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特表2024-537337初代卵巣癌細胞用の培養培地、初代卵巣癌細胞の培養方法及び用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-10
(54)【発明の名称】初代卵巣癌細胞用の培養培地、初代卵巣癌細胞の培養方法及び用途
(51)【国際特許分類】
C12N 5/09 20100101AFI20241003BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20241003BHJP
C12N 9/99 20060101ALN20241003BHJP
【ＦＩ】
C12N5/09
C12Q1/02
C12N9/99
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024522183
(86)(22)【出願日】2021-11-22
(85)【翻訳文提出日】2024-06-11
(86)【国際出願番号】 CN2021131967
(87)【国際公開番号】W WO2023060696
(87)【国際公開日】2023-04-20
(31)【優先権主張番号】202111201798.2
(32)【優先日】2021-10-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522178669
【氏名又は名称】合肥中科普瑞昇生物医▲薬▼科技有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110003845
【氏名又は名称】弁理士法人籾井特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】▲劉▼ 青松
(72)【発明者】
【氏名】赫 玉影
(72)【発明者】
【氏名】黄 涛
(72)【発明者】
【氏名】▲陳▼ 程
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ61
4B063QQ91
4B063QR77
4B063QS10
4B063QS13
4B063QX01
4B065AA93X
4B065BA30
4B065BB04
4B065BB19
4B065BB25
4B065BB34
4B065BB40
4B065BC03
4B065BC07
4B065BC46
4B065BD15
4B065BD18
4B065BD45
4B065CA46
(57)【要約】
初代卵巣癌細胞用の培養培地、初代卵巣癌細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養方法及び用途。培養培地は、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤と、Ｙ２７６３２、ファスジル及びＨ－１１５２のうち少なくとも１つから選択されるＲｈｏタンパク質キナーゼ阻害剤と、インスリン－トランスフェリン－亜セレン酸ナトリウムのサプリメントと、インスリンと、プロスタグランジンＥ２と、上皮成長因子と、ガストリンと、インスリン様成長因子－１と、コレラ毒素と、アンフィレグリンと、Ｎ２と、Ｂ２７とを含有する。既存の培養方法と比較して、上記培養培地を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏにおける培養はより高い増幅効率を有する。初代卵巣癌細胞の培養に該培養培地を使用することにより、初代組織の形態構造及び病理学的特徴を維持し、初代卵巣癌細胞の培養成功率及び培養した初代卵巣癌細胞の生存率を改善することができる。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
初代卵巣癌細胞用の培養培地であって、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤と、Ｙ２７６３２、ファスジル及びＨ－１１５２からなる群から選択される少なくとも１つのＲｈｏキナーゼ阻害剤と、インスリン－トランスフェリン－亜セレン酸ナトリウムのサプリメントと、インスリンと、プロスタグランジンＥ２と、上皮成長因子と、ガストリンと、インスリン様成長因子－１と、コレラ毒素と、アンフィレグリンと、Ｎ２と、Ｂ２７とを含むことを特徴とし、
前記ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤が、式（Ｉ）：
【化1】
Ｒ１は、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキルアルキル、Ｃ２～Ｃ６スピロシクロアルキル、並びに１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたアリール、１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたアリールＣ１～Ｃ６アルキル、及び１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたヘテロアリールから選択され、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ１～Ｃ６アルキルから選択され、
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキルアルキル、ヒドロキシルＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシＣ１～Ｃ６アルキル、及びＣ３～Ｃ６ヘテロシクリルＣ１～Ｃ６アルキルから選択され、
Ｒ６は、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、及びＣ１～Ｃ６ハロアルキルから選択される）の化合物、又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物を含む、培養培地。
【請求項2】
Ｒ１が、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキルアルキル、Ｃ２～Ｃ６スピロシクロアルキル、並びに１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたフェニル、１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたナフチル、１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたフェニルメチル、及び１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたチエニルから選択され、Ｒ２及びＲ３が、それぞれ独立して、Ｃ１～Ｃ３アルキルから選択され、
Ｒ４及びＲ５が、それぞれ独立して、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキルアルキル、ヒドロキシルＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシＣ１～Ｃ６アルキル、ピペリジルＣ１～Ｃ６アルキル、及びテトラヒドロピラニルＣ１～Ｃ６アルキルから選択され、
Ｒ６が、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、及びＣ１～Ｃ６ハロアルキルから選択される、
請求項１に記載の培養培地。
【請求項3】
前記ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤が、式（Ｉａ）：【化2】
Ｒ１は、Ｃ１～Ｃ６アルキル、１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたフェニル、１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたチエニル、及び１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたフェニルメチルから選択され、
Ｒ５は、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、及びＣ３～Ｃ６シクロアルキルから選択され、
Ｒ６は、独立して、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルキル、及びＣ１～Ｃ６ハロアルキルから選択される）の化合物、又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物を含む、請求項１に記載の培養培地。
【請求項4】
Ｒ１が１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたフェニルであり、Ｒ５が水素であり、
Ｒ６が、フルオロ、メチル又はトリフルオロメチルである、請求項３に記載の培養培地。
【請求項5】
前記ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤が、以下の化合物又はその薬学的に許容可能な塩から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の培養培地：【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【請求項6】
前記培養培地中の成分の量が、以下の条件：（１）前記培養培地中の前記ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤の量が、２．５μＭ～２０μＭである；
（２）前記培養培地中の前記Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の量が、２．５μＭ～２０μＭである；
（３）前記培養培地に対する前記インスリン－トランスフェリン－亜セレン酸ナトリウムのサプリメントの体積比が１：８００～１：５０である；
（４）前記培養培地中の前記インスリンの量が、１μｇ／ｍＬ～２７μｇ／ｍＬである；
（５）前記培養培地中の前記プロスタグランジンＥ２の量が、２．５μＭ～１０μＭである；
（６）前記培養培地中の前記上皮成長因子の量が、２．５ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬである；
（７）前記培養培地中の前記ガストリンの量が、１ｎＭ～９ｎＭである；
（８）前記培養培地中の前記インスリン様成長因子－１の量が、２５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬである；
（９）前記培養培地中の前記コレラ毒素の量が、０．０５μｇ／ｍＬ～０．８μｇ／ｍＬである；
（１０）前記培養培地中の前記アンフィレグリンの量が、１ｎｇ／ｍＬ～８１ｎｇ／ｍＬである；
（１１）前記培養培地に対する前記Ｂ２７添加剤の体積比が、好ましくは１：２５～１：４００である；
（１２）前記培養培地に対する前記Ｎ２添加剤の体積比が、好ましくは１：５０～１：４００である；
のうちのいずれか１つ以上又は全てを満たすことを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載の培養培地。
【請求項7】
ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭ、Ｆ１２又はＲＰＭＩ－１６４０からなる群から選択される初期培地と、ストレプトマイシン／ペニシリン、アムホテリシンＢ及びＰｒｉｍｏｃｉｎからなる群から選択される１つ以上の抗生物質とを更に含むことを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の培養培地。
【請求項8】
初代卵巣癌細胞を培養する方法であって、（１）請求項１～７のいずれか一項に記載の初代卵巣癌細胞用の培養培地を調製する工程と、
（２）卵巣癌組織試料から初代卵巣癌細胞を得る工程と、
（３）工程（２）で得られた前記初代卵巣癌細胞に、工程（１）で得られた初代卵巣癌細胞用の前記培養培地を添加し、培養する工程と、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項9】
卵巣癌を治療するための薬物を評価又はスクリーニングする方法であって、（１）請求項８に記載の初代卵巣癌細胞を培養する方法を用いて、初代卵巣癌細胞を培養する工程と、
（２）被検薬物を選択するとともに、所望の濃度勾配に前記薬物を希釈する工程と、
（３）工程（１）で培養した前記初代卵巣癌細胞に、様々な濃度勾配に希釈した前記薬物を添加する工程と、
（４）細胞生存率を検出する工程と、
を含むことを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物医学技術の分野、特に培養培地及びその用途、より詳細には、初代卵巣癌細胞用の培養培地、並びに初代卵巣癌細胞の培養方法及び用途に関する。
【背景技術】
【0002】
卵巣癌とは、卵巣に発生する悪性腫瘍疾患を指し、女性の生殖器の一般的な悪性腫瘍の１つであり、また子宮頸癌及び子宮体癌に次いで発生率が高い疾患である。上皮性卵巣癌が最も一般的な種類の卵巣癌であり、悪性卵巣胚細胞腫瘍がそれに続く。上皮性卵巣癌は、あらゆる種類の婦人科腫瘍の中で最も死亡率が高く、女性の生命に重大な脅威をもたらすおそれがある。卵巣癌は初期段階では無症状であることが多いが、後期になると下腹部の不快感、膨満感及び食欲低下等の消化器症状が現れることがある。卵巣癌の主な治療選択肢としては、外科的切除、薬物療法及び放射線療法が挙げられ、全般的な予後は不良である。
【0003】
化学療法は、卵巣腫瘍の主な治療法の１つである。現在、臨床使用に利用可能な化学療法薬は数多くあるが、卵巣腫瘍の臨床治療効果はわずか約２５％である。その主な理由は、患者が使用する化学療法薬のレジメンの殆どが臨床医の経験に基づいており、患者の個体差を考慮せずに治験評価による投薬変更及び治験再評価が行われており、薬物の治療効果を改善させることができないだけでなく、最良の治療期間を逃すこととなり、腫瘍が進行期に入ってしまうからである。さらに、患者は、治療過程を通じて薬物の副作用及び極めて高額な医療費を負担することになる。
【0004】
それ故、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの初代腫瘍モデルを確立し、それを使用して、効率的な薬物スクリーニング実験を行うことが、有望な解決策である。現在、初代卵巣腫瘍のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養モデルを確立する主な方法は、患者腫瘍移植（ＰＤＸ）モデルであり、これは、患者からの腫瘍細胞をヌードマウスに移植し、種々の抗腫瘍薬物の治療効果を検査することを伴う。しかしながら、ＰＤＸ方法には、ヒトとマウスとの種の違い、長い試験サイクル（４週間超）、高額な費用（２０００００超）、偽陽性及び偽陰性等といった幾つかの欠点も存在する。
【発明の概要】
【0005】
上述の技術的課題を解決するために、本発明は、初代卵巣癌細胞用の培養培地、並びにそのｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養方法及び用途を提供する。
【0006】
本発明の一態様は、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤と、Ｙ２７６３２、ファスジル及びＨ－１１５２からなる群から選択される少なくとも１つのＲｈｏキナーゼ阻害剤と、インスリン－トランスフェリン－亜セレン酸ナトリウムのサプリメントと、インスリンと、プロスタグランジンＥ２と、上皮成長因子（ＥＧＦ）と、ガストリンと、インスリン様成長因子－１と、コレラ毒素と、アンフィレグリンと、Ｎ２と、Ｂ２７とを含む、初代卵巣癌細胞用の培養培地を提供することである。
【0007】
ここで、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は、式（Ｉ）：
（式中、
Ｒ１は、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキルアルキル、Ｃ２～Ｃ６スピロシクロアルキル、並びに１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたアリール（例えば、フェニル及びナフチル等）、１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたアリールＣ１～Ｃ６アルキル（例えば、フェニルメチル等）、及び１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたヘテロアリール（例えば、チエニル等）から選択され、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ１～Ｃ６アルキル、好ましくはＣ１～Ｃ３アルキル、より好ましくはメチルから選択され、
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキルアルキル、ヒドロキシルＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシＣ１～Ｃ６アルキル、及びＣ３～Ｃ６ヘテロシクリルＣ１～Ｃ６アルキル（ヘテロシクリルは、例えば、ピペリジル、テトラヒドロピラニル等から選択される）から選択され、
Ｒ６は、ハロゲン（好ましくはフルオロ及びクロロ、より好ましくはフルオロ）、Ｃ１～Ｃ６アルキル（好ましくはメチル）、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ（好ましくはメトキシ）、及びＣ１～Ｃ６ハロアルキル（好ましくはトリフルオロメチル）から選択される）の化合物、又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物を含む。
【化1】
Ｒ１は、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキルアルキル、Ｃ２～Ｃ６スピロシクロアルキル、並びに１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたアリール（例えば、フェニル及びナフチル等）、１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたアリールＣ１～Ｃ６アルキル（例えば、フェニルメチル等）、及び１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたヘテロアリール（例えば、チエニル等）から選択され、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ１～Ｃ６アルキル、好ましくはＣ１～Ｃ３アルキル、より好ましくはメチルから選択され、
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキルアルキル、ヒドロキシルＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシＣ１～Ｃ６アルキル、及びＣ３～Ｃ６ヘテロシクリルＣ１～Ｃ６アルキル（ヘテロシクリルは、例えば、ピペリジル、テトラヒドロピラニル等から選択される）から選択され、
Ｒ６は、ハロゲン（好ましくはフルオロ及びクロロ、より好ましくはフルオロ）、Ｃ１～Ｃ６アルキル（好ましくはメチル）、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ（好ましくはメトキシ）、及びＣ１～Ｃ６ハロアルキル（好ましくはトリフルオロメチル）から選択される）の化合物、又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物を含む。
【0008】
好ましい実施の形態において、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は式（Ｉａ）：
（式中、
Ｒ１は、Ｃ１～Ｃ６アルキル、１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたフェニル、１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたチエニル、及び１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたフェニルメチルから選択され、より好ましくは、Ｒ１は１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたフェニルであり、
Ｒ５は、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル及びＣ３～Ｃ６シクロアルキルから選択され、より好ましくは、Ｒ５は水素であり、
Ｒ６は、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルキル及びＣ１～Ｃ６ハロアルキルから独立して選択され、より好ましくは、Ｒ６は、フルオロ、メチル又はトリフルオロメチルである）の化合物、又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物を含む。
【化2】
Ｒ１は、Ｃ１～Ｃ６アルキル、１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたフェニル、１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたチエニル、及び１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたフェニルメチルから選択され、より好ましくは、Ｒ１は１個～２個の独立したＲ６で任意に置換されたフェニルであり、
Ｒ５は、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル及びＣ３～Ｃ６シクロアルキルから選択され、より好ましくは、Ｒ５は水素であり、
Ｒ６は、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルキル及びＣ１～Ｃ６ハロアルキルから独立して選択され、より好ましくは、Ｒ６は、フルオロ、メチル又はトリフルオロメチルである）の化合物、又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物を含む。
【0009】
好ましくは、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は、以下の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、若しくは溶媒和物から選択される少なくとも１つである：
【0010】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【0011】
最も好ましくは、本発明のＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は化合物１である。
【0012】
本発明の実施の形態において、本発明の培養培地中の成分の量は、以下の条件：
（１）培養培地中のＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤の量が、２．５μＭ～２０μＭである；
（２）培養培地中のＲｈｏキナーゼ阻害剤の量が、２．５μＭ～２０μＭである；
（３）培養培地に対するインスリン－トランスフェリン－亜セレン酸ナトリウムのサプリメントの体積比が１：８００～１：５０である；
（４）培養培地中のインスリンの量が、１μｇ／ｍＬ～２７μｇ／ｍＬである；
（５）培養培地中のプロスタグランジンＥ２の量が、２．５μＭ～１０μＭである；
（６）培養培地中の上皮成長因子の量が、２．５ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬである；
（７）培養培地中のガストリンの量が、１ｎＭ～９ｎＭである；
（８）培養培地中のインスリン様成長因子－１の量が、２５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬである；
（９）培養培地中のコレラ毒素の量が、０．０５μｇ／ｍＬ～０．８μｇ／ｍＬである；
（１０）培養培地中のアンフィレグリンの量が、１ｎｇ／ｍＬ～８１ｎｇ／ｍＬである；
（１１）培養培地に対するＢ２７添加剤の体積比が、好ましくは１：２５～１：４００である；
（１２）培養培地に対するＮ２添加剤の体積比が、好ましくは１：５０～１：４００である；
のうちのいずれか１つ以上又は全てを満たす。
（１）培養培地中のＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤の量が、２．５μＭ～２０μＭである；
（２）培養培地中のＲｈｏキナーゼ阻害剤の量が、２．５μＭ～２０μＭである；
（３）培養培地に対するインスリン－トランスフェリン－亜セレン酸ナトリウムのサプリメントの体積比が１：８００～１：５０である；
（４）培養培地中のインスリンの量が、１μｇ／ｍＬ～２７μｇ／ｍＬである；
（５）培養培地中のプロスタグランジンＥ２の量が、２．５μＭ～１０μＭである；
（６）培養培地中の上皮成長因子の量が、２．５ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬである；
（７）培養培地中のガストリンの量が、１ｎＭ～９ｎＭである；
（８）培養培地中のインスリン様成長因子－１の量が、２５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬである；
（９）培養培地中のコレラ毒素の量が、０．０５μｇ／ｍＬ～０．８μｇ／ｍＬである；
（１０）培養培地中のアンフィレグリンの量が、１ｎｇ／ｍＬ～８１ｎｇ／ｍＬである；
（１１）培養培地に対するＢ２７添加剤の体積比が、好ましくは１：２５～１：４００である；
（１２）培養培地に対するＮ２添加剤の体積比が、好ましくは１：５０～１：４００である；
のうちのいずれか１つ以上又は全てを満たす。
【0013】
本発明の実施の形態において、培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭ、Ｆ１２又はＲＰＭＩ－１６４０からなる群から選択される初期培地と、ストレプトマイシン／ペニシリン、アムホテリシンＢ及びＰｒｉｍｏｃｉｎからなる群から選択される１つ以上の抗生物質とを更に含む。
【0014】
好ましい実施の形態において、抗生物質としてストレプトマイシン／ペニシリンを使用する場合、ストレプトマイシンの濃度範囲は、２５μｇ／ｍＬ～４００μｇ／ｍＬであり、ペニシリンの濃度範囲は、２５Ｕ／ｍＬ～４００Ｕ／ｍＬであり、抗生物質としてアムホテリシンＢを使用する場合、濃度範囲は０．２５μｇ／ｍＬ～４μｇ／ｍＬであり、抗生物質としてＰｒｉｍｏｃｉｎを使用する場合、濃度範囲は２５μｇ／ｍＬ～４００μｇ／ｍＬである。
【0015】
第２の態様によれば、本発明はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで初代卵巣癌細胞を培養する方法を提供する。初代卵巣癌細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養する本発明の方法においては、本発明の初代卵巣癌細胞用の培養培地を用いて初代卵巣癌細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養する。
【0016】
初代卵巣癌細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養する本発明の方法は、以下の工程を含む。
【0017】
１．初代卵巣癌細胞の単離
（１）卵巣癌組織試料を分離し、基本培地及び組織消化液（注釈：組織消化液の添加量は、腫瘍組織１ｇに対して組織消化液約５ｍＬ～１０ｍＬである）を１：３の比率で添加し、恒温振盪機に入れ、４℃～３７℃の消化温度、２００ｒｐｍ～３５０ｒｐｍの速度で消化を行う。
（２）消化が完全に完了し、すなわち、明らかな組織破片が見られなくなり、消化時間が３時間～６時間になれば消化を停止してもよい。
（３）１２００ｒｐｍ～１６００ｒｐｍの遠心分離速度での２分間～６分間の遠心分離後に、上清を捨て、後の使用のために基本培地を添加して細胞を再懸濁する。
（１）卵巣癌組織試料を分離し、基本培地及び組織消化液（注釈：組織消化液の添加量は、腫瘍組織１ｇに対して組織消化液約５ｍＬ～１０ｍＬである）を１：３の比率で添加し、恒温振盪機に入れ、４℃～３７℃の消化温度、２００ｒｐｍ～３５０ｒｐｍの速度で消化を行う。
（２）消化が完全に完了し、すなわち、明らかな組織破片が見られなくなり、消化時間が３時間～６時間になれば消化を停止してもよい。
（３）１２００ｒｐｍ～１６００ｒｐｍの遠心分離速度での２分間～６分間の遠心分離後に、上清を捨て、後の使用のために基本培地を添加して細胞を再懸濁する。
【0018】
ここで、基本培地の配合は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭ、Ｆ１２又はＲＰＭＩ－１６４０からなる群から選択される初期培地と、ストレプトマイシン／ペニシリン、アムホテリシンＢ及びＰｒｉｍｏｃｉｎからなる群から選択される１つ以上の抗生物質とを含む。組織消化液の配合は、１６４０培地、コラゲナーゼＩＩ（１ｍｇ／ｍＬ～２ｍｇ／ｍＬ）、コラゲナーゼＩＶ（１ｍｇ／ｍＬ～２ｍｇ／ｍＬ）、ＤＮアーゼ（５０Ｕ／ｍＬ～１００Ｕ／ｍＬ）、ヒアルロニダーゼ（０．５ｍｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬ）、塩化カルシウム（１ｍＭ～５ｍＭ）、ウシ血清アルブミンＢＳＡ（５ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬ）を含む。
【0019】
２．本発明の初代卵巣癌細胞用の培養培地を用いた細胞の培養
基本培地を、マトリゲル（Corning（商標）、３５６２３１）と２５：１～１００：１の比率で氷上において混合する。細胞をプレーティングした後、プレートを３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で２５分間～３５分間インキュベートし、上清を捨てる。上記工程１で得られた初代卵巣癌細胞を、本発明の初代卵巣癌細胞用の培養培地で再懸濁し、細胞を計数する。細胞密度を２×１０４細胞／ｃｍ２～８×１０４細胞／ｃｍ２に調節する。本発明の初代卵巣癌細胞用の培養培地を添加し、細胞をインキュベーター内で培養する。
基本培地を、マトリゲル（Corning（商標）、３５６２３１）と２５：１～１００：１の比率で氷上において混合する。細胞をプレーティングした後、プレートを３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で２５分間～３５分間インキュベートし、上清を捨てる。上記工程１で得られた初代卵巣癌細胞を、本発明の初代卵巣癌細胞用の培養培地で再懸濁し、細胞を計数する。細胞密度を２×１０４細胞／ｃｍ２～８×１０４細胞／ｃｍ２に調節する。本発明の初代卵巣癌細胞用の培養培地を添加し、細胞をインキュベーター内で培養する。
【0020】
更に別の態様において、本発明は、以下の工程：
（１）本発明の初代卵巣癌細胞を培養する方法を用いて、初代卵巣癌細胞を培養する工程と、
（２）被検薬物を選択するとともに、所望の濃度勾配に薬物を希釈する工程と、
（３）工程（１）で培養した細胞に、様々な濃度勾配に希釈した薬物を添加する工程と、
（４）細胞生存率を検出する工程と、
を含む、卵巣癌疾患用の薬物スクリーニング方法も提供する。
（１）本発明の初代卵巣癌細胞を培養する方法を用いて、初代卵巣癌細胞を培養する工程と、
（２）被検薬物を選択するとともに、所望の濃度勾配に薬物を希釈する工程と、
（３）工程（１）で培養した細胞に、様々な濃度勾配に希釈した薬物を添加する工程と、
（４）細胞生存率を検出する工程と、
を含む、卵巣癌疾患用の薬物スクリーニング方法も提供する。
【0021】
本発明の技術的解決策は、以下の技術的効果を達成することができる：
（１）初代卵巣癌細胞の培養の成功率が改善され、本発明により、上皮癌、悪性胚細胞腫瘍、間質腫瘍及び転移性腫瘍等の様々な試料供給元からの腫瘍組織を培養することが可能となり、成功率は８０％以上である；
（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した初代卵巣癌細胞は、確実に患者の病理学的特徴を維持する；
（３）培養した初代卵巣癌細胞は、線維芽細胞及び脂肪細胞等の間質細胞によって干渉されない；
（４）拡大増殖効率が高く、初代卵巣癌細胞は約１週間で首尾よく培養することができ、拡大増殖した初代卵巣癌細胞は、継続的な継代能力を有する；
（５）培養培地は、Ｗｎｔアゴニスト等の高額な因子を必要としないため、培養コストを抑制可能である；
（６）培養培地は血清を含まず、初代細胞と間質細胞との共培養を避けることができ、血清の含有及び間質細胞との共培養等の従来の培養プロトコルに存在する一連の問題も解決する；
（７）上記技術によって培養した初代卵巣癌細胞は、数が多く、高度に均質化されているため、新たな候補化合物の高スループットスクリーニングに適しており、患者に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでの高スループット薬物感受性をもたらす。
（１）初代卵巣癌細胞の培養の成功率が改善され、本発明により、上皮癌、悪性胚細胞腫瘍、間質腫瘍及び転移性腫瘍等の様々な試料供給元からの腫瘍組織を培養することが可能となり、成功率は８０％以上である；
（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した初代卵巣癌細胞は、確実に患者の病理学的特徴を維持する；
（３）培養した初代卵巣癌細胞は、線維芽細胞及び脂肪細胞等の間質細胞によって干渉されない；
（４）拡大増殖効率が高く、初代卵巣癌細胞は約１週間で首尾よく培養することができ、拡大増殖した初代卵巣癌細胞は、継続的な継代能力を有する；
（５）培養培地は、Ｗｎｔアゴニスト等の高額な因子を必要としないため、培養コストを抑制可能である；
（６）培養培地は血清を含まず、初代細胞と間質細胞との共培養を避けることができ、血清の含有及び間質細胞との共培養等の従来の培養プロトコルに存在する一連の問題も解決する；
（７）上記技術によって培養した初代卵巣癌細胞は、数が多く、高度に均質化されているため、新たな候補化合物の高スループットスクリーニングに適しており、患者に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでの高スループット薬物感受性をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】初代卵巣癌細胞の成長に対する、初代卵巣癌細胞用の培養培地中の添加因子の種々の組合せの影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0023】
本発明をより良く理解するために、実施形態及び図面と組み合わせて以下に更に説明する。以下の実施例は、本発明を限定するものではなく、例示のみを目的として提示される。
【0024】
（ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤の調製例）
本明細書では、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤とは、直接的又は間接的にＭＳＴ１／２シグナル伝達を負に制御するあらゆる阻害剤を指す。一般に、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は、例えば、ＭＳＴ１／２キナーゼに結合することにより、ＭＳＴ１／２キナーゼの活性を低下させる。ＭＳＴ１とＭＳＴ２は構造が似ているため、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は、例えば、ＭＳＴ１又はＭＳＴ２に結合してその活性を低下させる化合物であってもよい。
本明細書では、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤とは、直接的又は間接的にＭＳＴ１／２シグナル伝達を負に制御するあらゆる阻害剤を指す。一般に、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は、例えば、ＭＳＴ１／２キナーゼに結合することにより、ＭＳＴ１／２キナーゼの活性を低下させる。ＭＳＴ１とＭＳＴ２は構造が似ているため、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は、例えば、ＭＳＴ１又はＭＳＴ２に結合してその活性を低下させる化合物であってもよい。
【0025】
１．ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤化合物１の調製
４－（（７－（２，６－ジフルオロフェニル）－５，８－ジメチル－６－オキソ－５，６，７，８－テトラヒドロプテリジン－２－イル）アミノ）ベンズスルファミド１
４－（（７－（２，６－ジフルオロフェニル）－５，８－ジメチル－６－オキソ－５，６，７，８－テトラヒドロプテリジン－２－イル）アミノ）ベンズスルファミド１
【化3】
【0026】
メチル２－アミノ－２－（２，６－ジフルオロフェニル）アセテート（Ａ２）：２－アミノ－２－（２，６－ジフルオロフェニル）酢酸（２．０ｇ）、次いでメタノール（３０ｍＬ）を丸底フラスコに加え、続いて塩化チオニル（１．２ｍＬ）を氷浴下で滴下して加えた。反応系を８５℃で一晩反応させた。反応終了後、この系を減圧下で蒸発させて溶剤を乾燥させ、得られた白色固体をそのまま次の工程に使用した。
【0027】
メチル２－（（２－クロロ－５－ニトロピリミジン－４－イル）アミノ）－２－（２，６－ジフルオロフェニル）アセテート（Ａ３）：丸底フラスコにメチル２－アミノ－２－（２，６－ジフルオロフェニル）アセテート（２ｇ）、次いでアセトン（３０ｍＬ）及び炭酸カリウム（２．２ｇ）を加え、次いで氷塩浴で系を－１０℃に冷却した後、アセトン中の２，４－ジクロロ－５－ニトロピリミジン（３．１ｇ）の溶液をゆっくりと加えた。反応系を室温で一晩撹拌した。反応終了後、反応混合物を濾過し、濾液から減圧下で溶剤を除去し、残渣を加圧シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、化合物Ａ３を得た。ＬＣ／ＭＳ：Ｍ＋Ｈ ３５９．０。
【0028】
２－クロロ－７－（２，６－ジフルオロフェニル）－７，８－ジヒドロプテリジン－６（５Ｈ）－オン（Ａ４）：丸底フラスコにメチル２－（（２－クロロ－５－ニトロピリミジン－４－イル）アミノ）－２－（２，６－ジフルオロフェニル）アセテート（２．５ｇ）、次いで酢酸（５０ｍＬ）及び鉄粉（３．９ｇ）を加えた。反応系を６０℃で２時間撹拌した。反応終了後、反応系を減圧下で蒸発させて溶剤を乾燥させ、得られたものを飽和炭酸水素ナトリウム溶液でアルカリ性に中和し、酢酸エチルで抽出した。有機相を水と飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。有機相を濾過し、減圧下で蒸発乾固させて、粗生成物を得た。粗生成物をジエチルエーテルで洗浄し、化合物Ａ４を得た。ＬＣ／ＭＳ：Ｍ＋Ｈ ２９７．０。
【0029】
２－クロロ－７－（２，６－ジフルオロフェニル）－５，８－ジメチル－７，８－ジヒドロプテリジン－６（５Ｈ）－オン（Ａ５）：丸底フラスコに２－クロロ－７－（２，６－ジフルオロフェニル）－７，８－ジヒドロプテリジン－６（５Ｈ）－オン（２ｇ）及びＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（１０ｍＬ）を加え、－３５℃に冷却し、続いてヨードメタン（０．９ｍＬ）、次いで水素化ナトリウム（６１５ｍｇ）を加え、反応系を２時間撹拌した。反応終了後、反応混合物を水でクエンチし、酢酸エチルで抽出した。有機相をそれぞれ水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機相を濾過し、減圧下で蒸発乾固させて、粗生成物を得た。粗生成物をジエチルエーテルで洗浄し、化合物Ａ５を得た。ＬＣ／ＭＳ：Ｍ＋Ｈ ３２５．０。
【0030】
４－（（７－（２，６－ジフルオロフェニル）－５，８－ジメチル－６－オキソ－５，６，７，８－テトラヒドロプテリジン－２－イル）アミノ）ベンズスルファミド（１）：丸底フラスコに２－クロロ－７－（２，６－ジフルオロフェニル）－５，８－ジメチル－７，８－ジヒドロプテリジン－６（５Ｈ）－オン（１００ｍｇ）、スルファニルアミド（５３ｍｇ）、ｐ－トルエンスルホン酸（５３ｍｇ）及びｓｅｃ－ブタノール（５ｍＬ）を加えた。反応系を１２０℃で一晩撹拌した。反応終了後、反応混合物を濾過し、メタノール及びジエチルエーテルで洗浄し、化合物１を得た。ＬＣ／ＭＳ：Ｍ＋Ｈ ４６１．１。
【0031】
２．本発明の他のＭＳＴ１／２阻害剤化合物の調製
本発明の他のＭＳＴ１／２阻害剤化合物を化合物１と同様の方法で合成し、それらの構造及び質量スペクトルデータを以下の表に示す。
本発明の他のＭＳＴ１／２阻害剤化合物を化合物１と同様の方法で合成し、それらの構造及び質量スペクトルデータを以下の表に示す。
【0032】
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【表2-4】
【表2-5】
【0033】
実施例１．初代卵巣癌細胞の増殖に対する、初代卵巣癌細胞用の培養培地に添加した様々な因子の影響
（１）初代卵巣癌細胞用の培養培地の調製
初めに、初期培地を含有する基本培地を調製した。初期培地は、当該技術分野において一般に使用されているＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭ、Ｆ１２、又はＲＰＭＩ－１６４０からなる群から選択することができる。本実施例において、基本培地の配合は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Corningから購入）＋１００μｇ／ｍＬ Ｐｒｉｍｏｃｉｎ（InvivoGenから購入、０．２％（体積／体積）、市販品の濃度は５０ｍｇ／ｍＬである）である。種々のタイプの添加剤（表１を参照）を基本培地に添加し、種々の成分を含む初代卵巣癌細胞用の培養培地を調製した。
（１）初代卵巣癌細胞用の培養培地の調製
初めに、初期培地を含有する基本培地を調製した。初期培地は、当該技術分野において一般に使用されているＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭ、Ｆ１２、又はＲＰＭＩ－１６４０からなる群から選択することができる。本実施例において、基本培地の配合は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Corningから購入）＋１００μｇ／ｍＬ Ｐｒｉｍｏｃｉｎ（InvivoGenから購入、０．２％（体積／体積）、市販品の濃度は５０ｍｇ／ｍＬである）である。種々のタイプの添加剤（表１を参照）を基本培地に添加し、種々の成分を含む初代卵巣癌細胞用の培養培地を調製した。
【0034】
（２）初代卵巣癌細胞の単離及び処理
１．試料の選択
卵巣癌固形腫瘍の組織試料（術中）は、専門医療機関の専門医療従事者によって患者から得られ、全ての患者がインフォームドコンセントに署名した。サイズが０．２５ｃｍ３の術中試料、サイズが０．０２５ｃｍ３の内視鏡試料を、市販の組織保存液（製造業者：Miltenyi Biotec）を用いて保管及び輸送した。
１．試料の選択
卵巣癌固形腫瘍の組織試料（術中）は、専門医療機関の専門医療従事者によって患者から得られ、全ての患者がインフォームドコンセントに署名した。サイズが０．２５ｃｍ３の術中試料、サイズが０．０２５ｃｍ３の内視鏡試料を、市販の組織保存液（製造業者：Miltenyi Biotec）を用いて保管及び輸送した。
【0035】
２．材料の準備
表面滅菌に供した後、１５ｍＬ滅菌遠心分離管、ピペッター、１０ｍＬピペット、滅菌ピペットチップ等を超清浄作業台に置き、３０分間紫外線照射した。基本培地は、４℃の冷蔵庫から３０分前に取り出し、組織消化液は、－２０℃の冷蔵庫から３０分前に取り出した。
表面滅菌に供した後、１５ｍＬ滅菌遠心分離管、ピペッター、１０ｍＬピペット、滅菌ピペットチップ等を超清浄作業台に置き、３０分間紫外線照射した。基本培地は、４℃の冷蔵庫から３０分前に取り出し、組織消化液は、－２０℃の冷蔵庫から３０分前に取り出した。
【0036】
組織消化液：１６４０培地（Corning、１０－０４０－ＣＶＲ）、コラゲナーゼＩＩ（２ｍｇ／ｍＬ）、コラゲナーゼＩＶ（２ｍｇ／ｍＬ）、ＤＮアーゼ（５０Ｕ／ｍＬ）、ヒアルロニダーゼ（０．７５ｍｇ／ｍＬ）、塩化カルシウム（３．３ｍＭ）、ＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）。
【0037】
上述のコラゲナーゼＩＩ、コラゲナーゼＩＶ、ＤＮアーゼ及びヒアルロニダーゼは、全てSigma Corporationから購入し、塩化カルシウムはSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.から購入し、ＢＳＡはBiofroxx Corporationから購入した。
【0038】
３．初代卵巣癌細胞の単離
３．１．組織試料を超清浄作業台から培養皿に移し、血液が付いた組織を除去した。組織試料を基本培地で２回洗浄した後、別の培養皿に移し、滅菌メスで１×１×１ｍｍ３のサイズの組織ブロックに機械的に切断した。
３．１．組織試料を超清浄作業台から培養皿に移し、血液が付いた組織を除去した。組織試料を基本培地で２回洗浄した後、別の培養皿に移し、滅菌メスで１×１×１ｍｍ３のサイズの組織ブロックに機械的に切断した。
【0039】
３．２．切断した術中組織を１５ｍＬ遠心分離管に吸引し、これに５ｍＬの基本培地を添加し、完全に混合した後、１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した。
【0040】
３．３．上清を捨て、得られたものに基本培地及び組織消化液（組織消化液の添加量は、１ｇの腫瘍組織に対して約１０ｍＬの組織消化液とした）の１：３混合物を添加した。試料に名前及び番号を付け、シーリングフィルムで密閉した後、振盪機（Zhichu InstrumentのＺＱＬＹ－１８０Ｎ）内にて３７℃、３００ｒｐｍで消化した。消化の完了は、３０分毎の観察により、目に見える粒子が存在するか否かに基づいて決定した。消化時間は４時間であった。
【0041】
３．４．消化が完了した後、未消化の組織塊を１００μＭフィルターメッシュに通して濾過した。フィルターメッシュ上の組織塊を、細胞の喪失を減らすために基本培地で遠心分離管に洗い入れた。得られたものを２５℃、１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した。
【0042】
３．５．上清を捨て、得られたものを観察して、血球が存在するかを決定した。血球が存在する場合、得られたものに８ｍＬの血球溶解液（Sigmaから購入）を添加し、完全に混合し、４℃で２０分間溶解させた。この過程で転倒混和を１回行った。得られたものを２５℃、１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した。
【0043】
３．６．上清を捨て、２ｍＬの基本培地を添加し、細胞を再懸濁して保存した。
【0044】
４．細胞の計数及び処理
４．１．顕微鏡観察：少量の再懸濁細胞を培養皿にプレーティングし、癌細胞の密度及び形態を顕微鏡（CNOPTEC、ＢＤＳ４００）下で観察した。
４．１．顕微鏡観察：少量の再懸濁細胞を培養皿にプレーティングし、癌細胞の密度及び形態を顕微鏡（CNOPTEC、ＢＤＳ４００）下で観察した。
【0045】
４．２．生存細胞の計数：１２μＬの再懸濁した細胞懸濁液を１２μＬのトリパンブルー染色液（Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.）と完全に混合した後、２０μＬの混合物を細胞計数プレート（Countstar、仕様：５０個／箱）に添加した。セルカウンター（Countstar、ＩＣ１０００）を用いて、生存大細胞（１０μｍ超の細胞サイズ）のパーセンテージ＝生存細胞数／総細胞数×１００％を算出した。
【0046】
（３）初代卵巣癌細胞の培養
上記工程（２）に従って２例の卵巣癌組織（符号Ｌ４０及びＬＱＱ）から単離した初代卵巣癌細胞を、それぞれ表１中の培養培地に再懸濁し、細胞数を計数した。基本培地をマトリゲル（Corning（商標）、３５６２３１）と５０：１の比率で氷上において混合した。３００μＬの混合物をプレーティングし、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で２５分間～３５分間、好ましくは３０分間インキュベートした。上清は捨てた。初代卵巣癌細胞を含有する、表１の種々の成分を含む培養培地を、１ウェル当たり４×１０４細胞、及び５００μＬ／ウェルとなるまで４８ウェルプレートに添加した。添加剤を全く含まない基本培地をコントロールとして使用した。培養の７日～１０日後、細胞は８５％まで成長し、培養培地を捨て、細胞を１ウェル当たり１００μＬの０．０５％トリプシン（Gibcoから購入）で一度濯いだ。トリプシンを吸引した後、２００μＬの０．０５％トリプシンを各ウェルに添加した。次いでプレートを３７℃及び５％ＣＯ２のインキュベーター内に入れ、１０分間反応させ、細胞が完全に消化することを顕微鏡（CNOPTEC、ＢＤＳ４００）下で観察した。次いで、１０％血清（Excell Bio、ＦＮＤ５００）を含有する３００μＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を添加して、消化を停止し、得られたもの２０μＬを細胞計数プレート（Countstar、サイズ：５０個／箱）に添加した。セルカウンター（Countstar、ＩＣ１０００）を用いて、総細胞数を計数した。実験結果を表１に示す。
上記工程（２）に従って２例の卵巣癌組織（符号Ｌ４０及びＬＱＱ）から単離した初代卵巣癌細胞を、それぞれ表１中の培養培地に再懸濁し、細胞数を計数した。基本培地をマトリゲル（Corning（商標）、３５６２３１）と５０：１の比率で氷上において混合した。３００μＬの混合物をプレーティングし、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で２５分間～３５分間、好ましくは３０分間インキュベートした。上清は捨てた。初代卵巣癌細胞を含有する、表１の種々の成分を含む培養培地を、１ウェル当たり４×１０４細胞、及び５００μＬ／ウェルとなるまで４８ウェルプレートに添加した。添加剤を全く含まない基本培地をコントロールとして使用した。培養の７日～１０日後、細胞は８５％まで成長し、培養培地を捨て、細胞を１ウェル当たり１００μＬの０．０５％トリプシン（Gibcoから購入）で一度濯いだ。トリプシンを吸引した後、２００μＬの０．０５％トリプシンを各ウェルに添加した。次いでプレートを３７℃及び５％ＣＯ２のインキュベーター内に入れ、１０分間反応させ、細胞が完全に消化することを顕微鏡（CNOPTEC、ＢＤＳ４００）下で観察した。次いで、１０％血清（Excell Bio、ＦＮＤ５００）を含有する３００μＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を添加して、消化を停止し、得られたもの２０μＬを細胞計数プレート（Countstar、サイズ：５０個／箱）に添加した。セルカウンター（Countstar、ＩＣ１０００）を用いて、総細胞数を計数した。実験結果を表１に示す。
【0047】
【表3】
【0048】
ここで、「＋」は、基本培地と比較して、添加剤（複数の場合もある）を添加した培養培地が、卵巣癌組織から単離した初代卵巣癌細胞の２例の増殖を促進する効果を有することを示し、「－」は、添加剤（複数の場合もある）を添加した培養培地が、卵巣癌組織から単離した初代卵巣癌細胞の１例の増殖を促進する効果を有することを示し、「〇」は、添加剤（複数の場合もある）を添加した培養培地が、卵巣癌組織から単離した初代卵巣癌細胞の少なくとも２例の増殖に対して顕著な影響を及ぼさないことを示す。
【0049】
上記の結果により、化合物１、プロスタグランジンＥ２、Ｂ２７、Ｎ２、上皮成長因子、インスリン、インスリン－トランスフェリン－亜セレン酸ナトリウムのサプリメント、アンフィレグリン、Ｙ－２７６３２、インスリン様成長因子－１、ガストリン、コレラ毒素等の因子を更なる培養実験に選択した。
【0050】
実施例２ 初代卵巣癌細胞の増殖に対する、初代卵巣癌細胞用の培養培地に添加した因子の種々の組合せの影響
添加因子の種々の組合せを含有する初代卵巣癌細胞用の培養培地を、表２の成分に従って調製し、初代卵巣癌細胞に対する種々の添加因子の組合せの増殖促進効果を調査した。
添加因子の種々の組合せを含有する初代卵巣癌細胞用の培養培地を、表２の成分に従って調製し、初代卵巣癌細胞に対する種々の添加因子の組合せの増殖促進効果を調査した。
【0051】
【表4】
【0052】
初代卵巣癌細胞は、実施例１の工程（２）－３のプロセスに従って卵巣癌組織（符号Ｌ４６、Ｌ５５、Ｌ５６）から得た。得られた細胞懸濁液を１４等分し、次いで１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した。遠心分離後、細胞を２００μＬのＢＭ及び培養培地番号１～１３にそれぞれ再懸濁した。基本培地をマトリゲル（Corning（商標）、３５６２３１）と５０：１の比率で氷上において混合した。３００μＬの混合物を４８ウェルプレートにプレーティングし、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で２５分間～３５分間、好ましくは３０分間インキュベートした。上清は捨てた。初代卵巣癌細胞を、４８ウェルプレートに生細胞密度４×１０４細胞／ウェル（１ウェル当たり４００００細胞）で接種した。４８ウェルプレートの各ウェルに、体積が１ｍＬとなるまで対応する培養培地を補充し、得られたものを十分に混合した。表面滅菌後、プレートを３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター（Thermo Fisherから購入）に入れ、培養した。
【0053】
細胞が４８ウェルプレート内で８５％を超えるまで成長したら、培養培地を捨てた。細胞を１ウェル当たり１００μＬの０．０５％トリプシン（Gibcoから購入）で一度濯いだ。トリプシンを吸引した後、２００μＬの０．０５％トリプシンを各ウェルに添加した。次いでプレートを３７℃及び５％ＣＯ２のインキュベーターに入れ、１０分間反応させ、細胞が完全に消化することを顕微鏡（CNOPTEC、ＢＤＳ４００）下で観察した。次いで、１０％ウシ胎児血清を含有する３００μＬのＤＭＥＭ培地を添加して、消化を停止し、得られたもの２０μＬを細胞計数プレート（Countstar、仕様：５０個／箱）に添加した。総細胞数をセルカウンター（Countstar、ＩＣ１０００）で計数した。Ｌ４６、Ｌ５５及びＬ５６（術中）から単離した初代卵巣癌細胞から得られた結果を図１に示す。
【0054】
図１の結果によれば、基本培地と比較して、上記の培養培地番号１～１３は、程度の差こそあれ初代卵巣癌細胞の増殖を促進し得る。したがって、初代卵巣癌細胞を、添加剤、例えば、化合物１、プロスタグランジンＥ２、Ｂ２７、Ｎ２、上皮成長因子、インスリン、インスリン－トランスフェリン－亜セレン酸ナトリウムのサプリメント、アンフィレグリン、Ｙ－２７６３２、インスリン様成長因子－１、ガストリン、コレラ毒素を含有する培養培地で培養すると、増殖がより良好となる。
【0055】
実施例３ 初代卵巣癌細胞の増殖に対する、初代卵巣癌細胞用の培養培地に含まれる種々の濃度の添加因子の影響
初代卵巣癌細胞は、実施例１の工程（２）－３のプロセスに従って組織試料（符号Ａ２６０８３、Ｌ５６、Ｌ６２）から得た。実施例２における有効な因子の組合せを含む培養培地を使用して培養した。基本培地をマトリゲル（Corning（商標）、３５６２３１）と５０：１の比率で氷上において混合した。４ｍＬの混合物をＴ１２．５培養フラスコでプレーティングし、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で２５分間～３５分間、好ましくは３０分間インキュベートした。上清は捨てた。
初代卵巣癌細胞は、実施例１の工程（２）－３のプロセスに従って組織試料（符号Ａ２６０８３、Ｌ５６、Ｌ６２）から得た。実施例２における有効な因子の組合せを含む培養培地を使用して培養した。基本培地をマトリゲル（Corning（商標）、３５６２３１）と５０：１の比率で氷上において混合した。４ｍＬの混合物をＴ１２．５培養フラスコでプレーティングし、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で２５分間～３５分間、好ましくは３０分間インキュベートした。上清は捨てた。
【0056】
得られた初代卵巣癌細胞をＴ１２．５ウェルプレート（１ウェル当たり３０００００細胞）に生細胞密度２．４×１０４細胞／ｃｍ２で播種した。次いでプレートを、表面滅菌後に３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター（Thermo Fisherから購入）に入れた。実施例２で求めた有効な因子の組合せを含む培養培地（基本培地（ＢＭ）、２０μＭ化合物１、５μＭプロスタグランジンＥ２、１：１００（体積／体積）Ｂ２７、１：１００（体積／体積）Ｎ２、１０ｎｇ／ｍＬ上皮成長因子、３μｇ／ｍＬインスリン、１：５０（体積／体積）インスリン－トランスフェリン－亜セレン酸ナトリウムのサプリメント、２７ｎｇ／ｍＬアンフィレグリン、５μＭ Ｙ－２７６３２、５０ｎｇ／ｍＬインスリン様成長因子－１、２７ｎＭガストリン、０．１μｇ／ｍＬコレラ毒素を含有する）を用いて、細胞が８５％以上に成長するまで、細胞を培養及び拡大増殖させ、５００μＬの０．０５％トリプシン（Gibcoから購入）を添加して細胞を１分間濯いだ。トリプシンを吸引した後、５００μＬの０．０５％トリプシンを次いで各ウェルに添加し、プレートを３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターに入れ、２分間～１０分間反応させた。細胞が完全に消化したら消化を停止した。１５００ｒｐｍでの４分間の遠心分離後、上清を捨てた。細胞ペレットをＤＭＥＭ／Ｆ１２に再懸濁した後、２０μＬの懸濁液を細胞計数プレート（製造業者：Countstar、仕様：５０個／箱）に添加し、総細胞数をセルカウンター（Countstar、ＩＣ１０００）で計数した。得られた細胞を以下の培養実験に使用した。
【0057】
以下の１２種類の培養培地の配合を実験用に調製した。
【0058】
配合１：化合物１を含まない上述の初代卵巣癌細胞用の培養培地、
配合２：プロスタグランジンＥ２を含まない上述の初代卵巣癌細胞用の培養培地、
配合３：Ｂ２７を含まない上述の初代卵巣癌細胞用の培養培地、
配合４：Ｎ２を含まない上述の初代卵巣癌細胞用の培養培地、
配合５：上皮成長因子を含まない上述の初代卵巣癌細胞用の培養培地、
配合６：インスリンを含まない上述の初代卵巣癌細胞用の培養培地、
配合７：インスリン－トランスフェリン－亜セレン酸ナトリウムのサプリメントを含まない上述の初代卵巣癌細胞用の培養培地、
配合８：アンフィレグリンを含まない上述の初代卵巣癌細胞用の培養培地、
配合９：Ｙ－２７６３２を含まない上述の初代卵巣癌細胞用の培養培地、
配合１０：インスリン様成長因子－１を含まない上述の初代卵巣癌細胞用の培養培地、
配合１１：ガストリンを含まない上述の初代卵巣癌細胞用の培養培地、
配合１２：コレラ毒素を含まない上述の初代卵巣癌細胞用の培養培地。
配合２：プロスタグランジンＥ２を含まない上述の初代卵巣癌細胞用の培養培地、
配合３：Ｂ２７を含まない上述の初代卵巣癌細胞用の培養培地、
配合４：Ｎ２を含まない上述の初代卵巣癌細胞用の培養培地、
配合５：上皮成長因子を含まない上述の初代卵巣癌細胞用の培養培地、
配合６：インスリンを含まない上述の初代卵巣癌細胞用の培養培地、
配合７：インスリン－トランスフェリン－亜セレン酸ナトリウムのサプリメントを含まない上述の初代卵巣癌細胞用の培養培地、
配合８：アンフィレグリンを含まない上述の初代卵巣癌細胞用の培養培地、
配合９：Ｙ－２７６３２を含まない上述の初代卵巣癌細胞用の培養培地、
配合１０：インスリン様成長因子－１を含まない上述の初代卵巣癌細胞用の培養培地、
配合１１：ガストリンを含まない上述の初代卵巣癌細胞用の培養培地、
配合１２：コレラ毒素を含まない上述の初代卵巣癌細胞用の培養培地。
【0059】
４×１０４細胞を含有する細胞再懸濁液２０μｌを各ウェルに添加し、次いでこれを上記の配合１～配合１２の培養培地１ｍＬでそれぞれ希釈した。
【0060】
配合１の培養培地を使用する場合、初代細胞を播種した４８ウェルプレートの各ウェルに、調製した化合物１を、化合物１の最終濃度がそれぞれ２．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ及び４０μＭとなるように１ウェル当たり１ｍＬ添加した。配合１の培養培地を用いてブランクコントロール（ＢＣ）のウェルを設定した。
【0061】
配合２の培養培地を使用する場合、初代細胞を播種した４８ウェルプレートの各ウェルに、調製したプロスタグランジンＥ２を、プロスタグランジンＥ２の最終濃度がそれぞれ２．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ及び４０μＭとなるように１ウェル当たり１ｍＬ添加した。配合２の培養培地を用いてブランクコントロール（ＢＣ）のウェルを設定した。
【0062】
配合３の培養培地を使用する場合、初代細胞を播種した４８ウェルプレートの各ウェルに、調製したＢ２７を、Ｂ２７の最終濃度がそれぞれ１：４００（体積／体積）、１：２００（体積／体積）、１：１００（体積／体積）、１：５０（体積／体積）及び１：２５（体積／体積）となるように１ウェル当たり１ｍＬ添加した。配合３の培養培地を用いてブランクコントロール（ＢＣ）のウェルを設定した。
【0063】
配合４の培養培地を使用する場合、初代細胞を播種した４８ウェルプレートの各ウェルに、調製したＮ２を、Ｎ２の最終濃度がそれぞれ１：４００（体積／体積）、１：２００（体積／体積）、１：１００（体積／体積）、１：５０（体積／体積）及び１：２５（体積／体積）となるように１ウェル当たり１ｍＬ添加した。配合４の培養培地を用いてブランクコントロール（ＢＣ）のウェルを設定した。
【0064】
配合５の培養培地を使用する場合、初代細胞を播種した４８ウェルプレートの各ウェルに、調製した上皮成長因子を、上皮成長因子の最終濃度がそれぞれ２．５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ及び４０ｎｇ／ｍＬとなるように１ウェル当たり１ｍＬ添加した。配合５の培養培地を用いてブランクコントロール（ＢＣ）のウェルを設定した。
【0065】
配合６の培養培地を使用する場合、初代細胞を播種した４８ウェルプレートの各ウェルに、調製したインスリンを、インスリンの最終濃度がそれぞれ１μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、９μｇ／ｍＬ、２７μｇ／ｍＬ及び８１μｇ／ｍＬとなるように１ウェル当たり１ｍＬ添加した。配合６の培養培地を用いてブランクコントロール（ＢＣ）のウェルを設定した。
【0066】
配合７の培養培地を使用する場合、初代細胞を播種した４８ウェルプレートの各ウェルに、調製したインスリン－トランスフェリン－亜セレン酸ナトリウムのサプリメントを、インスリン－トランスフェリン－亜セレン酸ナトリウムのサプリメントの最終濃度がそれぞれ１：８００（体積／体積）、１：４００（体積／体積）、１：２００（体積／体積）、１：１００（体積／体積）及び１：５０（体積／体積）となるように１ウェル当たり１ｍＬ添加した。配合７の培養培地を用いてブランクコントロール（ＢＣ）のウェルを設定した。
【0067】
配合８の培養培地を使用する場合、初代細胞を播種した４８ウェルプレートの各ウェルに、調製したアンフィレグリンを、アンフィレグリンの最終濃度がそれぞれ１ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、２７ｎｇ／ｍＬ及び８１ｎｇ／ｍＬとなるように１ウェル当たり１ｍＬ添加した。配合８の培養培地を用いてブランクコントロール（ＢＣ）のウェルを設定した。
【0068】
配合９の培養培地を使用する場合、初代細胞を播種した４８ウェルプレートの各ウェルに、調製したＹ－２７６３２を、Ｙ－２７６３２の最終濃度がそれぞれ２．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ及び４０μＭとなるように１ウェル当たり１ｍＬ添加した。配合９の培養培地を用いてブランクコントロール（ＢＣ）のウェルを設定した。
【0069】
配合１０の培養培地を使用する場合、初代細胞を播種した４８ウェルプレートの各ウェルに、調製したインスリン様成長因子－１を、インスリン様成長因子－１の最終濃度がそれぞれ１２．５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ及び２００ｎｇ／ｍＬとなるように１ウェル当たり１ｍＬ添加した。配合１０の培養培地を用いてブランクコントロール（ＢＣ）のウェルを設定した。
【0070】
配合１１の培養培地を使用する場合、初代細胞を播種した４８ウェルプレートの各ウェルに、調製したガストリンを、ガストリンの最終濃度がそれぞれ１ｎＭ、３ｎＭ、９ｎＭ、２７ｎＭ及び８１ｎＭとなるように１ウェル当たり１ｍＬ添加した。配合１１の培養培地を用いてブランクコントロール（ＢＣ）のウェルを設定した。
【0071】
配合１２の培養培地を使用する場合、初代細胞を播種した４８ウェルプレートの各ウェルに、調製したコレラ毒素を、コレラ毒素の最終濃度がそれぞれ０．０５μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ及び０．８μｇ／ｍＬとなるように１ウェル当たり１ｍＬ添加した。配合１２の培養培地を用いてブランクコントロール（ＢＣ）のウェルを設定した。
【0072】
細胞が４８ウェルの約８５％まで拡大増殖した場合、細胞を消化して計数し、ブランクコントロール（ＢＣ）のウェル内の細胞数を参照することによって増殖倍数を算出し、結果はそれぞれ図２Ａ～図２Ｌに示した。図２Ａ～図２Ｌ中、比率は、ブランクコントロールの対応するウェルで培養した第１継代の細胞数に対する、各培養培地を用いることによって培養した第１継代の細胞数の比率である。この比率が１より大きければ、種々の濃度の因子又は低分子化合物を含有する調製された培養培地の増殖促進効果が、ブランクコントロールのウェル内の培養培地の増殖促進効果よりも好ましいことを示す。この比率が１未満であれば、種々の濃度の因子又は低分子化合物を含有する調製された培養培地の増殖促進効果が、ブランクコントロールのウェル内の培養培地の増殖促進効果よりも低いことを示す。
【0073】
図２Ａ～図２Ｌの結果によれば、化合物１、プロスタグランジンＥ２、Ｂ２７、Ｎ２、上皮成長因子、インスリン、インスリン－トランスフェリン－亜セレン酸ナトリウムのサプリメント、アンフィレグリン、Ｙ－２７６３２、インスリン様成長因子－１、ガストリン及びコレラ毒素が、初代卵巣癌細胞に対して顕著な増殖促進効果を有する。本実施例の結果によれば、化合物１の量は、好ましくは２．５μＭ～２０μＭ、より好ましくは２．５μＭ～１０μＭであり、濃度が５μＭである場合に細胞増殖効果が最も顕著である。プロスタグランジンＥ２の量は好ましくは２．５μＭ～１０μＭであり、濃度が２．５μＭである場合に細胞増殖効果が最も顕著である。Ｂ２７の量は、好ましくは１：２５（体積／体積）～１：４００（体積／体積）、より好ましくは１：５０（体積／体積）～１：２００（体積／体積）であり、濃度が１：１００（体積／体積）である場合に細胞増殖効果が最も顕著である。Ｎ２の量は好ましくは１：５０（体積／体積）～１：４００（体積／体積）であり、濃度が１：４００（体積／体積）である場合に細胞増殖効果が最も顕著である。上皮成長因子の量は、好ましくは２．５ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇ／ｍＬであり、濃度が１０ｎｇ／ｍＬである場合に細胞増殖効果が最も顕著である。インスリンの量は、好ましくは１μｇ／ｍＬ～２７μｇ／ｍＬ、より好ましくは３μｇ／ｍＬ～９μｇ／ｍＬであり、濃度が９μｇ／ｍＬである場合に細胞増殖効果が最も顕著である。インスリン－トランスフェリン－亜セレン酸ナトリウムのサプリメントの量は、好ましくは１：５０（体積／体積）～１：８００（体積／体積）、より好ましくは１：４００（体積／体積）～１：１００（体積／体積）であり、濃度が１：２００（体積／体積）である場合に細胞増殖効果が最も顕著である。アンフィレグリンの量は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ～８１ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ～２７ｎｇ／ｍＬであり、濃度が３ｎｇ／ｍＬである場合に細胞増殖効果が最も顕著である。Ｙ－２７６３２の量は好ましくは２．５μＭ～２０μＭであり、濃度が５μＭである場合に細胞増殖効果が最も顕著である。インスリン様成長因子－１の量は好ましくは２５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬであり、濃度が５０ｎｇ／ｍＬである場合に細胞増殖効果が最も顕著である。ガストリンの量は好ましくは１ｎＭ～９ｎＭであり、濃度が３ｎＭである場合に細胞増殖効果が最も顕著である。コレラ毒素の量は、好ましくは０．０５μｇ／ｍＬ～０．８μｇ／ｍＬ、より好ましくは０．０５μｇ／ｍＬ～０．２μｇ／ｍＬであり、濃度が０．１μｇ／ｍＬである場合に細胞増殖効果が最も顕著である。
【0074】
上記の培養培地に添加された各因子の最も好ましい濃度を使用すると、以下の実施例で使用される本発明の初代卵巣癌細胞用の培養培地は、基本培地（ＢＭ）、５μＭ化合物１、２．５μＭプロスタグランジンＥ２、１：１００（体積／体積）Ｂ２７、１：４００（体積／体積）Ｎ２、１０ｎｇ／ｍＬ上皮成長因子、９μｇ／ｍＬインスリン、１：２００（体積／体積）インスリン－トランスフェリン－亜セレン酸ナトリウムのサプリメント、３ｎｇ／ｍＬアンフィレグリン、５μＭ Ｙ－２７６３２、５０ｎｇ／ｍＬインスリン様成長因子－１、３ｎＭガストリン、０．１μｇ／ｍＬコレラ毒素を含有する（以後、培養培地「ＯＣ－２」と称する）。
【0075】
実施例４ 初代卵巣癌細胞の培養
実施例１の工程（２）－３のプロセスに従って６例の術中組織試料（符号Ａ２６０８３、Ｌ６５、Ｌ６６、Ｌ７２、Ｌ７４、Ｌ８４）から初代卵巣癌細胞を得て、培養培地ＯＣ－２を用いて培養した。基本培地をマトリゲル（Corning（商標）、３５６２３１）と５０：１の比率で氷上において混合した。２ｍＬの混合物を６ウェルプレートにプレーティングし、３７℃で５％ＣＯ２インキュベーター内において２５分間～３５分間、好ましくは３０分間インキュベートし、上清を捨てた。得られた初代卵巣癌細胞を６ウェルプレート（１ウェル当たり２５００００細胞）に生細胞密度２×１０４細胞／ｃｍ２で播種し、４ｍＬの培養培地ＯＣ－２を添加した。表面滅菌後、プレートを３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター（Thermo Fisherから購入）に入れ、培養した。
実施例１の工程（２）－３のプロセスに従って６例の術中組織試料（符号Ａ２６０８３、Ｌ６５、Ｌ６６、Ｌ７２、Ｌ７４、Ｌ８４）から初代卵巣癌細胞を得て、培養培地ＯＣ－２を用いて培養した。基本培地をマトリゲル（Corning（商標）、３５６２３１）と５０：１の比率で氷上において混合した。２ｍＬの混合物を６ウェルプレートにプレーティングし、３７℃で５％ＣＯ２インキュベーター内において２５分間～３５分間、好ましくは３０分間インキュベートし、上清を捨てた。得られた初代卵巣癌細胞を６ウェルプレート（１ウェル当たり２５００００細胞）に生細胞密度２×１０４細胞／ｃｍ２で播種し、４ｍＬの培養培地ＯＣ－２を添加した。表面滅菌後、プレートを３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター（Thermo Fisherから購入）に入れ、培養した。
【0076】
培養した初代卵巣癌細胞を顕微鏡（ＥＶＯＳ Ｍ５００、Invitrogen）下で観察した。図３Ａ～図３Ｆは、４日間～６日間培養した後にそれぞれ試料Ａ２６０８３、Ｌ６５、Ｌ６６、Ｌ７２、Ｌ７４及びＬ８４から得られ、１０倍の対物レンズで撮影した初代卵巣癌細胞の写真である。顕微鏡の下で観察すると、細胞は密に配置されており、形状は僅かに不規則であった。
【0077】
実施例５ 初代卵巣癌細胞の培養物の組織化学的特定
およそ０．２５ｃｍ３の癌組織を、卵巣癌患者の術中組織（試料符号Ｌ７４）から取り出し、１ｍＬの４％パラホルムアルデヒド中に浸漬させることによって固定した。実施例４の方法を使用して、本発明の初代卵巣癌細胞用の培養培地ＯＣ－２を用いて試料Ｌ７４を第４継代まで培養し続けた。４％パラホルムアルデヒドで固定した初代卵巣癌細胞をパラフィンに包埋し、ミクロトームを用いて厚さ４μｍの組織切片に切断した。次いでルーチンの免疫組織化学的検出を実施した（具体的な手順については、Li et al., Nature Communication, (2018) 9: 2983を参照）。使用した一次抗体は、ＥＲ、ＰＲ、Ｐ５３、ＮａｐｓｉｎＡ、Ｐａｘ－８、ＷＴ－１、及びＫｉ－６７（全てCSTから購入）とした。
およそ０．２５ｃｍ３の癌組織を、卵巣癌患者の術中組織（試料符号Ｌ７４）から取り出し、１ｍＬの４％パラホルムアルデヒド中に浸漬させることによって固定した。実施例４の方法を使用して、本発明の初代卵巣癌細胞用の培養培地ＯＣ－２を用いて試料Ｌ７４を第４継代まで培養し続けた。４％パラホルムアルデヒドで固定した初代卵巣癌細胞をパラフィンに包埋し、ミクロトームを用いて厚さ４μｍの組織切片に切断した。次いでルーチンの免疫組織化学的検出を実施した（具体的な手順については、Li et al., Nature Communication, (2018) 9: 2983を参照）。使用した一次抗体は、ＥＲ、ＰＲ、Ｐ５３、ＮａｐｓｉｎＡ、Ｐａｘ－８、ＷＴ－１、及びＫｉ－６７（全てCSTから購入）とした。
【0078】
図４Ａ～図４Ｇ及び図５Ａ～図５Ｇはそれぞれ、元の組織細胞と、本発明の初代卵巣癌細胞用の培養培地ＯＣ－２で元の組織細胞を培養することによって得られた初代卵巣癌細胞との免疫組織化学的結果の比較用写真である。図４Ａ及び図５Ａはそれぞれ、卵巣癌組織及び培養した初代卵巣癌細胞におけるＥＲ抗体標識の写真である。図４Ｂ及び図５Ｂはそれぞれ、卵巣癌組織及び培養した初代卵巣癌細胞におけるＰＲ抗体標識の写真である。図４Ｃ及び図５Ｃはそれぞれ、卵巣癌組織及び培養した初代卵巣癌細胞におけるＰ５３抗体標識の写真である。図４Ｄ及び図５Ｄはそれぞれ、卵巣癌組織及び培養した初代卵巣癌細胞におけるＮａｐｓｉｎＡ抗体標識の写真である。図４Ｅ及び図５Ｅは、卵巣癌組織及び培養した初代卵巣癌細胞におけるＰａｘ－８抗体標識の写真である。図４Ｆ及び図５Ｆはそれぞれ、卵巣癌組織及び培養した初代卵巣癌細胞におけるＷＴ－１抗体標識の写真である。図４Ｇ及び図５Ｇは、卵巣癌組織及び培養した初代卵巣癌細胞におけるＫｉ－６７抗体標識の写真である。これにより、本発明の技術を用いて培養した初代卵巣癌細胞を第４継代まで培養する場合、初代卵巣癌細胞上の卵巣癌に関連するバイオマーカーの発現が、初代卵巣癌細胞が由来する元の組織切片の発現と一致することを確認することができる。本発明の技術によって培養した初代卵巣癌細胞は、卵巣癌患者の癌組織の元の病理学的特徴を維持することが示される。
【0079】
実施例６ 既存の培養培地の培養効果との比較、初代卵巣癌細胞の培養サイクル及び細胞数の統計、並びに集団倍加（ＰＤ）数の算出
以下の配合を有する従来技術の培養培地（Xuefeng Liu et al., Nat. Protoc., 12(2): 439-451, (2017)）：ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地＋２５０ｎｇ／ｍＬアムホテリシンＢ（Selleckから購入）＋１０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（MCEから購入）＋０．１ｎＭコレラ毒素＋０．１２５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ＋２５ｎｇ／ｍＬヒドロコルチゾン＋１０μＭ Ｙ２７６３２＋１０％ ＦＢＳ。
以下の配合を有する従来技術の培養培地（Xuefeng Liu et al., Nat. Protoc., 12(2): 439-451, (2017)）：ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地＋２５０ｎｇ／ｍＬアムホテリシンＢ（Selleckから購入）＋１０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（MCEから購入）＋０．１ｎＭコレラ毒素＋０．１２５ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ＋２５ｎｇ／ｍＬヒドロコルチゾン＋１０μＭ Ｙ２７６３２＋１０％ ＦＢＳ。
【0080】
市販の培養培地：既定のＫ－ＳＦＭであるケラチノサイト血清培地（gibcoから購入、１０７４４－０１９）
【0081】
初代卵巣癌細胞は、実施例１の工程（２）－３のプロセスに従って３例の卵巣癌組織試料（符号Ｌ６５、Ｌ６６及びＡ２２０８３）から得た。従来技術の培養培地、市販の培養培地、及び実施例３の培養培地ＯＣ－２をそれぞれ用いて、得られた初代卵巣癌細胞を培養し、細胞を６ウェルプレートに生細胞密度３×１０４細胞／ｃｍ２で播種した。細胞が９５％まで拡大増殖した後、それらを消化して計数し、消化までの培養日数を培養サイクルとして記録した。この実験条件下で、拡大増殖させた細胞を、異なる継代で拡大増殖させた。各継代の細胞を消化して計数し、対応する培養サイクルを記録した。ＰＤ数は次の式に従って算出した。集団倍加（ＰＤ）＝３．３２×ｌｏｇ１０（消化後の総細胞数／接種した細胞の初期数）。式については、Chapman et al., Stem Cell Research & Therapy 2014, 5: 60を参照されたい。
【0082】
図６Ａ～図６Ｃは、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアによって描かれた、従来技術の培養培地、市販の培養培地、及び本発明の初代卵巣癌細胞用の培養培地ＯＣ－２を用いて培養した３例の初代細胞の成長曲線を示す。横軸は細胞培養の日数を表し、縦軸は細胞増殖の累積倍数、すなわち、培養サイクルにおける細胞増殖の倍数を表す。値が大きいほど、或る特定のサイクル内で細胞が拡大増殖する回数が多くなり、すなわち、より多くの細胞が拡大増殖する。傾きは細胞拡大増殖速度を表す。図６Ａ～図６Ｃから、本発明の培養培地ＯＣ－２で培養した初代卵巣癌細胞が少なくとも３０日間継続的に培養及び拡大増殖される場合、細胞拡大増殖速度は基本的に変化せず、細胞は依然として拡大増殖し続ける能力を有することを確認することができる。図６Ａ～図６Ｃの結果は、従来技術の培養培地及び市販の培地を用いて培養した初代卵巣癌細胞の拡大増殖速度が、ＯＣ－２培地における拡大増殖速度よりも著しく低いことを示す。要するに、従来技術の培養培地及び市販の培地と比較して、本発明の初代卵巣癌細胞用の培養培地を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した卵巣癌細胞の増殖効率は著しく良好である。
【0083】
実施例７ 薬物のスクリーニング及び有効性評価のための、本発明の培養培地を用いて拡大増殖した初代卵巣癌細胞の使用
１．細胞の培養及びプレーティング
実施例１の工程（２）－３のプロセスに従って初代卵巣癌細胞（符号Ａ２２０８３）を単離し、一世代として使用し、これを、細胞が８５％まで拡大増殖して継代するまで、本発明の初代卵巣癌細胞用の培養培地ＯＣ－２で培養した。細胞を継代し、実施例１の工程（２）－４に従って計数した。細胞をローディングスロット（Corningから購入）に生細胞密度１×１０５細胞／ｍＬで入れた。十分に混合した後、それらを３８４ウェルの不透明白色細胞培養プレート（Corningから購入）に、１ウェル当たり５０μＬの容量及び５０００細胞／ウェルの細胞数で入れた。本発明の初代卵巣癌細胞用の培養培地をプレートの端から加えることによってプレートを封止し、試料名、投与時間、及びＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Promega）の試験時間をプレートにマークした。プレートの表面を７５％アルコール（LIRCON）で消毒し、プレートを３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で培養し、２４時間後に投与した。薬物スクリーニングのために培養の第１、第２、第３、第４及び第５継代の細胞をそれぞれ得て、継続的な継代用の本発明の培養培地を用いて培養した初代卵巣癌細胞の薬物感受性を試験した。
１．細胞の培養及びプレーティング
実施例１の工程（２）－３のプロセスに従って初代卵巣癌細胞（符号Ａ２２０８３）を単離し、一世代として使用し、これを、細胞が８５％まで拡大増殖して継代するまで、本発明の初代卵巣癌細胞用の培養培地ＯＣ－２で培養した。細胞を継代し、実施例１の工程（２）－４に従って計数した。細胞をローディングスロット（Corningから購入）に生細胞密度１×１０５細胞／ｍＬで入れた。十分に混合した後、それらを３８４ウェルの不透明白色細胞培養プレート（Corningから購入）に、１ウェル当たり５０μＬの容量及び５０００細胞／ウェルの細胞数で入れた。本発明の初代卵巣癌細胞用の培養培地をプレートの端から加えることによってプレートを封止し、試料名、投与時間、及びＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Promega）の試験時間をプレートにマークした。プレートの表面を７５％アルコール（LIRCON）で消毒し、プレートを３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で培養し、２４時間後に投与した。薬物スクリーニングのために培養の第１、第２、第３、第４及び第５継代の細胞をそれぞれ得て、継続的な継代用の本発明の培養培地を用いて培養した初代卵巣癌細胞の薬物感受性を試験した。
【0084】
２．候補薬物の調製
以下の表に従って、６つの薬物（シタラビン、ドキソルビシン、ボルテゾミブ、パノビノスタット、アザシチジン、及びホモハリングトニン、全てMCEから購入）を６つの濃度勾配で調製し、これを３８４ウェルプレート（Thermo Fisher）に１ウェル当たり３０μＬの体積で添加し、使用まで保管した。
以下の表に従って、６つの薬物（シタラビン、ドキソルビシン、ボルテゾミブ、パノビノスタット、アザシチジン、及びホモハリングトニン、全てMCEから購入）を６つの濃度勾配で調製し、これを３８４ウェルプレート（Thermo Fisher）に１ウェル当たり３０μＬの体積で添加し、使用まで保管した。
【0085】
【表5】
【0086】
３．高スループット投与
調製した薬物を含むプレートを取り出し、室温に維持した。プレートを室温で１０００ｒｐｍ、遠心分離機（Beckman）において１分間遠心分離し、次いで遠心分離機から取り出した。高スループット投与には、高スループット自動ワークステーション（ＪＡＮＵＳ、Perkin Elmer）を使用した。培養した初代卵巣癌細胞を含む３８４ウェルプレートの各ウェルに、対応する濃度の候補薬物０．１μＬを添加した。投与後、３８４ウェルプレートの表面を消毒し、インキュベーターに移動させた。細胞生存率を７２時間後に測定した。
調製した薬物を含むプレートを取り出し、室温に維持した。プレートを室温で１０００ｒｐｍ、遠心分離機（Beckman）において１分間遠心分離し、次いで遠心分離機から取り出した。高スループット投与には、高スループット自動ワークステーション（ＪＡＮＵＳ、Perkin Elmer）を使用した。培養した初代卵巣癌細胞を含む３８４ウェルプレートの各ウェルに、対応する濃度の候補薬物０．１μＬを添加した。投与後、３８４ウェルプレートの表面を消毒し、インキュベーターに移動させた。細胞生存率を７２時間後に測定した。
【0087】
４．細胞生存率の測定
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光試薬（Promega）を４℃の冷蔵庫から取り出し、試薬１０ｍＬをローディングスロットに添加した。試験する３８４ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光試薬１０μＬを各ウェルに添加した。１０分間静置した後、多機能マイクロプレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ、Perkin Elmer）を用いて試験を行った。
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光試薬（Promega）を４℃の冷蔵庫から取り出し、試薬１０ｍＬをローディングスロットに添加した。試験する３８４ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光試薬１０μＬを各ウェルに添加した。１０分間静置した後、多機能マイクロプレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ、Perkin Elmer）を用いて試験を行った。
【0088】
５．データ処理
細胞阻害率（％）＝１００％－薬物投与ウェルの化学発光値／コントロールウェルの化学発光値×１００％の式に従って、種々の薬物で処理した細胞の細胞阻害率を算出し、細胞上の薬物の半数阻害率（ＩＣ５０）を、ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアによって算出した。結果を図７Ａ～図７Ｆに示す。
細胞阻害率（％）＝１００％－薬物投与ウェルの化学発光値／コントロールウェルの化学発光値×１００％の式に従って、種々の薬物で処理した細胞の細胞阻害率を算出し、細胞上の薬物の半数阻害率（ＩＣ５０）を、ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアによって算出した。結果を図７Ａ～図７Ｆに示す。
【0089】
図７Ａ～図７Ｆから、本発明の初代卵巣癌細胞用の培養培地ＯＣ－２から培養した初代卵巣癌細胞を薬物スクリーニングに使用する場合、種々の継代の培養細胞に対する同じ薬物の阻害効果が実質的に一貫している（阻害曲線が実質的に一貫している）。同じ患者からの細胞は、人体の最大血中濃度において異なる薬物に対して異なる感受性を有する。この結果に従って、卵巣癌患者の臨床使用における薬物の有効性を判断することができる。同時に、結果から、薬物に対する、本発明の培養方法により得られた種々の継代の腫瘍細胞の感受性は安定していることが示される。
【産業上の利用可能性】
【0090】
本発明は、初代卵巣癌細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養するための初代細胞培養培地及び培養方法を提供し、培養した細胞は、薬物の有効性評価及びスクリーニングに使用することができる。したがって、本発明は産業上の利用に適している。
【0091】
本発明を本明細書において詳細に説明したが、本発明はこれに限定されず、当業者であれば本発明の原理に従って変更を加えることができる。したがって、本発明の原理に従って加えられたいかなる変更も、本発明の保護範囲に含まれると理解されるものとする。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7】
【国際調査報告】