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特表2024-537024骨形態形成タンパク質及び受容体のｍＲＮＡ誘導発現及びこれに関する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-10
(54)【発明の名称】骨形態形成タンパク質及び受容体のｍＲＮＡ誘導発現及びこれに関する方法
(51)【国際特許分類】
A61L 27/36 20060101AFI20241003BHJP
A61P 19/08 20060101ALI20241003BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241003BHJP
A61K 47/22 20060101ALI20241003BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20241003BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20241003BHJP
A61K 47/46 20060101ALI20241003BHJP
A61L 27/24 20060101ALI20241003BHJP
A61K 38/18 20060101ALN20241003BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20241003BHJP
【ＦＩ】
A61L27/36 110
A61P19/08
A61K48/00
A61K47/22
A61K47/18
A61K47/24
A61K47/46
A61L27/24
A61L27/36 311
A61K38/18
C12N15/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024518500
(86)(22)【出願日】2022-10-03
(85)【翻訳文提出日】2024-05-21
(86)【国際出願番号】 US2022077467
(87)【国際公開番号】W WO2023060041
(87)【国際公開日】2023-04-13
(31)【優先権主張番号】63/252,373
(32)【優先日】2021-10-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524108525
【氏名又は名称】デー、アレグザーンダー
(71)【出願人】
【識別番号】524108536
【氏名又は名称】マリン、ブラドフォッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000877
【氏名又は名称】弁理士法人ＲＹＵＫＡ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】デー、アレグザーンダー
(72)【発明者】
【氏名】マリン、ブラドフォッド
【テーマコード（参考）】
4C076
4C081
4C084
【Ｆターム（参考）】
4C076AA61
4C076BB32
4C076CC09
4C076DD49
4C076DD60
4C076DD63
4C076EE57
4C076FF68
4C081AB02
4C081BB06
4C081CD121
4C081CD28
4C081CD34
4C081CE02
4C081CE11
4C084AA13
4C084DB60
4C084MA67
4C084NA14
4C084ZA961
4C084ZA962
(57)【要約】
【要約】
少なくとも骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）及び／又はＢＭＰ受容体をコードする合成メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を調製する段階を含む方法及び治療。合成ｍＲＮＡは、脂質又は脂質誘導担体において脂質可溶化されている。術中に骨採取サンプルが取得され、脂質可溶化ｍＲＮＡでインキュベートされる。骨採取サンプルは、脂質可溶化ｍＲＮＡの少なくとも一部を取り込み、それにより、活性化ＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲ材料を形成する。活性化ＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲ材料は、術中に骨融合床に送達され得る。
少なくとも骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）及び／又はＢＭＰ受容体をコードする合成メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を調製する段階を含む方法及び治療。合成ｍＲＮＡは、脂質又は脂質誘導担体において脂質可溶化されている。術中に骨採取サンプルが取得され、脂質可溶化ｍＲＮＡでインキュベートされる。骨採取サンプルは、脂質可溶化ｍＲＮＡの少なくとも一部を取り込み、それにより、活性化ＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲ材料を形成する。活性化ＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲ材料は、術中に骨融合床に送達され得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）をコードする合成メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を調製する段階；脂質又は脂質誘導担体に前記合成ｍＲＮＡを脂質可溶化させ、それにより、脂質可溶化ｍＲＮＡを形成する段階；
骨採取サンプルを術中に取得する段階；
前記脂質可溶化ｍＲＮＡ及び前記骨採取サンプルを術中にインキュベートする段階、それにより前記骨採取サンプルは前記脂質可溶化ｍＲＮＡの少なくとも一部を取り込み、それにより活性化ＢＭＰ材料を形成する；
前記活性化ＢＭＰ材料を骨融合床に術中に送達する段階
を備える、方法。
【請求項2】
前記ＢＭＰが、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＢＭＰがＢＭＰ２である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記脂質又は脂質誘導担体が、テトラキス（８－メチルノニル）３，３'、３''，３'''－（（（メチルアザンジイル）ビス（プロパン－３，１ジイル））ビス（アザントリイル））テトラプロピオネート；デシル（２－（ジオクチルアンモニオ）エチル）フォスフェート（９Ａ１Ｐ９）；エチル５，５－ジ（（Ｚ）－ヘプタデカ－８－エン－１－イル）－１－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－２－カルボキシレート（Ａ２－Ｉｓｏ５－２ＤＣ１８）；エチル５，５－ジ（（Ｚ）－ヘプタデカ－８－エン－１－イル）－１－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－２－カルボキシレート（Ａ２－Ｉｓｏ５－２ＤＣ１８）；（（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート）（ＡＬＣ－０３１５）；２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド（ＡＬＣ－０１５９）；β－シトステロール，（３Ｓ，８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）－１７－（（２Ｒ，５Ｒ）－５－エチル－６－メチルへプタン－２－イル）－１０，１３－ジメチル－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－オール；ビス（２－（ドデシルジスルファニル）エチル）３，３'－（（３－メチル－９－オキソ－１０－オキサ－１３，１４－ジチア－３，６－ジアザヘキサコシル）アザンジイル）ジプロピオネート（ＢＡＭＥ Ｏ１６Ｂ）；２－（（（（（３Ｓ，８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）カルボニル）アミノ）－Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ－メチルエタン－１－アミニウムブロミド（ＢＨＥＭ－コレステロール）；１，１'－（（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン－２－オール）（Ｃ１２－２００）；３，６－ビス（４－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）ピペラジン－２，５－ジオン（ｃＫＫ－Ｅ１２）；３β－［Ｎ－（Ｎ'，Ｎ'－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－コレステロール）；（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）；１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２－（スペルミンカルボキシアミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）；１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）；１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＭＡ）；１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；エチルホスファチジルコリン（ｅＰＣ）；ヘキサ（オクタン－３－イル）９，９'，９''，９'''，９''''，９'''''－（（（（ベンゼン－１，３，５－トリカルボニル）イリス（アザンジイル）トリス（プロパン－３，１－ジイル）トリス（アザントリイル））ヘキサノナノエート（ＦＴＴ５）；ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート（Ｌｉｐｉｄ Ｈ（ＳＭ－１０２））；（（（３，６－ジオキソピペラジン－２，５－イイル）ビス（ブタン－４，１－ジイル））ビス（アザントリイル））テトラキス（エタン－２，１－ジイル）（９Ｚ，９'Ｚ，９''Ｚ，９'''Ｚ，１２Ｚ，１２'Ｚ，１２''Ｚ，１２'''Ｚ）－テトラキス（オクタデカ－９，１２－ジエノエート）（ＯＦ－Ｄｅｇ－Ｌｉｎ）；１，２－ジミリストイル－ラク－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ）；Ｎ１，Ｎ３，Ｎ５－トリス（３－（ジドデシルアミノ）プロピル）ベンゼン－１，３，５－トリカルボキシアミド（ＴＴ３）；及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記骨採取サンプルが、骨粉、骨片、骨髄、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記骨採取サンプルが、骨粉及び骨髄の組み合わせ、骨粉及び骨片の組み合わせ、又は骨片及び骨髄の組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記骨採取サンプルが、骨粉、骨片、及び骨髄の組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記骨融合床が長骨又は脊椎骨に位置している、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記活性化ＢＭＰ材料が、スカフォールドに移送され、その後、前記送達が実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記スカフォールドがコラーゲンマトリックスで構成されている、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記送達が、皮下ポート及びカテーテルを使用して実行され、前記カテーテルは、前記骨融合床において又はその近くで終端する、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記合成ｍＲＮＡが、骨形態形成タンパク質受容体を更にコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
少なくとも骨形態形成タンパク質受容体（ＢＭＰＲ）をコードする合成メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を調製する段階；脂質又は脂質誘導担体に前記合成ｍＲＮＡを脂質可溶化させ、それにより、脂質可溶化ｍＲＮＡを形成する段階；
骨採取サンプルを術中に取得する段階；
前記脂質可溶化ｍＲＮＡ及び前記骨採取サンプルを術中にインキュベートする段階、それにより前記骨採取サンプルは前記脂質可溶化ｍＲＮＡの少なくとも一部を取り込み、それにより活性化ＢＭＰＲ材料を形成する；
前記活性化ＢＭＰＲ材料を骨融合床に術中に送達する段階
を備える、方法。
【請求項14】
前記ＢＭＰＲがＢＭＰＲタイプ１である、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記骨採取サンプルが、骨粉、骨片、骨髄、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項16】
前記骨採取サンプルが、骨粉及び骨髄の組み合わせ、骨粉及び骨片の組み合わせ、又は骨片及び骨髄の組み合わせである、請求項１３に記載の方法。
【請求項17】
前記骨採取サンプルが、骨粉、骨片、及び骨髄の組み合わせである、請求項１３に記載の方法。
【請求項18】
前記骨融合床が長骨又は脊椎骨に位置している、請求項１３に記載の方法。
【請求項19】
前記活性化ＢＭＰＲ材料が、スカフォールドに移送され、その後、前記送達が実行される、請求項１３に記載の方法。
【請求項20】
前記送達が、皮下ポート及びカテーテルを使用して実行され、前記カテーテルは、前記骨融合床において又はその近くで終端する、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は、「ｍＲＮＡ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ Ｐｅｒｉｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ Ｈａｒｖｅｓｔｅｄ Ｂｏｎｅ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ」と題する、２０２１年１０月５日出願の米国特許出願第６３／２５２，３７３号の優先権を主張する。
【0002】
本開示は、１つ又は複数のタンパク質及び関連するタンパク質受容体のｍＲＮＡ誘導発現及びこれに関する方法に関する。より具体的には、本開示は、自家骨採取サンプル内での骨形態形成タンパク質及び骨形態形成タンパク質受容体の内因性合成ｍＲＮＡ誘導過剰発現に関する。
【背景技術】
【0003】
骨形態形成タンパク質（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＭＰ）は、様々な組織における広範囲の生物学的活動に不可欠な天然の成長因子であり、特に、骨及び軟骨形成細胞の誘導における重要なシグナル分子である。そのため、ＢＭＰは、骨形成、骨（例えば、長骨）の偽関節、脊椎固定、及び任意の他の骨融合（例えば、顔の骨融合）（別途示されない限り、集合的に「骨融合」）を含め、様々な整形外科的処置に対して貴重な治療可能性を呈する。骨融合の整形外科的処置は、現行の自家骨移植方法の骨移植に代替物の必要性に起因して、ＢＭＰについて特に関心を持たれている。現行の自家骨移植方法は、局所部位採取（すなわち、損傷の位置、又はその近くにおける）又はドナー部位採取（すなわち、典型的には腸骨稜（骨盤）の骨である、損傷以外の位置における）を利用し、これは、同種骨材料と組み合わされることが多い。これらの現行の方法では、最大３０％の偽関節率が報告されており、ドナー部位の相当な罹患率に関連付けられており、したがって、患者に対して深刻なリスクを呈している。ＢＭＰは、現行の自家移植方法の必要性を排除し、したがって、偽関節の割合及び率を潜在的に低下させることによって有望な代替物を提供する。実際、脊椎固定におけるＢＭＰの有効性の利用可能な臨床前研究は、ＢＭＰが、ヒトを含む動物レベルにおいて偽関節率が低下した、腸骨稜の自家骨移植に対する有効な代替物となり得ることを実証している。また、そのような研究は、ＢＭＰの使用により、腸骨稜の自家骨移植と比較して、手術時間の短縮、失血の低下、及び入院時間の短縮がもたらされ得ることを実証している。
【0004】
２００２年に、米国食品医薬品局（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ：ＦＤＡ）は、腰部融合デバイスを使用した前腰部椎体間固定のためのＢＭＰの使用を承認した。その後、承認適応症外使用が劇的に増加し、例えば２００６年までに米国において全ての脊椎固定について最大２５％の使用が報告された。関連付けられる合併症が追従し、これには、異所骨形成、ＢＭＰに対して発生する中和抗体、椎骨溶解、及び重度の炎症（例えば、漿液腫の形成、神経根炎、脊髄膨大）が含まれる。これに対して、２００８年に、ＦＤＡは、更なる研究が実施されるまで、全ての頸部の脊椎固定治療でのＢＭＰの承認適応症外使用、及びより一般に、全ての骨融合治療に対するＢＭＰの使用をしないよう忠告した。しかしながら、脊椎固定を含む骨融合のためのＢＭＰの使用は未だに普及している。
【0005】
外科的なコンテキストにおけるＢＭＰの使用のための現行の方法は、骨形成及び脊椎固定を誘導するためのその超生理的濃度を含み、当該超生理的濃度において組換えヒトＢＭＰがコラーゲンマトリックスに結合して、融合部位に埋め込まれる。「バースト」にある超生理的濃度は、ＢＭＰに関連付けられる短い半減期（例えば、ＢＭＰ２は約７～１６分間の半減期を有する）の観点から治療の有効性を実現するために使用される。コラーゲンマトリックスは経時的に化学変化を起こすため、一定の高濃度のＢＭＰが放出される（例えば、１．５ｍｇ／ｍｌ）。しかしながら、現行の方法は非特異的であり、ＢＭＰ作用を骨形成細胞の活性に対するものに制限することができない（例えば、標準的でないシグナリング、融合部位の外部にある周囲の組織への漏れ）。また、様々な副作用が、現行の方法に従って溶出したそのような高濃度のＢＭＰに関連付けられており、これには、炎症性サイトカイン及びケモカインの発現の活性化、破骨細胞（骨を劣化させる）の活性化、及び脂肪生成シグナリングの活性化による、不可欠な器官系の機能に対する干渉が含まれる。研究は、偽関節の増加という犠牲が伴うものの、ＢＭＰの濃度の低減によりこれらの副作用が低減され得ることを示している。
【0006】
したがって、偽関節率を犠牲にすることなく、副作用を回避するために、脊椎及び他の骨融合を治療するための、低いＢＭＰ濃度でのＢＭＰの使用の標的化した手法に対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【0007】
本開示のこれら及び他の特徴及び特性、及びそれらの有利な用途及び／又は使用は、以下の詳細な説明から明らかとなろう。
【0008】
１つ又は複数の態様において、本開示は、少なくとも骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）をコードする合成メッセンジャーリボ核酸（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ：ｍＲＮＡ）を調製する段階；脂質又は脂質誘導担体に前記合成ｍＲＮＡを脂質可溶化させ、それにより、脂質可溶化ｍＲＮＡを形成する段階；骨採取サンプルを術中に取得する段階；前記脂質可溶化ｍＲＮＡ及び前記骨採取サンプルを術中にインキュベートする段階、それにより前記骨採取サンプルは前記脂質可溶化ｍＲＮＡの少なくとも一部を取り込み、それにより活性化ＢＭＰ材料を形成する；前記活性化ＢＭＰ材料を骨融合床に術中に送達する段階を含む方法を提供する。
【0009】
１つ又は複数の態様において、本開示は、少なくとも骨形態形成タンパク質受容体（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＢＭＰＲ）をコードする合成メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を調製する段階；脂質又は脂質誘導担体に前記合成ｍＲＮＡを脂質可溶化させ、それにより、脂質可溶化ｍＲＮＡを形成する段階；骨採取サンプルを術中に取得する段階；前記脂質可溶化ｍＲＮＡ及び前記骨採取サンプルを術中にインキュベートする段階、それにより前記骨採取サンプルは前記脂質可溶化ｍＲＮＡの少なくとも一部を取り込み、それにより活性化ＢＭＰＲ材料を形成する；前記活性化ＢＭＰＲ材料を骨融合床に術中に送達する段階を含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0010】
当業者が本明細書の主題を作成及び使用することを支援するために、添付図面を参照する。以下の図面は、本開示の特定の態様を示すために含まれており、排他的な構成として見られるべきではない。開示される主題は、本開示の利点を有する当業者が思いつくように、形態及び機能における相当な修正、変更、組み合わせ、及び等価物が可能である。
【0011】
【図1】本開示の１つ又は複数の態様による、ＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲの過剰発現のための脂質担体のｍＲＮＡトランスフェクションの概略図である。
【0012】
【図2】本開示の１つ又は複数の態様による、整形外科的手術中に、術中の自家融合処置を実行する方法のフローチャートである。
【0013】
【図3】本開示の１つ又は複数の態様による、融合床へのＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲ ｍＲＮＡ材料の送達のための構成例である。
【0014】
【図4A】本開示の１つ又は複数の態様による、融合床へのＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲ ｍＲＮＡ材料の送達のための構成例である。
【図4B】本開示の１つ又は複数の態様による、融合床へのＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲ ｍＲＮＡ材料の送達のための構成例である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本開示は、タンパク質及びその受容体のｍＲＮＡ誘導発現及びこれに関する方法に関する。より具体的には、本開示は、自家骨採取サンプル内での骨形態形成タンパク質（「ＢＭＰ」）及び骨形態形成タンパク質受容体（「ＢＭＰＲ」）の内因性合成ｍＲＮＡ誘導過剰発現に関する。
【0016】
本開示は、ＢＭＰ及びＢＭＰＲに関する本明細書の方法を議論するが、本明細書で説明する方法は、他のタンパク質及び受容体のｍＲＮＡ誘導発現に等しく適用可能であることが理解されるべきである。本開示の範囲から逸脱することなく、そのようなタンパク質及び受容体は同化サイトカインを含み得るがこれに限定されない。
【0017】
本開示は、収集した自家骨採取サンプルからのＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲのｍＲＮＡ誘導発現のための方法論及びこれに関する治療の方法論を提供する。骨採取サンプルは、骨採取サンプルの骨形成細胞内の適切なＢＭＰ及びＢＭＰＲの過剰発現を引き起こし、それにより「活性化ＢＭＰ材料」又は「ａＢＭＰ」をもたらす、目的の１つ又は複数のＢＭＰタイプ及び／又は目的のＢＭＰＲタイプをコードする脂質可溶化ｍＲＮＡを用いて治療される。本明細書で説明する方法論は、限定するものではないが、骨形成、骨融合、脊椎固定、及びこれらの任意の組み合わせに適用可能である。
【0018】
「活性化ＢＭＰ材料」又は「ａＢＭＰ材料」という用語及びそれらの文法的な変異形は、本明細書において使用される場合、目的の１つ又は複数のＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲタイプ（いずれか又は両方）をコードする脂質可溶化ｍＲＮＡでトランスフェクトされた骨採取サンプルを指す。
【0019】
本開示は、ＢＭＰ及びＢＭＰＲ発現の同種ｍＲＮＡ誘導のためのＭＳＣ（間葉系幹細胞）の自家ソースとして具体的に骨採取サンプルを利用する。ｍＲＮＡで治療された骨採取材料は、骨融合床に移植（又は別様に導入）されてよく、ここで、ＢＭＰ又はＢＭＰＲタンパク質は、ａＢＭＰ材料から骨融合床に分泌されて、本明細書において以下でより詳細に説明するように、血管新生及び骨形成細胞の活性化を局所的に刺激する。
【0020】
現行の方法論とは異なり、本開示のＢＭＰのｍＲＮＡ誘導性の内因性発現を通した治療は、有利には、ながら、有効性及び偽関節率の低減を確実にしながら、副作用（例えば、上記のような、骨以外の生物学との干渉、患者の反応など）低減させる局所的治療を提供する。１つ又は複数の態様において、本開示の方法は、それらの間の任意の値及びサブセットを包含する、０％の偽関節から約５％未満の偽関節を含む約５％未満の偽関節の範囲などに、偽関節率を実質的に低下させると信じられている。他の態様において、本開示の方法は、少なくとも、本明細書で説明する他の副作用を伴わずに、現在のｒｈＢＭＰ治療によって得られるような最大３０％の現在の偽関節率をもたらす。有利には、本明細書で説明する内因性ｍＲＮＡ ａＢＭＰ材料治療は、現行の骨融合治療と比較して、外因的に発現された組換えタンパク質に存在する汚染物質、タンパク質凝集物、又はミスフォールドしたタンパク質の可能性が排除される。本開示の治療は、ｍＲＮＡ ａＢＭＰ材料においてＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲを排他的に過剰発現するため、ＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲの効果を、融合床（周囲の組織に対して）に特異的に標的化することができ、超生理的な投薬及び関連付けられる、あらゆる、又は持続性の副作用を伴わずに骨誘導の利点を実現することができる。
【0021】
また、本開示のａＢＭＰ材料での治療は、独自の術中の方法論を提供し、それにより、患者が、ＢＭＰ治療を受けるために別個の手術を受ける必要が低減され、追加の手術による合併症の可能性が低減され、手術及び労働コストなどが低減される。
定義
定義
【0022】
本明細書の詳細な説明及び特許請求の範囲内の全ての数値は、示された値に関して「約」又は「およそ」によって修飾されており、当業者によって予想されるであろう実験誤差及び変動を考慮している。別途示されない限り、周囲温度（室温又は「ＲＴ」）は約２５℃である。
【0023】
本開示及び特許請求の範囲で使用される場合、別途文脈が明らかに指示しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は複数形を含む。
【0024】
本明細書で「Ａ及び／又はＢ」などの表現で使用される「及び／又は」という用語は、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」、及び「Ｂ」を含むことが意図される。
【0025】
本開示及びこれに対する特許請求の範囲の目的のために、以下の定義が使用されるものとする。
【0026】
本明細書において使用される、「骨採取サンプル」という用語及びその文法的な変異形は、収集された生きた骨組織、例えば、外科的処置中に手術部位又はドナー部位において収集された、生きた自家骨組織を指す。骨採取サンプルは、骨髄、骨片、骨粉、及びこれらの任意の組み合わせを含み得るが、これらに限定されない。
【0027】
「自家」という用語及びその文法的な変異形は、本明細書において使用される場合、同じ個体から取得された組織（又は細胞）を指す。ＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲを過剰発現するようにｍＲＮＡで治療される本開示の骨採取サンプルは、同じ個体から収集されてそれを治療するために使用され、したがって、自家治療において使用するための自家骨採取サンプルである。
【0028】
本明細書において使用される場合、「骨形態形成タンパク質」又は「ＢＭＰ」という用語及びその文法的な変異形は、骨及び軟骨形成の誘導に関与する成長因子であり、タンパク質のトランスフォーミング成長因子ベータ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ：ＴＧＦ－β）に属するタンパク質群を指す。
【0029】
本明細書において使用される場合、「骨形態形成タンパク質受容体」、「ＢＭＰＲ」、又は単に「受容体」という用語、及びその文法的な変異形は、ＴＧＦ－βタンパク質が結合するセリン－スレオニンキナーゼ受容体の群を指す。
【0030】
本明細書において使用される場合、「合成ｍＲＮＡ」という用語及びその文法的な変異形は、酵素媒介転写を使用して線状化デオキシリボ核酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ：ＤＮＡ）鋳型からインビトロで調製されたメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を指す。本開示の合成ｍＲＮＡは、ＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲタンパク質翻訳を媒介する。
【0031】
本明細書において使用される場合、「骨融合床」又は「融合床」という用語及びその文法的な変異形は、外科的介入によって単一の骨構造へと接合されることが意図される、長骨（すなわち、それらの幅より長い）及び椎骨、ならびに他の骨タイプ（例えば、顔、頭蓋骨、肋骨、足根骨、及び中足骨など）を含む、骨又は骨セグメントの間の領域を指す。本開示のａＢＭＰ材料は、そのような融合床に置かれる、又は別様に導入されて、融合床の両側の骨を一緒に成長（「融合」）させる。
ａＢＭＰ材料の調製及びそれを用いた治療の方法
ａＢＭＰ材料の調製及びそれを用いた治療の方法
【0032】
上で提供されるように、ａＢＭＰ材料が調製され、融合床に導入されて、ＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲを分泌し、血管新生、及び骨形成細胞への多能性幹細胞の分化を局所的に刺激し、それにより、骨融合を誘導する。
【0033】
様々な骨採取サンプルのタイプが本開示の１つ又は複数の態様に適用可能であり得る。好適な骨採取サンプルのタイプは、骨髄、骨片、骨粉、及びこれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない。骨髄は、針及び／又は吸引システムを使用することなどによって、椎体又は腸骨稜のいずれかから採取されてよく、術中に収集されてよい。骨片又は骨粉は、椎弓切除（椎骨の背部の除去）及び／又は椎体切除（椎体の全部又は一部の除去）から収集され得る。
【0034】
本開示の１つ又は複数の態様において、骨粉は、単体で、又は他のタイプの骨採取サンプルのうちの１つ又は複数との組み合わで、骨採取サンプルとして利用される。骨粉は、有利には、他の潜在的な構成要素の中でも、生体骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞、骨前駆細胞、及び間葉系（多能性）幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ＭＳＣ）を含む。骨粉は、更に有利には、同化サイトカイン（例えば、インターロイキン１β（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １ ｂｅｔａ：ＩＬ－１β）、インターロイキン６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６：ＩＬ－６）、及び成長因子（例えば、ＴＧＦ－β、血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ））の放出を通して骨誘導特性を実証する。これらの同化サイトカイン及び成長因子は、骨芽細胞（骨形成細胞）の形成に寄与する。したがって、現行の自家移植とは異なる供給源である骨粉の使用は、脊椎及び他の骨融合のための自家骨移植のための有効な供給源として機能することができ、有利には、骨形成細胞を単離し、自家融合移植前に具体的な修正を可能にする。すなわち、骨因子（ＢＭＰ及び他のもの）は、別の組織源からではなく、代わりに、骨自体から選択される。これらの因子はまた、現行の自家骨移植を使用しても存在するが、術中に集められない。
【0035】
自家骨粉は、任意の好適な手段によって患者から取得され得る。患者の不快さを緩和するために骨粉が術中の期間の間に収集され、更に、必要とされる融合の位置（すなわち、手術部位）において骨粉を取得することが特に望ましい場合がある。本開示の１つ又は複数の態様において、本開示の方法論及び治療における使用のための自家骨粉は、Ｓｔｒｙｋｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｂｏｎｅ Ｖａｃ（Ｋａｌａｍａｚｏｏ，ＭＩ）コレクタ又は類似のそのような他のコレクタを使用して取得され得る。骨粉コレクタは、リアルタイムの外科的骨ドリルと同時に骨粉を抽出する（例えば、吸引、バキューム）ために、骨ドリルデバイスに取り付け可能であり得る。
【0036】
本開示は、骨粉採取サンプルを取得し（例えば、Ｓｔｒｙｋｅｒ Ｂｏｎｅ Ｖａｃ又は利用可能な他の骨粉コレクタを使用して）、合成ｍＲＮＡを術中に利用して、骨粉採取サンプル内でＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲ発現（上で言及したものなどのＶＥＧＦ又は他の骨誘導特性も誘導され得る）を誘導するための方法論を提供する。より具体的には、骨粉採取サンプルは、目的の１つ又は複数のＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲタイプをコードする脂質可溶化ｍＲＮＡでインキュベートされ、ここで脂質は、骨採取サンプルの細胞により飲み込まれ、ＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲを過剰発現することが可能である。過剰発現されたタンパク質は骨採取サンプルの細胞から分泌され、血管新生、及び骨形成細胞へのＭＳＣ又は他の幹細胞の分化を局所的に刺激し、骨の成長経路の活性化を促進する。
【0037】
骨髄及び骨片採取サンプルにおいて完全に又は部分的に骨粉の有利な構成要素も追加的に存在し、したがって、本開示の範囲から逸脱することなく、患者が受けている具体的な手術処置に応じて、骨粉に置き換わってよいことに留意されたい。
【0038】
様々なＢＭＰタイプが本開示の１つ又は複数の態様に適用可能であり得る。１つ又は複数の態様において、ＢＭＰ２及び／又はＢＭＰ７が特に適用可能であり得、これは、それらが両方とも、ＦＤＡを通して様々な観点から骨及び脊椎の治療の融合療法における使用のために現在承認されているためである。ＭＳＣからの骨芽細胞の分化の強力な誘導を呈するため、本開示の１つ又は複数の態様における使用のためにＢＭＰ２が特に好ましい場合がある。
【0039】
様々なＢＭＰＲタイプが本開示の１つ又は複数の態様に適用可能であり得る。好適なＢＭＰＲタイプは、ＢＭＰＲタイプ１（例えば、アクチビンＡ受容体タイプ１（ａｃｔｉｖｉｎ Ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ １：ＡＣＶＲ１）、骨形態形成タンパク質受容体タイプ１Ａ（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ １Ａ：ＢＭＰＲ１Ａ）、骨形態形成タンパク質受容体タイプ１Ｂ（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ １Ｂ：ＢＭＰＲ１Ｂ）を含むが、これらに限定されない。
【0040】
ＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲの選択に対する限定は、特定の骨採取サンプル内での特定のＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲの出現率、結合機構及び翻訳率、経済性及び利用可能性の制約など、及びこれらの任意の組み合わせを含み得るが、これらに限定されない。
【0041】
本明細書で提供されるように、本開示の骨採取材料は、目的の１つ又は複数のＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲタイプをコードする脂質可溶化合成ｍＲＮＡを用いて治療される。合成ｍＲＮＡは、５'非翻訳リーダ配列領域（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｇｉｏｎ：ＵＴＲ）及び３'ポリアデニル化配列（ｐｏｌｙＡテール）を組み込む線状化ＤＮＡ鋳型からのＲＮＡ媒介転写を利用する標準的な転写方法に従って調製される。従来の培養培地、例えばダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）、乳酸化リンゲル液、及び生理食塩水など、及びこれらの任意の組み合わせ及び適切な添加物において合成ｍＲＮＡ（室温）を用いて１つ又は複数の脂質担体タイプがインキュベートされて、ｍＲＮＡをカプセル化する。
【0042】
ｍＲＮＡの脂質カプセル化は、脂質又はリポソームナノ粒子（本明細書では集合的に「脂質」と称される）、脂質誘導体ナノ粒子、及びこれらの任意の組み合わせを使用して実現され得る。脂質の例としては、カチオン性脂質であるが、テトラキス（８－メチルノニル）３，３'、３''，３'''－（（（メチルアザンジイル）ビス（プロパン－３，１ジイル））ビス（アザントリイル））テトラプロピオネート；デシル（２－（ジオクチルアンモニオ）エチル）フォスフェート（９Ａ１Ｐ９）；エチル５，５－ジ（（Ｚ）－ヘプタデカ－８－エン－１－イル）－１－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－２－カルボキシレート（Ａ２－Ｉｓｏ５－２ＤＣ１８）；エチル５，５－ジ（（Ｚ）－ヘプタデカ－８－エン－１－イル）－１－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－２－カルボキシレート（Ａ２－Ｉｓｏ５－２ＤＣ１８）；（（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート）（ＡＬＣ－０３１５）；２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド（ＡＬＣ－０１５９）；β－シトステロール，（３Ｓ，８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）－１７－（（２Ｒ，５Ｒ）－５－エチル－６－メチルへプタン－２－イル）－１０，１３－ジメチル－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－オール；ビス（２－（ドデシルジスルファニル）エチル）３，３'－（（３－メチル－９－オキソ－１０－オキサ－１３，１４－ジチア－３，６－ジアザヘキサコシル）アザンジイル）ジプロピオネート（ＢＡＭＥ Ｏ１６Ｂ）；２－（（（（（３Ｓ，８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）カルボニル）アミノ）－Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ－メチルエタン－１－アミニウムブロミド（ＢＨＥＭ－コレステロール）；１，１'－（（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン－２－オール）（Ｃ１２－２００）；３，６－ビス（４－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）ピペラジン－２，５－ジオン（ｃＫＫ－Ｅ１２）；３β－［Ｎ－（Ｎ'，Ｎ'－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－コレステロール）；（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）；１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２－（スペルミンカルボキシアミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）；１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）；１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＭＡ）；１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；エチルホスファチジルコリン（ｅＰＣ）；ヘキサ（オクタン－３－イル）９，９'，９''，９'''，９''''，９'''''－（（（（ベンゼン－１，３，５－トリカルボニル）イリス（アザンジイル）トリス（プロパン－３，１－ジイル）トリス（アザントリイル））ヘキサノナノエート（ＦＴＴ５）；ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート（Ｌｉｐｉｄ Ｈ（ＳＭ－１０２））；（（（３，６－ジオキソピペラジン－２，５－イイル）ビス（ブタン－４，１－ジイル））ビス（アザントリイル））テトラキス（エタン－２，１－ジイル）（９Ｚ，９'Ｚ，９''Ｚ，９'''Ｚ，１２Ｚ，１２'Ｚ，１２''Ｚ，１２'''Ｚ）－テトラキス（オクタデカ－９，１２－ジエノエート）（ＯＦ－Ｄｅｇ－Ｌｉｎ）；１，２－ジミリストイル－ラク－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ）；Ｎ１，Ｎ３，Ｎ５－トリス（３－（ジドデシルアミノ）プロピル）ベンゼン－１，３，５－トリカルボキシアミド（ＴＴ３）；及びこれらの任意の組み合わせに限定されないカチオン性脂質が挙げられ得る。
【0043】
選択された脂質可溶化ＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲ ｍＲＮＡは、１つ又は複数の術中に取得された骨採取サンプルでインキュベートされて、本明細書で説明するａＢＭＰ材料を生成する。インキュベーションは、約３５℃～約３７℃など、それらの間の任意の値及びサブセットを包含する、約３５℃～約３９℃の範囲内の温度で、生理食塩水、５％のグルコース溶液、又は、骨移植材料の周術期の保管のための他の好適な培地中で行われてよい。いくつかの事例において、インキュベーション温度は、３７℃±１℃、例えば約３６℃、約３６．１℃、３６．２℃、３６．３℃、３６．４℃、３６．５℃、３６．６℃、３６．６℃、３６．７℃、３６．８℃、３６．９℃、又は３７℃であり得る。
【0044】
ａＢＭＰ材料は、それらの間の任意の値及びサブセットを包含する、少なくとも３０分間～約６時間、例えば少なくとも３０分間～少なくとも約４時間、術中にインキュベートされ、融合床に直接、又はその近くに注入され、ここで、ａＢＭＰ材料は、骨採取サンプルの膜から分泌されたＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲを、融合床部位における修復及び融合のために過剰発現する。注入は、融合床で、又はその近くで終端する皮下ポート及びカテーテルを使用して実行されてよく、又は代替的には、ａＢＭＰ材料は、スカフォールドに移送されて、融合床部位に直接インプラントされてよい（例えば、融合床が露出している場合）。皮下ポート及びカテーテルにより、複数回の用量が経時的に投与されることが可能になり得、これは、仮関節の場合に特に有益であり得る。１つ又は複数の事例において、本開示の範囲から逸脱することなく、ａＢＭＰ材料ではなく、ＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲ ｍＲＮＡ又は脂質可溶化ＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲ ｍＲＮＡが融合床に直接導入されてよい。
【0045】
スカフォールド材料は生体適合性であり、特に制限されるものと見なされない；それらは、生体適合性の天然及び合成ポリマー、生体適合性の無機セラミック、生体適合性の金属、及びこれらの任意の組み合わせを含み得るが、これらに限定されない。例えば、好適なスカフォールドの具体例としては、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、オクタカルシウムホスフェート二相性カルシウムホスフェート、ウイトロカイト、バイオガラス、キトサン、コラーゲン、ゼラチン、アルギネート、ヒアルロン酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸－ポリグリコール酸、ポリ－ε－カプロラクトン、チタンメッシュ、ステンレス鋼メッシュ、コバルト系メッシュ、多孔性タンタル、及びマグネシウムメッシュなど、及びこれらの任意の組み合わせを含み得るが、これらに限定されない。いくつかの事例において、スカフォールドは３Ｄプリントされていてよく、例えば、チタンスカフォールドの３Ｄプリントであってよいが、生体適合性であり、３Ｄプリントが可能な他の材料も、本開示の範囲から逸脱することなく利用されてよい。
【0046】
ここで図１を参照すると、本開示の１つ又は複数の態様による、ＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲの過剰発現のための脂質担体のｍＲＮＡトランスフェクションの概略図１００が示される。ＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲをコードするｍＲＮＡ１０２は、脂質担体１０４に脂質可溶化され、ここで、ＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲタンパク質１０６はそれにより過剰発現される。骨採取サンプル１０８は術中に取得され、例えば骨粉を含んでよい。骨採取サンプル１０８は、他の細胞の中でもとりわけ、骨細胞１１０及び骨芽細胞１１２を含み、これらは各々、ＢＭＰＲ１１４（Ｙ形状）を含み得る。骨採取サンプル１０８は、ＢＭＰ１１６（三日月形状）を更に含み得る。脂質可溶化ｍＲＮＡ（１０２、１０４、及び１０６）は、骨採取サンプル１０８でインキュベートされる（右矢印）。ＢＭＰ ｍＲＮＡが使用される場合、ａＢＭＰ材料１１８においてＢＭＰの過剰発現が生じる；ＢＭＰＲ ｍＲＮＡが使用される場合、ａＢＭＰ材料１２０においてＢＭＰＲの過剰発現が生じる。ＢＭＰ ｍＲＮＡ及びＢＭＰＲ ｍＲＮＡの組み合わせも使用され得る。
【0047】
本開示の１つ又は複数の態様において、ＢＭＰＲ ｍＲＮＡは、それらの脱リン酸化及び／又はエンドサイトーシスを防止するために修飾されてよい。これらの修飾は、Ｎ１－メチルシュード－ウリジン－５'－三リン酸でのウリジン－５'－三リン酸の置換、ポリ（Ａ）テール延長、５'キャップアナログ付加、及び５'及び３'－ＵＴＲ領域の最適化を含むが、これらに限定されない。これらの修飾により、ｍＲＮＡの翻訳及び半減期が高められ、免疫原性が回避される。それに際して、かつ、ＢＭＰが内因的に発現されるため、上記で議論したように、融合部位におけるａＢＭＰ材料のＢＭＰ信号が有効に高められて、短い半減期に対して反作用し得る。融合部位に適用されたａＢＭＰ材料のＢＭＰ発現を高めることにより、ＢＭＰ濃度を更に低減させて、高いＢＭＰ濃度に関連付けられる有害反応と更に戦い得る。本開示の１つ又は複数の態様において、ＢＭＰ ｍＲＮＡ及び／又はＢＭＰＲ ｍＲＮＡは、例えば単体で、又は以前に説明したＢＭＰＲ ｍＲＮＡとの組み合わせで化学的に改変されて、免疫応答を回避して安定性を増加させ得る。化学的修飾は、ポリＡテールの延長及び／又はポリウリジン置換（例えば、Ｎ１－メチルシュード－ウリジン－５'－三リン酸でのウリジン－５'－三リン酸の置換）を含み得る。
【0048】
ここで図２を参照すると、本開示の１つ又は複数の態様による、整形外科的手術中に術中自家融合処置２００を実行する方法の図である。処置は、１つ又は複数の骨採取サンプル２０２の収集を含む。本明細書で提供されるように、骨採取サンプル２０２は、骨粉、骨片、及び／又は骨髄を含み得る。骨粉及び骨片は、椎弓切除又は椎体切除から収集され得る；骨髄は、椎体又は腸骨稜のうちの１つ又は複数から、針又は吸引システムを通して収集され得る。収集された骨採取サンプルは、１つ又は複数のＢＭＰ ｍＲＮＡ及び／又はＢＭＰＲ ｍＲＮＡタイプ１０６でトランスフェクトされた脂質担体と結合されて、約３７℃（例えば、３６．９℃）の温度の水浴中での少なくとも３０分間の時間にわたる滅菌インキュベーション後にａＢＭＰ２０８を生成する。このインキュベーション時間の間、ＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲ ｍＲＮＡをカプセル化する脂質が、骨採取サンプルの細胞によって取り込まれる。１つ又は複数の態様において、例えば、目的の細胞が利用されることを確実にするために、インキュベーションの前に、骨採取サンプルの細胞が任意に遠心分離を使用して分離され得る２０２ａ。
【0049】
図２を引き続き参照すると、インキュベートされたａＢＭＰ材料が融合床（例えば、長骨又は椎骨）に送達される２１０。ａＢＭＰは、皮下ポートを使用した注入によって、又は代替的には、スカフォールド担体、例えばコラーゲンマトリックスを利用することによって、又はそれらの組み合わせなどによって、融合床に直接導入され得る。
【0050】
図３は、本開示の１つ又は複数の態様による、融合床へのＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲ ｍＲＮＡ材料の送達のための構成例３００を示す。構成３００は、図２の融合床への送達２１０に対応する。特に、図３は、皮膚３０４を通して位置し、本開示のＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲ ｍＲＮＡ材料の投与のためにカテーテル３０６に連結された皮下ポート３０２の使用を示す。カテーテル３０６の端部は、ＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲ ｍＲＮＡ材料の送達のために、長骨３１０（例えば、大腿骨及び上腕骨など）の融合床３０８に、又はその近くに位置している。長骨３１０は、急性の、又は仮関節の結果としてのいずれかの骨折を含み得る。皮下ポート３０２及びカテーテル３０６は、経時的な複数回の用量を可能にする。長骨３１０の漸進性融合は撮像により経時的に監視され得、いったん適切に融合されると、皮膚３０４における小さい表面的な切開を通して皮下ポート３０２及びカテーテル３０６が除去され得る。
【0051】
皮下ポート３０２及びカテーテル３０６を通して融合床に提供される材料は、担体液中の単体のＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲ ｍＲＮＡ、担体液中の脂質可溶化（カプセル化）ＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲ ｍＲＮＡ、及び／又は、本明細書で説明する担体材料中のａＢＭＰ材料であり得る。担体液は、いくつかの事例において、親油性又は疎油性の溶液であり得る。担体液は、生理食塩水及び乳酸化リンゲル液など、及びこれらの任意の組み合わせを含み得る。すなわち、融合部位における骨形成細胞は、ｍＲＮＡ及び／又は脂質を取り込む又はインターナライズし（例えば、エンドサイトーシスを通して）、ＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲを過剰発現し得る（例えば、脂質担体の劣化に際して）；代替的に、又は任意の組み合わせで、骨採取サンプルがＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲを過剰発現するようにａＢＭＰが使用され得る。そのようなＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲ ｍＲＮＡ材料のうちの１つ又は複数の任意の送達は、長骨の骨折に限定されず、脊椎固定及び他の整形外科的骨折に限定なく等しく適用可能である。
【0052】
ここで図４Ａ及び４Ｂを参照すると、本開示の１つ又は複数の態様による、脊椎固定床へのＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲ ｍＲＮＡ材料の送達のための構成例４００の側面図（図４Ａ）及び上面図（図４Ｂ）が示されている。構成４００は、図２の融合床への送達２１０に対応する。図４Ａを最初に参照すると、皮膚（図３の３０４を参照されたい）を通して位置しており、本開示のＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲ ｍＲＮＡ材料（複数の円として示される）の投与のためのカテーテル４０６に連結された皮下ポート４０２の使用が示されている。カテーテル４０６の端部は、ＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲ ｍＲＮＡ材料の送達のために、２つの椎骨４１０の間の融合床４０８に、又はその近くに位置している。各々が棘突起４１２及び２つの横突起４１４（側面図において各椎骨に１つ示されている）を含む椎骨４１０は、脊椎椎体固定を必要とする、又は仮関節の結果である損傷を含み得る。皮下ポート４０２及びカテーテル４０６は、経時的な複数回の用量を可能にする。椎骨４１０の漸進性融合は撮像により経時的に監視され得、いったん適切に融合されると、皮膚３０４における小さい表面的な切開を通して皮下ポート４０２及びカテーテル４０６が除去され得る。
【0053】
皮下ポート４０２及びカテーテル４０６を通して融合床に提供される材料は、ＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲ ｍＲＮＡ、担体液中の脂質可溶化（カプセル化）ＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲ ｍＲＮＡ、及び／又は、本明細書で説明する担体材料中のａＢＭＰ材料であり得る。担体液は、例えば、クエン酸緩衝生理食塩水（特に、修飾ｍＲＮＡ自体のため）、又はリン酸緩衝生理食塩水中の脂質ナノ粒子を含み得るが、これらに限定されない。すなわち、融合部位における骨形成細胞は、ｍＲＮＡ及び／又は脂質を取り込む又はインターナライズし（例えば、エンドサイトーシスを通して）、ＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲを過剰発現し得る（例えば、脂質担体の劣化に際して）；代替的に、又は任意の組み合わせで、骨採取サンプルがＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲを過剰発現するようにａＢＭＰが使用され得る。そのようなＢＭＰ及び／又はＢＭＰＲ ｍＲＮＡ材料のうちの１つ又は複数の任意の送達は、長骨の骨折に限定されず、脊椎固定及び他の整形外科的骨折に限定なく等しく適用可能である。
【0054】
【0055】
したがって、本開示は、有利には、本明細書で提供されるような長骨の骨融合床、脊椎固定、及び他の整形外科的骨折の治療を可能にする。
【0056】
別途示されない限り、本明細書及び関連付けられる特許請求の範囲において使用される、成分の量、分子量などの特性、及び反応条件などを表現する全ての数は、全ての事例において「約」という用語で修飾されているものと理解されるべきである。したがって、逆に示されない限り、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、本発明の具体かによって取得されることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。最小限でも、また、特許請求の範囲の均等論の適用を制限することを企図するものではなく、各数値パラメータは、少なくとも、報告された有効数字の数を鑑みて、かつ通常の四捨五入機能を適用することによって解釈されるべきである。
【0057】
１つ又は複数の発明の要素を組み込む１つ又は複数の例示的な具体化が本明細書で提示される。明瞭性のために、本願において、物理的実装の全ての特徴が説明又は示されていない。本発明の１つ又は複数の要素を組み込む物理的実施形態の展開において、実装形態ごとに、及び時間の経過と共に変化する、システム関連、ビジネス関連、政府関連、及び他の制約との遵守など、開発者の目標を実現するために、数々の実装形態固有の判断を行わなければならないことが理解される。開発者の努力は時間のかかるものであり得るが、しかしながら、そのような努力は、本開示の利点を有する当業者が請け負っている慣例である。
【0058】
本明細書において組成物及び方法は、様々なコンポーネント又はステップを「備える」という用語で説明しているが、組成物及び方法はまた、様々なコンポーネント及びステップ「から本質的になる」又は「からなる」場合がある。
例示的実施形態
例示的実施形態
【0059】
本開示の非限定的な例示的実施形態は以下を含む：
【0060】
実施形態Ａ：少なくとも骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）をコードする合成メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を調製する段階；脂質又は脂質誘導担体に前記合成ｍＲＮＡを脂質可溶化させ、それにより、脂質可溶化ｍＲＮＡを形成する段階；骨採取サンプルを術中に取得する段階；前記脂質可溶化ｍＲＮＡ及び前記骨採取サンプルを術中にインキュベートする段階、それにより前記骨採取サンプルは前記脂質可溶化ｍＲＮＡの少なくとも一部を取り込み、それにより活性化ＢＭＰ材料を形成する；前記活性化ＢＭＰ材料を骨融合床に術中に送達する段階を備える、方法。
【0061】
実施形態Ｂ：少なくとも骨形態形成タンパク質受容体（ＢＭＰＲ）をコードする合成メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を調製する段階；脂質又は脂質誘導担体に前記合成ｍＲＮＡを脂質可溶化させ、それにより、脂質可溶化ｍＲＮＡを形成する段階；骨採取サンプルを術中に取得する段階；前記脂質可溶化ｍＲＮＡ及び前記骨採取サンプルを術中にインキュベートする段階、それにより前記骨採取サンプルは前記脂質可溶化ｍＲＮＡの少なくとも一部を取り込み、それにより活性化ＢＭＰＲ材料を形成する；前記活性化ＢＭＰＲ材料を骨融合床に術中に送達する段階を備える、方法。
【0062】
非限定な例示的実施形態Ａ及びＢは、以下の要素のうちの１つ又は複数を含み得る：
【0063】
要素１：前記ＢＭＰが、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【0064】
要素２：前記ＢＭＰがＢＭＰ２である。
【0065】
要素３：前記脂質又は脂質誘導担体が、テトラキス（８－メチルノニル）３，３'、３''，３'''－（（（メチルアザンジイル）ビス（プロパン－３，１ジイル））ビス（アザントリイル））テトラプロピオネート；デシル（２－（ジオクチルアンモニオ）エチル）フォスフェート（９Ａ１Ｐ９）；エチル５，５－ジ（（Ｚ）－ヘプタデカ－８－エン－１－イル）－１－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－２－カルボキシレート（Ａ２－Ｉｓｏ５－２ＤＣ１８）；エチル５，５－ジ（（Ｚ）－ヘプタデカ－８－エン－１－イル）－１－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－２－カルボキシレート（Ａ２－Ｉｓｏ５－２ＤＣ１８）；（（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート）（ＡＬＣ－０３１５）；２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド（ＡＬＣ－０１５９）；β－シトステロール，（３Ｓ，８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）－１７－（（２Ｒ，５Ｒ）－５－エチル－６－メチルへプタン－２－イル）－１０，１３－ジメチル－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－オール；ビス（２－（ドデシルジスルファニル）エチル）３，３'－（（３－メチル－９－オキソ－１０－オキサ－１３，１４－ジチア－３，６－ジアザヘキサコシル）アザンジイル）ジプロピオネート（ＢＡＭＥ Ｏ１６Ｂ）；２－（（（（（３Ｓ，８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）カルボニル）アミノ）－Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ－メチルエタン－１－アミニウムブロミド（ＢＨＥＭ－コレステロール）；１，１'－（（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン－２－オール）（Ｃ１２－２００）；３，６－ビス（４－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）ピペラジン－２，５－ジオン（ｃＫＫ－Ｅ１２）；３β－［Ｎ－（Ｎ'，Ｎ'－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－コレステロール）；（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）；１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２－（スペルミンカルボキシアミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）；１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）；１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＭＡ）；１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；エチルホスファチジルコリン（ｅＰＣ）；ヘキサ（オクタン－３－イル）９，９'，９''，９'''，９''''，９'''''－（（（（ベンゼン－１，３，５－トリカルボニル）イリス（アザンジイル）トリス（プロパン－３，１－ジイル）トリス（アザントリイル））ヘキサノナノエート（ＦＴＴ５）；ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート（Ｌｉｐｉｄ Ｈ（ＳＭ－１０２））；（（（３，６－ジオキソピペラジン－２，５－イイル）ビス（ブタン－４，１－ジイル））ビス（アザントリイル））テトラキス（エタン－２，１－ジイル）（９Ｚ，９'Ｚ，９''Ｚ，９'''Ｚ，１２Ｚ，１２'Ｚ，１２''Ｚ，１２'''Ｚ）－テトラキス（オクタデカ－９，１２－ジエノエート）（ＯＦ－Ｄｅｇ－Ｌｉｎ）；１，２－ジミリストイル－ラク－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ）；Ｎ１，Ｎ３，Ｎ５－トリス（３－（ジドデシルアミノ）プロピル）ベンゼン－１，３，５－トリカルボキシアミド（ＴＴ３）；及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【0066】
要素４：前記骨採取サンプルが、骨粉、骨片、骨髄、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【0067】
要素５：前記骨採取サンプルが、骨粉及び骨髄の組み合わせ、骨粉及び骨片の組み合わせ、又は骨片及び骨髄の組み合わせである。
【0068】
要素６：前記骨採取サンプルが、骨粉、骨片、及び骨髄の組み合わせである。
【0069】
要素７：前記骨融合床が長骨又は脊椎骨に位置している。
【0070】
要素８：前記活性化ＢＭＰ材料が、スカフォールドに移送され、その後、前記送達が実行される。
【0071】
要素９：前記活性化ＢＭＰ材料が、スカフォールドに移送され、その後、前記送達が実行され、前記スカフォールドがコラーゲンマトリックスで構成されている。
【0072】
要素１０：前記送達が、皮下ポート及びカテーテルを使用して実行され、前記カテーテルは、前記骨融合床において又はその近くで終端する。
【0073】
要素１１：前記合成ｍＲＮＡが、骨形態形成タンパク質受容体を更にコードする。
【0074】
要素１２：前記合成ｍＲＮＡが骨形態形成タンパク質受容体を更にコードし、前記ＢＭＰＲがＢＭＰＲタイプ１である。
【0075】
実施形態Ａ及びＢは、限定することなく、要素１～１２のうちのいずれか１つ、１つより多く、又は全てと組み合わせて使用され得る。
【0076】
したがって、本発明は、言及された目的及び利点並びにそこに内在するものを達成するために良好に適合されている。上で開示された具体的な実施例及び構成は単に例示的であり、本発明は、本明細書の教示の利点を有する当業者にとって明らかな、異なるが同等の方法で修正及び実践され得る。更に、以下の特許請求の範囲で説明するもの以外、本明細書で示される構造又は設計の詳細に対して限定は意図されない。したがって、上で開示した具体的な例示的実施例が改変され、組み合わされ、又は修正されてよいことは自明であり、全てのそのような変形例は本発明の範囲及び趣旨内にあると見なされる。本明細書で明示的に開示された発明は、好適には、本明細書で具体定期に開示されていない任意の要素及び／又は本明細書で開示された任意のオプションの要素の不在下で実践され得る。本明細書において組成物及び方法は、様々なコンポーネント又はステップを「備える」、「含有する」、又は「含む」という用語で説明しているが、組成物及び方法はまた、様々なコンポーネント及びステップ「から本質的になる」又は「からなる」場合がある。上で開示された全ての数及び範囲は少量だけ変化してよい。下限及び上限を有する数値範囲が開示される場合、その範囲内に含まれる任意の数及び任意の含まれる範囲が具体的に開示される。特に、本明細書で開示される値のすべての範囲（「約ａ～約ｂ」、又は同等に「およそａ～ｂ」、又は同等に「およそａ～ｂ」という形）は、値のより広い範囲内に包含されるすべての数及び範囲を記載しているものと理解されるべきである。また、特許請求の範囲における用語は、出願人によって別途明示的かつ明らかに定義されない限り、それらの平易な通常の意味を有する。また、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、特許請求の範囲において使用される場合、それが導入する要素のうちの１つ又は１つより多くを意味するものと本明細書で定義される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【手続補正書】
【提出日】2024-05-23
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）をコードする合成メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を調製する段階；脂質又は脂質誘導担体に前記合成ｍＲＮＡを脂質可溶化させ、それにより、脂質可溶化ｍＲＮＡを形成する段階；
骨採取サンプルを取得する段階；
前記脂質可溶化ｍＲＮＡ及び前記骨採取サンプルをインキュベートし、それにより前記骨採取サンプルは前記脂質可溶化ｍＲＮＡの少なくとも一部を取り込み、それにより活性化ＢＭＰ材料を形成する段階；
を備える、活性化ＢＭＰ材料を製造する方法。
【請求項2】
前記ＢＭＰが、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＢＭＰがＢＭＰ２である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記脂質又は脂質誘導担体が、テトラキス（８－メチルノニル）３，３'、３''，３'''－（（（メチルアザンジイル）ビス（プロパン－３，１ジイル））ビス（アザントリイル））テトラプロピオネート；デシル（２－（ジオクチルアンモニオ）エチル）フォスフェート（９Ａ１Ｐ９）；エチル５，５－ジ（（Ｚ）－ヘプタデカ－８－エン－１－イル）－１－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－２－カルボキシレート（Ａ２－Ｉｓｏ５－２ＤＣ１８）；エチル５，５－ジ（（Ｚ）－ヘプタデカ－８－エン－１－イル）－１－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－２－カルボキシレート（Ａ２－Ｉｓｏ５－２ＤＣ１８）；（（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート）（ＡＬＣ－０３１５）；２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド（ＡＬＣ－０１５９）；β－シトステロール，（３Ｓ，８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）－１７－（（２Ｒ，５Ｒ）－５－エチル－６－メチルへプタン－２－イル）－１０，１３－ジメチル－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－オール；ビス（２－（ドデシルジスルファニル）エチル）３，３'－（（３－メチル－９－オキソ－１０－オキサ－１３，１４－ジチア－３，６－ジアザヘキサコシル）アザンジイル）ジプロピオネート（ＢＡＭＥ Ｏ１６Ｂ）；２－（（（（（３Ｓ，８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）カルボニル）アミノ）－Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ－メチルエタン－１－アミニウムブロミド（ＢＨＥＭ－コレステロール）；１，１'－（（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン－２－オール）（Ｃ１２－２００）；３，６－ビス（４－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）ピペラジン－２，５－ジオン（ｃＫＫ－Ｅ１２）；３β－［Ｎ－（Ｎ'，Ｎ'－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－コレステロール）；（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）；１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２－（スペルミンカルボキシアミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）；１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）；１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＭＡ）；１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；エチルホスファチジルコリン（ｅＰＣ）；ヘキサ（オクタン－３－イル）９，９'，９''，９'''，９''''，９'''''－（（（（ベンゼン－１，３，５－トリカルボニル）イリス（アザンジイル）トリス（プロパン－３，１－ジイル）トリス（アザントリイル））ヘキサノナノエート（ＦＴＴ５）；ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート（Ｌｉｐｉｄ Ｈ（ＳＭ－１０２））；（（（３，６－ジオキソピペラジン－２，５－イイル）ビス（ブタン－４，１－ジイル））ビス（アザントリイル））テトラキス（エタン－２，１－ジイル）（９Ｚ，９'Ｚ，９''Ｚ，９'''Ｚ，１２Ｚ，１２'Ｚ，１２''Ｚ，１２'''Ｚ）－テトラキス（オクタデカ－９，１２－ジエノエート）（ＯＦ－Ｄｅｇ－Ｌｉｎ）；１，２－ジミリストイル－ラク－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ）；Ｎ１，Ｎ３，Ｎ５－トリス（３－（ジドデシルアミノ）プロピル）ベンゼン－１，３，５－トリカルボキシアミド（ＴＴ３）；及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記骨採取サンプルが、骨粉、骨片、骨髄、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記骨採取サンプルが、骨粉及び骨髄の組み合わせ、骨粉及び骨片の組み合わせ、又は骨片及び骨髄の組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記骨採取サンプルが、骨粉、骨片、及び骨髄の組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記合成ｍＲＮＡが、骨形態形成タンパク質受容体を更にコードする、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
少なくとも骨形態形成タンパク質受容体（ＢＭＰＲ）をコードする合成メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を調製する段階；脂質又は脂質誘導担体に前記合成ｍＲＮＡを脂質可溶化させ、それにより、脂質可溶化ｍＲＮＡを形成する段階；
骨採取サンプルを取得する段階；
前記脂質可溶化ｍＲＮＡ及び前記骨採取サンプルをインキュベートし、それにより前記骨採取サンプルは前記脂質可溶化ｍＲＮＡの少なくとも一部を取り込み、それにより活性化ＢＭＰＲ材料を形成する段階；
を備える、活性化ＢＭＰＲ材料を製造する方法。
【請求項10】
前記ＢＭＰＲがＢＭＰＲタイプ１である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記骨採取サンプルが、骨粉、骨片、骨髄、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項12】
前記骨採取サンプルが、骨粉及び骨髄の組み合わせ、骨粉及び骨片の組み合わせ、又は骨片及び骨髄の組み合わせである、請求項９に記載の方法。
【請求項13】
前記骨採取サンプルが、骨粉、骨片、及び骨髄の組み合わせである、請求項９に記載の方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0076】
したがって、本発明は、言及された目的及び利点並びにそこに内在するものを達成するために良好に適合されている。上で開示された具体的な実施例及び構成は単に例示的であり、本発明は、本明細書の教示の利点を有する当業者にとって明らかな、異なるが同等の方法で修正及び実践され得る。更に、以下の特許請求の範囲で説明するもの以外、本明細書で示される構造又は設計の詳細に対して限定は意図されない。したがって、上で開示した具体的な例示的実施例が改変され、組み合わされ、又は修正されてよいことは自明であり、全てのそのような変形例は本発明の範囲及び趣旨内にあると見なされる。本明細書で明示的に開示された発明は、好適には、本明細書で具体定期に開示されていない任意の要素及び／又は本明細書で開示された任意のオプションの要素の不在下で実践され得る。本明細書において組成物及び方法は、様々なコンポーネント又はステップを「備える」、「含有する」、又は「含む」という用語で説明しているが、組成物及び方法はまた、様々なコンポーネント及びステップ「から本質的になる」又は「からなる」場合がある。上で開示された全ての数及び範囲は少量だけ変化してよい。下限及び上限を有する数値範囲が開示される場合、その範囲内に含まれる任意の数及び任意の含まれる範囲が具体的に開示される。特に、本明細書で開示される値のすべての範囲（「約ａ～約ｂ」、又は同等に「およそａ～ｂ」、又は同等に「およそａ～ｂ」という形）は、値のより広い範囲内に包含されるすべての数及び範囲を記載しているものと理解されるべきである。また、特許請求の範囲における用語は、出願人によって別途明示的かつ明らかに定義されない限り、それらの平易な通常の意味を有する。また、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、特許請求の範囲において使用される場合、それが導入する要素のうちの１つ又は１つより多くを意味するものと本明細書で定義される。
［項目１］
少なくとも骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）をコードする合成メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を調製する段階；
脂質又は脂質誘導担体に前記合成ｍＲＮＡを脂質可溶化させ、それにより、脂質可溶化ｍＲＮＡを形成する段階；
骨採取サンプルを術中に取得する段階；
前記脂質可溶化ｍＲＮＡ及び前記骨採取サンプルを術中にインキュベートする段階、それにより前記骨採取サンプルは前記脂質可溶化ｍＲＮＡの少なくとも一部を取り込み、それにより活性化ＢＭＰ材料を形成する；
前記活性化ＢＭＰ材料を骨融合床に術中に送達する段階
を備える、方法。
［項目２］
前記ＢＭＰが、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
［項目３］
前記ＢＭＰがＢＭＰ２である、項目１に記載の方法。
［項目４］
前記脂質又は脂質誘導担体が、テトラキス（８－メチルノニル）３，３'、３''，３'''－（（（メチルアザンジイル）ビス（プロパン－３，１ジイル））ビス（アザントリイル））テトラプロピオネート；デシル（２－（ジオクチルアンモニオ）エチル）フォスフェート（９Ａ１Ｐ９）；エチル５，５－ジ（（Ｚ）－ヘプタデカ－８－エン－１－イル）－１－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－２－カルボキシレート（Ａ２－Ｉｓｏ５－２ＤＣ１８）；エチル５，５－ジ（（Ｚ）－ヘプタデカ－８－エン－１－イル）－１－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－２－カルボキシレート（Ａ２－Ｉｓｏ５－２ＤＣ１８）；（（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート）（ＡＬＣ－０３１５）；２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド（ＡＬＣ－０１５９）；β－シトステロール，（３Ｓ，８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）－１７－（（２Ｒ，５Ｒ）－５－エチル－６－メチルへプタン－２－イル）－１０，１３－ジメチル－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－オール；ビス（２－（ドデシルジスルファニル）エチル）３，３'－（（３－メチル－９－オキソ－１０－オキサ－１３，１４－ジチア－３，６－ジアザヘキサコシル）アザンジイル）ジプロピオネート（ＢＡＭＥ Ｏ１６Ｂ）；２－（（（（（３Ｓ，８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）カルボニル）アミノ）－Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ－メチルエタン－１－アミニウムブロミド（ＢＨＥＭ－コレステロール）；１，１'－（（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン－２－オール）（Ｃ１２－２００）；３，６－ビス（４－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）ピペラジン－２，５－ジオン（ｃＫＫ－Ｅ１２）；３β－［Ｎ－（Ｎ'，Ｎ'－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－コレステロール）；（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）；１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２－（スペルミンカルボキシアミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）；１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）；１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＭＡ）；１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；エチルホスファチジルコリン（ｅＰＣ）；ヘキサ（オクタン－３－イル）９，９'，９''，９'''，９''''，９'''''－（（（（ベンゼン－１，３，５－トリカルボニル）イリス（アザンジイル）トリス（プロパン－３，１－ジイル）トリス（アザントリイル））ヘキサノナノエート（ＦＴＴ５）；ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート（Ｌｉｐｉｄ Ｈ（ＳＭ－１０２））；（（（３，６－ジオキソピペラジン－２，５－イイル）ビス（ブタン－４，１－ジイル））ビス（アザントリイル））テトラキス（エタン－２，１－ジイル）（９Ｚ，９'Ｚ，９''Ｚ，９'''Ｚ，１２Ｚ，１２'Ｚ，１２''Ｚ，１２'''Ｚ）－テトラキス（オクタデカ－９，１２－ジエノエート）（ＯＦ－Ｄｅｇ－Ｌｉｎ）；１，２－ジミリストイル－ラク－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ）；Ｎ１，Ｎ３，Ｎ５－トリス（３－（ジドデシルアミノ）プロピル）ベンゼン－１，３，５－トリカルボキシアミド（ＴＴ３）；及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
［項目５］
前記骨採取サンプルが、骨粉、骨片、骨髄、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
［項目６］
前記骨採取サンプルが、骨粉及び骨髄の組み合わせ、骨粉及び骨片の組み合わせ、又は骨片及び骨髄の組み合わせである、項目１に記載の方法。
［項目７］
前記骨採取サンプルが、骨粉、骨片、及び骨髄の組み合わせである、項目１に記載の方法。
［項目８］
前記骨融合床が長骨又は脊椎骨に位置している、項目１に記載の方法。
［項目９］
前記活性化ＢＭＰ材料が、スカフォールドに移送され、その後、前記送達が実行される、項目１に記載の方法。
［項目１０］
前記スカフォールドがコラーゲンマトリックスで構成されている、項目９に記載の方法。
［項目１１］
前記送達が、皮下ポート及びカテーテルを使用して実行され、前記カテーテルは、前記骨融合床において又はその近くで終端する、項目１に記載の方法。
［項目１２］
前記合成ｍＲＮＡが、骨形態形成タンパク質受容体を更にコードする、項目１に記載の方法。
［項目１３］
少なくとも骨形態形成タンパク質受容体（ＢＭＰＲ）をコードする合成メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を調製する段階；
脂質又は脂質誘導担体に前記合成ｍＲＮＡを脂質可溶化させ、それにより、脂質可溶化ｍＲＮＡを形成する段階；
骨採取サンプルを術中に取得する段階；
前記脂質可溶化ｍＲＮＡ及び前記骨採取サンプルを術中にインキュベートする段階、それにより前記骨採取サンプルは前記脂質可溶化ｍＲＮＡの少なくとも一部を取り込み、それにより活性化ＢＭＰＲ材料を形成する；
前記活性化ＢＭＰＲ材料を骨融合床に術中に送達する段階
を備える、方法。
［項目１４］
前記ＢＭＰＲがＢＭＰＲタイプ１である、項目１３に記載の方法。
［項目１５］
前記骨採取サンプルが、骨粉、骨片、骨髄、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、項目１３に記載の方法。
［項目１６］
前記骨採取サンプルが、骨粉及び骨髄の組み合わせ、骨粉及び骨片の組み合わせ、又は骨片及び骨髄の組み合わせである、項目１３に記載の方法。
［項目１７］
前記骨採取サンプルが、骨粉、骨片、及び骨髄の組み合わせである、項目１３に記載の方法。
［項目１８］
前記骨融合床が長骨又は脊椎骨に位置している、項目１３に記載の方法。
［項目１９］
前記活性化ＢＭＰＲ材料が、スカフォールドに移送され、その後、前記送達が実行される、項目１３に記載の方法。
［項目２０］
前記送達が、皮下ポート及びカテーテルを使用して実行され、前記カテーテルは、前記骨融合床において又はその近くで終端する、項目１３に記載の方法。
［項目１］
少なくとも骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）をコードする合成メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を調製する段階；
脂質又は脂質誘導担体に前記合成ｍＲＮＡを脂質可溶化させ、それにより、脂質可溶化ｍＲＮＡを形成する段階；
骨採取サンプルを術中に取得する段階；
前記脂質可溶化ｍＲＮＡ及び前記骨採取サンプルを術中にインキュベートする段階、それにより前記骨採取サンプルは前記脂質可溶化ｍＲＮＡの少なくとも一部を取り込み、それにより活性化ＢＭＰ材料を形成する；
前記活性化ＢＭＰ材料を骨融合床に術中に送達する段階
を備える、方法。
［項目２］
前記ＢＭＰが、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
［項目３］
前記ＢＭＰがＢＭＰ２である、項目１に記載の方法。
［項目４］
前記脂質又は脂質誘導担体が、テトラキス（８－メチルノニル）３，３'、３''，３'''－（（（メチルアザンジイル）ビス（プロパン－３，１ジイル））ビス（アザントリイル））テトラプロピオネート；デシル（２－（ジオクチルアンモニオ）エチル）フォスフェート（９Ａ１Ｐ９）；エチル５，５－ジ（（Ｚ）－ヘプタデカ－８－エン－１－イル）－１－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－２－カルボキシレート（Ａ２－Ｉｓｏ５－２ＤＣ１８）；エチル５，５－ジ（（Ｚ）－ヘプタデカ－８－エン－１－イル）－１－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－２－カルボキシレート（Ａ２－Ｉｓｏ５－２ＤＣ１８）；（（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート）（ＡＬＣ－０３１５）；２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド（ＡＬＣ－０１５９）；β－シトステロール，（３Ｓ，８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）－１７－（（２Ｒ，５Ｒ）－５－エチル－６－メチルへプタン－２－イル）－１０，１３－ジメチル－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－オール；ビス（２－（ドデシルジスルファニル）エチル）３，３'－（（３－メチル－９－オキソ－１０－オキサ－１３，１４－ジチア－３，６－ジアザヘキサコシル）アザンジイル）ジプロピオネート（ＢＡＭＥ Ｏ１６Ｂ）；２－（（（（（３Ｓ，８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）カルボニル）アミノ）－Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ－メチルエタン－１－アミニウムブロミド（ＢＨＥＭ－コレステロール）；１，１'－（（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン－２－オール）（Ｃ１２－２００）；３，６－ビス（４－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）ピペラジン－２，５－ジオン（ｃＫＫ－Ｅ１２）；３β－［Ｎ－（Ｎ'，Ｎ'－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－コレステロール）；（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）；１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２－（スペルミンカルボキシアミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）；１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）；１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＭＡ）；１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；エチルホスファチジルコリン（ｅＰＣ）；ヘキサ（オクタン－３－イル）９，９'，９''，９'''，９''''，９'''''－（（（（ベンゼン－１，３，５－トリカルボニル）イリス（アザンジイル）トリス（プロパン－３，１－ジイル）トリス（アザントリイル））ヘキサノナノエート（ＦＴＴ５）；ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート（Ｌｉｐｉｄ Ｈ（ＳＭ－１０２））；（（（３，６－ジオキソピペラジン－２，５－イイル）ビス（ブタン－４，１－ジイル））ビス（アザントリイル））テトラキス（エタン－２，１－ジイル）（９Ｚ，９'Ｚ，９''Ｚ，９'''Ｚ，１２Ｚ，１２'Ｚ，１２''Ｚ，１２'''Ｚ）－テトラキス（オクタデカ－９，１２－ジエノエート）（ＯＦ－Ｄｅｇ－Ｌｉｎ）；１，２－ジミリストイル－ラク－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ）；Ｎ１，Ｎ３，Ｎ５－トリス（３－（ジドデシルアミノ）プロピル）ベンゼン－１，３，５－トリカルボキシアミド（ＴＴ３）；及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
［項目５］
前記骨採取サンプルが、骨粉、骨片、骨髄、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
［項目６］
前記骨採取サンプルが、骨粉及び骨髄の組み合わせ、骨粉及び骨片の組み合わせ、又は骨片及び骨髄の組み合わせである、項目１に記載の方法。
［項目７］
前記骨採取サンプルが、骨粉、骨片、及び骨髄の組み合わせである、項目１に記載の方法。
［項目８］
前記骨融合床が長骨又は脊椎骨に位置している、項目１に記載の方法。
［項目９］
前記活性化ＢＭＰ材料が、スカフォールドに移送され、その後、前記送達が実行される、項目１に記載の方法。
［項目１０］
前記スカフォールドがコラーゲンマトリックスで構成されている、項目９に記載の方法。
［項目１１］
前記送達が、皮下ポート及びカテーテルを使用して実行され、前記カテーテルは、前記骨融合床において又はその近くで終端する、項目１に記載の方法。
［項目１２］
前記合成ｍＲＮＡが、骨形態形成タンパク質受容体を更にコードする、項目１に記載の方法。
［項目１３］
少なくとも骨形態形成タンパク質受容体（ＢＭＰＲ）をコードする合成メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を調製する段階；
脂質又は脂質誘導担体に前記合成ｍＲＮＡを脂質可溶化させ、それにより、脂質可溶化ｍＲＮＡを形成する段階；
骨採取サンプルを術中に取得する段階；
前記脂質可溶化ｍＲＮＡ及び前記骨採取サンプルを術中にインキュベートする段階、それにより前記骨採取サンプルは前記脂質可溶化ｍＲＮＡの少なくとも一部を取り込み、それにより活性化ＢＭＰＲ材料を形成する；
前記活性化ＢＭＰＲ材料を骨融合床に術中に送達する段階
を備える、方法。
［項目１４］
前記ＢＭＰＲがＢＭＰＲタイプ１である、項目１３に記載の方法。
［項目１５］
前記骨採取サンプルが、骨粉、骨片、骨髄、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、項目１３に記載の方法。
［項目１６］
前記骨採取サンプルが、骨粉及び骨髄の組み合わせ、骨粉及び骨片の組み合わせ、又は骨片及び骨髄の組み合わせである、項目１３に記載の方法。
［項目１７］
前記骨採取サンプルが、骨粉、骨片、及び骨髄の組み合わせである、項目１３に記載の方法。
［項目１８］
前記骨融合床が長骨又は脊椎骨に位置している、項目１３に記載の方法。
［項目１９］
前記活性化ＢＭＰＲ材料が、スカフォールドに移送され、その後、前記送達が実行される、項目１３に記載の方法。
［項目２０］
前記送達が、皮下ポート及びカテーテルを使用して実行され、前記カテーテルは、前記骨融合床において又はその近くで終端する、項目１３に記載の方法。
【国際調査報告】