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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-10
(54)【発明の名称】試料分離用磁性ナノ粒子
(51)【国際特許分類】
H01F 1/44 20060101AFI20241003BHJP
C12N 15/10 20060101ALI20241003BHJP
C01G 49/08 20060101ALI20241003BHJP
C12N 9/50 20060101ALN20241003BHJP
【ＦＩ】
H01F1/44 150
C12N15/10 114Z
C01G49/08 A
C12N9/50
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024516478
(86)(22)【出願日】2022-09-30
(85)【翻訳文提出日】2024-05-09
(86)【国際出願番号】 US2022077402
(87)【国際公開番号】W WO2023056457
(87)【国際公開日】2023-04-06
(31)【優先権主張番号】PCT/US2021/052974
(32)【優先日】2021-09-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】399117121
【氏名又は名称】アジレント・テクノロジーズ・インク
【氏名又は名称原語表記】ＡＧＩＬＥＮＴ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】110002310
【氏名又は名称】弁理士法人あい特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ブラマン，ジェフリー，カール
(72)【発明者】
【氏名】ノヴォラドフスカヤ，ナタリア
(72)【発明者】
【氏名】ロン，デイヴィッド
(72)【発明者】
【氏名】リヒター，ブルース
(72)【発明者】
【氏名】ルーカス，デリック
【テーマコード（参考）】
4G002
5E041
【Ｆターム（参考）】
4G002AA04
4G002AB02
4G002AE02
5E041AB11
5E041BC01
5E041BD07
5E041BD12
5E041CA01
5E041HB14
5E041HB17
5E041NN05
5E041NN06
(57)【要約】
【課題】診断および研究用途のために、様々な試料形態から精製核酸を簡単かつ確実に製造するための磁性ナノ粒子および組成物ならびにそれらの製造方法を提供する。
【解決手段】分散を保つ能力が高いシリカ被覆磁性ナノ粒子、ならびに、新たに製造された粒子の水性分散剤を室温でシリカ被覆磁性ナノ粒子のクラスターが生成する時間インキュベートすることを含むシリカ被覆磁性ナノ粒子の製造方法。得られたクラスターは、ヒト臨床試料からのウイルスＲＮＡの抽出に最適のサイズである。磁性ナノ粒子はコアとコーティングとを含み、コアはＦｅ３Ｏ４または他の磁性材料を含み、コーティングは厚さ約１．５ｎｍ～約２ｎｍを有する。磁性ナノ粒子は、核酸を他の成分から分離することと、核酸濃度を正規化することと、による、分析用の核酸の調製に有用である。
【選択図】図１Ａ
【解決手段】分散を保つ能力が高いシリカ被覆磁性ナノ粒子、ならびに、新たに製造された粒子の水性分散剤を室温でシリカ被覆磁性ナノ粒子のクラスターが生成する時間インキュベートすることを含むシリカ被覆磁性ナノ粒子の製造方法。得られたクラスターは、ヒト臨床試料からのウイルスＲＮＡの抽出に最適のサイズである。磁性ナノ粒子はコアとコーティングとを含み、コアはＦｅ３Ｏ４または他の磁性材料を含み、コーティングは厚さ約１．５ｎｍ～約２ｎｍを有する。磁性ナノ粒子は、核酸を他の成分から分離することと、核酸濃度を正規化することと、による、分析用の核酸の調製に有用である。
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
液体媒体中に磁性ナノ粒子を含む組成物であって、前記磁性ナノ粒子が、それぞれ磁性コアと前記コア上のコーティングとを含み、前記コーティングが厚さ約１ｎｍ～約２ｎｍを有し、前記組成物中の磁性ナノ粒子が約１１０ｍ２／ｇ～約１３０ｍ２／ｇのＢｒｕｎａｕｅｒ－Ｅｍｍｅｔｔ－Ｔｅｌｌｅｒ（ＢＥＴ）表面積を有し、前記組成物が個々の磁性ナノ粒子のクラスターを含み、前記クラスターが約２５０ｎｍ～約３５０ｎｍの平均クラスターサイズを有する、組成物。
【請求項2】
前記コーティングが約１．５ｎｍ～約２．０ｎｍの厚さを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記磁性ナノ粒子が約１１３ｍ２／ｇ～約１２７ｍ２／ｇのＢＥＴ表面積を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
個々の前記磁性ナノ粒子が約１５ｎｍ以下の平均総直径を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項5】
個々の前記磁性ナノ粒子が約１０～約１５ｎｍの平均総直径を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項6】
前記磁性ナノ粒子の前記コアが約１０ｎｍ以下の平均直径を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項7】
前記コアが、常磁性を示すＦｅ３Ｏ４の単一ドメイン磁性ナノ粒子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項8】
前記コアがマグネタイトのナノスケール単一結晶である、請求項１に記載の組成物。
【請求項9】
前記コアがＦｅ２Ｏ３を実質的に含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項10】
前記コーティングがシリカを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項11】
前記コーティングが、分析物に結合する結合部位をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項12】
前記分析物が核酸である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項13】
前記液体媒体が水である、請求項１に記載の組成物。
【請求項14】
前記組成物が安定な水性分散剤である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項15】
前記組成物が、前記水に分散された前記磁性ナノ粒子のクラスターを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項16】
前記クラスターが約３００ｎｍの平均クラスターサイズを有する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項17】
前記組成物が前記磁性ナノ粒子の安定な懸濁液であり、前記磁性ナノ粒子が約３～約３０ｇ／Ｌの濃度で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項18】
前記磁性ナノ粒子が、約２５℃の温度で短くとも６ヶ月懸濁したままである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項19】
密封パッケージ中にパッケージされた磁性ナノ粒子の安定な懸濁液であって、前記磁性ナノ粒子がコアと前記コア上のコーティングとを含み、前記コーティングが厚さ約１ｎｍ～約２ｎｍを有し、
前記密封パッケージの内容積が酸素を実質的に含まない、懸濁液。
【請求項20】
シリカ被覆磁性ナノ粒子を製造する方法であって、脱イオン脱酸素水中のＦｅ３＋／Ｆｅ２＋モル比が約２／１のＦｅ３＋およびＦｅ２＋イオンの水溶液を調製することと、
前記水溶液を超音波処理することと、
前記水溶液からＦｅ３Ｏ４を沈殿させ、それによってＦｅ３Ｏ４ナノ粒子を含む混合物を作成する、沈殿させることと、
前記混合物に脱酸素アルコールおよびケイ酸塩を加えることと、
前記Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子上にシリカコーティングを形成することと、
前記混合物から前記シリカ被覆Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を分離することと、
を含む、方法。
【請求項21】
前記水溶液中のＦｅ３＋の前記濃度が２～５０ｍＭであり、前記水溶液中のＦｅ２＋の前記濃度が１～２５ｍＭである、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記水溶液が、ＦｅＣｌ３とＦｅＣｌ２とを脱イオン脱酸素水に溶解することによって調製される、請求項２０に記載の方法。
【請求項23】
不活性雰囲気下で前記水溶液に塩基を添加することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項24】
前記塩基がアンモニアであり、前記塩基が２倍以上のモル過剰で添加される、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記混合物を撹拌することなく不活性雰囲気下で沈降時間維持し、その間に前記Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子が前記混合物から沈降する、維持することと、前記沈降時間の後、前記混合物から大部分の水を除去し、それによってＦｅ３Ｏ４ナノ粒子の前記混合物を濃縮する、除去することと、
をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項26】
前記不活性雰囲気下でコーティング時間撹拌することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項27】
前記沈降時間および／または前記コーティング時間が約８時間～約２４時間である、請求項２０に記載の方法。
【請求項28】
無水ケイ酸塩溶液を添加する前に、前記混合物に追加の塩基を添加することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項29】
前記混合物を撹拌し、超音波処理しながら、前記混合物に前記ケイ酸塩を滴下添加する、請求項２０に記載の方法。
【請求項30】
前記Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を前記混合物から磁気捕捉によって分離し、前記方法が、メタノールで前記シリカ被覆Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を洗浄することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項31】
前記分離されたシリカ被覆Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を真空乾燥させ、それによって前記シリカ被覆Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子の粉末を形成する、真空乾燥させることをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項32】
不活性雰囲気下でパッケージに密封する前に、前記粉末を脱酸素水に分散させ、不活性ガスでスパージングし、超音波処理することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
約２５０ｎｍ～約３５０ｎｍの平均クラスターサイズを有する個々の磁性ナノ粒子のクラスターを形成するために、シリカ被覆Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子をクラスタリング時間の間維持することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項34】
前記クラスタリング時間の間、２０℃～３０℃の温度に前記シリカ被覆Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を維持する、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記クラスタリング時間が短くとも一ヶ月である、請求項３３に記載の方法。
【請求項36】
分析用の核酸を調製するための方法であって、核酸を含む試料と、結合媒体および磁性ナノ粒子組成物とを容器内で混合するステップであって、
前記磁気粒子組成物が、コアと前記コア上のコーティングとを含む複数の磁性ナノ粒子を含み、前記コーティングが約１．５ｎｍ～約２ｎｍの厚さを有し、
前記核酸が前記磁性ナノ粒子の前記コーティングに結合する、混合するステップと、
結合時間の後、磁石を用いて前記核酸結合磁性ナノ粒子を前記容器内の液体から分離するステップと、
前記容器から前記液体を除去し前記核酸結合磁性ナノ粒子を前記容器内に保持するステップと、
前記ナノ粒子が前記容器内の前記磁石に引き付けられたままである間に、前記ナノ粒子を洗浄して不純物を除去するステップと、
前記洗浄媒体を除去するステップと、
前記核酸結合磁性ナノ粒子と溶出媒体とを接触させ、それによって前記磁性ナノ粒子から前記結合核酸を分離する、接触させるステップと、
磁石を用いて前記容器内の核酸含有液から前記磁性ナノ粒子を分離するステップと、
前記容器から前記核酸を除去し、それによって核酸調製物を得る、除去するステップと、
を含む、方法。
【請求項37】
前記試料が前記核酸の入力量を含み、前記磁性ナノ粒子組成物が、核酸の出力量に対する結合能を有し、前記出力量が前記入力量よりも少ない、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
少なくとも８０ｖ／ｖ％のアルコールを含む洗浄媒体で前記核酸結合磁性ナノ粒子を洗浄することをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項39】
前記磁性ナノ粒子の前記コーティングが、前記核酸に結合するように構成されている結合部位を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項40】
前記磁性ナノ粒子組成物が正規化係数０．８～１．２を有し、前記正規化係数が、第１試料からの第１出力量と第２試料からの第２出力量との比であり、前記第１試料が、請求項３６に記載の方法、
【請求項41】
前記出力量が、前記磁性ナノ粒子組成物の所定の出力量の１０％以内である、請求項３６に記載の方法。
【請求項42】
前記核酸調製物が、所定の長さの範囲内の長さを有する核酸を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項43】
前記入力試料が２００ｎｇ未満の核酸を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項44】
前記入力試料が５０ｎｇ未満の核酸を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項45】
前記方法の前記ステップが自動化装置によって行われる、請求項３６に記載の方法。
【請求項46】
生体試料から核酸を取得し分析用の核酸を調製する方法であって、核酸を含む生体試料を容器に入れて試料混合物を作成し、前記生体試料は細胞またはウイルスである、容器に入れることと、
前記容器に前記試料混合物に応じた磁性ナノ粒子組成物を添加し、前記磁性粒子組成物がコアと前記コア上のコーティングとを含む複数の磁性ナノ粒子を含み、前記コーティングが厚さ約１．５ｎｍ～約２ｎｍを有する、添加することと、
前記試料混合物と前記磁性ナノ粒子とを混合し、インキュベーション時間インキュベートすることと、
前記試料混合物から前記磁性ナノ粒子を分離することと、
前記容器に溶出媒体を添加し前記磁性ナノ粒子と前記溶出媒体とを混合することと、
核酸を前記磁性ナノ粒子から溶出して溶出液を作成する溶出時間の後、前記容器から前記溶出液を除去することと、
を含む、方法。
【請求項47】
前記生体試料と、グアニジンチオシアネート（ＧＴＣ）およびプロテイナーゼＫとを接触させて前記試料混合物を作成することと、試料調製時間の間、前記試料混合物を高温でインキュベートすることと、
前記容器内の前記試料混合物にニートアルコールを添加することことと、
をさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
磁力を加えて前記容器内の上清から前記磁性ナノ粒子を分離することと、分離している前記磁性ナノ粒子を乱すことなく前記容器から前記上清を除去することと、
分離された前記磁性ナノ粒子をアルコール溶液で１回または複数回洗浄することと、
によって前記磁性ナノ粒子が前記試料混合物から分離される、請求項４６に記載の方法。
【請求項49】
前記溶出時間が１０分未満である、請求項４６に記載の方法。
【請求項50】
除去された前記溶出液を第２容器に入れることと、前記第２容器を密封することと、
前記第２容器を低温で保存することと、
をさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項51】
前記試料調製時間および／または前記インキュベーション時間が約１０分以下である、請求項４６に記載の方法。
【請求項52】
前記アルコール溶液が約８０ｖ／ｖ％以上のアルコールを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項53】
前記核酸がＲＮＡである、請求項４６に記載の方法。
【請求項54】
前記核酸がＤＮＡである、請求項４６に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許商標庁を受理官庁として２０２１年９月３０日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０５２９７４号に基づく優先権を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、米国特許商標庁を受理官庁として２０２１年９月３０日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０５２９７４号に基づく優先権を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、シリカ被覆磁性ナノ粒子、このような磁性ナノ粒子を含む組成物、ならびにこのような磁性ナノ粒子と組成物とを用いて生体試料から分析物を分離する技術に関する。
【背景技術】
【0003】
分析および処理のために生体試料から分子を分離する際に、様々な表面修飾を有する磁性粒子が用いられる。磁性粒子に所望の分子を結合させ、分子が結合した粒子を外部磁場を加えて試料の残りの部分から捕捉し、粒子を洗浄して不純物を除去し、最終的に水または低イオン強度緩衝液を用いて所望の分子を回収することによって、分析する分子が試料中の他の成分から分離される。
【0004】
生体分子の分離に用いる磁性粒子は、通常、そのコアに磁性酸化鉄を有する。磁性酸化鉄粒子は、一般にマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）、マグヘマイト（γ－Ｆｅ２Ｏ３）またはヘマタイト（Ｆｅ２Ｏ３）として存在する。磁性粒子は、たとえばシリカで被覆することができ、数十～数百ナノメートルから数ミクロンまでの幅広い粒径分布が想定される。シリカ被覆磁性粒子を作製するための合成方法の多くは、結果として境界不明瞭な（不均一な）シリカ表面を有する材料となる、および／または懸濁液から沈殿して処理の困難な大きな凝集体を生成する。そのため、生体分子を最大限に結合させ、高純度の材料を回収するために、プロトコルの前および最中に粒子を混合する必要がある。
【0005】
より具体的には、生体試料から核酸を単離するためにシリカ被覆磁性粒子を用いることができる。シリカを用いた試料からの核酸の捕捉の最初の例は、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎによって提示された［非特許文献１］。彼は、核酸が、カオトロピック塩の存在下でシリカガラスに強固に結合することを見出した。核酸をシリカに結合させたままで結合した核酸を水性有機溶媒で洗浄して不純物を除去することができた。次いで、低イオン強度緩衝液に暴露すると、核酸はシリカから放出された。大変小さな、または最適に小さなシリカ被覆「ナノ粒子」（nanoparticles;ＮＰ）を作製するための再現可能な合成法を開発することによって、凝集およびその後の沈降という付随する問題なしに、核酸をシリカ表面に捕捉し、洗浄して不純物を除去し、低イオン強度緩衝液で溶出することができる。
【0006】
上記のナノ粒子ＮＰは、様々な核酸精製プロトコルに使用することができる。たとえば、Ｃｏｖｉｄ－１９疾患の病原体であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスからのＲＮＡの濃縮に依存する診断法を開発することができる。得られたＲＮＡは、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＲＴ－ＰＣＲ）によって検出することができる。Ｆｌｕ－Ａ、Ｆｌｕ－Ｂおよびレジオネラ菌（レジオネラ症を引き起こす）などの様々な他のウイルス性および細菌性の感染性病原体は、それぞれ、高度に精製したナノ粒子ＮＰベースの核酸が提供されれば、様々な分析ツールを用いて検出することができる。
【0007】
さらに、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）プロトコルは、ナノ粒子ＮＰを使用して各ＮＧＳライブラリーを「正規化」と呼ばれる同じ特定の標的濃度に調整することによって、合理化し、より高い試料処理量をもたらすことができる。濃度にばらつきがある複数のＮＧＳライブラリーを正規化することによって、配列決定装置にロードする前にそれらをプールすることができる。このプロセスによって、１回の配列決定操作で複数のＮＧＳライブラリーを配列決定することができ、データ収集を最大化し、配列決定装置のコストを最小限に抑えることができる。
【0008】
濃度にばらつきがあるＮＧＳライブラリーを正規化するためのいくつかの既存のアプローチがある。これらは、分光光度法、蛍光測定、定量ＰＣＲ、または電気泳動により核酸定量を行い、続いて所望の濃度を計算し、次にすべての試料を正規化された濃度に希釈することを含む。核酸正規化の他のアプローチは、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社などによって販売されているキットを含む。Ｃｏｒｎｉｎｇ社の「ＡｘｙＰｒｅｐ Ｍａｇ ＰＣＲ Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｒ」プロトコルは、１０μＬのビーズ混合物が、入力ライブラリーＤＮＡ２００ｎｇに対する結合能を有していることを述べている。このプロトコルは、「各データポイントでのばらつきを最小限に抑えるために、入力ＤＮＡは、所望のＤＮＡ量より少なくとも３～４倍多くなくてはならない。たとえば、所望の溶出ＤＮＡ濃度が２ｎｇ／μＬである場合、入力試料は少なくとも８ｎｇ／μＬでなければならない」と推奨している。配列決定プロジェクトにおいて、これらの量のライブラリーＤＮＡ、たとえばライブラリー回収容量５０μＬまたは濃度２００ｎＭからＤＮＡ４００ｎｇを実現することは非常に難しい。これは、ＮＧＳライブラリー合成に用いるＤＮＡが、特性上、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料から回収されたＤＮＡなどの質の悪いものである場合に特に当てはまる。
【0009】
Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（カリフォルニア州サンタクララ）は、現在、「ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔＸＴ Ｔａｒｇｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ」などの次世代シーケンシングライブラリーを作製するためのキットを提供している。ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔＸＴ法は、１０ｎＭから約５０ｎＭまでの非正規化ＤＮＡ量のライブラリーを作製する。これらのＤＮＡ量は、ＡｘｙＰｒｅｐ Ｍａｇ ＰＣＲ Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｒキットを使用するには少なすぎると推定される。
【0010】
研究および医療診断における核酸ベースの診断および配列決定の使用は増えているが、分析前の核酸の調製は、リアルタイムＰＣＲ、核酸配列決定およびハイブリダイゼーション試験などの核酸分析技術に関する重要なコスト要素である。試料調製は試験結果を遅らせ、十分に訓練された人材を擁する研究室の、これらのアッセイを実施する能力を制限する。現在の試料調製プロセスは、労力を要し、時間がかかり、研究室の能力を必要とする。
【0011】
診断および研究用途のために、様々な試料形態から精製核酸を簡単かつ確実に製造するための磁性ナノ粒子および組成物の必要性が残っている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0012】
【非特許文献1】Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．およびＧｉｌｌｅｓｐｉｅ，Ｄ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｌｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．アメリカ合衆国、第７６巻（２）号、６１５～６１９ページ、１９７９年
【発明の概要】
【0013】
本発明の一態様として、磁性粒子の安定な水性分散剤が提供される。個々の磁性ナノ粒子は、それぞれ、磁性コアと、コアを取り囲む均一なコンフォーマルコーティングとで構成される。均一なコンフォーマルコーティングは厚さ約１．５ｎｍ～約２ｎｍを有する。個々の均一なコンフォーマル被覆磁性ナノ粒子の平均総直径は約１０ｎｍ～約２０ｎｍである。いくつかの例では、分散剤中で平均クラスターサイズ約５０～約１９０ｎｍを有する、磁性ナノ粒子の小さなクラスターが形成される。いくつかの例では、クラスターは、分散剤中で約１０～約１０００ｎｍ、たとえば約３００ｎｍの平均クラスターサイズを有する。
【0014】
本発明の別の態様として、シリカ被覆磁性ナノ粒子の製造方法が提供される。Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子をアルコール混合物で提供し、この混合物を超音波処理しながらケイ酸塩（ｓｉｌｉｃａｔｅ）溶液を加える。磁性ナノ粒子上のシリカコーティング厚さは、加えるケイ酸塩の量を変えることによって調整してもよい。
【0015】
共沈法を用いてＦｅ３Ｏ４粒子を製造するいくつかの例では、本方法は、不必要なＦｅ２Ｏ３の形成を最小限に抑える／排除するためにＦｅ３Ｏ４共沈反応中に酸素を排除する。いくつかの例では、コーティング厚さは、（１）Ｆｅ２Ｏ３へのさらなる酸化からＦｅ３Ｏ４コアを保護し、（２）磁性コアを完全に覆い、（３）最終粒子をより核酸に結合しやすくするシラノール基（Ｓｉ－ＯＨ）を高密度に含むように、得られたコアシェル粒子の表面化学を変化させるように選択される。コーティング厚さと表面積は、生体試料から核酸を精製するための本磁性粒子の使用および効率に関する重要なパラメータであることが見出された。
【0016】
別の態様では、本明細書に記載のナノ粒子の水性分散剤を、安定で最適なサイズのクラスターの形成をもたらすクラスタリング時間の間維持する方法が提供される（「熟成（ａｇｅｄ）」ナノ粒子）。たとえば、ナノ粒子は、個々の磁性ナノ粒子が、選択された値または範囲の平均クラスターサイズ（たとえば直径）を有するクラスターを形成するように、短くとも１ヶ月、あるいは短くとも２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヵ月、７ヶ月または８ヶ月であってもよいクラスタリング時間にわたって、室温または２０℃～３０℃に維持することができる。たとえば、平均クラスターサイズは、小さくとも約２００ｎｍ、あるいは小さくとも約２２０ｎｍ、あるいは小さくとも約２３５ｎｍ、あるいは小さくとも約２５０ｎｍ、あるいは小さくとも約２６０ｎｍとすることができ、および／または、平均クラスターサイズは、大きくとも約４００ｎｍ、あるいは大きくとも約３７０ｎｍ、あるいは大きくとも約３５０ｎｍ、あるいは大きくとも約３２０ｎｍ、あるいは大きくとも約３００ｎｍ、あるいは大きくとも約２９０ｎｍとすることができる。上記の最小値と最大値のいずれかを組み合わせて約２００ｎｍ～約４００ｎｍの範囲、あるいは約２５０ｎｍ～約３５０ｎｍの範囲などの選択された範囲を形成することができることが明示的に企図されている。ヒト臨床試料中の核酸の検出の強化は、「未熟性（ｕｎａｇｅｄ）」ナノ粒子と比較して、熟成ナノ粒子を用いることによって実現される。いくつかの実施の形態では、熟成ナノ粒子は、約２５０ｎｍ、約２５５ｎｍ、約２６０ｎｍ、約２６５ｎｍ、約２７０ｎｍ、約２７５ｎｍ、約２８０ｎｍ、約２８５ｎｍ、約２９０ｎｍ、約２９５ｎｍ、約３００ｎｍ、約３０５ｎｍ、約３１０ｎｍ、約３１５ｎｍ、または約３２０ｎｍの平均クラスターサイズを有するクラスターを形成し、これらの値のいずれかを組み合わせてある範囲を形成してもよいことが企図される。上記の概略値のそれぞれは、具体的な値の開示であることも企図されており、ここに明記される。
【0017】
別の態様では、分析用の核酸を調製するための方法が提供される。方法は、核酸を含む試料と、結合媒体および本明細書に記載の磁性ナノ粒子組成物とを容器内で混合するステップと、磁性ナノ粒子のコーティングに核酸を結合させるステップと、磁場を使用することによって容器内の液体からナノ粒子を分離するステップと、容器から液体を除去し容器内に核酸結合磁性ナノ粒子を保持するステップと、磁性ナノ粒子が磁石に引き付けられたままである間か、または磁性ナノ粒子を分散させた後で磁場によって再び引き付けられたままである間に核酸結合磁性ナノ粒子と洗浄液とを接触させて不純物を除去し、続いて洗浄液を除去するステップと、最後に溶出媒体を添加して磁性ナノ粒子から放出された核酸を回収するステップとを含む。容器から核酸を除去し、それによって核酸調製物を得る。
【0018】
本発明の別の態様として、生体試料からＲＮＡを取得し、分析用にＲＮＡを調製するための方法が提供される。方法は、ＲＮＡを含む生体試料を容器に入れることを含み、生体試料は細胞またはウイルスである。生体試料と、グアニジンチオシアネート（ＧＴＣ）およびプロテイナーゼＫとを接触させて試料混合物を作成し、試料調製時間の間、この試料混合物を高温でインキュベートする。ニートアルコールおよび磁性ナノ粒子組成物（本明細書に記載の実施の形態）を容器内の試料混合物に添加する。方法は、試料混合物と磁性ナノ粒子とを混合することと、第２インキュベーション時間の間インキュベートすることと、次いで磁力を加えて容器内の上清から磁性ナノ粒子を分離することと、も含む。分離された磁性ナノ粒子を乱すことなく容器から上清を除去し、分離された磁性ナノ粒子をアルコール溶液で１回または複数回洗浄する。分離された磁性ナノ粒子を乾燥させ、溶出媒体を容器に添加し、磁性ナノ粒子と混合する。磁性ナノ粒子からＲＮＡを溶出して溶出液を作成する溶出時間の後、溶出液を容器から除去する。
【0019】
本方法および組成物のこれらおよび他の特徴および利点は、添付の特許請求の範囲とあわせて、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図4-1】図４－１は、シリカコーティングプロセスに使用したＴＥＯＳの容量（０．５ｍｌ～２．５ｍｌ）が増加するにつれてＳｉ－Ｏ対Ｆｅ－Ｏのピーク比が増加することを強調する一連のＩＲスペクトルを示す。Ｓｉ－Ｏ対Ｆｅ－Ｏのピーク比シグナルが高いほど、Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子コア上に厚いシリカシェルが形成される。
【図7】図７は、本技術によるシリカ被覆磁性ナノ粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像である。一般的なＦｅ３Ｏ４コアは７～１０ｎｍの範囲である。１．５ｍｌのＴＥＯＳを用いたときの粒子上のシリカコーティングの平均厚さは約１．６ｎｍであった。コアの内部に見えるＦｅ３Ｏ４の顕著な結晶格子は、ナノ粒子が合成中に酸化されなかったことを示している。
【図8A】図８Ａは、診断定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＲＴ－ＰＣＲ）の結果を示す。手動プロトコル（図８Ａ～図８Ｃ）および自動化プロトコル（図８Ｄ～図８Ｆ）と磁性シリカナノ粒子の複数のロットとを用い、試料からウイルスＲＮＡを回収し、診断ＱＲＴ－ＰＣＲによって分析した。
【図8B】図８Ｂは、診断定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＲＴ－ＰＣＲ）の結果を示す。手動プロトコル（図８Ａ～図８Ｃ）および自動化プロトコル（図８Ｄ～図８Ｆ）と磁性シリカナノ粒子の複数のロットとを用い、試料からウイルスＲＮＡを回収し、診断ＱＲＴ－ＰＣＲによって分析した。
【図8C】図８Ｃは、診断定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＲＴ－ＰＣＲ）の結果を示す。手動プロトコル（図８Ａ～図８Ｃ）および自動化プロトコル（図８Ｄ～図８Ｆ）と磁性シリカナノ粒子の複数のロットとを用い、試料からウイルスＲＮＡを回収し、診断ＱＲＴ－ＰＣＲによって分析した。
【図8D】図８Ｄは、診断定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＲＴ－ＰＣＲ）の結果を示す。手動プロトコル（図８Ａ～図８Ｃ）および自動化プロトコル（図８Ｄ～図８Ｆ）と磁性シリカナノ粒子の複数のロットとを用い、試料からウイルスＲＮＡを回収し、診断ＱＲＴ－ＰＣＲによって分析した。
【図8E】図８Ｅは、診断定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＲＴ－ＰＣＲ）の結果を示す。手動プロトコル（図８Ａ～図８Ｃ）および自動化プロトコル（図８Ｄ～図８Ｆ）と磁性シリカナノ粒子の複数のロットとを用い、試料からウイルスＲＮＡを回収し、診断ＱＲＴ－ＰＣＲによって分析した。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本技術は、添付の図面とともに読むと、以下の詳細な説明から最もよく理解される。特徴は必ずしも縮尺どおりに描かれていない。
【0022】
本開示のシリカ被覆磁性ナノ粒子（本明細書では、「ナノ粒子ＮＰ」とも略記する）は、試料からの核酸の分離に驚くほど有効である。シリカコーティングは親水性基質を提供し、核酸の精製などの重要な用途において非特異的結合を大幅に低減させる。
【0023】
いくつかの実施の形態では、本技術は、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＲＴ－ＰＣＲ）検出アッセイの一部として、細胞試料またはウイルス試料から得られたＲＮＡの濃縮に用いる。例として、本技術は、ＱＲＴ－ＰＣＲによってＲＮＡを検出する前に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または他のウイルス病原体からＲＮＡを濃縮するために使用することができる。いくつかの実施の形態では、本技術は、ヒトＲＮＡ、ヒトＤＮＡおよび細菌ＤＮＡの濃縮に用いる。たとえば、本技術は、レジオネラ菌（レジオネラ症病原体）などの呼吸器病原体からＤＮＡを濃縮し検出するために使用してもよい。いくつかの実施の形態では、本技術は、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）の前にＤＮＡライブラリーの正規化に用いる。いくつかの実施の形態では、本技術は、試料の分析前のＤＮＡまたはＲＮＡ試料の正規化に用いる。
【0024】
図１Ａを参照すると、本技術は、コア１０と、コア１０を実質的に封入するコア１０上の均一なコンフォーマルコーティング２０とを含む磁性ナノ粒子１００を提供する。一例では、コーティング２０はコア１０を完全に封入する。コア１０は、金属、合金、または金属酸化物で製造することができ、コーティングはシリカで製造することができる。一例では、コア１０はＦｅ３Ｏ４とすることができ、コーティングはシリカを含む。一例では、シリカコーティングは実質的に非多孔質である。コア直径とコーティング厚さとの比と、コーティング表面の特性は、試料溶液中の分析物が磁性ナノ粒子１００のコーティング表面に最適に結合できるようにして複数の磁性ナノ粒子１００が凝集するようなものであってもよい。次に、磁性ナノ粒子１００を有する試料溶液に磁場を加えることによって、被覆表面に結合した分析物を有する磁性ナノ粒子１００を試料溶液から迅速に除去することができる。
【0025】
図１Ａは、本磁性ナノ粒子１００の調製の一実施の形態を示す。一例では、磁性ナノ粒子１００は、約９ｎｍ～約４０ｎｍ、たとえば約２０ｎｍ～約３０ｎｍのサイズを含むことができる。コア１０は、約５ｎｍ～約２０ｎｍ、たとえば約７ｎｍ～約１５ｎｍ以下、たとえば約１０ｎｍ～約１５ｎｍ以下、たとえば約８．８ｎｍ以下、約８ｎｍ以下、または約７．９ｎｍの直径を含むことができる。コーティング２０はコア１０を実質的に封入する。いくつかの例では、コーティング２０は、約０．５ｎｍ～約７．５ｎｍ、約１ｎｍ～約２ｎｍ、たとえば約１．５ｎｍ～約２ｎｍの厚さを含むことができる。図１Ｂは、約２．５ｎｍのコーティング厚さを有し、約１５ｎｍの粒径を有する磁性ナノ粒子１００を示す。
【0026】
図２Ａおよび図２Ｂに示すように、コア直径とシリカコーティング２０の厚さとの比と、シリカコーティング２０の特性との組み合わせは、磁性ナノ粒子１００が凝集し、クラスターを生成することを可能にする。一例では、クラスターは、約１０ｎｍ～約１０００ｎｍ、たとえば約２０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１００ｎｍ～約５００ｎｍ、約２００ｎｍ～約５００ｎｍ、約２５０ｎｍ～約４５０ｎｍ、約２７５ｎｍ～約３２５ｎｍ（たとえば約３００ｎｍ）、約３０ｎｍ～約４００ｎｍ、約４０ｎｍ～約３００ｎｍとなることができる。図２Ｃは、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社のＭａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ３０００を用いて測定したレーザー回折データを示し、一般的な水性分散剤でのナノ粒子ＮＰの粒径分布を示す。直径で約１ミクロンまでのクラスターの個々の粒子が分散剤中に存在し、平均クラスターサイズは直径１２８～１７４ｎｍである。この例でのナノ粒子は「未熟成」であった。
【0027】
本ナノ粒子ＮＰは、手動および自動化ワークフローにおいて高い磁化率を示す。これには、磁性粒子捕捉のタイミングおよび効率が重要であり、捕捉、洗浄および溶出ステップにおいて迅速かつ定量的な粒子回収を必要とする自動化プラットフォームにおいて特に望ましい。
【0028】
いくつかの実施の形態では、ナノ粒子のコアは、大部分または全体がＦｅ３Ｏ４の結晶格子で構成される。いくつかの実施の形態では、ナノ粒子のコアは、大部分または全体が、常磁性を示すマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）のナノスケール単一結晶またはＦｅ３Ｏ４の単一ドメイン磁性ナノ粒子で構成される。
【0029】
いくつかの例では、ナノ粒子ＮＰは、少なくとも１０５ｍ２／ｇ、たとえば少なくとも約１１０ｍ２／ｇ～約１８０ｍ２／ｇまたは少なくとも約１１０ｍ２／ｇ～約１３０ｍ２／ｇのＢｒｕｎａｕｅｒ－Ｅｍｍｅｔｔ－Ｔｅｌｌｅｒ（ＢＥＴ）表面積を有する。ナノ粒子ＮＰのＢＥＴ表面積は、窒素吸着法によって測定することができる。たとえば、窒素吸着／脱離等温線は、メソ多孔性（ｍｅｓｏｐｏｒｏｓｉｔｙ）を測定するためのＭｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ ＡＳＡＰ２０２０容量吸着分析器を用いて液体窒素温度（－１９６℃）で測定することができる。
【0030】
本明細書に記載のシリカ被覆磁性ナノ粒子は、直接用いることもできるし、機能化して特定の用途の必要性に合わせることもできる。カルボキシレート、エポキシドおよびトシレートなどの官能基をシリカコーティングに含めるか、またはシリカコーティングに添加することができ、また、そのような官能基は共有結合的機能化のための簡便な方法となり得る。さらなる例として、シリカコーティングは、シリカマトリックスに１つまたは複数のタイプの有機基を組み込むことによって修飾することもできる。有機基は、シリカコーティングの表面および／または細孔を共有結合で機能化することができる。他の例として、ポリマーは、単純なコーティングまたは共有結合によってシリカ表面を機能化することもできる。
【0031】
本明細書に記載のシリカ磁性ナノ粒子のコーティングは、磁性ナノ粒子の表面まで延びている細孔を含むことができる。コーティングは、その細孔の内部および外部の両方を官能基で修飾することができる。いくつかの例では、コーティングは、核酸などの分析物に結合するように構成されている反応性化学部分をさらに含む。
【0032】
本技術は、本明細書に記載の複数の磁性ナノ粒子を含むことができる組成物を提供する。複数の磁性ナノ粒子は、約１５ｎｍ以下、または約１２ｎｍ以下、または約１１ｎｍ以下の平均粒径を有する。組成物は、水などの液体媒体中の磁性ナノ粒子の安定な懸濁液である。いくつかの例では、磁性ナノ粒子は、３～３０ｇ／Ｌ、または１０～２０ｇ／Ｌ、または約１３ｇ／Ｌの濃度で安定な懸濁液中に存在する。
【0033】
いくつかの例では、ナノ粒子は、２５℃の温度で、短くとも６ヶ月、あるいは短くとも９ヶ月懸濁したままである。いくつかの例では、ナノ粒子は、使用される前、使用者に発送される前、または一般的な使用もしくは特定の使用のために販売される前に、ある凝集時間の間保持される。凝集時間は、ナノ粒子が、所望のサイズまたは特性のクラスターを形成するように選択される。例示的な凝集時間は、短くとも約１ヶ月、短くとも約２ヶ月、短くとも約３ヶ月、短くとも約４ヶ月、短くとも約６ヶ月、短くとも約８ヶ月、またはそれ以上を含む。あるいは、例示的な凝集時間は、長くとも約１８ヶ月、長くとも約１２ヶ月、長くとも約１０ヶ月、長くとも約８ヶ月、長くとも約６ヶ月、長くとも約５ヶ月、またはそれより短い時間を含む。最小値が最大値より短ければ、上記の最小値と最大値のいずれかを組み合わせて範囲を形成することができることが企図される。いくつかの例では、一般的な使用は、試料からＲＮＡなどの分析物を分離することである。いくつかの例では、特定の使用は、試料から得られた核酸の量を正規化することである。
【0034】
本技術は、磁性ナノ粒子がパッケージされた安定な懸濁液も含む。本明細書に記載の磁性粒子または組成物は、内容積がナノ粒子の水性懸濁液である密封パッケージで提供することができる。
【0035】
本技術は、シリカ被覆磁性ナノ粒子を製造する方法を提供する。シリカ被覆磁性ナノ粒子を製造するための本方法は、室温、不活性雰囲気下で塩基（たとえばアンモニアまたはＮａＯＨ）を添加することによってＦｅ３＋／Ｆｅ２＋塩水溶液から磁性酸化鉄を合成することを含む。Ｆｅ３Ｏ４粒子は共沈法を用いて製造してもよい。磁性ナノ粒子のサイズ、形状および組成物は、使用する塩の種類（たとえば塩化物、硫酸塩、硝酸塩）、Ｆｅ３＋／Ｆｅ２＋比、反応温度およびｐＨ値に依存する。合成条件を一定にすれば、合成されたマグネタイトナノ粒子の最終的な特性は完全に再現可能となる。Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子の形成における本技術の利点は、迅速な粒子形成、安価な溶媒の使用、生成物の単離のための磁気分離、制御された粒径および形態、再現可能な磁気特性、およびより大きな工業規模でナノ粒子の合成を行う能力を含む。いくつかの例では、共沈法に用いるＦｅ＋の濃度は、０．１Ｍ未満、あるいは０．０５Ｍ未満、あるいは０．０２Ｍ未満、たとえば０．０１Ｍである。
【0036】
方法は、脱イオン脱酸素水中、Ｆｅ３＋／Ｆｅ２＋モル比が約２／１のＦｅ３＋およびＦｅ２＋イオンの水溶液を調製することを含む。いくつかの例では、水溶液中のＦｅ３＋の濃度は約２～約５０ｍＭであり、水溶液中のＦｅ２＋の濃度は約１～約２５ｍＭである。水溶液は、ＦｅＣｌ３およびＦｅＣｌ２を脱イオン脱酸素水に溶解することによって調製することができるが、他の鉄塩を使用して溶解することもできる。水は、水と鉄塩とを混合する前に、十分な脱酸素時間の間、不活性ガスによるスパージング、超音波処理、および／または撹拌などの任意の適切な技術によって脱酸素することができる。脱酸素時間は一般に短くとも２時間であるが、これより長い時間または短い時間を使用してもよい。
【0037】
Ｆｅ３＋およびＦｅ２＋イオンの水溶液をさらに超音波処理し、任意選択で（水溶液を室温から加熱するなどして）約３５℃に調整してもよい。不活性雰囲気下で、加熱された水溶液に塩基を添加してもよい。いくつかの例では、適切な塩基はアンモニア、水酸化ナトリウムなどを含む。塩基は、水溶液からＦｅ３ＣＯ４コアを形成するのに十分な量で添加される。たとえば、塩基は、２倍以上（たとえば、４倍または８倍）のモル過剰で添加してもよい。十分な量の塩基を添加した結果として、Ｆｅ３ＣＯ４ナノ粒子とアルカリ水とを含む混合物が形成される。いくつかの例では、塩基は、任意選択で水溶液を撹拌および／または超音波処理しながら、水溶液に滴下添加してもよい。
【0038】
混合物は、Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子がアルカリ水から沈降する沈降時間の間、撹拌することなく不活性雰囲気下で維持される。いくつかの例では、沈降時間は一晩または約１２時間である。他の例では、沈降時間は短くとも４、６、８、１２、もしくは１８時間であり、および／または６０時間、４８時間、３６時間、２４時間もしくは２０時間以下である。上記の値を組み合わせて沈降時間の範囲を作成することができる。沈降時間の後、アルカリ水の大部分が吸引によって混合物から移動する。これによって、アルカリ水中のＦｅ３Ｏ４ナノ粒子の濃縮混合物が得られる。
【0039】
濃縮混合物に脱酸素アルコールを添加して水性アルコール混合物を作成する。水性アルコール混合物を撹拌し、超音波処理して、Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を懸濁させる。いくつかの例では、さらなる処理の前に、水性アルコール混合物に追加の塩基を添加する。
【0040】
超音波処理し、不活性雰囲気を維持しながら、水性アルコール混合物にケイ酸塩溶液を添加する。シリカコーティング厚さは、用いる反応物の量によって制御することができる。ケイ酸塩溶液は、混合物を撹拌し超音波処理しながら、たとえば３０～９０分かけて水性アルコール混合物に徐々に滴下添加してもよい。ケイ酸塩溶液はオルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）およびアルコールを含む。いくつかの例では、ケイ酸塩溶液は無水である。
【0041】
この混合物を不活性雰囲気下でコーティング時間撹拌し、その間にＦｅ３Ｏ４ナノ粒子上にシリカコーティングを形成させる。いくつかの例では、コーティング時間は一晩または約１２時間である。他の実施の形態では、コーティング時間は短くとも４、６、８、１２、もしくは１８時間であり、および／または６０時間、４８時間、３６時間、２４時間もしくは２０時間以下である。上記の値を組み合わせて、コーティング時間の範囲を作成することができる。
【0042】
シリカ被覆Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子は、任意の適切な分離技術によってアルコール水性混合物から分離される。いくつかの例では、Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子は、水性アルコール混合物から磁性捕捉によって分離される。シリカ被覆Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子は、メタノールまたは他のアルコールまたは溶媒で洗浄することができる。分離されたシリカ被覆Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子は、たとえば真空乾燥によって乾燥させることができる。シリカ被覆Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子の粉末は、乾燥によって形成される。いくつかの例では、シリカ被覆Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を含む粉末は、ナノ粒子を粉砕または機械的に分離することなく形成される。
【0043】
得られた乾燥ナノ粒子を脱酸素水に分散させて組成物を作製してもよい。いくつかの例では、組成物は安定な懸濁液である。得られた粒子懸濁液は、ナノ粒子の平均クラスターサイズが平均１２５ｎｍから２６０ｎｍまで増大できるように、６ヶ月まで熟成させることができる。
【0044】
本技術は、試料から核酸を分離することによって分析用の核酸を調製するための方法も含む。いくつかの例では、方法は、核酸を含む試料と、本明細書に記載の結合媒体および磁性ナノ粒子組成物とを容器内で混合するステップを含む。核酸は磁性ナノ粒子のコーティングに結合する。結合時間の後、核酸結合磁性ナノ粒子は容器内で結合媒体から分離される。核酸結合磁性ナノ粒子を洗浄液と接触させて不必要な不純物を除去し、次いで溶出媒体と接触させ、それによって結合核酸を磁性ナノ粒子から分離する。磁性ナノ粒子は磁石によって引き付けられ、得られた所望の核酸を含む清澄化溶液を容器から除去し、それによって核酸調製物を得る。
【0045】
本明細書に記載の磁性ナノ粒子および組成物は、生体試料からの小分子、タンパク質、および／または核酸などの分析物の分離のためなどの多くの用途を有する。磁性ナノ粒子および組成物は、たとえば貴金属粒子、低分子の有機または無機分子、ＤＮＡ、ペプチドまたはポリペプチド（たとえば抗体および他のタンパク質）、および全細胞を含む、化学物質種または生物学的種の担体として使用してもよい。このような担体の用途は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、光イメージング、標的薬物送達および細胞送達を含んでもよい。
【0046】
本技術は、分析用の核酸を調製するための方法を提供する。この方法は、核酸を含む試料と、結合媒体および本明細書に記載の磁性ナノ粒子組成物とを容器内で混合するステップを含む。核酸は磁性ナノ粒子のコーティングに結合する。結合時間の後、核酸結合磁性ナノ粒子は、容器内で結合媒体から分離される。いくつかの例では、核酸結合磁性ナノ粒子は、次いで、水性アルコールまたは様々な水混和性有機溶媒、たとえばアセトニトリル、アセトンおよびスルホランなどを含む洗浄媒体で洗浄される。次いで、核酸結合磁性ナノ粒子を容器内に保持するように注意しながら、液体（結合媒体および／または洗浄媒体）の大部分を容器から除去する。核酸結合磁性ナノ粒子を溶出媒体と接触させ、それによって磁性ナノ粒子から結合核酸を分離する。容器から核酸を除去し、それによって核酸調製物を得る。
【0047】
磁性ナノ粒子のコーティングは、核酸または別の分析物に選択的に結合するように構成されている結合部位を含んでもよい。
【0048】
試料からの核酸の分離は、他の分析物、たとえば、医薬品などの小分子、タンパク質もしくはポリペプチド、脂質、または他の分析物を分離する場合の例示である。
【0049】
本方法は、試料から得られた核酸の量を正規化するために使用してもよい。このような方法では、試料は入力量の核酸を含み、磁性ナノ粒子組成物は、出力量の核酸に対する結合能を有する。出力量は入力量よりも少ない。
【0050】
磁性ナノ粒子組成物は正規化係数０．８～１．２を有してもよく、正規化係数とは、高濃度の核酸に暴露した後に磁性シリカナノ粒子から回収した核酸の濃度値を、低濃度の核酸に暴露した後に磁性シリカナノ粒子から回収した核酸の濃度値で割ったものを指す。理想的には、ＮＧＳ用に調製した組成物の場合、正規化係数は約１．０である。
【0051】
核酸調製物は、所定の長さの範囲内の長さを有する核酸を含む。いくつかの例では、最小ヌクレオチド長は、５０ヌクレオチド（以下、ｎｔ）、または７０ｎｔ、または７５ｎｔ、または８０ｎｔ、または１００ｎｔ、または１５０ｎｔ、または２００ｎｔ、または５００ｎｔ、または２，０００ｎｔ、または５，０００ｎｔ、または１０，０００ｎｔ、または５０，０００ｎｔ、または１００，０００ｎｔである。最大ヌクレオチドは、２００万ｎｔ、または１００万ｎｔ、または５００，０００ｎｔ、または２００，０００ｎｔ、または７５，０００ｎｔ、または２５，０００ｎｔ、または１２，５００ｎｔ、または６，０００ｎｔ、または３，０００ｎｔ、または１，５００ｎｔ、または７５０ｎｔ、または４００ｎｔ、または２５０ｎｔであってもよい。最小値が最大値より小さければ、上記の最小値および最大値のいずれかを組み合わせて所望のヌクレオチド長範囲を形成することが可能である。
【0052】
本方法は、入力試料が少量の核酸、たとえば、１，０００ｎｇ未満、または５００ｎｇ未満、または２００ｎｇ未満、または１００ｇ未満、または５０ｎｇ未満の核酸を含む場合に使用してもよい。
【0053】
本技術は、生体試料からＲＮＡを取得し、分析用のＲＮＡを調製する方法を提供する。この方法では、ＲＮＡを含む生体試料を容器に入れる。生体試料は細胞またはウイルスであってもよい。
【0054】
方法は、生体試料と、グアニジンチオシアネート（ＧＴＣ）およびプロテイナーゼＫとを接触させて試料混合物を作成し、試料調製時間の間（たとえば１０分以下または約５分）、高温（たとえば約６０℃）でインキュベートすることを含む。ＧＴＣおよびプロテイナーゼＫは別々に添加してもよいし、予め混合して一緒に添加してもよい。試料調製時間の後、ニートアルコールを容器内の試料混合物に添加し、本明細書に記載の磁性ナノ粒子組成物の１つも容器内の試料混合物に添加する。試料混合物と磁性ナノ粒子とを混合し、第２インキュベーション時間の間（たとえば１０分以下または約５分）、インキュベートする。
【0055】
第２インキュベーション時間の後、磁力を加えて、容器内の上清から磁性ナノ粒子を分離する。分離している磁性ナノ粒子を乱すことなく容器から上清を除去し、この磁性ナノ粒子をアルコール溶液で１回または複数回洗浄する。適切なアルコール溶液は、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、またはそれらの混合物などの、８０ｖ／ｖ％以上の低級アルコールを含んでもよい。水と混和性のある様々な非アルコール有機溶媒も、洗浄目的に有効であり、かつ当業者に公知である。そのいくつかは、限定されるものではないが、アセトニトリル、アセトンおよびスルホランを含む。分離された磁性ナノ粒子を乾燥させ、溶出媒体を容器に添加する。磁性ナノ粒子を溶出時間の間（たとえば１０分未満）溶出媒体と混合し、次いでＲＮＡを磁性ナノ粒子から溶出して溶出液を作成する。ＲＮＡを含む溶出液を容器から除去し、次いでＲＮＡは、診断および研究目的のために定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＲＴ－ＰＣＲ）などの分析に供してもよく、または、ＳａｎｇｅｒおよびＮＧＳ配列決定などのヌクレオチド配列決定の基質として機能するように修飾することができる。あるいは、除去された溶出液は、発送またはその後の分析などのために、第２容器に入れ、低温で密封保存してもよい。
【0056】
いくつかの例では、上記の方法の１つ、いくつかまたはすべてのステップが自動化装置で行われる。
【0057】
（用語）
本明細書で用いられる用語は、特定の実施の形態を説明するためだけのものであり、限定することを意図するものではないと理解すべきである。定義された用語は、本開示の技術分野において一般的に理解され受け入れられている定義された用語の技術的および科学的意味に追加されるものである。
本明細書で用いられる用語は、特定の実施の形態を説明するためだけのものであり、限定することを意図するものではないと理解すべきである。定義された用語は、本開示の技術分野において一般的に理解され受け入れられている定義された用語の技術的および科学的意味に追加されるものである。
【0058】
「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では、ヌクレオチド、たとえば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドで構成される、たとえば、約１０塩基を超える、約１００塩基を超える、約５００塩基を超える、１０００塩基を超える、１０，０００塩基を超える、もしくはそれ以上の任意の長さのポリマー、またはたとえば２つの天然に存在する核酸と同様に、天然に存在する核酸と配列特異的にハイブリダイズすることが可能な、たとえば、Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対相互作用に関与することができる合成的に製造された化合物、を説明するために同義で使用される。天然に存在するヌクレオチドは、グアニン、シトシン、アデニン、チミンおよびウラシル（それぞれＧ、Ｃ、Ａ、ＴおよびＵ）を含む。
【0059】
「相補性」、「相補鎖」または「相補的な核酸配列」という用語は、Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対形成則によって別の核酸鎖の塩基配列と関連する核酸鎖を指す。一般に、各配列の３’末端が他の配列の５’末端にハイブリダイズし、一方の配列の各Ａ、Ｔ／Ｕ、Ｇ、Ｃが、他方の配列のＴ／Ｕ、Ａ、Ｃ、Ｇのそれぞれと整列するように、一方の配列が他方の配列とアンチパラレルセンス（ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ ｓｅｎｓｅ）にハイブリダイズすることができる場合、２つの配列は相補的である。
【0060】
「二本鎖」という用語は、全部または一部が相補的にＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ型塩基対形成を行って、そのヌクレオチドのすべてまたは大部分の間で安定な複合体が形成される少なくとも２つの配列を意味する。「アニーリング」および「ハイブリダイゼーション」という用語は、安定な二本鎖の形成を意味するために同義で使用される。
【0061】
ヌクレオチド配列の文脈において、「ハイブリダイゼーション」および「ハイブリッド形成」という用語は、本明細書では同義で使用される。２つのヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズする能力は、２つのヌクレオチド配列の相補性の程度に基づいており、これは一方で、マッチした相補的ヌクレオチド対の割合に基づいている。所定の配列において、別の配列に相補的なヌクレオチドが多ければ多いほど、ハイブリダイゼーションの条件はよりストリンジェントになり、２つの配列のハイブリダイゼーションはより特異的になる。ストリンジェンシーを高くすることは、温度を上げること、補助溶剤の比率を増やすこと、塩濃度を下げることなどによって実現することができる。
【0062】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、また通常の意味に付け加えるとき、「実質的」または「実質的に」という用語は、当業者にとって許容できる限度または程度内であることを意味する。たとえば、「実質的にキャンセルされる」とは、当業者がキャンセルを許容できると考えることを意味する。
【0063】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、また通常の意味に付け加えるとき、「およそ」および「約」という用語は、当業者にとって許容できる限度または量内であることを意味する。「約」という用語は、一般に、記載された数の±１５％を指す。たとえば、「約１０」は、８．５～１１．５の範囲を示すことが可能である。たとえば、「ほぼ同じ」とは、比較された品目を当業者が同じと考えることを意味する。
【0064】
本開示において、数値範囲は、その範囲を規定する数を含む。化学構造および式は、例示目的で引き延ばしたり拡大したりすることがあることを認識すべきである。
【0065】
別途定義しない限り、本明細書で用いられるすべての科学技術用語は、本開示が属する分野で働く人々によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。
【0066】
様々な実施の形態が説明される前に、本開示の技術が、説明されている特定の実施の形態に限定されるものではなく、そのようなものとして多様であり得ることを理解すべきである。本明細書で用いられる用語は、特定の実施の形態を説明するためだけのものであり、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定することを意図するものではないと理解すべきである。
【0067】
本明細書に開示されるように、多数の値の範囲が提供される。文脈により明確に否定されない限りは、その範囲の上限と下限との間の、下限の単位の１０分の１までの各介在値（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ ｖａｌｕｅ）も具体的に開示されていることが理解されよう。
【0068】
別途定義しない限り、本明細書で用いられるすべての科学技術用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法および材料も本技術の実施または試験に使用してよいが、いくつかの例示的な方法および材料をここに記載する。
【0069】
本明細書で言及されるすべての特許および刊行物は、参照により明示的に組み込まれる。
【0070】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という用語は、文脈により明確に否定されない限りは、単数および複数の指示対象を含む。したがって、たとえば、「ある部位」は、１つの部位および複数の部位を含む。
【実施例】
【0071】
（実施例１）
本実施例では、上記および下記の方法を用いてシリカ被覆磁性ナノ粒子（ナノ粒子ＮＰ）が製造される。Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を１ｇスケールで合成する例示的な手順を以下のように行った。ハードＮ２パージ、機械的撹拌および超音波処理を用いてＤＩ水４００ｍｌを２時間十分に脱酸素した。脱酸素後、２．５０８ｇのＦｅＣｌ３（９．２４ｍＭ）および０．９１９ｇのＦｅＣｌ２（４．６２ｍＭ）を窒素雰囲気下で添加し、さらにパージ／超音波処理を行った。超音波処理の過程で、水の温度は３５℃まで上昇した。その後、迅速に撹拌し超音波処理した溶液に２８％アンモニア溶液１０ｍｌ（０．１８Ｍ、これは鉄をマグネタイトに完全に変換するのに必要な約４モル過剰量である）を迅速に加えた。溶液は即座に黒色となり、ナノ粒子の沈殿物が見られた。超音波処理を中止し、混合物を窒素雰囲気下でさらに４時間撹拌した。その後、撹拌することなく翌日まで窒素雰囲気下で粒子を放置した。ナノ粒子はフラスコの底部に沈殿し、透明な上部の水層と、磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子からなる黒色の底部の層とが得られた。
本実施例では、上記および下記の方法を用いてシリカ被覆磁性ナノ粒子（ナノ粒子ＮＰ）が製造される。Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を１ｇスケールで合成する例示的な手順を以下のように行った。ハードＮ２パージ、機械的撹拌および超音波処理を用いてＤＩ水４００ｍｌを２時間十分に脱酸素した。脱酸素後、２．５０８ｇのＦｅＣｌ３（９．２４ｍＭ）および０．９１９ｇのＦｅＣｌ２（４．６２ｍＭ）を窒素雰囲気下で添加し、さらにパージ／超音波処理を行った。超音波処理の過程で、水の温度は３５℃まで上昇した。その後、迅速に撹拌し超音波処理した溶液に２８％アンモニア溶液１０ｍｌ（０．１８Ｍ、これは鉄をマグネタイトに完全に変換するのに必要な約４モル過剰量である）を迅速に加えた。溶液は即座に黒色となり、ナノ粒子の沈殿物が見られた。超音波処理を中止し、混合物を窒素雰囲気下でさらに４時間撹拌した。その後、撹拌することなく翌日まで窒素雰囲気下で粒子を放置した。ナノ粒子はフラスコの底部に沈殿し、透明な上部の水層と、磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子からなる黒色の底部の層とが得られた。
【0072】
翌日、アンモニア／水の透明な上層を吸引除去することによって沈殿Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を分離した。残りの溶媒（１００ｍｌ）はそのまま残した。次いで、この黒色スラリーに脱酸素エタノール３００ｍｌを加えた。粒子を１時間撹拌および超音波処理してナノ粒子を再懸濁した。超音波処理しながら、ＴＥＯＳ １．５ｍｌを無水エタノール８０ｍｌと混合し、窒素パージ下で滴下ロートに入れ、フラスコに取り付けた。Ｎ２気流下でフラスコをパージし、次いで密封した。次いで、この黒色ナノ粒子懸濁液に追加のアンモニア溶液（２８％）５ｍｌを加えた。混合物を再び超音波処理し、窒素気流下で機械的に１０分攪拌した。次いで、撹拌し超音波処理したナノ粒子に約６０分かけてＴＥＯＳ溶液を滴下添加した。ＴＥＯＳ溶液の添加後、Ｎ２下で一晩ゆっくりと撹拌を継続した。
【0073】
翌日、磁石を用いて、フラスコの底部にナノ粒子を分離した。透明なエタノール／水混合物を、磁石によってその場に保持されたナノ粒子からデカントして除いた。シリカ被覆Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を新しいメタノールで２回洗浄し、磁気的に分離した。次いで、ナノ粒子を窒素気流下で乾燥させて粉末にし、次いで脱酸素水１００ｍｌに分散させた。ナノ粒子を窒素で十分にスパージし、超音波処理し、不活性雰囲気下で密封して、１．３重量％のナノ粒子水溶液を得た。
【0074】
様々な分析を行うために、シリカ被覆Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子試料を乾燥粒子として単離した。走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）を用いて粒子を画像化し、個々の粒子の凝集の程度および全サイズを見積もった。図２Ａ～図２Ｂは、本技術によるシリカ被覆磁性ナノ粒子の走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）像である。図２Ｃは、本技術によるシリカ被覆磁性ナノ粒子のレーザー回折データを示す。
【0075】
合成中の超音波処理を含む現在の技術の使用は、ナノ粒子コアを分散させるのに役立ち、それによって均一なシリカコーティングが行われることを可能にし、かつ早期の粒子の凝集を防止する。ＳＥＭによる推定では、最終的なシリカ被覆Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子が直径１０～１５ｎｍであることが示されている。これによって、コア上のコーティング構造は、厚さ約１．５ｎｍの均一な外部シリカシェルを組み込んだ直径約７～１０ｎｍの内部Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子で構成されていることが示唆される。これらのサイズは高分解能ＴＥＭを用いて確認された。
【0076】
実施例１－１、実施例１－２、および実施例１－３は、異なる量のＴＥＯＳ溶液を用い、上記の技術を用いて調製した。シリカ被覆Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子をＩＲおよびＴＥＭによって分析したところ、これらの粒子は非常に望ましいサイズ特性およびＳｉＯ：ＦｅＯ比を有していることが見出された。図２Ｄおよび図２Ｅは、実施例１－１のＴＥＭ像であり、図２Ｆおよび図２Ｇは実施例１－２のＴＥＭ像であり、図２Ｈおよび図２Ｉは実施例１－３のＴＥＭ像である。以下の表は、これらの実施例のそれぞれの平均シェル厚さおよび平均コア粒径を示す。
【0077】
【表1】
【0078】
Ｂｒｕｎａｕｅｒ－Ｅｍｍｅｔｔ－Ｔｅｌｌｅｒ（ＢＥＴ）理論を用いた乾燥シリカ被覆Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子の分析は、１０５ｍ２／ｇを超える、たとえば１１３～１２７ｍ２／ｇの材料表面積を示し、これは粒子の推定直径とよく一致する。ナノ粒子の分析は、シリカシェルを用いた機能化の前後にもＦＴ－ＩＲ分光法を用いて行った。非被覆Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子のＦＴ－ＩＲ分析では、５８０ｃｍ－１および６３０ｃｍ－１に２つの重なり合ったバンドが見られ、これはＦｅ３Ｏ４磁性相の結晶格子の金属－酸素Ｆｅ－Ｏ伸縮振動に関連している。ナノ粒子をシリカでコーティングした後、これらのバンドには、ＳｉＯ２シェルのシリカのＯ－Ｈ伸縮およびＳｉ－Ｏ伸縮に由来する３４００ｃｍ－１、１０９４ｃｍ－１、および４６７ｃｍ－１の追加モードが加わる（図３参照）。新しいモードの出現は、シリカの薄いシェルによるナノ粒子の封入を裏付けている。
【0079】
シリカ被覆ナノ粒子の他の２つのバッチを、実施例１－１と同様に調製し、コーティング厚さを評価した。以下の表に示すように、本手順は、極めて安定したコーティング厚さを有し、バッチ間のばらつきがほとんどないシリカ被覆ナノ粒子をもたらした。
【0080】
【表2】
本実施例では、異なる量のケイ酸塩を本手順に用いたこと以外は、実施例１に記載されている手順に基づいてシリカ被覆ナノ粒子を調製した。以下の表で、本実施例で調製した磁性ナノ粒子の５つの異なる実施の形態を要約する。
【0081】
【表3】
【0082】
【表4】
【0083】
図５は、ＴＥＯＳ量の増加に伴ってシリカコーティング厚さが直線的に増加することを示すグラフである。
【0084】
図６は、２５０，０００倍の倍率での、本技術によるシリカ被覆磁性ナノ粒子の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）像である。粒子は、１．５ｍｌのＴＥＯＳおよび超音波処理を用いて製造した。
【0085】
図７は、本技術によるシリカ被覆磁性ナノ粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像である。個々のシリカ被覆磁性ナノ粒子が見える。粒子の凝集も見える。一般的なＦｅ３Ｏ４コアは７～１０ｎｍの範囲である。１．５ｍｌのＴＥＯＳを用いたときの粒子上のシリカコーティングの平均厚さは約１．６ｎｍであった。コアの内部にはＦｅ３Ｏ４の結晶格子が見えており、これはナノ粒子が合成または輸送中に酸化されなかったことを示している。
【0086】
（実施例３）
本実施例では、実施例１に記載されている手順に基づいてシリカ被覆磁性ナノ粒子のいくつかのロットを調製し、それによって実施例３－１～実施例３－１４を製造した。これらの実施例のいくつかの表面積をＢｒｕｎａｕｅｒ－Ｅｍｍｅｔｔ－Ｔｅｌｌｅｒ（ＢＥＴ）表面積によって測定し、約１１３ｍ２／ｇ～約１２７ｍ２／ｇの表面積を有していることが見出された。
本実施例では、実施例１に記載されている手順に基づいてシリカ被覆磁性ナノ粒子のいくつかのロットを調製し、それによって実施例３－１～実施例３－１４を製造した。これらの実施例のいくつかの表面積をＢｒｕｎａｕｅｒ－Ｅｍｍｅｔｔ－Ｔｅｌｌｅｒ（ＢＥＴ）表面積によって測定し、約１１３ｍ２／ｇ～約１２７ｍ２／ｇの表面積を有していることが見出された。
【0087】
【表5】
本実施例では、本開示の磁性ナノ粒子を用いて、手動および自動化プロトコルの両方で試料からＲＮＡを回収した。これらの方法では、ＲＮＡを含む生体試料のアリコート７５μＬを０．２ｍｌストリップチューブにピペットで移した。溶解緩衝液を含むグアニジンチオシアネート（ＧＴＣ）７５μＬとプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）２μＬとを各チューブに添加した。チューブにキャップをし、ボルテックスで混合し、回転させた。チューブを６０℃で５分インキュベートした。インキュベーション後、各チューブに、コア粒径８．８２ｎｍとコーティング厚さ１．５６ｎｍとに基づいて粒径１０．３８ｎｍを有する磁性ナノ粒子２μＬとともに７５μＬの１００％ＥｔＯＨを添加した。チューブにキャップをし、混合し、短時間回転させ、室温で５分インキュベートした。この第２インキュベーション時間の間に、試料からのＲＮＡはシリカ被覆磁性ナノ粒子に結合した。
【0088】
第２インキュベーション時間の後、チューブを磁石上に５分置いた。次いで、ナノ粒子ペレットを乱すことなくすべての上清をチューブから除去した。洗浄媒体（８０％ＥｔＯＨ）２００μＬをチューブ内のペレットに添加した。ナノ粒子ペレットを乱すことなく洗浄媒体を除去し、洗浄ステップおよび除去ステップを繰り返した。ナノ粒子ペレットを室温で３分インキュベートしてナノ粒子を乾燥させた。
【0089】
次いで、６５℃に予熱した溶出媒体７５μＬをチューブに添加し、上下に数回ピペッティングして、気泡の発生を避けながらナノ粒子を混合した。チューブを２分放置し、ナノ粒子を磁石で捕捉し、ＲＮＡを含む溶出液を回収し、新しいチューブに移した。新しいチューブにキャップをし、氷上に置いた。
【0090】
（実施例５）
本実施例では、本開示の磁性ナノ粒子を用いて手動プロトコルで試料からＲＮＡを回収した。図８Ａは、手動ワークフローを用いた場合の、ウイルスＲＮＡ抽出のための６つのナノ粒子（ナノ粒子ＮＰ）ロットの比較を示す。
本実施例では、本開示の磁性ナノ粒子を用いて手動プロトコルで試料からＲＮＡを回収した。図８Ａは、手動ワークフローを用いた場合の、ウイルスＲＮＡ抽出のための６つのナノ粒子（ナノ粒子ＮＰ）ロットの比較を示す。
【0091】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ１およびＮ２標的の最終濃度が１マイクロリットルあたり１０５、１０４、１０３、１０２、１０、１および０．５コピーになるようにＶＴＭに採取した鼻腔スワブ（ＮＳ）にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アーマード合成ＲＮＡをスパイクインすることによって人為的（ｃｏｎｔｒｉｖｅｄ）試料を調製した。ＮＡＰ手動プロトコルに従って、各希釈液７５ｕｌを２連で用いてＲＮＡ抽出を行った。つまり、各試料７５ｕｌと、溶解緩衝液７５ｕｌおよびプロテイナーゼＫ２ｕｌとを混合し、ＲＴで５分、６０℃で５分インキュベートし、次いでナノ粒子ビーズ２ｕｌを含む１００％エタノール７５ｕｌを加えた。この実験では、以下の６つのナノ粒子ロット、実施例３－３、実施例３－５、実施例３－６、実施例３－７、実施例３－８、および実施例３－９を用いた。試料を混合し、ＲＴで５分インキュベートして、核酸を磁性ビーズに結合させ、次いでチューブをマグネットスタンドに移し、ビーズをチューブの底側で採取した（このステップでは、ＲＮＡは磁性ビーズに結合したままである）。上清を吸引した後、ビーズを８０％エタノールで２回洗浄し、ＲＴで３分乾燥させて、低ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）３０ｕｌでＲＮＡを溶出した。
【0092】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ１およびＮ２標的と、ヒトＲＮアーゼＰ遺伝子とに特異的なプライマーおよびプローブを用いるマルチプレックスＱＲＴ－ＰＣＲ反応に、各抽出ＲＮＡ試料５ｕｌを用いた。アッセイは、Ａｇｉｌｅｎｔ社のＡｒｉａＭｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムで行った。Ｎ１、Ｎ２およびＲＰ標的の増幅曲線を図８Ａ、図８Ｂおよび図８Ｃに示し、対応するＣｑ値を表Ａ、表Ｂおよび表Ｃに示した。６つのナノ粒子ロット間に有意差は認められず、１０５～０．５コピー／ｕｌのＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＮ１およびＮ２ ＲＮＡ標的ならびにヒトＲＰのＱＲＴ－ＰＣＲ検出が実証された。
【0093】
【表6】
【0094】
【表7】
【0095】
【表8】
以下の実施例では、本開示の磁性ナノ粒子を用いて、試料から自動化プロトコルでＲＮＡを回収した。図８Ｄ、図８Ｅおよび図８Ｆは、自動ワークフローを用いたウイルスＲＮＡ抽出のための６つのナノ粒子ロットの比較を示す。
【0096】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ１およびＮ２標的の最終濃度が１マイクロリットルあたり１０５、１０４、１０３、１０２、１０、１および０．５コピーになるようにウイルス移入媒体（ＶＴＭ：ｖｉｒａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅｄｉｕｍ）に採取した鼻腔スワブ（ＮＳ）にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アーマード合成ＲＮＡをスパイクインすることによって人為的試料を調製した。各希釈液７５ｕｌを用いてＲＮＡ抽出を行った。つまり、各試料７５ｕｌと、溶解緩衝液７５ｕｌおよびプロテイナーゼＫ２ｕｌとを混合し、ＲＴで５分インキュベートし、次いで自動処理のためにＢｒａｖｏ装置に移した。この実験では、以下のナノ粒子ロット、実施例３－２、実施例３－３（２つの異なるバイアルからのものであり、３－３ａ、３－３ｂと呼ぶ）、実施例３－４、実施例３－５、および実施例１－１Ｂを用いた。ＲＮＡを低ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）３０ｕｌで溶出した。
【0097】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ１およびＮ２標的と、ヒトＲＮアーゼＰ遺伝子とに特異的なプライマーおよびプローブを用いるマルチプレックスＱＲＴ－ＰＣＲ反応に、各抽出ＲＮＡ試料５ｕｌを用いた。アッセイは、Ａｇｉｌｅｎｔ社のＡｒｉａＭｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムで行った。Ｎ１、Ｎ２およびＲＰ標的の増幅曲線を図８Ｄ、図８Ｅおよび図８Ｆに示し、対応するＣｑ値を表Ｄ、表Ｅおよび表Ｆに示した。６つのナノ粒子ロット間に有意差は認められず、１０５～０．５コピー／ｕｌのＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＮ１およびＮ２ ＲＮＡ標的ならびにヒトＲＰのＱＲＴ－ＰＣＲ検出が実証された。
【0098】
【表9】
【0099】
【表10】
【0100】
【表11】
本実験では、平均クラスターサイズに対するナノ粒子ＮＰ熟成（ａｇｉｎｇ）効果を評価した。図１２Ａおよび図１２Ｂは、本開示のナノ粒子組成物を２１８日まで熟成させたときのクラスターサイズの増加を示す。表Ｈは、示された時点で測定された値を示す。
【0101】
【0102】
【表13】
【0103】
（実施例８）
本実施例では、２週間および１４週間経過したナノ粒子ＮＰを用いて単離したＲＮＡのＱＲＴ－ＰＣＲ分析を比較することによって、核酸抽出効率に対するナノ粒子ＮＰの熟成効果を評価した。核酸を１４個の鼻咽頭（ナノ粒子ＮＰ）臨床試料から抽出し、そのうち８個はヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）陽性であり、６個はヒトパラインフルエンザウイルス３型（ｈＰＩＶ３）陽性であることが判明していた。抽出されたウイルスＲＮＡ量は、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩＩ ＱＲＴ－ＰＣＲ試薬、ＡＢＩ ＴａｑＭａｎ微生物アッセイ（ｈＭＰＶまたはｈＰＩＶ３を検出するためのプライマーおよびプローブ）および各ＲＮＡ試料２μｌを２０μｌのＰＣＲ反応に用いて、ＡｒｉａＭｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムでＱＲＴ－ＰＣＲにより評価した。結果を、ＡｒｉａＭｘ ｖ１．５ソフトウェア（各試料のΔＣｑ値は［ΔＣｑ＝Ｃｑ２週間－Ｃｑ１４週間］として計算した）を用いて分析した。そのデータを下表に示す。
本実施例では、２週間および１４週間経過したナノ粒子ＮＰを用いて単離したＲＮＡのＱＲＴ－ＰＣＲ分析を比較することによって、核酸抽出効率に対するナノ粒子ＮＰの熟成効果を評価した。核酸を１４個の鼻咽頭（ナノ粒子ＮＰ）臨床試料から抽出し、そのうち８個はヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）陽性であり、６個はヒトパラインフルエンザウイルス３型（ｈＰＩＶ３）陽性であることが判明していた。抽出されたウイルスＲＮＡ量は、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩＩ ＱＲＴ－ＰＣＲ試薬、ＡＢＩ ＴａｑＭａｎ微生物アッセイ（ｈＭＰＶまたはｈＰＩＶ３を検出するためのプライマーおよびプローブ）および各ＲＮＡ試料２μｌを２０μｌのＰＣＲ反応に用いて、ＡｒｉａＭｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムでＱＲＴ－ＰＣＲにより評価した。結果を、ＡｒｉａＭｘ ｖ１．５ソフトウェア（各試料のΔＣｑ値は［ΔＣｑ＝Ｃｑ２週間－Ｃｑ１４週間］として計算した）を用いて分析した。そのデータを下表に示す。
【0104】
表Ｇに示すように、１４週経過したナノ粒子ＮＰを用いて抽出された１４試料のうち１０試料（７１％）が、０．５Ｃｑを超える改善を示した（ΔＣｑ１＝ＲＮＡ収量の３倍差）
【0105】
【表14】
【0106】
（実施例９）
以下の実施例では、異なる濃度を有し、「ライブラリー」と呼ぶＮＧＳ用ＤＮＡ試料を「正規化した」。これは、磁性シリカナノ粒子が暴露されたＤＮＡ濃度にかかわらず、正規化後に得られるすべてのＤＮＡ濃度がほぼ等しい濃度であることを意味する。
以下の実施例では、異なる濃度を有し、「ライブラリー」と呼ぶＮＧＳ用ＤＮＡ試料を「正規化した」。これは、磁性シリカナノ粒子が暴露されたＤＮＡ濃度にかかわらず、正規化後に得られるすべてのＤＮＡ濃度がほぼ等しい濃度であることを意味する。
【0107】
以下のステップはすべて４℃で行った。
【0108】
磁性ナノ粒子１０μＬ（０．１μｇ／ｍＬ；１μｇ）およびＤＮＡ結合媒体６０μＬを、チューブＡ１～Ｈ１（ナノ粒子ロットＣＳ－０１９Ａ）およびＡ２～Ｈ２（ナノ粒子ＣＳ－０１９Ｂ）に加え、ピペッティングにより混合する。
【0109】
１０ｎＭ ＤＮＡライブラリー２０μＬをチューブＡ１～Ｄ１およびチューブＡ２～Ｄ２に加え、１００ｎＭ ＤＮＡライブラリー２０μＬをチューブＥ１～Ｈ１およびチューブＥ２～Ｈ２に加え、ピペッティングにより混合し、直ちに粒子を捕捉する。
【0110】
捕捉した粒子を８０％ＥｔＯＨ １５０μＬで１回洗浄し、上清を除去し、粒子を乾燥させ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－０．１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）１０μＬを加え、混合し、直ちに粒子を捕捉し、上清について電気泳動分析（ＨＳＤ１０００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ）を行う。
【0111】
図９はＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ分析の結果を示す。正規化法のための入力としてＤＮＡライブラリーにおいて異なる濃度の核酸を用いたにもかかわらず、正規化係数は、ＣＳ－０１９Ａについて１．１、ＣＳ－０１９Ｂについて１．０であった。チューブＡ１～Ｄ１およびＥ１～Ｈ１（ＣＳ－０１９Ａ）の平均ＤＮＡ濃度はそれぞれ９．４ｎＭおよび１０．４ｎＭであった。１０．４を９．４で割れば、正規化係数はほぼ１．１となる。チューブＡ２～Ｄ２およびＥ２～Ｈ２（ＣＳ－０１９Ｂ）の平均ＤＮＡ濃度は、それぞれ９．８ｎＭおよび９．７ｎＭであった。９．８を９．７で割れば、正規化係数はほぼ１．０となる。
【0112】
（実施例１０）
本実施例では、異なる濃度を有するＮＧＳ用ＤＮＡ試料（またはライブラリー）を正規化した。本実施例は、濃度にばらつきがある核酸ライブラリーをナノ粒子ＮＰを用いて正規化することによってＮＧＳプロトコルを改善することができ、その結果、より高い試料処理量と、削減された配列決定装置の時間およびコストとがもたらされることをさらに示す。ＮＧＳ装置のプラットフォームは、一般に、配列決定装置にロードされる特定の濃度の核酸を必要とする。濃度が低すぎたり高すぎたりすると、配列データの出力および品質が低下する。濃度にばらつきがあるＮＧＳ用核酸を正規化するために、いくつかの既存のアプローチがある。これらには、分光光度法、蛍光測定、定量ＰＣＲ、または電気泳動による核酸定量と、それに続く所望の濃度の計算、および正規化された濃度へのすべての試料のさらなる希釈とが含まれる。以下のＮＧＳデータ比較は、電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ社のＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ装置）と比較して、ナノ粒子ＮＰ正規化の品質が同等以上であることを示す。
本実施例では、異なる濃度を有するＮＧＳ用ＤＮＡ試料（またはライブラリー）を正規化した。本実施例は、濃度にばらつきがある核酸ライブラリーをナノ粒子ＮＰを用いて正規化することによってＮＧＳプロトコルを改善することができ、その結果、より高い試料処理量と、削減された配列決定装置の時間およびコストとがもたらされることをさらに示す。ＮＧＳ装置のプラットフォームは、一般に、配列決定装置にロードされる特定の濃度の核酸を必要とする。濃度が低すぎたり高すぎたりすると、配列データの出力および品質が低下する。濃度にばらつきがあるＮＧＳ用核酸を正規化するために、いくつかの既存のアプローチがある。これらには、分光光度法、蛍光測定、定量ＰＣＲ、または電気泳動による核酸定量と、それに続く所望の濃度の計算、および正規化された濃度へのすべての試料のさらなる希釈とが含まれる。以下のＮＧＳデータ比較は、電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ社のＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ装置）と比較して、ナノ粒子ＮＰ正規化の品質が同等以上であることを示す。
【0113】
実施例８に記載されている正規化手順を、実施例１に従って調製したシリカ被覆磁性ナノ粒子（ナノ粒子ロットＣＳ－０１９）で使用した。
【0114】
結果を図１１Ａ～図１１Ｊに示す。これらの図において、ＢＮはナノ粒子ＮＰ正規化ライブラリーを指し、ＴＳはＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ正規化ライブラリーを指す。図１１ＡはＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ分析の結果を示す。
【0115】
図１１Ｂは、「ｂａｍカウント」を示す。ｂａｍカウントは、遺伝子、エクソン、転写物などの標的とする各特徴にマッピングされた配列リードの数である。ｂａｍカウントは、ＴＳ正規化ライブラリーと比較してナノ粒子ＮＰ正規化ライブラリーでは低かったが、より均一であった。
【0116】
図１１Ｃは、正規化ライブラリーの複雑さを示す。これは、所定の実験計画によって生じる偏りの量を反映する。ライブラリーの複雑さに関しては、理想は、原材料のもともとの複雑さを忠実に反映する非常に複雑なライブラリーである。ほぼ等しい変動係数によって示されるように、ナノ粒子ＮＰ正規化とＴＳ正規化は、等しい複雑さを生じた。ナノ粒子ＮＰ正規化ライブラリーとＴＳ正規化ライブラリーは、等しく複雑である。
【0117】
図１１Ｄは、正規化ライブラリーの均一性を示す。これは、リード深度が、平均領域標的カバレッジ深度を規定回数超える標的塩基位置の割合である。ナノ粒子ＮＰ正規化ライブラリーはＴＳ正規化ライブラリーよりも均一であった。
【0118】
図１１Ｅは、正規化ライブラリーのカバレッジを示す。標的領域内の特定の塩基が配列データで示される回数はカバレッジまたはカバレッジ深度と呼ばれる。「倍」の前の数はカバレッジ（ゲノムが配列決定される平均回数）である。たとえば、３０倍の全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）を行う場合、「３０倍」は、全ゲノムを平均３０回配列決定することを意味する。２０倍および３０倍カバレッジの両方で、ナノ粒子ＮＰ正規化とＴＳ正規化は等しい結果を示す。
【0119】
図１ＩＦは、「ｆｏｌｄ ８０」塩基対ペナルティを示す。これは、８０％の標的塩基が平均カバレッジを達成するのを確実にするのに必要な追加の配列決定のｆｏｌｄである。オンターゲット率が低いほど、またはｆｏｌｄ－８０が高いほど、捕捉の非効率性および無駄な配列決定が多くなる。ナノ粒子ＮＰ正規化では平均「ｆｏｌｄ ８０」が３であったのに対し、ＴＳ正規化では平均「ｆｏｌｄ ８０」が３．２５であった。これは、ナノ粒子ＮＰ正規化ライブラリーでは、ＴＳ正規化ライブラリーと比較して、より少ない配列決定しか必要としないことを意味する。ｆｏｌｄ ８０の数が低いほど、よい結果となる。
【0120】
図１１Ｇは、正規化ライブラリーにおける重複を示す。複数の配列決定リードが、３’末端および５’末端の座標を含む正確な同じ位置にマッピングされる場合、それらは重複リードとみなされる。重複率は、特定のデータセットにおいてマークされたマップリードの割合である。オーバーラップリードと対照的に、重複リードは追加情報を提供せず、バイオインフォマティクス分析中配列決定データから除去され、これは、重複排除として知られているプロセスである。ナノ粒子ＮＰ正規化とＴＳ正規化は、等しい重複値を与える。
【0121】
図１１Ｈは、ＡＴ／ＧＣドロップアウト（ｄｒｏｐｏｕｔ）を示す。ＡＴ／ＧＣドロップアウトメトリクスは、ＡＴまたはＧＣ含量に基づく特定の領域の不十分なカバレッジの程度を示す。ナノ粒子ＮＰ正規化ライブラリーおよびＴＳ正規化ライブラリーの場合、これらのメトリクスの値は等しかった。
【0122】
図１１Ｉは平均挿入サイズを示す。挿入サイズは、配列決定される長さであり、かつアダプター間に「挿入される」ＤＮＡ（またはＲＮＡ）の長さである。ナノ粒子ＮＰ正規化ライブラリーの場合、平均挿入サイズは２２０ｂｐであり、ＴＳ正規化ライブラリーの場合、平均挿入サイズは１９０ｂｐであり、ナノ粒子ＮＰ正規化のほうが３０ｂｐ高いという違いがあった。
【0123】
図１１Ｊは、正規化ライブラリーのオンターゲット値を示す。パーセントオンターゲット塩基は、標的領域にマップする塩基の数であり、パーセントオンターゲットリードは、標的領域に１塩基でもオーバーラップするすべての配列決定リードを含む。標的領域内に含まれる塩基またはリードが多いほど、全体のオンターゲット率は高くなり、高いプローブ特異性、高品質なプローブ、およびハイブリダイゼーションに基づく効率的なターゲット濃縮を示す。ナノ粒子ＮＰ正規化ライブラリーとＴＳ正規化ライブラリーの差はわずか０．０３％であった。
【0124】
本開示を考慮すれば、本方法、組成物、およびシステムは本技術に従って実施することができることに留意されたい。さらに、様々な成分、材料、構造およびパラメータは、例示としてのみ含まれ、いかなる限定的な意味においても含まれない。本開示を考慮すれば、本技術は他の用途に実施することができ、これらの用途を実施するための成分、材料、構造および装置は、添付の特許請求の範囲に留まりながら決定することができる。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図2H】
【図2I】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図8F】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図11E】
【図11F】
【図11G】
【図11H】
【図11I】
【図11J】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【国際調査報告】