特表 2024-536893 疾患の再発を予測するためのウイルスＤＮＡの配列決定

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-08

(54)【発明の名称】疾患の再発を予測するためのウイルスＤＮＡの配列決定

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6869 20180101AFI20241001BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20241001BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20241001BHJP

   C12Q 1/6888 20180101ALN20241001BHJP

   C12N 7/00 20060101ALN20241001BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6869 Z

C12Q1/686 Z

C12M1/34 B

C12Q1/6888 Z

C12N7/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024520577

(86)(22)【出願日】2022-09-29

(85)【翻訳文提出日】2024-04-15

(86)【国際出願番号】 CN2022122509

(87)【国際公開番号】W WO2023056884

(87)【国際公開日】2023-04-13

(31)【優先権主張番号】63/251,985

(32)【優先日】2021-10-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＳＷＩＦＴ

２．ＰＹＴＨＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】512037244

【氏名又は名称】ザ チャイニーズ ユニバーシティ オブ ホンコン

(71)【出願人】

【識別番号】522380594

【氏名又は名称】グレイル，リミティド ライアビリティ カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ロー， ユク－ミン デニス

(72)【発明者】

【氏名】チャン， クワン チー

(72)【発明者】

【氏名】ラム， ワイ ケイ

(72)【発明者】

【氏名】チャン， チウ トゥン

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B029AA27

4B029BB11

4B029BB20

4B029FA15

4B063QA19

4B063QQ02

4B063QQ03

4B063QQ42

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR62

4B063QS25

4B063QX02

4B065AA95X

4B065AA95Y

4B065CA60

(57)【要約】

様々な実施形態は、ウイルス等の病原体からの核酸を含む無細胞核酸、例えば、血漿ＤＮＡ及び血清ＤＮＡの個数及びサイズの分析の応用（例えば、生体サンプルの分類）に関する。一応用の実施形態では、以前に病態の治療を受けた対象が将来の時点で再発するか否かを予測することができる。標的配列決定（例えば、特別に設計された捕捉プローブ、増幅プライマー）は、ウイルスゲノム全体にわたってＤＮＡを同定するために使用することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

以前に病態の治療を受けており現在その病態の症状がない対象からの生体サンプルを分析する方法であって、
前記生体サンプルの核酸分子の混合物からの第１の複数の無細胞核酸分子を配列決定して第１配列リードを得るステップであって、前記生体サンプルが前記対象からの核酸分子とウイルスからの核酸分子との混合物を含むステップと、
前記第１配列リードを、前記ウイルスに対応する参照ゲノムにアライメントするように試みるステップと、
前記参照ゲノムにアライメントする前記第１配列リードの量を特定するステップと、
前記量を第１カットオフと比較するステップと、
前記量と前記第１カットオフとの比較に基づいて前記病態の再発の分類を特定するステップと、を含む、前記方法。

【請求項2】

前記対象の前記生体サンプルの核酸分子の混合物からの第２の複数の無細胞核酸分子のそれぞれについて、
前記無細胞核酸分子のサイズを測定し、そして
前記無細胞核酸分子が前記参照ゲノムからのものであるか否かを判定するステップと、
前記参照ゲノムからのものである前記第２の複数の無細胞核酸分子の測定されたサイズから導き出された統計値を特定するステップと、
前記統計値を第２カットオフと比較するステップであって、前記病態の再発の分類が、更に前記量と前記第１カットオフとの比較及び前記統計値と前記第２カットオフとの比較に基づいて特定されるステップと、を更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記無細胞核酸分子のサイズを測定するステップは、前記生体サンプルの核酸分子の混合物からの前記第２の複数の無細胞核酸分子を配列決定して第２配列リードを得るステップを含み、前記無細胞核酸分子のサイズが前記第２配列リードを使用して測定される、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記第１の複数の無細胞核酸分子は前記第２の複数の無細胞核酸分子である、請求項２に記載の方法。

【請求項5】

前記統計値は、
前記ウイルスの前記参照ゲノムからのものである、所与の範囲内のサイズを有する前記第２の複数の無細胞核酸分子の第１割合と、
ヒト参照ゲノムからのものである、前記所与の範囲内のサイズを有する前記第２の複数の無細胞核酸分子の第２割合と、の比を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項6】

前記第２カットオフは６～１１の値である、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記所与の範囲は、８０～１１０塩基対、５０～７５塩基対、６０～９０塩基対、９０～１２０塩基対、１２０～１５０塩基対、又は１５０～１８０塩基対である、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

前記統計値は前記比の逆数である、請求項５に記載の方法。

【請求項9】

前記第２カットオフは、０．９～０．１６の値である、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記第１カットオフ及び前記第２カットオフは、再発の分類が既知の訓練サンプルから特定される、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記第１カットオフ及び前記第２カットオフのそれぞれは、前記訓練サンプルの分類を正確に特定するための特異性及び感度を使用して選択される、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記病態は癌である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記癌は、上咽頭癌、頭頸部扁平上皮癌、子宮頸癌、及び肝細胞癌からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記ウイルスからの核酸分子について前記生体サンプルを濃縮するステップを更に含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

前記ウイルスからの核酸分子について前記生体サンプルを濃縮する前記ステップは、前記ウイルスのゲノムの一部又は全体に結合する捕捉プローブを使用するステップを含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

ヒトゲノムの一部からの核酸分子について前記生体サンプルを濃縮するステップを更に含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

前記ウイルスは、ＥＢＶ ＤＮＡ、ＨＰＶ ＤＮＡ、ＨＢＶ ＤＮＡ、ＨＣＶ核酸、又はそれらの断片を含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

前記対象は妊婦である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

前記病態は上咽頭癌である、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記分類の特定に応じて、前記病態の再発を予防するように前記対象に別の治療を開始するステップを更に含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

前記分類は、寛解、再発、局所領域不全、又は遠隔転移を含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

以前に病態の治療を受けており現在前記病態の症状がない対象からの生体サンプルを分析する方法であって、
第１アッセイを行うステップであって、前記第１アッセイが、前記対象の前記生体サンプルの核酸分子の混合物からの第１の複数の無細胞核酸分子を分析することを含み、前記生体サンプルが前記対象からの核酸分子とウイルスからの核酸分子との混合物を含むステップと、
第２アッセイを行うステップであって、前記第２アッセイが、
前記対象の前記生体サンプルの核酸分子の混合物からの第２の複数の無細胞核酸分子のそれぞれについて、
前記無細胞核酸分子のサイズを測定し、そして
前記無細胞核酸分子が前記ウイルスに対応する参照ゲノムからのものであるか否かを判定することを含む、ステップと、
前記参照ゲノムにアライメントする前記第１の複数の無細胞核酸分子の量を特定するステップと、
前記参照ゲノムからのものである前記第２の複数の無細胞核酸分子の測定されたサイズから導き出された統計値を特定するステップと、
前記量を第１カットオフと比較するステップと
前記統計値を第２カットオフと比較するステップと
前記量と前記第１カットオフとの比較及び前記統計値と前記第２カットオフとの比較に基づいて前記病態の再発の分類を特定するステップと、を含む、前記方法。

【請求項23】

前記無細胞核酸分子のサイズを測定するステップは、前記生体サンプルの核酸分子の混合物からの前記第２の複数の無細胞核酸分子を配列決定して配列リードを得るステップを含み、前記無細胞核酸分子のサイズが、前記配列リードを使用して測定される、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記第１アッセイは、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、又は配列決定を含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項25】

前記第１の複数の無細胞核酸分子は前記第２の複数の無細胞核酸分子である、請求項２２に記載の方法。

【請求項26】

前記統計値は、
前記ウイルスの前記参照ゲノムからのものである、所与の範囲内のサイズを有する前記第２の複数の無細胞核酸分子の第１割合と、
ヒト参照ゲノムからのものである、前記所与の範囲内のサイズを有する前記第２の複数の無細胞核酸分子の第２割合と、の比を含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項27】

前記第２カットオフは６～１１の値である、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記所与の範囲は、８０～１１０塩基対、５０～７５塩基対、６０～９０塩基対、９０～１２０塩基対、１２０～１５０塩基対、又は１５０～１８０塩基対である、請求項２６に記載の方法。

【請求項29】

前記統計値は前記比の逆数である、請求項２６に記載の方法。

【請求項30】

前記第２カットオフは、０．９～０．１６の値である、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記第１カットオフ及び前記第２カットオフは、再発の分類が既知の訓練サンプルから特定される、請求項２２～３０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項32】

前記第１カットオフ及び前記第２カットオフのそれぞれは、前記訓練サンプルの分類を正確に特定するための特異性及び感度を使用して選択される、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記病態は癌である、請求項２２～３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

前記癌は、上咽頭癌、頭頸部扁平上皮癌、子宮頸癌、及び肝細胞癌からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記ウイルスからの核酸分子について前記生体サンプルを濃縮するステップを更に含む、請求項２２～３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項36】

前記ウイルスからの核酸分子について前記生体サンプルを濃縮する前記ステップは、前記ウイルスのゲノムの一部又は全体に結合する捕捉プローブを使用するステップを含む、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

ヒトゲノムの一部からの核酸分子について前記生体サンプルを濃縮するステップを更に含む、請求項３５に記載の方法。

【請求項38】

前記ウイルスは、ＥＢＶ ＤＮＡ、ＨＰＶ ＤＮＡ、ＨＢＶ ＤＮＡ、ＨＣＶ核酸、又はそれらの断片を含む、請求項２２～３７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

前記対象は妊婦である、請求項２２～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項40】

前記病態は上咽頭癌である、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記分類の特定に応じて、前記病態の再発を予防するように前記対象に別の治療を開始するステップを更に含む、請求項２２～４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

前記分類は、寛解、再発、局所領域不全、又は遠隔転移を含む、請求項２２～４１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項43】

実行されるとコンピュータシステムに先行する請求項のいずれか１項に記載の方法を行わせる複数の命令を記憶する非一時的なコンピュータ可読媒体を含む、コンピュータ製品。

【請求項44】

請求項４３に記載のコンピュータ製品と、
前記コンピュータ可読媒体に記憶された命令を実行するための１つ又は複数のプロセッサと、を含む、システム。

【請求項45】

上記の方法のいずれかを行うための手段を含む、システム。

【請求項46】

上記の方法のいずれかを行うように構成された１つ又は複数のプロセッサを含む、システム。

【請求項47】

それぞれ上記の方法のいずれかのステップを行うモジュールを含む、システム。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

腫瘍細胞が腫瘍由来のＤＮＡを血流に放出するという発見により、無細胞サンプル（例えば、血漿）を使用して対象における腫瘍の存在、位置及び／又はタイプを特定可能な非侵襲的方法の開発が立ち上がってきた。循環無細胞ＤＮＡ分析は、癌治療応答の非侵襲的モニタリング及び癌再発の検出に有用であることが示されている。しかし、従来の技術は、以前に特定の治療を完了した対象における疾患の再発を検出するための感度及び／又は特異性を欠いている可能性がある。例えば、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、無細胞サンプル中のウイルスＤＮＡの検出に使用されており、検出されたウイルスＤＮＡからの統計値が癌患者のスクリーニングに使用された。しかし、これらの従来技術は、治療後サンプルから疾患の再発を予測する感度が低いという難題に臨んでいる。したがって、治療後サンプルにおける疾患の再発を予測する際に、全体的により高い正確度を有する方法が臨床的に求められている。

【発明の概要】

【0002】

様々な実施形態は、ウイルス等の病原体からの核酸を含む無細胞核酸、例えば、血漿ＤＮＡ及び血清ＤＮＡの個数及び／又はサイズの分析の応用（例えば、生体サンプルの分類）に関する。一応用の実施形態では、以前に病態の治療を受けた対象が将来の時点で再発するか否かを予測することができる。いくつかの実施において、標的配列決定（例えば、捕捉プローブ又は増幅プライマーを使用）は、対象のゲノム（例えば、ヒトゲノム）に関して、ウイルスゲノムの（例えば、ウイルスゲノムの全ての遺伝子座又は特定の遺伝子座にわたって）ＤＮＡを濃縮するために使用することができる。標的配列決定は、例えば、ヒトゲノムの一部のみが分析されるように、対象のゲノムに対して実行することができ、その結果、対象の分析されるＤＮＡの量が、遥かに多いのではなく、対象の分析されたＤＮＡの量と同等になる。かかる標的配列決定により、正確度が向上する。

【0003】

１つの実施形態によれば、無細胞核酸分子の混合物の配列決定から得られた配列リードは、ウイルスに対応するウイルス参照ゲノムにアライメントしている前記配列リードの量を特定するために使用することができる。１つの実施例において、前記配列リードの量は、配列リードの総数に対する前記ウイルス参照ゲノムにアライメントされた配列リードの割合で表すことができる。前記ウイルス参照ゲノムにアライメントしている前記配列リードの量は、第１カットオフ値と比較して治療後サンプルにおける再発を予測することができる。

【0004】

別の実施形態によれば、個数ベースの分析は、再発を予測するためにウイルス核酸分子（例えば、ウイルスに対応するウイルス参照ゲノムにアライメントしているもの）のサイズと組み合わせることができる。統計値は、（１）所与の範囲内のサイズを有する、前記ウイルス参照ゲノムにアライメントする核酸分子の配列リードの第１割合と、（２）前記所与の範囲内のサイズを有する、ヒト参照ゲノムにアライメントする核酸分子の配列リードの第２割合とのサイズ比を表すことができる。前記対象の疾患の再発（例えば、遠隔転移）は、前記配列リードの量を前記第１カットオフ値と比較し、前記統計値を第２カットオフ値と比較することで特定できる。場合によっては、異なる第１及び第２カットオフ値は、疾患の再発を予測する感度及び／又は特異性を増加させるために選択される。場合によっては、前記統計値は、前記ウイルス参照ゲノムからの前記複数の核酸分子のサイズ分布に対応する。

【0005】

他の実施形態は、本明細書に記載の方法に関連するシステム、ポータブル消費者デバイス、及びコンピュータ可読媒体に関する。

【0006】

本開示の更なる態様及び利点は、以下の詳細な説明から当業者に容易に明らかになるであろう。ここで本開示の例示的な実施形態のみが示され説明される。認識されるように、本開示は、他の異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、全て本開示から逸脱することなく、様々な明白な点において修正することができる。したがって、図面及び説明は、限定的なものではなく、本質的に例示的なものと考えられる。

【0007】

本特許又は出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数可）を含む本特許又は特許出願公報の複写物は、依頼に応じて、及び必要な料金の支払いを受けて特許庁により提供される。

【0008】

本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に記載されている。本発明の特徴及び利点は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態及び添付の図面（本明細書で「図（Ｆｉｇｕｒｅ及びＦＩＧ．）」とも記載される）を説明する以下の詳細な説明を参照することによって、よりよく理解される。図面の説明を次に記載する。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】対象の血流に沈着している上咽頭癌（ＮＰＣ）細胞からのエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ＤＮＡ断片を示す概略図を示す。

【0010】

【図2】ＮＰＣを有する対象及び対照対象における血漿ＥＢＶ ＤＮＡ（コピー／ｍＬ血漿）の濃度を示す。

【0011】

【図3A】異なる対象群についてリアルタイムＰＣＲによって測定された血漿ＥＢＶ ＤＮＡ濃度を示す。

【図3B】異なる対象群についてリアルタイムＰＣＲによって測定された血漿ＥＢＶ ＤＮＡ濃度を示す。

【0012】

【図4】早期ＮＰＣを有する対象及び進行期ＮＰＣを有する対象における血漿ＥＢＶ ＤＮＡ（コピー／ｍＬ血漿）の濃度を示す。

【0013】

【図5】（左）血漿ＥＢＶ ＤＮＡが持続的に陽性であるが観察可能な病態がない対象、及び（右）検証分析の一環としてスクリーニングによって同定された早期ＮＰＣ患者の、リアルタイムＰＣＲによって測定された血漿ＥＢＶ ＤＮＡ濃度を示す。

【0014】

【図6】血漿ＥＢＶ ＤＮＡが一時的に陽性又は持続的に陽性（それぞれ左又は中央）であるが観察可能な病態がない対象、及びＮＰＣを有すると同定された対象における、リアルタイムＰＣＲによって測定された血漿ＥＢＶ ＤＮＡ濃度（コピー／ミリリットル）を示す。

【0015】

【図7】血漿ＥＢＶ ＤＮＡが一時的に陽性又は持続的に陽性（それぞれ左又は中央）であるが観察可能な病態がない対象、及びＮＰＣを有すると同定された対象における、リアルタイムＰＣＲによって測定された血漿ＥＢＶ ＤＮＡ濃度（コピー／ミリリットル）を示す。

【0016】

【図8A】異なる対象群のＥＢＶゲノムにマッピングされた、配列決定された血漿ＤＮＡ断片の割合を示す。

【図8B】異なる対象群のＥＢＶゲノムにマッピングされた、配列決定された血漿ＤＮＡ断片の割合を示す。

【0017】

【図9】（左）血漿ＥＢＶ ＤＮＡが持続的に陽性であるが観察可能な病態がない対象、及び（右）スクリーニングによって同定された早期ＮＰＣ患者の、血漿中のＥＢＶゲノムにマッピングされたリードの割合を示す。

【0018】

【図10】様々な病期のＮＰＣを有する対象の全生存率を経時的に示す。

【0019】

【図11】リアルタイムＰＣＲを使用して治療後サンプルから検出された血漿ＥＢＶ ＤＮＡ濃度を示す。

【0020】

【図12】リアルタイムＰＣＲによって特定された血漿ＥＢＶ ＤＮＡ状態に基づいて群化されたＮＰＣ患者の全生存率を同定するグラフを示す。

【0021】

【図13】標的捕捉配列決定を使用して治療後サンプルから検出された配列リードの割合を同定するグラフを示す。

【0022】

【図14】本発明の実施形態に係る、対象の無細胞混合物中のウイルス核酸断片の配列リードを使用して疾患の再発を予測する個数ベースの方法を図示するフローチャートである。

【0023】

【図15】標的捕捉配列決定を使用して治療後サンプルから検出されたＥＢＶ ＤＮＡの割合及びサイズ比を同定するグラフを示す。

【0024】

【図16】本発明の実施形態に係る、疾患の再発を予測するためにウイルス核酸断片の個数ベースの分析とサイズベースの分析を組み合わせた方法のフローチャートである。

【0025】

【図17】ＮＰＣ患者の治癒を目的とした治療完了後６週間で採取された血漿サンプルの分析に基づいて疾患の再発を予測する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。

【0026】

【図18】標的捕捉配列決定を使用して組み合わせ分析に基づいて群化されたＮＰＣ患者の全生存率を同定するグラフを示す。

【0027】

【図19】推定の配列決定ベースのＥＢＶレベルに基づいて群化されたＮＰＣ患者の全生存率を同定するグラフを示す。

【0028】

【図20】血漿中のＥＢＶ ＤＮＡ割合が０．０１％を下回ったＮＰＣ患者の全生存率を同定するグラフを示す。

【0029】

【図21】ＮＰＣ患者及びＮＰＣが同定されなかった妊婦にわたるリアルタイムＰＣＲによる血漿ＥＢＶ ＤＮＡ濃度を示す。

【0030】

【図22】ＮＰＣ患者及びＮＰＣが同定されなかった妊婦にわたる個数ベースの分析を使用した血漿ＥＢＶ ＤＮＡ濃度を示す。

【0031】

【図23】ＮＰＣ患者及びＮＰＣが同定されなかった妊婦にわたる血漿ＥＢＶ ＤＮＡの個数及びサイズベースの分析を示す。

【0032】

【図24】本開示の実施形態に係る、対象の標的化捕捉配列決定用の捕捉プローブの設計例を示す。

【0033】

【図25】様々な標的捕捉オプションを通じたＮＰＣサンプルの配列決定による血漿ＥＢＶ ＤＮＡ分画濃度を同定する１組の棒プロットを示す。

【0034】

【図26】本発明の実施形態に係るシステムを図示する。

【0035】

【図27】本発明の実施形態に係るシステム及び方法と共に使用可能なコンピュータシステムの例のブロック図を示す。

【発明を実施するための形態】

【0036】

用語
「組織」は、機能単位として共に群化する細胞の群に対応する。１タイプより多くの細胞が、単一の組織内に見出され得る。異なるタイプの組織は、異なるタイプの細胞（例えば、肝細胞、肺胞細胞、又は血球細胞）からなり得るが、異なる生物（宿主対ウイルス）からの組織又は健康細胞対腫瘍細胞にも対応し得る。「組織」という用語は一般に、ヒト体内に見られる任意の細胞群（例えば、心臓組織、肺組織、腎臓組織、鼻咽頭組織、口腔咽頭組織）を指し得る。いくつかの態様において、「組織」又は「組織型」という用語は、無細胞核酸が由来する組織を指すために使用され得る。一例では、ウイルス核酸断片は、例えば、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）の血液組織に由来し得る。別の例では、ウイルス核酸断片は、腫瘍組織、例えば、ＥＢＶ又はヒトパピローマウイルス感染（ＨＰＶ）に由来し得る。

【0037】

「サンプル」、「生体サンプル」、又は「患者サンプル」という用語は、生きている対象又は死んだ対象に由来する任意の組織又は物質を含むことを意味する。生体サンプルは、無細胞サンプルであり得、それは、対象からの核酸分子と、場合によっては病原体、例えばウイルスからの核酸分子との混合物を含み得る。生体サンプルは一般に、核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はその断片を含む。「核酸」という用語は一般に、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、又はそれらの任意のハイブリッド又は断片を指し得る。サンプル中の核酸は無細胞核酸であり得る。サンプルは、液体サンプル又は固体サンプル（例えば、細胞又は組織サンプル）であり得る。生体サンプルは、血液、血漿、血清、尿、膣液、（例えば精巣の）水腫からの液、膣洗浄流体、胸水、腹水、脳脊髄液、唾液、汗、涙、痰、気管支肺胞洗浄液、乳首からの排出液、体の異なる部分（例えば、甲状腺、乳房）からの吸引流体等の体液であり得る。便サンプルもまた、使用することができる。様々な実施形態において、無細胞ＤＮＡについて濃縮された生体サンプル（例えば、遠心分離プロトコルを通じて得られた血漿サンプル）中のＤＮＡの大部分は、無細胞であり得る（例えば、ＤＮＡの５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、又は９９％超は、無細胞であり得る）。いくつかの実施形態において、少なくとも１，０００個の無細胞ＤＮＡ分子が分析される。他の実施形態において、少なくとも１０，０００又は５０，０００又は１００，０００又は５００，０００又は１，０００，０００又は５，０００，０００個の無細胞ＤＮＡ分子、又はそれ以上の無細胞ＤＮＡ分子が、分析され得る。少なくとも同じ数の配列リードが分析され得る。生体サンプルは、組織又は細胞の構造を物理的に破壊するように（例えば、遠心分離及び／又は細胞溶解）処理され得るため、細胞内成分を、分析用のサンプルを調製するための酵素、緩衝液、塩、界面活性剤等を更に含有し得る溶液中に放出し得る。

【0038】

「対照」、「対照サンプル」、「参照」、「参照サンプル」、「正常」、及び「正常サンプル」という用語は、特定の症状を持たないサンプル、又はそうでなければ健康なサンプルを一般的に説明するために交換可能に使用され得る。一例では、本明細書に開示される方法は、腫瘍を有する対象に対して実施することができ、ここで参照サンプルは、対象の健康な組織から採取されたサンプルである。別の例では、参照サンプルは、疾患、例えば、癌又は特定の病期の癌を有する対象から得られたサンプルである。参照サンプルは、対象又はデータベースから取得され得る。参照は一般に、対象からのサンプルを配列決定することから得られた配列リードをマッピングするために使用される参照ゲノムを指す。

【0039】

「参照ゲノム」という用語は一般に、生体サンプル及び生得的サンプルからの配列リードがアライメント及び比較され得る、１倍体又は２倍体ゲノムを指す。１倍体ゲノムについては、各遺伝子座において１つのヌクレオチドのみが存在する。２倍体ゲノムについては、ヘテロ接合遺伝子座を同定することができ、このような遺伝子座は２つの対立遺伝子を有し、いずれかの対立遺伝子が、遺伝子座へのアライメントの一致を可能にし得る。参照ゲノムは、例えば、１つ又は複数のウイルスゲノムを含めることにより、ウイルスに対応し得る。

【0040】

本明細書で使用されるように、「健康」という語句は一般に、良好な健康状態を有する対象を指す。このような対象は、悪性疾患が存在しないこと又は非悪性疾患であることを示す。「健康個体」は、通常「健康」とは見なされないアッセイされる症状とは無関係の、他の疾患又は症状を有し得る。

【0041】

「癌」又は「腫瘍」という用語は交換可能に使用され、一般に、組織の異常な塊を指し、その塊の成長は正常組織の成長を上回り、それと協調されない。癌又は腫瘍は、形態及び機能性を含む細胞分化の程度、成長速度、局所侵襲、及び転移といった特徴に応じて「良性」又は「悪性」と定義され得る。「良性」腫瘍は一般に十分に分化しており、悪性腫瘍よりも特徴的に成長が遅く、原発巣に局在したままである。加えて、良性腫瘍には、離れた部位に浸潤、侵襲、又は転移する能力を有さない。「悪性」腫瘍は一般に低分化（退形成）であり、周囲組織の進行性浸潤、侵襲、及び破壊を伴う特徴的な急速成長を示す。更に、悪性腫瘍は離れた部位に転移する能力を有する。「病期」は、悪性腫瘍の進行状況を説明するために使用できる。早期の癌又は悪性腫瘍は、後期の悪性腫瘍よりも体内の腫瘍負荷が少なく、一般的に症状が少なく、予後が良好で、治療成績が良好であることに関連している。後期又は進行期の癌又は悪性腫瘍は、多くの場合、遠隔転移及び／又はリンパ行性浸潤に関連している。

【0042】

「病態のレベル」は、生物に関連する病態の量、程度、又は重篤度を指し得、そのレベルは、癌について上記で記述した通りであり得る。病態の別の例は、移植された臓器の拒絶反応である。他の病態の例としては、自己免疫発作（例えば、腎臓を損傷するループス腎炎又は中枢神経系を損傷する多発性硬化症）、炎症性疾患（例えば、肝炎）、線維化プロセス（例えば、肝硬変）、脂肪浸潤（例えば、脂肪性肝疾患）、変性プロセス（例えば、アルツハイマー病）、及び虚血性組織損傷（例えば、心筋梗塞又は脳卒中）を含み得る。対象の健康な状態は、病態のない分類と見なし得る。病態は癌であり得る。

【0043】

「癌のレベル」という用語は、癌が存在するか否か（即ち、存在又は不在）、癌の病期、腫瘍のサイズ、転移があるか否か、体の総腫瘍負荷、治療に対する癌の応答、及び／又は癌の重篤度の他の尺度（例えば、癌の再発）を指し得る。癌のレベルは、数字、又は、記号、アルファベット文字、及び色等の他のしるしであり得る。レベルは、ゼロであり得る。癌のレベルは、前悪性症状又は前癌性症状（状態）も含み得る。癌のレベルは、様々な方法で使用され得る。例えば、スクリーニングによって、癌を有することを今まで知らなかった者において癌が存在するか否かをチェックすることができる。評価は、癌と診断されている者を検査して、癌の進行を経時的に監視し、療法の有効性を研究し、又は予後を判定し得る。１つの実施形態において、予後は、患者が癌で死亡する確率、又は特定の持続時間若しくは特定の時間後、癌が進行する確率、又は癌が転移する確率若しくは程度として表し得る。検出は、「スクリーニング」を意味し得るか、又は癌の示唆的な特徴（例えば、症状又は他の陽性検査結果）を有する者が癌を有するか否かをチェックすることを意味し得る。

【0044】

本明細書で使用されるように、「断片」（例えば、ＤＮＡ断片）という用語は、少なくとも３つの連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の一部を指し得る。核酸断片は、親ポリペプチドの生物学的活性及び／又はいくつかの特性を保持することができる。核酸断片は、二本鎖又は一本鎖、メチル化又は非メチル化、インタクト又はニック、他の高分子、例えば脂質粒子、タンパク質と複合又は非複合であり得る。一例では、鼻咽頭癌細胞は、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ＤＮＡ断片を対象、例えば患者の血流に放出し得る。これらの断片は、血漿中の腫瘍由来ＤＮＡのレベルを検出するために使用できる、１つ又は複数のＢａｍＨＩ－Ｗ配列断片を含み得る。ＢａｍＨＩ－Ｗ配列断片は、Ｂａｍ－ＨＩ制限酵素を使用して認識及び／又は消化することができる配列に対応する。ＢａｍＨＩ－Ｗ配列は、配列５´－ＧＧＡＴＣＣ－３´を指し得る。

【0045】

腫瘍由来の核酸は、腫瘍細胞内の病原体からの病原体核酸を含む、腫瘍細胞から放出された任意の核酸を指し得る。例えば、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ＤＮＡである。

【0046】

「アッセイ」という用語は一般に、核酸の特性を特定するための技術を指す。アッセイ（例えば、第１アッセイ又は第２アッセイ）は一般に、サンプル中の核酸の量、サンプル中の核酸のゲノム同一性、サンプル中の核酸のコピー数変動、サンプル中の核酸のメチル化状態、サンプル中の核酸の断片サイズ分布、サンプル中の核酸の変異状態、又はサンプル中の核酸の断片化パターンを特定する技術を指す。当業者に既知の任意のアッセイを使用して、本明細書で言及した核酸の特性のいずれかを検出することができる。核酸の特性は、配列、量、ゲノム同一性、コピー数、１つ又は複数のヌクレオチド位置でのメチル化状態、核酸のサイズ、１つ又は複数のヌクレオチド位置での核酸の突然変異、及び核酸の断片化のパターン（例えば、核酸が断片化するヌクレオチド位置（複数可））を含む。用語「アッセイ」は、用語「方法」と交換可能に使用され得る。アッセイ又は方法は特定の感度及び／又は特異性を有し、その診断ツールとしての相対的な有用性はＲＯＣ－ＡＵＣ統計を使用して測定することができる。

【0047】

本明細書で使用されるように、「ランダム配列決定」という用語は一般に、配列決定される核酸断片が、配列決定手順の前に、具体的に同定又は予め決定されていない配列決定を指す。特定の遺伝子座を標的とする配列特異的プライマーは、必要とされない。いくつかの実施形態において、断片の端部にアダプターが付加され、配列決定用のプライマーがアダプターに付着した。よって、いかなる断片も、同じユニバーサルアダプターに付着する同じプライマーで配列決定することができ、よって、配列決定はランダムであり得る。ランダム配列決定を使用して、超並列配列決定を実施してもよい。

【0048】

本明細書で使用されるように、「配列リード」（又は配列決定リード）は一般に、核酸分子の任意の部分又は全部から配列決定されたヌクレオチドの鎖を指す。例えば、配列リードは、核酸断片から配列決定されたヌクレオチドの短鎖（例えば、約２０～１５０）、核酸断片の片端若しくは両端のヌクレオチドの短鎖、又は生体サンプル中に存在する核酸断片全体の配列であり得る。配列リードは、例えば、配列決定技術を使用する若しくはプローブを使用する様々な方法で、例えば、ハイブリダイゼーションアレイ若しくは捕捉プローブで、又は単一プライマー若しくは等温増幅を使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）若しくは線形増幅等の増幅技術で、得られ得る。

【0049】

本明細書で使用されるように、「配列決定深度」という用語は、一般に、遺伝子座が、その遺伝子座にアライメントされた配列リードによってカバーされる回数を指す。遺伝子座は、ヌクレオチドの小ささ、又は染色体腕の大きさ、又はゲノム全体の大きさであり得る。配列決定深度は、５０ｘ、１００ｘ等と表され得、ここで「ｘ」は、遺伝子座が配列リードでカバーされる回数を指す。配列決定深度は、複数の遺伝子座又はゲノム全体に適用することもでき、この場合、ｘはそれぞれ、遺伝子座若しくはハプロイドゲノム又はゲノム全体が配列決定される平均回数を指し得る。平均深度が引用される場合、データセットに含まれた異なる遺伝子座のための実際の深度は値が一定範囲にある。ウルトラディープ配列決定は、少なくとも１００ｘの配列決定深度を指し得る。

【0050】

「サイズプロファイル」及び「サイズ分布」という用語は一般に、生体サンプル中のＤＮＡ断片のサイズに関する。サイズプロファイルは、様々なサイズの、ある量のＤＮＡ断片の分布を提供するヒストグラムであり得る。様々な統計パラメーター（サイズパラメーター又は単にパラメーターとも呼ばれる）は、１つのサイズプロファイルを別のサイズプロファイルと区別することができる。１つのパラメーターは、全てのＤＮＡ断片に対する、又は他のサイズ若しくは範囲のＤＮＡ断片に対する、特定のサイズ若しくはサイズ範囲のＤＮＡ断片の百分率である。

【0051】

「相対存在量」とは一般に、特定の特徴（例えば、指定された長さ、ゲノムの特定の領域にアライメントすること、特定の参照ゲノムにアライメントすること）を有する第２量の核酸断片に対する、特定の特徴（例えば、指定された長さ、１つ又は複数の指定された座標／終了位置で終了すること、又はゲノムの特定の領域にアライメントすること、特定の参照ゲノムにアライメントすること）を有する第１量の核酸断片の比を指し得る。一例では、相対存在量は、（１）所与の範囲内（例えば、８０～１１０塩基対）のサイズを有するウイルス参照ゲノムからのＤＮＡ断片の数と、（２）該所与の範囲内（例えば、８０～１１０塩基対）のサイズを有するヒト参照ゲノムからのＤＮＡ断片の数との比を指し得る。いくつかの態様において、「相対存在量」は、ゲノム位置の１つのウィンドウ内で終了するある量（１つの値）の無細胞ＤＮＡ分子を、ゲノム位置の別のウィンドウ内で終了するある量（他の値）の無細胞ＤＮＡ分子と関連付ける分離値の１種に対応し得る。２つのウィンドウは重複し得るが、サイズが異なり得る。他の実施形態において、２つのウィンドウは重複し得ない。更に、ウィンドウの幅は、１ヌクレオチドであり得るため、１ゲノム位置に相当し得る。

【0052】

「分類」という用語は、サンプルの特定の特性に関連付けられた任意の数（複数可）又は他の文字（複数可）を指し得る。例えば、「＋」記号（又は「陽性」という語）は、サンプルが欠失又は増幅を有すると分類されることを表し得る。別の例では、用語「分類」は、対象及び／又はサンプルにおける腫瘍組織の量、対象及び／又はサンプルにおける腫瘍のサイズ、対象における腫瘍の病期、対象及び／又はサンプルにおける腫瘍量、対象における腫瘍転移の存在、対象における疾患（例えば、癌）の再発、及び／又は一定期間の改善後における疾患症状の任意の他の再発を指し得る。例えば、分類は、疾患の寛解、再発、局所領域不全、又は遠隔転移を含み得る。分類は、二項分類（例えば、陽性又は陰性）であり得るか、又はより多くの分類レベル（例えば、１～１０又は０～１のスケール）を有し得る。

【0053】

「カットオフ」及び「閾値」という用語は、ある操作において使用される所定の数を指す。例えば、カットオフサイズは、それを上回ると断片が除外されるサイズを指し得る。閾値は、特定の分類が適用されるのを上回る又は下回る値であり得る。これらの用語のいずれかは、これらの文脈のいずれかにおいて使用され得る。カットオフ又は閾値は、「参照値」であり得るか、又は特定の分類を表すか若しくは２つ以上の分類間を区別する参照値から導き出され得る。かかる参照値は、当業者によって理解されるように、様々な方法で決定され得る。例えば、メトリックは、異なる既知の分類を有する対象の２つの異なるコホートについて決定され得、参照値は、１つの分類（例えば、平均）の代表として、又はメトリックの２つのクラスター間の値（例えば、所望の感度及び特異性を取得するために選択された）として選択され得る。別の例として、参照値は、サンプルの統計シミュレーションに基づいて決定され得る。カットオフ、閾値、参照等の特定の値は、所望の正確度（例えば、感度及び特異性）に基づいて決定することができる。

【0054】

「真陽性」（ＴＰ）という用語は、症状を有する対象を指し得る。真陽性は一般に、腫瘍、癌、前癌性症状（例えば、前癌性病変）、限局性若しくは転移性癌、又は非悪性疾患を有する対象を指す。真陽性は一般に、症状を有し、且つ本開示のアッセイ又は方法によって該症状を有すると同定された対象を指す。

【0055】

「真陰性」（ＴＮ）という用語は、症状を有さない又は検出可能な症状を有さない対象を指し得る。真陰性は一般に、疾患を有さない又は検出可能な疾患、例えば腫瘍、癌、前癌性症状（例えば、前癌性病変）、限局性若しくは転移性癌、非悪性疾患を有さない対象、又はそうでなければ健康な対象を指す。真陰性は一般に、症状を有さない又は検出可能な症状を有さない対象、又は本開示のアッセイ若しくは方法によって症状を有さないと同定された対象を指す。

【0056】

「偽陽性」（ＦＰ）という用語は、症状を有さない対象を指し得る。偽陽性は一般に、腫瘍、癌、前癌性症状（例えば、前癌性病変）、限局性若しくは転移性癌、非悪性疾患を有さない対象、又はそうでなければ健康な対象を指す。偽陽性という用語は一般に、症状を有さないが、本開示のアッセイ若しくは方法によって症状を有すると同定される対象を指す。

【0057】

「偽陰性」（ＦＮ）という用語は、症状を有する対象を指し得る。偽陰性は一般に、腫瘍、癌、前癌性症状（例えば、前癌性病変）、限局性若しくは転移性癌、又は非悪性疾患を有する対象を指す。偽陰性という用語は一般に、症状を有するが、本開示のアッセイ若しくは方法によって症状を有さないと同定された対象を指す。

【0058】

「感度」又は「真陽性率」（ＴＰＲ）という用語は、真陽性の数を真陽性と偽陰性の数の合計で割ったものを指し得る。感度は、真に症状を有する集団の割合を正確に同定するアッセイ又は方法の能力を特徴付けることができる。例えば、感度は、癌を有する集団内の対象の数を正確に同定する方法の能力を特徴付けることができる。別の例では、感度は、癌を示す１つ又は複数のマーカーを正確に同定する方法の能力を特徴付けることができる。

【0059】

「特異性」又は「真陰性率」（ＴＮＲ）という用語は、真陰性の数を真陰性と偽陽性の数の合計で割ったものを指し得る。特異性は、真に症状を有さない集団の割合を正確に同定するアッセイ又は方法の能力を特徴付けることができる。例えば、特異性は、癌を有さない集団内の対象の数を正確に同定する方法の能力を特徴付けることができる。別の例では、特異性は、癌を示す１つ又は複数のマーカーを正確に同定する方法の能力を特徴付けることができる。

【0060】

「ＲＯＣ」又は「ＲＯＣ曲線」という用語は、受信者動作特性曲線を指し得る。ＲＯＣ曲線は、二項分類システムの性能をグラフィカルに表現することができる。任意の所与の方法について、様々な閾値設定で感度を特異性に対してプロットすることにより、ＲＯＣ曲線を生成することができる。対象における腫瘍の存在を検出する方法の感度及び特異性は、対象の血漿サンプル中の腫瘍由来核酸の様々な濃度で決定され得る。更に、得られた３つのパラメーター（例えば、感度、特異性、及び閾値設定）のうちの少なくとも１つ、及びＲＯＣ曲線によって、任意の不明なパラメーターの値又は期待値を特定し得る。不明なパラメーターは、ＲＯＣ曲線にフィッティングされた曲線を使用して特定され得る。「ＡＵＣ」又は「ＲＯＣ－ＡＵＣ」という用語は一般に、受信者動作特性曲線下の面積を指す。このメトリックは、方法の感度と特異性の両方を考慮して、方法の診断的有用性の尺度を提供し得る。一般的に、ＲＯＣ－ＡＵＣの範囲は０．５～１．０であり、そのうち、０．５に近い値は方法の診断的有用性が限られていること（例えば、低感度及び／又は低特異性）を示し、１．０に近い値は方法の診断的有用性が高いこと（例えば、高感度及び／又は高特異性）を示す。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｅｐｅ ｅｔ ａｌ， “Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｏｄｄｓ Ｒａｔｉｏ ｉｎ Ｇａｕｇｉｎｇ ｔｈｅ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ， Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ， ｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｍａｒｋｅｒ，” Ａｍ． Ｊ． Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ ２００４， １５９ （９）： ８８２－８９０を参照されたい。尤度関数、オッズ比、情報理論、的中率、キャリブレーション（適合度を含む）、及び再分類測定を使用して診断的有用性を特徴付ける追加のアプローチは、参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ｃｏｏｋ， “Ｕｓｅ ａｎｄ Ｍｉｓｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ Ｃｕｒｖｅ ｉｎ Ｒｉｓｋ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，” Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００７， １１５： ９２８－９３５に要約されている。

【0061】

「陰性的中率」又は「ＮＰＶ」は、ＴＮ／（ＴＮ＋ＦＮ）又は全ての陰性検査結果の真陰性画分によって計算され得る。陰性的中率は、固有に、集団における症状の有病率及び検査すべき集団の検査前確率の影響を受ける。「陽性的中率」又は「ＰＰＶ」は、ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＰ）又は全ての陽性検査結果の真陽性画分によって計算され得る。これは、固有に、検査すべき集団の疾患の有病率及び検査前確率の影響を受ける。例えば、参照によって全体として本明細書に組み込まれるＯ’Ｍａｒｃａｉｇｈ Ａ Ｓ， Ｊａｃｏｂｓｏｎ Ｒ Ｍ， “Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ Ｔｈｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ Ｖａｌｕｅ Ｏｆ Ａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｔｅｓｔ， Ｈｏｗ Ｔｏ Ｐｒｅｖｅｎｔ Ｍｉｓｌｅａｄｉｎｇ Ｏｒ Ｃｏｎｆｕｓｉｎｇ Ｒｅｓｕｌｔｓ，” Ｃｌｉｎ． Ｐｅｄ． １９９３， ３２（８）： ４８５－４９１を参照のこと。

【0062】

略語「ｂｐ」は塩基対を指す。場合によっては、一本鎖であり塩基対を含まないＤＮＡ断片でも、「ｂｐ」はその長さを示すために使用できる。一本鎖ＤＮＡの文脈において、「ｂｐ」はヌクレオチドとしての長さを提供すると解してもよい。

【0063】

「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容誤差範囲内を意味し得、これは値の測定若しくは決定方法、即ち測定システムの制限に部分的に依存する。例えば、「約」は、当分野の慣例により、１つ以内又は１つより多くの標準偏差を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、最大１０％、最大５％、又は最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システム又はプロセスに関して、「約」又は「およそ」という用語は、値の１桁以内、５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。本出願及び特許請求の範囲に特定の値が記載されている場合、特に明示しない限り、「約」という用語は特定の値の許容誤差範囲内を意味すると想定すべきである。「約」という用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有し得る。「約」という用語は±１０％を指し得る。「約」という用語は、±５％を指し得る。

【0064】

本明細書で使用される用語は、単に特定のケースを説明する目的のものであり、限定することを意図したものではない。本明細書で使用されるように、単数形「一（ａ）」、「一つ（ａｎ）」、及び「該（ｔｈｅ）」は、文脈上明らかに別途指示されない限り、複数形も含むことを意図している。更に、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ、ｈａｓ）」、「と共に（ｗｉｔｈ）」という用語、又はその変形は、詳細な説明及び／又は特許請求の範囲のいずれかで使用される限りでは、かかる用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と同様の方式で包括的であることを意図している。

【0065】

本発明をより詳細に説明する前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されず、当然変動し得ることが理解される。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲にのみ限定されることから、本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のものであり、限定を意図するものではないことも理解される。

【0066】

値の範囲が提供される場合、文脈が別段明確に示さない限り、その範囲の上限と下限との間の各介在する値も、下限の１０分の１まで具体的に開示されていることが理解される。示された範囲における任意の示された値又は介在する値と、その示された範囲における任意の他の示された又は介在する値との間の各より小さな範囲が本発明内に包含される。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、独立して範囲に含まれるか除外されてもよく、どちらか一方、両方の限界がより小さな範囲に含まれるか、又はどちらも含まれない各範囲も、示された範囲内で特に除外される任意の限界を条件として、本発明内に包含される。示された範囲が一方又は両方の限界を含む場合、それらの限界のいずれか又は両方を除外する範囲も本発明に含まれる。

【0067】

特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語と科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味である。本明細書に記載の場合と類似又は相当する任意の方法及び材料が本発明の実施又は試験において使用できるが、ここでいくつかの可能な例示的方法及び材料を説明する。本明細書で言及した任意の及び全ての刊行物は、該刊行物がそれとの関連で引用される方法及び／又は材料を開示及び説明するように、参照によって本明細書に組み込まれる。

【0068】

本明細書に記載の特定の実施例は、当業者に本発明の製造方法及び使用方法の完全な開示及び説明を提供するために記載されるものであり、発明者らがそれらの発明と見なすものの範囲を限定することを意図するものではなく、以下の実験が実施される全て又は唯一の実験であると示すことを意図するものでもない。使用される数値（例えば、量、温度等）の正確性を確保するために取り込んでいたが、いくつかの実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。特に明記しない限り、部は重量部、分子量は重量平均分子量、温度は摂氏、圧力は大気圧又は大気圧付近である。

【0069】

標準略語は使用され得、例えば、ｂｐは塩基対、ｋｂはキロ塩基、ｐｉはピコリットル、ｓ又はｓｅｃは秒間、ｍｉｎは分間、ｈ又はｈｒは時間、ａａはアミノ酸、ｎｔはヌクレオチド、等である。

【0070】

ウイルス感染は、様々なタイプの癌の病因となり得る。例えば、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）は、上咽頭癌（ＮＰＣ）、特定のタイプのリンパ腫、及び胃癌を引き起こすと知られている。そこで、リアルタイムＰＣＲによる血漿ＥＢＶ ＤＮ分析は、ＮＰＣの検出に有用であることが示されている（Ｌｏ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９９；５９：１１８８－９１）。更に、治癒を目的とした治療後のリアルタイムＰＣＲによるＮＰＣ患者の血漿中のＥＢＶ ＤＮＡの検出は、疾患再発と強く関連していることが示されている（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ２００２；９４：１６１４－９）。この的中率を考慮して、無作為化対照試験は、治癒を目的とした療法後に検出可能なＥＢＶ ＤＮＡを有するＮＰＣ患者の転帰を改善するためにアジュバント化学療法が有用であるか否かを調査するために、実施されていた（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ． ２０１８；３６： ３０９１－３１００）。具体的には、治癒を目的とした治療後に検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有するＮＰＣ患者が、アジュバント化学療法又は臨床観察（即ち、標準治療）のいずれかを受けるように無作為化され、ここで血漿ＥＢＶ ＤＮＡはリアルタイムＥＢＶ ＤＮＡを使用して検出された。

【0071】

しかし、結果は、これら２群は無再発生存期間に有意な差がないことを示した。これらの結果は、検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有するＮＰＣ患者の同定におけるリアルタイムＰＣＲの低感度によるものである可能性がある。例えば、リアルタイムＰＣＲによる治療後血漿ＥＢＶ ＤＮＡ分析では、後続で再発する症例の４８％しか同定されなかった。局所領域不全及び遠隔転移を予測する感度は、それぞれ４２％及び５３％であった。したがって、血漿中の検出可能なＥＢＶ ＤＮＡが疾患の再発に関連していることが示されているが、リアルタイムＰＣＲは、再発の予測において治療後サンプル中のＥＢＶ ＤＮＡの検出に有効な方法ではないことが判明された。

【0072】

少なくとも上記の欠点を克服するために、本技術は、癌等の疾患の再発を検出するために、配列決定を使用して治療後サンプル中のウイルスＤＮＡを正確に検出することができる。特に、本技術は、他の技術を通じて検出不能であった低い量のウイルスＤＮＡを検出することで疾患の再発を予測する改良された方法に関する。例えば、リアルタイムＰＣＲは、検出されたウイルスＤＮＡレベルがゼロに近いと予想される結果を出し得るが、本技術は、このような情報を使用して癌の再発を正確に予測することができる。更に、本技術は、ウイルスゲノムの特定の領域にアライメントする配列リードに注目するのではなく、ウイルスゲノム全体に対応する配列リードを分析して再発を予測する。対照の疾患の再発を正確に予測することで、本技術は、早期介入及び適切な治療の選択を促進して対象の疾患転帰及び全生存率を改善することができる。例えば、対象の対応するサンプルが疾患の再発を予測可能な事象において、対象に強化化学療法を選択することができる。

【0073】

以下において、最初のセクションでは、病原体ＤＮＡの検出を通じて対象を診断する、即ち、再発の予後を判定するのではなく、対象が現在病態を有しているか否かを判定するために使用できる技術を説明する。後のセクションでは、対象の再発の分類を特定するための技術及び改良された技術を説明する。
Ｉ．無細胞サンプル中のウイルスＤＮＡ

【0074】

病原体は細胞を侵襲し得る。例えば、ＥＢＶ等のウイルスは細胞内に存在し得る。これらの病原体は、それらの核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を放出し得る。核酸は、病原体が何らかの病態、例えば、癌を引き起こしている細胞から放出されることが多い。

【0075】

図１は、ＥＢＶを含むＮＰＣ細胞を示す。ＮＰＣ細胞は、ウイルスの多数の、例えば、５０個のコピーを含み得る。図１は、（例えば、細胞が死亡する時に）血流中に放出されたＥＢＶゲノムの核酸断片１１０を示す。核酸断片１１０は円形で示されている（例えば、ＥＢＶゲノムが円形であるように）が、該断片はＥＢＶゲノムの一部に過ぎない。よって、ＮＰＣ細胞は、対象の血流中にＥＢＶ ＤＮＡの断片を沈着させることができる。この腫瘍マーカーは、ＮＰＣのモニタリング（Ｌｏ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９９； ５９： ５４５２－５４５５）及び予後診断（Ｌｏ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０００； ６０： ６８７８－６８８１）に有用であり得る。
Ａ．特定のウイルスと様々な癌の関係

【0076】

ウイルス感染は、多くの病理学的症状に関係している。例えば、ＥＢＶ感染は、ＮＰＣ及びナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ－細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、胃癌、及び伝染性単核球症と密接に関連している。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染及びＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は、肝細胞癌（ＨＣＣ）の発症リスクの増加と関連している。ヒトパピローマウイルス感染（ＨＰＶ）は、子宮頸癌（ＣＣ）及び頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）の発症リスクの増加と関連している。

【0077】

しかし、このような感染症にかかっている全ての対象が関連癌になるわけではない。血漿ＥＢＶ ＤＮＡの供給源は、ＮＰＣを有さない者において必ず異なっている。ＮＰＣ細胞から循環へのＥＢＶ ＤＮＡの持続的な放出とは異なり、ＥＢＶ ＤＮＡの供給源は、ＮＰＣを有さない者では一時的にこのようなＤＮＡを提供するだけである。
Ｂ．無細胞サンプル中のウイルスＤＮＡを検出

【0078】

例として、サンプル（例えば、血漿又は血清）中で見出される病原体の核酸は、（１）腫瘍組織から放出され得、（２）非癌細胞、例えば、ＥＢＶを担持する残りのＢ細胞から放出され得、（３）ビリオン内に含有され得る。

【0079】

ＮＰＣの病因は、ＥＢＶ感染と密接に関連している。ＮＰＣの流行地域、例えば、中国南部では、ほぼ全てのＮＰＣ腫瘍組織にＥＢＶゲノムが存在する。この点に関して、血漿ＥＢＶ ＤＮＡは、ＮＰＣのバイオマーカーとして確立されている（Ｌｏ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９９； ５９：１１８８－９１）。血漿ＥＢＶ ＤＮＡは、治癒を目的とした治療後のＮＰＣ対象における残存病変の検出に有用であることが示されている（Ｌｏ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９９； ５９：５４５２－５及びＣｈａｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ２００２；９４：１６１４－９）。ＮＰＣ対象における血漿ＥＢＶ ＤＮＡは、２００ｂｐ未満の短いＤＮＡ断片であるため、インタクトなビリオン粒子に由来する可能性が低いことが示されている（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００３， ６３：２０２８－３２）。
１．後期のｑＰＣＲアッセイ

【0080】

リアルタイム定量ＰＣＲアッセイ（ｑＰＣＲ）は、ＥＢＶゲノムの特定の領域、特に、ＢａｍＨＩ－Ｗ及びＥＢＮＡ－１領域といったＥＢＶゲノムの２つの領域を使用して後期ＮＰＣを検出することができる。各ＥＢＶゲノムにおいてＢａｍＨＩ－Ｗ断片の反復が約６～１２個存在し得、各ＮＰＣ腫瘍細胞においておよそ５０個のＥＢＶゲノムが存在し得る（Ｌｏｎｇｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｈａｐｔｅｒ ６１ “Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ”。Ｔｉｅｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ２０１１； ８５： １２３６２－１２３７５）。言い換えれば、各ＮＰＣ腫瘍細胞においてＰＣＲ標的のコピーが約３００～６００（例えば、約５００）個存在し得る。

【0081】

図２は、ＮＰＣ対象及び対照対象における血漿無細胞ＥＢＶ ＤＮＡの比較を示す。カテゴリー（ＮＰＣ及び対照対象）は、Ｘ軸上にプロットされる。Ｙ軸は、ＢａｍＨＩ－Ｗ領域ＰＣＲシステムによって検出された無細胞ＥＢＶ ＤＮＡの濃度（ＥＢＶ ＤＮＡコピー／ｍｌ血漿）を示す。ＢａｍＨＩ－Ｗ領域ＰＣＲデータとの強い相関を示したＥＢＮＡ－１ ＰＣＲを使用して、同様な結果が得られた（Ｓｐｅａｒｍａｎ ｒａｎｋ ｏｒｄｅｒ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ， ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ５ ０．９１８； Ｐ ， ０．０００５）。

【0082】

図２に示すように、無細胞ＥＢＶ ＤＮＡは、９６％（５７人中５５人）の上咽頭癌（ＮＰＣ）患者（濃度中央値、２１０５８コピー／ｍｌ）及び７％（４３人中３人）の対照（濃度中央値、０コピー／ｍｌ）の血漿において検出可能であった。

【0083】

更なる分析において、表１は、分析された異なるタイプのサンプルの数を示す。初期分析（コホート１）において、首のしこり、難聴及び鼻出血を含むＮＰＣに一致する症状を呈する６人の対象が耳鼻咽喉科（ＥＮＴ）クリニックから募集された。コホート１におけるＮＰＣ対象は、症状を示さなかった他のコホートで検査された対象より進行した疾患（後期）を有する。Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｇｉｓｔｒｙからの履歴データによると、症状を呈し、後にＮＰＣと確定された個体の８０％は、医療機関で受診した時点で進行期ＮＰＣを有した。

【表1】

【0084】

図３Ａ及び３Ｂは、異なる対象群についてリアルタイムＰＣＲによって測定された血漿ＥＢＶ ＤＮＡ濃度を示す。図３Ａに示すように、血漿ＥＢＶ ＤＮＡ濃度は、検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有するが、いかなる観察可能な病態もなかった対象と比較して、ＮＰＣ、リンパ腫、及び伝染性単核球症を有する対象の方がより高かった。図３Ｂに示すように、登録時に検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有したがいかなる観察可能な病態もなかった対象について、登録時に測定された血漿ＥＢＶ ＤＮＡ濃度は、フォローアップ検査で陰性となった（即ち、血漿ＥＢＶ ＤＮＡが一時的に検出可能であった）対象と比較して、持続的に陽性結果を示した対象の方が高かった（ｐ＝０．００２、マン・ホイットニー検定）。
２．早期のｑＰＣＲ結果

【0085】

図４は、早期ＮＰＣ及び進行期ＮＰＣを有する対象における血漿ＥＢＶ ＤＮＡの濃度（コピー／ｍＬ血漿）を示す。図４に示すように、進行性ＮＰＣ症例におけるこの試験血漿無細胞ＥＢＶ ＤＮＡレベル（中央値、４７，０４７コピー／ｍｌ。四分位範囲、１７，３１４～１３３，７６６コピー／ｍｌ）は、早期ＮＰＣ症例（中央値、５，９１８コピー／ｍｌ。四分位範囲、２７９～２０，４５２コピー／ｍｌ。マン・ホイットニー順位和検定、Ｐ＜０．００１）より有意に高かった。

【0086】

本明細書で言及した通り、後期ＮＰＣの検出は、早期検出ほど有用ではない。ＢａｍＨＩ－Ｗ断片についてリアルタイムＰＣＲを使用した血漿ＥＢＶ ＤＮＡ分析の有用性は、無症候性対象の早期ＮＰＣを検出するために調査された（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ ２０１３；１１９：１８３８－１８４４）。１，３１８人の参加者による集団試験において、血漿ＥＢＶ ＤＮＡレベルはＥＢＶ ＤＮＡコピー数がＮＰＣ監視に有用であり得るか否かを調査するために測定された。６９人の参加者（５．２％）が、検出可能なレベルの血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有し、３人の参加者が、経鼻内視鏡検査及び磁気共鳴イメージングを使用して、最終的にＮＰＣを有すると臨床診断された。よって、この試験における単一血漿ＥＢＶ ＤＮＡ検査の陽性的中率（ＰＰＶ）は、実際にＮＰＣを有する患者の数（ｎ＝３）を、実際にＮＰＣを有する患者の数と誤ってＮＰＣを有すると同定された患者の数（ｎ＝６６）の合計で割って計算すると、約４％である。

【0087】

２０，１７４人の４０～６２歳の無症候性中国男性のより規模が大きい試験を行った。募集された２０，１７４人のうち、ベースラインＰＣＲ検査で検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する対象が１，１１２人（５．５％）であった。そのうち、３４人の対象が後にＮＰＣを有すると確認された。残りの１，０７８人の非癌対象のうち、８０３人の対象が「一時的に陽性」の血漿ＥＢＶ ＤＮＡ結果を示し（即ち、ベースラインでは陽性であったがフォローアップでは陰性であった）、２７５人が「持続的に陽性」の血漿ＥＢＶ ＤＮＡ結果を示した（即ち、ベースライン及びフォローアップの両方でも陽性であった）。検証分析を最初にデータのサブセットを用いて行った。

【0088】

図５は、（左）血漿ＥＢＶ ＤＮＡが持続的に陽性であるが観察可能な病態がない対象、及び（右）検証分析の一環としてスクリーニングによって同定された早期ＮＰＣ患者の、リアルタイムＰＣＲによって測定された血漿ＥＢＶ ＤＮＡ濃度を示す。２０，１７４人の無症候性対象のスクリーニングを通って同定されたＮＰＣ対象の３４人中５人がこの検証分析に含まれた。これら５人の対象は試験に参加する時に無症候性であった。コホート２におけるこれら５人の対象の血漿サンプルは、ＥＢＶ ＤＮＡが持続的に陽性であり、後続で、内視鏡検査及びＭＲＩによってＮＰＣが確認された。これら５人の無症候性ＮＰＣ病例は、症状を訴えてクリニックで受診し進行期ＮＰＣと診断されたコホート１における６人のＮＰＣ対象とは異なり、早期であった。

【0089】

図６は、血漿ＥＢＶ ＤＮＡが一時的に陽性（ｎ＝８０３）又は持続的に陽性（ｎ＝２７５）である（それぞれ左又は中央）が観察可能な病態がない対象、及びＮＰＣを有すると同定された対象（ｎ＝３４）の血漿からのＥＢＶ ＤＮＡ断片の濃度（コピー／ミリリットル）の箱ひげ図を示す。図６は、ベースラインＰＣＲ検査で検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する１，１１２人の対象全員についての結果を示す。ＥＢＶ ＤＮＡ断片の濃度（コピー／ミリリットル）はリアルタイムＰＣＲ分析によって測定された。

【0090】

血漿ＥＢＶ ＤＮＡ結果は、「陽性」又は「陰性」と表した。群間の血漿ＥＢＶ ＤＮＡ濃度の定量レベルは、リアルタイムＰＣＲによって測定される（図６）。ＮＰＣ群の平均血漿ＥＢＶ ＤＮＡ濃度（９４２コピー／ｍＬ。四分位範囲（ＩＱＲ）、１８～６８コピー／ｍＬ）は、「一時的に陽性」群（１６コピー／ｍＬ。ＩＱＲ、７～１８コピー／ｍＬ）及び「持続的に陽性」群（３０コピー／ｍＬ。ＩＱＲ、９～２６コピー／ｍＬ）より有意に高かった（Ｐ＜０．０００１、クラスカル・ワリス検定）。しかし、３群間の血漿ＥＢＶ ＤＮＡ濃度には多くの重複がある（図６）。

【0091】

図７は、血漿ＥＢＶ ＤＮＡが一時的に陽性又は持続的に陽性である（それぞれ左又は中央）が観察可能な病態がない対象、及びＮＰＣを有すると同定された対象における、リアルタイムＰＣＲによって測定された血漿ＥＢＶ ＤＮＡ濃度（コピー／ミリリットル）を示す。この７２対象のコホートでは、リアルタイムＰＣＲによって測定された血漿ＥＢＶ ＤＮＡ濃度に、異なる対象群間で統計的に有意な差はなかった（ｐ値＝０．１９。クラスカル・ワリス検定）。
３．早期の２つのアッセイ分析

【0092】

この予測スクリーニング試験で使用されたリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイは、小さな腫瘍からの血漿ＥＢＶ ＤＮＡでも、その検出に非常に高い感度を示した。しかし、検査の特異性は低下する。香港におけるＮＰＣの年齢別発生率のピークは、１００，０００人当たり４０人であるが、健康集団のおよそ５％は血漿中に検出可能なレベルのＥＢＶ ＤＮＡを有する。リアルタイムＰＣＲアッセイによる血漿ＥＢＶ ＤＮＡ評価が参加者ごとに１回実施した場合、スクリーニング試験の陽性的中率（ＰＰＶ）が３．１％であった。

【0093】

リアルタイムＰＣＲアッセイのＰＰＶが低いことを考慮して、２回の２アッセイの有用性を調査した。例えば、上記の以前の試験は、ＥＢＶ ＤＮＡがＮＰＣ対象の血漿において持続的に検出可能である傾向があるが、非癌対象の血漿において一時的に現れることを示した。

【0094】

試験では、血漿ＥＢＶ ＤＮＡ分析を使用してＮＰＣの症状を有さない２０，１７４人の対象をスクリーニングした。検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する対象は、フォローアップ血漿ＥＢＶ ＤＮＡ分析を用いておよそ４週間後に再検査された。２つの連続分析で持続的に陽性結果を示した対象は、鼻内視鏡検査及び鼻咽頭の磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）を用いて更に調査された。募集された２０，１７４人の対象のうち、１，１１２人は登録時に血漿ＥＢＶ ＤＮＡが陽性であった。そのうち、３０９人はフォローアップ検査で持続的に陽性であった。血漿中のＥＢＶ ＤＮＡが持続的に陽性である対象のコホート内で、３４人は、鼻内視鏡検査及びＭＲＩで調査された後、ＮＰＣを有すると確認された。

【0095】

２時点検査アプローチは、偽陽性率を５．４％から１．４％に減少させ、結果のＰＰＶが１１．０％であった。これらの結果によると、初期の陽性血漿ＥＢＶ ＤＮＡ結果を示した対象の再検査では、ＮＰＣ対象を一時的に陽性の結果を示した対象と区別し、より侵襲的で費用のかかる調査、即ち内視鏡検査及びＭＲＩを必要とする対象の割合を大幅に低下させることができた。しかし、血漿ＥＢＶ ＤＮＡの連続検査は、初期の陽性結果を示した対象から追加の血液サンプルを採取する必要があり、これはロジスティックな課題を提起し得る。
Ｃ．ウイルスＤＮＡを使用した早期及び後期癌の分析

【0096】

いくつかのケースでは、初期アッセイ（例えば、ｑＰＣＲアッセイ）後に又はｑＰＣＲの代わりとして症状（例えば、腫瘍、例えば、ＮＰＣ）をスクリーニングするアッセイは、ウイルス参照ゲノムにマッピングしたサンプル（例えば、ＥＢＶ）からの配列リードの割合を評価するために超並列配列決定を使用することを含み得る。

【0097】

血漿中の無細胞ウイルスＤＮＡを分析するために、標的配列決定（例えば、特別に設計された捕捉プローブ、増幅プライマー）を使用できる。これらの捕捉プローブは、全ＥＢＶゲノム、全ＨＢＶゲノム、全ＨＰＶゲノム及びヒトゲノム内の複数のゲノム領域（ｃｈｒ１、ｃｈｒ２、ｃｈｒ３、ｃｈｒ５、ｃｈｒ８、ｃｈｒ１５及びｃｈｒ２２上の領域を含む）をカバーした。分析された血漿サンプルごとに、ＤＮＡは４ｍＬの血漿からＱＩＡａｍｐ ＤＳＰ ＤＮＡ血液ミニキットを使用して抽出された。各ケースについて、全ての抽出されたＤＮＡは、ＫＡＰＡライブラリー調製キットを使用した配列決定ライブラリーの調製に使用された。１２サイクルのＰＣＲ増幅は、ＫＡＰＡ ＰＣＲ増幅キットを使用して配列決定ライブラリーに実行された。増幅産物は、上記で記載されたウイルス及びヒトゲノム領域をカバーするカスタム設計のプローブを使用したＳＥＱＣＡＰ－ＥＺキット（Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ）を使用して捕捉した。標的捕捉後、１４サイクルのＰＣＲ増幅が実行され、産物がＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑプラットフォームを使用して配列決定された。各回の配列決定について、ユニークなサンプルバーコードを有する４～６個のサンプルがペアエンドモードを使用して配列決定された。各ＤＮＡ断片は、２つの末端の各々から７５ヌクレオチド配列決定された。配列決定後、配列決定されたリードは、全ヒトゲノム（ｈｇ１９）、全ＥＢＶゲノム、全ＨＢＶゲノム及び全ＨＰＶゲノムを含む人工的に組み合わせた参照配列にマッピングされた。組み合わせられたゲノム配列におけるユニークな位置にマッピングされた配列決定されたリードは、下流分析に使用された。ユニークにマッピングされたリード数の中央値は、５，３００万（範囲：１，５００万～１億４，１００万）である。
１．後期

【0098】

図８Ａ及び８Ｂは、異なる対象群の血漿中ＥＢＶゲノムにマッピングされた配列決定された血漿ＤＮＡ断片の割合を示す。対象は、図３Ａ及び３Ｂと同様に、コホート１に対応する。

【0099】

図８Ａに示すように、標的捕捉後に超並列配列決定を使用したことで、ＥＢＶゲノムにユニークにマッピングされたリードの割合は、登録時に検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有するがいかなる観察可能な病態もない対象と比較して、ＮＰＣ、リンパ腫及び伝染性単核球症を有する対象の方がより高くなった。パネルＢに示すように、登録時に検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有するがいかなる観察可能な病態もない対象について、登録時に測定された、ＥＢＶゲノムにマッピングされたリードの割合は、フォローアップ検査で陰性になる（即ち、一時的に検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する）対象と比較して、持続的に陽性結果を示した対象の方がより高かった（ｐ＝０．００２、マン・ホイットニー検定）。リアルタイムＰＣＲを使用して測定された血漿ＥＢＶ ＤＮＡの濃度と比較して、ＥＢＶゲノムにユニークにマッピングされたリードの割合の測定を使用する場合、一時的に陽性結果を示した対象と持続的に陽性結果を示した対象との間の差はより大きかった（１９．３倍対１．７倍）。

【0100】

血漿ＥＢＶ ＤＮＡの上昇はＮＰＣと関連している。以前の試験では、ＮＰＣ症例と血漿ＥＢＶ ＤＮＡが殆ど陰性である健康対照とを比較した。図３Ａ、３Ｂ、８Ａ、及び８Ｂは、ＮＰＣ症例と血漿ＥＢＶ ＤＮＡが偽陽性である非ＮＰＣ症例との定量比較を提供する。以下に記載の技術は、病態を有する対象と有さない対象を区別する正確度の向上を可能にすることで、偽陽性を低減する。ＥＢＶ ＤＮＡの文脈において、用語「偽陽性」は、対象が検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有するがＮＰＣ（病原体と関連する病態の例）を有さないことを意味し得る。血漿ＥＢＶ ＤＮＡの存在は真であるが、関連病態（例えば、ＮＰＣ）の同定は偽である可能性がある。
２．早期

【0101】

図９は、（左）血漿ＥＢＶ ＤＮＡが持続的に陽性であるが観察可能な病態がない対象、及び（右）早期ＮＰＣ対象における、血漿中ＥＢＶゲノムにマッピングされたリードの割合を示す。対象は、図５と同様に、コホート２に対応する。

【0102】

血漿サンプルは、上述した通り、標的濃縮後に配列決定された。コホート２における５人のＮＰＣ対象について、それらの血漿サンプルはＥＢＶ ＤＮＡが持続的に陽性であったが、ＥＢＶ ＤＮＡ濃度は、リアルタイムＰＣＲ分析に基づく偽陽性血漿ＥＢＶ ＤＮＡ結果を示した９人対象と比較して、有意差を示さなかった（Ｐ＝０．７、マン・ホイットニー検定）。血漿ＥＢＶ ＤＮＡ濃度は、ＮＰＣの病期と相関することが知られている。よって、早期ＮＰＣ対象がより低いレベルの血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有することは予想外ではない。

【0103】

ＥＢＶゲノムにマッピングされた配列決定された血漿ＤＮＡリードの割合は、偽陽性症例とコホート２のＮＰＣ症例との間で有意差を示さなかった。

【0104】

これらの初期データは、図５及び９に示すアプローチは再発を同定するために偽陽性と早期ＮＰＣを区別するのに効果的でない可能性があることを示唆する。
Ｄ．早期診断の利点

【0105】

図１０は、それぞれ、香港における、様々な病期の癌を有するＮＰＣ患者の全生存率、及びＮＰＣの病期分布を示す。対象をより鋭敏にモニタリングして（例えば、内視鏡検査、ＭＲＩ、ＰＥＴ－ＣＴスキャン）実際に再発がいつ起こったかを特定し、それによって治療をいつ実施すべきかを特定することができることから、早期診断のこのような利点は再発の検出にも適用できる。再発の可能性が高いならば、対象はより頻繁に検査を受けてもよい。したがって、いくつかの実施形態は、癌のより後期の病期に達する患者の数を減少させて、それらの全生存確率を高めるのに有用であり得る。
ＩＩ．疾患の再発を予測するためのリアルタイムＰＣＲ
Ａ．リアルタイムＰＣＲの再発予測感度

【0106】

上述した通り、リアルタイムＰＣＲは、循環ウイルスＤＮＡのレベルを分析することで、ウイルス感染と関連する様々な症状を検出及び区別するために使用できる。例えば、リアルタイムＰＣＲ技術は、対象の病態（例えば、癌）の再発を予測するために、治療後サンプルで試みられている。これらの試みは、治療が完了した後に対象においてウイルスＤＮＡが同定されたとすれば、一部の対象は数年内に疾患が再発するという事実に基づいて行われた。

【0107】

しかし、リアルタイムＰＣＲは、治療後サンプル中の残留ウイルスＤＮＡの存在を所望の感度レベルで予測することはしない。例えば、リアルタイムＰＣＲは、治療完了後に実際に再発した対象の約４０～５０％を検出可能であった。リアルタイムＰＣＲの性能は、治療後サンプルにおける再発の特定の分類を検出する場合に更に低下する。例えば、リアルタイムＰＣＲは、治療後サンプルにおける遠隔再発の検出と比較して、局所再発の予測に使用される場合、感度レベルがより低い（３３．３％）。

【0108】

リアルタイムＰＣＲの感度レベルが低い原因の１つは、対象における低い量の循環ウイルスＤＮＡを検出できないことと考えられ得る。対象が癌を有するならば、ウイルスＤＮＡは、該対象の循環中に放出される。特定の治療を完了したが依然として再発が予想される対象について、治療の結果として残存腫瘍が小さくなる可能性があるため、初期にウイルスＤＮＡの濃度が非常に低いと予想される。この特徴にも関わらず、リアルタイムＰＣＲは、ウイルスゲノムの特定の領域又は少しの特定の領域（例えば、約７０～１００塩基対）のみを検出するように設計されている。残存腫瘍が小さくウイルスＤＮＡ濃度が非常に低い場合、リアルタイムＰＣＲが標的とするウイルスゲノムの特定の領域（複数可）がサンプル中に存在しないか又はアッセイの検出限界以下の濃度で存在することから、リアルタイムＰＣＲは偽陰性の結果を出す可能性がある。

【0109】

治療後再発の予測について、ウイルスゲノム全体の捕捉は低い量の残留ウイルスＤＮＡの検出に寄与し得る。本開示の実施形態では、プローブの使用によりサンプル中のウイルス配列の全て（例えば、約１７０キロ塩基）の捕捉が可能になることに認識する。ウイルスゲノム全体が捕捉されると、配列決定を行って核酸分子の様々な特徴を同定してより高い感度レベルで上咽頭癌（ＮＰＣ）、特定のタイプのリンパ腫及び胃癌の再発を検出することができる。
Ｂ．実施例

【実施例】

【0110】

上咽頭癌の治療を受けた７３７人の患者から治療後サンプルを採取した（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ． ２０１８；３６： ３０９１－３１００）。治療後サンプルの各々は初期に、国際がん対策連合（ＵＩＣＣ。第６版）によるステージＩＩＢ、ＩＩＩ、ＩＶＡ、又はＩＶＢの局所領域進行性ＮＰＣと組織学的に診断されたが、一次放射線療法又は化学放射線療法の完了後に持続性局所領域疾患又は遠隔転移の臨床的証拠がなかった。加えて、治療後の静脈サンプルを治療完了後の６～８週間で採取した。フォローアップ間隔の中央値は６．６年であった。７３７人の患者のうち、６４３人の患者（８７％）は、治療後の最初の１年間、継続的な臨床的寛解を示したが、９４人の患者（１３％）は疾患の再発を報告した。該９４人の再発患者のうち、２４人の患者（２６％）は局所領域不全、７０人の患者（７４％）は遠隔転移を発現した。

【0111】

ＥＢＶ Ｂａｍ－ＨＩ Ｗ断片を標的とするリアルタイムＰＣＲを、治療後サンプルごとにウイルスＤＮＡ濃度（コピー／ミリリットル）を同定するために行った。その後、各治療後サンプルのウイルスＤＮＡ濃度を、対応する再発分類に従ってプロットした。分類は、継続的な臨床的寛解を示した患者に対応する第１分類、及び治療完了後の１年内に再発した患者に対応する第２分類を含んだ。再発分類の下で、患者を更に、（１）局所再発に対応する局所再発（ＬＲ）分類、及び（２）他の臓器に転移した癌を示す遠隔転移（ＤＭ）分類に分けた。

【0112】

図１１は、リアルタイムＰＣＲを使用して治療後サンプルから検出された血漿ＥＢＶ ＤＮＡ濃度を示す。ｘ軸は、治療後サンプルと関連付けられた分類を表し、ｙ軸は、対応する治療後サンプルのウイルスＤＮＡ濃度を表す。寛解分類下の患者に対応する６４３個の治療後サンプルにおいて、血漿ＥＢＶ ＤＮＡは、サンプルの１３７個（２１％）で検出された。再発分類下の９４個の治療後サンプルにおいて、６６個（７０％）は検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有した。その後、９４個の再発サンプルを、ＬＲ及びＤＭ分類に更に分けた。ＤＭ分類下の７０個の治療後サンプルについて、５８個（８３％）は検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有した。ＬＲ分類下の２４個の治療後サンプルについて、検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有するのは８個（３３％）のみであった。

【0113】

よって、リアルタイムＰＣＲは、疾患の再発を発現した患者の７０％においてしかウイルスＤＮＡを検出できなかった。よって、このような低い感度は、リアルタイムＰＣＲは治療後サンプル中のウイルスＤＮＡを検出するための最も有効な技術でない可能性があることを示す。

【0114】

図１２は、リアルタイムＰＣＲによって特定された血漿ＥＢＶ ＤＮＡ状態に応じて群化されたＮＰＣ患者の全生存率を同定するグラフ１２００を示す。カプラン・マイヤー生存分析を使用して、異なる患者群の生存率を分析した。血漿中に所定の閾値より下のＥＢＶ ＤＮＡを有する患者は「検出不能」と示された一方、血漿ＥＢＶ ＤＮＡが所定の閾値より上の患者は「検出可能」と同定された。この実施例において、所定の閾値は２０コピー／ｍＬに設定した。検出不能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する患者の全生存率は破線１２０５で表され、検出可能な血漿ＥＢＶを有する患者の全生存率は実線１２１０で表される。リアルタイムＰＣＲによる検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する患者の全生存率は、検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有さない患者より有意に低かった（ｐ＜０．０００１、ログランク検定）（図ａ）。ｑＰＣＲによる検出不能な及び検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する患者の５年生存率は、それぞれ８７．６％及び６０．４％であった。２群間のハザード比は３．２４であった（９５％ＣＩ、２．４０～４．３９）。

【0115】

グラフ１２００は、以前に特定の疾患の治療を受けた対象を含めて、対象の全生存率の特定に、検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡの影響が大きいことを示す。したがって、血漿ＥＢＶ ＤＮＡが所与の生体サンプル（例えば、治療後サンプル）から正確に検出できれば、全生存率特定の正確度は向上する。リアルタイムＰＣＲでは「検出不能」群の生存率が「検出可能」群より高いが、偽陰性の発生率が比較的高い。よって、より正確な分類が望ましい。例えば、残存癌細胞から放出された血漿ＥＢＶ ＤＮＡのより高感度な検出により、破線１２０５を１００％近くに上昇させることが容易になる。よって、「検出不能」のカテゴリー下の患者は、疾患再発の確率がより低く、追加治療を避けることができる。
ＩＩＩ．治療後サンプル中のウイルスＤＮＡを検出するための配列決定

【0116】

配列決定技術は、癌スクリーニング用のリアルタイムＰＣＲの代替技術として使用されている。例えば、２０，０００人超の対象が参加した臨床試験では、リアルタイムＰＣＲによる血漿ＥＢＶ ＤＮＡ分析がＮＰＣの症状を有さない対象におけるＮＰＣのスクリーニングに有用であることが示されている（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ２０１７；３７７：５１３－５２２）。試験において、初期に血漿ＥＢＶ ＤＮＡ検査で陽性結果を示した対象は、４週間後に再検査された。２回持続的に陽性の結果を示した対象は、鼻内視鏡検査及びＭＲＩ検査で更に調査された。この取り決めの下で、３４人のＮＰＣ患者が同定された。このＮＰＣスクリーニングプロトコルの感度及び特異性は、それぞれ９７．１％及び９８．６％であった。スクリーニングによって同定された患者は、スクリーニングを受けなかった歴史的コホートと比較して、遥かに早期の病期分布を有した。その結果、スクリーニングされた対象は、０．１のハザード比で優れた無増悪生存期間を有した。

【0117】

血漿ＥＢＶ ＤＮＡ分子のサイズに対応する分析も、ＮＰＣ患者とリアルタイムＰＣＲによる検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する非ＮＰＣ対象を区別できる次世代配列決定（ＮＧＳ）によって実施された（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２０１８；１１５：Ｅ５１１５－Ｅ５１２４）。実際、ＮＧＳを使用したサイズ及び個数の組み合わせ分析の特異性は、元のスクリーニングプロトコルの９８．６％から９９．３％に向上したが、感度は９７．１％のままであった。特異性の向上により、陽性的中率は１１％から１９．６％に向上した。

【0118】

ＰＣＲベースの技術は典型的に、特異性が最適化される。これは、殆どの対象が癌を患っていない癌スクリーニングに有効であり得る。しかし、かかる技術は、治療後サンプルにおける再発の予測にあまり有効ではない。これは、かかる予測は通常、癌と診断され治癒を目的とした療法を受けた対象に対して行われるためである。この患者群において、適時の治療を実現するために、任意の残存癌の高感度な検出が望ましい。よって、高感度を達成すれば、再発の予測に有利であり得る。高い特異性で機能できるにも関わらず、ＰＣＲベースの技術は、高感度で真陽性を同定するのにあまり性能が高くない。本開示は、配列決定でより高い感度をもたらすことができるか否かを調査する。そこで、配列決定技術は、治療後サンプルにおける再発予測により高い正確度を提供することが示される。

【0119】

配列決定技術は、リアルタイムＰＣＲより大幅に高い感度で治療後サンプルにおける再発を予測することができた。よって、本技術は、治癒を目的とした癌治療を受けたＮＰＣ患者における血漿ＥＢＶ ＤＮＡの分析用に配列決定を適用することを含むことができる。これは、治療後サンプルに癌を患っている又は患った対象が含まれるという事実に帰すると考えられる。このように、再発予測の正確度は感度を最大化することで向上する。

【0120】

上記で言及した及び以下により詳細に説明するように、ヒトゲノムの標的配列決定及び病原体ゲノム（例えば、ウイルスゲノム）の濃縮を使用して、分析されるヒト及び病原体ＤＮＡの所望の割合を提供することができ、これにより、より高い正確度を提供することができる。捕捉プローブでカバーされるヒトゲノムの割合は、該捕捉プローブでカバーされるＥＢＶゲノムの割合より小さくてもよい。場合によっては、捕捉プローブでカバーされるヒトゲノムの割合は、癌の再発を予測する場合に特異性及び／又は感度を増加するために調整される。標的捕捉配列決定の代替として、治療後サンプルに対して全ゲノム配列決定又はランダム配列決定を行って治療後サンプル中の無細胞核酸分子の個数及びサイズデータを導き出すことができる。
ＩＶ．疾患の再発を予測するための個数ベースの分析

【0121】

標的配列決定から生成された配列リードは、病態の再発を予測するために、アライメントされ、そして分析されてもよい。例えば、個数ベースの分析を行ってウイルス参照ゲノムにアライメントする配列リードの量を特定することができる。ウイルス参照ゲノムにアライメントしている配列リードの量は、配列リードの総数に対する、ウイルス参照ゲノムにアライメントされた配列リードの割合を含み得る。場合によっては、ヒトＤＮＡに対するウイルス核酸の相対量（存在量）の任意の関数又は導関数を使用することができ、ここで相対量の例としては、ウイルス核酸及びヒトＤＮＡの量の間の比（例えば、割合）又は差を含む。アライメントされたリードの特定された量は、特定のカットオフ値と比較できる。該量が該カットオフ値を超える場合、所与の対象の疾患の再発を予測できる。

【0122】

図９に示すように、標的配列決定は、早期ＮＰＣから偽陽性を区別するのにあまり性能が高くない傾向がある。したがって、最初は、標的配列決定は、疾患を有すると既に診断された患者における疾患の再発を予測するのに適しない予想であった。しかし、治療後サンプル中の低いレベルのＥＢＶ ＤＮＡを検出することで、標的配列決定は、驚いたことに、かかるデータを使用して継続的な臨床的寛解を示した患者と疾患が再発した患者（例えば、局所再発、及び遠隔転移）を区別するのに有用であった。当初は懐疑的であったにも関わらず、標的配列決定は、疾患の再発の予測において予想外の正確度増加を示した。更に、血漿中のＥＢＶ ＤＮＡの定量化におけるより高い感度及びより良好な精度により、異なる臨床シナリオでの管理を指導するために様々な閾値を採用することができる。例えば、血漿ＥＢＶ ＤＮＡの２つの閾値（高及び低）を使用できる。高閾値より高い血漿ＥＢＶ ＤＮＡ濃度を有する患者について、化学療法薬による先制治療を施して隠れた癌細胞を除去することができる。高閾値と低閾値の間の血漿ＥＢＶ ＤＮＡ濃度を有する患者について、高頻度のフォローアップを手配して臨床進捗をモニタリングすることができる。下限閾値以下の血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する患者について、フォローアップの頻度をより低くすることができる。
Ａ．配列リードの割合

【0123】

治療後サンプル中の無細胞ウイルスＤＮＡを分析するために、標的配列決定（例えば、特別に設計された捕捉プローブによる捕捉濃縮を使用）を使用して配列リードを生成することができる。様々な実施において、これらの捕捉プローブは、全ＥＢＶゲノム及びヒトゲノムにおける複数のゲノム領域（例えば、領域ｃｈｒ１、ｃｈｒ２、ｃｈｒ３、ｃｈｒ５、ｃｈｒ８、ｃｈｒ１５及びｃｈｒ２２を含むが、これらに限定されない）をカバーすることができる。様々なタイプの標的配列決定（例えば、特別に設計された捕捉プローブ、増幅プライマー）を使用して対象のゲノム（例えば、ヒトゲノム）に対して（例えば、ウイルスゲノムの全ての遺伝子座又は特定の遺伝子座にわたって）ウイルスゲノムのＤＮＡを濃縮することができ、かかる標的配列決定は配列リードを生成するために行うことができる。配列決定後、配列決定されたリードは、全ヒトゲノム（ｈｇ１９）及び全ＥＢＶゲノムを含む人工的に組み合わせた参照配列にマッピングすることができる。組み合わせゲノム配列におけるユニークな位置にマッピングされた配列決定されたリードは、下流分析に使用することができる。マッピングされたリード数の中央値は、１，２２０万（範囲：１８０万～９，７６０万）である。

【0124】

その後、治療後サンプルごとに、ウイルスに対応するウイルス参照ゲノムにアライメントしている配列リードの量を特定するために、マッピングされたリードを分析した。配列リードの量は、治療後サンプル中のウイルスＤＮＡ量を表すために使用できる。配列リードの量を使用することで、治療後サンプルの各々中のウイルスＤＮＡ量を表すための様々なタイプのメトリックは得られる。例えば、メトリックは、血漿中の全ＤＮＡに対するウイルスＤＮＡの百分率を含み得る。別の例では、メトリックは、血漿中の全ＤＮＡの濃度とウイルス参照ゲノムにアライメントされたＤＮＡ分子の分率との積を表すことができる。メトリックの他の例としては、（ｉ）ウイルスＤＮＡ断片の数と非ウイルスＤＮＡ断片の数との比、及び（ｉｉ）任意の配列決定されたサンプル中の異なるウイルスＤＮＡ断片の総数を含み得る。

【0125】

治療後サンプルごとに測定された配列リードの量を、サンプルの対応する再発分類に従ってプロットした。分類は、継続的な臨床的寛解を示した患者に対応する第１分類、及び再発した患者に対応する第２分類を含んだ。再発分類の下で、患者を、（１）局所再発に対応する局所再発（ＬＲ）分類、及び（２）他の臓器に転移した癌を示す遠隔転移（ＤＭ）分類に更に分けた。
Ｂ．実施例

【0126】

上咽頭癌の治療を受けた７３７人の患者から治療後サンプルを採取した（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ． ２０１８；３６： ３０９１－３１００）。治療後サンプルの各々は初期に、国際がん対策連合（ＵＩＣＣ。第６版）によるステージＩＩＢ、ＩＩＩ、ＩＶＡ、又はＩＶＢの局所領域進行性ＮＰＣと組織学的に診断されたが、一次放射線療法又は化学放射線療法の完了後に持続性局所領域疾患又は遠隔転移の臨床的証拠がなかった。加えて、治療後の静脈サンプルを治療完了後の６～８週間で採取した。フォローアップ間隔の中央値は６．６年であった。７３７人の患者のうち、６４３人の患者（８７％）は、フォローアップ期間の最初の１年間、継続的な臨床的寛解を示したが、９４人の患者（１３％）は疾患の再発を報告した。該９４人の再発患者のうち、２４人の患者（２６％）は局所領域不全、７０人の患者（７４％）は遠隔転移を発現した。標的捕捉配列決定を使用して治療後サンプルごとに配列リードの割合を同定した。

【0127】

図１３は、標的捕捉配列決定を使用して治療後サンプルから検出された配列リードの割合を同定するグラフを示す。ｘ軸は、治療後サンプルと関連付けられた分類を表し、ｙ軸は、対応する治療後サンプルの血漿ＥＢＶ ＤＮＡリードの割合を表す。図１３に示すように、配列決定されたリードの総数に対するＥＢＶ ＤＮＡリードの百分率は、継続的な寛解を示した患者と比較して、後続で疾患が再発したＮＰＣ患者の方が有意に高かった（ｐ＜０．０１、マン・ホイットニー順位和検定）。後続で疾患が再発した患者のうち、遠隔転移を発現した患者は、局所再発を発現した患者と比較して、ＥＢＶ百分率が有意に高かった（ｐ＜０．０１、マン・ホイットニー順位和検定）。

【0128】

低いレベルのＥＢＶ ＤＮＡは、継続的な臨床的寛解を示した患者の治療後サンプルから検出され、これはリアルタイムＰＣＲに比べて大幅な向上を示した。同様に、局所再発及び遠隔転移分類下の全ての治療後サンプルは、検出可能なレベルのウイルスＤＮＡを含んだ。また、治療後の再発サンプルと寛解サンプルの区別を同定できる。このような所見は、１つ又は複数のカットオフ値（例えば、０．０１％、０．１％、０．４５％、０．５％、１％）を同定するために使用できる。
Ｃ．方法

【0129】

図１４は、本発明の実施形態に係る、対象の無細胞混合物中のウイルス核酸断片の配列リードを使用して疾患の再発を予測する個数ベースの方法１４００を図示するフローチャートである。方法１４００の態様は、本明細書に記載のように、例えば、コンピュータシステムによって実行できる。

【0130】

方法１４００は、以前に病態の治療を受けており現在該病態の症状がない対象の疾患の再発を予測するために使用できる。疾患の再発は、対象の生体サンプルから予測でき、ここで該生体サンプルは、正常組織（即ち、病態に影響されない細胞）に由来する無細胞ＤＮＡ断片と病態に影響される又は影響されている疾患組織（例えば、病態が対象に存在する場合）に由来する無細胞ＤＮＡ断片（例えば、ＥＢＶ ＤＮＡ）との混合物を含む。疾患組織に由来する無細胞ＤＮＡ断片は、臨床上関連するＤＮＡと考えられ、正常組織は他のＤＮＡと考えられる。場合によっては、病態は、ウイルス（例えば、ＥＢＶ、ＨＢＶ、又はＨＰＶ）によって引き起こされる癌に対応する。癌は、上咽頭癌、頭頸部扁平上皮癌、子宮頸癌、及び肝細胞癌のうちの１つであり得る。

【0131】

ブロック１４１０で、生体サンプルを対象から取得する。例として、生体サンプルは、血液、血漿、血清、尿、唾液、汗、涙、及び痰、並びに本明細書で提供される他の例であり得る。いくつかの実施形態において（例えば、血液の場合）、生体サンプルは、例えば、血液を遠心分離して血漿を得るように、無細胞核酸分子の混合物に精製してもよい。

【0132】

ブロック１４２０で、無細胞核酸分子の混合物を配列決定して複数の配列リードを得る。配列決定は、例えば、超並列配列決定又は次世代配列決定を使用し、単一分子配列決定を使用し、及び／又は二本鎖又は一本鎖ＤＮＡ配列決定ライブラリー調製プロトコルを使用するように、様々な方式で行い得る。当業者であれば、使用され得る様々な配列決定技術を理解するであろう。配列決定の一環として、一部の配列リードは細胞核酸に対応してもよい。

【0133】

配列決定は、本明細書に記載の標的捕捉配列決定としてもよい。例えば、生体サンプルは、ウイルスからの核酸分子について濃縮することができる。生体サンプルの、ウイルスからの核酸分子についての濃縮は、ウイルスのゲノムの一部又は全部に結合する捕捉プローブを使用することを含み得る。生体サンプルは、ヒトゲノムの一部、例えば、常染色体の領域からの核酸分子について濃縮してもよい。他の実施形態において、配列決定はランダム配列決定を含む。

【0134】

統計的に有意な数の無細胞ＤＮＡ分子は、分画濃度を正確に特定するように、分析してもよい。いくつかの実施形態において、少なくとも１，０００個の無細胞ＤＮＡ分子は、分析される。他の実施形態において、少なくとも１０，０００又は５０，０００又は１００，０００又は５００，０００又は１，０００，０００又は５，０００，０００個の無細胞ＤＮＡ分子、又はそれ以上の無細胞ＤＮＡ分子は分析され得る。

【0135】

ブロック１４３０で、無細胞核酸分子の混合物の配列決定から得られた複数の配列リードを受信する。配列リードは、例えば、有線若しくは無線通信又は取り外し可能な記憶装置を介して、配列決定を実行した配列決定装置に通信可能に結合され得るコンピュータシステムによって受け取られてもよい。

【0136】

ブロック１４４０で、ウイルスに対応するウイルス参照ゲノムにアライメントしている複数の配列リードの量を特定する。配列リードをウイルスゲノムにアライメントする例は本明細書で提供する。量は、ウイルス参照ゲノムにアライメントする配列リードの数に基づいて様々な方式で特定できる。例えば、ウイルス参照ゲノムにアライメントされた配列リードの数は正規化してもよい。様々な実施形態において、正規化は、生体サンプル（又は精製された混合物）の体積、又はヒト参照ゲノムにアライメントされた配列リードの数に対するものであり得る。

【0137】

いくつかの実施形態において、ウイルス参照ゲノムにアライメントしている配列リードの量は、配列リードの総数に対する、ウイルス参照ゲノムにアライメントされた配列リードの割合を含む。配列リードの総数は、ウイルス参照ゲノムにアライメントされた配列リードとヒトゲノムにアライメントされた配列リードとの合計であってもよい。様々な実施において、ヒトＤＮＡに対するウイルス核酸の相対量（存在量）の任意の関数又は導関数を使用することができ、ここで相対量の例としては、ウイルス核酸とヒトＤＮＡとの比（例えば、割合）又は差を含む。

【0138】

ブロック１４５０で、ウイルス参照ゲノムにアライメントしている配列リードの量をカットオフ値と比較して対象の病態の再発を予測する。例えば、カットオフ値は、以下に示すように、血漿ＥＢＶ ＤＮＡリードの割合で０．４５％であってもよく、図１５の水平破線１５１０で表すことができる。再発の予測は、病態の再発の分類を特定することを含み得る。分類は、寛解、再発、局所領域不全、又は遠隔転移を含み得る。

【0139】

カットオフ値は、再発の分類が既知の１組の訓練サンプルから決定してもよい。例として、カットオフ値は、（１）病態を有すると分類された訓練サンプルのウイルス参照ゲノムにアライメントしている配列リードの最低量を下回る値、（２）病態を有すると分類された訓練サンプルのウイルス参照ゲノムにアライメントしている配列リードの平均量からの指定された数の標準偏差、又は（３）訓練サンプルの分類を正確に特定するための特異性及び感度を使用して選択することができる。

【0140】

場合によっては、カットオフ値は、特異性の低下を補償しながら感度を増加するように、又はその逆で、調整される。例えば、ＥＢＶ ＤＮＡの割合のカットオフ値は、感度を向上させるために、０．４５％から０．１％に下げてもよい。実際に、個数ベースの分析では、以前に治療を完了した対象の再発を予測するための最適な感度及び特異性を同定することができる。
Ｄ．カットオフ値の決定

【0141】

異なるカットオフ値を選択して、疾患の再発を予測するための感度及び特異性を最適化することができる。いくつかの実施形態において、カットオフ値は、癌の再発の分類を特定する感度が少なくとも８０％であり、癌の再発の分類を特定する特異性が少なくとも７０％であるように、選択してもよい。追加的に又は代替的に、カットオフ値は、局所再発及び遠隔転移を含む特定のタイプの再発を予測するための感度及び特異性を増加するように選択してもよい。例えば、カットオフ値は、局所再発の分類を特定する感度が少なくとも５０％であり、癌の再発の分類を特定する特異性が少なくとも７０％であるように、選択してもよい。別の例では、カットオフ値は、遠隔転移の分類を特定する感度が少なくとも８０％であり、及び／又は癌の再発の分類を特定する特異性が少なくとも７０％であるように、選択してもよい。

【0142】

いくつかの実施形態において、ウイルス参照ゲノムにアライメントしている配列リードの量のカットオフ値は、対象が寛解状態にあるか又は再発しているかを特定するために使用され得る。例えば、再発した対象は、寛解状態にある又は非癌細胞から検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する対象より、ＥＢＶ ＤＮＡの割合が高い。いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＤＮＡの割合のカットオフ値は、約０．０２％、約０．０３％、約０．０４％、約０．０５％、約０．０６％、約０．０７％、約０．０８％、約０．０９％、約０．１％、約０．１５％、約０．２％、約０．２５％、約０．３％、約０．３５％、約０．４％、約０．４５％、約０．５％、約０．５５％、約０．６％、約０．６５％、約０．７５％、約０．８％、約０．８５％、約０．９％、約０．９５％、約１％、又は約１％より大きくてもよい。例えば、カットオフ値は、血漿ＥＢＶ ＤＮＡの０．０４６％～０．３８５％の範囲から選択してもよい。いくつかの実施形態において、カットオフ値以下のＥＢＶ ＤＮＡの割合は、再発を示すことができる。いくつかの実施形態において、カットオフ値以上のＥＢＶ ＤＮＡの割合は、再発を示すことができる。

【0143】

１つの実施形態において、配列リードの量のカットオフ値は、分析中の癌患者の最低割合を下回る任意の値として決定してもよい。他の実施形態において、カットオフ値は、例えば、癌患者の平均サイズ指数－１標準偏差（ＳＤ）、平均－２ＳＤ、及び平均－３ＳＤに決定してもよいが、それらに限定されない。更に他の実施形態において、カットオフは、ウイルスゲノムにマッピングされた血漿ＤＮＡ断片の割合の対数変換後に、例えば、癌患者の値の対数変換の平均－１ＳＤ、平均－２ＳＤ、平均－３ＳＤに決定してもよいが、それらに限定されない。更に他の実施形態において、カットオフは、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を使用することで、又はノンパラメトリック方法によって決定してもよく、例えば再発した患者の１００％、９５％、９０％、８５％、８０％を含むが、それらに限定されない。
Ｖ．個数及びサイズに基づく組み合わせ技術

【0144】

ＥＢＶ ＤＮＡ断片の量に加えて、各血漿サンプルの配列決定結果に基づいてＥＢＶ ＤＮＡ断片のサイズも分析した。この試験では、サイズベースの分析（例えば、サイズ分布、サイズ比）が治癒を目的とした治療を受けたＮＰＣ患者の疾患の再発を予測する性能を強化できるか否かも探索した。例えば、以前に病態の治療を受けており該病態に無症候となっている癌患者の生体サンプルからの血漿ウイルスＤＮＡリード（例えば、ＥＢＶ、ＨＢＶ、及びＨＰＶ）のサイズ分布における差異を調べた。癌対象の血漿ウイルス断片のサイズ分布は、同じ対象の血漿ヒトＤＮＡ断片より、統計的に有意に短かった。サイズ分布の変動は、配列決定された血漿ＤＮＡのサイズプロファイルパターンにおける個体間の変動を同定するために使用できる。

【0145】

いくつかの実施形態において、配列決定は、各サンプル中の無細胞ウイルス核酸のサイズを測定するために使用される。例えば、各配列決定された血漿ＤＮＡ分子のサイズは、配列の開始及び終了座標から導き出すことができ、ここで該座標は、配列リードをウイルスゲノムにマッピング（アライメント）することで特定できる。様々な実施形態において、ＤＮＡ分子の開始及び終了座標は、単一分子配列決定で達成され得るように、２つのペアエンドリード又は両端をカバーする単一リードから特定できる。追加的に又は代替的に、無細胞ウイルス核酸のサイズは、コンピュータで、又は電気泳動等の物理的プロセスを使用して、測定できる。

【0146】

場合によっては、サイズ分布は、横軸上に核酸断片のサイズによるヒストグラムとして表示できる。各サイズ（例えば、１ｂｐ分解能）での核酸断片の数は、例えば、生の数値又は頻度百分率として、決定して縦軸上にプロットすることができる。サイズの分解能は、１ｂｐ超（例えば、２、３、４、又は５ｂｐ分解能）であってもよい。サイズ分布（サイズプロファイルとも呼ばれる）は、ＮＰＣ対象からの無細胞混合物中のウイルスＤＮＡ断片が、観察可能な病態のない対象より統計的に長いことを判定するために使用できる。
Ａ．サイズ比

【0147】

個体間で特定のサイズ範囲（例えば、８０～１１０塩基対）内にある血漿ウイルスＤＮＡリード（例えば、ＥＢＶリード）の割合を比較するために、血漿ウイルスＤＮＡ断片の量は、同じサイズ範囲内の常染色体ＤＮＡ断片の量に正規化してもよい。このメトリックは、サイズ比とする。サイズ比は、対応するサイズ範囲内の常染色体（例えば、常染色体ＤＮＡ断片）の割合で割った特定のサイズ範囲内の血漿ウイルスＤＮＡ断の割合によって定義できる。例えば、８０～１１０塩基対のＥＢＶ ＤＮＡ断片のサイズ比は下記式となる。

【数1】

サイズ比は、各サンプル中の短いＤＮＡ断片の相対割合を示すことができる。ＥＢＶ ＤＮＡのサイズ比が低いほど、サイズが８０～１１０ｂｐのＥＢＶ ＤＮＡ分子の割合が低くなる。

【0148】

他の実施形態において、ＥＢＶ ＤＮＡ又はヒトＤＮＡの異なるサイズ範囲は、サイズ比の計算に使用できる。サイズ範囲の下限の例としては、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、１１０ｂｐ、１２０ｂｐを含むが、それらに限定されない。サイズ範囲の上限の例としては、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、１１０ｂｐ、１２０ｂｐ、１３０ｂｐ、１４０ｂｐ、又は１５０ｂｐを含むが、それらに限定されない。更に他の実施形態において、ＥＢＶ ＤＮＡ及び／又はヒトＤＮＡに１つより多くのサイズ範囲が使用できる。いくつかの実施形態において、ＥＢＶ ＤＮＡ及びヒトＤＮＡのサイズ範囲は異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、サイズ分布を測定するために、例えば、１つ又は複数の選択されたサイズ範囲に収まるＥＢＶ ＤＮＡ断片の数、ＥＢＶ ＤＮＡ断片と非ＥＢＶ ＤＮＡ断片のサイズの平均値又は中央値、ＥＢＶ ＤＮＡ断片のサイズの平均値、中央値若しくは最頻値の間の比を含むがそれらに限定されない、他のメトリックを使用してもよい。

【0149】

いくつかの実施形態において、配列決定されたリードのサイズ比は、ＥＢＶ ＤＮＡ断片が癌細胞からか又は非癌細胞からかを特定するために使用される。よって、このような情報は、検出されたＥＢＶ ＤＮＡ断片が再発を示すか否かを判定するために有用であり得る。様々なカットオフは、ＥＢＶ ＤＮＡ断片とヒトＤＮＡ断片、及び／又は癌性ＥＢＶ ＤＮＡ断片と非癌性ＥＢＶ ＤＮＡ断片を区別するために使用できる。カットオフ値を下回るＥＢＶ ＤＮＡ断片の量は、対応する対象が継続的な臨床的寛解状態にあるか又は再発しているか（例えば、局所再発、遠隔転移）を分類するように測定してもよい。

【0150】

他の実施形態では、ＥＢＶゲノムにアライメントする無細胞サンプル中の配列リードのサイズ分布（例えば、平均値、中央値、最頻値、別のサイズ範囲での量に対する１つのサイズ範囲でのリードの量の比）の他の統計値を使用して疾患の再発を予測することができる。
Ｂ．実施例

【0151】

上咽頭癌の治療を受けた７３７人の患者から治療後サンプルを採取した（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ． ２０１８；３６： ３０９１－３１００）。治療後サンプルの各々は初期に、国際がん対策連合（ＵＩＣＣ。第６版）によるステージＩＩＢ、ＩＩＩ、ＩＶＡ、又はＩＶＢの局所領域進行性ＮＰＣと組織学的に診断されたが、一次放射線療法又は化学放射線療法の完了後に持続性局所領域疾患又は遠隔転移の臨床的証拠がなかった。加えて、治療後の静脈サンプルを治療完了後の６～８週間で採取した。フォローアップ間隔の中央値は６．６年であった。７３７人の患者のうち、６４３人の患者（８７％）は、フォローアップ期間の最初の１年間、継続的な臨床的寛解を示したが、９４人の患者（１３％）は疾患の再発を報告した。該９４人の再発患者のうち、２４人の患者（２６％）は局所領域不全、７０人の患者（７４％）は遠隔転移を発現した。標的捕捉配列決定を使用して各治療後サンプル中の無細胞ウイルス核酸のサイズを評価した。

【0152】

図１５は、標的捕捉配列決定を使用して治療後サンプルから検出されたＥＢＶ ＤＮＡの割合及びサイズ比を同定するグラフを示す。ｘ軸は、治療後サンプルの８０～１１０ｂｐのサイズ範囲内のＥＢＶ ＤＮＡサイズ比を表し、ｙ軸は、対応する治療後サンプルの血漿ＥＢＶ ＤＮＡリードの割合を表す。治療後サンプルの各々を、円形で表される寛解、角形で表される遠隔転移（ＤＭ）、又は三角形で表される局所領域不全（ＬＲ）にあると同定した。カットオフを再発予測に使用する例示的な例として、図１５は、サイズ比のカットオフ値９を表す垂直破線１５０５、及び血漿ＥＢＶ ＤＮＡリードの割合のカットオフ値０．４５％を表す水平破線１５１０を示す。カットオフ値９を下回るサイズ比及びカットオフ値０．４５％を上回るＥＢＶ ＤＮＡの割合を有する配列リードを使用して、対応する対象が再発することを予測した。

【0153】

図１５に示すように、上記のカットオフ基準下の円形及び角形は、患者９４人中６３人（６７％）が後続で疾患が再発することを示す。後続で遠隔転移を発症する７０人の対象について、５６人（８０％）が同定された。後続で局所再発を発症する２４人の対象について、７人（２９％）が同定された。継続的な寛解にある６４３人の患者について、５８３人（９１％）がＥＢＶ ＤＮＡの量カットオフ値（例えば、水平破線１５１０で表される０．４５％のＥＢＶ ＤＮＡ割合）及びサイズカットオフ値（例えば、垂直破線１５０５で表される９のサイズ比）の範囲外であった。

【0154】

よって、標的捕捉配列決定を使用した組み合わせ分析は、治療完了後の最初の１年内に再発する治療後サンプルを予測するために、リアルタイムＰＣＲ（それぞれ７０％及び７９％）よりも高い感度及び特異性（それぞれ６７％及び９１％）の組み合わせを有した。これは、組み合わせ分析が治療後サンプルにおける再発の予測にリアルタイムＰＣＲより大幅に有効であることを示す。
Ｃ．方法

【0155】

図１６は、本発明の実施形態に係る、ウイルス核酸断片の個数ベースの分析とサイズベースの分析を組み合わせて疾患の再発を予測した方法のフローチャートである。該方法の少なくとも一部はコンピュータシステムによって実行され得る。

【0156】

方法１６００は、生体サンプルを分析して、以前に病態の治療を受けており、現在該病態の症状がない対象からの生体サンプルの再発を予測することができる。疾患の再発は、対象の生体サンプルから予測でき、ここで該生体サンプルは、正常組織（即ち、病態に影響されない細胞）に由来する無細胞ＤＮＡ断片と病態に影響される又はされている疾患組織（例えば、病態が対象に存在する場合）に由来する無細胞ＤＮＡ断片（例えば、ＥＢＶ ＤＮＡ）との混合物を含む。疾患組織に由来する無細胞ＤＮＡ断片は、臨床上関連するＤＮＡと考えられ、正常組織は、他のＤＮＡと考えられる。場合によっては、病態は、ウイルス（例えば、ＥＢＶ、ＨＢＶ、又はＨＰＶ）によって引き起こされる癌に対応する。癌は、上咽頭癌、頭頸部扁平上皮癌、子宮頸癌、及び肝細胞癌のうちの１つであり得る。

【0157】

ブロック１６１０で、第１アッセイを実行する。第１アッセイは、対象の第１生体サンプルからの複数の無細胞核酸分子を分析して、ウイルスに対応するウイルス参照ゲノムにアライメントしている該複数の無細胞核酸分子の第１量を特定することができる。例として、第１アッセイは、例えば、方法１４００で実行されるように、配列決定を含み得る。他の例はリアルタイムＰＣＲ又はデジタルＰＣＲである。

【0158】

ブロック１６２０で、サイズベースの分析を使用して第２アッセイを実行する。ブロック１６２２及び１６２４は、第２アッセイの実行の一環として実行できる。第２アッセイは、第１生体サンプルと同じ又は異なり得る第２生体サンプルに対して実行することができる。第１生体サンプル及び第２生体サンプルは、同じ血液サンプル（例えば、異なる血漿／血清部分）からのものであってもよい。いくつかの実施形態において、第２アッセイは、第１量が第１カットオフを上回る場合にのみ実行される。

【0159】

ブロック１６２２で、第２生体サンプル中の複数の核酸分子の各々のサイズを測定する。サイズは、任意の好適な方法、例えば、上記の方法を通じて測定され得る。例として、測定されたサイズは、長さ、分子量、又は長さに比例する測定パラメーターであり得る。

【0160】

いくつかの実施形態において、核酸分子の両末端を配列決定しゲノムにアライメントして、核酸分子の開始及び終了座標を特定し、それによって、サイズの例である塩基単位の長さを得ることができる。かかる配列決定は、例えば、本明細書に記載の捕捉プローブを含む標的捕捉配列決定であり得る。サイズを特定するための他の例示的な技術は、電気泳動、光学的方法、蛍光ベースの方法、プローブベースの方法、デジタルＰＣＲ、ローリングサークル増幅、質量分析、融解分析（又は融解曲線分析）、分子ふるい等を含む。質量分析の例として、分子が長いほど質量が大きくなる（サイズ値の例）。

【0161】

ブロック１６２４で、ウイルス参照ゲノムからの複数の核酸分子のサイズに対応する統計値を特定する。いくつかの実施形態において、統計値は、（１）所与の範囲内のサイズを有するウイルス参照ゲノムにアライメントする核酸分子の配列リードの第１割合と、（２）該所与の範囲内のサイズを有するヒト参照ゲノムにアライメントする核酸分子の配列リードの第２割合とのサイズ比を含み得る。様々な実施形態において、所与の範囲は、約８０～約１１０塩基対、約５０～約７５塩基対、約６０～約９０塩基対、約９０～約１２０塩基対、約１２０～約１５０塩基対、又は約１５０～約１８０塩基対であり得る。他の実施形態において、統計値は、サイズ比の逆数であり得るため、サイズ指数を使用する。

【0162】

統計値は、ウイルス参照ゲノムからの複数の核酸分子のサイズ分布に対応してもよい。サイズ閾値より小さい断片の累積頻度は、統計値の例である。統計値は、全体サイズ分布の尺度、例えば、大きな断片の量に対する小さな断片の量を提供できる。別の例として、統計値は、（１）ウイルス参照ゲノムからの生体サンプル中の、第１サイズ範囲内の複数の核酸分子の第１量と、（２）ウイルス参照ゲノムからの生体サンプル中の、該第１サイズ範囲と異なる第２サイズ範囲内の複数の核酸分子の第２量との比を含み得る。例えば、第１範囲は、第１サイズ閾値を下回る断片であり得、第２サイズ範囲は、第２サイズ閾値を上回る断片であり得る。２つの範囲は、例えば、第２サイズ範囲が全てのサイズである場合、重複してもよい。

【0163】

様々な実施形態において、統計値は、平均値、最頻値、中央値、又はサイズ分布の平均値であり得る。他の実施形態において、統計値は、ウイルス参照ゲノムからの生体サンプル中の、サイズ閾値（例えば、１５０ｂｐ）を下回る複数の核酸分子の百分率であり得る。かかる統計値について、対象は、統計値がカットオフ値を下回る場合、病態が陽性であると特定できる。

【0164】

いくつかの実施形態において、統計値は、異なる範囲内のサイズを有し且つウイルス参照ゲノムにアライメントしている無細胞核酸分子の量を使用して正規化できる。別の例として、統計値は、所与の範囲内のサイズを有し且つ及び常染色体ゲノムにアライメントしている無細胞核酸分子の量を使用して正規化できる。

【0165】

ブロック１６３０で、第１量を第１カットオフと比較する。第１量が第１カットオフを超える（例えば、上回る）か否かを判定してもよい。例えば、第１カットオフは、血漿ＥＢＶ ＤＮＡリードの割合について０．４５％であり得、図１５の水平破線１５１０で表すことができる。例えば、疾患の再発の最終判定の情報を提供するように、第１量が第１カットオフを超える程度を特定してもよい。

【0166】

ブロック１６４０で、統計値を第２カットオフと比較する。統計値が第２カットオフを超える（例えば、第２量の定義方式に応じて、上回る又は下回る）か否かを判定してもよい。例えば、第２カットオフは、ＥＢＶ ＤＮＡとヒトＤＮＡの間の９のサイズ比であり得、図１５の垂直破線１５０５で表すことができる。第２量が第２カットオフを超える程度は、例えば、疾患の再発の最終判定の情報を提供するように、特定してもよい。

【0167】

ブロック１６５０で、第１量と第１カットオフ、及び統計値と第２カットオフの比較に基づいて病態の再発の分類を特定する。いくつかの実施形態において、対象は、第１量が第１カットオフを超え（例えば、図１５の水平破線１５１０で表される０．４５％のＥＢＶ ＤＮＡ割合）且つ第２量が第２カットオフを超える（例えば、図１５の垂直破線１５０５で表される９のサイズ比）場合にのみ、再発していると判定される。

【0168】

異なる第１及び第２カットオフ値を選択して、疾患の再発を予測するための感度及び／又は特異性を増加することができる。いくつかの実施形態において、第１及び第２カットオフ値の各々は、癌再発の分類を特定する感度が少なくとも８０％であり、癌再発の分類を特定する特異性が少なくとも７０％であるように、選択してもよい。追加的に又は代替的に、第１及び／又は第２カットオフ値を選択して、局所再発及び遠隔転移を含む特定のタイプの再発を予測するための感度及び特異性を増加することができる。例えば、第１及び第２カットオフ値の各々は、局所再発の分類を特定する感度が少なくとも５０％であり、癌再発の分類を特定する特異性が少なくとも７０％であるように、選択してもよい。別の例では、第１及び第２カットオフ値の各々は、遠隔転移の分類を特定する感度が少なくとも８０％であり、及び／又は癌再発の分類を特定する特異性が少なくとも７０％であるように、選択してもよい。

【0169】

場合によっては、第１及び第２カットオフ値の各々は、感度の僅かな低下を補償しながら特異性を増加するように、又はその逆で、調整してもよい。実際に、組み合わせ分析は、治療を完了した対象の疾患の再発を予測するための最適な感度及び特異性を同定できる。
Ｄ．サイズのカットオフ値の決定

【0170】

いくつかの実施形態において、サイズのカットオフ値（例えば、サイズ比、サイズ分布）は、対象が寛解状態にあるか又は再発しているかを判定するために使用され得る。例えば、再発した対象は、寛解状態にある又は非癌細胞からの検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する対象よりも低い８０～１１０ｂｐのサイズ範囲内のサイズ比を有する。いくつかの実施形態において、サイズ比のカットオフ値は、約０．１、約０．５、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２５、約５０、約１００、又は約１００より大きくてもよい。例えば、カットオフ値は、６～１１のサイズ比から選択してもよい。いくつかの実施形態において、カットオフ値以下のサイズ比は再発を示すことができる。いくつかの実施形態において、カットオフ値以上のサイズ比は再発を示すことができる。

【0171】

いくつかの実施形態において、サイズ指数のカットオフ値は、約又は少なくとも１０、約又は少なくとも２、約又は少なくとも１、約又は少なくとも０．５、約又は少なくとも０．３３３、約又は少なくとも０．２５、約又は少なくとも０．２、約又は少なくとも０．１６７、約又は少なくとも０．１４３、約又は少なくとも０．１２５、約又は少なくとも０．１１１、約又は少なくとも０．１、約又は少なくとも０．０９１、約又は少なくとも０．０８３、約又は少なくとも０．０７７、約又は少なくとも０．０７１、約又は少なくとも０．０６７、約又は少なくとも０．０６３、約又は少なくとも０．０５９、約又は少なくとも０．０５６、約又は少なくとも０．０５３、約又は少なくとも０．０５、約又は少なくとも０．０４、約又は少なくとも０．０２、約又は少なくとも０．００１、又は約０．００１より小さくてもよい。いくつかの実施形態において、カットオフ値以下のサイズ指数は再発を示すことができる。いくつかの実施形態において、カットオフ値以上のサイズ指数は再発を示すことができる。

【0172】

１つの実施形態において、サイズ比又はサイズ指数のカットオフ値は、分析中の癌患者の最低割合を下回る任意の値と決定できる。他の実施形態において、カットオフ値は、例えば、癌患者の平均サイズ指数－１標準偏差（ＳＤ）、平均－２ＳＤ、及び平均－３ＳＤに決定してもよいが、それらに限定されない。更に他の実施形態において、カットオフは、ウイルスゲノムにマッピングされた血漿ＤＮＡ断片の割合の対数変換後、例えば、癌患者の値の対数変換後の平均－１ＳＤ、平均－２ＳＤ、平均－３ＳＤに決定してもよいが、それらに限定されない。更に他の実施形態において、カットオフは、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を使用することで、又はノンパラメトリック方法によって決定してもよく、例えば再発した患者の１００％、９５％、９０％、８５％、８０％を含むが、それらに限定されない。
ＶＩ．疾患の再発の予測におけるリアルタイムＰＣＲと配列決定の比較

【0173】

受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析を使用することで、対象における治療後の１年内に発生した疾患の再発の予測での、個数ベースの分析、個数及びサイズベースの組み合わせ分析、及びリアルタイムＰＣＲの診断性能を比較した。加えて、個数ベースの分析及びリアルタイムＰＣＲの性能も、患者の全生存率に関して比較し、ここで生存率はウイルスＤＮＡの検出された量に基づいて予測された。
Ａ．疾患の再発の予測

【0174】

図１７は、ＮＰＣ患者の治癒を目的とした治療の完了後の６週間で採取された血漿サンプルの分析に基づいて疾患の再発を予測するための受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。ＲＯＣ曲線は、リアルタイムＰＣＲを表す点線１７０５、個数ベースの分析を表す破線１７１０、及び個数及びサイズベースの組み合わせ分析を表す実線１７１５を含む。ＥＢＶゲノム全体を捕捉するように設計されたプローブによる標的捕捉配列決定を使用して組み合わせ分析を実行した。リアルタイムＰＣＲの性能は、再発対象と寛解対象を区別するためのリアルタイムＰＣＲアッセイによって特定された定量血漿ＥＢＶ ＤＮＡ値に基づく。

【0175】

曲線下面積（ＡＵＣ）値は、リアルタイムＰＣＲ及び個数ベースの分析において、それぞれ０．７８及び０．８４であった。ＡＵＣ値は、サイズベースの分析を個数ベースの分析と組み合わせた場合、更に向上した。サイズ比の組み合わせによって、ＡＵＣは０．８６となり、リアルタイムＰＣＲのＡＵＣより有意に大きかった（ｐ＜０．０１、ブートストラップ検定）。

【0176】

別の例では、更なる評価のために、様々な技術にわたる特異性及び感度を特定した。この例において、異なるＥＢＶ ＤＮＡ量カットオフによる個数ベースの分析、様々なＥＢＶ ＤＮＡ量カットオフ（例えば、０．１％、０．４５％）及びサイズ比カットオフ（例えば、９）による個数及びサイズベースの組み合わせ分析、及びリアルタイムＰＣＲの診断性能を評価した。結果は下記表２に示す。

【表2】

【0177】

表２に示すように、個数ベースの分析及び組み合わせ分析は、それぞれ、治療後の最初の１年内に発生した疾患の再発の予測において、リアルタイムＰＣＲより高い感度及び特異性の組み合わせと関連している。再発の予測が、低いレベルのウイルスＤＮＡを有する治療後サンプルに関わるため、再発の真陽性（ＴＰ）を同定することは有利である。よって、個数ベースの分析及び組み合わせ分析は、リアルタイムＰＣＲより適切な技術である。
Ｂ．個数及びサイズベースの分析に基づく生存率

【0178】

上記のカットオフを使用して、患者を異なる予後群に分類することができる。図１８は、標的捕捉配列決定を使用した組み合わせ分析に応じて群化されたＮＰＣ患者の全生存率を同定するグラフを示す。図１５で使用されるカットオフと同様に、ＥＢＶ ＤＮＡの割合に０．４５％、サイズ比に９を使用した。両方のカットオフを満たした対象は、「配列決定陽性」と定義され、破線１８０５で表され、カットオフの一方のみを満たした又はいずれも満たさなかった対象は、「配列決定陰性」と定義され、実線１８１０で表された。図１８に示すように、配列決定陽性と分類された患者は、配列決定陰性と分類された患者と比較して、優れた全生存率と関連していた（ｐ＜０．０００１、ログランク検定）。特に、配列決定陽性及び配列決定陰性である患者の５年生存期間は、それぞれ、８８．０％及び４０．１％であった。２群間のハザード比は６．４４（９５％ＣＩ、４．７４～８．７４）であった。リアルタイムＰＣＲを使用した図１２に示す全生存率と比較して、図１８に示す生存率は、配列決定－陽性対象と配列決定－陰性対象の間のより大きな分離を示した。これは、標的捕捉配列決定はより低い生存率に対応する疾患の再発が実際に発生する対象を検出する可能性がより高いことを示すかもしれない。

【0179】

Ｃｏｘ比例ハザードモデルを使用して、組み合わせ分析を含む様々な変数の予後性能を評価した。リアルタイムＰＣＲについて、検出不能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する患者のハザードを、検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する患者のハザードと比較した。個数及びサイズ分析について、ＥＢＶ ＤＮＡの割合がカットオフ０．４５％を満たし且つサイズ比がカットオフ９を満たす患者のハザードを、カットオフの一方のみを満たす又はいずれも満たさない患者のハザードと比較した。比較上、癌レベル分類（例えば、ＵＩＣＣ全体病期）、治療方式、腫瘍のサイズ（例えば、Ｔ病期）、付近のリンパ節への癌の浸潤（例えば、Ｎ病期）、年齢、及び性別も、モデルに含まれる他の変数であった。全生存率の単変量分析は、組み合わせ分析が最も重要な独立予後因子（ｐ＜０．０００１）であり、それに続くのがリアルタイムＰＣＲ（ｐ＜０．０００１）、ＵＩＣＣ全体病期（ｐ＜０．０００１）、治療方式（ｐ＜０．０００１）、Ｔ病期（ｐ＝０．０００１）、Ｎ病期（ｐ＝０．０００４）、年齢（ｐ＝０．０１３）であることを示唆した。性別は僅かに重要な因子であった（ｐ＝０．０５１）。多変量Ｃｏｘ比例ハザードモデルにおいて、組み合わせ分析は依然として全生存率にとって最も有力な独立予後因子であり（ｐ＜０．０００１）、それに続くのはＴ病期（ｐ＝０．０２）、性別（ｐ＝０．０２）であったが、ＵＩＣＣ全体病期（ｐ＝０．０５）、リアルタイムＰＣＲ（ｐ＝０．５８）、治療方式（ｐ＝０．９６）、Ｎ病期（ｐ＝０．４５）、及び年齢（ｐ＝０．０７）はそうでなかった。

【0180】

ウイルスＤＮＡの組み合わせ分析を使用して、治療後サンプルを含む様々な生体サンプル中のウイルスＤＮＡの割合を推定することができる。そして、ウイルスＤＮＡの割合を使用して、対象の全生存率の予測を容易にすることができる。例えば、全生存率がＥＢＶ ＤＮＡの量と相関するか否かを判定するために、患者は、ＤＮＡの割合の１０倍増加ごとに異なる予後群に層別化された。

【0181】

図１９は、推定された配列決定ベースのＥＢＶ ＤＮＡレベルに応じて群化されたＮＰＣ患者の全生存率を同定するグラフ１９００を示す。それぞれ、０．０１％を下回るＥＢＶ ＤＮＡの割合を有する第１群の患者（線１９０５で表される）、０．０１％～０．１％内のＥＢＶ ＤＮＡの割合を有する第２群の患者（線１９１０で表される）、０．１％～１％内のＥＢＶ ＤＮＡの割合を有する第３群の患者（線１９１５で表される）、及び１％より高いＥＢＶ ＤＮＡの割合を有する第４群の患者（線１９２０で表される）を含む、４つの予後群に分類した。図１９に示すように、血漿中のＥＢＶ ＤＮＡの割合の増加に伴い、全生存率の悪化が観察された。０．０１％を下回るＥＢＶ ＤＮＡの割合を有する患者と比較すると、０．０１％～０．０１、０．１％～１％、又は＞１％のＥＢＶ ＤＮＡの割合を有する他の患者群は、それぞれ、ハザード比（ＨＲ）値が２．１２、３．７４、１３．５６であった（表３を参照）。

【表3】

【0182】

よって、個数ベースの分析を実施して、ＥＢＶ ＤＮＡの割合の１０倍増分に対応する全生存率をモデリングすることができる。様々な評価において、組み合わせ分析からの結果は、最も重要な独立予後因子として浮上した。単変量分析について、組み合わせ分析は、全生存率にとって最も重要な予後因子であり（ｐ＜０．０００１）、それに続くのはリアルタイムＰＣＲ（ｐ＜０．０００１）、ＵＩＣＣ全体病期（ｐ＜０．０００１）、治療方式（ｐ＜０．０００１）、Ｔ病期（ｐ＝０．０００１）、Ｎ病期（ｐ＝０．０００４）、及び年齢（ｐ＝０．０１３）であった。対照的に、単変量分析において性別は僅かに重要であった（ｐ＝０．０５１）。多変量分析について、組み合わせ分析は依然として全生存率にとって最も有力な独立予後因子であり（ｐ＜０．０００１）、それに続くのはＴ病期（ｐ＝０．０２）、性別（ｐ＝０．０３）、ＵＩＣＣ全体病期（ｐ＝０．０４）であった。対照的に、リアルタイムＰＣＲ（ｐ＝０．４１）、治療方式（ｐ＝０．７７）、Ｎ病期（ｐ＝０．３３）、及び年齢（ｐ＝０．０７）は多変量分析に有効な予後因子とは考えられなかった。
Ｃ．高い生存率を有する患者の予測

【0183】

加えて、個数ベースの分析は、高い全生存率に関連する患者群を予測することができた。予測は、非常に低い量のウイルスＤＮＡが検出された１つ又は複数の患者に基づいて行ってもよい。図２０は、血漿中のＥＢＶ ＤＮＡの割合が０．０１％を下回ったＮＰＣ患者の全生存率を同定するグラフ２０００を示す。グラフ２０００において、線２００５は個数ベースの分析を使用して検出された０．０１％未満のＥＢＶ ＤＮＡを有するＮＰＣ患者の生存率を表し、線２０１０はリアルタイムＰＣＲを使用していかなるＥＢＶ ＤＮＡも検出されなかったＮＰＣ患者の生存率を表した。個数ベースの分析による０．０１％を下回るＥＢＶ ＤＮＡの割合を有する患者について、５年生存率は９３．２％であった。対照的に、ｑＰＣＲによる検出不能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する患者の５年生存率は８７．６％に止まった。実際に、図２０００に示すように、個数ベースの分析によるＥＢＶ ＤＮＡの割合を有する患者の全生存率は、ｑＰＣＲによる検出不能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する患者より有意に良好であった（ｐ＝０．０１、ログランク検定）。したがって、個数ベースの分析は、予後が良好な患者を同定する優位性を示し、治療後サンプルにおける疾患の再発の予測にも有効であり得る。
ＶＩＩ．妊娠に関連する異常を同定するためのウイルスＤＮＡ配列決定

【0184】

ＮＰＣ等のウイルス関連疾患は、最も多くは４０～６０歳の年齢で流行するが、かかる疾患は、より若い年齢層の生殖可能年齢でも発生し得る。妊娠中のＮＰＣの発生は、妊婦に身体的及び心理的の両方で重大な悪影響を及ぼす可能性がある。これに関して、ウイルスＤＮＡ（例えば、ＥＢＶ、ＨＰＶ）の個数ベースの分析及び組み合わせ分析が妊婦におけるＮＰＣ及び他の妊娠関連異常の同定においてリアルタイムＰＣＲより正確であるか否かを探索した。２６人のＮＰＣ患者及びＮＰＣを有さない２６人の妊婦からのサンプルを分析した。上記の通り、血漿ＥＢＶ ＤＮＡの定量分析用のリアルタイムＰＣＲ及び血漿ＥＢＶ ＤＮＡの標的捕捉配列決定を実行した。

【0185】

図２１は、ＮＰＣ患者及びＮＰＣが同定されなかった妊婦にわたるリアルタイムＰＣＲによる血漿ＥＢＶ ＤＮＡ濃度を示す。ｘ軸は、対象（例えば、ＮＰＣ、妊婦）に対応する分類を表し、ｙ軸は、対象に対応する生体サンプルのウイルスＤＮＡ濃度を表す。図２１に示すように、血漿ＥＢＶ ＤＮＡは、２６人のＮＰＣ患者全員で検出可能であった。しかし、２６人の妊婦のうち２人（８％）は、検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡ濃度が１００～１０００コピー／ｍＬの範囲であった。よって、検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを妊婦におけるＮＰＣのスクリーニング検査として使用すれば、検査の感度及び特異性はそれぞれ１００％及び９２％であった。２例の妊娠においてかなりのウイルスＤＮＡが検出されたので、ＥＢＶ ＤＮＡの存在以外に、ＮＰＣと妊婦の間におけるＥＢＶ ＤＮＡの他のタイプの区分は利用可能ではないようである。

【0186】

図２２は、ＮＰＣ患者及びＮＰＣが同定されなかった妊婦にわたる個数ベースの分析による血漿ＥＢＶ ＤＮＡ濃度を示す。ｘ軸は、対象（例えば、ＮＰＣ、妊婦）に対応する分類を表し、ｙ軸は、対象に対応する生体サンプルのウイルスＤＮＡ濃度を表す。妊娠対象群は、ｑＰＣＲ陽性及びｑＰＣＲ陰性の２つのサブグループに更に分けられた。標的捕捉配列決定を使用して血漿ＥＢＶ ＤＮＡ濃度を特定した。

【0187】

ＥＢＶ ＤＮＡ割合に＞０．１％のカットオフを使用したところ、２６人のＮＰＣ患者全員は、正確に陽性と同定され、２６人の妊婦は、リアルタイムＰＣＲによるＥＢＶ ＤＮＡ状態にも関わらず、陰性と同定された。このため、個数ベースの分析は、１００％感度及び１００％特異性で、リアルタイムＰＣＲ分析よりも正確に機能した。更に、リアルタイムＰＣＲとは対照的に、標的捕捉配列決定を使用した個数ベースの分析における検出されたＥＢＶ ＤＮＡがより明確に区分され、これにより、ウイルス関連病態のレベルを正確に同定できるカットオフ値をより容易に選択することができる。

【0188】

図２３は、ＮＰＣ患者及びＮＰＣが同定されなかった妊婦にわたる血漿ＥＢＶ ＤＮＡの個数及びサイズベースの分析を示す。ｘ軸は、対象（例えば、ＮＰＣ、妊婦）に対応する分類を表し、ｙ軸は、対象に対応する生体サンプルのウイルスＤＮＡ濃度を表す。妊娠対象群は、ｑＰＣＲ陽性及びｑＰＣＲ陰性の２つのサブグループに更に分けられた。標的捕捉配列決定を使用して血漿ＥＢＶ ＤＮＡ濃度を特定した。

【0189】

図２３において、ＥＢＶ ＤＮＡ割合について０．１％の第１カットオフ、サイズ比について９．０の第２カットオフが使用された。図２３における例と同様に、２６人のＮＰＣ患者全員は陽性と分類され、２６人の妊婦全員は陰性と分類された。したがって、個数及びサイズベースの分析を使用して妊婦におけるＮＰＣをスクリーニングする感度及び特異性は、１００％感度及び１００％特異性である。個数ベースの分析と同様に、標的捕捉配列決定を使用した個数及びサイズベースの分析における検出されたＥＢＶ ＤＮＡがより明確に区分され、これにより、レベル ｏｆウイルス関連病態のレベルを正確に同定できるカットオフ値をより容易に選択することができる。
ＶＩＩＩ．配列決定技術の例

【0190】

以下に、様々な実施形態において実施され得る様々な技術例を説明する。
Ａ．サンプル採取

【0191】

治療完了後の６～８週間でＮＰＣ患者の血液サンプルを採取した。ＮＰＣ患者は、香港の６つの腫瘍センターから、インフォームドコンセントを得た上で募集された。適格な患者は、年齢が１８歳以上で、国際がん対策連合（ＵＩＣＣ。第６版）によるステップＩＩＢ、ＩＩＩ、ＩＶＡ、又はＩＶＢの局所領域進行性ＮＰＣと組織学的に診断された患者であった。適格な患者は、一次放射線療法又は化学放射線療法の完了後に持続性の局所領域疾患又は遠隔転移の臨床的証拠を示さなかった。場合によっては、ＤＮＡは、分析された治療後血漿サンプルごとに、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄキット使用して抽出された。

【0192】

ＤＮＡライブラリー構築に関して、製造業者のプロトコルに従ってＴｒｕＳｅｑ Ｎａｎｏ ライブラリー調製キットを使用してインデックス化血漿ＤＮＡライブラリーを構築することができる。アダプターが連結されたＤＮＡは、ＴｒｕＳｅｑ Ｎａｎｏ ＰＣＲ増幅キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して８サイクルのＰＣＲで増幅された。増幅産物は、上記で示されたウイルス及びヒトゲノム領域をカバーするカスタム設計のプローブを使用したｍｙＢａｉｔｓ Ｃｕｓｔｏｍ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｐａｎｅｌ（Ａｒｂｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して捕捉された。標的捕捉後、１４サイクルのＰＣＲ増幅が実行され、産物がＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑプラットフォームを使用して配列決定された。各回の配列決定について、ユニークなサンプルバーコードを有する２４個のサンプルは、ペアエンドモードを使用して配列決定された。

【0193】

ＤＮＡライブラリーの配列決定に関して、ＮｅｘｔＳｅｑ５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、多重化ＤＮＡライブラリーを配列決定することもできる。ペアエンド配列決定プロトコルを使用し、各端末から７５ヌクレオチド配列決定した。

【0194】

配列決定データのアライメントに関して、前記ペアエンド配列決定データをペアエンドモードでのＳＯＡＰ２によって分析することができる。ペアエンドリードを、参照ヒトゲノム（ｈｇ１９）及びＥＢＶゲノム（ＡＪ５０７７９９．２）を含む参照ゲノムにアライメントした。各末端のアライメントでは、最大２ヌクレオチドのミスマッチが許容された。下流分析には、両末端とも正しい向きで同じ染色体にユニークにアライメントされた、挿入サイズが６００ｂｐ以内であるペアエンドリードのみ使用された。

【0195】

いくつかの実施形態において、配列決定データ分析を、Ｐｅｒｌ及びＲ言語で書かれたバイオインフォマティクスプログラムによって実行した。クラスカル・ワリス検定を使用して、全スクリーニングコホート及び探索と検証データセットにおける、ＮＰＣ患者、一時的に陽性のＥＢＶ ＤＮＡを有する非癌対象及び持続的に陽性のＥＢＶ ＤＮＡを有する非癌対象の間で、血漿ＥＢＶ ＤＮＡ濃度を比較した。クラスカル・ワリス検定を使用して、探索と検証データセットにおける３つの群のＥＢＶ ＤＮＡリードの割合も比較した。＜０．０５のＰ値は統計的に有意と考えられた。
Ｂ．捕捉プローブ

【0196】

腫瘍由来核酸を検出する特異性及び／又は感度は、サンプル中の腫瘍由来核酸の濃度に比例し得る。したがって、標的特異的濃縮を使用して、サンプル中の腫瘍由来核酸の濃度を増加することができる。例えば、ＥＢＶ ＤＮＡにおけるＢａｍＨＩ－Ｗ配列に相補的で結合可能な配列を有するＤＮＡプローブを使用して、サンプル中のＥＢＶ ＤＮＡ断片の標的化濃縮を行うことができる。ＤＮＡプローブも高親和性タグ（例えば、ビオチン）で標識されるため、標的結合プローブを回収することが可能である。標的結合プローブの回収後、ＥＢＶ ＤＮＡはプローブから解離・分離される。続いて、濃縮されたサンプルを本明細書に記載の方法に従って分析することができる。

【0197】

後続の配列決定分析用に血漿ＤＮＡサンプルからウイルスＤＮＡ分子を濃縮するために、ＥＢＶ捕捉プローブを用いて標的濃縮を行った。ＥＢＶゲノム全体をカバーするＥＢＶ捕捉プローブは、Ａｒｂｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ｍｙＢａｉｔｓ Ｃｕｓｔｏｍ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｐａｎｅｌ、Ａｒｂｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に注文した。２４個のサンプルからのＤＮＡライブラリーを１つの捕捉反応で多重化した。サンプルごとに等量のＤＮＡライブラリーを使用した。参照用に、ヒト常染色体領域をカバーするプローブも含めた。ＥＢＶ ＤＮＡが血漿ＤＮＡプールで少数であるため、常染色体ＤＮＡプローブに対して約１００ｘ過剰のＥＢＶプローブを各捕捉反応に使用した。捕捉反応後、捕捉されたＤＮＡライブラリーを１４サイクルのＰＣＲで再増幅した。

【0198】

いくつかの実施形態において、ＥＢＶゲノムの任意の部分に結合するように設計された捕捉プローブを使用して標的化捕捉を行うことができる。いくつかの実施形態において、捕捉プローブはビオチン化してもよく、及び磁気ビーズ（例えば、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズ）は、ライブラリー調製後に核酸標的（例えば、ＥＢＶゲノム断片）にハイブリダイズした捕捉プローブをプルダウン又は濃縮するために使用される。いくつかの実施形態において、使用された捕捉プローブのパネルは、ヒトゲノムを標的とすることもできる。例えば、捕捉プローブは、１つ又は複数の染色体（例えば、染色体１、８、及び／又は１３のいずれかのコピー）の少なくとも一部にハイブリダイズするように設定されてもよい。いくつかの実施形態において、少なくとも約１ｍｂ、少なくとも５ｍｂ、少なくとも１０ｍｂ、少なくとも２０ｍｂ、少なくとも３０ｍｂ、少なくとも４０ｍｂ、少なくとも５０ｍｂ、少なくとも６０ｍｂ、少なくとも７０ｍｂ、少なくとも８０ｍｂ、少なくとも９０ｍｂ、又は少なくとも１００ｍｂのヒトゲノムは、パネル内の捕捉プローブを使用して標的にされる。

【0199】

血漿中の無細胞ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ＤＮＡを分析するために、標的配列決定（例えば、特別に設計された捕捉プローブ、増幅プライマー）を使用することができる。例えば、捕捉プローブは、全ＨＰＶゲノム、全Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノム、全ＥＢＶゲノム及びヒトゲノムにおける複数のゲノム領域（例えば、ｃｈｒ１、ｃｈｒ２、ｃｈｒ３、ｃｈｒ５、ｃｈｒ８、ｃｈｒ１５、ｃｈｒ２２上の領域を含むが、それらに限定されない）をカバーすることができる。分析された血漿サンプルごとに、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄキットを使用して１～４ｍＬの血漿からＤＮＡを抽出した。各ケースについて、全ての抽出されたＤＮＡをＴｒｕＳｅｑ Ｎａｎｏライブラリー調製キットを使用した配列決定ライブラリーの調製に使用した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ Ｎａｎｏ ＰＣＲ増幅キットを使用して配列決定ライブラリーに８サイクルのＰＣＲ増幅を行った。上記で示されるウイルス及びヒトゲノム領域をカバーするカスタム設計のプローブを使用したｍｙＢａｉｔｓ Ｃｕｓｔｏｍ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｐａｎｅｌ（Ａｒｂｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、増幅産物を捕捉した。標的捕捉後、１４サイクルのＰＣＲ増幅を行い、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑプラットフォームを使用して産物を配列決定した。各回の配列決定について、ペアエンドモードを使用して、ユニークなサンプルバーコードを有する２４個のサンプルを配列決定した。各ＤＮＡ断片は、両末端の各々から７５ヌクレオチド配列決定される。配列決定後、配列決定されたリードは、全ヒトゲノム（ｈｇ１９）、全ＨＰＶゲノム、全ＨＢＶゲノム及び全ＥＢＶゲノムからなる人工的に組み合わせられた参照配列にマッピングされた。組み合わせゲノム配列におけるユニークな位置にマッピングされた配列決定されたリードは、下流分析に使用された。

【0200】

例えば、捕捉プローブは、全ＥＢＶゲノム、全Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノム、全ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ゲノム及び／又はヒトゲノムにおける複数のゲノム領域（例えば、ｃｈｒ１、ｃｈｒ２、ｃｈｒ３、ｃｈｒ５、ｃｈｒ８、ｃｈｒ１５及びｃｈｒ２２上の領域を含むが、それらに限定されない）をカバーするように、設定されてもよい。血漿からウイルスＤＮＡ断片を効率的に捕捉するために、目的のヒト常染色体領域より多くの、ウイルスゲノムにハイブリダイズするプローブを使用してもよい。１つの実施形態において、全ウイルスゲノムについて、サイズが約２００ｂｐの各領域をカバーする平均１００個のハイブリダイゼーションプローブ（例えば、１００Ｘタイリング捕捉プローブ）を設計した。ヒトゲノムの目的領域について、サイズが約２００ｂｐの各領域をカバーする平均２個のハイブリダイゼーションプローブ（例えば、２Ｘタイリング捕捉プローブ）を設計した。

【0201】

図２４は、本開示の実施形態に係る、対象の標的化捕捉配列決定用の捕捉プローブの設計の例を示す。図２４は、捕捉プローブに関する情報、例えば、捕捉領域のサイズ及びプローブによってカバーされるタイリングの量を提供する。捕捉プローブは、様々な長さであり得、互いに重複し得る。かかる捕捉プローブは、ｍｙＢａｉｔｓ Ｃｕｓｔｏｍ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｐａｎｅｌ（Ａｒｂｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用することができる。他の実施形態ではかかる捕捉プローブを使用しなくてもよい。

【0202】

図２４を参照し、血漿ＥＢＶ ＤＮＡの標的捕捉配列決定は、捕捉プローブの設計を変更して実施された（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２０１８；１１５：Ｅ５１１５－Ｅ５１２４）。捕捉プローブは、捕捉プローブによってカバーされる領域の総サイズが１７１キロ塩基である全ＥＢＶゲノム（ＡＪ５０７７９９．２）をカバーした。加えて、４６７キロ塩基のヒトゲノム（ｈｇ１９）も対照として捕捉した。

【0203】

列２４０１では、配列のタイプ、即ち、ヒト又はウイルス標的の常染色体を同定する。列２４０２では、特定の（例えば、染色体の又は特定のウイルスゲノムの）配列を同定する。列２４０３では、捕捉プローブがカバーする塩基対（ｂｐ）での総長さを提供する。捕捉プローブは、（例えば、常染色体について示すように）配列全体をカバーしなくてもよいが、例えば、ウイルスゲノムについて配列全体をカバーしてもよい。常染色体について、捕捉プローブは、平均５ｘのタイリングを提供する。ウイルス標的について、捕捉プローブは、平均２００ｘのタイリングを提供する。よって、ウイルスについてのプローブの数は、常染色体より高い単位長当たりの百分率／割合である。ウイルス標的についての捕捉プローブのこのようなより高いレベルの濃度は、ウイルスＤＮＡを捕捉する確率を最大化するのに寄与する。
Ｃ．様々な標的捕捉オプションを使用した結果の例

【0204】

生体サンプルをウイルスＤＮＡについて濃縮する場合、様々な標的捕捉オプションを考慮できる。例えば、ウイルスゲノムと標的常染色体領域との間の比を設計して、生体サンプルからのウイルスＤＮＡの検出を最大化することができる。捕捉プローブが、標的ＥＢＶゲノムと標的常染色体領域との間のより高い比を含むゲノム領域を標的とするように設計される場合、標的濃縮技術を通じて生体サンプルから血漿ＥＢＶ ＤＮＡの増加量を検出できる。よって、異なる標的捕捉オプションを使用して濃縮技術を最適化すると、治療後サンプルにおける疾患の再発のより正確な診断が容易になる。

【0205】

血漿サンプルからのＤＮＡは、次世代配列決定（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑプラットフォーム）を使用した分子分析に供される。異なるアプローチは、分析の目的ＤＮＡ分子、例えば、ＥＢＶ ＤＮＡ分子の標的濃縮に使用できる。上述した通り、捕捉プローブは、サンプル中のＤＮＡ分子の標的濃縮に使用できる。追加的に又は代替的に、アンプリコン配列決定（Ｘｕ ｅｔ ａｌ． ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２０１７；１８：５． ｄｏｉ： １０．１１８６／ｓ１２８６４－０１６－３４２５－４）及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９濃縮（Ｈａｆｆｏｒｄ－Ｔｅａｒ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１９；２１：２０９２－２１０２）を使用して、ウイルスゲノムと標的常染色体領域との間の比を設計することができる。

【0206】

標的捕捉配列決定において、捕捉プローブは、ウイルスゲノム（例えば、ＥＢＶゲノム）全体をカバーするように設計される。ヒトゲノムにおける所定のゲノム領域を標的にするために捕捉プローブを含めることもできる。標的ＥＢＶゲノムと標的常染色体領域のサイズの比は、ＥＢＶ ＤＮＡ分子の濃縮の程度を左右するように設計してもよい。例示的な例として、標的捕捉配列決定からの血漿ＥＢＶ ＤＮＡの割合は、異なる捕捉プローブ設計（標的常染色体領域に対するＥＢＶの高い比及び低い比）を使用して特定された。加えて、これらの設計は、いかなる標的捕捉も使用することなく特定された血漿ＥＢＶ ＤＮＡの割合と比較された。３タイプの分析にわたって、定量ＰＣＲによって測定されたＥＢＶ ＤＮＡと同等の濃度を有する血漿サンプルが使用された。

【0207】

以下に、様々な捕捉プローブ設計間の比較分析の例示的な例を示す。「高い」ウイルス対ヒト領域サイズ比を有する捕捉プローブに関しては、ＥＢＶ対標的常染色体領域比が０．３７（１７２ｋｂ：４６７ｋｂ）の捕捉プローブ設計（即ち、表１に記載の設計）による標的捕捉配列決定を使用して、４つのＮＰＣ血漿サンプルからのＥＢＶ ＤＮＡの割合を特定した。「低い」ウイルス高いヒト領域サイズ比を有する捕捉プローブに関しては、ＥＢＶ対標的常染色体領域比が０．０００２（１７２ｋｂ：７０Ｍｂ）の捕捉プローブ設計による標的捕捉配列決定を使用して、別の１組の４ＮＰＣサンプルからのＥＢＶ ＤＮＡの割合を特定した。上記の分析のためのＮＰＣサンプルは定量ＰＣＲによって測定されたものと同等の血漿ＥＢＶ ＤＮＡ濃度を有した。比較データについて、サンプルからのＥＢＶ ＤＮＡの割合も、捕捉無しの配列決定を使用して特定された。

【0208】

図２５は、標的捕捉無しの配列決定２５０５、ＥＢＶ対標的常染色体領域比が低いプローブ設計を使用した標的捕捉配列決定２５１０、及びＥＢＶ対標的常染色体領域比が高い設計を使用した標的捕捉配列決定２５１５、によって分析されたＮＰＣサンプルの配列決定による血漿ＥＢＶ ＤＮＡ分画濃度を同定する１組の棒プロット２５００を示す。

【0209】

棒プロット２５１０及び２５１５に示すように、配列決定されたリードの総数に対する血漿ＥＢＶ ＤＮＡリードの割合は、標的捕捉配列決定を使用する場合に大幅に高くなった（事後ダン検定、ｐ＝０．００５）。よって、標的捕捉配列決定によるＥＢＶ ＤＮＡ分子の濃縮は、（例えば）治療後サンプルからウイルスＤＮＡを検出するために効果的に使用できる。対照的に、棒プロット２５０５に示すように、標的捕捉無しの配列決定では、得られる血漿ＥＢＶ ＤＮＡリードの数が少ない可能性があり、後続の下流分析（例えば、疾患の再発の予測）を妨げる可能性がある。例えば、サンプルＴＢＲ２８９２において、標的捕捉無しの配列決定は、後続の下流分析（例えば、セクションＶに記載の組み合わせ分析）にとって正確度が低いかもしれない。これは、標的捕捉無しの配列決定を使用すると、８０～１１０ｂｐのサイズ範囲内で（合計５６個のＥＢＶ ＤＮＡリードのうち）いかなるＥＢＶ ＤＮＡリードも検出できないためである。

【0210】

加えて、図２５に示すように、ＥＢＶ対標的常染色体領域比が低い捕捉プローブ設計２５１０を使用して測定された配列決定されたリードの総数に対する血漿ＥＢＶ ＤＮＡリードの割合は、ＥＢＶ対標的常染色体領域比が高い捕捉プローブ設計２５１５を使用して測定されたものより大幅に低かった。
ＩＸ．疾患－再発予測に基づく治療
Ａ．治療選択

【0211】

本開示の実施形態では、疾患の再発を正確に予測でき、それによって、対象の疾患転帰及び全生存率を改善するための早期介入及び適切な治療の選択が容易になる。例えば、対応するサンプルが疾患の再発を予測可能な事象において、対象に強化化学療法を選択することができる。別の例では、初期治療を完了した対象の生体サンプルを配列決定して、疾患の再発を予測可能なウイルスＤＮＡを同定することができる。かかる例において、対象の癌が初期治療に抵抗性を示している可能性があるため、対象に代替治療レジメン（例えば、より高用量）及び／又は異なる治療を選択することができる。

【0212】

実施形態は、病態の再発の分類の特定に応じて対象を治療することをも含み得る。例えば、予測が局所領域不全に対応する場合、手術を可能な治療として選択できる。別の例では、予測が遠隔転移に対応する場合、化学療法を可能な治療として追加的に選択できる。いくつかの実施形態において、治療は、手術、放射線療法、化学療法、免疫療法、標的療法、ホルモン療法、幹細胞移植、又は精密医療を含む。特定された再発の分類に基づき、対象への危害リスクを低減し全生存率を増加する治療計画を立てることができる。実施形態は、治療計画に従って対象を治療することを更に含み得る。
Ｂ．治療のタイプ

【0213】

実施形態は、対象について分類を特定した後に患者の病態を治療することを更に含み得る。治療は、病態の特定されたレベル、臨床上関連するＤＮＡの分画濃度、又は起源の組織に応じて提供できる。例えば、同定された変異は、特定の薬物又は化学療法の標的となり得る。起源の組織は、手術又は任意の他の形式の治療をガイドするために使用できる。そして、病態のレベルは、あらゆる治療の攻撃性を決定するために使用でき、治療の攻撃性は病態の該レベルに基づいて決定してもよい。病態（例えば、癌）は、化学療法、薬物、食事、療法、及び／又は手術によって治療され得る。いくつかの実施形態において、パラメーター（例えば、量又はサイズ）の値が参照値を超えるほど、治療の攻撃性が高くなり得る。

【0214】

治療は切除を含み得る。膀胱癌について、治療は、経尿道的膀胱腫瘍切除術（ＴＵＲＢＴ）を含み得る。この手順は、診断、病期分類及び治療に使用される。ＴＵＲＢＴ中、外科医は膀胱鏡を尿道から膀胱に挿入する。そして、腫瘍は、小さなワイヤーループ、レーザー、又は高エネルギー電気を備えるツールを使用して除去される。筋層非浸潤性膀胱癌（ＮＭＩＢＣ）を有する患者について、ＴＵＲＢＴは、該癌の治療又は除去に使用され得る。別の治療は、根治的膀胱切除術及びリンパ節郭清を含み得る。根治的膀胱切除術は、膀胱全体及び可能な周囲組織と臓器の切除である。治療は尿路変更術も含み得る。尿路変更術は、治療の一環として膀胱を切除する際に、医師が尿の体外に排出される新しい経路を作る場合のことである。

【0215】

治療は、通常、癌細胞の成長及び分裂を防ぐことで癌細胞を破壊する薬物の使用である化学療法を含み得る。薬物は、例えば、マイトマイシン－Ｃ（ジェネリック医薬品として入手可能）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）、及び膀胱内化学療法用のチオテパ（Ｔｅｐａｄｉｎａ）に関わり得るが、それらに限定されない。全身化学療法は、例えば、シスプラチンゲムシタビン、メトトレキサート（Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ、Ｔｒｅｘａｌｌ）、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ）、ドキソルビシン、及びシスプラチンに関わり得るが、それらに限定されない。

【0216】

いくつかの実施形態において、治療は、免疫療法を含み得る。免疫療法は、ＰＤ－１と呼ばれるタンパク質を遮断する免疫チェックポイント阻害剤を含み得る。阻害剤は、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ）、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ）、デュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ）、及びペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）を含み得るが、それらに限定されない。

【0217】

治療の実施形態は、標的療法も含み得る。標的療法は、癌の成長及び生存に寄与する癌の特定の遺伝子及び／又はタンパク質を標的とする治療である。例えば、エルダフィチニブは、癌細胞が成長又は浸潤し続けているＦＧＦＲ３又はＦＧＦＲ２遺伝子変異を伴う局所進行性又は転移性尿路上皮癌を有する者の治療用に承認された経口投与薬物である。

【0218】

いくつかの治療は放射線療法を含み得る。放射線療法は、高エネルギーｘ線又は他の粒子を使用して癌細胞を破壊することである。各個別治療に加えて、本明細書に記載のこれらの治療の組み合わせが使用され得る。いくつかの実施形態において、パラメーターの値が閾値を超え、該閾値自体が参照値を超える場合、治療の組み合わせが使用され得る。参照文献における治療に関する情報は、参照によって本明細書に組み込まれる。
Ｘ．システムの例

【0219】

図２６は、本開示の実施形態に係る測定システム２６００を示す。図示のように、システムは、アッセイ装置２６１０内の無細胞ＤＮＡ分子等のサンプル２６０５を含み、ここでアッセイ２６０８はサンプル２６０５に対して行うことができる。例えば、サンプル２６０５をアッセイ２６０８の試薬と接触させて、物理的特性２６１５の信号を提供することができる。アッセイ装置の例としては、アッセイのプローブ及び／若しくはプライマー又は液滴が（アッセイを含む液滴と共に）移動するチューブを含むフローセルであり得る。物理的特性２６１５（例えば、蛍光強度、電圧、又は電流）は、検出器２６２０によってサンプルから検出される。検出器２６２０は、一定の間隔（例えば、周期的な間隔）で測定を行って、データ信号を構成するデータ点を取得することができる。１つの実施形態において、アナログデジタル変換器は、検出器からのアナログ信号をデジタル形態へと複数回変換する。アッセイ装置２６１０及び検出器２６２０は、アッセイシステム、例えば、本明細書に記載の実施形態に従って配列決定を行う配列決定システムを形成することができる。データ信号２６２５は検出器２６２０から論理システム２６３０に送信される。例として、データ信号２６２５を使用して、ＤＮＡ分子の参照ゲノムにおける配列及び／又は位置を特定することができる。データ信号２６２５は、同時に生成された様々な測定値、例えば、蛍光色素の異なる色又はサンプル２６０５の異なる分子への異なる電気信号を含み得るため、データ信号２６２５は、複数の信号に対応し得る。データ信号２６２５は、ローカルメモリ２６３５、外部メモリ２６４０、又は記憶装置２６４５に記憶され得る。

【0220】

論理システム２６３０は、コンピュータシステム、ＡＳＩＣ、マイクロプロセッサ、グラフィックスプロセッシングユニット（ＧＰＵ）等であってもよいし、それらを含んでもよい。それはディスプレイ（例えば、モニタ、ＬＥＤディスプレイ等）及びユーザ入力装置（例えば、マウス、キーボード、ボタン等）を含んでもよいし、それらに結合されてもよい。論理システム２６３０及び他の部品は、スタンドアローン又はネットワーク接続されたコンピュータシステムの一部であってもよいし、検出器２６２０及び／又はアッセイ装置２６１０を含む装置（例えば、配列決定装置）に直接取り付けられても組み込まれてもよい。論理システム２６３０は、プロセッサ２６５０において実行されるソフトウェアも含み得る。論理システム２６３０は、本明細書に記載の方法のいずれかを実行するように測定システム２６００を制御するための命令を記憶するコンピュータ可読媒体を含み得る。例えば、論理システム２６３０は、配列決定又は他の物理的操作が実行されるように、アッセイ装置２６１０を含むシステムにコマンドを提供することができる。かかる物理的操作は、例えば、試薬を特定の順序で添加及び除去するように、特定の順序で実行できる。かかる物理的操作は、サンプルを取得してアッセイを行うために使用され得るように、例えば、ロボットアームを含むロボットシステムによって実行され得る。

【0221】

システム２６００は、対象に治療を提供できる治療装置２６６０も含み得る。治療装置２６６０は、治療を決定でき及び／又は治療を実施するために使用できる。かかる治療の例としては、手術、放射線療法、化学療法、免疫療法、標的療法、ホルモン療法、及び幹細胞移植を含み得る。論理システム２６３０は、例えば、本明細書に記載の方法の結果を提供するために、治療装置２６６０に接続され得る。治療装置は、（例えば、ロボットシステムを制御するように、治療を制御するために）他の装置からの入力、例えばイメージング装置及びユーザ入力を受信し得る。

【0222】

本明細書で言及したコンピュータシステムのいずれも、任意の好適な数のサブシステムを利用し得る。かかるサブシステムの例は、図２７においてコンピュータ装置１０で示される。いくつかの実施形態において、コンピュータシステムは、単一のコンピュータ装置を含み、ここでサブシステムは該コンピュータ装置の部品であり得る。他の実施形態において、コンピュータシステムは、それぞれがサブシステムであり内部部品を備える、複数のコンピュータ装置を含み得る。コンピュータシステムは、デスクトップ及びラップトップコンピュータ、タブレット、携帯電話及び他のモバイル装置を含み得る。

【0223】

図２７に示すサブシステムは、システムバス７５を介して相互接続される。プリンター７４、キーボード７８、記憶装置（複数可）７９、ディスプレイアダプター８２に結合されるモニタ７６等の追加のサブシステムが示される。Ｉ／Ｏコントローラー７１に結合する周辺機器及び入力／出力（Ｉ／Ｏ）装置は、入力／出力（Ｉ／Ｏ）ポート７７（例えば、ＵＳＢ、ＦｉｒｅＷｉｒｅ（登録商標））等の当分野で既知の任意の数の接続手段によって、コンピュータシステムに接続することができる。例えば、Ｉ／Ｏポート７７又は外部インターフェース８１（例えば、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）、Ｗｉ－Ｆｉ等）を使用して、コンピュータシステム１０をＩｎｔｅｒｎｅｔ等の広域ネットワーク、マウス入力装置、又はスキャナーに接続することができる。システムバス７５を介した相互接続により、中央プロセッサ７３が各サブシステムと通信し、システムメモリ７２又は記憶装置（複数可）７９（例えば、ハードドライブ等の固定ディスク、又は光ディスク）からの複数の命令の実行、及びサブシステム間の情報交換を制御することが可能になる。システムメモリ７２及び／又は記憶装置（複数可）７９は、コンピュータ可読媒体を具現化し得る。別のサブシステムは、カメラ、マイクロフォン、加速度計等のデータ収集装置８５である。本明細書で言及したデータのいずれも、１つの部品から別の部品へ出力でき、ユーザへ出力できる。

【0224】

コンピュータシステムは、例えば、外部インターフェース８１又は内部インターフェースによって一緒に接続された、複数の同じ部品又はサブシステムを含み得る。いくつかの実施形態において、コンピュータシステム、サブシステム、又は装置は、ネットワーク上で通信することができる。かかる例において、１つのコンピュータをクライアント、別のコンピュータをサーバと見なすことができ、ここで疎の各々は、同じコンピュータシステムの一部であり得る。クライアント及びサーバはそれぞれ複数のシステム、サブシステム、又は部品を含み得る。

【0225】

実施形態の態様は、ハードウェア（例えば、特定用途向け集積回路又はフィールドプログラマブルゲートアレイ）、及び／又はモジュラー様式又は統合様式で一般にプログラム可能なプロセッサと共にコンピュータソフトウェアを使用して、制御論理の形態で実施することができる。本明細書で使用されるように、プロセッサは、同じ集積チップ上のシングルコアプロセッサ、マルチコアプロセッサ、又は単一の回路基板上の若しくはネットワーク化の、複数の処理ユニットを含む。本明細書で提供される開示及び教示に基づき、当業者は、ハードウェア及びハードウェアとソフトウェアの組み合わせを使用して、本発明の実施形態を実施するための他の方式及び／又は方法を認識・理解するであろう。

【0226】

本出願に記載のソフトウェア部品又は機能のいずれも、例えば、従来の又はオブジェクト指向の技術を使用して、任意の好適な、例えば、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ－Ｃ、Ｓｗｉｆｔのようなコンピュータ言語、又はＰｅｒｌ又はＰｙｔｈｏｎ等のスクリプト言語を使用するプロセッサによって実行されるソフトウェアコードとして、実装され得る。ソフトウェアコードは、記憶及び／又は送信のためのコンピュータ可読媒体上に一連の命令又はコマンドとして記憶され得る。好適な非一時的なコンピュータ可読媒体としては、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、ハードドライブ若しくはフロッピー（登録商標）ディスク等の磁気媒体、又はコンパクトディスク（ＣＤ）若しくはＤＶＤ（デジタル多用途ディスク）等の光学媒体、及びフラッシュメモリ等を含み得る。コンピュータ可読媒体は、かかる記憶又は送信装置の任意の組み合わせであり得る。

【0227】

かかるプログラムは、符号化され、Ｉｎｔｅｒｎｅｔを含む様々なプロトコルに従う有線ネットワーク、光ネットワーク、及び／又は無線ネットワークを介した送信に適合したキャリア信号を使用して送信されてもよい。したがって、コンピュータ可読媒体は、かかるプログラムで符号化されたデータ信号を使用して作製され得る。プログラムコードで符号化されたコンピュータ可読媒体は、互換性装置でパッケージ化されてもよいし、（例えば、Ｉｎｔｅｒｎｅｔダウンロードを介して）他の装置とは別個に提供されてもよい。任意のかかるコンピュータ可読媒体は、単一のコンピュータ製品（例えば、ハードドライブ、ＣＤ、又はコンピュータシステム全体）上又はその内部に存在してもよく、システム又はネットワークにおける異なるコンピュータ製品上又はその内部に存在してもよい。コンピュータシステムは、本明細書で言及した結果のいずれかをユーザへ提供するためのモニタ、プリンター、又は他の好適なディスプレイを含み得る。

【0228】

本明細書で使用されるセクションの見出しは、構成のみを目的とするものであり、記載された発明主題を限定するものと解釈すべきではない。

【0229】

本明細書に記載の方法は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル、対象、及び配列決定技術に限定されるものではなく、当然変動し得ることが理解される。また、本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のものであり、本明細書に記載の方法及び組成物を限定することを意図するものではなく、それらは添付の特許請求の範囲のみに限定されることも理解される。本開示のいくつかの実施形態は本明細書で図示及び説明したが、かかる実施形態は単なる例として提供されることは当業者にとって自明であろう。当業者であれば、本開示から逸脱することなく、多数の変形、変化、及び置換は可能であろう。本明細書に記載の本開示の実施形態に対する様々な代替案は、本開示を実施する際に採用され得ることを理解すべきである。以下の請求項は、本開示の範囲を規定し、これらの請求項の範囲内の方法及び構造並びにそれらの均等物はそれによって包含されることが意図される。

【0230】

いくつかの態様は、図示のために応用例を参照しながら説明される。特に断らない限り、いかなる実施形態もいかなる他の実施形態と組み合わせることができる。多数の具体的な詳細、関係、及び方法は本明細書に記載の特徴の完全な理解を提供するために記載されることを理解すべきである。しかし、当業者であれば、本明細書に記載の特徴は、具体的な詳細の１つ又は複数無しで、又は他の方法を用いて、実施できることを容易に認識するであろう。本明細書に記載の特徴は、一部の行動が異なる順序で及び／又は他の行動若しくは事象と同時に発生する可能性があるため、図示された行動若しくは事象の順序によって限定されない。更に、本明細書に記載の特徴に応じて方法論を実施するためには、図示された行動若しくは事象の全てが必要なわけではない。

【0231】

本発明のいくつかの実施形態は本明細書で図示し説明したが、かかる実施形態は単なる例として提供されることは当業者にとって自明であろう。本発明は明細書内で提供される特定の実施例に限定されることは意図されない。本発明は前述の明細書を参照しながら説明したが、本明細書の実施形態の説明及び図示は、限定的な意味で解釈されることを意図するものではない。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多数の変形、変化、及び置換は可能であろう。

【0232】

更に、本発明の全ての態様は、様々な条件及び変数に依存する本明細書に記載の特定の描写、構成又は相対割合に限定されないことを理解すべきである。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替案は、本発明を実施する際に採用され得ることを理解すべきである。したがって、本発明は、任意のかかる代替案、修飾、変形又は均等物も包含するものと考えられる。以下の請求項は本発明の範囲を規定し、これらの請求項の範囲内の方法及び構造並びにそれらの均等物はそれによって包含されることが意図される。

【0233】

本明細書に記載の方法のいずれも、ステップを実行するように構成され得る１つ又は複数のプロセッサを含むコンピュータシステムによって全部又は部分的に実行され得る。プロセッサで実行される任意の操作（例えば、アライメント、決定、比較、演算、計算）は、リアルタイムで実行され得る。「リアルタイム」という用語は、特定の時間制約内で完了される演算操作又はプロセスを指し得る。時間制約は、１分間、１時間、１日間、又は７日間であり得る。よって、実施形態は、本明細書に記載の方法のいずれかのステップを実行するように構成された、個別のステップ又は個別のステップの群を実行する異なる部品を備える可能性のあるコンピュータシステムに関し得る。番号付けのステップとして示されたが、本明細書の方法のステップは、同じ時間又は異なる時間又は異なる順序で実行することができる。加えて、これらのステップの一部は、他の方法からの他のステップの一部と共に使用され得る。また、ステップの全部又は一部は選択的である場合もある。加えて、方法のいずれかのステップのいずれも、これらのステップを実行するためのシステムのモジュール、ユニット、回路、又は他の手段を用いて実行できる。

【0234】

本明細書に１群の置換が開示される場合、それらの群の全ての個々のメンバー、及び該置換を使用して形成できる全てのサブグループ及びクラスは個別に開示されることが理解される。マルクーシュ群又は他の群化が本明細書で使用される場合、該群の全ての個々のメンバー、及び該群の可能な全ての組み合わせ及びサブコンビネーションは、本開示に個別に含まれることが意図される。本明細書で使用されるように、「及び／又は」は、「及び／又は」で区切られたリストにおける項目の１つ、全て、又は任意の組み合わせが該リストに含まれることを意味し、例えば、「１、２及び／又は３」は、「『１』、又は『２』、又は『３』、又は『１及び２』、又は『１及び３』、又は『２及び３』、又は『１、２及び３』」に相当する。

【0235】

例えば、温度範囲、時間範囲、又は組成範囲等、明細書で範囲が与えられる場合、全ての中間範囲及び部分範囲、並びに所与の範囲に含まれる全ての個々の値は本開示に含まれることが意図される。

【0236】

本明細書で使用されるように、「本質的に…からなる」は、請求項の基本的又は新規な特徴に実質的に影響しない材料又はステップを排除するものではない。

【0237】

特許請求の範囲は、あらゆる選択的な要素を排除するように作成される場合がある。したがって、この記述は、請求項の要素の記載に関連して「単独で」、「のみ」等の排他的な用語を使用したり、「否定的」な限定を使用したりするための先行根拠として機能することが意図される。

【0238】

本明細書で言及した全ての特許、特許出願、刊行物、及び説明は、あらゆる目的で参照によって全体として組み込まれる。いずれも先行技術とは認められない。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【国際調査報告】