特表 2024-537188 カドヘリン－１７タンパク質を検出するための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-10

(54)【発明の名称】カドヘリン－１７タンパク質を検出するための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/574 20060101AFI20241003BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20241003BHJP

   G01N 33/577 20060101ALI20241003BHJP

【ＦＩ】

G01N33/574 A

G01N33/53 D

G01N33/577 B

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024520899

(86)(22)【出願日】2022-10-08

(85)【翻訳文提出日】2024-05-29

(86)【国際出願番号】 US2022077826

(87)【国際公開番号】W WO2023060276

(87)【国際公開日】2023-04-13

(31)【優先権主張番号】63/253,609

(32)【優先日】2021-10-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518242019

【氏名又は名称】アーベル リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＡＲＢＥＬＥ ＬＩＭＩＴＥＤ

【住所又は居所原語表記】＃５２２， Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ２， １１ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐａｒｋ Ｗｅｓｔ Ａｖｅ．， Ｓｈａｔｉｎ， Ｎ．Ｔ． Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ （ＣＮ）

(74)【代理人】

【識別番号】110001139

【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人

(74)【代理人】

【識別番号】100130328

【弁理士】

【氏名又は名称】奥野 彰彦

(74)【代理人】

【識別番号】100130672

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 寛之

(72)【発明者】

【氏名】ルク， ジョン ムーンチン

(72)【発明者】

【氏名】アイエル， ディーパック ナラヤナン

(57)【要約】

対象からのサンプル中のＣＤＨ１７タンパク質の量を決定することにより、対象のがんをスクリーニングする方法であって、前記サンプルをＣＤＨ１７に対して結合親和性を有する捕捉抗体に接触させ、前記サンプル中の任意のＣＤＨ１７タンパク質は、前記捕捉抗体に結合して結合サンプルを提供するように構成されるステップと、前記結合サンプルを検出分子に接触させて検出サンプルを提供し、前記検出分子は、ＣＤＨ１７タンパク質に対して結合親和性を有する二次抗体に結合したセンシングシグナル分子を含むステップと、前記検出サンプルに結合した前記センシングシグナル分子を介してセンシングシグナルを生成するステップと、前記センシングシグナルの量を決定するステップと、前記センシングシグナルの量に基づいて、前記サンプル中のＣＤＨ１７タンパク質の量を決定するステップと、を含む、方法。
【選択図】図５ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象からのサンプル中のＣＤＨ１７タンパク質の量を決定することにより、対象のがんをスクリーニングする方法であって、
前記サンプルをＣＤＨ１７に対して結合親和性を有する捕捉抗体に接触させ、前記サンプル中の任意のＣＤＨ１７タンパク質は、前記捕捉抗体に結合して結合サンプルを提供するように構成されるステップと、
前記結合サンプルを検出分子に接触させて検出サンプルを提供し、前記検出分子は、ＣＤＨ１７タンパク質に対して結合親和性を有する二次抗体に結合したセンシングシグナル分子を含むステップと、
前記検出サンプルに結合した前記センシングシグナル分子を介してセンシングシグナルを生成するステップと、
前記センシングシグナルの量を決定するステップと、
前記センシングシグナルの量に基づいて、前記サンプル中のＣＤＨ１７タンパク質の量を決定するステップと、
を含む、方法。

【請求項2】

サンプル中のＣＤＨ１７タンパク質の量に基づいて、対象がＣＤＨ１７陽性前がん状態又はＣＤＨ１７陽性がんを有する確率を決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記センシングシグナル分子は、ペルオキシダーゼ酵素を含み、前記センシングシグナルは、酸化基質を含み、
前記センシングシグナル分子を介して前記センシングシグナルを生成するステップは、前記ペルオキシダーゼ酵素で基質を酸化して前記酸化基質を提供することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記センシングシグナル分子は、蛍光標識試薬を含み、前記センシングシグナルは、蛍光シグナルを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記捕捉抗体は、配列番号１、２、３、４、５又は６と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記捕捉抗体は、
配列番号９、１０、１１を有する３つの重鎖相補的決定領域（ＣＤＲ）及び配列番号１２、１３、１４を有する３つの軽鎖ＣＤＲ；
配列番号１５、１６、１７を有する３つの重鎖ＣＤＲ及び配列番号１８、１９、２０を有する３つの軽鎖ＣＤＲ；又は
配列番号２１、２２、２３を有する３つの重鎖ＣＤＲ及び配列番号２４、２５、２６を有する３つの軽鎖ＣＤＲ；
を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記二次抗体は、配列番号７－８と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記二次抗体は、配列番号２７、２８、２９を有する３つの重鎖ＣＤＲ及び配列番号３０、３１、３２を有する３つの軽鎖ＣＤＲを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記捕捉抗体は、バイオセンサーに担持される、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記がんは、胃腸系のＣＤＨ１７陽性がんを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記サンプルは、体液を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記体液は、末梢血、血清、血漿、尿、唾液、骨髄、胸水若しくは腹水、又は腸液を含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

ＣＤＨ１７に対して親和性を有するモノクローナル抗体であって、
配列番号９、１０、１１を有する３つの重鎖ＣＤＲ及び配列番号１２、１３、１４を有する３つの軽鎖ＣＤＲ；
配列番号１５、１６、１７を有する３つの重鎖ＣＤＲ及び配列番号１８、１９、２０を有する３つの軽鎖ＣＤＲ；
配列番号２１、２２、２３を有する３つの重鎖ＣＤＲ及び配列番号２４、２５、２６を有する３つの軽鎖ＣＤＲ；又は
配列番号２７、２８、２９を有する３つの重鎖ＣＤＲ及び配列番号３０、３１、３２を有する３つの軽鎖ＣＤＲ；
を含む、モノクローナル抗体。

【請求項14】

配列番号１、２、３、４、５、６、７又は８と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のモノクローナル抗体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）に基づいて２０２１年１０月８日に提出された米国仮出願第６３／２５３，６０９の利益を主張し、その全開示は参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は、がんの検出に有用な方法に関する。特に、本発明は、ヒト生体液サンプルにおけるＣＤＨ１７タンパク質の検出に関する。

【背景技術】

【0003】

本明細書に別段の指示がない限り、このセクションに記載される材料は、本出願の特許請求の範囲に対する先行技術ではなく、このセクションに含めることによって先行技術であるとは認められない。

【0004】

消化器（ＧＩ、即ち、胃、肝臓、食道、膵臓、大腸）がんは、世界中で罹患率と死亡率の主な原因となっている。国際がん研究機関によると、ＧＩがんは世界中で４８０万件のがん症例とがん関連死亡の３人に１人を占めており、その主役は大腸がんである（Ｓｕｎｇ ｅｔ ａｌ，２０２１）。大腸がんと診断された患者の５年生存率は、局所疾患の場合９１％、局所転移の場合７２％、ステージＩＶの場合１４％である（Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｐｏｎｓ，２０１５）。この疾患を早期に検出すれば、ほとんどの腫瘍の治癒手術が可能になる（Ｓｉｅｇｅｌ ２０１７）。特に、悪性疾患発症の高危険因子として認識されている消化管内の非悪性病変、腺腫、結節を特定することで、疾患全体の転帰を大幅に改善することができる。現在適用可能なＣＥＡやＣＡ１９－９などの血液ベースの臨床バイオマーカーは、消化器がんの早期検出に必要な感度と特異性を欠いている（Ｌｅｃｈ ２０１６）。

【0005】

カドヘリン－１７（ＣＤＨ１７）は、胃がん、肝臓がん、大腸がんでは過剰発現するが、健康な成人の正常組織では過剰発現しないことを特徴とする消化器がんのバイオマーカーである。ＣＤＨ１７は、消化器系の腺癌の診断に有用な免疫組織化学マーカーでもある（Ｓｕ ｅｔ ａｌ ２００８）。さらに、ＣＤＨ１７は、転移性がんで高度に発現しており、ＣＤＨ１７の発現と機能を阻害すると、肝細胞がん（ＨＣＣ）の肺転移を著しく減少させることができる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ ２０１０）。ＣＤＨ１７は有効な消化器がん診断バイオマーカーとして機能するが、より高い検査感度と特異性で大規模なスクリーニングアプローチにＣＤＨ１７を適用するには、ＣＤＨ１７の検出戦略の改善が不可欠である。

【発明の概要】

【0006】

以下の概要は例示のみを目的としており、いかなる形でも限定することを意図したものではない。上述の例示的な態様、実施形態及び特徴に加えて、さらなる態様、実施形態及び特徴は、図面及び以下の詳細な説明を参照することによって明らかになるであろう。

【0007】

一態様において、本発明は、対象のがんを検出又はスクリーニングする方法を提供する。この方法は、対象からのサンプル中のＣＤＨ１７タンパク質の量を決定するステップを含む。前記対象は、がん又は前がん状態を有する可能性がある。前記サンプルには、ＣＤＨ１７タンパク質が含まれていても含まれていなくてもよい。この方法は、サンプル中にＣＤＨ１７タンパク質が存在する場合、その存在を検出するために使用され、したがって、対象が有する可能性のあるがん又は前がん状態を特徴付けることができる。

【0008】

一実施形態において、前記方法は、
前記サンプルをＣＤＨ１７に対して結合親和性を有する捕捉抗体に接触させ、前記サンプル中の全てのＣＤＨ１７タンパク質は、前記捕捉抗体に結合して結合サンプルを提供するように構成されるステップと、
前記結合サンプルを検出分子に接触させて検出サンプルを提供し、前記検出分子は、ＣＤＨ１７タンパク質に対して結合親和性を有する二次抗体に結合したセンシングシグナル分子を含むステップと、
前記検出サンプルに結合したセンシングシグナル分子によりセンシングシグナルを生成するステップと、
センシングシグナルの量を決定するステップと、
前記センシングシグナルの量に基づいて、前記サンプル中のＣＤＨ１７タンパク質の量を決定するステップと、
を含む。

【0009】

一実施形態において、前記方法は、前記サンプル中のＣＤＨ１７タンパク質の量に基づいて、前記対象がＣＤＨ１７陽性前がん状態を有する確率を決定するステップをさらに含む。一実施形態において、前記方法は、前記サンプル中のＣＤＨ１７タンパク質の量に基づいて前記対象がＣＤＨ１７陽性がんを有する確率を決定するステップをさらに含んでもよい。

【0010】

一実施形態において、前記センシングシグナル分子は、ペルオキシダーゼ酵素を含み、前記センシングシグナルは、酸化基質を含む。前記ペルオキシダーゼ酵素は、基質を酸化して前記酸化基質を提供する。

【0011】

一実施形態において、前記センシングシグナル分子は、蛍光標識試薬を含み、前記センシングシグナルは、蛍光シグナルを含む。一実施形態において、前記蛍光標識試薬は、ユウロピウムを含む。

【0012】

一実施形態において、前記方法は、
ＣＤＨ１７タンパク質を含む可能性があるサンプルをＣＤＨ１７タンパク質に対して結合親和性を有する捕捉抗体に接触させるステップと、
前記ＣＤＨ１７タンパク質を前記捕捉抗体に結合させて結合サンプルを提供するステップと、
検出分子を前記結合サンプルに接触させ、ここで、前記検出分子は、ＣＤＨ１７タンパク質に対して親和性を有する二次抗体に結合したペルオキシダーゼ酵素を含むステップと、
前記ペルオキシダーゼ酵素で基質を酸化して酸化基質を提供するステップと、
前記酸化基質の量を決定するステップと、
前記酸化基質の量に基づいて前記ＣＤＨ１７タンパク質の量を決定するステップと、
を含む。

【0013】

一実施形態において、前記方法は、
ＣＤＨ１７タンパク質を含む可能性があるサンプルをＣＤＨ１７タンパク質に対して結合親和性を有する捕捉抗体に接触させるステップと、
前記ＣＤＨ１７タンパク質を前記捕捉抗体に結合させて結合サンプルを提供するステップと、
検出分子を前記結合サンプルに接触させ、ここで、前記検出分子は、ＣＤＨ１７タンパク質に対して親和性を有する二次抗体に結合した蛍光標識剤（例えば、ユウロピウム）を含むステップと、
生成した蛍光シグナルの量を決定するステップと、
生成した前記蛍光シグナルに基づいてＣＤＨ１７タンパク質の量を決定するステップと、
を含む。

【0014】

一実施形態において、前記捕捉抗体は、配列番号１、２、３、４、５又は６と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、前記捕捉抗体は、配列番号９、１０、１１を有する３つの重鎖相補的決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１２、１３、１４を有する３つの軽鎖ＣＤＲとを含む。一実施形態において、前記捕捉抗体は、配列番号１５、１６、１７を有する３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号１８、１９、２０を有する３つの軽鎖ＣＤＲとを含む。一実施形態において、前記捕捉抗体は、配列番号２１、２２、２３を有する３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号２４、２５、２６を有する３つの軽鎖ＣＤＲとを含む。

【0015】

一実施形態において、前記二次抗体は、配列番号７又は８と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、前記二次抗体は、配列番号２７、２８、２９を有する３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号３０、３１、３２を有する３つの軽鎖ＣＤＲとを含む。

【0016】

一実施形態において、前記捕捉抗体は、バイオセンサー上に担持されてもよい。一実施形態において、前記捕捉抗体は、固体表面上に固定されてもよい。一実施形態において、前記捕捉抗体は、プレート上に固定されてもよい。

【0017】

開示された方法で検出可能ながんは、ＣＤＨ１７陽性がんであり得る。一実施形態において、前記がんは、消化器がんであり得る。

【0018】

サンプルは、例えば、末梢血、血清、血漿、尿、唾液、骨髄、胸水もしくは腹水、又は腸液を含む対象からの体液であり得る。一実施形態において、前記対象は、ヒトであり得る。

【0019】

別の態様において、本発明は、ＣＤＨ１７に対して親和性を有するモノクローナル抗体を含んでもよい。一実施形態において、前記抗体は、配列番号１、２、３、４、５又は６と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。一実施形態において、前記抗体は、配列番号７又は８と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。

【0020】

一実施形態において、前記抗体は、配列番号９、１０、１１を有する３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号１２、１３、１４を有する３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでもよい。一実施形態において、前記抗体は、配列番号１５、１６、１７を有する３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号１８、１９、２０を有する３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでもよい。一実施形態において、前記抗体は、配列番号２１、２２、２３を有する３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号２４、２５、２６を有する３つの軽鎖ＣＤＲを含んでもよい。一実施形態において、前記抗体は、配列番号２７、２８、２９を有する３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号３０、３１、３２を有する３つの軽鎖ＣＤＲを含んでもよい。

【図面の簡単な説明】

【0021】

本開示の前述の特徴又は他の特徴は、添付の図面と併せて、以下の説明又は添付の特許請求の範囲からより完全に明らかになるであろう。これらの図面は、本開示に従って構成されたいくつかの実施形態のみを示しており、したがって、本開示の範囲を限定するものとみなされるべきではないことを理解されたい。この開示は、添付の図面を使用してさらに具体的に又は詳細に説明される。

【0022】

【図1】（ａ）ＩＨＣアッセイを用いて推定された複数の消化器がん組織におけるＣＤＨ１７タンパク質の発現；並びに（ｂ）非腫瘍（ＮＴ）結腸及びＣＲＣ組織におけるＣＤＨ１７タンパク質の特徴的な発現パターンを示す。

【0023】

【図2】（ａ）患者のＦＦＰＥ組織（Ｔ／Ｎ）（免疫組織化学によって決定）及び血漿（ＣＲＣ）（ＥＬＩＳＡによって決定）検体におけるＣＤＨ１７タンパク質発現の高相関性；並びに（ｂ）ＥＬＩＳＡによって決定された同患者の血清サンプル及び血漿サンプルにおけるＣＤＨ１７タンパク質発現の高相関性を示す。

【0024】

【図3】（ａ）非がん個体及び大腸腺腫又は大腸がんを有する患者におけるＣＤＨ１７タンパク質濃度の測定（ＢＬＩアッセイを使用）；並びに（ｂ）高ＣＤＨ１７発現と遠隔転移の増加との臨床的相関を示す。

【0025】

【図4】（ａ）非がん個体、腺腫、及び大腸がんの進行段階にある患者におけるＣＤＨ１７タンパク質濃度の測定（ＥＬＩＳＡを使用）；（ｂ）非がん個体、大腸がんの早期又は晩期段階にある患者におけるＣＤＨ１７タンパク質濃度の測定（ＴＲＦＩＡを使用）；並びに（ｃ）高ＣＤＨ１７発現と、（ｃ１）腫瘍浸潤、（ｃ２）リンパ節転移又は（ｃ３）遠隔転移の増加との臨床的相関を示す。

【0026】

【図5】（ａ）液体サンプル中のＣＤＨ１７タンパク質の定量を可能にする（Ａ）ＣＤＨ１７－ＢＬＩアッセイ、（Ｂ）ＣＤＨ１７－ＥＬＩＳＡ、又は（Ｃ）ＣＤＨ１７－ＴＲＦＩＡ３つのアッセイプラットフォームの概略図；並びに（ｂ）捕捉されたＣＤＨ１７を定量するための（ｂ１）ＣＤＨ１７－ＢＬＩアッセイ、（ｂ２）ＣＤＨ１７－ＥＬＩＳＡ、又は（ｂ３）ＣＤＨ１７－ＴＲＦＩＡの標準化と感度を示す。標準曲線は、複数の濃度の組換えＣＤＨ１７－ｈＦｃを使用して確立され、ｐｇ／ｍＬまでカーバーされる。

【0027】

【図6】（ａ）ＣＤＨ１７を検出する抗ＣＤＨ１７抗体Ｌｉｃ３、９Ａ６又は７Ｃ５のクーマシーブルー染色；（ｂ）ＣＤＨ１７－ｈＦｃタンパク質に対するＬｉｃ３（ドメイン２）、９Ａ６（ドメイン４）又は７Ｃ５（ドメイン１）のＣＤ１７ドメイン結合特異性の決定；並びに（ｃ）ＯＣＴＥＴ（上）又はＥＬＩＳＡ（下）によって測定された、ＣＤＨ１７－ｈＦｃタンパク質に対する（ｃ１）Ｌｉｃ３、（ｃ２）９Ａ６又は（ｃ３）７Ｃ５の結合親和性分析を示す。

【発明を実施するための形態】

【0028】

以下の詳細な説明では、本明細書の一部を構成する添付図面を参照する。これらの図面では、文脈で別段の指示がない限り、同様の記号は通常、同様のコンポーネントを表す。詳細な説明、図面、又は特許請求の範囲に記載された例示的な実施形態は、限定することを意味するものではない。本明細書に提示される主題の精神又は範囲から逸脱することなく、他の実施形態が利用されてもよく、他の変更が行われてもよい。本明細書に一般的に説明され、図に示される本開示の態様は、多種多様な異なる構成で配置、置換、結合、分離、又は設計することができ、そのすべてが本明細書で明示的に考慮されることが容易に理解されるであろう。

【0029】

本発明は一般に、とりわけ、がん診断に関連する組成物、方法、装置、システム、デバイス、又は／又はコンピュータプログラム製品を対象とする。

【0030】

一実施形態において、本発明は、ヒト生体液サンプル中のＣＤＨ１７タンパク質を検出するための方法に関する。ＣＤＨ１７は、肝臓－腸カドヘリンとしても知られ、ペプチド輸送体又は細胞接着分子として機能し、上皮の組織構造の完全性を維持するのに役立つ７Ｄ－カドヘリンスーパーファミリーに属する。このタンパク質は、胚形成中に胎児の肝臓又は胃腸管で一般的に発現されるが、成人の肝臓又は胃組織では発現が抑制されている（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ，２０１０）。ただし、ＣＤＨ１７は、胃がん、肝細胞がん、大腸がん、膵臓がん、食道がんなどのいくつかの消化器がんで高発現を示す（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ ２０１９，Ｑｉｕ ｅｔ ａｌ ２０１３，Ｂａｒｔｏｌｏｍｅ ｅｔ ａｌ ２０１４，Ｐａｎａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ ２０１２）。さらに、ＣＤＨ１７発現は、疾患段階又は遠隔転移の存在と直接相関する（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ ２０１１，Ｂａｒｔｏｌｏｍｅ ｅｔ ａｌ ２０１４，Ｔａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ ２００４）。疾患の早期発見のマーカーとして、ＣＤＨ１７発現レベルは、胃腸上皮化生や鎮痙ポリペプチド表現化生などの前がん組織でも増加することが報告されている（Ｌｅｅ ＨＪ ｅｔ ａｌ ２０１０）。したがって、ＣＤＨ１７は、複数の消化器がんにわたる前がん状態又は進行中の悪性腫瘍の早期検出のための診断バイオマーカーとして高い臨床的有用性を持っている（ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３２７５２）。ただし、リキッドバイオプシー中のＣＤＨ１７の迅速かつ正確な検出のための堅牢で正確なアッセイが明らかに不足している。したがって、臨床でカドヘリン１７を検出するために高感度のプラットフォームを使用することにより、がんの早期発見が大幅に向上し、それによって疾患の転帰が大幅に改善される。そこで、本開示は、とりわけ、極めて高い診断感度又は特異性で血液サンプル（リキッドバイオプシー）中のＣＤＨ１７発現を正確に定量するための組成物、試薬又は方法を提供する。

【0031】

組織中のＣＤＨ１７の発現は、免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いて決定することができる。ほとんどのＧＩ組織はＣＤＨ１７を発現する（図１ａ）。しかし、ＣＤＨ１７発現の顕著な増加が正常組織とがんＧＩ組織の間で観察され、大腸がんの代表的な例を図１ｂに示す。

【0032】

一実施形態において、本開示は、血液検体中のＣＤＨ１７を正確かつ迅速に定量するための高感度かつ特異的なアッセイの開発に関する。図５ａに示されるＣＤＨ１７－ＢＬＩアッセイ、ＣＤＨ１７－ＥＬＩＳＡ又はＣＤＨ１７－ＴＲＦＩＡの３つのプラットフォームを比較して、生体液中のＣＤＨ１７を検出するための最大の感度とダイナミックレンジを有するアッセイを開発した。これらの中で、ＣＤＨ１７－ＢＬＩアッセイは、限られた数のステップを必要とする最も迅速なアッセイであるという利点がある。バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）は、生体分子相互作用を測定するためのラベルフリーアッセイである。タンパク質の定量には、システムは固定化タンパク質でプレコートされた光ファイバーバイオセンサーを利用する。バイオセンサーチップの表面に固定化されたリガンドと溶液中の分析物との結合により、バイオセンサーチップの光学的厚さが増加し、その結果、生物学的層の厚さの変化の直接的な尺度である波長シフトが生じる。このような干渉パターンのシフトはリアルタイムで測定されるため、システムはタンパク質の結合特異性と濃度を高精度で監視することができる。これらのメカニズムのおかげで、ＢＬＩテクノロジーは、標的代謝物の高感度な定量に対するサンプルマトリックス（細胞培養上清、尿、血液などのリキッドバイオプシー）の干渉を受けない。さらに、未希釈のサンプルは、ＢＬＩアッセイを使用した代謝物の定量化に直接使用することができる。ＢＬＩアッセイと比較して、ＥＬＩＳＡとＴＲＦＩＡは両方とも、捕捉抗体を親水性マイクロプレート表面に固定し、その後、サンプル内の抗原（ＣＤＨ１７）に曝露することに依存する。ＥＬＩＳＡは、ペルオキシダーゼ主導の吸光度ベースの検出技術に依存するのに対し、ＴＲＦＩＡにはユウロピウムなどの重金属が組み込まれており、これにより大きなストークスシフトが得られ、その結果、蛍光シグナルの保持時間が長くなる。

【0033】

分析検証の主な手順は下記の通りである。

【0034】

(Ａ）効果的な捕捉又は検出抗ＣＤＨ１７抗体の同定

【0035】

捕捉抗体
一実施形態において、本明細書に示されるアッセイは、ＣＲＣ診断におけるＣＤＨ１７の臨床応用に有用である。循環するＣＤＨ１７が自由に循環する総タンパク質、切断型タンパク質、エクソソーム関連タンパク質などの複数の形態で存在する可能性があることを考慮すると、リキッドバイオプシーからの大部分の形態のＣＤＨ１７の捕捉を支援できる潜在的な抗体の同定に重点が置かれた。４００個を超えるＣＤＨ１７モノクローナル抗体のパネル（ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３２７５２）を使用して、いくつかの抗体をスクリーニング又は同定している。これらの抗体は、ＣＤＨ１７検出のための捕捉抗体又は検出抗体として使用できる可能性がある。これらの抗体のそれぞれによって認識される各エピトープの位置を特定するために、ＥＬＩＳＡアッセイにより切断型ヒトＣＤＨ－１７ペプチドを使用してドメインマッピングを実行した（図６ｂ）。さらに、ＣＤＨ１７に対するこれらの抗体のそれぞれの標的特異性は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動とそれに続くクーマシー染色により評価された（図６ａ）。最後に、７Ｃ５、Ｌｉｃ３又は９Ａ６（配列番号１～６）などの最終候補に挙げられた捕捉抗体について、ＥＬＩＳＡ又はＯＣＴＥＴにより標的親和性を決定した（図６ｃ）。

【0036】

検出抗体
検出抗体は、ＣＤＨ１７に対する高親和性及び捕捉抗体と異なるＣＤＨ１７の１つ又は複数の細胞外ドメインに対する結合特性に基づいて選択された。精製されたＣＤＨ１７－ｈＦｃを標準として使用し、ＣＤＨ１７－ＢＬＩアッセイ、ＣＤＨ１７－ＥＬＩＳＡ又はＣＤＨ１７－ＴＲＦＩＡを使用してアッセイの感度を決定したところ、すべてのアッセイがｐｇ／ｍＬまでカーバーすることが発見された（図５ｂ）。

【0037】

(Ｂ）サンプルタイプの選択
がん又は正常個体から得られたＦＦＰＥ組織はＣＤＨ１７の明確な発現パターンを示したが、観察された重要な結果は、この発現パターンと特定の個体のＣＤＨ１７の血漿発現との間の高い一致であった（図２ａ）。サンプルの選択については、血清か血漿についても明らかな議論が存在する。私たちの研究プール内で、個体から血清と血漿を抽出し、各サンプル中のＣＤＨ１７発現を分析した。どちらのサンプルタイプでもＣＤＨ１７の発現間に高い一致が見出され、両方の血液サンプルのサブタイプがＣＤＨ１７の発現を分析するための最適な選択肢として機能することを示している（図２ｂ）。

【0038】

(Ｃ）組換え抗ＣＤＨ１７抗体の使用
アッセイの有効性と柔軟性を向上させるために、ビオチン化のために少なくとも１つのＡｖｉｔａｇを組み込んだ組換え捕捉抗ＣＤＨ１７抗体を開発した。さらに、検出抗体には、ビオチン化又はＨＲＰストレプトアビジン又はユウロピウム－ストレプトアビジン結合体への結合のためにＡｖｉｔａｇを組み込むこともできる。
実施例
実施例１：サンプルの調製方法

【0039】

個体から血液検体を収集し、血清又は血漿サンプルを抽出した。抽出された血清又は血漿サンプルを直ちに分析するか、又はさらに使用するまで－８０℃で保存した。アッセイによる全体的なＣＤＨ１７検出効率に対する影響を特定するために、２つのサンプルタイプ間のアッセイ性能の比較が行った（図２ｂ）ところ、血清と血漿サンプル中のＣＤＨ１７発現の強い一致を示している。さらに、ＣＤＨ１７の血漿発現は、タンパク質の組織発現と強い相関関係を示した（図２ａ）。
実施例２：循環ＣＤＨ１７タンパク質の特性評価方法

【0040】

循環内のＣＤＨ１７タンパク質の発現は、免疫組織化学、ＢＬＩアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＴＲＦＩＡなどのいくつかの方法により定量化することができる。本明細書に開示されている方法により、消化器系でＣＤＨ１７タンパク質を簡単に検出することができる。具体的に、がん組織ではほぼ１ｕｇ／ｍＬの中から高発現範囲を示す一方、非がん組織ではサブナノモル又は無視できる範囲の極めて低いタンパク質発現を示す（図３、４）。さらに、ＣＤＨ１７の発現は、非がん群と比較して、前がん性腺腫性ポリープを有する個体で顕著に高かった（図３、４）。大腸ポリープの個人歴又は家族歴は、ＣＲＣ発症の強力な危険因子として特定されている。悪性疾患の発症リスクが高い他のＧＩがんにおける同様の前がん病変又は結節は、進行中のがんを早期に検出するための潜在的な診断時点として機能する。診断マーカーとしてＣＤＨ１７を使用してＧＩ内のこのような前がん病変、良性ポリープ又は結節を早期に特定することは、全体的な疾患転帰の改善において臨床的に重要な関連性を持っている。

【0041】

さらに、がん組織内のＣＤＨ１７の発現は、より大きな浸潤、リンパ節又は遠隔転移の発生という観点から、全身腫瘍組織量の相対的な増加に伴って増加した。複数の研究により、ＣＤＨ１７発現と、ＣＤＨ１７の高発現を示す進行性疾患の表現及びがんにおける全体的な予後不良との直接的な相関関係が示されている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，２０１３；Ｔｓｏｉ ｅｔ ａｌ，２０１３；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，２００５；Ｋａｐｏｓｉ－Ｎｏｖａｋ ｅｔ ａｌ，２００６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ，２０１８；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ，２０１２）。したがって、ＧＩがん患者の血液サンプル中のＣＤＨ１７を非侵襲的に推定することで、疾患の予後をモニタリングすることができる。

【0042】

ＣＤＨ１７タンパク質は、進行中の腫瘍又は前腫瘍段階から、遊離型、結合型、エンベロープ型などの複数の形態で放出され得る。さらに、６つのドメインを含む細胞外ドメインの長さのため、タンパク質は完全型又は切断型で存在することもできる。したがって、循環タンパク質に最大限に結合できる高価の捕捉抗体の同定は、タンパク質のほぼ全濃度が確定されることを確保することにより検出感度が向上するという顕著な技術的利点を提供する。臨床的に適用可能な診断アッセイを開発するために、エピトープが全ての７つのＣＤＨ１７細胞外ドメインにマッピングされた４００種超えのＣＤＨ１７モノクローナル抗体を生成した（ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３２７５２）。ＣＤＨ１７タンパク質の異なるドメインを標的とすることができる複数の捕捉抗体を１つのアッセイに組み込むことによって（図６）、単一抗体ベースの捕捉と比較して、総ＣＤＨ１７タンパク質濃度の可視性（又は感度）を向上させることができる。

【0043】

複数の消化器がんの診断と予後モニタリングのために、臨床では、いくつかのマーカーが定期的に使用されている。ＣＲＣについては、ＣＥＡ（がん胎児性抗原）やＣａ１９－９（炭酸脱水酵素１９－９）などの臨床マーカーは、疑わしい症例やいくつかのＧＩがんの臨床的なモニタリングに使用されている。しかし、いくつかの研究では、これらのマーカーは診断感度と疾患特異性が低いことが報告されている（Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ，１９７８；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ，２０２０；Ｍａｃｄｏｎａｌｄ，１９９９；Ｅｌｅｆｔｈｅｒｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ，２００９）。ＣＤＨ１７診断アッセイと比較して、ＣＥＡ又はＣａ１９－９は、ＣＲＣ症例の検出に関して顕著に低い感度と特異性を示した（表２）。この情報は、腫瘍の進行過程を決定するため、又はＧＩがんを治療するための治療法を検討するための予後アッセイとしてさらに開発することができる。
実施例３：ＣＤＨ１７診断アッセイプラットフォーム

【0044】

臨床検体中のＣＤＨ１７のレベルを定量するには、既知のＣＤＨ１７希釈液を使用して標準曲線を作成する（図５Ｂ）。図５Ａでは、ＢＬＩアッセイ、ＥＬＩＳＡ、又はＴＲＦＩＡの３つのアッセイ形式の操作図を定義している。ＣＤＨ１７－ＢＬＩアッセイの場合、プロトコールにはストレプトアビジンプローブ上でのビオチン化捕捉抗体の初期固定化が含まれる。次に、ＣＤＨ１７標準品又は検出抗体に結合した後、金属強化ＤＡＢ基質などの二次試薬を使用してシグナルを生成し、これによって、システムの測定可能なシグナルが急激に上昇する。標準曲線が確立されると、それが１回限りのイベントであるため、その後アッセイプロトコルを変更しない限り、ＣＤＨ１７－ＢＬＩプラットフォームは、臨床検体を使用したＣＤＨ１７発現レベルの分析に直接利用することができる。ＣＤＨ１７－ＥＬＩＳＡ又はＣＤＨ１７－ＴＲＦＩＡプラットフォームの場合、捕捉抗体は親水性マイクロプレート表面に固定され、ＣＤＨ１７標準品又は生体液にさらされる。ＥＬＩＳＡの場合、抗ＣＤＨ１７二次抗体は、基質の酸化を引き起こす可能性のあるペルオキシダーゼ酵素に直接的又は間接的に結合することがあり、酸化された基質の量の定量化は、サンプル中のＣＤＨ１７の量の定量化に役立つ。ＴＲＦＩＡとは対照的に、抗ＣＤＨ１７二次抗体はユウロピウム又はビオチン（その後ユウロピウムストレプトアビジンによって結合される可能性がある）に直接的又は間接的に結合することができ、これを使用して蛍光シフトを測定することができる。これによって、特定のサンプル中のＣＤＨ１７の量を定量化することができる。

【0045】

これらの診断プラットフォームはリキッドバイオプシー（血漿又は血清）に適用されているが、これらの技術は細胞培養上清及び末梢血、血清、血漿、尿、唾液、骨髄、胸水、腹水、腸液などの他の生体液を含む他のサンプルを使用してＣＤＨ１７レベルの定量的推定にも利用することができる。サンプルは、希釈せずに適用することも、アッセイバッファーで希釈して実験評価に使用することもできる。希釈形式は、サンプルタイプ中の基礎ＣＤＨ１７濃度の予備的な理解に基づいて決定することができる。例えば、非がん性検体にはサブナノモルの濃度のＣＤＨ１７が含まれるのに対し、がん性検体にはＣＤＨ１７濃度がより高い可能性が高くなる。アッセイの実行後、標準回帰曲線を用いて作成したＣＤＨ１７標準曲線を使用して、サンプル中のＣＤＨ１７の濃度を外挿することができる。
実施例４：ＣＤＨ１７診断アッセイの臨床応用

【0046】

ＣＤＨ１７診断アッセイは、ＣＤＨ１７タンパク質の量を決定する方法であり、
ａ）バイオセンサー又は親水性マイクロプレート表面上に固定された捕捉抗体を、ＣＤＨ１７タンパク質を含むサンプルに曝露し、この捕捉抗体はＣＤＨ１７タンパク質に対して結合親和性を有するステップと、
ｂ）ＣＤＨ１７タンパク質を捕捉抗体に結合させて結合したＣＤＨ１７タンパク質を提供するステップと、
ｃ）検出分子を前記結合したＣＤＨ１７タンパク質に結合させ、ここで、前記検出分子は、ＣＤＨ１７タンパク質に対する親和性を有する二次抗体に結合したペルオキシダーゼ酵素又はユウロピウムのような蛍光標識試薬を含むステップと、
ｄ）ペルオキシダーゼ酵素によって酸化された基質の量又は生成された蛍光シグナルの量に基づいて、ＣＤＨ１７タンパク質の量を決定するステップと、
ｅ）前記対象がＣＤＨ１７陽性前がん状態又は腫瘍を有する可能性を決定するステップと、
を含む。

【0047】

アッセイの臨床性能は、疾患を患っている個体又は疾患のリスクのある個体を非がん患者から効果的に識別できるかどうかに依存する。大腸腺腫又はポリープは、ＣＲＣ発症の強力な危険因子として特定されている。したがって、高い診断感度と特異性で腺腫を同定することは、アッセイの診断力を大幅に向上させる。ＣＤＨ１７の発現レベルは、大腸腺腫、早期ＣＲＣ、後期ＣＲＣと疾患の進行に伴って増加し、転移性ＣＲＣ個体で最も高い発現が観察される（図２、３）。ＣＤＨ１７診断アッセイプラットフォームは、ＣＲＣの診断とモニタリングのために現在臨床的に利用されているがん胎児性抗原や炭酸脱水酵素１９－９などのバイオマーカーと比較して極めて高い診断感度と特異性を有するため（表２）、この技術は、ＣＤＨ１７の高発現が観察されている大腸がん又は他のＧＩがんの集団スクリーニングに適用することができる。ＣＤＨ１７診断アッセイにより腺腫やがん腫などの前がん状態を有する潜在的な個体を特定することによりスクリーニングされた候補者は、その後、はるかに高価な侵襲的ツールである大腸内視鏡検査により評価して疾患の重症度を確認することができる。

【0048】

この技術は数年前から存在しているにもかかわらず未開拓のままであるため、本発明に開示されたソリューションは実際に臨床分野と研究分野の両方で非常に価値がある。ＣＤＨ－１７はいくつかのがんにおいて確立された診断バイオマーカーですが、商業化を目的としてこのバイオマーカーを研究している企業は限られている。ＣＤＨ１７診断アッセイプラットフォームは、臨床的に適用可能な体外診断（ＩＶＤ）技術に成熟し、ＧＩがんの疾患管理の改善に適用することができる。

【0049】

医薬製剤は単位剤形であってもよい。このような剤形では、製剤は、適切な量の活性成分を含む単位用量に細分化することができる。単位剤形は、キット又は他の形態などのパッケージされた製剤であってもよく、前記パッケージは、パッケージされた錠剤、カプセル、バイアル又はアンプルに入った液体若しくは粉末などの個別量の製剤を含む。また、単位剤形は、カプセル、錠剤、カシェ剤、又はトローチ剤であってもよく、又はこれらのいくつかのパッケージ形態であってもよい。

【0050】

本開示は、以下の実施例によってさらに説明されるが、本出願を通して引用されたすべての参考文献の内容は、いかなる形でも限定するものとして解釈されるべきではなく、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。本開示の実施には、別段の指示がない限り、当該技術分野の範囲内である薬理学又は製薬の従来の技術が使用される。

【0051】

表１：循環ＣＤＨ１７タンパク質をアッセイするための特徴的な試薬

【表1】

【0052】

表２：大腸がんに臨床的に使用されている標準品（ＣＥＡ／ＣＡ１９－９）と比較したＣＤＨ１７の診断精度

【表2】

【0053】

配列表
>配列番号1
m7C5可変重鎖ドメインのアミノ酸配列
QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSYGLSWVKQRTGQGLEWIGEIFPRSGNSYYNEKFKGKAALTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARHYYSSLYYAMDYWGQGTSVTVSS

>配列番号2
m7C5可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列
DIQVTQSPASLSASVGESVSITCGTNENLYGALNWYQRKQGKSPQLLIYGATNLADGMSSRFSGSGSGRQYSLKISSLHPDDVATYYCQNVLSTPRTFGGGTKLEIK

>配列番号3
mLic3可変重鎖ドメインのアミノ酸配列
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFSFSDYYMYWVRQAPEKRLEWVASISFDGTYTYYTDRVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLKSEDTAMYYCARDRPAWFPYWGQGTLVTVSA

>配列番号4
mLic3可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列
DVLMTQIPLSLTVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQRPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELK

>配列番号5
m9A6可変重鎖ドメインのアミノ酸配列
EVKLQESGPELVKPGASVTISCKASGYTFTDYYINWVKQRPGQGLEWIGWLFPGSGTTYYNEKFKGKATLTVAKSSSTAYMLLSSLTSEDSAVYFCARWGFGNYAFAYWGQGTLVTVSA

>配列番号6
m9A6可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列
DIVLTQSQKFMSATVGDRVSITCKASQNVGTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSPSSRNTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDLADYFCQQYSTYPRTFGGGTKLEIK

>配列番号7
10C12可変重鎖ドメインのヒト化アミノ酸配列(ARB102)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPGKGLEWVAVIDSNGGSTYYPDTVKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCSSYTNLGAYWGQGTLVTVSA

>配列番号8
10C12可変軽鎖ドメインのヒト化アミノ酸配列(ARB102)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISGYLNWLQQKPGGAIKRLIYTTSTLDSGVPKRFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDFATYYCLQYASSPFTFGGGTKVEIK

>配列番号9
m7C5重鎖CDR-H1配列
GYTFTSYG

>配列番号10
m7C5重鎖CDR-H2配列
IFPRSGNS

>配列番号11
m7C5重鎖CDR-H3配列
ARHYYSSLYYAMDY
>配列番号12
m7C5軽鎖CDR-L1配列
ENLYGA
>配列番号13
m7C5軽鎖CDR-L2配列
GAT
>配列番号14
m7C5軽鎖CDR-L3配列
QNVLSTPRT
>配列番号15
mLic3重鎖CDR-H1配列
DYYMY

>配列番号16
mLic3重鎖CDR-H2配列
SISFDGTYTYYTDRVKG

>配列番号17
mLic3重鎖CDR-H3配列
DRPAWFPY

>配列番号18
mLic3軽鎖CDR-L1配列
RSSQSIVHSNGNTYLE
>配列番号19
mLic3軽鎖CDR-L2配列
KVSNRFS
>配列番号20
mLic3軽鎖CDR-L3配列
FQGSHVPLT
>配列番号21
m9A6重鎖CDR-H1配列
DYYIN

>配列番号22
m9A6重鎖CDR-H2配列
WLFPGSGTTYYNEKFKG

>配列番号23
m9A6重鎖CDR-H3配列
WGFGNYAFAY

>配列番号24
m9A6軽鎖CDR-L1配列
KASQNVGTAVA
>配列番号25
m9A6軽鎖CDR-L2配列
SPSSRNT
>配列番号26
m9A6軽鎖CDR-L3配列
QQYSTYPRT
>配列番号27
10C12重鎖CDR-H1(ARB102)配列
GFTFSSYA

>配列番号28
10C12重鎖CDR-H2(ARB102)配列
IDSNGGST

>配列番号29
10C12重鎖CDR-H3(ARB102)配列
SSYTNLGAY

>配列番号30
10C12軽鎖CDR-L1(ARB102)配列
QDISGY
>配列番号31
10C12軽鎖CDR-L2(ARB102)配列
TTS
>配列番号32
10C12軽鎖CDR-L3(ARB102)配列
LQYASSPFT

【図1】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図6-4】

【図6-5】

【配列表】

2024537188000001.xml

【国際調査報告】