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特表2024-537357呼吸器合胞体ウイルスを中和する全ヒト抗体の設計および使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-10
(54)【発明の名称】呼吸器合胞体ウイルスを中和する全ヒト抗体の設計および使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/08 20060101AFI20241003BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241003BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241003BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241003BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20241003BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20241003BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241003BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20241003BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20241003BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20241003BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241003BHJP
A61K 38/19 20060101ALI20241003BHJP
G01N 33/569 20060101ALI20241003BHJP
G01N 33/531 20060101ALI20241003BHJP
C12N 5/0783 20100101ALN20241003BHJP
【ＦＩ】
C07K16/08
C12N15/13 ZNA
C12N15/63 Z
C12N5/10
C12P21/08
C07K19/00
C12N15/62 Z
A61K47/68
A61P31/12
A61K35/17
A61K39/395 N
A61K38/19
G01N33/569 L
G01N33/531 A
C12N5/0783
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024522267
(86)(22)【出願日】2022-10-08
(85)【翻訳文提出日】2024-06-12
(86)【国際出願番号】 CN2022123876
(87)【国際公開番号】W WO2023061264
(87)【国際公開日】2023-04-20
(31)【優先権主張番号】202111189228.6
(32)【優先日】2021-10-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520308488
【氏名又は名称】センター フォー エクセレンス イン モレキュラー セル サイエンス，チャイニーズ アカデミー オブ サイエンシーズ
(74)【代理人】
【識別番号】110003971
【氏名又は名称】弁理士法人葛和国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】スン，ビン
(72)【発明者】
【氏名】イー，チュエンヤン
(72)【発明者】
【氏名】リン，ヂーヤン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C076
4C084
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA94X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA44
4C076AA11
4C076BB01
4C076BB11
4C076BB13
4C076BB21
4C076EE59
4C084AA01
4C084AA02
4C084BA41
4C084DA01
4C084MA17
4C084MA52
4C084MA56
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZB331
4C084ZB332
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085CC23
4C085EE01
4C085GG01
4C085GG02
4C085GG06
4C085GG08
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB65
4C087MA17
4C087MA52
4C087MA56
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZB33
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045BA72
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は呼吸器合胞体ウイルスを中和する全ヒト抗体の設計および使用を提供する。具体的に、本発明では、コンピュータ支援設計および部位特異的突然変異技術によって呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質の全ヒトモノクローナル抗体４Ｆ１に対して胚胎系遺伝子の復帰突然変異および親和力の向上を行った。本発明の改造された抗体は、比較的に低い体細胞突然変異部位を有し、高親和力を有し、有効にＲＳＶ感染を予防し、同時に有効にＲＳＶ感染後の拡散を抑制することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
特異的抗呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質の抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、ここで、前記重鎖の可変領域は配列番号１５で示される配列に相応し、以下のアミノ酸突然変異を有し：
（Ｚ１） ｎ個の以下の群から選ばれる復帰型突然変異で、ここで、ｎは３、４、５、６、７、８または９である：
１番目のＥ→Ｑ
６番目のＱ→Ｅ
１３番目のＲ→Ｑ
６２番目のＥ→Ｄ
６５番目のＲ→Ｋ
６９番目のＳ→Ｔ
７６番目のＴ→Ｋ
８８番目のＰ→Ａ
１１９番目のＲ→Ｔ；
（Ｚ２） 中和増強型ＦＲ突然変異
７５番目のＳ→Ｒ；
（Ｚ３）Ｚ１とＺ２の組み合わせ；
および、前記軽鎖の可変領域は配列番号１６で示される配列に相応し、以下のアミノ酸突然変異を有する：
（Ｙ１） ｍ個の以下の群から選ばれる復帰型突然変異で、ここで、ｍは３、４、５、６または７である：
１２番目のＳ→Ｐ
２４番目のＫ→Ｒ
４７番目のＫ→Ｑ
６５番目のＡ→Ｄ
７９番目のＥ→Ｋ
１０９番目のＶ→Ｌ
１１０番目のＤ→Ｅ；
（Ｙ２） 中和増強型ＣＤＲ突然変異
３０番目のＬ→Ｒ；
（Ｙ３）Ｙ１とＹ２の組み合わせ；
ことを特徴とする抗体。
【請求項2】
前記抗体は特異的に呼吸器合胞体ウイルスの融合前Ｆタンパク質に結合することを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項3】
前記重鎖は以下の群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の抗体：ａ） アミノ酸配列が配列番号１、２で示される重鎖可変領域；ならびに
ｂ） 配列番号１、または２で示されるアミノ酸配列が、３つのＣＤＲ領域の配列が残ったまま、ＦＲ領域が少なくとも１個（たとえば１－５個、好ましくは１－３個、最も好ましくは１または２個）のアミノ酸残基の置換、欠失、修飾および／または付加を経てなる、呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質（好ましくは融合前Ｆタンパク質）の結合親和力が残った誘導配列で示される重鎖可変領域。
【請求項4】
前記軽鎖可変領域は以下の群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の抗体：ｃ） アミノ酸配列が配列番号４または５で示される軽鎖可変領域；ならびに
ｄ） 配列番号４または５で示されるアミノ酸配列が、３つのＣＤＲ領域の配列が残ったまま、ＦＲ領域が少なくとも１個（たとえば１－４個、好ましくは１－３個、最も好ましくは１または２個）のアミノ酸残基の置換、欠失、修飾および／または付加を経てなる、呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質（好ましくは融合前Ｆタンパク質）の結合親和力が残った誘導配列で示される重鎖可変領域。
【請求項5】
前記重鎖可変領域は配列番号１または２で示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項6】
前記軽鎖可変領域は配列番号４または５で示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項7】
前記抗体は配列が配列番号２で示される重鎖可変領域および配列が配列番号４で示される軽鎖可変領域を有することを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項8】
組み換えタンパク質であって、（ｉ） 請求項１に記載の抗体；ならびに
（ｉｉ）任意の発現および／または精製を補助するタグ配列
を有するタンパク質。
【請求項9】
ＣＡＲ構築物であって、前記のＣＡＲ構築物の抗原結合領域のｓｃＦｖ断片は特異的にＲＳＶ融合タンパク質（好ましくは融合前Ｆタンパク質）に結合する結合領域で、かつ前記ｓｃＦｖは請求項１に記載の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有するＣＡＲ構築物。
【請求項10】
外来の請求項７に記載のＣＡＲ構築物を発現する組み換え免疫細胞。
【請求項11】
抗体薬物複合体であって、（ａ） 請求項１に記載の的抗体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、抗体部分；および
（ｂ） 検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、前記抗体部分と複合する複合部分
を含有する抗体薬物複合体。
【請求項12】
薬物組成物であって、（ｉ） 請求項１に記載の抗体、請求項６に記載の組み換えタンパク質、請求項８に記載の免疫細胞、請求項９に記載の抗体薬物複合体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、活性成分；および
（ｉｉ） 薬学的に許容される担体
を含有する薬物組成物。
【請求項13】
以下の群から選ばれるポリペプチドをコードのするポリヌクレオチド：（１） 請求項１～７のいずれかに記載の抗体；
（２） 請求項８に記載の組み換えタンパク質；および
（３） 請求項９に記載のＣＡＲ構築物。
【請求項14】
サンプルにおける呼吸器合胞体ウイルスを検出する方法であって、以下の工程を含む方法：（１） サンプルを請求項１～７のいずれかに記載の抗体と接触させる工程、および
（２） 抗原－抗体複合体が形成したか検出し、ここで、複合体が形成したというのはサンプルに呼吸器合胞体ウイルスが存在することを意味する。
【請求項15】
呼吸器合胞体ウイルス感染を治療する方法であって、必要な対象に本発明の請求項１－７のいずれかに記載の抗体、または前記抗体の抗体－薬物複合体、または前記抗体を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞、またはこれらの組み合わせを施用する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物医薬の分野に関する。具体的に、本発明は、呼吸器合胞体ウイルスを中和する全ヒト抗体の設計および使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ヒト呼吸器合胞体ウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ、ＲＳＶ）は、児童の下部呼吸器感染を引き起こす要因である。ＲＳＶ感染によって１か月から１歳の児童が重度な細気管支炎や肺炎に罹患することによる死亡の比率が６．７％で、そして２歳前にほとんどの児童に感染する。年寄りの層では、呼吸器合胞体ウイルスは季節性Ａ型インフルエンザウイルスに相当する疾患の負担を与える。ＲＳＶは人類の健康を大いに脅かすが、臨床の許可が得られたＲＳＶワクチンおよび有効な抗ウイルス薬がまだ欠けている。
【0003】
ＲＳＶ Ｆタンパク質は融合前の状態（ｐｒｅ－Ｆ、ｐｒｅ－ｆｕｓｉｏｎ Ｆ）から融合後の状態（ｐｏｓｔ－Ｆ、ｐｏｓｔ－ｆｕｓｉｏｎ Ｆ）への構造変化により、ウイルスのエンベロープ膜と宿主の細胞膜の融合過程を仲介し、その構造の融合前の状態から融合の状態への変化過程でもある。ＲＳＶ侵入における重要な作用および高度の保存性のため、ＲＳＶ Ｆタンパク質は中和抗体の標的およびワクチン開発の主要な抗原である。大量の研究により、Ｆタンパク質の高活性中和抗体の認識部位は主にｐｒｅ－ｆｕｓｉｏｎ Ｆタンパク質に位置し、ｐｒｅ－ｆｕｓｉｏｎ Ｆに基づいて設計された組み換えタンパク質は免疫原性および保護効果が顕著にｐｏｓｔ－ｆｕｓｉｏｎ Ｆタンパク質に基づいて設計されたワクチンよりも良いことが実証された。
【0004】
過去の数十年では、ワクチン開発、抗ウイルス化合物（リバビリン）、アンチセンス薬物、ＲＮＡ干渉技術および抗体製品、たとえば、免疫グロブリンや静脈注射モノクローナル抗体を含む、ＲＳＶ感染を予防および治療するいくつかの方法が研究されてきた。パリビズマブ（Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）は、ハイリスク児童におけるＲＳＶ予防への使用が許可された唯一のものである。しかしながら、中国では、ＲＳＶのワクチンまたは市販品による治療はまだない。ＲＳＶ感染の治療への使用が許可されたのはリバビリンのみであるが、重度な副作用がある。パリビズマブはＦタンパク質の保存的な領域を標的とし、作用の範囲が広いが、一回の投与に必要なパリビズマブの投与量が１５ｍｇ／ｋｇ（体重）で、一年に受動免疫５回で、投与量が高い、複数回の投与が必要、高価といった欠点があり、そしてパリビズマブはヒト化抗体で、一部のネズミ由来の配列がまだ残っており、ある程度の免疫原性が存在する可能性がり、安全性においてある程度異論がある。免疫学および分子生物学の発展につれ、遺伝子工学による抗体が迅速に発展し、キメラ抗体、ヒト化抗体および全ヒト抗体の生産技術が進み、ＨＡＭＡ反応を最低限にし、ひいてはなくすこと、特に、全ヒト抗体は抗体薬物の将来の発展方向になっている。抗体に基づく療法で考慮される要素は抗体が幅広い抗ウイルス作用があるか、好適な物理・化学的性質および合理的で実行可能な投与量で保護を仲介できるように、抗体が十分に有効であるかといったことである。
そのため、本分野では、抗ＲＳＶウイルス感染の新規な薬物の候補の開発が必要である。
そのため、本分野では、抗ＲＳＶウイルス感染の新規な薬物の候補の開発が必要である。
【発明の概要】
【0005】
本発明の目的は、抗ＲＳＶウイルス感染の新規な薬物の候補を提供することである。具体的に、本発明は、呼吸器合胞体ウイルスを中和する全ヒト抗体の設計、ならびにＲＳＶ関連疾患の予防と治療、およびＲＳＶ感染の診断における最適化された４Ｆ１抗体の使用を公開する。
【0006】
本発明の第一の側面では、特異的抗呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質の抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、
中では、前記重鎖の可変領域は配列番号１５で示される配列に相応し、以下のアミノ酸突然変異を有し：
（Ｚ１） ｎ個の以下の群から選ばれる復帰型突然変異で、ここで、ｎは３、４、５、６、７、８または９である：
１番目のＥ→Ｑ
６番目のＱ→Ｅ
１３番目のＲ→Ｑ
６２番目のＥ→Ｄ
６５番目のＲ→Ｋ
６９番目のＳ→Ｔ
７６番目のＴ→Ｋ
８８番目のＰ→Ａ
１１９番目のＲ→Ｔ；
（Ｚ２） 中和増強型ＦＲ突然変異
７５番目のＳ→Ｒ；
（Ｚ３）Ｚ１とＺ２の組み合わせ；
そして、前記軽鎖の可変領域は配列番号１６で示される配列に相応し、以下のアミノ酸突然変異を有する：
（Ｙ１） ｍ個の以下の群から選ばれる復帰型突然変異で、ここで、ｍは３、４、５、６または７である：
１２番目のＳ→Ｐ
２４番目のＫ→Ｒ
４７番目のＫ→Ｑ
６５番目のＡ→Ｄ
７９番目のＥ→Ｋ
１０９番目のＶ→Ｌ
１１０番目のＤ→Ｅ；
（Ｙ２） 中和増強型ＣＤＲ突然変異
３０番目のＬ→Ｒ；
（Ｙ３）Ｙ１とＹ２の組み合わせ；
抗体を提供する。
中では、前記重鎖の可変領域は配列番号１５で示される配列に相応し、以下のアミノ酸突然変異を有し：
（Ｚ１） ｎ個の以下の群から選ばれる復帰型突然変異で、ここで、ｎは３、４、５、６、７、８または９である：
１番目のＥ→Ｑ
６番目のＱ→Ｅ
１３番目のＲ→Ｑ
６２番目のＥ→Ｄ
６５番目のＲ→Ｋ
６９番目のＳ→Ｔ
７６番目のＴ→Ｋ
８８番目のＰ→Ａ
１１９番目のＲ→Ｔ；
（Ｚ２） 中和増強型ＦＲ突然変異
７５番目のＳ→Ｒ；
（Ｚ３）Ｚ１とＺ２の組み合わせ；
そして、前記軽鎖の可変領域は配列番号１６で示される配列に相応し、以下のアミノ酸突然変異を有する：
（Ｙ１） ｍ個の以下の群から選ばれる復帰型突然変異で、ここで、ｍは３、４、５、６または７である：
１２番目のＳ→Ｐ
２４番目のＫ→Ｒ
４７番目のＫ→Ｑ
６５番目のＡ→Ｄ
７９番目のＥ→Ｋ
１０９番目のＶ→Ｌ
１１０番目のＤ→Ｅ；
（Ｙ２） 中和増強型ＣＤＲ突然変異
３０番目のＬ→Ｒ；
（Ｙ３）Ｙ１とＹ２の組み合わせ；
抗体を提供する。
【0007】
もう一つの好適な例において、前記の重鎖可変領域は配列番号１５に相応し、４－１０個の前記のアミノ酸突然変異が存在する。
もう一つの好適な例において、前記の軽鎖可変領域は配列番号１６に相応し、４－８個の前記のアミノ酸突然変異が存在する。
もう一つの好適な例において、前記の抗体は特異的に呼吸器合胞体ウイルスの融合前Ｆタンパク質に結合する。
もう一つの好適な例において、前記の軽鎖可変領域は配列番号１６に相応し、４－８個の前記のアミノ酸突然変異が存在する。
もう一つの好適な例において、前記の抗体は特異的に呼吸器合胞体ウイルスの融合前Ｆタンパク質に結合する。
【0008】
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域は配列番号１５に相応する突然変異がＥ１Ｑ、Ｑ６Ｅ、Ｒ１３Ｑ、Ｅ６２Ｄ、Ｒ６５Ｋ、Ｓ６９Ｔ、Ｓ７５Ｒ、Ｔ７６Ｋ、Ｐ８８Ａ、Ｒ１１９Ｔ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【0009】
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域は以下の群から選ばれる：
ａ）アミノ酸配列が配列番号１、２で示される重鎖可変領域；あるいは
ｂ）配列番号１、または２で示されるアミノ酸配列が、３つのＣＤＲ領域の配列が残ったまま、ＦＲ領域が少なくとも１個（たとえば１－５個、好ましくは１－３個、最も好ましくは１または２個）のアミノ酸残基の置換、欠失、修飾および／または付加を経てなる、呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質（好ましくは融合前Ｆタンパク質）の結合親和力が残った誘導配列で示される重鎖可変領域。
ａ）アミノ酸配列が配列番号１、２で示される重鎖可変領域；あるいは
ｂ）配列番号１、または２で示されるアミノ酸配列が、３つのＣＤＲ領域の配列が残ったまま、ＦＲ領域が少なくとも１個（たとえば１－５個、好ましくは１－３個、最も好ましくは１または２個）のアミノ酸残基の置換、欠失、修飾および／または付加を経てなる、呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質（好ましくは融合前Ｆタンパク質）の結合親和力が残った誘導配列で示される重鎖可変領域。
【0010】
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域は配列番号１６に相応する突然変異がＳ１２Ｐ、Ｋ２４Ｒ、Ｌ３０Ｒ、Ｋ４７Ｑ、Ａ６５Ｄ、Ｅ７９Ｋ、Ｖ１０９Ｌ、Ｄ１１０Ｅ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【0011】
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域は以下の群から選ばれる：
ｃ）アミノ酸配列が配列番号４または５で示される軽鎖可変領域；あるいは
ｄ）配列番号４または５で示されるアミノ酸配列が、３つのＣＤＲ領域の配列が残ったまま、ＦＲ領域が少なくとも１個（たとえば１－４個、好ましくは１－３個、最も好ましくは１または２個）のアミノ酸残基の置換、欠失、修飾および／または付加を経てなる、呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質（好ましくは融合前Ｆタンパク質）の結合親和力が残った誘導配列で示される重鎖可変領域。
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域は配列番号１または２で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域は配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する。
ｃ）アミノ酸配列が配列番号４または５で示される軽鎖可変領域；あるいは
ｄ）配列番号４または５で示されるアミノ酸配列が、３つのＣＤＲ領域の配列が残ったまま、ＦＲ領域が少なくとも１個（たとえば１－４個、好ましくは１－３個、最も好ましくは１または２個）のアミノ酸残基の置換、欠失、修飾および／または付加を経てなる、呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質（好ましくは融合前Ｆタンパク質）の結合親和力が残った誘導配列で示される重鎖可変領域。
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域は配列番号１または２で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域は配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する。
【0012】
もう一つの好適な例において、前記の抗体の重鎖は、さらに、重鎖定常領域を含む。
もう一つの好適な例において、前記の重鎖定常領域はヒト由来のものである。
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域は配列番号４または５で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域は配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記の抗体の軽鎖は、さらに、軽鎖定常領域を含む。
もう一つの好適な例において、前記の軽鎖定常領域はヒト由来のものである。
もう一つの好適な例において、前記抗体はヒト化抗体から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の抗体は二本鎖抗体、または一本鎖抗体である。
もう一つの好適な例において、前記の抗体はモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体である。
もう一つの好適な例において、前記の抗体は部分的にまたは全部ヒト化したモノクローナル抗体である。
もう一つの好適な例において、前記の抗体は、薬物複合体の形態である。
もう一つの好適な例において、前記の重鎖定常領域はヒト由来のものである。
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域は配列番号４または５で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域は配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記の抗体の軽鎖は、さらに、軽鎖定常領域を含む。
もう一つの好適な例において、前記の軽鎖定常領域はヒト由来のものである。
もう一つの好適な例において、前記抗体はヒト化抗体から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の抗体は二本鎖抗体、または一本鎖抗体である。
もう一つの好適な例において、前記の抗体はモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体である。
もう一つの好適な例において、前記の抗体は部分的にまたは全部ヒト化したモノクローナル抗体である。
もう一つの好適な例において、前記の抗体は、薬物複合体の形態である。
【0013】
もう一つの好適な例において、前記抗体は配列が配列番号１または２で示される重鎖可変領域を有し、そして配列が配列番号４または５で示される軽鎖可変領域を有する。
もう一つの好適な例において、前記抗体は配列が配列番号２で示される重鎖可変領域および配列が配列番号４で示される軽鎖可変領域を有する。
もう一つの好適な例において、前記抗体は配列が配列番号２で示される重鎖可変領域および配列が配列番号４で示される軽鎖可変領域を有する。
【0014】
本発明の第二の側面では、組み換えタンパク質であって、
（ｉ）本発明の第一の側面に記載の抗体、ならびに
（ｉｉ）任意の発現および／または精製を補助するタグ配列
を有する組み換えタンパク質を提供する。
もう一つの好適な例において、前記のタグ配列は６Ｈｉｓタグ、ＧＧＧＳ配列、ＦＬＡＧタグを含む。
もう一つの好適な例において、前記の組み換えタンパク質（またはポリペプチド）は融合タンパク質を含む。
もう一つの好適な例において、前記の組み換えタンパク質は、単量体、二量体、または多量体である。
もう一つの好適な例において、前記の組み換えタンパク質は特異的に呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質、好ましくは融合前Ｆタンパク質に結合する。
もう一つの好適な例において、前記の組み換えタンパク質は融合タンパク質である。
（ｉ）本発明の第一の側面に記載の抗体、ならびに
（ｉｉ）任意の発現および／または精製を補助するタグ配列
を有する組み換えタンパク質を提供する。
もう一つの好適な例において、前記のタグ配列は６Ｈｉｓタグ、ＧＧＧＳ配列、ＦＬＡＧタグを含む。
もう一つの好適な例において、前記の組み換えタンパク質（またはポリペプチド）は融合タンパク質を含む。
もう一つの好適な例において、前記の組み換えタンパク質は、単量体、二量体、または多量体である。
もう一つの好適な例において、前記の組み換えタンパク質は特異的に呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質、好ましくは融合前Ｆタンパク質に結合する。
もう一つの好適な例において、前記の組み換えタンパク質は融合タンパク質である。
【0015】
もう一つの好適な例において、前記の融合タンパク質は単特異性抗体（すなわち、抗ＲＳＶ融合タンパク質の単特異性抗体）、二重特異性抗体、または多重特異性抗体（たとえば、三重特異性抗体）である。
【0016】
もう一つの好適な例において、前記の二重特異性抗体または多重特異性抗体は、抗ＲＳＶ融合タンパク質以外、特異的に別の標的抗原（たとえば、ほかのウイルス抗原、たとえば、呼吸器合胞体ウイルスのほかの抗原またはほかのウイルスの抗原）に結合する。
【0017】
本発明の第三の側面では、ＣＡＲ構築物であって、前記のＣＡＲ構築物の抗原結合領域のｓｃＦｖ断片は特異的にＲＳＶ融合タンパク質（好ましくは融合前Ｆタンパク質）に結合する結合領域で、かつ前記ｓｃＦｖは本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有するＣＡＲ構築物を提供する。
本発明の第四の側面では、組み換えの免疫細胞であって、外来の本発明の第三の側面に記載のＣＡＲ構築物を発現する免疫細胞を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の免疫細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞からなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の免疫細胞はヒトまたはヒト以外の哺乳動物（たとえばマウス）由来のものである。
本発明の第四の側面では、組み換えの免疫細胞であって、外来の本発明の第三の側面に記載のＣＡＲ構築物を発現する免疫細胞を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の免疫細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞からなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の免疫細胞はヒトまたはヒト以外の哺乳動物（たとえばマウス）由来のものである。
【0018】
本発明の第五の側面では、抗体薬物複合体であって、
（ａ）本発明の第一の側面に記載の的抗体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、抗体部分；ならびに
（ｂ） 検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、前記抗体部分と複合する複合部分を含有する抗体薬物複合体を提供する。
（ａ）本発明の第一の側面に記載の的抗体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、抗体部分；ならびに
（ｂ） 検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、前記抗体部分と複合する複合部分を含有する抗体薬物複合体を提供する。
【0019】
もう一つの好適な例において、前記複合体は、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像）またはＣＴ（コンピュータＸ線断層撮影技術）造影剤、または検出可能な生成物を生成させる酵素、放射性核種、生物毒素、サイトカイン（たとえばＩＬ－２など）、抗体、抗体Ｆｃ断片、抗体ｓｃＦｖ断片、金ナノ粒子／ナノロッド、ウイルス粒子、リポソーム、磁性ナノ粒子、プロドラッグ活性化酵素（たとえば、ＤＴ－ジアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニルヒドロラーゼ様蛋白質（ＢＰＨＬ））、化学治療剤（たとえば、シスプラチン）または任意の様態のナノ粒子などから選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の抗体部分と前記の複合部分は化学結合またはリンカーを介して複合している。
もう一つの好適な例において、前記の抗体部分と前記の複合部分は化学結合またはリンカーを介して複合している。
【0020】
本発明の第六の側面では、活性成分の使用であって、前記活性成分は、本発明の第一の側面に記載の抗体、本発明の第二の側面に記載の組み換えタンパク質、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、前記活性成分は薬剤、試薬、検出プレートまたはキットの製造に用いられる使用を提供する。
もう一つの好適な例において、前記試薬、検出プレートまたはキットは呼吸器合胞体ウイルスの検出に用いられる。
もう一つの好適な例において、前記薬剤は呼吸器合胞体ウイルス感染の治療または予防に用いられる。
もう一つの好適な例において、前記の試薬は、チップ、抗体で被覆された免疫マイクロスフェアを含む。
もう一つの好適な例において、前記試薬、検出プレートまたはキットは呼吸器合胞体ウイルスの検出に用いられる。
もう一つの好適な例において、前記薬剤は呼吸器合胞体ウイルス感染の治療または予防に用いられる。
もう一つの好適な例において、前記の試薬は、チップ、抗体で被覆された免疫マイクロスフェアを含む。
【0021】
本発明の第七の側面では、薬物組成物であって、
（ｉ） 本発明第一の側面に記載の抗体、本発明第二の側面に記載の組み換えタンパク質、本発明の第四の側面に記載の免疫細胞、本発明の第五の側面に記載の抗体薬物複合体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、活性成分；ならびに
（ｉｉ） 薬学的に許容される担体を含有する薬物組成物を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物は液体製剤である。
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物は注射剤である。
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物は呼吸器合胞体ウイルス感染の予防および／または治療に用いられる。
（ｉ） 本発明第一の側面に記載の抗体、本発明第二の側面に記載の組み換えタンパク質、本発明の第四の側面に記載の免疫細胞、本発明の第五の側面に記載の抗体薬物複合体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、活性成分；ならびに
（ｉｉ） 薬学的に許容される担体を含有する薬物組成物を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物は液体製剤である。
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物は注射剤である。
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物は呼吸器合胞体ウイルス感染の予防および／または治療に用いられる。
【0022】
本発明の第八の側面では、以下の群から選ばれるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する：
（１）本発明の第一の側面に記載の抗体；あるいは
（２） 本発明の第二の側面に記載の組み換えタンパク質；
（３） 本発明の第三の側面に記載のＣＡＲ構築物。
もう一つの好適な例において、前記のポリヌクレオチドは配列番号８または９ならびに／あるいは配列番号１１または１２で示される配列を含有する。
もう一つの好適な例において、前記のポリヌクレオチドは配列番号９および／または配列番号１１で示される配列を含有する。
（１）本発明の第一の側面に記載の抗体；あるいは
（２） 本発明の第二の側面に記載の組み換えタンパク質；
（３） 本発明の第三の側面に記載のＣＡＲ構築物。
もう一つの好適な例において、前記のポリヌクレオチドは配列番号８または９ならびに／あるいは配列番号１１または１２で示される配列を含有する。
もう一つの好適な例において、前記のポリヌクレオチドは配列番号９および／または配列番号１１で示される配列を含有する。
【0023】
本発明の第九の側面では、本発明の第八の側面に記載のポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。
もう一つの好適な例において、前記のベクターは、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳動物細胞ウイルス、たとえばアデノウイルス、レトロウイルス、またはほかのベクターを含む。
もう一つの好適な例において、前記のベクターは、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳動物細胞ウイルス、たとえばアデノウイルス、レトロウイルス、またはほかのベクターを含む。
【0024】
本発明の第十の側面では、工学化された宿主細胞であって、本発明第九の側面に記載のベクターを含むか、あるいはゲノムに本発明第八の側面に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた宿主細胞を提供する。
本発明の第十一の側面では、サンプルにおける呼吸器合胞体ウイルスを検出する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
（１） サンプルを本発明の第一の側面に記載の抗体と接触させる；
（２） 抗原－抗体複合体が形成したか検出し、ここで、複合体が形成したというのはサンプルに呼吸器合胞体ウイルスが存在することを意味する。
もう一つの好適な例において、前記検出は非治療的かつ非診断的な目的である。
本発明の第十一の側面では、サンプルにおける呼吸器合胞体ウイルスを検出する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
（１） サンプルを本発明の第一の側面に記載の抗体と接触させる；
（２） 抗原－抗体複合体が形成したか検出し、ここで、複合体が形成したというのはサンプルに呼吸器合胞体ウイルスが存在することを意味する。
もう一つの好適な例において、前記検出は非治療的かつ非診断的な目的である。
【0025】
本発明の第十二の側面では、サンプルにおける呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質を検出する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
（１） サンプルを本発明の第一の側面に記載の抗体と接触させる；
（２） 抗原－抗体複合体が形成したか検出し、ここで、複合体が形成したというのはサンプルにに呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質が存在することを意味する。
（１） サンプルを本発明の第一の側面に記載の抗体と接触させる；
（２） 抗原－抗体複合体が形成したか検出し、ここで、複合体が形成したというのはサンプルにに呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質が存在することを意味する。
【0026】
もう一つの好適な例において、前記呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質は呼吸器合胞体ウイルス融合前Ｆタンパク質である。
もう一つの好適な例において、前記検出は非治療的かつ非診断的な目的である。
もう一つの好適な例において、前記検出は非治療的かつ非診断的な目的である。
【0027】
本発明の第十三の側面では、下地シート（支持プレート）と、本発明の第一の側面に記載の抗体または本発明の第五の側面に記載の免疫複合体を含有する測定バーとを含む検出プレートを提供する。
本発明の第十四の側面では、キットであって、
（１） 本発明の第一の側面に記載の抗体を含有する第一容器、および／または
（２） 本発明の第一の側面に記載の抗体に対する二次抗体を含有する第二容器を含むか、
あるいは、本発明の第十三の側面に記載の検出プレートを含有する
キットを提供する。
本発明の第十五の側面では、組み換えポリペプチドの製造方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
（ａ） 発現に適切な条件において、本発明の第十の側面に記載の宿主細胞を培養する；
（ｂ） 培養物から、本発明の第一の側面に記載の抗体または本発明の第二の側面に記載の組み換えタンパク質である、組み換えポリペプチドを単離する。
本発明の第十四の側面では、キットであって、
（１） 本発明の第一の側面に記載の抗体を含有する第一容器、および／または
（２） 本発明の第一の側面に記載の抗体に対する二次抗体を含有する第二容器を含むか、
あるいは、本発明の第十三の側面に記載の検出プレートを含有する
キットを提供する。
本発明の第十五の側面では、組み換えポリペプチドの製造方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
（ａ） 発現に適切な条件において、本発明の第十の側面に記載の宿主細胞を培養する；
（ｂ） 培養物から、本発明の第一の側面に記載の抗体または本発明の第二の側面に記載の組み換えタンパク質である、組み換えポリペプチドを単離する。
【0028】
本発明の第十六の側面では、呼吸器合胞体ウイルス感染を治療する方法であって、必要な対象に本発明の第一の側面に記載の抗体、前記抗体の抗体－薬物複合体、または前記抗体を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞、またはこれらの組み合わせを施用する工程を含む方法を提供する。
【0029】
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
【図面の簡単な説明】
【0030】
図面の説明
以下の図面は本発明の具体的な実施方案を説明するためのもので、請求の範囲で決められる本発明の範囲を限定するものではない。
以下の図面は本発明の具体的な実施方案を説明するためのもので、請求の範囲で決められる本発明の範囲を限定するものではない。
【図1】図１はコンピュータ支援設計によって最適化して４Ｆ１抗体の結合活性および中和活性を向上させることを示す。（Ａ） ４Ｆ１およびＡ２／ｐｒｅ－Ｆタンパク質の分子ドッキングシミュレーションの構造である。青色は４Ｆ１重鎖を、浅青色は４Ｆ１軽鎖を、緑色はｐｒｅ－Ｆを、バラ色は重鎖の三つの可変領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を、オレンジ色は軽鎖の三つの可変領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を表す。ｐｒｅＦタンパク質の構造はＰＤＢ：４ＪＨＷ由来のものである。（Ｂ） 構造分析に基づいて４Ｆ１抗体の体細胞突然変異部位を生殖細胞系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）に相応するアミノ酸に戻した。（Ｃ） ＥＬＩＳＡによって構造最適化に基づいた４Ｆ１突然変異体のＲＳＶ／Ａ／Ａ２およびＲＳＶ／Ｂ／Ｂ９３２０ ｐｒｅ－Ｆタンパク質に対する結合活性を検証した。（Ｄ） 異なる４Ｆ１突然変異体のＲＳＶ／Ａ／Ａ２に対する中和能力である。ＲＳＶウイルスを異なる濃度の抗体と１ｈインキュベートした後、トリプシンで消化されたＨＥｐ２細胞に入れ、２４時間培養さいた後、上清を捨て、８０％アセトンで細胞を３０ ｍｉｎ固定し、ＥＬＩＳＡによって抗ＦおよびＧの抗体でウイルスの力価を検出し、ＩＣ５０を計算した。（Ｅ） 統計分析による異なる４Ｆ１突然変異体のｐｒｅ－Ｆタンパク質に対する結合およびＲＳＶ／Ａ／Ａ２に対する中和活性の比較である。ＥＣ５０は最大反応の５０％が生じる抗体濃度である。結合倍数の変化の計算は以下の通りである：４Ｆ１突然変異体のＥＣ５０／４Ｆ１野生型のＥＣ５０。
【0031】
【図3】図３は最適化後の４Ｆ１Ｅｎ１抗体がより高い親和力および中和活性を有することを示す。（Ａ） 異なる抗体のＲＳＶ／Ａ／Ａ２ ｐｒｅ－Ｆタンパク質に対する親和力である。（Ｂ） 異なる抗体のＲＳＶ／Ｂ／Ｂ９３２０ ｐｒｅ－Ｆタンパク質に対する親和力である。ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＯｃｔｅｔR ＲＥＤ９６相互作用解析装置によって親和力の検出を行った。ＡＨＣセンサーを使用し、以下のプログラムで行った：ｂａｓｅｌｉｎｅ １２０ｓ－ｌｏａｄｉｎｇ Ａｂ ３００ｓ－ｂａｓｅｌｉｎｅ ６００ｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ １２００ｓ－ｄｉｓａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ９００ｓ－ｒｅｇｅｎａｒａｔｉｏｎ ５ｓ－ ｂａｓｅｌｉｎｅ ５ｓ－ｒｅｇｅｎａｒａｔｉｏｎ ５ｓ－ｂａｓｅｌｉｎｅ ５ｓ－ｒｅｇｅｎａｒａｔｉｏｎ ５ｓ－ｂａｓｅｌｉｎｅ ５ｓ。ｌｏａｄｉｎｇの抗体濃度は５ｕｇ／ｍｌで、ｐｒｅ－Ｆ抗原濃度は以下の六つを設けた：５０ｎＭ－２５ｎＭ－１２．５ｎＭ－６．２５ｎＭ－３．１２５ｎＭ－１．５６２５ ｎＭ。Ｋｄ値を計算した。（Ｃ） 異なる抗体のＲＳＶ－Ａ２ウイルス株に対する中和能力である。（Ｄ） ４Ｆ１Ｅｎ１と第一世代のパリビズマブ（Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ、ＰＶＺ）および第二世代のＭＥＤＩ８８９７ ＲＳＶ中和抗体の親和力および中和活性の比較分析である。
【0032】
【図4】図４はハイコンテントスクリーニングシステムによる４Ｆ１Ｅｎ１のＲＳＶ感染と拡散に対する抑制能力の検証を示す。（Ａ）ＲＳＶウイルスを中和する能力である。系列希釈された抗体を５００ ｐｆｕ ＲＳＶ／Ａ２と１時間インキュベートし、そしてＨＥｐ－２細胞に添加した。３日後、ウイルスに感染した細胞をビオチン化抗ＦおよびＧモノクローナル抗体で染色し、そしてＦＩＴＣで標識されたストレプトアビジンでウイルス感染に対する抑制作用を検出した。Ｏｐｅｒａハイコンテントスクリーニングシステムで撮影した。（Ｂ）抗体のＲＳＶ拡散に対する抑制機能の検証である。系列希釈された抗体を予めＲＳＶ／Ａ２に２４時間感染させたＨＥｐ－２細胞に添加し、そして３日目に上記のようにウイルス感染に対する抑制を測定した。ＡおよびＢについて、画像は２倍の拡大倍率で撮影された。（Ｃ）１０倍拡大の場合、中和および拡散抑制の１００％保護効果である。左の図では、抗体を入れていない場合、大きい合胞体が形成した；中央の図では、試験において感染細胞がなかった；右の図では、拡散抑制試験における単一の感染細胞である。比較のためにＤＡＰＩで細胞核を染色した。（Ｄ－Ｅ）１０倍拡大を基準に、統計分析によって抗体の中和および拡散抑制効果を数値化した。ＰＶＺおよびＭＥＤＩ８８９７を対照とした。これらのデータは少なくとも二つの独立した実験を表す。
【0033】
【図5】図５は４Ｆ１ Ｅｎ１およびパリビズマブ（ＰＶＺ）のマウスＲＳＶに対する予防作用の比較を示す。（Ａ）マウスの予防性投与の概略図である。６－８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４－６）に経鼻（ｉ．ｎ．）による５×１０５ ｐ．ｆ．ｕ．ＲＳＶ ａ／Ａ２感染の２４時間前に１５ｍｇ／ｋｇおよび１．５ｍｇ／ｋｇの４Ｆ１抗体およびＰＶＺまたは対照として希釈剤を注射した。（Ｂ）４日目（ｄ．ｐ．ｉ．）にマウスを安楽死させ、ウイルスＲＮＡの抽出のために鼻甲介および肺を分離して均質化した。β－アクチンおよびＨＲＳＶ ＮＰの特異的プライマーでサンプルに対してｑＰＣＲを行った。対応のないＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定でＰ値を計算した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ＮＳ、有意でない。（Ｃ）マウス肺切片の４ ｄｐｉにおけるヘマトキシリン・エオジン染色である。画像は２倍の拡大倍率（頂部スケールバー、５００μｍ）および２０倍の拡大倍率（底部スケールバー、５０μｍ）である。
【0034】
具体的な実施形態
本発明者は幅広く深く研究し、新たな呼吸器合胞体ウイルスを中和する全ヒト抗体の設計および使用を開発した。本発明者は、大量のスクリーニングにより、そして部位特異的突然変異技術を合わせ、呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質の全ヒトモノクローナル抗体４Ｆ１に対して胚胎系遺伝子の復帰突然変異および親和力の向上を行うことで、性能が顕著に改良された新規な抗体を得た。改造された新規な抗体は、アミノ酸配列が比較的に低い体細胞突然変異部位を有し、同時にＲＳＶの異なるサブタイプに対するＦタンパク質親和力定数がピコモルのレベルに達し、そして臨床における二つの抗体よりも良い。体内外の実験により、本発明の抗体は有効にＲＳＶ感染を予防し、同時に有効にＲＳＶ感染後の拡散を抑制することができることが実証された。これに基づき、本発明を完成させた。
本発明者は幅広く深く研究し、新たな呼吸器合胞体ウイルスを中和する全ヒト抗体の設計および使用を開発した。本発明者は、大量のスクリーニングにより、そして部位特異的突然変異技術を合わせ、呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質の全ヒトモノクローナル抗体４Ｆ１に対して胚胎系遺伝子の復帰突然変異および親和力の向上を行うことで、性能が顕著に改良された新規な抗体を得た。改造された新規な抗体は、アミノ酸配列が比較的に低い体細胞突然変異部位を有し、同時にＲＳＶの異なるサブタイプに対するＦタンパク質親和力定数がピコモルのレベルに達し、そして臨床における二つの抗体よりも良い。体内外の実験により、本発明の抗体は有効にＲＳＶ感染を予防し、同時に有効にＲＳＶ感染後の拡散を抑制することができることが実証された。これに基づき、本発明を完成させた。
【0035】
用語
以下、本発明がより理解しやすくなるように、具体的に、一部の技術および科学用語を定義する。本明細書で別途に明確に定義しない限り、本明細書で用いられるすべてのほかの技術および科学用語はいずれも本発明が属する分野の普通の技術者が通常理解する意味と同様である。本発明を説明する前、方法および条件は変更することができるため、本発明は記載される具体的な方法および実験条件に限定されないと理解される。また、本明細書で用いられる用語は具体的な実施形態の説明だけを目的とし、かつその意図は限定性のものではなく、本発明の範囲は添付の請求の範囲だけに限定されると理解される。
以下、本発明がより理解しやすくなるように、具体的に、一部の技術および科学用語を定義する。本明細書で別途に明確に定義しない限り、本明細書で用いられるすべてのほかの技術および科学用語はいずれも本発明が属する分野の普通の技術者が通常理解する意味と同様である。本発明を説明する前、方法および条件は変更することができるため、本発明は記載される具体的な方法および実験条件に限定されないと理解される。また、本明細書で用いられる用語は具体的な実施形態の説明だけを目的とし、かつその意図は限定性のものではなく、本発明の範囲は添付の請求の範囲だけに限定されると理解される。
【0036】
別途に定義しない限り、本明細書で用いられるすべての技術と科学の用語はいずれも本発明が属する分野の当業者が通常理解する意味と同様である。本明細書で用いられるように、具体的に例示される数値で使用される場合、用語「約」とは当該値が例示される数値から１％以内で変わってもよい。たとえば、本明細書で用いられるように、「約１００」という表示は９９と１０１およびその間の全部の値（たとえば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。
本発明で使用されるアミノ酸の３文字の略号および１文字の略号はＪ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ， ２４３， ｐ３５５８（１９６８）に記載の通りである。
本発明で使用されるアミノ酸の３文字の略号および１文字の略号はＪ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ， ２４３， ｐ３５５８（１９６８）に記載の通りである。
【0037】
本明細書で用いられるように、用語「治療」とは患者に本発明の呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質（好ましくは融合前Ｆタンパク質）に対する抗体およびその組成物の任意の一つを含む内用または外用の治療剤を投与することで、前記患者は一つまたは複数の疾患症状を有し、既知の前記治療剤はこれらの症状に治療作用を有する。通常、有効に一つまたは複数の疾患症状を緩和する治療剤の量（治療有効量）で患者に投与する。
【0038】
本明細書で用いられるように、用語「任意」または「任意に」はその後に記載されるイベントや状況はありうるが、必須ではない。たとえば、「任意に１～３個の抗体の重鎖可変領域を含む」とは、特定の配列の抗体の重鎖可変領域が存在してもよいが、必ずしも存在しなくてもよく、１個、２個または３個でもよい。
【0039】
本発明に記載の「配列同一性」は適切な置換、挿入または欠失などの突然変異がある場合、アラインメントおよび比較の時、２つの核酸または２つのアミノ酸配列の間の同一性の程度を表す。本発明に記載の配列とそれに同一性を有する配列の間の配列同一性は少なくとも８５％、９０％または９５％、好ましくは少なくとも９５％でもよい。非限定的な実施例は８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％を含む。
【0040】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）
ＲＳＶはパラミクソウイルス科、肺炎ウイルス属に属し、１５２２２個のヌクレオチドからなるマイナス鎖ＲＮＡウイルスである。ＲＳＶはエンベロープウイルスで、ゲノムが融合タンパク質Ｆ、吸着タンパク質Ｇ、小型疏水性タンパク質ＳＨ、マトリックスタンパク質Ｍ、核タンパク質Ｎ、リンタンパク質Ｐ、大型ポリメラーゼタンパク質Ｌ、小型マトリックスタンパク質Ｍ２および非構造タンパク質ＮＳ１とＮＳ２を含む、計１１種のタンパク質をコードし、中では、融合タンパク質Ｆ、吸着タンパク質Ｇおよび小型疎水性タンパク質ＳＨはウイルスの表面に位置する。ＲＳＶは２種の主な表面糖タンパク質、ＧおよびＦを有する。Ｇタンパク質はウイルスの当該細胞の表面への結合を仲介し、同時にケモカインＣＸ３Ｃの作用を模擬し、その受容体と相互作用し、ＲＳＶ感染後の炎症反応を増強させる。Ｒタンパク質はウイルスと細胞膜の融合を仲介し、そして感染した細胞の膜と周囲の細胞の合胞体への融合を促進する。血清学では、ＲＳＶに２種の異なる抗原グループまたはサブタイプ、すなわち、ＡとＢが存在し、主にＧタンパク質の違いによって区別する。ＲＳＶタンパク質の大半は２種のサブグループ間で高度に保存的で、中では、融合タンパク質Ｆは９１％のアミノ酸の類似性を示し、Ｇタンパク質はＡとＢの間で５３％の相同性しかない。Ｆタンパク質は高度に保存的で、それから誘導される中和抗体は同時にＡとＢの二つのサブタイプのウイルス感染を抑制することができ、抗ＲＳＶモノクローナル抗体薬物およびワクチンの研究開発のいずれにおいても重要な意義がある。Ｆタンパク質はＩ型膜貫通タンパク質に属し、まず、前駆体タンパク質Ｆ０が合成される。Ｆ０は小胞体において三量体化して二つの保存的な部位が細胞のフーリンプロテアーゼによって処理され、Ｆ１、Ｆ２およびＰｅｐ２７ポリペプチドが生成し、最後にジスルフィド結合で連結したＦ１とＦ２の二つの断片になり、Ｆ２－Ｆ１ヘテロ二量体が三量体になって成熟Ｆタンパク質に組み立てられる。Ｆ１サブユニットはヘプタペプチド重複領域Ａ（ＨＲＡ）、機能領域Ｉ／ＩＩ、ヘプタペプチド重複領域Ｂ（ＨＲＢ）、膜貫通タンパク質（ＴＭ）、細胞内領域（ＣＰ）を含み、Ｆ２サブユニットはヘプタペプチド重複領域Ｃ（ＨＲＣ）からなる。Ｆ１疎水性Ｎ末端（１３７－１５５）は融合の仲介において重要な作用を果たす。Ｆタンパク質が仲介する膜融合過程はその構造の融合前の状態から融合の状態への変化過程でもある。それは準安定状態の融合前の配座になっている。Ｇタンパク質が標的の細胞膜における受容体に結合すると、融合前Ｆタンパク質（ｐｒｅ－ｆｕｓｉｏｎ Ｆタンパク質）の構造変化が触発され、安定した融合後の様態（ｐｏｓｔ－ｆｕｓｉｏｎ）になる。そのＲＳＶ侵入における重要な作用および高度の保存性のため、ＲＳＶ Ｆタンパク質は中和抗体の標的およびワクチン開発の主要な抗原である。大量の研究により、Ｆタンパク質に対する中和抗体の認識部位は主にｐｒｅ－ｆｕｓｉｏｎ Ｆタンパク質に位置し、ｐｒｅ－ｆｕｓｉｏｎ Ｆに基づいて設計された組み換えタンパク質は免疫原性および保護効果が顕著に融合後Ｆタンパク質（ｐｏｓｔ－ｆｕｓｉｏｎ Ｆタンパク質）に基づいて設計されたワクチンよりも良いことが実証された。
ＲＳＶはパラミクソウイルス科、肺炎ウイルス属に属し、１５２２２個のヌクレオチドからなるマイナス鎖ＲＮＡウイルスである。ＲＳＶはエンベロープウイルスで、ゲノムが融合タンパク質Ｆ、吸着タンパク質Ｇ、小型疏水性タンパク質ＳＨ、マトリックスタンパク質Ｍ、核タンパク質Ｎ、リンタンパク質Ｐ、大型ポリメラーゼタンパク質Ｌ、小型マトリックスタンパク質Ｍ２および非構造タンパク質ＮＳ１とＮＳ２を含む、計１１種のタンパク質をコードし、中では、融合タンパク質Ｆ、吸着タンパク質Ｇおよび小型疎水性タンパク質ＳＨはウイルスの表面に位置する。ＲＳＶは２種の主な表面糖タンパク質、ＧおよびＦを有する。Ｇタンパク質はウイルスの当該細胞の表面への結合を仲介し、同時にケモカインＣＸ３Ｃの作用を模擬し、その受容体と相互作用し、ＲＳＶ感染後の炎症反応を増強させる。Ｒタンパク質はウイルスと細胞膜の融合を仲介し、そして感染した細胞の膜と周囲の細胞の合胞体への融合を促進する。血清学では、ＲＳＶに２種の異なる抗原グループまたはサブタイプ、すなわち、ＡとＢが存在し、主にＧタンパク質の違いによって区別する。ＲＳＶタンパク質の大半は２種のサブグループ間で高度に保存的で、中では、融合タンパク質Ｆは９１％のアミノ酸の類似性を示し、Ｇタンパク質はＡとＢの間で５３％の相同性しかない。Ｆタンパク質は高度に保存的で、それから誘導される中和抗体は同時にＡとＢの二つのサブタイプのウイルス感染を抑制することができ、抗ＲＳＶモノクローナル抗体薬物およびワクチンの研究開発のいずれにおいても重要な意義がある。Ｆタンパク質はＩ型膜貫通タンパク質に属し、まず、前駆体タンパク質Ｆ０が合成される。Ｆ０は小胞体において三量体化して二つの保存的な部位が細胞のフーリンプロテアーゼによって処理され、Ｆ１、Ｆ２およびＰｅｐ２７ポリペプチドが生成し、最後にジスルフィド結合で連結したＦ１とＦ２の二つの断片になり、Ｆ２－Ｆ１ヘテロ二量体が三量体になって成熟Ｆタンパク質に組み立てられる。Ｆ１サブユニットはヘプタペプチド重複領域Ａ（ＨＲＡ）、機能領域Ｉ／ＩＩ、ヘプタペプチド重複領域Ｂ（ＨＲＢ）、膜貫通タンパク質（ＴＭ）、細胞内領域（ＣＰ）を含み、Ｆ２サブユニットはヘプタペプチド重複領域Ｃ（ＨＲＣ）からなる。Ｆ１疎水性Ｎ末端（１３７－１５５）は融合の仲介において重要な作用を果たす。Ｆタンパク質が仲介する膜融合過程はその構造の融合前の状態から融合の状態への変化過程でもある。それは準安定状態の融合前の配座になっている。Ｇタンパク質が標的の細胞膜における受容体に結合すると、融合前Ｆタンパク質（ｐｒｅ－ｆｕｓｉｏｎ Ｆタンパク質）の構造変化が触発され、安定した融合後の様態（ｐｏｓｔ－ｆｕｓｉｏｎ）になる。そのＲＳＶ侵入における重要な作用および高度の保存性のため、ＲＳＶ Ｆタンパク質は中和抗体の標的およびワクチン開発の主要な抗原である。大量の研究により、Ｆタンパク質に対する中和抗体の認識部位は主にｐｒｅ－ｆｕｓｉｏｎ Ｆタンパク質に位置し、ｐｒｅ－ｆｕｓｉｏｎ Ｆに基づいて設計された組み換えタンパク質は免疫原性および保護効果が顕著に融合後Ｆタンパク質（ｐｏｓｔ－ｆｕｓｉｏｎ Ｆタンパク質）に基づいて設計されたワクチンよりも良いことが実証された。
【0041】
本明細書で用いられるように、用語「融合前Ｆタンパク質」、「ｐｒｅ－ｆｕｓｉｏｎ Ｆタンパク質」、「ｐｒｅＦタンパク質」は入れ替えて使用することができ、いずれも呼吸器合胞体ウイルスの融合タンパク質Ｆの融合前の様態を指す。
【0042】
さらに治療効果がより良く、物理・化学的性質がより優れた斬新なＲＳＶ抗体薬物を得るために、部位特異的突然変異技術およびコンピュータ支援設計を利用して１株の抗ＲＳＶ Ｆタンパク質の広域中和抗体４Ｆ１に対して改造および最適化を行った。最適化された新たな抗体は、広域中和抗体の治療および応用により優れた選択を提供すると同時に、本プロジェクトの実施を通じてその認識のエピトープおよびウイルスの機序に対してより明晰な理解が得られ、さらに薬物の設計に新たな標的を提供する。
【0043】
抗体
本明細書で用いられるように、用語「抗体」または「免疫グロブリン」は同様な構造特徴を持つ、約１５００００ダルトンのヘテロテトラマーの糖タンパク質で、２つの同じ軽鎖（Ｌ）と２つの同じ重鎖（Ｈ）からなるものである。各軽鎖は、重鎖に１つの共有ジスルフィド結合によって結合しているが、重鎖間のジスルフィド結合の数は、免疫グロブリンのアイソタイプによるものである。各重鎖および軽鎖も、それぞれ一定の間隔の鎖内ジスルフィド結合を有する。各重鎖は、１つの末端に可変領域（ＶＨ）を有し、その先に多数の定常領域を有する。各軽鎖は、一方の末端に可変領域（ＶＬ）を有し、他方の末端に定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の一つ目の定常領域と、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と対向している。特殊なアミノ酸残基が軽鎖と重鎖の可変領域の間に界面を形成している。
本明細書で用いられるように、用語「抗体」または「免疫グロブリン」は同様な構造特徴を持つ、約１５００００ダルトンのヘテロテトラマーの糖タンパク質で、２つの同じ軽鎖（Ｌ）と２つの同じ重鎖（Ｈ）からなるものである。各軽鎖は、重鎖に１つの共有ジスルフィド結合によって結合しているが、重鎖間のジスルフィド結合の数は、免疫グロブリンのアイソタイプによるものである。各重鎖および軽鎖も、それぞれ一定の間隔の鎖内ジスルフィド結合を有する。各重鎖は、１つの末端に可変領域（ＶＨ）を有し、その先に多数の定常領域を有する。各軽鎖は、一方の末端に可変領域（ＶＬ）を有し、他方の末端に定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の一つ目の定常領域と、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と対向している。特殊なアミノ酸残基が軽鎖と重鎖の可変領域の間に界面を形成している。
【0044】
本明細書で用いられるように、用語の「可変」とは、抗体において可変領域のある部分が配列で異なっており、これによって各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性が構成されることを指す。しかし、可変性は、均一に抗体の可変領域全体に分布しているわけではない。軽鎖と重鎖の可変領域における相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つの断片に集中している。可変領域において、比較的に保存的な部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）ＦＲと呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変領域に、それぞれ、基本的にβシート構造となっており、連結ループを形成する３つのＣＤＲで連結され、場合によって部分βシート構造となる４つのＦＲ領域が含まれる。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲ領域で密接し、かつ他方の鎖のＣＤＲと一緒に抗体の抗原結合部位（Ｋａｂａｔら、ＮＩＨ Ｐｕｂｌ． Ｎｏ． ９１－３２４２， 卷Ｉ，６４７－６６９頁（１９９１）を参照する）を形成している。定常領域は、抗体と抗原との結合には直接関与しないが、たとえば抗体の抗体依存細胞毒性に参与するなどの異なるエフェクター機能を示す。
【0045】
脊椎動物の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、その定常領域のアミノ酸配列に基づき、明らかに異なる二種類（とと呼ばれる）のいずれかに分類することができる。免疫グロブリンは、重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づき、異なるクラスに分類することができる。免疫グロブリンには、主として５つのクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、そのうちのいくつかは、さらに、サブクラス（アイソタイプ）、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＡ２に分類することができる。異なるクラスの免疫グロブリンの重鎖の定常領域に応じて、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。各クラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元構造は本分野の技術者熟知である。
【0046】
本明細書で用いられるように、用語「モノクローナル抗体」とは、一類のほぼ均一なコロニーから得られた抗体で、すなわち、少数のあり得る自然発生の突然変異以外、このコロニーに含まれる単独の抗体が同様である。モノクローナル抗体は、高度特異的に単一の抗原部位に対するものである。そして、通常のポリクローナル抗体製剤（通常は異なる抗原決定基に対する異なる抗体である）と違い、各モノクローナル抗体は、抗原における単一の抗原決定基にたいするものである。それらの特異性以外、モノクローナル抗体の利点は、ハイブリドーマの培養によって合成されるので、他の免疫グロブリンに汚染される恐れがないことにある。修飾語の「モノクローナル」は、抗体の特性を表し、ほぼ均一な抗体コロニーから得られることで、何らかの特殊な方法で抗体を生産する必要があると理解されるべきではない。
【0047】
また、本発明は、前記の抗呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質（好ましくはｐｒｅ－ｆｕｓｉｏｎ Ｆタンパク質）モノクローナル抗体に相応するアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体、前記の抗呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質（好ましくはｐｒｅ－ｆｕｓｉｏｎ Ｆタンパク質）モノクローナル抗体の可変領域鎖を有するモノクローナル抗体、およびこれらの鎖を有するほかのタンパク質またはタンパク質複合体と融合発現産物を含む。具体的に、本発明は、超可変領域（相補性決定領域、ＣＤＲ）が本発明の軽鎖および重鎖の超可変領域と同様で、あるいは少なくとも９０％、好ましくは９５％の相同性を持つものであれば、この超可変領域を含有する軽鎖および重鎖を有する任意のタンパク質またはタンパク質複合体と融合発現産物（すなわち免疫複合体と融合発現産物）を含む。
【0048】
本分野の技術者に知られるように、免疫複合体と融合発現産物は、薬物、毒素、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、放射性核種、酵素または他の診断・治療分子と前記の抗呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質モノクローナル抗体またはその断片と結合してなる複合体を含む。さらに、本発明は、前記の抗呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質モノクローナル抗体またはその断片と結合した細胞表面マーカーあるいは抗原を含む。
【0049】
用語「抗体の抗原結合断片」（または「抗体断片」と略す）とは抗体の特異的に抗原に結合する能力を維持する一つまたは複数の断片である。全長抗体の断片で抗体の抗原結合機能を実現できることが示されている。用語「抗体の抗原結合断片」に含まれる結合断片の実例は（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる１価の断片である、Ｆａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋で連結した２つのＦａｂ断片を含む２価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の一方のアームのＶＨおよびＶＬドメインからなるＦｖ断片を含む。Ｆｖ抗体は抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域を含有するが、定常領域がなく、かつすべての抗原結合部位を有する最小の抗体断片である。一般的に、Ｆｖ抗体はさらにＶＨとＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーを含み、かつ抗原結合に必要な構造を形成することができる。
本発明は、完全のモノクローナル抗体だけではなく、免疫活性を有する抗体断片、たとえばＦａｂまたは（Ｆａｂ’）２断片、抗体の重鎖、抗体の軽鎖も含む。
本発明は、完全のモノクローナル抗体だけではなく、免疫活性を有する抗体断片、たとえばＦａｂまたは（Ｆａｂ’）２断片、抗体の重鎖、抗体の軽鎖も含む。
【0050】
用語「エピトープ」または「抗原決定基」とは抗原における免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する部位である。エピトープは、通常、独特な配座で、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の連続または非連続のアミノ酸を含む。
【0051】
用語「特異的な結合」、「選択的な結合」、「選択的に結合する」および「特異的に結合する」とは抗体の予め決定された抗原におけるエピトープに対する結合である。通常、抗体は約１０－７Ｍ未満、たとえば約１０－８Ｍ、１０－９Ｍまたは１０－１０Ｍ未満あるいはそれよりも低い親和力（ＫＤ）で結合する。
本明細書で用いられるように、用語「抗原決定基」とは抗原における不連続の、本発明の抗体または抗原結合断片によって認識される立体空間部位である。
本明細書で用いられるように、用語「抗原決定基」とは抗原における不連続の、本発明の抗体または抗原結合断片によって認識される立体空間部位である。
【0052】
本発明は、完全の抗体だけではなく、免疫活性を有する抗体の断片または抗体とほかの配列からなる融合タンパク質も含む。そのため、本発明は、さらに、前記抗体の断片、誘導体および類似体を含む。
【0053】
本発明において、抗体は当業者に熟知の技術によって製造されるマウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体または全ヒト抗体を含む。組み換え抗体、たとえばキメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、ヒトの部分および非ヒトの部分を含み、本分野で熟知されるＤＮＡ組み換え技術によって製造することができる。本発明において、用語「ネズミ由来抗体」は本分野の知識および技能によって製造さされた呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質に対するモノクローナル抗体である。用語「キメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、マウス由来抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域を融合させてなる抗体で、マウス由来抗体による免疫応答反応を減少することができる。用語「ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、ＣＤＲ移植抗体（ＣＤＲ－ｇｒａｆｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）とも呼ばれ、マウスのＣＤＲ配列をヒトの抗体可変領域のフレームワーク、すなわち、異なる種類のヒト種抗体骨格配列に移植してなる抗体である。ヒト化抗体はキメラ抗体が大量のマウスタンパク質成分を持つことで、異種性反応が誘導されることを克服することができる。このような骨格配列は、系列の抗体の遺伝子配列を含む公共ＤＮＡデータベースまたは公開された参照文献から得ることができる。免疫原性の低下およびそれによる活性の低下を防止するには、前記のヒト抗体の可変領域のフレームワーク配列に最低限の逆向突然変異または復帰突然変異をさせることによって活性を維持することができる。
本発明において、抗体は、単特異性、二重特異性、三重特異性、またはそれ以上の多重特異性でもよい。
本明細書で用いられるように、用語「重鎖可変領域」と「ＶＨ」は入れ替えて使用することができる。
本発明において、抗体は、単特異性、二重特異性、三重特異性、またはそれ以上の多重特異性でもよい。
本明細書で用いられるように、用語「重鎖可変領域」と「ＶＨ」は入れ替えて使用することができる。
【0054】
本明細書で用いられるように、用語「可変領域」と「相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）」は入れ替えて使用することができる。
【0055】
用語「ＣＤＲ」とは抗体の可変ドメイン内における主に抗原の結合を促進する６つの超可変領域の１つである。前記６つのＣＤＲの最も用いられる定義の一つはＫａｂａｔ Ｅ．Ａら，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ． ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ９１－３２４２）によって提供される。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１、２または３で示されるものである。
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域は配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域の核酸コード配列は配列番号９で示される。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１、２または３で示されるものである。
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域は配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域の核酸コード配列は配列番号９で示される。
【0056】
本発明の一つの好適な実施形態において、前記抗体の重鎖は上記重鎖可変領域および重鎖定常領域を含み、前記重鎖定常領域はネズミ由来またはヒト由来のものでもよい。
本明細書で用いられるように、用語「軽鎖可変領域」と「ＶＬ」は入れ替えて使用することができる。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４、５、６または７で示されるものである。
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４で示される。
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域の核酸コード配列は配列番号１１で示される。
本明細書で用いられるように、用語「軽鎖可変領域」と「ＶＬ」は入れ替えて使用することができる。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４、５、６または７で示されるものである。
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４で示される。
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域の核酸コード配列は配列番号１１で示される。
【0057】
本発明の一つの好適な実施形態において、前記抗体の軽鎖は上記軽鎖可変領域および軽鎖定常領域を含み、前記軽鎖定常領域はネズミ由来またはヒト由来のものでもよい。
【0058】
本発明の抗体の機能は当該抗体の軽鎖と重鎖の可変領域の遺伝子の特異的遺伝子配列によって決定される。本発明の抗体は低免疫原性を有し、高親和力でＲＳＶ Ａ型とＢ型ウイルスのｐｒｅ－ｆｕｓｉｏｎ Ｆタンパク質に結合することができ、呼吸器合胞体ウイルスの感染しやすい細胞への侵襲を阻止することが可能である。当該抗体の可変領域の遺伝子または相補性決定領域（ＣＤＲ）の遺伝子を利用し、原核と真核細胞を使用する任意の発現系において異なる様態の遺伝子工学による抗体を改造および生産することができる。
【0059】
本発明において、用語「本発明の抗体」、「本発明のタンパク質」、または「本発明のポリペプチド」は入れ替えて使用することができ、いずれも特異的に呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質（好ましくはｐｒｅ－ｆｕｓｉｏｎ Ｆタンパク質）に結合する抗体、たとえば重鎖可変領域（たとえば配列番号９で示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列）および／または軽鎖可変領域（たとえば配列番号１１で示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列）を有するタンパク質またはポリペプチドをいう。これらは、開始のメチオニンを含有してもよく、含有しなくてもよい。
【0060】
もう一つの好適な例において、前記の抗体は抗呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質（好ましくはｐｒｅ－ｆｕｓｉｏｎ Ｆタンパク質）の全ヒトモノクローナル抗体で、その重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域がヒト化の重鎖定常領域または軽鎖定常領域でもよい。より好ましくは、前記ヒト化の重鎖定常領域または軽鎖定常領域はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２などの重鎖定常領域または軽鎖定常領域である。
【0061】
一般的に、抗体の抗原結合特性は、重鎖および軽鎖の可変領域に位置する３つの特定の領域によって特徴付けられ、可変領域（ＣＤＲ）と呼ばれ、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）に分かれ、４つのＦＲのアミノ酸配列が比較的に保存され、直接結合反応に関与しない。これらのＣＤＲは環状構造を形成し、その中のＦＲで形成されるβシートによって空間構造上で近づき、重鎖におけるＣＤＲおよび相応の軽鎖におけるＣＤＲが抗体の抗原結合部位を構成する。同類の抗体のアミノ酸配列の比較によってどのアミノ酸がＦＲあるいはＣＤＲ領域を構成するか確認することができる。
【0062】
本発明の抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域は、その少なくとも一部が抗原結合に関与するため、特に注目されている。そのため、ＣＤＲ含有モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の可変領域鎖を有する分子は、そのＣＤＲはここで同定されるＣＤＲと９０％以上（好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の相同性を持つものであれば、本発明に含まれる。
【0063】
本発明は、完全のモノクローナル抗体だけではなく、免疫活性を有する抗体の断片または抗体とほかの配列からなる融合タンパク質も含む。そのため、本発明は、さらに、前記抗体の断片、誘導体および類似体を含む。たとえば、本発明の抗体に基づくＦｃ断片の改造、抗体の半減期を延ばすためのＣＨ２領域への三つの突然変異部位Ｍ２５２Ｙ ／Ｓ２５４Ｔ ／Ｔ２５６Ｅの導入が挙げられる。
【0064】
本明細書で用いられるように、用語「断片」、「誘導体」および「類似体」とは、基本的に本発明の抗体と同じ生物学的機能または活性を維持するポリペプチドをいう。本発明のポリペプチドの断片、誘導体や類似体は、（ｉ）１個または複数個の保存的または非保存的なアミノ酸残基（好ましくは保存的なアミノ酸残基）が置換されたポリペプチドでもよく、このような置換されたアミノ酸残基が遺伝コードでコードされてもされていなくてもよく、あるいは（ｉｉ）１個または複数個のアミノ酸残基に置換基があるポリペプチドでもよく、あるいは（ｉｉｉ）成熟のポリペプチドと別の化合物（たとえば、ポリエチレングリコールのようなポリペプチドの半減期を延ばす化合物）と融合したポリペプチドでもよく、あるいは（ｉｖ）付加のアミノ酸配列がこのポリペプチドに融合したポリペプチド（たとえばリーダー配列または分泌配列またはこのポリペプチドを精製するための配列またはタンパク質前駆体配列、あるいは６Ｈｉｓタグと形成した融合タンパク質）でもよい。本明細書の開示に基づき、これらの断片、誘導体および類似体は当業者に公知の範囲に入っている。
【0065】
本発明の抗体とは、抗呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質（好ましくはｐｒｅ－ｆｕｓｉｏｎ Ｆタンパク質）結合活性を有する、上記ＣＤＲ領域を含むポリペプチドをいう。当該用語は、さらに、本発明の抗体と同じ機能を有する、上記ＣＤＲ領域を含むポリペプチドの変異の様態を含む。これらの突然変異の様態は、１個または複数個（通常は１～５０個、好ましくは１～３０個、より好ましくは１～２０個、最も好ましくは１～１０個）のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換、ならびにＣ末端および／またはＮ末端への１個または複数個（通常は２０個以内、好ましくは１０個以内、より好ましくは５個以内）のアミノ酸の付加を含むが、これらに限定されない。たとえば、本分野において、機能が近い、または類似のアミノ酸で置換する場合、通常、蛋白質の機能を変えることがない。また、Ｃ末端および／またはＮ末端への一つまたは複数のアミノ酸の付加も、通常、蛋白質の機能を変えることはない。この用語は、さらに、本発明の抗体の活性断片と活性誘導体を含む。
【0066】
当該ポリペプチドの変異の様態は、相同配列、保存的変異体、対立遺伝子変異体、天然突然変異体、誘導突然変異体、高いまたは低い厳格さの条件において本発明の抗体のコードＤＮＡと交雑が可能なＤＮＡがコードするタンパク質、および抗本発明の抗体の抗血清で得られるポリペプチドまたはタンパク質を含む。
【0067】
本発明は、さらに、ほかのポリペプチド、たとえばヒト抗体またはその断片の融合タンパク質を含む。ほとんど全長のポリペプチドのほか、本発明は、さらに、本発明の抗体の断片を含む。通常、当該断片は本発明の抗体の少なくとも約５０個の連続のアミノ酸、好ましくは少なくとも約６０個の連続のアミノ酸、より好ましくは少なくとも約８０個の連続のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも約１００個の連続のアミノ酸を有する。
【0068】
本発明において、「本発明の抗体の保存的変異体」とは、本発明の抗体のアミノ酸配列と比較すると、１０個以下、好ましくは８個以下、より好ましくは５個以下、最も好ましくは３個以下のアミノ酸が類似または近い性質を持つアミノ酸で置換されてなるポリペプチドをいう。これらの保存的突然変異のポリペプチドは、表Ａのようにアミノ酸の置換を行って生成することが好ましい。
【0069】
【化1】
【0070】
さらに、本発明は、上記抗体またはその断片またはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ形態でもＲＮＡ形態でもよい。ＤＮＡ形態は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは人工合成のＤＮＡを含む。ＤＮＡは、一本鎖でも二本鎖でもよい。ＤＮＡは、コード鎖でも非コード鎖でもよい。成熟ポリペプチドをコードするコード領域の配列は、配列番号４または８で示されるコード領域の配列と同様でもよく、あるいは縮重変異体でもよい。本明細書で用いられるように、本発明において、「縮重変異体」とは本発明のポリペプチドと同様のアミノ酸配列を有するものをコードするが、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３または１４で示されるコード領域の配列と違う核酸配列をいう。
【0071】
本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドだけをコードするコード配列、成熟ポリペプチドのコード配列および様々な付加コード配列、成熟ポリペプチドのコード配列（および任意の付加コード配列）および非コード配列を含む。
【0072】
用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでもよく、さらに付加のコードおよび／または非コード配列を含むポリヌクレオチドでもよい。
【0073】
本発明は、さらに、上記の配列とハイブリダイズし、かつ２つの配列の間に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％の相同性を有するポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、厳格な条件で本発明に係るポリヌクレオチドとハイブリダイズできるポリヌクレオチドに関する。本発明において、「厳格な条件」とは、（１）低いイオン強度および高い温度、例えば０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃でのハイブリダイズおよび溶離、あるいは（２）ハイブリダイズ時変性剤、たとえば４２℃で５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ胎児血清／０．１％ Ｆｉｃｏｌｌなどを入れること、あるいは（３）２つの配列の間の相同性が少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上の時だけハイブリダイズすることである。そして、ハイブリダイズできるポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６および／または７で示される成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能および活性を有する。
【0074】
本発明の抗体のヌクレオチド全長配列あるいはその断片は、通常、ＰＣＲ増幅法、組換え法または人工合成の方法で得られる。適用できる方法として、特に断片の長さが短い場合、人工合成の方法で関連配列を合成する。通常、まず多数の小さい断片を合成し、そして連接させることにより、配列の長い断片を得ることができる。また、重鎖のコード配列を発現タグ（たとえば６Ｈｉｓ）一体に融合させ、融合タンパク質を形成してもよい。
【0075】
関連の配列を獲得すれば、組み換え法で大量に関連配列を獲得することができる。この場合、通常、その配列をベクターにクローンした後、細胞に導入し、さらに通常の方法で増殖させた宿主細胞から関連配列を単離して得る。本発明に係る生物分子（核酸、タンパク質など）は単離の形態で存在する生物分子を含む。
【0076】
現在、本発明のタンパク質（またはその断片、あるいはその誘導体）をコードするＤＮＡ配列は全部化学合成で獲得することがすでに可能である。さらに、このＤＮＡ配列を本分野で周知の各種の既知のＤＮＡ分子（あるいはベクターなど）や細胞に導入してもよい。また、化学合成で本発明のタンパク質配列に変異を導入することもできる。
【0077】
さらに、本発明は、上記の適当なＤＮＡ配列および適当なプロモーターあるいは制御配列を含むベクターに関する。これらのベクターは、タンパク質を発現するように、適当な宿主細胞の形質転換に用いることができる。
【0078】
宿主細胞は、原核細胞、たとえば細菌細胞、あるいは、低等真核細胞、たとえば酵母細胞、あるいは、高等真核細胞、たとえば哺乳動物細胞でもよい。代表例として、大腸菌、ストレプトマイセス属、ネズミチフス菌のような細菌細胞、酵母のような真菌細胞、ミバエＳ２若しくはＳｆ９のような昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ７、２９３細胞のような動物細胞などがある。
【0079】
ＤＮＡ組み換えによる宿主細胞の形質転換は当業者に熟知の通常の技術で行ってもよい。宿主が原核細胞、たとえば大腸菌である場合、ＤＮＡを吸収できるコンピテントセルは指数成長期後収集でき、ＣａＣｌ２法で処理し、用いられる工程は本分野では周知のものである。もう一つの方法は、ＭｇＣｌ２を使用する。必要により、形質転換はエレクトロポレーションの方法でもよい。宿主が真核生物の場合、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションのような通常の機械方法、リポフェクションなどのＤＮＡトランスフェクションの方法が用いられる。
【0080】
得られる形質転換体は通常の方法で培養し、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドを発現することができる。用いられる宿主細胞によって、培養に用いられる培地は通常の培地を選んでもよい。宿主細胞の成長に適する条件で培養する。宿主細胞が適当の細胞密度に成長したら、適切な方法（たとえば温度転換もしくは化学誘導）で選んだプロモーターを誘導し、さらに細胞を培養する。
【0081】
上記の方法における組み換えポリペプチドは細胞内または細胞膜で発現し、あるいは細胞外に分泌することができる。必要であれば、その物理・化学的特性およびほかの特性を利用して各種の単離方法で組み換えタンパク質を単離・精製することができる。これらの方法は、本分野の技術者に熟知である。これらの方法の例として、通用の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心、浸透圧ショック、超音波処理、超遠心、分子篩クロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびほかの各種の液体クロマトグラフィー技術、ならびにこれらの方法の組合せを含むが、これらに限定されない。
【0082】
本発明の抗体は単独に使用してもよく、検出可能なマーカー（診断目的）、治療剤、ＰＫ（タンパク質キナーゼ）修飾部分またはこれらの任意の組み合わせと結合またはカップリングしてもよい。
【0083】
診断の目的に使用される検出可能なマーカーは、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像）またはＣＴ（コンピュータＸ線断層撮影技術）造影剤、または検出可能な生成物を生成させる酵素を含むが、これらに限定されない。
【0084】
カップリングすることができる治療剤は、インスリン、ＩＬ－２、インターフェロン、カルシトニン、ＧＨＲＨペプチド、腸管ペプチド類似体、アルブミン、抗体断片、サイトカインやホルモンを含むが、これらに限定されない。
【0085】
また、本発明の抗体と結合またはカップリングすることができる治療剤は、１．放射性核種、２．生物毒素、３．サイトカイン、たとえばＩＬ－２など、４．金ナノ粒子／ナノロッド、５．ウイルス粒子、６．リポソーム、７．磁性ナノ粒子、８．プロドラッグ活性化酵素、１０．化学治療剤（たとえば、シスプラチン）または任意の様態のナノ粒子などを含むが、これらに限定されない。
【0086】
さらに、本発明は組成物を提供する。好適な例において、前記の組成物は薬物組成物で、上記の抗体またはその活性断片あるいはその融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含有する。通常、これらの物質を無毒で不活性で薬学的に許容される水系担体で配合し、ｐＨ値は配合される物質の性質および治療しようとする疾患にもよるが、ｐＨ値は通常５～８程度、好ましくは６～８程度である。配合された薬物組成物は通常の経路で投与することができ、経口投与、気道、腫瘍内、腹膜内、静脈内、あるいは局部投与が含まれるが、これらに限定されない。
【0087】
本発明の薬物組成物はそのまま呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質（好ましくはｐｒｅ－ｆｕｓｉｏｎ Ｆタンパク質）の分子との結合に使用することができるため、薬物の半減期の延長、またほかの治療剤の併用に有用である。
【0088】
本発明の薬物組成物は、安全有効量（たとえば０．００１～９９ｗｔ％、好ましくは０．０１～９０ｗｔ％、より好ましくは０．１～８０ｗｔ％）の本発明の上記のモノクローナル抗体（またはその複合体）と薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む。このような担体は、食塩水、緩衝液、ブドウ糖、水、グリセリン、エタノール、およびこれらの組み合せを含むが、これらに限定されない。薬物の製剤は投与形態に相応する。本発明の薬物組成物は、注射剤としてもよく、たとえば生理食塩水またはブドウ糖およびほかの助剤を含有する水溶液で通常の方法によって製造することができる。薬物組成物は、注射剤、溶液の場合、無菌条件で製造する。活性成分の投与量は治療有効量、たとえば毎日約１μｇ／ｋｇ体重～約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。また、本発明のポリペプチドはほかの治療剤と併用することが出来る。
【0089】
薬物組成物の使用時、安全有効量の免疫複合体を哺乳動物に施用するが、その安全有効量は、通常、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重で、かつ多くの場合、約５０ｍｇ／ｋｇ体重未満で、好ましくは当該投与量が約１０μｇ／ｋｇ体重～約１ｍｇ／ｋｇ体重である。勿論、具体的な投与量は、さらに投与の様態、患者の健康状況などの要素を考えるべきで、すべて熟練の医者の技能範囲以内である。
【0090】
検出用途およびキット
本発明の抗体は検出に有用で、たとえば検体を検出することによって診断情報を提供することができる。
本発明において、使用される検体（サンプル）は細胞、組織検体および生検標本を含む。本発明で用いられる用語「生検」は当業者に既知のすべての種類の生検を含む。そのため、本発明で使用される生検は、たとえば内視鏡方法あるいは器官の穿刺または針刺しによって調製された組織検体を含む。
本発明で使用される検体は固定または保存された細胞または組織検体を含む。
本発明の抗体は検出に有用で、たとえば検体を検出することによって診断情報を提供することができる。
本発明において、使用される検体（サンプル）は細胞、組織検体および生検標本を含む。本発明で用いられる用語「生検」は当業者に既知のすべての種類の生検を含む。そのため、本発明で使用される生検は、たとえば内視鏡方法あるいは器官の穿刺または針刺しによって調製された組織検体を含む。
本発明で使用される検体は固定または保存された細胞または組織検体を含む。
【0091】
また、本発明は、本発明の抗体（またはその断片）を含有するキットを提供するが、本発明の一つの好適な例において、前記のキットはさらに容器、使用説明書、緩衝液などを含む。好適な例において、本発明の抗体は検出プレートに固定されてもよい。
【0092】
本発明の主な利点は以下の通りである。
本発明は呼吸器合胞体ウイルスを中和する全ヒト抗体の設計および使用を提供する。以下の利点がある。
１）本発明の抗体は、アミノ酸配列が比較的に低い体細胞突然変異部位を有し、低免疫原性を有する。
２）本発明の抗体は、ＲＳＶの異なるサブタイプに対するＦタンパク質親和力定数がピコモルのレベルに達し、かつ臨床における二つの抗体よりも良い。
３）本発明の抗体は、体内外の実験において有効にＲＳＶ感染を予防し、同時に有効にＲＳＶ感染後の拡散を抑制することができた。
本発明は呼吸器合胞体ウイルスを中和する全ヒト抗体の設計および使用を提供する。以下の利点がある。
１）本発明の抗体は、アミノ酸配列が比較的に低い体細胞突然変異部位を有し、低免疫原性を有する。
２）本発明の抗体は、ＲＳＶの異なるサブタイプに対するＦタンパク質親和力定数がピコモルのレベルに達し、かつ臨床における二つの抗体よりも良い。
３）本発明の抗体は、体内外の実験において有効にＲＳＶ感染を予防し、同時に有効にＲＳＶ感染後の拡散を抑制することができた。
【0093】
４）本発明の最適化された新たな抗体の研究で、その認識のエピトープおよびウイルスの機序に対してより明晰な理解が得られ、さらに薬物の設計に新たな標的を提供する。
【0094】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。下記実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」（ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、１９８９） に記載の条件などの通常の条件に、あるいは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に説明しない限り、百分率および部は重量百分率および重量部である。
【0095】
実施例１ ホモロジーモデリングおよび分子ドッキング技術による４Ｆ１およびＲＳＶ ｐｒｅ－Ｆの相互作用のモデルの構築
１．１ ホモロジーモデリングおよび分子ドッキング技術による４Ｆ１およびＲＳＶ ｐｒｅ－Ｆの相互作用のモデルの構築
コンピュータ支援設計によって前にヒトの末梢血ＰＢＭＣから分離された１株の広域中和抗体４Ｆ１抗体に対して最適化および改造を行った。まず、Ｐｒｉｍｅ ｄｏｃｋｉｎｇ（Ｓｃｈｒｏ¨ｄｉｎｇｅｒ，Ｉｎｃ．）における抗体モデリングモジュールで４Ｆ１抗体に対してホモロジーモデリングを行った。要約すると、重鎖および軽鎖の配列をプログラムに入力し、そして抗体構造データベースを検索することによってフレームの鋳型（ＦＲＨ／ＦＲＬ領域）を識別し、配列と配列類似度が最も高い抗体構造を決定して鋳型とした。本実施例において、４Ｆ１の可変領域の配列をヒト由来抗体胚胎系遺伝子データベースで照合し、相同性の高いＩＧＨＶ３／ ＩＧＫＶ２配列を設計の鋳型とし、抗体のＣＤＲ領域を鋳型につなぎ、さらに抗体構造のモデルを構築した。ＲｏｓｅｔｔａＤｏｃｋで４Ｆ１のホモロジーモデリングの構造をｐｒｅ－Ｆの構造（４ＪＨＷ）にドッキングした。抗体および抗原の点突然変異の結果およびドッキング採点の結果から複合体の構造を決定した。
結果：ＰｙＭＯＬ分子イメージシステム（バージョン２．０，Ｓｃｈｒoｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ）で構造図を生成した（図１Ａ）。
１．１ ホモロジーモデリングおよび分子ドッキング技術による４Ｆ１およびＲＳＶ ｐｒｅ－Ｆの相互作用のモデルの構築
コンピュータ支援設計によって前にヒトの末梢血ＰＢＭＣから分離された１株の広域中和抗体４Ｆ１抗体に対して最適化および改造を行った。まず、Ｐｒｉｍｅ ｄｏｃｋｉｎｇ（Ｓｃｈｒｏ¨ｄｉｎｇｅｒ，Ｉｎｃ．）における抗体モデリングモジュールで４Ｆ１抗体に対してホモロジーモデリングを行った。要約すると、重鎖および軽鎖の配列をプログラムに入力し、そして抗体構造データベースを検索することによってフレームの鋳型（ＦＲＨ／ＦＲＬ領域）を識別し、配列と配列類似度が最も高い抗体構造を決定して鋳型とした。本実施例において、４Ｆ１の可変領域の配列をヒト由来抗体胚胎系遺伝子データベースで照合し、相同性の高いＩＧＨＶ３／ ＩＧＫＶ２配列を設計の鋳型とし、抗体のＣＤＲ領域を鋳型につなぎ、さらに抗体構造のモデルを構築した。ＲｏｓｅｔｔａＤｏｃｋで４Ｆ１のホモロジーモデリングの構造をｐｒｅ－Ｆの構造（４ＪＨＷ）にドッキングした。抗体および抗原の点突然変異の結果およびドッキング採点の結果から複合体の構造を決定した。
結果：ＰｙＭＯＬ分子イメージシステム（バージョン２．０，Ｓｃｈｒoｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ）で構造図を生成した（図１Ａ）。
【0096】
１．２ 抗体の最適化設計
４Ｆ１とｐｒｅ－Ｆ複合体のドッキング構造モデルに示された抗体構造に関連する重要なアミノ酸およびｐｒｅ－Ｆとの相互作用の重要な部位から、フレームワーク領域に復帰突然変異部位を設計し、４Ｆ１の抗原と結合する部位に特異的に抗体の親和力を増強させる突然変異部位を導入した。
４Ｆ１とｐｒｅ－Ｆ複合体のドッキング構造モデルに示された抗体構造に関連する重要なアミノ酸およびｐｒｅ－Ｆとの相互作用の重要な部位から、フレームワーク領域に復帰突然変異部位を設計し、４Ｆ１の抗原と結合する部位に特異的に抗体の親和力を増強させる突然変異部位を導入した。
【0097】
免疫原性は常に治療性抗体の注目の要点である。高い体細胞突然変異頻度が抗体の免疫原性のリスクを増やすことを報告した研究がすでにある。そのため、体細胞突然変異部位を推定生殖細胞系列（ｉｎｆｅｒｒｅｄ ｇｅｒｍｌｉｎｅ、ｉＧＬ）の配列に戻すと、抗体の免疫原性が低下する可能性がある。構造分析から、４Ｆ１抗体に存在しうる免疫原性を低下させるために、重鎖のフレーム領域の配列における９個の体細胞突然変異部位および軽鎖における７個の体細胞突然変異部位を同時に相応する胚胎系の配列に戻した（図１Ｂ）。よって、４Ｆ１胚胎系復帰が得られた。
【0098】
高親和力は、通常、抗ウイルス抗体の品質評価の重要な指標の一つである。さらに４Ｆ１抗体の親和力を向上させるために、本プロジェクトでは、シュレディンガー（Ｓｃｈｒoｄｉｎｇｅｒ）によって抗体に対してい親和力の最適化を行い、それぞれ４Ｆ１胚胎系復帰の重鎖と軽鎖の位置に５個の突然変異部位（ＶＨ－Ｓ７５Ｒ、ＶＨ－Ｖ１０２Ｓ、ＶＬ－Ｌ３０Ｒ、ＶＬ－Ｓ３２Ｑ、ＶＬ－Ｓ７２Ｑ）の突然変異を導入し、それぞれ４Ｆ１Ｅｎ１、４Ｆ１Ｅｎ２、４Ｆ１Ｅｎ３、４Ｆ１Ｅｎ４および４Ｆ１Ｅｎ５と名付けた。
結果：配列アライメントの結果は図２に、アミノ酸およびヌクレオチドの配列は表１に示す。
結果：配列アライメントの結果は図２に、アミノ酸およびヌクレオチドの配列は表１に示す。
【0099】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【0100】
実施例２ 抗体の発現と精製
ＣＨＯ細胞に一過性形質移入し、全ヒト抗体の発現を行った。形質移入の１日前（－１日目）に、ＥｘｐｉＣＨＯ－ＳTM細胞を分けて接種し、最終の密度が３×１０６－４×１０６個生細胞／ｍＬで、細胞を一晩生長させた。翌日（０日目）に、生細胞の密度および生存率の百分率を測定した。細胞密度が約７×１０６-１０×１０６個生細胞／ｍＬに、生存率が９５－９９％にならないと、形質移入が続けられない。細胞を最終の密度が６×１０６個生細胞／ｍＬになるように希釈した。予め冷却された試薬（４℃）でＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅTMＣＨＯ／プラスミドＤＮＡ複合体を調製した。室温でＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅTMＣＨＯ／プラスミドＤＮＡ複合体を１－５分インキュベートした後、溶液をゆっくりＣＨＯ細胞培養瓶に移し、添加の過程において軽く培養瓶を振とうしていた。細胞をオービタルシェーカーにおいて（３７℃インキュベーターの８％ＣＯ２含有湿潤空气の条件において）培養した。７－１１日培養し、細胞が半分死亡すると、上清を回収し、抗体の精製を開始した。
ＣＨＯ細胞に一過性形質移入し、全ヒト抗体の発現を行った。形質移入の１日前（－１日目）に、ＥｘｐｉＣＨＯ－ＳTM細胞を分けて接種し、最終の密度が３×１０６－４×１０６個生細胞／ｍＬで、細胞を一晩生長させた。翌日（０日目）に、生細胞の密度および生存率の百分率を測定した。細胞密度が約７×１０６-１０×１０６個生細胞／ｍＬに、生存率が９５－９９％にならないと、形質移入が続けられない。細胞を最終の密度が６×１０６個生細胞／ｍＬになるように希釈した。予め冷却された試薬（４℃）でＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅTMＣＨＯ／プラスミドＤＮＡ複合体を調製した。室温でＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅTMＣＨＯ／プラスミドＤＮＡ複合体を１－５分インキュベートした後、溶液をゆっくりＣＨＯ細胞培養瓶に移し、添加の過程において軽く培養瓶を振とうしていた。細胞をオービタルシェーカーにおいて（３７℃インキュベーターの８％ＣＯ２含有湿潤空气の条件において）培養した。７－１１日培養し、細胞が半分死亡すると、上清を回収し、抗体の精製を開始した。
【0101】
プロテインＧアガロース４ＦＦフィラー（ＧＥから購入）で抗体を精製した。まず、収集されたＣＨＯ細胞懸濁液を４０００ｒｐｍ、４℃で３０ｍｉｎ遠心し、収集した上清をさらに０．４５μｍフィルターでろ過し、精製に供した。重力型遠心カラムを取り、プロテインＧアガロース４ＦＦフィラーを入れ、３倍カラム体積の２０％エタノールでフィラーを安定化させ、さらに５倍カラム体積の結合緩衝液でカラムを平衡化させた後、サンプルを仕込み、さらに１０倍カラム体積の結合緩衝液でカラムを平衡化させ、最後に３倍カラム体積の溶離緩衝液でカラムを溶離させ、溶離した抗体溶液に中和緩衝液を入れて溶離したサンプルのｐＨを７．５程度にした。抗体溶液を５Ｌ １ＸＰＢＳで３回透析すると、抗体を濃縮して－８０℃で保存した。
【0102】
実施例３ ＥＬＩＳＡ法による抗体の抗原結合活性の検出
ＥＬＩＳＡによって発現された抗体がＲＳＶ Ａ２およびＢ９３２０ ｐｒｅ－ｆｕｓｉｏｎ Ｆタンパク質を認識するか検出した。Ａ２ Ｆタンパク質の配列はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ： Ｐ０３４２０．１を参照し、Ｂ９３２０の配列はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ： Ｑ６Ｖ２Ｅ７を参照し、ＲＳＶ ｐｒｅ－ｆｕｓｉｏｎ Ｆタンパク質の設計はＪａｓｏｎ Ｓ． ＭｃＬｅｌｌａｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３で使用されたストラテジーに基づいて設計し、ＲＳＶ ｐｏｓｔ－ｆｕｓｉｏｎ Ｆタンパク質の設計はＤａｖｉｄｅ Ｃｏｒｔｉ． Ｎａｔｕｒｅ ２０１３で使用されたストラテジーに基づいて設計し、上海Ｇｅｎｅｒａｙ社で全遺伝子の合成が行われ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｐｃＤＮＡ３．１の発現ベクターに構築した。哺乳動物細胞ＣＨＯ発現系で発現させたが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＥｘｐｉＣＨＯ－ＳTM Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍマニュアルを参照する。パリビズマブ（Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ、ＳＹＮＡＧＩＳR）を陽性対照抗体とし、アボット社から購入された。Ｆタンパク質でＥＬＩＳＡプレートを、５μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェルで、４℃で一晩コーティングした。翌日にＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した。２％ＢＳＡで、２００μＬ／ウェルで、３７℃で２ｈブロッキングした。再びＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した。サンプルを、１００μＬ／ウェルで、３７℃で２ｈ仕込んだ。ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）－ペルオキシダーゼ抗体を、１：２０００で希釈し、１００μＬ／ウェルで、３７℃で１ｈインキュベートした。ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した。基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで入れて呈色させ、色が浅い場合、３７℃で光を避けて１５ｍｉｎ反応させてもよい。２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を５０μＬ／ウェルで入れて反応を停止させた。ＯＤ４５０を測定し、そしてデータ処理を行った。
ＥＬＩＳＡによって発現された抗体がＲＳＶ Ａ２およびＢ９３２０ ｐｒｅ－ｆｕｓｉｏｎ Ｆタンパク質を認識するか検出した。Ａ２ Ｆタンパク質の配列はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ： Ｐ０３４２０．１を参照し、Ｂ９３２０の配列はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ： Ｑ６Ｖ２Ｅ７を参照し、ＲＳＶ ｐｒｅ－ｆｕｓｉｏｎ Ｆタンパク質の設計はＪａｓｏｎ Ｓ． ＭｃＬｅｌｌａｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３で使用されたストラテジーに基づいて設計し、ＲＳＶ ｐｏｓｔ－ｆｕｓｉｏｎ Ｆタンパク質の設計はＤａｖｉｄｅ Ｃｏｒｔｉ． Ｎａｔｕｒｅ ２０１３で使用されたストラテジーに基づいて設計し、上海Ｇｅｎｅｒａｙ社で全遺伝子の合成が行われ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｐｃＤＮＡ３．１の発現ベクターに構築した。哺乳動物細胞ＣＨＯ発現系で発現させたが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＥｘｐｉＣＨＯ－ＳTM Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍマニュアルを参照する。パリビズマブ（Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ、ＳＹＮＡＧＩＳR）を陽性対照抗体とし、アボット社から購入された。Ｆタンパク質でＥＬＩＳＡプレートを、５μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェルで、４℃で一晩コーティングした。翌日にＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した。２％ＢＳＡで、２００μＬ／ウェルで、３７℃で２ｈブロッキングした。再びＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した。サンプルを、１００μＬ／ウェルで、３７℃で２ｈ仕込んだ。ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）－ペルオキシダーゼ抗体を、１：２０００で希釈し、１００μＬ／ウェルで、３７℃で１ｈインキュベートした。ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した。基質ＴＭＢを１００μＬ／ウェルで入れて呈色させ、色が浅い場合、３７℃で光を避けて１５ｍｉｎ反応させてもよい。２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を５０μＬ／ウェルで入れて反応を停止させた。ＯＤ４５０を測定し、そしてデータ処理を行った。
【0103】
結果：４Ｆ１と比べ、復帰突然変異した４Ｆ１（胚胎系復帰）は、４Ｆ１野生型と同様の結合および中和活性を維持した。４Ｆ１Ｅｎ１（ＶＨ－Ｓ７５Ｒ）は４Ｆ１ＷＴと比べ、より高い結合活性を有する（図１Ｃ）。
【0104】
実施例４ バイオレイヤー干渉技術による抗体の親和力定数の検出
４Ｆ１Ｅｎ１抗体と既存の臨床を許可または評価された抗体の親和力および中和活性の比較を研究するために、ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＯｃｔｅｔR ＲＥＤ９６相互作用解析装置によって４Ｆ１Ｅｎ１抗体の２種の異なるサブタイプのＲＳＶ ｐｒｅ－Ｆタンパク質との親和力を分析した。パリビズマブおよびＭＥＤＩ８８９７を対照とした。本試験では、異なる様態の抗体とＲＳＶ／Ａ／Ａ２およびＲＳＶ／Ｂ／Ｂ９３２０ウイルス株由来のｐｒｅ－Ｆタンパク質の結合定数（ＫＤ値で表す）を検出した。本実験では、ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＯｃｔｅｔR ＲＥＤ９６相互作用解析装置によって分析を行った。本実験では、Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｂｕｆｆｅｒ（ＫＢ：１× ＰＢＳ、０．０１％ＢＳＡ）を実験過程における緩衝液とした。まず、ＡＨＣセンサーをＫＢ含有黒色９６ウェルプレートにおいて少なくとも１０分浸漬させた。ＫＢで５μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を調製して抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（ＡＨＣ）コーティング生物センサーの表面において５分捕獲させた。ＫＢにおいてベースラインの工程を行った後、センサーをＫＢで希釈された組み換えＤＳ－Ｃａｖ１を含有するウェルにおいて６００ｓ浸漬させた（結合期）。その後、センサーをＫＢにおいて浸漬させ、所定の時間（分離段階）として１２００ｓ持続した。最後にソフトで結果を分析した。１：１結合グローバルフィッティング動態学モデルで平均Ｋｏｎ、ＫｏｆｆおよびＫＤ値を計算し、Ｒ２値は≧０．９５である。
４Ｆ１Ｅｎ１抗体と既存の臨床を許可または評価された抗体の親和力および中和活性の比較を研究するために、ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＯｃｔｅｔR ＲＥＤ９６相互作用解析装置によって４Ｆ１Ｅｎ１抗体の２種の異なるサブタイプのＲＳＶ ｐｒｅ－Ｆタンパク質との親和力を分析した。パリビズマブおよびＭＥＤＩ８８９７を対照とした。本試験では、異なる様態の抗体とＲＳＶ／Ａ／Ａ２およびＲＳＶ／Ｂ／Ｂ９３２０ウイルス株由来のｐｒｅ－Ｆタンパク質の結合定数（ＫＤ値で表す）を検出した。本実験では、ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＯｃｔｅｔR ＲＥＤ９６相互作用解析装置によって分析を行った。本実験では、Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｂｕｆｆｅｒ（ＫＢ：１× ＰＢＳ、０．０１％ＢＳＡ）を実験過程における緩衝液とした。まず、ＡＨＣセンサーをＫＢ含有黒色９６ウェルプレートにおいて少なくとも１０分浸漬させた。ＫＢで５μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を調製して抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（ＡＨＣ）コーティング生物センサーの表面において５分捕獲させた。ＫＢにおいてベースラインの工程を行った後、センサーをＫＢで希釈された組み換えＤＳ－Ｃａｖ１を含有するウェルにおいて６００ｓ浸漬させた（結合期）。その後、センサーをＫＢにおいて浸漬させ、所定の時間（分離段階）として１２００ｓ持続した。最後にソフトで結果を分析した。１：１結合グローバルフィッティング動態学モデルで平均Ｋｏｎ、ＫｏｆｆおよびＫＤ値を計算し、Ｒ２値は≧０．９５である。
【0105】
結果：最適化後の４Ｆ１Ｅｎ１抗体は既存の抗体よりもＲＳＶ Ａ型とＢ型 ｐｒｅ－Ｆに高い親和力を有する。４Ｆ１ＷＴと比べ、４Ｆ１Ｅｎ１はＡ２－ｐｒｅＦにより高い結合定数を、そしてＢ９３２０－ｐｒｅ－Ｆにより遅い解離定数を有する。また、ＰＶＺおよびＭＥＤＩ８８９７と比べ、４Ｆ１Ｅｎ１はＡ２－ｐｒｅＦとの親和力が少なくとも１０倍高く、Ｂ９３２０／ｐｒｅＦとの結合親和力が少なくとも１００倍高かった。４Ｆ１ ＥｎのＲＳＶ／Ａ／Ａ２菌株を中和する効果が４Ｆ１－ＷＴよりも３倍向上した。また、４Ｆ１はＲＳＶ／Ａ２に対するＩＣ５０値がパリビズマブよるも６２倍低く、ＭＥＤＩ８８９７に近かった（図３Ａ－Ｄ）。
【0106】
実施例５ ウイルスのマイクロ中和実験
５．１ ウイルスのＴＣＩＤ５０の測定
ＴＣＩＤ５０実験によってＲＳＶマイクロ中和実験における希釈ウイルス液の力価を確認した。２００μｌの希釈ウイルス液を９６ウェル細胞プレートのＢ２－Ｄ２ウェルに入れ、ほかのウェルに１００ μｌの細胞培養液を入れた。Ｂ２－Ｄ２ウェルから１００ μｌのウェル液を吸い取ってＢ３－Ｄ３ウェルに入れ、均一に混合した後、２倍勾配で希釈し、ウイルスは計１８の濃度に希釈し、重複ウェルを３つとした。その後、テストプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２時間インキュベートした。ＨＥｐ２細胞を２５，０００個細胞／ウェルの密度でテストプレートに接種して３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで５日培養した。
５．１ ウイルスのＴＣＩＤ５０の測定
ＴＣＩＤ５０実験によってＲＳＶマイクロ中和実験における希釈ウイルス液の力価を確認した。２００μｌの希釈ウイルス液を９６ウェル細胞プレートのＢ２－Ｄ２ウェルに入れ、ほかのウェルに１００ μｌの細胞培養液を入れた。Ｂ２－Ｄ２ウェルから１００ μｌのウェル液を吸い取ってＢ３－Ｄ３ウェルに入れ、均一に混合した後、２倍勾配で希釈し、ウイルスは計１８の濃度に希釈し、重複ウェルを３つとした。その後、テストプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２時間インキュベートした。ＨＥｐ２細胞を２５，０００個細胞／ウェルの密度でテストプレートに接種して３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで５日培養した。
【0107】
５日培養した後、上清を捨て、８０％アセトンでテストプレートにおける細胞を固定した。ＥＬＩＳＡによって細胞内におけるウイルス含有量を検出した。元データをウイルスのＴＣＩＤ５０の計算に使用した（Ｋａｒｂｅｒ法）。計算式は以下の通りである。
ＴＣＩＤ５０／ウェル＝Ａｎｔｉｌｏｇ１０［（陽性ウェル数／３）-０．５｝×０．３］／２
陽性ウェルの判定基準：テストウェルの読み値＞（培養液対照の平均値＋３×培養液対照のＳＤ値）
ＱＣ基準：希釈ウイルス液の力価は５０－２０００ ＴＣＩＤ５０／ウェルである。
ＴＣＩＤ５０／ウェル＝Ａｎｔｉｌｏｇ１０［（陽性ウェル数／３）-０．５｝×０．３］／２
陽性ウェルの判定基準：テストウェルの読み値＞（培養液対照の平均値＋３×培養液対照のＳＤ値）
ＱＣ基準：希釈ウイルス液の力価は５０－２０００ ＴＣＩＤ５０／ウェルである。
【0108】
５．２ ウイルスのマイクロ中和実験
テストウイルス株Ａ２およびＢ９３２０（ＡＴＣＣから購入）をそれぞれ細胞培養液で４０００ＴＣＩＤ５０／ｍｌに希釈した。倍で希釈された抗体および２００ＴＣＩＤ５０／ウェルのウイルスを等体積比で９６ウェル細胞培養プレートに入れ、均一に混合した後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２時間インキュベートした。その後、ＨＥｐ２細胞を２５，０００個細胞／ウェルの密度でテストプレートに接種して３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで５日培養した。抗体はいずれも９つの濃度でテストし、３倍勾配希釈し、重複ウェルを３つとし、開始テスト濃度が４０００ｎｇ／ｍｌである。
テストウイルス株Ａ２およびＢ９３２０（ＡＴＣＣから購入）をそれぞれ細胞培養液で４０００ＴＣＩＤ５０／ｍｌに希釈した。倍で希釈された抗体および２００ＴＣＩＤ５０／ウェルのウイルスを等体積比で９６ウェル細胞培養プレートに入れ、均一に混合した後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２時間インキュベートした。その後、ＨＥｐ２細胞を２５，０００個細胞／ウェルの密度でテストプレートに接種して３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで５日培養した。抗体はいずれも９つの濃度でテストし、３倍勾配希釈し、重複ウェルを３つとし、開始テスト濃度が４０００ｎｇ／ｍｌである。
【0109】
５日培養した後、上清を捨て、８０％アセトンでテストプレートにおける細胞を固定した。ＥＬＩＳＡによって細胞内におけるウイルス含有量を検出した。元データを抗体の異なる濃度における中和活性の計算に使用した。計算式は以下の通りである。
活性百分率（％）＝（テストウェルの読み値－ウイルス対照の平均値）／（細胞対照の平均値－ウイルス対照の平均値）×１００
ＥＣ５０値はＰｒｉｓｍソフトで計算し、中和活性曲線フィッティング方法はシグモイド型用量－反応（可変傾き）である。
結果：体外マイクロ中和試験の結果から、４Ｆ１Ｅｎ１（ＶＨ－Ｓ７５Ｒ）は４Ｆ１ＷＴと比べ、より高い中和活性を有することが実証された（図１Ｄ－Ｅ）。
活性百分率（％）＝（テストウェルの読み値－ウイルス対照の平均値）／（細胞対照の平均値－ウイルス対照の平均値）×１００
ＥＣ５０値はＰｒｉｓｍソフトで計算し、中和活性曲線フィッティング方法はシグモイド型用量－反応（可変傾き）である。
結果：体外マイクロ中和試験の結果から、４Ｆ１Ｅｎ１（ＶＨ－Ｓ７５Ｒ）は４Ｆ１ＷＴと比べ、より高い中和活性を有することが実証された（図１Ｄ－Ｅ）。
【0110】
実施例６ ハイコンテント細胞イメージング技術による中和抗体のＲＳＶ感染と拡散に対する抑制機能の検出
ＨＥｐ－２細胞を１００００個／ウェルで９６ウェルの黒色培養プレートに敷き、そして３７度のインキュベーターで一晩培養した。４Ｆ１の最適化抗体のウイルスを中和する能力を検証するために、系列釈された抗体を５００ ｐｆｕ ＲＳＶ／Ａ２と１時間インキュベートし、そしてＨｅｐ－２細胞に添加した。抗体がＲＳＶの細胞感染後のウイルスの拡散に対する抑制作用を検証するために、まず、ＲＳＶウイルスをＨＥｐ－２に接種し、２４時間感染させた後、上清を吸い取って捨て、連続希釈された抗体を感染ＨＥｐ－２に入れた。ウイルス感染の３日後、パラホルムアルデヒドにおいて１５分固定し、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳにおいて３０分ブロッキングした。ビオチン化抗ＲＳＶ－Ｆおよび抗ＲＳＶ－Ｇモノクローナル抗体を３％ＢＳＡのＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈し、ＲＳＶ感染の検出に供し、室温で２ｈインキュベートした。ＦＩＴＣがカップリングされたストレプトアビジンを０．５％ＢＳＡのＰＢＳで１：５００で希釈し、そしてＤＡＰＩ（１：１０００）と二次抗体で共にインキュベートして細胞核を、室温で１時間染色した。未結合の抗体を除去するために、０．０５％ツイン－２０含有ＰＢＳで３回５分洗浄した。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｏｐｅｒａ ＰｈｅｎｉｘTM ハイコンテントスクリーニングシステムによって９６ウェルプレートに対して撮影およびデータ統計を行った。２倍または１０倍の対物レンズで２つの蛍光チャネルにおいて細胞を撮影した。１０倍の対物レンズで１０の異なる領域をイメージングした。どのくらいの細胞がＲＳＶ感染に陽性を示したか確認するために、ＲＳＶ陽性細胞数を細胞核の合計数で割り、さらに１００をかけ、ＲＳＶ感染細胞の百分率を得た。
ＨＥｐ－２細胞を１００００個／ウェルで９６ウェルの黒色培養プレートに敷き、そして３７度のインキュベーターで一晩培養した。４Ｆ１の最適化抗体のウイルスを中和する能力を検証するために、系列釈された抗体を５００ ｐｆｕ ＲＳＶ／Ａ２と１時間インキュベートし、そしてＨｅｐ－２細胞に添加した。抗体がＲＳＶの細胞感染後のウイルスの拡散に対する抑制作用を検証するために、まず、ＲＳＶウイルスをＨＥｐ－２に接種し、２４時間感染させた後、上清を吸い取って捨て、連続希釈された抗体を感染ＨＥｐ－２に入れた。ウイルス感染の３日後、パラホルムアルデヒドにおいて１５分固定し、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳにおいて３０分ブロッキングした。ビオチン化抗ＲＳＶ－Ｆおよび抗ＲＳＶ－Ｇモノクローナル抗体を３％ＢＳＡのＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈し、ＲＳＶ感染の検出に供し、室温で２ｈインキュベートした。ＦＩＴＣがカップリングされたストレプトアビジンを０．５％ＢＳＡのＰＢＳで１：５００で希釈し、そしてＤＡＰＩ（１：１０００）と二次抗体で共にインキュベートして細胞核を、室温で１時間染色した。未結合の抗体を除去するために、０．０５％ツイン－２０含有ＰＢＳで３回５分洗浄した。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｏｐｅｒａ ＰｈｅｎｉｘTM ハイコンテントスクリーニングシステムによって９６ウェルプレートに対して撮影およびデータ統計を行った。２倍または１０倍の対物レンズで２つの蛍光チャネルにおいて細胞を撮影した。１０倍の対物レンズで１０の異なる領域をイメージングした。どのくらいの細胞がＲＳＶ感染に陽性を示したか確認するために、ＲＳＶ陽性細胞数を細胞核の合計数で割り、さらに１００をかけ、ＲＳＶ感染細胞の百分率を得た。
【0111】
結果：本プロジェクトでは、さらに４Ｆ１Ｅｎ１の細胞間ウイルス拡散を遮断する能力をテストした。本試験において、感染の１時間前（感染の抑制）または感染の２４時間後（拡散の抑制）に連続希釈された４Ｆ１－Ｅｎ、パリビズマブおよびＭＥＤＩ８８７を添加した。感染の７２ｈ後にハイコンテント解析によってＩＣ５０値を計算した。図４に示すように、４Ｆ１Ｅｎ１はウイルス感染のみならず、ＨＥｐ－２細胞がＲＳＶ／Ａ２に感染させて２４時間後でもウイルスの拡散を抑制することができた。４Ｆ１Ｅｎ１は合胞体形成の大きさを制限することもできた（図４Ｃ）。４Ｆ１のウイル感染および拡散の抑制能力はＭＥＤＩ８８９７に相当し、効果が顕著にパリビズマブよりも高かった（図４Ｄ－Ｅ）。上記のように、これらの結果から、４Ｆ１ Ｅｎはウイルスの感染と拡散および合胞体の形成を抑制することができることが示された。
【0112】
実施例７ ウイルスチャレンジ試験
本実験例において、本発明の抗体４Ｆ１およびパリビズマブのマウスのＲＳＶ感染を予防する能力を検出した。方法は以下の通りである。
６－８週齢のメスのＢａｌＢ／ｃマウスを予めバイオセーフティレベル２の動物実験部屋に置いた。ｄａｙ０では、マウスにそれぞれ１５ｍｇ／ｋｇおよび１．５ ｍｇ／ｋｇの４Ｆ１抗体、パリビズマブおよびＰＢＳを腹腔内注射した。２４ｈ後、ペントバルビタールトンナトリウムでマウスを麻酔して鼻腔から５×１０５ ＰＦＵ／５０μｌ／マウスのＲＳＶ Ａ２ウイルスを攻撃させた。４日後、動物を殺処分して肺および鼻甲介を採取した。各マウスから左肺を取って４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンで包埋して通常のヘマトキシリン－エオジン（ＨＥ）染色を行い、デジタル切片スキャンシステムによって肺部の病理的損傷および炎症性細胞浸潤の様子を観察した。各マウスから右の肺組織および鼻甲介を取って組織を均質化し、ＥＺ－ｐｒｅｓｓ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで全ＲＮＡ抽出を行った後、ｃＤＮＡに逆転写し、リアルタイム定量ＲＴ－ＰＣＲの方法によってＲＳＶのゲノムを相対的定量を行い、ＲＳＶのＮＰタンパク質をコードする遺伝子配列をアライメントし、保存的な断片を選んでプライマーを設計し、マウスのβ－アクチンを内部参照遺伝子とした（表２を参照する）。Ｔｏｙｏｂｏ ＫＯＤ ＳＹＢＲRｑＰＣＲ Ｍｉｘのマニュアルを参照する。
本実験例において、本発明の抗体４Ｆ１およびパリビズマブのマウスのＲＳＶ感染を予防する能力を検出した。方法は以下の通りである。
６－８週齢のメスのＢａｌＢ／ｃマウスを予めバイオセーフティレベル２の動物実験部屋に置いた。ｄａｙ０では、マウスにそれぞれ１５ｍｇ／ｋｇおよび１．５ ｍｇ／ｋｇの４Ｆ１抗体、パリビズマブおよびＰＢＳを腹腔内注射した。２４ｈ後、ペントバルビタールトンナトリウムでマウスを麻酔して鼻腔から５×１０５ ＰＦＵ／５０μｌ／マウスのＲＳＶ Ａ２ウイルスを攻撃させた。４日後、動物を殺処分して肺および鼻甲介を採取した。各マウスから左肺を取って４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンで包埋して通常のヘマトキシリン－エオジン（ＨＥ）染色を行い、デジタル切片スキャンシステムによって肺部の病理的損傷および炎症性細胞浸潤の様子を観察した。各マウスから右の肺組織および鼻甲介を取って組織を均質化し、ＥＺ－ｐｒｅｓｓ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで全ＲＮＡ抽出を行った後、ｃＤＮＡに逆転写し、リアルタイム定量ＲＴ－ＰＣＲの方法によってＲＳＶのゲノムを相対的定量を行い、ＲＳＶのＮＰタンパク質をコードする遺伝子配列をアライメントし、保存的な断片を選んでプライマーを設計し、マウスのβ－アクチンを内部参照遺伝子とした（表２を参照する）。Ｔｏｙｏｂｏ ＫＯＤ ＳＹＢＲRｑＰＣＲ Ｍｉｘのマニュアルを参照する。
【0113】
【表2】
【0114】
結果：リアルタイム定量ＲＴ－ＰＣＲの結果は図５Ｂに示すように、４Ｆ１は肺および鼻甲介におけるＨＲＳＶウイルスの低下において明らかにパリビズマブよりも有効である。そして、１．５ ｍｇ／ｋｇ体重と低い濃度で有効である。肺組織の病理学の結果から、４Ｆ１は単核球の肺間質および肺胞間隙への浸潤を防止することができ、効果がパリビズマブよりも良いことが示された（図５Ｃ）。これらのデータから、４Ｆ１Ｅｎ１は体内において高度に有効な保護作用を示し、潜在的にＲＳＶ感染を予防する薬物の候補として有望であることがわかる。
【0115】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の形態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-06-12
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
特異的抗呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質の抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、ここで、前記重鎖の可変領域は配列番号１５で示される配列に相応し、以下のアミノ酸突然変異を有し：
（Ｚ１） ｎ個の以下の群から選ばれる復帰型突然変異で、ここで、ｎは３、４、５、６、７、８または９である：
１番目のＥ→Ｑ
６番目のＱ→Ｅ
１３番目のＲ→Ｑ
６２番目のＥ→Ｄ
６５番目のＲ→Ｋ
６９番目のＳ→Ｔ
７６番目のＴ→Ｋ
８８番目のＰ→Ａ
１１９番目のＲ→Ｔ；
（Ｚ２） 中和増強型ＦＲ突然変異
７５番目のＳ→Ｒ；または
（Ｚ３）Ｚ１とＺ２の組み合わせ；
および、前記軽鎖の可変領域は配列番号１６で示される配列に相応し、以下のアミノ酸突然変異を有する：
（Ｙ１） ｍ個の以下の群から選ばれる復帰型突然変異で、ここで、ｍは３、４、５、６または７である：
１２番目のＳ→Ｐ
２４番目のＫ→Ｒ
４７番目のＫ→Ｑ
６５番目のＡ→Ｄ
７９番目のＥ→Ｋ
１０９番目のＶ→Ｌ
１１０番目のＤ→Ｅ；
（Ｙ２） 中和増強型ＣＤＲ突然変異
３０番目のＬ→Ｒ；または
（Ｙ３）Ｙ１とＹ２の組み合わせ；
ことを特徴とする抗体。
【請求項2】
前記抗体は特異的に呼吸器合胞体ウイルスの融合前Ｆタンパク質に結合することを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項3】
前記重鎖は以下の群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の抗体：ａ） アミノ酸配列が配列番号１、２で示される重鎖可変領域；ならびに
ｂ） 配列番号１、または２で示されるアミノ酸配列が、３つのＣＤＲ領域の配列が残ったまま、ＦＲ領域が１～５個（好ましくは１～３個、最も好ましくは１または２個）のアミノ酸残基の置換、欠失、修飾および／または付加を経てなる、呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質（好ましくは融合前Ｆタンパク質）の結合親和力が残った誘導配列で示される重鎖可変領域。
【請求項4】
前記軽鎖可変領域は以下の群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の抗体：ｃ） アミノ酸配列が配列番号４または５で示される軽鎖可変領域；ならびに
ｄ） 配列番号４または５で示されるアミノ酸配列が、３つのＣＤＲ領域の配列が残ったまま、ＦＲ領域が１～４個（好ましくは１～３個、最も好ましくは１または２個）のアミノ酸残基の置換、欠失、修飾および／または付加を経てなる、呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質（好ましくは融合前Ｆタンパク質）の結合親和力が残った誘導配列で示される軽鎖可変領域。
【請求項5】
前記重鎖可変領域は配列番号１または２で示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項6】
前記軽鎖可変領域は配列番号４または５で示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項7】
前記抗体は配列が配列番号２で示される重鎖可変領域および配列が配列番号４で示される軽鎖可変領域を有することを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項8】
組み換えタンパク質であって、（ｉ） 請求項１に記載の抗体；ならびに
（ｉｉ） 任意の発現および／または精製を補助するタグ配列
を有するタンパク質。
【請求項9】
ＣＡＲ構築物であって、前記のＣＡＲ構築物の抗原結合領域のｓｃＦｖ断片は特異的にＲＳＶ融合タンパク質（好ましくは融合前Ｆタンパク質）に結合する結合領域で、かつ前記ｓｃＦｖは請求項１に記載の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有するＣＡＲ構築物。
【請求項10】
外来の請求項９に記載のＣＡＲ構築物を発現する組み換え免疫細胞。
【請求項11】
抗体薬物複合体であって、（ａ） 請求項１に記載の抗体である、抗体部分；および
（ｂ） 検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、前記抗体部分と複合する複合部分
を含有する抗体薬物複合体。
【請求項12】
薬物組成物であって、（ｉ） 請求項１に記載の抗体、請求項８に記載の組み換えタンパク質、請求項１０に記載の免疫細胞、請求項１１に記載の抗体薬物複合体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、活性成分；および
（ｉｉ） 薬学的に許容される担体
を含有する薬物組成物。
【請求項13】
以下の群から選ばれるポリペプチドをコードのするポリヌクレオチド：（１） 請求項１～７のいずれかに記載の抗体；
（２） 請求項８に記載の組み換えタンパク質；および
（３） 請求項９に記載のＣＡＲ構築物。
【請求項14】
サンプルにおける呼吸器合胞体ウイルスを検出する方法であって、以下の工程を含む方法：（１） サンプルを請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体と接触させる工程、および
（２） 抗原－抗体複合体が形成したか検出し、ここで、複合体が形成したというのはサンプルに呼吸器合胞体ウイルスが存在することを意味する。
【請求項15】
呼吸器合胞体ウイルス感染を治療することにおける使用のための、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体、または前記抗体の抗体－薬物複合体、または前記抗体を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞、またはこれらの組み合わせ。
【国際調査報告】