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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-10
(54)【発明の名称】組換えＡＡＶ生成のための組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/34 20060101AFI20241003BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241003BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241003BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241003BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241003BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20241003BHJP
C12N 15/864 20060101ALN20241003BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20241003BHJP
【ＦＩ】
C12N15/34 ZNA
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N1/15
C12N7/01
C12N15/864 100Z
C12N15/63 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024520680
(86)(22)【出願日】2022-10-05
(85)【翻訳文提出日】2024-04-26
(86)【国際出願番号】 US2022077587
(87)【国際公開番号】W WO2023060113
(87)【国際公開日】2023-04-13
(31)【優先権主張番号】63/252,585
(32)【優先日】2021-10-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/320,335
(32)【優先日】2022-03-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518278029
【氏名又は名称】リジェネクスバイオ インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(74)【代理人】
【識別番号】100221741
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 直子
(74)【代理人】
【識別番号】100114926
【弁理士】
【氏名又は名称】枝松 義恵
(72)【発明者】
【氏名】リウ ピン
(72)【発明者】
【氏名】マイヤー アイダ
(72)【発明者】
【氏名】ジェームズ デヴィッド シー．
(72)【発明者】
【氏名】ポーレ ティロ エイチ．
(72)【発明者】
【氏名】ジョハリ ユスフ ビー．
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA95X
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BC01
4B065CA44
(57)【要約】
本明細書では、ヘルパー機能をコードする組換えポリヌクレオチド、及び組換えＡＡＶ粒子の生成に使用するのに適したヘルパープラスミドを提供する。また、本明細書では、ｒＡＡＶ粒子を生成するための方法も提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ）第１のプロモーター及び第１のポリＡシグナルに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）をコードするヌクレオチド配列、ｂ）第２のプロモーター及び第２のポリＡシグナルに作用可能に結合したアデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ならびに
ｃ）アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列
のうちの１つ以上を含み、
アデノウイルスＩＴＲ配列、Ｌ３ ２３Ｋエンドプロテアーゼ、Ｌ５ ｐＶＩ／ファイバー、及び／またはＬ４ ｐＶＩＩＩ／ヘキソン関連前駆体をコードするヌクレオチド配列を含まない、
単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項2】
ａ）前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列、前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列、ならびに前記アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードする前記ヌクレオチド配列、ｂ）前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列、ならびに前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列、
ｃ）前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列、及び前記アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードする前記ヌクレオチド配列、
ｄ）前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列、ならびに前記アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードする前記ヌクレオチド配列、
ｅ）前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列、
ｆ）前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列、または
ｇ）前記アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードする前記ヌクレオチド配列
を含む、請求項１に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項3】
前記単離された組換えポリヌクレオチドが、前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列と、前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列と、前記アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードする前記ヌクレオチド配列とを含み、前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列と、前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７をコードする前記ヌクレオチド配列とが、反対の５’→３’方向にある、
請求項１に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項4】
前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項5】
前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列が配列番号１を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項6】
前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰが、配列番号４５に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項7】
前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰが配列番号４５のアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項8】
前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号８に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する、請求項１～７のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項9】
前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が配列番号８を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項10】
前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドが、配列番号４６に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項11】
前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドが配列番号４６のアミノ酸配列を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項12】
前記アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号５４に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項13】
前記アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードする前記ヌクレオチド配列が、ＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードし、任意選択で、配列番号９に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項14】
前記第１のプロモーター及び前記第２のプロモーターが異なるプロモーターである、請求項１～１３のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項15】
前記第１のプロモーターが、アデノウイルスＥ２Ａプロモーター、ＣＭＶプロモーターまたはＣＭＶ由来プロモーターである、請求項１～１４のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項16】
前記第１のプロモーターがアデノウイルスＥ２Ａプロモーターである、請求項１５に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項17】
前記アデノウイルスＥ２Ａプロモーターが、配列番号２に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項18】
前記アデノウイルスＥ２Ａプロモーターが、配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項19】
前記アデノウイルスＥ２Ａプロモーター及びＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号３または４に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項20】
前記アデノウイルスＥ２Ａプロモーター及びＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号３または４を含む、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項21】
前記アデノウイルスＥ２Ａプロモーター及びＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２２または２３に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項22】
前記アデノウイルスＥ２Ａプロモーター及びＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２２または２３を含む、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項23】
前記第１のプロモーターが誘導性プロモーターである、請求項１～１４のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項24】
前記第２のプロモーターが、アデノウイルスＥ４プロモーター、ＣＭＶプロモーター、またはＣＭＶ由来プロモーターである、請求項１～２３のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項25】
前記第２のプロモーターがアデノウイルスＥ４プロモーターである、請求項２４に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項26】
前記アデノウイルスＥ４プロモーターが、配列番号５に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項２５に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項27】
前記アデノウイルスＥ４プロモーターが、配列番号５のヌクレオチド配列を含む、請求項２５に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項28】
前記第２のプロモーターが誘導性プロモーターである、請求項１～２３のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項29】
配列番号１０に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１～２８のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項30】
配列番号１０のヌクレオチド配列を含む、請求項１～２８のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項31】
配列番号１１に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１～２８のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項32】
配列番号１１のヌクレオチド配列を含む、請求項１～２８のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項33】
第３のプロモーター及び第３のポリＡシグナルに作用可能に結合したボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１～２８のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項34】
前記ボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１２に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する、請求項３３に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項35】
前記ボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１２を含む、請求項３３に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項36】
前記第３のプロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項３３～３５のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項37】
配列番号１３に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項３３～３５のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項38】
配列番号１３のヌクレオチド配列を含む、請求項３３～３５のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項39】
配列番号１４に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項３３～３８のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項40】
配列番号１４のヌクレオチド配列を含む、請求項３３～３８のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項41】
第３のプロモーター及び第３のポリＡシグナルに作用可能に結合したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）アセンブリー活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１～２８のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項42】
前記ＡＡＶ ＡＡＰをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１５に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する、請求項４１に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項43】
前記ＡＡＶ ＡＡＰをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１５を含む、請求項４１に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項44】
前記第３のプロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項４１～４３のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項45】
配列番号１６に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４１～４４のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項46】
配列番号１６のヌクレオチド配列を含む、請求項４１～４４のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項47】
配列番号１７に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４１～４６のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項48】
配列番号１７のヌクレオチド配列を含む、請求項４１～４６のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項49】
第３のプロモーター及び第３のポリＡシグナルに作用可能に結合したアデノウイルスＥ１Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１～２８のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項50】
前記アデノウイルスＥ１Ａポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１８に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する、請求項４９に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項51】
前記アデノウイルスＥ１Ａポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１８を含む、請求項４９に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項52】
前記アデノウイルスＥ１Ａポリペプチドが、配列番号５１に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４９に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項53】
前記アデノウイルスＥ１Ａポリペプチドが、配列番号５１のアミノ酸配列を含む、請求項４９に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項54】
前記第３のプロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項４９～５３のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項55】
配列番号１９に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４９～５４のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項56】
配列番号１９のヌクレオチド配列を含む、請求項４９～５４のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項57】
配列番号２０に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４９～５６のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項58】
配列番号２０のヌクレオチド配列を含む、請求項４９～５６のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項59】
前記単離された組換えポリヌクレオチドが、前記Ｅ２Ａプロモーターと、Ｌ４ ２２Ｋ／３３Ｋポリペプチド及びプロモーターと、Ｎ末端欠失を含むＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドと、前記Ｅ２Ａ ＤＢＰとをコードするヌクレオチド配列を含み、前記Ｌ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドの前記Ｎ末端欠失が、配列番号２１のヌクレオチド配列に対応する、
請求項１～２７、３３～３６、４１～４４、及び４９～５４のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項60】
前記Ｅ２Ａプロモーターと、Ｌ４ ２２Ｋ／３３Ｋポリペプチド及びプロモーターと、Ｎ末端欠失を含むＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドと、前記Ｅ２Ａ ＤＢＰとをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２２に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項５９に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項61】
前記Ｅ２Ａプロモーターと、Ｌ４ ２２Ｋ／３３Ｋポリペプチド及びプロモーターと、Ｎ末端欠失を含むＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドと、前記Ｅ２Ａ ＤＢＰとをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２２を含む、請求項５９に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項62】
前記Ｅ２Ａプロモーターと、Ｌ４ ２２Ｋ／３３Ｋポリペプチド及びプロモーターと、その開始コドンに変異を含むＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドと、前記Ｅ２Ａ ＤＢＰとをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１～２７、３３～３６、４１～４４、及び４９～５４のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項63】
前記Ｅ２Ａプロモーターと、Ｌ４ ２２Ｋ／３３Ｋポリペプチド及びプロモーターと、その開始コドンに変異を含むＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドと、前記Ｅ２Ａ ＤＢＰとをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２３に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項６２に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項64】
前記Ｅ２Ａプロモーターと、Ｌ４ ２２Ｋ／３３Ｋポリペプチド及びプロモーターと、その開始コドンに変異を含むＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドと、前記Ｅ２Ａ ＤＢＰとをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２３を含む、請求項６２に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項65】
前記単離された組換えポリヌクレオチドが、前記Ｅ２Ａプロモーターと、Ｌ４ ２２Ｋ／３３Ｋポリペプチド及びプロモーターと、Ｎ末端欠失を含むＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドと、前記Ｅ２Ａ ＤＢＰとをコードするヌクレオチド配列を含み、前記Ｌ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドの前記Ｎ末端欠失が、Ｌ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドの開始コドンを包含するが、前記Ｌ４ ２２Ｋ／３３Ｋポリペプチドの開始コドンは包含しない、
請求項１～２７、３３～３６、４１～４４、及び４９～５４のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項66】
前記単離された組換えポリヌクレオチドが、前記Ｅ２Ａプロモーターと、Ｌ４ ２２Ｋ／３３Ｋポリペプチド及びプロモーターと、Ｎ末端欠失を含むＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドと、前記Ｅ２Ａ ＤＢＰとをコードするヌクレオチド配列を含み、前記Ｌ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドの全部または一部が、Ｌ４ ２２Ｋ／３３Ｋ開始コドンの破壊を伴わずに欠失している、
請求項１～２７、３３～３６、４１～４４、及び４９～５４のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項67】
前記単離された組換えポリヌクレオチドが、前記Ｅ２Ａプロモーターと、Ｌ４ ２２Ｋ／３３Ｋポリペプチド及びプロモーターと、Ｎ末端欠失を含むＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドと、前記Ｅ２Ａ ＤＢＰとをコードするヌクレオチド配列を含み、前記Ｌ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーの前記Ｎ末端欠失が、Ｌ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーの開始コドンで開始し、前記Ｌ４ ２２Ｋ／３３Ｋプロモーターのすぐ隣で終了する、
請求項１～２７、３３～３６、４１～４４、及び４９～５４、及び４５～５０のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項68】
配列番号２５、２７、２９、３１、または３３に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１～２７、３３～３６、４１～４４、及び４９～５４、及び５９～６７のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項69】
配列番号２５、２７、２９、３１、または３３のヌクレオチド配列を含む、請求項１～２７、３３～３６、４１～４４、及び４９～５４、及び５９～６７のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項70】
配列番号２６、２８、３０、３２、または３４に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１～２７、３３～３６、４１～４４、及び４９～５４、及び５９～６９のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項71】
配列番号２６、２８、３０、３２、または３４のヌクレオチド配列を含む、請求項１～２７、３３～３６、４１～４４、及び４９～５４、及び５９～６９のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項72】
前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列と、前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列と、前記アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードする前記ヌクレオチド配列とを含む、請求項１～７１のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項73】
前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列と、前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列とを含む、請求項１～７１のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項74】
前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列と、前記アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードする前記ヌクレオチド配列とを含む、請求項１～７１のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項75】
前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列と、前記アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードする前記ヌクレオチド配列とを含む、請求項１～７１のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項76】
前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列を含む、請求項１～７１のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項77】
前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列を含む、請求項１～７１のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項78】
前記アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードする前記ヌクレオチド配列を含む、請求項１～７１のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項79】
細菌複製起点及び選択マーカー遺伝子を含むプラスミドである、請求項１～７８のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項80】
前記細菌複製起点がＣｏｌＥ１起点である、請求項７９に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項81】
前記選択マーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子である、請求項７９または請求項８０に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項82】
前記選択マーカー遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子である、請求項８１に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項83】
配列番号３７～４２または４３に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１～８２のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項84】
配列番号３７～４２または４３のヌクレオチド配列を含む、請求項１～８２のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項85】
配列番号３７に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１～８２のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項86】
配列番号３７のヌクレオチド配列を含む、請求項１～８２のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【請求項87】
請求項１～８６のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
【請求項88】
細菌細胞である、請求項８７に記載の宿主細胞。
【請求項89】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、請求項８７に記載の宿主細胞。
【請求項90】
真核細胞である、請求項８７に記載の宿主細胞。
【請求項91】
哺乳類細胞である、請求項８７に記載の宿主細胞。
【請求項92】
ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ由来細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＨｅＬａ細胞、ＳＦ－９細胞、ＢＨＫ細胞、ベロ細胞、ＣＡＰ細胞、またはＰｅｒＣ６細胞である、請求項８７に記載の宿主細胞。
【請求項93】
請求項１～８６のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチドを生成する方法であって、好適な条件下で請求項８７～９２のいずれか１項に記載の宿主細胞をインキュベートすることを含む、前記方法。
【請求項94】
好適な条件下で請求項８８または請求項８９に記載の宿主細胞をインキュベートすることを含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項95】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を生成する方法であって、前記ｒＡＡＶ粒子を生成可能な細胞を培養することを含み、前記細胞が、ｉ．ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
ｉｉ．機能的ｒｅｐ遺伝子をコードするポリヌクレオチドと、
ｉｉｉ．少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端リピート（ＩＴＲ）と、標的細胞内での遺伝子産物の発現を指示する配列に作用可能に結合した前記遺伝子産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列とを含むゲノムを含む、ポリヌクレオチドと、
ｉｖ．前記ＡＡＶカプシドへの前記ゲノムのパッケージングを可能にする条件下で、前記ＡＡＶカプシドタンパク質への前記ゲノムのパッケージングを可能にするための、十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドであって、請求項１～８６のいずれか１項に記載の単離された組換えポリヌクレオチドを独立して含む、前記十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドと
を含む、前記方法。
【請求項96】
前記十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドが、前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列と、前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列と、前記アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードする前記ヌクレオチド配列とを含む、前記単離されたポリヌクレオチド
を含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項97】
ｒＡＡＶ粒子を生成する方法であって、ａ）細胞を含む細胞培養物を準備することと、
ｂ）前記細胞に、
ｉ．ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
ｉｉ．機能的ｒｅｐ遺伝子をコードするポリヌクレオチドと、
ｉｉｉ．少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端リピート（ＩＴＲ）と、標的細胞内での遺伝子産物の発現を指示する配列に作用可能に結合した前記遺伝子産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列とを含むゲノムを含む、ポリヌクレオチドと、
ｉｖ．前記ＡＡＶカプシドへの前記ゲノムのパッケージングを可能にする条件下で、前記ＡＡＶカプシドタンパク質への前記ゲノムのパッケージングを可能にするための、十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドであって、請求項１～８６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを独立して含む、前記十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドと
を含む、１つ以上のポリヌクレオチドを導入することと、
ｃ）前記ｒＡＡＶ粒子の生成が可能な条件下で前記細胞培養物を維持することと
を含む、前記方法。
【請求項98】
前記十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドが、前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列と、前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列と、前記アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードする前記ヌクレオチド配列とを含む、前記単離されたポリヌクレオチド
を含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項99】
前記細胞に、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド及び機能的ｒｅｐ遺伝子を導入することを含む、請求項９７または請求項９８に記載の方法。
【請求項100】
前記１つ以上のポリヌクレオチドを前記細胞に導入することが、形質移入により行われる、請求項９７～９９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項101】
前記細胞が哺乳類細胞である、請求項９５～１００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項102】
前記細胞が昆虫細胞である、請求項９５～１００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項103】
前記細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ由来細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＨｅＬａ細胞、ＳＦ－９細胞、ＢＨＫ細胞、ベロ細胞、またはＰｅｒＣ６細胞である、請求項９５～１００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項104】
前記細胞がＨＥＫ２９３細胞である、請求項９５～１００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項105】
前記細胞培養物が、浮遊培養物または接着培養物である、請求項９５～１０４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項106】
前記ｒＡＡＶ粒子を回収することをさらに含む、請求項９５～１０５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項107】
配列番号４４のヌクレオチド配列を含むヘルパー機能を含むポリヌクレオチドを用いた参照方法よりも多く、ＧＣ／ｍｌとして測定されるｒＡＡＶ粒子を生成する、請求項９５～１０５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項108】
配列番号４４のヌクレオチド配列を含むヘルパー機能を含むポリヌクレオチドを用いた参照方法よりも少なくとも約２倍多く、ＧＣ／ｍｌとして測定されるｒＡＡＶ粒子を生成する、請求項９５～１０５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項109】
配列番号４４のヌクレオチド配列を含むヘルパー機能を含むポリヌクレオチドを用いた参照方法よりも多く、完全カプシドを含むｒＡＡＶ粒子の集団を生成する、請求項９５～１０５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項110】
前記細胞培養物が、約５０リットル～約２０，０００リットルの体積を有する、請求項９５～１０９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項111】
前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶＭＹＯ、ＭｙｏＡＡＶ．１Ａ、ＭｙｏＡＡＶ１Ｃ、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６血清型のカプシドタンパク質を含む、請求項９５～１１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項112】
前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、またはＡＡＶ．ｈｕ３７血清型のカプシドタンパク質を含む、請求項９５～１１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項113】
前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む、請求項９５～１１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項114】
前記遺伝子産物が、ポリペプチドまたは二重鎖ＲＮＡ分子である、請求項９５～１１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項115】
前記遺伝子産物がポリペプチドである、請求項１１４に記載の方法。
【請求項116】
前記遺伝子産物が、抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ、抗カリクレイン抗体、抗ＴＮＦ抗体、ミクロジストロフィン、ミニジストロフィン、イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、またはＶＥＧＦ受容体１の非膜関連スプライスバリアント（ｓＦｌｔ－１）である、請求項１１５に記載の方法。
【請求項117】
前記遺伝子産物が、ガンマ－サルコグリカン、Ｒａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１／ＣＨＭ）、レチノイドイソメロヒドラーゼ（ＲＰＥ６５）、環状ヌクレオチドゲートチャネルアルファ３（ＣＮＧＡ３）、環状ヌクレオチドゲートチャネルベータ３（ＣＮＧＢ３）、芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、リソソーム関連膜タンパク質２アイソフォームＢ（ＬＡＭＰ２Ｂ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、網膜色素変性ＧＴＰアーゼ制御因子（ＲＰＧＲ）、レチノシシン（ＲＳ１）、筋小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ２ａ）、アフリベルセプト、バッテニン（ＣＬＮ３）、膜貫通ＥＲタンパク質（ＣＬＮ６）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、アクアポリン１（ＡＱＰ１）、ジストロフィン、ミオチューブラリン１（ＭＴＭ１）、フォリスタチン（ＦＳＴ）、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐアーゼ）、アポリポタンパク質Ａ２（ＡＰＯＡ２）、ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、Ｎ－アセチル－アルファ－グルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、アルファ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、ベータ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、アルファ１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）、ホスホジエステラーゼ６Ｂ（ＰＤＥ６Ｂ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ９ＯＴＣ）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ１）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ２）、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３／ＮＴＦ３）、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ミトコンドリアコードＮＡＤＨ：ユビキノンオキシドレダクターゼコアサブユニット４（ＭＴ－ＮＤ４）、保護タンパク質カテプシンＡ（ＰＰＣＡ）、ジスフェリン、ＭＥＲ原がん遺伝子、チロシンキナーゼ（ＭＥＲＴＫ）、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）、または腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）－免疫グロブリン（ＩｇＧ１）Ｆｃ融合物である、請求項１１５に記載の方法。
【請求項118】
前記遺伝子産物が、ジストロフィンまたはミクロジストロフィンである、請求項１１５に記載の方法。
【請求項119】
前記遺伝子産物がマイクロＲＮＡである、請求項１１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
技術分野
本開示は、ヘルパー機能をコードする組換えポリヌクレオチド、及び組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を生成する方法におけるその使用に関する。
本開示は、ヘルパー機能をコードする組換えポリヌクレオチド、及び組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を生成する方法におけるその使用に関する。
【0002】
関連出願の相互参照
本出願は、米国出願第６３／２５２，５８５号（２０２１年１０月５日出願）及び米国出願第６３／３２０，３３５号（２０２２年３月１６日出願）の利益を主張し、これらの各出願は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
本出願は、米国出願第６３／２５２，５８５号（２０２１年１０月５日出願）及び米国出願第６３／３２０，３３５号（２０２２年３月１６日出願）の利益を主張し、これらの各出願は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【0003】
電子提出された配列表の参照
本出願で電子提出した配列表（名称：６７２８＿１８０２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌ、サイズ：３７６，９８０バイト、作成日：２０２２年９月１３日）の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
本出願で電子提出した配列表（名称：６７２８＿１８０２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌ、サイズ：３７６，９８０バイト、作成日：２０２２年９月１３日）の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【背景技術】
【0004】
背景
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースベクターは、現在最も広く使用されている開発中の遺伝子療法製品である。ｒＡＡＶベクター系の使用が好まれる理由は、部分的には、野生型ウイルスに関連する疾患がないこと、ＡＡＶの形質導入が非分裂細胞にも分裂細胞にも可能であること、及びその結果として臨床試験で長期のロバストな導入遺伝子発現が観察されていることによるものであり、このことは、遺伝子療法の適応症における、送達の大きな可能性を示している。加えて、種々の天然及び組換えｒＡＡＶベクター血清型は、種々の組織、器官、及び細胞を特異的に標的化し、ベクターに対する任意の既存の免疫を回避するのに役立ち、そのためＡＡＶベース遺伝子療法の治療応用を拡大する。複製欠損型ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベースの遺伝子療法をより広く後期臨床段階及び商業的使用に採用できるようになる前に、組換えウイルス粒子を大規模生産するための新たな方法を開発する必要がある。
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースベクターは、現在最も広く使用されている開発中の遺伝子療法製品である。ｒＡＡＶベクター系の使用が好まれる理由は、部分的には、野生型ウイルスに関連する疾患がないこと、ＡＡＶの形質導入が非分裂細胞にも分裂細胞にも可能であること、及びその結果として臨床試験で長期のロバストな導入遺伝子発現が観察されていることによるものであり、このことは、遺伝子療法の適応症における、送達の大きな可能性を示している。加えて、種々の天然及び組換えｒＡＡＶベクター血清型は、種々の組織、器官、及び細胞を特異的に標的化し、ベクターに対する任意の既存の免疫を回避するのに役立ち、そのためＡＡＶベース遺伝子療法の治療応用を拡大する。複製欠損型ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベースの遺伝子療法をより広く後期臨床段階及び商業的使用に採用できるようになる前に、組換えウイルス粒子を大規模生産するための新たな方法を開発する必要がある。
【0005】
したがって、当技術分野では、ｒＡＡＶ粒子を大規模に生成するための方法の生産性及び収率の改善が必要とされている。
【発明の概要】
【0006】
概要
１つの態様において、本開示は、ａ）第１のプロモーター及び第１のポリＡシグナルに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）をコードするヌクレオチド配列、ｂ）第２のプロモーター及び第２のポリＡシグナルに作用可能に結合したアデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ならびにｃ）アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列のうちの１つ以上を含む、単離された組換えポリヌクレオチドを提供し、単離された組換えポリヌクレオチドは、アデノウイルスＩＴＲ配列、Ｌ３ ２３Ｋエンドプロテアーゼ、Ｌ５ ｐＶＩ／ファイバー、及び／またはＬ４ ｐＶＩＩＩ／ヘキソン関連前駆体をコードするヌクレオチド配列を含まない。
１つの態様において、本開示は、ａ）第１のプロモーター及び第１のポリＡシグナルに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）をコードするヌクレオチド配列、ｂ）第２のプロモーター及び第２のポリＡシグナルに作用可能に結合したアデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ならびにｃ）アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列のうちの１つ以上を含む、単離された組換えポリヌクレオチドを提供し、単離された組換えポリヌクレオチドは、アデノウイルスＩＴＲ配列、Ｌ３ ２３Ｋエンドプロテアーゼ、Ｌ５ ｐＶＩ／ファイバー、及び／またはＬ４ ｐＶＩＩＩ／ヘキソン関連前駆体をコードするヌクレオチド配列を含まない。
【0007】
いくつかの実施形態において、単離された組換えポリヌクレオチドは、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列とを含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列は、ＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードする。
【0008】
いくつかの実施形態において、単離された組換えポリヌクレオチドは、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列とを含み、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７をコードするヌクレオチド配列とが、反対の５’→３’方向にある。
【0009】
いくつかの実施形態において、単離された組換えポリヌクレオチドは、細菌複製起点及び選択マーカー遺伝子を含むプラスミドである。
【0010】
いくつかの実施形態において、単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、または５１に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【0011】
いくつかの実施形態において、単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、または５１のヌクレオチド配列を含む。
【0012】
１つの態様において、本開示は、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドを含む、宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は細菌細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ由来細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＨｅＬａ細胞、ＳＦ－９細胞、ＢＨＫ細胞、ベロ細胞、ＣＡＰ（登録商標）細胞、またはＰｅｒＣ６細胞である。
【0013】
１つの態様において、本開示は、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドを生成する方法であって、本明細書に記載の宿主細胞を好適な条件下でインキュベートすることを含む、方法を提供する。
【0014】
１つの態様において、本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を生成する方法であって、ｒＡＡＶ粒子を生成可能な細胞を培養することを含み、細胞が、ｉ）ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ｉｉ）機能的ｒｅｐ遺伝子をコードするポリヌクレオチドと、ｉｉｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端リピート（ＩＴＲ）と、標的細胞内での遺伝子産物の発現を指示する配列に作用可能に結合した遺伝子産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列とを含むゲノムを含む、ポリヌクレオチドと、ｉｖ）ＡＡＶカプシドへのゲノムのパッケージングを可能にする条件下で、ＡＡＶカプシドタンパク質へのゲノムのパッケージングを可能にするための、十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドであって、独立して、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドを含む、十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドとを含む、方法を提供する。
【0015】
１つの態様において、本開示は、ｒＡＡＶ粒子を生成する方法であって、ａ）細胞を含む細胞培養物を準備することと、ｂ）当該細胞に、ｉ）ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む１つ以上のポリヌクレオチドと、ｉｉ）機能的ｒｅｐ遺伝子をコードするポリヌクレオチドと、ｉｉｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端リピート（ＩＴＲ）と、標的細胞内での遺伝子産物の発現を指示する配列に作用可能に結合した遺伝子産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列とを含むゲノムを含む、ポリヌクレオチドと、ｉｖ）ＡＡＶカプシドへのゲノムのパッケージングを可能にする条件下で、ＡＡＶカプシドタンパク質へのゲノムのパッケージングを可能にするための、十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドであって、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドを独立して含む、十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドとを含む、１つ以上のポリヌクレオチドを導入することと、ｃ）ｒＡＡＶ粒子の生成が可能な条件下で細胞培養物を維持することとを含む、方法を提供する。
【0016】
いくつかの実施形態において、本開示は以下を提供する。
【0017】
［１．］
ａ）第１のプロモーター及び第１のポリＡシグナルに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）をコードするヌクレオチド配列、
ｂ）第２のプロモーター及び第２のポリＡシグナルに作用可能に結合したアデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ならびに
ｃ）アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列
のうちの１つ以上を含み、
アデノウイルスＩＴＲ配列、Ｌ３ ２３Ｋエンドプロテアーゼ、Ｌ５ ｐＶＩ／ファイバー、及び／またはＬ４ ｐＶＩＩＩ／ヘキソン関連前駆体をコードするヌクレオチド配列を含まない、
単離された組換えポリヌクレオチド。
ａ）第１のプロモーター及び第１のポリＡシグナルに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）をコードするヌクレオチド配列、
ｂ）第２のプロモーター及び第２のポリＡシグナルに作用可能に結合したアデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ならびに
ｃ）アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列
のうちの１つ以上を含み、
アデノウイルスＩＴＲ配列、Ｌ３ ２３Ｋエンドプロテアーゼ、Ｌ５ ｐＶＩ／ファイバー、及び／またはＬ４ ｐＶＩＩＩ／ヘキソン関連前駆体をコードするヌクレオチド配列を含まない、
単離された組換えポリヌクレオチド。
【0018】
［２．］
ａ）前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列、前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列、ならびに前記アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードする前記ヌクレオチド配列、
ｂ）前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列、ならびに前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列、
ｃ）前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列、及び前記アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードする前記ヌクレオチド配列、
ｄ）前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列、ならびに前記アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードする前記ヌクレオチド配列、
ｅ）前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列、
ｆ）前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列、または
ｇ）前記アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードする前記ヌクレオチド配列
を含む、［１］に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
ａ）前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列、前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列、ならびに前記アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードする前記ヌクレオチド配列、
ｂ）前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列、ならびに前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列、
ｃ）前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列、及び前記アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードする前記ヌクレオチド配列、
ｄ）前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列、ならびに前記アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードする前記ヌクレオチド配列、
ｅ）前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列、
ｆ）前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列、または
ｇ）前記アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードする前記ヌクレオチド配列
を含む、［１］に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0019】
［３．］前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列と、前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列と、前記アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードする前記ヌクレオチド配列とを含み、
前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列と、前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７をコードする前記ヌクレオチド配列とが、反対の５’→３’方向にある、
［１］に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列と、前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７をコードする前記ヌクレオチド配列とが、反対の５’→３’方向にある、
［１］に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0020】
［４．］前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する、［１］～［３］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0021】
［５．］前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列が配列番号１を含む、［１］～［３］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0022】
［６．］前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰが、配列番号４５に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、［１］～［５］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0023】
［７．］前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰが配列番号４５のアミノ酸配列を含む、［１］～［５］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0024】
［８．］前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号８に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する、［１］～［７］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0025】
［９．］前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が配列番号８を含む、［１］～［７］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0026】
［１０．］前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドが、配列番号４６に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、［１］～［９］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0027】
［１１．］前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドが配列番号４６のアミノ酸配列を含む、［１］～［９］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0028】
［１２．］前記アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号５４に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、［１］～［１１］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0029】
［１３．］前記アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードする前記ヌクレオチド配列が、ＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードし、任意選択で、配列番号９に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、［１］～［１１］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0030】
［１４．］前記第１のプロモーター及び前記第２のプロモーターが異なるプロモーターである、［１］～［１３］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0031】
［１５．］前記第１のプロモーターが、アデノウイルスＥ２Ａプロモーター、ＣＭＶプロモーターまたはＣＭＶ由来プロモーターである、［１］～［１４］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0032】
［１６．］前記第１のプロモーターがアデノウイルスＥ２Ａプロモーターである、［１５］に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0033】
［１７．］前記アデノウイルスＥ２Ａプロモーターが、配列番号２に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、［１６］に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0034】
［１８．］前記アデノウイルスＥ２Ａプロモーターが、配列番号２のヌクレオチド配列を含む、［１６］に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0035】
［１９．］前記アデノウイルスＥ２Ａプロモーター及びＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号３または４に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、［１５］～［１８］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0036】
［２０．］前記アデノウイルスＥ２Ａプロモーター及びＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号３または４を含む、［１５］～［１８］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0037】
［２１．］前記アデノウイルスＥ２Ａプロモーター及びＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２２または２３に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、［１５］～［１８］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0038】
［２２．］前記アデノウイルスＥ２Ａプロモーター及びＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２２または２３を含む、［１５］～［１８］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0039】
［２３．］前記第１のプロモーターが誘導性プロモーターである、［１］～［１４］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0040】
［２４．］前記第２のプロモーターが、アデノウイルスＥ４プロモーター、ＣＭＶプロモーター、またはＣＭＶ由来プロモーターである、［１］～［２３］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0041】
［２５．］前記第２のプロモーターがアデノウイルスＥ４プロモーターである、［２４］に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0042】
［２６．］前記アデノウイルスＥ４プロモーターが、配列番号５に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、［２５］に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0043】
［２７．］アデノウイルスＥ４プロモーターが、配列番号５のヌクレオチド配列を含む、［２５］に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0044】
［２８．］前記第２のプロモーターが誘導性プロモーターである、［１］～［２３］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0045】
［２９．］配列番号１０に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、［１］～［２８］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0046】
［３０．］配列番号１０のヌクレオチド配列を含む、［１］～［２８］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0047】
［３１．］配列番号１１に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、［１］～［２８］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0048】
［３２．］配列番号１１のヌクレオチド配列を含む、［１］～［２８］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0049】
［３３．］第３のプロモーター及び第３のポリＡシグナルに作用可能に結合したボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、［１］～［２８］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0050】
［３４．］前記ボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１２に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する、［３３］に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0051】
［３５．］前記ボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１２を含む、［３３］に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0052】
［３６．］前記第３のプロモーターがＣＭＶプロモーターである、［３３］～［３５］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0053】
［３７．］配列番号１３に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、［３３］～［３５］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0054】
［３８．］配列番号１３のヌクレオチド配列を含む、［３３］～［３５］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0055】
［３９．］配列番号１４に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、［３３］～［３８］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0056】
［４０．］配列番号１４のヌクレオチド配列を含む、［３３］～［３８］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0057】
［４１．］第３のプロモーター及び第３のポリＡシグナルに作用可能に結合したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）アセンブリー活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、［１］～［２８］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0058】
［４２．］前記ＡＡＶ ＡＡＰをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１５に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する、［４１］に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0059】
［４３．］前記ＡＡＶ ＡＡＰをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１５を含む、［４１］に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0060】
［４４．］前記第３のプロモーターがＣＭＶプロモーターである、［４１］～［４３］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0061】
［４５．］配列番号１６に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、［４１］～［４４］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0062】
［４６．］配列番号１６のヌクレオチド配列を含む、［４１］～［４４］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0063】
［４７．］配列番号１７に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、［４１］～［４６］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0064】
［４８．］配列番号１７のヌクレオチド配列を含む、［４１］～［４６］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0065】
［４９．］第３のプロモーター及び第３のポリＡシグナルに作用可能に結合したアデノウイルスＥ１Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、［１］～［２８］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0066】
［５０．］前記アデノウイルスＥ１Ａポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１８に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する、［４９］に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0067】
［５１．］前記アデノウイルスＥ１Ａポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１８を含む、［４９］に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0068】
［５２．］前記アデノウイルスＥ１Ａポリペプチドが、配列番号５１に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、［４９］に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0069】
［５３．］前記アデノウイルスＥ１Ａポリペプチドが、配列番号５１のアミノ酸配列を含む、［４９］に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0070】
［５４．］前記第３のプロモーターがＣＭＶプロモーターである、［４９］～［５３］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0071】
［５５．］配列番号１９に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、［４９］～［５４］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0072】
［５６．］配列番号１９のヌクレオチド配列を含む、［４９］～［５４］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0073】
［５７．］配列番号２０に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、［４９］～［５６］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0074】
［５８．］配列番号２０のヌクレオチド配列を含む、［４９］～［５６］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0075】
［５９．］前記単離された組換えポリヌクレオチドが、前記Ｅ２Ａプロモーターと、Ｌ４ ２２Ｋ／３３Ｋポリペプチド及びプロモーターと、Ｎ末端欠失を含むＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドと、前記Ｅ２Ａ ＤＢＰとをコードするヌクレオチド配列を含み、
前記Ｌ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドの前記Ｎ末端欠失が、配列番号２１のヌクレオチド配列に対応する、
［１］～［２７］、［３３］～［３６］、［４１］～［４４］、及び［４９］～［５４］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
前記Ｌ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドの前記Ｎ末端欠失が、配列番号２１のヌクレオチド配列に対応する、
［１］～［２７］、［３３］～［３６］、［４１］～［４４］、及び［４９］～［５４］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0076】
［６０．］前記Ｅ２Ａプロモーターと、Ｌ４ ２２Ｋ／３３Ｋポリペプチド及びプロモーターと、Ｎ末端欠失を含むＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドと、前記Ｅ２Ａ ＤＢＰとをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２２に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、［５９］に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0077】
［６１．］前記Ｅ２Ａプロモーターと、Ｌ４ ２２Ｋ／３３Ｋポリペプチド及びプロモーターと、Ｎ末端欠失を含むＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドと、前記Ｅ２Ａ ＤＢＰとをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２２を含む、［５９］に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0078】
［６２．］前記Ｅ２Ａプロモーターと、Ｌ４ ２２Ｋ／３３Ｋポリペプチド及びプロモーターと、その開始コドンに変異を含むＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドと、前記Ｅ２Ａ ＤＢＰとをコードするヌクレオチド配列を含む、［１］～［２７］、［３３］～［３６］、［４１］～［４４］、及び［４９］～［５４］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0079】
［６３．］前記Ｅ２Ａプロモーターと、Ｌ４ ２２Ｋ／３３Ｋポリペプチド及びプロモーターと、その開始コドンに変異を含むＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドと、前記Ｅ２Ａ ＤＢＰとをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２３に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、［６２］に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0080】
［６４．］前記Ｅ２Ａプロモーターと、Ｌ４ ２２Ｋ／３３Ｋポリペプチド及びプロモーターと、その開始コドンに変異を含むＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドと、前記Ｅ２Ａ ＤＢＰとをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２３を含む、［６２］に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0081】
［６５．］前記単離された組換えポリヌクレオチドが、前記Ｅ２Ａプロモーターと、Ｌ４ ２２Ｋ／３３Ｋポリペプチド及びプロモーターと、Ｎ末端欠失を含むＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドと、前記Ｅ２Ａ ＤＢＰとをコードするヌクレオチド配列を含み、
前記Ｌ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドの前記Ｎ末端欠失が、Ｌ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドの開始コドンを包含するが、前記Ｌ４ ２２Ｋ／３３Ｋポリペプチドの開始コドンは包含しない、
［１］～［２７］、［３３］～［３６］、［４１］～［４４］、及び［４９］～［５４］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
前記Ｌ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドの前記Ｎ末端欠失が、Ｌ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドの開始コドンを包含するが、前記Ｌ４ ２２Ｋ／３３Ｋポリペプチドの開始コドンは包含しない、
［１］～［２７］、［３３］～［３６］、［４１］～［４４］、及び［４９］～［５４］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0082】
［６６．］前記単離された組換えポリヌクレオチドが、前記Ｅ２Ａプロモーターと、Ｌ４ ２２Ｋ／３３Ｋポリペプチド及びプロモーターと、Ｎ末端欠失を含むＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドと、前記Ｅ２Ａ ＤＢＰとをコードするヌクレオチド配列を含み、
前記Ｌ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドの全部または一部が、Ｌ４ ２２Ｋ／３３Ｋ開始コドンの破壊を伴わずに欠失している、
［１］～［２７］、［３３］～［３６］、［４１］～［４４］、及び［４９］～［５４］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
前記Ｌ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドの全部または一部が、Ｌ４ ２２Ｋ／３３Ｋ開始コドンの破壊を伴わずに欠失している、
［１］～［２７］、［３３］～［３６］、［４１］～［４４］、及び［４９］～［５４］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0083】
［６７．］前記単離された組換えポリヌクレオチドが、前記Ｅ２Ａプロモーターと、Ｌ４ ２２Ｋ／３３Ｋポリペプチド及びプロモーターと、Ｎ末端欠失を含むＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドと、前記Ｅ２Ａ ＤＢＰとをコードするヌクレオチド配列を含み、
前記Ｌ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドの前記Ｎ末端欠失が、Ｌ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーの開始コドンで開始し、前記Ｌ４ ２２Ｋ／３３Ｋプロモーターのすぐ隣で終了する、
［１］～［２７］、［３３］～［３６］、［４１］～［４４］、及び［４９］～［５４］、及び［４５］～［５０］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
前記Ｌ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドの前記Ｎ末端欠失が、Ｌ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーの開始コドンで開始し、前記Ｌ４ ２２Ｋ／３３Ｋプロモーターのすぐ隣で終了する、
［１］～［２７］、［３３］～［３６］、［４１］～［４４］、及び［４９］～［５４］、及び［４５］～［５０］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0084】
［６８．］配列番号２５、２７、２９、３１、または３３に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、［１］～［２７］、［３３］～［３６］、［４１］～［４４］、及び［４９］～［５４］、及び［５９］～［６７］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0085】
［６９．］配列番号２５、２７、２９、３１、または３３のヌクレオチド配列を含む、［１］～［２７］、［３３］～［３６］、［４１］～［４４］、及び［４９］～［５４］、及び［５９］～［６７］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0086】
［７０．］配列番号２６、２８、３０、３２、または３４に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、［１］～［２７］、［３３］～［３６］、［４１］～［４４］、及び［４９］～［５４］、及び［５９］～［６９］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0087】
［７１．］配列番号２６、２８、３０、３２、または３４のヌクレオチド配列を含む、［１］～［２７］、［３３］～［３６］、［４１］～［４４］、及び［４９］～［５４］、及び［５９］～［６９］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0088】
［７２．］前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列と、前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列と、前記アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードする前記ヌクレオチド配列とを含む、［１］～［７１］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0089】
［７３．］前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列と、前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列とを含む、［１］～［７１］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0090】
［７４．］前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列と、前記アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードする前記ヌクレオチド配列とを含む、［１］～［７１］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0091】
［７５．］前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列と、前記アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードする前記ヌクレオチド配列とを含む、［１］～［７１］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0092】
［７６．］前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列を含む、［１］～［７１］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0093】
［７７．］前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列を含む、［１］～［７１］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0094】
［７８．］前記アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列を含む、［１］～［７１］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0095】
［７９．］細菌複製起点及び選択マーカー遺伝子を含むプラスミドである、［１］～［７８］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0096】
［８０．］前記細菌複製起点がＣｏｌＥ１起点である、［７９］に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0097】
［８１．］前記選択マーカー遺伝子が薬物耐性遺伝子である、［７９］または［８０］に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0098】
［８２．］前記選択マーカー遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子である、［８１］に記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0099】
［８３．］配列番号３７～４２または４３に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、［１］～［８２］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0100】
［８４．］配列番号３７～４２または４３のヌクレオチド配列を含む、［１］～［８２］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0101】
［８５．］配列番号３７に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、［１］～［８２］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0102】
［８６．］配列番号３７のヌクレオチド配列を含む、［１］～［８２］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチド。
【0103】
［８７．］［１］～［８６］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
【0104】
［８８．］細菌細胞である、［８７］に記載の宿主細胞。
【0105】
［８９．］大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、［８７］に記載の宿主細胞。
【0106】
［９０．］真核細胞である、［８７］に記載の宿主細胞。
【0107】
［９１．］哺乳類細胞である、［８７］に記載の宿主細胞。
【0108】
［９２．］ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ由来細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＨｅＬａ細胞、ＳＦ－９細胞、ＢＨＫ細胞、ベロ細胞、ＣＡＰ（登録商標）細胞、またはＰｅｒＣ６細胞である、［８７］に記載の宿主細胞。
【0109】
［９３．］［１］～［８６］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチドを生成する方法であって、［８７］～［９２］のいずれかに記載の宿主細胞を好適な条件下でインキュベートすることを含む、前記方法。
【0110】
［９４．］好適な条件下で［８８］または［８９］に記載の宿主細胞をインキュベートすることを含む、［９３］に記載の方法。
【0111】
［９５．］組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を生成する方法であって、前記ｒＡＡＶ粒子を生成可能な細胞を培養することを含み、
前記細胞が、
ｉ．ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
ｉｉ．機能的ｒｅｐ遺伝子をコードするポリヌクレオチドと、
ｉｉｉ．少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端リピート（ＩＴＲ）と、標的細胞内での遺伝子産物の発現を指示する配列に作用可能に結合した前記遺伝子産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列とを含むゲノムを含む、ポリヌクレオチドと、
ｉｖ．前記ＡＡＶカプシドへの前記ゲノムのパッケージングを可能にする条件下で、前記ＡＡＶカプシドタンパク質への前記ゲノムのパッケージングを可能にするための、十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドであって、［１］～［８６］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチドを独立して含む、前記十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドと
を含む、前記方法。
前記細胞が、
ｉ．ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
ｉｉ．機能的ｒｅｐ遺伝子をコードするポリヌクレオチドと、
ｉｉｉ．少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端リピート（ＩＴＲ）と、標的細胞内での遺伝子産物の発現を指示する配列に作用可能に結合した前記遺伝子産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列とを含むゲノムを含む、ポリヌクレオチドと、
ｉｖ．前記ＡＡＶカプシドへの前記ゲノムのパッケージングを可能にする条件下で、前記ＡＡＶカプシドタンパク質への前記ゲノムのパッケージングを可能にするための、十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドであって、［１］～［８６］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチドを独立して含む、前記十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドと
を含む、前記方法。
【0112】
［９６．］前記十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドが、
前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列と、前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列と、前記アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードする前記ヌクレオチド配列とを含む、前記単離されたポリヌクレオチド
を含む、［９５］に記載の方法。
前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列と、前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列と、前記アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードする前記ヌクレオチド配列とを含む、前記単離されたポリヌクレオチド
を含む、［９５］に記載の方法。
【0113】
［９７．］ｒＡＡＶ粒子を生成する方法であって、
ａ）細胞を含む細胞培養物を準備することと、
ｂ）前記細胞に、
ｉ．ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
ｉｉ．機能的ｒｅｐ遺伝子をコードするポリヌクレオチドと、
ｉｉｉ．少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端リピート（ＩＴＲ）と、標的細胞内での遺伝子産物の発現を指示する配列に作用可能に結合した前記遺伝子産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列とを含むゲノムを含む、ポリヌクレオチドと、
ｉｖ．前記ＡＡＶカプシドへの前記ゲノムのパッケージングを可能にする条件下で、前記ＡＡＶカプシドタンパク質への前記ゲノムのパッケージングを可能にするための、十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドであって、［１］～［８６］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチドを独立して含む、前記十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドと
を含む、１つ以上のポリヌクレオチドを導入することと、
ｃ）前記ｒＡＡＶ粒子の生成が可能な条件下で前記細胞培養物を維持することと
を含む、前記方法。
ａ）細胞を含む細胞培養物を準備することと、
ｂ）前記細胞に、
ｉ．ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
ｉｉ．機能的ｒｅｐ遺伝子をコードするポリヌクレオチドと、
ｉｉｉ．少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端リピート（ＩＴＲ）と、標的細胞内での遺伝子産物の発現を指示する配列に作用可能に結合した前記遺伝子産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列とを含むゲノムを含む、ポリヌクレオチドと、
ｉｖ．前記ＡＡＶカプシドへの前記ゲノムのパッケージングを可能にする条件下で、前記ＡＡＶカプシドタンパク質への前記ゲノムのパッケージングを可能にするための、十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドであって、［１］～［８６］のいずれか１つに記載の単離された組換えポリヌクレオチドを独立して含む、前記十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドと
を含む、１つ以上のポリヌクレオチドを導入することと、
ｃ）前記ｒＡＡＶ粒子の生成が可能な条件下で前記細胞培養物を維持することと
を含む、前記方法。
【0114】
［９８．］前記十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドが、
前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列と、前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列と、前記アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードする前記ヌクレオチド配列とを含む、前記単離されたポリヌクレオチド
を含む、［９７］に記載の方法。
前記アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードする前記ヌクレオチド配列と、前記アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列と、前記アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードする前記ヌクレオチド配列とを含む、前記単離されたポリヌクレオチド
を含む、［９７］に記載の方法。
【0115】
［９９．］前記細胞に、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド及び機能的ｒｅｐ遺伝子を導入することを含む、［９７］または［９８］に記載の方法。
【0116】
［１００．］前記１つ以上のポリヌクレオチドを前記細胞に導入することが、形質移入により行われる、［９７］～［９９］のいずれか１つに記載の方法。
【0117】
［１０１．］前記細胞が哺乳類細胞である、［９５］～［１００］のいずれか１つに記載の方法。
【0118】
［１０２．］前記細胞が昆虫細胞である、［９５］～［１００］のいずれか１つに記載の方法。
【0119】
［１０３．］前記細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ由来細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＨｅＬａ細胞、ＳＦ－９細胞、ＢＨＫ細胞、ベロ細胞、ＣＡＰ（登録商標）細胞、またはＰｅｒＣ６細胞である、［９５］～［１００］のいずれか１つに記載の方法。
【0120】
［１０４．］前記細胞がＨＥＫ２９３細胞である、［９５］～［１００］のいずれか１つに記載の方法。
【0121】
［１０５．］前記細胞培養物が、浮遊培養物または接着培養物である、［９５］～［１０４］のいずれか１つに記載の方法。
【0122】
［１０６．］前記ｒＡＡＶ粒子を回収することをさらに含む、［９５］～［１０５］のいずれか１つに記載の方法。
【0123】
［１０７．］配列番号４４のヌクレオチド配列を含むヘルパー機能を含むポリヌクレオチドを用いた参照方法よりも多く、ＧＣ／ｍｌとして測定されるｒＡＡＶ粒子を生成する、［９５］～［１０５］のいずれか１つに記載の方法。
【0124】
［１０８．］配列番号４４のヌクレオチド配列を含むヘルパー機能を含むポリヌクレオチドを用いた参照方法よりも少なくとも約２倍多く、ＧＣ／ｍｌとして測定されるｒＡＡＶ粒子を生成する、［９５］～［１０５］のいずれか１つに記載の方法。
【0125】
［１０９．］配列番号４４のヌクレオチド配列を含むヘルパー機能を含むポリヌクレオチドを用いた参照方法よりも多く、完全カプシドを含むｒＡＡＶ粒子の集団を生成する、［９５］～［１０５］のいずれか１つに記載の方法。
【0126】
［１１０．］前記細胞培養物が、約５０リットル～約２０，０００リットルの体積を有する、［９５］～［１０９］のいずれか１つに記載の方法。
【0127】
［１１１．］前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶＭＹＯ、ＭｙｏＡＡＶ．１Ａ、ＭｙｏＡＡＶ１Ｃ、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６血清型のカプシドタンパク質を含む、［９５］～［１１０］のいずれか１つに記載の方法。
【0128】
［１１２．］前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、またはＡＡＶ．ｈｕ３７血清型のカプシドタンパク質を含む、［９５］～［１１０］のいずれか１つに記載の方法。
【0129】
［１１３．］前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む、［９５］～［１１０］のいずれか１つに記載の方法。
【0130】
［１１４．］前記遺伝子産物が、ポリペプチドまたは二重鎖ＲＮＡ分子である、［９５］～［１１０］のいずれか１つに記載の方法。
【0131】
［１１５．］前記遺伝子産物がポリペプチドである、［１１４］に記載の方法。
【0132】
［１１６．］前記遺伝子産物が、抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ、抗カリクレイン抗体、抗ＴＮＦ抗体、ミクロジストロフィン、ミニジストロフィン、イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、またはＶＥＧＦ受容体１の非膜関連スプライスバリアント（ｓＦｌｔ－１）である、［１１５］に記載の方法。
【0133】
［１１７．］前記遺伝子産物が、ガンマ－サルコグリカン、Ｒａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１／ＣＨＭ）、レチノイドイソメロヒドラーゼ（ＲＰＥ６５）、環状ヌクレオチドゲートチャネルアルファ３（ＣＮＧＡ３）、環状ヌクレオチドゲートチャネルベータ３（ＣＮＧＢ３）、芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、リソソーム関連膜タンパク質２アイソフォームＢ（ＬＡＭＰ２Ｂ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、網膜色素変性ＧＴＰアーゼ制御因子（ＲＰＧＲ）、レチノシシン（ＲＳ１）、筋小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ２ａ）、アフリベルセプト、バッテニン（ＣＬＮ３）、膜貫通ＥＲタンパク質（ＣＬＮ６）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、アクアポリン１（ＡＱＰ１）、ジストロフィン、ミオチューブラリン１（ＭＴＭ１）、フォリスタチン（ＦＳＴ）、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐアーゼ）、アポリポタンパク質Ａ２（ＡＰＯＡ２）、ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、Ｎ－アセチル－アルファ－グルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、アルファ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、ベータ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、アルファ１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）、ホスホジエステラーゼ６Ｂ（ＰＤＥ６Ｂ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ９ＯＴＣ）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ１）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ２）、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３／ＮＴＦ３）、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ミトコンドリアコードＮＡＤＨ：ユビキノンオキシドレダクターゼコアサブユニット４（ＭＴ－ＮＤ４）、保護タンパク質カテプシンＡ（ＰＰＣＡ）、ジスフェリン、ＭＥＲ原がん遺伝子、チロシンキナーゼ（ＭＥＲＴＫ）、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）、または腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）－免疫グロブリン（ＩｇＧ１）Ｆｃ融合物である、［１１５］に記載の方法。
【0134】
［１１８．］前記遺伝子産物が、ジストロフィンまたはミクロジストロフィンである、［１１５］に記載の方法。
【0135】
［１１９．］前記遺伝子産物がマイクロＲＮＡである、［１１４］に記載の方法。
【0136】
本明細書で説明される組成物及び方法のさらなる他の特徴及び利点は、添付の図面と共に読めば、以下の詳細な説明からさらに明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0137】
【図1-1】ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６参照ヘルパープラスミド。
【図2】ヘルパープラスミド＃１のマップ。
【図3】ヘルパー＃１はＡＡＶ力価を改善した。ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６オリジナル／旧型ヘルパー及びクローン１－Ｐ８を用いて得た力価に対するｒＡＡＶ生成力価の変化倍率を示している。
【図4】ヘルパープラスミド＃２のマップ。
【図5】ヘルパー＃２プラスミドはＡＡＶ力価を改善した。ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６オリジナル／旧型ヘルパー及びクローン１を用いて得た力価に対するｒＡＡＶ生成力価の変化倍率を示している。
【図6】Ｅ４バリアントのスクリーニング。全Ｅ４を含むヘルパーを用いて得た力価に対するｒＡＡＶ生成力価の変化倍率を示している。
【図7】ヘルパー＃３プラスミドのマップ。
【図8】ヘルパー＃３はＡＡＶ力価をさらに改善した。ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６オリジナル／旧型ヘルパー及びクローン１（５ｅ６）を用いて得た力価に対するｒＡＡＶ生成力価の変化倍率を示している。
【図9】ヘルパー＃３はＡＡＶ力価をさらに改善した。ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６オリジナル／旧型ヘルパー及びクローン１（５ｅ６）を用いて得た力価に対するｒＡＡＶ生成力価の変化倍率を示している。
【図10】ヘルパープラスミド＃２にボカウイルス遺伝子ＮＰ１及びＮＳ２を付加。
【図11】ボカウイルスヘルパー遺伝子を加えてもＡＡＶ力価は改善しなかった。ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６オリジナル／旧型ヘルパー及びクローン１を用いて得た力価に対するｒＡＡＶ生成力価の変化倍率を示している。
【図12】ヘルパー＃３にＡＡＰを付加。
【図13】ヘルパープラスミド＃４のマップ。
【図14】ＡＡＰ及びＥ１Ａの付加がウイルス力価に及ぼす効果。ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６オリジナル／旧型ヘルパー及びクローン１を用いて得た力価に対するｒＡＡＶ生成力価の変化倍率を示している。
【図15】ヘキソンアセンブリー及びＬ４ ２２Ｋ／３３Ｋの配列における変異がＡＡＶ力価に及ぼす効果。新型ヘルパー＃３及びクローン１を用いて得た力価に対するｒＡＡＶ生成力価の変化倍率を示している。
【発明を実施するための形態】
【0138】
詳細な説明
１つの態様において、本明細書では、組換えＡＡＶ粒子の生産に使用するのに適した、ヘルパー機能をコードする改善された組換えポリヌクレオチド及びプラスミドである。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチド及びプラスミドは、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＮＡ結合タンパク質、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ならびにアデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列のうちの１つ以上をコードする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド及びプラスミドは、アデノウイルスＩＴＲ配列、Ｌ３ ２３Ｋエンドプロテアーゼ、Ｌ５ ｐＶＩ／ファイバー、及び／またはＬ４ ｐＶＩＩＩ／ヘキソン関連前駆体をコードするヌクレオチド配列を含まない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド及びプラスミドは、組換えＡＡＶ粒子の生産に使用するのに適したヘルパー機能をコードする、以前から利用可能なポリヌクレオチド及びプラスミドよりも小さい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の改善されたポリヌクレオチド及びプラスミドを組換えＡＡＶ粒子の生成に使用すると、結果としてｒＡＡＶ収量が増加する。
１つの態様において、本明細書では、組換えＡＡＶ粒子の生産に使用するのに適した、ヘルパー機能をコードする改善された組換えポリヌクレオチド及びプラスミドである。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチド及びプラスミドは、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＮＡ結合タンパク質、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ならびにアデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列のうちの１つ以上をコードする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド及びプラスミドは、アデノウイルスＩＴＲ配列、Ｌ３ ２３Ｋエンドプロテアーゼ、Ｌ５ ｐＶＩ／ファイバー、及び／またはＬ４ ｐＶＩＩＩ／ヘキソン関連前駆体をコードするヌクレオチド配列を含まない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド及びプラスミドは、組換えＡＡＶ粒子の生産に使用するのに適したヘルパー機能をコードする、以前から利用可能なポリヌクレオチド及びプラスミドよりも小さい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の改善されたポリヌクレオチド及びプラスミドを組換えＡＡＶ粒子の生成に使用すると、結果としてｒＡＡＶ収量が増加する。
【0139】
定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本開示の方法の理解を容易にするため、以下に複数の用語及び表現を定義する。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本開示の方法の理解を容易にするため、以下に複数の用語及び表現を定義する。
【0140】
「ＡＡＶ」とはアデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）の省略形であり、このウイルス自体またはその修飾物、派生物、もしくはシュードタイプを意味するように使用することができる。当該用語は、別段に要求される場合を除いて、全てのサブタイプ、ならびに天然の形態及び組換え形態両方を包含する。省略形「ｒＡＡＶ」とは、組換えアデノ随伴ウイルスを意味する。「ＡＡＶ」という用語は、１型ＡＡＶ（ＡＡＶ１）、２型ＡＡＶ（ＡＡＶ２）、３型ＡＡＶ（ＡＡＶ３）、４型ＡＡＶ（ＡＡＶ４）、５型ＡＡＶ（ＡＡＶ５）、６型ＡＡＶ（ＡＡＶ６）、７型ＡＡＶ（ＡＡＶ７）、８型ＡＡＶ（ＡＡＶ８）、９型ＡＡＶ（ＡＡＶ９）、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶ、ならびにこれらの修飾物、派生物、またはシュードタイプを含む。「霊長類ＡＡＶ」とは霊長類に感染するＡＡＶを意味し、「非霊長類ＡＡＶ」とは非霊長類哺乳類に感染するＡＡＶを意味し、「ウシＡＡＶ」とはウシ哺乳類に感染するＡＡＶを意味する、などとなる。
【0141】
ＡＡＶ粒子に適用される「組換え」とは、ＡＡＶ粒子が、本質的にＡＡＶ粒子とは異なるＡＡＶ粒子コンストラクトをもたらす１つ以上の手順の生成物であることを意味する。
【0142】
組換えアデノ随伴ウイルス粒子「ｒＡＡＶ粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質と、異種ポリヌクレオチド（すなわち、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド、例えば、哺乳類細胞に送達させる導入遺伝子）を含むカプシド化ポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターゲノムとから構成されるウイルス粒子を意味する。ｒＡＡＶ粒子は、任意の修飾物、派生物、またはシュードタイプを含めた任意のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、もしくはＡＡＶ１０、またはこれらの派生体／修飾物／シュードタイプ）とすることができる。このようなＡＡＶ血清型及び派生物／修飾物／シュードタイプ、ならびにこのような血清型／派生物／修飾物／シュードタイプを生成する方法は、当技術分野で知られている（例えば、Ａｓｏｋａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０（４）：６９９－７０８（２０１２）を参照）。
【0143】
本開示のｒＡＡＶ粒子は、任意の血清型、または血清型の任意の組合せ（例えば、２つ以上の血清型を含む（例えば、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ８、及びｒＡＡＶ９粒子のうちの２つ以上を含む）ｒＡＡＶ粒子集団）とすることができる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ｒＡＡＶ４、ｒＡＡＶ５、ｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ８、ｒＡＡＶ９、及びｒＡＡＶ１０、もしくはその他のｒＡＡＶ粒子、またはこれらの２つ以上の組合せである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ８またはｒＡＡＶ９粒子である。
【0144】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、またはこれらの派生物、修飾物、もしくはシュードタイプからなる群より選択される血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはこれらの派生物、修飾物、もしくはシュードタイプの血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。
【0145】
「細胞培養物」という用語は、接着してまたは浮遊液中で成長させる細胞、バイオリアクター、ローラーボトル、ハイパースタック、ミクロスフェア、マクロスフェア、フラスコなどに加えて、上清または浮遊液自体の構成成分を意味し、このような構成成分としては、限定されるものではないが、ｒＡＡＶ粒子、細胞、細胞デブリ、細胞混入物、コロイド粒子、生体分子、宿主細胞タンパク質、核酸、脂質、及び凝集剤が挙げられる。また、バイオリアクターなどの大規模アプローチ（浮遊培養物、及び撹拌バイオリアクター内のマイクロキャリアまたはマクロキャリアに付着して成長させる付着細胞が含まれる）も「細胞培養物」という用語に包含される。タンパク質の大規模生産及び小規模生産いずれのための細胞培養手順も、本開示に包含される。いくつかの実施形態において、「細胞培養物」という用語は、浮遊状態で成長した細胞を意味する。いくつかの実施形態において、「細胞培養物」という用語は、撹拌バイオリアクター内でマイクロキャリアまたはマクロキャリアに付着して成長した接着性細胞を意味する。いくつかの実施形態において、「細胞培養物」という用語は、灌流培養物中で成長した細胞を意味する。いくつかの実施形態において、「細胞培養物」という用語は、交互タンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）支持高密度灌流培養物中で成長した細胞を意味する。
【0146】
本明細書で使用する場合、「精製すること」、「精製」、「分離」、「分離すること」、「分離」、「単離する」、「単離すること」、または「単離」という用語は、ターゲット生成物と１つ以上の不純物とを含む試料からのターゲット生成物（例えば、ｒＡＡＶ粒子及びｒＡＡＶゲノム）の純度の程度を高めることを意味する。典型的には、ターゲット生成物の純度の程度は、試料から少なくとも１つの不純物を（完全にまたは不完全に）除去することによって高められる。いくつかの実施形態において、試料中のｒＡＡＶの純度の程度は、本明細書で説明される方法を使用することにより、試料から１つ以上の不純物を（完全にまたは不完全に）除去することによって増加する。
【0147】
例えば、組成物中の成分の量、組成物中の成分の濃度、流量、ｒＡＡＶ粒子収量、フィード体積、塩濃度、類似の値、及びこれらの範囲を修飾し、本明細書で提供される方法で用いられる「約」とは、例えば、濃縮物もしくは使用溶液を作製するために使用される典型的な測定及び取扱い手順によって；これらの手順における偶発性のエラーによって；組成物の作製もしくは方法の実行に用いられる製造、供給源、もしくは成分の純度の違いによって；及び類似の考慮事項によって生じ得る、数値的量のバリエーションを意味する。「約」という用語は、特定の初期濃度を有する組成物または混合物が老化することによって相違する量も包含する。「約」という用語は、特定の初期濃度を有する組成物または混合物を混合または処理することによって相違する量も包含する。「約」という用語で修飾されているかどうかにかかわらず、請求項は、その量の等価物を含む。いくつかの実施形態において、「約」という用語は、示された数または範囲よりも約１０～２０％多いまたは少ない範囲を意味する。さらなる実施形態において、「約」とは、示された数または範囲のプラスマイナス１０％を意味する。例えば、「約１０％」は、９％～１１％の範囲を示す。
【0148】
本開示及び請求項で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈による明確な別段の定めがない限り、複数形を含む。
【0149】
諸実施形態が「～を含む」という語を用いて本明細書で説明されている場合は常に、「～からなる」及び／または「本質的に～からなる」という観点から説明されている別の類似の実施形態も提供されるものと理解されたい。また、諸実施形態が「本質的に～からなる」という語を用いて本明細書で説明されている場合は常に、「～からなる」という観点から説明されている別の類似の実施形態も提供されるものと理解されたい。
【0150】
「及び／または」という用語は、本明細書で「Ａ及び／またはＢ」などの表現で使用される場合、Ａ及びＢの両方、ＡまたはＢ、Ａ（単独）、ならびにＢ（単独）を含むように意図されている。同様に、「及び／または」という用語は、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」のような表現で使用される場合、以下の実施形態の各々を包含するように意図されている：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。
【0151】
本開示の実施形態がマーカッシュグループまたはその他の代替のグループに関して説明される場合、本開示の方法は、全体として挙げられたグループ全体を包含するだけでなく、グループの各メンバーも個別に包含し、メイングループの全ての可能なサブグループも包含し、さらにグループメンバーの１つ以上不在のメイングループも包含する。また、本開示の方法は、本開示の方法におけるグループメンバーのいずれかの１つ以上が明示的に除外されることも想定している。
【0152】
組換えポリヌクレオチド
いくつかの実施形態において、本開示は、宿主細胞（例えば、ＨＥＫ細胞）内で組換えＡＡＶ粒子の生成を促進可能な１つ以上のヘルパー機能をコードする、単離された組換えポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、（ａ）アデノウイルスＥ２Ａ ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）をコードするヌクレオチド配列、（ｂ）アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ならびに（ｃ）アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列は、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードする。いくつかの実施形態において、単離された組換えポリヌクレオチドは、アデノウイルスＩＴＲ配列、Ｌ３ ２３Ｋエンドプロテアーゼ、Ｌ５ ｐＶＩ／ファイバー、及び／またはＬ４ ｐＶＩＩＩ／ヘキソン関連前駆体をコードするヌクレオチド配列を含まない。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＩＴＲ配列、Ｌ３ ２３Ｋエンドプロテアーゼ、Ｌ５ ｐＶＩ／ファイバー、及び／またはＬ４ ｐＶＩＩＩ／ヘキソン関連前駆体をコードするヌクレオチド配列は、ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６の対応するヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、タンパク質もしくはポリペプチド（例えば、Ｅ２Ａ ＤＢＰまたはＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７）、またはＲＮＡ（例えば、ＶＡ ＲＮＡ Ｉ）をコードするヌクレオチド配列は、タンパク質もしくはポリペプチド、またはＲＮＡのコード領域を含むヌクレオチド配列に作用可能に結合したプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、タンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、コード領域を含むヌクレオチド配列に作用可能に結合したプロモーター及びポリＡシグナルを含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、宿主細胞（例えば、ＨＥＫ細胞）内で組換えＡＡＶ粒子の生成を促進可能な１つ以上のヘルパー機能をコードする、単離された組換えポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、（ａ）アデノウイルスＥ２Ａ ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）をコードするヌクレオチド配列、（ｂ）アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ならびに（ｃ）アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列は、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードする。いくつかの実施形態において、単離された組換えポリヌクレオチドは、アデノウイルスＩＴＲ配列、Ｌ３ ２３Ｋエンドプロテアーゼ、Ｌ５ ｐＶＩ／ファイバー、及び／またはＬ４ ｐＶＩＩＩ／ヘキソン関連前駆体をコードするヌクレオチド配列を含まない。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＩＴＲ配列、Ｌ３ ２３Ｋエンドプロテアーゼ、Ｌ５ ｐＶＩ／ファイバー、及び／またはＬ４ ｐＶＩＩＩ／ヘキソン関連前駆体をコードするヌクレオチド配列は、ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６の対応するヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、タンパク質もしくはポリペプチド（例えば、Ｅ２Ａ ＤＢＰまたはＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７）、またはＲＮＡ（例えば、ＶＡ ＲＮＡ Ｉ）をコードするヌクレオチド配列は、タンパク質もしくはポリペプチド、またはＲＮＡのコード領域を含むヌクレオチド配列に作用可能に結合したプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、タンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、コード領域を含むヌクレオチド配列に作用可能に結合したプロモーター及びポリＡシグナルを含む。
【0153】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列とを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列とを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列とを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列は、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードする。いくつかの実施形態において、単離された組換えポリヌクレオチドは、アデノウイルスＩＴＲ配列、Ｌ３ ２３Ｋエンドプロテアーゼ、Ｌ５ ｐＶＩ／ファイバー、及び／またはＬ４ ｐＶＩＩＩ／ヘキソン関連前駆体をコードするヌクレオチド配列を含まない。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＩＴＲ配列、Ｌ３ ２３Ｋエンドプロテアーゼ、Ｌ５ ｐＶＩ／ファイバー、及び／またはＬ４ ｐＶＩＩＩ／ヘキソン関連前駆体をコードするヌクレオチド配列は、ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６の対応するヌクレオチド配列である。単離された組換えポリヌクレオチドのいくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７をコードするヌクレオチド配列とが、反対の５’→３’方向にある。単離された組換えポリヌクレオチドのいくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７をコードするヌクレオチド配列とが、同じ５’→３’方向にある。
【0154】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列とを含み、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７をコードするヌクレオチド配列とは、反対の５’→３’方向にあり、単離された組換えポリヌクレオチドは、アデノウイルスＩＴＲ配列、Ｌ３ ２３Ｋエンドプロテアーゼ、Ｌ５ ｐＶＩ／ファイバー、及び／またはＬ４ ｐＶＩＩＩ／ヘキソン関連前駆体をコードするヌクレオチド配列を含まない。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列は、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードする。
【0155】
アデノウイルスＥ２Ａ ＤＮＡ結合タンパク質
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰポリペプチドは、配列番号４５に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰポリペプチドは、配列番号４５に対し少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰポリペプチドは、配列番号４５に対し少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰポリペプチドは、配列番号４５に対し少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰポリペプチドは、配列番号４５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、プロモーター及びポリＡシグナルに作用可能に結合している。
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰポリペプチドは、配列番号４５に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰポリペプチドは、配列番号４５に対し少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰポリペプチドは、配列番号４５に対し少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰポリペプチドは、配列番号４５に対し少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰポリペプチドは、配列番号４５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、プロモーター及びポリＡシグナルに作用可能に結合している。
【0156】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４５に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰポリペプチドは、配列番号４５に対し少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰポリペプチドは、配列番号４５に対し少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰポリペプチドは、配列番号４５に対し少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰポリペプチドは、配列番号４５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、プロモーター及びポリＡシグナルに作用可能に結合している。
【0157】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、アデノウイルスＥ２Ａプロモーターに作用可能に結合している。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーターは、配列番号２に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を含むヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーターは、配列番号２に対し少なくとも９５％の同一性を含むヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーターは、配列番号２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、アデノウイルスＥ２Ａプロモーターではないプロモーターに作用可能に結合している。
【0158】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーター及び任意選択でポリＡシグナルに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、３’→５’方向に、アデノウイルスＥ２Ａプロモーター、アデノウイルスＬ４ ２２Ｋ／３３Ｋ遺伝子、アデノウイルスＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリー遺伝子、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列、及び任意選択でポリＡシグナルを包含する。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーター、アデノウイルスＬ４ ２２Ｋ／３３Ｋ遺伝子、アデノウイルスＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリー遺伝子、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列、及び任意選択でポリＡシグナルの相対的方向は、ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６と同じである。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーターに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーターに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーターに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーターに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーターに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーター及びポリＡシグナルに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーター及びポリＡシグナルに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーター及びポリＡシグナルに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーター及びポリＡシグナルに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーター及びポリＡシグナルに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４のヌクレオチド配列を含む。
【0159】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーターに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、３’→５’方向に、アデノウイルスＥ２Ａプロモーター、アデノウイルスＬ４ ２２Ｋ／３３Ｋ遺伝子、アデノウイルスＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリー遺伝子、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列を包含し、アデノウイルスＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリー遺伝子は、Ｌ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドのＮ末端欠失を含む。いくつかの実施形態において、Ｎ末端欠失は、Ｌ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリープロモーターに影響を及ぼさない。いくつかの実施形態において、Ｎ末端欠失は、配列番号２１の配列に対応する。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーター、アデノウイルスＬ４ ２２Ｋ／３３Ｋ遺伝子、アデノウイルスＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリー遺伝子、及びアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列の相対的方向は、ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６と同じである。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーターに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２２に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーターに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２２に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーターに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２２に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーターに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２２に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーターに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰ及びアデノウイルスＥ２Ａプロモーターをコードするヌクレオチド配列は、作用可能に結合したポリＡシグナルをさらに含む。
【0160】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーターに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、３’→５’方向に、アデノウイルスＥ２Ａプロモーター、アデノウイルスＬ４ ２２Ｋ／３３Ｋ遺伝子、アデノウイルスＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリー遺伝子、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列を包含し、アデノウイルスＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリー遺伝子は、Ｌ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドの開始コドンに変異を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーター、アデノウイルスＬ４ ２２Ｋ／３３Ｋ遺伝子、アデノウイルスＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリー遺伝子、及びアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列の相対的方向は、ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６と同じである。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーターに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２３に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーターに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２３に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーターに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２３に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーターに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２３に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーターに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２３のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰ及びアデノウイルスＥ２Ａプロモーターをコードするヌクレオチド配列は、作用可能に結合したポリＡシグナルをさらに含む。
【0161】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーターに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、３’→５’方向に、アデノウイルスＥ２Ａプロモーター、アデノウイルスＬ４ ２２Ｋ／３３Ｋ遺伝子、アデノウイルスＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリー遺伝子、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列を包含し、アデノウイルスＬ４ ２２Ｋ／３３Ｋ遺伝子は、Ｌ４ ２２Ｋ／３３Ｋポリペプチドの開始コドンに変異を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーター、アデノウイルスＬ４ ２２Ｋ／３３Ｋ遺伝子、アデノウイルスＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリー遺伝子、及びアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列の相対的方向は、ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６と同じである。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーターに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２４に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーターに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２４に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーターに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２４に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーターに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２４に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーターに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２４のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰ及びアデノウイルスＥ２Ａプロモーターをコードするヌクレオチド配列は、作用可能に結合したポリＡシグナルをさらに含む。
【0162】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーターに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、３’→５’方向に、アデノウイルスＥ２Ａプロモーター、アデノウイルスＬ４ ２２Ｋ／３３Ｋ遺伝子、アデノウイルスＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリー遺伝子、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列を包含し、Ｌ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリー遺伝子は、Ｌ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドの開始コドンを包含するがＬ４ ２２Ｋ／３３Ｋポリペプチドの開始コドンを包含しないＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドのＮ末端欠失を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーターに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、３’→５’方向に、アデノウイルスＥ２Ａプロモーター、アデノウイルスＬ４ ２２Ｋ／３３Ｋ遺伝子、アデノウイルスＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリー遺伝子、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列を包含し、Ｌ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリー遺伝子は、Ｌ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドのＮ末端欠失を含み、Ｌ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドの全部または一部が、Ｌ４ ２２Ｋ／３３Ｋ開始コドンを崩壊せずに欠失している。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーターに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、３’→５’方向に、アデノウイルスＥ２Ａプロモーター、アデノウイルスＬ４ ２２Ｋ／３３Ｋ遺伝子、アデノウイルスＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリー遺伝子、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列を包含し、Ｌ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリー遺伝子は、Ｌ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドの開始コドンを包含するがＬ４ ２２Ｋ／３３Ｋプロモーターを包含しないＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドのＮ末端欠失を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーターに作用可能に結合したアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、３’→５’方向に、アデノウイルスＥ２Ａプロモーター、アデノウイルスＬ４ ２２Ｋ／３３Ｋ遺伝子、アデノウイルスＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリー遺伝子、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列を包含し、ここで、Ｌ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリー遺伝子は、Ｌ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドの開始コドンで開始し、Ｌ４ ２２Ｋ／３３Ｋポリペプチドのすぐ隣で終了するＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリーポリペプチドのＮ末端欠失を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａプロモーター、アデノウイルスＬ４ ２２Ｋ／３３Ｋ遺伝子、アデノウイルスＬ４ １００ｋ／ヘキソンアセンブリー遺伝子、及びアデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列の相対的方向は、ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６と同じである。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰ及びアデノウイルスＥ２Ａプロモーターをコードするヌクレオチド配列は、作用可能に結合したポリＡシグナルをさらに含む。
【0163】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、ＣＭＶ最初期プロモーターに作用可能に結合している。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、操作されたＣＭＶ最初期プロモーター、または転写活性フラグメントもしくはその一部に作用可能に結合している。
【0164】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに作用可能に結合している。
【0165】
アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチド
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号８に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号８に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号８に対し少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号８に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号８を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドは、配列番号４６に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドは、配列番号４６に対し少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドは、配列番号４６に対し少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドは、配列番号４６に対し少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドは、配列番号４６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、プロモーター及びポリＡシグナルに作用可能に結合している。
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号８に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号８に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号８に対し少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号８に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号８を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドは、配列番号４６に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドは、配列番号４６に対し少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドは、配列番号４６に対し少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドは、配列番号４６に対し少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドは、配列番号４６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、プロモーター及びポリＡシグナルに作用可能に結合している。
【0166】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４６に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドは、配列番号４６に対し少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドは、配列番号４６に対し少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドは、配列番号４６に対し少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドは、配列番号４６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、プロモーター及びポリＡシグナルに作用可能に結合している。
【0167】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、アデノウイルスＥ４プロモーターに作用可能に結合している。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４プロモーターは、配列番号５に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を含むヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４プロモーターは、配列番号５に対し少なくとも９５％の同一性を含むヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４プロモーターは、配列番号５のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、アデノウイルスＥ４プロモーターではないプロモーターに作用可能に結合している。
【0168】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＣＭＶ最初期プロモーターに作用可能に結合している。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、操作されたＣＭＶ最初期プロモーター、または転写活性フラグメントもしくはその一部に作用可能に結合している。
【0169】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに作用可能に結合している。
【0170】
アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５４に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５４に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５４に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５４に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５４を含む。
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５４に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５４に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５４に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５４に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５４を含む。
【0171】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５５に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５５に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５５に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５５に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５５を含む。
【0172】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードするヌクレオチド配列は、配列番号９に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードするヌクレオチド配列は、配列番号９に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードするヌクレオチド配列は、配列番号９に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードするヌクレオチド配列は、配列番号９に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードするヌクレオチド配列は、配列番号９を含む。
【0173】
Ｅ２Ａ ＤＢＰ、Ｅ４ ＯＲＦ６／７、及びＶＡ ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列とを含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列は、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードする。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰを発現するプロモーター、ならびにアデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドを発現するプロモーターは同じである。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰを発現するプロモーター、ならびにアデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドを発現するプロモーターは異なる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列とを含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列は、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードする。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰを発現するプロモーター、ならびにアデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドを発現するプロモーターは同じである。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰを発現するプロモーター、ならびにアデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドを発現するプロモーターは異なる。
【0174】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードするヌクレオチド配列とを含む、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１０に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１０に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１０に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１０に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。
【0175】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードするヌクレオチド配列とを含む、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１１に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１１に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１１に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１１に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１１のヌクレオチド配列を含む。
【0176】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードするヌクレオチド配列とを含む、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号５６に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号５６に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号５６に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号５６に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号５６のヌクレオチド配列を含む。
【0177】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードするヌクレオチド配列とを含む、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号５７に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号５７に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号５７に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号５７に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号５７のヌクレオチド配列を含む。
【0178】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードするヌクレオチド配列とを含む、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号２５に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号２５に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号２５に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号２５に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号２５のヌクレオチド配列を含む。
【0179】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードするヌクレオチド配列とを含む、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号２６に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号２６に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号２６に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号２６に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号２６のヌクレオチド配列を含む。
【0180】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードするヌクレオチド配列とを含む、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号２７に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号２７に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号２７に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号２７に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号２７のヌクレオチド配列を含む。
【0181】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードするヌクレオチド配列とを含む、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号２８に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号２８に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号２８に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号２８に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号２８のヌクレオチド配列を含む。
【0182】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードするヌクレオチド配列とを含む、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号２９に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号２９に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号２９に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号２９に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号２９のヌクレオチド配列を含む。
【0183】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードするヌクレオチド配列とを含む、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号３０に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号３０に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号３０に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号３０に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号３０のヌクレオチド配列を含む。
【0184】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードするヌクレオチド配列とを含む、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号３１に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号３１に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号３１に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号３１に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号３１のヌクレオチド配列を含む。
【0185】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードするヌクレオチド配列とを含む、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号３２に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号３２に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号３２に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号３２に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号３２のヌクレオチド配列を含む。
【0186】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードするヌクレオチド配列とを含む、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号３３に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号３３に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号３３に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号３３に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号３３のヌクレオチド配列を含む。
【0187】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードするヌクレオチド配列とを含む、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号３４に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号３４に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号３４に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号３４に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号３４のヌクレオチド配列を含む。
【0188】
ボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチド
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ、及び任意選択でＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードするヌクレオチド配列とを含む、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、ボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、ボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、ボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２に対し少なくとも９０％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、ボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２に対し少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、ボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２に対し少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、ボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２を含む。いくつかの実施形態において、ボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドは、配列番号５２に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドは、配列番号５２に対し少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドは、配列番号５２に対し少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドは、配列番号５２に対し少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドは、配列番号５２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＣＭＶプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、ボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、操作されたＣＭＶ最初期プロモーターを含む。
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ、及び任意選択でＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードするヌクレオチド配列とを含む、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、ボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、ボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、ボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２に対し少なくとも９０％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、ボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２に対し少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、ボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２に対し少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、ボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２を含む。いくつかの実施形態において、ボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドは、配列番号５２に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドは、配列番号５２に対し少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドは、配列番号５２に対し少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドは、配列番号５２に対し少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドは、配列番号５２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＣＭＶプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、ボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、操作されたＣＭＶ最初期プロモーターを含む。
【0189】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩならびにボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１３に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１３に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１３に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１３に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１３のヌクレオチド配列を含む。
【0190】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩならびにボカウイルスＮＰ１及びＮＳ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１４に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１４に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１４に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１４に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１４のヌクレオチド配列を含む。
【0191】
アデノ随伴ウイルスアセンブリー活性化タンパク質
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ、及び任意選択でＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードするヌクレオチド配列とを含む、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）アセンブリー活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。当業者は、ＡＡＶ ＡＡＰ ＯＲＦは野生型ウイルスのＡＡＶカプシドＯＲＦと重複しており、その結果、ＡＡＶ血清型特異的ＡＡＰ、例えばＡＡＶ血清型１～１３に対応するＡＡＰ １～１３が存在することを理解している。Ｓｏｎｎｔａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８５：１２６８６－１２６９７（２０１１）． いくつかの実施形態において、ＡＡＰは、ＡＡＰ １、ＡＡＰ ２、ＡＡＰ ３Ｂ、ＡＡＰ ４、ＡＡＰ ５、ＡＡＰ ６、ＡＡＰ ７、ＡＡＰ ８、ＡＡＰ ９、ＡＡＰ １０、ＡＡＰ １１、ＡＡＰ １２、またはＡＡＶ １３である。いくつかの実施形態において、ＡＡＰアイソタイプは、生成される組換えＡＡＶのカプシドアイソタイプと一致する。いくつかの実施形態において、ＡＡＰはＡＡＰ ８である。いくつかの実施形態において、ＡＡＰはＡＡＰ ９である。いくつかの実施形態において、ＡＡＰは、配列番号５３に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＰは、配列番号５３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＡＡＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１５に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＡＡＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１５に対し少なくとも９０％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＡＡＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１５に対し少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＡＡＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１５に対し少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＡＡＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１５を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＡＡＰは、配列番号５３に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＡＡＰは配列番号５３に対し少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＡＡＰは配列番号５３に対し少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＡＡＰは配列番号５３に対し少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＡＡＰは、配列番号５３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＡＡＰをコードするヌクレオチド配列は、ＣＭＶプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＡＡＰをコードするヌクレオチド配列は、操作されたＣＭＶ最初期プロモーターを含む。
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ、及び任意選択でＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードするヌクレオチド配列とを含む、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）アセンブリー活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。当業者は、ＡＡＶ ＡＡＰ ＯＲＦは野生型ウイルスのＡＡＶカプシドＯＲＦと重複しており、その結果、ＡＡＶ血清型特異的ＡＡＰ、例えばＡＡＶ血清型１～１３に対応するＡＡＰ １～１３が存在することを理解している。Ｓｏｎｎｔａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８５：１２６８６－１２６９７（２０１１）． いくつかの実施形態において、ＡＡＰは、ＡＡＰ １、ＡＡＰ ２、ＡＡＰ ３Ｂ、ＡＡＰ ４、ＡＡＰ ５、ＡＡＰ ６、ＡＡＰ ７、ＡＡＰ ８、ＡＡＰ ９、ＡＡＰ １０、ＡＡＰ １１、ＡＡＰ １２、またはＡＡＶ １３である。いくつかの実施形態において、ＡＡＰアイソタイプは、生成される組換えＡＡＶのカプシドアイソタイプと一致する。いくつかの実施形態において、ＡＡＰはＡＡＰ ８である。いくつかの実施形態において、ＡＡＰはＡＡＰ ９である。いくつかの実施形態において、ＡＡＰは、配列番号５３に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＰは、配列番号５３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＡＡＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１５に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＡＡＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１５に対し少なくとも９０％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＡＡＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１５に対し少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＡＡＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１５に対し少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＡＡＰをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１５を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＡＡＰは、配列番号５３に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＡＡＰは配列番号５３に対し少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＡＡＰは配列番号５３に対し少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＡＡＰは配列番号５３に対し少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＡＡＰは、配列番号５３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＡＡＰをコードするヌクレオチド配列は、ＣＭＶプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＡＡＰをコードするヌクレオチド配列は、操作されたＣＭＶ最初期プロモーターを含む。
【0192】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩならびにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）アセンブリー活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードするヌクレオチド配列とを含む、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１６に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１６に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１６に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１６に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１６のヌクレオチド配列を含む。
【0193】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩならびにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）アセンブリー活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードするヌクレオチド配列とを含む、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１７に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１７に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１７に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１７に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１７のヌクレオチド配列を含む。
【0194】
アデノウイルスＥ１Ａポリペプチド
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ、及び任意選択でＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードするヌクレオチド配列とを含む、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、アデノウイルスＥ１Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ１Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１８に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ１Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１８に対し少なくとも９０％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ１Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１８に対し少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ１Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１８に対し少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ１Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１８を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ１Ａポリペプチドは、配列番号５１に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ１Ａポリペプチドは、配列番号５１に対し少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ１Ａポリペプチドは、配列番号５１に対し少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ１Ａポリペプチドは、配列番号５１に対し少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｅ１Ａポリペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ１Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＣＭＶプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ１Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、操作されたＣＭＶ最初期プロモーターを含む。
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ、及び任意選択でＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードするヌクレオチド配列とを含む、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、アデノウイルスＥ１Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ１Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１８に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ１Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１８に対し少なくとも９０％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ１Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１８に対し少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ１Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１８に対し少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ１Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１８を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ１Ａポリペプチドは、配列番号５１に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ１Ａポリペプチドは、配列番号５１に対し少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ１Ａポリペプチドは、配列番号５１に対し少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ１Ａポリペプチドは、配列番号５１に対し少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｅ１Ａポリペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ１Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＣＭＶプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ１Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、操作されたＣＭＶ最初期プロモーターを含む。
【0195】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩならびにアデノウイルスＥ１Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１９に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１９に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１９に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１９に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号１９のヌクレオチド配列を含む。
【0196】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩならびにアデノウイルスＥ１Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号２０に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号２０に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号２０に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号２０に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えポリヌクレオチドは、配列番号２０のヌクレオチド配列を含む。
【0197】
プラスミド
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載の組換えポリヌクレオチドを含むプラスミドであって、宿主細胞（例えば、ＨＥＫ細胞）内で組換えＡＡＶ粒子の生成を促進可能な１つ以上のヘルパー機能をコードする、プラスミドを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、（ａ）アデノウイルスＥ２Ａ ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）をコードするヌクレオチド配列、（ｂ）アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ならびに（ｃ）アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列のうちの１つ以上を含む、組換えポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列は、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードする。いくつかの実施形態において、プラスミドは、アデノウイルスＩＴＲ配列、Ｌ３ ２３Ｋエンドプロテアーゼ、Ｌ５ ｐＶＩ／ファイバー、及び／またはＬ４ ｐＶＩＩＩ／ヘキソン関連前駆体をコードするヌクレオチド配列を含まない。いくつかの実施形態において、プラスミドは細菌プラスミドである。
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載の組換えポリヌクレオチドを含むプラスミドであって、宿主細胞（例えば、ＨＥＫ細胞）内で組換えＡＡＶ粒子の生成を促進可能な１つ以上のヘルパー機能をコードする、プラスミドを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、（ａ）アデノウイルスＥ２Ａ ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）をコードするヌクレオチド配列、（ｂ）アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ならびに（ｃ）アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列のうちの１つ以上を含む、組換えポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列は、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードする。いくつかの実施形態において、プラスミドは、アデノウイルスＩＴＲ配列、Ｌ３ ２３Ｋエンドプロテアーゼ、Ｌ５ ｐＶＩ／ファイバー、及び／またはＬ４ ｐＶＩＩＩ／ヘキソン関連前駆体をコードするヌクレオチド配列を含まない。いくつかの実施形態において、プラスミドは細菌プラスミドである。
【0198】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、細菌宿主細胞（例えば、大腸菌宿主細胞）内でプラスミドを増殖可能な細菌複製起点を含む。いくつかの実施形態において、細菌複製起点はＣｏｌＥ１起点である。
【0199】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは選択マーカー遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、選択マーカー遺伝子は薬剤耐性遺伝子である。いくつかの実施形態において、選択マーカー遺伝子はカナマイシン耐性遺伝子である。いくつかの実施形態において、選択マーカー遺伝子はアンピシリン耐性遺伝子である。
【0200】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、細菌複製起点及び選択マーカー遺伝子を含む。
【0201】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列とを含む、本明細書に記載の組換えポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む、本明細書に記載の組換えポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列とを含む、本明細書に記載の組換えポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列とを含む、本明細書に記載の組換えポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列を含む、本明細書に記載の組換えポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、本明細書に記載の組換えポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードする組換えヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列は、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードする。いくつかの実施形態において、プラスミドは、アデノウイルスＩＴＲ配列、Ｌ３ ２３Ｋエンドプロテアーゼ、Ｌ５ ｐＶＩ／ファイバー、及び／またはＬ４ ｐＶＩＩＩ／ヘキソン関連前駆体をコードするヌクレオチド配列を含まない。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＩＴＲ配列、Ｌ３ ２３Ｋエンドプロテアーゼ、Ｌ５ ｐＶＩ／ファイバー、及び／またはＬ４ ｐＶＩＩＩ／ヘキソン関連前駆体をコードするヌクレオチド配列は、ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６の対応するヌクレオチド配列である。
【0202】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列とを含む、本明細書に記載の組換えヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列は、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードする。
【0203】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号１０に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。
【0204】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号１１に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号１１のヌクレオチド配列を含む。
【0205】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号２５～３４、５８、または５９に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号２５～３４、５８、または５９のヌクレオチド配列を含む。
【0206】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、１５，０００ｂｐ未満の長さである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、１２，０００ｂｐ未満の長さである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、９，０００～１２，０００ｂｐの長さである。
【0207】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号３５に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号３５に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号３５に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号３５に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号３５のヌクレオチド配列を含む。
【0208】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号３６に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号３６に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号３６に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号３６に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号３６のヌクレオチド配列を含む。
【0209】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号３７に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号３７に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号３７に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号３７に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号３７のヌクレオチド配列を含む。
【0210】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号３８に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号３８に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号３８に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号３８に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号３８のヌクレオチド配列を含む。
【0211】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号３９に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号３９に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号３９に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号３９に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号３９のヌクレオチド配列を含む。
【0212】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号４０に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号４０に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号４０に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号４０に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号４０のヌクレオチド配列を含む。
【0213】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号４１に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号４１に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号４１に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号４１に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号４１のヌクレオチド配列を含む。
【0214】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号４２に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号４２に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号４２に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号４２に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号４２のヌクレオチド配列を含む。
【0215】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号４３に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号４３に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号４３に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号４３に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号４３のヌクレオチド配列を含む。
【0216】
宿主細胞
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載の組換えポリヌクレオチドまたはプラスミドを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、本明細書に記載の組換えポリヌクレオチドまたはプラスミドを増殖可能な原核細胞である。いくつかの実施形態において、原核宿主細胞は細菌細胞である。いくつかの実施形態において、原核宿主細胞は大腸菌である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、組換えＡＡＶ粒子を生成可能な真核細胞である。いくつかの実施形態において、真核宿主細胞は哺乳類細胞である。いくつかの実施形態において、真核宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ由来細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＨｅＬａ細胞、ＳＦ－９細胞、ＢＨＫ細胞、ベロ細胞、ＣＡＰ細胞、またはＰｅｒＣ６細胞である。
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載の組換えポリヌクレオチドまたはプラスミドを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、本明細書に記載の組換えポリヌクレオチドまたはプラスミドを増殖可能な原核細胞である。いくつかの実施形態において、原核宿主細胞は細菌細胞である。いくつかの実施形態において、原核宿主細胞は大腸菌である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、組換えＡＡＶ粒子を生成可能な真核細胞である。いくつかの実施形態において、真核宿主細胞は哺乳類細胞である。いくつかの実施形態において、真核宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ由来細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＨｅＬａ細胞、ＳＦ－９細胞、ＢＨＫ細胞、ベロ細胞、ＣＡＰ細胞、またはＰｅｒＣ６細胞である。
【0217】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の宿主細胞は、（ａ）アデノウイルスＥ２Ａ ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）をコードするヌクレオチド配列、（ｂ）アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ならびに（ｃ）アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列のうちの１つ以上を含む組換えポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列は、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードする。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、アデノウイルスＩＴＲ配列、Ｌ３ ２３Ｋエンドプロテアーゼ、Ｌ５ ｐＶＩ／ファイバー、及び／またはＬ４ ｐＶＩＩＩ／ヘキソン関連前駆体をコードするヌクレオチド配列を含まない。いくつかの実施形態において、プラスミドは細菌プラスミドである。
【0218】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の宿主細胞は、配列番号１１に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、本明細書に記載のプラスミドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号１１に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号１１に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号１１に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号１１のヌクレオチド配列を含む。
【0219】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の宿主細胞は、配列番号３７に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、本明細書に記載のプラスミドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号３７に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号３７に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号３７に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号３７のヌクレオチド配列を含む。
【0220】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の宿主細胞は、配列番号１０、１１、２５～３４、５８、または５９に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、本明細書に記載のプラスミドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号１０、１１、２５～３４、５８、または５９のヌクレオチド配列を含む。
【0221】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の宿主細胞は、配列番号３５～４３に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、本明細書に記載のプラスミドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプラスミドは、配列番号３５～４３のヌクレオチド配列を含む。
【0222】
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載の組換えポリヌクレオチドまたは本明細書に記載のプラスミドを生成する方法であって、本明細書に記載の宿主細胞を好適な条件下でインキュベートして、組換えポリヌクレオチドまたはプラスミドを生成することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、本明細書に記載のプラスミドを増殖可能な原核細胞である。いくつかの実施形態において、原核宿主細胞は細菌細胞である。いくつかの実施形態において、原核宿主細胞は大腸菌である。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、配列番号１０、１１、２５～３４、５８、または５９に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、配列番号１０、１１、２５～３４、５８、または５９のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、プラスミドは、配列番号３５～４３に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を含むヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、プラスミドは、配列番号３５～４３のヌクレオチド配列を含む。
【0223】
組換えウイルス粒子を生成する方法
１つの態様において、本開示は、真核宿主細胞内で組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を生成する方法であって、本明細書に記載の組換えポリヌクレオチドまたはプラスミドを使用して、組換えＡＡＶ粒子の生成を促進可能な１つ以上のヘルパー機能を提供することにより行う、方法を提供する。いくつかの実施形態において、この方法は、ｒＡＡＶ粒子を回収することをさらに含む。
１つの態様において、本開示は、真核宿主細胞内で組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を生成する方法であって、本明細書に記載の組換えポリヌクレオチドまたはプラスミドを使用して、組換えＡＡＶ粒子の生成を促進可能な１つ以上のヘルパー機能を提供することにより行う、方法を提供する。いくつかの実施形態において、この方法は、ｒＡＡＶ粒子を回収することをさらに含む。
【0224】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子を生成する方法は、配列番号１１に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、組換えポリヌクレオチドまたはプラスミドの使用を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドまたはプラスミドは、配列番号１１に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドまたはプラスミドは、配列番号１１に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドまたはプラスミドは、配列番号１１に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドまたはプラスミドは、配列番号１１のヌクレオチド配列を含む。
【0225】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子を生成する方法は、配列番号３７に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、組換えポリヌクレオチドまたはプラスミドの使用を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドまたはプラスミドは、配列番号３７に対し少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドまたはプラスミドは、配列番号３７に対し少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドまたはプラスミドは、配列番号３７に対し少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドまたはプラスミドは、配列番号３７のヌクレオチド配列を含む。
【0226】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子を生成する方法は、配列番号１０、１１、２５～３４、５８、または５９に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、組換えポリヌクレオチドまたはプラスミドの使用を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドまたはプラスミドは、配列番号１０、１１、２５～３４、５８、または５９のヌクレオチド配列を含む。
【0227】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子を生成する方法は、配列番号３５～４３に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、組換えポリヌクレオチドまたはプラスミドの使用を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチドまたはプラスミドは、配列番号３５～４３のヌクレオチド配列を含む。
【0228】
いくつかの実施形態において、本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を生成する方法であって、ｒＡＡＶ粒子を生成可能な細胞を培養することを含み、細胞が、（ｉ）ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、（ｉｉ）機能的ｒｅｐ遺伝子をコードするポリヌクレオチドと、（ｉｉｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端リピート（ＩＴＲ）と、標的細胞内での遺伝子産物の発現を指示する配列に作用可能に結合した遺伝子産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列とを含むゲノムを含む、ポリヌクレオチドと、（ｉｖ）ＡＡＶカプシドへのゲノムのパッケージングを可能にする条件下で、ＡＡＶカプシドタンパク質へのゲノムのパッケージングを可能にするための、十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドであって、本明細書に記載の組換えポリヌクレオチドまたは本明細書に記載のプラスミドを独立して含む、十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドは、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列とを含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列は、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードする。いくつかの実施形態において、十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドは、配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドは、配列番号３７のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドは、配列番号３５～４３に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドは、配列番号１０、１１、２５～３４、５８、または５９に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、この方法は、ｒＡＡＶ粒子を回収することをさらに含む。いくつかの実施形態において、細胞は、ｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子をコードする１つのポリヌクレオチドと、パッケージングに必要なアデノウイルスヘルパー機能（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）をコードする本明細書で開示する１つのポリヌクレオチドと、パッケージング対象のｒＡＡＶゲノムをコードする１つのポリヌクレオチドとを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は浮遊培養物である。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約４００リットル～約５，０００リットルの体積を有する。
【0229】
いくつかの実施形態において、本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を生成する方法であって、（ａ）細胞を含む細胞培養物を準備することと、（ｂ）当該細胞に、（ｉ）ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、（ｉｉ）機能的ｒｅｐ遺伝子をコードするポリヌクレオチドと、（ｉｉｉ）少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端リピート（ＩＴＲ）と、標的細胞内での遺伝子産物の発現を指示する配列に作用可能に結合した遺伝子産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列とを含むゲノムを含む、ポリヌクレオチドと、（ｉｖ）ＡＡＶカプシドへのゲノムのパッケージングを可能にする条件下で、ＡＡＶカプシドタンパク質へのゲノムのパッケージングを可能にするための、十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドであって、本明細書に記載の組換えポリヌクレオチドまたは本明細書に記載のプラスミドを独立して含む、十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドとを含む、１つ以上のポリヌクレオチドを導入することと、（ｃ）ｒＡＡＶ粒子の生成が可能な条件下で細胞培養物を維持することとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドは、アデノウイルスＥ２Ａ ＤＢＰをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６及びＯＲＦ７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ／ＩＩ遺伝子をコードするヌクレオチド配列とを含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉをコードするヌクレオチド配列は、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩをコードする。いくつかの実施形態において、十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドは、配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドは、配列番号３７のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドは、配列番号３５～４３に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、十分なヘルパー機能を含む１つ以上のポリヌクレオチドは、配列番号１０、１１、２５～３４、５８、または５９に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、この方法は、ｒＡＡＶ粒子を回収することをさらに含む。いくつかの実施形態において、細胞に導入される１つ以上のポリヌクレオチドは、３つのポリヌクレオチド（１つはｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子をコードし、１つはパッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）をコードする本明細書で開示するポリヌクレオチドであり、１つはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノムをコードする）の混合物を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は浮遊培養物である。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約４００リットル～約５，０００リットルの体積を有する。
【0230】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示する方法は、細胞に、ＡＡＶカプシドタンパク質及び機能的ｒｅｐ遺伝子をコードするポリヌクレオチドを導入することを含む。
【0231】
いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドを細胞に導入することは、形質移入により行われる。
【0232】
いくつかの実施形態において、細胞は哺乳類細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は昆虫細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ由来細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＨｅＬａ細胞、ＳＦ－９細胞、ＢＨＫ細胞、ベロ細胞、ＣＡＰ細胞、またはＰｅｒＣ６細胞である。いくつかの実施形態において、細胞はＨＥＫ２９３細胞である。
【0233】
いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊培養物または接着培養物である。いくつかの実施形態において、細胞培養物は浮遊培養物である。
【0234】
いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約５０リットル～約２０，０００リットルの体積を有する。
【0235】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、参照方法よりも多く、ＧＣ／ｍｌとして測定されるｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、参照方法は、配列番号３５のヌクレオチド配列を含むヘルパー機能を含むポリヌクレオチドを使用する。いくつかの実施形態において、参照方法は、配列番号４４のヌクレオチド配列を含むヘルパー機能を含むポリヌクレオチドを使用する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、参照方法よりも少なくとも約１０％多く、ＧＣ／ｍｌとして測定されるｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、参照方法よりも少なくとも約１０％多く、ＧＣ／ｍｌとして測定されるｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、参照方法よりも少なくとも約２０％多く、ＧＣ／ｍｌとして測定されるｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、参照方法よりも少なくとも約３０％多く、ＧＣ／ｍｌとして測定されるｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、参照方法よりも少なくとも約４０％多く、ＧＣ／ｍｌとして測定されるｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、参照方法よりも少なくとも約５０％多く、ＧＣ／ｍｌとして測定されるｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、参照方法よりも少なくとも約７０％多く、ＧＣ／ｍｌとして測定されるｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、参照方法よりも少なくとも約９０％多く、ＧＣ／ｍｌとして測定されるｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、参照方法よりも少なくとも約２倍多く、ＧＣ／ｍｌとして測定されるｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、この方法は、参照方法よりも少なくとも約３倍多く、ＧＣ／ｍｌとして測定されるｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、この方法は、参照方法よりも少なくとも約４倍多く、ＧＣ／ｍｌとして測定されるｒＡＡＶ粒子を生成する。
【0236】
いくつかの実施形態において、この方法は、参照方法よりも多くの完全カプシドを含むｒＡＡＶ粒子の集団を生成する。いくつかの実施形態において、参照方法は、配列番号３５のヌクレオチド配列を含むヘルパー機能を含むポリヌクレオチドを使用する。いくつかの実施形態において、参照方法は、配列番号４４のヌクレオチド配列を含むヘルパー機能を含むポリヌクレオチドを使用する。
【0237】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶＭＹＯ、ＭｙｏＡＡＶ．１Ａ、ＭｙｏＡＡＶ１Ｃ、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、またはＡＡＶ．ｈｕ３７血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む。
【0238】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、遺伝子産物をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子産物は、ポリペプチドまたは二本鎖ＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、遺伝子産物はポリペプチドである。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、融合タンパク質、Ｆｃ融合ポリペプチド、イムノアドヘシン、免疫グロブリン、操作タンパク質、タンパク質フラグメント、または酵素をコードする。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドに作用可能に結合した調節エレメントを含む。
【0239】
いくつかの実施形態において、遺伝子産物は、抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ、抗カリクレイン抗体、抗ＴＮＦ抗体、ミクロジストロフィン、ミニジストロフィン、イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、またはＶＥＧＦ受容体１の非膜関連スプライスバリアント（ｓＦｌｔ－１）である。いくつかの実施形態において、遺伝子産物は、ガンマ－サルコグリカン、Ｒａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１／ＣＨＭ）、レチノイドイソメロヒドラーゼ（ＲＰＥ６５）、環状ヌクレオチドゲートチャネルアルファ３（ＣＮＧＡ３）、環状ヌクレオチドゲートチャネルベータ３（ＣＮＧＢ３）、芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、リソソーム関連膜タンパク質２アイソフォームＢ（ＬＡＭＰ２Ｂ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、網膜色素変性ＧＴＰアーゼ制御因子（ＲＰＧＲ）、レチノシシン（ＲＳ１）、筋小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ２ａ）、アフリベルセプト、バッテニン（ＣＬＮ３）、膜貫通ＥＲタンパク質（ＣＬＮ６）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、アクアポリン１（ＡＱＰ１）、ジストロフィン、ミオチューブラリン１（ＭＴＭ１）、フォリスタチン（ＦＳＴ）、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐアーゼ）、アポリポタンパク質Ａ２（ＡＰＯＡ２）、ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、Ｎ－アセチル－アルファ－グルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、アルファ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、ベータ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、アルファ１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）、ホスホジエステラーゼ６Ｂ（ＰＤＥ６Ｂ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ９ＯＴＣ）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ１）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ２）、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３／ＮＴＦ３）、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ミトコンドリアコードＮＡＤＨ：ユビキノンオキシドレダクターゼコアサブユニット４（ＭＴ－ＮＤ４）、保護タンパク質カテプシンＡ（ＰＰＣＡ）、ジスフェリン、ＭＥＲ原がん遺伝子、チロシンキナーゼ（ＭＥＲＴＫ）、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）、または腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）－免疫グロブリン（ＩｇＧ１）Ｆｃ融合物である。いくつかの実施形態において、遺伝子産物はジストロフィンまたはミクロジストロフィンである。いくつかの実施形態において、遺伝子産物はマイクロＲＮＡである。
【0240】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、ｒＡＡＶ粒子及びそれを含む組成物の品質属性を維持または改善しながら、ｒＡＡＶ粒子の生成を増加させる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子及びそれを含む組成物の品質は、ｒＡＡＶ粒子の濃度（例えば、ＧＣ／ｍｌ）、ｒＡＡＶゲノムのコピーを含む粒子のパーセンテージ、ゲノムを含まない粒子の比率、ｒＡＡＶ粒子の感染性、ｒＡＡＶ粒子の安定性、残留する宿主細胞タンパク質の濃度または残留する宿主細胞核酸の濃度（例えば、宿主細胞ゲノムＤＮＡ、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードするプラスミド、ヘルパー機能をコードするプラスミド、ｒＡＡＶゲノムをコードするプラスミド）を定量することにより、評価される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法により生成されるｒＡＡＶ粒子またはそれを含む組成物の品質は、配列番号３５または４４のヌクレオチド配列を含むヘルパープラスミドを用いた参照方法により生成されるｒＡＡＶ粒子または組成物の品質と同じである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法により生成されるｒＡＡＶ粒子またはそれを含む組成物の品質は、配列番号３５または４４のヌクレオチド配列を含むヘルパープラスミドを用いた参照方法により生成されるｒＡＡＶ粒子または組成物の品質よりも良好である。
【0241】
当技術分野では、ｒＡＡＶ粒子の生成のための多数の細胞培養に基づく系が知られており、これらはいずれも、本明細書に記載の方法の実施に使用することができる。ｒＡＡＶウイルス粒子を生成するためのｒＡＡＶ生成培養物は、（１）好適な宿主細胞（例えば、ヒト由来細胞株（例えば、ＨｅＬａ、Ａ５４９、またはＨＥＫ２９３細胞及びその派生物（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞））、哺乳類細胞株（例えば、ベロ）、羊膜細胞由来細胞（例えば、ＣＡＰ（登録商標）細胞）、ＣＨＯ細胞もしくはＣＨＯ由来細胞を含む）、（２）野生型もしくは変異型アデノウイルス（例えば、温度感受性アデノウイルス）、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、またはヘルパー機能を提供するプラスミドコンストラクトによって提供される、好適なヘルパーウイルス機能、（３）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子ならびに遺伝子産物、（４）ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する導入遺伝子（例えば、治療用導入遺伝子）、ならびに（５）ｒＡＡＶ生成を支持するための好適な培地及び培地構成成分を必要とする。
【0242】
当業者は、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ＡＡＶヘルパー遺伝子（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）、ならびにｒＡＡＶゲノム（逆方向末端リピート（ＩＴＲ）に隣接する１つ以上の目的遺伝子を含む）を細胞に導入して、ｒＡＡＶを生成またはパッケージングすることができる多数の方法を認識している。「アデノウイルスヘルパー機能」という表現は、ＡＡＶが細胞内で効率的に成長するように細胞内で（ＲＮＡまたはタンパク質として）発現する複数のウイルスヘルパー遺伝子を意味する。当業者は、アデノウイルス及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を含めたヘルパーウイルスがＡＡＶ複製を促進すること、そして、必須機能を提供するある特定の遺伝子が同定されており、例えば、ヘルパーが、このようなＡＡＶ遺伝子発現及び複製を促進する細胞環境への変化を誘導し得ることを理解している。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ヘルパー遺伝子、ならびにｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ヘルパー遺伝子、ならびにｒＡＡＶゲノムをコードする１つ以上のプラスミドベクターの形質移入により、細胞に導入される。
【0243】
ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ヘルパー遺伝子、及び／またはｒＡＡＶゲノムをコードするプラスミドまたはウイルスベクターを開発する分子生物学技法は、当技術分野で一般的に知られている。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、１つのプラスミドベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶヘルパー遺伝子（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）は、１つのプラスミドベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、Ｅ１ａ遺伝子またはＥ１ｂ遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現し、残りのＡＡＶヘルパー遺伝子は、１つのウイルスベクターによる形質移入によって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、Ｅ１ａ遺伝子及びＥ１ｂ遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現し、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子は、１つのプラスミドベクターによる形質移入によって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、１つ以上のヘルパー遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現し、１つ以上のヘルパー遺伝子は、１つのプラスミドベクターによる形質移入によって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、ヘルパー遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、１つのウイルスベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶヘルパー遺伝子（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）は、１つのウイルスベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、Ｅ１ａ遺伝子またはＥ１ｂ遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現し、残りのＡＡＶヘルパー遺伝子は、１つのウイルスベクターによる形質移入によって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、Ｅ１ａ遺伝子及びＥ１ｂ遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現し、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子は、１つのウイルスベクターによる形質移入によって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、１つ以上のヘルパー遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現し、１つ以上のヘルパー遺伝子は、１つのウイルスベクターによる形質移入によって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、パッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能、及びパッケージング対象のｒＡＡＶゲノムは、１つ以上のポリヌクレオチド、例えばベクターを用いた形質移入によって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、３つのポリヌクレオチドの混合物（１つはｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子をコードし、１つはパッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）をコードし、１つはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノムをコードする）を細胞に形質移入することを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、またはＡＡＶ．７ｍ８ ｃａｐ遺伝子である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７をコードする。いくつかの実施形態において、パッケージング対象のｒＡＡＶゲノムをコードするベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲに隣接する目的遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶＭＹＯ、ＭｙｏＡＡＶ．１Ａ、ＭｙｏＡＡＶ１Ｃ、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、またはその他のＡＡＶ血清型に由来する。
【0244】
任意のベクターの組合せを使用して、ｒＡＡＶ粒子が生成またはパッケージングされる細胞に、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ＡＡＶヘルパー遺伝子、ならびにｒＡＡＶゲノムを導入することができる。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、ＡＡＶ逆方向末端リピート（ＩＴＲ）に隣接する対象遺伝子を含むｒＡＡＶゲノムをコードする第１のプラスミドベクターと、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする第２のベクターと、ヘルパー遺伝子をコードする第３のベクターとを使用することができる。いくつかの実施形態において、３つのベクターの混合物を細胞内に同時形質移入することができる。
【0245】
いくつかの実施形態において、プラスミドベクターに加えてウイルスベクターを共に使用することにより、形質移入及び感染の組合せが使用される。
【0246】
いくつかの実施形態において、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子のうちの１つ以上ならびにＡＡＶヘルパー遺伝子は、細胞によって構成的に発現し、細胞に形質移入または形質導入する必要がない。いくつかの実施形態において、細胞は、ｒｅｐ及び／またはｃａｐ遺伝子を構成的に発現する。いくつかの実施形態において、細胞は、１つ以上のＡＡＶヘルパー遺伝子を構成的に発現する。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｅ１ａを構成的に発現する。いくつかの実施形態において、細胞は、ｒＡＡＶゲノムをコードする安定的な導入遺伝子を含む。
【0247】
いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ、ｃａｐ、及びヘルパー遺伝子（例えば、Ｅｌａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、またはＶＡ遺伝子）は、任意のＡＡＶ血清型とすることができる。同様に、ＡＡＶ ＩＴＲも、任意のＡＡＶ血清型とすることができる。例えば、いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶＭＹＯ、ＭｙｏＡＡＶ．１Ａ、ＭｙｏＡＡＶ１Ｃ、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、またはその他のＡＡＶ血清型（例えば、２つ以上の血清型からの配列を有するハイブリッド血清型）に由来する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ９またはＡＡＶ８ ｃａｐ遺伝子に由来する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶＭＹＯ、ＭｙｏＡＡＶ．１Ａ、ＭｙｏＡＡＶ１Ｃ、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、またはその他のＡＡＶ血清型（例えば、２つ以上の血清型からの配列を有するハイブリッド血清型）に由来する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子生成のためのＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、異なる血清型に由来する。例えば、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ２に由来し、一方ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ９に由来する。
【0248】
当技術分野で知られている任意の好適な培地を、本明細書に記載の方法に従って組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）の生成に使用することができる。このような培地としては、限定されるものではないが、変法イーグル培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、及び米国特許第６，７２３，５５１号（参照によりその全体が本明細書に援用される）で説明されているようなＳｆ－９００ ＩＩ ＳＦＭ培地を含めたＨｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ及びＪＲＨが生産する培地が挙げられる。いくつかの実施形態において、培地は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製のＤｙｎａｍｉｓ（商標）培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地、またはＥｘｐｉ２９３（商標）発現培地を含む。いくつかの実施形態において、培地は、Ｄｙｎａｍｉｓ（商標）培地を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、無血清培地、動物成分フリー培地、または化学的に定義された培地を含む細胞培養物を使用する。いくつかの実施形態において、培地は動物成分フリー培地である。いくつかの実施形態において、培地は、血清を含む。いくつかの実施形態において、培地は、ウシ胎児血清を含む。いくつかの実施形態において、培地は、無グルタミン培地である。いくつかの実施形態において、培地は、グルタミンを含む。いくつかの実施形態において、培地には、栄養素、塩、緩衝剤、及び添加物（例えば、消泡剤）のうちの１つ以上が補充される。いくつかの実施形態において、培地には、グルタミンが補充される。いくつかの実施形態において、培地には、血清が補充される。いくつかの実施形態において、培地には、ウシ胎児血清が補充される。いくつかの実施形態において、培地には、ポロキサマー、例えば、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ １８８ Ｂｉｏが補充される。いくつかの実施形態において、培地は、基本培地である。いくつかの実施形態において、培地は、フィード培地である。
【0249】
組換えウイルス（例えば、ｒＡＡＶ）生成培養物は、利用されている特定の宿主細胞に適した様々な条件下で（広い温度範囲にわたり、様々な長さの時間で、など）ルーチン的に成長させることができる。当技術分野で知られているように、ウイルス生成培養物には、浮遊適応性の宿主細胞、例えば、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ベロ細胞、ＣＡＰ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＥＢ６６細胞、ＢＳＣ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＬＬＣ－ＭＫ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＯＳ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＲＫ細胞、ＴＣＭＫ－１細胞、ＬＬＣＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＬＬＣ－ＲＫ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＮＳ－１細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＢＨＫ細胞、３Ｔ３細胞、２９３細胞、ＲＫ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ニワトリ胚細胞、及びＳＦ－９細胞が含まれ、これらは、例えば、スピナーフラスコ、撹拌タンクバイオリアクター、及びＷａｖｅバッグシステムなどの使い捨てシステムを含めた様々な方法で培養することができる。ｒＡＡＶ粒子を生成するための多数の浮遊培養物が当技術分野で知られており、これには例えば、米国特許第６，９９５，００６号、同第９，７８３，８２６号、ならびに米国特許出願公開第２００７０１１１３１２号及び同第２０１２０１２２１５５号が含まれる（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【0250】
当技術分野で組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）を生成することが知られている任意の細胞または細胞株を、本明細書に記載の方法のいずれか１つで使用することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）を生成する、または組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）の生成を増加させる方法は、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ベロ細胞、ＣＡＰ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＥＢ６６細胞、ＬＬＣ－ＭＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＲＫ細胞、ＴＣＭＫ－１細胞、ＰＫ１５細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＮＳ－１細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、ＲＫ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ニワトリ胚細胞、またはＳＦ－９細胞を使用する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、哺乳類細胞を使用する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、昆虫細胞、例えばＳＦ－９細胞を使用する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、浮遊培養での成長に適応した細胞を使用する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞を使用する。
【0251】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞培養物は浮遊培養物である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の大規模浮遊細胞培養物は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞培養物は、無血清培地、動物成分フリー培地、または化学的に定義された培地を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞培養物は無血清培地を含む。いくつかの実施形態において、浮遊適応性細胞は、振とうフラスコ、スピナーフラスコ、細胞バッグ、またはバイオリアクター内で培養される。
【0252】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞培養物は、無血清培地、動物成分フリー培地、または化学的に定義された培地を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞培養物は無血清培地を含む。
【0253】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の大規模浮遊培養細胞培養物は、高密度細胞培養物を含む。いくつかの実施形態において、培養物は、約１×１０Ｅ＋０６細胞／ｍｌ～約３０×１０Ｅ＋０６細胞／ｍｌの総細胞密度を有する。いくつかの実施形態において、細胞の約５０％超が生細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ベロ細胞、ＣＡＰ細胞、またはＳＦ－９細胞である。さらなる実施形態において、細胞はＨＥＫ２９３細胞である。
【0254】
本明細書に記載の方法は、任意のＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子の生成で使用することができる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶＭＹＯ、ＭｙｏＡＡＶ．１Ａ、ＭｙｏＡＡＶ１Ｃ、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶＭＹＯ、ＭｙｏＡＡＶ．１Ａ、ＭｙｏＡＡＶ１Ｃ、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。
【0255】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８のＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９のＡＡＶカプシド血清型を有する。
【0256】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を含む。
【0257】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質またはＡＡＶ９カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一のＡＡＶ８カプシドタンパク質を有する、カプシドタンパク質を含む。
【0258】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一のＡＡＶ９カプシドタンパク質を有する、カプシドタンパク質を含む。
【0259】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、またはＡＡＶ．７ｍ８カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上の同一性、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％の同一性を有するカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上の同一性、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％の同一性を有するカプシドタンパク質を含む。
【0260】
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、モザイクカプシドを含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、シュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、２つ以上のＡＡＶカプシド血清型のカプシドタンパク質キメラを含むカプシドを含む。
【0261】
ｒＡＡＶ粒子
提供する方法は、任意の単離された組換えＡＡＶ粒子の生成で使用するのに適している。そのため、ｒＡＡＶは、当技術分野で知られている任意の血清型、修飾物、もしくは派生物、またはこれらの任意の組合せ（例えば、２つ以上の血清型を含む（例えば、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ８、及びｒＡＡＶ９粒子のうちの２つ以上を含む）ｒＡＡＶ粒子の集団）とすることができる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶＭＹＯ、ＭｙｏＡＡＶ．１Ａ、ＭｙｏＡＡＶ１Ｃ、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、または他のｒＡＡＶ粒子、あるいはこれらの２つ以上の組合せである。
提供する方法は、任意の単離された組換えＡＡＶ粒子の生成で使用するのに適している。そのため、ｒＡＡＶは、当技術分野で知られている任意の血清型、修飾物、もしくは派生物、またはこれらの任意の組合せ（例えば、２つ以上の血清型を含む（例えば、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ８、及びｒＡＡＶ９粒子のうちの２つ以上を含む）ｒＡＡＶ粒子の集団）とすることができる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶＭＹＯ、ＭｙｏＡＡＶ．１Ａ、ＭｙｏＡＡＶ１Ｃ、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、または他のｒＡＡＶ粒子、あるいはこれらの２つ以上の組合せである。
【0262】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶＭＹＯ、ＭｙｏＡＡＶ．１Ａ、ＭｙｏＡＡＶ１Ｃ、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、またはこれらの派生物、修飾物、もしくはシュードタイプから選択されるＡＡＶ血清型からのカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ｒＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶＭＹＯ、ＭｙｏＡＡＶ．１Ａ、ＭｙｏＡＡＶ１Ｃ、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一である、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち最大１００％同一である、カプシドタンパク質を含む。
【0263】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶＭＹＯ、ＭｙｏＡＡＶ．１Ａ、ＭｙｏＡＡＶ１Ｃ、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、またはこれらの派生物、修飾物、もしくはシュードタイプから選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶＭＹＯ、ＭｙｏＡＡＶ．１Ａ、ＭｙｏＡＡＶ１Ｃ、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一である、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち最大１００％同一である、カプシドタンパク質を含む。
【0264】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、Ｚｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１２（６）：１０５６－１０６８（参照によりその全体が援用される）で説明されているように、Ａｎｃ８０またはＡｎｃ８０Ｌ６５のカプシドを含む。ある特定の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，１９３，９５６号、第９４５８５１７号、及び第９，５８７，２８２号、ならびに米国特許出願公開第２０１６／０３７６３２３号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で説明されているように、アミノ酸挿入物：ＬＧＥＴＴＲＰまたはＬＡＬＧＥＴＴＲＰのうちの１つを有するカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，１９３，９５６号、第９，４５８，５１７号、及び第９，５８７，２８２号、ならびに米国特許出願公開第２０１６／０３７６３２３号（これらの各々は、参照によりその全体が明細書に援用される）で説明されているように、ＡＡＶ．７ｍ８のカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，５８５，９７１号で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えばＡＡＶＰＨＰ．Ｂを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，８４０，７１９号及びＷＯ２０１５／０１３３１３（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えば、ＡＡＶ．Ｒｈ７４及びＲＨＭ４－１を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＷＯ２０１４／１７２６６９（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えばＡＡＶ ｒｈ．７４を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、Ｇｅｏｒｇｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２３：８５７－８６２及びＧｅｏｒｇｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２５：４５０（これらの各々は、参照によりその全体が援用される）で説明されているように、ＡＡＶ２／５のカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＷＯ２０１７／０７０４９１（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えばＡＡＶ２ｔＹＦを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、Ｐｕｚｚｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄ．２９（９）：４１８（参照によりその全体が援用される）で説明されているようなＡＡＶＬＫ０３またはＡＡＶ３Ｂのカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第８，６２８，９６６号、第ＵＳ８，９２７，５１４号、第ＵＳ９，９２３，１２０号、及びＷＯ２０１６／０４９２３０で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えば、ＨＳＣ１、ＨＳＣ２、ＨＳＣ３、ＨＳＣ４、ＨＳＣ５、ＨＳＣ６、ＨＳＣ７、ＨＳＣ８、ＨＳＣ９、ＨＳＣ１０、ＨＳＣ１１、ＨＳＣ１２、ＨＳＣ１３、ＨＳＣ１４、ＨＳＣ１５、またはＨＳＣ１６を含む（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。他の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、筋組織に対する向性が増強されたカプシドを含み、このようなカプシドは、目的の親カプシドにＲＧＤ含有ペプチドを挿入することにより操作される。このような例示的なカプシドとしては、ＡＡＶＭＹＯ（ＡＡＶ９－ ＲＧＤＬＧＬＳ）、ＭｙｏＡＡＶ．１Ａ（ＡＡＶ９－ＲＧＤＬＴＴＰ）、及びＭｙｏＡＡＶ１Ｃ（ＡＡＶ９－ＲＧＤＬＳＴＰ）（ＡＡＶ９の残基Ｑ５８８の後に挿入されたペプチド）がある。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１９／２０７１３２号、同第ＷＯ２０２０／２０６１８９号、同第ＷＯ２０２１／０７２１９７号、同第ＷＯ２０２１／０５０９７４号、同第ＷＯ２０２１／０７７０００号、及び同第ＷＯ２０２２／０２０６１６号に開示されている任意のＡＡＶカプシドを含む。
【0265】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、以下の特許及び特許出願（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）：米国特許第７，２８２，１９９号、第７，９０６，１１１号、第８，５２４，４４６号、第８，９９９，６７８号、第８，６２８，９６６号、第８，９２７，５１４号、第８，７３４，８０９号、第ＵＳ９，２８４，３５７号、第９，４０９，９５３号、第９，１６９，２９９号、第９，１９３，９５６号、第９４５８５１７、及び第９，５８７，２８２号、米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号、第２０１５／０１２６５８８号、第２０１７／００６７９０８号、第２０１３／０２２４８３６号、第２０１６／０２１５０２４号、第２０１７／００５１２５７号、ならびに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号、第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５のいずれかで開示されているＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、以下の特許及び特許出願（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）のいずれかで開示されているＡＡＶカプシドのＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一である、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち最大１００％同一であるカプシドタンパク質を有する：米国特許第７，２８２，１９９号、第７，９０６，１１１号、第８，５２４，４４６号、第８，９９９，６７８号、第８，６２８，９６６号、第８，９２７，５１４号、第８，７３４，８０９号、第ＵＳ９，２８４，３５７号、第９，４０９，９５３号、第９，１６９，２９９号、第９，１９３，９５６号、第９４５８５１７号、及び第９，５８７，２８２号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１５／０３７４８０３号、第２０１５／０１２６５８８号、第２０１７／００６７９０８号、第２０１３／０２２４８３６号、第２０１６／０２１５０２４号、第２０１７／００５１２５７、ならびに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号、第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号。
【0266】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、国際特許出願公開第ＷＯ２００３／０５２０５１号（例えば、配列番号２を参照）、第ＷＯ２００５／０３３３２１号（例えば、配列番号１２３及び８８を参照）、第ＷＯ０３／０４２３９７号（例えば、配列番号２、８１、８５、及び９７を参照）、第ＷＯ２００６／０６８８８８号（例えば、配列番号１及び３～６を参照）、第ＷＯ２００６／１１０６８９号（例えば、配列番号５～３８を参照）、第ＷＯ２００９／１０４９６４号（例えば、配列番号１～５、７、９、２０、２２、２４、及び３１を参照）、第ＷＯ２０１０／１２７０９７号（例えば、配列番号５～３８を参照）、ならびに第ＷＯ２０１５／１９１５０８号（例えば、配列番号８０～２９４を参照）、ならびに米国特許出願公開第２０１５００２３９２４号（例えば、配列番号１、５～１０を参照）（これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されているカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、以下で開示されているＡＡＶカプシドのＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３配列に対し、少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一であるカプシドタンパク質を有する：国際特許出願公開第ＷＯ２００３／０５２０５１号（例えば、配列番号２を参照）、第ＷＯ２００５／０３３３２１号（例えば、配列番号１２３及び８８を参照）、第ＷＯ０３／０４２３９７号（例えば、配列番号２、８１、８５、及び９７を参照）、第ＷＯ２００６／０６８８８８号（例えば、配列番号１及び３～６を参照）、第ＷＯ２００６／１１０６８９号（例えば、配列番号５～３８を参照）、第ＷＯ２００９／１０４９６４号（例えば、配列番号１～５、７、９、２０、２２、２４、及び３１を参照）、第ＷＯ２０１０／１２７０９７号（例えば、配列番号５～３８を参照）、ならびに第ＷＯ２０１５／１９１５０８号（例えば、配列番号８０～２９４を参照）、ならびに米国特許出願公開第２０１５００２３９２４号（例えば、配列番号１、５～１０を参照）。
【0267】
ＡＡＶベースウイルスベクターの核酸配列、ならびに組換えＡＡＶ及びＡＡＶカプシドを作製する方法は、例えば、以下で教示されている：米国特許第７，２８２，１９９号、第７，９０６，１１１号、第８，５２４，４４６号、第８，９９９，６７８号、第８，６２８，９６６号、第８，９２７，５１４号、第８，７３４，８０９号、第ＵＳ９，２８４，３５７号、第９，４０９，９５３号、第９，１６９，２９９号、第９，１９３，９５６号、第９４５８５１７号、及び第９，５８７，２８２号、米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号、第２０１５／０１２６５８８号、第２０１７／００６７９０８号、第２０１３／０２２４８３６号、第２０１６／０２１５０２４号、第２０１７／００５１２５７号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号、第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号、第ＷＯ２００３／０５２０５１号、第ＷＯ２００５／０３３３２１号、第ＷＯ０３／０４２３９７号、第ＷＯ２００６／０６８８８８号、第ＷＯ２００６／１１０６８９号、第ＷＯ２００９／１０４９６４号、第ＷＯ２０１０／１２７０９７号、及び第ＷＯ２０１５／１９１５０８号、ならびに米国特許出願公開第２０１５００２３９２４号。
【0268】
提供される方法は、導入遺伝子をコードする組換えＡＡＶの生成で使用するのに適している。ある特定の実施形態において、導入遺伝子は表１Ａ～１Ｃに由来する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、以下の構成要素：（１）発現カセットに隣接するＡＡＶ逆方向末端リピートと、（２）調節制御要素、例えば、ａ）プロモーター／エンハンサー、ｂ）ポリＡシグナル、及びｃ）任意選択でイントロンと、（３）導入遺伝子をコードする核酸配列とを含む、ベクターを含む。インタクトなまたは実質的にインタクトなモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を発現させるための他の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、以下の構成要素：（１）発現カセットに隣接するＡＡＶ逆方向末端リピートと、（２）調節制御要素、例えば、ａ）プロモーター／エンハンサー、ｂ）ポリＡシグナル、及びｃ）任意選択でイントロンと、（３）抗体の軽鎖Ｆａｂ及び重鎖Ｆａｂ、または少なくとも重鎖または軽鎖Ｆａｂ、ならびに任意選択で重鎖Ｆｃ領域をコードする核酸配列とを含む、ベクターを含む。インタクトなまたは実質的にインタクトなｍＡｂを発現させるためのさらに他の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、以下の構成要素を含むベクターを含む：（１）発現カセットに隣接するＡＡＶ逆方向末端リピート；（２）調節制御エレメント、例えば、ａ）プロモーター／エンハンサー、ｂ）ポリＡシグナル、及びｃ）任意選択でイントロン；ならびに（３）以下の重鎖Ｆａｂ：抗ＶＥＧＦ（例えば、セバシズマブ、ラニビズマブ、ベバシズマブ、及びブロルシズマブ）、抗ＥｐｏＲ（例えば、ＬＫＡ－６５１）、抗ＡＬＫ１（例えば、アスクリンバクマブ）、抗Ｃ５（例えば、テシドルマブ及びエクリズマブ）、抗ＣＤ１０５（例えば、カロツキシマブ）、抗ＣＣ１Ｑ（例えば、ＡＮＸ－００７）、抗ＴＮＦα（アダリムマブ、インフリキシマブ、及びゴリムマブ）、抗ＲＧＭａ（例えば、エレザヌマブ）、抗ＴＴＲ（例えば、ＮＩ－３０１及びＰＲＸ－００４）、抗ＣＴＧＦ（例えば、パムレブルマブ）、抗ＩＬ６Ｒ（例えば、サトラリズマブ及びサリルマブ）、抗ＩＬ４Ｒ（例えば、デュピルマブ）、抗ＩＬ１７Ａ（例えば、イキセキズマブ及びセクキヌマブ）、抗ＩＬ－５（例えば、メポリズマブ）、抗ＩＬ１２／ＩＬ２３（例えば、ウステキヌマブ）、抗ＣＤ１９（例えば、イネビリズマブ）、抗ＩＴＧＦ７ ｍＡｂ（例えば、エトロリズマブ）、抗ＳＯＳＴ ｍＡｂ（例えば、ロモソズマブ）、抗ｐＫａｌ ｍＡｂ（例えば、ラナデルマブ）、抗ＩＴＧＡ４（例えば、ナタリズマブ）、抗ＩＴＧＡ４Ｂ７（例えば、ベドリズマブ）、抗ＢＬｙＳ（例えば、ベリムマブ）、抗ＰＤ－１（例えば、ニボルマブ及びペムブロリズマブ）、抗ＲＡＮＫＬ（例えば、デンソマブ）、抗ＰＣＳＫ９（例えば、アリロクマブ及びエボロクマブ）、抗ＡＮＧＰＴＬ３（例えば、エビナクマブ＊）、抗ＯｘＰＬ（例えば、Ｅ０６）、抗ｆＤ（例えば、ラムパリズマブ）、または抗ＭＭＰ９（例えば、アンデカリキシマブ）；
任意選択で、治療抗体のネイティブ形態と同じアイソタイプのＦｃポリペプチド、例えば、ＩｇＧアイソタイプアミノ酸配列ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、もしくはＩｇＧ４、またはその修飾Ｆｃ；ならびに以下の軽鎖：抗ＶＥＧＦ（例えば、セバシズマブ、ラニビズマブ、ベバシズマブ、及びブロルシズマブ）、抗ＥｐｏＲ（例えば、ＬＫＡ－６５１）、抗ＡＬＫ１（例えば、アスクリンバクマブ）、抗Ｃ５（例えば、テシドルマブ及びエクリズマブ）、抗ＣＤ１０５または抗ＥＮＧ（例えば、カロツキシマブ）、抗ＣＣ１Ｑ（例えば、ＡＮＸ－００７）、抗ＴＮＦα（例えば、アダリムマブ、インフリキシマブ、及びゴリムマブ）、抗ＲＧＭａ（例えば、エレザヌマブ）、抗ＴＴＲ（例えば、ＮＩ－３０１及びＰＲＸ－００４）、抗ＣＴＧＦ（例えば、パムレブルマブ）、抗ＩＬ６Ｒ（例えば、サトラリズマブ及びサリルマブ）、抗ＩＬ４Ｒ（例えば、デュピルマブ）、抗ＩＬ１７Ａ（例えば、イキセキズマブ及びセクキヌマブ）、抗ＩＬ－５（例えば、メポリズマブ）、抗ＩＬ１２／ＩＬ２３（例えば、ウステキヌマブ）、抗ＣＤ１９（例えば、イネビリズマブ）、抗ＩＴＧＦ７ ｍＡｂ（例えば、エトロリズマブ）、抗ＳＯＳＴ ｍＡｂ（例えば、ロモソズマブ）、抗ｐＫａｌ ｍＡｂ（例えば、ラナデルマブ）、抗ＩＴＧＡ４（例えば、ナタリズマブ）、抗ＩＴＧＡ４Ｂ７（例えば、ベドリズマブ）、抗ＢＬｙＳ（例えば、ベリムマブ）、抗ＰＤ－１（例えば、ニボルマブ及びペムブロリズマブ）、抗ＲＡＮＫＬ（例えば、デンソマブ）、抗ＰＣＳＫ９（例えば、アリロクマブ及びエボロクマブ）、抗ＡＮＧＰＴＬ３（例えば、エビナクマブ）、抗ＯｘＰＬ（例えば、Ｅ０６）、抗ｆＤ（例えば、ラムパリズマブ）、または抗ＭＭＰ９（例えば、アンデカリキシマブ）、をコードする核酸配列であって、当該重鎖（Ｆａｂ及び任意選択でＦｃ領域）ならびに当該軽鎖が、自己切断フリン（Ｆ）／Ｆ２Ａまたはフレキシブルリンカーにより分離され、当該重鎖及び当該軽鎖ポリペプチドの等量の発現を確実にする、核酸配列。
任意選択で、治療抗体のネイティブ形態と同じアイソタイプのＦｃポリペプチド、例えば、ＩｇＧアイソタイプアミノ酸配列ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、もしくはＩｇＧ４、またはその修飾Ｆｃ；ならびに以下の軽鎖：抗ＶＥＧＦ（例えば、セバシズマブ、ラニビズマブ、ベバシズマブ、及びブロルシズマブ）、抗ＥｐｏＲ（例えば、ＬＫＡ－６５１）、抗ＡＬＫ１（例えば、アスクリンバクマブ）、抗Ｃ５（例えば、テシドルマブ及びエクリズマブ）、抗ＣＤ１０５または抗ＥＮＧ（例えば、カロツキシマブ）、抗ＣＣ１Ｑ（例えば、ＡＮＸ－００７）、抗ＴＮＦα（例えば、アダリムマブ、インフリキシマブ、及びゴリムマブ）、抗ＲＧＭａ（例えば、エレザヌマブ）、抗ＴＴＲ（例えば、ＮＩ－３０１及びＰＲＸ－００４）、抗ＣＴＧＦ（例えば、パムレブルマブ）、抗ＩＬ６Ｒ（例えば、サトラリズマブ及びサリルマブ）、抗ＩＬ４Ｒ（例えば、デュピルマブ）、抗ＩＬ１７Ａ（例えば、イキセキズマブ及びセクキヌマブ）、抗ＩＬ－５（例えば、メポリズマブ）、抗ＩＬ１２／ＩＬ２３（例えば、ウステキヌマブ）、抗ＣＤ１９（例えば、イネビリズマブ）、抗ＩＴＧＦ７ ｍＡｂ（例えば、エトロリズマブ）、抗ＳＯＳＴ ｍＡｂ（例えば、ロモソズマブ）、抗ｐＫａｌ ｍＡｂ（例えば、ラナデルマブ）、抗ＩＴＧＡ４（例えば、ナタリズマブ）、抗ＩＴＧＡ４Ｂ７（例えば、ベドリズマブ）、抗ＢＬｙＳ（例えば、ベリムマブ）、抗ＰＤ－１（例えば、ニボルマブ及びペムブロリズマブ）、抗ＲＡＮＫＬ（例えば、デンソマブ）、抗ＰＣＳＫ９（例えば、アリロクマブ及びエボロクマブ）、抗ＡＮＧＰＴＬ３（例えば、エビナクマブ）、抗ＯｘＰＬ（例えば、Ｅ０６）、抗ｆＤ（例えば、ラムパリズマブ）、または抗ＭＭＰ９（例えば、アンデカリキシマブ）、をコードする核酸配列であって、当該重鎖（Ｆａｂ及び任意選択でＦｃ領域）ならびに当該軽鎖が、自己切断フリン（Ｆ）／Ｆ２Ａまたはフレキシブルリンカーにより分離され、当該重鎖及び当該軽鎖ポリペプチドの等量の発現を確実にする、核酸配列。
【0269】
ｍＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ構造におけるようなガイドＲＮＡ（アンチセンス鎖）及び／またはパッセンジャーＲＮＡ（センス鎖）の文脈におけるアンチセンスＲＮＡ）を発現させるための他の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、以下の構成要素を含むベクターを含む：（１）発現カセットに隣接するＡＡＶ逆方向末端リピート；（２）調節制御エレメント、例えば、ａ）プロモーター／エンハンサー、ｂ）ポリＡシグナル、ｃ）任意選択でイントロン；及び（３）ｍＲＮＡをコードする核酸配列。いくつかの実施形態において、導入遺伝子（ｍＲＮＡをコードする核酸配列）は、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはＵ７－ｓｎＲＮＡコード配列を含むまたはそれからなる。
【0270】
（表１Ａ）
【0271】
（表１Ｂ）
【0272】
（表１Ｃ）
【0273】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、抗ＶＥＧＦ ＦａｂをコードするｒＡＡＶウイルスベクターである。特定の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、抗ＶＥＧＦ ＦａｂをコードするｒＡＡＶ８ベースのウイルスベクターである。より特定の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ラニビズマブをコードするｒＡＡＶ８ベースのウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）をコードするｒＡＡＶウイルスベクターである。特定の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＩＤＵＡをコードするｒＡＡＶ９ベースのウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）をコードするｒＡＡＶウイルスベクターである。特定の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＩＤＳをコードするｒＡＡＶ９ベースのウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）をコードするｒＡＡＶウイルスベクターである。特定の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＬＤＬＲをコードするｒＡＡＶ８ベースのウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）タンパク質をコードするｒＡＡＶウイルスベクターである。特定の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＴＰＰ１をコードするｒＡＡＶ９ベースのウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＶＥＧＦ受容体１（ｓＦｌｔ－１）の非膜結合型スプライスバリアントをコードするｒＡＡＶウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ガンマ－サルコグリカン、Ｒａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１／ＣＨＭ）、レチノイドイソメロヒドラーゼ（ＲＰＥ６５）、環状ヌクレオチドゲートチャネルアルファ３（ＣＮＧＡ３）、環状ヌクレオチドゲートチャネルベータ３（ＣＮＧＢ３）、芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、リソソーム関連膜タンパク質２アイソフォームＢ（ＬＡＭＰ２Ｂ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、網膜色素変性ＧＴＰアーゼ制御因子（ＲＰＧＲ）、レチノシシン（ＲＳ１）、筋小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ２ａ）、アフリベルセプト、バッテニン（ＣＬＮ３）、膜貫通ＥＲタンパク質（ＣＬＮ６）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、アクアポリン１（ＡＱＰ１）、ジストロフィン、ミクロジストロフィン、ミオチューブラリン１（ＭＴＭ１）、フォリスタチン（ＦＳＴ）、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐアーゼ）、アポリポタンパク質Ａ２（ＡＰＯＡ２）、ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、Ｎ－アセチル－アルファ－グルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、アルファ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、ベータ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、アルファ１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）、ホスホジエステラーゼ６Ｂ（ＰＤＥ６Ｂ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ９ＯＴＣ）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ１）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ２）、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３／ＮＴＦ３）、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ミトコンドリアコードＮＡＤＨ：ユビキノンオキシドレダクターゼコアサブユニット４（ＭＴ－ＮＤ４）、保護タンパク質カテプシンＡ（ＰＰＣＡ）、ジスフェリン、ＭＥＲ原がん遺伝子、チロシンキナーゼ（ＭＥＲＴＫ）、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）、または腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）－免疫グロブリン（ＩｇＧ１）Ｆｃ融合物をコードする、ｒＡＡＶウイルスベクターである。
【0274】
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、シュードタイプＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態において、シュードタイプＡＡＶカプシドは、ｒＡＡＶ２／８またはｒＡＡＶ２／９シュードタイプＡＡＶカプシドである。シュードタイプｒＡＡＶ粒子を生成し使用するための方法は当技術分野で知られている（例えば、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：７６６２－７６７１（２００１）；Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１５２４－１５３２（２０００）；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８：１５８－１６７（２００２）；及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５－３０８１，（２００１）を参照）。
【0275】
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、２つ以上のＡＡＶカプシド血清型のキメラであるカプシドタンパク質を含むカプシドを含む。いくつかの実施形態において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶＭＹＯ、ＭｙｏＡＡＶ．１Ａ、ＭｙｏＡＡＶ１Ｃ、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶ血清型からの２つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質のキメラである。
【0276】
ある特定の実施形態において、１本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）を使用することができる。ある特定の実施形態において、自己相補的ベクター、例えばｓｃＡＡＶを使用することができる（例えば、Ｗｕ，２００７，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１８（２）：１７１－８２；ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，２００１，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．８，Ｎｕｍｂｅｒ １６：１２４８－１２５４；ならびに米国特許第６，５９６，５３５号、第７，１２５，７１７号、及び第７，４５６，６８３号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）を参照）。
【0277】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８のＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９のＡＡＶカプシド血清型を有する。
【0278】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質またはＡＡＶ９カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一のＡＡＶ８カプシドタンパク質を有する、カプシドタンパク質を含む。
【0279】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一のＡＡＶ９カプシドタンパク質を有する、カプシドタンパク質を含む。
【0280】
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、モザイクカプシドを含む。モザイクＡＡＶ粒子は、ＡＡＶの異なる血清型由来のウイルスカプシドタンパク質の混合物から構成される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶＭＹＯ、ＭｙｏＡＡＶ．１Ａ、ＭｙｏＡＡＶ１Ｃ、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ならびにＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択される血清型のカプシドタンパク質を含むモザイクカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．２０、及びＡＡＶｒｈ．７４から選択される血清型のカプシドタンパク質を含むモザイクカプシドを含む。
【0281】
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、シュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態において、シュードタイプｒＡＡＶ粒子は、（ａ）ＡＡＶ ＩＴＲを含む核酸ベクター、ならびに（ｂ）ＡＡＶｘ（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶＭＹＯ、ＭｙｏＡＡＶ．１Ａ、ＭｙｏＡＡＶ１Ｃ、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６）に由来するカプシドタンパク質から構成されたカプシドを含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ．８、及びＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．２０、及びＡＡＶｒｈ．７４から選択されるＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質から構成されたシュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むシュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質から構成されるシュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態において、シュードタイプｒＡＡＶ８またはｒＡＡＶ９粒子は、ｒＡＡＶ２／８またはｒＡＡＶ２／９シュードタイプ粒子である。シュードタイプｒＡＡＶ粒子を生成し使用するための方法は当技術分野で知られている（例えば、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：７６６２－７６７１（２００１）；Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１５２４－１５３２（２０００）；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８：１５８－１６７（２００２）；及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５－３０８１，（２００１）を参照）。
【0282】
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、２つ以上のＡＡＶカプシド血清型のキメラであるカプシドタンパク質を含むカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質と、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶＭＹＯ、ＭｙｏＡＡＶ．１Ａ、ＭｙｏＡＡＶ１Ｃ、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶ血清型からの１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質とのキメラである、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質と、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ｒＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．２０、及びＡＡＶｒｈ．７４から選択されるＡＡＶ血清型からの１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質とのキメラである、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質と、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶＭＹＯ、ＭｙｏＡＡＶ．１Ａ、ＭｙｏＡＡＶ１Ｃ、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択される１つ以上のＡＡＶカプシド血清型のカプシドタンパク質とのキメラである、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質と、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．２０、及びＡＡＶｒｈ．７４から選択される１つ以上のＡＡＶカプシド血清型のカプシドタンパク質とのキメラであるＡＡＶカプシドタンパク質を含む。
【0283】
ｒＡＡＶ粒子を単離するための方法
いくつかの実施形態において、本開示は、単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を生成するための方法であって、不純物を含むフィード（例えば、ｒＡＡＶ生成培養物）からｒＡＡＶ粒子を単離することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む製剤を製造する方法は、（ａ）不純物を含むフィード（例えば、ｒＡＡＶ生成培養物）からｒＡＡＶ粒子を単離することと、及び（ｂ）製剤を生成するために、単離されたｒＡＡＶ粒子を製剤化することとを含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を生成するための方法であって、不純物を含むフィード（例えば、ｒＡＡＶ生成培養物）からｒＡＡＶ粒子を単離することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む製剤を製造する方法は、（ａ）不純物を含むフィード（例えば、ｒＡＡＶ生成培養物）からｒＡＡＶ粒子を単離することと、及び（ｂ）製剤を生成するために、単離されたｒＡＡＶ粒子を製剤化することとを含む。
【0284】
いくつかの実施形態において、本開示はさらに、医薬単位薬用量の単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む製剤を生成するための方法であって、不純物を含むフィード（例えば、ｒＡＡＶ生成培養物）からｒＡＡＶ粒子を単離することと、単離されたｒＡＡＶ粒子を製剤化することとを含む、方法を提供する。
【0285】
単離されたｒＡＡＶ粒子は、当技術分野で知られている方法を用いて単離することができる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、下流処理、例えば、細胞培養物の収集、（例えば、遠心分離または深層濾過による）収集した細胞培養物の清澄化、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、無菌濾過、またはこれらの任意の組合せ（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、下流処理は、細胞培養物の収集、（例えば、遠心分離または深層濾過による）収集した細胞培養物の清澄化、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及び無菌濾過のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つを含む。いくつかの実施形態において、下流処理は、細胞培養物の収集、（例えば、深層濾過による）収集した細胞培養物の清澄化、無菌濾過、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、及びアニオン交換クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態において、下流処理は、収集した細胞培養物の清澄化、無菌濾過、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、及びアニオン交換クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態において、下流処理は、深層濾過による収集した細胞培養物の清澄化、無菌濾過、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、及びアニオン交換クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物の清澄化は、無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、下流処理は、遠心分離を含まない。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む。
【0286】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従うｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、細胞培養物の収集、（例えば、深層濾過による）収集した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、第１のタンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、第２のタンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、細胞培養物の収集、（例えば、深層濾過による）収集した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、タンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って生成されたｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、収集した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、第１のタンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、第２のタンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、収集した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、タンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に従って生成されたｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、深層濾過による収集した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、第１のタンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、第２のタンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、深層濾過による収集した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、タンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、この方法は、遠心分離を含まない。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物の清澄化は、無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む。
【0287】
当技術分野では、形質移入、安定細胞株生成、及び感染性ハイブリッドウイルス生成系（アデノウイルス－ＡＡＶハイブリッド、ヘルペスウイルス－ＡＡＶハイブリッド、及びバキュロウイルス－ＡＡＶハイブリッドを含む）を含むｒＡＡＶ粒子の生成のための多数の細胞培養に基づく系が知られている。ｒＡＡＶウイルス粒子を生成するためのｒＡＡＶ生成培養物はいずれも、（１）好適な宿主細胞（例えば、ヒト由来細胞株（例えば、ＨｅＬａ、Ａ５４９、またはＨＥＫ２９３細胞及びその派生物（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞））、哺乳類細胞株（例えば、ベロ）、羊膜細胞由来細胞（例えば、ＣＡＰ細胞）、またはバキュロウイルス生成系の場合は昆虫由来細胞株（例えば、ＳＦ－９）を含む）；（２）野生型もしくは変異型アデノウイルス（例えば、温度感受性アデノウイルス）、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、またはヘルパー機能を提供するプラスミドコンストラクトによって提供される、好適なヘルパーウイルス機能；（３）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子ならびに遺伝子産物；（４）ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する導入遺伝子（例えば、治療用導入遺伝子）；ならびに（５）ｒＡＡＶ生成を支持するための好適な培地及び培地構成成分を必要とする。いくつかの実施形態において、好適なヘルパーウイルスの機能は、本明細書に記載の組換えポリヌクレオチドまたは本明細書に記載のプラスミドにより提供される。当技術分野で知られている好適な培地をｒＡＡＶベクターの生成に使用することができる。このような培地としては、限定されるものではないが、変法イーグル培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、及び米国特許第６，７２３，５５１号（参照によりその全体が本明細書に援用される）で説明されているようなＳｆ－９００ ＩＩ ＳＦＭ培地を含めたＨｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ及びＪＲＨが生産する培地が挙げられる。
【0288】
ｒＡＡＶ生成培養物は、利用されている特定の宿主細胞に適した様々な条件下で（広い温度範囲にわたり、様々な長さの時間で、など）ルーチン的に成長させることができる。当技術分野で知られているように、ｒＡＡＶ生成培養物は、好適な付着依存性容器（例えば、ローラーボトル、中空繊維フィルター、マイクロキャリア、及び充填床または流動床バイオリアクター）中で培養することができる付着依存性の培養物を含む。また、ｒＡＡＶベクター生成培養物は、浮遊適応性の宿主細胞、例えば、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ベロ細胞、ＣＡＰ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＥＢ６６細胞、ＢＳＣ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＬＬＣ－ＭＫ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＯＳ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＲＫ細胞、ＴＣＭＫ－１細胞、ＬＬＣＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＬＬＣ－ＲＫ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＮＳ－１細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＢＨＫ細胞、３Ｔ３細胞、２９３細胞、ＲＫ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ニワトリ胚細胞、またはＳＦ－９細胞も含むことができ、これらは、例えば、スピナーフラスコ、撹拌タンクバイオリアクター、及びＷａｖｅバッグシステムなどの使い捨てシステムを含めた様々な方法で培養することができる。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞である。ｒＡＡＶ粒子を生成するための多数の浮遊培養物が当技術分野で知られており、これには例えば、米国特許第６，９９５，００６号、第９，７８３，８２６号、及び米国特許出願公開第２０１２０１２２１５５号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている培養物が含まれる。
【0289】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ生成培養物は、高密度細胞培養物を含む。いくつかの実施形態において、培養物は、約１×１０Ｅ＋０６細胞／ｍｌ～約３０×１０Ｅ＋０６細胞／ｍｌの総細胞密度を有する。いくつかの実施形態において、細胞の約５０％超が生細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ベロ細胞、ＣＡＰ細胞、またはＳＦ－９細胞である。さらなる実施形態において、細胞はＨＥＫ２９３細胞である。さらなる実施形態において、細胞は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞である。
【0290】
提供される方法の追加の実施形態において、ｒＡＡＶ生成培養物は、ｒＡＡＶ粒子を含む浮遊培養物を含む。ｒＡＡＶ粒子を生成するための多数の浮遊培養物が当技術分野で知られており、これには例えば、米国特許第６，９９５，００６号、第９，７８３，８２６号、及び米国特許出願公開第２０１２０１２２１５５号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている培養物が含まれる。いくつかの実施形態において、浮遊培養物は、哺乳類細胞または昆虫細胞の培養物を含む。いくつかの実施形態において、浮遊培養物は、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ベロ細胞、ＣＡＰ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＥＢ６６細胞、ＢＳＣ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＬＬＣ－ＭＫ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＯＳ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＲＫ細胞、ＴＣＭＫ－１細胞、ＬＬＣＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＬＬＣ－ＲＫ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＮＳ－１細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＢＨＫ細胞、３Ｔ３細胞、２９３細胞、ＲＫ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ニワトリ胚細胞、またはＳＦ－９細胞の培養物を含む。いくつかの実施形態において、浮遊培養物は、ＨＥＫ２９３細胞の培養物を含む。
【0291】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子の生成のための方法は、ｒＡＡＶを生成可能な細胞を含む細胞培養物を準備することと、当該細胞培養物に、約０．１ｍＭ～約２０ｍＭの最終濃度までヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を添加することと、当該ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で当該細胞培養物を維持することとを包含する。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、短鎖脂肪酸またはその塩を含む。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸（例えば、酪酸ナトリウム）、バルプロ酸（例えば、バルプロ酸ナトリウム）、プロピオン酸（例えば、プロピオン酸ナトリウム）、またはこれらの組合せを含む。
【0292】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＷＯ２０２０／０３３８４２（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されているように生成される。
【0293】
組換えＡＡＶ粒子は、インタクトな宿主細胞から培地中へのｒＡＡＶ粒子放出を引き起こすことが当技術分野で知られている条件下で細胞が培養されることを条件に、宿主細胞を含む生成培養物を収集することにより、または生成培養物から消費培地を収集することにより、ｒＡＡＶ生成培養物から収集することができる。また、組換えＡＡＶ粒子は、生成培養物の宿主細胞を溶解することによってｒＡＡＶ生成培養物から収集することもできる。細胞を溶解する好適な方法も当技術分野で知られており、例えば、複数の凍結／解凍サイクル、超音波処理、マイクロ流動化、ならびに化学物質（例えば、界面活性剤及び／またはプロテアーゼ）による処理が挙げられる。
【0294】
収集時に、ｒＡＡＶ生成培養物は、以下：（１）宿主細胞タンパク質；（２）宿主細胞ＤＮＡ；（３）プラスミドＤＮＡ；（４）ヘルパーウイルス；（５）ヘルパーウイルスタンパク質；（６）ヘルパーウイルスＤＮＡ；ならびに（７）培地構成成分（例えば、血清タンパク質、アミノ酸、トランスフェリン、及び他の低分子量タンパク質を含む）のうちの１つ以上を含むことができる。ｒＡＡＶ生成培養物はさらに、生成物関連不純物、例えば、不活性なベクター形態、空のウイルスカプシド、凝集したウイルス粒子またはカプシド、ミスフォールドしたウイルスカプシド、分解されたウイルス粒子を含むことができる。
【0295】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ生成培養物収集物は、宿主細胞デブリを除去するように清澄化される。いくつかの実施形態において、生成培養物収集物は、一連の深層フィルターによる濾過によって清澄化される。また、清澄化は、当技術分野で知られている他の様々な標準的技法により、例えば、遠心分離、または当技術分野で知られている０．２ｍｍ以上の細孔サイズの任意の酢酸セルロースフィルターによる濾過により、達成することができる。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物の清澄化は、無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、生成培養物収集物は、遠心分離によって清澄化される。いくつかの実施形態において、生成培養物収集物の清澄化は、遠心分離を含まない。
【0296】
いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物は、濾過を用いて清澄化される。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物の清澄化は、深層濾過を含む。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物の清澄化はさらに、深層濾過及び無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物は、１つ以上の異なる濾過媒体を含むフィルタートレインを用いて清澄化される。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、１つの深層濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、１つ以上の深層濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、２つの深層濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、１つの無菌濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、２つの深層濾過媒体及び１つの無菌濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、深層フィルター媒体は、多孔質深層フィルターである。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ（登録商標）２０ＭＳ、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｃ０ＨＣ、及び無菌グレード濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ（登録商標）２０ＭＳ、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｃ０ＨＣ、及びＳａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２ ＸＬＧ ０．２μｍを含む。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物は、深層フィルターに接触させる前に前処理される。いくつかの実施形態において、前処理は、収集した細胞培養物に塩を添加することを含む。いくつかの実施形態において、前処理は、収集した細胞培養物に化学凝集剤を添加することを含む。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物は、深層フィルターに接触させる前に前処理されない。
【0297】
いくつかの実施形態において、生成培養物収集物は濾過によって清澄化され、これはＷＯ２０１９／２１２９２１（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている。
【0298】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ生成培養物収集物は、生成培養物中に存在する高分子量ＤＮＡを消化するようにヌクレアーゼ（例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標））またはエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ由来のエンドヌクレアーゼ）で処理される。ヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ消化は、当技術分野で知られている標準的な条件下でルーチン的に実施することができる。例えば、ヌクレアーゼ消化は、周囲温度～３７℃までの範囲の温度の最終濃度１～２．５単位／ｍＬのベンゾナーゼ（登録商標）で、３０分～数時間実施される。
【0299】
無菌濾過は、無菌グレードフィルター媒体を用いた濾過を包含する。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、０．２または０．２２μｍの細孔フィルターである。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）を含む。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を含む。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、親水性の不均一な二重層設計を有する。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、０．８μｍのプレフィルター及び０．２μｍの最終フィルター膜の親水性の不均一な二重層設計を有する。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、１．２μｍのプレフィルター及び０．２μｍの最終フィルター膜の親水性の不均一な二重層設計を有する。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、０．２または０．２２μｍの細孔フィルターである。さらなる実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、０．２μｍの細孔フィルターである。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２ ＸＬＧ ０．２μｍ、Ｄｕｒａｐｏｒｅ（商標）ＰＶＤＦ膜０．４５μｍ、またはＳａｒｔｏｇｕａｒｄ（登録商標）ＰＥＳ １．２μｍ＋０．２μｍの名目孔径の組合せである。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２ ＸＬＧ ０．２μｍである。
【0300】
いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、クロマトグラフィー媒体、例えば、アフィニティークロマトグラフィー媒体に適用される前に、タンジェンシャルフロー濾過（「ＴＦＦ」）を介して濃縮される。ＴＦＦ限外濾過を用いたウイルスの大規模用濃度は、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５（１９９３）で説明されている。清澄化フィードのＴＦＦ濃度により、技術的に管理可能な量の清澄化フィードをクロマトグラフィーにかけることが可能になり、また、長い再循環時間を必要とせずにカラムをより合理的にサイジングすることが可能になる。いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、少なくとも２倍～少なくとも１０倍で濃縮される。いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、少なくとも１０倍～少なくとも２０倍で濃縮される。いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、少なくとも２０倍～少なくとも５０倍で濃縮される。いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、約２０倍に濃縮される。また、当業者は、透析濾過を介して清澄化されたフィードから小分子不純物（例えば、培地成分、血清アルブミン、または他の血清タンパク質を含む細胞培養不純物）を除去するためにＴＦＦが使用されてもよいことも認識するであろう。いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、小分子不純物を除去するために透析濾過に供される。いくつかの実施形態において、透析濾過は、約３～約１０の透析濾過体積の緩衝液を使用することを含む。いくつかの実施形態において、透析濾過は、約５透析濾過体積の緩衝液を使用することを含む。また、当業者は、精製処理における次のステップを実施する前に緩衝液の交換が望ましい場合における精製プロセスの任意のステップでＴＦＦが使用されてもよいことも認識するであろう。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の清澄化されたフィードからｒＡＡＶを単離するための方法は、緩衝液を交換するためのＴＦＦの使用を含む。
【0301】
アフィニティークロマトグラフィーを使用して、組成物からｒＡＡＶ粒子を単離することができる。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィーを使用して、清澄化されたフィードからｒＡＡＶ粒子を単離する。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィーを使用して、タンジェンシャルフロー濾過に供されて清澄化されたフィードからｒＡＡＶ粒子を単離する。好適なアフィニティークロマトグラフィー媒体は当技術分野で知られており、限定されるものではないが、ＡＶＢ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸアフィニティー樹脂、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９アフィニティー樹脂、及びＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８アフィニティー樹脂が挙げられる。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィー媒体は、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９アフィニティー樹脂である。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィー媒体は、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８アフィニティー樹脂である。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィー媒体は、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸアフィニティー樹脂である。
【0302】
アニオン交換クロマトグラフィーを使用して、組成物からｒＡＡＶ粒子を単離することができる。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィーは、最終濃縮及び研磨ステップとしてアフィニティークロマトグラフィーの後に使用される。好適なアニオン交換クロマトグラフィー媒体は当技術分野で知られており、限定されるものではないが、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｑ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）、及びＮ－荷電アミノもしくはイミノ樹脂、例えば、ＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＰＩ、または任意のＤＥＡＥ、ＴＭＡＥ、３級もしくは４級アミン、または当技術分野で知られているＰＥＩベース樹脂が挙げられる（米国特許第６，９８９，２６４号；Ｂｒｕｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ６（５）：６７８－６８６（２００２）；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：２０７９－２０９１（２０００））。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、４級アミンを含む。いくつかの実施形態において、アニオン交換媒体は、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー樹脂である。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、グリシジルメタクリレート－エチレンジメタクリレートポリマーまたはスチレン－ジビニルベンゼンポリマーを含む。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＱＡ－１アドバンストコンポジットカラム（４級アミン）、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＤＥＡＥ－１アドバンストコンポジットカラム（ジエチルアミノ）、ＣＩＭ（登録商標）ＱＡディスク（４級アミン）、ＣＩＭ（登録商標）ＤＥＡＥ、及びＣＩＭ（登録商標）ＥＤＡディスク（エチレンジアミノ）からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＱＡ－１アドバンストコンポジットカラム（４級アミン）である。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＣＩＭ（登録商標）ＱＡディスク（４級アミン）である。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＣＩＭ ＱＡ（ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｓｌｏｖｅｎｉａ）である。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＢＩＡ ＣＩＭ（登録商標）ＱＡ－８０（カラム体積８０ｍＬ）である。当業者は、ｒＡＡＶが樹脂との結合を保ちながら不純物（限定されるものではないが、上流精製ステップによって導入され得る不純物を含む）が除去されるように、好適なイオン強度の洗浄緩衝液が特定され得ることを理解することができる。
【0303】
いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィーは、ＷＯ２０１９／２４１５３５（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示される方法に従って実施される。
【0304】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、単離されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物中のベクターゲノム力価、カプシド力価、及び／または完全なカプシド：空のカプシドの比を定量することを含む。いくつかの実施形態において、ベクターゲノム力価は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）またはデジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）またはドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって定量される。いくつかの実施形態において、カプシド力価は、血清型特異的ＥＬＩＳＡによって定量される。いくつかの実施形態において、完全なカプシド：空のカプシドの比は、分析用超遠心分離（ＡＵＣ）または透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって定量される。
【0305】
いくつかの実施形態において、ベクターゲノム力価、カプシド力価、及び／または完全なカプシド：空のカプシドの比は、分光測光法により、例えば、２６０ｎｍにおける組成物の吸光度を測定することにより、及び２８０ｎｍにおける組成物の吸光度を測定することにより、定量される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、組成物の吸光度を測定する前に変性されない。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、組成物の吸光度を測定する前に変性される。いくつかの実施形態において、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける組成物の吸光度は、分光光度計を用いて定量される。いくつかの実施形態において、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける組成物の吸光度は、ＨＰＬＣを用いて定量される。いくつかの実施形態において、吸光度はピーク吸光度である。２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける組成物の吸光度を測定するためのいくつかの方法が、当技術分野で知られている。単離された組換えｒＡＡＶ粒子を含む組成物のベクターゲノム力価及びカプシド力価を定量する方法は、ＷＯ２０１９／２１２９２２（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている。
【0306】
追加の実施形態において、本開示は、本明細書に記載の方法に従って生成された、単離されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、医薬的に許容される担体を含む医薬組成物である。
【0307】
本明細書で使用する場合、「医薬的に許容される」という用語は、１つ以上の投与経路、ｉｎ ｖｉｖｏ送達または接触に適した、生物学的に許容される製剤、気体、液体、もしくは固体、またはこれらの混合物を意味する。「医薬的に許容される」組成物は、生物学的または他の点で望ましくないものではない材料であり、例えば、この材料は、実質的な望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく対象に投与することができる。したがって、このような医薬組成物は、例えば、本開示の方法に従って単離されたｒＡＡＶを対象に投与する際に使用することができる。このような組成物としては、医薬投与またはｉｎ ｖｉｖｏでの接触または送達と適合性である、溶媒（水性または非水性）、溶液（水性または非水性）、エマルジョン（例えば、水中油または油中水）、懸濁液、シロップ、エリキシル、分散及び懸濁媒体、コーティング、等張性及び吸収の促進剤または遅延剤が挙げられる。水性及び非水性の溶媒、溶液、及び懸濁液は、懸濁剤及び増粘剤を含むことができる。このような医薬的に許容される担体としては、錠剤（コーティングされたまたはコーティングされていない）、カプセル（ハードまたはソフト）、マイクロビーズ、粉末、顆粒、及び結晶が挙げられる。補足活性化合物（例えば、防腐剤、抗微生物剤、抗ウイルス剤、及び抗真菌剤）も、組成物に組み込むことができる。医薬組成物は、本明細書で記載のように、または当業者に知られているように、特定の投与経路または送達経路と適合性であるように製剤化することができる。したがって、医薬組成物には、様々な経路による投与に適した担体、希釈剤、または賦形剤が含まれる。本発明のｒＡＡＶ粒子ならびに方法及び使用に適切な医薬組成物及び送達系は、当技術分野で知られている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２００３）２０ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）１８ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．；Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ（１９９６）１２ｔｈ ｅｄ．，Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ，Ｎ．Ｊ．；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（１９９３），Ｔｅｃｈｎｏｎｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｐａ．；Ａｎｓｅｌ ａｎｄ Ｓｔｏｋｌｏｓａ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（２００１）１１ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．；及びＰｏｚｎａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ （１９８０），Ｒ．Ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２５３－３１５を参照）。
【0308】
いくつかの実施形態において、組成物は、医薬単位用量である。「単位用量」とは、治療される対象のための単位薬用量として適した物理的に別々の単位を意味する。各単位は、任意選択で医薬担体（賦形剤、希釈剤、ビヒクル、または充填剤）と共に所定の量を含み、１回以上の用量で投与されたときに所望の効果（例えば、予防または治療効果）をもたらすように計算される。単位剤形は、例えば、アンプル及びバイアル内にあってもよく、これらは液体組成物、またはフリーズドライもしくは凍結乾燥状態の組成物を含むことができ、例えば、無菌液体担体をｉｎ ｖｉｖｏでの投与または送達の前に添加してもよい。個々の単位剤形は、多回用量キットまたは容器に含めることができる。組換えベクター（例えば、ＡＡＶ）配列、プラスミド、ベクターゲノム、及び組換えウイルス粒子、ならびにこれらの医薬組成物は、投与を容易にし、薬用量を均一にするために、単一または複数の単位用量形態でパッケージ化することができる。いくつかの実施形態において、組成物は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶＭＹＯ、ＭｙｏＡＡＶ．１Ａ、ＭｙｏＡＡＶ１Ｃ、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ならびにＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシド血清型はＡＡＶ８である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシド血清型は、ＡＡＶ９である。
【実施例】
【0309】
実施例１．改善されたヘルパープラスミドの開発
プラスミドｐＡｄＤｅｌｔａＦ６は、ジェームズ Ｍ．ウィルソン博士及びペンシルベニア大学の同僚により構築された。ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６のサイズは１５７７０ｂｐである。このプラスミドは、ＡＡＶ複製に重要であるアデノウイルスゲノムの領域、すなわちＥ２Ａ（ＤＮＡ結合タンパク質）、Ｅ４、及びＶＡ ＲＮＡＩを含むが、他のアデノウイルス複製遺伝子は含まない。このプラスミドは、Ａｄ５のＥ１、Ｅ３欠失分子クローン（ｐＢＨＧ１０、ｐＢＲ３２２ベースプラスミド）に由来する。Ａｄ５ ＤＮＡに欠失を導入して、不要なアデノウイルス遺伝子の発現を除去し、アデノウイルスＤＮＡの量を３２ｋｂから１２ｋｂに低減した（図１のＡ）。最後に、アンピシリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子で置き換えて、ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６を得た（図１のＢ）。ＡＡＶベクター生成に必要なＥ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ ＲＮＡＩアデノウイルス遺伝子の機能的要素はこのプラスミドに残存している。アデノウイルスＥ１の必須遺伝子機能は、ＨＥＫ２９３細胞により供給される。また、ｐＢＨＧ１０の部分的消化から生じたレムナント遺伝子／エレメントも存在する。これらは、プロモーターレスＬ３ ２３Ｋ／ウイルスエンドプロテアーゼ、Ｌ４ １００Ｋ／ヘキソンアセンブリー遺伝子、Ｌ４ ｐＶＩＩＩ／ヘキソン関連前駆体、及びＬ５ ｐＶＩ／ファイバー遺伝子をマップ内に含む（図１Ｃ）。ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６プラスミドの場合、これらの遺伝子は、プロモーターＭＬＰ（主要後期プロモーター）が欠失しているため転写されない。Ｂｉａｓｉｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．，１６：２８９３－２９１２；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｉｊｍｓ１６０２２８９３（２０１５）． Ｌ４ １００Ｋ及びＬ４ ｐＶＩＩＩを含むこれらの遺伝子のいくつかは、Ｅ２Ａ領域とオーバーラップするため、これらの遺伝子の欠失は、ヘルパープラスミドを順次再構成する間、後述のように必須ヘルパータンパク質Ｅ２Ａの生成に影響を及ぼす可能性がある。さらに、それ自身のインタクトなプロモーターがこの領域内に位置するＬ４ ２２Ｋ／３３Ｋ遺伝子も存在する。この遺伝子は、アデノウイルス５のパッケージングに関与するＬ４ ２２Ｋ及びＬ４ ３３Ｋタンパク質をコードする。Ｌ４ ２２Ｋ／３３Ｋ遺伝子のプロモーターもＥ２Ａ領域とオーバーラップしている。そのため、プロモーターの欠失がＥ２Ａの生成に影響を及ぼす可能性がある。プラスミドマップ内に部分的なアデノウイルス逆方向末端リピートがあるが、これもｐＢＨＧ１０の部分消化から生じたものである。しかし、アデノウイルス５のＤＮＡ複製のための必須ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（Ｅ２領域）が欠失しているため、感染性のアデノウイルスは生成されないものと予想される。ＤＮＡプラスミドのシークエンシングはＱｉａｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｅｒｖｉｃｅｓが実施し、参照配列ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６ ｐ１７０７ＦＨ－Ｑの以下に示す重要な機能的エレメントに対する１００％の相同性が明らかになった：Ｅ４ ＯＲＦ６ ３６９２～２８０８ｂｐ；Ｅ２Ａ ＤＮＡ結合タンパク質１１７８４～１０１９４ｂｐ；ＶＡ ＲＮＡＩ領域１２４２６～１３３７８ｂｐ。この配列は、Ａｌｄｅｖｒｏｎで製造プロセスの一部として確認される。
プラスミドｐＡｄＤｅｌｔａＦ６は、ジェームズ Ｍ．ウィルソン博士及びペンシルベニア大学の同僚により構築された。ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６のサイズは１５７７０ｂｐである。このプラスミドは、ＡＡＶ複製に重要であるアデノウイルスゲノムの領域、すなわちＥ２Ａ（ＤＮＡ結合タンパク質）、Ｅ４、及びＶＡ ＲＮＡＩを含むが、他のアデノウイルス複製遺伝子は含まない。このプラスミドは、Ａｄ５のＥ１、Ｅ３欠失分子クローン（ｐＢＨＧ１０、ｐＢＲ３２２ベースプラスミド）に由来する。Ａｄ５ ＤＮＡに欠失を導入して、不要なアデノウイルス遺伝子の発現を除去し、アデノウイルスＤＮＡの量を３２ｋｂから１２ｋｂに低減した（図１のＡ）。最後に、アンピシリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子で置き換えて、ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６を得た（図１のＢ）。ＡＡＶベクター生成に必要なＥ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ ＲＮＡＩアデノウイルス遺伝子の機能的要素はこのプラスミドに残存している。アデノウイルスＥ１の必須遺伝子機能は、ＨＥＫ２９３細胞により供給される。また、ｐＢＨＧ１０の部分的消化から生じたレムナント遺伝子／エレメントも存在する。これらは、プロモーターレスＬ３ ２３Ｋ／ウイルスエンドプロテアーゼ、Ｌ４ １００Ｋ／ヘキソンアセンブリー遺伝子、Ｌ４ ｐＶＩＩＩ／ヘキソン関連前駆体、及びＬ５ ｐＶＩ／ファイバー遺伝子をマップ内に含む（図１Ｃ）。ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６プラスミドの場合、これらの遺伝子は、プロモーターＭＬＰ（主要後期プロモーター）が欠失しているため転写されない。Ｂｉａｓｉｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．，１６：２８９３－２９１２；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｉｊｍｓ１６０２２８９３（２０１５）． Ｌ４ １００Ｋ及びＬ４ ｐＶＩＩＩを含むこれらの遺伝子のいくつかは、Ｅ２Ａ領域とオーバーラップするため、これらの遺伝子の欠失は、ヘルパープラスミドを順次再構成する間、後述のように必須ヘルパータンパク質Ｅ２Ａの生成に影響を及ぼす可能性がある。さらに、それ自身のインタクトなプロモーターがこの領域内に位置するＬ４ ２２Ｋ／３３Ｋ遺伝子も存在する。この遺伝子は、アデノウイルス５のパッケージングに関与するＬ４ ２２Ｋ及びＬ４ ３３Ｋタンパク質をコードする。Ｌ４ ２２Ｋ／３３Ｋ遺伝子のプロモーターもＥ２Ａ領域とオーバーラップしている。そのため、プロモーターの欠失がＥ２Ａの生成に影響を及ぼす可能性がある。プラスミドマップ内に部分的なアデノウイルス逆方向末端リピートがあるが、これもｐＢＨＧ１０の部分消化から生じたものである。しかし、アデノウイルス５のＤＮＡ複製のための必須ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（Ｅ２領域）が欠失しているため、感染性のアデノウイルスは生成されないものと予想される。ＤＮＡプラスミドのシークエンシングはＱｉａｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｅｒｖｉｃｅｓが実施し、参照配列ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６ ｐ１７０７ＦＨ－Ｑの以下に示す重要な機能的エレメントに対する１００％の相同性が明らかになった：Ｅ４ ＯＲＦ６ ３６９２～２８０８ｂｐ；Ｅ２Ａ ＤＮＡ結合タンパク質１１７８４～１０１９４ｂｐ；ＶＡ ＲＮＡＩ領域１２４２６～１３３７８ｂｐ。この配列は、Ａｌｄｅｖｒｏｎで製造プロセスの一部として確認される。
【0310】
新型ヘルパープラスミド＃１：新型ヘルパープラスミド＃１（図２）をＡｄ５配列に基づいて構築し、Ｅ２ＡとＥ４を二方向に発現するようにそれらの方向性を再構成した。この背後にある理論的根拠は、下流に位置するＥ２Ａプロモーターからの発現の低下をもたらし得るＥ４の強力なプロモーターからの干渉を回避することにあった。新型ヘルパープラスミド＃１遺伝子をＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社で合成し、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社から自由に入手できるｐＵＣ５７ベクターのＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ部位にクローニングした。この新たに設計したプラスミドでは、いくつかの必須ではないレムナント遺伝子（Ａｄ５構造遺伝子）ならびにエレメント（Ｅ４プロモーターに隣接するＩＴＲ配列（Ａｄ５逆方向末端リピート）、Ｌ３ ２３Ｋ／ウイルスエンドプロテアーゼ、Ｌ５ ｐＶＩ／ファイバー、及びＬ４ ｐＶＩＩＩ／ヘキソン関連前駆体配列を含む）を除去した。一方、Ｌ４ ３３Ｋ／Ｌ４ １００Ｋヘキソンアセンブリー遺伝子は、Ｅ２Ａの転写開始部位（ＴＳＳ）がその領域に位置し、それを除去するとＥ２Ａ発現に影響を及ぼす可能性があるため、維持した。ウイルス関連（ＶＡ）ＲＮＡは、ＶＡ ＲＮＡＩにＶＡ ＲＮＡＩＩを組み込むことによりさらに修飾した。ＶＡ ＲＮＡは、感染細胞におけるウイルスタンパク質合成を刺激し、自然の細胞応答を調節することにより、インターフェロン誘導性細胞防御システムをアンタゴナイズすることが知られている（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ａｕｇ．１９９６，ｐ５０８３－５０９９）。新型プラスミドのサイズは１１，４８４ｂｐである。
【0311】
新型ヘルパープラスミド＃１は、図３に示すように、ＡＡＶ力価を改善し、異なる導入遺伝子において良好に機能した。クローン１、２、３、４、及び５のＨＥＫ２９３由来宿主細胞を用いてｒＡＡＶ生成力価を評価した。
【0312】
新型ヘルパープラスミド＃２：新型ヘルパープラスミド＃２（図４）を新型ヘルパー＃１に基づいて設計した。この新たな設計では、Ｅ４領域を順次欠失により分析し、欠失がＡＡＶ生成に与える影響について調べた。Ｅ４ Ｏｒｆ １及び２の欠失がＡＡＶ力価を改善したことを示す結果に基づき、Ｅ４ Ｏｒｆ １及び２を欠失させた（データは示さず）。当分野では、Ｅ４領域を制御するプロモーターがアデノウイルス感染の初期に活性であり、後期まで継続することが知られている。Ｅ４領域は、このプロモーターによって生成される単一の一次転写産物（Ｏｒｆ１、２、３、３／４、４、６、６／７）の差次的スプライシングから生じる７つの異なるタンパク質を転写しコードする可能性を有する。この転写産物における差次的スプライシングのパターンは、ウイルス感染の段階の間に変化し、初期にのみ出現するものもあれば後期に出現するものもある（Ｄｉｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９５），７６，１０５１－１０５５）。Ｏｒｆ１、Ｏｒｆ２、Ｏｒｆ３、Ｏｒｆ４、Ｏｒｆ６、及びＯｒｆ６／７のコードタンパク質産物は、Ｏｒｆ３／４（不在か、または検出限界未満で発現）以外は感染細胞内に存在することが報告されている（Ｔａｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２７８（２００１）１－２３）。Ｏｒｆ１にコードされるタンパク質は後期に発現し、細胞シグナル伝達及びシグナル形質移入を担う細胞タンパク質のファミリーを標的とする。Ｏｒｆ２にコードされるＥ４産物に関する機能的情報は存在しない。さらに、Ｅ４ Ｏｒｆ２が欠失したＡｄ５変異体は、野生型レベルに成長しようとしていた（Ｔａｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ ２７８（２００１）１－２３）。Ｏｒｆ１及び２の欠失はＡＡＶ生成に影響を及ぼさなかったが、その力価を改善した。このことから、Ｅ４ Ｏｒｆ１及び２は必須ではないことが示される（図５）。クローン１、２、４、及び６のＨＥＫ２９３由来宿主細胞を用いてｒＡＡＶ生成力価を評価した。
【0313】
新型ヘルパープラスミド＃３：ヘルパープラスミド＃３の設計時に、Ｅ４領域を順次欠失によりさらに分析した。Ｅ４ネイティブプロモーター及びＣＭＶプロモーターを有する種々のＥ４変異体をＡＡＶ生成用にスクリーニングした（図６）。Ｅ４ Ｏｒｆ６～７を有するＥ４変異体のみが最も高い力価を示した。Ｅ４ Ｏｒｆ３～４をヘルパー＃２からさらに除去してヘルパー＃３を生成した（図７）。Ｏｒｆ３及びＯｒｆ４を除去する理論的根拠をさらに説明すると、Ｏｒｆ３及びＯｒｆ６は、互いの欠点を部分的または完全に補う可能性があるように思われる。Ｏｒｆ３及びＯｒｆ６は重複した機能を有し、独立して、ウイルスＤＮＡ複製の増幅、後期ウイルスタンパク質合成、宿主タンパク質合成の遮断、及びウイルスゲノムのコンカテマー形成の防止を行う（Ｔａｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ ２７８（２００１）１－２３）。また、Ｅ４ Ｏｒｆ４は、多くの細胞プロセスで重要な役割を果たす酵素セリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）との相互作用を通じて、Ｅ４プロモーターのＥ１Ａ媒介性トランス活性化を阻害することにより、Ｅ４の転写の下方調節も行う。この自動調節ループは、Ｅ４ Ｏｒｆ４がカスパーゼ活性化を介し細胞株特異的方式でアポトーシスを誘導し得る感染初期段階に、Ｅ４遺伝子産物の細胞毒性作用を制限するために必要とされる可能性がある。そのため、Ｅ４ Ｏｒｆ５をさらに除去した結果、この細胞毒性作用は妨げられた（Ｔａｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ ２７８（２００１）１－２３）。
【0314】
ヘルパー＃３は、ＡＡＶ力価（ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、及び異なる導入遺伝子を含む）を改善した（図８及び９）。クローン１及びクローン４のＨＥＫ２９３由来宿主細胞を用いてｒＡＡＶ生成力価を評価した。
【0315】
新型ヘルパープラスミド＃４：ＡＡＶの力価をさらに改善するために、新型ヘルパープラスミドに他の遺伝子を加える可能性について調べた。ＡＡＶ生成に好影響を与えることが報告されたボカウイルスヘルパーからの選択した遺伝子の組込み（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｖｏｌ．１１ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１８）、ＣＭＶプロモーター下におけるＥ１Ａ遺伝子のコピー及びＡＡＰ（トランスプラスミドに由来するアセンブリー活性化タンパク質）の付加について検討した。ボカウイルス選択遺伝子ＮＰ１及びＮＳ２遺伝子をヘルパープラスミド＃２に付加したところ（図１０）、ＡＡＶ力価に影響は見られなかった（図１１）。当分野では、ＡＡＶカプシドにコードされるアセンブリー活性化タンパク質は、途中で発現させるとカプシドタンパク質の安定性を増加させ得ることが知られている（Ｍａｕｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２３，１８１７－１８３０；Ｍａｕｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１９ Ｖｏｌｕｍｅ ９３ Ｉｓｓｕｅ ７ ｅ０２０１３－１８）。途中で発現させたＡＡＰ遺伝子をＡＡＶ８に付加したところ（図１２）、ＡＡＶ力価に負の影響を及ぼした（図１４）。Ｅ１Ａは、ｒｅｐ遺伝子プロモーターＰ５及びＰ１９からの転写を増強することにより、ならびにＥ２Ａ及びＥ４アデノウイルスプロモーターを活性化することにより、ＡＡＶウイルスの複製を開始することが知られている。また、Ｅ１Ａは、ＡＡＶウイルスＤＮＡ複製に適応して宿主の細胞周期を制御することも知られている。Ｅ１Ａの過剰発現による潜在的欠点は、ｐ５３を安定化させることが知られており、それによりアポトーシスを引き起こし得ることである。これは、ｐ５３と複合体を形成してそれを分解させるＥ１Ｂ５５Ｋ及びＥ４Ｏｒｆ６タンパク質により克服することができる（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００４），８５，２２０９－２２１４；Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓｅｓ ２０２０，１２，６６２；）。ＣＭＶプロモーターの制御下にあるＥ１Ａのコピーをヘルパープラスミド＃３に付加して、ヘルパープラスミド＃４を作成した（図１３）。Ｅ１Ａの位置はＥ４とＶＡ ＲＮＡ Ｉ／ＩＩとの間とした。結果からは、図１４に示すように、ヘルパー＃４がＡＡＶ力価をさらに改善することが示された。クローン１及び４のＨＥＫ２９３由来宿主細胞を用いてｒＡＡＶ生成力価を評価した。
【0316】
新型ヘルパープラスミド＃５、＃６、＃７、＃８、及び＃９：Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ ＲＮＡ Ｉ／ＩＩマイクロＲＮＡは、ＡＡＶ生成に必須のヘルパー構成要素であることが知られている（Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓｅｓ ２０２０，１２， ６６２；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｖ１２０６０６６２）。現在のヘルパープラスミド＃１～４において、Ｌ４ １００Ｋ／ヘキソンアセンブリー及びＬ４ ２２Ｋ／３３Ｋは、それらの遺伝子がＥ２ＡプロモーターとＥ２Ａオープンリーディングフレームとの間に位置するため、ヘルパープラスミド＃３内で保持された。Ｄｏｎｏｖａｎ－Ｂａｎｆｉｅｌｄらのロングリード直接ＲＮＡシークエンシング研究（Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ （２０２０） ３：１２４）で実証されているように、この領域は、２つのＥ２Ａ転写開始部位（ＴＳＳ）が位置することため、重要である可能性がある。これらの２つの配列を、高い力価を維持したまま除去できるかどうかを試験するため、ヘルパー＃３に基づいていくつかの変異を生成した（表２）。これら全ての変異の解析により、ヘルパー＃５及びヘルパー＃８が、ヘルパープラスミド＃３と同程度の力価またはそれよりわずかに高い力価をもたらすことが示された（図１５）。クローン１及び４のＨＥＫ２９３由来宿主細胞を用いてｒＡＡＶ生成力価を評価した。ヘルパープラスミド＃５において、コードされたヘキソンアセンブリーのＮ末端領域を除去し、ヘルパープラスミド＃８において、ヘキソンアセンブリー領域の開始コドンを変異させた。一方、Ｌ４ ２２Ｋ／３３Ｋの開始コドンを変異させた全ての変異体は力価の減少を示した。このことから、Ｌ４ ２２Ｋ／３３ＫがＡＡＶ生成に重要であり得ることが示される。これらの知見は、Ｌ４ ２２Ｋ欠失について報告されている効果、すなわち、後期段階でＥ２Ａ（ＤＢＰ）発現を継続的に増加させ、続いてＥ４発現に悪影響を及ぼすという効果と一致するものである（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２０１２）ｐ．１０４７４－１０４８３；Ｇｕｉｍｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２０１３）ｐ．７６８８－７６９９）。
【0317】
新型ヘルパープラスミドは、生成されるｒＡＡＶ粒子の質も改善する。２００Ｌの生成バイオリアクターに移した、形質移入プロセスでオリジナルヘルパーを用いて行った生成ランと比較すると、ヘルパー＃５形質移入プロセスにより実施した導入遺伝子Ａをコードするウイルスベクターの生成では、結果として完全カプシドの％が有意に増加した（ＡＵＣによる測定において、３６．２％に対し完全カプシドは７１．９％）。
【0318】
（表２）ヘルパープラスミド＃３に基づくヘキソンアセンブリー及びＬ４ ２２Ｋ／３３Ｋ遺伝子の変異
【0319】
本開示の方法は、現在最も実用的で好ましい実施形態であると考えられるものと共に説明してきたが、本開示に包含される方法は、開示された実施形態に限定されるべきではなく、むしろ、添付の請求項の趣旨及び範囲に含まれる様々な変更及び同等のアレンジを網羅するように意図されていることを理解されたい。
【0320】
本明細書で引用された全ての刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、及びアクセッション番号／データベースの配列（ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の両方を含む）は、各々の個別の刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、またはアクセッション番号／データベースの配列が、具体的かつ個別に参照によって援用されるのと同程度に、あらゆる目的において、参照によりこれらの全体が本明細書に援用される。
【図1-1】
【図1-2】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】
【国際調査報告】