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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-08
(54)【発明の名称】抗ＬＡＧ３抗体、医薬組成物、及び使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20241001BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241001BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241001BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241001BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241001BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241001BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20241001BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241001BHJP
C07K 1/14 20060101ALI20241001BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241001BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20241001BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241001BHJP
A61P 7/06 20060101ALI20241001BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20241001BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C12N15/13
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
C12N15/63 Z
C07K1/14
A61K39/395 N
A61K47/68
A61K39/395 L
A61P35/00
A61P7/06
A61P35/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024519329
(86)(22)【出願日】2022-09-28
(85)【翻訳文提出日】2024-05-27
(86)【国際出願番号】 CN2022122185
(87)【国際公開番号】W WO2023051621
(87)【国際公開日】2023-04-06
(31)【優先権主張番号】202111149114.9
(32)【優先日】2021-09-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】519063026
【氏名又は名称】中山康方生物医▲藥▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＡＫＥＳＯ ＢＩＯＰＨＡＲＭＡ，ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】６ Ｓｈｅｎｎｏｎｇ Ｒｏａｄ，Ｔｏｒｃｈ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｚｏｎｅ Ｚｈｏｎｇｓｈａｎ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５２８４３７ （ＣＮ）
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100231902
【弁理士】
【氏名又は名称】吉田 李花
(72)【発明者】
【氏名】ユイ シア
(72)【発明者】
【氏名】チョンミン ワン
(72)【発明者】
【氏名】チャン ポン
(72)【発明者】
【氏名】パイヨン リー
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA02
4B064CA05
4B064CA06
4B064CA08
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA13
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA57X
4B065AA57Y
4B065AA72X
4B065AA72Y
4B065AA83X
4B065AA83Y
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BD14
4B065CA44
4B065CA46
4C076AA95
4C076CC14
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF68
4C085AA14
4C085AA27
4C085BB11
4C085BB31
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
4H045GA21
(57)【要約】
本発明は生物医学の分野に属し、抗ＬＡＧ３抗体、それを含む医薬組成物、及びその使用に関する。具体的には、本発明は、抗ＬＡＧ３抗体又はその抗原結合性断片であって、前記抗体が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域が、配列番号９～１１に示されるアミノ酸配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が、配列番号１２～１４に示されるアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む、抗ＬＡＧ３抗体又はその抗原結合性断片に関する。本発明の抗ＬＡＧ３抗体は優れた親和性と特異性を有し、応用性に優れている。
【選択図】 図１
【選択図】 図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、抗ＬＡＧ３抗体又はその抗原結合性断片であって、前記重鎖可変領域が、配列番号９～１１に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１２～１４に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む；
前記重鎖可変領域が、配列番号９～１１に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１２、配列番号１５、及び配列番号１６に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む；又は、
前記重鎖可変領域が、配列番号９～１１に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１７、配列番号１５、及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む、抗ＬＡＧ３抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項2】
請求項１に記載の抗体又はその抗原結合性断片であって、前記抗体の前記重鎖可変領域が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、前記抗体の前記軽鎖可変領域が、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する；
前記抗体の前記重鎖可変領域が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、前記抗体の前記軽鎖可変領域が、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する；又は、
前記抗体の前記重鎖可変領域が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、前記抗体の前記軽鎖可変領域が、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する、抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項3】
前記抗体又はその抗原結合性断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補性決定領域断片、単鎖可変領域断片、ヒト化抗体、又はキメラ抗体から選択される、請求項１～２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項4】
前記抗体が、ヒトＬＡＧ３－ｍＦｃに対して、０．２ｎＭ未満、例えば、０．１５ｎＭ未満、０．１ｎＭ未満、０．０８ｎＭ未満、０．０６ｎＭ未満、もしくは０．０５ｎＭ未満、又はそれ以下のＥＣ５０値で結合し、好ましくは前記ＥＣ５０値が間接ＥＬＩＳＡによって測定される、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項5】
前記抗体が、マウス以外の種に由来する、例えば、ヒト抗体に由来する非ＣＤＲ領域を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項6】
前記抗体がヒト抗体に由来する定常領域を含み；好ましくは、前記抗体の前記定常領域がヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４の定常領域から選択される、
請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項7】
前記抗ＬＡＧ３抗体の重鎖定常領域が、Ｉｇガンマ－１鎖Ｃ領域（例えば、配列番号１８に記載されている）又はＩｇガンマ－４鎖Ｃ領域（例えば、配列番号２０に記載されている）であり、前記抗ＬＡＧ３抗体の軽鎖定常領域が、Ｉｇカッパ鎖Ｃ領域（例えば、配列番号１９に記載されている）である、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項8】
抗体又はその抗原結合性断片、及び小分子薬を含む、抗体薬物複合体であって、前記抗体又はその抗原結合性断片が、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片であり；好ましくは前記小分子薬が小分子細胞毒性薬であり；より好ましくは前記小分子薬が抗腫瘍化学療法薬である、抗体薬物複合体。
【請求項9】
前記抗体又はその抗原結合性断片が、リンカーを介して前記小分子薬に連結しており、例えば、前記リンカーがヒドラゾン結合、ジスルフィド結合、又はペプチド結合である、請求項８に記載の抗体薬物複合体。
【請求項10】
前記抗体又はその抗原結合性断片の前記小分子薬に対するモル比が、１：（２～４）である、請求項８又は９に記載の抗体薬物複合体。
【請求項11】
請求項１～７のいずれか１項に記載の抗ＬＡＧ３抗体をコードする、単離核酸分子。
【請求項12】
請求項１１に記載の単離核酸分子を含む、組換えベクター。
【請求項13】
請求項１１に記載の単離核酸分子又は請求項１２に記載の組換えベクターを含む、宿主細胞。
【請求項14】
請求項１３に記載の宿主細胞を適した条件下で培養すること、及び細胞培養物から前記抗体又はその抗原結合性断片を単離することを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片を調製する方法。
【請求項15】
請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、又は請求項８～１０のいずれか１項に記載の抗体薬物複合体を含む医薬組成物であって、前記医薬組成物が任意に、薬理学的に許容される副原料をさらに含む、医薬組成物。
【請求項16】
腫瘍又は貧血を治療及び／又は予防するための薬剤の調製における、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、又は請求項８～１０のいずれか１項に記載の抗体薬物複合体の使用であって、好ましくは前記腫瘍が、卵巣がん、食道がん、メラノーマ、血液悪性腫瘍、膠芽腫、腎細胞がん、肺がん、前立腺がん、膀胱がん、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、消化器がん、乳がん、脳腫瘍、膵臓がん、甲状腺がん、頭頸部がん、及び腎臓がんの１つ又は複数から選択され；
好ましくは、前記肺がんが非小細胞肺がんであり；
好ましくは、前記血液悪性腫瘍が白血病であり；
好ましくは、前記食道がんが食道扁平上皮がんである、抗体もしくはその抗原結合性断片又は抗体薬物複合体の使用。
【請求項17】
腫瘍又は貧血の治療及び／又は予防において使用するための、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、又は請求項８～１０のいずれか１項に記載の抗体薬物複合体であって、好ましくは前記腫瘍が、卵巣がん、食道がん、メラノーマ、血液悪性腫瘍、膠芽腫、腎細胞がん、肺がん、前立腺がん、膀胱がん、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、消化器がん、乳がん、脳腫瘍、膵臓がん、甲状腺がん、頭頸部がん、及び腎臓がんの１つ又は複数から選択され；
好ましくは、前記肺がんが非小細胞肺がんであり；
好ましくは、前記血液悪性腫瘍が白血病であり；
好ましくは、前記食道がんが食道扁平上皮がんである、抗体もしくはその抗原結合性断片又は抗体薬物複合体。
【請求項18】
腫瘍又は貧血を治療及び／又は予防する方法であって、前記方法が、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、又は請求項８～１０のいずれか１項に記載の抗体薬物複合体の有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含み、好ましくは前記腫瘍が、卵巣がん、食道がん、メラノーマ、血液悪性腫瘍、膠芽腫、腎細胞がん、肺がん、前立腺がん、膀胱がん、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、消化器がん、乳がん、脳腫瘍、膵臓がん、甲状腺がん、頭頸部がん、及び腎臓がんの１つ又は複数から選択され；
好ましくは、前記肺がんが非小細胞肺がんであり；
好ましくは、前記血液悪性腫瘍が白血病であり；
好ましくは、前記食道がんが食道扁平上皮がんである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は生物医学の分野に属し、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体を含む医薬組成物、及びそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
腫瘍、特に悪性腫瘍は、今日では、健康を脅かす世界的に深刻な疾患であり、各種疾患の中でも死因の第２位となっている。近年、これら疾患の罹患率が著しく増加している。悪性腫瘍は、治療反応性が悪く、後期の転移率が高く、また、予後が不良であることが特徴である。現在臨床的に採用されている従来の治療方法（例えば、放射線療法、化学療法、及び外科治療など）は、疼痛を大幅に緩和し、生存時間を延長するものであるが、それらの方法には大きな制約があり、それらの有効性をさらに向上させるのは困難である。
【0003】
リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、すなわちＣＤ２２３は、４９８アミノ酸から構成されるＩ型膜貫通タンパク質であり、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）のメンバーである。ＬＡＧ３は主に、活性化ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞で発現している。また、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）、及び形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣｓ）などの細胞においてもＬＡＧ３が発現している（Ｒｕｆｆｏ Ｅｌｉｓａ， Ｗｕ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｃ， Ｂｒｕｎｏ Ｔｕｌｌｉａ Ｃ ｅｔ ａｌ．， Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ ３ （ＬＡＧ３）： Ｔｈｅ ｎｅｘｔ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ． ［Ｊ］．Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２０１９， ４２： １０１３０５．）。
【0004】
ＬＡＧ３分子遺伝子はヒト第１２染色体（２０ｐ１３．３）上でＣＤ４分子遺伝子に隣接して位置し、両者とも同じエクソンとイントロンを有する。ＬＡＧ３分子とＣＤ４分子は構造的に類似性が高いが、両者間のアミノ酸配列相同性は２０％程度しかない。主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ（ＭＨＣ ＩＩ）分子、肝類洞内皮細胞レクチン（ＬＳＥＣｔｉｎ）分子、及びガレクチン－３分子はＬＡＧ３分子に対する関連リガンドである。ＭＨＣクラスＩＩ分子はＬＡＧ３に対する主要リガンドである。ＭＨＣクラスＩＩ分子に対するＬＡＧ３分子の親和性（Ｋｄ：６０ｎｍｏｌ・Ｌ－１）はＣＤ４分子のものと比較して１００倍であり、このことは、ＬＡＧ３分子が、ＭＨＣクラスＩＩ分子への結合に関してＣＤ４分子と効果的に競合し、Ｔ細胞活性化を阻害しうるということを示している。
【0005】
腫瘍微小環境内においては、Ｔ細胞活性化の２４時間後に免疫抑制分子ＬＡＧ３の発現を検出することができ、これがひいてはＴ細胞の機能不全又はアポトーシスをもたらす。ＬＡＧ３分子は、そのＤ１ドメイン（プロリンに富む１個のループ構造を有する）を介して二量体を形成し、ＣＤ４＋ Ｔ細胞活性化の第１シグナル伝達軸（ｆｉｒｓｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｘｉｓ）である「ＣＤ３－ＴＣＲ－ＭＨＣＩＩ」においてＭＨＣクラスＩＩ分子に特異的に結合する。それにより、一方ではＴ細胞活性化のためのシグナル伝達経路がブロックされ、他方ではＬＡＧ３分子の細胞内セグメント（ＫＩＥＥＬＥモチーフ）が免疫抑制シグナルを生成して、ＣＤ４＋ Ｔ細胞の活性を下方制御する。ＬＡＧ３分子はＴｒｅｇ細胞の分化を促進し、シグナル伝達兼転写活性化因子５の下流シグナル伝達に関与し、それによってＴｒｅｇ細胞の阻害効果を増強することができる。これは、腫瘍が免疫系による殺傷を回避するメカニズムの１つである（Ａｎｄｒｅｗｓ Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｐ， Ｍａｒｃｉｓｃａｎｏ Ａｒｉｅｌ Ｅ， Ｄｒａｋｅ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｇ， ｅｔ ａｌ．， ＬＡＧ３ （ＣＤ２２３） ａｓ ａ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｔａｒｇｅｔ． ［Ｊ］． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ， ２０１７， ２７６： ８０－９６．）。
【0006】
各種悪性腫瘍の腫瘍浸潤ＣＤ８＋ Ｔ細胞においてＬＡＧ３が過剰発現していることが、複数の研究によって示されている。例えば、卵巣がんにおいては、ニューヨーク食道扁平上皮がん１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）抗原特異的腫瘍浸潤ＣＤ８＋ Ｔ細胞が、ＰＤ－１及びＬＡＧ３を高度に発現し、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αを産生する能力が減少しており、そのためリンパ球が不活性化されている。ガレクチン－３及びＬＳＥＣｔｉｎは、主にＬＡＧ３と相互作用し、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化と機能を調節する。また、転移性メラノーマの患者から単離されたメラノーマ抗原特異的Ｔ細胞は、ＬＡＧ３並びに他の免疫チェックポイント分子ＣＴＬＡ－４及びＴＩＭ－３の発現の有意な上方制御を示す（Ｌｉｕ Ｈａｏ， Ｌｉ Ｘｉｎｙｉｎｇ， Ｌｕｏ Ｌｏｎｇｌｏｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ－３ （ＬＡＧ－３） ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＬＡＧ－３ ［Ｊ］． Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ， ２０１９， ３３（０１）： ７０－７８．）。
【0007】
現在、複数のＬＡＧ３抗体薬が臨床研究段階に入っており、それらのうち、Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ社のレラトリマブは１０件の臨床研究が進行中であり、最も進展が見られる。これらの研究の大部分は、血液悪性腫瘍、メラノーマ、神経膠芽腫、腎細胞がん、非小細胞肺がん、及び同種のものなどの腫瘍の治療に用いられる、レラトリマブとニボルマブの併用療法を伴う。
【0008】
現在、新規抗ＬＡＧ３抗体薬の開発が必要とされている。
【発明の概要】
【0009】
本願発明者らは鋭意研究を重ね、創造的な努力を行うことによって、抗ＬＡＧ３抗体を得た。本願発明者らは驚くべきことに、本発明の抗ＬＡＧ３抗体（以下、前記抗体又は本発明の抗体と略す場合がある）が優れた親和性及び／又は特異性を有し、陽性対照抗体（例えば、レラトリマブ）と比べても１つ以上の点においてさらに優れたものであることを見出した。本発明を以下に詳細に説明する。
【0010】
本発明の一態様は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、抗ＬＡＧ３抗体又はその抗原結合性断片（ａｎ ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）であって、
前記重鎖可変領域が、配列番号９～１１に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１２～１４に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む；
前記重鎖可変領域が、配列番号９～１１に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１２、配列番号１５、及び配列番号１６に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む；又は、
前記重鎖可変領域が、配列番号９～１１に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１７、配列番号１５、及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む、抗ＬＡＧ３抗体又はその抗原結合性断片に関する。
前記重鎖可変領域が、配列番号９～１１に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１２～１４に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む；
前記重鎖可変領域が、配列番号９～１１に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１２、配列番号１５、及び配列番号１６に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む；又は、
前記重鎖可変領域が、配列番号９～１１に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１７、配列番号１５、及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含む、抗ＬＡＧ３抗体又はその抗原結合性断片に関する。
【0011】
本発明のいくつかの実施形態では、
前記抗体の前記重鎖可変領域が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、前記抗体の前記軽鎖可変領域が、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する；
前記抗体の前記重鎖可変領域が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、前記抗体の前記軽鎖可変領域が、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する；又は、
前記抗体の前記重鎖可変領域が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、前記抗体の前記軽鎖可変領域が、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する、
前記抗体又はその抗原結合性断片が提供される。
前記抗体の前記重鎖可変領域が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、前記抗体の前記軽鎖可変領域が、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する；
前記抗体の前記重鎖可変領域が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、前記抗体の前記軽鎖可変領域が、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する；又は、
前記抗体の前記重鎖可変領域が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、前記抗体の前記軽鎖可変領域が、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する、
前記抗体又はその抗原結合性断片が提供される。
【0012】
本発明のいくつかの実施形態では、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補性決定領域断片、単鎖可変領域断片（ａ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｖａｒｉａｂｌｅ）、ヒト化抗体、又はキメラ抗体から選択される、前記抗体又はその抗原結合性断片が提供される。
【0013】
本発明のいくつかの実施形態では、前記抗体が、ヒトＬＡＧ３－ｍＦｃに対して、０．２ｎＭ未満、例えば、０．１５ｎＭ未満、０．１ｎＭ未満、０．０８ｎＭ未満、０．０６ｎＭ未満、もしくは０．０５ｎＭ未満、又はそれ以下のＥＣ５０値で結合し、好ましくは前記ＥＣ５０値が間接ＥＬＩＳＡによって測定される、前記抗体又はその抗原結合性断片が提供される。
【0014】
本発明のいくつかの実施形態では、前記抗体が、マウス以外の種に由来する、例えば、ヒト抗体に由来する非ＣＤＲ領域を含む、前記抗体又はその抗原結合性断片が提供される。
【0015】
本発明のいくつかの実施形態では、
前記抗体がヒト抗体に由来する定常領域を含み、
好ましくは、前記抗体の定常領域がヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４の定常領域から選択される、
前記抗体又はその抗原結合性断片が提供される。
前記抗体がヒト抗体に由来する定常領域を含み、
好ましくは、前記抗体の定常領域がヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４の定常領域から選択される、
前記抗体又はその抗原結合性断片が提供される。
【0016】
本発明のいくつかの実施形態では、前記抗ＬＡＧ３抗体の重鎖定常領域が、Ｉｇガンマ－１鎖Ｃ領域（例えば、配列番号１８に記載されている）又はＩｇガンマ－４鎖Ｃ領域（例えば、配列番号２０に記載されている）であり、前記抗ＬＡＧ３抗体の軽鎖定常領域が、Ｉｇカッパ鎖Ｃ領域（例えば、配列番号１９に記載されている）である、抗体又はその抗原結合性断片が提供される。
【0017】
本発明のいくつかの実施形態では、前記抗ＬＡＧ３抗体はモノクローナル抗体である。
【0018】
本発明のいくつかの実施形態では、前記抗ＬＡＧ３抗体は免疫グロブリン形態である。
【0019】
本発明のいくつかの実施形態では、前記抗ＬＡＧ３抗体は単鎖可変領域断片である。
【0020】
本発明の他の態様は、抗体又はその抗原結合性断片、及び小分子薬を含む、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）であって、前記抗体又はその抗原結合性断片が、本発明のいずれかの実施形態の抗ＬＡＧ３抗体又はその抗原結合性断片であり；好ましくは前記小分子薬が小分子細胞毒性薬であり；より好ましくは前記小分子薬が抗腫瘍化学療法薬である、抗体薬物複合体に関する。
【0021】
前記化学療法薬は、従来の抗腫瘍化学療法薬、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、植物系抗がん剤、ホルモン、及び免疫剤などであってよい。
【0022】
本発明の１つ又は複数の実施形態では、前記抗体薬物複合体が提供され、前記抗体又はその抗原結合性断片は、リンカーを介して小分子薬に連結されており、前記リンカーは当業者に公知のもの、例えば、ヒドラゾン結合、ジスルフィド結合、又はペプチド結合であってよい。
【0023】
本発明の１つ又は複数の実施形態では、前記抗体又はその抗原結合性断片の前記小分子薬に対するモル比が、１：（２～４）、例えば、１：２、１：３、又は１：４である、前記抗体薬物複合体が提供される。
【0024】
本発明のさらなる他の一態様は、本発明のいずれかの実施形態の抗ＬＡＧ３抗体をコードする、単離核酸分子に関する。
【0025】
本発明のさらなる他の一態様は、本発明の単離核酸分子を含む組換えベクターに関する。
【0026】
本発明のさらなる他の一態様は、本発明の単離核酸分子又は本発明の組換えベクターを含む、宿主細胞に関する。
【0027】
本発明のさらなる他の一態様は、本発明のいずれかの実施形態の抗体又はその抗原結合性断片を調製する方法であって、本発明の宿主細胞を適した条件下で培養すること、及び細胞培養物から前記抗体又はその抗原結合性断片を単離することを含む、方法に関する。
【0028】
本発明のさらなる他の一態様は、本発明のいずれかの実施形態の抗体もしくはその抗原結合性断片、又は本発明のいずれかの実施形態の抗体薬物複合体、を含む医薬組成物であって、前記医薬組成物が任意に、薬理学的に許容される副原料をさらに含む、医薬組成物に関する。
【0029】
本発明のさらなる他の一態様は、腫瘍又は貧血を治療及び／又は予防するための薬剤の調製における、本発明のいずれかの実施形態の抗体もしくはその抗原結合性断片、又は本発明のいずれかの実施形態の抗体薬物複合体の使用であって、
好ましくは前記腫瘍が、卵巣がん、食道がん、メラノーマ、血液悪性腫瘍、膠芽腫、腎細胞がん、肺がん、前立腺がん、膀胱がん、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、消化器がん、乳がん、脳腫瘍、膵臓がん、甲状腺がん、頭頸部がん、及び腎臓がんの１つ又は複数から選択され；
好ましくは、前記肺がんが非小細胞肺がんであり；
好ましくは、前記血液悪性腫瘍が白血病であり；
好ましくは、前記食道がんが食道扁平上皮がんである、抗体もしくはその抗原結合性断片又は抗体薬物複合体の使用に関する。
好ましくは前記腫瘍が、卵巣がん、食道がん、メラノーマ、血液悪性腫瘍、膠芽腫、腎細胞がん、肺がん、前立腺がん、膀胱がん、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、消化器がん、乳がん、脳腫瘍、膵臓がん、甲状腺がん、頭頸部がん、及び腎臓がんの１つ又は複数から選択され；
好ましくは、前記肺がんが非小細胞肺がんであり；
好ましくは、前記血液悪性腫瘍が白血病であり；
好ましくは、前記食道がんが食道扁平上皮がんである、抗体もしくはその抗原結合性断片又は抗体薬物複合体の使用に関する。
【0030】
前記の本発明のいずれかの実施形態の抗体もしくはその抗原結合性断片、又は本発明のいずれかの実施形態の抗体薬物複合体は、腫瘍又は貧血の治療及び／又は予防において使用するためのものであって、
好ましくは前記腫瘍が、卵巣がん、食道がん、メラノーマ、血液悪性腫瘍、膠芽腫、腎細胞がん、肺がん、前立腺がん、膀胱がん、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、消化器がん、乳がん、脳腫瘍、膵臓がん、甲状腺がん、頭頸部がん、及び腎臓がんの１つ又は複数から選択され；
好ましくは、前記肺がんは非小細胞肺がんであり；
好ましくは、前記血液悪性腫瘍は白血病であり；
好ましくは、前記食道がんは食道扁平上皮がんである。
好ましくは前記腫瘍が、卵巣がん、食道がん、メラノーマ、血液悪性腫瘍、膠芽腫、腎細胞がん、肺がん、前立腺がん、膀胱がん、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、消化器がん、乳がん、脳腫瘍、膵臓がん、甲状腺がん、頭頸部がん、及び腎臓がんの１つ又は複数から選択され；
好ましくは、前記肺がんは非小細胞肺がんであり；
好ましくは、前記血液悪性腫瘍は白血病であり；
好ましくは、前記食道がんは食道扁平上皮がんである。
【0031】
本発明のさらなる他の一態様は、腫瘍又は貧血を治療及び／又は予防する方法であって、本発明のいずれかの実施形態の抗体もしくはその抗原結合性断片、又は本発明のいずれかの実施形態の抗体薬物複合体の有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含み、
好ましくは前記腫瘍が、卵巣がん、食道がん、メラノーマ、血液悪性腫瘍、膠芽腫、腎細胞がん、肺がん、前立腺がん、膀胱がん、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、消化器がん、乳がん、脳腫瘍、膵臓がん、甲状腺がん、頭頸部がん、及び腎臓がんの１つ又は複数から選択され；
好ましくは、前記肺がんが非小細胞肺がんであり；
好ましくは、前記血液悪性腫瘍が白血病であり；
好ましくは、前記食道がんが食道扁平上皮がんである、方法に関する。
好ましくは前記腫瘍が、卵巣がん、食道がん、メラノーマ、血液悪性腫瘍、膠芽腫、腎細胞がん、肺がん、前立腺がん、膀胱がん、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、消化器がん、乳がん、脳腫瘍、膵臓がん、甲状腺がん、頭頸部がん、及び腎臓がんの１つ又は複数から選択され；
好ましくは、前記肺がんが非小細胞肺がんであり；
好ましくは、前記血液悪性腫瘍が白血病であり；
好ましくは、前記食道がんが食道扁平上皮がんである、方法に関する。
【0032】
本発明において、他に定義されない限り、本明細書内で使用される科学及び技術用語は、当業者が一般的に理解する意味を有する。また、本明細書で使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、及び免疫学の実験室操作は、対応する分野で広く使用されるルーチン手順である。一方、本発明の理解を促すために、関連のある語の定義及び説明を以下に提供する。
【0033】
本明細書で使用されるＥＣ５０という語は、最大効果の５０％に対する濃度、すなわち、最大効果の５０％を引き起こしうる濃度のことを指す。
【0034】
本明細書で使用される「抗体」という語は、一般に２対のポリペプチド鎖からなる（それぞれの対が１本の「軽」（Ｌ）鎖と１本の「重」（Ｈ）鎖を有する）免疫グロブリン分子のことを指す。抗体軽鎖はκ及びλ軽鎖へと分類される。重鎖はμ、δ、γ、α、又はεへと分類される。抗体のアイソタイプはＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥとして定義される。軽鎖及び重鎖において、可変領域と定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結しており、重鎖はさらに、約３以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。軽鎖定常領域は１つのドメイン、ＣＬからなる。抗体の定常領域は、免疫系の各種細胞（例えば、エフェクター細胞）の古典的な補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）への結合を含む、免疫グロブリンの宿主組織又は因子への結合を媒介することができる。ＶＨ及びＶＬ領域は、超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）にさらに細かく分けることができ、超可変領域間にはフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存的な領域が分布している。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシル末端に向けて次の順番で並んだ、３つのＣＤＲと４つのＦＲからなる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４。各重鎖／軽鎖ペアの可変領域（ＶＨ及びＶＬ）は、抗体結合部位を形成する。領域又はドメインに対するアミノ酸の割り当ては、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍ．ｄ．， Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， （１９８７及び１９９１））もしくはＣｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９８７； １９６：９０１－９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９８９； ３４２：８７８－８８３、又はＩＭＧＴ番号付けシステムの定義（Ｅｈｒｅｎｍａｎｎ Ｆ， Ｋａａｓ Ｑ， Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ Ｐ．， ＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢ ａｎｄ ＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ： ａ ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ， ＭＨＣ， ＩｇＳＦ ａｎｄ ＭｈｃＳＦ［Ｊ］．， Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００９； ３８（ｓｕｐｐｌ＿１）：Ｄ３０１－Ｄ３０７における定義を参照）に基づいて行われる。
【0035】
「抗体」という語は、抗体を製造するためのいかなる特定の方法によっても限定されない。例えば、抗体には、組換え抗体、モノクローナル抗体、及びポリクローナル抗体が含まれる。抗体は、ＩｇＧ（例えば、サブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はＩｇＭなどの、各種アイソタイプの抗体であってよい。
【0036】
本明細書で使用される「ｍＡｂ」及び「モノクローナル抗体」という語は、高度に相同な抗体のグループに由来する、すなわち、自然に生じうる天然の変異を例外として同一の抗体分子のグループに由来する、抗体又は抗体の断片のことを指す。モノクローナル抗体は、ある抗原上の単一のエピトープに対して高度に特異的である。モノクローナル抗体と異なり、ポリクローナル抗体は、通常、ある抗原上の異なるエピトープを一般に認識する少なくとも２つ以上の異なる抗体を含む。モノクローナル抗体は一般に、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ， Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ． Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ， １９７５； ２５６（５５１７）： ４９５）によって最初に報告されたハイブリドーマ技術を用いて取得することができるが、組換えＤＮＡ技術を用いても取得することができる（米国特許第４８１６５６７号明細書などを参照）。
【0037】
本明細書で使用される「ヒト化抗体」という語は、ヒト免疫グロブリン（レセプター抗体）のＣＤＲの全体又は部分を非ヒト抗体（ドナー抗体）のＣＤＲで置き換えた場合に得られる抗体又は抗体断片のことを指し、ドナー抗体は、期待される特異性、親和性、又は反応性を有する非ヒト（例えば、マウス、ラット、もしくはウサギ）抗体であってよい。さらに、レセプター抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）におけるいくつかのアミノ酸残基も、対応する非ヒト抗体のアミノ酸残基又は他の抗体のアミノ酸残基に置換し、抗体の性能をさらに改善又は最適化することができる。ヒト化抗体のさらなる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９８６； ３２１：５２２－５２５、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９８８； ３３２：３２３－３２９、Ｐｒｅｓｔａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， １９９２； ２：５９３－５９６；及びＣｌａｒｋ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ， ２０００； ２１：３９７－４０２を参照のこと。
【0038】
本明細書で使用される「単離される」という語は、天然状態から人為手段によって取得されることを指す。特定の「単離される」物質又は成分が天然に存在する場合に、その天然環境において変化が生ずることであってもよく、天然環境から単離されることであってもよく、その両者であってもよい。例えば、単離されていない特定のポリヌクレオチド又はポリペプチドが特定の動物生体中に天然に存在し、このような天然状態から高純度の同一のポリヌクレオチド又はポリペプチドが単離された場合、それを単離ポリヌクレオチド又はポリペプチドと呼ぶ。「単離される」という語は、前記物質の活性に影響を及ぼさない、人工もしくは合成物質、又は他の不純物の存在を除外するものではない。
【0039】
本明細書で使用される「ベクター」という語は、ポリヌクレオチドを挿入することができる核酸ビヒクルのことを指す。ベクターが、挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の発現を可能にする場合、そのベクターは、発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、ベクターによって運ばれる遺伝物質エレメントが宿主細胞で発現できるように、形質転換、形質導入、又はトランスフェクションによって宿主細胞に導入することができる。ベクターは当業者に周知であり、例として、プラスミド；ファージミド；コスミド；人工染色体、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、又はＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）など；ファージ、例えば、ラムダファージ又はＭ１３ファージなど；及び動物ウイルス、が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターとして使用しうる動物ウイルスとしては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルスなど）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、及びパポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、発現を調節するための各種エレメントを含んでいてよく、それらの例として、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメント、及びレポーター遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ベクターは、複製開始部位を含んでいてもよい。
【0040】
本明細書で使用される「宿主細胞」という語は、そこにベクターを導入できる細胞のことを指し、例として、原核細胞、例えば、Ｅ． ｃｏｌｉもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓなど；真菌細胞、例えば、酵母細胞もしくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓなど；昆虫細胞、例えば、Ｓ２ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞もしくはＳｆ９など；又は動物細胞、例えば、線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＧＳ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、もしくはヒト細胞など、が挙げられるが、これらに限定されない。
【0041】
本明細書で使用される「特異的結合」という語は、２つの分子間の非無作為的な結合反応、例えば、抗体とその標的となる抗原との間の反応などのことを指す。いくつかの実施形態において、ある抗原に特異的に結合する抗体（又は、ある抗原に対して特異的な抗体）とは、抗体が約１０－５Ｍ未満、例えば、約１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、もしくは１０－１０Ｍ未満、又はそれ以下の親和性（ＫＤ）で抗原に結合することを意味する。
【0042】
本明細書で使用される「ＫＤ」という語は、特異的抗体－抗原相互作用の解離平衡定数のことを指し、抗体と抗原との間の結合親和性を説明するために使用される。解離平衡定数が小さいことは、抗体－抗原結合が強く、抗体と抗原との間の親和性が高いことを表す。一般に、抗体は、約１０－５Ｍ未満、例えば、約１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、もしくは１０－１０Ｍ未満、又はそれ以下の解離平衡定数（ＫＤ）で抗原（ＰＤ－１タンパク質など）に結合する。ＫＤは、当業者に公知の方法、例えば、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ分子相互作用機器の使用を用いて決定することができる。
【0043】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という語と「ｍＡｂ」という語は同一の意味を有し、互換的に用いることができる。「ポリクローナル抗体」という語と「ｐＡｂ」という語は同一の意味を有し、互換的に用いることができる。また、本明細書において、アミノ酸は通常、当該分野で公知の１文字及び３文字略号を使用して表される。例えば、アラニンはＡ又はＡｌａで表すことができる。
【0044】
本明細書で使用される「薬理学的に許容される担体及び／又は賦形剤」という語は、対象及び活性成分に薬理学的及び／又は生理学的に適合した担体及び／又は賦形剤のことを指す。このような担体及び／又は賦形剤は当該分野で周知であり（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ， １９ｔｈ Ｅｄ．， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９５を参照）、例として、ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント、及びイオン強度増強剤が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ｐＨ調整剤の限定されない例として、リン酸緩衝液が挙げられ、界面活性剤の限定されない例として、陽イオン、陰イオン、又は非イオン界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ－８０などが挙げられ、イオン強度増強剤の限定されない例として、塩化ナトリウムが挙げられる。
【0045】
本明細書で使用される「有効量」という語は、所望の効果を得るのに、又は少なくとも部分的に得るのに、充分な量のことを指す。例えば、疾患（腫瘍など）に対する予防的有効量とは、その疾患（腫瘍など）の発症を予防、抑止、又は遅延するのに充分な量のことを指し、治療有効量とは、その疾患に罹患している患者において、疾患又はその合併症を治癒又は少なくとも部分的に抑止するのに充分な量のことを指す。そのような有効量を決定することは、疑いもなく当業者の能力の範囲内である。例えば、治療目的における有効量は、治療しようとする疾患の重症度；患者自身の免疫系の全体的な状態；年齢、体重、及び性別などの患者の一般的な条件；投与経路；並びに同時に行われる他の治療；などによって決まる。
【0046】
本明細書において、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）のアミノ酸配列といった場合、それは全長ＬＡＧ３タンパク質、もしくはＬＡＧ３の細胞外断片であるＬＡＧ３ ＥＣＤ、もしくはＬＡＧ３ ＥＣＤを含む断片のことも含んでおり、また、全長ＬＡＧ３タンパク質の融合タンパク質もしくはＬＡＧ３ ＥＣＤの融合タンパク質、例えば、マウスもしくはヒトＩｇＧのＦｃタンパク質断片（ｍＦｃもしくはｈＦｃ）などと融合した断片のことも包含する。しかし、ＬＡＧ３タンパク質のアミノ酸配列において、（置換、欠失、及び／又は付加を含むがそれらに限定されない）突然変異又は変異が、その生物学的機能に影響を与えることなく天然に生じうること、又は人工的に導入されうることを当業者は理解するであろう。したがって、本発明において、「ＬＡＧ３タンパク質」という語は、それらの天然又は人工的なバリアントを含むすべての配列を含むものとする。また、ＬＡＧ３タンパク質の配列断片について記述する場合は、それらの天然又は人工的なバリアント内の対応する配列断片のことも含んでいる。
【発明の効果】
【0047】
本発明の有益な効果
本発明は、以下の効果のいずれか１つ以上を達成する：
（１）本発明の抗ＬＡＧ３抗体が、優れた親和性と特異性を有すること；そして、
（２）本発明の抗ＬＡＧ３抗体が、ＬＡＧ３とＭＨＣ－ＩＩの間の相互作用を効果的にブロックし、生物におけるＬＡＧ３の免疫抑制を特異的に緩和できること。
本発明は、以下の効果のいずれか１つ以上を達成する：
（１）本発明の抗ＬＡＧ３抗体が、優れた親和性と特異性を有すること；そして、
（２）本発明の抗ＬＡＧ３抗体が、ＬＡＧ３とＭＨＣ－ＩＩの間の相互作用を効果的にブロックし、生物におけるＬＡＧ３の免疫抑制を特異的に緩和できること。
【図面の簡単な説明】
【0048】
【0049】
【0050】
【0051】
【0052】
【0053】
【0054】
【発明を実施するための形態】
【0055】
詳細な説明
本発明の実施形態を、実施例を参照しながら以下に詳細に説明する。当業者は、以下の実施例が本発明の単なる例証のためのものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではないと理解するであろう。具体的な技術又は条件が記載されていない実施例は、当該分野の文献に記載された技術又は条件（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ａｕｔｈｏｒｅｄ ｂｙ Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ａｎｄ ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｂｙ Ｈｕａｎｇ Ｐｅｉｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓを参照）に従い、又は添付の使用説明書に従い、行われる。使用する試薬又は機器の製造者が記載されていない場合、それらは市販の従来の製品である。
本発明の実施形態を、実施例を参照しながら以下に詳細に説明する。当業者は、以下の実施例が本発明の単なる例証のためのものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではないと理解するであろう。具体的な技術又は条件が記載されていない実施例は、当該分野の文献に記載された技術又は条件（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ａｕｔｈｏｒｅｄ ｂｙ Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ａｎｄ ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｂｙ Ｈｕａｎｇ Ｐｅｉｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓを参照）に従い、又は添付の使用説明書に従い、行われる。使用する試薬又は機器の製造者が記載されていない場合、それらは市販の従来の製品である。
【0056】
陽性対照抗体であるレラトリマブは、米国特許出願公開第２０１６０３２６２４８（Ａ１）号明細書に示される配列を有し、そのうち重鎖アミノ酸配列はこの特許文献の配列番号１に示されており、軽鎖アミノ酸配列はこの特許文献の配列番号２に示されている。レラトリマブは抗ＬＡＧ－３抗体である。
【0057】
レラトリマブの重鎖アミノ酸配列：
ＱＶＱＬＱＱＷＧＡＧＬＬＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＡＶＹＧＧＳＦＳＤＹＹＷＮＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥＩＮＨＲＧＳＴＮＳＮＰＳＬＫＳＲＶＴＬＳＬＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＲＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＦＧＹＳＤＹＥＹＮＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号２３）
ＱＶＱＬＱＱＷＧＡＧＬＬＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＡＶＹＧＧＳＦＳＤＹＹＷＮＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥＩＮＨＲＧＳＴＮＳＮＰＳＬＫＳＲＶＴＬＳＬＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＲＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＦＧＹＳＤＹＥＹＮＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号２３）
【0058】
レラトリマブの軽鎖アミノ酸配列：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＬＴＦＧＱＧＴＮＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号２４）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＬＴＦＧＱＧＴＮＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号２４）
【0059】
対照抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）は、Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社によって構築された、ロット番号Ｂ１０５Ｙ２０８０６０１の抗ＰＤ－１抗体であった。
【0060】
１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）の重鎖アミノ酸配列：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＤＷＶＡＴＩＳＧＧＧＲＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＮＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＬＹＹＣＡＮＲＹＧＥＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号２１）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＤＷＶＡＴＩＳＧＧＧＲＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＮＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＬＹＹＣＡＮＲＹＧＥＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号２１）
【0061】
１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）の軽鎖アミノ酸配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＭＳＡＳＶＧＤＲＶＴＦＴＣＲＡＳＱＤＩＮＴＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＶＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＭＡＴＹＹＣＬＱＹＤＥＦＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号２２）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＭＳＡＳＶＧＤＲＶＴＦＴＣＲＡＳＱＤＩＮＴＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＶＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＭＡＴＹＹＣＬＱＹＤＥＦＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号２２）
【0062】
細胞株２９３Ｔ－ＬＡＧ３は、Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社によって構築された。細胞株２９３Ｔ－ＬＡＧ３は、第３世代レンチウイルス系（例えば、Ａ Ｔｈｉｒｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ａ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ． Ｄｕｌｌ Ｔ， Ｚｕｆｆｅｒｅｙ Ｒ， Ｋｅｌｌｙ Ｍ， Ｍａｎｄｅｌ ＲＪ， Ｎｇｕｙｅｎ Ｍ， Ｔｒｏｎｏ Ｄ， ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ Ｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌ．， １９９８． ７２（１１）： ８４６３－８４７１を参照）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のウイルス感染によって調製された。ここで使用されたレンチウイルス発現ベクターは、ｐｌｅｎｔｉ６．３／Ｖ５－ｈｕＬＡＧ３ＦＬ－ＢＳＤ（ＬＡＧ３、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ：ＮＭ＿００２２７７．４；ベクターｐｌｅｎｔｉ６．３／Ｖ５－ＢＳＤ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入、カタログ番号Ｋ５３１５－２０）であった。
【0063】
細胞株Ｒａｊｉ－ＰＤＬ１は、Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社によって構築された。細胞株Ｒａｊｉ－ＰＤＬ１は、第３世代レンチウイルス系（例えば、Ａ Ｔｈｉｒｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ａ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ． Ｄｕｌｌ Ｔ， Ｚｕｆｆｅｒｅｙ Ｒ， Ｋｅｌｌｙ Ｍ， Ｍａｎｄｅｌ ＲＪ， Ｎｇｕｙｅｎ Ｍ， Ｔｒｏｎｏ Ｄ， ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ Ｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌ．， １９９８． ７２（１１）： ８４６３－８４７１を参照）を用いて、Ｒａｊｉ細胞のウイルス感染によって製造された。ここで使用されたレンチウイルス発現ベクターは、ｐｌｅｎｔｉ６．３／Ｖ５－ＰＤＬ１（ＰＤＬ１、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ：ＮＰ＿０５４８６２．１；ベクターｐｌｅｎｔｉ６．３／Ｖ５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入、カタログ番号Ｋ５３１５－２０）であった。
【0064】
細胞株Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＰＤ１－ＬＡＧ３は、Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社によって構築された。細胞株Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＰＤ１－ＬＡＧ３は、第３世代レンチウイルス系（例えば、Ａ Ｔｈｉｒｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ａ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ． Ｄｕｌｌ Ｔ， Ｚｕｆｆｅｒｅｙ Ｒ， Ｋｅｌｌｙ Ｍ， Ｍａｎｄｅｌ ＲＪ， Ｎｇｕｙｅｎ Ｍ， Ｔｒｏｎｏ Ｄ， ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ Ｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌ．， １９９８． ７２（１１）： ８４６３－８４７１を参照）を用いて、ＰＤ－１エフェクター細胞（ＣＰＭ、製造者：Ｐｒｏｍｅｇａ社、カタログ番号Ｊ１１２Ａ）のウイルス感染によって製造された。ここで使用されたレンチウイルス発現ベクターは、ｐＣＤＨ－ｈｕＬＡＧ３ＦＬ－ＲＦＰ－ＮＥＯ（ＬＡＧ３、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ：ＮＭ＿００２２７７．４；ベクターｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－ＲＦＰ＋Ｎｅｏ、Ｙｏｕｂｉｏ社より購入、カタログ番号ＶＴ９００５）であった。
【実施例】
【0065】
調製例１：抗ＬＡＧ３抗体の設計及び調製
１．抗体の設計
本願発明者らは、創意により、公知のＬＡＧ３タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００２２７７．４）及びその三次元結晶構造などに基づき、一連の抗体配列を設計した。広範なスクリーニングと試験により、ＬＡＧ３に特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体を最終的に取得し、それぞれＨ７Ｌ８、Ｈ７Ｌ９、及びＨ７Ｌ１０と命名した。モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列、及びそれらのコード配列は、次の通りである。
１．抗体の設計
本願発明者らは、創意により、公知のＬＡＧ３タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００２２７７．４）及びその三次元結晶構造などに基づき、一連の抗体配列を設計した。広範なスクリーニングと試験により、ＬＡＧ３に特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体を最終的に取得し、それぞれＨ７Ｌ８、Ｈ７Ｌ９、及びＨ７Ｌ１０と命名した。モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列、及びそれらのコード配列は、次の通りである。
【0066】
Ｈ７Ｌ８の重鎖可変領域Ｈ７ｖのヌクレオチド配列（３６０ｂｐ）：
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＧＡＧＣＴＧＧＡＣＴＧＣＴＧＡＡＡＣＣＴＡＧＣＧＡＧＡＣＡＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＧＣＴＧＴＧＴＡＣＧＧＣＧＧＡＴＣＴＡＴＣＡＧＣＧＡＴＴＡＣＴＡＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＡＧＡＧＡＴＣＡＡＣＣＡＣＡＧＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＣＣＡＡＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＣＡＧＧＧＴＧＡＣＡＣＴＧＡＧＣＣＴＣＧＡＣＡＣＡＡＧＣＡＡＧＡＡＴＣＡＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＧＴＣＣＧＴＧＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＡＴＡＣＡＧＣＴＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＧＡＴＴＡＣＧＡＧＴＡＣＧＡＴＴＧＧＴＴＣＧＡＣＣＣＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＡＣＴＧＧＴＴＡＣＡＧＴＧＡＧＣＴＣＣ（配列番号１）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＧＡＧＣＴＧＧＡＣＴＧＣＴＧＡＡＡＣＣＴＡＧＣＧＡＧＡＣＡＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＧＣＴＧＴＧＴＡＣＧＧＣＧＧＡＴＣＴＡＴＣＡＧＣＧＡＴＴＡＣＴＡＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＡＧＡＧＡＴＣＡＡＣＣＡＣＡＧＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＣＣＡＡＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＣＡＧＧＧＴＧＡＣＡＣＴＧＡＧＣＣＴＣＧＡＣＡＣＡＡＧＣＡＡＧＡＡＴＣＡＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＧＴＣＣＧＴＧＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＡＴＡＣＡＧＣＴＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＧＡＴＴＡＣＧＡＧＴＡＣＧＡＴＴＧＧＴＴＣＧＡＣＣＣＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＡＣＴＧＧＴＴＡＣＡＧＴＧＡＧＣＴＣＣ（配列番号１）
【0067】
Ｈ７Ｌ８の重鎖可変領域Ｈ７ｖのアミノ酸配列（１２０ａａ）：
ＱＶＱＬＱＱＷＧＡＧＬＬＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＡＶＹＧＧＳＩＳＤＹＹＷＮＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥＩＮＨＲＧＴＴＮＳＮＰＳＬＫＳＲＶＴＬＳＬＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＲＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＦＧＹＳＤＹＥＹＤＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２）
ＱＶＱＬＱＱＷＧＡＧＬＬＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＡＶＹＧＧＳＩＳＤＹＹＷＮＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥＩＮＨＲＧＴＴＮＳＮＰＳＬＫＳＲＶＴＬＳＬＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＲＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＦＧＹＳＤＹＥＹＤＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２）
【0068】
Ｈ７Ｌ８の軽鎖可変領域Ｌ８ｖのヌクレオチド配列（３２１ｂｐ）：
ＧＡＧＡＴＣＧＴＴＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＡＧＣＴＡＣＡＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＧＧＧＣＴＡＣＡＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＴＡＧＣＣＡＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＴＣＣＡＡＧＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＧＣＣＡＣＣＧＧＣＡＴＣＣＣＴＧＣＴＡＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＡＣＴＴＴＡＣＡＣＴＧＡＣＡＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＴＴＴＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＣＧＣＡＧＣＡＡＣＴＧＧＣＣＣＡＴＣＡＣＡＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＡＡＡＴＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ（配列番号３）
ＧＡＧＡＴＣＧＴＴＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＡＧＣＴＡＣＡＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＧＧＧＣＴＡＣＡＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＴＡＧＣＣＡＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＴＣＣＡＡＧＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＧＣＣＡＣＣＧＧＣＡＴＣＣＣＴＧＣＴＡＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＡＣＴＴＴＡＣＡＣＴＧＡＣＡＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＴＴＴＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＣＧＣＡＧＣＡＡＣＴＧＧＣＣＣＡＴＣＡＣＡＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＡＡＡＴＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ（配列番号３）
【0069】
Ｈ７Ｌ８の軽鎖可変領域Ｌ８ｖのアミノ酸配列（１０７ａａ）：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＴＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＩＴＦＧＱＧＴＮＬＥＩＫ（配列番号４）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＴＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＩＴＦＧＱＧＴＮＬＥＩＫ（配列番号４）
【0070】
Ｈ７Ｌ９の重鎖可変領域Ｈ７ｖのヌクレオチド配列は、配列番号１に記載のＨ７Ｌ８の重鎖可変領域Ｈ７ｖのヌクレオチド配列と同一である。
【0071】
Ｈ７Ｌ９の重鎖可変領域Ｈ７ｖのアミノ酸配列は、配列番号２に記載のＨ７Ｌ８の重鎖可変領域Ｈ７ｖのアミノ酸配列と同一である。
【0072】
Ｈ７Ｌ９の軽鎖可変領域Ｌ９ｖのヌクレオチド配列（３２１ｂｐ）：
ＧＡＧＡＴＣＧＴＴＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＡＧＣＴＡＣＡＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＧＧＧＣＴＡＣＡＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＴＡＧＣＣＡＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＴＣＣＡＡＧＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＧＣＣＡＣＣＧＧＣＡＴＣＣＣＴＧＣＴＡＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＡＣＴＴＴＡＣＡＣＴＧＡＣＡＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＴＴＴＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＣＧＣＡＧＣＡＡＣＴＧＧＣＣＣＣＴＣＡＣＡＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＡＡＡＴＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ（配列番号５）
ＧＡＧＡＴＣＧＴＴＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＡＧＣＴＡＣＡＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＧＧＧＣＴＡＣＡＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＴＡＧＣＣＡＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＴＣＣＡＡＧＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＧＣＣＡＣＣＧＧＣＡＴＣＣＣＴＧＣＴＡＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＡＣＴＴＴＡＣＡＣＴＧＡＣＡＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＴＴＴＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＣＧＣＡＧＣＡＡＣＴＧＧＣＣＣＣＴＣＡＣＡＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＡＡＡＴＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ（配列番号５）
【0073】
Ｈ７Ｌ９の軽鎖可変領域Ｌ９ｖのアミノ酸配列（１０７ｂｐ）：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＴＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＧＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＬＴＦＧＱＧＴＮＬＥＩＫ（配列番号６）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＴＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＧＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＬＴＦＧＱＧＴＮＬＥＩＫ（配列番号６）
【0074】
Ｈ７Ｌ１０の重鎖可変領域Ｈ７ｖのヌクレオチド配列は、配列番号１に記載のＨ７Ｌ８の重鎖可変領域Ｈ７ｖのヌクレオチド配列と同一である。
【0075】
Ｈ７Ｌ１０の重鎖可変領域Ｈ７ｖのアミノ酸配列は、配列番号２に記載のＨ７Ｌ８の重鎖可変領域Ｈ７ｖのアミノ酸配列と同一である。
【0076】
Ｈ７Ｌ１０の軽鎖可変領域Ｌ１０ｖのヌクレオチド配列（３２１ｂｐ）：
ＧＡＧＡＴＣＧＴＴＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＡＧＣＴＡＣＡＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＧＧＧＣＴＡＣＡＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＴＡＧＣＣＡＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＴＣＣＡＡＧＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＧＣＣＡＣＣＧＧＣＡＴＣＣＣＴＧＣＴＡＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＡＣＴＴＴＡＣＡＣＴＧＡＣＡＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＴＴＴＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＣＧＣＡＧＣＡＡＣＴＧＧＣＣＣＡＴＣＡＣＡＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＡＡＡＴＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ（配列番号７）
ＧＡＧＡＴＣＧＴＴＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＡＧＣＴＡＣＡＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＧＧＧＣＴＡＣＡＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＴＡＧＣＣＡＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＴＣＣＡＡＧＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＧＣＣＡＣＣＧＧＣＡＴＣＣＣＴＧＣＴＡＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＡＣＴＴＴＡＣＡＣＴＧＡＣＡＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＴＴＴＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＣＧＣＡＧＣＡＡＣＴＧＧＣＣＣＡＴＣＡＣＡＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＡＡＡＴＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ（配列番号７）
【0077】
Ｈ７Ｌ１０の軽鎖可変領域Ｌ１０ｖのアミノ酸配列（１０７ｂｐ）：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＧＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＩＴＦＧＱＧＴＮＬＥＩＫ（配列番号８）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＧＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＩＴＦＧＱＧＴＮＬＥＩＫ（配列番号８）
【0078】
抗体Ｈ７Ｌ８のＣＤＲのアミノ酸配列は次の通りである（ＩＭＧＴ番号付けシステムによる）：
ＨＣＤＲ１： ＧＧＳＩＳＤＹＹ（配列番号９）；
ＨＣＤＲ２： ＩＮＨＲＧＴＴ（配列番号１０）；
ＨＣＤＲ３： ＡＦＧＹＳＤＹＥＹＤＷＦＤＰ（配列番号１１）；
ＬＣＤＲ１： ＱＴＩＳＳＹ（配列番号１２）；
ＬＣＤＲ２： ＤＡＳ（配列番号１３）；及び
ＬＣＤＲ３： ＱＱＲＳＮＷＰＩＴ（配列番号１４）。
ＨＣＤＲ１： ＧＧＳＩＳＤＹＹ（配列番号９）；
ＨＣＤＲ２： ＩＮＨＲＧＴＴ（配列番号１０）；
ＨＣＤＲ３： ＡＦＧＹＳＤＹＥＹＤＷＦＤＰ（配列番号１１）；
ＬＣＤＲ１： ＱＴＩＳＳＹ（配列番号１２）；
ＬＣＤＲ２： ＤＡＳ（配列番号１３）；及び
ＬＣＤＲ３： ＱＱＲＳＮＷＰＩＴ（配列番号１４）。
【0079】
抗体Ｈ７Ｌ９のＣＤＲのアミノ酸配列は次の通りである（ＩＭＧＴ番号付けシステムによる）：
ＨＣＤＲ１： ＧＧＳＩＳＤＹＹ（配列番号９）；
ＨＣＤＲ２： ＩＮＨＲＧＴＴ（配列番号１０）；
ＨＣＤＲ３： ＡＦＧＹＳＤＹＥＹＤＷＦＤＰ（配列番号１１）；
ＬＣＤＲ１： ＱＴＩＳＳＹ（配列番号１２）；
ＬＣＤＲ２： ＤＧＳ（配列番号１５）；及び
ＬＣＤＲ３： ＱＱＲＳＮＷＰＬＴ（配列番号１６）。
ＨＣＤＲ１： ＧＧＳＩＳＤＹＹ（配列番号９）；
ＨＣＤＲ２： ＩＮＨＲＧＴＴ（配列番号１０）；
ＨＣＤＲ３： ＡＦＧＹＳＤＹＥＹＤＷＦＤＰ（配列番号１１）；
ＬＣＤＲ１： ＱＴＩＳＳＹ（配列番号１２）；
ＬＣＤＲ２： ＤＧＳ（配列番号１５）；及び
ＬＣＤＲ３： ＱＱＲＳＮＷＰＬＴ（配列番号１６）。
【0080】
抗体Ｈ７Ｌ１０のＣＤＲのアミノ酸配列は次の通りである（ＩＭＧＴ番号付けシステムによる）：
ＨＣＤＲ１： ＧＧＳＩＳＤＹＹ（配列番号９）；
ＨＣＤＲ２： ＩＮＨＲＧＴＴ（配列番号１０）；
ＨＣＤＲ３： ＡＦＧＹＳＤＹＥＹＤＷＦＤＰ（配列番号１１）；
ＬＣＤＲ１： ＱＳＩＳＳＹ（配列番号１７）；
ＬＣＤＲ２： ＤＧＳ（配列番号１５）；及び
ＬＣＤＲ３： ＱＱＲＳＮＷＰＩＴ（配列番号１４）。
ＨＣＤＲ１： ＧＧＳＩＳＤＹＹ（配列番号９）；
ＨＣＤＲ２： ＩＮＨＲＧＴＴ（配列番号１０）；
ＨＣＤＲ３： ＡＦＧＹＳＤＹＥＹＤＷＦＤＰ（配列番号１１）；
ＬＣＤＲ１： ＱＳＩＳＳＹ（配列番号１７）；
ＬＣＤＲ２： ＤＧＳ（配列番号１５）；及び
ＬＣＤＲ３： ＱＱＲＳＮＷＰＩＴ（配列番号１４）。
【0081】
２．ヒト化抗体Ｈ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）の発現及び精製
Ｈ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）の重鎖ｃＤＮＡ配列（可変領域のコード配列を配列番号１に示した；定常領域はＩｇガンマ－１鎖Ｃ領域であった）及び軽鎖ｃＤＮＡ配列（可変領域のコード配列を配列番号３に示した；定常領域はヒトＩｇカッパ鎖Ｃ領域であった）を別々にｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングし、プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｈ７及びｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｌ８をそれぞれ得た。プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｈ７及びｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｌ８をそれぞれ消化した（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ）。重鎖及び軽鎖を電気泳動で単離し、別々にｐｃＤＮＡ３．１ベクターにサブクローニングし、組換えプラスミドを抽出して２９３Ｆ細胞にコトランスフェクトした。細胞培養７日後に培地を高速遠心分離で分離し、上清を濃縮して、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム上にロードした。タンパク質を、溶出緩衝液を用いてワンステップで溶出した。標的試料を単離し、緩衝液をＰＢＳへと交換した。
Ｈ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）の重鎖ｃＤＮＡ配列（可変領域のコード配列を配列番号１に示した；定常領域はＩｇガンマ－１鎖Ｃ領域であった）及び軽鎖ｃＤＮＡ配列（可変領域のコード配列を配列番号３に示した；定常領域はヒトＩｇカッパ鎖Ｃ領域であった）を別々にｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングし、プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｈ７及びｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｌ８をそれぞれ得た。プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｈ７及びｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｌ８をそれぞれ消化した（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ）。重鎖及び軽鎖を電気泳動で単離し、別々にｐｃＤＮＡ３．１ベクターにサブクローニングし、組換えプラスミドを抽出して２９３Ｆ細胞にコトランスフェクトした。細胞培養７日後に培地を高速遠心分離で分離し、上清を濃縮して、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム上にロードした。タンパク質を、溶出緩衝液を用いてワンステップで溶出した。標的試料を単離し、緩衝液をＰＢＳへと交換した。
【0082】
Ｈ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）の重鎖定常領域のアミノ酸配列
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１８）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１８）
【0083】
Ｈ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）の軽鎖定常領域のアミノ酸配列
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１９）
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１９）
【0084】
３．ヒト化抗体Ｈ７Ｌ８（ｈＧ４ＷＴ）、Ｈ７Ｌ９（ｈＧ４ＷＴ）、及びＨ７Ｌ１０（ｈＧ４ＷＴ）の発現及び精製
Ｈ７Ｌ８（ｈＧ４ＷＴ）、Ｈ７Ｌ９（ｈＧ４ＷＴ）、及びＨ７Ｌ１０（ｈＧ４ＷＴ）の重鎖ｃＤＮＡ配列（可変領域のコード配列を配列番号１に示した；定常領域はＩｇガンマ－４鎖Ｃ領域であった）、Ｈ７Ｌ８（ｈＧ４ＷＴ）の軽鎖ｃＤＮＡ配列（可変領域のコード配列を配列番号３に示した；定常領域はヒトＩｇカッパ鎖Ｃ領域であった）、Ｈ７Ｌ９（ｈＧ４ＷＴ）の軽鎖ｃＤＮＡ配列（可変領域のコード配列を配列番号５に示した；定常領域はヒトＩｇカッパ鎖Ｃ領域であった）、並びにＨ７Ｌ１０（ｈＧ４ＷＴ）の軽鎖ｃＤＮＡ配列（可変領域のコード配列を配列番号７に示した；定常領域はヒトＩｇカッパ鎖Ｃ領域であった）を別々にｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングし、プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｈ７、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｌ８、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｌ９、及びｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｌ１０をそれぞれ得た。プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｈ７、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｌ８、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｌ９、及びｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｌ１０をそれぞれ消化した（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ）。重鎖及び軽鎖を電気泳動で単離し、別々にｐｃＤＮＡ３．１ベクターにサブクローニングし、組換えプラスミドを抽出して２９３Ｆ細胞にコトランスフェクトした。細胞培養７日後に培地を高速遠心分離で分離し、上清を濃縮して、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム上にロードした。タンパク質を、溶出緩衝液を用いてワンステップで溶出した。標的試料を単離し、緩衝液をＰＢＳへと交換した。
Ｈ７Ｌ８（ｈＧ４ＷＴ）、Ｈ７Ｌ９（ｈＧ４ＷＴ）、及びＨ７Ｌ１０（ｈＧ４ＷＴ）の重鎖ｃＤＮＡ配列（可変領域のコード配列を配列番号１に示した；定常領域はＩｇガンマ－４鎖Ｃ領域であった）、Ｈ７Ｌ８（ｈＧ４ＷＴ）の軽鎖ｃＤＮＡ配列（可変領域のコード配列を配列番号３に示した；定常領域はヒトＩｇカッパ鎖Ｃ領域であった）、Ｈ７Ｌ９（ｈＧ４ＷＴ）の軽鎖ｃＤＮＡ配列（可変領域のコード配列を配列番号５に示した；定常領域はヒトＩｇカッパ鎖Ｃ領域であった）、並びにＨ７Ｌ１０（ｈＧ４ＷＴ）の軽鎖ｃＤＮＡ配列（可変領域のコード配列を配列番号７に示した；定常領域はヒトＩｇカッパ鎖Ｃ領域であった）を別々にｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングし、プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｈ７、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｌ８、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｌ９、及びｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｌ１０をそれぞれ得た。プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｈ７、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｌ８、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｌ９、及びｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－Ｌ１０をそれぞれ消化した（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ）。重鎖及び軽鎖を電気泳動で単離し、別々にｐｃＤＮＡ３．１ベクターにサブクローニングし、組換えプラスミドを抽出して２９３Ｆ細胞にコトランスフェクトした。細胞培養７日後に培地を高速遠心分離で分離し、上清を濃縮して、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム上にロードした。タンパク質を、溶出緩衝液を用いてワンステップで溶出した。標的試料を単離し、緩衝液をＰＢＳへと交換した。
【0085】
Ｈ７Ｌ８（ｈＧ４ＷＴ）、Ｈ７Ｌ９（ｈＧ４ＷＴ）、又はＨ７Ｌ１０（ｈＧ４ＷＴ）の重鎖定常領域のアミノ酸配列
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号２０）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号２０）
【0086】
Ｈ７Ｌ８（ｈＧ４ＷＴ）、Ｈ７Ｌ９（ｈＧ４ＷＴ）、又はＨ７Ｌ１０（ｈＧ４ＷＴ）の軽鎖定常領域のアミノ酸配列
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１９）
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１９）
【0087】
調製例２：ヒト抗鶏卵リゾチーム抗体の調製
ヒト抗鶏卵リゾチームＩｇＧ（抗ＨＥＬ、又はヒトＩｇＧ；ｈＩｇＧと略記する）抗体の配列を、“Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｖ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ａｎｔｉ－ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”と題したＡｃｉｅｒｎｏ ｅｔ ａｌ．による報告の研究（Ａｃｉｅｒｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．， ２００７； ３７４（１）： １３０－４６）における、Ｆａｂ Ｆ１０．６．６配列の可変領域配列から得た。調製法は次のとおりであった：
ヒト抗鶏卵リゾチームＩｇＧ（抗ＨＥＬ、又はヒトＩｇＧ；ｈＩｇＧと略記する）抗体の配列を、“Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｖ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ａｎｔｉ－ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”と題したＡｃｉｅｒｎｏ ｅｔ ａｌ．による報告の研究（Ａｃｉｅｒｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．， ２００７； ３７４（１）： １３０－４６）における、Ｆａｂ Ｆ１０．６．６配列の可変領域配列から得た。調製法は次のとおりであった：
【0088】
Ｎａｎｊｉｎｇ Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ社への委託により、ヒトＩｇＧ抗体の重鎖及び軽鎖（完全配列又は可変領域）遺伝子のアミノ酸のコドン最適化及び遺伝子合成を行った。“Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ （Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）”に紹介されている標準的な技術を参照することにより、また、標準的な分子クローニング技術、例えば、ＰＣＲ、酵素消化、ＤＮＡゲル抽出、ライゲーション形質転換、コロニーＰＣＲ、又は酵素消化識別などを使用することにより、重鎖及び軽鎖遺伝子を、哺乳類発現系の抗体重鎖発現ベクター及び抗体軽鎖発現ベクターにそれぞれサブクローニングした。組換え発現ベクターの重鎖及び軽鎖遺伝子をさらにシーケンシングして分析を行った。配列が正確であることを確認した後、エンドトキシンフリーの発現プラスミドを大量又は中程度の量、調製した。組換え抗体を発現させるために、重鎖及び軽鎖発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞に対して一過性トランスフェクションした。７日間の培養後、細胞培養培地を回収し、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（ＧＥ）を用いて親和性精製行った。得られた抗体試料の品質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＳＥＣ－ＨＰＬＣの標準的な分析技術を用いて測定した。
【0089】
実験例１：抗ＬＡＧ３抗体の抗原に対する結合活性のＥＬＩＳＡによる分析
ＥＬＩＳＡプレートを０．５μｇ／ｍＬのヒトＬＡＧ３－ｍＦｃ（Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社による構築；ロット番号２０２００４１７）でコートし、４℃で一晩インキュベートした。その後、抗原でコートされたＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで１回洗浄し、ブロッキング溶液として１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を用いて３７℃にて２時間ブロッキングした。ブロッキング後、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。ＰＢＳＴ溶液で段階希釈した抗体（抗体の希釈勾配を表１に示す）を加えた。試験抗体を含むＥＬＩＳＡプレートを３７℃で３０分間インキュベートし、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。洗浄後、１：５０００の割合で希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ ＦＣ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ社、カタログ番号１０９－０３５－０９８）二次抗体のワーキング溶液を加え、次いでプレートを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ社、３０８１７７）を暗所で加えて５分間発色させた後、停止溶液を加えて発色反応を停止させた。ＥＬＩＳＡプレートを直ちにＥＬＩＳＡプレートリーダーに入れ、ＥＬＩＳＡプレート中の各ウェルのＯＤ値を４５０ｎｍで読み取った。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ６．２．１により、データの分析と加工を行った。
ＥＬＩＳＡプレートを０．５μｇ／ｍＬのヒトＬＡＧ３－ｍＦｃ（Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社による構築；ロット番号２０２００４１７）でコートし、４℃で一晩インキュベートした。その後、抗原でコートされたＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで１回洗浄し、ブロッキング溶液として１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を用いて３７℃にて２時間ブロッキングした。ブロッキング後、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。ＰＢＳＴ溶液で段階希釈した抗体（抗体の希釈勾配を表１に示す）を加えた。試験抗体を含むＥＬＩＳＡプレートを３７℃で３０分間インキュベートし、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。洗浄後、１：５０００の割合で希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ ＦＣ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ社、カタログ番号１０９－０３５－０９８）二次抗体のワーキング溶液を加え、次いでプレートを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ社、３０８１７７）を暗所で加えて５分間発色させた後、停止溶液を加えて発色反応を停止させた。ＥＬＩＳＡプレートを直ちにＥＬＩＳＡプレートリーダーに入れ、ＥＬＩＳＡプレート中の各ウェルのＯＤ値を４５０ｎｍで読み取った。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ６．２．１により、データの分析と加工を行った。
【0090】
【0091】
図１から明らかなように、レラトリマブ及びＨ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）は、抗原ヒトＬＡＧ３－ｍＦｃに対して用量依存的に効果的に結合することができた。各用量に対する吸光度を表１に示す。結合した抗体の吸光度の定量分析に基づき、カーブフィッティング計算によって得られた抗体レラトリマブ（陽性対照）及びＨ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）の結合効率ＥＣ５０値は、それぞれ０．１０６ｎＭ及び０．０４５ｎＭであった。
【0092】
上記実験結果は、同一の実験条件下で、Ｈ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）がヒトＬＡＧ３－ｍＦｃに効果的に結合する活性を有したこと、及びＨ７Ｌ８（ｈＧ１ＷＴ）のヒトＬＡＧ３－ｍＦｃへの結合活性が、陽性薬物レラトリマブの同じ標的に対する結合活性よりも強かったことを示す。
【0093】
実施例２：抗ＬＡＧ３抗体の抗原に対する結合活性のＥＬＩＳＡによる分析
ＥＬＩＳＡプレートを２μｇ／ｍＬのヒトＬＡＧ３－ｍＦｃでコートし、４℃で一晩インキュベートした。その後、抗原でコートされたＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで１回洗浄し、ブロッキング溶液として１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を用いて３７℃にて２時間ブロッキングした。ブロッキング後、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。ＰＢＳＴ溶液で段階希釈した抗体（抗体の希釈勾配を表１に示す）を加えた。試験抗体を含むＥＬＩＳＡプレートを３７℃で３０分間インキュベートし、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。洗浄後、１：５０００の割合で希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ社、カタログ番号１０９－０３５－０８８）二次抗体のワーキング溶液を加え、次いでプレートを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ社、３０８１７７）を暗所で加えて５分間発色させた後、停止溶液を加えて発色反応を停止させた。ＥＬＩＳＡプレートを直ちにＥＬＩＳＡプレートリーダーに入れ、ＥＬＩＳＡプレート中の各ウェルのＯＤ値を４５０ｎｍで読み取った。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ６．２．１により、データの分析と加工を行った。
ＥＬＩＳＡプレートを２μｇ／ｍＬのヒトＬＡＧ３－ｍＦｃでコートし、４℃で一晩インキュベートした。その後、抗原でコートされたＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで１回洗浄し、ブロッキング溶液として１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を用いて３７℃にて２時間ブロッキングした。ブロッキング後、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。ＰＢＳＴ溶液で段階希釈した抗体（抗体の希釈勾配を表１に示す）を加えた。試験抗体を含むＥＬＩＳＡプレートを３７℃で３０分間インキュベートし、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。洗浄後、１：５０００の割合で希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ社、カタログ番号１０９－０３５－０８８）二次抗体のワーキング溶液を加え、次いでプレートを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ社、３０８１７７）を暗所で加えて５分間発色させた後、停止溶液を加えて発色反応を停止させた。ＥＬＩＳＡプレートを直ちにＥＬＩＳＡプレートリーダーに入れ、ＥＬＩＳＡプレート中の各ウェルのＯＤ値を４５０ｎｍで読み取った。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ６．２．１により、データの分析と加工を行った。
【0094】
【0095】
結果は、抗体Ｈ７Ｌ８（ｈＧ４ＷＴ）、Ｈ７Ｌ９（ｈＧ４ＷＴ）、及びＨ７Ｌ１０（ｈＧ４ＷＴ）が、抗原ヒトＬＡＧ３－ｍＦｃに対して用量依存的に効果的に結合できたこと、及びそれらが陽性対照抗体レラトリマブに匹敵する結合活性を有していたことを示す。
【0096】
実施例３：抗ＬＡＧ３抗体の細胞表面上の抗原ＬＡＧ３への結合活性の、フローサイトメトリーによる分析
１．抗原ＬＡＧ３を発現する２９３Ｔ宿主細胞の構築
手順は以下の通りであった：
１．抗原ＬＡＧ３を発現する２９３Ｔ宿主細胞の構築
手順は以下の通りであった：
【0097】
抗原ＬＡＧ３を発現する２９３Ｔ宿主細胞の構築：リポフェクタミントランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入）の使用説明書に従い、ＬＡＧ３を含むベクターｐＬｅｎｔｉ６．３／Ｖ５－ｈｕＬＡＧ３ＦＬ－ＢＳＤ（ベクターｐＬｅｎｔｉ６．３はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入）を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、スクリーニングによってＬＡＧ３を安定に発現するクローングループ２９３Ｔ－ＬＡＧ３を得た。
【0098】
２．２９３Ｔ－ＬＡＧ３細胞表面上の抗原への抗体の結合
抗体標識及びフローサイトメーター検出：先の工程で得た、抗原ＬＡＧ３を発現する２９３Ｔ－ＬＡＧ３宿主細胞を、従来のパンクレアチンで消化し、各回収チューブ内の細胞数を３×１０５にした。ＬＡＧ３抗体希釈物を、１％ ＰＢＳＡ（１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ）を用いて、それぞれ０．０１２３ｎＭ、０．１２３ｎＭ、１．２３ｎＭ、３．７ｎＭ、１１．１ｎＭ、３３．３ｎＭ、１００ｎＭ、及び３００ｎＭの最終濃度で調製し、それぞれを、ＬＡＧ３を発現する２９３Ｔ細胞とともに氷上で１時間インキュベートした。遠心分離を行い、１％ ＰＢＳＡを用いて数回の洗浄を行った後、各チューブに１００μＬのＦＩＴＣヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ社より購入；カタログ番号１０９－０９５－０９８）（１：５００の割合で希釈）を加え、混合物を暗所にて氷上で４０分間インキュベートした。１％ ＰＢＳＡで１回洗浄した後、２００μＬの１％ ＰＢＳＡを加えて細胞を再懸濁した。蛍光シグナルをフローサイトメーター上のＦＩＴＣチャネルで検出した。
抗体標識及びフローサイトメーター検出：先の工程で得た、抗原ＬＡＧ３を発現する２９３Ｔ－ＬＡＧ３宿主細胞を、従来のパンクレアチンで消化し、各回収チューブ内の細胞数を３×１０５にした。ＬＡＧ３抗体希釈物を、１％ ＰＢＳＡ（１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ）を用いて、それぞれ０．０１２３ｎＭ、０．１２３ｎＭ、１．２３ｎＭ、３．７ｎＭ、１１．１ｎＭ、３３．３ｎＭ、１００ｎＭ、及び３００ｎＭの最終濃度で調製し、それぞれを、ＬＡＧ３を発現する２９３Ｔ細胞とともに氷上で１時間インキュベートした。遠心分離を行い、１％ ＰＢＳＡを用いて数回の洗浄を行った後、各チューブに１００μＬのＦＩＴＣヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ社より購入；カタログ番号１０９－０９５－０９８）（１：５００の割合で希釈）を加え、混合物を暗所にて氷上で４０分間インキュベートした。１％ ＰＢＳＡで１回洗浄した後、２００μＬの１％ ＰＢＳＡを加えて細胞を再懸濁した。蛍光シグナルをフローサイトメーター上のＦＩＴＣチャネルで検出した。
【0099】
【0100】
図３から明らかなように、抗ＬＡＧ３抗体は、２９３Ｔ－ＬＡＧ３宿主細胞表面上の標的ＬＡＧ３タンパク質に効果的に結合し、抗ＬＡＧ３抗体Ｈ７Ｌ８（ｈＧ４ＷＴ）、Ｈ７Ｌ９（ｈＧ４ＷＴ）、及びＨ７Ｌ１０（ｈＧ４ＷＴ）の、２９３Ｔ－ＬＡＧ３細胞表面上の抗原への結合活性は、陽性対照抗体レラトリマブの結合活性に匹敵するものであった。
【0101】
実施例４：細胞膜表面上の抗原ＭＨＣ ＩＩへの結合に関してＬＡＧ３－ｍＦｃと競合する抗ＬＡＧ３抗体の競合結合活性の、競合フローサイトメトリーによる分析
Ｒａｊｉ細胞（培地：１６４０＋１０％ ＦＢＳ）（Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号ＴＣＨｕ ４４）を、ＥＰチューブに試料あたり３００，０００細胞で加えた。１０００μＬの１％ ＰＢＳＡ（１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ）を加えた。混合物を６００×ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。実験設計に従い、最終濃度３００ｎＭのｈＩｇＧ１（Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社による構築；ロット番号２０１９０４１０）を各チューブに１００μＬ加え、混合物を氷上で１時間インキュベートした。２００μＬの１％ ＰＢＳＡをインキュベート後のＲａｊｉ細胞に加え、混合物を６００×ｇで５分間遠心分離し、その後、上清を除去した。一方、実験設計に従い、対応する希釈を行った抗体（それぞれ３００ｎＭ、１００ｎＭ、３３．３ｎＭ、１１．１ｎＭ、３．７ｎＭ、１．２３ｎＭ、０．１２３ｎＭ、及び０．０１２３ｎＭの濃度）を別の新しいＥＰチューブに６０μＬ／チューブで加え、また、ブランク群（ＰＢＳＡ＋細胞）をデザインした。その後、６０μＬのＬＡＧ３－ｍＦｃ（Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社による構築；ロット番号２０１９０５０８）（最終濃度３ｎＭ）を、対応する各抗体チューブに加えた。混合物をよく混ぜ、氷上で３０分間プレインキュベートした。抗体とタンパク質のプレインキュベート済み混合物の１００μＬを、試料に加えた。混合物をよく混ぜ、暗所にて氷上で１時間インキュベートした。２００μＬの１％ ＰＢＳＡを加え、混合物を６００×ｇで５分間遠心分離した後に上清を除去し、次いで２回洗浄を行った。１００μＬのＡＰＣ抗マウス抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社より購入；カタログ番号４０５３０８）（１：４００の割合で希釈）を加え、混合物をよく混ぜて、暗所にて氷上で４０分間インキュベートした。２００μＬの１％ ＰＢＳＡを加え、混合物を６００×ｇで５分間遠心分離した後に上清を除去した。２００μＬの洗浄緩衝液を各チューブに加えて細胞を再懸濁し、その後、懸濁物をフローサイトメーター上の試験用サンプルローディングチューブに移した。
Ｒａｊｉ細胞（培地：１６４０＋１０％ ＦＢＳ）（Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号ＴＣＨｕ ４４）を、ＥＰチューブに試料あたり３００，０００細胞で加えた。１０００μＬの１％ ＰＢＳＡ（１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ）を加えた。混合物を６００×ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。実験設計に従い、最終濃度３００ｎＭのｈＩｇＧ１（Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社による構築；ロット番号２０１９０４１０）を各チューブに１００μＬ加え、混合物を氷上で１時間インキュベートした。２００μＬの１％ ＰＢＳＡをインキュベート後のＲａｊｉ細胞に加え、混合物を６００×ｇで５分間遠心分離し、その後、上清を除去した。一方、実験設計に従い、対応する希釈を行った抗体（それぞれ３００ｎＭ、１００ｎＭ、３３．３ｎＭ、１１．１ｎＭ、３．７ｎＭ、１．２３ｎＭ、０．１２３ｎＭ、及び０．０１２３ｎＭの濃度）を別の新しいＥＰチューブに６０μＬ／チューブで加え、また、ブランク群（ＰＢＳＡ＋細胞）をデザインした。その後、６０μＬのＬＡＧ３－ｍＦｃ（Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社による構築；ロット番号２０１９０５０８）（最終濃度３ｎＭ）を、対応する各抗体チューブに加えた。混合物をよく混ぜ、氷上で３０分間プレインキュベートした。抗体とタンパク質のプレインキュベート済み混合物の１００μＬを、試料に加えた。混合物をよく混ぜ、暗所にて氷上で１時間インキュベートした。２００μＬの１％ ＰＢＳＡを加え、混合物を６００×ｇで５分間遠心分離した後に上清を除去し、次いで２回洗浄を行った。１００μＬのＡＰＣ抗マウス抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社より購入；カタログ番号４０５３０８）（１：４００の割合で希釈）を加え、混合物をよく混ぜて、暗所にて氷上で４０分間インキュベートした。２００μＬの１％ ＰＢＳＡを加え、混合物を６００×ｇで５分間遠心分離した後に上清を除去した。２００μＬの洗浄緩衝液を各チューブに加えて細胞を再懸濁し、その後、懸濁物をフローサイトメーター上の試験用サンプルローディングチューブに移した。
【0102】
結果を図４及び表４に示す。蛍光定量分析及びカーブフィッティングにより、抗体レラトリマブ、Ｈ７Ｌ８（ｈＧ４ＷＴ）、Ｈ７Ｌ９（ｈＧ４ＷＴ）、及びＨ７Ｌ１０（ｈＧ４ＷＴ）の競合結合ＥＣ５０値は、それぞれ、１．１５３ｎＭ、１．３４２ｎＭ、１．３１７ｎＭ、及び１．２６７ｎＭと算出された。
【表4】
【0103】
結果は、抗体Ｈ７Ｌ８（ｈＧ４ＷＴ）、Ｈ７Ｌ９（ｈＧ４ＷＴ）、及びＨ７Ｌ１０（ｈＧ４ＷＴ）が、Ｒａｊｉ宿主細胞の表面上のＭＨＣ ＩＩへのＬＡＧ－３の結合を用量依存的に効果的にブロックできたこと、及びそれらが陽性対照抗体レラトリマブに匹敵する活性を有していたことを示す。
【0104】
実験例５：ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２分泌の促進における抗ＬＡＧ３抗体の生物学的活性の、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）による分析
１．Ｒａｊｉ－ＰＤＬ１混合リンパ球反応系での、ＩＦＮ－γ分泌の促進における抗ＬＡＧ３抗体の生物学的活性の分析
Ｒａｊｉ－ＰＤＬ１細胞を従来通り継代培養した。ＰＢＭＣを融解して１０ｍＬの１６４０完全培地中で培養し、０．５μｇ／ｍＬのＳＥＢ（ブドウ球菌エンテロトキシンＢ）（Ｄｉａｎｏｔｅｃｈ社；カタログ番号Ｓ０１０２０１）で２日間刺激した。前記Ｒａｊｉ－ＰＤＬ１細胞を２５μｇ／ｍＬのＭＭＣ（Ｓｔｒｅｓｓｍａｒｑ社；カタログ番号ＳＩＨ－２４６－１０ＭＧ）で処理し、５％ ＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で１時間インキュベートした。ＳＥＢで２日間刺激したＰＢＭＣ及びＭＭＣで１時間処理したＲａｊｉ－ＰＤＬ１細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、完全培地（すなわちＲＰＭＩ１６４０＋１０％ ＦＢＳ）中に再懸濁して、計数した。前記ＰＢＭＣ及びＲａｊｉ－ＰＤＬ１細胞をＵ字型９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社；モデル番号３７９９）に１０×１０４細胞／ウェルでそれぞれ加え、同時培養を行った。実験設計に基づき、抗体（単独又は組合せで使用の場合の各抗体の最終濃度は、３００ｎＭ、３０ｎＭ、及び３ｎＭであった）を加えてインキュベーター中で３日間細胞を同時培養した。３日後、細胞を１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞培養上清を回収して、ＩＦＮ－γをＥＬＩＳＡにより分析した。
１．Ｒａｊｉ－ＰＤＬ１混合リンパ球反応系での、ＩＦＮ－γ分泌の促進における抗ＬＡＧ３抗体の生物学的活性の分析
Ｒａｊｉ－ＰＤＬ１細胞を従来通り継代培養した。ＰＢＭＣを融解して１０ｍＬの１６４０完全培地中で培養し、０．５μｇ／ｍＬのＳＥＢ（ブドウ球菌エンテロトキシンＢ）（Ｄｉａｎｏｔｅｃｈ社；カタログ番号Ｓ０１０２０１）で２日間刺激した。前記Ｒａｊｉ－ＰＤＬ１細胞を２５μｇ／ｍＬのＭＭＣ（Ｓｔｒｅｓｓｍａｒｑ社；カタログ番号ＳＩＨ－２４６－１０ＭＧ）で処理し、５％ ＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で１時間インキュベートした。ＳＥＢで２日間刺激したＰＢＭＣ及びＭＭＣで１時間処理したＲａｊｉ－ＰＤＬ１細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、完全培地（すなわちＲＰＭＩ１６４０＋１０％ ＦＢＳ）中に再懸濁して、計数した。前記ＰＢＭＣ及びＲａｊｉ－ＰＤＬ１細胞をＵ字型９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社；モデル番号３７９９）に１０×１０４細胞／ウェルでそれぞれ加え、同時培養を行った。実験設計に基づき、抗体（単独又は組合せで使用の場合の各抗体の最終濃度は、３００ｎＭ、３０ｎＭ、及び３ｎＭであった）を加えてインキュベーター中で３日間細胞を同時培養した。３日後、細胞を１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞培養上清を回収して、ＩＦＮ－γをＥＬＩＳＡにより分析した。
【0105】
図５に示すように、ヒトＰＢＭＣとＲａｊｉ－ＰＤＬ１細胞の混合培養により、ＰＢＭＣにおけるＩＦＮ－γの分泌が促進され、混合培養系への抗体の添加により、ＩＦＮ－γのさらなる分泌をＰＢＭＣにおいて有意に誘導することができた。ＩＦＮ－γ分泌を促進する活性の程度については、抗ＬＡＧ３抗体Ｈ７Ｌ８（ｈＧ４ＷＴ）、Ｈ７Ｌ９（ｈＧ４ＷＴ）、及びＨ７Ｌ１０（ｈＧ４ＷＴ）をそれぞれ１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）と組合せた場合においても、陽性対照抗体レラトリマブを１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）と組合せた場合においても、同程度の活性でＩＦＮ－γ分泌が促進することができた。
【0106】
２．Ｒａｊｉ－ＰＤＬ１混合リンパ球反応系での、ＩＬ－２分泌の促進における抗ＬＡＧ抗体の生物学的活性の分析
Ｒａｊｉ－ＰＤＬ１細胞を従来通り継代培養した。ＰＢＭＣを融解して１０ｍＬの１６４０完全培地中で培養し、０．５μｇ／ｍＬのＳＥＢ（ブドウ球菌エンテロトキシンＢ；Ｄｉａｎｏｔｅｃｈ社より購入；カタログ番号Ｓ０１０２０１）で２日間刺激した。前記Ｒａｊｉ－ＰＤＬ１細胞を２５μｇ／ｍＬのＭＭＣ（Ｓｔｒｅｓｓｍａｒｑ社；カタログ番号ＳＩＨ－２４６－１０ＭＧ）で処理し、５％ ＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で１時間インキュベートした。ＳＥＢで２日間刺激したＰＢＭＣ及びＭＭＣで１時間処理したＲａｊｉ－ＰＤＬ１細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、完全培地（すなわちＲＰＭＩ１６４０＋１０％ ＦＢＳ）中に再懸濁して、計数した。前記ＰＢＭＣ及びＲａｊｉ－ＰＤＬ１細胞をＵ字型９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社；モデル番号３７９９）に１０×１０４細胞／ウェルでそれぞれ加え、同時培養を行った。実験設計に基づき、抗体（単独又は組合せで使用の場合の各抗体の最終濃度は、３００ｎＭ、３０ｎＭ、及び３ｎＭであった）を加えて３日間細胞を同時培養した。３日後、細胞を１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞培養上清を回収して、ＩＬ－２をＥＬＩＳＡにより分析した。
Ｒａｊｉ－ＰＤＬ１細胞を従来通り継代培養した。ＰＢＭＣを融解して１０ｍＬの１６４０完全培地中で培養し、０．５μｇ／ｍＬのＳＥＢ（ブドウ球菌エンテロトキシンＢ；Ｄｉａｎｏｔｅｃｈ社より購入；カタログ番号Ｓ０１０２０１）で２日間刺激した。前記Ｒａｊｉ－ＰＤＬ１細胞を２５μｇ／ｍＬのＭＭＣ（Ｓｔｒｅｓｓｍａｒｑ社；カタログ番号ＳＩＨ－２４６－１０ＭＧ）で処理し、５％ ＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で１時間インキュベートした。ＳＥＢで２日間刺激したＰＢＭＣ及びＭＭＣで１時間処理したＲａｊｉ－ＰＤＬ１細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、完全培地（すなわちＲＰＭＩ１６４０＋１０％ ＦＢＳ）中に再懸濁して、計数した。前記ＰＢＭＣ及びＲａｊｉ－ＰＤＬ１細胞をＵ字型９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社；モデル番号３７９９）に１０×１０４細胞／ウェルでそれぞれ加え、同時培養を行った。実験設計に基づき、抗体（単独又は組合せで使用の場合の各抗体の最終濃度は、３００ｎＭ、３０ｎＭ、及び３ｎＭであった）を加えて３日間細胞を同時培養した。３日後、細胞を１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞培養上清を回収して、ＩＬ－２をＥＬＩＳＡにより分析した。
【0107】
図６に示すように、ヒトＰＢＭＣ（健常ドナー由来）とＲａｊｉ－ＰＤＬ１細胞の混合培養により、ＰＢＭＣにおけるＩＬ－２の分泌がある程度促進された。また、混合培養系への抗体の添加により、ＩＬ－２のさらなる分泌をＰＢＭＣにおいて有意に誘導することができ、それは用量依存的な関係を示した。ＩＬ－２分泌を促進する活性の程度については、抗ＬＡＧ３抗体Ｈ７Ｌ８（ｈＧ４ＷＴ）、Ｈ７Ｌ９（ｈＧ４ＷＴ）、及びＨ７Ｌ１０（ｈＧ４ＷＴ）をそれぞれ１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）と組合せた場合においても、陽性対照抗体レラトリマブを１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＴＭ）と組合せた場合においても、同程度の活性でＩＬ－２分泌が促進することができた。
【0108】
実験例６：ＬＡＧ－３とＭＨＣ－ＩＩの間の相互作用のブロックにおける、抗ＬＡＧ抗体の生物学的活性の分析（レポーター遺伝子法）
Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＰＤ１－ＬＡＧ３細胞及びＲａｊｉ細胞を、レポーター遺伝子系として使用した。スーパー抗原ＳＥＥを加えた後、ＴＣＲ－ＮＦＡＴシグナル伝達経路を活性化させて、ルシフェラーゼの発現を誘導した。Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＬＡＧ－３を、ＮＦＡＴシグナル伝達経路が阻害され、ルシフェラーゼの発現が下方制御されるように、Ｒａｊｉ細胞上のＭＨＣ－ＩＩに結合した。抗体は、ＬＡＧ－３に特異的に結合することによってルシフェラーゼの発現の阻害を軽減し、上方制御をもたらした。
Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＰＤ１－ＬＡＧ３細胞及びＲａｊｉ細胞を、レポーター遺伝子系として使用した。スーパー抗原ＳＥＥを加えた後、ＴＣＲ－ＮＦＡＴシグナル伝達経路を活性化させて、ルシフェラーゼの発現を誘導した。Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＬＡＧ－３を、ＮＦＡＴシグナル伝達経路が阻害され、ルシフェラーゼの発現が下方制御されるように、Ｒａｊｉ細胞上のＭＨＣ－ＩＩに結合した。抗体は、ＬＡＧ－３に特異的に結合することによってルシフェラーゼの発現の阻害を軽減し、上方制御をもたらした。
【0109】
Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＰＤ１－ＬＡＧ３及びＲａｊｉ細胞（Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓより購入；カタログ番号ＴＣＨｕ ４４）を回収し、１１０×ｇで５分間遠心分離し、次いで上清を除去した。その後、細胞を１６４０＋１０％ ＦＢＳ培地に再懸濁し、計数した。Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＰＤ１－ＬＡＧ３細胞を黒底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社；モデル番号３９１６）中に１０５細胞／ウェル（３０μＬ／ウェル）で播種した。実験設計に従い、抗体（それぞれ０．３ｎＭ、３ｎＭ、及び３００ｎＭの最終濃度）を１０μＬ／ウェル加え、混合物を５％ ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で３０分間プレインキュベートした。一方、ＳＥＥ（ブドウ球菌エンテロトキシンＥ；Ｔｏｘｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社より購入；カタログ番号ＥＴ４０４）（最終濃度０．０５ｎｇ／ｍＬ）をＲａｊｉ細胞に加え、混合物を５％ ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で３０分間インキュベートした。３０分後、ＳＥＥ処理済みＲａｊｉ細胞を、上記Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＰＤ１－ＬＡＧ３細胞を含む９６ウェルプレートに２×１０４細胞／ウェル（４０μＬ／ウェル）加え、各ウェルの最終容量を８０μＬとした。混合物をよく混ぜ、５％ ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で６時間インキュベートした。インキュベート後、培養プレートを取り出し、室温に戻した。Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社より購入；カタログ番号Ｅ２６５０）を８０μＬ／ウェル加え、混合物を暗所で２分間インキュベートした。その後、ＲＬＵ値を読み取った。アイソタイプコントロールｈＩｇＧ１ＤＭが、Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社によってロット番号２０１８１１０７にて構築された。アイソタイプコントロールｈＧ４ＷＴが、Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社によってロット番号２０１９０９１０にて構築された。
【0110】
図７に示すように、抗ＬＡＧ抗体Ｈ７Ｌ８（ｈＧ４ＷＴ）、Ｈ７Ｌ９（ｈＧ４ＷＴ）、及びＨ７Ｌ１０（ｈＧ４ＷＴ）、並びに陽性対照抗体レラトリマブは、ＬＡＧ－３とＭＨＣ－ＩＩの間の相互作用をブロックし、ルシフェラーゼの発現を上方制御することができた。また、抗ＬＡＧ抗体Ｈ７Ｌ８（ｈＧ４ＷＴ）、Ｈ７Ｌ９（ｈＧ４ＷＴ）、及びＨ７Ｌ１０（ｈＧ４ＷＴ）の活性は、いずれも対照抗体レラトリマブよりも優れたものであった。
【0111】
本発明の具体的な実施形態を詳細に記載したが、当業者は、開示されたあらゆる教示に従い、それらの詳細に対して各種改変及び置換を行いうること、そして、これらの変更が全て本発明の保護範囲内に含まれることを理解するであろう。本発明の完全な範囲が、添付の請求の範囲及びその任意の等価物によって提供される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】
【国際調査報告】