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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-10
(54)【発明の名称】合成ゲノム編集システム
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20241003BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20241003BHJP
C12N 9/16 20060101ALI20241003BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241003BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20241003BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241003BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241003BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241003BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241003BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20241003BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20241003BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20241003BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241003BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 100
C12N15/113 Z ZNA
C12N9/16 Z
C12N5/10
C12N15/55
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
A61K48/00
A61K38/16
A61K31/7088
A61K47/64
A61P43/00 111
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024521748
(86)(22)【出願日】2022-10-07
(85)【翻訳文提出日】2024-06-04
(86)【国際出願番号】 GB2022052555
(87)【国際公開番号】W WO2023057777
(87)【国際公開日】2023-04-13
(31)【優先権主張番号】2114453.0
(32)【優先日】2021-10-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】2209735.6
(32)【優先日】2022-07-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524132553
【氏名又は名称】ペンシル バイオサイエンシズ リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100141195
【弁理士】
【氏名又は名称】西澤 恵美子
(72)【発明者】
【氏名】イブラヒム，モハメド ラジック モハメド
(72)【発明者】
【氏名】カンワル，ニシャ
(72)【発明者】
【氏名】ライトスキン，オレーグ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B065AA26X
4B065AA93X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA44
4C076AA94
4C076AA95
4C076CC29
4C076CC42
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF31
4C076FF34
4C076FF63
4C084AA01
4C084AA07
4C084AA13
4C084BA02
4C084BA31
4C084BA41
4C084NA13
4C084NA14
4C084NA15
4C084ZC41
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA13
4C086NA14
4C086NA15
4C086ZC41
(57)【要約】
本発明は、ゲノム編集のために用いうるＤＮＡ改変のための合成モジュラーシステムであって、ＤＮＡターゲティング能力とモジュラーポリペプチド構成要素の認識モジュールに結合する能力の両方を有するターゲティング核酸を含み、モジュラーポリペプチド構成要素が、エフェクター構成要素および標的中の既定配列（ＰＢＳ）に結合する短ペプチドＤＮＡ結合配列（ＤＢＤ）も含む、システムを提供する。ＤＢＤは好ましくは１５マー以下でよく、結合すると標的とされるｄｓＤＮＡの構造を不安定化し、それによって所望のＤＮＡ改変を促進する機能を果たす。エフェクター構成要素は、例えば、連結された自己集合性ペプチドを含む人工ニッカーゼでもよく、それによって細胞へのベクター送達に有利な小型のサイズの完全なゲノム編集システムを提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
標的核酸配列を改変するのに使用するための核タンパク質複合体であって、（Ａ）ターゲティング核酸および（Ｂ）モジュラーポリペプチド構成要素を含み、前記ターゲティング核酸が、
（ｉ）標的の一領域に相補的であるターゲティング核酸エレメント（ＴＥ）；
（ｉｉ）前記モジュラーポリペプチド構成要素の核酸認識モジュールと特異的に相互作用する認識エレメントおよび
（ｉｉｉ）前記ターゲティングエレメントと前記認識エレメントを連結する接続配列を含み、前記モジュラーポリペプチド構成要素が、連結された分離機能的モジュールとして：
（ａ）酵素活性を欠く前記核酸認識モジュール；
（ｂ）標的中の既定の配列を認識するＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）であって、モジュール（ａ）および前記ＤＢＤは天然には連結して見出されることはない、ＤＢＤ
（ｃ）標的を改変するのに使用するためのエフェクター構成要素であって、それによって前記ＴＥおよびＤＢＤにより指示される部位特異的改変が生じる、エフェクター構成要素、ならびに
（ｄ）任意選択的に、または必要ならば、モジュール（ａ）、（ｂ）および（ｃ）が接合される第１のリンカーおよび／または第２のリンカー
を含み、
前記ＤＢＤが、７０～７５以下のアミノ酸残基のポリペプチド配列である、
核タンパク質複合体。
【請求項2】
前記モジュラーポリペプチド構成要素が：（ａ）前記核酸認識モジュール；
（ｂ）標的中の既定配列を認識する、（ａ）に直接連結された前記ＤＢＤであって、モジュール（ａ）および前記ＤＢＤは天然には連結して見出されることはない、ＤＢＤ；
（ｃ）標的を改変するのに使用するための、（ｂ）に直接連結されたエフェクター構成要素であって、それによって前記ＴＥおよびＤＢＤにより指示される部位特異的改変が生じる、エフェクター構成要素、ならびに
（ｄ）任意選択的に、または必要ならば、それぞれ前記エフェクター構成要素および前記核酸認識モジュールへの前記ＤＢＤの直接連結を提供する第１のリンカーおよび／または第２のリンカー配列
を含む、請求項１に記載の核タンパク質複合体。
【請求項3】
前記ターゲティング核酸がＲＮＡである、請求項１または請求項２に記載の核タンパク質複合体。
【請求項4】
前記ターゲティング核酸の前記認識エレメントが、前記モジュラーポリペプチド構成要素の前記モジュール（ａ）を提供するＲＮＡスキャフォールド結合ドメイン（ＲＳＢＤ）に結合するＲＮＡスキャフォールド（ＲＳ）であり、例えば、前記ＲＳが１９ｎｔボックスＢ ＲＮＡモチーフであり、前記ＲＳＢＤが配列番号２に示されるラムダＮ２２ペプチドである、請求項１～３のいずれか一項に記載の核タンパク質複合体。
【請求項5】
前記構成要素として（Ａ）完全な核酸構成要素（ＮＡＣ）および（Ｂ）モジュラーポリペプチド構成要素を含み、ＮＡＣが：
（ｉ）標的の一領域に相補的であるターゲティングエレメント（ＴＥ）；
（ｉｉ）前記モジュラーポリペプチド構成要素のＲＮＡスキャフォールド結合ドメイン（ＲＳＢＤ）に特異的に結合するＲＮＡスキャフォールド（ＲＳ）および
（ｉｉｉ）前記ＴＥとＲＳを連結する接続配列
を含み、前記モジュラーポリペプチド構成要素が、連結された分離機能的モジュールとして：
（ａ）前記ＲＳＢＤ；
（ｂ）標的中の既定の配列を認識する、（ａ）に連結された前記ＤＮＡ結合ドメイン、モジュール（ａ）および前記ＤＢＤは天然には連結して見出されることはない、ＤＮＡ結合ドメイン、
（ｃ）標的を改変するのに使用するための、（ｂ）に連結されたエフェクター構成要素であって、それによって前記ＴＥおよび前記ＤＢＤにより指示される部位特異的改変が生じる、エフェクター構成要素、ならびに
（ｄ）任意選択的に、または必要ならば、それぞれ前記エフェクター構成要素およびＲＳＢＤに前記ＤＢＤを連結する第１のリンカーおよび／または第２のリンカー
を含む、請求項４に記載の核タンパク質複合体。
【請求項6】
前記ターゲティング核酸または前記ＮＡＣが、同じまたは異なる２つ以上のＲＮＡスキャフォールドを提供する、請求項４または５に記載の核タンパク質複合体。
【請求項7】
標的がｄｓＤＮＡである、請求項１～６のいずれか一項に記載の核タンパク質複合体。
【請求項8】
前記ＤＢＤが、３０マー以下、２５マー以下、２０マー以下、好ましくは１５マー以下である、請求項１～７のいずれか一項に記載の核タンパク質複合体。
【請求項9】
標的がｄｓＤＮＡであり、前記ＤＮＡ結合ドメインが３～６ヌクレオチドの既定の配列に結合する、請求項８に記載の核タンパク質複合体。
【請求項10】
前記ＤＢＤが、１５以下のアミノ酸のペプチド、例えば、５’から３’の配列５’ＧＡＧＧＴＣ３’により表されるｄｓＤＮＡ配列に結合する１５マーの配列【化1】
【請求項11】
前記ＤＢＤが、１つよりも多い既定の配列に結合することができる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の核タンパク質複合体。
【請求項12】
前記モジュラーポリペプチド構成要素が、核局在化シグナル（ＮＬＳ）および／またはオルガネラ局在化シグナルをさらに提供し、前記ＮＬＳおよび／またはオルガネラ局在化シグナルが、検出を助ける追加の配列に任意選択的に接続されているＮまたはＣ末端で提供される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の核タンパク質複合体。
【請求項13】
前記エフェクター構成要素が、（ｉ）二本鎖切断を生じさせるためのエンドヌクレアーゼまたはＦｏｋ１ヌクレアーゼドメイン、（ｉｉ）ニッカーゼ、（ｉｉｉ）転写活性化因子、（ｉｖ）転写リプレッサー、（ｖ）エピジェネティックモジュレーター酵素、（ｖｉｉ）リコンビナーゼ、（ｖｉｉｉ）トランスポザーゼ、（ｉｘ）インテグラーゼおよび（ｘ）核酸塩基修飾酵素構築物から選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載の核タンパク質複合体。
【請求項14】
前記エフェクター構成要素が、ベータシート構造を形成する連結された自己集合性ペプチドのマルチマーを含む人工ヌクレアーゼまたはニッカーゼであり、（ｉ）前記マルチマーの自己集合性ペプチドがそれぞれ交互パターンの疎水性と親水性残基を示し、それぞれのそのようなペプチドの親水性残基のすべてまたは少なくとも一部分がアミノ酸の触媒三残基を表し、それにより前記マルチマーがｄｓＤＮＡの単一の鎖または両方の鎖を切断することができ；
（ｉｉ）自己集合性ペプチドがリンカーにより接合されて、マルチマー数を、例えば、４～１５に、好ましくは５～１０に制限し、
（ｉｉｉ）Ｎ末端およびＣ末端隣接配列は、１つまたは複数の正電荷残基の包含に起因して、例えば、１つまたは複数のリジンまたはアルギニン残基の包含により、マルチマーのペプチド単位と比べて正電荷が増加しているヌクレアーゼタンパク質のマルチマー間での凝集を防ぐまたは制限するためにマルチマーに連結されて提供される、
請求項１３に記載の核タンパク質複合体。
【請求項15】
モジュラーポリペプチド構成要素が、構成要素（ａ）～（ｄ）以外のいかなる切断可能タグもしくは局在化シグナルまたはいかなる他の配列も排除する２２０～３００以下のアミノ酸である、請求項１４に記載の核タンパク質複合体。
【請求項16】
前記マルチマーを形成する前記ペプチドが、同一の７マーであるかまたは２つ以上の非同一７マーを含み、交互の疎水性残基がＮ末端残基から開始するロイシンおよび／またはイソロイシンである、請求項１４または請求項１５に記載の核タンパク質複合体。
【請求項17】
前記マルチマーを形成する前記ペプチドが、逆平行ベータシート構造を提供するようにすべてがＮ末端からＣ末端方向に連続して連結される同一のペプチドである、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の核タンパク質複合体。
【請求項18】
前記マルチマーのペプチドを接合するリンカーが、ベータターンまたはベータターン様ループを提供することができる、例えば、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびアスパラギン酸（Ｄ）から選択されるアミノ酸の組合せからなるアミノ酸リンカーである、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の核タンパク質複合体。
【請求項19】
前記Ｃ末端隣接ペプチドのＣ末端が、可溶性を助けるためそのＣ末端で柔軟なテール配列を提供する、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の核タンパク質複合体。
【請求項20】
前記マルチマーの前記ペプチドが、配列ＩＥＩＤＩＨＩの７マーである、請求項１４～１９のいずれか一項に記載の核タンパク質複合体。
【請求項21】
人工ニッカーゼが、配列【化2】
【請求項22】
モジュラーポリペプチド構成要素が、Ｎ末端からＣ末端方向に融合された以下の構成要素：（ｉ）ラムダＮ２２タンパク質、
【化3】
【化4】
【化5】
【化6】
（ｖ）ニッカーゼモジュール：
【化7】
または前記リンカーの１つもしくは両方が代替のリンカーにより置換されている同じモジュラーポリペプチド配列
を含む、請求項２１に記載の核タンパク質複合体。
【請求項23】
前記人工ヌクレアーゼモジュールが、代替のエフェクター構成要素、例えば、ＶＰ６４などの転写活性化因子により置換されている、請求項２２に記載の核タンパク質複合体。
【請求項24】
宿主細胞における先行する請求項のいずれかに記載の１つまたは複数の核タンパク質複合体の提供のための核酸または核酸の組合せ。
【請求項25】
人工ニッカーゼおよび少なくとも１つのターゲティング核酸、例えば、ターゲティングＲＮＡを提供する請求項１４～２２のいずれか一項に記載の核タンパク質複合体の両方のポリペプチド構成要素を発現することができるベクターである、請求項２４に記載の核酸。
【請求項26】
ヒトの生殖系列アイデンティティーを改変する方法でもヒトまたは動物の身体で実行される処置方法でもないという条件で、請求項１～２３のいずれか一項に記載の１つもしくは複数の核タンパク質複合体または宿主細胞におけるその提供のための１つもしくは複数の核酸を用いる１つまたは複数の標的核酸配列を改変するための方法。
【請求項27】
標的核酸を改変する方法において使用するための、例えば、治療処置のためのそのような方法において使用するための、（ｉ）請求項１～２３のいずれか一項に記載の核タンパク質複合体用の少なくとも１つのモジュラーポリペプチド構成要素またはそれをコードするポリヌクレオチドおよび（ｉｉ）前記ポリペプチド構成要素（複数可）と連結できる１つもしくは複数のターゲティング核酸、またはそれをコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドの組合せ。
【請求項28】
請求項１～２３のいずれか一項に記載の１つもしくは複数の核タンパク質複合体または宿主細胞におけるその提供のための１つもしくは複数の核酸を用いて、例えばゲノムにおいて、１つまたは複数の標的核酸部位を改変することを含む、治療処置の方法。
【請求項29】
請求項１４および１６～２２のいずれか一項で定義される人工ヌクレアーゼまたはニッカーゼを含むまたはからなるポリペプチド。
【請求項30】
請求項１～２３のいずれか一項で定義されるモジュラーポリペプチド構成要素であり、任意選択的に、発現系における可溶性および／または精製および／または検出および／または膜透過を助ける１つまたは複数の配列を提供するＮ末端および／またはＣ末端伸長をさらに含む、請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項31】
請求項２９または請求項３０に記載のポリペプチドを発現することができる核酸。
【請求項32】
請求項１および３～５のいずれか一項で定義されるターゲティング核酸またはＮＡＣならびにリンカー配列により接合される請求項１で定義される構成要素（ａ）および（ｂ）を含むモジュラーポリペプチド構成要素を含む、標的ＤＮＡ部位で転写を阻害するための核タンパク質複合体。
【請求項33】
宿主細胞、例えば、植物細胞またはヒトもしくは非ヒト動物細胞または原核細胞における請求項３２に記載の核タンパク質複合体の提供のための核酸または核酸の組合せ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ゲノム編集のために用いうるＤＮＡ改変のための合成モジュラーシステムであって、ＤＮＡターゲティング能力とモジュラーポリペプチドの認識モジュールに結合する能力の両方を有するターゲティング核酸を含み、モジュラーポリペプチドが分離モジュールとしてエフェクター構成要素も含む、合成モジュラーシステムを提供する。エフェクター構成要素は、単独でまたは例えば二量体化後に遺伝子の構造または調節を改変するためのタンパク質構成要素でもよい。望ましくは、エフェクター構成要素は、現在本明細書でも教示される連結された自己集合性（linked, self-assembling）短ペプチドの多量体を含む人工ニッカーゼでもよい。モジュラーポリペプチド構成要素中にさらに酵素活性を欠き、標的中の既定の配列を認識する短ペプチドＤＮＡ結合構成要素を含むことにより、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）遺伝子改変システムよりもはるかに小さく、それにより細胞への送達を楽にする完全合成遺伝子改変ツールが獲得された。ポリペプチド構成要素は、単一ＡＡＶベクター中でターゲティング核酸（複数可）と一緒に送達されうる。
【背景技術】
【0002】
ＲＮＡガイドＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムおよび他のＲＮＡガイドＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、最初の研究が、標的ＤＮＡにおけるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）認識によりＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９二本鎖ＤＮＡ切断を指示するｓｇＲＮＡの能力を明らかにして以来遺伝子編集の分野に大改革をもたらした。しかし、すべての所望の目的に、特に治療的ゲノム改変のためにそのようなＲＮＡガイドＤＮＡターゲティングシステムを使用することに関していくつかの欠点がまだ取り組まれていない。１つのそのように認識されている不利な点は、効率的なＡＡＶパッケージングを制限するサイズである。ｓｇＲＮＡを備えた化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）（最も広く使用されているＣａｓ９バージョン）はサイズが４．１ｋｂｐ（１３６８アミノ酸）であり、つい最近同定されたもっと小型のｃａｓ酵素はそれでもかなりのサイズのヌクレアーゼであり、所望のベクター送達には決して最適ではない。ＡＡＶの全体サイズは、最大５ｋｂの異種配列をパッケージすることができるだけである。
【0003】
さらに、免疫原性はヒトでのインビボ治療応用のために考慮すべき事柄である。化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９反応性Ｔ細胞が成人ヒト集団において報告されている。
【0004】
Ｔａｒｇｅｔｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．の国際公開第２０１３／０８８４４６号パンフレットは、連結ドメインを介して特異性付与核酸（ＳＣＮＡ）と連結されたＦｏｋ１ヌクレアーゼドメインを用いる代替のＤＮＡ編集システムを提唱している。ＳＣＮＡは、標的核酸の配列に相補的なヌクレオチド配列およびＳＣＮＡを連結ドメインに特異的に連結させることができる認識構成要素を含み、例えば、ＳＣＮＡの認識構成要素は、特異的結合パートナーペアのうちの１つまたはその同族ポリペプチド結合構成要素を認識する天然に存在するＲＮＡアプタマーでもよい。標的ＤＮＡ上でのそのような人工核タンパク質複合体の対合は、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼドメインの二量体化を可能にするのに必要とされる。さらに、このようにして提供されるＦｏｋ１ヌクレアーゼは、ＤＮＡと効果的に相互作用して二本鎖ＤＮＡを標的部位で切断させることができなければならない。しかし、国際公開第２０１３／０８８４４６号パンフレットは、治療上の有用性については予言的例証しか提供しておらず、そのようなシステムの効率に対する疑念が残る。
【発明の概要】
【0005】
本発明者らは、この場合には、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ／ｓｇＲＮＡシステムの使用の代替案としての遺伝子改変のための完全合成モジュラーシステムであって、ヌクレアーゼモードでは、既定の標的部位でのＤＮＡ標的二本鎖または一本鎖切断に良好な効率を提供し、はるかに小型のサイズの遺伝子編集システムを提供するように設計することができシステムを提供することを目指した。現在教示される人工ニッカーゼを使用して達成可能な小型のサイズは、１つまたは１つよりも多いターゲティングＲＮＡを有する単一ＡＡＶベクター送達を含む多種多様な送達手段を選択する機会を提供する。
【0006】
一態様では、本発明は、標的核酸、例えば、標的ＤＮＡを改変するのに使用するための核タンパク質複合体であって、（Ａ）ターゲティング核酸および（Ｂ）モジュラーポリペプチド構成要素を含み、
前記ターゲティング核酸が、
（ｉ）標的の一領域（a region）に相補的であるターゲティング核酸エレメント（本明細書ではターゲティングエレメント、ＴＥとも呼ばれる）；
（ｉｉ）前記モジュラーポリペプチド構成要素の核酸認識モジュール（例えば、ＲＮＡスキャフォールド結合ドメイン、ＲＳＢＤ）と特異的に相互作用する認識エレメント（例えば、ＲＮＡスキャフォールド、ＲＳ）および
（ｉｉｉ）前記ターゲティングエレメントと前記認識エレメントを連結する接続配列を含み、
前記モジュラーポリペプチド構成要素が、連結された分離機能的モジュールとして（as linked, separate functional module）：
（ａ）酵素活性を欠く前記核酸認識モジュール；
（ｂ）標的中の既定の配列を認識するＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、モジュール（ａ）および前記ＤＢＤは天然には連結して見出されることはない、ＤＢＤ、ならびに
（ｃ）それによってターゲティング核酸の前記ターゲティングエレメントと前記ＤＢＤにより指示される（directed by）部位特異的改変が生じる、標的を改変するのに使用するためのエフェクター構成要素、ならびに
（ｄ）任意選択的に、または必要ならば、モジュール（ａ）、（ｂ）および（ｃ）が接合される第１のリンカーおよび／または第２のリンカーを含み、
前記ＤＢＤが、７０～７５以下のアミノ酸残基、例えば、３０マー以下、２５マー以下、２０マー以下、好ましくは１５マー以下のポリペプチド配列である、核タンパク質複合体を提供する。
前記ターゲティング核酸が、
（ｉ）標的の一領域（a region）に相補的であるターゲティング核酸エレメント（本明細書ではターゲティングエレメント、ＴＥとも呼ばれる）；
（ｉｉ）前記モジュラーポリペプチド構成要素の核酸認識モジュール（例えば、ＲＮＡスキャフォールド結合ドメイン、ＲＳＢＤ）と特異的に相互作用する認識エレメント（例えば、ＲＮＡスキャフォールド、ＲＳ）および
（ｉｉｉ）前記ターゲティングエレメントと前記認識エレメントを連結する接続配列を含み、
前記モジュラーポリペプチド構成要素が、連結された分離機能的モジュールとして（as linked, separate functional module）：
（ａ）酵素活性を欠く前記核酸認識モジュール；
（ｂ）標的中の既定の配列を認識するＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、モジュール（ａ）および前記ＤＢＤは天然には連結して見出されることはない、ＤＢＤ、ならびに
（ｃ）それによってターゲティング核酸の前記ターゲティングエレメントと前記ＤＢＤにより指示される（directed by）部位特異的改変が生じる、標的を改変するのに使用するためのエフェクター構成要素、ならびに
（ｄ）任意選択的に、または必要ならば、モジュール（ａ）、（ｂ）および（ｃ）が接合される第１のリンカーおよび／または第２のリンカーを含み、
前記ＤＢＤが、７０～７５以下のアミノ酸残基、例えば、３０マー以下、２５マー以下、２０マー以下、好ましくは１５マー以下のポリペプチド配列である、核タンパク質複合体を提供する。
【0007】
理論に縛られずに、ＤＢＤの意図された目的は、ハイブリダイズするためにターゲティング核酸配列がｄｓＤＮＡ構造に接近するのを促進するような様式で、既定の配列（ＰＤＳ）に結合すると標的とされるｄｓＤＮＡの構造を不安定化することである。そのような機能的能力は、例えば、ＤＮＡ構造を評価するための選択されたＰＤＳおよびＴ７エンドヌクレアーゼ１（Ｔ７Ｅ１）を含むｄｓＤＮＡを使用して、実施例１において例証されるように査定しうる。Ｔ７Ｅ１は、ｄｓＤＮＡにおいて構造的奇形を検出する構造選択酵素として周知である。ＤＢＤポリペプチドがＰＤＳに結合すると所望の構造変形を検出する他の方法は、認識される。
【0008】
ＤＢＤは単一の既定配列に対する結合親和性を有しうるが、１つを超える既定配列に結合する能力を有しうる。必要条件は、ＤＢＤが、ターゲティング核酸のターゲティングエレメントと協同して部位特異的改変を指示することである。しかし、ＤＢＤは必要な標的部位での位置決めのためのただの二次的ツール以上のものであると見なされており、ターゲティングエレメントのハイブリダイゼーションを促進し、それにより全体的な所望の標的改変を促進するのに構造的役割を有すると見なされている。したがって、この場合の短いＤＢＤポリペプチド配列の提供は、特定のＤＮＡ配列へのエフェクターまたはエフェクターの一部を配置するためだけに、例えば、亜鉛フィンガータンパク質またはＴＡＬＥアレイを使用することとは比較できないと認識される。
【0009】
一般的に、本発明のモジュラーポリペプチドのエフェクター構成要素は末端モジュールになる。好ましくは、核酸認識モジュール（例えば、ＲＳＢＤ）も末端モジュールになる。したがって、好ましくは、モジュラーポリペプチド構成要素は：
（ａ）前記核酸認識モジュール；
（ｂ）標的中の既定配列を認識する、（ａ）に直接連結された前記ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）であって、モジュール（ａ）および前記ＤＢＤは天然には連結して見出されることはない、ＤＢＤ；
（ｃ）標的を改変するのに使用するための、（ｂ）に直接連結されたエフェクター構成要素であって、それによってターゲティング核酸のターゲティングエレメントと前記ＤＢＤにより指示される部位特異的改変が生じる、エフェクター構成要素、ならびに
（ｄ）任意選択的に、または必要ならば、それぞれ前記エフェクター構成要素および前記核酸認識モジュールへの前記ＤＢＤの直接連結を提供する第１のリンカーおよび／または第２のリンカー
を含む。
（ａ）前記核酸認識モジュール；
（ｂ）標的中の既定配列を認識する、（ａ）に直接連結された前記ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）であって、モジュール（ａ）および前記ＤＢＤは天然には連結して見出されることはない、ＤＢＤ；
（ｃ）標的を改変するのに使用するための、（ｂ）に直接連結されたエフェクター構成要素であって、それによってターゲティング核酸のターゲティングエレメントと前記ＤＢＤにより指示される部位特異的改変が生じる、エフェクター構成要素、ならびに
（ｄ）任意選択的に、または必要ならば、それぞれ前記エフェクター構成要素および前記核酸認識モジュールへの前記ＤＢＤの直接連結を提供する第１のリンカーおよび／または第２のリンカー
を含む。
【0010】
モジュラーポリペプチド構成要素のモジュールは、一般に直線的に連結される。したがって、モジュール（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、例えば、Ｎ末端で（ａ）に、Ｃ末端でエフェクター構成要素にまたはその逆に直線的に接合されうる。このようにして、ターゲティング核酸とモジュラーポリペプチド構成要素の認識モジュールの相互作用はエフェクター構成要素から引き離されている。
【0011】
ターゲティング核酸は、ＲＮＡでよく、完全にＲＮＡであることが好ましい。核酸ターゲティングエレメントは、機能的目的の点でＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｇＲＮＡと比較可能であることが認識される。前述の通り、都合のよいことにはおよび好ましくは、このターゲティングエレメントは、コネクターを介して、モジュラーポリペプチド中の同族タンパク質またはペプチドモジュールに結合するＲＮＡスキャフォールド（多分、あるいはＲＮＡアプタマーと呼ばれる）を提供するＲＮＡモチーフと接合されうる。この場合、モジュラーポリペプチド構成要素のＲＮＡスキャフォールド認識モジュールは、ＲＮＡスキャフォールド結合ドメイン（ＲＳＢＤ）と呼ばれることもある。このように、核タンパク質複合体は、都合よく、（ｉ）コード核酸配列からＲＮＡとして発現することができる核酸構成要素（ＮＡＣ）および（ｉｉ）これも単一コード核酸配列から発現可能なモジュラーポリペプチド構成要素を含みうる。
【0012】
このように、好ましい実施形態では、標的核酸、例えば、標的ＤＮＡを改変するのに使用するための本発明の核タンパク質複合体は、（Ａ）完全な核酸構成要素（ＮＡＣ）および（Ｂ）モジュラーポリペプチド構成要素を含み、
ＮＡＣは：
（ｉ）標的の一領域に相補的であるターゲティングエレメント（ＴＥ）；
（ｉｉ）前記モジュラーポリペプチド構成要素のＲＮＡスキャフォールド結合ドメイン（ＲＳＢＤ）に特異的に結合するＲＮＡスキャフォールド（ＲＳ）および
（ｉｉｉ）前記ＴＥとＲＳを連結する接続配列
を含み、前記モジュラーポリペプチド構成要素は、連結された分離機能的モジュールとして：
（ａ）前記ＲＳＢＤ；
（ｂ）標的中の既定の配列を認識する、（ａ）に連結されたＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、モジュール（ａ）および前記ＤＢＤは天然には連結して見出されることはない、ＤＢＤ
（ｃ）標的を改変するのに使用するための、（ｂ）に連結されたエフェクター構成要素であって、それによってＮＡＣの前記ターゲティングエレメントと前記ＤＢＤにより指示される部位特異的改変が生じる、エフェクター構成要素、ならびに
（ｄ）任意選択的に、または必要ならば、それぞれ前記エフェクター構成要素およびＲＳＢＤに前記ＤＢＤを連結する第１のリンカーおよび／または第２のリンカー
を含み、
上で論じられるように、前記ＤＢＤは、７０～７５以下のアミノ酸残基、例えば、３０マー以下、２５マー以下、２０マー以下、好ましくは１５マー以下のポリペプチド配列である。図１を参照のこと。
ＮＡＣは：
（ｉ）標的の一領域に相補的であるターゲティングエレメント（ＴＥ）；
（ｉｉ）前記モジュラーポリペプチド構成要素のＲＮＡスキャフォールド結合ドメイン（ＲＳＢＤ）に特異的に結合するＲＮＡスキャフォールド（ＲＳ）および
（ｉｉｉ）前記ＴＥとＲＳを連結する接続配列
を含み、前記モジュラーポリペプチド構成要素は、連結された分離機能的モジュールとして：
（ａ）前記ＲＳＢＤ；
（ｂ）標的中の既定の配列を認識する、（ａ）に連結されたＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、モジュール（ａ）および前記ＤＢＤは天然には連結して見出されることはない、ＤＢＤ
（ｃ）標的を改変するのに使用するための、（ｂ）に連結されたエフェクター構成要素であって、それによってＮＡＣの前記ターゲティングエレメントと前記ＤＢＤにより指示される部位特異的改変が生じる、エフェクター構成要素、ならびに
（ｄ）任意選択的に、または必要ならば、それぞれ前記エフェクター構成要素およびＲＳＢＤに前記ＤＢＤを連結する第１のリンカーおよび／または第２のリンカー
を含み、
上で論じられるように、前記ＤＢＤは、７０～７５以下のアミノ酸残基、例えば、３０マー以下、２５マー以下、２０マー以下、好ましくは１５マー以下のポリペプチド配列である。図１を参照のこと。
【0013】
モジュラーポリペプチド構成要素の分離機能的モジュールは、独立して置換され、限定して直線的に連続して接合されるように単一核酸によりコード可能であることが都合がよいのは理解される。
【0014】
標的は、ウイルス核酸を含むいかなる標的核酸、ＲＮＡまたはＤＮＡでもよい。標的は、一本鎖ＤＮＡまたはもっと一般的には二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）でもよい。上記の本発明の核タンパク質複合体は、特に植物細胞およびヒト細胞を含む真核細胞において、ゲノムＤＮＡ改変を達成するための細胞への送達にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの代替案として特に好まれうる。
【0015】
上述の通りに、理論に縛られることなく、ＤＢＤは、二本鎖ＤＮＡにおける既定の配列のその特異的認識により二重らせんの融解および／または巻き戻しを助け、それにより標的核酸によるターゲティングおよび所望の部位でのエフェクター構成要素の作用を助けると考えられている。
【0016】
核局在化シグナル（ＮＬＳ）および／またはオルガネラ局在化シグナル、例えば、ミトコンドリアまたは葉緑体局在化シグナルは、真核細胞の核中への効率的輸送または所望の細胞オルガネラ中への効率的輸送のためにモジュラーポリペプチド構成要素の一部としても提供されうる。そのようなシグナル配列は一般にはＮまたはＣ末端で提供される。そのようなシグナル配列は、モジュラーポリペプチド構成要素の必要な機能が維持されるという条件で、１つまたは複数の追加の配列、例えば、エピトープタグなどの検出を助ける検出タグに接続してよい；図２５を参照のこと。
【0017】
エフェクター構成要素は、前記既定の配列に特異的に結合することはなく、一般に標的結合能力を欠く。しかし、エフェクター構成要素は、核酸ターゲティングエレメントおよびＤＢＤによる所望の改変の部位特異的ターゲティングを妨げないことが不可欠であるにすぎないことが認識される。これは、ある標的、例えば、ＤＮＡ、認識能力を有するエフェクター構成要素を排除しなくてよい。
【0018】
前述の通り、標的の改変は、構造的または化学的改変、例えば、ヌクレオチド配列の変更、または調節の変更、例えば、転写活性化でもよい。
【0019】
エフェクター構成要素は、例えば、本発明の２つの核タンパク質複合体を標的ＤＮＡ領域に適切に向けることにより、例えば、二量体化が起こると機能的ヌクレアーゼを形成できるＦｏｋ１ヌクレアーゼドメイン（すなわち、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼマイナスそのＤＮＡ結合ドメイン）を含む、ＤＮＡを改変することで知られているいかなるタイプのエフェクターでもよい。しかし、前述の通り、エフェクター構成要素は、下でさらに論じられるように、好ましくは、連結された自己集合性短ペプチドから形成される人工ヌクレアーゼを含みうる。そのような人工ヌクレアーゼは、それが標的とされる部位で二本鎖ＤＮＡの１つの鎖だけを切断する点で人工ニッカーゼとしての機能を果たしうる。エフェクター構成要素は、ニッカーゼが別の機能的構成要素、例えば、塩基エディターまたは逆転写酵素に連結されているまたはそれに置き換えられている融合タンパク質でよい。
【0020】
上述の通りに、ＤＢＤは、標的中の既定の配列、例えば、２～７、好ましくは、３～６ヌクレオチド、例えば、本明細書に例示されるｄｓＤＮＡ標的中の６ヌクレオチド配列５’ＧＡＧＧＴＣ３’に対する結合親和性で選択される、一般には、２０マー以下、例えば、１６マー～１８マー以下、好ましくは、１５マー以下の短いペプチドになる。ＤＢＤは、ゲノムのスキャニングを助け、所望の改変部位、例えば、切断部位の隣の最初の接触を確立すると予想される。さらに、標的ＤＮＡへのＤＢＤの結合は、構造変化およびそれに続く隣接部位での融解の引き金を引くと予想されることがさらに強調される。そのような巻き戻しは、ＴＥが相補性につい隣接する配列に問い合わせ、ＴＥがＲＮＡ配列である場合は、ＲＮＡ－ＤＮＡ複合体（Ｒ－ループ）を形成するのを助けるはずである。したがって、本発明のゲノム編集ツールのＤＢＤ構成要素は、ゲノム改変効率を改善するのに重要なモジュールであって、好ましくは少なくとも１つのターゲティングＲＮＡも発現するＡＡＶベクターからの発現に適している、短い全ポリペプチド構成要素長への願いを傷つけることなく提供できるモジュールと見なされる。
【0021】
本発明のゲノム編集ツールのモジュラーポリペプチド構成要素は、したがって、リンカーを有し、標的ＤＮＡ部位で人工ヌクレアーゼによってニッカーゼまたはヌクレアーゼ活性を提供する完全合成短ペプチドを含んでよい。モジュラーポリペプチド構成要素を用いるそのようなゲノム編集ツールは、「人工ペプチド性ゲノム編集ツール」を表すＡｐＧｅｔと呼ばれてきた。そのようなポリペプチド構成要素は、
Ｎ末端からＣ末端方向に融合された以下の構成要素：
－ ラムダＮ２２タンパク質に相当する２２アミノ酸のＲＳＢＤ、
Ｎ末端からＣ末端方向に融合された以下の構成要素：
－ ラムダＮ２２タンパク質に相当する２２アミノ酸のＲＳＢＤ、
【0022】
【化1】
【0023】
【化2】
－ ５’から３’の配列５’ＧＡＧＧＴＣ３’により表されるｄｓＤＮＡ配列に結合するＤＢＤ
【0024】
【化3】
【0025】
【化4】
－ ヌクレアーゼモジュール
【0026】
【化5】
からなる、
配列番号１のＡｐＧｅｔポリペプチド：
【0027】
【化6】
【0028】
ヌクレアーゼ（上の配列番号１に太字で示されている）は１０個の同一な７マーペプチド単位（ＩＥＩＤＩＨＩ；配列番号７）を有し、そのすべてが同じＮからＣ末端方向に４マーリンカーで連結されて（本明細書では非反転デカマーの例と呼ばれる）ベータターンならびに追加のＮおよびＣ末端隣接配列を与える。これにより折り畳みが可能になり、それにより同一のペプチド単位のデカマーは、連続モノマー単位が反対方向に配向して見える逆平行ベータシートに似た二次構造を生じさせることができる；図８ｂおよび図９を参照のこと。配列番号１のモジュラーポリペプチド構成要素は、本発明のＤＮＡ編集ツールの一部として、ｄｓＤＮＡの一本鎖を標的とされる部位で切断することができることが明らかにされている。したがって、人工ヌクレアーゼモジュールは、ニッカーゼの機能を与えると見なすことができ、したがって、人工ニッカーゼと呼んでもよい。より小型のそのようなゲノム編集ツールを達成できるほど、例えば、自己集合性ペプチドの多様性および／または他の構成要素の変動が低いヌクレアーゼが提供されると予想される。これには、同じパターンの任意の異なるペプチド配列および異なるペプチド配列の組合せも含まれる。
【0029】
配列番号１の人工ヌクレアーゼは、別のエフェクター構成要素、例えば、ＶＰ６４などの転写活性化因子または下で論じられる別のエフェクター構成要素で置換しうる。さらに、柔軟な（flexible）リンカーのうちの１つまたは両方が代替のリンカーにより置換されうることが認識される。したがって、例えば、人工ヌクレアーゼ（または代替のエフェクター構成要素）とＤＢＤの間のリンカー１は、リンカーＬ１ａ（配列番号６９）として指定されるリンカーにより置換されうる。ＲＳＢＤとＤＢＤの間のリンカー２は、例えば、リンカー２ｂ（配列番号７０）により例示されるもっと短いリンカーにより置換されうる。本発明のモジュラーポリペプチド構成要素中のリンカーは、種々雑多でありＤＢＤ結合部位と標的切断部位の任意のペアについて最適化されうる。そのような変動は、既知の標的配列情報および適切な試験に基づく長さ必要条件計算の問題であると認識される。そのようなリンカーは、タンパク質安定性および／または可溶性を増加させるようにも設計されうる。
【0030】
ラムダＮ２２タンパク質は、これが１９ヌクレオチドボックスＢラムダファージ配列を認識する周知の能力を備えた短い２２アミノ酸配列にすぎないことに基づいて上に配列番号１として提示された実例となるＡｐＧｅｔのためのＲＳＢＤとして選択された(Baron-Benhamou et al.(2004) Methods Mol. Biol. 257, 135-54)けれども、これはさらにまたは代わりに、ＲＮＡスキャフォールド、例えば、同じボックスＢ配列に対する所望の結合親和性を保持するその任意の変異体を含む、別のＲＳＢＤにより置換されてもよいことは認識される。ＲＳは、複数のＲＳＢＤの結合を促進するように縦一列になって使用できることはさらに認識される。ターゲティング核酸のＲＳとして提供されるボックスＢ配列と対合したラムダＮ２２タンパク質ＲＳＢＤは、本明細書の下でさらに論じられるいくつかの他の周知のＲＮＡアプタマー－ポリペプチド結合ドメイン対合のうちのいずれかにより置換しうる。
【0031】
小サイズのＡｐＧｅｔのポリペプチド構成要素は、標的とされるＤＮＡ鎖の切断を生じさせ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼおよびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ実体などのより大きな分子量タンパク質を用いるための公知の遺伝子編集システムと比べてシステムのＤＮＡスキャニングおよび認識効率を改善すると予想される。そのようなより大きな先行技術システムは、拡散速度がもっと低くなる。
【0032】
本明細書で提供される例証は、ＡｐＧｅｔマイナス任意のヌクレアーゼまたは他のエフェクター構成要素、すなわち、ＤＢＤに連結され、適切なターゲティング核酸と結合している核酸認識モジュール、例えば、ＲＳＢＤを含むだけなら、標的部位での転写を阻害するのに有用である可能性があることをさらに示している。そのようなシステムは、本明細書ではＡｐＧｅｔ－ｉシステムと呼ばれる。一部の例では、最終Ｃ末端リンカー配列、例えば、上の配列番号５のリンカーを付加してＡｐＧｅｔ－ｉポリペプチドを発現することが選択されうる。しかし、転写阻害のためには、ＡｐＧｅｔ－ｉポリペプチドマイナスそのようなリンカーが好ましくなる。
【0033】
本発明の核タンパク質複合体用のモジュラーポリペプチド構成要素が、発現系、例えば、大腸菌（E.coli）などの宿主細胞またはインビトロ発現系での、例えば、可溶性および／または精製および／または検出を助けるためにＮ末端および／またはＣ末端伸長のあるさらに長いポリペプチドの一部として最初に発現されてよいことは認識される。そのような伸長は、プロテアーゼ切断部位、例えば、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含んでよく、それによりプロテアーゼ切断が標的改変用の最終モジュラーポリペプチドで望ましくない配列を取り除く；図１０および３１を参照のこと。
【0034】
一部の場合では、膜を横断して、例えば、標的細胞中に送達することを促進する細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）またはドメインと呼ばれることもある、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を含むモジュラーポリペプチド構成要素を発現することが選択されうる。再び、そのようなドメインは、プロテアーゼ切断部位を提供するリンカーと一緒に提供しうる。そのようなＰＴＤは、Ｎ末端またはＣ末端に配置してよい。一般に、ＰＴＤは３つのタイプ：主にアルギニン、オルニチンおよび／またはリジン残基を含む、例えば、６～１２アミノ酸長のカチオン性ペプチド、分泌された成長因子およびサイトカインのリーダー配列などの疎水性ペプチドならびに細胞特異的ペプチドに分類できる。例示的なＰＴＤは、ＨＩＶ ＴＡＴタンパク質、ポリアルギニンペプチド配列、ＶＰ２２ドメイン(Zender et al. (2002) Cancer Gene Ther. 9,, 486-96)、ＰＤＸ１タンパク質形質導入ドメイン(Noguchi et al. (2003) Diabetes 52, 1732-1737)、切断型ヒトカルシトニンペプチド(Trehin et al. (2004) Pharma. Res. 21 1248-1256)およびポリリジン配列(Wender et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 13003-13008)のＰＴＤを含むがこれらに限定されない。正味電荷をほぼゼロまで減少しそれによって付着および細胞内への取込みを阻害するマッチングポリアニオン（例えば、Ｇｌｕ９またはＥ９）に切断可能なリンカーを介して接続されたポリカチオン性ＣＰＰ（例えば、Ａｒｇ９またはＲ９）を含む活性化可能なＣＰＰ（ＡＣＰＰ）が提供されうる(Aguilera et al. (2009) Integr. Biol. (Camb) 1, 371-381)。リンカーを切断すると、ポリアニオンが放出され、したがって、ポリアルギニンを局所的にアンマスクし、その固有の粘着性を活性化して膜輸送を促進する。
【0035】
本発明の核タンパク質複合体は、例えば、電気穿孔により活性複合体として、またはポリヌクレオチドにより発現されるポリペプチド構成要素とターゲティング核酸の一方もしくは両方と一緒に宿主細胞に送達されうる。
【0036】
したがって、さらなる態様では、宿主細胞での本発明の１つまたは複数の核タンパク質複合体を提供するための核酸または核酸の組合せが提供される。前述の通り、核酸は、好ましくは、例えば、本発明の人工ニッカーゼを含むモジュラーポリペプチド構成要素とターゲティング核酸の両方を発現できるベクター、例えば、ＡＡＶベクターでよい。１つよりも多い部位を標的とするために、１つよりも多いターゲティング核酸が宿主細胞に提供されてもよい。例えば、人工ニッカーゼを含む本発明の核タンパク質複合体のペアは、細胞へのベクター送達により、相同組換えのための配列鋳型と一緒におそらく単一のベクターにより提供されうる。
【0037】
本発明の核タンパク質複合体（単数または複数）の適用は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ／ｓｇＲＮＡを用いうるＤＮＡ改変のための完全一揃いの適用まで拡張する。したがって、本発明のさらなる態様として、本発明の１つもしくは複数の核タンパク質複合体または宿主細胞でのその提供のための１つもしくは複数の核酸を用いて１つまたは複数の標的核酸配列を改変するための方法が、ただし、主張されるそのような方法が、ヒトの生殖系列アイデンティティーを改変する方法またはヒトもしくは動物の身体自体で実行される医療の方法には拡張しないという条件で、提供される。前述の通り、望ましくは、１つまたは複数の核タンパク質複合体の提供のための単一のモジュラーポリペプチド構成要素は、ベクターからの発現により細胞において提供されうる。同じベクターは、好ましくは、必要な１つまたは複数のターゲティング核酸も発現しうる。
【0038】
本発明のさらにさらなる態様として、上で論じられる本発明の方法において使用するためにまたは治療的処置において使用するために、（ｉ）本発明のゲノム改変ツール用の少なくとも１つのモジュラーポリペプチド構成要素、またはそれをコードするポリヌクレオチドおよび（ｉｉ）前記ポリペプチド構成要素（複数可）と連結できる１つもしくは複数のターゲティング核酸、またはそれをコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドの組合せが提供される。前述の通り、ポリペプチド構成要素と１つまたは複数のターゲティング核酸の両方は、好ましくは単一ベクターから発現されうる。
【0039】
本明細書で論じられるＡｐＧｅｔ核タンパク質複合体において使用するための人工ヌクレアーゼが本発明のもう１つの態様を表すことは認識される。触媒残基を組み入れる自己集合性ペプチドクラスターの使用は、エステラーゼとしての機能を果たすまたはいくつかの他の酵素反応を提供する人工酵素を生成するために以前使用された。しかし、発明者らはこの場合、サイズを最小限に抑えそれによってゲノム編集ツールにおいてエフェクターモジュールを提供するのによく適した人工酵素を提供しつつ必要な機能を果たすように設計されたアプローチで、連結された自己集合性短ペプチドを使用して、ｄｓＤＮＡにおいてニッカーゼ機能を提供できる人工ヌクレアーゼをはじめて獲得した。個々のペプチド単位をこのようにして連結すれば、自己集合性の程度を制御するのにも役立つ。
【0040】
本発明のそのような人工ヌクレアーゼおよびゲノム改変核タンパク質複合体は、以下に続く図を参照して下でさらに詳細に論じられる。
【図面の簡単な説明】
【0041】
【図1】核酸構成要素（ＮＡＣ）およびモジュラーポリペプチド構成要素からなる本発明のゲノム編集ツールの模式図である。ＮＡＣは、ＴＥが、標的の鎖領域に相補的な配列を提供するターゲティングエレメントであるターゲティングＲＮＡである。ＲＳは、ＲＮＡスキャフォールド結合ドメイン（ＲＳＢＤ）に結合するＮＡＣのＲＮＡスキャフォールド部分であり、それによりＮＡＣはモジュラーポリペプチド構成要素と相互作用する。ＴＥおよびＲＳは、必要な結合が生じることができるように、２つの機能的結合配列を接合する接続配列を有する単一核酸を形成する。ＤＢＤは、モジュラーポリペプチド構成要素のＤＮＡ結合ドメインであり、このドメインは標的ＤＮＡの既定の配列（ＰＤＳ）を認識し、Ｌ１はＤＢＤをゲノム改変のためのエフェクタータンパク質、例えば、ヌクレアーゼ（二本鎖切断のためのエンドヌクレアーゼまたは一本鎖切断のためのニッカーゼ）、転写活性化因子もしくはリプレッサーまたはメチラーゼに連結させるリンカーであり、Ｌ２はＤＢＤとＲＳＢＤを連結するリンカーである。標的配列は、ＰＤＳに直ぐ隣接しているまたはＰＤＳから間隔を開けていることも可能である。
【図2】より具体的には、モジュラーポリペプチド構成要素が融合人工ヌクレアーゼを含むＡｐＧｅｔシステムの模式図である。ＴＥは、ニッカーゼ作用のために標的ＤＮＡ領域で配列にハイブリダイズするターゲティングＲＮＡのターゲティングエレメントである。ターゲティングＲＮＡの認識エレメントは、接続配列によりＴＥに接合され、ＲＮＡスキャフォールド結合ドメイン（ＲＳＢＤ）に結合するＲＮＡスキャフォールド（ＲＳ）を提供する。ＤＢＤは、標的ｄｓＤＮＡの一本の鎖上で既定の配列（ＰＤＳ）に結合するＤＮＡ結合ドメインである。Ｌ１およびＬ２はペプチドリンカーである。ＰＤＳにＤＢＤが結合すると、ＴＥのその相補的配列へのハイブリダイゼーションが促進される。
【図3-1】図３ａ～ｃ：１２マーポリペプチドを示す選択されたファージクローンによるｄｓＤＮＡ標的の特異的結合および巻き戻しの証拠である。ｄｓＤＮＡ標的は、２つのＰＤＳ配列：５’－ＧＡＧＧＴＣ－３’（ＰＤＳ１）および５’－ＡＣＧＧＧＴ－３’（ＰＤＳ２）を示した。選択されたファージクローンは、ＰＤＳ１（反応３、４、５、１０、１１および１２）またはＰＤＳ２（反応１、２、８および９）配列を含有するｄｓＤＮＡと一緒におよびＴ７Ｅ１ヌクレアーゼ（反応１～５）またはサーベイヤーヌクレアーゼ（反応８～１２）と一緒にインキュベートされた。モック反応は、選択されたファージクローンなしでの、Ｔ７Ｅ１（反応６および７）またはサーベイヤー（反応１３および１４）と一緒のｄｓＤＮＡのインキュベーションである。ファージクローンがｄｓＤＮＡに結合すると、部分的巻き戻しが生じることがあり、これがヘテロ二重鎖ＤＮＡに類似する構造を生成し、Ｔ７Ｅ１およびサーベイヤーヌクレアーゼによるエンドヌクレアーゼ的切断に対して適切な基質を提供し、それによってもっと速く遊走するＤＮＡバンドが生じる（図３ａの矢印を参照のこと）。Ｔ７Ｅ１およびサーベイヤー媒介切断の定量化は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用するデンシトメトリー分析により実施した。結果は、それぞれ図３ｂおよび３ｃに示されている。
【図3-2】同上。
【図4】ｄｓＤＮＡ標的およびｄｓＤＮＡ標的の巻き戻しにおける上で命名されたＰＤＳ１およびＰＤＳ２としての２つの６ｎｔ配列への化学的に合成されたペプチド１、２、３および４（実施例１における表２）の結合のためのＴ７Ｅ１酵素を使用する切断アッセイ結果である。矢印は、ｄｓＤＮＡ標的がＴ７Ｅ１エンドヌクレアーゼ的切断すると増大するバンドを示す。これらの結果は、６ｎｔ ＰＤＳ ５’－ＧＡＧＧＴＣ－３’に対するＤＮＡ結合ドメインとしてのペプチド１配列（配列番号４、表２では配列番号３７としても示され、ＧＧＳリンカー配列を組み入れる）の選択をもたらした。
【図5】ＲＮＡハイブリダイゼーションと共にＰＤＳへのペプチド結合によるｄｓＤＮＡ標的の特異的結合および巻き戻しを評価するためのＦＲＥＴ実験を説明する模式図である。結果は、５’から３’への配列ＧＡＧＧＴＣを有するＰＤＳ１へのペプチド１（表２に示される配列番号３７）の結合についても示されている。ＦＲＥＴシグナルは、ｄｓＤＮＡ標的を含有するＰＤＳ１を、ペプチドあり（２、４）のまたはペプチドなし（１、３）の５’ＦＡＭ－ＲＮＡと一緒にインキュベートすると決定された。ペプチド１の結合は、ＦＲＥＴシグナルの増加から明らかなように、ＰＤＳ１に隣接する配列へのＲＮＡのハイブリダイゼーションを促進することが示されている。
【図6】ターゲティングＲＮＡのターゲティングエレメント（ＴＥ）の考えられる代替鎖ハイブリダイゼーションを示す本発明のゲノム編集ツールの模式図である。ＲＳは、ＲＮＡスキャフォールド結合ドメイン（ＲＳＢＤ）を介してターゲティングＲＮＡをモジュラーポリペプチド構成要素に繋ぐためのＲＮＡスキャフォールドである。ＤＢＤは、短い既定の配列（ＰＤＳ）に結合してヘテロ二重鎖形成を促進するＤＮＡ結合ドメインである。ＤＢＤは、核酸改変のためにリンカーを介してＣ末端エフェクタータンパク質に連結されている。
【図7】７アミノ酸ペプチドＬＥＬＤＬＨＬ（ｂＤペプチド；配列番号８）の存在下でチオフラビンＴ（Ｔｈｔ）の発光シグナルであり、アミロイドβ－シート構造の生成を示す。
【図8】リジンまたはアルギニンなどの正電荷残基による疎水性残基の置換により増加する正電荷を有する隣接しているペプチド単位と連結した同一のベータシート形成ペプチドの（ａ）ペンタマーまたは（ｂ）デカマーを用いる人工ヌクレアーゼのための設計図である。Ｈ＝疎水性残基。Ｃ＝触媒アミノ酸。Ｎ＝負のデザインペプチド単位（分子間重合化を制限するまたは回避する）、この場合、増加する正電荷を有するＣ末端およびＮ末端ペプチド単位。Ｋ＝ベータシート形成ペプチドの疎水性残基と置き換わるリジン残基。Ｃ末端隣接ペプチドは、最終柔軟性可溶性テール、例えば、４マーＮＱＲＳを有してもよい。先行するペプチド単位のそれぞれは、例えば、ベータターンを提供する４アミノ酸残基のリンカーにより連結されている。
【図9】「非反転および反転」人工ヌクレアーゼ設計である。「非反転」とは、ヌクレアーゼの個々のベータ鎖単位がＮからＣ末端方向に同じ一次配列を共有していることを意味し、「反転」設計では、連続するベータ鎖単位の一次配列が反転している。ボックス１～７は、ＮからＣ末端方向へのベータペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図10】ＡｐＧｅｔの完全なモジュラーポリペプチド構成要素におけるペンタマーおよびデカマーベータタンパク質ヌクレアーゼの構築を説明する図である。ベータペプチド単位（黒色）は５個または１０個のベータペプチド単位を使用して構築される。単位は、接続ループのように一連のベータターンを使用して接続される。それぞれの設計は、分子間重合化を制限するために荷電残基（リジン、Ｋ）を組み入れる追加の隣接ベータペプチド単位、すなわち、負の設計（隣接する矢印）を含有する。ベータペプチド配列の配向は、平行または逆平行ベータシート折り畳みを模倣する試みで反転または非反転を模倣するように改変される（ＮからＣ末端方向へのベータペプチドのアミノ酸配列を示す図９のボックス１～７を再び参照のこと）。それぞれの人工ベータタンパク質ヌクレアーゼ設計のＮ末端は、完全な合成ゲノム編集システムに必要なモジュールの残りを提供するＡｐＧｅｔ－ｉタンパク質のＣ末端上にＡｐＧｅｔ－１．０タンパク質と同じようにリンカー１で融合される。ＡｐＧｅｔ－ｉは、タンパク質発現および可溶性を増強するためにいくつかの精製／可溶性タグを含有できる。Ｎ末端とＣ末端の両方で６ｘＨｉｓタグに融合されたマルトース結合タンパク質を提供するそのようなタグが示される。Ｃ末端Ｈｉｓタグは、スペーサー単位および全マルチエレメントタグを取り除くことができるＴＥＶ切断部位によりＡｐＧｅｔのＮ末端から分離される。
【図11】１０マーのＩｂＤペプチドを有するインビトロ転写および翻訳（ＩＶＴＴ）発現ＡｐＧｅｔ１．０タンパク質によるプラスミドＤＮＡ切断のゲル分析である。ＡｐＧｅｔ－ｉ（Ｃ末端にＡｐＧｅｔ１．０のＤＢＤ酵素リンカーを追加で含んで発現される）およびタンパク質なし対照は、バッファー組成によりまたはＩＶＴＴ混合物の混入タンパク質構成要素により可能になる活性について制御するためそれぞれのバッファー条件について実行された。プラスミドＤＮＡは、金属なしまたは５ｍＭのＭｎ２＋もしくはＭｇ２＋を含有する反応バッファーにおいてＡｐＧｅｔ１．０ １０マー非反転、反転、ＡｐＧｅｔｉおよび水対照について、同一量の全ＩＶＴＴタンパク質混合物（Ａｂ ２８０ｎｍにより）と混合された。Ｍｎ２＋存在下でのＩＶＴＴタンパク質とヌクレアーゼインヒビタータンパク質の切断を比較する二次反応も実行された。
【図12】大腸菌（E.coli）細胞においてＰＤＳ標的配列部位へのターゲティング核酸によるＡｐＧｅｔ－ｉの動員を試験するのに使用されるプラスミドの図である。
【図13】ＥＰＩ３００大腸菌（E.coli）細胞において（ａ）ｅＹＦＰ発現についてのディテクターおよび（ｂ）ＬａｃＺα発現についてのディテクターに対する転写活性を減少させるためのＡｐＧｅｔ－ｉを試験する結果である。例証での表５および６は、構築物試験をまとめている。提示される値は３通り行われた実験のｅＹＦＰ／ＯＤ６００またはＬａｃＺα／ＯＤ６００の平均値であり、標準偏差が示される。
【図14】大腸菌（E.coli）細胞において完全ＡｐＧｅｔシステムを試験するのに使用される「エディター」プラスミドおよび「ディテクター」プラスミドの図である。ＡｐＧｅｔモジュラーポリペプチド構成要素は配列番号１のアミノ酸配列であったが、人工ヌクレアーゼの代わりにＦｏｋ１ヌクレアーゼドメインを有していた。
【図15】図１４において例示される「エディター」および「ディテクター」プラスミドを使用して得られるＡｐＧｅｔ－ＦｏｋＩ編集の結果である。ＡｐＧｅｔ－Ｆｏｋ１ヌクレアーゼ構築物による編集は、選択培地上での細菌成長の減少をもたらす標的含有ディテクタープラスミドの消失から明らかである（バー１～３を参照のこと）。示される結果は、ＡｐＧｅｔ－ＦｏｋＩ発現エディタープラスミドと標的の「ＰＤＳｉｎ」配置および標的配列間に異なる長さのスペーサーを含有するディテクタープラスミドでのＥＰＩ３００大腸菌（E.coli）細胞の同時形質転換からである。編集活性の検出は、アンヒドロテトラサイクリン（ＡＴＣ）を用いたＡｐＧｅｔの誘導１日後にＯＤ６００を測定することによった。対照実験は、ＥＰＩ３００細胞中への、ＡｐＧｅｔ－ｉ発現エディター（ＡｐＧｅｔ構築物、ヌクレアーゼドメインを欠く）または非ＡｐＧｅｔ発現プラスミドとディテクタープラスミドの同時形質転換を含んだ。バーは、以下の：１．ＴＥおよび５ｎｔスペーサーディテクターを有するＡｐＧｅｔ－Ｆｏｋ１２．ＴＥおよび８ｎｔスペーサーディテクターを有するＡｐＧｅｔ－Ｆｏｋ１３．ＴＥおよび１４ｎｔスペーサーを有するＡｐＧｅｔ－Ｆｏｋ１４．ＴＥを有しＦｏｋ１および５ｎｔスペーサーディテクターなしのＡｐＧｅｔ５．ＴＥを有しＦｏｋ１および８ｎｔスペーサーディテクターなしのＡｐＧｅｔ６．ＴＥを有しＦｏｋ１および１４ｎｔスペーサーディテクターなしのＡｐＧｅｔ７．ベクター骨格単独および５ｎｔスペーサーディテクター８．ベクター骨格単独および８ｎｔスペーサーディテクター９．ベクター骨格単独および１４ｎｔスペーサーディテクターの通りであるＡｐＧｅｔ－Ｆｏｋ１構築物およびディテクター標的の発現に対応している。
【図16】細菌細胞において人工ヌクレアーゼを有するＡｐＧｅｔシステムを試験するのに使用した「エディター」プラスミドの概略図である。
【図17】細菌細胞において人工ヌクレアーゼを有するＡｐＧｅｔシステムを試験するのに使用した「ディテクター」プラスミドの概略図である。ディテクターは、ＰＤＳ標的配列エレメントのペアについて、「ＰＤＳ－ｏｕｔ」配置（構築物ｆ）または「ＰＤＳ－ｉｎ」配置（構築物ｇ）で設計された。ＰＤＳｉｎおよびＰＤＳｏｕｔディテクターの標的およびＰＤＳ配列は、図１４でのように、正確に相同性アーム間に位置しており、図１４での標的およびＰＤＳ配列と同一である。首尾よくいったターゲティングは、適切なＨＤＲ鋳型の存在下でナノルシフェラーゼ活性の観察により示される。ナノルシフェラーゼに対する相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型は、ＡｐＧｅｔを分離単位として発現する同じプラスミド上で構築された。
【図18】図１８および図１９は、本発明のゲノム編集ツールのペアが、標的ゲノムＤＮＡの両方の鎖を選択された部位で改変する、例えば、切断するのに用いられる場合の考えられる代替のヘテロ二重鎖相互作用を示す模式図である。図１８では、それぞれのポリペプチド構成要素はＦｏｋ１ヌクレアーゼドメインを含むものとして示される。２つのそのようなヌクレアーゼドメインは、標的ＤＮＡの反対鎖上の異なる配列を標的とする２つのターゲティングＲＮＡの使用により機能的エンドヌクレアーゼを提供するために二量体化されるものとして示される。２つのＤＮＡ結合ドメインは、それぞれが、Ｆｏｋ１エンドヌクレアーゼが切断する標的ＤＮＡの完全相補的領域においてＰＤＳに結合するものとして示される。ＰＤＳ配列は両方が、標的配列のペアの内側である。これは、ＰＤＳ－ｉｎ位置を用いると呼ばれる。図１９では、それぞれのポリペプチド構成要素は、例えば、本明細書に記載される融合人工ニッカーゼでもよい融合酵素を含むものとして示される。この場合、それぞれのＤＢＤは、異なる標的鎖とハイブリダイズする２つの異なるターゲティングＲＮＡのターゲティング配列により形成される単一ヘテロ二重鎖領域の外側でＰＤＳに結合するものとして示される。酵素ドメインのペアのそれぞれは、ヘテロ二重鎖領域内部の異なる鎖上で作用する。ＰＤＳ配列のペアは標的配列のペアの外側にあるので、この図式はＰＤＳ－ｏｕｔ位置を用いると呼ばれる。
【図19】同上。
【図20】図２０ａおよびｂ：破壊されたナノルシフェラーゼオープンリーディングフレームの相同性指向修復の引き金を引くことにより機能的ナノルシフェラーゼを回復するためのＡｐＧｅｔ編集の試験の結果である。種々の配置のＡｐＧｅｔ１．０（図１６）用の発現カセットを含み、ナノルシフェラーゼＨＤＲ鋳型用の発現カセットを有する種々のエディタープラスミドは、ナノルシフェラーゼの破壊されたオープンリーディングフレームを発現し標的を「ＰＤＳｉｎ」および「ＰＤＳｏｕｔ」配置で有するディテクタープラスミドで同時形質転換された（図１７）。ディテクターを有するＡｐＧｅｔ１．０の同時形質転換体のコロニーはＩＰＴＧを備えた液体培地においてまたは同じ構築物および対応する抗生物質についてＩＰＴＧありおよびなしで増殖され、Ｎａｎｏｌｕｃ／ＯＤ６００シグナルは次の日に分析された。エラーバーは３実験の標準偏差である。
【図21】ＰＤＳ１（５’－ＧＡＧＧＴＣ－３’）の変異体への結合に対する配列番号４のＤＢＤの柔軟性を評価するのに使用されるＡｐＧｅｔ－ｉ発現エディタープラスミドを図示している。
【図22】同上。
【図24】哺乳動物細胞系においてＡｐＧｅｔ変異体の一過性発現のために設計されたＡｐＧｅｔ発現プラスミド構築物の概略図である。
【図25】高コピー数の細菌複製起点および抗生物質耐性遺伝子と一緒に図２４に示されるプラスミド構築物中に組み入れられた変異ＡｐＧｅｔ発現単位の概略図である。それぞれの発現単位は、ＡｐＧｅｔのＮ末端で、ＲＳＢＤに連結する核局在化シグナルが先行する検出タグ（ＦＬＡＧ（登録商標）エピトープタグ）を提供した。
【図26】ＰＤ－Ｌ１遺伝子のエキソン４におけるＡｐＧｅｔターゲティング領域のレイアウトである。ＰＤ－Ｌ１標的部位と命名されたＴＥ結合領域には、ＰＤＳ部位が隣接している。ＴＥ結合領域の方向は、ＡｐＧｅｔに対するフォワードおよびリバース相補鎖結合部位を示す。
【図27】ＡｐＧｅｔをトランスフェクトされた細胞培養物におけるＰＤ－Ｌ１発現の減少を示す図である。それぞれの画像（ＩｍａｇｅＪ）由来の細胞試料におけるＰＤ－Ｌ１発現の定量化。エラーバーは、試料中の個々の細胞のシグナル強度の標準偏差である。
【図28】（ａ）ＰＤ－Ｌ１遺伝子中の標的領域のＡｐＧｅｔ媒介修復を調べるために実施例６（ｉｉ）で論じられるゲノム標的領域およびドナー鋳型構造の描写ならびに（ｂ）用いられる編集構成要素およびＨＤＲイベントのＰＣＲ確認についての試料結果を提示する表を提供する。
【図29】実施例（６）（ｉｉｉ）で報告されるＡｐＧｅｔ発現構築物を用いたＨＥＫ２９３細胞におけるＴＳＫＵ遺伝子のターゲティングを評価するのに使用されたプライマーのレイアウトを用いたゲノム参照配列を示す。
【図30】非処理試料とＡｐＧｅｔトランスフェクト試料の間の野生型配列からの置換のレベルを比較した、サンガーシーケンシングを使用する実施例（６）（ｉｉｉ）で報告される研究からのＴＩＤＥＲ分析である。
【図31】大腸菌（E.coli）発現系から精製された組換えＡｐＧｅｔタンパク質の配置である。配置は、実施例７で論じられる種々の精製、可溶性および切断タグを詳細に述べる。
【図32】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＳＣＬ－１遺伝子の転写活性化について実施例８で論じられるＡｐＧｅｔｉ－ＶＰ６４構築物を発現するために用いられる発現カセットの図解である。
【図33】異なるプロモーター位置を標的とする４つのＮＡＣと併せて発現されるＡｐＧｅｔｉ－ＶＰ６４構築物を使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＳＣＬ－１遺伝子の転写活性化の結果およびｄＣａｓ９－ＶＰ６４融合構築物との比較である。
【発明を実施するための形態】
【0042】
詳細な説明
本発明のゲノム編集ツールを提供するためのターゲティング核酸は一般にはＲＮＡになる。ターゲティングエレメント（ＴＥ）は標的ＤＮＡ上の配列に相補的である。「相補的」とは、ＴＥが標的配列とハイブリダイズしてそのターゲティング目的を果たすことと理解され、一般に、ＴＥは標的配列と完全に相補的になる。
本発明のゲノム編集ツールを提供するためのターゲティング核酸は一般にはＲＮＡになる。ターゲティングエレメント（ＴＥ）は標的ＤＮＡ上の配列に相補的である。「相補的」とは、ＴＥが標的配列とハイブリダイズしてそのターゲティング目的を果たすことと理解され、一般に、ＴＥは標的配列と完全に相補的になる。
【0043】
一般には、ＴＥは１５～２５ヌクレオチド、例えば、１５～２０または２１ヌクレオチド、好ましくは１８～２０または２１ヌクレオチドである。しかし、もっと長いまたはもっと短いＴＥ、例えば、約１０～３５ヌクレオチドのＴＥが一部の状況では実行可能になりうる。しかし、一本鎖核酸、例えば、一本鎖ＲＮＡでゲノム中の特定の配列を標的とするためには、選択された標的配列が巻き戻されしたがって接近可能状態であることが必要である。本発明者らは、この例では、例えば、３～６ヌクレオチドの近位の短い既定ｄｓＤＮＡ配列（ＰＤＳ）に結合できる小型のペプチドを提供することによりこれを助けることができると仮定した。理論に縛られたくはないが、ペプチド（ＤＮＡ結合ドメインまたはＤＢＤ）とＰＤＳの間の高親和性結合相互作用はｄｓＤＮＡヘリックスの隣接領域でワトソン－クリック塩基対合を不安定にすることがあり、それが今度はＴＥのその相補的標的領域へのハイブリダイゼーションを促進すると推論された。ＴＥがＲＮＡ配列である場合、それによってＲループ、すなわち、一本鎖ＤＮＡの配列が、その相補体が侵入してくるＲＮＡ鎖とＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドヘリックスを形成する間に置き換えられる、さもなければ二本鎖ＤＮＡの領域が形成される。前述の通り、このタイプのＤＮＡ結合ドメインは、必要なゲノム改変の効率を最適化するのを助ける本発明のゲノム編集ツールの不可欠な要素と見なされる。
【0044】
既定の配列へのそのようなＤＢＤの提供は、種々の方法により達成できる。そのような方法は、リガンド設計のためのコンピュータによる計算方法の使用を含んでよい。しかし、本明細書で例示される好ましい方法は、選択された標的ｄｓＤＮＡ配列に対する結合親和性を有する表示されたペプチドを選択するためのファージディスプレイペプチドライブラリーの使用である。そのようなバイオパニング法の使用は、ＧＧＳリンカーによりファージマイナーコートタンパク質ＩＩＩのＮ末端に融合された約１×１０９のユニーク１２アミノ酸長ペプチドを含有する市販のＭ１３ファージディスプレイライブラリーを使用してのＤＢＤ候補の選択により本明細書では例示される。実施例１を参照のこと。この手段により、組み入れられたＣ末端ＧＧＳを備えた好ましい１５マーペプチドが選択され（上の配列番号４を参照）、このペプチドは、ＰＤＳとしての考えられる選択を表す６マーｄｓＤＮＡ配列５’ＧＡＧＧＴＣ３’に結合する。これは用いてもよい１つのＤＢＤ－ＰＤＳ組合せだけを表す。他の所望の短いｄｓＤＮＡ配列に結合する多くの代替のＤＢＤペプチドを見つけうることが認識される。
【0045】
前述の通り、ＤＢＤは、例えば、７０～７５以下のアミノ酸残基、例えば、３０マー以下、２５マー以下、２０マー以下、好ましくは１５マー以下のポリペプチド配列でもよい。本発明のゲノム編集ツールのための全ポリヌクレオチド構成要素のサイズを最小限に抑えるという望ましさを踏まえつつ、しかし、１５以下のアミノ酸、例えば、約１２～１５アミノ酸のＤＢＤの提供が支持される（おそらく、Ｃ末端ではＧＧＳエレメントを含む）。さらに、ＤＢＤは必ずしも６ｂｐの認識を必要としないことがあると認識される。それは６ｂｐ未満、例えば、５’ＮＮＧＧ３’または５’ＧＧ３’が可能であろう。
【0046】
前述の通り、選択されたＤＢＤは、１つよりも多い既定の配列、例えば、１つよりも多い６マーｄｓＤＮＡ配列に対する結合親和性を有しうる。これは、異なるＤＮＡ部位で使用する柔軟性を提供するのに支持されうる。したがって、配列番号４の例示されるＤＢＤは、ＰＤＳとして５’ＧＡＧＧＴＣ３’以外のいくつかの６マーｄｓＤＮＡ配列が提示される場合、同じターゲティング核酸を用いるのが効果的であることが示された；実施例５および図２３ｂを参照のこと。例えば、配列５’ＴＴＧＧＴＡ３’、５’ＡＡＡＡＡＡ３’または５’ＡＡＡＧＴＣ３’のＰＤＳとも対合することは特に支持されうる。
【0047】
ＤＢＤは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、例えば、Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲシステムがＰＡＭ制限のために接近できないゲノムの部分を標的とするのに選択しうる。ＤＢＤは、例えば、ＣＧＧ領域においてＣａｓ９ ＰＡＭ、すなわち、５’－ＮＧＧ－３’を提供する領域よりむしろゲノムのＡＴリッチ領域に結合するように特に設計しうる。
【0048】
ターゲティング核酸構成要素は、モジュラーポリペプチド構成要素のモジュールが結合しなければならない。好ましくは、これは末端モジュールになる。この相互作用は、核酸をポリペプチド構造中の認識ドメインと連結することで種々の手段により知られうる。例えば、ターゲティング核酸構成要素は、モジュラーポリペプチド構成要素との相互作用のためのその認識エレメントとして、特異的結合ペアのメンバーである非核酸標識を提示しうる。これは、モジュラーポリペプチド構成要素により提示されるその結合パートナーと結合する。例として、特異的結合ペアは、ビオチン－ストレプトアビジンでもよくまたは核酸は抗原エピトープと結合していてもよく、その場合、モジュラーポリペプチドの認識ドメインはエピトープに結合するためのＳｃＦＶを含んでいてよい。しかし、さらに好ましくは、ターゲティング核酸構成要素がＲＮＡである場合、前述の通り、提供される認識エレメントは、本明細書ではＲＮＡスキャフォールド結合ドメイン（ＲＳＢＤ）と呼ばれるポリペプチド構成要素のモジュールに結合するＲＮＡモチーフ（あるいは、ＲＮＡスキャフォールドと呼ばれる）になる。多くのそのような天然に存在するＲＮＡスキャフォールド－ＲＳＢＤ相互作用が知られており、多くの場合、文献では、ＲＮＡ配列をタンパク質ドメインに繋ぐためのＲＮＡアプタマー－結合ドメイン相互作用と呼ばれる。そのような結合複合体の例は、（ｉ）１９ｎｔボックスＢ ＲＮＡモチーフおよびラムダファージアンチターミネーターＮタンパク質（ラムダＮ２２ペプチド；上記配列番号２を参照）のその同族２２アミノ酸ＲＮＡ結合ドメイン、（ｉｉ）ＭＳ２ファージオペレータステム－ループおよびそのためのＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）結合ドメイン配列、（ｉｉｉ）ＰＰ７ファージオペレータステム－ループ配列およびそのためのＰＰ７ファージコートタンパク質（ＰＣＰ）結合ドメイン配列、（ｉｖ）ファージＣｏｍ ＲＮＡスキャフォールド配列およびそのためのファージＣｏｍ結合ポリペプチド、（ｖ）テロメラーゼＲＮＡ Ｋｕ結合モチーフおよびそのＫｕタンパク質またはＲＮＡ結合セクションならびに（ｖｉ）テロメラーゼＲＮＡ Ｓｍ７結合モチーフおよびそのＳｍ７タンパク質またはＲＮＡ結合セクションを含む。しかし、非天然ＲＮＡアプタマーまたはスキャフォールドは、モジュラーポリペプチド構成要素の合成結合ドメインに結合するターゲティングＲＮＡの認識エレメントとして好まれうる。したがって、上記の天然に存在するＲＮＡスキャフォールド－ＲＳＢＤペアのいずれも、必要な結合親和性が維持されるという条件で、そのペアのどちらかのまたは両方のメンバーが突然変異配列である変異体で置換しうる。ファージディスプレイペプチドライブラリーは、ＲＮＡスキャフォールド、例えば、１つ以上のヘアピンを含むＲＮＡ構造に適したペプチド結合活性の同定のためにペプチド－ＲＮＡスキャフォールド結合ペアまたはペプチドライブラリーの代替のパニングを達成するのに再び用いてもよい。ＲＮＡスキャフォールドの長さは好ましくは、約１５と２５ヌクレオチドの間、例えば、ラムダボックスＢ配列により例示されるように１９～２０ヌクレオチドであるべきである。ＲＮＡスキャフォールド－ＲＳＢＤペアは、高親和性相互作用を提供するためおよびいかなる宿主ゲノム配列とのスキャフォールド配列のオフターゲット非特異的相互作用をも減らすことを視野に入れて複数の接触点を有する。
【0049】
ターゲティング核酸もしくはそのＲＮＡスキャフォールドエレメントおよび／またはコネクター配列が１つもしくは複数の改変ヌクレオチドおよび／または１つもしくは複数の改変ヌクレオチド間結合を組み入れることは選択しうる。この目的での改変ヌクレオチドは、例えば、２’－Ｏ－メチル類似体、２’－フルオロ類似体または２’デオキシ類似体を含みうる。２’ヒドロキシル基が２’Ｃ，４’－Ｃ－オキシメチレン結合を形成する糖環の４’炭素原子に連結されて、それによって二環式糖部分を提供するロックド核酸（ＬＮＡ）モノマーの使用を想定してもよい。２－アミノプリン、５－ブロモウリジン、５－メチルシチジンおよび５－メトキシウリジンなどの改変塩基を用いてもよい。１つまたは複数のヌクレオチド間結合は、例えば、ホスホロチオエート結合でもよい。細胞環境において安定性および必要な活性を助けるためにＲＮＡオリゴヌクレオチドを改変するためのそのような方法は周知であり、いかなるそのような方法も、本発明に従って使用するためのターゲティング核酸を設計する際に利用されうる。ターゲティング核酸の化学合成を核タンパク質複合体のＲＮＰ送達のために実行できる場合には、そのようなＲＮＡオリゴヌクレオチド改変が想定されうることは認識される。
【0050】
その同族結合タンパク質に対する結合親和性を保持し本発明のターゲティング核酸において用いうる改変野生型ファージアプタマーの特定の例として、国際公開第２０２２／０１１２３２号パンフレット（Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ ａｎｄ Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｉｎｃ；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ １３ Ｊａｎｕａｒｙ ２０２２）でＲＮＡステム－ループモチーフとして教示されるＭＳ２ステム－ループ変異体、例えば、Ａがステム－ループの５’末端から１０位の２’－デオキシ－２－アミノプリンまたは２’－リボース－２－アミノプリンに変更されるＭＳ２モチーフ変異体（同じ公開ＷＯ出願の図２Ｂに示されるＦ－５変異体置換ａ）を参照しうる。
【0051】
一部の例では、システムの効率を増強するためにまたはＲＳＢＤを介して１つよりも多いタンパク質との相互作用を促進するためにターゲティングＲＮＡ上に２つ以上のＲＮＡスキャフォールド（同じまたは異なる）、例えば、コネクター配列により分離された直列の２つの異なるＲＮＡスキャフォールドを提供することが望ましい可能性がある。このようにして、単一ターゲティングＲＮＡは、本発明の核タンパク質複合体用の同じでも異なっていてもよい１つよりも多いモジュラーポリペプチド構成要素と相互作用することがある。１つよりも多いＲＮＡスキャフォールドを有するそのようなターゲティングＲＮＡは、適切なＲＳＢＤに接合している別のエフェクター構成要素、例えば、塩基エディターを動員するのにも使用しうる。
【0052】
本明細書で報告される概念研究の最初の証明を目的として、前述の通り、ボックスＢ ＲＮＡモチーフは、その同族結合ペプチド、ラムダＮ２２
【0053】
【化7】
【0054】
ターゲティング核酸の選択された認識エレメントが何であれ、例えば、２、３、４、５または６ヌクレオチドの短いコネクター配列が一般に、必ずしもではないが、ターゲティングエレメントと認識エレメントの間に提供されて、それぞれその相補的配列と結合ドメインの両方への正確な結合を促進する。ＲＮＡスキャフォールドは、核酸構成要素の５’または３’末端に置くことができる。したがって、下に与える実施例では、ＲＮＡ核酸構成要素は、短いコネクターＡＡＴＴＴが太字で示されるＢｏｘＢ ＲＮＡスキャフォールド配列に融合されている以下の配列の５’末端に融合されていた。
【0055】
【化8】
【0056】
この配列でのコネクターは、代替の配列が、接合したターゲティングエレメント（ＴＥ）とＲＮＡスキャフォールド（ＲＳ）の両方の正確な機能を可能にするという条件で、代替の配列により置換しうることが認識される。その上、ＴＥまたはＲＳは５’末端配列でもよい。
【0057】
本発明の遺伝子編集ツール用のターゲティング核酸中のＴＥは、ｄｓＤＮＡのどちらかの鎖に結合するように設計しうる。図６を参照のこと。
【0058】
完全なモジュラーポリペプチド構成要素は、それぞれのモジュールがその所望の目的を果たす能力を有するようにも設計しなければならず、したがって、１つまたは２つのモジュール間リンカーを必要としうることが認識される。したがって、ターゲティング核酸を繋ぐため、選択されたＤＢＤおよびエフェクター構成要素と認識ドメインのうちの１つまたは両方の間でリンカー－図１、２および６のいずれかのリンカー１および２として示される異なるリンカーペプチドのうちの１つまたは両方、が提供されうる。二次構造も望ましくないドメイン相互作用も与えないこの目的に適したリンカーは周知である；例えば、Chen et al. (2013) Adv. Drug Deliv. Rev. 65, 1357-1369, 'Fusion Protein Linkers: Property, Design and Functionality'を参照のこと。一般に、例えば、一続きのグリシンおよびセリン残基またはＸＴＥＮペプチドリンカーで構成された柔軟なリンカーが好ましい (Komor et al, “Programmable Editing of a Target Base in Genomic DNA without Double-Stranded DNA Cleavage.” Nature 533 (7603) p.420-424)。適切なリンカーは、２～１５またはそれよりも多いアミノ酸長、例えば、（Ｇｌｙ）ｎまたは（ＧＧＧＧＳ）ｎでもよい。実施例８の研究に用いられるリンカー１ａも参照のこと。一部の例では、１５アミノ酸よりもはるかに長い柔軟なリンカー、例えば、ＲＳＢＤとＤＢＤを連結する配列番号１のＡｐＧｅｔ中のリンカーにより例示される最大３５アミノ酸－（ＧＧＧＧＳ）７が好まれることがある。実施例８で用いられるこのリンカーの短縮バージョン（ＧＧＧＧｓ）６も参照のこと。いかなるそのようなリンカーの長さも、好ましくは、モジュラーポリペプチド構成要素の完全長ができる限り低い、例えば、本明細書に記載される人工ヌクレアーゼを含む場合、例えば、好ましくは２２０～２５０以下のアミノ酸であるという願いを視野に入れて、最小限に抑えうる。しかし、例えば、異なるエフェクター構成要素を使用するならば、もっと長い、例えば、３００アミノ酸長またはそれよりも長いモジュラーポリペプチド構成要素が一部の場合では必要とされうる。
【0059】
上文に示されるエフェクター構成要素は、（ｉ）二本鎖切断を生じさせるためのエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼドメイン、（ｉｉ）ニッカーゼ、（ｉｉｉ）ＶＰ６４などの転写活性化因子、（ｉｖ）転写リプレッサー、（ｖ）エピジェネティックモジュレーター酵素、（ｖｉｉ）リコンビナーゼ、（ｖｉｉｉ）トランスポザーゼ、（ｉｘ）インテグラーゼおよび（ｘ）例えば、塩基エディターと共に本明細書に記載される人工ニッカーゼなどのニッカーゼを含む核酸塩基修飾酵素構築物を含むＤＮＡを改変する（構造または調節を改変する）のに使用するための多様な範囲の部分のいずれかでよい。
【0060】
前述の通り、エフェクター構成要素はＤＮＡ結合能力がないことが好まれうるけれども、エフェクター構成要素がある程度のＤＮＡ結合能力を有することは、それがターゲティングエレメントおよびＤＢＤにより指示される部位特異的改変を妨げないという条件で、排除されない。例えば、ゲノム中への外因性核酸の部位特異的挿入のために、Ｃａｓ９タンパク質をトランスポザーゼまたはＨＩＶインテグラーゼと融合させることは知られている。トランスポザーゼまたはインテグラーゼは、今記載されているゲノム編集用のモジュラーポリペプチド構成要素中のエフェクター構成要素として同様に用いてもよく、同時供給される外因性核酸の部位特異的挿入は、ＤＢＤの結合により促進されるターゲティングエレメントのその相補的配列へのハイブリダイゼーションにより指示される。
【0061】
しかし、上述の通り、今下でさらに記載される人工ニッカーゼの提供が特に好ましい。エフェクター構成要素は、例えば、おそらく本明細書に記載される人工ヌクレアーゼを含むニッカーゼが塩基エディターまたは逆転写酵素と一緒に提供される融合構築物でもよい。
【0062】
人工ヌクレアーゼ
ベータシート構造を形成する連結された自己集合性ペプチドのマルチマーを含み、
（ｉ）前記マルチマーの自己集合性ペプチドがそれぞれ交互パターン（alternating pattern）の疎水性と親水性残基を示し、それぞれのそのようなペプチドの親水性残基のすべてまたは少なくとも一部分がアミノ酸の触媒三残基（catalytic triad）または３つよりも多い触媒アミノ酸を表し、それにより前記マルチマーはｄｓＤＮＡを両方の鎖でまたは単一の鎖で切断することができ、すなわち、ニッカーゼ活性を示し；
（ｉｉ）自己集合性ペプチドはリンカーにより接合されて、マルチマー数を、例えば、２０以下に、例えば、４～１５または１６に、好ましくは１０以下に、さらに好ましくは５～１０に制限すし、
（ｉｉｉ）Ｎ末端およびＣ末端隣接配列は、１つまたは複数の正電荷残基の包含に起因して、例えば、１つまたは複数のリジンまたはアルギニン残基の包含により、マルチマーのペプチド単位と比べて正電荷が増加しているヌクレアーゼタンパク質のマルチマー間での凝集を防ぐまたは制限するためにマルチマーに連結されて提供される、人工ヌクレアーゼが今や提供される。Ｎおよび／またはＣ末端でマルチマーをキャッピングする他の手段を用いて、例えば、可溶性および／または安定性を助けることにより実行を助けてもよい。
ベータシート構造を形成する連結された自己集合性ペプチドのマルチマーを含み、
（ｉ）前記マルチマーの自己集合性ペプチドがそれぞれ交互パターン（alternating pattern）の疎水性と親水性残基を示し、それぞれのそのようなペプチドの親水性残基のすべてまたは少なくとも一部分がアミノ酸の触媒三残基（catalytic triad）または３つよりも多い触媒アミノ酸を表し、それにより前記マルチマーはｄｓＤＮＡを両方の鎖でまたは単一の鎖で切断することができ、すなわち、ニッカーゼ活性を示し；
（ｉｉ）自己集合性ペプチドはリンカーにより接合されて、マルチマー数を、例えば、２０以下に、例えば、４～１５または１６に、好ましくは１０以下に、さらに好ましくは５～１０に制限すし、
（ｉｉｉ）Ｎ末端およびＣ末端隣接配列は、１つまたは複数の正電荷残基の包含に起因して、例えば、１つまたは複数のリジンまたはアルギニン残基の包含により、マルチマーのペプチド単位と比べて正電荷が増加しているヌクレアーゼタンパク質のマルチマー間での凝集を防ぐまたは制限するためにマルチマーに連結されて提供される、人工ヌクレアーゼが今や提供される。Ｎおよび／またはＣ末端でマルチマーをキャッピングする他の手段を用いて、例えば、可溶性および／または安定性を助けることにより実行を助けてもよい。
【0063】
ベータシートにより構造は、望ましくはアミロイド様ベータシート構造として理解される。自己集合性ペプチドは、例えば、逆平行ベータシートを獲得することを視野に入れて選択され連結されうる。それぞれのそのようなペプチド間のリンカーは、同じまたは異なる長さを有することができる。したがって、リンカー長は、２～２５アミノ酸でよく、例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２マーリンカーを選択しうる。ベータターンまたはベータターン様ループを提供するのに適した短いリンカー、例えば、４マーは、下でさらに論じられ例示されるように、天然のタンパク質中でのそのようなターンのアミノ酸組成の知識に基づいて設計しうる。
【0064】
適切な自己集合性ペプチド（あるいは、単一折り畳み構造でのように、折り畳みペプチドと呼ばれる）は、チオフラビンＴ（Ｔｈｔ）結合により同定することができる構造を形成する。チオフラビンＴ結合の蛍光放射アッセイは、アミロイド線維を検出するために一般に用いられる。アミロイド線維に結合すると、ＴｈＴは、４５０ｎｍで励起された場合おおよそ４８２～４８５ｎｍで強力な蛍光シグナルを発する(Xue et al. (2017) Royal . Soc. Open Sci. 4: 160696, 'Thioflavin T as an amyloid dye: fibril quantification, optimal concentration and effect on aggregation)。
【0065】
Ｃ末端隣接配列は、好ましくは、そのＣ末端で可溶性を助ける柔軟なテール配列、例えば、４マーＮＱＧＳ［配列番号１０］またはもっと長い配列も提供しうる。
【0066】
別々の酵素実体としてまたは融合構築物の一部としての産生では、人工ヌクレアーゼを含むそのようなポリペプチドは、望ましくは、精製および／もしくは可溶性を助けるためにＮ末端タグ、例えば、精製を助けるためにＨｉｓタグ、例えば、ヘキサＨｉｓタグ、または可溶性を助けるために１つもしくは複数のＨｉｓタグを含むタグおよび／もしくはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）などの配列と一緒に産生されてもよい。好ましくは、そのようなタグは、例えば、ＳＵＭＯまたはＴＥＶタグから選択される切断可能タグになる。したがって、適切なタグは、ＭＢＰに連結された６ｘ Ｈｉｓを、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位から短いスペーサーにより分離されたさらなるＣ末端６ｘ Ｈｉｓタグと一緒に含みうる；図１０を参照のこと。
【0067】
エフェクター構成要素として本発明の合成ゲノム編集ツールへの包含では、本明細書で開示される人工ニッカーゼが好ましい。しかし、本発明はもっと一般的には、今教示される人工ヌクレアーゼを含むまたはそれからなるポリペプチドまで拡大することが認識される。
【0068】
前記マルチマーの自己集合性ペプチドは、上で論じられた配列番号６の人工ヌクレアーゼにおけるように、同一でもよいことは認識されるが、同じ長さ、例えば、７マーの２つ以上の非同一ペプチドを使用することを選択しうる。好ましくは、自己集合性ペプチドの交互疎水性残基は、Ｎ末端残基で始まる、ロイシンおよび／またはイソロイシン、最も好ましくは、イソロイシンでよい。しかし、疎水性アミノ酸残基は、例えば、バリンを含む任意の疎水性アミノ酸残基からも選択してよい。長さは、例えば、６マー～１５マー、好ましくは、７マー～１１マー、例えば、７マーまたは９マーでよいが、７マー、好ましくは、Ｎ末端残基から始まって交互イソロイシン残基を有する７マーが好まれる。
【0069】
マルチマーのペプチドはＮ末端からＣ末端方向に連続して連結されてよくまたは交互ペプチドは全体を通してまたは部分的に逆転させてもよく、便宜上、好ましくは同一になることが認識される。したがって、７マーの自己集合性ペプチドで形成されるマルチマーは：
（ｉ）非反転マルチマー：（Ｈ－Ｃ１－Ｈ－Ｃ２－Ｈ－Ｃ３－Ｈ－（Ｘ）ｎ－Ｈ－Ｃ１－Ｈ－Ｃ２－Ｈ－Ｃ３－Ｈ）ｎ
または
（ｉｉ）反転マルチマー：（Ｈ－Ｃ１－Ｈ－Ｃ２－Ｈ－Ｃ３－Ｈ－（Ｘ）ｎ－Ｈ－Ｃ３－Ｈ－Ｃ２－Ｈ－Ｃ１－Ｈ）ｎ
として表してもよく、
Ｈ＝疎水性残基、好ましくは、ロイシンまたはイソロイシン、最も好ましくは、イソロイシン、
Ｃ１、Ｃ２およびＣ３はそれぞれが異なる触媒アミノ酸であり、
Ｘは、多様であってよいアミノ酸リンカー、例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２マーのいずれか、好ましくは、ベータターンまたはベータターン様ループを提供する目的で設計された４マー、例えば、ＮＤＧＧ、ＤＳＳＧ、ＳＳＧＳ、ＮＮＧＮ、ＧＳＤＧ、ＧＮＳＧ、ＤＮＧＧ、ＤＳＤＧ、ＳＳＳＧ、ＧＳＥＧ、ＧＤＳＧ（配列番号１１～２１）ならびにグリシン（Ｇ）、極性アミノ酸セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、およびスレオニン（Ｔ）ならびに荷電アミノ酸であるグルタミン酸（Ｅ）およびアスパラギン酸（Ｄ）から選択されるアミノ酸の組合せからなる他のリンカーを表す。そのようなリンカーは、マルチマーサイズを制御するために任意の適切な自己集合性ペプチドと一緒に、ならびに所望のベータ構造設計の安定化および可溶性を助けることを視野に入れて用いてよい。考えられる選択肢は、提供された例示を考慮するタンパク質構造分析および設計の分野の当業者により容易に識別しうる。
（ｉ）非反転マルチマー：（Ｈ－Ｃ１－Ｈ－Ｃ２－Ｈ－Ｃ３－Ｈ－（Ｘ）ｎ－Ｈ－Ｃ１－Ｈ－Ｃ２－Ｈ－Ｃ３－Ｈ）ｎ
または
（ｉｉ）反転マルチマー：（Ｈ－Ｃ１－Ｈ－Ｃ２－Ｈ－Ｃ３－Ｈ－（Ｘ）ｎ－Ｈ－Ｃ３－Ｈ－Ｃ２－Ｈ－Ｃ１－Ｈ）ｎ
として表してもよく、
Ｈ＝疎水性残基、好ましくは、ロイシンまたはイソロイシン、最も好ましくは、イソロイシン、
Ｃ１、Ｃ２およびＣ３はそれぞれが異なる触媒アミノ酸であり、
Ｘは、多様であってよいアミノ酸リンカー、例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２マーのいずれか、好ましくは、ベータターンまたはベータターン様ループを提供する目的で設計された４マー、例えば、ＮＤＧＧ、ＤＳＳＧ、ＳＳＧＳ、ＮＮＧＮ、ＧＳＤＧ、ＧＮＳＧ、ＤＮＧＧ、ＤＳＤＧ、ＳＳＳＧ、ＧＳＥＧ、ＧＤＳＧ（配列番号１１～２１）ならびにグリシン（Ｇ）、極性アミノ酸セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、およびスレオニン（Ｔ）ならびに荷電アミノ酸であるグルタミン酸（Ｅ）およびアスパラギン酸（Ｄ）から選択されるアミノ酸の組合せからなる他のリンカーを表す。そのようなリンカーは、マルチマーサイズを制御するために任意の適切な自己集合性ペプチドと一緒に、ならびに所望のベータ構造設計の安定化および可溶性を助けることを視野に入れて用いてよい。考えられる選択肢は、提供された例示を考慮するタンパク質構造分析および設計の分野の当業者により容易に識別しうる。
【0070】
好ましくは、すべての自己集合性ペプチドは、ＮからＣ末端方向に連結される。このようにして、連続モノマー単位の集合は、下でさらに論じられるように、逆平行ベータシート構造で提供されうる。図８および９を参照のこと。
【0071】
Ｃ１、Ｃ２およびＣ３は、ｄｓＤＮＡの一本鎖に切れ目を入れることができることで知られている天然に存在するヌクレアーゼの異なるアミノ酸のトリオ、例えば、そのようなヌクレアーゼの既知の触媒三残基に対応しうる。好ましくは、選択された触媒アミノ酸は、エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ中に存在するＲｕｖＣヌクレアーゼドメインの触媒アミノ酸、すなわち、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）およびヒスチジン（Ｈ）に対応しうる。
【0072】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼ中に存在するＲｕｖＣヌクレアーゼドメインは、４つの触媒アミノ酸、Ｈｉｓ９８３、Ａｓｐ９８６、Ａｓｐ１０およびＧｌｕ７６２を有すると報告されていた。これらの触媒アミノ酸のいずれかの突然変異は、機能の消失をもたらすことが明らかにされた(Nishimasu et al. (2014) Cell 156, 935-949)。しかし、上記のマルチマーという文脈では、簡略化のために交互の疎水性残基を有する同一のペプチド単位、例えば、単一のＨｉｓ、ＡｓｐおよびＧｌｕだけを用いることが可能であり、それによりペプチド単位は超分子構造のような安定なβシートを形成する傾向を維持し、必要な触媒アミノ酸残基すべてが、機能しているニッカーゼに近接されることが明らかにされた。
【0073】
したがって、例として、上記の結合のための好ましい７アミノ酸ペプチドはＩＥＩＤＩＨＩである。このペプチドは、５～１１の間のいずれかの異なる長さのアミノ酸で作ることもできると考えられる。本発明の人工ヌクレアーゼでは、そのようなペプチドは、任意選択的に、マルチマー構造において、前述のアスパラギン酸（Ｄ残基）を提供するリンカー配列に融合させうる。Ｄ残基は、完全なヌクレアーゼの可溶性を潜在的に増加させることを視野に入れてベータターン設計中に組み入れてよい。
【0074】
上述の通り、同一自己集合性ペプチドのマルチマーは、凝集傾向を減少させるために、正電荷が増加したＮ末端およびＣ末端配列が隣接する。これは、正電荷残基による、マルチマー用の自己集合性ペプチドに他の点では同一であるペプチドにおける少なくとも１つの疎水性残基の置換、例えば、好ましくはリジンによる疎水性残基の置換によるものでよい。例えば、マルチマーが、ロイシンまたはイソロイシンから始まる交互の疎水性および触媒残基の７マー単位、好ましくは、例えば、ＩＥＩＤＩＨＩの７マー単位で形成される場合、そのようなＣ末端およびＮ末端単位は、Ｎ末端から３位および／または５位でのイソロイシンに対する正電荷アミノ酸、例えば、リジン（Ｋ）残基置換を除いて同一配列を有してよい。したがって、Ｎ末端隣接配列は、同一ペプチド単位のマルチマーの第１の７マーペプチド単位への結合のために、４マー連結配列に融合したＩＥＫＤＩＨＩ（配列番号２２）またはＩＥＩＤＫＨＩ（配列番号２３）でもよい。Ｃ末端隣接配列は、追加のＣ末端テール配列を有する同じ配列から選択しうる。したがって、Ｎ末端隣接配列はＩＥＫＤＩＨＩでよく、Ｃ末端隣接配列はＩＥＩＤＫＨＩでよく、またはその逆でもよい。１つまたは両方のリジン残基は、交互正電荷残基、例えば、アルギニンでよい。このようにして、例えば、そのような隣接単位が１０の同一ペプチドのマルチマーに連結されている場合は、ヌクレアーゼ集合体の反発が存在する。前述の通り、Ｃ末端テール配列は、可溶性を助けるように選択しうる、例えば、ＮＱＧＳである。
【0075】
連結された合成ペプチドから完全に形成されるそのような機能的ニッカーゼの例示により、以下の通り：
【0076】
【化9】
すべてＮからＣ末端方向に個々のペプチド単位として代わりに表すことができる配列番号６のアミノ酸配列が提供される。
【0077】
これらのペプチドはすべて、Ｎ末端からＣ末端方向に、ベータターンを提供することを目的とする４マーリンカーにより連結されているので、連続するペプチドモノマーは逆平行ベータシート構造において以下の通りに：
【0078】
【化10】
【0079】
ベータターンの１つまたは複数は変動しているおよび／またはＣ末端ＮＱＧＳ配列でもよく、所望のヌクレアーゼ活性を維持することは認識される。
【0080】
配列番号１の人工ヌクレアーゼの置換
配列番号１で提供される人工ヌクレアーゼは、ＤＢＤへのリンカーの維持または変更を用いて、標的ｄｓＤＮＡ部位の改変のために望まれるいかなる代替のエフェクター構成要素によっても置換しうることは認識される。例証として、今教示されるそのような機能的合成ゲノム編集ツールは、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼドメイン（本明細書ではＡｐＧｅｔ－Ｆｏｋ１構築物と呼ばれる）により置換された配列番号１の人工ヌクレアーゼを有する。ＤＢＤに連結された核酸認識モジュールを含むいかなるＡｐＧｅｔ－ｉも、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼドメインにさらに連結しうることは認識される。そのようなモジュラーポリペプチド構築物は、例えば、標的部位でｄｓＤＮＡを切断できる機能的Ｆｏｋ１ヌクレアーゼを提供するために異なるＴＥを有するターゲティング核酸のペアと一緒に使用しうる。このための１つの配置が図１８に図示される。ディテクタープラスミドに二本鎖切断を生じさせるＡｐＧｅｔ－Ｆｏｋ１構築物の発現のために図１４に図示される「エディター」プラスミドを用いる下の例証も参照のこと。ＤＢＤおよびターゲティングエレメントは、異なるｄｓＤＮＡ標的部位で二本鎖切断を生じさせるように変更しうることは認識される。しかし、今教示される遺伝子編集ツールの完全なモジュラーポリペプチド構成要素の発現のためにサイズを最小に抑えることを視野に入れると、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼドメインを本発明の人工ニッカーゼにより置換することが好ましい。
配列番号１で提供される人工ヌクレアーゼは、ＤＢＤへのリンカーの維持または変更を用いて、標的ｄｓＤＮＡ部位の改変のために望まれるいかなる代替のエフェクター構成要素によっても置換しうることは認識される。例証として、今教示されるそのような機能的合成ゲノム編集ツールは、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼドメイン（本明細書ではＡｐＧｅｔ－Ｆｏｋ１構築物と呼ばれる）により置換された配列番号１の人工ヌクレアーゼを有する。ＤＢＤに連結された核酸認識モジュールを含むいかなるＡｐＧｅｔ－ｉも、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼドメインにさらに連結しうることは認識される。そのようなモジュラーポリペプチド構築物は、例えば、標的部位でｄｓＤＮＡを切断できる機能的Ｆｏｋ１ヌクレアーゼを提供するために異なるＴＥを有するターゲティング核酸のペアと一緒に使用しうる。このための１つの配置が図１８に図示される。ディテクタープラスミドに二本鎖切断を生じさせるＡｐＧｅｔ－Ｆｏｋ１構築物の発現のために図１４に図示される「エディター」プラスミドを用いる下の例証も参照のこと。ＤＢＤおよびターゲティングエレメントは、異なるｄｓＤＮＡ標的部位で二本鎖切断を生じさせるように変更しうることは認識される。しかし、今教示される遺伝子編集ツールの完全なモジュラーポリペプチド構成要素の発現のためにサイズを最小に抑えることを視野に入れると、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼドメインを本発明の人工ニッカーゼにより置換することが好ましい。
【0081】
さらなる例証として、配列番号１で提供される人工ヌクレアーゼは、転写活性化因子、例えば、ＶＰ６４により置換され、得られたモジュラーポリペプチドはプロモーター位置を標的とするように設計された１つまたは複数のターゲティング核酸と組み合わされ、それによってプロモーターと作動的に連動した１つまたは複数のコード配列の転写を活性化するまたは増強しうる；実施例８を参照のこと。そのようなエフェクター構成要素置換は、ＲＳＢＤ、ＤＢＤおよびエフェクター構成要素の必要な機能が維持されるという条件で、ＲＳＢＤ、ＤＢＤ、ＲＳＢＤとＤＢＤの間のリンカー（図１に示されるリンカー２、Ｌ２）およびエフェクター構成要素とＤＢＤの間のリンカー（図１に示されるリンカーＬ１、Ｌ１）のうちの１つまたは複数の変更を伴いうる。したがって、例えば、実施例８により例示されるように、配列番号１の人工ヌクレアーゼは、リンカー２を短縮して（配列番号７０のリンカー２ｂ参照）またはリンカー１を変更して（配列番号６９のリンカー１ａ参照）、ＶＰ６４ポリペプチドにより置換されうる。
【0082】
本発明のさらなる態様
本発明の人工ニッカーゼは、上で論じられた完全合成遺伝子編集ツールへの包含を超えた用途があることは認識される。人工ニッカーゼは、おそらく塩基エディターまたは逆転写酵素などのＤＮＡ改変のためのさらなる構成要素にも連結されたＤＮＡ改変のための別の実体、例えば、ｄＣａｓ９と融合した融合酵素の一部として用いうる。人工ニッカーゼは、ポリヌクレオチド、例えば、発現ベクターから、融合タンパク質の一部、例えば、ターゲティング核酸と一緒に使用するためのＤＮＡ改変ツールのモジュラーポリペプチド構成要素として、または分離タンパク質として発現されうる。
本発明の人工ニッカーゼは、上で論じられた完全合成遺伝子編集ツールへの包含を超えた用途があることは認識される。人工ニッカーゼは、おそらく塩基エディターまたは逆転写酵素などのＤＮＡ改変のためのさらなる構成要素にも連結されたＤＮＡ改変のための別の実体、例えば、ｄＣａｓ９と融合した融合酵素の一部として用いうる。人工ニッカーゼは、ポリヌクレオチド、例えば、発現ベクターから、融合タンパク質の一部、例えば、ターゲティング核酸と一緒に使用するためのＤＮＡ改変ツールのモジュラーポリペプチド構成要素として、または分離タンパク質として発現されうる。
【0083】
例えば、本発明の人工ヌクレアーゼまたはニッカーゼを含むまたはそれからなる、本発明のポリペプチドを発現することができるポリヌクレオチドおよびそのようなポリヌクレオチドにより形質転換される宿主細胞も本発明の態様を構成する。
【0084】
上で論じられた精製および可溶性を助けるためのＮ末端タグ配列、例えば、Ｈｉｓタグと可溶性を助けるためのタグ、例えば、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）配列の両方を提供する切断可能なタグ配列であるそのようなタグ配列を有する本発明の人工ヌクレアーゼまたはニッカーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドも提供される。そのようなポリヌクレオチドは、インビトロ転写および翻訳システムにおいてヌクレアーゼもしくはニッカーゼタンパク質の産生のための発現カセットまたは宿主細胞、例えば、大腸菌（E.coli）細胞などの細菌細胞もしくは酵母細胞でのそのようなヌクレアーゼタンパク質の発現のための発現ベクターでもよい。このように形質転換された宿主細胞は、本発明のさらなる態様を表す。
【0085】
本発明の人工ヌクレアーゼまたはニッカーゼを含むポリペプチドを産生する方法であって、
（ｉ）上記の宿主細胞を培養することまたは前記ポリペプチドが精製および可溶性を助けるためのＮ末端タグ配列と一緒に、望ましくは、切断可能Ｈｉｓ－ＭＢＰ－Ｈｉｓ融合タグなどの切断可能タグと一緒に産生されるインビトロ転写－翻訳システムの使用；
（ｉｉ）Ｎ末端タグを使用してポリペプチドを単離することおよび前記Ｎ末端タグは切断可能である；
（ｉｉｉ）ポリペプチドからタグを切断することならびに
（ｉｖ）タグからポリペプチドを分離すること
を含む方法がさらに提供される。
（ｉ）上記の宿主細胞を培養することまたは前記ポリペプチドが精製および可溶性を助けるためのＮ末端タグ配列と一緒に、望ましくは、切断可能Ｈｉｓ－ＭＢＰ－Ｈｉｓ融合タグなどの切断可能タグと一緒に産生されるインビトロ転写－翻訳システムの使用；
（ｉｉ）Ｎ末端タグを使用してポリペプチドを単離することおよび前記Ｎ末端タグは切断可能である；
（ｉｉｉ）ポリペプチドからタグを切断することならびに
（ｉｖ）タグからポリペプチドを分離すること
を含む方法がさらに提供される。
【0086】
前述の通り、本発明の人工ヌクレアーゼ、好ましくは本発明の人工ニッカーゼは、しかし、本発明の人工遺伝子編集システムのモジュラーポリペプチドの一部として提供されるのが特に好まれる。この場合、人工ヌクレアーゼまたはニッカーゼは、ＤＢＤが選択されたＰＤＳに結合できヌクレアーゼが必要な標的部位で機能することができるように、一般にリンカー配列によりＤＢＤに接合される。そのようなモジュラーポリペプチドの発現には、全モジュラーポリペプチドをコードする発現カセット、例えば、ベクターが提供される。一部の例では、Ｎ末端タグ、例えば、切断可能Ｈｉｓタグを提供しうる（図１６参照）。
【0087】
本発明の人工ヌクレアーゼを含むＡｐＧｅｔ－ｉまたは完全ＡｐＧｅｔモジュラーポリペプチドの組換え産生のための好ましい方法が本明細書で今や教示される。したがって、標的配列改変のために本発明の核タンパク質複合体において使用するためのそのようなモジュラーポリペプチド構成要素、または任意のモジュラーポリペプチド構成要素は、最初は、例えば、大腸菌（E.coli）などの宿主細胞において、使用に先立って望まれないタグ配列を取り除くことができるプロテアーゼ切断部位を含む可溶性、精製および検出のすべてまたはいずれかを助けるための複数の構成要素タグ配列と一緒に発現しうる。そのような複数の構成要素タグ配列はＮＬＳに連結させてよく、それによってプロテアーゼ切断するとＮＬＳは、おそらく、必要な標的改変を妨害しない追加の配列、例えば、検出配列を含む末端配列と一緒に、ＮまたはＣ末端で保持される。そのような複数の構成要素配列タグは、望ましくは、（ｉ）少なくとも１つのＨｉｓタグ、例えば、少なくとも１つのヘキサＨｉｓタグ、（ｉｉ）可溶性を助けるポリペプチド配列、例えば、ＭＢＰまたは小さなユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）、（ｉｉｉ）プロテアーゼ切断部位および（ｉｖ）検出配列、例えば、エピトープタグのすべてを提供しうる。そのような好ましい複数の構成要素タグの例として、ＮからＣ末端方向に、（ｉ）ヘキサＨｉｓタグ、（ｉｉ）ＭＢＰまたはＳＵＭＯの可溶性タグ、（ｉｉｉ）スペーサーを提供するリンカー、（ｉｖ）ＴＥＶプロテアーゼ切断部位および（ｖ）ＮＬＳに接合しているＦＬＡＧ（登録商標）エピトープなどのエピトープタグのすべてを提供するＮ末端伸長と一緒にＡｐＧｅｔまたはＡｐＧｅｔ－ｉを大腸菌（E.coli）で発現するのは有益であることが見出されている。プロテアーゼ切断すると、標的改変のための最終モジュラーポリペプチドは、ＮＬＳとエピトープタグの両方を、短いＮ末端リーダー配列、例えば、ＧＷＧＳなどの４マーＮ末端リーダー配列と一緒に保持する（図３１参照）。可溶性タグとＴＥＶプロテアーゼ切断部位の間のリンカーは、望ましくは、グリシンおよびセリンに対する要求を増やすリンカーよりむしろアスパラギンリッチリンカーでよい。ＡｐＧｅｔの発現では、時期尚早に終結した産物からの分離を助けるためにＣ末端にＳｔｒｅｐ－タグ（登録商標）を組み入れることがさらに有益であることが見出された。しかし、可溶性および／または精製および／または検出および／または膜透過を助けるために、本発明のモジュラーポリペプチド構成要素を最初に発現する際に、種々の他のＮおよびＣ末端タグを用いてよいことが認識される。例えば、前述の通り、モジュラーポリペプチド構成要素は、一部の例では、細胞透過性ペプチド配列を含めて発現されうる。
【0088】
本発明の合成遺伝子改変システムの使用
前述の通り、本発明の核タンパク質複合体は、例えば、電気穿孔により活性複合体として、またはポリヌクレオチドにより発現されるポリペプチド構成要素とターゲティング核酸構成要素のうちの１つもしくは両方と一緒に宿主細胞に送達されうる。
前述の通り、本発明の核タンパク質複合体は、例えば、電気穿孔により活性複合体として、またはポリヌクレオチドにより発現されるポリペプチド構成要素とターゲティング核酸構成要素のうちの１つもしくは両方と一緒に宿主細胞に送達されうる。
【0089】
ＡｐＧｅｔ構成要素の細胞中への送達
必要とされる核酸構成要素は、制限なく種々の適切な方法のいずれかにより細胞に送達することができる。多くのそのような方法が公知である。したがって、目的の細胞への合成ＲＮＡ分子の直接導入は、電気穿孔、ヌクレオフェクション、トランスフェクションにより、ナノ粒子により、ウイルス媒介ＲＮＡ送達により、非ウイルス媒介送達により、細胞外小胞（例えば、エキソソームおよび微小胞）により、真核細胞移入により（例えば、組換え酵母により）および核酸分子を詰め込んで標的生存可能細胞への送達を提供することができる他の方法でもよい。ＲＮＡ分子の導入のための他の方法は、関連する配列が細胞内に転写されるＤＮＡポリヌクレオチドの非組入れ一過性移入を含む。これは、限定せずに、ＤＮＡのみの媒体（例えば、プラスミド、ミニサークル、ミニベクター、ミニストリング、プロテロメラーゼ生成ＤＮＡ分子（例えば、ドギーボーンズ（Doggybones）、人工染色体（例えば、ＨＡＣ）、コスミド）を用いることによる、またはナノ粒子、細胞外小胞（例えば、エキソソームおよび微小胞）などの媒体の使用、真核細胞移入により（例えば、組換え酵母により）、ＡＡＶによる一過性ウイルス移入、非組入れウイルス粒子（例えば、レンチウイルスおよびレトロウイルスベースのシステム）、細胞透過性ペプチドおよびゲノムランドスケープ中への直接組入れなしで細胞中へのＤＮＡの導入を媒介することができる他の技術を含む。ＲＮＡ構成要素の導入のための別の方法は、標的細胞のゲノム中へのＲＮＡ転写用の機構の安定な導入のための組入れ遺伝子移入技術の使用を含む。これは、ＲＮＡ発現を減弱する構成的またはプロモーター誘導システムにより制御することができる。安定な遺伝子移入のためのそのような技術は、組入れウイルス粒子（例えば、レンチウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルスベースのシステム）、トランスポザーゼ媒介移入（例えば、スリーピングビューティー（Sleeping Beauty）およびピギーバック（Piggybac））、および目的の細胞中への標的ＤＮＡの組入れを促進する他の技術を含むがこれらに限定されない。
必要とされる核酸構成要素は、制限なく種々の適切な方法のいずれかにより細胞に送達することができる。多くのそのような方法が公知である。したがって、目的の細胞への合成ＲＮＡ分子の直接導入は、電気穿孔、ヌクレオフェクション、トランスフェクションにより、ナノ粒子により、ウイルス媒介ＲＮＡ送達により、非ウイルス媒介送達により、細胞外小胞（例えば、エキソソームおよび微小胞）により、真核細胞移入により（例えば、組換え酵母により）および核酸分子を詰め込んで標的生存可能細胞への送達を提供することができる他の方法でもよい。ＲＮＡ分子の導入のための他の方法は、関連する配列が細胞内に転写されるＤＮＡポリヌクレオチドの非組入れ一過性移入を含む。これは、限定せずに、ＤＮＡのみの媒体（例えば、プラスミド、ミニサークル、ミニベクター、ミニストリング、プロテロメラーゼ生成ＤＮＡ分子（例えば、ドギーボーンズ（Doggybones）、人工染色体（例えば、ＨＡＣ）、コスミド）を用いることによる、またはナノ粒子、細胞外小胞（例えば、エキソソームおよび微小胞）などの媒体の使用、真核細胞移入により（例えば、組換え酵母により）、ＡＡＶによる一過性ウイルス移入、非組入れウイルス粒子（例えば、レンチウイルスおよびレトロウイルスベースのシステム）、細胞透過性ペプチドおよびゲノムランドスケープ中への直接組入れなしで細胞中へのＤＮＡの導入を媒介することができる他の技術を含む。ＲＮＡ構成要素の導入のための別の方法は、標的細胞のゲノム中へのＲＮＡ転写用の機構の安定な導入のための組入れ遺伝子移入技術の使用を含む。これは、ＲＮＡ発現を減弱する構成的またはプロモーター誘導システムにより制御することができる。安定な遺伝子移入のためのそのような技術は、組入れウイルス粒子（例えば、レンチウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルスベースのシステム）、トランスポザーゼ媒介移入（例えば、スリーピングビューティー（Sleeping Beauty）およびピギーバック（Piggybac））、および目的の細胞中への標的ＤＮＡの組入れを促進する他の技術を含むがこれらに限定されない。
【0090】
本システムの人工ニッカーゼなどのタンパク質またはペプチド作動性構成要素の送達は、同じ技術によって実行できるが、一部の状況では、異なる方法により送達を媒介する利点がある。そのような適用可能な方法は下に収載されているがそれに限定されない。第１に、目的の細胞へのタンパク質分子の直接導入は、電気穿孔、ヌクレオフェクション、トランスフェクションにより、ナノ粒子により、ウイルス媒介パッケージド送達、細胞外小胞（例えば、エキソソームおよび微小胞）により、真核細胞移入により（例えば、組換え酵母により）およびゲノムランドスケープ中への組入れなしで標的生存細胞への送達のために巨大分子を詰め込むことができる他の方法でもよい。タンパク質分子の導入のための他の方法は、必要な細胞内タンパク質分子を提供するために転写および翻訳に関連する配列を含むＤＮＡポリヌクレオチドの非組入れ一過性移入を含む。再び、これは、限定せずに、ＤＮＡのみの媒体（例えば、プラスミド、ミニサークル、ミニベクター、ミニストリング、プロテロメラーゼ生成ＤＮＡ分子（例えば、ドギーボーンズ）、人工染色体（例えば、ＨＡＣ）、コスミド）の考えられる使用、またはナノ粒子、細胞外小胞（例えば、エキソソームおよび微小胞）などのＤＮＡ運搬媒体、真核細胞移入により（例えば、組換え酵母による）、ＡＡＶによる一過性ウイルス移入、非組入れウイルス粒子（例えば、レンチウイルスおよびレトロウイルスベースのシステム）およびゲノムランドスケープ中への直接組入れなしで細胞中へのＤＮＡの導入を媒介することができる他の技術を含む。タンパク質構成要素（複数可）の導入のための別の方法は、標的細胞のゲノム中への転写および翻訳用の機構の安定な導入のための組入れ遺伝子移入技術の使用を含む。ゲノム改変分野では多くのそのような方法が周知である。制御は、再び、構成的または誘導性プロモーターシステムによることが可能である。設計は、有用性が満たされた（例えば、Ｃｒｅ－Ｌｏｘ組換えシステムを導入する）後にシステムを取り除くことができるようにしうる。安定な遺伝子移入のためのそのような技術は、組入れウイルス粒子（例えば、レンチウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルスベースのシステム）、トランスポザーゼ媒介移入（例えば、スリーピングビューティーおよびピギーバック）、および目的の細胞中への標的ＤＮＡの組入れを促進する他の技術を含むがこれらに限定されない。
【0091】
発現システム
前述の通り、コードポリヌクレオチドからいずれかのタンパク質構成要素および／またはＲＮＡ構成要素のうちの１つまたは複数を発現するのが望ましいことがある。これは、種々のやり方で実施することができる。
前述の通り、コードポリヌクレオチドからいずれかのタンパク質構成要素および／またはＲＮＡ構成要素のうちの１つまたは複数を発現するのが望ましいことがある。これは、種々のやり方で実施することができる。
【0092】
例えば、１つまたは複数の中間ベクターは、原核または真核細胞中への導入のために用い、必要な構成要素（複数可）を発現するための複製および／または転写に適していることがある。発現ベクターは、選択された宿主細胞、例えば、植物細胞、動物細胞、例えば、トリ、哺乳動物細胞またはヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞、または原生動物細胞への投与のために用いてもよい。したがって、本発明は、上述した本発明のＲＮＡ構成要素またはタンパク質のいずれかをコードする核酸を提供する。好ましくは、核酸は単離されるおよび／または精製される。
【0093】
本発明の核タンパク質複合体の適用において有用な発現構築物の例は、本発明の核酸配列が前向きにまたは反対向きに挿入されている、プラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターを含む。好ましい実施形態では、構築物は、配列に作動可能に連結された、プロモーターを含む、調節配列をさらに含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には知られており、市販されている。
【0094】
本発明の核タンパク質複合体の適用において有用な発現ベクターの例は、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組合せに由来するベクター、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病などのウイルスＤＮＡを含む。
【0095】
ベクターは、発現を増幅するのに適した配列を含んでよい。さらに、発現ベクターは、好ましくは、真核細胞培養物にジヒドロ葉酸レダクターゼもしくはネオマイシン耐性などの、または大腸菌（E.coli）におけるテトラサイクリンもしくはアンピシリン耐性などの形質転換宿主細胞の選択のための表現型形質を提供する１つまたは複数の選択可能マーカー遺伝子を含有する。
【0096】
本発明の核タンパク質複合体の適用、例えば、モジュラーポリペプチド構成要素（複数可）および／もしくは１つもしくは複数のターゲティングＲＮＡを細胞内で発現する、または本発明のタンパク質構成要素の産生における使用のためのベクター（単数または複数）は、選択された宿主細胞でのそのような発現または産生のために適切な制御配列と一緒に設計することができる。適切な発現宿主の例は、細菌細胞（例えば、大腸菌（E.coli）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium））、真菌細胞（酵母）、昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエ（Drosophila）およびヨトウガ（Spodoptera frugiperda）（Ｓｆ９））、動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、およびＨＥＫ２９３）、アデノウイルス、および植物細胞を含む。本発明のタンパク質、例えば、人工ヌクレアーゼ、の産生に適切な宿主の選択は、当業者の能力の範囲内である。
【0097】
適用
したがって、さらなる態様では、宿主細胞における本発明の１つまたは複数の核タンパク質複合体の提供のための核酸または核酸の組合せが提供される。しかし、宿主細胞への本発明の活性複合体（タンパク質構成要素プラスターゲティングＲＮＡ）の直接送達は排除されていない。そのような宿主細胞は、原核細胞または真核細胞でもよい。宿主細胞は、例えば、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および真菌細胞ならびに植物細胞およびヒトおよび、例えば、ハムスター（例えば、ＣＨＯ細胞）、サル（例えば、ベロ細胞）、ラット、マウス、トリまたはニワトリ細胞などの非ヒト動物細胞を含む真核細胞のいずれでもよい。適切な宿主細胞は、エキソビボ細胞、例えば、エキソビボ幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および操作ＣＡＲ－Ｔ細胞を含むエキソビボＴ細胞を含むと理解される。
したがって、さらなる態様では、宿主細胞における本発明の１つまたは複数の核タンパク質複合体の提供のための核酸または核酸の組合せが提供される。しかし、宿主細胞への本発明の活性複合体（タンパク質構成要素プラスターゲティングＲＮＡ）の直接送達は排除されていない。そのような宿主細胞は、原核細胞または真核細胞でもよい。宿主細胞は、例えば、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および真菌細胞ならびに植物細胞およびヒトおよび、例えば、ハムスター（例えば、ＣＨＯ細胞）、サル（例えば、ベロ細胞）、ラット、マウス、トリまたはニワトリ細胞などの非ヒト動物細胞を含む真核細胞のいずれでもよい。適切な宿主細胞は、エキソビボ細胞、例えば、エキソビボ幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および操作ＣＡＲ－Ｔ細胞を含むエキソビボＴ細胞を含むと理解される。
【0098】
核酸は、好ましくは、ベクター、例えば、本発明の人工ニッカーゼを含む、本発明の少なくとも１つのモジュラーポリペプチド構成要素と少なくとも１つのターゲティング核酸構成要素の両方を発現することができる組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはセンダイウイルスベクターなどの、例えば、ウイルスベクターでよい。１つよりも多いＤＮＡ部位を標的とするため、１つよりも多いターゲティング核酸構成要素が宿主細胞に提供されてよい。この場合、それぞれのターゲティング核酸構成要素は、単一のモジュラーポリペプチド構成要素と相互作用してよく、すなわち、１つよりも多いターゲティング核酸、例えば、ペアは、単一ＰＤＳに会う単一ＤＢＤと作動中に組み合わされる。しかし、ペアのそれぞれのターゲティング核酸構成要素は、それぞれが異なるＰＤＳに結合するＤＢＤを有する異なるモジュラーポリペプチド構成要素と相互作用しうる。これらの送達様式のどちらが選択されようとも、ターゲティング核酸構成要素に対するＤＮＡ標的部位はＰＤＳ部位のペアの外側にあってよく（「ＰＤＳ－ｉｎ」配置と呼ばれる）またはターゲティング核酸構成要素に対するＤＮＡ標的部位はＰＤＳ部位のペアの内側にあってもよい（「ＰＤＳ－ｏｕｔ」配置と呼ばれる）。そのような配置は図１８および１９に図示されており、それぞれのターゲティング核酸がｄｓＤＮＡの異なるＤＮＡ鎖を標的としている。
【0099】
上記の通りに使用するための本発明の核タンパク質複合体のペアは、エフェクター構成要素として、適切なリンカー配列によりＤＢＤに接合されたＦｏｋ１ヌクレアーゼドメインを含みうる、すなわち、リンカーによりＦｏｋ１エンドヌクレアーゼの触媒ドメインに接合されるＡｐＧｅｔ－ｉ構築物（本明細書ではＡｐＧｅｔ－Ｆｏｋ１モジュラーポリペプチドと呼ばれる）を表すことが認識される。そのような複合体のペアは、ｄｓＤＮＡにおいて二本鎖切断、例えば、遺伝子ノックアウト用のゲノムＤＮＡを生じさせるようにＰＤＳ－ｉｎまたはＰＤＳ－ｏｕｔ配置で作用しうる。この目的のためにＰＤＳ－ｉｎ配置で機能を果たすＡｐＧｅｔ－Ｆｏｋ１モジュラーポリペプチドのペアを図示する図１８を参照のこと。
【0100】
ｄｓＤＮＡの両方の鎖を切断するために細胞に人工ニッカーゼを提供する本発明の核タンパク質複合体のペアのベクター送達のためには、１つまたは複数のベクター、好ましくは、単一ベクターが特に好まれる。そのような送達は、非相同末端結合により遺伝子ノックアウトを達成することもできうる。しかし、そのような核タンパク質複合体送達は、相同組換え用の配列鋳型の提供を伴いうることは認識される。この配列鋳型は、完全分離発現構築物によりまたは同じベクター上の分離した発現カセットからの発現により提供されうる。図１６は、人工ヌクレアーゼを含むモジュラーポリペプチド、モジュラーポリペプチドと相互作用するためのターゲティング核酸構成要素および標的部位のペアの切断による酵素コード配列の相同修復のための配列のすべてを発現することができる単一ベクター構築物を図示する。
【0101】
本発明のさらなる態様として、宿主細胞において、本発明の１つまたは複数の核タンパク質複合体またはその提供のための１つまたは複数の核酸を用いて１つまたは複数の標的核酸配列を改変するための方法が提供される。但し、請求されるそのような方法は、ヒトの生殖系列アイデンティティーを改変する方法またはそういうものとしてヒトまたは動物の身体で実行される医学的処置の方法に拡張しない。前述の通り、望ましくは、１つまたは複数の核タンパク質複合体の提供のための単一ポリペプチド構成要素は、ベクターからの発現により細胞で提供されうる。同じベクターは、好ましくは、必要な１つまたは複数のターゲティング核酸、好ましくは１つまたは複数のターゲティングＲＮＡも発現しうる。
【0102】
本発明のさらにさらなる態様として、（ｉ）本発明のゲノム改変ツールのための少なくとも１つのポリペプチド構成要素、またはそれを発現することができるポリヌクレオチドおよび（ｉｉ）上記の方法で使用するための、または治療的処置において使用するための、前記ポリペプチド構成要素（複数可）と相互作用するもしくは連結することができる１つもしくは複数のターゲティング核酸、またはそれを発現することができる１つもしくは複数のポリヌクレオチドの組合せが提供される。そのような組み合わせは、１つまたは複数の特定の適用のためのキットの形態で提供しうる、例えば、単一のポリペプチド構成要素またはそれをコードするポリヌクレオチドは、１つまたは複数の所望の核酸位置を標的とするように設計された、１つもしくは複数のターゲティング核酸、または１つもしくは複数のポリヌクレオチドと一緒に提供しうる。しかし、前述の通り、ポリペプチド構成要素と１つまたは複数のターゲティング核酸、好ましくはターゲティングＲＮＡの両方は、好ましくは単一ベクターから発現されてよい。
【0103】
例として、本発明は、バイオプロダクション、ワクチン作製、研究ツールおよび試薬、遺伝子改変動物および植物の作製ならびに細胞治療において利用される細胞を編集するのに役立たせることができることが認識される。本発明の構成要素は、遺伝子治療適用のために利用することができる。
【0104】
本発明の核タンパク質複合体は、例えば、治療において使用するための細胞の提供に利用しうる。１つのそのような適用は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ－Ｔ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように操作されたＴ細胞などの治療細胞を作製することである。ＣＡＲ－Ｔ／ＴＣＲ細胞は、始原Ｔ細胞に由来するまたは幹細胞から分化してもよい。適切な幹細胞は、造血性、神経、胚性、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間充織、中胚葉、肝臓、膵臓、筋肉および網膜幹細胞を含むがこれらに限定されないヒト幹細胞などの哺乳動物幹細胞を含むがこれらに限定されない。他の幹細胞は、マウス幹細胞、例えば、マウス胚性幹細胞などの哺乳動物幹細胞を含むがこれらに限定されない。
【0105】
本発明の核タンパク質複合体は、哺乳動物由来の細胞を含むがこれらに限定されない種々の型の細胞または細胞株において単一遺伝子または複数の遺伝子をノックアウトする、改変するまたはその発現を増加するのに使用しうる。本発明の核タンパク質複合体は、多重遺伝子改変に適応可能でありえ、この改変は、当技術分野で公知であるように、同じ遺伝子内で複数の遺伝子または複数の標的を遺伝的に改変することを含む。その技術は、非宿主細胞を宿主にとって非免疫原性にすることにより移植片対宿主病を予防するまたは非宿主細胞を宿主による攻撃に対して抵抗性にすることにより宿主対移植片病を予防するための遺伝子のノックアウトを含むがこれに限定されない、多くの適用のために使用しうる。これらのアプローチは、アロジェニック（オフザシェルフ（off-the-shelf））または自家性（患者特異的な）細胞ベースの治療薬を作製することにも関連する。標的遺伝子は、Ｔ細胞受容体、Ｂ２Ｍを含む、主要組織適合抗原（ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ）遺伝子、および自然免疫応答に関与する遺伝子を含みうるがこれらに限定されない。
【0106】
前述の通りにおよび要約のため、今教示されているＤＮＡ改変システムは、
１．リボ核タンパク質粒子の導入
２．ｍＲＮＡ
３．ターゲティングＲＮＡ構成要素およびモジュラーポリペプチド構成要素を発現するプラスミド
４．上記１、２または３で言及されるいずれかを含有するウイルス様粒子
５．上記１、２または３で言及されるいずれかを含有する脂質ナノ粒子
６．上記１、２または３で言及されるいずれかを含有するエキソソーム
７．１、２または３で言及されるいずれかを含有するリポソーム
８．ターゲティングＲＮＡ構成要素およびモジュラーポリペプチド構成要素を発現するウイルスベクター、例えば、ｒＡＡＶベクター
を含む細胞形質転換において当業者に周知である種々の方法で細胞中に送達されうることが認識される。
１．リボ核タンパク質粒子の導入
２．ｍＲＮＡ
３．ターゲティングＲＮＡ構成要素およびモジュラーポリペプチド構成要素を発現するプラスミド
４．上記１、２または３で言及されるいずれかを含有するウイルス様粒子
５．上記１、２または３で言及されるいずれかを含有する脂質ナノ粒子
６．上記１、２または３で言及されるいずれかを含有するエキソソーム
７．１、２または３で言及されるいずれかを含有するリポソーム
８．ターゲティングＲＮＡ構成要素およびモジュラーポリペプチド構成要素を発現するウイルスベクター、例えば、ｒＡＡＶベクター
を含む細胞形質転換において当業者に周知である種々の方法で細胞中に送達されうることが認識される。
【0107】
上述の通り、連結した合成ペプチド単位から形成される人工ヌクレアーゼを含む今教示されている合成ゲノム編集ツールは、必要な発現カセットの送達のための単一ベクター、例えば、ＡｐＧｅｔモジュラーポリペプチドおよび少なくとも１つのターゲティングＲＮＡならびにおそらくさらに切断部位のペア間の相同組換えのための鋳型配列のすべてを発現できるベクターだけを用いて、遺伝子ノックアウトのためのゲノム編集、または相同組換えによる遺伝子改変を有利に可能にしうることが想定される。
【0108】
以下の非限定的実施例は、好ましくは、本発明の合成ゲノム編集システムのエレメントとして用いうる人工ニッカーゼの概念証明として、本発明を説明し配列番号１のモジュラーポリペプチド中のニッカーゼの誘導および試験をさらに記載するために提供される。
【実施例】
【0109】
[実施例１]
ＤＮＡ結合ドメインの選択
上述の通り、市販のＭ１３ファージディスプレイライブラリーを用いた（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｅ８１１１Ｌ）。これは、ファージマイナーコートタンパク質ＩＩＩのＮ末端に融合された約１×１０９の１２マーペプチドを含有する。下の表１に指定されるように、ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート上に固定されたビオチンタグと共に、２つの異なる６ｎｔ ｄｓＤＮＡベイトが用いられた。
ＤＮＡ結合ドメインの選択
上述の通り、市販のＭ１３ファージディスプレイライブラリーを用いた（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｅ８１１１Ｌ）。これは、ファージマイナーコートタンパク質ＩＩＩのＮ末端に融合された約１×１０９の１２マーペプチドを含有する。下の表１に指定されるように、ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート上に固定されたビオチンタグと共に、２つの異なる６ｎｔ ｄｓＤＮＡベイトが用いられた。
【0110】
【表1】
【0111】
ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識された抗Ｍ１３ファージ抗体を使ってＰＤＳ１およびＰＤＳ２ ｄｓＤＮＡベイトへのファージディスプレイライブラリーのペプチドの結合を査定した。３ラウンドのバイオパニングおよびライブラリー中の結合したペプチドの配列分析後、２つの１２マーペプチド配列を選択し、化学的に合成し、下の表２に提示される通りに改変した。
【0112】
ＤＢＤのバイオパニングおよび選択のさらなる詳細は下に提示される。
【0113】
ＤＢＤのバイオパニングおよび選択
１．ブロッキングバッファー（０．１ＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．６）、５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、フィルター無菌化および４℃で保存）を用いたストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＫ）のブロッキングステップ
２．ブロッキング液を捨てた後の１×ＴＢＳＴでの６ラウンドの洗浄
３．前複合体化ステップ（このステップは、上述のブロッキングステップと同じ時間に行うことができる）、増幅されたファージライブラリーを別々の反応においてｄｓＤＮＡベイトのそれぞれと一緒にインキュベートした。それぞれのベイトは、ＰＤＳ部位のうちの１つを含有する、アニールした二本鎖ＤＮＡオリゴ（ｄｓＤＮＡ）を含む。今提供される実施例では、上述のｄｓＤＮＡオリゴのそれぞれでのフォワード鎖がＴＥＧ－ビオチン（Ｓｉｇｍａ／Ｍｅｒｃｋ）で３’末端標識された。このステップでｄｓＤＮＡ ＰＤＳ含有ベイトを作製するために使用された一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列は上記の表１に表されている。ＰＤＳの長さはできる限り短くしておくべきである（信頼のおけるオリゴヌクレオチド合成およびｄｓＤＮＡを形成するための安定な塩基対合を可能にするため）。前複合体化ステップの条件：５ｍｉｃＬファージライブラリー（１０１１ｐｆｕ）は２００μｌのＴＢＳＴ（結合反応の全容積）中５０ｎＭのｄｓＤＮＡベイト（最終濃度）とインキュベートされる。
４．固定化ステップ 前複合体化ライブラリーはストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＫ）上に固定化された。
５．未結合ファージを捨てた後ＴＢＳＴで１０回洗浄
６．溶出ステップ ０．２Ｍのグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ２．２）で１０～２０分間、続いて中和（１５μＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．１から１００μＭの０．２Ｍ グリシン－ＨＣｌ、ｐＨ２．２）
７．増幅およびタイタリングステップ（非増幅および増幅溶出物について）は、それぞれの選択（パニング）ラウンド前に、製造業者の説明書（ＮＥＢ）に従って実施された。合計で、２～３ラウンドが行われた。
８．配列分析ステップ クローンＰＣＲとサンガー配列のそれに続く分析（それぞれの試験ラウンドでそれぞれのベイトについて２０クローン）は、タイタリング分析（ＮＥＢ）からのＬＢ寒天プレート上で成長させた「ブルー」（機能的ｂ－ｇａｌを有する）クローンで実施された。
１．ブロッキングバッファー（０．１ＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．６）、５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、フィルター無菌化および４℃で保存）を用いたストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＫ）のブロッキングステップ
２．ブロッキング液を捨てた後の１×ＴＢＳＴでの６ラウンドの洗浄
３．前複合体化ステップ（このステップは、上述のブロッキングステップと同じ時間に行うことができる）、増幅されたファージライブラリーを別々の反応においてｄｓＤＮＡベイトのそれぞれと一緒にインキュベートした。それぞれのベイトは、ＰＤＳ部位のうちの１つを含有する、アニールした二本鎖ＤＮＡオリゴ（ｄｓＤＮＡ）を含む。今提供される実施例では、上述のｄｓＤＮＡオリゴのそれぞれでのフォワード鎖がＴＥＧ－ビオチン（Ｓｉｇｍａ／Ｍｅｒｃｋ）で３’末端標識された。このステップでｄｓＤＮＡ ＰＤＳ含有ベイトを作製するために使用された一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列は上記の表１に表されている。ＰＤＳの長さはできる限り短くしておくべきである（信頼のおけるオリゴヌクレオチド合成およびｄｓＤＮＡを形成するための安定な塩基対合を可能にするため）。前複合体化ステップの条件：５ｍｉｃＬファージライブラリー（１０１１ｐｆｕ）は２００μｌのＴＢＳＴ（結合反応の全容積）中５０ｎＭのｄｓＤＮＡベイト（最終濃度）とインキュベートされる。
４．固定化ステップ 前複合体化ライブラリーはストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＫ）上に固定化された。
５．未結合ファージを捨てた後ＴＢＳＴで１０回洗浄
６．溶出ステップ ０．２Ｍのグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ２．２）で１０～２０分間、続いて中和（１５μＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．１から１００μＭの０．２Ｍ グリシン－ＨＣｌ、ｐＨ２．２）
７．増幅およびタイタリングステップ（非増幅および増幅溶出物について）は、それぞれの選択（パニング）ラウンド前に、製造業者の説明書（ＮＥＢ）に従って実施された。合計で、２～３ラウンドが行われた。
８．配列分析ステップ クローンＰＣＲとサンガー配列のそれに続く分析（それぞれの試験ラウンドでそれぞれのベイトについて２０クローン）は、タイタリング分析（ＮＥＢ）からのＬＢ寒天プレート上で成長させた「ブルー」（機能的ｂ－ｇａｌを有する）クローンで実施された。
【0114】
上記の選択手順の追加の修正は、以下を含んだ：
１．別々の対抗選択ラウンドの導入（第２ラウンド前または第１ラウンド前）、未結合ファージライブラリー（ステップ１後）は、実際のバイオパニングラウンド前に、収集され、増幅され、タイタリングにより試験された。
２．対抗選択ラウンド後のプレスクリーニングラウンドの導入。これは、ＰＤＳ、続いて「伸長領域」配列を含有し、したがって、バイオパニング手順を３７℃で実施することを可能にするベイトを用いた実験で行われた。プレスクリーニングステップは、「伸長領域のみ」を含有し、それゆえに、これらの伸長領域に結合するファージクローンを除去させるオリゴを用いて実施された。
１．別々の対抗選択ラウンドの導入（第２ラウンド前または第１ラウンド前）、未結合ファージライブラリー（ステップ１後）は、実際のバイオパニングラウンド前に、収集され、増幅され、タイタリングにより試験された。
２．対抗選択ラウンド後のプレスクリーニングラウンドの導入。これは、ＰＤＳ、続いて「伸長領域」配列を含有し、したがって、バイオパニング手順を３７℃で実施することを可能にするベイトを用いた実験で行われた。プレスクリーニングステップは、「伸長領域のみ」を含有し、それゆえに、これらの伸長領域に結合するファージクローンを除去させるオリゴを用いて実施された。
【0115】
ファージライブラリー中のペプチド２は、ＰＤＳ１ ｄｓＤＮＡベイトに対して高結合能力を有した。ペプチド４は、ＰＤＳ２ ｄｓＤＮＡベイトへの結合に基づいて選択された。これらのペプチドは、ＧＧＳリンカーによりファージコートタンパク質にライブラリー中で接合される。したがって、Ｃ末端にこのリンカーを有するペプチド１およびペプチド３もさらなる試験のために提供された。
【0116】
【表2】
【0117】
選択されたＤＮＡ結合ペプチドを有するファージクローンは、同族ＰＤＳを提示する領域でＤＮＡ二重鎖を変更し、それにより挿入または欠失（インデル）を検出するのに一般に使用される、Ｔ７Ｅ１などのＤＮＡヌクレアーゼによる認識がもたらされることがあり、このインデルはＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、等などのゲノム編集酵素の活性から生じると推論された。下の表３に提示される伸長ｄｓＤＮＡベイトならびにＴ７Ｅ１およびサーベイヤー酵素を使用する、不安定化されたＤＮＡ二重鎖についてのそのような切断アッセイの結果は、この仮説（図３ａ～ｃ参照）、すなわち、選択された融合ペプチドを提示するクローンのｄｓＤＮＡへの結合が、ＲＮＡハイブリダイゼーションへの到達性を促進するようにＤＮＡ二重鎖の構造を不安定化することを支持している。図２に示されるように、こうして得られる一過性巻き戻しおよびヘテロ二重鎖構造の形成を想定することができる。
【0118】
【表3】
【0119】
表２に提示される改変ペプチドを使用して、Ｍ１３ファージ連結なしでＤＮＡ結合ドメインとして使用するための配列を試験した。改変は、ペプチド安定性を改善し分解を予防する天然のペプチド改変を反映させるため、Ｎ末端およびＣ末端でのそれぞれアミド化およびアセチル化を含んでいた。ペプチド１および３の場合、追加のＣ末端リンカー（ＧＧＳ）が前述の通りに提供された。これにより、異なる非ファージタンパク質への連結を可能にするリンカーの存在によって同族ＰＤＳへの結合特性の査定も可能になった。
【0120】
同族ＰＤＳを含有する伸長ｄｓＤＮＡを提示された場合、結合および非二重鎖構造形成についてＴ７Ｅ１酵素を使用する切断アッセイの結果は、ＰＤＳ１が選択された既定の同族ＰＤＳである場合、ＤＮＡ結合ドメインである最良の候補としてペプチド１配列をはっきりと指摘した。図４参照のこと。
【0121】
これらの結果は、蛍光ＤＮＡ結合アッセイを実施することによりさらに裏付けられた。ＦＲＥＴ実験を実行して、図５に模式的に示される伸長ｄｓＤＮＡ標的中のＰＤＳ１が提示されるとＲＮＡハイブリダイゼーションを促進する能力を有するペプチド１の結合および巻き戻し活性を査定した。結合すると、ペプチド１はｄｓＤＮＡのある程度の一過性巻き戻しを引き起こしてターゲティングＲＮＡの結合を促進すると仮定された。蛍光ドナー、６－カルボキシフルオセイン（ＦＡＭ）を使用して、適切なターゲティングＲＮＡに１５ｂｐの相補的配列をタグ付けした。標的ＤＮＡは、３’末端に蛍光アクセプターＣｙ５をまたは５’末端にＴｅｘａｓ Ｒｅｄをタグ付けした。ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーションは、ＦＡＭ励起するとＦＲＥＴシグナル－Ｃｙ５またはＴｅｘａｓ Ｒｅｄ蛍光シグナルにより反映される、ペプチド１のその同族ＰＤＳ１配列への結合により促進されることが明らかにされた（図５参照）。
【0122】
まとめると、切断およびＦＲＥＴ実験からの結果は、ペプチド１がｄｓＤＮＡ中のそのそれぞれのＰＤＳに結合し、ｄｓＤＮＡの部分的および一過性の巻き戻しを引き起こして相補的ＲＮＡのハイブリダイゼーションを促進することと矛盾しない。したがって、Ｃ末端ＧＧＳリンカーを組み入れるペプチド１アミノ酸配列（配列番号４）は、本発明のゲノム編集ツール、例えば、ＡｐＧｅｔシステムにおけるＤＮＡ結合ドメインとして使用するための支持されるポリペプチド配列の一例である。類似する研究により、短いポリペプチド配列は、６または６未満のヌクレオチドの他の所望の既定のｄｓＤＮＡ標的配列への結合に向いていると見出されうることが認識される。部位特異的変異誘発は、いかなる所望のＰＤＳに対する結合能力もさらに改善するのに利用しうる。
【0123】
ペプチド１は一般には、さらにターゲティング核酸認識ドメインおよびエフェクター構成要素を含む完全な必要とされるモジュラーポリペプチド構成要素中への組入れのための少なくとも第２のリンカーと一緒に提供されることが認識される。さらに、組込まれたＧＧＳリンカーを伸長することが望ましい場合がある。しかし、これは、ＰＤＳに対する所望の結合特性の維持により達成され、適切なさらなる試験により確認できる。したがって、ＤＢＤとしてのペプチド１は、ＧおよびＳ残基のさらなる配列、例えば、配列番号１のＡｇＰｅｔ中で用いられる配列番号５のリンカー
【0124】
【化11】
【0125】
[実施例２]
人工ニッカーゼの提供
人工ニッカーゼの設計の第１のステップは、超分子自己集合性ナノ構造を形成することができる規則正しいポリペプチドの選択であった。この目的のために、交互パターンの疎水性ロイシンと親水性リジン残基を有する長さ７または９アミノ酸のベータシート形成ペプチドが選択された。そのようなパターンは、自己集合性ナノ構造を形成し、アミロイド構造形成の傾向があることが知られている。このパターンは、天然に存在するヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９に存在するＲｕｖＣ１ヌクレアーゼドメインの既知の触媒アミノ酸に基づいて親水性位置でアミノ酸の置換によりさらに改変された。
人工ニッカーゼの提供
人工ニッカーゼの設計の第１のステップは、超分子自己集合性ナノ構造を形成することができる規則正しいポリペプチドの選択であった。この目的のために、交互パターンの疎水性ロイシンと親水性リジン残基を有する長さ７または９アミノ酸のベータシート形成ペプチドが選択された。そのようなパターンは、自己集合性ナノ構造を形成し、アミロイド構造形成の傾向があることが知られている。このパターンは、天然に存在するヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９に存在するＲｕｖＣ１ヌクレアーゼドメインの既知の触媒アミノ酸に基づいて親水性位置でアミノ酸の置換によりさらに改変された。
【0126】
複数のそのようなベータシート形成ペプチドは、７マーについて下に示される数を制御するためにリンカーまたはループにより接合されることができると推測され、下ではＨは疎水性アミノ酸のことであり、Ｃは触媒アミノ酸のことであり、Ｘは長さｎのアミノ酸の接続リンカーのことである。ペプチド単位のそれぞれは同一でよく、その場合、それぞれのＣは触媒トリオの異なるアミノ酸、認識された触媒三残基または、ＲｕｖＣ１ヌクレアーゼドメインなどの既知の天然に存在するヌクレアーゼの触媒機能を与える異なるアミノ酸タイプのトリオでもよい。交互の連結ペプチド単位は、Ｎ末端からＣ末端にまたは逆戻りに連結されていてもよい。
（Ｈ－Ｃ１－Ｈ－Ｃ２－Ｈ－Ｃ３－Ｈ－（Ｘ）ｎ－Ｈ－Ｃ１－Ｈ－Ｃ２－Ｈ－Ｃ３－Ｈ）ｎ
または
（Ｈ－Ｃ１－Ｈ－Ｃ２－Ｈ－Ｃ３－Ｈ－（Ｘ）ｎ－Ｈ－Ｃ３－Ｈ－Ｃ２－Ｈ－Ｃ１－Ｈ）ｎ
（Ｈ－Ｃ１－Ｈ－Ｃ２－Ｈ－Ｃ３－Ｈ－（Ｘ）ｎ－Ｈ－Ｃ１－Ｈ－Ｃ２－Ｈ－Ｃ３－Ｈ）ｎ
または
（Ｈ－Ｃ１－Ｈ－Ｃ２－Ｈ－Ｃ３－Ｈ－（Ｘ）ｎ－Ｈ－Ｃ３－Ｈ－Ｃ２－Ｈ－Ｃ１－Ｈ）ｎ
【0127】
下の表４は、最初に効率的な人工ニッカーゼを開発するのに使用された７または９アミノ酸の正確なペプチド配列を提示する。前述の通りの開始配列（ｂＡ）は、交互ロイシン残基およびリジン残基の不活性７マーであった。触媒トリオのアミノ酸の親水性位置で提供するための天然に存在するヌクレアーゼドメインが収載されている。例えば、ペプチドｂＢ、ｂＤ、ｉＢＤ、ｂＥ、ｂＦのすべては、すべてのリジンが、ＲｕｖＣ１ヌクレアーゼドメインの触媒アミノ酸と一致し疎水性残基により分離された３アミノ酸［グルタミン酸（Ｅ）アスパラギン酸（Ｄ）およびヒスチジン（Ｈ）］により置換されていた。
【0128】
上述の通りに、ＲｕｖＣ１ヌクレアーゼドメインは、４触媒アミノ酸、Ｈｉｓ９８３、Ａｓｐ９８６、Ａｓｐ１０およびＧｌｕ７６２を有することが報告されている。これらの触媒アミノ酸のいずれの突然変異でも、機能消失をもたらすことが明らかにされた(Nishimasu et al. (2014) Cell 156, 935-949)。しかし、上記のマルチマーという文脈では、簡略化するため、交互の疎水性残基ならびに、例えば、単一のＨｉｓ、ＡｓｐおよびＧｌｕだけを有する同一のペプチド単位を用いることで十分でありえ、それによって、必要な触媒アミノ酸残基すべてを機能しているヌクレアーゼに対して近接させつつ疎水性残基は安定なβ－シート様超分子構造を形成する傾向を維持すると推論された。しかし、９マーペプチドｂＥは、２つのＡｓｐ残基プラスグルタミン酸およびヒスチジンと一緒に提供された。
【0129】
一部の場合、ロイシンはイソロイシンによっても置換された。したがって、ｂＤは、ロイシンから開始してロイシン残基をＥ、ＤおよびＨとその順番で交互に有する７マーである。ＩｂＤは、疎水性残基としてイソロイシン（Ｉ）によるロイシンの置換を除いて同じアミノ酸パターンを有する。イソロイシン残基がβ－シート構造の形成をロイシン残基よりも効率的に助けられることが起こりうる。なぜならば、前者の方が後者よりも疎水性が大きいからである。
【0130】
【表4】
【0131】
ペプチドＩｂＤおよびペプチドｂＤは前で、それぞれ配列番号７および配列番号８として上では表されている。残りのペプチドは、配列番号４７～５９である。
【0132】
そのようなペプチドは、自己集合してβ－シート超分子構造およびニッカーゼ活性を与える能力について試験した。β－シート超分子構造を与える能力は、チオフラビンＴ蛍光結合により判定された(Xue et al. (2017) Royal Soc. Open Sci. 4: 160696)。ニッカーゼ活性は、ゲルプラスミド切断アッセイと組み合わせた分子ビーコンアッセイによって調べた。
【0133】
チオフラビンＴアッセイ
チオフラビンＴ（ＴｈＴ）は反応バッファー液中でペプチドと混ぜ合わせた。ペプチドは反応バッファー液（下に提示される最初の分子ビーコンアッセイについて使用されたのと同じバッファー）を使用して２００μＭまで（ＤＭＳＯ中４．４ｍＭの保存溶液から）希釈した。ＴｈＴは、パルスボルテックスおよび遠心分離を用いて、反応バッファー液中２５μＭでペプチドに付加した。ペプチド／Ｔｈｔ溶液を細胞あたり２００μｌ含有するプレートを３７℃でインキュベートした。４８５ｎｍの発光シグナルは、４５０ｎｍの励起波長を使用して５分毎に測定した。発光シグナルの増加はＴｈＴがアミロイド様原線維に結合したことを示すと解釈された。ペプチドｂＤでは、高発光シグナルが測定され、そのような原線維を形成するペプチドの迅速な自己集合を即座に示した（図７参照）。
チオフラビンＴ（ＴｈＴ）は反応バッファー液中でペプチドと混ぜ合わせた。ペプチドは反応バッファー液（下に提示される最初の分子ビーコンアッセイについて使用されたのと同じバッファー）を使用して２００μＭまで（ＤＭＳＯ中４．４ｍＭの保存溶液から）希釈した。ＴｈＴは、パルスボルテックスおよび遠心分離を用いて、反応バッファー液中２５μＭでペプチドに付加した。ペプチド／Ｔｈｔ溶液を細胞あたり２００μｌ含有するプレートを３７℃でインキュベートした。４８５ｎｍの発光シグナルは、４５０ｎｍの励起波長を使用して５分毎に測定した。発光シグナルの増加はＴｈＴがアミロイド様原線維に結合したことを示すと解釈された。ペプチドｂＤでは、高発光シグナルが測定され、そのような原線維を形成するペプチドの迅速な自己集合を即座に示した（図７参照）。
【0134】
ニッカーゼ活性調査
第１に分子ビーコンアッセイを使用して、ＤＮＡ結合および切断についてペプチドのそれぞれをスクリーニングした。こうした研究を目的として、３３ヌクレオチドを含有する以下のＤＮＡオリゴヌクレオチドを用い、
第１に分子ビーコンアッセイを使用して、ＤＮＡ結合および切断についてペプチドのそれぞれをスクリーニングした。こうした研究を目的として、３３ヌクレオチドを含有する以下のＤＮＡオリゴヌクレオチドを用い、
【0135】
【化12】
【0136】
反応条件は、それぞれのペプチドによるＤＮＡ切断の可能性を増強すると予想されうる条件を反映するように選択された。上述の通りに、ペプチドデザインは、既知のヌクレアーゼの触媒活性部位により示唆された。多くの場合、そのような部位に一般的に好まれる二価金属はＭｇ２＋である。しかし、Ｍｇ２＋イオンを有する反応中間体を生成するには、厳密な配向幾何および電荷要件が必要であり、基質特異的および高度に選択的でありうる。これとは対照的に、Ｍｎ２＋イオンは、触媒作用を促進するのに必要な配位部位は少なくて済む。Ｍｎ２＋イオンは、インビトロで変異ヌクレアーゼをスクリーニングするのに使用されてきた。なぜならば、そのようなイオンは緩い基質特異性を示す傾向があり、Ｍｇ２＋イオンと比べて欠陥のある酵素を救済することができるからである。したがって、Ｍｎ２＋イオンは、この場合では、ペプチドの最初の活性スクリーニングに使用された。
【0137】
それぞれの反応は、２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１３０ｍＭのＮａＣｌ、２７μＭのＫＣｌおよび５ｍＭのＭｎＣｌ２の反応バッファーで実行された。分子ビーコンは、４００ｎＭの濃度で提供された。
【0138】
１５分間インキュベーション後のフルオロフォアの発光シグナルは、５００対１の濃度比で分子ビーコンと混合されたそれぞれのペプチドについて測定された。
【0139】
ペプチドｂＬおよびｂＮは、そのような条件で比較的高度な発光シグナルを出した。したがって、これらのペプチドを使用して、Ｍｎ２＋濃度、金属イオン依存性およびペプチド濃度に関するアッセイ条件の変動をさらに査定した。
【0140】
金属濃度
最初のスクリーニングで使用される塩化マンガンの濃度は過剰であった。これは、反応を完了まで推し進めるため反応中間体を形成する可能性を増強するためであった。金属イオンの過剰量はインビトロ反応ではよく用いられる。しかし、金属が多すぎると、反応に阻害効果を生じることがある。０～５ｍＭの塩化マンガン濃度の範囲を用いることにより、ｂＮペプチドに対する最適塩化マンガン濃度は０．２５ｍＭであることが分かった。
最初のスクリーニングで使用される塩化マンガンの濃度は過剰であった。これは、反応を完了まで推し進めるため反応中間体を形成する可能性を増強するためであった。金属イオンの過剰量はインビトロ反応ではよく用いられる。しかし、金属が多すぎると、反応に阻害効果を生じることがある。０～５ｍＭの塩化マンガン濃度の範囲を用いることにより、ｂＮペプチドに対する最適塩化マンガン濃度は０．２５ｍＭであることが分かった。
【0141】
金属依存性
金属イオンが異なる反応は、ｂＬまたはｂＮペプチドを用いた分子ビーコンが発するシグナルの違いを示した。分子ビーコンの分解は、ｂＬペプチドについてのマンガン、カルシウムおよび塩化マグネシウムと比べて塩化亜鉛イオンの存在下でのほうが広範であった。これとは対照的に、ｂＮペプチドは、反応中の金属とは無関係にシグナルの高い増加を示した。高シグナルは、いかなる金属イオンなしでも観察された。しかし、シグナルはＭｎ２＋イオンがあったほうが大きかった。これにより、異なる活性部位領域を含有する異なるペプチド設計を使用することにより、ＤＮＡ切断の潜在的に異なる機構を生成できることが示唆される。
金属イオンが異なる反応は、ｂＬまたはｂＮペプチドを用いた分子ビーコンが発するシグナルの違いを示した。分子ビーコンの分解は、ｂＬペプチドについてのマンガン、カルシウムおよび塩化マグネシウムと比べて塩化亜鉛イオンの存在下でのほうが広範であった。これとは対照的に、ｂＮペプチドは、反応中の金属とは無関係にシグナルの高い増加を示した。高シグナルは、いかなる金属イオンなしでも観察された。しかし、シグナルはＭｎ２＋イオンがあったほうが大きかった。これにより、異なる活性部位領域を含有する異なるペプチド設計を使用することにより、ＤＮＡ切断の潜在的に異なる機構を生成できることが示唆される。
【0142】
ペプチド濃度の効果
４００ｎＭでの分子ビーコンが、Ｍｎ２＋またはＺｎ２＋イオンの存在下０～８００μＭの漸増濃度のｂＮペプチドに付加された。ｂＮペプチドは、Ｍｎ２＋およびＺｎ２＋イオンありでシグナル変化を誘発した。しかし、４００μＭの濃度では、Ｍｎ２＋イオンありのｂＮペプチドからのシグナルは、Ｍｇ２＋イオンありのｂＮペプチドよりも大きかった。分子ビーコンの分解について測定されたシグナルの全体的増加が、ペプチドｂＮ濃度が増すにしたがって観察された。Ｍｎ２＋イオン存在下でのｂＮペプチドのシグナルは４００μＭ後飽和せず、Ｚｎ２＋イオンありではシグナルは８００μＭのｂＮペプチドまでまだ増加することが見出された。
４００ｎＭでの分子ビーコンが、Ｍｎ２＋またはＺｎ２＋イオンの存在下０～８００μＭの漸増濃度のｂＮペプチドに付加された。ｂＮペプチドは、Ｍｎ２＋およびＺｎ２＋イオンありでシグナル変化を誘発した。しかし、４００μＭの濃度では、Ｍｎ２＋イオンありのｂＮペプチドからのシグナルは、Ｍｇ２＋イオンありのｂＮペプチドよりも大きかった。分子ビーコンの分解について測定されたシグナルの全体的増加が、ペプチドｂＮ濃度が増すにしたがって観察された。Ｍｎ２＋イオン存在下でのｂＮペプチドのシグナルは４００μＭ後飽和せず、Ｚｎ２＋イオンありではシグナルは８００μＭのｂＮペプチドまでまだ増加することが見出された。
【0143】
ゲルプラスミド切断アッセイ
分子ビーコンから発せられるシグナルは、ペプチドによるＤＮＡの切断から生じ、こうして生じたオリゴについて低いＴｍ範囲（融解温度）のためにヘアピン構造の二本鎖領域の解離が生じることができた。しかし、シグナルは、ペプチドがＤＮＡに結合し、ヘアピン構造の形状をゆがめることによっても発生させることができた。これは、フルオロフォアとクエンチャーの近接を変えることができ、それによりシグナル放出も生じることができた。したがって、分子ビーコンアッセイは結合と切断を区別できない。
分子ビーコンから発せられるシグナルは、ペプチドによるＤＮＡの切断から生じ、こうして生じたオリゴについて低いＴｍ範囲（融解温度）のためにヘアピン構造の二本鎖領域の解離が生じることができた。しかし、シグナルは、ペプチドがＤＮＡに結合し、ヘアピン構造の形状をゆがめることによっても発生させることができた。これは、フルオロフォアとクエンチャーの近接を変えることができ、それによりシグナル放出も生じることができた。したがって、分子ビーコンアッセイは結合と切断を区別できない。
【0144】
こうした理由で、切断を探すためにさらなるゲルプラスミド切断アッセイが用いられた。そのようなゲル切断アッセイは、無傷である（切断なし）、切れ目が入っている（ｓｓＤＮＡ切断）および直線化されている（ｄｓＤＮＡ切断）プラスミドを区別できる。なぜならば、３つのプラスミド種はアガロースゲル上の移動が異なるからである。無傷のプラスミドはスーパーコイル構造を有しており、したがって、アガロースゲル中を容易に移動でき、プラスミド上のｓｓＤＮＡ切断はこのスーパーコイル構造を緩める。これにより、ポア中をもっとゆっくり移動する緩んだサークル／ニック構造が生じる。プラスミドのｄｓＤＮＡ切断は直線化したプラスミドを生じさせる。直線構造は、緩んだサークル構造よりも速く移動するが、スーパーコイル構造ほど速くはない。
【0145】
アッセイを最適化するため、プラスミドＤＮＡ（ｐＢＲ３２２）を、Ｚｎ２＋イオンの存在下で漸増濃度のペプチドｂＬまたはｂＮと混合した。これは、１２時間後ニックプラスミドのパーセンテージの増加をもたらすことが分かった。ニック種のパーセンテージは、ｂＬとｂＮの両方でペプチド濃度が大きくなるに従って増加する。ニックプラスミドのパーセンテージは、ｂＮペプチドでは６００μＭよりも大きなペプチド濃度と共に減少し、ｂＬペプチドではそのようなより高いペプチド濃度ではニックプラスミドの量は増加し続ける。プラスミドＤＮＡの増加する割合はゲルのウェルでも観察される。このＤＮＡはペプチドに結合することができ、ゲル中に移動できない複合体を引き起こす。
【0146】
ペプチドｂＬ、ｂＮおよびｂＤはすべてある程度の切断を実証した。しかし、ペプチドｂＤは、ＴｈＴアッセイにより査定した場合、高度に安定なアミロイドベータシート構造を生じさせるそのより高い傾向のためにさらなる研究のために選択された。
【0147】
タンパク質設計
ペプチドｂＤにより生じる切断のパーセンテージは、ペプチド濃度と共に増加することが見い出されており、超分子構造へのペプチドの集合が切断酵素としてのその機能性を増強ことが示唆される。しかし、制御されないペプチド集合は大きな凝集体を生じさせることがある。したがって、いくつかの同一なペプチドが、ベータターン様構造を作り出すことを予想できる短いアミノ酸リンカーまたはループにより連結されている構築物が設計された。これは、モノマー単位を接続するだけではなく、ペプチドが所望のベータシート構造を作り出すことを促進するモノマー単位の密接な近接も可能にする。
ペプチドｂＤにより生じる切断のパーセンテージは、ペプチド濃度と共に増加することが見い出されており、超分子構造へのペプチドの集合が切断酵素としてのその機能性を増強ことが示唆される。しかし、制御されないペプチド集合は大きな凝集体を生じさせることがある。したがって、いくつかの同一なペプチドが、ベータターン様構造を作り出すことを予想できる短いアミノ酸リンカーまたはループにより連結されている構築物が設計された。これは、モノマー単位を接続するだけではなく、ペプチドが所望のベータシート構造を作り出すことを促進するモノマー単位の密接な近接も可能にする。
【0148】
概念設計の実証は以下の原則を考慮した：
１．交互パターンの疎水性および親水性残基が使用される長さ７または９アミノ酸（以下ベータペプチドと呼ばれる）のベータ鎖模倣ペプチド。疎水性ロイシン残基はイソロイシンと交換可能である。
２．ベータターンを与え接続ペプチド単位間のベータシート折り畳みを促進するように設計された個々のベータ鎖模倣モノマーを接続するための４アミノ酸のリンカーの提供。
３．ネガティブ設計（negative design）の隣接単位の提供、すなわち、それぞれのベータシートタンパク質分子間の分子間結合および凝集を妨げるため。
１．交互パターンの疎水性および親水性残基が使用される長さ７または９アミノ酸（以下ベータペプチドと呼ばれる）のベータ鎖模倣ペプチド。疎水性ロイシン残基はイソロイシンと交換可能である。
２．ベータターンを与え接続ペプチド単位間のベータシート折り畳みを促進するように設計された個々のベータ鎖模倣モノマーを接続するための４アミノ酸のリンカーの提供。
３．ネガティブ設計（negative design）の隣接単位の提供、すなわち、それぞれのベータシートタンパク質分子間の分子間結合および凝集を妨げるため。
【0149】
概念構築物の最終の実証では、ペプチドｂＤのロイシン残基がイソロイシンで置き換えられて７マーペプチドｉｂＤを与えた。なぜならば、ｉｂＤは、最も高い試験濃度でさえ観察可能な凝集物を生じないことが見い出されたからであった。イソロイシンはロイシンよりも疎水性なので、前者のほうが後者よりも効率的にβ－シート構造の形成を助けることができた可能性がある。ｂＤペプチドは、インビトロでのペプチド機能性研究から最大のシグナルを示さなかった。しかし、このペプチドが示した凝集し沈殿する傾向は最小であり、したがって、ｂＤペプチドは、設計されたデカマーなどのもっと大きなマルチマー構築物のモノマー単位としてさらに安定なペプチドになると予想された。安定な二次ベータ構造に折り畳まれる潜在力を増強するため、ロイシンはイソロイシンで置換された。これは、アミロイド形成ペプチドの酵素活性を増強することが以前実証されており(Rufo et al. Short peptides self-assemble to produce catalytic amyloids. Nature Chem. (2014) 6, 303-309)、これが適用されて、マルチマー構築物に対してより安定な折り畳みを潜在的に生じさせた。
【0150】
ベータターン設計
ベータペプチド単位を互いに接続することができるベータターンを作製するためには、それぞれのベータターンの適切な長さおよびアミノ酸組成を設計する必要がある。天然のタンパク質中のベータターンの設計とベータ鎖配列（ベータペプチド単位）を水素結合に配向してベータシート構造を作り出すのに必要なアミノ酸側鎖のタイプの両方が考慮される。研究によれば、天然のタンパク質中の最適ベータターン長は多くの場合、２、４または５残基長であることが示されている。天然のタンパク質では、２または５アミノ酸からなるベータターンは多くの場合、特定の鏡像異性に有利になるように折り畳まれ、４アミノ酸の長さを有するベータターンはいかなる特定の鏡像異性に有利になるように折り畳まれることはない。したがって、概念実証では、選択された自己集合性ペプチド間にリンカーを提供するため、４のアミノ酸長が選択された。
ベータペプチド単位を互いに接続することができるベータターンを作製するためには、それぞれのベータターンの適切な長さおよびアミノ酸組成を設計する必要がある。天然のタンパク質中のベータターンの設計とベータ鎖配列（ベータペプチド単位）を水素結合に配向してベータシート構造を作り出すのに必要なアミノ酸側鎖のタイプの両方が考慮される。研究によれば、天然のタンパク質中の最適ベータターン長は多くの場合、２、４または５残基長であることが示されている。天然のタンパク質では、２または５アミノ酸からなるベータターンは多くの場合、特定の鏡像異性に有利になるように折り畳まれ、４アミノ酸の長さを有するベータターンはいかなる特定の鏡像異性に有利になるように折り畳まれることはない。したがって、概念実証では、選択された自己集合性ペプチド間にリンカーを提供するため、４のアミノ酸長が選択された。
【0151】
ベータターンの役割は、ペプチド単位を互いに近づけることによりこの自己集合性を促進することである。したがって、特定のターン立体構造を強制しベータペプチドの潜在的な構造折り畳みを制限する可能性のあるアミノ酸残基を有する硬直したベータターンを設計する必要はない。それどころか、ベータターンの設計はもっと柔軟性がある。天然のタンパク質では、極性アミノ酸残基（セリン、アスパラギン、グルタミンおよびスレオニン）は多くの場合、ベータターンに存在する。これらのアミノ酸の親水性側鎖は容易に水素結合して、潜在的ベータターン立体構造を安定化することができる。さらに、これらのアミノ酸の側鎖は電荷がなく、したがって、構造再配置に寄与するまたは活性部位残基と相互作用する可能性は少ない。主として疎水性のベータペプチド単位を安定化するためには、荷電アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）もベータターン設計中に組み入れられ、完全タンパク質の可溶性を潜在的に増加させる。４番目のアミノ酸の選択は、優先的にグリシンにさらに制限される。このアミノ酸の小型で柔軟な側鎖は立体反発を防ぎ、β－β接続を可能にする。
【0152】
隣接単位のネガティブ設計
容易にベータシート構造に自己集合するベータベプチドの能力は、ベータシートタンパク質構造を作り出すのに有利であるが、ベータペプチドの自己集合性は制御不可能であり、潜在的に大きな原線維構造を作り出す。ベータターンを導入すれば、分子あたりのベータペプチドの数を制御できる。しかし、これは、これらのベータシートタンパク質分子の分子間集合を妨げない。これを防ぐためには、「ネガティブ設計」が、天然のβ－シートタンパク質に見られるように、ベータシートタンパク質設計中に組み入れられる(Richardson and Richardson (2002 PNAS 99, 2754-2759参照)。このため、荷電側鎖を有する単一アミノ酸であるリジンアミノ酸残基が、それぞれの隣接ベータペプチド単位中に導入され、それによって分子間インターフェイスで荷電残基を提供してベータシートタンパク質分子の凝集を阻害した。
容易にベータシート構造に自己集合するベータベプチドの能力は、ベータシートタンパク質構造を作り出すのに有利であるが、ベータペプチドの自己集合性は制御不可能であり、潜在的に大きな原線維構造を作り出す。ベータターンを導入すれば、分子あたりのベータペプチドの数を制御できる。しかし、これは、これらのベータシートタンパク質分子の分子間集合を妨げない。これを防ぐためには、「ネガティブ設計」が、天然のβ－シートタンパク質に見られるように、ベータシートタンパク質設計中に組み入れられる(Richardson and Richardson (2002 PNAS 99, 2754-2759参照)。このため、荷電側鎖を有する単一アミノ酸であるリジンアミノ酸残基が、それぞれの隣接ベータペプチド単位中に導入され、それによって分子間インターフェイスで荷電残基を提供してベータシートタンパク質分子の凝集を阻害した。
【0153】
概念構築物の実証では、第２および第３の疎水性残基（３位および５位）を、それぞれのＮおよびＣ末端ベータペプチド単位においてリジンアミノ酸残基の代わりに使用した。図８を参照のこと。
【0154】
ベータシートペプチド配向
ＦＴＩＲ実験により、ベータペプチド単位が主に逆平行ベータシート構造を取り入れていることが示唆されたが、同じ実験により、自己集合性が動的であり、平衡ベータシートおよび一部の非構造ループ領域を含みながら時間をかけて発展することも示唆された。人工構築物は、モノマーが同じＮからＣ末端方向にまたは反対方向に互いに結合する２つの異なるタイプの二次構造形成を有することができることが認識された。非反転ベータシート様集合を作り出すためには、それぞれのペプチド単位は、ベータターンを使用してＮからＣ末端方向に接続された。これにより、第２のペプチド単位の６位の触媒残基に潜在的に水素結合する第１のペプチド単位の２位の触媒残基がもたらされる（図９）。したがって、例えば、連続するｉｂＤペプチドは以下の通りベータターンを提供するＮ４リンカーにより連結されうる：
ＦＴＩＲ実験により、ベータペプチド単位が主に逆平行ベータシート構造を取り入れていることが示唆されたが、同じ実験により、自己集合性が動的であり、平衡ベータシートおよび一部の非構造ループ領域を含みながら時間をかけて発展することも示唆された。人工構築物は、モノマーが同じＮからＣ末端方向にまたは反対方向に互いに結合する２つの異なるタイプの二次構造形成を有することができることが認識された。非反転ベータシート様集合を作り出すためには、それぞれのペプチド単位は、ベータターンを使用してＮからＣ末端方向に接続された。これにより、第２のペプチド単位の６位の触媒残基に潜在的に水素結合する第１のペプチド単位の２位の触媒残基がもたらされる（図９）。したがって、例えば、連続するｉｂＤペプチドは以下の通りベータターンを提供するＮ４リンカーにより連結されうる：
【0155】
【0156】
反転ベータシート様構造を作り出すためには、一つおきのペプチド単位の配列が反転される。これにより、ペプチド単位２の２位の触媒残基に潜在的に水素結合するペプチド単位１の２位（ＮからＣ末端方向に）の触媒残基が得られる（図９）。
【0157】
[実施例３]
ＡｐＧｅｔモジュラーポリペプチドへの人工ニッカーゼの融合
上記の設計態様を取り上げて、ベータペプチドを最初に、５ベータペプチドからなるペンタマー、および１０ベータペプチドからなるデカマーに集合させた。ペンタマーおよびデカマー（図８）は、上で説明したように凝集を減らすためにネガティブ設計を組み入れるベータペプチド単位によりそのＮおよびＣ末端に隣接させた。さらに、反転および非反転設計を作り出した（図９参照）。それぞれのペプチド単位は、潜在的ベータ鎖を表し、４アミノ酸のベータターンにより分離される。Ｎ末端は、リンカー（リンカー１）を通じて配列番号１に示されるＤＢＤのＣ末端に直接融合された。柔軟で可溶性の領域は、アスパラギン、グルタミン、グリシンおよびセリンからなるＣ末端隣接領域の末端で提供された。
ＡｐＧｅｔモジュラーポリペプチドへの人工ニッカーゼの融合
上記の設計態様を取り上げて、ベータペプチドを最初に、５ベータペプチドからなるペンタマー、および１０ベータペプチドからなるデカマーに集合させた。ペンタマーおよびデカマー（図８）は、上で説明したように凝集を減らすためにネガティブ設計を組み入れるベータペプチド単位によりそのＮおよびＣ末端に隣接させた。さらに、反転および非反転設計を作り出した（図９参照）。それぞれのペプチド単位は、潜在的ベータ鎖を表し、４アミノ酸のベータターンにより分離される。Ｎ末端は、リンカー（リンカー１）を通じて配列番号１に示されるＤＢＤのＣ末端に直接融合された。柔軟で可溶性の領域は、アスパラギン、グルタミン、グリシンおよびセリンからなるＣ末端隣接領域の末端で提供された。
【0158】
さらにＲＳＢＤとＤＢＤの両方を提供するもっと長い融合構築物の一部としてのニッカーゼ活性の試験では、それぞれのタンパク質構築物は、リンカー配列の提供により構築物ＡｐＧｅｔ－ｉ（配列番号１マイナス最終リンカーおよびニッカーゼ）のＣ末端領域に融合された。選択されたリンカーは、
【0159】
【化14】
この最終構築物は、ＡｐＧｅｔ１．０ヌクレアーゼタンパク質と呼ばれる。
【0160】
そのようなモジュラーポリペプチドは、種々の作用機序またはインビトロ特徴付け研究を使用する２つの異なるシステム：（ｉ）インビトロ転写翻訳（ＩＶＴＴ）および２）細菌組換えタンパク質産生（大腸菌（E.coli）タンパク質産生）を使用して発現された。可溶性を増強するためおよび下流タンパク質精製ステップを楽にするため、一連のタンパク質タグをＡｐＧｅｔ１．０配列に結合させた（図１０参照）。第１のタンパク質設計は、プロテアーゼ特異的切断部位（ＴＥＶ切断部位）に先行するＮ末端ヘキサヒスチジンタグ（６Ｈｉｓ－タグ）を含有していた。切断部位はＴＥＶプロテアーゼにより切断でき、ＡｐＧｅｔ１．０タンパク質の精製後６Ｈｉｓ－タグの除去が可能になる。第２のタンパク質設計は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）をＡｐＧｅｔ１．０のＮ末端に融合することによりＡｐＧｅｔ１．０構築物の可溶性を潜在的に増強すると考えられた。ＭＢＰタグはＮ末端６Ｈｉｓ－タグと一緒に提供された。Ｃ末端は、第２の６Ｈｉｓタグに、続いてグリシンおよびセリンからなるスペーサー領域に、続いてＴＥＶプロテアーゼ切断部位に融合された。スペーサーは、ＡｐＧｅｔ１．０の折り畳みによりＭＢＰの立体障害を減少させ、ＡｐＧｅｔ１．０からのＨｉｓ－ＭＢＰ－Ｈｉｓタグの首尾よい切断のために、ＴＥＶプロテアーゼへの適切な接近を可能にする。
【0161】
インビトロ転写および翻訳（ＩＶＴＴ）
ＩＶＴＴ発現システムを使用して、上で論じられたように発現を増強し、最初に切断活性についてＡｐＧｅｔ１．０タンパク質をスクリーニングした。無細胞インビトロ転写および翻訳システムは、細胞環境の束縛なしでタンパク質を翻訳する。そのようなシステムは、細胞内で安定しておらず別の点では凝集するまたは細胞死を引き起こしてタンパク質収量を減らすと考えられる不溶性で毒性にあるタンパク質を発現するために使用されることが多い。プロテアーゼ、ＲＮアーゼおよびＤＮアーゼなしでタンパク質を発現できるＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ＩＶＴＴシステム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）が使用された。プロテアーゼが存在すると全タンパク質収量を減らすことができ、ＲＮアーゼ／ＤＮアーゼはインビトロ切断アッセイを妨害できるので、これは望ましかった。
ＩＶＴＴ発現システムを使用して、上で論じられたように発現を増強し、最初に切断活性についてＡｐＧｅｔ１．０タンパク質をスクリーニングした。無細胞インビトロ転写および翻訳システムは、細胞環境の束縛なしでタンパク質を翻訳する。そのようなシステムは、細胞内で安定しておらず別の点では凝集するまたは細胞死を引き起こしてタンパク質収量を減らすと考えられる不溶性で毒性にあるタンパク質を発現するために使用されることが多い。プロテアーゼ、ＲＮアーゼおよびＤＮアーゼなしでタンパク質を発現できるＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ＩＶＴＴシステム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）が使用された。プロテアーゼが存在すると全タンパク質収量を減らすことができ、ＲＮアーゼ／ＤＮアーゼはインビトロ切断アッセイを妨害できるので、これは望ましかった。
【0162】
ＭＢＰ融合ＡｐＧｅｔ１．０は、大きなＭＢＰタンパク質を取り除くためいかなる切断アッセイにも先立って切断された。なぜならば、それはＡｐＧｅｔ１．０タンパク質の作用を立体的に妨害する可能性があったからであった。切断されたタンパク質は、Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂とのタンパク質混合物の粗（バッチ）精製を実行することにより切断アッセイ前に半精製された。樹脂は、タンパク質溶液からＨｉｓ－ＭＢＰ－Ｈｉｓ融合タグおよびＨｉｓ－ＴＥＶプロテアーゼを抽出する６Ｈｉｓタグを捕獲する。
【0163】
ＡｐＧｅｔ１．０タンパク質を用いた最初の非特異的切断アッセイ
最初の切断アッセイは、ＩＶＴＴで発現されプラスミドＤＮＡ基質と一緒にインキュベートされたＡｐＧｅｔ１．０デカマータンパク質を用いて実行された。負の対照としての機能を果たすため、ＡｐＧｅｔ１．０デカマーを用いたアッセイは、ＩＶＴＴ混合物からの種々雑多な活性について制御するためのＩＶＴＴ発現ＡｐＧｅｔ－ｉ（Ｃ末端にＡｐＧｅｔ１．０のＤＢＤ酵素リンカーを追加で包含して発現された）および異なるバッファー組成について制御するためのタンパク質なし対照と一緒に実行された。関連するターゲティング核酸なしでは、ＡｐＧｅｔ１．０タンパク質によるＤＮＡ基質のいかなる切断も非特異的であると予想された。人工ヌクレアーゼのために使用された設計原理は、二価金属カチオンが活性に不可欠であると予測するので、金属なし、Ｍｎ２＋またはＭｇ２＋を含有するバッファーが試験された。Ｍｎ２＋およびＭｇ２＋は５ｍＭで使用された。残りのバッファー成分は生理的条件を反映した：２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ。
最初の切断アッセイは、ＩＶＴＴで発現されプラスミドＤＮＡ基質と一緒にインキュベートされたＡｐＧｅｔ１．０デカマータンパク質を用いて実行された。負の対照としての機能を果たすため、ＡｐＧｅｔ１．０デカマーを用いたアッセイは、ＩＶＴＴ混合物からの種々雑多な活性について制御するためのＩＶＴＴ発現ＡｐＧｅｔ－ｉ（Ｃ末端にＡｐＧｅｔ１．０のＤＢＤ酵素リンカーを追加で包含して発現された）および異なるバッファー組成について制御するためのタンパク質なし対照と一緒に実行された。関連するターゲティング核酸なしでは、ＡｐＧｅｔ１．０タンパク質によるＤＮＡ基質のいかなる切断も非特異的であると予想された。人工ヌクレアーゼのために使用された設計原理は、二価金属カチオンが活性に不可欠であると予測するので、金属なし、Ｍｎ２＋またはＭｇ２＋を含有するバッファーが試験された。Ｍｎ２＋およびＭｇ２＋は５ｍＭで使用された。残りのバッファー成分は生理的条件を反映した：２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ。
【0164】
例として、配列番号１のＡｐＧｅｔ１．０タンパク質は、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋イオンの存在下でプラスミドＤＮＡに切れ目を入れる（ｓｓＤＮＡ切断を表す）ことが見い出された。前述の通り、これは、配列番号６の人工ヌクレアーゼを用いるＡｐＧＥＴである。
【0165】
【化15】
【0166】
この配列では、ＩｂＤ（ＩＥＩＤＩＨＩ）の７マーモノマー単位すべてが反転なしでＮ末端からＣ末端方向に４マーリンカーにより連結されてベータターンを提供する。隣接するＮ末端およびＣ末端ペプチド単位はすぐ上において太字で示されており、それぞれ２番目および３番目の疎水性残基位置が正電荷リジン残基により置換されている。前述の通り、Ｃ末端単位も、可溶性を助けるためにＮＱＧＳのＣ末端配列で提供される。
【0167】
二価金属が存在しなければ切断は検出されなかった。ニックド種（nicked species）のパーセンテージは、Ｍｇ２＋と比べてＭｎ２＋が存在する場合のほうが大きかった。タンパク質なし対照およびＡｐＧｅｔ－ｉは、金属の存在下でも非存在下でもＤＮＡ基質を切断できず、ｉｂＤペプチドデカマーと関連する特異的な切断活性を示している（図１１参照）。
【0168】
大腸菌（E.coli）における組換えタンパク質発現
ＩＶＴＴシステムを使用するＡｐＧｅｔ１．０ １０マータンパク質の発現は、最初の切断活性についてスクリーニングすることができるので有用である。しかし、タンパク質収量の増加、純度およびタンパク質を定量化する能力は、酵素の効率を明らかにしその作用機序を理解するのを支援できる。大腸菌（E.coli）組換え技術は、より大きな収量のタンパク質を産生でき、精製はクロマトグラフィー用の一連のカラムを使用して支援することができる。
ＩＶＴＴシステムを使用するＡｐＧｅｔ１．０ １０マータンパク質の発現は、最初の切断活性についてスクリーニングすることができるので有用である。しかし、タンパク質収量の増加、純度およびタンパク質を定量化する能力は、酵素の効率を明らかにしその作用機序を理解するのを支援できる。大腸菌（E.coli）組換え技術は、より大きな収量のタンパク質を産生でき、精製はクロマトグラフィー用の一連のカラムを使用して支援することができる。
【0169】
発現および精製
増加した高レベル発現では、上で論じられたＭＢＰタグ付きのＡｐＧｅｔ１．０タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、高コピープラスミドであるｐＥＴ２４ａ内に置かれ、このプラスミドは形質転換すると、それぞれの細胞がＡｐＧｅｔ１．０タンパク質の多くのコピーを含有し、それによってタンパク質収量を増やすことを保証する。これはＴ７プロモーターを使用することによりさらに増強された。このプラスミドを使用して、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有するＤＥ３溶原性細菌細胞を形質転換し、ＲＮＡポリメラーゼの発現はＩＰＴＧにより誘導された。
増加した高レベル発現では、上で論じられたＭＢＰタグ付きのＡｐＧｅｔ１．０タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、高コピープラスミドであるｐＥＴ２４ａ内に置かれ、このプラスミドは形質転換すると、それぞれの細胞がＡｐＧｅｔ１．０タンパク質の多くのコピーを含有し、それによってタンパク質収量を増やすことを保証する。これはＴ７プロモーターを使用することによりさらに増強された。このプラスミドを使用して、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有するＤＥ３溶原性細菌細胞を形質転換し、ＲＮＡポリメラーゼの発現はＩＰＴＧにより誘導された。
【0170】
選択された宿主細胞はＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＰＬコドンプラス大腸菌（E.coli）細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であった。ＭＢＰ融合ＡｐＧｅｔ１．０タンパク質は、誘導温度１８℃で１２～１８時間過剰発現された。ＡｐＧｅｔ－ｉタンパク質（再びＣ末端リンカーを含む）は３７℃で４時間、同様に発現された。
【0171】
ＡｐＧｅｔ１．０タンパク質を精製するため、過剰発現ＡｐＧｅｔ１．０タンパク質を含有する細胞ライセートは、６Ｈｉｓ－タグを使用してＮｉ－ＮＴＡアフィニティーベースのクロマトグラフィーカラム中を通過させ、ＭＢＰ融合ＡｐＧｅｔ１．０タンパク質をライセートから精製した。第２のカチオン交換カラムを使用して、ＭＢＰ－ＡｐＧｅｔ１．０タンパク質をさらに精製し、続いてＴＥＶプロテアーゼを用いて切断反応させた。これにより、標的タンパク質は全Ｈｉｓ－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質タグから切断される。標的タンパク質からのＨｉｓ－ＭＢＰ－ＨｉｓタグおよびＴＥＶプロテアーゼの最終分離は、Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂を使用するバッチ精製により実行した。標的タンパク質は溶液中に残り、タグおよびプロテアーゼは樹脂に結合する。
【0172】
[実施例４]
細菌細胞での概念試験の実証
我々は、まず第一に、大腸菌（E.coli）細胞においてＡｐＧｅｔポリペプチドのオンターゲット動員を調査するための試験プラットフォームを考案した。大腸菌（E.coli）は、試験されるＡｐＧｅｔ配置をコードする「エディター」と名付けられた第１のプラスミドおよびＡｐＧｅｔシステムにより媒介される遺伝子編集により差次的シグナルを生成する因子をコードする「ディテクター」である第２のプラスミドで同時形質転換された。２つのプラスミドははっきり異なる適合性の複製起点を有し、大腸菌（E.coli）集団において両方のプラスミドの同時形質転換および安定な維持を可能にする異なる抗生物質耐性遺伝子を含有する。
細菌細胞での概念試験の実証
我々は、まず第一に、大腸菌（E.coli）細胞においてＡｐＧｅｔポリペプチドのオンターゲット動員を調査するための試験プラットフォームを考案した。大腸菌（E.coli）は、試験されるＡｐＧｅｔ配置をコードする「エディター」と名付けられた第１のプラスミドおよびＡｐＧｅｔシステムにより媒介される遺伝子編集により差次的シグナルを生成する因子をコードする「ディテクター」である第２のプラスミドで同時形質転換された。２つのプラスミドははっきり異なる適合性の複製起点を有し、大腸菌（E.coli）集団において両方のプラスミドの同時形質転換および安定な維持を可能にする異なる抗生物質耐性遺伝子を含有する。
【0173】
細菌細胞中へのＡｐＧｅｔ－ｉシステムの送達および転写阻害の実証
エディタープラスミドはマルチコピープラスミドであり、天然のＳｐＣａｓ９プロモーターの制御下のＡｐＧｅｔポリペプチドおよびＪ２３１１９プロモーターの制御下の核酸構成要素（ＮＡＣ）をコードする。これは、大腸菌（E.coli）においてｇＲＮＡ発現を駆動する一般に使用されている強力な合成プロモーターである(例えば、in Qi et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence specific control of gene expression. Cell (2013) 152, 1173-1183参照)。ディテクタープラスミドは、Ｌａｃプロモーター駆動ｅＹＦＰまたはＬａｃＺａタンパク質コード配列を含み、その５’上流領域はＡｐＧｅｔシステムに配置される標的エレメントに相補的な４つの同一な標的を含有する。図１２を参照のこと。
エディタープラスミドはマルチコピープラスミドであり、天然のＳｐＣａｓ９プロモーターの制御下のＡｐＧｅｔポリペプチドおよびＪ２３１１９プロモーターの制御下の核酸構成要素（ＮＡＣ）をコードする。これは、大腸菌（E.coli）においてｇＲＮＡ発現を駆動する一般に使用されている強力な合成プロモーターである(例えば、in Qi et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence specific control of gene expression. Cell (2013) 152, 1173-1183参照)。ディテクタープラスミドは、Ｌａｃプロモーター駆動ｅＹＦＰまたはＬａｃＺａタンパク質コード配列を含み、その５’上流領域はＡｐＧｅｔシステムに配置される標的エレメントに相補的な４つの同一な標的を含有する。図１２を参照のこと。
【0174】
エディタープラスミド中の標的エレメント配列（ＴＥ）は：
【0175】
【化16】
【0176】
ＮＡＣ中のターゲティングエレメントは、コネクターＡＡＴＴＴを使用してＢｏｘＢ ＲＮＡスキャフォールド配列に融合され、このスキャフォールド配列はＡｐＧｅｔポリペプチドのＲＳＢＤに結合する。
【0177】
２つのディテクタープラスミド中の標的は以下の通りである（配列番号６２）：
ＰＣ１およびＰＣ２における５’から３’方向への標的配列（灰色の箱の配列はＰＤＳであり、白色の箱の配列は標的であり、中間は他の配列で分離されている）：
ＰＣ１およびＰＣ２における５’から３’方向への標的配列（灰色の箱の配列はＰＤＳであり、白色の箱の配列は標的であり、中間は他の配列で分離されている）：
【0178】
【化17】
【0179】
予備実験では、エディタープラスミドによりコードされるタンパク質構成要素はいかなるヌクレアーゼも排除する「ＡｐＧｅｔ－ｉ」システムが作製された。これは、配列番号１のＡｐＧｅｔポリペプチドの連結されたＲＳＢＤおよびＤＢＤ構成要素マイナス人工ニッカーゼと同一であった。にもかかわらず、ＰＤＳ含有標的へＡｐＧｅｔモジュラーポリペプチド－ＮＡＣ複合体が首尾よく動員されれば、ｅＹＦＰの転写が阻害されて蛍光シグナルを減らすまたはＬａｃＺａの発現を阻害すると予想された。これは事実であると判明した；図１３ａおよびｂを参照のこと。誘導後、ｅＹＦＰ蛍光のまたはＬａｃＺａ遺伝子の活性（ｏ－ニトロフェニル－ベータ－Ｄ－ガラクトシダーゼの加水分解において）の減少はディテクタープラスミドのどちらかがＡｐＧｅｔ－ｉ発現プラスミドと一緒に送達された時だけ観察され、ＡｐＧｅｔ－ｉの転写阻害活性を示していた。
【0180】
下の表５は、ｅＹＦＰの発現の検出を用いた構築物試験を要約する。下の表６は、ＬａｃＺａの発現の検出を用いた構築物試験を要約する。構築物１＝ＡｐＧｅｔ－ｉの発現用のプラスミド。構築物２＝ｅＹＦＰディテクタープラスミド。構築物３＝ＬａｃＺａディテクタープラスミド。構築物４＝構築物１に類似する骨格を有するが、ＡｐＧｅｔ－ｉ発現カセットはないプラスミド。
【0181】
【表5】
【0182】
【表6】
【0183】
Ｆｏｋ１ヌクレアーゼドメインを用いた試験
次に、ＡｐＧｅｔ概念の試験は、完全に機能的なＲＮＡ依存性ゲノム編集酵素を作出するためにＦｏｋＩヌクレアーゼの触媒単位をリンカー（配列番号１において上で示される配列番号５のリンカー）を通じてＡｐＧｅｔ－ｉのＤＢＤドメインに融合させることにより拡張した。ヌクレアーゼリンカーは、一部分、合成ＤＮＡ断片の合成用のヌクレオチド配列を最適化するように選択された。この場合、ＡｐＧｅｔ－ＦｏｋＩシステムのエディタープラスミドは、構成的Ｊ２３１１９プロモーター制御下で発現される核酸構成要素（ＮＡＣ）および誘導性Ｔｅｔ－Ｏｎプロモーターの制御下のＡｐＧｅｔ－ＦｏｋＩタンパク質（Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）は、Ｔｅｔオペレータ（ＴｅｔＯ）配列）に結合することによりＴｅｔプロモーター（ＴｅｔＰ）の発現を調節する）からなっていた。エディタープラスミドの骨格はｐＥＴ２８ａに由来し、ＣｏｌＥ１複製起点およびカナマイシン耐性発現単位を含む（図１４参照）。ディテクタープラスミドは、向かい合っているＤＮＡ鎖上に２つの同一の標的配列（実験で使用されるエディタープラスミドから発現される単一のＡｐＧｅｔ ＮＡＣ構成要素により認識される）を含む標的カセットを含有し、例えば、ＰＤＳ配列はそのそれぞれの標的配列の内部に位置していた（我々は、これを「インワード」または「ＰＤＳ－ｉｎ」配置と名付ける）。
標的エレメント配列および標的配列は以下の通りであった：
標的エレメント配列：
次に、ＡｐＧｅｔ概念の試験は、完全に機能的なＲＮＡ依存性ゲノム編集酵素を作出するためにＦｏｋＩヌクレアーゼの触媒単位をリンカー（配列番号１において上で示される配列番号５のリンカー）を通じてＡｐＧｅｔ－ｉのＤＢＤドメインに融合させることにより拡張した。ヌクレアーゼリンカーは、一部分、合成ＤＮＡ断片の合成用のヌクレオチド配列を最適化するように選択された。この場合、ＡｐＧｅｔ－ＦｏｋＩシステムのエディタープラスミドは、構成的Ｊ２３１１９プロモーター制御下で発現される核酸構成要素（ＮＡＣ）および誘導性Ｔｅｔ－Ｏｎプロモーターの制御下のＡｐＧｅｔ－ＦｏｋＩタンパク質（Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）は、Ｔｅｔオペレータ（ＴｅｔＯ）配列）に結合することによりＴｅｔプロモーター（ＴｅｔＰ）の発現を調節する）からなっていた。エディタープラスミドの骨格はｐＥＴ２８ａに由来し、ＣｏｌＥ１複製起点およびカナマイシン耐性発現単位を含む（図１４参照）。ディテクタープラスミドは、向かい合っているＤＮＡ鎖上に２つの同一の標的配列（実験で使用されるエディタープラスミドから発現される単一のＡｐＧｅｔ ＮＡＣ構成要素により認識される）を含む標的カセットを含有し、例えば、ＰＤＳ配列はそのそれぞれの標的配列の内部に位置していた（我々は、これを「インワード」または「ＰＤＳ－ｉｎ」配置と名付ける）。
標的エレメント配列および標的配列は以下の通りであった：
標的エレメント配列：
【0184】
【化18】
「ＰＤＳｏｕｔ」配置：
【0185】
【化19】
【0186】
【化20】
【0187】
【化21】
【0188】
【化22】
【0189】
ディテクタープラスミドは、ｏｒｉ２およびｏｒｉＶ複製起点ならびに抗生物質耐性遺伝子、エディタープラスミド上の抗生物質耐性遺伝子とは異なり、この特定の実施例ではクロラムフェニコール耐性遺伝子を含有するｐＣＣ１由来のエレメントも含有していた（再び、図１４参照）。
【0190】
ＡｐＧｅｔ－ＦｏｋＩの動員に成功すれば、部位特異的二本鎖切断を生じ、ディテクタープラスミドが消失すると予想され、この消失により、このプラスミドは培養培地中に存在する抗生物質に対する耐性遺伝子を含有するので、細菌成長が減少するはずである（図１５）。ＡｐＧｅｔの編集活性の検出を促進するために、これらの試験は、ＥＰＩ３００細胞（ＥｐｉＣｅｎｔｒｅ）中へのエディターおよびディテクタープラスミドの同時形質転換により行われ、これらのプラスミドはＬ－アラビノースにより誘導可能なＰａｒａＢＡＤプロモーターの厳格な調節下でｏｒｉＶ活性化因子ｔｒｆａをコードするように操作されていた。Ｌ－アラビノースを欠く増殖培地においてエディターおよびディテクタープラスミドで同時形質転換されたＥＰＩ３００細胞が成長すると、非常に低いコピー数のディテクタープラスミドが生じる（マルチコピーｏｒｉ－Ｖ複製起点が活性化されていないからである）。これは、ＡｐＧｅｔ－ＦｏｋＩのＤＮＡ編集活性の結果としてディテクタープラスミドが消失すると、クロラムフェニコールに対して細胞をさらに感受性にすると予想された。編集活性の検出は、アンヒドロテトラサイクリン（ＡＴＣ）を用いたＡｐＧｅｔの誘導１日後ＯＤ６００を測定することによった。対照実験は、ＥＰＩ３００細胞へのＡｐＧｅｔ－ｉ発現エディター（ＡｐＧｅｔ構築物、ヌクレアーゼドメインを欠く）または非ＡｐＧｅｔ発現プラスミドおよびディテクタープラスミドの同時形質転換を含んでいた。試験に成功したかどうかは、ＰＤＳ－標的配列ペアおよび５、８または１４ｎｔのこれらのペア間のスペーサーに対して「ＰＤＳ－ｉｎ」フォーマットを有するディテクタープラスミドも含有する細胞でのＡｐＧｅｔ－ＦｏＫ１の発現と共に観察されるＯＤ６００の減少により例証される（図１５でのバー１～３参照）。
【0191】
人工ニッカーゼモジュールを用いた試験
ＦｏｋＩヌクレアーゼに融合されたＡｐＧｅｔプラットフォームの成功した試験に続いて、我々は試験を、前述の通りの好ましい選択された人工ニッカーゼ（配列番号６）を含む人工ヌクレアーゼ（ＡＮ）に融合されたＡｐＧｅｔまで拡大した。
ＦｏｋＩヌクレアーゼに融合されたＡｐＧｅｔプラットフォームの成功した試験に続いて、我々は試験を、前述の通りの好ましい選択された人工ニッカーゼ（配列番号６）を含む人工ヌクレアーゼ（ＡＮ）に融合されたＡｐＧｅｔまで拡大した。
【0192】
要約すると、ＡｐＧｅｔシステムは、破壊された遺伝子を修正する目的で、大腸菌（E.coli）細菌細胞に送達された。細胞は、破壊されたナノルシフェラーゼ遺伝子を保有するディテクタープラスミドおよびＡｐＧｅｔシステムを発現するエディタープラスミドで同時形質転換され、このシステムでは、システムのポリペプチド構成要素（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するモジュラーポリペプチド）がＴ７プロモーターおよびＬａｃオペレータの制御下にありシステムのＲＮＡ構成要素が合成プロモーター（Ｊ２３１１９）の制御下で発現される。修復鋳型も、おおよそ２００ｂｐの右および左相同アームと一緒にエディタープラスミドに包埋される。
【0193】
ドナーまたは修復鋳型エレメントの５’から３’方向への配列は以下の通りであった：（左相同アームの配列は下線が引かれており、右相同アームの配列は灰色で強調されている）：
【0194】
【化23】
【0195】
ヌクレアーゼペプチド単位の長さおよび配向が異なる種々のＡｐＧｅｔポリペプチドを試験した（図１６参照）。発現カセットは、上で論じられた精製および試験のために、ＡｐＧｅｔポリペプチド産生の発現のための発現カセットと比べて改変された。発現試みにより、可溶性タグＭＢＰを付加すると大腸菌（E.coli）でのタンパク質の発現が増強されたことが示された。しかし、そのようなタグは、編集活性を得るのに必要ではなかった。しかし、切断可能な６Ｈｉｓタグは保持された。具体的には、我々は、「非反転」および「反転」タンパク質翻訳方向に最大１０ペプチド単位（デカマー）からなるヌクレアーゼドメインを有するＡｐＧｅｔ１．０を試験した。ＡｐＧｅｔ編集活性の検出感度を最大にするため、ディテクタープラスミドは「機能獲得型」検出システムを提供し、そこではディテクターエレメントの二本鎖ＤＮＡ配列中でニックを生成すると相同組換え修復（ＨＤＲ）を促進して、ドナー鋳型の存在下でディテクター活性を回復させることができる。検出活性をさらに増やすため、ディテクターは、Ｔ７プロモーターの制御下で発現され標的カセットにより破壊され、ＡｐＧｅｔ１．０により認識されるナノルシフェラーゼ遺伝子の形態で設計された。標的カセットは、「ＰＤＳ－ｏｕｔ」または「ＰＤＳ－ｉｎ」配置で縦一列に並んだ２つの同一の標的配列で構成されている。（図１７においてそれぞれ構築物ｆおよびｇを参照）。ＰＤＳ－ｉｎおよびＰＤＳ－ｏｕｔディテクターは、以前用いられ上述の同じ標的配列を用い、相同アームの間に正確に位置していた。
【0196】
我々は、標的カセットは、互いにごく接近して位置する２つの標的配列からなるが、ＡｐＧｅｔ１．０のＡＮのクラスター化ニッキング活性を増加し、したがって、二本鎖切断の機会を増やし、それが今度はより効率的なＨＤＲの引き金を引く可能性があって、機能的ナノルシフェラーゼの発現をもたらすと推論した。上述の通りに、ナノルシフェラーゼ用の相同組換え修復（ＨＤＲ）鋳型はＡｐＧｅｔを分離単位として発現する同じプラスミド上に構築された。
【0197】
図１８および１９は、本発明の合成ゲノム編集システムにより標的とされるＰＤＳ－標的配列のペアのＰＤＳ－ｉｎおよびＰＤＳ－ｏｕｔ配置の使用をさらに図解する。
【0198】
試験されたＡｐＧｅｔ１．０の種々の配置が下の表７に収載されている。
【0199】
【表7】
【0200】
ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、これらの配置のそれぞれおよびナノルシフェラーゼオープンリーディングフレーム（Ｎａｎｏｌｕｃ ＯＲＦ）が破壊されている２つのタイプのディテクターのどちらかで同時形質転換した（ＰＤＳ－ｉｎまたはＰＤＳ－ｏｕｔ配置）。機能的ナノルシフェラーゼを回復させるＨＤＲの効率を反映するＮａｎｏｌｕｃシグナル／ＯＤ６００比をそれぞれの試料について分析した（図１９）。ＨＤＲイベントは、サンガーシーケンシング分析ならびにディテクター単位の修復されたナノルシフェラーゼコード配列のディープアンプリコンシーケンシングにより確かめられた。
【0201】
これらの結果は、明らかに組込み部位にニックを生じることにより、大腸菌（E.coli）においてＨＤＲを促進する際のＡｐＧｅｔ１．０システムの識別可能な活性をはっきり示していた。適切なターゲティング核酸を有する配列番号１のＡｐＧｅｔモジュラーポリペプチドはこの目的に好ましい。
【0202】
[実施例５]
変異ＰＤＳへの選択されたＤＢＤの結合能力
前述の通り、配列
変異ＰＤＳへの選択されたＤＢＤの結合能力
前述の通り、配列
【0203】
【化24】
【0204】
ＡｐＧｅｔ－ｉ発現プラスミド（エディタープラスミド）は図２１に示される通りに提供された。ナノルシフェラーゼ発現カセットは、ＤＢＤ選択のために最初に使用されたＰＤＳおよび図２２に示される標的領域でのそのＰＤＳの変異体を有する第２のプラスミドベクター（ディテクタープラスミド）にクローニングされた。
【0205】
細菌細胞は、ＡｐＧｅｔ－ｉ発現がＴｅｔＲプロモーターの制御下であったエディタープラスミドで形質転換された。ＮＡＣも、構成的Ｊ２３１１９プロモーターの制御下で同じプラスミドにより発現された。異なる耐性遺伝子および適合する複製起点を有するディテクターおよびエディタープラスミドが提供された。ＡｐＧｅｔ－ｉ発現プラスミドはＣｏＩＥ１高コピー複製起点を有する。ディテクタープラスミドはＯｒｉ２およびＯｒｉＶ複製起点を有する。ディテクターおよびエディタープラスミドの形質転換はＥＰＩ３００細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）で実行され、この細胞はディテクタープラスミドのコピー制御を可能にする。形質転換された培養物はその次の日にアンヒドロテトラサイクリン（ＡＴＣ）を用いて誘導されて、ＡｐＧｅｔ－ｉの発現を誘導し、ナノルシフェラーゼ発現はＩＰＴＧ（イソプロピル β－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド）を用いて誘導された。ナノルシフェラーゼのシグナルはマイクロプレートリーダー上でモニターされ、培養中の細菌成長の程度を考慮するために正規化された。
【0206】
エディタープラスミドに類似する骨格を有しＡｐＧｅｔ－ｉ ＯＲＦのないＬａｃＺタンパク質を発現するプラスミドは対照として使用された（図２３ａ）。この対照により、種々のＰＤＳの影響下でのルシフェラーゼ遺伝子の発現レベルの減少が比較できた。
【0207】
実験の結果は図２３ｂにまとめられている。
【0208】
ＤＮＡの異なるＰＤＳに向けられたＤＢＤがルシフェラーゼの発現を阻害するのに効果的であることが実証された。これにより、本発明のＤＢＤがＤＮＡに結合するその能力という点で柔軟であることが確かめられる。例えば、配列番号４のＤＢＤは、ｄｓＤＮＡ中の５’ＧＡＧＧＴＣ３’配列だけではなく、例えば、５’ＴＴＧＧＧＴＣ３’および５’ＡＡＡＡＡＡ３’も、こちらの方が上というわけではないがよい親和性で標的とするのに効果的であることが予想できる。
【0209】
[実施例６]
哺乳動物細胞における遺伝子編集研究
哺乳動物細胞におけるＡｐＧｅｔの編集効率は、ＨＥＫ２９３ＴおよびＨＡＰ１細胞で試験された。この目的のため、プラスミドまたはＲＮＰ形態のＡｐＧｅｔの最適化配置が作り出された。哺乳動物細胞培養物でのＡｐＧｅｔの一過性発現では、ＡｐＧｅｔおよびＮＡＣ発現単位が最小必要長さの環状ベクターで構築され、このベクターの効率的作製を可能にする高コピー複製起点および抗生物質耐性遺伝子を含有するだけであった（図２４）。ＡｐＧｅｔおよびＮＡＣ単位は、それぞれＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩおよびＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター下で発現され：ＡｐＧｅｔの発現用にＣＭＶ、Ｃｂｈ／ＣＡＧまたはＥｆ１Ａプロモーターおよび２つのＮＡＣ単位のそれぞれの発現用にＵ６プロモーターが使用された。用いられたＡｐＧｅｔ発現カセットの変異体は、図２５にさらに完全に図解されている。核局在化シグナルはＮ末端でＦＬＡＧ（登録商標）エピトープタグの後で提供された。
哺乳動物細胞における遺伝子編集研究
哺乳動物細胞におけるＡｐＧｅｔの編集効率は、ＨＥＫ２９３ＴおよびＨＡＰ１細胞で試験された。この目的のため、プラスミドまたはＲＮＰ形態のＡｐＧｅｔの最適化配置が作り出された。哺乳動物細胞培養物でのＡｐＧｅｔの一過性発現では、ＡｐＧｅｔおよびＮＡＣ発現単位が最小必要長さの環状ベクターで構築され、このベクターの効率的作製を可能にする高コピー複製起点および抗生物質耐性遺伝子を含有するだけであった（図２４）。ＡｐＧｅｔおよびＮＡＣ単位は、それぞれＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩおよびＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター下で発現され：ＡｐＧｅｔの発現用にＣＭＶ、Ｃｂｈ／ＣＡＧまたはＥｆ１Ａプロモーターおよび２つのＮＡＣ単位のそれぞれの発現用にＵ６プロモーターが使用された。用いられたＡｐＧｅｔ発現カセットの変異体は、図２５にさらに完全に図解されている。核局在化シグナルはＮ末端でＦＬＡＧ（登録商標）エピトープタグの後で提供された。
【0210】
（ｉ）免疫蛍光顕微鏡を使用するＡｐＧｅｔによるＰＤ－Ｌ１／ＣＤ２７４編集の検出
本実施例では、ＡｐＧｅｔの標的領域が、ＰＤ－Ｌ１遺伝子（ＣＤ２７４としても知られる）のオープンリーディングフレームを有するすべての既知の選択的スプライシング転写物の発現に影響するように選択された（Ｑ９ＮＺＱ７－１、Ｑ９ＮＺＱ７－２、Ｑ９ＮＺＱ７－３、Ｕｎｉｐｒｏｔ）。ＡｐＧｅｔ標的エレメントの結合部位およびＰＤＳ部位を含む、ＰＤ－Ｌ１遺伝子標的のエキソン４中のＡｐＧｅｔターゲティング領域のレイアウトは図２６に示されている。
本実施例では、ＡｐＧｅｔの標的領域が、ＰＤ－Ｌ１遺伝子（ＣＤ２７４としても知られる）のオープンリーディングフレームを有するすべての既知の選択的スプライシング転写物の発現に影響するように選択された（Ｑ９ＮＺＱ７－１、Ｑ９ＮＺＱ７－２、Ｑ９ＮＺＱ７－３、Ｕｎｉｐｒｏｔ）。ＡｐＧｅｔ標的エレメントの結合部位およびＰＤＳ部位を含む、ＰＤ－Ｌ１遺伝子標的のエキソン４中のＡｐＧｅｔターゲティング領域のレイアウトは図２６に示されている。
【0211】
ＡｐＧｅｔ ＲＮＰは電気穿孔（ＮＥＯＮ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）によりハプロイドＨＡＰ１細胞に送達された。ハプロイド細胞は、この細胞が単一コピーの標的遺伝子を含有するだけなのでいかなるリーディングフレーム変化または著しい欠失変異の直接表現型結果も予測できるように選択された。トランスフェクション２時間後、インターフェロンガンマがトランスフェクトした細胞培養物に添加されて、ＰＤ－Ｌ１発現を誘導した。トランスフェクション２４時間後、細胞は固定され、ＰＤ－Ｌ１は免疫蛍光標識抗体を使用して検出された。
【0212】
ＰＤ－Ｌ１発現細胞の定量化は、ＩｍａｇｅＪにより行われ、値はＭＳ Ｅｘｃｅｌを使用してグラフにプロットされた；図２７参照のこと。
【0213】
この実験により、インターフェロンガンマ誘導に応答したＰＤ－Ｌ１タンパク質の発現は大いに減少していることが確かめられ、これはＡｐＧｅｔシステムにより標的とされたＰＤ－Ｌ１遺伝子座での遺伝子編集と一致している。
【0214】
（ｉｉ）ＡｐＧｅｔ活性は相同組換え修復（ＨＤＲ）を通じたドナー鋳型配列のゲノム組込みを促進する
ＨＡＰ１細胞は、ＡｐＧｅｔ（図２５、構築物１）、ＲＮＡオリゴの形態でのＰＤ－Ｌ１遺伝子中の標的領域の２つの隣接領域に対するＮＡＣおよび一本鎖ＤＮＡオリゴ（ｓｓＯＤＮ、Ａｌｔ－Ｒ、ＩＤＴ）の形態でのドナー鋳型を発現するベクターで同時トランスフェクトされた。ドナー鋳型は、３’末端に終止コドンを備え両側から５０ｂｐの相同アームで隣接されたＨＡタグ配列を有するように設計された。ドナー鋳型の相同アームは、すでに組み込まれたＨＤＲ鋳型に対する標的領域上およびそれに接する潜在的ＡｐＧｅｔ活性の効果を最小限に抑えるように標的領域の３０ｂｐ上流および下流の配列に結合するように設計された（図２８ａ）。細胞はトランスフェクションの２４時間後に収穫され、ゲノムＤＮＡは抽出されＨＤＲ特異的ＰＣＲにより分析され、そこではプライマーのうちの１つが組み込まれたＨＡタグに結合し別のプライマーが相同アームの外側のゲノム配列に結合する。本実施例に記載される実験のレイアウトおよび結果は図２８ｂに提示されている。
ＨＡＰ１細胞は、ＡｐＧｅｔ（図２５、構築物１）、ＲＮＡオリゴの形態でのＰＤ－Ｌ１遺伝子中の標的領域の２つの隣接領域に対するＮＡＣおよび一本鎖ＤＮＡオリゴ（ｓｓＯＤＮ、Ａｌｔ－Ｒ、ＩＤＴ）の形態でのドナー鋳型を発現するベクターで同時トランスフェクトされた。ドナー鋳型は、３’末端に終止コドンを備え両側から５０ｂｐの相同アームで隣接されたＨＡタグ配列を有するように設計された。ドナー鋳型の相同アームは、すでに組み込まれたＨＤＲ鋳型に対する標的領域上およびそれに接する潜在的ＡｐＧｅｔ活性の効果を最小限に抑えるように標的領域の３０ｂｐ上流および下流の配列に結合するように設計された（図２８ａ）。細胞はトランスフェクションの２４時間後に収穫され、ゲノムＤＮＡは抽出されＨＤＲ特異的ＰＣＲにより分析され、そこではプライマーのうちの１つが組み込まれたＨＡタグに結合し別のプライマーが相同アームの外側のゲノム配列に結合する。本実施例に記載される実験のレイアウトおよび結果は図２８ｂに提示されている。
【0215】
実験は、ＡｐＧｅｔ媒介編集が、ＨＤＲ機構による染色体ＤＮＡ中へのＨＡタグの組込みの引き金を引いたという証拠を提出している。
【0216】
（ｉｉｉ）ＡｐＧｅｔはヒト細胞において標的部位での染色体編集を誘起する
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、標的部位のどちらかの側に並置されたＰＤＳ配列を含む、ＴＳＫＵ遺伝子に向けた、ＡｐＧｅｔ発現構築物（図２５に示されるｊおよびｋ）でトランスフェクトされた；図２９参照のこと。ゲノムＤＮＡはトランスフェクションの４８時間後に収集され、標的部位に隣接するプライマーを使用してＰＣＲにより増幅させた。蛍光鎖終結残基を用いたサンガーシーケンシング由来のＤＮＡ配列痕跡はＰＣＲ産物から得られた。これらは、それぞれの位置で野生型配列の割合を査定することにより遺伝子編集の程度を計算するクラウドベースのソフトウェアパッケージであるＴＩＤＥＲを使用して分析された。非トランスフェクト試料は対照として使用された(Brinkman et al, Nucleic Acids Res. (2018))。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、標的部位のどちらかの側に並置されたＰＤＳ配列を含む、ＴＳＫＵ遺伝子に向けた、ＡｐＧｅｔ発現構築物（図２５に示されるｊおよびｋ）でトランスフェクトされた；図２９参照のこと。ゲノムＤＮＡはトランスフェクションの４８時間後に収集され、標的部位に隣接するプライマーを使用してＰＣＲにより増幅させた。蛍光鎖終結残基を用いたサンガーシーケンシング由来のＤＮＡ配列痕跡はＰＣＲ産物から得られた。これらは、それぞれの位置で野生型配列の割合を査定することにより遺伝子編集の程度を計算するクラウドベースのソフトウェアパッケージであるＴＩＤＥＲを使用して分析された。非トランスフェクト試料は対照として使用された(Brinkman et al, Nucleic Acids Res. (2018))。
【0217】
図３０に示される結果は、対照試料と比べて、試験試料中の配列位置５’から塩基対１５０まで野生型配列からの高い置換率を示す。これは、ＡｐＧｅｔシステムがヒトＨＥＫ－２９３細胞において染色体ＤＮＡを標的部位で編集しているという主張を強く支持している。
【0218】
[実施例７]
ＡｐＧｅｔタンパク質の組換え産生
組換えタンパク質発現および精製技法を使用して、ＡｐＧｅｔタンパク質産生に関するさらなる研究に着手した。これらの研究は、大腸菌（E.coli）での発現によりＡｐＧｅｔ－ｉおよびＡｐＧｅｔ産生（下では「目的のタンパク質」またはＰＯＩと呼ばれる）を最適化することを視野に入れて着手された。ＰＯＩは、種々のタグとの融合物を産生することにより可溶性発現および精製の容易さを可能にするように改変された。これらの融合タンパク質のために用いられた開始配置は図３１に詳述されており、以下のもの：固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）ベースの精製用のＨｉｓタグ（６×ヒスチジン）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）または低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）の可溶性タグ、スペーサー、続いてＴＥＶプロテアーゼ切断部位、ＦＬＡＧ（登録商標）エピトープタグ、核局在化配列（ＮＬＳ）、ＰＯＩ配列および最後はＣ末端のＳｔｒｅｐタグ（登録商標）ＩＩ配列からなっていた。このタグは、ＡｐＧｅｔｉとＡｐＧｅｔ産生の両方で使用しうる。しかし、ＡｐＧｅｔｉはＳｔｒｅｐＩＩタグなしでも精製することができ、したがってＣ末端にリンカー１（配列番号５）を包含するだけで発現しうる。
ＡｐＧｅｔタンパク質の組換え産生
組換えタンパク質発現および精製技法を使用して、ＡｐＧｅｔタンパク質産生に関するさらなる研究に着手した。これらの研究は、大腸菌（E.coli）での発現によりＡｐＧｅｔ－ｉおよびＡｐＧｅｔ産生（下では「目的のタンパク質」またはＰＯＩと呼ばれる）を最適化することを視野に入れて着手された。ＰＯＩは、種々のタグとの融合物を産生することにより可溶性発現および精製の容易さを可能にするように改変された。これらの融合タンパク質のために用いられた開始配置は図３１に詳述されており、以下のもの：固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）ベースの精製用のＨｉｓタグ（６×ヒスチジン）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）または低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）の可溶性タグ、スペーサー、続いてＴＥＶプロテアーゼ切断部位、ＦＬＡＧ（登録商標）エピトープタグ、核局在化配列（ＮＬＳ）、ＰＯＩ配列および最後はＣ末端のＳｔｒｅｐタグ（登録商標）ＩＩ配列からなっていた。このタグは、ＡｐＧｅｔｉとＡｐＧｅｔ産生の両方で使用しうる。しかし、ＡｐＧｅｔｉはＳｔｒｅｐＩＩタグなしでも精製することができ、したがってＣ末端にリンカー１（配列番号５）を包含するだけで発現しうる。
【0219】
Ｈｉｓタグと可溶性タグの間に、いくつかのグリシンまたはセリン残基が組み入れられた。可溶性タグとＴＥＶプロテアーゼ部位の間のスペーサーは最初はグリシンセリンリッチなリンカーであったので、タンパク質構築物中のグリシンおよびセリン残基の数を減らすために、これはアスパラギンリッチなリンカーで置き換えられた。
【0220】
これらの構築物中のＴＥＶプロテアーゼ媒介切断は、アミノ酸Ｇｌｙ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（ＧＷＧＳ）からなるＮＨ２末端リーダーを生成し、したがって、追加の芳香族アミノ酸残基を導入して、タンパク質定量化のために２８０ｎｍでの吸光度測定の感度を改善した。
【0221】
ＣＯＯＨ末端タグとして組み入れられると、ＳｔｒｅｐＩＩタグは、完全長タンパク質を選択するためにストレプトアビジンの特に操作されたバージョンでのアフィニティークロマトグラフィーの使用を可能にする。これは、最終タンパク質製剤からの時期尚早で終了した翻訳産物の除去を可能にした。この方法を通じて、精製、検出および可溶性タグを備えた完全長ＡｐＧｅｔタンパク質の産生が首尾よく達成された。
【0222】
[実施例８]
ＶＰ６４に連結されたＡｐＧｅｔｉを使用する転写活性化
非ヌクレアーゼエフェクターに連結されたＡｐＧｅｔｉプラットフォームの遺伝子調節の改変を提供する能力ならびにシステムの個々の構成要素のモジュール性を証明するための実験に着手した。ＡｐＧｅｔｉ－ＶＰ６４と名付けられた構築物を提供するために配列番号１に一致するＡｐＧｅｔモジュラーポリペプチド中の人工ヌクレアーゼをＶＰ６４転写活性化因子タンパク質で置換し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてこの構築物がＡＳＣＬ１遺伝子を転写的に活性化する能力が判定された。リンカー変動およびｄＣａｓ９－ＶＰ６４構築物を有するＡｐＧｅｔｉ－ＶＰ６４の２つの変異体も試験された。
ＶＰ６４に連結されたＡｐＧｅｔｉを使用する転写活性化
非ヌクレアーゼエフェクターに連結されたＡｐＧｅｔｉプラットフォームの遺伝子調節の改変を提供する能力ならびにシステムの個々の構成要素のモジュール性を証明するための実験に着手した。ＡｐＧｅｔｉ－ＶＰ６４と名付けられた構築物を提供するために配列番号１に一致するＡｐＧｅｔモジュラーポリペプチド中の人工ヌクレアーゼをＶＰ６４転写活性化因子タンパク質で置換し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてこの構築物がＡＳＣＬ１遺伝子を転写的に活性化する能力が判定された。リンカー変動およびｄＣａｓ９－ＶＰ６４構築物を有するＡｐＧｅｔｉ－ＶＰ６４の２つの変異体も試験された。
【0223】
ＡＳＣＬ－１遺伝子は、背景転写レベルが低いそのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの転写活性化因子で知られる標的遺伝子として選択された。４つの異なるＮＡＣを使用して標的とされる遺伝子プロモーター領域の４つの位置が選択された。それぞれのＮＡＣは、短いコネクターにより同じＲＮＡスキャフォールドに接合されたターゲティングエレメントからなっていた（ボックスＢラムダファージ配列）。前述の通り、３つの異なるモジュラーＡｐＧｅｔポリペプチドが同じＶＰ６４エフェクターおよび同じＲＳＢＤと一緒に用いられた（ラムダＮ２２ペプチド）。ＶＰ６４構成要素とＤＢＤの間のリンカー１またはＲＳＢＤとＤＢＤの間のリンカー２は、下の表８に示されるように多彩であった。
【0224】
【表8】
【0225】
【表9】
【0226】
それぞれのＡｐＧｅｔｉ－ＶＰ６４変異体は、同じプラスミドから４つの分離ＮＡＣ転写単位と一緒に発現された。図３２に示されるように、プラスミド構築物はすべて、最小主義のベクター骨格（ＣｏｌＥ１複製起点および細菌耐性遺伝子を含有する）を含む全体構造および５つの分離転写単位を含むインサート：２つのＵ６プロモーター駆動ＮＡＣ単位、続いておよび転写の逆方向にＥｆ１－αプロモーター駆動ＡｐＧｅｔｉ―ＶＰ６４発現単位、続いて別の２つの分離Ｕ６プロモーター駆動ＮＡＣ単位を有していた。異なるＮＡＣ発現単位ならびにＡｐＧｅｔｉ－ＶＰ６４変異発現単位の配列は、以下の表１０に提示されている。表１１はそれぞれのプラスミド構築物の発現単位をまとめている。
【0227】
ＮＡＣ番号付け（１～４）は構築物中のＮＡＣの位置による（５’から３’）。ＮＡＣ１およびＮＡＣ２配列は、ＡｐＧｅｔｉ－ＶＰ６４およびＮＡＣ３およびＮＡＣ４に対して逆転写配向しているので、逆相補鎖上に与えられる。それぞれのＮＡＣ発現単位は、Ｕ６プロモーター、続いてＲＳ（太字）、ＴＥ（下線部配列）および７×ｔを含むターミネーター配列を含む。それぞれのＡｐＧｅｔｉ－ＶＰ６４発現配列は、Ｅｆ１－αプロモーターおよび５’非翻訳領域、続いてＲＳＢＤ（イタリック体大文字）を含むＡｐＧｅｔｉ－ＶＰ６４コード配列（下線部）、続いてリンカー２（太字）、ＤＢＤ（太字大文字）、リンカー１（大文字）およびＶＰ６４モジュール（イタリック体）を含む。
【0228】
表１０
ＮＡＣ１（配列番号７２）
ＮＡＣ１（配列番号７２）
【0229】
【化25】
【0230】
【化26】
【0231】
【化27】
【0232】
【化28】
【0233】
【化29】
【0234】
【化30】
【0235】
【化31】
【0236】
【化32】
【0237】
【化33】
【0238】
【化34】
【0239】
【化35】
【0240】
【化36】
【0241】
【表10】
【0242】
細胞の成長およびトランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、リポフェクタミン３０００試薬を製造業者の説明書に従って使用してＶＰ６４に融合されたＡｐＧｅｔ－ｉタンパク質プラス４つのＮＡＣを発現するプラスミドでトランスフェクトした。ＡｐＧｅｔｉ－ＶＰ６４発現プラスミド２．５ｍｇを、６ウェルプレートフォーマット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でウェル中０．７～１×１０６ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に用いた。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、リポフェクタミン３０００試薬を製造業者の説明書に従って使用してＶＰ６４に融合されたＡｐＧｅｔ－ｉタンパク質プラス４つのＮＡＣを発現するプラスミドでトランスフェクトした。ＡｐＧｅｔｉ－ＶＰ６４発現プラスミド２．５ｍｇを、６ウェルプレートフォーマット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でウェル中０．７～１×１０６ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に用いた。
【0243】
ＲＮＡおよびｃＤＮＡ調製
全ＲＮＡは、市販のＲＮＡ調製キット（Ｍｏｎａｒｃｈ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ、ＮＥＢ）を使用してトランスフェクション４８時間後に抽出した。収穫し精製したＲＮＡは、また市販のキット、Ｉｍｐｒｏｍ－ＩＩ（商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｒｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用して転写した。ｍＲＮＡの発現レベルは、予め設計されたＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲアッセイ（ＩＤＴ）を使用して定量化した。標的Ｃｑ値（ＦＡＭ色素）はＡｃｔｉｎＢ Ｃｑ値（ＨＥＸ色素）に正規化した。標的遺伝子（ＡＳＣＬ１）発現の倍率変化は、モックトランスフェクト対照と比べることにより決定した。
全ＲＮＡは、市販のＲＮＡ調製キット（Ｍｏｎａｒｃｈ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ、ＮＥＢ）を使用してトランスフェクション４８時間後に抽出した。収穫し精製したＲＮＡは、また市販のキット、Ｉｍｐｒｏｍ－ＩＩ（商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｒｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用して転写した。ｍＲＮＡの発現レベルは、予め設計されたＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲアッセイ（ＩＤＴ）を使用して定量化した。標的Ｃｑ値（ＦＡＭ色素）はＡｃｔｉｎＢ Ｃｑ値（ＨＥＸ色素）に正規化した。標的遺伝子（ＡＳＣＬ１）発現の倍率変化は、モックトランスフェクト対照と比べることにより決定した。
【0244】
結果
種々のＡｐＧｅｔ－ＶＰ６４ポリペプチドにより転写活性化を査定するＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲアッセイの結果は、図３３に示されている。それぞれの試料について、ＡＳＣ１特異的シグナルはＡｃｔＢシグナルに正規化した。モックトランスフェクト細胞（ＡｐＧｅｔ－ＶＰ６４がないベクター骨格）のレベルに正規化されたＡＳＣＬ－１遺伝子の転写レベルの相対的倍率変化はグラフに提示されている。
種々のＡｐＧｅｔ－ＶＰ６４ポリペプチドにより転写活性化を査定するＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲアッセイの結果は、図３３に示されている。それぞれの試料について、ＡＳＣ１特異的シグナルはＡｃｔＢシグナルに正規化した。モックトランスフェクト細胞（ＡｐＧｅｔ－ＶＰ６４がないベクター骨格）のレベルに正規化されたＡＳＣＬ－１遺伝子の転写レベルの相対的倍率変化はグラフに提示されている。
【0245】
試験したＡｐＧｅｔｉ－ＶＰ６４ポリペプチドのすべてが転写活性化を示した。
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【配列表】
【国際調査報告】