特表 2024-537214 ＦＳＨＲを標的とする二重特異性Ｔ細胞エンゲージャと、がん治療における利用法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-10

(54)【発明の名称】ＦＳＨＲを標的とする二重特異性Ｔ細胞エンゲージャと、がん治療における利用法

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20241003BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20241003BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20241003BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20241003BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20241003BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20241003BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241003BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20241003BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241003BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20241003BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20241003BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20241003BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20241003BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20241003BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20241003BHJP

   A61K 38/095 20190101ALI20241003BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241003BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46

C07K16/28 ZNA

C07K19/00

C12N15/13

C12N15/62 Z

C07K14/705

A61P35/00

A61P37/04

A61K39/395 D

A61K39/395 E

A61K39/395 N

A61K39/395 T

A61K39/395 U

A61K31/7088

A61K31/7105

A61K31/711

A61K45/00

A61K9/14

A61K9/51

A61K38/095

A61K48/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024521043

(86)(22)【出願日】2022-10-06

(85)【翻訳文提出日】2024-06-03

(86)【国際出願番号】 US2022077665

(87)【国際公開番号】W WO2023060169

(87)【国際公開日】2023-04-13

(31)【優先権主張番号】63/252,727

(32)【優先日】2021-10-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/377,473

(32)【優先日】2022-09-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】516142001

【氏名又は名称】ザ ウィスター インスティテュート オブ アナトミー アンド バイオロジー

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(72)【発明者】

【氏名】デイビッド ウェイナー

(72)【発明者】

【氏名】アルフレド ペラレス－プチャルト

(72)【発明者】

【氏名】デビバシャ ボルドロイ

(72)【発明者】

【氏名】プラティック ボージナガルワラ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA31

4C076AA65

4C076AA95

4C076CC07

4C076CC27

4C076FF70

4C084AA13

4C084AA19

4C084MA02

4C084MA38

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4C084NA05

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4C085BB31

4C085BB33

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4C085BB35

4C085BB36

4C085BB37

4C085BB43

4C085CC22

4C085CC23

4C085EE01

4C085EE03

4C086AA01

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4C086MA01

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4C086MA04

4C086NA05

4C086NA13

4C086ZB09

4C086ZB26

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、二重特異性抗ＦＳＨＲ Ｔ細胞エンゲージャをコードする組み換え核酸配列のほか、ＦＳＨＲ特異的ＣＡＲ分子、その断片、そのバリアント、その組み合わせを含む組成物と、それを利用する方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも１つの最低１つの卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）抗原結合ドメインと少なくとも１つの免疫細胞誘引ドメインを含む、合成二重特異性免疫細胞エンゲージャ（ＢＩＣＥ）。

【請求項2】

前記免疫細胞誘引ドメインが、Ｔ細胞、抗原提示細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージからなるグループから選択される細胞を標的とする、請求項１に記載のＢＩＣＥ。

【請求項3】

前記免疫細胞誘引ドメインが、ＣＤ３、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、Ｏｘ４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ４０、ＦｃｇＲ、ＦｃｅＲ、ＦｃａＲ、およびＣＤ９５からなるグループから選択される少なくとも１つのＴ細胞特異的受容体分子を標的とする、請求項１に記載のＢＩＣＥ。

【請求項4】

前記免疫細胞誘引ドメインがＣＤ３を標的とする、請求項３に記載のＢＩＣＥ。

【請求項5】

ａ）アミノ酸配列の全長にわたって配列番号２と少なくとも約９０％一致するアミノ酸配列；
ｂ）配列番号２の少なくとも６５％にわたって少なくとも約９０％一致するアミノ酸配列の断片；
ｃ）配列番号２のアミノ酸配列；および
ｄ）配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも６５％を含むアミノ酸配列の断片
からなるグループから選択される１つ以上の配列を含む、請求項１に記載のＢＩＣＥ。

【請求項6】

請求項１～５のいずれか１項に記載のＢＩＣＥをコードする核酸分子。

【請求項7】

ＲＮＡ分子とＤＮＡ分子からなるグループから選択される、請求項６に記載の核酸分子。

【請求項8】

ａ）核酸配列の全長にわたって配列番号１と少なくとも約９０％一致するヌクレオチド配列；
ｂ）核酸配列の少なくとも６５％にわたって配列番号１と少なくとも約９０％一致するヌクレオチド配列の断片；
ｃ）配列番号１のヌクレオチド配列；および
ｄ）配列番号１のヌクレオチド配列の少なくとも６５％を含むヌクレオチド配列の断片
からなるグループから選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項６または７に記載の核酸分子。

【請求項9】

発現ベクターを含む、請求項６～８のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項10】

請求項１～５のいずれか１項に記載のＢＩＣＥまたは請求項６～９のいずれか１項に記載の核酸分子を含む組成物。

【請求項11】

医薬として許容可能な賦形剤をさらに含む、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤をさらに含む、請求項１０に記載の組成物。

【請求項13】

少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤をコードする少なくとも１つの核酸分子をさらに含む、請求項１０に記載の組成物。

【請求項14】

前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－１の阻害剤、ＰＤ－Ｌ－１の阻害剤、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原－４（ＣＴＬＡ－４）の阻害剤、ムチンドメイン含有－３（ＴＩＭ－３）の阻害剤、およびリンパ球活性化３（ＬＡＧ３）の阻害剤からなるグループから選択される、請求項１２または１３に記載の組成物。

【請求項15】

請求項１～５のいずれか１項に記載のＢＩＣＥまたは請求項６～９のいずれか１項に記載の核酸分子を含む脂質ナノ粒子を含む、請求項１０に記載の組成物。

【請求項16】

対象におけるＦＳＨＲ発現と関係する疾患または障害を予防または治療する方法であって、請求項１～５のいずれか１項に記載のＢＩＣＥ、請求項６～９のいずれか１項に記載の核酸分子、または請求項１０～１５のいずれか１項に記載の組成物を前記対象に投与することを含む方法。

【請求項17】

前記疾患が、良性腫瘍、がん、およびがん関連疾患からなるグループから選択される、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記疾患が、卵巣がん、乳がん、前立腺がん、腎臓がん、結腸直腸がん、胃がん、肺がん、精巣がん、子宮内膜がん、および甲状腺がんからなるグループから選択される、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

ａ）配列番号３のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％一致するアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３の少なくとも６５％にわたって少なくとも約９０％一致するアミノ酸配列の断片；
ｃ）配列番号３のアミノ酸配列；および
ｄ）配列番号３のアミノ酸配列の少なくとも６５％を含むアミノ酸配列の断片
からなるグループから選択される配列を含むＦＳＨＲ ｓｃＦｖ分子。

【請求項20】

請求項１９に記載のＦＳＨＲ ｓｃＦｖ分子を含む組成物。

【請求項21】

医薬として許容可能な賦形剤をさらに含む、請求項２０に記載の組成物。

【請求項22】

少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤をさらに含む、請求項２１に記載の組成物。

【請求項23】

前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－１の阻害剤、ＰＤ－Ｌ－１の阻害剤、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原－４（ＣＴＬＡ－４）の阻害剤、ムチンドメイン含有－３（ＴＩＭ－３）の阻害剤、およびリンパ球活性化３（ＬＡＧ３）の阻害剤からなるグループから選択される、請求項２２に記載の組成物。

【請求項24】

請求項１９に記載のｓｃＦｖを含む脂質ナノ粒子を含む、請求項２０に記載の組成物。

【請求項25】

請求項１９に記載のｓｃＦｖを含むＣＡＲ分子を含む、請求項２０に記載の組成物。

【請求項26】

前記ＣＡＲ分子が、配列番号４、配列番号５、および配列番号６からなるグループから選択される配列を含む、請求項２５に記載の組成物。

【請求項27】

請求項１９に記載のｓｃＦｖまたは請求項２５～２６のいずれか１項に記載のＣＡＲ分子を発現している細胞含む、請求項２０に記載の組成物。

【請求項28】

ＦＳＨＲ特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子。

【請求項29】

配列番号３に示されているヌクレオチド配列を含むＦＳＨＲ特異的ｓｃＦｖを含む、請求項２８に記載のＣＡＲ分子。

【請求項30】

配列番号４、配列番号５、および配列番号６からなるグループから選択される配列を含む、請求項２８に記載のＣＡＲ分子。

【請求項31】

請求項２８～３０のいずれか１項に記載のＦＳＨＲ特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子を含む組成物。

【請求項32】

前記ＦＳＨＲ特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子を発現している細胞を含む、請求項３１に記載の組成物。

【請求項33】

前記細胞が操作されたＴ細胞である、請求項３２に記載の組成物。

【請求項34】

対象におけるＦＳＨＲ発現に関係する疾患または障害を予防または治療する方法であって、請求項１９に記載のｓｃＦｖ抗体断片、請求項２０～２７のいずれか１項に記載の組成物、請求項２８～３０のいずれか１項に記載のＣＡＲ分子、または請求項３１～３３のいずれか１項に記載の組成物を前記対象に投与することを含む方法。

【請求項35】

前記疾患が、良性腫瘍、がん、およびがん関連疾患からなるグループから選択される、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記疾患が、卵巣がん、乳がん、前立腺がん、腎臓がん、結腸直腸がん、胃がん、肺がん、精巣がん、子宮内膜がん、および甲状腺がんからなるグループから選択される、請求項３５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連する出願の相互参照
本出願は２０２１年１０月６日に出願されたアメリカ合衆国仮特許出願第６３／２５２，７２７号と２０２２年９月２８日に出願されたアメリカ合衆国仮特許出願第６３／３７７，４７３号の優先権を主張するものであり、そのそれぞれの全体が参照によって本明細書に組み込まれている。

【0002】

連邦が資金援助した研究または開発に関する宣言
本発明は政府の支援をアメリカ国防総省陸軍から資金援助第Ｗ８１ＸＷＨ－１９－１－０１８９号のもとで得てなされたものであり、政府は本発明に所定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

卵巣がん（ＯＣ）は最も致命的な婦人科悪性腫瘍を代表する。これは女性におけるがん死の５番目の主因であり、女性生殖器系のがんに関する死の最大数を占める。アメリカがん協会によれば、２０２１年には２１，４１０人の女性が新たに卵巣がんと診断され、ＯＣに起因して１３，７７０人が死亡したと推定されている（Ｋｕｎｉｔ ｅｔ ａｌ．， ２０２１， Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ． ２０２１；１３７（１）：１０８－２１；Ｋｅｙ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ。２０２１年１１月２２日にアクセス。ｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ）。ＯＣは高度に不均一ながんであり、腫瘍の９０％が上皮起源である。上皮卵巣がん（ＥＯＣ）の最も一般的なサブタイプは高異型度の漿液性がんであり、ほぼ７０～８０％のケースを構成するのに対し、低グレード漿液性（＜５％）、類内膜（１０％）、明細胞（１０％）、および粘液産生性（３％）は、より少ないサブタイプである（Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２０２１， Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄ， １３（１）：１４０）。

【0004】

外科手術と化学療法がＯＣに関する第１の治療法である（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０２０， Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１：５７７８６９）。これらのアプローチは多くの患者で部分的に成功しているが、最初の治療から数年以内に化学療法抵抗性を発達させ、次いで疾患再発に直面する（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０２０， Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１：５７７８６９）。ＯＣの大きな死亡率は、主観的症状がないことのほか、原発検出のための低侵襲技術がないことが原因で早期検出率が低いこととも結びついている。したがってＯＣは、新規な治療アプローチが切実に必要とされる分野であり続けている（Ｂａｎｎｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ， ２０１４：２３２８１７）。卵巣腫瘍細胞と腫瘍微小環境の間には密な相互作用が存在するため、腫瘍細胞を標的とするだけでなく、この微小環境において抗腫瘍機能を維持できる治療アプローチの開発が特に重要である（ＣＳＳＯＣＲ。Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒｓ： Ｅｖｏｌｖｉｎｇ Ｐａｒａｄｉｇｍｓ ｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｃａｒｅ． Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ （ＤＣ）： Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｅｓ Ｐｒｅｓｓ （ＵＳ）； ２０１６）。研究が進んでいる１つの領域は、ＯＣのための免疫に基づく療法である。このような研究に含まれるのは、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（とＴ細胞受容体（ＴＣＲ））が操作されたＴ細胞である （Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０２０， Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１：５７７８６９）。特に、ＣＡＲ療法の発展における１つの主要な障害は、腫瘍細胞の表面だけで特異的に発現するが健康な組織の表面では発現しない標的を見いだすことである（Ｐｅｒａｌｅｓ－Ｐｕｃｈａｌｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ２３（２）：４４１－５００）。卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）は、卵巣顆粒膜細胞で選択的に発現しているのに対し、正常な卵巣内皮では低レベルの発現であることが報告されており、１つの重要な標的である。ＦＳＨＲは漿液性卵巣癌のケースの５０～７０％で発現しており、免疫療法の１つの重要な潜在的標的を提供する（Ｐｅｒａｌｅｓ－Ｐｕｃｈａｌｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ２３（２）：４４１－５００）。

【0005】

モノクローナル抗体療法はがん治療におけるゲーム－チェンジャーであり続けてきたが、この療法はいくつかの制約（反復投与の必要性、より限定された安定性、およびコストが含まれる）を有する。モノクローナル技術に関する１つのさらなる進展は、モノクローナル抗体の特異性にＴ細胞の細胞傷害能力を組み合わせる二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ）の開発である。ＢｉＴＥは白血病臨床試験において有望な結果を示した（Ｖｉａｒｄｏｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， Ｂｌｏｏｄ， １２７（１１）：１４１０－６；Ｇｏｅｂｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ， ３４（１０）：１１０４－１１）が、この療法は適用可能性が限定されている。なぜならサイクルごとに４～８週間にわたる連続的な静脈内輸液を必要とすること（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ， ５５（１０）：１２７１－８８）と、製造が限られる可能性があるからである。抗体に基づく製品のためのより長寿命でより簡単な製造法は、がん免疫療法のための重要な新ツールとなる可能性が大きい。

【0006】

そのため本分野では、がん免疫療法のための、より長寿命であり、製造がより簡単で、抗体に基づく製品が必要とされている。本発明はこの要求を満たす。

【発明の概要】

【0007】

一実施形態では、本発明は、少なくとも１つの最低１つの卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）抗原結合ドメインと少なくとも１つの免疫細胞誘引ドメインを含む、合成二重特異性免疫細胞エンゲージャ（ＢＩＣＥ）に関する。

【0008】

一実施形態では、免疫細胞誘引ドメインは、Ｔ細胞、抗原提示細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、またはマクロファージを標的とする。

【0009】

一実施形態では、免疫細胞誘引ドメインは、ＣＤ３、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、Ｏｘ４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ４０、ＦｃｇＲ、ＦｃｅＲ、ＦｃａＲ、およびＣＤ９５からなるグループから選択される少なくとも１つのＴ細胞特異的受容体分子を標的とする。一実施形態では、免疫細胞誘引ドメインは、ＣＤ３を標的とする

【0010】

一実施形態では、ＢＩＣＥは、アミノ酸配列の全長にわたって配列番号２と少なくとも約９０％一致するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＢＩＣＥは、配列番号２の少なくとも６５％にわたって少なくとも約９０％一致するアミノ酸配列の断片を含む。一実施形態では、ＢＩＣＥは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＢＩＣＥは、配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも６５％を含むアミノ酸配列の断片を含む。

【0011】

一実施形態では、本発明は、少なくとも１つの最低１つの卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）抗原結合ドメインと少なくとも１つの免疫細胞誘引ドメインを含む合成二重特異性免疫細胞エンゲージャ（ＢＩＣＥ）をコードする核酸分子に関する。一実施形態では、核酸分子ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子。一実施形態では、核酸分子は、核酸配列の全長にわたって配列番号１と少なくとも約９０％一致するヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、核酸配列の少なくとも６５％にわたって配列番号１と少なくとも約９０％一致するヌクレオチド配列の断片を含む。一実施形態では、核酸分子は配列番号１のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列の少なくとも６５％を含むヌクレオチド配列の断片を含む。一実施形態では、核酸分子は発現ベクターを含む。

【0012】

一実施形態では、本発明は、少なくとも１つの最低１つの卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）抗原結合ドメインと少なくとも１つの免疫細胞誘引ドメインを含む合成二重特異性免疫細胞エンゲージャ（ＢＩＣＥ）、またはそれをコードする核酸分子を含む組成物に関する。

【0013】

一実施形態では、組成物は、医薬として許容可能な賦形剤をさらに含む。一実施形態では、組成物は、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤、またはそれをコードする核酸分子をさらに含む。

【0014】

一実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１の阻害剤、ＰＤ－Ｌ－１の阻害剤、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原－４（ＣＴＬＡ－４）の阻害剤、ムチンドメイン含有－３（ＴＩＭ－３）の阻害剤、またはリンパ球活性化３（ＬＡＧ３）の阻害剤である。

【0015】

一実施形態では、組成物は、合成二重特異性免疫細胞エンゲージャ（ＢＩＣＥ）を含む脂質ナノ粒子を含み、その合成二重特異性免疫細胞エンゲージャは、少なくとも１つの最低１つの卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）抗原結合ドメインと、少なくとも１つの細胞誘引ドメインまたはそれをコードする核酸分子を含む。

【0016】

一実施形態では、本発明は、対象におけるＦＳＨＲ発現と関係する疾患または障害を予防または治療する方法に関するものであり、この方法は、少なくとも１つの最低１つの卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）抗原結合ドメインと少なくとも１つの細胞誘引ドメインを含む合成二重特異性免疫細胞エンゲージャ（ＢＩＣＥ）、またはそれをコードする核酸分子を前記対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、対象におけるＦＳＨＲ発現と関係する疾患または障害を予防または治療する方法に関するものであり、この方法は、少なくとも１つの最低１つの卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）抗原結合ドメインと少なくとも１つの細胞誘引ドメインを含む合成二重特異性免疫細胞エンゲージャ（ＢＩＣＥ）、またはそれをコードする核酸分子を含む組成物を前記対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１つの最低１つの卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）抗原結合ドメインと少なくとも１つの細胞誘引ドメインを含む合成二重特異性免疫細胞エンゲージャと、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤、またはそれをコードする核酸分子を含む。

【0017】

一実施形態では、疾患は、良性腫瘍、がん、またはがん関連疾患である。一実施形態では、疾患は、卵巣がん、乳がん、前立腺がん、腎臓がん、結腸直腸がん、胃がん、肺がん、精巣がん、子宮内膜がん、または甲状腺がんである。

【0018】

一実施形態では、本発明はＦＳＨＲ ｓｃＦｖ分子に関する。一実施形態では、ＦＳＨＲ ｓｃＦｖ分子は、配列番号３のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％一致するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＦＳＨＲ ｓｃＦｖ分子は、配列番号３の少なくとも６５％にわたって少なくとも約９０％一致するアミノ酸配列の断片を含む。一実施形態では、ＦＳＨＲ ｓｃＦｖ分子は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＦＳＨＲ ｓｃＦｖ分子は、配列番号３のアミノ酸配列の少なくとも６５％を含むアミノ酸配列の断片を含む。」

【0019】

一実施形態では、本発明は、ＦＳＨＲ ｓｃＦｖ分子を含む組成物に関する。一実施形態では、組成物は、医薬として許容可能な賦形剤を含む。一実施形態では、組成物は、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤を含む。一実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤ＰＤ－１の阻害剤、ＰＤ－Ｌ－１の阻害剤、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原－４（ＣＴＬＡ－４）の阻害剤、ムチンドメイン含有－３（ＴＩＭ－３）の阻害剤、またはリンパ球活性化３（ＬＡＧ３）の阻害剤。

【0020】

一実施形態では、組成物は、ＦＳＨＲ ｓｃＦｖを含む脂質ナノ粒子を含む。

【0021】

一実施形態では、組成物は、ＦＳＨＲ ｓｃＦｖを含むＣＡＲ分子を含む。一実施形態では、ＣＡＲ分子は、配列番号４、配列番号５、または配列番号６を含む。

【0022】

一実施形態では、組成物は、ＦＳＨＲ ｓｃＦｖ、またはＦＳＨＲ ｓｃＦｖを含むＣＡＲ分子を発現している細胞を含む。一実施形態では、細胞は、ＦＳＨＲ ｓｃＦｖ、またはＦＳＨＲ ｓｃＦｖを含むＣＡＲ分子を発現しているＴ細胞である。

【0023】

一実施形態では、本発明は、ＦＳＨＲ特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子に関する。一実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３に示されているヌクレオチド配列を含むＦＳＨＲ特異的ｓｃＦｖを含む。一実施形態では、ＣＡＲは、配列番号４、配列番号５、または配列番号６の配列を含む。

【0024】

一実施形態では、本発明は、ＦＳＨＲ特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子を含む組成物に関する。一実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３に示されているヌクレオチド配列を含むＦＳＨＲ特異的ｓｃＦｖを含む。一実施形態では、ＣＡＲは、配列番号４、配列番号５、または配列番号６の配列を含む。

【0025】

一実施形態では、組成物は、ＦＳＨＲ特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子を発現している細胞を含む。一実施形態では、細胞は、操作されたＣＡＲ Ｔ細胞である。

【0026】

一実施形態では、本発明は、対象におけるＦＳＨＲ発現と関係する疾患または障害を予防または治療する方法に関するものであり、この方法は、ＦＳＨＲ ｓｃＦｖ抗体断片、ＦＳＨＲ ｓｃＦｖ抗体断片を含むＣＡＲ分子、またはＦＳＨＲ ｓｃＦｖ抗体断片またはＦＳＨＲ ｓｃＦｖ抗体断片を含むＣＡＲ分子を含む組成物を前記対象に投与することを含む。一実施形態では、この方法は、ＦＳＨＲ ｓｃＦｖ抗体断片を含むＣＡＲ分子を含む操作されたＣＡＲ Ｔ細胞を投与することを含む。

【0027】

一実施形態では、疾患は、良性腫瘍、がん、またはがん関連疾患である。一実施形態では、疾患は、卵巣がん、乳がん、前立腺がん、腎臓がん、結腸直腸がん、胃がん、肺がん、精巣がん、子宮内膜がん、または甲状腺がんである。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】図１は、Ｋ５６２－ＦＳＨＲ細胞へのＦＳＨＲ二重特異性抗体の結合を実証するデータ。

【0029】

【図2】図２は、ＦＳＨＲ二重特異性ａｂがＴ細胞の存在下でＯＶＣＡＲ３細胞を殺傷することを実証するデータを示す。エフェクタ細胞：Ｔ細胞；エフェクタ：標的 １０：１；エフェクタ細胞と処理は２３．８時間の時点で与えた。

【0030】

【図3】図３は、ＯＶＩＳＥ（卵巣明細胞腺癌）細胞においてｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅを用いて評価したときのＦＳＨＲ×ＣＤ３二重特異性抗体の細胞傷害効果を実証するデータを示す。

【0031】

【図4】図４は、ＣａＯＶ３（高異型度の卵巣漿液性腺癌）細胞においてｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅを用いて評価したときのＦＳＨＲ×ＣＤ３二重特異性抗体の細胞傷害効果を実証するデータを示す。

【0032】

【図5】図５は、ＮＳＧマウスにおいて生体内に放出したＦＳＨＲ×ＣＤ３二重特異性がＯＶＣＡＲ３腫瘍細胞の増殖を制御することを実証するデータを示す。

【0033】

【図6A-6F】図６Ａから図６Ｆまで：抗ヒトＦＳＨＲ抗体の生成。（Ａ）ＦＳＨＲの構造を示す。（Ｂ）ｐＢＭＮ－Ｉ－ＧＦＰ発現ベクターへのクローニング戦略。（Ｃ）マウス免疫化スキーム。（Ｄ）異なる用量のＦＳＨホルモンに対するＫ５６２とＫ５６２－ＦＳＨＲのｃＡＭＰ応答。（Ｅ）ＦＳＨを用いてＫ５６２細胞とＫ５６２－ＦＳＨＲ細胞を刺激してから２０分後のホスホ－ホスホ－ｐ４４／４２（Ｅｒｋ１／２）とｐ４４／４２（Ｅｒｋ１／２）のウエスタンブロット。（Ｆ）ＦＳＨＲをＦＳＨで刺激したときのＫ５６２－ＦＳＨＲ細胞におけるＤ２ＡＰ１１抗ＦＳＨＲ抗体によるｃＡＭＰ産生の部分的阻止。分散分析。＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意差なし。

【0034】

【図7A-7D】図７Ａから図７Ｄまで：抗ヒトＦＳＨＲ抗体のスクリーニング。（Ａ）Ｋ５６２とＫ５６２－ＦＳＨＲを用いたスクリーニングプロセスにおいて可能な結果を表わすフローサイトメトリープロットのスキーム。（Ｂ）１：１０００に希釈したヒトＦＳＨＲまたは空ベクターと、抗マウスＩｇＧ ＡＰＣで免疫化したマウスからの血清で染色したＫ５６２（ＧＦＰ－）／Ｋ５６２－ＦＳＨＲ（ＧＦＰ＋）細胞のフローサイトメトリープロット。（Ｃ）ハイブリドーマからＦＳＨＲ結合抗体をＫ５６２－ＦＳＨＲ／Ｋ５６２のフロープロットおよび平均蛍光強度倍数変化として検出するための代表的なフローサイトメトリースクリーニング出力戦略（Ｄ）Ｋ５６２－ＦＳＨＲ／Ｋ５６２のＭＦＩ倍数変化として測定したときの、ＦＳＨＲに結合するハイブリドーマ上清を示すウォータフォールプロット。第１ラウンドのスクリーニングの後、上位２０クローン（赤い棒の左）をさらなる研究のために選択した。

【0035】

【図8A-8B】図８Ａから図８Ｂまで：Ｄ２ＡＰ１１と市販のマウス抗ヒトＦＳＨＲ抗体の結合効力。（Ａ）ＦＳＨＲを過剰発現しているＫ５６２細胞におけるＤ２ＡＰ１１抗ＦＳＨＲ Ａｂと４つの異なる市販のＡｂ（市販のＡｂ＃１、２、３、および４）の結合をフローサイトメトリーによって分析。二次Ａｂ対照だけと、無関係なＡｂ対照の場合が左に示されており、ここではＫ５６２細胞とＫ５６２－ＦＳＨＲ細胞への結合は観察されなかった。異なる抗ＦＳＨＲ抗体との結合を異なる濃度で評価した；２５００ｎｇ／ｍｌ、１２５０ｎｇ／ｍｌ、６２５ｎｇ／ｍｌ、３１２．５ｎｇ／ｍｌ、１５６．２５ｎｇ／ｍｌ、および７８．１２５ｎｇ／ｍｌ。（Ｂ）Ｋ５６２－ＦＳＨＲ細胞への用量に依存したＤ２ＡＰ１１抗ＦＳＨＲ Ａｂの結合をフローサイトメトリーによって分析した。Ｄ２ＡＰ１１の結合が９．７７ｎｇ／ｍｌという低い濃度で観察され、その効力を示している。

【0036】

【図9A-9C】図９Ａから図９Ｃまで：健康な組織と卵巣がん組織へのＤ２ＡＰ１１の結合。（Ａ）異なるヒト臓器（膵臓、肺、心臓、小腸、大腸、子宮、卵巣、および卵管内皮）の健康な組織へのＤ２ＡＰ１１抗ＦＳＨＲ抗体の結合を示す代表的な画像を免疫組織化学／ＩＨＣによって分析。（Ｂ）異なる病状（高異型度と低異型度の漿液性癌、粘液腺癌、明細胞癌、未分化胚細胞腫、内胚葉洞癌、および転移腺癌）の卵巣がん組織に対するＤ２ＡＰ１１抗ＦＳＨＲ抗体の結合を示す代表的な画像を卵巣がんＴＭＡ（ＵＳ Ｂｉｏｍａｘ）のＩＨＣ染色によって分析。ニコンＮＩＳ－エレメントイメージングシステム（２０倍、スケール：５００μｍ）を用いて組織（ＡとＢ）を見て画像を取得した。画像の取得後に調整し、明るさ、コントラスト、および画像視認性を最適にした。（Ｃ）「ヒトタンパク質アトラス」のデータに基づき、５５種類のヒト組織タイプの表面におけるＦＳＨＲとＥＲＢＢ２／Ｈｅｒ２のＲＮＡ発現を規格化して比較。

【0037】

【図10A-10B】図１０Ａから図１０Ｂまで：５５種類の組織タイプにおけるＦＳＨＲとＥＲＢＢ２／Ｈｅｒ２の発現の差。（Ａ）５５種類の異なるヒト組織タイプにおけるＦＳＨＲの発現（ＲＮＡ）の差を「ヒトタンパク質アトラス」のデータベースを利用して分析。（Ｂ）異なるヒト組織におけるＥＲＢＢ２／Ｈｅｒ２の発現（ＲＮＡ）の差を「ヒトタンパク質アトラス」のデータベース（ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ）を利用して分析；ｎＴＰＭ：規格化した発現レベル。

【0038】

【図11A-11D】図１１Ａから図１１Ｄまで：Ｄ２ＡＰ１１はヒトとマウスのＦＳＨＲに結合する。（Ａ）Ｄ２ＡＰ１１、または一次抗体なしの後に、二次ＡＰＣ標識抗体で染色したＣａＯＶ３、ＯＶＣＡＲ３、およびＴＯＶ－２１Ｇのフローサイトメトリープロット。（Ｂ）ＴＯＶ－２１Ｇ親、またはＦＳＨＲのクリスパー後のＴＯＶ－２１ＧをＤ２ＡＰ１１で染色したフローサイトメトリープロット。（Ｃ）Ｄ２ＡＰ１１、または一次抗体なしの後に、二次ＡＰＣ標識抗体で染色したＫ５６２、Ｋ５６２－ＦＳＨＲ、およびＫ５６２－ＬＨＣＧＲ ２１Ｇのフローサイトメトリープロット。（Ｄ）Ａ２０（ＧＦＰ－）／Ａ２０－Ｆｈｓｒ（ＧＦＰ＋）細胞、およびＩＤ８－Ｄｅｆｂ２９／Ｖｅｇｆ－ａ細胞とＩＤ８－Ｄｅｆｂ２９／Ｖｅｇｆ－ａ－ＦＳＨＲ細胞をＤ２ＡＰ１１で染色したフローサイトメトリープロット（両方の細胞系にマウスＦＳＨＲをトランスフェクトした）。

【0039】

【図12A-12G】図１２Ａから図１２Ｇまで：Ｄ２ＡＰ１１は免疫組織化学と免疫細胞化学においてＦＳＨＲに結合し、抗体依存性細胞傷害を誘導する。（Ａ）Ｋ５６２、Ｋ５６２－ＦＳＨＲ、ＯＶＣＡＲ３、およびＴＯＶ－２１Ｇ細胞系に由来する腫瘍の凍結切片をＤ２ＡＰ１１で染色したものからの免疫組織化学画像。４０倍、スケール棒５０μｍ。（Ｂ）ヒトＦＳＨＲをトランスフェクトし、マウス抗ヒトＦＳＨＲまたはＤ２ＡＰ１１抗体いずれかの後に二次抗マウスＩｇＧで染色した２９３Ｔ細胞の免疫蛍光画像。（Ｃ）トランスフェクトされていない２９３Ｔ細胞をＤ２ＡＰ１１抗体の後に二次抗マウスＩｇＧで染色した免疫蛍光画像。Ｂ～Ｄ：スケール棒１０μｍ。（Ｄ）Ｄ２ＡＰ１１抗体について実施したアイソタイプＥＬＩＳＡの吸光値。（Ｅ）Ｄ２ＡＰ１１または無関係なマウスＩｇＧ２ａ（Ｃ１．１８．４）がＫ５６２－ＦＳＨＲに対して生じさせるＡＤＣＣによる細胞傷害。（Ｆ）Ｄ２ＡＰ１１または無関係なマウスＩｇＧ２ａ（Ｃ１．１８．４）がＫ５６２に対して生じさせるＡＤＣＣによる細胞傷害。（Ｇ）Ｄ２ＡＰ１１または無関係なマウスＩｇＧ２ａ（Ｃ１．１８．４）がＯＶＣＡＲ３細胞に対して生じさせるＡＤＣＣによる細胞傷害。ｔ検定、分散分析。＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ有意差なし。

【0040】

【図13A-13H】図１３Ａから図１３Ｈまで：ＦＳＨＲ ＴＣＥの生成、発現、および抗腫瘍活性。（Ａ）ＴＣＥ 誘引ＦＳＨＲとＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の模式図。ＧＳ、グリシン－セリン；ＶＨ、重鎖可変領域；ＶＬ、軽鎖可変領域。（Ｂ）Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥをコードするＤＮＡコンストラクトの図解。（Ｃ）Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥまたはｐＶａｘ１空ベクターをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした後のインビトロ発現のウエスタンブロット。（Ｄ）ＦＳＨＲの天然の発現を欠くＫ５６２細胞を用いてＤ２ＡＰ１１－ＴＣＥの結合特異性を検証した。ＦＳＨＲを発現していないＫ５６２細胞では、Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥの結合は観察されなかった。（Ｅ）ＦＳＨＲを過剰発現しているＫ５６２細胞へのＤ２ＡＰ１１－ＴＣＥの結合。（Ｆ）ＦＳＨＲへのＤ２ＡＰ１１－ＴＣＥの結合を、追加のＦＳＨＲ発現細胞であるＣａＯＶ３を用いて示す。Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥでピークがｐＶａｘ１および二次Ａｂだけと比べてシフトしているのは、それがＦＳＨＲに結合していることを示す。（Ｇ）ＦＳＨＲへのＤ２ＡＰ１１－ＴＣＥの結合を、ＦＳＨＲを過剰発現させるためＦＳＨＲをコードするｐＢＭＮ－Ｉ－ＧＦＰプラスミドを用いて形質導入したＯＶＣＡＲ３細胞を用いて示す。ＦＳＨＲを過剰発現しているＯＶＣＡＲ３細胞では、空ベクターおよび二次抗体だけの対照と比べてピークの顕著なシフトが存在する。（Ｈ）Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥと空ベクター対照を用いた初代ヒトＴ細胞のフロー染色、ピークのシフトは、ヒトＴ細胞へのＤ２ＡＰ１１－ＴＣＥの結合を示す。

【0041】

【図14A-14P】図１４Ａから図１４Ｐまで：Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥは標的卵巣がん細胞の特異的殺傷を誘導する。ＦＳＨＲ陰性である（ＡとＢ）ＨＥＫ２９３細胞、（ＣとＤ）ＡＧＳ胃腺癌細胞、および（Ｅ）ＷＭ３７４３ヒト悪性黒色腫細胞のほか、標的ヒト卵巣がん細胞である（ＦとＧ）ＯＶＩＳＥ細胞、（ＨとＩ）ＣａＯＶ３細胞、（Ｊ）ＯＶＣＡＲ４細胞、（ＫとＬ）ＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ細胞、（Ｍ）ＰＥＯ－４細胞、および（Ｎ）倉持－ＦＳＨＲ細胞におけるＤ２ＡＰ１１－ＴＣＥの細胞傷害効果、Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥとヒトＰＢＭＣの存在下での（Ｏ）ＯＶＩＳＥ－ＦＳＨＲと（Ｐ）ＯＶＣＡＲ３細胞の用量依存性殺傷の評価。ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅリアルタイム細胞分析装置（ＲＴＣＡ）（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、アメリカ合衆国）を使用し、インピーダンスに基づいてインビトロで細胞傷害を測定した。ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ装置によって電気伝導度を１５分ごとに無単位の細胞指数（ＣＩ）パラメータに変換し、画像は１時間の間隔で取得した。生成したデータは、エフェクタ（Ｅ）細胞（ＰＢＭＣ）とＤ２ＡＰ１１－ＴＣＥを標的（Ｔ）細胞に添加した時点によって規格化する；Ｅ：Ｔは５：１（ＡとＢ、ＦとＧ、Ｍ、Ｎ）と１０：１（Ｃ～Ｅ、Ｈ～Ｌ、ＯとＰ）である。データはＲＴＣＡ／ＲＴＣＡ Ｐｒｏソフトウエアを用いて分析した。非特異的殺傷がＨＥＫ２９３Ｔ、７７３ＡＧＳ、およびＷＭ３７４３細胞で得られたのに対し、強力な殺傷はＯＶＩＳＥ、ＣａＯＶ３、ＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ、ＰＥＯ－４、および倉持－ＦＳＨＲ標的ＯＣ細胞で観察された。矢印は、抗体とエフェクタ細胞を標的細胞に添加した時点を示す。示されている画像は、エフェクタ細胞と抗体を添加してから２～３日後の殺傷を示す。

【0042】

【図15A-15C】図１５Ａから図１５Ｃまで：ＦＳＨＲを標的とする二重特異性Ｔ細胞エンゲージャは、精製したＴ細胞の存在下で卵巣がんの細胞傷害を誘導した。Ｔ細胞を（Ａ） ＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ細胞および（Ｂ）ＯＶＣＡＲ４細胞とＤ２ＡＰ１１－ＴＣＥの存在下で共培養して生じたインビトロでの細胞傷害。リアルタイムインビトロ細胞傷害分析をｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅによって実施した；Ｅ：Ｔ＝５：１／１０：１（Ｃ）エフェクタ細胞と抗体を添加してから３日後、ヒトＴ細胞の存在下でのＯＶＣＡＲ４細胞に対するＤ２ＡＰ１１－ＴＣＥの細胞傷害効果を示す画像。Ａｂなし（エフェクタ＋標的だけ）が対照として機能した。矢印は、エフェクタ細胞とＴＣＥを添加した時点を示す。

【0043】

【図16A-16C】図１６Ａから図１６Ｃまで：Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥによる用量に依存したＯＶＩＳＥ－ＦＳＨＲ細胞の殺傷。ＯＶＩＳＥ－ＦＳＨＲ細胞において、（Ａ）ヒトＰＢＭＣと（Ｂ）ヒトＴ細胞の存在下でＤ２ＡＰ１１－ＴＣＥによる用量に依存した殺傷が観察された。（Ｃ）ヒトＰＢＭＣの存在下でのＤ２ＡＰ１１－ＴＣＥによる用量に依存したＯＶＣＡＲ３細胞の殺傷。リアルタイムインビトロ細胞傷害分析をｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅによって実施した；Ｅ：Ｔ＝１０：１。Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥは、示されている５００ｎｇ／ｍｌ～７．８１ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で添加した。

【0044】

【図17】図１７Ａ：無関係なＴＣＥは、ＦＳＨＲを過剰発現している卵巣がん細胞において殺傷を誘導しなかった。ＩＬ１３Ｒα２－ＴＣＥ（無関係な／非ＦＳＨＲ標的ＴＣＥ）は、ヒトＰＢＭＣの存在下で、ＦＳＨＲを過剰発現しているＯＶＣＡＲ３細胞に対する細胞傷害を引き起こさなかった。矢印は、エフェクタ細胞とＴＣＥを添加した時点を示す。赤い線は、Ａｂ対照なし（エフェクタ＋標的細胞だけ）を示す；Ｅ：Ｔ＝５：１。

【0045】

【図18A-18D】図１８Ａから図１８Ｄまで：Ｄ２ＡＰ１１とＤ２ＡＰ１１－ＴＣＥの比較細胞殺傷分析。（Ａ）ヒトＰＢＭＣの存在下における、示されている濃度のＤ２ＡＰ１１抗ＦＳＨＲ抗体によるＯＶＣＡＲ４細胞の殺傷。（Ｂ）ヒトＰＢＭＣの存在下における、示されている濃度のＤ２ＡＰ１１－ＴＣＥによるＯＶＣＡＲ４細胞の殺傷。矢印は、エフェクタ細胞とＤ２ＡＰ１１／Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥを添加した時点を示す。（Ｃ）Ｄ２ＡＰ１１抗ＦＳＨＲ ＡｂはヒトＰＢＭＣの存在下で用量に依存したＯＶＣＡＲ４細胞の殺傷を示し、ＥＣ５０値は３０．３μｇ／ｍｌであった（Ｄ）Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥはヒトＰＢＭＣの存在下で用量に依存したＯＶＣＡＲ４細胞の殺傷を示し、ＥＣ５０値は１１．３ｎｇ／ｍｌであった。これは、効力が抗ＦＳＨＲ抗体と比べて約１０００倍大きいことを示す。リアルタイムインビトロ細胞傷害分析はｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅによって実施した；Ｅ：Ｔ＝１０：１。ＥＣ５０値はＲＴＣＡ Ｐｒｏソフトウエアを用いて計算した。

【0046】

【図19A-19F】図１９Ａから図１９Ｆまで：サイトカイン分泌プロファイルと、Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥの生体内活性。（Ａ）サイトカインの分泌プロファイル；Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥの存在下でＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲとヒトＰＢＭＣを共培養したときのＩＦＮ－ガンマ、ｓＦａｓ、グランザイムＡとＢ、およびパーフォリン；Ｅ：Ｔ＝１０：１。サイトカイン分泌プロファイルを知るために分析する上清を、エフェクタ細胞とＴＣＥを標的ＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ細胞に添加してから４８時間後に回収した。３人の異なるドナーからのＰＢＭＣを使用した；対応のないスチューデントの両側ｔ検定；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｂ）Ｋ５６２／Ｋ５６２－ＦＳＨＲでチャレンジしたＮＳＧマウスモデルにおける腫瘍進行に対するＤ２ＡＰ１１－ＴＣＥの効果を評価するための腫瘍研究の図解。（Ｃ）ＮＳＧマウスにグラフトしてＤ２ＡＰ１１－ＴＣＥまたは空ベクターで治療したＫ５６２腫瘍の平均増殖曲線（ｎ＝５匹／群）。（Ｄ）ＮＳＧマウスにグラフトしてＤ２ＡＰ１１－ＴＣＥまたは空ベクターで治療したＫ５６２－ＦＳＨＲ腫瘍の平均増殖曲線（ｎ＝５匹のマウス／群）。（Ｅ）ＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲでチャレンジしたＮＳＧマウスモデルにおける腫瘍進行に対するＤ２ＡＰ１１－ＴＣＥの効果を評価するための腫瘍研究の図解。（Ｆ）ＮＳＧマウスにグラフトしてＤ２ＡＰ１１－ＴＣＥまたは空ベクターで治療した３６個のＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ腫瘍の平均増殖曲線（ｎ＝１０匹のマウス／群）。二元配置分散分析；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。

【0047】

【図20】図２０は、Ｄ２ＡＰ１１－ＢＴＥは卵巣がん細胞においてニボルマブ（抗ＰＤ１抗体）による殺傷を相乗的に増強することを示す。矢印は、エフェクタ細胞と処理を与えた時点を示す。

【0048】

【図21】図２１は、Ｄ２ＡＰ１１－ＢＴＥは卵巣がん細胞においてペムブロリズマブ（抗ＰＤ１抗体）による殺傷を相乗的に増強することを示す。矢印は、エフェクタ細胞と処理を与えた時点を示す。

【0049】

【図22-1】図２２は、Ｄ２ＡＰ１１－ＢＴＥは卵巣がん細胞において抗ＣＴＬＡ４抗体による殺傷を相乗的に増強することを示す。矢印は、エフェクタ細胞と処理を与えた時点を示す。

【0050】

【図22-2】図２２は、Ｄ２ＡＰ１１－ＢＴＥは卵巣がん細胞において抗ＣＴＬＡ４抗体による殺傷を相乗的に増強することを示す。矢印は、エフェクタ細胞と処理を与えた時点を示す。

【0051】

【図23】図２３は、９ｈ１１（Ｄ２ＡＰ１１）抗体配列に基づいて開発されたＣＡＲ Ｔ細胞を示すダイヤグラムを示す。

【発明を実施するための形態】

【0052】

本発明は、二重特異性免疫細胞誘引抗体（ＢＩＣＥ）、二重特異性Ｔ細胞誘引（ＢｉＴＥ）抗体、ｓｃＦｖ抗体断片、およびＣＡＲ分子、その断片、そのバリアント、その組み合わせを含むＦＳＨＲ特異性結合分子と、それをコードする核酸分子を含む組成物に関する。

【0053】

一実施形態では、ＢＩＣＥまたはＢｉＴＥは、少なくとも１つの抗原結合ドメインと、少なくとも１つの免疫細胞誘引ドメインを含む。一実施形態では、免疫細胞誘引ドメインは、免疫細胞の表面に発現した抗原に対して特異的である。免疫細胞の非限定的な例に含まれるのは、Ｔ細胞、抗原提示細胞、ＮＫ細胞、好中球、およびマクロファージである。

【0054】

さまざまな実施形態では、免疫細胞誘引ドメインは、免疫細胞特異的受容体分子への結合に関して特異的な抗体、その断片、またはそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、免疫細胞特異的受容体分子はＴ細胞表面抗原である。一実施形態では、Ｔ細胞特異的受容体分子は、ＣＤ３、ＴＣＲ、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、Ｏｘ４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ４０、ＦｃｇＲ、ＦｃｅＲ、ＦｃａＲ、およびＣＤ９５の１つである。

【0055】

さまざまな実施形態では、抗原結合ドメインは、抗原への結合に関して特異的な抗体，またはその断片、またはそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、抗体またはその断片は、ＤＮＡがコードするモノクローナル抗体（ＤＭＡｂ）、またはその断片またはバリアントである。一実施形態では、抗体またはその断片は、ｍＲＮＡがコードするモノクローナル抗体、またはその断片またはバリアントである。

【0056】

一実施形態では、ＢＩＣＥまたはＢｉＴＥの抗原結合ドメインは、標的抗原の結合と、標的抗原へのＴ細胞のリクルートに関して特異的である。一実施形態では、標的抗原は腫瘍抗原である。一実施形態では、抗原卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）。したがって一実施形態では、本発明により、１つ以上のＢＩＣＥまたはＢｉＴＥを含む組成物と、対象のがん、またはがんに関係する疾患または障害の治療または予防に利用する方法が提供される。

【0057】

一実施形態では、本発明は、ＦＳＨＲに対する結合に関して特異的な抗原結合ドメインを含むＣＡＲ分子を発現しているＣＡＲ Ｔ細胞に関する。いくつかの実施形態では、ＦＳＨＲ結合ドメインは、ＦＳＨＲに対する結合に関して特異的なｓｃＦｖ抗体断片を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３に示されている配列を含む。一実施形態では、本発明のＣＡＲ分子は、ＣＤ２８および／または４－１ＢＢドメインによる共刺激と、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインによる活性化の両方を提供する。本明細書に開示されている実施形態では、ＣＡＲは、配列番号４、配列番号５、または配列番号６に示されている配列、またはその断片またはバリアントを含む。

【0058】

定義

【0059】

特に断わらない限り、本明細書で用いられているあらゆる科学技術用語は、当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を持つ。矛盾がある場合には、本文書が、定義を含めて優先する。好ましい方法と材料が下に記載されているが、本明細書に記載されているのと類似または同等の方法と材料を本発明の実践または試験で利用することができる。本明細書で言及されているあらゆる刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照によって組み込まれている。本明細書に開示されている材料、方法、および実施例は説明だけを目的としており、制限する意図はない。

【0060】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する」、「持つ」、「できる」、「含有する」という用語、およびこれらの変化形は、本明細書では、その前とその後をつないでいて列挙する数に制限のない句、用語、または単語であり、追加の操作または構造の可能性を排除しない。単数形「１つの」、「および」、および「その」は、文脈が明らかに別のことを述べているのでない限り、複数形を含む。本開示では、本明細書に示されている実施形態またはエレメントを「含む」、それ「からなる」、および「主に」それ「からなる」他の実施形態も、明示的に示されているかどうかに関係なく考慮する。

【0061】

「抗体」は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥの抗体または断片、これらの断片または誘導体（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、および一本鎖抗体と、これらの誘導体が含まれる）を意味することができる。抗体として、哺乳類の血清サンプルから単離された抗体、ポリクローナル抗体、アフィニティ精製された抗体で、望むエピトープまたはそれに由来する配列に対して十分な結合特異性を示すもの、またはこれらの混合物が可能である。

【0062】

「抗体断片」または「抗体の断片」は、本明細書では交換可能に使用され、インタクトな抗体のうちで抗原結合部位または可変領域を含む部分を意味する。この部分は、インタクトな抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（すなわち抗体アイソタイプに応じてＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４）を含まない。抗体断片の非限定的な例に含まれるのは、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’－ＳＨ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ディアボディ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、１つの軽鎖可変ドメインだけを含有する一本鎖ポリペプチド、軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有する一本鎖ポリペプチド、１つの重鎖可変領域だけを含有する一本鎖ポリペプチド、および重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有する一本鎖ポリペプチドである。

【0063】

「抗原」は、宿主の体内で免疫応答を生じさせる能力を持つタンパク質を意味する。 抗原は、抗体が認識して結合することができる。抗原は、体内または外部環境に由来することができる。

【0064】

「コード配列」または「コード核酸」は、本明細書では、本明細書に記載されている抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子）を意味することができる。コード配列は、調節エレメント（核酸が投与される個人または哺乳類の細胞の中で発現を指示することのできるプロモータとポリアデニル化シグナルが含まれる）に機能可能に連結された開始と終結のシグナルをさらに含むことができる。コード配列は、シグナルペプチドをコードする配列をさらに含むことができる。

【0065】

「相補体」または「相補的」は、本明細書では、核酸を意味することができるは、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の間のワトソン－クリック（例えばＡ－Ｔ／ＵとＣ－Ｇ）対形成またはフーグスティーン型塩基対形成を意味することができる。

【0066】

「内在性抗体」は、本明細書では、液性免疫応答を誘導するために有効な用量の抗原を投与された対象の体内で生成する抗体を意味することができる。

【0067】

「フィードバック機構」は、本明細書では、ソフトウエアまたはハードウエア（またはファームウエア）によって実行されるプロセスを意味することができ、このプロセスは、（エネルギーのパルスを送達する前、間、および／または後に）望む組織のインピーダンスを受け取って現在の値（好ましくは電流）と比較した後、設定値を実現するために送られるエネルギーのパルスを調節する。フィードバック機構はアナログ式閉ループ回路によって実現できる。

【0068】

「断片」は、抗体のポリペプチド断片であって、機能であるもの、すなわち望む標的に結合できて完全長抗体と同じ想定する効果を持つことができるものを意味することができる。抗体の断片は、Ｎ末端および／またはＣ末端から、それぞれの場合にシグナルペプチドおよび／または１位のメチオニンあり、またはなしの状態で少なくとも１個のアミノ酸が失われていることを除き、完全長と１００％一致していることが可能である。断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除き、その特定の完全長抗体の長さの２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含むことができる。その断片は、抗体と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上が同じであるポリペプチドの断片を含むことに加え、パーセント一致を計算するときには含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドを追加して含むことができる。断片は、Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチド（免疫グロブリンシグナルペプチドなど、例えばＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチド）をさらに含むことができる。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドは抗体の断片に連結させることができる。

【0069】

抗体をコードする核酸配列の断片は、５’および／または３’末端から、それぞれの場合にシグナルペプチドおよび／または１位のメチオニンあり、またはなしの状態で少なくとも１個のヌクレオチドが失われていることを除き、全長が１００％一致することが可能である。断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除き、その特定の完全長コード配列の長さの２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含むことができる。その断片は、抗体と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上が同じであるポリペプチドをコードする断片を含むことに加え、場合により、パーセント一致を計算するときに含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをコードする配列を含むことができる。断片は、Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチド（免疫グロブリンシグナルペプチドなどであり、例えばＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチド）のコード配列をさらに含むことができる。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドをコードするコード配列はコード配列の断片に連結させることができる。

【0070】

「遺伝子コンストラクト」は、本明細書では、タンパク質（抗体など）をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を意味する。コード配列は、調節エレメント（核酸分子が投与される個体の細胞における発現を指示することのできるプロモータとポリアデニル化シグナルが含まれる）に機能可能に連結された開始と終結のシグナルを含む。本明細書では、「発現可能形態」という用語は、タンパク質をコードするコード配列に機能可能に連結された必要な調節エレメントを含有する遺伝子コンストラクトを意味し、個体の細胞内に存在するとき、そのコード配列が発現する。

【0071】

本明細書において２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈で用いられる「同じ」または「一致」は、配列が、指定された領域全体で、指定された割合の同じ残基を持つことを意味する。割合の計算は、２つの配列を最適にアラインメントさせ、その２つの配列を指定された領域全体で比較し、両方の配列で同じ残基になる位置の数を明らかにして一致した位置の数を取得し、一致した位置の数を、指定された領域内の位置の総数で割り、その結果を１００倍することによって実現でき、その結果として配列一致の割合が得られる。２つの配列の長さが異なっていて、すなわちアラインメントによって端部に１つ以上のずれが生じて、比較する指定された領域に１つの配列しか含まれない場合には、その１つだけの配列の残基は計算の分母に含まれるが、分子には含まれない。ＤＮＡとＲＮＡを比較するとき、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は同等であると見なすことができる。一致は、手作業で、またはコンピュータ配列アルゴリズム（ＢＬＡＳＴやＢＬＡＳＴ ２．０など）を用いて実施することができる。

【0072】

「インピーダンス」は、本明細書では、フィードバック機構を議論するときに用いることができ、オームの法則に従って電流値に変換できるため、設定電流と比較することが可能である。

【0073】

「免疫応答」は、本明細書では、１つ以上の核酸および／またはペプチドの導入に応答した宿主（例えば哺乳類）の免疫系の活性化を意味することができる。免疫応答は、細胞応答または液性応答、または両方の形態が可能である。

【0074】

「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、本明細書では、互いに共有結合された少なくとも２つのヌクレオチドを意味することができる。一本鎖の描写は相補鎖の配列も規定する。したがって核酸は、描写された一本鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くのバリアントを所与の核酸と同じ目的で用いることができる。したがって核酸は、実質的に同じ核酸とその相補体も包含する。一本鎖は、厳しいハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズできるプローブを提供する。したがって核酸は、厳しいハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。

【0075】

核酸は、一本鎖または二本鎖であること、または二本鎖と一本鎖両方の配列の一部を含有することができる。核酸として、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの両方）、ＲＮＡ、またはハイブリッドが可能であり、その核酸は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの組み合わせと、塩基（ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンが含まれる）の組み合わせを含有することができる。核酸は化学合成法または組み換え法によって取得できる。

【0076】

「機能可能に連結された」は、本明細書では、遺伝子の発現が、それと空間的に接続されたプロモータの制御下にあることを意味することができる。プロモータは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置させることができる。プロモータとある遺伝子の間の距離は、プロモータの出所であるその遺伝子内で、そのプロモータと、このプロモータが制御する遺伝子の間の距離とほぼ同じにすることができる。本分野で知られているように、この距離は、プロモータ機能の喪失なしに調節して変化させることができる。

【0077】

「ペプチド」、「タンパク質」、または「ポリペプチド」は、本明細書では、アミノ酸が連結された配列を意味することができ、天然、合成、または天然と合成の修飾または組み合わせが可能である。

【0078】

「プロモータ」は、本明細書では、細胞における核酸の発現を与える、活性化させる、または増強することのできる合成または天然由来の分子を意味することができる。プロモータは、核酸の発現をさらに増強するため、および／または空間的発現および／または時間的発現を変化させるため、１つ以上の特異的転写調節配列を含むことができる。プロモータは遠位エンハンサエレメントまたは遠位リプレッサエレメントも含むことができ、これは転写開始部位から数千塩基を対離して位置させることができる。プロモータは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む供給源に由来することができる。プロモータは、遺伝子構成要素の発現を構成的に調節すること、または発現が起こる細胞、組織、または臓器に関して、または発現が起こる発生段階に関して異なるように調節すること、または外部刺激（生理学的ストレス、病原体、金属イオン、または誘導剤など）に応答して調節することができる。プロモータの代表例に含まれるのは、バクテリオファージＴ７プロモータ、バクテリオファージＴ３プロモータ、ＳＰ６プロモータ、ｌａｃオペレータ－プロモータ、ｔａｃプロモータ、ＳＶ４０後期プロモータ、ＳＶ４０初期プロモータ、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモータ、ＣＭＶ ＩＥプロモータ、ＳＶ４０初期プロモータ、またはＳＶ４０後期プロモータ、およびＣＭＶ ＩＥプロモータである。

【0079】

「シグナルペプチド」と「リーダー配列」は本明細書では交換可能に使用され、本明細書に示されているタンパク質のアミノ末端に連結させることのできるアミノ酸配列を意味する。シグナルペプチド／リーダー配列は典型的にはタンパク質の局在化を指示する。本明細書で使用されるシグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質が産生される細胞からのそのタンパク質の分泌を容易にすることが好ましい。シグナルペプチド／リーダー配列は、細胞から分泌されるときにしばしばタンパク質の残部（成熟タンパク質と呼ばれる）から切断される。シグナルペプチド／リーダー配列はタンパク質のＮ末端に連結される。

【0080】

「厳しいハイブリダイゼーション条件」は、本明細書では、核酸の複合混合物の中などで第１の核酸配列（例えばプローブ）が第２の核酸配列（例えば標的）にハイブリダイズする条件を意味することができる。厳しい条件は配列に依存しており、異なる環境では異なることになる。厳しい条件は、規定されたイオン強度ｐＨで特定の配列の融点（Ｔ_ｍ）よりも約５～１０℃低くなるように選択することができる。Ｔ_ｍとして、（規定されたイオン強度、ｐＨ、および核濃度のもとで）平衡状態において標的と相補的であるプローブの５０％が標的配列にハイブリダイズする温度が可能である（標的配列が過剰に存在するとき、Ｔ_ｍでプローブの５０％が占有される）。厳しい条件として、ｐＨ７．０～８．３で塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン（約０．０１～１．０Ｍのナトリウム（または他の塩）のイオン濃度など）であり、短いプローブ（例えば約１０～５０個のヌクレオチド）については温度が少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば約５０個超のヌクレオチド）については少なくとも約６０℃である条件が可能である。厳しい条件は、不安定化剤（ホルムアミドなど）の添加によって実現することもできる。選択的または特異的なハイブリダイゼーションのためには、陽性シグナルはバックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２～１０倍であることが可能である。代表的な厳しいハイブリダイゼーション条件に含まれるのは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳで４２℃でのインキュベーション、または５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで６５℃でのインキュベーションと、０．２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳの中での６５℃での洗浄という条件である。

【0081】

「対象」と「患者」は本明細書では交換可能であり、任意の脊椎動物を意味し、その非限定的な例に含まれるのは、哺乳類（例えばウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、およびマウス、非ヒト霊長類（例えばサルであり、カニクイザルまたはアカゲザル、チンパンジーなど）、および ヒト）である。いくつかの実施形態では、対象としてヒトまたは非ヒトが可能である。対象または患者は他の形態の治療中であってもよい。

【0082】

「実質的に相補的」は、本明細書では、第１の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個、またはそれよりも多い個数のヌクレオチドまたはアミノ酸の領域にわたって第２の配列の相補体と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％一致すること、またはそれら２つの配列が厳しいハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味することができる。

【0083】

「実質的に同じ」が、本明細書において、第１と第２の配列が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００個、またはそれよりも多い個数のヌクレオチドまたはアミノ酸の領域にわたって、または核酸に関して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であることを意味することができるのは、第１の配列が第２の配列の相補体と実質的に相補的である場合である。

【0084】

「合成抗体」は、本明細書では、本明細書に記載されている組み換え核酸配列によってコードされていて対象の中で生成する抗体を意味する。

【0085】

「治療」または「治療している」は、本明細書では、疾患から対象を、その疾患の予防、抑制、押さえ込み、または完全な排除の手段を通じて保護することを意味することができる。疾患の予防は、その疾患が発症する前に対象に本発明の抗体を投与することを含む。疾患の抑制は、疾患の誘導後だが、その疾患が臨床で出現する前に本発明の抗体を対象に投与することを含む。疾患の押さえ込みは、疾患が臨床で出現した後に本発明の抗体を対象に投与することを含む。

【0086】

核酸に関して本明細書で使用される「バリアント」が意味する可能性があるのは、（ｉ）参照ヌクレオチド配列の一部または断片；（ii）参照ヌクレオチド配列の相補体、またはその一部；（iii）参照核酸と実質的に同じ核酸、またはその相補体；または（iv）参照核酸、その相補体、またはそれらと実質的に同じ配列に厳しい条件下でハイブリダイズする核酸である。

【0087】

アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列は異なるが、少なくとも１つの生物活性を保持しているペプチドまたはポリペプチドに関する「バリアント」。バリアントは、少なくとも１つの生物活性を保持しているアミノ酸配列を持つ参照タンパク質と実質的に同じアミノ酸配列を持つタンパク質も意味することができる。アミノ酸の保存的置換、すなわち１個のアミノ酸を似た特性（例えば親水性、帯電領域の程度と分布）の異なるアミノ酸で置き換えることは、本分野では典型的にはわずかな変化を含むと認識されている。これらのわずかな変化は、本分野で理解されているように、アミノ酸のハイドロパシー指数を考慮することによって部分的に特定することができる。Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５７：１０５－１３２ （１９８２）。アミノ酸のハイドロパシー指数は、その疎水性と電荷を考慮することに基づく。ハイドロパシー指数が似たアミノ酸は置換してもタンパク質の機能が相変わらず保持されることが本分野で知られている。１つの側面では、±２のハイドロパシー指数を持つアミノ酸が置換される。生物学的機能を保持したタンパク質になると考えられる置換を明らかにするのにアミノ酸の親水性を利用することもできる。ペプチドの文脈においてアミノ酸の親水性を考慮すると、そのペプチドの最大の局所的平均親水性を計算することができる。これは、抗原性および免疫原性とよく相関することが報告されている１つの有用な指標である。アメリカ合衆国特許第４，５５４，１０１号（参照によって全体が本明細書に組み込まれている）。本分野で理解されているように、似た親水性値を持つアミノ酸の置換の結果、生物活性（例えば免疫原性）を保持したペプチドになることができる。置換は、互いに±２以内の親水性値を持つアミノ酸を用いて実行することができる。アミノ酸の疎水性指数と親水性値の両方が、そのアミノ酸の具体的な側鎖によって影響を受ける。この観察に合致して、生物学的機能の互換性があるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、および他の特性によって明らかにされるように、アミノ酸の相対的類似性、特にこれらアミノ酸の側鎖に依存すると理解されている。

【0088】

バリアントとして、全遺伝子配列またはその断片の全長にわたって実質的に同じ核酸配列が可能である。その核酸配列は、全遺伝子配列またはその断片の全長にわたって８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％一致する可能性がある。バリアントとして、アミノ酸配列またはその断片の全長にわたって実質的に同じアミノ酸配列が可能である。そのアミノ酸配列は、アミノ酸配列またはその断片の全長にわたって８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％一致する可能性がある。

【0089】

「ベクター」は、本明細書では、複製起点を含有する核酸配列を意味することができる。ベクターとして、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体が可能である。ベクターとしてＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターが可能である。ベクターとして、自己複製する染色体外ベクター、または宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかが可能である。

【0090】

本明細書における数値範囲の記載について、その中に同程度の精度で入るそれぞれの数が明示的に考慮される。例えば６～９の範囲については、数字７と８が６と９に加えて考慮され、６．０～７．０の範囲については、数６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０が明示的に考慮される。

【0091】

組成物

【0092】

一実施形態では、本発明は、二重特異性免疫細胞エンゲージャ（すなわちＢＩＣＥ）または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（すなわちＢｉＴＥ）、その断片、そのバリアント、またはその組み合わせを含む組成物に関する。組成物は、それを必要とする対象に投与されたとき、対象の体内で合成二重特異性免疫細胞エンゲージャを生成させる結果を生じさせることができる。いくつかの実施形態では、本発明のＢＩＣＥまたはＢｉＴＥは核酸モレキュー（例えばＤＮＡまたはｍＲＮＡ）によってコードされる。したがっていくつかの実施形態では、本発明はＢＩＣＥまたはＢｉＴＥをコードする核酸分子に関する。

【0093】

一実施形態では、ＢＩＣＥまたはＢｉＴＥは、少なくとも１つの抗原結合ドメインと少なくとも１つの免疫細胞誘引ドメインを含む。一実施形態では、免疫細胞誘引ドメインは、免疫細胞の表面に発現した抗原に対して特異的である。免疫細胞の非限定的な例に含まれるのは、Ｔ細胞、抗原提示細胞、ＮＫ細胞、好中球、およびマクロファージである。

【0094】

さまざまな実施形態では、免疫細胞誘引ドメインは、免疫細胞特異的受容体分子への結合に関して特異的な抗体、その断片をコードするヌクレオチド配列、またはそのバリアントを含む。一実施形態では、免疫細胞特異的受容体分子はＴ細胞表面抗原である。一実施形態では、Ｔ細胞特異的受容体分子は、ＣＤ３、ＴＣＲ、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、Ｏｘ４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ４０、ＦｃｇＲ、ＦｃｅＲ、ＦｃａＲ、およびＣＤ９５の１つである。

【0095】

いくつかの実施形態では、本発明により、抗原結合ドメインと免疫細胞活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子が提供される。いくつかの実施形態では、免疫細胞活性化ドメインは、共刺激分子（例えばＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、Ｏｘ４０など）からの少なくとも１つの細胞内ドメインを含む。

【0096】

さまざまな実施形態では、抗原結合ドメインは、抗原への結合に関して特異的な抗体、その断片（例えばｓｃＦｖ断片）、またはそのバリアントを含む。一実施形態では、抗原は腫瘍抗原である。一実施形態では、抗原は卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）である。

【0097】

一実施形態では、ＦＳＨＲ－ＢｉＴＥは、配列番号２のアミノ酸配列、またはその断片またはバリアントを含む。

【0098】

さまざまな実施形態では、抗原結合ドメインはＦＳＨＲに対して特異的なｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ分子は配列番号３に示されているアミノ酸配列を含む。

【0099】

ある実施形態では、組成物は、ＦＳＨＲ発現と関係する疾患または障害を治療、予防すること、およびまたは／その疾患または障害から保護することができる。ある実施形態では、組成物は、ＦＳＨＲ発現と関係するがんを治療、予防すること、およびまたは／そのがんから保護することができる。

【0100】

本発明の合成抗体（例えばｓｃＦｖ抗体断片、ＢＩＣＥ、またはＢｉＴＥ）またはＣＡＲ分子は、組成物を投与された対象の疾患を治療、予防すること、および／または、その疾患から保護することができる。本発明の合成抗体（例えばｓｃＦｖ抗体断片、ＢＩＣＥ、またはＢｉＴＥ）またはＣＡＲ分子は、組成物を投与された対象の疾患の生存を促進することができる。合成抗体（例えばｓｃＦｖ抗体断片、ＢＩＣＥ、またはＢｉＴＥ）またはＣＡＲ分子は、組成物を投与された対象において疾患の少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の生存率を提供することができる。他の実施形態では、合成抗体（例えばｓｃＦｖ抗体断片、ＢＩＣＥ、またはＢｉＴＥ）またはＣＡＲ分子は、組成物を投与された対象において疾患の少なくとも約６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、または８０％の生存率を提供することができる。

【0101】

組成物は、対象に組成物を投与してから少なくとも約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、４５時間、５０時間、または６０時間以内に、その対象で合成抗体（例えばｓｃＦｖ抗体断片、ＢＩＣＥ、またはＢｉＴＥ）またはＣＡＲ分子の生成という結果を生じさせることができる。組成物は、対象に組成物を投与してから少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、または１０日以内に、その対象で合成抗体（例えばｓｃＦｖ抗体断片、ＢＩＣＥ、またはＢｉＴＥ）またはＣＡＲ分子の生成という結果を生じさせることができる。組成物は、対象に組成物を投与してから約１時間～約６日間、約１時間～約５日間、約１時間～約４日間、約１時間～約３日間、約１時間～約２日間、約１時間～約１日間、約１時間～約７２時間、約１時間～約６０時間、約１時間～約４８時間、約１時間～約３６時間、約１時間～約２４時間、約１時間～約１２時間、または約１時間～約６時間以内に、その対象で合成抗体（例えばｓｃＦｖ抗体断片、ＢＩＣＥ、またはＢｉＴＥ）またはＣＡＲ分子の生成という結果を生じさせることができる。

【0102】

組成物は、それを必要とする対象に投与されたとき、その対象において、液性免疫応答を誘導するために抗原を投与される対象で内在性抗体が生成するよりも迅速な合成抗体（例えばｓｃＦｖ抗体断片、ＢＩＣＥ、またはＢｉＴＥ）またはＣＡＲ分子の生成という結果を生じさせることができる。組成物は、液性免疫応答を誘導するために抗原を投与された対象で内在性抗体が生成する少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、または１０日前に、合成抗体（例えばｓｃＦｖ抗体断片、ＢＩＣＥ、またはＢｉＴＥ）またはＣＡＲ分子の生成という結果を生じさせることができる。

【0103】

本発明の組成物は、有効な組成物に必要とされる特徴を持つことができる。その特徴とは、安全であるため組成物によって病気または死が生じることがないこと；病気から保護すること；および投与が容易で、副作用がほとんどなく、生物学的に安定で、投与１回当たりのコストが低いことなどである。

【0104】

抗体

【0105】

いくつかの実施形態では、本発明は、抗体、その断片、そのバリアント、またはその組み合わせに関する。抗体は、抗原と結合または反応することができる。これについては下により詳しく記載する。いくつかの実施形態では、断片はｓｃＦｖ断片である。いくつかの実施形態では、抗体は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ）、その断片、またはそのバリアントである。

【0106】

いくつかの実施形態では、抗体は、重鎖と軽鎖の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含むことができ、それぞれ、重鎖と軽鎖のフレームワーク（「ＦＲ」）セットの間に配置されており、そのＦＲセットが、ＣＤＲのサポートを提供するとともに、ＣＤＲの互いの相対的な空間的関係を規定する。ＣＤＲセットは、重鎖または軽鎖のＶ領域の３つの超可変領域を含有することができる。重鎖または軽鎖のＮ末端から順番に、これらの領域はそれぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と表記される。抗原結合部位はしたがって、重鎖と軽鎖のＶ領域のそれぞれからのＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを含むことができる。

【0107】

タンパク質分解酵素パパインはＩｇＧ分子を優先的に切断していくつかの断片を生じさせ、そのうちの２つ（Ｆ（ａｂ）断片）は、それぞれインタクトな抗原結合部位を含む共有結合ヘテロ二量体を含む。酵素ペプシンはＩｇＧ分子を切断していくつかの断片（両方の抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）_２断片が含まれる）を提供することができる。したがって抗体としてＦａｂまたはＦ（ａｂ’）_２が可能である。Ｆａｂは重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドを含むことができる。Ｆａｂの重鎖ポリペプチドはＶＨ領域とＣＨ１領域を含むことができる。Ｆａｂの軽鎖はＶＬ領域とＣＬ領域を含むことができる。

【0108】

抗体として免疫グロブリン（Ｉｇ）が可能である。Ｉｇとして例えばＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＧが可能である。免疫グロブリンは重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドを含むことができる。重鎖免疫グロブリンのポリペプチドは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含むことができる。免疫グロブリンの軽鎖ポリペプチドはＶＬ領域とＣＬ領域を含むことができる。

【0109】

抗体としてポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が可能である。抗体として、キメラ抗体、一本鎖抗体、親和性成熟抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体が可能である。ヒト化抗体として、非ヒト種からの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域とを持っていて望む抗原に結合する非ヒト種からの抗体が可能である。

【0110】

抗体として、下により詳しく記述する二重特異性抗体が可能である。抗体として、やはり下により詳しく記述する二機能性抗体が可能である。

【0111】

抗体は対象の体内で半減期を持つことができる。いくつかの実施形態では、抗体は、対象の体内でその半減期を改変して延長または短縮することができる。そのような改変は下により詳しく記述されている。

【0112】

重鎖ポリペプチド

【0113】

本発明の結合分子は、重鎖ポリペプチド、その断片、そのバリアント、またはその組み合わせを含むことができる。重鎖ポリペプチドは、可変重鎖（ＶＨ）領域および／または少なくとも１つの定常重鎖（ＣＨ）領域を含むことができる。その少なくとも１つの定常重鎖領域は、定常重鎖領域１（ＣＨ１）、定常重鎖領域２（ＣＨ２）、および定常重鎖領域３（ＣＨ３）、および／またはヒンジ領域を含むことができる。

【0114】

いくつかの実施形態では、重鎖ポリペプチドはＶＨ領域とＣＨ１領域を含むことができる。他の実施形態では、重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含むことができる。

【0115】

重鎖ポリペプチドは相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含むことができる。ＣＤＲセットはＶＨ領域の３つの超可変領域を含有することができる。重鎖ポリペプチドのＮ末端から順番に、これらＣＤＲはそれぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と表記される。重鎖ポリペプチドのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は抗原の結合または認識に寄与することができる。

【0116】

軽鎖ポリペプチド

【0117】

本発明の結合分子は、軽鎖ポリペプチド、その断片、そのバリアント、またはその組み合わせを含むことができる。軽鎖ポリペプチドは可変軽鎖（ＶＬ）領域および／または 定常軽鎖（ＣＬ）領域を含むことができる。

【0118】

軽鎖ポリペプチドは相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含むことができる。ＣＤＲセットはＶＬ領域の３つの超可変領域を含有することができる。軽鎖ポリペプチドのＮ末端から順番に、これらＣＤＲはそれぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と表記される。軽鎖ポリペプチドのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は抗原の結合または認識に寄与することができる。

【0119】

リンカー配列

【0120】

本発明の本発明の結合分子は１つ以上のリンカー配列を含むことができる。リンカー配列は、本明細書に記載されている前記１つ以上の構成要素を空間的に分離または連結することができる。他の実施形態では、リンカー配列は、２つ以上のポリペプチドを空間的に分離または連結するアミノ酸配列を含むことができる。一実施形態では、リンカー配列はＧ４Ｓリンカー配列である。

【0121】

リーダー配列

【0122】

本発明の本発明の結合分子は１つ以上のリーダー配列を含むことができる。一実施形態では、リーダー配列はシグナルペプチドである。シグナルペプチドとして免疫グロブリン（Ｉｇ）シグナルペプチドが可能であり、その非限定的な例は例えばＩｇＧシグナルペプチドとＩｇＥシグナルペプチドである。

【0123】

ＳｃＦｖ抗体

【0124】

一実施形態では、本発明の結合分子はｓｃＦｖ抗体断片を含む。一実施形態では、ｓｃＦｖはＣＨ１領域とＣＬ領域がないＦａｂ断片に関する。したがって一実施形態では、ｓｃＦｖはＶＨとＶＬを含むＦａｂ断片に関する。一実施形態では、ｓｃＦｖはＶＨとＶＬの間にリンカーを含む。一実施形態では、ｓｃＦｖはＶＬとＶＨを含むＦａｂ断片に関する。一実施形態では、ｓｃＦｖはＶＬとＶＨの間にリンカーを含む。一実施形態では、ｓｃＦｖ断片はＳｃＦｖ－Ｆｃである。一実施形態では、ｓｃＦｖ－Ｆｃ断片は、ＶＨ、ＶＬ、およびＣＨ２領域とＣＨ３領域を含む。一実施形態では、ｓｃＦｖ－Ｆｃ断片はＶＨとＶＬの間にリンカーを含む。一実施形態では、本発明のＳｃＦｖ断片は、親抗体と比べて変化した発現、安定性、半減期、抗原結合、重鎖－軽鎖の対形成、組織侵入力、またはその組み合わせを持つ。

【0125】

一実施形態では、本発明のｓｃＦｖは、親抗体よりも発現が少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超多い。

【0126】

一実施形態では、本発明のｓｃＦｖ断片は、親抗体よりも抗原との結合が少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超強い。

【0127】

一実施形態では、本発明のｓｃＦｖ断片は、親抗体よりも半減期が少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超長い。

【0128】

一実施形態では、本発明のｓｃＦｖ断片は親抗体よりも安定性が少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超大きい。

【0129】

一実施形態では、本発明のｓｃＦｖ断片は親抗体よりも組織侵入力が少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超大きい。

【0130】

一実施形態では、本発明のｓｃＦｖ断片は親抗体よりも重鎖－軽鎖の対形成が少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超多い。

【0131】

二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ

【0132】

上に記載したように、本発明の結合分子として、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ）、その断片、そのバリアント、またはその組み合わせが可能である。ＢｉＴＥの抗原ターゲティングドメインは抗原と結合または反応することができる。これについては下により詳しく記載する。

【0133】

ＢｉＴＥの抗原ターゲティングドメインは、抗体、その断片、そのバリアント、またはその組み合わせを含むことができる。ＢｉＴＥの抗原ターゲティングドメインは、重鎖と軽鎖の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含むことができ、それぞれ、重鎖と軽鎖のフレームワーク（「ＦＲ」）セットの間に配置されており、そのＦＲセットが、ＣＤＲのサポートを提供するとともに、ＣＤＲの互いの相対的な空間的関係を規定する。ＣＤＲセットは重鎖または軽鎖のＶ領域の３つの超可変領域を含有することができる。重鎖または軽鎖のＮ末端から順番に、これらの領域はそれぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と表記される。１つの抗原結合ドメインはしたがって、重鎖と軽鎖のＶ領域のそれぞれからのＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを含むことができる。

【0134】

タンパク質分解酵素パパインはＩｇＧ分子を優先的に切断していくつかの断片を生じさせ、そのうちの２つ（Ｆ（ａｂ）断片）のそれぞれは、インタクトな抗原結合部位を含む共有結合ヘテロ二量体を含む。酵素ペプシンはＩｇＧ分子を切断していくつかの断片を提供することができ、その中に含まれるＦ（ａｂ’）_２断片は両方の抗原結合部位を含む。したがってＢｉＴＥの抗原ターゲティングドメインとしてＦａｂまたはＦ（ａｂ’）_２が可能である。Ｆａｂは重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドを含むことができる。Ｆａｂの重鎖ポリペプチドはＶＨ領域とＣＨ１領域を含むことができる。Ｆａｂの軽鎖はＶＬ領域とＣＬ領域を含むことができる。

【0135】

ＢｉＴＥの抗原ターゲティングドメインとして免疫グロブリン（Ｉｇ）が可能である。Ｉｇとして例えばＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＧが可能である。免疫グロブリンは重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドを含むことができる。免疫グロブリンの重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含むことができる。免疫グロブリンの軽鎖ポリペプチドはＶＬ領域とＣＬ領域を含むことができる。

【0136】

ＢｉＴＥの抗原ターゲティングドメインとしてポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が可能である。抗体として、キメラ抗体、一本鎖抗体、親和性成熟抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体が可能である。ヒト化抗体として、非ヒト種からの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を持っていて望む抗原に結合する非ヒト種からの抗体が可能である。

【0137】

いくつかの実施形態では、本発明はＢｉＴＥをコードする核酸分子（例えばＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を含む。

【0138】

一実施形態では、本発明のＢｉＴＥの抗原結合ドメインと免疫細胞誘引ドメインの少なくとも１つは、上に詳細に記述したｓｃＦｖ抗体断片である。

【0139】

二重特異性抗体

【0140】

本発明の二重特異性Ｔ細胞エンゲージャとして、二重特異性抗体、その断片、そのバリアント、またはその組み合わせが可能である。二重特異性抗体は、２つの抗原（例えば下により詳しく記述する抗原の２つ）と結合または反応することができる。二重特異性抗体は、本明細書に記載されている抗体の２つの断片からなることができ、そのことによって二重特異性抗体は望む２つの標的分子と結合または反応することが可能になる。望む標的分子に含めることができるのは、抗原（下により詳しく記述する）、リガンド（受容体のためのリガンドが含まれる）、受容体（この受容体の表面のリガンド結合部位が含まれる）、リガンド－受容体複合体、およびマーカーである。

【0141】

本発明により、第１の標的に特異的に結合する第１の抗原結合部位と、第２の標的に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含んでいて、特に有利な特性（生産性、安定性、結合親和性、生物活性、あるＴ細胞を特異的に標的とすること、ターゲティング効率、および低下した毒性など）を持つ新規な二重特異性抗体が提供される。いくつかの場合には、第１の標的に高親和性で、第２の標的に低親和性で結合する二重特異性抗体が存在する。他の場合には、第１の標的に低親和性で、第２の標的に高親和性で結合する二重特異性抗体が存在する。他の場合には、第１の標的に望む親和性で、第２の標的に望む親和性で結合する二重特異性抗体が存在する。

【0142】

一実施形態では、二重特異性抗体は、ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖と第１の重鎖、およびｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖と第２の重鎖を含む２価抗体である。

【0143】

本発明による二重特異性抗体分子は、望む特異性が任意である２つの結合部位を持つことができる。いくつかの実施形態では、結合部位の１つは腫瘍抗原が可能である。いくつかの実施形態では、Ｆａｂ断片に含まれる結合部位は、腫瘍抗原に対して特異的な結合部位である。いくつかの実施形態では、一本鎖Ｆｖ断片に含まれる結合部位は、ＦＳＨＲ腫瘍抗原に対して特異的な結合部位である。

【0144】

いくつかの実施形態では、本発明による抗体分子の結合部位の１つは、Ｔ細胞特異的受容体分子および／またはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）特異的受容体分子に結合することができる。Ｔ細胞特異的受容体はいわゆる「Ｔ細胞受容体」（ＴＣＲ）であり、それが、抗原提示細胞またはＡＰＣと呼ばれる別の細胞によって提示されるエピトープ／抗原にＴ細胞が結合すること、そして追加シグナルが存在する場合には、ＡＰＣによってＴ細胞が活性化されること、およびＴ細胞がＡＰＣに応答することを可能にする。Ｔ細胞受容体は天然の免疫グロブリンのＦａｂ断片に似ていることが知られている。それは一般に１価であってアルファ鎖とベータ鎖を包含し、いくつかの実施形態では、ガンマ鎖とデルタ鎖（上記）を包含する。したがっていくつかの実施形態では、ＴＣＲはＴＣＲ（アルファ／ベータ）であり、いくつかの実施形態ではＴＣＲ（ガンマ／デルタ）である。Ｔ細胞受容体はＣＤ３ Ｔ細胞共受容体と複合体を形成する。ＣＤ３はタンパク質複合体であり、４本の明確に異なる鎖からなる。哺乳類では、この複合体は、ＣＤ３ｙ鎖、ＣＤ３６鎖、および２つのＣＤ３Ｅ鎖を含有する。これらの鎖はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）として知られる分子およびζ鎖と会合してＴリンパ球の中で活性化シグナルを生成させる。そのためいくつかの実施形態では、Ｔ細胞特異的受容体はＣＤ３ Ｔ細胞共受容体である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞特異的受容体は、Ｔ細胞の表面でも発現するタンパク質であるＣＤ２８である。ＣＤ２８は、Ｔ細胞の活性化に必要な共刺激シグナルを提供することができる。ＣＤ２８は、Ｔ細胞の増殖と生存、サイトカインの産生、および２型ヘルパーＴの発達において重要な役割を果たしている。Ｔ細胞特異的受容体のさらなる一例はＣＤ１３４であり、Ｏｘ４０とも呼ばれる。ＣＤ１３４／ＯＸ４０は活性化の２４～７２時間後に発現しており、第２の共刺激分子を規定すると見なすことができる。Ｔ細胞受容体の別の一例は４－１ＢＢであり、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面の４－１ＢＢリガンドに結合できるため、そのことによってＴ細胞のための共刺激シグナルが生成する。Ｔ細胞の表面に主に見いだされる受容体の別の一例はＣＤ５であり、これはＢ細胞の表面にも低レベルで見いだされる。Ｔ細胞の機能を変化させる受容体のさらなる一例はＣＤ９５であり、Ｆａｓ受容体としても知られており、他の細胞の表面に発現したＦａｓリガンドによってアポトーシスシグナル伝達を媒介する。ＣＤ９５は、休止しているＴリンパ球においてＴＣＲ／ＣＤ３が駆動するシグナル伝達経路を変化させることが報告されている。

【0145】

ＮＫ細胞特異的受容体分子の一例は、低親和性Ｆｃ受容体であるであるＣＤ１６と、ＮＫＧ２Ｄである。Ｔ細胞とナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の両方の表面に存在する受容体分子の一例は、ＣＤ２と、ＣＤ２スーパーファミリーのさらなるメンバーである。ＣＤ２はＴ細胞とＮＫ細胞の表面で共刺激分子として機能することができる。

【0146】

いくつかの実施形態では、抗体分子の第１の結合部位は腫瘍抗原に結合し、第２の結合部位はＴ細胞特異的受容体分子および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞特異的受容体分子に結合する。

【0147】

いくつかの実施形態では、抗体分子の第１の結合部位はＦＳＨＲに結合し、第２の結合部位はＴ細胞特異的受容体分子および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞特異的受容体分子に結合する。いくつかの実施形態では、抗体分子の第１の結合部位はＦＳＨＲに結合し、第２の結合部位は、ＣＤ３、ＴＣＲ、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、Ｏｘ４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ４０、ＦｃｇＲ、ＦｃｅＲ、ＦｃａＲ、およびＣＤ９５の１つに結合する。いくつかの実施形態では、抗体分子の第１の結合部位はＦＳＨＲに結合し、第２の結合部位はＣＤ３に結合する。

【0148】

いくつかの実施形態では、抗体分子の第１の結合部位はＴ細胞特異的受容体分子および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞特異的受容体分子に結合し、第２の結合部位は腫瘍抗原に結合する。いくつかの実施形態では、抗体の第１の結合部位はＴ細胞特異的受容体分子および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞特異的受容体分子に結合し、第２の結合部位はＦＳＨＲに結合する。いくつかの実施形態では、抗体の第１の結合部位は、ＣＤ３、ＴＣＲ、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、Ｏｘ４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ４０、ＦｃｇＲ、ＦｃｅＲ、ＦｃａＲ、およびＣＤ９５の１つに結合し、第２の結合部位はＦＳＨＲに結合する。いくつかの実施形態では、抗体の第１の結合部位はＣＤ３に結合し、第２の結合部位はＦＳＨＲに結合する。

【0149】

一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、本明細書に記載されている１つ以上のｓｃＦｖ抗体断片を含むＢｉＴＥを含み、そのことによってＢｉＴＥが望む標的分子と結合または反応することが可能になる。

【0150】

一実施形態では、ＢｉＴＥは、標的疾患特異的抗原への結合に関して特異的な第１のｓｃＦｖを含み、Ｔ細胞特異的受容体分子への結合に関して特異的な第２のｓｃＦｖがそれに連結されている。連結は第１と第２のドメインを任意の順番で配置することができ、例えば一実施形態では、標的疾患特異的抗原への結合に関して特異的なｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列を、Ｔ細胞特異的受容体分子への結合に関して特異的なｓｃＦｖにとってＣ末端に向ける。別の一実施形態では、標的疾患特異的抗原への結合に関して特異的なｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列を、Ｔ細胞特異的受容体分子への結合に関して特異的なｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列にとってＮ末端に向ける。

【0151】

二機能性抗体

【0152】

二重特異性Ｔ細胞エンゲージャとして、二機能性抗体、その断片、そのバリアント、またはその組み合わせが可能である。二機能性抗体は下記の抗原と結合または反応することができる。二機能性抗体を改変し、抗原を認識してその抗原に結合することを超えた追加機能を抗体に与えることもできる。このような改変の非限定的な例に含めることができるのは、因子Ｈまたはその断片へのカップリングである。因子Ｈは補体活性化の可溶性調節因子であるため、補体依存性溶解（ＣＭＬ）を通じた免疫応答に寄与する可能性がある。

【0153】

抗体半減期の延長

【0154】

合成抗体（例えばｓｃＦｖ抗体断片、ＢＩＣＥ、またはＢｉＴＥ）を改変し、対象の体内での抗体の半減期を延長または短縮することができる。改変は、対象の血清中での抗体の半減期を延長または短縮することができる。

【0155】

改変は、抗体の定常領域に存在することができる。改変として、抗体の定常領域内の１つ以上のアミノ酸置換であって、その抗体の半減期を、その１つ以上のアミノ酸置換を含有しない抗体の半減期と比べて延長させるものが可能である。改変として、抗体のＣＨ２ドメイン内の１つ以上のアミノ酸置換であって、その抗体の半減期を、その１つ以上のアミノ酸置換を含有しない抗体の半減期と比べて延長させるものが可能である。

【0156】

いくつかの実施形態では、定常領域の中の前記１つ以上のアミノ酸置換に含めることができるのは、定常領域内のメチオニン残基からチロシン残基への置換、定常領域内のセリン残基からトレオニン残基への置換、定常領域内のトレオニン残基からグルタミン酸残基への置換、またはこれらの任意の組み合わせであり、そうすることによって抗体の半減期が延長する。

【0157】

他の実施形態では、定常領域の中の前記１つ以上のアミノ酸置換に含めることができるのは、ＣＨ２ドメイン内のメチオニン残基からチロシン残基への置換、ＣＨ２ドメイン内のセリン残基からトレオニン残基への置換、ＣＨ２ドメイン内のトレオニン残基からグルタミン酸残基への置換、またはこれらの任意の組み合わせであり、そうすることによって抗体の半減期が延長する。

【0158】

抗原

【0159】

一実施形態では、合成抗体（例えばｓｃＦｖ抗体断片、ＢＩＣＥ、またはＢｉＴＥ）またはＣＡＲ分子は、抗原、またはその断片またバリアントに向けられる。抗原として、核酸配列、アミノ酸配列、多糖、またはこれらの組み合わせが可能である。核酸配列として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、そのバリアント、その断片、またはその組み合わせが可能である。アミノ酸配列として、タンパク質、ペプチド、そのバリアント、その断片、またはその組み合わせが可能である。多糖として、核酸がコードする多糖が可能である。

【0160】

抗原として腫瘍抗原が可能である。抗原はがんの発達または進行のリスク増大と関係づけることができる。一実施形態では、抗原としてＦＳＨＲが可能である。

【0161】

一実施形態では、本発明の合成二重特異性免疫細胞エンゲージャは２つ以上の抗原を標的とする。一実施形態では、二重特異性抗体の少なくとも１つの抗原は腫瘍抗原である。一実施形態では、二重特異性抗体の少なくとも１つの抗原はＴ細胞活性化抗原である。

【0162】

腫瘍抗原

【0163】

本発明の合成抗体の抗原結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ抗体断片、ＢＩＣＥ、またはＢｉＴＥ）またはＣＡＲ分子は腫瘍抗原と相互作用することができる。本発明の文脈では、「腫瘍抗原」または「超増殖性障害抗原」、または「超増殖性障害に関係する抗原」は、特定の超増殖性障害（がんなど）に共通する抗原を意味する。

【0164】

本発明で言及する腫瘍抗原のタイプとして、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が可能である。ＴＳＡは腫瘍細胞に独自であり、体内の他の細胞の表面には生じない。ＴＡＡ抗原は腫瘍細胞に独自ではなく、抗原に対する免疫寛容の状態を誘導するのに失敗した条件下では正常な細胞の表面にも発現する。腫瘍表面での抗原の発現は、免疫系が抗原に応答する条件下で起こることができる。ＴＡＡとして、胚発生の間に免疫系が未熟で応答できないときに正常な細胞の表面に発現する抗原が可能である。あるいはＴＡＡとして、正常な細胞の表面には通常は極端に低レベルで存在するが、腫瘍細胞の表面ではそれよりもはるかに高いレベルで発現する抗原が可能である。

【0165】

本明細書で議論する抗原は、例として含まれているにすぎない。リストは網羅的であることを意図しておらず、当業者にはさらなる例が容易に明らかになろう。

【0166】

腫瘍抗原は、免疫応答、特にＴ細胞を媒介とする免疫応答を誘起する腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。本発明の抗原結合部分の選択は、治療する具体的なタイプのがんに依存するであろう。腫瘍抗原は本分野で周知であり、その中に含まれるのは、例えば神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡ IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２、サバイビンとテロメラーゼ、前立腺－癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－Ｉ受容体、およびメソテリンである。

【0167】

腫瘍関連表面抗原の代表例は、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ－３、ＣＤ１３５）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４、悪性黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＩＧＦＲ、ＣＤ１３３、ＩＬ３Ｒ、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＣＤＣＰ１、デルリン１、テネイシン、フリズルド１－１０、血管抗原ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／ＦＬＫ１）、ＶＥＧＦＲ３（ＦＬＴ４、ＣＤ３０９）、ＰＤＧＦＲ－α（ＣＤ１４０ａ）、ＰＤＧＦＲ－ベータ（ＣＤ１４０ｂ）エンドグリン、ＣＬＥＣ１４、Ｔｅｍｌ－８、およびＴｉｅ２である。さらなる例に含めることができるのは、Ａ３３、ＣＡＭＰＡＴＨ－１（ＣＤｗ５２）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、炭酸脱水酵素IX（ＭＮ／ＣＡIX）、ＣＤ２１、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ｄｅ２－７ ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖIII、ＥｐＣＡＭ、Ｅｐ－ＣＡＭ、葉酸結合タンパク質、Ｇ２５０、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ－３、ＣＤ１３５）、卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）、ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、ＣＳＦ１Ｒ（ＣＤ１１５）、ＨＬＡ－ＤＲ、ＩＧＦＲ、ＩＬ－２受容体、ＩＬ３Ｒ、ＭＣＳＰ（悪性黒色腫関連細胞表面コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、Ｍｕｃ－１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、およびＴＡＧ－７２である。腫瘍の細胞外マトリックスの表面に発現する抗原の例は、テナシンと線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。

【0168】

一実施形態では、腫瘍抗原は、特異的受容体を標的とするのに使用できるホルモンまたはその断片である。非限定的な例に含まれるのは、ＦＳＨホルモン、ＬＨホルモン、ＴＳＨホルモン、またはこれらの断片である。

【0169】

ＴＳＡ抗原またはＴＡＡ抗原の非限定的な例に含まれるのは、以下のもの、すなわち分化抗原（ＭＡＲＴ－１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ－Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２など）と腫瘍特異的多系統抗原（ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ｐ１５など）；過剰発現した胚性抗原（ＣＥＡなど）；過剰発現したがん遺伝子と変異した腫瘍抑制遺伝子（５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕなど）；染色体転座から生じる独自の腫瘍抗原；ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲなど；およびウイルス抗原（エプスタイン・バールウイルス抗原ＥＢＶＡと、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７など）である。タンパク質に基づく他の大きな抗原に含まれるのは、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＲＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ－７２、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡＭ １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、ベータ－カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ１５、ｐ１６、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、アルファ－フェトプロテイン、ベータ－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０＼Ｍａｃ－２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、およびＴＰＳである。

【0170】

本発明の側面には、抗原に対する免疫応答の増強を必要とする対象で免疫応答を増強するための組成物が含まれ、その組成物は、対象で免疫応答を生じさせることのできる合成抗体（例えばｓｃＦｖ抗体断片、ＢＩＣＥ、またはＢｉＴＥ）またはＣＡＲ分子、またはその生物学的機能性断片またはバリアントを含む。いくつかの実施形態では、抗原はＦＳＨＲである。いくつかの実施形態では、本発明の合成抗体は、ＦＳＨＲを標的とするｓｃＦｖを含むＢｉＴＥである。

【0171】

Ｔ細胞特異的受容体

【0172】

一実施形態では、本発明のＢｉＴＥまたはＢＩＣＥはＴ細胞特異的受容体のｓｃＦｖを含む。Ｔ細胞特異的受容体の非限定的な例に含まれるのは、ＣＤ３、ＴＣＲ、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、Ｏｘ４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ４０、ＦｃｇＲ、ＦｃｅＲ、ＦｃａＲ、およびＣＤ９５である

【0173】

ＣＡＲ分子

【0174】

一実施形態では、本発明により、抗原結合ドメインとＴ細胞活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供される。一実施形態では、抗原結合ドメインはターゲティングドメインであり、そのターゲティングドメインは、ＣＡＲを発現している細胞を、抗原を発現している細胞または粒子に向かわせる。一実施形態では、抗原はＦＳＨＲである。

【0175】

さまざまな実施形態では、ＣＡＲとして、「第１世代」、「第２世代」、「第３世代」、「第４世代」、または「第５世代」のＣＡＲが可能である（例えばＳａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ． ３（４）：３８８－３９８ （２０１３）；Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． ２５７：１２７－１３３ （２０１４）；Ｓｈａｒｐｅ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｓ． Ｍｏｄｅｌ Ｍｅｃｈ． ８（４）：３３７－３５０ （２０１５）；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １３：５４２６－５４３５ （２００７）；Ｇａｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６５：９０８０－９０８８ （２００５）；Ｍａｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０：７０－７５ （２００２）；Ｋｅｒｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７３：２１４３－２１５０ （２００４）；Ｓａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２００９）；Ｈｏｌｌｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ３２：１６９－１８０ （２００９）を参照されたい）。

【0176】

本発明で使用する「第１世代」ＣＡＲは、膜貫通ドメインに融合された抗原結合ドメイン（例えば一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ））を含み、その膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体鎖の細胞質／細胞内ドメインに融合されている。「第１世代」ＣＡＲは、典型的には、内在性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）からのシグナルの主要な伝達要素であるＣＤ３ζ鎖からの細胞内ドメインを持つ。「第１世代」ＣＡＲは新たな抗原認識を提供し、ＨＬＡを媒介とした抗原提示とは独立に、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を、単一の融合分子内のＣＤ３ζ鎖シグナル伝達ドメインを通じて活性化させることができる。

【0177】

本発明で使用する「第２世代」ＣＡＲは、Ｔ細胞を活性化させることのできる細胞内シグナル伝達ドメインに融合された抗原結合ドメイン（例えば一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ））と、Ｔ細胞の効力と持続性を増大させる設計にされた共刺激ドメインを含む（Ｓａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ． ３：３８８－３９８ （２０１３））。ＣＡＲの設計はしたがって抗原認識にシグナル伝達を組み合わせることができ、２つの機能が２つの別々の複合体、すなわちＴＣＲヘテロ二量体とＣＤ３複合体によって生理学的に担われる。「第２世代」ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞質尾部内にさまざまな共刺激分子（例えばＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０など）からの細胞内ドメインを含み、追加シグナルを細胞に提供する。

【0178】

「第２世代」ＣＡＲは、例えばＣＤ２８または４－１ＢＢドメインによる共刺激と、例えばＣＤ３ζシグナル伝達ドメインによる活性化の両方を提供する。臨床前研究は、「第２世代」ＣＡＲがＴ細胞の抗腫瘍活性を改善できることを示した。例えば「第２世代」ＣＡＲで改変したＴ細胞のロバストな有効性が、慢性リンパ芽球性白血病（ＣＬＬ）と急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の患者でＣＤ１９分子を標的とする臨床試験において実証された（Ｄａｖｉｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌ． １（９）：１５７７－１５８３ （２０１２））。

【0179】

「第３世代」ＣＡＲは、例えばＣＤ２８と４－１ＢＢドメインの両方を含むことによる複数の共刺激と、例えばＣＤ３ζ活性化ドメインを含むことによる活性化を提供する。

【0180】

「第４世代」ＣＡＲは、例えばＣＤ２８または４－１ＢＢドメインによる共刺激と、例えば構成的または誘導性のケモカイン成分に加えてＣＤ３ζシグナル伝達ドメインによる活性化を提供する。

【0181】

「第５世代」ＣＡＲは、例えばＣＤ２８または４－１ＢＢドメインによる共刺激と、例えばＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、構成的または誘導性のケモカイン成分、およびサイトカイン受容体（例えばＩＬ－２Ｒβ）の細胞内ドメインによる活性化を提供する。

【0182】

さまざまな実施形態では、ＣＡＲは多価ＣＡＲ系（例えば二重ＣＡＲ系または「タンデムＣＡＲ」系）に含めることができる。多価ＣＡＲ系には、複数のＣＡＲを含む系または細胞と、２つ以上の抗原を標的とする２価／二重特異性ＣＡＲを含む系または細胞が含まれる。

【0183】

本明細書に開示されている実施形態では、ＣＡＲは一般に、上に記載したように抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む。特別な非限定的な一実施形態では、抗原結合ドメインは、ＦＳＨＲへの結合に関して特異的なＦＳＨＲ ｓｃＦｖ抗体断片またはそのバリアントである。いくつかの実施形態では、ＦＳＨＲ結合ドメインは配列番号３に示されている配列を含む。

【0184】

さまざまな実施形態では、本発明のＣＡＲ分子は、ＣＤ２８および／または４－１ＢＢドメインによる共刺激と、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインによる活性化の両方を提供する。

【0185】

本明細書に開示されている実施形態では、ＣＡＲは、配列番号４、配列番号５、または配列番号６に示されている配列、またはその断片またはバリアントを含む。

【0186】

基板

【0187】

一実施形態では、本発明により、二重特異性免疫細胞エンゲージャ、その断片、またはそれをコードする核酸分子を含む足場、基板、または装置が提供される。例えばいくつかの実施形態では、本発明により、組織を操作する足場（その非限定的な例に含まれるのは、ヒドロゲル、エレクトロスピニングによる足場、ポリマーマトリックスなどである）で前記モジュレータを含むものが提供される。ある実施形態では、足場、基板、または装置の表面に沿って二重特異性免疫細胞エンゲージャ、その断片、またはそれをコードする核酸分子で被覆することができる。ある実施形態では、二重特異性免疫細胞エンゲージャ、その断片、またはそれをコードする核酸分子は、足場、基板、または装置の中に封入される。

【0188】

組み換え核酸配列

【0189】

上に記載したように、組成物は組み換え核酸配列を含むことができる。組み換え核酸配列は、合成抗体（例えばｓｃＦｖ抗体断片、ＢＩＣＥ、またはＢｉＴＥ）またはＣＡＲ分子、その断片、そのバリアント、またはその組み合わせをコードすることができる。

【0190】

組み換え核酸配列として異種核酸配列が可能である。組み換え核酸配列は、少なくとも１つの異種核酸配列、または１つ以上の異種核酸配列を含むことができる。

【0191】

一実施形態では、ＦＳＨＲ－ＢｉＴＥをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド配列、またはその断片またはバリアントを含む。

【0192】

組み換え核酸配列として、最適化された核酸配列が可能である。そのような最適化は、抗体の免疫原性を増加または変化させることができる。最適化は、転写および／または翻訳を改善することもできる。最適化に含めることができるのは、以下の項目の１つ以上である：低ＧＣ含量のリーダー配列による転写の増加；ｍＲＮＡ安定性とコドン最適化；コザック配列（例えばＧＣＣ ＡＣＣ）の付加による翻訳の増加；シグナルペプチドをコードする免疫グロブリン（Ｉｇ）リーダー配列の付加；およびシス作用性配列モチーフ（すなわち内部ＴＡＴＡボックス）の可能な限りの除去。

【0193】

組み換え核酸配列は、１つ以上の組み換え核酸配列コンストラクトを含むことができる。組み換え核酸配列コンストラクトは１つ以上の構成要素を含むことができ、それについては下により詳しく記載する。

【0194】

組み換え核酸配列コンストラクトは、重鎖ポリペプチド、その断片、そのバリアント、またはその組み合わせをコードする異種核酸配列を含むことができる。組み換え核酸配列コンストラクトは、軽鎖ポリペプチド、その断片、そのバリアント、またはその組み合わせをコードする異種核酸配列を含むことができる。組み換え核酸配列コンストラクトは、プロテアーゼまたはペプチダーゼの切断部位をコードする異種核酸配列も含むことができる。組み換え核酸配列コンストラクトは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をコードする異種核酸配列も含むことができる。ＩＲＥＳとしてウイルスＩＲＥＳまたは真核生物ＩＲＥＳのいずれかが可能である。組み換え核酸配列コンストラクトは１つ以上のリーダー配列を含むことができ、その中の各リーダー配列はシグナルペプチドをコードしている。組み換え核酸配列コンストラクトは、１つ以上のプロモータ、１つ以上のイントロン、１つ以上の転写終結領域、１つ以上の開始コドン、１つ以上の終結または終止コドン、および／または１つ以上のポリアデニル化シグナルを含むことができる。組み換え核酸配列コンストラクトは、１つ以上のリンカーまたはタグ配列も含むことができる。タグ配列はヘマグルチニン（ＨＡ）タグをコードすることができる。

【0195】

プロモータ

【0196】

組み換え核酸配列コンストラクトは１つ以上のプロモータを含むことができる。その１つ以上のプロモータとして、遺伝子発現の駆動と遺伝子発現の調節が可能な任意のプロモータが可能である。このようなプロモータは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを通じた転写に必要なシス作用性配列エレメントである。遺伝子発現を指示するのに使用されるプロモータの選択は具体的な応用に依存する。プロモータは、組み換え核酸配列コンストラクトの中で、転写開始から、天然の設定における転写開始部位からとほぼ同じ距離に位置させることができる。しかしこの距離は、プロモータ機能の喪失なしに調節して変化させることができる。

【0197】

プロモータは、重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列に機能可能に連結させることができる。プロモータとして、真核細胞における発現に有効であることが示されているプロモータが可能である。コード配列に機能可能に連結されるプロモータとして、ＣＭＶプロモータ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）からのプロモータ（ＳＶ４０初期プロモータとＳＶ４０後期プロモータなど）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモータ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモータ（ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）プロモータなど）、モロニーウイルスプロモータ、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモータ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ（ＣＭＶ最初期プロモータなど）、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）プロモータ、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータが可能である。プロモータとして、ヒト遺伝子（ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、ヒトポリヘドリン、またはヒトメタロチオネインなど）からのプロモータも可能である。

【0198】

プロモータは構成的プロモータまたは誘導性プロモータが可能であり、宿主細胞がある特定の外部刺激に曝露されたときだけ転写を開始する。多細胞生物の場合には、プロモータは、特定の組織または臓器に対して、または発生の特定の段階に対して特異的であることも可能である。プロモータとして、組織特異的プロモータ（筋肉または皮膚に特異的な天然または合成のプロモータなど）も可能である。そのようなプロモータの例はアメリカ合衆国特許出願公開第２００４０１７５７２７号に記載されており、その内容は全体が本明細書に組み込まれている。

【0199】

プロモータはエンハンサと関連させることができる。エンハンサはコード配列の上流に位置することができる。エンハンサとして、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはウイルスエンハンサ（ＣＭＶ、ＦＭＤＶ、ＲＳＶ、またはＥＢＶからのものなど）が可能である。ポリヌクレオチド機能は増強するはアメリカ合衆国特許第５，５９３，９７２号、第５，９６２，４２８号、およびＷ０９４／０１６７３７に記載されており、それぞれの内容は参照によって完全に組み込まれている。

【0200】

転写終結領域

【0201】

組み換え核酸配列コンストラクトは１つ以上の転写終結領域を含むことができる。効率的な終結を提供するため、転写終結領域はコード配列の下流に存在することができる。転写終結領域は、上記のプロモータと同じ遺伝子から得ること、または１つ以上の異なる遺伝子から得ることができる。

【0202】

開始コドン

【0203】

組み換え核酸配列コンストラクトは１つ以上の開始コドンを含むことができる。開始コドンはコード配列の上流に位置させることができる。開始コドンはコード配列のフレーム内に存在することができる。開始コドンは、効率的な翻訳開始に必要な１つ以上のシグナルと関係させることができる（例えばその非限定的な例はリボソーム結合部位である）。

【0204】

終結コドン

【0205】

組み換え核酸配列コンストラクトは、１つ以上の終結または終止コドンを含むことができる。終結コドンはコード配列の下流に存在することができる。終結コドンはコード配列のフレーム内に存在することができる。終結コドンは、効率的な翻訳終結に必要な１つ以上のシグナルと関連させることができる。

【0206】

ポリアデニル化シグナル

【0207】

組み換え核酸配列コンストラクトは１つ以上のポリアデニル化シグナルを含むことができる。ポリアデニル化シグナルは、転写産物の効率的なポリアデニル化に必要な１つ以上のシグナルを含むことができる。ポリアデニル化シグナルはコード配列の下流に位置することができる。ポリアデニル化シグナルとして、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ－グロビンポリアデニル化シグナルが可能である。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルとして、ｐＣＥＰ４プラスミドからのポリアデニル化シグナルが可能である（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、サン・ディエゴ、カリフォルニア州）。

【0208】

プロテアーゼ切断部位

【0209】

組み換え核酸配列コンストラクトは、プロテアーゼ切断部位をコードする異種核酸配列を含むことができる。プロテアーゼ切断部位はプロテアーゼまたはペプチダーゼによる認識が可能である。プロテアーゼとしてエンドペプチダーゼまたはエンドプロテアーゼが可能であり、その非限定的な例は、フーリン、エラスターゼ、ＨｔｒＡ、カルパイン、トリプシン、キモトリプシン、トリプシン、およびペプシンである。プロテアーゼとしてフーリンが可能である。他の実施形態では、プロテアーゼとして、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、または内部ペプチド結合を切断する（すなわちＮ末端またはＣ末端のペプチド結合を切断しない）任意のプロテアーゼが可能である。

【0210】

プロテアーゼ切断部位は、切断を促進するか切断の効率を増大させる１つ以上のアミノ酸配列を含むことができる。その１つ以上のアミノ酸配列は、離散したポリペプチドの形成または生成を促進するか、その効率を増大させることができる。その１つ以上のアミノ酸配列は２Ａペプチド配列を含むことができる。

【0211】

ベクター

【0212】

上に記載した組み換え核酸配列コンストラクトは１つ以上のベクターの中に位置させることができる。前記１つ以上のベクターは複製起点を含有することができる。前記１つ以上のベクターとして、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体が可能である。前記１つ以上のベクターとして、自己複製染色体外ベクター、または宿主ゲノムに組み込まれるベクターが可能である。

【0213】

前記１つ以上のベクターとして異種発現コンストラクトが可能であり、それは一般に、特定の遺伝子を標的細胞に導入するのに使用されるプラスミドである。発現ベクターが細胞の中に入ると、組み換え核酸配列コンストラクによってコードされる重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドが、細胞転写・翻訳機構リボソーム複合体によって産生される。前記１つ以上のベクターは、大量の安定なメッセンジャーＲＮＡを、したがってタンパク質を発現することができる。

【0214】

発現ベクター

【0215】

前記１つ以上のベクターとして環状プラスミドまたは直線状核酸が可能である。環状プラスミドと直線状核酸は、適切な対象細胞の中で特定のヌクレオチド配列の発現を指示することができる。組み換え核酸配列コンストラクトを含む前記１つ以上のベクターはキメラであることが可能である。これは、ベクターの構成要素の少なくとも１つが、他の構成要素の少なくとも１つにとって異種であることを意味する。

【0216】

プラスミド

【0217】

前記１つ以上のベクターとしてプラスミドが可能である。プラスミドは細胞に組み換え核酸配列コンストラクトをトランスフェクトするのに有用である可能性がある。プラスミドは組み換え核酸配列コンストラクトを対象に導入するのに有用である可能性がある。プラスミドは、そのプラスミドが投与される細胞における遺伝子発現によく適している可能性のある調節配列も含むことができる。

【0218】

プラスミドは、染色体外でそのプラスミドを維持し、細胞内でそのプラスミドの多数のコピーを生成させるため、哺乳類複製起点も含むことができる。プラスミドとして、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（サン・ディエゴ、カリフォルニア州）からのｐＶＡＸ１、ｐＣＥＰ４、またはｐＲＥＰ４が可能であり、これらはエプスタイン・バールウイルスの複製起点と核抗原ＥＢＮＡ－１コード領域を含むことができるため、組み込まれることなく高コピー数のエピソーム複製を生じさせることができる。プラスミドの骨格としてｐＡＶ０２４２が可能である。プラスミドとして複製欠陥アデノウイルス５型（Ａｄ５）プラスミドが可能である。

【0219】

プラスミドとしてｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、サン・ディエゴ、カリフォルニア州）が可能であり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中でのタンパク質産生に使用できる。プラスミドとしてｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、サン・ディエゴ、カリフォルニア州）も可能であり、酵母のサッカロミセス・セレビジエ株の中でのタンパク質産生に使用できる。プラスミドとして、ＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、サン・ディエゴ、カリフォルニア州）のものも可能であり、昆虫細胞の中でのタンパク質産生に使用できる。プラスミドとしてｐｃＤＮＡＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、サン・ディエゴ、カリフォルニア州）も可能であり、哺乳類細胞（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞など）の中でのタンパク質産生に使用できる。

【0220】

ＲＮＡ

【0221】

一実施形態では、核酸はＲＮＡ分子である。一実施形態では、ＲＮＡ分子はＤＮＡ配列から転写される。したがって一実施形態では、本発明により、本発明の合成抗体の１つ以上をコードするＲＮＡ分子が提供される。ＲＮＡはプラス鎖が可能である。したがっていくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、いかなる複製工程（逆転写など）の介在もなしに細胞による翻訳が可能である。本発明で有用なＲＮＡ分子は５’キャップ（例えば７－メチルグアノシン）を持つことができる。このキャップはＲＮＡの生体内翻訳を増強することができる。本発明で有用なＲＮＡ分子の５’ヌクレオチドは５’三リン酸基を持つことができる。キャップ付きのＲＮＡでは、これは、５’から５’への架橋を通じて７－メチルグアノシンに連結させることができる。ＲＮＡ分子は３’ポリ－Ａ尾部を持つことができる。これは、その３’末端近傍にポリ－Ａポリメラーゼ認識配列（例えばＡＡＵＡＡＡ）も含むことができる。本発明で有用なＲＮＡ分子は一本鎖が可能である。本発明で有用なＲＮＡ分子は合成ＲＮＡを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は裸のＲＮＡ分子である。一実施形態では、ＲＮＡ分子はベクターの中に含まれる。

【0222】

一実施形態では、ＲＮＡは、５’ＵＴＲと３’ＵＴＲを持つ。一実施形態では、５’ＵＴＲはヌクレオチドの長さが０と３０００個の間である。コード領域に付加する５’と３’ＵＴＲ配列の長さはさまざまな方法（その非限定的な例に含まれるのは、ＵＴＲの異なる領域にアニールするＰＣＲ用プライマーの設計である）によって変えることができる。このアプローチを利用し、当業者は、転写されたＲＮＡをトランスフェクトした後の最適な翻訳効率を実現するのに必要な５’と３’ＵＴＲの長さを変えることができる。

【0223】

５’ ＵＴＲおよび３’ＵＴＲとして、興味ある遺伝子に関する天然の内在性５’ ＵＴＲと３’ＵＴＲが可能である。あるいは興味ある遺伝子にとって内在性ではないＵＴＲ配列は、ＵＴＲ配列を順プライマーと逆プライマーに組み込むことによって、または鋳型の他の任意の改変によって、付加することができる。興味ある遺伝子にとって内在性ではないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を変えるために有用である可能性がある。例えば３’ＵＴＲ配列の中のＡＵリッチなエレメントはＲＮＡの安定性を低下させる可能性があることが知られている。したがって３’ＵＴＲは、本分野で周知のＵＴＲの特性に基づき、転写されたＲＮＡの安定性を増大させるよう選択または設計することができる。

【0224】

一実施形態では、５’ＵＴＲは、内在性遺伝子のコザック配列を含有することができる。あるいは興味ある遺伝子にとって内在性ではない５’ＵＴＲが上記のようにＰＣＲによって付加されるとき、コンセンサスコザック配列は５’ＵＴＲ配列を付加することによって再設計することができる。コザック配列は、いくつかのＲＮＡ転写産物の翻訳の効率を増加させることができるが、効率的な翻訳を可能にするのに全ＲＮＡに必要とされるようには見えない。多くのＲＮＡにコザック配列が必要とされることが本分野で知られている。他の実施形態では、５’ＵＴＲは、ＲＮＡゲノムが細胞内で安定であるＲＮＡウイルスに由来することができる。他の実施形態では、さまざまなヌクレオチド類似体を３’ ＵＴＲまたは５’ ＵＴＲで用いてエキソヌクレアーゼによるＲＮＡの分解を妨げることができる。

【0225】

一実施形態では、ＲＮＡは５’末端のキャップと３’ポリ（Ａ）尾部の両方を持ち、これらが、細胞の中でのＲＮＡのリボソーム結合、翻訳開始、および安定性を決定する。

【0226】

一実施形態では、ＲＮＡはヌクレオシドが修飾されたＲＮＡである。ヌクレオシドが修飾されたＲＮＡは非修飾ＲＮＡと比べて特別な利点（例えば増大した安定性、低いか存在しない天然の免疫原性、および増強された翻訳が含まれる）を持つ。

【0227】

環状ベクターと直線状ベクター

【0228】

前記１つ以上のベクターとして環状プラスミドが可能であり、細胞ゲノムに組み込まれることによって標的細胞を形質転換すること、または染色体外に存在することができる（例えば複製起点を持つ自律的複製プラスミド）。ベクターとして、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、またはｐｒｏｖａｘ、または組み換え核酸配列コンストラクトによってコードされる重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドを発現させることのできる他の任意の発現ベクターが可能である。

【0229】

本明細書でやはり提供されるのは、対象に効率的に送達し、組み換え核酸配列コンストラクトによってコードされる重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドを発現させることのできる直線状核酸または直線状発現カセット（「ＬＥＣ」）である。ＬＥＣとして、あらゆるリン酸骨格を欠く任意の直線状ＤＮＡが可能である。ＬＥＣは、いかなる抗生剤抵抗性遺伝子および／またはリン酸骨格も含有していなくてよい。ＬＥＣは、望む遺伝子発現とは無関係な他の核酸配列を含有していなくてもよい。

【0230】

ＬＥＣは直線化が可能な任意のプラスミドに由来することができる。プラスミドは、組み換え核酸配列コンストラクトによってコードされる重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドを発現することができる。プラスミドとしてｐＮＰ（プエルト・リコ／３４）またはｐＭ２（ニュー・カレドニア／９９）が可能である。プラスミドとして、ＷＬＶ００９、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、またはｐｒｏｖａｘ、または組み換え核酸配列コンストラクトによってコードされる重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドを発現することのできる他の任意の発現ベクターが可能である。

【0231】

ＬＥＣとしてｐｃｒＭ２が可能である。ＬＥＣとしてｐｃｒＮＰが可能である。ｐｃｒＮＰとｐｃｒＭＲはそれぞれｐＮＰ（プエルト・リコ／３４）とｐＭ２（ニュー・カレドニア／９９）に由来することができる。

【0232】

ベクターを調製する方法

【0233】

本明細書で提供されるのは、組み換え核酸配列コンストラクトが配置された前記１つ以上のベクターを調製する方法である。最終サブクローニング工程の後、本分野で知られている方法を利用し、ベクターを用いて大規模な発酵タンクの中で細胞培養物に接種することができる。

【0234】

前記１つ以上のベクターは既知の装置と技術の組み合わせを利用して形成または作製することができるが、２００７年５月２３日に出願された同時係属中のライセンスされたアメリカ合衆国仮出願、すなわちアメリカ合衆国シリアル番号第６０／９３９，７９２号に記載されているプラスミド製造技術を利用して作製されることが好ましい。いくつかの例では、本明細書に記載されているＤＮＡプラスミドは１０ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で形成することができる。製造技術には、アメリカ合衆国シリアル番号第６０／９３９，７９２号に記載されているものに加え、当業者に一般に知られているさまざまな装置とプロトコルも含まれるか組み込まれており、その中にはライセンスされた特許である２００７年７月３日に発行されたアメリカ合衆国特許第７，２３８，５２２号に記載されているものが含まれる。上に参照した出願と特許、すなわちアメリカ合衆国シリアル番号第６０／９３９，７９２号とアメリカ合衆国特許第７，２３８，５２２号のそれぞれは、その全体が本明細書に組み込まれている。

【0235】

組み換え核酸配列コンストラクトからの発現

【0236】

上に記載したように、組み換え核酸配列コンストラクトは、前記１つ以上の構成要素のうちで、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列、および／または軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含むことができる。したがって組み換え核酸配列コンストラクトは、重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドの発現を容易にすることができる。

【0237】

上記の配置１を利用するとき、第１の組み換え核酸配列コンストラクトは重鎖ポリペプチドの発現を容易にすることができ、第２の組み換え核酸配列コンストラクトは軽鎖ポリペプチドの発現を容易にすることができる。上記の配置２を利用するとき、組み換え核酸配列コンストラクトは重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの発現を容易にすることができる。

【0238】

重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドは、非限定的な例として例えば細胞、生物、または哺乳類の中で発現すると、組み立てられて合成抗体（例えばｓｃＦｖ抗体断片、ＢＩＣＥ、またはＢｉＴＥ）またはＣＡＲ分子になることができる。特に重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドは互いに相互作用することができて、組立体は、抗原に結合できる合成抗体（例えばｓｃＦｖ抗体断片、ＢＩＣＥ、またはＢｉＴＥ）またはＣＡＲ分子になる。他の実施形態では、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドは互いに相互作用することができて、組立体は、本明細書に記載されているように、組み立てられていない抗体と比べて免疫原性がより大きい合成抗体（例えばｓｃＦｖ抗体断片、ＢＩＣＥ、またはＢｉＴＥ）またはＣＡＲ分子になる。さらに別の実施形態では、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドは互いに相互作用することができて、組立体は、抗原に対する免疫応答を誘起または誘導することのできる合成抗体（例えばｓｃＦｖ抗体断片、ＢＩＣＥ、またはＢｉＴＥ）またはＣＡＲ分子になる。

【0239】

賦形剤と、組成物の他の成分

【0240】

組成物は、医薬として許容可能な賦形剤をさらに含むことができる。医薬として許容可能な賦形剤として、機能性分子（ビヒクル、担体、または希釈剤など）が可能である。医薬として許容可能な賦形剤としてトランスフェクション易化剤が可能であり、その中に含めることができるのは、表面活性剤である免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイントの不完全アジュバント、ＬＰＳ類似体（モノホスホリル脂質Ａが含まれる）、ムラミルペプチド、キノン類似体、小胞（スクワレンやスクワレンなど）、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、またはナノ粒子、または他の既知のトランスフェクション易化剤などである。

【0241】

トランスフェクション易化剤は、ポリアニオン、ポリカチオン（ポリ－Ｌ－グルタミン酸塩（ＬＧＳ）が含まれる）、または脂質である。トランスフェクション易化剤はポリ－Ｌ－グルタミン酸塩であり、そのポリ－Ｌ－グルタミン酸塩は組成物の中に６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で存在することができる。トランスフェクション易化剤は、表面活性剤である免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイントの不完全アジュバント、ＬＰＳ類似体（モノホスホリル脂質Ａが含まれる）、ムラミルペプチド、キノン類似体、および小胞（スクワレンやスクワレンなど）も含むことができ、ヒアルロン酸は、組成物と組み合わせて投与するのに使用することもできる。組成物は、トランスフェクション易化剤（脂質、リポソーム（レシチンリポソーム、または本分野で知られている他のリポソーム（ＤＮＡ－リポソーム混合物（例えばＷ０９３２４６４０参照）など）が含まれる）、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、またはナノ粒子など）、または他の既知のトランスフェクション易化剤も含むことができる。トランスフェクション易化剤は、ポリアニオン、ポリカチオン（ポリ－Ｌ－グルタミン酸塩（ＬＧＳ）が含まれる）、または脂質である。組成物の中のトランスフェクション剤の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。

【0242】

組成物は利用する投与様式に応じて製剤化することができる。注射可能な医薬組成物は、減菌されていて、無発熱物質であり、無粒子状物質であることが可能である。等張製剤または溶液を使用できる。等張性にするための添加剤は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含むことができる。組成物は血管収縮剤を含むことができる。等張溶液はリン酸塩緩衝化生理食塩水を含むことができる。組成物は、ゼラチンとアルブミンを含む安定剤をさらに含むことができる。安定剤（ＬＧＳまたはポリカチオンまたはポリアニオンが含まれる）は、製剤が室温または周囲温度で長期にわたって安定であることを可能にする。

【0243】

組成物を送達する方法

【0244】

本発明は、組成物を、それを必要とする対象に送達する方法にも関する。送達の方法は対象に組成物を投与することを含むことができる。いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の二重特異性抗体、ｓｃＦｖ、ＣＡＲ分子、ＣＡＲ Ｔ細胞の投与、または本発明の二重特異性抗体、ｓｃＦｖ、またはＣＡＲ分子をコードする核酸分子の投与に関する。いくつかの実施形態では、核酸分子はＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子はＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子はｍＲＮＡ分子である。

【0245】

投与の非限定的な例に含めることができるのは、抗体、ｓｃＦｖ、ＣＡＲ分子、またはＣＡＲ Ｔ細胞の静脈内送達、ＤＮＡ注入、リポソームを媒介とした送達、ＤＮＡナノ粒子によって容易にされた送達である。

【0246】

組成物の送達を受ける哺乳類として、ヒト、霊長類、非ヒト霊長類、ウシ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、スイギュウ、バイソン、ウシ科、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、およびニワトリが可能である。

【0247】

組成物は異なる経路によって投与することができ、経路に含まれるのは、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、吸入を通じて、口腔投与を通じて、胸腔内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、髄腔内、および関節内、またはこれらの組み合わせである。獣医学で使用するため、組成物は、獣医の慣例に従って適切に受け入れることが可能な製剤として投与することができる。獣医は、ある特定の動物にとって最適な投与計画と投与経路を容易に決定することができる。組成物は、伝統的な注射器、針なし注入装置、「マイクロプロジェクタイルボンバードメント遺伝子銃」、または他の物理的方法（電気穿孔（「ＥＰ」）、「ハイドロダイナミック法」、または超音波など）によって投与することができる。

【0248】

治療の方法

【0249】

本明細書でやはり提供されるのは、疾患の治療、疾患からの保護、および／または疾患の予防を必要とする対象において、本発明の二重特異性抗体、ｓｃＦｖ、ＣＡＲ分子、ＣＡＲ Ｔ細胞を、または本発明の二重特異性抗体、ｓｃＦｖ、またはＣＡＲ分子をコードする核酸分子を対象に投与することによってその疾患の治療、その疾患からの保護、および／またはその疾患の予防をする方法である。この方法は、本発明の二重特異性抗体、ｓｃＦｖ、ＣＡＲ分子、ＣＡＲ Ｔ細胞を含むか、本発明の二重特異性抗体、ｓｃＦｖ、またはＣＡＲ分子をコードする核酸分子を含む組成物を対象に投与することを含むことができる。対象への組成物の投与は上に記載した送達法を利用してなすことができる。

【0250】

ある実施形態では、本発明により、がんを治療する、がんから保護する、および／またはがんを予防する方法が提供される。一実施形態では、この方法は、腫瘍増殖を治療する、腫瘍増殖から保護する、および／または腫瘍増殖を予防する。一実施形態では、この方法は、がん進行を治療する、がん進行から保護する、および／またはがん進行を予防する。一実施形態では、この方法は、がん転移を治療する、がん転移から保護する、および／またはがん転移を予防する。

【0251】

一実施形態では、本発明により、良性腫瘍の増殖（その非限定的な例は子宮筋腫である）を予防する方法が提供される。この方法は、良性腫瘍を持つと診断された対象に本発明の組成物の１つ以上を有効な量で投与することを含む。

【0252】

合成抗体、ＢｉＴｅ、ｓｃＦｖ、ＣＡＲ分子、またはＣＡＲ Ｔ細胞を対象に投与すると、その合成抗体、ＢｉＴｅ、ｓｃＦｖ、ＣＡＲ分子、またはＣＡＲ Ｔ細胞は、抗原と結合または反応することができる。このような結合は抗原を中和し、別の分子（例えばタンパク質または核酸）による抗原の認識を阻止し、その抗原に対する免疫応答を誘起または誘導し、そのことによって対象でその抗原に関係する疾患を治療する、その疾患から保護する、および／またはその疾患を予防する。

【0253】

組成物の用量は、１μｇと１０ｍｇの間の活性成分／体重ｋｇ／回と、２０μｇ～１０ｍｇの成分／体重ｋｇ／回が可能である。組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１日ごとに投与することができる。有効な治療のための組成物投与の回数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回が可能である。

【0254】

がん療法

【0255】

本発明により、がんの治療または予防の方法、または腫瘍の増殖または転移の治療と予防の方法が提供される。本発明の関連する側面により、個体において過形成細胞または腫瘍細胞の転移を予防する、予防を助ける、および／または減らす方法が提供される。

【0256】

本発明の１つの側面により、転移を阻害する必要がある個体において転移を阻害する方法が提供され、この方法は、本発明の組成物をその個体に有効量で投与することを含む。本発明によりさらに、転移を阻害する必要がある対象で転移を阻害する方法が提供され、この方法は、本明細書に記載されている組成物のいずれか１つをその個体に有効な転移阻害量で投与することを含む。

【0257】

がんの治療または予防、または腫瘍の転移の治療または予防を必要とする個体におけるその治療または予防のいくつかの実施形態では、第２の薬剤（抗悪性腫瘍剤など）がその個体に投与される。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は、第２の転移阻害剤（プラスミノーゲンアンタゴニスト、またはアデノシンデアミナーゼアンタゴニストなど）を含む。他の実施形態では、第２の薬剤は血管新生阻害剤である。

【0258】

本発明の組成物を使用して、ヒトと動物におけるがんを予防すること、軽減すること、最小にすること、制御すること、および／またはより小さくすることができる。本発明の組成物は、原発腫瘍の増殖速度を遅くするのにも使用できる。本発明の組成物は、それを必要とする対象に投与されるとき、がん細胞の拡散を停止させるのに使用できる。そのため本発明の組成物は、併用療法の一部として１つ以上の薬または他の医薬剤とともに投与することができる。併用療法の一部として使用されるとき、本発明の組成物によって提供される転移の減少と原発腫瘍増殖の低下により、患者の治療に使用中のあらゆる医薬または薬物療法のより有効かつ効率的な使用が可能になる。それに加え、本発明の組成物によって転移が制御されると、対象は、疾患を１つの位置に集中させるより大きな能力を持つ。

【0259】

一実施形態では、本発明により、悪性腫瘍または他のがん性細胞の転移を予防するほか、腫瘍増殖の速度を低下させる方法が提供される。この方法は、悪性腫瘍またはがん性細胞を診断された対象、または腫瘍またはがん性細胞を持つ対象に、本発明の組成物の１つ以上を有効な量で投与することを含む。

【0260】

本発明の方法と組成物によって治療できるがんの非限定的な例は、以下のもの、すなわち卵巣がん、乳がん、前立腺がん、腎臓がん、結腸直腸がん、胃がん、肺がん、精巣がん、子宮内膜がん、および甲状腺がんである。

【0261】

一実施形態では、本発明により、がん転移を治療する方法として、本発明の組成物を用いて治療する前に、治療するのと同時に、または治療した後に、がんの相補的療法である外科手術、化学療法、化学療法剤、放射線療法、またはホルモン療法など、またはこれらの組み合わせで対象を治療することを含む方法が提供される。

【0262】

化学療法剤に含まれるのは、細胞傷害剤（例えば５－フルオロウラシル、シスプラチン、カルボプラチン、メトトレキサート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、オキソルビシン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シタラビンＵＳＰ、シクロホスファミド、エストラムシンリン酸ナトリウム、アルトレタミン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、プロカルバジン、マイトマイシン、ブスルファン、シクロホスファミド、ミトキサントロン、カルボプラチン、シスプラチン、組み換えインターフェロンアルファ－２ａ、パクリタキセル、テニポシド、およびストレプトゾシ）、細胞傷害性アルキル化剤（例えばブスルファン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファラン、またはエチルスルホン酸）、アルキル化剤（例えばアサリー、ＡＺＱ、ＢＣＮＵ、ブスルファン、ビスルファン、カルボキシフタラト白金、ＣＢＤＣＡ、ＣＣＮＵ、ＣＨＩＰ、クロラムブシル、クロロゾトキシン、シス－白金、クロメソン、シアノモルホリノドキソルビシン、シクロジソン、シクロホスファミド、ジアンヒドロガラクチトール、フルオロドパン、ヘプスルファム、ハイカントン、イホスファミド、メルファラン、メチルＣＣＮＵ、マイトマイシンＣ、ミトゾラミド、ナイトロジェンマスタード、ＰＣＮＵ、ピペラジン、ピペラジンジオン、ピポブロマン、ポルフィロマイシン、スピロヒダントインマスタード、ストレプトゾトシン、テロキシロン、テトラプラチン、チオテパ、トリエチレンメラミン、ウラシルナイトロジェンマスタード、およびヨシ－８６４）、抗有糸分裂剤（例えばアロコルヒチン、ハリコンドリンＭ、コルヒチン、コルヒチン誘導体、ドラスタチン１０、メイタンシン、リゾキシン、パクリタキセル誘導体、パクリタキセル、チオコルヒチン、トリチルシステイン、硫酸ビンブラスチン、および硫酸ビンクリスチン）、植物アルカロイド（例えばアクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、Ｌ－アスパラギナーゼ、イダルビシン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ダウノルビシン、ＶＰ－１６－２１３、ＶＭ－２６、ナベルビン、およびタキソテール）、生物学的製剤（例えばアルファインターフェロン、ＢＣＧ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、およびインターロイキン－２）、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えばカンプトテシン、カンプトテシン誘導体、およびモルホリノドキソルビシン）、トポイソメラーゼII阻害剤（例えばミトキサントロン、アモナフィド、ｍ－ＡＭＳＡ、アントラピラゾール誘導体、ピラゾロアクリジン、ビサントレンＨＣＬ、ダウノルビシン、デオキシドキソルビシン、メノガリル、Ｎ，Ｎ－ジベンジルダウノマイシン、オキサントラゾール、ルビダゾン、ＶＭ－２６、およびＶＰ－１６）、および合成製剤（例えばヒドロキシウレア、プロカルバジン、ｏ，ｐ’－ＤＤＤ、ダカルバジン、ＣＣＮＵ、ＢＣＮＵ、シス－ジアミンジクロロ白金、ミトキサントロン、ＣＢＤＣＡ、レバミゾール、ヘキサメチルメラミン、オール－トランスレチノイン酸、グリアデル、およびポルフィマーナトリウム）である。

【0263】

抗増殖剤は細胞の増殖を減らす化合物である。抗増殖剤に含まれるのは、アルキル化剤、抗代謝剤、酵素、生物学的応答調節物質、さまざまな薬剤、ホルモンとアンタゴニスト、アンドロゲン阻害剤（例えばフルタミドと酢酸リュープロリド）、抗エストロゲン（例えばクエン酸タモキシフェンとその類似体、トレミフェン、ドロロキシフェン、およびロロキシフェン）であり、特異的抗増殖剤の非限定的な追加例に含まれるのは、レバミゾール、硝酸ガリウム、グラニセトロン、サルグラモスチム塩化ストロンチウム－８９、フィルグラスチム、ピロカルピン、デキストラゾキサン、およびオンダンセトロンである。

【0264】

本発明の化合物は、単独で、または他の抗腫瘍剤（細胞傷害／抗悪性腫瘍剤や抗血管新生剤が含まれる）と組み合わせて投与することができる。細胞傷害／抗悪性腫瘍剤は、がん細胞を攻撃して殺傷する薬剤と定義される。いくつかの細胞傷害／抗悪性腫瘍剤は、腫瘍細胞の中の遺伝材料をアルキル化するアルキル化剤である例えばシス－プラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、トリメチレンチオホスホラミド、カルムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、ベルスチン、ウラシルマスタード、クロマファジン、およびダカバジンである。他の細胞傷害／抗悪性腫瘍剤は、腫瘍細胞の抗代謝剤である例えばシトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプイリン、アザチオプリム、およびプロカルバジンである。他の細胞傷害／抗悪性腫瘍剤は、抗生剤である例えばドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、マイトマイシンＣ、およびダウノマイシンである。これら化合物に関する多数のリポソーム製剤が市販されている。さらに別の細胞傷害／抗悪性腫瘍剤は有糸分裂阻害剤（ビンカアルカロイド）であり、その中には、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびエトポシドが含まれる。さまざまな細胞傷害／抗悪性腫瘍剤に含まれるのは、タキソールとその誘導体、Ｌ－アスパラギナーゼ、抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサクリン、メルファラン、ＶＭ－２６、イホスファミド、ミトキサントロン、およびビンデシンである。

【0265】

抗血管新生剤は当業者に周知である。本発明の方法と組成物で用いるのに適した抗血管新生剤に含まれるのは、抗ＶＥＧＦ抗体（ヒト化抗体とキメラ抗体が含まれる）、抗ＶＥＧＦアプタマー、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドである。他の既知の血管新生阻害剤に含まれるのは、アンギオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、インターロイキン１（アルファとベータが含まれる）インターロイキン１２、レチノイン酸、およびメタロプロテイナーゼ－１と－２の組織阻害剤（ＴＩＭＰ－１と－２）である。小分子も、トポイソメラーゼ（抗血管新生活性を持つトポイソメラーゼII阻害剤であるラゾキサンなど）を含め、使用することができる。

【0266】

本発明の組成物と組み合わせて使用できる他の抗がん剤の非限定的な例に含まれるのは、アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール塩酸塩；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；酢酸アメタントロン；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼアスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；ビサントレン塩酸塩；ジメシル酸ビスナフィド；ビゼレシン；硫酸ブレオマイシン；ブレキナルナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルムスチン；カルビシン塩酸塩；カルゼレシン；セデフィンゴル；クロラムブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；メシル酸クリスナトール；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン塩酸塩；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；メシル酸デザグアニン；ジアジコン；ドセタキセル；ドキソルビシン；ドキソルビシン塩酸塩；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；デュアゾマイシン；エダトレキサート；エフロミチン塩酸塩；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロマート；エピプロピジン；エピルビシン塩酸塩；エルブロゾール；エソルビシン塩酸塩；エストラムスチン；エストラムスチンリン酸ナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン；ファドロゾール塩酸塩；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン：リン酸；フルオロウラシル、フルオロシタビン；ホスキドン；ホストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；ゲムシタビン塩酸塩；ヒドロキウレア；イダルビシン塩酸塩；イホスファミド；イルモホシン；インターロイキンII（組み換えインターロイキンIIまたはｒＩＬ２が含まれる）、インターフェロンアルファ－２ａ；インターフェロンアルファ－２ｂ；インターフェロンアルファ－ｎ１；インターフェロンアルファ－ｎ３；インターフェロンベータ－Ｉａ；インターフェロンガンマ－Ｉｂ；イプロプラチン；イリノテカン塩酸塩；酢酸ランレオチド；レトロゾール；酢酸リュープロリド；リアロゾール塩酸塩；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；ロソキサントロン塩酸塩；マソプロコル；メイタンシン；メクロレタミン塩酸塩；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；マイトジリン；マイトマルシン；マイトマイシン；マイトスパー；ミトタン；ミトキサントロン塩酸塩；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；硫酸ペプロマイシン；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピロキサントロン塩酸塩；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドミムスチン；プロカルバジン塩酸塩；ピューロマイシン；ピューロマイシン塩酸塩；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴール；サフィンゴール塩酸塩；セムスチン；シムトラゼン；スパルフォセートナトリウム；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム塩酸塩；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル；タリソマイシン；テコガランナトリウム；テガフル；テロキサントロン塩酸塩；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；クエン酸トレミフェン；酢酸トレストロン；リン酸トリシリビン；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トチプトレリン；ツブロゾール塩酸塩；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン；硫酸ビングリシナート；硫酸ビンロイロシン；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビンロシジン；硫酸ビンゾリジン；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；ゾルビシン塩酸塩である。他の抗がん薬の非限定的な例に含まれるのは、２０－エピ－１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；５－エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アルデスロイキン；オール－ＴＫアンタゴニスト；アルトレタミン；アンバムスチン；アミドクス；アミホスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラフォライド；血管新生阻害剤；アンタゴニストＤ；アンタゴニストＧ；アンタレリクス；抗背側化骨形成タンパク質－１；抗アンドロゲン、前立腺癌；抗エストロゲン；抗ネオプラストン；アンチセンスオリゴヌクレオチド；グリシン酸アフィジコリン；アポトーシス遺伝子調節物質；アポトーシス調節物質；アプリン酸；アラ－ＣＤＰ－ＤＬ－ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン１；アキシナスタチン２；アキシナスタチン３；アザステロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンIII誘導体；バラノール；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト；ベンゾクロリン；ベンゾイルスタウロスポリン；ベータラクタム誘導体；ベータ－アレチン；ベタクラマイシンＢ；ベツリン酸；ｂＦＧＦ阻害剤；ビカルタミド；ビサントレン；ビスアジリジニルスペルミン；ビスナフィド；ビストラテンＡ；ビゼレシン；ブレフラート；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンＣ；カンプトテシン誘導体；カナリア痘ＩＬ－２；カペシタビン；カルボキサミド－アミノ－トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔ Ｍ３；ＣＡＲＮ ７００；軟骨由来阻害剤；カルゼレシン；カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリクス；クロリン；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；シス－ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェン類似体；クロトリマゾール；コリスマイシンＡ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチン類似体；コナゲニン；クランベシジン８１６；クリスナトール；クリプトフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体；クラシンＡ；シクロペンタントラキノン；シクロプラタム；シペマイシン；シタラビンオクホスファート；細胞溶解因子；サイトスタチン；ダクリキシマブ；デシタビン；デヒドロジデムニンＢ；デスロレリン；デキサメタゾン；デキシホスファミド；デキストラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジクオン；ジデムニンＢ；ジドックス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ－５－アザシチジン；ジヒドロタキソール，９－；ジオキサマイシン；ジフェニルスピロムスチン；ドセタキセル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンＳＡ；エブセレン；エコムスチン；エデルホシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフール；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチン類似体；エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアンタゴニスト；エタニダゾール；リン酸エトポシド；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン；フルアステロン；フルダラビン；フルオロダウノルビシン塩酸塩；ホルフェニメクス；フォルメスタン；フォストリエシン；フォテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；硝酸ガリウム；ガロシタビン；ガニレリクス；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲムシタビン；グルタチオン阻害剤；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イルモホシン；イロマスタット；イミダゾアクリドン；イミキモド；免疫刺激ペプチド；インスリン様増殖因子－１受容体阻害剤；インターフェロンアゴニスト；；インターフェロン；インターロイキン；ヨーベングアン；ヨードドキソルビシン；イポメアノール，４－；イロプラクト；イルソグラジン；イソベンガゾール；イソホモハリコンドリンＢ；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリドＦ；ラメラリン－Ｎトリアセタート；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；硫酸レンチナン；レプトルスタチン；レトロゾール；白血病阻害因子；白血球アルファインターフェロン；リュープロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；リュープロレリン；レバミゾール；リアロゾール；直線状ポリアミン類似体；親油性二糖ペプチド；親油性白金化合物；リソクリナミド７；ロバプラチン；ロンブリシン；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロバスタチン；ロキソリビン；ルートテカン；ルテチウムテキサフィリン；リソフィリン；溶解性ペプチド；メイタンシン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコル；マスピン；マトリリシン阻害剤；マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤；メノガリル；メルバロン；メテレリン；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；ＭＩＦ阻害剤；ミフェプリストン；ミルテホシン；ミリモスチム；ミスマッチ二本鎖ＲＮＡ；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシン類似体；ミトナフィド；マイトトキシン線維芽細胞増殖因子－サポリン；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；モノクローナル抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロフィン；モノホスホリル脂質Ａ＋マイコバクテリウム細胞壁ｓｋ；モピダモール；多剤抵抗性遺伝子阻害剤；多腫瘍抑制遺伝子１に基づく療法；マスタード抗がん剤；ミカペルオキシドＢ；微生物細胞壁抽出液；ミリアポロン；Ｎ－アセチルジナリン；Ｎ置換ベンズアミド；ナファレリン；ナグレスチプ；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ナダプラチン；ネモルビシン；ネリドロン酸；中性エンドペプチダーゼ；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素調節物質；窒素酸化物抗酸化剤；ニトルリン；Ｏ６－ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン；経口サイトカイン誘導剤；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプラチン；オキサウノマイシン；パクリタキセル；パクリタキセル類似体；パクリタキセル誘導体；パラウアミン；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；ペガスパルガーゼ；ペルデシン；ペントサンポリ硫酸ナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール；ペルフルブロン；ペルホスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；酢酸フェニル；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニル；ピロカルピン塩酸塩；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチンＡ；プラセチンＢ；プラスミノーゲンアクチベータ阻害剤；白金錯体；白金化合物；白金－トリアミン錯体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニゾン；プロピルビス－アクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソーム阻害剤；プロテインＡに基づく免疫調節物質；プロテインキナーゼＣ阻害剤；プロテインキナーゼＣ阻害剤、微細藻類；プロテインチロシンホスファターゼ阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレン重合体；ｒａｆアンタゴニスト；ラルチトレキセド；ラモステロン；ｒａｓファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤；ｒａｓ阻害剤；ｒａｓ－ＧＡＰ阻害剤；脱メチル化レテリプチン；エチドロン酸レニウムＲｅ １８６；リゾキシン；リボザイム；ＲＩＩレチナミド；ログレチミド；ロヒツキン；ロムルチド；ロキニメックス；ルビジノンＢ１；ルボキシル；サフィンゴール；サイントピン；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトールＡ；サルグラモス
チム；Ｓｄｉ １模倣体；セムスチン；老化由来阻害剤１；センスオリゴヌクレオチド；シグナル伝達阻害剤；シグナル伝達調節物質；一本鎖抗原結合タンパク質；シゾフラン；ソブゾキサン；ボロカプテイトナトリウム；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール；ソマトメジン結合タンパク質；ソネルミン；スパルフォシン酸；スピカマイシン；スピカマイシンＤ；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンギスタチン１；スクアラミン；幹細胞阻害剤；幹細胞分裂阻害剤；スチピアミド；ストロメリシン阻害剤；スルフィノシン；超活性血管作動性腸管ペプチドアンタゴニスト；スラジスタ；スラミン；スワインソニン；合成グリコサミノグリカン；タリムスチン；タモキシフェンメチオジド；タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフル；テルラピリリウム；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン；テモゾロミド；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン；サリブラスチン；チオコラリン；トロンボポエチン；トロンボポエチン模倣体；サイマルファシン；チモポエチン受容体アゴニスト；チモトリナン；甲状腺刺激ホルモン；エチルエチプルプリンすず；チラパザミン；チタノセンビクロリド；トプセンチン；トレミフェン；全能性幹細胞因子；翻訳阻害剤；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシンキナーゼ阻害剤；チルホスチン；ＵＢＣ阻害剤；ウベニメクス；尿生殖洞由来の増殖阻害因子；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；バプレオチド；バリオリンＢ；ベクター系、赤血球遺伝子療法；ベラレソール；ベラミン；ベルジン；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン；ビタキシン；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；およびジノスタチンスチマラマーである。一実施形態では、抗がん薬は、５－フルオロウラシル、タキソール、またはロイコボリンである。

【0267】

Ｔ細胞応答を改善する薬剤

【0268】

いくつかの側面では、合成抗体、ｓｃＦｖ、ＢｉＴＥ、ＣＡＲコンストラクト、またはＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｔ細胞応答を改善する少なくとも１つの薬剤と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞応答を改善する少なくとも１つの薬剤は免疫チェックポイント阻害剤である。いくつかの側面では、本明細書に開示されている方法のいずれか１つで使用される免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイント経路に関与するタンパク質に結合する抗体、および／またはその機能を低下させるか阻止する抗体である。

【0269】

いくつかの側面では、免疫チェックポイント阻害剤は、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原－４（ＣＴＬＡ－４）である。いくつかの側面では、ＣＴＬＡ－４を標的とする免疫チェックポイント阻害剤はイピリムマブまたはトレメリムマブ（チシリムマブ、ＣＰ－６７５，２０６）である。いくつかの側面では、免疫チェックポイント阻害剤はＰＤ－１を標的とする。いくつかの側面では、ＰＤ－１を標的とする免疫チェックポイント阻害剤は、ニボルマブ（ＯＮＯ－４５３８／ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ１１０６、オプジーボ（登録商標））、ペムブロリズマブ（ＭＫ－３４７５、キートルーダ（登録商標））、ピジリズマブ（ＣＴ－０１１）、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、セミプリマブ（リブタヨ（商標））、スパルタリズマブ（ＰＤＲ００１）、カムレリズマブ（ＳＨＲ１２１０）、シンチリマブ（ＩＢＩ３０８）、チスレリズマブ（ＢＧＢ－Ａ３１７）、トリパリマブ（ＪＳ ００１）、ＡＭＰ－２２４、ＡＭＰ－５１４、またはスパルタリズマブ（ＰＤＲ００１）である。いくつかの側面では、免疫チェックポイント阻害剤はＰＤ－Ｌ－１を標的とする。いくつかの側面では、ＰＤ－Ｌ－１を標的とする免疫チェックポイント阻害剤は、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ＫＮ０３５、ＣＫ－３０１、ＡＵＮＰ１２、ＣＡ－１７０、またはＢＭＳ－９８６１８９である。いくつかの側面では、免疫チェックポイント阻害剤は、Ｔ細胞免疫グロブリンと、ムチン－ドメイン含有－３（ＴＩＭ－３）および／またはリンパ球活性化３（ＬＡＧ３）タンパク質を標的とする。いくつかの側面では、ＴＩＭ３を標的とする免疫チェックポイント阻害剤は、ＭＢＧ４５３；ＴＳＲ－０２２；またはＬＹ３３２１３６７である。いくつかの側面では、ＬＡＧ３を標的とする免疫チェックポイント阻害剤は、ＩＭＰ３２１（エフチラギモドアルファ）、ＢＭＳ－９８６０１６（レラトリマブ）、ＬＡＧ５２５（抗ＬＡＧ－３ ｍＡｂ）、ＲＥＧＮ３７６７（抗ＬＡＧ－３ｍＡｂ）、ＴＳＲ－０３３（抗ＬＡＧ－３ ｍＡｂ）、ＭＧＤ０１３（ＰＤ－１／ＬＡＧ－３二重特異性ＤＡＲＴ（登録商標）タンパク質）、またはＦＳ１１８（ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体）である。

【0270】

いくつかの側面では、免疫チェックポイント阻害剤はインドールアミン ２，３－ジオキシゲナーゼ－１（ＩＤＯ１）を標的とする。いくつかの側面、ＩＤＯ１を標的とする免疫チェックポイント阻害剤は、インドキシモド（Ｄ－１ＭＴ；ＮＬＧ－８１８９）、ナボキシモド（ＮＬＧ－９１９）、エパカドスタット（ＩＮＣＢ０２４３６０）、ＢＭＳ－９８６２０５、ＰＦ－０６８４０００３、ＩＯＭ２９８３、またはＲＧ－７００９９である。

【0271】

いくつかの側面では、免疫チェックポイント阻害剤はＴ細胞活性化のＶ－ドメインＩｇサプレッサ（ＶＩＳＴＡ）を標的とする。

【0272】

いくつかの側面では、Ｔ細胞応答を改善する前記少なくとも１つの薬剤はサイトカイン（炎症性サイトカインなど）である。いくつかの側面では、サイトカインはＩ型ＩＦＮまたはＩＬ－１２である。いくつかの側面では、サイトカインは、共通するガンマ鎖受容体を共有するサイトカインである。共通するガンマ鎖受容体を共有するサイトカインの非限定的な例に含まれるのは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１である。いくつかの側面では、Ｔ細胞応答を改善する前記少なくとも１つの薬剤はＩＬ－２である。

【0273】

いくつかの側面では、Ｔ細胞応答を改善する前記少なくとも１つの薬剤はＴｒｅｇ細胞を標的とする。いくつかの側面では、Ｔｒｅｇ細胞を標的とする薬剤は、抗ＣＣＲ４抗体、ニューロピリン－１（Ｎｒｐ－１）阻害剤、またはセマフォリング－４ａ（Ｓｅｍａ４ａ）阻害剤である。いくつかの側面では、Ｔ細胞応答を改善する前記少なくとも１つの薬剤はｍＴＯＲ阻害剤である。ｍＴＯＲ阻害剤の非限定的な例に含まれるのは、ラパマイシン、テムシロリムス（ＣＣＩ－７７９）、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、リダホロリムス（ＡＰ－２３５７３）、シロリムス、ダクトリシブ、ＢＧＴ２２６、ＳＦ１１２６、ＰＫＩ－５８７、サパニセルチブ、ＡＺＤ８０５５、およびＡＺＤ２０１４である。

【0274】

免疫チェックポイント阻害剤の投与様式は制限されておらず、本分野で記載されているように、免疫チェックポイント阻害剤に関して推奨されているか適することが知られている任意の様式が可能である。投与様式は、使用する具体的な免疫チェックポイント阻害剤に応じて変わる可能性がある。いくつかの側面では、本明細書に開示されている免疫チェックポイント阻害剤は、全身経路（例えば非経口経路の投与など）；粘膜経路；経皮経路によって投与すること；または特定の組織に直接投与することができる。いくつかの側面では、免疫チェックポイント阻害剤は、それを必要とする対象に、治療に有効な用量で投与される。治療に有効な用量は、治療するがんのタイプ、対象の年齢、体重、および健康と、投与の経路などの因子に依存する。

【0275】

対象に投与される免疫チェックポイント阻害剤の量は制限されておらず、内科医によって決められる任意の量、および／または本分野で記載されているか知られている任意の量が可能である。いくつかの側面では、対象に投与される免疫チェックポイント阻害剤の量は約１μｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの範囲（例えば５μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇなど）であり、その中にはその間のあらゆる値と下位範囲が含まれる。いくつかの側面では、その用量を、約０．１ｍＬ～約１．５ｍＬ（例えば約０．２ｍＬ、約０．４ｍＬ、０．５ｍＬ、約０．６ｍＬ、約０．８ｍＬ、約１ｍＬ、または約１．２ｍＬ）の体積で投与することができ、その中にはその間のあらゆる値と下位範囲が含まれる。

【0276】

いくつかの側面では、免疫チェックポイント阻害剤は、本明細書に開示されている合成抗体、ｓｃＦｖ、ＢｉＴＥ、ＣＡＲコンストラクト、またはＣＡＲ Ｔ細胞と同時に投与される。いくつかの側面では、免疫チェックポイント阻害剤は、本明細書に開示されている合成抗体、ｓｃＦｖ、ＢｉＴＥ、ＣＡＲコンストラクト、またはＣＡＲ Ｔ細胞よりも前に投与される。いくつかの側面では、免疫チェックポイント阻害剤は、本明細書に開示されている合成抗体、ｓｃＦｖ、ＢｉＴＥ、ＣＡＲコンストラクト、またはＣＡＲ Ｔ細胞の後に投与される。

【0277】

インビトロと生体外での合成抗体の生成

【0278】

一実施形態では、合成抗体、ｓｃＦｖ、ＢｉＴＥ、ＣＡＲコンストラクト、またはＣＡＲ Ｔ細胞はインビトロまたは生体外で生成する。例えば一実施形態では、合成抗体、ｓｃＦｖ、ＣＡＲコンストラクト、またはＢｉＴＥをコードする核酸をインビトロまたは生体外で細胞の中に導入して発現させることができる。遺伝子を細胞に導入して発現させる方法は本分野で知られている。発現ベクターの文脈では、ベクターは、本分野の任意の方法によって宿主細胞（例えば哺乳類、細菌、酵母、または昆虫細胞）の中に容易に導入することができる。例えば発現ベクターは、物理的、化学的、または生物学的な手段によって宿主細胞の中にトランスフェクトすることができる。

【0279】

ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する物理的方法に含まれるのは、リン酸カルシウム沈降、リポフェクション、粒子ボンバードメント、微量注入、電気穿孔などである。ベクターおよび／または外来性核酸を含む細胞を生成させる方法は本分野で周知である。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（２０１２， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する１つの好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。

【0280】

興味あるポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する生物学的方法に含まれるのは、ＤＮＡベクターとＲＮＡベクターの使用である。ウイルスベクター（特にレトロウイルスベクター）が遺伝子を哺乳類（例えばヒト細胞）に挿入する最も広く使用される方法になっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスなどに由来することができる。例えばアメリ合衆国特許第５，３５０，６７４号と第５，５８５，３６２号を参照されたい。

【0281】

ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する化学的手段に含まれるのは、コロイド分散系（巨大分子複合体など）、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、および脂質に基づく系（水中油型エマルション、ミセル、混合されたミセル、およびリポソームが含まれる）である。インビトロと生体内で送達ビヒクルとして使用するための１つの代表的なコロイド系はリポソーム（例えば人工膜小胞）である。

【0282】

非ウイルス送達系を使用する場合、代表的な１つの送達ビヒクルはリポソームである。脂質製剤の使用が、宿主細胞に核酸を導入するために考慮される（インビトロ、生体外、または生体内）。別の１つの側面では、核酸を脂質と会合させることができる。脂質と会合した核酸は、リポソームの水性内部の中に封入すること、リポソームの脂質二層の中に散在させること、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方と会合した連結分子を介してリポソームに付着させること、リポソームの中に捕獲すること、リポソームとの複合体にすること、脂質を含有する溶液の中に分散させること、脂質と混合すること、脂質と組み合わせること、脂質の中に懸濁液として含めること、ミセルとともに含有するかミセルとの複合体にすること、または他のやり方で脂質と会合させることができる。脂質、脂質／ＤＮＡ、または脂質／発現ベクターが会合した組成物が溶液中でどれか特定の構造に限定されることはなく、例えば二層構造の中にミセルとして、または「崩壊した」構造で存在することができる。これら組成物は単純に溶液中に散在させることもでき、おそらくサイズまたは形が一様ではない凝集体を形成する。脂質は脂肪物質であり、天然または合成の脂質が可能である。例えば脂質に含まれるのは、細胞質の中に自然に生じる脂肪液滴のほか、長鎖脂肪族炭化水素とその誘導体（脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、およびアルデヒドなど）を含有する化合物のクラスである。

【0283】

送達ベクター

【0284】

一実施形態では、本発明により、本明細書に記載されているように、二重特異性抗ＦＳＨＲ免疫細胞誘引抗体、ｓｃＦｖ、ＣＡＲ分子、またはその断片、またはそれをコードする核酸分子を含む送達ビヒクルを含む組成物が提供される。一実施形態では、二重特異性抗ＦＳＨＲ免疫細胞誘引抗体ｓｃＦｖ、ＣＡＲ分子、またはその断片をコードする核酸分子はｍＲＮＡ分子を含む。

【0285】

代表的な送達ビヒクルの非限定的な例に含まれるのは、マイクロスフェア、微粒子、ナノ粒子、ポリメロソーム、リポソーム、およびミセルである。例えばいくつかの実施形態では、送達ビヒクルは、本発明の二重特異性抗ＦＳＨＲ免疫細胞誘引抗体またはその断片をコードする核酸分子をロードされた脂質ナノ粒子である。一実施形態では、二重特異性抗ＦＳＨＲ免疫細胞誘引抗体をコードする核酸分子はｍＲＮＡ分子を含む。一実施形態では、二重特異性抗ＦＳＨＲ免疫細胞誘引抗体をコードするｍＲＮＡは、配列番号１に示されているＤＮＡ配列に対応するか、そのＤＮＡ配列から転写される。一実施形態では、二重特異性抗ＦＳＨＲ免疫細胞誘引抗体をコードするｍＲＮＡは配列番号２をコードする。一実施形態では、抗ＦＳＨＲ ｓｃＦｖをコードするｍＲＮＡは配列番号３をコードする。

【0286】

いくつかの実施形態では、送達ビヒクルは、ロードされたカーゴを制御放出、遅延放出、または連続放出する。いくつかの実施形態では、送達ビヒクルは、送達ビヒクルを治療部位に向かわせるターゲティング部分を含む。

【0287】

ある実施形態では、コードｍＲＮＡの送達によるタンパク質の発現には、タンパク質、プラスミドＤＮＡ、またはウイルスベクターを用いる方法と比べて多くの利点がある。ｍＲＮＡをトランスフェクトしている間、望むタンパク質のコード配列が細胞に送達される唯一の物質であるため、プラスミド骨格、ウイルス遺伝子、およびウイルスタンパク質に関係するあらゆる副作用が回避される。より重要なのは、ＤＮＡとウイルスに基づくベクターとは異なり、ｍＲＮＡはゲノムに組み込まれるリスクがなく、タンパク質の産生がｍＲＮＡ送達の直後に始まることである。例えば高レベルのタンパク質の循環が、コードｍＲＮＡを生体内に注入してから１５～３０分以内に測定されている。ある実施形態では、タンパク質ではなくｍＲＮＡを使用することには多くの利点もある。循環中のタンパク質の半減期は短いことがしばしばあるため、タンパク質を用いた治療は頻繁な投与を必要とする可能性があるが、ｍＲＮＡは数日間にわたる連続的なタンパク質産生のための鋳型を提供する。タンパク質の精製は問題であり、タンパク質は、副作用を起こす凝集体と他の不純物を含有する可能性がある（Ｋｒｏｍｍｉｎｇａ ａｎｄ Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ， ２００５， Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０５０：２５７－２６５）。

【0288】

宿主細胞の中にｍＲＮＡ配列が存在することの確認に多彩なアッセイを実施することができる。そのようなアッセイに含まれるのは、例えば当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ（ノーザンブロッティングやＲＴ－ＰＣＲなど）；「生化学的」アッセイ（例えば免疫応答を引き起こす手段（ＥＬＩＳＡやウエスタンブロット）による、または本発明の範囲に入る薬剤を同定するための本明細書に記載のアッセイによる、特定のペプチドの存在または不在の検出など）である。

【0289】

操作された免疫細胞を用いた送達の方法

【0290】

さまざまな実施形態では、本発明は、腫瘍細胞を標的とするＣＡＲ分子を発現するように操作された免疫細胞を含む組成物に関する。腫瘍細胞を標的とする本発明のＣＡＲ分子を発現するように操作できる免疫細胞の非限定的な例に含まれるのは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはマクロファージである。いくつかの実施形態では、免疫細胞はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含む。したがっていくつかの実施形態では、本発明は、本発明のＦＳＨＲ特異的ＣＡＲ分子の発現または送達のためのＣＡＲ Ｔ細胞の利用に関する。

【0291】

一実施形態では、本発明により、二重特異性抗ＦＳＨＲ免疫細胞誘引抗体を標的細胞に送達し、二重特異性抗ＦＳＨＲ免疫細胞誘引抗体を発現する操作された免疫細胞を提供する方法が提供される。一実施形態では、免疫細胞を操作し、二重特異性抗ＦＳＨＲ免疫細胞誘引抗体を内在性分泌させる。一実施形態では、免疫細胞を操作し、二重特異性抗ＦＳＨＲ免疫細胞誘引抗体を表面で発現させる。

【0292】

さまざまな実施形態では、本発明は、二重特異性抗ＦＳＨＲ免疫細胞誘引抗体を発現するように操作されている操作されたＴ細胞（ＳＴＡｂ－Ｔ細胞）によりＴ細胞リダイレクト二重特異性抗体（Ｔ－ｂｓＡｂ）を内在性分泌させるための組成物に関する。さまざまな実施形態では、この方法は、二重特異性抗ＦＳＨＲ免疫細胞誘引抗体を発現するように操作されたＳＴＡｂ－Ｔ細胞を含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡｂ－Ｔ細胞はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含む。したがっていくつかの実施形態では、本発明は、二重特異性抗ＦＳＨＲ免疫細胞誘引抗体の発現または送達のためのＣＡＲ Ｔ細胞の利用に関する。

【0293】

実施例

【0294】

本発明を以下の実施例においてさらに説明する。これら実施例は本発明の好ましい実施形態を示しているが、説明だけのために与えられていることを理解すべきである。上記の議論とこれらの実施例から当業者は本発明の本質的な特徴を確認することができるため、その精神と範囲から逸脱することなく、さまざまな用途と条件のために本発明に対してさまざま変更と改変をなすことができる。したがって、本明細書に示されて記載されている改変に追加される本発明のさまざまな改変は、これまでの記述から当業者にとって明らかであろう。そのような改変も添付の請求項の範囲に入ることが想定されている。

【0295】

実施例１：ＦＳＨＲを標的とする二重特異性Ｔ細胞エンゲージャをコードするＤＮＡの予備的研究

【0296】

本明細書に示されている研究では、ＦＳＨＲを標的とする二重特異性Ｔ細胞エンゲージャが開発されることを実証する。ＦＳＨＲ二重特異性抗体は、ヒトＦＳＨＲをトランスフェクトされたＫ５６２細胞に結合し（図１）、インビトロでＴ細胞の存在下においてＯＶＣＡＲ３細胞の殺傷を促進する（図２）。図３と図４は、ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅによって評価したＦＳＨＲ×ＣＤ３二重特異性の殺傷応答を示す。生体内に放出されたＦＳＨＲ×ＣＤ３二重特異性はＮＳＧマウスにおいてＯＶＣＡＲ３腫瘍細胞の増殖を制御する（図５）。これらのデータは、インビトロと生体内で強力な腫瘍殺傷を示す新たなＦＳＨＲ Ｔ細胞誘引二重特異性が開発されたことを実証している。

【0297】

実施例２：表面に発現した卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）を標的とするモノクローナル抗体を生成させ、それを操作して卵巣がん標的免疫療法のための養子免疫に参加させる

【0298】

ＯＣ治療の分野における大きな進歩にもかかわらず、再発ＯＣは致死性が大きいがん表現型と関係する悪い予後を相変わらず示す（Ｋｕｒｎｉｔ ｅｔ ａｌ．， ２０２１， Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ， １３７（１）：１０８－２１；Ｉｚａｒ ｅｔ ａｌ．， ２０２０， Ｎａｔ Ｍｅｄ， ２６（８）：１２７１－９；Ｈａｍａｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２８（７）：３３９－４８）。ＯＣが免疫療法を用いた治療に好ましく応答するであろうと推定する多くの理由があるが；それでもＯＣ患者の間での免疫療法の応答率は比較的低いままである（Ｃｏｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ， １３（２）：７１－２）。多数の異なる免疫標的が、能動的アプローチ（メソテリン、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ｐ５３、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＷＴ－１）、受動的アプローチ（Ｈ７－Ｂ４、ＥｐＣＡＭ、ＣＡ－１２５、ＣＤ－２５、葉酸受容体α、ＰＤ－１／ＰＤＬ－１、ＣＴＬＡ－４）、および養子アプローチ（養子Ｔ細胞療法、天然のＴ細胞療法、遺伝子改変されたＴ細胞療法、ＤＣ療法）を通じてＯＣを標的とするのに過去数年間使用されてきた（Ｓｃｈｗａｂ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ， ６（１２）：１２７９－９３）。特に、標的療法の開発における１つの主要な障害は、オフターゲット組織ではなく腫瘍細胞の表面でだけ特異的に発現する標的を見いだすことである（Ｐｅｒａｌｅｓ－Ｐｕｃｈａｌｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ２３（２）：４４１－５００）。ＦＳＨＲは、卵巣顆粒膜細胞の表面で選択的に発現する１つのそのような標的である（Ｐｅｒａｌｅｓ－Ｐｕｃｈａｌｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ２３（２）：４４１－５００）ため、それをＯＣにおける潜在的な標的と見なすことを可能にするツールが開発された。卵胞刺激ホルモンすなわちＦＳＨは１つの極めて重要な卵巣上皮細胞増殖誘導因子であり、ＦＳＨＲに結合することによって機能する。ＦＳＨＲの過剰発現は、発がん経路の上方調節と増加したＥＯＣ増殖に責任がある。したがってＦＳＨＲは、Ｔ細胞をＯＣに向かわせるための１つの重要な治療標的として利用できる可能性がある（Ｐｅｒａｌｅｓ－Ｐｕｃｈａｌｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ２３（２）：４４１－５００）。ワクチン接種によってＦＳＨＲを標的とすることの腫瘍に対する影響、忍容性、および安全性に関する可能性が、免疫正常マウスモデルを用いて評価された（Ｐｅｒａｌｅｓ－Ｐｕｃｈａｌｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１９， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， ２７（２）：３１４－２５）。最適化されたＤＮＡ配列の注射とそれに続く電気穿孔により、そのタンパク質が、強力な細胞免疫応答と液性免疫応答を誘起することのできる天然の立体配座で過剰発現する（Ｔｅｂａｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ；Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ， １（３）：１７９－８９）。ここではこの仕事を、抗ＦＳＨＲモノクローナル抗体を生成させるこのアプローチを利用して拡張し、得られた試薬を新規な生物製剤として研究する。強力な抗ＦＳＨＲ抗体の生成および特徴づけと、ＯＣの免疫療法のためのツールとしての応用を記述する。いくつかのクローンが同定され、その中から、追加研究のため、フロー分析において一貫して大きな細胞結合能力だったことに基づいてクローンＤ２ＡＰ１１が選択された。このｍＡｂは、多くの方法（フローサイトメトリー、ＩＦＡ、および免疫組織化学が含まれる）によるサンプル中のＦＳＨＲ発現の検出をサポートする。これは、追加の研究が、この新たな試薬の臨床での利用の可能性を広げる（臨床では、個別化された医学のアプローチのため、患者サンプルのＦＳＨＲの状態を判断する助けになる可能性がある）ために必要であることを示唆する。

【0299】

がん療法のための抗体技術の分野における１つの重要な最近のツールは、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャのアプローチである（Ｂｈｏｊｎａｇａｒｗａｌａ ｅｔ ａｌ．， ２０２２， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ． Ｓ２３７２－７７０５（２２）：０００９２－４）。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャは腫瘍細胞を殺傷するためＣＤ４とＣＤ８ Ｔ細胞の両方をリダイレクトすることができ、Ｔ細胞による固有の抗原特異的ＴＣＲ認識とは独立である（Ｄａｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ３３（１０）：１０７９－８６）。これらの大半は臨床前研究と初期臨床研究だが、ごく少数の承認されたがん二重特異性製品が存在する。ビーリンサイト（ブリナツモマブ）は急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）のための療法として使用され、Ｂ細胞上のＣＤ１９を標的とし、連結した抗ＣＤ３結合を通じてＴ細胞を誘引する（Ｓｈｅｒｉｄａｎ， ２０２１， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ３９（３）： ２５１－４）；テベンタフスプ－ｔｅｂｎ（キムトラック、Ｉｍｍｕｎｏｃｏｒｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ）は、二重特異性ｇｐ１００ペプチド－ＨＬＡ指向性ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージャであり、切除不能または転移ブドウ膜悪性黒色腫を持つ患者に対して承認された（ＦＤＡはテベンタフスプ－ｔｅｂｎを切除不能な、または転移ブドウ膜悪性黒色腫について承認した。２０２２年４月２０日にアクセス。ｆｄａ．ｇｏｖ）ため、このアプローチの重要性を裏づけている。ブリナツモマブは、マイナスの予後因子によって示される再発した／難治性の前駆Ｂ細胞性ＡＬＬを持つ成人で抗白血病機能を示した。グレード３以上で報告が最も多い有害事象に含まれるのは、発熱性好中球減少症、好中球減少症、および貧血である。患者は、グレード３のサイトカイン放出症候群（２％）と、最悪グレード３（１１％）または４（２％）の神経学的事象を示した（Ｔｏｐｐ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ， １６（１）：５７－６６）。テベンタフスプを用いた治療により、以前に治療を受けていない転移ブドウ膜悪性黒色腫患者の全生存期間がより長くなった。報告されている最も多い治療関連有害事象は、サイトカインを媒介とする事象と皮膚関連の事象であり、その中には発疹（８３％）、発熱（７６％）、および掻痒（６９％）が含まれる。しかしこれら事象の発生と重症度は最初の３または４回の投与の後に低下することが報告された（Ｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０２１， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ， ３８５（１３）：１１９６－２０６）。重篤な疾患の出現におけるこれら二重特異性Ｔ細胞エンゲージャのアプローチ３０４の利益は重要であるように見えるため、さらなる研究が、重篤な疾患を持つ患者の利益となる可能性がある。

【0300】

Ｄ２ＡＰ１１抗ＦＳＨＲクローンの特異性に基づき、これがＯＣ二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＴＣＥ）アプローチのための１つの重要な標的になりうると推測した。Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥは、一群の異なるヒト卵巣腫瘍細胞で評価したとき、腫瘍特異的細胞殺傷において非常に強力であった。異なる化学療法（ＨＤＡＣ阻害剤、Ｗｅｅ阻害剤、微小管安定剤、アルキル化剤などが含まれる）に対して抵抗性を示す細胞系（Ｓａｋａｉ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ６９（１６）：６３８１－６）が含まれていた。ＯＣ患者の約２３％が最初の化学療法から６ヶ月以内に再発し、別の６０％の患者が６ヶ月後の再発を報告された（Ｐｉｇｎａｔａ ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ． ２８（ｓｕｐｐｌ＿８）：ｖｉｉｉ５１－ｖｉｉｉ６）。治療逃避は、卵巣がん治療アプローチにとって大きな障害である。Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥは、これらの異なる薬抵抗性ＯＣ細胞系、すなわちＯＶＩＳＥ、ＣａＯＶ３、倉持、ＯＶＣＡＲ３、ＯＶＣＡＲ４、およびＰＥＯ－４に対して有意な殺傷を示した。ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２腫瘍抑制遺伝子における生殖細胞系変異は相同組み換えにおいて重要な役割を果たしており、ＥＯＣのケースの約１０％に見られる（Ｓａｆｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ． １０（１０）： ２０００－７；Ｈｅｎｎｅｓｓｙ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｌａｎｃｅｔ． ３７４（９６９８）：１３７１－８２）。散発性の高異型度漿液性ＯＣのほかＢＲＣＡ関連ＯＣにおいて優れた活性が実証されているが、残念なことに、古典的化学療法と同様、多くの患者が、ポリ－ＡＤＰ－リボースポリメラーゼ阻害剤（ＰＡＲＰｉ）治療に対して最終的に抵抗性を獲得すると報告されている（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０２０， Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １１：５７７８６９；ＭｃＭｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０２０， Ｃａｎｃｅｒｓ （Ｂａｓｅｌ）， １２（６）；Ｆｒａｎｚｅｓｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１９， Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ， ７３：１－９；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ， １３３（２）：３６２－９）。これは、そのようなＯＣ腫瘍を標的とするアプローチの開発が相変わらず重要であることを裏づける。興味深いことに、Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥは、ＢＲＣＡ１（ＯＶＩＳＥ）とＢＲＣＡ２（倉持、ＰＥＯ－４）に変異を有する細胞に対してに加え、ＰＡＲＰｉ（ＰＥＯ－４）に対して抵抗性を示す遺伝子シグネチャに対しても非常に有効であった（Ｓａｋａｉ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ６９（１６）：６３８１－６）。したがってＤ２ＡＰ１１－ＴＣＥは、ＯＣ療法において以前に文書化されているさまざまな一群の遺伝的逃避と免疫逃避に対して臨床的な利益があるように見える。これらの研究は、Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥが他の治療アプローチ（化学療法、小分子、および免疫調節薬（チェックポイント阻害剤など）など）との組み合わせで価値を持つ可能性があることを裏づける根拠を与える。しかしこの疑問に取り組む将来の研究が重要である。

【0301】

直接的ＤＮＡ生体内送達を利用し、ＯＣチャレンジモデルにおいてこの新たな可能性のあるツールを迅速に評価した。特に、ＦＳＨＲを標的とするＴ細胞エンゲージャが、卵巣腫瘍を有するマウスモデルにおいて生体内で非常に強力に腫瘍量／腫瘍進行を減弱させることが見いだされ、移植された腫瘍がほぼ消失した。１２人の異なる健康なヒトドナーからのＰＢＭＣをこれらの研究で使用した。これも、ＦＳＨＲのために開発された、ｓｃＦｖに基づく最初の治療剤である。これは、ｓｃＦｖに基づく他の治療剤（ＯＣのためのＦＳＨＲを標的とするＣＡＲ Ｔ細胞など）の設計に有用である可能性がある。

【0302】

これらの研究は、生体内での腫瘍の増殖に影響を与えるため、ＯＣの１つの主要なサブセットについてＦＳＨＲを標的とすることの有用性と、ＦＳＨＲとＣＤ３に焦点を絞った非常に免疫が強力な二重特異性ツールの有用性を初めて実証する。多彩な集団のＯＣを標的とすることと、この疾患の治療に現在利用できるツールを補足する能力が、追加のＦＳＨＲ＋腫瘍モデルにおける研究をサポートする。ＦＳＨＲを発現している多彩な卵巣がんとがんのためのこの新たなツールの潜在的なトランスレーショナルな進展のため、さらなる研究が必要とされる。

【0303】

実験で用いる方法をこれから記述する

【0304】

細胞系と動物

【0305】

研究で使用する細胞系に含まれるのは、ＩＤ８－Ｄｅｆｂ２９／Ｖｅｇｆ－ａ－ＦＳＨＲ、ＩＤ８－Ｄｅｆｂ２９／Ｖｅｇｆ－ａ、ＯＶＣＡＲ３、ＣａＯＶ３、およびＴＯＶ－２１Ｇ、ＯＶＩＳＥ、ＯＶＣＡＲ４、ＰＥＯ－４、倉持細胞、ヒト胚性腎臓２９３Ｔ、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ、胃腺癌ＡＧＳ、およびマウス骨髄腫細胞系Ｓｐ２．０／０である。ＯＶＣＡＲ３、ＯＶＩＳＥ、および倉持細胞には、以前に記載されているようにレトロウイルスを用いてヒトＦＳＨＲを形質導入した（Ｐｅｒａｌｅｓ－Ｐｕｃｈａｌｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１９， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， ２７（２）：３１４－２５）。Ｋ５６２とＡ２０をＡＴＣＣから購入し、レトロウイルスを用いて形質導入してヒトとマウスのＦＳＨＲをそれぞれ発現させた。発現ベクターｐＢＭＮ－Ｉ－ＧＦＰはＡｄｄｇｅｎｅから購入した。

【0306】

ＦＳＨＲ×ＣＤ３ ＴＣＥの設計

【0307】

ＦＳＨＲ×ＣＤ３ ＤＮＡがコードする二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＴＣＥ）を、ＦＳＨＲ ＭＡｂ（Ｄ２ＡＰ１１）のコドン最適化ｓｃＦｖをコードした後、ＩｇＥリーダー配列の付加によって改変したＵＣＨＴ１抗ヒトＣＤ３抗体のｓｃＦｖをコードすることによって設計した。このコンストラクトを、改変されたｐＶａｘ１発現ベクターにサブクローニングした（Ｐｅｒａｌｅｓ－Ｐｕｃｈａｌｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１９， ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ． ４（８））。ＦＳＨＲ×ＣＤ３ ＴＣＥをＤ２ＡＰ１１－ＴＣＥと表記する。

【0308】

フローサイトメトリー

【0309】

のためのＢＤ ＬＳＲIIフローサイトメータを細胞の染色に使用した。ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、ＦＳＨＲを安定に発現している細胞をソーティングした。使用した抗ヒト抗体には蛍光色素を直接標識した。ＰＥ－二次抗ヒト（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＥ／ＡＦ６４７－二次抗ヒトＦ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ）、およびＡＰＣ二次抗マウスＩｇＧ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用した。生／死バイオレット生死判定キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して死んだ細胞を分析から除外した。

【0310】

酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）

【0311】

Ｄ２ＡＰ１１のアイソタイプを判断するため、ＰＢＳの中でＥＬＩＳＡプレートを一晩Ｄ２ＡＰ１１で覆った。その後、プレートをブロックし、以下のＨＲＰで標識した抗体を添加した：抗マウスＩｇＡ、抗マウスＩｇＭ、抗マウスＩｇＧ１、抗マウスＩｇＧ２ａ、抗マウスＩｇＧ２ｂ、３９２抗マウスＩｇＧ３、抗マウスカッパ軽鎖（すべて、Ｂｅｔｈｙｌから）。

【0312】

サイクリックＡＭＰの測定

【0313】

２５，０００個のＫ５６２細胞またはＫ５６２－ｈＦＳＨＲ細胞を９６ウエルのプレートに播種した。温めたＰＢＳで細胞を２回洗浄した後、Ｄ２ＡＰ１１抗体あり、またはなしで、０．５ｍＭのＩＢＭＸ（Ｃａｙｍａｎ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含む１００μｌの無血清ＲＰＭＩの中に再懸濁させた。３７℃で３０分間インキュベートした後、ＦＳＨ（５０ｎｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌ）またはＰＢＳを添加した。１時間後、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、溶解させ、サイクリックＡＭＰの測定を製造者の指示（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）に従って実施した。

【0314】

イムノブロッティング

【0315】

タンパク質の抽出、変性、およびウエスタンブロッティングを以前に記載されているようにして実施した（Ｂｏｒｄｏｌｏｉ ｅｔ ａｌ．， ２０２１， ＡＣＳ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｒａｎｓｌ Ｓｃｉ， ４（４）：１３４９－６１；Ｔｅｓｏｎｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ， １４（７）：１７７４－８６；Ｂｏｒｄｏｌｏｉ ｅｔ ａｌ．， ２０２１， Ｇｅｎｅｓ Ｃａｎｃｅｒ， １２：５１－６４）。抗ホスホ－ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（＃９１０１、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）と抗ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（クローン１３７Ｆ５、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いて膜をブロットした。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔＬＡＳ ４０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて画像を取得した。Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥの発現を検出するため、ウサギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）とヤギ抗ウサギ二次抗体（ＬｉＣＯＲ）を使用し、ＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘイメージャを用いて膜をスキャンした。

【0316】

ルシフェラーゼ発現の測定を通じたインビトロ細胞傷害分析

【0317】

９６ウエルのプレートの中に１０，０００個のＯＶＣＡＲ３細胞／ウエルで播種し、１８時間後に初代末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を添加した。４時間にわたって両者をインキュベートした後、細胞を７ＡＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、アネキシンＶ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、および抗ヒトＣＤ４５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色し、次いでフローサイトメトリーに基づく細胞傷害アッセイを以前に記載されているようにして実施した（Ｐｅｒａｌｅｓ－Ｐｕｃｈａｌｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ２３（２）：４４１－５００）。Ｋ５６２とＫ５６２－ＦＳＨＲにホタルルシフェラーゼを安定にトランスフェクトした。ルシフェラーッゼを発現している２０，０００個のＫ５６２とＫ５６２－ＦＳＨＲを９６ウエルのプレートに播種し、ＰＢＭＣとともに５時間にわたってインキュベートした。インキュベーションの後、細胞を溶解させ、ルシフェラーゼの発現をＣｙｔｏＴｏｘ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて以前に記載されているようにして測定した（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ６９（１６）：６５０６－１４）。細胞傷害を、（最大生存率対照-個々のウエル）／（最大生存率対照-最大死亡率対照）×１００により、対照（マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照Ｃ１．１８．４を持つＰＢＭＣ）に対する割合または相対値として計算した。

【0318】

ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅリアルタイム細胞分析装置を用いたインビトロ細胞傷害分析

【0319】

ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅリアルタイム細胞分析装置（ＲＴＣＡ）（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、アメリカ合衆国）を用い、インピーダンスに基づいてインビトロ細胞傷害アッセイを実施した。インピーダンスは、細胞指数と呼ばれる任意単位として表わした（Ｃｕｒｄａｇｉ ｅｔ ａｌ．， ２０２１， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ）。ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ装置の９６ウエルの使い捨て減菌Ｅ－プレートに標的細胞を最終細胞濃度１×１０^４～２×１０^４個の細胞／ウエルで播種した。実験中はこの装置がＣＯ_２インキュベータの中に入れられており、制御ユニットにケーブルで接続することによって制御されていた。９６ウエルのＥ－プレートをｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ装置の中に入れて１８～２４時間インキュベートした。その後、エフェクタ細胞（ヒトＰＢＭＣ；Ｅ（エフェクタ）：Ｔ（標的）比＝５：１／１０：１）と処理を加えた。リアルタイム分析を３～７日間実施した。電気伝導度をｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ装置によって１５分ごとに無単位の細胞指数（ＣＩ）パラメータに変換し、画像は１時間間隔で取得した。生成したデータはエフェクタ細胞とＴＣＥを標的細胞に添加した時点に合わせて規格化し、ＲＴＣＡ／ＲＴＣＡ Ｐｒｏソフトウエアを用いて分析した。健康なドナーからのヒトＰＢＭＣとＴ細胞はペンシルヴェニア大学のＨｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅによって提供された。

【0320】

免疫組織化学と免疫細胞化学

【0321】

マウス腫瘍をＯＣＴ（ＴｉｓｓｕｅＴｅｋ）の中で凍結させ、凍結した切片を切断した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ポリ－Ｌ－リシンで覆ったカバースライド（Ｓｉｇｍａ）の上で増殖させた後、ヒトまたはマウスのＦＳＨＲ発現ベクターを用いてこの細胞にトランスフェクトした。次いでスライドを４％パラホルムアルデヒドで４３８固定し、０．５％トリトンＸ－１００を含むＰＢＳで透過性にした。切片を５％の正常なヤギ血清でブロックした後、Ｄ２ＡＰ１１抗体で染色し、それに続けてヒトまたはマウスのＩｇＧに対して特異的なＡＦ６４７標識二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ－５共焦点顕微鏡とＬｅｉｃａ ＬＡＳ－Ｘソフトウエア（免疫細胞化学）、またはニコンＥＣＬＩＰＳＥ ８０ｉ顕微鏡とＮＩＳ－エレメントイメージング（免疫組織化学）を利用してスライドを見た。ＴＭＡスライド（ＵＳ Ｂｉｏｍａｘ）を免疫組織化学分析のためにパラフィン処理し、再水和させた後、抗原を回収し、５％の正常なヤギ血清でブロックし、Ｄ２ＡＰ１１抗体で染色し、次いでビオチニル化された抗マウス二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で染色した。その後、ＴＭＡスライドをペルオキシダーゼ溶液（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともに、その後ＤＡＢ基質とともにインキュベートし、ヘマトキシリン（Ｌｅｉｃａ）で対比染色した。ニコンＮＩＳエレメントイメージングシステム（２０倍、スケール：５００μｍ）を用いてスライドを見て画像を取得した。

【0322】

サイトカイン分泌プロファイルの分析

【0323】

ＯＶＣＡＲ３ＦＳＨＲ（標的）細胞を１×１０４個の細胞／ウエルの密度で播種した。一晩インキュベートした後、ＰＢＭＣ（エフェクタ細胞；Ｅ：Ｔ＝５：１）と処理（Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥとｐＶａｘ１）を標的細胞に加えた。４８時間後、上清を回収し、分泌されたサイトカインを、ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘ（商標）ヒトＣＤ８／ＮＫパネル多重ビーズに基づくアッセイ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）により製造者のプロトコルに従って分析した。

【0324】

腫瘍チャレンジ

【0325】

ＮＯＤ／ＳＣＩＤ－γ（ＮＳＧ）マウスにＫ５６２細胞とＫ５６２－ＦＳＨＲ細胞でチャレンジした。ＮＳＧマウスの右脇腹に４×１０６個のＫ５６２細胞またはＫ５６２－ＦＳＨＲ細胞を皮下注射した。７日後に腫瘍を触知できるようになったとき、マウスにｐＶａｘ１（１００μｇ）またはＤ２ＡＰ１１－ＴＣＥ（１００μｇ）を接種した。同日に発現ベクターが与えられたとき、４×１０^６個のヒトＴ細胞を各マウスに腹腔内注射した。マウスにはＤＮＡを１週間空けて２回接種した。ＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲでチャレンジしたマウスモデルのため、マウスの右脇腹にＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ細胞を皮下接種した。１４日後に腫瘍を触知できるようになったとき、マウスにｐＶａｘ１（１００μｇ）またはＤ２ＡＰ１１－ＴＣＥ（１００μｇ）を接種した。同日、１０×１０^６個のヒトＴ細胞を各マウスに腹腔内注射した。マウスには２週間空けて２回接種した。腫瘍のサイズをノギス測定によって定期的にモニタした。移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の兆候が現われたとき、マウスを安楽死させた。腫瘍体積（Ｖ）は、式Ｖ＝［（長さ×幅^２）］／２によって計算した；幅は、より小さい測定値を持つ側である。動物実験はＷｉｓｔａｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの施設内動物実験委員会によって承認された。健康なドナーからのヒトＴ細胞はペンシルヴェニア大学のＨｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅによって提供された。

【0326】

統計分析

【0327】

すべての統計分析をＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて実施した。ｐ値＜０．０５を統計的に有意と見なした。実験群の平均の差は、対応のないスチューデントの両側ｔ検定を用いて、または３つ以上の定量的変数を測定した場合には一元配置分散分析を用いて計算した。誤差棒は平均の標準誤差を表わす。それぞれの時点における腫瘍サイズの間の比較は、二元配置分散分析をフィッシャーの最小有意差（ＬＳＤ）検定とともに用いて実施した。

【0328】

実験結果をこれから記述する

【0329】

抗ヒトＦＳＨＲ抗体の生成とフローサイトメトリースクリーニング

【0330】

ＦＳＨＲは腫瘍関連抗原であり、卵巣がん（Ｐｅｒａｌｅｓ－Ｐｕｃｈａｌｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ２３（２）：４４１－５００）、前立腺がん（Ｍａｒｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．，， ２００６， Ｊ Ｕｒｏｌ， １７５（６）： ２０７２－７）、およびがんの８０％の新生血管（Ｒａｄｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ， ３６３（１７）： １６２１－３０）に存在する。これは、７回膜貫通ドメインを持つＧタンパク質共役型受容体である（Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｎａｔｕｒｅ， ４３３（７０２３）：２６９－７７）。この複合体構造は古典的抗原タンパク質のアプローチにとって難題である。直接的な生体内免疫化のため、ヒトＦＳＨＲのコドン最適化配列（図６Ａ）を生成させ、表面の推定天然抗原構造に対する応答が生じるようにした。直接的なプラスミド注入に続く生体内電気穿孔を利用して抗体応答を生じさせるため、特徴づけられた発現ベクターにＦＳＨＲ ｃＤＮＡをサブクローニングし（図６Ｂ）、マウスに接種した。動物は隔週で免疫化し、各免疫化の１週間後に血清を回収して抗体レベルを分析した（図６Ｃ）。細胞膜の中に発現した天然のＦＳＨＲに結合すると考えられる抗ＦＳＨＲ抗体を検出するため、Ｋ５６２細胞にヒトＦＳＨＲ（Ｋ５６２－ＦＳＨＲ）を安定に形質導入して過剰発現させた。組み換えＦＳＨＲが正しく折り畳まれて機能することを検証するため、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）に対するＫ５６２－ＦＳＨＲ細胞の応答を調べた。予想通り、Ｋ５６２－ＦＳＨＲはＦＳＨで刺激されるとサイクリックＡＭＰの産生とＥＲＫリン酸化を増加させたが、親Ｋ５６２では応答が観察されなかった（図６ＤとＥ）。予備的な実験において、抗ＦＳＨＲ抗体Ｄ２ＡＰ１１がＦＳＨＲのＦＳＨ刺激によってＡＭＰ産生を部分的に阻止することが観察された。ＦＳＨの添加がなくＤ２ＡＰ１１抗体だけの存在下でのＫ５６２－ＦＳＨＲ細胞におけるｃＡＭＰ産生に違いは見られなかった（図６Ｆ）。これは、機構を理解し、この観察をさらに確認するのにこの領域での追加の研究が重要であることを示唆する（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１８， Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ， ２９（８）：５７１－８０２４；Ｈａｌｄａｒ ｅｔ ａｌ．， ２０２２， Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ， １８（２）：６７５－９２）。免疫血清がＦＳＨＲに結合する能力をモニタするため、Ｋ５６２（ＧＦＰ－）細胞とＫ５６２－ＦＳＨＲ（ＧＦＰ＋）細胞を同じ比率で組み合わせ、１：１０００まで希釈した血清を添加した後、抗マウスＩｇＧ ＡＰＣで標識した二次抗体を添加し（図７ＡとＢ）（Ｓａｋａｉ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ６９（１６）：６３８１－６）、Ｋ５６２－ＦＳＨＲの平均蛍光強度（ＭＦＩ）の倍数変化を野生型Ｋ５６２と比較して求めた。１：１０００の血清希釈液が２０倍のＭＦＩを超えたとき、ＦＳＨＲを過剰発現しているＡ２０細胞を用いた追加免疫により、直前の免疫化から３週間後に最後の免疫化を実施した。、追加免疫をされた動物を４日後に安楽死させ、記載されているようにしてハイブリドーマを生成させた（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．， ２０２０， Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ， １６（４）：９０７－１８；Ｂｏｒｄｏｌｏｉ ｅｔ ａｌ．， ２０２１， ＡＣＳ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｒａｎｓｌ Ｓｃｉ， ４（４）：１３４９－６１）。融合の２週間後、１５個の９６ウエルのプレートからの上清をフローサイトメトリーを利用してスクリーニングし、可能性のあるハイブリドーマを分析した（図７Ｃ）。ＭＦＩの倍数変化値の範囲は０．２～４２．２であった。ＭＦＩの倍数に基づく上位２０のクローンをさらに分析するため増殖させた（図７Ｄ）。大きな結合特異性に基づき、１つの非常に強力なクローンＤ２ＡＰ１１（ＭＦＩ倍数変化４２．２）に絞り込んだ。次に、絞り込んだこの強力な抗体の結合能力を、４つの異なる市販のマウス抗ヒトＦＳＨＲ抗体と、２５００ｎｇ／ｍｌ～９．７７ｎｇ／ｍｌの範囲の異なる濃度で比較した。図８Ａに示されているように、Ｄ２ＡＰ１１は大きな特異的結合を示し（Ｋ５６２－ＦＳＨＲ細胞）、非特異的結合は示さなかった（Ｋ５６２細胞）。市販のＡｂ＃１は、Ｋ５６２－ＦＳＨＲ細胞に対して２５００、１２５０、および６２５ｎｇ／ｍｌの濃度で大きな結合を示したが、ＦＳＨＲを発現していない野生型Ｋ５６２細胞へは非特異的結合を示した。市販のＡｂ＃３は、２５００と１２５０ｎｇ／ｍｌで中程度の結合を示したが、Ｋ５６２細胞へは大きな非特異的結合を示した。市販のＡｂ＃２と市販のＡｂ＃４の場合には、最大で２５００ｎｇ／ｍｌまでの異なる濃度で比較したときＦＳＨＲへの結合は観察されなかった。特に、Ｄ２ＡＰ１１ ｍＡｂは９．７７ｎｇ／ｍｌという低い濃度で強力な結合を示した。この強力なｍＡｂクローンの用量依存性結合が図８Ｂに示されており、ヒトＦＳＨＲ研究のための新たな強力なツールとなる。

【0331】

抗ＦＳＨＲ抗体はＦＳＨＲに大きな特異性で結合する

【0332】

一群の異なる健康なヒト組織（膵臓、肺、心臓、小腸、大腸、子宮、卵巣、および卵管内皮が含まれる）を染色することにより、Ｄ２ＡＰ１１抗ＦＳＨＲ抗体を特異性に関して細かく特徴づけた。健康な組織の大半では、Ｄ２ＡＰ１１の有意な結合は観察されなかった。Ｄ２ＡＰ１１の結合は卵巣と卵管内皮で観察され、大きな結合が、異なる卵巣がん組織で観察された（高異型度の漿液性癌、低異型度の漿液性癌、明細胞癌、未分化胚細胞腫、粘液性癌、内胚葉洞癌、および転移腺癌）（図９ＡとＢ）。追加の健康な組織と卵巣がん組織に関するさらなる研究が重要である。Ｈｅｒ２を標的とする二重特異性免疫細胞エンゲージャに焦点を絞り、どのモノクローナル抗体と小分子阻害剤が開発されて現在臨床試験が進行しているかに注目しながら、「ヒトタンパク質アトラス」のデータに基づいてＦＳＨＲの発現の違い（ＲＮＡ）をＥＲＢＢ２／Ｈｅｒ２と比較した（ＦＤＡはテベンタフスプ－ｔｅｂｎを切除不能な、または転移ブドウ膜悪性黒色腫について承認した。２０２２年４月２０日にアクセス。ｆｄａ．ｇｏｖ；ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ）。５５種類の異なるヒト組織タイプ（ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ）に関するこれらの比較は、ＦＳＨＲが卵巣がん標的免疫療法のための追加研究に値することの裏づけとなる可能性が大きい（図９Ｃ、図１０）。次いでＤ２ＡＰ１１を、ＦＳＨＲを発現している異なる細胞への結合に関してさらに詳細に特徴づけた。Ｄ２ＡＰ１１は、ＦＳＨＲを自発的に発現する卵巣がん細胞系に結合する（Ｐｅｒａｌｅｓ－Ｐｕｃｈａｌｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ２３（２）：４４１－５００；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ６９（１６）：６５０６－１４）。細胞系（ＣＡＯＶ３、ＯＶＣＡＲ３、およびＴＯＶ－２１Ｇ）はすべて、Ｄ２ＡＰ１１染色によってＦＳＨＲを予想されたように発現した（図１１Ａ）。Ｄ２ＡＰ１１によって誘起されたシグナルがＦＳＨＲに対応していたことをさらに確認するため、ＴＯＶ－２１Ｇ細胞系においてクリスパーによるＦＳＨＲの削除を実施した。Ｄ２ＡＰ１１抗体を用いたフローサイトメトリー染色により、クリスパーによるＦＳＨＲノックアウトの後はＴＯＶ－２１Ｇ細胞系への結合がないことが示された（図１１Ｂ）。ＦＳＨＲと相同なタンパク質であるＬＨＣＧＲ（配列相同性はＥＣＤで約４６％、７ＴＭＤで約７２％）（Ｕｌｌｏａ－Ａｇｕｉｒｒｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１８， Ｆｒｏｎｔ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ （Ｌａｕｓａｎｎｅ）， ９：７０７）をトランスフェクトされたＫ５６２細胞はフローサイトメトリー分析によって交差反応性を示さなかったため、このクローンはＦＳＨＲに対して非常に特異的であった（図１１Ｃ）。マウスモデル疾患は新たな療法の生体内での有効性と安全性の研究にとって重要であるため、Ｄ２ＡＰ１１がマウスＦＳＨＲにも結合できるかどうかをさらに調べた。マウスＦＳＨＲはマウス腫瘍系Ａ２０とＩＤ８－Ｄｅｆｂ２９／Ｖｅｇｆ－ａで発現したため、トランスフェクトされた細胞とトランスフェクトされていない細胞へのＤ２ＡＰ１１の結合をフローサイトメトリーによって再度調べた。Ｄ２ＡＰ１１はヒトＦＳＨＲと同様にマウスＦＳＨＲにうまく結合することが見いだされた（図１１Ｄ）。

【0333】

ＦＳＨＲ＋腫瘍細胞を検出するための抗ＦＳＨＲ抗体

【0334】

生物サンプルからのタンパク質の免疫組織化学検出は、腫瘍または他の試料からのタンパク質発現を明らかにして予後予測または治療の目的でそれらタンパク質をよりよく分類するための１つの一般的なやり方である。Ｄ２ＡＰ１１が免疫組織化学においてＦＳＨＲ＋腫瘍細胞を検出するかどうかをさらに調べるため、ＮＳＧ免疫不全マウスの体内に固形腫瘍を生じさせた。腫瘍を生じさせるため、５００万個のＫ５６２、Ｋ５６２－ＦＳＨＲ、ＯＶＣＡＲ－３、またはＴＯＶ－２１Ｇを含む５０％ＰＢＳ／マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）をＮＳＧマウスの腋窩部の脇腹に注射した。Ｄ２ＡＰ１１は、凍結した腫瘍切片からのＦＳＨＲを検出した（図１２Ａ）。ヒトＦＳＨＲを形質導入された２９３Ｔ細胞をＤ２ＡＰ１１で染色した。Ｄ２ＡＰ１１はポリクローナル抗ヒト抗体と同様にヒトＦＳＨＲに結合できたが、モックをトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞には結合できなかったため、この活性が確認される（図１２Ｂ～Ｃ）。

【0335】

抗ＦＳＨＲ抗体は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する

【0336】

Ｄ２ＡＰ１１のアイソタイプを明らかにするためＥＬＩＳＡを実施すると、Ｄ２ＡＰ１１がＩｇＧ２ａであり（図１２Ｄ）、ＡＤＣＣを誘導できるアイソタイプであることが見いだされた（Ａｋｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ４４（１１）：５１２７－３１）。最初に、ＡＤＣＣの能力を、ＦＳＨＲあり、またはなしでＫ５６２を用いて調べた。Ｄ２ＡＰ１１はＫ５６２－ＦＳＨＲに対するＰＢＭＣの細胞傷害活性を増大させることができたが、Ｋ５６２に対してはできなかった（図１２ＥとＦ）。改変されていないＦＳＨＲ＋卵巣がん細胞系に対してＡＤＣＣを誘導する能力を明らかにするため、ＯＶＣＡＲ３細胞をＰＢＭＣの中でＤ２ＡＰ１１または無関係なＩｇＧ２ａ抗体の存在下にて共培養した。卵巣がん細胞の中のＦＳＨＲの生理学的発現レベルは、特に抗体の用量を増やしていくと、Ｄ２ＡＰ１１による細胞傷害が標的とするのに十分であることが見いだされた（図１２Ｇ）。

【0337】

新規な二重特異性Ｔ細胞エンゲージャの標的となるＦＳＨＲの生成、発現、および結合

【0338】

二重特異性Ｔ細胞エンゲージャは、モノクローナル技術の分野における最近の顕著な発展を代表する。Ｄ２ＡＰ１１抗ＦＳＨＲ抗体は初期レベルのＡＤＣＣを示したため、この可能性の改善を試みた。ＦＳＨＲを標的とするＴＣＥ（Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥ）を設計した（Ｇａｒｙ ｅｔ ａｌ．， ２０２１， ｉＳｃｉｅｎｃｅ， ２４（７）：１０２６９９；Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１８， Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ， ２５（７）：１９８２－９３ ｅ４；Ｐｅｒａｌｅｓ－Ｐｕｃｈａｌｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１９， ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ． ４（８））。ＦＳＨＲ ｍＡｂのｓｃＦｖの遺伝子を最適化し、（ＵＣＨＴ１から改変した）抗ＣＤ３をコードするよう開発された最適化配列のｓｃＦｖと融合させた（図１３ＡとＢ）。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞にＤＮＡをトランスフェクトするとＤ２ＡＰ１１－ＴＣＥがインビトロで効率的に発現した（図１３Ｃ）。この新規な二重特異性は、天然のＦＳＨＲ発現がないＫ５６２細胞への非特異的結合を示さず（図１３Ｄ）、Ｋ５６２－ＦＳＨＲ細胞への結合を維持した（図１３Ｅ）。ＦＳＨＲへの結合は、ＣａＯＶ３細胞（図１３Ｆ）とＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ細胞（図１３Ｇ）でさらに確認された。Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥ二重特異性のＣＤ３への結合は、初代ヒトＴ細胞を用いて確認された（図１３Ｈ）。

【0339】

Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥは多くの卵巣腫瘍系において強力な殺傷を誘導した

【0340】

ＦＳＨＲを標的とする新規な二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ；Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥがＴ細胞の活性化を通じて細胞傷害を誘導する能力を明らかにするため、ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅリアルタイム細胞分析装置を用い、インビトロ細胞傷害アッセイをインピーダンスに基づいて実施した。標的細胞（ＯＶＩＳＥ、ＣａＯＶ３、ＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ、ＯＶＣＡＲ４、ＰＥＯ－４、および倉持－ＦＳＨＲ）をｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ装置の中に入れて１８～２４時間インキュベートした後、ヒトＰＢＭＣとＤ２ＡＰ１１－ＴＣＥを添加した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を対照として使用した；ＦＳＨＲ陰性細胞系（Ｕｒｂａｎｓｋａ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ， ３（１０）：１１３０－７）。特に、ＦＳＨＲ陰性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対するオフターゲット殺傷は観察されなかった（図１４ＡとＢ）。追加の対照として、ＦＳＨＲを発現していない他の２つの細胞（例えばＡＧＳ胃腺癌（図１４ＣとＤ）とＷＭ３７４３（図１４Ｅ）ヒト悪性黒色腫細胞）を使用すると、Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥはこれら２つの細胞でもオフターゲット毒性を誘導しなかった。ＦＳＨＲを発現しているさまざまな卵巣腫瘍細胞の評価から、Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥがＣＡＯＶ３（図１４ＦとＧ）、ＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ（図１４ＨとＩ、図１５Ａ）、ＯＶＣＡＲ４（図１４Ｊ、図１５ＢとＣ）、ＯＶＩＳＥ（図１４ＫとＬ）、ＰＥＯ－４細胞（図１４Ｍ）、および倉持－ＦＳＨＲ細胞（図１４Ｎ）を非常に効率的に殺傷することが実証された。用量に依存した殺傷が、ＯＶＩＳＥ－ＦＳＨＲ細胞とＯＶＣＡＲ３細胞においてＤ２ＡＰ１１－ＴＣＥとヒトＰＢＭＣ／Ｔ細胞の存在下で観察され、ＥＣ５０値はそれぞれ２４．７ｎｇ／ｍｌと１５．９ｎｇ／ｍｌであった（図１４ＯとＰ、図１６）。ＯＶＣＡＲ４は高異型度の漿液性卵巣腺癌細胞系であり、表面受容体を明確に陽性発現することが報告されている；ＦＳＨＲ（ｄｅｐｍａｐ．ｏｒｇ）とＤ２ＡＰ１１－ＴＣＥはこの細胞系においてヒトＰＢＭＣとヒトＴ細胞の存在下で強力な殺傷を誘導した（図１４Ｊ、図１５ＢとＣ）。研究した卵巣腫瘍系はさまざまながんドライバー変異を持ち、多くの抗がん薬に対する抵抗性を示す（表１）。注目すべきことに、倉持とＰＥＯ－４はＢＲＣＡ２変異を持ち、後者はＰＡＲＰ阻害剤に対する抵抗性も示す（Ｓａｋａｉ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ６９（１６）：６３８１－６、Ｈｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１８， Ｎａｔｕｒｅ， ５６３（７７３２）：５２２－６）。このアッセイでは、これら２つの抵抗性卵巣腫瘍系でもＤ２ＡＰ１１－ＴＣＥ殺傷からの逃避はない。画像（図１４Ｄ、Ｆ、およびＨ）に示されているように、エフェクタ細胞の添加とＤ２ＡＰ１１－ＴＣＥを用いた処理の３日後、処理されたウエルでは付着した腫瘍細胞は観察されなかった。しかし対照ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（図１４Ｂ）では、エフェクタ細胞とＤ２ＡＰ１１－ＴＣＥを添加してから２～３日後、全細胞が健康に増殖していることが見いだされた。それに加え、ヒトＩＬ－１３受容体アルファ２を標的とする無関係なＴＣＥ（ＩＬ１３Ｒα２－ＴＣＥ）は、ＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ細胞の中でヒトＰＢＭＣの存在下において毒性を示さなかった。これは、ＦＳＨＲを発現した腫瘍を特異的に殺傷するというＤ２ＡＰ１１アームの役割を示す（図１７）。注目すべきことに、Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥは、Ｄ２ＡＰ１１抗体と比べたとき、ほぼ１０００倍低い濃度でＦＳＨＲ陽性ＯＶＣＡＲ４細胞に有意な毒性を誘導することができた。これは、Ｄ２ＡＰ１１が、その二重特異性エンゲージャ；Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥとしての設計を通じて殺傷有効性を増強されたことを示す（図１８ＡとＢ）。Ｄ２ＡＰ１１とＤ２ＡＰ１１－ＴＣＥのＥＣ５０値が得られ、それぞれ３０．３μｇ／ｍｌと１１．３ｎｇ／ｍｌであった。これは、Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥが、抗ＦＳＨＲ ａｂであるＤ２ＡＰ１１と比べて約１０００倍大きい効力であることを示す（図１８ＣとＤ）。

【0341】

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【0342】

ＦＳＨＲを標的とする新規なＴ細胞エンゲージャのサイトカイン分泌プロファイル

【0343】

サイトカインは、リンパ球の増殖、生存、分化、および活性化の促進に関与する（Ｒｏｍａｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｂｌｏｏｄ， １２４（２２）：３２４１－９）。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャとＣＡＲに関するさまざまな知見は、標的細胞に連結したときに分泌されるサイトカインが抗原特異的誘引の近傍で抗原陰性腫瘍細胞を溶解させることを示唆する（Ｓｌａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１８， Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ， ８（８）：９２４－３４）。次に、Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥのサイトカイン分泌プロファイルを調べた。ＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ標的細胞＋ヒトＰＢＭＣをＤ２ＡＰ１１－ＴＣＥとともにインキュベートすると、ＩＦＮ－γ、２３７可溶性Ｆａｓ（ｓＦａｓ）、グランザイムＡ、グランザイムＢ、およびパーフォリンが空ベクター対照と比べて４８時間の時点で有意に誘導され、このコンストラクトはロバストな腫瘍抗原特異的殺傷を駆動する（図１９Ａ）。これらのエフェクタサイトカインは、腫瘍微小環境を変化させ、内在性抗腫瘍免疫を誘導する能力を持つことが知られている（Ｓｌａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１８， Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ， ８（８）：９２４－３４）。

【0344】

ＦＳＨＲを標的とするＴ細胞エンゲージャは生体内腫瘍量を減らした

【0345】

Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥの生体内抗腫瘍効果を評価するため、生体内チャレンジモデルを開発した。このモデルのため、Ｋ５６２細胞、またはＦＳＨＲを過剰発現しているＫ５６２細胞（Ｋ５６２－ＦＳＨＲ）を投与されたＮＳＧマウスを使用した（図１９Ｂ）。マウスに、Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥをコードするＤＮＡ（１００μｇ）とヒトＴ細胞を記載されているようにして接種した。興味深いことに、Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥで治療した群または空ベクター対照群の両方で、Ｋ５６２でチャレンジされたマウスに腫瘍逃避が存在していた（図１９Ｃ）が、Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥ治療群では、Ｋ５６２－ＦＳＨＲチャレンジ群の中の空ベクター対照と比べて腫瘍体積が有意に減少した（図１９Ｄ）。このモデルにおけるＤ２ＡＰ１１－ＴＣＥの特異性と効力を確認した後、ＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲでチャレンジした卵巣腫瘍マウスモデルにおけるその効果を調べた。腫瘍移植の１４日後、生体内で抗体を生成させるため、マウスに、Ｄ２ＡＰ１１－ＴＣＥをコードするＤＮＡ（１００μｇ）、または空ベクター（１００μｇ）を２週間空けて２回投与した。１４日目、マウスにヒトＴ細胞（１０００万個／マウス）を接種し、腫瘍体積を定期的に測定した（図１９Ｅ）。この二重特異性を用いた治療はＯＶＣＡＲ３－ＦＳＨＲ腫瘍を有するマウスにおいて腫瘍量を有意に低下させるに至ったが、対照群では同様の影響は観察されなかった（図１９Ｆ）。これは、ＯＣに対する治療法開発のためのこの新規なアプローチの可能性を裏づけている。

【0346】

実施例３：卵巣がんにおける免疫チェックポイント阻害剤

【0347】

免疫チェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）はいくつかのがんの生存率を劇的に改善しており、卵巣がん（ＯＣ）で評価中である。残念なことに、ＣＰＩはＯＣにおいて全体的に不満足な結果を示している。

【0348】

図２０は、Ｄ２ＡＰ１１－ＢＴＥが卵巣がん細胞においてニボルマブ（抗ＰＤ１抗体）による殺傷を相乗的に増強することを示す。

【0349】

図２１は、Ｄ２ＡＰ１１－ＢＴＥが卵巣がん細胞においてペムブロリズマブ（抗ＰＤ１抗体）による殺傷を相乗的に増強することを示す。

【0350】

図２２は、Ｄ２ＡＰ１１－ＢＴＥが卵巣がん細胞において抗ＣＴＬＡ４抗体による殺傷を相乗的に増強することを示す。

【0351】

実施例４：ＣＡＲ分子

【0352】

図２３は、ＦＳＨＲを標的とする９ｈ１１（Ｄ２ＡＰ１１）クローンに基づくＣＡＲ Ｔ細胞の開発を示す。ＣＡＲ Ｔ細胞は、膜貫通ドメインと少なくとも１つの細胞内ドメイン（４１ｂｂ、ＣＤ２８、またはＣＤ３ｚ）に連結されたＦＳＨＲを標的とするｓｃＦｖを発現する。

【0353】

配列

【0354】

ｈｕ９ｈ１１×ＣＤ３ ＢＴＥ（Ｄ２ＡＰ１１とも呼ばれる）

【0355】

配列番号１ － ＤＮＡ配列
ＡＴＧＧＡＴＴＧＧＡＣＡＴＧＧＡＴＴＣＴＧＴＴＣＣＴＧＧＴＣＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＡＡＧＡＧＴＧＣＡＴＴＣＣＧＡＴＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＴＴＣＡＡＧＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＣＴＧＴＧＧＧＣＧＡＴＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＡＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＣＴＡＣＧＧＣＡＴＣＴＣＣＴＴＣＣＴＧＡＡＴＴＧＧＴＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＡＡＣＣＡＧＣＧＧＴＣＣＧＧＡＧＴＧＣＣＡＴＣＴＣＧＣＴＴＣＴＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＡＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＡＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＡＴＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＡＡＧＧＡＧＧＴＧＣＣＴＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＡＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＡＧＧＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＣＴＣＴＣＴＧＡＧＧＣＴＧＴＣＴＴＧＴＡＧＣＴＴＣＴＣＣＧＧＣＴＴＴＴＣＴＣＴＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＧＡＡＴＧＧＧＡＧＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＧＡＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＣＣＡＣＡＴＣＴＧＧＴＧＧＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＣＧＧＴＡＣＡＡＣＣＣＣＧＣＣＣＴＧＡＡＧＴＣＴＣＧＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＧＴＧＧＡＴＡＧＧＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＡＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＣＡＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＴＧＣＡＧＡＴＣＡＡＣＴＡＣＧＧＣＡＡＴＴＡＴＣＧＧＴＴＴＧＡＴＡＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＣＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＧＴＣＴＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＡＡＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＣＧＡＡＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＡＧＧＣＧＧＣＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣＣＧＧＡＴＡＣＴＣＴＴＴＣＡＣＣＧＧＣＴＡＴＡＣＡＡＴＧＡＡＴＴＧＧＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＣＡＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＧＧＣＣＣＴＧＡＴＣＡＡＣＣＣＡＴＡＣＡＡＧＧＧＣＧＴＧＡＧＣＡＣＣＴＡＴＡＡＴＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＡＴＡＧＧＴＴＴＡＣＣＡＴＣＴＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＴＡＡＧＡＡＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＴＴＡＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＣＡＧＧＡＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＴＧＧＣＧＡＴＴＣＣＧＡＣＴＧＧＴＡＴＴＴＴＧＡＣＧＴＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＡＧＴＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＧＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＡＡＧＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＡＧＣＧＴＣＧＧＣＧＡＴＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＴＡＧＡＧＣＣＴＣＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＣＧＧＡＡＣＴＡＣＣＴＧＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＡＴＡＣＡＡＧＣＡＧＡＣＴＧＧＡＧＴＣＣＧＧＣＧＴＧＣＣＴＴＣＴＣＧＧＴＴＣＴＣＣＧＧＡＴＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＡＴＴＡＣＡＣＣＣＴＧＡＣＡＡＴＣＴＣＴＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＴＴＧＣＣＡＣＡＴＡＣＴＡＴＴＧＴＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＴＡＣＴＣＴＧＣＣＴＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＡＡＣＡＡＡＡＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＴＣＡ

【0356】

配列番号２ - アミノ酸配列
ＭＤＷＴＷＩＬＦＬＶＡＡＡＴＲＶＨＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦＬＮＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＱＲＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＳＫＥＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＳＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＧＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＨＩＷＷＤＤＤＫＲＹＮＰＡＬＫＳＲＦＴＬＳＶＤＲＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＴＹＹＣＶＱＩＮＹＧＮＹＲＦＤＮＷＧＨＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＬＩＮＰＹＫＧＶＳＴＹＮＱＫＦＫＤＲＦＴＩＳＶＤＫＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＧＹＹＧＤＳＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＮＴＬＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＳＳ＊＊

【0357】

配列番号３ - ＦＳＨＲ ＳｃＦｖ - ＩｇＥリーダー配列なし
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＳＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＧＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＨＩＷＷＤＤＤＫＲＹＮＰＡＬＫＳＲＦＴＬＳＶＤＲＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＴＹＹＣＶＱＩＮＹＧＮＹＲＦＤＮＷＧＨＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦＬＮＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＱＲＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＳＫＥＶＰＷＴＦＧQＧＴＫＶＥＩＫ

【0358】

ｈｕ９ｈ１１ｂｂｚ ＣＡＲＴコンストラクト（配列番号４）
ＭＤＷＴＷＩＬＦＬＶＡＡＡＴＲＶＨＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＳＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＧＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＨＩＷＷＤＤＤＫＲＹＮＰＡＬＫＳＲＦＴＬＳＶＤＲＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＴＹＹＣＶＱＩＮＹＧＮＹＲＦＤＮＷＧＨＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦＬＮＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＱＲＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＳＫＥＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＱＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ＊＊：

【0359】

ｈｕ９ｈ１１２８ｚ ＣＡＲＴコンストラクト（配列番号５）：
ＭＤＷＴＷＩＬＦＬＶＡＡＡＴＲＶＨＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＳＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＧＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＨＩＷＷＤＤＤＫＲＹＮＰＡＬＫＳＲＦＴＬＳＶＤＲＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＴＹＹＣＶＱＩＮＹＧＮＹＲＦＤＮＷＧＨＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦＬＮＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＱＲＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＳＫＥＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＱＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ＊＊

【0360】

ｈｕ９ｈ１１２８ｂｂｚ ＣＡＲコンストラクト（配列番号６）：
ＭＤＷＴＷＩＬＦＬＶＡＡＡＴＲＶＨＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＳＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＧＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＨＩＷＷＤＤＤＫＲＹＮＰＡＬＫＳＲＦＴＬＳＶＤＲＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＴＹＹＣＶＱＩＮＹＧＮＹＲＦＤＮＷＧＨＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦＬＮＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＱＲＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＳＫＥＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＱＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ＊＊

【0361】

これまでの詳細な記述と添付の実施例は単なる説明例であり、本発明の範囲を制限すると取ってはならず、本発明の範囲は添付の請求項とその等価物によってだけ規定されることを理解されたい。

【0362】

開示されている実施形態に対するさまざまな変更と改変は当業者に明らかであろう。そのような変更または改変は、本発明の化学構造、置換体、誘導体、中間体、合成、組成物、製剤、または利用の方法に関する非限定的な例としての変更または改変を含め、その精神と範囲から逸脱することなく実施することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A-6F】

【図7A-7D】

【図8A-8B】

【図9A-9C】

【図10A-10B】

【図11A-11D】

【図12A-12G】

【図13A-13H】

【図14A-14P】

【図15A-15C】

【図16A-16C】

【図17】

【図18A-18D】

【図19A-19F】

【図20】

【図21】

【図22-1】

【図22-2】

【図23】

【配列表】

2024537214000001.xml

【国際調査報告】