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特表2024-537266ＣＤＨ１７を検出するためのＴＩＢＴＥＣＨの方法及び組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-10
(54)【発明の名称】ＣＤＨ１７を検出するためのＴＩＢＴＥＣＨの方法及び組成物
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20241003BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20241003BHJP
G01N 33/577 20060101ALI20241003BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 D
G01N33/574 A
G01N33/53 Y
G01N33/577 B
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024521338
(86)(22)【出願日】2022-10-08
(85)【翻訳文提出日】2024-05-30
(86)【国際出願番号】 US2022077828
(87)【国際公開番号】W WO2023060278
(87)【国際公開日】2023-04-13
(31)【優先権主張番号】63/253,609
(32)【優先日】2021-10-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524132025
【氏名又は名称】ティベリアス テクノロジー （エイチケー） リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001139
【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人
(74)【代理人】
【識別番号】100130328
【弁理士】
【氏名又は名称】奥野 彰彦
(74)【代理人】
【識別番号】100130672
【弁理士】
【氏名又は名称】伊藤 寛之
(72)【発明者】
【氏名】ルク， ジョン ムーンチン
(72)【発明者】
【氏名】サン， ステラ
(72)【発明者】
【氏名】レオン， プイ リン
(57)【要約】
対象からのサンプル中のＣＤＨ１７タンパク質の量を検出するための方法であって、前記サンプルを少なくとも９８℃の温度でバッファーと接触させて処理済サンプルを提供するステップと、ＣＤＨ１７に対して結合親和性を有する前記処理済サンプルを捕捉抗体と接触させ、前記処理済サンプルにおける任意の露出したＣＤＨ１７発現エピトープは、前記捕捉抗体に結合して結合サンプルを提供するように構成されるステップと、前記結合サンプルを検出分子と接触して検出サンプルを提供し、前記検出分子は、前記捕捉抗体に対して結合親和性を有する二次抗体に結合した生体適合性酵素を含むステップと、前記検出サンプルを３，３'－ジアミノベンジジン色原体と反応させて酸化基質を提供するステップと、前記酸化基質の量に基づいて前記サンプル中のＣＤＨ１７タンパク質の量を決定するステップと、を含む、方法。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象からのサンプル中のＣＤＨ１７タンパク質の量を検出するための方法であって、前記サンプルを少なくとも９８℃の温度でバッファーと接触させて処理済サンプルを提供するステップと、
ＣＤＨ１７に対して結合親和性を有する前記処理済サンプルを捕捉抗体と接触させ、前記処理済サンプルにおける任意の露出したＣＤＨ１７発現エピトープは、前記捕捉抗体に結合して結合サンプルを提供するように構成されるステップと、
前記結合サンプルを検出分子と接触して検出サンプルを提供し、前記検出分子は、前記捕捉抗体に対して結合親和性を有する二次抗体に結合した生体適合性酵素を含むステップと、
前記検出サンプルを３，３'－ジアミノベンジジン色原体と反応させて酸化基質を提供するステップと、
前記酸化基質の量に基づいて前記サンプル中のＣＤＨ１７タンパク質の量を決定するステップと、
を含む、方法。
【請求項2】
前記サンプル中のＣＤＨ１７発現をスコアリングし、データベースのレポートを生成するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記サンプル中のＣＤＨ１７タンパク質発現を定量化するステップをさらに含み、ここで、異なる細胞強度をスコアリングし、合わせて代表的な数値を与える、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記結合サンプルを検出分子と接触するステップは、周囲温度及び湿度が制御される自動染色装置において前記結合サンプルを前記検出分子と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記サンプル中のＣＤＨ１７タンパク質の量を決定するステップは、デジタルパソロジーシステムを用いて酸化基質の量に基づいてサンプル中のＣＤＨ１７タンパク質の量を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記捕捉抗体は、配列番号１、２、３、４、５、６、７又は８と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記捕捉抗体は、配列番号９、１０、１１を有する３つの重鎖ＣＤＲ及び配列番号１２、１３、１４を有する３つの軽鎖ＣＤＲ、
配列番号１５、１６、１７を有する３つの重鎖ＣＤＲ及び配列番号１８、１９、２０を有する３つの軽鎖ＣＤＲ、
配列番号２１、２２、２３を有する３つの重鎖ＣＤＲ及び配列番号２４、２５、２６を有する３つの軽鎖ＣＤＲ、又は
配列番号２７、２８、２９を有する３つの重鎖ＣＤＲ及び配列番号３０、３１、３２を有する３つの軽鎖ＣＤＲ
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記サンプルは、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）又は凍結された消化器がん組織を含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）に基づいて２０２１年１０月８日に提出された米国仮出願第６３／２５３，６０９の利益を主張し、その全開示は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）に基づいて２０２１年１０月８日に提出された米国仮出願第６３／２５３，６０９の利益を主張し、その全開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、がん検出に使用される方法に関する。特に、本発明は、ヒト組織検体（例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織サンプル、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）及び凍結切片）中のＣＤＨ１７発現を検出するための自動化、標準化及びハイスループットの免疫組織化学（ＩＨＣ）法に関する。
【背景技術】
【0003】
本明細書に別段の指示がない限り、このセクションに記載される材料は、本出願の特許請求の範囲に対する先行技術ではなく、このセクションに含めることによって先行技術であるとは認められない。
【0004】
消化器（ＧＩ、即ち、食道、胃、肝臓、胆管／胆嚢、小腸、膵臓、結腸直腸）がんは、世界中でがんによる死亡の主な原因となっている。２０１８年のがんによる新規症例数は４８０万人、がんによる死亡者数は３４０万人と推定されている［１］。食道、胃、膵臓、肝臓は、すべての原発がんの種類の中で予後が最も悪かった上位５のＧＩがんである［２］。
【0005】
原発不明の腺がんは、最も一般的な臨床問題の１つである。異なる場所からの転移性腺がんは、顕微鏡外観が同じであるので、原発部位の特定が困難になるためである。サイトケラチン７、サイトケラチン２０、甲状腺転写因子１、ＣＤＸ２、前立腺特異抗原、メソテリンなどの免疫組織化学的マーカーは、ＧＩがん診断の組織学的マーカーとして一般的に使用されている。しかし、これらのマーカーの特異性が低いため、消化器系の腺がんに対する高感度でより信頼性の高い診断マーカーが緊急に必要とされている［３，４］。
【0006】
カドヘリン１７（ＣＤＨ１７又はＣＡ１７）は、胃がん、肝臓がん、及び大腸がん（colorectal cancers）における過剰発現を特徴とするＧＩがんのバイオマーカーである［３，５，６］。ＣＤＨ１７は、診断、悪性腫瘍の病期分類、予後診断に有用な免疫組織化学マーカーであることが報告されている［３，５，６］。さらに、ＣＤＨ１７は転移性がんで高度に発現しており、ＣＤＨ１７の発現と機能を阻害することにより、肝細胞がん（ＨＣＣ）の肺転移を著しく減少させることができる［７］。ＣＤＨ１７は有効な消化器がん診断バイオマーカーとして機能するが、より高い検査感度と特異性で大規模なスクリーニングアプローチにＣＤＨ１７を適用するには、ＣＤＨ１７の検出戦略の改善が不可欠である。
【0007】
ＣＤＨ１７は、がんの進行に関与しており、予後不良と関連していることが示されている。ＣＤＨ１７は、ＣＲＣ、ＧＥ、ＰＤＡＣなどのＧＩがんにおいてデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）発現又は異常な高レベルで過剰発現する［８］ため、組織サンプル中のＣＤＨ１７発現量の決定は、診断、組織起源の鑑別、悪性腫瘍のモニタリング、疾患の予後診断に有用なマーカーとなる可能性がある。
【0008】
ＧＩがんの治療は従来の細胞傷害性療法に大きく依存し続けているが、二重特異性ＴＲＡＩＬＲ２／ＣＤＨ１７抗体（ＢＩ９０５７１１）［９］や二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーＣＤＨ１７／ＣＤ３（ＡＲＢ２０２）などの現在フェーズＩ／ＩＩ期で開発中の標的薬剤は増えている［１０］。これらの治療法では、最も効果が得られる適切な集団を定義するためにコンパニオン診断検査が必要である。ＣＤＨ１７バイオマーカーと開発された自動ＩＨＣアッセイは、治療に適格な集団を選択するための情報を治療医に提供するために使用することができる。臨床診断及び薬剤コンパニオン診断における免疫組織化学の需要の増大と、継続的な組織学スタッフ不足により、免疫組織化学の自動化の必要性が高まっている。
【発明の概要】
【0009】
以下の概要は例示のみを目的としており、いかなる形でも限定することを意図したものではない。上述の例示的な態様、実施形態、及び特徴に加えて、さらなる態様、実施形態、及び特徴は、図面及び以下の詳細な説明を参照することによって明らかになるであろう。
【0010】
一態様において、本発明は、対象からのサンプル中のＣＤＨ１７タンパク質を検出するための方法、薬剤及び組成物を提供する。
【0011】
一実施形態において、本発明は、対象からのサンプル中のＣＤＨ１７タンパク質の量を検出するための方法を提供する。一実施形態において、前記サンプルは、ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）又は凍結がん組織であり得る。一実施形態において、前記サンプルは、消化器組織であり得る。一実施形態において、前記サンプルは、前がん状態又はがんを有する疑いのある対象からのものであり得る。一実施形態において、前記サンプルは、がんに罹患している対象からのものであり得る。この方法は、がん又は前がん状態をさらに特徴付けるために使用することができ、したがって治療のガイドラインを提供することができる。
【0012】
一実施形態において、前記方法は、まず、前記サンプルを高温でバッファーと接触させて処理済サンプルを提供するステップを含む。一実施形態において、前記高温は、少なくとも８０℃、９０℃、９８℃、１００℃又は１１０℃であり得る。前記サンプルがＣＤＨ１７タンパク質を含む場合、このステップにより、ＣＤＨ１７発現エピトープが露出した処理済サンプルが提供される。
【0013】
前記方法は、また、前記処理済サンプルをＣＤＨ１７に対して結合親和性を有する捕捉抗体と接触させるステップを含む。前記処理済サンプルに存在する任意の露出したＣＤＨ１７発現エピトープは、前記捕捉抗体に結合して結合サンプルを提供するように構成される。一実施形態において、前記捕捉抗体は、配列番号１、２、３、４、５、６、７又は８と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。一実施形態において、前記捕捉抗体は、配列番号９、１０、１１を有する３つの重鎖ＣＤＲ及び配列番号１２、１３、１４を有する３つの軽鎖ＣＤＲを含み得る。一実施形態において、前記捕捉抗体は、配列番号１５、１６、１７を有する３つの重鎖ＣＤＲ及び配列番号１８、１９、２０を有する３つの軽鎖ＣＤＲを含み得る。一実施形態において、前記捕捉抗体は、配列番号２１、２２、２３を有する３つの重鎖ＣＤＲ及び配列番号２４、２５、２６を有する３つの軽鎖ＣＤＲを含み得る。一実施形態において、前記捕捉抗体は、配列番号２７、２８、２９を有する３つの重鎖ＣＤＲ及び配列番号３０、３１、３２を有する３つの軽鎖ＣＤＲを含み得る。
【0014】
前記方法は、さらに、前記結合サンプルを検出分子と接触させて検出サンプルを提供するステップを含む。一実施形態において、前記検出分子は、前記捕捉抗体に対して結合親和性を有する二次抗体に結合した生体適合性酵素を含み得る。一実施形態において、前記結合サンプル及び前記検出分子は、周囲温度及び湿度が制御される自動染色装置に接触して配置され得る。
【0015】
前記方法は、さらに、前記検出サンプルを３，３'－ジアミノベンジジン色原体と反応させて酸化基質を提供するステップと、前記酸化基質の量に基づいて前記サンプル中のＣＤＨ１７タンパク質の量を決定するステップとを含み得る。一実施形態において、デジタルパソロジーシステムは、酸化基質の量に基づいて前記サンプル中のＣＤＨ１７タンパク質の量を決定するのに使用され得る。
【0016】
一実施形態において、前記方法は、さらに、前記サンプル中のＣＤＨ１７発現をスコアリングし、データベースのレポートを生成するステップを含む。
【0017】
一実施形態において、前記方法は、さらに、前記サンプル中のＣＤＨ１７タンパク質発現を定量化するステップを含む。ここで、異なる細胞強度をスコアリングし、合わせて代表的な数値を与える。
【図面の簡単な説明】
【0018】
本開示の前述の特徴又は他の特徴は、添付の図面と併せて、以下の説明又は添付の特許請求の範囲からより完全に明らかになるであろう。これらの図面は、本開示に従って構成されたいくつかの実施形態のみを示しており、したがって、本開示の範囲を限定するものとみなされるべきではないことを理解されたい。この開示は、添付の図面を使用してさらに具体的に又は詳細に説明される。
【図1】Ｌｉｃ３、１０Ｃ１２、７Ｃ５、９Ａ６及び８Ｇ５の５つの抗ＣＤＨ１７抗体（Ａｂ，１ｕｇ／ｍＬ）をそれぞれ用いたペアとなる正常（Ｎ）と腫瘍（Ｔ）の大腸検体における免疫組織化学的染色パターン及びＣＤＨ１７発現の強度を示す。
【図2】免疫組織化学アッセイ（ＩＨＣ）に使用される一次抗ＣＤＨ１７抗体（Ｌｉｃ３）濃度の最適化を示す。濃度範囲は、０から２ｕｇ／ｍｌである。
【図3】正常なヒト組織におけるＣＤＨ１７（Ｌｉｃ３）の免疫反応性を示す。結腸と小腸のみが陽性の膜染色を示した（オリジナル倍率：１０倍）。
【図4】ａ）代表的な写真では、食道、胃、結腸、膵臓、胆嚢腺がん、胆管がんなどのＧＩ腫瘍性組織において強いＣＤＨ１７陽性染色が示されたが、他の腫瘍性がん組織タイプではそうではないこと（オリジナル倍率：１０倍）を示し；ｂ）Ｍスコアによって定量化されたＣＤＨ１７染色強度は、すべてのＧＩ腫瘍組織において＞１０（カットオフ値として）を示した。
【図5】ＣＤＨ１７をＧＩがんとの腺がんタイプの潜在的な診断マーカーとして示す。自動化ＣＤＨ１７（Ｌｉｃ３）ＩＨＣアッセイとＭスコア（デジタルスコアリング法）は、食道腺がん（ＥＡＣ；ｎ＝３５）、肝内胆管がん（ｉＣＣＡ；ｎ＝２５）、膵管腺がｎ（ＰＤＡＣ；ｎ＝３７）、胃腺がん（ＧＡＣ；ｎ＝４０）及び大腸腺がん（ＣＲＣ；ｎ＝１１２）を、それらの健康な隣接組織と区別するために使用することができる。
【図6】（ａ）自動化ＣＤＨ１７ ＩＨＣアッセイとデジタルスコアリング法（Ｍスコア）との組み合わせは、ＧＩがん起源、例えば、肝内胆管がん（ｉＣＡＡ）と肝外胆管がん（ｅＣＣＡ）、及び食道腺がん（ＥＡＣ）と食道扁平上皮がん（ＥＳＣＣ）を区別できることを示す。（ｂ）代表例の対応するＩＨＣ画像（オリジナル倍率：２０倍）を示す。
【図7】Ｍスコアによって定量化されたＣＤＨ１７発現が進行期の膵管腺がん（ＰＤＡＣ）と顕著に関連していることを示す。
【図8】高いＣＤＨ１７発現が患者の予後不良に関連することを実証している。ＣＤＨ１７発現が異なる大腸がん患者をＣＤＨ１７低レベル（Ｍスコア≦３０）とＣＤＨ１７高レベル（Ｍスコア＞３０）の２群に分けた。高レベルのＣＤＨ１７発現（Ｍスコア＞３０）を有する患者は、ａ）より低い全生存期間（ログランクｐ＝０．０２１）及びｂ）より高いハザード率と関連している。
【図9】独特な明視野イメージング分析システム、ＮＭＰＡ承認のハイスループット自動組織染色、デジタル化サンプルスコアリングアルゴリズム、及びクラウドベースのレポートシステムを含む統合されたＣＤＨ１７ ＩＨＣアッセイプラットフォームを示す。それは、定量的なＩＨＣスコアリング及びＩＨＣ染色サンプルのホールスライドイメージングを含む様々な組織病理学ニーズを満たすことができる。
【図10】自動化ＩＨＣスコアリング法と手動ＩＨＣスコアリング法の間の良好な相関関係を示す。病理医によって得られた陽性細胞スコアのパーセンテージは、自動化定量によるデジタルスコアリング法（Ｍスコア）と良好な一致を示した。ここで、（ａ）はピアソン相関分析、（ｂ）はペアとなったサンプルのＴ検定を示す。
【発明を実施するための形態】
【0019】
以下の詳細な説明では、その一部を構成する添付の図面を参照する。図面では、文脈上別段の指示がない限り、通常、類似の記号は類似のコンポーネントを識別します。詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲に記載されている例示的な実施形態は、限定することを意味するものではない。本明細書に提示される主題の精神又は範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用することができ、他の変更を行うことができる。本明細書に記載され、図に示されているように、本開示の側面は、本明細書で明示的に検討されている様々な構成で配置、置換、結合、分離、及び設計が可能であることは、容易に理解できる。
【0020】
本発明は一般に、とりわけ、免疫キャパシタ及び／又は電気化学キャパシタに関連する組成物、方法、装置、システム、デバイス、及び／又はコンピュータプログラム製品に関する。本明細書で開示される方法、デバイス、及びシステムは、本発明で説明される様々な消化器（ＧＩ）状態（ＧＩがん、ＣＤＨ１７発現正常組織及びがん組織を含むが、これらに限定されない）の診断又は治療を目的としてデータを取得及び処理するための任意の構成で実装できるとともに、一連の指令を具体化するコンピュータ又は他の電子システムに使用される機械可読媒体を利用して実行することができる。他の特徴は、添付の図面及び以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【0021】
いくつかの実施形態において、様々な種類の疾患及び悪性腫瘍におけるＣＤＨ１７発現レベルは、限定されないが、がんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）ＲＮＡ配列データ（ＲＮＡ Ｓｅｑ Ｖ２）を使用することにより、低から高までランク付けることができる。いくつかの実施形態において、高レベルのＣＤＨ１７発現は、ＧＩがん（大腸がん、胃がん、膵臓がん、及び食道がんを含むがこれらに限定されない）と関連している。ＣＤＨ１７発現レベルは、乳頭状腎細胞がん（ＰＲＣＣ）、胆管がん、肺腺がんでは高い。他の実施形態では、ＣＤＨ１７抗原及びｍＲＮＡは小腸及び結腸に限定されるが、肺、心臓、肝臓及び腎臓などの主要臓器では検出されない。
【0022】
本発明は、組織検体（又はサンプル）中のＣＤＨ１７発現を正確かつ一貫して検出するための免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイを含むデジタルパソロジーシステムを開示する。いくつかの実施形態において、組織検体中のＣＤＨ１７発現を検出するための免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイは、プロトコール及びキットを含む。いくつかの実施形態において、このシステムは、明視野イメージングと、労働効率及びデータアクセシビリティを向上させたコンピュータ化ワークフローと、研究室と病理医の間のコミュニケーションを合理化しかつ共有プロセスを簡素化するバーチャルスライド読み取りオプションとを含む。
【0023】
一実施形態において、本発明は、例えば、自動染色装置で染色したホルマリン固定・パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）消化器組織中のＣＤＨ１７タンパク質の定性的検出に有用なＣＤＨ１７（Ｌｉｃ３）ＩＨＣアッセイ／方法を提供する。本明細書に開示されるアッセイ／方法は、診断、モニタリング、腫瘍起源の識別、及び予後の補助に使用することができる。本発明は、とりわけ、Ｌｉｃ３抗体、自動化ＩＨＣ法、及び／又はデジタルパソロジーシステムを使用して、臨床組織中のＣＤＨ１７抗原発現の半定量化を可能にするように最適化された方法を提供する。
【0024】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるアッセイは、診断、悪性腫瘍のモニタリング、組織起源の識別及び疾患の予後診断に有用である。いくつかの実施形態において、前記検体は、凍結された、又は寒天ブロック、ホルマリン固定パラフィン（ＦＦＰＥ）及び組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）に包埋された細胞、組織及び生検であってもよいが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の方法の前記ＣＤＨ１７アッセイキットは、抗ＣＤＨ１７抗体から選択される一次抗体と、抗ＣＤＨ１７一次抗体に対する結合親和性を有しかつ生体適合性酵素に結合した二次抗体と、発色基質とを含む。いくつかの実施形態において、組織中のＣＤＨ１７発現を検出するためのＩＨＣキットは、希釈バッファー、洗浄バッファー、抗原賦活化溶液、ブロッカー試薬、抗ＣＤＨ１７マウスモノクローナル一次抗体、二次抗体及び３，３'－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）試薬から構成される。
【0025】
本明細書で使用される「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という用語は、「１つ以上」を意味すると定義され、文脈が不適切でない限り複数形を含む。
【0026】
「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、望ましい生物学的活性を示す限り、単一のモノクローナル抗体（アゴニスト及びアンタゴニスト抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、及び抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、及びＦｖ）を具体的にカバーする。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、単鎖、二重特異性又は二重有効性、ヒト及びヒト化抗体、並びにその活性断片であってもよい。
【0027】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。即ち、集団を含む個々の抗体は、少量存在する可能性のある自然発生突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は特異性が高く、モノクローナル単一特異性抗体として1つの抗原部位に指向され、モノクローナル多重特異性抗体として複数の抗原部位に対して指向される。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に指向される。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養により合成され、他の免疫グロブリンにコンタミネーションされていないという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の特性を示し、特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈されない。例えば、本明細書の開示に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製されてもよく、又は組換えＤＮＡ法によって作製されてもよい（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８１６，５６７参照）。
【0028】
本明細書の開示は、本明細書に含まれる特定の実施形態及び実施例の以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解されてもよい。本明細書の開示は、その特定の実施形態の特定の詳細を参照して説明されたが、そのような詳細な説明は、開示の範囲に対する限定とみなされるべきではない。実際、本明細書に記載されたものに加えて、本開示の様々な修飾は、前述の説明及び添付の図面から当業者には明らかとなるであろう。このような修飾は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図されている。
実施例
実施例１：抗ＣＤＨ１７抗体
実施例
実施例１：抗ＣＤＨ１７抗体
【0029】
ハイブリドーマ技術によりマウス抗ＣＤＨ１７抗体を開発し、結合親和性及びエピトープ／ドメインマッピング研究によりＣＤＨ１７に対するその親和性を特徴評価した。抗体の全長配列は本明細書に列挙されており、ＣＤＲ配列は同定された（下線）。
【0030】
臨床検体からＣＤＨ１７抗原を捕捉する能力についてスクリーニングされた１０個のＣＤＨ１７モノクローナル抗体のうち、５つの抗体（Ｌｉｃ３、１０Ｃ１２、７Ｃ５、９Ａ６及び８Ｇ５）は、それぞれＣＤＨ１７の３つのドメインにマッピングされた（表１）。図１は、１ｕｇ／ｍＬの濃度で上記の５つのエピトープ特異的抗ＣＤＨ１７抗体を用いて検出された、ペアとなる正常（Ｎ）及び腫瘍（Ｔ）の大腸検体における免疫組織化学的染色パターン及びＣＤＨ１７シグナルの強度を示す。正常及び腫瘍検体（結腸）に対して、半定量ＩＨＣフォーマットで、一次抗ＣＤＨ１７抗体によって捕捉されるＣＤＨ１７抗原の存在を検査した（図２）。寒天ブロックに包埋されたＣＤＨ１７陽性ＣＲＣ（ＤＬＤ－１）、ＣＤＨ１７陰性ＣＲＣ（ＳＷ４８０）などのがん細胞株を対照として使用した。Ｌｉｃ３は、ＣＤＨ１７の様々なドメインを認識する一次抗体の中から選択された。選択は、目的の用途に応じてテストされた２００以上の検体のうち潜在的な最も高い感度によってガイドされた。最も高い一次抗体希釈倍率でＬｉｃ３を滴定して、陽性染色組織と非特異的バックグラウンド染色の間のコントラストを最適化した。最初の滴定では、０～２ｕｇ／ｍＬの抗体濃度をテストした（ＣＲＣ：大腸がん；Ｔ：腫瘍）。デジタルスコアリング（Ｍスコア）法を用いたＬｉｃ３ ＩＨＣ染色の定量化により、ＣＤＨ１７ ＩＨＣアッセイには１ｕｇ／ｍＬ濃度のＬｉｃ３一次抗体が推奨されることが示唆された。
実施例２：自動化ＣＤＨ１７ ＩＨＣアッセイ
実施例２：自動化ＣＤＨ１７ ＩＨＣアッセイ
【0031】
ＣＤＨ１７タンパク質の発現を検出するための方法及び診断キットは、ＩＨＣによって異なる疾患起源からの組織／生検を分析するためのコンパニオン及びスタンドアロンのインビトロ診断目的の両方に使用され得る。ヒトＣＤＨ１７の様々なドメインを標的とする抗ＣＤＨ１７抗体を使用して、様々な感度でＣＤＨ１７タンパク質を検出することができる（表１）。抗ＣＤＨ１７（Ｌｉｃ３）一次抗体と検出キットを用いたＩＨＣ染色法は、ＣＤＨ１７抗原検出のために自動化組織染色プラットフォームに使用され得る。自動化プラットフォームでは、独特な明視野イメージング及び捕捉システムは、免疫染色された臨床組織サンプル上でデジタル化ＣＤＨ１７陽性シグナルを生成することができる。クラウドベースのサーバーで認定病理医検査用の半定量レポートを生成できる先進なデジタルパソロジーシステムは、上記の方法及び診断キットと統合することができる。
【0032】
アッセイの最適化に向けたステップには、最適な抗体希釈、抗原賦活化条件、及びインキュベーション時間の決定が含まれる。ＣＤＨ１７（Ｌｉｃ３）ＩＨＣアッセイの特異性を実証するために研究を実施した。１ロットの抗ＣＤＨ１７（Ｌｉｃ３）を市販のツアーオブボディ（ＴＯＢ）組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）上で染色した。中枢神経系、内分泌、乳房、心血管、胃腸、泌尿生殖器を含む正常組織のスクリーニングでは、結腸及び小腸のみが陽性ＣＤＨ１７ ＩＨＣ染色を示した（図３）。理想的なＬｉｃ３抗体の希釈率は１ｕｇ／ｍＬであり、これは感度と特異性の最適なバランスが得られる最低の抗体濃度である。高ｐＨベースの市販抗原賦活溶液を用いて一次抗体の結合を最適化した。残りの検証プロセスでは、最適なシグナル対バックグラウンド比を生み出す染色条件の組み合わせを使用した。
【0033】
アッセイの解釈基準は文献の基準と一致し、病理医の検証を受けることができる。ＣＤＨ１７抗原とｍＲＮＡは小腸と結腸に限定されており、肺、心臓、肝臓、腎臓などの主要臓器では検出することができない（図３）。一方、食道、胃、結腸、膵臓、胆嚢腺がん、胆管がんなどの消化器がんでは、ＣＤＨ１７の強い陽性染色を示したが、他の腫瘍組織ではそうではなかった（表２、図４ａ）。
【0034】
自動化ＩＨＣシステムのうち、定量的デジタルスコアリング法により、ＧＩがんでは、他の非ＧＩがんタイプと比較して高い平均スコア（＞１０）を示し、ＧＩ腫瘍組織の代表的な画像は、強い腫瘍内ＣＤＨ１７シグナル強度を示した。実際、病理医による手動スコアリングとデジタルスコアリングを比較することによって解釈を行ったところ、両方の方法間の一貫した相関関係が明らかになった（表３、図４ｂ）。
実施例３：操作プロトコル
実施例３：操作プロトコル
【0035】
自動化染色システムはさらに最適化され得るが、ルーチンのＩＨＣ操作手順を以下に示す。
１．ＩＨＣアッセイでは、ＦＦＰＥ組織切片を高ｐＨバッファーに入れ、半自動抗原検索システムに挿入する。
２．試薬（ブロッキング、一次抗体、二次抗体など）を調製し、ＣＤＨ１７エピトープ賦活サンプルをＩＨＣプロセス用の自動染色装置に配置する。
３．指定ソフトウェアに従って自動染色装置を操作し、一次抗体と二次抗体をサンプル上に分注し、他の試薬のインキュベーション時間は変わる場合がある。
４．ＩＨＣアッセイは維持された環境で行われ、スライドを染色装置から取り出し、スライドをマウントすると同時にヘマトキシリンによる対比染色の準備をする。
６．デジタル画像解析ソフトウェアを用いて組織切片におけるＣＤＨ１７発現を定量化する。
７．アッセイスコアリングアルゴリズムを用いてアッセイ結果の解釈を支援する。
１．ＩＨＣアッセイでは、ＦＦＰＥ組織切片を高ｐＨバッファーに入れ、半自動抗原検索システムに挿入する。
２．試薬（ブロッキング、一次抗体、二次抗体など）を調製し、ＣＤＨ１７エピトープ賦活サンプルをＩＨＣプロセス用の自動染色装置に配置する。
３．指定ソフトウェアに従って自動染色装置を操作し、一次抗体と二次抗体をサンプル上に分注し、他の試薬のインキュベーション時間は変わる場合がある。
４．ＩＨＣアッセイは維持された環境で行われ、スライドを染色装置から取り出し、スライドをマウントすると同時にヘマトキシリンによる対比染色の準備をする。
６．デジタル画像解析ソフトウェアを用いて組織切片におけるＣＤＨ１７発現を定量化する。
７．アッセイスコアリングアルゴリズムを用いてアッセイ結果の解釈を支援する。
【0036】
検証サンプル：ＣＤＨ１７陽性及び陰性発現を有するがん細胞株を寒天ブロックに包埋し、検証に使用した。様々な臓器からの正常及び患者の組織標本を使用して、特定の腫瘍タイプ内又は異なる腫瘍タイプにわたる適切な染色スペクトルを実証した。この場合、社内のＣＤＨ１７ ＩＨＣアッセイによって、ＣＤＨ１７タンパク質の発現はＧＩ検体に限定される。
実施例４：自動ＣＤＨ１７ ＩＨＣアッセイのＭスコア
実施例４：自動ＣＤＨ１７ ＩＨＣアッセイのＭスコア
【0037】
自動化ＣＤＨ１７ ＩＨＣアッセイにより、ＣＤＨ１７が腺がんタイプのＧＩがんの有用な診断マーカーであることが確認された。ＣＤＨ１７発現の結果は、デジタルスコアリング法であるＭスコアにより定量化することができる。図５は、Ｍスコアが、食道腺がん（ＥＡＣ；ｎ＝３５）、肝内胆管がん（ｉＣＣＡ；ｎ＝２５）、膵管腺がｎ（ＰＤＡＣ；ｎ＝３７）、胃腺がん（ＧＡＣ；ｎ＝４０）及び大腸腺がん（ＣＲＣ；ｎ＝１１２）を、それらの健康な隣接組織と区別するために使用できることを示す。
【0038】
Ｍスコアによって測定されるように、自動化ＣＤＨ１７ ＩＨＣアッセイは、ＧＩがんの起源を区別するために使用できる。ＣＤＨ１７（Ｌｉｃ３）ＩＨＣアッセイは、肝内胆管がん（ｉＣＣＡ）と肝外胆管がん（ｅＣＣＡ）のサブタイプをｐ＝０．００２４で有意に区別するために使用でき、食道がん、例えば、食道扁平上皮がん（ＥＳＣＣ）及び食道腺がん（ＥＡＣ）をｐ＝０．０５０で有意に区別するために使用できる（図６）。
【0039】
自動化ＣＤＨ１７ ＩＨＣアッセイは、ＣＤＨ１７発現レベルに対応するＭスコアを測定することにより、進行期の膵管腺がん（ＰＤＡＣ）を検出するために使用できる（図７）。
実施例５：予後のＭスコアカットオフ値
実施例５：予後のＭスコアカットオフ値
【0040】
自動化治療ガイドＩＨＣアッセイは、標準化レポートテンプレートとしてクラウドベースのレポートに統合されることが望ましい。Ｍスコアは、計算範囲０～５０である膜染色の定量的尺度である。図８は、すべての大腸がん患者におけるＭスコア≦３０及びＭスコア＞３０の層別を示し、ＣＤＨ１７陽性率が高い患者（Ｍスコア－カットオフ値＞３０）は、より低い全生存率（ログランクｐ＝０．０２１）及びより高いハザード率と関連することを示している。したがって、高レベルのＣＤＨ１７発現は患者の予後不良と関連している。
実施例６：自動化及び統合されたＣＤＨ１７ ＩＨＣシステム
実施例６：自動化及び統合されたＣＤＨ１７ ＩＨＣシステム
【0041】
明視野イメージング分析システムは、ＣＤＨ１７ ＩＨＣアッセイプラットフォームの自動化に統合された。図９に示すように、統合されたＣＤＨ１７ ＩＨＣシステムには、ＮＭＰＡ（中国国家医療製品総局）承認のハイスループット自動組織染色、デジタル化サンプルスコアリングアルゴリズム、及びクラウドベースのレポートシステムも含まれている。この明視野イメージング分析システムは、Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリン及びエオシン）染色／ＩＨＣサンプルの定量的ＩＨＣスコアリングやホールスライドイメージングなどの様々な組織病理学のニーズに対応することができる。
【0042】
品質管理：ＣＤＨ１７の安定性と再現性は次のようにテストされた。連続１０日間の検証期間の開始時に、発現が保持された腫瘍組織の５つのＦＦＰＥブロックのそれぞれから１０枚の切片を切り取った。分析は、２人の異なる組織検査者によって交代で、これら５つのブロックのそれぞれからの１枚の未染色ＦＦＰＥスライドに対して毎日実行された。アッセイの再現性は次のようにテストされた。発現が保持された腫瘍組織の３つのＦＦＰＥブロックのそれぞれから、３枚の切片を２つの異なる機械で染色した。各アッセイは、これらの検証実験全体にわたって一貫したパフォーマンスを示した。
実施例７：コンパニオン／スタンドアロン診断検査としての自動ＣＤＨ１７ ＩＨＣアッセイ
実施例７：コンパニオン／スタンドアロン診断検査としての自動ＣＤＨ１７ ＩＨＣアッセイ
【0043】
組織サンプル中のＣＤＨ１７に結合する特異性の高いＣＤＨ１７抗体の使用は、診断、疾患の病期分類、腫瘍起源の区別、消化管の複数の進行性悪性腫瘍（胆管がん、食道がん、膵臓がん、胃がん及び大腸腺がんを含む）の予後に有用である。これらすべての悪性腫瘍において、従来のパソロジー／デジタルスコアリング（ＩＨＣ膜スコアリング法）が、ＣＤＨ１７の定量化に使用することができる。従来のＩＨＣスコアリングとデジタル法の間には良好な相関関係が示された（図１０）。デジタルパソロジーシステムによって生成されたデジタルスコア（Ｍスコアなど）は、疾患の評価の指標となる。研究開発目標では、このカットオフは疾患の早期指標として使用することができる。各組織の異なる悪性腫瘍サブタイプの区別及び病期分類は、スコアのより高い閾値で行うことができる。組織診断検査は、その高い特異性と感度のため、臨床研究におけるコンパニオン診断ツールとしても、スタンドアロンのＩＶＤアッセイとしても使用することができる。
【0044】
免疫組織化学染色の従来の手動方法では、人為的及び技術的バリエーションの導入に加えて、膨大な時間が必要である。プロセス全体を標準化することはほぼ不可能である。これに対し、ＩＨＣ染色の自動化技術により、制御された温度と湿度設定で使いやすくなり、環境への影響を最小限に抑えながら、染色プロセスの様々なステップで正確なタイミングを確保することができる。各染色実行に必要な正確な試薬量がリストされ、適切な試薬の分注が保証される。自動化技術の最適化と検証は、アッセイ結果の信頼性を高めるために、日内、日中、プラットフォーム間の比較からなる精密な研究によって実行された。組織特異的及び多臓器組織マイクロアレイアッセイ（ＴＭＡ）によって提供された様々なサンプルの異なる組織サンプルにおける染色結果の検証は、既知のテスト済みの染色と比較することによって行われた。
【0045】
ＣＤＨ１７ＩＨＣアッセイの臨床応用：このアッセイは、診断、悪性腫瘍のモニタリング、組織起源の識別、疾患の予後及びコンパニオン診断に使用することを目的としている。
【0046】
参考文献
1. Arnold, M., et al., Global Burden of 5 Major Types of Gastrointestinal Cancer. Gastroenterology, 2020. 159(1): p. 335-349 e15.
2. Arnold, M., et al., Progress in cancer survival, mortality, and incidence in seven high-income countries 1995-2014 (ICBP SURVMARK-2): a population-based study. Lancet Oncol, 2019. 20(11): p. 1493-1505.
3. Su, M.C., et al., Cadherin-17 is a useful diagnostic marker for adenocarcinomas of the digestive system. Mod Pathol, 2008. 21(11): p. 1379-86.
4. Weimann, A., et al., CDX2 and LI-cadherin expression in esophageal mucosa: use of both markers can facilitate the histologic diagnosis of Barrett's esophagus and carcinoma. Int J Surg Pathol, 2010. 18(5): p. 330-7.
5. Panarelli, N.C., et al., Tissue-specific cadherin CDH17 is a useful marker of gastrointestinal adenocarcinomas with higher sensitivity than CDX2. Am J Clin Pathol, 2012. 138(2): p. 211-22.
6. Suh, Y.S., et al., The combined expression of metaplasia biomarkers predicts the prognosis of gastric cancer. Ann Surg Oncol, 2012. 19(4): p. 1240-9.
7. Lee, N.P., et al., Role of cadherin-17 in oncogenesis and potential therapeutic implications in hepatocellular carcinoma. Biochim Biophys Acta, 2010. 1806(2): p. 138-45.
8. Vafa, O. and N.D. Trinklein, Perspective: Designing T-Cell Engagers With Better Therapeutic Windows. Front Oncol, 2020. 10: p. 446.
9. Garcia-Martinez, J.M., et al., Selective Tumor Cell Apoptosis and Tumor Regression in CDH17-Positive Colorectal Cancer Models using BI 905711, a Novel Liver-Sparing TRAILR2 Agonist. Mol Cancer Ther, 2021. 20(1): p. 96-108.
10. Wong, D.A., et al., Efficacy and preclinical safety of ARB202, a potential first-in-class anti-CDH17/CD3 bispecific T-cell engager, for treatment of pancreatic and colorectal cancers. Journal of Clinical Oncology, 2021. 39(3_suppl): p. 405-405.
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3. Su, M.C., et al., Cadherin-17 is a useful diagnostic marker for adenocarcinomas of the digestive system. Mod Pathol, 2008. 21(11): p. 1379-86.
4. Weimann, A., et al., CDX2 and LI-cadherin expression in esophageal mucosa: use of both markers can facilitate the histologic diagnosis of Barrett's esophagus and carcinoma. Int J Surg Pathol, 2010. 18(5): p. 330-7.
5. Panarelli, N.C., et al., Tissue-specific cadherin CDH17 is a useful marker of gastrointestinal adenocarcinomas with higher sensitivity than CDX2. Am J Clin Pathol, 2012. 138(2): p. 211-22.
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10. Wong, D.A., et al., Efficacy and preclinical safety of ARB202, a potential first-in-class anti-CDH17/CD3 bispecific T-cell engager, for treatment of pancreatic and colorectal cancers. Journal of Clinical Oncology, 2021. 39(3_suppl): p. 405-405.
【0047】
表１：ＩＨＣアッセイにおける様々な抗ＣＤＨ１７一次抗体によるシグナル対ノイズ比
表２：すべてのタイプのＧＩがんにおける高ＣＤＨ１７発現
表３：ヒト正常組織における免疫反応性
【表1】
【表2】
【表3】
【0048】
配列表
>配列番号1: m7C5 VH
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ARHYYSSLYYAMDY
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GAT
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QNVLSTPRT
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DRPAWFPY
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>配列番号19: mLic3軽鎖CDR-L2配列
KVSNRFS
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FQGSHVPLT
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WGFGNYAFAY
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SPSSRNT
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QQYSTYPRT
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SYTNLGAY
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LQYASSPFT
【図1】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図】
【図4-2】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【配列表】
【国際調査報告】