ホーム > 特許ランキング > エンドクライン リミテッド
知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-10
(54)【発明の名称】キメラタンパク質及び発現系
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20241003BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241003BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241003BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241003BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20241003BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00 ZNA
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N1/19
C12P21/02 C
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024521249
(86)(22)【出願日】2022-10-04
(85)【翻訳文提出日】2024-05-24
(86)【国際出願番号】 GB2022052514
(87)【国際公開番号】W WO2023057750
(87)【国際公開日】2023-04-13
(31)【優先権主張番号】2114216.1
(32)【優先日】2021-10-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524130593
【氏名又は名称】エンドクライン リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(74)【代理人】
【識別番号】100156982
【弁理士】
【氏名又は名称】秋澤 慈
(72)【発明者】
【氏名】イーガン ローナン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA20
4B065AA72X
4B065AA72Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA60
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA15
4H045DA89
4H045EA60
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
Ｌｉｐ５ポリペプチドに作動可能に連結されたＢｏｌ３ポリペプチドを含む、宿主細胞において酸化ストレスを軽減する新規なキメラタンパク質が記載される。このキメラタンパク質は、Ｂｏｌ３ポリペプチドとＬｉｐ５ポリペプチドの間にリンカーを含み得る。このリンカーは、ポリヒスチジンリンカーであり得る。又、このキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを組み込んだベクター、及びそのベクターで形質転換した宿主細胞も記載される。真核生物宿主細胞内で少なくとも１つのジスルフィド結合（例えば、少なくとも３つのジスルフィド結合）を有する標的ポリペプチド、例えば、ＩＣＫを有する標的ポリペプチドを発現させる方法であって、前記宿主細胞を、前記キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドで形質転換すること、及び前記宿主細胞を、前記キメラタンパク質と前記ポリペプチドが共に発現される条件下で培養することを含む方法。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｌｉｐ５ポリペプチドに作動可能に連結されたＢｏｌ３ポリペプチドを含む、キメラタンパク質。
【請求項2】
前記Ｂｏｌ３ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項3】
前記Ｌｉｐ５ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有する、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項4】
前記キメラタンパク質がＢｏｌ３ポリペプチドとＬｉｐ５ポリペプチドの間にリンカー配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
【請求項5】
前記リンカー配列がポリヒスチジンペプチドを含む、請求項４に記載のキメラタンパク質。
【請求項6】
前記リンカー配列がポリヒスチジンリンカー中の６～２０個の連続するヒスチジン残基を含む、請求項５に記載のキメラタンパク質。
【請求項7】
前記タンパク質が配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
【請求項8】
前記リンカー配列がＣｉａ２配列を含む、請求項４に記載のキメラタンパク質。
【請求項9】
前記リンカー配列が配列番号２８のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のキメラタンパク質。
【請求項10】
前記リンカー配列が配列番号２９のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のキメラタンパク質。
【請求項11】
前記キメラタンパク質が配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項８～１０のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
【請求項12】
配列番号３２のポリヌクレオチドから発現される、請求項１～４のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれか一項に記載のキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項14】
配列番号４のヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有し、及び／又は配列番号５のヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項15】
配列番号３のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有するポリペプチドをコードする、請求項１３及び１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項16】
配列番号３２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１３～１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項17】
請求項１３～１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項18】
請求項１３～１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項１７に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項19】
酵母細胞である、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項20】
宿主細胞内で標的ポリペプチドを発現させるための発現系であって、請求項１７に記載の発現ベクターを含み、前記ベクターは又、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入のためのクローニング部位も含む、発現系。
【請求項21】
宿主細胞内で標的ポリペプチドを発現させるための発現系であって、請求項１７に記載の発現ベクター及び前記標的ポリペプチドをコードする発現ベクターを含む、発現系。
【請求項22】
前記標的ポリペプチドが少なくとも１つのジスルフィド結合を有する、請求項２０及び２１のいずれか一項に記載の発現系。
【請求項23】
前記標的ポリペプチドが２つ～５つのジスルフィド結合を含む、請求項２２に記載の発現系。
【請求項24】
前記標的ポリペプチドのジスルフィド結合がＩＣＫを形成する、請求項２３に記載の発現系。
【請求項25】
宿主細胞内で少なくとも１つのジスルフィド結合を有する標的ポリペプチドを産生するための方法であって、請求項１８及び１９のいずれか一項に記載の宿主細胞を、前記標的ポリペプチドの発現と共に前記キメラタンパク質の発現に適した条件下で培養することを含む、方法。
【請求項26】
前記標的ポリペプチドが少なくとも１つのジスルフィド結合を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記標的ポリペプチドが２つ～５つのジスルフィド結合を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記標的ポリペプチドのジスルフィド結合がＩＣＫを形成する、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記標的ペプチドが毒素ペプチドである、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記宿主細胞が前記標的ポリペプチドを発現するように遺伝子操作されている、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
技術分野
本発明は、キメラタンパク質及び複雑なジスルフィド結合ポリペプチドの生産のためにそのキメラタンパク質を用いる真核生物発現系に関する。この発現系は、「複雑な」翻訳後修飾タンパク質産物、即ち、ジスルフィドに富むタンパク質の異種発現に特に有用である。このキメラタンパク質と目的の複雑なタンパク質の共発現は、細胞の適応力を増進してそれらの発現に伴う有害作用が大幅に緩和（「救済」）される。
このキメラタンパク質は、宿主細胞が少なくとも１つのジスルフィド結合を有する標的ポリペプチドも発現している場合に特に有用である。新規融合タンパク質の共発現は、酵母の複製（即ち増殖速度）及び／又は少なくとも１つのジスルフィド結合を有する標的ポリペプチドの収量を増加させることが示されている。
本発明は、キメラタンパク質及び複雑なジスルフィド結合ポリペプチドの生産のためにそのキメラタンパク質を用いる真核生物発現系に関する。この発現系は、「複雑な」翻訳後修飾タンパク質産物、即ち、ジスルフィドに富むタンパク質の異種発現に特に有用である。このキメラタンパク質と目的の複雑なタンパク質の共発現は、細胞の適応力を増進してそれらの発現に伴う有害作用が大幅に緩和（「救済」）される。
このキメラタンパク質は、宿主細胞が少なくとも１つのジスルフィド結合を有する標的ポリペプチドも発現している場合に特に有用である。新規融合タンパク質の共発現は、酵母の複製（即ち増殖速度）及び／又は少なくとも１つのジスルフィド結合を有する標的ポリペプチドの収量を増加させることが示されている。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
ジスルフィド結合二次構造を含むポリペプチドは一般に、化学的、熱的及び酵素的（例えば、タンパク質消化に対する抵抗性）安定性を著しく高めることが実証され、これらの安定性は、分子の生物活性（即ち、より長い半減期及び標的親和性）を補助する(Hayward et al., 2017, Journal of Biological Chemistry, 292(38), 15670-15680; Sermadiras et al., 2013, PLoS ONE, 8(12), 1-11)。
特定の例として、インヒビターシスチンノット(inhibitor cystine knot)（「ＩＣＫ」）モチーフと総称される、複雑なジスルフィドに富んだ（３＋結合）構造を典型的に含む毒素由来ペプチドがある。ＩＣＫモチーフによって観察される有益な安定性と生物活性形質から、ＩＣＫモチーフを有するポリペプチドを組換え発現させ、新規治療薬として利用する数多くの試みに至っている(Cao et al., 2003, Peptides, 24(2), 187-192; Schmoldt et al., 2005, Protein Expression and Purification, 39(1), 82-89; Sermadiras et al., 2013, 前掲; Zhong et al., 2014, PLoS ONE, 9(10), 2-7)。多くの場合、ＩＣＫペプチドは微量しか存在しないため（例えば、毒液分泌物内）、それらの研究と工業的スケールアップは極めて困難で、コストがかかり、予測不可能である(Sermadiras et al., 2013, 前掲)ことに留意されたい。
ジスルフィド結合二次構造を含むポリペプチドは一般に、化学的、熱的及び酵素的（例えば、タンパク質消化に対する抵抗性）安定性を著しく高めることが実証され、これらの安定性は、分子の生物活性（即ち、より長い半減期及び標的親和性）を補助する(Hayward et al., 2017, Journal of Biological Chemistry, 292(38), 15670-15680; Sermadiras et al., 2013, PLoS ONE, 8(12), 1-11)。
特定の例として、インヒビターシスチンノット(inhibitor cystine knot)（「ＩＣＫ」）モチーフと総称される、複雑なジスルフィドに富んだ（３＋結合）構造を典型的に含む毒素由来ペプチドがある。ＩＣＫモチーフによって観察される有益な安定性と生物活性形質から、ＩＣＫモチーフを有するポリペプチドを組換え発現させ、新規治療薬として利用する数多くの試みに至っている(Cao et al., 2003, Peptides, 24(2), 187-192; Schmoldt et al., 2005, Protein Expression and Purification, 39(1), 82-89; Sermadiras et al., 2013, 前掲; Zhong et al., 2014, PLoS ONE, 9(10), 2-7)。多くの場合、ＩＣＫペプチドは微量しか存在しないため（例えば、毒液分泌物内）、それらの研究と工業的スケールアップは極めて困難で、コストがかかり、予測不可能である(Sermadiras et al., 2013, 前掲)ことに留意されたい。
【0003】
ＩＣＫモチーフを含むポリペプチドは細菌系でも真核生物系で問題なく生産できることが多くの研究で証明されているが(Sermadiras et al., 2013, 前掲)、真核生物宿主細胞内での発現はあまり成功していない。出芽酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)は、よく研究され、遺伝学的に扱いやすい真核微生物であり、バイオテクノロジー産業において長く確かな実績がある。他の真核生物と同様に、酵母のジスルフィド結合形成は、５８ｋＤａのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）とその同族パートナーであるチオールオキシダーゼＥｒｏ１（６５ｋＤａ）の協働作用によって小胞体（ＥＲ）内で行われる。結合形成を触媒するために、ＰＤＩはまず標的タンパク質上のシステインチオールから電子を除去し、この電子はＥｒｏ１を経由して最終的なアクセプター。通常は酸素にシャトルされる(Frand & Kaiser, 1998; Tyo et al., 2012)。このシャトルは又、生成される各ジスルフィド結合に対して化学量論的な量の酸化剤、過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）を生成する(Tyo et al., 2012, 前掲)。これに加えて、タンパク質の「適切な」折り畳みを維持・保証する酵母のプロテオスタシス機構である小胞体ストレス応答(unfolded protein response)（ＵＰＲ）が、このような高い折り畳み要求の下で活性化され、更なる代謝コストと宿主の適応力への影響をもたらす可能性がある(Karagoz, et al., 2019 Cold Spring Harbor perspectives in biology vol. 11,9)。
【0004】
結果的に、ジスルフィド結合タンパク質はバイオテクノロジー産業にとって魅力的な生物活性標的である一方、組換えジスルフィド結合タンパク質の商業生産には、宿主細胞にかかる代謝負担（例えば、酸化ストレス）を緩和する新たな戦略が必要となる。
ジスルフィド結合の生成によって引き起こされる代謝ストレスの直接的な結果として、このようなポリペプチドの発現は、ポリペプチドが複数のジスルフィド結合を有する場合に特に悪化する問題をもたらす。ＩＣＫモチーフを含むような「複雑な」ジスルフィド含有ペプチドの異種発現の場合、これらのストレス（例えば、酸化ストレス）は、宿主の増殖指標（例えば、増殖率、倍加時間など）の低下から、プロセス時間（及び支出）の指数関数的な増加、最終産物の品質、バルクバイオマス（湿細胞質量、ｇ／Ｌ）、及び収量の低下に至るまで、多くの有害な結果をもたらす可能性がある。
製品の品質に関しても、酸化剤の生成が抑制されないと、タンパク質の酸化、特にカルボニル化を介した付加物形成の可能性が高まり、最終産物の品質に悪影響を及ぼす可能性がある(Yang, et al., 2014 Analytical Chemistry, 86(10), 4799-4806)。タンパク質付加物は、Ｎ末端又はスルフヒドリル官能基若しくはアミン官能基を含むアミノ酸側鎖など、タンパク質中の求核部位と求電子部位との反応から生じる共有結合修飾である。タンパク質へのカルボニル基の付加は付加物の一例である。
ジスルフィド結合の生成によって引き起こされる代謝ストレスの直接的な結果として、このようなポリペプチドの発現は、ポリペプチドが複数のジスルフィド結合を有する場合に特に悪化する問題をもたらす。ＩＣＫモチーフを含むような「複雑な」ジスルフィド含有ペプチドの異種発現の場合、これらのストレス（例えば、酸化ストレス）は、宿主の増殖指標（例えば、増殖率、倍加時間など）の低下から、プロセス時間（及び支出）の指数関数的な増加、最終産物の品質、バルクバイオマス（湿細胞質量、ｇ／Ｌ）、及び収量の低下に至るまで、多くの有害な結果をもたらす可能性がある。
製品の品質に関しても、酸化剤の生成が抑制されないと、タンパク質の酸化、特にカルボニル化を介した付加物形成の可能性が高まり、最終産物の品質に悪影響を及ぼす可能性がある(Yang, et al., 2014 Analytical Chemistry, 86(10), 4799-4806)。タンパク質付加物は、Ｎ末端又はスルフヒドリル官能基若しくはアミン官能基を含むアミノ酸側鎖など、タンパク質中の求核部位と求電子部位との反応から生じる共有結合修飾である。タンパク質へのカルボニル基の付加は付加物の一例である。
【発明の概要】
【0005】
本発明は、このような問題に取り組む。特に、本発明は、少なくとも１つのジスルフィド結合を有する標的ポリペプチド、例えば、ＩＣＫモチーフを含む標的ポリペプチドを発現するトランスジェニック宿主細胞の増殖（増殖率、毎時の世代数）の低さを著しく緩和するキメラタンパク質（又は「キメラ」）を提供する。
本発明は又、宿主細胞の適応力の改善及び／又は標的ポリペプチド収率の改善をもたらす、少なくとも１つのジスルフィド結合を有する標的ポリペプチド、例えば、ＩＣＫモチーフを含む標的ポリペプチドを発現させる方法も提供する。少なくとも１つのジスルフィド結合を有する標的ポリペプチド、例えば、ＩＣＫモチーフを含む標的ポリペプチドを生産するための発現系も記載される。
本発明は又、宿主細胞の適応力の改善及び／又は標的ポリペプチド収率の改善をもたらす、少なくとも１つのジスルフィド結合を有する標的ポリペプチド、例えば、ＩＣＫモチーフを含む標的ポリペプチドを発現させる方法も提供する。少なくとも１つのジスルフィド結合を有する標的ポリペプチド、例えば、ＩＣＫモチーフを含む標的ポリペプチドを生産するための発現系も記載される。
【0006】
発明の概要
本発明は、リポイルシンターゼ（「Ｌｉｐ５」）ポリペプチドに作動可能に連結されたＢｏｌ３ポリペプチドを含む新規なキメラタンパク質を提供する。このキメラタンパク質は、Ｂｏｌ３ポリペプチドとＬｉｐ５ポリペプチドの間にリンカーを含み得る。リンカーは、好都合にフレキシビリティーを確保し、キメラタンパク質においてＢｏｌ３ドメインをＬｉｐ５ドメインから離すことを容易にする。
更に、本発明は、このキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドを組み込んだベクター、及びこのベクターで形質転換した宿主細胞を提供する。
本発明は、リポイルシンターゼ（「Ｌｉｐ５」）ポリペプチドに作動可能に連結されたＢｏｌ３ポリペプチドを含む新規なキメラタンパク質を提供する。このキメラタンパク質は、Ｂｏｌ３ポリペプチドとＬｉｐ５ポリペプチドの間にリンカーを含み得る。リンカーは、好都合にフレキシビリティーを確保し、キメラタンパク質においてＢｏｌ３ドメインをＬｉｐ５ドメインから離すことを容易にする。
更に、本発明は、このキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドを組み込んだベクター、及びこのベクターで形質転換した宿主細胞を提供する。
【0007】
更なる態様において、本発明は、少なくとも１つのジスルフィド結合を有する標的ポリペプチド（例えば、少なくとも３つのジスルフィド結合を有する標的ポリペプチド、例えば、ＩＣＫモチーフの形態で少なくとも３つのジスルフィド結合を有する標的ポリペプチド）を真核生物宿主細胞内で発現させる方法を提供し、前記方法は、前記宿主細胞を、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドで形質転換すること、及び前記宿主細胞を前記キメラタンパク質と前記標的ポリペプチドが発現される条件下で培養することを含む。特筆すべきは、更に、キメラタンパク質自体の発現は、その発現だけでは細胞増殖率に悪影響を与えないため、宿主に十分に忍容されるということである。
本発明は更に、目的の標的タンパク質の発現のための発現系を提供し、その発現系は、本発明によるキメラタンパク質、及び目的の標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入のためのクローニング部位を含む発現ベクターを含む。一般に、標的ポリペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合（例えば、標的ポリペプチドは、少なくとも３つのジスルフィド結合を有し、例えば、標的ポリペプチドは、ＩＣＫモチーフの形態で少なくとも３つのジスルフィド結合を有する）。
本発明は更に、目的の標的タンパク質の発現のための発現系を提供し、その発現系は、本発明によるキメラタンパク質、及び目的の標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入のためのクローニング部位を含む発現ベクターを含む。一般に、標的ポリペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合（例えば、標的ポリペプチドは、少なくとも３つのジスルフィド結合を有し、例えば、標的ポリペプチドは、ＩＣＫモチーフの形態で少なくとも３つのジスルフィド結合を有する）。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】Ａ：増幅のＴＡＥゲル；及びＢ：ＯＥ－ＰＣＲの模式図。
【図2】プラスミドマップ表示。多重クローニング部位（ＭＣＳ）１及び２を示す。ＭＣＳ－１は、キメラオープンリーディングフレームを含む。
【図3】本発明によるキメラタンパク質（キメラ）と対照株（対照）の増殖率の箱ひげ図。データは、酵母がキメラを発現する場合には有意差はない（即ち、適応力の低下がない）ことを示す。Ｎ＝１２、有意性には一元配置ＡＮＯＶＡを使用、有意性がないことは「ＮＳ」で示す。
【図4】本発明によるキメラタンパク質の精製。画分３及び４でキメラタンパク質のおよその分子量に単一のバンドが分離した。１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル、５μＬのＰａｇｅＲｕｌｅｒ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダーを含む２０μＬローディング容量。
【図5】酸化ストレス下での本発明によるキメラタンパク質（キメラ－１）と対照株（対照）の増殖率の箱ひげ図。データは、キメラの発現が５ｍＭまでの過酸化水素に対して耐性を助長することを示す。各条件Ｎ＝６。有意性には一元配置ＡＮＯＶＡを使用。**＝ｐ＜０．０１、ＮＳ．＝有意性なし。
【図6】還元ストレス下での本発明によるキメラタンパク質（キメラ）と対照株（対照）の増殖率の箱ひげ図。各条件Ｎ＝６、有意性には一元配置ＡＮＯＶＡを使用。***＝ｐ＜０．００１、ｎ．ｓ．＝有意性なし。
【図7】Ａ：エバシン遺伝子（配列番号１９）（ＥＶＡ）のゲル画像；及びＢ：ＮｉＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製したポリペプチド産物（配列番号１８（ＥＶＡ）のゲル画像。
【図8】Ａ：Ｃ８エバシンの多重配列比較及び構造。８つのエバシン変異体は、（８）つの保存されたシステイン残基を示す。Ｂ：Ｃ８エバシンファミリーの構造にはシスチンノット（ＩＣＫモチーフ）が示される。
【図9】エバシン発現酵母（「エバシン－２」）の最大増殖率及びキメラの共発現（キメラ；＋エバシン－２）によるその救済を示す箱ひげ図。有意性には一元配置ＡＮＯＶＡを使用した。***＝ｐ＜０．００１、ＮＳ．＝有意性なし。
【図10】各ペプチドに存在するシスチンノットの場所を示すペプチドの模式図。シスチンは「Ｃ」で示し、その後に一次配列における場所を示した。
【図11】ポリヒスチジンタグ付きポリペプチド、プロトキシン－１、プサルモトキシン－１及びエバシン－２の競合ラテラルフローアッセイ。バンドパターンは、目的産物の発現の成功を示す。
【図12】酵母（Ｓ．セレビシエ）の増殖率に対する他のＩＣＫポリペプチド（プロトキシン－１、プサルモトキシン－１）の影響を示す箱ひげ図。有意性には一元配置ＡＮＯＶＡを使用した。***＝ｐ＜０．００１、*＝ｐ＜０．０５、ＮＳ．＝有意性なし。
【図13】キメラ；＋ＥＶＡの発酵。バッチモード、各バッチの結果（湿細胞質量ｇ／Ｌ、最終ＯＤ600及び溶存酸素設定値までの時間）。
【図14】ＥＶＡ（エバシン－２）の発酵。バッチモード、各バッチの結果（湿細胞質量ｇ／Ｌ、最終ＯＤ600及び溶存酸素設定値までの時間）。
【図15】キメラを共発現するプロトキシン－１の発酵。バッチモード、各バッチの結果（湿細胞質量ｇ／Ｌ、最終ＯＤ600及び溶存酸素設定値までの時間）。
【図16】プロトキシン－１の発酵。バッチモード、各バッチの結果（湿細胞質量ｇ／Ｌ、最終ＯＤ600及び溶存酸素設定値までの時間）。
【発明を実施するための形態】
【0009】
発明の詳細な説明
以下、本発明のキメラタンパク質、ポリヌクレオチド及びキメラタンパク質をコードするベクター、発現系及び方法を更に詳細に説明する。
本明細書で使用する場合「及び／又は」という用語は、２つの指定された特徴又は構成要素のそれぞれについて、他方の有無にかかわらず具体的に開示されていると理解されるべきである。
本明細書で使用する場合、「を含む」という用語は、「を包含する」及び「からなる」の両方を包含すると解釈されるべきであり、両方の意味は、具体的に意図され、従って、本発明に従って個別に開示された実施形態である。
以下、本発明のキメラタンパク質、ポリヌクレオチド及びキメラタンパク質をコードするベクター、発現系及び方法を更に詳細に説明する。
本明細書で使用する場合「及び／又は」という用語は、２つの指定された特徴又は構成要素のそれぞれについて、他方の有無にかかわらず具体的に開示されていると理解されるべきである。
本明細書で使用する場合、「を含む」という用語は、「を包含する」及び「からなる」の両方を包含すると解釈されるべきであり、両方の意味は、具体的に意図され、従って、本発明に従って個別に開示された実施形態である。
【0010】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸から構成されるポリマーを指し、特定の長さのポリマーを指すものではない。「ペプチド結合」は、一方のアミノ酸のα－アミノ基が他のアミノ酸のα－カルボキシル基に結合されている１つのアミノ酸間の共有結合である。ポリペプチドは、例えば、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化など、修飾されていてもよい。修飾はｉｎ ｖｉｔｒｏであってもｉｎ ｖｉｖｏであってもよい。約１００アミノ酸未満の長さのアミノ酸鎖は一般に当技術分野で「ペプチド」と見なされるが、「ペプチド」と「タンパク質」は、本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」の定義内に含まれる。「アミノ酸配列」及び「ポリペプチド配列」という用語は、互換的に使用される。全てのアミノ酸又はポリペプチド配列は、特に断りのない限り、アミノ末端（Ｎ末端）からカルボキシ末端（Ｃ末端）へと記載される。
命名の便宜上、本願は、「キメラタンパク質」（又は「キメラ」）及び「少なくとも１つのジスルフィド結合を有する標的ポリペプチド」に言及する。しかしながら、「キメラタンパク質」という用語における「タンパク質」及び「少なくとも１つのジスルフィド結合を有する標的ポリペプチド」という用語における「ポリペプチド」という呼称は、当該２つのポリマーのサイズ又は相対的サイズに関する情報を示唆することを意図するものではない。
命名の便宜上、本願は、「キメラタンパク質」（又は「キメラ」）及び「少なくとも１つのジスルフィド結合を有する標的ポリペプチド」に言及する。しかしながら、「キメラタンパク質」という用語における「タンパク質」及び「少なくとも１つのジスルフィド結合を有する標的ポリペプチド」という用語における「ポリペプチド」という呼称は、当該２つのポリマーのサイズ又は相対的サイズに関する情報を示唆することを意図するものではない。
【0011】
本発明は、特に、少なくとも１つのジスルフィド結合を有する標的ポリペプチドの発現に関する。ジスルフィド結合は、ポリペプチド内の２つのシステイン残基のチオール基の共有結合によって形成される。２つのシステイン残基は、各ジスルフィド結合に必要とされる。上記に説明したように、ジスルフィド結合の形成は、宿主細胞に酸化ストレスをもたらす。任意選択により、標的ポリペプチドは、２つ以上のジスルフィド結合を有する。任意選択により、標的タンパク質は、３つ以上のジスルフィド結合を有する。任意選択により、少なくとも１つのジスルフィド結合を有する標的タンパク質は、以下に更に詳細に定義するようなＩＣＫを有する。任意選択により、標的ポリペプチドは、環状シスチンノット又は増殖因子シスチンノットなどの別のシスチンモチーフを含み得る。
「インヒビターシスチンノット」又は「ＩＣＫ」は、３つの別個のジスルフィド結合を形成する少なくとも３対のシステイン残基を含む、ポリペプチド内のモチーフを指す。２つのジスルフィド結合はループを形成し、そのループに３つ目のジスルフィド結合（配列中の３番目のシステインと６番目のシステインをつなぐ）が通ってノットを形成する。
「インヒビターシスチンノット」又は「ＩＣＫ」は、３つの別個のジスルフィド結合を形成する少なくとも３対のシステイン残基を含む、ポリペプチド内のモチーフを指す。２つのジスルフィド結合はループを形成し、そのループに３つ目のジスルフィド結合（配列中の３番目のシステインと６番目のシステインをつなぐ）が通ってノットを形成する。
【0012】
アミノ酸配列に適用される場合に本明細書で使用する「保存的置換」とは、あるアミノ酸残基の、類似の物理的及び化学的特性を備えた側鎖を有する別のアミノ酸残基での置換を指す。例えば、保存的置換は、疎水性側鎖を有するアミノ酸残基（例えば、Ｍｅｔ、Ａｌａ、ＶａＬ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅ）、中性親水性側鎖を有するアミノ酸残基（例えば、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、及びＧｌｎ）、酸性側鎖を有するアミノ酸残基（例えば、Ａｓｐ及びＧｌｕ）、塩基性側鎖を有するアミノ酸残基（例えば、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＡｒｇ）、又は芳香族側鎖を有するアミノ酸残基（例えば、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＰｈｅ）の中で行うことができる。タンパク質のコンフォメーション構造に大きな変化を生じず、従ってタンパク質の生物活性を保持し得ることが当技術分野で知られている。
「ポリヌクレオチド」という用語は、核酸、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ又は合成生産されたＤＮＡ若しくはＲＮＡのポリマー，或いはこれらのポリヌクレオチドの１つを単独で若しくは組み合わせて含む組換え生産されたキメラポリヌクレオチド分子を指す。「核酸」という用語は、「ポリヌクレオチド」という用語と互換的に使用される。
「ポリヌクレオチド」という用語は、核酸、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ又は合成生産されたＤＮＡ若しくはＲＮＡのポリマー，或いはこれらのポリヌクレオチドの１つを単独で若しくは組み合わせて含む組換え生産されたキメラポリヌクレオチド分子を指す。「核酸」という用語は、「ポリヌクレオチド」という用語と互換的に使用される。
【0013】
「ベクター」という用語は、本明細書で使用する場合、標的ポリヌクレオチドの取り扱いを容易にするための遺伝子構築物を指す。ベクターは、適切な宿主細胞内、及び適切な条件下でベクターの選択を可能とするマーカー遺伝子などの遺伝子を更に含み得る。前記ポリヌクレオチド又はベクターの発現は、ポリヌクレオチドの、翻訳可能なｍＲＮＡへの転写を含む。通常、ベクターは、転写の開始を保証する調節配列を含む。調節要素など、転写の開始を担う他の要素も存在してよい。ベクターは又、標的ポリヌクレオチドの下流に転写終結シグナルも含む。
【0014】
アミノ酸配列（又は核酸配列）に適用される場合、「配列同一性パーセント」とは、配列アラインメントの際に、及び必要に応じて、同一のアミノ酸（又は核酸）の数を最大にするためにギャップを導入した後に、候補配列中のアミノ酸（又は核酸）残基と比較して、候補配列中の、参照配列のものと同一のアミノ酸（又は核酸）残基のパーセンテージを指す。アミノ酸残基の保存的置換は、同一残基とみなしてもみなさなくてもよい。アミノ酸（又は核酸）配列の配列同一性パーセントは、当技術分野で開示されているツールによって配列をアラインすることにより決定することができる。当業者は、ツールのデフォルトパラメーターを使用するか、又は例えば適切なアルゴリズムを選択することにより、アラインメントの必要性に応じてパラメーターを適切に調整することができる。２つのポリペプチド配列間の同一性パーセンテージは、http://blast.ncbi.nlm.nih.govに公開されているＢＬＡＳＴｐなどのプログラムによって容易に決定することができる。
【0015】
「単離された」材料は、その天然の状態から人為的に変更されている。「単離された」物質又は構成要素が自然界に存在する場合、それはその元の状態から変化しているか、取り出されているか、又はその両方である。例えば、生きている動物に天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドは、単離されてはいないが、そのポリヌクレオチド又はポリペプチドが、本来の状態で共存する物質から十分に分離され、十分に純粋な状態で存在する場合には、「単離された」とみなすことができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、キャピラリー電気泳動）、又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー若しくは逆相ＨＰＬＣ）により決定した場合に、少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の純度である。
「変異体」、「ホモログ」又は「誘導体」という用語は、ヌクレオチド配列に関して、その配列からの又はその配列に対する１つの（又は複数の）核酸のいずれの置換、変動、修飾、置換、欠失又は付加も含む。
「変異体」、「ホモログ」又は「誘導体」という用語は、ヌクレオチド配列に関して、その配列からの又はその配列に対する１つの（又は複数の）核酸のいずれの置換、変動、修飾、置換、欠失又は付加も含む。
【0016】
第１の態様において、本発明は、Ｌｉｐ５ポリペプチドに作動可能に連結されたＢｏｌ３ポリペプチドを含む新規なキメラタンパク質を提供する。キメラタンパク質は、Ｂｏｌ３ポリペプチドとＬｉｐ５ポリペプチドの間にリンカーを含み得る。キメラタンパク質の発現は、宿主細胞における酸化ストレスを軽減し、宿主が少なくとも１つのジスルフィド結合を有する標的ポリペプチドも発現する場合に特に有用性が見られる。
「Ｂｏｌ３」という用語は、酵母（例えば、Ｓ．セレビシエ）のＢｏｌ３タンパク質を表すために使用されるが、本明細書では、他種のこのタンパク質のホモログ、特に、真核生物（マウス、ウシ及びヒト細胞のＢｏｌ３Ａホモログなど）及び大腸菌(E. coli)のＢｏｌ３タンパク質のホモログを指すためにも使用される。
「Ｂｏｌ３」という用語は、酵母（例えば、Ｓ．セレビシエ）のＢｏｌ３タンパク質を表すために使用されるが、本明細書では、他種のこのタンパク質のホモログ、特に、真核生物（マウス、ウシ及びヒト細胞のＢｏｌ３Ａホモログなど）及び大腸菌(E. coli)のＢｏｌ３タンパク質のホモログを指すためにも使用される。
【0017】
一実施形態では、Ｂｏｌ３ポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも５０％の配列同一性を含む。
任意選択により、Ｂｏｌ３ポリペプチドは、配列番号１に対して５０％を超える配列同一性を有し、例えば、配列番号１に対して少なくとも５５％、６０％、６５％ ７０％、７５％ ８０％、８５％又は９０％の配列同一性を有する。任意選択により、Ｂｏｌ３ポリペプチドは、配列番号１に対して９０％を超える配列同一性を有し、例えば、配列番号１に対して９５％以上、例えば、９８％以上の配列同一性を有する。配列番号１は、Ｓ．セレビシエのＢｏｌ３タンパク質の配列である。
任意選択により、Ｂｏｌ３ポリペプチドは、配列番号４から発現されるタンパク質に対して５０％を超える配列同一性を有し、例えば、配列番号４から発現されるタンパク質に対して少なくとも５５％、６０％、６５％ ７０％、７５％ ８０％、８５％又は９０％の配列同一性を有する。任意選択により、Ｂｏｌ３ポリペプチドは、配列番号４から発現されるタンパク質に対して９０％を超える配列同一性を有し、配列番号４から発現されるタンパク質に対して例えば９５％以上の、例えば、９８％以上の配列同一性を有する。配列番号４は、実施例に記載されるキメラタンパク質において使用される、天然終止コドンを含まない、Ｓ．セレビシエのＢｏｌ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列である。
任意選択により、Ｂｏｌ３ポリペプチドは、配列番号１に対して５０％を超える配列同一性を有し、例えば、配列番号１に対して少なくとも５５％、６０％、６５％ ７０％、７５％ ８０％、８５％又は９０％の配列同一性を有する。任意選択により、Ｂｏｌ３ポリペプチドは、配列番号１に対して９０％を超える配列同一性を有し、例えば、配列番号１に対して９５％以上、例えば、９８％以上の配列同一性を有する。配列番号１は、Ｓ．セレビシエのＢｏｌ３タンパク質の配列である。
任意選択により、Ｂｏｌ３ポリペプチドは、配列番号４から発現されるタンパク質に対して５０％を超える配列同一性を有し、例えば、配列番号４から発現されるタンパク質に対して少なくとも５５％、６０％、６５％ ７０％、７５％ ８０％、８５％又は９０％の配列同一性を有する。任意選択により、Ｂｏｌ３ポリペプチドは、配列番号４から発現されるタンパク質に対して９０％を超える配列同一性を有し、配列番号４から発現されるタンパク質に対して例えば９５％以上の、例えば、９８％以上の配列同一性を有する。配列番号４は、実施例に記載されるキメラタンパク質において使用される、天然終止コドンを含まない、Ｓ．セレビシエのＢｏｌ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列である。
【0018】
「Ｌｉｐ５」という用語は、酵母（例えば、Ｓ．セレビシエ）のＬｉｐ５タンパク質を表すために使用されるが、本明細書では、他種のこのタンパク質のホモログ、特に、真核生物、植物及び大腸菌のＬｉｐ５タンパク質のホモログを指すためにも使用される。
任意選択により、Ｌｉｐ５ポリペプチドは、配列番号２に対して少なくとも５０％の配列同一性を含む。任意選択により、Ｌｉｐ５ポリペプチドは、配列番号２に対して５５％を超える配列同一性を有し、例えば、配列番号２に対して６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％の配列同一性を有する。任意選択により、Ｌｉｐ５ポリペプチドは、配列番号２に対して９０％を超える配列同一性を有し、例えば、配列番号２に対して９５％以上の、例えば、９８％以上の配列同一性を有する。
任意選択により、Ｌｉｐ５ポリペプチドは、配列番号５から発現されるタンパク質に対して少なくとも５０％の配列同一性を含む。任意選択により、Ｌｉｐ５ポリペプチドは、配列番号５から発現されるタンパク質に対して５５％を超える配列同一性を有し、例えば、配列番号５から発現されるタンパク質に対して６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％の配列同一性を有する。任意選択により、Ｌｉｐ５ポリペプチドは、配列番号５から発現されるタンパク質に対して９０％を超える配列同一性を有し、例えば、配列番号５から発現されるタンパク質に対して９５％以上の、例えば、９８％以上の配列同一性を有する。配列番号５は、実施例に記載されるキメラタンパク質において使用される、天然開始コドンを含まない、Ｓ．セレビシエのＬｉｐ５タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列である。
任意選択により、Ｌｉｐ５ポリペプチドは、配列番号２に対して少なくとも５０％の配列同一性を含む。任意選択により、Ｌｉｐ５ポリペプチドは、配列番号２に対して５５％を超える配列同一性を有し、例えば、配列番号２に対して６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％の配列同一性を有する。任意選択により、Ｌｉｐ５ポリペプチドは、配列番号２に対して９０％を超える配列同一性を有し、例えば、配列番号２に対して９５％以上の、例えば、９８％以上の配列同一性を有する。
任意選択により、Ｌｉｐ５ポリペプチドは、配列番号５から発現されるタンパク質に対して少なくとも５０％の配列同一性を含む。任意選択により、Ｌｉｐ５ポリペプチドは、配列番号５から発現されるタンパク質に対して５５％を超える配列同一性を有し、例えば、配列番号５から発現されるタンパク質に対して６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％の配列同一性を有する。任意選択により、Ｌｉｐ５ポリペプチドは、配列番号５から発現されるタンパク質に対して９０％を超える配列同一性を有し、例えば、配列番号５から発現されるタンパク質に対して９５％以上の、例えば、９８％以上の配列同一性を有する。配列番号５は、実施例に記載されるキメラタンパク質において使用される、天然開始コドンを含まない、Ｓ．セレビシエのＬｉｐ５タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列である。
【0019】
一実施形態では、リンカー配列は、Ｂｏｌ３ポリペプチドとＬｉｐ５ポリペプチドの間に位置する。「リンカー」という用語は、本明細書で使用する場合、キメラタンパク質の２つの部分を連結することを可能にする基又は配列を表す。例えば、リンカーは、Ｂｏｌ３ポリペプチドとＬｉｐ５ポリペプチドとの連結とを可能にする。リンカーは２つの構成要素を連結する役割を果たす。本発明によるリンカーは、フレキシブルでもリジッドでもよいが、より好ましくは、キメラタンパク質のＢｏｌ３部分とＬｉｐ５部分の間にある程度のフレキシビリティーを可能とするものである。適切なリンカーは当業者に公知である。より具体的には、「リンカー」という用語は、ペプチド結合を形成する１～５０アミノ酸からなるペプチド鎖、又はその誘導体を指し、そのＮ末端及びＣ末端は、それぞれＢｏｌ３ドメイン又はＬｉｐ５ドメインのいずれかと共有結合を形成し、それによってＢｏｌ３ドメインをＬｉｐ５ドメインに結合する。
任意選択により、リンカー配列は、ポリヒスチジンリンカーである。例えば、リンカー配列は、ポリヒスチジンリンカーの６～２０個（例えば８～１６個、例えば８～１２個）のヒスチジン残基を含むことができ、即ち、リンカーは、ポリヒスチジンリンカーを形成するために、６～２０個の連続するヒスチジン残基を含む。
他の適切なリンカーも当技術分野で公知であり、ＦＬＡＧタグ、Ｃｙｓタグ、ＧＳＴタグなどが含まれる。別の適切なリンカーとして、Ｃｉａ２タンパク質のＮ末端部分（配列番号２８参照）があり、任意選択により、付加的な連結アミノ酸を伴う。配列番号２８はＣｉａ２タンパク質のＮ末端部分を示し、任意選択により、リンカーは更なるアミノ酸を含むことができ、例えば、配列番号２９の配列がリンカーとして使用できる。任意選択により、Ｃｉａ２タンパク質のこのＮ末端部分をコードするポリヌクレオチド配列は、インフレームクローニングを保証するために付加的ヌクレオチドと共に使用することができる。例えば、配列番号３０は、適切なリンカー配列をコードするポリヌクレオチドを示し、Ｃｉａ２配列は、ヌクレオチド１９～５２（含む）によってコードされている。配列番号２９は、配列番号３０によってコードされるアミノ酸配列を示す。よって、リンカーは、配列番号２９の配列を含む配列であり得る。
任意選択により、リンカー配列は、ポリヒスチジンリンカーである。例えば、リンカー配列は、ポリヒスチジンリンカーの６～２０個（例えば８～１６個、例えば８～１２個）のヒスチジン残基を含むことができ、即ち、リンカーは、ポリヒスチジンリンカーを形成するために、６～２０個の連続するヒスチジン残基を含む。
他の適切なリンカーも当技術分野で公知であり、ＦＬＡＧタグ、Ｃｙｓタグ、ＧＳＴタグなどが含まれる。別の適切なリンカーとして、Ｃｉａ２タンパク質のＮ末端部分（配列番号２８参照）があり、任意選択により、付加的な連結アミノ酸を伴う。配列番号２８はＣｉａ２タンパク質のＮ末端部分を示し、任意選択により、リンカーは更なるアミノ酸を含むことができ、例えば、配列番号２９の配列がリンカーとして使用できる。任意選択により、Ｃｉａ２タンパク質のこのＮ末端部分をコードするポリヌクレオチド配列は、インフレームクローニングを保証するために付加的ヌクレオチドと共に使用することができる。例えば、配列番号３０は、適切なリンカー配列をコードするポリヌクレオチドを示し、Ｃｉａ２配列は、ヌクレオチド１９～５２（含む）によってコードされている。配列番号２９は、配列番号３０によってコードされるアミノ酸配列を示す。よって、リンカーは、配列番号２９の配列を含む配列であり得る。
【0020】
本発明の一実施形態は、配列番号１に対して少なくとも５０％の配列同一性又は配列番号４によってコードされるポリペプチドに対して少なくとも５０％の配列同一性を有するＢｏｌ３の第１のアミノ酸配列、リンカーペプチド及び配列番号２に対して少なくとも５０％の配列同一性又は配列番号５によってコードされるポリペプチドに対して少なくとも５０％の配列同一性を有するＬｉｐ５の第２のアミノ酸配列を含むキメラタンパク質である。任意選択により、リンカー配列は、ポリヒスチジンリンカーである。例えば、リンカー配列は、ポリヒスチジンリンカー中の６～２０個（例えば８～１６個、例えば８～１２個）のヒスチジン残基を含み得る。例えば、リンカー配列は、Ｃｉａ２タンパク質のＮ末端部分であり得る。任意選択により、リンカーは、配列番号２８又は配列番号２９の配列を含み得る、又はからなり得る。
任意選択により、上記のキメラタンパク質における、配列番号１又は配列番号４によってコードされるポリペプチドに対する、キメラタンパク質中のＢｏｌ３ポリペプチドの配列同一性は、５０％を超え、例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％である。任意選択により、上記のキメラタンパク質中のＢｏｌ３ポリペプチドは、配列番号１又は配列番号４によってコードされるポリペプチドに対して９０％を超える配列同一性を有する。
任意選択により、上記のキメラタンパク質における、配列番号２又は配列番号５によってコードされるポリペプチドに対する、キメラタンパク質中のＬｉｐ５ポリペプチドの配列同一性は、５０％を超え、例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％である。任意選択により、上記のキメラタンパク質中のＬｉｐ５ポリペプチドは、配列番号２又は配列番号５によってコードされるポリペプチドに対して９０％を超える配列同一性を有する。
任意選択により、上記のキメラタンパク質における、配列番号１又は配列番号４によってコードされるポリペプチドに対する、キメラタンパク質中のＢｏｌ３ポリペプチドの配列同一性は、５０％を超え、例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％である。任意選択により、上記のキメラタンパク質中のＢｏｌ３ポリペプチドは、配列番号１又は配列番号４によってコードされるポリペプチドに対して９０％を超える配列同一性を有する。
任意選択により、上記のキメラタンパク質における、配列番号２又は配列番号５によってコードされるポリペプチドに対する、キメラタンパク質中のＬｉｐ５ポリペプチドの配列同一性は、５０％を超え、例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％である。任意選択により、上記のキメラタンパク質中のＬｉｐ５ポリペプチドは、配列番号２又は配列番号５によってコードされるポリペプチドに対して９０％を超える配列同一性を有する。
【0021】
本発明の一実施形態は、配列番号１又は配列番号４によってコードされるポリペプチドに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＢｏｌ３の第１のアミノ酸配列、リンカーペプチド及び配列番号２又は配列番号５によってコードされるポリペプチドに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＬｉｐ５の第２のアミノ酸配列を含むキメラタンパク質である。任意選択により、リンカー配列は、ポリヒスチジンリンカーである。例えば、リンカー配列は、ポリヒスチジンリンカー中の６～２０個（例えば８～１６個、例えば８～１２個）のヒスチジン残基を含み得る。任意選択により、リンカー配列は、Ｃｉａ２タンパク質のＮ末端部分（配列番号２８参照）である。任意選択により、リンカーは、配列番号２８又は配列番号２９の配列を含み得る、又はからなり得る。
いくつかの実施形態では、第１のアミノ酸配列（Ｂｏｌ３）は、配列番号１又は配列番号４によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超える配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、第２のアミノ酸配列（Ｌｉｐ５）は、配列番号２又は配列番号５によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超える配列同一性を有する。
任意選択により、キメラタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を含み、例えば、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有する。任意選択により、キメラタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超える配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、第１のアミノ酸配列（Ｂｏｌ３）は、配列番号１又は配列番号４によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超える配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、第２のアミノ酸配列（Ｌｉｐ５）は、配列番号２又は配列番号５によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超える配列同一性を有する。
任意選択により、キメラタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を含み、例えば、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有する。任意選択により、キメラタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超える配列同一性を有する。
【0022】
本発明の一実施形態では、キメラタンパク質は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む。
本発明の一実施形態では、キメラタンパク質は、配列番号３１から発現されるタンパク質に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する。任意選択により、キメラタンパク質は、配列番号３１から発現されるタンパク質に対して５５％を超える配列同一性を有し、例えば、配列番号３１から発現されるタンパク質に対して６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％の配列同一性を有する。任意選択により、キメラタンパク質は、配列番号３１から発現されるタンパク質に対して９０％を超える配列同一性を有し、例えば、配列番号３１から発現されるタンパク質に対して９５％以上の、例えば、９８％以上の配列同一性を有する。任意選択により、キメラタンパク質は、配列番号３１によってコードされる。
本発明の一実施形態では、キメラタンパク質は、配列番号３１から発現されるタンパク質に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する。任意選択により、キメラタンパク質は、配列番号３１から発現されるタンパク質に対して５５％を超える配列同一性を有し、例えば、配列番号３１から発現されるタンパク質に対して６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％の配列同一性を有する。任意選択により、キメラタンパク質は、配列番号３１から発現されるタンパク質に対して９０％を超える配列同一性を有し、例えば、配列番号３１から発現されるタンパク質に対して９５％以上の、例えば、９８％以上の配列同一性を有する。任意選択により、キメラタンパク質は、配列番号３１によってコードされる。
【0023】
本発明の第２の態様において、本発明は、上記のキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。更に、本発明は又、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ストリンジェント条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドも包含する。本明細書の目的で、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションとは、Sambrook et al (Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press)により記載されているように、少なくとも６８℃の温度にて０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで洗浄した後もハイブリダイゼーションを維持することを意味する。
任意選択により、本発明は、単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明の実施形態によれば、単離されたポリヌクレオチドは、上記のようなキメラタンパク質をコードする。よって、本発明による、単離されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で酸化ストレスを軽減するキメラタンパク質をコードするために使用可能である。
任意選択により、本発明は、単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明の実施形態によれば、単離されたポリヌクレオチドは、上記のようなキメラタンパク質をコードする。よって、本発明による、単離されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で酸化ストレスを軽減するキメラタンパク質をコードするために使用可能である。
【0024】
多くの異なるポリヌクレオチド及び核酸が遺伝子コードの縮重の結果として同じポリペプチドをコードし得ることが当業者に理解されるであろう。更に、当業者は、慣例の技術を用いて、ポリペプチドを発現させる任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映するために、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列を変更しないヌクレオチド置換を行うことができると理解される。
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡからなり得る。ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖であり得る。ポリヌクレオチドは、合成又は修飾ヌクレオチドを含み得る。ポリヌクレオチドに対するいくつかの異なるタイプの修飾が当技術分野で公知である。これらには、メチルホスホネート及びホスホロチオエート骨格、分子の３’末端及び／又は５’末端へのアクリジン又はポリリジン鎖の付加が含まれる。本明細書に記載の発明の目的では、ポリヌクレオチドは当技術分野で利用可能ないずれの方法によって修飾されてもよいと理解されるべきである。このような修飾は、目的のポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏ活性又は寿命を増大させるために行うことができる。
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡからなり得る。ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖であり得る。ポリヌクレオチドは、合成又は修飾ヌクレオチドを含み得る。ポリヌクレオチドに対するいくつかの異なるタイプの修飾が当技術分野で公知である。これらには、メチルホスホネート及びホスホロチオエート骨格、分子の３’末端及び／又は５’末端へのアクリジン又はポリリジン鎖の付加が含まれる。本明細書に記載の発明の目的では、ポリヌクレオチドは当技術分野で利用可能ないずれの方法によって修飾されてもよいと理解されるべきである。このような修飾は、目的のポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏ活性又は寿命を増大させるために行うことができる。
【0025】
任意選択により、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号４のヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列を含む。任意選択により、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号４のヌクレオチド配列に対して少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％の配列同一性を有する配列を含む。任意選択により、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号４のヌクレオチド配列に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％を超える配列同一性を含む。
任意選択により、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号５のヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列を含む。任意選択により、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号５のヌクレオチド配列に対して少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％配列同一性を有する配列を含む。任意選択により、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号５のヌクレオチド配列に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％を超える配列同一性を含む。
任意選択により、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号３に対して少なくとも７０％配列同一性を有するキメラタンパク質を発現するヌクレオチド配列を有する。任意選択により、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号３に対して７０％を超える、例えば、７５％、８０％、８５％、９０％又は更にはそれを超える配列同一性を有するポリペプチドをコードする。任意選択により、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号３のヌクレオチド配列に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％を超える配列同一性を有するポリペプチドをコードする。
任意選択により、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号５のヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列を含む。任意選択により、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号５のヌクレオチド配列に対して少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％配列同一性を有する配列を含む。任意選択により、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号５のヌクレオチド配列に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％を超える配列同一性を含む。
任意選択により、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号３に対して少なくとも７０％配列同一性を有するキメラタンパク質を発現するヌクレオチド配列を有する。任意選択により、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号３に対して７０％を超える、例えば、７５％、８０％、８５％、９０％又は更にはそれを超える配列同一性を有するポリペプチドをコードする。任意選択により、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号３のヌクレオチド配列に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％を超える配列同一性を有するポリペプチドをコードする。
【0026】
任意選択により、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号３２のヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する。任意選択により、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号３２のヌクレオチド配列に対して少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％の配列同一性を有する配列を含む。任意選択により、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号３２のヌクレオチド配列に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％を超える配列同一性を含む。
任意選択により、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号３のヌクレオチド配列を含むポリペプチドをコードする。
任意選択により、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号３１のヌクレオチド配列を含むポリペプチドをコードする。
任意選択により、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号３のヌクレオチド配列を含むポリペプチドをコードする。
任意選択により、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号３１のヌクレオチド配列を含むポリペプチドをコードする。
【0027】
第３の態様において、本発明は、このようなポリヌクレオチドを含むベクター、特に、前記ポリヌクレオチドを発現する、又は過剰発現する発現ベクターを提供する。
本発明において「ベクター」は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、そのタンパク質の発現を可能とするように作動可能に挿入することができる伝達体を指す。ベクターは、ベクターが保持している遺伝要素が宿主細胞内で発現されるように、宿主細胞に形質転換、形質導入、又はトランスフェクション（これらの用語は本明細書では互換的に使用される）を行うために使用することができる。様々なベクターが利用可能である。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、シグナル配列、１以上のマーカー遺伝子、選択要素、リポーター遺伝子、及び転写終結配列を含む発現を制御する様々な要素を含み得る。更に、ベクターは又、複製起点も含み得る。ベクターは又、限定されるものではないが、ウイルス粒子、リポソーム、又はタンパク質殻を含む、ベクターの細胞への進入を助ける構成要素も含み得る。
例えば、ベクターとしては、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体（例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）又はＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ））、バクテリオファージ（例えば、２バクテリオファージ又はＭ１３バクテリオファージ）、動物ウイルスなどが含まれる。
いくつかの実施形態では、ベクター系としては、哺乳動物、細菌、及び酵母系が含まれ、限定されるものではないが「ｐＥＮＤＯ－２」などのプラスミド及び研究室から入手可能な他のベクター又は市販のベクターも含む。適切な真核生物ベクターとしては、２ミクロン又はセントロメア複製起点を有するベクターが含まれる。適切なベクターとしては、プラスミド又はウイルスベクター（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）を含み得る。
本発明において「ベクター」は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、そのタンパク質の発現を可能とするように作動可能に挿入することができる伝達体を指す。ベクターは、ベクターが保持している遺伝要素が宿主細胞内で発現されるように、宿主細胞に形質転換、形質導入、又はトランスフェクション（これらの用語は本明細書では互換的に使用される）を行うために使用することができる。様々なベクターが利用可能である。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、シグナル配列、１以上のマーカー遺伝子、選択要素、リポーター遺伝子、及び転写終結配列を含む発現を制御する様々な要素を含み得る。更に、ベクターは又、複製起点も含み得る。ベクターは又、限定されるものではないが、ウイルス粒子、リポソーム、又はタンパク質殻を含む、ベクターの細胞への進入を助ける構成要素も含み得る。
例えば、ベクターとしては、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体（例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）又はＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ））、バクテリオファージ（例えば、２バクテリオファージ又はＭ１３バクテリオファージ）、動物ウイルスなどが含まれる。
いくつかの実施形態では、ベクター系としては、哺乳動物、細菌、及び酵母系が含まれ、限定されるものではないが「ｐＥＮＤＯ－２」などのプラスミド及び研究室から入手可能な他のベクター又は市販のベクターも含む。適切な真核生物ベクターとしては、２ミクロン又はセントロメア複製起点を有するベクターが含まれる。適切なベクターとしては、プラスミド又はウイルスベクター（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）を含み得る。
【0028】
よって、本発明は、上記のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。本実施形態の発現ベクターは、従来から知られている任意の遺伝子工学的方法によって上記のようなポリヌクレオチドを発現ベクターにサブクローニングすることによって作製することができる。本実施形態で使用可能な発現ベクターのタイプは特に限定はなく、その例には、真核生物における異種遺伝子発現に適切であり、且つ、標的ポリペプチドの発現を駆動できるいずれの発現ベクターも含まれる。例えば、２ミクロン又はセントロメア複製起点を、例えばＴｅｆ１プロモーターなどの構成プロモーター／ターミネーターカセットと共に有する真核生物ベクターを好都合に使用することができる。
キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、当技術分野で周知の組換え技術を用いて、クローニング（ＤＮＡの増幅）又は遺伝子発現のために宿主細胞に導入することができる。別の実施形態では、キメラタンパク質は、当技術分野で周知の相同組換え法によって作製することができる。
キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、当技術分野で周知の組換え技術を用いて、クローニング（ＤＮＡの増幅）又は遺伝子発現のために宿主細胞に導入することができる。別の実施形態では、キメラタンパク質は、当技術分野で周知の相同組換え法によって作製することができる。
【0029】
よって、第４の態様において、本発明は、上記のようなベクター又はポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。
本発明において「宿主細胞」とは、外因性のポリヌクレオチド及び／又はベクターが導入される細胞を指す。本願の融合タンパク質のアミノ酸配列は、当技術分野で周知の遺伝子工学的技術を用いて、相当するＤＮＡコード配列に変換することができる。遺伝コードの縮重のために、形質転換されたＤＮＡ配列は、コードされるタンパク質配列は不変のまま、完全には同一ではない場合がある。
本発明のベクターへのクローニング又は発現に適切な宿主細胞は、原核細胞、酵母又は上述の高度な真核細胞である。本発明での使用に適切な原核細胞としては、大腸菌（例えば、大腸菌ＤＨ５α及びＢＬ２１ｄｅ３）が含まれる。
本発明において「宿主細胞」とは、外因性のポリヌクレオチド及び／又はベクターが導入される細胞を指す。本願の融合タンパク質のアミノ酸配列は、当技術分野で周知の遺伝子工学的技術を用いて、相当するＤＮＡコード配列に変換することができる。遺伝コードの縮重のために、形質転換されたＤＮＡ配列は、コードされるタンパク質配列は不変のまま、完全には同一ではない場合がある。
本発明のベクターへのクローニング又は発現に適切な宿主細胞は、原核細胞、酵母又は上述の高度な真核細胞である。本発明での使用に適切な原核細胞としては、大腸菌（例えば、大腸菌ＤＨ５α及びＢＬ２１ｄｅ３）が含まれる。
【0030】
一実施形態では、真核宿主細胞は、キメラタンパク質をコードするベクターのクローニング又は発現のために使用される。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ２８８Ｃ）又はパン酵母は、最もよく使用されている下等な真核宿主微生物である。しかしながら、多くの他の属、種及び株も一般的であり、本発明での使用に適切であり、例えば、サッカロミセス分岐群の他のメンバー（Ｓ．パストリアヌス(S. pastorianus)、Ｓ．ユーバヤヌス(S. eubayanus)及びＳ．パラドキサス(S. paradoxus)を含む）、コマガタエラ属(Komagataella)（Ｋ．パストリス(K. pastoris)を含む）、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)（Ｋ．ラクチス(K. lactis)を含む）及びヤロウイア属（Yarrowia）（Ｙ．リポリチカ(Y. lipolytica)を含む）がある。本発明の別の態様では、本発明は、上記のようなポリヌクレオチド又はベクターを含む組換え細胞又は組換え微生物を提供する。よって、本発明による組換え細胞又は組換え微生物は、本発明のキメラタンパク質を発現し得る。本発明は更に、上記のようなポリヌクレオチド、又はベクターを含む組換え宿主細胞に関する。宿主細胞中に存在する本発明のポリヌクレオチド又はベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれ得るか、又は染色体外で維持され得る。ポリヌクレオチド又はベクターが適当な「宿主細胞」に組み込まれると、宿主細胞は、そのポリヌクレオチド又はベクターの高レベル発現に適切な条件下で維持される。
【0031】
形質転換宿主細胞は、細胞増殖を達成するために当技術分野で公知の方法論に従って増殖させることができる。
任意選択により、発現させたところで、キメラタンパク質は当技術分野の標準的な手順に従って精製することができる。アフィニティーカラム、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）などのカラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、硫酸アンモニウム沈殿などが挙げられる。次に、本発明のキメラタンパク質は、増殖培地、細胞溶解液、又は細胞膜画分から単離することができる。キメラタンパク質の単離及び精製は、例えば、分取クロマトグラフィー分離などの従来のいずれの手段によるものでもよい。
任意選択により、発現させたところで、キメラタンパク質は当技術分野の標準的な手順に従って精製することができる。アフィニティーカラム、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）などのカラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、硫酸アンモニウム沈殿などが挙げられる。次に、本発明のキメラタンパク質は、増殖培地、細胞溶解液、又は細胞膜画分から単離することができる。キメラタンパク質の単離及び精製は、例えば、分取クロマトグラフィー分離などの従来のいずれの手段によるものでもよい。
【0032】
宿主細胞は、キメラタンパク質を生産できる上述の発現又はクローニングベクターで形質転換させ、次いで、プロモーターの誘導、形質転換細胞の選択、又は改変された後の標的配列をコードする遺伝子の増幅に適切な、従来栄養培地で培養する。
本発明においてキメラタンパク質を生産するために使用される宿主細胞は、当技術分野で公知の様々な培地で培養することができる。培地は又、当技術分野で公知の他の必要な添加剤を適切な濃度で含んでもよい。温度、ｐＨなどの培地の条件は、宿主細胞の発現のために従前に選択したものであり、当業者に周知である。
本発明においてキメラタンパク質を生産するために使用される宿主細胞は、当技術分野で公知の様々な培地で培養することができる。培地は又、当技術分野で公知の他の必要な添加剤を適切な濃度で含んでもよい。温度、ｐＨなどの培地の条件は、宿主細胞の発現のために従前に選択したものであり、当業者に周知である。
【0033】
本発明は更に、上記のようなキメラタンパク質を生産するための方法を提供し、その方法は、以下の工程：組換え宿主細胞を適宜培養すること、及びキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド又はキメラタンパク質をコードするベクターを発現させることを含む。
第５の態様において、本発明は、宿主細胞内で、少なくとも１つのジスルフィド結合を有する標的ポリペプチドを生産するための方法を提供し、前記方法は、標的ポリペプチドの発現と共にキメラタンパク質の発現に適切な条件下で宿主細胞を培養することを含む。
第５の態様において、本発明は、宿主細胞内で、少なくとも１つのジスルフィド結合を有する標的ポリペプチドを生産するための方法を提供し、前記方法は、標的ポリペプチドの発現と共にキメラタンパク質の発現に適切な条件下で宿主細胞を培養することを含む。
【0034】
標的ポリペプチドは、天然又は合成ポリペプチドであり得る。
任意選択により、標的ポリペプチドは、その所望の３Ｄ構造を作り出すために２つ以上のジスルフィド結合を有し、例えば、２、３、４又は５つのジスルフィド結合を有する。任意選択により、これらのジスルフィド結合は、隣接していないシステイン残基間で形成され、即ち、ジスルフィド結合は、標的ポリペプチドに複雑な３Ｄ配置の「ノット」を形成する。任意選択により、標的ポリペプチドは、「インヒビターシスチンノット」又は「ＩＣＫ」を含む。
任意選択により、標的ポリペプチドは、毒素ポリペプチドであり、例えば、唾液ペプチドの「エバシン」ファミリーに由来する。任意選択により、標的ポリペプチドは、配列番号６～１３のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。任意選択により、標的ポリペプチドは、配列番号１８、配列番号２０又は配列番号２２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。
任意選択により、標的ポリペプチドは、その所望の３Ｄ構造を作り出すために２つ以上のジスルフィド結合を有し、例えば、２、３、４又は５つのジスルフィド結合を有する。任意選択により、これらのジスルフィド結合は、隣接していないシステイン残基間で形成され、即ち、ジスルフィド結合は、標的ポリペプチドに複雑な３Ｄ配置の「ノット」を形成する。任意選択により、標的ポリペプチドは、「インヒビターシスチンノット」又は「ＩＣＫ」を含む。
任意選択により、標的ポリペプチドは、毒素ポリペプチドであり、例えば、唾液ペプチドの「エバシン」ファミリーに由来する。任意選択により、標的ポリペプチドは、配列番号６～１３のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。任意選択により、標的ポリペプチドは、配列番号１８、配列番号２０又は配列番号２２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【0035】
任意選択により、標的ポリペプチドは、毒素ポリペプチドであり、例えば、コモリグモ(Alopecosa marikovskyi)の「プロトキシン」（配列番号２０、又は配列番号２１によってコードされる）及び／又はトリニダードシェブロンタランチュラ(Psalmopoeus cambridgei）の「プサルモトキシン－１」（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：ＴＸＰ１＿ＰＳＡＣＡ）（配列番号２２、又は配列番号２３によってコードされる）に由来する。或いは、標的ポリペプチドは、例えば、アメリカカブトガニ(Limulus polyphemus)の因子「Ｃ」と「Ｂ」及び／又はカブトガニ(Tachypleus tridentatus)の「コアギュローゲン－１」（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：ＣＯＡＧ＿ＴＡＣＴＲ）、又はジャイアントキーホールリンペット(Megathura crenulata)の「ヘモシアニン－１」（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：ＨＣＹ１＿ＭＥＧＣＲ）及びジャイアントキーホールリンペット(Megathura crenulata)の「ヘモシアニン－２」（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：ＨＣＹ２＿ＭＥＧＣＲ）、並びにウシ血清アルブミン、ＢＳＡ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０２７６９（ＡＬＢＵ＿ＢＯＶＩＮ）、ヒト血清アルブミン、ＨＳＡ、ＵｎｉＰｒｏｔ－Ｂ－Ｐ０２７６８（ＡＬＢＵ＿ＨＵＭＡＮ）、ヒトインスリン（ヒトインスリン類似体及びヒトインスリン模倣ペプチドを含む）ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１３０８（ＩＮＳ＿ＨＵＭＡＮ）、ヒトエリスロポエチンＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１５８８（ＥＰＯ＿ＨＵＭＡＮ）又はヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０４１４１（ＣＳＦ２＿ＨＵＭＡＮ）など、ジスルフィド結合を有する他の目的ポリペプチドであってもよい。
任意選択により、標的ポリペプチドは、抗体、例えば、モノクローナル抗体、ヒト化抗体又は抗体フラグメントであってもよい。
任意選択により、標的ポリペプチドは、糖タンパク質、例えば、分泌配列を有する糖タンパク質（即ち、宿主細胞から分泌される糖タンパク質）であってもよい。
任意選択により、標的ポリペプチドは、抗体、例えば、モノクローナル抗体、ヒト化抗体又は抗体フラグメントであってもよい。
任意選択により、標的ポリペプチドは、糖タンパク質、例えば、分泌配列を有する糖タンパク質（即ち、宿主細胞から分泌される糖タンパク質）であってもよい。
【0036】
宿主細胞は、前記標的ポリペプチドを発現するように遺伝子操作することができる。例えば、宿主細胞は、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターで形質転換させることができる。発現ベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれ得るか、又は染色体外で維持され得る。ベクターが適当な「宿主細胞」に導入されると、宿主細胞は、標的ポリペプチドの高レベル発現に適切な条件下で維持される。
宿主細胞は、標的ポリペプチドを発現するように遺伝子操作し、次いでキメラタンパク質を発現するように更に遺伝子操作することができ、又はその逆も可能である。任意選択により、宿主細胞は、標的ポリペプチドを自然に発現し、上記のようなキメラタンパク質を発現するように形質転換させるだけである。
任意選択により、キメラタンパク質と標的ポリペプチドの両方をコードするポリヌクレオチドを含む単一のベクターを形成することができ、次いで、宿主細胞を、標的ポリペプチドとキメラタンパク質の両方を発現させることができるこのベクターで形質転換させるだけである。任意選択により、両ポリヌクレオチドは、同じプロモーター／インデューサー／エンハンサーの制御下にある。
宿主細胞は、標的ポリペプチドを発現するように遺伝子操作し、次いでキメラタンパク質を発現するように更に遺伝子操作することができ、又はその逆も可能である。任意選択により、宿主細胞は、標的ポリペプチドを自然に発現し、上記のようなキメラタンパク質を発現するように形質転換させるだけである。
任意選択により、キメラタンパク質と標的ポリペプチドの両方をコードするポリヌクレオチドを含む単一のベクターを形成することができ、次いで、宿主細胞を、標的ポリペプチドとキメラタンパク質の両方を発現させることができるこのベクターで形質転換させるだけである。任意選択により、両ポリヌクレオチドは、同じプロモーター／インデューサー／エンハンサーの制御下にある。
【0037】
更なる態様において、本発明は、上記のようなキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド及び標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入のためのクローニング部位を含む発現ベクターを提供する。クローニング部位は、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの容易な挿入を可能とする適切な制限部位によって定義され得る。例えば、発現ベクターは、標的ポリペプチドの異なる構築物の容易な挿入を助けるために、最大２０の異なる制限部位を有する多重クローニング部位を含み得る。
【0038】
なお更なる側面において、本発明は、宿主細胞内で目的の標的ポリペプチドを発現させるための発現系を提供し、前記系は、上記のようなキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入のためのクローニング部位を含むベクターを含む。任意選択により、クローニング部位は、本発明のキメラタンパク質をコードするベクター上に提供することができる。或いは、別のベクターに標的ポリペプチドの発現のためのクローニング部位を提供することもできる。クローニング部位は、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチの容易な挿入を可能とする適切な制限部位によって定義することができる。例えば、発現ベクターは、標的ポリペプチドの異なる構築物の容易な挿入を助けるために、最大２０の異なる制限部位を有する多重クローニング部位を含み得る。
【0039】
標的ポリペプチドは、天然又は合成ポリペプチドであり得る。
任意選択により、標的ポリペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合を有し、その所望の３Ｄ構造を作り出すために２つ以上のジスルフィド結合を含んでよく、例えば、２、３、４又は５つのジスルフィド結合を有する。任意選択により、ジスルフィド結合は、隣接していないシステイン残基間で形成され、即ち、ジスルフィド結合は、標的ポリペプチドに複雑な３Ｄ配置の「ノット」を形成する。任意選択により、標的ポリペプチドは、「インヒビターシスチンノット」又は「ＩＣＫ」を含む。
任意選択により、標的ポリペプチドは、毒素ポリペプチドであり、例えば、唾液ペプチドの「エバシン」ファミリーに由来する。任意選択により、標的ポリペプチドは、配列番号６～１３のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。任意選択により、標的ポリペプチドは、配列番号１８、配列番号２０又は配列番号２２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。
任意選択により、標的ポリペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合を有し、その所望の３Ｄ構造を作り出すために２つ以上のジスルフィド結合を含んでよく、例えば、２、３、４又は５つのジスルフィド結合を有する。任意選択により、ジスルフィド結合は、隣接していないシステイン残基間で形成され、即ち、ジスルフィド結合は、標的ポリペプチドに複雑な３Ｄ配置の「ノット」を形成する。任意選択により、標的ポリペプチドは、「インヒビターシスチンノット」又は「ＩＣＫ」を含む。
任意選択により、標的ポリペプチドは、毒素ポリペプチドであり、例えば、唾液ペプチドの「エバシン」ファミリーに由来する。任意選択により、標的ポリペプチドは、配列番号６～１３のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。任意選択により、標的ポリペプチドは、配列番号１８、配列番号２０又は配列番号２２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【0040】
任意選択により、標的ポリペプチドは、毒素ポリペプチドであり、例えば、コモリグモ(Alopecosa marikovskyi)の「プロトキシン」（配列番号２０及び２１参照）及び／又はトリニダードシェブロンタランチュラ(Psalmopoeus cambridgei）の「プサルモトキシン－１」（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：ＴＸＰ１＿ＰＳＡＣＡ）（配列番号２２及び２３参照）に由来する。任意選択により、標的ポリペプチドは、アメリカカブトガニ(Limulus polyphemus)の因子「Ｃ」若しくは「Ｂ」、カブトガニ(Tachypleus tridentatus)の「コアギュローゲン－１」（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：ＣＯＡＧ＿ＴＡＣＴＲ）、又はジャイアントキーホールリンペット(Megathura crenulata)の「ヘモシアニン－１」（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：ＨＣＹ１＿ＭＥＧＣＲ）及びジャイアントキーホールリンペット(Megathura crenulata)の「ヘモシアニン－２」（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：ＨＣＹ２＿ＭＥＧＣＲ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０２７６９（ＡＬＢＵ＿ＢＯＶＩＮ）、ヒト血清アルブミン（ｈａｓ）ＵｎｉＰｒｏｔ－Ｂ－Ｐ０２７６８（ＡＬＢＵ＿ＨＵＭＡＮ）、ヒトインスリンＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１３０８（ＩＮＳ＿ＨＵＭＡＮ）、ヒトエリスロポエチンＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１５８８（ＥＰＯ＿ＨＵＭＡＮ）、又はヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０４１４１（ＣＳＦ２＿ＨＵＭＡＮ）に由来する。
【0041】
任意選択により、標的ポリペプチドは、抗体、例えば、モノクローナル抗体、ヒト化抗体又は抗体フラグメントであってもよい。
任意選択により、標的ポリペプチドは、糖タンパク質、例えば、分泌配列を有する糖タンパク質（即ち、宿主細胞から分泌される糖タンパク質）であってもよい。
任意選択により、発現させたところで、標的タンパク質は当技術分野の標準的な手順に従って精製することができる。アフィニティーカラム、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）などのカラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、硫酸アンモニウム沈殿などが挙げられる。次に、標的ポリペプチドは、増殖培地、細胞溶解液、又は細胞膜画分から単離することができる。標的ポリペプチドの単離及び精製は、例えば、分取クロマトグラフィー分離などの従来のいずれの手段によるものでもよい。
任意選択により、標的ポリペプチドは、糖タンパク質、例えば、分泌配列を有する糖タンパク質（即ち、宿主細胞から分泌される糖タンパク質）であってもよい。
任意選択により、発現させたところで、標的タンパク質は当技術分野の標準的な手順に従って精製することができる。アフィニティーカラム、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）などのカラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、硫酸アンモニウム沈殿などが挙げられる。次に、標的ポリペプチドは、増殖培地、細胞溶解液、又は細胞膜画分から単離することができる。標的ポリペプチドの単離及び精製は、例えば、分取クロマトグラフィー分離などの従来のいずれの手段によるものでもよい。
【0042】
本明細書で言及される全ての文書は、参照により組み込まれる。当業者に明らかであろう記載された実施形態に対する任意の修正及び／又は変形も本明細書に包含される。本発明を特定の具体的な実施形態及び実施例を参照して本明細書に記載してきたが、本発明は、これらの具体的な実施形態又は実施例に不当に限定されることを意図するものではないことを理解されたい。
本発明の各態様又は実施形態の好ましい特徴又は代替の特徴は、本発明の他の各態様又は実施形態に準用される（文脈上別段の要求がない限り）。
本発明の各態様又は実施形態の好ましい特徴又は代替の特徴は、本発明の他の各態様又は実施形態に準用される（文脈上別段の要求がない限り）。
【実施例】
【0043】
方法
菌株、培養条件及び材料
この研究のためのオリゴヌクレオチド及び配列は、サッカロミセスゲノムデータベースを参照して、まずｉｎ ｓｉｌｉｃｏクローニングソフトウエアを用いて設計し、その後ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカスタムオリゴオーダーサービスから購入した。ＰＣＲ用鋳型は、サッカロミセス・セレビシエ（ＢＹ４７４１， ＭＡＴａ ｈｉｓ３Δ１ ｌｅｕ２Δ０ ｍｅｔ１５Δ０ ｕｒａ３Δ０）の新鮮な一晩培養液から、２０ｍｇ／ｍＬ Ｌｙｔｉｃａｓｅ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＫ）を用いたデジタルドライブロック（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＵＫ）中＋３７℃での消化とその後のＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓのトータル・ゲノミック・スピン・プレップ・キット（Ｍｏｎａｒｃｈ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＫ）を行って精製した。サブクローニングには、１０μＬのエレクトロコンピテント大腸菌（ＤＨ５α）細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＫ）を通常使用し、プラスミド選択はＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地に１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加した正の抗生物質選択下で行った。大腸菌の形質転換は製造者の説明書に従って行い、形質転換体は＋３７℃、静置で少なくとも１６時間インキュベートした。使用前に、全てのアリコートとバッファーを最大速度（１５，５００ ｒ．ｃ．ｆ．）で少なくとも６０秒間、短時間で遠心分離した。
融合ＯＲＦの作出
融合ＯＲＦを作出するために２つの方法論を用いた；用いた第１の方法論は、Hilgarth & Lanigan, (2020), MethodsX, 7 (October 2019), 100759から採用した。後者の構築物では、従来の制限酵素クローニングを用いた。
菌株、培養条件及び材料
この研究のためのオリゴヌクレオチド及び配列は、サッカロミセスゲノムデータベースを参照して、まずｉｎ ｓｉｌｉｃｏクローニングソフトウエアを用いて設計し、その後ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカスタムオリゴオーダーサービスから購入した。ＰＣＲ用鋳型は、サッカロミセス・セレビシエ（ＢＹ４７４１， ＭＡＴａ ｈｉｓ３Δ１ ｌｅｕ２Δ０ ｍｅｔ１５Δ０ ｕｒａ３Δ０）の新鮮な一晩培養液から、２０ｍｇ／ｍＬ Ｌｙｔｉｃａｓｅ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＫ）を用いたデジタルドライブロック（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＵＫ）中＋３７℃での消化とその後のＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓのトータル・ゲノミック・スピン・プレップ・キット（Ｍｏｎａｒｃｈ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＫ）を行って精製した。サブクローニングには、１０μＬのエレクトロコンピテント大腸菌（ＤＨ５α）細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＫ）を通常使用し、プラスミド選択はＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地に１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加した正の抗生物質選択下で行った。大腸菌の形質転換は製造者の説明書に従って行い、形質転換体は＋３７℃、静置で少なくとも１６時間インキュベートした。使用前に、全てのアリコートとバッファーを最大速度（１５，５００ ｒ．ｃ．ｆ．）で少なくとも６０秒間、短時間で遠心分離した。
融合ＯＲＦの作出
融合ＯＲＦを作出するために２つの方法論を用いた；用いた第１の方法論は、Hilgarth & Lanigan, (2020), MethodsX, 7 (October 2019), 100759から採用した。後者の構築物では、従来の制限酵素クローニングを用いた。
【0044】
ステージ１： ＰＣＲ用のＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼは、４ｍＭ ＭｇＣｌ2、及び２ｍＭ ｄＮＴＰミックスを含む（２×）マスターミックス（Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｑ５ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ、ＮＥＢ ＵＫ）として使用した。通常、ＰＣＲは清浄な薄壁の０．２ｍＬチューブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＵＫ）中５０μＬで行い、氷上で調製し、最大速度でパルスボルテックス撹拌（Ｓｔｕａｒｔ、ＵＫ）を行うことで十分に混合した。サーモサイクリングは、２４ウェルＰｒｉｍｅ3サーモサイクラー（Ｔｅｃｈｎｅ、ＵＫ）にて、予熱した蓋（＋１０５℃）をして２時間３０分行った。ＯＥ－ＰＣＲのステージ１とステージ３の一般的なサーモサイクリング条件は、＋９８℃で１０秒の初期変性、＋９８℃で１０秒、＋６０℃で６０秒、次いで＋７２℃で２分秒の伸長段階を３５サイクルとした。これを合計３５サイクル行った。最後に、＋７２℃で１０分の最終伸長段階を行った。反応はその後＋２０℃で保持した。
サーモサイクリングの後、１５，０００ ｒ．ｃ．ｆ．で約１０秒間のパルス遠心によりアンプリコンを短時間で再構成した。この後、ＤＮＡインターカレーターとして０．７％ｗ／ｖアガロース（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉ、ＵＫ）と０．０５％ｖ／ｖ ＥｔＢｒ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＫ）を用いたＴＡＥゲル電気泳動によって反応を確認した。ゲルは、小型ゲルタンク（Ａｌｐｈａ ｌａｂｓ、ＵＫ）と電気泳動パワーパック（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉ、ＵＫ）を用いて、１５０Ｖ、４００ｍＡで３０分間実施した。終了後、ゲルを青色光（ｐｒｏＢＬＵＥＶｉｅｗ、Ａｌｐｈａ Ｌａｂｓ、ＵＫ）下で注意深く可視化した。アンプリコンのおおよその分子量を決定するために、１０μＬのＧｅｎｅＲｕｌｅｒ １ｋｂ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＵＫ）を標準として用いた。ＰＣＲの結果、約３５０ｂｐｓと１２００ｂｐｓの２つの単一バンドが得られ、これらはそれぞれＢｏｌ３とＬｉｐ５の参照分子量(Saccharomyces genome database, yeastgenome.org)と一致していた。その後、ゲル断片を清浄なメスで切り出し、市販のスピンカラムプロトコール（ＧｅｎｅＪｅｔ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＵＫ）によって、製造者の説明書に従って精製した。
サーモサイクリングの後、１５，０００ ｒ．ｃ．ｆ．で約１０秒間のパルス遠心によりアンプリコンを短時間で再構成した。この後、ＤＮＡインターカレーターとして０．７％ｗ／ｖアガロース（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉ、ＵＫ）と０．０５％ｖ／ｖ ＥｔＢｒ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＫ）を用いたＴＡＥゲル電気泳動によって反応を確認した。ゲルは、小型ゲルタンク（Ａｌｐｈａ ｌａｂｓ、ＵＫ）と電気泳動パワーパック（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉ、ＵＫ）を用いて、１５０Ｖ、４００ｍＡで３０分間実施した。終了後、ゲルを青色光（ｐｒｏＢＬＵＥＶｉｅｗ、Ａｌｐｈａ Ｌａｂｓ、ＵＫ）下で注意深く可視化した。アンプリコンのおおよその分子量を決定するために、１０μＬのＧｅｎｅＲｕｌｅｒ １ｋｂ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＵＫ）を標準として用いた。ＰＣＲの結果、約３５０ｂｐｓと１２００ｂｐｓの２つの単一バンドが得られ、これらはそれぞれＢｏｌ３とＬｉｐ５の参照分子量(Saccharomyces genome database, yeastgenome.org)と一致していた。その後、ゲル断片を清浄なメスで切り出し、市販のスピンカラムプロトコール（ＧｅｎｅＪｅｔ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＵＫ）によって、製造者の説明書に従って精製した。
【0045】
ステージ２： 第２ステージは、各アンプリコン間に組み込まれた相補性を用いて両方のＯＲＦを融合させた。これは、アニーリング配列の融解温度よりもわずかに高い融解温度（＋６８℃）を持つ３０マーのポリヒスチジン（１０×）配列を付加することで実現した。この領域は各ＯＲＦ間の「リンカー」を形成した。ｔＲＮＡの枯渇を避けるため、ヒスチジンのコドンは交互に配置した。ステージ１とは異なり、このステージではポリヒスチジンリンカー領域に対してより高い感度が得られるように、タッチダウンＰＣＲプロトコールを用いた。タッチダウンＰＣＲ用の鋳型は、ステージ１で生成されたアンプリコンの等モル（１：１）濃度（ｎｇ／μＬ）で構成された。計算はライゲーション計算機を用いて行い、短い方の配列を「インサート」とみなした。ＰＣＲは蒸発を軽減するために、予熱した蓋を使用して再度行った。サーモサイクリングは、＋９５℃で３０秒の変性、その後＋７２℃で１５秒のアニーリングを３分、１サイクルごとにアニーリング温度を０．５℃ずつ下げながらの９サイクルからなった。その後、＋９５℃で３０秒の変性、次いで＋６７．５℃で３０秒のアニーリングを５サイクル行い、その後＋６８℃で３０秒の伸長ステップを３分行った。最後に、＋６８℃で１０分の伸長工程を行った。
【0046】
ステージ３： ＯＥ－ＰＣＲの最終ステージでは、第２ステージの未精製ＰＣＲ産物を鋳型として用いた。サーモサイクリングは、異なるオリゴヌクレオチドを用いたこと以外はステージ１と同じプログラムで行った。ここでは、第１及び第２のＯＲＦの５’（フォワード）及び３’（リバース）に対するオリゴヌクレオチドを用いて、ステージ２で生成された融合配列のみを増幅した。使用したオリゴヌクレオチドを以下の表１に示す。上述のように、融合反応の成否を確認するためにＴＡＥゲル電気泳動を行った。ここでは、両方のＯＲＦを合わせた分子量を表す単一のバンドが検出された。その後、ゲル切片を切り出し、上記のように市販のゲル抽出キットを用いてＤＮＡを精製した。
【表1】
【0047】
制限酵素消化とその後のクローニング
制限酵素（Ｘｂａ Ｉ、Ｎｏｔ Ｉ及びＳａｃ ＩＩ）は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓのＣｕｔＳｍａｒｔ ｒａｎｇｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＫ）から入手し、消化（５０μＬ）は、製造者の説明書に従い、デジタルドライバッチ内で＋３７℃にて２時間、１×ＣｕｔＳｍａｒｔバッファー中で行った。消化の後、任意の凝縮物をベンチトップ遠心機（ＳｃｉＱｕｉｐ、ＵＫ）にて、最大速度（１５，５００ ｒ．ｃ．ｆ．）でのパルス遠心により除去した。ＤＮＡライゲーション（２０μＬ）も同様に、Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＫ）を製造者の説明書に従って用い、インサートとベクターのモル比を５：１として（ベクター比１を２７ｆｍｏｌで標準化した）行った。通常通り、ＤＮＡ（ｎｇ／μＬ）を、スペクトル（２６０～７００ｎｍ）のＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計（ＳｐｅｃｔｒｏＳｔａｒ Ｎａｎｏ、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、ＵＫ）を用いて定量した。インキュベーション後、氷上で２μＬのライゲーション反応物をエレクトコンピテントＤＨ５α大腸菌細胞に形質転換した。＋３７℃で少なくとも１６時間のインキュベーション（コロニー成長を可能とする）の後、個々のコロニーを診断敵消化とコロニーＰＣＲでライゲーションの成否を分析した。最終反応量２０μＬで、１ライゲーション当たり約２０コロニーをスクリーニングした。このプロトコールは、反応当たり１つのコロニー（マークされたもの）を使用すること以外は上記と同様にステージ３を繰り返した。増幅に成功していたものは個々のコロニーに戻し、市販のＭｉｎｉＰｒｅｐキット（ＧｅｎｅＪｅｔ ＭｉｎｉＰｒｅｐ Ｋｉｔ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）でプラスミドを精製した。精製後、プラスミド溶出液を標識し、－２０℃で保存した。
制限酵素（Ｘｂａ Ｉ、Ｎｏｔ Ｉ及びＳａｃ ＩＩ）は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓのＣｕｔＳｍａｒｔ ｒａｎｇｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＫ）から入手し、消化（５０μＬ）は、製造者の説明書に従い、デジタルドライバッチ内で＋３７℃にて２時間、１×ＣｕｔＳｍａｒｔバッファー中で行った。消化の後、任意の凝縮物をベンチトップ遠心機（ＳｃｉＱｕｉｐ、ＵＫ）にて、最大速度（１５，５００ ｒ．ｃ．ｆ．）でのパルス遠心により除去した。ＤＮＡライゲーション（２０μＬ）も同様に、Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＫ）を製造者の説明書に従って用い、インサートとベクターのモル比を５：１として（ベクター比１を２７ｆｍｏｌで標準化した）行った。通常通り、ＤＮＡ（ｎｇ／μＬ）を、スペクトル（２６０～７００ｎｍ）のＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計（ＳｐｅｃｔｒｏＳｔａｒ Ｎａｎｏ、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、ＵＫ）を用いて定量した。インキュベーション後、氷上で２μＬのライゲーション反応物をエレクトコンピテントＤＨ５α大腸菌細胞に形質転換した。＋３７℃で少なくとも１６時間のインキュベーション（コロニー成長を可能とする）の後、個々のコロニーを診断敵消化とコロニーＰＣＲでライゲーションの成否を分析した。最終反応量２０μＬで、１ライゲーション当たり約２０コロニーをスクリーニングした。このプロトコールは、反応当たり１つのコロニー（マークされたもの）を使用すること以外は上記と同様にステージ３を繰り返した。増幅に成功していたものは個々のコロニーに戻し、市販のＭｉｎｉＰｒｅｐキット（ＧｅｎｅＪｅｔ ＭｉｎｉＰｒｅｐ Ｋｉｔ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）でプラスミドを精製した。精製後、プラスミド溶出液を標識し、－２０℃で保存した。
【0048】
迅速酵母形質転換
新たに作製したプラスミドのＳ．セレビシエ宿主への導入は、ＢＹ４７４１の一晩培養と予め乾燥させたウラシルドロップアウトプレート（Ｋａｉｓｅｒ ｍｉｎｉｍａｌ ｄｒｏｐ－ｏｕｔ ｍｅｄｉａ、Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ、ＵＫ）を用いて行った。反応を行う前に、１ｍｇ／ｍＬの一本鎖ＤＮＡ（Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ Ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＫ）１ｍＬを＋９５℃で１０分煮沸した後、すぐに氷上に置いた。トランスフォーメーションは、２４０μＬの５０％ｗ／ｖポリエチレングリコール（ＰＥＧ4000、Ｍｅｌｆｏｒｄ、ＵＫ）、３６μＬの１Ｍ酢酸リチウム（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＫ）、１０μＬの新たに煮沸した一本鎖キャリアＤＮＡ、７．２μＬの５Ｍ ＤＴＴ（Ｍｅｌｆｏｒｄ、ＵＫ）、２μＬのプラスミド及び最後に６９．５μＬの滅菌ミリＱ水を含む反応混合物を用いて行った。全ての溶液及び緩衝液は、使用前にオートクレーブで滅菌した。
反応混合物を組み立てた後、混合物を形質転換ごとに少なくとも１分間、最大速度で十分にボルテックス撹拌し、室温で２０分間インキュベートし、次いで＋４２℃で更に２０分間ヒートショックを与えた。この後、反応混合物を２０００ｒ．ｃ．ｆ．で２分間ゆっくりと遠心分離してペレットとし、２００μＬの滅菌脱イオン水に穏やかに再懸濁し、予め乾燥させたドロップアウトプレートにプレーティングした。プレートを密封し、＋３０℃で４日間インキュベートした後、コロニーが出現した。
新たに作製したプラスミドのＳ．セレビシエ宿主への導入は、ＢＹ４７４１の一晩培養と予め乾燥させたウラシルドロップアウトプレート（Ｋａｉｓｅｒ ｍｉｎｉｍａｌ ｄｒｏｐ－ｏｕｔ ｍｅｄｉａ、Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ、ＵＫ）を用いて行った。反応を行う前に、１ｍｇ／ｍＬの一本鎖ＤＮＡ（Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ Ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＫ）１ｍＬを＋９５℃で１０分煮沸した後、すぐに氷上に置いた。トランスフォーメーションは、２４０μＬの５０％ｗ／ｖポリエチレングリコール（ＰＥＧ4000、Ｍｅｌｆｏｒｄ、ＵＫ）、３６μＬの１Ｍ酢酸リチウム（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＫ）、１０μＬの新たに煮沸した一本鎖キャリアＤＮＡ、７．２μＬの５Ｍ ＤＴＴ（Ｍｅｌｆｏｒｄ、ＵＫ）、２μＬのプラスミド及び最後に６９．５μＬの滅菌ミリＱ水を含む反応混合物を用いて行った。全ての溶液及び緩衝液は、使用前にオートクレーブで滅菌した。
反応混合物を組み立てた後、混合物を形質転換ごとに少なくとも１分間、最大速度で十分にボルテックス撹拌し、室温で２０分間インキュベートし、次いで＋４２℃で更に２０分間ヒートショックを与えた。この後、反応混合物を２０００ｒ．ｃ．ｆ．で２分間ゆっくりと遠心分離してペレットとし、２００μＬの滅菌脱イオン水に穏やかに再懸濁し、予め乾燥させたドロップアウトプレートにプレーティングした。プレートを密封し、＋３０℃で４日間インキュベートした後、コロニーが出現した。
【0049】
高分解能増殖率分析
酵母株を１０ｍＬの規定の合成カイザードロップアウト培地（ウラシルドロップアウト、Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ）中、＋３０℃、１７５ｒ．ｐ．ｍ．で一晩（少なくとも１６時間）インキュベートした。インキュベーション後、各培養物の密度を分光法（ＳｐｅｃｔｒｏＳｔａｒ Ｎａｎｏ、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、ＵＫ）により、１ｍＬキュベット（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、ＵＫ）中の６００ナノメートル（ＯＤ600nm）の光学密度で定量した。次に、培養物をＯＴ－２液体ハンドリングロボット（Ｏｐｅｎｔｒｏｎｓ、ＵＳＡ）に装填し、滅菌平底９６ウェルプレート（３６０μＬウェル容量、Ｇｒｅｉｎｅｒ ＣＥＬＬＳＴＡＲ（登録商標）９６ウェルプレート、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＵＫ）で光学密度（ＯＤ600nm）が０．１になるまで希釈し直した。その後、各株の増殖を飽和するまで継続的にモニターし、その時点で実験を終了し、データを収集した。
酵母株を１０ｍＬの規定の合成カイザードロップアウト培地（ウラシルドロップアウト、Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ）中、＋３０℃、１７５ｒ．ｐ．ｍ．で一晩（少なくとも１６時間）インキュベートした。インキュベーション後、各培養物の密度を分光法（ＳｐｅｃｔｒｏＳｔａｒ Ｎａｎｏ、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、ＵＫ）により、１ｍＬキュベット（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、ＵＫ）中の６００ナノメートル（ＯＤ600nm）の光学密度で定量した。次に、培養物をＯＴ－２液体ハンドリングロボット（Ｏｐｅｎｔｒｏｎｓ、ＵＳＡ）に装填し、滅菌平底９６ウェルプレート（３６０μＬウェル容量、Ｇｒｅｉｎｅｒ ＣＥＬＬＳＴＡＲ（登録商標）９６ウェルプレート、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＵＫ）で光学密度（ＯＤ600nm）が０．１になるまで希釈し直した。その後、各株の増殖を飽和するまで継続的にモニターし、その時点で実験を終了し、データを収集した。
【0050】
バッチ発酵
発酵は、規定の合成ウラシルドロップアウト培地（Ｋａｉｓｅｒ、Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ、ＵＫ）で一晩増殖させた組換え酵母の培養物を用いて行った。通常、アミノ酸を含まないＹｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ（Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ、ＵＫ）０．６７ｇ、関連アミノ酸サプリメント０．１９ｇ、及び無水Ｄ－グルコース（Ｍｅｌｆｏｒｄ、ＵＫ）２ｇからなる１００ｍＬの実施容量（総容量２５０ｍＬ）を使用した。反応器（ＭｉｎｉＢｉｏ総容量２５０ｍＬ、Ａｐｐｌｉｋｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＮＬ）を組み立て、その内容物は、Ｐｒｅｓｔｉｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｌａｓｓｉｃオートクレーブ（＋１２１℃、１０４ｋＰａ、３０分）で滅菌した。この後、反応器をＭｉｎｉＢｉｏ発酵コントロールシステム（Ａｐｐｌｉｋｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＮＬ）に接続し、チューブ（アルカリ、空気）を接続し、プローブ（ｐＨ及び溶存酸素）を室温で一晩放置して分極させた。このステップは、無菌対照としても用いた。
酵母の一晩培養物（５ｍＬ）を適切なドロップアウト培地で調製し、上記のように１７５ｒ．ｐ．ｍ．、＋３０℃で１６時間インキュベートした。一方、プローブは次のように較正した：溶存酸素（ＤＯ2）は、未接種培地の１００％ＤＯ2（＋３０℃で約７０ｎＡ）を読み取るように較正した。ｐＨは、ｐＨ４．０及びｐＨ７．０の標準液（２０ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）で較正した。翌朝、菌株をＯＤ600nmが０．２になるまで継代培養し（５ｍＬ）、１７５ ｒ．ｐ．ｍ．、＋３０℃で４時間、再びインキュベートした。この時間が経過した後、バイオリアクターに予め計算した接種量（ｍＬ）を０．１（ＯＤ600nm）となるように接種し、Ｌｕｃｕｌｌｕｓ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＳｅｃｕｒｅＣｅｌｌ、ＣＨ）を用いて発酵を監視した。設定値は、３５％ＤＯ2±５％、ｐＨ５．０±０．５及び圧縮空気（Ｂａｍｂｉ ＰＴ５ ＵＫ）で１ｖｖｍのスパージングとした。通常、全発酵時間は２０時間であった。
発酵は、規定の合成ウラシルドロップアウト培地（Ｋａｉｓｅｒ、Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ、ＵＫ）で一晩増殖させた組換え酵母の培養物を用いて行った。通常、アミノ酸を含まないＹｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ（Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ、ＵＫ）０．６７ｇ、関連アミノ酸サプリメント０．１９ｇ、及び無水Ｄ－グルコース（Ｍｅｌｆｏｒｄ、ＵＫ）２ｇからなる１００ｍＬの実施容量（総容量２５０ｍＬ）を使用した。反応器（ＭｉｎｉＢｉｏ総容量２５０ｍＬ、Ａｐｐｌｉｋｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＮＬ）を組み立て、その内容物は、Ｐｒｅｓｔｉｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｌａｓｓｉｃオートクレーブ（＋１２１℃、１０４ｋＰａ、３０分）で滅菌した。この後、反応器をＭｉｎｉＢｉｏ発酵コントロールシステム（Ａｐｐｌｉｋｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＮＬ）に接続し、チューブ（アルカリ、空気）を接続し、プローブ（ｐＨ及び溶存酸素）を室温で一晩放置して分極させた。このステップは、無菌対照としても用いた。
酵母の一晩培養物（５ｍＬ）を適切なドロップアウト培地で調製し、上記のように１７５ｒ．ｐ．ｍ．、＋３０℃で１６時間インキュベートした。一方、プローブは次のように較正した：溶存酸素（ＤＯ2）は、未接種培地の１００％ＤＯ2（＋３０℃で約７０ｎＡ）を読み取るように較正した。ｐＨは、ｐＨ４．０及びｐＨ７．０の標準液（２０ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）で較正した。翌朝、菌株をＯＤ600nmが０．２になるまで継代培養し（５ｍＬ）、１７５ ｒ．ｐ．ｍ．、＋３０℃で４時間、再びインキュベートした。この時間が経過した後、バイオリアクターに予め計算した接種量（ｍＬ）を０．１（ＯＤ600nm）となるように接種し、Ｌｕｃｕｌｌｕｓ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＳｅｃｕｒｅＣｅｌｌ、ＣＨ）を用いて発酵を監視した。設定値は、３５％ＤＯ2±５％、ｐＨ５．０±０．５及び圧縮空気（Ｂａｍｂｉ ＰＴ５ ＵＫ）で１ｖｖｍのスパージングとした。通常、全発酵時間は２０時間であった。
【0051】
下流処理
発酵後、全サンプル（約１２０ｍＬ、ＯＤ600nmは株によって約３５～５５）を抽出し、２本の５０ｍＬファルコンチューブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＵＫ）にデカントした。次に、１５ｍＬの培養液を１５，５００ｒ．ｃ．ｆ．で１０分間遠心分離してペレットとし、秤量し（湿細胞質量ｇ／Ｌ）、次いで製造者の説明書に従って、Ｙｅａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＹＰＥＲ、Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＫ）に溶解した。
化学的細胞溶解（タンパク質抽出）
サンプルの溶解は、上記の「下流処理」の説明と同様に行った。細胞ペレットを適切な量のＹＰＥＲ（製造者の説明書に従う）に入れ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｔａｂｌｅｔｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＫ）を用いて１８００ｒ．ｐ．ｍ．（Ｓｔｕａｒｔ Ｖｏｒｔｅｘ、ＵＫ）で２０分間室温で撹拌した。その後、サンプルを遠心分離して不溶性の残渣を取り除くことで清澄化し、更なる分析のために上清を清浄な１．５ｍＬエッペンドルフチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ＵＫ）に吸引した。
発酵後、全サンプル（約１２０ｍＬ、ＯＤ600nmは株によって約３５～５５）を抽出し、２本の５０ｍＬファルコンチューブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＵＫ）にデカントした。次に、１５ｍＬの培養液を１５，５００ｒ．ｃ．ｆ．で１０分間遠心分離してペレットとし、秤量し（湿細胞質量ｇ／Ｌ）、次いで製造者の説明書に従って、Ｙｅａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＹＰＥＲ、Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＫ）に溶解した。
化学的細胞溶解（タンパク質抽出）
サンプルの溶解は、上記の「下流処理」の説明と同様に行った。細胞ペレットを適切な量のＹＰＥＲ（製造者の説明書に従う）に入れ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｔａｂｌｅｔｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＫ）を用いて１８００ｒ．ｐ．ｍ．（Ｓｔｕａｒｔ Ｖｏｒｔｅｘ、ＵＫ）で２０分間室温で撹拌した。その後、サンプルを遠心分離して不溶性の残渣を取り除くことで清澄化し、更なる分析のために上清を清浄な１．５ｍＬエッペンドルフチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ＵＫ）に吸引した。
【0052】
アフィニティー精製
固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を行い、６０ｋＤａの融合タンパク質の発現を確認した。Ｂｏｌ３及びＬｉｐ５ポリペプチドの個々の分子量は、それぞれ１３及び４６ｋＤａである（出典、Saccharomyces Genome database, yeastgenome.org）。精製のために、１ｍＬのＨｉｓＰｕｒ Ｎｉｃｋｅｌクロマトグラフィー樹脂（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）を空のＰＤ－１０（１０ｍＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＫ）カラムに分注し、１カラム容量の変性結合バッファー（８Ｍ尿素、１０ｍＭイミダゾール、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１．８ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、２０％ｖ／ｖグリセロール ｐＨ７．４）で平衡化した。これに、「化学的細胞溶解（タンパク質抽出）」で調製したサンプルをピペットで注意深く添加し、重力で流出させた。通過液を回収し、更なる分析のために「ＲＴ」と表示した。洗浄は、（８Ｍ尿素、５０ｍＭイミダゾール、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１．８ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、２０％ｖ／ｖグリセロール、ｐＨ７．４）を用いて行った。タンパク質を溶出バッファーＢ（８Ｍ尿素、５０ｍＭイミダゾール、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１．８ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、２０％ｖ／ｖグリセロール、ｐＨ７．４）を用いて溶出し、１５×１ｍＬ画分（１．５ｍＬエッペンドルフチューブ）に回収した。全てのサンプルは精製の間、氷上で維持した。ＬＶｉｓプレート（ＢＭＧ、ＵＫ）を用いた２８０ｎｍでのＵＶ／Ｖｉｓ分光法（ＳＰＥＣＴＲＯｓｔａｒ Ｎａｎｏ、英国）を使用してタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）を定量した。
固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を行い、６０ｋＤａの融合タンパク質の発現を確認した。Ｂｏｌ３及びＬｉｐ５ポリペプチドの個々の分子量は、それぞれ１３及び４６ｋＤａである（出典、Saccharomyces Genome database, yeastgenome.org）。精製のために、１ｍＬのＨｉｓＰｕｒ Ｎｉｃｋｅｌクロマトグラフィー樹脂（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）を空のＰＤ－１０（１０ｍＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＫ）カラムに分注し、１カラム容量の変性結合バッファー（８Ｍ尿素、１０ｍＭイミダゾール、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１．８ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、２０％ｖ／ｖグリセロール ｐＨ７．４）で平衡化した。これに、「化学的細胞溶解（タンパク質抽出）」で調製したサンプルをピペットで注意深く添加し、重力で流出させた。通過液を回収し、更なる分析のために「ＲＴ」と表示した。洗浄は、（８Ｍ尿素、５０ｍＭイミダゾール、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１．８ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、２０％ｖ／ｖグリセロール、ｐＨ７．４）を用いて行った。タンパク質を溶出バッファーＢ（８Ｍ尿素、５０ｍＭイミダゾール、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１．８ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、２０％ｖ／ｖグリセロール、ｐＨ７．４）を用いて溶出し、１５×１ｍＬ画分（１．５ｍＬエッペンドルフチューブ）に回収した。全てのサンプルは精製の間、氷上で維持した。ＬＶｉｓプレート（ＢＭＧ、ＵＫ）を用いた２８０ｎｍでのＵＶ／Ｖｉｓ分光法（ＳＰＥＣＴＲＯｓｔａｒ Ｎａｎｏ、英国）を使用してタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）を定量した。
【0053】
ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）による組換えタンパク質の検出
上記のアフィニティー精製ステップからの画分を、１００Ｖで１０分間及び１８０Ｖ、２００ｍＡで５０分間のドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって分析した。ポリアクリルアミドゲルは、Ｌａｅｍｍｌｉスタック法に従い、１０％ｖ／ｖ分離ゲル（Ｓｕｒｅｃａｓｔ、Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇバッファー ｐＨ８．８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ＵＫ）及び４％ｖ／ｖスタッキングゲル（Ｓｕｒｅｃａｓｔ Ｓｔａｃｋｉｎｇバッファー、ｐＨ６．８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ＵＫ）を用いて調製し、重合は５０μＬの１０％ｗ／ｖ過硫酸アンモニウム（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）及び５μＬの１００％ｖ／ｖテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ、Ｍｅｌｆｏｒｄ、ＵＫ）で誘導した。
サンプルを４×Ｌａｅｍｍｌｉ還元バッファー中で変性させ、最終容量２０μＬで実施濃度（１×）に希釈し、サーモサイクラー（Ｐｒｉｍｅ３、Ｔｅｃｈｎｅ、ＵＫ）で５分間＋１００℃に加熱した。サンプル当たり２０μＬの希釈（１：２０）サンプルを、５μＬのＰａｇｅＲｕｌｅｒプレステイン分子量マーカー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＵＫ）と一緒にウェルに添加した。泳動後、ゲルを除去し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅタンパク質染色液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）を用い、製造者の説明書に従って染色した。染色後、白色光透過照明（ｐｒｏＢＬＵＥ Ｖｉｅｗ、Ｃｌｅａｖｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてゲルを記録した。
上記のアフィニティー精製ステップからの画分を、１００Ｖで１０分間及び１８０Ｖ、２００ｍＡで５０分間のドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって分析した。ポリアクリルアミドゲルは、Ｌａｅｍｍｌｉスタック法に従い、１０％ｖ／ｖ分離ゲル（Ｓｕｒｅｃａｓｔ、Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇバッファー ｐＨ８．８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ＵＫ）及び４％ｖ／ｖスタッキングゲル（Ｓｕｒｅｃａｓｔ Ｓｔａｃｋｉｎｇバッファー、ｐＨ６．８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ＵＫ）を用いて調製し、重合は５０μＬの１０％ｗ／ｖ過硫酸アンモニウム（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）及び５μＬの１００％ｖ／ｖテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ、Ｍｅｌｆｏｒｄ、ＵＫ）で誘導した。
サンプルを４×Ｌａｅｍｍｌｉ還元バッファー中で変性させ、最終容量２０μＬで実施濃度（１×）に希釈し、サーモサイクラー（Ｐｒｉｍｅ３、Ｔｅｃｈｎｅ、ＵＫ）で５分間＋１００℃に加熱した。サンプル当たり２０μＬの希釈（１：２０）サンプルを、５μＬのＰａｇｅＲｕｌｅｒプレステイン分子量マーカー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＵＫ）と一緒にウェルに添加した。泳動後、ゲルを除去し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅタンパク質染色液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）を用い、製造者の説明書に従って染色した。染色後、白色光透過照明（ｐｒｏＢＬＵＥ Ｖｉｅｗ、Ｃｌｅａｖｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてゲルを記録した。
【0054】
ポリヒスチジンタグ付きポリペプチドの競合ラテラルフローアッセイ
Ｐｒｏ－Ｄｅｔｅｃｔ（商標）Ｒａｐｉｄ Ｈｉｓ競合アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＫ）を用い、製造者の説明書に従って組換えポリヒスチジンタグ付きポリペプチドの発現を確認した。
データ解析
データ解析分析及びグラフ化は通常、ＲＳｔｕｄｉｏ（ＲＳｔｕｄｉｏ、Ｖ４．０．０１）で行い、その後、Ａｄｏｂｅ ＩｌｌｕｓｔｒａｔｏｒＣＣ（２０２０）で可視化した。
増殖率は、https://cran.rproject.org/web/packages/growthcurver/vignettes/Growthcurver-vignette.htmlで利用できる「ＧｒｏｗｔｈＣｕｒｖｅｒ」スクリプトを用いて計算した。通常、グラフィックデザインにはhttps://ggplot2.tidyverse.org/で利用可能なグラフィクスの文法（ｇｇｐｌｏｔ２）を使用した。
発酵データは、Ｌｕｃｕｌｌｕｓ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ソフトウエア（Ａｐｐｌｉｋｏｎ、Ｇｅｔｉｎｇｅ、ＮＬ ａｎｄ ＳｅｃｕｒｅＣｅｌｌ、ＣＨ）を用いて記録し、可視化した。
Ｐｒｏ－Ｄｅｔｅｃｔ（商標）Ｒａｐｉｄ Ｈｉｓ競合アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＫ）を用い、製造者の説明書に従って組換えポリヒスチジンタグ付きポリペプチドの発現を確認した。
データ解析
データ解析分析及びグラフ化は通常、ＲＳｔｕｄｉｏ（ＲＳｔｕｄｉｏ、Ｖ４．０．０１）で行い、その後、Ａｄｏｂｅ ＩｌｌｕｓｔｒａｔｏｒＣＣ（２０２０）で可視化した。
増殖率は、https://cran.rproject.org/web/packages/growthcurver/vignettes/Growthcurver-vignette.htmlで利用できる「ＧｒｏｗｔｈＣｕｒｖｅｒ」スクリプトを用いて計算した。通常、グラフィックデザインにはhttps://ggplot2.tidyverse.org/で利用可能なグラフィクスの文法（ｇｇｐｌｏｔ２）を使用した。
発酵データは、Ｌｕｃｕｌｌｕｓ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ソフトウエア（Ａｐｐｌｉｋｏｎ、Ｇｅｔｉｎｇｅ、ＮＬ ａｎｄ ＳｅｃｕｒｅＣｅｌｌ、ＣＨ）を用いて記録し、可視化した。
【0055】
結果
実施例１：組換えＢｏｌ３－Ｌｉｐ５キメラのエピソーム発現
オーバーラップ伸長ＰＣＲを用いて、ｂｏｌ３とｌｉｐ５の２つのオープンリーディングフレームを、それぞれｂｏｌ３とｌｉｐ５の天然停止コドンと開始コドンを欠く、単一の融合オープンリーディングフレームに融合させ（図１Ｂ）、単一の融合転写産物とした。増幅すると、最終的なキメラアンプリコンはおおよその分子量１６３２ｂｐｓに移動した。これはｂｏｌ３とｌｉｐ５の両方を合わせた場合に予想される質量と一致していた（図１Ａ）。
次に、アンプリコンのゲルを切り出し、消化し、セントロメア酵母発現構築物に連結した後、製造者（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＫ）の説明書に従って化学コンピテントＤＨ５α大腸菌に形質転換した。得られた構築物（図２）を次に、１００ｍＭのＤＴＴを用い、改変ＬｉＡＣ／ＰＥＧ法(Gietz, et al., 2002 Methods in Enzymology, Volume 350, 87-96頁)に従ってサッカロミセス・セレビシエ（ＢＹ４７４１）に形質転換した。両ＯＲＦを連結する働きをするポリヒスチジンモチーフが存在するために、ニッケルカラムクロマトグラフィーにより酵母溶解液から融合ポリペプチドを精製することが可能であった。これにより、Ｂｏｌ３（１３ｋＤａ）及びＬｉｐ５（４６ｋＤａ）の両方のポリペプチドを合わせた分子量と一致する約６０ｋＤａのおおよその分子量に分離した単一のポリペプチドが得られた（図４）。
実施例１：組換えＢｏｌ３－Ｌｉｐ５キメラのエピソーム発現
オーバーラップ伸長ＰＣＲを用いて、ｂｏｌ３とｌｉｐ５の２つのオープンリーディングフレームを、それぞれｂｏｌ３とｌｉｐ５の天然停止コドンと開始コドンを欠く、単一の融合オープンリーディングフレームに融合させ（図１Ｂ）、単一の融合転写産物とした。増幅すると、最終的なキメラアンプリコンはおおよその分子量１６３２ｂｐｓに移動した。これはｂｏｌ３とｌｉｐ５の両方を合わせた場合に予想される質量と一致していた（図１Ａ）。
次に、アンプリコンのゲルを切り出し、消化し、セントロメア酵母発現構築物に連結した後、製造者（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＫ）の説明書に従って化学コンピテントＤＨ５α大腸菌に形質転換した。得られた構築物（図２）を次に、１００ｍＭのＤＴＴを用い、改変ＬｉＡＣ／ＰＥＧ法(Gietz, et al., 2002 Methods in Enzymology, Volume 350, 87-96頁)に従ってサッカロミセス・セレビシエ（ＢＹ４７４１）に形質転換した。両ＯＲＦを連結する働きをするポリヒスチジンモチーフが存在するために、ニッケルカラムクロマトグラフィーにより酵母溶解液から融合ポリペプチドを精製することが可能であった。これにより、Ｂｏｌ３（１３ｋＤａ）及びＬｉｐ５（４６ｋＤａ）の両方のポリペプチドを合わせた分子量と一致する約６０ｋＤａのおおよその分子量に分離した単一のポリペプチドが得られた（図４）。
【0056】
キメラタンパク質の発現は酵母の増殖率に悪影響を及ぼさず、環境刺激からの圧力を緩和する助けをする
高分解能増殖率分析は、新たに作出したキメラ発現酵母株の細胞の適応力は対照と統計学的に区別できない（ＣＩ＝９５％）ことを示した（図３）。これらのデータは、このキメラが酵母系で十分に忍容されていることを示唆する。
準致死的～致死的な酸化条件下（過酸化水素）で更に実験を行ったところ、キメラ発現は１０ｍＭの過酸化物濃度まで十分な程度の保護を与えることが示された（図５）。重要なことに、この所見はキメラ発現酵母に特有のものであった。
これに反して、還元状態での実験では、キメラの発現は対照に比べて、ジスルフィド結合破壊剤であるジチオトレイトール（ＤＴＴ）に対する感受性が高いことが示された（図６）。
高分解能増殖率分析は、新たに作出したキメラ発現酵母株の細胞の適応力は対照と統計学的に区別できない（ＣＩ＝９５％）ことを示した（図３）。これらのデータは、このキメラが酵母系で十分に忍容されていることを示唆する。
準致死的～致死的な酸化条件下（過酸化水素）で更に実験を行ったところ、キメラ発現は１０ｍＭの過酸化物濃度まで十分な程度の保護を与えることが示された（図５）。重要なことに、この所見はキメラ発現酵母に特有のものであった。
これに反して、還元状態での実験では、キメラの発現は対照に比べて、ジスルフィド結合破壊剤であるジチオトレイトール（ＤＴＴ）に対する感受性が高いことが示された（図６）。
【0057】
実施例２：組換え毒素由来ペプチドＥＶＡの発現
合成ポリペプチド「ＥＶＡ」（配列番号１８）は、生理活性唾液ペプチドのダニ「エバシン」ファミリーの分泌タンパク質に由来する（図８）(Hayward et al., 2017 前掲)。宿主生物（Amblyomma cajennense、「ケイジャンダニ」を含む）内で、エバシンは唾液腺から分泌され、寄生虫を排除するために宿主が放出するＣＸＸＣ及びＣＸＣケモカイン及びサイトカインを標的として隔離することにより、寄生虫の生存を促進する(Denisov et al., 2019, Journal of Biological Chemistry, 294(33), 12370-12379)。これらの分子を隔離することで、ダニは宿主の防御（免疫細胞の走化性）を効果的に弱め、ひいては、摂食と寄生のライフサイクルを長期化する(Denisov et al., 2019, 前掲)。最近、このメカニズムは、ウイルスと他の病態の両方に関連する、そうでなければ致命的な「サイトカインストーム」を治療（沈静化）するための潜在的治療薬として注目されている(Darlot et al., 2020, The Journal of Biological Chemistry, 295(32), 10926-10939)。
図７Ａに示すように、酵母培養物が組換えＥＶＡ遺伝子（配列番号１９）を保有していることを決定した後、ニッケルクロマトグラフィー及びＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いてタンパク質発現を確認した。この結果を図７Ｂに示し、ＥＶＡの予測分子量（約３０ｋＤａ）にほぼ相当する濃いバンドが分離されたことを示す。抗体に基づくアッセイを用いて、ポリヒスチジンタグ付きポリペプチドが画分内に存在することを確認した（図１１）。
合成ポリペプチド「ＥＶＡ」（配列番号１８）は、生理活性唾液ペプチドのダニ「エバシン」ファミリーの分泌タンパク質に由来する（図８）(Hayward et al., 2017 前掲)。宿主生物（Amblyomma cajennense、「ケイジャンダニ」を含む）内で、エバシンは唾液腺から分泌され、寄生虫を排除するために宿主が放出するＣＸＸＣ及びＣＸＣケモカイン及びサイトカインを標的として隔離することにより、寄生虫の生存を促進する(Denisov et al., 2019, Journal of Biological Chemistry, 294(33), 12370-12379)。これらの分子を隔離することで、ダニは宿主の防御（免疫細胞の走化性）を効果的に弱め、ひいては、摂食と寄生のライフサイクルを長期化する(Denisov et al., 2019, 前掲)。最近、このメカニズムは、ウイルスと他の病態の両方に関連する、そうでなければ致命的な「サイトカインストーム」を治療（沈静化）するための潜在的治療薬として注目されている(Darlot et al., 2020, The Journal of Biological Chemistry, 295(32), 10926-10939)。
図７Ａに示すように、酵母培養物が組換えＥＶＡ遺伝子（配列番号１９）を保有していることを決定した後、ニッケルクロマトグラフィー及びＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いてタンパク質発現を確認した。この結果を図７Ｂに示し、ＥＶＡの予測分子量（約３０ｋＤａ）にほぼ相当する濃いバンドが分離されたことを示す。抗体に基づくアッセイを用いて、ポリヒスチジンタグ付きポリペプチドが画分内に存在することを確認した（図１１）。
【0058】
実施例３：ＥＶＡ保有酵母は対照に比べて増殖率に著しい温度依存的低下を示す
摂氏＋３０及び＋３２度の両方で高分解能成長率分析を行ったところ、ＥＶＡの発現は、対照（野生型及びエンプティベクター）と比較して、増殖率に有意な低下（ｐ＜０．００１）をもたらすことが示された（図９）。これらのデータ（表２に要約）は、ＥＶＡの発現は、野生型及びエンプティベクター対照と比較して、相対増殖率にそれぞれおよそ６０及び４０％の低下をもたらすことを示した。これは、インキュベーション温度を＋３２℃まで上げると悪化し、直線性が示された。
摂氏＋３０及び＋３２度の両方で高分解能成長率分析を行ったところ、ＥＶＡの発現は、対照（野生型及びエンプティベクター）と比較して、増殖率に有意な低下（ｐ＜０．００１）をもたらすことが示された（図９）。これらのデータ（表２に要約）は、ＥＶＡの発現は、野生型及びエンプティベクター対照と比較して、相対増殖率にそれぞれおよそ６０及び４０％の低下をもたらすことを示した。これは、インキュベーション温度を＋３２℃まで上げると悪化し、直線性が示された。
【表2】
【0059】
実施例４：増強されたミトコンドリア抗酸化系によるＥＶＡ増殖率低下の救済
キメラとＥＶＡの共発現はＥＶＡ依存性の増殖率低下を有意に救済する
強力な抗酸化物質であり、ＰＤＨとａＫＤＨの両酵素のリポイル化を介した代謝の重要な調節因子であるので、リポ酸の過剰産生は、細胞内の酸化ストレスに対する抵抗性を高め得るという仮説を立てた。細胞増殖率は、様々な酸化条件下で、細胞の適応力の尺度として用いた（図５）。
上記に示したように、ダニポリペプチド類似体ＥＶＡの発現は、細胞の適応力（増殖率）に著しい（野生型の約６０％及び対照の４０％の）低下をもたらした。ＥＶＡ及びキメラタンパク質は、増強された抗酸化系が見られる表現型を救済する働きをする可能性があるという仮説をもって共発現された。
キメラとＥＶＡの共発現はＥＶＡ依存性の増殖率低下を有意に救済する
強力な抗酸化物質であり、ＰＤＨとａＫＤＨの両酵素のリポイル化を介した代謝の重要な調節因子であるので、リポ酸の過剰産生は、細胞内の酸化ストレスに対する抵抗性を高め得るという仮説を立てた。細胞増殖率は、様々な酸化条件下で、細胞の適応力の尺度として用いた（図５）。
上記に示したように、ダニポリペプチド類似体ＥＶＡの発現は、細胞の適応力（増殖率）に著しい（野生型の約６０％及び対照の４０％の）低下をもたらした。ＥＶＡ及びキメラタンパク質は、増強された抗酸化系が見られる表現型を救済する働きをする可能性があるという仮説をもって共発現された。
【0060】
表３は、増殖率救済実験の実験計画を詳細に示す。合計４つの独立した酵母株の増殖率を比較した。「エンプティ」プラスミドを保有する「対照」株は、組換えタンパク質が発現していない低コピー（セントロメア）プラスミドを維持することのバックグラウンド代謝効果を調べるために使用した。全ての酵母は同じ遺伝的バックグラウンドを持っていた。
【表3】
【0061】
【0062】
図９及び表４のデータは又、救済された場合、キメラ；＋ＥＶＡ培養物の増殖は対照（＋エンプティベクター、又は非ＥＶＡ発現）培養物に比べて統計学的に有意ではないことも示し、キメラの発現はそれだけで細胞野適応力の保存に十分であったことが示唆される。
これらの実験は又、キメラの発現がＥＶＡ発現酵母において温度依存的な増殖率の低下を逆転させることも示した。
これらの実験は又、キメラの発現がＥＶＡ発現酵母において温度依存的な増殖率の低下を逆転させることも示した。
【0063】
キメラ融合物と他の２つのＩＣＫ－ペプチド、プロトキシン－１及びプサルモトキシン－１との共発現はＥＶＡと同様の応答を惹起する
キメラ株が１つのＩＣＫポリペプチドの増殖を有意に救済できることがデータから示されたので、更に２つのＩＣＫ発現株が救済できるかどうかも調べた。毒ペプチドであるコモリグモAlopecosa marikovskyi由来の「プロトキシン」（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：ＴＸＰＲ１＿ＡＬＯＭＲ）（配列番号２０及び２１参照）とトリニダードシェブロンタランチュラPsalmopoeus cambridgei由来の毒ペプチド「プサルモトキシン－１」（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：ＴＸＰ１＿ＰＳＡＣＡ）（配列番号２２及び２３参照）の発現構築物を酵母培養物に形質転換し、それらの増殖率を上記のように監視した。両方のペプチドは、鎮痛剤又は抗マラリア剤としての治療的可能性が十分に記載されており、他のＩＣＫペプチドと共に、それぞれ４つ及び３つのジスルフィド結合を含んでいる。それぞれのペプチドの模式図を図１０に示す。両ポリペプチドの発現は抗体に基づくアッセイで確認された（図１１）。
キメラ株が１つのＩＣＫポリペプチドの増殖を有意に救済できることがデータから示されたので、更に２つのＩＣＫ発現株が救済できるかどうかも調べた。毒ペプチドであるコモリグモAlopecosa marikovskyi由来の「プロトキシン」（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：ＴＸＰＲ１＿ＡＬＯＭＲ）（配列番号２０及び２１参照）とトリニダードシェブロンタランチュラPsalmopoeus cambridgei由来の毒ペプチド「プサルモトキシン－１」（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：ＴＸＰ１＿ＰＳＡＣＡ）（配列番号２２及び２３参照）の発現構築物を酵母培養物に形質転換し、それらの増殖率を上記のように監視した。両方のペプチドは、鎮痛剤又は抗マラリア剤としての治療的可能性が十分に記載されており、他のＩＣＫペプチドと共に、それぞれ４つ及び３つのジスルフィド結合を含んでいる。それぞれのペプチドの模式図を図１０に示す。両ポリペプチドの発現は抗体に基づくアッセイで確認された（図１１）。
【0064】
合計４つの独立した酵母株の増殖率を比較した（表５参照）。「エンプティ」プラスミドを保有する「対照」株は、組換えタンパク質が発現していない低コピーの（セントロメア）プラスミドを維持することのバックグラウンド代謝効果を調べるために使用した。全ての酵母はＢＹ４７４１バックグラウンドを持っていた。
【表5】
【表6】
【0065】
上記の表６に示される（図１２でのグラフで示される）データは、ここでも、キメラ融合物の共発現がＩＣＫペプチドのいずれかを発現する細胞の増殖率を回復させるために十分であったことを示す。エバシン（ＥＶＡ）の発現に比べて、これらのデータセット内にはより大きな変動が示された。これは特にプサルモトキシン－１発現酵母（プサルモトキシン－１）の増殖に当てはまり、おそらく比較的複雑でない（ジスルフィドの点で）ポリペプチドに対する忍容性を反映している。
組み合わせて見ると（図１０及び１２）、各毒素ペプチドに存在するジスルフィド（Ｓ－Ｓ）の数（表６）は、酵母培養物がそれらの発現にどの程度応答（増殖率）するか（又はしないか）を推測するものであると思われる。この効果は、各ペプチドの分子量とは無関係のようである（表５）。ジスルフィドの数が多い場合（エバシン及びプロトキシン、４つ）は、少ない（プサルモトキシン、３つ）場合よりも増殖率に大きな低下がもたらされた。同様に、キメラ依存的な増殖率の救済もこの所見を反映しており、高分子量（２６ ｋＤａ）でジスルフィドの数が多い（４）と、より強い救済が見られた（図１０及び表６）。
組み合わせて見ると（図１０及び１２）、各毒素ペプチドに存在するジスルフィド（Ｓ－Ｓ）の数（表６）は、酵母培養物がそれらの発現にどの程度応答（増殖率）するか（又はしないか）を推測するものであると思われる。この効果は、各ペプチドの分子量とは無関係のようである（表５）。ジスルフィドの数が多い場合（エバシン及びプロトキシン、４つ）は、少ない（プサルモトキシン、３つ）場合よりも増殖率に大きな低下がもたらされた。同様に、キメラ依存的な増殖率の救済もこの所見を反映しており、高分子量（２６ ｋＤａ）でジスルフィドの数が多い（４）と、より強い救済が見られた（図１０及び表６）。
【0066】
次に、上記の増殖度の所見（すなわち、プロトキシンとエバシン）が商業的に適切なバッチ発酵システムに移行できるかどうかを確認するために、パイロットスケールの１００ｍＬ発酵を行った。これらのデータを図１３～１６に示す。４つの独立したバッチ発酵において、キメラの発現は、培養（光学）密度（ＯＤ600）と湿細胞質量の両方に関して、最終収量と同様に、より速い増殖指標（設定点ＤＯまでの時間）をもたらした。特に注目すべきは、これらのバッチ発酵が、図９及び図１２で得られた増殖測定と一致していること、すなわち、キメラ発現によって、酵母系内で高分子量エバシンがプロトキシン－１よりも良好に支持されることである。
ジスルフィドが豊富なＩＣＫを組換え発現させると、酸化的タンパク質フォールディング経路のフラックスが増大し、その結果、ラジカル種の産生が増加すると推測される。各ジスルフィド結合は、Ｅｒｏ１依存的なシステインチオールの酸化を介して、化学量論的量のラジカル酸素種を形成することから(Tyo et al., 2012, BMC Biology, 10.)、ＩＣＫペプチドの異種発現も又、酸化物質の産生の「増大」をもたらし、タンパク質フォールディング機構（ＵＰＲを含む）に大きな負担をかけ、その結果、蔵書率と最終産物収率に悲惨な結果をもたらす可能性もあるいう仮説を立てた。このことは、エバシン、プロトキシン－１及びプサルモトキシンの増殖率の違いによって証明されており、ジスルフィドの数が最も少ないペプチド（プサルモトキシン、ジスルフィドｎ＝３）は、エバシン又はプロトキシン－１（それぞれ４つのジスルフィド）よりも忍容性が高い（増殖率への影響が小さい）ようである。
ジスルフィドが豊富なＩＣＫを組換え発現させると、酸化的タンパク質フォールディング経路のフラックスが増大し、その結果、ラジカル種の産生が増加すると推測される。各ジスルフィド結合は、Ｅｒｏ１依存的なシステインチオールの酸化を介して、化学量論的量のラジカル酸素種を形成することから(Tyo et al., 2012, BMC Biology, 10.)、ＩＣＫペプチドの異種発現も又、酸化物質の産生の「増大」をもたらし、タンパク質フォールディング機構（ＵＰＲを含む）に大きな負担をかけ、その結果、蔵書率と最終産物収率に悲惨な結果をもたらす可能性もあるいう仮説を立てた。このことは、エバシン、プロトキシン－１及びプサルモトキシンの増殖率の違いによって証明されており、ジスルフィドの数が最も少ないペプチド（プサルモトキシン、ジスルフィドｎ＝３）は、エバシン又はプロトキシン－１（それぞれ４つのジスルフィド）よりも忍容性が高い（増殖率への影響が小さい）ようである。
【0067】
本発明者らは、キメラを介して重要な抗酸化経路の改変型を共発現させることで、ＩＣＫ発現酵母がもはや遅い増殖率を示さなくなり、それらの適応力が回復したように見えることを実証することができた。これは、キメラタンパク質の発現による間接的な抗酸化「緩衝」効果によるものであったことが示唆される。これには、ラジカルが主要な生体分子（核酸、脂質、タンパク質など）を傷害し、細胞の適応力を損なうのを防ぐことで、酵母宿主が組換えＩＣＫのフォールディング「コスト」に耐えられるようにする効果があると考えられる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】
【国際調査報告】