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▶ コンセプト トゥー メディシン バイオテック カンパニー， リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-10
(54)【発明の名称】単一ドメイン４－１ＢＢ抗体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20241003BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20241003BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241003BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241003BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241003BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241003BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241003BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241003BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241003BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241003BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20241003BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C07K16/46
C12N15/13
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N15/62 Z
C12N5/10
A61P35/00
A61K39/395 N
C07K19/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024522068
(86)(22)【出願日】2022-10-12
(85)【翻訳文提出日】2024-06-10
(86)【国際出願番号】 CN2022124973
(87)【国際公開番号】W WO2023061421
(87)【国際公開日】2023-04-20
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/123368
(32)【優先日】2021-10-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524069695
【氏名又は名称】コンセプト トゥー メディシン バイオテック カンパニー， リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ゴン， ウェンツー
(72)【発明者】
【氏名】ヤン， リウ
(72)【発明者】
【氏名】ガオ， シャン
(72)【発明者】
【氏名】ヤン， ユアンユアン
(72)【発明者】
【氏名】ファン， レイ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA57X
4B065AA57Y
4B065AA72X
4B065AA72Y
4B065AA83X
4B065AA83Y
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065BA02
4B065BD14
4B065CA44
4B065CA46
4C085AA14
4C085BB31
4C085CC23
4C085EE01
4C085GG02
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
4H045GA20
(57)【要約】
単一ドメイン抗４－１ＢＢ抗体、およびこれらの単一ドメイン抗体を含むポリペプチド、例えば、二重特異性抗体およびキメラ抗原受容体が、提供される。がんなどの疾患を処置および診断するために抗体またはポリペプチドを使用する方法も提供される。本開示の単一ドメイン抗体は、独力では４－１ＢＢシグナル伝達を活性化しない、「非アゴニスト」であり得る。しかし、抗クローディン１８．２抗体と組み合わせた場合、その後の二重特異性抗体は、クローディン１８．２陽性細胞の存在下で４－１ＢＢシグナル伝達を活性化する点で強力な活性を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
単一ドメイン抗体、または前記単一ドメイン抗体を含むポリペプチドであって、前記単一ドメイン抗体が、ヒト４－１ＢＢタンパク質に対して結合特異性を有し、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、（ａ）前記ＣＤＲ１が、配列番号６のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ２が、配列番号７、３９もしくは４０のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ３が、配列番号８のアミノ酸配列を含むか；
（ｂ）前記ＣＤＲ１が、配列番号９のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ２が、配列番号１０、４１もしくは４２のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ３が、配列番号１１のアミノ酸配列を含むか；
（ｃ）前記ＣＤＲ１が、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ２が、配列番号１３、４３もしくは４４のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ３が、配列番号１４のアミノ酸配列を含むか；
（ｄ）前記ＣＤＲ１が、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ２が、配列番号１６のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ３が、配列番号１７のアミノ酸配列を含むか；または
（ｅ）前記ＣＤＲ１が、配列番号１８のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ２が、配列番号１９のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ３が、配列番号２０のアミノ酸配列を含む、抗体またはポリペプチド。
【請求項2】
前記ＣＤＲ１が、配列番号６のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ２が、配列番号７、３９または４０のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ３が、配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはポリペプチド。
【請求項3】
配列番号１および２１～２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の抗体またはポリペプチド。
【請求項4】
前記ＣＤＲ１が、配列番号９のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ２が、配列番号１０、４１または４２のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ３が、配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはポリペプチド。
【請求項5】
配列番号１および３１～３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の抗体またはポリペプチド。
【請求項6】
前記ＣＤＲ１が、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ２が、配列番号１３、４３または４４のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ３が、配列番号１４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはポリペプチド。
【請求項7】
配列番号３および２６～３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の抗体またはポリペプチド。
【請求項8】
前記ＣＤＲ１が、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ２が、配列番号１６のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ３が、配列番号１７のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはポリペプチド。
【請求項9】
配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体またはポリペプチド。
【請求項10】
前記ＣＤＲ１が、配列番号１８のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ２が、配列番号１９のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ３が、配列番号２０のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはポリペプチド。
【請求項11】
配列番号５および３５～３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の抗体またはポリペプチド。
【請求項12】
前記ポリペプチドが、４－１ＢＢとは異なる抗原に対して結合特異性を有する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または二重特異性抗体である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗体またはポリペプチド。
【請求項13】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗体と、４－１ＢＢではない標的抗原に対して結合特異性を有する二次抗体または抗原結合性断片とを含む、二重特異性抗体。
【請求項14】
前記標的抗原が、クローディン１８．２、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＣＤ７３、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ－７２、ＣＩＸ、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、インテグリン、αＶβ３、α５β１、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰおよびテネイシンからなる群から選択される、請求項１３に記載の二重特異性抗体。
【請求項15】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体またはポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項16】
請求項１５に記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。
【請求項17】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体またはポリペプチドと薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項18】
それを必要とする患者におけるがんを処置する方法であって、請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体またはポリペプチドの有効量を前記患者に投与するステップを含む方法。
【請求項19】
がんを処置するための医薬の調製のための、請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体またはポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
背景
ナノボディとしても公知の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。ラクダ科動物およびある特定の他の動物から産生されたナノボディは、ＶＨＨ断片とも呼ばれる。全抗体と同様に、ナノボディは、特定の抗原に選択的に結合することができる。分子量がわずか１２～１５ｋＤａである、単一ドメイン抗体は、一般的な抗体（１５０～１６０ｋＤａ）よりはるかに小さい。単一ドメイン抗体は、それらの小さいサイズおよび一本鎖の性質を考えると、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および二重特異性抗体などの他のタンパク質に断片として含めるのに特に好適であり得る。
ナノボディとしても公知の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。ラクダ科動物およびある特定の他の動物から産生されたナノボディは、ＶＨＨ断片とも呼ばれる。全抗体と同様に、ナノボディは、特定の抗原に選択的に結合することができる。分子量がわずか１２～１５ｋＤａである、単一ドメイン抗体は、一般的な抗体（１５０～１６０ｋＤａ）よりはるかに小さい。単一ドメイン抗体は、それらの小さいサイズおよび一本鎖の性質を考えると、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および二重特異性抗体などの他のタンパク質に断片として含めるのに特に好適であり得る。
【0002】
４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー９）は、ＴＮＦ－受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーであり、自然免疫細胞と適応免疫細胞の両方である免疫細胞の活性化後に発現される共刺激分子である。４－１ＢＢは、様々な免疫細胞の活性を調節する上で重要な役割を果たす。４－１ＢＢアゴニストは、免疫細胞増殖、生存、サイトカインの分泌、および細胞溶解活性ＣＤ８ Ｔ細胞を増強する。多くの他の研究により、４－１ＢＢの活性化はマウスにおいて免疫応答を増強して腫瘍を消失させることが示された。したがって、４－１ＢＢは、がん免疫学において有望な標的分子であることが示唆された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0003】
要旨
ヒト４－１ＢＢタンパク質に特異的なナノボディ、およびそのようなナノボディが組み込まれている二重または多重特異的抗体が、提供される。一部の実施形態では、本開示のナノボディは、独力では４－１ＢＢシグナル伝達を活性化しない、「非アゴニスト」である。しかし、抗クローディン１８．２抗体と組み合わせた場合、その後の二重特異性抗体は、クローディン１８．２陽性細胞の存在下で４－１ＢＢシグナル伝達を活性化する点で強力な活性を有する。
ヒト４－１ＢＢタンパク質に特異的なナノボディ、およびそのようなナノボディが組み込まれている二重または多重特異的抗体が、提供される。一部の実施形態では、本開示のナノボディは、独力では４－１ＢＢシグナル伝達を活性化しない、「非アゴニスト」である。しかし、抗クローディン１８．２抗体と組み合わせた場合、その後の二重特異性抗体は、クローディン１８．２陽性細胞の存在下で４－１ＢＢシグナル伝達を活性化する点で強力な活性を有する。
【0004】
４－１ＢＢシグナル伝達活性化は、アゴニスト抗体、例えば、ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）およびウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）について予想される機構である。しかし、本明細書で開示される抗４－１ＢＢナノボディは、そのような活性を必要としない。実際には、二重特異性抗体の抗４－１ＢＢ部分は、その二重特異性抗体が同じく標的とする腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）への結合の非存在下では４－１ＢＢを独立して活性化することができないことが好ましく、そのような場合、そのような二重特異性抗体は、オフ腫瘍副作用が低減していることになる。
【0005】
用量制限オンターゲット毒性を一般に伴う公知の抗４－１ＢＢアゴニスト抗体と比較して、本開示の抗体は、はるかに安全である。対応するＴＡＡが発現されない組織、例えば、肝臓では、本開示の二重特異性抗体は、４－１ＢＢシグナル伝達を活性化することができないので、細胞傷害性免疫応答を誘発すると予想されない。ＴＡＡが発現されるおよび／または入手可能である腫瘍組織では、対照的に、これらの二重特異性抗体は、腫瘍細胞への強力な免疫応答を開始することができる。したがって、オンターゲット／固有の毒性を被る現在臨床開発中の抗４－１ＢＢ抗体とは異なり、本開示の抗体は、がんを処置する上で同時に強力かつ安全であり得る。
【0006】
したがって、本開示の一実施形態では、ヒト４－１ＢＢタンパク質に対して結合特異性を有し、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１が、配列番号６のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２が、配列番号７、３９または４０のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３が、配列番号８のアミノ酸配列を含む、単一ドメイン抗体またはその単一ドメイン抗体を含むポリペプチドが、提供される。
【0007】
別の実施形態では、ヒト４－１ＢＢタンパク質に対して結合特異性を有し、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１が、配列番号９のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２が、配列番号１０、４１または４２のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３が、配列番号１１のアミノ酸配列を含む、単一ドメイン抗体またはその単一ドメイン抗体を含むポリペプチドが、提供される。
【0008】
別の実施形態では、ヒト４－１ＢＢタンパク質に対して結合特異性を有し、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１が、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２が、配列番号１３、４３または４４のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３が、配列番号１４のアミノ酸配列を含む、単一ドメイン抗体またはその単一ドメイン抗体を含むポリペプチドが、提供される。
【0009】
別の実施形態では、ヒト４－１ＢＢタンパク質に対して結合特異性を有し、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号１５～１７のアミノ酸配列を含む、単一ドメイン抗体またはその単一ドメイン抗体を含むポリペプチドが、提供される。
【0010】
別の実施形態では、ヒト４－１ＢＢタンパク質に対して結合特異性を有し、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号１８～２０のアミノ酸配列を含む、単一ドメイン抗体またはその単一ドメイン抗体を含むポリペプチドが、提供される。
【0011】
別の実施形態では、ヒト４－１ＢＢタンパク質に対して結合特異性を有し、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号１～５のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、単一ドメイン抗体またはその単一ドメイン抗体を含むポリペプチドが、提供される。
【0012】
ナノボディの１つまたは複数のユニットが組み込まれている二重特異性／多重特異性抗体も、提供される。一部の実施形態では、第２の特異性は、クローディン１８．２などの腫瘍抗原に対するものである。腫瘍抗原の他の例も、本明細書で開示される。一部の実施形態では、本開示のナノボディを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、提供される。
【0013】
抗体またはポリペプチドと薬学的に許容される担体とを含む組成物も提供される。さらに、抗体またはポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド、抗体またはその断片をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む単離された細胞も、提供される。
【0014】
処置方法および使用も提供される。一実施形態では、それを必要とする患者におけるがんを処置する方法であって、本開示の抗体またはポリペプチドの有効量を患者に投与するステップを含む方法が、提供される。一部の実施形態では、がんは、固形腫瘍である。一部の実施形態では、がんは、膀胱がん、肝臓がん、結腸がん、直腸がん、子宮内膜がん、白血病、リンパ腫、膵臓がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、乳がん、尿道がん、頭頸部がん、消化管がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、腎がん、黒色腫、前立腺がんおよび甲状腺がんからなる群から選択される。一部の実施形態では、方法は、第２のがん治療剤を患者に投与するステップをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【0016】
【0017】
【0018】
【0019】
【0020】
【0021】
【0022】
【0023】
【0024】
【発明を実施するための形態】
【0025】
詳細な説明
定義
用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」実体は、その実体の１つまたは複数を指し、例えば、「１つの抗体（ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、１つまたは複数の抗体を表すと理解されることに留意されたい。したがって、用語「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１つまたは複数（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」および「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」は、本明細書では同義で使用され得る。
定義
用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」実体は、その実体の１つまたは複数を指し、例えば、「１つの抗体（ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、１つまたは複数の抗体を表すと理解されることに留意されたい。したがって、用語「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１つまたは複数（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」および「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」は、本明細書では同義で使用され得る。
【0026】
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）が別の配列に対してある特定のパーセンテージ（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％）の「配列同一性」を有するとは、アラインメントされたとき、塩基（またはアミノ酸）のそのパーセンテージが、２つの配列を比較した際に同じであるという意味である。このアラインメント、および相同性または配列同一性パーセントは、当技術分野において公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biologyに記載されているものを使用して、決定され得る。好ましくは、デフォルトパラメーターがアラインメントに使用される。１つのアラインメントプログラムは、デフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴである。特に、プログラムは、次のデフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；表示＝５０配列；ソート順：ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。生物学的に等価のポリヌクレオチドは、上述の特定相同パーセントを有するものであって、同じまたは同様の生物活性を有するポリペプチドをコードするものである。
【0027】
用語「等価の核酸またはポリヌクレオチド」は、核酸のヌクレオチド配列またはその相補配列とある程度の相同性または配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を指す。二本鎖核酸のホモログは、二本鎖核酸またはその相補配列とある程度の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を含むように意図されている。一態様では、核酸のホモログは、核酸またはその相補配列とハイブリダイズすることができる。同様に、「等価のポリペプチド」は、参照ポリペプチドのアミノ酸配列と、ある程度の相同性または配列同一性を有する、ポリペプチドを指す。一部の態様では、配列同一性は、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％である。一部の態様では、等価のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと比較して１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの付加、欠失、置換およびこれらの組合せを有する。一部の態様では、等価の配列は、参照配列の活性（例えば、エピトープ結合）または構造（例えば、塩架橋）を保持する。
【0028】
本明細書で使用される場合、「抗体」または「抗原結合性断片」は、抗原を特異的に認識し、それに結合する、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体を指す。抗体は、全抗体およびその任意の抗原結合性断片または一本鎖であり得る。したがって、用語「抗体」は、抗原に結合する生物活性を有する免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含む分子を含有する、任意のタンパク質またはペプチドを含む。そのようなものの例としては、重鎖もしくは軽鎖またはそのリガンド結合部分の相補性決定領域（ＣＤＲ）、重鎖または軽鎖可変領域、重鎖または軽鎖定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域、あるいはその任意の部分、あるいは結合タンパク質の少なくとも一部分が挙げられるが、これらに限定されない。
【0029】
用語「抗体断片」または「抗原結合性断片」は、本明細書で使用される場合、抗体の一部分、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどである。構造に関係なく、抗体断片は、無傷抗体により認識される同じ抗原と結合する。用語「抗体断片」は、アプタマー、スピーゲルマー、およびダイアボディを含む。用語「抗体断片」は、特定の抗原に結合して複合体を形成することにより抗体のように動作する、任意の合成のまたは遺伝子操作されたタンパク質も含む。
【0030】
「一本鎖可変断片」または「ｓｃＦｖ」は、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）の可変領域と軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質を指す。一部の態様では、領域は、１０～約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドによって結合されている。リンカーは、可動性のためにグリシンはもちろん可溶性のためにセリンまたはトレオニンも多く含むことができ、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と結合すること、またはその逆、どちらかができる。このタンパク質は、定常領域の除去およびリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。ｓｃＦｖ分子は、当技術分野において公知であり、例えば米国特許第５，８９２，０１９号に、記載されている。
【0031】
抗体という用語は、生化学的に区別され得るポリペプチドの様々な広範なクラスを包含する。重鎖が、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として、一部はこれらの中のサブクラス（例えば、γ１～γ４）として、分類されることは、当業者には理解されるであろう。それは、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧまたはＩｇＥのような抗体の「クラス」を決定するこの鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５などは、十分に特徴付けられており、機能の特化をもたらすことが公知である。これらのクラスおよびアイソタイプの各々についての改変バージョンは、本開示に鑑みて当業者には容易に識別可能であり、したがって、本開示の範囲内である。全ての免疫グロブリンクラスは、明らかに本開示の範囲内であり、以下の論述は、一般に、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに関することになる。ＩｇＧに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量おおよそ２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖ポリペプチド、および分子量５３，０００～７０，０００の２つの同一の重鎖ポリペプチドを含む。４本の鎖は、典型的に、ジスルフィド結合により「Ｙ」形状に連結されており、軽鎖が、「Ｙ」の口で始まって可変領域まで続いて重鎖を両側から挟んでいる。
【0032】
本開示の抗体、その抗原結合ポリペプチド、バリアントまたは誘導体は、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、ヒト、ヒト化、霊長類化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ結合性断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＫまたはＶＨドメインを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより生成される断片、ならびに抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書で開示されるＬＩＧＨＴ抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）を含むが、これらに限定されない。本開示の免疫グロブリンまたは抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであり得る。
【0033】
「特異的に結合する」または「に対して特異性を有する」とは、一般に、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、および結合が抗原結合ドメインとエピトープ間のある程度の相補性を必要とすることを意味する。この定義によれば、抗体は、エピトープに、それがそのエピトープに、それがランダムな無関係のエピトープに結合するよりも容易に、その抗原結合ドメインを介して結合する場合、「特異的に結合する」と言われる。用語「特異性」は、ある特定の抗体がある特定のエピトープに結合する相対的親和性を認定するために本明細書では使用される。例えば、抗体「Ａ」は、抗体「Ｂ」よりも所与のエピトープに対して高い特異性を有すると見なされることがあり、または抗体「Ａ」は、それが関連エピトープ「Ｄ」に対して有するよりも高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言われることがある。
【0034】
本明細書で使用される場合、用語「処置する」または「処置」は、治療的処置も、目的が、望ましくない生理的変化または障害、例えばがんの進行、を予防するまたは減速させる（減らす）ことである、予防的対策または予防対策も、指す。有益なまたは所望の臨床結果としては、検出可能であるか検出不能であるかを問わず、症候の緩和、疾患の程度の低下、疾患の安定化した（すなわち、悪化しない）状態、疾患進行の遅延または緩徐化、病状の改善または軽減、および寛解（部分寛解であるか完全寛解あるかを問わず）が挙げられるが、これらに限定されない。「処置」は、処置を受けなかった場合の予想生存期間と比較して生存期間を延長することも意味し得る。処置を必要とする者は、状態または障害に既に罹患している者はもちろん、状態もしくは障害に罹患しやすい者、または状態もしくは障害を予防すべき者を含む。
【0035】
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」とは、診断、予後判定または治療が望まれる任意の対象、特に、哺乳動物対象を意味する。哺乳類の対象としては、ヒト、飼育動物、家畜、動物園、競技またはペット動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、雌ウシなどが挙げられる。
【0036】
本明細書で使用される場合、「処置を必要とする患者に」または「処置を必要とする対象」などの句は、例えば、検出に、診断手順に、および／または処置に、使用される本開示の抗体または組成物の投与の恩恵を受けることになる対象、例えば、哺乳類の対象を含む。
単一ドメイン抗４－１ＢＢ抗体
単一ドメイン抗４－１ＢＢ抗体
【0037】
本開示は、ヒト４－１ＢＢタンパク質に対して高い親和性を有する一本鎖抗４－１ＢＢ抗体を提供する。一部の実施形態では、提供されるナノボディは、そのような結合だけによって４－１ＢＢシグナル伝達を活性化することができず、それ故、「非アゴニスト」抗４－１ＢＢ抗体と呼ばれる。このような非アゴニスト抗４－１ＢＢナノボディは、二重特異性抗体を調製するのに特に好適である。
【0038】
４－１ＢＢシグナル伝達活性化は、アゴニスト抗体、例えば、ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）およびウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）について予想される機構である。しかし、本明細書で開示される抗４－１ＢＢナノボディは、そのような活性を有する必要がない。実際には、二重特異性抗体の抗４－１ＢＢ部分は、ＣＬＤＮ１８．２結合の非存在下では４－１ＢＢを独立して活性化することができないことが好ましく、そのような場合、そのような二重特異性抗体は、オフターゲット副作用が低減していることになる。
【0039】
用量制限オンターゲット毒性を一般に伴う公知の抗４－１ＢＢアゴニスト抗体、例えば、ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）およびウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）と比較して、本開示の二重特異性抗体は、はるかに安全である。ＣＬＤＮ１８．２が発現されない組織では、本開示の二重特異性抗体は、４－１ＢＢシグナル伝達を活性化することができないので、細胞傷害性免疫応答を誘発すると予想されない。ＣＬＤＮ１８．２が発現されるおよび／または入手可能である腫瘍組織では、対照的に、これらの二重特異性抗体は、腫瘍細胞への強力な免疫応答を開始することができる。したがって、オンターゲット／固有の毒性を被る現在臨床開発中の抗４－１ＢＢ抗体とは異なり、本開示の抗体は、がんを処置する上で同時に強力かつ安全であり得る。
【0040】
したがって、本開示の一実施形態では、単一ドメイン抗体、およびそのような単一ドメイン抗体を含むポリペプチドが、提供される。本開示の一実施形態では、抗体Ｂ３１（配列番号１）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む単一ドメイン抗体、またはその単一ドメイン抗体を含むポリペプチドが、提供される。一部の実施形態では、ＣＤＲ１は、配列番号６のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号７、３９または４０のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号６～８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号６、３９および８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号６、４０および８のアミノ酸配列を含む。
【0041】
ヒト化抗体、例えば、抗体Ｂ３１について配列番号２１～２５で提供されるものも、提供される。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、Ｋａｂａｔ番号付けに準拠して、２３Ａ、３７Ｙ、４０Ｐ、４１Ｑ、４４Ｑ、４５Ｒ、４９Ａ、７４Ｎ、７８Ｍ、８２（８２Ａ）Ｄ、および９４Ａからなる群から選択される復帰変異を含む。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、復帰変異３７Ｙ、４４Ｑ、４５Ｒおよび９４Ａを含む。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、復帰変異２３Ａ、３７Ｙ、４４Ｑ、４５Ｒ、４９Ａ、７４Ｎおよび９４Ａを含む。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、復帰変異２３Ａ、３７Ｙ、４４Ｑ、４５Ｒ、４９Ａ、７８Ｍ、８２（８２Ａ）Ｄ、および９４Ａを含む。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、復帰変異２３Ａ、３７Ｙ、４０Ｐ、４１Ｑ、４４Ｑ、４５Ｒ、４９Ａ、７４Ｎ、８２（８２Ａ）Ｄ、および９４Ａを含む。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、復帰変異３７Ｙ、４４Ｑ、４５Ｒおよび４９Ａを含む。
【0042】
一部の実施形態では、抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号２１のヒト化配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号２２のヒト化配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号２３のヒト化配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号２４のヒト化配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号２５のヒト化配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、述べられたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、配列番号１および２１～２５のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
【0043】
別の実施形態では、抗体Ｂ１６（配列番号２）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む単一ドメイン抗体、またはその単一ドメイン抗体を含むポリペプチドが、提供される。一部の実施形態では、ＣＤＲ１は、配列番号９のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号１０、４１または４２のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号９～１１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号９、４１および１１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号９、４２および１１のアミノ酸配列を含む。
【0044】
ヒト化抗体、例えば、抗体Ｂ１６について配列番号３１～３４で提供されるものも、提供される。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、Ｋａｂａｔ番号付けに準拠して、２９Ｌ、３０Ｄ、３７Ｆ、４４Ｅ、４５Ｒ、４７Ｇ、７４Ａ、８４Ｐおよび９４Ｔからなる群から選択される復帰変異を含む。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、Ｋａｂａｔ番号付けに準拠して、３７Ｆ、４４Ｅ、４５Ｒ、４７Ｇおよび９４Ｔからなる群から選択される復帰変異を含む。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、Ｋａｂａｔ番号付けに準拠して、２９Ｌ、３０Ｄ、３７Ｆ、４４Ｅ、４５Ｒ、４７Ｇおよび９４Ｔからなる群から選択される復帰変異を含む。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、Ｋａｂａｔ番号付けに準拠して、２９Ｌ、３０Ｄ、３７Ｆ、４４Ｅ、４５Ｒ、４７Ｇ、７４Ａ、８４Ｐおよび９４Ｔからなる群から選択される復帰変異を含む。
【0045】
一部の実施形態では、抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号３１のヒト化配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号３２のヒト化配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号３３のヒト化配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号３４のヒト化配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、述べられたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、配列番号２および３１～３４のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
【0046】
別の実施形態では、抗体Ｂ１２５（配列番号３）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む単一ドメイン抗体、またはその単一ドメイン抗体を含むポリペプチドが、提供される。一部の実施形態では、ＣＤＲ１は、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号１３、４３または４４のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１２～１４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１２、４３および１４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１２、４４および１４のアミノ酸配列を含む。
【0047】
ヒト化抗体、例えば、抗体Ｂ１２５について配列番号２６～３０で提供されるものも、提供される。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、Ｋａｂａｔ番号付けに準拠して、３７Ｆ、４３Ｋ、４４Ｅ、４５Ｒ、４７Ｇ、７４Ａ、８４Ｐおよび９４Ｔからなる群から選択される復帰変異を含む。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、Ｋａｂａｔ番号付けに準拠して、３７Ｆ、４４Ｅ、４５Ｒ、４７Ｇおよび９４Ｔからなる群から選択される復帰変異を含む。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、Ｋａｂａｔ番号付けに準拠して、３７Ｆ、４３Ｋ、４４Ｅ、４５Ｒ、４７Ｇおよび７４Ａからなる群から選択される復帰変異を含む。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、Ｋａｂａｔ番号付けに準拠して、３７Ｆ、４３Ｋ、４４Ｅ、４５Ｒ、４７Ｇ、７４Ａおよび９４Ｔからなる群から選択される復帰変異を含む。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、Ｋａｂａｔ番号付けに準拠して、３７Ｆ、４３Ｋ、４４Ｅ、４５Ｒ、４７Ｇ、７４Ａ、８４Ｐおよび９４Ｔからなる群から選択される復帰変異を含む。
【0048】
一部の実施形態では、抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号２６のヒト化配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号２７のヒト化配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号２８のヒト化配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号２９のヒト化配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号３０のヒト化配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、述べられたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、配列番号３および２６～３０のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
【0049】
別の実施形態では、抗体Ｂ１６４（配列番号４）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む単一ドメイン抗体、またはその単一ドメイン抗体を含むポリペプチドが、提供される。一部の実施形態では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１５～１７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、述べられたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
【0050】
別の実施形態では、抗体Ｂ２１０（配列番号５）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む単一ドメイン抗体、またはその単一ドメイン抗体を含むポリペプチドが、提供される。一部の実施形態では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１８～２０のアミノ酸配列を含む。
【0051】
ヒト化抗体、例えば、抗体Ｂ２１０について配列番号２６～３０で提供されるものも、提供される。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、Ｋａｂａｔ番号付けに準拠して、２７Ｌ、２９Ｌ、３７Ｆ、４４Ｅ、４５Ｒ、４７Ｇ、８９Ｄおよび９４Ｔからなる群から選択される復帰変異を含む。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、Ｋａｂａｔ番号付けに準拠して、３７Ｆ、４４Ｅ、４５Ｒ、４７Ｇおよび９４Ｔからなる群から選択される復帰変異を含む。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、Ｋａｂａｔ番号付けに準拠して、２７Ｌ、３７Ｆ、４４Ｅ、４５Ｒ、４７Ｇおよび９４Ｔからなる群から選択される復帰変異を含む。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、Ｋａｂａｔ番号付けに準拠して、２７Ｌ、２９Ｌ、３７Ｆ、４４Ｅ、４５Ｒ、４７Ｇ、８９Ｄおよび９４Ｔからなる群から選択される復帰変異を含む。
【0052】
一部の実施形態では、抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号３５のヒト化配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号３６のヒト化配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号３７のヒト化配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号３８のヒト化配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、述べられたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、配列番号５および３５～３８のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
【0053】
一部の実施形態では、ヒト４－１ＢＢへの結合において本明細書で開示される抗体のいずれかと競合する、抗４－１ＢＢ抗体および抗原結合性断片も、提供される。一部の実施形態では、本明細書で開示される抗体のいずれかと同じエピトープに結合する、抗４－１ＢＢ抗体および抗原結合性断片も、提供される。一部の実施形態では、本明細書で開示される抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含んだ、抗４－１ＢＢ抗体および抗原結合性断片も、提供される。
【0054】
抗体またはポリペプチドと薬学的に許容される担体とを含む組成物も提供される。
【0055】
本明細書で開示される抗体を、それらが由来した天然に存在する結合ポリペプチドとはアミノ酸配列の点で異なるように、改変することができることも、当業者には理解されるであろう。例えば、指定タンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、出発配列と同様であり得、例えば、出発配列に対してある特定の同一性パーセントを有し得、例えば、それは、出発配列と６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であり得る。一部の実施形態では、改変抗体または断片は、指定されたＣＤＲ配列を保持する。
【0056】
ある特定の実施形態では、抗体は、抗体に通常は付随しないアミノ酸配列または１つもしくは複数の部分を含む。例示的な改変は、下でより詳細に説明される。例えば、本開示の抗体は、可動性リンカー配列を含むことがあり、または機能的部分（例えば、ＰＥＧ、薬物、毒素、もしくは標識）を付加するように改変されていることがある。
【0057】
本明細書で開示される単一ドメイン抗４－１ＢＢ抗体の１つ、２つ、３つまたは４つのユニットと１つまたは複数の他の特異性（４－１ＢＢではない）とを含む二重特異性および多重特異性抗体も、提供される。
二重特異性および多重特異性抗体、ならびにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
二重特異性および多重特異性抗体、ならびにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
【0058】
提供されるような、ここで開示される抗４－１ＢＢ抗体は、二重特異性および多重特異性抗体、ならびにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を調製するのに特に有用である。これは、少なくとも、これらの抗体の向上した治療指数およびそれらの小さいサイズのためである。
【0059】
したがって、一実施形態では、本開示の抗４－１ＢＢナノボディ、またはその抗原結合性断片と、４－１ＢＢではない標的抗原に対して結合特異性を有する二次抗体または抗原結合性断片とを含む、二重特異性抗体が、提供される。一部の実施形態では、第３および第４の特異性が、さらに含まれる。
【0060】
一部の実施形態では、４－１ＢＢではない標的抗原は、腫瘍抗原である。多数の腫瘍抗原が当技術分野において公知であり、新たな腫瘍抗原は、スクリーニングによって容易に同定され得る。腫瘍抗原の非限定的な例としては、ＡＢＬ、ＡＬＫ、Ｂ４ＧＡＬＮＴ１、ＢＡＦＦ、ＢＣＬ２、ＢＲＡＦ、ＢＴＫ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＣＤ７３、クローディン１８．２、ＣＴＬＡ－４、ＥＧＦＲ、ＦＯＬＲ１、ＦＬＴ３、ＨＤＡＣ、ＨＥＲ２、ＩＤＨ２、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ、ＪＡＫ１／２、ＪＡＫ３、ＫＩＴ、ＬＡＧ－３、ＭＥＫ、ネクチン４、ＲＯＲ１、ｍＴＯＲ、ＰＡＲＰ、ＰＤ－１、ＰＤＧＦＲ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤ－Ｌ１、ＰＩ３Ｋδ、ＰＩＧＦ、ＰＴＣＨ、ＲＡＦ、ＲＡＮＫＬ、スムーズンド、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、およびＶＥＧＦＲ２が挙げられる。他の例は、Ｈｅｒ２、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＤ１３３、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ－７２、ＣＩＸ、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、インテグリン、αＶβ３、α５β１、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰおよびテネイシンである。
【0061】
一部の実施形態では、二重特異性抗体は、４－１ＢＢおよびクローディン１８．２に対して特異性を有する。
【0062】
本開示のナノボディを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も提供される。ＣＡＲにおいて、ナノボディは、抗原認識ドメインとしての役割を果たし得る。加えて、一部の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインも含む。
【0063】
スペーサーとも呼ばれるヒンジは、抗原認識領域と細胞の外膜の間にある小さい構造ドメインである。好適なヒンジは、ｓｃＦｖ受容体頭部の可動性を向上させ、ひいてはＣＡＲとその標的抗原の間の空間制約を低減させる。ヒンジ配列の例は、ＩｇＧ、ＣＤ８およびＣＤ２８などの、免疫分子からの膜近傍領域に基づく。
【0064】
膜貫通ドメインは、細胞膜を貫通する疎水性アルファヘリックスからなる構造成分である。それは、ＣＡＲを原形質膜に繋留し、ひいては細胞外ヒンジおよび抗原認識領域と細胞内シグナル伝達領域の橋渡しをする。典型的には、エンドドメインの膜近傍成分からの膜貫通ドメイン、例えば、ＣＤ２８膜貫通ドメインが、使用され得る。
【0065】
細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、細胞内の、受容体のエンドドメインに存する。抗原が外側の抗原認識ドメインに結合されると、ＣＡＲ受容体は、互いにクラスターを形成し、活性化シグナルを伝達する。その結果、受容体の内側の細胞質側末端がＴ細胞内へのシグナル伝達を永続させる。このプロセスを模倣するために、ＣＤ３－ゼータの細胞質ドメインが、一般に、主ＣＡＲエンドドメイン成分として使用される。
【0066】
Ｔ細胞は、活性化後に存続するためにＣＤ３シグナル伝達に加えて共刺激分子も必要とする。一部の実施形態では、ＣＡＲ受容体のエンドドメインは、共刺激タンパク質、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、およびＣＤ１３７（４－１ＢＢ）からの、１つまたは複数のキメラドメインも含む。
抗体をコードするポリヌクレオチドおよび抗体を調製する方法
抗体をコードするポリヌクレオチドおよび抗体を調製する方法
【0067】
本開示は、本開示の抗体、そのバリアントまたは誘導体をコードする、単離されたポリヌクレオチドまたは核酸分子も提供する。本開示のポリヌクレオチドは、抗原結合ポリペプチド、そのバリアントまたは誘導体の重鎖および軽鎖可変領域全体を同じポリヌクレオチド分子上にまたは別々のポリヌクレオチド分子上にコードし得る。加えて、本開示のポリヌクレオチドは、抗原結合ポリペプチド、そのバリアントまたは誘導体の重鎖および軽鎖可変領域の部分を同じポリヌクレオチド分子上にまたは別々のポリヌクレオチド分子上にコードし得る。
【0068】
抗体を作製する方法は、当技術分野において周知であり、本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合ポリペプチドの可変領域と定常領域の両方が、完全にヒトのものである。完全ヒト抗体は、当技術分野において記載されている技法を使用して、および本明細書に記載されているように作製することができる。例えば、特定の抗原に対する完全ヒト抗体を、抗原投与に応答してそのような抗体を産生するように改変されているが内在性遺伝子座が無効にされているトランスジェニック動物に抗原を投与することによって、調製することができる。そのような抗体を作製するために使用され得る例示的な技法は、米国特許第６，１５０，５８４号、同第６，４５８，５９２号、同第６，４２０，１４０号に記載されており、これらの参考特許文献は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
がん処置
がん処置
【0069】
本明細書に記載されるように、本開示の抗体、二重特異性抗体、ポリペプチド、バリアントまたは誘導体を、ある特定の処置および診断方法において使用することができる。
【0070】
本開示は、本開示の抗体を患者、例えば、動物、哺乳動物およびヒトに投与して、本明細書に記載される障害または状態の１つまたは複数を処置することを含む、抗体に基づく治療に、さらに関する。本開示の治療化合物は、本開示の抗体（本明細書に記載のそのバリアントおよび誘導体を含む）、および本開示の抗体（本明細書に記載のそのバリアントおよび誘導体を含む）をコードする核酸またはポリヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。
【0071】
一部の実施形態では、それを必要とする患者におけるがんを処置するための方法が提供される。方法は、一実施形態では、本開示の抗体の有効量を患者に投与するするステップを必然的に伴う。一部の実施形態では、患者におけるがん細胞（例えば、間質細胞）の少なくとも１つは、クローディン１８．２などの腫瘍抗原を過剰発現する。
【0072】
細胞療法、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞またはＮＫ細胞療法も、本開示で提供される。本開示の抗体またはＣＡＲと接触させられる（または代替的に、本開示の抗体もしくはＣＡＲを発現するように操作された）好適な細胞を、使用することができる。したがって、そのような接触または操作によって、細胞を、処置を必要とするがん患者に導入することができる。がん患者は、本明細書で開示されるようなタイプのいずれかのがんを有し得る。細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）は、例えば、腫瘍浸潤Ｔリンパ球、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはこれらの組合せであり得るが、それらに限定されない。
【0073】
一部の実施形態では、細胞は、がん患者彼または彼女自身から単離された。一部の実施形態では、細胞は、ドナーによりまたは細胞バンクから提供された。細胞が、がん患者から単離された場合、望ましくない免疫反応を最小限に抑えることができる。
【0074】
本開示の抗体もしくはバリアント、またはそれらの誘導体によって処置、予防、診断および／または予後判定され得る、細胞生存期間の増加に関連するさらなる疾患または状態としては、悪性病変および関連障害、例えば、白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、および赤白血病を含む））および慢性白血病（例えば、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病）を含む）、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、重鎖病、および固形腫瘍の、進行および／または転移が挙げられるがこれらに限定されず、固形腫瘍には、肉腫および癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓がん、乳がん、甲状腺がん、子宮内膜がん、黒色腫、前立腺がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞種、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫（menangioma）、黒色腫、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫が含まれるが、これらに限定されない。
診断方法
診断方法
【0075】
４－１ＢＢの過剰発現は、ある特定の腫瘍試料に見られ、４－１ＢＢ過剰発現細胞を有する患者は、本開示の抗４－１ＢＢ抗体での処置に応答する可能性が高い。したがって、本開示の抗体を、診断および予後判定を目的として使用することもできる。
【0076】
細胞を好ましくは含む試料を、がん患者または診断を望む患者であり得る患者から、得ることができる。細胞は、腫瘍組織もしくは腫瘍ブロック、血液試料、尿試料または患者からの任意の試料の細胞であり得る。試料を最適に前処理したら、試料を、本開示の抗体とともに、抗体が、試料に存在する可能性のある４－１ＢＢタンパク質と相互作用することを可能にする条件下で、インキュベートすることができる。ＥＬＩＳＡなどの方法を使用して、抗４－１ＢＢ抗体をうまく利用することにより、試料中の４－１ＢＢタンパク質の存在を検出することができる。
【0077】
試料中の４－１ＢＢタンパク質の存在を（必要に応じて、量または濃度とともに）、患者が抗体による処置に好適であることの指標として、または患者ががん処置に応答している（していない）ことの指標として、がんの診断に使用することができる。予後判定の方法については、がん処置を開始したら、ある特定のステージで、１回、２回またはそれより多くの回数、検出を行って、処置の進行を示すことができる。
組成物
組成物
【0078】
本開示は、医薬組成物も提供する。そのような組成物は、抗体の有効量と許容可能な担体とを含む。一部の実施形態では、組成物は、第２の抗がん剤（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）をさらに含む。
【0079】
具体的な実施形態では、用語「薬学的に許容される」とは、動物における、さらに特にヒトにおける使用について、連邦もしくは州政府の監督機関により承認された、または米国薬局方もしくは他の一般に認知されている薬局方に収載されている、という意味である。さらに、「薬学的に許容される担体」は、一般に、任意のタイプの、非毒性固体、半固体もしくは液体フィラー、希釈剤、カプセル化材または製剤助剤であろう。
【0080】
用語「担体」は、それを用いて治療薬が投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような医薬担体は、滅菌液、例えば、水および油であり得、この油には、石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などが含まれる。水は、医薬組成物が静脈内投与されるときに好ましい担体である。生理食塩水、ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液も、液体担体として、特に、注射可能溶液に、利用することができる。好適な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は、所望される場合には、少量の湿潤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩もしくはリン酸塩も含有し得る。抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸；および浸透張力の調整のための薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースも、想定される。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、粉末、徐放性製剤などの形態をとり得る。旧来の結合剤および担体、例えば、トリグリセリドを用いて、組成物を坐薬として製剤化することができる。経口製剤は、標準的な担体、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含み得る。好適な医薬品担体の例は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるRemington’s Pharmaceutical Sciencesに記載されている。そのような組成物は、好ましくは精製された形態での、抗原結合ポリペプチドの治療有効量を、患者への適正投与のための形態を提供するために好適な量の担体とともに、含有することになる。製剤は、投与方法に適していなければならない。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または複数回投与用バイアルに封入され得る。
【0081】
ある実施形態では、組成物は、人間への静脈内投与に適応する医薬組成物として常套的手順に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与用の組成物は、滅菌等張性水性緩衝液中の溶液である。必要に応じ、組成物は、可溶化剤、および注射部位の痛みを和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔薬も含み得る。一般に、これらの成分は、別々にまたは混合されて単位剤形で、のどちらかで、例えば、活性薬剤の量を示すアンプルまたはサッシェなどの密閉シールされている容器の中の乾いた凍結粉末または無水濃縮物として供給される。組成物を注入により投与すべき場合、それは、医薬品グレードの滅菌水または食塩水が入っている注入ボトルを用いて分注され得る。組成物が注射により投与される場合、投与の前に成分を混合することができるように、注射用滅菌水または食塩水のアンプルが提供され得る。
【実施例】
【0082】
（実施例１）
ヒト４－１ＢＢに対するＶＨＨ抗体の生成
この実施例は、ヒト４－１ＢＢタンパク質に対する単一ドメイン（ＶＨＨ）抗体の生成を説明する。
ヒト４－１ＢＢに対するＶＨＨ抗体の生成
この実施例は、ヒト４－１ＢＢタンパク質に対する単一ドメイン（ＶＨＨ）抗体の生成を説明する。
【0083】
免疫化：ヒト４－１ＢＢに対するＶＨＨ抗体を生成するために、２頭のアルパカをヒト４－１ＢＢタンパク質によって免疫した。２ラウンドの免疫化後、免疫化アルパカの血清を、ＥＬＩＳＡによる抗体力価評価に付した。
【0084】
免疫化ライブラリー構築：ファージライブラリーを、４－１ＢＢ免疫化アルパカのＰＢＭＣから増幅したＶＨＨ遺伝子断片からなるファージミドベクターを使用して構築した。抗体形式は、ファージディスプレイライブラリーではＶＨＨ断片である。３つの免疫化ライブラリーを、異なるアルパカのＰＢＭＣから異なる免疫化ラウンドにおいて生成した。どのライブラリーサイズも１×１０９より大きく、配列多様性を以下のように解析した。各ライブラリーからピックアップし、さらにシークエンシングした、４８のクローンについて。配列は、これらの３つのライブラリーについてＣＤＲの十分な多様性を示した。
【0085】
ファージパニングおよびクローン選択：４－１ＢＢタンパク質をファージライブラリーパニングのための抗原として使用した。
【0086】
ヒト４－１ＢＢに対するファージライブラリー溶液パニングまたは固相パニング：結合したファージをＧｌｙ－Ｈｃｌによって溶離した。得られたファージが、アウトプット１である。結合したファージをＳＳ３２０細胞とともにインキュベートし、パニングスクリーニングの次のラウンドのために２ＹＴプレートに蒔いた。合計３ラウンドのパニングスクリーニングがあった。アウトプット１、アウトプット２およびアウトプット３のファージＥＬＩＳＡは、３ラウンドのスクリーニング後に濃縮された４－１ＢＢ結合因子を示した。
【0087】
アウトプット２およびアウトプット３ファージから単一のクローンをピックアップした。これらのクローンのファージを抗原結合ＥＬＩＳＡに付した。良好な結合作用強度を示したクローンを、後続のシークエンシングに選択した。
【0088】
５つの候補配列をｐｃＤＮＡ ３．４ベクターにクローニングし、２９３Ｆ細胞に発現させた。モノクローナル抗体をプロテインＧにより培養上清から精製した。精製された抗体を、４－１ＢＢ－Ｈｉｓタンパク質に対するＥＬＩＳＡ結合評価に付した。
【0089】
Ｂ３１、Ｂ１６、Ｂ１２５、Ｂ１６４、Ｂ２１０の単一可変ドメインのアミノ酸配列を下の表１に収載する。ＣＤＲ配列を表１Ａ～１Ｅに要約する。ＣＤＲ配列の一部は、翻訳後改変されやすい可能性があるＮＧおよびＤＧなどのジペプチドを含む。そのような翻訳後改変リスクを低下させるが抗体活性を保持すると考えられる、これらの配列のある特定の「リスク回避」バージョンも、表に提供する。
【表1】
【表1A】
【表1B】
【表1C】
【表1D】
【表1E】
【0090】
（実施例２）
４－１ＢＢ抗原に対する結合活性
この実施例は、４－１ＢＢタンパク質に対する抗体の結合活性を試験した。
２．１ ４－１ＢＢへのＥＬＩＳＡ結合
４－１ＢＢ抗原に対する結合活性
この実施例は、４－１ＢＢタンパク質に対する抗体の結合活性を試験した。
２．１ ４－１ＢＢへのＥＬＩＳＡ結合
【0091】
クローンＢ３１、Ｂ１６、Ｂ１２５、Ｂ１６４およびＢ２１０の結合活性を評価するために、これらのクローンからのキメラｍＡｂを、参照抗４－１ＢＢアゴニスト抗体であるウレルマブとともに、ＥＬＩＳＡ試験に付した。
【0092】
手短に述べると、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中の０．５μｇ／ｍｌのヒト４－１ＢＢ－Ｈｉｓタンパク質、１００μｌ／ウェルで、４℃で一晩、コーティングし、次いで、１５０μｌ／ウェルの１％ＢＳＡでブロックした。３μｇ／ｍｌで出発するＢ３１、Ｂ１６、Ｂ１２５、Ｂ１６４およびＢ２１０抗体の３倍希釈物を各ウェルに添加し、１時間、３７℃でインキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）で洗浄し、次いで、抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）（ヤギ）抗体・ペルオキシダーゼコンジュゲート型とともに、３０分間、３７℃でインキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で現像し、分光光度計によりＯＤ ４５０ｎｍで解析した。図１および表２に示すように、これら全てのクローンは、ヒト４－１ＢＢに高い親和性で結合した。
【0093】
マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中の０．５μｇ／ｍｌのカニクイザル４－１ＢＢ－Ｈｉｓタンパク質、１００μｌ／ウェルで、４℃で一晩、コーティングし、次いで、１５０μｌ／ウェルの１％ＢＳＡでブロックした。１５μｇ／ｍｌで出発するＢ３１、Ｂ１６、Ｂ１２５、Ｂ１６４およびＢ２１０抗体の３倍希釈物を各ウェルに添加し、１時間、３７℃でインキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次いで、抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）（ヤギ）抗体・ペルオキシダーゼコンジュゲート型とともに、３０分間、３７℃でインキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で現像し、分光光度計によりＯＤ ４５０ｎｍで解析した。図１および表２に示すように、これら全てのクローンは、カニクイザル４－１ＢＢに高い親和性で結合した。
【0094】
マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中の０．５μｇ／ｍｌのマウス４－１ＢＢ－Ｈｉｓタンパク質、１００μｌ／ウェルで、４℃で一晩、コーティングし、次いで、１５０μｌ／ウェルの１％ＢＳＡでブロックした。１５μｇ／ｍｌで出発するＢ３１、Ｂ１６、Ｂ１２５、Ｂ１６４およびＢ２１０抗体の３倍希釈物を各ウェルに添加し、１時間、３７℃でインキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次いで、抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）（ヤギ）抗体・ペルオキシダーゼコンジュゲート型とともに、３０分間、３７℃でインキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で現像し、分光光度計によりＯＤ ４５０ｎｍで解析した。図１および表２に示すように、Ｂ１６、Ｂ１２５、Ｂ２１０のみがマウス４－１ＢＢに結合した。
２．２ ４－１ＢＢへの細胞ベースの結合
【表2】
【0095】
４－１ＢＢ結合特性を評価するために、抗ＣＬＤＮ１８．２－４－１ＢＢ二重特異性抗体を、４－１ＢＢを発現したＨＥＫ２９３へのそれらの結合についてＦＡＣＳにより解析した。各ウェルにおいて合計数１×１０５のＨＥＫ２９３－４－１ＢＢ細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液中、１００ｎＭから出発して４倍段階希釈した抗体とともに３０分間、４℃でインキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液による洗浄後、ＰＥコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体を各ウェルに添加し、４℃で３０分間、インキュベートした。洗浄後、ＰＥのＭＦＩをＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １６により評価した。図２に示すように、試験した抗ＣＬＤＮ１８．２－４－１ＢＢ二重特異性抗体は、４－１ＢＢへの濃度依存性結合能力を示した。
２．３ ４－１ＢＢについてのタンパク質完全動力学
２．３ ４－１ＢＢについてのタンパク質完全動力学
【0096】
組換え４－１ＢＢタンパク質（ヒト４－１ＢＢ－ｈｉｓタグ）へのＢ３１、Ｂ１６、Ｂ１２５、Ｂ１６４およびＢ２１０抗体の結合を、捕捉法を使用してＢｉａｃｏｒｅで試験した。Ｂ３１、Ｂ１６、Ｂ１２５、Ｂ１６４およびＢ２１０ ｍＡｂを、プロテインＡチップを使用して捕捉した。ヒト４－１ＢＢ－ｈｉｓタグタンパク質の段階希釈物を、捕捉された抗体上に３０秒間、３０μｌ／分の流速で注入した。抗原を、３６０秒間、放置して解離させた。全ての実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で行った。データ解析は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して行った。結果を図３および下の表３に示す。
２．４ ＯＸ４０およびＣＤ４０との交差結合活性
【表3】
【0097】
クローンＢ３１、Ｂ１６、Ｂ１２５、Ｂ１６４およびＢ２１０とヒトＣＤ４０およびヒトＯＸ４０との交差結合活性を評価するために、これらのクローンからのキメラｍＡｂをＥＬＩＳＡ試験に付した。
【0098】
手短に述べると、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中の０．５μｇ／ｍｌのヒトＣＤ４０タンパク質またはヒトＯＸ４０タンパク質、１００μｌ／ウェルで、４℃で一晩、コーティングし、次いで、１５０μｌ／ウェルの１％ＢＳＡでブロックした。３μｇ／ｍｌで出発するＢ３１、Ｂ１６、Ｂ１２５、Ｂ１６４およびＢ２１０抗体の５倍希釈物を各ウェルに添加し、１時間、３７℃でインキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次いで、抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）（ヤギ）抗体・ペルオキシダーゼコンジュゲート型とともに、３０分間、３７℃でインキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で現像し、分光光度計によりＯＤ ４５０ｎｍで解析した。図４に示すように、これら全てのクローンは、ヒトＣＤ４０にもヒトＯＸ４０にも交差結合しない。
【0099】
（実施例３）
４－１ＢＢナノボディの機能活性
この実施例は、抗体の機能活性を試験したものであり、ウレルマブとは異なり、本抗体が４－１ＢＢシグナル伝達を活性化しなかったことを示す。
４－１ＢＢモノクローナル抗体の細胞系ベースの機能の特徴付け
４－１ＢＢナノボディの機能活性
この実施例は、抗体の機能活性を試験したものであり、ウレルマブとは異なり、本抗体が４－１ＢＢシグナル伝達を活性化しなかったことを示す。
４－１ＢＢモノクローナル抗体の細胞系ベースの機能の特徴付け
【0100】
４－１ＢＢシグナル伝達経路を活性化する４－１ＢＢモノクローナル抗体の能力を評価するために、市販の４－１ＢＢ ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーター系を使用した。このアッセイでは、ＨＥＫ－４－１ＢＢ ＮＦ－κＢをレポーター細胞系として使用する。ＨＥＫ－４－１ＢＢ ＮＦ－κＢ細胞系は、応答エレメントの下流に４－１ＢＢおよびルシフェラーゼを安定的に発現するように遺伝子改変されている（Ｇｅｎｏｍｅｄｉｔｅｃｈ、カタログ番号ＧＭ－Ｃ０４８３２）。ルシフェラーゼ発現は、４－１ＢＢ受容体への抗体結合によって誘導される。手短に述べると、レポーター細胞をウェル当たり細胞２．５×１０４個の密度で白色９６ウェルプレートにおいて培養した。抗体を段階希釈し、Ｂ３１分子については１５０ｎＭ～０．００００７６８ｎＭの範囲の最終濃度ならびにＢ１６、Ｂ１２５、Ｂ１６４およびＢ２１０分子については１００ｎＭ～０．０００３８１ｎＭの範囲の最終濃度で白色９６ウェルアッセイプレートに添加した。３７℃での６時間のインキュベーション後、ルシフェラーゼの基質を添加することにより発光を得、マイクロプレートリーダーにより測定した。４パラメーターロジスティック曲線解析をＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアによって行った。
【0101】
図５に示すように、ウレルマブモノクローナル抗体は、４－１ＢＢシグナル伝達を用量依存的に活性化したが、Ｂ３１、Ｂ１６、Ｂ１２５、Ｂ１６４およびＢ２１０抗体は、同じ実験設定で４－１ＢＢ誘導をブーストしなかった。
【0102】
（実施例４）
抗クローディン１８．２／４－１ＢＢ二重特異性抗体の機能活性
この実施例では、抗４－１ＢＢナノボディが組み込まれており、クローディン１８．２に対する特異性も有する、二重特異性抗体を生成し、試験した。
４．１ クローディン１８．２－４－１ＢＢ二重特異性抗体の細胞系ベースの機能の特徴付け
抗クローディン１８．２／４－１ＢＢ二重特異性抗体の機能活性
この実施例では、抗４－１ＢＢナノボディが組み込まれており、クローディン１８．２に対する特異性も有する、二重特異性抗体を生成し、試験した。
４．１ クローディン１８．２－４－１ＢＢ二重特異性抗体の細胞系ベースの機能の特徴付け
【0103】
４－１ＢＢシグナル伝達経路を活性化する生成された抗クローディン１８．２／４－１ＢＢ二重特異性抗体の能力を評価するために、市販の４－１ＢＢ ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーター系を使用した。このアッセイでは、Ｈ＿ＴＮＦＲＳＦ９（４－１ＢＢ）ＮＦκＢ－レポータージャーカット（Ｇｅｎｏｍｅｄｉｔｅｃｈ、カタログ番号ＧＭ－Ｃ０９４６８）をエフェクター細胞として使用し、クローディン１８．２を発現するまたはしないＣＨＯ－Ｋ１を標的細胞として使用した。Ｈ＿ＴＮＦＲＳＦ９（４－１ＢＢ）ＮＦＫＢ－レポータージャーカット細胞系は、応答エレメントの下流に４－１ＢＢおよびルシフェラーゼを安定的に発現するように遺伝子改変されている。ルシフェラーゼ発現は、４－１ＢＢレポーターへの抗体結合によって誘導される。手短に述べると、ウェル当たり細胞２．５×１０４個の密度でのエフェクター細胞を２．５×１０４標的細胞と（Ｅ／Ｔ比＝１：１）、白色９６ウェルプレートにおいて共培養した。抗体を４倍段階希釈し、１００ｎＭ～０．０００３８１ｎＭの範囲の最終濃度で白色９６ウェルアッセイプレートに添加した。３７℃での６時間のインキュベーション後、ルシフェラーゼの基質を添加することにより発光を得、マイクロプレートリーダーにより測定した。４パラメーターロジスティック曲線解析をＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアによって行った。
【0104】
図６に示すように、ウレルマブモノクローナル抗体は、ＣＨＯ－Ｋ１およびＣＨＯ－クローディン１８．２過剰発現細胞の両方において４－１ＢＢシグナル伝達を用量依存的にブーストすることができる。その一方で、抗クローディン１８．２／４－１ＢＢ二重特異性抗体Ｂ３１－ＢｉＡｂ、Ｂ１６－ＢｉＡｂ、Ｂ１２５－ＢｉＡｂ、Ｂ１６４－ＢｉＡｂおよびＢ２１０－ＢｉＡｂの活性は、細胞上のクローディン１８．２の発現に依存していた。
４．２ ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）免疫応答を促進する二重特異性抗体の活性
４．２ ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）免疫応答を促進する二重特異性抗体の活性
【0105】
刺激されたヒトＰＢＭＣの応答を促進するクローディン１８．２－４－１ＢＢ二重特異性抗体の能力を調査するために、ＩＬ－２サイトカイン放出を、ＬＡＮＣＥ Ｕｌｔｒａ ＴＲ－ＦＲＥＴ検出キットにより調べた。０．５μｇ／ｍｌのヒト抗ＣＤ３抗体で刺激したヒトＰＢＭＣを、エフェクター細胞として使用した。クローディン１８．２を発現するＣＨＯ－Ｋ１を標的細胞として使用した。ヒトＰＢＭＣ（１×１０５）をＣＨＯ－Ｋ１－クローディン１８．２または親ＣＨＯ－Ｋ１細胞（２．５×１０４）と（Ｅ／Ｔ比＝４：１）、ヒト抗ＣＤ３抗体の存在下で共培養した。５倍段階希釈した二重特異性抗体を、１００ｎＭから出発する最終濃度で培養培地に添加した。４８時間後、培養培地中のＩＬ２の分泌物レベルを、ＩＬ－２（ヒト）ＬＡＮＣＥ Ｕｌｔｒａ ＴＲ－ＦＲＥＴ検出キット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して測定した。図７に示すように、二重特異性抗体は、クローディン１８．２過剰発現細胞の存在下でＰＢＭＣ応答をもっぱら活性化することができた。
【0106】
（実施例５）
Ｂ３１／Ｂ１２５／Ｂ１６／Ｂ２１０ ＶＨＨ抗体のヒト化
Ｂ３１／Ｂ１２５／Ｂ１６／Ｂ２１０可変領域遺伝子を利用して、ヒト化ｍＡｂを作出した。このプロセスの第１ステップでは、Ｂ３１／Ｂ１２５／Ｂ１６／Ｂ２１０のＶＨＨのアミノ酸配列を、ヒトＩｇ遺伝子配列の利用可能なデータベースと比較して、全体として最もよくマッチするヒト生殖細胞系列Ｉｇ遺伝子配列を見つけた。次いで、Ｂ３１／Ｂ１２５／Ｂ１６／Ｂ２１０のヒト化可変ドメイン配列を設計した；ここで、ＣＤＲＨ１、Ｈ２およびＨ３は、ＶＨ遺伝子のフレームワーク配列上にある。
Ｂ３１／Ｂ１２５／Ｂ１６／Ｂ２１０ ＶＨＨ抗体のヒト化
Ｂ３１／Ｂ１２５／Ｂ１６／Ｂ２１０可変領域遺伝子を利用して、ヒト化ｍＡｂを作出した。このプロセスの第１ステップでは、Ｂ３１／Ｂ１２５／Ｂ１６／Ｂ２１０のＶＨＨのアミノ酸配列を、ヒトＩｇ遺伝子配列の利用可能なデータベースと比較して、全体として最もよくマッチするヒト生殖細胞系列Ｉｇ遺伝子配列を見つけた。次いで、Ｂ３１／Ｂ１２５／Ｂ１６／Ｂ２１０のヒト化可変ドメイン配列を設計した；ここで、ＣＤＲＨ１、Ｈ２およびＨ３は、ＶＨ遺伝子のフレームワーク配列上にある。
【0107】
ヒト化抗体の一部についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列を下の表４に収載する。
【表4A】
【表4B】
【表4C-1】
【表4C-2】
【表4D】
【0108】
Ｂ３１の復帰変異は、２３Ａ、３７Ｙ、４０Ｐ、４１Ｑ、４４Ｑ、４５Ｒ、４９Ａ、７４Ｎ、７８Ｍ、８２（８２Ａ）Ｄ、および９４Ａを含む。より具体的には、ＶＨＨ－ｖ２は、復帰変異３７Ｙ、４４Ｑ、４５Ｒおよび９４Ａを含み；ＶＨＨ－ｖ３は、復帰変異２３Ａ、３７Ｙ、４４Ｑ、４５Ｒ、４９Ａ、７４Ｎおよび９４Ａを含み；ＶＨＨ－ｖ４は、復帰変異２３Ａ、３７Ｙ、４４Ｑ、４５Ｒ、４９Ａ、７８Ｍ、８２（８２Ａ）Ｄ、および９４Ａを含み；ＶＨＨ－ｖ５は、復帰変異２３Ａ、３７Ｙ、４０Ｐ、４１Ｑ、４４Ｑ、４５Ｒ、４９Ａ、７４Ｎ、８２（８２Ａ）Ｄ、および９４Ａを含み；ＶＨＨ－ｖ６は、復帰変異３７Ｙ、４４Ｑ、４５Ｒおよび４９Ａを含んだ。
【0109】
Ｂ１６の復帰変異は、２９Ｌ、３０Ｄ、３７Ｆ、４４Ｅ、４５Ｒ、４７Ｇ、７４Ａ、８４Ｐおよび９４Ｔを含む。より具体的には、ＶＨＨ－ｖ２は、復帰変異３７Ｆ、４４Ｅ、４５Ｒ、４７Ｇおよび９４Ｔを含み；ＶＨＨ－ｖ３は、復帰変異２９Ｌ、３０Ｄ、３７Ｆ、４４Ｅ、４５Ｒ、４７Ｇおよび９４Ｔを含み；ＶＨＨ－ｖ４は、復帰変異２９Ｌ、３０Ｄ、３７Ｆ、４４Ｅ、４５Ｒ、４７Ｇ、７４Ａ、８４Ｐおよび９４Ｔを含んだ。
【0110】
Ｂ１２５の復帰変異は、３７Ｆ、４３Ｋ、４４Ｅ、４５Ｒ、４７Ｇ、７４Ａ、８４Ｐおよび９４Ｔを含む。より具体的には、ＶＨＨ－ｖ２は、復帰変異３７Ｆ、４４Ｅ、４５Ｒ、４７Ｇおよび９４Ｔを含み；ＶＨＨ－ｖ３は、復帰変異３７Ｆ、４３Ｋ、４４Ｅ、４５Ｒ、４７Ｇおよび７４Ａを含み；ＶＨＨ－ｖ４は、復帰変異３７Ｆ、４３Ｋ、４４Ｅ、４５Ｒ、４７Ｇ、７４Ａおよび９４Ｔを含み；ＶＨＨ－ｖ５は、復帰変異３７Ｆ、４３Ｋ、４４Ｅ、４５Ｒ、４７Ｇ、７４Ａ、８４Ｐおよび９４Ｔを含んだ。
【0111】
Ｂ２１０の復帰変異は、２７Ｌ、２９Ｌ、３７Ｆ、４４Ｅ、４５Ｒ、４７Ｇ、８９Ｄおよび９４Ｔを含む。より具体的には、ＶＨＨ－ｖ２は、復帰変異３７Ｆ、４４Ｅ、４５Ｒ、４７Ｇおよび９４Ｔを含み；ＶＨＨ－ｖ３は、復帰変異２７Ｌ、３７Ｆ、４４Ｅ、４５Ｒ、４７Ｇおよび９４Ｔを含み；ＶＨＨ－ｖ４は、復帰変異２７Ｌ、２９Ｌ、３７Ｆ、４４Ｅ、４５Ｒ、４７Ｇおよび９４Ｔを含み；ＶＨＨ－ｖ５は、復帰変異２７Ｌ、２９Ｌ、３７Ｆ、４４Ｅ、４５Ｒ、４７Ｇ、８９Ｄおよび９４Ｔを含んだ。
【0112】
ヒト化ＶＨＨ遺伝子をｐｃＤＮＡ３．４ベクターにクローニングし、さらなる解析のために２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。
【0113】
（実施例６）
ヒト化抗体の抗原結合特性
Ｂｉａｃｏｒｅによるヒト化抗体の完全動力学的親和性
組換えヒト４－１ＢＢタンパク質（ヒト４－１ＢＢ－ｈｉｓタグ）へのヒト化抗体の結合を、捕捉法を使用してＢｉａｃｏｒｅで試験した。Ｂ３１－Ｖ２、Ｂ３１－Ｖ３、Ｂ３１－Ｖ４、Ｂ３１－Ｖ５およびＢ３１－Ｖ６を、プロテインＡチップを使用して捕捉した。ヒト４－１ＢＢ－ｈｉｓタグタンパク質の段階希釈物を、捕捉された抗体上に３０秒間、１０μｌ／分の流速で注入した。抗原を、３６０秒間、放置して解離させた。全ての実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で行った。データ解析は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して行った。結果を下の表５に示す。全てのヒト化抗体が強い結合を示した。
ヒト化抗体の抗原結合特性
Ｂｉａｃｏｒｅによるヒト化抗体の完全動力学的親和性
組換えヒト４－１ＢＢタンパク質（ヒト４－１ＢＢ－ｈｉｓタグ）へのヒト化抗体の結合を、捕捉法を使用してＢｉａｃｏｒｅで試験した。Ｂ３１－Ｖ２、Ｂ３１－Ｖ３、Ｂ３１－Ｖ４、Ｂ３１－Ｖ５およびＢ３１－Ｖ６を、プロテインＡチップを使用して捕捉した。ヒト４－１ＢＢ－ｈｉｓタグタンパク質の段階希釈物を、捕捉された抗体上に３０秒間、１０μｌ／分の流速で注入した。抗原を、３６０秒間、放置して解離させた。全ての実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で行った。データ解析は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して行った。結果を下の表５に示す。全てのヒト化抗体が強い結合を示した。
【表5-1】
【表5-2】
【0114】
（実施例７）
ヒト化二重特異性抗体の機能活性
この実施例では、抗クローディン１８．２／４－１ＢＢ二重特異性抗体を、ヒト化４－１ＢＢナノボディを用いて調製し、試験した。
７．１ クローディン１８．２－４－１ＢＢヒト化二重特異性抗体の細胞系ベースの機能の特徴付け
ヒト化二重特異性抗体の機能活性
この実施例では、抗クローディン１８．２／４－１ＢＢ二重特異性抗体を、ヒト化４－１ＢＢナノボディを用いて調製し、試験した。
７．１ クローディン１８．２－４－１ＢＢヒト化二重特異性抗体の細胞系ベースの機能の特徴付け
【0115】
４－１ＢＢシグナル伝達経路を活性化するクローディン１８．２－４－１ＢＢヒト化二重特異性抗体の能力を評価するために、市販の４－１ＢＢ ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーター系を使用した。このアッセイでは、Ｈ＿ＴＮＦＲＳＦ９（４－１ＢＢ）ＮＦκＢ－レポータージャーカット（Ｇｅｎｏｍｅｄｉｔｅｃｈ、カタログ番号ＧＭ－Ｃ０９４６８）をエフェクター細胞として使用し、クローディン１８．２を発現するまたはしないＣＨＯ－Ｋ１を標的細胞として使用した。Ｈ＿ＴＮＦＲＳＦ９（４－１ＢＢ）ＮＦＫＢ－レポータージャーカット細胞系は、応答エレメントの下流に４－１ＢＢおよびルシフェラーゼを安定的に発現するように遺伝子改変されている。ルシフェラーゼ発現は、４－１ＢＢ受容体への抗体結合によって誘導される。手短に述べると、ウェル当たり細胞２．５×１０４個の密度でのエフェクター細胞を２．５×１０４標的細胞と（Ｅ／Ｔ比＝１：１）、白色９６ウェルプレートにおいて共培養した。抗体を３倍段階希釈し、１００ｎＭ～０．００５ｎＭの範囲の最終濃度で白色９６ウェルアッセイプレートに添加した。３７℃での６時間のインキュベーション後、ルシフェラーゼの基質を添加することにより発光を得、マイクロプレートリーダーにより測定した。４パラメーターロジスティック曲線解析をＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアによって行った。
【0116】
図８に示すように、抗クローディン１８．２／４－１ＢＢヒト化二重特異性抗体の活性は、Ｂ３１キメラ抗体と同等であった。
７．２ ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）免疫応答を促進するヒト化二重特異性抗体の活性
７．２ ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）免疫応答を促進するヒト化二重特異性抗体の活性
【0117】
刺激されたヒトＰＢＭＣの応答を促進するクローディン１８．２－４－１ＢＢヒト化二重特異性抗体の能力を調査するために、ＩＬ－２サイトカイン放出を、ＬＡＮＣＥ Ｕｌｔｒａ ＴＲ－ＦＲＥＴ検出キットにより調べた。０．５μｇ／ｍｌのヒト抗ＣＤ３抗体で刺激したヒトＰＢＭＣを、エフェクター細胞として使用した。クローディン１８．２を発現するＣＨＯ－Ｋ１を標的細胞として使用した。ヒトＰＢＭＣ（１×１０５）をＣＨＯ－Ｋ１－クローディン１８．２または親ＣＨＯ－Ｋ１細胞（２．５×１０４）と（Ｅ／Ｔ比＝４：１）、ヒト抗ＣＤ３抗体の存在下で共培養した。５倍段階希釈したヒト化二重特異性抗体を、１００ｎＭから出発する最終濃度で培養培地に添加した。４８時間後、培養培地中のＩＬ２の分泌物レベルを、ＩＬ－２（ヒト）ＬＡＮＣＥ Ｕｌｔｒａ ＴＲ－ＦＲＥＴ検出キット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して測定した。図９に示すように、ヒト化二重特異性抗体により誘導されたＩＬ－２分泌は、Ｂ３１キメラ抗体と同等であった。
【0118】
（実施例８）
抗クローディン１８．２／４－１ＢＢ二重特異性抗体による腫瘍成長阻害
この実施例では、ヒト４－１ＢＢの細胞外ドメインを発現したヒト化マウスを使用して、腫瘍成長を阻害する二重特異性抗体の活性を試験した。
抗クローディン１８．２／４－１ＢＢ二重特異性抗体による腫瘍成長阻害
この実施例では、ヒト４－１ＢＢの細胞外ドメインを発現したヒト化マウスを使用して、腫瘍成長を阻害する二重特異性抗体の活性を試験した。
【0119】
マウス結腸腺癌細胞（ＭＣ３８）を、ヒトＣＬＤＮ１８．２を発現するように操作した。ヒト化マウス（ｈ４－１ＢＢ）にＭＣ３８－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を皮下移植した。マウスに、週に１回、３週間にわたって次の抗体を腹腔内投与した：ＰＢＳ対照（１ｍｇ／ｋｇ）、ウレルマブ（０．８５ｍｇ／ｋｇ）、Ｂ３１抗ＣＬＤＮ１８．２／４－１ＢＢ二重特異性抗体（１ｍｇ／ｋｇ）、Ｂ１６抗ＣＬＤＮ１８．２／４－１ＢＢ二重特異性抗体（１ｍｇ／ｋｇ）、Ｂ１２５抗／ＣＬＤＮ１８．２－４－１ＢＢ二重特異性抗体（１ｍｇ／ｋｇ）、Ｂ１６４抗ＣＬＤＮ１８．２／４－１ＢＢ二重特異性抗体（１ｍｇ／ｋｇ）、Ｂ２１０抗ＣＬＤＮ１８．２／４－１ＢＢ二重特異性抗体（１ｍｇ／ｋｇ）。実験の継続期間にわたっての週に２回のノギスによる測定によって、腫瘍体積をモニターした。図１０に示すように、ウレルマブ、Ｂ３１、Ｂ１６、Ｂ１２５、Ｂ１６４およびＢ２１０は全て、腫瘍成長を６２．４％～９６．９％のＴＧ１で抑制することができる。
＊ ＊ ＊
【表6】
【0120】
本開示は、記載した特定の実施形態によって範囲が限定されることはなく、これらの実施形態は、本開示の個々の態様の単一の実例として意図したものであり、機能的に等価であるあらゆる組成物または方法が本開示の範囲内である。本開示の主旨および範囲を逸脱することなく、本開示の方法および組成物に様々な改変および変形を加えることができることは、当業者には明らかであろう。したがって、本開示は、本開示の改変形態および変形形態を、それらが添付の請求項およびそれらの均等物の範囲内に入ることを条件に、包含する。
【0121】
本明細書で言及した全ての公表文献および特許出願は、個々の公表文献または特許出願各々が参照により組み込まれると具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】
【国際調査報告】