特表 2024-537321 ヒトおよびカニクイザルタンパク質に対して交差反応性を有する抗ＣＤ３抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-10

(54)【発明の名称】ヒトおよびカニクイザルタンパク質に対して交差反応性を有する抗ＣＤ３抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20241003BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20241003BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20241003BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20241003BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241003BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241003BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241003BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241003BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241003BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241003BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20241003BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28 ZNA

C07K16/46

C12N15/13

C12N15/62 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61P35/00

A61K39/395 E

A61P35/02

A61K39/395 T

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024522067

(86)(22)【出願日】2022-10-12

(85)【翻訳文提出日】2024-06-10

(86)【国際出願番号】 CN2022124968

(87)【国際公開番号】W WO2023061419

(87)【国際公開日】2023-04-20

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/123371

(32)【優先日】2021-10-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524069695

【氏名又は名称】コンセプト トゥー メディシン バイオテック カンパニー， リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ジェン， ウェイ

(72)【発明者】

【氏名】ヤン， リウ

(72)【発明者】

【氏名】ファン， レイ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AB04

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB11

4C085BB41

4C085BB44

4C085CC01

4C085DD62

4C085EE01

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、ヒト化されたものを含む新たな抗ＣＤ３抗体、およびそれらの抗原結合性断片を提供する。これらの抗体は、ヒトＣＤ３とカニクイザルＣＤ３の両方に高い親和性で結合することができ、それらの一本鎖断片（ｓｃＦｖ）を容易に多重特異性抗体に組み込んで腫瘍細胞の存在下でＴ細胞を有効に活性化することができる。さらに、たとえ比較的少数であったとしても、これらの抗体は、広範囲の抗ＣＤ３活性を有し、それに基づいて９つの異なるグレードにカテゴリー分けされる。さらに実証されるように、これらの抗ＣＤ３抗体および断片を二重または三重特異性抗体において適切に使用して、最適化された活性および安全域を達成することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトＣＤ３タンパク質とカニクイザルＣＤ３タンパク質の両方に対して結合特異性を有する、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片であって、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびにＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、
前記ＶＨ ＣＤＲ１が、配列番号７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２が、配列番号８、６４、６５もしくは６６のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３が、配列番号９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１が、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２が、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３が、配列番号１２もしくは６７のアミノ酸配列を含むか；
前記ＶＨ ＣＤＲ１が、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２が、配列番号１４、６８、６９もしくは７０のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３が、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１が、配列番号１６のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２が、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３が、配列番号１７もしくは７１のアミノ酸配列を含むか；または
前記ＶＨ ＣＤＲ１が、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２が、配列番号１８、７２、７３もしくは７４のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３が、配列番号１９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１が、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２が、配列番号２１もしくは７５のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３が、配列番号２２もしくは７６のアミノ酸配列を含む、
抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項2】

前記ＶＨ ＣＤＲ１が、配列番号７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２が、配列番号８のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３が、配列番号９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１が、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２が、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３が、配列番号１２のアミノ酸配列を含むか；
前記ＶＨ ＣＤＲ１が、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２が、配列番号１４のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３が、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１が、配列番号１６のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２が、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３が、配列番号１７のアミノ酸配列を含むか；または
前記ＶＨ ＣＤＲ１が、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２が、配列番号１８のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３が、配列番号１９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１が、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２が、配列番号２１のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３が、配列番号２２のアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載の抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項3】

前記ＶＨ ＣＤＲ１が、配列番号７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２が、配列番号８、６４、６５または６６のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３が、配列番号９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１が、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２が、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３が、配列番号１２または６７のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項4】

前記ＶＨが、Ｇ５５Ａ置換、Ｓ６１Ａ置換またはこれらの組合せを必要に応じて有する、配列番号１および２３～２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、Ｓ９３Ａ置換を必要に応じて有する、配列番号２および３０～３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、全てのアミノ酸位置がＫａｂａｔ番号付けに準拠する、請求項３に記載の抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項5】

前記ＶＨが、配列番号２４のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号３０のアミノ酸配列を含むか；
前記ＶＨが、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号３０のアミノ酸配列を含むか；または
前記ＶＨが、配列番号２６のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号３０のアミノ酸配列を含む、
請求項４に記載の抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項6】

前記ＶＨが、配列番号２３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号３１のアミノ酸配列を含むか；または
前記ＶＨが、配列番号２３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号３２のアミノ酸配列を含む、
請求項４に記載の抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項7】

前記ＶＨ ＣＤＲ１が、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２が、配列番号１４、６８、６９または７０のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３が、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１が、配列番号１６のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２が、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３が、配列番号１７または７１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項8】

前記ＶＨが、Ｇ５５Ａ置換、Ｓ６１Ａ置換またはこれらの組合せを必要に応じて有する、配列番号３および３６～４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、Ｓ９３Ａ置換を必要に応じて有する、配列番号４および４４～４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、全てのアミノ酸位置がＫａｂａｔ番号付けに準拠する、請求項７に記載の抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項9】

前記ＶＨが、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４５のアミノ酸配列を含むか；
前記ＶＨが、配列番号３８のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４５のアミノ酸配列を含むか；
前記ＶＨが、配列番号３９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４５のアミノ酸配列を含むか；
前記ＶＨが、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４６のアミノ酸配列を含むか；
前記ＶＨが、配列番号３８のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４６のアミノ酸配列を含むか；または
前記ＶＨが、配列番号３９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４６のアミノ酸配列を含む、
請求項８に記載の抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項10】

前記ＶＨが、Ｇ５５Ａ置換、Ｓ６１Ａ置換またはこれらの組合せを必要に応じて有する、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、Ｓ９３Ａ置換を必要に応じて有する、配列番号４５のアミノ酸配列を含み、全てのアミノ酸位置がＫａｂａｔ番号付けに準拠する、請求項８に記載の抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項11】

前記ＶＨが、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか；
前記ＶＨが、配列番号３８のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか；または
前記ＶＨが、配列番号３９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４４のアミノ酸配列を含む、
請求項８に記載の抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項12】

前記ＶＨ ＣＤＲ１が、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２が、配列番号１８、７２、７３または７４のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３が、配列番号１９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１が、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２が、配列番号２１または７５のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３が、配列番号２２または７６のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項13】

前記ＶＨが、Ｇ５５Ａ置換、Ｓ６１Ａ置換またはこれらの組合せを必要に応じて有する、配列番号５および５０～５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、Ｓ５３Ａ置換、Ｓ９３Ａ置換またはこれらの組合せを必要に応じて有する、配列番号６および５９～６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、全てのアミノ酸位置がＫａｂａｔ番号付けに準拠する、請求項１２に記載の抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項14】

前記ＶＨが、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号６０のアミノ酸配列を含むか；または
前記ＶＨが、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号６１のアミノ酸配列を含む、
請求項１２に記載の抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項15】

前記ＶＨが、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号５９のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項16】

抗ＣＤ３ユニットが、ＣＤ３複合体に特異的な一本鎖断片（ｓｃＦｖ）を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項17】

請求項１から１６のいずれか一項に記載の抗ＣＤ３抗原結合性断片と、抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ユニットとを含む、多重特異性抗体。

【請求項18】

前記抗ＴＡＡユニットが、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）の対を含むＦａｂ断片を含み、前記抗ＣＤ３抗原結合性断片が、一本鎖断片（ｓｃＦｖ）である、請求項１７に記載の多重特異性抗体。

【請求項19】

前記抗ＣＤ３抗原結合性断片および前記抗ＴＡＡユニットが、両方とも、Ｆｃ断片のＮ末端に配置されている、請求項１７に記載の多重特異性抗体。

【請求項20】

前記ＴＡＡが、クローディン１８．２、ＧＰＣ３、５Ｔ４、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＣＤ７３、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ－７２、ＣＩＸ、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、インテグリン、αＶβ３、α５β１、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰおよびテネイシンからなる群から選択される、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項21】

請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体または断片をコードする、１つまたは複数のポリヌクレオチド。

【請求項22】

請求項２１に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む、細胞。

【請求項23】

請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体もしくは断片、請求項２１に記載の１つもしくは複数のポリヌクレオチド、または請求項２２に記載の細胞を含む、組成物。

【請求項24】

がんを処置するための方法であって、請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体または断片の有効量をがん患者に投与するステップを含む方法。

【請求項25】

がんを処置するための医薬の製造のための、請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体または断片の使用。

【請求項26】

前記がんが、前立腺がん、膵臓がん、白血病、乳がん、大腸がん、胃がん、頭頸部がん、肝臓がん、食道がん、子宮頸がん、甲状腺がん、肺がん、膀胱がん、腎臓がん、子宮がん、または黒色腫である、請求項２４に記載の方法または請求項２５に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

背景
ＣＤ３（表面抗原分類３）は、タンパク質複合体であり、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞）とヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞）の両方を活性化することに関与するＴ細胞共受容体である。ＣＤ３は、４本の別個の鎖で構成されている。哺乳動物では、この複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、および２本のＣＤ３ε鎖を含有する。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびＣＤ３－ゼータ（ζ鎖）と会合して、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生成する。ＴＣＲ、ＣＤ３－ゼータ、および他のＣＤ３分子が一緒にＴＣＲ複合体を構成する。

【0002】

その複雑な細胞外構造を考えると、抗ＣＤ３アゴニスト抗体は、開発するのが難しい。ＣＤ３を標的とする治療用抗体を生成する当初の試み以来、何十年にもわたって、成功しているものは、ほとんどない。ＳＰ３４は、最初に広く使用された抗ＣＤ３アゴニスト抗体であり、カニクイザルＣＤ３と交差反応し得る。また、かなりの数の誘導体が、元のＳＰ３４抗体に基づいて開発されている。とはいえ、ＳＰ３４抗体またはその誘導体をｓｃＦｖ形式に組み入れることが大きな課題であることは証明されている。ｓｃＦｖは、二重特異性または三重特異性抗体への組込みに最も一般的に使用されている断片であることを考えると、この欠損がＳＰ３４の応用を大幅に制限している。もう１つの広く使用されている抗ＣＤ３抗体は、ＯＫＴ３であり、これは、カニクイザルＣＤ３との交差反応性を残念ながら有さず、それ故、好適な前臨床試験モデルの欠如によりその臨床使用が妨げられている。

【0003】

抗ＣＤ３ユニットを有する二重特異性抗体は、患者自身のＴ細胞を悪性細胞に結合させる標的化されたがん免疫プラットフォームを提供する。そのような二重特異性抗体は、Ｔ細胞のがん細胞への直接的な結合を確実にし、したがって、Ｔ細胞活性化を可能ならしめることができ、その結果、細胞傷害活性が、がん細胞に指向されることになる。ＣＤ３に対して特異性を有する二重特異性抗体の開発は、バランスのとれた作用強度、カニクイザルに対する交差反応性、および好適な断片形式への組入れ可能性を有する抗ＣＤ３抗体の欠如により妨げられている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

要旨
本開示は、ヒト化されたものを含む新たな抗ＣＤ３抗体、およびそれらの抗原結合性断片を提供する。これらの抗体は、ヒトＣＤ３とカニクイザルＣＤ３の両方に高い親和性で結合することができ、それらの一本鎖断片（ｓｃＦｖ）には合理的な開発可能性があり、したがって、これらのＣＤ３抗体を容易に多重特異性抗体に組み込んで腫瘍細胞の存在下でＴ細胞を有効に活性化することができる。さらに、それらのうち比較的少数で、これらの抗体は、広範囲の抗ＣＤ３活性を示した。活性に基づいて、これらの抗体を９個異なるグレード（グレード１～９）にカテゴリー分けした。

【0005】

したがって、一実施形態では、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片が提供される。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＣＤ３とカニクイザルＣＤ３の両方に対して結合親和性を有する。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片は、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、およびＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨ ＣＤＲ１が、配列番号７のアミノ酸配列を含み、ＶＨ ＣＤＲ２が、配列番号８、６４、６５もしくは６６のアミノ酸配列を含み、ＶＨ ＣＤＲ３が、配列番号９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ１が、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ２が、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ３が、配列番号１２もしくは６７のアミノ酸配列を含むか；ＶＨ ＣＤＲ１が、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、ＶＨ ＣＤＲ２が、配列番号１４、６８、６９もしくは７０のアミノ酸配列を含み、ＶＨ ＣＤＲ３が、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ１が、配列番号１６のアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ２が、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ３が、配列番号１７もしくは７１のアミノ酸配列を含むか；またはＶＨ ＣＤＲ１が、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、ＶＨ ＣＤＲ２が、配列番号１８、７２、７３もしくは７４のアミノ酸配列を含み、ＶＨ ＣＤＲ３が、配列番号１９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ１が、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ２が、配列番号２１もしくは７５のアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ３が、配列番号２２もしくは７６のアミノ酸配列を含む。

【0006】

一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号７のアミノ酸配列を含み、ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号８、６４、６５または６６のアミノ酸配列を含み、ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１２または６７のアミノ酸配列を含む。

【0007】

一部の実施形態では、ＶＨは、Ｇ５５Ａ置換、Ｓ６１Ａ置換またはこれらの組合せを必要に応じて有する、配列番号１および２３～２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＶＬは、Ｓ９３Ａ置換を必要に応じて有する、配列番号２および３０～３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、全てのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ番号付けに準拠する。

【0008】

一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号２４のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号３０のアミノ酸配列を含むか；ＶＨは、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号３０のアミノ酸配列を含むか；またはＶＨは、配列番号２６のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。

【0009】

一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号１４、６８、６９または７０のアミノ酸配列を含み、ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１６のアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１７または７１のアミノ酸配列を含む。

【0010】

一部の実施形態では、ＶＨは、Ｇ５５Ａ置換、Ｓ６１Ａ置換またはこれらの組合せを必要に応じて有する、配列番号３および３６～４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＶＬは、Ｓ９３Ａ置換を必要に応じて有する、配列番号４および４４～４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、全てのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ番号付けに準拠する。

【0011】

一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４５のアミノ酸配列を含むか；ＶＨは、配列番号３８のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４５のアミノ酸配列を含むか；ＶＨは、配列番号３９のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４５のアミノ酸配列を含むか；ＶＨは、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列を含むか；ＶＨは、配列番号３８のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列を含むか；またはＶＨは、配列番号３９のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４６のアミノ酸配列を含む。

【0012】

一部の実施形態では、ＶＨは、Ｇ５５Ａ置換、Ｓ６１Ａ置換またはこれらの組合せを必要に応じて有する、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、Ｓ９３Ａ置換を必要に応じて有する、配列番号４５のアミノ酸配列を含み、全てのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ番号付けに準拠する。

【0013】

一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号１８、７２、７３または７４のアミノ酸配列を含み、ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号１９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号２１または７５のアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号２２または７６のアミノ酸配列を含む。

【0014】

一部の実施形態では、ＶＨは、Ｇ５５Ａ置換、Ｓ６１Ａ置換またはこれらの組合せを必要に応じて有する、配列番号５および５０～５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＶＬは、Ｓ５３Ａ置換、Ｓ９３Ａ置換またはこれらの組合せを必要に応じて有する、配列番号６および５９～６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、全てのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ番号付けに準拠する。

【0015】

一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号６０のアミノ酸配列を含むか；またはＶＨは、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号６１のアミノ酸配列を含む。

【0016】

がんなどの疾患を処置するために、開示される抗体または断片を使用するための方法および使用も、提供される。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】図１は、抗ＣＤ３キメラ抗体が、異なる作用強度でヒトＰＢＭＣおよびカニクイザルＰＢＭＣに結合したことを示す。

【0018】

【図2】図２は、試験したキメラ抗体のＣＤ３活性が、ベンチマーク抗体ＯＫＴ３と比較して弱い応答を呈したことを示す。

【0019】

【図3】図３は、試験した抗ＣＤ３キメラ抗体により誘導された４－１ＢＢ発現を示す。

【0020】

【図4-1】図４は、試験したヒト化ＣＤ３抗体の細胞ベースの結合を示す。

【図4-2】図４は、試験したヒト化ＣＤ３抗体の細胞ベースの結合を示す。

【0021】

【図5-1】図５は、試験したヒト化ＣＤ３抗体が、多種多様なＣＤ３活性を示したことを示す。

【図5-2】図５は、試験したヒト化ＣＤ３抗体が、多種多様なＣＤ３活性を示したことを示す。

【0022】

【図6】図６は、ヒト化ＣＤ３抗体により誘導された４－１ＢＢ発現を示す。

【0023】

【図7】図７は、ＴＣＲ／ＣＤ３細胞により調べたＣＤ３ ＮＦＡＴ活性を示す。

【0024】

【図8】図８は、ＳＰ３４と比較して、ＣＤ３ ＢｓＡｂのＴＡＡ依存性アゴニスト活性を示す。

【0025】

【図9】図９は、１＋１形式の二重特異性抗体が、２＋Ｌｃ２形式の二重特異性抗体より頑強な応答を誘導したことを示す。

【0026】

【図10】図１０は、４－１ＢＢ誘導ＩＬ－２分泌がＣＤ３依存性であったことを示す。

【0027】

【図11】図１１は、三重特異性抗体により刺激されたＩＬ－２分泌にはＣＤ３ ＮＦＡＴ活性の正の相関があったことを示す。

【0028】

【図12】図１２は、三重特異性抗体により刺激された４－１ＢＢ誘導がＣＤ３ ＮＦＡＴ活性の正の相関を示すことを示す。

【0029】

【図13】図１３は、ベンチマーク二重特異性抗体により誘導されたＩＬ－２分泌および細胞溶解活性を示す。

【0030】

【図14】図１４は、ベンチマーク三重特異性抗体により誘導されたＩＬ－２分泌および細胞溶解活性を示す。

【0031】

【図15】図１５は、三重特異性抗体によってＢ１６Ｆ１０－ｈ５Ｔ４誘導腫瘍を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ実験の計画および結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0032】

詳細な説明
定義
用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」実体は、その実体の１つまたは複数を指し、例えば、「１つの抗体（ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、１つまたは複数の抗体を表すと理解されることに留意されたい。したがって、用語「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１つまたは複数（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」および「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」は、本明細書では同義で使用され得る。

【0033】

本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、単数の「ポリペプチド」はもちろん複数の「ポリペプチド」も含み、アミド結合（ペプチド結合としても公知）により直鎖状に連結された単量体（アミノ酸）で構成されている分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２またはそれより多いアミノ酸数の任意の鎖（単数）または鎖（複数）を指し、生成物の特定の長さを指さない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２もしくはそれより多いアミノ酸数の鎖（単数）もしくは鎖（複数）を指すために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはいずれかと同義で使用され得る。用語「ポリペプチド」は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解的切断、または天然に存在しないアミノ酸による改変を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの発現後改変の産物を指すことを意図したものでもある。ポリペプチドは、天然の生物学的起源に由来することもあり、または組換え技術により産生されることもあるが、必ずしも示されている核酸配列から翻訳されるとは限らない。それは、化学合成によるものを含む、任意の手法で生成され得る。

【0034】

用語「単離された」は、細胞、核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡに関して本明細書で使用される場合、高分子の天然源に存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡから分離された分子をそれぞれ指す。本明細書で使用される場合の用語「単離された」はまた、組換えＤＮＡ技法により産生された場合、細胞物質もウイルス物質も培養培地も実質的にない、または化学合成された場合、化学的前駆体も他の化学物質も実質的にない、核酸もしくはペプチドを指す。さらに、「単離された核酸」は、断片として天然に存在しないおよび自然な状態で見出されない、核酸断片を含むように意図されている。用語「単離された」は、他の細胞タンパク質または組織から単離されている細胞またはポリペプチドを指すためにも本明細書で使用される。単離されたポリペプチドは、精製されたポリペプチドと組換えポリペプチドの両方を包含するように意図されている。

【0035】

本明細書で使用される場合、「抗体」または「抗原結合性断片」は、抗原を特異的に認識し、それに結合する、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体を指す。抗体は、全抗体およびその任意の抗原結合性断片または一本鎖であり得る。したがって、用語「抗体」は、抗原に結合する生物活性を有する免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含む分子を含有する、任意のタンパク質またはペプチドを含む。そのようなものの例としては、重鎖もしくは軽鎖またはそのリガンド結合部分の相補性決定領域（ＣＤＲ）、重鎖または軽鎖可変領域、重鎖または軽鎖定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域、あるいはその任意の部分、あるいは結合タンパク質の少なくとも一部分が挙げられるが、これらに限定されない。

【0036】

用語「抗体断片」または「抗原結合性断片」は、本明細書で使用される場合、抗体の一部分、例えば、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどである。構造に関係なく、抗体断片は、無傷抗体により認識される同じ抗原と結合する。用語「抗体断片」は、アプタマー、スピーゲルマー、およびダイアボディを含む。用語「抗体断片」は、特定の抗原に結合して複合体を形成することにより抗体のように動作する、任意の合成のまたは遺伝子操作されたタンパク質も含む。

【0037】

「一本鎖可変断片」または「ｓｃＦｖ」は、免疫グロブリンの重鎖（Ｖ_Ｈ）の可変領域と軽鎖（Ｖ_Ｌ）の可変領域の融合タンパク質を指す。一部の態様では、領域は、１０～約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドによって結合されている。リンカーは、可動性のためにグリシンはもちろん可溶性のためにセリンまたはトレオニンも多く含むことができ、Ｖ_ＨのＮ末端をＶ_ＬのＣ末端と結合すること、またはその逆、どちらかができる。このタンパク質は、定常領域の除去およびリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。ｓｃＦｖ分子は、当技術分野において公知であり、例えば米国特許第５，８９２，０１９号に、記載されている。

【0038】

抗体という用語は、生化学的に区別され得るポリペプチドの様々な広範なクラスを包含する。重鎖が、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として、一部はこれらの中のサブクラス（例えば、γ１～γ４）として、分類されることは、当業者には理解されるであろう。それは、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧまたはＩｇＥのような抗体の「クラス」を決定するこの鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＧ_５などは、十分に特徴付けられており、機能の特化をもたらすことが公知である。これらのクラスおよびアイソタイプの各々についての改変バージョンは、本開示に鑑みて当業者には容易に識別可能であり、したがって、本開示の範囲内である。全ての免疫グロブリンクラスは、明らかに本開示の範囲内であり、以下の論述は、一般に、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに関することになる。ＩｇＧに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量おおよそ２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖ポリペプチド、および分子量５３，０００～７０，０００の２つの同一の重鎖ポリペプチドを含む。４本の鎖は、典型的に、ジスルフィド結合により「Ｙ」形状に連結されており、軽鎖が、「Ｙ」の口で始まって可変領域まで続いて重鎖を両側から挟んでいる。

【0039】

本開示の抗体、その抗原結合性ポリペプチド、バリアントまたは誘導体は、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、ヒト、ヒト化、霊長類化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ結合性断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＫまたはＶＨドメインを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより生成される断片、ならびに抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書で開示される抗ＣＤ３抗体を含む）を含むが、これらに限定されない。本開示の免疫グロブリンまたは抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであり得る。

【0040】

軽鎖は、カッパまたはラムダ（Ｋまたはλ）のどちらかとして分類される。各重鎖は、カッパ軽鎖と結合していることもあり、またはラムダ軽鎖と結合していることもある。一般に、軽鎖および重鎖は、互いに共有結合しており、２本の重鎖の「尾」部分は、免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞または遺伝子操作された宿主細胞のいずれかにより生成されたとき、共有結合性ジスルフィド連結または非共有結合性連結によって互いに結合している。重鎖の場合、アミノ酸配列は、Ｙ形状の分岐した末端におけるＮ末端から各鎖の底部におけるＣ末端に及ぶ。

【0041】

軽鎖と重鎖の両方は、構造的および機能的相同領域に分けられる。用語「定常」および「可変」は、機能的に使用される。このことに関して、軽鎖（ＶＫ）部分と重鎖（ＶＨ）部分の両方の可変ドメインが、抗原認識および特異性を決定することは理解されるであろう。逆に、軽鎖の定常ドメイン（ＣＫ）および重鎖の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）は、重要な生物学的特性、例えば、分泌、経胎盤移動度、Ｆｃ受容体結合、補体結合などを付与する。慣例により、定常領域ドメインの番号付けは、それらが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から遠位になるにつれて増加する。Ｎ末端部分は、可変領域であり、Ｃ末端部分に定常領域があり、ＣＨ３およびＣＫドメインは、実際には、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端をそれぞれ含む。

【0042】

上述のとおり、可変領域は、抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識し、それに特異的に結合することを可能にする。つまり、抗体の、ＶＫドメインおよびＶＨドメイン、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットは、三次元抗原結合部位を規定する可変領域を形成するように化合している。この四次抗体構造は、Ｙの各腕の末端に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、ＶＨおよびＶＫ鎖の各々の上の３つのＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３）により規定される。一部の事例、例えば、ラクダ科動物種に由来する、またはラクダ科動物免疫グロブリンに基づいて操作された、ある特定の免疫グロブリン分子、では、完全免疫グロブリン分子は、軽鎖を有さずに、重鎖のみからなり得る。例えば、Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)を参照されたい。

【0043】

天然に存在する抗体の場合、各抗原結合ドメインに存在する６つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、抗体が水性環境でその三次元形状をとったときに抗原結合ドメインを形成するように特異的に配置されている、アミノ酸の短い不連続な配列である。「フレームワーク」領域と呼ばれる、抗原結合ドメイン内のアミノ酸の残部は、分子間可変性をあまり示さない。フレームワーク領域は、主としてβシート立体構造をとり、ＣＤＲは、ループを形成し、これらのループは、βシート構造を結合し、一部の場合にはその一部を形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合性相互作用によりＣＤＲを正しい配向で配置することに備える足場を形成するように作用する。配置されたＣＤＲにより形成される抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに相補的な表面を規定する。この相補的表面は、抗体のその同種エピトープへの非共有結合を促進する。ＣＤＲおよびフレームワーク領域をそれぞれ構成するアミノ酸を、当業者は、任意の所与の重鎖または軽鎖可変領域について容易に同定することができる。それらは、正確に定義されているからである（“Sequences of Proteins of Immunological Interest,” Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983)；およびChothia and Lesk, J. MoI. Biol., 196:901-917 (1987)を参照されたい）。

【0044】

当技術分野において使用されているおよび／または認められている用語について２つまたはそれより多くの定義がある場合、本明細書で使用される場合のその用語の定義は、相いれない明示的な記述がない限り、全てのそのような意味を含むように意図されている。具体的な例は、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチド両方の可変領域内に見られる不連続な抗原結合部位を記載するための用語「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）の使用である。この特定の領域は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (1983)によりおよびChothia et al., J. MoI. Biol. 196:901-917 (1987)により記載されており、これらの参考文献は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲ定義は、互いに比較すると、アミノ酸残基のオーバーラップまたはサブセットを含む。とはいえ、抗体またはそのバリアントのＣＤＲに言及するためのどちらの定義の適用も、本明細書で定義され使用される用語の範囲内であるように意図されている。上に引用された参考文献の各々により定義されているようなＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基は、下の表に比較として示されている。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列およびサイズによって変わることになる。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列に鑑みて、どの残基が特定のＣＤＲを含むのかを、常套的に決定することができる。

【表11】

【0045】

Ｋａｂａｔらは、任意の抗体に適用できる可変ドメイン配列の番号付けシステムも定義している。当業者は、配列それ自体以外にいずれの実験データにも頼ることなく、「Ｋａｂａｔ番号付け」のこのシステムを任意の可変ドメイン配列に明確に割り当てることができる。本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequence of Proteins of Immunological Interest” (1983)により示されている番号付けシステムを指す。

【0046】

上の表に加えて、Ｋａｂａｔ番号付けシステムは、ＣＤＲ領域を以下のように記載している：ＣＤＲ－Ｈ１は、おおよそアミノ酸３１（すなわち、最初のシステイン残基のおおよそ９残基後）で始まり、おおよそ５～７個のアミノ酸を含み、次のトリプトファン残基で終わる。ＣＤＲ－Ｈ２は、ＣＤＲ－Ｈ１の終了後１５番目の残基で始まり、おおよそ１６～１９個のアミノ酸を含み、次のアルギニンまたはリシン残基で終わる。ＣＤＲ－Ｈ３は、ＣＤＲ－Ｈ２の終了後おおよそ３３番目のアミノ酸残基で始まり、３～２５個のアミノ酸を含み、配列Ｗ－Ｇ－Ｘ－Ｇで終わり、この配列中のＸは、任意のアミノ酸である。ＣＤＲ－Ｌ１は、おおよそ残基２４（すなわち、システイン残基の後）で始まり、おおよそ１０～１７個の残基を含み、次のトリプトファン残基で終わる。ＣＤＲ－Ｌ２は、ＣＤＲ－Ｌ１の終了後おおよそ１６番目の残基で始まり、おおよそ７個の残基を含む。ＣＤＲ－Ｌ３は、ＣＤＲ－Ｌ２の終了後（すなわち、システイン残基の後）おおよそ３３番目の残基で始まり、おおよそ７～１１個の残基を含み、配列ＦまたはＷ－Ｇ－Ｘ－Ｇで終わり、この配列中のＸは、任意のアミノ酸である。

【0047】

本明細書で開示される抗体は、鳥類および哺乳動物を含む任意の動物起源のものであり得る。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリ抗体である。別の実施形態では、可変領域は、起源が軟骨魚網様のもの（例えば、サメからのもの）であり得る。

【0048】

本明細書で使用される場合、用語「重鎖定常領域」は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。重鎖定常領域を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中部および／もしくは下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはそのバリアントもしくは断片のうちの少なくとも１つを含む。例えば、本開示における使用のための抗原結合ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインとヒンジドメインの少なくとも一部分とＣＨ２ドメインとを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインとＣＨ３ドメインとを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインとヒンジドメインの少なくとも一部分とＣＨ３ドメインとを含むポリペプチド鎖；またはＣＨ１ドメインとヒンジドメインの少なくとも一部分とＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含むポリペプチド鎖を含み得る。別の実施形態では、本開示のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本開示における使用のための抗体は、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部分（例えば、ＣＨ２ドメインの全てまたは一部）を欠いていることがある。上で示されたとおり、重鎖定常領域を、それらがアミノ酸配列の点で天然に存在する免疫グロブリン分子と異なるように改変することができることは、当業者には理解されるであろう。

【0049】

本明細書で開示される抗体の重鎖定常領域は、異なる免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、ポリペプチドの重鎖定常領域は、ＩｇＧ_１分子に由来するＣＨ１ドメイン、およびＩｇＧ_３分子に由来するヒンジ領域を含み得る。別の例では、重鎖定常領域は、一部がＩｇＧ_１分子におよび一部がＩｇＧ_３分子に由来する、ヒンジ領域を含み得る。別の例では、重鎖部分は、一部がＩｇＧ_１分子におよび一部がＩｇＧ_４分子に由来する、キメラヒンジを含み得る。

【0050】

本明細書で使用される場合、用語「軽鎖定常領域」は、抗体軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。好ましくは、軽鎖定常領域は、定常カッパドメインまたは定常ラムダドメインの少なくとも一方を含む。

【0051】

「特異的に結合する」または「に対して特異性を有する」とは、一般に、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、および結合が抗原結合ドメインとエピトープ間のある程度の相補性を必要とすることを意味する。この定義によれば、抗体は、エピトープに、それがそのエピトープに、それがランダムな無関係のエピトープに結合するよりも容易に、その抗原結合ドメインを介して結合する場合、「特異的に結合する」と言われる。用語「特異性」は、ある特定の抗体がある特定のエピトープに結合する相対的親和性を認定するために本明細書では使用される。例えば、抗体「Ａ」は、抗体「Ｂ」よりも所与のエピトープに対して高い特異性を有すると見なされることがあり、または抗体「Ａ」は、それが関連エピトープ「Ｄ」に対して有するよりも高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言われることがある。

【0052】

本明細書で使用される場合、用語「処置する」または「処置」は、治療的処置も、目的が、望ましくない生理的変化または障害、例えばがんの進行、を予防するまたは減速させる（減らす）ことである、予防的対策または予防対策も、指す。有益なまたは所望の臨床結果としては、検出可能であるか検出不能であるかを問わず、症候の緩和、疾患の程度の低下、疾患の安定化した（すなわち、悪化しない）状態、疾患進行の遅延または緩徐化、病状の改善または軽減、および寛解（部分寛解であるか完全寛解あるかを問わず）が挙げられるが、これらに限定されない。「処置」は、処置を受けなかった場合の予想生存期間と比較して生存期間を延長することも意味し得る。処置を必要とする者は、状態または障害に既に罹患している者はもちろん、状態もしくは障害に罹患しやすい者、または状態もしくは障害を予防すべき者を含む。

【0053】

「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」とは、診断、予後判定または治療が望まれる任意の対象、特に、哺乳動物対象を意味する。哺乳類の対象としては、ヒト、飼育動物、家畜、動物園、競技またはペット動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、雌ウシなどが挙げられる。

【0054】

本明細書で使用される場合、「処置を必要とする患者に」または「処置を必要とする対象」などの句は、例えば、検出に、診断手順に、および／または処置に、使用される本開示の抗体または組成物の投与の恩恵を受けることになる対象、例えば、哺乳類の対象を含む。
改善された治療指数のＴ細胞エンゲージャー

【0055】

ＣＤ３（表面抗原分類３）は、タンパク質複合体であり、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８^＋ナイーブＴ細胞）とヘルパーＴ細胞（ＣＤ４^＋ナイーブＴ細胞）の両方を活性化することに関与するＴ細胞共受容体である。ＣＤ３は、４本の別個の鎖で構成されている。哺乳動物では、この複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、および２本のＣＤ３ε鎖を含有する。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびＣＤ３－ゼータ（ζ鎖）と会合して、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生成する。ＴＣＲ、ＣＤ３－ゼータ、および他のＣＤ３分子が一緒にＴＣＲ複合体を構成する。

【0056】

その複雑な細胞外構造を考えると、抗ＣＤ３アゴニスト抗体は、開発するのが難しい。ＣＤ３を標的とする治療用抗体を生成する最初の試み以来、何十年にもわたって、成功しているものは、ほとんどない。ＳＰ３４は、最初に広く使用された抗ＣＤ３アゴニスト抗体であり、カニクイザルＣＤ３と交差反応し得る。また、かなりの数の誘導体が、元のＳＰ３４抗体に基づいて開発されている。とはいえ、ＳＰ３４抗体またはその誘導体をｓｃＦｖ形式に組み入れることが大きな課題であることは証明されている。ｓｃＦｖは、二重特異性または三重特異性抗体への組込みに最もよく使用されている断片であることを考えると、この欠損がＳＰ３４の臨床応用を大幅に制限している。もう１つの広く使用されている抗ＣＤ３抗体は、ＯＫＴ３であり、これは、カニクイザルＣＤ３との交差反応性を残念ながら有さず、それ故、好適な前臨床試験モデルの欠如によりその臨床使用が妨げられている。

【0057】

抗ＣＤ３抗体の現行の治療上の使用は、標的となる腫瘍細胞の非存在下でのＣＤ３活性化に起因してオフターゲット毒性を伴うことが多い。この課題は、異なる活性／物理的および化学的特性／安全性プロファイルを有する抗ＣＤ３抗体の限られた利用可能性によってさらに複雑化される。

【0058】

これに関連して、一実施形態では、本開示は、ヒト化されたものを含む新たな抗ＣＤ３抗体、およびそれらの抗原結合性断片を提供する。１５３Ａ６Ｂ１、１５５Ａ９Ｂ１および１９２Ａ７Ｂ９（表１）という３つのマウスハイブリドーマクローンを生成した。ヒト化によって、ＶＨ／ＶＬの各々から２つ～６つの間のヒト化バージョン（表４～６）を得た。これらのＶＨ／ＶＬ配列の組合せは、７０未満の抗体（表４Ａ～６Ａ）の産生につながった。

【0059】

意外なことに、これら約７０の抗体は、活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）ルシフェラーゼレポーターアッセイまたは４－１ＢＢ誘導アッセイにより測定して、非常に異なるｉｎ ｖｉｔｒｏ機能活性を示した。ＮＦＡＴ活性または４－１ＢＢ誘導活性に基づいて、これらの抗体を９つの異なるグレード（表１０、グレード１～９）にカテゴリー分けした。

【0060】

これらの抗ＣＤ３抗体のいくつかを使用して、二重特異性および三重特異性抗体（二重特異性または三重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）を構築した。Ｔ細胞は、完全に活性化されるために２つのシグナルを必要とする。抗原特異的である第１のシグナルは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の膜上のペプチド－ＭＨＣ分子と相互作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって提供される。共刺激シグナルである第２のシグナルは、抗原非特異的であり、ＡＰＣの膜上に発現される共刺激分子とＴ細胞上に発現される共刺激分子との相互作用により提供される。４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー９）は、ＴＮＦ－受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーであり、自然免疫細胞と適応免疫細胞の両方である免疫細胞の活性化後に発現される重要な共刺激分子である。

【0061】

ＣＤ３、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）および４－１ＢＢに対して特異性を有する三重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、少なくとも以下の利点を有することができると考えられる。第１に、そのような三重特異性抗体は、第１の（ＴＣＲシグナル）および第２の（共刺激）活性化シグナル伝達を同時に提供して、完全に、および持続的におよび効率的に、Ｔ細胞を活性化し、さらにメモリーＴ細胞応答を形づくり、その結果、悪性細胞に立ち向かう。第２に、４－１ＢＢは、活性化または腫瘍浸潤ＴおよびＮＫ細胞上に発現される、誘導性共刺激分子である。ＣＤ３シグナルは、Ｔ細胞上での４－１ＢＢ発現を誘導することによって４－１ＢＢシグナルとさらに相乗作用することができる。第３に、ＴＡＡ依存性抗４－１ＢＢ抗体（すなわち、対応するＴＡＡが存在しないとアゴニスト活性を有さない抗４－１ＢＢ抗体）が使用された場合、三重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、非腫瘍環境でよりいっそう安全になる。最後に、三重特異性抗体におけるＣＤ３活性を（例えば、適切なグレードの抗ＣＤ３部分、例えば表９、を使用することにより）調整して、４－１ＢＢ活性化を微調整することができる。同様に、異なる作用強度の抗ＣＤ３抗体を、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をさらに標的とする二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーにおいて最適に使用することもできる。

【0062】

したがって、そのような三重特異性Ｔ細胞エンゲージャーのために、４－１ＢＢシグナルとよりよく相乗作用し得るバランスのとれた作用強度を有する抗ＣＤ３ユニットを同定することが重要である。好適な抗ＣＤ３ユニットは、例えば、ＩＬ２活性化および４－１ＢＢ誘導およびＴＡＡ陽性標的細胞の死滅によって明らかなように、腫瘍抗原の存在下ではＴ細胞を効率的に活性化することができ、腫瘍抗原の非存在下ではＴ細胞を活性化することができない。そのような好適な抗ＣＤ３ユニットによって、三重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、対応するＴＡＡの存在下では強い４－１ＢＢ活性化作用強度を有することができ、対応するＴＡＡの非存在下では低い（例えば、＜１０％４－１ＢＢ陽性細胞）４－１ＢＢ活性化作用強度を有することができるかまたは４－１ＢＢ活性化作用強度を有することができない。

【0063】

グレード４抗体（わずかなｉｎ ｖｉｔｒｏアゴニスト活性を有する抗ＣＤ３抗体、例えば、Ｈｕ１５３Ａ６Ｂ１－２、－３および－４、Ｈｕ１５５Ａ９Ｂ１－８、－９、－１０、－１４、－１５および－１６、ならびにＨｕ１９２Ａ７Ｂ９－７および－１３）を伴う、抗ＣＤ３／抗４－１ＢＢ／抗クローディン１８．２三重特異性抗体は、対照細胞では非特異的活性化がないがクローディン１８．２陽性細胞では十分なサイトカイン放出および４－１ＢＢ誘導を誘導することが、実証された。その一方で、グレード３抗体（例えば、Ｈｕ１５３Ａ６Ｂ１－７および１３、Ｈｕ１５５Ａ９Ｂ１－２、－３および－４、ならびにＨｕ１９２Ａ７Ｂ９－４）も、ＴＡＡ陰性対照細胞では非特異的活性化がないがクローディン１８．２陽性細胞では許容可能なサイトカイン放出および４－１ＢＢ誘導を誘導した。

【0064】

それに基づいて、これらのバランスのよい抗ＣＤ３抗体を追加の試験に付し、これらの抗体は、二重特異性および三重特異性形式に組み込まれたとき、最高の有効性および治療指数を示した。したがって、これらのデータは、比較的弱い抗ＣＤ３抗体が二重特異性および三重特異性Ｔ細胞エンゲージャーへの組込みの卓越した候補であり得ることを実証する。また重要なこととして、異なる作用強度の抗ＣＤ３抗体は、異なるシナリオに好適であり得る。したがって、今般得られた抗体は、広範な臨床使用であり得、したがって既成の自己免疫－腫瘍治療への応用を可能にする。

【0065】

さらに、二重および三重特異性抗体の異なる構造を試験した。それらのうちの１つ、１＋１形式は、抗ＣＤ３ユニットを一本鎖断片（ｓｃＦｖ）に、および抗ＴＡＡユニットを正規のＦａｂ（ＶＨ／ＶＬ）ドメインに含む。他の構造、２＋Ｌｃ２形式は、対称であり、ＴＡＡに対して特異性を有する一対のＦａｂの２本の軽鎖の各々のＣ末端に融合している２つの抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含む。４－１ＢＢに対して特異性をさらに有する三重特異性抗体については、抗４－１ＢＢユニットは、抗ＴＡＡ／ＣＤ３二重特異性ユニットのＦｃドメインの各々のＣ末端に融合している２つのナノボディを含み得る（図６および１０Ａにおける図解を参照されたい）。１＋１形式は、より良好な安全域を有し、それ故、好ましいものであるが、それでもやはり、形式２＋Ｌｃ２も許容可能であることが、本明細書で明らかにされる。

【0066】

したがって、本開示の一実施形態によれば、抗ＣＤ３ユニットと抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ユニットとを含む多重特異性抗体が提供される。多重特異性抗体は、二重特異性（抗ＣＤ３および抗ＴＡＡ）、三重特異性（抗ＣＤ３、抗ＴＡＡおよび抗４－１ＢＢもしくは別の共刺激因子）、または四重特異性であり得るが、これらに限定されない。
バランスのとれたＴ細胞活性化活性を有する抗ＣＤ３ユニット

【0067】

好ましい実施形態では、本開示のＴ細胞エンゲージャーは、「バランスのよいＴ細胞活性化活性」（または単に「バランスのとれた作用強度」）を有する抗ＣＤ３ユニットを含む。バランスのよいＴ細胞活性化活性の例は、付随する実験例で実証されるように、および下でさらに説明されるように、グレード３または４により代表される。

【0068】

抗ＣＤ３ユニット（例えば、抗体または断片）の作用強度を、当技術分野において公知の様々な異なるアッセイによって、異なる形式で、測定することができる。一部の実施形態では、アッセイは、４－１ＢＢ誘導アッセイである。一部の実施形態では、アッセイは、Ｔ細胞増殖アッセイである。一部の実施形態では、アッセイは、ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞核内因子）シグナル伝達アッセイである。
Ａ．Ｔ細胞活性化ＮＦＡＴアッセイ

【0069】

一例では、Ｔ細胞活性化活性は、ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞核内因子）アッセイによって測定される。そのようなアッセイでは、Ｔ細胞活性化活性は、最大効果（Ｅｍａｘ、これは、アッセイからの最高発光計測値である）として表され得る。ＮＦＡＴアッセイの一例は、以下のように行われる。抗ＣＤ３抗体または抗原結合性断片（濃度範囲：１ｎＭ～１００ｎＭ）を、ＮＦＡＴ応答エレメント（ＮＦＡＴ－ＲＥ）により調節されるレポーター遺伝子を含有する２．５×１０^４個のジャーカットＴ細胞（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＣＡＴ＃Ｊ１６０１からの）とともに、６時間インキュベートする。レポーター遺伝子の発現を発光計測値として測定し、その最大値をＥｍａｘとして記録し、それを使用して、抗ＣＤ３抗体または断片のＴ細胞活性化活性を表す。

【0070】

抗ＣＤ３抗体または断片ごとに、２つのＥｍａｘ値を得ることができる。「ＴＡＡ依存性Ｅｍａｘ」または「Ｅｍａｘ_{（ＴＡＡ＋）}」と呼ばれる、それらのうちの１つは、被験抗体が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を標的とする抗体ユニットも含み、ジャーカットＴ細胞がＴＡＡ発現細胞（例えば、ＣＨＯ細胞または他の腫瘍細胞）と混合されるとき、測定される。一部の実施形態では、Ｔ細胞とＴＡＡ発現細胞間の細胞数の比は、１：１、または代替的に、１：２、２：１、１：３、３：１、１：４もしくは４：１である。一部の実施形態では、そのような抗体は、二重特異性（ＣＤ３＋ＴＡＡ）抗体である。一部の実施形態では、そのような抗体は、三重特異性（例えば、ＣＤ３＋ＴＡＡ＋４－１ＢＢ）抗体である。腫瘍抗原の非限定的な例としては、クローディン１８．２、５Ｔ４、ＧＰＣ３、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＣＤ７３、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ－７２、ＣＩＸ、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、インテグリン、αＶβ３、α５β１、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰおよびテネイシンが挙げられる。一部の実施形態では、ＴＡＡは、クローディン１８．２である。一部の実施形態では、ＴＡＡは、５Ｔ４である。

【0071】

「ＴＡＡ非含有Ｅｍａｘ」または「Ｅｍａｘ_{（ＴＡＡ－）}」と呼ばれる、第２のＥｍａｘ値は、被験抗体が追加の抗ＴＡＡユニットを含まないとき、インキュベーションがＴＡＡ発現細胞を含まないとき、または２つのＴＡＡが異なるとき、測定される。

【0072】

交差プラットフォーム再現性を増強するために、参照抗ＣＤ３抗体を使用することができ、活性を、参照抗体のものに対するパーセンテージとして表すことができる。参照抗ＣＤ３抗体の一例は、従来のフルサイズ、単一特異性Ｆａｂ形式でのＳＰ３４である（表２Ｂ、配列番号７８および７９における配列を参照されたい）。したがって、ＮＦＡＴアッセイ条件（例えば、ジャーカットＴ細胞数）は、最終結果（ＳＰ３４活性に対する％）に影響を与えることなく変わり得る。好ましい実施形態では、ＴＡＡ非含有Ｅｍａｘの測定について、被験抗ＣＤ３抗体は二価であり、参照抗体（例えば、ＳＰ３４）も二価である。例えば、両方は、従来のフルサイズＦａｂ抗体形式のものである。一部の実施形態では、ＴＡＡ非含有Ｅｍａｘの測定について、被験抗ＣＤ３抗体および参照抗体（例えば、ＳＰ３４）は、同じ形式のもの、例えば、フルサイズＦａｂ抗体、ｓｃＦｖ、または多重特異性抗体である。しかし、そのような選択は、一部の実施形態では、ＴＡＡ依存性Ｅｍａｘの測定には適用されない。

【0073】

一部の実施形態では、本開示の抗ＣＤ３抗体または抗原結合性断片は、ＮＦＡＴアッセイで測定されたときに以下の基準を満たす、バランスのとれたＴ細胞活性化活性を有する：（Ａ）Ｅｍａｘ_{（ＴＡＡ－）}＜［ＳＰ３４のＥｍａｘ_{（ＴＡＡ－）}の５０％］、および（Ｂ）Ｅｍａｘ_{（ＴＡＡ＋）}＞［ＳＰ３４のＥｍａｘ_{（ＴＡＡ－）}］。一部の実施形態では、基準（Ａ）について、Ｅｍａｘ_{（ＴＡＡ－）}は、ＳＰ３４のＥｍａｘ_{（ＴＡＡ－）}の１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％または７０％未満であり、その一方で（Ｂ）では、Ｅｍａｘ_{（ＴＡＡ＋）}＞［ＳＰ３４のＥｍａｘ_{（ＴＡＡ－）}］。一部の実施形態では、基準（Ａ）について、Ｅｍａｘ_{（ＴＡＡ－）}は、ＳＰ３４のＥｍａｘ_{（ＴＡＡ－）}の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％または２０％より高いが１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％または７０％未満であり、その一方で（Ｂ）では、Ｅｍａｘ_{（ＴＡＡ＋）}＞［ＳＰ３４のＥｍａｘ_{（ＴＡＡ－）}］。
Ｂ．代替Ｔ細胞活性化アッセイ

【0074】

一部の実施形態では、抗ＣＤ３ユニットのＴ細胞活性化活性を、実施例で説明するものなどのＮＦＡＴアッセイにおいて、ユニット、または多重特異性抗体全体に関して、測定することができる。一部の実施形態では、活性は、ＮＦＡＴアッセイからＥＣ５０として表される。

【0075】

一部の実施形態では、１０μｇ／ｍＬより高いＥＣ５０は、測定がＴＡＡを発現する細胞の非存在下で行われた場合（ＥＣ５０_ＴＡＡ－）、バランスのとれたＴ細胞活性化活性と見なされる。一部の実施形態では、バランスのとれたＴ細胞活性化活性を有する抗ＣＤ３抗体または断片について、ＥＣ５０またはＥＣ５０_ＴＡＡ－は、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬまたは３００μｇ／ｍＬより高い。一部の実施形態では、バランスのとれたＴ細胞活性化活性を有する抗ＣＤ３抗体または断片について、ＥＣ５０_ＴＡＡ－は、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬまたは５０００μｇ／ｍＬ未満である。

【0076】

一部の実施形態では、抗ＣＤ３ユニット（または多重特異性抗体全体）は、１０ｎＭより高いＴ細胞活性化活性、ＥＣ５０、を有する。一部の実施形態では、測定は、ＴＡＡを発現する細胞の非存在下で行われる（ＥＣ５０_ＴＡＡ－）。一部の実施形態では、バランスのとれたＴ細胞活性化活性を有する抗ＣＤ３抗体または断片について、ＥＣ５０またはＥＣ５０_ＴＡＡ－は、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭまたは３００ｎＭより高い。一部の実施形態では、バランスのとれたＴ細胞活性化活性を有する抗ＣＤ３抗体または断片について、ＥＣ５０_ＴＡＡ－は、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、１０００ｎＭまたは５０００ｎＭ未満である。

【0077】

一部の実施形態では、抗ＣＤ３ユニットは、それが、ＥＣ５０_ＴＡＡ－のせいぜい５分の１であるＴＡＡ依存性Ｔ細胞活性化活性ＥＣ５０_ＴＡＡ＋を有する場合、バランスのとれたＴ細胞活性化を有すると見なされる。一部の実施形態では、ＥＣ５０_ＴＡＡ＋は、ＥＣ５０_ＴＡＡ－のせいぜい６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、１１分の１、１２分の１、１３分の１、１４分の１、１５分の１、２０分の１、２５分の１、３０分の１、４０分の１、５０分の１、１００分の１、２００分の１、５００分の１、または１０００分の１である。

【0078】

一部の実施形態では、ＥＣ５０_ＴＡＡ＋を測定する場合、Ｔ細胞とＴＡＡ発現細胞間の細胞数の比は、１：１、または代替的に、１：２、２：１、１：３、３：１、１：４もしくは４：１である。

【0079】

一部の実施形態では、ＥＣ５０_ＴＡＡ－は、１００μｇ／ｍＬ、９０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、７０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、１５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、９μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、７μｇ／ｍＬ、６μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬまたは０．１μｇ／ｍＬ未満である。一部の実施形態では、ＥＣ５０_ＴＡＡ－は、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭまたは０．１ｎＭ未満である。
Ｃ．４－１ＢＢ誘導アッセイ

【0080】

一部の実施形態では、抗ＣＤ３ユニットのＴ細胞活性化活性は、４－１ＢＢ誘導アッセイによって測定される。一実施形態では、４－１ＢＢ誘導アッセイは、従来の形式のモノクローナル／単一特異性抗ＣＤ３抗体に関して行われる。

【0081】

従来の形式のモノクローナル／単一特異性抗ＣＤ３抗体の４－１ＢＢ誘導活性を、以下の様に決定することができる。初代ヒトＰＢＭＣをウェル当たり細胞１×１０^５個の密度で９６ウェルプレートにおいて培養することができる。ヒトＰＢＭＣ細胞は、アッセイに最適である約３０％ＣＤ８^＋細胞を概して含む。試験される抗体を段階希釈し、９６ウェルプレートに、例えば２０ｎＭから出発する、最終濃度で添加することができる。３７℃での４８時間のインキュベーション後、細胞を収集することができる。ＰＢＳによる洗浄後、試料を、次の抗体：抗ヒトＣＤ４－ＡＰＣ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｅ、１７－００４８－４２）、抗ヒトＣＤ８－ＢＶ５１０（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、５６３９１９）、抗ヒト４－１ＢＢ－ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５５９５６）との暗所における室温での３０分間のインキュベーションによる標準手順を使用して、染色することができる。次いで、試料をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄することができる。遠心分離後、上清を廃棄し、細胞を０．２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させる。ＣＤ８^＋Ｔ細胞の中の４－１ＢＢ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞サブセットをＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １６により評価することができる。全ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対する４－１ＢＢ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージ（％）を使用して４－１ＢＢ誘導率を示す：

【数1】

【0082】

より手短に述べると、単一特異性抗ＣＤ３抗体の４－１ＢＢ誘導活性は、ヒト末梢血ＣＤ８＋細胞を、例えば２０ｎＭの最終濃度での、抗ＣＤ３ユニットを含む単一特異性抗体とともに、３７℃で４８時間インキュベートすること、およびＣＤ８＋細胞の総数に対する４－１ＢＢ＋ＣＤ８＋細胞のパーセンテージを４－１ＢＢ誘導率として測定することにより、測定される。一部の実施形態では、単一特異性抗ＣＤ３抗体は、二価である。一部の実施形態では、単一特異性抗ＣＤ３抗体は、従来のＦａｂ＋Ｆｃ形式を有する。

【0083】

抗体の最終濃度は、上で説明されたように２０ｎＭ、または代替的に、１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭもしくは１００ｎＭであり得るが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、濃度は、１０ｎＭまたは２０ｎＭである。

【0084】

４－１ＢＢ誘導活性測定手順の上の例は、ドナー個体からの初代ヒト末梢血細胞を使用する。一部の実施形態では、代替細胞、例えば、樹立細胞系からのＣＤ８^＋細胞が、使用され得る。

【0085】

上の４－１ＢＢ誘導アッセイは、単一特異性抗ＣＤ３抗体のＴ細胞活性化活性を測定するように説明されているが、それを二重特異性または三重特異性／多重特異性抗体に使用することもできる。抗ＴＡＡユニットをさらに含む二重特異性または三重特異性／多重特異性抗体に関して、４－１ＢＢ誘導活性は、ＴＡＡ依存性４－１ＢＢ誘導活性（例えば、ＴＡＡ発現細胞とのコインキュベーション）であることがあり、またはＴＡＡ非含有４－１ＢＢ誘導活性（例えば、ＴＡＡ発現細胞とのコインキュベーションなし）であることがある。

【0086】

一部の実施形態では、これらのＴＡＡ非含有またはＴＡＡ依存性４－１ＢＢ誘導率は、多重特異性抗体が抗４－１ＢＢユニットを有さないときに測定される。一部の実施形態では、これらのＴＡＡ非含有またはＴＡＡ依存性４－１ＢＢ誘導率は、多重特異性抗体が抗４－１ＢＢユニットをさらに含むときに測定される。

【0087】

一部の実施形態では、測定は、１＋１形式の多重特異性抗体に関して行われる。一部の実施形態では、測定は、２＋２Ｌｃ形式の多重特異性抗体に関して行われる。一部の実施形態では、測定は、本開示の三重特異性抗体に関して行われる。一部の実施形態では、三重特異性抗体は、抗ＣＤ３ユニット、抗ＴＡＡユニット、および抗４－１ＢＢユニットを含む。一部の実施形態では、抗４－１ＢＢユニットは、１つまたは２つのＴＡＡ依存性アゴニスト抗体または断片を含む。

【0088】

多重特異性抗体のＴＡＡ非含有およびＴＡＡ依存性４－１ＢＢ誘導率を、単一特異性抗体のためのものと同様の方法によって測定することができる。例えば、ヒトＰＢＭＣをウェル当たり細胞１×１０^５個の密度で９６ウェルプレートにおいて培養することができる。ＴＡＡを発現する標的細胞系（ＴＡＡ発現細胞）または対照細胞（ＣＨＯ－Ｋ１）を２．５×１０^４の密度（したがって、４：１のＥ：Ｔ比、または１：１のＣＤ８^＋：Ｔ比）で播種することができる。被験抗体を段階希釈し、９６ウェルプレートに、１００ｎＭから出発する、最終濃度で添加することができる。３７℃での４８時間のインキュベーション後、細胞を収集することができる。ＰＢＳによる洗浄後、試料を、次の抗体：抗ヒトＣＤ４－ＡＰＣ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｅ、１７－００４８－４２）、抗ヒトＣＤ８－ＢＶ５１０（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、５６３９１９）、抗ヒト４－１ＢＢ－ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５５９５６）との暗所における室温での３０分間のインキュベーションによる標準手順を使用して、染色することができる。試料をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄することができる。遠心分離後、上清を廃棄することができ、ヒトＰＢＭＣを０．２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させることができる。ＣＤ８^＋Ｔ細胞の中の４－１ＢＢ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞サブセットをＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １６により評価することができる。４－１ＢＢ誘導率は、以下のように算出することができる：

【数2】

【数3】

【0089】

より手短に述べると、一部の実施形態では、ＴＡＡ非含有４－１ＢＢ誘導率は、ＴＡＡ発現細胞の非存在下で、ヒト末梢血ＣＤ８＋細胞を、１００ｎＭの最終濃度での多重特異性抗体とともに３７℃で４８時間インキュベートすること、およびＣＤ８＋細胞の総数に対する４－１ＢＢ^＋ＣＤ８^＋細胞のパーセンテージをＴＡＡ非含有４－１ＢＢ誘導率として測定することにより、測定される。一部の実施形態では、多重特異性抗体は、１００ｎＭで少なくとも２０％のＴＡＡ依存性４－１ＢＢ誘導率を有し、ＴＡＡ依存性４－１ＢＢ誘導率は、１：１の比のヒト末梢血ＣＤ８^＋細胞とＴＡＡ発現細胞を１００ｎＭの最終濃度での多重特異性抗体とともに３７℃で４８時間インキュベートすること、およびＣＤ８＋細胞の総数に対する４－１ＢＢ^＋ＣＤ８^＋細胞のパーセンテージをＴＡＡ依存性４－１ＢＢ誘導率として測定することにより、測定される。

【0090】

一部の実施形態では、多重特異性抗体は、ＴＡＡ発現細胞の存在下ではその非存在下でよりもかなり高い４－１ＢＢ誘導活性を有する。例えば、一部の実施形態では、多重特異性抗体は、ＴＡＡ非含有４－１ＢＢ誘導率と比較して少なくとも２倍である４－１ＢＢ誘導率を有する。一部の実施形態では、多重特異性抗体は、ＴＡＡ非含有４－１ＢＢ誘導率と比較して少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍または２０倍である４－１ＢＢ誘導率を有する。

【0091】

一部の実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性である。一部の実施形態では、多重特異性抗体は、三重特異性である。一部の実施形態では、多重特異性抗体は、形式１＋１（図９）で示されるような三重特異性形式を有する。この形式では、抗ＴＡＡユニットは、Ｆａｂ断片であり、抗ＣＤ３ユニットは、ｓｃＦｖであり、抗４－１ＢＢユニットは、Ｆｃ断片のＣ末端に融合している２つのナノボディを含む。

【0092】

一部の実施形態では、多重特異性抗体における抗ＣＤ３ユニットは、少なくとも１つの一本鎖断片（ｓｃＦｖ）を含む。一部の実施形態では、多重特異性抗体における抗ＣＤ３ユニットは、１つだけのｓｃＦｖを含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＦｃのＮ末端に、必要に応じてリンカーまたはヒンジ断片を介して、融合している。

【0093】

一部の実施形態では、多重特異性抗体における抗ＴＡＡユニットは、ＶＨ／ＶＬ対からなるＦａｂ断片を含む。一部の実施形態では、抗ＴＡＡユニットは、ＦｃのＮ末端に、必要に応じてリンカーまたはヒンジ断片を介して、融合している。

【0094】

多重特異性抗体のＦｃ断片は、野生型ヒトＦｃ断片と比較して、非対称抗体の誤対合を低減させるためにノブ・イン・ホールまたは改変塩架橋を含むように、必要に応じて改変されている。

【0095】

一部の実施形態では、多重特異性抗体は、抗原結合ユニットをさらに含む。一部の実施形態では、追加の抗原結合ユニットは、ヒト４－１ＢＢタンパク質に対して特異性を有する。一部の実施形態では、抗４－１ＢＢユニットは、２本のＦｃ鎖の一方または両方のＮ末端に融合している。一部の実施形態では、抗４－１ＢＢユニットは、１つのまたは一対のｓｃＦｖを含む。一部の実施形態では、抗４－１ＢＢユニットは、１つのまたは一対のナノボディを含む。一部の実施形態では、抗４－１ＢＢユニットは、非アゴニスト抗４－１ＢＢ抗体またはその断片である。非アゴニスト抗４－１ＢＢ抗体または断片は、腫瘍関連抗原への結合の非存在下では４－１ＢＢに結合するがそれを活性化しない。

【0096】

一部の実施形態では、バランスのとれたＴ細胞活性化活性を有すると見なされる抗ＣＤ３抗体または断片は、１％～２５％であるＴＡＡ非含有４－１ＢＢ誘導率を有する。一部の実施形態では、４－１ＢＢ誘導率は、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％または２％以下である。一部の実施形態では、４－１ＢＢ誘導率は、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％または２５％である。

【0097】

一部の実施形態では、バランスのとれたＴ細胞活性化活性を有すると見なされる抗ＣＤ３抗体または断片についてのＴＡＡ非含有４－１ＢＢ誘導率は、１％～２５％、１％～２４％、１％～２３％、１％～２２％、１％～２１％、１％～２０％、１％～１９％、１％～１８％、１％～１７％、１％～１６％、１％～１５％、１％～１４％、１％～１３％、１％～１２％、１％～１１％、１％～１０％、２％～２５％、２％～２４％、２％～２３％、２％～２２％、２％～２１％、２％～２０％、２％～１９％、２％～１８％、２％～１７％、２％～１６％、２％～１５％、２％～１４％、２％～１３％、２％～１２％、２％～１１％、２％～１０％、３％～２５％、３％～２４％、３％～２３％、３％～２２％、３％～２１％、３％～２０％、３％～１９％、３％～１８％、３％～１７％、３％～１６％、３％～１５％、３％～１４％、３％～１３％、３％～１２％、３％～１１％、３％～１０％、４％～２５％、４％～２４％、４％～２３％、４％～２２％、４％～２１％、４％～２０％、４％～１９％、４％～１８％、４％～１７％、４％～１６％、４％～１５％、４％～１４％、４％～１３％、４％～１２％、４％～１１％、４％～１０％、５％～２５％、５％～２４％、５％～２３％、５％～２２％、５％～２１％、５％～２０％、５％～１９％、５％～１８％、５％～１７％、５％～１６％、５％～１５％、５％～１４％、５％～１３％、５％～１２％、５％～１１％、５％～１０％、６％～２５％、６％～２４％、６％～２３％、６％～２２％、６％～２１％、６％～２０％、６％～１９％、６％～１８％、６％～１７％、６％～１６％、６％～１５％、６％～１４％、６％～１３％、６％～１２％、６％～１１％、６％～１０％、７％～２５％、７％～２４％、７％～２３％、７％～２２％、７％～２１％、７％～２０％、７％～１９％、７％～１８％、７％～１７％、７％～１６％、７％～１５％、７％～１４％、７％～１３％、７％～１２％、７％～１１％、７％～１０％、８％～２５％、８％～２４％、８％～２３％、８％～２２％、８％～２１％、８％～２０％、８％～１９％、８％～１８％、８％～１７％、８％～１６％、８％～１５％、８％～１４％、８％～１３％、８％～１２％、８％～１１％、８％～１０％、９％～２５％、９％～２４％、９％～２３％、９％～２２％、９％～２１％、９％～２０％、９％～１９％、９％～１８％、９％～１７％、９％～１６％、９％～１５％、９％～１４％、９％～１３％、９％～１２％、９％～１１％、９％～１０％、１０％～２５％、１０％～２４％、１０％～２３％、１０％～２２％、１０％～２１％、１０％～２０％、１０％～１９％、１０％～１８％、１０％～１７％、１０％～１６％、１０％～１５％、１０％～１４％、１０％～１３％、１０％～１２％、または１０％～１１％である。

【0098】

一部の実施形態では、ＴＡＡ非含有４－１ＢＢ誘導率の測定について、抗体の最終濃度は、本明細書で試験されるような１００ｎＭ、または代替的に１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、もしくは５０ｎＭであり得るが、これらに限定されない。

【0099】

一部の実施形態では、バランスのとれたＴ細胞活性化活性を有すると見なされる抗ＣＤ３抗体または断片は、１％～８０％であるＴＡＡ依存性４－１ＢＢ誘導率を有する。一部の実施形態では、ＴＡＡ依存性４－１ＢＢ誘導率は、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％または２５％以下である。一部の実施形態では、ＴＡＡ依存性４－１ＢＢ誘導率は、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％または５０％である。

【0100】

一部の実施形態では、バランスのとれたＴ細胞活性化活性を有すると見なされる抗ＣＤ３抗体または断片についてのＴＡＡ依存性４－１ＢＢ誘導率は、１５％～８０％、１５％～７０％、１５％～６０％、１５％～５０％、１５％～４０％、１５％～３５％、２０％～８０％、２０％～７０％、２０％～６０％、２０％～５０％、２０％～４０％、２０％～３５％、２０％～３０％、２５％～８０％、２５％～７０％、２５％～６０％、２５％～５０％、２５％～４０％、２５％～３５％、２５％～３０％、３０％～８０％、３０％～７０％、３０％～６０％、３０％～５０％、３０％～４０％、または３０％～３５％である。

【0101】

一部の実施形態では、ＴＡＡ依存性４－１ＢＢ誘導率の測定について、抗体の最終濃度は、上で説明されたように１ｎＭ、または代替的に０．５ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭもしくは１００ｎＭであり得るが、これらに限定されない。一実施形態では、濃度は、５ｎＭである。一実施形態では、濃度は、１０ｎＭである。一実施形態では、濃度は、２０ｎＭである。

【0102】

一部の実施形態では、多重特異性抗体は、１００ｎＭの抗体濃度で５％、１０％、１５％、２０％または２５％以下のＴＡＡ非含有４－１ＢＢ誘導率を有する。一部の実施形態では、多重特異性抗体は、１００ｎＭの抗体濃度で１５％、１４％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％以下のＴＡＡ非含有４－１ＢＢ誘導率を有する。一部の実施形態では、測定は、１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎｍ、１００ｎＭ、１５０ｎＭまたは２００ｎＭの代替抗体濃度で行われる。

【0103】

一部の実施形態では、多重特異性抗体は、１ｎＭで少なくとも１０％のＴＡＡ依存性４－１ＢＢ誘導率を有する。一部の実施形態では、多重特異性抗体は、１ｎＭの抗体濃度で、少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％または４０％のＴＡＡ依存性４－１ＢＢ誘導率を有する。一部の実施形態では、測定は、１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭまたは５０ｎＭの代替抗体濃度で行われる。
ＣＤ３および４－１ＢＢアゴニズムの相乗作用を生じさせるＴ細胞エンゲージャー

【0104】

抗ＣＤ３アゴニスト抗体は、４－１ＢＢ誘導を活性化することができる。上で提供されたように、抗ＣＤ３抗体の４－１ＢＢ誘導活性を、腫瘍抗原発現細胞の存在に「依存」させることができる。つまり、腫瘍抗原の非存在下では４－１ＢＢ誘導率が低く、腫瘍抗原の存在下では４－１ＢＢ誘導率がそれより何倍も高い。そのような腫瘍抗原依存性は、それがオフターゲット毒性を低下させるので、患者にとって有益である。

【0105】

これに関連して、腫瘍抗原依存性と腫瘍抗原依存性４－１ＢＢ誘導の両方は、Ｔ細胞エンゲージャーが抗ＣＤ３ユニットと抗４－１ＢＢユニットの両方を含むとき、相乗的に増強され得ることが、本明細書でさらに明らかにされる。特に、抗４－１ＢＢユニットそれ自体が腫瘍抗原依存性アゴニスト性抗体であるとき、相乗作用はさらに増大される。腫瘍抗原依存性アゴニスト性抗４－１ＢＢ抗体は、腫瘍抗原の存在がなければ４－１ＢＢシグナル伝達を活性化しない（または低い活性化能力を有する）が、腫瘍抗原の存在下では４－１ＢＢシグナル伝達を活性化する。そのような抗４－１ＢＢ抗体は、「腫瘍抗原依存性アゴニスト抗４－１ＢＢ抗体」または「非アゴニスト抗４－１ＢＢ抗体」と呼ばれる。

【0106】

興味深いことに、抗ＣＤ３抗体と抗４－１ＢＢ抗体のそのような相乗作用は、抗ＣＤ３抗体と、ＣＤ２８などの他のＴ細胞共刺激因子を標的とする抗体との間では観察されていない。したがって、この相乗作用は、全く予想外である。

【0107】

もう１つの驚くべき発見は、抗ＣＤ３ユニットと抗４－１ＢＢユニットの両方が多重特異性抗体に含まれるとき、それらは、互いに「離れて」位置するのが好ましいことである。例えば、図６に示されているような１＋１形式または２＋Ｌｃ２形式のどちらかでは、抗ＣＤ３ユニットおよび抗４－１ＢＢユニットは、Ｆｃ断片の同じ末端に位置するのではなく、Ｆｃ断片によって隔てられているのが好ましい。対照的に、抗ＴＡＡユニットも含まれるとき、抗ＣＤ３ユニットおよび抗ＴＡＡユニットは、Ｆｃ断片の同じ側（例えば、Ｎ末端）に位置するのが好ましい。

【0108】

そのような多重特異性抗体の劇的な有効性は、Ｂ１６Ｆ１０のｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルを用いて実施例１８で実証される。Ｂ１６Ｆ１０は、「冷たい腫瘍」と一般に呼ばれる、周知のＰＤ１非応答性および抵抗性モデルである。冷たい腫瘍は、定義上、特に治療が難しい。予想どおり、図１４に示されているように、抗ＰＤ１治療は、有効性を示さなかった。ＴＡＡおよびＣＤ３または４－１ＢＢのどちらかをもっぱら標的とする二重特異性抗体（４－１ＢＢを標的としないＣＴＭ０１－０１Ａ、およびＣＤ３を標的としないＣＴＭ０１－０１Ｂ）は、最適とは言えない有効性を有した。ＴＡＡ、ＣＤ３および４－１ＢＢの全てを標的とする三重特異性抗体（ＣＴＭ０１－０１）は、はるかに優れた有効性を有した。したがって、この例は、冷たい腫瘍の処置において本明細書で開示されるような方式でＣＤ３と４－１ＢＢの両方を標的とすることの予想外に素晴らしい有効性を実証する。

【0109】

したがって、本開示の一実施形態は、ヒトＣＤ３複合体に対して結合特異性を有する抗ＣＤ３抗体または抗原結合性断片を含む抗ＣＤ３ユニットと；ヒト４－１ＢＢタンパク質に対して結合特異性を有する抗４－１ＢＢ抗体または抗原結合性断片を含む抗４－１ＢＢユニットとを含む、多重特性抗体を提供する。一部の実施形態では、多重特異性抗体は、ヒトＴＡＡに対して結合特異性を有する抗ＴＡＡ抗体または抗原結合性断片を含む、抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ユニットをさらに含む。

【0110】

一部の実施形態では、多重特異性抗体は、Ｆｃ断片をさらに含む。Ｆｃ断片を有する多重特異性抗体の形式の例は、図６に示されている。一部の実施形態では、抗ＣＤ３ユニットおよび抗ＴＡＡユニットは、両方とも、Ｆｃ断片のＮ末端側に位置する。

【0111】

１＋１形式では、抗ＣＤ３抗体または抗原結合性断片は、Ｆｃ断片の鎖のＮ末端に融合している一本鎖断片（ｓｃＦｖ）であり、抗ＴＡＡ抗体または抗原結合性断片は、Ｆｃ断片の別の鎖に融合しているＦａｂ断片である。

【0112】

２＋Ｌｃ２形式では、抗ＴＡＡユニットは、Ｆｃ断片のＮ末端に、それぞれの重鎖を介して、融合している２つの抗ＴＡＡ Ｆａｂを含み、抗ＣＤ３ユニットは、抗ＴＡＡユニットのＦａｂの軽鎖のＣ末端に各々融合している２つのｓｃＦｖを含む。

【0113】

両方の説明された形式において、抗４－１ＢＢユニットは、Ｆｃ断片のＣ末端に融合していることがある。一部の実施形態では、抗４－１ＢＢユニットは、２つの抗４－１ＢＢナノボディまたはｓｃＦｖを含む。

【0114】

一部の実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体または抗原結合性断片は、腫瘍関連抗原依存性アゴニスト抗体または抗原結合性断片である。一部の実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体または抗原結合性断片は、細胞表面に４－１ＢＢタンパク質のクラスターを形成しない。そのような抗体、例えば、Ａｂｌ Ｂｉｏからの１Ａ１０は、当技術分野において公知である。

【0115】

腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーとしてのヒト４－１ＢＢは、その後のシグナル伝達を開始させるためにＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）結合モチーフを含有するＣ末端細胞質領域に結合されたＮ末端細胞外領域に４つのシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）を含有する。これら４つのＣＲＤ、ＣＲＤ１、ＣＲＤ２、ＣＲＤ３およびＣＲＤ４の位置は、表Ａに示されている。

【0116】

４－１ＢＢシグナル伝達活性化は、アゴニスト抗体、例えば、ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）およびウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）について予想される機構である。ウレルマブは、ＣＲＤ１に結合し、ウトミルマブは、ＣＲＤ３に結合する。本開示の多重特異性抗体への組込みに好ましい抗４－１ＢＢ抗体または断片は、ＣＲＤ１に結合しない。その代わりに、それは、ＣＲＤ２、ＣＲＤ３もしくはＣＲＤ４、またはこれらの組合せに結合する。一部の実施形態では、そのような抗４－１ＢＢ抗体または抗原結合性断片は、アゴニスト活性を有さない。

【表A-1】

【表A-2】

【0117】

「腫瘍関連抗原」または「腫瘍抗原」は、腫瘍細胞において産生される抗原性物質であり、すなわち、それは、宿主において免疫応答を誘発する。腫瘍抗原は、腫瘍細胞を同定するのに有用であり、がん治療における使用のための可能性のある候補である。体内の正常なタンパク質は、抗原性ではない。しかし、ある特定のタンパク質は、腫瘍発生中に産生または過剰発現され、それ故、身体にとって「異物」に見える。これは、免疫系から十分に隔絶されている正常なタンパク質、極めて少量で通常は産生されるタンパク質、ある特定の発達段階においてしか通常は産生されないタンパク質、またはその構造が変異に起因して改変されているタンパク質を含み得る。

【0118】

多数の腫瘍抗原が当技術分野において公知であり、新たな腫瘍抗原は、スクリーニングによって容易に同定され得る。腫瘍抗原の非限定的な例としては、クローディン１８．２、５Ｔ４、ＧＰＣ３、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＣＤ７３、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ－７２、ＣＩＸ、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、インテグリン、αＶβ３、α５β１、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰおよびテネイシンが挙げられる。特定の実施形態では、ＴＡＡは、クローディン１８．２である。クローディン１８．２を標的とする抗体の例は、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ／２０２０／２００１９６、同ＷＯ／２０２１／０５８０００、同ＷＯ／２０２０／１４７３２１および同ＷＯ／２０１９／２１９０８９において開示されているものを含めて、当技術分野において公知である。

【0119】

一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、免疫細胞の表面に発現される抗原に結合する。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ１１Ｃ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１５ｓ、ＣＤ１６、ＣＤｗｌ７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３Ｑ、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤｗ６０、ＣＤ６Ｉ、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６６Ｅ ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７６、ＣＤ７９ｏ、０Ｏ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤｗ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤＩＧＩ、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤｗ’１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤｗｌ２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤｗｌ２８、ＣＤ１２９、ＣＤ１３０、ＣＤｗｌ３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤｗ１３６、ＣＤｗｌ３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５Ｇ、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８ａ、ＣＤ１５８ｂ、ＣＤ１６１、ＣＤ１６２、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、およびＣＤ１８２からなる群から選択される表面抗原分類分子に結合する。
抗ＣＤ３抗体の例

【0120】

本開示は、一部の実施形態では、単独で使用され得る、または本技術のＴ細胞エンゲージャーへの組込みに選択され得る、抗ＣＤ３抗体および断片の例も提供する。

【0121】

本開示の一実施形態によれば、ヒトＣＤ３複合体に対して結合特異性を有する抗体または抗原結合性断片であって、ＶＨ ＣＤＲ１とＶＨ ＣＤＲ２とＶＨ ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、およびＶＬ ＣＤＲ１とＶＬ ＣＤＲ２とＶＬ ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、抗体または抗原結合性断片がある。

【0122】

一実施形態では、抗体は、１５３Ａ６Ｂ１もしくはその誘導体、またはそのヒト化バージョンである。一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号７のアミノ酸配列を含み、ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号８のアミノ酸配列を含み、ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。

【0123】

ＶＨ ＣＤＲ２（ＲＩＲＹＮＧＤＴＳＹＮＳＡＬＫＳ、配列番号８）は、翻訳後改変（ＰＴＭ）のリスクがある、Ｇ５５残基およびＳ６１残基（Ｋａｂａｔ番号付け）を含むことが観察されている。したがって、一部の実施形態では、１５３Ａ６Ｂ１またはヒト化もしくは派生バージョンについては、Ｇ５５Ａ置換および／またはＳ６１Ａ置換をＶＨに導入してＰＴＭを防止することができる。そのような変化を伴う、代替ＶＨ ＣＤＲ２は、ＲＩＲＹＮＡＤＴＳＹＮＳＡＬＫＳ（配列番号６４）、ＲＩＲＹＮＧＤＴＳＹＮＡＡＬＫＳ（配列番号６５）、またはＲＩＲＹＮＡＤＴＳＹＮＡＡＬＫＳ（配列番号６６）であり得る。

【0124】

同様に、ＶＬ ＣＤＲ３（ＬＱＨＧＳＧＹＴ、配列番号１２）は、ＰＴＭのリスクがあるＳ９３Ａ残基を含む。したがって、一部の実施形態では、１５３Ａ６Ｂ１またはヒト化もしくは派生バージョンについては、Ｓ９３Ａ置換をＶＬに導入してＰＴＭを防止することができる。そのような変化を伴う、代替ＶＬ ＣＤＲ３は、ＬＱＨＧＡＧＹＴ（配列番号６７）であり得る。

【0125】

一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号１および２３～２８、特に、配列番号２３～２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨには、Ｇ５５Ａ置換、Ｓ６１Ａ置換、またはこれらの組合せが組み込まれている。一部の実施形態では、ＶＬは、配列番号２および３０～３２、特に、配列番号３０～３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＬには、Ｓ９３Ａ置換が組み込まれている。

【0126】

一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号２３を含み、ＶＬは、配列番号３０を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号２３を含み、ＶＬは、配列番号３１を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号２３を含み、ＶＬは、配列番号３２を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号２４を含み、ＶＬは、配列番号３０を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号２４を含み、ＶＬは、配列番号３１を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号２４を含み、ＶＬは、配列番号３２を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号２５を含み、ＶＬは、配列番号３０を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号２５を含み、ＶＬは、配列番号３１を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号２５を含み、ＶＬは、配列番号３２を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号２６を含み、ＶＬは、配列番号３０を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号２６を含み、ＶＬは、配列番号３１を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号２６を含み、ＶＬは、配列番号３２を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号２７を含み、ＶＬは、配列番号３０を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号２７を含み、ＶＬは、配列番号３１を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号２７を含み、ＶＬは、配列番号３２を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号２８を含み、ＶＬは、配列番号３０を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号２８を含み、ＶＬは、配列番号３１を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号２８を含み、ＶＬは、配列番号３２を含む。一部の実施形態では、ＶＨには、Ｇ５５Ａ置換、Ｓ６１Ａ置換、またはこれらの組合せが組み込まれている。一部の実施形態では、ＶＬには、Ｓ９３Ａ置換が組み込まれている。

【0127】

配列解析および活性データの比較によって、ある特定の復帰変異は抗体の活性を決定する上で重要な役割を果たすことが本明細書において認められる。ＶＨにおける復帰変異２７Ｆ、７８Ｖ、２９Ｌおよび３０Ｔは、抗体のＴ細胞活性化活性を強く促進する一方で、ＶＨにおける復帰変異３７Ｖ、７１Ｒ、４８Ｍ、６７Ｌおよび９３Ｔは、活性（グレード３または４）のバランスを維持するのに役立つと考えられる。

【0128】

したがって、一実施形態では、本開示の抗ＣＤ３抗体または断片は、抗体１５３Ａ６Ｂ１のＣＤＲまたはそれらのリスク回避バージョン（上記のとおり）を含み、ＶＨに復帰変異３７Ｖ、７１Ｒ、４８Ｍ、６７Ｌおよび９３Ｔのうちの少なくとも１つをさらに含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、ＶＨに３７Ｖを少なくとも含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、ＶＨに７１Ｒを少なくとも含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、ＶＨに４８Ｍを少なくとも含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、ＶＨに６７Ｌを少なくとも含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、ＶＨに９３Ｔを少なくとも含む。

【0129】

一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、ＶＨに３７Ｖおよび７１Ｒ、３７Ｖおよび４８Ｍ、３７Ｖおよび６７Ｌ、または３７Ｖおよび９３Ｔを少なくとも含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、ＶＨに７１Ｒおよび４８Ｍ、７１Ｒおよび６７Ｌ、または７１Ｒおよび９３Ｔを少なくとも含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、ＶＨに４８Ｍおよび６７Ｌ、または４８Ｍおよび９３Ｔを少なくとも含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、ＶＨに６７Ｌおよび９３Ｔを少なくとも含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、ＶＨに３７Ｖ、７１Ｒ、４８Ｍ、６７Ｌおよび９３Ｔのうちの少なくとも３つを含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、ＶＨに３７Ｖ、７１Ｒ、４８Ｍ、６７Ｌおよび９３Ｔのうちの少なくとも４つを含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、ＶＨに３７Ｖ、７１Ｒ、４８Ｍ、６７Ｌおよび９３Ｔの全てを含む。

【0130】

一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、２７Ｆ、７８Ｖ、２９Ｌおよび３０Ｔのうちの少なくとも１つをＶＨに含まない。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、少なくとも、２７Ｆおよび７８Ｖも、２７Ｆおよび２９Ｌも、２７Ｆおよび３０Ｔも、ＶＨに含まない。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、７８Ｖ、２９Ｌおよび３０Ｔも、２７Ｆ、２９Ｌおよび３０Ｔも、２７Ｆ、７８Ｖおよび３０Ｔも、２７Ｆ、７８Ｖおよび２９Ｌも、ＶＨに含まない。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、２７Ｆ、７８Ｖ、２９Ｌおよび３０Ｔのいずれも、ＶＨに含まない。

【0131】

一部の実施形態では、本開示の抗ＣＤ３抗体または断片は、抗体１５３Ａ６Ｂ１のＣＤＲまたはそれらのリスク回避バージョン（上記のとおり）を含み、ＶＨに、復帰変異３７Ｖ、７１Ｒ、４８Ｍ、６７Ｌおよび９３Ｔのうちの少なくとも１つ（または上記のようにそれらのうちの２つ、３つ、４つもしくはそれより多く）をさらに含み、２７Ｆ、７８Ｖ、２９Ｌおよび３０Ｔのうちの少なくとも１つ（または上記のようにそれらのうちの２つ、３つもしくはそれより多く）を含まない。

【0132】

一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、表１０（例えば、１５３－２、３、４）で定義されるような作用強度グレード４のものである。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号２４を含み、ＶＬは、配列番号３０を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号２５を含み、ＶＬは、配列番号３０を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号２６を含み、ＶＬは、配列番号３０を含む。一部の実施形態では、ＶＨには、Ｇ５５Ａ置換、Ｓ６１Ａ置換、またはこれらの組合せが組み込まれている。一部の実施形態では、ＶＬには、Ｓ９３Ａ置換が組み込まれている。

【0133】

一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号２４に対して少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号２４のＣＤＲを含み、復帰変異３７Ｖ、７１Ｒ、４８Ｍ、６７Ｌおよび９３Ｔのうちの少なくとも１つ（または上記のようにそれらのうちの２つ、３つ、４つもしくはそれより多く）を含み、２７Ｆ、７８Ｖ、２９Ｌおよび３０Ｔのうちの少なくとも１つ（または上記のようにそれらのうちの２つ、３つもしくはそれより多く）を含まず、ＶＬは、配列番号３０に対して少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号３０のＣＤＲを含む。

【0134】

一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号２５に対して少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号２５のＣＤＲを含み、復帰変異３７Ｖ、７１Ｒ、４８Ｍ、６７Ｌおよび９３Ｔのうちの少なくとも１つ（または上記のようにそれらのうちの２つ、３つ、４つもしくはそれより多く）を含み、２７Ｆ、７８Ｖ、２９Ｌおよび３０Ｔのうちの少なくとも１つ（または上記のようにそれらのうちの２つ、３つもしくはそれより多く）を含まず、ＶＬは、配列番号３０に対して少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号３０のＣＤＲを含む。

【0135】

一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号２６に対して少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号２６のＣＤＲを含み、復帰変異３７Ｖ、７１Ｒ、４８Ｍ、６７Ｌおよび９３Ｔのうちの少なくとも１つ（または上記のようにそれらのうちの２つ、３つ、４つもしくはそれより多く）を含み、２７Ｆ、７８Ｖ、２９Ｌおよび３０Ｔのうちの少なくとも１つ（または上記のようにそれらのうちの２つ、３つもしくはそれより多く）を含まず、ＶＬは、配列番号３０に対して少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号３０のＣＤＲを含む。

【0136】

一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、表１０（例えば、１５３－７、１３）で定義されるような作用強度グレード３のものである。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号２３を含み、ＶＬは、配列番号３１を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号２３を含み、ＶＬは、配列番号３２を含む。一部の実施形態では、ＶＨには、Ｇ５５Ａ置換、Ｓ６１Ａ置換、またはこれらの組合せが組み込まれている。一部の実施形態では、ＶＬには、Ｓ９３Ａ置換が組み込まれている。

【0137】

一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号２３に対して少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号２３のＣＤＲを含み、復帰変異３７Ｖ、７１Ｒ、４８Ｍ、６７Ｌおよび９３Ｔのうちの少なくとも１つ（または上記のようにそれらのうちの２つ、３つ、４つもしくはそれより多く）を含み、２７Ｆ、７８Ｖ、２９Ｌおよび３０Ｔのうちの少なくとも１つ（または上記のようにそれらのうちの２つ、３つもしくはそれより多く）を含まず、ＶＬは、配列番号３１に対して少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号３１のＣＤＲを含む。

【0138】

一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号２３に対して少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号２３のＣＤＲを含み、復帰変異３７Ｖ、７１Ｒ、４８Ｍ、６７Ｌおよび９３Ｔのうちの少なくとも１つ（または上記のようにそれらのうちの２つ、３つ、４つもしくはそれより多く）を含み、２７Ｆ、７８Ｖ、２９Ｌおよび３０Ｔのうちの少なくとも１つ（または上記のようにそれらのうちの２つ、３つもしくはそれより多く）を含まず、ＶＬは、配列番号３２に対して少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号３２のＣＤＲを含む。

【0139】

一実施形態では、抗体は、１５５Ａ９Ｂ１もしくはその誘導体、またはそのヒト化バージョンである。一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号１４のアミノ酸配列を含み、ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１６のアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。

【0140】

ＶＨ ＣＤＲ２（ＲＶＲＹＮＧＤＴＳＹＮＳＡＬＫＳ、配列番号１４）は、翻訳後改変（ＰＴＭ）のリスクがある、Ｇ５５残基およびＳ６１残基（Ｋａｂａｔ番号付け）を含むことが観察されている。したがって、一部の実施形態では、１５５Ａ９Ｂ１またはヒト化もしくは派生バージョンについては、Ｇ５５Ａ置換および／またはＳ６１Ａ置換をＶＨに導入してＰＴＭを防止することができる。そのような変化を伴う、代替ＶＨ ＣＤＲ２は、ＲＶＲＹＮＡＤＴＳＹＮＳＡＬＫＳ（配列番号６８）、ＲＶＲＹＮＧＤＴＳＹＮＡＡＬＫＳ（配列番号６９）、またはＲＶＲＹＮＡＤＴＳＹＮＡＡＬＫＳ（配列番号７０）であり得る。

【0141】

同様に、ＶＬ ＣＤＲ３（ＬＱＨＮＳＧＹＴ、配列番号１７）は、ＰＴＭのリスクがあるＳ９３Ａ残基を含む。したがって、一部の実施形態では、１５５Ａ９Ｂ１またはヒト化もしくは派生バージョンについては、Ｓ９３Ａ置換をＶＬに導入してＰＴＭを防止することができる。そのような変化を伴う、代替ＶＬ ＣＤＲ３は、ＬＱＨＮＡＧＹＴ（配列番号７１）であり得る。

【0142】

一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３および３４～４１からなる群、特に、配列番号３および３６～４１からなる群、または配列番号３６～４１だけからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨには、Ｇ５５Ａ置換、Ｓ６１Ａ置換、またはこれらの組合せが組み込まれている。一部の実施形態では、ＶＬは、配列番号４および４３～４６、特に、配列番号４４～４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＬには、Ｓ９３Ａ置換が組み込まれている。

【0143】

一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３６を含み、ＶＬは、配列番号４４を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３６を含み、ＶＬは、配列番号４５を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３６を含み、ＶＬは、配列番号４６を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３７を含み、ＶＬは、配列番号４４を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３７を含み、ＶＬは、配列番号４５を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３７を含み、ＶＬは、配列番号４６を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３８を含み、ＶＬは、配列番号４４を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３８を含み、ＶＬは、配列番号４５を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３８を含み、ＶＬは、配列番号４６を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３９を含み、ＶＬは、配列番号４４を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３９を含み、ＶＬは、配列番号４５を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３９を含み、ＶＬは、配列番号４６を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号４０を含み、ＶＬは、配列番号４４を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号４０を含み、ＶＬは、配列番号４５を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号４０を含み、ＶＬは、配列番号４６を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号４１を含み、ＶＬは、配列番号４４を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号４１を含み、ＶＬは、配列番号４５を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号４１を含み、ＶＬは、配列番号４６を含む。一部の実施形態では、ＶＨには、Ｇ５５Ａ置換、Ｓ６１Ａ置換、またはこれらの組合せが組み込まれている。一部の実施形態では、ＶＬには、Ｓ９３Ａ置換が組み込まれている。

【0144】

配列解析および活性データの比較によって、ある特定の復帰変異は抗体の活性を決定する上で重要な役割を果たすことが本明細書において認められる。ＶＨにおける復帰変異２７Ｆ、７８Ａ、２９Ｌおよび３０Ｔは、抗体のＴ細胞活性化活性を強く促進する一方で、ＶＨにおける復帰変異３７Ｖ、７１Ｒ、４８Ｍ、６７Ｌおよび９３Ｔは、活性（グレード３または４）のバランスを維持するのに役立つと考えられる。さらに、ＶＬにおける復帰変異３６Ｆおよび５８Ｉは、活性（グレード３または４）のバランスを維持するのに役立つ。

【0145】

したがって、一実施形態では、本開示の抗ＣＤ３抗体または断片は、抗体１５５Ａ９Ｂ１のＣＤＲまたはそれらのリスク回避バージョン（上記のとおり）を含み、ＶＨに復帰変異３７Ｖ、７１Ｒ、４８Ｍ、６７Ｌおよび９３Ｔのうちの少なくとも１つをさらに含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、ＶＨに３７Ｖを少なくとも含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、ＶＨに７１Ｒを少なくとも含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、ＶＨに４８Ｍを少なくとも含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、ＶＨに６７Ｌを少なくとも含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、ＶＨに９３Ｔを少なくとも含む。

【0146】

一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、ＶＨに３７Ｖおよび７１Ｒ、３７Ｖおよび４８Ｍ、３７Ｖおよび６７Ｌ、または３７Ｖおよび９３Ｔを少なくとも含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、ＶＨに７１Ｒおよび４８Ｍ、７１Ｒおよび６７Ｌ、または７１Ｒおよび９３Ｔを少なくとも含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、ＶＨに４８Ｍおよび６７Ｌ、または４８Ｍおよび９３Ｔを少なくとも含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、ＶＨに６７Ｌおよび９３Ｔを少なくとも含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、ＶＨに３７Ｖ、７１Ｒ、４８Ｍ、６７Ｌおよび９３Ｔのうちの少なくとも３つを含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、ＶＨに３７Ｖ、７１Ｒ、４８Ｍ、６７Ｌおよび９３Ｔのうちの少なくとも４つを含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、ＶＨに３７Ｖ、７１Ｒ、４８Ｍ、６７Ｌおよび９３Ｔの全てを含む。

【0147】

一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、ＶＨに２７Ｆ、７８Ａ、２９Ｌおよび３０Ｔのうちの少なくとも１つを含まない。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、少なくとも、２７Ｆおよび７８Ａも、２７Ｆおよび２９Ｌも、２７Ｆおよび３０Ｔも、ＶＨに含まない。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、７８Ａ、２９Ｌおよび３０Ｔも、２７Ｆ、２９Ｌおよび３０Ｔも、２７Ｆ、７８Ａおよび３０Ｔも、２７Ｆ、７８Ａおよび２９Ｌも、ＶＨに含まない。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、２７Ｆ、７８Ａ、２９Ｌおよび３０Ｔのいずれも、ＶＨに含まない。

【0148】

したがって、一実施形態では、本開示の抗ＣＤ３抗体または断片は、抗体１５５Ａ９Ｂ１のＣＤＲまたはそれらのリスク回避バージョン（上記のとおり）を含み、ＶＬに復帰変異３６Ｆおよび／または５８Ｉの少なくとも１つをさらに含む。

【0149】

一部の実施形態では、本開示の抗ＣＤ３抗体または断片は、抗体１５５Ａ９Ｂ１のＣＤＲまたはそれらのリスク回避バージョン（上記のとおり）を含み、ＶＨに、復帰変異３７Ｖ、７１Ｒ、４８Ｍ、６７Ｌおよび９３Ｔのうちの少なくとも１つ（または上記のようにそれらのうちの２つ、３つ、４つもしくはそれより多く）をさらに含み、２７Ｆ、７８Ａ、２９Ｌおよび３０Ｔのうちの少なくとも１つ（または上記のようにそれらのうちの２つ、３つもしくはそれより多く）を含まない。一部の実施形態では、ＶＬは、復帰変異３６Ｆおよび／または５８Ｉの少なくとも１つを含む。

【0150】

特定の実施形態では、ＶＨは、配列番号３７を含み、ＶＬは、配列番号４５を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、Ｇ５５Ａ置換、Ｓ６１Ａ置換またはこれらの組合せを有する配列番号３７を含み、ＶＬは、配列番号４５を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３７を含み、ＶＬは、Ｓ９３Ａ置換を有する配列番号４５を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、Ｇ５５Ａ置換、Ｓ６１Ａ置換またはこれらの組合せを有する配列番号３７を含み、ＶＬは、Ｓ９３Ａ置換を有する配列番号４５を含む。

【0151】

一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、表１０（例えば、１５５－８、９、１０、１４、１５、１６）で定義されるような作用強度グレード４のものである。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３７を含み、ＶＬは、配列番号４５を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３８を含み、ＶＬは、配列番号４５を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３９を含み、ＶＬは、配列番号４５を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３７を含み、ＶＬは、配列番号４６を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３８を含み、ＶＬは、配列番号４６を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３９を含み、ＶＬは、配列番号４６を含む。一部の実施形態では、ＶＨには、Ｇ５５Ａ置換、Ｓ６１Ａ置換、またはこれらの組合せが組み込まれている。一部の実施形態では、ＶＬには、Ｓ９３Ａ置換が組み込まれている。

【0152】

一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３７に対して少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号３７のＣＤＲを含み、復帰変異３７Ｖ、７１Ｒ、４８Ｍ、６７Ｌおよび９３Ｔのうちの少なくとも１つ（または上記のようにそれらのうちの２つ、３つ、４つもしくはそれより多く）を含み、２７Ｆ、７８Ａ、２９Ｌおよび３０Ｔのうちの少なくとも１つ（または上記のようにそれらのうちの２つ、３つもしくはそれより多く）を含まず、ＶＬは、配列番号４５に対して少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号４５のＣＤＲを含み、復帰変異３６Ｆおよび／または５８Ｉを少なくとも含む。

【0153】

一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３８に対して少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号３８のＣＤＲを含み、復帰変異３７Ｖ、７１Ｒ、４８Ｍ、６７Ｌおよび９３Ｔのうちの少なくとも１つ（または上記のようにそれらのうちの２つ、３つ、４つもしくはそれより多く）を含み、２７Ｆ、７８Ａ、２９Ｌおよび３０Ｔのうちの少なくとも１つ（または上記のようにそれらのうちの２つ、３つもしくはそれより多く）を含まず、ＶＬは、配列番号４５に対して少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号４５のＣＤＲを含み、復帰変異３６Ｆおよび／または５８Ｉを少なくとも含む。

【0154】

一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３９に対して少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号３９のＣＤＲを含み、復帰変異３７Ｖ、７１Ｒ、４８Ｍ、６７Ｌおよび９３Ｔのうちの少なくとも１つ（または上記のようにそれらのうちの２つ、３つ、４つもしくはそれより多く）を含み、２７Ｆ、７８Ａ、２９Ｌおよび３０Ｔのうちの少なくとも１つ（または上記のようにそれらのうちの２つ、３つもしくはそれより多く）を含まず、ＶＬは、配列番号４５に対して少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号４５のＣＤＲを含み、復帰変異３６Ｆおよび／または５８Ｉを少なくとも含む。

【0155】

一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３７に対して少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号３７のＣＤＲを含み、復帰変異３７Ｖ、７１Ｒ、４８Ｍ、６７Ｌおよび９３Ｔのうちの少なくとも１つ（または上記のようにそれらのうちの２つ、３つ、４つもしくはそれより多く）を含み、２７Ｆ、７８Ａ、２９Ｌおよび３０Ｔのうちの少なくとも１つ（または上記のようにそれらのうちの２つ、３つもしくはそれより多く）を含まず、ＶＬは、配列番号４６に対して少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号４６のＣＤＲを含み、復帰変異３６Ｆおよび／または５８Ｉを少なくとも含む。

【0156】

一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３８に対して少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号３８のＣＤＲを含み、復帰変異３７Ｖ、７１Ｒ、４８Ｍ、６７Ｌおよび９３Ｔのうちの少なくとも１つ（または上記のようにそれらのうちの２つ、３つ、４つもしくはそれより多く）を含み、２７Ｆ、７８Ａ、２９Ｌおよび３０Ｔのうちの少なくとも１つ（または上記のようにそれらのうちの２つ、３つもしくはそれより多く）を含まず、ＶＬは、配列番号４６に対して少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号４６のＣＤＲを含み、復帰変異３６Ｆおよび／または５８Ｉを少なくとも含む。

【0157】

一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３９に対して少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号３９のＣＤＲを含み、復帰変異３７Ｖ、７１Ｒ、４８Ｍ、６７Ｌおよび９３Ｔのうちの少なくとも１つ（または上記のようにそれらのうちの２つ、３つ、４つもしくはそれより多く）を含み、２７Ｆ、７８Ａ、２９Ｌおよび３０Ｔのうちの少なくとも１つ（または上記のようにそれらのうちの２つ、３つもしくはそれより多く）を含まず、ＶＬは、配列番号４６に対して少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号４６のＣＤＲを含み、復帰変異３６Ｆおよび／または５８Ｉを少なくとも含む。

【0158】

一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、表１０（例えば、１５５－２、３、４）で定義されるような作用強度グレード３のものである。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３７を含み、ＶＬは、配列番号４４を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３８を含み、ＶＬは、配列番号４４を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３９を含み、ＶＬは、配列番号４４を含む。一部の実施形態では、ＶＨには、Ｇ５５Ａ置換、Ｓ６１Ａ置換、またはこれらの組合せが組み込まれている。一部の実施形態では、ＶＬには、Ｓ９３Ａ置換が組み込まれている。

【0159】

一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３７に対して少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号３７のＣＤＲを含み、復帰変異３７Ｖ、７１Ｒ、４８Ｍ、６７Ｌおよび９３Ｔのうちの少なくとも１つ（または上記のようにそれらのうちの２つ、３つ、４つもしくはそれより多く）を含み、２７Ｆ、７８Ａ、２９Ｌおよび３０Ｔのうちの少なくとも１つ（または上記のようにそれらのうちの２つ、３つもしくはそれより多く）を含まず、ＶＬは、配列番号４４に対して少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号４４のＣＤＲを含み、復帰変異３６Ｆおよび／または５８Ｉを少なくとも含む。

【0160】

一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３８に対して少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号３８のＣＤＲを含み、復帰変異３７Ｖ、７１Ｒ、４８Ｍ、６７Ｌおよび９３Ｔのうちの少なくとも１つ（または上記のようにそれらのうちの２つ、３つ、４つもしくはそれより多く）を含み、２７Ｆ、７８Ａ、２９Ｌおよび３０Ｔのうちの少なくとも１つ（または上記のようにそれらのうちの２つ、３つもしくはそれより多く）を含まず、ＶＬは、配列番号４４に対して少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号４４のＣＤＲを含み、復帰変異３６Ｆおよび／または５８Ｉを少なくとも含む。

【0161】

一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３９に対して少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号３９のＣＤＲを含み、復帰変異３７Ｖ、７１Ｒ、４８Ｍ、６７Ｌおよび９３Ｔのうちの少なくとも１つ（または上記のようにそれらのうちの２つ、３つ、４つもしくはそれより多く）を含み、２７Ｆ、７８Ａ、２９Ｌおよび３０Ｔのうちの少なくとも１つ（または上記のようにそれらのうちの２つ、３つもしくはそれより多く）を含まず、ＶＬは、配列番号４４に対して少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号４４のＣＤＲを含み、復帰変異３６Ｆおよび／または５８Ｉを少なくとも含む。

【0162】

一実施形態では、抗体は、１９２Ａ７Ｂ９もしくはその誘導体、またはそのヒト化バージョンである。一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号１８のアミノ酸配列を含み、ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号１９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号２１のアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。

【0163】

ＶＨ ＣＤＲ２（ＲＭＲＹＮＧＤＴＳＹＮＳＡＬＫＳ、配列番号１８）は、翻訳後改変（ＰＴＭ）のリスクがある、Ｇ５５残基およびＳ６１残基（Ｋａｂａｔ番号付け）を含むことが観察されている。したがって、一部の実施形態では、１９２Ａ７Ｂ９またはヒト化もしくは派生バージョンについては、Ｇ５５Ａ置換および／またはＳ６１Ａ置換をＶＨに導入してＰＴＭを防止することができる。そのような変化を伴う、代替ＶＨ ＣＤＲ２は、ＲＭＲＹＮＡＤＴＳＹＮＳＡＬＫＳ（配列番号７２）、ＲＭＲＹＮＧＤＴＳＹＮＡＡＬＫＳ（配列番号７３）、またはＲＭＲＹＮＡＤＴＳＹＮＡＡＬＫＳ（配列番号７４）であり得る。

【0164】

同様に、ＶＬ ＣＤＲ２（ＩＡＮＳＬＱＴ、配列番号２１）は、ＰＴＭのリスクがあるＳ５３残基を含む。したがって、一部の実施形態では、１９２Ａ７Ｂ９またはヒト化もしくは派生バージョンについては、Ｓ５３Ａ置換をＶＬに導入してＰＴＭを防止することができる。そのような変化を伴う、代替ＶＬ ＣＤＲ２は、ＩＡＮＡＬＱＴ（配列番号７５）であり得る。

【0165】

また、ＶＬ ＣＤＲ３（ＬＱＨＮＳＷＹＴ、配列番号２２）は、ＰＴＭのリスクがあるＳ９３Ａ残基を含む。したがって、一部の実施形態では、１９２Ａ７Ｂ９またはヒト化もしくは派生バージョンについては、Ｓ９３Ａ置換をＶＬに導入してＰＴＭを防止することができる。そのような変化を伴う、代替ＶＬ ＣＤＲ３は、ＬＱＨＮＡＷＹＴ（配列番号７６）であり得る。

【0166】

一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５および４８～５５からなる群、特に、配列番号５および５０～５５からなる群、または配列番号５０～５５だけからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨには、Ｇ５５Ａ置換、Ｓ６１Ａ置換、またはこれらの組合せが組み込まれている。一部の実施形態では、ＶＬは、配列番号６および５７～６２、特に、配列番号５９～６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＬには、Ｓ５３Ａ置換が組み込まれている。一部の実施形態では、ＶＬには、Ｓ９３Ａ置換が組み込まれている。

【0167】

一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５０を含み、ＶＬは、配列番号５９を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５０を含み、ＶＬは、配列番号６０を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５０を含み、ＶＬは、配列番号６１を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５０を含み、ＶＬは、配列番号６２を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５１を含み、ＶＬは、配列番号５９を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５１を含み、ＶＬは、配列番号６０を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５１を含み、ＶＬは、配列番号６１を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５１を含み、ＶＬは、配列番号６２を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５２を含み、ＶＬは、配列番号５９を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５２を含み、ＶＬは、配列番号６０を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５２を含み、ＶＬは、配列番号６１を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５２を含み、ＶＬは、配列番号６２を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５３を含み、ＶＬは、配列番号５９を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５３を含み、ＶＬは、配列番号６０を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５３を含み、ＶＬは、配列番号６１を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５３を含み、ＶＬは、配列番号６２を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５４を含み、ＶＬは、配列番号５９を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５４を含み、ＶＬは、配列番号６０を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５４を含み、ＶＬは、配列番号６１を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５４を含み、ＶＬは、配列番号６２を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５５を含み、ＶＬは、配列番号５９を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５５を含み、ＶＬは、配列番号６０を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５５を含み、ＶＬは、配列番号６１を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５５を含み、ＶＬは、配列番号６２を含む。一部の実施形態では、ＶＨには、Ｇ５５Ａ置換、Ｓ６１Ａ置換、またはこれらの組合せが組み込まれている。一部の実施形態では、ＶＬには、Ｓ５３Ａ置換が組み込まれている。一部の実施形態では、ＶＬには、Ｓ９３Ａ置換が組み込まれている。

【0168】

一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、表１０（例えば、１９２－７、１３）で定義されるような作用強度グレード４のものである。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５０を含み、ＶＬは、配列番号６０を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５０を含み、ＶＬは、配列番号６１を含む。

【0169】

一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または断片は、表１０（例えば、１９２－４）で定義されるような作用強度グレード３のものである。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５３を含み、ＶＬは、配列番号５９を含む。

【0170】

一部の実施形態では、抗体または断片は、クラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のものである。一部の実施形態では、抗体または断片は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）能を有する。一部の実施形態では、抗体または断片は、ＡＤＣＣ能を有さない。

【0171】

本明細書で開示される抗体を、それらが由来した天然に存在する結合ポリペプチドとはアミノ酸配列の点で異なるように、改変することができることも、当業者には理解されるであろう。例えば、指定タンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、出発配列と同様であり得、例えば、出発配列に対してある特定の同一性パーセントを有し得、例えば、それは、出発配列と６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であり得る。

【0172】

ある特定の実施形態では、抗体は、抗体に通常は付随しないアミノ酸配列または１つもしくは複数の部分を含む。例示的な改変は、下でより詳細に説明される。例えば、本開示の抗体は、可動性リンカー配列を含むことがあり、または機能的部分（例えば、ＰＥＧ、薬物、毒素、もしくは標識）を付加するように改変されていることがある。

【0173】

本開示の抗体、そのバリアント、または誘導体は、改変されている、すなわち、任意のタイプの分子の抗体への共有結合によりその共有結合がエピトープへの抗体の結合を妨げないように改変されている、誘導体を含む。例として、しかし限定としてではなく、抗体を、例えば、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロッキング基よる誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結になどにより、改変することができる。非常に多くの化学的改変のいずれを、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むがこれらに限定されない、公知の技法によって行ってもよい。加えて、抗体は、１つまたは複数の非古典的アミノ酸を含有し得る。

【0174】

一部の実施形態では、抗体は、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的応答改変物質、医薬品、またはＰＥＧにコンジュゲートされ得る。

【0175】

抗体は、検出可能な標識、例えば、放射性標識、免疫調節物質、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、光活性治療または診断剤、薬物または毒素であり得る細胞傷害剤、超音波強化剤、非放射性標識、これらの組合せ、および当技術分野において公知の他のそのような薬剤にコンジュゲートまたは融合され得る。

【0176】

抗体を、化学発光化合物とカップリングさせることにより、検出可能に標識することができる。その結果、化学発光タグ付き抗原結合ポリペプチドの存在は、化学反応の過程において生ずる発光の存在を検出することにより決定される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマティック（theromatic）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。

【0177】

蛍光を発する金属、例えば、^１５２Ｅｕ、またはランタニド系列の他のものを使用して、抗体を検出可能に標識することもできる。ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート基を使用して、これらの金属を抗体に結合させることができる。様々な部分を抗体にコンジュゲートするための技法は、周知であり、例えば、Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985)；Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al., (eds.), Marcel Dekker, Inc., pp. 623- 53 (1987)；Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)；“Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press pp. 303-16 (1985)、およびThorpe et al., “The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Immunol. Rev. (52:119-58 (1982))を参照されたい。
Ｔ細胞エンゲージャー形式および配列の例

【0178】

本開示のある特定の実施形態は、ヒトＣＤ３複合体に対して結合特異性を有する抗ＣＤ３抗体または抗原結合性断片を含む抗ＣＤ３ユニットと；ヒト４－１ＢＢタンパク質に対して結合特異性を有する抗４－１ＢＢ抗体または抗原結合性断片を含む抗４－１ＢＢユニットとを含む、多重特性抗体を提供する。

【0179】

一部の実施形態では、多重特異性抗体は、ヒトＴＡＡに対して結合特異性を有する抗ＴＡＡ抗体または抗原結合性断片を含む、抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ユニットをさらに含む。一部の実施形態では、多重特異性抗体は、Ｆｃ断片をさらに含む。

【0180】

一部の実施形態では、抗ＣＤ３ユニットは、Ｆｃ断片のＮ末端側に位置する。一部の実施形態では、抗ＣＤ３ユニットは、一価である。一部の実施形態では、抗ＣＤ３ユニットは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂまたはナノボディの形式を有する。

【0181】

一部の実施形態では、抗４－１ＢＢユニットは、Ｆｃ断片のＮ末端もしくはＣ末端または軽鎖のＣ末端に融合している。一部の実施形態では、抗４－１ＢＢユニットは、１つもしくは２つの抗４－１ＢＢナノボディまたはｓｃＦｖを含む。

【0182】

一部の実施形態では、抗ＴＡＡユニットは、Ｆｃ断片のＮ末端側に位置する。一部の実施形態では、抗ＴＡＡユニットは、Ｆｃ断片のＣ末端側に位置する。一部の実施形態では、抗ＴＡＡユニットは、一価または二価である。一部の実施形態では、抗ＴＡＡユニットは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂまたはナノボディの形式を有する。

【0183】

一部の実施形態では、多重特異性抗体は、Ｆｃ断片をさらに含み、抗ＣＤ３および抗ＴＡＡユニットは、Ｆｃ断片のＮ末端に位置する。一部の実施形態では、抗４－１ＢＢユニットは、Ｆｃ断片のＣ末端に融合している。一部の実施形態では、抗ＣＤ３および抗ＴＡＡユニットは、一価であり、抗４－１ＢＢユニットは、２つの抗４－１ＢＢナノボディまたはｓｃＦｖを含む。

【0184】

一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体または抗原結合性断片は、一本鎖断片（ｓｃＦｖ）またはＦａｂ断片またはナノボディであり、Ｆｃ断片の鎖のＮ末端に融合している。一部の実施形態では、抗ＴＡＡ抗体または抗原結合性断片は、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖまたはナノボディであり、Ｆｃ断片の別の鎖に融合している。抗４－１ＢＢ抗体または抗原結合性断片は、Ｆｃ断片のＣ末端に融合している、Ｆａｂ断片またはナノボディまたはｓｃＦｖである。

【0185】

一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体は、一価形式の、Ｆｃ断片の鎖のＮ末端に融合している一本鎖断片（ｓｃＦｖ）であり、抗ＴＡＡ抗体または抗原結合性断片は、一価形式の、Ｆｃ断片の別の鎖に融合しているＦａｂ断片であり、抗４－１ＢＢユニットは、ＦｃのＣ末端に融合している、かつ二価形式の、ナノボディである。
抗体をコードするポリヌクレオチドおよび抗体を調製する方法

【0186】

本開示は、本開示の抗体、そのバリアントまたは誘導体をコードする、単離されたポリヌクレオチドまたは核酸分子も提供する。本開示のポリヌクレオチドは、抗原結合ポリペプチド、そのバリアントまたは誘導体の重鎖および軽鎖可変領域全体を同じポリヌクレオチド分子上にまたは別々のポリヌクレオチド分子上にコードし得る。加えて、本開示のポリヌクレオチドは、抗原結合ポリペプチド、そのバリアントまたは誘導体の重鎖および軽鎖可変領域の部分を同じポリヌクレオチド分子上にまたは別々のポリヌクレオチド分子上にコードし得る。

【0187】

抗体を作製する方法は、当技術分野において周知であり、本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合ポリペプチドの可変領域と定常領域の両方が、完全にヒトのものである。完全ヒト抗体は、当技術分野において記載されている技法を使用して、および本明細書に記載されているように作製することができる。例えば、特定の抗原に対する完全ヒト抗体を、抗原投与に応答してそのような抗体を産生するように改変されているが内在性遺伝子座が無効にされているトランスジェニック動物に抗原を投与することによって、調製することができる。そのような抗体を作製するために使用され得る例示的な技法は、米国特許第６，１５０，５８４号、同第６，４５８，５９２号、同第６，４２０，１４０号に記載されており、これらの参考特許文献は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0188】

ある特定の実施形態では、調製された抗体は、処置すべき動物において、例えば、ヒトにおいて、有害な免疫応答を惹起しないであろう。一実施形態では、本開示の抗原結合ポリペプチド、そのバリアントまたは誘導体は、当技術分野において認知されている技法を使用してそれらの免疫原性を低下させるように改変される。例えば、抗体を、ヒト化、霊長類化、脱免疫化することができ、またはキメラ抗体を作製することができる。これらのタイプの抗体は、親抗体の抗原結合特性を保持するまたは実質的に保持するがヒトにおける免疫原性がより低い非ヒト抗体、典型的にはマウスまたは霊長類抗体に由来する。これを、（ａ）非ヒト可変ドメイン全体をヒト定常領域にグラフトしてキメラ抗体を生成すること；（ｂ）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つもしくは複数についての少なくとも一部を、ヒトフレームワーク領域および定常領域に、極めて重要なフレームワーク残基を保持してもしくはせずにグラフトすること；または（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、それらを表面残基の置き換えによりヒト様セクションで「クローキング」することを含む、様々な方法により、得ることができる。そのような方法は、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 57:6851-6855 (1984)；Morrison et al., Adv. Immunol. 44:65-92 (1988)；Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)；Padlan, Molec. Immun. 25:489-498 (1991)；Padlan, Molec. Immun. 31:169-217 (1994)、ならびに米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号および同第６，１９０，３７０号において開示されており、これらの参考文献の全ては、これによりそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0189】

脱免疫化を使用して抗体の免疫原性を減少させることもできる。本明細書で使用される場合、用語「脱免疫化」は、Ｔ細胞エピトープを改変するための抗体の変更を含む（例えば、国際出願公開番号ＷＯ／９８５２９７６ Ａ１およびＷＯ／００３４３１７ Ａ２を参照されたい）。例えば、出発抗体からの可変重鎖および可変軽鎖配列が解析され、各Ｖ領域から、配列内の相補性決定領域（ＣＤＲ）および他の肝要な残基との関連でエピトープの位置を示すヒトＴ細胞エピトープ「マップ」が作成される。Ｔ細胞エピトープマップからの個々のＴ細胞エピトープが、最終抗体の活性を変更するリスクが低い代替アミノ酸置換を同定するために解析される。アミノ酸置換の組合せを含む、様々な代替可変重鎖および可変軽鎖配列が設計され、これらの配列が、その後、様々な結合ポリペプチドに組み込まれる。典型的には、１２～２４の間のバリアント抗体が生成され、結合および／または機能について試験される。次いで、改変された可変およびヒト定常領域を含む完全な重鎖および軽鎖遺伝子が、発現ベクターにクローニングされ、その後のプラスミドが、全抗体の産生のために細胞系に導入される。次いで、抗体は、適切な生化学的および生物学的アッセイで比較され、最適なバリアントが同定される。

【0190】

本開示の抗原結合ポリペプチドの結合特異性を、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、例えば、免疫沈降法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により、決定することができる。
腫瘍、特に、冷たい腫瘍の処置

【0191】

本明細書に記載されるように、本開示の抗体、バリアントまたは誘導体を、ある特定の処置および診断方法において使用することができる。

【0192】

本開示は、本開示の抗体を患者、例えば、動物、哺乳動物およびヒトに投与して、本明細書に記載される障害または状態の１つまたは複数を処置することを含む、抗体に基づく治療に、さらに関する。本開示の治療化合物は、本開示の抗体（本明細書に記載のそのバリアントおよび誘導体を含む）、および本開示の抗体（本明細書に記載のそのバリアントおよび誘導体を含む）をコードする核酸またはポリヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。

【0193】

本開示の抗体を使用してがんを処置または阻害することもできる。一部の実施形態では、腫瘍抗原（例えば、クローディン１８．２）は、腫瘍細胞において過剰発現される。したがって、一部の実施形態では、それを必要とする患者におけるがんを処置するための方法が提供される。方法は、一実施形態では、本開示の抗体の有効量を患者に投与するするステップを必然的に伴う。一部の実施形態では、患者におけるがん細胞（例えば、間質細胞）の少なくとも１つは、腫瘍抗原を発現するか、過剰発現するか、または発現するように誘導される。遺伝子発現の誘導は、例えば、腫瘍ワクチンまたは放射線治療の投与によって行うことができる。

【0194】

好適に処置され得る腫瘍は、膀胱がん、非小細胞肺がん、腎がん、乳がん、尿道がん、大腸がん、頭頸部がん、扁平上皮がん、メルケル細胞癌、消化管がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、腎がん、および小細胞肺がんのものを含む。したがって、本開示の抗体を使用して、いずれか１つまたは複数のそのようながんを処置することができる。

【0195】

一部の実施形態では、処置される腫瘍は、従来のがん免疫療法によって、例えば、免役チェックポイント（ＩＣＰ）を標的とする抗体によって、処置することが特に難しいものである。そのような腫瘍は、「冷たい腫瘍」または「非免疫原性腫瘍」と呼ばれることもある。上で説明されたように、本開示の多重特異性抗体は、「冷たい腫瘍」であるＢ１６Ｆ１０のｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルにおいて劇的な有効性を示した（例えば、実施例１８を参照されたい）。一部の実施形態では、それに基づいて、本開示は、本明細書で開示される多重特異性抗体によって冷たい腫瘍を処置するための方法および使用を提供する。

【0196】

一部の実施形態では、非免疫原性腫瘍は、Ｔ細胞によって浸潤されないもの、あるいはＴ細胞濾過、抗原提示細胞（ＡＰＣ）もしくはＴ細胞活性化が欠損している、または腫瘍床へのＴ細胞ホーミングが不足しているものである。前立腺がん、膵臓がんおよび白血病の全てが非免疫原性である。乳がんの大多数（９５％）、大腸がんの大多数（９５％）、胃がんの大多数（８７％）、頭頸部がんの大多数（８４％）、肝臓がんの大多数（８３％）、食道がんの大多数（８６％）、子宮頸がんの大多数（８７％）および甲状腺がんの大多数（８７％）も、非免疫原性である。加えて、肺がんの８３％、膀胱がんの７９％、腎臓がんの７７％、７０％の子宮がんおよび６６％の黒色腫も、非免疫原性である。

【0197】

非免疫原性または冷たい腫瘍の同定を、腫瘍内の免疫細胞の型、密度および位置の測定によって行うこともできる。例えば、Galon and Bruni(Nature Reviews Drug Discovery volume 18, pages 197-218 (2019))には、熱いおよび冷たい腫瘍のガイド付き層別化のための、例えば、切除された組織における、２つのリンパ球集団（ＣＤ３およびＣＤ８）の定量化に基づく標準化スコアリングシステムであるイムノスコアが、記載されている。イムノスコアには、イムノスコア０（Ｉ０、両方の領域における両方の細胞型の低い密度、例えば、非存在）からＩ４（両方の位置における高い免疫細胞密度）までの幅がある。がんをそれらの免疫浸潤に従って分類することにより、このスコアリングシステムは、「熱い」（高浸潤型、イムノスコアＩ４）および「冷たい」（非浸潤型、イムノスコアＩ０）腫瘍の定義を含む、腫瘍の免疫に基づく分類を提供する。

【0198】

一部の実施形態では、腫瘍は、免疫チェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＰＤ－１阻害剤、ＣＴＬＡ－４阻害剤、またはこれらの組合せによる処置に対して抵抗性である。一部の実施形態では、がんは、前立腺がん、膵臓がん、または白血病である。一部の実施形態では、がんは、乳がん、大腸がん、胃がん、頭頸部がん、肝臓がん、食道がん、子宮頸がん、または甲状腺がんである。一部の実施形態では、がんは、肺がん、膀胱がん、腎臓がん、子宮がん、または黒色腫である。

【0199】

本開示の抗体もしくはバリアント、またはそれらの誘導体によって処置、予防、診断および／または予後判定され得る、細胞生存期間の増加に関連するさらなる疾患または状態としては、悪性病変および関連障害、例えば、白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、および赤白血病を含む））および慢性白血病（例えば、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病）を含む）、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、重鎖病、および固形腫瘍の、進行および／または転移が挙げられるがこれらに限定されず、固形腫瘍には、肉腫および癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓がん、乳がん、甲状腺がん、子宮内膜がん、黒色腫、前立腺がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞種、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫（menangioma）、黒色腫、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫が含まれるが、これらに限定されない。

【0200】

いずれの特定の患者についても具体的な投薬量および処置レジメンは、使用される特定の抗体、そのバリアントまたは誘導体、患者の年齢、体重、総体的な健康、性別および食事、ならびに投与の回数、排泄率、薬物の組合せ、ならびに処置される特定の疾患の重症度をはじめとする、様々な因子に依存することになる。医療介護者によるそのような因子の判断は、当技術分野における通常技能の範囲内である。量は、処置すべき個々の患者、投与経路、製剤のタイプ、使用される化合物の特徴、疾患の重症度、および所望される効果にも依存することになる。使用される量を当技術分野において周知の薬理学および薬物動態の原則によって決定することができる。

【0201】

抗体、バリアントまたはそれらの誘導体の投与方法は、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外および経口経路を含むが、これらに限定されない。抗原結合ポリペプチドまたは組成物を、任意の適便な経路により、例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）からの吸収により、投与することができ、他の生物活性薬剤とともに投与することができる。したがって、本開示の抗原結合ポリペプチドを含有する医薬組成物を、経口投与、直腸投与、非経口投与、大槽内（intracistemally）投与、膣内投与、腹腔内投与、局所的に投与（粉末、軟膏、滴剤もしくは経皮パッチによるような）、頬側投与、または口腔噴霧剤もしくは点鼻薬として投与することができる。

【0202】

用語「非経口」は、本明細書で使用される場合、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内注射および注入を含む、投与方法を指す。

【0203】

投与は、全身または局所のものであり得る。加えて、本開示の抗体を、脳室内および髄腔内注射を含む任意の好適な経路により、中枢神経系に導入することが望ましいことがあり、脳室内注射を、例えば、オマヤ貯留槽などの貯留槽に取り付けられた、脳室内カテーテルによって容易にすることができる。経肺投与も、例えば、吸入器またはネブライザー、およびエアロゾル化剤を含有する製剤を使用することにより、利用することができる。

【0204】

本開示の抗体、ポリペプチドまたは組成物を、処置を必要とするエリアに局所投与することが望ましいことがあり、これは、例として、限定としてではなく、外科手術中の局所注入、外科手術後の創傷包帯法の、例えばそれと併せての、局所的適用により、注射により、カテーテルによって、坐薬によって、または留置剤によって達成することができ、前記留置剤は、膜、例えばシラスティック（sialastic）膜、または繊維を含む、多孔質、無孔質またはゼラチン質材料のものである。好ましくは、本開示の、抗体を含む、タンパク質を投与する場合、タンパク質が吸収されない材料を使用するように心掛けなければならない。
組成物

【0205】

本開示は、医薬組成物も提供する。そのような組成物は、抗体の有効量と許容可能な担体とを含む。

【0206】

具体的な実施形態では、用語「薬学的に許容される」とは、動物における、さらに特にヒトにおける使用について、連邦もしくは州政府の監督機関により承認された、または米国薬局方もしくは他の一般に認知されている薬局方に収載されている、という意味である。さらに、「薬学的に許容される担体」は、一般に、任意のタイプの、非毒性固体、半固体もしくは液体フィラー、希釈剤、カプセル化材または製剤助剤であろう。

【0207】

用語「担体」は、それを用いて治療薬が投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような医薬担体は、滅菌液、例えば、水および油であり得、この油には、石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などが含まれる。水は、医薬組成物が静脈内投与されるときに好ましい担体である。生理食塩水、ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液も、液体担体として、特に、注射可能溶液に、利用することができる。好適な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は、所望される場合には、少量の湿潤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩もしくはリン酸塩も含有し得る。抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸；および浸透張力の調整のための薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースも、想定される。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、粉末、徐放性製剤などの形態をとり得る。旧来の結合剤および担体、例えば、トリグリセリドを用いて、組成物を坐薬として製剤化することができる。経口製剤は、標準的な担体、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含み得る。好適な医薬品担体の例は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるRemington’s Pharmaceutical Sciencesに記載されている。そのような組成物は、好ましくは精製された形態での、抗原結合ポリペプチドの治療有効量を、患者への適正投与のための形態を提供するために好適な量の担体とともに、含有することになる。製剤は、投与方法に適していなければならない。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または複数回投与用バイアルに封入され得る。

【0208】

ある実施形態では、組成物は、人間への静脈内投与に適応する医薬組成物として常套的手順に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与用の組成物は、滅菌等張性水性緩衝液中の溶液である。必要に応じ、組成物は、可溶化剤、および注射部位の痛みを和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔薬も含み得る。一般に、これらの成分は、別々にまたは混合されて単位剤形で、のどちらかで、例えば、活性薬剤の量を示すアンプルまたはサッシェなどの密閉シールされている容器の中の乾いた凍結粉末または無水濃縮物として供給される。組成物を注入により投与すべき場合、それは、医薬品グレードの滅菌水または食塩水が入っている注入ボトルを用いて分注され得る。組成物が注射により投与される場合、投与の前に成分を混合することができるように、注射用滅菌水または食塩水のアンプルが提供され得る。

【0209】

本開示の化合物を中性または塩形態として製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなどのアニオンとで形成されるもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどのカチオンとで形成されるものを含む。

【実施例】

【0210】

（実施例１）
抗ヒトＣＤ３抗体の生成および試験
この実施例は、ハイブリドーマ技術を使用する抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体の生成を説明する。

【0211】

抗原：ヒトＣＤ３ＤおよびＣＤ３Ｅヘテロ二量体タンパク質（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＣＴ０２６－Ｈ０３２３Ｈ）。

【0212】

免疫化：ヒトＣＤ３に対するモノクローナル抗体を生成するために、ウィスターラットおよびＳＤラットをＣＤ３ＤおよびＣＤ３Ｅヘテロ二量体タンパク質によって免疫した。４ラウンドの免疫化後、免疫化ラットの血清を、ＥＬＩＳＡによる抗体力価評価に付した。手短に述べると、マイクロタイタープレートを、ＥＬＩＳＡコーティング用緩衝剤中の０．５または１μｇ／ｍｌのヒトＣＤ３タンパク質、１００μｌ／ウェルで、４℃で一晩、コーティングし、次いで、２００μｌ／ウェルの５％脱脂粉乳でブロックした。免疫化マウスからの血清の希釈物を各ウェルに添加し、１～２時間、３７℃でインキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）で洗浄し、次いで、ペルオキシダーゼＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ラットＩｇＧとともに３０分間、３７℃でインキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で現像し、分光光度計によりＯＤ ４５０ｎｍで解析した。抗ＣＤ３ ＩｇＧの十分な力価を有するラットに、ヒトＣＤ３ＤおよびＣＤ３Ｅヘテロ二量体タンパク質によって追加免疫した。

【0213】

細胞融合：細胞融合を電気融合により行った。融合細胞を、融合ごとに５０の９６ウェルプレートに蒔いた。

【0214】

サブクローニングおよびスクリーニング：各融合からの陽性初代クローンを、サブクローンが単一の親細胞に確実に由来するように限界希釈によってサブクローニングした。サブクローニングを初代クローンと同じアプローチでスクリーニングし、陽性クローンの培養上清に、親和性ランク付けによる追加の確認スクリーニングを行った。

【0215】

ハイブリドーマクローン１５３Ａ６Ｂ１、１５５Ａ９Ｂ１および１９２Ａ７Ｂ９をさらなる解析に選択した。１５３Ａ６Ｂ１、１５５Ａ９Ｂ１および１９２Ａ７Ｂ９の可変領域のアミノ酸配列を下の表１で提供し、ＣＤＲ配列を表１Ａに要約する。

【表1】

【表1A】

【0216】

（実施例２）
ＣＤ３抗原に対するキメラ抗体の結合活性
ＥＬＩＳＡ試験
ハイブリドーマクローン１５３Ａ６Ｂ１、１５５Ａ９Ｂ１および１９２Ａ７Ｂ９の結合活性を評価するために、これらのクローンからのキメラｍＡｂをＥＬＩＳＡ試験に付した。

【0217】

手短に述べると、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌのヒト、カニクイザルおよびマウスＣＤ３タンパク質、１００μｌ／ウェルで、４℃で一晩、コーティングし、次いで、１５０μｌ／ウェルの１％ＢＳＡでブロックした。１５μｇ／ｍｌで出発する１５３Ａ６Ｂ１、１５５Ａ９Ｂ１および１９２Ａ７Ｂ９抗体の３倍希釈物を各ウェルに添加し、１時間、３７℃でインキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次いで、抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）（ヤギ）抗体・ペルオキシダーゼコンジュゲート型とともに、３０分間、３７℃でインキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で現像し、分光光度計によりＯＤ ４５０ｎｍで解析した。表２に示すように、１５３Ａ６Ｂ１、１５５Ａ９Ｂ１および１９２Ａ７Ｂ９の全てが、ヒトＣＤ３とカニクイザルＣＤ３の両方に結合した。試験した抗体は全て、マウスＣＤ３には結合しなかった。ＳＰ３４（Ｂｉｏｉｎｔｒｏｎ、Ｂ６７６２）は、ベンチマーク対照としての役割を果たした。ＳＰ３４の配列を表２Ｂで提供する。

【表2A】

【0218】

ＮＡ：入手不能

【表2B】

細胞ベースの結合

【0219】

ＦＡＣＳを使用して、ヒトまたはカニクイザルＰＢＭＣに対する１５３Ａ６Ｂ１、１５５Ａ９Ｂ１および１９２Ａ７Ｂ９キメラｍＡｂの結合活性を評価した。ＳＰ３４（Ｂｉｏｉｎｔｒｏｎ、Ｂ６７６２）およびＯＫＴ３（Ｂｉｏｉｎｔｒｏｎ、Ｂ６９２８）は、ベンチマーク対照としての役割を果たした。

【0220】

手短に述べると、先ず、ｃｙｎｏＰＢＭＣを、１０ｎＭで出発して３倍段階希釈した１５３Ａ６Ｂ１、１５５Ａ９Ｂ１および１９２Ａ７Ｂ９キメラｍＡｂとともに４℃で３０分間、インキュベートした。その一方で、ｈｕＰＢＭＣを、１０ｎＭで出発して４倍段階希釈した１５３Ａ６Ｂ１、１５５Ａ９Ｂ１および１９２Ａ７Ｂ９キメラｍＡｂとともに４℃で３０分間、インキュベートした。ＰＢＳにより洗浄した後、ＰＥヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ二次抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を各ウェルに添加し、４℃で３０分間インキュベートした。試料をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。ＰＥの平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １６により評価した。図１Ａおよび１Ｂに示すように、１５３Ａ６Ｂ１、１５５Ａ９Ｂ１および１９２Ａ７Ｂ９は、ヒトＰＢＭＣとｃｙｎｏ ＰＢＭＣの両方に結合した。

【0221】

（実施例３）
ＣＤ３キメラ抗体の結合親和性
組換えＣＤ３ＤおよびＥタンパク質（ヒトＣＤ３－ｈｉｓタグ）への１５３Ａ６Ｂ１、１５５Ａ９Ｂ１および１９２Ａ７Ｂ９抗体の結合を、捕捉法を使用してＢｉａｃｏｒｅで試験した。１５３Ａ６Ｂ１、１５５Ａ９Ｂ１および１９２Ａ７Ｂ９ ｍＡｂを、プロテインＡチップを使用して捕捉した。ヒトＣＤ３－ｈｉｓタグタンパク質の段階希釈物を、捕捉された抗体上に３分間、３０μｌ／分の流速で注入した。抗原を、１２０～３６０秒間、放置して解離させた。全ての実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で行った。データ解析は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して行った。結果を表３に示す。

【表3】

【0222】

（実施例４）
ＣＤ３キメラ抗体の機能活性
この実施例は、キメラＣＤ３抗体の機能活性を試験した。
ＣＤ３キメラ抗体の細胞系ベースの機能の特徴付け

【0223】

ＣＤ３シグナル伝達経路を活性化するＣＤ３キメラ抗体の能力を評価するために、市販のＣＤ３ ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター系を使用した。このアッセイでは、ジャーカット－ＣＤ３－ＮＦＡＴをレポーター細胞系として使用した。ジャーカット－ＣＤ３－ＮＦＡＴ細胞系は、応答エレメントの下流にＣＤ３およびルシフェラーゼを安定的に発現するように遺伝子改変されている（Ｇｅｎｏｍｅｄｉｔｅｃｈ ＃Ｃ１７９４０）。ルシフェラーゼ発現は、ＣＤ３受容体への抗体結合によって誘導される。手短に述べると、レポーター細胞をウェル当たり細胞２．５×１０^４個の密度で白色９６ウェルプレートにおいて培養した。抗体を３倍段階希釈し、１０ｎＭ～０．０００５ｎＭの範囲の最終濃度で白色９６ウェルアッセイプレートに添加した。３７℃での６時間のインキュベーション後、ルシフェラーゼの基質を添加することにより発光を得、マイクロプレートリーダーにより測定した。４パラメーターロジスティック曲線解析をＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアによって行った。

【0224】

図２に示すように、１５３Ａ６Ｂ１、１５５Ａ９Ｂ１および１９２Ａ７Ｂ９抗体の全てが、ＯＫＴ３と比較して弱いＣＤ３ ＮＦＡＴ活性を呈し、１９２Ａ７Ｂ９は、ＳＰ３４に対して同等のＣＤ３ ＮＦＡＴ活性を示した。

【0225】

（実施例５）
ＣＤ３キメラ抗体により誘導されるＣＤ８^＋細胞における４－１ＢＢ発現
この実施例は、キメラＣＤ３抗体により誘発されるＣＤ８^＋細胞における４－１ＢＢ誘導を試験した。

【0226】

４－１ＢＢ発現を誘導するＣＤ３キメラ抗体の能力を評価するために、ヒトＰＢＭＣをウェル当たり細胞１×１０^５個の密度で９６ウェルプレートにおいて培養した。キメラ抗体を３倍段階希釈し、１０ｎＭ～０．００１５ｎＭの範囲の最終濃度で９６ウェルプレートに添加した。３７℃で４８時間のインキュベーション後、ヒトＰＢＭＣをさらなる解析のために収集した。ＰＢＳによる洗浄後、試料を、次の抗体：抗ヒトＣＤ４－ＡＰＣ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｅ、１７－００４８－４２）、抗ヒトＣＤ８－ＢＶ５１０（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、５６３９１９）、抗ヒトＣＤ１３７－ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５５９５６）との暗所における室温での３０分間のインキュベーションによる標準手順を使用して、染色した。試料をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。遠心分離後、上清を廃棄し、ヒトＰＢＭＣを０．２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。ＣＤ８^＋Ｔ細胞の中のＣＤ１３７^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞サブセットを、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １６により評価した。

【0227】

図３に示すように、ＳＰ３４およびＯＫＴ３と同様に、３つ全てのキメラ抗体は、強い４－１ＢＢ誘導活性を示した。

【0228】

（実施例６）
ＣＤ３抗体のヒト化
１５３Ａ６Ｂ１／１５５Ａ９Ｂ１／１９２Ａ７Ｂ９可変領域遺伝子を利用して、ヒト化ｍＡｂを作出した。このプロセスの第１ステップでは、１５３Ａ６Ｂ１／１５５Ａ９Ｂ１／１９２Ａ７Ｂ９のＶＨおよびＶＫのアミノ酸配列を、ヒトＩｇ遺伝子配列の利用可能なデータベースと比較して、全体として最もよくマッチするヒト生殖細胞系列Ｉｇ遺伝子配列を見つけた。

【0229】

１５３Ａ６Ｂ１の軽鎖については、ＶＫ１－３９（Ｏ１２）－ＪＫ２が最良適合生殖細胞系列であり、１５３Ａ６Ｂ１の重鎖については、ＶＨ４－５９－ＪＨ３をヒト化骨格として選択した。次いで、ヒト化１５３Ａ６Ｂ１ ＣＤＲグラフト抗体を設計し、ＣＤＲＬ１、Ｌ２およびＬ３をＶＫ１－３９（Ｏ１２）－ＪＫ２のフレームワーク配列にグラフトし、ＣＤＲＨ１、Ｈ２およびＨ３をＶＨ４－５９－ＪＨ３のフレームワーク配列にグラフトした。次いで、３Ｄモデルを生成して、抗体結合および立体構造に不可欠である、元のマウスＦＲ領域配列内のアミノ酸を決定した。１５３Ａ６Ｂ１ ＣＤＲグラフト抗体配列に基づいて、６本の追加のヒト化重鎖および３本の追加の軽鎖を作出した。

【0230】

１５５Ａ９Ｂ１の軽鎖については、ＶＫ１－３９（Ｏ１２）－ＪＫ２が最良適合生殖細胞系列であり、１５５Ａ９Ｂ１の重鎖については、ＶＨ４－５９－ＪＨ３をヒト化骨格として選択した。次いで、ヒト化１５５Ａ９Ｂ１ ＣＤＲグラフト抗体を設計し、ＣＤＲＬ１、Ｌ２およびＬ３をＶＫ１－３９（Ｏ１２）－ＪＫ２のフレームワーク配列にグラフトし、ＣＤＲＨ１、Ｈ２およびＨ３をＶＨ４－５９－ＪＨ３のフレームワーク配列にグラフトした。次いで、３Ｄモデルを生成して、抗体結合および立体構造に不可欠である、元のマウスＦＲ領域配列内のアミノ酸を決定した。１５５Ａ９Ｂ１ ＣＤＲグラフト抗体配列に基づいて、６本の追加のヒト化重鎖および３本の追加の軽鎖を作出した。

【0231】

１９２Ａ７Ｂ９の軽鎖については、ＶＫ１－３９（Ｏ１２）－ＪＫ２が最良適合生殖細胞系列であり、１９２Ａ７Ｂ９の重鎖については、ＶＨ４－５９－ＪＨ３をヒト化骨格として選択した。次いで、ヒト化１９２Ａ７Ｂ９ ＣＤＲグラフト抗体を設計し、ＣＤＲＬ１、Ｌ２およびＬ３をＶＫ１－３９（Ｏ１２）－ＪＫ２のフレームワーク配列にグラフトし、ＣＤＲＨ１、Ｈ２およびＨ３をＶＨ４－５９－ＪＨ３のフレームワーク配列にグラフトした。次いで、３Ｄモデルを生成して、抗体結合および立体構造に不可欠である、元のマウスＦＲ領域配列内のアミノ酸を決定した。１９２Ａ７Ｂ９ ＣＤＲグラフト抗体配列に基づいて、６本の追加のヒト化重鎖および４本の追加の軽鎖を作出した。

【0232】

ＣＤＲグラフティングに使用したヒト生殖細胞系列の配列、および得られたヒト化配列を、表４～６に収載する。

【表4-1】

【表4-2】

【表4A】

【表5-1】

【表5-2】

【表5A】

【表6-1】

【表6-2】

【表6A-1】

【表6A-2】

【0233】

ＣＤ３ヒト化抗体とベンチマークＳＰ３４の物理的および化学的特性を比較するために、ｓｃＦｖ形態の示されているモノクローナル抗体を、一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞上清から、プロテインＡ親和性カラムにより精製した。純度をＳＥＣ－ＨＰＬＣにより調べた。表６Ｂは、１５５Ａ９Ｂ１－８－ｓｃＦｖ ｈＦｃモノ抗体が、ＳＰ３４と比較して高い純度および収量を有したことを示す。同じ実験条件で発現させることができたＳＰ３４－ｓｃＦｖ ｈＦｃ抗体はなかった。

【表6B】

【0234】

（実施例７）
ＣＤ３抗原に対するヒト化抗体の結合活性
ＥＬＩＳＡ試験
ヒト化抗体の結合活性を評価するために、ヒト化ＣＤ３抗体をＥＬＩＳＡ試験に付した。

【0235】

手短に述べると、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌのヒトＣＤ３タンパク質、１００μｌ／ウェルで、４℃で一晩、コーティングし、次いで、１５０μｌ／ウェルの１％ＢＳＡでブロックした。１５μｇ／ｍｌで出発するヒト化抗体の３倍希釈物を各ウェルに添加し、１時間、３７℃でインキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次いで、抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）（ヤギ）抗体・ペルオキシダーゼコンジュゲート型とともに、３０分間、３７℃でインキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で現像し、分光光度計によりＯＤ ４５０ｎｍで解析した。表７に示すように、ヒト化ＣＤ３抗体は、ヒトＣＤ３に異なる結合作用強度で結合した。
表７．ヒト化抗体の結合活性

【表7A】

【表7B】

【表7C】

【表7D】

【表7E】

【表7F】

【表7G】

【表7H】

【表7I】

【表7J】

細胞ベースの結合

【0236】

ＦＡＣＳを使用して、ヒトＰＢＭＣに対するヒト化抗体の結合活性を評価した。

【0237】

手短に述べると、ｈｕＰＢＭＣ細胞を、３倍段階希釈したヒト化ＣＤ３抗体とともに４℃で３０分間まずインキュベートした。ＰＥヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ二次抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を各ウェルに添加し、４℃で３０分間インキュベートした。試料をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。ＰＥの平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １６により評価した。図４に示すように、ヒト化ＣＤ３抗体は、ヒトＰＢＭＣに様々な結合親和性で結合した。

【0238】

（実施例８）
ヒト化抗体の結合親和性
組換えＣＤ３ＤおよびＥタンパク質（ヒトＣＤ３－ｈｉｓタグ）へのヒト化抗体の結合を、捕捉法を使用してＢｉａｃｏｒｅで試験した。ヒト化抗体を、プロテインＡチップを使用して捕捉した。ヒトＣＤ３－ｈｉｓタグタンパク質の段階希釈物を、捕捉された抗体上に３分間、３０μｌ／分の流速で注入した。抗原を、１２０～３６０秒間、放置して解離させた。全ての実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で行った。データ解析は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して行った。結果を表８に示す。
表８．Ｂｉａｃｏｒｅにより測定した親和性

【表8A】

【表8B-1】

【表8B-2】

【表8C】

【0239】

（実施例９）
ヒト化抗体により誘導されるＣＤ３ ＮＦＡＴ活性
この実施例は、ヒト化ＣＤ３抗体の機能活性を試験した。
ＣＤ３ヒト化抗体の細胞系ベースの機能の特徴付け

【0240】

ＣＤ３シグナル伝達経路を活性化するＣＤ３ヒト化抗体の能力を評価するために、市販のＣＤ３ ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター系を使用した。このアッセイでは、ジャーカット－ＣＤ３－ＮＦＡＴをレポーター細胞系として使用した。ジャーカット－ＣＤ３－ＮＦＡＴ細胞系は、遺伝子改変されており、ＮＦＡＴ応答エレメントの下流にＣＤ３を有する。ルシフェラーゼ発現は、ＣＤ３レポーターへの抗体結合によって誘導される。手短に述べると、レポーター細胞をウェル当たり細胞２．５×１０^４個の密度で白色９６ウェルプレートにおいて培養した。被験抗体を５倍段階希釈し、３μｇ／ｍｌで出発する最終濃度で白色９６ウェルアッセイプレートに添加した。３７℃での６時間のインキュベーション後、ルシフェラーゼの基質を添加することにより発光を得、マイクロプレートリーダーにより測定した。４パラメーターロジスティック曲線解析をＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアによって行った。

【0241】

図５に示すように、ヒト化ＣＤ３抗体は、様々な異なるＣＤ３活性を示した。

【0242】

（実施例１０）
ヒト化抗体により誘導される４－１ＢＢ発現
この実施例は、４－１ＢＢ発現を活性化するＣＤ３ヒト化抗体の能力を評価した。

【0243】

手短に述べると、ヒトＰＢＭＣをウェル当たり細胞１×１０^５個の密度で９６ウェルプレートにおいて培養した。試験した抗体を１０倍段階希釈し、２０ｎＭ～０．０００２ｎＭの範囲の最終濃度で９６ウェルプレートに添加した。３７℃で４８時間のインキュベーション後、ヒトＰＢＭＣをさらなる解析のために収集した。ＰＢＳによる洗浄後、試料を、次の抗体：抗ヒトＣＤ４－ＡＰＣ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｅ、１７－００４８－４２）、抗ヒトＣＤ８－ＢＶ５１０（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、５６３９１９）、抗ヒトＣＤ１３７（４－１ＢＢ）－ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５５９５６）との暗所における室温での３０分間のインキュベーションによる標準手順を使用して、染色した。試料をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。遠心分離後、上清を廃棄し、ヒトＰＢＭＣを０．２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。ＣＤ８^＋Ｔ細胞の中のＣＤ１３７^＋（４－１ＢＢ^＋）ＣＤ８^＋Ｔ細胞サブセットを、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １６により評価した。全ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対するＣＤ１３７^＋（４－１ＢＢ^＋）ＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージ（％）を使用して４－１ＢＢ誘導率を示した：

【数4】

【0244】

興味深いことに、ＮＦＡＴ試験において試験してわずかな応答を有したまたは応答を有さなかったこれらのヒト化抗体（グレード１～４）を、４－１ＢＢ誘導活性に基づいてより明確に分類することができた。４－１ＢＢ誘導率は、ＣＤ３ ＮＦＡＴ活性とよく相関する（図６）。

【0245】

（実施例１１）
ＣＤ３モノクローナル抗体および多重特異性抗体により誘導されるＣＤ３ ＮＦＡＴ活性
ＣＤ３作用強度をさらに定義するために、ＣＤ３媒介ＮＦＡＴ活性を、ＴＣＲ／ＣＤ３エフェクター細胞において参照としてＳＰ３４を使用することにより測定した。ＴＣＲ／ＣＤ３エフェクター細胞（ＮＦＡＴ、Ｐｒｏｍｅｇａ カタログ番号Ｊ１６０１）を使用した。抗ＴＣＲ／ＣＤ３刺激が加わると、受容体媒介シグナル伝達は、発光（ＮＦＡＴの活性化による）を誘導し、これを、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）試薬を添加し、ルミノメーターで定量することによって検出することができる。
ＣＤ３モノクローナル抗体により誘導されるＣＤ３ ＮＦＡＴ活性

【0246】

手短に述べると、ＴＣＲ／ＣＤ３エフェクター細胞をウェル当たり細胞２．５×１０^４個の密度で白色９６ウェルプレートにおいて培養した。ＣＤ３ヒト化抗体を４倍段階希釈し、１００ｎＭから出発する最終濃度で白色９６ウェルアッセイプレートに添加した。３７℃での６時間のインキュベーション後、ルシフェラーゼの基質を添加することにより発光を得、マイクロプレートリーダーにより測定した。４パラメーターロジスティック曲線解析をＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアによって行った。

【0247】

図７および表１０に示すように、ヒト化ＣＤ３抗体は、様々な異なるＣＤ３活性を示した。それらの中で、ＮＦＡＴ応答に関してＳＰ３４の５０％以下を示した最大効果（最高発光計測値、Ｅｍａｘ）を、グレード１～４と定義した。ＮＦＡＴ応答に関してＳＰ３４の５０％より高い％を示した最大効果（最高発光計測値、Ｅｍａｘ）を、グレード５～９と定義した。表９は、ＣＤ３－ＮＦＡＴアッセイにおいてＳＰ３４により誘導された最高値（Ｅｍａｘ）およびその相対パーセンテージを示した。

【表9-1】

【表9-2】

【表9-3】

【0248】

ＳＰ３４群の最高値を各アッセイについて１００％と設定した。ＳＰ３４の最高値に対する示されている抗体の最高値のパーセンテージを使用して、ＣＤ３ Ｔ細胞活性化活性を示した：

【数5】

ＣＤ３多重特異性抗体により誘導されるＣＤ３ ＮＦＡＴ活性

【0249】

ＣＤ３活性をさらに定義するために、ＣＤ３多重特異性抗体を生成し、ＣＤ３活性を、ＴＡＡ陽性細胞の存在下で多重特異性形式に関してさらに決定した。二重特異性抗体については、ＦｃのＮ末端に融合しているｓｃＦｖ形態の抗ＣＤ３、およびＦｃの別のＮ末端に融合しているＦａｂ形態の抗クローディン１８．２またはＧＰＣ３を、１＋１形式の二重特異性抗体になるように構築した（図９Ａ）。三重特異性抗体については、重鎖のＮ末端に融合しているｓｃＦｖ形態の抗ＣＤ３、Ｆｃの別のＮ末端に融合しているＦａｂ形態の５Ｔ４、および各重鎖のＣ末端に融合している抗４－１ＢＢを、三重特異性抗体１＋１形式になるように構築した（図１１Ａ）。ＳＰ３４は、参照対照としての役割を果たした。

【0250】

手短に述べると、ＴＣＲ／ＣＤ３エフェクター細胞をウェル当たり細胞２．５×１０^４個の密度で白色９６ウェルプレートにおいて培養した。クローディン１８．２（ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＣＬＤＮ１８．２）、５Ｔ４（ＣＨＯ－Ｋ１－ｈ５Ｔ４およびＭＣＦ７）またはＧＰＣ３（ＨｅｐＧ２）を発現する標的細胞系を、２．５×１０^４の密度（したがって、１：１のＥ：Ｔ比）で播種した。被験ＣＤ３－二重特異性または三重特異性抗体を段階希釈し、１００ｎＭから出発する最終濃度で白色９６ウェルアッセイプレートに添加した。ＳＰ３４（Ｂｉｏｉｎｔｒｏｎ、Ｂ６７６２）は、ベンチマーク対照としての役割を果たした。３７℃での６時間のインキュベーション後、ルシフェラーゼの基質を添加することにより発光を得、マイクロプレートリーダーにより測定した。４パラメーターロジスティック曲線解析をＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアによって行った。

【0251】

驚くべきことに、グレード１～４活性に属する全てのＣＤ３抗体を、上述のアッセイにおいて測定したそれらのＴＡＡ依存性Ｔ細胞活性化活性に基づいて、さらに定義および分類することができた。ベンチマークＳＰ３４モノクローナル抗体との比較でのそれらのＴＡＡ依存性活性に基づいて、ＳＰ３４モノクローナル抗体より強い活性を有する抗ＣＤ３抗体をグレード３および４と定義し、その一方で、検出不能の活性を有する抗ＣＤ３抗体をグレード１および２と定義した。

【0252】

図８Ａ～Ｂに示すように、１５５－７および１５５－１などの、グレード１または２活性を有する全てのＣＤ３抗体は、クローディン１８．２の存在下で検出不能のＣＤ３活性を有し、その一方で、グレード２レベルより上の活性を有する全ての他の抗体は、ＳＰ３４モノクローナル抗体と比較して強いＣＤ３活性を示した。同様に、図８Ｃに示すように、グレード２より上の活性を有する全ての試験したＣＤ３抗体（例えば、１５５－５は、「グレード５～９活性」に属し、１５５－１４および１５５－１６は、「グレード４活性」に属する）は、ＳＰ３４モノクローナル抗体により誘導されるものより強い活性を示し、これらのＣＤ３抗体を、ＧＰＣ３－ＣＤ３二重特異性抗体を用いて、ＧＰＣ３発現ＨｅｐＧ２細胞の存在下で構築した。この場合もやはり、一貫して、グレード２より上の活性を有する全ての試験したＣＤ３抗体（例えば、１５５－８および１５５－１６は、「グレード４活性」に属し、１５３－７は、「グレード３活性」に属する）もまた、これらの抗ＣＤ３抗体を５Ｔ４×ＣＤ３二重特異性抗体になるように構築したとき、５Ｔ４高発現細胞系においてＳＰ３４モノクローナル抗体と比較してより有意なＣＤ３活性化を誘導した（図８Ｄ～Ｅ）。

【0253】

したがって、グレード２より上の全ての抗体は、ＴＡＡ－ＣＤ３二重特異性抗体の形式で卓越したＴＡＡ依存性ＣＤ３活性を示した。グレード３および４配列は、ＣＤ３モノクローナル抗体形式に関してはＮＦＡＴ応答の点でわずかなＣＤ３アゴニズム活性を有するかまたは全くＣＤ３アゴニズム活性を有さず、ＴＡＡ－ＣＤ３二重特異性形式に関してはＴＡＡ発現細胞が関与したときに強力なＮＦＡＴ応答を有するので目を引く。そしてその一方で、グレード３～４配列によって誘導される最大効果（Ｅｍａｘとして測定した）は、少なくとも、ＳＰ３４抗体によって誘導されるものより大きい。

【0254】

（実施例１２）
ヒトＰＢＭＣ上のヒトＣＤ３に対するＣＤ３／クローディン１８．２二重特異性抗体の結合活性
以下の二重特異性分子をこの実施例では調製した。重鎖のＮ末端に融合しているｓｃＦｖ形態の１５５Ａ９Ｂ１－８からの抗ＣＤ３抗体断片および別のＮ末端に融合しているＦａｂ形態のクローディン１８．２を、２つの異なる二重特異性抗体形式ＡおよびＢになるように構築した（図９Ａ）。二重特異性抗体１５５－８Ａによって代表される形式Ａ（「１＋１形式」とも呼ばれる）は、Ｎ末端に（右側に）抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含み、別の末端に（左側に）抗クローディン１８．２ Ｆａｂを含む。誤対合を低減させるためにノブ・イン・ホール置換をＦｃ領域において使用する。二重特異性抗体１５５－８Ｂによって代表される形式Ｂ（「２＋Ｌｃ２形式」とも呼ばれる）は、抗クローディン１８．２ Ｆａｂの軽鎖可変領域の各々のＣ末端に融合している２つの抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含む。

【0255】

ヒト化抗体１５５－８のｓｃＦｖを含む１５５－８Ａおよび１５５－８Ｂである、２つの二重特異性抗体に加えて、第３の二重特異性抗体も調製した。この参照二重特異性抗体、Ｘｍａｂは、１＋１形式をとり、プラモタマブ（Ｘｅｎｃｏｒ）からのＣＤ３ ｓｃＦｖを含んだ。

【0256】

ＦＡＣＳを使用して、ヒトＰＢＭＣに対する、クローディン１８．２／ＣＤ３二重特異性抗体および参照単一特異性抗体ＳＰ３４および１５５－８という異なる形式についての結合活性を評価した。

【0257】

手短に述べると、先ず、ｈｕＰＢＭＣを、１００ｎＭで出発して４倍段階希釈したクローディン１８．２／ＣＤ３二重特異性抗体とともに４℃で３０分間、インキュベートした。ＰＥヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ二次抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を各ウェルに添加し、４℃で３０分間インキュベートした。試料をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。ＰＥの平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １６により評価した。

【0258】

結果を図９Ｂに示す。二重特異性抗体１５５－８Ａおよび１５５－８ＢによるｈｕＰＢＭＣに対する結合活性は、参照単一特異性抗体はもちろんＸｍａｂよりも弱かった。

【0259】

（実施例１３）
ＣＤ３／クローディン１８．２二重特異性抗体により誘導される４－１ＢＢ発現
この実施例は、ＣＤ３／クローディン１８．２二重特異性抗体の異なる形式についての４－１ＢＢ発現を活性化する能力を測定した。

【0260】

手短に述べると、ヒトＰＢＭＣをウェル当たり細胞１×１０^５個の密度で９６ウェルプレートにおいて培養した。クローディン１８．２を発現する標的細胞系（ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＣＬＤＮ１８．２）または対照細胞（ＣＨＯ－Ｋ１）を、２．５×１０^４の密度（したがって、４：１のＥ：Ｔ比）で播種した。ＦＡＣＳ解析は、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞におけるクローディン１８．２の過剰発現倍数が、ＣＨＯ－Ｋ１細胞と比較して約９０であることを示した。ＦＡＣＳ試験抗体は、Ｇａｎｙｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＡＧにより開発されたＩＭＡＢ３６２である。したがって、試験した二重特異性抗体を４倍段階希釈し、１００ｎＭ～０．０００４ｎＭの範囲の最終濃度で９６ウェルプレートに添加した。３７℃で４８時間のインキュベーション後、ヒトＰＢＭＣをさらなる解析のために収集した。ＰＢＳによる洗浄後、試料を、次の抗体：抗ヒトＣＤ４－ＡＰＣ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｅ、１７－００４８－４２）、抗ヒトＣＤ８－ＢＶ５１０（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、５６３９１９）、抗ヒトＣＤ１３７－ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５５９５６）との暗所における室温での３０分間のインキュベーションによる標準手順を使用して染色した。試料をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。遠心分離後、上清を廃棄し、ヒトＰＢＭＣを０．２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。ＣＤ８^＋Ｔ細胞の中のＣＤ１３７^＋（４－１ＢＢ^＋）ＣＤ８^＋Ｔ細胞サブセットを、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １６により評価した。

【0261】

全ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対するＣＤ１３７^＋（４－１ＢＢ^＋）ＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージ（％）を使用して４－１ＢＢ誘導率を示した。腫瘍関連抗原（クローディン１８．２）発現細胞を使用したときにＴＡＡ依存性４－１ＢＢ誘導率を得、これらのＴＡＡ発現細胞の非存在下で（その代わりにＣＨＯ－Ｋ１細胞を用いて）ＴＡＡフリー４－１ＢＢ誘導率を得た。

【0262】

図９Ｃは、１５５－８Ａ（１＋１形式）が、１５５－８Ｂ（２＋Ｌｃ２形式）より頑強な応答を誘導したことを示す。また重要なこととして、ＳＰ３４およびＸｍＡｂは、クローディン１８．２^－細胞（ＣＨＯ－Ｋ１）とクローディン１８．２^＋細胞の両方において強い４－１ＢＢ活性化活性を示した一方で、１５５－８Ａおよび１５５－８Ｂの活性は、クローディン１８．２^＋細胞において有意にさらに顕著であった。これは、クローディン１８．２発現へのそれらの依存性を示す。

【0263】

（実施例１４）
クローディン１８．２／４－１ＢＢ二重特異性抗体により誘導されるＩＬ－２分泌はＣＤ３依存性である
この実施例は、クローディン１８．２／４－１ＢＢ二重特異性抗体により誘導されるＩＬ－２分泌がＣＤ３依存性であるかどうかを調べた。

【0264】

手短に述べると、実験を２つの群に分けた。第１の群では、プレートをＣＤ３抗体（クローンＨＩＴ３ａ）でプレコーティングし、第２の群では、いかなるＣＤ３抗体も使用しなかった。次いで、ヒトＰＢＭＣをウェル当たり細胞１×１０^５個の密度で９６ウェルプレートにおいて培養した。クローディン１８．２を発現する標的細胞系（ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＣＬＤＮ１８．２）または対照細胞（ＣＨＯ－Ｋ１）を、２．５×１０^４の密度（したがって、４：１のＥ：Ｔ比）で播種した。クローディン１８．２／４－１ＢＢ二重特異性抗体を４倍段階希釈し、１００ｎＭ～０．００６１ｎＭの範囲の最終濃度で９６ウェルアッセイプレートに添加した。３７℃で４８時間のインキュベーション後、上清をさらなる解析のために収集した。ＩＬ－２を、ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、続いて製造業者のプロトコールによって測定した。Ｌａｎｃｅシグナルを、Ｅｎｖｉｓｉｏｎを使用して検出した。６１５ｎＭ（チャネル１）および６６５ｎＭ（チャネル２）からの二重放射を得た。Ｌａｎｃｅ計数（標準物質の濃度に対するＣｈ１／Ｃｈ２比）をプロットすることにより、標準曲線を生成した。非線形回帰、４パラメーターロジスティック方程式を使用して、データを解析した。

【0265】

図１０に示すように、４－１ＢＢ誘導ＩＬ－２分泌は、実際、ＣＤ３活性化に依存性であった。

【0266】

（実施例１５）
三重特異性抗体により刺激されるＩＬ－２分泌
この実施例は、クローディン１８．２、ＣＤ３および４－１ＢＢと相互作用してＴ細胞活性化と腫瘍標的化の両方を増強する、三重特異性抗体を説明した。この三重特異性抗体は、腫瘍細胞上のタンパク質クローディン１８．２、ならびにＴ細胞上のタンパク質ＣＤ３および４－１ＢＢという、３つの標的に結合する。抗体の標的結合ドメインを図１１Ａに示す。それは、Ｆｃ断片のＣ末端に融合している２つの抗４－１ＢＢナノボディを有する、１＋１形式の抗ＴＡＡ／ＣＤ３部分を含む。

【0267】

Ｔ細胞を活性化するＣＤ３三重特異性抗体の能力を評価するために、ＩＬ－２分泌をＬＡＮＣＥ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）により調べた。手短に述べると、ヒトＰＢＭＣ細胞をウェル当たり細胞１×１０^５個の密度で９６ウェルプレートにおいて培養した。クローディン１８．２を発現する標的細胞系（ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＣＬＤＮ１８．２）または対照細胞（ＣＨＯ－Ｋ１）を、２．５×１０^４の密度（４：１のＥ：Ｔ比である）で播種した。被験三重特異性抗体を４倍段階希釈し、１００ｎＭ～０．０９８ｎＭの範囲の最終濃度で９６ウェルプレートに添加した。３７℃で４８時間のインキュベーション後、上清をさらなる解析のために収集した。ＩＬ２を、ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイにより、製造業者のプロトコールに従って測定した。Ｌａｎｃｅシグナルを、Ｅｎｖｉｓｉｏｎを使用して検出した。６１５ｎＭ（チャネル１）および６６５ｎＭ（チャネル２）からの二重放射を得た。Ｌａｎｃｅ計数（標準物質の濃度に対するＣｈ１／Ｃｈ２比）をプロットすることにより、標準曲線を生成した。非線形回帰、４パラメーターロジスティック方程式を使用して、データを解析した。

【0268】

ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞の存在下で、ヒトＰＢＭＣにおけるＩＬ－２分泌（図１１Ｂ）は、ＣＤ３ ＮＦＡＴ活性との正の相関を示した。わずかなＣＤ３アゴニスト活性を有する１５５－８、１５５－９および１５５－１４を含む、グレード４Ｂ抗体は、ＣＨＯ－Ｋ１対照細胞において非特異的活性化なしに強力なサイトカイン放出を誘導した。グレード３抗体（１５５－２）では、非特異的ＩＬ－２活性化が、クローディン１８．２の存在下でそのＩＬ－２活性化があまり顕著ではなかったとはいえ、クローディン１８．２の非存在下で検出不能であった。したがって、グレード４抗体とグレード３抗体の両方が卓越した安全域を示した。

【0269】

（実施例１６）
三重特異性抗体により誘導される４－１ＢＢ発現
この実施例は、４－１ＢＢ発現を活性化する三重特異性抗体の能力を評価した。

【0270】

手短に述べると、ヒトＰＢＭＣをウェル当たり細胞１×１０^５個の密度で９６ウェルプレートにおいて培養した。クローディン１８．２を発現する標的細胞系（ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＣＬＤＮ１８．２）または対照細胞（ＣＨＯ－Ｋ１）を、２．５×１０^４の密度（したがって、４：１のＥ：Ｔ比）で播種した。試験した抗体を４倍段階希釈し、１００ｎＭ～０．０９８ｎＭの範囲の最終濃度で９６ウェルプレートに添加した。３７℃で４８時間のインキュベーション後、ヒトＰＢＭＣをさらなる解析のために収集した。ＰＢＳによる洗浄後、試料を、次の抗体：抗ヒトＣＤ４－ＡＰＣ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｅ、１７－００４８－４２）、抗ヒトＣＤ８－ＢＶ５１０（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、５６３９１９）、抗ヒトＣＤ１３７－ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５５９５６）との暗所における室温での３０分間のインキュベーションによる標準手順を使用して染色した。試料をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。遠心分離後、上清を廃棄し、ヒトＰＢＭＣを０．２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。ＣＤ８^＋Ｔ細胞の中のＣＤ１３７^＋（４－１ＢＢ^＋）ＣＤ８^＋Ｔ細胞サブセットを、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １６により評価した。

【0271】

全ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対するＣＤ１３７^＋（４－１ＢＢ^＋）ＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージ（％）を使用して４－１ＢＢ誘導率を示した。腫瘍関連抗原（クローディン１８．２）発現細胞を使用したときにＴＡＡ依存性４－１ＢＢ誘導率を得、これらのＴＡＡ発現細胞の非存在下で（その代わりにＣＨＯ－Ｋ１細胞を用いて）ＴＡＡフリー４－１ＢＢ誘導率を得た。

【0272】

ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞の存在下で、ヒトＰＢＭＣ ＣＤ８^＋細胞における４－１ＢＢ誘導（図１２）は、ＣＤ３ ＮＦＡＴ活性との正の相関を示した。図１０Ｂと同様に、グレード４Ｂ抗体１５５－８、１５５－９および１５５－１４は、ＣＨＯ－Ｋ１対照細胞において非特異的活性化なしに強力な４－１ＢＢ誘導を誘導した。また、グレード３抗体（１５５－２）では、非特異的４－１ＢＢ活性化が、クローディン１８．２の存在下でその活性化があまり顕著ではなかったとはいえ、クローディン１８．２の非存在下で検出不能であった。この場合もやはり、グレード４抗体とグレード３抗体の両方が卓越した安全域を示した。

【0273】

ＴＡＡを伴わないＣＤ３ユニットにより誘導されたＣＤ３－ＮＦＡＴ活性（図７Ａ～Ｄ）、ＴＡＡ－ＣＤ３二重特異性抗体によるＴＡＡ依存性Ｔ細胞活性化（図８Ａ～Ｅ）、およびＣＤ３－４－１ＢＢ－ＴＡＡ三重特異性抗体によるＴＡＡ依存性４－１ＢＢ誘導（図１２）からのデータに基づいて、ＣＤ３活性を表１０に示すような９つのカテゴリーに分けることができた。

【表10】

【0274】

（実施例１７）
ベンチマーク二重特異性抗体により誘導されるＩＬ－２分泌および細胞溶解活性
候補抗体と市販のベンチマークＣＤ３抗体のＣＤ３活性を比較するために、この実施例は、図９Ａに示すような二重特異性１＋１形式になるように本発明者らのＣＤ３および市販のベンチマークＣＤ３配列を構築した。Ｘｅｎｃｏｒ－ＢｉＡｂは、プラモタマブ（Ｘｅｎｃｏｒ）から得たＣＤ３配列を表し、Ｒｏｃｈｅ－ＢｉＡｂは、モスネツズマブ（Ｒｏｃｈｅ）から得たＣＤ３配列を表し、Ａｍｔ－ＢｉＡｂは、タルラタマブ（Ａｍｇｅｎ）から得たＣＤ３配列を表し、Ａｍｂ－ＢｉＡｂは、ブリナツモマブ（Ａｍｇｅｎ）から得たＣＤ３配列を表し、ＳＰ３４－ＢｉＡｂは、ＳＰ３４から得たＣＤ３配列を表す。

【0275】

この実施例は、ＩＬ－２分泌および細胞溶解活性をＣＤ３活性の読み出し情報として使用し、ひいては、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞と共培養したヒトＰＢＭＣのＩＬ－２産生および細胞溶解活性に対する二重特異性ＣＤ３抗体の効果を評価した。
ＣＤ３二重特異性抗体により誘導されるＩＬ－２分泌

【0276】

Ｔ細胞を活性化するＣＤ３二重特異性抗体の能力を評価するために、ＩＬ－２分泌をＬＡＮＣＥ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）により調べた。

【0277】

手短に述べると、ヒトＰＢＭＣをウェル当たり細胞１×１０^５個の密度で９６ウェルプレートにおいて培養した。クローディン１８．２を発現する標的細胞系（ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＣＬＤＮ１８．２）または対照細胞（ＣＨＯ－Ｋ１）を、２．５×１０^４の密度で播種した。したがって、Ｅ：Ｔ比は、４：１である。抗体を５倍段階希釈し、１００ｎＭ～０．０３２ｎＭの範囲の最終濃度で９６ウェルプレートに添加した。３７℃で４８時間のインキュベーション後、上清をさらなる解析のために収集した。ＩＬ２を、ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイにより、製造業者のプロトコールに従って測定した。Ｌａｎｃｅシグナルを、Ｅｎｖｉｓｉｏｎを使用して検出した。６１５ｎＭ（チャネル１）および６６５ｎＭ（チャネル２）からの二重放射を得た。Ｌａｎｃｅ計数（標準物質の濃度に対するＣｈ１／Ｃｈ２比）をプロットすることにより、標準曲線を生成した。非線形回帰、４パラメーターロジスティック方程式を使用して、データを解析した。
ＣＤ３二重特異性抗体により誘導される細胞溶解活性

【0278】

Ｔ細胞を活性化するＣＤ３二重特異性抗体の能力を評価するために、損傷した細胞のサイトゾルから放出される乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性をＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ^ＰＬＵＳ（Ｒｏｃｈｅ）により調べた。

【0279】

手短に述べると、ＣＤ８^＋細胞をヒトＰＢＭＣからＣＤ８単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．）により単離した。ＣＤ８^＋細胞をウェル当たり細胞２×１０^５個の密度で９６ウェルプレートにおいて培養した。クローディン１８．２を発現する標的細胞系（ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＣＬＤＮ１８．２）または対照細胞（ＣＨＯ－Ｋ１）を、１×１０^４の密度で播種した。したがって、Ｅ：Ｔ比は、２０：１である。抗体を４倍段階希釈し、１０ｎＭ～３．８１Ｅ－０５ｎＭの範囲の最終濃度で９６ウェルアッセイプレートに添加した。３７℃で２４時間のインキュベーション後、上清をさらなる解析のために収集した。ＬＤＨを、製造業者のプロトコールに従って調べた。ＥＬＩＳＡリーダーを使用して４９２ｎｍでの試料の吸光度を測定した。

【0280】

図１３Ａに示すように、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞の存在下では被験物質１５５－８二重特異性抗体は、ベンチマーク二重特異性抗体より小さい細胞溶解活性を示したが、ＣＨＯ－Ｋ１細胞の存在下では１５５－８二重特異性抗体は、ベンチマーク二重特異性抗体とは対照的に、より小さい非特異的細胞溶解活性も誘発した。

【0281】

さらに、ＩＬ－２分泌（図１３Ｂ）については、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞の存在下で、被験二重特異性抗体の全てがアイソタイプ対照と同等のＩＬ－２分泌を誘発した。

【0282】

（実施例１８）
ベンチマーク三重特異性抗体により誘導されるＩＬ－２分泌および細胞溶解活性
本発明者らの候補と市販のベンチマークＣＤ３抗体のＣＤ３活性を比較するために、この実施例は、図１１Ａに示すような三重特異性１＋１形式になるように本発明者らのＣＤ３および市販のベンチマークＣＤ３配列を構築した。Ｘｅｎｃｏｒ－ＴｒｉＡｂは、プラモタマブ（Ｘｅｎｃｏｒ）から得たＣＤ３配列を表し、Ｒｏｃｈｅ－ＴｒｉＡｂは、モスネツズマブ（Ｒｏｃｈｅ）から得たＣＤ３配列を表し、Ａｍｔ－ＴｒｉＡｂは、タルラタマブ（Ａｍｇｅｎ）から得たＣＤ３配列を表し、Ａｍｂ－ＴｒｉＡｂは、ブリナツモマブ（Ａｍｇｅｎ）から得たＣＤ３配列を表す。本発明者らは、ＩＬ－２分泌および細胞溶解活性をＣＤ３活性の読み出し情報として使用し、ひいては、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞と共培養したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のＩＬ－２産生および細胞溶解活性に対する三重特異性ＣＤ３抗体の効果を評価した。
ＣＤ３三重特異性抗体により誘導されるＩＬ－２分泌

【0283】

Ｔ細胞を活性化するＣＤ３三重特異性抗体の能力を評価するために、ＩＬ－２分泌をＬＡＮＣＥ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）により調べた。

【0284】

手短に述べると、ヒトＰＢＭＣをウェル当たり細胞１×１０^５個の密度で９６ウェルプレートにおいて培養した。クローディン１８．２を発現する標的細胞系（ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＣＬＤＮ１８．２）または対照細胞（ＣＨＯ－Ｋ１）を、２．５×１０^４の密度で播種した。したがって、Ｅ：Ｔ比は、４：１である。抗体を５倍段階希釈し、１００ｎＭ～０．０３２ｎＭの範囲の最終濃度で９６ウェルプレートに添加した。３７℃で４８時間のインキュベーション後、上清をさらなる解析のために収集した。ＩＬ２を、ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイ、続いて製造業者のプロトコールにより測定した。Ｌａｎｃｅシグナルを、Ｅｎｖｉｓｉｏｎを使用して検出した。６１５ｎＭ（チャネル１）および６６５ｎＭ（チャネル２）からの二重放射を得た。Ｌａｎｃｅ計数（標準物質の濃度に対するＣｈ１／Ｃｈ２比）をプロットすることにより、標準曲線を生成した。非線形回帰、４パラメーターロジスティック方程式を使用して、データを解析した。
ＣＤ３三重特異性抗体により誘導される細胞溶解活性

【0285】

Ｔ細胞を活性化するＣＤ３三重特異性抗体の能力を評価するために、損傷した細胞のサイトゾルから放出される乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性をＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＫｉｔＰＬＵＳ（Ｒｏｃｈｅ）により調べた。

【0286】

手短に述べると、ヒトＰＢＭＣをウェル当たり細胞４×１０^５個の密度で９６ウェルプレートにおいて培養した。クローディン１８．２を発現する標的細胞系（ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＣＬＤＮ１８．２）を、２×１０^４の密度で播種した。したがって、Ｅ：Ｔ比は、１０：１である。抗体を５倍段階希釈し、１００ｎＭ～０．０３２ｎＭの範囲の最終濃度で９６ウェルプレートに添加した。３７℃で４８時間のインキュベーション後、上清をさらなる解析のために収集した。ＬＤＨを調べ、続いて製造業者のプロトコールによって調べた。ＥＬＩＳＡリーダーを使用して４９２ｎｍでの試料の吸光度を測定した。

【0287】

図１４Ａに示すように、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞の存在下では被験物質１５５－８三重特異性抗体は、他のベンチマークＣＤ３配列を使用することによる三重特異性抗体と同等の細胞溶解活性を示したが、ＣＨＯ－Ｋ１細胞の存在下では、１５５－８三重特異性抗体は、他の対照よりも有意に小さい、わずかなオフターゲット細胞溶解活性を誘発した。

【0288】

さらに、ＩＬ－２分泌（図１４Ｂ）については、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞の存在下で、被験物質１５５－８三重特異性抗体は、ベンチマーク三重特異性抗体と比較してヒトＰＢＭＣからの頑強なＩＬ－２放出を誘導した。その一方で、ＣＨＯ－Ｋ１細胞の存在下では、１５５－８三重特異性抗体は、ベンチマーク三重特異性抗体とは対照的に、より少ない非特異的ＩＬ－２分泌を誘導した。

【0289】

これらの結果は、１５５－８のＣＤ３活性が、１＋１形式の三重特異性抗体においてＴＡＡ依存性Ｔ細胞活性化を開始させるのに十分なほど正確であったことを示す。

【0290】

（実施例１９）
三重特異性抗体によるｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍処置
この実施例は、Ｂ１６Ｆ１０－ｈ５Ｔ４腫瘍の処置における１５５－８と抗５Ｔ４（ナプツモマブ、Ａｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と抗４－１ＢＢエレメントとを利用する三重特異性抗体の有効性を試験した。

【0291】

Ｂ１６Ｆ１０は、肺黒色腫小結節に由来するマウス黒色腫細胞系である。Ｂ１６Ｆ１０－ｈ５Ｔ４細胞をＣＤ３／４－１ＢＢヒト化マウスに注射した。処置は、腫瘍サイズが１００ｍｍ^３に達したときに開始した。

【0292】

１５５－８に基づく三重特異性抗体（ＣＴＭ０１－０１）に加えて、対照処置は、ＣＴＭ０１－０１の２つの変異体を含んだ。変異体の一方、ＣＴＭ０１－０１Ａは、抗４－１ＢＢ抗体に不活性化変異を含むものであり、他方、ＣＴＭ０１－０１Ｂは、抗ＣＤ３抗体に不活性化変異を含むものであった。

【0293】

Ｂ１６Ｆ１０腫瘍は、最も処置困難な腫瘍の１つと広く見なされている、周知のＰＤ－１非応答および抵抗性モデルである。結果を図１５に示す。マウス抗ＰＤ－１治療は、このモデルでは有効性がなかった。ＣＴＭ０１－０１（ＣＤ３と４－１ＢＢとＴＡＡとしてのヒト５Ｔ４とを標的とする野生型三重特異性抗体）での処置は、劇的に腫瘍を低減させる結果となった。対照的に、抗ＣＤ３部分を不活性化したＣＴＭ０１－０１Ｂでの処置には有意な効果がなく、抗４－１ＢＢ部分を不活性化したＣＴＭ０１－０１Ａでの処置には最適とは言えない有効性しかなかった。したがって、これらの結果は、抗ＣＤ３／４－１ＢＢ／ｈ５Ｔ４三重特異性抗体の並外れたｉｎ ｖｉｖｏ有効性を実証する。
＊ ＊ ＊

【0294】

本開示は、記載した特定の実施形態によって範囲が限定されることはなく、これらの実施形態は、本開示の個々の態様の単一の実例として意図したものであり、機能的に等価であるあらゆる組成物または方法が本開示の範囲内である。本開示の主旨および範囲を逸脱することなく、本開示の方法および組成物に様々な改変および変形を加えることができることは、当業者には明らかであろう。したがって、本開示は、本開示の改変形態および変形形態を、それらが添付の請求項およびそれらの均等物の範囲内に入ることを条件に、包含する。

【0295】

本明細書で言及した全ての公表文献および特許出願は、個々の公表文献または特許出願各々が参照により組み込まれると具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【配列表】

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【国際調査報告】