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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-10
(54)【発明の名称】バイオセンサを作製するための方法及びシステム
(51)【国際特許分類】
C12M 1/00 20060101AFI20241003BHJP
C12N 11/04 20060101ALI20241003BHJP
【ＦＩ】
C12M1/00 Z
C12N11/04
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024522172
(86)(22)【出願日】2022-10-14
(85)【翻訳文提出日】2024-06-11
(86)【国際出願番号】 US2022078126
(87)【国際公開番号】W WO2023064908
(87)【国際公開日】2023-04-20
(31)【優先権主張番号】63/256,086
(32)【優先日】2021-10-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】508032284
【氏名又は名称】カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー
(71)【出願人】
【識別番号】519177323
【氏名又は名称】ゴットフリート・ビルヘルム・ライプニッツ・ウニベルシタート・ハノーファー
(71)【出願人】
【識別番号】501357201
【氏名又は名称】ヘルムホルツ ツェントゥルム ミュンヘン ドイチェス フォルシュングスツェントゥルム フューア ゲズントハイト ウント ウムヴェルト （ゲーエムベーハー）
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100229448
【弁理士】
【氏名又は名称】中槇 利明
(72)【発明者】
【氏名】プレッテンブルク，オリヴァー
(72)【発明者】
【氏名】アールブレヒト，クリスティン
(72)【発明者】
【氏名】アダリアン，ディーヴィン
(72)【発明者】
【氏名】シュレール，アクセル
(72)【発明者】
【氏名】マデロ，シオマラ リネッテ
(72)【発明者】
【氏名】チェン，サムソン
(72)【発明者】
【氏名】ジラニ，ムハンマド ムサブ
【テーマコード（参考）】
4B029
4B033
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029BB16
4B033NA23
4B033NA24
4B033ND02
4B033NE02
(57)【要約】
電極の上にヒドロゲルの液滴を配置するステップ、真空において高速でウェハを回転させるステップ、及びウェハを加熱して硬化させるステップを含む滴下－スピン方法によって、バイオセンサ上に薄いヒドロゲル層を作製するための方法及びシステムが記載されている。この方法では、ヒドロゲル又は金属の層を追加することによって、１層及び多層センサを作製することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
バイオセンサを作製する方法であって、表面に電極を有するウェハ又は他の固体材料を提供するステップと、
前記電極の上にヒドロゲルの液滴を配置するステップと、
前記ウェハが部分真空に曝されている間に前記ウェハ又は他の固体材料を回転させるステップと、
水性媒体にある間に、少なくとも１時間、前記ウェハ又は他の固体材料を加熱するステップと、
を含む方法。
【請求項2】
前記ヒドロゲルは、プルラン、デキストラン、アルギン酸、ヒアルロン酸、又はそれらの混合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ヒドロゲルはプルランを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記電極は、白金、金、グラファイト、チタン、又はナノ粒子である、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記回転は、１００００ｒｐｍまでの最大速度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
回転は、第１の時間間隔に対するより低い速度から第２の時間間隔におけるより高い速度まで進む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記より低い速度は１０００ｒｐｍ未満であり、前記より高い速度は１０００ｒｐｍを超える、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記ウェハを加熱するステップは、１時間以上、少なくとも３７°Ｃまで前記ウェハを加熱することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記ヒドロゲルは、１つ以上の固定化された酵素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
酵素を含有していないさらなるヒドロゲル層を堆積させるステップをさらに含む、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記さらなるヒドロゲル層は、オキシダーゼファミリー由来の酵素を含有している、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記オキシダーゼファミリー由来の酵素は、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ウリカーゼオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、コルチゾールオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼのうち少なくとも１つを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記さらなるヒドロゲル層の上に金属層を堆積させるステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項14】
前記ウェハを加熱するステップの後で、前記ヒドロゲルの上に金属層を堆積させるステップをさらに含む、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記液滴は、２μＬから１００μＬの範囲内にある、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記液滴は、１００μＬを超える、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
基板層の上に導電層を含む電極と、前記導電層の上にヒドロゲル層と、
を含み、前記ヒドロゲル層は、厚さが３マイクロメートル未満であり、前記ヒドロゲル層内に固定化された酵素を含み、前記ヒドロゲル層は、共有結合性で非分解性のネットワークを有している、バイオセンサ。
【請求項18】
前記ヒドロゲル層の上に拡散バリアをさらに含む、請求項１７に記載のバイオセンサ。
【請求項19】
前記拡散バリアは金属を含む、請求項１８に記載のバイオセンサ。
【請求項20】
前記拡散バリアは、固定化された酵素を有さないヒドロゲルを含む、請求項１８に記載のバイオセンサ。
【請求項21】
前記拡散バリアの上に第２の拡散バリアをさらに含み、前記第２の拡散バリアは金属を含む、請求項２０に記載のバイオセンサ。
【請求項22】
前記ヒドロゲル層は、厚さが２００から６００ｎｍである、請求項１７乃至２１のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項23】
前記拡散バリアは、厚さが５０から１００ｎｍである、請求項１９に記載のバイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本願は、２０２１年１０月１５日に出願された“Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｎｇ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ”と題された米国仮特許出願第６３／２５６，０８６号に対する優先権を主張するものであり、その開示全体を参照により本明細書に援用する。
本願は、２０２１年１０月１５日に出願された“Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｎｇ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ”と題された米国仮特許出願第６３／２５６，０８６号に対する優先権を主張するものであり、その開示全体を参照により本明細書に援用する。
【0002】
本開示は、バイオセンサ用のコーティングの作製に関する。特に、本開示は、生体適合性バイオポリマーを用いたコーティングバイオセンサの作製に関する。
【背景技術】
【0003】
酵素アッセイ等のバイオマーカーを測定するための埋め込み型センサは、防御的な異物反応に曝されるため、寿命が限られている。この反応には、炎症、免疫細胞の動員、及びその後の線維性カプセル（ａ ｆｉｂｒｏｔｉｃ ｃａｐｓｕｌｅ）の形成が含まれる。これは、酵素活性の減少、ひいてはバイオセンシング能力の減少、並びに分析物の拡散を制限する可能性のある高密度なカプセルをもたらし、従って機能的測定ウィンドウを減らす。免疫分子はまた、電気化学的電極表面を汚し、電極の酸化還元能力を阻止及び不活性化している。現在の酵素バイオセンサの作製方法は、可変性なしに調整することが困難であり、かなりの個々の較正を必要としているということも事実である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】ＥＰ２１２０２８０２．１
【特許文献2】ＰＣＴ／ＥＰ２０２２／０７８６３５
【発明の概要】
【0005】
本明細書では、ヒドロゲルをスピンコーティング及び硬化することを介した、生体適合性バイオポリマーを用いてバイオセンサ上に正確なコーティングを作製するための方法及びシステムが記載される。これらの薄い、幾何学的に定められたプルランフィルムは、一貫した細孔サイズ、耐薬品性を有し、酵素に対して安定した保護環境を提供する。
【0006】
本発明の第１の態様において、バイオセンサを作製する方法が開示され、当該方法は：表面に電極を有するウェハ又は他の固体材料を提供するステップ；電極の上にヒドロゲルの液滴を配置するステップ；ウェハが部分真空に曝されている間にウェハを回転させるステップ；及び、ウェハ又は他の固体材料を加熱するステップ；を含む。ウェハの代わりに、ガラス、ポリマー等の別の固体材料を使用して電極を支持することができる。
【0007】
本発明の第２の態様において、バイオセンサが開示され、当該バイオセンサは：基板層の上に導電層を含む電極；及び、導電層の上にヒドロゲル層；を含み、ヒドロゲル層は、厚さが３マイクロメートル未満であり、ヒドロゲル層内に固定化された酵素を含む。第２の態様の一部の実施形態において、ヒドロゲル層は、厚さが１マイクロメートル未満である。一部の実施形態において、酵素は、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ウリカーゼオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、コルチゾールオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、及び／又はサルコシンオキシダーゼ等、オキシダーゼファミリーにおけるものである。
【0008】
本開示の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面及び以下の説明に記載される。他の特徴、目的、及び利点は、説明、図面、及び特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、本開示の１つ以上の実施形態を例示し、例となる実施形態の説明と共に、本開示の原理及び実施を説明するのに役立つ。
【図1A】滴下－スピン（ｄｒｏｐ－ｓｐｉｎ）プロセスのための例となるセットアップを示した図である。
【図1B】滴下－スピンプロセスのための例となるセットアップを示した図である。
【図2A】上部にスパッタリングされた白金で被覆されたプルランの滴下－スピンの一例を示した図である。
【図2B】上部にスパッタリングされた白金で被覆されていないプルランの滴下－スピンの一例を示した図である。
【図3A】滴下－スピンセンサの例となる走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示した図であり、滴下－被覆（ｄｒｏｐ－ｃｏａｔ）プロセスによるセンサの一例を示している。
【図3B】滴下－スピンセンサの例となる走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示した図であり、滴下－スピンプロセスによるセンサの一例を示している。
【図4】滴下－スピンプロセスを使用して形成された多層の例を示した図である。
【図5A】滴下－スピン堆積により作製されたバイオセンサにおけるプルランヒドロゲルと白金電極との間の接着の例を示した図である。
【図5B】滴下－スピン堆積により作製されたバイオセンサにおけるプルランヒドロゲルと白金電極との間の接着の例を示した図である。
【図5C】滴下－スピン堆積により作製されたバイオセンサにおけるプルランヒドロゲルと白金電極との間の接着の例を示した図である。
【図5D】滴下－スピン堆積により作製されたバイオセンサにおけるプルランヒドロゲルと白金電極との間の接着の例を示した図である。
【図6A】例証的な１層の実施形態における滴下－スピン堆積の長寿命を例示した図であり、１層の実施形態の一例を示している。
【図6B】例証的な２層の実施形態における滴下－スピン堆積の長寿命を例示した図であり、２層の実施形態の一例を示している。
【図6C】例証的な１層及び２層の実施形態における滴下－スピン堆積の長寿命を例示した図であり、経時的な正規化感度の一例を示している。
【図6D】例証的な１層及び２層の実施形態における滴下－スピン堆積の長寿命を例示した図であり、３６日間にわたる（初期測定値に対する）正規化感度の例となる比較を示している。
【図7】例えば滴下－スピンによって作製されたセンサの濃度対電流の一例を示した図である。
【図8】濃度対電流についての（滴下－スピン作製方法によって被覆された）１層センサと２層センサとの間のさらなる例となる比較を示した図である。
【図10】経時的なＫｍ値に関する（各々が滴下－スピン作製方法によって被覆された）１層センサ対２層センサの例となる比較を示した図である。
【図11】２４日間にわたる乾燥ウェハ上で滴下－スピン作製方法によって被覆されたセンサに対する例となる酵素飽和曲線を示した図である。
【図12】滴下－スピン作製方法によって被覆されたセンサの長期寿命の例となるグラフを示した図である。
【図13A】二重層ヒドロゲルに関するデータの一例を示した図であり、二重層ヒドロゲルの一例を示している。
【図13B】二重層ヒドロゲルに関するデータの一例を示した図であり、経時的な感度の例となるグラフを示している。
【図13C】二重層ヒドロゲルに関するデータの一例を示した図であり、経時的なＫ値の例となるグラフを示している。
【図13D】二重層ヒドロゲルに関するデータの一例を示した図であり、経時的な正規化最大電流の例となるグラフを示している。
【図14A】滴下－被覆層対滴下－スピン層の厚さの例となる走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示した図である。
【図14B】滴下－被覆層対滴下－スピン層の厚さの例となる走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示した図である。
【図14C】滴下－被覆層対滴下－スピン層の厚さの例となる走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示した図である。
【図14D】滴下－被覆層対滴下－スピン層の厚さの例となる走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示した図である。
【図15】滴下－スピン方法による層の厚さを示すＳＥＭ画像の一例を示した図である。
【図16A】二重層ヒドロゲルセンサに対する例を示した図であり、センサコーティングの概略的な組成が描かれている。
【図16B】二重層ヒドロゲルセンサに対する例を示した図であり、９４８日間にわたる１つのセンサに対する酵素飽和曲線の例となるグラフを示している。
【図16C】二重層ヒドロゲルセンサに対する例を示した図であり、９４８日間にわたる１つのセンサに対する酵素飽和曲線の例となるグラフを示している。
【図16D】二重層ヒドロゲルセンサに対する例を示した図であり、１１４８日目のグルコース濃度の関数としての電流の例となるグラフを示している。
【図16E】１１４８日目の酵素飽和曲線の例となるグラフを示した図である。
【図17A】二重層被覆のヒドロゲルセンサに関する例となるデータを示した図であり、二重層ヒドロゲルの一例を示している。
【図17B】二重層被覆のヒドロゲルセンサに関する例となるデータを示した図であり、１日目のグルコース濃度の関数としての電流の例となるグラフを示している。
【図17C】二重層被覆のヒドロゲルセンサに関する例となるデータを示した図であり、１日目の酵素飽和曲線の例となるグラフを示している。
【図18A】二重層ヒドロゲルに関するデータの一例を示した図であり、二重層ヒドロゲルの一例を示している。
【図18B】二重層ヒドロゲルに関するデータの一例を示した図であり、１５日間にわたる酵素飽和曲線の例となるグラフを示している。
【発明を実施するための形態】
【0010】
生体適合性バイオポリマーを用いてバイオセンサ上に正確なコーティングを作製することは、電極上でヒドロゲルをスピンコーティング及び硬化することを介して達成することができる。スピンコーティング（「滴下－スピン」）によって、幾何学的に定められたフィルムを堆積させることができ、フィルムは、一貫した細孔サイズ及び耐薬品性を有し、その中で固定化された酵素に対して安定した保護環境となる。ヒドロゲルにおいて酵素を固定化するための例となるプロセスは、Ｏｌｉｖｅｒ Ｐｌｅｔｔｅｎｂｕｒｇ等によって発明され、２０２１年１０月１５日に出願された“ＨＹＤＲＯＧＥＬ ＦＯＲ ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＡＴＩＯＮ ＯＦ ＯＮＥ ＯＲ ＭＯＲＥ ＥＮＺＹＭＥ（Ｓ） ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤ ＦＯＲ ＰＲＥＰＡＲＩＮＧ ＴＨＥ ＳＡＭＥ”と題された特許文献１において見つけることができる。
【0011】
本明細書において使用される場合、電極は、通常は基板（Ｓｉ、窒化ケイ素、又はＳｉ／ＳｉＯ２等）上の導電層（Ｐｔ等）である。
【0012】
本明細書において使用される場合、拡散バリアは、別の金属由来の不純物の拡散から及び環境由来の腐食から導電金属層を保護するために使用される層である。
【0013】
一部の実施形態において、滴下－スピンプロセスは、ウェハの電極の上に１つ以上の間隔をあけたヒドロゲル（例えばプルラン等）の液滴を配置し、次に、高速でウェハを回転させることを含む。ウェハを真空下に配置して（例えば６０～７０ ｐｓｉで）スピンコータープラットフォームにウェハを保持するのに寄与することができる。ウェハは、代替案として、加えて接着剤で保持することができる。一部の実施形態において、電極は白金である。一部の実施形態において、電極は、別の貴金属（例えば、金、銀等）、白金族元素、グラファイト若しくはチタン等の金属のような生体適合性材料、又は酸化物（例えば、ＳｉＯ２、酸化チタン、若しくはＡｌ２Ｏ３等）、非貴金属、ナノ粒子若しくはナノチューブの層、又は、当技術分野において知られているセンサ上に堆積するための他の適切な導電性材料で作られている。一部の実施形態では、このプロセスに続いて加熱ステップが行われる。
【0014】
ヒドロゲルは、親水性ポリマーの３次元ネットワークである。多糖ポリマーを、全ての用途で使用することができるが、ヒドロゲルが第２の保護層として使用される場合には、他のポリマーを使用してもよい。ヒドロゲルは、例えば、炭水化物組成又は分子量が異なる１つ以上の多糖を含み得る。さらに、炭水化物ポリマーは、互いに又は他の種と共有結合するように官能基化することができる。加えて、ヒドロゲルは、他の非炭水化物ポリマー、例えば、ポリウレタン層又はグルタルアルデヒド／アルブミン混合物等と組み合わせて使用することができる。
【0015】
本明細書において及び本発明に関して使用される場合、「ヒドロゲル」という用語は、当業者には良く知られている用語であり、親水性である共有結合的に架橋されたポリマー鎖の任意のネットワークを含む。ヒドロゲルは、通常、特定の架橋剤によって共に保持されている親水性ポリマー鎖を含む３次元固体を構築する。固有の架橋剤のために、ヒドロゲルネットワークの構造的完全性は水に溶解しない。ヒドロゲルは、高吸収性の（９０％を超える水を含有することができる）天然又は合成ポリマーネットワークである。
【0016】
本発明の一部の態様において、異なるポリマー層を使用することが有用であり得る。これらのポリマーは、組成、極性、細孔サイズ、及び架橋の程度が異なり得る。これらの層は、以下に記載されるプロセスを使用して順次設置することができる。
【0017】
本発明の一実施形態において、１つ以上の酵素をポリマーの混合物に添加することができる。さらに、結果として生じる混合物の粘度は、さらなる溶媒、水、界面活性剤、又は当業者には知られている他の成分を添加することによって調整することができる。
【0018】
熱誘起の滴下－スピンゲル化プロセスによって、幾何学的に正確な層をセンサチップ表面に適用することが可能になる。これは、架橋の程度、リンカーの極性、リンカーの長さ、及び、対応して細孔サイズを制御することができるため、モジュール式作製システムを提供する。個々のゲル成分の非粘性溶液を混合及び滴下－スピンコーティングした後、酵素活性を維持するのに適合した温和な温度まで（例えば、１時間から１５時間４０°Ｃで）センサを加熱することによって、共有結合性の非分解性ネットワークの形成を層内で誘発することができる。
【0019】
本明細書において使用される場合、「共有結合ネットワーク」は、共有化学結合によって共に結合された、すなわち、例えば（ネットワークの形成に寄与する可能性があるが）静電又はファンデルワールス相互作用に排他的に依存しない少なくとも２つのポリマー成分を含む。「非分解性」という用語は、（例えばペプチダーゼ若しくはエステラーゼ等による）酵素反応又は自己加水分解によって切断することができない結合を形成することを指す。
【0020】
溶液を、電極パターンセットの中心に滴下し、次に、回転させて、標的領域にわたって広げることができる。パターンセット全体に広がる複数の液滴を使用することもできる。層の厚さは、より薄いフィルムを生成するより高い速度で回転速度（例えば、１０００～６０００ｒｐｍ等）を変えることによって変化させることができる。このプロセスは、微細作製ツーリングに適合し、結果として生じる層は、微細作製真空システム及び有機溶媒に適合する。２０ｎｍから１０００ｎｍの薄い層が達成可能であるが、必要に応じてより厚い層を達成することができる。一般に、薄い電極コーティング層は、電極に到達するための生成された反応生成物の拡散時間がより短いため、優れた信号効率を提供する。
【0021】
本明細書において示されているように、滴下－スピンプロセス及び様々な微細作製プロセスは、複数の配置における複数の層が構築されることを可能にする。これらの滴下－スピンヒドロゲルは、繰り返し層及びバイオセンサ電極に対して良好な接着性を示す。
【0022】
図１Ａは、滴下－スピン方法の一例を示している。滴下コーティング方法では、アプリケータ（１１０）（例えばピペット等）が、コーティング（例えばヒドロゲル等）の液滴（１１５）をウェハ（１２０）の表面に塗布し、これが、時間の経過に伴い１～３マイクロメートルの厚さまで広がる（１２５）。滴下－スピンコーティング方法では、回転プラットフォーム（１３０）がコーティング（１３５）をわずか２００～６００ｎｍの厚さまで圧縮させる。例となる液滴サイズは、混合物（例えば、プルラン＋酵素、２成分系等）から２０マイクロリットル（μＬ）である。例となる回転速度は、３０秒にわたり４０００ｒｐｍである。一部の実施形態において、回転速度は、１０００～６０００ｒｐｍの範囲内にある。一部の実施形態において、液滴サイズは、２μＬから１００μＬの範囲内にある。一部の実施形態において、液滴サイズは、１００μＬを超える。一部の実施形態において、回転は、第１の間隔（例えば１０秒間等）に対して低速（例えば５００ｒｐｍ等）で始まり、次に、第２の間隔（例えば３０秒等）に対して高速（例えば４０００ｒｐｍ等）まで増加する。例えば、低速は、１０００ｒｐｍ未満であってもよく、高速は、１０００ｒｐｍを超えてもよい。滴下－スピンの後、ヒドロゲルは、（例えば、４０°Ｃのオーブンにおいて）電極の上部で重合することができる。
【0023】
図１Ｂは、回転ステップの前に回転アセンブリ（１５５）上にセットされた複数の液滴（１４５）を有するウェハ（１５０）を示している。
【0024】
滴下－スピン方法は、ウェハ処理のためのマイクロエレクトロニクス方法に適合する。例えば、紫外線（ＵＶ）誘発官能基化、真空、有機溶媒によるクリアリング／洗浄等である。図２Ａ及び２Ｂは、滴下－スピン方法によって堆積されたプルラン上にスパッタリングされた白金（図２Ａ）、及び、白金を有していない滴下－スピン方法によって堆積されたプルラン（図２Ｂ）の例を示している。堆積プロセスは、電極上にバイオポリマーの薄層を正確に配置し、それと共に、その上部に金属コーティングを正確に配置することを可能にする。一部の実施形態において、コーティングは、センサあたり０．２μＬから１００μＬの範囲内にあり、又は、直径１００ｍｍのウェハあたり約２～１５ｍＬ（好ましくは３～１０ｍＬ）である。また、少量、すなわち０．１μＬから１０μＬを使用することができる。一部の実施形態において、バイオポリマー層は、厚さが６００ｎｍ未満である。一部の実施形態において、バイオポリマー層は、厚さが２００～６００ｎｍである。一部の実施形態において、バイオポリマー層は、厚さが２００～４００ｎｍである。一部の実施形態において、バイオポリマー層は、厚さが２００ｎｍ未満である。一部の実施形態において、バイオポリマー上の層（例えば白金等）は、厚さが５０ｎｍまでである。一部の実施形態において、バイオポリマー上の層は、厚さが５０ｎｍから１００ｎｍである。一部の実施形態において、バイオポリマー上の層は、厚さが１００ｎｍまでである。一部の実施形態において、バイオポリマー上の層は、厚さが１００ｎｍを超える。
【0025】
図３は、プルラン－酵素混合物が滴下－スピン方法によって堆積されたセンサの例となる走査電子顕微鏡画像を示している。示されているように、深い３Ｄ構造を有さない（例えば、２０ｎｍから１マイクロメートル等の）非常に薄い層が可能である。
【0026】
図４は、コーティング技術の例を示している。パネルＡは、電極（例えばシリコン／ＳｉＯ２上の白金等）の上の単層ヒドロゲル（例えばプルラン等）を示している。パネルＢは、ヒドロゲルネットワークにおいて固定化された酵素を有する単層ヒドロゲルを示している。パネルＣは、２層コーティングを示しており、ここで、最上層は、酵素を有さないバイオポリマー層であってもよく、それによって、拡散又は保護バリアとして作用している。これらの層は、特に薄層／多層が望まれる場合に、滴下スピンコーティングによって作製することができ、当業者によって理解されるように、他の作製方法を使用することもできる。パネルＤは、最上層にスパッタリングされた白金を有する異なる２層システムを示している。パネルＥは、スパッタリングされた白金層及び酵素を含まないヒドロゲル層の両方がヒドロゲル－酵素層の上にある３層システムを示している。これによって、体の免疫応答系の観点から改善されたアプローチが得られ、従って、埋め込み型チップに対してうまく機能する。さらに、所望の特性及び用途に応じて層を追加することができる。
【0027】
図５Ａから５Ｄは、ヒドロゲルと電極との接着の例を示している。この例では、センサ（白金電極）を、滴下－スピンによってプルラン－酵素で被覆し、次に、脱イオン水によって完全に覆われるのを可能にするのに十分大きいチャンバ内で、脱イオン水において２から３日間インキュベートした。これによって、結合したバイオポリマー及び固定化された酵素以外の全てが洗い流された。チャンバからウェハを取り出した後、電極の上にないヒドロゲル領域全てを洗い流した。プルランが電極領域に非常に強く付着する特定の領域が存在する。フォトリソグラフィー及びリフトオフ処理を使用して、基板上の電極の位置を定めることができる。ウェハ（例えばＳｉ３Ｎ４等）の他の領域では、プルランは除去される。個々のネットワーク特性及び密度は、使用されるポリマーの性質及びその架橋の程度に依存する。これは、ＰＣＭ１及びＰＣＭ９で覆われた電極の光学的外観によって例示することができる。しかし、電極接着特性は、２つの異なる架橋ポリマーに対して同等である。特定のバイオセンシングの問題に応じて、異なって変更された材料が、当業者によって理解されるように、所望の用途のための最適なコーティングを提供することができる。図５Ｃ及び５Ｄは、１回カルボキシメチル化された（ＣＭ）１プルラン（図５Ｃ）及び９回カルボキシメチル化された（ＣＭ９）プルラン（図５Ｄ）の接着の例を示している。
【0028】
本発明に関して、プルランのカルボキシメチル化の程度は、数が続く「ＰＣＭ」の表現（例えば、ＰＣＭ１、ＰＣＭ３、及びＰＣＭ５等）によって表される。この数は、それぞれのカルボキシメチル化の程度を特徴づけ、指定された回数の反復カルボキシメチル化反応サイクルを適用することによってプルランに導入されるカルボキシメチル基を意味している。本明細書において使用される場合、ＣＭ１、ＣＭ２、ＣＭ３等は、（特にプルランに言及することなく）一般的な多糖のそれぞれのカルボキシメチル化の程度を記述している。
【0029】
ＣＭ１（又はプルランの場合にはＰＣＭ１）は、低度に変性したバイオポリマーと考えられる。ＣＭ９（又はＰＣＭ９）は、高度に変性したバイオポリマーと考えられる。高度に変性したバイオポリマー（ＰＣＭ５～ＰＣＭ９）は、短いゲル化時間（２～５時間；４０ｍｇ／ｍｌ材料）を有する。低度に変性したバイオポリマー（ＰＣＭ１～３）は、３～１０時間のゲル化時間（４０ｍｇ／ｍｌ材料）を有する。
【0030】
図６Ａから６Ｄは、滴下－スピンで堆積したセンサシステムの長寿命を例示している。一例では、単一のウェハが、その上に滴下－スピン堆積した２つのセンサタイプを有し：それらは、単層のプルランＣＭ９（図６Ａ）、及び、上部の白金層を有するプルランＣＭ９（図６Ｂ）である。ここでのヒドロゲル層は、ＰＣＭにおいて単離されたグルコースオキシダーゼ（ＧＯＸ）を有するプルランＣＭ（ＰＣＭ）であった。電極システム上に堆積された層は、リン酸緩衝生理食塩水又は空気のいずれかにおいて保存した。滴下－スピンプロセスでは、酵素及びセンサは、室温での乾燥保存後も依然として活性であり、これは、以前の方法では異なるということに留意されたい。グルコース濃度は、４２ｍＭまでの範囲であった。どちらのセンサタイプも、高真空に曝露させ、その後、アセトンインキュベーションを（１～２時間）行い、次に、測定に先立ちイソプロピルアルコールで洗浄した。これらの困難な条件下でもセンサの機能性は維持されているということがわかる。
【0031】
図６Ｃは、センサに対する経時的な正規化感度を示している。図６Ｃ、６Ｄ、及び７～１１では、センサ１、２、５、６、及び７は１層センサ（図６Ａ、ＰＣＭ９＋ＧＯＸ）であり、センサ３、４、８、９、及び１０は２層センサ（図６Ｂ、ＰＣＭ９＋ＧＯＸ＋１００ｎｍ Ｐｔ）である。テストを、２つのウェハで行って、１つはＰＢＳにおいて保存し、もう１つは乾燥状態で保存した。
【0032】
【0033】
図７は、４３日間にわたる前の例のセンサ（図６Ａ及び図６Ｂ）に対する濃度対電流のグラフを示している。ウェハは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）において保存した。１層センサ（ここでは１、２、及び７）は、２層センサ（ここでは３、９、及び１０）とは異なる傾きを有し、初期勾配は時間と共に変化した。
【0034】
【0035】
図９Ａ及び９Ｂは、１層センサ（図６Ａ及び９Ａ）と２層センサ（図６Ｂ及び９Ｂ）との例となる比較を示しており、２層センサは１００ｎｍの厚さ（白金の最上層）を有し、いずれもＰＢＳにおいて保存した。示されているように、２層センサは、より良好な線形範囲を示している。観察された電流密度は、例えば、１０．５Ａ／ｍ２であり、これは、測定された電流（ｎＡの縦軸）を作用電極の面積で割ることによって得られ、例えば、測定された１５０ｎＡ＝１０．５Ａ／ｍ２である。
【0036】
図１０は、３～２４日までの１層センサ（図６Ａ）及び２層「サンドイッチ」センサ（図６Ｂ）のＫｍ（酵素の基質親和性）値の比較を示している。Ｋｍ値は、１層センサよりも２層センサの方が著しく高い。１層センサは、９～１２ｍＭのＫｍ値を有し、２層センサは、２５～３８ｍＭのＫｍ値を有した。
【0037】
図１１は、（前の例におけるセンサからの）例となる酵素飽和曲線を示している。データは、乾燥したウェハから２４日間にわたって取得した。２層センサ（ここでは４及び８；例えば図６Ｂ参照）は、１００ｎｍのＰｔ拡散バリア、２００～６００ｎｍのＧＯＸヒドロゲル層、２００ｎｍのＰｔ導電層、２０００ｎｍのＳｉＯ２、及び０．５ｍｍのＳｉ基板であった。２層センサは、より大きな線形範囲を示すため、１層センサと比較して経時的により安定している。１層センサ（ここでは１及び２；例えば図６Ａ参照）は、ＰＣＭ９である。
【0038】
図１２は、ＰＣＭ５ヒドロゲルの上に５０ｎｍのスパッタリングされた白金最上層を有する２層センサ（例えば図４Ｃ参照）であるセンサの長期（例えば２００日）寿命の例となるグラフを示している。センサは、室温（ｒｔ）で１×ＰＢＳにおいて保存した。
【0039】
図１３Ａ～１３Ｄは、２つの２層センサに対する例となるデータを示している（図４Ｃのセンサ７及び９参照）。図１３Ａは、センサの構造を示しており、これは、Ｐｔサンドイッチの代わりにヒドロゲル（酵素なし）で覆われた２層センサである。図１３Ｂは、経時的な正規化感度を示しており、経時的な感度の良好な安定性を示している。図１３Ｃは、経時的なＫｎｅｅ（Ｋ）値（ｍＭ）を示しており、これも非常に安定していることが示されている。図１３Ｄは、経時的な正規化最大電流を示しており、１６０日間にわたる１００から６０への低下のみを示している。これらの結果は、室温でＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）において行ったテストから得られたものである。ヒドロゲルはＰＣＭ５（中間範囲）であり、グルコースオキシダーゼが酵素である。
【0040】
図１４Ａ～１４Ｄは、滴下－被覆（以前の技術）塗布の例となる走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示している。示されているように、滴下－スピン塗布方法は、より薄い層を提供する。
【0041】
図１４Ａは、蒸留水（ｄＨ２Ｏ）における、ヒドロゲルを用いたＰＣＭ５の滴下－被覆を示している。図１４Ｂ及び１４Ｃは、ｄＨ２Ｏにおける、ヒドロゲルを用いたＰＣＭ９の滴下－被覆を示している。図１４Ｄは、ＰＢＳにおける、ヒドロゲルを用いたＰＣＭ６の滴下－被覆の拡大図を示している。
【0042】
【0043】
図１６Ａ～１６Ｄは、２層センサ（例えば図４Ｃ参照）に対する例証的なデータを示している。図１６Ａは、センサの組成を示しており、データは、ヒドロゲル層（酵素なし）で覆われた２層センサを参照している。図１６Ｂ及び１６Ｃは、９４８日の期間にわたる酵素飽和曲線を示している。図１６Ｄ及び図１６ＥＥのグラフは、１１４８日目のセンサの感度を示し、従って、センサのロバスト性及び酵素に対するヒドロゲルの安定化効果を例示している。いずれのヒドロゲル層もＰＣＭ５を含み、グルコースオキシダーゼを酵素として使用した。センサは、測定期間にわたって室温でＰＢＳ（ｐＨ７．４）において保存した。
【0044】
図１７Ａ～１７Ｃは、２層センサ（例えば図４Ｃ参照）に対する例証的なデータを示している。図１７Ａは、センサの組成を示しており、データは、ヒドロゲル層（酵素なし）で覆われた２層センサを参照している。図１７Ｂ～１７Ｃのグラフは、高グルコース濃度範囲（０～４２ｍＭ）にわたるセンサの感度を示している。４９ｎＡ／ｍＭの特に高い感度を、センサに対して決定した。第１のヒドロゲル層は、グルコースオキシダーゼが固定化されたＰＣＭ４ヒドロゲルで構成されており、第２のヒドロゲル層は、アルギン酸ヒドロゲルを含む。センサは、１日３７°ＣでＰＢＳ（ｐＨ７．４）において保存した。
【0045】
図１８Ａ～１８Ｂは、２層センサ（例えば図４Ｃ参照）に対する例となるデータを示している。センサの組成が図１８Ａにおいて描かれており、データは、ヒドロゲル（酵素なし）で覆われた２層センサを参照している。図１８Ｂのグラフは、１５日間にわたる酵素飽和曲線を示している。３７°Ｃでの１５日間の連続したインキュベーション期間にわたって、これらの結果は、固定化されたグルコースオキシダーゼの安定性及び長寿命、並びに、第２のアルギン酸のヒドロゲル層の肯定的な利点を実証している。第１のヒドロゲル層は、グルコースオキシダーゼが固定化されたＰＣＭ４ヒドロゲルで構成されており、第２のヒドロゲル層は、アルギン酸ヒドロゲルを含む。センサは、１５日間３７°ＣでＰＢＳ（ｐＨ７．４）において保存した。
【0046】
例となるヒドロゲル
本滴下－スピン方法は、１つ以上の酵素の共有結合を必要としない生体適合性ヒドロゲル（この例では「生体適合性ヒドロゲル」として特定される）において酵素を固定化する方法と共に使用することができる。このヒドロゲルは、酵素に対する完璧な安定化環境を提供し、より良好な寿命及び酵素の安定性をもたらしている。このヒドロゲルは、生物付着及び体の免疫応答から酵素を保護する。このヒドロゲルは、Ｏｌｉｖｅｒ Ｐｌｅｔｔｅｎｂｕｒｇ等によって発明され、２０２１年１０月１５日に出願された“ＨＹＤＲＯＧＥＬ ＦＯＲ ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＡＴＩＯＮ ＯＦ ＯＮＥ ＯＲ ＭＯＲＥ ＥＮＺＹＭＥ（Ｓ） ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤ ＦＯＲ ＰＲＥＰＡＲＩＮＧ ＴＨＥ ＳＡＭＥ”と題された特許文献１、及び、同じ題名を有し、２０２２年１０月１４日に出願され、ＷＯ／として公開された特許文献２において記載されており、これらは全て、参照により本明細書において援用する。
本滴下－スピン方法は、１つ以上の酵素の共有結合を必要としない生体適合性ヒドロゲル（この例では「生体適合性ヒドロゲル」として特定される）において酵素を固定化する方法と共に使用することができる。このヒドロゲルは、酵素に対する完璧な安定化環境を提供し、より良好な寿命及び酵素の安定性をもたらしている。このヒドロゲルは、生物付着及び体の免疫応答から酵素を保護する。このヒドロゲルは、Ｏｌｉｖｅｒ Ｐｌｅｔｔｅｎｂｕｒｇ等によって発明され、２０２１年１０月１５日に出願された“ＨＹＤＲＯＧＥＬ ＦＯＲ ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＡＴＩＯＮ ＯＦ ＯＮＥ ＯＲ ＭＯＲＥ ＥＮＺＹＭＥ（Ｓ） ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤ ＦＯＲ ＰＲＥＰＡＲＩＮＧ ＴＨＥ ＳＡＭＥ”と題された特許文献１、及び、同じ題名を有し、２０２２年１０月１４日に出願され、ＷＯ／として公開された特許文献２において記載されており、これらは全て、参照により本明細書において援用する。
【0047】
そのような生体適合性ヒドロゲルを調製する方法は、以下の：
ａ） 第１の多糖及び第２の多糖を提供するステップであり、好ましくは、第１の多糖及び／又は第２の多糖は、互いに独立して、プルラン、アルギン酸、セルロース、ヒアルロン酸、デキストラン、リケニン、レンチナン、及びそれらの混合物を含む群から選択され、ｎは第１及び／又は第２の多糖のモノマー繰り返し単位の数であり、ｎは１０から１００００までの整数である、ステップ；
ｂ） 任意的に、第１及び／又は第２の多糖の少なくとも１つのＯＨ基をカルボキシメチル化するステップ；
ｃ） 第１の多糖のモノマー繰り返し単位がカルボン酸残基を含まない場合に、構造－Ａ－Ｘの１つ以上のリンカー単位で第１の多糖を官能基化するか、又は、第１の多糖のモノマー繰り返し単位がカルボン酸残基を含む場合に、構造－Ｘの１つ以上のリンカー単位で第１の多糖を官能基化するステップであり、Ａは、－（ＣＨ２）ｄ－Ｃ（Ｏ）－又は－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－であり、ｄは１から３の整数であり、Ｘは、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｒ－Ｎ３、－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ－ＣＨ２ＣＨ２Ｎ３、及び－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ））ｔ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｎ３を含む群から選択され、ｒは２から２０の整数であり、ｓは１から１５の整数であり、ｔは１から１５の整数であり；
並びに、
第２の多糖のモノマー繰り返し単位がカルボン酸残基を含まない場合に、構造－Ａ´－Ｙの１つ以上のリンカー単位で第２の多糖を官能基化するか、又は、第２の多糖のモノマー繰り返し単位がカルボン酸残基を含む場合に、構造－Ｙの１つ以上のリンカー単位で第２の多糖を官能基化するステップであり、Ａ´は、－（ＣＨ２）ｄ－Ｃ（Ｏ）－又は－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－であり、ｄは１から３の整数であり、
Ｙは、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｒ－Ｑ、－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ－ＣＨ２ＣＨ２Ｑ、及び－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ））ｔ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｑを含む群から選択され、
Ｑは
ａ） 第１の多糖及び第２の多糖を提供するステップであり、好ましくは、第１の多糖及び／又は第２の多糖は、互いに独立して、プルラン、アルギン酸、セルロース、ヒアルロン酸、デキストラン、リケニン、レンチナン、及びそれらの混合物を含む群から選択され、ｎは第１及び／又は第２の多糖のモノマー繰り返し単位の数であり、ｎは１０から１００００までの整数である、ステップ；
ｂ） 任意的に、第１及び／又は第２の多糖の少なくとも１つのＯＨ基をカルボキシメチル化するステップ；
ｃ） 第１の多糖のモノマー繰り返し単位がカルボン酸残基を含まない場合に、構造－Ａ－Ｘの１つ以上のリンカー単位で第１の多糖を官能基化するか、又は、第１の多糖のモノマー繰り返し単位がカルボン酸残基を含む場合に、構造－Ｘの１つ以上のリンカー単位で第１の多糖を官能基化するステップであり、Ａは、－（ＣＨ２）ｄ－Ｃ（Ｏ）－又は－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－であり、ｄは１から３の整数であり、Ｘは、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｒ－Ｎ３、－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ－ＣＨ２ＣＨ２Ｎ３、及び－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ））ｔ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｎ３を含む群から選択され、ｒは２から２０の整数であり、ｓは１から１５の整数であり、ｔは１から１５の整数であり；
並びに、
第２の多糖のモノマー繰り返し単位がカルボン酸残基を含まない場合に、構造－Ａ´－Ｙの１つ以上のリンカー単位で第２の多糖を官能基化するか、又は、第２の多糖のモノマー繰り返し単位がカルボン酸残基を含む場合に、構造－Ｙの１つ以上のリンカー単位で第２の多糖を官能基化するステップであり、Ａ´は、－（ＣＨ２）ｄ－Ｃ（Ｏ）－又は－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－であり、ｄは１から３の整数であり、
Ｙは、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｒ－Ｑ、－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ－ＣＨ２ＣＨ２Ｑ、及び－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ））ｔ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｑを含む群から選択され、
Ｑは
【0048】
【化1】
【0049】
【化2】
Ｍ、Ｍ´＝Ｈ又はＭｅであり、さらに、
Ｗ＝ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＯＨ、ＮＨ２、又はＮＨＭｅである、ステップ；
ｄ） 任意的に、ステップａ）～ｃ）によって形成された混合物に１つ以上の酵素を添加するステップ；
ｅ） ステップａ）～ｄ）によって形成された混合物を、水性媒体において２５°Ｃから７０°Ｃの範囲内にある温度、好ましくは４０°Ｃで少なくとも１時間、好ましくは１から１０時間インキュベートするステップ；
を含み得る。
【0050】
生体適合性ヒドロゲルは：
以下の構造：
－ 第１の多糖及び第２の多糖であり、
好ましくは、第１の多糖及び／又は第２の多糖は、独立して、プルラン、アルギン酸、セルロース、ヒアルロン酸、デキストラン、リケニン、レンチナン、及びそれらの混合物を含む群から選択され、ｎは、第１の多糖及び／又は第２の多糖のモノマー繰り返し単位の数であり、ｎは、１０から１００００の整数である、第１の多糖及び第２の多糖、
－ 第１の多糖を第２の多糖に連結する１つ以上のリンカー単位であり、１つ以上のリンカー単位の構造が、
－Ａ－Ｚ１－Ｂ－Ｚ２－Ａ´－であり、
Ａ及びＡ´は、互いに独立して、－（ＣＨ２）ｄ－Ｃ（Ｏ）－又は－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－であり、ｄは１から３の整数であり、
Ｚ１は、－Ｏ－、－（ＣＨ２）ｒ－、－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ－ＣＨ２ＣＨ２－、及び、－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ））ｔ－ＣＨ２－ＣＨ２－を含む群から選択され、ｄは１から４の整数であり、ｒは２から２０の整数であり、ｓは１から１５の整数であり、ｔは１から１５の整数であり；
さらに、
Ｚ２は、－Ｏ－、－（ＣＨ２）ｒ－、－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ－ＣＨ２ＣＨ２－、及び、－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ））ｔ－ＣＨ２－ＣＨ２－を含む群から選択され、
Ｂは、
以下の構造：
－ 第１の多糖及び第２の多糖であり、
好ましくは、第１の多糖及び／又は第２の多糖は、独立して、プルラン、アルギン酸、セルロース、ヒアルロン酸、デキストラン、リケニン、レンチナン、及びそれらの混合物を含む群から選択され、ｎは、第１の多糖及び／又は第２の多糖のモノマー繰り返し単位の数であり、ｎは、１０から１００００の整数である、第１の多糖及び第２の多糖、
－ 第１の多糖を第２の多糖に連結する１つ以上のリンカー単位であり、１つ以上のリンカー単位の構造が、
－Ａ－Ｚ１－Ｂ－Ｚ２－Ａ´－であり、
Ａ及びＡ´は、互いに独立して、－（ＣＨ２）ｄ－Ｃ（Ｏ）－又は－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－であり、ｄは１から３の整数であり、
Ｚ１は、－Ｏ－、－（ＣＨ２）ｒ－、－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ－ＣＨ２ＣＨ２－、及び、－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ））ｔ－ＣＨ２－ＣＨ２－を含む群から選択され、ｄは１から４の整数であり、ｒは２から２０の整数であり、ｓは１から１５の整数であり、ｔは１から１５の整数であり；
さらに、
Ｚ２は、－Ｏ－、－（ＣＨ２）ｒ－、－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ－ＣＨ２ＣＨ２－、及び、－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ））ｔ－ＣＨ２－ＣＨ２－を含む群から選択され、
Ｂは、
【0051】
【化3】
Ｒ´は、１つ以上の酵素の非共有結合固定化のために、－ＣＦ３、－Ｃ（Ｏ）－ＯＭｅ、－Ｃ（Ｏ）－ＯＥｔ、－Ｃ（Ｏ）－ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ２、及び、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨＭｅを含む群から選択される、１つ以上のリンカー単位、
を含む架橋ポリマーを含み得る。
【0052】
本明細書において使用される場合、「生体適合性」という用語は、特にヒドロゲルに関連して、生体適合性であると呼ばれているか又は評価されているそれぞれの材料が、生物学的系に対して毒性又は有害な影響を及ぼさない品質を有するということ、レシピエントにおいていかなる望ましくない局所的又は全身的な影響も誘発することなくその所望の機能を果たすが、その特定の状況において最も適切で有益な応答を生成する能力、又は、有害な変化を引き起こすことなく組織と調和して存在する能力を有するということを意味する。生体適合性材料の好ましい特性は、炎症及び免疫応答の低下、及び／又は、低い／限定的な線維性カプセル化である。
【0053】
第１及び／又は第２の多糖は、任意的に、ステップｂ）においてカルボキシメチル化されてもよく、本明細書において先に記載した第１及び／又は第２の多糖の少なくとも１つのＯＨ基がカルボキシメチル化されてもよい。一実施形態において、カルボキシメチル化は、好ましくは、第１及び／又は第２の多糖がプルラン又はデキストランである場合に実行される。
【0054】
本明細書において使用される場合、「官能基化」又は「官能基化された」という用語は、一般に、新しい所望の特性を化合物に提供するための特定の官能基の付加、例えば、既存の多糖構造への１つ又は複数のリンカー単位の付加等を意味する。
【0055】
ステップｃ）における上記の第２の多糖の官能基化は、第２の多糖のモノマー繰り返し単位がカルボン酸残基を含まない場合に、構造－Ａ´－Ｙの１つ以上のリンカー単位で行われてもよく、又は、ステップｃ）における上記の第２の多糖の官能基化は、第２の多糖のモノマー繰り返し単位がカルボン酸残基を含む場合に、構造－Ｙの１つ以上のリンカー単位で行われてもよく、Ａ´は、－（ＣＨ２）ｄ－Ｃ（Ｏ）－又は－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－であり、ｄは１から３の整数であり、Ｙは、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｒ－Ｑ、－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）Ｓ－ＣＨ２ＣＨ２Ｑ、及び、－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ））ｔ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｑを含む群から選択され、
Ｑは
Ｑは
【0056】
【化4】
【0057】
【化5】
Ｍ、Ｍ´＝Ｈ又はＭｅであり、さらに、
Ｗ＝ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＯＨ、ＮＨ２、又はＮＨＭｅである。
【0058】
本発明において使用される場合、Ｑは
【0059】
【化6】
【0060】
【化7】
Ｍ、Ｍ´＝Ｈ又はＭｅであり、さらに、
Ｗ＝ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＯＨ、ＮＨ２、又はＮＨＭｅである。構造式
【0061】
【化8】
【0062】
【化9】
【0063】
【化10】
【0064】
【化11】
【0065】
さらに、本発明に関して、構造－Ａ´－Ｙの１つ以上のリンカー単位での第２の多糖の官能基化について、
Ｙは、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｒ－Ｑ、－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ－ＣＨ２ＣＨ２Ｑ、及び、－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ））ｔ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｑを含む群から選択され、
Ｑは
Ｙは、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｒ－Ｑ、－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ－ＣＨ２ＣＨ２Ｑ、及び、－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ））ｔ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｑを含む群から選択され、
Ｑは
【0066】
【化12】
【0067】
【化13】
Ｍ、Ｍ´＝Ｈ又はＭｅであり、さらに、
Ｗ＝ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＯＨ、ＮＨ２、又はＮＨＭｅであり、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｒ－Ｑ、－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ－ＣＨ２ＣＨ２Ｑ、又は、－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ））ｔ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｑ内でのＱの連結が、構造式
【0068】
【化14】
【0069】
【化15】
【0070】
一実施形態では、ステップｄ）において、任意的に、ステップａ）～ｃ）によって形成された混合物に１つ以上の酵素を添加することが実行されてもよい。この実施形態では、いかなる酵素も原則として可能である。
【0071】
ステップｅ）において、ステップａ）～ｄ）によって形成された混合物のインキュベーションが、水性媒体において２５°Ｃから７０°Ｃの範囲内にある温度で少なくとも１時間実行される。ステップｅ）において、ステップａ）～ｄ）によって形成された混合物のインキュベーションが、水性媒体において２５°Ｃから７０°Ｃの範囲内にある温度で１～１５時間実行されることがより好ましい。ステップｅ）において、ステップａ）～ｄ）によって形成された混合物のインキュベーションが、水性媒体において２５°Ｃから７０°Ｃの範囲内にある温度で１～１０時間実行されることがさらにより好ましい。
【0072】
ステップｅ）において、ステップａ）～ｄ）によって形成された混合物のインキュベーションが、水性媒体において３０°Ｃから６０°Ｃの範囲内にある温度で少なくとも１時間実行されることが好ましい。ステップｅ）において、ステップａ）～ｄ）によって形成された混合物のインキュベーションが、水性媒体において３０°Ｃから６０°Ｃの範囲内にある温度で１～１５時間実行されることがより好ましい。ステップｅ）において、ステップａ）～ｄ）によって形成された混合物のインキュベーションが、水性媒体において３０°Ｃから６０°Ｃの範囲内にある温度で１～１０時間実行されることがさらにより好ましい。
【0073】
ステップｅ）において、ステップａ）～ｄ）によって形成された混合物のインキュベーションが、水性媒体において３５°Ｃから５０°Ｃの範囲内にある温度で少なくとも１時間実行されることがさらに好ましい。ステップｅ）において、ステップａ）～ｄ）によって形成された混合物のインキュベーションが、水性媒体において３５°Ｃから５０°Ｃの範囲内にある温度で１～１５時間実行されることがより好ましい。ステップｅ）において、ステップａ）～ｄ）によって形成された混合物のインキュベーションが、水性媒体において３５°Ｃから５０°Ｃの範囲内にある温度で１～１０時間実行されることがさらにより好ましい。
【0074】
ステップｅ）において、ステップａ）～ｄ）によって形成された混合物のインキュベーションが、水性媒体において３５°Ｃから４５°Ｃの範囲内にある温度で少なくとも１時間実行されることがさらに好ましい。ステップｅ）において、ステップａ）～ｄ）によって形成された混合物のインキュベーションが、水性媒体において３５°Ｃから４５°Ｃの範囲内にある温度で１～１５時間実行されることがより好ましい。ステップｅ）において、ステップａ）～ｄ）によって形成された混合物のインキュベーションが、水性媒体において３５°Ｃから４５°Ｃの範囲内にある温度で１～１０時間実行されることがさらにより好ましい。
【0075】
ステップｅ）において、ステップａ）～ｄ）によって形成された混合物のインキュベーションが、水性媒体において約４０°Ｃの温度で少なくとも１時間実行されることがより好ましい。ステップｅ）において、ステップａ）～ｄ）によって形成された混合物のインキュベーションが、水性媒体において約４０°Ｃの温度で１～１５時間実行されることがさらにより好ましい。ステップｅ）において、ステップａ）～ｄ）によって形成された混合物のインキュベーションが、水性媒体において約４０°Ｃの温度で１～１０時間実行されることがさらにより好ましい。
ステップｅ）において、ステップａ）～ｄ）によって形成された混合物のインキュベーションが、水性媒体において３０°Ｃから６０°Ｃの範囲内にある温度で４から１０時間実行されることがさらに好ましい。ステップｅ）において、ステップａ）～ｄ）によって形成された混合物のインキュベーションが、水性媒体において３５°Ｃから５０°Ｃの範囲内にある温度で４から１０時間実行されることがさらに好ましい。ステップｅ）において、ステップａ）～ｄ）によって形成された混合物のインキュベーションが、水性媒体において３５°Ｃから４５°Ｃの範囲内にある温度で４から１０時間実行されることがさらに好ましい。ステップｅ）において、ステップａ）～ｄ）によって形成された混合物のインキュベーションが、水性媒体において約４０℃の温度で４から１０時間実行されることがより好ましい。
ステップｅ）において、ステップａ）～ｄ）によって形成された混合物のインキュベーションが、水性媒体において３０°Ｃから６０°Ｃの範囲内にある温度で４から１０時間実行されることがさらに好ましい。ステップｅ）において、ステップａ）～ｄ）によって形成された混合物のインキュベーションが、水性媒体において３５°Ｃから５０°Ｃの範囲内にある温度で４から１０時間実行されることがさらに好ましい。ステップｅ）において、ステップａ）～ｄ）によって形成された混合物のインキュベーションが、水性媒体において３５°Ｃから４５°Ｃの範囲内にある温度で４から１０時間実行されることがさらに好ましい。ステップｅ）において、ステップａ）～ｄ）によって形成された混合物のインキュベーションが、水性媒体において約４０℃の温度で４から１０時間実行されることがより好ましい。
【0076】
ステップｅ）において、ステップａ）～ｄ）によって形成された混合物のインキュベーションが、水性媒体において３０°Ｃから６０°Ｃの範囲内にある温度で４から６時間実行されることがさらに好ましい。ステップｅ）において、ステップａ）～ｄ）によって形成された混合物のインキュベーションが、水性媒体において３５°Ｃから５０°Ｃの範囲内にある温度で４から６時間実行されることがさらに好ましい。ステップｅ）において、ステップａ）～ｄ）によって形成された混合物のインキュベーションが、水性媒体において３５°Ｃから４５°Ｃの範囲内にある温度で４から６時間実行されることがさらに好ましい。ステップｅ）において、ステップａ）～ｄ）によって形成された混合物のインキュベーションが、水性媒体において約４０℃の温度で４から６時間実行されることがより好ましい。
【0077】
ステップｅ）において、ステップａ）～ｄ）によって形成された混合物のインキュベーションが、水性媒体において３０°Ｃから６０°Ｃの範囲内にある温度で６から８時間実行されることがさらに好ましい。ステップｅ）において、ステップａ）～ｄ）によって形成された混合物のインキュベーションが、水性媒体において３５°Ｃから５０°Ｃの範囲内にある温度で６から８時間実行されることがさらに好ましい。ステップｅ）において、ステップａ）～ｄ）によって形成された混合物のインキュベーションが、水性媒体において３５°Ｃから４５°Ｃの範囲内にある温度で６から８時間実行されることがさらに好ましい。ステップｅ）において、ステップａ）～ｄ）によって形成された混合物のインキュベーションが、水性媒体において約４０℃の温度で６から８時間実行されることがより好ましい。
【0078】
生体適合性ヒドロゲルを調製するこの方法は、ステップｅ）と共に、熱誘起ゲル化を含むステップを含んでもよく、このステップは、例えば、適切に形成された鋳型の完全な気泡のない充填によって、又は親油性有機媒体内に個々の成分の２つの非粘性溶液の混合物を滴下して規定の直径の液滴を形成することによって、例えば、特定のフォームファクタの形成を可能にする。生体適合性ヒドロゲルの共有結合性の非分解性ネットワークの形成は、酵素がその中にカプセル化された場合に、酵素活性を維持することと両立できる上記のような温和な温度まで加熱することによって誘発することができる。この方法は、１，３－双極子環化付加を介した架橋、副反応及び毒性試薬（例えばグルタルアルデヒド等）なしの非常に穏やかな反応条件下（例えば、水性媒体において４０°Ｃ）での熱ゲル化を含んでもよい。生体適合性ヒドロゲルの細孔サイズの最適化は、パラメータの実現可能な調整及び任意のカルボキシメチル化の程度の調整によって可能である。ステップｄ）において記載されているように酵素が添加される場合、１つ以上の酵素は、生成された生体適合性ヒドロゲルにおいて固定化され、次に、１つ以上の酵素は、周囲温度又は上昇した温度、例えば体温、３７°Ｃの溶液において遊離の酵素よりも有意に長く安定で活性である。アルコールオキシダーゼ又はグルコースオキシダーゼのような不安定な感受性酵素は、これらの条件下でより良好な寿命性能を有する。この実施形態は、他の感受性酵素にも適用可能である。そのような生成された生体適合性ヒドロゲルは、より多量の酵素活性を失うことなく、乾燥した状態で保存することができる。さらに、酵素の浸出は全く又はほとんど達成することはできない。この方法に従って調製されたそのようなヒドロゲルは、酵素活性を維持しながら、水性又は有機溶媒において懸濁させることができる（例えばアセトン等）。個々の成分並びに混合物の粘度は、容易に調整することができる。
【0079】
生体適合性ヒドロゲルを調製する方法の一実施形態において、第１の多糖及び第２の多糖は、プルラン、アルギン酸、セルロース、ヒアルロン酸、デキストラン、リケニン、レンチナン、及びそれらの混合物を含む群から互いに独立して選択される。
【0080】
プルランは、マルトトリオース単位を含む多糖ポリマーである。マルトトリオースの３つのグルコース単位が、α－１，４－グリコシド結合によって接続され、連続するマルトトリオース単位は、α－１，６－グリコシド結合によって互いに接続されている。プルランは、菌類のオーレオバシヂウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）によって澱粉から生成されてもよく、主に、乾燥及び捕食に抵抗するために細胞によって利用されてもよい。この多糖の存在も、細胞内外の両方への分子の拡散を促進する。本発明に関して、プルランに対するそれぞれのモノマー繰り返し単位は
【0081】
【化16】
【0082】
アルギンとも呼ばれるアルギン酸は、褐藻類の細胞壁内に広く分布する多糖であり、親水性であり、水和させられると粘性のゴムを形成する。アルギン酸は、（１－４）－結合β－Ｄ－マンヌロン酸（Ｍ）及びそのＣ－５エピマーα－Ｌ－グルロン酸（Ｇ）残基のホモポリマーブロックがそれぞれ異なる配列又はブロックで共に共有結合した線状コポリマーである。モノマーは、連続したＧ残基のホモポリマーブロック（Ｇブロック）、連続したＭ残基のホモポリマーブロック（Ｍブロック）、又はＭ残基とＧ残基とが交互に並んだホモポリマーブロック（ＭＧブロック）で現れてもよい。ナトリウム及びカルシウム等の金属では、その塩はアルギン酸塩として知られている。本発明に関して、アルギン酸に対するそれぞれのモノマー繰り返し単位は
【0083】
【化17】
【0084】
ヒアルロナンとも呼ばれるヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（ＨＡに省略される；共役塩基：ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ））は、結合組織、上皮組織、及び神経組織に広く分布するアニオン性の非硫酸化グリコサミノグリカンであり、非硫酸化であり、ゴルジ体の代わりに細胞膜において形成され、非常に大きくなり得るという点で、グリコサミノグリカンの中でユニークである。ヒアルロン酸は、それ自体がＤ－グルクロン酸及びＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンで構成された二糖のポリマーであり、交互のβ－（１→４）及びβ－（１→３）グリコシド結合を介して結合している。本発明に関して、ヒアルロナンに対するそれぞれのモノマー繰り返し単位は
【0085】
【化18】
【0086】
デキストランは、複雑な分岐グルカン（グルコースの縮合から得られる多糖）である。ＩＵＰＡＣは、「主にＣ－１→Ｃ－６のグリコシド結合を有する微生物起源の分岐ポリ－α－Ｄ－グルコシド」としてデキストランを定義している。デキストラン鎖は、異なる長さ（３から２０００キロダルトン）のものである。このポリマーの主鎖は、グルコースモノマー間にα－１，６－グリコシド結合を含み、α－１，３－結合からランダムに分岐している。この特徴的な分岐により、デキストランは、α－１，４又はα－１，６－結合によって繋ぎ止められた直鎖グルコースポリマーであるデキストリンと区別される。本発明に関して、デキストランに対するそれぞれのモノマー繰り返し単位は
【0087】
【化19】
【0088】
リケナン又はコケ澱粉（ｍｏｓｓ ｓｔａｒｃｈ）としても知られるリケニンは、特定の種の地衣類に存在する複雑なグルカンであり、化学的には混合結合グリカンであり、β－１，３－及びβ－１，４－グリコシド結合によって結合された繰り返しグルコース単位を含んでいる。本発明に関して、リケニンに対するそれぞれのモノマー繰り返し単位は
【0089】
【化20】
【0090】
レンチナンは、シイタケの子実体から単離された多糖である。化学的に、レンチナンは、β－１，６－分枝を有するβ－１，３－ベータ－グルカンである。本発明に関して、レンチナンに対するそれぞれのモノマー繰り返し単位は
【0091】
【化21】
【0092】
生体適合性ヒドロゲルを調製する方法の一実施形態において、第１及び／又は第２の多糖はデキストラン又はプルランであり、デキストラン又はプルランの少なくとも１つのＯＨ基のカルボキシメチル化はステップｂ）において実行される。この実施形態に対しては、デキストラン又はプルランの少なくとも１つのＯＨ基のカルボキシメチル化はステップｂ）においてデキストラン及び／又はプルランのＣ６で実行されることが好ましい。この実施形態に対しては、デキストラン又はプルランの少なくとも１つのＯＨ基のカルボキシメチル化はステップｂ）においてデキストラン及び／又はプルランのＣ２で実行されることが好ましい。この実施形態に対しては、デキストラン又はプルランの少なくとも１つのＯＨ基のカルボキシメチル化はステップｂ）においてデキストラン及び／又はプルランのＣ３で実行されることが好ましい。この実施形態に対しては、デキストラン又はプルランの少なくとも１つのＯＨ基のカルボキシメチル化はステップｂ）においてデキストラン及び／又はプルランのＣ４で実行されることが好ましい。
【0093】
生体適合性ヒドロゲルを調製する方法のさらなる実施形態では、ステップｃ）において、第１の多糖は、第１の多糖のモノマー繰り返し単位あたり０．０１～１．５のＡで官能基化される。生体適合性ヒドロゲルを調製する方法のさらに好ましい実施形態では、ステップｃ）において、第１の多糖は、第１の多糖のモノマー繰り返し単位あたり０．０５～１．５のＡで官能基化される。生体適合性ヒドロゲルを調製する方法のさらに好ましい実施形態では、ステップｃ）において、第１の多糖は、第１の多糖のモノマー繰り返し単位あたり０．０５～１．０のＡで官能基化される。
【0094】
生体適合性ヒドロゲルを調製する方法に対して、ステップｃ）において、第２の多糖は、第２の多糖のモノマー繰り返し単位あたり０．０１～１．５のＡ´で官能基化されることが好ましい。生体適合性ヒドロゲルを調製する方法のさらに好ましい実施形態では、ステップｃ）において、第２の多糖は、第２の多糖のモノマー繰り返し単位あたり０．０５～１．５のＡ´で官能基化される。本発明に従って生体適合性ヒドロゲルを調製する方法のさらに好ましい実施形態では、ステップｃ）において、第２の多糖は、第２の多糖のモノマー繰り返し単位あたり０．０５～１．０のＡ´で官能基化される。
【0095】
生体適合性ヒドロゲルを調製する方法のさらなる実施形態では、ステップｃ）において、第１の多糖は、第１の多糖のモノマー繰り返し単位あたり０．０１～１．５のＸで官能基化される。本発明に従って生体適合性ヒドロゲルを調製する方法のさらに好ましい実施形態では、ステップｃ）において、第１の多糖は、第１の多糖のモノマー繰り返し単位あたり０．０５～１．５のＸで官能基化される。本発明に従って生体適合性ヒドロゲルを調製する方法のさらに好ましい実施形態では、ステップｃ）において、第１の多糖は、第１の多糖のモノマー繰り返し単位あたり０．０５～１．０のＸで官能基化される。
【0096】
ステップｃ）において、第２の多糖は、第２の多糖のモノマー繰り返し単位あたり０．０１～１．５のＹで官能基化されることが好ましい。生体適合性ヒドロゲルを調製する方法のさらに好ましい実施形態では、ステップｃ）において、第２の多糖は、第２の多糖のモノマー繰り返し単位あたり０．０５～１．５のＹで官能基化される。生体適合性ヒドロゲルを調製する方法のさらに好ましい実施形態では、ステップｃ）において、第２の多糖は、第２の多糖のモノマー繰り返し単位あたり０．０５～１．０のＹで官能基化される。
【0097】
生体適合性ヒドロゲルを調製する方法の一実施形態において、ｄは１である。
【0098】
生体適合性ヒドロゲルを調製する方法に対して、ステップｅ）は、架橋ポリマーを形成するためのＸとＹとの間の熱誘起の環状付加反応であることがさらに好ましい。
【0099】
生体適合性ヒドロゲルを調製する方法の一実施形態において、Ｎ３の含有量は、第１の多糖のモノマー繰り返し単位あたり０．０１～１．５のＮ３である。生体適合性ヒドロゲルを調製する方法の１つの好ましい実施形態において、Ｎ３の含有量は、第１の多糖のモノマー繰り返し単位あたり０．０１～１．０のＮ３である。生体適合性ヒドロゲルを調製する方法の１つのさらに好ましい実施形態において、Ｎ３の含有量は、第１の多糖のモノマー繰り返し単位あたり０．１～１．０のＮ３である。
【0100】
生体適合性ヒドロゲルを調製する方法の一実施形態において、Ｑの含有量は、第２の多糖のモノマー繰り返し単位あたり０．０１～１．５である。生体適合性ヒドロゲルを調製する方法の１つの好ましい実施形態において、Ｑの含有量は、第２の多糖のモノマー繰り返し単位あたり０．０１～１．０である。生体適合性ヒドロゲルを調製する方法の１つの好ましい実施形態において、Ｑの含有量は、第２の多糖のモノマー繰り返し単位あたり０．１～１．０である。
【0101】
生体適合性ヒドロゲルを調製する方法の１つの好ましい実施形態では、ステップｃ）において、－Ａ－Ｘは、好ましくは第１の多糖のモノマー繰り返し単位のＣ２、Ｃ３、Ｃ４、又はＣ６の少なくとも１つを介して、より好ましくは第１の多糖のモノマー繰り返し単位のＣ６を介して、第１の多糖の少なくとも１つの第１級又は第２級ＯＨ基に連結される。
【0102】
生体適合性ヒドロゲルを調製する方法の１つの好ましい実施形態では、ステップｃ）において、－Ａ´－Ｙは、好ましくは第２の多糖のモノマー繰り返し単位のＣ２、Ｃ３、Ｃ４、又はＣ６の少なくとも１つを介して、より好ましくは第２の多糖のモノマー繰り返し単位のＣ６を介して、第２の多糖の少なくとも１つの第１級又は第２級ＯＨ基に連結される。
【0103】
生体適合性ヒドロゲルを調製する方法に対して、当該方法は、毒性試薬を使用せず、好ましくはグルタルアルデヒドを使用しないことがさらに好ましい。
【0104】
生体適合性ヒドロゲルを調製する方法の一実施形態において、官能基化されていない第１の多糖の分子量は、５から２０００ｋＤａの範囲内にある。生体適合性ヒドロゲルを調製する方法の一実施形態において、官能基化された第１の多糖の分子量は、５から２５００ｋＤａの範囲内にある。生体適合性ヒドロゲルを調製する方法の１つの好ましい実施形態において、官能基化された第１の多糖の分子量は、５から２０００ｋＤａの範囲内にある。生体適合性ヒドロゲルを調製する方法の１つのより好ましい実施形態において、官能基化された第１の多糖の分子量は、５から１５００ｋＤａの範囲内にある。生体適合性ヒドロゲルを調製する方法の１つのさらにより好ましい実施形態において、官能基化された第１の多糖の分子量は、１０から１５００ｋＤａの範囲内にある。
【0105】
生体適合性ヒドロゲルを調製する方法の一実施形態において、官能基化されていない第２の多糖の分子量は、５から２０００ｋＤａの範囲内にある。生体適合性ヒドロゲルを調製する方法の一実施形態において、官能基化された第２の多糖の分子量は、５から２５００ｋＤａの範囲内にある。生体適合性ヒドロゲルを調製する方法の１つの好ましい実施形態において、官能基化された第２の多糖の分子量は、５から２０００ｋＤａの範囲内にある。生体適合性ヒドロゲルを調製する方法の１つのより好ましい実施形態において、官能基化された第２の多糖の分子量は、５から１５００ｋＤａの範囲内にある。生体適合性ヒドロゲルを調製する方法の１つのさらにより好ましい実施形態において、官能基化された第２の多糖の分子量は、１０から１５００ｋＤａの範囲内にある。
【0106】
ヒドロゲルは、上記のような生体適合性ヒドロゲルを調製する任意の方法によって得ることができる。上記のヒドロゲルは、１つ以上のカプセル化酵素を含むことが好ましい。ヒドロゲルは、膨潤性又は膨潤したヒドロゲルマトリックスであることがさらに好ましい。
【0107】
本開示の多くの実施形態が記載されてきた。それにもかかわらず、本開示の真意及び範囲から逸脱することなく、様々な修正を行うことができるということが理解されることになる。従って、他の実施形態が、添付の特許請求の範囲内にある。
【0108】
上記の例は、本開示の実施形態を作成及び使用する方法の完全な開示及び説明として当業者に提供されており、１人以上の本発明者がそれらの開示とみなす範囲を限定することを意図するものではない。
【0109】
当業者には明らかである、本明細書において開示された方法及びシステムを実行するための上記の態様の修正は、添付の特許請求の範囲内にあることを意図している。本明細書において記載された全ての特許文献及び刊行物は、本開示が関係する当業者の技術レベルを示している。本開示において引用された全ての参考文献を、各参考文献がその全体を個別に参照により援用された場合と同じ程度に、参照によって援用する。
【0110】
本開示は、特定の方法又はシステムに限定されるものではなく、当然ながら、変更され得ることを理解されたい。本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定的であることを意図していないことも理解されたい。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」を伴う単数形は、別段の明確な指示がない限り、その複数形を含む。「複数」という用語は、別段の明確な指示がない限り、２つ以上の指示対象を含む。別段の定めがない限り、本明細書において使用される全ての技術的及び科学的用語は、本開示が関係する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。「上」及び「下」という用語は、他の要素に対する相対位置を示すものであり、地面に対する絶対位置を示すものではないと理解される。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図14D】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図16D】
【図16E】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図18A】
【図18B】
【国際調査報告】