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特表2024-537244好ましくは血糖コントロールと組み合わせた、血管新生コントロール
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-10
(54)【発明の名称】好ましくは血糖コントロールと組み合わせた、血管新生コントロール
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20241003BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20241003BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20241003BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20241003BHJP
A61P 25/02 20060101ALI20241003BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20241003BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20241003BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20241003BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241003BHJP
A61K 38/08 20190101ALI20241003BHJP
A61K 38/07 20060101ALI20241003BHJP
A61K 38/10 20060101ALI20241003BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20241003BHJP
A61K 38/28 20060101ALI20241003BHJP
A61K 38/18 20060101ALI20241003BHJP
C07K 4/00 20060101ALN20241003BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
A61P13/12
A61P27/02
A61P25/00
A61P25/02
A61P17/02
A61P3/10
A61P9/00
A61P43/00 121
A61K38/08
A61K38/07
A61K38/10
A61K38/02
A61K38/28
A61K38/18
C07K4/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024521233
(86)(22)【出願日】2022-10-05
(85)【翻訳文提出日】2024-06-04
(86)【国際出願番号】 NL2022050558
(87)【国際公開番号】W WO2023059188
(87)【国際公開日】2023-04-13
(31)【優先権主張番号】63/252,488
(32)【優先日】2021-10-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523112013
【氏名又は名称】バイオテンプト ベー．フェー
(71)【出願人】
【識別番号】524130098
【氏名又は名称】リシリアン ベー．フェー．
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(72)【発明者】
【氏名】ヴェンスフォールト，ヘルト
【テーマコード（参考）】
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA17
4C084AA19
4C084AA20
4C084BA01
4C084BA03
4C084BA16
4C084BA17
4C084BA18
4C084CA59
4C084DB34
4C084DB52
4C084MA02
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZA011
4C084ZA012
4C084ZA201
4C084ZA202
4C084ZA331
4C084ZA332
4C084ZA361
4C084ZA362
4C084ZA811
4C084ZA812
4C084ZA891
4C084ZA892
4C084ZC351
4C084ZC352
4C084ZC411
4C084ZC412
4C084ZC75
4H045AA30
4H045BA15
4H045EA20
4H045FA10
(57)【要約】
本発明は、明確に異なりかつ新たに出現するクラスの薬物：オートファジー阻害化合物として作用し、機構的ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）の栄養素感知系を標的化し、血管新生活性を誘導する、ｍＴＯＲのペプチドモジュレーター、に関する。本発明は、好ましくは血糖コントロールに付随して、血管新生コントロールを達成または維持するために、脈管障害、特に、糖尿病性脈管障害を予防または処置するための製剤、方法および手段を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象の脈管障害の予防または処置における血管新生活性の誘導を含む血管新生コントロールにおける使用のための、ｍＴＯＲのオートファジー阻害モジュレーターであって、前記モジュレーターが、アミノ酸の供給源、好ましくは、ペプチドを含み、前記アミノ酸が、少なくとも５０％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）およびアスパラギン（Ｎ）からなる群から選択される、モジュレーター。
【請求項2】
腎症の予防または処置における使用のための、請求項１に記載のモジュレーター。
【請求項3】
末期腎疾患の予防または処置における使用のための、請求項１または２に記載のモジュレーター。
【請求項4】
網膜症の予防または処置における使用のための、請求項１に記載のモジュレーター。
【請求項5】
盲目の予防または処置における使用のための、請求項１または４に記載のモジュレーター。
【請求項6】
神経障害の予防または処置における使用のための、請求項１に記載のモジュレーター。
【請求項7】
末梢糖尿病性神経障害の予防または処置における使用のための、請求項１または６に記載のモジュレーター。
【請求項8】
糖尿病性潰瘍の予防または処置における使用のための、請求項１、６または７に記載のモジュレーター。
【請求項9】
前記対象が、血糖コントロールを達成または維持するための処置も為される、請求項１～８のいずれか一項に記載のモジュレーター。
【請求項10】
前記対象が、血糖コントロールを達成または維持するためのインスリンによる処置も為される、請求項９に記載のモジュレーター。
【請求項11】
前記脈管障害が、糖尿病性脈管障害を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のモジュレーター。
【請求項12】
前記対象が、Ｃ－ペプチド欠乏を有しているかまたは有することが疑われる、請求項１～１１のいずれか一項に記載のモジュレーター。
【請求項13】
成長因子およびｍＴＯＲのオートファジー阻害モジュレーターの製剤であって、前記モジュレーターが、アミノ酸の供給源、好ましくは、ペプチドを含み、前記アミノ酸が、少なくとも５０％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）およびアスパラギン（Ｎ）からなる群から選択される、製剤。
【請求項14】
前記成長因子が、血糖コントロールにおける使用のためのインスリンと、血管新生コントロールにおける使用のためのｍＴＯＲのオートファジー阻害モジュレーターとを含む、請求項１３に記載の製剤。
【請求項15】
請求項１３または１４に記載の製剤を含む医薬製剤。
【請求項16】
対象の脈管障害の予防または処置における血管新生活性の誘導における使用のための、請求項１３～１５のいずれかに記載の製剤。
【請求項17】
腎症の予防または処置における使用のための、請求項１６に記載の製剤。
【請求項18】
末期腎疾患の予防または処置における使用のための、請求項１６または１７に記載の製剤。
【請求項19】
網膜症の予防または処置における使用のための、請求項１６に記載の製剤。
【請求項20】
盲目の予防または処置における使用のための、請求項１６または１９に記載の製剤。
【請求項21】
神経障害の予防または処置における使用のための、請求項１６に記載の製剤。
【請求項22】
末梢糖尿病性神経障害の予防または処置における使用のための、請求項１６または２１に記載の製剤。
【請求項23】
糖尿病性潰瘍の予防または処置における使用のための、請求項１６、２１または２２に記載の製剤。
【請求項24】
前記脈管障害が、糖尿病性脈管障害を含む、請求項１３～２３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項25】
前記対象が、Ｃ－ペプチド欠乏を有しているかまたは有することが疑われる、請求項１３～２４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項26】
ｍＴＯＲのオートファジー阻害モジュレーターを対象に投与するステップを含む、対象の脈管障害の予防または処置において血管新生活性を誘導するための方法であって、前記モジュレーターが、アミノ酸の供給源、好ましくは、ペプチドを含み、前記アミノ酸が、少なくとも５０％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）およびアスパラギン（Ｎ）からなる群から選択される、方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、薬物の明確に異なりかつ新たに出現するクラス：オートファジー阻害化合物として作用し、ラパマイシン（rapamycine）の機構的標的（ｍＴＯＲ）の栄養素感知系を標的化し、オートファジーを阻害する、ｍＴＯＲのペプチドモジュレーターに関する。本発明は、血管新生コントロールを発揮するための医薬製剤、方法および手段を提供し、これらは、単独使用のためのものであると共に、特に、前記血管新生コントロールに付随して血糖コントロールを発揮するための確立されたインスリン製剤、方法および手段と組み合わされる。
【背景技術】
【0002】
真性糖尿病は、高血糖を引き起こす、全体的なインスリン欠乏または欠損したインスリン機能が原因の内分泌障害である。１型糖尿病は、通常、若年患者に見られ、世界的に症例の５％～１０％を占め、膵臓のＢ島細胞の自己免疫性破壊に続発すると考えられる。２型糖尿病は、世界的に症例の９０％～９５％を占め、遺伝的および環境的要因が原因であると考えられ、結果として生じるインスリン抵抗性および膵ベータ細胞機能障害を伴う。高血糖から生じる合併症は、大血管性または微小血管性のいずれかであり得る。大血管性疾患は、心血管および脳血管系を主に冒し、微小血管性疾患は、腎症、網膜症および神経障害を含む。真性糖尿病における血糖コントロールは、多くの場合、膵島のベータ細胞の作用を置き換えて、インスリンの必要を検出し、患者の身体の必要に従ってインスリンが投与されるようにすることを必要とする。インスリンは、天然のホルモンであり、多数の病状に必須の薬物療法である。インスリンの最も重大な用途の１つは、１型真性糖尿病および２型真性糖尿病にある。インスリンは、妊娠糖尿病の管理における使用の必要が示される僅かな薬物療法の１つである。真性糖尿病患者において（Dave HD, Preuss CV. Human Insulin. [Updated 2021 Feb 17]. 以下に収載: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2021 Jan-. 以下から利用可能：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK545190/）、真性糖尿病がない健康な成人におけるような同様の２４時間インスリン活性による正常な血糖コントロールの目標に達するために、作用の規定された開始、ピークおよび持続時間を有するある単一のインスリン製剤は、多くの場合、役に立たないと考慮される。したがって、異なる薬物動態を有する異なる種類のインスリンの必要がある。作用機序に基づき、少なくとも４つの異なる型のインスリンアナログが存在する。速効型インスリンは、作用の急速開始（約３０分間未満）、約１時間目のピーク作用および作用の短い持続時間（最大５時間）を有する。インスリンリスプロおよびインスリンアスパルトが、速効型インスリンの例である。これらのインスリンは、特に摂食後状態における、血糖コントロールの達成に役立つ。短時間作用型インスリンアナログ活性は、約３０～６０分間で始まり、２～４時間目にピークに達し、活性は約８時間持続する。これらのインスリンアナログ、例えば、インスリングルリシンは、有効性のために食事のおよそ２０～３０分前に投与しなければならない。速効型または短時間作用型インスリンアナログ（インスリンリスプロ、インスリンアスパルトおよびインスリングルリシン等）は典型的に、レギュラーヒトインスリンよりも速く作用する。中時間作用型インスリンアナログは、１～２時間目前後の活性の開始、６～１０時間目のピーク作用および最大約１６時間の作用の持続時間を有する。中性プロタミンハーゲドルン（Neutral protamine Hagedorn）（ＮＰＨ）およびレンテインスリンは、中時間作用型インスリンアナログの例である。長時間作用型インスリンアナログの一部は、インスリンデテミルおよびインスリングラルギンである。これらの活性は、２時間目前後に始まり、６～２０時間のピーク効果であり、最大約３６時間持続する。中時間作用型および長時間作用型（基礎）インスリンは、１型、２型または妊娠糖尿病の患者に推奨される。これらは、他の型の糖尿病（すなわち、ステロイド誘導性）において使用することもできる。１型糖尿病の人は一般に、レギュラーまたは速効型インスリンと併せて、中時間作用型インスリンまたは長時間作用型インスリンを使用して、血糖コントロールを達成する。２型糖尿病の人は、レギュラーもしくは速効型インスリンと併せてまたは経口薬物療法と併せて、中時間作用型または長時間作用型インスリンを使用して、血糖コントロールを達成することができる。
【0003】
しかし、血糖コントロールの達成または発揮は、内在性インスリン欠乏患者のあらゆる病気を消散させる訳ではない。特に、インスリン欠乏による全体的な状態における糖尿病性脈管障害、例えば、網膜症、末梢神経障害（ＤＰＮ）は、最良の血糖コントロールによっても消散しない、真性糖尿病のよく知られた微小血管性合併症である。ＤＰＮは、例えば、さらなる感染を生じ、糖尿病性足部潰瘍（図１）、非外傷性切断および死亡のリスクを増加させる。高血糖と共に低血糖が、ＤＰＮの発症において重要な役割を果たすが、集中的な血糖コントロール（インスリンによるまたはインスリンによらない）は、糖尿病患者におけるＤＰＮを発症するリスクを排除せず、インスリンの欠如および／または不安定なグルコース代謝以外の因子が、ＤＰＮ発症に関与し得ることを示唆する。末梢血中のＣ－ペプチドレベルは、インスリン分泌の最も適切な尺度として広く受け入れられており、肝臓を介した初回通過代謝において排出されない。インスリン合成の不活性副産物であると以前に考慮されていたが、Ｃ－ペプチドは、ホルモン的に活性なペプチドである。１型糖尿病において、イタリアの研究（Panero et al. Fasting plasma C-peptide and micro- and macrovascular complications in a large clinic-based cohort of type 1 diabetic patients. Diabetes Care. 2009;32:301-5）は、Ｃ－ペプチドレベルと、神経障害を含む微小血管性合併症との間の有意なかつ負の関連を実証した。典型的にはＣ－ペプチド欠乏は、これらの微小血管性合併症と関連し、これは、そのような患者を外来性Ｃ－ペプチドで処置する試みの動機となる。糖尿病の動物モデルおよび１型糖尿病患者におけるいくつかの研究は、糖尿病における末梢および自律神経機能の両方におけるＣ－ペプチド補充の有益な効果を実際に実証した（Johansson et al. Beneficial effects of C-peptide on incipient nephropathy and neuropathy in patients with Type 1 diabetes mellitus. Diabetic Med. 2000;17:181-9.）。２型糖尿病において、中国の（Chinees）研究によると（Qiao et al. C-peptide is independent associated with diabetic peripheral neuropathy: a community-based study. Diabetol Metab Syndr 9, 12 (2017)）、Ｃ－ペプチドレベルは、ＤＰＮを伴う微小血管性合併症とも有意にかつ負に関連した。内在性Ｃ－ペプチドは、我々の脈管系の血管新生コントロールによる脈管障害の消散に寄与し、前記脈管系において血管新生活性を発揮すると考えられる。低いＣ－ペプチドレベルを有する患者において、網膜症、腎症および神経障害を伴う脈管障害の高い有病率が観察される。身体に対する末梢神経障害性変化は、足の感覚の減少をもたらし、糖尿病性足部に機械的または圧力傷害による創傷の傾向を持たせる。微小血管性変化は、四肢への血流低減および創傷の治癒の遅延をもたらし得る。誘発因子はほとんどの場合軽度の外傷であるため、この合併症は予防することができる。これらの皮膚性傷害の早期同定は、進行のリスクを減少させつつ、アウトカム改善を生じることもできる。
【0004】
しかし、１型糖尿病および神経障害を有する対象における長時間作用型（ペグ化）Ｃ－ペプチドの有効性および安全性を評定する臨床治験は、その主要エンドポイントを満たすことができなかった（Wahren et al., Long-acting C-peptide and neuropathy in type 1 diabetes: A 12-month clinical trial. Diabetes Care. 2016 Apr;39(4):596-602.）。１型糖尿病および末梢神経障害を有する総計２５０名の患者は、５２週間にわたり０．８ｍｇ（ｎ＝７１）または２．４ｍｇ（ｎ＝７３）またはプラセボ（ｎ＝１０６）の毎週投薬量において長時間作用型（ペグ化）Ｃ－ペプチドを受けた。５２週間にわたる長時間作用型Ｃ－ペプチドの週１回の皮下投与は、両側性腓腹神経伝導速度（ＳＮＣＶ）も、他の電気生理学的変数も、修正トロント臨床神経障害スコア（modified Toronto Clinical Neuropathy Score）（ｍＴＣＮＳ）も改善しなかったが、プラセボと比較した振動覚閾値（ＶＰＴ）の改善のみをもたらし、この製剤中のＣ－ペプチドは、血管新生コントロールを生じなかった。
【0005】
足部の感染性壊疽は、糖尿病の重篤な合併症である。これは通常、一定レベルの下肢切断（ＬＥＡ）を生じる。足部壊疽は、不適切な血流供給に起因する、足部における死んだ組織として定義される。これは、重大な肢虚血の最終徴候の１つである。これは、閉塞した末梢循環または微生物感染によって引き起こされ得る。糖尿病患者における足部潰瘍は、主に末梢動脈疾患が原因で、足部壊疽開始の増加したリスクがある。足部壊疽は、両極端：（図１Ａ）虚血性および壊死性組織を有するが感染はない、乾性壊疽発症を伴う足部潰瘍の早期徴候から、（図１Ｂ）感染性および壊死性組織の両方を有する湿性壊疽の後期徴候に及ぶ。よって、乾性壊疽は、湿性壊疽につながる場合がある。乾性壊疽のより顕著なステージにおいて、罹患部は多くの場合、暗い緑色または紫色、ほとんど黒色の色によって特徴付けされる。湿性壊疽は、水疱および腫脹を伴う湿った外観を有する。湿性壊疽は、凍傷を有するかまたは重度熱傷を経験する人々においても起こり得る。糖尿病を有する人々は、例えば、水虫において見られるもの等、軽微な足指または足部傷害を経験した後に、最終的に湿性壊疽を発症し得る。四肢への血流は一般に、糖尿病を有する人々において縮小される。これは、これらの区域における組織が、速く治癒することができないことを意味する。結果として、より容易に感染が発症し得る。湿性壊疽は、速く拡散することができ、無処置のままでいた場合、致死性となり得る。典型的には、そのような患者は、敗血症を急速に発症し、死亡する。
【0006】
あらゆる形態の壊疽のための処置には、死んだ組織を除去すること、感染の可能な拡散を処置および停止すること、ならびに壊疽を引き起こした状態を処置することが関与する。処置は、死んだ組織を除去して、感染が拡散するのを防ぐための外科手術（デブリードマンとも呼ばれる）を含むことができる。罹患した肢、手、手指、足部または足指を除去することが必要となり得る。時には、外科手術の代わりに、ハエの幼虫の蛆虫が潰瘍創傷上に置かれ、そこで蛆虫は、健康な組織を傷つけることなく、死んだ組織および感染した組織を食べる。抗生物質を使用して、感染を処置または予防することができ、高気圧酸素療法は、糖尿病または末梢動脈疾患に関係する湿性壊疽または潰瘍を処置することができる。
【0007】
よって、感染性壊疽は、肢および生命の両方を脅かす疾患である。抗生物質および創傷被覆材による適正な医学的処置は、壊死性および感染性組織を除去するための時宜を得た外科手術なしでは有効ではなく、最終的に肢の切断をもたらす可能性がある。しかし、報告は、糖尿病関連切断を行った患者が、切断の病因学に関係なく、４０～４８％の５年生存率による高い死亡リスクを依然として有することを示しており（Huang et al., Survival and associated risk factors in patients with diabetes and amputations caused by infectious foot gangrene. J Foot Ankle Res. 2018 Jan 4;11:1.）、図２も参照されたい。
【0008】
真性糖尿病（１または２型）患者は、２５％（一部は５０％を報告）もの高さの糖尿病性足部潰瘍合併症の全生涯リスクを有し、イングランド単独で既にＮＨＳに対する９億３５００万ポンドの推定費用を伴う（Diabetic foot care in England: an economic study - Marion Kerr, Insight Health Economics, 2017）。不適切な処置を受けた（ill-treated）糖尿病性潰瘍の最終結果は、全罹患率の増加である（Packer CF, Ali SA, Manna B. Diabetic Ulcer. [Updated 2021 Feb 20]. In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2021 Jan-.以下から利用可能：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK499887/）。
【0009】
指し示される通り、糖尿病性潰瘍形成は、悪化した血糖コントロールの条件下で増悪およびスピードアップされる。Ｐｅｌｅｄら（Association of Inpatient Glucose Measurements With Amputations in Patients Hospitalized With Acute Diabetic Foot, The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, Volume 104, Issue 11, November 2019, Pages 5445-5452）は、いずれかの高血糖およびいずれかのまたは重度の低血糖を経験する患者が、入院中にいずれかのまたは大切断を受ける可能性が高かったことを見出す。高い血糖可変性は、大切断に関連した。末梢血管性疾患（ＰＶＤ）、高いワグナー（Wagner）スコアおよび低血糖は、切断の独立した予測因子であった。高齢、末梢血管性疾患（ＰＶＤ）、以前の切断、上昇した白血球細胞レベル、高いワグナースコアおよび低血糖は、大切断の独立した予測因子であった。そのうち４７例がメタ解析において含まれた６０例の観察研究の系統的な総説において（Lane et al., Glycemic control and diabetic foot ulcer outcomes: A systematic review and meta-analysis of observational studies. J Diabetes Complications. 2020 Oct;34(10):107638.）、高血糖（より高いＡ１Ｃおよびより高い空腹時グルコース）は、糖尿病性足部潰瘍を有する対象の間の下肢切断の見込み増加に関連した。Ｌａｎｅらの知見は、８％以上のＡ１Ｃレベルおよび１２６ｍｇ／ｄｌ以上の空腹時グルコースレベルが、現存する糖尿病性足部潰瘍を有する患者における下肢切断の見込み増加に関連することを示唆する。
【0010】
糖尿病性潰瘍は、それ自体が患者を衰弱させるのみならず、不適切な処置を受けた（ill-treatable）足部潰瘍が原因の非外傷性下肢切断のリスクは、非糖尿病患者と比較して、糖尿病患者において１５倍高い。糖尿病患者は、下肢切断、より高い医療費およびより低いクオリティ・オブ・ライフの高いリスクがある（Song K, Chambers AR. Diabetic Foot Care. [Updated 2021 Jul 31]. In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2021 Jan-.以下から利用可能：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK553110/）。真性糖尿病および末梢血管性疾患の患者の非外傷性切断に関する系統的な研究において（Thorud et al., Mortality After Nontraumatic Major Amputation Among Patients With Diabetes and Peripheral Vascular Disease: A Systematic Review. J Foot Ankle Surg. 2016 May-Jun;55(3):591-9）、膝より下の切断後の患者の５年死亡率は、４０～８２％であり、膝より上の切断後の死亡率は、４０～９０％であった。これらの合併症の多くは、徹底的な毎年の足部試験および患者によって行われるルーチンのフットケアによって予防可能である。正しいフットケア施術に関する患者教育は、糖尿病性足部疾患の予防の現在の土台である。足部潰瘍は、糖尿病を有する人々の病院滞在の一般的な理由である。足部潰瘍が治癒するには数週間またはさらには数カ月間を要する場合がある。糖尿病性潰瘍は多くの場合、無痛性である（足部における感覚減少が原因で）。潰瘍化した糖尿病性足部の処置は、複合的な問題である（Lepantalo et al., Chapter V: Diabetic foot. Eur J Vasc Endovasc Surg. 2011 Dec;42 Suppl 2:S60-74.）。虚血、神経障害および感染は、糖尿病性足部合併症を生じる３つの病理学的構成成分であり、これらは高頻度で、病原学的三徴候として一緒に起こる。神経障害および虚血は、ほとんどの場合、一緒に神経虚血（neuroischaemia）として生じるが、開始因子であり、一方、感染は大部分が結果である。さらに、潰瘍の治癒は、微小血管性機能障害によって妨害される。ガイドラインは、潰瘍化した糖尿病性足部に関係するこれらの特異的な需要を大部分は無視した。いかなる糖尿病性足部潰瘍も、そうでないことが立証されない限り、血管機能障害を有すると常に考慮されるべきである。早期照会、血管検査、イメージングおよび介入は、糖尿病性足部潰瘍治癒を改善し、切断を予防するのに決定的である。潰瘍を治癒し脚を残す治療機会は容易に失われるため、タイミングが肝要である。しかし、これらの糖尿病患者を診断および処置する最良の仕方に関するデータが不足している。糖尿病性足部を扱う研究の大部分は、患者集団、介入またはアウトカムの観点から比較できない。
【0011】
真性糖尿病は、損なわれた血管新生が原因で、創傷修復を破壊し、慢性創傷の発症をもたらす可能性がある。１５年間を超える持続時間の真性糖尿病患者の約４０％が自律神経障害に悩まされる。これは、温度調節の欠損、不能および膀胱機能障害と、それに続く心血管反射異常を通して発展し得る。後期徴候は、全身性発汗障害、体位性低血圧、胃腸の問題および低減された血糖コントロールを含むことができる。後者の症状は、不十分な創傷治癒、慢性潰瘍化および結果として生じる肢切断の重篤な合併症を含む種々の併存症が関与する重大な臨床意義を有する。明確な秩序だった相を有する皮膚創傷治癒において、糖尿病は、全ステージで不適正な機能をもたらす。慢性非治癒糖尿病性創傷の病因学は多面的であるが、非治癒表現型への進行は、不十分な脈管形成／血管新生を指し示す不十分な血管網に密接に関連付けられる。これらの用語は多くの場合、互換的に使用される（本明細書において同様に、血管形成および修復の様々な側面を表示する）が、厳密に言えば、脈管形成は、原始血管網へと癒合する前駆体細胞からの新たな血管の形成として定義され、血管新生は、確立された脈管構造からの新たな毛細血管の形成である。この区別は、血管が、２つのその後のプロセス、脈管形成および血管新生を経て発生し、これらは両者共に、血管維持および修復に決定的に重要であるという事実を描写する。これらのプロセスは、胎児および胎盤脈管構造の発生にも関与する。血管発生（新生血管形成、Rafii S, Lyden D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nat Med. 2003 Jun;9(6):702-12；Masuda, H and Asahara, T. Post-natal endothelial progenitor cells for neovascularization in tissue regeneration, Cardiovascular Research, Volume 58, Issue 2, May 2003, Pages 390-398,）は、隣接する既存の血管からの既存の内皮細胞のｉｎ ｓｉｔｕ増殖および遊走によって操作される（血管新生）、または中胚葉前駆体からの内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の分化後の（脈管形成）、内皮細胞（ＥＣ）の増殖、遊走およびリモデリングが関与する調節されたプロセスである。脈管形成および血管新生は、細胞および成長因子の間の広範な相互関係が関与する重要なかつ複合的なプロセスである。脈管形成において、最も早い毛細血管の形成は、多能性間葉系細胞に由来する血管原性（hemangiogenic）幹細胞のｉｎ ｓｉｔｕ分化によって達成される。その後のプロセス、血管新生は、既に現存する血管および血管細胞から生じる細胞の増殖を伴う、血管新生活性による新たな血管の発生によって特徴付けされ、様々な成長因子の刺激によって開始される十分に調整されたプロセスである。典型的には、組織再生および創傷修復（すなわち、出生後）における新血管新生には主に血管新生活性が関与する。血管原性活性は典型的に、コロニーへと成長する単一細胞の能力に基づくｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞生存アッセイである、コロニーアッセイ（クローン原性アッセイまたはコロニー形成アッセイ）においてｉｎ ｖｉｔｒｏで研究される。血管新生活性は典型的に、血管新生を再現する、ｉｎ ｖｉｔｒｏで毛細血管様構造を形成する被験細胞の能力に基づくｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞生存アッセイである、出芽アッセイ（管形成アッセイまたは血管新生アッセイ）においてｉｎ ｖｉｔｒｏで研究される。我々の身体において、内皮細胞は、薄い高度に特殊化された細胞外マトリックス（ＥＣＭ）である基底膜に囲まれている。内皮細胞、例えば、ヒト臍帯静脈細胞（ＨＵＶＥＣ）は、基底膜様表面（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標））上に播種されると、毛細血管に似ている分枝管または出芽（spout）を形成する。
【0012】
過去１０年間に、ヒトおよび動物の両方における多数の研究は、Ｃ－ペプチドが、血糖コントロールに影響を与えないが、１型糖尿病の慢性合併症のいくつかの予防および潜在的に反転における役割を果たし得ることを実証した。Ｌｉｍら（Proinsulin C-peptide prevents impaired wound healing by activating angiogenesis in diabetes. J Invest Dermatol. 2015 Jan;135(1):269-278）は、ヒトＣ－ペプチドが、糖尿病における脈管障害から保護することができることを実証し、ストレプトゾトシン誘導性糖尿病マウスおよびヒト臍帯静脈内皮細胞を使用して、血管新生を誘導することによる損なわれた創傷治癒からの保護におけるＣ－ペプチドの潜在的な役割を調査した。糖尿病は、マウス皮膚における創傷治癒を遅延させ、浸透圧ポンプを使用したＣ－ペプチド補給は、糖尿病マウスにおける皮膚創傷閉鎖の速度を有意に増加させた。さらに、Ｃ－ペプチドは、０．５ｎＭにおける最大効果により、用量依存的様式で内皮細胞遊走および管形成を誘導した。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＣ－ペプチド増強性血管新生は、免疫組織化学およびＭａｔｒｉｇｅｌプラグアッセイによって実証された。Ｌｉｍらの知見は、糖尿病における修復的および治療的血管新生における有意な意義を有する可能性がある、Ｃ－ペプチドの血管新生的役割および損なわれた創傷治癒から保護するその能力に光を当て、Ｃ－ペプチド補充が、糖尿病における損なわれた血管新生および遅延した創傷治癒に対する有望な治療法であることを提起する。Ｃ－ペプチドの一貫した欠如は実際に、外来性Ｃ－ペプチドにより是正され得る微小血管性病変をもたらすことがあり、Ｃ－ペプチドが、血管修復プロセスにおける効能に関与することを指し示す。ベータ細胞が機能せず、Ｃ－ペプチドがほとんどまたは全く排出されない場合、前記微小血管性合併症は、網膜症、腎症および神経障害をもたらすことがあり、そのような合併症はおそらく、Ｃ－ペプチドによる処置によって是正され得る。Ｃ－ペプチドが、糖尿病マウスにおける損なわれた創傷治癒を正常化することができるか否か調査するために、ストレプトゾトシン誘導性糖尿病マウスにおいて皮下に植え込んだ浸透圧ポンプを使用してＣ－ペプチドを継続的に補給した。正常マウス、糖尿病マウスおよびＣ－ペプチドを補給した糖尿病マウスの後肢の背側表面に４ｍｍ直径の創傷を創出した。糖尿病マウスは、正常マウスと比較して、有意により遅い治癒速度を示した。しかし、Ｃ－ペプチド補給は、糖尿病マウスにおける創傷閉鎖を加速させた。この効果は、創傷直径を測定するＬｉｍら（前記の箇所に）によって定量的に解析された。これらの結果は、Ｃ－ペプチドが、糖尿病マウスにおける創傷閉鎖を含む損なわれた創傷治癒を有意に予防することを指し示す。血管新生は、創傷治癒のための決定的なプロセスであるため、Ｌｉｍら（前記の箇所に）は、Ｃ－ペプチドが、出芽アッセイとも呼ばれるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて内皮細胞遊走、増殖および管形成を活性化することができるか否か調査した。Ｃ－ペプチドが、血管新生に必須である内皮細胞遊走、増殖および管形成を活性化することにより出芽を誘導することが確認された。しかし、これらの有望な前臨床研究は、現在のところ糖尿病性脈管障害のコントロールにおいていかなる進歩をもたらすこともできなかった、Ｃ－ペプチドによるヒト臨床治験と完全に対比をなす。
【0013】
手短に言えば、Ｃ－ペプチド欠乏の患者における（典型的には１型および末期（end-phase）２型糖尿病における）腎症、網膜症および神経障害等の糖尿病性脈管障害を有する患者のケアにおける、よって、最終的に同様に糖尿病性潰瘍ケアにおけるパラダイムシフト；すなわち、臨床業務および研究に関する、血管機能障害を有する糖尿病患者の新たなアプローチおよび分類の差し迫った必要がある。選ばれた介入技術に無関係に、治癒を改善し、治癒速度をスピードアップし、切断を回避するために、腎症、網膜症および／または神経障害を有する患者等、糖尿病性脈管障害患者のためのならびに最終的に血管機能障害を有する潰瘍患者のための新たな戦略を開発および実行する必要がある。予測検査の値に関する集中的な研究、新たな処置モダリティならびに選択的なおよび標的化された戦略が必要とされる。潰瘍化糖尿病性足部に関する具体的なデータは不足しているため、推奨は多くの場合、低グレードのものである。手短に言えば、血糖コントロールの現存するおよび十分に検査された戦略を越えて、これらの患者の多くのため、何らかの形態の血管新生コントロールも探索される。
【0014】
栄養素感知は、正常な細胞成長および増殖の持続に重要である。ｍＴＯＲ複合体１（ｍＴＯＲＣ１）は、栄養素を感知して、細胞成長、オートファジーおよび他のｍＴＯＲＣ１媒介性プロセスを調節する。インスリン、ＩＧＦ、ＰＤＧＦおよびＶＥＧＦ等の成長因子、アミノ酸、エネルギー状態、ならびにストレスは、ｍＴＯＲＣ１を制御する。アミノ酸は、ｍＴＯＲＣ１活性化に必須である。成長因子単独は、アミノ酸補給なしで最大ｍＴＯＲＣ１活性を達成することができない（Sancak et al., The Rag GTPases bind raptor and mediate amino acid signaling to mTORC1. Science. 2008 Jun 13;320(5882):1496-501.）。増加した細胞内アミノ酸濃度は、ｍＴＯＲＣ１リソソーム局在化およびその後の活性化を促進する。
【発明の概要】
【0015】
一方では、本発明は、明確に異なりかつ新たに出現するクラスの薬物：その他の面では適正な血糖コントロール下にある患者であっても起こる前記脈管障害と戦うための、血管新生コントロールの確立に要求される血管新生活性の誘導における使用のためのオートファジー阻害化合物として作用するｍＴＯＲのペプチドモジュレーター、の使用を提供する。本発明は、対象の脈管障害の予防または処置における血管新生活性の誘導における使用のための、ｍＴＯＲのオートファジー阻害モジュレーターであって、前記モジュレーターが、アミノ酸の供給源、好ましくは、ペプチドを含み、前記アミノ酸が、少なくとも（least）５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）およびアスパラギン（Ｎ）の群から選択される、モジュレーターを提供する。好まれる実施形態では、本発明は、対象の脈管障害の予防または処置における血管新生活性の誘導における使用のための、ｍＴＯＲのオートファジー阻害モジュレーターであって、前記モジュレーターが、アミノ酸の供給源、好ましくは、ペプチドを含み、前記アミノ酸が、少なくとも（least）５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびプロリン（Ｐ）の群から選択される、モジュレーターを提供する。好まれる実施形態では、本発明は、対象の脈管障害の予防または処置における血管新生活性の誘導における使用のための、ｍＴＯＲのオートファジー阻害モジュレーターであって、前記モジュレーターが、アミノ酸の供給源、好ましくは、ペプチドを含み、前記アミノ酸が、少なくとも（least）５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）の群から選択される、モジュレーターを提供する。好まれる実施形態では、本発明は、対象の脈管障害の予防または処置における血管新生活性の誘導における使用のための、ｍＴＯＲのオートファジー阻害モジュレーターであって、前記モジュレーターが、アミノ酸の供給源、好ましくは、ペプチドを含み、前記アミノ酸が、少なくとも（least）５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびバリン（Ｖ）の群から選択される、モジュレーターを提供する。好まれる実施形態では、本発明は、対象の脈管障害の予防または処置における血管新生活性の誘導における使用のための、ｍＴＯＲのオートファジー阻害モジュレーターであって、前記モジュレーターが、アミノ酸の供給源、好ましくは、ペプチドを含み、前記アミノ酸が、少なくとも（least）５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびロイシン（Ｌ）の群から選択される、モジュレーターを提供する。好まれる実施形態では、本発明は、対象の脈管障害の予防または処置における血管新生活性の誘導における使用のための、ｍＴＯＲのオートファジー阻害モジュレーターであって、前記モジュレーターが、アミノ酸の供給源、好ましくは、ペプチドを含み、前記アミノ酸が、少なくとも（least）５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、ロイシン（Ｌ）およびプロリン（Ｐ）の群から選択される、モジュレーターを提供する。好まれる実施形態では、本発明は、対象の脈管障害の予防または処置における血管新生活性の誘導における使用のための、ｍＴＯＲのオートファジー阻害モジュレーターであって、前記モジュレーターが、アミノ酸の供給源、好ましくは、ペプチドを含み、前記アミノ酸が、少なくとも（least）５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびプロリン（Ｐ）の群から選択される、モジュレーターを提供する。別の好まれる実施形態では、本発明は、腎症の予防または処置における使用のための、特に、末期腎疾患の予防における使用のための、本発明に係るモジュレーターを提供する。別の好まれる実施形態では、本発明は、網膜症の予防または処置における使用のための、特に、部分的な盲目または失明の予防における使用のための、本発明に係るモジュレーターを提供する。別の好まれる実施形態では、本発明は、神経障害の予防または処置における使用のための、より好ましくは、末梢糖尿病性神経障害の予防または処置における使用のための、より好ましくは、糖尿病性潰瘍の予防または処置における使用のための、本発明に係るモジュレーターを提供する。前記対象がまた、血糖コントロールを達成または維持するために処置される場合、特に、前記対象がまた、血糖コントロールを達成または維持するためにインスリンで処置される場合、そのような本発明に係るｍＴＯＲのオートファジー阻害ペプチドモジュレーターが使用されることが特に好まれる。
本発明は、血管新生活性を誘導することができる好ましくはＬ－タンパク質原性のアミノ酸の供給源、好ましくは、ペプチドを同定するための方法であって、Ｌ－タンパク質原性アミノ酸を含むペプチドを細胞に提供するステップであって、前記アミノ酸が、少なくとも（least）５０％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）およびアスパラギン（Ｎ）の群から選択される、ステップと、出芽アッセイにおいて血管新生活性を決定するステップとを含む方法を提供する。血管新生活性は、本明細書に提供される通り、毛細血管の管形成を評価することにより、また、毛細血管の分枝形成を評価することにより決定することができる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）およびアスパラギン（Ｎ）の群から選択されることが好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびプロリン（Ｐ）の群から選択されることがより好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、ロイシン（１文字コードでは：Ｌ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびバリン（Ｖ）の群から選択されることがより好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびバリン（Ｖ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびロイシン（Ｌ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびプロリン（Ｐ）の群から選択されることがさらになお好まれる。本発明はまた、好ましくはＬ－タンパク質原性のアミノ酸の供給源を細胞に提供するステップを含む、血管新生活性を誘導するための方法であって、前記アミノ酸が、少なくとも５０％にわたり、より好ましくは、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）およびアスパラギン（Ｎ）の群から選択される、方法を提供する。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびプロリン（Ｐ）の群から選択されることがより好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびバリン（Ｖ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、ロイシン（１文字コードでは：Ｌ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびバリン（Ｖ）の群から選択されることがより好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびロイシン（Ｌ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびプロリン（Ｐ）の群から選択されることがさらになお好まれる。
本発明はまた、好ましくはＬ－タンパク質原性のアミノ酸の供給源を細胞に提供するステップを含む、血管新生活性を誘導するための方法であって、前記アミノ酸が、少なくとも５０％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）およびアスパラギン（Ｎ）の群から選択され、より好ましくは、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）およびアスパラギン（Ｎ）の群から選択される、方法を提供する。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびプロリン（Ｐ）の群から選択されることがより好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびバリン（Ｖ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、ロイシン（１文字コードでは：Ｌ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびバリン（Ｖ）の群から選択されることがより好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびロイシン（Ｌ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびプロリン（Ｐ）の群から選択されることがさらになお好まれる。
本発明はまた、好ましくはＬ－タンパク質原性のアミノ酸の供給源を細胞に提供するステップを含む、血管新生活性を誘導するための方法であって、前記アミノ酸が、少なくとも５０％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）およびアスパラギン（Ｎ）の群から選択される、方法を提供する。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびプロリン（Ｐ）の群から選択されることがより好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびバリン（Ｖ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、ロイシン（１文字コードでは：Ｌ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびバリン（Ｖ）の群から選択されることがより好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびロイシン（Ｌ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびプロリン（Ｐ）の群から選択されることがさらになお好まれる。
本発明はまた、好ましくはＬ－タンパク質原性のアミノ酸の供給源を細胞に提供するステップを含む、血管新生活性を誘導するための方法であって、前記アミノ酸が、少なくとも５０％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）およびアスパラギン（Ｎ）の群から選択される、方法を提供する。本発明はまた、好ましくはＬ－タンパク質原性のアミノ酸の供給源としてペプチドを細胞に提供するステップを含む、血管新生活性を誘導するための方法であって、前記ペプチドが、少なくとも５０％にわたり、より好ましくは、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）およびアスパラギン（Ｎ）の群から選択されるアミノ酸からなる、方法を提供する。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびプロリン（Ｐ）の群から選択されることがより好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびバリン（Ｖ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、ロイシン（１文字コードでは：Ｌ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびバリン（Ｖ）の群から選択されることがより好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびロイシン（Ｌ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびプロリン（Ｐ）の群から選択されることがさらになお好まれる。
本発明はまた、好ましくはＬ－タンパク質原性のアミノ酸の供給源を細胞に提供するステップを含む、血管新生活性を誘導するための方法であって、前記アミノ酸が、少なくとも５０％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）およびアスパラギン（Ｎ）の群から選択される、方法を提供する。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびプロリン（Ｐ）の群から選択されることがより好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびバリン（Ｖ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたりロイシン（１文字コードでは：Ｌ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびバリン（Ｖ）、の群から選択されることがより好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびロイシン（Ｌ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびプロリン（Ｐ）の群から選択されることがさらになお好まれる。
本発明はまた、好ましくはＬ－タンパク質原性のアミノ酸の供給源を細胞に提供するステップを含む、血管新生活性を誘導するための方法であって、前記アミノ酸が、少なくとも５０％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）およびアスパラギン（Ｎ）の群から選択される、方法を提供する。本発明はまた、好ましくはＬ－タンパク質原性のアミノ酸の前記供給源、好ましくは、ペプチドが、本明細書に提供される方法により同定可能である、本発明に係る処置の方法を提供する。本発明は特に、前記供給源またはペプチドが、血管新生活性を有することが示されたかまたはそれを有することが疑われるペプチドまたはタンパク質に由来するアミノ酸配列を有する、本発明に係る処置の方法を提供する。多くの場合、生物のプロテオームにおいて、タンパク質におけるそのような血管新生配列は、よりＮおよびＣ末端に配置されたアルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）残基の近くに又はその間に配置され、コンバターゼ等の酵素が、前記血管新生アミノ酸配列を切り離すことを可能にし、これにより、その配列をｍＴＯＲのオートファジー阻害ペプチドモジュレーターとして使用することができる。ペプチド使用を、それが入れられて使用される細胞の種と相関させることが好まれる。例えば、ペプチドが、ｍＴＯＲのオートファジー阻害ペプチドモジュレーターとしてヒト細胞において使用される場合、前記ペプチドが、ヒトプロテオームから派生することが好まれる。同様に、種Ｘ等の別の種の細胞において、種Ｘプロテオームから派生するペプチドを使用することが好まれる。好まれる実施形態では、本発明は、妊娠中の血管新生活性に関与するタンパク質である絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）に由来するアミノ酸配列を有する前記オートファジー阻害ペプチドを提供し、好ましくは、前記ペプチドは、ＣＧのベータ鎖、好ましくは、前記ベータ鎖のループ２に由来する。ヒトＣＧ（ｈＣＧ）は、血管新生アミノ酸配列ＭＴＲＶＬＱＧＶＬＰＡＬＰＱＶＶＣＮＹＲを有し、配列中、コア血管新生配列は、ＮおよびＣ末端に配置されたアルギニン（Ｒ）残基の間に配置される。さらに、この血管新生コアは、ＥＲＣ結合モチーフｘＧｘｘＰｘを含む。このモチーフの分割は、特に、血糖と血管新生コントロールの両方を発揮するための、速効型および短時間作用型インスリン調製物と組み合わせた、オートファジー阻害ペプチドモジュレーターとしてのｈＣＧ誘導体ＬＱＧＶ、ＶＬＰＡＬＰ ＡＱＧＶ、ＬＡＧＶ、ＬＱＡＶ、ＬＱＧＡ、ＡＬＰＡＬＰ、ＶＡＰＡＬＰ、ＶＬＡＡＬＰ、ＶＬＰＡＡＰおよびＶＬＰＡＬＡの使用を容易にする。例えば、ペプチドＶＬＱＧＶＬＰＡＬＰＱＶＶは、中時間作用型および長時間作用型インスリン調製物との組合せにおいて、より優れた用途を見出し、これは、より遅く、よりインスリンの放出速度に合致して放出される。別の好まれる実施形態では、本発明は、前記オートファジー阻害ペプチドであって、Ｃ－ペプチドに由来する血管新生アミノ酸配列を有するペプチドを提供する。プレプロインスリン分子において、ヒトＣ－ペプチドは、配列ＲＲＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱＫＲを有し、実際に血管新生コア配列は、アルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）残基によってフランキングされている。さらに、この血管新生コアは、ＥＲＣ結合モチーフｘＧｘｘＰＧを含む。ＥＲＣ結合モチーフは、これらの配列を有するペプチドのオリゴマー化による（trough）コアセルベーションに関与するため、ＥＲＧ結合モチーフを有するそのようなオートファジー阻害ペプチドは典型的に、注射されたときに、より遅い放出速度を有し、典型的に、中時間作用型またはより好ましくは長時間作用型インスリンとの組合せ製剤中等、そのような遅い放出が所望される状況下で、より有用かつ好まれる。コアセルベーションには典型的に、静電引力によって一緒に保持されたペプチドのコロイド液滴の凝集が関与し、これは、より速い放出特徴を典型的に有する、ＥＲＣモチーフがなくコアセルベーションを示さないペプチドと少なくとも比較して、注射されたときの、ペプチドを構成するそのようなＥＲＣモチーフの遅い放出の性質を説明する。特に、Ｃ－ペプチド欠乏の状況における、血管新生機能障害の処置におけるｍＴＯＲのオートファジー阻害ペプチドモジュレーターとしての使用のための好まれるＣ－ペプチド断片ペプチドは、好ましくは、単離されたおよび／または合成の、好ましくは非ペグ化（peggylated）の、Ｃ－ペプチド断片である。全てｘＧｘｘＰＧモチーフを含む、ＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬ、ＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰ、ＬＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬ、ＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬ、ＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬ、ＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱ、ＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱ、およびＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱ、ＬＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬ、ＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬおよびＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧならびに機能的均等物は、よって、中時間作用型または長時間作用型インスリンにおける包含またはそれとの組合せに最も適しておりかつ好まれる。ｘＧｘｘＰＧモチーフを含まないＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧおよび／またはＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬならびに機能的均等物は、よって、速効型または短時間作用型インスリンにおける包含またはそれとの組合せに最も適しておりかつ好まれる。
本発明は、血管新生活性を誘導することができる好ましくはＬ－タンパク質原性のアミノ酸の供給源、好ましくは、ペプチドを同定するための方法であって、Ｌ－タンパク質原性アミノ酸を含むペプチドを細胞に提供するステップであって、前記アミノ酸が、少なくとも（least）５０％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）およびアスパラギン（Ｎ）の群から選択される、ステップと、出芽アッセイにおいて血管新生活性を決定するステップとを含む方法を提供する。血管新生活性は、本明細書に提供される通り、毛細血管の管形成を評価することにより、また、毛細血管の分枝形成を評価することにより決定することができる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）およびアスパラギン（Ｎ）の群から選択されることが好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびプロリン（Ｐ）の群から選択されることがより好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、ロイシン（１文字コードでは：Ｌ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびバリン（Ｖ）の群から選択されることがより好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびバリン（Ｖ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびロイシン（Ｌ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびプロリン（Ｐ）の群から選択されることがさらになお好まれる。本発明はまた、好ましくはＬ－タンパク質原性のアミノ酸の供給源を細胞に提供するステップを含む、血管新生活性を誘導するための方法であって、前記アミノ酸が、少なくとも５０％にわたり、より好ましくは、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）およびアスパラギン（Ｎ）の群から選択される、方法を提供する。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびプロリン（Ｐ）の群から選択されることがより好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびバリン（Ｖ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、ロイシン（１文字コードでは：Ｌ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびバリン（Ｖ）の群から選択されることがより好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびロイシン（Ｌ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびプロリン（Ｐ）の群から選択されることがさらになお好まれる。
本発明はまた、好ましくはＬ－タンパク質原性のアミノ酸の供給源を細胞に提供するステップを含む、血管新生活性を誘導するための方法であって、前記アミノ酸が、少なくとも５０％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）およびアスパラギン（Ｎ）の群から選択され、より好ましくは、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）およびアスパラギン（Ｎ）の群から選択される、方法を提供する。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびプロリン（Ｐ）の群から選択されることがより好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびバリン（Ｖ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、ロイシン（１文字コードでは：Ｌ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびバリン（Ｖ）の群から選択されることがより好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびロイシン（Ｌ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびプロリン（Ｐ）の群から選択されることがさらになお好まれる。
本発明はまた、好ましくはＬ－タンパク質原性のアミノ酸の供給源を細胞に提供するステップを含む、血管新生活性を誘導するための方法であって、前記アミノ酸が、少なくとも５０％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）およびアスパラギン（Ｎ）の群から選択される、方法を提供する。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびプロリン（Ｐ）の群から選択されることがより好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびバリン（Ｖ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、ロイシン（１文字コードでは：Ｌ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびバリン（Ｖ）の群から選択されることがより好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびロイシン（Ｌ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびプロリン（Ｐ）の群から選択されることがさらになお好まれる。
本発明はまた、好ましくはＬ－タンパク質原性のアミノ酸の供給源を細胞に提供するステップを含む、血管新生活性を誘導するための方法であって、前記アミノ酸が、少なくとも５０％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）およびアスパラギン（Ｎ）の群から選択される、方法を提供する。本発明はまた、好ましくはＬ－タンパク質原性のアミノ酸の供給源としてペプチドを細胞に提供するステップを含む、血管新生活性を誘導するための方法であって、前記ペプチドが、少なくとも５０％にわたり、より好ましくは、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）およびアスパラギン（Ｎ）の群から選択されるアミノ酸からなる、方法を提供する。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびプロリン（Ｐ）の群から選択されることがより好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびバリン（Ｖ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、ロイシン（１文字コードでは：Ｌ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびバリン（Ｖ）の群から選択されることがより好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびロイシン（Ｌ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびプロリン（Ｐ）の群から選択されることがさらになお好まれる。
本発明はまた、好ましくはＬ－タンパク質原性のアミノ酸の供給源を細胞に提供するステップを含む、血管新生活性を誘導するための方法であって、前記アミノ酸が、少なくとも５０％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）およびアスパラギン（Ｎ）の群から選択される、方法を提供する。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびプロリン（Ｐ）の群から選択されることがより好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびバリン（Ｖ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたりロイシン（１文字コードでは：Ｌ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびバリン（Ｖ）、の群から選択されることがより好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびロイシン（Ｌ）の群から選択されることがさらになお好まれる。前記アミノ酸が、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびプロリン（Ｐ）の群から選択されることがさらになお好まれる。
本発明はまた、好ましくはＬ－タンパク質原性のアミノ酸の供給源を細胞に提供するステップを含む、血管新生活性を誘導するための方法であって、前記アミノ酸が、少なくとも５０％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）およびアスパラギン（Ｎ）の群から選択される、方法を提供する。本発明はまた、好ましくはＬ－タンパク質原性のアミノ酸の前記供給源、好ましくは、ペプチドが、本明細書に提供される方法により同定可能である、本発明に係る処置の方法を提供する。本発明は特に、前記供給源またはペプチドが、血管新生活性を有することが示されたかまたはそれを有することが疑われるペプチドまたはタンパク質に由来するアミノ酸配列を有する、本発明に係る処置の方法を提供する。多くの場合、生物のプロテオームにおいて、タンパク質におけるそのような血管新生配列は、よりＮおよびＣ末端に配置されたアルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）残基の近くに又はその間に配置され、コンバターゼ等の酵素が、前記血管新生アミノ酸配列を切り離すことを可能にし、これにより、その配列をｍＴＯＲのオートファジー阻害ペプチドモジュレーターとして使用することができる。ペプチド使用を、それが入れられて使用される細胞の種と相関させることが好まれる。例えば、ペプチドが、ｍＴＯＲのオートファジー阻害ペプチドモジュレーターとしてヒト細胞において使用される場合、前記ペプチドが、ヒトプロテオームから派生することが好まれる。同様に、種Ｘ等の別の種の細胞において、種Ｘプロテオームから派生するペプチドを使用することが好まれる。好まれる実施形態では、本発明は、妊娠中の血管新生活性に関与するタンパク質である絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）に由来するアミノ酸配列を有する前記オートファジー阻害ペプチドを提供し、好ましくは、前記ペプチドは、ＣＧのベータ鎖、好ましくは、前記ベータ鎖のループ２に由来する。ヒトＣＧ（ｈＣＧ）は、血管新生アミノ酸配列ＭＴＲＶＬＱＧＶＬＰＡＬＰＱＶＶＣＮＹＲを有し、配列中、コア血管新生配列は、ＮおよびＣ末端に配置されたアルギニン（Ｒ）残基の間に配置される。さらに、この血管新生コアは、ＥＲＣ結合モチーフｘＧｘｘＰｘを含む。このモチーフの分割は、特に、血糖と血管新生コントロールの両方を発揮するための、速効型および短時間作用型インスリン調製物と組み合わせた、オートファジー阻害ペプチドモジュレーターとしてのｈＣＧ誘導体ＬＱＧＶ、ＶＬＰＡＬＰ ＡＱＧＶ、ＬＡＧＶ、ＬＱＡＶ、ＬＱＧＡ、ＡＬＰＡＬＰ、ＶＡＰＡＬＰ、ＶＬＡＡＬＰ、ＶＬＰＡＡＰおよびＶＬＰＡＬＡの使用を容易にする。例えば、ペプチドＶＬＱＧＶＬＰＡＬＰＱＶＶは、中時間作用型および長時間作用型インスリン調製物との組合せにおいて、より優れた用途を見出し、これは、より遅く、よりインスリンの放出速度に合致して放出される。別の好まれる実施形態では、本発明は、前記オートファジー阻害ペプチドであって、Ｃ－ペプチドに由来する血管新生アミノ酸配列を有するペプチドを提供する。プレプロインスリン分子において、ヒトＣ－ペプチドは、配列ＲＲＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱＫＲを有し、実際に血管新生コア配列は、アルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）残基によってフランキングされている。さらに、この血管新生コアは、ＥＲＣ結合モチーフｘＧｘｘＰＧを含む。ＥＲＣ結合モチーフは、これらの配列を有するペプチドのオリゴマー化による（trough）コアセルベーションに関与するため、ＥＲＧ結合モチーフを有するそのようなオートファジー阻害ペプチドは典型的に、注射されたときに、より遅い放出速度を有し、典型的に、中時間作用型またはより好ましくは長時間作用型インスリンとの組合せ製剤中等、そのような遅い放出が所望される状況下で、より有用かつ好まれる。コアセルベーションには典型的に、静電引力によって一緒に保持されたペプチドのコロイド液滴の凝集が関与し、これは、より速い放出特徴を典型的に有する、ＥＲＣモチーフがなくコアセルベーションを示さないペプチドと少なくとも比較して、注射されたときの、ペプチドを構成するそのようなＥＲＣモチーフの遅い放出の性質を説明する。特に、Ｃ－ペプチド欠乏の状況における、血管新生機能障害の処置におけるｍＴＯＲのオートファジー阻害ペプチドモジュレーターとしての使用のための好まれるＣ－ペプチド断片ペプチドは、好ましくは、単離されたおよび／または合成の、好ましくは非ペグ化（peggylated）の、Ｃ－ペプチド断片である。全てｘＧｘｘＰＧモチーフを含む、ＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬ、ＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰ、ＬＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬ、ＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬ、ＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬ、ＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱ、ＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱ、およびＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱ、ＬＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬ、ＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬおよびＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧならびに機能的均等物は、よって、中時間作用型または長時間作用型インスリンにおける包含またはそれとの組合せに最も適しておりかつ好まれる。ｘＧｘｘＰＧモチーフを含まないＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧおよび／またはＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬならびに機能的均等物は、よって、速効型または短時間作用型インスリンにおける包含またはそれとの組合せに最も適しておりかつ好まれる。
【0016】
別の好まれる実施形態では、本発明は、前記オートファジー阻害ペプチドであって、ガレクチン－３に由来する血管新生アミノ酸配列を有するペプチドを提供する。ヒトガレクチン－３の成熟Ｎ末端断片、ＰＱＧＷＰＧＡＷＧＮＱＰＡＧＡＧＧＹＰＧＡＳＹＰＧＡＹＰＧＱＡＰＰＧＡＹＰＧＱＡＰＰＧＡＹＰＧＡＰＧＡＹＰＧＡＰＡＰＧＶＹＰＧＰＰＳＧＰＧＡＹＰＳＳＧＱＰＳＡＴＧＡＹＰＡＴＧＰＹＧＡＰＡＧＰＬＩＶＰＹＮＬＰＬＰＧＧＶＶＰＲＭは典型的に、複数のＥＲＣ結合モチーフｘＧｘｘＰＧによって特徴付けされ、血管新生コア配列は、加水分解によっても遊離される。典型的には（Pineda et al.,Trypanosoma cruzi cleaves galectin-3 N-terminal domain to suppress its innate microbicidal activity. Clin Exp Immunol. 2020 Feb;199(2):216-229.）、ヒト病原体クルーズトリパノソーマ（T. cruzi）は、ヒトＮ末端ガレクチン－３に結合するだけでなく、その加水分解も行う。注目すべきことに、この機構は、ガレクチン－３媒介性の寄生生物の死を防止し、クルーズトリパノソーマ（T. cruzi）が、その哺乳類宿主内での感染、生存および繁栄に成功するようにガレクチン－３機能をモジュレートする複雑な戦略を開発した可能性があることを示唆する。実際に、非病原性ランゲルトリパノソーマ（T. rangeli）は、ガレクチン－３に結合するが、タンパク質構造を修飾しない。よって、クルーズトリパノソーマ（T. cruzi）は、Ｎ末端コラーゲン様ドメインを切断し、Ｃ末端ガレクチン－３を、コアセルベーションによるオリゴマー化をできなくし、モチーフｘＧｘｘＰＧを有するＮ末端断片が、ＥＲＣと相互作用し、寄生生物の利益となるようにｍＴＯＲをモジュレートすることを可能にする。具体的には、寄生生物加水分解により得られる３つの断片のＮ末端配列は、バンド１：ＡＧＧＹＰＧＡＳＹＰＧ、バンド２：ＧＡＰＧＡＹＰＧＡＰおよびバンド３：ＧＡＰＡＧＰＬＩＶＰであり、人間におけるＡＧＧＹＰＧＡＳＹＰＧＡＹＰＧＱＡＰＰＧＡＹＰＧＱＡＰＰＧＡＹＰ、ＧＡＰＧＡＹＰＧＡＰＡＰＧＶＹＰＧＰＰＳＧＰＧＡＹＰＳＳＧＱＰＳＡＴＧＡＹＰＡＴＧＰＹおよびＧＡＰＡＧＰＬＩＶＰＹＮＬＰＬＰＧＧＶＶＰに由来するガレクチン－３ Ｎ末端ペプチド断片のｍＴＯＲモジュレート特徴を指し示す。例えば、断片ＧＡＹＰＧＡＰＧＡＹＰＧＡＰＡＰＧＶおよびＰＧＡＹＰＧは、本明細書で実証される通り、血管新生コア活性を有し、ＰＧＡＹＰＧＱＡＰＰＧＡＹＰＧ、ＰＧＡＹＰＧＱＡおよびＧＱＡＰＰＧＡＹＰＧも、特に、中時間作用型または長時間作用型インスリンの中にまたはそれと共に含まれる場合、人間における使用に有用なオートファジー阻害ペプチドにする。本発明はまた、前記ペプチドが、女性における血管新生活性に毎月関与することが多いタンパク質であるルトロピン（ＬＨ）に由来するアミノ酸配列を有し、好ましくは、前記ペプチドが、ＬＨのベータ鎖、好ましくは、前記ベータ鎖のループ２に由来する、本発明に係る処置の方法およびそこでの使用を提供する。ヒトＬＨ（ｈＬＨ）のベータ－２－ループは、血管新生アミノ酸配列ＭＭＲＶＬＱＡＶＬＰＰＬＰＱＶＶＣＴＹＲを有し、配列中、コア血管新生配列は、ＮおよびＣ末端に配置されたアルギニン（Ｒ）残基の間に配置される。さらに、この血管新生コアは、ＥＲＣ結合モチーフｘＧｘｘＰｘを含まず、速効型および短時間作用型インスリン製剤におけるｍＴＯＲモジュレーターとしてのＶＬＱＡＶＬＰＰＬＰＱＶＶ、ＶＬＱＡＶＬＰ、ＶＬＱＡ、ＬＱＡＶＬＰ、ＬＱＡＶ、ＰＬＰＱＶＶおよびＰＰＬＱＶならびにさらに別の誘導体等のＬＨ由来配列の使用を容易にする。本発明はまた、前記ペプチドが、細胞外マトリックスタンパク質（ＥＣＭ）に由来するアミノ酸配列を有する、本発明に係る処置の方法およびそこでの使用を提供する。ＥＣＭタンパク質は、オートファジー阻害アミノ酸の豊富な供給源を含み、オートファジー阻害ペプチドの設計のための鋳型として有用である。基質としてのプロリンは、細胞外マトリックス、結合組織および骨におけるエラスチンおよびコラーゲンにおいて貯蔵され、マトリックスメタロプロテイナーゼ、ペプチダーゼ、エラスターゼおよびプロリダーゼの逐次作用によって、このリザーバーから急速に放出される。唯一のタンパク質原性二級（secondary）アミノ酸として、プロリンは、特殊な生物学的効果を有し、全てのタンパク質－タンパク質相互作用および代謝ストレスに対する応答の調節因子として機能し、オートファジーを含む種々の下流代謝活性を開始する（Kadowaki et al. Nutrient control of macroautophagy in mammalian cells. Mol Aspects Med. 2006 Oct-Dec;27(5-6):426-43）。本発明はまた、前記細胞外マトリックスタンパク質がエラスチンである、本発明に係る処置の方法およびそこでの使用を提供する。典型的コア－血管新生活性は、両者共にヒトエラスチンのエクソン２４領域に由来する、本明細書におけるペプチド、ＶＧＶＡＰＧおよびＶＧＶＡＰＧＶＧＶＡＰＧＶＧＶＡＰＧにより実証された。本発明はまた、前記細胞外マトリックスタンパク質がコラーゲンである、本発明に係る処置の方法およびそこでの使用を提供する。コラーゲンは、有用となり得るＰＧＰ配列に満ちている。コア血管新生配列ＡＱＧＶＰＱＩＡＶＬＶならびに誘導体、例えば、ＡＱＧＶＰＱ、ＡＱＧＶＰＱＩ、ＡＱＧＶＰＱＩＡ、ＧＶＰＱＩＡＶＬＶ、ＰＱＩＡＶＬＶ、ＩＡＶＬＶおよびその他を同定する、ＲＲＡＱＧＶＰＱＩＡＶＬＶＴＨＲ等、ＲまたはＫによってフランキングされた血管新生コアペプチドを含む一部のコラーゲン（本明細書において、ヒトＣＯＬ６Ａ５からの例が示される）に典型的である。より多くのそのような配列は、ＲまたはＫ反復によってフランキングされる血管新生コアペプチド配列の反復出現を実証することが見出され、そこからｍＴＯＲの望ましいペプチドモジュレーターを選択することができる、（ヒトＣＯＬ６Ａ５における）ＲＧＡＰＧＱＹＧＥＫＧＦＰＧＤＰＧＮＰＧＱＮＮＮＩＫＧＱＫＧＳＫＧＥＱＧＲＱＧＲＳＧＱＫＧＶＱＧＳＰＳＳＲＧＳＲＧＲＥＧＱＲＧＬＲＧＶＳＧＥＰＧＮＰＧＰＴＧＴＬＧＡＥＧＬＱＧＰＱＧＳＱＧＮＰＧＲＫＧＥＫＧＳＱＧＱＫＧＰＱＧＳＰＧＬＭＧＡＫＧＳＴＧＲＰＧＬＬＧＫＫＧＥＰＧＬＰＧＤＬＧＰＶＧＱＴＧＱＲＧＲＱＧＤＳＧＩＰＧＹＧＱＭＧＲＫＧＶＫＧＰＲＧＦＰＧＤＡＧＱＫ、等のコラーゲンストレッチにおいて見出すことができる。そのペプチドが本明細書に提供される別の血管新生タンパク質は、ヒトアルファ－フェトプロテインであり、抗原性コアＱＡＱＧＶＡＬＱを含む配列ＫＤＬＣＱＡＱＧＶＡＬＱＴＭＫを有するペプチドが観察され、誘導体ＡＱＧＶ、ＡＱＧＶＡ、ＡＱＧＶＡＬ、ＱＧＶＡＬＱおよびＧＶＡＬＱが見出され、全て、好ましくは速効型または短時間作用型インスリンと組み合わせた、ｍＴＯＲのオートファジー阻害ペプチドモジュレーターとして有用である。典型的には、ｍＴＯＲ ＡＱのジペプチドモジュレーターによるオートファジー阻害は近年、子豚において実証され、アミノ酸Ａ＋Ｑよりも改善されたモジュレート特徴を有する（Zhang et al., Alanyl-glutamine supplementation regulates mTOR and ubiquitin proteasome proteolysis signaling pathways in piglets. Nutrition. 2016 Oct;32(10):1123-31.）。
【0017】
前記脈管障害が、糖尿病性脈管障害を含み、特に、前記対象が、Ｃ－ペプチド欠乏を有しているかまたは有することが疑われる場合、血管新生コントロールにおける使用のために、本発明に係るｍＴＯＲのオートファジー阻害ペプチドモジュレーターが特に提供される。多くの場合、そのような患者は、糖尿病性脈管障害に一般的に関連付けられ、それに起因すると考えられる、盲目、末期腎不全または下肢切断に関するリスクのいずれかと戦うために、インスリンにより（速効型インスリンによりオンポンプ（on-pump）にて、または速効型、短時間作用型、中時間作用型もしくは長時間作用型インスリンにより皮下に、他の成長因子、例えば、ＩＧＦ、ＰＤＧＦもしくはＶＥＧＦまたはそれらに関係する成長因子により）既に処置されている場合がある。そのようなｍＴＯＲのモジュレーターは、Ｃ－ペプチド欠乏を患う患者における特定の有利な使用を見出し、前記患者が、少なくとも１ｎｍｏｌ／Ｌ未満、好ましくは少なくとも０．５ｎｍｏｌ／Ｌ未満、より好ましくは少なくとも０．３ｎｍｏｌ／Ｌ未満、より好ましくは少なくとも０．２ｎｍｏｌ／Ｌ未満、より好ましくは少なくとも０．１ｎｍｏｌ／Ｌ未満、より好ましくは少なくとも０．０６ｎｍｏｌ／Ｌ未満の、好ましくは再発性の空腹時Ｃ－ペプチドレベルを有する場合、前記欠乏が、例えば、存在する。特に、本発明は、脈管障害、好ましくは糖尿病性脈管障害の処置におけるｍＴＯＲのオートファジー阻害ペプチドモジュレーターの使用を提供する。別の実施形態では、本発明は、腎症、好ましくは糖尿病性腎症の処置におけるｍＴＯＲのオートファジー阻害ペプチドモジュレーターの使用を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、網膜症、好ましくは糖尿病性網膜症の処置におけるｍＴＯＲのオートファジー阻害ペプチドモジュレーターの使用を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、神経障害、好ましくは糖尿病性神経障害の処置におけるｍＴＯＲのオートファジー阻害ペプチドモジュレーターの使用を提供する。
【0018】
他方では、本発明は、本明細書に提供される通り、血管新生コントロールの目的で、ｍＴＯＲのオートファジー阻害ペプチドモジュレーターと共に提供された、成長因子製剤（好ましくは医薬製剤または医薬組成物を含む、本明細書における製剤）、例えば、インスリン製剤、ＩＧＦ製剤、ＰＤＧＦ製剤、ＶＥＧＦ製剤、または血管性疾患の処置において有用な、特に、血糖コントロールにおいて有用な別の成長因子の製剤を提供する。成長因子およびｍＴＯＲのオートファジー阻害モジュレーターの製剤であって、前記モジュレーターが、アミノ酸の供給源、好ましくは、ペプチドを含み、前記アミノ酸が、少なくとも（least）５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）およびアスパラギン（Ｎ）の群から選択される、製剤が提供される。好まれる実施形態では、本発明は、ｍＴＯＲのオートファジー阻害モジュレーターを有するインスリン製剤であって、前記モジュレーターが、アミノ酸の供給源、好ましくは、ペプチドを含み、前記アミノ酸が、少なくとも（least）５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびプロリン（Ｐ）の群から選択される、製剤を提供する。好まれる実施形態では、本発明は、ｍＴＯＲのオートファジー阻害モジュレーターを有するインスリン製剤であって、前記モジュレーターが、アミノ酸の供給源、好ましくは、ペプチドを含み、前記アミノ酸が、少なくとも（least）５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）の群から選択される、製剤を提供する。好まれる実施形態では、本発明は、ｍＴＯＲのオートファジー阻害モジュレーターを有するインスリン製剤であって、前記モジュレーターが、アミノ酸の供給源、好ましくは、ペプチドを含み、前記アミノ酸が、少なくとも（least）５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびバリン（Ｖ）の群から選択される、製剤を提供する。好まれる実施形態では、本発明は、ｍＴＯＲのオートファジー阻害モジュレーターを有するインスリン製剤であって、前記モジュレーターが、アミノ酸の供給源、好ましくは、ペプチドを含み、前記アミノ酸が、少なくとも（least）５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）およびロイシン（Ｌ）の群から選択される、製剤を提供する。好まれる実施形態では、本発明は、ｍＴＯＲのオートファジー阻害モジュレーターを有するインスリン製剤であって、前記モジュレーターが、アミノ酸の供給源、好ましくは、ペプチドを含み、前記アミノ酸が、少なくとも（least）５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、ロイシン（Ｌ）およびプロリン（Ｐ）の群から選択される、製剤を提供する。好まれる実施形態では、本発明は、ｍＴＯＲのオートファジー阻害モジュレーターを有するインスリン製剤であって、前記モジュレーターが、アミノ酸の供給源、好ましくは、ペプチドを含み、前記アミノ酸が、少なくとも（least）５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびプロリン（Ｐ）の群から選択される、製剤を提供する。本発明に係るｍＴＯＲのオートファジー阻害モジュレーターを含む（有する）インスリンの製剤は、血糖コントロールの達成または維持も必要とする対象の脈管障害の予防または処置における血管新生活性の誘導における使用に好まれ、特に、腎症の予防または処置における使用に、末期腎疾患の予防または処置における使用に、網膜症の予防または処置における使用に、盲目または視力の実質的な喪失（＞３０％～＜９０％）の予防または処置における使用に、神経障害の予防または処置における使用に、末梢糖尿病性神経障害の予防または処置における使用に、糖尿病性潰瘍の予防または処置における使用に好まれ、本明細書に定義される通り、特に、前記対象が、Ｃ－ペプチド欠乏を有しているかまたは有することが疑われる場合、特に、前記脈管障害は、糖尿病性脈管障害を含む。本明細書に提供される通り、そのようなｍＴＯＲのオートファジー阻害ペプチドモジュレーターおよび成長因子製剤におけるその使用は典型的に、それを必要とする患者における機構的ラパマイシン標的、ｍＴＯＲの栄養素、特に、アミノ酸感知系を標的化し、オートファジーを阻害し、それと共に、血管新生活性を誘導する、ペプチドおよび／またはアミノ酸の供給源を含む。典型的には、インスリン製剤の使用による血糖コントロールの場合、インスリン必要量（ユニット／ｋｇ／日）は、患者の年齢、体重および残存膵インスリン活性に基づいて決定される。患者は典型的に、０．４～１．０ユニット／ｋｇ／日の総１日インスリン用量を必要とし、代謝的に安定な患者における典型的な出発用量は、０．５ユニット／ｋｇ／日である。しかし、前記の通り、血糖コントロールは、インスリンを用いた場合であっても、Ｃ－ペプチド欠乏に代わるものにはならない。これは、特に、Ｃ－ペプチド欠乏を患う患者において、ｍＴＯＲのオートファジー阻害ペプチドモジュレーターも含むインスリン製剤を使用するために、本明細書において提供され、前記患者が、少なくとも１ｎｍｏｌ／Ｌ未満、好ましくは少なくとも０．５ｎｍｏｌ／Ｌ未満、より好ましくは少なくとも０．３ｎｍｏｌ／Ｌ未満、より好ましくは少なくとも０．２ｎｍｏｌ／Ｌ未満、より好ましくは少なくとも０．１ｎｍｏｌ／Ｌ未満、より好ましくは少なくとも０．０６ｎｍｏｌ／Ｌ未満の、好ましくは再発性の空腹時Ｃ－ペプチドレベルを有する場合、前記欠乏が、例えば、存在する。
【0019】
それと共に、本発明は、腎症（末期腎疾患の素因になる）、網膜症（盲目の素因になる）および／または神経障害、特に、末梢糖尿病性神経障害を有する患者の処置等、患者における糖尿病性脈管障害の出現を予防または処置するための医薬製剤、方法および手段を提供し、最終的に、特に、人間における下肢の切断の素因になる血管機能障害、糖尿病性潰瘍を有する潰瘍患者の処置を提供する。典型的には、本明細書において、ペプチドは、本開示の目的のため、５０個以下のアミノ酸を有するものとして定義され、タンパク質は、＞５０個のアミノ酸を有するものとして定義される。ｍＴＯＲのオートファジー阻害ペプチドモジュレーターは、本明細書において、オートファジー阻害アミノ酸アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、プロリン（Ｐ）、イソロイシン（Ｉ）、アルギニン（Ｒ）およびアスパラギン（Ｎ）の群から選択される少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは１００％アミノ酸を有するペプチド配列を含む５０個以下のアミノ酸の直鎖状、分枝状または環状のストリングとして定義される。この群のペプチドの分子作用機序（ＭｏＡ）は、その正確な配列に依存しない。代わりに、その構成物アミノ酸が、ｍＴＯＲの栄養素感知系にオートファジー阻害シグナルを提供し；疾患の消散を伴って、オートファジーの阻害を生じ、タンパク質生成（proteogenesis）をもたらす。
【0020】
Ｓｃｉａｒｒｅｔｔａら（New Insights Into the Role of mTOR Signaling in the Cardiovascular System. Circ Res. 2018 Feb 2;122(3):489-505）において総説される通り、機構的（以前は哺乳類と呼ばれる）ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）は、ホスホイノシチドキナーゼ関連キナーゼ（ＰＩＫＫ）ファミリーに属する異型セリン／スレオニンキナーゼである。これは、細胞生理学、代謝およびストレス応答の調節において中心的な役割を果たす進化的に保存されたタンパク質である。これは一部では、細胞マスタースイッチと呼ばれる。ｍＴＯＲは、特異的アダプタータンパク質と相互作用し、ｍＴＯＲ複合体１（ｍＴＯＲＣ１）およびｍＴＯＲ複合体２（ｍＴＯＲＣ２）と命名された２種の明確に異なる巨大分子複合体を形成する。ｍＴＯＲ生物学における以前のパラダイムは、タンパク質合成、細胞成長およびリボソーム新生の調節、ならびに成長因子、栄養素、アミノ酸、飢餓および低酸素等の異なる上流インプットの感知および統合におけるｍＴＯＲの関与を含んだ。しかし、現在、ｍＴＯＲ経路が、細胞生存、ミトコンドリア新生および機能、脂質合成およびオートファジーを含む他の重要な細胞プロセスも制御することが知られている。ｍＴＯＲＣ２のシグナル伝達ネットワークは、ｍＴＯＲＣ１のシグナル伝達ネットワークほどには特徴付けされていない。いくつかの研究は、ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２の活性が強く相互接続されており、ｍＴＯＲＣ２が、急性ラパマイシン処置に対して、ｍＴＯＲＣ１よりも感受性が低いことを示唆した。以前の研究は、ｍＴＯＲＣ２が、細胞生存、成長および増殖の調節に関与し、細胞アーキテクチャおよび極性を制御することも指し示した。典型的には、アミノ酸は、タンパク質の構成要素であるだけではなく、健康および疾患におけるアミノ酸およびその代謝物の決定的な役割を有する、シグナル伝達分子ならびに遺伝子発現、代謝プロセスおよび発生上の身体変化の調節因子でもある。十分な証拠により、アミノ酸が、脈管系において基礎的な役割を果たすことが指し示されている。アミノ酸は、タンパク質合成のための基本的構成要素として機能し、重要なエネルギー源を構成するが、選抜された群が、血管性疾患の文脈で広く研究されている。ｍＴＯＲ、特にｍＴＯＲＣ１は、アミノ酸およびグルコース等の栄養素を感知することにより細胞成長および増殖を調節する重大なキナーゼである。アラニンおよびグルタミンは、血液中で循環する最も豊富なアミノ酸である。アミノ酸は、中間代謝に関与するのみならず、主要代謝経路を制御するインスリン－機構的ラパマイシン標的（ＭＴＯＲ）媒介性シグナルトランスダクションも刺激する。これらの中でもとりわけ、長い時間存在したタンパク質の分解および損傷したまたは機能的に冗長なオルガネラの排除を担当するオートファジーの経路が挙げられる。このプロセスの適正な機能は、細胞生存に必須である。オートファジーの調節不全は、いくつかの病理の病因学に関係付けられてきた。明らかに、ある特定のアミノ酸のみが、オートファジーをモジュレートすることができ、それらの機能は、高度に細胞特異的である。しかし、ある特定のアミノ酸および細胞代謝の間の関係性の詳細の多くは不明である（さらに図５を参照）。
【0021】
さらなる実施形態
１ 血管新生活性を誘導することができる好ましくはＬ－タンパク質原性のアミノ酸の供給源、好ましくは、ペプチドを同定するための方法であって、Ｌ－タンパク質原性アミノ酸を含むペプチドを細胞に提供するステップであって、前記アミノ酸が、少なくとも（least）５０％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）およびアルギニン（Ｒ）の群から選択される、ステップと、出芽アッセイにおいて血管新生活性を決定するステップとを含む方法。
２ 好ましくはＬ－タンパク質原性のアミノ酸の供給源を細胞に提供するステップを含む、血管新生活性を誘導するための方法であって、前記アミノ酸が、少なくとも５０％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）およびアルギニン（Ｒ）の群から選択される、方法。
３ 好ましくはＬ－タンパク質原性のアミノ酸の供給源としてペプチドを細胞に提供するステップを含む、血管新生活性を誘導するための方法であって、前記ペプチドが、少なくとも５０％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）およびアルギニン（Ｒ）の群から選択されるアミノ酸からなる、方法。
４ 好ましくはＬ－タンパク質原性のアミノ酸の前記供給源、好ましくは、ペプチドが、さらなる実施形態１に記載の方法により同定可能である、さらなる実施形態２または３に記載の方法。
５ 前記アミノ酸が、少なくとも５０％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびプロリン（Ｐ）の群から選択される、さらなる実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法。
６ 前記供給源またはペプチドが、血管新生活性を有することが示されたかまたはそれを有することが疑われるペプチドまたはタンパク質に由来するアミノ酸配列を有する、さらなる実施形態２～５のいずれか１つに記載の方法。
７ 前記ペプチドが、絨毛性ゴナドトロピンに由来するアミノ酸配列を有する、さらなる実施形態６に記載の方法。
８ 前記ペプチドが、Ｃ－ペプチドに由来するアミノ酸配列を有する、さらなる実施形態６に記載の方法。
９ 前記ペプチドが、ガレクチン－３に由来するアミノ酸配列を有する、さらなる実施形態６に記載の方法。
１０ 前記ペプチドが、ルテオトロピンに由来するアミノ酸配列を有する、さらなる実施形態６に記載の方法。
１１ 前記ペプチドが、細胞外マトリックスタンパク質に由来するアミノ酸配列を有する、さらなる実施形態６に記載の方法。
１２ 前記細胞外マトリックスタンパク質が、エラスチンまたはコラーゲンである、さらなる実施形態１２に記載の方法。
１３ 前記ペプチドが、３１個未満のアミノ酸、好ましくは２６個未満のアミノ酸、より好ましくは２１個未満のアミノ酸、より好ましくは１６個未満のアミノ酸、より好ましくは１３個未満のアミノ酸を含む、さらなる実施形態１～１２のいずれか１つに記載の方法。
１４ 前記ペプチドが、３個超のアミノ酸、好ましくは５個超のアミノ酸、より好ましくは７個超のアミノ酸、より好ましくは少なくとも９個のアミノ酸を含む、さらなる実施形態１～１３のいずれか１つに記載の方法。
１５ 前記細胞が、インスリンまたはその誘導体等、血糖コントロールが可能な化合物も提供される、さらなる実施形態１～１４のいずれか１つに記載の方法。
１６ 前記インスリンが、速効型インスリンである、さらなる実施形態１５に記載の方法。
１７ 前記供給源が、３個超のアミノ酸かつ１３個未満のアミノ酸を含むペプチドを含む、さらなる実施形態１６に記載の方法。
１８ 前記インスリンが、短時間作用型インスリンである、さらなる実施形態１５に記載の方法。
１９ 前記供給源が、４個超のアミノ酸かつ２１個未満のアミノ酸を含むペプチドを含む、さらなる実施形態１８に記載の方法。
２０ 前記インスリンが、中時間作用型インスリンである、さらなる実施形態１５に記載の方法。
２１ 前記供給源が、６個超のアミノ酸かつ２６個未満のアミノ酸を含むペプチドを含む、さらなる実施形態２０に記載の方法。
２２ 前記インスリンが、長時間作用型インスリンである、さらなる実施形態１５に記載の方法。
２３ 前記供給源が、７個超のアミノ酸かつ３１個未満のアミノ酸を含むペプチドを含む、さらなる実施形態２２に記載の方法。
２４ 前記ペプチドが、有機酸の塩として提供され、好ましくは、前記ペプチドが、マレイン酸の、より好ましくは酢酸の、より好ましくは酒石酸の、最も好ましくはクエン酸の塩として提供される、さらなる実施形態１～２３のいずれか１つに記載の方法。
２５ 前記細胞が、ヒト起源のものである、さらなる実施形態１～２４のいずれか１つに記載の方法。
２６ 前記ペプチドが、ヒト起源のものである、さらなる実施形態１～２５のいずれか１つに記載の方法。
２７ 脈管障害、好ましくは糖尿病性末梢神経障害を有するかまたは有することが疑われる対象の処置のための医薬組成物の製造のための、好ましくはＬ－タンパク質原性のアミノ酸の供給源、好ましくは、ペプチドの使用であって、前記アミノ酸が、少なくとも５０％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）およびアルギニン（Ｒ）の群から選択される、使用。
２８ 前記対象が、糖尿病性潰瘍、好ましくは足部潰瘍を有するかまたはそれを発症するリスクがある、さらなる実施形態２６に記載の使用。
２９ 前記対象が、Ｃ－ペプチド欠乏を有するかまたはそれを有すると疑われる、さらなる実施形態２６または２７に記載の使用。
３０ 前記対象が、少なくとも１ｎｍｏｌ／Ｌ未満、好ましくは少なくとも０．５ｎｍｏｌ／Ｌ未満、より好ましくは少なくとも０．３ｎｍｏｌ／Ｌ未満、より好ましくは少なくとも０．２ｎｍｏｌ／Ｌ未満、より好ましくは少なくとも０．１ｎｍｏｌ／Ｌ未満、より好ましくは少なくとも０．０６ｎｍｏｌ／Ｌ未満の空腹時Ｃ－ペプチドレベルを有する、さらなる実施形態２６～２８のいずれか１つに記載の使用。
３１ 前記ペプチドが、有機酸の塩として提供され、好ましくは、前記ペプチドが、マレイン酸の、より好ましくは酢酸の、より好ましくは酒石酸の、最も好ましくはクエン酸の塩として提供される、さらなる実施形態２６～２９のいずれか１つに記載の使用。
３２ 前記処置が、さらなる実施形態２～２５のいずれか１つに記載の血管新生活性を誘導するための方法を含む、さらなる実施形態２６～３０のいずれか１つに記載の使用。
３３ 脈管障害、好ましくは糖尿病性末梢神経障害を有するかまたは有することが疑われる対象の処置における、好ましくはＬ－タンパク質原性のアミノ酸の供給源、好ましくは、ペプチドであって、前記アミノ酸が、少なくとも５０％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）およびアルギニン（Ｒ）の群から選択される、供給源、好ましくは、ペプチド。
３４ 前記対象が、糖尿病性潰瘍、好ましくは足部潰瘍を有するかまたはそれを発症するリスクがある、さらなる実施形態３０に記載の供給源。
３５ 前記対象が、Ｃ－ペプチド欠乏を有するかまたはそれを有すると疑われる、さらなる実施形態３０または３１に記載の供給源。
３６ 前記対象が、少なくとも１ｎｍｏｌ／Ｌ未満、好ましくは少なくとも０．５ｎｍｏｌ／Ｌ未満、より好ましくは少なくとも０．３ｎｍｏｌ／Ｌ未満、より好ましくは少なくとも０．２ｎｍｏｌ／Ｌ未満、より好ましくは少なくとも０．１ｎｍｏｌ／Ｌ未満、より好ましくは少なくとも０．０６ｎｍｏｌ／Ｌ未満の空腹時Ｃ－ペプチドレベルを有する、さらなる実施形態３２～３４のいずれか１つに記載の供給源。
３７ 前記ペプチドが、有機酸の塩として提供され、好ましくは、前記ペプチドが、マレイン酸の、より好ましくは酢酸の、より好ましくは酒石酸の、最も好ましくはクエン酸の塩として提供される、さらなる実施形態３２～３５のいずれか１つに記載の供給源。
３８ 前記処置が、さらなる実施形態２～２４のいずれか１つに記載の血管新生活性を誘導するための方法を含む、さらなる実施形態３０～３３のいずれか１つに記載の供給源。
３９ 脈管障害、好ましくは糖尿病性末梢神経障害を有するかまたは有することが疑われる対象の処置の方法であって、より好ましくは、前記対象が、糖尿病性潰瘍、好ましくは足部潰瘍を有するかまたはそれを発症するリスクがあり、前記方法が、さらなる実施形態３０～３４のいずれか１つに記載のアミノ酸の供給源を前記対象に提供するステップを含む、処置の方法。
１ 血管新生活性を誘導することができる好ましくはＬ－タンパク質原性のアミノ酸の供給源、好ましくは、ペプチドを同定するための方法であって、Ｌ－タンパク質原性アミノ酸を含むペプチドを細胞に提供するステップであって、前記アミノ酸が、少なくとも（least）５０％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）およびアルギニン（Ｒ）の群から選択される、ステップと、出芽アッセイにおいて血管新生活性を決定するステップとを含む方法。
２ 好ましくはＬ－タンパク質原性のアミノ酸の供給源を細胞に提供するステップを含む、血管新生活性を誘導するための方法であって、前記アミノ酸が、少なくとも５０％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）およびアルギニン（Ｒ）の群から選択される、方法。
３ 好ましくはＬ－タンパク質原性のアミノ酸の供給源としてペプチドを細胞に提供するステップを含む、血管新生活性を誘導するための方法であって、前記ペプチドが、少なくとも５０％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）およびアルギニン（Ｒ）の群から選択されるアミノ酸からなる、方法。
４ 好ましくはＬ－タンパク質原性のアミノ酸の前記供給源、好ましくは、ペプチドが、さらなる実施形態１に記載の方法により同定可能である、さらなる実施形態２または３に記載の方法。
５ 前記アミノ酸が、少なくとも５０％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびプロリン（Ｐ）の群から選択される、さらなる実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法。
６ 前記供給源またはペプチドが、血管新生活性を有することが示されたかまたはそれを有することが疑われるペプチドまたはタンパク質に由来するアミノ酸配列を有する、さらなる実施形態２～５のいずれか１つに記載の方法。
７ 前記ペプチドが、絨毛性ゴナドトロピンに由来するアミノ酸配列を有する、さらなる実施形態６に記載の方法。
８ 前記ペプチドが、Ｃ－ペプチドに由来するアミノ酸配列を有する、さらなる実施形態６に記載の方法。
９ 前記ペプチドが、ガレクチン－３に由来するアミノ酸配列を有する、さらなる実施形態６に記載の方法。
１０ 前記ペプチドが、ルテオトロピンに由来するアミノ酸配列を有する、さらなる実施形態６に記載の方法。
１１ 前記ペプチドが、細胞外マトリックスタンパク質に由来するアミノ酸配列を有する、さらなる実施形態６に記載の方法。
１２ 前記細胞外マトリックスタンパク質が、エラスチンまたはコラーゲンである、さらなる実施形態１２に記載の方法。
１３ 前記ペプチドが、３１個未満のアミノ酸、好ましくは２６個未満のアミノ酸、より好ましくは２１個未満のアミノ酸、より好ましくは１６個未満のアミノ酸、より好ましくは１３個未満のアミノ酸を含む、さらなる実施形態１～１２のいずれか１つに記載の方法。
１４ 前記ペプチドが、３個超のアミノ酸、好ましくは５個超のアミノ酸、より好ましくは７個超のアミノ酸、より好ましくは少なくとも９個のアミノ酸を含む、さらなる実施形態１～１３のいずれか１つに記載の方法。
１５ 前記細胞が、インスリンまたはその誘導体等、血糖コントロールが可能な化合物も提供される、さらなる実施形態１～１４のいずれか１つに記載の方法。
１６ 前記インスリンが、速効型インスリンである、さらなる実施形態１５に記載の方法。
１７ 前記供給源が、３個超のアミノ酸かつ１３個未満のアミノ酸を含むペプチドを含む、さらなる実施形態１６に記載の方法。
１８ 前記インスリンが、短時間作用型インスリンである、さらなる実施形態１５に記載の方法。
１９ 前記供給源が、４個超のアミノ酸かつ２１個未満のアミノ酸を含むペプチドを含む、さらなる実施形態１８に記載の方法。
２０ 前記インスリンが、中時間作用型インスリンである、さらなる実施形態１５に記載の方法。
２１ 前記供給源が、６個超のアミノ酸かつ２６個未満のアミノ酸を含むペプチドを含む、さらなる実施形態２０に記載の方法。
２２ 前記インスリンが、長時間作用型インスリンである、さらなる実施形態１５に記載の方法。
２３ 前記供給源が、７個超のアミノ酸かつ３１個未満のアミノ酸を含むペプチドを含む、さらなる実施形態２２に記載の方法。
２４ 前記ペプチドが、有機酸の塩として提供され、好ましくは、前記ペプチドが、マレイン酸の、より好ましくは酢酸の、より好ましくは酒石酸の、最も好ましくはクエン酸の塩として提供される、さらなる実施形態１～２３のいずれか１つに記載の方法。
２５ 前記細胞が、ヒト起源のものである、さらなる実施形態１～２４のいずれか１つに記載の方法。
２６ 前記ペプチドが、ヒト起源のものである、さらなる実施形態１～２５のいずれか１つに記載の方法。
２７ 脈管障害、好ましくは糖尿病性末梢神経障害を有するかまたは有することが疑われる対象の処置のための医薬組成物の製造のための、好ましくはＬ－タンパク質原性のアミノ酸の供給源、好ましくは、ペプチドの使用であって、前記アミノ酸が、少なくとも５０％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）およびアルギニン（Ｒ）の群から選択される、使用。
２８ 前記対象が、糖尿病性潰瘍、好ましくは足部潰瘍を有するかまたはそれを発症するリスクがある、さらなる実施形態２６に記載の使用。
２９ 前記対象が、Ｃ－ペプチド欠乏を有するかまたはそれを有すると疑われる、さらなる実施形態２６または２７に記載の使用。
３０ 前記対象が、少なくとも１ｎｍｏｌ／Ｌ未満、好ましくは少なくとも０．５ｎｍｏｌ／Ｌ未満、より好ましくは少なくとも０．３ｎｍｏｌ／Ｌ未満、より好ましくは少なくとも０．２ｎｍｏｌ／Ｌ未満、より好ましくは少なくとも０．１ｎｍｏｌ／Ｌ未満、より好ましくは少なくとも０．０６ｎｍｏｌ／Ｌ未満の空腹時Ｃ－ペプチドレベルを有する、さらなる実施形態２６～２８のいずれか１つに記載の使用。
３１ 前記ペプチドが、有機酸の塩として提供され、好ましくは、前記ペプチドが、マレイン酸の、より好ましくは酢酸の、より好ましくは酒石酸の、最も好ましくはクエン酸の塩として提供される、さらなる実施形態２６～２９のいずれか１つに記載の使用。
３２ 前記処置が、さらなる実施形態２～２５のいずれか１つに記載の血管新生活性を誘導するための方法を含む、さらなる実施形態２６～３０のいずれか１つに記載の使用。
３３ 脈管障害、好ましくは糖尿病性末梢神経障害を有するかまたは有することが疑われる対象の処置における、好ましくはＬ－タンパク質原性のアミノ酸の供給源、好ましくは、ペプチドであって、前記アミノ酸が、少なくとも５０％にわたり、アラニン（１文字コードでは：Ａ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）およびアルギニン（Ｒ）の群から選択される、供給源、好ましくは、ペプチド。
３４ 前記対象が、糖尿病性潰瘍、好ましくは足部潰瘍を有するかまたはそれを発症するリスクがある、さらなる実施形態３０に記載の供給源。
３５ 前記対象が、Ｃ－ペプチド欠乏を有するかまたはそれを有すると疑われる、さらなる実施形態３０または３１に記載の供給源。
３６ 前記対象が、少なくとも１ｎｍｏｌ／Ｌ未満、好ましくは少なくとも０．５ｎｍｏｌ／Ｌ未満、より好ましくは少なくとも０．３ｎｍｏｌ／Ｌ未満、より好ましくは少なくとも０．２ｎｍｏｌ／Ｌ未満、より好ましくは少なくとも０．１ｎｍｏｌ／Ｌ未満、より好ましくは少なくとも０．０６ｎｍｏｌ／Ｌ未満の空腹時Ｃ－ペプチドレベルを有する、さらなる実施形態３２～３４のいずれか１つに記載の供給源。
３７ 前記ペプチドが、有機酸の塩として提供され、好ましくは、前記ペプチドが、マレイン酸の、より好ましくは酢酸の、より好ましくは酒石酸の、最も好ましくはクエン酸の塩として提供される、さらなる実施形態３２～３５のいずれか１つに記載の供給源。
３８ 前記処置が、さらなる実施形態２～２４のいずれか１つに記載の血管新生活性を誘導するための方法を含む、さらなる実施形態３０～３３のいずれか１つに記載の供給源。
３９ 脈管障害、好ましくは糖尿病性末梢神経障害を有するかまたは有することが疑われる対象の処置の方法であって、より好ましくは、前記対象が、糖尿病性潰瘍、好ましくは足部潰瘍を有するかまたはそれを発症するリスクがあり、前記方法が、さらなる実施形態３０～３４のいずれか１つに記載のアミノ酸の供給源を前記対象に提供するステップを含む、処置の方法。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】血糖コントロールに付随した血管新生コントロールの必要性は、Ｃ－ペプチド欠乏を伴う１型糖尿病または２型糖尿病を患う患者の大きいセットにおいて必ず発症する糖尿病性末梢神経障害（ＤＰＮ）を伴う糖尿病性脈管障害の症例において特によく説明される。ＤＰＮは、足部壊疽へと発展し得る足部潰瘍の素因になる。これは、（図１Ａ）乾性壊疽、虚血性および壊死性組織の発症を伴うが感染は伴わない潰瘍と、（図１Ｂ）感染性および壊死性組織の両方を伴う湿性壊疽との間に及ぶ。乾性壊疽は、湿性壊疽につながる場合がある。ここに描かれたものよりも顕著な乾性壊疽ステージにおいて、罹患部は多くの場合、暗い緑色または紫色、ほとんど黒色の色によって特徴付けされる。皮膚は、酸素の欠如が原因で、乾燥してしわが寄っている場合がある。湿性壊疽は、湿った外観を有する。この型は、劇症型炎症を指し示す水疱および腫脹によって特徴付けされる。
【図2】同様に、血糖コントロールに付随した血管新生コントロールの必要性は、Ｃ－ペプチド欠乏を伴う１型糖尿病または２型糖尿病を患う患者の大きいセットにおいて最終的に発症する糖尿病性末梢神経障害（ＤＰＮ）および腎症を伴う糖尿病性脈管障害の症例において特によく説明される。下肢切断（ＬＥＡ）状態および腎機能状態によるコックス比例ハザードモデルから補正された生存曲線。 ２Ａ 小ＬＥＡ群と比較して、死亡率の補正されたハザード比は、大ＬＥＡ患者について１．８０（９５％ＣＩ １．０５～３．０９、Ｐ＝０．０３）であった。 ２Ｂ 正常腎機能群と比較して、死亡率の補正されたハザード比は、ＣＫＤ患者について０．８７（９５％ＣＩ ０．４８～１．５９、Ｐ＝０．６６）であり、透析を受けている患者について２．０９（９５％ＣＩ ０．９９～４．４１、Ｐ＝０．０５）であった。
【図3】骨格筋、肝臓および腸において開始するグルタミン組織間代謝フラックスは、免疫細胞において続く。略語：グルタミン、ＧＬＮ；グルタミン酸、ＧＬＵ；アスパラギン酸、ＡＳＰ；アルギニン、ＡＲＧ；ロイシン、ＬＥＵ；アラニン、ＡＬＡ；グルコース、Ｇｌｕｃ；ピルビン酸、Ｐｙｒ；ピルビン酸デヒドロゲナーゼ；ＰＤＣ；ピルビン酸カルボキシラーゼ、ＰＣ；リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ＭＤ；グリセルアルデヒド－３－リン酸、Ｇ３－Ｐ；乳酸、Ｌａｃ；トリアシルグリセロール、ＴＧ；リボース５－リン酸、Ｒ５Ｐ；アラニンアミノトランスフェラーゼ、ＡＬＴ；グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ＧＤＨ；グルタミンシンテターゼ、ＧＳ；グルタミナーゼ、ＧＬＳ；誘導型一酸化窒素シンターゼ、ｉＮＯＳ；細胞内熱ショックタンパク質、ｉＨＳＰ；熱ショック因子１、ＨＳＦ－１；熱ショックエレメント、ＨＳＥ；サーチュイン１、ＳＩＲＴ１；ヘキソサミン生合成経路、ＨＢＰ；アンモニア、ＮＨ３；グルタチオン、ＧＳＨ；酸化型ＧＳＨ、ＧＳＳＧ；グルタチオンＳ－リダクターゼ、ＧＳＲ；タンパク質キナーゼＢ、Ａｋｔ；ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ、ＡＭＰＫ；ｍＴＯＲ複合体１および２、ｍＴＯＲＣ１／２、細胞外シグナル調節キナーゼ、ＥＲＫ；ｃ－Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ、ＪＮＫ；ガンマ－アミノ酪酸、ＧＡＢＡ。
【図4】グルタミンに直接的に結合したＰｉｂ２複合体へのグルタミン結合によるｍＴＯＲ複合体活性化機構は、ＴＯＲ複合体を活性化し、細胞成長を誘導し、オートファジーを阻害する。グルタミンが利用できる場合、細胞は成長を開始するが、利用できない場合、オートファジーを開始する。
【図5】エラスチン受容体複合体（ＥＲＣ）結合モチーフｘＧｘｘＰｘは、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ベータ－ｈＣＧ）のループ２におけるほぼ４１～５７位に由来するペプチド断片に存在する。 左側：Lapthorn AJ, Harris DC, Littlejohn A, Lustbader JW, Canfield RE, Machin KJ, et al. Crystal structure of human chorionic gonadotropin. Nature. 1994;369(6480):455-61から書き換えた、灰色で指し示されるループ２を有するβ－ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ベータ－ｈＣＧ）の構造。 右上：ベータ－ｈＣＧのループ２のアミノ酸配列。そのｘＧｘｘＰｘモチーフは、ヘキサペプチドＱＧＶＬＰＡによって表される。ベータ－ｈＣＧの様々な「ニックを入れられた」または断片化されたペプチドは、アミノ酸４０～５４の間のペプチド骨格からタンパク質分解によって派生する（Birken S, Berger P, Bidart J-M, Weber M, Bristow A, Norman R, et al. Preparation and Characterization of New WHO Reference Reagents for Human Chorionic Gonadotropin and Metabolites. Clinical Chemistry. 2003;49(1):144-54）。全てのアミノ酸配列は、１文字コードで表される。 右下：ＭＴＲＶＬＱＧＶＬＰＡＬＰＱ、環状ＣＶＬＱＧＶＬＰＡＬＰＱＶＶＣ、ＶＬＱＧＶＬＰＡＬＰＱＶＶＣ、ＶＬＱＧＶＬＰＡＬＰＱ、ＬＱＧＶ、ＡＱＧＶ、ＶＬＰＡＬＰおよびＶＬＰＡＬＰＱ等、ループ２のニックを入れられた断片に由来する様々な合成ペプチドは、免疫および／または血管細胞において検査されたときに生物活性がある。これらの断片の受容体は、現在に至るまで開示されていない。
【図6】ヒトＣ－ペプチドの活性は、ｘＧｘｘＰＧモチーフに依存し、ＥＲＣのアンタゴニストによって遮断される。 Ａ：合成ヒト－Ｃ－ペプチド（１～３１、ＥＲＣ結合モチーフＬＧＧＧＰＧを有する）を、ヒトＣＤ４＋リンパ球遊走アッセイにおいて、陰性および処置対照と一緒に検査した：Ｃ－ペプチド添加なし、スクランブルバージョンのヒトＣ－ペプチド（１～３１、いかなるｘＧｘｘＰｘモチーフも欠如する）およびブタ－Ｃ－ペプチド（１～２９、ヒトＣ－ペプチドに対してほぼ７４％類似性だが、いかなるｘＧｘｘＰｘモチーフも欠如する；本明細書により示されるヒトＣ－ペプチドとのアライメント）。 新鮮に単離されたヒトＣＤ４＋細胞を、指し示されるＣ－ペプチドバリアント（１０ｎＭ）と共に３時間インキュベートして、修正Ｂｏｙｄｅｎチャンバーにおいて細胞遊走における効果を評価した。結果は、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊＊＊Ｐ＜０．００１ 処置ｖｓ．対照。 Ｂ：新鮮に単離されたヒトＣＤ４細胞を、Ｖ１４ペプチド（１０μＭ）またはラクトース（１０ｍＭ）と共に３時間プレインキュベートし、次いで、（Ａ）に指し示される通りにＣ－ペプチド（１～３１）で３時間刺激した。結果は、平均±ＳＥＭとして表される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊＊Ｐ＜０．００１ 処置ｖｓ．対照、＃＃＃＃Ｐ＜０．００１ 処置ｖｓ．ヒトＣ－ペプチド（１～３１）。 ブタＣ－ペプチドにおけるＥＲＣ結合モチーフの欠如を、ヒトＣ－ペプチドにおけるその存在と対比して説明するために、ヒトおよびブタＣ－ペプチドのＣＬＵＳＴＡＬ Ｏ（１．２．４）多重配列アライメントが示される。
【図7】栄養素感知は、正常な細胞成長および増殖の持続に重要である。ｍＴＯＲ複合体１（ｍＴＯＲＣ１）は、栄養素を感知して、細胞成長、オートファジーおよび他のｍＴＯＲＣ１媒介性プロセスを調節する。インスリン、ＩＧＦ－１、ＰＤＧＦおよびＶＥＧＦ等の成長因子、アミノ酸、エネルギー状態、ならびにストレスは、ｍＴＯＲＣ１を制御する。アミノ酸は、ｍＴＯＲＣ１活性化に必須である。成長因子単独は、アミノ酸補給なしで最大のｍＴＯＲＣ１活性を達成することができない（Sancak et al., The Rag GTPases bind raptor and mediate amino acid signaling to mTORC1. Science. 2008 Jun 13;320(5882):1496-501.）。増加したアミノ酸濃度は、ｍＴＯＲＣ１リソソーム局在化およびその後の活性化を促進する。典型的には、一部のアミノ酸は、他のアミノ酸よりもｍＴＯＲを活性化し、それにより、他のアミノ酸よりもオートファジーを阻害する。ｍＴＯＲのオートファジー阻害ペプチドモジュレーターは、最もよくｍＴＯＲを活性化するために、相対的な増加した含有量のこれらのオートファジー阻害アミノ酸を有するペプチドを優先的に含む。そのようなペプチド（本明細書に示す、ＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰ（ヒトＣ－ペプチドに由来する）、ＱＧＶＬＰＡまたはＡＱＧＶ（両者共にｈＣＧに由来する）と共に、本出願に開示されているその他）は、左上に描写される通り、細胞外加水分解および様々なアミノ酸トランスポーターによる取込みの共通機構によって細胞に進入することができる。細胞内グルタミンも、細胞外必須アミノ酸（https://www.nature.com/articles/ncomms11457 - ref-CR14）、特にロイシンと交換する能力を有する。ペプチド進入が右上に描写されている。細胞外ジおよびトリペプチドは、ペプチドトランスポーター（ＰＥＰＴ１／２）調節性輸送を介して進入することができる。より大型のペプチドは、（受容体媒介性）エンドサイトーシスまたはファゴサイトーシスを介して進入することができる。アルギニンリッチ細胞透過ペプチドは、膜多層（multilamellarity）および融合を誘導することにより、小胞および生細胞に受動的に進入することができる。オートファジー阻害ペプチドのさらなる細胞内加水分解は、ｍＴＯＲをモジュレートするオートファジー阻害アミノ酸を遊離させ、細胞生存から細胞死に及ぶ、代謝合成（タンパク質生成）または分解（オートファジー）の間のバランスを保つ多数のプロセスをシグナル伝達する。
【図8】Ｍａｔｒｉｇｅｌにおいて育成され、増加する濃度のペプチド、ヘキサペプチドＱＧＶＬＰＡ（ｈＣＧに由来する）および１８－ｍｅｒのペプチドＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰ（ヒトＣ－ペプチドに由来する）に応答した、ヒト肺微小血管内皮細胞の微小血管血管新生（出芽）アッセイ。示されるデータは、ｔ＝２４時間目の総管長測定値である。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。ヘキサペプチド、ＶＧＶＡＰＧ（ヒトエラスチンに由来する）、ＬＧＧＧＰＧ（ヒトＣ－ペプチドに由来する）およびＰＧＡＹＰＧ（ヒトガレクチン－３に由来する）も、本実験において血管新生活性を有意に誘導した（図示せず）。
【図9】Ｍａｔｒｉｇｅｌにおいて育成され、増加する濃度のペプチド３（１８－ｍｅｒのペプチドＶＧＶＡＰＧＶＧＶＡＰＧＶＧＶＡＰＧ、ヒトエラスチンに由来する）、６（１８－ｍｅｒのペプチドＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰ、ヒトＣ－ペプチドに由来する）および８（１８－ｍｅｒのペプチド、ＧＡＹＰＧＡＰＧＡＹＰＧＡＰＡＰＧＶ、ガレクチン－３のヒトＮ末端断片に由来する）に応答した、ヒト肺微小血管内皮細胞の微小血管血管新生（出芽）アッセイ（それぞれ図９ａ、図９ｂおよび図９ｃ）。示されるデータは、ｔ＝２４時間目の総管長測定値および総分枝長測定値である。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図10】図９において検査された、ｍＴＯＲのオートファジー阻害ペプチドモジュレーターＶＧＶＡＰＧＶＧＶＡＰＧＶＧＶＡＰＧ（ヒトエラスチンに由来する）、ＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰ（ヒトＣ－ペプチドに由来する）およびＧＡＹＰＧＡＰＧＡＹＰＧＡＰＡＰＧＶ（ヒトガレクチン－３に由来する）の管または分枝形成における５０％血管新生活性を得るために要求される薬理学的濃度である、ＥＣ５０の決定。
【図11】皮膚創傷治癒は、皮膚バリアの統合性を最終的に回復させる、様々な細胞型（炎症性細胞、ケラチノサイト、内皮細胞（ＥＣ）、線維芽細胞、血小板）の増殖および遊走からなる、炎症応答、血管新生、新たな組織形成および組織リモデリングが関与する包括的かつ複合的なプロセスである。創傷治癒における血管新生には、アンジオポエチン（angiopoetin）１（ＡＮＧ１）対アンジオポエチン（angiopoetin）２（ＡＮＧ２）のモジュレーションが関与し、それと共に、血管新生におけるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路も含む。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路は、一酸化窒素およびアンジオポエチン等の血管新生因子の発現をモジュレートする。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の多数の阻害剤が開発されており、そのような薬剤は、ＶＥＧＦ分泌および血管新生を減少させ、それにより、創傷治癒を妨害することが示された。それとは反対に、ｍＴＯＲＣ１の活性化は実際に、血管新生を促進することが示された（Karar J, Maity A. PI3K/AKT/mTOR Pathway in Angiogenesis. Front Mol Neurosci. 2011 Dec 2;4:51）。本明細書に提供されるｍＴＯＲのオートファジー阻害ペプチドモジュレーターは、ｍＴＯＲを活性化し、それにより、創傷治癒におけるＶＥＧＦ分泌および血管新生を増加させる。
【図12】創傷治癒減少に寄与するさらに別の因子は、高血糖を含み、適正な血糖コントロールを維持することの重要性を説明する。
【図13】Ｃ－ペプチド欠乏の決定。 Ｑｉａｏら（C-peptide is independent associated with diabetic peripheral neuropathy: a community-based study. Diabetol Metab Syndr 9, 12 (2017).）は、２型糖尿病患者における残存Ｃ－ペプチドおよびＤＰＮの間の関係性を研究した。糖尿病の持続時間の増加に伴い、島機能は徐々に縮小し、低減したＣ－ペプチドおよびインスリンレベルをもたらし、ＤＰＮの有病率が増加する。非ＤＰＮ群における空腹時Ｃ－ペプチド、摂食２時間後Ｃ－ペプチドおよびΔＣ－ペプチド（すなわち、摂食２時間後Ｃ－ペプチド、マイナス、空腹時Ｃ－ペプチド）血清濃度は、臨床ＤＰＮ群（全てＰ≦０．０４０）および確認されたＤＰＮ群（全てＰ＜０．００２）における血清濃度よりも有意に高かった。
【発明を実施するための形態】
【0023】
オートファジー阻害ペプチド
１文字コード
本明細書においてタンパク質またはペプチド組成、構造および機能を表す際に、アミノ酸を参照する。本明細書において、アミノ酸残基は、次の略語を使用することにより同定される。また、明示的にそれ以外のことが指し示されていない限り、ペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端に、左末端から右末端に同定され、Ｎ末端は、第１の残基として同定される。Ａｌａ：アラニン残基；Ａｓｐ：アスパラギン酸残基；Ｇｌｕ：グルタミン酸残基；Ｐｈｅ：フェニルアラニン残基；Ｇｌｙ：グリシン残基；Ｈｉｓ：ヒスチジン残基；Ｉｌｅ：イソロイシン残基；Ｌｙｓ：リジン残基；Ｌｅｕ：ロイシン残基；Ｍｅｔ：メチオニン残基；Ａｓｎ：アスパラギン残基；Ｐｒｏ：プロリン残基；Ｇｌｎ：グルタミン残基；Ａｒｇ：アルギニン残基；Ｓｅｒ：セリン残基；Ｔｈｒ：スレオニン残基；Ｖａｌ：バリン残基；Ｔｒｐ：トリプトファン（tryptophane）残基；Ｔｙｒ：チロシン残基；Ｃｙｓ：システイン残基。アミノ酸は、その従来の１文字コード略語によって参照することもできる；Ａ＝Ａｌａ；Ｔ＝Ｔｈｒ；Ｖ＝Ｖａｌ；Ｃ＝Ｃｙｓ；Ｌ＝Ｌｅｕ；Ｙ＝Ｔｙｒ；Ｉ＝Ｉｌｅ；Ｎ＝Ａｓｎ；Ｐ＝Ｐｒｏ；Ｑ＝Ｇｌｎ；Ｆ＝Ｐｈｅ；Ｄ＝Ａｓｐ；Ｗ＝Ｔｒｐ；Ｅ＝Ｇｌｕ；Ｍ＝Ｍｅｔ；Ｋ＝Ｌｙｓ；Ｇ＝Ｇｌｙ；Ｒ＝Ａｒｇ；Ｓ＝Ｓｅｒ；およびＨ＝Ｈｉｓ。
１文字コード
本明細書においてタンパク質またはペプチド組成、構造および機能を表す際に、アミノ酸を参照する。本明細書において、アミノ酸残基は、次の略語を使用することにより同定される。また、明示的にそれ以外のことが指し示されていない限り、ペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端に、左末端から右末端に同定され、Ｎ末端は、第１の残基として同定される。Ａｌａ：アラニン残基；Ａｓｐ：アスパラギン酸残基；Ｇｌｕ：グルタミン酸残基；Ｐｈｅ：フェニルアラニン残基；Ｇｌｙ：グリシン残基；Ｈｉｓ：ヒスチジン残基；Ｉｌｅ：イソロイシン残基；Ｌｙｓ：リジン残基；Ｌｅｕ：ロイシン残基；Ｍｅｔ：メチオニン残基；Ａｓｎ：アスパラギン残基；Ｐｒｏ：プロリン残基；Ｇｌｎ：グルタミン残基；Ａｒｇ：アルギニン残基；Ｓｅｒ：セリン残基；Ｔｈｒ：スレオニン残基；Ｖａｌ：バリン残基；Ｔｒｐ：トリプトファン（tryptophane）残基；Ｔｙｒ：チロシン残基；Ｃｙｓ：システイン残基。アミノ酸は、その従来の１文字コード略語によって参照することもできる；Ａ＝Ａｌａ；Ｔ＝Ｔｈｒ；Ｖ＝Ｖａｌ；Ｃ＝Ｃｙｓ；Ｌ＝Ｌｅｕ；Ｙ＝Ｔｙｒ；Ｉ＝Ｉｌｅ；Ｎ＝Ａｓｎ；Ｐ＝Ｐｒｏ；Ｑ＝Ｇｌｎ；Ｆ＝Ｐｈｅ；Ｄ＝Ａｓｐ；Ｗ＝Ｔｒｐ；Ｅ＝Ｇｌｕ；Ｍ＝Ｍｅｔ；Ｋ＝Ｌｙｓ；Ｇ＝Ｇｌｙ；Ｒ＝Ａｒｇ；Ｓ＝Ｓｅｒ；およびＨ＝Ｈｉｓ。
【0024】
ペプチド
ペプチドは本明細書において、ペプチド（アミド）結合によって連結されたアミノ酸単量体の天然の生物学的なまたは人工的に製造された（合成）短鎖を意味するものとする。グルタミンペプチドは本明細書において、ペプチド（アミド）結合によって連結されたアミノ酸単量体の天然の生物学的なまたは人工的に製造された（合成）短鎖であって、前記アミノ酸単量体の１つがグルタミンである、短鎖を意味するものとする。化学合成されたペプチドは一般に、遊離ＮおよびＣ末端を有する。Ｎ末端アセチル化およびＣ末端アミド化は、ペプチドの全体的な電荷を低減させ；したがって、その全体的な溶解性が減少し得る。しかし、末端アセチル化／アミド化は、ネイティブタンパク質のより類似した模倣物を生成するため、ペプチドの安定性も増加し得る。これらの修飾は、ペプチドの生物学的活性を増加させることができ、これらもまた本明細書に提供される。
ペプチドは本明細書において、ペプチド（アミド）結合によって連結されたアミノ酸単量体の天然の生物学的なまたは人工的に製造された（合成）短鎖を意味するものとする。グルタミンペプチドは本明細書において、ペプチド（アミド）結合によって連結されたアミノ酸単量体の天然の生物学的なまたは人工的に製造された（合成）短鎖であって、前記アミノ酸単量体の１つがグルタミンである、短鎖を意味するものとする。化学合成されたペプチドは一般に、遊離ＮおよびＣ末端を有する。Ｎ末端アセチル化およびＣ末端アミド化は、ペプチドの全体的な電荷を低減させ；したがって、その全体的な溶解性が減少し得る。しかし、末端アセチル化／アミド化は、ネイティブタンパク質のより類似した模倣物を生成するため、ペプチドの安定性も増加し得る。これらの修飾は、ペプチドの生物学的活性を増加させることができ、これらもまた本明細書に提供される。
【0025】
ペプチド合成
本出願において、ペプチドは、固体支持体上で（Ａｎｓｙｎｔｈ ＢＶ、Ｒｏｏｓｅｎｄａａｌ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）または溶液中で（Ｓｙｎｃｏｍ ＢＶ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、Ｔｈｅ ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓおよびＤｉｏｓｙｎｔｈ ＢＶ、Ｏｓｓ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、古典的に知られている化学合成によって合成される。医薬ペプチド組成物は、対イオンまたは塩としてトリフルオロ酢酸塩を使用して合成することができ、その後、トリフルオロ酢酸塩は、マレイン酸塩（マレイン酸由来）、酢酸塩（酢酸由来）、酒石酸塩（酒石酸由来）またはクエン酸塩（クエン酸由来）等の対イオンによって交換される。前臨床および臨床ヒト研究における使用のためのＡＱＧＶの原薬（ＥＡ－２３０）は、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｎ．Ｖ（以前はＤｉｏｓｙｎｔｈ Ｂ．Ｖ．）（Ｏｓｓ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって製造され、一方、最終製品の充填および仕上げは、Ｏｃｔｏｐｌｕｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｌｅｉｄｅｎ（Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって行われた。ＥＡ－２３０（ＡＱＧＶ）の分子量は、３７３ｇ／ｍｏｌである。
本出願において、ペプチドは、固体支持体上で（Ａｎｓｙｎｔｈ ＢＶ、Ｒｏｏｓｅｎｄａａｌ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）または溶液中で（Ｓｙｎｃｏｍ ＢＶ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、Ｔｈｅ ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓおよびＤｉｏｓｙｎｔｈ ＢＶ、Ｏｓｓ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、古典的に知られている化学合成によって合成される。医薬ペプチド組成物は、対イオンまたは塩としてトリフルオロ酢酸塩を使用して合成することができ、その後、トリフルオロ酢酸塩は、マレイン酸塩（マレイン酸由来）、酢酸塩（酢酸由来）、酒石酸塩（酒石酸由来）またはクエン酸塩（クエン酸由来）等の対イオンによって交換される。前臨床および臨床ヒト研究における使用のためのＡＱＧＶの原薬（ＥＡ－２３０）は、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｎ．Ｖ（以前はＤｉｏｓｙｎｔｈ Ｂ．Ｖ．）（Ｏｓｓ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって製造され、一方、最終製品の充填および仕上げは、Ｏｃｔｏｐｌｕｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｌｅｉｄｅｎ（Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって行われた。ＥＡ－２３０（ＡＱＧＶ）の分子量は、３７３ｇ／ｍｏｌである。
【0026】
走化活性の決定
ヒトＵ９３７単球細胞を、アメリカ培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ－１５９３．２、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ）から購入する。１０％ウシ胎仔血清および抗生物質を補給したＲＰＭＩ １６４０培地を含有するＴ－７５フラスコにおいて懸濁培養で細胞を維持し、３～５日毎に培養物を分割する。走化性アッセイにおける使用の３日前に、記載された通り、１ｍｍｏｌ／Ｌジブチリルサイクリックアデノシン一リン酸（ｄｂｃＡＭＰ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ）への曝露により、Ｕ９３７細胞を刺激して、マクロファージ系列に沿って分化させる。細胞を３回洗浄して、培養培地を除去し、次いで、２．５×１０６細胞／ｍＬの最終濃度でアッセイチャンバーへとプレーティングするために走化性培地（１％ラクトアルブミン加水分解物を補給したダルベッコ変法必須培地）に再懸濁する。４８ウェルマイクロケモタキシス（microchemotaxis）チャンバー（Ｎｅｕｒｏ Ｐｒｏｂｅ、Ｃａｂｉｎ Ｊｏｈｎ、Ｍｄ）において走化性アッセイを行う。チャンバーの底部ウェルに、３回繰り返して２５ｍＬの走化性刺激剤（または培地単独）を充填する。５ｍｍのポアサイズを有するコーティングされていない１０ｍｍ厚のポリビニルピロリドン不含ポリカーボネートフィルターを、試料の上に置く（Ｎｅｕｒｏ Ｐｒｏｂｅ）。シリコンガスケットおよびチャンバーの上部ピースを適用し、５０ｍＬの単球細胞懸濁液を上部ウェル内に置く。加湿５％ＣＯ２雰囲気下にて３時間３７℃でチャンバーをインキュベートし、フィルターの上部表面から非遊走細胞を穏やかに拭き取る。メタノールベースの固定液中にフィルターを３０秒間浸漬し、修正Ｗｒｉｇｈｔ－Ｇｉｅｍｓａ技法（Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｈｅｍａ ３染色セット；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ、Ｓｗｅｄｅｓｂｏｒｏ、ＮＪ）で染色し、次いでスライドガラス上にマウントする。フィルターを通って完全に遊走した細胞を光学顕微鏡下で計数し、ウェル当たり３個のランダムな強拡大視野（ＨＰＦ；本来の拡大率×４００）を計数する。他の箇所に記載されている通りに、連続フィコール／ペラスチン受容体複合体（ＥＲＣ）オール（Pelastin receptor complex(ERC)oll）勾配遠心分離を使用して、健康なボランティアの新鮮に採取された血液からヒト単球を単離する。単離後に静止状態になるように、０．５％ヒト血清を補給したＲＰＭＩ－１６４０培地において細胞を１６時間培養する。細胞の純度は、フローサイトメトリー解析によって決定された場合＞９５％である。４８ウェルマイクロケモタキシスチャンバー（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）内で無血清培地において単球走化性をアッセイする。上部および下部チャンバーにおけるウェルは、ポリビニルピロリドン不含ポリカーボネート膜（ポアサイズ５μｍ；Ｃｏｓｔａｒ）によって分離されている。５×１０５／ｍＬの密度の新鮮に単離された単球を、組換えＣ－ペプチド（Ｓｉｇｍａ）と共に２．５時間インキュベートし、その後、フィルターの底面における遊走した細胞を染色し、光学顕微鏡下で計数する。最大走化活性は、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎ－ホルミル－メチオニル－ロイシル－フェニルアラニン（ｆ－ＭＬＦ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ）により測定され、チェッカーボード解析を使用して、ケモキネシスから走化性を区別する。
ヒトＵ９３７単球細胞を、アメリカ培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ－１５９３．２、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ）から購入する。１０％ウシ胎仔血清および抗生物質を補給したＲＰＭＩ １６４０培地を含有するＴ－７５フラスコにおいて懸濁培養で細胞を維持し、３～５日毎に培養物を分割する。走化性アッセイにおける使用の３日前に、記載された通り、１ｍｍｏｌ／Ｌジブチリルサイクリックアデノシン一リン酸（ｄｂｃＡＭＰ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ）への曝露により、Ｕ９３７細胞を刺激して、マクロファージ系列に沿って分化させる。細胞を３回洗浄して、培養培地を除去し、次いで、２．５×１０６細胞／ｍＬの最終濃度でアッセイチャンバーへとプレーティングするために走化性培地（１％ラクトアルブミン加水分解物を補給したダルベッコ変法必須培地）に再懸濁する。４８ウェルマイクロケモタキシス（microchemotaxis）チャンバー（Ｎｅｕｒｏ Ｐｒｏｂｅ、Ｃａｂｉｎ Ｊｏｈｎ、Ｍｄ）において走化性アッセイを行う。チャンバーの底部ウェルに、３回繰り返して２５ｍＬの走化性刺激剤（または培地単独）を充填する。５ｍｍのポアサイズを有するコーティングされていない１０ｍｍ厚のポリビニルピロリドン不含ポリカーボネートフィルターを、試料の上に置く（Ｎｅｕｒｏ Ｐｒｏｂｅ）。シリコンガスケットおよびチャンバーの上部ピースを適用し、５０ｍＬの単球細胞懸濁液を上部ウェル内に置く。加湿５％ＣＯ２雰囲気下にて３時間３７℃でチャンバーをインキュベートし、フィルターの上部表面から非遊走細胞を穏やかに拭き取る。メタノールベースの固定液中にフィルターを３０秒間浸漬し、修正Ｗｒｉｇｈｔ－Ｇｉｅｍｓａ技法（Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｈｅｍａ ３染色セット；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ、Ｓｗｅｄｅｓｂｏｒｏ、ＮＪ）で染色し、次いでスライドガラス上にマウントする。フィルターを通って完全に遊走した細胞を光学顕微鏡下で計数し、ウェル当たり３個のランダムな強拡大視野（ＨＰＦ；本来の拡大率×４００）を計数する。他の箇所に記載されている通りに、連続フィコール／ペラスチン受容体複合体（ＥＲＣ）オール（Pelastin receptor complex(ERC)oll）勾配遠心分離を使用して、健康なボランティアの新鮮に採取された血液からヒト単球を単離する。単離後に静止状態になるように、０．５％ヒト血清を補給したＲＰＭＩ－１６４０培地において細胞を１６時間培養する。細胞の純度は、フローサイトメトリー解析によって決定された場合＞９５％である。４８ウェルマイクロケモタキシスチャンバー（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）内で無血清培地において単球走化性をアッセイする。上部および下部チャンバーにおけるウェルは、ポリビニルピロリドン不含ポリカーボネート膜（ポアサイズ５μｍ；Ｃｏｓｔａｒ）によって分離されている。５×１０５／ｍＬの密度の新鮮に単離された単球を、組換えＣ－ペプチド（Ｓｉｇｍａ）と共に２．５時間インキュベートし、その後、フィルターの底面における遊走した細胞を染色し、光学顕微鏡下で計数する。最大走化活性は、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎ－ホルミル－メチオニル－ロイシル－フェニルアラニン（ｆ－ＭＬＦ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ）により測定され、チェッカーボード解析を使用して、ケモキネシスから走化性を区別する。
【0027】
細胞単離
健康なボランティアから、抗凝固薬としてクエン酸塩を含有するチューブ中へと血液を採取する。製造業者の説明書に従ってＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐキット（Ｎｉｃｏｍｅｄ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）を使用することにより好中球を単離する；単球は、磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて精製する。フローサイトメトリー（抗ＣＤ４５、１４、ＤＲおよびＣＤ６６ｂ）によって評価される細胞の純度は、＞９３％である。細胞型毎に、２名の異なるドナー由来の試料を試験する。
健康なボランティアから、抗凝固薬としてクエン酸塩を含有するチューブ中へと血液を採取する。製造業者の説明書に従ってＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐキット（Ｎｉｃｏｍｅｄ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）を使用することにより好中球を単離する；単球は、磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて精製する。フローサイトメトリー（抗ＣＤ４５、１４、ＤＲおよびＣＤ６６ｂ）によって評価される細胞の純度は、＞９３％である。細胞型毎に、２名の異なるドナー由来の試料を試験する。
【0028】
マウスにおける静脈内注射された［１４Ｃ］－ＡＱＧＶの分布および排出
ＴＮＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｔｒｅｃｈｔｓｅｗｅｇ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓによって行われた本研究は、５０ｍｇ／ｋｇの単一静脈内用量の後に雄ＣＤ－１マウスにおける［１４Ｃ］－ＡＱＧＶ（Ａｌａ－Ｇｌｎ－［１－１４Ｃ］Ｇｌｙ－Ｖａｌ）の分布および代謝に関するデータを提供するように設計された。この目的のために、放射標識されたＡＱＧＶの投与後１０、３０および６０分目ならびに６および２４時間目にマウスを屠殺し、様々な組織におけるカウントを決定し、尿および血漿中に存在する放射能をＨＰＬＣによって解析した。
ＴＮＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｔｒｅｃｈｔｓｅｗｅｇ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓによって行われた本研究は、５０ｍｇ／ｋｇの単一静脈内用量の後に雄ＣＤ－１マウスにおける［１４Ｃ］－ＡＱＧＶ（Ａｌａ－Ｇｌｎ－［１－１４Ｃ］Ｇｌｙ－Ｖａｌ）の分布および代謝に関するデータを提供するように設計された。この目的のために、放射標識されたＡＱＧＶの投与後１０、３０および６０分目ならびに６および２４時間目にマウスを屠殺し、様々な組織におけるカウントを決定し、尿および血漿中に存在する放射能をＨＰＬＣによって解析した。
【0029】
放射標識されたペプチドが注射されてから１０分後に血液中の放射能は相対的に少なかった。カウントの全てがインタクトペプチド中にあった場合、存在する量は、１７．２μｇ／ｇとなる筈である。１０分後に血漿中に親化合物を検出することはできなかったが；［１４Ｃ］－ＡＱＧＶは、非常に急速に加水分解されたと思われた。尿中にもまた親化合物は検出されなかった。尿中の放射能は、ＨＰＬＣカラムのデッドボリュームにおいてまたはその直後に溶出する親水性化合物として大部分は存在した。
【0030】
様々な臓器中に存在する放射能は、血液中の放射能を超えた。１０分後の「ペプチド」の最高濃度は、腎臓（３６２μｇ／ｇ）、肝臓（１０５μｇ／ｇ）、精巣（８５．７μｇ／ｇ）、肺（７５．２μｇ／ｇ）および脾臓（７４．７μｇ／ｇ）中に見出された。全般に、放射能の漸進的な減少がその後に観察された。２４時間後に、最高濃度は、腎臓（６１．９μｇ／ｇ）、胸腺（４３．１μｇ／ｇ）、脾臓（３９．３μｇ／ｇ）、肝臓（３７．６μｇ／ｇ）および皮膚（３７．５μｇ／ｇ）中に見出された。
【0031】
用量投与の１０、３０および６０分後ならびに６および２４時間後の放射能の平均総回収率は、それぞれ８３．２、７０．５、６２．９、５２．６および５０．８％であった。これらの結果は、呼気により発散される、用量投与後の［１４Ｃ］－揮発性物質、最も可能性が高いのは１４Ｃ－ＣＯ２の急速形成が為されることを強く指し示す。２４時間後に、投与された放射能の１０．２％が尿中に排泄され、２．６％が糞便中に排泄された。
【0032】
－ 結論
静脈内注射後に、［１４Ｃ］－ＡＱＧＶは、血液から急速に除去された。これは、下に提示される薬物動態研究の結果と一致している。血漿および尿中の代謝物プロファイルは、親化合物がないことを明らかにし、［１４Ｃ］－ＡＱＧＶの急速代謝を指し示す。投与された放射能の約５０％は、最大２４時間まで、揮発性物質、最も可能性が高いのは１４Ｃ－ＣＯ２として発散された。本研究の結果は、［１－１４Ｃ］－グリシンを生じる［１４Ｃ］－ＡＱＧＶの急速加水分解を指し示し、［１－１４Ｃ］－グリシンはその後、１４Ｃ－ＣＯ２へと代謝され、呼気中に発散される。血漿および尿中の親化合物の非存在は、組織および臓器中に存在する放射能が、［１４Ｃ］－ＡＱＧＶの代謝の加水分解産物としてのみ存在し得ることを示唆する。
静脈内注射後に、［１４Ｃ］－ＡＱＧＶは、血液から急速に除去された。これは、下に提示される薬物動態研究の結果と一致している。血漿および尿中の代謝物プロファイルは、親化合物がないことを明らかにし、［１４Ｃ］－ＡＱＧＶの急速代謝を指し示す。投与された放射能の約５０％は、最大２４時間まで、揮発性物質、最も可能性が高いのは１４Ｃ－ＣＯ２として発散された。本研究の結果は、［１－１４Ｃ］－グリシンを生じる［１４Ｃ］－ＡＱＧＶの急速加水分解を指し示し、［１－１４Ｃ］－グリシンはその後、１４Ｃ－ＣＯ２へと代謝され、呼気中に発散される。血漿および尿中の親化合物の非存在は、組織および臓器中に存在する放射能が、［１４Ｃ］－ＡＱＧＶの代謝の加水分解産物としてのみ存在し得ることを示唆する。
【0033】
ペプチド加水分解
本開示は、ペプチドＡＱＧＶ等のオートファジー阻害アミノ酸を有するペプチドが細胞に遭遇すると、細胞外であれば、当該細胞の表面において、または血管細胞の場合は、例えば、細胞によるペプチドのエラスチン受容体媒介性エンドサイトーシスによるエンドサイトーシス後に、ファゴリソソームにおいて、ペプチドは加水分解されると定める。多くのペプチダーゼは、細胞表面にまたは細胞内に存在することが知られており、これは、ペプチドを急速に加水分解することができ、継続した加水分解は、トリペプチドおよびジペプチドを必ず生じる。同様に、トリペプチジルおよびジペプチジルペプチダーゼによるリソソームにおける加水分解は、単一アミノ酸を等しくもたらすであろう。１４Ｃ標識ＡＱＧＶを用いた研究は、事実上、マウスにおけるその投与後の１５分間においてペプチドの完全加水分解を示した。トリペプチド、ジペプチドおよび単一アミノ酸は、細胞に提示された場合の、ＡＱＧＶもしくはその姉妹化合物ＬＱＧＶの加水分解に起因する、または当該物質については、他のいずれかの適したオリゴペプチドに起因するであろう。
本開示は、ペプチドＡＱＧＶ等のオートファジー阻害アミノ酸を有するペプチドが細胞に遭遇すると、細胞外であれば、当該細胞の表面において、または血管細胞の場合は、例えば、細胞によるペプチドのエラスチン受容体媒介性エンドサイトーシスによるエンドサイトーシス後に、ファゴリソソームにおいて、ペプチドは加水分解されると定める。多くのペプチダーゼは、細胞表面にまたは細胞内に存在することが知られており、これは、ペプチドを急速に加水分解することができ、継続した加水分解は、トリペプチドおよびジペプチドを必ず生じる。同様に、トリペプチジルおよびジペプチジルペプチダーゼによるリソソームにおける加水分解は、単一アミノ酸を等しくもたらすであろう。１４Ｃ標識ＡＱＧＶを用いた研究は、事実上、マウスにおけるその投与後の１５分間においてペプチドの完全加水分解を示した。トリペプチド、ジペプチドおよび単一アミノ酸は、細胞に提示された場合の、ＡＱＧＶもしくはその姉妹化合物ＬＱＧＶの加水分解に起因する、または当該物質については、他のいずれかの適したオリゴペプチドに起因するであろう。
【0034】
ペプチド輸送
同様に、いくつかの研究が、異なる型の成熟顆粒球の生存におけるｐ３８ ＭＡＰＫの役割を報告した。顆粒球（例えば、好中球、好酸球、好塩基球）は、それらの終末分化ステージにおいて共通点がある。これらの細胞は、断片化された核を有し、予め形成された分泌因子を含有する顆粒の蓄積を有する。本明細書において、ｐ３８ ＭＡＰＫが、好中球の生存のために要求され、ｐ３８ ＭＡＰＫの不活性化が、これらの細胞の死および排除に必須であると共に、ｐ３８ ＭＡＰＫが、内皮細胞の収縮のために要求され、ｐ３８ ＭＡＰＫの不活性化が、血管壁統合性を回復することができるようなそのような血管細胞の弛緩に必須であると共に、ｐ３８ ＭＡＰＫ活性の不活性化が、血管内皮血管壁の血管透過性を探索する好中球および他の白血球細胞を静めるのに必須であることが提案された。
同様に、いくつかの研究が、異なる型の成熟顆粒球の生存におけるｐ３８ ＭＡＰＫの役割を報告した。顆粒球（例えば、好中球、好酸球、好塩基球）は、それらの終末分化ステージにおいて共通点がある。これらの細胞は、断片化された核を有し、予め形成された分泌因子を含有する顆粒の蓄積を有する。本明細書において、ｐ３８ ＭＡＰＫが、好中球の生存のために要求され、ｐ３８ ＭＡＰＫの不活性化が、これらの細胞の死および排除に必須であると共に、ｐ３８ ＭＡＰＫが、内皮細胞の収縮のために要求され、ｐ３８ ＭＡＰＫの不活性化が、血管壁統合性を回復することができるようなそのような血管細胞の弛緩に必須であると共に、ｐ３８ ＭＡＰＫ活性の不活性化が、血管内皮血管壁の血管透過性を探索する好中球および他の白血球細胞を静めるのに必須であることが提案された。
【0035】
ジペプチドおよびトリペプチドは、ＰＥＰＴ１／２トランスポーターを介して選択的に輸送される。トリペプチド、ジペプチドおよび単一アミノ酸は、細胞膜を通して能動的に輸送され、それによって、ジペプチドおよびトリペプチドの取込みには、単一アミノ酸の取込みとは別々の機構が関与し、すなわち、ＰＥＰＴ１およびＰＥＰＴ２トランスポーターを介する。潜在的に、全４００種のジペプチドおよび８，０００種のトリペプチドが、ＰｅｐＴ１およびＰＥＰＴ２によって輸送され得る。ペプチドの形態のアミノ酸の腸管細胞輸送は、遊離形態のそれらの構成物アミノ酸よりも速い、単位時間当たりの取込みの経路であることが実証された（J Anim Sci, 2008; 9, 2135-2155に総説）。
【0036】
ｍＴＯＲが関与する
最後に、本出願人らは、機構的ラパマイシン標的、ｍＴＯＲの関与を提案する。この展望において、ペプチドは、ＰＥＰＴ１／２経由で、または能動的エンドサイトーシスもしくはファゴサイトーシスプロセシングによって細胞に進入し、その後、ペプチドは、ファゴリソソームにおいて完全に加水分解され、その結果生じるオートファジー阻害アミノ酸は、ｍＴＯＲ複合体に提示され、そこで、細胞のオートファジーの阻害を引き起こす。テトラペプチド、トリペプチドおよびジペプチド活性は全て、アミノ酸Ａ、Ｑ、Ｇ、Ｖ、ＬおよびＰの群から選択される、単一アミノ酸Ａ、Ｑ、Ｇ、Ｖの最終因果活性を反映することができる。このようにして、アミノ酸Ａ、Ｑ、Ｇ、Ｖ、ＬおよびＰは、ｍＴＯＲのための食べ物である。実際に、ＦＰＲシグナル伝達アッセイにおいてＡＱＧＶに由来する異なるトリペプチドおよびジペプチドが使用される場合、予備的結果は、ｐ３８経路の阻害において同様の効果を示す。個々のアミノ酸は、サイトゾル経由でｍＴＯＲにアプローチすることができるが、ペプチド断片（ＡＱＧＶ等のストリング）におけるアミノ酸は、ファゴリソソーム経由でｍＴＯＲの仕組みに進入する可能性がある。したがって、ペプチド等の供給源におけるアミノ酸によるｍＴＯＲの活性化は、２種の展望、１）それによって、ペプチドストリングのエンドサイトーシスが、全ファゴサイトーシス細胞、例えば、好中球および単球について最高である展望、２）それによって、ペプチド断片が、ＰＥＰＴ１／２経由で進入する展望から説明することができる。
最後に、本出願人らは、機構的ラパマイシン標的、ｍＴＯＲの関与を提案する。この展望において、ペプチドは、ＰＥＰＴ１／２経由で、または能動的エンドサイトーシスもしくはファゴサイトーシスプロセシングによって細胞に進入し、その後、ペプチドは、ファゴリソソームにおいて完全に加水分解され、その結果生じるオートファジー阻害アミノ酸は、ｍＴＯＲ複合体に提示され、そこで、細胞のオートファジーの阻害を引き起こす。テトラペプチド、トリペプチドおよびジペプチド活性は全て、アミノ酸Ａ、Ｑ、Ｇ、Ｖ、ＬおよびＰの群から選択される、単一アミノ酸Ａ、Ｑ、Ｇ、Ｖの最終因果活性を反映することができる。このようにして、アミノ酸Ａ、Ｑ、Ｇ、Ｖ、ＬおよびＰは、ｍＴＯＲのための食べ物である。実際に、ＦＰＲシグナル伝達アッセイにおいてＡＱＧＶに由来する異なるトリペプチドおよびジペプチドが使用される場合、予備的結果は、ｐ３８経路の阻害において同様の効果を示す。個々のアミノ酸は、サイトゾル経由でｍＴＯＲにアプローチすることができるが、ペプチド断片（ＡＱＧＶ等のストリング）におけるアミノ酸は、ファゴリソソーム経由でｍＴＯＲの仕組みに進入する可能性がある。したがって、ペプチド等の供給源におけるアミノ酸によるｍＴＯＲの活性化は、２種の展望、１）それによって、ペプチドストリングのエンドサイトーシスが、全ファゴサイトーシス細胞、例えば、好中球および単球について最高である展望、２）それによって、ペプチド断片が、ＰＥＰＴ１／２経由で進入する展望から説明することができる。
【0037】
アミノ酸は、ｍＴＯＲ経路を活性化し、オートファジーを阻害する
オートファジーは、栄養素が不十分である場合、細胞の生存のためにアミノ酸を産生するように機能し、アミノ酸は、オートファジーの有効な阻害剤である。機構的ラパマイシン（rapamicin）標的（ｍＴＯＲ）は、オートファジー誘導の重大な調節因子であり、活性化されたｍＴＯＲは、オートファジーを抑制し、ｍＴＯＲの負の調節は、それを促進する。アミノ酸は実際に、細胞増殖、タンパク質合成、オートファジーおよび生存に影響を与える、ｍＴＯＲ複合体１または２活性化の重要な調節因子であると考慮される。これらの知見は、アミノ酸によって使用される新たなシグナル伝達経路を同定し、細胞代謝におけるこれらの栄養素の決定的な重要性を強調し、薬学的に活性なペプチドの開発における新たな機構的洞察を提案する。
オートファジーは、栄養素が不十分である場合、細胞の生存のためにアミノ酸を産生するように機能し、アミノ酸は、オートファジーの有効な阻害剤である。機構的ラパマイシン（rapamicin）標的（ｍＴＯＲ）は、オートファジー誘導の重大な調節因子であり、活性化されたｍＴＯＲは、オートファジーを抑制し、ｍＴＯＲの負の調節は、それを促進する。アミノ酸は実際に、細胞増殖、タンパク質合成、オートファジーおよび生存に影響を与える、ｍＴＯＲ複合体１または２活性化の重要な調節因子であると考慮される。これらの知見は、アミノ酸によって使用される新たなシグナル伝達経路を同定し、細胞代謝におけるこれらの栄養素の決定的な重要性を強調し、薬学的に活性なペプチドの開発における新たな機構的洞察を提案する。
【0038】
ｍＴＯＲ経路に対するアミノ酸の差次的シグナル伝達
いくつかのアミノ酸は、他のアミノ酸よりもタンパク質生成（ｍＴＯＲキナーゼ）またはタンパク質分解（オートファジー）を制御することが知られている。近年およびそれ以前のデータは、効果がないかまたは反対の効果を有することが報告されたグルタミン酸（Ｅ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、リジン（Ｋ）、スレオニン（Ｔ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびメチオニン（Ｍ）等の他のアミノ酸よりも強力なｍＴＯＲの活性化因子またはオートファジーの阻害剤として、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、アラニン（Ａ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、プロリン（Ｐ）およびアスパラギン（Ｎ）を単独でまたは組み合わせて同定する。アミノ酸ロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）、グルタミン（Ｑ）およびプロリン（Ｐ）は、ヒト細胞において最も顕著なオートファジー効果を有することが報告される（AJ Meijer et al Amino Acids 2015, 47, 2037-2063.）。
いくつかのアミノ酸は、他のアミノ酸よりもタンパク質生成（ｍＴＯＲキナーゼ）またはタンパク質分解（オートファジー）を制御することが知られている。近年およびそれ以前のデータは、効果がないかまたは反対の効果を有することが報告されたグルタミン酸（Ｅ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、リジン（Ｋ）、スレオニン（Ｔ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびメチオニン（Ｍ）等の他のアミノ酸よりも強力なｍＴＯＲの活性化因子またはオートファジーの阻害剤として、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、アラニン（Ａ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、プロリン（Ｐ）およびアスパラギン（Ｎ）を単独でまたは組み合わせて同定する。アミノ酸ロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）、グルタミン（Ｑ）およびプロリン（Ｐ）は、ヒト細胞において最も顕著なオートファジー効果を有することが報告される（AJ Meijer et al Amino Acids 2015, 47, 2037-2063.）。
【0039】
いくつかのｍＴＯＲのオートファジー阻害ペプチドモジュレーターおよびいくつかのそのようなペプチドの有機塩は、ＰＣＴ／ＮＬ２０１８／０５２８２２、ＰＣＴ／ＮＬ２０２０／０５０５３５、ＰＣＴ／ＮＬ２０２０／０５０６０５またはＰＣＴ／ＮＬ２０２１／０５０２２３において、炎症の処置または血行動態不安定の問題に取り組むことにおいて有用であることが前に見出された。本出願において、このクラスのオートファジー阻害ペプチドが、ヒト血管内皮細胞の出芽アッセイにおいて示される通り、血管新生特性を有し、ヒトにおける糖尿病性（足部）潰瘍の治癒において有用であることが開示されている。
【0040】
これらのペプチドのいくつかは、ヒトエラスチン受容体複合体（ＥＲＣ）への結合モチーフを保有する；そのような結合モチーフｘＧｘｘＰｘは、例えば、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ベータ－ｈＣＧ）のループ２におけるほぼ４１～５７位に由来するペプチド断片に存在する（図５も参照）。β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ベータ－ｈＣＧ）におけるほぼ４１～５７位（一部は、４０～５４に指定する）に由来する小型のペプチドは、妊娠中の母子免疫応答から母子共に保護する可能性がある（ＵＳ６５８３１０９Ｂ１、ＵＳ７３５８３３０Ｂ２、Khan, Immunoregulatory Properties of Break Down Products of Human Choriogonadotropin, thesis, 2010）。ＵＳ６５８３１０９Ｂ１は、関与するとしてＬＱＧＶＬＰＡＬＰＱＶＶＣを同定し、Ｋｈａｎ（前記の箇所に、２０１０年）は、関与するとしてＭＴＲＶＬＱＧＶＬＰＡＬＰＱを同定し、ＵＳ７３５８３３０Ｂ２は、前記保護の提供に少なくとも関与するとして共通モチーフＬＱＧＶＬＰＡＬＰＱ（本出願において、コアＥＲＣ結合モチーフＱＧＶＬＰＡにより認識される）を同定する。Ｋｈａｎ（前記の箇所に、２０１０年）は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）におけるＬＱＧＶおよびＶＬＰＡＬＰを検査する： － 両方のペプチドは、ＮＯＤマウスにおけるＴ１Ｄ開始を有意に（ｐ＜０．０００１）遅延させる。Ｂｉｏｔｅｍｐｔ（ＵＳ７３５８３３０Ｂ２）は、ＬＰＳ研究においてｉｎ ｖｉｔｒｏでＬＱＧＶ、ＶＬＰＡＬＰおよびそれぞれのｈＣＧ由来アラニン補充ペプチドを検査した：ＬＱＧＶ、ＡＱＧＶ、ＬＡＧＶ、ＬＱＡＶ、ＬＱＧＡ、ＶＬＰＡＬＰ、ＡＬＰＡＬＰ、ＶＡＰＡＬＰ、ＶＬＡＡＬＰ、ＶＬＰＡＡＰおよびＶＬＰＡＬＡ。全てが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＬＰＳ－活性を有意に阻害した。Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら（Synthetic oligopeptides related to the [beta]-subunit of human chorionic gonadotropin attenuate inflammation and liver damage after (trauma) haemorrhagic shock and resuscitation. Shock. 2009 Mar;31(3):285-91）は、出血性ショックのラットモデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏでＬＱＧＶ、ＡＱＧＶおよびＬＡＧＶを検査する。全３種は、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６の全身性放出を有意に（ｐ＜０．００１）予防した。
ヒトＣ－ペプチドの活性も、ｘＧｘｘＰＧモチーフに依存し、ＥＲＣのアンタゴニストによって遮断される（図６も参照）。図６Ａは、早期血管新生における重要なプロセスであるＣＤ４＋リンパ球遊走におけるｘＧｘｘＰＧを有するヒトＣ－ペプチドの上方調節効果を示す（Kwee et al., CD4 T-cells regulate angiogenesis and myogenesis. Biomaterials. 2018 Sep;178:109-121）。また（Lemaire et al. The elastin peptide VGVAPG increases CD4(+) T-cell IL-4 production in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Respir Res. 2021;22(1):14）、ＶＧＶＡＰＧエラスチンペプチドのプロトタイプｘＧｘｘＰＧ結合モチーフは、ＣＤ４＋リンパ球ＩＬ－４産生をモジュレートし、血管新生におけるエラスチン由来ペプチドの同様のＣＤ４＋結合活性を指し示す。ｘＧｘｘＰＧモチーフを有しないスクランブルＣ－ペプチドおよびブタＣ－ペプチドは、ＣＤ４＋遊走に影響を与えなかった。Ｇａｌ－３は、ＣＤ４＋細胞によって発現されると考慮されるため、同様のアッセイにおいて検査されなかった。図６Ｂは、Ｃ－ペプチドのＣＤ４＋遊走性効果が、モチーフＶＧＶＡＰＧを有するペプチドの技術分野で実証される通り、それぞれｘＧｘｘＰＧ－エラスチン受容体結合の特異的阻害剤であるＶ１４ペプチドおよびラクトースによって鈍らされることを示す。よって、ヒトＣ－ペプチドの中央部分（断片）の結合は、エラスチン受容体特異的であり、血管新生におけるｘＧｘｘＰＧモチーフの存在に依存し、このようなｘＧｘｘＰＧを有するペプチドが、受容体媒介性エンドサイトーシスによって細胞に進入することをさらに説明する。実際に、Ｌｕｐｐｉら（Luppi et al., C-peptide is internalised in human endothelial and vascular smooth muscle cells via early endosomes. Diabetologia. 2009 Oct;52(10):2218-28.）は、Ｃ－ペプチドが、エンドサイトーシスによって細胞に進入し、エンドソーム内からシグナル伝達することを示す。Ｌｕｐｐｉら（前記の箇所に）によると、エンドソームは、Ｃ－ペプチドがその細胞効果を達成することができる、シグナル伝達ステーションを表す。これは、加水分解するためのセットアップ、アミノ酸が、ｍＴＯＲを活性化し、オートファジーを阻害するのに必要な条件を説明する。典型的には、いくつかのアミノ酸は、他のアミノ酸よりもｍＴＯＲを活性化し、それにより、他のアミノ酸よりもオートファジーを阻害する（図７も参照）。アラニンは、オートファジーにおいて非常に特異的な同時調節効果を有することが示された（Meijer et al., Regulation of autophagy by amino acids and MTOR-dependent signal transduction. Amino Acids. 2015 Oct;47(10):2037-63；Kadowaki et al. Nutrient control of macroautophagy in mammalian cells. Mol Aspects Med. 2006 Oct-Dec;27(5-6):426-43）。生理的濃度でのアラニンおよびロイシンの組合せは、ラット肝細胞におけるオートファジータンパク質分解において、全２０種のアミノ酸の完全混合物と同じ阻害効果を誘発する（Meijer et al、前記の箇所に）。この同じ研究は、アラニンの代謝が、オートファジーにおけるその阻害効果に要求されることも示した。また、栄養および健康におけるＬ－グルタミン（Ｇｌｎ）の役割は、広範に報告されてきたが、心血管系におけるその効果は、つい最近になって明るみに出た（Bertero et al., The molecular rationale for therapeutic targeting of glutamine metabolism in pulmonary hypertension. Expert Opin Ther Targets. 2019 Jun;23(6):511-524）。Ｔａｎら（Glutamine metabolism regulates autophagy-dependent mTORC1 reactivation during amino acid starvation. Nat Commun. 2017 Aug 24;8(1):33）は、グルタミン代謝が、オートファジー依存的様式で、延長されたアミノ酸飢餓においてｍＴＯＲＣ１活性を回復させるのに十分であることを示す。Ｕｋａｉら（Gtr/Ego-independent TORC1 activation is achieved through a glutamine-sensitive interaction with Pib2 on the vacuolar membrane. PLoS Genet 14(4): e1007334. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1007334, 2018）は、２種の分子的な仕組み、Ｐｉｂ２およびＧｔｒ／Ｅｇｏが、相互に排他的な様式で、明確に異なる複合体をＴＯＲＣ１と形成し、様々なアミノ酸に応答したＴＯＲＣ１およびＰｉｂ２またはＧｔｒ／Ｒａｇの間の排他的な機能的関係性を暗示することを示す。彼らは、ＴＯＲＣ１のアミノ酸依存的活性化が、これらを液胞膜に繋留することにより、Ｐｉｂ２およびＧｔｒ／Ｅｇｏ経路により達成されることも示し、グルタミンが、Ｐｉｂ２複合体に直接的に結合し、Ｐｉｂ２－ＴＯＲＣ１複合体形成を増強することも示し、ｍＴＯＲに対する推定グルタミンセンサーのエレメントとしてＰｉｂ２を見出す（図４も参照）。細胞内グルタミンも、細胞外必須アミノ酸と交換し（https://www.nature.com/articles/ncomms11457 - ref-CR14）（Nicklin et al., Bidirectional transport of amino acids regulates mTOR and autophagy. Cell. 2009 Feb 6;136(3):521-34）、それにより、ｍＴＯＲ活性をさらに調節する（Jewell Metabolism. Differential regulation of mTORC1 by leucine and glutamine. Science. 2015 Jan 9;347(6218):194-8. doi: 10.1126/science.1259472. Epub 2015 Jan 7）能力を有する。Ｓｕｎら（Glycine Regulates Protein Turnover by Activating Protein Kinase B/Mammalian Target of Rapamycin and by Inhibiting MuRF1 and Atrogin-1 Gene Expression in C2C12 Myoblasts. J Nutr. 2016 Dec;146(12):2461-2467.）は、グリシンが、ｍＴＯＲＣ１を活性化し、タンパク質分解のための遺伝子の発現を阻害することによりタンパク質ターンオーバーを調節することを見出す。また、デカルボキシラーゼ（ＧＬＤＣ、グリシン切断系に属する酵素）によるグリシン除去は、オートファジーを刺激する（Zhuang et al., Glycine decarboxylase induces autophagy and is downregulated by miRNA-30d-5p in hepatocellular carcinoma. Cell Death Dis 10, 192 (2019)）。さらに、Ｔ２Ｄは、内皮機能障害を引き起こし、異常な血管新生を誘導し、特に、高血糖が原因で有意に減少しているグリシンに関する血清アミノ酸代謝を変化させる。
アミノ酸プロファイルのメタボロミック解析は、細胞内グリシンが、糖尿病患者由来の内皮細胞（ＥＣ）に由来する人工多能性幹細胞由来細胞（ｉＰＳＣ）において、健康な対象に由来するそのような細胞よりも有意に低かったことを示し（Su et al., Diabetic Endothelial Cells Differentiated From Patient iPSCs Show Dysregulated Glycine Homeostasis and Senescence Associated Phenotypes. Front Cell Dev Biol. 2021 May 31;9:667252）、Ｔ２ＤにおけるＥＣのグリシン喪失を指し示す。ヒトの必須アミノ酸である分枝鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）バリンは、細胞成長および代謝において特に重要な役割を果たす。いくつかの研究は、哺乳類ラパマイシン標的（ＭＴＯＲ）経路の刺激により、タンパク質合成およびミルク収量を増加させるバリンの能力に光を当てた（Long et al., Valine increases milk fat synthesis in mammary gland of gilts through stimulating AKT/MTOR/SREBP1 pathway, Biology of Reproduction, Volume 101, Issue 1, July 2019, Pages 126-137,）。近年、血漿ＢＣＡＡ濃度は、脂質代謝恒常性の新規証明として考慮された。ヒトおよびラットにおける証拠は、バリン代謝および脂肪代謝の間の強い関係性を同定した。オートファジーの制御において、ロイシンは、アルギニンと共に、最もまたは少なくとも特に顕著な、阻害性アミノ酸であると思われる。加えて、その抗タンパク質分解効果は、インスリンおよび細胞腫脹によって増強された（Meijer et al、前記の箇所に）。基質としてのプロリンは、細胞外マトリックス、結合組織および骨においてコラーゲンとして貯蔵され、マトリックスメタロプロテイナーゼ、ペプチダーゼおよびプロリダーゼの逐次作用によってこのリザーバーから急速に放出される。唯一のタンパク質原性二級アミノ酸として、プロリンは、特殊な生物学的効果を有し、全てのタンパク質－タンパク質相互作用および代謝ストレスに対する応答の調節因子として機能し、オートファジーを含む種々の下流代謝活性を開始する（Kadowaki et al. Nutrient control of macroautophagy in mammalian cells. Mol Aspects Med. 2006 Oct-Dec;27(5-6):426-43）。１）のため、プロリンを利用する酵素は、ストレスシグナル伝達に応答し；２）のため、プロリンの大きい可動性のプールが存在し；３）のため、プロリンの代謝は、特殊なストレス機能を果たす。がんにおいて、プロリンは、オートファジーにおける栄養素および酸素喪失に対する応答者として作用することが報告された。さらになお、ここ数年間、プロリンは、神経細胞オートファジーにおけるその弁別的な代謝機能について調査されてきた。プロリンが、神経細胞オートファジーを阻害し、一方、プロリン－オキシダーゼによるプロリンの酸化が、酸化的ストレスを増強し、次いで酸化的ストレスが、オートファジーを誘発することが示された。数十年に及ぶ研究は、酵素ＮＯシンターゼ（ＮＯＳ）によるガス一酸化窒素（ＮＯ）の生成を介した心血管健康の促進におけるＬ－アルギニンの重要性を確立した。内皮細胞（ＥＣ）によるＮＯの放出は、動脈緊張を阻害することにより血流および血圧を調節する。さらに、ＮＯは、血小板凝集および接着を限定することにより、血液流動性を維持し、血栓症を予防する。ＮＯはまた、平滑筋細胞（ＳＭＣ）増殖、遊走およびコラーゲン合成を遮断することにより、内膜肥厚から保護する。近年、Ｌ－アスパラギンは、グルタミンと同様に、Ｒａｇ ＧＴＰａｓｅｓの非存在下で、Ａｒｆ１を介してｍＴＯＲＣ１にシグナル伝達し、グルタミンと同様に、細胞内アスパラギンが、細胞外アミノ酸と交換することが見出された。グルタミンは、グルタミン酸の産生を介して異なるアミノ酸の合成に関与することができるが、アスパラギンのみが、ｄｅ ｎｏｖｏ合成のためにグルタミンを要求する。アスパラギンシンテターゼ（ＡＳＮＳ）は、ＡＴＰ依存的様式でグルタミンおよびアスパラギン酸からグルタミン酸およびアスパラギンへと変換する酵素である６。ＡＳＮＳ発現は、活性化転写因子４（ＡＴＦ４）の活性化により、アミノ酸飢餓中に上方調節される。アスパラギンは、セリン／スレオニンキナーゼ哺乳類ラパマイシン標的複合体１（ｍＴＯＲＣ１）、ヌクレオチド生合成および増殖を調節する交換アミノ酸因子として同定された（Bodineau et al., Two parallel pathways connect glutamine metabolism and mTORC1 activity to regulate glutamoptosis. Nat Commun. 2021 Aug 10;12(1):4814.）。
ヒトＣ－ペプチドの活性も、ｘＧｘｘＰＧモチーフに依存し、ＥＲＣのアンタゴニストによって遮断される（図６も参照）。図６Ａは、早期血管新生における重要なプロセスであるＣＤ４＋リンパ球遊走におけるｘＧｘｘＰＧを有するヒトＣ－ペプチドの上方調節効果を示す（Kwee et al., CD4 T-cells regulate angiogenesis and myogenesis. Biomaterials. 2018 Sep;178:109-121）。また（Lemaire et al. The elastin peptide VGVAPG increases CD4(+) T-cell IL-4 production in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Respir Res. 2021;22(1):14）、ＶＧＶＡＰＧエラスチンペプチドのプロトタイプｘＧｘｘＰＧ結合モチーフは、ＣＤ４＋リンパ球ＩＬ－４産生をモジュレートし、血管新生におけるエラスチン由来ペプチドの同様のＣＤ４＋結合活性を指し示す。ｘＧｘｘＰＧモチーフを有しないスクランブルＣ－ペプチドおよびブタＣ－ペプチドは、ＣＤ４＋遊走に影響を与えなかった。Ｇａｌ－３は、ＣＤ４＋細胞によって発現されると考慮されるため、同様のアッセイにおいて検査されなかった。図６Ｂは、Ｃ－ペプチドのＣＤ４＋遊走性効果が、モチーフＶＧＶＡＰＧを有するペプチドの技術分野で実証される通り、それぞれｘＧｘｘＰＧ－エラスチン受容体結合の特異的阻害剤であるＶ１４ペプチドおよびラクトースによって鈍らされることを示す。よって、ヒトＣ－ペプチドの中央部分（断片）の結合は、エラスチン受容体特異的であり、血管新生におけるｘＧｘｘＰＧモチーフの存在に依存し、このようなｘＧｘｘＰＧを有するペプチドが、受容体媒介性エンドサイトーシスによって細胞に進入することをさらに説明する。実際に、Ｌｕｐｐｉら（Luppi et al., C-peptide is internalised in human endothelial and vascular smooth muscle cells via early endosomes. Diabetologia. 2009 Oct;52(10):2218-28.）は、Ｃ－ペプチドが、エンドサイトーシスによって細胞に進入し、エンドソーム内からシグナル伝達することを示す。Ｌｕｐｐｉら（前記の箇所に）によると、エンドソームは、Ｃ－ペプチドがその細胞効果を達成することができる、シグナル伝達ステーションを表す。これは、加水分解するためのセットアップ、アミノ酸が、ｍＴＯＲを活性化し、オートファジーを阻害するのに必要な条件を説明する。典型的には、いくつかのアミノ酸は、他のアミノ酸よりもｍＴＯＲを活性化し、それにより、他のアミノ酸よりもオートファジーを阻害する（図７も参照）。アラニンは、オートファジーにおいて非常に特異的な同時調節効果を有することが示された（Meijer et al., Regulation of autophagy by amino acids and MTOR-dependent signal transduction. Amino Acids. 2015 Oct;47(10):2037-63；Kadowaki et al. Nutrient control of macroautophagy in mammalian cells. Mol Aspects Med. 2006 Oct-Dec;27(5-6):426-43）。生理的濃度でのアラニンおよびロイシンの組合せは、ラット肝細胞におけるオートファジータンパク質分解において、全２０種のアミノ酸の完全混合物と同じ阻害効果を誘発する（Meijer et al、前記の箇所に）。この同じ研究は、アラニンの代謝が、オートファジーにおけるその阻害効果に要求されることも示した。また、栄養および健康におけるＬ－グルタミン（Ｇｌｎ）の役割は、広範に報告されてきたが、心血管系におけるその効果は、つい最近になって明るみに出た（Bertero et al., The molecular rationale for therapeutic targeting of glutamine metabolism in pulmonary hypertension. Expert Opin Ther Targets. 2019 Jun;23(6):511-524）。Ｔａｎら（Glutamine metabolism regulates autophagy-dependent mTORC1 reactivation during amino acid starvation. Nat Commun. 2017 Aug 24;8(1):33）は、グルタミン代謝が、オートファジー依存的様式で、延長されたアミノ酸飢餓においてｍＴＯＲＣ１活性を回復させるのに十分であることを示す。Ｕｋａｉら（Gtr/Ego-independent TORC1 activation is achieved through a glutamine-sensitive interaction with Pib2 on the vacuolar membrane. PLoS Genet 14(4): e1007334. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1007334, 2018）は、２種の分子的な仕組み、Ｐｉｂ２およびＧｔｒ／Ｅｇｏが、相互に排他的な様式で、明確に異なる複合体をＴＯＲＣ１と形成し、様々なアミノ酸に応答したＴＯＲＣ１およびＰｉｂ２またはＧｔｒ／Ｒａｇの間の排他的な機能的関係性を暗示することを示す。彼らは、ＴＯＲＣ１のアミノ酸依存的活性化が、これらを液胞膜に繋留することにより、Ｐｉｂ２およびＧｔｒ／Ｅｇｏ経路により達成されることも示し、グルタミンが、Ｐｉｂ２複合体に直接的に結合し、Ｐｉｂ２－ＴＯＲＣ１複合体形成を増強することも示し、ｍＴＯＲに対する推定グルタミンセンサーのエレメントとしてＰｉｂ２を見出す（図４も参照）。細胞内グルタミンも、細胞外必須アミノ酸と交換し（https://www.nature.com/articles/ncomms11457 - ref-CR14）（Nicklin et al., Bidirectional transport of amino acids regulates mTOR and autophagy. Cell. 2009 Feb 6;136(3):521-34）、それにより、ｍＴＯＲ活性をさらに調節する（Jewell Metabolism. Differential regulation of mTORC1 by leucine and glutamine. Science. 2015 Jan 9;347(6218):194-8. doi: 10.1126/science.1259472. Epub 2015 Jan 7）能力を有する。Ｓｕｎら（Glycine Regulates Protein Turnover by Activating Protein Kinase B/Mammalian Target of Rapamycin and by Inhibiting MuRF1 and Atrogin-1 Gene Expression in C2C12 Myoblasts. J Nutr. 2016 Dec;146(12):2461-2467.）は、グリシンが、ｍＴＯＲＣ１を活性化し、タンパク質分解のための遺伝子の発現を阻害することによりタンパク質ターンオーバーを調節することを見出す。また、デカルボキシラーゼ（ＧＬＤＣ、グリシン切断系に属する酵素）によるグリシン除去は、オートファジーを刺激する（Zhuang et al., Glycine decarboxylase induces autophagy and is downregulated by miRNA-30d-5p in hepatocellular carcinoma. Cell Death Dis 10, 192 (2019)）。さらに、Ｔ２Ｄは、内皮機能障害を引き起こし、異常な血管新生を誘導し、特に、高血糖が原因で有意に減少しているグリシンに関する血清アミノ酸代謝を変化させる。
アミノ酸プロファイルのメタボロミック解析は、細胞内グリシンが、糖尿病患者由来の内皮細胞（ＥＣ）に由来する人工多能性幹細胞由来細胞（ｉＰＳＣ）において、健康な対象に由来するそのような細胞よりも有意に低かったことを示し（Su et al., Diabetic Endothelial Cells Differentiated From Patient iPSCs Show Dysregulated Glycine Homeostasis and Senescence Associated Phenotypes. Front Cell Dev Biol. 2021 May 31;9:667252）、Ｔ２ＤにおけるＥＣのグリシン喪失を指し示す。ヒトの必須アミノ酸である分枝鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）バリンは、細胞成長および代謝において特に重要な役割を果たす。いくつかの研究は、哺乳類ラパマイシン標的（ＭＴＯＲ）経路の刺激により、タンパク質合成およびミルク収量を増加させるバリンの能力に光を当てた（Long et al., Valine increases milk fat synthesis in mammary gland of gilts through stimulating AKT/MTOR/SREBP1 pathway, Biology of Reproduction, Volume 101, Issue 1, July 2019, Pages 126-137,）。近年、血漿ＢＣＡＡ濃度は、脂質代謝恒常性の新規証明として考慮された。ヒトおよびラットにおける証拠は、バリン代謝および脂肪代謝の間の強い関係性を同定した。オートファジーの制御において、ロイシンは、アルギニンと共に、最もまたは少なくとも特に顕著な、阻害性アミノ酸であると思われる。加えて、その抗タンパク質分解効果は、インスリンおよび細胞腫脹によって増強された（Meijer et al、前記の箇所に）。基質としてのプロリンは、細胞外マトリックス、結合組織および骨においてコラーゲンとして貯蔵され、マトリックスメタロプロテイナーゼ、ペプチダーゼおよびプロリダーゼの逐次作用によってこのリザーバーから急速に放出される。唯一のタンパク質原性二級アミノ酸として、プロリンは、特殊な生物学的効果を有し、全てのタンパク質－タンパク質相互作用および代謝ストレスに対する応答の調節因子として機能し、オートファジーを含む種々の下流代謝活性を開始する（Kadowaki et al. Nutrient control of macroautophagy in mammalian cells. Mol Aspects Med. 2006 Oct-Dec;27(5-6):426-43）。１）のため、プロリンを利用する酵素は、ストレスシグナル伝達に応答し；２）のため、プロリンの大きい可動性のプールが存在し；３）のため、プロリンの代謝は、特殊なストレス機能を果たす。がんにおいて、プロリンは、オートファジーにおける栄養素および酸素喪失に対する応答者として作用することが報告された。さらになお、ここ数年間、プロリンは、神経細胞オートファジーにおけるその弁別的な代謝機能について調査されてきた。プロリンが、神経細胞オートファジーを阻害し、一方、プロリン－オキシダーゼによるプロリンの酸化が、酸化的ストレスを増強し、次いで酸化的ストレスが、オートファジーを誘発することが示された。数十年に及ぶ研究は、酵素ＮＯシンターゼ（ＮＯＳ）によるガス一酸化窒素（ＮＯ）の生成を介した心血管健康の促進におけるＬ－アルギニンの重要性を確立した。内皮細胞（ＥＣ）によるＮＯの放出は、動脈緊張を阻害することにより血流および血圧を調節する。さらに、ＮＯは、血小板凝集および接着を限定することにより、血液流動性を維持し、血栓症を予防する。ＮＯはまた、平滑筋細胞（ＳＭＣ）増殖、遊走およびコラーゲン合成を遮断することにより、内膜肥厚から保護する。近年、Ｌ－アスパラギンは、グルタミンと同様に、Ｒａｇ ＧＴＰａｓｅｓの非存在下で、Ａｒｆ１を介してｍＴＯＲＣ１にシグナル伝達し、グルタミンと同様に、細胞内アスパラギンが、細胞外アミノ酸と交換することが見出された。グルタミンは、グルタミン酸の産生を介して異なるアミノ酸の合成に関与することができるが、アスパラギンのみが、ｄｅ ｎｏｖｏ合成のためにグルタミンを要求する。アスパラギンシンテターゼ（ＡＳＮＳ）は、ＡＴＰ依存的様式でグルタミンおよびアスパラギン酸からグルタミン酸およびアスパラギンへと変換する酵素である６。ＡＳＮＳ発現は、活性化転写因子４（ＡＴＦ４）の活性化により、アミノ酸飢餓中に上方調節される。アスパラギンは、セリン／スレオニンキナーゼ哺乳類ラパマイシン標的複合体１（ｍＴＯＲＣ１）、ヌクレオチド生合成および増殖を調節する交換アミノ酸因子として同定された（Bodineau et al., Two parallel pathways connect glutamine metabolism and mTORC1 activity to regulate glutamoptosis. Nat Commun. 2021 Aug 10;12(1):4814.）。
【0041】
Ｍａｔｒｉｇｅｌ中で育成されたヒト血管内皮細胞の微小血管血管新生（出芽）アッセイ（図８、図９および図１０も参照）
ヒト肺微小血管内皮細胞（Ｈｐｍｅｃ、ＨＵＶＥまたは他の血管ＥＣを使用することもできる）を、１０％ＦＢＳ、ならびにヒト組換えＦＧＦ－Ｂ、ヒト組換えＶＥＧＦ、ヒト組換えＲ３－ＩＧＦ－１、アスコルビン酸、ヒト組換えＥＧＦおよびＧＡ－１０００（ゲンタマイシン硫酸塩－アンホテリシン）を含有するビュレット（bullet）キット（Ｌｏｎｚａ、ＣＣ－４１４７）中に存在する全構成成分を補給したＥＢＭ－２培地（Ｌｏｎｚａ、ＣＣ－３１５６）において培養した。アッセイの２４時間前に、１０％ＦＢＳの代わりに０．５％ＦＢＳを含有するＥＢＭ－２培地においてＨｐｍｅｃを飢餓状態にした。血管新生アッセイにおける導入のため、内皮細胞を温かいＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン処理し、無血清ＥＢＭ－２培地に再懸濁した。血管新生アッセイのため、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌａｎｄｓｍｅｅｒ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ＃１１５２３５５０）を無血清ＥＢＭ－２培地において１：１希釈し、９６ウェルプレート（５０ｕＬ）においてプレーティングした。重合後に、細胞を実験ペプチド断片と組み合わせ、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１００μＬ）の上面に添加した。インキュベーションの２４時間後に４×対物レンズを用いて微小血管網の写真を撮り、ＩｍａｇｅＪにおけるプラグイン血管新生分析計を使用して解析した。
ヒト肺微小血管内皮細胞（Ｈｐｍｅｃ、ＨＵＶＥまたは他の血管ＥＣを使用することもできる）を、１０％ＦＢＳ、ならびにヒト組換えＦＧＦ－Ｂ、ヒト組換えＶＥＧＦ、ヒト組換えＲ３－ＩＧＦ－１、アスコルビン酸、ヒト組換えＥＧＦおよびＧＡ－１０００（ゲンタマイシン硫酸塩－アンホテリシン）を含有するビュレット（bullet）キット（Ｌｏｎｚａ、ＣＣ－４１４７）中に存在する全構成成分を補給したＥＢＭ－２培地（Ｌｏｎｚａ、ＣＣ－３１５６）において培養した。アッセイの２４時間前に、１０％ＦＢＳの代わりに０．５％ＦＢＳを含有するＥＢＭ－２培地においてＨｐｍｅｃを飢餓状態にした。血管新生アッセイにおける導入のため、内皮細胞を温かいＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン処理し、無血清ＥＢＭ－２培地に再懸濁した。血管新生アッセイのため、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌａｎｄｓｍｅｅｒ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ＃１１５２３５５０）を無血清ＥＢＭ－２培地において１：１希釈し、９６ウェルプレート（５０ｕＬ）においてプレーティングした。重合後に、細胞を実験ペプチド断片と組み合わせ、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１００μＬ）の上面に添加した。インキュベーションの２４時間後に４×対物レンズを用いて微小血管網の写真を撮り、ＩｍａｇｅＪにおけるプラグイン血管新生分析計を使用して解析した。
【0042】
創傷治癒における血管新生は、アンジオポエチン１（ＡＮＧ１）対アンジオポエチン２（ＡＮＧ２）のモジュレーションを要求する（図１１も参照）
アンジオポエチンファミリー（Ａｎｇ－１～４）は、生理学的血管新生および病理学的新血管新生のモジュレーションにおいて重大な役割を果たすことが示された。ＶＥＧＦおよびアンジオポエチンは、血管発生および胚発生において独立した役割を果たしつつ一緒に機能する；ＶＥＧＦは、血管形成において早期に作用し、Ａｎｇ－１は、血管リモデリング、成熟および安定化においてより後期に作用する。アンジオポエチン１および２は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおいて研究された。ＶＥＧＦの血管新生促進性（pro-angiogenic）特性の多くを共有する十分に確立された分泌７０ＫＤａリガンドであるＡｎｇ－１は、ＶＥＧＦによって刺激される経内皮透過性を相殺することにより、増加した血漿漏出から血管を保護する。Ａｎｇ－１は、血管内皮において遍在的に発現され、静止状態の血管においてリン酸化される膜貫通受容体チロシンキナーゼ（Ｔｉｅ２）を主に介してシグナル伝達する。Ａｎｇ－１は、インテグリンを介して好中球、内皮細胞および線維芽細胞等のいくつかの細胞と相互作用して、生存、細胞接着および遊走を媒介する。Ａｎｇ－１は、胚性致死であるＡｎｇ－１ヌルマウスによって証明される通り、血管発生の必須かつ重大な調節因子である。対照的に、Ａｎｇ－１およびＴｉｅ２シグナル伝達のアンタゴニストであるＡｎｇ－２は一般に、健康な成人の組織において発現されないが、創傷の治癒等、炎症および血管リモデリングを起こしている分泌性組織において発現される。
アンジオポエチンファミリー（Ａｎｇ－１～４）は、生理学的血管新生および病理学的新血管新生のモジュレーションにおいて重大な役割を果たすことが示された。ＶＥＧＦおよびアンジオポエチンは、血管発生および胚発生において独立した役割を果たしつつ一緒に機能する；ＶＥＧＦは、血管形成において早期に作用し、Ａｎｇ－１は、血管リモデリング、成熟および安定化においてより後期に作用する。アンジオポエチン１および２は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおいて研究された。ＶＥＧＦの血管新生促進性（pro-angiogenic）特性の多くを共有する十分に確立された分泌７０ＫＤａリガンドであるＡｎｇ－１は、ＶＥＧＦによって刺激される経内皮透過性を相殺することにより、増加した血漿漏出から血管を保護する。Ａｎｇ－１は、血管内皮において遍在的に発現され、静止状態の血管においてリン酸化される膜貫通受容体チロシンキナーゼ（Ｔｉｅ２）を主に介してシグナル伝達する。Ａｎｇ－１は、インテグリンを介して好中球、内皮細胞および線維芽細胞等のいくつかの細胞と相互作用して、生存、細胞接着および遊走を媒介する。Ａｎｇ－１は、胚性致死であるＡｎｇ－１ヌルマウスによって証明される通り、血管発生の必須かつ重大な調節因子である。対照的に、Ａｎｇ－１およびＴｉｅ２シグナル伝達のアンタゴニストであるＡｎｇ－２は一般に、健康な成人の組織において発現されないが、創傷の治癒等、炎症および血管リモデリングを起こしている分泌性組織において発現される。
【0043】
減少した創傷治癒に寄与する因子（図１２も参照）
慢性糖尿病性潰瘍は、毎年の米国における４２，５００件を超える非外傷性下肢切断および糖尿病医療費の２７％の原因である。皮膚性糖尿病性創傷治癒の表現型における機能障害は、示されているいくつかの内因性および外因性因子に関連する。糖尿病患者におけるならびにＩ型およびＩＩ型糖尿病のマウスモデルにおける創傷は、血管新生、再上皮化および創傷閉鎖の欠損を示す。初期再上皮化は、血管新生に依存しないが、完全治癒および成熟は、血管新生活性に関与するいくつかの細胞の血管性応答および細胞・マトリックス相互作用によって密接に調節される。血管新生の欠乏は、不十分に管理された血液グルコースレベルに、ならびに内皮細胞（ＥＣ）および内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の両方における関連する血管欠損に起因した。糖尿病における新血管新生の欠損は、代謝撹乱の結果として、創傷治癒における虚血に対する応答が損なわれていることと関連することが知られているが、この曖昧な理解を越えて、糖尿病における虚血性組織の血行を再建する能力が損なわれていることは、理解が不十分である。この機能障害を説明するための潜在的な機構は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン－１（Ａｎｇ－１）およびそれらの受容体等の血管新生成長因子の発現の減少である。２型糖尿病対象の下肢の創傷周囲区域から採取された皮膚試料（創傷周縁部から１ｃｍ以内の皮膚）は、非糖尿病対象の皮膚組織よりも有意に少ない、ＶＥＧＦ（４６％）およびＡｎｇ－１（３６％）の両方の発現を有する。多くのグループが、損なわれた新血管新生を、糖尿病性創傷の遅延された閉鎖と関連付ける証拠を示し、さらに、組換え成長因子療法または遺伝子移入による血管新生成長因子、例えば、ＶＥＧＦ、Ａｎｇ－１、ＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびＨＩＦ１－α、またはこれらの因子の組合せの補給が、新血管新生の改善および糖尿病性創傷閉鎖のアウトカムにおいてプラスの効果を有することを示した。
慢性糖尿病性潰瘍は、毎年の米国における４２，５００件を超える非外傷性下肢切断および糖尿病医療費の２７％の原因である。皮膚性糖尿病性創傷治癒の表現型における機能障害は、示されているいくつかの内因性および外因性因子に関連する。糖尿病患者におけるならびにＩ型およびＩＩ型糖尿病のマウスモデルにおける創傷は、血管新生、再上皮化および創傷閉鎖の欠損を示す。初期再上皮化は、血管新生に依存しないが、完全治癒および成熟は、血管新生活性に関与するいくつかの細胞の血管性応答および細胞・マトリックス相互作用によって密接に調節される。血管新生の欠乏は、不十分に管理された血液グルコースレベルに、ならびに内皮細胞（ＥＣ）および内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の両方における関連する血管欠損に起因した。糖尿病における新血管新生の欠損は、代謝撹乱の結果として、創傷治癒における虚血に対する応答が損なわれていることと関連することが知られているが、この曖昧な理解を越えて、糖尿病における虚血性組織の血行を再建する能力が損なわれていることは、理解が不十分である。この機能障害を説明するための潜在的な機構は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン－１（Ａｎｇ－１）およびそれらの受容体等の血管新生成長因子の発現の減少である。２型糖尿病対象の下肢の創傷周囲区域から採取された皮膚試料（創傷周縁部から１ｃｍ以内の皮膚）は、非糖尿病対象の皮膚組織よりも有意に少ない、ＶＥＧＦ（４６％）およびＡｎｇ－１（３６％）の両方の発現を有する。多くのグループが、損なわれた新血管新生を、糖尿病性創傷の遅延された閉鎖と関連付ける証拠を示し、さらに、組換え成長因子療法または遺伝子移入による血管新生成長因子、例えば、ＶＥＧＦ、Ａｎｇ－１、ＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびＨＩＦ１－α、またはこれらの因子の組合せの補給が、新血管新生の改善および糖尿病性創傷閉鎖のアウトカムにおいてプラスの効果を有することを示した。
【0044】
Ｃ－ペプチド欠乏の決定（図１３も参照）
Ｐａｎｅｒｏら（Fasting plasma C-peptide and micro- and macrovascular complications in a large clinic-based cohort of type 1 diabetic patients. Diabetes Care. 2009 Feb;32(2):301-5）は、微小血管性脈管障害を有するＴ１Ｄ患者における空腹時血漿Ｃ－ペプチド（正常値０．３６～１．１７ｎｍｏｌ／ｌ；Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）を測定することにより、残存β－細胞機能と、それに伴う、相対的Ｃ－ペプチド欠乏を評価した。彼らは次いで、微小血管性（網膜症、ミクロアルブミン尿およびマクロアルブミン尿、ならびに糖尿病性末梢神経障害（ＤＰＮ））および大血管性合併症（心筋梗塞、アンギナ、冠動脈バイパス移植、脳卒中および末梢動脈症）に独立して関連する変数を研究するためにロジスティック回帰解析を行った。Ｃ－ペプチドの独立した役割は、その分布の三分位値を使用して試験した（＜０．０６、０．０６～０．１０および０．１１～２．７６ｎｍｏｌ／ｌ）。最低三分位値（＜０．０６ ｎｍｏｌ／ｌ）における空腹時Ｃ－ペプチド値に関して、より高い値は、微小血管性合併症のより低い有病率に関連した（オッズ比［ＯＲ］０．５９［９５％ＣＩ ０．３７～０．９４］）。大血管性合併症との関連は明らかでなかった（０．７７［０．３８～１．５８］）。
Ｐａｎｅｒｏら（Fasting plasma C-peptide and micro- and macrovascular complications in a large clinic-based cohort of type 1 diabetic patients. Diabetes Care. 2009 Feb;32(2):301-5）は、微小血管性脈管障害を有するＴ１Ｄ患者における空腹時血漿Ｃ－ペプチド（正常値０．３６～１．１７ｎｍｏｌ／ｌ；Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）を測定することにより、残存β－細胞機能と、それに伴う、相対的Ｃ－ペプチド欠乏を評価した。彼らは次いで、微小血管性（網膜症、ミクロアルブミン尿およびマクロアルブミン尿、ならびに糖尿病性末梢神経障害（ＤＰＮ））および大血管性合併症（心筋梗塞、アンギナ、冠動脈バイパス移植、脳卒中および末梢動脈症）に独立して関連する変数を研究するためにロジスティック回帰解析を行った。Ｃ－ペプチドの独立した役割は、その分布の三分位値を使用して試験した（＜０．０６、０．０６～０．１０および０．１１～２．７６ｎｍｏｌ／ｌ）。最低三分位値（＜０．０６ ｎｍｏｌ／ｌ）における空腹時Ｃ－ペプチド値に関して、より高い値は、微小血管性合併症のより低い有病率に関連した（オッズ比［ＯＲ］０．５９［９５％ＣＩ ０．３７～０．９４］）。大血管性合併症との関連は明らかでなかった（０．７７［０．３８～１．５８］）。
【0045】
Ｑｉａｏら（C-peptide is independent associated with diabetic peripheral neuropathy: a community-based study. Diabetol Metab Syndr 9, 12 (2017).）は、２型糖尿病患者における残存Ｃ－ペプチドおよびＤＰＮの間の関係性を研究した。糖尿病の持続時間の増加に伴い、島機能は徐々に縮小し、低減したＣ－ペプチドおよびインスリンレベルをもたらし、ＤＰＮの有病率が増加する。非ＤＰＮ群における空腹時Ｃ－ペプチド、摂食２時間後Ｃ－ペプチドおよびΔＣ－ペプチド（すなわち、摂食２時間後Ｃ－ペプチド、マイナス、空腹時Ｃ－ペプチド）血清濃度は、臨床ＤＰＮ群（全てＰ≦０．０４０）および確認されたＤＰＮ群（全てＰ＜０．００２）における血清濃度よりも有意に高かった。３種のＣ－ペプチドパラメータは、年齢、性別、糖尿病持続時間、喫煙状態、収縮期圧、肥満度指数、アンジオテンシン変換酵素阻害剤／アンジオテンシン受容体遮断薬使用、空腹時血漿グルコース、ＨｂＡ１ｃ、トリグリセリドおよび推定糸球体濾過率について補正した後にＤＰＮ（全てＰ＜０．０５）に独立して関連した。ΔＣ－ペプチド四分位値１（参照）と比較して、四分位値３（オッズ比［ＯＲ］、０．１１０；９５％信頼区間［ＣＩ］０．０２６～０．４６６；Ｐ＝０．００３）および四分位値４（ＯＲ、０．０１２；９５％ＣＩ ０．０２６～０．５５９；Ｐ＝０．００７）における患者は、交絡要因について補正した後にＤＰＮのより低いリスクを有した。２００μＬの試料体積を使用して、ＡＤＶＩＡ Ｃｅｎｔａｕｒ ＸＰ自動分析計（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）におけるケミルミネッセンス（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＳＡ）によってＣ－ペプチドを測定した。これらの研究から、ＤＰＮを有する患者における空腹時Ｃ－ペプチド欠乏が、１ｎｍｏｌ／ｌ未満の値で、より具体的には、０．５ｎｍｏｌ／ｌ未満の値で、より具体的には、０．３ｎｍｏｌ／Ｌ未満で、より具体的には、０．３ｎｍｏｌ／ｌ未満の値で、より具体的には、０．２ｎｍｏｌ／Ｌ未満で、より具体的には、０．１ｎｍｏｌ／ｌ未満の値で、より具体的には、０．０６ｎｍｏｌ／Ｌ未満で、ますます存在することが分かってきた。そのような患者をよりよく区別するために、摂食後Ｃ－ペプチドレベル（例えば、Qiao et al、前記の箇所によって提供される通り）を決定することにより、さらなる解析を為すことができ、臨床的に関連性があるＣ－ペプチド欠乏が、１ｎｍｏｌ／ｌ未満で摂食後に既に見出され得ることを指し示す。ΔＣ－ペプチド（すなわち、摂食２時間後Ｃ－ペプチド、マイナス、空腹時Ｃ－ペプチド、例えば、Qiao et al、前記の箇所によって提供される通り）の決定は、患者がＣ－ペプチド欠乏を患っているか否かについてさらに決定することができる。一般に、１ｎｍｏｌ／ｌ未満のΔＣ－ペプチドを有する患者は、ＤＰＮのリスクがあると考えられる。
【実施例】
【0046】
さらなる用量設定研究後の製剤、変数の実施例。
【0047】
[実施例１]
ＱＡＱＧＶＡＬＱ－マレイン酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＱＡＱＧＶＡＬＱ－マレイン酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＱＡＱＧＶＡＬＱ－マレイン酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＱＡＱＧＶＡＬＱ－マレイン酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0048】
[実施例２]
ＬＱＧＶＬＰＡＬ－マレイン酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＶＬＰＡＬ－マレイン酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＬＱＧＶＬＰＡＬ－マレイン酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＶＬＰＡＬ－マレイン酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0049】
[実施例３]
ＶＬＱＡＶＬＰＰ－マレイン酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＶＬＱＡＶＬＰＰ－マレイン酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＶＬＱＡＶＬＰＰ－マレイン酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＶＬＱＡＶＬＰＰ－マレイン酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0050】
[実施例４]
ＰＧＡＹＰＧＱＡ－マレイン酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＰＧＡＹＰＧＱＡ－マレイン酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＰＧＡＹＰＧＱＡ－マレイン酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＰＧＡＹＰＧＱＡ－マレイン酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0051】
[実施例５]
ＡＱＧＶ－マレイン酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＡＱＧＶ－マレイン酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＡＱＧＶ－マレイン酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＡＱＧＶ－マレイン酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0052】
[実施例６]
ＬＱＧＶＬ－マレイン酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＶＬ－マレイン酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＬＱＧＶＬ－マレイン酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＶＬ－マレイン酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0053】
[実施例７]
ＡＱＧＬＱ－マレイン酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＡＱＧＬＱ－マレイン酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＡＱＧＬＱ－マレイン酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＡＱＧＬＱ－マレイン酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0054】
[実施例８]
ＬＱＧＬＱ－マレイン酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＬＱ－マレイン酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＬＱＧＬＱ－マレイン酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＬＱ－マレイン酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0055】
[実施例９]
ＱＡＱＧＶＡＬＱ－酢酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＱＡＱＧＶＡＬＱ－酢酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＱＡＱＧＶＡＬＱ－酢酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＱＡＱＧＶＡＬＱ－酢酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0056】
[実施例１０]
ＬＱＧＶＬＰＡＬ－酢酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＶＬＰＡＬ－酢酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＬＱＧＶＬＰＡＬ－酢酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＶＬＰＡＬ－酢酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0057】
[実施例１１]
ＶＬＱＡＶＬＰＰ－酢酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＶＬＱＡＶＬＰＰ－酢酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＶＬＱＡＶＬＰＰ－酢酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＶＬＱＡＶＬＰＰ－酢酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0058】
[実施例１２]
ＰＧＡＹＰＧＱＡ－酢酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＰＧＡＹＰＧＱＡ－酢酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＰＧＡＹＰＧＱＡ－酢酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＰＧＡＹＰＧＱＡ－酢酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0059】
[実施例１３]
ＡＱＧＶ－酢酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＡＱＧＶ－酢酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＡＱＧＶ－酢酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＡＱＧＶ－酢酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0060】
[実施例１４]
ＬＱＧＶＬ－酢酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＶＬ－酢酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＬＱＧＶＬ－酢酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＶＬ－酢酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0061】
[実施例１５]
ＡＱＧＬＱ－酢酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＡＱＧＬＱ－酢酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＡＱＧＬＱ－酢酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＡＱＧＬＱ－酢酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0062】
[実施例１６]
ＬＱＧＬＱ－酢酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＬＱ－酢酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＬＱＧＬＱ－酢酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＬＱ－酢酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0063】
[実施例１７]
ＱＡＱＧＶＡＬＱ－酒石酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＱＡＱＧＶＡＬＱ－酒石酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＱＡＱＧＶＡＬＱ－酒石酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＱＡＱＧＶＡＬＱ－酒石酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0064】
[実施例１８]
ＬＱＧＶＬＰＡＬ－酒石酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＶＬＰＡＬ－酒石酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＬＱＧＶＬＰＡＬ－酒石酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＶＬＰＡＬ－酒石酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0065】
[実施例１９]
ＶＬＱＡＶＬＰＰ－酒石酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＶＬＱＡＶＬＰＰ－酒石酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＶＬＱＡＶＬＰＰ－酒石酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＶＬＱＡＶＬＰＰ－酒石酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0066】
[実施例２０]
ＰＧＡＹＰＧＱＡ－酒石酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＰＧＡＹＰＧＱＡ－酒石酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＰＧＡＹＰＧＱＡ－酒石酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＰＧＡＹＰＧＱＡ－酒石酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0067】
[実施例２１]
ＡＱＧＶ－酒石酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＡＱＧＶ－酒石酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＡＱＧＶ－酒石酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＡＱＧＶ－酒石酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0068】
[実施例２２]
ＬＱＧＶＬ－酒石酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＶＬ－酒石酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＬＱＧＶＬ－酒石酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＶＬ－酒石酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0069】
[実施例２３]
ＡＱＧＬＱ－酒石酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＡＱＧＬＱ－酒石酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＡＱＧＬＱ－酒石酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＡＱＧＬＱ－酒石酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0070】
[実施例２４]
ＬＱＧＬＱ－酒石酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＬＱ－酒石酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＬＱＧＬＱ－酒石酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＬＱ－酒石酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0071】
[実施例２５]
ＱＡＱＧＶＡＬＱ－クエン酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＱＡＱＧＶＡＬＱ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＱＡＱＧＶＡＬＱ－クエン酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＱＡＱＧＶＡＬＱ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0072】
[実施例２６]
ＬＱＧＶＬＰＡＬ－クエン酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＶＬＰＡＬ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＬＱＧＶＬＰＡＬ－クエン酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＶＬＰＡＬ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0073】
[実施例２７]
ＶＬＱＡＶＬＰＰ－クエン酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＶＬＱＡＶＬＰＰ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＶＬＱＡＶＬＰＰ－クエン酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＶＬＱＡＶＬＰＰ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0074】
[実施例２８]
ＰＧＡＹＰＧＱＡ－クエン酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＰＧＡＹＰＧＱＡ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＰＧＡＹＰＧＱＡ－クエン酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＰＧＡＹＰＧＱＡ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0075】
[実施例２９]
ＡＱＧＶ－クエン酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＡＱＧＶ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＡＱＧＶ－クエン酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＡＱＧＶ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0076】
[実施例３０]
ＬＱＧＶＬ－クエン酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＶＬ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＬＱＧＶＬ－クエン酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＶＬ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0077】
[実施例３１]
ＡＱＧＬＱ－クエン酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＡＱＧＬＱ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＡＱＧＬＱ－クエン酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＡＱＧＬＱ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0078】
[実施例３２]
ＬＱＧＬＱ－クエン酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＬＱ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＬＱＧＬＱ－クエン酸塩
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＬＱ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0079】
[実施例３３]
ＱＡＱＧＶＡＬＱ－マレイン酸塩と、短時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＱＡＱＧＶＡＬＱ－マレイン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト短時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＱＡＱＧＶＡＬＱ－マレイン酸塩と、短時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＱＡＱＧＶＡＬＱ－マレイン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト短時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0080】
[実施例３４]
ＬＱＧＶＬＰＡＬ－マレイン酸塩と、中時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＶＬＰＡＬ－マレイン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト中時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＬＱＧＶＬＰＡＬ－マレイン酸塩と、中時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＶＬＰＡＬ－マレイン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト中時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0081】
[実施例３５]
ＶＬＱＡＶＬＰＰ－マレイン酸塩と、速効型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＶＬＱＡＶＬＰＰ－マレイン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト速効型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＶＬＱＡＶＬＰＰ－マレイン酸塩と、速効型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＶＬＱＡＶＬＰＰ－マレイン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト速効型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0082】
[実施例３６]
ＰＧＡＹＰＧＱＡ－マレイン酸塩と、中時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＰＧＡＹＰＧＱＡ－マレイン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト中時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＰＧＡＹＰＧＱＡ－マレイン酸塩と、中時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＰＧＡＹＰＧＱＡ－マレイン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト中時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0083】
[実施例３７]
ＡＱＧＶ－マレイン酸塩と、速効型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＡＱＧＶ－マレイン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト速効型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＡＱＧＶ－マレイン酸塩と、速効型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＡＱＧＶ－マレイン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト速効型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0084】
[実施例３８]
ＬＱＧＶＬ－マレイン酸塩と、速効型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＶＬ－マレイン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト速効型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＬＱＧＶＬ－マレイン酸塩と、速効型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＶＬ－マレイン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト速効型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0085】
[実施例３９]
ＡＱＧＬＱ－マレイン酸塩と、短時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＡＱＧＬＱ－マレイン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト短時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＡＱＧＬＱ－マレイン酸塩と、短時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＡＱＧＬＱ－マレイン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト短時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0086】
[実施例４０]
ＬＱＧＬＱ－マレイン酸塩と、速効型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＬＱ－マレイン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト速効型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＬＱＧＬＱ－マレイン酸塩と、速効型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＬＱ－マレイン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト速効型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0087】
[実施例４１]
ＱＡＱＧＶＡＬＱ－酢酸塩と、短時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＱＡＱＧＶＡＬＱ－酢酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト短時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＱＡＱＧＶＡＬＱ－酢酸塩と、短時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＱＡＱＧＶＡＬＱ－酢酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト短時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0088】
[実施例４２]
ＬＱＧＶＬＰＡＬ－酢酸塩と、中時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＶＬＰＡＬ－酢酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト中時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＬＱＧＶＬＰＡＬ－酢酸塩と、中時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＶＬＰＡＬ－酢酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト中時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0089】
[実施例４３]
ＶＬＱＡＶＬＰＰ－酢酸塩と、短時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＶＬＱＡＶＬＰＰ－酢酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト短時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＶＬＱＡＶＬＰＰ－酢酸塩と、短時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＶＬＱＡＶＬＰＰ－酢酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト短時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0090】
[実施例４４]
ＰＧＡＹＰＧＱＡ－酢酸塩と、中時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＰＧＡＹＰＧＱＡ－酢酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト中時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＰＧＡＹＰＧＱＡ－酢酸塩と、中時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＰＧＡＹＰＧＱＡ－酢酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト中時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0091】
[実施例４５]
ＡＱＧＶ－酢酸塩と、速効型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＡＱＧＶ－酢酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト速効型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＡＱＧＶ－酢酸塩と、速効型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＡＱＧＶ－酢酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト速効型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0092】
[実施例４６]
ＬＱＧＶＬ－酢酸塩と、速効型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＶＬ－酢酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト速効型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＬＱＧＶＬ－酢酸塩と、速効型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＶＬ－酢酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト速効型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0093】
[実施例４７]
ＡＱＧＬＱ－酢酸塩と、短時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＡＱＧＬＱ－酢酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト短時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＡＱＧＬＱ－酢酸塩と、短時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＡＱＧＬＱ－酢酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト短時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0094】
[実施例４８]
ＬＱＧＬＱ－酢酸塩と、速効型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＬＱ－酢酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト速効型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＬＱＧＬＱ－酢酸塩と、速効型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＬＱ－酢酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト速効型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0095】
[実施例４９]
ＱＡＱＧＶＡＬＱ－酒石酸塩と、短時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＱＡＱＧＶＡＬＱ－酒石酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト短時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＱＡＱＧＶＡＬＱ－酒石酸塩と、短時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＱＡＱＧＶＡＬＱ－酒石酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト短時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0096】
[実施例５０]
ＬＱＧＶＬＰＡＬ－酒石酸塩と、中時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＶＬＰＡＬ－酒石酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト中時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＬＱＧＶＬＰＡＬ－酒石酸塩と、中時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＶＬＰＡＬ－酒石酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト中時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0097】
[実施例５１]
ＶＬＱＡＶＬＰＰ－酒石酸塩と、短時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＶＬＱＡＶＬＰＰ－酒石酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト短時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＶＬＱＡＶＬＰＰ－酒石酸塩と、短時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＶＬＱＡＶＬＰＰ－酒石酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト短時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0098】
[実施例５２]
ＰＧＡＹＰＧＱＡ－酒石酸塩と、中時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＰＧＡＹＰＧＱＡ－酒石酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト中時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＰＧＡＹＰＧＱＡ－酒石酸塩と、中時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＰＧＡＹＰＧＱＡ－酒石酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト中時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0099】
[実施例５３]
ＡＱＧＶ－酒石酸塩と、速効型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＡＱＧＶ－酒石酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト速効型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＡＱＧＶ－酒石酸塩と、速効型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＡＱＧＶ－酒石酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト速効型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0100】
[実施例５４]
ＬＱＧＶＬ－酒石酸塩と、速効型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＶＬ－酒石酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト速効型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＬＱＧＶＬ－酒石酸塩と、速効型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＶＬ－酒石酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト速効型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0101】
[実施例５５]
ＡＱＧＬＱ－酒石酸塩と、速効型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＡＱＧＬＱ－酒石酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト速効型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＡＱＧＬＱ－酒石酸塩と、速効型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＡＱＧＬＱ－酒石酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト速効型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0102】
[実施例５６]
ＬＱＧＬＱ－酒石酸塩と、短時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＬＱ－酒石酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト短時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＬＱＧＬＱ－酒石酸塩と、短時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＬＱ－酒石酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト短時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0103】
[実施例５７]
ＱＡＱＧＶＡＬＱ－クエン酸塩と、短時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＱＡＱＧＶＡＬＱ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト短時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＱＡＱＧＶＡＬＱ－クエン酸塩と、短時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＱＡＱＧＶＡＬＱ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト短時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0104】
[実施例５８]
ＬＱＧＶＬＰＡＬ－クエン酸塩と、短時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＶＬＰＡＬ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト短時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＬＱＧＶＬＰＡＬ－クエン酸塩と、短時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＶＬＰＡＬ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト短時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0105】
[実施例５９]
ＶＬＱＡＶＬＰＰ－クエン酸塩と、短時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＶＬＱＡＶＬＰＰ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト短時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＶＬＱＡＶＬＰＰ－クエン酸塩と、短時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＶＬＱＡＶＬＰＰ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト短時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0106】
[実施例６０]
ＰＧＡＹＰＧＱＡ－クエン酸塩と、中時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＰＧＡＹＰＧＱＡ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト中時間作用型（imntermediate-acting）インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＰＧＡＹＰＧＱＡ－クエン酸塩と、中時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＰＧＡＹＰＧＱＡ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト中時間作用型（imntermediate-acting）インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0107】
[実施例６１]
ＡＱＧＶ－クエン酸塩と、速効型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＡＱＧＶ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト速効型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＡＱＧＶ－クエン酸塩と、速効型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＡＱＧＶ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト速効型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0108】
[実施例６２]
ＬＱＧＶＬ－クエン酸塩と、速効型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＶＬ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト速効型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＬＱＧＶＬ－クエン酸塩と、速効型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＶＬ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト速効型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0109】
[実施例６３]
ＡＱＧＬＱ－クエン酸塩と、短時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＡＱＧＬＱ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト短時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＡＱＧＬＱ－クエン酸塩と、短時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＡＱＧＬＱ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト短時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0110】
[実施例６４]
ＬＱＧＬＱ－クエン酸塩と、短時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＬＱ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト短時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＬＱＧＬＱ－クエン酸塩と、短時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＬＱＧＬＱ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト短時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0111】
[実施例６５]
ＶＧＶＡＰＧＶＧＶＡＰＧＶＧＶＡＰＧ－クエン酸塩と、中時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＶＧＶＡＰＧＶＧＶＡＰＧＶＧＶＡＰＧ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト中時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＶＧＶＡＰＧＶＧＶＡＰＧＶＧＶＡＰＧ－クエン酸塩と、中時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＶＧＶＡＰＧＶＧＶＡＰＧＶＧＶＡＰＧ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト中時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0112】
[実施例６６]
ＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰ－クエン酸塩と、中時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト中時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰ－クエン酸塩と、中時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト中時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0113】
[実施例６７]
ＧＡＹＰＧＡＰＧＡＹＰＧＡＰＡＰＧＶ－クエン酸塩と、中時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＧＡＹＰＧＡＰＧＡＹＰＧＡＰＡＰＧＶ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト中時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕを混合する。
ＧＡＹＰＧＡＰＧＡＹＰＧＡＰＡＰＧＶ－クエン酸塩と、中時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＧＡＹＰＧＡＰＧＡＹＰＧＡＰＡＰＧＶ－クエン酸塩－－１．８ｍｏｌ
ヒト中時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕを混合する。
【0114】
[実施例６８]
ＶＧＶＡＰＧＶＧＶＡＰＧＶＧＶＡＰＧ－クエン酸塩と、長時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＶＧＶＡＰＧＶＧＶＡＰＧＶＧＶＡＰＧ－クエン酸塩－－２．４ｍｏｌ
ヒト長時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＶＧＶＡＰＧＶＧＶＡＰＧＶＧＶＡＰＧ－クエン酸塩と、長時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＶＧＶＡＰＧＶＧＶＡＰＧＶＧＶＡＰＧ－クエン酸塩－－２．４ｍｏｌ
ヒト長時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0115】
[実施例６９]
ＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰ－クエン酸塩と、長時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰ－クエン酸塩－－２．４ｍｏｌ
ヒト長時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰ－クエン酸塩と、長時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰ－クエン酸塩－－２．４ｍｏｌ
ヒト長時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【0116】
[実施例７０]
ＧＡＹＰＧＡＰＧＡＹＰＧＡＰＡＰＧＶ－クエン酸塩と、長時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＧＡＹＰＧＡＰＧＡＹＰＧＡＰＡＰＧＶ－クエン酸塩－－２．４ｍｏｌ
ヒト長時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
ＧＡＹＰＧＡＰＧＡＹＰＧＡＰＡＰＧＶ－クエン酸塩と、長時間作用型インスリン
１Ｌの組成物を調製するために、
ＧＡＹＰＧＡＰＧＡＹＰＧＡＰＡＰＧＶ－クエン酸塩－－２．４ｍｏｌ
ヒト長時間作用型インスリン（２８００Ｕ／ｍｇ）－－１０００００Ｕ
Ｍ－Ｋｒｅｏｓｏｌ－－２５ｍｇ、グリセロール－－１６０ｍｇ、０．９％ＮａＣＬ、必要に応じて、１Ｌの組成物体積および所望の最終ｐＨを得るのに十分な、水および１０％塩酸または１０％水酸化ナトリウムのいずれかを混合する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【国際調査報告】