温度で共培養される。別の実施形態では、胚外植片は、約２日～約１０日、または約５日～約７日の範囲の期間にわたって共培養される。さらに別の実施形態では、共培養培地はオーキシンまたはサイトカイニンを含まない。なおさらに別の実施形態では、共培養培地は界面活性剤を含まない。一実施形態では、共培養培地は、共培養培地で湿らせた紙基材と接触している。別の実施形態では、共培養培地は、少なくとも１つの細胞を異種ポリヌクレオチド分子で形質転換する能力のある第２のＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌を含む。さらに別の実施形態では、Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌と第２のＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌は同じ種である。さらに別の実施形態では、第２のＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍであり、共培養培地中のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのＯＤ６６０は、約０．５～約２．０である。なおさらに別の実施形態では、第２のＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍであり、共培養培地中のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのＯＤ６６０は、約０．７５～約１．２５、または約１．０である。
【0011】
さらに別の態様では、本開示は再生培地を提供する。一実施形態では、遺伝子改変単子葉植物または植物部分は、約２０℃～約３２℃、約２５℃～約２９℃、または約２７℃～約２８℃の範囲の温度で再生培地と接触して再生される。別の実施形態では、遺伝子改変単子葉植物または植物部分は、約２０日～約５０日または約２８日～約４２日の範囲の期間にわたって再生培地と接触して再生される。さらに別の実施形態では、再生培地は低い塩濃度を有する。なおさらに別の実施形態では、再生培地はオーキシンまたはサイトカイニンを含まない。一実施形態では、再生培地は界面活性剤を含まない。別の実施形態では、再生培地は、本明細書に記載の選択剤を含む。さらに別の実施形態では、再生培地は固体培地である。なおさらに別の実施形態では、本明細書で提供される方法は、遺伝子改変植物から遺伝子改変植物部分を調製することをさらに含む。
【0012】
以下の図面は本明細書の一部をなし、かつ本発明の特定の態様をさらに裏付けるために含まれる。本発明は、これらの図面の１つ以上を本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによって、より深く理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種前または接種中に重力に曝露された形質転換トウモロコシ外植片の一過性遺伝子発現を示す。
【図2】さまざまな温度でのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種中に重力に曝露された形質転換トウモロコシ外植片の一過性遺伝子発現を示す。
【図3】Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種中にさまざまな重力に曝露された形質転換コムギ外植片の一過性遺伝子発現を示す。
【図4】接種中の異なる重力（２９１ｇ、１１６４ｇ、２６１９ｇ及び４６５７ｇ）が２つの実験における一過性ＧＵＳ発現に及ぼす影響の画像を示す。
【図5】Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種及び共培養の６日後の一過性ＧＵＳ発現を示す。Ａ－１は、ＯＤ０．２５でＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを接種し、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを添加せずに共培養した外植片におけるＧＵＳ発現を示す。Ｂ－１は、ＯＤ０．２５でＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを接種し、ＯＤ０．２５でＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ１．２５ｍＬを添加して共培養した外植片におけるＧＵＳ発現を示す。Ｃ－１は、ＯＤ０．５でＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを接種し、ＯＤ０．５でＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ１．２５ｍＬを添加して共培養した外植片におけるＧＵＳ発現を示す。Ｄ－１は、ＯＤ１．０でＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを接種し、ＯＤ１．０でＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ１．２５ｍＬを添加して共培養した外植片におけるＧＵＳ発現を示す。
【図6】粉砕したＳｅｔａｒｉａ種子のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換を示す。Ａは、接種後８週間で再生されたシュートを示す。Ｂは、Ｘ－ｇｌｕｃ溶液中で１時間後のＧＵＳ発現を伴う再生されたシュートからの葉を示し、これにより形質転換が確認される。Ｃは、ＣＰ４遺伝子に特異的なプローブを使用した、温室で生育した再生植物（Ｄの植物の例を参照）から単離されたＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションを示し、これによりトランスジェニック植物がＣＰ４導入遺伝子の単一コピーを含むことが確認される。
【図7】Ｓｅｔａｒｉａ種子から種皮を除去するための種子ローリングアセンブリ（Ａ）を示す。Ｂは、種皮を除去する前のＳｅｔａｒｉａ種子を示す。Ｃは、種皮を除去した後のＳｅｔａｒｉａ種子を示す。
【図8】インタクトなＳｅｔａｒｉａ種子からの植物のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換、培養、及び再生の進行を示す。Ａは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染後のＳｅｔａｒｉａ種子を示す。Ｂは、Ｘ－ｇｌｕｃ染色後の分裂領域周囲のＧＵＳ発現を示す。Ｃは、ＧＵＳ染色が観察された葉基近くの分裂領域周囲に新たに形成された芽を示す。Ｄは、選別及び発根後の再生植物を示す。
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下は、当業者が本発明を実施するのを助けるために提供される詳細な説明である。本明細書に記載された実施形態に対する修正及び変形は、本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく行うことができる。単子葉植物種子から切除された胚外植片の形質転換を向上するための組成物及び方法が提供され、これには、本明細書に記載される外植片の調製、外植片の再水和、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの接種及び共培養、出芽誘導、拡大出芽誘導、及び／または遺伝子改変植物もしくは植物部分の再生のうちの１つ以上の工程を含み得る。
【0015】
Ａ．外植片の調製
本発明の実施形態によれば、遺伝子改変単子葉植物または植物部分の作出のために、単子葉植物種子から１つ以上の単子葉植物種子胚外植片を作出することができる。そのような植物種子は、圃場または温室で生育された植物から採取または収穫することができる。そのような単子葉植物種子は、成熟または未成熟の単子葉植物種子であり得るが、好ましくは成熟した単子葉植物種子であり得る。単子葉植物の例としては、トウモロコシ植物、コムギ植物、イネ植物、オオムギ植物、ライムギ植物、キビ植物、エンバク植物、芝草植物、及びソルガム植物が挙げられるが、これらに限定されない。単子葉植物種子の例としては、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）またはトウモロコシ（ｍａｉｚｅ）種子、コムギ種子、イネ種子、オオムギ種子、ライムギ種子、キビ種子、エンバク種子、芝草種子、及びソルガム種子が挙げられるが、これらに限定されない。成熟した単子葉植物種子の使用は、種子の保存、外植片の調製、及び／または培養の向上による利益または利点が得られる可能性がある。本実施形態に従って遺伝子改変または形質転換され得る単子葉植物または植物種子の例としては、Ｐｏａｃｅａｅ科またはＧｒａｍｉｎｅａｅ科の単子葉植物または穀物植物及び草に含まれる任意の植物種が挙げられ、これには、任意のＺｅａ属トウモロコシもしくはトウモロコシ種、例えば、Ｚｅａ ｍａｙｓ、任意のＯｒｙｚａ属イネ種、例えば、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、任意のＴｒｉｔｉｃｕｍ属コムギ種、例えば、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍもしくはＴｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒｇｉｄｕｍ ｖａｒ ｄｕｒｕｍ、任意のＨｏｒｄｅｕｍ属オオムギ種、例えば、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ、任意のＡｖｅｎａ属エンバク種、例えばＡｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ、任意のＳｏｒｇｈｕｍ属ソルガム種、例えばＳｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒもしくはＳｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ、任意のＳｅｃａｌｅ属ライ麦種、例えば、Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ、任意のＳａｃｃｈａｒｕｍサトウキビ種または任意のＳｅｔａｒｉａ、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ、Ｅｌｅｕｓｉｎｅ、Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ、またはＰａｎｉｃｕｍ属キビ種、例えばＳｅｔａｒｉａ ｖｉｒｄｉｓ、Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ、Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｃｏｒａｃａｎａ、Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ ｆｒｕｍｅｎｔａｃｅａ、Ｐａｎｉｃｕｍ ｓｕｍａｔｒｅｎｓｅもしくはＰａｎｉｃｕｍ ｍｉｌｉａｃｅｕｍが含まれ得る。
本発明の実施形態によれば、遺伝子改変単子葉植物または植物部分の作出のために、単子葉植物種子から１つ以上の単子葉植物種子胚外植片を作出することができる。そのような植物種子は、圃場または温室で生育された植物から採取または収穫することができる。そのような単子葉植物種子は、成熟または未成熟の単子葉植物種子であり得るが、好ましくは成熟した単子葉植物種子であり得る。単子葉植物の例としては、トウモロコシ植物、コムギ植物、イネ植物、オオムギ植物、ライムギ植物、キビ植物、エンバク植物、芝草植物、及びソルガム植物が挙げられるが、これらに限定されない。単子葉植物種子の例としては、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）またはトウモロコシ（ｍａｉｚｅ）種子、コムギ種子、イネ種子、オオムギ種子、ライムギ種子、キビ種子、エンバク種子、芝草種子、及びソルガム種子が挙げられるが、これらに限定されない。成熟した単子葉植物種子の使用は、種子の保存、外植片の調製、及び／または培養の向上による利益または利点が得られる可能性がある。本実施形態に従って遺伝子改変または形質転換され得る単子葉植物または植物種子の例としては、Ｐｏａｃｅａｅ科またはＧｒａｍｉｎｅａｅ科の単子葉植物または穀物植物及び草に含まれる任意の植物種が挙げられ、これには、任意のＺｅａ属トウモロコシもしくはトウモロコシ種、例えば、Ｚｅａ ｍａｙｓ、任意のＯｒｙｚａ属イネ種、例えば、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、任意のＴｒｉｔｉｃｕｍ属コムギ種、例えば、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍもしくはＴｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒｇｉｄｕｍ ｖａｒ ｄｕｒｕｍ、任意のＨｏｒｄｅｕｍ属オオムギ種、例えば、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ、任意のＡｖｅｎａ属エンバク種、例えばＡｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ、任意のＳｏｒｇｈｕｍ属ソルガム種、例えばＳｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒもしくはＳｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ、任意のＳｅｃａｌｅ属ライ麦種、例えば、Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ、任意のＳａｃｃｈａｒｕｍサトウキビ種または任意のＳｅｔａｒｉａ、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ、Ｅｌｅｕｓｉｎｅ、Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ、またはＰａｎｉｃｕｍ属キビ種、例えばＳｅｔａｒｉａ ｖｉｒｄｉｓ、Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ、Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｃｏｒａｃａｎａ、Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ ｆｒｕｍｅｎｔａｃｅａ、Ｐａｎｉｃｕｍ ｓｕｍａｔｒｅｎｓｅもしくはＰａｎｉｃｕｍ ｍｉｌｉａｃｅｕｍが含まれ得る。
【0016】
いくつかの実施形態によれば、外植片を調製、培養、選別及び使用するための方法及び組成物、ならびにそれによって作出される外植片または培養外植片が提供される。本明細書で使用する場合、「外植片」または「種子胚外植片」という用語は、遺伝子改変され、その後、遺伝子改変植物または植物部分に再生することができる植物部分または植物組織を指す。「外植片」または「種子胚外植片」は、植物種子または植物種子の任意の部分を指し得、これは植物種子胚の少なくとも一部を含み得る。「外植片」または「種子胚外植片」は、胚分裂組織の少なくとも一部を含み得る植物種子から切除された胚外植片を含み得る。あるいは、「外植片」または「種子胚外植片」は、任意の適切な機械的プロセスによって作出され得る、完全なもしくはインタクトな植物種子、または粉砕された、変形された、もしくは部分的に開かれた植物種子を指し得る。外植片または種子胚外植片に関して使用される場合、「部分的に開かれた」とは、圧搾、粉砕、ローリング、押圧、押出などの機械的な力によって導入された植物種子に１つ以上の開口部または裂け目を有する植物種子の変化した状態を指す。完全なもしくはインタクトな植物種子、または粉砕された、変形された、もしくは部分的に開かれた植物種子である外植片もしくは種子胚外植片は、多くの場合、その種皮が除去され得る。本明細書で使用する場合、「遺伝子改変」植物、植物部分、植物組織、外植片、または植物細胞は、遺伝子形質転換またはゲノム編集技術を介するものであり得る遺伝子工学によって、植物、植物部分、植物組織、外植片、または植物細胞のゲノムに導入された遺伝子改変または導入遺伝子を含む。本明細書で使用する場合、「トランスジェニック」植物、植物部分、植物組織、外植片または植物細胞は、植物、植物部分、植物組織、外植片、または植物細胞のゲノムに組み込まれた外因性核酸配列、ポリヌクレオチド、発現カセット、及び／または導入遺伝子を有する。ある特定の実施形態では、本発明による外植片は、手動で、または自動化プロセスを用いて作出することができる。例えば、種子組織は、切断、研削、研磨、または他の同様のプロセスによって種子から除去され得る。不要な種子部分を手動または自動で除去する方法も実施することができる。種子を機械的に取り扱う際に、例えば、圧縮空気、他の気体、及び液体などの流体を使用して、外植片を移動させ、破片から所望の外植片を分離することができる。胚外植片は、乾燥、乾燥させた、または湿潤種子から切除され得る。成熟した植物種子（ｐａｎｔ ｓｅｅｄ）は、通常の成熟プロセスの一部として乾燥し得るが、種子は切除前にさらに乾燥させることもあり得、及び／または外植片は種子から切除後に乾燥させることもあり得る。植物胚外植片の乾燥または乾燥切除は、すぐに使用するために、または一定期間保管した後に後で使用するために実施され得る。外植片の調製は、種子または外植片の乾燥させていない初期含水量に応じて、改良した保管調製（例えば、切除）または使用のために種子及び／または外植片の所望の含水量を得るために種子及び／または外植片を乾燥させることをさらに含み得る。切除後、外植片は、すすぎ、浮遊、または当該技術分野で知られている他の方法によって、他の種子材料及び破片から精製または単離され得る。
【0017】
他の実施形態では、本発明の実施形態に従って調製または使用される種子または外植片は、約３％～約２５％、約３％～約２０％、約３％～約１５％、約３％～約１０％、約５％～約１０％の内部水分、例えば、約３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、または約２５％（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の内部水分を有するものとして定義され得る。外植片は、本明細書に記載の含水量を有する成熟種子から作出され得る。具体的な態様では、種子または外植片の含水量は、外植片の切除、外植片の保管の前後、外植片の保管中、外植片の再水和前、及び／または遺伝子改変もしくは形質転換の前に測定することができる。
【0018】
一態様では、本発明の実施形態に従って、任意の単子葉胚外植片を調製または使用することができる。特定の実施形態では、単子葉植物胚外植片は、成熟胚、未成熟胚、分裂組織、カルス組織、または形質転換可能な及び再生可能な任意の他の組織であり得る。いくつかの実施形態では、成熟胚外植片は、乾燥切除された外植片である。乾燥切除された外植片は、種子から採取され、形質転換または遺伝子改変のための標的としてほとんど直接的に使用され得る。一実施形態では、乾燥切除された外植片は、成熟した乾燥種子から採取され得、おそらく、最少限の湿潤、水和または前培養工程のみにより形質転換または遺伝子改変の標的として使用され得る。他の実施形態では、湿潤、乾燥湿潤、または湿潤切除された胚外植片は、形質転換または遺伝子改変の標的として使用され得る。本明細書で使用する場合、「湿潤」胚外植片は、形質転換または遺伝子改変の前に、湿潤、水和、吸水、または他の最小限の培養工程に供された乾燥切除された外植片を指す。本明細書で使用する場合、「乾燥湿潤」胚外植片は、湿らせることによって発芽のために準備され、次いで乾燥させて発芽を停止する胚外植片を指す。本明細書で使用する場合、「湿潤切除された」外植片は、吸水したまたは水和した種子から切除された外植片を指す。湿潤胚外植片は、種子からの切除後に水和または吸水させられるが、湿潤切除された胚外植片は、すでに水和させた種子または吸水させた種子から切除される。本明細書で使用する場合、「カルス」とは、未組織化、未分化、及び／または脱分化した植物細胞または組織の増殖塊を指す。
【0019】
本発明に従って使用するための外植片は、成熟した単子葉植物種子からの単離、切除、または除去後のさまざまな時点で遺伝子改変され得る。一実施形態では、外植片は、使用前に、１日未満、例えば、約１～約２４時間、例えば、約１、２、３、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間かけて種子から除去され得る。他の実施形態では、外植片は、使用前に、数日間、数週間、数ヶ月間、または数年間など、長期間にわたって保存され得る。種子を乾燥、保存、及び発芽させるための方法及びパラメーターは、当該技術分野で知られている（例えば、米国特許第８，３６２，３１７号（その全体が特に参照により本明細書に組み込まれる）、Ｓｅｎａｒａｔｎａ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．７２：６２０－６２４，１９８３；Ｖｅｒｔｕｃｃｉ ａｎｄ Ｒｏｏｓ，１９９０，Ｐｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．９０：１０１９－１０２３，１９９０；Ｃｈａｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｓｅｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １）：２３－２８，１９９８）。例えば、約－８０℃～約６０℃の温度でのインキュベーションまたは保存を含む、任意の条件を必要に応じて使用することができる。
【0020】
本発明は、特定の態様において、種子または外植片の殺菌を含み得る。殺菌には、そうしないと種子または胚の生存能力を妨げる可能性のある生存可能な細菌または真菌汚染物質の存在を低減または除去する役割を果たすさまざまな液体または気体と種子または外植片材料を接触させることを含むことができる。液体の適用による殺菌はまた、植物種子、外植片、胚または組織を水和または部分的に水和することができ、種子、外植片、胚または組織をプライミングする目的を果たす。殺菌方法には、塩素ガス、オゾン、漂白剤またはアルコールの溶液、紫外線、－２０℃以下の温度、及び４０℃を超える温度への曝露の使用が含まれるが、これらに限定されない。
【0021】
本発明の一態様では、形質転換または遺伝子改変の前に外植片を再水和してもよい。再水和培地または溶液は当該技術分野で知られており、例えば、水、基礎塩、多量要素、微量要素、及び／またはビタミンを含み得る。再水和培地は、通常、任意の植物ホルモン、例えば、オーキシンまたはサイトカイニンを含まない。一実施形態では、単子葉植物種子胚外植片の再水和は、形質転換もしくは遺伝子改変の前に約３０分～約２４時間の範囲の期間、またはそのような範囲内の任意の長さの期間、例えば、約１時間、約１．５時間、約２時間、もしくは約２．５時間、または約３時間以下、もしくは約２．５時間以下、もしくは約２時間以下、または約１時間～約３時間の範囲内、もしくは約１時間～約２．５時間の範囲内、もしくは約１．５時間～約２．５時間の範囲内で実施することができる。形質転換または遺伝子改変の前に胚外植片を再水和すると、再水和しなかった外植片と比較して、形質転換もしくは編集頻度または形質転換もしくは編集された植物の回収が少なくとも約０．２倍、０．４倍、０．６倍、０．８倍、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、または４０倍（その間で導出可能なすべての範囲を含む）向上し得る。特定の実施形態では、形質転換または遺伝子改変の前に単子葉植物種子胚外植片を少なくとも約２時間再水和すると、約１時間再水和した外植片と比較して、形質転換もしくは編集頻度または形質転換もしくは編集された植物の回収が少なくとも約０．２倍、０．４倍、０．６倍、０．８倍、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、または１０倍（その間で導出可能なすべての範囲を含む）向上し得る。
【0022】
本開示のいくつかの実施形態では、植物の形質転換または編集の向上は、遺伝子型決定、一過性発現、シュート頻度、正常シュートの割合、正常シュート頻度、正常植物頻度、１つ以上の異なる植物引き抜き工程における発根シュートの割合、及び／または全体的な形質転換頻度、プラギング頻度、低コピー数植物の頻度、及び／または低コピー数頻度によって測定され得る。本明細書に記載の方法は、例えば、植物の形質転換または編集を少なくとも約０．１倍、０．２倍、０．４倍、０．６倍、０．８倍、１倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、７．５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、または４０倍（その間で導出可能なすべての範囲を含む）向上し得る。
【0023】
Ｂ．接種及び力による形質転換
本明細書では、単子葉植物種子由来外植片または単子葉胚外植片の遺伝子形質転換または改変のための方法及び組成物が提供される。一態様または実施形態では、これらの外植片は、分裂組織または胚分裂組織を含むものとして定義され得、これには、分化または発生して、複数の植物構造（茎、根、葉、生殖系列組織、及び種子が挙げられるが、これらに限定されない）を作出することができる植物細胞が含まれる。実際、胚外植片は、他の非胚種子組織から除去された種子胚の全部または一部を含み、さらに分裂組織または胚分裂組織の全部または一部を含むものとして定義され得る。本発明の実施形態は、当該技術分野で知られている任意の適切な方法または技術、例えばエレクトロポレーション、マイクロプロジェクタイルまたはパーティクルボンバードメント、マイクロインジェクション、ＰＥＧ媒介形質転換、ＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換、及び他の直接的なＤＮＡ取り込み様式によって、少なくとも１つの細胞に異種ポリヌクレオチド分子を導入することによって外植片の少なくとも１つの細胞を遺伝子形質転換または改変することを含み得る。次いで、異種ポリヌクレオチドの全部または一部は、形質転換されるか、もしくは植物細胞のゲノムに組み込まれ、１つ以上の編集分子もしくはツール（ガイドＲＮＡ及び／または部位特異的ヌクレアーゼなど）へと発現し、及び／または編集もしくは部位指向的組込み用の鋳型をもたらす。多くの実施形態によれば、異種ポリヌクレオチドは、ＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換によって少なくとも１つの外植片細胞に導入される。導入または接種工程は、周囲照明条件下で実施することができ、胚外植片に何らかの力処理に供することを含み得る。
本明細書では、単子葉植物種子由来外植片または単子葉胚外植片の遺伝子形質転換または改変のための方法及び組成物が提供される。一態様または実施形態では、これらの外植片は、分裂組織または胚分裂組織を含むものとして定義され得、これには、分化または発生して、複数の植物構造（茎、根、葉、生殖系列組織、及び種子が挙げられるが、これらに限定されない）を作出することができる植物細胞が含まれる。実際、胚外植片は、他の非胚種子組織から除去された種子胚の全部または一部を含み、さらに分裂組織または胚分裂組織の全部または一部を含むものとして定義され得る。本発明の実施形態は、当該技術分野で知られている任意の適切な方法または技術、例えばエレクトロポレーション、マイクロプロジェクタイルまたはパーティクルボンバードメント、マイクロインジェクション、ＰＥＧ媒介形質転換、ＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換、及び他の直接的なＤＮＡ取り込み様式によって、少なくとも１つの細胞に異種ポリヌクレオチド分子を導入することによって外植片の少なくとも１つの細胞を遺伝子形質転換または改変することを含み得る。次いで、異種ポリヌクレオチドの全部または一部は、形質転換されるか、もしくは植物細胞のゲノムに組み込まれ、１つ以上の編集分子もしくはツール（ガイドＲＮＡ及び／または部位特異的ヌクレアーゼなど）へと発現し、及び／または編集もしくは部位指向的組込み用の鋳型をもたらす。多くの実施形態によれば、異種ポリヌクレオチドは、ＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換によって少なくとも１つの外植片細胞に導入される。導入または接種工程は、周囲照明条件下で実施することができ、胚外植片に何らかの力処理に供することを含み得る。
【0024】
本発明の実施形態によれば、単子葉植物種子胚外植片に異種ポリヌクレオチド分子を含むＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細菌を接種する前もしくは接種する間、または接種する前及び接種する間に、単子葉植物種子胚外植片に力処理が適用される。いくつかの実施形態によれば、力処理は、単子葉植物種子胚外植片の再水和中及び／または再水和後に適用される。多くの実施形態によれば、力処理は、単子葉植物種子胚外植片が接種培地と接触している間の接種工程中に適用することができる。一実施形態では、培地と「接触している」外植片は、培地中または培地上に完全にまたは部分的に配置され得る。外植片が接触し得る培地の非限定的な例としては、液体培地、固体培地、及び培地を含む基質が含まれる。単子葉植物種子胚外植片は、力処理が適用されるときに、ある体積の接種培地に浸漬され得る。あるいは、単子葉植物種子胚外植片は、過剰量の接種培地を除去した後に、力処理を適用され得る。接種培地は、例えば、力処理を適用する前に、外植片からデカントされるか、注ぎ出されるか、または吸い取られ得る。力処理が接種工程中に適用される場合、たとえ力処理の前にある量またはある体積の接種培地が外植片から除去されたとしても、接種培地が単子葉植物種子胚外植片と接触することが完全にないわけではない。
【0025】
本明細書で使用する場合、「異種ポリヌクレオチド分子」という用語は、人為的な介入なしには、形質転換される細胞内に、天然に存在しない、または同じ形態、構造などで天然に存在しないポリヌクレオチド分子を指す。例えば、異種ポリヌクレオチド分子は、形質転換される植物種には天然には存在し得ない、または形質転換される種において見出される天然の発現パターンもしくはゲノム状況とは異なる様式もしくはゲノム状況で発現され得る（例えば、過剰発現）。一実施形態では、異種ポリヌクレオチド分子は、２つ以上のポリヌクレオチド分子の組み合わせであってもよく、そのような組み合わせは天然には通常見出されない。ある特定の実施形態では、２つのポリヌクレオチド分子は異なる種に由来してもよく、または異なる遺伝子に由来してもよい（例えば、同じ種由来の異なる遺伝子、または異なる種由来の同じ遺伝子）。特定の実施形態では、異種ポリヌクレオチド分子は、いかなる天然に存在するポリヌクレオチド分子においても並置または作動可能に連結されていない２つのポリヌクレオチド配列を含み得る。一実施形態では、異種ポリヌクレオチド分子は、転写可能なポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターまたは他の調節配列を含んでもよく、該プロモーター及び転写可能なポリヌクレオチド配列は、いかなる天然に存在するポリヌクレオチド分子においても作動可能に連結されていない。本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド分子」という用語は、任意の供給源に由来し得る、直鎖状または環状の一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド分子または配列を指す。例えば、ポリヌクレオチド分子は、１つ以上の核酸配列が機能的に作動する様式で互いに連結されているポリヌクレオチド配列を含み得る。本明細書で使用する場合、「核酸配列」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）配列を指す。
【0026】
いくつかの実施形態によれば、ポリヌクレオチド分子または異種ポリヌクレオチド分子は、組換えポリヌクレオチド分子であり得る。本明細書で使用する場合、「組換え」という用語は、ポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）分子、タンパク質、構築物、ベクターなどに関して使用される場合、人為的な介入なしには、天然に存在しない、または同じ形態、構造などで天然に存在しないポリヌクレオチドまたはタンパク質分子または配列を指す。一実施形態では、組換えポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）分子、タンパク質、構築物、ベクターなどは、例えば、作動可能に連結されているが互いに関して異種である少なくとも２つのポリヌクレオチドまたはタンパク質配列を含むポリヌクレオチド分子、タンパク質、構築物など、同じ様式で天然には一緒に存在しない２つ以上のポリヌクレオチドまたはタンパク質配列の組み合わせを含み得る。別の実施形態では、組換えポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）分子、タンパク質、構築物、ベクターなどは、例えば、同じ分子（例えば、プラスミド、構築物、ベクター、染色体、タンパク質など）中の２つ以上のポリヌクレオチドまたはタンパク質配列の任意の組み合わせを含んでもよく、そのような組み合わせは人工的であり、天然には通常見出されない。この定義において使用される場合、「天然には通常見出されない」という語句は、人為的な介入なしでは天然に見出されないことを意味する。組換えポリヌクレオチドまたはタンパク質分子、構築物などは、ポリヌクレオチドまたはタンパク質配列（複数可）であって、（ｉ）互いに天然では近接して存在する他のポリヌクレオチドまたはタンパク質配列（複数可）から分離されている、ポリヌクレオチドまたはタンパク質配列（複数可）、及び／または（ｉｉ）天然では互いに近接していない他のポリヌクレオチドまたはタンパク質配列（複数可）に隣接している（またはそれと連続している）、ポリヌクレオチドまたはタンパク質配列（複数可）を含み得る。かかる組換えポリヌクレオチド分子、タンパク質、構築物などは、細胞の外側で、遺伝子操作された及び／または構築されたポリヌクレオチドまたはタンパク質分子、または配列も指し得る。例えば、組換えＤＮＡ分子は、任意の操作されたまたは人工のプラスミド、ベクターなどを含み得、直鎖状または環状のＤＮＡ分子を含み得る。そのようなプラスミド、ベクターなどは、例えば、原核生物の複製起点及び選別マーカー、ならびにおそらく植物の選別マーカー遺伝子などに加えて１つ以上の導入遺伝子または発現カセットを含む種々の維持エレメントを含み得る。
【0027】
接種培地中のＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌またはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの濃度は、光学密度（ＯＤ）の観点から測定及び／または定義することができる。実施例に示されるように、接種培地及び／または共培養培地中のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの濃度が高くなると、シュート頻度及びプラギング頻度、ひいては形質転換頻度が向上または増加する可能性がある。接種培地におけるＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌またはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのＯＤ濃度は、約０．１～約２．０、約０．１～約１．０、約０．１～約０．７５、約０．１～約０．５、約０．２～約２．０、約０．２～約１．０、約０．２～約０．５、約０．２５～約２．０、約０．５～約２．０、約０．５～約１．５、約０．７５～約１．５、もしくは約０．７５～約１．２５、または約０．１、０．２、０．２５、０．５、０．７５、１．０、１．２５、１．５、もしくは２．０（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の範囲内であり得る。
【0028】
植物の形質転換または編集を向上するために、種々の異なる力処理、例えば、遠心力処理、重力処理、真空処理、超音波処理、ボルテックス処理、剪断処理、機械的力処理、及び／または圧力処理、またはそれらの任意の組み合わせを、接種工程の前及び／または間に、単子葉植物種子胚外植片に使用または適用することができる。いくつかの実施形態によれば、力処理は、圧力処理及び／または重力（または遠心力）の力処理を含み得る。いくつかの実施形態によれば、力処理は圧力処理を含み得る。いくつかの実施形態によれば、力処理は、重力（または遠心力）の力処理を含み得る。具体的な実施形態では、本明細書に記載の方法は、圧力処理及び／または重力（または遠心力）の力処理に加えて、機械的力処理、ボルテックス処理、振とうまたは剪断処理、超音波処理、及び／または真空処理を適用することをさらに含むことができる。理論に束縛されるものではないが、接種前または接種中に力処理を適用すると、単子葉植物種子胚外植片へのＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌の接触及び付着を増加させることにより、単子葉植物種子胚外植片を付傷することにより、及び／または分裂組織もしくは他の外植片組織へのＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌の浸透を増加させることにより、形質転換を向上し得る。
【0029】
いくつかの実施形態では、力処理は、単子葉植物種子胚外植片に対して、約１００ポンド／平方インチ（ｐｓｉ）～約２０，０００ｐｓｉ、約１００ｐｓｉ～約１８，０００ｐｓｉ、約１００ｐｓｉ～約１６，０００ｐｓｉ、約１００～約１４，０００ｐｓｉ、約１００～約１２，０００ｐｓｉ、約１００～約１０，０００ｐｓｉ、約１００～約８，０００ｐｓｉ、約１００～約６，０００ｐｓｉ、約１００～約４，０００ｐｓｉ、約１００～約２，０００ｐｓｉ、約１００～約１，０００ｐｓｉ、または約１００ｐｓｉ～約５００ｐｓｉ、例えば、約１００ｐｓｉ、約１５０ｐｓｉ、約２００ｐｓｉ、約２５０ｐｓｉ、約３００ｐｓｉ、約３５０ｐｓｉ、約４００ｐｓｉ、または約５００ｐｓｉの範囲の圧力（その間で導出可能なすべての範囲を含む）で圧力または処理を適用することを含み得る。圧力の他の単位も当該技術分野で知られている。ｐｓｉでの圧力を他の単位、例えば標準大気圧（ａｔｍ）及びニュートン（Ｎ）毎平方メートル（Ｎ／ｍ２）に変換する方法は、当該技術分野で知られている。ａｔｍでの圧力は、以下の式：ａｔｍ＝圧力（ｐｓｉ）／１４．６９５９４８８を用いて正確に計算することができ、１ｐｓｉは約６８９４．７６Ｎ／ｍ２に相当する。したがって、１００ｐｓｉは約６．８０ａｔｍに相当し、２０，０００ｐｓｉは約１３６０．９ａｔｍに相当する。圧力処理はまた、表面積が既知または固定されている場合、力の量に変換することもできる。例えば、本明細書の実施例で使用されるフレンチプレス４０Ｋ圧力セル（Ｔｈｅｒｍｏ（登録商標）ＩＥＣ、ＦＡ－０３２）のピストン／セルキャビティの表面積は、約０．８８インチ２である。したがって、フレンチプレス４０Ｋ圧力セルを使用して適用される３，３３４ｐｓｉは、約１３，０００Ｎ［（３，３３４ｐｓｉ×０．８８インチ２）］／［０．２２５ポンド／Ｎ］に相当する。いくつかの実施形態では、圧力処理は、約１０秒～約１０分、約１５秒～約８分、約３０秒～約６分、約２分～約４分、または約３分間（その間で導出可能なすべての範囲を含む）適用され得る。
【0030】
本明細書に記載の方法は、約１００×ｇ～約１０，０００×ｇ、約１００×ｇ～約５，０００×ｇ、約２５０×ｇ～約５，０００×ｇ、約５００×ｇ～約５，０００×ｇ、約５００×ｇ～約３，０００×ｇ、約６００×ｇ～約２，７００×ｇ、例えば、約５００×ｇ、約５５０×ｇ、約６００×ｇ、約６５０×ｇ、約７００×ｇ、約７５０×ｇ、約８００×ｇ、約８５０×ｇ、約９００×ｇ、約９５０×ｇ、約１０００×ｇ、約１５００×ｇ、約２０００×ｇ、約２５００×ｇ、約３０００×ｇ、約３５００×ｇ、または約４０００×ｇの範囲（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の重力または遠心力を適用することを含み、単子葉植物種子胚外植片に適用され得る。単子葉植物種子胚外植片に適用され得る重力処理の非限定的な例としては、適切な遠心分離機を使用して適用され得る遠心力または相対遠心力が挙げられる。遠心分離機によって生じる相対遠心力（ＲＣＦ）などの重力または遠心力を、他の単位、例えば、毎分回転数（ｒｐｍ）及びニュートン（Ｎ）に変換する方法は、当該技術分野で知られている。相対遠心力は、次の式：ｒｐｍ＝√［ＲＣＦ／（ｒ×１．１１８）×１×１０５］（式中、ｒ＝センチメートルでの回転半径）を使用して、ｒｐｍとデバイスの既知の寸法に基づいて計算できる。本明細書に記載の実施例において使用したＳｏｒｖａｌｌ（商標）ＲＣ３ＢＰ遠心分離機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）の場合、回転半径は約２４．６７ｃｍである。したがって、２６２０×ｇは、約３，０８２ｒｐｍ［√［２６２０／（２４．６７×１．１１８）］×１×１０５］に相当する。同様に、ニュートン単位の遠心力は、次の式：力（Ｎ）＝ＲＣＦ×遠心分離管の内容物の質量（ｋｇ）×９．８２ｍ／ｓ２を使用して正確に推定することができる。一実施形態では、遠心分離管の内容物の質量が約０．０５ｋｇであり得る場合、２６２０×ｇは約１２８６Ｎ［（２６２０×ｇ）×０．０５ｋｇ×９．８２ｍ／ｓ２］に相当し得る。いくつかの実施形態では、重力または遠心力処理は、約１分～約２時間、約２分～約１１０分、約５分～約９０分、約１０分～約９０分、約１０分～約８０分、約１０分～約７０分、約１０分～約６０分、約１０分～約５０分、約１５分～約４５分、または約２０分～約４０分、例えば、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、または約６０分（１時間）（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の範囲で適用され得る。
【0031】
力処理、例えば重力（または遠心力）及び／または圧力処理（複数可）は、約０．５℃～約２８℃、約２℃～約２８℃、約４℃～約２８℃、約１０℃～約２８℃、約１０℃～約２５℃、または約１５℃～約２３℃（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の温度で適用され得る。
【0032】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される力処理の適用は、植物の形質転換または編集を少なくとも約０．２倍、０．４倍、０．６倍、０．８倍、１倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、または５倍（その間で導出可能なすべての範囲を含む）向上し得る。
【0033】
本明細書で提供される方法の一態様では、力処理は、単子葉植物種子胚外植片に圧力処理と重力処理の両方を適用することを含んでもよい。圧力処理及び／または重力処理は、単子葉植物種子胚外植片にＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ目からの細菌を接種する前、接種中、または接種前及び接種中に適用することができ、ここで、Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌は、単子葉植物種子胚外植片の少なくとも１つの植物細胞を形質転換、編集、または遺伝子改変するための異種ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、圧力処理は、重力処理を適用する前に適用される。いくつかの実施形態では、重力処理は、圧力処理の前に適用される。圧力処理と重力処理の適用順序は、形質転換または編集効率もしくは頻度の向上に基づいて、または取り扱いの容易さに基づいて選択され得る。いくつかの実施形態では、圧力処理と重力処理の組み合わせが単子葉植物種子胚外植片に適用される場合、圧力処理は、重力処理の前に適用され得、これは、少なくとも部分的に、重力処理または遠心力処理で外植片をペレット化する前に、力処理をより均一に適用できるためであり得る。しかしながら、遠心分離またはペレット化された外植片は、その後の圧力処理の前に再懸濁される可能性があり得、または再懸濁せずに遠心分離もしくはペレット化された外植片に圧力処理が適用される可能性がある。本発明の一態様では、接種前、接種中、または接種前及び接種中のいずれかで圧力処理及び重力処理を適用することは、圧力処理のみ、または重力処理のみを適用する場合と比較して、少なくとも約０．２倍、０．４倍、０．６倍、０．８倍、１倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、または５倍（その間で導出可能なすべての範囲を含む）、植物の形質転換または編集を向上し得る。
【0034】
別の態様では、本明細書に記載の方法は、単子葉植物種子胚外植片に真空処理を適用することをさらに含み得る。真空処理は、例えば、Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌を含む液体接種培地に単子葉植物種子胚外植片を浸漬することと、単子葉植物種子胚外植片を減圧に供した後、急速または徐々に再加圧することとを含み得る。あるいは、液体接種培地に浸漬されていない単子葉植物種子胚外植片に真空処理を適用してもよい。いくつかの実施形態では、真空処理は、力処理が適用される前、力処理が適用された後、重力処理が適用される前、重力処理が適用された後、圧力処理が適用される前、及び／または圧力処理が適用された後に適用され得る。特定の実施形態では、力処理が圧力処理と重力処理を適用することを含む場合、重力処理または圧力処理のどちらを先に適用したかに関係なく、圧力処理の適用と重力処理の適用との間に真空処理を適用することができる。一実施形態では、単子葉植物種子胚外植片は、約０．０５ａｔｍ～約０．５０ａｔｍ、約０．０５ａｔｍ～約０．４０ａｔｍ、約０．０５ａｔｍ～約０．３０ａｔｍ、約０．０５ａｔｍ～約０．２０ａｔｍ、約０．０５ａｔｍ～約０．１０ａｔｍ、約０．１０ａｔｍ～約０．５０ａｔｍ、約０．１０ａｔｍ～約０．４０ａｔｍ、約０．１０ａｔｍ～約０．３０ａｔｍの圧力、または約０．１０ａｔｍ～約０．２０ａｔｍの圧力（その間で導出可能なすべての範囲）の真空処理に供され得る。
【0035】
Ｃ．胚外植片の共培養
異種ポリヌクレオチドを含むＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを単子葉植物種子胚外植片（複数可）に接種して、異種ポリヌクレオチドを単子葉植物種子胚外植片（複数可）の少なくとも１つの細胞に導入した後、単子葉植物種子胚外植片（複数可）は、共培養培地と接触して共培養され得る。共培養培地は、例えば、水、基礎塩、多量要素、微量要素、及び／またはビタミンを含み得る。しかしながら、本実施形態によれば、共培養培地は、任意の植物ホルモン、例えば、オーキシンもしくはサイトカイニン及び／または任意の界面活性剤もしくは湿潤剤を含まなくてもよいが、植物ホルモンもしくはオーキシン及び／または界面活性剤もしくは湿潤剤が代替的に共培養培地中に存在してもよい。ある特定の実施形態では、界面活性剤には、当該技術分野で知られている任意の界面活性剤または界面活性剤の組み合わせ、例えば洗剤、湿潤剤、乳化剤、発泡剤、または分散剤が含まれ得る。一実施形態では、界面活性剤は、Ｓｉｌｗｅｔ（登録商標）または類似の界面活性剤であり得る。いくつかの実施形態によれば、単子葉植物種子胚外植片（複数可）は、約１５℃～約２５℃、もしくは約１７℃～約２３℃、もしくは約１８℃～約２０℃の範囲の温度で、または約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、もしくは約２５℃の温度で共培養培地と接触し得る。いくつかの実施形態によれば、単子葉植物種子胚外植片（複数可）は、約１日～約１０日、または約２日～約１０日、または約２日～約８日、または約３日～約８日、または約４日～約８日、または約５日～約７日、例えば、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、または約８日の範囲の期間、共培養培地と接触し得る。多くの実施形態によれば、単子葉植物種子胚外植片（複数可）は、少なくとも５日間または少なくとも６日間、共培養培地と接触し得る。本実施形態によれば、単子葉植物種子胚外植片（複数可）と接触する共培養培地は、固体、液体、または半固体培地であり得る。本実施形態によれば、単子葉植物種子胚外植片（複数可）は、液体共培養培地で湿らせ、充填され、または浸漬された、マトリックス、紙、またはメッシュ材料または基材、例えばワットマンまたは他の濾紙と接触し得る。本実施形態によれば、単子葉植物種子胚外植片（複数可）は、共培養培地と接触してもよいが、共培養培地中に浸漬されない。
異種ポリヌクレオチドを含むＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを単子葉植物種子胚外植片（複数可）に接種して、異種ポリヌクレオチドを単子葉植物種子胚外植片（複数可）の少なくとも１つの細胞に導入した後、単子葉植物種子胚外植片（複数可）は、共培養培地と接触して共培養され得る。共培養培地は、例えば、水、基礎塩、多量要素、微量要素、及び／またはビタミンを含み得る。しかしながら、本実施形態によれば、共培養培地は、任意の植物ホルモン、例えば、オーキシンもしくはサイトカイニン及び／または任意の界面活性剤もしくは湿潤剤を含まなくてもよいが、植物ホルモンもしくはオーキシン及び／または界面活性剤もしくは湿潤剤が代替的に共培養培地中に存在してもよい。ある特定の実施形態では、界面活性剤には、当該技術分野で知られている任意の界面活性剤または界面活性剤の組み合わせ、例えば洗剤、湿潤剤、乳化剤、発泡剤、または分散剤が含まれ得る。一実施形態では、界面活性剤は、Ｓｉｌｗｅｔ（登録商標）または類似の界面活性剤であり得る。いくつかの実施形態によれば、単子葉植物種子胚外植片（複数可）は、約１５℃～約２５℃、もしくは約１７℃～約２３℃、もしくは約１８℃～約２０℃の範囲の温度で、または約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、もしくは約２５℃の温度で共培養培地と接触し得る。いくつかの実施形態によれば、単子葉植物種子胚外植片（複数可）は、約１日～約１０日、または約２日～約１０日、または約２日～約８日、または約３日～約８日、または約４日～約８日、または約５日～約７日、例えば、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、または約８日の範囲の期間、共培養培地と接触し得る。多くの実施形態によれば、単子葉植物種子胚外植片（複数可）は、少なくとも５日間または少なくとも６日間、共培養培地と接触し得る。本実施形態によれば、単子葉植物種子胚外植片（複数可）と接触する共培養培地は、固体、液体、または半固体培地であり得る。本実施形態によれば、単子葉植物種子胚外植片（複数可）は、液体共培養培地で湿らせ、充填され、または浸漬された、マトリックス、紙、またはメッシュ材料または基材、例えばワットマンまたは他の濾紙と接触し得る。本実施形態によれば、単子葉植物種子胚外植片（複数可）は、共培養培地と接触してもよいが、共培養培地中に浸漬されない。
【0036】
共培養工程は、さまざまな照明条件下で実施することもできる。ある程度の照明が一般に使用され得るが、共培養工程のすべてまたは一部を代替的に暗所で行ってもよい。照明処理は、明暗サイクル及び光強度の観点で定量化でき、μ／ｍ２・ｓの単位で光合成光子束密度（ＰＰＦＤ）として表すことができる。いくつかの実施形態によれば、共培養工程は、約０μ／ｍ２・ｓ～約２００μ／ｍ２・ｓ、２０μ／ｍ２・ｓ～約２００μ／ｍ２・ｓ、２０μ／ｍ２・ｓ～約１８０μ／ｍ２・ｓ、３０μ／ｍ２・ｓ～約１８０μ／ｍ２・ｓ、３０μ／ｍ２・ｓ～約１５０μ／ｍ２・ｓ、３０μ／ｍ２・ｓ～約１２０μ／ｍ２・ｓ、６０μ／ｍ２・ｓ～約１２０μ／ｍ２・ｓ、７０μ／ｍ２・ｓ～約１１０μ／ｍ２・ｓ、または８０μ／ｍ２・ｓ～約１００μ／ｍ２・ｓの範囲で光合成有効放射（ＰＡＲ）の平均または設定光強度で実施され得る。いくつかの実施形態によれば、共培養工程は、約０μ／ｍ２・ｓ、約１０μ／ｍ２・ｓ、約２０μ／ｍ２・ｓ、約３０μ／ｍ２・ｓ、約４０μ／ｍ２・ｓ、約５０μ／ｍ２・ｓ、約６０μ／ｍ２・ｓ、約７０μ／ｍ２・ｓ、約８０μ／ｍ２・ｓ、約９０μ／ｍ２・ｓ、約１００μ／ｍ２・ｓ、約１１０μ／ｍ２・ｓ、約１２０μ／ｍ２・ｓ、約１３０μ／ｍ２・ｓ、約１４０μ／ｍ２・ｓ、約１５０μ／ｍ２・ｓ、約１６０μ／ｍ２・ｓ、約１７０μ／ｍ２・ｓ、約１８０μ／ｍ２・ｓ、約１９０μ／ｍ２・ｓ、または約２００μ／ｍ２・ｓで光合成有効放射（ＰＡＲ）の平均または設定光強度で実施され得る。いくつかの実施形態によれば、異なる量の明暗サイクルが共培養工程中に使用されてもよく、これは、約０時間～約２４時間の明期、約２時間～約２２時間の明期、約４時間～約２０時間の明期、約８時間～約２０時間の明期、約１２時間～約２０時間の明期、約１６時間～約２０時間の明期の時間の長さにわたる照明の存在を含み得、それぞれ２４時間の１日の長さに基づいて対応する長さの時間の対応する量の相対的な暗期を有する。
【0037】
いくつかの実施形態によれば、共培養工程中の明暗サイクルの量は、約０時間の明期及び約２４時間の暗期、約１時間の明期及び約２３時間の暗期、約２時間の明期及び約２２時間の暗期、約３時間の明期及び約２１時間の暗期、約４時間の明期及び約２０時間の暗期、約５時間の明期及び約１９時間の暗期、約６時間の明期及び約１８時間の暗期、約７時間の明期及び約１７時間の暗期、約８時間の明期及び約１６時間の暗期、約９時間の明期及び約１５時間の暗期、約１０時間の明期及び約１４時間の暗期、約１１時間の明期及び約１３時間の暗期、約１２時間の明期及び約１２時間の暗期、約１３時間の明期及び約１１時間の暗期、約１４時間の明期及び約１０時間の暗期、約１５時間の明期及び約９時間の暗期、約１６時間の明期及び約８時間の暗期、約１７時間の明期及び約７時間の暗期、約１８時間の明期及び約６時間の暗期、約１９時間の明期及び約５時間の暗期、約２０時間の明期及び約４時間の暗期、約２１時間の明期及び約３時間の暗期、約２２時間の明期及び約２時間の暗期、約２３時間の明期及び約１時間の暗期、約２４時間の明期及び約０時間の暗期であり得る。
【0038】
いくつかの実施形態によれば、共培養培地は、外植片の少なくとも１つの細胞を異種ポリヌクレオチド分子で形質転換する能力のあるＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌またはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを含み得る。実施例に示されるように、接種培地及び／または共培養培地中のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの濃度が高くなると、シュート頻度及びプラギング頻度、ひいては形質転換頻度が向上または増加する可能性がある。共培養培地におけるＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌またはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのＯＤ濃度は、約０．１～約２．０、約０．１～約１．０、約０．１～約０．７５、約０．１～約０．５、約０．２～約２．０、約０．２～約１．０、約０．２～約０．５、約０．２５～約２．０、約０．５～約２．０、約０．５～約１．５、約０．７５～約１．５、もしくは約０．７５～約１．２５、または約０．１、０．２、０．２５、０．５、０．７５、１．０、１．２５、１．５、もしくは２．０（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の範囲内であり得る。
【0039】
Ｄ．出芽誘導及び拡大出芽誘導
本実施形態によれば、異種ポリヌクレオチド分子を胚外植片の少なくとも１つの細胞に導入することによって形質転換または編集された単子葉植物種子胚外植片は、オーキシン及びサイトカイニンを含む少なくとも第１の出芽誘導培地と接触して培養され得る。単子葉植物種子胚外植片は、異種ポリヌクレオチド分子を含むＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを含む接種培地で接種されていてもよく、単子葉植物種子胚外植片は、出芽誘導工程の前に共培養培地と接触して共培養されていてもよい。
本実施形態によれば、異種ポリヌクレオチド分子を胚外植片の少なくとも１つの細胞に導入することによって形質転換または編集された単子葉植物種子胚外植片は、オーキシン及びサイトカイニンを含む少なくとも第１の出芽誘導培地と接触して培養され得る。単子葉植物種子胚外植片は、異種ポリヌクレオチド分子を含むＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを含む接種培地で接種されていてもよく、単子葉植物種子胚外植片は、出芽誘導工程の前に共培養培地と接触して共培養されていてもよい。
【0040】
本明細書に提供されるように、単子葉植物種子胚外植片は、オーキシン及びサイトカイニンを含む第２のまたは拡大出芽誘導培地と接触してさらに培養されてもよく、次いで、再生培地と接触して培養されて、遺伝子改変植物または植物部分を作出し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、単子葉植物種子胚外植片を出芽誘導培地（または第１の出芽誘導培地）と接触させて培養した後、かつ再生培地と接触させて、培養した単子葉植物種子胚外植片から遺伝子改変単子葉植物または植物部分を再生する前に、第２の出芽誘導培地と接触させて単子葉植物種子胚外植片を培養することを含む。別の実施形態では、（第１の）出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地はそれぞれ、高いサイトカイニン対オーキシン比を含み得る。
【0041】
本実施形態によれば、出芽誘導培地（または第１の出芽誘導培地）及び第２の出芽誘導培地（または拡大出芽誘導培地）はそれぞれ、さまざまな標準的な培養培地または溶液成分または構成成分、例えば、基礎塩、多量要素、微量要素、糖類、抗生物質、及び／またはビタミンを含み得る。出芽誘導培地（または第１の出芽誘導培地）及び第２の出芽誘導培地（または拡大出芽誘導培地）は、それぞれオーキシン及びサイトカイニンを含み得る。出芽誘導培地（または第１の出芽誘導培地）及び第２の出芽誘導培地（または拡大出芽誘導培地）は、それぞれ１つ以上の選択剤を含んでもよいが、多くの実施形態によれば、選択剤は第１の出芽誘導培地中に存在しない。第１の出芽誘導培地中に選択剤が存在しないことにより、第１の出芽誘導培地が遅延培地として機能する可能性がある。選択剤の特性は、典型的には、単子葉植物種子胚外植片に導入された異種ポリヌクレオチド分子に存在する選別マーカー遺伝子に依存する。出芽誘導培地（または第１の出芽誘導培地）及び／または第２の出芽誘導培地（または拡大出芽誘導培地）は、それぞれ固体、半固体、または液体培地であってもよいが、これらの培地のそれぞれは、典型的には、固体培地であり得る。固体培地は、固化して固体培地を形成できるゲル化剤またはポリマー剤または成分、例えばアガロースを含んでもよい。
【0042】
本明細書で使用する場合、「高いサイトカイニン対オーキシン比」は、一般に、サイトカイニン活性のレベルが、培地中に存在するオーキシン活性のレベルと比較して相対的に高い状態を指し、典型的には、サイトカイニン：オーキシン比は、重量／体積で少なくとも約１：１以上である；ただし、当該技術分野で知られているように異なるオーキシン及びサイトカイニンが異なる活性及び／または作用様式を有することができるため、正確なサイトカイニン：オーキシン比は、オーキシン及びサイトカイニンの正確な化学的特性によって異なる。高いサイトカイニン対オーキシン比を有する培地中のサイトカイニンとオーキシンのレベルは、例えば約１：１、１．５：１、２：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４：１、４．５：１、５：１、５．５：１、６：１、６．５：１、７：１、７．５：１、８：１、８．５：１、９：１、９．５：１、１０：１、１０．５：１、１１：１、１１．５：１、１２：１、１２．５：１、１３：１、１３．５：１、１４：１、１４．５：１、または１５：１（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の比で培地中に存在し得る（重量／体積で測定）。
【0043】
高いサイトカイニン対オーキシン比を有する培養培地中のサイトカイニンとオーキシンのレベルは、例えば、約１：１以上もしくは少なくとも約１：１以上、約１．５：１以上もしくは少なくとも約１．５：１以上、約２：１以上もしくは少なくとも約２：１以上、約２．５：１以上もしくは少なくとも約２．５：１以上、約３：１以上もしくは少なくとも約３：１以上、約３．５：１以上もしくは少なくとも約３．５：１以上、約４：１以上もしくは少なくとも約４：１以上、約４．５：１以上もしくは少なくとも約４．５：１以上、約５：１以上もしくは少なくとも約５：１以上、約５．５：１以上もしくは少なくとも約５．５：１以上、約６：１以上もしくは少なくとも約６：１以上、約６．５：１以上もしくは少なくとも約６．５：１以上、約７：１以上もしくは少なくとも約７：１以上、約７．５：１以上もしくは少なくとも約７．５：１以上、約８：１以上もしくは少なくとも約８：１以上、約８．５：１以上もしくは少なくとも約８．５：１以上、約９：１以上もしくは少なくとも約９：１以上、約９．５：１以上もしくは少なくとも約９．５：１以上、約１０：１以上もしくは少なくとも約１０：１以上、約１０．５：１以上もしくは少なくとも約１０．５：１以上、約１１：１以上もしくは少なくとも約１１：１以上、約１１．５：１以上もしくは少なくとも約１１．５：１以上、または約１２：１以上もしくは少なくとも約１２：１以上（その間で導出可能なすべての範囲を含む）であり得る。
【0044】
高いサイトカイニン対オーキシン比を有する培養培地中のサイトカイニンとオーキシンのレベルは、例えば、約１：１～約１２：１、約２：１～約１２：１、約４：１～約１２：１、約６：１～約１２：１、約８：１～約１２：１、約１：１～約１０：１、約２：１～約１０：１、約４：１～約１０：１、約６：１～約１０：１、約８：１～約１０：１、約１：１～約８：１、約２：１～約８：１、約４：１～約８：１、約６：１～約８：１、約１：１～約６：１、約２：１～約６：１、約４：１～約６：１、約１：１～約５：１、約２：１～約５：１、約３：１～約５：１、約１：１～約４：１、約２：１～約４：１、約３：１～約４：１、約１：１～約３：１、または約１：１～約２：１（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の範囲であり得る。
【0045】
本発明に従って使用され得るサイトカイニンの非限定的な例としては、これらに限定されないが、６－ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、チジアズロン（ＴＤＺ）、Ｎ－（２－クロロ－４－ピリジル）－Ｎ－フェニル尿素（４－ＣＰＰＵ）、カイネチン、ゼアチン、ジフェニル尿素（ＤＰＵ）、６－（γ，γ－ジメチルアリルアミノ）プリン（２ｉＰ）、及び６－（３－ヒドロキシベンジルアミノ）プリン（メタ－トポリン）が挙げられ得る。本発明に従って使用され得るオーキシンとしては、限定されないが、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）、４－アミノ－３，５，６－トリクロロピコリン酸（ピクロラム）、インドール－３－酢酸（ＩＡＡ）、インドール－３－酪酸（ＩＢＡ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、４－クロロフェノキシ酢酸またはｐ－クロロ－フェノキシ酢酸（４－ＣＰＡまたはｐＣＰＡ）、２，４，５－トリクロロフェノキシ酢酸（２，４，５－Ｔ）、２，３，５－トリヨード安息香酸（ＴＩＢＡ）、フェニル酢酸（ＰＡＡ）、及び３，６－ジクロロ－２－メトキシ－安息香酸（ジカンバ）が挙げられ得る。
【0046】
本実施形態によれば、出芽誘導培地（または第１の出芽誘導培地）は、第２の出芽誘導培地（または拡大出芽誘導培地）と同じもしくは異なるオーキシン及び／または同じもしくは異なるサイトカイニンを含み得る。出芽誘導培地（または第１の出芽誘導培地）は、第１のオーキシン及び第１のサイトカイニンを含み得、第２の出芽誘導培地または拡大出芽誘導培地は、第１のオーキシンまたは第２のオーキシンと、第１のサイトカイニンまたは第２のサイトカイニンとを含み得る。いくつかの実施形態によれば、第２の出芽誘導培地（または拡大出芽誘導培地）は、出芽誘導培地（または第１の出芽誘導培地）と同じオーキシンまたは異なるオーキシンを含み得る。いくつかの実施形態によれば、第２の出芽誘導（または拡大出芽誘導培地）は、出芽誘導培地（または第１の出芽誘導培地）と同じサイトカイニンまたは異なるサイトカイニンを含み得る。
【0047】
本実施形態によれば、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地のサイトカイニン（または２つ以上のサイトカイニン）の濃度は、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１００．０ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ～約９０．０ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ～約８０．０ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ～約７５．０ｍｇ／Ｌ、２ｍｇ／Ｌ～約９０．０ｍｇ／Ｌ、２ｍｇ／Ｌ～約８０．０ｍｇ／Ｌ、２ｍｇ／Ｌ～約７５．０ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ～約９０．０ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ～約８０．０ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ～約７５．０ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ～約７０．０ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ～約９０．０ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ～約８０．０ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ～約７５．０ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ～約７０．０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ～約９０．０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ～約８０．０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ～約７５．０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ～約７０．０ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ～約９０．０ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ～約８０．０ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ～約７５．０ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ～約７０．０ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ～約６０．０ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ～約９０．０ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ～約８０．０ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ～約７５．０ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ～約７０．０ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ～約６０．０ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ～約９０．０ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ～約８０．０ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ～約７５．０ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ～約７０．０ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ～約６０．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、または約１．０ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の範囲内である。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地または第２の出芽誘導培地のサイトカイニンの濃度は、例えば、約０．１ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ、約０．３ｍｇ／Ｌ、約０．４ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ、約０．６ｍｇ／Ｌ、約０．７ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、約１．５ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ、約２．５ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ、約３．５ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ、約４．５ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ、約６．０ｍｇ／Ｌ、約７．０ｍｇ／Ｌ、約８．０ｍｇ／Ｌ、約９．０ｍｇ／Ｌ、約１０．０ｍｇ／Ｌ、約１１．０ｍｇ／Ｌ、約１２．０ｍｇ／Ｌ、約１３．０ｍｇ／Ｌ、約１４．０ｍｇ／Ｌ、約１５．０ｍｇ／Ｌ、約１６．０ｍｇ／Ｌ、約１７．０ｍｇ／Ｌ、約１８．０ｍｇ／Ｌ、約１９．０ｍｇ／Ｌ、約２０．０ｍｇ／Ｌ、約２１．０ｍｇ／Ｌ、約２２．０ｍｇ／Ｌ、約２３．０ｍｇ／Ｌ、約２４．０ｍｇ／Ｌ、約２５．０ｍｇ／Ｌ、約３０ｍｇ／Ｌ、約４０ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約６０ｍｇ／Ｌ、約７０ｍｇ／Ｌ、約７５ｍｇ／Ｌ、約８０ｍｇ／Ｌ、約９０ｍｇ／Ｌ、または約１００ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）であり得る。第１及び第２の出芽誘導培地のサイトカイニンは同じであっても異なっていてもよく、これらの出芽誘導培地のそれぞれは１つ以上のサイトカイニンを含み得る。
【0048】
いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地のオーキシン（または２つ以上のオーキシン）の濃度は、約０．０１ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約０．０５ｍｇ／Ｌ～約２５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約８．０ｍｇ／Ｌ～約１２．０ｍｇ／Ｌ、約９．０ｍｇ／Ｌ～約１１．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約１．５ｍｇ／Ｌ～約２．５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約２．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１．５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１．２５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１．２ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１．１ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約２．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１．５ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１．２５ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１．２ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１．１ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約２．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１．５ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１．２５ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１．２ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１．１ｍｇ／Ｌ、約０．７５ｍｇ／Ｌ～約２．０ｍｇ／Ｌ、約０．７５ｍｇ／Ｌ～約１．５ｍｇ／Ｌ、約０．７５ｍｇ／Ｌ～約１．２５ｍｇ／Ｌ、約０．７５ｍｇ／Ｌ～約１．２ｍｇ／Ｌ、約０．７５ｍｇ／Ｌ～約１．１ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ～約２．０ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ～約１．５ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ～約１．２５ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ～約１．２ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ～約１．１ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ～約２．０ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ～約１．５ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ～約１．２５ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ～約１．２ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ～約１．１ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約０．７５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約０．７ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約０．６ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約０．７５ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約０．７ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約０．６ｍｇ／Ｌ、約０．３ｍｇ／Ｌ～約１．０ｍｇ／Ｌ、約０．３ｍｇ／Ｌ～約０．７５ｍｇ／Ｌ、約０．３ｍｇ／Ｌ～約０．７ｍｇ／Ｌ、約０．３ｍｇ／Ｌ～約０．６ｍｇ／Ｌ、約０．４ｍｇ／Ｌ～約１．０ｍｇ／Ｌ、約０．４ｍｇ／Ｌ～約０．７５ｍｇ／Ｌ、約０．４ｍｇ／Ｌ～約０．７ｍｇ／Ｌ、約０．４ｍｇ／Ｌ～約０．６ｍｇ／Ｌ、約０．０５ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．０２ｍｇ／Ｌ～約５ｍｇ／Ｌ、または約０．７５ｍｇ／Ｌ～約２．５ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の範囲である。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導または第２の出芽誘導培地のオーキシンの濃度は、例えば、約０．１ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ、約０．３ｍｇ／Ｌ、約０．４ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ、約０．６ｍｇ／Ｌ、約０．７ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、約１．５ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ、約２．５ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ、約３．５ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ、約４．５ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ、約６．０ｍｇ／Ｌ、約７．０ｍｇ／Ｌ、約８．０ｍｇ／Ｌ、約９．０ｍｇ／Ｌ、約１０．０ｍｇ／Ｌ、約１１．０ｍｇ／Ｌ、約１２．０ｍｇ／Ｌ、約１３．０ｍｇ／Ｌ、約１４．０ｍｇ／Ｌ、約１５．０ｍｇ／Ｌ、約１６．０ｍｇ／Ｌ、約１７．０ｍｇ／Ｌ、約１８．０ｍｇ／Ｌ、約１９．０ｍｇ／Ｌ、約２０．０ｍｇ／Ｌ、約２１．０ｍｇ／Ｌ、約２２．０ｍｇ／Ｌ、約２３．０ｍｇ／Ｌ、約２４．０ｍｇ／Ｌ、または約２５．０ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）であり得る。第１及び第２の出芽誘導培地のオーキシンは同じであっても異なっていてもよく、これらの培地のそれぞれは１つ以上のオーキシンを含み得る。
【0049】
いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地はサイトカイニンを含み得、サイトカイニンは６－ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）である。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地のＢＡＰの濃度は、約１．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約８．０ｍｇ／Ｌ～約１２．０ｍｇ／Ｌ、または約９．０ｍｇ／Ｌ～約１１．０ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地のＢＡＰの濃度は、例えば、約１．０ｍｇ／Ｌ、約１．５ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ、約２．５ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ、約３．５ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ、約４．５ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ、約６．０ｍｇ／Ｌ、約７．０ｍｇ／Ｌ、約８．０ｍｇ／Ｌ、約９．０ｍｇ／Ｌ、約１０．０ｍｇ／Ｌ、約１１．０ｍｇ／Ｌ、約１２．０ｍｇ／Ｌ、約１３．０ｍｇ／Ｌ、約１４．０ｍｇ／Ｌ、約１５．０ｍｇ／Ｌ、約１６．０ｍｇ／Ｌ、約１７．０ｍｇ／Ｌ、約１８．０ｍｇ／Ｌ、約１９．０ｍｇ／Ｌ、約２０．０ｍｇ／Ｌ、約２１．０ｍｇ／Ｌ、約２２．０ｍｇ／Ｌ、約２３．０ｍｇ／Ｌ、約２４．０ｍｇ／Ｌ、または約２５．０ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）であり得る。
【0050】
いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地はサイトカイニンを含み得、該サイトカイニンはチジアズロン（ＴＤＺ）である。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地のＴＤＺの濃度は、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、または約１．５ｍｇ／Ｌ～約２．５ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地のＴＤＺの濃度は、約０．１ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ、約０．３ｍｇ／Ｌ、約０．４ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ、約０．６ｍｇ／Ｌ、約０．７ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、約１．５ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ、約２．５ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ、約３．５ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ、約４．５ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ、約６．０ｍｇ／Ｌ、約７．０ｍｇ／Ｌ、約８．０ｍｇ／Ｌ、約９．０ｍｇ／Ｌ、または約１０．０ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）であり得る。
【0051】
いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地はサイトカイニンを含み得、サイトカイニンはＮ－（２－クロロ－４－ピリジル）－Ｎ－フェニル尿素（４－ＣＰＰＵ）である。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地の４－ＣＰＰＵの濃度は、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、または約１．５ｍｇ／Ｌ～約２．５ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地の４－ＣＰＰＵの濃度は、約０．１ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ、約０．３ｍｇ／Ｌ、約０．４ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ、約０．６ｍｇ／Ｌ、約０．７ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、約１．５ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ、約２．５ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ、約３．５ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ、約４．５ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ、約６．０ｍｇ／Ｌ、約７．０ｍｇ／Ｌ、約８．０ｍｇ／Ｌ、約９．０ｍｇ／Ｌ、または約１０．０ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）であり得る。
【0052】
いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地はサイトカイニンを含み得、サイトカイニンはカイネチンである。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地のカイネチンの濃度は、約１．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約８．０ｍｇ／Ｌ～約１２．０ｍｇ／Ｌ、または約９．０ｍｇ／Ｌ～約１１．０ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地のカイネチンの濃度は、約１．０ｍｇ／Ｌ、約１．５ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ、約２．５ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ、約３．５ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ、約４．５ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ、約６．０ｍｇ／Ｌ、約７．０ｍｇ／Ｌ、約８．０ｍｇ／Ｌ、約９．０ｍｇ／Ｌ、約１０．０ｍｇ／Ｌ、約１１．０ｍｇ／Ｌ、約１２．０ｍｇ／Ｌ、約１３．０ｍｇ／Ｌ、約１４．０ｍｇ／Ｌ、約１５．０ｍｇ／Ｌ、約１６．０ｍｇ／Ｌ、約１７．０ｍｇ／Ｌ、約１８．０ｍｇ／Ｌ、約１９．０ｍｇ／Ｌ、約２０．０ｍｇ／Ｌ、約２１．０ｍｇ／Ｌ、約２２．０ｍｇ／Ｌ、約２３．０ｍｇ／Ｌ、約２４．０ｍｇ／Ｌ、または約２５．０ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）であり得る。
【0053】
いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地はサイトカイニンを含み得、サイトカイニンはゼアチンである。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地のゼアチンの濃度は、約１．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約８．０ｍｇ／Ｌ～約１２．０ｍｇ／Ｌ、または約９．０ｍｇ／Ｌ～約１１．０ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地のゼアチンの濃度は、例えば、約１．０ｍｇ／Ｌ、約１．５ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ、約２．５ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ、約３．５ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ、約４．５ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ、約６．０ｍｇ／Ｌ、約７．０ｍｇ／Ｌ、約８．０ｍｇ／Ｌ、約９．０ｍｇ／Ｌ、約１０．０ｍｇ／Ｌ、約１１．０ｍｇ／Ｌ、約１２．０ｍｇ／Ｌ、約１３．０ｍｇ／Ｌ、約１４．０ｍｇ／Ｌ、約１５．０ｍｇ／Ｌ、約１６．０ｍｇ／Ｌ、約１７．０ｍｇ／Ｌ、約１８．０ｍｇ／Ｌ、約１９．０ｍｇ／Ｌ、約２０．０ｍｇ／Ｌ、約２１．０ｍｇ／Ｌ、約２２．０ｍｇ／Ｌ、約２３．０ｍｇ／Ｌ、約２４．０ｍｇ／Ｌ、または約２５．０ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）であり得る。
【0054】
いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地はサイトカイニンを含み得、サイトカイニンは６－（γ，γ－ジメチルアリルアミノ）プリン（２ｉＰ）である。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地の２ｉＰの濃度は、５ｍｇ／Ｌ～約１００．０ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ～約９０．０ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ～約８０．０ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ～約７５．０ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ～約７０．０ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ～約１００．０ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ～約９０．０ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ～約８０．０ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ～約７５．０ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ～約７０．０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ～約１００．０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ～約９０．０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ～約８０．０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ～約７５．０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ～約７０．０ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ～約１００．０ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ～約９０．０ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ～約８０．０ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ～約７５．０ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ～約７０．０ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ～約６０．０ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ～約１００．０ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ～約９０．０ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ～約８０．０ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ～約７５．０ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ～約７０．０ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ～約６０．０ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ～約１００．０ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ～約９０．０ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ～約８０．０ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ～約７５．０ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ～約７０．０ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ～約６０．０ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地の２ｉＰの濃度は、約５．０ｍｇ／Ｌ、約６．０ｍｇ／Ｌ、約７．０ｍｇ／Ｌ、約８．０ｍｇ／Ｌ、約９．０ｍｇ／Ｌ、約１０．０ｍｇ／Ｌ、約１１．０ｍｇ／Ｌ、約１２．０ｍｇ／Ｌ、約１３．０ｍｇ／Ｌ、約１４．０ｍｇ／Ｌ、約１５．０ｍｇ／Ｌ、約１６．０ｍｇ／Ｌ、約１７．０ｍｇ／Ｌ、約１８．０ｍｇ／Ｌ、約１９．０ｍｇ／Ｌ、約２０．０ｍｇ／Ｌ、約２１．０ｍｇ／Ｌ、約２２．０ｍｇ／Ｌ、約２３．０ｍｇ／Ｌ、約２４．０ｍｇ／Ｌ、または約２５．０ｍｇ／Ｌ、約３０ｍｇ／Ｌ、約４０ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約６０ｍｇ／Ｌ、約７０ｍｇ／Ｌ、約７５ｍｇ／Ｌ、約８０ｍｇ／Ｌ、約９０ｍｇ／Ｌ、または約１００ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）であり得る。
【0055】
いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地はサイトカイニンを含み得、サイトカイニンは６－（３－ヒドロキシベンジルアミノ）プリン（メタ－トポリン）である。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地のメタ－トポリンの濃度は、約１．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約８．０ｍｇ／Ｌ～約１２．０ｍｇ／Ｌ、または約９．０ｍｇ／Ｌ～約１１．０ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地のメタ－トポリンの濃度は、例えば、約１．０ｍｇ／Ｌ、約１．５ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ、約２．５ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ、約３．５ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ、約４．５ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ、約６．０ｍｇ／Ｌ、約７．０ｍｇ／Ｌ、約８．０ｍｇ／Ｌ、約９．０ｍｇ／Ｌ、約１０．０ｍｇ／Ｌ、約１１．０ｍｇ／Ｌ、約１２．０ｍｇ／Ｌ、約１３．０ｍｇ／Ｌ、約１４．０ｍｇ／Ｌ、約１５．０ｍｇ／Ｌ、約１６．０ｍｇ／Ｌ、約１７．０ｍｇ／Ｌ、約１８．０ｍｇ／Ｌ、約１９．０ｍｇ／Ｌ、約２０．０ｍｇ／Ｌ、約２１．０ｍｇ／Ｌ、約２２．０ｍｇ／Ｌ、約２３．０ｍｇ／Ｌ、約２４．０ｍｇ／Ｌ、または約２５．０ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）であり得る。
【0056】
いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地はオーキシンを含み得、オーキシンは２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）である。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地の２，４－Ｄの濃度は、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約２．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１．５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１．２５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１．２ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１．１ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約２．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１．５ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１．２５ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１．２ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１．１ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約２．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１．５ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１．２５ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１．２ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１．１ｍｇ／Ｌ、約０．７５ｍｇ／Ｌ～約２．０ｍｇ／Ｌ、約０．７５ｍｇ／Ｌ～約１．５ｍｇ／Ｌ、約０．７５ｍｇ／Ｌ～約１．２５ｍｇ／Ｌ、約０．７５ｍｇ／Ｌ～約１．２ｍｇ／Ｌ、約０．７５ｍｇ／Ｌ～約１．１ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ～約２．０ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ～約１．５ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ～約１．２５ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ～約１．２ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ～約１．１ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ～約２．０ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ～約１．５ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ～約１．２５ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ～約１．２ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ～約１．１ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地の２，４－Ｄの濃度は、約０．１ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ、約０．３ｍｇ／Ｌ、約０．４ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ、約０．６ｍｇ／Ｌ、約０．７ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、約１．５ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ、約２．５ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ、約３．５ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ、約４．５ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ、約６．０ｍｇ／Ｌ、約７．０ｍｇ／Ｌ、約８．０ｍｇ／Ｌ、約９．０ｍｇ／Ｌ、または約１０．０ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）であり得る。
【0057】
いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地はオーキシンを含み得、オーキシンは２，４，５－トリクロロフェノキシ酢酸（２，４，５－Ｔ）である。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地の２，４，５－Ｔの濃度は、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約２．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１．５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１．２５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１．２ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１．１ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約２．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１．５ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１．２５ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１．２ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１．１ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約２．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１．５ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１．２５ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１．２ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１．１ｍｇ／Ｌ、約０．７５ｍｇ／Ｌ～約２．０ｍｇ／Ｌ、約０．７５ｍｇ／Ｌ～約１．５ｍｇ／Ｌ、約０．７５ｍｇ／Ｌ～約１．２５ｍｇ／Ｌ、約０．７５ｍｇ／Ｌ～約１．２ｍｇ／Ｌ、約０．７５ｍｇ／Ｌ～約１．１ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ～約２．０ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ～約１．５ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ～約１．２５ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ～約１．２ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ～約１．１ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ～約２．０ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ～約１．５ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ～約１．２５ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ～約１．２ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ～約１．１ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地の２，４，５－Ｔの濃度は、約０．１ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ、約０．３ｍｇ／Ｌ、約０．４ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ、約０．６ｍｇ／Ｌ、約０．７ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、約１．５ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ、約２．５ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ、約３．５ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ、約４．５ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ、約６．０ｍｇ／Ｌ、約７．０ｍｇ／Ｌ、約８．０ｍｇ／Ｌ、約９．０ｍｇ／Ｌ、または約１０．０ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）であり得る。
【0058】
いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地はオーキシンを含み得、オーキシンは４－アミノ－３，５，６－トリクロロピコリン酸（ピクロラム）である。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地のピクロラムの濃度は、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、または約１．５ｍｇ／Ｌ～約２．５ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地のピクロラムの濃度は、約０．１ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ、約０．３ｍｇ／Ｌ、約０．４ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ、約０．６ｍｇ／Ｌ、約０．７ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、約１．５ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ、約２．５ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ、約３．５ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ、約４．５ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ、約６．０ｍｇ／Ｌ、約７．０ｍｇ／Ｌ、約８．０ｍｇ／Ｌ、約９．０ｍｇ／Ｌ、または約１０．０ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）であり得る。
【0059】
いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地はオーキシンを含み得、オーキシンはインドール－３－酢酸（ＩＡＡ）である。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地のＩＡＡの濃度は、約０．１ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約８．０ｍｇ／Ｌ～約１２．０ｍｇ／Ｌ、または約９．０ｍｇ／Ｌ～約１１．０ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地のＩＡＡの濃度は、約０．１ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ、約０．３ｍｇ／Ｌ、約０．４ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ、約０．６ｍｇ／Ｌ、約０．７ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ、約１．５ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ、約２．５ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ、約３．５ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ、約４．５ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ、約６．０ｍｇ／Ｌ、約７．０ｍｇ／Ｌ、約８．０ｍｇ／Ｌ、約９．０ｍｇ／Ｌ、約１０．０ｍｇ／Ｌ、約１１．０ｍｇ／Ｌ、約１２．０ｍｇ／Ｌ、約１３．０ｍｇ／Ｌ、約１４．０ｍｇ／Ｌ、約１５．０ｍｇ／Ｌ、約１６．０ｍｇ／Ｌ、約１７．０ｍｇ／Ｌ、約１８．０ｍｇ／Ｌ、約１９．０ｍｇ／Ｌ、約２０．０ｍｇ／Ｌ、約２１．０ｍｇ／Ｌ、約２２．０ｍｇ／Ｌ、約２３．０ｍｇ／Ｌ、約２４．０ｍｇ／Ｌ、または約２５．０ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）であり得る。
【0060】
いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地はオーキシンを含み得、オーキシンはインドール－３－酪酸（ＩＢＡ）である。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地のＩＢＡの濃度は、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、または約１．５ｍｇ／Ｌ～約２．５ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地のＩＢＡの濃度は、約０．１ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ、約０．３ｍｇ／Ｌ、約０．４ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ、約０．６ｍｇ／Ｌ、約０．７ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、約１．５ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ、約２．５ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ、約３．５ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ、約４．５ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ、約６．０ｍｇ／Ｌ、約７．０ｍｇ／Ｌ、約８．０ｍｇ／Ｌ、約９．０ｍｇ／Ｌ、または約１０．０ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）であり得る。
【0061】
いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地はオーキシンを含み得、オーキシンはナフタレン酢酸（ＮＡＡ）である。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地のＮＡＡの濃度は、約０．１ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地のＮＡＡの濃度は、０．１ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ、約０．３ｍｇ／Ｌ、約０．４ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ、約０．６ｍｇ／Ｌ、約０．７ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ、約１．５ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ、約２．５ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ、約３．５ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ、約４．５ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ、約６．０ｍｇ／Ｌ、約７．０ｍｇ／Ｌ、約８．０ｍｇ／Ｌ、約９．０ｍｇ／Ｌ、約１０．０ｍｇ／Ｌ、約１１．０ｍｇ／Ｌ、約１２．０ｍｇ／Ｌ、約１３．０ｍｇ／Ｌ、約１４．０ｍｇ／Ｌ、約１５．０ｍｇ／Ｌ、約１６．０ｍｇ／Ｌ、約１７．０ｍｇ／Ｌ、約１８．０ｍｇ／Ｌ、約１９．０ｍｇ／Ｌ、または約２０．０ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）であり得る。
【0062】
いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地はオーキシンを含み得、オーキシンは２，３，５－トリヨード安息香酸（ＴＩＢＡ）である。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地のＴＩＢＡの濃度は、約０．１ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地のＴＩＢＡの濃度は、０．１ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ、約０．３ｍｇ／Ｌ、約０．４ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ、約０．６ｍｇ／Ｌ、約０．７ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ、約１．５ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ、約２．５ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ、約３．５ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ、約４．５ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ、約６．０ｍｇ／Ｌ、約７．０ｍｇ／Ｌ、約８．０ｍｇ／Ｌ、約９．０ｍｇ／Ｌ、約１０．０ｍｇ／Ｌ、約１１．０ｍｇ／Ｌ、約１２．０ｍｇ／Ｌ、約１３．０ｍｇ／Ｌ、約１４．０ｍｇ／Ｌ、約１５．０ｍｇ／Ｌ、約１６．０ｍｇ／Ｌ、約１７．０ｍｇ／Ｌ、約１８．０ｍｇ／Ｌ、約１９．０ｍｇ／Ｌ、または約２０．０ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）であり得る。
【0063】
いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地はオーキシンを含み得、オーキシンはフェニル酢酸（ＰＡＡ）である。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地のＰＡＡの濃度は、約０．１ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約８．０ｍｇ／Ｌ～約１２．０ｍｇ／Ｌ、または約９．０ｍｇ／Ｌ～約１１．０ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地のＰＡＡの濃度は、約０．１ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ、約０．３ｍｇ／Ｌ、約０．４ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ、約０．６ｍｇ／Ｌ、約０．７ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ、約１．５ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ、約２．５ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ、約３．５ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ、約４．５ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ、約６．０ｍｇ／Ｌ、約７．０ｍｇ／Ｌ、約８．０ｍｇ／Ｌ、約９．０ｍｇ／Ｌ、約１０．０ｍｇ／Ｌ、約１１．０ｍｇ／Ｌ、約１２．０ｍｇ／Ｌ、約１３．０ｍｇ／Ｌ、約１４．０ｍｇ／Ｌ、約１５．０ｍｇ／Ｌ、約１６．０ｍｇ／Ｌ、約１７．０ｍｇ／Ｌ、約１８．０ｍｇ／Ｌ、約１９．０ｍｇ／Ｌ、約２０．０ｍｇ／Ｌ、約２１．０ｍｇ／Ｌ、約２２．０ｍｇ／Ｌ、約２３．０ｍｇ／Ｌ、約２４．０ｍｇ／Ｌ、または約２５．０ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）であり得る。
【0064】
いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地はオーキシンを含み得、オーキシンは３，６－ジクロロ－２－メトキシ－安息香酸（ジカンバ）である。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地のジカンバの濃度は、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、または約１．５ｍｇ／Ｌ～約２．５ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、第１の出芽誘導培地及び／または第２の（または拡大）出芽誘導培地のジカンバの濃度は、約０．１ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ、約０．３ｍｇ／Ｌ、約０．４ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ、約０．６ｍｇ／Ｌ、約０．７ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、約１．５ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ、約２．５ｍｇ／Ｌ、約３．０ｍｇ／Ｌ、約３．５ｍｇ／Ｌ、約４．０ｍｇ／Ｌ、約４．５ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ、約６．０ｍｇ／Ｌ、約７．０ｍｇ／Ｌ、約８．０ｍｇ／Ｌ、約９．０ｍｇ／Ｌ、または約１０．０ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）であり得る。
【0065】
いくつかの実施形態によれば、第１の出芽誘導培地は、第１のオーキシン及び第１のサイトカイニンを含み、第１のオーキシンは２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）であり、第１のサイトカイニンは６－ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）である。これらの実施形態によれば、第１の出芽誘導培地の２，４－Ｄの濃度は、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約２．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１．５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１．２５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１．２ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１．１ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約２．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１．５ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１．２５ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１．２ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１．１ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約２．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１．５ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１．２５ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１．２ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１．１ｍｇ／Ｌ、約０．７５ｍｇ／Ｌ～約２．０ｍｇ／Ｌ、約０．７５ｍｇ／Ｌ～約１．５ｍｇ／Ｌ、約０．７５ｍｇ／Ｌ～約１．２５ｍｇ／Ｌ、約０．７５ｍｇ／Ｌ～約１．２ｍｇ／Ｌ、約０．７５ｍｇ／Ｌ～約１．１ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ～約２．０ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ～約１．５ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ～約１．２５ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ～約１．２ｍｇ／Ｌ、約０．８ｍｇ／Ｌ～約１．１ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ～約２．０ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ～約１．５ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ～約１．２５ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ～約１．２ｍｇ／Ｌ、約０．９ｍｇ／Ｌ～約１．１ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の範囲であり得る。これらの実施形態によれば、第１の出芽誘導培地の６－ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）の濃度は、約１．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約２．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約５．０ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約２５．０ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約２０．０ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約１５．０ｍｇ／Ｌ、約７．５ｍｇ／Ｌ～約１２．５ｍｇ／Ｌ、約８．０ｍｇ／Ｌ～約１２．０ｍｇ／Ｌ、または約９．０ｍｇ／Ｌ～約１１．０ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の範囲であり得る。
【0066】
いくつかの実施形態によれば、第２の（または拡大）出芽誘導培地は、第２のオーキシン及び第２のサイトカイニンを含み、第２のオーキシンは４－アミノ－３，５，６－トリクロロピコリン酸（ピクロラム）であり、第２のサイトカイニンはチジアズロン（ＴＤＺ）である。これらの実施形態によれば、第２の（または拡大）出芽誘導培地のピクロラムの濃度は、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、または約１．５ｍｇ／Ｌ～約２．５ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の範囲であり得る。これらの実施形態によれば、第２の（または拡大）出芽誘導培地のＴＤＺの濃度は、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．２ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１０．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約７．５ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約７．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約６．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約５．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約４．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約３．０ｍｇ／Ｌ、または約１．５ｍｇ／Ｌ～約２．５ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の範囲であり得る。
【0067】
本発明の実施形態によれば、単子葉植物種子胚外植片（複数可）は、第１の出芽誘導培地と接触して約２日～約１４日、約４日～約１２日、約５日～約１０日、または約６日～約８日間（その間で導出可能なすべての範囲を含む）培養され得る。いくつかの実施形態によれば、単子葉植物種子胚外植片（複数可）は、第１の出芽誘導培地と接触して約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日（または約１週間）、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、または約１４日（または約２週間）（その間で導出可能なすべての範囲を含む）培養される。いくつかの実施形態では、単子葉植物種子胚外植片（複数可）は、第１の出芽誘導培地と接触して約２０℃～約３０℃、約２２℃～約２８℃、約２５℃～約３０℃、約２５℃～約２９℃、または約２５℃～約２８℃（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の範囲の温度で培養され得る。いくつかの実施形態によれば、単子葉植物種子胚外植片（複数可）は、第１の出芽誘導培地と接触して約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、または約３０℃（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の温度で培養され得る。本開示の一態様によれば、単子葉植物種子胚外植片（複数可）は、約３０℃～約４０℃、約３０℃～約３８℃、約３０℃～約３６℃、約３０℃～約３５℃、約３１℃～約４０℃、約３１℃～約３８℃、約３１℃～約３６℃、約３１℃～約３５℃、約３２℃～約４０℃、約３２℃～約３８℃、約３２℃～約３６℃、約３２℃～約３５℃、約３３℃～約４０℃、約３３℃～約３８℃、約３３℃～約３６℃、または約３３℃～約３５℃（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の範囲内であり得る高温で第１の出芽誘導培地と接触する。いくつかの実施形態によれば、単子葉植物種子胚外植片（複数可）は、第１の出芽誘導培地と接触して約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、または約４０℃（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の高温で培養され得る。選択剤は一般に第１の出芽誘導培地には存在しないが、第１の出芽誘導培地は代替的に選択剤を含んでもよい。
【0068】
別の態様では、単子葉植物種子胚外植片を、第１の出芽誘導培地と接触して高温、例えば約３０℃～約４０℃の範囲の温度で約１週間培養することは、第１の出芽誘導工程の間、外植片を第１の出芽誘導培地と接触して低温、例えば約２０℃～約３０℃の範囲の温度で培養することと比較して、形質転換を少なくとも約０．２倍、０．４倍、０．６倍、０．８倍、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、または４０倍（その間で導出可能なすべての範囲を含む）向上し得る。
【0069】
第１の出芽誘導工程は、さまざまな照明条件下で実施することもできる。ある程度の照明が一般に使用され得るが、第１の出芽誘導工程のすべてまたは一部を代替的に暗所で行ってもよい。いくつかの実施形態によれば、第１の出芽誘導工程は、約０μ／ｍ２・ｓ～約２００μ／ｍ２・ｓ、２０μ／ｍ２・ｓ～約２００μ／ｍ２・ｓ、２０μ／ｍ２・ｓ～約１８０μ／ｍ２・ｓ、３０μ／ｍ２・ｓ～約１８０μ／ｍ２・ｓ、５０μ／ｍ２・ｓ～約１８０μ／ｍ２・ｓ、５０μ／ｍ２・ｓ～約１５０μ／ｍ２・ｓ、６０μ／ｍ２・ｓ～約１５０μ／ｍ２・ｓ、７０μ／ｍ２・ｓ～約１４０μ／ｍ２・ｓ、８０μ／ｍ２・ｓ～約１３０μ／ｍ２・ｓ、または９０μ／ｍ２・ｓ～約１２０μ／ｍ２・ｓの範囲で光合成有効放射（ＰＡＲ）の平均または設定光強度で実施され得る。いくつかの実施形態によれば、第１の出芽誘導工程は、約０μ／ｍ２・ｓ、約１０μ／ｍ２・ｓ、約２０μ／ｍ２・ｓ、約３０μ／ｍ２・ｓ、約４０μ／ｍ２・ｓ、約５０μ／ｍ２・ｓ、約６０μ／ｍ２・ｓ、約７０μ／ｍ２・ｓ、約８０μ／ｍ２・ｓ、約９０μ／ｍ２・ｓ、約１００μ／ｍ２・ｓ、約１１０μ／ｍ２・ｓ、約１２０μ／ｍ２・ｓ、約１３０μ／ｍ２・ｓ、約１４０μ／ｍ２・ｓ、約１５０μ／ｍ２・ｓ、約１６０μ／ｍ２・ｓ、約１７０μ／ｍ２・ｓ、約１８０μ／ｍ２・ｓ、約１９０μ／ｍ２・ｓ、または約２００μ／ｍ２・ｓで光合成有効放射（ＰＡＲ）の平均または設定光強度で実施され得る。いくつかの実施形態によれば、異なる量の明暗サイクルが第１の出芽誘導工程中に使用されてもよく、これは、約０時間～約２４時間の明期、約２時間～約２２時間の明期、約４時間～約２０時間の明期、約８時間～約２０時間の明期、約１２時間～約２０時間の明期、約１６時間～約２０時間の明期の時間の長さにわたる照明の存在を含み得、それぞれ２４時間の１日の長さに基づいて対応する長さの時間の対応する量の相対的な暗期を有する。
【0070】
いくつかの実施形態によれば、第１の出芽誘導工程中の明暗サイクルの量は、約０時間の明期及び約２４時間の暗期、約１時間の明期及び約２３時間の暗期、約２時間の明期及び約２２時間の暗期、約３時間の明期及び約２１時間の暗期、約４時間の明期及び約２０時間の暗期、約５時間の明期及び約１９時間の暗期、約６時間の明期及び約１８時間の暗期、約７時間の明期及び約１７時間の暗期、約８時間の明期及び約１６時間の暗期、約９時間の明期及び約１５時間の暗期、約１０時間の明期及び約１４時間の暗期、約１１時間の明期及び約１３時間の暗期、約１２時間の明期及び約１２時間の暗期、約１３時間の明期及び約１１時間の暗期、約１４時間の明期及び約１０時間の暗期、約１５時間の明期及び約９時間の暗期、約１６時間の明期及び約８時間の暗期、約１７時間の明期及び約７時間の暗期、約１８時間の明期及び約６時間の暗期、約１９時間の明期及び約５時間の暗期、約２０時間の明期及び約４時間の暗期、約２１時間の明期及び約３時間の暗期、約２２時間の明期及び約２時間の暗期、約２３時間の明期及び約１時間の暗期、約２４時間の明期及び約０時間の暗期であり得る。
【0071】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単子葉植物種子胚外植片（複数可）は、第２の（または拡大）出芽誘導培地と接触して約４日～約２８日、約４日～約２５日、約４日～約２１日、約５日～約２５日、約５日～約２３日、約７日～約２１日、約５日～約１５日、約７日～約１４日、約１２日～約２３日、または約１４日～約２１日間（その間で導出可能なすべての範囲を含む）培養され得る。いくつかの実施形態によれば、単子葉植物種子胚外植片（複数可）は、第２の（または拡大）出芽誘導培地と接触して約４日、約５日、約６日、約７日（または約１週間）、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日（または約２週間）、約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日、約２０日、約２１日（または約３週間）、約２２日、約２３日、約２４日、約２５日、約２６日、約２７日、または約２８日間（または約４週間）（その間で導出可能なすべての範囲を含む）培養される。いくつかの実施形態では、単子葉植物種子胚外植片（複数可）は、第２の（または拡大）出芽誘導培地と接触して約２０℃～約３２℃、約２０℃～約３０℃、約２２℃～約２８℃、約２５℃～約３０℃、約２５℃～約２９℃、約２６℃～約２９℃、約２５℃～約２８℃、または約２７℃～約２８℃（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の範囲の温度で培養され得る。いくつかの実施形態によれば、単子葉植物種子胚外植片（複数可）は、第２の（または拡大）出芽誘導培地と接触して約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、または約３０℃（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の温度で培養され得る。特定の実施形態では、単子葉植物種子胚外植片は、第１の出芽誘導培地と接触して約２０℃～約３０℃の範囲の温度で、または約３０℃～約４０℃の範囲の高温で、約２日～約１４日の範囲の期間にわたって培養され、その後、第２の（または拡大）出芽誘導培地と接触して約２０℃～約３２℃の範囲の温度で、約４日～約２８日の範囲の期間にわたって培養され得る。第２の（または拡大）出芽誘導培地はまた、選択剤を含んでもよい。別の実施形態では、外植片を第２の出芽誘導培地と接触して培養することは、形質転換を少なくとも約０．２倍、０．４倍、０．６倍、０．８倍、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、または４０倍向上し得る。
【0072】
第２の（または拡大）出芽誘導工程は、さまざまな照明条件下で実施することもできる。第２の（または拡大）出芽誘導工程では、通常、ある程度の照明が使用され得る。いくつかの実施形態によれば、第２の（または拡大）出芽誘導工程は、約３０μ／ｍ２・ｓ～約２００μ／ｍ２・ｓ、３０μ／ｍ２・ｓ～約１８０μ／ｍ２・ｓ、５０μ／ｍ２・ｓ～約１８０μ／ｍ２・ｓ、５０μ／ｍ２・ｓ～約１５０μ／ｍ２・ｓ、６０μ／ｍ２・ｓ～約１５０μ／ｍ２・ｓ、７０μ／ｍ２・ｓ～約１４０μ／ｍ２・ｓ、８０μ／ｍ２・ｓ～約１３０μ／ｍ２・ｓ、または９０μ／ｍ２・ｓ～約１２０μ／ｍ２・ｓの範囲で光合成有効放射（ＰＡＲ）の平均または設定光強度で実施され得る。いくつかの実施形態によれば、第２の（または拡大）出芽誘導工程は、約１０μ／ｍ２・ｓ、約２０μ／ｍ２・ｓ、約３０μ／ｍ２・ｓ、約４０μ／ｍ２・ｓ、約５０μ／ｍ２・ｓ、約６０μ／ｍ２・ｓ、約７０μ／ｍ２・ｓ、約８０μ／ｍ２・ｓ、約９０μ／ｍ２・ｓ、約１００μ／ｍ２・ｓ、約１１０μ／ｍ２・ｓ、約１２０μ／ｍ２・ｓ、約１３０μ／ｍ２・ｓ、約１４０μ／ｍ２・ｓ、約１５０μ／ｍ２・ｓ、約１６０μ／ｍ２・ｓ、約１７０μ／ｍ２・ｓ、約１８０μ／ｍ２・ｓ、約１９０μ／ｍ２・ｓ、または約２００μ／ｍ２・ｓで光合成有効放射（ＰＡＲ）の平均または設定光強度で実施され得る。いくつかの実施形態によれば、異なる量の明暗サイクルが第２の（または拡大）出芽誘導工程中に使用されてもよく、これは、約２時間～約２４時間の明期、約２時間～約２２時間の明期、約４時間～約２０時間の明期、約８時間～約２０時間の明期、約１２時間～約２０時間の明期、約１６時間～約２０時間の明期の時間の長さにわたる照明の存在を含み得、それぞれ２４時間の１日の長さに基づいて対応する長さの時間の対応する量の相対的な暗期を有する。
【0073】
いくつかの実施形態によれば、第２の（または拡大）出芽誘導工程中の明暗サイクルの量は、約２時間の明期及び約２２時間の暗期、約３時間の明期及び約２１時間の暗期、約４時間の明期及び約２０時間の暗期、約５時間の明期及び約１９時間の暗期、約６時間の明期及び約１８時間の暗期、約７時間の明期及び約１７時間の暗期、約８時間の明期及び約１６時間の暗期、約９時間の明期及び約１５時間の暗期、約１０時間の明期及び約１４時間の暗期、約１１時間の明期及び約１３時間の暗期、約１２時間の明期及び約１２時間の暗期、約１３時間の明期及び約１１時間の暗期、約１４時間の明期及び約１０時間の暗期、約１５時間の明期及び約９時間の暗期、約１６時間の明期及び約８時間の暗期、約１７時間の明期及び約７時間の暗期、約１８時間の明期及び約６時間の暗期、約１９時間の明期及び約５時間の暗期、約２０時間の明期及び約４時間の暗期、約２１時間の明期及び約３時間の暗期、約２２時間の明期及び約２時間の暗期、約２３時間の明期及び約１時間の暗期、約２４時間の明期及び約０時間の暗期であり得る。
【0074】
理論に束縛されるものではないが、出芽誘導工程（複数可）は、外植片の細胞を分化及び／または増殖させ、外植片上に複数の出芽を形成し、それがその後、植物に再生され得る。いくつかの好ましい実施形態によれば、第１のオーキシン及びサイトカイニンは、第２のオーキシン及びサイトカイニンとは異なり、何らかの活性及び／または作用機序を通じて複数の出芽の形成に影響を及ぼす。理論に束縛されるものではないが、第１の出芽誘導工程は外植片の細胞を複数の芽に分化させる可能性があるのに対して、第２の（または拡大）出芽誘導工程は複数の芽をさらに増殖または拡大して、より密集したまたは固形の複数の出芽外植片を作出し得、得られた遺伝子改変植物または植物部分のキメラ化を減少させるというさらなる利点を有し得る植物へさらに培養及び再生する。いくつかの実施形態によれば、単子葉植物種子胚外植片（複数可）を第１の出芽誘導培地で、続いて第２の（または拡大）出芽誘導培地で培養することにより、第１の出芽誘導培地で単子葉植物種子胚外植片（複数可）を培養するが、再生前に第２の（または拡大）出芽誘導培地で培養しない場合と比較して、再生植物におけるキメラ化を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％減少させ得る。
【0075】
Ｅ．形質転換植物の再生
本開示の別の態様では、遺伝子改変単子葉植物または植物部分は、再生培地と接触して培養単子葉植物種子胚外植片（複数可）から再生される。本実施形態によれば、再生培地は、さまざまな標準的な培養培地または溶液成分または構成成分、例えば、基礎塩、多量要素、微量要素、糖類、抗生物質及び／またはビタミンを含み得る。再生培地は一般にオーキシンまたはサイトカイニンを含まなくてもよいが、オーキシン及び／またはサイトカイニンが代替的に存在してもよい。再生培地は、典型的には、１つ以上の選択剤を含み得る。再生培地は、固体、半固体、または液体培地であり得るが、再生培地は、典型的には固体培地であり得る。固体培地は、固化して固体培地を形成できるゲル化剤またはポリマー剤または成分、例えばアガロースを含んでもよい。本明細書で使用する場合、「再生」という用語は、外植片の１つ以上の植物細胞または組織から植物を生育させるプロセスを指し、「再生培地」という用語は、外植片から植物を再生するために配合された植物組織の培養培地を指す。いくつかの実施形態では、再生または再生工程は、外植片または培養外植片を２つ以上の再生培地（同じまたは異なる再生培地であり得る）で培養すること（例えば、外植片を第１の再生培地から第２の再生培地に、場合によっては第３の再生培地などに継代培養または移すことによる）を含み得る１つ以上の再生工程（複数可）を指し得る。
本開示の別の態様では、遺伝子改変単子葉植物または植物部分は、再生培地と接触して培養単子葉植物種子胚外植片（複数可）から再生される。本実施形態によれば、再生培地は、さまざまな標準的な培養培地または溶液成分または構成成分、例えば、基礎塩、多量要素、微量要素、糖類、抗生物質及び／またはビタミンを含み得る。再生培地は一般にオーキシンまたはサイトカイニンを含まなくてもよいが、オーキシン及び／またはサイトカイニンが代替的に存在してもよい。再生培地は、典型的には、１つ以上の選択剤を含み得る。再生培地は、固体、半固体、または液体培地であり得るが、再生培地は、典型的には固体培地であり得る。固体培地は、固化して固体培地を形成できるゲル化剤またはポリマー剤または成分、例えばアガロースを含んでもよい。本明細書で使用する場合、「再生」という用語は、外植片の１つ以上の植物細胞または組織から植物を生育させるプロセスを指し、「再生培地」という用語は、外植片から植物を再生するために配合された植物組織の培養培地を指す。いくつかの実施形態では、再生または再生工程は、外植片または培養外植片を２つ以上の再生培地（同じまたは異なる再生培地であり得る）で培養すること（例えば、外植片を第１の再生培地から第２の再生培地に、場合によっては第３の再生培地などに継代培養または移すことによる）を含み得る１つ以上の再生工程（複数可）を指し得る。
【0076】
多くの実施形態によれば、再生培地は低塩濃度を含む。本明細書で使用する場合、「低塩濃度」とは、約２８００ｍｇ／Ｌ以下の総塩濃度を含む培地を指す。本明細書で使用する場合、「塩」とは、化学分野において一般に理解されている意味を有し、イオン性化合物、または溶液中に存在する場合は溶解した化合物を指し、少なくとも１つのカチオン（または塩基）及び少なくとも１つのアニオン（または酸）を含む。いくつかの実施形態では、再生培地は、約３０００ｍｇ／Ｌ、２８００ｍｇ／Ｌ、約２７００ｍｇ／Ｌ、約２６００ｍｇ／Ｌ、約２５００ｍｇ／Ｌ、約２４００ｍｇ／Ｌ、約２３００ｍｇ／Ｌ、約２２００ｍｇ／Ｌ、約２１００ｍｇ／Ｌ、または約２０００ｍｇ／Ｌ以下の総塩濃度を含み得る。別の実施形態では、再生培地は、約１２００ｍｇ／Ｌ～約３０００ｍｇ／Ｌ、約１２００ｍｇ／Ｌ～約２８００ｍｇ／Ｌ、約１３００ｍｇ／Ｌ～約２７００ｍｇ／Ｌ、約１４００ｍｇ／Ｌ～約２６００ｍｇ／Ｌ、約１５００ｍｇ／Ｌ～約２５００ｍｇ／Ｌ、約１６００ｍｇ／Ｌ～約２４００ｍｇ／Ｌ、約１７００ｍｇ／Ｌ～約２４００ｍｇ／Ｌ、約１８００ｍｇ／Ｌ～約２４００ｍｇ／Ｌ、約１９００ｍｇ／Ｌ～約２４００ｍｇ／Ｌ、約２０００ｍｇ／Ｌ～約２４００ｍｇ／Ｌ、約２１００ｍｇ／Ｌ～約２４００ｍｇ／Ｌ、約２２００ｍｇ／Ｌ～約２４００ｍｇ／Ｌ、または約２３００ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の塩濃度を含み得る。いくつかの実施形態では、再生培地の総窒素濃度は、約０．５ｍＭ～約２０ｍＭ、約０．５ｍＭ～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約２０ｍＭ、約５ｍＭ～約２０ｍＭ、約１ｍＭ～約１５ｍＭ、約５ｍＭ～約１５ｍＭ、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約７．５ｍＭ、約２．５ｍＭ～約７．５ｍＭ、約５ｍＭ～約１０ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、または約１５ｍＭ～約２０ｍＭ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の範囲内であり得る。本明細書で使用する場合、「総窒素濃度」という用語は、硝酸イオン及びアンモニウムイオンなどの窒素含有イオンの総濃度を指す。
【0077】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法に従って使用するための再生培地は、その硝酸イオン、アンモニウムイオン、カリウムイオン、または硫酸イオンの濃度で記載され得る。硝酸イオン濃度は、例えば、約０．５ｍＭ～約２０ｍＭ、約５ｍＭ～約２０ｍＭ、約５ｍＭ～約１５ｍＭ、約５ｍＭ～約１０ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、または約１５ｍＭ～約２０ｍＭ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）であり得る。アンモニウムイオン濃度は、例えば、約０．５ｍＭ～約１５ｍＭ、約２．５ｍＭ～約１５ｍＭ、約２．５ｍＭ～約１０ｍＭ、約２．５ｍＭ～約５ｍＭ、約５ｍＭ～約１５ｍＭ、約５ｍＭ～約１０ｍＭ、または約１０ｍＭ～約１５ｍＭ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）であり得る。カリウムイオン濃度は、例えば、約０．５ｍＭ～約１５ｍＭ、約２．５ｍＭ～約１５ｍＭ、約２．５ｍＭ～約１０ｍＭ、約２．５ｍＭ～約５ｍＭ、約５ｍＭ～約１５ｍＭ、約５ｍＭ～約１０ｍＭ、または約１０ｍＭ～約１５ｍＭ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）であり得る。硫酸イオン濃度は、例えば、約０．５ｍＭ～約２０ｍＭ、約５ｍＭ～約２０ｍＭ、約５ｍＭ～約１５ｍＭ、約５ｍＭ～約１０ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、または約１５ｍＭ～約２０ｍＭ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）であり得る。
【0078】
いくつかの実施形態では、再生培地は、その硝酸アンモニウム、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、または硫酸カリウムの濃度によって説明され得る。硝酸アンモニウム濃度は、例えば、約１００ｍｇ／Ｌ～約１０００ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ～約７５０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ～約５００ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ～約２５０ｍｇ／Ｌ、または約２５０ｍｇ／Ｌ～約５００ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）の範囲内であり得る。塩化カルシウム濃度は、例えば、約１００ｍｇ／Ｌ以下、約５０ｍｇ／Ｌ以上、約５０ｍｇ／Ｌ～約１００ｍｇ／Ｌ、または約５０ｍｇ／Ｌ～約７５ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）であり得る。硝酸カルシウム濃度は、例えば、約５００ｍｇ／Ｌ以下、約１００ｍｇ／Ｌ～約５００ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ～約３００ｍｇ／Ｌ、約３００ｍｇ／Ｌ～約４００ｍｇ／Ｌ、または約１００ｍｇ／Ｌ～約２００ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）であり得る。硫酸カリウム濃度は、例えば、約５００ｍｇ／Ｌ超、約５００ｍｇ／Ｌ～約７５０ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ～約１０００ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ～約１５００ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ～約２０００ｍｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ～約１０００ｍｇ／Ｌ、または約１０００ｍｇ／Ｌ（その間で導出可能なすべての範囲を含む）であり得る。
【0079】
一態様では、単子葉植物種子胚外植片は、約２０℃～約３２℃、２５℃～約２９℃、または約２７℃～約２８℃（その間で導出可能なすべての範囲を含む）で再生培地と接触して再生される。いくつかの実施形態では、単子葉植物種子胚外植片は、約２０日～約５０日または約２８日～約４２日間（その間で導出可能なすべての範囲を含む）再生され得る。
【0080】
別の態様では、低塩濃度を含む再生培地上で遺伝子改変単子葉植物または植物部分を再生することは、より高い塩濃度を含む再生培地上で再生された遺伝子改変単子葉植物または植物部分と比較して、形質転換を少なくとも約０．１倍、０．２倍、０．３倍、０．４倍、０．５倍、０．６倍、０．７倍、０．８倍、０．９倍、１倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、または５倍向上し得る。加えて、低塩濃度を含む培地上で遺伝子改変単子葉植物または植物部分を再生することは、より高い塩濃度を含む再生培地上で再生された遺伝子改変単子葉植物または植物部分と比較して、発根頻度が少なくとも約０．１倍、０．２倍、０．３倍、０．４倍、０．５倍、０．６倍、０．７倍、０．８倍、０．９倍、１倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、または５倍増加し得る。
【0081】
再生工程は、さまざまな照明条件下で実施することもできる。第２の（または拡大）出芽誘導工程では、通常、ある程度の照明が使用され得る。いくつかの実施形態によれば、再生工程は、約３０μ／ｍ２・ｓ～約２５０μ／ｍ２・ｓ、約３０μ／ｍ２・ｓ～約２２５μ／ｍ２・ｓ、約３０μ／ｍ２・ｓ～約２００μ／ｍ２・ｓ、約４０μ／ｍ２・ｓ～約２００μ／ｍ２・ｓ、約５０μ／ｍ２・ｓ～約２００μ／ｍ２・ｓ、５０μ／ｍ２・ｓ～約１８０μ／ｍ２・ｓ、６０μ／ｍ２・ｓ～約１８０μ／ｍ２・ｓ、７０μ／ｍ２・ｓ～約１８０μ／ｍ２・ｓ、８０μ／ｍ２・ｓ～約１８０μ／ｍ２・ｓ、９０μ／ｍ２・ｓ～約１８０μ／ｍ２・ｓ、１００μ／ｍ２・ｓ～約１７０μ／ｍ２・ｓ、１１０μ／ｍ２・ｓ～約１６０μ／ｍ２・ｓ、または約１２０μ／ｍ２・ｓ～約１５０μ／ｍ２・ｓの範囲で光合成有効放射（ＰＡＲ）の平均または設定光強度で実施され得る。いくつかの実施形態によれば、第２の（または拡大）出芽誘導工程は、約２０μ／ｍ２・ｓ、約３０μ／ｍ２・ｓ、約４０μ／ｍ２・ｓ、約５０μ／ｍ２・ｓ、約６０μ／ｍ２・ｓ、約７０μ／ｍ２・ｓ、約８０μ／ｍ２・ｓ、約９０μ／ｍ２・ｓ、約１００μ／ｍ２・ｓ、約１１０μ／ｍ２・ｓ、約１２０μ／ｍ２・ｓ、約１３０μ／ｍ２・ｓ、約１４０μ／ｍ２・ｓ、約１５０μ／ｍ２・ｓ、約１６０μ／ｍ２・ｓ、約１７０μ／ｍ２・ｓ、約１８０μ／ｍ２・ｓ、約１９０μ／ｍ２・ｓ、約２００μ／ｍ２・ｓ、約２１０μ／ｍ２・ｓ、約２２０μ／ｍ２・ｓ、約２３０μ／ｍ２・ｓ、約２４０μ／ｍ２・ｓ、または約２５０μ／ｍ２・ｓで光合成有効放射（ＰＡＲ）の平均または設定光強度で実施され得る。いくつかの実施形態によれば、異なる量の明暗サイクルが第２の（または拡大）出芽誘導工程中に使用されてもよく、これは、約２時間～約２４時間の明期、約２時間～約２２時間の明期、約４時間～約２０時間の明期、約８時間～約２０時間の明期、約１２時間～約２０時間の明期、約１６時間～約２０時間の明期の時間の長さにわたる照明の存在を含み得、それぞれ２４時間の１日の長さに基づいて対応する長さの時間の対応する量の相対的な暗期を有する。
【0082】
いくつかの実施形態によれば、再生工程中の明暗サイクルの量は、約２時間の明期及び約２２時間の暗期、約３時間の明期及び約２１時間の暗期、約４時間の明期及び約２０時間の暗期、約５時間の明期及び約１９時間の暗期、約６時間の明期及び約１８時間の暗期、約７時間の明期及び約１７時間の暗期、約８時間の明期及び約１６時間の暗期、約９時間の明期及び約１５時間の暗期、約１０時間の明期及び約１４時間の暗期、約１１時間の明期及び約１３時間の暗期、約１２時間の明期及び約１２時間の暗期、約１３時間の明期及び約１１時間の暗期、約１４時間の明期及び約１０時間の暗期、約１５時間の明期及び約９時間の暗期、約１６時間の明期及び約８時間の暗期、約１７時間の明期及び約７時間の暗期、約１８時間の明期及び約６時間の暗期、約１９時間の明期及び約５時間の暗期、約２０時間の明期及び約４時間の暗期、約２１時間の明期及び約３時間の暗期、約２２時間の明期及び約２時間の暗期、約２３時間の明期及び約１時間の暗期、約２４時間の明期及び約０時間の暗期であり得る。
【0083】
本発明のなおさらに別の態様では、単子葉植物種子胚外植片及び遺伝子改変単子葉植物または植物部分は、カルス組織培養物を作出することなく培養され、再生される。
【0084】
本発明の一態様では、再生された遺伝子改変単子葉植物または植物部分は、非キメラであるか、またはキメラ化が低減されている。本明細書で使用する場合、「キメラ」または「キメラ化」という用語は、遺伝子改変に関して遺伝的に異なる２つのタイプの組織または細胞から構成される植物、植物組織、外植片などを指す。
【0085】
Ｆ．遺伝子工学による遺伝子改変植物
さまざまな遺伝子工学技術が開発されており、当業者はトランスジェニック形質または編集形質を植物に導入するために用いることができる。この方法は一般に、植物細胞へのポリヌクレオチド配列の送達を伴い、これは典型的には異種及び／または組換えＤＮＡ分子であり得、少なくとも１つの導入遺伝子または発現カセットまたはＲＮＡ分子、例えばガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、またはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）の一部、例えばゲノム編集用のｇＲＮＡ／部位指向的ヌクレアーゼ複合体を含み得る。本実施形態の特定の態様において、形質は、単一の遺伝子座もしくは導入遺伝子を植物のゲノムに改変または導入することによって単子葉植物に導入される。植物のゲノムＤＮＡに導入遺伝子、編集、変異、及びポリヌクレオチド配列を改変、欠失、または挿入するための遺伝子工学の方法は、当該技術分野で知られている。ゲノム編集技術を使用して植物細胞ゲノムまたは内因性植物遺伝子を編集する分子的方法は、当該技術分野で知られている。本実施形態によれば、ガイドＲＮＡ、部位指向的ヌクレアーゼ及び／または鋳型ＤＮＡ分子などのゲノム編集ツールまたは機構を含む及び／またはコードするポリヌクレオチドまたはＤＮＡ分子は、本明細書に記載される方法を用いて植物細胞に導入することができる。
さまざまな遺伝子工学技術が開発されており、当業者はトランスジェニック形質または編集形質を植物に導入するために用いることができる。この方法は一般に、植物細胞へのポリヌクレオチド配列の送達を伴い、これは典型的には異種及び／または組換えＤＮＡ分子であり得、少なくとも１つの導入遺伝子または発現カセットまたはＲＮＡ分子、例えばガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、またはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）の一部、例えばゲノム編集用のｇＲＮＡ／部位指向的ヌクレアーゼ複合体を含み得る。本実施形態の特定の態様において、形質は、単一の遺伝子座もしくは導入遺伝子を植物のゲノムに改変または導入することによって単子葉植物に導入される。植物のゲノムＤＮＡに導入遺伝子、編集、変異、及びポリヌクレオチド配列を改変、欠失、または挿入するための遺伝子工学の方法は、当該技術分野で知られている。ゲノム編集技術を使用して植物細胞ゲノムまたは内因性植物遺伝子を編集する分子的方法は、当該技術分野で知られている。本実施形態によれば、ガイドＲＮＡ、部位指向的ヌクレアーゼ及び／または鋳型ＤＮＡ分子などのゲノム編集ツールまたは機構を含む及び／またはコードするポリヌクレオチドまたはＤＮＡ分子は、本明細書に記載される方法を用いて植物細胞に導入することができる。
【0086】
いくつかの実施形態では、形質転換された単子葉植物は、植物ゲノムの部位特異的改変を通じて作製することができる。導入遺伝子またはポリヌクレオチド配列の部位指向的組込みの方法には、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼなどの配列特異的ヌクレアーゼ（例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２０３０１２号を参照）、操作したまたは天然のメガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥ－エンドヌクレアーゼ（例えば、米国特許第８，５８６，３６３号及び同第９，１８１，５３５号を参照）、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのものなどのＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ（例えば、米国特許第８，６９７，３５９号、同第８，７７１，９４５号、及び同第９，７９０，４９０号、ならびに米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号を参照）、ならびにＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼまたはＣＡＳＴ（例えば、米国特許出願公開第２０２０／０１９０４８７号を参照）が挙げられ、これらの内容及び開示の全体は参照により本明細書に組み込まれる。したがって、いくつかの実施形態は、ヌクレアーゼまたは任意の関連タンパク質を利用してゲノム改変を実施することに関する。このヌクレアーゼは、鋳型ゲノム編集用のドナー鋳型ＤＮＡ内で異種的に、または別個の分子もしくはベクター内で提供され得る。組換えＤＮＡ構築物はまた、改変される植物ゲノム内の部位にヌクレアーゼを誘導するための１つ以上のガイドＲＮＡをコードする配列を含んでもよい。単一の遺伝子座を改変または導入するためのさらなる方法としては、例えば、一本鎖オリゴヌクレオチドを利用して植物ゲノムに塩基対改変を導入することが含まれる（例えば、Ｓａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１７０（４）：１９１７－１９２８，２０１６（この内容及び開示の全体は参照により本明細書に組み込まれる）を参照）。遺伝子座を改変する他の方法としては、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ塩基エディターまたはプライムエディターを利用して、植物ゲノムに単一または複数の塩基対改変を導入することが含まれる（例えば、Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５３３，４２０－４２４（２０１６）；Ｇａｕｄｅｌｌｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５５１，４６４－４７１（２０１７）；Ｋｏｍｏｒ，ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｄｖａｎｃｅｓ ３：（８）（２０１７）、及びＲｅｅｓ，ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２０１８ Ｄｅｃ，１９（１２）：７７０－７８８、ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ２０２０／１９１２４８号（これらの内容及び開示の全体は参照により本明細書に組み込まれる）を参照）。
【0087】
異種及び／または組換え遺伝子配列または導入遺伝子の部位指向的改変または導入／組込みの方法は、当該技術分野において知られており、上記に述べたような配列特異的ヌクレアーゼ、またはゲノムＤＮＡを切断して遺伝子座に二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニックを生成するタンパク質とガイドＲＮＡの複合体を利用する方法が含まれる。当該技術分野でよく理解されているように、ヌクレアーゼ酵素によって導入されたＤＳＢまたはニックを修復するプロセスにおいて、ドナー鋳型、導入遺伝子、または発現カセットポリヌクレオチドは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって、または所望の配列の相同アーム（複数可）と標的配列との間の相同組換え（ＨＲ）によって、ＤＳＢまたはニックの部位においてゲノムに組み込まれ得る。これにより、ドナー鋳型、導入遺伝子、または発現カセットポリヌクレオチドのすべてまたは一部が、ゲノム内のヌクレアーゼの標的部位に部位指向的に組み込まれ、標的化挿入事象が引き起こされる可能性がある。組み込まれるＤＮＡに相同アームが存在することで、相同組換えまたは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による修復プロセス中に、植物ゲノムへの挿入配列または挿入配列の一部の導入及び標的化が促進され得る。
【0088】
他の実施形態では、植物の遺伝子改変は、植物、植物部分、植物組織または植物細胞のゲノムにポリヌクレオチドまたはＤＮＡ配列または導入遺伝子を挿入するために、植物、植物部分、植物組織または植物細胞の形質転換を含み得る。当該技術分野で知られており、多くの作物種に応用可能な植物の形質転換の方法としては、これらに限定されるものではないが、エレクトロポレーション、マイクロプロジェクタイルまたはパーティクルボンバードメント、マイクロインジェクション、ＰＥＧ媒介形質転換、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換、及び他の直接的なＤＮＡ取り込み様式が挙げられる。植物細胞の形質転換を媒介することが知られている細菌には、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ以外のＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ目に分類される可能性のある多数の細菌の属、種、及び株が含まれ、これには限定されないが、分類学上のＲｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ科（例えば、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属菌、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属菌）、Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科（例えば、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属菌、Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属菌）、Ｂｒｕｃｅｌｌａｃｅａｅ科（例えば、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ属菌）、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ科（例えば、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属菌）及びＸａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科（例えば、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属菌）などからの細菌種及び株が挙げられる。いくつかの実施形態によれば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによって媒介される。このような形質転換の標的は未分化カルス組織であることが多いが、分化した組織も一時的及び安定した植物の形質転換のために使用されてきた。当該技術分野で周知のように、例えばＭｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９３，“Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ ｉｎｔｏ Ｐｌａｎｔｓ，”ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｌｉｃｋ Ｂ．Ｒ．ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．Ｅｄｓ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ｐａｇｅｓ ６７－８８）によって記載されているように、植物形質転換のための他の方法を利用してもよい。
【0089】
具体的な実施形態では、マイクロプロジェクタイルボンバードメントを用いて、ポリヌクレオチドまたはＤＮＡ分子、ベクター、配列またはセグメントを植物外植片（複数可）の少なくとも１つの細胞に形質転換をもたらすことができる。この方法では、粒子をポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド／タンパク質複合体でコーティングし、推進力によって細胞に送達する。例示的な粒子としては、タングステン、白金、または金からなる粒子が挙げられ得る。ボンバードメントでは、外植片または他の標的細胞は固体培養培地上に配置され得る。撃ち込まれる細胞は、プロジェクタイル停止プレートの下に適当な距離で配置される。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはポリヌクレオチド分子でコーティングされた粒子を、ステンレス鋼またはＮｙｔｅｘスクリーンなどのスクリーンを通して、そして表面に配置された外植片に向かって推進させることができる、バイオリスティック粒子送達システムを使用した加速によって植物細胞内に送達することができる。スクリーンは、粒子が大きな凝集体としてレシピエント細胞に送達されないように、粒子を分散させることができる。マイクロプロジェクタイルボンバードメント技術は広く応用可能であり、さまざまな植物種の形質転換に使用することができる。
【0090】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介またはＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ媒介による外植片の形質転換は、異種及び／または組換えＤＮＡ分子を植物細胞に導入するためのもう１つの広く適用可能なシステムである。最新のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ内で複製が可能であり、操作に都合がよい（例えば、Ｋｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３（７）：６３７－６４２，１９８５を参照）。さらに、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介遺伝子移入のためのベクターにおける最近の技術的進歩により、ベクター内の遺伝子及び制限部位の配置が向上され、さまざまなポリペプチドをコードする遺伝子を発現できるベクターの構築が容易になった。記載されたベクターは、挿入されたポリペプチドをコードする遺伝子を直接発現させるためのプロモーター及びポリアデニル化部位に隣接した便利なマルチリンカー領域を有している。さらに、武装Ｔｉプラスミド及び非武装Ｔｉプラスミドの両方を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを形質転換に使用することができる。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換は、多くの植物種でよく選ばれる方法である。植物細胞にＤＮＡを導入するためのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介による植物組込みベクターの使用は、当該技術分野で知られている（例えば、Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３：６２９－６３５，１９８５；米国特許第５，５６３，０５５号を参照）。
【0091】
多くのプロモーター及び発現エレメントは、任意の選別マーカー、スコアリングマーカー、導入遺伝子、または農学的に利点のある任意の他の遺伝子の植物遺伝子発現に有用である。プロモーターとしては、任意の構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、器官特異的プロモーター、誘導性プロモーター、生殖組織プロモーター、発生段階プロモーター、ウイルスプロモーターなどが挙げられ得る。さまざまなタイプのプロモーター及び発現エレメントの例が当該技術分野で知られている。植物遺伝子発現に有用であり得る発現エレメントとしては、例えば、当該技術分野で知られているような、さまざまなプロモーター、エンハンサー、リーダー、５’及び３’非翻訳領域、イントロン、ターミネーターなどが挙げられ得る。選別マーカーもしくはスクリーニングマーカーまたは目的の遺伝子はまた、伝達ペプチドまたは他の標的配列に融合され得る。導入遺伝子によって産生されたタンパク質の、葉緑体、液胞、ペルオキシソーム、グリオキシソーム、細胞壁、核、またはミトコンドリアなどの細胞内区画への輸送、またはアポプラストへの分泌は、目的のタンパク質をコードする遺伝子の５’及び／または３’領域にシグナルまたは標的配列をコードするヌクレオチド配列を作動可能に連結することによって達成され得る。構造遺伝子の５’及び／または３’末端の標的配列は、タンパク質の合成及びプロセシング中に、コードされたタンパク質が最終的にどこで区画化されるかを決定し得る。シグナル配列の存在は、細胞内小器官または細胞内区画のいずれかに、またはアポプラストへの分泌のために、ポリペプチドを指向する。多くのシグナル配列が当該技術分野で知られている。例えば、Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０：４９，１９９２）；Ｋｎｏｘ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９：３－１７，１９８７）；Ｌｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９１：１２４－１２９，１９８９）；Ｆｏｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，３：４８３－４９６，１９９１）；Ｍａｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８３４，１９９１）；Ｇｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０８：１６５７，１９８９）；Ｃｒｅｉｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｊ．，２：１２９，１９９１）；Ｋａｌｄｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ，３９：４９９－５０９，１９８４）；Ｓｔｅｉｆｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２：７８５－７９３，１９９０）を参照のこと。
【0092】
構成的プロモーターの例としては、例えば、単子葉植物（例えば、Ｄｅｋｅｙｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２：５９１，１９９０；Ｔｅｒａｄａ ａｎｄ Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２０：３８９，１９９０を参照）を含むほとんどの植物組織において構成的な高レベルの発現を与えるカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター（例えば、Ｏｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１３：８１０，１９８５を参照）；ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターのタンデム重複バージョン、強化された３５Ｓプロモーター（ｅ３５Ｓ）、ノパリンシンターゼプロモーター（Ａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，８８：５４７，１９８８）、オクトピンシンターゼプロモーター（Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１：９７７，１９８９）；及び米国特許第５，３７８，６１９号に記載されているようなフィグウォルトモザイクウイルス（ＦＭＶ）プロモーター、及びＦＭＶのプロモーター配列がタンデムで重複されているＦＭＶプロモーターの強化バージョン（ｅＦＭＶ）、カリフラワーモザイクウイルス１９Ｓプロモーター、サトウキビ桿状型ウイルスプロモーター、ツユクサ黄斑ウイルス（ｃｏｍｍｅｌｉｎａ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ）プロモーター、及び植物細胞で発現することが知られている他の植物ＤＮＡウイルスプロモーターが挙げられ得る。
【0093】
誘導性プロモーターを用いると、転写速度は誘導剤に応じて増加する。任意の誘導性プロモーターを本発明で使用することができる。環境、ホルモン、化学、及び／または発生シグナルに応答して調節されるさまざまな植物遺伝子プロモーターは、植物細胞における作動可能に連結された遺伝子の発現のために使用することができ、これには（１）熱（Ｃａｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，８８：９６５，１９８８）、（２）光（例えば、エンドウｒｂｃＳ－３Ａプロモーター、Ｋｕｈｌｅｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１：４７１，１９８９；トウモロコシｒｂｃＳプロモーター、Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ ａｎｄ Ｓｈｅｅｎ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，３：９９７，１９９１；またはクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質プロモーター、Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，４：２７２３，１９８５）、（３）ホルモン、例えば、アブシジン酸（Ｍａｒｃｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１：９６９，１９８９）、（４）創傷（例えば、ｗｕｎｌ，Ｓｉｅｂｅｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１：９６１，１９８９）；または（５）化学物質、例えば、ジャスモン酸メチル、サリチル酸、またはＳａｆｅｎｅｒによって調製されるプロモーターが含まれる。当該技術分野で知られている器官特異的または組織特異的プロモーターを用いることも有利であり得る（例えば、Ｒｏｓｈａｌ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，６：１１５５，１９８７；Ｓｃｈｅｒｎｔｈａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，７：１２４９，１９８８；Ｂｕｓｔｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１：８３９，１９８９）。
【0094】
単子葉植物に導入され得る例示的なポリヌクレオチドまたはＤＮＡ分子としては、例えば、別の種のＤＮＡ配列もしくは遺伝子、または同じ種に由来するか同じ種に存在するが、古典的な生殖もしくは育種技術ではなく、遺伝子工学的方法によってレシピエント細胞に組み込まれる遺伝子もしくは配列さえも含まれる。しかしながら、「外因性」という用語は、形質転換される細胞に通常は存在しない遺伝子、またはおそらくその形態、構造、位置などで存在しない遺伝子を指すことも意図されている。ポリヌクレオチドは、植物細胞内にすでに存在する、別の植物の、異なる生物の、外因性の、または外部で生成されたＤＮＡ分子または配列を含み得る。導入遺伝子または発現カセットは、抑制のためのｍＲＮＡ及びタンパク質またはＲＮＡ分子、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、逆反復ＲＮＡなどをコードし得る。ポリヌクレオチドは、外因性、異種及び／または組換えポリヌクレオチドまたはＤＮＡ分子または配列であり得る。
【0095】
数千ではないにしても数百もの異なる遺伝子が知られており、本発明に従って植物に導入される可能性がある。単子葉植物に導入するために選択され得る特定の遺伝子及び対応する表現型の非限定的な例としては、以下の１つ以上の遺伝子：昆虫耐性の遺伝子、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂ．ｔ．）遺伝子、害虫耐性の遺伝子、例えば真菌性疾患を制御するための遺伝子、除草耐性の遺伝子、例えばグリホサート耐性を付与する遺伝子、及び品質向上、例えば収量、栄養強化、環境耐性もしくはストレス耐性、または植物の生理機能、生育、発達、形態もしくは植物産物（複数可）における任意の所望の変化のための遺伝子が含まれる。例えば、構造遺伝子には、ＷＯ９９／３１２４８（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、米国特許第５，６８９，０５２号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、米国特許第５，５００，３６５号及び同第５，８８０，２７５号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているＢａｃｉｌｌｕｓ昆虫制御タンパク質遺伝子を含むがこれらに限定されない、昆虫耐性を付与する任意の遺伝子が含まれるであろう。別の実施形態では、構造遺伝子は、米国特許第５，６３３，４３５号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ＣＰ４グリホセート耐性ＥＰＳＰＳ遺伝子（ａｒｏＡ：ＣＰ４）、または米国特許第５，４６３，１７５号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるグリホサートオキシドレダクターゼ遺伝子（ＧＯＸ）を含むがこれらに限定されない遺伝子により付与されるような除草剤グリホセートに対する耐性を付与し得る。
【0096】
さまざまなアッセイが当該技術分野で知られており、形質転換、編集、または遺伝子改変植物における外因性ＤＮＡ配列または導入遺伝子の存在を確認するために使用することができる。そのようなアッセイには、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、配列決定、ＰＣＲ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、酵素機能アッセイ、植物部分アッセイ、または再生植物の表現型の分析が含まれるが、これらに限定されない。
【0097】
Ｇ．培養培地
種々の組織培養培地は、適切に補充された場合、切除された植物組織からの成熟植物の形成を含む、植物組織の生育及び発達を支援することが知られている。本明細書で使用する場合、「組織培養培地」という用語は、非土壌環境における植物の生育及び発達を支援するために使用される液体、半固体、または固体の培地を指す。これらの組織培養培地は、市販の調製物として購入することもでき、または当業者によって特注で調製及び改変されることもできる。そのような培地の例には、限定されないが、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ，（１９６２）；Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，（１９７５）；Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ，（１９６５）；Ｕｃｈｉｍｉｙａ ａｎｄ Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，（１９６２）；Ｇａｍｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，（１９６８）；Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）；ＭｃＣｏｗｎ ａｎｄ Ｌｌｏｙｄ，（１９８１）；Ｎｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｎｉｔｓｃｈ（１９６９）；及びＳｃｈｅｎｋ ａｎｄ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ，（１９７２）に記載されたもの、または適切に補充されるこれらの培地の派生物が挙げられる。当業者は、目的の特定の標的作物または変種のための培地及び培地補充物、例えば形質転換及び再生における使用のための栄養素及び植物生育調節物質が、通常最適化されることを承知している。組織培養培地は、限定されないが、グルコース、スクロース、マルトース、マンノース、フルクトース、ラクトース、ガラクトース、及び／またはデキストロースなどの炭水化物、または炭水化物の比率により補充され得る。試薬は市販されており、多くの供給業者から購入することができる（例えば、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；及びＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ，ＫＳを参照）。これらの組織培養培地は、接種培地、共培養培地、出芽誘導培地、第２の誘導培地、または再生培地を調製するために使用することができ、特定の実施形態では、選択剤を含み得る。
種々の組織培養培地は、適切に補充された場合、切除された植物組織からの成熟植物の形成を含む、植物組織の生育及び発達を支援することが知られている。本明細書で使用する場合、「組織培養培地」という用語は、非土壌環境における植物の生育及び発達を支援するために使用される液体、半固体、または固体の培地を指す。これらの組織培養培地は、市販の調製物として購入することもでき、または当業者によって特注で調製及び改変されることもできる。そのような培地の例には、限定されないが、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ，（１９６２）；Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，（１９７５）；Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ，（１９６５）；Ｕｃｈｉｍｉｙａ ａｎｄ Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，（１９６２）；Ｇａｍｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，（１９６８）；Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）；ＭｃＣｏｗｎ ａｎｄ Ｌｌｏｙｄ，（１９８１）；Ｎｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｎｉｔｓｃｈ（１９６９）；及びＳｃｈｅｎｋ ａｎｄ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ，（１９７２）に記載されたもの、または適切に補充されるこれらの培地の派生物が挙げられる。当業者は、目的の特定の標的作物または変種のための培地及び培地補充物、例えば形質転換及び再生における使用のための栄養素及び植物生育調節物質が、通常最適化されることを承知している。組織培養培地は、限定されないが、グルコース、スクロース、マルトース、マンノース、フルクトース、ラクトース、ガラクトース、及び／またはデキストロースなどの炭水化物、または炭水化物の比率により補充され得る。試薬は市販されており、多くの供給業者から購入することができる（例えば、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；及びＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ，ＫＳを参照）。これらの組織培養培地は、接種培地、共培養培地、出芽誘導培地、第２の誘導培地、または再生培地を調製するために使用することができ、特定の実施形態では、選択剤を含み得る。
【0098】
Ｈ．選別マーカー
特定の実施形態では、本発明に従って使用するための培地は、１つ以上の選択剤を含むことができ、本発明で使用するための異種ポリヌクレオチド分子は、選別マーカー遺伝子を含むことができ、選別マーカー遺伝子は、選択剤に対する耐性を与える。本明細書で使用する場合、「選別マーカー」または「スクリーニングマーカー」または「スコアリングマーカー」とは、その発現が核酸配列を含む細胞の同定を容易にする表現型を与える核酸配列を指す。さまざまな選別マーカー及びそれらに対する耐性をもたらす遺伝子の例は、Ｍｉｋｉ ａｎｄ ＭｃＨｕｇｈ，２００４に開示されている。使用できる選別マーカー遺伝子には、ａｒｏＡ、ＥＰＳＰＳ、ａａｄＡ、ｐａｔ、ｂａｒ、ｈｐｈ（ハイグロマイシンＢリン酸基転移酵素）、ＤＭＯ（ジカンバノモオキシゲナーゼ（ｄｉｃａｍｂａ ｎｏｍｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ））、及びＮＰＴ ＩＩが含まれるが、決してこれらに限定されない。本発明に従って使用され得る選択剤の非限定的な例としては、グリホサート、グルホシネート、ホスフィノトリシン、ブロモキシニル、ビアラホス、ジカンバ、イミダゾリノン、スルホニル尿素、アセト乳酸シンターゼ阻害剤、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害剤、ヒドロキシフェニル－ピルビン酸－ジオキシゲナーゼ阻害剤、抗生物質阻害剤、ネオマイシン、カナマイシン、パラモマイシン（ｐａｒａｍｏｍｙｃｉｎ）、Ｇ４１８、アミノグリコシド、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、ハイグロマイシンＢ、ブレオマイシン、フレオマイシン、スルホンアミド、ゲンタマイシン、ストレプトトリシン、クロラムフェニコール、メトトレキサート、２－デオキシグルコース、ベタインアルデヒド、Ｓ－アミノエチルＬ‐システイン、４－メチルトリプトファン、Ｄ－キシロース、Ｄ－マンノース、及びベンジルアデニン－Ｎ－３－グルクロニダーゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明で使用するための異種ポリヌクレオチド分子は、２つ以上の選別マーカー遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明で使用するための選択剤は、単独で、または２つ以上の選択剤の組み合わせとして使用され得る。一実施形態では、本発明の実施形態は、選択剤の非存在下で実施することができる。
特定の実施形態では、本発明に従って使用するための培地は、１つ以上の選択剤を含むことができ、本発明で使用するための異種ポリヌクレオチド分子は、選別マーカー遺伝子を含むことができ、選別マーカー遺伝子は、選択剤に対する耐性を与える。本明細書で使用する場合、「選別マーカー」または「スクリーニングマーカー」または「スコアリングマーカー」とは、その発現が核酸配列を含む細胞の同定を容易にする表現型を与える核酸配列を指す。さまざまな選別マーカー及びそれらに対する耐性をもたらす遺伝子の例は、Ｍｉｋｉ ａｎｄ ＭｃＨｕｇｈ，２００４に開示されている。使用できる選別マーカー遺伝子には、ａｒｏＡ、ＥＰＳＰＳ、ａａｄＡ、ｐａｔ、ｂａｒ、ｈｐｈ（ハイグロマイシンＢリン酸基転移酵素）、ＤＭＯ（ジカンバノモオキシゲナーゼ（ｄｉｃａｍｂａ ｎｏｍｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ））、及びＮＰＴ ＩＩが含まれるが、決してこれらに限定されない。本発明に従って使用され得る選択剤の非限定的な例としては、グリホサート、グルホシネート、ホスフィノトリシン、ブロモキシニル、ビアラホス、ジカンバ、イミダゾリノン、スルホニル尿素、アセト乳酸シンターゼ阻害剤、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害剤、ヒドロキシフェニル－ピルビン酸－ジオキシゲナーゼ阻害剤、抗生物質阻害剤、ネオマイシン、カナマイシン、パラモマイシン（ｐａｒａｍｏｍｙｃｉｎ）、Ｇ４１８、アミノグリコシド、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、ハイグロマイシンＢ、ブレオマイシン、フレオマイシン、スルホンアミド、ゲンタマイシン、ストレプトトリシン、クロラムフェニコール、メトトレキサート、２－デオキシグルコース、ベタインアルデヒド、Ｓ－アミノエチルＬ‐システイン、４－メチルトリプトファン、Ｄ－キシロース、Ｄ－マンノース、及びベンジルアデニン－Ｎ－３－グルクロニダーゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明で使用するための異種ポリヌクレオチド分子は、２つ以上の選別マーカー遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明で使用するための選択剤は、単独で、または２つ以上の選択剤の組み合わせとして使用され得る。一実施形態では、本発明の実施形態は、選択剤の非存在下で実施することができる。
【0099】
本発明の実施形態によれば、形質転換またはゲノム編集のための外因性ポリヌクレオチドまたはＤＮＡ分子の挿入配列は、形質転換またはトランスジェニックＲ０植物の選別及び作出を成功させるための植物選別マーカー遺伝子を含み得る。植物選別マーカー遺伝子または導入遺伝子としては、植物選別マーカー導入遺伝子により形質転換された植物細胞が、選択剤によって課される選択圧に耐性となり、耐えられ得るように、対応する選択剤に対する耐性を付与する任意の遺伝子を挙げることができる。結果として、外植片の形質転換された植物細胞は、選別下での生育、増殖、発達などに有利となる。植物選別マーカー遺伝子は、選択剤に耐性を付与するために一般的に使用されるが、追加のスクリーニングマーカー遺伝子（複数可）もまた、選別マーカーに加えて、おそらく農業上関心のある遺伝子とともに使用され得る。そのようなスクリーニングマーカー遺伝子には、例えば、β－グルクロニダーゼのｕｉｄＡ（ＧＵＳ；例えば、米国特許第５，５９９，６７０号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている）または緑色蛍光タンパク質及びその変異体のｇｆｐ（米国特許第５，４９１，０８４号及び同第６，１４６，８２６号（両方とも参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているＧＦＰ）またはフィトエンシンターゼのｃｒｔＢ（例えば、米国特許第８，２３７，０１６号及び同第１０，２４０，１６５号（両方とも参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている）が挙げられ得る。スクリーニングマーカーの追加の例としては、その発現が形質転換された細胞を同定するための手段として検出することができる分子（複数可）の分泌を引き起こす、分泌マーカーが挙げられ得る。
【0100】
植物選別マーカー遺伝子は、除草剤、例えばグリホサート及びグルホシネートへの耐性または抵抗性を提供または付与するタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。当該技術分野で知られている有用な植物選別マーカー遺伝子としては、ストレプトマイシンまたはスペクチノマイシン（例えば、ａａｄＡ、ｓｐｅｃ／ｓｔｒｅｐ）、カナマイシン（例えば、ｎｐｔＩＩ）、ハイグロマイシンＢ（例えば、ａｐｈ ＩＶ）、ゲンタマイシン（例えば、ａａｃ３及びａａｃＣ４）、及びクロラムフェニコール（例えば、ＣＡＴ）に対する抵抗性または耐性を付与するタンパク質をコードするものを挙げることができる。除草剤抵抗性または耐性を付与するタンパク質をコードする既知の植物選別マーカー遺伝子のさらなる例としては、例えば、５－エノールピルビルシキミ酸３－リン酸シンターゼをコードする転写可能ＤＮＡ分子（グリホサート耐性用ＥＰＳＰＳ；例えば、米国特許第５，６２７，０６１号、同第５，６３３，４３５号、同第６，０４０，４９７号、及び同第５，０９４，９４５号（これらのすべてが参照によって本明細書に組み込まれる）に記載）；グリホサートオキシドレダクターゼ及びグリホサート－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼをコードする転写可能ＤＮＡ分子（ＧＯＸ；例えば、米国特許第５，４６３，１７５号に記載；ＧＡＴ、米国特許公開第２００３００８３４８０号に記載；フィトエンデサチュラーゼをコードする転写可能ＤＮＡ分子（ｃｒｔＩ；例えば、ノルフルラゾン耐性についてＭｉｓａｗａ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，４：８３３－８４０（１９９３）及びＭｉｓａｗａ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，６：４８１－４８９（１９９４）（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載）；ならびにｂａｒ遺伝子（例えば、グルホシネート及びビアラホス耐性についてＤｅＢｌｏｃｋ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，６：２５１３－２５１９（１９８７）（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載）が挙げられる。
【0101】
外因性ＤＮＡ分子の挿入配列は、形質転換された植物（複数可）の作出及び／または確認が成功した後、特に導入遺伝子または発現カセットがもはや必要とされなくなった後に、１つ以上の導入遺伝子（複数可）もしくは発現カセット（複数可）、例えば、植物選別マーカー導入遺伝子、またはその任意の部分もしくは配列を除去するための配列をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、これは、除去される導入遺伝子配列を、内在性であるかまたは外因的に提供されるリコンビナーゼ酵素（例えば、Ｃｒｅ、Ｆｌｐなど）によって認識及び除去することができる、公知のまたは後に発生する組換え部位（例えば、ＬｏｘＰ部位、ＦＲＴ部位など）と隣接させることによって達成することができる。リコンビナーゼ酵素は、導入遺伝子の切除を達成するために、トランスで、例えば、リコンビナーゼ導入遺伝子を有する別の植物と形質転換された植物を交配させることによって導入及び発現させることができる。したがって、望まれない配列エレメントまたは導入遺伝子は、その使用または目的が終了すると除去することができ、したがって、生殖系列におけるそのさらなる発現または伝達は防止され得る。
【実施例】
【0102】
当業者であれば、本発明によって提供される方法及び組成物の多くの利点を理解するであろう。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例において開示された技術は、本発明の実行において良好に機能することが本発明者らによって発見された技術を表し、したがって、その実施のための好ましい様式を構成すると考えられ得ることを、当業者は理解されたい。しかしながら、当業者であれば、本開示に照らして、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく、開示される特定の実施形態に多くの変更を行っても、同様または類似の結果を得ることができることを理解するであろう。本明細書で引用されるすべての参考文献は、本明細書で使用される方法論、技術、または組成物を補足し、説明し、背景を提供し、または教示する範囲で、参照により本明細書に組み込まれる。
【0103】
実施例１
トウモロコシの切除された外植片の形質転換
この実施例は、外植片の調製、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの接種及び共培養、出芽誘導、拡大出芽誘導、ならびにトランスジェニック植物の再生の工程を含む、乾燥成熟トウモロコシ種子から切除された胚外植片のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換の方法について記載する。
トウモロコシの切除された外植片の形質転換
この実施例は、外植片の調製、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの接種及び共培養、出芽誘導、拡大出芽誘導、ならびにトランスジェニック植物の再生の工程を含む、乾燥成熟トウモロコシ種子から切除された胚外植片のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換の方法について記載する。
【0104】
外植片の調製
外植片を乾燥成熟０１ＤＫＤ２トウモロコシ種子から切除し、密封ポーチ内で－２０℃で保存した。外植片を冷凍庫から取り出し、外植片の調製前に少なくとも３０分間室温に平衡化させた。外植片を、適切なサイズのローラーボトル内で分子量（ＭＷ）８００の１００ｇ／Ｌのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む７０％エタノールで、約３．５分間ゆっくりと回転させることによって撹拌して、表面殺菌した。約３００ｍＬの殺菌溶液が最大約１５，０００のトウモロコシ外植片に使用され、約５００ｍＬの殺菌溶液が約１５，０００～約３０，０００のトウモロコシ外植片に使用された。殺菌後、トウモロコシ外植片と殺菌溶液を大きな鋼製ストレーナー上に注いだ。ストレーナー上に保持された外植片を約２．５～約３．０Ｌの滅菌水ですすいで、有意な残存する殺菌溶液を除去し、その後、滅菌ガラスビーカーに移した。
外植片を乾燥成熟０１ＤＫＤ２トウモロコシ種子から切除し、密封ポーチ内で－２０℃で保存した。外植片を冷凍庫から取り出し、外植片の調製前に少なくとも３０分間室温に平衡化させた。外植片を、適切なサイズのローラーボトル内で分子量（ＭＷ）８００の１００ｇ／Ｌのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む７０％エタノールで、約３．５分間ゆっくりと回転させることによって撹拌して、表面殺菌した。約３００ｍＬの殺菌溶液が最大約１５，０００のトウモロコシ外植片に使用され、約５００ｍＬの殺菌溶液が約１５，０００～約３０，０００のトウモロコシ外植片に使用された。殺菌後、トウモロコシ外植片と殺菌溶液を大きな鋼製ストレーナー上に注いだ。ストレーナー上に保持された外植片を約２．５～約３．０Ｌの滅菌水ですすいで、有意な残存する殺菌溶液を除去し、その後、滅菌ガラスビーカーに移した。
【0105】
殺菌後、トウモロコシ外植片を浮遊濃縮して破片を除去した。簡単に説明すると、外植片を含む滅菌ガラスビーカーに５００ｍＬの滅菌水を注ぎ、表面に浮遊した外植片を大きなストレーナーに注ぐことによって収集した。残存する生存外植片が表面に浮遊しなくなるまで、浮遊を数回繰り返した。
【0106】
浮遊濃縮後に収集したトウモロコシ外植片を、再水和のために新しい滅菌ガラスビーカーに移した。簡単に説明すると、１／２濃度であるＣａＣｌ２を除く２／５濃度のＢ５マクロ塩、１／１０濃度のＢ５ミクロ塩及びビタミン、１ｇ／Ｌの硝酸カリウム、３０ｇ／Ｌのデキストロース、２．８ｍｇ／Ｌのセクエストレン、３．９ｇ／Ｌの２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、及び０．０３ｇ／ＬのＣｌｅａｒｙｓ ３３３６ ＷＰ、ｐＨ５．４を含む再水和培地４００ｍＬをビーカーに添加した 次いで、ビーカーをアルミホイルで覆い、約１～約２時間インキュベートした。ＭＳ、ガンボーグＢ５（Ｂ５）、及び木本植物培地（ＷＰＭ）の塩及びビタミンのそれぞれの構成成分は当該技術分野で知られており、まとめて表１に提供する。例えば、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ（１９６２）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１５：４７３－４９７；Ｏ Ｌ Ｇａｍｂｏｒｇ，ｅｔ ａｌ．（１９６８）Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，５０（１）：１５１－８；及びＭｃＣｏｗｎ ａｎｄ Ｌｌｏｙｄ（１９８１）ＨｏｒｔＳｃｉｅｎｃｅ，１６：４５３－４５３（それぞれの内容及び開示の全体は参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
表１．ＭＳ、Ｂ５、ＷＰＭ、ならびに低窒素ＭＳの塩及びビタミンの構成成分。
表１．ＭＳ、Ｂ５、ＷＰＭ、ならびに低窒素ＭＳの塩及びビタミンの構成成分。
【表1】
【0107】
表１では、主要な塩類または多量要素は太字で、ミクロ塩または微量要素は通常のフォントで、ビタミンは斜体で示されている。これらの塩及びビタミン混合物のそれぞれは、ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓなどから市販されている（例えば、ＭＳ塩混合物のカタログ番号はＭ５１９、Ｂ５塩混合物のカタログ番号はＧ３９８、ＷＰＭ塩混合物のカタログ番号はＬ４４９、及び低窒素ＭＳ混合物のカタログ番号はＭ５２９とＧ２４９の組み合わせである）。基礎塩混合物には多量要素と微量要素の両方が含まれている。濃度は、溶液で示されるか、または総水量１Ｌあたり指定された量が添加されたときに示される（これは任意の他の容量に合わせて調整され得る）。希釈はこれらの完全濃度に対して行われ、分数として表記され得る。表１の塩またはビタミンの完全濃度は、希釈が指定されない限り、本明細書に記載される溶液に含まれる。
【0108】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの調製
ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのグリセロールストックＡＢ３２を－８０℃の冷凍庫から取り出し、層流フード内で周囲温度で解凍した。ボルテックスにより完全に混合した後、解凍したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのグリセロールストック２５０ｍＬを、滅菌した１Ｌフラスコ内の形質転換構築物のための適切な抗生物質を含む２５０ｍＬの液体ＬＢ培地に接種した。適切な抗生物質には、例えば、５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンまたは３０ｍｇ／Ｌのゲンタマイシンが含まれ得る。フラスコを２００ｒｐｍに設定したオービタルシェーカー／インキュベーターに置き、２７．５＋２℃で暗所で１６～２４時間、または接種物の６６０ｎｍでの光学密度測定値（ＯＤ６６０）が０．６～１．２の範囲内になるまで培養した。一晩Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの培養物を約３０００ｒｐｍまたは２６２０×ｇ（Ｓｏｒｖａｌｌ（登録商標）３Ｂ、６０００Ａローター）で、４℃で２５分間遠心分離した後、ペレットを２／５濃度のＢ５マクロ塩、１／１０のＢ５ミクロ塩及びビタミン、１ｇ／Ｌの硝酸カリウム、３０ｇ／Ｌのデキストロース、及び３．９ｇ／ＬのＭＥＳを含む接種培地５０ｍＬに再懸濁した。再懸濁後、すべてのチューブからのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍをプールし、よく混合し、ＯＤ６６０測定のためにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液の１：２０希釈液を作成した。次いで、濃縮されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液を接種培地中で最終ＯＤ６６０が０．２５になるまで希釈した。
ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのグリセロールストックＡＢ３２を－８０℃の冷凍庫から取り出し、層流フード内で周囲温度で解凍した。ボルテックスにより完全に混合した後、解凍したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのグリセロールストック２５０ｍＬを、滅菌した１Ｌフラスコ内の形質転換構築物のための適切な抗生物質を含む２５０ｍＬの液体ＬＢ培地に接種した。適切な抗生物質には、例えば、５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンまたは３０ｍｇ／Ｌのゲンタマイシンが含まれ得る。フラスコを２００ｒｐｍに設定したオービタルシェーカー／インキュベーターに置き、２７．５＋２℃で暗所で１６～２４時間、または接種物の６６０ｎｍでの光学密度測定値（ＯＤ６６０）が０．６～１．２の範囲内になるまで培養した。一晩Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの培養物を約３０００ｒｐｍまたは２６２０×ｇ（Ｓｏｒｖａｌｌ（登録商標）３Ｂ、６０００Ａローター）で、４℃で２５分間遠心分離した後、ペレットを２／５濃度のＢ５マクロ塩、１／１０のＢ５ミクロ塩及びビタミン、１ｇ／Ｌの硝酸カリウム、３０ｇ／Ｌのデキストロース、及び３．９ｇ／ＬのＭＥＳを含む接種培地５０ｍＬに再懸濁した。再懸濁後、すべてのチューブからのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍをプールし、よく混合し、ＯＤ６６０測定のためにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液の１：２０希釈液を作成した。次いで、濃縮されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液を接種培地中で最終ＯＤ６６０が０．２５になるまで希釈した。
【0109】
接種及び共培養
上記のように再水和した後、外植片／再水和混合物を滅菌ステンレス鋼メッシュストレーナーに注ぐことによって外植片を収集した。保持された外植片を滅菌タオル上に素早く吸い取り、余分な液体を取り除いた。約２，５００のトウモロコシ外植片と４０ｍＬのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液を５０ｍＬの通気孔付き円錐チューブに加えた。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液は、チューブ内のすべての外植片をカバーした。次に、チューブを真空チャンバーに置き、約３００ｐｓｉの圧力を約３分間加えた。圧力をゆっくりと解放した後、チューブを２，６２０×ｇで、４℃で３０分間遠心分離した。圧力による接種及び遠心分離の後、外植片を滅菌ステンレス鋼ストレーナーに移すことによってＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液を除去した。滅菌ペーパータオル上でストレーナーを軽くたたいて余分な液体を除去した。
上記のように再水和した後、外植片／再水和混合物を滅菌ステンレス鋼メッシュストレーナーに注ぐことによって外植片を収集した。保持された外植片を滅菌タオル上に素早く吸い取り、余分な液体を取り除いた。約２，５００のトウモロコシ外植片と４０ｍＬのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液を５０ｍＬの通気孔付き円錐チューブに加えた。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液は、チューブ内のすべての外植片をカバーした。次に、チューブを真空チャンバーに置き、約３００ｐｓｉの圧力を約３分間加えた。圧力をゆっくりと解放した後、チューブを２，６２０×ｇで、４℃で３０分間遠心分離した。圧力による接種及び遠心分離の後、外植片を滅菌ステンレス鋼ストレーナーに移すことによってＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液を除去した。滅菌ペーパータオル上でストレーナーを軽くたたいて余分な液体を除去した。
【0110】
接種したトウモロコシ外植片を、１．２５ｍＬの再水和培地で湿らせた滅菌ワットマン＃１濾紙（８２ｍｍ）を１枚含む共培養プレート（２５ｍｍ×１００ｍｍ）に移した。各プレートには、単層でプレート全体に均一に広がった約５００～６００のトウモロコシ外植片が含まれていた。共培養プレートを２０℃、相対湿度約６５％で、明期１６時間／暗期８時間の光周期で５～６日間インキュベートした。目標とした光強度は、約９０μ／ｍ２・ｓの光合成有効放射（ＰＡＲ）であった。
【0111】
出芽誘導
共培養工程の後、トウモロコシ外植片を、例えばＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、３０ｇ／Ｌのスクロース、０．６９ｇ／Ｌのプロリン、１ｇ／ＬのＮＺアミン－Ａ（カゼイン酵素加水分解物；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、２ｍｇ／Ｌのグリシン、１ｇ／ＬのＭＥＳ、１ｍｇ／Ｌの２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）、１０ｍｇ／Ｌの６－ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、４００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、２００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、１００ｍｇ／Ｌのチメンチン、及び３．５ｇ／Ｌの低ＥＥＯアガロース、ｐＨ５．８を含む固体出芽誘導培地に移した。各共培養プレートからの外植片を、出芽誘導培地を含む５つのプレート上に均等にプレーティングした。プレートをＰｅｒｃｉｖａｌ（登録商標）チャンバー内で３３℃（実際のプレート温度は３５℃）、明期１６時間／暗期８時間の光周期で、約９０μ／ｍ２・ｓのＰＡＲの光強度で６～８日間インキュベートした。
共培養工程の後、トウモロコシ外植片を、例えばＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、３０ｇ／Ｌのスクロース、０．６９ｇ／Ｌのプロリン、１ｇ／ＬのＮＺアミン－Ａ（カゼイン酵素加水分解物；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、２ｍｇ／Ｌのグリシン、１ｇ／ＬのＭＥＳ、１ｍｇ／Ｌの２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）、１０ｍｇ／Ｌの６－ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、４００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、２００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、１００ｍｇ／Ｌのチメンチン、及び３．５ｇ／Ｌの低ＥＥＯアガロース、ｐＨ５．８を含む固体出芽誘導培地に移した。各共培養プレートからの外植片を、出芽誘導培地を含む５つのプレート上に均等にプレーティングした。プレートをＰｅｒｃｉｖａｌ（登録商標）チャンバー内で３３℃（実際のプレート温度は３５℃）、明期１６時間／暗期８時間の光周期で、約９０μ／ｍ２・ｓのＰＡＲの光強度で６～８日間インキュベートした。
【0112】
拡大出芽誘導
出芽誘導工程の後、トウモロコシ外植片を、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、６０ｇ／Ｌのスクロース、０．５ｇ／Ｌのグルタミン、０．６９ｇ／Ｌのプロリン、１ｇ／ＬのＮＺアミン－Ａ、２ｍｇ／Ｌのグリシン、１．９５ｇ／ＬのＭＥＳ、１．２５ｍｇ／Ｌの硫酸銅、２ｍｇ／Ｌのチジアズロン、２ｍｇ／Ｌのピクロラム、４００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、２００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、１００ｍｇ／Ｌのチメンチン、２５μＭのグリホサート、及び３．５ｇ／Ｌの低ＥＯアガロース、ｐＨ５．８を含む固体拡大出芽誘導培地に移した。各出芽誘導プレートからの外植片を、拡大出芽誘導培地を含む２つのプレート上に均等に分割した。これらのプレートを、２８℃で、明期１６時間／暗期８時間の光周期で、約５～１８日間、約１５０μ／ｍ２・ｓのＰＡＲの光強度で培養した。
出芽誘導工程の後、トウモロコシ外植片を、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、６０ｇ／Ｌのスクロース、０．５ｇ／Ｌのグルタミン、０．６９ｇ／Ｌのプロリン、１ｇ／ＬのＮＺアミン－Ａ、２ｍｇ／Ｌのグリシン、１．９５ｇ／ＬのＭＥＳ、１．２５ｍｇ／Ｌの硫酸銅、２ｍｇ／Ｌのチジアズロン、２ｍｇ／Ｌのピクロラム、４００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、２００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、１００ｍｇ／Ｌのチメンチン、２５μＭのグリホサート、及び３．５ｇ／Ｌの低ＥＯアガロース、ｐＨ５．８を含む固体拡大出芽誘導培地に移した。各出芽誘導プレートからの外植片を、拡大出芽誘導培地を含む２つのプレート上に均等に分割した。これらのプレートを、２８℃で、明期１６時間／暗期８時間の光周期で、約５～１８日間、約１５０μ／ｍ２・ｓのＰＡＲの光強度で培養した。
【0113】
再生
拡大出芽誘導プレートからの外植片を、シュートの発達及び発根のために、ＬＭ木本植物培地（ＷＰＭ）の塩及びビタミン、０．０３ｇ／ＬのＣｌｅａｒｙ３３３６ＷＰ（チオファネートメチル）、３０ｇ／Ｌのスクロース、０．６９ｇ／Ｌのプロリン、２ｍｇ／Ｌのグリシン、１ｇ／ＬのＭＥＳ、３．５ｇ／Ｌの低ＥＥＯアガロース、４００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、２００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、１００ｍｇ／Ｌのチメンチン及び２０μＭのグリホサート、ｐＨ５．８を９ｃｍのＶｉｖｉ（登録商標）トレイ（Ｖｉｖｉ（登録商標）、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）中に含む固体再生培地に移した。外植片を再生培地上に均一に分布させた後、Ｖｉｖｉ（登録商標）トレイを、手持ち式のシーリングアイロンを用いてプラスチックフィルムで密封し、２８℃及び周囲湿度で、明期１６時間／暗期８時間の光周期で、約１６０μ／ｍ２・ｓのＰＡＲの光強度で２８～４２日間培養した。再生工程の後、典型的には接種工程から約１０～１１週間後に、根が目に見え、キメラ化の兆候がない推定上のトランスジェニック植物を、土壌プラグ（直径２インチ×高さ３インチ（Ｇｒｏ－Ｔｅｃｈ，Ｒｏｕｇｈ ａｎｄ Ｒｅａｄｙ，ＣＡ ９５９７５）において移植し、さらに生育及び発達させた。
拡大出芽誘導プレートからの外植片を、シュートの発達及び発根のために、ＬＭ木本植物培地（ＷＰＭ）の塩及びビタミン、０．０３ｇ／ＬのＣｌｅａｒｙ３３３６ＷＰ（チオファネートメチル）、３０ｇ／Ｌのスクロース、０．６９ｇ／Ｌのプロリン、２ｍｇ／Ｌのグリシン、１ｇ／ＬのＭＥＳ、３．５ｇ／Ｌの低ＥＥＯアガロース、４００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、２００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、１００ｍｇ／Ｌのチメンチン及び２０μＭのグリホサート、ｐＨ５．８を９ｃｍのＶｉｖｉ（登録商標）トレイ（Ｖｉｖｉ（登録商標）、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）中に含む固体再生培地に移した。外植片を再生培地上に均一に分布させた後、Ｖｉｖｉ（登録商標）トレイを、手持ち式のシーリングアイロンを用いてプラスチックフィルムで密封し、２８℃及び周囲湿度で、明期１６時間／暗期８時間の光周期で、約１６０μ／ｍ２・ｓのＰＡＲの光強度で２８～４２日間培養した。再生工程の後、典型的には接種工程から約１０～１１週間後に、根が目に見え、キメラ化の兆候がない推定上のトランスジェニック植物を、土壌プラグ（直径２インチ×高さ３インチ（Ｇｒｏ－Ｔｅｃｈ，Ｒｏｕｇｈ ａｎｄ Ｒｅａｄｙ，ＣＡ ９５９７５）において移植し、さらに生育及び発達させた。
【0114】
実施例２
コムギの切除された外植片の形質転換
この実施例は、外植片の調製、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの接種及び共培養、出芽誘導、拡大出芽誘導、ならびにトランスジェニック植物の再生の工程を含む、乾燥成熟コムギ種子から切除された胚外植片のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換の方法について記載する。
コムギの切除された外植片の形質転換
この実施例は、外植片の調製、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの接種及び共培養、出芽誘導、拡大出芽誘導、ならびにトランスジェニック植物の再生の工程を含む、乾燥成熟コムギ種子から切除された胚外植片のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換の方法について記載する。
【0115】
外植片の調製
外植片を乾燥成熟コムギ種子から切除し、密封ポーチ内で－２０℃で保存した。外植片を冷凍庫から取り出し、外植片の調製前に少なくとも３０分間室温に平衡化させた。約１０，０００の外植片を、約５００ｍＬの７０％エタノールを含む滅菌１Ｌボトルに外植片を入れることによって表面殺菌した。ボトルを約５分間手で軽く転がしたり振ったりして撹拌した。表面殺菌し、７０％のエタノール溶液を除去した後、コムギ外植片を滅菌水ですすぎ、有意な残存する殺菌培地を除去した。
外植片を乾燥成熟コムギ種子から切除し、密封ポーチ内で－２０℃で保存した。外植片を冷凍庫から取り出し、外植片の調製前に少なくとも３０分間室温に平衡化させた。約１０，０００の外植片を、約５００ｍＬの７０％エタノールを含む滅菌１Ｌボトルに外植片を入れることによって表面殺菌した。ボトルを約５分間手で軽く転がしたり振ったりして撹拌した。表面殺菌し、７０％のエタノール溶液を除去した後、コムギ外植片を滅菌水ですすぎ、有意な残存する殺菌培地を除去した。
【0116】
コムギ外植片を浮遊濃縮して破片を除去した。簡単に説明すると、滅菌水中の外植片を、外側の容器と内側のふるい容器を含む滅菌したふるい／収集容器装置に注いだ。内側のふるい容器は外側の容器の内部に収まり、底部に溶融された２６×２６のステンレス鋼メッシュを有する。外植片を装置に移した後、滅菌水を加えた。コムギ外植片の浮遊を誘導するために、内側のふるい容器を水中から上げたり下げたりするのを繰り返した。浮遊外植片を真空コレクターを使用して収集した。この浮遊工程は、浮遊物質の約５０％が破片になるまで数回繰り返された。浮選工程の後、破片は廃棄された。次に、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを接種するために、滅菌スパチュラを使用して、収集したコムギ外植片を５０ｍＬの遠心チューブに加えた。チューブごとに約５，０００のコムギ外植片を加えた。
【0117】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの調製
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのグリセロールストックを－８０℃の冷凍庫から取り出し、層流フード内で周囲温度で解凍した。ボルテックスにより完全に混合した後、５００ｍＬの解凍したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのグリセロールストックを、１Ｌの滅菌フラスコ内の形質転換構築物に適切な抗生物質を含む液体ＬＢ培地２５０ｍＬに、１７０ｒｐｍのシェーカーで接種し、２７～２８℃の暗所で約１６～１８時間、またはＯＤ６６０が０．６～１．６の範囲内になるまで培養した。適切な抗生物質としては、例えば、５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンまたは３０ｍｇ／Ｌのゲンタマイシンが挙げられ得る。一晩のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ培養物を約３５００～３７００ｒｐｍ、２０℃で２０分間遠心分離した後、ペレットを、１／１０のＭＳ塩、ＭＳビタミン、０．５ｇ／Ｌのグルタミン、０．１ｇ／Ｌのカゼイン加水分解物、０．７５ｇ／Ｌの塩化マグネシウム、１．９５ｇ／ＬのＭＥＳ、４０ｇ／Ｌのマルトース及び１００ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸、ｐＨ５．８を含む２５ｍＬの接種培地に再懸濁した。再懸濁後、すべての遠心チューブからのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍをプールし、よく混合し、ＯＤ６６０測定のために１：２０希釈のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液を作成した。次いで、濃縮されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液を接種培地中で最終ＯＤ６６０が０．５になるまで希釈した。調製したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液は、形質転換に使用するまで４℃で最大８時間保存した。
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのグリセロールストックを－８０℃の冷凍庫から取り出し、層流フード内で周囲温度で解凍した。ボルテックスにより完全に混合した後、５００ｍＬの解凍したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのグリセロールストックを、１Ｌの滅菌フラスコ内の形質転換構築物に適切な抗生物質を含む液体ＬＢ培地２５０ｍＬに、１７０ｒｐｍのシェーカーで接種し、２７～２８℃の暗所で約１６～１８時間、またはＯＤ６６０が０．６～１．６の範囲内になるまで培養した。適切な抗生物質としては、例えば、５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンまたは３０ｍｇ／Ｌのゲンタマイシンが挙げられ得る。一晩のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ培養物を約３５００～３７００ｒｐｍ、２０℃で２０分間遠心分離した後、ペレットを、１／１０のＭＳ塩、ＭＳビタミン、０．５ｇ／Ｌのグルタミン、０．１ｇ／Ｌのカゼイン加水分解物、０．７５ｇ／Ｌの塩化マグネシウム、１．９５ｇ／ＬのＭＥＳ、４０ｇ／Ｌのマルトース及び１００ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸、ｐＨ５．８を含む２５ｍＬの接種培地に再懸濁した。再懸濁後、すべての遠心チューブからのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍをプールし、よく混合し、ＯＤ６６０測定のために１：２０希釈のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液を作成した。次いで、濃縮されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液を接種培地中で最終ＯＤ６６０が０．５になるまで希釈した。調製したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液は、形質転換に使用するまで４℃で最大８時間保存した。
【0118】
接種及び共培養
上記のように調製した約４０～５０ｍＬのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液を、調製したコムギ外植片を含む各５０ｍＬの遠心チューブに加えた。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ及び外植片を含むチューブを１４００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。遠心分離後、外植片及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを振とうして再懸濁し、外植片をチューブの底に沈降させた。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液をデカンテーションにより除去した。次に、接種したコムギ外植片を滅菌スパチュラまたはループを使用して１００ｍｍ×２５ｍｍのペトリ皿に移し、残存するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液を、滅菌トランスファーピペットを用いて除去した。あるいは、実施例１に記載されているように、滅菌ステンレス鋼のふるいを使用して外植片を収集し、余分なＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液を除去してもよい。
上記のように調製した約４０～５０ｍＬのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液を、調製したコムギ外植片を含む各５０ｍＬの遠心チューブに加えた。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ及び外植片を含むチューブを１４００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。遠心分離後、外植片及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを振とうして再懸濁し、外植片をチューブの底に沈降させた。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液をデカンテーションにより除去した。次に、接種したコムギ外植片を滅菌スパチュラまたはループを使用して１００ｍｍ×２５ｍｍのペトリ皿に移し、残存するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液を、滅菌トランスファーピペットを用いて除去した。あるいは、実施例１に記載されているように、滅菌ステンレス鋼のふるいを使用して外植片を収集し、余分なＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液を除去してもよい。
【0119】
次いで、接種した外植片を、１．２５ｍＬの接種培地で湿らせた滅菌Ａｈｌｓｔｒｏｍ濾紙を１枚含む共培養プレート（２５ｍｍ×１００ｍｍ）に移した。各共培養プレートには、単層でプレート全体に均一に広がった約５００～６００のコムギ外植片が含まれていた。共培養プレートを２３℃、相対湿度約７０％の暗所で約７０％で３～４日間インキュベートした。
【0120】
遅延
共培養工程の後、外植片を含む濾紙を、滅菌ピンセットを用いて共培養プレートから取り出し、窒素を含まない０．７８ｇ／ＬのＭＳ基礎塩、ＭＳビタミン、１．６４ｇ／Ｌの硫酸カリウム、４．９５ｇ／Ｌの硝酸アンモニウム、６０ｇ／Ｌのマルトース、０．５ｇ／Ｌのグルタミン、１ｇ／ＬのＮＺアミン－Ａ、０．７５ｇ／Ｌの塩化マグネシウム六水和物、１．９５ｇ／ＬのＭＥＳ、１．２５ｍｇ／Ｌの硫酸銅、３ｍｇ／Ｌのチジアズロン、２ｍｇ／Ｌのピクロラム、２００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、１００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム及び３．５ｇ／Ｌのアガロース低ＥＥＯ、ｐＨ５．８を含む固体遅延培地を含有するプレートに直接移した。次に、プレートを２５℃、相対湿度約３５％、明期１６時間／暗期８時間の光周期で１２～１６日間培養した。
共培養工程の後、外植片を含む濾紙を、滅菌ピンセットを用いて共培養プレートから取り出し、窒素を含まない０．７８ｇ／ＬのＭＳ基礎塩、ＭＳビタミン、１．６４ｇ／Ｌの硫酸カリウム、４．９５ｇ／Ｌの硝酸アンモニウム、６０ｇ／Ｌのマルトース、０．５ｇ／Ｌのグルタミン、１ｇ／ＬのＮＺアミン－Ａ、０．７５ｇ／Ｌの塩化マグネシウム六水和物、１．９５ｇ／ＬのＭＥＳ、１．２５ｍｇ／Ｌの硫酸銅、３ｍｇ／Ｌのチジアズロン、２ｍｇ／Ｌのピクロラム、２００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、１００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム及び３．５ｇ／Ｌのアガロース低ＥＥＯ、ｐＨ５．８を含む固体遅延培地を含有するプレートに直接移した。次に、プレートを２５℃、相対湿度約３５％、明期１６時間／暗期８時間の光周期で１２～１６日間培養した。
【0121】
選抜
遅延工程の後、液体培地を使用して選抜を実施した。簡単に説明すると、遅延培地上のコムギ外植片を、フェルト２枚、吸引を助けるために穴を開けた濾紙１枚、ならびに窒素を含ままない０．７８ｇ／ＬのＭＳ基礎塩、ＭＳビタミン、１．６４ｇ／Ｌの硫酸カリウム、４．９５ｇ／Ｌの硝酸アンモニウム、３０ｇ／Ｌのマルトース、０．５ｇ／Ｌのグルタミン、１ｇ／ＬのＮＺアミン－Ａ、０．７５ｇ／Ｌの塩化マグネシウム、１．９５ｇ／ＬのＭＥＳ、１．２５ｍｇ／Ｌの硫酸銅、３ｍｇ／Ｌのチジアズロン、２ｍｇ／Ｌのピクロラム、２００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、１００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム及び３０μＭのグリホサート、ｐＨ５．８を含む２５ｍＬの選抜培地を含有する選抜プレートに移した。約８０～１００のコムギ外植片を各選抜プレートに置いた。プレートを２５℃、相対湿度約３５％、明期１６時間／暗期８時間の光周期で１２～１６日間培養した。
遅延工程の後、液体培地を使用して選抜を実施した。簡単に説明すると、遅延培地上のコムギ外植片を、フェルト２枚、吸引を助けるために穴を開けた濾紙１枚、ならびに窒素を含ままない０．７８ｇ／ＬのＭＳ基礎塩、ＭＳビタミン、１．６４ｇ／Ｌの硫酸カリウム、４．９５ｇ／Ｌの硝酸アンモニウム、３０ｇ／Ｌのマルトース、０．５ｇ／Ｌのグルタミン、１ｇ／ＬのＮＺアミン－Ａ、０．７５ｇ／Ｌの塩化マグネシウム、１．９５ｇ／ＬのＭＥＳ、１．２５ｍｇ／Ｌの硫酸銅、３ｍｇ／Ｌのチジアズロン、２ｍｇ／Ｌのピクロラム、２００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、１００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム及び３０μＭのグリホサート、ｐＨ５．８を含む２５ｍＬの選抜培地を含有する選抜プレートに移した。約８０～１００のコムギ外植片を各選抜プレートに置いた。プレートを２５℃、相対湿度約３５％、明期１６時間／暗期８時間の光周期で１２～１６日間培養した。
【0122】
再生
選抜工程の後、選抜培地を吸引し、ＭＳ基礎塩、ＭＳビタミン、３０ｇ／Ｌのスクロース、０．６９ｇ／Ｌのプロリン、１ｇ／ＬのＭＥＳ、４００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、２００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、１００ｍｇ／Ｌのチメンチン、及び３０μＭのグリホサート、ｐＨ５．８を含む２０ｍＬの液体再生培地を加えた。プレートを２５℃、相対湿度約３５％、明期１６時間／暗期８時間の光周期で１２～１６日間培養した（再生工程１）。次いで、再生培地を吸引し、１５ｍＬの新鮮な再生培地と交換した。次いで、プレートを２５℃、相対湿度約３５％、明期１６時間／暗期８時間の光周期でさらに５～９日間インキュベートした（再生工程２）。
選抜工程の後、選抜培地を吸引し、ＭＳ基礎塩、ＭＳビタミン、３０ｇ／Ｌのスクロース、０．６９ｇ／Ｌのプロリン、１ｇ／ＬのＭＥＳ、４００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、２００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、１００ｍｇ／Ｌのチメンチン、及び３０μＭのグリホサート、ｐＨ５．８を含む２０ｍＬの液体再生培地を加えた。プレートを２５℃、相対湿度約３５％、明期１６時間／暗期８時間の光周期で１２～１６日間培養した（再生工程１）。次いで、再生培地を吸引し、１５ｍＬの新鮮な再生培地と交換した。次いで、プレートを２５℃、相対湿度約３５％、明期１６時間／暗期８時間の光周期でさらに５～９日間インキュベートした（再生工程２）。
【0123】
再生工程２の後、１０ｍＬの新鮮な再生培地を各プレートに加えた。次いで、再生されたシュートを移植する準備ができるまで、プレートを２５℃、相対湿度約３５％、明期１６時間／暗期８時間の光周期で培養した。
【0124】
典型的には、接種後約６０～７０日で、再生されたシュートを、ＭＳ基礎塩、ＭＳビタミン、１．９５ｇ／ＬのＭＥＳ、４０ｇ／Ｌのマルトース、０．５ｍｇ／Ｌの硫酸銅、１００ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸、１ｍｇ／ＬのＩＢＡ、３ｇ／ＬのＧｅｌｚａｎ ＣＭ、４００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、５００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム及び３０μＭのグリホサート、ｐＨ５．８を含む固形発根培地に移し、２５℃、明期１６時間／暗期８時間の光周期で２週間培養した。根が発達した推定上のトランスジェニックコムギ植物を、土壌プラグ（直径２インチ×高さ３インチ（Ｇｒｏ－Ｔｅｃｈ，Ｒｏｕｇｈ ａｎｄ Ｒｅａｄｙ，ＣＡ ９５９７５）において移植し、さらに生育及び発達させた。
【0125】
実施例３
出芽誘導中の高温によりトウモロコシ種子外植片の形質転換が向上する
この実施例は、複数の出芽誘導中の高温がトウモロコシ種子から切除された外植片の形質転換に及ぼす影響を評価するために設計された実験を提供する。
出芽誘導中の高温によりトウモロコシ種子外植片の形質転換が向上する
この実施例は、複数の出芽誘導中の高温がトウモロコシ種子から切除された外植片の形質転換に及ぼす影響を評価するために設計された実験を提供する。
【0126】
２８℃で２週間の出芽誘導と、３５℃で１週間の後２８℃で１週間の出芽誘導との比較
トウモロコシ種子から切除された外植片を出芽誘導培地と接触させ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの接種及び共培養後、２８℃で２週間培養する。
トウモロコシ種子から切除された外植片を出芽誘導培地と接触させ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの接種及び共培養後、２８℃で２週間培養する。
【0127】
最初の出芽誘導工程中の高温が形質転換に及ぼす影響を評価するために、選抜にグリホサートを使用して２つの温度処理：１）２８℃で２週間の出芽誘導と、２）３５℃の高温で１週間の出芽誘導の後、２８℃で１週間の出芽誘導を評価した。この実験におけるトウモロコシ外植片の形質転換のための進行及びその後の工程は、一般に実施例１に記載されているように実施した。
【0128】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの接種及び共培養後、トウモロコシ外植片を、２ｍｇ／ＬのＴＤＺ、１ｍｇ／Ｌの２，４－Ｄ、及び異なる濃度のグリホサートを補充したＭＳ塩及びＢ５ビタミンを含む出芽誘導培地に移し、上記の温度条件下で培養した。表２に示されるように、出芽誘導の第１週に外植片を３５℃で培養すると、外植片の発芽が阻害されるようであったが、第２週の２８℃での出芽誘導の後では、緑色の芽が形成された外植片の割合が増加した。さらに、出芽誘導の第１週に外植片を高温で培養すると、４週間の再生後に正常な緑色のシュートを作出する外植片の頻度が大幅に増加した。これにより、シュート頻度が増加し、キメラシュートの頻度が減少した（表２）。さらに、この結果は、選抜培地中のグリホサート濃度が１２．５μＭから５０μＭに増加するにつれて、正常シュートの割合（％）が一般的に増加することも示した。
表２．第１週の出芽誘導中の高温により、トランスジェニックシュートの再生が増加する。
表２．第１週の出芽誘導中の高温により、トランスジェニックシュートの再生が増加する。
【表2】
【0129】
シュートの総数は、正常シュートとキメラシュートの両方を含む、接種された外植片から再生されたシュートの総数として計算された。シュート頻度は、シュートを作出する接種された外植片の数を接種された外植片の総数で割ったものとして計算された。正常シュート数は、キメラ組織表現型を示さなかった、再生された正常シュートの総数として計算された。正常シュートの割合（％）は、正常シュート数をシュートの総数で割ったものとして計算された。正常シュート頻度は、正常シュート数を接種された外植片の総数で割ったものとして計算された。
【0130】
別の実験では、出芽誘導工程中のさまざまな温度条件：１）第１週の出芽誘導３５℃の後、第２週の出芽誘導２８℃と、２）２８℃で２週間の出芽誘導を比較するために評価した。この実験には、トウモロコシ外植片の２つの異なるバッチと、出芽誘導培地中の植物生育調節剤の異なる組み合わせが含まれた。以下の植物生育調節剤の組み合わせを評価した：１）２ｍｇ／ＬのＴＤＺ及び１ｍｇ／Ｌの２，４－Ｄと、２）１０ｍｇ／ＬのＢＡＰ及び１ｍｇ／Ｌの２，４－Ｄ。上記のように、出芽誘導培地には、２ｍｇ／ＬのＴＤＺ、１ｍｇ／Ｌの２，４－Ｄまたは１０ｍｇ／ＬのＢＡＰ及び１ｍｇ／Ｌの２，４－Ｄのいずれかを補充したＭＳ塩及びＢ５ビタミンと、選択剤として５μＭのグリホサートが含まれた。前述のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの接種及び共培養の後、外植片を上記の条件に従って培養した。共培養の後、外植片の２つのバッチ間で一過性発現に明らかな差はなかった。この実験の結果は、３５℃で第１週の出芽誘導を行うと、最初はトウモロコシ外植片の生育が遅くなり、２週間の出芽誘導全体にわたって２８℃で培養された外植片と比較して、トウモロコシ外植片がよりコンパクトで緑色になることが確認された。この結果は、出芽誘導培地中の外植片バッチまたは植物生育調節剤の組み合わせとは無関係であった。最初に３５℃で培養した外植片の生育は、その後の２８℃での出芽誘導中に回復した。これらの外植片は、外植片を再生及び選抜培地に移し、２、３または４週間生育させた後、２８℃で２週間培養したものと比較して、より大きな割合の緑色外植片を作出した。さらに、表３に示されるように、最初に３５℃で培養した外植片は、外植片バッチまたは出芽誘導培地中の植物生育調節剤の組み合わせに関係なく、シュート頻度と正常シュートの割合（％）の増加を示した。
表３．第１週の出芽誘導中の高温により、外植片バッチまたは植物生育調節剤の組み合わせに関係なくトランスジェニックシュートの再生が増加した。
表３．第１週の出芽誘導中の高温により、外植片バッチまたは植物生育調節剤の組み合わせに関係なくトランスジェニックシュートの再生が増加した。
【表3】
【0131】
シュートの総数は、正常シュートとキメラシュートの両方を含む、接種された外植片から再生されたシュートの総数として計算された。シュート頻度は、シュートを作出する接種された外植片の数を接種された外植片の総数で割ったものとして計算された。正常シュート数は、キメラ組織表現型を示さなかった、再生された正常シュートの総数として計算された。正常シュートの割合（％）は、正常シュート数をシュートの総数で割ったものとして計算された。正常シュート頻度は、正常シュート数を接種された外植片の総数で割ったものとして計算された。
【0132】
２８℃での出芽誘導と、３５℃での出芽誘導の後で拡大出芽誘導した場合の比較
トウモロコシ外植片の３つの異なるバッチを使用して３つの独立した実験を実施し、第１週は３５℃、その後第２週は２８℃で出芽誘導を評価し、上記の追加の拡大出芽誘導、選抜、及び再生工程の前に、２８℃で２週間の出芽誘導と比較した。各実験には、表４に提供された４つの温度条件が含まれていた。
表４．出芽誘導中に高温で外植片を培養すると、トランスジェニックシュートの再生が劇的に増加した。
トウモロコシ外植片の３つの異なるバッチを使用して３つの独立した実験を実施し、第１週は３５℃、その後第２週は２８℃で出芽誘導を評価し、上記の追加の拡大出芽誘導、選抜、及び再生工程の前に、２８℃で２週間の出芽誘導と比較した。各実験には、表４に提供された４つの温度条件が含まれていた。
表４．出芽誘導中に高温で外植片を培養すると、トランスジェニックシュートの再生が劇的に増加した。
【表4】
【0133】
表４に示されるように、外植片を３５℃で出芽誘導の第１週に培養した後、２８℃で出芽誘導の第２週に培養すると、３つの実験すべてにおいて、２８℃で２週間の出芽誘導と比較して、トランスジェニックシュートの再生が劇的に増加した。正常植物頻度（ＮＰＦ）は、正常植物の数を接種された外植片の総数で割ったものとして計算された。
【0134】
３５℃で４日間出芽誘導し、その後、出芽誘導の残り期間を２８℃で出芽誘導することは、２８℃で２週間の出芽誘導と比較して、トランスジェニックシュートの再生を増加させるのに十分であった
さまざまな期間の３５℃での出芽誘導が形質転換に及ぼす影響をさらに評価した。４つの独立した実験を、２８℃で２週間の出芽誘導（すなわち、３５℃では０日間）を対照として含めて実施した。処理条件には、３５℃で２、４または７日間、出芽誘導した後、残りの２週間を２８℃に移すことが含まれた（すなわち、２日＋１２日、４日＋１０日、または７日＋７日）。表５に示されるように、第１週の出芽誘導中に３５℃で４日間培養した外植片は、出芽誘導工程全体を通じて２８℃で培養した外植片と比較して、トランスジェニックシュートの再生が大幅に増加した。さらに、３５℃で４日間出芽誘導処理した場合の平均シュート再生頻度と平均正常シュート頻度は、３５℃で７日間出芽誘導処理した場合と同等であり、３５℃で４日間の高温での出芽誘導が形質転換向上に十分であることが示された。
表５．さまざまな期間の３５℃の出芽誘導がトランスジェニックシュートの再生頻度に及ぼす影響。
さまざまな期間の３５℃での出芽誘導が形質転換に及ぼす影響をさらに評価した。４つの独立した実験を、２８℃で２週間の出芽誘導（すなわち、３５℃では０日間）を対照として含めて実施した。処理条件には、３５℃で２、４または７日間、出芽誘導した後、残りの２週間を２８℃に移すことが含まれた（すなわち、２日＋１２日、４日＋１０日、または７日＋７日）。表５に示されるように、第１週の出芽誘導中に３５℃で４日間培養した外植片は、出芽誘導工程全体を通じて２８℃で培養した外植片と比較して、トランスジェニックシュートの再生が大幅に増加した。さらに、３５℃で４日間出芽誘導処理した場合の平均シュート再生頻度と平均正常シュート頻度は、３５℃で７日間出芽誘導処理した場合と同等であり、３５℃で４日間の高温での出芽誘導が形質転換向上に十分であることが示された。
表５．さまざまな期間の３５℃の出芽誘導がトランスジェニックシュートの再生頻度に及ぼす影響。
【表5】
【0135】
シュート頻度は、シュートを作出する外植片の数を、各処理の出芽誘導培地上の外植片の総数で割ったものとして計算し、各処理について４回の反復の平均をとった。正常シュート頻度は、正常シュートの数を、各処理の出芽誘導培地上の外植片の総数で割ったものとして計算し、各処理について４回の反復の平均をとった。
【0136】
実施例４
低レベルの塩を含む再生培地によりトウモロコシ種子外植片の形質転換が向上する
この実施例は、低レベルの塩を含む培地と接触させたトウモロコシの切除された外植片から再生したトランスジェニック植物の形質転換及び発根頻度の向上について説明する。
低レベルの塩を含む再生培地によりトウモロコシ種子外植片の形質転換が向上する
この実施例は、低レベルの塩を含む培地と接触させたトウモロコシの切除された外植片から再生したトランスジェニック植物の形質転換及び発根頻度の向上について説明する。
【0137】
トランスジェニック植物の作出中、再生培地と接触した発根したトランスジェニックシュートをペトリ皿から土壌に直接移し（このプロセスは直接的なプラギングとして知られる）、Ｐｈｙｔａｔｒａｙ（商標）またはＰｌａｎｔＣｏｎ（商標）容器で植物またはシュートを生育させる中間工程を排除することが望ましい。直接的なプラギングは必要なリソースが少なく、トランスジェニック植物の作出プロセスを加速し、トランスジェニック植物の品質が向上する。トウモロコシ外植片は、接種、共培養、出芽誘導、及び拡大出芽誘導工程の後に外植片をＭＳ再生培地と接触させることによって再生できる。しかしながら、ＭＳ再生培地を使用する場合、シュートの発根頻度は低く、変動することが多く、直接的なプラギングの効果的な実施が妨げられる。ＭＳベースの培地は塩分レベルが高いため、塩分レベルが低い他の再生培地が形質転換及び／または発根頻度を向上するかどうかを評価するために実験が設計された。評価した再生培地は、ＭＳ再生培地、Ｂ５再生培地、木本植物培地（ＷＰＭ）再生培地、及び低窒素ＭＳ再生培地であった。
【0138】
葉緑体を標的とするＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｒｏＡ遺伝子、ｕｉｄＡ遺伝子、及び隣接するＴ－ＤＮＡ境界を含む形質転換ベクターを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを、実施例１に記載のように調製した。ａｒｏＡ遺伝子は、グリホサートに対する耐性を付与する選別マーカーであり、ｕｉｄＡ遺伝子は、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの接種及び共培養の後、トウモロコシ外植片を出芽誘導培地上に置き、３５℃で１週間培養し、続いて２８℃でさらに１週間出芽誘導を行った。次に、外植片を拡大出芽誘導培地に移し、さらに２週間培養した後、ＭＳ、Ｂ５、ＷＰＭ、または低窒素ＭＳ再生培地のいずれかに置いた。ＭＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰＭ培地、及び低窒素ＭＳ培地の構成成分は当該技術分野で知られており、表１にまとめて提供されている。表６に示されるように、ＷＰＭ再生培地と接触して再生された外植片は、ＭＳ再生培地と接触して再生された外植片と比較して、正常植物頻度（ＮＰＦ）によって測定されるように形質転換が向上したことが実証された。
表６．ＷＰＭ再生培地は、トランスジェニックトウモロコシ植物の正常植物頻度を向上する。
表６．ＷＰＭ再生培地は、トランスジェニックトウモロコシ植物の正常植物頻度を向上する。
【表6】
【0139】
シュートの総数は、正常シュートとキメラシュートの両方を含む、接種された外植片から再生されたシュートの総数として計算された。シュート頻度は、シュートを作出する接種された外植片の数を接種された外植片の総数で割ったものとして計算された。正常シュート数は、キメラ組織表現型を示さなかった、再生された正常シュートの総数として計算された。正常シュート頻度は、正常シュート数を接種された外植片の総数で割ったものとして計算された。正常植物頻度（ＮＰＦ）は、正常植物の数を接種された外植片の総数で割ったものとして計算された。
【0140】
別の実験では、異なるバッチのトウモロコシの切除された外植片と、異なる形質転換ベクター構築物を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを使用して、ＭＳ再生培地と比較して、ＷＰＭ再生培地と接触して再生されたシュートの形質転換及び／または発根頻度を評価した。この実験で使用した形質転換ベクター構築物は、上記のａｒｏＡ発現カセット、目的の遺伝子をコードする別のカセット、及び隣接するＴ－ＤＮＡ境界から構成されていた。この発現カセットにはｕｉｄＡ遺伝子が含まれていなかった。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの接種及び共培養の後、トウモロコシ外植片を出芽誘導培地上に置き、３５℃で１週間培養し、続いて２８℃でさらに１週間出芽誘導した。次に、外植片を拡大出芽誘導培地に移し、２週間培養した後、ＭＳ再生培地またはＷＰＭ再生培地のいずれかに置いた。再生されたトランスジェニックシュートは、土壌に移植される前にＰｈｙｔａｔｒａｙ（商標）で生育するか、またはペトリ皿から土壌に直接移植された（ダイレクトトゥプラグ（ＤＴＰ））。表７に示されるように、ＷＰＭ再生培地は、ＮＰＦによって測定されるように形質転換が向上したことが実証された。表８に示されるように、Ｐｈｙｔａｔｒａｙｓ（商標）で生育し、ＷＰＭ再生培地と接触して再生されたトランスジェニックシュートは、Ｐｈｙｔａｔｒａｙｓ（商標）で生育し、ＭＳ再生培地と接触して再生されたものと比較して、発根頻度が２倍であった。ＷＰＭ再生培地と接触して再生されたトランスジェニックシュートはまた、１回目の引き抜き時の発根シュート（％）の増加によって示されるように、ＭＳ再生培地と接触して再生されたものと比較して、より早く発根植物を作出した。
表７．ＷＰＭ再生培地は、トランスジェニックトウモロコシ植物の正常植物頻度を向上する。
表７．ＷＰＭ再生培地は、トランスジェニックトウモロコシ植物の正常植物頻度を向上する。
【表7】
【0141】
シュート頻度は、シュートを作出する接種された外植片の数を接種された外植片の総数で割ったものとして計算された。正常シュート頻度は、正常シュート数を接種された外植片の総数で割ったものとして計算された。正常植物頻度（ＮＰＦ）は、正常植物の数を接種された外植片の総数で割ったものとして計算された。
表８．ＷＰＭ再生培地は、トランスジェニックトウモロコシ植物の発根頻度を向上する。
表８．ＷＰＭ再生培地は、トランスジェニックトウモロコシ植物の発根頻度を向上する。
【表8】
【0142】
１回目の引き抜き時の発根シュートは、根を有するシュートの数を１回目の引き抜き時のシュートの総数で割ったものとして計算された。２回目の引き抜き時の発根シュート（％）は、根を有するシュートの数を２回目の引き抜き時のシュートの総数で割ったものとして計算された。全体の発根シュートは、根を有するシュートの総数を１回目と２回目の引き抜きのシュートの総数で割ったものとして計算された。
【0143】
ＭＳ、Ｂ５、ＷＰＭ、及び低窒素ＭＳ再生培地中の多量要素を詳しく調べると、評価した他の再生培地と比較して、ＷＰＭ再生培地は低レベルの窒素及び他の塩を含むことが実証された（表９）。ＷＰＭ再生培地は、ＭＳ再生培地と比較して約１／５の総窒素、Ｂ５再生培地と比較して約１／２の総塩、低窒素ＭＳ再生培地と比較して約１／３の総塩を含む。さらに、ＷＰＭ再生培地は、ＭＳ再生培地及びＢ５再生培地と比較して約１／３のカリウム、低窒素ＭＳ再生培地と比較して約１／４のカリウムを含む。したがって、本明細書に提供される結果は、ＷＰＭ再生培地中に存在する塩レベルの低さが、それと接触して再生されたトランスジェニックトウモロコシ植物の観察される形質転換及び発根頻度の向上をもたらす可能性が高いことを実証する。
表９．ＭＳ、Ｂ５、ＷＰＭ、及び低窒素ＭＳ再生培地中の多量要素の濃度。
表９．ＭＳ、Ｂ５、ＷＰＭ、及び低窒素ＭＳ再生培地中の多量要素の濃度。
【表9】
【0144】
実施例５
トウモロコシ種子外植片の形質転換における再生培地中の異なる硝酸塩レベルの比較
この実施例では、再生培地中の異なるレベルの窒素がトウモロコシ外植片の形質転換及び再生に及ぼす影響をさらに調査した実験及び結果について説明する。
トウモロコシ種子外植片の形質転換における再生培地中の異なる硝酸塩レベルの比較
この実施例では、再生培地中の異なるレベルの窒素がトウモロコシ外植片の形質転換及び再生に及ぼす影響をさらに調査した実験及び結果について説明する。
【0145】
実施例４に示されるように、ＷＰＭ再生培地中のより低い塩レベルは、トウモロコシの形質転換及び発根頻度の向上に寄与すると思われる。ＷＰＭ塩ベース再生培地には、ＭＳ塩ベース再生培地と比較して総窒素が大幅に少ないため、改良ＭＳ塩ベース再生培地の異なるレベルの窒素成分が発根頻度及び再生に及ぼす影響を調べるために追加の実験を実施した。
表１０．塩ベース再生培地における窒素レベル。
表１０．塩ベース再生培地における窒素レベル。
【表10】
【0146】
異なる量の窒素含有構成成分を含む４つのＭＳ塩ベース再生培地を、対照としてＷＰＭとともに試験した。再生培地には、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ（１９６２）に記載されている多量栄養素と微量養素が含まれていたが、硝酸アンモニウム及び硝酸カリウムは、これらの構成成分の量を個別に添加できるようにするために塩混合物中に含まれなかった。硝酸アンモニウム及び硝酸カリウムを、ＭＳ塩混合物中の標準量に対して完全濃度（１×）、半分の濃度（１／２×）、及び四分の一濃度（１／４×）を表す表１０に示す量で、またはＷＰＭ塩と同じ量（ＷＰＭ様）で培地に添加した。残りの培地成分は標準ＭＳ塩混合物と同じであった。ＷＰＭも対照として使用された。
【0147】
最初の実験では、実施例１に記載のように、エリート生殖質から切除されたトウモロコシ外植片に２つの光学濃度（ＯＤ０．２５または１）でＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを接種した。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは、Ｔｉプラスミド上のＴ－ＤＮＡ境界に隣接する２つの発現カセットを保有していた。第１の発現カセットは、トランスジェニック事象の選別マーカーとして、構成的プロモーターの制御下にある葉緑体を標的としたＣＰ４ ＥＰＳＰＳ遺伝子を含んでいた。第２の発現カセットは、形質転換体を視覚的に識別するためのスクリーニングマーカーとして、異なる構成的プロモーターの制御下にあるｕｉｄＡ遺伝子を含んでいた。接種したトウモロコシ外植片を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ無添加（接種ＯＤ０．２５の処理）、またはＯＤが１．０の１．２５ｍＬのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを含む（接種ＯＤ１．０の処理）、１．２５ｍＬの再水和培地で湿らせた滅菌ワットマン＃１濾紙（８２ｍｍ）を１枚含む共培養プレート（２５ｍｍ×１００ｍｍ）に移した。共培養プレートを２０℃、相対湿度約６５％で、明期１６時間／暗期８時間の光周期で６日間インキュベートした。
【0148】
接種及び共培養後、接種された外植片は、実施例１に記載されるように出芽誘導及び拡大出芽誘導（ＥＢＩ）工程を経た。ＥＢＩ後、外植片をペトリ皿あたり約３０の外植片で異なる再生培地に移した。プレートを２８℃、明期１６時間／暗期８時間の光周期で、１６０ＰＡＲの光強度目標でインキュベートした。２～３週間後、応答した外植片を同じ培地を含むＰｌａｎｔＣｏｎｓ（商標）に移し、さらに２～３週間インキュベートした後、データを取得した。
【0149】
この実験の結果を表１１に要約する。発根頻度（％）は、発根シュート数をシュートを作出する外植片の数で割った値×１００として定義される。形質転換（ＴＦＮ）頻度（％）は、発根シュート数を接種した外植片数で割った値×１００として定義され、形質転換と再生頻度の尺度となる。平均発根頻度は、０．２５と１．０での接種ＯＤの処理を含む、特定の窒素レベルの平均である。同様に、平均形質転換頻度は各培地の平均である。表１１に示されるように、ＭＳ塩ベース再生培地では、窒素レベルが１×から１／４×に減少するにつれて、平均発根頻度が増加した。ＷＰＭ様再生培地には、類似しているが低レベルの窒素が含まれており、類似しているか、またはわずかに高い平均発根頻度が生じた。低レベルの窒素を含む培地でも、平均形質転換頻度が向上した。
表１１．再生培地中の硝酸塩レベルが再生及び形質転換に及ぼす影響。
表１１．再生培地中の硝酸塩レベルが再生及び形質転換に及ぼす影響。
【表11】
【0150】
２つの追加の実験（実験２及び３）は、（１）トウモロコシ外植片が異なるエリートトウモロコシ生殖質からのものであることと、（２）０．２５の接種ＯＤのみを使用したことと、（３）実験の１つがＣＰ４ ＥＰＳＰＳ発現カセットのみを含む異なる構築物を保有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを使用したことと、（４）拡大出芽誘導培地からの応答する緑化外植片のサブセットのみを無作為に選抜し、ペトリ皿中の再生培地に移し、続いてＰｌａｎｔＣｏｎｓ（商標）に移したことを除いて、上記の第１の実験と同じプロトコルに従って実施した。
【0151】
これらの２つの実験の結果を表１２に示す。前の段落で説明したように、再生プレートに移された応答する外植片数は、拡大出芽誘導後にすべての外植片にわたってランダムに採取され、さらなる試験のために再生培地に移された応答する緑化外植片のサブセットのみを表している。調整された再生頻度（％）は、発根シュートの数を、再生プレートに移された応答する外植片の数で割った値×１００として表される。これらの特定の実験の結果は発根頻度に明らかな変化を示さなかったが、１／４×窒素処理による調整された再生頻度は両方の実験で一貫してより高いようであった。
表１２．再生培地中の窒素レベルが再生及び形質転換に及ぼす影響。
表１２．再生培地中の窒素レベルが再生及び形質転換に及ぼす影響。
【表12】
【0152】
実施例６
力による形質転換によりトウモロコシ外植片の形質転換が向上する
この実施例は、力による形質転換が、乾燥種子から切除されたトウモロコシ胚外植片の形質転換を向上することを実証する。この実施例では、力による形質転換は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの接種前または接種中に、外植片を高圧、遠心分離、または高圧及び遠心分離に供することを含み得る。
力による形質転換によりトウモロコシ外植片の形質転換が向上する
この実施例は、力による形質転換が、乾燥種子から切除されたトウモロコシ胚外植片の形質転換を向上することを実証する。この実施例では、力による形質転換は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの接種前または接種中に、外植片を高圧、遠心分離、または高圧及び遠心分離に供することを含み得る。
【0153】
実験は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの接種前または接種中に遠心分離に供した乾燥種子からの成熟トウモロコシ胚外植片の形質転換を評価するように設計された。外植片を９５％エタノール及び２００ｐｐｍの活性塩素で表面殺菌し、３回すすぎ、２／５濃度のＢ５マクロ塩、１／１０濃度のＢ５ミクロ塩及びビタミン、１ｇ／Ｌの硝酸カリウム、３０ｇ／Ｌのデキストロース、３．９ｇ／Ｌの２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）及び２０％のＰＥＧ４０００、ｐＨ５．４を含む２０％のＰＥＧ４０００ ＩＮＯ培地で３時間再水和し、すすぎ、接種前に浮遊濃縮した。その後、乾燥胚外植片を以下の処理のいずれかに供した：１）４５ｋＨｚで１分間の超音波処理後、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、室温で３０分間のインキュベーション；２）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種前に２９１×ｇで３０分間の遠心分離後、４５ｋＨｚで１分間の超音波処理と、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、室温で３０分間のインキュベート；３）４５ｋＨｚで１分間の超音波処理後、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、２９１×ｇで３０分間、室温での遠心分離；４）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、室温で３０分間のインキュベーション；５）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種前に２９１×ｇで３０分間の遠心分離後、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、室温で３０分間のインキュベーション；または６）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、室温で３０分間、２９１×ｇでの遠心分離。この実験で接種に使用したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは、３つの発現カセットを含む植物形質転換ベクターを含み、１つ目はβ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードするもの、２つ目はＧＦＰをコードするもの、３つ目はａａｄＡをコードするものであった。ｕｉｄＡ（ＧＵＳ）遺伝子は、イネアクチン１プロモーター、ＣａＭＶ由来の重複された３５Ｓ Ａ１－Ｂ３ドメインのエンハンサー、コムギ主要クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質の５’非翻訳リーダー、イネアクチン１遺伝子由来のイントロン、及びｍＲＮＡのポリアデニル化を指示するように機能するジャガイモプロテイナーゼ阻害剤ＩＩ遺伝子の３’ＵＴＲの制御下にあった。ｇｆｐ遺伝子は、ＣａＭＶ由来の増強された３５Ｓ ＲＮＡプロモーター、コムギ主要クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質の５’非翻訳リーダー、イネアクチン１遺伝子由来のイントロン、及びコムギ低分子量熱ショックタンパク質遺伝子の３’ＵＴＲの制御下にあった。ａａｄＡ遺伝子は、増強された３５Ｓ ＲＮＡプロモーター、イネアクチン１由来の第１のイントロンと融合したコムギ主要クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質の５’非翻訳リーダー、及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドのノパリンシンターゼ遺伝子の３’ＵＴＲの制御下にあった。遠心分離は、Ｓｏｒｖａｌｌ（商標）ＲＣ３ＢＰ遠心分離機及びＨ６０００Ａローター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して実施された。
【0154】
接種後、外植片を、２／５濃度、１／１０濃度のＢ５ミクロ塩及びビタミン、１ｇ／Ｌの硝酸カリウム、３０ｇ／Ｌのデキストロース、３．９ｇ／Ｌの２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ｐＨ５．４と、５０ｐｐｍのナイスタチン、１０ｐｐｍのチアベンダゾール（ＴＢＺ）、及び５０ｐｐｍのペンタクロロニトロベンゼン（ＰＣＮＢ）を含む１．２５ｍｌのＩＮＯ培地中で、２３℃、相対湿度７０％、明期１６時間／暗期８時間の光周期で５日間共培養した。次に、外植片を採取し、定量的ＭＵＧアッセイを使用してＧＵＳ活性について分析した。表１３に示されるように、接種前または接種中のいずれかに遠心分離した外植片は、全体的な一過性ＧＵＳ発現の有意な増加を示した。この実験では、超音波処理は一過性ＧＵＳ発現に統計的に有意な影響を与えなかった。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの接種前に遠心分離した外植片とＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの接種中に遠心分離した外植片との間に観察された一過性ＧＵＳ発現にも統計的に有意な差はなかった。これらの実験では、ＧＵＳ発現測定値が負の場合は、ＧＵＳ染色がないものと解釈される。
表１３．接種前または接種中に遠心分離された外植片における一過性発現の向上。
表１３．接種前または接種中に遠心分離された外植片における一過性発現の向上。
【表13】
【0155】
さらに、各処理群からの５つの外植片を二分し、ＧＦＰ及びＧＵＳ発現について画像化した。図１に示されるように、一過性発現は、接種前または接種中に遠心分離された外植片の子葉鞘及び葉基でより高かった。図１は、ａ）４５ｋＨｚで１分間の超音波処理後、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、室温で３０分間のインキュベーション；ｂ）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種前に２９１×ｇで３０分間の遠心分離後、４５ｋＨｚで１分間の超音波処理と、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、室温で３０分間のインキュベート；ｃ）４５ｋＨｚで１分間の超音波処理後、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、２９１×ｇで３０分間、室温での遠心分離；ｄ）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、室温で３０分間のインキュベーション；ｅ）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種前に２９１×ｇで３０分間の遠心分離後、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、室温で３０分間のインキュベーション；またはｆ）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、室温で３０分間、２９１×ｇでの遠心分離に供した外植片の明視野画像、蛍光画像、及びＸ－ｇａｌ染色を示す。
【0156】
実験は、４℃または２３℃でのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの接種中に遠心分離に供した乾燥種子から切除された成熟トウモロコシ胚外植片の形質転換を評価するように設計された。外植片を９５％エタノール及び２００ｐｐｍの活性塩素で表面殺菌し、３回すすぎ、２／５濃度のＢ５マクロ塩、１／１０濃度のＢ５ミクロ塩及びビタミン、１ｇ／Ｌの硝酸カリウム、３０ｇ／Ｌのデキストロース、３．９ｇ／Ｌの２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）及び２０％のＰＥＧ４０００、ｐＨ５．４を含むＩＮＯ培地中、２０％のＰＥＧ４０００で３時間再水和し、すすぎ、接種前に浮遊濃縮した。その後、乾燥胚外植片を以下の処理のいずれかに供した：１）４５ｋＨｚで１分間の超音波処理後、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、２３℃で３０分間のインキュベーション；２）４５ｋＨｚで１分間の超音波処理後、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、４℃で３０分間のインキュベーション；３）４５ｋＨｚで１分間の超音波処理後、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、２３℃で３０分間、２９１×ｇでの遠心分離；４）４５ｋＨｚで１分間の超音波処理後、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、４℃で３０分間、２９１×ｇでの遠心分離；５）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、２３℃で３０分間のインキュベーション；６）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、４℃で３０分間のインキュベーション；７）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、２３℃で３０分間、２９１×ｇでの遠心分離；または８）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、４℃で３０分間、２９１×ｇでの遠心分離。この実験で接種に使用したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは、３つの発現カセットを含む植物形質転換ベクターを含み、１つ目はβ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードするもの、２つ目はＧＦＰをコードするもの、３つ目はａａｄＡをコードするものであった。ｕｉｄＡ（ＧＵＳ）遺伝子は、イネアクチン１プロモーター、ＣａＭＶ由来の重複された３５Ｓ Ａ１－Ｂ３ドメインのエンハンサー、コムギ主要クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質の５’非翻訳リーダー、イネアクチン１遺伝子由来のイントロン、及びｍＲＮＡのポリアデニル化を指示するように機能するジャガイモプロテイナーゼ阻害剤ＩＩ遺伝子の３’ＵＴＲの制御下にあった。ｇｆｐ遺伝子は、ＣａＭＶ由来の増強された３５Ｓ ＲＮＡプロモーター、コムギ主要クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質の５’非翻訳リーダー、イネアクチン１遺伝子由来のイントロン、及びコムギ低分子量熱ショックタンパク質遺伝子の３’ＵＴＲの制御下にあった。ａａｄＡ遺伝子は、増強された３５Ｓ ＲＮＡプロモーター、イネアクチン１由来の第１のイントロンと融合したコムギ主要クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質の５’非翻訳リーダー、及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドのノパリンシンターゼ遺伝子の３’ＵＴＲの制御下にあった。遠心分離は、Ｓｏｒｖａｌｌ（商標）ＲＣ３ＢＰ遠心分離機及びＨ６０００Ａローター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して実施された。
【0157】
接種後、外植片を、２／５濃度、１／１０濃度のＢ５ミクロ塩及びビタミン、１ｇ／Ｌの硝酸カリウム、３０ｇ／Ｌのデキストロース、３．９ｇ／Ｌの２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ｐＨ５．４と、５０ｐｐｍのナイスタチン、１０ｐｐｍのチアベンダゾール（ＴＢＺ）、及び５０ｐｐｍのペンタクロロニトロベンゼン（ＰＣＮＢ）を含む１．２５ｍｌのＩＮＯ培地中で、２３℃、相対湿度７０％、明期１６時間／暗期８時間の光周期で６日間共培養した。次に、外植片を、定量的ＭＵＧアッセイを使用してＧＵＳ活性について分析した。表１４に示されるように、接種中に遠心分離した外植片は、接種が行われた温度に関係なく、全体的な一過性ＧＵＳ発現の有意な増加を示した。この実験では、インキュベーション温度も超音波処理も一過性ＧＵＳ発現に統計的に有意な影響を与えなかった。上記の表３０と同様、負のＧＵＳ発現測定値は、ＧＵＳ染色がないものと解釈される。
表１４．さまざまな温度での接種中に遠心分離された外植片における一過性発現の向上。
表１４．さまざまな温度での接種中に遠心分離された外植片における一過性発現の向上。
【表14】
【0158】
さらに、各処理群からの５つの外植片を二分し、ＧＦＰ及びＧＵＳ発現について画像化した。図２に示されるように、一過性発現は、接種中に遠心分離された外植片の葉基でより高かった。図２は、ａ）４５ｋＨｚで１分間の超音波処理後、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、２３℃で３０分間のインキュベーション；ｂ）４５ｋＨｚで１分間の超音波処理後、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、４℃で３０分間のインキュベーション；ｃ）４５ｋＨｚで１分間の超音波処理後、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、２３℃で３０分間、２９１×ｇでの遠心分離；ｄ）４５ｋＨｚで１分間の超音波処理後、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、４℃で３０分間、２９１×ｇでの遠心分離；ｅ）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、２３℃で３０分間のインキュベーション；ｆ）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、４℃で３０分間のインキュベーション；ｇ）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、２３℃で３０分間、２９１×ｇでの遠心分離；またはｈ）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、４℃で３０分間、２９１×ｇでの遠心分離に供した外植片の明視野画像、蛍光画像、及びＸ－ｇａｌ染色を示す。
【0159】
実験は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの接種前に遠心分離または高圧に曝露された乾燥種子から切除された成熟トウモロコシ胚外植片の形質転換を評価するように設計された。外植片を７０％エタノールに５分間及び１０％のＣｌｏｒｏｘ（登録商標）で順次殺菌し、３回すすぎ、２／５濃度のＢ５マクロ塩、１／１０濃度のＢ５ミクロ塩及びビタミン、１ｇ／Ｌの硝酸カリウム、３０ｇ／Ｌのデキストロース、３．９ｇ／Ｌの２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ｐＨ５．４、ならびに３０ｐｐｍのＣｌｅａｒｙｓ（登録商標）殺菌剤を含む接種培地で１時間再水和した後、高圧または遠心分離に曝露した。高圧または遠心分離に曝露した後、乾燥胚外植片に、２つの発現カセットを含む植物形質転換ベクターを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを接種した。一方のカセットはｕｉｄＡ遺伝子を含み、イネアクチン１プロモーター、ＣａＭＶ由来の重複された３５Ｓ Ａ１－Ｂ３ドメインのエンハンサー、コムギ主要クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質の５’非翻訳リーダー、イネアクチン１遺伝子由来のイントロン、及びｍＲＮＡのポリアデニル化を指示するように機能するジャガイモプロテイナーゼ阻害剤ＩＩ遺伝子の３’ＵＴＲの制御下にあるβ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする。もう一方のカセットは、ａｒｏＡ遺伝子を含み、これは、クラス ＩＩ ＥＰＳＰＳ酵素（５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸シンターゼ）をコードし、イネアクチン１プロモーター、リーダー及びイントロン、ならびにｍＲＮＡのポリアデニル化を指示するように機能するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｔｉプラスミドのノパリンシンターゼ遺伝子の３’ＵＴＲの制御下で、室温で１時間、曝露後のさまざまな時点で、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＥＰＳＰＳのトランジットペプチドによって葉緑体に標的化される。遠心分離は、上記のように、約５０ｍＬの接種培地を含む５０ｍＬのポリプロピレン遠心分離チューブ（Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）Ｂｌｕｅｍａｘ（商標），Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ４－２０９８－１１）に外植片を入れ、Ｓｏｒｖａｌｌ（商標）ＲＣ３ＢＰ遠心分離機及びＨ６０００Ａローター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して遠心分離することによって実施した。上記の接種培地２０ｍＬ中の乾燥胚外植片をフレンチプレス４０Ｋ圧力セル（Ｔｈｅｒｍｏ（登録商標）ＩＥＣ、ＦＡ－０３２）にロードし、圧力セル内の３３３４ｐｓｉ（２２７ａｔｍ）の圧力に相当する２００ｐｓｉｇに高比率で５分間外植片を曝露することによって高圧を適用した。
【0160】
接種後、外植片を共培養、出芽誘導、拡大出芽誘導、及び再生に供した。簡単に説明すると、外植片を、２３℃で明期１６時間／暗期８時間の光周期で、３０ｐｐｍのＣｌｅａｒｙｓ（登録商標）及び５ｐｐｍの２，４－Ｄを含む上記の１．２５ｍｌの接種培地を含むＰｌａｎｔＣｏｎ（商標）（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ＬＬＣカタログ＃２６－７２０－０２）生育チャンバー中で、濾紙上にプレーティングすることにより、５日間、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍと共培養した。共培養外植片を、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、３０ｇ／Ｌのスクロース、０．６９ｇ／Ｌのプロリン、１ｇ／ＬのＮＺアミン－Ａ（カゼイン酵素加水分解物；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、２ｍｇ／Ｌのグリシン、１ｇ／ＬのＭＥＳ、１ｍｇ／Ｌの２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）、１０ｍｇ／Ｌの６－ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、４００ｍｇ／ＬＬのカルベニシリン、２００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、１００ｍｇ／Ｌのチメンチン、及び３．５ｇ／Ｌの低ＥＥＯアガロース、ｐＨ５．８を含む固体出芽誘導培地に移し、２８℃で明期１６時間／暗期８時間の光周期で２週間インキュベートした。次に、外植片を濾紙サンドイッチに移し、２８℃で明期１６時間／暗期８時間の光周期で液体選抜を行った。液体選抜中、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、３０ｇ／Ｌのスクロース、０．６９ｇ／Ｌのプロリン、２ｍｇ／Ｌのグリシン、１ｇ／ＬのＭＥＳ、４００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、２００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、１００ｍｇ／Ｌのチメンチン、及び２０μＭのグリホサート、ｐＨ５．８を含む１０ｍＬの選抜培地を最初に各プレートに添加し、さらに５ｍｌを毎週添加した。シュートを、接種の８～１０週間後に、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、３０ｇ／Ｌのスクロース、０．６９ｇ／Ｌのプロリン、２ｍｇ／Ｌのグリシン、１ｇ／ＬのＭＥＳ、１ｍｇ／Ｌの２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）、１０ｍｇ／Ｌの６－ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、４００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、２００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、１００ｍｇ／Ｌのチメンチン、２０μＭのグリホサート、及び３．５ｇ／Ｌの低ＥＥＯアガロース、ｐＨ５．８を含む出芽誘導及び選抜培地に移した。発根したＲ０事象は、表現型解析とコピー数解析のために温室に送られた。
【0161】
表１５に示されるように、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの接種前に高圧または遠心分離に曝露すると、トウモロコシ乾燥胚外植片の形質転換頻度が有意に増加した。さらに、高圧または遠心分離への曝露と接種の間の経過時間が増加するにつれて、形質転換頻度は低下した。形質転換頻度は、Ｒ０植物の数を出芽誘導培地に移した外植片の総数で割ったものとして計算された。
表１５．形質転換前に遠心分離または高圧に曝露されたトウモロコシ外植片の形質転換頻度の向上。
表１５．形質転換前に遠心分離または高圧に曝露されたトウモロコシ外植片の形質転換頻度の向上。
【表15】
【0162】
実験は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの接種前または接種中に高圧に曝露された成熟トウモロコシ胚外植片の形質転換を評価するように設計された。この実験では、トウモロコシの乾燥胚外植片は表面殺菌されなかった。１）２／５濃度のＢ５マクロ塩、１／１０のＢ５ミクロ塩及びビタミン、１ｇ／Ｌの硝酸カリウム、３０ｇ／Ｌのデキストロース及び３．９ｇ／ＬのＭＥＳを含む接種培地２０ｍＬ；または２）接種培地中のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物２０ｍｌのいずれかにおける乾燥胚外植片を、フレンチプレス４０Ｋ圧力セル（Ｔｈｅｒｍｏ（登録商標）ＩＥＣ、ＦＡ－０３２）にロードし、外植片を１４．７ｐｓｉ～３０，０００ｐｓｉの範囲の圧力に曝露することによって高圧を適用した。次いで、乾燥胚外植片に、２つの発現カセットを含む植物形質転換ベクターを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを３０分間接種した。一方のカセットはｕｉｄＡ遺伝子を含み、イネアクチン１プロモーター、ＣａＭＶ由来の重複された３５ＳＡ１－Ｂ３ドメインのエンハンサー、コムギ主要クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質の５’非翻訳リーダー、イネアクチン１遺伝子由来のイントロン、及びｍＲＮＡのポリアデニル化を指示するように機能するジャガイモプロテイナーゼ阻害剤ＩＩ遺伝子の３’ＵＴＲの制御下にあるβ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする。もう一方のカセットは、ａｒｏＡ遺伝子を含み、これは、クラス ＩＩ ＥＰＳＰＳ酵素（５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸シンターゼ）をコードし、イネアクチン１プロモーター、リーダー及びイントロン、ならびにｍＲＮＡのポリアデニル化を指示するように機能するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｔｉプラスミドのノパリンシンターゼ遺伝子の３’ＵＴＲの制御下で、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＥＰＳＰＳのトランジットペプチドによって葉緑体に標的化される。
【0163】
接種後、外植片を共培養、出芽誘導、拡大出芽誘導、及び再生に供した。簡単に説明すると、外植片を、２３℃で明期１６時間／暗期８時間の光周期で、３０ｐｐｍのＣｌｅａｒｙｓ（登録商標）及び５ｐｐｍの２，４－Ｄを含む上記の１．２５ｍｌの接種培地を含むＰｌａｎｔＣｏｎ（商標）（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ＬＬＣカタログ＃２６－７２０－０２）生育チャンバー中で、濾紙上にプレーティングすることにより、５日間、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍと共培養した。共培養外植片を、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、３０ｇ／Ｌのスクロース、０．６９ｇ／Ｌのプロリン、１ｇ／ＬのＮＺアミン－Ａ（カゼイン酵素加水分解物；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、２ｍｇ／Ｌのグリシン、１ｇ／ＬのＭＥＳ、１ｍｇ／Ｌの２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）、１０ｍｇ／Ｌの６－ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、４００ｍｇ／ＬＬのカルベニシリン、２００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、１００ｍｇ／Ｌのチメンチン、及び３．５ｇ／Ｌの低ＥＥＯアガロース、ｐＨ５．８を含む固体出芽誘導培地に移し、２８℃で明期１６時間／暗期８時間の光周期で２週間インキュベートした。次に、外植片を濾紙サンドイッチに移し、２８℃で明期１６時間／暗期８時間の光周期で液体選抜を行った。液体選抜中、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、３０ｇ／Ｌのスクロース、０．６９ｇ／Ｌのプロリン、２ｍｇ／Ｌのグリシン、１ｇ／ＬのＭＥＳ、４００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、２００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、１００ｍｇ／Ｌのチメンチン、及び２０μＭのグリホサート、ｐＨ５．８を含む１０ｍＬの選抜培地を最初に各プレートに添加し、さらに５ｍｌを毎週添加した。シュートを、接種の８～１０週間後に、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、３０ｇ／Ｌのスクロース、０．６９ｇ／Ｌのプロリン、２ｍｇ／Ｌのグリシン、１ｇ／ＬのＭＥＳ、１ｍｇ／Ｌの２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）、１０ｍｇ／Ｌの６－ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、４００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、２００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、１００ｍｇ／Ｌのチメンチン、２０μＭのグリホサート、及び３．５ｇ／Ｌの低ＥＥＯアガロース、ｐＨ５．８を含む出芽誘導及び選抜培地に移した。発根したＲ０事象は、表現型解析とコピー数解析のために温室に送られた。表１６に示されるように、形質転換頻度は、１６６７ｐｓｉ、３３３４ｐｓｉ、１０，０００ｐｓｉ、及び２０，０００ｐｓｉの圧力に曝露された外植片において有意に増加した。この実験では、３０，０００ｐｓｉへの曝露は致死的であるように思われた。形質転換頻度は、Ｒ０植物の数を出芽誘導培地に移した外植片の総数で割ったものとして計算された。
表１６．接種前または接種中に高圧に曝露された外植片における一過性発現の向上。
表１６．接種前または接種中に高圧に曝露された外植片における一過性発現の向上。
【表16】
【0164】
実験は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種中に遠心分離、高圧、または遠心分離と高圧の組み合わせに供した乾燥種子からの成熟トウモロコシ胚外植片の形質転換頻度を評価するように設計された。外植片の２つのバッチを実施例１に記載のように調製した。各外植片バッチを以下の処理のいずれかに供した：（１）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、２，６２０×ｇで３０分間の遠心分離；（２）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、３分間、３００ｐｓｉの高圧；（３）接種前に３分間、３００ｐｓｉの高圧後、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、２，６２０×ｇで３０分間の遠心分離；または（４）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、３分間、３００ｐｓｉの高圧後、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、２，６２０×ｇで３０分間の遠心分離。第３の処理（接種前の高圧に続いてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下での遠心分離）により、第４の処理群の工程の組み合わせにおける高圧要素の寄与を評価することができた。２つの外植片バッチのそれぞれを４つの処理群の１つに分割した。各処理について３回の反復を、１回の反復ごとに１，１４０の外植片を用いて完了した。Ｍｏｄｅｌ ６００－ＥＸＰ圧力チャンバー（ＰＭＳ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｌｂａｎｙ，ＯＲ，ＵＳＡ）を、外部ポートを介してより大きな外部圧力チャンバーに接続して用いて，高圧を適用した。窒素ガスを使用してチャンバーを加圧した。Ｓｏｒｖａｌｌ（商標）ＲＣ３ＢＰ遠心分離機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して遠心分離を適用した。
【0165】
トウモロコシ乾燥胚外植片を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びエタノールの溶液で４分間殺菌し、次いで４０ｍｌの再水和培地で２時間再水和した。次に、上記のように遠心分離、高圧、または遠心分離と高圧の組み合わせに曝露しながら、外植片にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを接種した。接種に使用したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは、２つの発現カセット（１つ目はβ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードし、２つ目はＥＰＳＰＳ－ＣＰ４をコードする）を有するバイナリー植物形質転換ベクターを含んだ。最初の再水和とその後の高圧及び遠心分離処理は、通気キャップ付きの５０ｍＬ Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ミニバイオリアクターチューブ（カタログ番号ＣＬＳ４３１７２０，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を使用して実施した。
【0166】
接種後、外植片を、本明細書に記載の共培養、出芽誘導、拡大出芽誘導、及び再生に供した。簡単に説明すると、外植片をＰｅｒｃｉｖａｌ（登録商標）生育チャンバー中で２０℃、相対湿度７０％、明期１６時間／暗期８時間の光周期で５日間共培養した。各共培養トレイには最大約５７０の外植片が収容できるため、処理の反復ごとに２つのトレイ（または最大約１，１４０の外植片）を使用した。各トレイからの共培養外植片を、出芽誘導培地を含む５つのトレイに移し、３３℃、相対湿度７０％、明期１６時間／暗期８時間の光周期で１週間インキュベートした。次いで、各出芽誘導トレイからの外植片を、選抜のために２５μＭのグリホサートを含む拡大出芽誘導培地の２つのトレイに移し、３３℃、相対湿度７０％、明期１６時間／暗期８時間の光周期で１週間インキュベートした。外植片を、２０μＭのグリホサート選別したＶｉｖｉ（登録商標）トレイ（ＶＩＶＩ Ｇｒｅｅｎ Ｉｎｎｏｖａｔｏｒｓ，ｓ－Ｇｒａｖｅｎｄｅｅｌ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）中の再生培地に移し、４～６週間インキュベートしてトランスジェニック植物を発達させた。再生後、表現型が正常な植物をプラギング培地（Ｐｒｏｄｕｃｔ＃７２－Ｒ，Ｇｒｏ－Ｔｅｃｈ．ｃｏｍ Ｆａｌｍｏｕｔｈ，ＭＥ，ＵＳＡ）にプラギングし、トレイ（Ｉｔｅｍ＃ＰＬ－Ｏ３６－ＳＴＡＲ－ＨＷ－ＶＨ－ＢＫ－５０，Ｃｌｅａｒｗａｔｅｒ，ＭＮ，ＵＳＡ）中でインキュベートした。分子アッセイ用の葉組織試料をプラギングされた各植物から取得した。次に、プラギングされた植物を生育チャンバーに移して硬化させた。
【0167】
分子データに基づいて、形質転換植物を温室に移して観察した。ＧＵＳ発現は、共培養後の一過性発現を検出し、出芽誘導中及びＲ０シュート発達中などの他の時点での安定した発現を検出するための可視マーカーとして使用された。Ｒ０葉組織のＧＵＳ発現アッセイ及びプラギング時の植物の視覚的観察もまた、キメラ植物を同定するために使用された。キメラ植物は通常、プラギング中に緑と白の部分を持つ縞模様の葉の表現型を示した。リアルタイムＰＣＲを使用してＲ０葉組織に対して分子アッセイを実施し、ＣＰ４ ＥＰＳＰＳ及びｕｉｄＡ遺伝子の存在及びコピー数を決定した。これらのアッセイに基づいて、各処理の非キメラ形質転換植物（別名、正常トランスジェニック植物または正常植物）の割合は、非キメラ、及びＣＰ４ ＥＰＳＰＳとｕｉｄＡの両方が陽性であるトランスジェニック植物の数を、プラギング後に採取した植物の総数で割ることによって決定される。表１７は、プラギング頻度、低コピー数植物の頻度（すなわち、低コピー数のＥＰＳＰＳ ＣＰ４遺伝子とｕｉｄＡ遺伝子の両方について陽性であった非キメラ植物の割合）、及び低コピー数の導入遺伝子を有する形質転換体の頻度を示す。プラギング頻度は、プラギングされたトランスジェニックＲ０植物の数を接種された外植片の総数で割ったものとして計算された。低コピー数植物の頻度は、低コピー数の導入遺伝子陽性（すなわち、各導入遺伝子のコピーが１つまたは２つしかない植物）及び非キメラ植物の数を、プラギングされたＲ０植物の総数で割ったものとして計算された。低コピー数の導入遺伝子を有する形質転換体の頻度は、低コピー数導入遺伝子を有する形質転換体の数を接種された外植片の総数で割ったものとして計算された。これらの頻度の計算結果のそれぞれにさらに１００％を掛けて、頻度をパーセンテージで表す。計算は、プラギング後にランダムな数の植物から採取した試料に基づいて行われた。
表１７．高圧と遠心分離の組み合わせに曝露されたトウモロコシ外植片における形質転換頻度の向上。
表１７．高圧と遠心分離の組み合わせに曝露されたトウモロコシ外植片における形質転換頻度の向上。
【表17】
【0168】
表１７に示されるように、低コピー数植物の頻度及び低コピー導入遺伝子を有する形質転換体の頻度は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、３００ｐｓｉで３分間の高圧及び２，６２０×ｇで３０分間の遠心分離を使用して接種が行われた場合に最も高かった。低コピー形質転換頻度は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下で３００ｐｓｉで３分間の高圧を使用して接種が行われた場合に２番目に高かった。したがって、接種中の遠心分離と高圧の組み合わせは、高圧または遠心分離のいずれかのみを使用した接種と比較して、形質転換のさらなる増加と低いコピー数頻度を示す。
【0169】
実施例７
力による形質転換によりコムギ外植片の形質転換が向上する
この実施例では、力による形質転換を使用して乾燥種子から切除されたコムギ胚外植片の形質転換の向上について説明する。この実施例では、力による形質転換は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの接種中に外植片を遠心分離に供することを含み得る。
力による形質転換によりコムギ外植片の形質転換が向上する
この実施例では、力による形質転換を使用して乾燥種子から切除されたコムギ胚外植片の形質転換の向上について説明する。この実施例では、力による形質転換は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの接種中に外植片を遠心分離に供することを含み得る。
【0170】
外植片を７０％のエタノールで１分間表面殺菌し、すすぎ、浮遊濃縮し、２０％のＰＥＧ４０００中で１．５時間再水和し、接種前にすすいだ。乾燥胚外植片を以下の処理のいずれかに供した：１）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、４℃で３０分間のインキュベーション；２）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、４℃で３０分間、７２×ｇでの遠心分離；３）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、４℃で３０分間、２９１×ｇでの遠心分離；または４）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、４℃で３０分間、６５４×ｇでの遠心分離。この実験で接種に使用したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは、３つの発現カセットを含む植物形質転換ベクターを含み、１つ目はβ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードするもの、２つ目はＧＦＰをコードするもの、３つ目はａａｄＡをコードするものであった。ｕｉｄＡ（ＧＵＳ）遺伝子は、イネアクチン１プロモーター、ＣａＭＶ由来の重複された３５Ｓ Ａ１－Ｂ３ドメインのエンハンサー、コムギ主要クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質の５’非翻訳リーダー、イネアクチン１遺伝子由来のイントロン、及びｍＲＮＡのポリアデニル化を指示するように機能するジャガイモプロテイナーゼ阻害剤ＩＩ遺伝子の３’ＵＴＲの制御下にあった。ｇｆｐ遺伝子は、ＣａＭＶ由来の増強された３５Ｓ ＲＮＡプロモーター、コムギ主要クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質の５’非翻訳リーダー、イネアクチン１遺伝子由来のイントロン、及びコムギ低分子量熱ショックタンパク質遺伝子の３’ＵＴＲの制御下にあった。ａａｄＡ遺伝子は、増強された３５Ｓ ＲＮＡプロモーター、イネアクチン１由来の第１のイントロンと融合したコムギ主要クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質の５’非翻訳リーダー、及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドのノパリンシンターゼ遺伝子の３’ＵＴＲの制御下にあった。遠心分離は、Ｓｏｒｖａｌｌ（商標）ＲＣ３ＢＰ遠心分離機及びＨ６０００Ａローター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して実施された。
【0171】
接種後、外植片を、５０ｐｐｍのナイスタチン、１０ｐｐｍのチアベンダゾール（ＴＢＺ）、及び５０ｐｐｍのペンタクロロニトロベンゼン（ＰＣＮＢ）を含む１．０ｍｌまたは１．２５ｍｌのＩＮＯ培地中で、２３℃、相対湿度７０％、明期１６時間／暗期８時間の光周期で４日間共培養した。各処理群からの５つの外植片を二分し、ＧＦＰ及びＧＵＳ発現について画像化した。図３に示されるように、接種中に７２×ｇを超えて遠心分離された外植片では一過性発現が増加した。図３は、ａ）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、４℃で３０分間のインキュベーション；ｂ）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、４℃で３０分間、７２×ｇでの遠心分離；ｃ）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、４℃で３０分間、２９１×ｇでの遠心分離；またはｄ）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の存在下、４℃で３０分間、６５４×ｇでの遠心分離に供した外植片の明視野画像、蛍光画像、及びＸ－ｇａｌ染色を示す。
【0172】
実施例８
重力及び遠心分離容器がトウモロコシ外植片の形質転換に及ぼす影響
トランスジェニックトウモロコシ植物を作出するために、２９１×ｇまたは６５４×ｇの重力が使用されている。接種中の重力が形質転換頻度（ＴＦ）にプラスの影響を与えるかどうかを確認するために、複数の実験（実験１、２、及び３）を実施した。図４に２つの実験（実験１及び３）について示されるように、重力が２９１×ｇ（またはこの実験では１０００ｒｐｍ）から４６５７×ｇ（またはこの実験では４０００ｒｐｍ）に増加するにつれて、一過性発現が増加した。さらに、重力が２９１×ｇから２６１９×ｇ（またはこの実験では３０００ｒｐｍ）に増加すると最終的な形質転換頻度は増加したが、重力がさらに４６５７×ｇに増加すると、おそらく組織培養応答に対する重力の影響に起因して、若干減少した（表１８を参照）。
表１８．接種中の重力が安定した形質転換に及ぼす影響。
重力及び遠心分離容器がトウモロコシ外植片の形質転換に及ぼす影響
トランスジェニックトウモロコシ植物を作出するために、２９１×ｇまたは６５４×ｇの重力が使用されている。接種中の重力が形質転換頻度（ＴＦ）にプラスの影響を与えるかどうかを確認するために、複数の実験（実験１、２、及び３）を実施した。図４に２つの実験（実験１及び３）について示されるように、重力が２９１×ｇ（またはこの実験では１０００ｒｐｍ）から４６５７×ｇ（またはこの実験では４０００ｒｐｍ）に増加するにつれて、一過性発現が増加した。さらに、重力が２９１×ｇから２６１９×ｇ（またはこの実験では３０００ｒｐｍ）に増加すると最終的な形質転換頻度は増加したが、重力がさらに４６５７×ｇに増加すると、おそらく組織培養応答に対する重力の影響に起因して、若干減少した（表１８を参照）。
表１８．接種中の重力が安定した形質転換に及ぼす影響。
【表18】
【0173】
トウモロコシの形質転換中の遠心分離にはＦａｌｃｏｎ遠心チューブ（５０ｍＬ）が使用されてきたが、スケールアップ生産の実施を念頭に置いて、５０ｍＬのＦａｌｃｏｎ遠心チューブの代わりにＣｏｒｎｉｎｇ円錐ボトル（５００ｍＬ）もＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの生育に使用されている。しかしながら、形質転換頻度が向上すれば、より大きな遠心分離容器は必要なくなる可能性がある。遠心分離容器が形質転換頻度（ＴＦ）に及ぼす影響を調査するために、複数の実験（実験１、２、３、及び４）を実施した。表１９に示されるように、５００ｍＬのＣｏｒｎｉｎｇ円錐ボトルと比較して、５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブではより高いＴＦが達成された。
表１９．遠心分離容器が安定した形質転換に及ぼす影響。
表１９．遠心分離容器が安定した形質転換に及ぼす影響。
【表19】
【0174】
実施例９
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種前のトウモロコシ外植片の再水和によるトウモロコシ外植片の形質転換の向上
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種前のトウモロコシ外植片の再水和がトウモロコシ外植片の形質転換に及ぼす影響を評価するために、２つの実験を実施した。形質転換は、特に断りのない限り、一般に実施例１に記載のように実施した。各実験の外植片を０、１、または２時間再水和し、各処理群は３，３３３のトウモロコシ外植片を含んだ。
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種前のトウモロコシ外植片の再水和によるトウモロコシ外植片の形質転換の向上
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種前のトウモロコシ外植片の再水和がトウモロコシ外植片の形質転換に及ぼす影響を評価するために、２つの実験を実施した。形質転換は、特に断りのない限り、一般に実施例１に記載のように実施した。各実験の外植片を０、１、または２時間再水和し、各処理群は３，３３３のトウモロコシ外植片を含んだ。
【0175】
簡単に説明すると、外植片を７０％エタノールを使用して４分間表面殺菌し、滅菌水で３回すすいだ後、１／２濃度であるＣａＣｌ２を除く２／５濃度のＢ５マクロ塩、１／１０濃度のＢ５ミクロ塩及びビタミン、１ｇ／Ｌの硝酸カリウム、３０ｇ／Ｌのデキストロース、２．８ｍｇ／Ｌのセクエストレン、３．９ｇ／ＬのＭＥＳ、０．０３ｇ／ＬのＣｌｅａｒｙｓ ３３３６ ＷＰ、ｐＨ５．４、ならびに５ｍｇ／Ｌの２，４－Ｄを含む培地中で、０、１、または２時間、再水和した。この実験では、再水和に使用したのと同じ培地をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの接種及び共培養にも使用した。外植片にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを０．３５のＯＤ６００で接種し、６００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは、Ｔｉプラスミド上のＴ－ＤＮＡ境界に隣接する２つの発現カセットを含んだ。第１の発現カセットは、構成的プロモーターの制御下にある葉緑体を標的としたＣＰ４ ＥＰＳＰＳ遺伝子を含んでいた。第２の発現カセットは、異なる構成的プロモーターの制御下にあるｕｉｄＡ遺伝子を含んでいた。共培養後、外植片を、明期２２時間／暗期２時間の光周期サイクル（光周期１）の暖かい部屋で、または明期１６時間／暗期８時間（光周期２）の光周期サイクルの暖かい部屋で培養した。
【0176】
表２０に示されるように、再水和工程を組み込むと、両方の光周期で培養後のシュート頻度と形質転換頻度が一貫して向上された。さらに、２時間の再水和は、１時間の再水和と比較してシュート頻度と形質転換頻度を向上した。
表２０．再水和によりトウモロコシ種子外植片のシュート頻度と形質転換頻度が向上する。
表２０．再水和によりトウモロコシ種子外植片のシュート頻度と形質転換頻度が向上する。
【表20】
【0177】
シュート頻度は、シュートを作出する接種された外植片の数を接種された外植片の総数で割ったものとして計算された。形質転換頻度またはＴＦ（％）は、プラギングされた再生植物の数を接種されたトウモロコシ外植片の総数で割ったものとして計算された。
【0178】
実施例１０
接種及び共培養中のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ濃度の上昇によりトウモロコシ外植片の形質転換が向上する
この実施例は、接種中のさまざまな濃度のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍと共培養中のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの添加がトウモロコシ外植片の形質転換に及ぼす影響を実証する実験及び結果について記載する。
接種及び共培養中のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ濃度の上昇によりトウモロコシ外植片の形質転換が向上する
この実施例は、接種中のさまざまな濃度のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍと共培養中のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの添加がトウモロコシ外植片の形質転換に及ぼす影響を実証する実験及び結果について記載する。
【0179】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ濃度がトウモロコシ外植片の形質転換に及ぼす影響を評価するために、３つの初期実験を実施した。実験には、表２１に示されるように接種及び共培養中のさまざまな濃度（光学密度によって測定）のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍが含まれていた。簡単に説明すると、表２１に示されるように、接種培地中のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの濃度（ＯＤ６６０）を変化させた以外は、実施例１に記載のように外植片及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを調製し、接種した。実験１及び２では、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは、Ｔｉプラスミド上のＴ－ＤＮＡ境界に隣接する２つの発現カセットを含んでいた。第１の発現カセットは、トランスジェニック事象の選別マーカーとして、構成的プロモーターの制御下にある葉緑体を標的としたＣＰ４ ＥＰＳＰＳ遺伝子を含んでいた。第２の発現カセットは、形質転換体を視覚的に識別するためのスクリーニングマーカーとして、異なる構成的プロモーターの制御下にあるｕｉｄＡ遺伝子を含んでいた。実験３では、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは、Ｔｉプラスミド上のＴ－ＤＮＡ境界に隣接するＣＰ４ ＥＰＳＰＳをコードする１つの発現カセットを含んでいた。
【0180】
表２１に示されるように、接種したトウモロコシ外植片を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ無添加（実験１～３の処理１）、または実験１では異なるＯＤ濃度のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（０．２５、０．５、または１．０）を含む、または実験２及び３ではＯＤ濃度が１．０のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを含む１．２５ｍＬの再水和培地で湿らせた滅菌ワットマン＃１濾紙（８２ｍｍ）を１枚含む共培養プレート（２５ｍｍ×１００ｍｍ）に移した。共培養プレートを、２０℃、相対湿度約６５％、明期１６時間／暗期８時間の光周期で６日間インキュベートした。
【0181】
共培養の終了時に、外植片を出芽誘導（ＢＩ）培地に移して７日間培養し、続いて拡大出芽誘導（ＥＢＩ）培地に移して１４日間培養した。ＢＩ及びＥＢＩ培地ならびに培養条件は実施例１に記載のものと同じであった。次いで、ＥＢＩからの外植片をペトリ皿内の固体再生培地（実施例１に記載）に１０日間移した後、シュートの発達及び発根のため同じ再生培地を含む９ｃｍのＶｉｖｉ（登録商標）トレイ（Ｖｉｖｉ（登録商標）、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に移した。Ｖｉｖｉ（登録商標）トレイを手持ち式のシーリングアイロンを用いてプラスチックフィルムで密封し、２８℃、周囲湿度で明期１６時間／暗期８時間の光周期で３２日間培養した。再生工程の後、根が目に見え、キメラ化の兆候がない推定上の緑色のトランスジェニック植物を、土壌プラグ（直径２インチ×高さ３インチ（Ｇｒｏ－Ｔｅｃｈ（商標），Ｒｏｕｇｈ ａｎｄ Ｒｅａｄｙ，ＣＡ ９５９７５）において移植し、さらに生育と発達、及び分子特性解析を行った。
表２１．接種及び共培養中のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ濃度がプラギング頻度に及ぼす影響。
表２１．接種及び共培養中のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ濃度がプラギング頻度に及ぼす影響。
【表21】
【0182】
図５に示されるように、実験１における一過性のＧＵＳ発現は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの濃度が増加するにつれて増加した。表２１に示す結果はまた、実験１における一過性発現のこの増加が、より高い平均プラギング頻度と相関していることも実証している。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ濃度を高くすると、出芽誘導中及び拡大出芽誘導の初期に、対照と比較した場合に外植片の生育が遅くなるように思われたが、接種及び共培養の両工程においてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍがＯＤ１．０で存在する場合に、最も高いプラギング頻度が得られた。実験２では、一過性発現及び平均プラギング頻度の両方について同様の結果が得られた（表２１参照）。実験３では、接種及び共培養において、ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍがＯＤ１．０では、対照（２．０４％）と比較して、プラギング頻度のわずかな増加（２．３３％）が観察された（表２１参照）。
【0183】
この実施例に記載される実験では、シュート頻度は、キメラシュート及び非キメラシュートを含む再生されたシュートの数を、接種された外植片の総数で割った値×１００として定義される。キメラシュート頻度は、キメラシュートの数をシュートの総数で割った値×１００として定義される。平均シュート頻度と平均キメラシュート頻度は、単純にそれぞれ複数の反復で平均したシュート頻度とキメラシュート頻度である。プラギング頻度は、土壌に移された非キメラ事象の数を接種された外植片の総数で割った値×１００として定義される。質の高いプラギング頻度は、単一コピーのプラギング事象の数を接種された外植片の総数で割った値×１００として定義される。単一コピー頻度は、単一コピー事象の数を生成された事象の総数で割った値×１００として定義される。
【0184】
実験２では、キメラシュート頻度と平均シュート頻度を測定し比較し、接種及び共培養中のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ濃度が高いことがキメラシュート形成頻度に影響を与えるかどうかを評価した。表２２に示されるように、接種及び共培養中のより高いＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのＯＤ１．０濃度では、対照と比較して、より高い平均シュート頻度が得られたが、平均キメラシュート頻度は、より高いＯＤ濃度と対照群との間で類似していた。したがって、より高いＯＤ濃度を使用して作出されたより高いシュート頻度は、キメラ化の増加と関連していなかった。
表２２．接種及び共培養中のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ濃度がシュート頻度及びキメラシュート頻度に及ぼす影響。
表２２．接種及び共培養中のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ濃度がシュート頻度及びキメラシュート頻度に及ぼす影響。
【表22】
【0185】
接種及び共培養中のより高いＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ濃度が単一コピー事象の頻度に影響を与えるかどうかを評価するために、実験２及び３で土壌に移された事象に対してＣＰ４ ＥＰＳＰＳ コピー数アッセイを実施した。表２３に示されるように、単一コピー事象（％）は、低い標準ＯＤ処理と高いＯＤ処理の間で同様であった。
表２３．接種及び共培養中のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ濃度が単一コピー事象の頻度に及ぼす影響。
表２３．接種及び共培養中のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ濃度が単一コピー事象の頻度に及ぼす影響。
【表23】
【0186】
３つの最初の実験の後、１６の異なる構築物を含むいくつかの大規模スケールの実験が実施された。１６の構築物すべてに選別マーカーとして同じＣＰ４ ＥＰＳＰＳカセットが含まれており、実験はそれらの構築物に含まれる追加の目的遺伝子の発現カセット（複数可）に基づいて３つの群に分類された。シュート頻度の増加は、すべての実験群にわたってＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ濃度が高いほど観察され、群１及び３では統計的に有意な増加（「＊」で示す）が見られた（表２４を参照）。群１のＯＤ濃度が高い方ではプラギング頻度の有意な増加が観察されたが、群２及び３のプラギング頻度の結果は対照と同等であった。群３のＯＤ濃度が高い方では、キメラシュート頻度のわずかな増加も観察された。加えて、表２４の結果は、導入遺伝子の単一コピー頻度がこれらの実験におけるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ濃度に依存しないことをさらに実証している。表２４において、下線付きの数字はｕｉｄＡのコピー数を表し、下線のない数字はＣＰ４のコピー数を表す。結果は、低いＯＤ濃度と高いＯＤ濃度の間で単一コピー頻度に有意な差がないことを示している。ＣＰ４及びｕｉｄＡの単一コピー頻度において測定された変動は、統計的に有意ではなかった。同様に、これらの実験では、質の高いプラギング頻度は、対照群とより高いＯＤ処理群の間で同等であることが判明した。
表２４．接種及び共培養中のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ濃度の影響；大規模スケール実験結果の概要。
表２４．接種及び共培養中のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ濃度の影響；大規模スケール実験結果の概要。
【表24】
【0187】
実施例１１
出芽誘導中の温度及び光強度がトウモロコシ外植片の形質転換に及ぼす影響
出芽誘導中の温度及び光強度の影響を評価するために２つの実験を実施した。実施例９に記載されるように、外植片を表面殺菌し、精製し、再水和し、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを接種した。次に、外植片を共培養し、特に断りのない限り、実施例１に記載されるように出芽誘導、拡大出芽誘導、及び再生に供した。
出芽誘導中の温度及び光強度がトウモロコシ外植片の形質転換に及ぼす影響
出芽誘導中の温度及び光強度の影響を評価するために２つの実験を実施した。実施例９に記載されるように、外植片を表面殺菌し、精製し、再水和し、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを接種した。次に、外植片を共培養し、特に断りのない限り、実施例１に記載されるように出芽誘導、拡大出芽誘導、及び再生に供した。
【0188】
最初の実験では、３２℃及び３５℃の２つの培養温度と、９０μ／ｍ２・ｓ及び１４０～１５０μ／ｍ２・ｓの２つのＰＡＲ光強度で出芽誘導を評価した。各処理群には約２，５００のトウモロコシ外植片が含まれた。培養物は、指定された温度と光強度でＰｅｒｃｉｖａｌ（登録商標）チャンバー内でインキュベートした。表２５に示されるように、３２℃で出芽誘導を行うと、３５℃で出芽誘導を行う場合と比較して、シュート頻度、正常シュート頻度、土壌プラグに移された正常シュート数、及び正常植物頻度が向上した。この実験では、光強度は正常植物頻度に統計的に有意な影響を与えなかったが、９０μ／ｍ２・ｓのＰＡＲで出芽誘導を実施すると、１４０～１５０μ／ｍ２・ｓのＰＡＲで出芽誘導を実施した場合と比較して、わずかに高い正常植物頻度が生じた。
表２５．出芽誘導中の温度及び光強度がトウモロコシ外植片の形質転換に及ぼす影響。
表２５．出芽誘導中の温度及び光強度がトウモロコシ外植片の形質転換に及ぼす影響。
【表25】
【0189】
シュート頻度は、シュートを作出する接種された外植片の数を接種された外植片の総数で割ったものとして計算された。正常シュート頻度は、正常シュート数を接種された外植片の総数で割ったものとして計算された。正常植物頻度（ＮＰＦ）は、正常植物の数を接種された外植片の総数で割ったものとして計算された。
【0190】
第２の実験では、４つの異なる光強度、９０μ／ｍ２・ｓのＰＡＲ、１５０μ／ｍ２・ｓのＰＡＲ、１８０μ／ｍ２・ｓのＰＡＲ、及び１９０μ／ｍ２・ｓのＰＡＲで出芽誘導を評価した。出芽誘導は、１８０ＰＡＲ処理群において２８℃、９０μ／ｍ２・ｓのＰＡＲ、１５０μ／ｍ２・ｓのＰＡＲ、及び１９０μ／ｍ２・ｓのＰＡＲ処理群において３３℃で実施した。各処理には２，５００のトウモロコシ外植片が含まれた。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの接種後、外植片を、２／５のＢ５マクロ塩、１／１０のＢ５ミクロ塩及びビタミン、１ｇ／Ｌの硝酸カリウム、３０ｇ／Ｌのデキストロース、３．９ｇ／Ｌの２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、０．０３ｇ／ＬのＣｌｅａｒｙｓ ３３３６ ＷＰ、及び５ｍｇ／Ｌの２，４－Ｄ、ｐＨ５．４を含む共培養培地に移した。次いで、外植片を出芽誘導培地に移し、Ｃｏｎｖｉｒｏｎ（登録商標）チャンバー内で培養した１８０μ／ｍ２・ｓのＰＡＲ処理群を除いて、Ｐｅｒｃｉｖａｌ（登録商標）チャンバー内で、指定された温度及び光強度で培養した後、拡大出芽誘導及び再生を行った。
【0191】
表２６に示されるように、３３℃での出芽誘導は、２８℃での出芽誘導と比較して、シュート頻度、正常シュート頻度、土壌プラグに移された正常シュート数、及び正常植物頻度を一般に向上させた。さらに、９０μ／ｍ２・ｓのＰＡＲでの出芽誘導では、最も高い正常植物頻度（ＮＰＦ）が生じた。この実験では、１５０μ／ｍ２・ｓのＰＡＲでの出芽誘導と１９０μ／ｍ２・ｓのＰＡＲでの出芽誘導の間に有意な差はなかった。
表２６．出芽誘導中の温度及び光強度がトウモロコシ外植片の形質転換に及ぼす影響。
表２６．出芽誘導中の温度及び光強度がトウモロコシ外植片の形質転換に及ぼす影響。
【表26】
【0192】
シュート頻度は、シュートを作出する接種された外植片の数を接種された外植片の総数で割ったものとして計算された。正常シュート頻度は、正常シュート数を接種された外植片の総数で割ったものとして計算された。正常植物頻度（ＮＰＦ）は、正常植物の数を接種された外植片の総数で割ったものとして計算された。
【0193】
実施例１２
再生中の光密度及び温度が形質転換頻度に及ぼす影響
光密度が液体培養システムにおける形質転換効率に有意な影響を与えるかどうかを試験するために、光密度が再生工程中の成熟トウモロコシ胚外植片の形質転換に及ぼす影響を評価する実験を実施した。この実験では、ペトリ皿あたり約３０の外植片を含む液体培養物のペトリ皿を４枚重ねてプラスチックのボックスに入れた。ボックスの半分を、約６０μｍｏｌｅ／ｍ２ｓの光密度を有する第１の光チャンバー内で培養し、残りの半分を、約１００μｍｏｌｅ／ｍ２ｓの光密度を有する第２の光チャンバー内で培養した。結果は、約６０μｍｏｌｅ／ｍ２ｓのより低い光密度と比較して、約１００μｍｏｌｅ／ｍ２ｓのより高い光密度の存在下で再生の形質転換頻度が高いことを示した。各明室では、形質転換頻度は、箱及びスタックの最上部にあるペトリ皿で最大であり、最上層から最下層へと光密度が徐々に減少するにつれて徐々に減少した（表２７）。付随して、温度もプレートの最上層が最も高く、プレートの最上層から最下層へと徐々に低下した（表２８）。したがって、より高い光密度とプレート温度の組み合わせは、より高い形質転換頻度に寄与する可能性がある。セーターボックスの外の温度は約２９℃であった。光密度が高くなると、液体培養プロトコルと固体培養プロトコルの両方で形質転換頻度が増加することも示されたが、増加の程度は固体培養プロトコルよりも液体培養の方が大きかった。加えて、これらの実験では、より高い光密度がトランスジェニック植物の発根頻度を増加させることが示された（表２９）。
表２７．光密度が液体培養プロトコルによる安定した形質転換に及ぼす影響。
表２８．実際のプレート光密度とプレート温度の相関関係。
表２９．光密度が液体培養と固体培養に及ぼす影響、及びトランスジェニック植物の発根頻度。
再生中の光密度及び温度が形質転換頻度に及ぼす影響
光密度が液体培養システムにおける形質転換効率に有意な影響を与えるかどうかを試験するために、光密度が再生工程中の成熟トウモロコシ胚外植片の形質転換に及ぼす影響を評価する実験を実施した。この実験では、ペトリ皿あたり約３０の外植片を含む液体培養物のペトリ皿を４枚重ねてプラスチックのボックスに入れた。ボックスの半分を、約６０μｍｏｌｅ／ｍ２ｓの光密度を有する第１の光チャンバー内で培養し、残りの半分を、約１００μｍｏｌｅ／ｍ２ｓの光密度を有する第２の光チャンバー内で培養した。結果は、約６０μｍｏｌｅ／ｍ２ｓのより低い光密度と比較して、約１００μｍｏｌｅ／ｍ２ｓのより高い光密度の存在下で再生の形質転換頻度が高いことを示した。各明室では、形質転換頻度は、箱及びスタックの最上部にあるペトリ皿で最大であり、最上層から最下層へと光密度が徐々に減少するにつれて徐々に減少した（表２７）。付随して、温度もプレートの最上層が最も高く、プレートの最上層から最下層へと徐々に低下した（表２８）。したがって、より高い光密度とプレート温度の組み合わせは、より高い形質転換頻度に寄与する可能性がある。セーターボックスの外の温度は約２９℃であった。光密度が高くなると、液体培養プロトコルと固体培養プロトコルの両方で形質転換頻度が増加することも示されたが、増加の程度は固体培養プロトコルよりも液体培養の方が大きかった。加えて、これらの実験では、より高い光密度がトランスジェニック植物の発根頻度を増加させることが示された（表２９）。
表２７．光密度が液体培養プロトコルによる安定した形質転換に及ぼす影響。
【表27】
【表28】
【表29】
【0194】
実施例１３
出芽誘導中の異なるサイトカイニンがトウモロコシ外植片の形質転換に及ぼす影響
出芽誘導中に異なるサイトカイニンを使用することがトウモロコシ外植片の形質転換に及ぼす影響を評価するために実験を実施した。特に断りのない限り、実施例１に記載のように、トウモロコシ外植片を表面殺菌し、精製し、再水和し、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを接種し、共培養し、出芽誘導（第２の拡大出芽誘導工程は含まず）及び再生工程に供した。グリホサートを選択剤として使用した。
出芽誘導中の異なるサイトカイニンがトウモロコシ外植片の形質転換に及ぼす影響
出芽誘導中に異なるサイトカイニンを使用することがトウモロコシ外植片の形質転換に及ぼす影響を評価するために実験を実施した。特に断りのない限り、実施例１に記載のように、トウモロコシ外植片を表面殺菌し、精製し、再水和し、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを接種し、共培養し、出芽誘導（第２の拡大出芽誘導工程は含まず）及び再生工程に供した。グリホサートを選択剤として使用した。
【0195】
この実験では、４つのサイトカイニン、６－ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、ゼアチン、チジアズロン（ＴＤＺ）、及び６－（γ，γ－ジメチルアリルアミノ）プリン（２ｉＰ）を使用した出芽誘導を評価した。表３０に示されるように、１０ｍｇ／ＬのＢＡＰまたは２ｍｇ／ＬのＴＤＺを使用した出芽誘導は、１０ｍｇ／Ｌの２ｉＰまたは２ｍｇ／Ｌのゼアチンを使用した出芽誘導と比較して、有意に高い正常シュート頻度を示した。この実験では、ＴＤＺを使用した出芽誘導は、ＢＡＰを使用した出芽誘導と比較して、わずかに高い正常シュート頻度が生じた。例えば、１～８ｍｇ／ＬのＢＡＰの出芽誘導を利用した他の研究でも観察された。
表３０．出芽誘導中の異なるサイトカイニンがトウモロコシ外植片の形質転換に及ぼす影響。
表３０．出芽誘導中の異なるサイトカイニンがトウモロコシ外植片の形質転換に及ぼす影響。
【表30】
【0196】
シュート頻度は、シュートを作出する接種された外植片の数を接種された外植片の総数で割ったものとして計算された。正常シュート頻度は、正常シュート数を接種された外植片の総数で割ったものとして計算された。
【0197】
実施例１４
２，４－Ｄ及びＳｉｌｗｅｔ（登録商標）を使用しない共培養によりコムギ種子から切除された外植片のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換が向上する
この実験では、コムギ種子から切除された外植片のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換のための共培養培地中の２，４－Ｄ及び界面活性剤Ｓｉｌｗｅｔ（登録商標）の影響を評価した。特に断りのない限り、実施例２に記載のように、コムギ外植片を表面殺菌し、精製し、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを接種し、共培養し、遅延、選抜、及び再生に供した。
２，４－Ｄ及びＳｉｌｗｅｔ（登録商標）を使用しない共培養によりコムギ種子から切除された外植片のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換が向上する
この実験では、コムギ種子から切除された外植片のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換のための共培養培地中の２，４－Ｄ及び界面活性剤Ｓｉｌｗｅｔ（登録商標）の影響を評価した。特に断りのない限り、実施例２に記載のように、コムギ外植片を表面殺菌し、精製し、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを接種し、共培養し、遅延、選抜、及び再生に供した。
【0198】
この実験では、２，４－Ｄ及びＳｉｌｗｅｔ（登録商標）の添加は、形質転換頻度または正常植物頻度に統計的に有意な影響を与えなかった。しかしながら、表３１に示されるように、２，４－Ｄ及びＳｉｌｗｅｔ（登録商標）の両方を含む共培養培地を使用した場合、２，４－ＤもＳｉｌｗｅｔ（登録商標）も含まない共培養培地と比較して、形質転換頻度及び正常植物頻度が減少した。Ｓｉｌｗｅｔ（登録商標）のみを含む共培養培地では、Ｓｉｌｗｅｔ（登録商標）も２，４－Ｄも含まない共培養培地と比較して正常植物頻度が高くなったが、形質転換頻度はＳｉｌｗｅｔ（登録商標）及び２，４－Ｄの非存在下で最も高くなった。
表３１．共培養培地中の２，４－Ｄ及びＳｉｌｗｅｔ（登録商標）がコムギ外植片形質転換に及ぼす影響。
表３１．共培養培地中の２，４－Ｄ及びＳｉｌｗｅｔ（登録商標）がコムギ外植片形質転換に及ぼす影響。
【表31】
【0199】
形質転換頻度は、トランスジェニック植物を作出する接種された外植片の数を接種された外植片の総数で割ったものとして計算された。正常植物頻度は、正常植物の数を再生された植物の総数で割ったものとして計算された。
【0200】
実施例１５
２，４－Ｄを含まない共培養によりトウモロコシ種子から切除された外植片のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換が向上する
共培養培地中の２，４－Ｄがトウモロコシ外植片の形質転換に及ぼす影響を評価するために、１７の独立した実験を実施した。特に断りのない限り、実施例１に記載のように、トウモロコシ外植片を表面殺菌し、精製し、再水和し、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを接種し、共培養し、出芽誘導、拡大出芽誘導、及び再生に供した。実施例９に記載したのと同じＴｉプラスミドを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを、実験１３～１７を除くすべての実験に使用し、Ｔｉプラスミド中の２つの異なる細菌の複製起点を共培養培地中で２，４－Ｄの存在下または非存在下で評価した。これらの場合、Ｔｉプラスミドは、Ｔ－ＤＮＡ境界に隣接する同じ２つの発現カセットを保持しており、一方は、構成的プロモーターの制御下にある葉緑体を標的とするＣＰ４ ＥＰＳＰＳ遺伝子を含み、他方は、同様の構成的プロモーターの制御下にあるｕｉｄＡ遺伝子を含む。
２，４－Ｄを含まない共培養によりトウモロコシ種子から切除された外植片のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換が向上する
共培養培地中の２，４－Ｄがトウモロコシ外植片の形質転換に及ぼす影響を評価するために、１７の独立した実験を実施した。特に断りのない限り、実施例１に記載のように、トウモロコシ外植片を表面殺菌し、精製し、再水和し、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを接種し、共培養し、出芽誘導、拡大出芽誘導、及び再生に供した。実施例９に記載したのと同じＴｉプラスミドを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを、実験１３～１７を除くすべての実験に使用し、Ｔｉプラスミド中の２つの異なる細菌の複製起点を共培養培地中で２，４－Ｄの存在下または非存在下で評価した。これらの場合、Ｔｉプラスミドは、Ｔ－ＤＮＡ境界に隣接する同じ２つの発現カセットを保持しており、一方は、構成的プロモーターの制御下にある葉緑体を標的とするＣＰ４ ＥＰＳＰＳ遺伝子を含み、他方は、同様の構成的プロモーターの制御下にあるｕｉｄＡ遺伝子を含む。
【0201】
表３２は、１７の実験からの、共培養培地中で２，４－Ｄを含む処理と含まない処理の結果をまとめたものを提供する。これらの実験には２，４－Ｄの有無とは別に追加の変数が含まれたが、結果は、共培養培地から２，４－Ｄを除去すると、異なる場所にわたる異なる研究室の研究者による１７の実験中１６の実験で、追加のパラメーターに関係なく、一貫して正常植物頻度が高くなることを示す。正常植物頻度の増加は１．１～３．０倍の範囲であり、平均増加は１．８倍であった。
表３２．共培養培地からの２，４－Ｄ除去によりトウモロコシ外植片の形質転換が向上する
表３２．共培養培地からの２，４－Ｄ除去によりトウモロコシ外植片の形質転換が向上する
【表32】
【0202】
正常植物頻度は、正常植物の数を接種された外植片の総数で割ったものとして計算された。
【0203】
実施例１６
共培養期間がトウモロコシ外植片の形質転換に及ぼす影響
共培養期間がトウモロコシ外植片の形質転換に及ぼす影響を評価するために、トウモロコシ種子から切除された外植片を７０％エタノール中で４分間表面殺菌した。１／２濃度であるＣａＣｌ２を除く２／５濃度のＢ５マクロ塩、１／１０のＢ５ミクロ塩及びビタミン、１ｇ／Ｌの硝酸カリウム、３０ｇ／Ｌのデキストロース、２．８ｍｇ／Ｌのセクエストレン、３．９ｇ／Ｌの２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、及び０．０３ｇ／ＬのＣｌｅａｒｙｓ ３３３６ ＷＰ、ｐＨ５．４を含む再水和培地中で、シェーカー上、１００ｒｐｍで室温で２時間インキュベートした後、外植片に、実施例１に記載されるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを接種した。次いで、接種された外植片を共培養プレートに移し、５または７日間共培養した後、この実験では再生培地がＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、３０ｇ／Ｌのスクロース、０．６９ｇ／Ｌのプロリン、２ｍｇ／Ｌのグリシン、１ｇ／ＬのＭＥＳ、４００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、２００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、１００ｍｇ／Ｌのチメンチン、及び２０μＭのグリホサート、ｐＨ５．８を含有したことを除いて、実施例１に記載されるように出芽誘導、拡大出芽誘導、及び再生に供した。再生されたシュートを、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、３０ｇ／Ｌのスクロース、０．６９ｇ／Ｌのプロリン、２ｍｇ／Ｌのグリシン、１ｇ／ＬのＭＥＳ、３ｇ／ＬのＧｅｌｚａｎ ＣＭ、０．２５ｍｇ／ＬのＩＢＡ、２５０ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、及び５０μＭのグリホサート、ｐＨ５．８を含む発根培地に発根させた。
共培養期間がトウモロコシ外植片の形質転換に及ぼす影響
共培養期間がトウモロコシ外植片の形質転換に及ぼす影響を評価するために、トウモロコシ種子から切除された外植片を７０％エタノール中で４分間表面殺菌した。１／２濃度であるＣａＣｌ２を除く２／５濃度のＢ５マクロ塩、１／１０のＢ５ミクロ塩及びビタミン、１ｇ／Ｌの硝酸カリウム、３０ｇ／Ｌのデキストロース、２．８ｍｇ／Ｌのセクエストレン、３．９ｇ／Ｌの２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、及び０．０３ｇ／ＬのＣｌｅａｒｙｓ ３３３６ ＷＰ、ｐＨ５．４を含む再水和培地中で、シェーカー上、１００ｒｐｍで室温で２時間インキュベートした後、外植片に、実施例１に記載されるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを接種した。次いで、接種された外植片を共培養プレートに移し、５または７日間共培養した後、この実験では再生培地がＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、３０ｇ／Ｌのスクロース、０．６９ｇ／Ｌのプロリン、２ｍｇ／Ｌのグリシン、１ｇ／ＬのＭＥＳ、４００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、２００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、１００ｍｇ／Ｌのチメンチン、及び２０μＭのグリホサート、ｐＨ５．８を含有したことを除いて、実施例１に記載されるように出芽誘導、拡大出芽誘導、及び再生に供した。再生されたシュートを、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、３０ｇ／Ｌのスクロース、０．６９ｇ／Ｌのプロリン、２ｍｇ／Ｌのグリシン、１ｇ／ＬのＭＥＳ、３ｇ／ＬのＧｅｌｚａｎ ＣＭ、０．２５ｍｇ／ＬのＩＢＡ、２５０ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、及び５０μＭのグリホサート、ｐＨ５．８を含む発根培地に発根させた。
【0204】
表３３に示されるように、７日間の共培養は、５日間の共培養と比較して、より高い総数のトランスジェニックシュートを作出したが、作出されたシュートのより高い割合（％）はキメラであった。その結果、５日間の共培養により、より高い頻度の正常植物が得られた。
表３３．トウモロコシ外植片の形質転換における共培養期間の比較（５日と７日）。
表３３．トウモロコシ外植片の形質転換における共培養期間の比較（５日と７日）。
【表33】
【0205】
シュート頻度は、シュートを作出する接種された外植片の数を接種された外植片の総数で割ったものとして計算された。正常植物頻度は、正常植物の数を接種された外植片の総数で割ったものとして計算された。
【0206】
別の実験では、共培養培地中の５ｍｇ／Ｌの２，４－Ｄの存在または非存在と組み合わせて、４日間及び５日間の共培養期間を評価した。トウモロコシ種子から切除された外植片を、先の実験で説明されたように表面殺菌し、再水和し、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液を接種した。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍには、Ｔｉプラスミド上のＴ－ＤＮＡ境界に隣接する構成的プロモーターの制御下にある葉緑体を標的とするＣＰ４ ＥＰＳＰＳ遺伝子が含まれていた。接種された外植片を、５ｍｇ／Ｌの２，４－Ｄを含むまたは含まない共培養プレートに移し、４または５日間共培養した後、先の実験で説明されたように出芽誘導、拡大出芽誘導、及び再生を行った。
【0207】
表３４に示されるように、共培養培地中に２，４－Ｄが存在しない場合には２．４７％の平均正常植物頻度が得られたのに対し、２，４－Ｄが存在する場合には０．７３％であった。このデータは実施例１５に記載された結果と一致している。さらに、４日間の共培養では、５日間の共培養と比較して、より高い正常植物頻度が生じた。表３５は、表３４に示されているデータに基づく平均算出値を示している。
表３４．共培養中の２，４－Ｄ及び共培養期間がトウモロコシ外植片の形質転換に及ぼす影響。
表３４．共培養中の２，４－Ｄ及び共培養期間がトウモロコシ外植片の形質転換に及ぼす影響。
【表34】
【0208】
シュート頻度は、シュートを作出する接種された外植片の数を接種された外植片の総数で割ったものとして計算された。正常植物頻度は、正常植物の数を接種された外植片の総数で割ったものとして計算された。
表３５．共培養培地からの２，４－Ｄ除去により、平均正常植物頻度（％）で実証されるようにトウモロコシ外植片の形質転換が向上する
表３５．共培養培地からの２，４－Ｄ除去により、平均正常植物頻度（％）で実証されるようにトウモロコシ外植片の形質転換が向上する
【表35】
【0209】
正常植物頻度は、正常植物の数を接種された外植片の総数で割ったものとして計算された。
【0210】
実施例１７
Ｓｅｔａｒｉａ ｖｉｒｉｄｉｓ粉砕種子のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換
Ｓｅｔａｒｉａ ｖｉｒｉｄｉｓ（エノコログサ）は、低身長（１０～３０ｃｍ）、生活環が速い（６～９週間）、種子生産量が豊富（植物あたり約１３，０００種子）、自家和合性、ゲノムサイズが小さい（約３９５Ｍｂ）、二倍体遺伝（２ｎ＝１８）、及び生育要件が単純などのいくつかの特性のために、Ｃ４植物の生態及び他の農業形質を研究するための魅力的なモデル植物系となり得る。組織培養ベース及びｉｎ ｐｌａｎｔａフローラルディップ法などのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換法が、Ｓ．ｖｉｒｉｄｉｓについて報告されている。例えば、Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｒｏｂｕｓｔ ａｎｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｃ４ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｅｌ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｓｅｔａｒｉａ ｖｉｒｄｉｓ”，Ｆｒｏｎｔ． Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１３：２８１（２０２０）；及びＶａｎ Ｅｃｋ，Ｊ．，“Ｔｈｅ Ｓｔａｔｕｓ ｏｆ Ｓｅｔａｒｉａ ｖｉｒｄｉｓ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｏ Ｆｌｏｒａｌ Ｄｉｐ”，Ｆｒｏｎｔ． Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．９：６５２（２０１８）を参照のこと。しかしながら、これまでの組織培養ベースの方法は、種子由来カルス培養のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換を含み、これは労働集約的であり、植物においてソマクローン変異及びオフタイプを生じやすい。非組織培養ベースのフローラルディップ法には、Ｓ．ｖｉｒｉｄｉｓ植物の未成熟な花序をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに曝露した後、成熟した種子を回収し、それらの採取した種子から生育したトランスジェニック植物を同定することが含まれる。しかしながら、ｉｎ ｐｌａｎｔａフローラルディップ法では、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染の前後に植物を生育及び維持するための生育チャンバーまたは温室スペースが必要である。
Ｓｅｔａｒｉａ ｖｉｒｉｄｉｓ粉砕種子のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換
Ｓｅｔａｒｉａ ｖｉｒｉｄｉｓ（エノコログサ）は、低身長（１０～３０ｃｍ）、生活環が速い（６～９週間）、種子生産量が豊富（植物あたり約１３，０００種子）、自家和合性、ゲノムサイズが小さい（約３９５Ｍｂ）、二倍体遺伝（２ｎ＝１８）、及び生育要件が単純などのいくつかの特性のために、Ｃ４植物の生態及び他の農業形質を研究するための魅力的なモデル植物系となり得る。組織培養ベース及びｉｎ ｐｌａｎｔａフローラルディップ法などのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換法が、Ｓ．ｖｉｒｉｄｉｓについて報告されている。例えば、Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｒｏｂｕｓｔ ａｎｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｃ４ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｅｌ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｓｅｔａｒｉａ ｖｉｒｄｉｓ”，Ｆｒｏｎｔ． Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１３：２８１（２０２０）；及びＶａｎ Ｅｃｋ，Ｊ．，“Ｔｈｅ Ｓｔａｔｕｓ ｏｆ Ｓｅｔａｒｉａ ｖｉｒｄｉｓ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｏ Ｆｌｏｒａｌ Ｄｉｐ”，Ｆｒｏｎｔ． Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．９：６５２（２０１８）を参照のこと。しかしながら、これまでの組織培養ベースの方法は、種子由来カルス培養のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換を含み、これは労働集約的であり、植物においてソマクローン変異及びオフタイプを生じやすい。非組織培養ベースのフローラルディップ法には、Ｓ．ｖｉｒｉｄｉｓ植物の未成熟な花序をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに曝露した後、成熟した種子を回収し、それらの採取した種子から生育したトランスジェニック植物を同定することが含まれる。しかしながら、ｉｎ ｐｌａｎｔａフローラルディップ法では、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染の前後に植物を生育及び維持するための生育チャンバーまたは温室スペースが必要である。
【0211】
本明細書では、Ｓｅｔａｒｉａ種子のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換のための新規なアプローチについて説明する。上記の実施例に記載の切除されたトウモロコシ及びコムギの胚外植片システムと同様に、Ｓｅｔａｒｉａ ｖｉｒｉｄｉｓ種子からの乾燥した切除された種子胚外植片を用いて、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換システムを開発する最初の試みがなされた。しかしながら、植物に形質転換して再生する可能性はあるものの、切除されたＳｅｔａｒｉａ種子胚は非常に小さく、取り扱いが困難であった。したがって、切除された種子胚外植片の代わりに、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換のために、完全または粉砕Ｓｅｔａｒｉａ ｖｉｒｉｄｉｓ種子を使用する代替アプローチが開発された。形質転換されたＳｅｔａｒｉａ植物を培養し、トウモロコシ及びコムギ種子胚外植片の培養及び再生について本明細書に記載されたシステム及び方法と同様の出芽誘導及び再生プロトコルを使用して、接種された完全または粉砕種子から植物に再生した。
【0212】
Ｓｅｔａｒｉａの粉砕種子の調製
最大１０ｍＬのＳｅｔａｒｉａ種子（約５～１０グラム）を、殺菌のために３０ｍＬの７０％エタノールを含む５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに入れた。振とう後、種子を２００ｍＬ～４００ｍＬの使い捨てプラスチックビーカーに注ぎ、２分間インキュベートした。次いで、エタノールを３５ｍｌピペットで除去した。Ｓｅｔａｒｉａ種子の場合、総エタノール接触時間は４分未満に制御されることが好ましい。次いで、種子を約２００ｍｌの滅菌水で３回すすいだ。あるいは、種子を１０％漂白剤と０．１％のＴｗｅｅｎ ２０で３分間殺菌し、その後、滅菌水で３回すすいだ。殺菌した種子を滅菌水に少なくとも３時間浸漬して、再水和し、種子を柔らかくした後にローリング及び粉砕工程を行った。殺菌して再水和した種子を清潔なプラスチックシートに移し、単一の層に広げ、第２のプラスチックシートで覆った。次に、２つのシート層の間の種子を、種皮の大部分が粉砕されるか開かれるまで、１Ｌボトルまたは麺棒を転がすことによって粉砕した。次に、粉砕種子を１つ以上の５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに移した。
最大１０ｍＬのＳｅｔａｒｉａ種子（約５～１０グラム）を、殺菌のために３０ｍＬの７０％エタノールを含む５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに入れた。振とう後、種子を２００ｍＬ～４００ｍＬの使い捨てプラスチックビーカーに注ぎ、２分間インキュベートした。次いで、エタノールを３５ｍｌピペットで除去した。Ｓｅｔａｒｉａ種子の場合、総エタノール接触時間は４分未満に制御されることが好ましい。次いで、種子を約２００ｍｌの滅菌水で３回すすいだ。あるいは、種子を１０％漂白剤と０．１％のＴｗｅｅｎ ２０で３分間殺菌し、その後、滅菌水で３回すすいだ。殺菌した種子を滅菌水に少なくとも３時間浸漬して、再水和し、種子を柔らかくした後にローリング及び粉砕工程を行った。殺菌して再水和した種子を清潔なプラスチックシートに移し、単一の層に広げ、第２のプラスチックシートで覆った。次に、２つのシート層の間の種子を、種皮の大部分が粉砕されるか開かれるまで、１Ｌボトルまたは麺棒を転がすことによって粉砕した。次に、粉砕種子を１つ以上の５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに移した。
【0213】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の調製
約０．５ｍＬの解凍したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのグリセロールストックを、滅菌１Ｌフラスコ中の５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン及び３０ｍｇ／Ｌのゲンタマイシン選別を含む２００ｍＬの液体ＬＢ培地に接種した。フラスコを２００ｒｐｍに設定したオービタルシェーカー／インキュベーターに置き、２８℃で暗所で１６～２４時間、または接種物の６６０ｎｍでの吸光度（ＯＤ６６０）が０．６～１．０の範囲内になるまで培養した。一晩Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの培養物を約３，０００ｒｐｍまたは２，６２０×ｇ（Ｓｏｒｖａｌｌ（登録商標）３Ｂ、６０００Ａローター）で、４℃で２５分間遠心分離した後、ペレットを２／５濃度のＢ５マクロ塩、１／１０のＢ５ミクロ塩及びビタミン、１ｇ／Ｌの硝酸カリウム、３０ｇ／Ｌのデキストロース、及び３．９ｇ／ＬのＭＥＳ、５ｍｇ／Ｌの２，４－Ｄ、及び０．０５％のＳｉｌｗｅｔを含む接種培地に再懸濁し、最終ＯＤ６６０が約０．５になるようにした。オーキシン（２，４－Ｄ）及び界面活性剤が接種培地に使用されたとしても、これらの構成成分の一方または両方が代替的に接種培地に存在しない場合もある。
約０．５ｍＬの解凍したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのグリセロールストックを、滅菌１Ｌフラスコ中の５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン及び３０ｍｇ／Ｌのゲンタマイシン選別を含む２００ｍＬの液体ＬＢ培地に接種した。フラスコを２００ｒｐｍに設定したオービタルシェーカー／インキュベーターに置き、２８℃で暗所で１６～２４時間、または接種物の６６０ｎｍでの吸光度（ＯＤ６６０）が０．６～１．０の範囲内になるまで培養した。一晩Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの培養物を約３，０００ｒｐｍまたは２，６２０×ｇ（Ｓｏｒｖａｌｌ（登録商標）３Ｂ、６０００Ａローター）で、４℃で２５分間遠心分離した後、ペレットを２／５濃度のＢ５マクロ塩、１／１０のＢ５ミクロ塩及びビタミン、１ｇ／Ｌの硝酸カリウム、３０ｇ／Ｌのデキストロース、及び３．９ｇ／ＬのＭＥＳ、５ｍｇ／Ｌの２，４－Ｄ、及び０．０５％のＳｉｌｗｅｔを含む接種培地に再懸濁し、最終ＯＤ６６０が約０．５になるようにした。オーキシン（２，４－Ｄ）及び界面活性剤が接種培地に使用されたとしても、これらの構成成分の一方または両方が代替的に接種培地に存在しない場合もある。
【0214】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの接種及び共培養
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の調製工程からの約３０ｍｌのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの懸濁液を、Ｓｅｔａｒｉａの粉砕種子の調製工程からの粉砕種子を含むＦａｌｃｏｎチューブに加えた。次に、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ／粉砕種子の混合物をＳｏｒｖａｌｌ ５Ｂで約６９０～１５００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。遠心分離後、チューブを撹拌して粉砕種子を再懸濁し、再懸濁した粉砕種子を容器に注ぎ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液の大部分をピペッティングにより除去した。
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の調製工程からの約３０ｍｌのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの懸濁液を、Ｓｅｔａｒｉａの粉砕種子の調製工程からの粉砕種子を含むＦａｌｃｏｎチューブに加えた。次に、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ／粉砕種子の混合物をＳｏｒｖａｌｌ ５Ｂで約６９０～１５００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。遠心分離後、チューブを撹拌して粉砕種子を再懸濁し、再懸濁した粉砕種子を容器に注ぎ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液の大部分をピペッティングにより除去した。
【0215】
接種した粉砕種子（出発種子の約２００～３００）を、上記のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ接種物の調製工程に記載された接種培地１．２５ｍｌで湿らせた滅菌ワットマン＃１濾紙（８２ｍｍ）を１枚含む深ペトリ皿に移し、均一に単一の層に広げた。共培養プレートを２３℃、相対湿度約７０％で、明期１６時間／暗期８時間の光周期で３～８日間インキュベートした。
【0216】
選別及びシュート／根の再生
共培養後、粉砕種子を含む濾紙を、ＭＳ基礎塩、Ｂ５ビタミン、２ｍｇ／Ｌのグリシン、６９０ｍｇ／Ｌのプロリン、１ｇ／Ｌのカゼイン加水分解物、３０ｇ／Ｌのスクロース、１ｇ／ＬのＭＥＳ、１ｍｇ／Ｌの２，４－Ｄ、１０ｍｇ／ＬのＢＡＰ、２００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、１００ｍｇ／Ｌのチカルシリン、２００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、及び３．５ｇ／Ｌのアガロース、ｐＨ５．８を含み、１０μＭのグリホサート選択を含むまたは含まないシュート／出芽誘導培地に移した。これらの実験ではシュート／出芽誘導培地にオーキシンを使用しなかったが、少量のオーキシンを代替的に使用してもよい。培養プレートを、２８℃に設定したＰｅｒｃｉｖａｌインキュベーター内で、明期１６時間／暗期８時間の光周期でインキュベートした。膨張及び伸長した種子外植片を、ＭＳ基礎塩、Ｂ５ビタミン、２ｍｇ／Ｌのグリシン、６９０ｍｇ／Ｌのプロリン、３０ｇ／Ｌのスクロース、１ｇ／ＬのＭＥＳ、４００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、１００ｍｇ／Ｌのチカルシリン、２００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、３０μＭのグリホサート、及び３．５ｇ／Ｌのアガロース、ｐＨ５．８を含む第１の再生培地；またはＭＳ基礎塩、ＭＳビタミン、６９０ｍｇ／Ｌのプロリン、３０ｇ／Ｌのスクロース、１ｇ／ＬのＭＥＳ、４００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、１００ｍｇ／Ｌのチカルシリン、２００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、３０μＭのグリホサート、及び３．５ｇ／Ｌのアガロース、ｐＨ５．８を含む第２の再生培地のいずれかに移した。実験３では、第１の再生培地で４週間後、緑色の複数のシュートを５０μＭのグリホサートを含む同じ再生培地で継代培養した。継代培養後２～３週間で、この培地上で暗緑色のシュートが観察され、発根培地（同じ培地、または約０．１～０．２ｍｇ／ＬのＩＡＡなどの低レベルのオーキシンを含む）に移した。これらの実験の一部では発根培地にオーキシンが使用されている場合があるが、発根培地にはオーキシンまたはサイトカイニンが含まれていなくてもよい。
共培養後、粉砕種子を含む濾紙を、ＭＳ基礎塩、Ｂ５ビタミン、２ｍｇ／Ｌのグリシン、６９０ｍｇ／Ｌのプロリン、１ｇ／Ｌのカゼイン加水分解物、３０ｇ／Ｌのスクロース、１ｇ／ＬのＭＥＳ、１ｍｇ／Ｌの２，４－Ｄ、１０ｍｇ／ＬのＢＡＰ、２００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、１００ｍｇ／Ｌのチカルシリン、２００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、及び３．５ｇ／Ｌのアガロース、ｐＨ５．８を含み、１０μＭのグリホサート選択を含むまたは含まないシュート／出芽誘導培地に移した。これらの実験ではシュート／出芽誘導培地にオーキシンを使用しなかったが、少量のオーキシンを代替的に使用してもよい。培養プレートを、２８℃に設定したＰｅｒｃｉｖａｌインキュベーター内で、明期１６時間／暗期８時間の光周期でインキュベートした。膨張及び伸長した種子外植片を、ＭＳ基礎塩、Ｂ５ビタミン、２ｍｇ／Ｌのグリシン、６９０ｍｇ／Ｌのプロリン、３０ｇ／Ｌのスクロース、１ｇ／ＬのＭＥＳ、４００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、１００ｍｇ／Ｌのチカルシリン、２００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、３０μＭのグリホサート、及び３．５ｇ／Ｌのアガロース、ｐＨ５．８を含む第１の再生培地；またはＭＳ基礎塩、ＭＳビタミン、６９０ｍｇ／Ｌのプロリン、３０ｇ／Ｌのスクロース、１ｇ／ＬのＭＥＳ、４００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、１００ｍｇ／Ｌのチカルシリン、２００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、３０μＭのグリホサート、及び３．５ｇ／Ｌのアガロース、ｐＨ５．８を含む第２の再生培地のいずれかに移した。実験３では、第１の再生培地で４週間後、緑色の複数のシュートを５０μＭのグリホサートを含む同じ再生培地で継代培養した。継代培養後２～３週間で、この培地上で暗緑色のシュートが観察され、発根培地（同じ培地、または約０．１～０．２ｍｇ／ＬのＩＡＡなどの低レベルのオーキシンを含む）に移した。これらの実験の一部では発根培地にオーキシンが使用されている場合があるが、発根培地にはオーキシンまたはサイトカイニンが含まれていなくてもよい。
【0217】
最初の形質転換実験（実験１）では、粉砕種子に、２つの発現カセット（１つ目はスコアリングマーカーとしてβ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードし、２つ目は選別マーカーとしてＣＰ４ ＥＰＳＰＳをコードする）を含む第１のＴｉプラスミド構築物を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞を接種した。ｕｉｄＡ（ＧＵＳ）遺伝子は、ジャガイモのＬＳ１（光誘導性遺伝子）の第２のイントロンを含み、イネアクチン１プロモーター、ＣａＭＶ由来の重複された３５Ｓ Ａ１－Ｂ３ドメインのエンハンサー、コムギ主要クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質の５’非翻訳リーダー、イネアクチン１遺伝子由来のイントロン、及びｍＲＮＡのポリアデニル化を指示するように機能するジャガイモプロテイナーゼ阻害剤ＩＩ遺伝子の３’ＵＴＲの制御下にあった。ＣＰ４ ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするａｒｏＡ遺伝子は、イネアクチン１遺伝子のプロモーター、リーダー、及びイントロン、ならびにｍＲＮＡのポリアデニル化を指示すように機能するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｔｉプラスミドのノパリンシンターゼ遺伝子の３’ＵＴＲの制御下にあった。ＥＰＳＰＳタンパク質は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＥＰＳＰＳ遺伝子由来の融合したトランジットペプチドによって葉緑体を標的とした。第１のＴｉプラスミド構築物と同じ２つのＧＵＳ及びＥＰＳＰＳ発現カセットを含む第２のＴｉプラスミド構築物を保持するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞を用いて、２つの追加の実験（実験２及び３）を実施した。各実験には約５グラムのＳｅｔａｒｉａ種子を使用した。
【0218】
表３６は、実験の詳細と、粉砕種子を使用した３つの形質転換実験すべての結果をまとめたものである。実験１では、粉砕種子を接種工程中に１，５００×ｇの遠心力に供し、８日間共培養し、選別せずに約２１日間シュート／出芽誘導培地に移し、次いで３０μＭのグリホサート選別を含む第２の再生培地で約６週間再生した。実験２では、粉砕種子を接種工程中に８００×ｇの遠心力に供し、４日間共培養し、約１７日間、１０μＭのグリホサート選別を含むシュート／出芽誘導培地に移し、次いで３０μＭのグリホサート選別を含む第１の再生培地で約５週間再生した。実験３では、粉砕種子を接種工程中に８００×ｇの遠心力に供し、８日間共培養し、約２３日間、１０μＭのグリホサート選別を含むシュート／出芽誘導培地に移し、次いで、３０μＭのグリホサート選別を含む第１の再生培地で約４週間の第１の再生工程の後、５０μＭのグリホサート選別を含む第１の再生培地で約３週間の第２の再生工程に供した。実験１から１つのトランスジェニック（ＧＵＳ＋）植物が得られ、実験２及び３から３つのトランスジェニック（ＧＵＳ＋）植物が得られた。
表３６．粉砕したＳｅｔａｒｉａ種子のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換の概要。
表３６．粉砕したＳｅｔａｒｉａ種子のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換の概要。
【表36】
【0219】
外植片、及び実験１からのトランスジェニック挿入物を有する再生植物の画像も図６に示す。接種から８週間後、ふさふさしたシュート塊が得られ、ＧＵＳ染色によって確認された（図６Ａ及び６Ｂ）。再生植物を温室で生育し（図６Ｄ）、種子を収穫した。サザンブロットハイブリダイゼーションでは、ＣＰ４でプローブした場合、事象が導入遺伝子の単一コピーを含むことが示された（図６Ｃ）。
【0220】
実施例１８
Ｓｅｔａｒｉａ ｖｉｒｉｄｉｓ完全種子のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介直接形質転換
種子を粉砕したり胚外植片を切除したりすることなく、完全種子またはインタクトな種子を形質転換することには利点がある。この可能性を試験するために、完全種子またはインタクトな種子を、種皮のみを除去して形質転換に使用した。トレイの底に敷かれたプラスチックの引き出しライナーと、別のうねのあるプラスチックライナーで包まれたボール紙の芯を含む手製の研磨ツールを使用して、Ｓｅｔａｒｉａ種子から種皮を除去した。Ｓｅｔａｒｉａ種子をトレイ内のライナー上に置き、ライナーで覆われたボール紙の芯で転がして種皮を機械的に緩めた（図７Ａを参照）。図７Ｂは、種皮を除去する前のＳｅｔａｒｉａ種子を示し、図７Ｃは、種皮を除去または分離した後のＳｅｔａｒｉａ種子を示す。次に、種子を別の容器に注ぎ、空気を吹きかけて種皮を除去するか、または種子を水槽に移して種皮が水面に浮くようにして種皮から種子を分離させた。次に、形質転換に使用するために種子を収集した。
Ｓｅｔａｒｉａ ｖｉｒｉｄｉｓ完全種子のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介直接形質転換
種子を粉砕したり胚外植片を切除したりすることなく、完全種子またはインタクトな種子を形質転換することには利点がある。この可能性を試験するために、完全種子またはインタクトな種子を、種皮のみを除去して形質転換に使用した。トレイの底に敷かれたプラスチックの引き出しライナーと、別のうねのあるプラスチックライナーで包まれたボール紙の芯を含む手製の研磨ツールを使用して、Ｓｅｔａｒｉａ種子から種皮を除去した。Ｓｅｔａｒｉａ種子をトレイ内のライナー上に置き、ライナーで覆われたボール紙の芯で転がして種皮を機械的に緩めた（図７Ａを参照）。図７Ｂは、種皮を除去する前のＳｅｔａｒｉａ種子を示し、図７Ｃは、種皮を除去または分離した後のＳｅｔａｒｉａ種子を示す。次に、種子を別の容器に注ぎ、空気を吹きかけて種皮を除去するか、または種子を水槽に移して種皮が水面に浮くようにして種皮から種子を分離させた。次に、形質転換に使用するために種子を収集した。
【0221】
種皮を除去した後、実施例１７で上述したように種子を１０％漂白剤と０．１％のＴｗｅｅｎ ２０で３分間殺菌し、その後、滅菌水で３回すすいだ。インタクトな種子に、第２のＴｉプラスミド構築物を有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞を接種し、シュート／出芽誘導培地中のＢＡＰ濃度が４ｍｇ／Ｌであったことを除いて、実施例１７の粉砕種子について記載のように培養した。これらの実験ではシュート／出芽誘導培地にオーキシンを使用しなかったが、少量のオーキシンを代替的に使用してもよい。各実験には約５グラムのＳｅｔａｒｉａ種子を使用した。その後、接種及び培養した種子から植物が再生された。
【0222】
図８は、完全種子またはインタクトな種子のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染後の形質転換及びシュート再生の一般的な進行を示す。表３７は、実験の詳細と、インタクトな種子を使用した３つのこれらの形質転換実験すべて（実験４、５、及び６）の結果をまとめたものである。実験４では、種子を接種工程中に８００×ｇの遠心力に供し、約４日間共培養し、約８日間、１０μＭのグリホサート選別を含むシュート／出芽誘導培地に移し、次いで３０μＭのグリホサート選別を含む第１の再生培地で約６週間再生した。実験５では、種子を接種工程中に１，５００×ｇの遠心力に供し、４日間共培養し、約１０日間、１０μＭのグリホサート選別を含むシュート／出芽誘導培地に移し、次いで３０μＭのグリホサート選別を含む第１の再生培地で約５週間再生した。実験６では、種子を接種工程中に１，５００×ｇの遠心力に供し、８日間共培養し、約１０日間、１０μＭのグリホサート選別を含むシュート／出芽誘導培地に移し、次いで、３０μＭのグリホサート選別を含む第１の再生培地で約３週間の第１の再生工程の後、５０μＭのグリホサート選別を含む第１の再生培地で約３週間の第２の再生工程に供した。実験４から２つのトランスジェニック（ＧＵＳ＋）植物が得られ、実験５からトランスジェニック（ＧＵＳ＋）植物が得られ、実験５と実験６のそれぞれで１つのトランスジェニック（ＧＵＳ＋）植物が得られた。
表３７．Ｓｅｔａｒｉａ完全種子のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換の概要。
表３７．Ｓｅｔａｒｉａ完全種子のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換の概要。
【表37】
【0223】
導入遺伝子の伝達を確認するために、形質転換植物のＲ０生殖組織及びＲ１実生をＧＵＳ発現について染色した。染色結果を図９に示す。ＧＵＳ発現は、形質転換植物の葯、花粉柱頭、小穂、及び未成熟種子、ならびに発芽したＲ１実生において観察された。２つのＧＵＳ陽性Ｓｅｔａｒｉａ植物事象からのＲ１種子をセグリゲーションについて分析した：事象１は、本実施例１８による完全種子の形質転換からのものであり、事象４は、実施例１７による粉砕種子の形質転換からのものであった。これらのＲ１種子から発芽した実生をＧＵＳ発現について染色した。表３８に示されるように、両方の事象はおよそ３：１のセグリゲーションを示し、導入遺伝子が単一遺伝子座に組み込まれたことを示している。
表３８．トランスジェニックＳｅｔａｒｉａ植物のＲ１子孫における導入遺伝子の伝達。
表３８．トランスジェニックＳｅｔａｒｉａ植物のＲ１子孫における導入遺伝子の伝達。
【表38】
【0224】
実施例１７及び１８で提供された結果は、複数のシュート／出芽誘導及び再生工程を通じた遺伝子改変単子葉植物の形質転換及び生成に使用するために、完全なもしくはインタクトな単子葉植物種子または粉砕したもしくは部分的に開いた単子葉植物種子を使用することを支持する。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換を使用した完全種子または粉砕種子の直接的な形質転換によって、トランスジェニックＳｅｔａｒｉａ ｖｅｒｄｉｓ植物を得ることができることが、本明細書において実証される。完全種子、インタクトな種子、粉砕種子、または部分的に開いた種子を使用すると、胚外植片の切除が必要でなくなることによって、単子葉植物の形質転換が大幅に促進される可能性がある。
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【手続補正書】
【提出日】2024-05-29
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
遺伝子改変単子葉植物または植物部分を作出する方法であって、分裂組織を含む単子葉植物種子胚外植片の少なくとも１つの細胞を異種ポリヌクレオチド分子で形質転換する能力を有するＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌を含む接種培地を、前記胚外植片に接種することによって、前記少なくとも１つの細胞に前記異種ポリヌクレオチド分子を導入することと、
第１のオーキシン及び第１のサイトカイニンを含む第１の出芽誘導培地と接触させて、約３３℃～約３７℃の温度で第１の期間、前記胚外植片を培養し、その後、前記第１の出芽誘導培地と接触させて、約２６℃～約３０℃の温度で第２の期間、前記胚外植片を培養することであって、前記第１の出芽誘導培地の前記第１のサイトカイニンの濃度が約５ｍｇ／Ｌ～約１５ｍｇ／Ｌであり、前記第１の出芽誘導培地の前記第１のオーキシンの濃度が約０．５ｍｇ／Ｌ～約１．５ｍｇ／Ｌである、前記培養することと、
前記胚外植片から前記遺伝子改変単子葉植物または植物部分を再生することと、を含む、前記方法。
【請求項2】
前記第１の期間または前記第２の期間が、約２日～約１４日、または約６日～約８日である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記第１のサイトカイニンが、６－ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、チジアズロン（ＴＤＺ）、カイネチン、ゼアチン、ジフェニル尿素（ＤＰＵ）、６－（γ，γ－ジメチルアリルアミノ）プリン（２ｉＰ）、及びメタ－トポリンからなる群から選択される；または前記第１のオーキシンが、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）、４－アミノ－３，５，６－トリクロロピコリン酸（ピクロラム）、インドール－３－酢酸（ＩＡＡ）、インドール－３－酪酸（ＩＢＡ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、４－クロロフェノキシ酢酸またはｐ－クロロ－フェノキシ酢酸（４－ＣＰＡまたはｐＣＰＡ）、２，４，５－トリクロロフェノキシ酢酸（２，４，５－Ｔ）、２，３，５－トリヨード安息香酸（ＴＩＢＡ）、フェニル酢酸（ＰＡＡ）、及び３，６－ジクロロ－２－メトキシ－安息香酸（ジカンバ）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記第１のサイトカイニンが、６－ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）であり、前記第１のオーキシンが、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記第１のオーキシンまたは第２のオーキシン及び前記第１のサイトカイニンまたは第２のサイトカイニンを含む第２の出芽誘導培地と接触させて前記胚外植片を培養することをさらに含み、前記第２の出芽誘導培地と接触させて前記胚外植片を前記培養することが、前記胚外植片が前記第１の出芽誘導培地と接触させて培養した後、かつ前記再生培地と接触させて前記培養した胚外植片から前記遺伝子改変単子葉植物または植物部分を再生する前に実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記胚外植片が、前記第２の出芽誘導培地と接触して約４日～約２８日間もしくは約７日～約１４日間培養されるか、または前記胚外植片が、前記第２の出芽誘導培地と接触して約２０℃～約３２℃、約２５℃～約２９℃、もしくは約２７℃～約２８℃の温度で培養される、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記第２の出芽誘導培地が、高いサイトカイニン対オーキシン比を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項8】
前記遺伝子改変単子葉植物が、トウモロコシ植物、コムギ植物、イネ植物、オオムギ植物、芝草植物、またはソルガム植物である、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記胚外植片を共培養培地と接触させて前記Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌と共培養すること、または前記接種培地中で、もしくは前記胚外植片に前記接種培地を接種する前に、前記胚外植片に力処理を適用することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
遺伝子改変単子葉植物または植物部分を作出する方法であって、分裂組織を含む単子葉植物種子胚外植片の少なくとも１つの細胞を異種ポリヌクレオチド分子で形質転換する能力を有するＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌を含む接種培地を、前記胚外植片に接種することによって、前記少なくとも１つの細胞に前記異種ポリヌクレオチド分子を導入することと、
前記胚外植片に圧力処理及び重力処理を適用することと、
第１のオーキシン及び第１のサイトカイニンを含む第１の出芽誘導培地と接触させて、約３３℃～約３７℃の温度で前記胚外植片を培養することと、
前記胚外植片から前記遺伝子改変単子葉植物または植物部分を再生することと、を含む、前記方法。
【請求項11】
前記接種培地と接触させて前記胚外植片に前記圧力処理及び前記重力処理を適用すること、前記胚外植片に前記接種培地を接種する前に、前記胚外植片に前記圧力処理及び前記重力処理を適用すること、
前記重力処理の前に前記圧力処理を適用すること、
前記圧力処理の前に前記重力処理を適用すること、
前記胚外植片に前記重力処理を約１分間～約２時間、約２分間～約１１０分間、約５分間～約９０分間、約１０分間～約６０分間、もしくは約２０分間～約４０分間適用すること、または
前記胚外植片に前記圧力処理を約１０秒間～約１０分間、約１５秒間～約８分間、約３０秒間～約６分間、もしくは約２分間～約４分間適用することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記重力処理を適用することが、約１００×ｇ～約１０，０００×ｇ、約５００×ｇ～約３，０００×ｇ、約６５５×ｇ、もしくは約２６２０×ｇの力を適用することを含む、または前記圧力処理を適用することが、約１００ｐｓｉ～約１，０００ｐｓｉ、約１２５ｐｓｉ～約７５０ｐｓｉ、約１５０ｐｓｉ～約５００ｐｓｉ、約２００ｐｓｉ～約４００ｐｓｉ、もしくは約３００ｐｓｉの力を適用することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項13】
前記Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌が、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ細菌、Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ細菌、Ｂｒｕｃｅｌｌａｃｅａｅ細菌、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ細菌、Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ細菌、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細菌、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ細菌、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ細菌、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ細菌、Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細菌、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ細菌、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ細菌、及びＡｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ細菌からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項14】
前記接種培地中のＲｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌のＯＤ６６０が、約０．５～約２．０、約０．７５～約１．２５、または約１．０である、請求項１０に記載の方法。
【請求項15】
前記胚外植片を共培養培地と接触させて前記Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌と共培養することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項16】
前記共培養培地中の前記Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌のＯＤ６６０が、約０．５～約２．０、約０．７５～約１．２５、または約１．０である、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記遺伝子改変単子葉植物が、トウモロコシ植物、コムギ植物、イネ植物、オオムギ植物、芝草植物、またはソルガム植物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項18】
遺伝子改変単子葉植物または植物部分を作出する方法であって、分裂組織を含む単子葉植物種子胚外植片の少なくとも１つの細胞に異種ポリヌクレオチド分子を導入することと、
第１のオーキシン及び第１のサイトカイニンを含む第１の出芽誘導培地と接触させて、前記胚外植片を培養することと、
再生培地と接触して前記培養した胚外植片から前記遺伝子改変単子葉植物または植物部分を再生することであって、前記再生培地が、約０．５ｍＭ～約２０ｍＭの総窒素濃度を含む、前記再生することと、を含む、前記方法。
【請求項19】
前記再生培地が、約２８００ｍｇ／Ｌ未満、約２５００ｍｇ／Ｌ未満、もしくは約２２００ｍｇ／Ｌ～約２５００ｍｇ／Ｌの範囲内の総塩濃度、
約０．５ｍＭ～約２０ｍＭの硝酸イオン濃度、
約０．５ｍＭ～約１５ｍＭのアンモニウムイオン濃度、
約０．５ｍＭ～約１５ｍＭのカリウムイオン濃度、
約５ｍＭ以上の硫酸イオン濃度、
約１００ｍｇ／Ｌ～約１０００ｍｇ／Ｌの硝酸アンモニウム濃度、
約１００ｍｇ／Ｌ以下の塩化カルシウム濃度、
約５００ｍｇ／Ｌ以下の硝酸カルシウム濃度、または
約５００ｍｇ／Ｌ以上の硫酸カリウム濃度を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記遺伝子改変単子葉植物または植物部分を、約２０℃～約３２℃、約２５℃～約２９℃、もしくは約２７℃～約２８℃の温度で再生すること、または前記遺伝子改変単子葉植物または植物部分を、約２０日～約５０日間もしくは約２８日～約４２日間再生することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項21】
前記第１のオーキシンまたは第２のオーキシン、及び前記第１のサイトカイニンまたは第２のサイトカイニンを含む第２の出芽誘導培地と接触させて前記胚外植片を培養することをさらに含み、前記第２の出芽誘導培地と接触させて前記胚外植片を培養することが、前記胚外植片が前記第１の出芽誘導培地と接触させて培養した後、かつ前記再生培地と接触させて前記培養した胚外植片から前記遺伝子改変単子葉植物または植物部分を再生する前に実施される、請求項１８に記載の方法。
【請求項22】
前記胚外植片を共培養培地と接触させて前記Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ細菌と共培養すること、または前記接種培地中で、もしくは前記胚外植片に前記接種培地を接種する前に、前記胚外植片に力処理を適用することをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項23】
前記遺伝子改変単子葉植物が、トウモロコシ植物、コムギ植物、イネ植物、オオムギ植物、芝草植物、またはソルガム植物である、請求項１８に記載の方法。
【国際調査報告】