特表 2024-537098 オリゴヌクレオチド化合物の遺伝子サイレンシング活性を増強するための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-10

(54)【発明の名称】オリゴヌクレオチド化合物の遺伝子サイレンシング活性を増強するための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20241003BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20241003BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

C12Q1/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024520007

(86)(22)【出願日】2022-10-04

(85)【翻訳文提出日】2024-05-24

(86)【国際出願番号】 US2022045664

(87)【国際公開番号】W WO2023059629

(87)【国際公開日】2023-04-13

(31)【優先権主張番号】63/252,596

(32)【優先日】2021-10-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500049716

【氏名又は名称】アムジエン・インコーポレーテツド

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ルゥ，ジアミャオ

(72)【発明者】

【氏名】オルマン，マイケル

(72)【発明者】

【氏名】コリンズ，パトリック

(72)【発明者】

【氏名】リー，チー－ミン

(72)【発明者】

【氏名】ワン，ソンリー

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA20

4B063QQ02

4B063QQ08

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR90

4B063QS38

4B063QS40

4B063QX10

(57)【要約】

本発明は、オリゴヌクレオチド化合物の遺伝子サイレンシング活性を増強するための組成物及び方法に関する。特に、本発明は、細胞内の標的遺伝子の発現を低減するリガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチド化合物の効力を向上させるために、ＲＡＢ１８、ＺＷ１０、ＳＴＸ１８、ＳＣＦＤ２、ＮＡＰＧ、ＳＡＭＤ４Ｂ、又はＶＰＳ３７Ａなどのサプレッサータンパク質の発現又は活性を阻害することに関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞内の第１のオリゴヌクレオチド化合物のサイレンシング活性を増強するための方法において、
前記細胞内のサプレッサータンパク質の発現又は活性を阻害することであって、前記サプレッサータンパク質が、ＲＡＢ１８、ＺＷ１０、ＳＴＸ１８、ＳＣＦＤ２、ＮＡＰＧ、ＳＡＭＤ４Ｂ、又はＶＰＳ３７Ａである、阻害することと、
標的遺伝子の配列と実質的に相補的な配列を含む前記第１のオリゴヌクレオチド化合物と前記細胞を接触させることであって、前記オリゴヌクレオチド化合物が、前記細胞の表面に発現する受容体のリガンドに共有結合される、接触させることと
を含む方法。

【請求項2】

前記サプレッサータンパク質がＲＡＢ１８、ＺＷ１０又はＳＴＸ１８である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記サプレッサータンパク質がＲＡＢ１８である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

サプレッサータンパク質の発現又は活性を阻害することが、前記サプレッサータンパク質をコードするｍＲＮＡ配列と実質的に相補的な配列を含む第２のオリゴヌクレオチド化合物と前記細胞を接触させることを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記第２のオリゴヌクレオチド化合物が一本鎖である、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記第２のオリゴヌクレオチド化合物が二本鎖である、請求項４に記載の方法。

【請求項7】

前記第２のオリゴヌクレオチド化合物が、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項４～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記修飾ヌクレオチドが２’－修飾ヌクレオチドである、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記修飾ヌクレオチドが、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、二環式核酸（ＢＮＡ）、デオキシリボヌクレオチド、又はこれらの組み合わせである、請求項７に記載の方法。

【請求項10】

前記第２のオリゴヌクレオチド化合物の全てのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである、請求項７に記載の方法。

【請求項11】

前記第２のオリゴヌクレオチド化合物が、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項４～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

細胞内の標的遺伝子の発現を低減させるための方法において、
前記細胞をサプレッサータンパク質の阻害剤と接触させることであって、前記サプレッサータンパク質が、ＲＡＢ１８、ＺＷ１０、ＳＴＸ１８、ＳＣＦＤ２、ＮＡＰＧ、ＳＡＭＤ４Ｂ、又はＶＰＳ３７Ａである、接触させることと、
前記標的遺伝子の配列と実質的に相補的な配列を含む第１のオリゴヌクレオチド化合物に前記細胞を接触させることであって、前記オリゴヌクレオチド化合物が、前記細胞の表面に発現する受容体のリガンドに共有結合される、接触させることと
を含む方法。

【請求項13】

前記サプレッサータンパク質がＲＡＢ１８、ＺＷ１０又はＳＴＸ１８である、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記サプレッサータンパク質がＲＡＢ１８である、請求項１２に記載の方法。

【請求項15】

前記サプレッサータンパク質の前記阻害剤が、前記サプレッサータンパク質をコードするｍＲＮＡ配列と実質的に相補的な配列を含む第２のオリゴヌクレオチド化合物である、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記第２のオリゴヌクレオチド化合物が一本鎖である、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記第２のオリゴヌクレオチド化合物が二本鎖である、請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

前記第２のオリゴヌクレオチド化合物が、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記修飾ヌクレオチドが２’－修飾ヌクレオチドである、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記修飾ヌクレオチドが、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ、デオキシリボヌクレオチド、又はこれらの組み合わせである、請求項１８に記載の方法。

【請求項21】

前記第２のオリゴヌクレオチド化合物の全てのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである、請求項１８に記載の方法。

【請求項22】

前記第２のオリゴヌクレオチド化合物が、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項１５～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記標的遺伝子がヒト遺伝子である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記標的遺伝子の発現が、疾患又は障害に関連付けられる、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記第１のオリゴヌクレオチド化合物が、前記標的遺伝子の配列と実質的に相補的な配列を含む一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、約１５～約３０ヌクレオチド長である、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記第１のオリゴヌクレオチド化合物が、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡであり、前記アンチセンス鎖が前記標的遺伝子の配列と実質的に相補的な配列を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記センス鎖が、約１５～約３０塩基対長の二重鎖領域を形成するために、前記アンチセンス鎖の配列と十分に相補的な配列を含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、それぞれ独立して、約１９～約３０ヌクレオチド長である、請求項２７又は２８に記載の方法。

【請求項30】

前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、それぞれ独立して、約１９～約２３ヌクレオチド長である、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記第１のオリゴヌクレオチド化合物が、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記修飾ヌクレオチドが２’－修飾ヌクレオチドである、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記修飾ヌクレオチドが、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ、デオキシリボヌクレオチド、又はこれらの組み合わせである、請求項３１に記載の方法。

【請求項34】

前記第１のオリゴヌクレオチド化合物の全てのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである、請求項３１に記載の方法。

【請求項35】

前記第１のオリゴヌクレオチド化合物が、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記リガンドが、コレステロール部分、ビタミン、ステロイド、胆汁酸、葉酸部分、脂肪酸、炭水化物、グリコシド、又は抗体若しくはその抗原結合断片を含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記リガンドが、ガラクトース、ガラクトサミン、又はＮ－アセチル－ガラクトサミンを含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記リガンドが、多価ガラクトース部分又は多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分を含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記多価ガラクトース部分又は多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分が、三価又は四価である、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記リガンドが、肝臓細胞の表面に発現する受容体のリガンドである、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記受容体がアシアロ糖タンパク質受容体である、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記細胞がインビトロである、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記細胞がインビボである、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記細胞が、前記標的遺伝子の発現を低減させる必要のある対象に存在する、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記細胞が肝細胞である、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

対象の標的遺伝子の発現を低減させるための方法において、
サプレッサータンパク質の阻害剤であって、前記サプレッサータンパク質が、ＲＡＢ１８、ＺＷ１０、ＳＴＸ１８、ＳＣＦＤ２、ＮＡＰＧ、ＳＡＭＤ４Ｂ、又はＶＰＳ３７Ａである、サプレッサータンパク質の阻害剤と、
前記標的遺伝子の配列と実質的に相補的な配列を含む第１のオリゴヌクレオチド化合物であって、第１のリガンドに共有結合される第１のオリゴヌクレオチド化合物と
を前記対象に投与することを含む方法。

【請求項47】

前記サプレッサータンパク質がＲＡＢ１８、ＺＷ１０又はＳＴＸ１８である、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記サプレッサータンパク質がＲＡＢ１８である、請求項４６に記載の方法。

【請求項49】

前記サプレッサータンパク質の前記阻害剤が、前記サプレッサータンパク質をコードするｍＲＮＡ配列と実質的に相補的な配列を含む第２のオリゴヌクレオチド化合物である、請求項４６～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記第２のオリゴヌクレオチド化合物が一本鎖である、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

前記第２のオリゴヌクレオチド化合物が二本鎖である、請求項４９に記載の方法。

【請求項52】

前記第２のオリゴヌクレオチドが、第２のリガンドに共有結合される、請求項４９～５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記第２のリガンドが、前記第１のリガンドと同一である、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記標的遺伝子がヒト遺伝子である、請求項４６～５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

前記標的遺伝子の発現が、前記対象の疾患又は障害に関連付けられる、請求項４６～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記標的遺伝子が、肝臓で発現する遺伝子である、請求項４６～５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記第１のオリゴヌクレオチド化合物が、前記標的遺伝子の配列と実質的に相補的な配列を含む一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項４６～５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、約１５～約３０ヌクレオチド長である、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

前記第１のオリゴヌクレオチド化合物が、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡであり、前記アンチセンス鎖が前記標的遺伝子の配列と実質的に相補的な配列を含む、請求項４６～５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

前記センス鎖が、約１５～約３０塩基対長の二重鎖領域を形成するために、前記アンチセンス鎖の配列と十分に相補的な配列を含む、請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、それぞれ独立して、約１９～約３０ヌクレオチド長である、請求項５９又は６０に記載の方法。

【請求項62】

前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、それぞれ独立して、約１９～約２３ヌクレオチド長である、請求項５９～６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

前記第１のオリゴヌクレオチド化合物、前記第２のオリゴヌクレオチド化合物、又は前記第１及び第２のオリゴヌクレオチド化合物の両方が、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項４９～６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

前記修飾ヌクレオチドが２’－修飾ヌクレオチドである、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記修飾ヌクレオチドが、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ、デオキシリボヌクレオチド、又はこれらの組み合わせである、請求項６３に記載の方法。

【請求項66】

前記第１のオリゴヌクレオチド化合物、前記第２のオリゴヌクレオチド化合物、又は前記第１及び第２のオリゴヌクレオチド化合物の両方の全てのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである、請求項６３に記載の方法。

【請求項67】

前記第１のオリゴヌクレオチド化合物、前記第２のオリゴヌクレオチド化合物、又は前記第１及び第２のオリゴヌクレオチド化合物の両方が、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項４９～６６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項68】

前記第１のリガンド、前記第２のリガンド、又は前記第１及び第２のリガンドの両方が、コレステロール部分、ビタミン、ステロイド、胆汁酸、葉酸部分、脂肪酸、炭水化物、グリコシド、又は抗体若しくはその抗原結合断片を含む、請求項４６～６７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項69】

前記第１のリガンド、前記第２のリガンド、又は前記第１及び第２のリガンドの両方が、ガラクトース、ガラクトサミン、又はＮ－アセチル－ガラクトサミンを含む、請求項４６～６７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項70】

前記第１のリガンド、前記第２のリガンド、又は前記第１及び第２のリガンドの両方が、多価ガラクトース部分又は多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分を含む、請求項６９に記載の方法。

【請求項71】

前記多価ガラクトース部分又は多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分が、三価又は四価である、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

前記第１のリガンド、前記第２のリガンド、又は前記第１及び第２のリガンドの両方が、肝臓細胞の表面に発現する受容体のリガンドである、請求項４６～７１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項73】

前記受容体がアシアロ糖タンパク質受容体である、請求項７２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１０月５日出願の米国仮特許出願第６３／２５２，５９６号明細書の利益を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

電子提出されたテキストファイルの説明
本出願は、ＸＭＬフォーマットで電子提出されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２２年１０月３日に作成したコンピュータ可読フォーマットの配列表のコピーは、名称がＡ－２８４６－ＷＯ０１－ＳＥＣ＿ＳＴ２６．ｘｍｌであり、サイズが８１．２キロバイトである。

【0003】

本発明は、細胞内でオリゴヌクレオチド化合物の遺伝子サイレンシング活性を抑制するように作用するタンパク質の同定に関する。より具体的には、本発明は、ＲＡＢ１８、ＺＷ１０、ＳＴＸ１８、ＳＣＦＤ２、ＮＡＰＧ、ＳＡＭＤ４Ｂ、又はＶＰＳ３７Ａなどのこのようなサプレッサータンパク質の発現又は活性を阻害することによって、細胞内の標的遺伝子の発現を低減するリガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチド化合物の効力を増強するための組成物及び方法に関する。記載される方法は、治療目的で投与されるリガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチド化合物の効力を増大させるのに特に有用である。

【背景技術】

【0004】

低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子及びアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸ベースの治療薬は、大型で高電荷の核酸を送達することに伴う課題があるにもかかわらず、近年急速に発展してきている。従来の薬剤分子と比較して、ｓｉＲＮＡ分子及びアンチセンスオリゴヌクレオチドは高い効力があり、以前は「創薬不可能（ｎｏｎ－ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）」であった標的に作用することができる（Ｊｕｌｉａｎｏ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．４４；６５１８－６５４８，２０１６；Ｄｏｗｄｙ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｖｏｌ．３５；２２２－２２９，２０１７；及びＫｈｖｏｒｏｖａ ａｎｄ Ｗａｔｔｓ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｖｏｌ．３５；２３８－２４８，２０１７）。更に驚くべきことに、特にｓｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングの持続時間は、数ヶ月間継続することが示されている（Ｎａｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．４５；１０９６９－１０９７７，２０１７；Ｊｕｌｉａｎｏ，２０１６；Ｄｏｗｄｙ，２０１７；及びＫｈｖｏｒｏｖａ ａｎｄ Ｗａｔｔｓ，２０１７、前掲）。

【0005】

オリゴヌクレオチド治療用分子の肝臓への送達は、肝細胞表面に高発現するアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合するＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）から構成されるリガンドへのオリゴヌクレオチドの結合によって確立されている（例えば、Ｎａｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，Ｖｏｌ．１３６；１６９５８－１６９６１，２０１４を参照されたい）。次いで、ｓｉＲＮＡ分子は、受容体依存性エンドサイトーシス機構によって原形質膜を通過し、エンドソームに送達される（例えば、Ｂａｅｎｚｉｇｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｔｅ，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．２２；６１１－６２０，１９８０；Ｐｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．４２；８７９６－８８０７，２０１４を参照されたい）。エンドソームが成熟すると、内部のｐＨが低下して、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートオリゴヌクレオチドのＡＳＧＰＲからの放出がもたらされ、次いでＡＳＧＰＲは速やかに細胞表面に再度リサイクルされるが、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートオリゴヌクレオチドはエンドソーム内部に留まる（Ｐｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ．，２０１４、前掲）。標的ｍＲＮＡと接近してタンパク質発現を効果的に阻害するためには、オリゴヌクレオチドがエンドソームから細胞質ゾルに脱出し、ｓｉＲＮＡ分子の場合であればＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に、アンチセンスオリゴヌクレオチドの場合であればＲＮアーゼＨと会合する必要がある。エンドソーム内のオリゴヌクレオチド分子の１％未満が、細胞質ゾルに脱出することができる（Ｇｉｌｌｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｖｏｌ．３１；６３８－６４６，２０１３）。治療用オリゴヌクレオチド分子の細胞内輸送及び脱出のステップは非常に非効率的であり、その根底にあるメカニズムは完全に理解されていない（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｄｏｗｄｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ，Ｖｏｌ．２８；１０９－１１８，２０１８；Ｐｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ．，２０１４、前掲）。

【0006】

従って、治療用オリゴヌクレオチドの細胞質ゾル内の作用部位への細胞内送達を向上させ、その結果、これらの分子の効力を向上し得ることが当技術分野において依然として求められている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｊｕｌｉａｎｏ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．４４；６５１８－６５４８，２０１６

【非特許文献2】Ｄｏｗｄｙ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｖｏｌ．３５；２２２－２２９，２０１７

【非特許文献3】Ｋｈｖｏｒｏｖａ ａｎｄ Ｗａｔｔｓ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｖｏｌ．３５；２３８－２４８，２０１７

【非特許文献4】Ｎａｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．４５；１０９６９－１０９７７，２０１７

【非特許文献5】Ｎａｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，Ｖｏｌ．１３６；１６９５８－１６９６１，２０１４

【非特許文献6】Ｂａｅｎｚｉｇｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｔｅ，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．２２；６１１－６２０，１９８０

【非特許文献7】Ｐｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．４２；８７９６－８８０７，２０１４

【非特許文献8】Ｇｉｌｌｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｖｏｌ．３１；６３８－６４６，２０１３

【非特許文献9】Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｄｏｗｄｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ，Ｖｏｌ．２８；１０９－１１８，２０１８

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、オリゴヌクレオチド化合物、特にリガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチド化合物の遺伝子サイレンシング活性を阻害又は抑制するように作用する細胞タンパク質の同定に部分的に基づく。従って、本明細書に記載される本発明の方法は、標的細胞又は対象におけるこのようなサプレッサータンパク質の発現又は活性を阻害することによって、リガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチド化合物、特に治療用オリゴヌクレオチド化合物の遺伝子サイレンシング活性を増強するための手段を提供する。

【0009】

いくつかの実施形態では、方法は、例えば、細胞をサプレッサータンパク質の阻害剤と接触させることによって、細胞内のサプレッサータンパク質の発現又は活性を阻害することと、標的遺伝子配列と実質的に又は完全に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド化合物（例えば、標的遺伝子指向性オリゴヌクレオチド化合物）と細胞を接触させることであって、オリゴヌクレオチド化合物が、細胞の表面に発現する受容体のリガンドに共有結合される、接触させることとを含む。細胞は、インビトロ又はインビボであり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、標的遺伝子の発現を低減させる必要のある対象に存在する。従って、特定の実施形態では、本発明はまた、サプレッサータンパク質の阻害剤と、標的遺伝子の配列と実質的に又は完全に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド化合物（例えば、標的遺伝子指向性オリゴヌクレオチド化合物）であって、リガンドに共有結合されるオリゴヌクレオチド化合物とを対象に投与することを含む、対象の標的遺伝子の発現を低減するための方法を含む。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、ヒト遺伝子であり、肝臓細胞又は組織に発現する遺伝子であり得る。これら及び他の実施形態では、標的遺伝子の発現は、対象の疾患又は障害と関連するものであり、従ってオリゴヌクレオチド化合物は治療的であり得る。

【0010】

本発明の方法に使用される標的遺伝子指向性オリゴヌクレオチド化合物は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。例えば、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、標的遺伝子配列と実質的に又は完全に相補的な配列を含む一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである。このような実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１５～約３０ヌクレオチド長であり得る。他の実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ分子であり、アンチセンス鎖は、標的遺伝子の配列と実質的に又は完全に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は、約１５～約３０塩基対長の二重鎖領域を形成するために、アンチセンス鎖の配列と十分に相補的な配列を含み得る。これら及び他の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ独立して、約１９～約３０ヌクレオチド長である。

【0011】

本発明の方法に使用される標的遺伝子指向性オリゴヌクレオチド化合物は、リボース環、核酸塩基又はホスホジエステル骨格に修飾を有するヌクレオチドを含む、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、１つ以上の２’－修飾ヌクレオチドを含む。このような２’－修飾ヌクレオチドとしては、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、二環式核酸（ＢＮＡ）、デオキシリボヌクレオチド、又はこれらの組み合わせを挙げることができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物のヌクレオチド全てが、修飾ヌクレオチドである。特定の実施形態では、本発明の方法に使用される標的遺伝子指向性オリゴヌクレオチド化合物は、修飾ヌクレオチド間結合又はヌクレオシド間結合などの少なくとも１つの骨格修飾を含む。例えば、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。

【0012】

本発明の方法の特定の実施形態では、標的遺伝子指向性オリゴヌクレオチド化合物は、オリゴヌクレオチド化合物を送達することが意図される細胞又は組織内に発現する受容体のリガンドに共有結合される。いくつかの実施形態では、リガンドは、コレステロール部分、ビタミン、ステロイド、胆汁酸、葉酸部分、脂肪酸、炭水化物、グリコシド、又は抗体若しくはその抗原結合断片を含む。特定の実施形態では、リガンドは、オリゴヌクレオチド化合物を肝臓細胞（例えば、肝細胞）に送達することを標的とする。これら及び他の実施形態では、リガンドは、アシアロ糖タンパク質受容体のリガンドであってよく、ガラクトース、ガラクトサミン、又はＮ－アセチル－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含み得る。特定の実施形態では、リガンドは、多価ガラクトース又は多価ＧａｌＮＡｃ部分、例えば、三価又は四価のガラクトース又はＧａｌＮＡｃ部分を含む。リガンドは、任意選択により、リンカーを介して、オリゴヌクレオチド化合物のオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端に共有結合され得る。

【0013】

サプレッサータンパク質の阻害剤は、標的遺伝子指向性オリゴヌクレオチド化合物が送達される細胞内のサプレッサータンパク質の発現又は活性を低減する、あらゆる種類の分子又は薬剤であり得る。本発明の方法のいくつかの実施形態では、サプレッサータンパク質は、ＲＡＢ１８、ＺＷ１０、ＳＴＸ１８、ＳＣＦＤ２、ＮＡＰＧ、ＳＡＭＤ４Ｂ、ＶＰＳ３７Ａ、ＹＡＰ１、ＣＣＮＥ１、ＳＬＣ３０Ａ９、ＴＥＤＣ１、ＨＩＦ１ＡＮ、又はＴＲＡＦ２である。本発明の方法の特定の実施形態では、サプレッサータンパク質は、ＲＡＢ１８、ＺＷ１０、ＳＴＸ１８、ＳＣＦＤ２、ＮＡＰＧ、ＳＡＭＤ４Ｂ、又はＶＰＳ３７Ａである。本発明の方法の特定の他の実施形態では、サプレッサータンパク質は、ＲＡＢ１８、ＺＷ１０、又はＳＴＸ１８である。特定の一実施形態では、サプレッサータンパク質は、ＲＡＢ１８である。

【0014】

本発明の方法のいくつかの実施形態では、サプレッサータンパク質の阻害剤、例えば、本明細書に記載されるサプレッサータンパク質のいずれかは、サプレッサータンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の発現を低減するオリゴヌクレオチドベースの阻害剤であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、サプレッサータンパク質の阻害剤は、本明細書に記載されるようなオリゴヌクレオチド化合物であって、オリゴヌクレオチド化合物は、サプレッサータンパク質をコードするｍＲＮＡ配列と実質的に又は完全に相補的な配列を含む化合物である（例えば、サプレッサータンパク質指向性オリゴヌクレオチド化合物）。このようなサプレッサータンパク質指向性オリゴヌクレオチド化合物は、一本鎖であってよく、例えば、サプレッサータンパク質をコードするｍＲＮＡ配列と実質的に又は完全に相補的な配列を含む一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであってよい。代替的な実施形態では、サプレッサータンパク質指向性オリゴヌクレオチド化合物は、二本鎖であってもよく、例えば、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを含んでもよい。本発明の方法のいくつかの実施形態では、サプレッサータンパク質指向性オリゴヌクレオチド化合物は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ分子であり、アンチセンス鎖は、サプレッサータンパク質をコードするｍＲＮＡ配列と実質的に又は完全に相補的な配列を含む。サプレッサータンパク質指向性オリゴヌクレオチド化合物は、本明細書に記載されるように、１つ以上の修飾ヌクレオチド（例えば、２’－修飾ヌクレオチド）、又は修飾ヌクレオチド間結合若しくはヌクレオシド間結合（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）を含み得る。いくつかの実施形態では、サプレッサータンパク質指向性オリゴヌクレオチド化合物は、本明細書に記載されるリガンドのいずれかに共有結合されてもよい。このような一実施形態では、サプレッサータンパク質指向性オリゴヌクレオチド化合物に共有結合されたリガンドは、標的遺伝子指向性オリゴヌクレオチド化合物に共有結合されたリガンドと同一であってもよい。別の実施形態では、サプレッサータンパク質指向性オリゴヌクレオチド化合物に共有結合されたリガンドは、標的遺伝子指向性オリゴヌクレオチド化合物に共有結合されたリガンドと異なっていてもよいが、どちらのリガンドも、同一の細胞型又は組織に発現する受容体のリガンドである。

【0015】

本発明の方法の他の実施形態では、サプレッサータンパク質の阻害剤、例えば、本明細書に記載されるサプレッサータンパク質のいずれかは、低減した活性又は機能を有するサプレッサータンパク質のバリアントをコードするように、又は遺伝子の発現を全体的に排除する（すなわち遺伝子をノックアウトする）ように、サプレッサータンパク質をコードする遺伝子を改変する遺伝子改変剤である。特定の実施形態では、遺伝子改変剤は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）若しくはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、又はヌクレアーゼをコードするベクター／ポリヌクレオチドを含む。特定の他の実施形態では、遺伝子改変剤は、（ｉ）Ｃａｓヌクレアーゼ又はヌクレアーゼをコードするベクター／ポリヌクレオチド、及び（ｉｉ）ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡ発現カセットを含むベクター／ポリヌクレオチドを含み、ガイドＲＮＡは、サプレッサータンパク質をコードする遺伝子配列の一部と相補的な配列を含む。ヌクレアーゼ及び／又はガイドＲＮＡ発現カセットをコードするベクターは、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターであり得る。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1A】２つのｇＲＮＡレンチウイルスベクター、ＳＬＣ３Ａ２－８３又はＳＬＣ３Ａ２－８４のうちの１つで形質導入した後の、Ｈｅｐ３Ｂ親細胞株又は異なる３つの安定Ｈｅｐ３ＢＣａｓ９細胞株のうちの１つにおけるＳＬＣ３Ａ２発現の棒グラフを示す。

【図1B】２つのｇＲＮＡレンチウイルスベクター、ＡＳＧＲ１－７７又はＡＳＧＲ１－７８のうちの１つで形質導入した後の、Ｈｅｐ３Ｂ親細胞株又は３つの異なる安定Ｈｅｐ３ＢＣａｓ９細胞株のうちの１つにおけるＡＳＧＲ１発現の棒グラフを示す。

【図2A】異なる４つの処理群のうちの１つにおける、１００μＭの６－チオグアニン（６ＴＧ）で処理した後の３日目（図２Ａ）及び６日目（図２Ｂ）に測定された生存細胞数の棒グラフである。ｇＲＮＡレンチウイルスライブラリーで形質導入されたＨｅｐ３ＢＣａｓ９細胞を、ＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡ単独（ＨＰＲＴ１－ｓｉ）、ＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡと６ＴＧ（ＨＰＲＴ１－ｓｉ＋６－ＴＧ）、６－ＴＧ単独（６－ＴＧ）、又はｓｉＲＮＡも６ＴＧも含まないもの（陰性対照）で処理した。各処理群で、６ＴＧ処理後の３日目と６日目にＶｉＣｅｌｌで測定した生存細胞数を、陰性対照群の測定値によって正規化した。両時点で得られた各群の正規化された生存率を、平均±標準偏差で示す。

【図2B】異なる４つの処理群のうちの１つにおける、１００μＭの６－チオグアニン（６ＴＧ）で処理した後の３日目（図２Ａ）及び６日目（図２Ｂ）に測定された生存細胞数の棒グラフである。ｇＲＮＡレンチウイルスライブラリーで形質導入されたＨｅｐ３ＢＣａｓ９細胞を、ＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡ単独（ＨＰＲＴ１－ｓｉ）、ＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡと６ＴＧ（ＨＰＲＴ１－ｓｉ＋６－ＴＧ）、６－ＴＧ単独（６－ＴＧ）、又はｓｉＲＮＡも６ＴＧも含まないもの（陰性対照）で処理した。各処理群で、６ＴＧ処理後の３日目と６日目にＶｉＣｅｌｌで測定した生存細胞数を、陰性対照群の測定値によって正規化した。両時点で得られた各群の正規化された生存率を、平均±標準偏差で示す。

【図3A】ｓｉＲＮＡを含まないが６ＴＧで処理された試料（ｎｏｓｉ６ＴＧｄ９）に対する１５０ｎＭのｓｉＲＮＡ＋６ＴＧ処理試料（１５０ｓｉ６ＴＧｄ９）、及びｓｉＲＮＡを含まないが６ＴＧで処理された試料（ｎｏｓｉ６ＴＧｄ９）に対する７５０ｎＭのｓｉＲＮＡ＋６ＴＧ処理試料（７５０ｓｉ６ＴＧｄ９）の両方で濃縮された遺伝子を示す散布図である。偽発見率（ＦＤＲ）＜０．２の合計１７個の遺伝子が同定された（黒く塗りつぶされた点で表示されている）。

【図3B】ｓｉＲＮＡを含まず、６ＴＧを含まない試料に対する６ＴＧのみで枯渇した遺伝子による、ｓｉＲＮＡを含まないが６ＴＧで処理された試料（ｎｏｓｉ６ＴＧｄ９）に対する７５０ｎＭのｓｉＲＮＡ＋６ＴＧ処理試料（７５０ｓｉ６ＴＧｄ９）による濃縮された遺伝子を示す散布図である。横軸は６ＴＧに対する感受性を示す。６ＴＧで処理したときに大幅に枯渇したＦＤＲ＜０．２の８個の遺伝子が、破線の枠によって囲われている。

【図4A】様々な濃度の異なる３つのＲＡＢ１８標的ｓｉＲＮＡ分子のうちの１つで２４時間処理されたＨｅｐ３Ｂ細胞における、ＲＡＢ１８のｍＲＮＡレベルのパーセンテージを示す折れ線グラフである。ＲＡＢ１８遺伝子を標的とする様々な濃度の異なる３つのｓｉＲＮＡ分子で処理されたＨｅｐ３Ｂ細胞から、処理してから２４時間後にＲＮＡ試料を抽出した。次いで、逆転写によってＲＮＡから合成したｃＤＮＡ試料を、ｄｄＰＣＲ分析にかけた。ＲＡＢ１８のｄｄＰＣＲ測定値をハウスキーピングＴＢＰ遺伝子のｄｄＰＣＲ測定値に正規化し、ＲＡＢ１８のｍＲＮＡレベルのパーセンテージを算出した。

【図4B】ＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡ分子によって処理してから４日後の、非標的対照ｓｉＲＮＡ分子（ｓｉＮＴＣ）又はＲＡＢ１８標的ｓｉＲＮＡ分子（ｓｉＲＡＢ１８）でトランスフェクトしたＨｅｐ３Ｂ細胞における、ＲＡＢ１８のｍＲＮＡレベルの棒グラフである。Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、トランスフェクションによってｓｉＲＡＢ１８－３又はｓｉＮＴＣ分子で前処理した。２４時間後、トランスフェクション培地を洗い流した後に、様々な濃度のＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡ分子（二重鎖番号８１７２）で細胞を処理した。二重鎖番号８１７２による処理後の４日目に、ＲＡＢ１８のｍＲＮＡレベルをｄｄＰＣＲで測定するために細胞を採取した。

【図4C】非標的対照ｓｉＲＮＡ分子（ｓｉＮＴＣ）又はＲＡＢ１８標的ｓｉＲＮＡ分子（ｓｉＲＡＢ１８）のいずれかでトランスフェクトしたＨｅｐ３Ｂ細胞における、ＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡ分子（二重鎖８１７２）の用量反応曲線を示す。二重鎖番号８１７２による処理後の４日目に、ＨＰＲＴ１のｍＲＮＡレベルを、図４Ｂに記載した実験から採取した細胞からｄｄＰＣＲによって測定した。ＨＰＲＴ１のｍＲＮＡレベルを、ハウスキーピングＴＢＰ遺伝子の測定値及びｓｉＲＮＡを含まない（ＰＢＳのみの）処理対照群で正規化したパーセンテージとして表す。

【図5】示されたＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートｓｉＲＮＡ分子の、濃度を関数とした細胞溶解率のグラフである。Ｈｅｐ３ＢＣａｓ９細胞及び異なる２つのＲＡＢ１８ノックアウト細胞プール（ＲＡＢ１８ ＫＯ＿１及びＲＡＢ１８ ＫＯ＿２）を、様々な濃度のＧａｌＮＡｃ－ＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子（ＨＰＲＴ１－ｓｉ）又はＧａｌＮＡｃ－ＰＰＩＢ ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子（ＰＰＩＢ－ｓｉ）のいずれかで３日間処理した。次いで、細胞を１００μＭの６ＴＧを使用する生存／死滅選択スクリーニングにかけた。６ＴＧ処理後の６日目に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を使用して生存細胞を検出した。

【図6A】Ｈｅｐ３ＢＣａｓ９細胞及び異なる２つのＲＡＢ１８ノックアウト細胞プール（ＲＡＢ１８ ＫＯ＿１及びＲＡＢ１８ ＫＯ＿２）における、ＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡ分子（二重鎖番号８１７２）の用量反応曲線を示す。細胞を、様々な濃度のＧａｌＮＡｃ－ＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子（ＨＰＲＴ１－ｓｉ）又は対照としてのＧａｌＮＡｃ－ＰＰＩＢ ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子（ＰＰＩＢ－ｓｉ）のいずれかで４日間処理した。ｍＲＮＡレベルをｄｄＰＣＲによって測定した。ＨＰＲＴ１のｍＲＮＡレベルを、ハウスキーピングＴＢＰ遺伝子の測定値及びｓｉＲＮＡを含まない（ＰＢＳのみの）処理対照群で正規化したパーセンテージとして表す。

【図6B】Ｈｅｐ３ＢＣａｓ９細胞及び異なる２つのＲＡＢ１８ノックアウト細胞プール（ＲＡＢ１８ ＫＯ＿１及びＲＡＢ１８ ＫＯ＿２）における、ＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡ分子（二重鎖番号１６０８４）の用量反応曲線を示す。細胞を、様々な濃度のＧａｌＮＡｃ－ＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子（ＡＳＧＲ１－ｓｉ）又は対照としてのＧａｌＮＡｃ－ＰＰＩＢ ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子（ＰＰＩＢ－ｓｉ）のいずれかで４日間処理した。ｍＲＮＡレベルをｄｄＰＣＲによって測定した。ＡＳＧＲ１のｍＲＮＡレベルを、ハウスキーピングＴＢＰ遺伝子の測定値及びｓｉＲＮＡを含まない（ＰＢＳのみの）処理対照群で正規化したパーセンテージとして表す。

【図6C】Ｈｅｐ３ＢＣａｓ９細胞及び異なる２つのＲＡＢ１８ノックアウト細胞プール（ＲＡＢ１８ ＫＯ＿１及びＲＡＢ１８ ＫＯ＿２）における、ＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＰＰＩＢ ｓｉＲＮＡ分子（二重鎖番号８７１４）の用量反応曲線を示す。細胞を、様々な濃度のＧａｌＮＡｃ－ＰＰＩＢ ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子（ＰＰＩＢ－ｓｉ）又は対照としてのＧａｌＮＡｃ－ＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子（ＨＰＲＴ１－ｓｉ）のいずれかで４日間処理した。ｍＲＮＡレベルをｄｄＰＣＲによって測定した。ＰＰＩＢのｍＲＮＡレベルを、ハウスキーピングＴＢＰ遺伝子の測定値及びｓｉＲＮＡを含まない（ＰＢＳのみの）処理対照群で正規化したパーセンテージとして表す。

【図7】Ｈｅｐ３ＢＣａｓ９細胞及び異なる２つのＲＡＢ１８ノックアウト細胞プール（ＲＡＢ１８ ＫＯ＿１及びＲＡＢ１８ ＫＯ＿２）における、ＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡ分子（二重鎖番号８１７２）の用量反応曲線を示す。細胞を、抗ＡＳＧＲ１抗体（７Ｅ１１）、アイソタイプ対照抗体（アイソタイプ）、又は抗体を含まないもので３０分間前処理した。次いで、ＧａｌＮＡｃ－ＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲートを様々な濃度で細胞に添加した。ｓｉＲＮＡ処理後の４日目に、ｍＲＮＡレベルをｄｄＰＣＲによって測定した。ＨＰＲＴ１のｍＲＮＡレベルを、ハウスキーピングＴＢＰ遺伝子の測定値及びｓｉＲＮＡを含まない（ＰＢＳのみの）処理対照群で正規化したパーセンテージとして表す。

【図8】Ｈｅｐ３ＢＣａｓ９細胞とＲＡＢ１８ノックアウト細胞（ＲＡＢ１８ ＫＯ）における、リポフェクタミン試薬（ＲＮＡｉＭＡＸ）を含む場合と含まない場合の、非コンジュゲートＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡ分子（二重鎖番号１７６２９）の用量反応曲線を示す。細胞を、様々な濃度の非コンジュゲートＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡ分子（ＨＰＲＴ１－ｓｉ １７６２９）単独で、又はリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ試薬と共に４日間処理した。ｍＲＮＡレベルをｄｄＰＣＲによって測定した。ＨＰＲＴ１のｍＲＮＡレベルを、ハウスキーピングＴＢＰ遺伝子の測定値及びｓｉＲＮＡを含まない（ＰＢＳのみの）処理対照群で正規化したパーセンテージとして表す。

【図9】Ｈｅｐ３ＢＣａｓ９細胞とＲＡＢ１８ノックアウト細胞（ＲＡＢ１８ ＫＯ）における、ＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＨＰＲＴ１一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）分子（化合物番号１５４６９及び１５４７０）、並びに対照のＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＰＮＰＬＡ３ ＡＳＯ分子（化合物番号１５４７２）の用量反応曲線を示す。細胞を、様々な濃度の異なるＧａｌＮＡｃ－ＡＳＯコンジュゲート分子で４日間処理した。ｍＲＮＡレベルをｄｄＰＣＲによって測定した。ＨＰＲＴ１のｍＲＮＡレベルを、ハウスキーピングＴＢＰ遺伝子の測定値及びＡＳＯを含まない（ＰＢＳのみの）処理対照群で正規化したパーセンテージとして表す。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本発明は、ｓｉＲＮＡ分子などのオリゴヌクレオチド化合物の遺伝子サイレンシング活性に負の影響を及ぼす細胞内タンパク質の同定に部分的に基づく。本明細書に更に記載されるように、このようなサプレッサータンパク質の発現又は活性を抑制又は阻害することにより、オリゴヌクレオチド化合物の遺伝子サイレンシング活性を著しく増大させ、それによってオリゴヌクレオチド化合物の治療的有用性が潜在的に拡張される。ＲＡＢ１８などの同定されたサプレッサータンパク質のいくつかは、エンドソームを細胞内輸送する役割を果たすものと考えられているため、本発明の方法は、受容体依存性エンドサイトーシス経路を介して細胞に侵入するリガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチド化合物の遺伝子サイレンシング活性を増強又は増大させるのに特に有用である。従って、特定の実施形態では、本発明は、細胞内のオリゴヌクレオチド化合物のサイレンシング活性を増強するための方法であって、細胞内のサプレッサータンパク質の発現又は活性を阻害することと、細胞をオリゴヌクレオチド化合物と接触させることであって、オリゴヌクレオチド化合物が標的遺伝子の配列と実質的に相補的な配列を含む、接触させることとを含む方法を提供する。

【0018】

本明細書で使用する場合、「オリゴヌクレオチド化合物」は、標的核酸とハイブリダイズして遺伝子サイレンシング活性を引き起こすために、標的核酸配列と十分に相補的なヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む化合物である。「ハイブリダイズする」又は「ハイブリダイゼーション」は、典型的には２つのオリゴヌクレオチド内の相補的塩基間の水素結合（例えばワトソン－クリック水素結合、フーグスティーン又は逆フーグスティーン水素結合）を介した、相補的ポリヌクレオチドの対形成を指す。本明細書で使用する場合、第１の配列を含むオリゴヌクレオチドが、生理的条件などの特定の条件下で第２の配列を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズして二本鎖領域を形成することができる場合、第１の配列は第２の配列と「相補的」である。他のそのような条件には、中程度又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を含むことができ、これらは当業者に公知である。第１の配列を含むオリゴヌクレオチドが、第２の配列を含むオリゴヌクレオチドと、あらゆるミスマッチも含まずに一方又は両方のヌクレオチド配列の全長にわたって塩基対形成する場合、第１の配列は第２の配列と完全に相補的（１００％相補的）であるとみなされる。配列が標的配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％相補的である場合、配列は標的配列と「実質的に相補的」である。相補性パーセントは、第２の配列又は標的配列内の対応する位置の塩基と相補的な第１の配列内の塩基の数を、第１の配列の全長で割ることによって算出することができる。また、２つの配列がハイブリダイズしたときに、３０塩基対の二本鎖領域にわたって５、４、３、又は２つ以下のミスマッチが存在する場合、配列は他方の配列と実質的に相補的であると言うことができる。

【0019】

本発明の方法に使用されるオリゴヌクレオチド化合物は、標的遺伝子配列と実質的に又は完全に相補的な配列を有する領域を有する、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。標的遺伝子配列とは、一般的には、ポリペプチドの部分的又は完全なコード配列を含む核酸配列を指す。標的遺伝子配列は、５’若しくは３’非翻訳領域（ＵＴＲ）又はプロモーター領域などの非コード領域も含み得る。特定の実施形態では、標的遺伝子配列は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列である。ｍＲＮＡ配列は、スプライスバリアントを含み、任意の種（例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長類、ヒト）に由来するタンパク質、タンパク質バリアント、又はアイソフォームをコードする任意のメッセンジャーＲＮＡ配列を指す。一実施形態では、標的遺伝子配列は、ヒトタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列である。標的遺伝子配列はまた、ｔＲＮＡ配列、マイクロＲＮＡ配列、又はウイルスＲＮＡ配列などの、ｍＲＮＡ配列以外のＲＮＡ配列であってもよい。

【0020】

本発明の方法の特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、標的遺伝子配列の少なくとも１０個の連続的なヌクレオチドと実質的に相補的な又は完全に相補的な領域を有する、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドが相補性領域を含む標的遺伝子配列の領域は、約１０～約３０個の連続したヌクレオチド、約１５～約３０個の連続したヌクレオチド、約１６～約２８個の連続したヌクレオチド、約１８～約２６個の連続したヌクレオチド、約１７～約２４個の連続したヌクレオチド、約１５～約２０個の連続したヌクレオチド、約１９～約３０個の連続したヌクレオチド、約１９～約２５個の連続したヌクレオチド、約１９～約２３個の連続したヌクレオチド、又は約１９～約２１個の連続したヌクレオチドの範囲であり得る。

【0021】

「遺伝子サイレンシング活性」又は「サイレンシング活性」は、転写又は翻訳のレベルにおける標的遺伝子の下方制御又は発現の低減を指す。遺伝子サイレンシング活性には、ＲＮＡ干渉メカニズムによる遺伝子発現の低減、ＲＮアーゼＨ媒介分解、及び立体阻害が包含される。ＲＮＡ干渉は、核酸分子が、例えば、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を介して、配列特異的に標的ＲＮＡ分子（例えば、メッセンジャーＲＮＡすなわちｍＲＮＡ分子）の切断及び分解を誘導するプロセスである。ＲＮアーゼＨ媒介分解は、デオキシリボヌクレオチドのストレッチ又はギャップを含むオリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ分子）にハイブリダイズし、リボヌクレアーゼであるＲＮアーゼＨの基質となるＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドが生成され、これによってＲＮアーゼＨによる標的ＲＮＡ分子の切断が起こるときに生じる。遺伝子サイレンシング活性はまた、オリゴヌクレオチドが標的核酸配列にハイブリダイズし、ＲＮＡポリメラーゼによる転写を阻害する（例えば、標的核酸配列がプロモーター領域である場合）、又は標的核酸配列がｍＲＮＡ分子である場合はリボソームによる翻訳を阻害する立体阻害によって生じる可能性がある。

【0022】

本発明の方法のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は一本鎖である。例えば、オリゴヌクレオチド化合物は、あらゆる二本鎖領域又は自己相補領域も含まない、単一のオリゴヌクレオチドを含むか又はそれからなる。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、標的遺伝子配列と実質的に相補的な又は完全に相補的な配列を含む一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１０～約３０ヌクレオチド長、約１５～約３０ヌクレオチド長、約１２～約２８ヌクレオチド長、約１８～約２６ヌクレオチド長、約２０～約３０ヌクレオチド長、約１５～約２０ヌクレオチド長、約１９～約２５ヌクレオチド長、約１９～約２３ヌクレオチド長、約１９～約２１ヌクレオチド長、約２１～約２５ヌクレオチド長、又は約２０～約２３ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、又は約２５ヌクレオチド長である。

【0023】

本発明の方法の他の実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は二本鎖である。このようないくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、ハイブリダイズして二重鎖領域を形成するために、互いに十分に相補的な２つの逆平行オリゴヌクレオチドを含むか又はそれからなる。標的遺伝子配列（例えば、標的ｍＲＮＡ）と実質的に相補的な又は完全に相補的な配列を有する領域を含むオリゴヌクレオチドは、「アンチセンス鎖」又は「ガイド鎖」と称される。「センス鎖」又は「パッセンジャー鎖」は、アンチセンス鎖の領域と実質的に相補的な又は完全に相補的な領域を含むオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、センス鎖は、標的遺伝子配列と実質的に同一な配列を有する領域を含み得る。

【0024】

二本鎖オリゴヌクレオチド化合物（例えば、二本鎖ＲＮＡ分子）は、本明細書に記載されるか又は当技術分野において公知のものなどの、リボヌクレオチドのリボース糖、塩基、又は骨格構成要素の修飾を含む、リボヌクレオチドの化学修飾を含み得る。二本鎖ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）で使用されているように、このようなあらゆる修飾が、本開示の目的のために「二本鎖ＲＮＡ」という用語によって包含される。

【0025】

オリゴヌクレオチド化合物が二本鎖である実施形態では、アンチセンス鎖の領域は、標的遺伝子配列（例えば、標的ｍＲＮＡ）の領域と実質的に又は完全に相補的な配列を含む。このような実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の配列と完全に相補的な配列を含み得る。他のこのような実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の配列と実質的に相補的な配列、例えばセンス鎖とアンチセンス鎖によって形成された二重鎖領域に１、２、３、４、又は５つのミスマッチを有する配列を含み得る。特定の実施形態では、任意のミスマッチが末端領域内（例えば、鎖の５’末端及び／又は３’末端の６、５、４、３又は２ヌクレオチド以内）に生じることが好ましい。一実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖から形成される二重鎖領域内の任意のミスマッチは、アンチセンス鎖の５’末端の６、５、４、３又は２ヌクレオチド以内に生じる。

【0026】

本発明の方法の特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、ハイブリダイズして二重鎖領域を形成するが、そうでなければ分離している別々の２つの分子であり得る。２つの別々の鎖から形成されるそのような二本鎖ＲＮＡ分子は、「低分子干渉ＲＮＡ」又は「短干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）と称される。従って、いくつかの実施形態では、本発明の方法に使用されるオリゴヌクレオチド化合物は、ｓｉＲＮＡを含むか又はそれからなる。

【0027】

他の実施形態では、ハイブリダイズして二重鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖は、単一のオリゴヌクレオチドの一部であってよく、すなわち、センス鎖及びアンチセンス鎖は、単一のオリゴヌクレオチドの自己相補的領域の一部である。このような場合、オリゴヌクレオチド化合物は、二重鎖領域（ステム領域とも称される）とループ領域を含む単一のオリゴヌクレオチドを含むか又はそれからなる。センス鎖の３’末端は、不対ヌクレオチドの連続配列によってアンチセンス鎖の５’末端に連結されており、これによりループ領域が形成されることとなる。ループ領域は、典型的には、アンチセンス鎖がセンス鎖と塩基対を形成して二重鎖領域又はステム領域を形成することができるように、オリゴヌクレオチドがそれ自体で再度折り畳まれることが可能なほど十分に長い。ループ領域は、約３～約２５、約５～約１５、又は約８～約１２個の不対ヌクレオチドを含み得る。少なくとも部分的な自己相補的領域を含むこのようなオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ分子）は、「低分子ヘアピン型ＲＮＡ」（ｓｈＲＮＡ）と称される。特定の実施形態では、本発明の方法に使用されるオリゴヌクレオチド化合物は、ｓｈＲＮＡを含むか又はそれからなる。単一で、少なくとも部分的な自己相補的オリゴヌクレオチドの長さは、約４０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド～約８５ヌクレオチド、又は約５０ヌクレオチド～約６０ヌクレオチドであってよく、それぞれ本明細書に列挙される長さを有する二重鎖領域及びループ領域を含み得る。

【0028】

オリゴヌクレオチド化合物が二本鎖である（例えば、ｓｉＲＮＡを含む）実施形態では、センス鎖は、典型的に、２本の鎖が生理的条件下でハイブリダイズして二重鎖領域を形成するように、アンチセンス鎖の配列と十分に相補的な配列を含む。「二重鎖領域」は、ワトソン－クリック塩基対形成又は他の水素結合相互作用のいずれかによって互いに塩基対を形成して、２つのオリゴヌクレオチド間で二重鎖を生成する、２つの相補的又は実質的に相補的なオリゴヌクレオチド内の領域を指す。オリゴヌクレオチド化合物の二重鎖領域は、例えば、ダイサー酵素及び／又はＲＩＳＣ複合体の関与によって化合物がＲＮＡ干渉経路に入ることができるほど十分な長さでなければならない。例えば、いくつかの実施形態では、二重鎖領域は、約１５～約３０塩基対長である。この範囲内における二重鎖領域の他の長さ、例えば約１５～約２８塩基対、約１５～約２６塩基対、約１５～約２４塩基対、約１５～約２２塩基対、約１７～約２８塩基対、約１７～約２６塩基対、約１７～約２４塩基対、約１７～約２３塩基対、約１７～約２１塩基対、約１９～約２５塩基対、約１９～約２３塩基対、又は約１９～約２１塩基対も好適である。特定の実施形態では、二重鎖領域は、約１７～約２４塩基対長である。他の実施形態では、二重鎖領域は、約１９～約２１塩基対長である。一実施形態では、二重鎖領域は、約１９塩基対長である。別の実施形態では、二重鎖領域は、約２１塩基対長である。

【0029】

センス鎖及びアンチセンス鎖が２つの別々のオリゴヌクレオチドである（例えば、オリゴヌクレオチド化合物がｓｉＲＮＡを含むか又はそれからなる）実施形態の場合、センス鎖及びアンチセンス鎖は、二重鎖領域の長さと同一の長さである必要はない。例えば、一方又は両方の鎖が二重鎖領域よりも長くてもよく、二重鎖領域に隣接する１つ以上の不対ヌクレオチド又はミスマッチを有してもよい。従って、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物（例えば、ｓｉＲＮＡ分子）は、少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを含む。本明細書で使用する場合、「ヌクレオチドオーバーハング」は、鎖の末端に二重鎖領域を越えて延在する不対ヌクレオチドを指す。ヌクレオチドオーバーハングは、典型的に、一方の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を越えて延在する場合、又は一方の鎖の５’末端が他方の鎖の３’末端を越えて延在する場合に生成される。ヌクレオチドオーバーハングの長さは、一般に、１～６ヌクレオチド、１～５ヌクレオチド、１～４ヌクレオチド、１～３ヌクレオチド、２～６ヌクレオチド、２～５ヌクレオチド、又は２～４ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、１、２、３、４、５、又は６ヌクレオチドを含む。特定の一実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、１～４ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、２ヌクレオチドを含む。特定の他の実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、単一のヌクレオチドを含む。

【0030】

オーバーハング内のヌクレオチドは、本明細書に記載されるようなリボヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、オーバーハング内のヌクレオチドは、２’－修飾ヌクレオチド（例えば、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド）、デオキシリボヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、逆位ヌクレオチド（例えば、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド）、又はこれらの組み合わせである。例えば、一実施形態では、オーバーハング内のヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、例えば、デオキシチミジンである。別の実施形態では、オーバーハング内のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせである。他の実施形態では、オーバーハングは、５’－ウリジン－ウリジン－３’（５’－ＵＵ－３’）ジヌクレオチドを含む。このような実施形態では、ＵＵジヌクレオチドは、リボヌクレオチド又は修飾ヌクレオチド、例えば２’－修飾ヌクレオチドを含み得る。他の実施形態では、オーバーハングは、５’－デオキシチミジン－デオキシチミジン－３’（５’－ｄＴｄＴ－３’）ジヌクレオチドを含む。ヌクレオチドオーバーハングがアンチセンス鎖に存在する場合、オーバーハング内のヌクレオチドは、標的遺伝子配列と相補的であり得るか、標的遺伝子配列とミスマッチを形成し得るか、又は何らかの他の配列を含み得る（例えば、ポリピリミジン配列又はポリプリン配列、例えば、ＵＵ、ＴＴ、ＡＡ、ＧＧなど）。

【0031】

ヌクレオチドオーバーハングは、一方又は両方の鎖の５’末端又は３’末端に存在し得る。例えば、一実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物（例えば、ｓｉＲＮＡ分子）は、アンチセンス鎖の５’末端及び３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物（例えば、ｓｉＲＮＡ分子）は、センス鎖の５’末端及び３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物（例えば、ｓｉＲＮＡ分子）は、センス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の５’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。他の実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物（例えば、ｓｉＲＮＡ分子）は、センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。

【0032】

本発明の方法に使用されるオリゴヌクレオチド化合物（例えば、ｓｉＲＮＡ分子）は、二重鎖分子の一方の末端に単一のヌクレオチドオーバーハングを含み、他の末端に平滑末端を含み得る。「平滑末端」は、センス鎖及びアンチセンス鎖が分子の末端で完全な塩基対を形成しており、二重鎖領域を越えて延在する不対ヌクレオチドが存在しないことを意味する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物（例えば、ｓｉＲＮＡ分子）は、センス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含み、センス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の３’末端に平滑末端を含む。他の実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物（例えば、ｓｉＲＮＡ分子）は、アンチセンス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含み、アンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端に平滑末端を含む。特定の実施形態では、本発明の方法に使用されるオリゴヌクレオチド化合物（例えば、ｓｉＲＮＡ分子）は、二重鎖分子の両方の末端に平滑末端を含む。このような実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は同一の長さを有し、二重鎖領域は、センス鎖及びアンチセンス鎖と同一の長さである（すなわち、分子は、その全長にわたって二本鎖である）。

【0033】

オリゴヌクレオチド化合物がセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む（例えば、オリゴヌクレオチド化合物がｓｉＲＮＡ分子を含むか又はそれからなる）実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ独立して、約１５～約３０ヌクレオチド長、約１９～約３０ヌクレオチド長、約１８～約２８ヌクレオチド長、約１９～約２７ヌクレオチド長、約１９～約２５ヌクレオチド長、約１９～約２３ヌクレオチド長、約１９～約２１ヌクレオチド長、約２１～約２５ヌクレオチド長、又は約２１～約２３ヌクレオチド長であり得る。特定の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ独立して、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、又は約２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、同一の長さを有するが、オリゴヌクレオチド化合物が２つのヌクレオチドオーバーハングを有するように、これらの鎖よりも短い二重鎖領域を形成する。例えば、一実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、（ｉ）それぞれ２１ヌクレオチド長のセンス鎖及びアンチセンス鎖、（ｉｉ）１９塩基対長の二重鎖領域、並びに（ｉｉｉ）センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端の両方における２つの不対ヌクレオチドのヌクレオチドオーバーハングを含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、（ｉ）それぞれ２３ヌクレオチド長のセンス鎖及びアンチセンス鎖、（ｉｉ）２１塩基対長の二重鎖領域、並びに（ｉｉｉ）センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端の両方における２つの不対ヌクレオチドのヌクレオチドオーバーハングを含む。他の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は同一の長さを有し、二本鎖分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングが存在しないように、それらの全長にわたって二重鎖領域を形成する。このような一実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は平滑末端であり（例えば、２つの平滑末端を有し）、且つ（ｉ）それぞれ２１ヌクレオチド長のセンス鎖及びアンチセンス鎖、並びに（ｉｉ）２１塩基対長の二重鎖領域を含む。別のこのような実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は平滑末端であり（例えば、２つの平滑末端を有し）、且つ（ｉ）それぞれ２３ヌクレオチド長のセンス鎖及びアンチセンス鎖、並びに（ｉｉ）２３塩基対長の二重鎖領域を含む。更に別のこのような実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は平滑末端であり（例えば、２つの平滑末端を有し）、且つ（ｉ）それぞれ１９ヌクレオチド長のセンス鎖及びアンチセンス鎖、並びに（ｉｉ）１９塩基対長の二重鎖領域を含む。

【0034】

本発明の方法の他の実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物のセンス鎖又はアンチセンス鎖が他方の鎖よりも長く、この２本の鎖が、オリゴヌクレオチド化合物（例えば、ｓｉＲＮＡ分子）が少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを含むように、短い方の鎖の長さと等しい長さを有する二重鎖領域を形成する。例えば、一実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、（ｉ）１９ヌクレオチド長のセンス鎖、（ｉｉ）２１ヌクレオチド長のアンチセンス鎖、（ｉｉｉ）１９塩基対長の二重鎖領域、及び（ｉｖ）アンチセンス鎖の３’末端における２つの不対ヌクレオチドのヌクレオチドオーバーハングを含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、（ｉ）２１ヌクレオチド長のセンス鎖、（ｉｉ）２３ヌクレオチド長のアンチセンス鎖、（ｉｉｉ）２１塩基対長の二重鎖領域、及び（ｉｖ）アンチセンス鎖の３’末端における２つの不対ヌクレオチドのヌクレオチドオーバーハングを含む。

【0035】

本発明の方法に使用されるオリゴヌクレオチド化合物は、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド、核酸塩基、ペントース環、又はホスフェート基に１つ以上の化学修飾を有するヌクレオチドを指す。本明細書で使用する場合、修飾ヌクレオチドは、アデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジン一リン酸、及びシチジン一リン酸を含有するリボヌクレオチドを包含しない。しかしながら、オリゴヌクレオチド化合物は、修飾ヌクレオチドとリボヌクレオチドの組み合わせを含み得る。オリゴヌクレオチド化合物に修飾ヌクレオチドを組み込むことにより、例えば、ヌクレアーゼ及び他の分解プロセスに対する分子の感受性を低減させることで、オリゴヌクレオチド分子のインビボ安定性を向上させることができる。修飾ヌクレオチドの組み込みにより、標的遺伝子の発現を低減するオリゴヌクレオチド化合物の効力を増強させることもできる。

【0036】

特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、リボース糖の修飾を有する。これらの糖修飾としては、ペントース環の２’位及び／又は５’位の修飾、並びに二環式糖修飾を挙げることができる。２’－修飾ヌクレオチドは、ＯＨ以外の置換基を２’位に備えるペントース環を有するヌクレオチドを指す。このような２’－修飾としては、２’－Ｈ（例えば、デオキシリボヌクレオチド）、２’－Ｏ－アルキル（例えば、Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_１０又はＯ－Ｃ_１－Ｃ_１０置換アルキル）、２’－Ｏ－アリル（Ｏ－ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２）、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ又は２’－フルオロとも称される）、２’－Ｏ－メチル（ＯＣＨ_３）、２’－Ｏ－メトキシエチル（Ｏ－（ＣＨ_２）_２ＯＣＨ_３）、２’－ＯＣＦ_３、２’－Ｏ（ＣＨ_２）_２ＳＣＨ_３、２’－Ｏ－アミノアルキル、２’－アミノ（例えば、ＮＨ_２）、２’－Ｏ－エチルアミン、及び２’－アジドが挙げられるがこれらに限定されない。ペントース環の５’位の修飾としては、５’－メチル（Ｒ又はＳ）、５’－ビニル、及び５’－メトキシが挙げられるが、これらに限定されない。

【0037】

「二環式糖修飾」は、環の２つの原子を架橋により連結して第２の環を形成し、二環式糖構造を生じさせる、ペントース環の修飾を指す。いくつかの実施形態では、二環式糖修飾は、ペントース環の４’炭素と２’炭素との間に架橋を含む。二環式糖修飾を有する糖部分を含むヌクレオチドは、本明細書では二環式核酸又はＢＮＡと称される。例示的な二環式糖修飾としては、α－Ｌ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ_２－Ｏ－２’）二環式核酸（ＢＮＡ）；β－Ｄ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ_２－Ｏ－２’）ＢＮＡ（ロックド核酸又はＬＮＡとも称される）；エチレンオキシ（４’－（ＣＨ_２）_２－Ｏ－２’）ＢＮＡ；アミノオキシ（４’－ＣＨ_２－Ｏ－Ｎ（Ｒ）－２’）ＢＮＡ；オキシアミノ（４’－ＣＨ_２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’）ＢＮＡ；メチル（メチレンオキシ）（４’－ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ－２’）ＢＮＡ（拘束エチル又はｃＥｔとも称される）；メチレン－チオ（４’－ＣＨ_２－Ｓ－２’）ＢＮＡ；メチレン－アミノ（４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－２’）ＢＮＡ；メチル炭素環式（４’－ＣＨ_２－ＣＨ（ＣＨ_３）－２’）ＢＮＡ；プロピレン炭素環式（４’－（ＣＨ_２）_３－２’）ＢＮＡ；及びメトキシ（エチレンオキシ）（４’－ＣＨ（ＣＨ_２ＯＭｅ）－Ｏ－２’）ＢＮＡ（拘束ＭＯＥ又はｃＭＯＥとも称される）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法に使用されるオリゴヌクレオチド化合物に組み込むことができるこれら及び他の糖修飾ヌクレオチドは、米国特許第９，１８１，５５１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０１２２７６１号明細書、及びＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９：９３７－９５４，２０１２に記載されており、これらの全ては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0038】

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、１つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、二環式核酸（ＢＮＡ）、デオキシリボヌクレオチド、又はこれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、１つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせを含む。特定の一実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、１つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせを含む。別の特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、１つ以上の２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ、デオキシリボヌクレオチド、又はこれらの組み合わせを含む。

【0039】

本発明の方法に使用されるオリゴヌクレオチド化合物がセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む（例えば、オリゴヌクレオチド化合物がｓｉＲＮＡを含むか又はそれからなる）実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、１つ又は複数の修飾ヌクレオチドを含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、センス鎖の全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の修飾ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、アンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。特定の他の実施形態では、センス鎖の全てのヌクレオチド及びアンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。これら及び他の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせであり得る。

【0040】

本発明の方法に使用されるオリゴヌクレオチド化合物が一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むか又はそれからなる実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである。このような実施形態では、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーオリゴヌクレオチドであり得る。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、５’末端セグメント及び３’末端セグメントを含み、各末端セグメントは２～５個の修飾ヌクレオチド（例えば、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド又はＢＮＡ）を含み、末端セグメントは８～１０個のデオキシリボヌクレオチドから構成される中央の「ギャップ」領域を挟んでいる。一実施形態では、ギャップマーオリゴヌクレオチドは、５’から３’の順に、５個の２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、１０個のデオキシリボヌクレオチド、及び５個の２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ギャップマーオリゴヌクレオチドは、５’から３’の順に、３個のＢＮＡ（例えば、ＬＮＡ）、１０個のデオキシリボヌクレオチド、及び３個のＢＮＡ（例えば、ＬＮＡ）を含む。

【0041】

特定の実施形態では、本発明の方法に使用されるオリゴヌクレオチド化合物に組み込まれる修飾ヌクレオチドは、核酸塩基（本明細書では「塩基」とも称される）の修飾を有する。「修飾核酸塩基」又は「修飾塩基」は、天然に存在するプリン塩基であるアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）以外の塩基を指す。修飾核酸塩基は、合成であっても天然に存在する修飾であってよく、ユニバーサル塩基、５ーメチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン（Ｘ）、ヒポキサンチン（Ｉ）、２－アミノアデニン、６－メチルアデニン、６－メチルグアニン、並びにアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２－プロピル及び他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン、並びに２－チオシトシン、５－ハロウラシル及びシトシン、５－プロピニルウラシル及びシトシン、６－アゾウラシル、シトシン、及びチミン、５－ウラシル（プソイドウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル、並びに他の８－置換アデニン及びグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル、並びに他の５－置換ウラシル及びシトシン、７－メチルグアニン及び７－メチルアデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、７－デアザグアニン及び７－デアザアデニン、並びに３－デアザグアニン及び３－デアザアデニンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0042】

いくつかの実施形態では、修飾塩基はユニバーサル塩基である。「ユニバーサル塩基」は、結果として生じる二重鎖領域の二重らせん構造を変えることなく、ＲＮＡ及びＤＮＡ内の天然の塩基の全てと無差別に塩基対を形成する塩基類似体を指す。ユニバーサル塩基は当業者に公知であり、イノシン、Ｃ－フェニル、Ｃ－ナフチル及び他の芳香族誘導体、アゾールカルボキサミド、並びに３－ニトロピロール、４－ニトロインドール、５－ニトロインドール及び６－ニトロインドールなどのニトロアゾール誘導体を含むが、これらに限定されない。

【0043】

本発明の方法に使用されるオリゴヌクレオチド化合物に組み込むことができる他の好適な修飾塩基としては、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，Ｖｏｌ．１０：２９７－３１０，２０００、及びＰｅａｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．７６：７２９５－７３００，２０１１に記載されているものが挙げられ、これらの両方は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。グアニン、シトシン、アデニン、チミン、及びウラシルは、上記に記載された修飾核酸塩基などの他の核酸塩基によって置換され得る（但し、そのような置換核酸塩基を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変えない）ことを当業者は十分に認識している。

【0044】

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、１つ以上の脱塩基ヌクレオチドを含み得る。「脱塩基ヌクレオチド」又は「脱塩基ヌクレオシド」は、リボース糖の１’位に核酸塩基を欠くヌクレオチド又はヌクレオシドである。特定の実施形態では、脱塩基ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド化合物の１つ以上のオリゴヌクレオチドの末端に組み込まれる。例えば、オリゴヌクレオチド化合物がｓｉＲＮＡを含むか又はそれからなる一実施形態では、センス鎖は、その３’末端、その５’末端、又はその３’末端及び５’末端の両方における末端ヌクレオチドとして脱塩基ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、アンチセンス鎖は、その３’末端、その５’末端、又はその３’末端及び５’末端の両方における末端ヌクレオチドとして脱塩基ヌクレオチドを含む。脱塩基ヌクレオチドが末端ヌクレオチドであるこのような実施形態では、ヌクレオチドは、逆位ヌクレオチドであってよく、すなわち、天然の３’－５’ヌクレオチド間結合ではなく、３’－３’ヌクレオチド間結合を介して（鎖の３’末端上にある場合）、又は５’－５’ヌクレオチド間結合を介して（鎖の５’末端上にある場合）、隣接するヌクレオチドと結合され得る。また、脱塩基ヌクレオチドは、糖修飾、例えば上記に記載された糖修飾のいずれかを含み得る。特定の実施形態では、脱塩基ヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾、２’－Ｏ－メチル修飾、又は２’－Ｈ（デオキシ）修飾などの２’－修飾を含む。一実施形態では、脱塩基ヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル修飾を含む。別の実施形態では、脱塩基ヌクレオチドは２’－Ｈ修飾を含む（すなわち、デオキシ脱塩基ヌクレオチド）。

【0045】

本発明の方法に使用されるオリゴヌクレオチド化合物はまた、１つ以上の修飾ヌクレオチド間結合を含み得る。本明細書で使用する場合、「修飾ヌクレオチド間結合」という用語は、天然の３’－５’ホスホジエステル結合以外のヌクレオチド間結合を指す。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチド間結合は、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、アルキルホスホナート（例えば、メチルホスホナート、３’－アルキレンホスホナート）、ホスフィナート、ホスホロアミダート（例えば、３’－アミノホスホロアミダート及びアミノアルキルホスホロアミダート）、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、及びボラノホスフェートなどのリン含有ヌクレオチド間結合である。一実施形態では、修飾ヌクレオチド間結合は、２’－５’ホスホジエステル結合である。他の実施形態では、修飾ヌクレオチド間結合は、非リン含有ヌクレオチド間結合であり、従って修飾ヌクレオシド間結合と称し得る。このような非リン含有結合としては、モルホリノ結合（部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン結合（－Ｏ－Ｓｉ（Ｈ）_２－Ｏ－）；スルフィド、スルホキシド及びスルホン結合；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル結合；アルケン含有骨格；スルファマート骨格；メチレンメチルイミノ（－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－Ｏ－ＣＨ_２－）及びメチレンヒドラジノ結合；スルホナート及びスルホンアミド結合；アミド結合；並びに混合されたＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ_２構成要素部分を有する他のものが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、修飾ヌクレオシド間結合は、米国特許第５，５３９，０８２号明細書、米国特許第５，７１４，３３１号明細書、及び米国特許第５，７１９，２６２号明細書に記載されているようなペプチド核酸又はＰＮＡを生成するためのペプチドベースの結合（例えばアミノエチルグリシン）である。オリゴヌクレオチド化合物で使用され得る他の好適な修飾ヌクレオチド間結合及びヌクレオシド間結合は、米国特許第６，６９３，１８７号明細書、米国特許第９，１８１，５５１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０１２２７６１号明細書、及びＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９：９３７－９５４，２０１２に記載されており、これらの全ては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0046】

特定の実施形態では、本発明の方法に使用されるオリゴヌクレオチド化合物は、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。オリゴヌクレオチド化合物が二本鎖である（例えば、オリゴヌクレオチド化合物がｓｉＲＮＡを含む）実施形態では、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、オリゴヌクレオチド化合物のセンス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖に存在し得る。例えば、いくつかの実施形態では、センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。他の実施形態では、アンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。更に他の実施形態では、両方の鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。オリゴヌクレオチド化合物は、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方に１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。例えば、特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の３’末端に、約１～約６つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６つ以上）の連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。他の実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の５’末端に、約１～約６つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６つ以上）の連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。特定の一実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも１つであるが６つ以下のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖は、少なくとも１つであるが４つ以下のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。別の特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも１つであるが４つ以下のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖は、少なくとも１つであるが２つ以下のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。

【0047】

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、センス鎖の３’末端の末端ヌクレオチド間に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。他の実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、センス鎖の３’末端の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。一実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、センス鎖の３’末端の末端ヌクレオチド間に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、アンチセンス鎖の３’末端の末端ヌクレオチド間に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、アンチセンス鎖の３’末端の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む（すなわち、アンチセンス鎖の３’末端の第１及び第２のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合）。別の実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。なお別の実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖の５’末端に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。更に別の実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖の３’末端の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖の３’末端及び５’末端の両方の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む（すなわちアンチセンス鎖の５’末端及び３’末端の両方の第１及び第２のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合、並びにセンス鎖の５’末端及び３’末端の両方の第１及び第２のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合）。なお別の実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖の３’末端の末端ヌクレオチド間に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。一方又は両方の鎖が１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む実施形態のいずれかでは、鎖内の残りのヌクレオチド間結合が、天然の３’－５’ホスホジエステル結合であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の各ヌクレオチド間結合が、ホスホジエステル及びホスホロチオエートから選択され、少なくとも１つのヌクレオチド間結合がホスホロチオエートである。同様に、オリゴヌクレオチド化合物が単一のオリゴヌクレオチド（例えば、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド）を含むか又はそれからなる実施形態では、オリゴヌクレオチド中の各ヌクレオチド間結合が、ホスホジエステル及びホスホロチオエートから選択され、少なくとも１つのヌクレオチド間結合がホスホロチオエートである。他の実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチド内の全てのヌクレオチド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合である。

【0048】

オリゴヌクレオチド化合物がヌクレオチドオーバーハングを含む実施形態では、オーバーハングの不対ヌクレオチドの２つ以上が、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって連結され得る。特定の実施形態では、アンチセンス鎖及び／又はセンス鎖の３’末端のヌクレオチドオーバーハングの全ての不対ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって連結されている。他の実施形態では、アンチセンス鎖及び／又はセンス鎖の５’末端のヌクレオチドオーバーハングの全ての不対ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって連結されている。更に他の実施形態では、任意のヌクレオチドオーバーハングの全ての不対ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって連結されている。

【0049】

本発明の方法に使用されるオリゴヌクレオチド化合物に組み込むことができる修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載される２つ以上の化学修飾を有し得る。例えば、修飾ヌクレオチドは、リボース糖の修飾と同様に、核酸塩基の修飾を有し得る。例として、修飾ヌクレオチドは、２’糖修飾（例えば、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、又はＢＮＡ）を含み得、修飾塩基（例えば、５－メチルシトシン又はプソイドウラシル）を含み得る。他の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに組み込まれたときに修飾ヌクレオチド間結合又はヌクレオシド間結合を生成する、５’ホスフェートの修飾と組み合わせた糖修飾を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは糖修飾、例えば２’－フルオロ修飾、２’－Ｏ－メチル修飾、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾、又は二環式糖修飾、並びに５’ホスホロチオエート基を含み得る。従って、いくつかの実施形態では、本発明の方法に使用されるオリゴヌクレオチド化合物の一方又は両方のオリゴヌクレオチドは、２’修飾ヌクレオチド又はＢＮＡ及びホスホロチオエートヌクレオチド間結合の組み合わせを含む。特定の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチド化合物のセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、及びホスホロチオエートヌクレオチド間結合の組み合わせを含む。

【0050】

本発明の方法に使用されるオリゴヌクレオチド化合物は、当技術分野において公知の技術を使用して、例えば、従来の核酸固相合成を使用して、容易に作製することができる。オリゴヌクレオチド化合物のオリゴヌクレオチドは、標準的なヌクレオチド又はヌクレオシド前駆体（例えば、ホスホラミダイト）を利用して、適切な核酸合成装置でアセンブルすることができる。自動核酸合成装置は、いくつかのベンダーによって市販されており、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置、ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｉｒｖｉｎｇ、ＴＸ）のＭｅｒＭａｄｅ合成装置、及びＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）のＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ合成装置が挙げられる。

【0051】

ホスホラミダイトの化学的性質によってオリゴヌクレオチドを合成するために、酸解離性ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）と共に、リボヌクレオシドの５’位に２’シリル保護基を使用することができる。ＲＮＡ産物を著しく分解することのない、最終的な脱保護条件は公知である。全ての合成は、任意の自動又は手動合成装置により、大規模、中規模、又は小規模で行うことができる。また、合成は、複数のウェルプレート、カラム、又はスライドガラスにおいて実行することができる。

【0052】

２’－Ｏ－シリル基は、フッ化物イオンに曝露することによって除去することができ、フッ化物イオンは、フッ化物イオンの任意の供給源、例えば無機対イオンと対になるフッ化物イオンを含有する塩、例えば、フッ化セシウム及びフッ化カリウム、又は有機対イオンと対になるフッ化物イオンを含有する塩、例えば、フッ化テトラアルキルアンモニウムを含み得る。脱保護反応では、クラウンエーテル触媒を無機フッ化物と組み合わせて利用することができる。好ましいフッ化物イオン源は、フッ化テトラブチルアンモニウム又はアミノヒドロフルオリドである（例えば、ジメチルホルムアミドなどの双極性非プロトン溶媒中でＨＦ水溶液をトリエチルアミンと混合する）。

【0053】

亜リン酸トリエステル及びホスホトリエステルに使用するための保護基を選択することにより、フッ化物に対するトリエステルの安定性を変化させることができる。ホスホトリエステル又は亜リン酸トリエステルのメチル保護により、フッ化物イオンに対する結合を安定化させ、プロセス収率を向上させることができる。

【0054】

リボヌクレオシドは、反応性の２’ヒドロキシル置換基を有することから、ＲＮＡ中の反応性の２’位を、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル保護基に対して直交性である保護基（例えば、酸処理に対して安定な保護基）で保護することが望ましい可能性がある。シリル保護基はこの条件を満たし、最終的なフッ化物脱保護ステップで容易に除去することができ、これにより、ＲＮＡ分解を最小限に抑えることが可能となる。

【0055】

標準的なホスホラミダイトカップリング反応では、テトラゾール触媒が使用され得る。好ましい触媒としては、例えば、テトラゾール、Ｓ－エチル－テトラゾール、ベンジルチオテトラゾール、ｐ－ニトロフェニルテトラゾールが挙げられる。

【0056】

当業者によって理解され得るように、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド化合物を合成する更なる方法は当業者に明らかであろう。加えて、様々な合成ステップを代替の順番又は順序で実施して、所望の化合物を得てもよい。本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド化合物の合成に有用な他の合成化学転換、（例えば、塩基に存在するヒドロキシル、アミノなどのための）保護基、及び保護基の方法論（保護及び脱保護）は、当技術分野において公知であり、例えば、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９１）；Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９４）；及びＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ，ｅｄ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９５）、並びにそれらの後続版に記載される方法が挙げられる。オリゴヌクレオチド化合物のカスタム合成もまた、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）、ＡｘｏＬａｂｓ ＧｍｂＨ（Ｋｕｌｍｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、及びＡｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を含む複数の商業的ベンダーによって利用可能である。

【0057】

本発明の方法の特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、リガンドに共有結合される。本明細書で使用する場合、「リガンド」は、別の化合物又は分子と特異的又は可逆的に結合し、複合体を形成する任意の化合物又は分子を指す。リガンドと別の化合物又は分子との相互作用は、生物学的応答を誘発する（例えば、シグナル伝達カスケードを惹起する、受容体依存性エンドサイトーシスを誘導する）ものであってよく、又は単に物理的会合であってよい。いくつかの実施形態では、リガンドは、オリゴヌクレオチド化合物が特異的に送達されることが意図される細胞などの、細胞の表面に発現する受容体のリガンドである。リガンドは、結合するオリゴヌクレオチド化合物の１つ以上の特性、例えば、オリゴヌクレオチド化合物の薬力学、薬物動態、結合、吸収、細胞分布、細胞内取り込み、電荷及び／又はクリアランス特性を改変することができる。

【0058】

リガンドは、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、低密度リポタンパク質、グロブリン）、コレステロール部分、ビタミン（ビオチン、ビタミンＥ、ビタミンＢ_１２）、葉酸部分、ステロイド、胆汁酸（例えば、コール酸）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ミリスチン酸）、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン若しくはヒアルロン酸）、グリコシド、リン脂質、又は抗体若しくはその結合断片（例えば、オリゴヌクレオチド化合物を肝臓などの特定の細胞型に標的化する抗体若しくは結合断片）を含み得る。リガンドの他の例は、色素、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子、例えばアダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、又はフェノキサジン）、ペプチド（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド、ＲＧＤペプチド）、アルキル化剤、ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ポリアミノ酸、及びポリアミン（例えば、スペルミン、スペルミジン）を含む。

【0059】

いくつかの実施形態では、リガンドは、脂質又は他の疎水性分子を含む。一実施形態では、リガンドは、コレステロール部分又は他のステロイドを含む。コレステロールコンジュゲートオリゴヌクレオチドは、それらの非コンジュゲートオリゴヌクレオチドよりも活性があることが報告されている（Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１２：１０３－２２８，２００２）。核酸分子にコンジュゲートするためのコレステロール部分及び他の脂質を含むリガンドは、米国特許第７，８５１，６１５号明細書；同第７，７４５，６０８号明細書；及び同第７，８３３，９９２号明細書にも記載されており、これらの全ては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、リガンドは、葉酸部分を含む。葉酸部分にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドは、受容体依存性エンドサイトーシス経路を介して細胞に取り込まれ得る。このような葉酸－オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、米国特許第８，１８８，２４７号明細書に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0060】

特定の実施形態では、リガンドは、オリゴヌクレオチド化合物が送達されることが意図される標的細胞の表面に発現する受容体又は他のタンパク質に特異的に結合する。このようないくつかの実施形態では、リガンドは、肝臓に送達するためのアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）又は低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、骨格筋、心筋、及び中枢神経系に送達するためのトランスフェリン受容体、並びに腫瘍組織に送達するための上皮成長因子受容体などの、細胞表面受容体に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ）である。

【0061】

本発明の方法のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、肝細胞などの肝臓細胞の表面に発現する受容体のリガンドに共有結合される。このような一実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、ＡＳＧＰＲ又はその構成要素（例えば、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２）に結合するリガンドに共有結合される。特定の一実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＲ１及び／又はＡＳＧＲ２に特異的に結合する抗体又はその結合断片を含む。別の実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＲ１及び／又はＡＳＧＲ２に特異的に結合する抗体のＦａｂ断片を含む。「Ｆａｂ断片」は、１つの免疫グロブリン軽鎖（すなわち軽鎖可変領域（ＶＬ）及び定常領域（ＣＬ））、並びに１つの免疫グロブリン重鎖のＣＨ１領域及び可変領域（ＶＨ）で構成される。別の実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＲ１及び／又はＡＳＧＲ２に特異的に結合する抗体の単鎖可変抗体断片（ｓｃＦｖ断片）を含む。「ｓｃＦｖ断片」は、抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域を含み、これらの領域は単鎖ポリペプチドに存在しており、任意選択によりＶＨ領域とＶＬ領域との間にペプチドリンカーを含み、これによってＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することが可能となる。オリゴヌクレオチド化合物を肝臓に標的化するためのリガンドとして使用することができる、ＡＳＧＲ１に特異的に結合する例示的な抗体及びその結合断片は、国際公開第２０１７／０５８９４４号パンフレットに記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明の方法に使用されるオリゴヌクレオチド化合物に共有結合することができるリガンドとして使用するのに好適な、ＡＳＧＲ１、ＬＤＬ受容体、又は他の肝臓表面に発現するタンパク質に特異的に結合する他の抗体又はその結合断片は、市販されている。

【0062】

特定の実施形態では、リガンドは、炭水化物を含む。「炭水化物」は、少なくとも６個の炭素原子（直鎖状、分岐状又は環状であり得る）を有し、各炭素原子に結合された酸素、窒素又は硫黄原子を含む、１つ以上の単糖単位で構成される化合物を指す。炭水化物としては、糖（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、及び約４、５、６、７、８、又は９つの単糖単位を含有するオリゴ糖）、並びに多糖、例えば、デンプン、グリコーゲン、セルロース、及び多糖類ガムが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、リガンドに組み込まれる炭水化物は、ペントース、ヘキソース、又はヘプトースから選択される単糖、並びにこのような単糖単位を含む二糖及び三糖である。他の実施形態では、リガンドに組み込まれる炭水化物は、ガラクトサミン、グルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、及びＮ－アセチルグルコサミンなどのアミノ糖である。

【0063】

いくつかの実施形態では、リガンドは、ヘキソース又はヘキソサミンを含む。ヘキソースは、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、又はフルクトースから選択され得る。ヘキソサミンは、フルクトサミン、ガラクトサミン、グルコサミン、又はマンノサミンから選択され得る。特定の実施形態では、リガンドは、グルコース、ガラクトース、ガラクトサミン、又はグルコサミンを含む。一実施形態では、リガンドは、グルコース、グルコサミン、又はＮ－アセチルグルコサミンを含む。別の実施形態では、リガンドは、ガラクトース、ガラクトサミン、又はＮ－アセチル－ガラクトサミンを含む。特定の実施形態では、リガンドは、Ｎ－アセチル－ガラクトサミンを含む。グルコース、ガラクトース、及びＮ－アセチル－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含むリガンドは、このようなリガンドが肝細胞の表面に発現するＡＳＧＰＲに結合するため、化合物を肝臓細胞に標的化するのに特に有効である。例えば、Ｄ’Ｓｏｕｚａ ａｎｄ Ｄｅｖａｒａｊａｎ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｖｏｌ．２０３：１２６－１３９，２０１５を参照されたい。オリゴヌクレオチド化合物のオリゴヌクレオチドに共有結合され得るＧａｌＮＡｃ又はガラクトース含有リガンドの例は、米国特許第７，４９１，８０５号明細書；同第８，１０６，０２２号明細書；及び同第８，８７７，９１７号明細書；米国特許出願公開第２００３０１３０１８６号明細書；並びに国際公開第２０１３１６６１５５号パンフレットに記載されており、これらの全ては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0064】

特定の実施形態では、リガンドは、多価炭水化物部分を含む。本明細書で使用する場合、「多価炭水化物部分」は、独立して他の分子と結合又は相互作用することができる２つ以上の炭水化物単位を含む部分を指す。例えば、多価炭水化物部分は、２つ以上の異なる分子、又は同じ分子上の２つ以上の異なる部位に結合することができる、炭水化物で構成される２つ以上の結合ドメインを含む。炭水化物部分の価数は、炭水化物部分内の個々の結合ドメインの数を示す。例えば、炭水化物部分に関する「一価」、「二価」、「三価」、及び「四価」という用語は、それぞれ、１、２、３及び４つの結合ドメインを有する炭水化物部分を指す。多価炭水化物部分は、多価ラクトース部分、多価ガラクトース部分、多価グルコース部分、多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分、多価Ｎ－アセチル－グルコサミン部分、多価マンノース部分、又は多価フコース部分を含み得る。いくつかの実施形態では、リガンドは、多価ガラクトース部分を含む。他の実施形態では、リガンドは、多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分を含む。これら及び他の実施形態では、多価炭水化物部分は、二価、三価、又は四価であり得る。このような実施形態では、多価炭水化物部分は、二分岐又は三分岐であり得る。特定の一実施形態では、多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分は、三価又は四価である。別の特定の実施形態では、多価ガラクトース部分は、三価又は四価である。本発明の方法に使用されるオリゴヌクレオチド化合物に共有結合するための例示的な三価又は四価ＧａｌＮＡｃ含有リガンドを、下記に詳細に記載する。

【0065】

リガンドは、オリゴヌクレオチド化合物に直接又は間接的に共有結合又はコンジュゲートされ得る。例えば、オリゴヌクレオチド化合物が二本鎖（例えば、オリゴヌクレオチド化合物がｓｉＲＮＡを含む）いくつかの実施形態では、リガンドは、オリゴヌクレオチド化合物のセンス鎖又はアンチセンス鎖に直接共有結合される。他の実施形態では、リガンドは、オリゴヌクレオチド化合物のセンス鎖又はアンチセンス鎖にリンカーを介して共有結合される。リガンドは、本発明の方法に使用されるオリゴヌクレオチド化合物に含まれるオリゴヌクレオチドの核酸塩基、糖部分、又はヌクレオチド間結合に結合され得る。プリン核酸塩基又はその誘導体へのコンジュゲーション又は結合は、環内原子及び環外原子を含むあらゆる位置で生じ得る。特定の実施形態では、プリン核酸塩基の２位、６位、７位又は８位がリガンドに結合される。ピリミジン核酸塩基又はその誘導体へのコンジュゲーション又は結合もまた、あらゆる位置で生じ得る。いくつかの実施形態では、ピリミジン核酸塩基の２位、５位及び６位がリガンドに結合され得る。ヌクレオチドの糖部分へのコンジュゲーション又は結合は、あらゆる炭素原子で生じ得る。リガンドに結合され得る糖部分の例示的な炭素原子としては、２’、３’及び５’炭素原子が挙げられる。例えば、脱塩基ヌクレオチドでは、１’位もリガンドに結合することができる。ヌクレオチド間結合も、リガンドの結合を支持することができる。リン含有結合（例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミダートなど）の場合、リガンドは、リン原子に直接結合され得るか、又はリン原子に結合されたＯ、Ｎ若しくはＳ原子に結合され得る。アミン又はアミド含有ヌクレオシド間結合（例えば、ＰＮＡ）の場合、リガンドは、アミン若しくはアミドの窒素原子か、又は隣接する炭素原子に結合され得る。

【0066】

いくつかの実施形態では、リガンドは、一本鎖オリゴヌクレオチド化合物（例えば、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド）の３’末端又は５’末端に結合され得る。オリゴヌクレオチド化合物が二本鎖である（例えば、オリゴヌクレオチド化合物がｓｉＲＮＡを含む）実施形態では、リガンドは、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの３’末端又は５’末端に結合され得る。特定の実施形態では、リガンドは、センス鎖の５’末端に共有結合される。このような実施形態では、リガンドは、センス鎖の５’末端ヌクレオチドに結合される。これら及び他の実施形態では、リガンドは、センス鎖の５’末端ヌクレオチドの５’位で結合される。他の実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端に共有結合される。例えば、いくつかの実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端ヌクレオチドに結合される。このような特定の実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端ヌクレオチドの３’位で結合される。代替的な実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端の近傍ではあるが、１つ以上の末端ヌクレオチドの前（すなわち１、２、３又は４つの末端ヌクレオチドの前）で結合される。いくつかの実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端ヌクレオチドの糖の２’位で結合される。他の実施形態では、リガンドは、センス鎖の５’末端ヌクレオチドの糖の２’位で結合される。

【0067】

特定の実施形態では、リガンドは、リンカーを介してオリゴヌクレオチド化合物に結合される。「リンカー」は、リガンドをオリゴヌクレオチド化合物のオリゴヌクレオチド構成要素に共有結合する原子又は原子団である。リンカーは、約１～約３０原子長、約２～約２８原子長、約３～約２６原子長、約４～約２４原子長、約６～約２０原子長、約７～約２０原子長、約８～約２０原子長、約８～約１８原子長、約１０～約１８原子長、及び約１２～約１８原子長であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、２つの官能基を有するアルキル部分を一般に含む、二官能性結合部分を含み得る。官能基の一方は、目的の化合物（例えば、オリゴヌクレオチド化合物のオリゴヌクレオチド）に結合するように選択され、他方は、本明細書に記載されるようなリガンドなどの任意の選択された基に実質的に結合するように選択される。特定の実施形態では、リンカーは、エチレングリコール単位又はアミノ酸単位などの反復単位からなる鎖構造又はオリゴマーを含む。二官能性結合部分に典型的に使用される官能基の例としては、求核性基と反応させるための求電子剤、及び求電子性基と反応させるための求核剤が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、二官能性結合部分としては、アミノ、ヒドロキシル、カルボン酸、チオール、不飽和（例えば、二重結合又は三重結合）などが挙げられる。

【0068】

本発明の方法に使用されるオリゴヌクレオチド化合物のオリゴヌクレオチドにリガンドを結合するのに使用され得るリンカーとしては、ピロリジン、８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシラート、６－アミノヘキサン酸、置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_１０アルケニル又は置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_１０アルキニルが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなリンカーに好ましい置換基としては、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルが挙げられるが、これらに限定されない。

【0069】

特定の実施形態では、リンカーは、切断可能である。切断可能リンカーは、細胞外部では十分に安定であるが、標的細胞に進入すると切断され、リンカーが一体に保持している２つの部分を放出する。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、標的細胞中又は第１の参照条件（例えば、細胞内条件を模倣するか、又はそれに相当するように選択され得る）下において、対象の血液中又は第２の参照条件（例えば、血液若しくは血清に見出される条件を模倣するか、又はそれに相当するように選択され得る）下よりも少なくとも１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍以上、又は少なくとも１００倍速く切断される。

【0070】

切断可能なリンカーは、切断剤、例えばｐＨ、酸化還元電位、又は分解性分子の存在に対して感受性である。一般に、切断剤は、血清又は血液中よりも細胞内部で優勢であるか、又は高いレベル若しくは活性で見出される。このような分解性薬剤の例としては、特定の基質のために選択されるか、又は基質特異性のない酸化還元剤、例えば、酸化酵素若しくは還元酵素、又は細胞内に存在し、還元によって酸化還元切断可能リンカーを分解することができるメルカプタンなどの還元剤を含む酸化還元剤；エステラーゼ；エンドソーム又は酸性環境を生成することができる薬剤、例えば、５以下のｐＨをもたらすもの；一般酸として作用することによって酸切断可能リンカーを加水分解又は分解することができる酵素、ペプチダーゼ（基質特異的であり得る）、及びホスファターゼが挙げられる。

【0071】

切断可能リンカーは、ｐＨに感受性のある部分を含み得る。ヒト血清のｐＨは７．４であるが、平均的な細胞内のｐＨはそれより僅かに低く、約７．１～７．３の範囲である。エンドソームは、５．５～６．０の範囲のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、更により酸性であるおよそ５．０のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断され、それによってリガンドから細胞内部又は細胞の所望の区画にオリゴヌクレオチド化合物を放出する、切断可能な基を有する。

【0072】

リンカーは、特定の酵素によって切断可能となる、切断可能な基を含み得る。リンカーに組み込まれる切断可能な基の種類は、標的化される細胞に依存し得る。例えば、肝臓標的化リガンドは、エステル基を含むリンカーを介してオリゴヌクレオチド化合物に結合され得る。肝細胞はエステラーゼに富んでいるため、リンカーは、エステラーゼに富んでいない細胞型よりも肝細胞で効率的に切断されることとなる。エステラーゼに富む他の種類の細胞としては、肺、腎皮質及び精巣の細胞が挙げられる。肝臓細胞及び滑膜細胞などのペプチダーゼに富む細胞を標的化する場合は、ペプチド結合を含有するリンカーを使用することができる。

【0073】

一般に、切断可能リンカー候補の適合性は、リンカー候補を切断する分解性薬剤の能力（又は条件）を試験することによって評価することができる。また、血液中又は他の非標的組織と接触するときの切断に抵抗する能力について、切断可能なリンカー候補を試験することが望ましい。従って、標的細胞内で切断を示すように選択される第１の条件と、他の組織又は体液、例えば血液又は血清内で切断を示すように選択される第２の条件との間で、切断に対する相対的感受性を判断することができる。評価は、無細胞系、細胞、細胞培養物、臓器若しくは組織培養物中において又は動物全体で実行することができる。無細胞又は培養条件で初期評価を行い、更に動物全体で評価することによって確認することが有用であり得る。いくつかの実施形態では、有用なリンカー候補は、細胞において（又は細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で）、血液又は血清（又は細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比較して少なくとも２倍、４倍、１０倍、２０倍、５０倍、７０倍又は１００倍速く切断される。

【0074】

他の実施形態では、酸化還元切断可能なリンカーが利用される。酸化還元切断可能リンカーは、還元又は酸化されると切断される。還元的に切断可能な基の一例は、ジスルフィド連結基（－Ｓ－Ｓ－）である。切断可能なリンカー候補が、好適な「還元的に切断可能なリンカー」であるかどうか、又は、例えば特定のオリゴヌクレオチド化合物及び特定のリガンドと共に使用するのに好適であるかどうかを判断するために、本明細書に記載される１つ以上の方法を使用することができる。例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）や、又は細胞（例えば標的細胞）中で観察されるであろう切断速度を模倣する当技術分野において公知の他の還元剤とインキュベートすることにより、リンカー候補を評価することができる。リンカー候補は、血液条件又は血清条件を模倣するように選択された条件下で評価することもできる。特定の実施形態では、リンカー候補は、血液中で最大１０％切断される。

【0075】

なお他の実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物のオリゴヌクレオチドにリガンドを共有結合するために、ホスフェート基を分解又は加水分解する剤によって切断されるホスフェート系切断可能リンカーを利用する。細胞内でホスフェート基を加水分解する剤の一例は、細胞内におけるホスファターゼなどの酵素である。ホスフェート系の切断可能な基の例は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－、及び－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－であり、式中、Ｒｋは、水素又はアルキルであり得る。特定の実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－、及び－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－を含む。別の特定の実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。これらのリンカー候補は、上記に記載される方法に類似した方法を使用して評価することができる。

【0076】

他の実施形態では、リンカーは、酸性条件下で切断される基である、酸切断可能な基を含み得る。いくつかの実施形態では、酸切断可能な基は、約６．５以下のｐＨ（例えば、約６．０、５．５、５．０以下）の酸性環境において、又は一般酸として作用し得る酵素などの薬剤によって切断される。細胞内では、エンドソーム及びリソソームなどの特定の低ｐＨオルガネラが、酸切断可能な基に切断環境を提供することができる。酸切断可能な結合基の例としては、ヒドラゾン、エステル、及びアミノ酸のエステルが挙げられるが、これらに限定されない。酸切断可能な基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏ、又は－ＯＣ（Ｏ）を有し得る。特定の実施形態は、エステルの酸素（アルコキシ基）に結合した炭素が、アリール基、置換アルキル基、又はジメチル、ペンチル若しくはｔ－ブチルなどの三級アルキル基である場合である。これらの候補は、上記に記載される方法に類似した方法を使用して評価することができる。

【0077】

他の実施形態では、リンカーは、細胞中のエステラーゼ及びアミダーゼなどの酵素によって切断される、エステル系の切断可能な基を含み得る。エステル系の切断可能な基の例としては、アルキレン、アルケニレン及びアルキニレン基のエステルが挙げられるが、これらに限定されない。エステル切断可能な基は、一般式－Ｃ（Ｏ）Ｏ－又は－ＯＣ（Ｏ）－を有する。これらのリンカー候補は、上記に記載される方法に類似した方法を使用して評価することができる。

【0078】

更なる実施形態では、リンカーは、細胞中のペプチダーゼ及びプロテアーゼなどの酵素によって切断される、ペプチド系の切断可能な基を含み得る。ペプチド系の切断可能な基は、オリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）及びポリペプチドを生じるような、アミノ酸間で形成されたペプチド結合である。ペプチド系の切断可能な基は、アミド基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）を含む。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレン又はアルキニレン間で形成され得る。ペプチド結合は、ペプチド及びタンパク質を生じるような、アミノ酸間で形成される特殊な種類のアミド結合である。ペプチド系の切断可能な基は、一般に、ペプチド及びタンパク質を生じさせる、アミノ酸間に形成されるペプチド結合（すなわちアミド結合）に限定される。ペプチド系の切断可能な連結基は、一般式－ＮＨＣＨＲ^ＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲ^ＢＣ（Ｏ）－を有し、式中、Ｒ^Ａ及びＲ^Ｂは、２つの隣接するアミノ酸の側鎖である。これらの候補は、上記に記載される方法に類似した方法を使用して評価することができる。

【0079】

本発明の方法に使用されるオリゴヌクレオチド化合物のオリゴヌクレオチドにリガンドを結合するのに好適な他の種類のリンカーは、当技術分野において公知であり、米国特許第７，７２３，５０９号明細書；同第８，０１７，７６２号明細書；同第８，８２８，９５６号明細書；同第８，８７７，９１７号明細書；及び同第９，１８１，５５１号明細書に記載されるリンカーを含むことができ、これらの全ては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0080】

特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物のオリゴヌクレオチドに共有結合されるリガンドは、ＧａｌＮＡｃ部分、例えば、多価ＧａｌＮＡｃ部分を含む。いくつかの実施形態では、多価ＧａｌＮＡｃ部分は、三価ＧａｌＮＡｃ部分であり、オリゴヌクレオチド（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド化合物のセンス鎖）の３’末端に結合される。他の実施形態では、多価ＧａｌＮＡｃ部分は、三価ＧａｌＮＡｃ部分であり、オリゴヌクレオチド（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド化合物のセンス鎖）の５’末端に結合される。なお他の実施形態では、多価ＧａｌＮＡｃ部分は、四価ＧａｌＮＡｃ部分であり、オリゴヌクレオチド（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド化合物のセンス鎖）の３’末端に結合される。更に他の実施形態では、多価ＧａｌＮＡｃ部分は、四価ＧａｌＮＡｃ部分であり、オリゴヌクレオチド（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド化合物のセンス鎖）の５’末端に結合される。

【0081】

本発明の方法に使用されるオリゴヌクレオチド化合物のオリゴヌクレオチドに結合され得る、例示的な三価及び四価ＧａｌＮＡｃ部分並びにリンカーを、下記の構造式Ｉ～ＩＸに示す。本明細書に列記される式中の「Ａｃ」は、アセチル基を表す。

【0082】

一実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、以下の式Ｉの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、式中、各ｎは独立して１～３であり、ｋは１～３であり、ｍは１又は２であり、ｊは１又は２であり、リガンドは、オリゴヌクレオチド化合物のオリゴヌクレオチド（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド化合物のセンス鎖）（実線の波線で表される）の３’末端に結合される。

【化1】

【0083】

別の実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、以下の式ＩＩの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、式中、各ｎは独立して１～３であり、ｋは１～３であり、ｍは１又は２であり、ｊは１又は２であり、リガンドは、オリゴヌクレオチド化合物のオリゴヌクレオチド（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド化合物のセンス鎖）（実線の波線で表される）の３’末端に結合される。

【化2】

【0084】

なお別の実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、以下の式ＩＩＩの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、リガンドは、オリゴヌクレオチド化合物のオリゴヌクレオチド（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド化合物のセンス鎖）（実線の波線で表される）の３’末端に結合される。

【化3】

【0085】

更に別の実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、以下の式ＩＶの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、リガンドは、オリゴヌクレオチド化合物のオリゴヌクレオチド（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド化合物のセンス鎖）（実線の波線で表される）の３’末端に結合される。

【化4】

【0086】

特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、以下の式Ｖの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、式中、各ｎは独立して１～３であり、ｋは１～３であり、リガンドは、オリゴヌクレオチド化合物のオリゴヌクレオチド（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド化合物のセンス鎖）（実線の波線で表される）の５’末端に結合される。

【化5】

【0087】

他の実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、以下の式ＶＩの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、式中、各ｎは独立して１～３であり、ｋは１～３であり、リガンドは、オリゴヌクレオチド化合物のオリゴヌクレオチド（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド化合物のセンス鎖）（実線の波線で表される）の５’末端に結合される。

【化6】

【0088】

特定の一実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、以下の式ＶＩＩの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、式中、Ｘ＝Ｏ又はＳであり、リガンドは、オリゴヌクレオチド化合物のオリゴヌクレオチド（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド化合物のセンス鎖）（波線で表される）の５’末端に結合される。

【化7】

【0089】

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、以下の式ＶＩＩＩの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、式中、各ｎは独立して１～３であり、リガンドは、オリゴヌクレオチド化合物のオリゴヌクレオチド（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド化合物のセンス鎖）（実線の波線で表される）の５’末端に結合される。

【化8】

【0090】

特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、以下の式ＩＸの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、リガンドは、オリゴヌクレオチド化合物のオリゴヌクレオチド（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド化合物のセンス鎖）（実線の波線で表される）の５’末端に結合される。

【化9】

【0091】

リガンド及びリンカーをオリゴヌクレオチドと共有結合させるために、ホスホロチオエート結合を式Ｉ～ＩＸのいずれか１つに示されるホスホジエステル結合と置き換えてもよい。

【0092】

本発明の方法は、細胞内のサプレッサータンパク質の発現又は活性を阻害することを含む。本明細書で使用する場合、サプレッサータンパク質は、オリゴヌクレオチド化合物の遺伝子サイレンシング活性を低減又は阻害するタンパク質の存在又は活性を指す。特定の実施形態では、サプレッサータンパク質は、細胞内の小胞輸送、特にエンドソーム輸送を負に制御することによって、受容体依存性エンドサイトーシスによって内在化したリガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチド化合物の遺伝子サイレンシング活性を低減又は防止する。本発明の方法のいくつかの実施形態では、サプレッサータンパク質は、Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ－１８（ＲＡＢ１８）、Ｚｗ１０動原体タンパク質（ＺＷ１０）、シンタキシン１８（ＳＴＸ１８）、Ｓｅｃ１ファミリードメイン含有タンパク質２（ＳＣＦＤ２）、ＮＳＦ付着タンパク質γ（ＮＡＰＧ）、滅菌アルファモチーフドメイン含有タンパク質４Ｂ（ｓｔｅｒｉｌｅ ａｌｐｈａ ｍｏｔｉｆ ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ４Ｂ）（ＳＡＭＤ４Ｂ）、液胞タンパク質ソーティング関連タンパク質３７Ａ（ｖａｃｕｏｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｒｔｉｎｇ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ３７Ａ）（ＶＰＳ３７Ａ）、ｙｅｓ関連タンパク質１（ＹＡＰ１）、サイクリンＥ１（ＣＣＮＥ１）、溶質キャリアファミリー３０メンバー９タンパク質（ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｆａｍｉｌｙ ３０ ｍｅｍｂｅｒ ９ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＳＬＣ３０Ａ９）、チューブリンε及びδ複合体タンパク質１（ｔｕｂｕｌｉｎ ｅｐｓｉｌｏｎ ａｎｄ ｄｅｌｔａ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｒｏｔｅｉｎ １）（ＴＥＤＣ１；Ｃ１４ｏｒｆ８０としても公知である）、低酸素誘導性因子１－αタンパク質阻害剤（ｈｙｐｏｘｉａ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ １－ａｌｐｈａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＨＩＦ１ＡＮ）、又はＴＮＦ受容体関連因子２（ＴＲＡＦ２）である。特定の実施形態では、サプレッサータンパク質は、ＲＡＢ１８、ＺＷ１０、ＳＴＸ１８、ＳＣＦＤ２、ＮＡＰＧ、ＳＡＭＤ４Ｂ、又はＶＰＳ３７Ａである。特定の他の実施形態では、サプレッサータンパク質は、ＲＡＢ１８、ＺＷ１０、又はＳＴＸ１８である。本発明の方法の特定の一実施形態では、サプレッサータンパク質は、ＲＡＢ１８である。

【0093】

サプレッサータンパク質の発現又は活性は、細胞をサプレッサータンパク質の阻害剤と接触させることによって阻害することができる。サプレッサータンパク質の阻害剤は、阻害剤と接触させなかった細胞におけるサプレッサータンパク質の細胞内の量又は活性と比較して、サプレッサータンパク質の細胞内の量又は活性を少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％低減する。特定の実施形態では、サプレッサータンパク質の阻害剤は、阻害剤と接触させなかった細胞におけるサプレッサータンパク質の細胞内の量又は活性と比較して、サプレッサータンパク質の細胞内の量又は活性を約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％低減する。一実施形態では、サプレッサータンパク質は、阻害剤と接触させなかった細胞におけるサプレッサータンパク質の細胞内の量又は活性と比較して、サプレッサータンパク質の細胞内の量又は活性を少なくとも７５％低減する。別の実施形態では、サプレッサータンパク質は、阻害剤と接触させなかった細胞におけるサプレッサータンパク質の細胞内の量又は活性と比較して、サプレッサータンパク質の細胞内の量又は活性を少なくとも８０％低減する。別の実施形態では、サプレッサータンパク質は、阻害剤と接触させなかった細胞におけるサプレッサータンパク質の細胞内の量又は活性と比較して、サプレッサータンパク質の細胞内の量又は活性を少なくとも９０％低減する。

【0094】

本発明の方法の特定の実施形態では、サプレッサータンパク質の阻害剤は、サプレッサータンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の発現を低減するオリゴヌクレオチドベースの阻害剤であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、サプレッサータンパク質の阻害剤は、本明細書に記載されるようなオリゴヌクレオチド化合物であり、オリゴヌクレオチド化合物は、サプレッサータンパク質をコードするｍＲＮＡ配列と実質的に又は完全に相補的な配列を含む。このようないくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、サプレッサータンパク質をコードするｍＲＮＡ配列と実質的に又は完全に相補的な配列を含む一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。他の実施形態では、サプレッサータンパク質の阻害剤は、本明細書に記載されるようなｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなどの二本鎖オリゴヌクレオチド化合物である。一実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチド化合物は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ分子であり、アンチセンス鎖は、サプレッサータンパク質をコードするｍＲＮＡ配列と実質的に又は完全に相補的な配列を含む。別の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチド化合物は、ループ領域によって共に結合されたセンス鎖及びアンチセンス鎖を含むｓｈＲＮＡ分子であり、アンチセンス鎖は、サプレッサータンパク質をコードするｍＲＮＡ配列と実質的に又は完全に相補的な配列を含む。

【0095】

サプレッサータンパク質をコードするｍＲＮＡ配列は、任意の種（例えば、非ヒト霊長類、ヒト）由来のサプレッサータンパク質のバリアント又はアイソフォームを含む、サプレッサータンパク質をコードする対立遺伝子バリアント及びスプライスバリアントなどの、あらゆるメッセンジャーＲＮＡ配列であり得る。サプレッサータンパク質をコードするｍＲＮＡ配列には、その相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列として発現される転写物配列も含まれる。ｃＤＮＡ配列は、ＲＮＡ塩基（例えば、グアニン、アデニン、ウラシル、及びシトシン）ではなく、ＤＮＡ塩基（例えば、グアニン、アデニン、チミン、及びシトシン）として発現されるｍＲＮＡ転写物の配列を指す。従って、いくつかの実施形態では、サプレッサータンパク質の阻害剤は、サプレッサータンパク質をコードするｍＲＮＡ配列又はｃＤＮＡ配列と実質的に又は完全に相補的な配列を有する領域を含むオリゴヌクレオチド化合物であり得る。オリゴヌクレオチド化合物が実質的に又は完全に相補的であり得る選択されたサプレッサータンパク質の例示的なｍＲＮＡ配列及びｃＤＮＡ配列に関する、Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｏｍｅデータベース又は全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）データベースにおける参照を下記の表１に列挙する。

【0096】

【表1】

【0097】

本発明の方法のいくつかの実施形態では、サプレッサータンパク質はＲＡＢ１８であり、ＲＡＢ１８の阻害剤は、配列番号８～１０、５’－ＵＵＵＡＧＣＣＵＵＡＵＵＵＣＣＡＵＣＣ－３’（配列番号２５）、５’－ＡＡＣＧＵＡＵＣＡＵＣＵＧＵＧＡＡＣＣ－３’（配列番号２６）、５’－ＡＵＣＧＡＣＵＵＣＡＣＧＡＵＵＵＵＣＣ－３’（配列番号２７）、５’－ＣＣＵＣＵＡＵＡＡＵＡＧＣＵＧＧＧＡＧＵＵＡ－３’（配列番号２８）、及び５’－ＣＣＣＵＧＵＧＣＡＣＣＵＣＵＡＵＡＡＵＡＧＣ－３’（配列番号２９）から選択されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである。特定の実施形態では、ＲＡＢ１８の阻害剤は、配列番号２５～２９のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、チミンがウラシルに置換されている。他の実施形態では、サプレッサータンパク質はＲＡＢ１８であり、ＲＡＢ１８の阻害剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡであり、アンチセンス鎖は、配列番号８～１０及び２５～２９から選択されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。このような実施形態では、センス鎖のヌクレオチド配列は、アンチセンス鎖の配列と実質的に又は完全に相補的である。特定の実施形態では、ＲＡＢ１８の阻害剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡであり、（ｉ）センス鎖が配列番号５のヌクレオチド配列を含むか若しくはそれからなり、アンチセンス鎖が配列番号８のヌクレオチド配列を含むか若しくはそれからなり、（ｉｉ）センス鎖が配列番号６のヌクレオチド配列を含むか若しくはそれからなり、アンチセンス鎖が配列番号９のヌクレオチド配列を含むか若しくはそれからなり、又は（ｉｉｉ）センス鎖が配列番号７のヌクレオチド配列を含むか若しくはそれからなり、アンチセンス鎖が配列番号１０のヌクレオチド配列を含むか若しくはそれからなる。

【0098】

本発明の方法のいくつかの実施形態では、細胞内のサプレッサータンパク質の発現又は活性を阻害するには、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓに基づく方法、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）に基づく方法、及びジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）に基づく方法を含むがこれらに限定されない、任意の好適な公知のゲノム編集技術を使用してサプレッサータンパク質をコードする遺伝子を改変することが含まれ得る（例えば、Ｐｏｒｔｅｕｓ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５６：１６３－１９０，２０１６；Ｍａｅｄｅｒ ａｎｄ Ｇｅｒｓｂａｃｈ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，Ｖｏｌ．２４；４３０－４４６，２０１６を参照されたい）。遺伝子が活性若しくは機能の低減したサプレッサータンパク質のバリアントをコードするようにサプレッサータンパク質をコードする遺伝子を改変してもよく、又は遺伝子の発現を完全に排除するように（すなわち、遺伝子をノックアウトするように）遺伝子を改変してもよい。従って、そのような実施形態では、サプレッサータンパク質の阻害剤は、遺伝子改変剤であり得る。利用するゲノム編集技術に応じて、遺伝子改変剤は、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、若しくはＺＦＮ）、又はヌクレアーゼ及び／若しくはガイドＲＮＡをコードするベクターを含み得る。ガイドＲＮＡとは、標的配列にハイブリダイズしてＣａｓヌクレアーゼの標的配列への配列特異的結合を誘導するように、標的核酸配列と十分な相補性を有する配列を含むポリヌクレオチドを指す。ＴＡＬＥＮに基づく方法又はＺＦＮに基づく方法の場合、ヌクレアーゼはサプレッサータンパク質をコードする遺伝子配列、例えば表１に記載される配列のいずれかの一部を認識するように遺伝子操作される。サプレッサータンパク質をコードする遺伝子を改変するためにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが使用される実施形態では、ガイドＲＮＡは、サプレッサータンパク質をコードする遺伝子配列、例えば表１に記載される配列のいずれかの一部に相補的な配列を含む。標的遺伝子配列を改変するためにガイドＲＮＡを設計する方法は当業者に公知であり、例えば、Ｍｏｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．２８３；３２３２－３２３８，２０１６及びＢｒａｚｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＧＭ Ｃｒｏｐｓ ＆ Ｆｏｏｄ，Ｖｏｌ．６；２６６－２７６，２０１５に記載されている方法がある。特定の実施形態では、サプレッサータンパク質の阻害剤は、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓヌクレアーゼをコードするベクター／核酸と、サプレッサータンパク質をコードする遺伝子配列の一部に相補的な配列を含むガイドＲＮＡとを含む遺伝子改変剤である。本明細書に更に記載されているように、遺伝子改変剤は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに使用する場合はヌクレアーゼ又はＣａｓヌクレアーゼとガイドＲＮＡの両方をコードするウイルスベクターを使用して、並びにヌクレアーゼ又はＣａｓヌクレアーゼ－ガイドＲＮＡ複合体をパッケージングすることが可能な脂質ベースの送達ビヒクルによって、細胞内に送達することができる。

【0099】

本発明の方法のいくつかの実施形態では、サプレッサータンパク質はＲＡＢ１８であり、ＲＡＢ１８の阻害剤は、配列番号１１又は配列番号１２の配列に相補的な配列を有するガイドＲＮＡを含む遺伝子改変剤である。関連する実施形態では、ＲＡＢ１８の阻害剤は、配列番号８～１０及び２５～２９から選択される配列を含むガイドＲＮＡを含む遺伝子改変剤である。前述の実施形態のいずれかでは、遺伝子改変剤は、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓヌクレアーゼをコードするベクター／核酸を更に含み得る。

【0100】

特定の実施形態では、本発明は、例えば、本明細書に記載される、又は当技術分野において公知のいずれかの阻害剤などのサプレッサータンパク質の阻害剤と細胞を接触させ、細胞をオリゴヌクレオチド化合物と接触させることによって、細胞内のサプレッサータンパク質の発現又は活性を阻害することを含む、細胞内のオリゴヌクレオチド化合物のサイレンシング活性を増強するための方法を提供する。オリゴヌクレオチド化合物、例えば本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド化合物のいずれかのサイレンシング活性を増強することは、サプレッサータンパク質の発現若しくは活性が阻害されていない細胞、又はサプレッサータンパク質の阻害剤と接触させなかった細胞におけるオリゴヌクレオチド化合物のサイレンシング活性と比較して、遺伝子発現における低減のレベル、低減の持続時間、及び／又は低減の効力の観点から、サイレンシング活性が細胞内で増大していることを意味する。オリゴヌクレオチド化合物のサイレンシング活性は、サプレッサータンパク質の発現若しくは活性が阻害されていない細胞、又はサプレッサータンパク質の阻害剤と接触させなかった細胞におけるオリゴヌクレオチド化合物のサイレンシング活性と比較して、本発明の方法によって、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、又は少なくとも３０倍増強され得る。オリゴヌクレオチド化合物のサイレンシング活性は、オリゴヌクレオチド化合物の存在下の標的遺伝子の発現の量を、オリゴヌクレオチド化合物の非存在下の細胞内の標的遺伝子の発現量と比較して測定することによって評価することができる。標的遺伝子の発現は、下記で更に記載されるように、標的ｍＲＮＡ、標的タンパク質、又は標的遺伝子の発現に関連する別のバイオマーカーの量又はレベルを測定することによって評価することができる。

【0101】

本明細書の実施例に記載されているように、サプレッサータンパク質（例えば、ＲＡＢ１８）の発現を阻害又は排除することは、リガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチド化合物によって媒介される標的遺伝子のノックダウンのレベルを著しく増大させ、それによって、通常ではオリゴヌクレオチド化合物を使用してサイレンシングすることが不可能な、極めて豊富なタンパク質の発現ですらも低減することが可能となる。従って、本発明はまた、本明細書に記載されるようなサプレッサータンパク質の阻害剤と細胞を接触させ、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド化合物などのオリゴヌクレオチド化合物と細胞を接触させることを含む、細胞内の標的遺伝子の発現を低減させる方法を含み、オリゴヌクレオチド化合物は、標的遺伝子の配列に実質的に又は完全に相補的な配列を含む。細胞は、インビトロ又はインビボであり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、標的遺伝子の発現を低減させる必要のある対象（例えば、ヒト対象）に存在する。細胞は、標的遺伝子を天然に発現する細胞であってもよく、又は標的遺伝子を発現するように遺伝子操作された細胞若しくは細胞株であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞又は哺乳動物細胞株である。細胞は、脂肪細胞、上皮細胞、ニューロン、グリア細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、膵β細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、腫瘍細胞、又は肝細胞を含むがこれらに限定されない、標的遺伝子を発現するあらゆる組織型の細胞であり得る。特定の実施形態では、細胞は、初代肝細胞などの肝細胞である。他の実施形態では、細胞は、ＨｅｐＡＤ３８細胞、ＨｕＨ－６細胞、ＨｕＨ－７細胞、ＨｕＨ－５－２細胞、ＢＮＬＣＬ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、又はＨｅｐＧ２細胞などの肝臓細胞株である。一実施形態では、細胞は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞である。

【0102】

本発明の方法によるオリゴヌクレオチド化合物と接触させた細胞又は動物における標的遺伝子発現の低減は、オリゴヌクレオチド化合物と接触させなかったか、又は対照オリゴヌクレオチド化合物と接触させた細胞又は動物における標的遺伝子発現と比較して判断することができる。例えば、いくつかの実施形態では、標的遺伝子発現の低減は、（ａ）本発明の方法によるオリゴヌクレオチド化合物と接触させた細胞における標的ｍＲＮＡの量又はレベルを測定すること、（ｂ）対照オリゴヌクレオチド化合物（例えば、細胞内では発現することのないＲＮＡ分子、若しくはナンセンス配列若しくはスクランブル配列を有するオリゴヌクレオチド化合物に誘導されるオリゴヌクレオチド化合物）と接触させた細胞、又は化合物を含まない細胞における標的ｍＲＮＡの量又はレベルを測定すること、及び（ｃ）（ａ）で処理された細胞に由来する測定された標的ｍＲＮＡレベルと、（ｂ）の対照細胞に由来する測定された標的ｍＲＮＡレベルとを比較することによって評価される。比較する前に、処理された細胞及び対照細胞における標的ｍＲＮＡレベルを、対照遺伝子（例えば、１８ＳリボソームＲＮＡ又はハウスキーピング遺伝子）のＲＮＡレベルに正規化してもよい。標的ｍＲＮＡレベルは、ノーザンブロット分析、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、逆転写酵素（ＲＴ）－ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ドロップレットデジタルＰＣＲなどを含む様々な方法によって測定することができる。

【0103】

他の実施形態では、標的遺伝子発現の低減は、（ａ）本発明の方法によるオリゴヌクレオチド化合物と接触させた細胞における標的タンパク質の量又はレベルを測定すること、（ｂ）対照オリゴヌクレオチド化合物（例えば、細胞内では発現することのないＲＮＡ分子、若しくはナンセンス配列若しくはスクランブル配列を有するオリゴヌクレオチド化合物に誘導されるオリゴヌクレオチド化合物）と接触させた細胞、又は化合物を含まない細胞における標的タンパク質の量又はレベルを測定すること、及び（ｃ）（ａ）で処理された細胞に由来する測定された標的タンパク質と、（ｂ）の対照細胞に由来する測定された標的タンパク質レベルとを比較することによって評価される。標的タンパク質レベルを測定する方法は当業者に公知であり、ウエスタンブロット、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、及びフローサイトメトリーが挙げられる。

【0104】

本発明はまた、本明細書に記載されるようなサプレッサータンパク質の阻害剤と、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド化合物などのオリゴヌクレオチド化合物とを対象に投与することを含む、それを必要とする対象の標的遺伝子の発現を低減させるための方法であって、オリゴヌクレオチド化合物は、標的遺伝子の配列と実質的に又は完全に相補的な配列を含む方法を提供する。本発明の方法のいくつかの実施形態では、標的遺伝子の発現は、例えば、遺伝子産物の過剰発現又はタンパク質バリアント若しくはアイソフォーム（例えば、遺伝子産物の変異形態）の発現が病理学的表現型の起因となる疾患又は障害に関連付けられる。本発明の方法の特定の実施形態では、標的遺伝子はヒト遺伝子である。例示的な標的遺伝子としては、ＬＰＡ、ＰＮＰＬＡ３、ＡＳＧＲ１、Ｆ７、Ｆ１２、ＦＸＩ、ＡＰＯＣＩＩＩ、ＡＰＯＢ、ＡＰＯＬ１、ＴＴＲ、ＰＣＳＫ９、ＨＳＤ１７Ｂ１３、ＨＰＲＴ１、ＰＰＩＢ、ＥＰＡＳ１、ＤＵＸ４、ＤＭＰＫ、ＸＤＨ、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＣＡＰ、ＫＲＡＳ、ＣＤ２７４、ＰＤＣＤ１、Ｃ３、Ｃ５、ＣＦＢ、ＡＬＡＳ１、ＧＹＳ１、ＨＡＯ１、ＬＤＨＡ、ＡＮＧＰＴＬ３、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＡＬＤＨ２、ＡＧＴ、ＨＡＭＰ、ＬＥＣＴ２、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＫＩＦ１１、ＡＴ３、ＣＴＮＮＢ１、ＨＭＧＢ１、ＨＩＦ１Ａ、及びＳＴＡＴ３が挙げられるが、これらに限定されない。標的遺伝子としては、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎ウイルス遺伝子、ヒト免疫不全ウイルス遺伝子、ヘルペスウイルス遺伝子などのようなウイルス遺伝子も挙げることができる。本発明の方法のいくつかの実施形態では、標的遺伝子は、ヒトマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする遺伝子である。本発明の方法の特定の実施形態では、標的遺伝子は、肝臓に発現する遺伝子である。

【0105】

本発明の方法のいくつかの実施形態では、細胞又は対象において、標的遺伝子の発現が少なくとも５０％低減する。本発明の方法の他の実施形態では、細胞又は対象において、標的遺伝子の発現が少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％低減する。更に他の実施形態では、細胞又は対象において、標的遺伝子の発現が約９０％以上、例えば、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％以上低減する。標的遺伝子発現の低減率は、本明細書に記載される方法だけでなく、当技術分野において公知の他の方法のいずれかによって測定することができる。

【0106】

本発明の方法の特定の実施形態では、方法は、サプレッサータンパク質の阻害剤と、標的遺伝子の配列と実質的に又は完全に相補的な配列を含む第１のオリゴヌクレオチド化合物と細胞を接触させることを含み、第１のオリゴヌクレオチド化合物は、細胞の表面に発現する受容体のリガンドに共有結合されており、サプレッサータンパク質の阻害剤は、サプレッサータンパク質をコードするｍＲＮＡ配列と実質的に相補的な又は完全に相補的な配列を含む第２のオリゴヌクレオチド化合物である。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチド化合物は、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである。他の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチド化合物は、ｓｉＲＮＡである。前述の実施形態のいずれかでは、第２のオリゴヌクレオチド化合物は、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡである。

【0107】

本発明の方法の特定の他の実施形態では、方法は、サプレッサータンパク質の阻害剤と、標的遺伝子の配列と実質的に又は完全に相補的な配列を含む第１のオリゴヌクレオチド化合物とを対象に投与することを含み、第１のオリゴヌクレオチド化合物は、第１のリガンドに共有結合されており、サプレッサータンパク質の阻害剤は、サプレッサータンパク質をコードするｍＲＮＡ配列と実質的に相補的な又は完全に相補的な配列を含む第２のオリゴヌクレオチド化合物である。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチド化合物は、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである。他の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチド化合物は、ｓｉＲＮＡである。前述の実施形態のいずれかでは、第２のオリゴヌクレオチド化合物は、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡである。いくつかの実施形態では、第２のオリゴヌクレオチド化合物は、第２のリガンドに共有結合される。第１のリガンド、第２のリガンド、又は第１及び第２のリガンドの両方は、本明細書に記載されるリガンドのいずれかであり得る。例えば、いくつかの実施形態では、第１のリガンド、第２のリガンド、又は第１及び第２のリガンドの両方は、コレステロール部分、ビタミン、ステロイド、胆汁酸、葉酸部分、脂肪酸、炭水化物、グリコシド、又は抗体若しくはその抗原結合断片を含む。他の実施形態では、第１のリガンド、第２のリガンド、又は第１及び第２のリガンドの両方は、ガラクトース、ガラクトサミン、又はＮ－アセチル－ガラクトサミンを含む。一実施形態では、第１のリガンド、第２のリガンド、又は第１及び第２のリガンドの両方は、多価ガラクトース部分又は多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分を含む。前述の実施形態のいずれかでは、第１のオリゴヌクレオチド化合物に共有結合された第１のリガンドは、第２のオリゴヌクレオチド化合物に共有結合された第２のリガンドと同一である。このようないくつかの実施形態では、第１及び第２のリガンドは、ＡＳＧＰＲなどの肝臓細胞の表面に発現する受容体のリガンドである。本発明の方法の他の実施形態では、第１のリガンドは第２のリガンドとは異なるが、第１のリガンドと第２のリガンドの両方は、同一の細胞型に発現する受容体のリガンドである。例として、第１のリガンドは、肝細胞に発現するＡＳＧＰＲのリガンドである多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分を含み得、第２のリガンドは、同様に肝細胞に発現するＬＤＬ受容体のリガンドであるコレステロール部分を含み得る。

【0108】

本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド化合物及び遺伝子改変剤は、トランスフェクション、ウイルス形質導入、脂質ベースの粒子、及び本明細書に更に記載されるようなリガンドへのコンジュゲーションを含む様々な方法によって細胞内に送達することができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物及び／又は遺伝子改変剤は、ベクターから発現される。「ベクター」とは、遺伝物質を宿主細胞に導入するのに使用される、任意の分子又は実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ又はウイルス）を指す。ベクターの例としては、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクター及び発現ベクター、例えば、組換え発現ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態で好ましい好適なウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びレトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターが挙げられる。「発現ベクター」又は「発現コンストラクト」という用語は、本明細書で使用される場合、所望の標的配列と、作動可能に連結された標的配列を特定の細胞で発現させるのに必要となる適切な核酸制御配列とを含む、組換え核酸分子を指す。発現ベクターは、転写、翻訳に影響を及ぼすか、又はそれらを制御し、且つ、イントロンが存在する場合には、そこに作動可能に連結されたコード領域のＲＮＡスプライシングに影響を及ぼす配列を含み得るが、これらに限定されない。原核生物における発現に必要な核酸配列としては、プロモーター、任意選択によりエンハンサー配列、並びに終止シグナル及びポリアデニル化シグナルが挙げられる。

【0109】

サプレッサータンパク質の阻害剤が、本明細書に記載されるようなオリゴヌクレオチド化合物であるいくつかの実施形態では、サプレッサータンパク質の阻害剤は、オリゴヌクレオチド化合物が細胞内で発現されるように、プロモーター（例えば、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター）に作動可能に連結されたオリゴヌクレオチドを含むベクター（例えば、ウイルスベクター）を使用して、細胞内に送達される。このような実施形態では、プロモーターに作動可能に連結されたオリゴヌクレオチド配列は、上記に記載されるようなアンチセンスオリゴヌクレオチド又はｓｈＲＮＡであり得る。本明細書で使用される「作動可能に連結された」という用語は、所与の遺伝子の転写及び／又は所望のタンパク質分子の合成を誘導することが可能な核酸分子が生成されるように、２つ以上の核酸配列が連結されていることを指す。例えば、ヌクレオチド配列に「作動可能に連結された」ベクターの制御配列は、制御配列の転写活性と適合する条件下でヌクレオチド配列の発現が達成されるように、ヌクレオチド配列にライゲートされる。種々の潜在的な宿主細胞によって認識される多数のプロモーターは、当業者によく知られている。例えば、哺乳動物宿主細胞と共に使用するのに好適なプロモーターとしては、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２型など）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られるものが挙げられる。所望の産物がオリゴヌクレオチド化合物又はガイドＲＮＡである実施形態では、プロモーターは、Ｕ６プロモーターなどのＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターであり得る。

【0110】

サプレッサータンパク質の阻害剤が、Ｃａｓヌクレアーゼ、ＺＦＮ、又はＴＡＬＥＮなどのヌクレアーゼを含む遺伝子改変剤である他の実施形態では、ヌクレアーゼは、目的の細胞に発現させるのに好適なプロモーターに作動可能に連結された、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むベクター（例えばウイルスベクター）を使用して細胞に送達することができる。遺伝子改変剤がガイドＲＮＡを更に含む実施形態（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓゲノム編集方法を利用する場合）では、ベクターは、Ｕ６プロモーターなどのＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターに作動可能に連結されたガイドＲＮＡ配列を含むガイドＲＮＡ発現カセットを更に含み得る。代替的な実施形態では、ヌクレアーゼをコードする第１のベクターと同時に、又は第１のベクターと接触させた後に、ガイドＲＮＡ発現カセットを含む第２のベクターと細胞を接触させることができる。

【0111】

本発明の方法の他の実施形態では、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド化合物及び遺伝子改変剤は、脂質ベースの送達方法を使用して細胞に送達することができる。例えば、オリゴヌクレオチド化合物及び遺伝子改変剤の送達ビヒクルとして、水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、及び脂質ベースの系などのコロイド分散系が使用され得る。核酸を送達するのに好適な市販の脂肪エマルションとしては、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）（Ａｂｂｏｔｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩ（Ｈｏｓｐｉｒａ）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩＩ（Ｈｏｓｐｉｒａ）、Ｎｕｔｒｉｌｉｐｉｄ（Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．）、及び他の類似の脂質エマルションが挙げられる。インビボにおける送達ビヒクルとして使用するための好ましいコロイド系は、リポソーム（すなわち、人工膜小胞）である。オリゴヌクレオチド化合物及び／又は遺伝子改変剤は、リポソーム内に封入されてもよく、又は、リポソーム、特にカチオン性リポソームと複合体を形成してもよい。或いは、オリゴヌクレオチド化合物及び／又は遺伝子改変剤は、脂質、特にカチオン性脂質と複合体化されてもよい。好適な脂質及びリポソームとしては、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、及びジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ））、並びにカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピル（ＤＯＴＡＰ）及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＴＭＡ））が挙げられる。そのようなコロイド分散系の調製及び使用は、当技術分野においてよく知られている。また、例示的な製剤は、米国特許第５，９８１，５０５号明細書、米国特許第６，２１７，９００号明細書；米国特許第６，３８３，５１２号明細書；米国特許第５，７８３，５６５号明細書；米国特許第７，２０２，２２７号明細書；米国特許第６，３７９，９６５号明細書；米国特許第６，１２７，１７０号明細書；米国特許第５，８３７，５３３号明細書；米国特許第６，７４７，０１４号明細書；及び国際公開第０３／０９３４４９号パンフレットにも開示されている。

【0112】

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物及び／又は遺伝子改変剤は、脂質製剤内に完全に封入されて、例えば、ＳＮＡＬＰ又は他の核酸脂質粒子を形成する。本明細書で使用する場合、「ＳＮＡＬＰ」という用語は、安定的な核酸脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰは、典型的には、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び粒子の凝集を妨げる脂質（例えば、ＰＥＧ脂質コンジュゲート）を含有する。ＳＮＡＬＰは、静脈内注射後に長期間の循環寿命を示し、且つ遠位部位（例えば、投与部位から物理的に隔てられた部位）で蓄積するため、全身投与に極めて有用である。核酸脂質粒子は、典型的には、平均直径が約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、又は約７０ｎｍ～約９０ｎｍであり、実質的に非毒性である。加えて、核酸は、核酸脂質粒子中に存在する場合、水溶液中でのヌクレアーゼによる分解に対して耐性がある。核酸脂質粒子及びそれらの調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号明細書、同第５，９８１，５０１号明細書、同第６，５３４，４８４号明細書、同第６，５８６，４１０号明細書、同第６，８１５，４３２号明細書及び国際公開第９６／４０９６４号パンフレットに開示されている。従って、サプレッサータンパク質の阻害剤が、本明細書に記載されるようなオリゴヌクレオチド化合物であるいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、ＳＮＡＬＰ又は他の種類のリポソームに封入され得る。同様に、サプレッサータンパク質の阻害剤が、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、ＺＦＮ、又はＴＡＬＥＮ）を含む遺伝子改変剤であるいくつかの実施形態では、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、任意選択によりガイドＲＮＡによって（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを使用する場合）、ＳＮＡＬＰ又は他のリポソームに組み込まれ得る。

【0113】

本発明の方法の特定の好ましい実施形態では、目的の遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド化合物は、上記で詳細に記載されているように、細胞の表面に発現する受容体のリガンドにコンジュゲートすることによって、インビトロ又はインビボで細胞に送達される。従って、このような実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物中で製剤化され得る。このような組成物は、標的遺伝子の発現の低減を、それを必要とする対象において行うのに有用である。臨床適用が企図される場合、医薬組成物は、目的の用途に適切な形態で調製される。一般に、このことは、パイロジェンと同様に、ヒト又は動物に有害となる虞のある他の不純物も本質的に含まない組成物を調製することが必要とされる。

【0114】

「薬学的に許容される」又は「薬理学的に許容される」という語句は、動物又はヒトに投与される場合に、有害な、アレルギー性の、又は他の不都合な反応をもたらさない分子実体及び組成物を指す。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される賦形剤」としては、医薬、例えばヒトの投与に好適な医薬の製剤化に使用するのに容認される溶媒、緩衝液、溶液、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張化剤、並びに吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的に活性な物質にそのような媒体及び薬剤を使用することは、当技術分野においてよく知られている。任意の従来の媒体又は薬剤がオリゴヌクレオチド化合物と適合しない場合を除いて、治療用組成物中で使用することが企図される。また、補助的な活性成分も、組成物のオリゴヌクレオチド化合物を不活性化しないのであれば、組成物に組み込むことができる。

【0115】

医薬組成物を製剤化するための組成物及び方法は、投与経路、治療すべき疾患若しくは障害の種類及び程度、又は投与すべき用量が挙げられるがこれらに限定されない、多くの基準に依存する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、意図される送達経路に基づいて製剤化される。例えば、特定の実施形態では、医薬組成物は、非経口送達用に製剤化される。非経口の送達形態としては、静脈内、動脈内、皮下、髄腔内、腹腔内、又は筋肉内注射又は注入が挙げられる。一実施形態では、医薬組成物は、静脈内送達用に製剤化される。別の実施形態では、医薬組成物は、皮下送達用に製剤化される。

【0116】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載される有効量のオリゴヌクレオチド化合物を含む。「有効量」とは、有利な又は所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量とは、対象の特定の組織又は細胞型（例えば、肝臓又は肝細胞）内の標的遺伝子の発現を低減させるのに十分な量である。

【0117】

医薬組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用可能である限り、あらゆる一般的な経路を介して行われ得る。そのような経路としては、非経口（例えば、皮下、筋肉内、腹腔内若しくは静脈内）、経口、経鼻、頬側、皮内、経皮、及び舌下経路、又は標的組織（例えば、肝臓組織）への直接注射若しくは肝門脈を介する送達が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、非経口投与される。例えば、特定の実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与される。他の実施形態では、医薬組成物は、皮下投与される。

【0118】

注射用途に好適な医薬組成物は、例えば、注射用滅菌溶液又は分散体を即時調製するための滅菌水溶液又は分散体及び滅菌粉末を含む。一般に、これらの調製物は、滅菌済みであり、容易に注射可能となる程度の流体である。調製物は、製造及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されていなければならない。適切な溶媒又は分散媒体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合液、並びに植物油を含有し得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用、分散体の場合に必要とされる粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物作用の予防は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中で使用することによってもたらすことができる。

【0119】

滅菌注射溶液は、活性化合物を適切な量で所望の（例えば、上記に列挙したような）他の任意の成分と共に溶媒中に組み込んだ後に、濾過滅菌することによって調製してもよい。一般的に、分散体は、塩基性分散媒及び所望の他の成分、例えば上記で列挙された成分を含有する滅菌ビヒクル中に、滅菌された様々な活性成分を組み込むことによって調製される。注射用滅菌溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法としては、真空乾燥及び凍結乾燥技術が挙げられ、これは、活性成分及び任意の追加の所望の成分の粉末を、予め滅菌濾過されたそれらの溶液から得るものである。

【0120】

本発明の組成物は、一般に、中性又は塩形態で製剤化され得る。薬学的に許容される塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸若しくはリン酸）又は有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）から誘導される酸付加塩（遊離アミノ基により形成される）が挙げられる。遊離カルボキシル基と共に形成される塩は、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、若しくは水酸化第二鉄）から誘導することもでき、又は有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導することもできる。

【0121】

水溶液中で非経口投与する場合、例えば、溶液は、通常適切に緩衝化され、液体希釈剤は、例えば十分な生理食塩水又はグルコースにより最初に等張にされる。このような水溶液は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に使用され得る。特に本開示を考慮すれば、当業者に公知であるような滅菌水性媒体を使用することが好ましい。例として、単回用量を等張ＮａＣｌ溶液１ｍｌに溶解し、皮下注入液１０００ｍｌに添加してもよく、又は提示された注入部位に注射してもよい（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ １０３５－１０３８ ａｎｄ １５７０－１５８０を参照されたい）。ヒトに投与する場合、調製物は、ＦＤＡ基準に要求される無菌性、発熱性、一般的安全性及び純度の基準を満たさなければならない。特定の実施形態では、医薬組成物は、滅菌生理食塩水及び本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド化合物を含むか又はそれらからなる。他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド化合物及び滅菌水（例えば、注射用水、ＷＦＩ）を含むか又はそれらからなる。更に他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド化合物及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含むか又はそれらからなる。

【0122】

実施された実験及び達成された結果を含む以下の実施例は、例示の目的のみのために提供されるものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

【実施例】

【0123】

実施例１．ｓｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングを調節するタンパク質の同定
ｓｉＲＮＡ治療用分子の細胞内送達を制限する細胞性因子を明らかにするために、ヒト肝細胞癌Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるＨＰＲＴ１遺伝子を標的とするＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分コンジュゲートｓｉＲＮＡの送達を利用して、プールしたゲノムワイド機能喪失スクリーニングを実施した。Ｈｅｐ３Ｂ細胞株を、その増殖能とアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）の発現レベルの高さから、スクリーニングに選択した。加えて、Ｈｅｐ３Ｂ細胞は、ＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートｓｉＲＮＡにより誘発されるサイレンシングによって、標的遺伝子を強固にノックダウンすることが示された（データは示さず）。

【0124】

ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）を安定的に発現するＨｅｐ３Ｂ細胞を、３つの異なる感染多重度（ＭＯＩ；０．５、１、及び２）のＴｒａｎｓＥＤＩＴ ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ヌクレアーゼ発現レンチウイルス（ｐＣＬＩＰ－Ｃａｓ９－ヌクレアーゼ－ＥＦＳ－Ｂｌａｓｔ；ＴｒａｎｓＯＭＩＣ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ、カタログ番号ＮＣ０９５６０８７）で細胞を形質導入することによって生成した。導入後に、全ての細胞を１０μｇ／ｍＬのブラストサイジンで選択して維持した。いずれのＣａｓ９安定発現Ｈｅｐ３Ｂプールにおいても、毒性は観察されなかった。Ｃａｓ９安定Ｈｅｐ３Ｂ細胞の編集能力を、２つの標的遺伝子、ＳＬＣ３Ａ２及びＡＳＧＲ１における編集の有効性を検証することによって評価した。ＳＬＣ３Ａ２遺伝子（ＳＬＣ３Ａ２－８３及びＳＬＣ３Ａ２－８４）又はＡＳＧＲ１遺伝子（ＡＳＧＲ１－７７及びＡＳＧＲ１－７８）を標的とする２つの異なるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）レンチウイルスベクターを、親Ｈｅｐ３Ｂ細胞株と各Ｃａｓ９安定Ｈｅｐ３Ｂプールの両方に個々に形質導入した。これらのｇＲＮＡレンチウイルスベクターを下記の表２に示す。ｇＲＮＡレンチウイルスを形質導入する前と後のＳＬＣ３Ａ２及びＡＳＧＲ１の発現レベルを、抗体染色後のフローサイトメトリー分析によって測定した。親Ｈｅｐ３Ｂ細胞株と比較して、全てのＣａｓ９安定Ｈｅｐ３Ｂプールでは、両方の標的遺伝子が正常にノックアウトされており（図１Ａ及び１Ｂ）、Ｃａｓ９安定Ｈｅｐ３ＢＣａｓ９細胞が編集機能を十分に備えていることが実証された。３つのＣａｓ９安定Ｈｅｐ３Ｂプールの全てで編集効果が類似していたため、潜在的なＣａｓ９毒性を最小化するために、最も低いＭＯＩを有するもの（０．５、Ｈｅｐ３ＢＣａｓ９と称する）を選択し、ＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートｓｉＲＮＡによって誘導されるサイレンシングの潜在的な調節因子を同定するために、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）スクリーニングを実施した。

【0125】

【表2】

【0126】

ＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートｓｉＲＮＡの効力の潜在的な調節因子を同定するために、ＣＲＩＳＰＲノックアウトスクリーニングにＨＰＲＴ１－６ＴＧに基づく生存／死滅選択系を使用した。６－チオグアニン（６ＴＧ）は、プリン類似体であり、ヒトではＨＰＲＴ１遺伝子にコードされるヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）によってリン酸化された後にＤＮＡ及びＲＮＡに組み込まれ、その結果として細胞死を生じさせる（Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．４３（２０）；ｅ１３４，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｖ６７５，２０１５）。細胞内のＨＰＲＴ１の発現をノックダウン又はノックアウトすることにより、６ＴＧに対する耐性がもたらされ、それらの細胞の生存が可能となる。２’－フルオロ及び２’－メトキシ（ＯＭｅ）修飾を組み込んだヒトＨＰＲＴ１を標的とするＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートｓｉＲＮＡ（二重鎖番号８１７２）を設計し、検証を行った。二重鎖番号８１７２のセンス配列及びアンチセンス配列を下記の表５に示す。ＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡが細胞に侵入してＨＰＲＴ１遺伝子サイレンシングを誘導することが可能である場合、これらの細胞は６ＴＧの存在下で生存することができる。そうでない場合、細胞は６ＴＧの選択によって死滅することとなる。ＣＲＩＳＰＲノックアウト条件下において、ある遺伝子がｓｉＲＮＡ活性に通常必要とされている場合、この遺伝子をノックアウトすることでｓｉＲＮＡの機能が低下又は消失することとなり、６ＴＧの選択によって細胞が排除される。或いは、ある遺伝子がｓｉＲＮＡの活性を阻害又は遮断するように通常機能している場合、この遺伝子をノックアウトすることでｓｉＲＮＡの効力が向上し、細胞が６ＴＧの選択で生存することが可能となる。従って、生存細胞でｇＲＮＡの塩基配列を決定する場合、濃縮されたｇＲＮＡにはｓｉＲＮＡの活性を通常阻害し得る遺伝子が反映されるが、ｓｉＲＮＡの機能に不可欠な遺伝子を標的とするｇＲＮＡは枯渇することになる。しかしながら、ｓｉＲＮＡに関連しないメカニズムによって細胞生存率に影響を及ぼす遺伝子を標的とする他のｇＲＮＡも生細胞集団から枯渇してしまうため、枯渇したｇＲＮＡ集団からｓｉＲＮＡに必須となる遺伝子を同定することは困難となる。従って、ＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートｓｉＲＮＡによって誘導されるサイレンシングを阻害する遺伝子を同定することができるように、生存細胞由来の濃縮されたｇＲＮＡに焦点を当てて、ＣＲＩＳＰＲノックアウトスクリーニングによる分析を行った。

【0127】

最初に、ｓｉＲＮＡで処理されていないＨｅｐ３ＢＣａｓ９細胞におけるベースラインの６ＴＧ死滅曲線を確定した。６ＴＧに起因する不十分な死滅と過剰な死滅の両方を回避するため、１００μＭの６ＴＧ（約ＩＣ７０）及び２０μＭの６ＴＧ（約ＩＣ５０）を使用して小規模なパイロットランを実施した。８０ＫのゲノムワイドｇＲＮＡレンチウイルスライブラリー（ＣＲＩＳＰＲ ＫＯＨＧＷ ８０Ｋ（ロット番号１７０５０３０１）、Ｃｅｌｌｅｃｔａ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）でＨｅｐ３ＢＣａｓ９細胞を形質導入し、ゲノムワイドノックアウトプールを生成した。最初に、細胞を４つの群（０．６Ｅ＋０６細胞／群）：１）ｓｉＲＮＡのみ、２）６ＴＧで処理したｓｉＲＮＡ、３）６ＴＧのみ、及び４）陰性対照に均等に分けた。十分ではあるが過剰でないｓｉＲＮＡ効果を得るために、７５０ｎＭ（約ＩＣ６０）のＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号８１７２）を、実験の０日目に第１群及び第２群に添加した。実験の３日目に、各群から組織培養培地を除去し、次いで、第２群及び第３群には１００μＭの６ＴＧ又は２０μＭの６ＴＧを添加する一方で、第１群及び第４群には非選択完全増殖培地を添加した。６ＴＧで処理した後に、細胞を３日間インキュベートした。次いで、細胞を分割し、６ＴＧ培地を６ＴＧを含まない完全増殖培地で交換し、更に３日間培養した。６ＴＧ処理後の３日目と６ＴＧ処理後の６日目に、細胞数の測定値（ＶｉＣｅｌｌによって測定した）を記録した（図２Ａ及び２Ｂ）。図２Ａに図示されるように、６ＴＧ処理後の３日目では、６ＴＧのみの群は生存細胞が３５％であったが、ＨＰＲＴ１－ｓｉ＋６ＴＧ群は生存細胞が５２％であった。６ＴＧ処理後の６日目では、６ＴＧのみの群は生存細胞が５％しかなかったが、ＨＰＲＴ１－ｓｉ＋６ＴＧ群は生存細胞が１７％であった（図２Ｂ）。これらの結果は、ＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡによる処理により、部分的に保護されたことを示している。これにより、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）活性を増強する遺伝子ノックアウトを検出するのに非常に適したスクリーニング表現型がもたらされる。この初期スクリーニングからの知見に基づき、大規模ゲノムワイドノックアウトスクリーニングの条件として、６日間の１００μＭの６ＴＧ処理が選択された。

【0128】

ｓｉＲＮＡの投与量の影響を試験するために、ＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号８１７２）の異なる２つの濃度、１５０ｎＭのｓｉＲＮＡコンジュゲート（低用量群）及び７５０ｎＭのコンジュゲート（高用量群）を用いて大規模スクリーニングを実施した。野生型Ｕ６プロモーター下でｇＲＮＡを発現し、ヒトユビキチンＣプロモーター下でＴａｇＲＦＰ及びＰｕｒｏ耐性遺伝子を発現するｇＲＮＡレンチウイルスライブラリーでＨｅｐ３ＢＣａｓ９細胞を形質導入した。ライブラリーは、約１９，０００個の遺伝子をカバーし、各遺伝子に対して４つのｇＲＮＡを含む。ｇＲＮＡレンチウイルスライブラリーを９．２Ｅ＋０７のＨｅｐ３ＢＣａｓ９細胞に形質導入した。ＲＦＰ陽性細胞集団によって反映された実際のライブラリーの形質導入効率（６１％）を、形質導入後の４日目にフローサイトメトリー分析によって確認した。計算に基づくと、実際のｇＲＮＡレンチウイルスライブラリーの形質導入のＭＯＩは約０．９であり、実際のカバレッジは１０３５であった。次いで、形質導入細胞をピューロマイシンとブラスチジンで１４日間選択した。選択後の１４日目では、フローサイトメトリーによって細胞の８７％がＲＦＰ陽性であった（細胞の８７％でｇＲＮＡが組み込まれたことを示す）。選択後の１４日目に、１Ｅ＋０８細胞をベースライン試料として採取し、冷凍した。残りの細胞を３つの群（２．４Ｅ＋０８細胞／群）に均等に分けた：第１群を低用量群として１５０ｎＭのＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号８１７２）で処理し、第２群を高用量群として７５０ｎＭのＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡで処理し、群３をｓｉＲＮＡを含まない対照として設定した。ｓｉＲＮＡ処理後の３日目に、６ＴＧ処理前の試料として、各群から２Ｅ＋０８細胞を採取して冷凍し、次いで各群の残りの細胞を更に２つのサブグループ：ａ）６ＴＧを含まない群、及びｂ）６ＴＧ群に分けた。ｓｉＲＮＡを含む細胞培養培地を各フラスコから除去し、６ＴＧ群の各フラスコには１００μＭの６ＴＧを含む新鮮な培地を添加し、６ＴＧを含まない群の各フラスコには６ＴＧを含まない新鮮な培地を添加した。全ての細胞を更に３日間インキュベートし、次いで、全ての細胞を６ＴＧを含まない新鮮な培地に分割した。最終的に３日間インキュベートした後に、全ての細胞を採取した。製造業者の指示書に従い、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｃｅｌｌキット（ＱＩＡＧＥＮ ＩＮＣ、カタログ番号１５８７６７）を使用して、採取された全ての試料からゲノムＤＮＡ試料を抽出し、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）バーコードシークエンシングに供した。ＮＧＳシークケンスの結果を、ＯＧＡアルゴリズム（Ｍｅｉｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ，Ｖｏｌ．１７；６０１－６１１，２０２０）によって分析した。カットオフラインとして、偽発見率（ＦＤＲ）＜０．２を使用した。全ての試料はｇＲＮＡライブラリーの良好な再現性を維持していた（約７７，０００個のｇＲＮＡが全体的に類似した分布で存在する）。加えて、ＨＰＲＴ１を標的とするｇＲＮＡは、６ＴＧを含まない群と比較して、６ＴＧ処理群において約２倍で正常に濃縮されていた（データは示さず）。

【0129】

ノックアウトされた場合にＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートｓｉＲＮＡの内部移行、輸送又はＲＮＡｉ活性を向上させることができる遺伝子を同定するために、ｓｉＲＮＡと６ＴＧの両方で処理した試料中では濃縮されるが、６ＴＧのみで処理した対照群では濃縮されないｇＲＮＡに焦点を当てた分析を行った。これらのヒットには、ノックアウトされた場合に、１）ＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡのサイレンシング効力を増強する、２）ｓｉＲＮＡの非存在下で６ＴＧに対する感受性を向上させる、又は３）６ＴＧの存在下で細胞生存率を増強することができる遺伝子が含まれる。最も強力な効力を有する遺伝子を同定するために、高用量（７５０ｎＭ）及び低用量（１５０ｎＭ）の両方のＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡと６ＴＧで処理された群の中で、６ＴＧのみの処理群と比較すると大幅に（ＦＤＲ＜０．２）濃縮されている遺伝子ヒットを選択した（図３Ａ）。この分析により、以下の１７個の遺伝子：ＡＤＫ、Ｃ１４ｏｒｆ８０（ＴＥＤＣ１としても公知である）、ＣＡＢ３９、ＣＣＮＥ１、ＤＥＮＲ、ＦＫＢＰ１Ａ、ＨＩＦ１ＡＮ、ＮＡＰＧ、ＮＤＵＦＢ１１、ＲＡＢ１８、ＳＡＭＤ４Ｂ、ＳＣＦＤ２、ＳＬＣ３０Ａ９、ＳＮＲＮＰ４０、ＴＲＡＦ２、ＶＰＳ３７Ａ、及びＹＡＰ１が同定された（図３Ａ）。これらの１７個の遺伝子のいずれかが、ｓｉＲＮＡ処理の非存在下の６ＴＧ処理に対する細胞の感受性に影響を及ぼしているかどうかを知るために、これらの遺伝子を、ｓｉＲＮＡ又は６ＴＧで処理しなかった細胞に由来する試料（ｓｉＲＮＡを含まず、６ＴＧを含まない試料）に対して６ＴＧ単独で処理した群（ｓｉＲＮＡを含まない）で枯渇した遺伝子でプロットした（図３Ｂ）。図３Ｂにおいて、横軸は６ＴＧに対する感受性を示す。遺伝子の発現がノックアウトされた場合に６ＴＧに対する感受性が増強し、６ＴＧで処理すると強力な細胞死をもたらす遺伝子は、濃縮され、ＦＤＲの小さい横軸上にある。ＦＤＲ＜０．２をカットオフとして設定した場合、８つの遺伝子が６ＴＧの処理に対する感受性を促進するものとして同定された（図３Ｂ）。残りの９つの遺伝子は、横軸上の大きいＦＤＲによって示されるように、ノックアウトされた場合でも６ＴＧの感受性に影響しなかった。これら９つの遺伝子（ＲＡＢ１８、ＹＡＰ１、ＣＣＮＥ１、ＳＬＣ３０Ａ９、Ｃ１４ｏｒｆ８０（ＴＥＤＣ１としても公知である）、ＨＩＦ１ＡＮ、ＴＲＡＦ２、ＮＡＰＧ及びＳＣＦＤ２）の濃縮は、恐らくは、ｓｉＲＮＡの送達及び活性における役割に直接的に関与するものと思われた。従って、これらの遺伝子の発現や、又はこれらの遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を阻害することにより、ＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートｓｉＲＮＡ分子などのリガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチド化合物のサイレンシング活性を増強することができる。

【0130】

実施例２．ｓｉＲＮＡサイレンシング活性のタンパク質調節因子の検証
ＨＰＲＴ１－６ＴＧ選択方法を使用して同定された候補を、異なるアッセイシステムによって独立して検証することが必要である。実施例１に記載されるゲノムワイド機能喪失スクリーニングで同定されたヒットを検証するために、マルチプレックス化合成ｇＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いる二次スクリーニングを使用した。このマルチガイド方式では、標的遺伝子に大きな欠失を誘導し、単一のｇＲＮＡよりも効率的な標的遺伝子のノックアウトを誘導するために、互いに近接して設計された３つのｇＲＮＡが、共にＣａｓ９＋細胞に送達される。

【0131】

実施例１に記載される初期スクリーニングで同定された遺伝子（ＲＡＢ１８、ＣＣＮＥ１、ＳＬＣ３０Ａ９、ＮＡＰＧ、ＳＣＦＤ２、ＶＰＳ３７Ａ、ＳＡＭＤ４Ｂ及びＣＡＢ３９）を含む５８個の選択された遺伝子のマルチプレックス化合成ｇＲＮＡを、いくつかの対照遺伝子（ＡＧＯ２、ＡＳＧＲ１、及びＡＳＧＲ２）と共に、リポフェクタミンＣＲＩＳＰＲＭＡＸ Ｃａｓ９トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＣＭＡＸ００００８）を使用して、９６ウェルプレート形式でＨｅｐ３ＢＣａｓ９安定細胞にトランスフェクトした。最初に、０．３μＭのマルチプレックス化合成ｇＲＮＡ１．５μＬを、各ウェルで８．５μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地と混合した。次いで、５μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地に希釈した０．２μＬのＣＲＩＳＰＲＭＡＸ試薬を各ウェルに添加し、室温で５～１０分間インキュベートした。インキュベート後に、Ｈｅｐ３ＢＣａｓ９安定細胞８５μＬ（１ウェルあたり１５，０００細胞）を各ウェルに添加した。プレートを２０分間静置してから３７℃の組織培養インキュベーターに入れ、トランスフェクションして約６時間後に、トランスフェクション培地を１０％ＦＢＳ及び１％ＡＡ（抗生物質－抗真菌溶液）を含むＥＭＥＭと交換した。インキュベート後の３日目に、細胞を１：６の比率で分割した。ＣＲＩＳＰＲＭＡＸによるトランスフェクションの後に、細胞を合計で６日間インキュベートし、タンパク質をノックダウンさせた。トランスフェクトしてから６日目後に、ＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号８１７２）、抗ＡＳＧＲ１抗体にコンジュゲートされたＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号６７０９）、又はコレステロールにコンジュゲートされたＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号１７１０２）で細胞を処理した。これらのＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲートの構造を、下記の表５に示す。ＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲートを所望の濃度（５００ｎＭ、１００ｎＭ及び２０ｎＭ）で各ウェルに添加し、続いて３７℃の組織培養インキュベーター内で４日間インキュベートした。各試料のトータルＲＮＡを、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＭａｇＭＡＸ ｍｉｒＶａｎａ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号Ａ２７８２８）を使用することによって、製造業者の指示書に従って抽出した。次いで、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号４３６８８１３）を使用してトータルＲＮＡ試料からｃＤＮＡを合成し、これをｄｄＰＣＲ（ドロップレットデジタルポリメラーゼ連鎖反応）によってｓｉＲＮＡ活性を定量化するために使用した。ｄｄＰＣＲ反応は、ＢｉｏＲａｄ ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（カタログ番号１８６３０１０）を使用して、ユーザーマニュアルに従って組み立てた。次いで、ＱＸ２００ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（ＢｉｏＲａｄ、カタログ番号１８６４１０１）によってドロップレットを生成した。次いで、９６－Ｄｅｅｐ Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅを備えたＣ１０００ Ｔｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ、カタログ番号１８５１１９７）でサーマルサイクリング反応を行った。次いで、ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＲａｄ、カタログ番号１８６４００３）で反応物を読み取り、ＢｉｏＲａｄ ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェアパッケージを使用することで分析を行った。プライマー／プローブ比が３．６：１の、ｄｄＰＣＲアッセイ用に予め設計されたプライマー／プローブを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）から入手した。ＨＰＲＴ１遺伝子及びハウスキーピングＴＢＰ（ＴＡＴＡボックス結合タンパク質）遺伝子を定量化するのに使用したプライマー／プローブのアッセイＩＤは、それぞれＨｓ．ＰＴ．３９ａ．２２２１４８２１及びＨｓ．ＰＴ．５８．１９４８９５１０であった。各ウェルで、標的遺伝子（ＨＰＲＴ１）とハウスキーピングＴＢＰ遺伝子の両方のｄｄＰＣＲコピー数の測定値（コピー数／２０μＬ）を記録した。標的遺伝子のｄｄＰＣＲの測定値を、同じウェルから採取したＴＢＰのｄｄＰＣＲの測定値で除算することによって、正規化された標的遺伝子のｍＲＮＡレベルを算出した。得られたｓｉＲＮＡ処理試料の数を、更にｓｉＲＮＡを含まない処理試料の数で除算して、標的遺伝子のｍＲＮＡレベルの測定値のパーセンテージを得た。

【0132】

選択された遺伝子をノックアウトした細胞における、ｄｄＰＣＲによって測定したときのＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡサイレンシング効力（ｓｉＲＮＡを含まない対照に正規化した）を、下記の表３に示す。予想されるように、ＡＧＯ２をマルチプレックス化合成ｇＲＮＡでノックアウトした場合、試験された全てのｓｉＲＮＡコンジュゲートによって、ＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡサイレンシング活性が消失する。ＡＳＧＲ１はＡＳＧＰＲの極めて重要な構成要素であるため、ＡＳＧＲ１ ＣＲＩＳＰＲ－ＫＯにより、ＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡと同様に、抗ＡＳＧＲ１抗体コンジュゲートＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡに対しても反応の喪失がもたらされる。しかしながら、ＡＳＧＲ１のノックアウトは、コレステロールコンジュゲートＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡの機能には影響を及ぼさなかった。これらの結果は、マルチプレックス化合成ｇＲＮＡシステムが予想通りに機能していたことを示している。表３に示すように、ＣＲＩＳＰＲスクリーニングヒットであるＲＡＢ１８、ＳＣＦＤ２、ＮＡＰＧ、及びＳＡＭＤ４Ｂを、マルチプレックス化合成ｇＲＮＡでノックアウトすると、ｓｉＲＮＡコンジュゲートの効力が異なる程度に増強された。ＶＰＳ３７Ａは、コレステロールコンジュゲートｓｉＲＮＡの効力を特異的に増強した。他のスクリーニングヒットであるＣＡＢ３９、ＣＣＮＥ１及びＳＬＣ３０Ａ９は、マルチプレックス化合成ｇＲＮＡによる手法では検証することができなかった。ＺＷ１０及びＳＴＸ１８によってコードされるタンパク質は、ＲＡＢ１８タンパク質と相互作用することが示されている（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，Ｖｏｌ．２１７；９７５－９９５，２０１８；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ，Ｖｏｌ．２７；３４３－３５８ ｅ３４５，２０１９）。マルチプレックス化合成ｇＲＮＡによるＺＷ１０及びＳＴＸ１８のノックアウトでも、ｓｉＲＮＡサイレンシング効果が増強された（表３）。本実施例における実験結果は、ＲＡＢ１８、ＳＣＦＤ２、ＮＡＰＧ、ＶＰＳ３７Ａ、及びＳＡＭＤ４Ｂを含む、ｓｉＲＮＡサイレンシング活性の潜在的な調節因子として同定された遺伝子のいくつかが、マルチプレックス化合成ｇＲＮＡを使用することによる、第二のアレイ化ＣＲＩＳＰＲスクリーニングシステムによって検証されたことを示している。

【0133】

【表3】

【0134】

実施例３．ＲＡＢ１８発現を阻害することによって複数のｓｉＲＮＡコンジュゲートのサイレンシング効果が増強される
ＲＡＢ１８は機能喪失スクリーニングで検出された唯一のＲＡＢファミリーメンバーであり、ＲＡＢファミリーが細胞内小胞輸送の調節に重要なものであることから、ＲＡＢ１８がＨｅｐ３Ｂ細胞のｓｉＲＮＡ活性を調節するメカニズムを理解するために、更なる実験を行った。ＲＡＢ１８の機能について研究するために、ヒトＲＡＢ１８遺伝子を標的とする異なる３つのｓｉＲＮＡ分子（ｓｉＲＡＢ１８－１、ｓｉＲＡＢ１８－２、及びｓｉＲＡＢ１８－３）をＡｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ；カタログ番号４３９０８２４、ｓｉＲＮＡ ＩＤ番号ｓ２２７０３、ｓ２２７０４、及びｓ２２７０５）から入手し、それらのＨｅｐ３Ｂ細胞におけるＲＡＢ１８のサイレンシング効力について検証した。ＲＡＢ１８標的ｓｉＲＮＡ分子のそれぞれのセンス鎖及びアンチセンス鎖の核酸塩基配列を、下記の表４に示す。各ｓｉＲＮＡ分子は、センス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の３’末端の両方に２ヌクレオチドのオーバーハングを含む、１９塩基対の二重鎖領域を有していた。非標的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＴＣ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号４３９０８４３）を陰性対照として使用した。

【0135】

【表4】

【0136】

ＲＡＢ１８標的ｓｉＲＮＡ分子の効力を試験するために、いくつかの濃度のそれぞれ３つのｓｉＲＮＡ分子（０．２４ｎＭ～５０ｎＭ）又は滅菌水（陰性対照）を、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１３７７８０７５）を使用して、Ｈｅｐ３Ｂ細胞に個別に二度繰り返してリバーストランスフェクトした。トランスフェクトしてから２４時間後、製造業者の指示書に従って、ＭａｇＭＡＸ ｍｉｒＶａｎａ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号Ａ２７８２８）を使用して、細胞を溶解してＲＮＡを採取し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号４３６８８１３）を使用して、ｄｄＰＣＲ分析のために逆転写した。ハウスキーピング遺伝子であるＴＢＰで正規化したＲＡＢ１８のｄｄＰＣＲ測定値を使用して、ＲＡＢ１８のｍＲＮＡレベルの正規化されたパーセンテージを算出した。結果を図４Ａに示す。試験した３つのＲＡＢ１８標的ｓｉＲＮＡ分子の中で、ｓｉＲＡＢ１８－３がＲＡＢ１８の発現を低減するのに最も高い効力を示したため（図４Ａ）、ＨＰＲＴ１を標的とするＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートｓｉＲＮＡ分子のサイレンシング活性におけるＲＡＢ１８の機能を研究する更なる実験のために選択した。

【0137】

ＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡの効力に及ぼすＲＡＢ１８ノックダウンの効果を分析するために、非標的対照ｓｉＲＮＡ分子（ｓｉＮＴＣ）（５０ｎＭ）又はｓｉＲＡＢ１８－３（５０ｎＭ）をＨｅｐ３Ｂ細胞にリバーストランスフェクトした。トランスフェクトしてから２４時間後に、細胞をトリプシン処理し、ＥＭＥＭ中で２回洗浄して残留するトランスフェクション試薬を除去し、次いでＰＢＳ又は複数の濃度のＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号８１７２）のいずれかを含む９６ウェルプレートに蒔いた。ＧａｌＮＡｃ－ＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲートによる処理後の４日目に、上記に記載されるようにＲＮＡを単離してｃＤＮＡを合成するために細胞を溶解した。図４Ｂに図示されるように、ｄｄＰＣＲによって測定されたＲＡＢ１８のｍＲＮＡは、二重鎖番号８１７２による処理後の４日目にｓｉＲＮＡ１８－３でトランスフェクトした細胞では、ｓｉＮＴＣでトランスフェクトした細胞のＲＡＢ１８のｍＲＮＡレベルと比較して低レベル（２３．２％）で維持された。また、二重鎖番号８１７２による処理後の４日目に、ＨＰＲＴ１のｍＲＮＡのレベルをｄｄＰＣＲによって測定した。図４Ｃに示されるように、ＨＰＲＴ１発現を低減するＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡの効力は、ｓｉＮＴＣでトランスフェクトした細胞と比較して、ｓｉＲＡＢ１８－３でトランスフェクトしたＨｅｐ３Ｂ細胞の方が大きかった。特に、ｓｉＲＡＢ１８－３トランスフェクト細胞におけるＧａｌＮＡｃ－ＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲートのＩＣ５０は２４．８ｎＭであったのに対し、ｓｉＮＴＣトランスフェクト細胞では２２３．６ｎＭであり（図４Ｃ）、効力は１０倍に向上した。

【0138】

次に、ＲＡＢ１８の機能を完全に消失させるために、ＲＡＢ１８を標的とする２つのレンチウイルスｇＲＮＡベクター（ＳＩＧＭＡベクター：Ｕ６－ｇＲＮＡ：ＰＧＫ－ｐｕｒｏ－２Ａ－ｔａｇＢＦＰ）をＨｅｐ３ＢＣａｓ９細胞に形質導入することによって、２つのＲＡＢ１８ノックアウトプール（ＲＡＢ１８＿ＫＯ＿１及びＲＡＢ１８＿ＫＯ＿２）を生成した。ＲＡＢ１８ ｇＲＮＡレンチウイルスベクターの構造的特徴は以下の通りである：
・ ＲＡＢ１８ ｇＲＮＡレンチウイルスベクター番号１：サンガークローンＩＤ：ＨＳ５００００３３６１１；ＤＮＡ標的配列：ＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＣＴＡＴＴＡＴＡＧＡＧＧ（配列番号１１）
・ ＲＡＢ１８ ｇＲＮＡレンチウイルスベクター番号２：サンガークローンＩＤ：ＨＳ５００００３３６１２；ＤＮＡ標的配列：ＧＣＴＡＴＴＡＴＡＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＧＧＧ（配列番号１２）

【0139】

Ａｍｐｌｉｃｏｎ－ＥＺシークエンシングによってＲＡＢ１８のノックアウト効率を実証した（データは示さず）。ＲＡＢ１８遺伝子をノックアウトしても、Ｈｅｐ３ＢＣａｓ９細胞の細胞生存率が変化することはなかった（データは示さず）。ＨＰＲＴ１－６ＴＧ選択スクリーニングによってＲＡＢ１８が同定されたため、ＲＡＢ１８ノックアウト細胞で同じＨＰＲＴ１－６ＴＧスクリーニングアッセイを繰り返した。具体的には、実験の０日目に、Ｈｅｐ３ＢＣａｓ９細胞と２つのＲＡＢ１８ノックアウト細胞を、様々な濃度のＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号８１７２）又はＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＰＰＩＢ（ペプチジル－プロリルｃｉｓ－ｔｒａｎｓイソメラーゼＢ）ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号８７１４；配列については表５を参照されたい）のいずれかで処理した。実験の３日目に、ｓｉＲＮＡコンジュゲートを含む組織培養培地を除去し、次いで、細胞に１００μＭの６ＴＧを添加した。６ＴＧで処理した後に、細胞を４日間インキュベートした。次いで、細胞を分割し、培地を除去し、７日目に新鮮な６ＴＧを添加して、更に２日間培養した。６ＴＧ処理後の６日目に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して細胞溶解率を測定した。図５に示すように、親Ｈｅｐ３ＢＣａｓ９細胞と比較して、ＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡで処理した場合、ＲＡＢ１８ノックアウト細胞は６ＴＧの選択下で約１５％多く生存することができ（試験されたｓｉＲＮＡの最大用量で、Ｈｅｐ３ＢＣａｓ９細胞では４３％であったのと比較して、ＲＡＢ１８ノックアウト細胞では５８％であった）、このことは、ＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡがＨｅｐ３ＢＣａｓ９親細胞よりもＲＡＢ１８ノックアウト細胞でより良好に遺伝子サイレンシングを誘導したことを示している。非関連ｓｉＲＮＡ対照としてＰＰＩＢ遺伝子を標的とするＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートｓｉＲＮＡで処理された、Ｈｅｐ３ＢＣａｓ９細胞も、ＲＡＢ１８ノックアウト細胞も、６ＴＧ処理に対して増強された耐性を示さなかった（図５）。

【0140】

次に、異なる３つのＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートｓｉＲＮＡ分子のサイレンシング効力に及ぼすＲＡＢ１８のノックアウトの効果を評価した。Ｈｅｐ３ＢＣａｓ９細胞とＲＡＢ１８ノックアウト細胞を、３つのＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートｓｉＲＮＡ：ＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号８１７２）、ＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号１６０８４）、及びＰＰＩＢ ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号８７１４）で４日間処理した。ｓｉＲＮＡ分子のそれぞれの配列を、下記の表５に示す。細胞を溶解してＲＮＡを抽出し、上記に記載されるようにｄｄＰＣＲ分析のために逆転写した。ＨＰＲＴ１遺伝子及びハウスキーピングＴＢＰ遺伝子を定量化するのに使用したプライマー／プローブのアッセイＩＤは、実施例２に記載されているものと同一であった。ＡＳＧＲ１遺伝子及びＰＰＩＢ遺伝子を定量化するのに使用したプライマー／プローブのアッセイＩＤは、それぞれＨｓ．ＰＴ．５６ａ．２４７２５３９５及びＨｓ．ＰＴ．５８．４０００６７１８であった。各標的遺伝子（ＨＰＲＴ１、ＡＳＧＲ１、又はＰＰＩＢ）のｄｄＰＣＲ測定値を、ハウスキーピングＴＢＰ遺伝子のｄｄＰＣＲ測定値で正規化し、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で処理された対照細胞（すなわち、ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子で処理しなかった細胞）における対応するｍＲＮＡレベルのパーセンテージとして表した。試験した３つのＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲート全てにおいて、標的遺伝子のノックダウンは、Ｈｅｐ３ＢＣａｓ９の親細胞と比較すると、ＲＡＢ１８ノックアウト細胞の方が良好であった（図６Ａ、６Ｂ、及び６Ｃ）。Ｈｅｐ３ＢＣａｓ９のＧａｌＮＡｃ－ＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲートのＩＣ５０は、２つのＲＡＢ１８ノックアウト株が２．６ｎＭと４．１ｎＭであったのと比較すると８３．４ｎＭであり、２０～３０倍の変化であった（図６Ａ）。同様のｓｉＲＮＡサイレンシング効力の増大が、ＲＡＢ１８ノックアウト細胞株のＧａｌＮＡｃ－ＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲートで観察された。ＧａｌＮＡｃ－ＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲートでは、ＩＣ５０は、Ｈｅｐ３ＢＣａｓ９細胞で１９８．３ｎＭであり、２つのＲＡＢ１８ノックアウト細胞では、７．９ｎＭ又は６．５ｎＭであった（図６Ｂ）。ＨＰＲＴ１及びＡＳＧＲ１と比較して、ＰＰＩＢはＨｅｐ３Ｂ細胞で高発現している遺伝子であるが、Ｈｅｐ３ＢＣａｓ９細胞では、ＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＰＰＩＢ ｓｉＲＮＡによって効果的にサイレンシングすることができなかった（図６Ｃ）。しかしながら、この同じＧａｌＮＡｃ－ＰＰＩＢ ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、２つのＲＡＢ１８ノックアウトプールでＰＰＩＢ発現をサイレンシングすることができ（ＩＣ５０＝２０５．２ｎＭ又は３９１．８ｎＭ）（図６Ｃ）、このことは、ＲＡＢ１８を抑制することで、ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子のサイレンシング効力を増強することができることを示している。また、３つ全てのＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子のｓｉＲＮＡサイレンシング効果を１１日目に評価した。この一連の実験では、細胞をＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子で４日間処理し、次いで、ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子を含まない培地中で更に７日間維持し、この時点で細胞を溶解し、ＲＮＡを抽出してｄｄＰＣＲ分析のために逆転写した。時間の経過と共に細胞が増殖するにつれて、サイレンシング効果は低下したものの、サイレンシング効力はＨｅｐ３ＢＣａｓ９細胞よりもＲＡＢ１８ノックアウト細胞の方が大きかった。例えば、ＧａｌＮＡｃ－ＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲートで処理した場合、１１日目のＩＣ５０は、２つのＲＡＢ１８ノックアウトプールでは４１．３ｎＭと５８．３ｎＭであったのと比較して、Ｈｅｐ３ＢＣａｓ９細胞では３６３．６ｎＭであった。これらの結果は、ＲＡＢ１８の発現を阻害することで、ｓｉＲＮＡ分子によって標的化される遺伝子に関係なく、ＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートｓｉＲＮＡ分子のサイレンシング効力が増強することを実証している。

【0141】

ＲＡＢ１８がリガンドコンジュゲートｓｉＲＮＡ分子の効力を制御し得るメカニズムを更に調査するために、最初に、抗体ブロッキング試験を用いて、ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートがＲＡＢ１８ノックアウト細胞で機能するのにＡＳＧＲ１が必要となるのかどうかを試験した。Ｈｅｐ３ＢＣａｓ９細胞とＲＡＢ１８ノックアウト細胞を、最初に抗ＡＳＧＲ１抗体（国際公開第２０１７／０５８９４４号パンフレットに記載のクローン番号７Ｅ１１）、アイソタイプ対照抗体、又は抗体を含まないもので３０分間プレインキュベートし、続いてＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号８１７２）を異なる濃度で添加した。最終抗体濃度は５０μｇ／ｍＬであり、２，０００個の細胞を各ウェルに播種した。３７℃の組織培養インキュベーター内で４日間インキュベートした後、細胞を溶解してＲＮＡを抽出し、上記に記載されるように逆転写してｄｄＰＣＲ分析にかけた。細胞を７Ｅ１１抗ＡＳＧＲ１抗体で前処理すると、Ｈｅｐ３ＢＣａｓ９細胞及びＲＡＢ１８ノックアウト細胞のＨＰＲＴ１遺伝子をサイレンシングするＧａｌＮＡｃ－ＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲートの効力が低減した（図７）。ＡＳＧＲ１遺伝子とＰＰＩＢ遺伝子をそれぞれサイレンシングするために、ＧａｌＮＡｃ－ＡＳＧＲ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲート及びＧａｌＮＡｃ－ＰＰＩＢ ｓｉＲＮＡコンジュゲートを使用して同一の実験を実施したときに、類似した結果が得られた（データは示さず）。この一連の実験の結果は、ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートをＨｅｐ３Ｂ細胞とＲＡＢ１８ノックアウト細胞に送達するのにＡＳＧＲ１が必要となることを示している。

【0142】

ＲＡＢ１８をノックアウトすることによって、ＡＳＧＰＲを介して送達されるＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートｓｉＲＮＡ分子のｓｉＲＮＡ効力が増強されることを確認した後に、本発明者らは、ＲＡＢ１８をノックアウトすることにより、リポフェクタミン媒介トランスフェクションによって送達されるｓｉＲＮＡ分子のｓｉＲＮＡ効力を増強することができるかどうかを検討した。この疑問を解決するために、Ｈｅｐ３ＢＣａｓ９細胞とＲＡＢ１８ノックアウト細胞を、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を含む場合と含まない場合で、様々な濃度の非コンジュゲートＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡ（二重鎖番号１７６２９；表５に記載されている配列）で処理した。図８に示されるように、リポフェクタミン媒介トランスフェクションによってＨＰＲＴ１ ｓｉＲＮＡ分子を細胞に送達した場合、ＨＰＲＴ１発現を低減するｓｉＲＮＡ分子の効力は、Ｈｅｐ３ＢＣａｓ９細胞（ＩＣ５０＝０．２ｎＭ）とＲＡＢ１８ノックアウト細胞（ＩＣ５０＝０．３ｎＭ）の間で類似したものであった。この知見は、ＲＡＢ１８活性を抑制しても、リポフェクタミン媒介トランスフェクションによって送達されたｓｉＲＮＡ分子の活性を増強しないことを示している。

【0143】

まとめると、本実施例に記載された実験結果は、ＲＡＢ１８の発現を阻害することで、ＡＳＧＰＲのような細胞表面受容体を介して細胞に送達されるｓｉＲＮＡ分子のサイレンシング効力を少なくとも２０倍大幅に増強することを実証するものである。ＲＡＢ１８は、脂質滴（ＬＤ）の形成の調節（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，Ｖｏｌ．２１７；９７５－９９５，２０１８；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，Ｖｏｌ．２８０；４２３２５－４２３３５，２００５）、ゴルジ体から小胞体（ＥＲ）へのＣＯＰＩ非依存的逆行輸送の阻害（Ｄｅｊｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ，Ｖｏｌ．１２１；２７６８－２７８１，２００８）、分泌顆粒及びペルオキシソームの調節（Ｖａｚｑｕｅｚ－Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｆｆｉｃ，Ｖｏｌ．８；８６７－８８２，２００７；Ｇｒｏｎｅｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，Ｖｏｌ．５８７；３２８－３３８，２０１３）、ＬＤ膜上のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の会合の促進（Ｓａｌｌｏｕｍ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ，Ｖｏｌ．９，ｅ１００３５１３，２０１３）、及び正常なＥＲ構造体の調節（Ｇｅｒｏｎｄｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，Ｖｏｌ．２０５；７０７－７２０，２０１４）を含む、様々な生理学的プロセスと関連付けられてきた。ＲＡＢ１８がオリゴヌクレオチド化合物のサイレンシング活性を調節することができるメカニズムはまだ明らかになっていないが、ＥＲ－ＬＤの繋留を調節するＲＡＢ１８の機能に関連する可能性がある。実施例２に記載され、また上記の表３に示されるように、マルチプレックス化合成ｇＲＮＡによって遺伝子ＺＷ１０及びＳＴＸ１８（シンタキシン１８をコードする）をノックアウトすることでｓｉＲＮＡサイレンシング効力が増強されるが、このことは、ＲＡＢ１８と相互作用してＥＲ－ＬＤの繋留を調節する遺伝子が、ｓｉＲＮＡサイレンシング活性に同一の抑制効果を及ぼしていることを示している。ＥＲはｓｉＲＮＡ媒介サイレンシングの中心的な核形成部位であることが報告されており、ＥＲ膜に常在するタンパク質（ＣＬＩＭＰ－６３）がダイサーと相互作用して安定化することが証明されている（Ｓｔａｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，Ｖｏｌ．３２；１１１５－１１２７，２０１３；Ｐｅｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．４０；１１６０３－１１６１７，２０１２）。ＲＡＢ１８の機能を抑制することで、受容体依存性エンドサイトーシスによって内在化したｓｉＲＮＡ又は他のオリゴヌクレオチド化合物を含むエンドソームの、ｓｉＲＮＡ分子の潜在的な細胞内サイレンシング部位であるＥＲへの逆行輸送が増強される可能性がある。ＲＡＢ１８は、複数の組織型にわたって普遍的に発現している遺伝子であり、種にわたって高度に保存されている。従って、肝臓以外の細胞及び組織でＲＡＢ１８の発現又は活性を抑制することで、リガンドコンジュゲートｓｉＲＮＡ分子の効力が増強する可能性もある。

【0144】

ｓｉＲＮＡ分子
下記の表５は、実施例１～３に記載された実験で使用したリガンドコンジュゲートｓｉＲＮＡ分子のそれぞれに関する、センス配列及びアンチセンス配列、並びにｓｉＲＮＡ分子にコンジュゲートされたリガンドの種類を列挙したものである。表５のヌクレオチド配列は、以下の表記法に従って列記されている。ａ、ｕ、ｇ、及びｃ＝対応する２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド；Ａｆ、Ｕｆ、Ｇｆ、及びＣｆ＝対応する２’－デオキシ－２’－フルオロ（「２’－フルオロ」）リボヌクレオチド；並びにｉｎｖＡｂ＝逆位脱塩基ヌクレオチド（すなわち鎖の３’末端上にあるときにはその３’位の置換基を介して隣接するヌクレオチドに結合するか（３’－３’結合）、又は鎖の５’末端上にあるときにはその５’位の置換基を介して隣接するヌクレオチドに結合した（５’－５’ヌクレオチド間結合）脱塩基ヌクレオチド）。配列中の「ｓ」の挿入は、２つの隣接するヌクレオチドがホスホロチオジエステル基（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）によって連結されることを示す。別段の指示がない限り、全ての他のヌクレオチドは、３’－５’ホスホジエステル基によって連結される。ＧａｌＮＡｃリガンドにコンジュゲートされる分子に関して、式ＶＩＩ（前掲）に示されるような構造を有するＧａｌＮＡｃ部分を、示されたｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の５’末端にホスホロチオエート結合を介してコンジュゲートした。二重鎖番号１７１０２をセンス鎖の５’末端を介してコレステロールにコンジュゲートする一方で、二重鎖番号６７０９をセンス鎖の３’末端を介して抗ＡＳＧＲ１抗体にコンジュゲートした。

【0145】

【表5】

【0146】

実施例４．ＲＡＢ１８発現を阻害することによってＧａｌＮＡｃコンジュゲートアンチセンスオリゴヌクレオチドのサイレンシング効果が増強される
一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、遺伝子発現をサイレンシングするために広く使用されている、別の種類のオリゴヌクレオチド化合物である。ＲＡＢ１８がＡＳＯ媒介遺伝子サイレンシングの効力も調節しているかどうかを知るために、ＲＡＢ１８のノックアウトがＡＳＯサイレンシング効力に及ぼす影響について研究した。実施例３に記載されたＨｅｐ３ＢＣａｓ９親細胞とＲＡＢ１８ノックアウト細胞を、ＰＢＳ、又はＨＰＲＴ１遺伝子を標的とする複数の濃度の２つのＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＡＳＯ分子（化合物番号１５４６９及び１５４７０）のうちの１つ、又はＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とする対照ＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＡＳＯ分子（化合物番号１５４７２）のいずれかで、４日間処理した。３つのＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＡＳＯ分子のそれぞれの配列を、下記の表６に示す。Ｈｅｐ３ＢＣａｓ９親細胞及びＲＡＢ１８ノックアウト細胞用に、ＥＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地中で４Ｅ＋０５細胞／ｍｌの濃度の細胞懸濁液を作製した。この細胞溶液を、５０μｌ／ウェルの量で９６ウェルプレートに蒔いた。細胞を蒔いた直後に、ＥＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地で希釈した様々な濃度のＧａｌＮＡｃ－ＡＳＯコンジュゲート５０μｌを、各ウェルに添加した。次いで、９６ウェルプレートを３７℃の組織培養インキュベーター内で４日間インキュベートした。ＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＡＳＯ分子による処理後の４日目に、細胞を溶解して各ウェルからＲＮＡ試料を抽出し、ｃＤＮＡに逆転写した。次いで、ＨＰＲＴ１のｍＲＮＡ発現における異なるＧａｌＮＡｃ部分コンジュゲートＡＳＯ分子のそれぞれのサイレンシング効果をｄｄＰＣＲ分析によって測定した。ＨＰＲＴ１遺伝子のｄｄＰＣＲ測定値を、ハウスキーピングＴＢＰ遺伝子のｄｄＰＣＲ測定値で正規化し、ＰＢＳで処理された対照細胞（すなわち、ＧａｌＮＡｃ－ＡＳＯコンジュゲート分子で処理しなかった細胞）における対応するｍＲＮＡレベルのパーセンテージとして表した。

【0147】

図９に示されるように、ＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とする対照ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡＳＯ分子（化合物番号１５４７２）で処理しても、Ｈｅｐ３ＢＣａｓ９細胞又はＲＡＢ１８ノックアウト細胞のいずれかにおけるＨＰＲＴ１の発現レベルに影響しなかった。ＨＰＲＴ１を標的とするＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡＳＯ分子で処理した群では、Ｈｅｐ３ＢＣａｓ９親細胞と比較したときに、ＲＡＢ１８ノックアウト細胞において、ＨＰＲＴ１発現におけるサイレンシング効果が増強したことが観察された（図９）。例えば、Ｈｅｐ３ＢＣａｓ９親細胞における化合物番号１５４６９のＩＣ５０値は２５０１ｎＭであった一方で、ＲＡＢ１８ノックアウト細胞における同化合物のＩＣ５０値は１００ｎＭであり、サイレンシング効力が２５倍増強されていた。これらの結果は、ＲＡＢ１８が、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートｓｉＲＮＡ分子とＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡＳＯ分子の両方で同様に用いられる細胞内のステップを調節していることを示している。従って、ＲＡＢ１８の発現を阻害することは、リガンドコンジュゲートＡＳＯ分子と同様にリガンドコンジュゲートｓｉＲＮＡ分子のサイレンシング活性を増強するための有効な手法である。

【0148】

ＡＳＯ分子
表６の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）化合物のヌクレオチド配列を、以下の表記に従って列記する：ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、及びｄＣ＝対応するデオキシリボヌクレオチド；

【化10】

（下線及び太字）＝対応するβ－Ｄ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ_２－Ｏ－２’）ヌクレオチド（「ロックド核酸」又はＬＮＡ）；並びにＣ＊＝５－メチルシトシン塩基を含むヌクレオチド。

【化11】

であって、５－メチルシトシン塩基を含むＬＮＡ。配列中の「ｓ」の挿入は、２つの隣接するヌクレオチドがホスホロチオジエステル基（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）によって連結されることを示す。別段の指示がない限り、全ての他のヌクレオチドは、３’－５’ホスホジエステル基によって連結される。３つ全ての一本鎖ＡＳＯ分子を、式ＶＩＩ（前掲）に示されるような構造を有するＧａｌＮＡｃ部分に、ホスホロチオエート結合を介して５’末端にコンジュゲートした。

【0149】

【表6】

【0150】

本明細書で説明及び引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、その全体が参照により本明細書により組み込まれる。記載された特定の方法、手順、及び材料は変動する可能性があるため、開示された本発明はそれらに限定されないことが理解されよう。また、本明細書に使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、添付の特許請求の範囲を限定することを意図するものではないことが理解されよう。

【0151】

当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの同等物を、単なる日常的な実験を使用して認識するか、又は確認可能であろう。このような同等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

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【国際調査報告】