特表 2024-537167 ミエリンタンパク質ゼロサイレンシング及びＣＭＴ１Ｂ疾患を治療するための生成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-10

(54)【発明の名称】ミエリンタンパク質ゼロサイレンシング及びＣＭＴ１Ｂ疾患を治療するための生成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20241003BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241003BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241003BHJP

   C12N 15/88 20060101ALI20241003BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20241003BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20241003BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20241003BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20241003BHJP

   A61P 25/02 20060101ALI20241003BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20241003BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20241003BHJP

   A61K 35/763 20150101ALI20241003BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241003BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

C12N15/63 Z

C12N5/10

C12N15/88 Z

C12N15/864 100Z

C12N15/12

A61K31/7105

A61P25/00

A61P25/02

A61K35/76

A61K35/761

A61K35/763

A61K48/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024520851

(86)(22)【出願日】2022-10-07

(85)【翻訳文提出日】2024-04-26

(86)【国際出願番号】 US2022077726

(87)【国際公開番号】W WO2023060215

(87)【国際公開日】2023-04-13

(31)【優先権主張番号】63/253,357

(32)【優先日】2021-10-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】515289842

【氏名又は名称】リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル

(74)【代理人】

【識別番号】100105957

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100068755

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 博宣

(74)【代理人】

【識別番号】100142907

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 淳

(74)【代理人】

【識別番号】100152489

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 美樹

(72)【発明者】

【氏名】ハーパー、スコット クエントン

(72)【発明者】

【氏名】ラシュノネジャド、アフルーズ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AA93Y

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA23

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA13

4C084MA52

4C084MA55

4C084MA65

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA011

4C084ZA201

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086EA16

4C086MA03

4C086MA05

4C086MA52

4C086MA55

4C086MA65

4C086MA66

4C086NA14

4C086ZA01

4C086ZA20

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087MA52

4C087MA55

4C087MA65

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA01

4C087ZA20

(57)【要約】

対象の１つの細胞又は複数の細胞おける変異体ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡ干渉ベースの生成物及び方法が開示される。本開示は、異常タンパク質の発現をノックダウンするために、ＭＰＺ遺伝子の様々な領域を特異的に標的とするマイクロＲＮＡを含む。追加的に、本開示は、正常、野生型、又は機能的に活性なＭＰＺタンパク質をコードする核酸の送達を含む。追加的に、本開示は、異常なＭＰＺタンパク質の発現をノックダウンするマイクロＲＮＡをコードする核酸を送達するために、かつ／又は正常、野生型、若しくは機能的に活性なＭＰＺタンパク質をコードする核酸を送達するために、組換えアデノ随伴ウイルスを含む。本開示には、シャルコー・マリー・トゥース病１Ｂ型（ＣＭＴ１Ｂ）疾患を含むが、これらに限定されないＭＰＺ遺伝子変異に関連する疾患の治療でこれらの核酸を使用する方法が含まれる。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

核酸であって、
ａ）配列番号７～１８のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を含む、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）マイクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、
ｂ）ＭＰＺマイクロＲＮＡを含むポリヌクレオチド配列であって、前記ＭＰＺマイクロＲＮＡが、配列番号１９～３０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、若しくは配列番号１９～３０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を含むそのバリアントを含む、ポリヌクレオチド配列、
ｃ）ＭＰＺマイクロＲＮＡを含むか、若しくはコードするポリヌクレオチド配列であって、前記ＭＰＺマイクロＲＮＡが、配列番号３１～４２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、若しくは配列番号３１～４２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を含むそのバリアントを含む、ポリヌクレオチド配列、
ｄ）前記ＭＰＺ遺伝子で標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、前記標的ヌクレオチド配列が、配列番号４３～５４のうちのいずれか１つに示される、ポリヌクレオチド配列、又は
ｅ）配列番号３若しくは６のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を含む、コドン最適化ＭＰＺ ＤＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、を含む、核酸。

【請求項2】

核酸であって、
ａ）ｉ）配列番号７～１８のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％％の同一性を含む、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）マイクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、又は
ｉｉ）前記ＭＰＺ遺伝子で標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、前記標的ヌクレオチド配列が、配列番号４３～５４のうちのいずれか１つに示される、ポリヌクレオチド配列と、
ｂ）ｉ）配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を含む、ヒトＭＰＺ ＤＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、
ｉｉ）配列番号３に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を含む、コドン最適化ＭＰＺ ＤＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、又は
ｉｉｉ）配列番号４に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を含む、ＭＰＺポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列と、を含む、核酸。

【請求項3】

１つのプロモーター又は複数のプロモーターを更に含む、請求項２に記載の核酸。

【請求項4】

前記プロモーターが、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｈ１９プロモーター、ニューロン特異的プロモーター、又はシュワン細胞特異的プロモーターである、請求項３に記載の核酸。

【請求項5】

前記シュワン細胞特異的プロモーターが、ＭＰＺプロモーター又はミニＭＰＺプロモーターである、請求項３に記載の核酸。

【請求項6】

前記ＭＰＺプロモーターが、配列番号５に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む、請求項５に記載の核酸。

【請求項7】

請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸又はそれらのいずれか１つ以上の組み合わせを含む、ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、又はベクター。

【請求項8】

前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項７に記載のベクター。

【請求項9】

前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、又は合成ウイルスである、請求項８に記載のウイルスベクター。

【請求項10】

前記ウイルスベクターが、ＡＡＶである、請求項８又は９に記載のウイルスベクター。

【請求項11】

前記ＡＡＶが、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いている、請求項１０に記載のウイルスベクター。

【請求項12】

前記ＡＡＶが、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）、自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）、又は一本鎖組換えＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）である、請求項１０又は１１に記載のウイルスベクター。

【請求項13】

前記ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓ、ＡＡＶｖ６６、又はＡＡＶ－Ｆである、請求項１０～１２のいずれか一項に記載のＡＡＶ。

【請求項14】

前記ＡＡＶが、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶｖ６６、又はＡＡＶ－Ｆである、請求項１０～１３のいずれか一項に記載のＡＡＶ。

【請求項15】

組成物であって、
（ａ）請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸、
（ｂ）請求項７に記載のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、又は
（ｃ）請求項８～１４のいずれか一項に記載のウイルスベクターと、
薬学的に許容される担体と、を含む、組成物。

【請求項16】

細胞における変異体ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）遺伝子の発現を低減する方法であって、前記細胞を、
（ａ）請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸、
（ｂ）請求項７に記載のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、又は
（ｃ）請求項８～１４のいずれか一項に記載のウイルスベクター、又は
（ｄ）請求項１５に記載の組成物、と接触させることを含む、方法。

【請求項17】

前記細胞が、神経細胞である、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記神経細胞が、シュワン細胞である、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記細胞が、ヒト細胞である、請求項１７又は１８に記載の方法。

【請求項20】

前記細胞が、ヒト対象の中にある、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記対象が、低髄鞘形成疾患又はシャルコー・マリー・トゥース病に罹患している、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記疾患が、ＣＭＴ（ＤＩ－ＣＭＴ）、ＣＭＴ １Ｂ型（ＣＭＴ１Ｂ）、ＣＭＴ ２Ｉ型（ＣＭＴ２Ｉ）、ＣＭＴ ２Ｊ型（ＣＭＴ２Ｊ）、又はデジェリーヌ－ソッタス症候群（ＤＳＳ若しくはＣＭＴ ３型）疾患である、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

変異体ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）遺伝子を含む対象を治療する方法であって、前記方法が、前記対象に、有効量の：
（ａ）請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸、
（ｂ）請求項７に記載のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、又は
（ｃ）請求項８～１４のいずれか一項に記載のウイルスベクター、又は
（ｄ）請求項１５に記載の組成物、を投与することを含む、方法。

【請求項24】

前記対象が、ヒト対象である、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記対象が、低髄鞘形成疾患又はシャルコー・マリー・トゥース病に罹患している、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記疾患が、ＣＭＴ（ＤＩ－ＣＭＴ）、ＣＭＴ １Ｂ型（ＣＭＴ１Ｂ）、ＣＭＴ ２Ｉ型（ＣＭＴ２Ｉ）、ＣＭＴ ２Ｊ型（ＣＭＴ２Ｊ）、又はデジェリーヌ－ソッタス症候群（ＤＳＳ若しくはＣＭＴ ３型）疾患である、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記核酸が、請求項２～６のいずれか一項である、請求項１６又は２３に記載の方法。

【請求項28】

前記核酸が、組成物中及び／又はナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター中に存在する、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項２７又は２８に記載の方法。

【請求項30】

前記ウイルスベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓ、ＡＡＶｖ６６、又はＡＡＶ－ＦであるＡＡＶである、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記ＡＡＶが、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶｖ６６、又はＡＡＶ－Ｆである、請求項２９に記載の方法。

【請求項32】

細胞における変異体ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）の発現を低減するための医薬品の調製のための、
（ａ）請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸、
（ｂ）請求項７に記載のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、又は
（ｃ）請求項８～１４のいずれか一項に記載のウイルスベクター、又は
（ｄ）請求項１５に記載の組成物、
の使用。

【請求項33】

前記細胞が、ヒト対象中にある、請求項３２に記載の使用。

【請求項34】

変異体ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）遺伝子を含む対象を治療する際の、
（ａ）請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸、
（ｂ）請求項７に記載のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、又は
（ｃ）請求項８～１４のいずれか一項に記載のウイルスベクター、又は
（ｄ）請求項１５に記載の組成物、
の使用。

【請求項35】

前記対象が、ヒト対象である、請求項３４に記載の使用。

【請求項36】

前記対象が、低髄鞘形成疾患又はシャルコー・マリー・トゥース病に罹患している、請求項３３又は３５に記載の使用。

【請求項37】

前記疾患が、ＣＭＴ（ＤＩ－ＣＭＴ）、ＣＭＴ １Ｂ型（ＣＭＴ１Ｂ）、ＣＭＴ ２Ｉ型（ＣＭＴ２Ｉ）、ＣＭＴ ２Ｊ型（ＣＭＴ２Ｊ）、又はデジェリーヌ－ソッタス症候群（ＤＳＳ若しくはＣＭＴ ３型）疾患である、請求項３６に記載の使用。

【請求項38】

前記核酸、ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、ベクター、ウイルスベクター、組成物、又は医薬品が、筋肉内注射、経口投与、皮下、皮内、若しくは経皮輸送、血流への注入、又はエアロゾル投与のために製剤化される、
（ａ）請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸、
（ｂ）請求項７に記載のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、
（ｃ）請求項８～１４のいずれか一項に記載のウイルスベクター、
（ｄ）請求項１５に記載の組成物、
（ｅ）請求項１６～３１のいずれか一項に記載の方法、又は
（ｆ）請求項３２～３７のいずれか一項の記載の使用。

【請求項39】

細胞における変異体ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）遺伝子の発現を低減し、細胞において機能的ＭＰＺタンパク質を発現させる方法であって、前記方法が、前記細胞に、有効量の
（ａ）
（ｉ）配列番号７～１８のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％％の同一性を含む、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）マイクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、
（ｉｉ）ＭＰＺマイクロＲＮＡを含むポリヌクレオチド配列であって、前記ＭＰＺマイクロＲＮＡが、配列番号１９～３０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、若しくは配列番号１９～３０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を含むそのバリアントを含む、ポリヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）ＭＰＺマイクロＲＮＡを含むか、若しくはコードするポリヌクレオチド配列であって、前記ＭＰＺマイクロＲＮＡが、配列番号３１～４２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、若しくは配列番号３１～４２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を含むそのバリアントを含む、ポリヌクレオチド配列、及び／又は
（ｉｖ）前記ＭＰＺ遺伝子で標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、前記標的ヌクレオチド配列が、配列番号４３～５４のうちのいずれか１つに示される、ポリヌクレオチド配列、のうちの１つ以上を含む核酸と、
（ｂ）配列番号３若しくは６のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を含む、コドン最適化ＭＰＺ ＤＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸と、を送達することを含む、方法。

【請求項40】

前記核酸のうちのいずれか１つ以上が、１つのプロモーター又は複数のプロモーターを更に含む、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記プロモーターが、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｈ１９プロモーター、ニューロン特異的プロモーター、又はシュワン細胞特異的プロモーターである、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記シュワン細胞特異的プロモーターが、ＭＰＺプロモーター又はミニＭＰＺプロモーターである、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記ＭＰＺプロモーターが、配列番号５に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記細胞が、神経細胞である、請求項３９～４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記神経細胞が、シュワン細胞である、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記細胞が、ヒト細胞である、請求項３９～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記細胞が、ヒト対象中にある、請求項３９～４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

前記対象が、低髄鞘形成疾患又はシャルコー・マリー・トゥース病に罹患している、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記疾患が、ＣＭＴ（ＤＩ－ＣＭＴ）、ＣＭＴ １Ｂ型（ＣＭＴ１Ｂ）、ＣＭＴ ２Ｉ型（ＣＭＴ２Ｉ）、ＣＭＴ ２Ｊ型（ＣＭＴ２Ｊ）、又はデジェリーヌ－ソッタス症候群（ＤＳＳ若しくはＣＭＴ ３型）疾患である、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記核酸が、前記細胞に、ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、又はそれらのうちのいずれか１つ以上の組み合わせで送達される、請求項３９～４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、又は合成ウイルスである、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記ウイルスベクターが、ＡＡＶである、請求項５１又は５２に記載の方法。

【請求項54】

前記ＡＡＶが、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いている、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

前記ＡＡＶが、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）、自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）、又は一本鎖組換えＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）である、請求項５３又は５４に記載の方法。

【請求項56】

前記ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓ、ＡＡＶｖ６６、又はＡＡＶ－Ｆである、請求項５３～５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記ＡＡＶが、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶｖ６６、又はＡＡＶ－Ｆである、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

前記ＭＰＺ ｍｉＲＮＡを含むか若しくはコードする前記ポリヌクレオチド配列、及び／又は前記ＭＰＺ遺伝子で標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸、並びに
前記コドン最適化ＭＰＺ ＤＮＡをコードする前記ポリヌクレオチド配列を含む前記核酸が、
前記細胞に同時に送達される、請求項５０～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記核酸が、前記細胞に同じベクターで送達される、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

前記ＭＰＺ ｍｉＲＮＡを含むか若しくはコードする前記ポリヌクレオチド配列、及び／又は前記ＭＰＺ遺伝子で標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸、並びに
前記コドン最適化ＭＰＺ ＤＮＡをコードする前記ポリヌクレオチド配列を含む前記核酸が、
前記細胞に異なる時間に細胞に送達される、請求項５０～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

変異体ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）遺伝子の異常発現に罹患している対象を治療する方法であって、前記方法が、前記対象における前記変異体ＭＰＺ遺伝子の発現を低減すること、及び機能的ＭＰＺを発現させることを含み、前記方法が、前記対象に、有効量の
（ａ）
（ｉ）配列番号７～１８のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％％の同一性を含む、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）マイクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、
（ｉｉ）ＭＰＺマイクロＲＮＡを含むポリヌクレオチド配列であって、前記ＭＰＺマイクロＲＮＡが、配列番号１９～３０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、若しくは配列番号１９～３０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を含むそのバリアントを含む、ポリヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）ＭＰＺマイクロＲＮＡを含むか、若しくはコードするポリヌクレオチド配列であって、前記ＭＰＺマイクロＲＮＡが、配列番号３１～４２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、若しくは配列番号３１～４２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を含むそのバリアントを含む、ポリヌクレオチド配列、及び／又は
（ｉｖ）前記ＭＰＺ遺伝子で標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、前記標的ヌクレオチド配列が、配列番号４３～５４のうちのいずれか１つに示される、ポリヌクレオチド配列、のうちの１つ以上を含む核酸と、
（ｂ）配列番号３又は６に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を含む、コドン最適化ＭＰＺ ＤＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸と、を送達することを含む、方法。

【請求項62】

前記核酸のうちのいずれか１つ以上が、１つのプロモーター又は複数のプロモーターを更に含む、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

前記プロモーターが、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｈ１９プロモーター、ニューロン特異的プロモーター、又はシュワン細胞特異的プロモーターである、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

前記シュワン細胞特異的プロモーターが、ＭＰＺプロモーター又はミニＭＰＺプロモーターである、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記ＭＰＺプロモーターが、配列番号５に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

前記対象が、ヒトである、請求項６１～６５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

前記対象が、低髄鞘形成疾患又はシャルコー・マリー・トゥース病に罹患している、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

前記疾患が、ＣＭＴ（ＤＩ－ＣＭＴ）、ＣＭＴ １Ｂ型（ＣＭＴ１Ｂ）、ＣＭＴ ２Ｉ型（ＣＭＴ２Ｉ）、ＣＭＴ ２Ｊ型（ＣＭＴ２Ｊ）、又はデジェリーヌ－ソッタス症候群（ＤＳＳ若しくはＣＭＴ ３型）疾患である、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

前記核酸が、前記対象に、ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクターで、又はそれらのうちのいずれか１つ以上の組み合わせで送達される、請求項６１～６８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項70】

前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項６９に記載の方法。

【請求項71】

前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、又は合成ウイルスである、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

前記ウイルスベクターが、ＡＡＶである、請求項７０又は７１に記載の方法。

【請求項73】

前記ＡＡＶが、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いている、請求項７２に記載の方法。

【請求項74】

前記ＡＡＶが、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）、自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）、又は一本鎖組換えＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）である、請求項７２又は７３に記載の方法。

【請求項75】

前記ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓ、ＡＡＶｖ６６、又はＡＡＶ－Ｆである、請求項７２～７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項76】

前記ＡＡＶが、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶｖ６６、又はＡＡＶ－Ｆである、請求項７５に記載の方法。

【請求項77】

前記ＭＰＺ ｍｉＲＮＡを含むか若しくはコードする前記ポリヌクレオチド配列、及び／又は前記ＭＰＺ遺伝子で標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸、並びに
前記コドン最適化ＭＰＺ ＤＮＡをコードする前記ポリヌクレオチド配列を含む前記核酸が、
前記対象に同時に送達される、請求項６１～７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項78】

前記核酸が、前記対象に同じベクターで送達される、請求項７７に記載の方法。

【請求項79】

前記ＭＰＺ ｍｉＲＮＡを含むか若しくはコードする前記ポリヌクレオチド配列、及び／又は前記ＭＰＺ遺伝子で標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸、並びに
前記コドン最適化ＭＰＺ ＤＮＡをコードする前記ポリヌクレオチド配列を含む前記核酸が、
前記対象に異なる時間で送達される、請求項６１～７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項80】

変異体ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）遺伝子の異常発現に罹患している対象を治療する方法であって、前記方法が、前記対象に、配列番号１、３、及び６のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む、ＭＰＺ ＤＮＡ又はコドン最適化ＭＰＺ ＤＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む有効量の核酸を送達することによって、前記対象において機能的ＭＰＺタンパク質を発現させることを含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

配列表の参照による組み込み
本出願は、開示の別個の部分として、コンピュータ可読形態の配列表（ファイル名：５７０１７＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ＸＭＬ、サイズ：１１１，５０１バイト、作成：２０２２年１０月３日）を含み、その全体が本明細書に参照によって組み込まれる。

【0002】

ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）遺伝子（１ｑ２２）の発現をサイレンシング又は阻害するための生成物及び方法が提供され、遺伝子の変異は、野生型ＭＰＺタンパク質の過小発現及び様々なタイプのシャルコー・マリー・トゥース（ＣＭＴ）病を含む重度の早期発症型の先天性低髄鞘形成に関連する。ＭＰＺは、広い表現型スペクトルを有するＣＭＴ原因遺伝子としてよく知られている。ＭＰＺ遺伝子におけるいくつかの変異は、多くの異なるタイプの低髄鞘形成疾患及びＣＭＴ病を引き起こし、優性中間型ＣＭＴ（ＤＩ－ＣＭＴ）、ＣＭＴ １Ｂ型（ＣＭＴ１Ｂ）、ＣＭＴ ２Ｉ型（ＣＭＴ２Ｉ）、及びＣＭＴ ２Ｊ型（ＣＭＴ２Ｊ）、並びにデジェリーヌ－ソッタス症候群（ＤＳＳ又はＣＭＴ ３型）疾患を含むが、これらに限定されない。ＣＭＴ１Ｂ疾患は、末梢神経障害の症状を示し、遠位筋力低下及び萎縮、足の変形、並びに感覚喪失を含むが、これらに限定されない。本開示は、ＭＰＺ遺伝子をコードする標的核酸配列に特異的にハイブリダイズする人工マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする核酸を使用してＣＭＴ１Ｂを治療するための遺伝子療法アプローチを提供し、標的核酸配列との複合体の結合が、ＭＰＺ遺伝子発現のノックダウンをもたらし、ＭＰＺ遺伝子をノックダウンするように設計された人工ｍｉＲＮＡに耐性であるコドン最適化ＭＰＺ遺伝子（ｃｏＭＰＺ又はｒｅｓＭＰＺ）をコードする核酸を使用することを伴う。組換えアデノ随伴ウイルスなどの送達ビヒクルは、１つ以上のＭＰＺマイクロＲＮＡ、並びにｃｏＰＭＺ遺伝子をコードする核酸を送達する。これらの生成物及び方法は、ＣＭＴ１Ｂ病及び異常なＭＰＺ発現を示す他の障害の治療における適用を有する。

【背景技術】

【0003】

シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）は、２，５００人に最大１人の有病率を有する遺伝性末梢神経障害の臨床的及び遺伝的に異種の集合である。ＣＭＴ神経障害１Ｂ型（ＣＭＴ１Ｂ）は、ＣＭＴ１の３番目に最も一般的なサブタイプであり、症例の１０％を占め、約３０，０００個体中およそ１個体に影響を及ぼす。ＣＭＴ１Ｂの特徴は、ゆっくり進行する遠位筋の脱力及び萎縮、垂れ足及び変形、感覚の喪失、並びに２つの典型的な発症：早期幼児及び思春期の発症を伴う非常に重度な反射の欠如を含む。ＣＭＴ１Ｂは、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ又はＰ０）遺伝子における２００を超える異なる変異によって引き起こされる。ＭＰＺ遺伝子は、ミエリン鞘内の主要なタンパク質であるＭＰＺタンパク質をコードする。ＭＰＺは、健常で効率的な末梢神経系を維持するのに不可欠なタンパク質である。シュワン細胞における欠陥タンパク質の蓄積は、経時的に脱髄及び細胞死を引き起こす。ＣＭＴ１Ｂ病の病理学的メカニズムは、２つの主要な群：（１）正常な髄鞘形成に直接影響を及ぼす毒性の機能獲得変異、及び（２）欠陥のある折り畳み不全タンパク質応答（ＵＰＲ）又は小胞体（ＥＲ）ストレス応答、にほとんど分けることができる。疾患の両方のメカニズムは、最終的に、シュワン細胞（ＳＣ）における変異体ミエリンタンパク質の蓄積、減少した髄鞘形成、筋力低下及び萎縮、並びに下肢及び足の感覚の喪失につながる。例えば、Ｒ９８Ｃ変異は、ＥＲにおける変異したＭＰＺタンパク質及び欠陥ＵＰＲを保持することに起因して、早期発症の重度の疾患を引き起こす。この変異を有する患者は、ミエリンが非常に低いか、又はほとんどない。これらの患者は、ＣＭＴ１Ｂとして分類されるが、非常に重度のＣＭＴ１Ｂ又は先天性低髄鞘形成の別の定義であるデジェリーヌ－ソッタス症候群（ＤＳＳ）としても分類される。この病気のための治療法はまだない。

【0004】

ＣＭＴ１Ｂ病を含むが、これに限定されないＭＰＺ遺伝子障害のための治療の生成物及び方法が当該技術分野で依然として必要とされている。

【発明の概要】

【0005】

本明細書において、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）遺伝子における変異を治療するため、並びにＭＰＺ遺伝子における変異から生じる疾患を治療、改善、その進行を遅延、及び／又はそれを予防するための生成物、方法、及び使用が提供される。

【0006】

本開示は、
ａ）配列番号７～１８のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％％の同一性を含む、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）マイクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、
ｂ）ＭＰＺマイクロＲＮＡを含むポリヌクレオチド配列であって、ＭＰＺマイクロＲＮＡが、配列番号１９～３０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、若しくは配列番号１９～３０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を含むそのバリアントを含む、ポリヌクレオチド配列、
ｃ）ＭＰＺマイクロＲＮＡを含むか、若しくはコードするポリヌクレオチド配列であって、ＭＰＺマイクロＲＮＡが、配列番号３１～４２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、若しくは配列番号３１～４２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を含むそのバリアントを含む、ポリヌクレオチド配列、
ｄ）ＭＰＺ遺伝子で標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、標的ヌクレオチド配列が、配列番号４３～５４のうちのいずれか１つに示される、ポリヌクレオチド配列、又は
ｅ）配列番号３若しくは６のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を含む、コドン最適化ＭＰＺ ＤＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、を含む、核酸を提供する。

【0007】

本開示は、
ａ）ｉ）配列番号７～１８のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％％の同一性を含む、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）マイクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、又は
ｉｉ）ＭＰＺ遺伝子で標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、標的ヌクレオチド配列が、配列番号４３～５４のうちのいずれか１つに示される、ポリヌクレオチド配列と、
ｂ）ｉ）配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を含む、ヒトＭＰＺ ＤＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、
ｉｉ）配列番号３に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を含む、コドン最適化ＭＰＺ ＤＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、又は
ｉｉｉ）配列番号４に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を含む、ＭＰＺポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列と、を含む核酸を提供する。

【0008】

いくつかの態様において、核酸は、１つのプロモーター又は複数のプロモーターを更に含む。
いくつかの態様において、プロモーターは、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｈ１９プロモーター、ニューロン特異的プロモーター、Ｈ１プロモーター、ＥＦ１－アルファプロモーター、最小ＥＦ１－アルファプロモーター、ｕｎｃ４５ｂプロモーター、ＣＫ１プロモーター、ＣＫ６プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ミニＣＭＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、アルファ－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、ｔＭＣＫプロモーター、最小ＭＣＫプロモーター、デスミンプロモーター、チキンβアクチンプロモーター（ＣＢＡ）、Ｐ５４６プロモーターシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン－バーウイルス即時早期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子－１ａプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、クレアチンキナーゼプロモーター、シュワン細胞特異的プロモーター、ミエリン特異的プロモーター、又はネイティブプロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、ＭＰＺプロモーター、ミニＭＰＺプロモーター、非圧縮ミエリン関連タンパク質（ＮＣＭＰＡ又はＭＰ１１）プロモーター、ＰＭＰ２２プロモーター、ＭＢＰプロモーター、ＳＯＸ１０プロモーター、又はＧＡＰ４３プロモーターであり得る。いくつかの態様において、ｍｉＭＰＺとともに使用されるプロモーターは、Ｕ６プロモーターである。いくつかの態様において、ＭＰＺ置換遺伝子とともに使用されるプロモーターは、ＭＰＺプロモーター又はミニＭＰＺプロモーターである。いくつかのより具体的な態様において、プロモーターは、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｈ１９プロモーター、ニューロン特異的プロモーター、又はシュワン細胞特異的プロモーターである。いくつかの態様において、かかるシュワン細胞特異的プロモーターは、ＭＰＺプロモーターである。いくつかの態様において、ＭＰＺプロモーターは、配列番号５に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む。

【0009】

本開示は、本開示の核酸のうちのいずれか、又はそれらのいずれか１つ以上の組み合わせを含む、ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、又はベクターを提供する。
いくつかの態様において、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、又は合成ウイルスである。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、ＡＡＶである。いくつかの態様において、ＡＡＶは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いている。いくつかの態様において、ＡＡＶは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）、自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）、又は一本鎖組換えＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）である。いくつかの態様において、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓ、ＡＡＶｖ６６、又はＡＡＶ－Ｆである。いくつかの具体的な態様において、ＡＡＶは、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶｖ６６、又はＡＡＶ－Ｆである。

【0010】

本開示は、本開示の核酸のうちのいずれか、又はそれらのうちのいずれか１つ以上の組み合わせを含む組成物を提供する。本開示は、本開示のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、ベクター、若しくはウイルスベクターのうちのいずれか、又はそれらのうちのいずれか１つ以上の組み合わせを含む組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物はまた、薬学的に許容される担体を含む。

【0011】

本開示は、細胞における変異体ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）遺伝子の発現を低減する方法を提供し、方法は、細胞を、本開示の核酸のうちのいずれか、又はそれらのうちのいずれか１つ以上の組み合わせと接触させることを含む。いくつかの態様において、方法は、細胞を、
ａ）配列番号７～１８のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％％の同一性を含む、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）マイクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、
ｂ）ＭＰＺマイクロＲＮＡを含むポリヌクレオチド配列であって、ＭＰＺマイクロＲＮＡが、配列番号１９～３０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、若しくは配列番号１９～３０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を含むそのバリアントを含む、ポリヌクレオチド配列、
ｃ）ＭＰＺマイクロＲＮＡを含むか、若しくはコードするポリヌクレオチド配列であって、ＭＰＺマイクロＲＮＡが、配列番号３１～４２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、若しくは配列番号３１～４２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を含むそのバリアントを含む、ポリヌクレオチド配列、
ｄ）ＭＰＺ遺伝子で標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、標的ヌクレオチド配列が、配列番号４３～５４のうちのいずれか１つに示される、ポリヌクレオチド配列、及び／又は
ｅ）配列番号３若しくは６のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を含む、コドン最適化ＭＰＺ ＤＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、を含む核酸と接触させることを含む。

【0012】

いくつかの態様において、方法は、細胞を、
ａ）ｉ）配列番号７～１８のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％％の同一性を含む、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）マイクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、又は
ｉｉ）ＭＰＺ遺伝子で標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、標的ヌクレオチド配列が、配列番号４３～５４のうちのいずれか１つに示される、ポリヌクレオチド配列と、
ｂ）ｉ）配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を含む、ヒトＭＰＺ ＤＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、
ｉｉ）配列番号３に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を含む、コドン最適化ＭＰＺ ＤＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、及び／又は
ｉｉｉ）配列番号４に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を含む、ＭＰＺポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列と、を含む核酸と接触させることを含む。

【0013】

いくつかの態様において、核酸は、１つのプロモーター又は複数のプロモーターを更に含む。いくつかの態様において、プロモーターは、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｈ１９プロモーター、ニューロン特異的プロモーター、Ｈ１プロモーター、ＥＦ１－アルファプロモーター、最小ＥＦ１－アルファプロモーター、ｕｎｃ４５ｂプロモーター、ＣＫ１プロモーター、ＣＫ６プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ミニＣＭＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、アルファ－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、ｔＭＣＫプロモーター、最小ＭＣＫプロモーター、デスミンプロモーター、チキンβアクチンプロモーター（ＣＢＡ）、Ｐ５４６プロモーターシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン－バーウイルス即時早期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子－１ａプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、クレアチンキナーゼプロモーター、シュワン細胞特異的プロモーター、ミエリン特異的プロモーター、又はネイティブプロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、ＭＰＺプロモーター、非圧縮ミエリン関連タンパク質（ＮＣＭＰＡ又はＭＰ１１）プロモーター、ＰＭＰ２２プロモーター、ＭＢＰプロモーター、ＳＯＸ１０プロモーター、又はＧＡＰ４３プロモーターであり得る。いくつかの態様において、ｍｉＭＰＺとともに使用されるプロモーターは、Ｕ６プロモーターである。いくつかの態様において、ＭＰＺ置換遺伝子とともに使用されるプロモーターは、ＭＰＺプロモーター又はミニＭＰＺプロモーターである。いくつかのより具体的な態様において、プロモーターは、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｈ１９プロモーター、ニューロン特異的プロモーター、又はシュワン細胞特異的プロモーターである。いくつかの態様において、かかるシュワン細胞特異的プロモーターは、ＭＰＺプロモーター又はミニＭＰＺプロモーターである。いくつかの態様において、ＭＰＺプロモーターは、配列番号５に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む。いくつかの態様において、核酸は、ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、又はベクター中にある。いくつかの態様において、核酸は、ウイルスベクター中にある。いくつかの態様において、核酸、ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、又はベクターは、組成物中にある。いくつかの態様において、細胞は、神経細胞である。いくつかの態様において、神経細胞は、シュワン細胞である。いくつかの態様において、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの態様において、細胞は、ヒト対象中にある。

【0014】

本開示は、変異体ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）遺伝子を含む対象を治療する方法を提供し、方法は、対象に、有効量の本開示の核酸のうちのいずれか、又はそれらのいずれか１つ以上の組み合わせを投与することを含む。いくつかの態様において、方法は、対象に、
ａ）配列番号７～１８のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％％の同一性を含む、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）マイクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、
ｂ）ＭＰＺマイクロＲＮＡを含むポリヌクレオチド配列であって、ＭＰＺマイクロＲＮＡが、配列番号１９～３０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、若しくは配列番号１９～３０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を含むそのバリアントを含む、ポリヌクレオチド配列、
ｃ）ＭＰＺマイクロＲＮＡを含むか、若しくはコードするポリヌクレオチド配列であって、ＭＰＺマイクロＲＮＡが、配列番号３１～４２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、若しくは配列番号３１～４２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を含むそのバリアントを含む、ポリヌクレオチド配列、
ｄ）ＭＰＺ遺伝子で標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、標的ヌクレオチド配列が、配列番号４３～５４のうちのいずれか１つに示される、ポリヌクレオチド配列、及び／又は
ｅ）配列番号３若しくは６のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を含む、コドン最適化ＭＰＺ ＤＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、を含む、有効量の核酸を投与することを含む。

【0015】

いくつかの態様において、方法は、対象に、
ａ）ｉ）配列番号７～１８のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％％の同一性を含む、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）マイクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、又は
ｉｉ）ＭＰＺ遺伝子で標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、標的ヌクレオチド配列が、配列番号４３～５４のうちのいずれか１つに示される、ポリヌクレオチド配列と、
ｂ）ｉ）配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を含む、ヒトＭＰＺ ＤＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、
ｉｉ）配列番号３若しくは６に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を含む、コドン最適化ＭＰＺ ＤＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、又は
ｉｉｉ）配列番号４に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を含む、ＭＰＺポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列と、を含む、有効量の核酸を投与することを含む。

【0016】

いくつかの態様において、核酸は、１つのプロモーター又は複数のプロモーターを更に含む。いくつかの態様において、プロモーターは、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｈ１９プロモーター、ニューロン特異的プロモーター、Ｈ１プロモーター、ＥＦ１－アルファプロモーター、最小ＥＦ１－アルファプロモーター、ｕｎｃ４５ｂプロモーター、ＣＫ１プロモーター、ＣＫ６プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ミニＣＭＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、アルファ－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、ｔＭＣＫプロモーター、最小ＭＣＫプロモーター、デスミンプロモーター、チキンβアクチンプロモーター（ＣＢＡ）、Ｐ５４６プロモーターシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン－バーウイルス即時早期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子－１ａプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、クレアチンキナーゼプロモーター、シュワン細胞特異的プロモーター、ミエリン特異的プロモーター、又はネイティブプロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、ＭＰＺプロモーター、非圧縮ミエリン関連タンパク質（ＮＣＭＰＡ又はＭＰ１１）プロモーター、ＰＭＰ２２プロモーター、ＭＢＰプロモーター、ＳＯＸ１０プロモーター、又はＧＡＰ４３プロモーターであり得る。いくつかの態様において、ｍｉＭＰＺとともに使用されるプロモーターは、Ｕ６プロモーターである。いくつかの態様において、ＭＰＺ置換遺伝子とともに使用されるプロモーターは、ＭＰＺプロモーター又はミニＭＰＺプロモーターである。いくつかのより具体的な態様において、プロモーターは、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｈ１９プロモーター、ニューロン特異的プロモーター、又はシュワン細胞特異的プロモーターである。いくつかの態様において、かかるシュワン細胞特異的プロモーターは、ＭＰＺプロモーター又はミニＭＰＺプロモーターである。いくつかの態様において、ＭＰＺプロモーターは、配列番号５に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む。いくつかの態様において、核酸は、ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、又はベクター中に存在する。いくつかの態様において、核酸は、ウイルスベクター中にある。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓ、ＡＡＶｖ６６、又はＡＡＶ－ＦであるＡＡＶである。いくつかの態様において、ＡＡＶは、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶｖ６６、又はＡＡＶ－Ｆである。いくつかの態様において、核酸、ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、又はベクターは、組成物中にある。いくつかの態様において、対象は、ヒト対象である。いくつかの態様において、対象は、低髄鞘形成疾患又はシャルコー・マリー・トゥース病に罹患している。いくつかの態様において、疾患は、ＣＭＴ（ＤＩ－ＣＭＴ）、ＣＭＴ １Ｂ型（ＣＭＴ１Ｂ）、ＣＭＴ ２Ｉ型（ＣＭＴ２Ｉ）、ＣＭＴ ２Ｊ型（ＣＭＴ２Ｊ）、又はデジェリーヌ－ソッタス症候群（ＤＳＳ若しくはＣＭＴ ３型）疾患である。

【0017】

本開示は、細胞における変異体ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）遺伝子の発現を低減し、細胞において機能的ＭＰＺタンパク質を発現させる方法を提供し、方法は、細胞に、有効量の
（ａ）
（ｉ）配列番号７～１８のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％％の同一性を含む、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）マイクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、
（ｉｉ）ＭＰＺマイクロＲＮＡを含むポリヌクレオチド配列であって、ＭＰＺマイクロＲＮＡが、配列番号１９～３０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、若しくは配列番号１９～３０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を含むそのバリアントを含む、ポリヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）ＭＰＺマイクロＲＮＡを含むか、若しくはコードするポリヌクレオチド配列であって、ＭＰＺマイクロＲＮＡが、配列番号３１～４２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、若しくは配列番号３１～４２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を含むそのバリアントを含む、ポリヌクレオチド配列、及び／又は
（ｉｖ）ＭＰＺ遺伝子で標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、標的ヌクレオチド配列が、配列番号４３～５４のうちのいずれか１つに示される、ポリヌクレオチド配列、のうちの１つ以上を含む核酸と、
（ｂ）配列番号３若しくは６のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を含む、コドン最適化ＭＰＺ ＤＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸と、を送達することを含む。

【0018】

いくつかの態様において、核酸のうちのいずれか１つ以上は、１つのプロモーター又は複数のプロモーターを更に含む。いくつかの態様において、プロモーターは、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｈ１９プロモーター、ニューロン特異的プロモーター、又はシュワン細胞特異的プロモーターである。いくつかの態様において、シュワン細胞特異的プロモーターは、ＭＰＺプロモーター又はミニＭＰＺプロモーターである。いくつかの態様において、ＭＰＺプロモーターは、配列番号５に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む。いくつかの態様において、細胞は、神経細胞である。いくつかの態様において、神経細胞は、シュワン細胞である。いくつかの態様において、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの態様において、細胞は、ヒト対象中にある。いくつかの態様において、対象は、低髄鞘形成疾患又はシャルコー・マリー・トゥース病に罹患している。いくつかの態様において、疾患は、ＣＭＴ（ＤＩ－ＣＭＴ）、ＣＭＴ １Ｂ型（ＣＭＴ１Ｂ）、ＣＭＴ ２Ｉ型（ＣＭＴ２Ｉ）、ＣＭＴ ２Ｊ型（ＣＭＴ２Ｊ）、又はデジェリーヌ－ソッタス症候群（ＤＳＳ若しくはＣＭＴ ３型）疾患である。いくつかの態様において、核酸は、細胞に、ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、又はそれらのうちのいずれか１つ以上の組み合わせで送達される。いくつかの態様において、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、又は合成ウイルスである。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、ＡＡＶである。いくつかの態様において、ＡＡＶは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いている。いくつかの態様において、ＡＡＶは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）、自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）、又は一本鎖組換えＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）である。いくつかの態様において、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓ、又はＡＡＶｖ６６、又はＡＡＶ－Ｆである。いくつかの具体的な態様において、ＡＡＶは、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶｖ６６、又はＡＡＶ－Ｆである。いくつかの態様において、ＭＰＺ ｍｉＲＮＡを含むか若しくはコードするポリヌクレオチド配列、及び／又はＭＰＺ遺伝子で標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む核酸、並びにコドン最適化ＭＰＺ ＤＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸は、細胞に同時に送達される。いくつかの態様において、核酸は、細胞に同じベクターで送達される。いくつかの態様において、ＭＰＺ ｍｉＲＮＡを含むか若しくはコードするポリヌクレオチド配列、及び／又はＭＰＺ遺伝子で標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む核酸、並びにコドン最適化ＭＰＺ ＤＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸は、細胞に異なる時間で送達される。

【0019】

本開示は、変異体ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）遺伝子の異常発現に罹患している対象を治療する方法を提供し、方法は、対象における変異体ＭＰＺ遺伝子の発現を低減すること、及び機能的ＭＰＺを発現させることを含み、方法は、対象に、有効量の
（ａ）
（ｉ）配列番号７～１８のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％％の同一性を含む、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）マイクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、
（ｉｉ）ＭＰＺマイクロＲＮＡを含むポリヌクレオチド配列であって、ＭＰＺマイクロＲＮＡが、配列番号１９～３０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、若しくは配列番号１９～３０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を含むそのバリアントを含む、ポリヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）ＭＰＺマイクロＲＮＡを含むか、若しくはコードするポリヌクレオチド配列であって、ＭＰＺマイクロＲＮＡが、配列番号３１～４２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、若しくは配列番号３１～４２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の同一性を含むそのバリアントを含む、ポリヌクレオチド配列、及び／又は
（ｉｖ）ＭＰＺ遺伝子で標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、標的ヌクレオチド配列が、配列番号４３～５４のうちのいずれか１つに示される、ポリヌクレオチド配列、のうちの１つ以上を含む核酸と、
（ｂ）配列番号３若しくは６のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を含む、コドン最適化ＭＰＺ ＤＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸と、を送達することを含む。

【0020】

本開示はまた、変異体ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）遺伝子の異常発現に罹患している対象を治療する方法を提供し、方法は、対象に、配列番号１、３、及び６のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む、ＭＰＺ ＤＮＡ又はコドン最適化ＭＰＺ ＤＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む有効量の核酸を送達することによって、対象において機能的ＭＰＺタンパク質を発現させることを含む。

【0021】

いくつかの態様において、核酸のうちのいずれか１つ以上は、１つのプロモーター又は複数のプロモーターを更に含む。いくつかの態様において、プロモーターは、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｈ１９プロモーター、ニューロン特異的プロモーター、又はシュワン細胞特異的プロモーターである。いくつかの態様において、シュワン細胞特異的プロモーターは、ＭＰＺプロモーター又はミニＭＰＺプロモーターである。いくつかの態様において、ＭＰＺプロモーターは、配列番号５に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む。いくつかの態様において、対象は、ヒトである。いくつかの態様において、対象は、低髄鞘形成疾患又はシャルコー・マリー・トゥース病に罹患している。いくつかの態様において、疾患は、ＣＭＴ（ＤＩ－ＣＭＴ）、ＣＭＴ １Ｂ型（ＣＭＴ１Ｂ）、ＣＭＴ ２Ｉ型（ＣＭＴ２Ｉ）、ＣＭＴ ２Ｊ型（ＣＭＴ２Ｊ）、又はデジェリーヌ－ソッタス症候群（ＤＳＳ若しくはＣＭＴ ３型）疾患である。いくつかの態様において、核酸は、対象に、ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、又はそれらのうちのいずれか１つ以上の組み合わせで送達される。いくつかの態様において、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、又は合成ウイルスである。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、ＡＡＶである。いくつかの態様において、ＡＡＶは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いている。いくつかの態様において、ＡＡＶは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）、自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）、又は一本鎖組換えＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）である。いくつかの態様において、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓ、又はＡＡＶｖ６６、又はＡＡＶ－Ｆである。いくつかの具体的な態様において、ＡＡＶは、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶｖ６６、又はＡＡＶ－Ｆである。いくつかの態様において、ＭＰＺ ｍｉＲＮＡを含むか若しくはコードするポリヌクレオチド配列、及び／又はＭＰＺ遺伝子で標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む核酸、並びにコドン最適化ＭＰＺ ＤＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸は、対象に同時に送達される。いくつかの態様において、核酸は、対象に同じベクターで送達される。いくつかの態様において、ＭＰＺ ｍｉＲＮＡを含むか若しくはコードするポリヌクレオチド配列、及び／又はＭＰＺ遺伝子で標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む核酸、並びにコドン最適化ＭＰＺ ＤＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸は、細胞に異なる時間で送達される。

【0022】

本開示は、本開示の核酸のうちのいずれか、又はそれらの組み合わせの使用を提供する。本開示は、本開示のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、又はベクターのうちのいずれかの使用を提供する。本開示は、本開示のウイルスベクターのうちのいずれかの使用を提供する。本開示は、本開示の組成物のうちのいずれかの使用を提供する。いくつかの態様において、使用は、細胞における変異体ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）遺伝子の発現を低減するための医薬品の調製のためのものである。いくつかの態様において、細胞は、ヒト対象中にある。したがって、いくつかの他の態様において、細胞は、エクスビボ又はインビトロ、及び対象の外部である。いくつかの態様において、使用は、変異体ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）遺伝子を含む対象を治療するためのものである。いくつかの態様において、対象は、ヒト対象である。いくつかの態様において、対象は、低髄鞘形成疾患又はシャルコー・マリー・トゥース病に罹患している。いくつかの態様において、疾患は、ＣＭＴ（ＤＩ－ＣＭＴ）、ＣＭＴ １Ｂ型（ＣＭＴ１Ｂ）、ＣＭＴ ２Ｉ型（ＣＭＴ２Ｉ）、ＣＭＴ ２Ｊ型（ＣＭＴ２Ｊ）、又はデジェリーヌ－ソッタス症候群（ＤＳＳ若しくはＣＭＴ ３型）疾患である。

【0023】

本開示は、本明細書に記載の核酸、ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、ベクター、ウイルスベクター、組成物、又は医薬品のうちのいずれかが、いくつかの態様において、筋肉内注射、経口投与、皮下、皮内、若しくは経皮輸送、血流への注入、又はエアロゾル投与のために製剤化されることを提供する。

【0024】

本開示の他の特徴及び利点は、以下の図面の説明及び詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、図面、詳細な説明、及び実施例は、開示される主題の実施形態を示し、例示としてのみ与えられるが、それは本開示の趣旨及び範囲内の様々な変更及び修正が、図面、詳細な説明、及び実施例から明らかになるためである。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】ヒト及びマウスＭＰＺ ｃＤＮＡの概略図を提供する。ＣＭＴ１Ｂを引き起こすＭＰＺ ｃＤＮＡにおける最も一般的な優性変異又は小さな欠失が示される。星印は、マウス及びヒトＭＰＺ配列上の保存領域を表す。太い水平線は、ＭＰＺ ｃＤＮＡで設計されたｍｉＲＮＡでの標的位置を示す。ｍｉＲＮＡは、高度に保存された配列を標的にするように設計され、１つの単一ベクターを使用して、マウスにおける前臨床試験でヒト及びマウスＭＰＺ配列の両方を標的とした。

【図2A】本開示のＭＰＺマイクロＲＮＡ（ｍｉＭＰＺ）ヌクレオチド配列の各々を示し、すなわち、図２ＡはｍｉＭＰＺ＿２２５を示し、図２ＢはｍｉＭＰＺ＿２２６を示し、図２ＣはｍｉＭＰＺ＿３１５を示し、図２ＤはｍｉＭＰＺ＿３１６を示し、図２ＥはｍｉＭＰＺ＿３１７を示し、図２ＦはｍｉＭＰＺ＿７１８を示し、図２ＧはｍｉＭＰＺ＿７１９を示し、図２ＨはｍｉＭＰＺ＿７２０を示し、図２ＩはｍｉＭＰＺ＿７２１を示し、図２ＪはｍｉＭＰＺ＿７２２を示し、図２ＫはｍｉＭＰＺ＿７２３を示し、図２ＬはｍｉＭＰＺ＿１８５２を示す。図２Ａ～Ｌの各々において、上部配列は、文脈で説明されるプライマー対を使用するＰＣＲによるＤＮＡテンプレート合成を示す。各ＤＮＡテンプレートは、それぞれのｍｉＭＰＺを転写する。折り畳まれたｍｉＲＮＡ転写物は、ヘアピン構造として示される。成熟ｍｉＭＰＺ配列は、宿主ｍｉＲＮＡプロセシング機構（ドローシャ、ＤＧＣＲ８、ダイサー、及びエクスポーチン－５を含む）による標的細胞におけるプロセシング後に生じる。灰色で薄くした配列は、各ｍｉＲＮＡをＵ６Ｔ６ベクターにクローニングするために使用される制限酵素切断部位を示す。ＲＮＡにおいて、ＣＴＣＧＡＧ（配列番号７９）は、ＸｈｏＩ部位であり、ＡＣＴＡＧＴ（配列番号８０）は、ＳｐｅＩ部位（ＲＮＡにおけるＣＵＣＧＡＧ（配列番号８１）及びＡＣＵＡＧＵ（配列番号８２）であり、Ｕはウラシル塩基である）である。下線が引かれたイタリック体配列は、最終的にＤＵＸ４標的ｍＲＮＡの切断を触媒するのに役立つ成熟ｍｉＲＮＡアンチセンスガイド鎖を示す。この配列はまた、この図のｍｉＲＮＡヘアピン部分で下線が引かれている。矢印は、それぞれ、ドローシャ触媒切断部位及びダイサー触媒切断部位を示す。番号１３、３５、５３、及び７５は、位置説明のために提供される。位置３５～５３の間の（及びこれらを含む）配列は、Ｇが正常なｍｉｒ－３０ａ配列である位置３９のＡを除いて、天然のヒトｍｉｒ－３０ａ配列に由来する。このヌクレオチドは、コンピュータによるＲＮＡ折り畳みモデルに基づいて、ｍｉＲＮＡループの折り畳みを容易にするためにＡに変更された。ステムの塩基（１３位の５’及び７５位の３’）は、ガイド鎖の一次配列に応じて、ｍｉｒ－３０ａ構造及びいくつかの修飾を有する配列に由来した。具体的には、１３位のヌクレオチドは、１３位と７５位のヌクレオチドとの間の必要なミスマッチを促進するのに役立つように変化させることができる。この膨らんだ構造は、適切なドローシャ切断を促進することが仮定される。

【図2B】同上。

【図2C】同上。

【図2D】同上。

【図2E】同上。

【図2F】同上。

【図2G】同上。

【図2H】同上。

【図2I】同上。

【図2J】同上。

【図2K】同上。

【図2L】同上。

【図3】ＭＰＺ発現をノックダウンする有効性について本開示のｍｉＭＰＺを予備的にスクリーニングした結果を示す。図３Ａは、本開示に記載の様々な試験で使用されるデュアルルシフェラーゼプラスミドの概略図を示す。デュアルルシフェラーゼレポータープラスミドを作製するために、ヒトＭＰＺ ｃＤＮＡを、ｐｓｉＣｈｅｃｋ２プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）中の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）として、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の下流にクローニングした。この構造は、ＭＰＺ配列がウミシイタケルシフェラーゼ終止コドンの後に配置されるため、ルシフェラーゼ－ＭＰＺ融合タンパク質を産生しない。代わりに、ＭＰＺ配列がウミシイタケシルフェラーゼの３’ＵＴＲとして作用する融合ｍＲＮＡが産生される。結果として、任意の有効なＭＰＺ標的化ｍｉＲＮＡは、ウミシイタケルシフェラーゼ－ＭＰＺ融合ｍＲＮＡを減少させ、続いて、トランスフェクトされた細胞におけるウミシイタケルシフェラーゼタンパク質発現を低減させる。同じプラスミド内の異なるプロモーターの下で発現された別個のホタルルシフェラーゼ遺伝子が存在し、ＭＰＺ配列を含まないため、ｍｉＭＰＺによる影響を受けない。図３Ｂは、最初のｍｉＭＰＺ有効性スクリーニングのルシフェラーゼアッセイ結果を示す。このアッセイにおける全ての試料は、レポーターベクター及びＵ６Ｔ６プラスミドで共トランスフェクトした細胞に対して正規化した。ｍｉＭＰＺ＿７２０を除く全てのｍｉＭＰＺは、効率的にウミシイタケルシフェラーゼ発現を低減させた。ｍｉＭＰＺ ２２５、２２６、７２１、及び７２３は、この実験で最大の効率を実証した。図３Ｃは、ｍｉＭＰＺ ２２５、２２６、３１７、７２１、７２３が、共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞においてＭＰＺ発現を著しく低減させたことを示すウェスタンブロットを示す。図３Ｄは、未処理の対照に関連するｈＭＰＺの相対的発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いて示し、ｍｉＭＰＺがＭＰＺ遺伝子発現を低減させることを実証する。これらの結果に基づいて、ｍｉＭＰＺ＿２２５、２２６、３１７、７２１、及び７２３は、共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞において、ＭＰＺ ｍＲＮＡレベルを最も著しく低減させた。これらのｍｉＭＰＺは、様々な態様において、それらが、共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＭＰＺ Ｒ９８Ｃ発現レベルを標的とし、低減させるのに効率的であることを示す。

【図4】本明細書に記載の人工ｍｉＭＰＺによって達成されたＭＰＺ Ｒ９８Ｃ発現の低減を示す。図４Ａは、ＨＥＫ２９３細胞における変異体ＭＰＺ Ｒ９８Ｃを標的とするｍｉＭＰＺ有効性スクリーンのルシフェラーゼアッセイ結果を示す。このアッセイにおける全ての試料は、レポーターベクター及びＵ６Ｔ６プラスミドで共トランスフェクトした細胞に対して正規化した。全てのｍｉＭＰＺは、ウミシイタケルシフェラーゼ発現を効率的に低減させた。図４Ｂは、共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞における様々なｍｉＭＰＺによるＭＰＺ Ｒ９８Ｃノックダウンのウェスタンブロット結果を示す。ｍｉＭＰＺ ２２５、２２６、３１７、７１９、７２１、及び７２３は、共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＲ９８Ｃ発現をより有意に低減させた。図４Ｃは、各ｍｉＭＰＺ及びＲ９８Ｃ発現プラスミドで共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＭＰＺ Ｒ９８Ｃ発現レベルのｑＲＴ－ＰＣＲ結果を示す。全てのＭＰＺ ｍｉＲＮＡは、共トランスフェクトした細胞において、未処理のＲ９８Ｃと比較してＲ９８Ｃ ｍＲＮＡレベルを有意に低減させた。

【図5】１２００ｂｐのヒトＭＰＺプロモーター（ＥＮＳＧ０００００１５８８８７）、６３ｂｐのヒトＭＰＺ ５’ＵＴＲ、及び７４７ｂｐの部分的にコドン最適化したＭＰＺ ｃＤＮＡから作製されたＭＰＺ発現カセットの配列である配列番号６を示す。それはまた、ＳＶ４０ポリＡシグナル及びＣＭＶアンプリコン配列を有する。ＣＭＶアンプリコンは、ｑＲＴ－ＰＣＲ又はｄｄＰＣＲアッセイを使用するＡＡＶ力価測定に使用される。ｍｉＭＰＺは、ＣＭＶアンプリコンの後に位置するＮｓｉＩ部位又はＮｏｔＩ部位にクローニングする。いくつかの例示的な態様において、発現カセットは、各末端で２つのＸｂａＩ制限酵素部位を使用してＡＡＶプレプラスミドにクローニングする。ｃｏＭＰＺ発現カセット内の配列順は、以下のとおりである：ＸＢＡＩ－ｓｔｕｉ－ＳａｌＩ－ｋａｓｉ－ヒトＭＰＺプロモーター（１２００ｂｐ）－ＮｈｅＩ－ヒトＭＰＺ ５’ＵＴＲ－部分的コドン最適化ヒトｍｐｚ ｃｄｓ－ＳＰＥＩ－ｎｄｅｉ－ＳＶ４０ ＰＡ－ｐａｃｉ－ＤＲＰ用ＣＭＶアンプリコン－ＮＳＩＩ－ｎｏｔｉ－ＸＢＡＩ。ヒト、ラット、マウスを含む様々なＭＰＺプロモーター、又はＣＭＶなどのユニバーサルエンハンサー若しくはＰＭＰ２２などのシュワン特異的エンハンサーとの組み合わせも、この構築物に使用することができる。

【図6】ｍｉ２２５とヒト及びマウスＭＰＺとの間の塩基対形成、並びにｍｉＭＰＺノックダウンに対するｃｏＭＰＺの耐性を示す。図６Ａは、野生型ヒト及びマウスＭＰＺとのｍｉＭＰＺ－２２５の完全な塩基対形成を示す。図６Ｂは、ｍｉＭＰＺ２２５とｃｏＭＰＺとの間のミスマッチを示す。変異したヌクレオチド（太字）は、揺らぐ位置にあり、野生型ＭＰＺアミノ酸を維持する。Ｇ・Ｕは、揺らぐ塩基対である。図６Ｃは、ｑＲＴ－ＰＣＲ結果を示す。ｍｉＭＰＺ－２２５は、共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞において野生型ヒトＭＰＺを＞７５％低減させたが、ｃｏＭＰＺは、高レベルのサイレンシングに対して比較的耐性だった。この実験でのｃｏＭＰＺ発現におけるわずかな減少は、２つのＭＰＺ転写物の転写又はｑＲＴ－ＰＣＲ検出における差を反映した可能性がある。

【発明を実施するための形態】

【0026】

本開示は、変異体ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ又はＰ０）遺伝子発現の阻害を、転写後に変異体ＭＰＺ遺伝子発現及びタンパク質産生を抑制又は阻害することによって達成する新規戦略を提供するが、変異体ＭＰＺタンパク質の発現は、シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）を含むがこれに限定されない、低髄鞘形成を伴う先天性神経障害を引き起こすことが知られているためである。したがって、いくつかの態様において、本明細書に記載の生成物、方法、及び使用は、ＣＭＴを含むがこれに限定されない、低髄鞘形成を伴う神経障害を治療、改善、進行の遅延、及び／又は予防する際に使用される。

【0027】

ＣＭＴは、２，５００人に最大１人の有病率を有する遺伝性末梢神経障害の臨床的及び遺伝的に異種の集合である。シャルコー・マリー・トゥース１Ｂ型（ＣＭＴ１Ｂ）は、遺伝性脱髄性神経障害の３番目に多い一般的な形態であり、症例の１０％を占める。ＣＭＴ１Ｂは、ＤＮＡ変異、すなわち、ＭＰＺ遺伝子における常染色体優性機能獲得変異によって引き起こされる。ＭＰＺは必須タンパク質であり、健常で効率的な末梢神経系を維持するために必要とされるミエリン鞘における主要タンパク質である。末梢神経で細胞を支持しているシュワン細胞における欠陥ＭＰＺタンパク質の蓄積は、進行性神経損傷を引き起こし、ＣＭＴ１Ｂ症状につながる。ＣＭＴ１Ｂの特徴は、ゆっくり進行する遠位筋の脱力及び萎縮、垂れ足及び変形、感覚の喪失、並びに２つの典型的な発症：早期幼児及び思春期の発症を伴う非常に重度な反射の欠如を含む。非常に重度なＣＭＴ１Ｂ又は先天性低髄鞘形成の別の定義であるデジェリーヌ－ソッタス症候群（ＤＳＳ）の治療は、本開示の方法及び使用に含まれる。

【0028】

ＭＰＺは、髄鞘形成するシュワン細胞によって発現される２７ｋＤａの単一膜糖タンパク質（Ｍａｇｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２０１１，３７（１－３）：３６０－３７１）である。末梢神経系における全てのタンパク質の５０％超を占め、ＰＮＳで発現される最も一般的なタンパク質となっている（Ｓｈｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００６，２４２（１－２）：５５－６６）。ＣＭＴ１Ｂを引き起こす大部分のＭＰＺ変異は、優性遺伝である。様々な病理学的メカニズムが、各ＭＰＺ遺伝子変異について示唆されている。しかしながら、ＭＰＺ遺伝子における優性変異の主な病理学的メカニズムは、２つの主要な群：（１）正常な髄鞘形成に直接影響を及ぼす毒性の機能獲得変異、及び（２）欠陥のある折り畳み不全タンパク質応答（ＵＰＲ）又は小胞体（ＥＲ）ストレス応答、に分けることができる（Ｂａｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｎｅｕｒｏｌ，２０１８，５：４４５－４５５、Ｂａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｒｅ Ｄｉｓ，２０１３，１：ｅ２４０４９、Ｗｒａｂｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００６，２６：２３５８－２３６８、Ｆｒａｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ，２０１９，１；２８（１）：１２４－１３２）。変異体タンパク質の細胞内蓄積は、両方のメカニズムに共通である。例えば、Ｒ９８Ｃ変異は、ＥＲにおける変異体ＭＰＺタンパク質及び欠陥ＵＰＲを保持することに起因して、早期発症の重度な疾患を引き起こす。この変異を有する患者は、ミエリンが非常に低いか、又はほとんどない。いくらかの患者は、最初の１０年の終わりまでに、決して歩行することができないか、又は一人で車椅子を使用し得る。運動神経伝導速度（ＭＮＣＶ）の中央値は、概して６ｍ／秒未満であり、一方、正常ではおよそ４０ｍ／秒である。これらの患者は、ＣＭＴ１Ｂとして分類される。

【0029】

異常なＭＰＺ発現に関連する追加の疾患には、重度の早期発症型の先天性低髄鞘形成、デジェリーヌ－ソッタス症候群又は疾患（ＤＳＳ若しくはＣＭＴ３型）が含まれるが、これらに限定されない。ＭＰＺ遺伝子におけるいくつかの変異はまた、優性中間型シャルコー・マリー・トゥース病（ＤＩ－ＣＭＴ）、ＣＭＴ ２Ｉ型（ＣＭＴ２Ｉ）、及びＣＭＴ ２Ｊ型（ＣＭＴ２Ｊ）を引き起こす。

【0030】

ＭＰＺレベルは、狭義に定義された範囲内に存在しなければならない。ホモ接合性ＭｐｚヌルマウスにおけるＭｐｚ発現の欠如は、圧縮化が不十分なミエリン鞘（Ｇｒａｎｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ，２００８，１；１７（１３）：１８７７－８９）、ミエリン特異的遺伝子発現の調節不全、及びシュワン細胞におけるミエリンタンパク質局在の異常（Ｂａｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｎｅｕｒｏｌ，２０１８，５：４４５－４５５、Ｗｒａｂｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００６，２６（８）：２３５８－２３６８）を引き起こす。ヘテロ接合性Ｍｐｚヌルマウスは、ＣＭＴ１Ｂの後期、成人発症型と同様の非常に軽度の表現型を示す。興味深いことに、Ｍｐｚ遺伝子の８０％を超える（＞１．８倍）過剰発現はまた、軸索とのシュワン細胞会合を阻害し、髄鞘形成を破壊する（Ｂａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｒｅ Ｄｉｓ，２０１３，１：ｅ２４０４９）。

【0031】

いくつかの遺伝子導入ＣＭＴ１Ｂマウスモデルが作製されており、ＭＰＺ遺伝子における優性変異が末梢神経障害を引き起こすことが確認されている（Ｓａｐｏｒｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ， ２０１２，１３５（７）：２０３２－４７、Ｗｒａｂｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，同上、Ｇｉｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９９２，７１：５６５－５７６）。ＣＭＴ１Ｂマウスモデルのうちの１つは、ＭＰＺＲ９８Ｃ遺伝子導入系統である。ＣＭＴ１ＢのＲ９８Ｃ「ノックイン」マウスモデル（Ｓａｐｏｒｔａ ｅｔ ａｌ．（同上）、Ｐｒｏｆ．Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓｈｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａによって提供された）を、相同組換え方法を使用して部位特異的変異誘発によって作製した。ＭＰＺＲ９８Ｃは、早期発症ＣＭＴ１Ｂのマウスモデルにおけるシュワン細胞発生を阻止する。これらのマウスは、組織学的及び行動的表現型を示す。ヘテロ接合（Ｒ９８Ｃ／＋）及びホモ接合（Ｒ９８Ｃ／Ｒ９８Ｃ）マウスの両方が、衰弱、異常な神経伝導速度、及び形態的に異常なミエリンを発症し、Ｒ９８Ｃ／Ｒ９８Ｃマウスはより重度の影響を受ける。これらのマウスは、同じ変異を有する患者と同様に、小胞体におけるＭｐｚＲ９８Ｃの蓄積及び髄鞘形成の発達遅延を示す。

【0032】

本開示は、遺伝子療法試験におけるホモ接合Ｒ９８Ｃ／Ｒ９８Ｃ及びヘテロ接合Ｒ９８Ｃ／＋マウスの使用を含む。ホモ接合マウスは、遅い不安定な歩行を有し、出生後約２１日の離乳時までに歩行中の持続的な振戦によって明らかである。ヘテロ接合Ｒ９８Ｃ／＋マウスは、少なくとも１年齢まで一貫した観察可能な臨床的異常を示さない。しかしながら、ヘテロ接合マウス及びホモ接合マウスの両方が、運動能力の試験において異常を示す。Ｒ９８Ｃ／Ｒ９８Ｃマウスは、回転ロッド上でそれらのバランスを維持することができず、Ｒ９８Ｃ／＋マウスは、野生型マウスよりも著しく悪かった。ホモ接合マウス及びヘテロ接合マウスは、６～８週齢で野生型マウスにおける約４０ｍ／ｓのＭＮＣＶと比較して、それぞれ約４ｍ／ｓ及び約１５ｍ／ｓの遅れた運動神経伝導速度（ＭＮＣＶ）を有する（ＭｐｚＲ９８Ｃは、早期発症性シャルコー・マリー・トゥース病１Ｂ型のマウスモデルにおけるシュワン細胞発達を停止させる）（Ｓａｐｏｒｔａ ｅｔ ａｌ．，同上）。したがって、ホモ接合マウスは、重度の早期発症ＣＭＴ１Ｂ（ＤＳＳ）により関連しており、ヘテロ接合マウスは、後期発症形態のＣＭＴ１Ｂを生じる。したがって、様々な態様において、ＭＰＺＲ９８Ｃマウスは、モデルとして使用される。したがって、ＭｐｚＲ９８Ｃは、治療モデル（ｈｔｔｐ－ｃｏｌｏｎ－ｆｏｒｗａｒｄｓｌａｓｈ－ｆｏｒｗａｒｄｓｌａｓｈ－ｗｗｗ．ｍｅｄｌｉｎｋ．ｃｏｍ－ｆｏｒｗａｒｄｓｌａｓｈ－ａｒｔｉｃｌｅ－ｆｏｒｗａｒｄｓｌａｓｈ－ｃｈａｒｃｏｔ－ｍａｒｉｅ－ｔｏｏｔｈ－ｄｉｓｅａｓｅ－ｔｙｐｅ－１ｂ）として本開示の様々な態様で使用される。これらのマウスにおける治療ベクター及び用量を最適化すると、追加のマウスモデルが、様々なＭＰＺ変異において提唱した治療戦略の適用可能性を調査する本開示での使用に含まれる。

【0033】

２つの他の一般的な機能獲得バリアントであるＳ６３ｄｅｌ（Ｗｒａｂｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，同上）及びＨ３９Ｐなどのより軽度の形態のＣＭＴ１Ｂのためのマウスモデルは、それぞれ、小児期発症及び成人発症のＣＭＴ１Ｂを表し、これらのモデルは、本開示の様々な態様に含まれる。Ｓ６３ｄｅｌマウスは、４～８週齢に明らかな神経筋障害を発症し、振戦、運動失調、衰弱、及び後肢における筋萎縮を特徴とする。Ｓ６３ｄｅｌマウスはまた、６ヶ月齢で、時々の裸の軸索及びタマネギ様構造（神経線維を囲む同心円状に層化したシュワン細胞プロセス）を伴う顕著な低髄鞘形成を発症し、１年齢後に数を増加させる。ＭＮＣＶ運動は、Ｓ６３ｄｅｌ／／＋／－マウスにおいて５０％低減する（Ｗｒａｂｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，同上）。

【0034】

本開示は、ＲＮＡ阻害（ＲＮＡｉ）を使用して、ｍＲＮＡレベルで欠陥又は変異体のミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ又はＰ０）遺伝子サイレンシングを達成する新規戦略を提供する。ＭＰＺ阻害性ＲＮＡには、野生型及び変異体ＭＰＺ遺伝子の発現を阻害するアンチセンスＲＮＡ、小分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、又は人工ｍｉＲＮＡ（ＭＰＺ ｍｉＲＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。

【0035】

ＭＰＺ ｍｉＲＮＡは、ヒトＭＰＺ遺伝子（ヒトＭＰＺ ｃＤＮＡである配列番号１によって表される）によってコードされたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のセグメントに特異的に結合することができ、セグメントは、野生型マウスＭＰＺ遺伝子（マウスＭＰＺ ｃＤＮＡである配列番号８２によって表される）によってコードされたｍＲＮＡと比較して保存されている。例えば、ＭＰＺ ｍｉＲＮＡは、配列番号１のヌクレオチド２２５～２４７、３１５～３１８、又は７１８～７４４内の配列に相補的であるｍＲＮＡセグメントに特異的に結合することができる。

【0036】

本開示は、健常レベルの正常なＭＰＺタンパク質を維持しながら、シュワン細胞における変異したＭＰＺ発現を阻害することに焦点を当てる。これを達成するために、内因性変異体及び野生型ＭＰＺ発現をサイレンシングするように特異的に設計した人工ｍｉＲＮＡが、野生型ＭＰＺ発現をｍｉＲＮＡ耐性（ｒＭＰＺ）遺伝子で同時に置き換えることによって提供される。本明細書で使用される場合、「ｍｉＲＮＡ耐性（ｒＭＰＺ）」という用語は、「耐性ＭＰＺ（ｒｅｓＭＰＺ）」又は「コドン最適化耐性ＭＰＺ（ｃｏＭＰＺ）」と互換的に使用される。したがって、本開示は、ヒトＭＰＺ及びマウスＭｐｚ遺伝子の両方を特異的かつ等しく標的とするように設計されたｍｉＲＮＡ（ｍｉＭＰＺと呼ばれる）を提供し、他の転写物との予測される非特異的結合は有しない。この戦略は、ネズミモデルからヒトモデルへの結果の置き換えを可能にし、特に臨床試験において重要である。

【0037】

本開示は、ＣＭＴ１Ｂ疾患を含む、ＣＭＴ疾患の根底にある遺伝子的原因、及びＭＰＺ遺伝子それ自体を直接的に標的とするための生成物、方法、及び使用を提供する。本開示は、ＭＰＺ遺伝子における優性変異によって引き起こされるＣＭＴ１Ｂの全ての早期及び後期発症形態に適用可能な普遍的療法を提供する。ＭＰＺ遺伝子のｍｉＲＮＡ媒介サイレンシングを使用することは、ＣＭＴ１Ｂ治療への新規アプローチである。ｍｉＲＮＡは、高度に保存された、小さな（およそ２２ヌクレオチド長）、非コードＲＮＡ分子であり、多くの遺伝子の発現を転写後レベルで負に調節する（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ，２００４，５：５２２－５３１、Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００３，３０１：３３６－３３８）。天然のｍｉＲＮＡは、いくつかの疾患表現型に関与し、２つ以上の内因性遺伝子転写物を調節するため、新規アプローチは、治療目的のために人工ｍｉＲＮＡを利用する（Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ，２００６，１２：９９－１０１、ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００８，１０５：５８６８－５８７３）。

【0038】

本開示は、正常なｍｉＲＮＡ生合成に必要な必須の構造的エレメント及び配列エレメントを維持するが、成熟ｍｉｒ－３０配列を、目的のＭＰＺ遺伝子を標的とするものと置き換えることによって、天然のヒトｍｉＲ－３０に基づいて操作された人工ｍｉＲＮＡを提供する。これらの新規人工ｍｉＲＮＡは、ＭＰＺ遺伝子と完全な相補性の２２－ｎｔを含む。本開示のｍｉＲＮＡ（ｍｉＭＰＺ）は、マウスＭＰＺ ｃＤＮＡとヒトＭＰＺ ｃＤＮＡとの間の高度に保存された配列を標的とするように設計される。ｍｉＭＰＺ－６～１１は、ＣＭＴ１Ｂに関連するいずれの報告された変異も有しないＭＰＺ遺伝子の領域に設計される（図１）。図１は、ヒト及びマウスＭＰＺ ｃＤＮＡの概略図を提供し、ＣＭＴ１Ｂを引き起こす最も一般的な優性変異又は小さい欠失が示される位置、及び単一のｍｉＲＮＡがヒト及びマウスＭＰＺ配列の両方を標的とすることができるように本開示のｍｉＲＮＡが設計された位置を示す。

【0039】

いくつかの態様において、本開示は、欠陥ＭＰＺタンパク質を低減し、それを健常なＭＰＺタンパク質と置き換えることによるＣＭＴ１Ｂの治療又は改善を含む。この戦略「ノックダウン及び置換」は、遺伝子療法を使用して、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と呼ばれるＭＰＺ低減分子を、ＭＰＺ遺伝子の健常なコピーとともにシュワン細胞に送達することによって達成される。したがって、いくつかの態様において、本明細書に記載の生成物及び方法は、ＣＭＴ１ＢなどのＣＭＴ疾患を含むがこれに限定されないＭＰＺ遺伝子障害の治療に使用される。

【0040】

本開示は、いくつかのｍｉＭＰＺが、ＭＰＺ過剰発現性ＨＥＫ２９３細胞において、ヒト変異体及び野生型ＭＰＺ発現を８０％超で著しく低減させたことを示すデータを提供する。本開示はまた、一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞においてｒＭＰＺ発現がｍｉＭＰＺサイレンシングに耐性であることを実証するデータを提供する。

【0041】

本開示は、様々な核酸及びポリペプチドを提供する。本開示は、本明細書に記載の様々なヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる様々な核酸を含む。いくつかの態様において、核酸は、ヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、核酸は、本質的にヌクレオチド配列からなる。いくつかの態様において、核酸は、ヌクレオチド配列からなる。本開示は、本明細書に記載の様々なアミノ酸配列を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる、様々なペプチドを含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは、アミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは、本質的にアミノ酸配列からなる。いくつかの態様において、ポリペプチドは、アミノ酸配列からなる。

【0042】

いくつかの態様において、核酸は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列で示されるヒトＭＰＺをコードするヌクレオチド配列を含む。様々な態様において、核酸は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含むヒトＭＰＺをコードするヌクレオチド配列のアイソフォーム又はバリアントである。いくつかの態様において、アイソフォーム又はバリアントは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列と９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、及び７０％の同一性を含む。

【0043】

いくつかの態様において、ポリペプチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むヒトＭＰＺポリペプチドである。様々な態様において、ポリペプチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むヒトＭＰＺポリペプチドのアイソフォーム又はバリアントである。いくつかの態様において、アイソフォーム又はバリアントは、配列番号４に示されるアミノ酸配列と９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、及び７０％の同一性を含む。

【0044】

したがって、いくつかの態様において、核酸は、配列番号４に示されるアミノ酸配列で示されるヒトＭＰＺをコードするヌクレオチド配列を含む。様々な態様において、核酸は、配列番号４に示されるアミノ酸配列に示されるヒトＭＰＺをコードするヌクレオチド配列のアイソフォーム又はバリアントである。いくつかの態様において、アイソフォーム又はバリアントは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、及び７０％の同一性を含む。

【0045】

いくつかの態様において、核酸は、配列番号２に示されるヒトＭＰＺ ３’ＵＴＲをコードするヌクレオチド配列を含む。３’ＵＴＲにおける標的部位は、ｍｉＲＮＡによるサイレンシングに対してそれを耐性にするように最適化される。様々な態様において、核酸は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含むヒトＭＰＺ ３’ＵＴＲをコードするヌクレオチド配列のアイソフォーム又はバリアントである。いくつかの態様において、アイソフォーム又はバリアントは、配列番号２に示されるヌクレオチド配列と９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、及び７０％の同一性を含む。

【0046】

ＲＮＡ阻害（ＲＮＡｉ）は、優性遺伝性障害に対する効果的な長期治療として本明細書に記載される。例として、関与する遺伝子の野生型及び変異体の両方をノックダウンすることによって、ＭＰＺ遺伝子変異を有する対象を治療し、一方また、ＲＮＡｉ耐性置換ＭＰＺ遺伝子を送達するための生成物及び方法が提供される。例として、本明細書において、対象における変異体ＭＰＺ遺伝子及び野生型ＭＰＺ遺伝子の発現をノックダウンするための生成物及び方法が記載される。方法は、ＭＰＺ阻害性ＲＮＡを利用して、変異体ＭＰＺ遺伝子発現をノックダウンする。方法はまた、ＲＮＡｉ耐性置換ＭＰＺ遺伝子を提供する。方法及び生成物の使用は、例えば、シャルコー・マリー・トゥース病１Ｂ型（ＣＭＴ１Ｂ）疾患などのＭＰＺ遺伝子における変異に関連する疾患を、例えば、予防、治療、又は改善することに適応される。

【0047】

本明細書に記載の全てのｍｉＲＮＡは、野生型ＭＰＺ遺伝子及び変異体ＭＰＺ遺伝子の両方を標的にするように設計された。ＣＭＴ１Ｂは、常染色体優性変異によって引き起こされるため、１つの変異対立遺伝子のみでＣＭＴ１Ｂ症状を引き起こすのに十分である。ＭＰＺ変異に罹患している患者は、１つの野生型及び１つの変異体ＭＰＺ対立遺伝子、又は２つの変異体ＭＰＺ対立遺伝子を有し得る。１つの変異体ＭＰＺ対立遺伝子のみを有する患者は、２つの変異体ＭＰＺ対立遺伝子を有する患者と比較して、より軽度の表現型を有する。本明細書に記載のｍｉＲＮＡは、両方の対立遺伝子を標的にしてサイレンシングするように設計された。追加的に、野生型ＭＰＺ対立遺伝子の発現は、健常なミエリン鞘を維持するために必要であるため、ＭＰＺ ｃＤＮＡ配列をコドン最適化し、その遺伝子でｍｉＲＮＡ標的部位を変異させることによって、ｍｉＲＮＡ耐性ＭＰＺ遺伝子を設計した（本明細書で説明され、図６Ａ～Ｂに示されるように）。

【0048】

例示的なｍｉＲＮＡ耐性ＭＰＺ遺伝子は、本開示のコドン最適化ＭＰＺ ｃＤＮＡ（代替的に、耐性ＭＰＺ（ｒｅｓＭＰＺ又はｒＭＰＺ）又はｃｏＭＰＺと呼ばれる）配列であり、配列番号３に示されるか、又は配列番号６に示されるＭＰＺ発現カセット内に見出される。「ｍｉＲＮＡ－ｒｅｓＭＰＺ」、「ｒｅｓＭＰＺ」、「ｒＭＰＺ」、「ｃｏＭＰＺ」という用語は、本明細書で使用される場合、互換的である。

【0049】

ＲＮＡｉ耐性置換ＭＰＺ遺伝子が提供される。「ＲＮＡｉ耐性置換ＭＰＺ遺伝子」は、その発現が本明細書に記載のＭＰＺ ｍｉＲＮＡによってノックダウンされず、ヌクレオチド配列が依然としてＭＰＺタンパク質活性を有するＭＰＺタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。例示的なＲＮＡｉ耐性置換ＭＰＺ遺伝子は、配列番号３に示されるか、又は配列番号６に示されるＭＰＺ発現カセット内に見出される。

【0050】

したがって、本開示は、ＭＰＺマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）によって下方調節される変異体ＭＰＺ又は野生型ＭＰＺを置き換えるための核酸を提供する。いくつかの態様において、核酸は、ＭＰＺ ｍｉＲＮＡの曝露に耐性であるようにコドン最適化される。いくつかの態様において、核酸は、配列番号３に示される部分的にコドン最適化したヒトＭＰＺ（ヒトｃｏＭＰＺ）をコードするヌクレオチド配列を含む。様々な態様において、核酸は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含む、部分的にコドン最適化したヒトＭＰＺをコードするヌクレオチド配列のアイソフォーム又はバリアントである。いくつかの態様において、アイソフォーム又はバリアントは、配列番号３に示されるヌクレオチド配列と９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、及び７０％の同一性を含む。

【0051】

いくつかの態様において、変異体ＭＰＺ又は野生型ＭＰＺを置き換えるための核酸は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を含むヒトＭＰＺプロモーターをコードするヌクレオチド配列を含む。様々な態様において、核酸は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を含むヒトＭＰＺプロモーターをコードするヌクレオチド配列のアイソフォーム又はバリアントである。いくつかの態様において、アイソフォーム又はバリアントは、配列番号５に示されるヌクレオチド配列と９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、及び７０％の同一性を含む。

【0052】

いくつかの態様において、核酸は、ヒトＭＰＺプロモーター、ヒトＭＰＺ ５’ＵＴＲ、及び部分的にコドン最適化したヒトＭＰＺ ｃＤＮＡを含むヒトＭＰＺ発現カセットを含むヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、かかる核酸は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列を含む。様々な態様において、核酸は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列のアイソフォーム又はバリアントである。いくつかの態様において、アイソフォーム又はバリアントは、配列番号６に示されるヌクレオチド配列と９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、及び７０％の同一性を含む。

【0053】

例示的なＲＮＡｉ耐性置換ＭＰＺ遺伝子は、配列番号３及び６のうちのいずれか１つに示されるか、又は配列番号３及び６のうちのいずれか１つと少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を含むそのバリアントである。例示的なＲＮＡｉ耐性置換ＭＰＺ遺伝子は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号５と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を含むそのバリアントを含むＭＰＺプロモーターを更に含む。

【0054】

以下に示される表１は、本開示の様々なヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を提供する。具体的には、表１は、本開示のヒトＭＰＺ ｃＤＮＡ、３’ＵＴＲ ＤＮＡ、部分的にコドン最適化したヒトｃＤＮＡ、ヒトＭＰＺポリペプチド、ヒトＭＰＺプロモーター、及びヒトＭＰＺ発現カセットの配列を提供する。

【0055】

【表1-1】

【0056】

【表1-2】

【0057】

【表1-3】

【0058】

【表1-4】

【0059】

本開示は、変異したＭＰＺ遺伝子及び結果として生じる変化した型のｍＲＮＡに起因する疾患又は障害を有する対象を改善及び／又は治療するための、発現変異体ＭＰＺを阻害又はそれに干渉するためのＲＮＡ干渉の使用を含む。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、真核細胞における遺伝子調節のメカニズムであり、様々な疾患の治療のために考慮されてきている。ＲＮＡｉは、阻害性ＲＮＡによって媒介される遺伝子発現の転写後制御を指す。ｍｉＲＮＡは、配列相同性を共有し、同族のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の３’非翻訳領域と塩基対形成する、小さい（２１～２５ヌクレオチド）、非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの間の相互作用は、ｍＲＮＡの翻訳を妨げる細胞遺伝子サイレンシング機構を支持する。

【0060】

天然ＲＮＡｉ経路の理解が進展してきており、研究者は、疾患を治療するため、標的遺伝子の発現を調節する際に使用するための人工ｓｈＲＮＡ及びｓｎＲＮＡを設計している。いくつかのクラスの小ＲＮＡは、哺乳動物細胞でＲＮＡｉプロセスを誘発することが知られており、これには、短（又は小）干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、並びに短（又は小）ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれ、類似のクラスのベクター発現トリガーを構成する［Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１２：３２９－４０，２０１１、Ｈａｒｐｅｒ，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．６６：９３３－８，２００９］。ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡは、プラスミド－又はウイルス－ベースのベクターからインビトロで発現され、そのため、ベクターが標的細胞核内に存在し、駆動プロモーターが活性である限り、単回投与で長期の遺伝子サイレンシングを達成し得る（Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３９２：１４５－７３，２００５）。重要なことには、このベクター発現アプローチは、筋遺伝子治療分野で既になされた数十年の長さにわたる進歩を強化するが、タンパク質コード遺伝子を発現する代わりに、ＲＮＡｉ療法戦略におけるベクターカーゴは、目的の疾患遺伝子を標的とする人工ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡカセットである。この戦略は天然のｍｉＲＮＡを発現させるために使用される。各ｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ａ配列及び構造に基づいている。天然のｍｉｒ－３０ａ成熟配列は、標的遺伝子に由来する固有のセンス及びアンチセンス配列によって置き換えられる。

【0061】

本開示は、内因性変異体ＭＰＺ発現及び野生型ＭＰＺ発現をサイレンシングするために特異的に設計された人工ｍｉＲＮＡを提供する。本開示はまた、内因性変異体ＭＰＺ発現及び野生型ＭＰＺ発現をサイレンシングするために特異的に設計された人工ｍｉＲＮＡを提供し、一方同時に、野生型ＭＰＺ発現をｍｉＲＮＡ耐性（ｒＭＰＺ）遺伝子に置き換える。この「ノックダウン及び置換」戦略は、欠陥のあるＭＰＺタンパク質を低減させ、欠陥のあるタンパク質を健常なＭＰＺタンパク質に置き換える。いくつかの態様において、人工のＭＰＺ低減化ｍｉＲＮＡは、単独で送達される。いくつかの態様において、人工のＭＰＺ低減化ｍｉＲＮＡは、ｒＭＰＺ遺伝子とともに、シュワン細胞を含むがこれに限定されない神経細胞に送達される。人工ｍｉＲＮＡ（本明細書ではｍｉＭＰＺと呼ばれる）は、ヒトＭＰＺ及びマウスＭｐｚ遺伝子の両方を特異的かつ等しく標的化するように設計され、他の転写物との予測される非特異的結合は有しない。この戦略は、ネズミモデルからヒト臨床試験への結果の置き換えを可能にする。したがって、本明細書に記載及び開示のｍｉＭＰＺは、ＭＰＺ変異及びこれらのＭＰＺ変異に関連する、ＣＭＴ疾患を含むがこれに限定されない疾患を治療するための治療薬として有用である。

【0062】

本開示は、変異体ＭＰＺ遺伝子及びタンパク質を含む、ＭＰＺ遺伝子及びタンパク質の発現をノックダウン、阻害、又は防止するために、ＭＰＺを標的とする阻害性ＲＮＡ（マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ））をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を提供する。阻害性ＲＮＡは、ＭＰＺ遺伝子の発現を阻害するアンチセンス配列を含む。いくつかの態様において、本開示は、ＭＰＺ ｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、及びＲＮＡｉ耐性ＭＰＺ遺伝子を含む核酸を提供する。本開示は、全長非プロセス化ＭＰＺ ｍｉＲＮＡ、及び成熟又はプロセスｍｉＲＮＡを提供する。本開示はまた、ｍｉＲＮＡ配列が標的とするように設計されるＭＰＺ配列を提供する。

【0063】

いくつかの態様において、本開示は、配列番号７～１８のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含むＭＰＺ ｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を提供する。

【0064】

いくつかの態様において、本開示は、配列番号７～１８のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含むＭＰＺ ｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を提供する。

【0065】

いくつかの態様において、本開示は、配列番号１９～３０のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む全長ｍｉＲＮＡアンチセンスガイド鎖を含むＭＰＺ ｍｉＲＮＡを含むポリヌクレオチドを含む核酸を提供する。したがって、いくつかの態様において、本開示は、配列番号３１～４２のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含むＭＰＺ最終プロセス化ガイド鎖ｍｉＲＮＡを含むか、又はコードするポリヌクレオチドを含む核酸を提供する。したがって、いくつかのより特定の態様において、本開示は、配列番号３１～４２のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含むＭＰＺ最終プロセス化ガイド鎖ｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。

【0066】

いくつかの態様において、本開示は、配列番号４３～５４のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含むＭＰＺ遺伝子のＤＮＡ配列を標的にするポリヌクレオチドを含む核酸を提供する。

【0067】

以下に示される表２は、例示的なｍｉＲＮＡコード配列、ＲＮＡ配列、及びＭＰＺ標的配列を提供する。以下に示される表３は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードするＤＮＡを合成する際に使用されたＰＣＲプライマー（配列番号５５～７８）を提供する。

【0068】

【表2-1】

【0069】

【表2-2】

【0070】

【表3-1】

【0071】

【表3-2】

【0072】

いくつかの態様において、本開示の核酸は、標的細胞内で機能的である転写制御エレメント（プロモーター、エンハンサー、及び／又はポリアデニル化シグナルを含むが、これらに限定されない）に操作可能に連結されているポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチド（又はヌクレオチド）配列は、プロモーターに連結される。

【0073】

誘導性プロモーターもまた、企図される。誘導性プロモーターの非限定的な例としては、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリン調節プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。ＭＰＺ置換遺伝子を含む遺伝子カセットはまた、哺乳動物細胞で発現されるときにＭＰＺ ＲＮＡ転写物のプロセシングを促進するためのイントロン配列を含み得る。

【0074】

いくつかの態様において、ＭＰＺ ｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列及び／又は置換ＭＰＺ遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列は、同じプロモーターの下で発現されるか、又は各ポリヌクレオチド配列は、それら自体のプロモーター下で発現される。かかるプロモーターとしては、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｈ１９プロモーター、ニューロン特異的プロモーター、Ｈ１プロモーター、ＥＦ１－アルファプロモーター、最小ＥＦ１－アルファプロモーター、ｕｎｃ４５ｂプロモーター、ＣＫ１プロモーター、ＣＫ６プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ミニＣＭＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、アルファ－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、ｔＭＣＫプロモーター、最小ＭＣＫプロモーター、デスミンプロモーター、チキンβアクチンプロモーター（ＣＢＡ）、Ｐ５４６プロモーターシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン－バーウイルス即時早期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、並びにアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子－１ａプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、クレアチンキナーゼプロモーター、ニューロン特異的プロモーター、ミエリン特異的プロモーター、又はネイティブプロモーターなどに限定されないヒト遺伝子プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、プロモーターは、シュワン細胞特異的プロモーター又はミエリン特異的プロモーターであり得、限定されないが、例えば、ＷＯ２０２０／２４５１６９に記載されているこれらのプロモーターを含む。いくつかの態様において、プロモーターは、マウス、ラット、又はヒトプロモーターであり得る。いくつかの態様において、ＭＰＺ ｍｉＲＮＡ及び／又は置換ＭＰＺ遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｈ１９プロモーター、又はニューロン特異的プロモーターの下で発現される。いくつかの態様において、かかるニューロン特異的プロモーターは、ＭＰＺプロモーター、非圧縮ミエリン関連タンパク質（ＮＣＭＰＡ又はＭＰ１１）プロモーター、ＰＭＰ２２プロモーター、ＭＢＰプロモーター、ＳＯＸ１０プロモーター、又はＧＡＰ４３プロモーターである。いくつかの態様において、ｍｉＭＰＺとともに使用されるプロモーターは、Ｕ６プロモーターである。いくつかの態様において、ＭＰＺ置換遺伝子とともに使用されるプロモーターは、ＭＰＺプロモーター又はミニＭＰＺプロモーターである。いくつかの態様において、ＭＰＺプロモーター又はミニＭＰＺプロモーターは、マウス、ラット、又はヒトプロモーターである。いくつかの態様において、ＭＰＺプロモーター又はミニＭＰＺプロモーターは、ヒトＭＰＺプロモーター又はヒトミニＭＰＺプロモーターである。いくつかの態様において、ヒトＭＰＺプロモーターは、配列番号５に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号５と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を含むそのバリアントを含む。

【0075】

いくつかの態様において、本開示の生成物、方法、及び使用はまた、ＭＰＺ発現に影響を与える（例えば、発現をノックダウン又は阻害する）ための短ヘアピンＲＮＡ又は小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む。短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ／ヘアピンベクター）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して標的遺伝子の発現をサイレンシングするために使用することができるタイトなヘアピンターンを有する人工ＲＮＡ分子である。ｓｈＲＮＡは、それが分解及びターンオーバーの速度が比較的低いという点でＲＮＡｉの有利なメディエーターであるが、それは発現ベクターの使用を必要とする。ベクターが宿主ゲノムを形質導入していると、次にｓｈＲＮＡは、プロモーター選択に応じてポリメラーゼＩＩ又はポリメラーゼＩＩＩによって核内で転写される。産物は、ｐｒｉ－マイクロＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）を模倣し、ドローシャによって処理される。得られるｐｒｅ－ｓｈＲＮＡは、エクスポーチン５によって核から輸出される。次にこの産物はダイサーによって処理され、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に負荷される。センス（パッセンジャー）鎖が分解される。アンチセンス（ガイド）鎖は、相補的な配列を有するｍＲＮＡにＲＩＳＣを指向させる。完全な相補性の場合、ＲＩＳＣはｍＲＮＡを切断する。不完全な相補性の場合、ＲＩＳＣはｍＲＮＡの翻訳を抑制する。これらの両方の場合で、ｓｈＲＮＡは、標的遺伝子サイレンシングをもたらす。いくつかの態様において、本開示は、ｓｈＲＮＡを介してＭＰＺアンチセンス配列を発現するＡＡＶベクターの産生及び投与を含む。ｓｈＲＮＡの発現は、様々なプロモーターの使用によって調節される。プロモーター選択は、頑強なｓｈＲＮＡ発現を達成するために必須である。様々な態様において、Ｕ６及びＨ１などのポリメラーゼＩＩプロモーター、並びにポリメラーゼＩＩＩプロモーターが使用される。いくつかの態様において、Ｕ６ ｓｈＲＮＡが使用される。

【0076】

したがって、いくつかの態様において、本開示は、Ｕ６ ｓｈＲＮＡ分子を使用して、ＭＰＺ遺伝子発現を阻害するか、ノックダウンするか、又はそれに干渉する。従来の小／短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）配列は通常、Ｕ６などのＰｏｌＩＩＩプロモーターを含むベクターから細胞核内に転写される。内因性Ｕ６プロモーターは、通常、スプライシングに関与する小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）であるＵ６ ＲＮＡの発現を制御し、十分に特性評価されている［Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．３２２（６０７４）：７３－７（１９８６）、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２（２）：１９６－２０４（１９８８）、Ｐａｕｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（６）：１２８３－９８（２０００）］。いくつかの態様において、Ｕ６プロモーターが、哺乳動物細胞におけるｓｈＲＮＡ分子のベクターに基づく発現を制御するために使用される［Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９（３）：１４４３－８（２００２）、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（５）：５０５－８（２００２）］が、それは（１）プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌｙＩＩＩ）によって認識され、ｓｈＲＮＡの高レベルの恒常的発現を制御し、（２）プロモーターが、ほとんどの哺乳動物細胞タイプにおいて活性であるためである。いくつかの態様において、プロモーターは、ｓｈＲＮＡの発現を制御するために必要な全てのエレメントが転写開始部位の上流に配置される、タイプＩＩＩ ＰｏｌＩＩＩプロモーターである（Ｐａｕｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（６）：１２８３－９８（２０００））。本開示は、ネズミ及びヒトＵ６プロモーターの両方を含む。ループによって接続された、標的遺伝子からのセンス配列及びアンチセンス配列を含むｓｈＲＮＡは、核から細胞質へと輸送され、そこでダイサーがそれを小／短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）へと処理する。

【0077】

いくつかの実施形態において、本開示の生成物、方法、及び使用は、ＭＰＺ遺伝子発現をノックダウン又は更に阻害するために、通常Ｕ－ＲＮＡとも称される小核リボ核酸（ｓｎＲＮＡ）を含む。ｓｎＲＮＡは、真核生物細胞における細胞核のスプライシングスペックル及びカハール体の内部に見出される小ＲＮＡ分子のクラスである。小核ＲＮＡは、特定のタンパク質のセットに関連付けられ、複合体は、小核リボ核タンパク質（しばしば「スナープ」と発音されるｓｎＲＮＰ）と称される。各ｓｎＲＮＰ粒子は、ｓｎＲＮＡ成分及びいくつかのｓｎＲＮＰ特異的タンパク質（核タンパク質のファミリーであるＳｍタンパク質を含む）からなる。ｓｎＲＮＡは、それらの関連するタンパク質と一緒に、プレｍＲＮＡ基質上の特定の配列に結合するリボ核タンパク質複合体（ｓｎＲＮＰ）を形成する。これらは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのいずれかによって転写される。ｓｎＲＮＡは、多くの場合、共通の配列特徴及びＲＮＡ結合ＬＳｍタンパク質などの関連するタンパク質因子の両方に基づいて、２つのクラスに分類される。ＳｍクラスのｓｎＲＮＡとして知られる第１のクラスは、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ４ａｔａｃ、Ｕ５、Ｕ７、Ｕ１１、及びＵ１２で構成される。ＳｍクラスのｓｎＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写される。第２のクラスは、ＬｓｍクラスのｓｎＲＮＡとして知られ、Ｕ６及びＵ６ａｔａｃで構成される。ＬｓｍクラスのｓｎＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって転写され、ＳｍクラスのｓｎＲＮＡとは対照的に、核から決して離れない。いくつかの態様において、本開示は、ＭＰＺアンチセンス配列の送達のためのＵ７ ｓｎＲＮＡを含むＡＡＶベクターの産生及び投与を含む。

【0078】

いくつかの態様において、本開示は、Ｕ７ ｓｎＲＮＡ分子を使用して、ＭＰＺ遺伝子発現を更に阻害、ノックダウン、又はそれに干渉する。Ｕ７ ｓｎＲＮＡは、通常、ヒストンプレｍＲＮＡ３’末端プロセシングに関与するが、いくつかの態様において、スプライシング調節のための汎用ツールに、又は細胞内で連続的に発現されるアンチセンスＲＮＡとして、変換される［Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０６（５７０２）：１７９６－９（２００４）］。野生型Ｕ７ Ｓｍ結合部位を、スプライセオソームｓｎＲＮＡに由来するコンセンサス配列で置き換えることによって、得られるＲＮＡは、スプライセオソームｓｎＲＮＡに見出される７つのＳｍタンパク質と組み立てられる。その結果、このＵ７ Ｓｍ ＯＰＴ ＲＮＡは、より効率的に核質内に蓄積し、ヒストンプレｍＲＮＡ切断をもはや媒介しないが、依然としてヒストンプレｍＲＮＡに結合し、野生型Ｕ７ ｓｎＲＮＰの競合阻害物質として作用することができる。ヒストン下流エレメントに結合する配列を、スプライシング基質における特定の標的に相補的なもので更に置き換えることによって、特定のスプライシング事象を調節することができるＵ７ ｓｎＲＮＡを作製することが可能である。Ｕ７誘導体を使用する利点は、アンチセンス配列が、小核リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）複合体に埋め込まれることである。更に、遺伝子療法ベクターに埋め込まれると、これらの小ＲＮＡは、単回注入後に標的細胞内で恒久的に発現することができる［Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１８（９）：９６９－７０（２０１０）、Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．３１（２）：１３６－４２，（２０１０）、Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０（９）：９９２－１０００（２０１４）］。

【0079】

Ｕ７ ｓｎＲＮＡは、通常、ヒストンプレｍＲＮＡ３’末端プロセシングに関与するが、スプライシング調節のための汎用ツールとして、又は細胞内で連続的に発現されるアンチセンスＲＮＡとしても使用される。Ｕ７誘導体を使用する１つの利点は、アンチセンス配列が、小核リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）複合体に埋め込まれることである。更に、遺伝子療法ベクターに埋め込まれると、これらの小ＲＮＡは、単回注入後に標的細胞内で恒久的に発現することができる。

【0080】

いくつかの態様において、本開示は、本開示の核酸のうちのいずれか、又はそれらのいずれか１つ以上の組み合わせを含む、ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、又はベクターを含む。いくつかの態様において、これらの配列の１つ以上のコピーは、単一ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、又はベクターに組み合わされる。

【0081】

したがって、本開示は、本開示の核酸又は本開示の核酸の組み合わせを含む、ベクターを含む。本開示の実施形態は、ベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ウマ関連ウイルス、アルファウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、ワクシニアウイルス、又は合成ウイルス、例えば、キメラウイルス、モザイクウイルス、若しくは偽型ウイルス、及び／又は外来タンパク質、合成ポリマー、ナノ粒子、若しくは小分子を含有するウイルスなどのウイルスベクター）を利用して、本明細書に開示の核酸を送達する。

【0082】

いくつかの実施形態において、本開示は、ＡＡＶを利用して、ＭＰＺ ｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡなどの阻害性ＲＮＡを送達し、ＭＰＺ ｍＲＮＡを標的として変異体ＭＰＺ発現を阻害する。ＡＡＶは、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、１４５ヌクレオチドの逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む、長さが約４．７ｋｂである。ＡＡＶの複数の血清型がある。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、既知である。例えば、ＡＡＶ－１の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＣ＿００２０７７で提供され、ＡＡＶ－２の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＣ＿００１４０１及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４｛１９８３）で提供され、ＡＡＶ－３の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＣ＿１８２９で提供され、ＡＡＶ－４の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＣ＿００１８２９で提供され、ＡＡＶ－５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ０８５７１６で提供され、ＡＡＶ－６の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＣ＿００１８６２で提供され、ＡＡＶ－７及びＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９で提供され（ＡＡＶ－８に関して米国特許第７，２８２，１９９号及び同第７，７９０，４４９号も参照）で提供され、ＡＡＶ－９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）で提供され、ＡＡＶ－１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）で提供され、ＡＡＶ－１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）で提供される。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、及び宿主細胞染色体組み込みを指示するシス作用配列は、ＡＡＶ ＩＴＲ内に含まれる。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対的マップ位置でｐ５、ｐ１９、及びｐ４０と名付けられる）は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。単一のＡＡＶイントロンの差次的スプライシング（ヌクレオチド２１０７位及び２２２７位）と結合した、２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５及びｐ１９）は、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０）の産生をもたらす。ｒｅｐタンパク質は、ウイルスゲノムを複製するために最終的に関与する複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質であるＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。代替的スプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連するカプシドタンパク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５位に配置される。ＡＡＶのライフサイクル及び遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５８：９７－１２９（１９９２）でレビューされている。

【0083】

ＡＡＶは、例えば遺伝子療法において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとしてそれを魅力的にする固有の特徴を有する。培養での細胞のＡＡＶ感染は、非細胞変性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は、無症状及び無症候性である。更に、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞を感染させて、インビボで多くの異なる組織を標的とする可能性を与える。更に、ＡＡＶは、ゆっくり分裂する細胞及び非分裂性細胞で形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外要素）として本質的にそれらの細胞の存続期間にわたって持続し得る。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にする、プラスミド中のクローン化ＤＮＡとして感染性である。更に、ＡＡＶ複製、ゲノムカプシド形成、及び組み込みを指示するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含有されるため、内部の約４．３ｋｂのゲノム（複製及び構造カプシドタンパク質ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）の一部又は全てが、外来ＤＮＡで置き換えられ得る。ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定した頑強なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低くする。ＡＡＶは、凍結乾燥され得、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性ではない。いくつかの態様において、ＡＡＶは、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、又はニューロン特異的プロモーターの制御下で阻害性ＲＮＡをコードする核酸を送達するために使用される。いくつかの態様において、ＡＡＶは、ＭＰＺプロモーター又はミニＭＰＺプロモーターの制御下で阻害性ＲＮＡをコードする核酸を送達するために使用される。いくつかの態様において、ＭＰＺプロモーター又はミニＭＰＺプロモーターは、マウス、ラット、又はヒトである。いくつかの態様において、ＡＡＶは、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、又はニューロン特異的プロモーターの制御下でＲＮＡｉ耐性置換ＭＰＺ遺伝子をコードする核酸を送達するために使用される。いくつかの態様において、ＡＡＶは、ＭＰＺプロモーター又はミニＭＰＺプロモーターの制御下でＲＮＡｉ耐性置換ＭＰＺ遺伝子をコードする核酸を送達するために使用される。いくつかの態様において、ＭＰＺプロモーター又はミニＭＰＺプロモーターは、マウス、ラット、又はヒトプロモーターである。いくつかの態様において、ＭＰＺプロモーター又はミニＭＰＺプロモーターは、ヒトプロモーターである。

【0084】

いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いている。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、組換え直鎖ＡＡＶ（ｒＡＡＶ）、一本鎖ＡＡＶ、又は組換え自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。

【0085】

ＡＡＶベクターにおける進歩は、単回注射で治療用導入遺伝子を送達する、より安全でより効率的なウイルスビヒクルをもたらしており、遺伝子療法は現在、単一遺伝子性疾患のための好ましい治療介入である。ＡＡＶベクターは、有糸分裂後の標的組織における遺伝子産物の長期的な発現を提供することができる。したがって、現在のＡＡＶベースの戦略は、１回のベクター投与のみを必要とし得る。

【0086】

本開示の組換えＡＡＶゲノムは、例えば、１つ以上のＭＰＺ阻害性ＲＮＡ又はＭＰＺ ｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。本明細書に提供されるｒＡＡＶのゲノムは、ＲＮＡｉ耐性置換ＭＰＺ遺伝子を更に含むか、又はＲＮＡｉ耐性置換ＭＰＺ遺伝子が別個のｒＡＡＶに存在するかのいずれかである。ｍｉＲＮＡ－及び置換ＭＰＺ－コードポリヌクレオチドは、標的細胞内で機能的である転写制御ＤＮＡ、例えばプロモーターＤＮＡに操作可能に連結される。Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、Ｄａｒｍａｃｏｎ Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＬＬＣ（Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）などの商業的プロバイダーが、カスタム阻害性ＲＮＡ分子を作製する。加えて、市販のキットが、ＳＩＬＥＮＣＥＲ（商標）ｓｉＲＮＡ構築キット（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．、Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）又はｐｓｉＲＮＡシステム（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）などのカスタムｓｉＲＮＡ分子を生成するために利用可能である。

【0087】

本明細書において、１つ以上のＭＰＺ ｍｉＲＮＡ及び／又は１つ以上のＲＮＡｉ耐性置換ＭＰＺ遺伝子を各々コードするｒＡＡＶが提供される。ｒＡＡＶは、１つ以上のＭＰＺ ｍｉＲＮＡ及びＲＮＡｉ耐性置換ＭＰＺ遺伝子をコードし得る。１つ以上のＭＰＺ ｍｉＲＮＡをコードするｒＡＡＶは、１、２、３、４、５、６、７、又は８つのＭＰＺ ｍｉＲＮＡをコードすることができる。いくつかの態様において、ＲＮＡｉ耐性置換ＭＰＺ遺伝子をコードする別個のｒＡＡＶが提供される。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、ＲＮＡｉ耐性置換ＭＰＺ遺伝子を同じｒＡＡＶベクターでコードする。いくつかの態様において、１つ以上のＭＰＺ ｍｉＲＮＡをコードするｒＡＡＶは、１つ、２つ、３つ、又は４つのＭＰＺ ｍｉＲＮＡをコードすることができる。

【0088】

したがって、いくつかの態様において、ウイルスベクターは、ＡＡＶである。本開示は、全てのタイプのＡＡＶを含み、本明細書に記載されるタイプのＡＡＶのみに限定されない。したがって、かかるＡＡＶには、ＡＡＶ１（すなわち、ＡＡＶ１逆位末端反復（ＩＴＲ）及びＡＡＶ１カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ２（すなわち、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ２カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ３（すなわち、ＡＡＶ３ ＩＴＲ及びＡＡＶ３カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ４（すなわち、ＡＡＶ４ ＩＴＲ及びＡＡＶ４カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ５（すなわち、ＡＡＶ５ ＩＴＲ及びＡＡＶ５カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ６（すなわち、ＡＡＶ６ ＩＴＲ及びＡＡＶ６カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ７（すなわち、ＡＡＶ７ ＩＴＲ及びＡＡＶ７カプシドタンパク質）、ＡＡＶ８（すなわち、ＡＡＶ８ ＩＴＲ及びＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ９（すなわち、ＡＡＶ９ ＩＴＲ及びＡＡＶ９カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ１０（すなわち、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ及びＡＡＶ１０カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ１１（すなわち、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ及びＡＡＶ１１カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ１２（すなわち、ＡＡＶ１２ ＩＴＲ及びＡＡＶ１２カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ１３（すなわち、ＡＡＶ１３ ＩＴＲ及びＡＡＶ１３カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ－ａｎｃ８０（すなわち、ＡＡＶ－ａｎｃ８０ ＩＴＲ及びＡＡＶ－ａｎｃ８０カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶｒｈ．７４（すなわち、ＡＡＶｒｈ．７４ ＩＴＲ及びＡＡＶｒｈ．７４カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶｒｈ．８（すなわち、ＡＡＶｒｈ．８ ＩＴＲ及びＡＡＶｒｈ．８カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶｒｈ．１０（すなわち、ＡＡＶｒｈ．１０ ＩＴＲ及びＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓ、ＡＡＶｖ６６、ＡＡＶ－Ｆ、又はＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／８、若しくはＡＡＶ２／９などの偽型ＡＡＶが含まれるが、これらに限定されない。

【0089】

様々な態様において、ウイルスベクターは、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ、又はＡＡＶ－Ｆである。様々な態様において、ウイルスベクターは、ＡＡＶ９又はＡＡＶ－Ｆである。ＡＡＶ９は、臨床において確立された安全性プロファイルを有する神経学的適応症のために最も広く使用されたベクターになっている。ＡＡＶ９の髄腔内投与は、神経系全体にわたる導入遺伝子の散在を可能にし、現在、脊髄筋萎縮（ＳＭＡ、ＮＣＴ０３３８１７２９）について、並びにニューロン性セロイドリポフスチン沈着症３（ＣＬＮ３、ＮＣＴ０３７７０５７２）、ＣＬＮ６（ＮＣＴ０２７２５５８０）、及び巨大軸索神経障害（ＧＡＮ、ＮＣＴ０２３６２４３８）の治療のための治験において、ＦＤＡによって承認されている。ＡＡＶ９はまた、ＣＭＴ１Ｂ疾患及び他の末梢神経障害の明確な治療標的であるシュワン細胞を標的とすることができることが知られている。更に重要なことに、ＡＡＶ９は、大型動物及び非ヒト霊長類におけるシュワン細胞を形質導入することが報告され（Ｂｒａｄｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，２０２０，１３０（９）：４９０６－４９２０、Ｇａｕｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ，２０２１，１２：２３５６）、それがヒトシュワン細胞への治療用遺伝子の送達を必要とする臨床適用のための望ましいウイルスベクターであることを示した。ＡＡＶ－Ｆは、最近、脊髄において有効であることが示されている（Ｂｅｈａｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０２２ Ｊａｎ；３３（１－２）：６１－７５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０２１．０６９．Ｅｐｕｂ ２０２１ Ａｕｇ ２６）。

【0090】

本開示のＤＮＡプラスミドは、本開示のｒＡＡＶゲノムを含む。いくつかの態様において、ＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムの感染性ウイルス粒子への組み立てのために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス、又はヘルペスウイルス）による感染を許容できる細胞に移入される。したがって、いくつかの態様において、本開示は、治療剤を細胞内に送達するＡＡＶベクターを含む。いくつかの態様において、細胞は、神経細胞である。いくつかの態様において、神経細胞は、シュワン細胞である。

【0091】

パッケージングされるべきＡＡＶゲノムと、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子と、ヘルパーウイルス機能とを細胞に提供するｒＡＡＶ粒子を産生する技術は、当該技術分野において標準的である。ｒＡＡＶの産生は、単一細胞（本明細書においてパッケージング細胞として示される）内に存在する以下の構成要素：ｒＡＡＶゲノムと、ｒＡＡＶゲノムから離れた（すなわち、その中に存在しない）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子と、ヘルパーウイルス機能と、を必要とする。ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来することができる任意のＡＡＶ血清型からであり得、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓ、又はＡＡＶｖ６６を含むが、これらに限定されない、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型からであり得る。いくつかの態様において、ｒＡＡＶゲノムにおけるＡＡＶ ＤＮＡは、組換えウイルスが由来することができる、任意のＡＡＶ血清型からであり、ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓ、ＡＡＶｖ６６、又はＡＡＶ－ＦであるＡＡＶ血清型が含まれるが、これらに限定されない。ｒＡＡＶバリアントの他のタイプ、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも本開示に含まれる。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。上記のように、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。同族構成要素の使用が具体的に企図される。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0092】

いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、偽型ＡＡＶであり、１つのＡＡＶ血清型からのＩＴＲ及び異なるＡＡＶ血清型からのカプシドタンパク質を含有する。いくつかの実施形態において、偽型ＡＡＶは、ＡＡＶ２／９（すなわち、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ９カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、偽型ＡＡＶは、ＡＡＶ２／８（すなわち、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ８カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、偽型ＡＡＶは、ＡＡＶ２／１（すなわち、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ１カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）である。

【0093】

いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓ、ＡＡＶｖ６６、又はＡＡＶ－Ｆからのカプシドタンパク質のうちの１つ以上のキメラを含むカプシドタンパク質などの組換えカプシドタンパク質を含む。他のタイプのｒＡＡＶバリアント、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶもまた、企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。上記の背景セクションで言及されるように、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。

【0094】

パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子産生に必要な全ての構成要素を安定して発現する細胞株を作製することである。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノムと、ｒＡＡＶゲノムから離れたＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子と、ネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能なマーカーと、を含むプラスミド（又は複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）、又は直接的な平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ＆ Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）などの手順によって細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスで感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適であることである。好適な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノム並びに／又はｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するためにプラスミドではなく、アデノウイルス又はバキュロウイルスを用いる。

【0095】

ｒＡＡＶ産生の一般的原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９、及びＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９）にレビューされている。様々なアプローチが、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８（１９８９）、米国特許第Ｎｏ．５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５及び対応する米国特許第５，６５８．７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，１３：１２４４－１２５０（１９９５）、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，４：６０９－６１５（１９９３）、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，３：１１２４－１１３２（１９９６）、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、米国特許第６，２５８，５９５号、及びＭｃＣａｒｔｙ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１６（１０）：１６４８－１６５６（２００８）に記載されている。前述の文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれ、ｒＡＡＶ産生に関する文書のこれらの部分を特に強調している。自己相補的（ｓｃ）ｒＡＡＶの産生及び使用が、具体的に企図されて例示される。

【0096】

したがって、本開示は、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。一実施形態において、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、及びＰｅｒＣ．６細胞（同族２９３株）などの、安定して形質転換されたがん細胞である。別の実施形態において、パッケージング細胞は、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）、及びＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）などの形質転換されたがん細胞ではない細胞である。

【0097】

いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、カラムクロマトグラフィー又は塩化セシウム勾配などの当該技術分野で標準的な方法によって精製される。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）、Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９ ４２７－４４３（２００２）、米国特許第６，５６６，１１８号及びＷＯ９８／０９６５７に開示されている方法が含まれる。

【0098】

本開示の核酸及びウイルスベクターを含む組成物が提供される。本明細書に記載の送達ビヒクル（ｒＡＡＶなど）を含む組成物が提供される。様々な態様において、かかる組成物はまた、薬学的に許容される担体を含む。いくつかの態様において、薬学的に許容される担体は、希釈剤、賦形剤、又は緩衝剤である。本組成物はまた、アジュバントなどの他の成分を含み得る。

【0099】

許容される担体、希釈剤、賦形剤、及びアジュバントは、レシピエントに非毒性であり、好ましくは、用いられる投与量及び濃度で不活性であり、リン酸、クエン酸、若しくは他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子量ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギニン、アルギニン、若しくはリシンなどのアミノ酸、グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトール若しくはソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩形成対イオン、並びに／又はツイーン、プルロニック（登録商標）、若しくはポリエチルグリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。

【0100】

滅菌注射可能溶液は、ｒＡＡＶを必要量で適切な溶媒に、必要に応じて上に列挙される他の様々な成分とともに組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製される。概して、分散剤は滅菌した活性成分を、基礎的な分散媒及び上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、それは、活性成分プラス予め滅菌濾過したそれらの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす。

【0101】

本開示の方法で投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与方式、治療目標、個体、及び標的にされる細胞型に応じて異なり、当該技術分野で標準的な方法によって決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、ｍｌ当たり約１×１０^６個、約１×１０^７個、約１×１０^８個、約１×１０^９個、約１×１０^１０個、約１×１０^１１個、約１×１０^１２個、約１×１０^１３～約１×１０^１４個、又はそれを超えるＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であり得る。投与量はまた、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表され得る（例えば、それぞれ、１×１０^７ｖｇ、１×１０^８ｖｇ、１×１０^９ｖｇ、１×１０^１０ｖｇ、１×１０^１１ｖｇ、１×１０^１２ｖｇ、１×１０^１３ｖｇ、及び１×１０^１４ｖｇ）。

【0102】

本開示のｒＡＡＶによる細胞の形質導入は、ＭＰＺ ｍｉＲＮＡ及びＲＮＡｉ耐性置換ＭＰＺ遺伝子の持続した発現をもたらす。したがって、本開示は、対象に、ＭＰＺ ｍｉＲＮＡ及びＲＮＡｉ耐性置換ＭＰＺ遺伝子を発現するｒＡＡＶを投与／送達する方法を提供する。いくつかの態様において、対象は、哺乳動物である。いくつかの態様において、哺乳動物は、ヒトである。これらの方法には、本明細書に記載の１つ以上のｒＡＡＶを用いて細胞及び組織（末梢運動ニューロン、感覚運動ニューロン、ニューロン、シュワン細胞、並びに筋肉、肝臓、及び脳などの他の組織又は臓器を含むが、これらに限定されない）に形質導入することが含まれる。形質導入は、細胞特異的制御エレメントを含む遺伝子カセットを用いて実行され得る。

【0103】

「形質導入」という用語は、例として、標的細胞によるＭＰＺ ｍｉＲＮＡ及びＲＮＡｉ耐性置換ＭＰＺの発現をもたらす本明細書に記載の複製欠損ｒＡＡＶを介した、インビボ又はインビトロのいずれかでの標的細胞へのＭＰＺ ｍｉＲＮＡ及びＲＮＡｉ耐性置換ＭＰＺの投与／送達を指すために使用される。

【0104】

インビボ又はインビトロで、標的細胞を送達ビヒクル（例えば、ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、又はベクター（ｒＡＡＶ））で形質導入する方法が、提供される。インビボ方法は、送達ビヒクル（ｒＡＡＶなど）を含む１回の有効用量又は複数回の有効用量の組成物を、それを必要とする動物（ヒト対象を含む）に投与するステップを含む。用量が、障害／疾患の発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量が、障害／疾患の発症後に投与される場合、投与は治療的である。有効用量は、治療される障害／疾患状態に関連する少なくとも１つの症状を緩和（排除又は低減）し、障害／疾患状態への進行を遅延若しくは防止し、障害／疾患状態の進行を遅延若しくは予防し、疾患の程度を軽減し、障害／疾患状態の寛解（部分若しくは完全）をもたらし、かつ／又は生存を延長する用量である。そのため、有効用量（又は本質的に同時に投与される用量若しくは間隔をおいて投与される用量）の本明細書に記載のｒＡＡＶを、それを必要とする患者に投与する方法が提供される。

【0105】

本明細書において、変異体ＭＰＺ遺伝子又は異常なＭＰＺ遺伝子発現に関連する疾患を治療、改善、又は予防するための医薬品及び方法が提供される。ＭＰＺ遺伝子は、ミエリン鞘内の主要なタンパク質であるＭＰＺタンパク質をコードする。ＭＰＺは、健常で効率的な末梢神経系を維持するのに不可欠なタンパク質である。シュワン細胞における欠陥タンパク質の蓄積は、経時的に脱髄及び細胞死を引き起こす。ＣＭＴ１Ｂ病の病理学的メカニズムは、２つの主要な群：（１）正常な髄鞘形成に直接影響を及ぼす毒性の機能獲得変異、及び（２）欠陥のある折り畳み不全タンパク質応答（ＵＰＲ）又は小胞体（ＥＲ）ストレス応答、にほとんど分けることができる。疾患の両方のメカニズムは、最終的に、シュワン細胞（ＳＣ）における変異体ミエリンタンパク質の蓄積、減少した髄鞘形成、筋力低下及び萎縮、並びに下肢及び足の感覚の喪失につながる。例えば、Ｒ９８Ｃ変異は、ＥＲにおける変異したＭＰＺタンパク質及び欠陥ＵＰＲを保持することに起因して、早期発症の重度の疾患を引き起こす。この変異を有する患者は、ミエリンが非常に低いか、又はほとんどない。これらの患者は、ＣＭＴ１Ｂとして分類されるが、非常に重度のＣＭＴ１Ｂ又は先天性低髄鞘形成の別の定義であるデジェリーヌ－ソッタス症候群（ＤＳＳ）としても分類される。したがって、本開示の方法による予防、治療、又は改善のために含まれる疾患の例は、ＣＭＴ１Ｂ疾患である。病理学的ＭＰＺ変異を有することが知られている家族において、予防するための方法は、対象に疾患発症前に実行される。他の対象では、本方法は診断後に実行される。

【0106】

分子的、生化学的、組織学的、及び機能的な転帰尺度は、方法の治療有効性を実証する。転帰尺度は、例えば、Ｄｙｃｋ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，４^ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌｕｍｅ １（２００５）のチャプター３２、３５、及び４３、並びにＢｕｒｇｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，６０２：３４７－３９３（２０１０）に記載されている。転帰尺度としては、罹患した組織における変異体ＭＰＺ ｍＲＮＡ若しくはタンパク質の低下若しくは除去、ＭＰＺ遺伝子ノックダウン、低減した脱髄、又は改善した髄鞘形成のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。他には、低減した細胞死が含まれるが、これらに限定されない。

【0107】

様々な態様において、定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）及びウェスタンブロットアッセイを使用して、ｍｉＭＰＺ及び／又はｃｏＭＰＺの発現を検出する。いくつかの態様において、トルイジンブルー染色を実行して、治療した対象及び未治療対象における脱髄／再髄鞘形成及びタマネギ様構造を調査する。いくつかの態様において、ロータロッド及びフットグリップ検査などの行動分析を行って、運動バランス、整合、及び筋力を評価する。いくつかの態様において、シュワン細胞死の量を決定するために、ＴＵＮＥＬアッセイを坐骨神経で実行する。いくつかの態様において、筋肉における小胞体（ＥＲ）の変化又はストレス、及び折り畳み不全タンパク質応答（ＵＰＲ）を試験するために検査が行われる。いくつかの態様において、これらの検査は、ｑＲＴ－ＰＣＲアッセイを使用して実行される。骨格筋は、身体活動、代謝摂動、及び疾患状態などの環境的な合図に応答して広範囲の適応を受ける、人体における高度に可塑的な組織である。ＥＲは、骨格筋を含む多くの哺乳動物細胞タイプにおいて、タンパク質の折り畳み及びカルシウム恒常性で重要な役割を果たす。しかしながら、ＥＲ管腔内の誤って折り畳まれたか、又は折り畳み不全タンパク質の過負荷は、ストレスを引き起こし、ＵＰＲと呼ばれるシグナル伝達ネットワークの活性化をもたらす。ＵＰＲは、３つのＥＲ膜貫通センサー：プロテインキナーゼＲ様小胞体キナーゼ、イノシトール要求タンパク質１α、及び活性化転写因子６によって開始される。ＵＰＲは、タンパク質合成の速度を調節し、多くのＥＲシャペロン及び調節タンパク質の遺伝子発現を増強することによって、ＥＲ恒常性を回復する。しかしながら、慢性的に高まったＥＲストレスは、細胞死を含む多くの病理学的結果にもつながる可能性がある。証拠の蓄積は、ＥＲストレス誘発性ＵＰＲ経路が、複数の状態における骨格筋量及び代謝機能での調節において重要な役割を果たすことを示唆する。いくつかの態様において、神経伝導速度（ＮＣＶ）試験が使用される。試験中、皮膚に取り付けられた表面電極パッチを通常用いて、神経が刺激される。２つの電極が、神経を覆う皮膚に配置される。一方の電極は、非常に軽度の電気インパルスで神経を刺激し、他方の電極はそれを記録する。得られる電気活動は、別の電極によって記録される。これは、試験される各神経について繰り返され、神経をとおる電気インパルスの伝導速度の測定を提供する。したがって、いくつかの態様において、ＮＣＶ試験は、神経損傷及び破壊、並びに／又は改善を決定することができる。

【0108】

本開示の方法において、変異体ＭＰＺ対立遺伝子（又は両方の変異体対立遺伝子）の発現は、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセント、又は１００パーセント阻害される。方法において、野生型ＭＰＺ対立遺伝子の発現は、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセント、又は１００パーセント阻害される。

【0109】

併用療法も本開示によって企図される。いくつかの態様において、２つ以上のｍｉＲＮＡの組み合わせを使用して、より高いサイレンシング効率を達成する。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡは、ＭＰＺ変異に関連する疾患のための他の療法とともに使用される。いくつかの態様において、本明細書に記載のｍｉＲＮＡは、変異体ＭＰＺ遺伝子の発現を中和又は低減するように設計された他の療法とともに使用される。いくつかの態様において、かかる他の療法は、本明細書に記載されている。いくつかの態様において、かかる他の療法は、当業者に既知である。本明細書に使用される併用は、同時治療及び連続治療の両方を含む。本明細書に記載の方法と標準的な医学的治療及び支持療法との併用は、療法との併用と同様に、具体的に企図される。

【0110】

有効用量の本開示の核酸、ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、ウイルスベクター、又は組成物の投与は、筋肉内、非経口、血管内、静脈内、経口、頬側、鼻腔、肺、頭蓋内、脳室内、髄腔内、骨内、眼内、直腸、又は膣を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で標準的な経路によるものであり得る。様々な態様において、有効用量は、経路の組み合わせによって送達される。例えば、様々な態様において、有効用量は、静脈内及び／若しくは筋肉内、又は静脈内及び脳室内などで送達される。いくつかの態様において、有効用量は、順番に、又は連続して送達される。いくつかの態様において、有効用量は、同時に送達される。本開示のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（具体的には、ＡＡＶ ＩＴＲ及びカプシドタンパク質）の投与経路及び血清型は、治療される感染症及び／又は疾患状態、並びにｍｉＲＮＡを発現すべき標的細胞／組織を考慮して、当業者によって選択及び／又は適合され得る。

【0111】

具体的には、送達ビヒクル（ｒＡＡＶなど）の実際の投与は、送達ビヒクル（ｒＡＡＶなど）を対象の標的細胞に輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。投与には、筋肉、血流、及び／又は直接的な神経系若しくは肝臓への注入が含まれるが、これらに限定されない。リン酸緩衝化生理食塩水中にｒＡＡＶを単に再懸濁させることが、筋肉組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと同時投与することができる担体又は他の成分について既知の制限はない（だが、ＤＮＡを分解する組成物は、ｒＡＡＶを用いる通常の手段では避けるべきである）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが神経細胞などの目的の特定の標的組織に標的化されるように改変され得る。例えば、開示が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ０２／０５３７０３を参照されたい。医薬組成物は、注射可能な製剤として、又は経皮輸送によって筋肉に送達される局所製剤として調製することができる。筋肉内注射及び経皮輸送の両方のための多数の製剤が既に開発されており、本開示を方法の実施に使用することができる。送達ビヒクル（ｒＡＡＶなど）は、投与及び取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用することができる。

【0112】

送達ビヒクル（ｒＡＡＶなど）の分散液はまた、グリセロール、ソルビトール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中で、並びに油中で調製することができる。通常の保存状態及び使用下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防止する保存剤を含有する。これに関連して、用いられる滅菌水性媒体は全て、当業者に周知の標準的な技術によって容易に得ることができる。

【0113】

注射可能な使用に好適な薬学的形態には、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射可能な溶液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、容易に注射器使用が可能性である程度に流動性でなければならない。製造及び保存の条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、ソルビトールなど）、それらの好適な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒体であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散剤の場合に必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、ｓｕＭＰＺ又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長時間の吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらすことができる。

【0114】

滅菌注射可能溶液は、ｒＡＡＶを必要量で適切な溶媒に、必要に応じて上に列挙される他の様々な成分とともに組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製される。概して、分散剤は滅菌した活性成分を、基礎的な分散媒及び上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、それは、活性成分プラス予め滅菌濾過したそれらの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす。

【0115】

本開示はまた、本明細書に記載の疾患又は障害の治療に使用するためのキットを提供する。かかるキットは、上記の本明細書に記載の核酸のうちのいずれか、又は上記の本明細書に記載のウイルスベクターのうちのいずれかを、薬学的に許容される担体中に含む、少なくとも第１の無菌組成物を含む。別の成分は、任意選択的に、治療組成物の投与のための好適な容器及びビヒクルを一緒に伴う、障害の治療のための第２の治療剤である。キットは、任意選択的に、第１及び第２の組成物を懸濁するか、希釈するか、又は送達をもたらすための溶液又は緩衝液を含む。

【0116】

一実施形態において、かかるキットは、密封されたボトル又はベセルなどの容器にパッケージングされた希釈液中に核酸又はベクターを含み、核酸又はベクターの使用を説明する、容器に貼付されたか、又はパッケージに含まれる表示を有する。一実施形態において、希釈液は、容器内のヘッドスペースの量（例えば、液体製剤と容器の上部との間の空気の量）が非常に少なくなるように、容器内にある。好ましくは、ヘッドスペースの量は無視できる（すなわち、ほとんどない）。

【0117】

いくつかの態様において、製剤は、安定剤を含む。「安定剤」という用語は、加熱又は凍結中に生じるものなどの有害な条件から製剤を保護し、かつ／又は安定状態で製剤の安定性若しくは有効期間を延長させる物質又は賦形剤を指す。安定剤の例としては、スクロース、ラクトース、及びマンノースなどの安定剤、糖、マンニトールなどの糖アルコール、グリシン又はグルタミン酸などのアミノ酸、並びにヒト血清アルブミン又はゼラチンなどのタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。

【0118】

いくつかの態様において、製剤は、抗微生物保存剤を含む。「抗微生物保存剤」という用語は、使用されるバイアル又は容器の反復穿刺時に導入され得る微生物の増殖を阻害する組成物に添加される任意の物質を指す。抗微生物保存剤の例としては、チメロサール、２－フェノキシエタノール、塩化ベンゼトニウム、及びフェノールなどの物質が挙げられるが、これらに限定されない。

【0119】

いくつかの態様において、キットは、キットに提供される試薬の使用を説明するラベル及び／又は説明書を含む。キットはまた、本明細書に記載の方法で使用される組成物のうちの１つ以上を送達するためのカテーテル、注射器、又は他の送達デバイスを任意選択的に含む。

【0120】

本文書全体は、統一された開示として関連することが意図されており、特徴の組み合わせが本文書の同じ文章、又は段落、又はセクションで一緒に認められない場合でも、本明細書に記載される特徴の全ての組み合わせが企図されることを理解されたい。本開示はまた、例えば、上記で具体的に言及される変形よりもいくらか範囲が狭い本開示の全ての実施形態を含む。属として記載される本開示の態様に関して、全ての個々の種は、本開示の別個の態様とみなされる。「ａ」又は「ａｎ」で記載又は特許請求される本開示の態様に関して、これらの用語は、文脈がより限定された意味を明確に必要としない限り、「１つ以上」を意味することを理解されたい。本開示の態様が、特徴を「含む」として記載される場合、その特徴「からなる」か又は「から本質的になる」実施形態も企図される。

【0121】

本明細書で引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個別の刊行物又は特許出願が、本開示と矛盾しない範囲内において、参照によりその全体が組み込まれることが具体的かつ個別に示されるかのように、参照により本明細書に組み込まれる。

【0122】

本明細書に記載の実施例及び実施形態は、例示的な目的のみのためのものであり、それらの観点から様々な修正又は変更が当業者に示唆されるが、本出願の趣旨及び範囲、並びに添付の特許請求の範囲内に含まれることを理解されたい。

【実施例】

【0123】

本開示の態様及び実施形態は、以下の実施例によって例示されるが、これらは、本発明の範囲を限定することを決して意味するものではない。
実施例１
材料及び方法
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）設計及び合成
ＣＭＴ１Ｂ疾患に特異的なマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を設計し、合成した。ヒトＭＰＺ ｃＤＮＡ（配列番号１、ＮＭ＿０００５３０．８）及びその３’ＵＴＲ（配列番号２、ＮＭ＿０００５３０．８）の配列が表１に提供される。部分的にコドン最適化したＭＰＺ ｃＤＮＡ（配列番号３）の配列が表１に提供される。配列番号３のヌクレオチド２２５～２４７（表１に下線が引かれている）は、ｍｉＭＰＺ ２２５及び２２６の標的部位を含む。配列番号３のヌクレオチド３１５～３３８（表１に下線が引かれている）は、ｍｉＭＰＺ ３１５、３１６、及び３１７の標的部位を含む。配列番号３のヌクレオチド７１８～７４４（表１に下線が引かれている）は、ｍｉＭＰＺ ７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、及び７２３の標的部位を含む。完全にコドン最適化したＭＰＺ遺伝子を使用して、ＭＰＺの発現レベルを比較するか、又は新規カセットを作製することができる。したがって、各アミノ酸について２つ以上のコドンが存在するため、他のコドン最適化ＭＰＺ配列が本開示によって包含される。ＭＰＺタンパク質配列（配列番号４、ＮＭ＿０００５３０．８）の配列が、表１に提供される。ヒトＭＰＺプロモーター（配列番号５、ＥＮＳＧ０００００１５８８８７）の配列が、表１に提供される。１２００ｂｐのヒトＭＰＺプロモーター（ＥＮＳＧ０００００１５８８８７）、６３ｂｐのヒトＭＰＺ ５’ＵＴＲ、及び７４７ｂｐの部分的にコドン最適化したＭＰＺ ｃＤＮＡから作製されたＭＰＺ発現カセット（配列番号６）の配列が、表１に提供される。配列番号６はまた、ＳＶ４０ポリＡシグナル及びＣＭＶアンプリコン配列を含む。ＣＭＶアンプリコンは、ｑＲＴ－ＰＣＲ又はｄｄＰＣＲアッセイを使用するＡＡＶ力価測定のために構築物に使用される。リードｍｉＭＰＺは、ＣＭＶアンプリコンの後に配置されたＮｓｉＩ部位又はＮｏｔＩ部位にクローニングすることができる。配列全体は、各末端に２つのＸｂａＩ制限酵素部位を使用して、ＡＡＶプレプラスミドにクローニングされる。配列は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）によって合成された。ＣｏＭＰＺ発現カセットにおける配列順：ＸＢＡＩ－ｓｔｕｉ－ＳａｌＩ－ｋａｓｉ－ヒトＭＰＺプロモーター（１２００ｂｐ）－ＮｈｅＩ－ヒトＭＰＺ ５’ＵＴＲ －部分的コドン最適化ヒトｍｐｚ ｃｄｓ－ＳＰＥＩ－ｎｄｅｉ－ＳＶ４０ ＰＡ－ｐａｃｉ －ＤＲＰ用ＣＭＶアンプリコン－ＮＳＩＩ－ｎｏｔｉ－ＸＢＡＩ。代替的に、本開示は、ＣＭＶ特異的エンハンサーなどのユニバーサルエンハンサー又はＰＭＰ２２などのシュワン特異的エンハンサーと組み合わせた、ヒト、ラット、又はマウスのプロモーターを含む様々なＭＰＺプロモーター又はミニＭＰＺプロモーターの使用を含む。

【0124】

ＭＰＺ（Ｐ０）遺伝子を標的とする１２の合成ｍｉＲＮＡ（ｍｉＭＰＺと名付けられた）が設計及び作製された。表２を参照されたい。これらのｍｉＲＮＡは、ヒト及びマウスＭＰＺ遺伝子の両方の領域（ＭＰＺ遺伝子配列が両方の種で保存されている）を標的とするように設計された。これらは、非対立遺伝子特異的ｍｉＭＰＺであり、すなわち、これらのｍｉＲＮＡは、変異体ＭＰＺ及び野生型ＭＰＺの両方を標的とし、標的細胞における全体的なＭＰＺ発現をサイレンシングする。ｍｉＭＰＺ番号は、ＭＰＺ ｃＤＮＡでカウントを開始した、ｃＤＮＡ及び３’ＵＴＲでの標的配列を示す。表３に提供されるように、１２対のプライマーを使用するＰＣＲによって、ｍｉＭＰＺ＿２２５、ｍｉＭＰＺ＿２２６、ｍｉＭＰＺ＿３１５、ｍｉＭＰＺ＿３１６、ｍｉＭＰＺ＿３１７、ｍｉＭＰＺ＿７１８、ｍｉＭＰＺ＿７１９、ｍｉＭＰＺ＿７２０、ｍｉＭＰＺ＿７２１、ｍｉＭＰＺ＿７２２、ｍｉＭＰＺ＿７２３、及びｍｉＭＰＺ＿１８５２と名付けられたｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡを生成した。

【0125】

ｍｉＲＮＡのＰＣＲクローニング
１μｇの各プライマーを、１サイクルプライマー伸長反応：９５℃で５分間、９４℃で２分間、５２℃で１分間、６８℃で１５分間に添加し、次いで４℃で保持した。ＰＣＲ産物をＱｉａｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットでクリーンアップした後、ＸｈｏＩ及びＳｐｅＩ制限酵素で一晩消化した。次いで、消化産物を１．５％ＴＢＥゲルで展開させ、バンドを切除し、Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用して精製した。図１Ａ～１Ｌに示される各ｍｉＲＮＡの配列。

【0126】

２つのＰＣＲ産物を、マウスＵ６プロモーター及びＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ終結シグナル（６つのチミジンヌクレオチド）を含有するＵ６Ｔ６ベクター（ＸｈｏＩ及びＸｂａＩを介して）に一晩ライゲーションした。ｍｉＲＮＡを、Ｕ６プロモーターの３’末端と終結シグナルとの間に位置するＸｈｏＩ及びＸｂａＩ制限部位にクローニングする（各ｍｉＲＮＡでのＤＮＡテンプレートの３’末端のＳｐｅＩ部位は、ＸｂａＩ部位と相補的な付着末端を有する）。ライゲーション生成物によって、４２℃の熱ショックを用いて化学的にコンピテントなＥ－ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、３７℃の振とうで１時間インキュベートしてから、カナマイシン選択プレートに播種した。コロニーを３７℃で一晩増殖させた。翌日、それらはミニプレップ処理し、正確性のために配列決定した。

【0127】

ルシフェラーゼアッセイ
ルシフェラーゼアッセイを使用して、各ｍｉＭＰＺの存在下でのＭＰＺの発現レベルを決定した。４２，０００個のＨＥＫ２９３細胞を、トランスフェクションの１６時間前に、９６ウェルプレートの各ウェルで培養した。翌日、細胞は、リポフェクタミン２０００を使用して、ＭＰＺ標的配列（図３Ａ）を含有する２５ｎｇのウミシイタケ－ホタルプラスミド、及び２５０ｎｇの各ｍｉＭＰＺコードプラスミドでトランスフェクトした。２４時間後、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ１９６０）を使用するルシフェラーゼアッセイを、製造業者のプロトコルに従って実行した。ウミシイタケ発現をホタル発現で除して、相対的発現を算出した。次いで、相対的発現を、陰性対照としてＭＰＺ及びＵ６Ｔ６プラスミドでトランスフェクトした細胞の発現に対して正規化した。結果が図３Ｂ～Ｄに示される。ｍｉＭＰＺ－２２５、２２６、７２１、及び７２３と名付けられたＭＰＺ標的化ｍｉＲＮＡは、初期実験において、トランスフェクトした細胞におけるルシフェラーゼタンパク質発現を低減するのに最も有効だった。

【0128】

ウェスタンブロット
ＨＥＫ２９３細胞（細胞２５０，０００個／ウェル）を、トランスフェクションの１６時間前に、２４ウェルプレートに播種した。翌朝、リポフェクタミン２０００（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，ＵＳ）を使用して、２５０ｎｇのＭＰＺ及び１２５０ｎｇのｍｉＭＰＺ発現プラスミドで共トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、プロテアーゼ阻害剤を含有するカクテルを補充したＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＳＤＳ、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、１％のＴｒｉｔｏｎＸ１００）に溶解した。タンパク質濃度をＤＣタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって決定した。２０μｇの各総タンパク質試料を、１２％ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルで展開させた。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｒａｉｎｂｏｗ分子量マーカー（Ｆｉｓｈｅｒｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を使用して、タンパク質バンドの分子量を決定した。タンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルからＰＶＤＦ膜に、半乾燥移行方法を介して移した。膜を５％脱脂乳でブロッキングし、次いで、一次ウサギ抗フラッグ抗体（１：１０，０００、Ａｂｃａｍ，ａｂ１１６２）、又はウサギポリクローナル抗αチューブリン抗体（１：１，０００、ａｂ１５２４６，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）とともに４℃で一晩インキュベートした。翌日、洗浄に続いて、次いでブロットを西洋ワサビペルオキシダーゼ－コンジュゲート化ヤギ抗ウサギ二次抗体（１：１００，０００、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）とともに室温で１時間３０分間探査した。Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ＨＲＰ基質（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）中で短時間インキュベーションした後、相対的なタンパク質バンドをＸ線フィルムで現像した。ウェストレンブロットの結果が図２Ｃに示される。ｍｉＭＰＺ２２５、２２６、３１７、７２１、及び７２３が、ＭＰＺタンパク質発現をノックダウンするのに最も効果的だった。

【0129】

ｑＲＴ－ＰＣＲ
ウェスタンブロットアッセイの前セクションで説明したように、ＭＰＺ及び各ｍｉＭＰＸプラスミドのそれぞれ２５０及び１２５０μｇを、ＨＥＫ２９３細胞に共トランスフェクトした。２４時間後、増殖培地を廃棄し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。全ＲＮＡは、トリゾール（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡからのトリゾール）を製造元プロトコルに従って使用して抽出した。単離したＲＮＡの質及び量をナノドロップによって調べ、次いで、ＤＮａｓｅ処理し、ランダムヘキサマー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅ キット、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用するＲＴ－ＰＣＲで使用した。その後のｃＤＮＡ試料は、次いで、事前に設計されたヒトＭＰＺ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｈｓ０１５９５２７１＿ｇ１）及びヒトＲＰＬ１３Ａ対照プライマー／プローブセット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用するＴａｑｍａｎアッセイでテンプレートとして使用した。各試料は三重測定で行った。全てのデータは、ＭＰＺのみでトランスフェクトした細胞に対して正規化した。図３Ｄは、ｑＲＴ－ＰＣＲ結果を示す。ｍｉＭＰＺ＿２２５、７２１、及び７２３は、ＭＰＺ ｍＲＮＡレベルを低減する最も効率的なｍｉＲＮＡだった。

【0130】

ＣＭＴ１Ｂ疾患を治療するための遺伝子療法としてｒＡＡＶベクターを使用するＭＰＺノックダウン及び置換
ＭＰＺタンパク質は、主な末梢ミエリンタンパク質又はミエリンタンパク質ゼロ（Ｐ０）としても知られ、通常、髄鞘形成するシュワン細胞によって発現され、全ＰＮＳミエリンタンパク質の５０％超を占める。この試験で設計されたｍｉＲＮＡは、変異体ＭＰＺ遺伝子及び野生型ＭＰＺ遺伝子の両方を標的とする。したがって、健常なミエリン鞘を維持するために必要である健常なレベルの正常なＭＰＺ発現を回復させるために、ｍｉＭＰＺ耐性ＭＰＺ遺伝子がＡＡＶベクターを介してシュワン細胞に送達される。そうするために、ヒトＭＰＺ遺伝子（ＮＭ＿０００５３０．８、配列番号１）でのｍｉＭＰＺ標的部位は、ｍｉＭＰＺがこれらの領域に結合できないようにコドン最適化した。コドン最適化ＭＰＺ ｃＤＮＡ（ｃｏＭＰＺ）は、配列番号３として提供される。野生型ＭＰＺ及びｃｏＭＰＺの両方が、同じ健常なＭＰＺタンパク質（配列番号４、ＮＭ＿０００５３０．８）を産生する。

【0131】

最後に、ノックダウン及び置換の両方を行うために、「ヒトＭＰＺプロモーター（ｈｐＭＰＺ）－ｃｏＭＰＺ－Ｕ６－ｍｉＭＰＺ」（配列番号６）を担持する遺伝子発現カセットを設計し、作製した。このカセットを作製するために、ヒトＭＰＺプロモーター（ＭＰＺはシュワン細胞でのみ発現されるため、このプロモーターは非常に好適である）と、ヒトｃｏＭＰＺと、このカセットにおいてｍｉＭＰＺをクローニングするのに必要な制限部位と、を含むカセットを設計した。カセットの各部分の完全な配列及び順序が図４に示される。ＭＰＺタンパク質の発現は、ＨＥＫ２９３細胞においてインビトロで試験され、次いで、ＭＰＺ標的配列を標的とする各ｍｉＭＰＺの能力は、ウェスタンブロット及びｑＲＴ－ＰＣＲによって試験される。その後、リードｍｉＭＰＺをこのプラスミドにクローニングした後、それはＣＭＴ１Ｂマウスでのインビボ試験のために、配列の各末端にＸｂａＩ部位を使用してＡＡＶベクターにパッケージングされる。

【0132】

このカセットは、２つの遺伝子を発現し、１つは、内因性（変異体及び野生型の両方）ＭＰＺ遺伝子のサイレンシングを提供するＵ６プロモーター下で発現されるｍｉＭＰＺである。他方の遺伝子は、ｍｉＭＰＺ媒介遺伝子サイレンシングに耐性であり、ヒトシュワン特異的ＭＰＺプロモーター、すなわち、１２００ｂｐの内因性ヒトＭＰＺプロモーター（配列番号５、ＥＮＳＧ０００００１５８８８７）下で発現される、健常なコドン最適化ＭＰＺ（ｃｏＭＰＺ）遺伝子である。

【0133】

転帰尺度
Ｍｐｚの発現レベルは、ｑＲＴ－ＰＣＲ及びウェスタンブロットアッセイによって調査される。トルイジンブルー染色を実行して、脱髄／再髄鞘形成及びタマネギ様構造の形成を調査する。ロータロッド及びフットグリップ検査などの行動分析を実行して、運動バランス、整合、及び筋力を評価する。シュワン細胞死の量を決定するために、ＴＵＮＥＬアッセイを坐骨神経で行う。ＥＲ及びＵＰＲ応答における変化は、ｑＲＴ－ＰＣＲアッセイを使用して決定される。神経組織学を調べるために、２ヶ月又は６ヶ月齢の処置したマウス又は対照マウスの末梢坐骨神経を、切離し、固定し、プラスチック包埋し、１μｍでの切片化し、トルイジンブルーで染色する。軸索数、軸索サイズ、ｇ比、及びミエリンの厚さ、並びにタマネギ様構造形成を、顕微鏡写真で測定する。グリップ強度は、マウスをワイヤグリッド上に置き、次に反転させることによって検査し、落下までの時間を、最大１分間で記録する。この検査は、３週齢以上のマウスに使用され、長軸方向で使用される。ロータロッド検査は、運動バランス及び整合を試験するために使用される。運動バランス及び整合は、加速するロータロッド装置を使用して決定される。マウスは、２ヶ月及び６ヶ月齢で試験される。動物の訓練は、連続する３日間、１日当たり３回の試験で構成され、試験の間に１５分間の休息を有する。マウスをロッド上に配置し、速度を４から４０ＲＰＭに徐々に増加させる。試験は、マウスがロッドから落ちたとき、又はロッド上に６００秒間持続するときに終了する。検査は、２０及び３２ＲＰＭの２つの異なる速度を使用して４日目に行われる。落下するまでの潜時（秒）が、速度ごとに計算される。

【0134】

本開示はまた、神経伝導速度（ＮＣＶ）検査を提供する。マウスをケタミン／キシラジンで麻酔し、坐骨神経を股関節（坐骨ノッチ）及び足首で刺激し、ＥＭＧシグナルを後足の母指球筋で記録する。刺激電極間の距離をＥＭＧへの潜時における差で除して、伝導速度を決定する。ＥＭＧ振幅が決定される。かかるＥＭＧ振幅は、複合筋活動電位（ｉＣＭＡＰ）のために積分することができる。いくつかの態様において、二次ＥＭＧ信号が記録される。ＥＭＧシグナルは、脊髄運動ニューロンへの活性化した感覚ニューロンの単シナプス反射であるＨ反射から生じる。したがって、筋活動（ＥＭＧ）、感覚神経伝導速度、及び脊髄におけるシナプス結合性が測定される。

【0135】

実施例２
共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＭＰＺ発現をノックダウンするためのｍｉＲＮＡの有効性
ｍｉＭＰＺは、ＰＣＲによって生成されて、Ｕ６プロモーターの制御下でプラスミド中にクローニングされ、これは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによる小ヘアピンループの発現に好都合である。ｍｉＭＰＺのプレスクリーニングは、ｍｉＲＮＡ及び野生型又は変異体ＭＰＺ発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞に共トランスフェクトすることによって実行した。要するに、標的配列を、ウミシイタケ／ホタルデュアルレポーターシステムにおけるウミシイタケルシフェラーゼの３’非翻訳領域に組み込んだ（図３Ａ）。標的結合及びノックダウンの有効性は、発光比によって決定された。図３Ｂ及び４Ａは、野生型及びＲ９８Ｃ変異体ＭＰＺ ｍＲＮＡを標的とする各ｍｉＭＰＺを決定するために使用されたルシフェラーゼアッセイ結果を示す。

【0136】

ｍｉＭＰＺ＿２２５、２２６、３１７、７１９、７２１、及び７２３の使用は、野生型及び変異体ＭＰＺ Ｒ９８Ｃの両方でルシフェラーゼシグナルにおよそ＞８０％の減少をもたらした。同じ結果が、トランスフェクションの２４時間後に共トランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞からウェスタンブロット及びｑＲＴ－ＰＣＲを使用して達成された（図３Ｃ及び４Ｂ）。同じｍｉＭＰＺは、野生型及び変異体ＭＰＺの顕著な低減を引き起こした。

【0137】

これらの結果は、ｍｉＲＮＡが、共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＭＰＺ発現をノックダウンするのに有効だったことを示す。
実施例３
Ｒ９８Ｃ ＣＭＴ１Ｂマウスモデルからの背根神経節（ＤＲＧ）／シュワン細胞共培養のビトロモデルにおけるＭＰＺ発現をノックダウンするｍｉＭＰＺの能力を試験する
インビトロモデルにおいて、ＭＰＺ Ｒ９８Ｃノックダウン及び置換の有効性を評価し、軸索の再髄鞘形成を調査するために、マウス背根神経節（ＤＲＴ）及びシュワン細胞（ＤＲＧ／シュワン）共培養を使用する。このインビトロＣＭＴ１Ｂモデルは、インビボ実験の前に、ＣＭＴ１Ｂ疾患メカニズムの試験及び治療構築物のインビトロ開発を可能にする。

【0138】

Ｒ９８Ｃマウスの胚性脊髄から単離及び精製されたＤＲＧ（Ｓａｐｏｒｔａ ｅｔ ａｌ．，同上）は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＩｏｗａのＤｒ．Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓｈｙによって提供され、Ｆｌｏｒｉｏ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１８，３８（１８）：４２７５－４２８７）によって報告されたように、一次シュワン細胞と共培養した。次いで、これらの細胞を、本明細書に記載のｍｉＭＰＺの各々、及び本明細書に記載のＭＰＺ若しくはｃｏＭＰＺのいずれか、又は本明細書に記載の発現カセットのいずれかでトランスフェクトする。いくつかの態様において、ｍｉＭＰＺ及びｃｏＭＰＺの各々は、同じ構築物で提供される。いくつかの態様において、ｍｉＭＰＺ及びｃｏＭＰＺの各々は、１つ以上の構築物で提供される。対照は、空ベクター、ｃｏＭＰＺ単独、ｍｉＭＰＺ単独で処理されるか、又は未処理である。

【0139】

一定期間後、髄鞘形成は、免疫染色、ウェスタンブロット、ｑＰＣＲ、及びｑＲＴ－ＰＣＲを含む様々な実験方法によって、様々な確立されたマーカーを使用して分析する。ｑＲＴ－ＰＣＲ試験及びウェスタンブロットアッセイを使用して、ｍｉＭＰＺ、変異体ＭＰＺ、及びｃｏＭＰＺの発現を検出する。トルイジンブルー染色を実行して、脱髄／再髄鞘化及び細胞でのタマネギ様構造の形成を調査する。

【0140】

髄鞘形成における改善が、ｍｉＭＰＺ及びｃｏＭＰＺによる処理で得られる。
実施例４
ＣＭＴ１ＢのＲ９８ＣマウスモデルにおけるｍｉＭＰＺノックダウン及びＭＰＺ置換
ノックダウン（ｍｉＭＰＺによるＡＡＶ９媒介ＭＰＺ遺伝子サイレンシング）及びＡＡＶ９－ｃｏＭＰＺによる遺伝子置換のインビボでの有効性を検証及び試験するために、ノックダウン及び遺伝子置換を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＩｏｗａのＤｒ．Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓｈｙによって提供された重度のＲ９８Ｃ ＣＭＴ１Ｂマウスモデル（Ｓａｐｏｒｔａ ｅｔ ａｌ．，同上）で実行する。

【0141】

本明細書に記載のｍｉＭＰＺのうちのいずれか及びｃｏＭＰＺのうちのいずれかを担持するＡＡＶベクターが、ＩＣＶ若しくは髄腔内注射のいずれかを介して、又は坐骨神経への直接注射を介して、前症候性又は後症候性のマウスのＣＳＦに投与される。対照は、空ベクター、ｃｏＭＰＺ単独、ｍｉＭＰＺ単独で処置されるか、又は未処置である。

【0142】

髄鞘形成の改善における変異体ＭＰＺノックダウン及びｃｏＭＰＺ置換の有効性は、マウスにおいて、本明細書に記載されるように、免疫染色、ウェスタンブロッティング、ｑＰＣＲ、及びｑＲＴ－ＰＣＲを含むがこれらに限定されない様々な方法を使用して、投与後のいくつかの時点で調査される。

【0143】

ｑＲＴ－ＰＣＲ試験及びウェスタンブロットアッセイを使用して、ｍｉＭＰＺ、変異体ＭＰＺ、及びｃｏＭＰＺの発現を検出する。トルイジンブルー染色を実行して、処置したマウス及び未処置マウスにおける脱髄／再髄鞘形成及びタマネギ様構造の形成を調査する。ロータロッド及びフットグリップ検査などの行動分析を行い、運動バランス、整合、及び筋力を評価する。シュワン細胞死の量を決定するために、ＴＵＮＥＬアッセイを坐骨神経で実行する。ＥＲ及びＵＰＲ応答における変化は、処置したマウス及び未処置マウスにｑＲＴ－ＰＣＲアッセイを使用して決定される。ＮＣＶアッセイを使用して、処置したマウスにおける運動機能の改善を、未処置動物と比較して調査する。

【0144】

ＣＭＴ１ＢのＲ９８ＣマウスモデルにおけるｍｉＭＰＺノックダウン及びｃｏＭＰＺ置換による処置は、マウスにおける髄鞘形成、運動バランス、運動機能、整合、及び／又は筋力を改善する。

【0145】

実施例５
ＣＭＴ１ＢのＳ６３ｄｅｌマウスモデルにおけるｍｉＭＰＺノックダウン及びＭＰＺ置換
ノックダウン（ｍｉＭＰＺによるＡＡＶ９媒介ＭＰＺ遺伝子サイレンシング）及びＡＡＶ９－ｃｏＭＰＺによる遺伝子置換のインビボでの有効性を検証及び試験するために、ノックダウン及び遺伝子置換を、Ｓ６３ｄｅｌ ＣＭＴ１Ｂマウスモデルで実行する（Ｗｒａｂｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，（同上）、Ｓｉｄｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２０１６，３６（４４）：１１３５０－６１）。この遺伝子導入マウスモデルは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｕｆｆａｌｏ，ＮＹのＤｒ．Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｗｒａｂｅｔｚ及びＤｒ．Ｌａｕｒａ Ｆｅｔｒｉによって証明される。

【0146】

ｍｉＭＰＺ及びｃｏＭＰＺを担持するＡＡＶベクターが、ＩＣＶ若しくは髄腔内注射のいずれかを介して、又は坐骨神経への直接注射を介して、前症候性又は後症候性のマウスのＣＳＦに投与される。対照は、空ベクター、ｃｏＭＰＺ単独、ｍｉＭＰＺ単独で処理されるか、又は未処理である。

【0147】

髄鞘形成の改善における変異体ＭＰＺノックダウン及びｃｏＭＰＺ置換の有効性は、マウスにおいて、本明細書に記載されるように、免疫染色、ウェスタンブロッティング、ｑＰＣＲ、及びｑＲＴ－ＰＣＲを含むがこれらに限定されない様々な方法を使用して、投与後のいくつかの時点で調査される。

【0148】

ｑＲＴ－ＰＣＲ試験及びウェスタンブロットアッセイを使用して、ｍｉＭＰＺ、変異体ＭＰＺ、及びｃｏＭＰＺの発現を検出する。トルイジンブルー染色を実行して、処置したマウス及び未処置マウスにおける脱髄／再髄鞘形成及びタマネギ様構造の形成を調査する。ロータロッド及びフットグリップ検査などの行動分析を行い、運動バランス、整合、及び筋力を評価する。シュワン細胞死の量を決定するために、ＴＵＮＥＬアッセイを坐骨神経で実行する。ＥＲ及びＵＰＲ応答における変化は、処置したマウス及び未処置マウスにｑＲＴ－ＰＣＲアッセイを使用して決定される。ＮＣＶアッセイを使用して、処置したマウスにおける運動機能の改善を、未処置動物と比較して調査する。

【0149】

ＣＭＴ１ＢのＳ６３ｄｅｌマウスモデルにおけるｍｉＭＰＺノックダウン及びｃｏＭＰＺ置換による処置は、マウスにおける髄鞘形成、運動バランス、運動機能、整合、及び／又は筋力を改善する。

【0150】

実施例６
ＭＰＺの変異を有するヒト患者の治療におけるｍｉＭＰＺノックダウン及びＭＰＺ置換又は単独でのＭＰＺ置換
ＭＰＺにおける変異は、ＣＭＴ１Ｂを引き起こし、＞２００の変異の多くは、ＥＲ保持、折り畳み不全タンパク質応答（ＵＰＲ）の活性化、又はミエリン圧縮の破壊などの変異体タンパク質による毒性の機能獲得を介して神経障害を引き起こす。患者は、ミエリンＰ０又はＰｏ遺伝子（ＭＰＺ）変異について、ヘテロ接合又はホモ接合であると特定されている（Ｉｋｅｇａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９６；２２２：１０７－１１０。Ｉｋｅｇａｍｉ ｅｔ ａｌ．（同上）は、新規ホモ接合性Ｐｈｅ６４欠失変異を特定し、髄鞘形成の障害は量依存的であることを示唆した。他の患者は、ＭＰＺのハプロ不全をもたらすＭＰＺの変異を有することが特定されており、軽度の神経障害、軸索喪失の実証、並びに様々な程度の下肢及び上肢に対する障害をもたらす（Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｒｉｐｈｅｒ Ｎｅｒｖ Ｓｙｓｔ．２０２１；２６：１７７－８３）。５人の患者は、ヘテロ接合ｃ．３０６ｄｅｌ；ｐ．Ａｓｐ１０４ｆｓ変異を有し、１人の患者は、ＭＰＺのｃ．２０４Ｃ＞Ａ；ｐ．Ｔｙｒ６８Ｔｅｒ変異を有した（Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（上記））。Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（上記）は、この群では、患者は主に大型線維性感覚神経障害を示しているが、マウスは感覚神経の関与よりも大きく運動を有するため、患者の表現型がＭｐｚ＋／－マウスのものと異なることを報告した。Ｈｏｗａｒｄら（上記）は、これらの患者が、Ｍｐｚ＋／－マウスに有効であることが実証されている治療アプローチでの候補として機能し得、ＭＰＺ変異を有する患者における他の遅発性表現型を比較するモデルとしても機能し得ると仮定した。

【0151】

ノックダウン（ｍｉＭＰＺによるＡＡＶ９媒介ＭＰＺ遺伝子サイレンシング）及びＡＡＶ９－ｃｏＭＰＺによる遺伝子置換のインビボの有効性を検証及び試験するために、ノックダウン及び遺伝子置換療法は、ＭＰＺ遺伝子のホモ接合及びヘテロ接合変異の両方を有するヒト患者の治療のために企図される。追加的に、単独でのＭＰＺ遺伝子置換は、これらの患者の治療のための１つの手段として企図される。

【0152】

したがって、規制当局の承認を条件として、（ｉ）ｍｉＭＰＺのうちのいずれか１つ以上及びｃｏＭＰＺのうちのいずれかを担持するＡＡＶベクター、（ｉｉ）ｃｏＭＰＺのうちのいずれかを担持するＡＡＶベクター、又は（ｉｉｉ）ＭＰＺ遺伝子若しくはその機能的バリアントを担持するＡＡＶベクターが、これらのＭＰＺ欠陥患者に投与又は送達される。いくつかの態様において、投与は、ＣＮＳ中へである。いくつかの態様において、投与は、ＩＣＶ又は髄腔内注射のいずれかを介する。いくつかの態様において、投与は、坐骨神経への直接注射によるものである。

【0153】

ヘテロ接合ＭＰＺ機能喪失（ＬＯＦ）変異は、より軽度の神経障害表現型を引き起こすが、ホモ接合ＭＰＺ ＬＯＦ変異は、デジェリーヌ－ソッタス症候群（ＤＳＳ）としても知られる重度の早期発症ＣＭＴ１Ｂを引き起こす。ＭＰＺ遺伝子置換（すなわち、コドン最適化ＭＰＺ遺伝子若しくは野生型ＭＰＺ遺伝子若しくは機能的ＭＰＺ遺伝子バリアントのいずれかの送達）又はＭＰＺノックダウン及び遺伝子置換（すなわち、ｍｉＭＰＺとｃｏＭＰＺとの送達）は、ヘテロ接合及びホモ接合ＬＯＦ変異患者の両方のための治療選択肢である。

【0154】

遺伝子置換単独、並びにノックダウン及び置換療法の両方の方法は、これらの患者の治療に有用である。同様に、したがって、野生型及びコドン最適化ＭＰＺの両方を治療に使用することができる。

【0155】

本開示は特定の実施形態に関して記載されているが、変更及び修正が当業者に生じることが理解されるであろう。したがって、特許請求の範囲内に現れるような制限のみが本開示に認められるべきである。

【0156】

本出願で参照される全ての文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図2H】

【図2I】

【図2J】

【図2K】

【図2L】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

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【国際調査報告】