特表 2024-537323 抗グリピカン３抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-10

(54)【発明の名称】抗グリピカン３抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/00 20060101AFI20241003BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20241003BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20241003BHJP

   C07K 16/42 20060101ALI20241003BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20241003BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20241003BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241003BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20241003BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241003BHJP

【ＦＩ】

C07K16/00

C12N15/13 ZNA

C12N15/62 Z

C07K16/42

C07K16/46

A61K47/68

A61P35/00

A61P35/02

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61K39/395 E

A61K39/395 T

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024522070

(86)(22)【出願日】2022-10-17

(85)【翻訳文提出日】2024-06-10

(86)【国際出願番号】 CN2022125725

(87)【国際公開番号】W WO2023061505

(87)【国際公開日】2023-04-20

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/124182

(32)【優先日】2021-10-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524069695

【氏名又は名称】コンセプト トゥー メディシン バイオテック カンパニー， リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ヤン， リウ

(72)【発明者】

【氏名】シェン， ハオ

(72)【発明者】

【氏名】ツイ， フェイフェイ

(72)【発明者】

【氏名】ファン， レイ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076BB01

4C076BB11

4C076BB13

4C076BB15

4C076BB16

4C076BB21

4C076BB22

4C076BB25

4C076BB29

4C076CC27

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF68

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB11

4C085CC23

4C085EE01

4C085GG01

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG05

4C085GG06

4C085GG08

4H045AA11

4H045BA40

4H045DA75

4H045EA22

(57)【要約】

マウス抗体、ヒト化抗体、およびさらに最適化されたＣＤＲ配列を有するものを含む、抗ＧＰＣ３抗体が、提供される。抗体は、臨床開発中の有力な抗ＧＰＣ３抗体候補よりも高い細胞ベースの結合効率を示した。本開示は、様々な実施形態で、ヒトＧＰＣ３タンパク質に特異的な抗体および抗原結合性断片を提供する。実験的試験は、これらの新たに同定された抗体がベンチマークＧＣ３３抗体よりも性能が優れていたことを示す。上記抗体またはその断片を用いてがんを処置するための方法および使用も提供される

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトグリピカン３タンパク質に対して特異性を有する、抗グリピカン３（ＧＰＣ３）抗体またはその断片であって、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびにＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号７１～７６のアミノ酸配列を含む、抗グリピカン３（ＧＰＣ３）抗体またはその断片。

【請求項2】

前記ＶＨ ＣＤＲ１が、配列番号１３、２５、５９および６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
前記ＶＨ ＣＤＲ２が、配列番号１４、１９、２３、２６、２９、３０、６０および６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
前記ＶＨ ＣＤＲ３が、配列番号１５、２０、２４および３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
前記ＶＬ ＣＤＲ１が、配列番号１６、２１、２７および３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
前記ＶＬ ＣＤＲ２が、配列番号１７、６１、６４および６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
前記ＶＬ ＣＤＲ３が、配列番号１８、２２、２８、３２、３４および６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載の抗体またはその断片。

【請求項3】

前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３が、それぞれ、
配列番号１３、１９、１５、２１、１７および１８；
配列番号１３、１９、２０、２１、１７および２２；
配列番号１３～１８；
配列番号１３、２３、２４、２１、１７および１８；
配列番号２５、２６、２０、２７、１７および２８；
配列番号２５、２９、２０、２７、１７および２８；
配列番号２５、３０、１５、３１、１７および３２；
配列番号５９、６０、１５、２１、６１、および６２；
配列番号６３、１９、１５、２１、６４、および６２；または
配列番号１３、６５、１５、２１、６６、および６２
のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の抗体またはその断片。

【請求項4】

前記ＶＨ ＣＤＲ１が、配列番号１３、５９および６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
前記ＶＨ ＣＤＲ２が、配列番号１９、６０および６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
前記ＶＨ ＣＤＲ３が、配列番号１５のアミノ酸配列を含み；
前記ＶＬ ＣＤＲ１が、配列番号２１のアミノ酸配列を含み；
前記ＶＬ ＣＤＲ２が、配列番号１７、６１、６４および６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
前記ＶＬ ＣＤＲ３が、配列番号１８および６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載の抗体またはその断片。

【請求項5】

前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号１３、１９、１５、２１、１７および１８のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の抗体またはその断片。

【請求項6】

前記ＶＨが、配列番号３５～３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４０～４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の抗体またはその断片。

【請求項7】

（ａ）前記ＶＨが、配列番号３６のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４１のアミノ酸配列を含むか；
（ｂ）前記ＶＨが、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４３のアミノ酸配列を含むか；
（ｃ）前記ＶＨが、配列番号３６のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４２のアミノ酸配列を含むか；
（ｄ）前記ＶＨが、配列番号３６のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４３のアミノ酸配列を含むか；
（ｅ）前記ＶＨが、配列番号３６のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか；
（ｆ）前記ＶＨが、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４１のアミノ酸配列を含むか；
（ｇ）前記ＶＨが、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４２のアミノ酸配列を含むか；
（ｈ）前記ＶＨが、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか；
（ｉ）前記ＶＨが、配列番号３８のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４１のアミノ酸配列を含むか；
（ｊ）前記ＶＨが、配列番号３８のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４２のアミノ酸配列を含むか；
（ｋ）前記ＶＨが、配列番号３８のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４３のアミノ酸配列を含むか；
（ｌ）前記ＶＨが、配列番号３８のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか；
（ｍ）前記ＶＨが、配列番号３９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４１のアミノ酸配列を含むか；
（ｎ）前記ＶＨが、配列番号３９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４２のアミノ酸配列を含むか；
（ｏ）前記ＶＨが、配列番号３９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４３のアミノ酸配列を含むか；または
（ｐ）前記ＶＨが、配列番号３９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４４のアミノ酸配列を含む、
請求項５に記載の抗体またはその断片。

【請求項8】

前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号５９、６０、１５、２１、６１および６２のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の抗体またはその断片。

【請求項9】

前記ＶＨが、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号５４のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体またはその断片。

【請求項10】

前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号６３、１９、１５、２１、６４および６２のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の抗体またはその断片。

【請求項11】

前記ＶＨが、配列番号５５のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号５６のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の抗体またはその断片。

【請求項12】

前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号１３、６５、１５、２１、６６および６２のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の抗体またはその断片。

【請求項13】

前記ＶＨが、配列番号５７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号５８のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の抗体またはその断片。

【請求項14】

前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号１３、１９、２０、２１、１７および２２のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体またはその断片。

【請求項15】

前記ＶＨが、配列番号３および４５～５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４、５１および５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の抗体またはその断片。

【請求項16】

（ａ）前記ＶＨが、配列番号４８のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号５１のアミノ酸配列を含むか；
（ｂ）前記ＶＨが、配列番号４８のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号５２のアミノ酸配列を含むか；
（ｃ）前記ＶＨが、配列番号４５のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号５１のアミノ酸配列を含むか；
（ｄ）前記ＶＨが、配列番号４５のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号５２のアミノ酸配列を含むか；
（ｅ）前記ＶＨが、配列番号４６のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号５１のアミノ酸配列を含むか；
（ｆ）前記ＶＨが、配列番号４６のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号５２のアミノ酸配列を含むか；
（ｇ）前記ＶＨが、配列番号４７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号５１のアミノ酸配列を含むか；
（ｈ）前記ＶＨが、配列番号４７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号５２のアミノ酸配列を含むか；
（ｉ）前記ＶＨが、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号５１のアミノ酸配列を含むか；
（ｊ）前記ＶＨが、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号５２のアミノ酸配列を含むか；
（ｋ）前記ＶＨが、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号５１のアミノ酸配列を含むか；または
（ｌ）前記ＶＨが、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号５２のアミノ酸配列を含む、
請求項１４に記載の抗体またはその断片。

【請求項17】

前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号１３～１８のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体またはその断片。

【請求項18】

前記ＶＨが、配列番号１のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の抗体またはその断片。

【請求項19】

前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号１３、２３、２４、２１、１７および１８のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体またはその断片。

【請求項20】

前記ＶＨが、配列番号５のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の抗体またはその断片。

【請求項21】

前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号２５、２６、２０、２７、１７および２８のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体またはその断片。

【請求項22】

前記ＶＨが、配列番号７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の抗体またはその断片。

【請求項23】

前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号２５、２９、２０、２７、１７および２８のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体またはその断片。

【請求項24】

前記ＶＨが、配列番号９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の抗体またはその断片。

【請求項25】

前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号２５、３０、１５、３１、１７および３２のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体またはその断片。

【請求項26】

前記ＶＨが、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号１２のアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の抗体またはその断片。

【請求項27】

前記ＶＨ ＣＤＲ１が、配列番号１３のアミノ酸配列を含み；
前記ＶＨ ＣＤＲ２が、配列番号１９のアミノ酸配列を含み；
前記ＶＨ ＣＤＲ３が、配列番号１５、２０、２４および３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
前記ＶＬ ＣＤＲ１が、配列番号２１のアミノ酸配列を含み；
前記ＶＬ ＣＤＲ２が、配列番号１７のアミノ酸配列を含み；
前記ＶＬ ＣＤＲ３が、配列番号１８、２２、２８、３２および３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、
請求項２に記載の抗体またはその断片。

【請求項28】

（ａ）前記ＶＨが、配列番号３５のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４のアミノ酸配列を含むか；
（ｂ）前記ＶＨが、配列番号６７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４のアミノ酸配列を含むか；
（ｃ）前記ＶＨが、配列番号３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４０のアミノ酸配列を含むか；
（ｄ）前記ＶＨが、配列番号３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号６８のアミノ酸配列を含むか；
（ｅ）前記ＶＨが、配列番号６９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４のアミノ酸配列を含むか；
（ｆ）前記ＶＨが、配列番号３５のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号６８のアミノ酸配列を含むか；
（ｇ）前記ＶＨが、配列番号６７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４０のアミノ酸配列を含むか；
（ｈ）前記ＶＨが、配列番号６７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号６８のアミノ酸配列を含むか；
（ｉ）前記ＶＨが、配列番号３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号７０のアミノ酸配列を含むか；
（ｊ）前記ＶＨが、配列番号６７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号７０のアミノ酸配列を含むか；
（ｋ）前記ＶＨが、配列番号３５のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号７０のアミノ酸配列を含むか；
（ｌ）前記ＶＨが、配列番号６９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号６８のアミノ酸配列を含むか；
（ｍ）前記ＶＨが、配列番号６９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４０のアミノ酸配列を含むか；または
（ｎ）前記ＶＨが、配列番号６９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号７０のアミノ酸配列を含む、
請求項２７に記載の抗体またはその断片。

【請求項29】

二価Ｆａｂ抗体であるか、またはＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ＦｖおよびｓｃＦｖからなる群から選択される断片である、請求項１から２８のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。

【請求項30】

ヒト化されている、請求項１から２９のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。

【請求項31】

請求項１から２９のいずれか一項に記載の抗体またはその断片と、ＧＰＣ３ではない標的抗原に対して結合特異性を有する１つまたは複数の抗体または抗原結合性断片とを含む、多重特異性抗体。

【請求項32】

請求項１から３０のいずれか一項に記載の抗体またはその断片と、膜貫通ドメインと、共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ細胞内ドメインとを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。

【請求項33】

請求項１から３０のいずれか一項に記載の抗体もしくはその断片または請求項３１に記載のＣＡＲをコードする、１つまたは複数のポリヌクレオチド。

【請求項34】

請求項３３に記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。

【請求項35】

（ａ）請求項１から３０のいずれか一項に記載の抗体またはその断片；および
（ｂ）前記抗体またはその断片にコンジュゲートされたコンジュゲーション部分
を含む抗体－薬物コンジュゲートであって、前記コンジュゲーション部分が、検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、またはこれらの組合せから選択される、抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項36】

請求項１から３０のいずれか一項に記載の抗体もしくはその断片、請求項３２に記載のＣＡＲ、または請求項３５に記載の抗体－薬物コンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。

【請求項37】

それを必要とする患者におけるがんを処置する方法であって、請求項１から３０のいずれか一項に記載の抗体もしくはその断片、請求項３２に記載のＣＡＲ、または請求項３５に記載の抗体－薬物コンジュゲートの有効量を前記患者に投与するステップを含む方法。

【請求項38】

がんを処置するための医薬の調製のための、請求項１から３０のいずれか一項に記載の抗体もしくはその断片、請求項３２に記載のＣＡＲ、または請求項３５に記載の抗体－薬物コンジュゲートの使用。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

背景
グリピカン３（ＧＰＣ３）は、細胞表面に存在するグリピカン関連膜内在性ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＧＲＩＰＳ）ファミリーのメンバーである。ＧＰＣ３のタンパク質コアは、２つのサブユニットからなり、Ｎ末端サブユニットは、約４０ｋＤａのサイズを有し、Ｃ末端サブユニットは、約３０ｋＤａである。６つのグリピカン（ＧＰＣ１～６）が哺乳動物において同定されている。ＧＰＣ３は、細胞増殖、分化、接着および遊走を調節する上で重要な役割を果たす。ＧＰＣ３は、ＷｎｔとＦｒｉｚｚｌｅｄ（ＦＺＤ）の両方と相互作用して複合体を形成し、下流のシグナル伝達を誘発する。ＧＰＣ３のコアタンパク質は、Ｗｎｔの共受容体またはレシーバーとしての役割を果たし得る。

【0002】

グリピカン３免疫染色は、肝細胞癌（ＨＣＣ）と肝硬変の際の異形成変化とを識別するためのものであり得る。ＧＰＣ３タンパク質発現は、ＨＣＣに見られるが、正常な肝臓および胆管癌には見られない。ＧＰＣ３は、より少ない程度にだが、黒色腫、卵巣明細胞癌、卵黄嚢腫瘍、神経芽細胞腫、肝芽腫、ウィルムス腫瘍細胞、および他の腫瘍においても発現される。

【0003】

ＧＰＣ３は、肝臓がんなどのがんの処置の有望な治療標的である。ＧＣ３３およびＹＰ７をはじめとする、いくつかの治療用抗ＧＰＣ３抗体が開発されている。これらの抗体の一部は、肝臓がん細胞においてＷｎｔシグナル伝達を阻害する。また、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞免疫療法が、がんを処置するために様々なステージで開発中である。異種移植または同所性（orthoptic）肝臓腫瘍を有するマウスにおいて、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、パーフォリン媒介およびグランザイム媒介細胞死を誘導すること、および腫瘍細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を低減させることにより、ＧＰＣ３陽性がん細胞を消失させることができる。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

要旨
本開示は、様々な実施形態で、ヒトＧＰＣ３タンパク質に特異的な抗体および抗原結合性断片を提供する。実験的試験は、これらの新たに同定された抗体がベンチマークＧＣ３３抗体よりも性能が優れていたことを示す。

【0005】

それ故、本開示の一実施形態に従って、ヒトグリピカン３タンパク質に対して特異性を有する、抗グリピカン３（ＧＰＣ３）抗体またはその断片であって、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびにＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号７１～７６のアミノ酸配列を含む、抗グリピカン３（ＧＰＣ３）抗体またはその断片が、提供される。

【0006】

一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号１３、２５、５９および６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号１４、１９、２３、２６、２９、３０、６０および６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号１５、２０、２４および３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１６、２１、２７および３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１７、６１、６４および６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１８、２２、２８、３２、３４および６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0007】

一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、
配列番号１３、１９、１５、２１、１７および１８；
配列番号１３、１９、２０、２１、１７および２２；
配列番号１３～１８；
配列番号１３、２３、２４、２１、１７および１８；
配列番号２５、２６、２０、２７、１７および２８；
配列番号２５、２９、２０、２７、１７および２８；
配列番号２５、３０、１５、３１、１７および３２；
配列番号５９、６０、１５、２１、６１、および６２；
配列番号６３、１９、１５、２１、６４、および６２；または
配列番号１３、６５、１５、２１、６６、および６２
のアミノ酸配列を含む。

【0008】

一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号１３、５９および６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号１９、６０および６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号１５のアミノ酸配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号２１のアミノ酸配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１７、６１、６４および６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１８および６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0009】

一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１３、１９、１５、２１、１７および１８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３５～３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４０～４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0010】

一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３６のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４３のアミノ酸配列を含む。

【0011】

一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３６のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３６のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３６のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３８のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３８のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３８のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３８のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３９のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３９のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３９のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３９のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。

【0012】

一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号５９、６０、１５、２１、６１および６２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。

【0013】

一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号６３、１９、１５、２１、６４および６２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５５のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号５６のアミノ酸配列を含む。

【0014】

一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１３、６５、１５、２１、６６および６２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５７のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。

【0015】

一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１３、１９、２０、２１、１７および２２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３および４５～５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４、５１および５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号４８のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号４８のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号５２のアミノ酸配列を含む。

【0016】

一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号４５のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号４５のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号５２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号４６のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号４６のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号５２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号４７のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号５２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号５２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号５２のアミノ酸配列を含む。

【0017】

一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１３～１８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。

【0018】

一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１３、２３、２４、２１、１７および１８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。

【0019】

一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号２５、２６、２０、２７、１７および２８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。

【0020】

一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号２５、２９、２０、２７、１７および２８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号９のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。

【0021】

一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号２５、３０、１５、３１、１７および３２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。

【0022】

一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号１３のアミノ酸配列を含み；ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号１９のアミノ酸配列を含み；ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号１５、２０、２４および３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号２１のアミノ酸配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１７のアミノ酸配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１８、２２、２８、３２および３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0023】

一部の実施形態では、抗体またはその断片は、ヒト化されている。

【0024】

一実施形態では、（ａ）本開示の抗体またはその断片；および（ｂ）その抗体または断片にコンジュゲートされたコンジュゲーション部分を含むことを特徴とする抗体－薬物コンジュゲートであって、コンジュゲーション部分が、検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、またはこれらの組合せから選択される、抗体－薬物コンジュゲートも、提供される。

【0025】

一実施形態では、本開示の抗体と、ＧＰＣ３ではない標的抗原に対して結合特異性を有する１つまたは複数の二次抗体または抗原結合性断片とを含む、多重特異性抗体も提供される。

【0026】

本開示の抗体またはその断片と、膜貫通ドメインと、共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ細胞内ドメインとを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も提供される。

【0027】

別の実施形態では、本開示の抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含む細胞、および抗体またはその断片と薬学的に許容される担体とを含む組成物が、提供される。抗体またはその断片を用いてがんを処置するための方法および使用も提供される。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】図１は、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定したときのＧＰＣ３タンパク質（ヒトＧＰＣ３－ｈｉｓタグ）に対する５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８抗体の結合親和性を示す。

【0029】

【図2A】図２Ａ～Ｂは、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８抗体の親和性が、ＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞、ＨＥＰＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞またはＨｕｈ－７細胞への結合について、ＧＣ３３より高いことを示す。

【図2B】図２Ａ～Ｂは、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８抗体の親和性が、ＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞、ＨＥＰＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞またはＨｕｈ－７細胞への結合について、ＧＣ３３より高いことを示す。

【0030】

【図3】図３は、ヒト、マウスおよびカニクイザルＧＰＣ３に結合した５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８のＥＬＩＳＡ結合活性を示す。

【0031】

【図4】図４は、ＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞への結合についての５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃キメラモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の親和性が、他の最適化５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８キメラｍＡｂより高いことを示す。

【0032】

【図5】図５は、ＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞およびＨｕｈ－７細胞への結合についての５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃キメラｍＡｂの親和性が、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８キメラｍＡｂおよびＧＣ３３抗体の中で最も高いことを示す。

【0033】

【図6】図６は、キメラ抗体へのＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋによる測定時のＧＰＣ３タンパク質（ヒトＧＰＣ３－ｈｉｓタグ）に対する５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃抗体の結合親和性を示す。

【0034】

【図7】図７は、ＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞、ＨＥＰＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞およびＨｕｈ－７細胞に対する各ヒト化抗体のＥＣ５０を示す。

【0035】

【図8】図８は、ＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞、ＨＥＰＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞およびＨｕｈ－７細胞に対する各ヒト化抗体のＥＣ５０を示す。

【0036】

【図9】図９は、捕捉法を使用してＢｉａｃｏｒｅにより試験したときの組換えＧＰＣ３タンパク質（ヒトＧＰＣ３－ｈｉｓタグ）への５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃－ＶＨ＋ＶＬ、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃－ＶＨ１＋ＶＬ１、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃－ＶＨ１＋ＶＬ３、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃－ＶＨ１＋ＶＬ４、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃－ＶＨ２＋ＶＬ４、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃－ＶＨ３＋ＶＬ１の結合を示す。

【0037】

【図10】図１０は、ヒトＧＰＣ３過剰発現ＣＨＯＫ１細胞およびＨＥＰＧ２細胞への抗体結合の結果を示す。

【0038】

【図11】図１１は、親和性成熟抗体についてのヒトＧＰＣ３過剰発現ＣＨＯＫ１細胞への結合の結果を示す。

【0039】

【図12】図１２は、ＧＰＣ３抗体媒介ＡＤＣＣシグナル伝達を誘導する抗体の結果を示す。

【0040】

【図13】図１３は、抗体がＮＫ細胞機能を活性化したことを示す。

【0041】

【図14】図１４は、抗体により刺激されたＮＫ細胞の脱顆粒を示す。

【0042】

【図15】図１５は、刺激されたＮＫ細胞におけるサイトカイン産生を示す。

【0043】

【図16】図１６は、全ての候補ヒト化抗体の結合効率が、ＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞に関してキメラ抗体と同等であり、Ｈｕｈ－７細胞に関してキメラ抗体より良好であることを示す。

【0044】

【図17】図１７は、ヒトＧＰＣ３過剰発現ＣＨＯＫ１細胞、Ｈｕｈ－７細胞およびＨＥＰＧ２細胞への抗体結合の結果を示す。

【0045】

【図18】図１８は、ＨＥＰＧ２細胞への抗体内在化の結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0046】

詳細な説明
定義
用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」実体は、その実体の１つまたは複数を指し、例えば、「１つの抗体（ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、１つまたは複数の抗体を表すと理解されることに留意されたい。したがって、用語「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１つまたは複数（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」および「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」は、本明細書では同義で使用され得る。

【0047】

本明細書で使用される場合、「抗体」または「抗原結合性断片」は、抗原を特異的に認識し、それに結合する、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体を指す。抗体は、全抗体およびその任意の抗原結合性断片または一本鎖であり得る。したがって、用語「抗体」は、抗原に結合する生物活性を有する免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含む分子を含有する、任意のタンパク質またはペプチドを含む。そのようなものの例としては、重鎖もしくは軽鎖またはそのリガンド結合部分の相補性決定領域（ＣＤＲ）、重鎖または軽鎖可変領域、重鎖または軽鎖定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域、あるいはその任意の部分、あるいは結合タンパク質の少なくとも一部分が挙げられるが、これらに限定されない。

【0048】

用語「抗体断片」または「抗原結合性断片」は、本明細書で使用される場合、抗体の一部分、例えば、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどである。構造に関係なく、抗体断片は、無傷抗体により認識される同じ抗原と結合する。用語「抗体断片」は、アプタマー、スピーゲルマー、およびダイアボディを含む。用語「抗体断片」は、特定の抗原に結合して複合体を形成することにより抗体のように動作する、任意の合成のまたは遺伝子操作されたタンパク質も含む。

【0049】

抗体という用語は、生化学的に区別され得るポリペプチドの様々な広範なクラスを包含する。重鎖が、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として、一部はこれらの中のサブクラス（例えば、γ１～γ４）として、分類されることは、当業者には理解されるであろう。それは、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧまたはＩｇＥのような抗体の「クラス」を決定するこの鎖の性質である。

【0050】

免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＧ_５などは、十分に特徴付けられており、機能の特化をもたらすことが公知である。これらのクラスおよびアイソタイプの各々についての改変バージョンは、本開示に鑑みて当業者には容易に識別可能であり、したがって、本開示の範囲内である。全ての免疫グロブリンクラスは、明らかに本開示の範囲内であり、以下の論述は、一般に、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに関することになる。ＩｇＧに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量おおよそ２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖ポリペプチド、および分子量５３，０００～７０，０００の２つの同一の重鎖ポリペプチドを含む。４本の鎖は、典型的に、ジスルフィド結合により「Ｙ」形状に連結されており、軽鎖が、「Ｙ」の口で始まって可変領域まで続いて重鎖を両側から挟んでいる。

【0051】

本開示の抗体、その抗原結合ポリペプチド、バリアントまたは誘導体は、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、ヒト、ヒト化、霊長類化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ結合性断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＫまたはＶＨドメインを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより生成される断片、ならびに抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書で開示される抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）を含むが、これらに限定されない。本開示の免疫グロブリンまたは抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであり得る。

【0052】

本明細書で使用される場合、用語「キメラ抗体」は、免疫反応性領域または部位が第１の種から得られまたはそれに由来し、定常領域（本開示によれば、無傷であることがあり、部分的であることがあり、または改変されていることがある）が第２の種から得られる、任意の抗体を意味すると考えられたい。ある特定の実施形態では、標的結合領域または部位は、非ヒト源（例えば、マウスまたは霊長類）からのものとなり、定常領域は、ヒトのものである。

【0053】

本明細書で開示される抗体は、鳥類および哺乳動物を含む任意の動物起源のものであり得る。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリ抗体である。一部の実施形態では、可変領域は、起源が軟骨魚網様のもの（例えば、サメからのもの）であり得る。

【0054】

本明細書で使用される場合、用語「組換え（の）」は、それがポリペプチドまたはポリヌクレオチドに付随する場合、天然に存在しないポリペプチドまたはポリヌクレオチドの形態を意図しており、その非限定的な例は、通常は一緒に存在しないポリヌクレオチドを組み合わせることにより作出され得る。

【0055】

ハイブリドーマ技術は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で行われ得る。一般に、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション反応は、約１０×ＳＳＣ、または等価のイオン強度／温度の溶液中、約４０℃で実行される。中ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、典型的に、約６×ＳＳＣ中、約５０℃で行われ、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション反応は、一般に、約１×ＳＳＣ中、約６０℃で行われる。ハイブリダイゼーション反応はまた、当業者には周知である「生理条件」下で行われ得る。生理条件の非限定的な例は、細胞に通常見られる温度、イオン強度、ｐＨおよびＭｇ２＋濃度である。
ＧＰＣ－３抗体

【0056】

別記実験例で実証されるように、本発明者らは、強力なマウス抗ＧＰＣ３抗体１８Ｃ１Ｄ９、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８、１６３Ｅ７Ｄ１２、１７２Ｂ４Ｅ９、１５２Ｅ９Ｆ７および１７１Ｆ９Ｃ５（表１）を生成することができた。例えば、実施例３で示されるように、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８抗体は、臨床開発中の有力な抗ＧＰＣ３抗体であるＧＣ３３より高い細胞ベースの結合効率を示した。加えて、実験データは、これらの新たな抗体が、細胞への内在化を誘導する点でより高い活性を有することを示す。そのような特性のため、これらの新たな抗体は、例えば抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）における使用に、特に好適である。

【0057】

さらに、ＶＨおよびＶＬ ＣＤＲ３におけるアミノ酸置換によって、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８抗体の配列をさらに最適化した。そのような最適化抗体の１つ、例えば、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃は、ＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞およびＨｕｈ－７細胞に、親５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８キメラｍＡｂと参照ＧＣ３３抗体の両方より高い親和性で結合した。

【0058】

５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃抗体のヒト化バージョンを生成し、ＧＣ３３はもちろん、別のベンチマーク抗体、Ｙ０３５（米国特許出願公開第２０１９００４６６５９号において開示されているような）とも比較した。興味深いことに、図１０および表１４に示されるとおり、ヒト化抗体５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃－ＶＨ１＋ＶＬ１および５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃－ＶＨ２＋ＶＬ３は、親抗体の高い親和性を保持し、ＧＣ３３とＹ０３５の両方よりも著しく性能が優れていた。

【0059】

ヒト化抗体を、結合効率をさらに向上させるための努力の一環としてさらなる親和性成熟に付した。図１１および表１６に示されているように、心強いことに、親和性成熟抗体の全てが、親抗体（５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃－ＶＨ２＋ＶＬ３）およびベンチマーク抗体ＧＣ３３と比較して向上した結合効率を示した。また驚くべきことに、中等度のＧＰＣ３発現レベルを有する細胞を標的とするとき、ヒト化抗体は、ＧＣ３３よりかなり高いＡＤＣＣシグナル伝達作用強度を示した（図１２および表１７）。

【0060】

これらのヒト化および親和性成熟抗体を、ＧＰＣ３発現細胞の存在下でＮＫ細胞を活性化するそれらの能力についてさらに試験した。図１３および表１８に示されているように、これらの新たな抗体の全てが、ＧＣ３３より高い活性を有した。それらは、ＧＣ３３よりもＮＫ細胞におけるＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αの高度な産生を誘導した（図１５）。

【0061】

親抗体５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８をヒト化にも付し、ヒト化したもののうちの２つであるＨｕ ５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－７およびＨｕ ５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－８を、それらの結合活性および内在化活性について、ＧＣ３３およびＹ０３５を参照として用いて、試験した。図１７～１８および表２４～２５に示されているように、これらのヒト化抗体は、両方の参照より性能が優れていた。非常に興味深いことに、Ｈｕ ５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－７／８のＣＤＲをＹ０３５のフレームワークに挿入したとき、またはＨｕ ５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－７／８のフレームワーク領域を、Ｙ０３５のＣＤＲを支持するために使用したとき、結果として生ずるグラフトされた抗体は全て、Ｙ０３５より成績がよかった（表２４）。これは、これらの新たな抗体のＣＤＲとフレームワーク配列の両方の卓越性を明確に示す。

【0062】

これらの抗体およびそれらのＣＤＲ配列は互いに高度に相同であることが認められ、これは、ＣＤＲ配列が交換可能であり得ることを示唆する（表Ａを参照されたい）。

【表A-1】

【表A-2】

【0063】

したがって、一実施形態では、本開示は、ＶＨ（重鎖可変領域）とＶＬ（軽鎖可変領域）とを含む抗グリピカン３抗体を提供する。ＶＨおよびＶＬ領域は、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３、例えば、表Ａ、１Ａ～１Ｆ、５Ａ～５Ｏ、８Ａおよび８Ｂに示されているものを含む。

【0064】

一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号７１のアミノ酸配列を含み、ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号７２のアミノ酸配列を含み、ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号７３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号７４のアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号７５のアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号７６のアミノ酸配列を含む。

【0065】

配列番号７１は、Ｘ _１ ＹＥＸ _２ Ｈであり、ここで、Ｘ_１は、Ｄ、ＲまたはＧであり得、Ｘ_２は、ＩまたはＭであり得る。配列番号７２は、ＡＩＸ _１ ＰＸ _２ Ｘ _３ Ｘ _４ Ｘ _５ ＴＡＹＸ _６ Ｘ _７ Ｘ _８ ＦＫＧであり、ここで、Ｘ_１は、Ｄ、ＧまたはＨであり得、Ｘ_２は、Ａ、ＥまたはＧであり得、Ｘ_３は、ＳまたはＴであり得、Ｘ_４は、ＤまたはＧであり得、Ｘ_５は、Ｄ、Ｇ、ＮまたはＳであり得、Ｘ_６は、Ｎ、ＳまたはＴであり得、Ｘ_７は、ＱまたはＳであり得、Ｘ_８は、Ｒ、ＫまたはＬであり得る。配列番号７３は、Ｘ _１ ＹＳＸ _２ ＡＹであり、ここで、Ｘ_１は、ＦまたはＹであり得、Ｘ_２は、ＦまたはＹであり得る。配列番号７４は、ＲＳＸ _１ ＱＳＸ _２ ＶＨＸ _３ ＮＧＸ _４ ＴＹＬＸ _５ であり、ここで、Ｘ_１は、ＲまたはＳであり得、Ｘ_２は、ＬまたはＰであり得、Ｘ_３は、Ｓ、ＲまたはＴであり得、Ｘ_４は、ＨまたはＮであり得、Ｘ_５は、ＨまたはＱであり得る。配列番号７５は、ＫＶＳＮＲＸ_１Ｘ_２であり、ここで、Ｘ_１は、ＦまたはＹであり得、Ｘ_２は、Ｓ、ＡまたはＰであり得る。配列番号７６は、Ｘ _１ Ｘ _２ Ｘ _３ Ｘ _４ ＨＶＰＹＴであり、ここで、Ｘ_１は、Ｆ、ＳまたはＶであり得、Ｘ_２は、ＱまたはＥであり得、Ｘ_３は、ＳまたはＴであり得、Ｘ_４は、ＩまたはＴであり得る。

【0066】

一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号１３および２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号１４、１９、２３、２６、２９および３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号１５、２０、２４および３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１６、２１、２７および３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１７のアミノ酸配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１８、２２、２８、３２および３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0067】

一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号１３、２５、５９および６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号１４、１９、２３、２６、２９、３０、６０および６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号１５、２０、２４および３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号１６、２１、２７および３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１７、６１、６４および６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１８、２２、２８、３２、３４および６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0068】

一部の実施形態では、ヒトＧＰＣ３への結合において本明細書で開示される抗体のいずれかと競合する、抗ＧＰＣ３抗体および抗原結合性断片も、提供される。一部の実施形態では、本明細書で開示される抗体のいずれかと同じエピトープに結合する、抗ＧＰＣ３抗体および抗原結合性断片も、提供される。一部の実施形態では、本明細書で開示される抗体のＶＨおよびＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含んだ、抗ＧＰＣ３抗体および抗原結合性断片も、提供される。

【0069】

一部の実施形態では、抗体５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃またはそのヒト化／親和性成熟バージョンのＣＤＲを含む、抗体または抗原結合性断片が、提供される。一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号１３、５９および６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号１９、６０および６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号１５のアミノ酸配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号２１のアミノ酸配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１７、６１、６４および６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１８および６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１３、１９、１５、２１、１７および１８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３５～３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４０～４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0070】

５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃に由来するヒト化抗体または抗原結合性断片の例としては、表８Ａに示されているものが挙げられる。例としては、配列番号３６のＶＨおよび配列番号４１のＶＬ、配列番号３６のＶＨおよび配列番号４２のＶＬ、配列番号３６のＶＨおよび配列番号４３のＶＬ、配列番号３６のＶＨおよび配列番号４４のＶＬ、配列番号３７のＶＨおよび配列番号４１のＶＬ、配列番号３７のＶＨおよび配列番号４２のＶＬ、配列番号３７のＶＨおよび配列番号４３のＶＬ、配列番号３７のＶＨおよび配列番号４４のＶＬ、配列番号３８のＶＨおよび配列番号４１のＶＬ、配列番号３８のＶＨおよび配列番号４２のＶＬ、配列番号３８のＶＨおよび配列番号４３のＶＬ、または配列番号３８のＶＨおよび配列番号４４のＶＬを有するものも挙げられる。

【0071】

一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３６のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４３のアミノ酸配列を含む。

【0072】

一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３６のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３６のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３６のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３７のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３８のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３８のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３８のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３８のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３９のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３９のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３９のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３９のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。

【0073】

これらの抗体の親和性成熟バージョン、例えば、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－１８＃－ＶＨ２＋ＶＬ３、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－１９＃－ＶＨ２＋ＶＬ３、および５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－２０＃－ＶＨ２＋ＶＬ３（表１５）も、提供される。一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号５９、６０、１５、２１、６１および６２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。

【0074】

一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号６３、１９、１５、２１、６４および６２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５５のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号５６のアミノ酸配列を含む。

【0075】

一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１３、６５、１５、２１、６６および６２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５７のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。

【0076】

一部の実施形態では、抗体５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８のＣＤＲを含む、抗体または抗原結合性断片が、提供される。一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１３、１９、２０、２１、１７および２２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３および４５～５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４、５１および５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0077】

５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８に由来するヒト化抗体または抗原結合性断片の例としては、表１９に示されているものが挙げられる。例としては、配列番号４５のＶＨおよび配列番号５１のＶＬ、配列番号４６のＶＨおよび配列番号５１のＶＬ、配列番号４７のＶＨおよび配列番号５１のＶＬ、配列番号４８のＶＨおよび配列番号５１のＶＬ、配列番号４９のＶＨおよび配列番号５１のＶＬ、配列番号５０のＶＨおよび配列番号５１のＶＬ、配列番号４５のＶＨおよび配列番号５２のＶＬ、配列番号４６のＶＨおよび配列番号５２のＶＬ、配列番号４７のＶＨおよび配列番号５２のＶＬ、配列番号４８のＶＨおよび配列番号５２のＶＬ、配列番号４９のＶＨおよび配列番号５２のＶＬ、または配列番号５０のＶＨおよび配列番号５２のＶＬを有するものも挙げられる。

【0078】

一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号４８のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号４８のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号５２のアミノ酸配列を含む。

【0079】

一部の実施形態では、表５Ａ～５Ｏに示されているような代替ＶＨ ＣＤＲ３およびＶＬ ＣＤＲ３を有するものなどの、抗体５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８に由来する抗体または抗原結合性断片が、提供される。一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号１３のアミノ酸配列を含み；ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号１９のアミノ酸配列を含み；ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号１５、２０、２４および３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号２１のアミノ酸配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号１７のアミノ酸配列を含み；ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１８、２２、２８、３２および３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0080】

一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３５のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号６７のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号６８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号６９のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３５のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号６８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号６７のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号６７のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号６８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号７０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号６７のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号７０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号３５のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号７０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号６９のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号６８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号６９のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号６９のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号７０のアミノ酸配列を含む。

【0081】

一部の実施形態では、抗体１８Ｃ１Ｄ９のＣＤＲを含む、抗体または抗原結合性断片が、提供される。一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１３～１８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。

【0082】

一部の実施形態では、抗体１６３Ｅ７Ｄ１２のＣＤＲを含む、抗体または抗原結合性断片が、提供される。一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１３、２３、２４、２１、１７および１８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号５のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。

【0083】

一部の実施形態では、抗体１７２Ｂ４Ｅ９のＣＤＲを含む、抗体または抗原結合性断片が、提供される。一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号２５、２６、２０、２７、１７および２８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。

【0084】

一部の実施形態では、抗体１５２Ｅ９Ｆ７のＣＤＲを含む、抗体または抗原結合性断片が、提供される。一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号２５、２９、２０、２７、１７および２８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号９のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。

【0085】

一部の実施形態では、抗体１７１Ｆ９Ｃ５のＣＤＲを含む、抗体または抗原結合性断片が、提供される。一部の実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号２５、３０、１５、３１、１７および３２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨは、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
抗体－薬物コンジュゲート

【0086】

予備データは、これらの新たな抗体が、細胞への内在化を誘導する点でより高い活性を有することを示す。そのような特性のため、これらの新たな抗体は、例えば抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）における使用に、特に好適である。

【0087】

一部の実施形態では、抗体または断片は、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的応答改変物質、医薬品、またはＰＥＧにコンジュゲートされ得る。

【0088】

一実施形態では、本開示の抗体または断片は、薬物部分に共有結合している。薬物部分は、抗体上にコンジュゲーション点を有する反応性の基であることがあり、またはその基を含むように改変されていることがある。例えば、薬物部分は、アルキル化（例えば、抗体のイプシロン－アミノ基リシンまたはＮ末端において）、酸化された炭水化物の還元アミノ化、ヒドロキシル基とカルボキシル基とのエステル交換、アミノ基またはカルボキシル基のアミド化、およびチオールへのコンジュゲーションにより、結合され得る。

【0089】

一部の実施形態では、抗体分子当たりのコンジュゲートされた薬物部分の数、ｐは、平均１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、または１～２の範囲である。一部の実施形態では、ｐは、平均２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、または２～３の範囲である。他の実施形態では、ｐは、平均１、２、３、４、５、６、７または８である。一部の実施形態では、ｐは、平均約１～約２０、約１～約１０、約２～約１０、約２～約９、約１～約８、約１～約７、約１～約６、約１～約５、約１～約４、約１～約３、または約１～約２の範囲である。一部の実施形態では、ｐは、約２～約８、約２～約７、約２～約６、約２～約５、約２～約４、または約２～約３の範囲である。

【0090】

例えば、タンパク質の化学的活性化が遊離チオール基の形成をもたらす場合、タンパク質は、スルフヒドリル反応性物質とコンジュゲートされ得る。一態様では、作用因子は、遊離チオール基に対して実質的に特異的であるものである。そのような作用因子としては、例えば、マレイミド、ハロアセトアミド（例えば、ヨード、ブロモまたはクロロ）、ハロエステル（例えば、ヨード、ブロモまたはクロロ）、ハロメチルケトン（例えば、ヨード、ブロモまたはクロロ）、ハロゲン化ベンジル（例えば、ヨウ化物、臭化物または塩化物）、ビニルスルホンおよびピリジルチオが挙げられる。

【0091】

薬物は、リンカーにより抗体または断片に連結され得る。好適なリンカーとしては、例えば、切断性および非切断性リンカーが挙げられる。切断性リンカーは、典型的に、細胞内条件下で切断されやすい。好適な切断性リンカーとしては、例えば、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼなどの細胞内プロテアーゼにより切断可能なペプチドリンカーが挙げられる。例示的な実施形態では、リンカーは、ジペプチドリンカー、例えば、バリン－シトルリン（ｖａｌ－ｃｉｔ）、フェニルアラニン－リシン（ｐｈｅ－ｌｙｓ）リンカー、またはマレイミドカプロン酸（maleimidocapronic）－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ｍｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＡ）リンカーであり得る。別のリンカーは、スルホスクシンイミジル－４－［Ｎ－マレイミドメチル］シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ｓｍｃｃ）である。スルホ－ｓｍｃｃコンジュゲーションは、マレイミド基を介して起こり、マレイミド基は、スルフヒドリル（チオール、－ＳＨ）と反応するが、そのスルホ－ＮＨＳエステルは、第一級アミン（リシンおよびタンパク質またはペプチドＮ末端に見られるような）に対して反応性である。さらに別のリンカーは、マレイミドカプロイル（ｍｃ）である。他の好適なリンカーとしては、特定のｐＨまたはｐＨ範囲で加水分解可能なリンカー、例えば、ヒドラゾンリンカーが挙げられる。追加の好適な切断性リンカーとしては、ジスルフィドリンカーが挙げられる。リンカー、例えば、ｍｃリンカーなどを、薬物を放出するために抗体が細胞内で分解されるはずであるような程度に、抗体に共有結合させることができる。

【0092】

リンカーは、抗体への連結のための基を含み得る。例えば、リンカーは、アミノ、ヒドロキシル、カルボキシルまたはスルフヒドリル反応性基（例えば、マレイミド、ハロアセトアミド（例えば、ヨード、ブロモまたはクロロ）、ハロエステル（例えば、ヨード、ブロモまたはクロロ）、ハロメチルケトン（例えば、ヨード、ブロモまたはクロロ）、ハロゲン化ベンジル（例えば、ヨウ化物、臭化物または塩化物）、ビニルスルホンおよびピリジルチオ）を含み得る。

【0093】

一部の実施形態では、薬物部分は、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤、免疫抑制剤、放射性同位体、毒素などである。コンジュゲートを、腫瘍細胞もしくはがん細胞の増殖を阻害するために、腫瘍もしくはがん細胞においてアポトーシスを引き起こすために、または患者におけるがんを処置するために、使用することができる。したがって、コンジュゲートを動物のがんの処置のための様々な状況で使用することができる。コンジュゲートを使用して、薬物を腫瘍細胞またはがん細胞に送達することができる。理論により拘束されるものではないが、一部の実施形態では、コンジュゲートは、ＧＰＣ３を発現するがん細胞に結合し、またはそれと会合し、コンジュゲートおよび／または薬物は、受容体媒介エンドサイトーシスによって腫瘍細胞またはがん細胞内に取り込まれ得る。

【0094】

細胞の中に入ると、コンジュゲート内（例えば、リンカーの中）の１つまたは複数の特定のペプチド配列は、１つまたは複数の腫瘍細胞またはがん細胞に付随するプロテアーゼによる加水分解で切断され、その結果、薬物が放出されることになる。その結果、放出された薬物は遊離して細胞内に遊走し、細胞傷害活性または細胞増殖抑制活性または他の活性を誘導する。一部の実施形態では、薬物は、腫瘍細胞もしくはがん細胞外で抗体から切断され、その後、薬物は、細胞に浸透するか、または細胞表面で作用する。

【0095】

薬物部分またはペイロードの例は、ＤＭ１（メイタンシン、Ｎ２’－デアセチル－Ｎ２’－（３－メルカプト－１－オキソプロピル）－またはＮ２’－デアセチル－Ｎ２’－（３－メルカプト－１－オキソプロピル）－メイタンシン）、ｍｃ－ＭＭＡＤ（６－マレイミドカプロイル－モノメチルアウリスタチン－ＤまたはＮ－メチル－Ｌ－バリル－Ｎ－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－メトキシ－４－［（２Ｓ）－２－［（１Ｒ，２Ｒ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソ－３－［［（１Ｓ）－２－フェニル－１－（２－チアゾリル）エチル］アミノ］プロピル］－１－ピロリジニル］－１－［（１Ｓ）－１－メチルプロピル］－４－オキソブチル］－Ｎ－メチル－（９Ｃｌ）－Ｌ－バリンアミド）、ｍｃ－ＭＭＡＦ（マレイミドカプロイル－モノメチルアウリスタチンＦまたはＮ－［６－（２，５－ジヒドロ－２，５－ジオキソ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－１－オキソヘキシル］－Ｎ－メチル－Ｌ－バリル－Ｌ－バリル－（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）－３－メトキシ－５－メチル－４－（メチルアミノ）ヘプタノイル－（αＲ，βＲ，２Ｓ）－β－メトキシ－α－メチル－２－ピロリジンプロパノイル－Ｌ－フェニルアラニン）およびｍｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＡ－ＭＭＡＥ（６－マレイミドカプロイル－ＶａｌｃＣｉｔ－（ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル）－モノメチルアウリスタチンＥまたはＮ－［［［４－［［Ｎ－［６－（２，５－ジヒドロ－２，５－ジオキソ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－１－オキソヘキシル］－Ｌ－バリル－Ｎ５－（アミノカルボニル）－Ｌ－オルニチル］アミノ］フェニル］メトキシ］カルボニル］－Ｎ－メチル－Ｌ－バリル－Ｎ－［（１Ｓ，２Ｒ）－４－［（２Ｓ）－２－［（１Ｒ，２Ｒ）－３－［［（１Ｒ，２Ｓ）－２－ヒドロキシ－１－メチル－２－フェニルエチル］アミノ］－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル］－１－ピロリジニル］－２－メトキシ－１－［（１Ｓ）－１－メチルプロピル］－４－オキソブチル］－Ｎ－メチル－Ｌ－バリンアミド）からなる群から選択される。ＤＭ１は、チューブリン阻害剤メイタンシンの誘導体であり、その一方で、ＭＭＡＤ、ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦは、アウリスタチンの誘導体である。一部の実施形態では、薬物部分は、ｍｃ－ＭＭＡＦおよびｍｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＡ－ＭＭＡＥからなる群から選択される。一部の実施形態では、薬物部分は、メイタンシノイドまたはアウリスタチンである。

【0096】

抗体または断片は、検出可能な標識、例えば、放射性標識、免疫調節物質、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、光活性治療または診断剤、薬物または毒素であり得る細胞傷害剤、超音波強化剤、非放射性標識、これらの組合せ、を含み得る治療剤、および当技術分野において公知の他のそのような薬剤にコンジュゲートまたは融合され得る。

【0097】

抗体を、化学発光化合物とカップリングさせることにより、検出可能に標識することができる。その結果、化学発光タグ付き抗原結合ポリペプチドの存在は、化学反応の過程において生ずる発光の存在を検出することにより決定される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマティック（theromatic）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。

【0098】

蛍光を発する金属、例えば、^１５２Ｅｕ、またはランタニド系列の他のものを使用して、抗体を検出可能に標識することもできる。ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート基を使用して、これらの金属を抗体に結合させることができる。様々な部分を抗体にコンジュゲートするための技法は、周知であり、例えば、Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985)；Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al., (eds.), Marcel Dekker, Inc., pp. 623- 53 (1987)；Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)；“Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press pp. 303-16 (1985)、およびThorpe et al., “The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Immunol. Rev. (52:119-58 (1982))を参照されたい。
多機能性分子

【0099】

腫瘍細胞上に優先的に発現される分子として、ＧＰＣ３に特異的な抗体または抗原結合性断片を、免疫細胞に特異的な第２のまたはそれより大きい序数の断片と化合させて、二重特異性抗体または多重特異性抗体を生成することができる。

【0100】

一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、食細胞、ナチュラルキラー細胞、好酸球、好塩基球およびマスト細胞からなる群から選択される。

【0101】

一部の実施形態では、第２の特異性は、ＣＤ３、ＣＤ４７、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＶＩＳＴＡ、ＣＳＦＲ１、Ａ２ＡＲ、ＣＤ７３、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＥＡ、ＨＥＲ２、ＣＭＥＴ、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＳＩＲＰＡ ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＨＶＥＭ、ＣＤ２７、ＶＥＧＦＲ、またはＶＥＧＦに対するものである。

【0102】

異なる形式の二重特異性抗体も提供される。一部の実施形態では、抗ＧＰＣ３断片および第２の断片の各々は、各々独立して、Ｆａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、または単一ドメイン抗体から選択される。一部の実施形態では、二重特異性抗体は、Ｆｃ断片をさらに含む。

【0103】

単に抗体を含むものでも抗原結合性断片を含むものでもない、二機能性分子も提供される。腫瘍抗原標的化分子として、ＧＰＣ３に特異的な抗体または抗原結合性断片、例えば、本明細書に記載されるものなどを、免疫サイトカインまたはリガンドと、必要に応じてペプチドリンカーを介して、化合させることができる。連結される免疫サイトカインまたはリガンドとしては、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＬＩＧＨＴおよびＧＩＴＲＬが挙げられるが、これらに限定されない。そのような二機能性分子は、免役チェックポイント遮断効果と腫瘍部位局所免疫調節を併せ持つことができる。
キメラ抗原受容体、ポリヌクレオチド、および抗体を調製する方法

【0104】

一実施形態では、本開示の抗体またはその断片を標的化ユニットとして含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も提供される。一部の実施形態では、ＣＡＲは、本開示の抗体またはその断片と、膜貫通ドメインと、共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ細胞内ドメインとを含む。

【0105】

膜貫通ドメインは、抗体または断片を含む細胞外ドメインに、必要に応じてヒンジドメインを介して、融合されるように設計され得る。それは、同様に、共刺激ドメインなどの細胞内ドメインに融合され得る。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、共刺激ドメインの天然の膜貫通領域（例えば、共刺激ドメインとして利用されるＣＤ２８Ｔもしくは４－ＩＢＢのＴＭ領域）またはヒンジ領域の天然の膜貫通ドメイン（例えば、ヒンジドメインとして利用されるＣＤ８アルファまたはＣＤ２８ＴのＴＭ領域）を含み得る。

【0106】

一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、細胞膜を貫通する、しかし細胞の細胞質へとおよび／または細胞外空間へと伸びる、配列を含み得る。例えば、膜貫通のものは、細胞の細胞質および／または細胞外空間へ伸びる１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くのアミノ酸をそれ自体がさらに含み得る、膜を貫通する配列を含み得る。したがって、膜貫通ドメインは、膜を貫通する領域を含み、その上、膜自体の内または外面を超えて伸びるアミノ酸をさらに含むことができ、それでもやはり、このような配列は、「膜貫通ドメイン」であると見なされ得る。

【0107】

一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、短いリンカーを介して細胞質ドメインに融合している。必要に応じて、短いペプチドまたはポリペプチドリンカー、好ましくは、長さ２アミノ酸～１０アミノ酸の間のものは、膜貫通ドメインとキメラ受容体の近位細胞質シグナル伝達ドメインとの連結を形成し得る。グリシン－セリンダブレット（ＧＳ）、グリシン－セリン－グリシントリプレット（ＧＳＧ）、またはアラニン－アラニン－アラニントリプレット（ＡＡＡ）は、好適なリンカーになる。

【0108】

一部の実施形態では、ＣＡＲは、さらに、共刺激ドメインを含む。一部の実施形態では、共刺激ドメインは、膜貫通ドメインと活性化ドメインの間に位置する。共刺激ドメインの例としては、ＣＤ２、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８ａ、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ（ＩＴＧＡＬ）、ＣＤ１１ｂ（ＩＴＧＡＭ）、ＣＤ１１ｃ（ＩＴＧＡＸ）、ＣＤ１１ｄ（ＩＴＧＡＤ）、ＣＤ１８（ＩＴＧＢ２）、ＣＤ１９（Ｂ４）、ＣＤ２７（Ｔ ＦＲＳＦ７）、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｔ、ＣＤ２９（ＩＴＧＢ１）、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ４０（ＴＮＦＲＳＦ５）、ＣＤ４８（ＳＬＡＭＦ２）、ＣＤ４９ａ（ＩＴＧＡ１）、ＣＤ４９ｄ（ＩＴＧＡ４）、ＣＤ４９ｆ（ＩＴＧＡ６）、ＣＤ６６ａ（ＣＥＡＣＡＭ１）、ＣＤ６６ｂ（ＣＥＡＣＡＭ８）、ＣＤ６６ｃ（ＣＥＡＣＡＭ６）、ＣＤ６６ｄ（ＣＥＡＣＡＭ３）、ＣＤ６６ｅ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＤ６９（ＣＬＥＣ２）、ＣＤ７９Ａ（Ｂ細胞抗原受容体複合体関連アルファ鎖）、ＣＤ７９Ｂ（Ｂ細胞抗原受容体複合体関連ベータ鎖）、ＣＤ８４（ＳＬＡＭＦ５）、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３（ＩＴＧＡＥ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５８Ａ（ＫＩＲ２ＤＬ１）、ＣＤ１５８Ｂ１（ＫＩＲ２ＤＬ２）、ＣＤ１５８Ｂ２（ＫＩＲ２ＤＬ３）、ＣＤ１５８Ｃ（ＫＩＲ３ＤＰ１）、ＣＤ１５８Ｄ（ＫＩＲＤＬ４）、ＣＤ１５８Ｆ１（ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ）、ＣＤ１５８Ｆ２（ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ）、ＣＤ１５８Ｋ（ＫＴＲ３ＤＬ２）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ１６２（ＳＥＬＰＬＧ）、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）、ＣＤ２２９（ＳＬＡＭＦ３）、ＣＤ２４４（ＳＬＡＭＦ４）、ＣＤ２４７（ＣＤ３－ゼータ）、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＣＤ２６８（ＢＡＦＦＲ）、ＣＤ２７０（Ｔ ＦＳＦ１４）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２７９（ＰＤ－１）、ＣＤ３１４（ＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３１９（ＳＬＡＭＦ７）、ＣＤ３３５（Ｋ－ｐ４６）、ＣＤ３３６（Ｋ－ｐ４４）、ＣＤ３３７（Ｋ－ｐ３０）、ＣＤ３５２（ＳＬＡＭＦ６）、ＣＤ３５３（ＳＬＡＭＦ８）、ＣＤ３５５（ＣＲＴＡＭ）、ＣＤ３５７（ＴＮＦＲＳＦ １８）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、ＬＦＡ－１（ＣＤ １ １ａ／ＣＤ １８）、ＫＧ２Ｃ、ＤＡＰ－１０、ＩＣＡＭ－１、Ｋｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、ＬＦＡ－１、ＳＬＡＭＦ９、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ（ＧｒｐＬ）、ＳＬＰ－７６（ＬＣＰ２）、ＰＡＧ１／ＣＢＰ、ＣＤ８３リガンド、Ｆｃガンマ受容体、ＭＨＣクラス１分子、ＭＨＣクラス２分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、活性化ＮＫ細胞受容体、Ｔｏｌｌリガンド受容体、およびこれらの断片または組合せが挙げられるが、それらに限定されない。

【0109】

一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞質部分は、シグナル伝達／活性化ドメインも含む。一実施形態では、シグナル伝達／活性化ドメインは、ＣＤ３ζドメインであるか、またはＣＤ３ζドメインに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。

【0110】

本開示は、本開示の抗体、そのバリアントもしくは誘導体、またはＣＡＲをコードする、単離されたポリヌクレオチドまたは核酸分子も提供する。本開示のポリヌクレオチドは、抗原結合ポリペプチド、そのバリアントまたは誘導体の重鎖および軽鎖可変領域全体を同じポリヌクレオチド分子上にまたは別々のポリヌクレオチド分子上にコードし得る。加えて、本開示のポリヌクレオチドは、抗原結合ポリペプチド、そのバリアントまたは誘導体の重鎖および軽鎖可変領域の部分を同じポリヌクレオチド分子上にまたは別々のポリヌクレオチド分子上にコードし得る。

【0111】

抗体を作製する方法は、当技術分野において周知であり、本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合ポリペプチドの可変領域と定常領域の両方が、完全にヒトのものである。完全ヒト抗体は、当技術分野において記載されている技法を使用して、および本明細書に記載されているように作製することができる。例えば、特定の抗原に対する完全ヒト抗体を、抗原投与に応答してそのような抗体を産生するように改変されているが内在性遺伝子座が無効にされているトランスジェニック動物に抗原を投与することによって、調製することができる。そのような抗体を作製するために使用され得る例示的な技法は、米国特許第６，１５０，５８４号、同第６，４５８，５９２号、同第６，４２０，１４０号に記載されており、これらの参考特許文献は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
処置および使用

【0112】

本明細書に記載されるように、本開示の抗体、バリアント、誘導体、または抗体－薬物コンジュゲートを、ある特定の処置および診断方法において使用することができる。

【0113】

本開示は、本開示の抗体、断片、または抗体－薬物コンジュゲートを、本明細書に記載される障害または状態の１つまたは複数を処置するために患者、例えば、動物、哺乳動物およびヒトに投与することを含む、抗体に基づく治療に、さらに関する。本開示の治療化合物は、本開示の抗体（本明細書に記載のそのバリアントおよび誘導体を含む）、および本開示の抗体（本明細書に記載のそのバリアントおよび誘導体を含む）をコードする核酸またはポリヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。

【0114】

本開示の抗体を使用してがんを処置または阻害することもできる。上で提供されたように、ＧＰＣ３は、腫瘍細胞において、特に、肝臓、胃、膵臓、食道、卵巣および肺腫瘍において、過剰発現され得る。ＧＰＣ３の阻害は、腫瘍の処置に有用であることが示されている。

【0115】

したがって、一部の実施形態では、それを必要とする患者におけるがんを処置するための方法が提供される。方法は、一実施形態では、本開示の抗体、断片、または抗体－薬物コンジュゲートの有効量を患者に投与するするステップを必然的に伴う。一部の実施形態では、患者におけるがん細胞（例えば、間質細胞）の少なくとも１つは、ＧＰＣ３を過剰発現する。

【0116】

細胞療法、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法も、本開示で提供される。本開示の抗ＧＰＣ３抗体を含む（または代替的に、本開示の抗ＧＰＣ３抗体を発現するように操作された）ＣＡＲをコードするまたはそれと接触させるベクターによって形質導入される、好適な細胞を使用することができる。したがって、そのような接触または操作によって、細胞を、処置を必要とするがん患者に導入することができる。がん患者は、本明細書で開示されるようなタイプのいずれかのがんを有し得る。細胞（例えば、Ｔ細胞）は、例えば、腫瘍浸潤Ｔリンパ球、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはこれらの組合せであり得るが、それらに限定されない。

【0117】

一部の実施形態では、細胞は、がん患者彼または彼女自身から単離された。一部の実施形態では、細胞は、ドナーによりまたは細胞バンクから提供された。細胞が、がん患者から単離された場合、望ましくない免疫反応を最小限に抑えることができる。

【0118】

がんの非限定的な例としては、膀胱がん、乳がん、大腸がん、子宮内膜がん、食道がん、頭頸部がん、腎臓がん、白血病、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、黒色腫、膵臓がん、前立腺がん、および甲状腺がんが挙げられる。一部の実施形態では、がんは、胃、膵臓、食道、卵巣および肺がんのうちの１つまたは複数である。

【0119】

本開示の抗体もしくはバリアント、またはそれらの誘導体によって処置、予防、診断および／または予後判定され得る、細胞生存期間の増加に関連するさらなる疾患または状態としては、悪性病変および関連障害、例えば、白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、および赤白血病を含む））および慢性白血病（例えば、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病）を含む）、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、重鎖病、および固形腫瘍の、進行および／または転移が挙げられるがこれらに限定されず、固形腫瘍には、肉腫および癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞種、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫（menangioma）、黒色腫、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫が含まれるが、これらに限定されない。

【0120】

いずれの特定の患者についても具体的な投薬量および処置レジメンは、使用される特定の抗体、そのバリアントまたは誘導体、患者の年齢、体重、総体的な健康、性別および食事、ならびに投与の回数、排泄率、薬物の組合せ、ならびに処置される特定の疾患の重症度をはじめとする、様々な因子に依存することになる。医療介護者によるそのような因子の判断は、当技術分野における通常技能の範囲内である。量は、処置すべき個々の患者、投与経路、製剤のタイプ、使用される化合物の特徴、疾患の重症度、および所望される効果にも依存することになる。使用される量を当技術分野において周知の薬理学および薬物動態の原則によって決定することができる。

【0121】

抗体、断片、または抗体－薬物コンジュゲートの投与方法は、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外および経口経路を含むが、これらに限定されない。抗原結合ポリペプチドまたは組成物を、任意の適便な経路により、例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）からの吸収により、投与することができ、他の生物活性薬剤とともに投与することができる。したがって、本開示の抗原結合ポリペプチドを含有する医薬組成物を、経口投与、直腸投与、非経口投与、大槽内（intracistemally）投与、膣内投与、腹腔内投与、局所的に（粉末、軟膏、滴剤もしくは経皮パッチとして）投与、頬側投与、または口腔噴霧剤もしくは点鼻薬として投与することができる。

【0122】

用語「非経口」は、本明細書で使用される場合、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内注射および注入を含む、投与方法を指す。

【0123】

投与は、全身または局所のものであり得る。加えて、本開示の抗体を、脳室内および髄腔内注射を含む任意の好適な経路により、中枢神経系に導入することが望ましいことがあり、脳室内注射を、例えば、オマヤ貯留槽などの貯留槽に取り付けられた、脳室内カテーテルによって容易にすることができる。経肺投与も、例えば、吸入器またはネブライザー、およびエアロゾル化剤を含有する製剤を使用することにより、利用することができる。

【0124】

本開示の抗原結合ポリペプチドまたは組成物を、処置を必要とするエリアに局所投与することが望ましいことがあり、これは、例として、限定としてではなく、外科手術中の局所注入、外科手術後の創傷包帯法の、例えばそれと併せての、局所的適用により、注射により、カテーテルによって、坐薬によって、または留置剤によって達成することができ、前記留置剤は、膜、例えばシラスティック（sialastic）膜、または繊維を含む、多孔質、無孔質またはゼラチン質材料のものである。好ましくは、本開示の、抗体を含む、タンパク質を投与する場合、タンパク質が吸収されない材料を使用するように心掛けなければならない。

【0125】

炎症性、免疫または悪性疾患、障害または状態の処置、阻害および予防において有効であろう、本開示の抗体、断片、または抗体－薬物コンジュゲートの量を、標準的な臨床技法により決定することができる。加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを、最適な投薬量範囲の同定を助けるために、必要に応じて利用することができる。製剤に利用されることになる正確な用量は、投与経路、および疾患、障害または状態の重篤性にも依存することになり、実施者の判断および各患者の状況に応じて決定されるべきである。有効用量をｉｎ ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から導出された用量応答曲線から外挿することができる。

【0126】

一般的な提案として、本開示の抗体、断片、または抗体－薬物コンジュゲートの患者に投与される投薬量は、典型的に、患者の体重のｋｇ当たり０．００１ｍｇ～１００ｍｇ、患者の体重のｋｇ当たり０．０１ｍｇ～２０ｍｇの間、または患者の体重のｋｇ当たり０．５ｍｇ～１０ｍｇである。一般に、ヒト抗体は、外来ポリペプチドへの免疫応答に起因してヒトの体内で他の動物種からの抗体より長い半減期を有する。したがって、ヒト抗体のより少ない投薬量、およびより低頻度の投与が、多くの場合、可能である。さらに、本開示の抗体の投薬量および投薬頻度を、例えば脂質化などの改変により抗体の取込みおよび組織透過性（例えば、脳への）を増強することによって、低減させることができる。

【0127】

追加の実施形態では、本開示の組成物は、サイトカインと組み合わせて投与される。本開示の組成物とともに投与され得るサイトカインとしては、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、およびＴＮＦ－αが挙げられるが、これらに限定されない。

【0128】

追加の実施形態では、本開示の組成物は、例えば放射線療法などの、他の治療または予防レジメンと組み合わせて投与される。
組成物

【0129】

本開示は、医薬組成物も提供する。そのような組成物は、抗体、断片、または抗体－薬物コンジュゲートの有効量と、許容される担体とを含む。一部の実施形態では、組成物は、第２の抗がん剤（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）をさらに含む。

【0130】

具体的な実施形態では、用語「薬学的に許容される」とは、動物における、さらに特にヒトにおける使用について、連邦もしくは州政府の監督機関により承認された、または米国薬局方もしくは他の一般に認知されている薬局方に収載されている、という意味である。さらに、「薬学的に許容される担体」は、一般に、任意のタイプの、非毒性固体、半固体もしくは液体フィラー、希釈剤、カプセル化材または製剤助剤であろう。

【0131】

用語「担体」は、それを用いて治療薬が投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような医薬担体は、滅菌液、例えば、水および油であり得、この油には、石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などが含まれる。水は、医薬組成物が静脈内投与されるときに好ましい担体である。生理食塩水、ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液も、液体担体として、特に、注射可能溶液に、利用することができる。好適な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は、所望される場合には、少量の湿潤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩もしくはリン酸塩も含有し得る。抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸；および浸透張力の調整のための薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースも、想定される。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、粉末、徐放性製剤などの形態をとり得る。旧来の結合剤および担体、例えば、トリグリセリドを用いて、組成物を坐薬として製剤化することができる。経口製剤は、標準的な担体、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含み得る。好適な医薬品担体の例は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるRemington’s Pharmaceutical Sciencesに記載されている。そのような組成物は、好ましくは精製された形態での、抗原結合ポリペプチドの治療有効量を、患者への適正投与のための形態を提供するために好適な量の担体とともに、含有することになる。製剤は、投与方法に適していなければならない。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または複数回投与用バイアルに封入され得る。

【0132】

ある実施形態では、組成物は、人間への静脈内投与に適応する医薬組成物として常套的手順に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与用の組成物は、滅菌等張性水性緩衝液中の溶液である。必要に応じ、組成物は、可溶化剤、および注射部位の痛みを和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔薬も含み得る。一般に、これらの成分は、別々にまたは混合されて単位剤形で、のどちらかで、例えば、活性薬剤の量を示すアンプルまたはサッシェなどの密閉シールされている容器の中の乾いた凍結粉末または無水濃縮物として供給される。組成物を注入により投与すべき場合、それは、医薬品グレードの滅菌水または食塩水が入っている注入ボトルを用いて分注され得る。組成物が注射により投与される場合、投与の前に成分を混合することができるように、注射用滅菌水または食塩水のアンプルが提供され得る。

【0133】

本開示の化合物を中性または塩形態として製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなどのアニオンとで形成されるもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどのカチオンとで形成されるものを含む。

【実施例】

【0134】

（実施例１）
ヒトＧＰＣ３に対するマウスモノクローナル抗体の生成
この実施例は、ハイブリドーマ技術を使用する抗ヒトＧＰＣ３マウスモノクローナル抗体の生成を説明する。

【0135】

抗原：ヒトＧＰＣ３－Ｈｉｓタンパク質。

【0136】

免疫化：ヒトＧＰＣ３を標的とするマウスモノクローナル抗体を生成するために、Ｂａｌｂ／ｃマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスを、先ず、ＧＰＣ３－Ｈｉｓタンパク質によって免疫した。その後、免疫化マウスにＧＰＣ３－Ｈｉｓタンパク質によって追加免疫した。ＧＰＣ３タンパク質に結合する抗体を産生するマウスを選択するために、免疫化マウスの血清をＥＬＩＳＡによる抗体力価評価に付した。手短に述べると、マイクロタイタープレートを、ＥＬＩＳＡコーティング用緩衝液中の０．５μｇ／ｍｌのヒトＧＰＣ３タンパク質、１００μｌ／ウェルで、４℃で一晩、コーティングし、次いで、１５０μｌ／ウェルの１％ＢＳＡでブロックした。免疫化マウスからの血清の希釈物を各ウェルに添加し、１～２時間、３７℃でインキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）で洗浄し、次いで、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートされた抗マウスＩｇＧ抗体とともに、１時間、３７℃でインキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で現像し、分光光度計によりＯＤ ４５０ｎｍで解析した。数ラウンドの免疫化後、免疫応答も、ＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞系に対する血清ＦＡＣＳにより試験し、ＣＨＯＫ１親細胞系が陰性対照としての役割を果たした。得られたマウスを、融合に使用した。ハイブリドーマ上清をＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。

【0137】

細胞融合：融合を電気融合により行った。融合細胞を、融合ごとに５０の９６ウェルプレートに蒔いた。

【0138】

スクリーニング：上清を、組換えヒト（ｒｈ）ＧＰＣ３－Ｈｉｓタンパク質およびカウンタースクリーニング抗原に対してＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。次いで、陽性上清に、ＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞系に対する細胞ベースの結合による確認スクリーニングを行った。

【0139】

サブクローニングおよびスクリーニング：各融合からの陽性初代クローンを、サブクローンが単一の親細胞に確実に由来するように限界希釈によってサブクローニングした。サブクローニングを初代クローンと同じアプローチでスクリーニングし、陽性クローンの培養上清に、親和性ランク付けによる追加の確認スクリーニングを行った。

【0140】

ハイブリドーマクローン１８Ｃ１Ｄ９、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８、１６３Ｅ７Ｄ１２、１７２Ｂ４Ｅ９、１５２Ｅ９Ｆ７および１７１Ｆ９Ｃ５をさらなる解析に選択した。１８Ｃ１Ｄ９、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８、１６３Ｅ７Ｄ１２、１７２Ｂ４Ｅ９、１５２Ｅ９Ｆ７および１７１Ｆ９Ｃ５の可変領域のアミノ酸配列を下の表１に収載する。

【表1】

【表1A】

【表1B】

【表1C】

【表1D】

【表1E】

【表1F】

【0141】

（実施例２）
マウスおよびキメラｍＡｂの結合親和性
マウスモノクローナル抗体の親和性ランク付け
ヒトＧＰＣ３－ｈｉｓへのマウスモノクローナル抗体の結合を、捕捉法を使用してＢｉａｃｏｒｅで試験した。抗体を、ＣＭ５センサーチップを使用して捕捉した。ヒトＧＰＣ３－ｈｉｓタグタンパク質の単一用量を、捕捉された抗体上に２分間、３０μｌ／分の流速で注入した。抗原を、３６０秒間、放置して解離させた。全ての実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋで行った。データ解析は、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ評価ソフトウェアを使用して行った。

【0142】

表２Ａの結果で示されるとおり、全てのマウスモノクローナル抗体は、組換えＧＰＣ３タンパク質に対して高い結合親和性を示した。

【表2A】

【0143】

次いで、マウス抗体１８Ｃ１Ｄ９、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８、１６３Ｅ７Ｄ１２、１７２Ｂ４Ｅ９、１５２Ｅ９Ｆ７および１７１Ｆ９Ｃ５の可変領域をヒトＩｇＧ１に融合させてキメラｍＡｂを生成した。
Ｂｉａｃｏｒｅによる５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８の完全動力学的親和性

【0144】

ヒトＧＰＣ３－ｈｉｓへのキメラ５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８ ｍＡｂの結合を、捕捉法を使用してＢｉａｃｏｒｅで試験した。５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８ ｍＡｂを、ＣＭ５センサーチップを使用して捕捉した。ヒトＧＰＣ３－ｈｉｓタグタンパク質の段階希釈物を、捕捉された抗体上に２分間、３０μｌ／分の流速で注入した。抗原を、３６０秒間、放置して解離させた。全ての実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋで行った。データ解析は、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ評価ソフトウェアを使用して行った。

【0145】

図１および下の表２Ｂの結果で示されるとおり、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８抗体は、組換えＧＰＣ３タンパク質に対して高い結合親和性を示した。

【表2B】

【0146】

（実施例３）
ＧＰＣ３抗原に対する結合活性
キメラ抗体のＦＡＣＳ試験
細胞ベースの結合：ＦＡＣＳを使用して、ヒトＧＰＣ３が過剰発現されたＣＨＯＫ１細胞に対するキメラｍＡｂ（１８Ｃ１Ｄ９、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８、１６３Ｅ７Ｄ１２、１７２Ｂ４Ｅ９、１５２Ｅ９Ｆ７および１７１Ｆ９Ｃ５）の結合活性を、公知のＧＰＣ３抗体ＧＣ３３（Ｃｈｕｇａｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）と比較して評価した。

【0147】

手短に述べると、ＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞をＦＡＣＳ緩衝液により洗浄し、５μｇ／ｍＬで出発して３倍段階希釈したキメラｍＡｂまたはＧＣ３３ ｍＡｂを有する各ウェルに、４℃で４０分にわたって分けた。ＦＡＣＳ緩衝液により洗浄した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を各ウェルに添加し、４℃で３０分間、インキュベートした。試料をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を評価した。ＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞に対する各ｍＡｂのＥＣ５０を下の表３Ａに収載する。５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８キメラ抗体は、ＧＣ３３より高い細胞ベースの結合効率を示した（図２Ａおよび表３Ａ）。

【表3A】

５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８キメラ抗体のＦＡＣＳ試験

【0148】

細胞ベースの結合：ＦＡＣＳを使用して、ヒトＧＰＣ３が過剰発現されたＣＨＯＫ１細胞、ＨＥＰＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞およびＨｕｈ－７細胞に対する５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８キメラｍＡｂの結合活性を、公知のＧＰＣ３抗体ＧＣ３３（Ｃｈｕｇａｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）と比較して評価した。

【0149】

手短に述べると、ＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞、ＨＥＰＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞またはＨｕｈ－７細胞を、先ず、Ｆｃブロッキング試薬とともに４℃で１５分間、インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液により洗浄し、３０μｇ／ｍＬで出発して３倍段階希釈した５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８キメラｍＡｂまたはＧＣ３３ ｍＡｂを有する各ウェルに、４℃で６０分にわたって分けた。細胞をＦＡＣＳ緩衝液により洗浄し、２％ＰＦＡによってＲＴで１５分間、固定した。ＦＡＣＳ緩衝液により洗浄した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧを各ウェルに添加し、ＲＴで３０分間、インキュベートした。試料をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １６により評価した。図２Ｂに示すように、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８は、ＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞、ＨＥＰＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞またはＨｕｈ－７細胞に同等の結合効率で結合した。これは、ＧＣ３３より高い。ＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞、ＨＥＰＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞およびＨｕｈ－７細胞に対する各ｍＡｂのＥＣ５０を下の表３Ｂに収載する。５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８抗体は、ＧＣ３３より高い細胞ベースの結合効率を示した（図２Ｂおよび表３Ｂ）。

【表3B】

異種間活性

【0150】

ＥＬＩＳＡ試験を行って、ヒト、マウスおよびカニクイザルＧＰＣ３へのキメラ抗体の結合をそれぞれ評価した。

【0151】

手短に述べると、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌのヒト、マウスおよびカニクイザルＧＰＣ３タンパク質、１００μｌ／ウェルで、４℃で一晩、コーティングし、次いで、１５０μｌ／ウェルの１％ＢＳＡでブロックした。９μｇ／ｍｌで出発するキメラ抗体の３倍希釈物を各ウェルに添加し、１時間、３７℃でインキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次いで、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートされたマウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体とともに、３０分間、３７℃でインキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で現像し、分光光度計によりＯＤ ４５０ｎｍで解析した。５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８抗体は、ヒト、カニクイザルＧＰＣ３およびマウスＧＰＣ３に結合した（図３および表４）。

【表4A】

【表4B】

【0152】

（実施例４）
５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８キメラｍＡｂの最適化
この実施例は、ヒトＧＰＣ３に対する５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８キメラｍＡｂの結合活性を増強するためのＣＤＲ３の変異による５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８キメラｍＡｂの最適化を説明する。

【0153】

変異：抗体のＣＤＲ３ドメインは、抗原と相互作用する上で極めて重要な役割を果たすので、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８キメラｍＡｂのＣＤＲ３ドメインに変異を加えた。ＣＤＲＨ３とＣＤＲＬ３の両方を、２つの候補変異部位を有するようにそれぞれ設計した。合わせて、ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ３配列の１５の候補組合せを、下の表５に収載する。

【表5-1】

【表5-2】

【表5-3】

【表5A】

【表5B】

【表5C】

【表5D】

【表5E】

【表5F】

【表5G】

【表5H】

【表5I】

【表5J】

【表5K】

【表5L】

【表5M】

【表5N】

【表5O】

ＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞への最適化抗体の細胞結合

【0154】

細胞ベースの結合：ＦＡＣＳを使用して、ヒトＧＰＣ３が過剰発現されたＣＨＯＫ１細胞に対する５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－１＃、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－２＃、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－３＃、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－４＃、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－５＃、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－７＃、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－８＃、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－９＃、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－１０＃、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－１１＃、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－１２＃、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－１３＃、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－１４＃および５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－１５＃キメラｍＡｂの結合活性を評価した。

【0155】

手短に述べると、ＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞を、先ず、Ｆｃブロッキング試薬とともに４℃で１５分間、インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液により洗浄し、３０μｇ／ｍＬで出発して３倍段階希釈した５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－１＃、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－２＃、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－３＃、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－４＃、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－５＃、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－７＃、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－８＃、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－９＃、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－１０＃、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－１１＃、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－１２＃、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－１３＃、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－１４＃および５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－１５＃キメラｍＡｂを有する各ウェルに、４℃で６０分にわたって分けた。細胞をＦＡＣＳ緩衝液により洗浄し、２％ＰＦＡによってＲＴで１５分間、固定した。ＦＡＣＳ緩衝液により洗浄した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧを各ウェルに添加し、ＲＴで３０分間、インキュベートした。試料をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １６により評価した。図４に示すように、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃キメラｍＡｂは、他のものより高い親和性でＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞に結合した。ＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞に対する各キメラｍＡｂのＥＣ５０を下の表６に収載する。

【表6-1】

【表6-2】

Ｂｉａｃｏｒｅによる最適化抗体の親和性ランク付け

【0156】

ヒトＧＰＣ３－ｈｉｓへの５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８ ｍＡｂの最適化抗体の結合を、捕捉法を使用してＢｉａｃｏｒｅで試験した。ヒトＧＰＣ３－ｈｉｓタグタンパク質の単一用量または２用量を、捕捉された抗体上に注入した。全ての実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋで行った。データ解析は、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ評価ソフトウェアを使用して行った。

【0157】

上の表６の結果で示されるとおり、最適化抗体は、組換えＧＰＣ３タンパク質に対して１０^－８～１０^－１０の範囲の多様な結合親和性を示した。加えて、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃ｍＡｂは、ＧＰＣ３タンパク質に対して最も高い親和性を示した。
ＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞への最適化抗体の細胞結合

【0158】

細胞ベースの結合：ＦＡＣＳを使用して、ヒトＧＰＣ３が過剰発現されたＣＨＯＫ１細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞およびＨｕｈ－７細胞に対する５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃キメラｍＡｂ、およびＧＣ３３抗体の結合活性を評価した。

【0159】

手短に述べると、ＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞またはＨｕｈ－７細胞を、先ず、Ｆｃブロッキング試薬とともに４℃で１５分間、インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液により洗浄し、３０μｇ／ｍＬで出発して３倍段階希釈した５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃キメラｍＡｂまたはＧＣ３３抗体を有する各ウェルに、４℃で６０分にわたって分けた。細胞をＦＡＣＳ緩衝液により洗浄し、２％ＰＦＡによってＲＴで１５分間、固定した。ＦＡＣＳ緩衝液により洗浄した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧを各ウェルに添加し、ＲＴで３０分間、インキュベートした。試料をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １６により評価した。図５に示すように、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃キメラｍＡｂは、ＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞およびＨｕｈ－７細胞に、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８キメラｍＡｂとＧＣ３３抗体の両方より高い親和性で結合した。ＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞およびＨｕｈ－７細胞に対する各ｍＡｂのＥＣ５０を下の表７に収載する。

【表7】

【0160】

（実施例５）
キメラ抗体５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃のヒト化
５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃可変領域を利用して、ヒト化ｍＡｂを作出した。このプロセスの第１ステップでは、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を、ヒトＩｇ遺伝子配列の利用可能なデータベースと比較して、全体として最もよくマッチするヒト生殖細胞系列Ｉｇ遺伝子配列を見つけた。

【0161】

５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃の軽鎖については、ＩＧＫＶ２－２９^＊０２が最良適合生殖細胞系列であり、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃の重鎖については、ＩＧＨＶ１－４６^＊０１をヒト化骨格として選択した。次いで、ヒト化５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃ ＣＤＲグラフト抗体を設計し、ＣＤＲＬ１、Ｌ２およびＬ３をＩＧＫＶ２－２９^＊０２のフレームワーク配列にグラフトし、ＣＤＲＨ１、Ｈ２およびＨ３をＩＧＨＶ１－４６^＊０１のフレームワーク配列にグラフトした。次いで、３Ｄモデルを生成して、抗体結合および立体構造に不可欠である、元のマウスＦＲ領域配列内のアミノ酸を決定した。５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃ ＣＤＲグラフト抗体配列に基づいて、３本の追加のヒト化重鎖および３本の追加のヒト化軽鎖を作出した。重鎖の場合、フレームワーク内のＬ、Ｋ、Ｉ、Ａ、ＦおよびＴが復帰変異に関与した。軽鎖の場合、フレームワーク内のＫおよびＦが復帰変異に関与した。

【0162】

ヒト化抗体のアミノ酸配列を下の表８に収載する。

【表8A】

【表8B】

【0163】

次いで、４本のヒト化重鎖および４本のヒト化軽鎖を合成し、ｐｃＤＮＡ３．４ベクターにそれぞれクローニングした。プラスミドの抽出後、４本の重鎖および４本の軽鎖を対合させ、ＨＥＫ２９３細胞に発現させた。ヒトＶＨおよびヒトＶＬの対合によって、１６のヒト化抗体が作出された（表９を参照されたい）。

【表9】

【0164】

（実施例６）
ヒト化抗体の抗原結合特性
Ｂｉａｃｏｒｅによるヒト化抗体の親和性ランク付け
抗原結合活性を評価するために、キメラ抗体の親和性をＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋにより測定した。ヒトＧＰＣ３－ｈｉｓタグタンパク質の段階希釈物を、捕捉されたキメラ抗体５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃－ＶＨ＋ＶＬ上に３分間、３０μｌ／分の流速で注入した。抗原を、７２０秒間、放置して解離させた。複数検出用量の中で、キメラ抗体の親和性に最も近い親和性を有する２つの濃度を１６のヒト化抗体親和性検出に選択した。図６および表１０に示すように、１６全てのヒト化抗体は、同様の親和性を示した。これらは、キメラ抗体と同等である。

【表10-1】

【表10-2】

ヒトＧＰＣ３が過剰発現されたＣＨＯＫ１細胞、ＨＥＰＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞およびＨｕｈ－７細胞への結合

【0165】

抗原結合特性を評価するために、ヒト化抗体を、ヒトＧＰＣ３が過剰発現されたＣＨＯＫ１細胞、ＨＥＰＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞およびＨｕｈ－７細胞へのそれらの結合についてＦＡＣＳにより解析した。手短に述べると、ＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞、ＨＥＰＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞およびＨｕｈ－７細胞を、先ず、Ｆｃブロッキング試薬とともに４℃で１５分間、インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液により洗浄し、１０μｇ／ｍＬで出発して４倍段階希釈したヒト化抗体を有する各ウェルに、４℃で６０分にわたって分けた。細胞をＦＡＣＳ緩衝液により洗浄し、２％ＰＦＡによってＲＴで１５分間、固定した。ＦＡＣＳ緩衝液により洗浄した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧを各ウェルに添加し、ＲＴで３０分間、インキュベートした。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７のＭＦＩをＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １６により評価した。１６のヒト化抗体を２つのプレートに分けた。図７～８に示すとおり、ＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞、ＨＥＰＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞およびＨｕｈ－７細胞に対する各ヒト化抗体のＥＣ５０を下の表１１～１２に収載する。同じプレート内の５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃－ＶＨ＋ＶＬとヒト化抗体のＥＣ５０の比較により、ヒト化抗体の全ての候補は、キメラ抗体と同等の結合効率を示した。

【表11-1】

【表11-2】

【表12】

Ｂｉａｃｏｒｅによるヒト化抗体の完全動力学的親和性

【0166】

組換えＧＰＣ３タンパク質（ヒトＧＰＣ３－ｈｉｓタグ）へのヒト化抗体の結合を、捕捉法を使用してＢｉａｃｏｒｅで試験した。５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃－ＶＨ＋ＶＬ、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃－ＶＨ１＋ＶＬ１、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃－ＶＨ１＋ＶＬ３、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃－ＶＨ１＋ＶＬ４、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃－ＶＨ２＋ＶＬ４、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃－ＶＨ３＋ＶＬ１、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃－ＶＨ３＋ＶＬ３ ｍＡｂを、ＣＭ５センサーチップを使用して捕捉した。ヒトＧＰＣ３－ｈｉｓタグタンパク質の段階希釈物を、捕捉された抗体上に２分間、３０μｌ／分の流速で注入した。抗原を、３６０秒間、放置して解離させた。全ての実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で行った。データ解析を、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ評価ソフトウェアを使用して行った。結果を図９および下の表１３に示す。

【表13】

ヒトＧＰＣ３が過剰発現されたＣＨＯＫ１細胞およびＨＥＰＧ２細胞への結合

【0167】

ＦＡＣＳを使用して、ヒトＧＰＣ３が過剰発現されたＣＨＯＫ１細胞およびＨＥＰＧ２細胞に対する５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃－ＶＨ１＋ＶＬ１および５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃－ＶＨ２＋ＶＬ３の結合活性を、ＧＣ３３（Ｃｈｕｇａｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）およびＹ０３５（Ｃａｒｓｇｅｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、米国特許出願公開第２０１９００４６６５９号）と比較して評価した。ＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞およびＨＥＰＧ２細胞に対する各抗体のＥＣ５０を下の表１４に収載する。

【0168】

図１０に示すように、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃－ＶＨ１＋ＶＬ１と５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃－ＶＨ２＋ＶＬ３の両方が、ＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞およびＨＥＰＧ２細胞に同等の親和性で結合した。これらは、ベンチマークｍＡｂより高い。

【表14】

【0169】

（実施例７）
ヒト化抗体５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃の親和性成熟
５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃のヒト化抗体の親和性を増強するために、親和性成熟を行った。手短に述べると、ＣＤＲ領域に単点または２点飽和変異を含有する４つのファージライブラリーを構築した。ＣＤＲに特有の変異を有する３つの候補を、固体または液体パニングを用いる２ラウンドのスクリーニングにより得た。これらの候補のＣＤＲを５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃－ＶＨ２＋ＶＬ３フレームワークに移植して、さらなる結合および機能評価のための抗体を生成した。

【0170】

フレームワークに移植された親和性成熟候補の可変領域のアミノ酸配列を下の表１５に収載する。

【表15】

【表15A】

【表15B】

【表15C】

ヒトＧＰＣ３が過剰発現されたＣＨＯＫ１細胞への結合

【0171】

抗原結合特性を評価するために、親和性成熟抗体を、ヒトＧＰＣ３が過剰発現されたＣＨＯＫ１細胞へのそれらの結合について、前に説明したようにＦＡＣＳにより解析した。ＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞に対する各抗体のＥＣ５０を下の表１６に収載する。

【0172】

図１１に示すように、全ての親和性成熟抗体は、ＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞に関して親５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃－ＶＨ２＋ＶＬ３およびベンチマーク抗体ＧＣ３３より向上した結合効率を示した。

【表16】

【0173】

（実施例８）
ヒト化ＧＰＣ３抗体はＡＤＣＣシグナル伝達を媒介した
ＧＣ３３と比較して５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃－ＶＨ１＋ＶＬ１、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃－ＶＨ２＋ＶＬ３および３つの親和性成熟抗体の抗原結合媒介抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）シグナル伝達を評価するために、ＡＤＣＣシグナル伝達レポーターアッセイを構成した。手短に述べると、Ｆｃ領域に結合する高親和性アロタイプ（１７６Ｖ）を有する完全長ヒトＣＤ１６ａを、ジャーカット－ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞系（ジャーカット－ｈＣＤ１６ａ－ＮＦＡＴと呼ぶ）に導入した。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、この細胞系ではＮＦＡＴ応答エレメントの支配下にある。ジャーカット－ｈＣＤ１６ａ－ＮＦＡＴ細胞系によって、本発明者らは、下流のＮＦＡＴシグナル伝達を調べることによりＧＰＣ３結合媒介ＡＤＣＣシグナル伝達を評価することが可能になった。このレポーター細胞系を、高いまたは中等度のＧＰＣ３発現レベルをそれぞれ有するＨＥＰＧ２またはＨｕｈ－７肝細胞癌細胞を含むいくつかのＧＰＣ３陽性腫瘍細胞系を用いて共培養した。ルシフェラーゼに基づく化学発光を、ＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ６１３０）およびＥｎｖｉｓｉｏｎ ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｅｍｅｒ）により検出することができた。

【0174】

図１２および表１７に示すように、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃－ＶＨ１＋ＶＬ１と５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃－ＶＨ２＋ＶＬ３の両方は、ＨＥＰＧ２細胞およびＨｕｈ－７細胞への効率的なＧＰＣ３結合媒介ＡＤＣＣシグナル伝達を示した。これらは、ＧＣ３３より高度である。加えて、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－１９＃－ＶＨ２＋ＶＬ３と５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－２０＃－ＶＨ２＋ＶＬ３の両方は、ＨＥＰＧ２細胞へのＡＤＣＣシグナル伝達の、親５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃－ＶＨ２＋ＶＬ３より良好なＥＣ５０を示したが、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－１８＃－ＶＨ２＋ＶＬ３は、他の抗体より良好な最大ＡＤＣＣシグナル伝達作用強度を示した。注目すべきことに、中等度のＧＰＣ３発現レベルを示したＨｕｈ－７細胞では、全てのヒト化抗体は、ＧＣ３３より増強された最大ＡＤＣＣシグナル伝達作用強度を示した。

【表17】

【0175】

（実施例９）
ヒト化ＧＰＣ３抗体はＮＫ細胞による腫瘍致死を媒介した
この実施例では、ＧＰＣ３ヒト化抗体の機能活性を試験した。
９．１ ＧＰＣ３ヒト化抗体により媒介される標的細胞へのＮＫ細胞傷害性

【0176】

ＧＰＣ３媒介ＡＤＣＣシグナル伝達活性化が標的細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害効果につながるかどうかを評価するために、ヒト初代ＮＫ細胞媒介細胞傷害性アッセイを構成した。手短に述べると、新鮮なヒト初代ＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）を、健康なドナーのバフィーコートから、磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９２－６５７）によるネガティブ選択により単離した。単離されたＮＫ細胞の純度をＦＡＣＳ解析によりモニターし、純度は、典型的に、９０％より高かった。次いで、単離されたＮＫ細胞を２４時間、完全培養培地において休ませ、それらをエフェクター細胞として使用した。ＨＥＰＧ２またはＨｕｈ－７ヒト肝細胞癌細胞系を標的細胞として使用した。ＮＫ細胞媒介細胞傷害性アッセイを、細胞傷害性検出キット（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１６４４７９３００１）の製造業者のプロトコールに従うことにより行った。エフェクター細胞をウェル当たり細胞５．０×１０^４個の密度で丸底９６ウェルマイクロプレートにおいて１．０×１０^４標的細胞と共培養した（Ｅ／Ｔ比＝５：１）。５０ｎＭで出発して５倍で抗体を段階希釈し、対応するウェルに添加した。３７℃で５時間（ＨＥＰＧ２細胞について）または２４時間（Ｈｕｈ－７細胞について）のインキュベーション後、各ウェルにおける細胞の生存を表す乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を細胞傷害性検出キットにより検出した。吸光度を４９２ｎｍで測定した。計算式：細胞傷害性（％）＝（エフェクター－標的細胞ミックス－エフェクター細胞対照－低対照）／（高対照－低対照）×１００。４パラメーター非線形回帰曲線適合をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９によって行った。

【0177】

図１３および表１８に示すように、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃－ＶＨ１＋ＶＬ１と５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃－ＶＨ２＋ＶＬ３の両方は、ＨＥＰＧ２細胞およびＨｕｈ－７細胞への効率的なＧＰＣ３抗体媒介ＮＫ細胞傷害性を示した。これらは、ＧＣ３３より高度である。

【0178】

加えて、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－１９＃－ＶＨ２＋ＶＬ３と５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－２０＃－ＶＨ２＋ＶＬ３の両方は、ＨＥＰＧ２細胞への、親５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃－ＶＨ２＋ＶＬ３と同等のＧＰＣ３抗体媒介ＮＫ細胞傷害性を示した。興味深いことに、中等度のＧＰＣ３発現レベルを示したＨｕｈ－７細胞では、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－１９＃－ＶＨ２＋ＶＬ３と５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－２０＃－ＶＨ２＋ＶＬ３の両方は、親５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－６＃－ＶＨ２＋ＶＬ３より良好なＥＣ５０を示した。

【表18】

９．２ ＧＰＣ３ヒト化抗体により刺激されるＮＫ細胞の脱顆粒

【0179】

ＮＫ細胞の脱顆粒を刺激するＧＰＣ３ヒト化抗体の能力を調査するために、脱顆粒マーカーであるＣＤ１０７ａの発現レベルをＮＫ細胞において解析した。手短に述べると、ウェル当たり細胞２．５×１０^４個の密度でのエフェクター細胞としての上記のとおり生成したヒト初代ＮＫ細胞を、丸底９６ウェルマイクロプレートにおいて、ＨＥＰＧ２を含む２．５×１０^４標的細胞とともにコインキュベートした（Ｅ／Ｔ比＝１：１）。５０ｎＭで出発して５倍で抗体を段階希釈し、対応するウェルに添加した。３７℃で４時間のインキュベーション後、細胞を回収し、氷冷染色用緩衝液（ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ）で洗浄した。抗ＣＤ１０７ａ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２８６０８）を、ウェル当たり１μＬで、染色用緩衝液で希釈し、細胞とともに４０分間４℃で暗所においてインキュベートした。次いで、試料を洗浄し、２％ＰＦＡで固定した。細胞をフローサイトメーターＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅ １６（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で解析した。データをＦｌｏｗｊｏ １０．０ソフトウェアで解析した。４パラメーター非線形回帰曲線適合をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９によって行った。

【0180】

図１４に示すように、全てのＧＰＣ３ヒト化抗体は、ＧＣ３３よりも有効なＣＤ１０７ａ上方制御をＨＥＰＧ２細胞の存在下で刺激した。
９．３ ＧＰＣ３ヒト化抗体により刺激されるＮＫのサイトカイン産生

【0181】

標的細胞の存在下でＮＫ細胞のサイトカイン産生を刺激するヒト化抗体の能力を調査するために、ＮＫ細胞における細胞間ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αをＦＡＣＳ染色により解析した。手短に述べると、ヒト初代ＮＫ細胞をウェル当たり細胞２．５×１０^４個の密度でエフェクター細胞として上記のとおり調製し、丸底９６ウェルマイクロプレートにおいて、ＨＥＰＧ２を含む２．５×１０^４標的細胞と共培養した（Ｅ／Ｔ比＝１：１）。タンパク質輸送阻害剤ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）を共培養系に添加して、ＮＫ細胞活性化中の上清へのサイトカイン分泌を防止した。５０ｎＭで出発して５倍で抗体を段階希釈し、対応するウェルに添加した。３７℃で４時間のインキュベーション後、試料を洗浄し、Ｆｏｘｐ３／転写因子染色用緩衝液セット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号００－５５２３－００）の手順に従って細胞内染色した。抗ＩＦＮ－γ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号５０６５１０）および抗ＴＮＦ－α抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５６２７８３）を、ウェル当たり１μＬで、推奨の染色用緩衝液で希釈した。細胞をフローサイトメーターＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅ １６（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で解析した。データをＦｌｏｗｊｏ １０．０ソフトウェアで解析した。４パラメーター非線形回帰曲線適合をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９によって行った。

【0182】

図１５に示すように、全てのＧＰＣ３ヒト化抗体は、ＮＫ細胞においてＧＣ３３より多くのＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α産生をＨＥＰＧ２細胞の存在下で誘導した。

【0183】

（実施例１０）
キメラ抗体５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８のヒト化
５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８可変領域遺伝子を利用して、ヒト化ｍＡｂを作出した。このプロセスの第１ステップでは、５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８のＶＨおよびＶＬまたはＶＫのアミノ酸配列を、ヒトＩｇ遺伝子配列の利用可能なデータベースと比較して、全体として最もよくマッチするヒト生殖細胞系列Ｉｇ遺伝子配列を見つけた。

【0184】

手短に述べると、ＩＧＫＶ２－２９^＊０２およびＩＧＨＶ１－２^＊０２を、それぞれ、重鎖および軽鎖の骨格として使用した。次いで、３Ｄモデルを生成して、抗体結合および立体構造に不可欠である、元のマウスＦＲ領域配列内のアミノ酸を決定した。５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８ ＣＤＲグラフト抗体配列に基づいて、５本の追加のヒト化重鎖および１本の追加の軽鎖を作出した。重鎖の場合、フレームワーク内のＩ、Ｋ、Ａ、Ｌ、Ｔが復帰変異に関与した。軽鎖の場合、フレームワーク内のＦが復帰変異に関与した。

【0185】

ヒト化抗体の一部についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列を下の表１９に収載する。

【表19-1】

【表19-2】

【0186】

次いで、６本のヒト化重鎖および２本のヒト化軽鎖を合成し、ｐｃＤＮＡ３．４ベクターにそれぞれクローニングした。プラスミドの抽出後、６本の重鎖および２本の軽鎖を対合させ、ＨＥＫ２９３細胞に発現させた。ヒトＶＨおよびヒトＶＬの対合によって、１２のヒト化抗体が作出された（表２０を参照されたい）。

【表20】

【0187】

（実施例１１）
ヒト化抗体の抗原結合特性
Ｂｉａｃｏｒｅによるヒト化抗体の親和性ランク付け
抗原結合活性を評価するために、キメラ抗体の親和性をＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋにより測定した。キメラ抗体の親和性に最も近い親和性を有する２つの濃度を１２のヒト化抗体親和性検出に選択した。ヒトＧＰＣ３－ｈｉｓタグタンパク質を、捕捉された抗体上に３分間、３０μｌ／分の流速で注入した。抗原を、７２０秒間、放置して解離させた。表２１に示すように、１２全てのヒト化抗体は、キメラ抗体と同様の親和性を示した。

【表21】

ヒトＧＰＣ３が過剰発現されたＣＨＯＫ１細胞およびＨｕｈ－７細胞への結合

【0188】

抗原結合特性を評価するために、ヒト化抗体を、ヒトＧＰＣ３が過剰発現されたＣＨＯＫ１細胞およびＨｕｈ－７細胞へのそれらの結合についてＦＡＣＳにより解析した。手短に述べると、ＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞およびＨｕｈ－７細胞を、先ず、Ｆｃブロッキング試薬とともに４℃で１５分間、インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液により洗浄し、１０μｇ／ｍＬで出発して４倍段階希釈したヒト化抗体を有する各ウェルに、４℃で６０分にわたって分けた。細胞をＦＡＣＳ緩衝液により洗浄し、２％ＰＦＡによってＲＴで１５分間、固定した。ＦＡＣＳ緩衝液により洗浄した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧを各ウェルに添加し、ＲＴで３０分間、インキュベートした。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７のＭＦＩをＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １６により評価した。異なるプレートが５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－ＶＨ＋ＶＬのＥＣ５０に影響を与える可能性があったので、１２のヒト化抗体を２つのプレートに分けた。ＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞およびＨｕｈ－７細胞に対する各ヒト化抗体のＥＣ５０を下の表２２～２３に収載する。図１６に示すように、ヒト化抗体の全ての候補は、ＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞に関してキメラ抗体と同等の結合効率、およびＨｕｈ－７細胞に関してキメラ抗体より良好な結合効率を示した。

【表22】

【表23】

ヒトＧＰＣ３が過剰発現されたＣＨＯＫ１細胞、Ｈｕｈ－７細胞およびＨＥＰＧ２細胞への結合

【0189】

ＦＡＣＳを使用して、ＣＨＯＫ１細胞、Ｈｕｈ－７細胞およびＨＥＰＧ２細胞上に発現されたヒトＧＰＣ３に対するＨｕ ５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－７およびＨｕ ５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－８の結合活性を、ベンチマーク抗体ＧＣ３３およびＹ０３５と比較して評価した。Ｈｕ ５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－７ ＡｂのＣＤＲおよびフレームワークの特性を評価するために、２つのキメラ抗体を生成した。「Ｙ０３５ ＦＲに伴うＨｕ ５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－７／８ ＣＤＲ」と名付けた抗体は、Ｈｕ ５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－７ ＣＤＲおよびＹ０３５ ＦＲを含有する。「Ｈｕ ５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－７ ＦＲに伴うＹ０３５ ＣＤＲ」と名付けた抗体は、Ｈｕ ５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－７ ＦＲに移植されたＹ０３５ ＣＤＲを有するキメラ抗体を表す。ＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞、Ｈｕｈ－７細胞およびＨＥＰＧ２細胞に対する各抗体のＥＣ５０を下の表２４に収載する。

【0190】

図１７に示すように、Ｈｕ ５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－７とＨｕ ５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－８の両方は、ＧＰＣ３－ＣＨＯＫ１細胞、Ｈｕｈ－７細胞およびＨＥＰＧ２細胞に同等の親和性で結合した。これらは、ベンチマーク抗体ＧＣ３３およびＹ０３５より高い。より重要なこととして、Ｙ０３５ ＦＲに伴うＨｕ ５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－７／８ ＣＤＲと、Ｈｕ ５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－７ ＦＲに伴うＹ０３５ ＣＤＲの両方は、Ｙ０３５より高い親和性を示し、これは、Ｈｕ ５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－７のＣＤＲおよびフレームワークがＹ０３５の優れた結合能力の一因となることを実証していた。

【表24】

【0191】

（実施例１２）
ＧＰＣ３が発現された腫瘍細胞系に対するヒト化ＧＰＣ３抗体の内在化活性
細胞ベースの内在化を使用して、ＨＥＰＧ２細胞に対するＨｕ ５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－７およびＨｕ ５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－８の内在化活性をＹ０３５と比較して評価した。Ｈｕ ５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－７ ＡｂのＣＤＲおよびフレームワークの特性を評価するために、２つの抗体（Ｙ０３５ ＦＲに伴うＨｕ ５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－７／８ ＣＤＲ、およびＨｕ ５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－７ ＦＲに伴うＹ０３５ ＣＤＲ）も評価した。

【0192】

ＰＨＡｂチオール色素は、ｐＨ＞７で非常に低い蛍光を有するｐＨセンサー色素であり、ｐＨがそれぞれおよそ６．３または４．７であるエンドソームまたはリソソームにそれが内在化されたとき／場合、蛍光の劇的な増加が生じることになる。手短に述べると、ｐＨＡｂチオール色素で標識したα－ｈＩｇＧ二次抗体（１０μｇ／ｍＬ）を、抗体（２０μｇ／ｍＬ）とともに３０分間、インキュベートした。インキュベーション後、混合Ａｂを２倍で段階希釈した。次いで、希釈された混合物を、２×１０^４個のＨＥＰＧ２細胞を各ウェルに予め播種した９６ウェルアッセイプレートに、添加した。４８時間のインキュベーション後、蛍光シグナルをＭｕｌｔｉｍｏｄｅプレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）２１０５）で捕捉した。

【0193】

図１８に示すように、Ｈｕ ５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－７とＨｕ ５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－８の両方は、他のｍＡｂより高い内在化有効性を示した。加えて、Ｙ０３５ ＦＲに伴うＨｕ ５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－７／８ ＣＤＲは、Ｙ０３５より高い内在化有効性（より高いトップおよび同等のＥＣ５０）を示し、これは、Ｈｕ－５２Ｈ５Ｄ３Ｂ８－７のＣＤＲが、Ｙ０３５と比較して増強された標的媒介内在化の一因となることを示していた。各ｍＡｂのＥＣ５０およびトップを下の表２５に収載する。

【表25】

＊ ＊ ＊

【0194】

本開示は、記載した特定の実施形態によって範囲が限定されることはなく、これらの実施形態は、本開示の個々の態様の単一の実例として意図したものであり、機能的に等価であるあらゆる組成物または方法が本開示の範囲内である。本開示の主旨および範囲を逸脱することなく、本開示の方法および組成物に様々な改変および変形を加えることができることは、当業者には明らかであろう。したがって、本開示は、本開示の改変形態および変形形態を、それらが添付の請求項およびそれらの均等物の範囲内に入ることを条件に、包含する。

【0195】

本明細書で言及した全ての公表文献および特許出願は、個々の公表文献または特許出願各々が参照により組み込まれると具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

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【国際調査報告】