特表 2024-537425 アンチセンスオリゴを使用した逆転写の標的阻害

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-10

(54)【発明の名称】アンチセンスオリゴを使用した逆転写の標的阻害

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20241003BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20241003BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20241003BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z

C12Q1/686 Z ZNA

C12Q1/6869 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024523541

(86)(22)【出願日】2022-06-28

(85)【翻訳文提出日】2024-06-17

(86)【国際出願番号】 EP2022067813

(87)【国際公開番号】W WO2023066534

(87)【国際公開日】2023-04-27

(31)【優先権主張番号】21204208.9

(32)【優先日】2021-10-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523123307

【氏名又は名称】ハミングバード ダイアグノスティクス ゲーエムベーハー

【氏名又は名称原語表記】Ｈｕｍｍｉｎｇｂｉｒｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ

(74)【代理人】

【識別番号】110001999

【氏名又は名称】弁理士法人はなぶさ特許商標事務所

(72)【発明者】

【氏名】ホロス，ラスティスラブ

(72)【発明者】

【氏名】ラジャクマール，ティモシー

(72)【発明者】

【氏名】スタインクラウス，ブルーノ

(72)【発明者】

【氏名】カフラマン，ムスタファ

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA13

4B063QQ03

4B063QR08

4B063QR35

4B063QS25

4B063QS28

4B063QX02

(57)【要約】

本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ブロッキングオリゴヌクレオチド）を使用した逆転写の標的阻害に関する。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ブロッキングオリゴヌクレオチド）及び前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する方法が具体的に開示される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

１つ以上の修飾リボヌクレオチド及び／又は１つ以上のロックドヌクレオチドを含むブロッキングオリゴヌクレオチド。

【請求項2】

前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、不要なＲＮＡ分子の少なくとも１領域に対して逆相補的である、請求項１に記載のブロッキングオリゴヌクレオチド。

【請求項3】

前記１つ以上の修飾リボヌクレオチド及び／又は前記１つ以上のロックドヌクレオチドが、不要なＲＮＡ分子の少なくとも１領域への前記ブロッキングオリゴヌクレオチドの結合を増加させる、請求項１又は２に記載のブロッキングオリゴヌクレオチド。

【請求項4】

前記不要なＲＮＡ分子が、２００リボヌクレオチド未満の長さを有する豊富な非コードＲＮＡ分子である、請求項２又は３に記載のブロッキングオリゴヌクレオチド。

【請求項5】

前記不要なＲＮＡ分子が、豊富なｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）、Ｙ－ＲＮＡ、Ｙ－ＲＮＡフラグメント（Ｙ－ＲＮＡフラグメントは完全長Ｙ－ＲＮＡではない）、ｓｎｏＲＮＡ、ｒＲＮＡフラグメント（ｒＲＮＡフラグメントは完全長ｒＲＮＡではない）、又はｔＲＮＡである、請求項４に記載のブロッキングオリゴヌクレオチド。

【請求項6】

前記１つ以上の修飾リボヌクレオチドが、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチド配列及び／又は３’末端ヌクレオチド配列に含まれる、請求項１乃至請求項５のいずれか一項に記載のブロッキングオリゴヌクレオチド。

【請求項7】

前記１つ以上のロックドヌクレオチドが、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドの中央ヌクレオチド配列に含まれる、請求項１乃至請求項６のいずれか一項に記載のブロッキングオリゴヌクレオチド。

【請求項8】

前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは、５’から３’までを：
（ｉ）１つ以上の（連続した）修飾リボヌクレオチドを含む５’末端ヌクレオチド配列、
（ｉｉ）１つ以上の（連続しない）ロックドヌクレオチドを含む中央ヌクレオチド配列、及び
（ｉｉ）１つ以上の（連続した）修飾リボヌクレオチドを含む３’末端ヌクレオチド配列、
の順序で含む、請求項１乃至請求項７のいずれか一項に記載のブロッキングオリゴヌクレオチド。

【請求項9】

前記１つ以上のロックドヌクレオチドが、３つ以上のＧ／Ｃのストレッチに含まれない、請求項１乃至請求項８のいずれか一項に記載のブロッキングオリゴヌクレオチド。

【請求項10】

前記ロックドヌクレオチドが、連続した順序で配置されていない、又は各ロックドヌクレオチドの後に、ロックドヌクレオチドではない少なくとも１つのヌクレオチドが続く、請求項１乃至請求項９のいずれか一項に記載のブロッキングオリゴヌクレオチド。

【請求項11】

前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは、３乃至１０、好ましくは３乃至６、及びより好ましくは４乃至５のロックドヌクレオチドを含む、請求項１乃至請求項１０のいずれか一項に記載のブロッキングオリゴヌクレオチド。

【請求項12】

前記ブロッキングオリゴヌクレオチドの前記５’末端ヌクレオチド配列に含まれる前記修飾リボヌクレオチド及び／又は前記３’末端ヌクレオチド配列に含まれる前記修飾リボヌクレオチドは、連続した順序で配置される、請求項６乃至請求項１１のいずれか一項に記載のブロッキングオリゴヌクレオチド。

【請求項13】

前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、４乃至２２、好ましくは４乃至１６、及びより好ましくは６乃至１０の修飾リボヌクレオチドを含む、請求項１乃至請求項１２のいずれか一項に記載のブロッキングオリゴヌクレオチド。

【請求項14】

前記修飾リボヌクレオチドが、２’－ｏ－メチルリボヌクレオチドである、請求項１乃至請求項１３のいずれか一項に記載のブロッキングオリゴヌクレオチド。

【請求項15】

前記ロックドヌクレオチドが、ＬＮＡ－アデニン、ＬＮＡ－グアニン、ＬＮＡ－シトシン、及びＬＮＡ－チミンからなる群から選択される、請求項１乃至請求項１４のいずれか一項に記載のブロッキングオリゴヌクレオチド。

【請求項16】

前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、その３’末端に修飾を含まない、請求項１乃至請求項１５のいずれか一項に記載のブロッキングオリゴヌクレオチド。

【請求項17】

前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、１６乃至２２ヌクレオチド長を有する、請求項１乃至請求項１６のいずれか一項に記載のブロッキングオリゴヌクレオチド。

【請求項18】

前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、不要なＲＮＡ分子の１４乃至２０ヌクレオチド、好ましくは１６乃至２２ヌクレオチドの領域に対して逆相補的である、請求項１乃至請求項１７のいずれか一項に記載のブロッキングオリゴヌクレオチド。

【請求項19】

前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、配列番号３４乃至配列番号６６及び配列番号１２３乃至配列番号１６９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する不要なＲＮＡ分子の少なくとも１領域に対して逆相補的である、請求項１乃至請求項１８のいずれか一項に記載のブロッキングオリゴヌクレオチド。

【請求項20】

前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、配列番号１乃至配列番号３３及び配列番号７６乃至配列番号１２２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項１乃至請求項１９のいずれか一項に記載のブロッキングオリゴヌクレオチド。

【請求項21】

請求項１乃至請求項２０のいずれか一項に記載の少なくとも２つのブロッキングオリゴヌクレオチドを含むセット。

【請求項22】

前記少なくとも２つのブロッキングオリゴヌクレオチドが、それらのヌクレオチド配列において互いに異なる、請求項２１に記載のセット。

【請求項23】

前記少なくとも２つのブロッキングオリゴヌクレオチドが、異なる不要なＲＮＡ分子の少なくとも１領域に対して逆相補的である、請求項２１又は請求項２２に記載のセット。

【請求項24】

逆転写中のＲＮＡサンプル中の１つ以上の不要なＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成を阻害する方法であって、：
（ｉ）１つ以上の所望のＲＮＡ分子及び１つ以上の不要なＲＮＡ分子を含むＲＮＡサンプル、ならびに請求項１乃至２０のいずれか一項に記載の１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチド（又は請求項２１乃至請求項２３のいずれか一項に記載のセットに含まれるブロッキングオリゴヌクレオチド）を含有する混合物を提供するステップであって、ここで
該１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドが、１つ以上の不要なＲＮＡ分子にアニーリングされるステップ、及び
（ｉｉ）１つ以上の所望のＲＮＡ分子を逆転写し、それによって前記所望のＲＮＡ分子から１つ以上のｃＤＮＡ産物を得、かつ１つ以上の不要なＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成を阻害するステップ、
を含む方法。

【請求項25】

逆転写中のＲＮＡサンプル中の１つ以上の所望のＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成の（ｃＤＮＡ合成を改善する）ための方法であって、：
（ｉ）１つ以上の所望のＲＮＡ分子及び１つ以上の不要なＲＮＡ分子を含むＲＮＡサンプル、ならびに請求項１乃至請求項２０のいずれか一項に記載の１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチド（又は請求項２１乃至請求項２３のいずれか一項に記載のセットに含まれるブロッキングオリゴヌクレオチド）を含有する混合物を提供するステップであって、ここで該１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドが１つ以上の不要なＲＮＡ分子にアニーリングされるステップ、及び
（ｉｉ）１つ以上の所望のＲＮＡ分子を逆転写し、それによって前記所望のＲＮＡ分子から１つ以上のｃＤＮＡ産物を得、かつ１つ以上の不要なＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成を阻害するステップ、
を含む、方法

【請求項26】

前記１つ以上の不要なＲＮＡ分子への、前記１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドのアニーリングが、前記混合物中に含有される前記１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチド及び１つ以上の不要なＲＮＡ分子を変性すること、及び続いて冷却することによって達成される、請求項２４又は請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記変性が、７５℃乃至９０℃で１乃至５分間行われる、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記冷却が、０．１乃至２℃／秒の速度で２０℃乃至３０℃で行われる、請求項２６又は請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記混合物が、１つ以上の所望のＲＮＡ分子及び１つ以上の不要なＲＮＡ分子を含むＲＮＡサンプルと、１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドと混合することにより、又は１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドと、１つ以上の所望のＲＮＡ分子及び１つ以上の不要なＲＮＡ分子を含むＲＮＡサンプルとを混合することにより生成されている、請求項２４乃至請求項２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記１つ以上の所望のＲＮＡ分子の逆転写が、
（ｉｉａ）逆転写（ＲＴ）プライマー用のプライマーを１つ以上の所望のＲＮＡ分子とアニーリングすること、及び
（ｉｉｂ）逆転写酵素（ＲＴ）を使用することによって、又は逆転写酵素（ＲＴ）とともに、１つ以上の所望のＲＮＡ分子を逆転写すること、
によって行われる、請求項２４乃至請求項２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記アニーリングが、２５乃至６０℃で１乃至１０分間、好ましくは３７乃至５６℃で３乃至６分間行われる、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記逆転写が、３７乃至７２℃で１乃至９０分間、好ましくは４０乃至６０℃で１０乃至３５分間行われる、請求項３０又は３１に記載の方法。

【請求項33】

前記逆転写酵素が、ＡＭＶ（鳥骨髄芽球症ウイルス）逆転写酵素、ＭｏＬＶ（モロニー
マウス白血病ウイルス）逆転写酵素、又はＴｔｈ（サーマス サーモピュラス）ＤＮＡポリメラーゼ及びそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項３０乃至請求項３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記ＲＴ－プライマーが、所望のＲＮＡ分子に対して逆相補的である、請求項３０乃至請求項３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記ＲＮＡサンプルが、生体サンプルであるか、又は生体サンプルから調製される、請求項２４乃至請求項３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記生体サンプルが、血液サンプルである、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記血液サンプルが、全血又は血液分画、好ましく血球、血清、又は血漿である、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記ＲＮＡサンプルが、全ＲＮＡを含む、請求項２４乃至請求項３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

１つ以上の所望のＲＮＡ分子から１つ以上の二本鎖ｃＤＮＡ産物を生成するための方法であって、
（ｉ）請求項２４乃至請求項３８のいずれか一項に記載の方法を行うステップ、及び
（ｉｉ）１つ以上のｃＤＮＡ産物を増幅し、それによって１つ以上の所望のＲＮＡ分子から１つ以上の二本鎖ｃＤＮＡ産物を生成するステップ、
を含む方法。

【請求項40】

前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して行われる、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記ＰＣＲが、リアルタイムＰＣＲ（定量的ＰＣＲ又はｑＰＣＲ）、好ましくはＴａｑ－ｍａｎ ｑＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ハイフィデリティＰＲ、ファストＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、及びＧＣ－リッチＰＣＲからなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記増幅が、フォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて行われる、請求項３９乃至請求項４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

増幅がＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる、請求項３９から４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ並びにそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

１つ以上の所望のＲＮＡ分子のプロファイルを決定する方法であって、
請求項３９乃至請求項４４のいずれか一項に記載の方法によって生成される１つ以上の所望のＲＮＡ分子からの１つ以上の二本鎖ｃＤＮＡ産物をシーケンシングするステップを含む、方法

【請求項46】

前記シーケンシングが次世代シーケンシング（ＮＧＳ）である、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記プロファイルが、前記１つ以上の所望のＲＮＡ分子の発現プロファイルである、請求項４５又は請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

逆転写中のＲＮＡサンプル中の不要なＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成を阻害するための、請求項１乃至請求項２０のいずれか一項に記載のブロッキングオリゴヌクレオチドの使用。

【請求項49】

逆転写中のＲＮＡサンプル中の不要なＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成を阻害するための、請求項２１乃至請求項２３のいずれか一項に記載の少なくとも２つのブロッキングオリゴヌクレオチドを含むセットの使用。

【請求項50】

請求項１乃至請求項２０のいずれか一項に記載の前記オリゴヌクレオチド、又は請求項２１乃至請求項２３のいずれか一項に記載の少なくとも２つのブロッキングオリゴヌクレオチドを含む前記セット、を含むキット

【請求項51】

前記キットが、逆転写酵素をさらに含む、請求項５０に記載のキット。

【請求項52】

前記逆転写酵素が、ＡＭＶ（鳥骨髄芽球症ウイルス）逆転写酵素、ＭｏＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）逆転写酵素、又はＴｔｈ（サーマス サーモピュラス）ＤＮＡポリメラーゼ及びそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項５１に記載のキット。

【請求項53】

前記キットが、逆転写を行うためのＲＴ－プライマー及び／又は緩衝液成分をさらに含む、請求項５０乃至請求項５２のいずれか一項に記載のキット。

【請求項54】

前記キットが、請求項２４乃至請求項３８のいずれか一項に記載の方法を行うため方法についての説明書をさらに含む、請求項５０乃至請求項５３のいずれか一項に記載のキット。

【請求項55】

前記キットが、請求項２４乃至請求項３８のいずれか一項に記載の方法を行うことができる、請求項５０乃至請求項５４のいずれか一項に記載のキット。

【請求項56】

前記キットが、ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項５０乃至請求項５５のいずれか一項に記載のキット。

【請求項57】

前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ並びにそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項５６に記載のキット。

【請求項58】

前記キットが、ＤＮＡ増幅を行うためのフォワード及びリバースプライマー及び／又は緩衝液成分をさらに含む、請求項５０乃至請求項５７のいずれか一項に記載のキット。

【請求項59】

前記キットが、請求項３９乃至請求項４４のいずれか一項に記載の方法を行う方法についての説明書をさらに含む、請求項５６乃至請求項５８のいずれか一項に記載のキット。

【請求項60】

前記キットが、請求項３９乃至請求項４４のいずれか一項に記載の方法を行うことができる、請求項５６乃至請求項５９のいずれか一項に記載のキット。

【請求項61】

前記キットが、シーケンシングのための手段をさらに含む、請求項５０乃至請求項６０のいずれか一項に記載のキット。

【請求項62】

前記キットが、請求項４５乃至請求項４７のいずれか一項に記載の方法を行う方法についての説明書をさらに含む、請求項６１に記載のキット。

【請求項63】

前記キットが、請求項４５乃至請求項４７のいずれか一項に記載の方法を行うことができる、請求項６１又は請求項６２に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ブロッキングオリゴヌクレオチド）を使用した逆転写の標的阻害に関する。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ブロッキングオリゴヌクレオチド）及び前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する方法が具体的に開示される。

【背景技術】

【0002】

ｍｉＲＮＡなどの低分子非コードＲＮＡは、その多様性及び特徴的な発現により、ヒトの疾患の診断に使用できる。例えば、ヒトの末梢血から分離された生体サンプル中の低分子非コードＲＮＡの複雑さを完全に網羅するため、及び潜在的なバイオマーカーの発見のためにこの情報を使用するために、ハイスループットの次世代シーケンシング（ＮＧＳ）などのシーケンシング用に低分子非コードＲＮＡをｃＤＮＡライブラリに変換する生化学的手法が採用されている。このライブラリ調製プロセスは、通常、酵素反応（ライゲーション、逆転写、重合）に基づいており、そして初期のＲＮＡサンプル内の低分子非コードＲＮＡの複雑さを公平かつ真実に表現することを目的としている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

次世代シーケンシング（ＮＧＳ）は、数百万の分子を並行してシーケンス（読み取り）する能力を通じて、生物学的機能について前例のない洞察を可能にした。サンプル内の定められた分子種に対応する読み取り数は、その相対的な存在量と相関する。これは、読み取りの大部分が割り当てられている少数の非常に豊富な種を含むサンプルでは問題となり、豊富ではない多数の種の正確な検出と定量化を妨げる。シーケンシングに前記の非常に豊富な種を含めると、読み取り深度が消費され、それによって無関係なデータが生成されると同時にシーケンシングのコストが増加する。

【0004】

同様に、特定の低分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ＲＮＡ）シーケンシングライブラリ調製キットは、特定のＲＮＡ種の偏った取り込みに非常に有利であり、量が少ない、又は取り込まれる効率が低い種を犠牲にして何度も読み取られることが観察されている。この偏りは、キットのコンポーネント（アダプターなど）とｍｉＲＮＡなどの特定の低分子ＲＮＡの分子間ペアリングによって引き起こされ、ライゲーション反応の好ましい基質であるＲＮＡ二本鎖構造の形成につながる。

【0005】

現在、一部のＲＮＡ ＮＧＳキットには、ライブラリプール内の非常に豊富なＲＮＡ種（ｒＲＮＡなど）の存在を阻害できるコンポーネントが含まれている。ただし、これらのキットはそれほど効果的ではない。さらに、前記キットは、非常に豊富なｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）、又はＹ－ＲＮＡ分子の存在を阻害することはできない。さらに、前記キットは、非常に豊富な低分子核小体リボ核酸（ｓｎｏＲＮＡ）、リボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）フラグメント、又はトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の存在を阻害することができない。

【0006】

したがって、改良されたキット及び方法論が依然として必要とされている。

【0007】

現在のキット及び方法論を改善するために、本発明者らは、新しいブロッキングオリゴヌクレオチド及び前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが使用される方法を開発した。このようにして、選択された任意の豊富な低分子ＲＮＡを標的にすることができ、その逆転写を阻害／防止することができ、その結果、ＮＧＳデータセットにおけるその存在を有意
に減少させることができる。したがって、それほど豊富でない低分子ＲＮＡ分子を、迅速、簡単かつコスト効率の高い方法で正確に検出及び定量することができる。

【課題を解決するための手段】

【0008】

第１の態様では、本発明は、１つ以上の修飾リボヌクレオチド及び／又は１つ以上のロックドヌクレオチドを含むブロッキングオリゴヌクレオチドに関する。

【0009】

第２の態様では、本発明は、第１の態様による少なくとも２つのブロッキングオリゴヌクレオチドを含むセットに関する。

【0010】

第３の態様では、本発明は、逆転写中のＲＮＡサンプル中の１つ以上の不要なＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成を阻害する方法であって、
（ｉ）１つ以上の所望のＲＮＡ分子及び１つ以上の不要なＲＮＡ分子、ならびに第１の態様による１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチド（又は、第２の態様によるセットに含まれるブロッキングオリゴヌクレオチド）を含むＲＮＡサンプルを含む混合物を提供するステップであって、ここで、１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドが１つ以上の不要なＲＮＡ分子にアニーリングされるステップ、及び
（ｉｉ）１つ以上の所望のＲＮＡ分子を逆転写し、それによって前記所望のＲＮＡ分子から１つ以上のｃＤＮＡ産物を得、かつ１つ以上の不要なＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成を阻害するステップ、
を含む方法に関する。

【0011】

第４の態様では、本発明は、逆転写中のＲＮＡサンプル中の１つ以上の所望のＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成の（を改善する）ための方法であって、
（ｉ）１つ以上の所望のＲＮＡ分子及び１つ以上の不要なＲＮＡ分子を含むＲＮＡサンプル、ならびに第１の態様による１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチド（又は第２の態様によるセットに含まれるブロッキングオリゴヌクレオチド）を含有する混合物を提供するステップであって、ここで、１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドが１つ以上の不要なＲＮＡ分子にアニーリングされるステップ、及び
（ｉｉ）１つ以上の所望のＲＮＡ分子を逆転写し、それによって前記所望のＲＮＡ分子から１つ以上のｃＤＮＡ産物を得、かつ１つ以上の不要なＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成を阻害するステップ、
を含む方法に関する。

【0012】

第５の態様では、本発明は、１つ以上の所望のＲＮＡ分子から１つ以上の二本鎖ｃＤＮＡ産物を生成する方法であって、
（ｉ）第３又は第４の態様による方法を行うステップ、及び
（ｉｉ）１つ以上のｃＤＮＡ産物を増幅し、それによって１つ以上の所望のＲＮＡ分子から１つ以上の二本鎖ｃＤＮＡ産物を生成するステップ、
を含む方法に関する。

【0013】

第６の態様では、本発明は、１つ以上の所望のＲＮＡ分子のプロファイルを決定するための方法であって、第５の態様による方法によって産生される１つ以上の所望のＲＮＡ分子からの１つ以上の二本鎖ｃＤＮＡ産物をシーケンシングするステップを含む方法に関する。

【0014】

第７の態様では、本発明は、逆転写中のＲＮＡサンプル中の不要なＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成を阻害するための、第１の態様によるブロッキングオリゴヌクレオチドの使用に関する。

【0015】

第８の態様では、本発明は、逆転写中のＲＮＡサンプル中の不要なＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成を阻害するための、第２の態様によるオリゴヌクレオチドのセットの使用に関する。

【0016】

第９の態様では、本発明は、第１の態様によるオリゴヌクレオチド、又は第２の態様による少なくとも２つのブロッキングオリゴヌクレオチドを含むセット、を含むキットに関する。

【0017】

本発明の概要は、必ずしも本発明のすべての特徴を説明するものではない。 他の実施形態は、以下の詳細な説明を検討することにより明らかになるであろう。

【0018】

発明の詳細な説明
定義
本発明を以下に詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル及び試薬に限定されず、これらは変化し得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことも理解されたい。他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

【0019】

好ましくは、本明細書で使用される用語は、「バイオテクノロジー用語の多言語用語集：（ＩＵＰＡＣ勧告）」、Leuenberger, H.G.W、Nagel, B. 及び Kolbl, H. 編 (1995)、Helvetica Chimica Acta、CH-4010 バーゼル、スイス、に記載されているように定義される。

【0020】

この明細書の本文全体を通じていくつかの文書が引用されている。本明細書で引用される各文書（すべての特許、特許出願、科学出版物、製造業者の仕様書、説明書、GenBank Accession Number sequence submissionsなどを含む）は、上記であろうと下記であろうと、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本発明が先願発明のおかげでそのような開示に先立つ権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。そのような組み込まれた参考文献の定義又は教示と、本明細書に記載される定義又は教示との間に矛盾がある場合には、本明細書の本文が優先する。

【0021】

本発明による、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、定められた整数又は整数のグループを含むことを意味するが、他の整数又は整数のグループを除外することを意味するものではない。本発明による「本質的に構成される」という用語は、定められた整数又は整数のグループを含むことを意味するが、定められた整数に重大な影響又は変更を及ぼす修飾又は他の整数は除外される。本発明による「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語又は「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」などの変形は、定められた整数又は整数のグループを含めること、及び他の整数又は整数のグループを除外することを意味する。

【0022】

本発明の説明の文脈（特に特許請求の範囲の文脈）で使用される「ａ」及び「ａｎ」並びに「ｔｈｅ」という用語、及び同様の参照は、本明細書で別段の指示がある場合、又は文脈と明らかに矛盾する場合をのぞき、単数形と複数形の両方を包含するものと解釈されるべきである。

【0023】

本明細書で使用する「ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシドとリン酸塩からなる有機分子を指す。特に、ヌクレオチドは、核酸塩基、五炭糖（リボース又はデオキシリボ
ース）、及び１乃至３個のリン酸塩からなるリン酸基である３つのサブユニット分子で構成されている。ＤＮＡ内の４つの核酸塩基は、グアニン、アデニン、シトシン、チミンである。ＲＮＡでは、チミンの代わりにウラシルが使用される。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド酸（ＤＮＡ）又はリボヌクレオチド酸（ＲＮＡ）などの核酸ポリマーのモノマー単位として機能する。したがって、ヌクレオチドはＤＮＡとＲＮＡの分子構成単位である。

【0024】

本明細書で使用される「ヌクレオシド」という用語は、リン酸基を有さないヌクレオチドと考えることができるグリコシルアミンを指す。ヌクレオシドは、単純に核酸塩基（窒素塩基とも呼ばれる）及び五炭糖（リボース又は２’－デオキシリボース）で構成されるが、ヌクレオチドは核酸塩基、五炭糖、及び１つ以上のリン酸基で構成される。ヌクレオシドでは、アノマー炭素は、グリコシド結合を介してプリンのＮ９又はピリミジンのＮ１に結合する。

【0025】

本明細書で使用される「ヌクレオチド配列」という用語は、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合連結によって連結された２’－デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）及びリボヌクレオチド（ＲＮＡ）、又はヌクレオチド間類似体（アナログ）、及び例えばＨ^＋、ＮＨ_４ ^＋、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ^２＋、Ｎａ^＋などの関連する対イオンを含むが、これらに限定されない、一連の一本鎖又は二本鎖ヌクレオチドモノマーのストレッチを指す。ヌクレオチド配列は、デオキシリボヌクレオチドだけ、リボヌクレオチドだけ、又はそれらのキメラ混合物から構成され得、ヌクレオチド類似体を含み得る。本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、好ましくは少なくとも２３ヌクレオチド長を有するヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、好ましくは、２乃至２２ヌクレオチド長を有するヌクレオチド配列を指す。本発明のブロッキングオリゴヌクレオチドは、好ましくは、１６乃至２２、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２ヌクレオチドを包含する。ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドだけ、リボヌクレオチドだけ、又はそれらのキメラ混合物から構成され得、ヌクレオチド類似体を含み得る。

【0026】

ヌクレオチドモノマー単位は、ヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載のヌクレオチドのいずれかを含み得る。

【0027】

本明細書で使用される「ヌクレオチド類似体」という用語は、修飾された塩基部分、修飾された糖部分、及び／又は修飾されたリン酸エステル部分を有する合成類似体が含まれる。リン酸塩類似体は、一般に、リン原子が＋５酸化状態にあり、及び１つ以上の酸素原子が非酸素部分（例えば、硫黄原子）で置換されているリン酸塩の類似体を含む。例示的なリン酸塩類似体は、結合対イオン（例えば、Ｈ^＋、ＮＨ^４＋、Ｎａ^＋など）を含む、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニリデート、ホスホルアミデート、ボロノホスフェートを含む。例示的な塩基類似体は、２，６－ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、Ｃ－５－プロピン、イソシトシン、イソグアニン、２－チオピリミジンを含む。例示的な糖類似体は、２’位又は３’位が水素、ヒドロキシ、アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ及びフェノキシ）、アジド、アミノ又はアルキルアミノ、フルオロ、クロロ、及びブロモである、２’－又は３’－修飾を含む。

【0028】

一実施形態では、１つ以上の修飾リボヌクレオチドが、本発明のブロッキングオリゴヌクレオチド中に／その一部に存在する。特に、１つ以上の修飾リボヌクレオチドは２’－ｏ－メチルリボヌクレオチドである。

【0029】

本明細書で使用される「ブロッキングオリゴヌクレオチド」という用語は、不要なＲＮＡ分子の少なくとも１領域に対して逆相補的であるオリゴヌクレオチドを指す。特定の一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、不要なＲＮＡ分子（のコア構造）の全長に対して逆相補的である。

【0030】

本明細書で使用される「コア配列」という用語は、すべてのＲＮＡ分子（例えば、不要なｍｉＲＮＡ分子及びこの不要なｍｉＲＮＡ分子に属するすべてのｉｓｏｍｉＲ分子）に共通する領域を指すが、これらのｉｓｏｍｉＲは、典型的には、排他的ではないが、最端の５’位もしくは３’位、又はその両方におけるヌクレオチド配列の変化により不要なｍｉＲＮＡ配列とは異なる。「コア配列」又は「コア領域」という用語は、本明細書では互換的に使用される。

【0031】

本明細書で使用される「ブロッキングオリゴヌクレオチド」という用語は、さらに、不要なＲＮＡ分子の領域に安定に結合することができるオリゴヌクレオチドを指す。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、不要なＲＮＡ分子の領域を「標的」と表現される場合がある。この「標的」により、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、不要なＲＮＡ分子の（コア配列）領域を使用してｃＤＮＡ合成を阻害することができる。逆転写酵素はテンプレート（鋳型）として一本鎖ＲＮＡ分子を必要とするため、不要なＲＮＡ分子とブロッキングオリゴヌクレオチドの間に形成された二重鎖により、逆転写反応が非効率になる。

【0032】

オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡ分子の領域にアニーリングし、ＲＮＡ分子を含むＲＮＡサンプルの逆転写中にＲＮＡ分子の領域に結合したままである場合、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ分子の領域に安定に結合することができる。本発明のブロッキングオリゴヌクレオチドは、同じ配列を有するが１つ以上の修飾リボヌクレオチド及び／又は１つ以上のロックドヌクレオチドを有さないオリゴヌクレオチドと比較して、オリゴヌクレオチドと不要なＲＮＡ分子の（コア）領域との間の結合を増加させる、１つ以上の修飾リボヌクレオチド及び／又は１つ以上のロックドヌクレオチドを含む。

【0033】

ブロッキングオリゴヌクレオチドに含まれる１つ以上修飾リボヌクレオチド及び／又は１つ以上のロックドヌクレオチドは、それらが１つ以上の修飾リボヌクレオチド及び／又は１つ以上のロックドヌクレオチドを含むブロッキングオリゴヌクレオチドと、不要なＲＮＡ分子の領域との間に形成される二重鎖の融解温度（Ｔｍ）を、同じ条件で測定された、同じ配列を有するが、１つ以上の修飾リボヌクレオチド及び／又は１つ以上のロックドヌクレオチドを有さないオリゴヌクレオチドと、不要なＲＮＡ分子の（コア）領域との間に形成された二重鎖の融解温度（Ｔｍ）と比較して上昇させる場合、同一の配列を有するが、１つ以上の修飾リボヌクレオチド及び／又は１つ以上のロックドヌクレオチドを有さないオリゴヌクレオチドと比較して、ブロッキングオリゴヌクレオチドと、不要なＲＮＡ分子の（コア）領域との間の結合を増加させる。

【0034】

本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、オリゴヌクレオチドの５０％がその完全相補体と二重鎖を形成し、５０％が遊離する温度である。Ｔｍは、温度の関数としてオリゴヌクレオチドとその相補体の吸光度変化を測定すること（すなわち、融解曲線を作成すること）によって決定される。Ｔｍは、融解曲線における二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡプラトーの間の中間の読み取り値である。本明細書に記載されているブロッキングオリゴヌクレオチドと、ブロッキングオリゴヌクレオチドが逆相補的である不要なＲＮＡ分子の領域との間に形成される二重鎖のＴｍは、Ｔｍを推定するために設計された自由に入手可能なオンラインツールによって予測されるように、４０乃至８５℃、好ましくは６０乃至７５℃の範囲である。

【0035】

ブロッキングオリゴヌクレオチドが逆相補的である不要なＲＮＡ種の（コア）領域は、
少なくとも１０ヌクレオチド長（少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１ヌクレオチド長又は２２ヌクレオチド長など）であり得る。このような領域は、例えば最大３０ヌクレオチド長（最大３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、又は２２ヌクレオチド長など）であり得る。１つの好ましい実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、不要なＲＡＮ分子の１４乃至２０ヌクレオチド長（例えば、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２ヌクレオチド長）の（コア）領域、に対して逆相補的である。１つのより好ましい実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、不要なＲＮＡ分子の１６乃至２２ヌクレオチド長（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２ヌクレオチド長）の（コア）領域、に対して逆相補的である。

【0036】

本明細書で使用される「ロックドヌクレオチド（ＬＮＡ）」という用語は、例えば、リボースの２’－Ｏ原子と４’－Ｃ原子がメチレン架橋を介して結合しているデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドを指す。この追加の架橋は、環に通常関連する柔軟性を制限し、本質的に構造を硬い構造に固定する。これらの核酸類似体は、一部の分野では「アクセス不可能なヌクレオチド」とも呼ばれる。ＬＮＡヌクレオチドは、ポリヌクレオチド／オリゴヌクレオチド中のＤＮＡ又はＲＮＡ残基と混合することができ、実際には、ワトソン－クリック塩基対ルールに従ってＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズする。これらの分子の柔軟性のない性質は、ハイブリダイゼーションの安定性を大幅に向上させる。具体的には、ロックされたリボース構造は塩基スタッキングと骨格の事前組織化を強化し、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性（融解温度）を大幅に上昇させる。さらに、ＬＮＡを含むポリヌクレオチド／オリゴヌクレオチドは、非常に大きな識別力を提供し、これらの分子が正確に一致する相補的標的配列と不一致の相補的標的配列を、ほとんど困難なく区別することを可能にする。二本鎖融解温度の上昇は、本明細書に記載のブロッキングオリゴヌクレオチドに組み込まれた場合、ＬＮＡヌクレオチド当たり２乃至８℃、好ましくは４乃至６℃であり得る。１つ以上のＬＮＡヌクレオチドを含むＤＮＡ又はＲＮＡオリゴヌクレオチドは、「ＬＮＡオリゴヌクレオチド」と称することもできる。

【0037】

一実施形態では、１つ以上のロックドヌクレオチドが、本発明のブロッキングオリゴヌクレオチド内／その一部に存在する。 特に、１つ以上のロックドヌクレオチドは、ＬＮＡ－リボヌクレオチド又はＬＮＡ－デオキシリボヌクレオチドである。より具体的には、１つ以上のロックドヌクレオチドは、ＬＮＡ－アデニン、ＬＮＡ－グアニン、ＬＮＡ－シトシン、及びＬＮＡ－チミンからなる群から選択される。

【0038】

１つの他の実施形態では、１つ以上の修飾リボヌクレオチドが、本発明のブロッキングオリゴヌクレオチド内／その一部に存在する。特に、1つ以上の修飾リボヌクレオチドは２’－ｏ－メチルリボヌクレオチドである。

【0039】

１つの好ましい実施形態では、１つ以上の修飾リボヌクレオチド及び／又は１つ以上のロックドヌクレオチドが、本発明のブロッキングオリゴヌクレオチド内／その一部に存在する。特に、１つ以上の修飾リボヌクレオチドは２’－ｏ－メチルリボヌクレオチドであり、かつ／又は１つ以上のロックドヌクレオチドはＬＮＡ－リボヌクレオチドもしくはＬＮＡ－デオキシリボヌクレオチドである。より具体的には、１つ以上のロックドヌクレオチドは、ＬＮＡ－アデニン、ＬＮＡ－グアニン、ＬＮＡ－シトシン、及びＬＮＡ－チミンからなる群から選択される。

【0040】

本明細書で使用される「修飾リボヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドの天然に存在する、又は合成された化学修飾を指す。好ましい一実施形態では、修飾リボヌクレオチドは２’－ｏ－メチルリボヌクレオチドである。ブロッキングオリゴヌクレオチド
に組み込まれた場合、２’－ｏ－メチルリボヌクレオチド当たり、１乃至８℃、好ましくは３乃至５℃の二本鎖融解温度の上昇が達成できる。

【0041】

本明細書で使用する「不要なＲＮＡ分子」という用語は、ＲＮＡ組成物又はサンプルの所与の下流操作又は分析のために、最初のＲＮＡ組成物又はサンプル中の望ましくないＲＮＡ分子を指す。このようなＲＮＡ分子は、下流の操作又は分析の標的ではないが、干渉する可能性がある。不要なＲＮＡ分子は、最初のＲＮＡ組成物又はサンプル中に存在する任意の望ましくないＲＮＡ分子であり得る。不要なＲＮＡ分子は、ブロッキングオリゴヌクレオチドの配列特異的設計を可能にするために、それらが目的の残りのＲＮＡ集団（すなわち、所望の／必要なＲＮＡ分子）からそれらの配列によって区別可能である限り、任意の配列を有するか、又は含むことができる。

【0042】

上で述べたように、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）は、数百万の分子を並行してシーケンス（読み取り）する能力により、生物学的機能についての前例のない洞察を可能にした。サンプル内の特定の分子種に対応する読み取り数は、その相対的な存在量と相関する。これは、読み取りの大部分が割り当てられている少数の非常に豊富な種を含むサンプルでは問題となり、多数のそれほど豊富ではない種の正確な検出と定量化を妨げる。シーケシングに前記の非常に豊富な種を含めると読み取り深度が消費され、それによって無関係なデータが生成されると同時にシーケシングのコストが増加する。

【0043】

したがって、好ましい一実施形態では、不要なＲＮＡ分子は、豊富なＲＮＡ分子である。本明細書で使用される「豊富なＲＮＡ分子」という用語は、低分子ＲＮＡＮＧＳ実験において処理された読み取りの合計の０．０５％を超えて消費するＲＮＡ実体（ｅｎｔｉｔｉｅｓ）を指す。当業者は、例えばＮＧＳ実験で、ＲＮＡ分子の存在量を決定することができる。より好ましい一実施形態では、不要なＲＮＡ分子は、２００リボヌクレオチド未満の長さを有する豊富な非コードＲＮＡ分子である。

【0044】

さらにより好ましい一実施形態では、不要なＲＮＡ分子は、豊富なｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）、Ｙ－ＲＮＡ、又はＹ－ＲＮＡフラグメント（Ｙ－ＲＮＡフラグメントは完全長Ｙ－ＲＮＡではない）である。あるいは、不要なＲＮＡ分子は、豊富な低分子核小体リボ核酸（ｓｎｏＲＮＡ）、リボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）フラグメント（ｒＲＮＡフラグメントは完全長ｒＲＮＡではない）、又はトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）である。具体的には、不要なＲＮＡ分子は、豊富なｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）、Ｙ－ＲＮＡ、Ｙ－ＲＮＡフラグメント（Ｙ－ＲＮＡフラグメントは完全長Ｙ－ＲＮＡではない）、ｓｎｏＲＮＡ、ｒＲＮＡフラグメント（ｒＲＮＡフラグメントは完全長ｒＲＮＡではない）、及び／又はｔＲＮＡである。

【0045】

本明細書で使用される「豊富なｍｉＲＮＡ」又は「豊富なｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）」という用語は、低分子ＲＮＡ ＮＧＳ実験において全処理された読み取りの０．０５％を超えて消費するｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）実体を指す。当業者は、例えばＮＧＳ実験で、ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）の存在量を決定することができる。

【0046】

本明細書で使用される「豊富なＹ－ＲＮＡ又はそのフラグメント」という用語は、低分子ＲＮＡ ＮＧＳ実験からの全処理された読み取りの０．０５％を超えて消費するＹ－ＲＮＡ又はＹ－ＲＮＡフラグメント実体を指す。当業者は、例えばＮＧＳ実験で、Ｙ－ＲＮＡ又はそのフラグメントの存在量を決定することができる。

【0047】

本明細書で使用される「豊富なｓｎｏＲＮＡ」という用語は、低分子ＲＮＡ ＮＧＳ実験からの全処理された読み取りの０．０５％を超えて消費するｓｎｏＲＮＡ実体を指す。
当業者は、例えばＮＧＳ実験で、ｓｎｏＲＮＡの存在量を決定することができる。

【0048】

本明細書で使用される「豊富なｒＲＮＡフラグメント」という用語は、低分子ＲＮＡ ＮＧＳ実験からの全処理された読み取りの０．０５％を超えて消費するｒＲＮＡ実体を指す。当業者は、例えばＮＧＳ実験で、ｒＲＮＡフラグメントの存在量を決定することができる。

【0049】

本明細書で使用される「豊富なｔＲＮＡ」という用語は、低分子ＲＮＡ ＮＧＳ実験からの全処理された読み取りの０．０５％を超えて消費するｔＲＮＡ実体を指す。当業者は、例えばＮＧＳ実験で、ｔＲＮＡの存在量を決定することができる。最も好ましい一実施形態では、不要なＲＮＡ分子は、豊富なｍｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）である。

【0050】

本発明者らは、新しいブロッキングオリゴヌクレオチド及び前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが使用される方法を開発した。このようにして、選択した豊富な低分子ＲＮＡを標的にすることができ、かつその逆転写を阻害／防止することができ、結果的にＮＧＳ
データセットにおけるその存在を大幅に減少させることがでる。したがって、それほど豊富ではない低分子ＲＮＡ種は、迅速、簡単かつコスト効率の高い方法で正確に検出及び定量できる。

【0051】

本明細書で使用される「所望のＲＮＡ分子」という用語は、ＲＮＡ組成物又はサンプルの所与の下流操作又は分析のために、初期ＲＮＡ組成物又はサンプルにおいて所望されるＲＮＡ分子を指す。不要なＲＮＡ分子に加えて、ＲＮＡサンプルには１つ以上の所望のＲＮＡ分子も含まれている。所望のＲＮＡ分子は、その特徴（例えば、発現レベル又は配列）に関心のあつまる任意のＲＮＡ分子であり得る。特定の実施形態では、所望のＲＮＡ分子は、（参照発現レベルと比較された）発現レベル変化又は（野生型配列と比較された）配列変化が、疾患もしくは障害、又は疾患もしくは障害の治療に対する反応性と関連するＲＮＡ分子を含む。

【0052】

上で述べたように、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）は、並行して数百万の分子をシーケンス（読み取り）する能力により、生物学的機能についての前例のない洞察を可能にした。サンプル内の所与の分子種に対応する読み取り数は、その相対的な存在量と相関する。これは、読み取りの大部分が割り当てられている少数の非常に豊富な種を含有するサンプルでは問題となり、多数のあまり豊富ではない種の正確な検出及び定量化を妨げる。

【0053】

したがって、好ましい一実施形態では、所望のＲＮＡ分子は、あまり豊富ではないＲＮＡ分子である。本明細書で使用する「あまり豊富ではないＲＮＡ分子」という用語は、低分子ＲＮＡ ＮＧＳ実験において全処理された読み取りの総量の０．０５％以下を消費するＲＮＡ実体を指す。当業者は、例えばＮＧＳ実験で、ＲＮＡ分子の存在量を決定することができる。

【0054】

より好ましい一実施形態では、所望のＲＮＡ分子は、２００リボヌクレオチド未満の長さを有する、あまり豊富ではない非コードＲＮＡ分子である。

【0055】

さらにより好ましい一実施形態では、所望のＲＮＡ分子は、それほど豊富でないｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）、Ｙ－ＲＮＡ、又はＹ－ＲＮＡフラグメント（Ｙ－ＲＮＡフラグメントは完全長Ｙ－ＲＮＡではない）である。あるいは、所望のＲＮＡ分子は、あまり豊富ではない低分子核小体リボ核酸（ｓｎｏＲＮＡ）、リボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）フラグメント（ｒＲＮＡフラグメントは完全長ｒＲＮＡではない）、又はトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）である。具体的には、所望のＲＮＡ分子は、
あまり豊富ではないｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）、Ｙ－ＲＮＡ、Ｙ－ＲＮＡフラグメント（Ｙ－ＲＮＡフラグメントは完全長Ｙ－ＲＮＡではない）、ｓｎｏＲＮＡ、ｒＲＮＡフラグメント（ｒＲＮＡフラグメントは完全長ｒＲＮＡではない）、及び／又はｔＲＮＡである。

【0056】

本明細書で使用される「あまり豊富ではないｍｉＲＮＡ」又は「あまり豊富ではないｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）」という用語は、低分子ＲＮＡ ＮＧＳ実験における全処理された読み取りの０．０５％以下を消費するｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）実体を指す。当業者は、例えばＮＧＳ実験で、ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）の存在量を決定することができる。本明細書で使用される「あまり豊富ではないＹ－ＲＮＡ又はそのフラグメント」という用語は、低分子ＲＮＡ ＮＧＳ実験からの全処理された読み取りの０．０５％以下を消費するＹ－ＲＮＡ又はＹ－ＲＮＡフラグメント実体を指す。当業者は、例えばＮＧＳ実験で、Ｙ－ＲＮＡ又はそのフラグメントの存在量を決定することができる。

【0057】

本明細書で使用される「あまり豊富ではないｓｎｏＲＮＡ」という用語は、低分子ＲＮＡ ＮＧＳ実験からの全処理された読み取りの０．０５％以下を消費するｓｎｏＲＮＡ実体を指す。当業者は、例えばＮＧＳ実験で、ｓｎｏＲＮＡの存在量を決定することができる。
本明細書で使用される「あまり豊富ではないｒＲＮＡフラグメント」という用語は、低分子ＲＮＡ ＮＧＳ実験からの全処理された読み取りの０．０５％以下を消費するｒＲＮＡフラグメント実体を指す。当業者は、例えばＮＧＳ実験で、ｒＲＮＡフラグメントの存在量を決定することができる。

【0058】

本明細書で使用される「あまり豊富ではないｔＲＮＡ」という用語は、低分子ＲＮＡ ＮＧＳ実験からの全処理された読み取りの０．０５％以下を消費するｔＲＮＡ実体を指す。当業者は、例えばＮＧＳ実験で、ｔＲＮＡの存在量を決定することができる。
さらにより好ましい一実施形態では、所望のＲＮＡ分子は、それほど豊富でないｍｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）である。

【0059】

本発明者らは、新しいブロッキングオリゴヌクレオチド及び前記ブロッキングオリゴヌクレオチドを使用する方法を開発した。このようにして、選択した任意の豊富な低分子ＲＮＡを標的にすることができ、その逆転写を阻害／防止することができ、結果的にＮＧＳデータセットにおけるその存在を大幅に減少させることができる。したがって、あまり豊富ではない低分子ＲＮＡ種を、迅速、簡単かつコスト効率の高い方法で正確に検出及び定量することができる。

【0060】

最も好ましい一実施形態では、豊富なＲＮＡ分子は、ｍｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）であり、かつあまり豊富ではないＲＮＡ分子は、ｍｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）であり、ここで、豊富なＲＮＡ分子又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）、及びあまり豊富ではないｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）は、互いに異なるか／異なる種である。

【0061】

本明細書で使用される「ＲＮＡサンプル」という用語は、ＲＮＡ含有サンプルを指す。具体的には、ＲＮＡサンプルは、生体サンプルなどの出発物質であり得る。あるいは、ＲＮＡサンプルは、生体サンプルなどの出発物質から単離されたＲＮＡを含有するサンプルであってもよい。ＲＮＡサンプルには、出発物質から単離されたＤＮＡをさらに含有し得る。他の場合には、ＲＮＡサンプルは、特異的な核酸の単離をせずに直接溶解されたサンプルに由来する。ＲＮＡサンプルを生成する出発物質は、ＲＮＡ分子を含む任意の物質で
あり得る。出発物質は、細胞サンプル、環境サンプル、身体から得られたサンプル、特に体液サンプル、及びヒト、動物又は植物の組織サンプルなどの生体サンプル又は物質であり得る。生体サンプルの具体例は、全血、血漿、血清もしくは血球（例えば、赤血球、白血球及び／又は血小板）などの血液画分、尿、痰、唾液、精液、リンパ液、羊水、脳脊髄液、腹水、胸水、嚢胞からの液体、滑液、硝子体液、房水、滑液包液、洗眼液、目の吸引液、肺洗浄、骨髄穿刺液、肺吸引液、生検サンプル、綿棒サンプル、動物（ヒトを含む）又は植物組織（肝臓、脾臓、腎臓、肺、腸、脳、心臓、筋肉、膵臓、細胞培養物からのサンプル、ならびにライセート、抽出物又は上記に記載のサンプル又は任意の細胞、及びサンプル上又はサンプル中に存在し得る微生物及びウイルスから得られる物質及び分画を含むが、これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。

【0062】

ＲＮＡを含有する、臨床現場又は法医学現場から得られた物質も、出発物質の意図された意味に含まれる。

【0063】

好ましくは、生体サンプルは血液サンプルである。より好ましくは、血液サンプルは、全血、又は血漿、血清、又は血球（例えば、赤血球、白血球及び／又は血小板）などの血液画分である。特に、上記の生体サンプルは、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）、Ｙ－ＲＮＡ、及び／又はＹ－ＲＮＡフラグメントを包含する。あるいは、上記の生体サンプルは、ｓｎｏＲＮＡ、ｒＲＮＡフラグメント、及び／又はｔＲＮＡを包含する。より具体的には、上記の生体サンプルは、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）、Ｙ－ＲＮＡ、Ｙ－ＲＮＡフラグメント、ｓｎｏＲＮＡ、ｒＲＮＡフラグメント、及び／又はｔＲＮＡを包含する。

【0064】

全血サンプルは採血管を用いて採取することができる。 それは、例えば、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡチューブ、Ｔｅｍｐｕｓ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡチューブ、ＥＤＴＡチューブ、クエン酸Ｎａチューブ、ヘパリンチューブ、又はＡＣＤチューブ（クエン酸デキストロース）中に採取される。

【0065】

全血サンプルは、例えばＭｉｔｒａマイクロサンプリングデバイスを使用するブラッドスポット法などによって採取することもできる。この技術は、より少ないサンプル量、人間の場合は通常４５乃至６０μＬ以下を要求する。例えば、全血は、針又はランセットを指に刺すことによって患者から抽出され得る。したがって、全血サンプルは、血液滴の形態を有し得る。次いで、前記血液滴は、吸収性プローブ（例えば、全血を吸収できるセルロースなどの親水性ポリマー材料）上に置かれる。サンプリングが完了すると、血液スポットは、処理のために研究室に移送又は郵送される前に、空気中で乾燥される。血液は乾燥しているので、それは危険とは考えられない。したがって、取り扱いや輸送の際に特別な注意を払う必要はない。分析サイトに到着すると、必要な成分（例えば、ｍｉＲＮＡ）が、乾燥血液スポットから上清に抽出され、さらに分析される。

【0066】

核酸は、ＲＮＡサンプルを提供するために、当技術分野で知られている方法に従って出発物質から単離され得る。ＲＮＡサンプルは、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方を含有し得る。特定の実施形態では、出発物質中のＤＮＡが除去又は分解されているため、ＲＮＡサンプルは主にＲＮＡを含む。ＲＮＡサンプル中のＲＮＡは、出発物質から単離された全ＲＮＡであり得る。あるいは、ＲＮＡサンプル中のＲＮＡは、特定のＲＮＡ分子が枯渇又は除去された出発物質から単離された全ＲＮＡのフラクション（例えば、ｍｉＲＮＡ又はｉｓｏｍｉＲを含むフラクション）であり得る。特定の実施形態では、ＲＮＡサンプルは、特定の核酸の単離又は分離が実行されていない生体サンプルである。

【0067】

特に、ＲＮＡサンプルは、必要な／不要なＲＮＡ分子としてｍｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）を包含する。前記ｍｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮ
Ａアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）は、一本鎖ＲＮＡ分子として存在し得る。前記ｍｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）はまた、生化学反応後にアダプター分子に付着／連結／隣接して存在し得る。特に、アダプター分子は、ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）の５’末端に連結され（５’アダプター）、及びｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）の３’末端に連結される（３’アダプター）。言い換えれば、必要な／不要なＲＮＡ分子としてのｍｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）は、５’アダプター分子及び３’アダプター分子に隣接されている。ｍｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）の５’末端及び３’末端にあるアダプターは、ｃＤＮＡ合成のためのテンプレートとして使用できる連結されたＲＮＡ分子の形成を可能にする。このようにして、ｍｉＲＮＡだけでなく、そのバリアント（即ち、ｉｓｏｍｉＲ）も検出でき、そして、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、ｃＤＮＡライブラリ構築、及び多様な診断方法などの種々の分子技術が向上する。

【0068】

上述したように、不要なＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成は、不要なＲＮＡ分子にアニーリングし、それによって逆転写を防止する本発明のブロッキングオリゴヌクレオチドが原因で阻害される。

【0069】

「不要なＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成の阻害」とは、逆転写中にテンプレートとして不要なＲＮＡ分子を使用して生成される一本鎖又は二本鎖ｃＤＮＡの量が、参照条件化（例えば、１つ以上の修飾リボヌクレオチド及び／又は１つ以上のロックドヌクレオチドを含むブロッキングオリゴヌクレオチドが存在しない場合）での逆転写中に生成される一本鎖又は二本鎖ｃＤＮＡの量と比較して、修正条件下（例えば、１つ以上の修飾リボヌクレオチド及び／又は１つ以上のロックドヌクレオチドを含むブロッキングオリゴヌクレオチドが存在する場合）では統計的に有意な程度で減少する。合成されたｃＤＮＡの量の減少は、本明細書に開示されるように、ｑＰＣＲ又はトランスクリプトームシーケシングを使用して測定され得る。特に、不要なＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又はさらに１００％まで阻害される。

【0070】

言い換えれば、不要なＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成の阻害の原理は、逆転写酵素の処理能力を阻害、減速、又は停止させる高い融解温度を有するオリゴ標的ＲＮＡ二本鎖構造を形成することである。

【0071】

不要なＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成の阻害は、不要なＲＮＡ分子の枯渇と呼ばれることがある。不要なＲＮＡ分子が最初のＲＮＡサンプルから物理的に除去されていなくても、最初のＲＮＡサンプルの下流の操作又は分析における不要なＲＮＡ分子の関与は、不要なＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成の阻害により減少又は排除される。

【0072】

本明細書で使用される「ｍｉＲＮＡ」（「ｍｉｃｒｏＲＮＡ」と称することもできる）という用語は、一本鎖ＲＮＡ分子を指す。ｍｉＲＮＡは、１０乃至５０ヌクレオチド長（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０ヌクレオチド長）の分子であり得るが、任意の標識及び／又は伸長配列（例えば、ビオチンストレッチ）を含まない。

【0073】

ｍｉＲＮＡは、遺伝子発現を調節し、かつそのＤＮＡから転写される遺伝子によってコードされるが、ｍｉＲＮＡは、タンパク質には翻訳されない（即ち、ｍｉＲＮＡは、非コードＲＮＡである）。ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子は、処理された成熟ｍｉＲＮＡ分子
よりも長い。ｍｉＲＮＡは最初、一次ｍｉＲＮＡ転写物（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）と呼ばれるより長い前駆体分子（＞１０００ヌクレオチド長）として転写されます。Ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、（マイクロプロセッサー複合体の一部として）Ｄｒｏｓｈａ酵素によって処理されるヘアピン構造を有している。Ｄｒｏｓｈａプロセシング後、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、わずか６０乃至１００ヌクレオチド長であり、かつ前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる。この時点で、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、細胞質に輸送され、そしてＤｉｃｅｒ酵素に遭遇する。Ｄｉｃｅｒは、ｍｉＲＮＡを２つに切断し、二本鎖ｍｉＲＮＡ鎖を生成する。従来、これらのｍｉＲＮＡアームのうち１つだけが、遺伝子制御において重要であると考えられていた：このアームは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中にロードされる運命にあり、そして細胞内に高濃度で存在する。これは大抵「ガイド」鎖と呼ばれ、ｍｉＲで示される。他方のアームは「マイナーｍｉＲＮＡ」又は「パッセンジャーｍｉＲＮＡ」と呼ばれ、大抵ｍｉＲ^＊で示される。パッセンジャーｍｉＲＮＡは完全に分解されると考えられていたが、詳細なシーケシング研究は、一部のマイナーｍｉＲＮＡが残存し、実際に遺伝子制御において機能的な役割を果たしていることを判明した。これらの発展により、命名規則が変わった。ｍｉＲ／ｍｉＲ^＊命名スキームの代わりに、ｍｉＲ－５ｐ／ｍｉＲ－３ｐ命名法が採用されている。新しいシステムでは、ｍｉＲＮＡの５’アームは常に、ｍｉＲ－５ｐで示され、３’アームはｍｉＲ－３ｐで示される。現在の命名法は次のとおりである：接頭辞「ｍｉＲ」の後にダッシュ及び数字が続き、後者は大抵命名順序を示す。たとえば、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６は、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２より前に命名及び発見された可能性がある。大文字の「ｍｉＲ－」は、ｍｉＲＮＡの成熟型（例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１６－３ｐ）を指すが、一方、大文字でない「ｍｉｒ－」はｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ及びｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－１６）を指し、かつ「ＭＩＲ」はそれらをコードする遺伝子を指す。ただし、これは最近の変更であるため、文献ではオリジナルのｍｉＲ／ｍｉＲ^＊名が参照されることがよくある。プロセッシング後、二本鎖ｍｉＲＮＡ鎖は、アルゴノート（ＡＧＯ）タンパク質にロードされ、ＲＩＳＣの前駆体を形成する。この複合体は二重鎖をほどき、そしてパッセンジャーＲＮＡ鎖が廃棄され、成熟した一本鎖ｍｉＲＮＡを保持する成熟ＲＩＳＣを残す。ｍｉＲＮＡは、その標的遺伝子の発現を抑制するため、ＲＩＳＣの一部に残る。これはｍｉＲＮＡ生合成の標準的な経路であるが、他にもさまざまな経路が発見されている。これらには、Ｄｒｏｓｈａ非依存性経路（ミルトロン経路、ｓｎｏＲＮＡ由来経路、及びｓｈＲＮＡ由来経路など）、及びＤｉｃｅｒ非依存性経路（切断のためのＡＧＯに依存する経路、さらにｔＲＮａｓｅＺに依存する経路など）が含まれる。

【0074】

本明細書で使用される「ｍｉＲＢａｓｅ」という用語は、検証されたｍｉＲＮＡの十分に確立されたリポジトリを指す。ｍｉＲＢａｓｅ（ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）は、公開されているｍｉＲＮＡ配列及び注釈の検索可能なデータベースである。ｍｉＲＢａｓｅ配列データベースの各エントリは、成熟ｍｉＲＮＡ配列（ｍｉＲと呼ばれる）の位置と配列に関する情報とともに、ｍｉＲＮＡ転写産物（データベースではｍｉｒと呼ばれる）の予測されたヘアピン部分を表す。ヘアピン配列及び成熟配列の両方が、検索及び参照でき、そしてエントリは名前、キーワード、参考文献及び注釈によって検索することもできる。すべてのシーケンスデータ及び注釈データも、ダウンロードできる。２０１８年１０月に、ｍｉＲｂａｓｅバージョン２２．１がリリースされた。これが現在のバージョンである。

【0075】

本明細書で使用される用語「ｉｓｏｍｉＲ」（又は「ｍｉＲＮＡアイソフォーム」）は、ｍｉＲＮＡ生合成中の切断部位の変化から生じる、配列がわずかに異なるｍｉＲＮＡを指す。特に、Ｄｒｏｓｈａ及びＤｉｃｅｒの不正確な切断、又はｍｉＲＮＡの代謝回転は、長さ及び／又は配列が不均一なｍｉＲＮＡを生じ得る。ＩｓｏｍｉＲ（ｍｉＲＮＡアイソフォーム）は、３つの主要なカテゴリに分類できる：３’ｉｓｏｍｉＲ（３’位で１つ以上のヌクレオチドのトリミング又は追加）、５’ｉｓｏｍｉＲ（５’位で１つ以上のヌ
クレオチドのトリミング又は追加）、及び多型ｉｓｏｍｉＲ（配列内の一部のヌクレオチドが野生型成熟ｍｉＲＮＡ配列とは異なる）。ｍｉＲＮＡバリアント又は個々のｉｓｏｍｉＲの発現の増加は、対応する野生型成熟ｍｉＲＮＡの機能の喪失又は弱化を導くか、あるいは異なるトランスクリプトームの制御をもたらすとことが想定され得る。最近の研究では、ｉｓｏｍｉＲがさまざまな癌、組織、及び細胞型において重要な役割を果たしている可能性があることが示唆されている。したがって、ｍｉＲＮＡ及びｉｓｏｍｉＲの検出が、基礎的な生物学的状況を正確に反映するため、及び正しい診断と治療の決定を下すために、絶対に必要である。

【0076】

本発明者らによって設計されたブロッキングオリゴヌクレオチドは、不要なｍｉＲＮＡの検出を可能にする。本発明者らによって設計された前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは、前記ｍｉＲＮＡのすべてのｉｓｏｍｉＲの検出も可能にする。これが可能であるのは、本発明者らによって設計されたブロッキングオリゴヌクレオチドが、ｍｉＲＮＡのコア配列及び前記ｍｉＲＮＡのすべてのｉｓｏｍｉＲに対して逆相補的であるためである。

【0077】

本明細書で使用される「Ｙ－ＲＮＡ分子」という用語は、非コードＲＮＡ分子を指す。これは、Ｒｏ６０リボ核タンパク質粒子の構成要素である。前記分子は、例えば、クロマチン及び開始タンパク質との相互作用を介したＤＮＡ複製に必要である。現在、４つの成熟Ｙ－ＲＮＡが、ヒト細胞で発現すると報告されている（ｈＹ１、ｈＹ３、ｈＹ４、ｈＹ５）。

【0078】

本明細書で使用される「ｓｎｏＲＮＡ分子」という用語は、非コードＲＮＡ分子を指す。これは主に、他のＲＮＡ、主にリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）又はトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の化学修飾を導く。ｓｎｏＲＮＡの種類には、メチル化に関連するＣ／ＤボックスｓｎｏＲＮＡ、及びシュードウリジル化に関連するＨ／ＡＣＡボックスｓｎｏＲＮＡがある。

【0079】

本明細書で使用される「ｒＲＮＡフラグメント」という用語は、非コードＲＮＡ分子を指す。これは、リボソームの主要な分子構成ブロックを表す全長リボソームＲＮＡの一部である。したがって、ｒＲＮＡフラグメントは、ｒＲＮＡ由来フラグメントとも呼ばれる。リボソームＲＮＡは、１２０乃至４０００ヌクレオチド長であり得るが、本書で言及されているｒＲＮＡフラグメントは、通常１８乃至３９ヌクレオチド長である。

【0080】

本明細書で使用される「ｔＲＮＡ分子」という用語は、非コードＲＮＡ分子を指す。これは、ｍＲＮＡとタンパク質のアミノ酸配列の間の物理的結合として機能する、通常７６乃至９０ヌクレオチド長（真核生物の場合）のＲＮＡで構成されるアダプター分子である。トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）は、リボソームと呼ばれる細胞のタンパク質合成機構にアミノ酸を運ぶことによってこれを行う。

【0081】

本明細書で使用される「アニーリング」という用語は、逆相補配列を有する２つの一本鎖ヌクレオチド配列を加熱及び冷却するプロセスを指す。 熱はすべての水素結合を破壊し、そして冷却は、新しい結合が配列間に形成できることを許す。このプロセス中に、本発明のブロッキングオリゴヌクレオチドは、不要なRNA分子に結合し、二本鎖/ハイブリッド構造を形成する。

【0082】

本明細書では、さらに、ＲＮＡサンプルに含まれる必要な／所望のＲＮＡ分子からｃＤＮＡ産物を生成する方法が開示される。この方法は、伸長反応が必要である。本明細書で使用される場合、「伸長反応」という用語は、必要な／所望のＲＮＡ分子が、ＲＴ－プライマーを介して、特に５’から３’方向に伸長され、必要な／所望のＲＮＡ分子に逆相補的な鎖を含む「伸長反応生成物」形成するための伸長反応を指す。「伸長反応」は、本明
細書において「逆転写」とも称され得る。いくつかの実施形態では、必要な／所望のＲＮＡ分子はｍｉＲＮＡ又はｉｓｏｍｉＲ分子であり、かつ伸長反応は逆転写酵素を含む逆転写反応であり、それによって必要な／所望のＲＮＡ分子のＤＮＡ（特にｃＤＮＡ）コピーが作製される。特定の実施形態では、伸長反応は、逆転写酵素などのポリメラーゼを含む逆転写反応である。
本明細書で使用する「逆転写酵素」という用語は、逆転写酵素活性を有する任意の酵素を指す。特に、本明細書で使用される「逆転写酵素」という用語は、逆転写と呼ばれるプロセスにおいて必要な／所望のＲＮＡ分子からＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成するために使用される酵素を指す。逆転写酵素は、ＲＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。この活性により、ＲＮＡ及びＤＮＡのハイブリッド二本鎖が、相補的なペアのＤＮＡ構成ブロック（デオキシリボヌクレオチド）の連結による一本鎖ＲＮＡの提示後、まず構築される。その後、そのＲＮＡ部分は、タンパク質の特別な部分のＲＮａｓｅ Ｈ活性によって大幅に分解される。残りのＤＮＡ一本鎖は、逆転写酵素のさらなる固有のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性によって触媒されて、最終的にＤＮＡ二本鎖を完成させる。逆転写を開始するために、逆転写酵素が、新しい鎖を合成するための着転写のための開始点として機能するプライマーが必要である。このプライマーは、ＲＴ－プライマー配列とも呼ばれる。ＲＴ－プライマーは、必要な／所望のＲＮＡ分子に対して逆相補的であり得る。必要な／所望のＲＮＡ分子の両側に５’アダプター及び３’アダプターが配置されている場合、ＲＴ－プライマーの配列は、通常３’アダプター配列に依存する。１つの好ましい実施形態において、逆転写酵素は、ＡＭＶ（鳥骨髄芽球症ウイルス）逆転写酵素、ＭｏＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）逆転写酵素、又はＴｔｈ（サーマス サーモピュラス）ＤＮＡポリメラーゼ及びそれらの誘導体からなる群から選択される。

【0083】

この点において、第一鎖ｃＤＮＡ分子は、ブロッキングオリゴヌクレオチドが逆相補的である不要なＲＮＡ分子からのｃＤＮＡ合成の阻害におけるブロッキングオリゴヌクレオチドの効率を確認するためのＰＣＲ実験（例えば、ｑＰＣＲ実験）におけるテンプレートとして使用され得ることに留意すべきである。簡潔には、逆転写中にブロッキングオリゴヌクレオチドが使用された場合に、逆転写中にブロッキングオリゴヌクレオチドを使用しない場合と比較して、不要なＲＮＡ分子から逆転写されたｃＤＮＡ増幅のＣｔの増加は、ブロッキングオリゴヌクレオチドが、不要なＲＮＡ分子からのｃＤＮＡ合成の阻害に効果的であることを示す。Ｃｔの増加は、他の治療と同等又はそれを上回ることを示すために、別の治療（例えば、市販の治療）のＣｔの増加と比較され得る。

【0084】

特定の実施形態では、逆転写中にブロッキングオリゴヌクレオチドが使用される場合、不要なＲＮＡ分子から逆転写されたｃＤＮＡを増幅する際のＣｔ値は、逆転写中にブロッキングオリゴヌクレオチドを使用しない場合のＣｔ値の少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、又は少なくとも４倍である。本開示による逆転写中にブロッキングオリゴヌクレオチドが使用される場合、不要なＲＮＡ分子に由来する全読み取りのパーセンテージは、最大５％、最大４％、最大３％、最大２％、最大１％、最大０．８％、最大０．６％、最大０．５％、最大０．４％、最大０．３％、最大０．２％、最大０．１％、最大０．０５％、又は０％であり得る。

【0085】

逆転写中にブロッキングオリゴヌクレオチドが使用される場合の不要なＲＮＡ分子に由来する全読み取りのパーセンテージに対する、ブロッキングオリゴヌクレオチドが使用さない場合の不要なＲＮＡ分子に由来する全読み取りのパーセンテージの比は、最大０．２、最大０．１５、最大０．１、最大０．０８、最大０．０６、最大０．０５、最大０．０４、最大０．０３、最大０．０２、又は０％であり得る。

【0086】

逆転写のプロセスにより、必要な／所望のＲＮＡ分子のｃＤＮＡ産物が生成される。本明細書に記載のＲＮＡサンプル中の必要な／所望のＲＮＡ分子からｃＤＮＡライブラリを
作製する方法は、好ましくは、ｃＤＮＡ産物を増幅するステップをさらに含む。増幅は、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して行われる。ＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲ（定量的ＰＣＲ又はｑＰＣＲ）、好ましくはＴａｑ－ｍａｎ ｑＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ハイフィデリティＰＲ、高速ＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、及びＧＣリッチＰＣＲからなる群から選択され得る。本明細書で使用される「アンプリコン」及び「増幅産物」という用語は、一般に、増幅反応の産物を指す。アンプリコンは、二本鎖又は一本鎖であり得、かつ二本鎖増幅産物を変性することによって得られる分離された成分鎖を含み得る。特定の実施形態では、１つの増幅サイクルのアンプリコンは、その後の増幅サイクルにおいてテンプレートとして機能することができる。

【0087】

本明細書で使用される「増幅する」という用語は、必要な／所望のＲＮＡ分子の少なくとも一部が、典型的にはテンプレート依存的な方法で行われるが、これに限定されない、直線的又は指数関数的に核酸配列を増幅するための広範囲の技術によって複製される任意の手段を指す。必要な／所望のＲＮＡ分子を増幅するために、いくつかの方法のいずれかが使用される。核酸の標的配列のコピーを増殖させるための任意のインビトロ手段を利用することができる。例示的な方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、等温手順（１つ以上のＲＮＡポリメラーゼを使用）、鎖置換、プライマー分子の部分的破壊、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑ ＲＮＡレプリカーゼシステム、ＲＮＡ転写ベースのシステム（例：ＴＡＳ、３ＳＲ）、またはローリングサークル増幅（ＲＣＡ）が含まれる。これらには、線形、対数、又はその他の増幅方法が含まれる。本発明の文脈において、必要な／所望のＲＮＡ分子のｃＤＮＡは、特に、ＲＮＡサンプル中の必要な／所望のＲＮＡ分子のｃＤＮＡライブラリを生成するために増幅される。

【0088】

本明細書で使用する「ｃＤＮＡライブラリ」という用語は、ＲＮＡサンプルに含まれる必要な／所望のＲＮＡ分子（特に低分子の非コードの必要な／所望の低分子ＲＮＡ分子）に相補的であるｃＤＮＡ配列の集合を指す。したがって、ｃＤＮＡライブラリは、ＲＮＡサンプルに含まれる必要な／所望のＲＮＡ分子（特に低分子の非コードの必要な／所望のＲＮＡ分子）の組成を反映する。ＲＮＡサンプルは、生物、組織、細胞、又は血液などの体液から単離された、必要な／所望のＲＮＡ分子（特に低分子の非コードの必要な／所望のＲＮＡ分子）を含み得る。ｃＤＮＡライブラリの調製は、ＲＮＡサンプルに含まれる、必要な／所望のＲＮＡ分子（特に、低分子の非コードの不要な／所望のＲＮＡ分子）の分布を調べることを可能にする。ｃＤＮＡライブラリの調製は、さらにＲＮＡサンプルに含まれる必要な／所望のＲＮＡ分子（特に低分子の非コードの必要な／所望の低分子ＲＮＡ分子）の発現プロファイルを得ることを可能する。

【0089】

したがって、本明細書ではさらに、ＲＮＡサンプル中の必要な／所望のＲＮＡ分子のプロファイルを決定する方法を開示する。前記方法は、ＲＮＡサンプルに含まれる必要な／所望のＲＮＡ分子から生成された二本鎖ｃＤＮＡ産物／ｃＤＮＡライブラリのシーケンシングを含む。好ましくは、シーケンシングは、次世代シーケンシングである。二本鎖ｃＤＮＡ産物／ｃＤＮＡライブラリのシーケンシングにより、ＲＮＡサンプル中の必要な／所望のＲＮＡ分子のレベルを、例えば定量的に、決定し得る。

【0090】

本明細書で使用される「レベル」という用語は、ＲＮＡ分子の量（例えば、グラム、モル、又はイオン数で測定される）又は濃度（例えば、絶対濃度又は相対濃度、例えば１００万当たりの読み取り数（ＲＰＭ）又はＮＧＳカウント）を指す。本明細書で使用される「レベル」という用語は、スケール化された、正規化された、又はスケール化及び正規化された量もしくは値も含む。特に、ＲＮＡ分子のレベルは、シーケシング、好ましくは次世代シーケシング（例えば、ＡＢＩ ＳＯＬＩＤ、イルミナ社Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ、ロシュ社４５４ ＧＳ ＦＬ、ＢＧＩＳＥＱ）、核酸ハイブリダイゼーション（例えば、マイクロアレイ又はビーズ）、核酸増幅（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ｑＲ
Ｔ－ＰＣＲ、又はハイスループットＲＴ－ＰＣＲ）、ポリメラーゼ伸長、質量分析法、フローサイトメトリー（例えば、ＬＵＭＩＮＥＸ）、又はそれらの任意の組み合わせによって決定される。具体的には、ＲＮＡ分子のレベルは、前記ＲＮＡ分子の発現レベルである。

【0091】

本明細書で使用される「次世代シーケンシング（ＮＧＳ）」という用語は、高速かつ低コストでヌクレオチド配列をシーケンシングするための新しい方法を指す。したがって、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）は、ＤＮＡ又はＲＮＡサンプル内の塩基対の迅速なシーケンシングを可能にするハイスループットの方法論である。遺伝子発現プロファイリング、染色体計数、エピジェネティック変化の検出、及び分子解析を含む幅広いアプリケーションをサポートするので、ＮＧＳは、発見を促進し、個別化医療の未来を可能にする。ＮＧＳは、第２世代シーケンシング（ＳＧＳ）又は超並列シーケンシング（ＭＰＳ）としても知られている。

【0092】

２つ以上のポリヌクレオチド中の残基は、それがポリヌクレオチド構造中の類似の位置を占める場合、互いに「対応する」と言われる。２つ以上のポリヌクレオチドにおける類似の位置が、核酸配列又は構造的類似性に基づいてポリヌクレオチド配列をアニーリングさせることによって決定され得ることは、当該技術分野においてよく知られている。このようなアライメントツールは当業者には周知であり、例えばワールドワイドウェブ上（例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ又は標準設定を用いたＡｌｉｇｎ、好ましくはＡｌｉｇｎ ＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ Ｏｐｅｎ１０．０、Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ ０．５用）上で入手できる。

【0093】

本発明の文脈において、「部品のキット（略してキット）」という用語は、本明細書で特定されるコンポーネントの少なくとも一部の任意の組み合わせであると理解され、それらは空間的に共存して、機能単位に結合され、かつさらなるコンポーネントを含めることができる。

【0094】

本発明の実施形態
次に、本発明をさらに説明する。本文章では、本発明のさまざまな態様がより詳細に定義される。そのように定義された各態様は、反対のことが明確に示されない限り、他の任意の態様と組み合わせることができる。特に、好ましい又は有利であると示された任意の特徴は、反対に明確に示されない限り、好ましい又は有利であると示された他の任意の特徴と組み合わせることができる。

【0095】

本発明者らは、新しいブロッキングオリゴヌクレオチド及び前記ブロッキングオリゴヌクレオチドを使用する方法を開発した。このようにして、選択した任意の豊富な低分子ＲＮＡを標的にすることができ、その逆転写を阻害／防止することができ、結果的にＮＧＳデータセットにおけるその存在を大幅に減少させることができる。したがって、それほど豊富ではない低分子ＲＮＡ種を、迅速、簡単かつコスト効率の高い方法で正確に検出及び定量することができる。

【0096】

したがって、第１の態様では、本発明は、１つ以上の修飾リボヌクレオチド及び／又は１つ以上のロックドヌクレオチドを含むブロッキングオリゴヌクレオチドに関する。

【0097】

特に、本発明は、（ｉ）１つ以上の修飾リボヌクレオチドを含むブロッキングオリゴヌクレオチド、（ｉｉ）１つ以上のロックドヌクレオチドを含むブロッキングオリゴヌクレオチド、又は（ｉｉｉ）１つ以上の修飾リボヌクレオチド及び１つ以上のロックドヌクレオチドを含むブロッキングオリゴヌクレオチドに関する。

【0098】

一実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、不要なＲＮＡ分子の少なくとも１（コア）領域に対して逆相補的である。特定の一実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、不要なＲＮＡ分子の３’末端の少なくとも１領域に対して逆相補的である。１つの特定の実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、不要なＲＮＡ分子（のコア領域）の全長に対して逆相補的である。

【0099】

一実施形態では、１つ以上の修飾リボヌクレオチド及び／又は１つ以上のロックドヌクレオチドは、不要なＲＮＡ分子の少なくとも１（コア）領域へのブロッキングオリゴヌクレオチドの結合を増加させる。１つの特定の実施形態では、１つ以上の修飾リボヌクレオチド及び／又は１つ以上のロックドヌクレオチドは、不要なＲＮＡ分子（のコア領域）の全長へのブロッキングオリゴヌクレオチドの結合を増加させる。
この結合により、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、不要なＲＮＡ分子の（コア）領域を使用してｃＤＮＡ合成を阻害することができえる。逆転写酵素はテンプレートとして一本鎖ＲＮＡ分子を必要とするため、不要なＲＮＡ分子とブロッキングオリゴヌクレオチドの間に形成された二重鎖により、逆転写反応が非効率になる。さらに、ブロッキングオリゴヌクレオチドが不要なＲＮＡ分子の領域に結合すると、形成される二重鎖の融解温度（Ｔｍ）が上昇する。形成された二本鎖の融解温度（Ｔｍ）は、逆転写反応が行われる温度（通常６０℃より高い）より高いため、この二本鎖は逆転写反応中に破壊されない。

【0100】

特に、ブロッキングオリゴヌクレオチドに含まれる１つ以上の修飾リボヌクレオチド及び／又は１つ以上のロックドヌクレオチドが、同じ条件で測定した、同じ配列を有するが、１つ以上の修飾リボヌクレオチド及び／又は１つ以上のロックドヌクレオチドを有さないオリゴヌクレオチドと、不要なＲＮＡ分子の（コア）領域との間に形成される二本鎖の融解温度（Ｔｍ）と比較して、１つ以上の修飾リボヌクレオチド及び／又は１つ以上のロックドヌクレオチドを含むブロッキングオリゴヌクレオチドと、不要なＲＮＡ分子の（コア）領域との間に形成される二本鎖の融解温度（Ｔｍ）を増加させる場合、ブロッキングオリゴヌクレオチドに含まれる１つ以上の修飾リボヌクレオチド及び／又は１つ以上のロックドヌクレオチドは、同じ配列を有するが、１つ以上の修飾リボヌクレオチド及び／又は１つ以上のロックドヌクレオチドを有さないオリゴヌクレオチドと比較して、ブロッキングオリゴヌクレオチドと不要なＲＮＡ分子の（コア）領域との間の結合を増加させる。

【0101】

本明細書に記載のブロッキングオリゴヌクレオチドと、ブロッキングオリゴヌクレオチドが逆相補的である不要なＲＮＡ分子の領域との間に形成される二重鎖のＴｍは、そのようなＴｍを推定するために設計された無料で利用できるオンラインツールによって予測されるとおりに、４０乃至８５℃、好ましくは６０乃至７５℃の範囲である。

【0102】

具体的には、不要なＲＮＡ分子は、豊富に存在するＲＮＡ分子である。好ましくは、不要なＲＮＡ分子は、２００リボヌクレオチド未満の長さを有する豊富な非コードＲＮＡ分子である。より好ましくは、不要なＲＮＡ分子は、豊富なｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）、Ｙ－ＲＮＡ、又はＹ－ＲＮＡフラグメント（Ｙ－ＲＮＡフラグメントは完全長Ｙ－ＲＮＡではない）である。あるいは、不要なＲＮＡ分子は、豊富な低分子核小体リボ核酸（ｓｎｏＲＮＡ）、リボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）フラグメント（ｒＲＮＡ）フラグメントは完全長ｒＲＮＡではない）、又はトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）である。より具体的には、不要なＲＮＡ分子は、豊富なｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）、Ｙ－ＲＮＡ、Ｙ－ＲＮＡフラグメント（Ｙ－ＲＮＡフラグメントは完全長Ｙ－ＲＮＡではない）、ｓｎｏＲＮＡ、ｒＲＮＡフラグメント（ｒＲＮＡフラグメントは完全長ｒＲＮＡではない）、又はｔＲＮＡである。

【0103】

さらにより好ましくは、不要なＲＮＡ分子は、豊富なｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）である。豊富な分子とは、低分子ＲＮＡ ＮＧＳ実験中の全処
理された読み取りの合計の０．０５％を超えて消費するＲＮＡ実態である。当業者は、例えばＮＧＳ実験で、ＲＮＡ分子の存在量を決定することができる。

【0104】

一実施形態では、１つ以上の修飾リボヌクレオチドは、ブロッキングオリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチド配列及び／又は３’末端ヌクレオチド配列に含まれる。

【0105】

一実施形態では、１つ以上のロックドヌクレオチドは、ブロッキングオリゴヌクレオチドの中央ヌクレオチド配列に含まれる。

【0106】

したがって、特定の一実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、順序で５’から３’までを含む：
（ｉ）１つ以上の（連続した）修飾リボヌクレオチドを含む５’末端ヌクレオチド配列、（ｉｉ）１つ以上の（連続しない）ロックドヌクレオチドを含む中央ヌクレオチド配列、及び
（ｉｉｉ）１つ以上の（連続した）修飾リボヌクレオチドを含む３’末端ヌクレオチド配列。

【0107】

１つの特定の実施形態では、１つ以上のロックドヌクレオチドは、３つ以上、例えば４、５、又は６のＧ／Ｃには含まれない。

【0108】

特定の一実施形態では、ロックドヌクレオチドが、連続した順序で配置されていない、又は各ロックドヌクレオチドの後には、ロックドヌクレオチドではない少なくとも１つのヌクレオチドが続く。

【0109】

１つの特定の実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、３乃至１０、好ましくは３乃至６、及びより好ましくは４及び５（例えば、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）のロックドヌクレオチドを含む。

【0110】

ＬＮＡヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド内のＤＮＡ又はＲＮＡ残基と混合でき、ワトソン・クリック塩基対合則に従ってＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズする。ロックされたリボース構造は、塩基のスタッキングとバックボーンの事前組織化を強化する。これにより、ブロッキングオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性（融解温度）が大幅に上昇します。
ブロッキングオリゴヌクレオチドに組み込まれた場合、ＬＮＡヌクレオチド当たり２乃至８℃、好ましくは４乃至６℃の二本鎖融解温度の上昇に達することができる。

【0111】

特に、ロックドヌクレオチドは、ＬＮＡ－リボヌクレオチド又はＬＮＡ－デオキシリボヌクレオチドである。より具体的には、ロックドヌクレオチドは、ＬＮＡ－アデニン、ＬＮＡ－グアニン、ＬＮＡ－シトシン、及びＬＮＡ－チミンからなる群から選択される。

【0112】

別の特定の実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチド配列に含まれる修飾リボヌクレオチド及び／又は３’末端ヌクレオチド配列に含まれる修飾リボヌクレオチドは、連続した順序で配置される。

【0113】

別の特定の実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、４乃至２２、好ましくは４乃至１６、及びより好ましくは６乃至１０（例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２）の修飾リボヌクレオチドを含む。

【0114】

例えば、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、５’末端ヌクレオチド配列内３乃至５（
例えば３、４、又は５）の（連続した）修飾リボヌクレオチド及び／又は３’末端ヌクレオチド配列内の３乃至５（例えば３、４又は５）の（連続した）修飾リボヌクレオチドを含む。

【0115】

特に、修飾リボヌクレオチドは、２’－ｏ－メチルリボヌクレオチドである。ブロッキングオリゴヌクレオチドに組み込まれた場合、１乃至８℃、好ましくは３乃至５℃の二本鎖融解温度の上昇が、２’－ｏ－メチルリボヌクレオチド当たり達成される。

【0116】

１つの好ましい実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、３乃至１０（例えば、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）のロックドヌクレオチドを含み、ここでロックドヌクレオチドは、連続した順序で配置されていないか、又は各ロックドヌクレオチドに、ロックドヌクレオチドではない少なくとも１つのヌクレオチドが続く。

【0117】

特に、ロックドヌクレオチドは、ＬＮＡ－リボヌクレオチド又はＬＮＡ－デオキシリボヌクレオチドである。より具体的には、ロックドヌクレオチドは、ＬＮＡ－アデニン、ＬＮＡ－グアニン、ＬＮＡ－シトシン、及びＬＮＡ－チミンからなる群から選択される。本発明者らによって設計されたバージョン１のブロッキングオリゴヌクレオチドは、この特定のブロッキングオリゴヌクレオチドタイプの例である（実験セクションを参照）。

【0118】

別の好ましい一実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、１６乃至２２（例えば１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２）の修飾リボヌクレオチドからなり、ここで修飾リボヌクレオチドが連続した順序で配置されている。特に、修飾リボヌクレオチドは、２’－ｏ－メチルリボヌクレオチドである。本発明者らによって、設計されたバージョン２のブロッキングオリゴヌクレオチドは、この特定のブロッキングオリゴヌクレオチドタイプの一例である（実験セクションを参照）。

【0119】

１つのより好ましい実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、
（ｉ）３乃至５（例えば３、４又は５）の（連続した）修飾リボヌクレオチドを含む５’末端ヌクレオチド配列、
（ｉｉ）４乃至５（例えば４又は５）の（非連続の）ロックドヌクレオチドを含む中央ヌクレオチド配列、及び
（ｉｉｉ）３乃至５（例えば３、４、又は５）の（連続した）修飾リボヌクレオチドを含む３’末端ヌクレオチド配列、
を含む。

【0120】

特に、ロックドヌクレオチドは、ＬＮＡ－リボヌクレオチド又はＬＮＡ－デオキシリボヌクレオチドであり、かつ／又は修飾リボヌクレオチドは、２’－ｏ－メチルリボヌクレオチドである。より具体的には、ロックドヌクレオチドは、ＬＮＡ－アデニン、ＬＮＡ－グアニン、ＬＮＡ－シトシン、及びＬＮＡ－チミンからなる群から選択され、かつ／又は修飾リボヌクレオチドは２’－ｏ－メチルリボヌクレオチドである。

【0121】

本発明者らによって設計されたバージョン３のブロッキングオリゴヌクレオチドは、この特定のブロッキングオリゴヌクレオチドタイプの一例である（実験セクションを参照）。

【0122】

本明細書に記載されるすべてのブロッキングオリゴヌクレオチドは、その３’末端に修飾を含まないことに留意すべきである。３’修飾は、ブロッキングオリゴヌクレオチドをポリメラーゼ又は逆転写酵素によって伸長できなくなる状態にする。

【0123】

一実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、１６乃至２２（例えば１６、１
７、１８、１９、２０、２１、又は２２）のヌクレオチド長を有する。

【0124】

本発明者らによって設計されたブロッキングオリゴヌクレオチドは、不要なｍｉＲＮＡの検出を可能にする。本発明者らによって設計されたブロッキングオリゴヌクレオチドはまた、前記不要なｍｉＲＮＡのすべてのｉｓｏｍｉＲの検出を可能にする。これが可能であるのは、本発明者らによって設計されたブロッキングオリゴヌクレオチドが、ｍｉＲＮＡのコア配列及び前記ｍｉＲＮＡのすべてのｉｓｏｍｉＲに対して逆相補的であるためである。

【0125】

ブロッキングオリゴヌクレオチドが逆相補的である不要なＲＮＡ分子の領域は、少なくとも１０ヌクレオチド長（例えば、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１ヌクレオチド長又は２２ヌクレオチド長）であり得る。このような領域は、最大３０ヌクレオチド長（例えば、最大３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、又は２２ヌクレオチド長）であり得る。１つの好ましい実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、不要なＲＮＡ分子の１４乃至２０ヌクレオチド長（例えば、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２ヌクレオチド長）の領域に対して逆相補的である。好ましくは、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、不要なＲＮＡ分子の１４乃至２０ヌクレオチド長（例えば、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチド長）の（コア）領域に対して逆相補的である。より好ましくは、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、不要なＲＮＡ分子の１６乃至２２ヌクレオチド長（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２ヌクレオチド長）の（コア）領域に対して逆相補的である。

【0126】

さらにより好ましい一実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、配列番号３４乃至配列番号６６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する不要なＲＮＡ分子の少なくとも１（コア）領域、又はそれらの不要なＲＮＡ分子アイソマーの少なくとも１（コア）領域に対して逆相補的である。ここで、不要なＲＮＡ分子は、ｍｉＲＮＡ又はＹ－ＲＮＡ分子である。あるいは、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、配列番号１２３乃至配列番号１６９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する不要なＲＮＡ分子の少なくとも１（コア）領域、又はそれらの不要なＲＮＡ分子アイソマーの少なくとも１（コア）領域に対して逆相補的である。具体的には、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、配列番号３４乃至配列番号６６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する不要なＲＮＡ分子の少なくとも１（コア）領域、又はそれらの不要なＲＮＡ分子アイソマーの少なくとも１（コア）領域、及び配列番号１２３乃至配列番号１６９、又はそれらの不要なＲＮＡ分子アイソマーの少なくとも１（コア）領域に対して逆相補的である。より具体的には、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、配列番号３４乃至配列番号６６及び配列番号１２３乃至配列番号１６９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する不要なＲＮＡ分子の少なくとも１（コア）領域に対して逆相補的である。

【0127】

特に、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、配列番号３４乃至配列番号３６、配列番号３８乃至配列番号５３、配列番号５５乃至配列番号５７、及び配列番号５９乃至配列番号６６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する不要なｍｉＲＮＡ分子の少なくとも１（コア）領域、又はそれらの不要なｉｓｏｍｉＲ分子の少なくとも１（コア）領域に対して逆相補的である。

【0128】

特に、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、配列番号３７、配列番号５４及び配列番号５８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する不要なＹ－ＲＮＡ分子の少なくとも１（コア）領域に対して逆相補的である。

【0129】

最も好ましい一実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、配列番号１乃至配
列番号３３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するか、又はこのヌクレオチド配列の変異体である。ここで、ブロッキングヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ／ｉｓｏｍｉＲブロッキングオリゴヌクレオチド又はＹ－ＲＮＡ分子ブロッキングオリゴヌクレオチドである。あるいは、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、配列番号７６乃至配列番号１２２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するか、又はこのヌクレオチド配列の変異体である。具体的には、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、配列番号１乃至配列番号３３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するか、又はこのヌクレオチド配列の変異体であるか、及び配列７６乃至配列番号１２２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するか、又はこのヌクレオチド配列の変異体である。より具体的には、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、配列番号１乃至配列番号３３及び配列番号７６乃至配列番号１２２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する。

【0130】

特に、ｍｉＲＮＡ／ｉｓｏｍｉＲブロッキングオリゴヌクレオチドは、配列番号１乃至配列番号３、配列番号５乃至配列番号２０、配列番号２２乃至配列番号２４及び配列番号２６乃至配列番号３３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するか、又はこのヌクレオチド配列の変異体である。

【0131】

特に、Ｙ－ＲＮＡブロッキングオリゴヌクレオチドは、配列番号４、配列番号２１及び配列番号２５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するか、又はこのヌクレオチド配列の変異体である。

【0132】

上述のブロッキングオリゴヌクレオチド変異体は、配列番号１乃至配列番号３３、又は配列番号７６乃至配列番号１２２によるヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％、及びなおさらにより好ましくは９９％（例えば、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。このようなブロッキングオリゴヌクレオチド変異体は依然として修飾リボヌクレオチドを含む。さらに、このようなブロッキングオリゴヌクレオチド変異体は依然としてＬＮＡ強化されている。さらに、このようなブロッキングオリゴヌクレオチド変異体は依然としてｃＤＮＡ合成を阻害することができる。当業者であれば、ブロッキングオリゴヌクレオチド変異体が依然としてｃＤＮＡ合成を阻害できるかどうかを容易に評価することができる。たとえば、実験セクションでは、この点において十分な情報が提供されている。

【0133】

本発明者らによって設計されたブロッキングオリゴヌクレオチドは、不要なｍｉＲＮＡの検出を可能にする。本発明者らによって設計されたブロッキングオリゴヌクレオチドは、前記ｍｉＲＮＡのすべてのｉｓｏｍｉＲの検出も可能にする。これが可能であるのは、本発明者らによって設計されたブロッキングオリゴヌクレオチドが、ｍｉＲＮＡのコア配列及び前記ｍｉＲＮＡのすべてのｉｓｏｍｉＲに対して逆相補的であるためである。

【0134】

第２の態様では、本発明は、第１の態様による少なくとも２つのブロッキングオリゴヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３のブロッキングオリゴヌクレオチド、又は例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、又は４７ブロッキングオリゴヌクレオチド、又は例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、
３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、又は８０のブロッキングオリゴヌクレオチド）を含むセットに関する。

【0135】

特に、少なくとも２つのブロッキングオリゴヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３のブロッキングオリゴヌクレオチド、又は例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、又は４７のブロッキングオリゴヌクレオチド、又は例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、又は８０のブロッキングオリゴヌクレオチド）は、それらのヌクレオチド配列が互いに異なる。より具体的には、少なくとも２つのブロッキングオリゴヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３のブロッキングオリゴヌクレオチド、又は例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、又は４７ブロッキングオリゴヌクレオチド、又は例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、又は８０のブロッキングオリゴヌクレオチド）は、異なる不要なＲＮＡ分子の少なくとも１（コア）領域に対して逆相補的である。最も好ましい一実施形態では、セットは、配列番号１乃至配列番号３３によるヌクレオチド配列を有するブロッキングオリゴヌクレオチドを含む。あるいは、セットは、配列番号７６乃至配列番号１２２によるヌクレオチド配列を有するブロッキングオリゴヌクレオチドを含む。具体的には、セットは、配列番号１乃至配列番号３３及び配列番号７６乃至配列番号１２２に記載のヌクレオチド配列を有するブロッキングオリゴヌクレオチドを含む。このセットは、Ｙ－ＲＮＡ分子だけでなく、特定の不要なｍｉＲＮＡ及び／又はｉｓｏｍｉＲ分子の阻害を可能にする。規定された不要なｍｉＲＮＡ及び／又はｉｓｏｍｉＲ分子を阻害するための特異的なセットは、特に、配列番号１乃至配列番号３、配列番号５乃至配列番号２０、配列番号２２乃至配列番号２４及び配列番号２６乃至配列番号３３によるヌクレオチド配列を有するブロッキングオリゴヌクレオチドを含む。さらに、規定の不要なＹ－ＲＮＡ分子を阻害するための特異的なセットは、特に、配列番号４、配列番号２１、及び配列番号２５によるヌクレオチド配列を有するブロッキングオリゴヌクレオチドを含む。さらに、定義された不要なｓｎｏＲＮＡ分子を阻害するための特異的なセットは、実験セクションの表に示すように、特にｓｎｏＲＮＡに対するブロッキングオリゴヌクレオチドを含み、定義された不要なｒＲＮＡフラグメントの阻害のための特異
的なセットは、実験セクションの表に示すように、特にｒＲＮＡフラグメントに対するブロッキングオリゴヌクレオチドを含み、及び／又は定義された不要なｔＲＮＡ分子のための阻害に特異的なセットは、実験セクションの表に示すように、特にｔＲＮＡに対するブロッキングオリゴヌクレオチドを含む。

【0136】

第３の態様では、本発明は、逆転写中のＲＮＡサンプル中の１つ以上の不要なＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成を阻害する方法であって、
（ｉ）１つ以上の所望のＲＮＡ分子及び１つ以上の不要なＲＮＡ分子を含むＲＮＡサンプル、並びに第１の態様による１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチド（又は第２の態様によるセットに含まれるブロッキングオリゴヌクレオチド）を含有する混合物を提供するステップであって、ここで、該１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドが１つ以上の不要なＲＮＡ分子にアニーリングされるステップ、及び
（ｉｉ）１つ以上の所望のＲＮＡ分子を逆転写し、それによって前記所望のＲＮＡ分子から１つ以上のｃＤＮＡ産物を得、かつ１つ以上の不要なＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成を阻害するステップ、
を含む方法に関する。

【0137】

第４の態様では、本発明は、
（ｉ）１つ以上の所望のＲＮＡ分子及び１つ以上の不要なＲＮＡ分子を含むＲＮＡサンプル、並びに第１の態様による１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチド（又は第２の態様によるセットに含まれるブロッキングオリゴヌクレオチド）を含有する混合物を提供するステップであって、ここで、１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドが１つ以上の不要なＲＮＡ分子にアニーリングされるステップ、及び
（ｉｉ）１つ以上の所望のＲＮＡ分子を逆転写し、それによって前記所望のＲＮＡ分子から１つ以上のｃＤＮＡ産物を得、かつ１つ以上の不要なＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成を阻害するステップ、
を含む、逆転写中のＲＮＡサンプル中の１つ以上の所望のＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成（を改善する）ための方法に関する。

【0138】

以下の説明は、本発明の第３の態様及び第４の態様に適用される。

【0139】

（第３及び第４の態様の）一実施形態では、１つ以上の不要なＲＮＡ分子への１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドのアニーリングは、混合物に含まれる１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチド及び１つ以上の不要なＲＮＡ分子を変性し、かつその後冷却することによって達成される。

【0140】

変性は、７５乃至９０℃（例えば、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、又は９０℃）で、特に１乃至５分間（例えば、１、２、３、４、又は５分間）で行われることが好ましい。

【0141】

また、冷却は、２０乃至３０℃（例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０℃）で、特に０．１乃至２°Ｃ／ｓ（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、又は２℃／ｓ）の速度で行われることが好ましい。

【0142】

変性が、７５乃至９０℃（例えば、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、又は９０℃）で、特に１乃至５分間（例えば、１、２、３、４、又は５分間）で行われ、かつ冷却が、２０乃至３０℃（例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０℃）で、特に
０．１乃至２℃／ｓ（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、又は２℃／ｓ）の速度で行われることが好ましい。

【0143】

具体的には、混合物に含まれる１つ以上の所望のＲＮＡ分子、１つ以上の不要なＲＮＡ分子、及び１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドは、変性され、かつ続いて冷却されており、変性及びその後の冷却は、１つ以上の不要なＲＮＡ分子に対して１つ以上のブロッキングヌクレオチドのアニーリングを得る。具体的な変性及び冷却条件については、上記の説明を参照する。

【0144】

（第３及び第４の態様の）別の実施形態では、混合物（ステップ（ｉ）で提供される）は、１つ以上の所望のＲＮＡ分子及び１つ以上の不要なＲＮＡ分子を含むＲＮＡサンプルと、１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドを混合するか、又は１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドと、１つ以上の所望のＲＮＡ分子及び１つ以上の不要なＲＮＡ分子を含むＲＮＡサンプルを混合することによって生成される。

【0145】

（第３及び第４の態様の）１つの好ましい実施形態では、１つ以上の所望のＲＮＡ分子の逆転写は、
（ｉｉａ）逆転写（ＲＴ）プライマー用のプライマーを１つ以上の所望のＲＮＡ分子とのアニーリング、及び
（ｉｉｂ）逆転写酵素（ＲＴ）を使用することによって、又は逆転写酵素（ＲＴ）とともに、１つ以上の所望のＲＮＡ分子の逆転写、
によって行われる。

【0146】

前記アニーリングは、２５乃至６０℃（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、又は６０℃）で、特に１乃至１０分間（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０分間）行われることがより好ましい。前記アニーリングは、３７℃乃至５６℃（例えば３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、又は５６℃）で、特に３乃至６分間（例えば、３、４、５、又は６分間）で行われることがより好ましい。

【0147】

また、前記逆転写は、３７℃乃至７２℃（例えば、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、又は７２℃）で、特に１乃至９０分間（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、又は９０分）で行われることがより好ましい。また、前記逆転写が４０℃乃至６０℃（４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、又は６０℃）で、特に１０乃至３５分間（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５分間）で行われることがさらにより好ましい。

【0148】

前記アニーリングは２５乃至６０℃（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、又は６０℃）で、特に１乃至１０分間（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０分間）で行われ、及び前記逆転写は３７℃乃至７２℃（例えば、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、又は７２℃）で、特に１乃至９０分間（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、又は９０分間）で行われることが、なおさらにより好ましい。

【0149】

逆転写酵素は、ＡＭＶ（鳥骨髄芽球症ウイルス）逆転写酵素、ＭｏＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）逆転写酵素、又はＴｔｈ（サーマス サーモピュラス）ＤＮＡポリメラーゼ及びそれらの誘導体からなる群から選択され得る。

【0150】

逆転写を開始するために、逆転写酵素は、新しい鎖を合成するための開始点として機能するプライマーが必要です。このプライマーはＲＴ－プライマーとも呼ばれます。ＲＴ－プライマーは、所望のＲＮＡ分子に対して逆相補的であり得る。所望のＲＮＡ分子が、５’アダプター及び３’アダプターに隣接している場合、ＲＴ－プライマーの配列は、３’アダプター配列に依存する可能性がある。

【0151】

特に、ＲＮＡサンプルは、生体サンプルであるか、又は生体サンプルから調製／取得される。より具体的には、生体サンプルは血液サンプルである。さらにより具体的には、血液サンプルは全血又は血液分画、具体的には血球（例えば、赤血球、白血球、及び／又は血小板）、血清、又は血漿である。ＲＮＡサンプルはまた、全ＲＮＡを含み得る。

【0152】

さらに、ＲＮＡサンプルは、所望の／不要なＲＮＡ分子として、ｍｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）を特に含ふむことが明らかである。前記ｍｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）は、一本鎖ＲＮＡ分子として存在し得る。前記ｍｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）はまた、アダプター分子に付着／結合／隣接して存在し得る。特に、アダプター分子は、ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）の５’末端に連結され（５’アダプター）、かつｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）の３’末端に連結される（３’アダプター）。言い換えれば、所望の／不要なＲＮＡ分子としてのｍｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）は、５’アダプター分子及び３’アダプター分子に隣接している。このアダプターは、ｍｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）の５’及び３’末端にハイブリダイズし、ｃＤＮＡ合成のテンプレートとして使用できる連結されたＲＮＡ分子の形成を可能にする。このようにして、ｍｉＲＮＡだけでなく、そのバリアント（即ち、ｉｓｏｍｉＲ）も検出でき、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、ｃＤＮＡライブラリ構築、及び多様な診断方法などのさまざまな分子技術を向上させる。

【0153】

不要なＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成の阻害は、逆転写中にテンプレートとして不要なＲＮＡ分子を使用して生成される一本鎖又は二本鎖ｃＤＮＡの量が、参照条件下（例えば、１
つ以上の修飾リボヌクレオチド及び／又は１つ以上のロックドヌクレオチドを含むブロッキングオリゴヌクレオチドが存在しない場合）での逆転写中に生成される一本鎖又は二本鎖ｃＤＮＡの量と比較して、修飾された条件下（例えば、１つ以上の修飾リボヌクレオチド及び／又は１つ以上のロックドヌクレオチドを含むブロッキングオリゴヌクレオチドの存在下）では、統計的に有意な程度に減少することを意味する。合成されたｃＤＮＡの量の減少は、本明細書に開示されるように、ｑＰＣＲ又はトランスクリプトームシーケンシングを使用して測定され得る。特に、不要なＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、さらには１００％まで阻害される。

【0154】

不要なＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成の阻害は、不要なＲＮＡ分子の枯渇と呼ばれ得る。不要なＲＮＡ分子が、最初のＲＮＡサンプルから物理的に除去されていなくても、最初のＲＮＡサンプルの下流の操作又は分析における不要なＲＮＡ分子の関与は、不要なＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成の阻害により減少又は排除される。

【0155】

結果として、所望のＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成が向上する。合成されたｃＤＮＡの量の改善は、本明細書に開示されるように、ｑＰＣＲ又はトランスクリプトームシーケンシングを使用して測定され得る。特に、所望のＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、さらには１００％改善される。

【0156】

具体的には、不要なＲＮＡ分子は、豊富なＲＮＡ分子である。好ましくは、不要なＲＮＡ分子は、２００リボヌクレオチド未満の長さを有する豊富な非コードＲＮＡ分子である。より好ましくは、不要なＲＮＡ分子は、豊富なｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）、Ｙ－ＲＮＡ、及び／又はＹ－ＲＮＡフラグメント（Ｙ－ＲＮＡフラグメントは完全長Ｙ－ＲＮＡではない）である。あるいは、不要なＲＮＡ分子は、豊富な低分子核小体リボ核酸（ｓｎｏＲＮＡ）、リボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）フラグメント（ｒＲＮＡ）フラグメントは完全長ｒＲＮＡではない）、及び／又はトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）である。より具体的には、不要なＲＮＡ分子は、豊富なｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）、Ｙ－ＲＮＡ、Ｙ－ＲＮＡフラグメント（Ｙ－ＲＮＡフラグメントは完全長Ｙ－ＲＮＡではない）、ｓｎｏＲＮＡ、ｒＲＮＡフラグメント（ｒＲＮＡフラグメントは完全長ｒＲＮＡではない）、及び／又はｔＲＮＡである。さらにより好ましくは、不要なＲＮＡ分子は、豊富なｍｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）である。豊富なＲＮＡ分子は、低分子ＲＮＡ ＮＧＳ実験で全処理された読み取りの０．０５％を超えて消費するＲＮＡ実体である。当業者は、例えばＮＧＳ実験で、ＲＮＡ分子の存在量を決定することができる。

【0157】

逆に、所望のＲＮＡ分子は、それほど豊富ではないＲＮＡ分子である。好ましくは、所望のＲＮＡ分子は、２００リボヌクレオチド未満の長さを有する、それほど豊富ではない非コードＲＮＡ分子である。より好ましくは、所望のＲＮＡ分子は、それほど豊富でないｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）、Ｙ－ＲＮＡ、及び／又はＹ－ＲＮＡフラグメント（Ｙ－ＲＮＡフラグメントは完全長Ｙ－ＲＮＡではない）である。あるいは、所望のＲＮＡ分子は、それほど豊富でない低分子核小体リボ核酸（ｓｎｏＲＮＡ）、リボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）フラグメント（ｒＲＮＡフラグメントは完全長ｒＲＮＡではない）、及び／又はトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）である。より具体的には、所望のＲＮＡ分子は、それほど豊富でないｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）、Ｙ－ＲＮＡ、Ｙ－ＲＮＡフラグメント（Ｙ－ＲＮＡフラグメントは完全長Ｙ－ＲＮＡではない）、ｓｎｏＲＮＡ、ｒＲＮＡフラグメント（ｒＲＮＡフラグメントは完全長ｒＲＮＡではない）、及び／又はｔＲＮＡである。さらにより好ましくは、所望のＲＮＡ分子は、それほど豊富ではないｍｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（
ｉｓｏｍｉＲ）である。それほど豊富ではないＲＮＡ分子は、低分子ＲＮＡ ＮＧＳ実験の全処理された読み取りの０．０５％以下を消費するＲＮＡ実体である。当業者は、例えばＮＧＳ実験で、ＲＮＡ分子の存在量を決定することができる。

【0158】

第５の態様では、本発明は、
（ｉ）第３又は第４の態様による方法を行うステップ、及び
（ｉｉ）１つ以上のｃＤＮＡ産物を増幅し、それによって１つ以上の所望のＲＮＡ分子から１つ以上の二本鎖ｃＤＮＡ産物を生成するステップ、
を含む、１つ以上の所望のＲＮＡ分子から１つ以上の二本鎖ｃＤＮＡ産物を生成する方法に関する。

【0159】

上記の方法を用いて、少なくとも２つの所望のＲＮＡ分子から少なくとも２つの二本鎖ｃＤＮＡ産物が生成される場合、ｃＤＮＡライブラリが構築される。

【0160】

１つの好ましい実施形態では、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して行われる。より好ましい一実施形態では、ＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲ（定量的ＰＣＲ又はｑＰＣＲ）、好ましくはＴａｑ－ｍａｎ ｑＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ハイフィデリティＰＲ、高速ＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、及びＧＣ－リッチＰＣＲからなる群から選択される。
当業者であれば、増幅が、フォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて行われることは明らかであるはずである。フォワードプライマー及びリバースプライマーの配列は、テンプレートとして使用されるｃＤＮＡ産物によって決定される。当業者であれば、上記の方法で問題なく使用できる適切なフォワードプライマー及び適切なリバースプライマーを設計できる。
フォワード及びリバースプライマーはユニークデュアルインデックス（ＵＤＩ）を含むことが好ましい。この点で、ＵＤＩはユニークデュアルインデックス（Ｕｎｉｑｕｅ Ｄｕａｌ Ｉｎｄｅｘ）の頭字語であることに注意してください。固有のデュアルインデックス（ＵＤＩ）を使用すると、各サンプルインデックスは、定められたサンプルライブラリに特有である。サンプル内のすべての核酸は、同じ配列タグで標識され、かつ得られたライブラリは他のライブラリとプールされ、１回の実行で並行してシーケンスされる。

【0161】

特に、増幅は、ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる。ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、並びにそれらの誘導体からなる群から選択され得る。

【0162】

第６の態様では、本発明は、第５の態様による方法によって生成される１つ以上の所望のＲＮＡ分子から１つ以上の二本鎖ｃＤＮＡ産物をシーケンシングするステップを含む、１つ以上の所望のＲＮＡ分子のプロファイルを決定するための方法に関する。ｃＤＮＡライブラリが、本発明の第５の態様に係る方法の結果である場合、このｃＤＮＡライブラリは、本発明の第６の態様による方法における配列である。

【0163】

当業者に知られている任意のシーケンシング技術を使用することができる。 二本鎖ｃＤＮＡ産物（ｃＤＮＡライブラリー）のシーケンシングにより、ＲＮＡサンプル中の所望のＲＮＡのレベルは、例えば定量的に決定され得る。所望のＲＮＡのレベルは、具体的には、前記所望のＲＮＡの発現レベルである。

【0164】

好ましくは、シーケンシングは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）である。次世代シーケンシングは、ヌクレオチド配列を高速でシーケンシングための新しい手法である。したがって、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）は、ＤＮＡ又はＲＮＡサンプル内の塩基対の素早いシーケンシングを可能にするハイスループットの方法論である。これは、診断及び予
後の目的に使用できる広範囲のＲＮＡのためのＲＮＡ発現データを生成することにより、分子分析だけでなく診断分析もサポートする。

【0165】

特に、プロファイルは、１つ以上の所望のＲＮＡ分子の発現プロファイルである。

【0166】

第７の態様では、本発明は、逆転写中のＲＮＡサンプル中の不要なＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成を阻害するための、第１の態様によるブロッキングオリゴヌクレオチドの使用に関する。

【0167】

具体的には、不要なＲＮＡ分子は、豊富なＲＮＡ分子である。好ましくは、不要なＲＮＡ分子は、２００リボヌクレオチド未満の長さを有する豊富な非コードＲＮＡ分子である。より好ましくは、不要なＲＮＡ分子は、豊富なｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）、Ｙ－ＲＮＡ、及び／又はＹ－ＲＮＡフラグメント（Ｙ－ＲＮＡフラグメントは完全長Ｙ－ＲＮＡではない）である。あるいは、不要なＲＮＡ分子は、豊富な低分子核小体リボ核酸（ｓｎｏＲＮＡ）、リボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）フラグメント（ｒＲＮＡフラグメントは完全長ｒＲＮＡではない）、及び／又はトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）である。より具体的には、不要なＲＮＡ分子は、豊富なｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）、Ｙ－ＲＮＡ、Ｙ－ＲＮＡフラグメント（Ｙ－ＲＮＡフラグメントは完全長Ｙ－ＲＮＡではない）、ｓｎｏＲＮＡ、ｒＲＮＡフラグメント（ｒＲＮＡフラグメントは完全長ｒＲＮＡではない）、及び／又はｔＲＮＡである。さらにより好ましくは、不要なＲＮＡ分子は、豊富なｍｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）である。豊富なＲＮＡ分子は、低分子ＲＮＡ ＮＧＳ実験における全処理された読み取りの０．０５％を超えて消費するＲＮＡ実体である。当業者は、例えばＮＧＳ実験で、ＲＮＡ分子の存在量を決定することができる。

【0168】

ブロッキングオリゴヌクレオチド、不要なＲＮＡ分子、及びＲＮＡサンプルの好ましい実施形態については、本発明の第１、第３、及び第４の態様を参照する。

【0169】

第８の態様では、本発明は、逆転写中のＲＮＡサンプル中の不要なＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成を阻害するための、第２の態様による少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含むセットの使用に関する。

【0170】

具体的には、不要なＲＮＡ分子は、豊富なＲＮＡ分子である。好ましくは、不要なＲＮＡ分子は、２００リボヌクレオチド未満の長さを有する豊富な非コードＲＮＡ分子である。より好ましくは、不要なＲＮＡ分子は、豊富なｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）、Ｙ－ＲＮＡ、及び／又はＹ－ＲＮＡフラグメント（Ｙ－ＲＮＡフラグメントは完全長Ｙ－ＲＮＡではない）である。あるいは、不要なＲＮＡ分子は、豊富な低分子核小体リボ核酸（ｓｎｏＲＮＡ）、リボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）フラグメント（ｒＲＮＡフラグメントは完全長ｒＲＮＡではない）、及び／又はトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）である。より具体的には、不要なＲＮＡ分子は、豊富なｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ アイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）、Ｙ－ＲＮＡ、Ｙ－ＲＮＡフラグメント（Ｙ－ＲＮＡフラグメントは完全長Ｙ－ＲＮＡではない）、ｓｎｏＲＮＡ、ｒＲＮＡフラグメント（ｒＲＮＡフラグメントは完全長ｒＲＮＡではない）、及び／又はｔＲＮＡである。さらにより好ましくは、不要なＲＮＡ分子は、豊富なｍｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）である。豊富なＲＮＡ分子は、低分子ＲＮＡ ＮＧＳ実験における全処理された読み取りの０．０５％を超えて消費するＲＮＡ実体である。当業者は、例えばＮＧＳ実験で、ＲＮＡ分子の存在量を決定することができる。

【0171】

ブロッキングオリゴヌクレオチド、不要なＲＮＡ分子、及びＲＮＡサンプルの好ましい実施形態については、本発明の第１、第２、第３、及び第４の態様を参照する。

【0172】

第９の態様では、本発明は、第一の態様によるオリゴヌクレオチド、又は第２の態様による少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含むセット、を含むキットに関する。

【0173】

好ましい一実施形態では、キットは、逆転写酵素をさらに含む。特に、逆転写酵素は、ＡＭＶ（鳥骨髄芽球症ウイルス）逆転写酵素、ＭｏＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）逆転写酵素、又はＴｔｈ（サーマス サーモピュラス）ＤＮＡポリメラーゼ及びそれらの誘導体からなる群から選択される。逆転写を開始するために、逆転写酵素は、新しい鎖を合成するための開始点として機能するプライマーを必要とする。このプライマーは、ＲＴ－プライマーとも呼ばれる。したがって、より具体的には、キットは、逆転写を行うためのＲＴ－プライマー及び／又は緩衝液成分をさらに含む。

【0174】

ＲＴ－プライマーは、所望のＲＮＡ分子に対して逆相補的であることができる。所望のＲＮＡ分子が、５’アダプター及び３’アダプターに隣接している場合、ＲＴ－プライマーの配列は３’アダプターの配列に依存する可能性がある。

【0175】

この場合、キットは、具体的には、本発明の第３又は第４の態様による方法を行う方法についての説明書をさらに含む。この構成を有するキットは、具体的には、本発明の第３又は第４の態様による方法をさらに行うことを可能にする。

【0176】

１つの（付加的又は代替的な）好ましい実施形態において、キットは、ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む。特に、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ
ＤＮＡポリメラーゼ及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ並びにそれらの誘導体からなる群から選択される。より具体的には、キットは、ＤＮＡ増幅を行うためのフォワードプライマー及びリバースプライマー及び／又は緩衝液成分をさらに含む。

【0177】

この場合、キットは、具体的には、本発明の第５の態様による方法を行う方法についての説明書をさらに含む。この構成のキットにより、具体的には、本発明の第５の態様に係る方法をさらに行うことができる。

【0178】

１つの（追加的又は代替的な）好ましい実施形態では、キットは、例えば説明書、必要な成分、ポジティブコントロール及びネガティブコントロールなどのシーケンシング（例えば、次世代シーケンシング）、特に二本鎖ｃＤＮＡ産物（例えば、ｃＤＮＡライブラリ）のための手段をさらに含む。この場合、キットは、第６の態様による方法を行う方法についての説明書をさらに含むことが好ましい。この構成を有するキットは、好ましくはさらに、第６の態様による方法を行うことを可能にする。

【0179】

特に、このキットは、逆転写中のＲＮＡサンプル中の１つ以上の不要なＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成を阻害するのに適している／使用される。あるいは、このキットは、逆転写中のＲＮＡサンプル中の１つ以上の所望のＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成を改善するために適している／使用される。

【0180】

特に、ＲＮＡサンプルは、生体サンプルであるか、又は生体サンプルから調製／取得される。より具体的には、生体サンプルは、血液サンプルである。さらにより具体的には、血液サンプルは、全血又は血液分画、具体的には血球（例えば、赤血球、白血球、及び／又は血小板）、血清、又は血漿である。ＲＮＡサンプルはまた、全ＲＮＡを含み得る。

【0181】

さらに、ＲＮＡサンプルは、必要な／不要なＲＮＡ分子としてｍｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）を特に含むことが明らかである。前記ｍｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）は、一本鎖ＲＮＡ分子として存
在し得る。前記ｍｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）はまた、アダプター分子に付着／結合／隣接して存在し得る。特に、アダプター分子は、ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）の５’末端に連結され（５’アダプター）、及びｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）の３’末端に連結される（３’アダプター）。言い換えれば、必要な／不要なＲＮＡ分子としてのｍｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）は、５’アダプター分子及び３’アダプター分子に隣接している。このアダプターは、ｍｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）の５’及び３’末端にハイブリダイズし、ｃＤＮＡ合成のテンプレートとして使用できる連結されたＲＮＡ分子の形成を可能にする。このようにして、ｍｉＲＮＡだけでなく、それらのバリアント（即ち、ｉｓｏｍｉＲ）も検出することができ、これにより、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、ｃＤＮＡライブラリ構築、及び多様な診断方法などのさまざまな分子技術が改善される。

【0182】

上記を考慮して、キットは、さらに好ましい実施形態では、以下のコンポーネントを含む：
第１の態様によるオリゴヌクレオチド、
第２の態様による少なくとも２つのブロッキングオリゴヌクレオチドを含むセット、
逆転写酵素、及び
任意で逆転写を行うためのＲＴ－プライマー。

【0183】

特に、逆転写酵素は、ＡＭＶ（鳥類骨髄芽球症ウイルス）逆転写酵素、ＭｏＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）逆転写酵素、又はＴｔｈ（サーマス サーモピュラス）ＤＮＡポリメラーゼ及びそれらの誘導体からなる群から選択される。逆転写を行うための緩衝液成分は、さらにキットの一部となり得る。

【0184】

キットは、さらに好ましい実施形態では、以下のコンポーネントを含む：
第１の態様によるオリゴヌクレオチド、又は
第２の態様による少なくとも２つのブロッキングオリゴヌクレオチドを含むセット、
逆転写酵素、
ＤＮＡポリメラーゼ、及び
任意で逆転写を行うためのＲＴ－プライマー及び／又はＤＮＡ増幅を行うためのフォワード及びリバースプライマー。

【0185】

特に、逆転写酵素は、ＡＭＶ（鳥類骨髄芽球症ウイルス）逆転写酵素、ＭｏＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）逆転写酵素、又はＴｔｈ（サーマス サーモピュラス）ＤＮＡポリメラーゼ及びそれらの誘導体からなる群から選択される。

【0186】

特に、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、並びにそれらの誘導体からなる群から選択される。逆転写及び／又はＤＮＡ増幅を行うための緩衝液成分が、さらにキットの一部であり得る。

【0187】

キットは、さらに好ましい実施形態では、以下のコンポーネントを含む：
第１の態様によるオリゴヌクレオチド、又は
第２の態様による少なくとも２つのブロッキングオリゴヌクレオチドを含むセット、
逆転写酵素、
ＤＮＡポリメラーゼ、
シーケンシング手段（例えば、次世代シーケンシング）、及び
任意で、逆転写を行うためのＲＴ－プライマー及び／又はＤＮＡ増幅を行うためのフォワード及びリバースプライマー。

【0188】

特に、逆転写酵素は、ＡＭＶ（鳥類骨髄芽球症ウイルス）逆転写酵素、ＭｏＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）逆転写酵素、又はＴｔｈ（サーマス サーモピュラス）ＤＮＡポリメラーゼ及びそれらの誘導体からなる群から選択される。
特に、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ並びにそれらの誘導体からなる群から選択される。
逆転写、ＤＮＡ増幅、及びシーケンシング（例えば、次世代シーケンシング）を行うための緩衝液成分が、さらにキットの一部であり得る。

【0189】

キットは、さらに、
（ｉ）キットのさまざまなコンポーネント用の１つ以上のコンテナ、及び／又は
（ｉｉ）データキャリアが含まれ得る。
上記データキャリアは、非電子データキャリア（例えば、情報リーフレット、情報シート、バーコード、アクセスコードなどのグラフィカルデータキャリア）、又は、フロッピーディスク、コンパクトディスク（ＣＤ）、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、マイクロチップ又は他の半導体ベースの電子データキャリアなどの電子データキャリアであり得る。アクセスコードは、データベース（例えば、インターネットデータベース、集中型又は分散型データベース）にアクセスすることを許可する。アクセスコードもまた、コンピューターユーザーのためにコンピューターにタスクを実行させるアプリケーションソフトウェア、又はスマートフォン及びその他のモバイルデバイスで実行するために設計されたソフトウェアであるモバイルアプリにアクセスをすることを可能にする。

【0190】

前記データキャリアは、本発明の第３乃至第６の態様による方法を行う方法に関する情報又は指示をさらに含んでもよい。

【0191】

前記キットにはまた、本発明の第３乃至第６の態様による方法を行うために役立ち得る緩衝液、試薬、及び／又は希釈剤を含む、商業的及び使用者の観点から望ましい物質も含まれ得る。

【0192】

本明細書に記載の配列番号１乃至配列番号３３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するブロッキングオリゴヌクレオチドは、それぞれ配列番号３４乃至配列番号６６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する不要なＲＮＡ分子の少なくとも１（コア）領域に対して逆相補的であることに留意すべきである。さらに、本明細書に記載の配列番号７６乃至配列番号１２２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するブロッキングオリゴヌクレオチドは、それぞれ配列番号１２３乃至配列番号１６９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する不要なＲＮＡ分子の少なくとも１（コア）領域に対して逆相補的である。

【0193】

本発明の様々な修正及び変形は、本発明の範囲から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して説明されているが、特許請求の範囲の発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際、関連分野の当業者にとって明らかな、本発明を実施するための説明されたモードの様々な修正は、本発明によってカバーされることが意図されている。

【図面の簡単な説明】

【0194】

以下の図は、本発明を例示するに過ぎず、いかなる方法であっても、添付の特許請求の範囲で示される本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

【図1】ｍｉＲ－１６－５ｐの相対的発現を示す第１ブロッキングテストのｑＲＴ－ＰＣＲ結果。ブロッキングコントロールなしは、１に設定されている。結果は、カスタムオリゴが、ｍｉＲ－１６－５ｐの発現を１０，０００倍以上抑制できることを示している。

【図2】マップされたｍｉＲＮＡの正規化されたＲＰＭ値が、プロットされている。Ｘ軸には、ブロッキングなしのコントロールサンプルの値がプロットされ、一方Ｙ軸には、ブロッキングオリゴサンプルの値がプロットされている。値は、ｌｏｇ２ ＲＰＭとして表される。標的ｍｉＲ－１６－５ｐ ｍｉＲＮＡが注釈されている。

【図3】すべての検出されたＲＮＡの正規化されたＲＰＭ値が、プロットされている。Ｘ軸は、ブロッキングなしのコントロールサンプルの値であり、一方Ｙ軸は、ブロッキングオリゴサンプルの値である。値はｌｏｇ２ ＲＰＭとして表される。１より低いＲＰＭを有するＲＮＡは、表示されない。ｍｉＲ－１６－５ｐのシーケンス（カノニカルｍｉＲＮＡ及びｉｓｏｍｉＲ）は黒で表され、注釈が付けられている。

【図4】マップされたｍｉＲＮＡの正規化されたＲＰＭ値がプロットされている。Ｙ軸には、ブロッキングなしのコントロールサンプルの値がプロットされ、一方Ｘ軸には、ブロッキングオリゴ混合実験からのサンプルの値がプロットされている。値は、ｌｏｇ２ ＲＰＭとして表される。標的（ターゲット）又は標的外（オフターゲット）としてブロッキングされたｍｉＲＮＡには注釈が付けられている。

【実施例】

【0195】

以下に示す例は説明のみを目的としており、上記の発明を何ら制限するものではない。

【0196】

イントロダクション
ＰＡＸｇｅｎｅチューブに採取された臨床末梢血サンプルは、ＲＮＡの抽出に使用できる。ＰＡＸｇｅｎｅＲＮＡサンプルは、血液の細胞コンパートメント（血球）と非細胞コンパートメント（血漿）に含まれる、全ＲＮＡを表す。ＰＡＸｇｅｎｅＲＮＡは、通常、シリカビーズベースの手順を使用して分離され、そして溶出後に－８０℃で保存される。

【0197】

ＰＡＸｇｅｎｅＲＮＡ安定化試薬の無差別な性質により、ＲＮＡ含有量は、最も豊富な細胞種（即ち、赤血球）由来のＲＮＡにより占められている。次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用したｍｉＲＮＡプロファイリングは、典型的なヒトＰＡＸｇｅｎｅ末梢血ＲＮＡが、通常、診断価値がなく、ＮＧＳ機器の読み取り容量を不必要に消費するいくつかのｍｉＲＮＡ及びＹ－ＲＮＡフラグメントにより占められていることが明らかになった。

【0198】

ここでは、不要な（豊富な）ＲＮＡ種をブロックすることにより、ＮＧＳパイプラインを使用して、特定のサンプル中の低分子ＲＮＡ種の読み取り深度及び検出を増加できる方法が説明される。この方法は、逆転写ステップを使用する任意の標的ＲＮＡ、任意のＲＮＡサンプル、及び任意のライブラリ準備プロトコルに適用できる。

【0199】

その原理は、逆転写酵素の進行を阻害、減速、又は停止させる高融点を有するオリゴ標的ＲＮＡ二本鎖構造を形成することである。通常、ＲＴは鎖置換活性を有しているので、分子レベルでこれがどのように起こるかは、現在不明である。ただし、ＲＮＡ生化学の分野では、高度に構造化されたＲＮＡの二本鎖領域は、ＲＴ反応にたいして不利であることがしられており、そして最終的には、二本鎖ＲＮＡ構造を融解するために高温（最大５５℃）で機能できるＲＴバリアントの開発につながる。

【0200】

実施例１ ３つのオリゴバージョンのｑＰＣＲ及びＮＧＳ：
安定した二本鎖構造を実現するために、ロック核酸（ＬＮＡ）修飾ヌクレオチド及び／又は２’－ｏ－メチル修飾を有するリボヌクレオチドを、ブロッキングオリゴヌクレオチドの構成要素として使用した。このアプローチを試験するために、ｍｉＲ－１６－５ｐは標的とされ、成熟したカノニカル配列は以下のとおりである：
５’－ＵＡＧＣＡＧＣＡＣＧＵＡＡＡＵＡＵＵＧＧＣＧ－３’（配列番号６７）
（ここで、下線付きの領域は、アンチセンスオリゴヌクレオチド ｂｌｏｃｋ＿ｍｉＲ－１６－５ｐ＿ｖ１、ｂｌｏｃｋ＿ｍｉＲ－１６－５ｐ＿ｖ２、及びｂｌｏｃｋ＿ｍｉＲ－１６－５ｐ＿ｖ３によって標的にされる（下記を参照。））

【0201】

ｍｉＲ－１６－５ｐに対するアンチセンスオリゴの３つのバージョンが設計された：
ｂｌｏｃｋ＿ｍｉＲ－１６－５ｐ＿ｖ１：Ｃ＋ＣＡＡ＋ＴＡ＋ＴＴ＋ＴＡ＋ＣＧＴ＋ＧＣＴ＋ＧＣ（配列番号６８）
ｂｌｏｃｋ＿ｍｉＲ－１６－５ｐ＿ｖ２：ｍＣｍＣｍＡｍＡｍＵｍＡｍＵｍＵｍＵｍＡｍＣｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵｍＧｍＣ （配列番号６９）
ｂｌｏｃｋ＿ｍｉＲ－１６－５ｐ＿ｖ３： ｍＣｍＣｍＡｍＡ＋ＴＡ＋ＴＴ＋ＴＡ＋ＣＧ＋ＴＧｍＣｍＵｍＧｍＣ（配列番号２）
（ここで、「＋Ｎ」は、ＬＮＡヌクレオチドを示し、「ｍＮ」は、２’－ｏ－メチルリボヌクレオチドを示す。

【0202】

次に、ブロッキングの効果を試験するために、以下の実験を準備した。

【0203】

以下に概説するように、１００ｎｇのＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡを、３’アダプター連結反応に使用した。

【0204】

【表1】

【0205】

プレアデニル化ＤＮＡリンカー配列：５’－ＡＡＣＴＧＴＡＧＧＣＡＣＣＡＴＣＡＡＴ－３’（配列番号７０）。
反応を、２５℃で１時間保持し、その後６５℃で１５分間保持した。その後、反応を、４℃まで冷却した。前の反応に、以下の成分を、５’アダプターのライゲーションのために追加した。

【0206】

【表2】

【0207】

ＲＮＡアダプター配列：５’－ＧＵＵＣＡＧＡＧＵＵＣＵＡＣＡＧＵＣＣＧＡＣＧＡＵＣ－３’（配列番号７１）。
反応を、２５℃で１時間保持し、その後６５℃で１５分間保持した。その後、反応を、４℃まで冷却した。

【0208】

前の反応に、以下のストックからのブロッキングオリゴ１μＬを加えた：１００μＭ、
１０μＭ、１μＭ、０．１μＭ。

【0209】

【表3】

【0210】

反応を、８５℃で２分間変性させ、ＰＣＲ装置で０．１℃／秒で２５℃まで傾斜降下させ、２５℃で５分間保持させた。その後、反応を、氷上に置き、以下の成分を加えた。

【0211】

【表4】

【0212】

ＲＴ－プライマーＤＮＡオリゴの配列は、次のとおりである（ここで、“＋”はロックド核酸を示し、“Ｎ”は任意のデオキシリボヌクレオチドである）。
５’－ＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＴＴＧＡＴＧ＋ＧＴ＋ＧＣＣＴＡＣＡＧＴＴ－３’（配列番号７２）（“＋”はＬＮＡ強化ヌクレオチドを示し、“＋”の右側のヌクレオチドはＬＮＡ強化ヌクレオチドであり、“Ｎ”はランダムなデオキシヌクレオチドを示す）。

【0213】

反応を、５０℃で３０分間、及びその後８５℃で５分間インキュベートした。その後、反応を氷上に置いた。

【0214】

次に、ｃＤＮＡを、販売会社の推奨に従って、Ｏｍｅｇａ ＭａｇＢｉｎｄ ｐｕｒｅ
ＮＧＳビーズ（Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏ－Ｔｅｋ社）を使用して、精製した。ビーズを、ｃＤＮＡ反応体積に対して２．５倍の比率で使用した。ｃＤＮＡを、２５μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で溶出した。

【0215】

その後、ｃＤＮＡを、ヌクレアーゼフリー水で１：２５に希釈し、ＳｙＢｒグリーンベースのｑＰＣＲ検出に使用した。ｑＰＣＲテスト（図１）は、カスタムオリゴが、ｍｉＲ－１６－５ｐの発現を１０，０００倍以上抑制できることを示した。

【0216】

次に、１０μＭブロッキングオリゴを有するサンプルのためのｃＤＮＡを、規範的な成分を使用してライブラリＰＣＲに使用した。

【0217】

【表5】

【0218】

インデックスプライマーの配列は、以下のとおりです：
フォワードプライマー：
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＡＣＡＣＧＴＴＣＡＧＡＧＴＴＣＴＡＣＡＧＴＣＣＧ＊Ａ（配列番号７３）。
リバースプライマー：
ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＡＴＮＮＮＮＮＮＮＮＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣ＊Ｔ（配列番号７４）、
（“＊”は、ホスホチオエート結合を示し、“Ｎ”はプライマー毎に固有の８ヌクレオチドインデックス配列を示す。）

【0219】

反応条件は次のとおりであった。

【表6】

【0220】

次に、ＰＣＲ産物を、販売会社の推奨に従って、Ｏｍｅｇａ ＭａｇＢｉｎｄ ｐｕｒｅ ＮＧＳビーズ（Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏ－Ｔｅｋ社）を使用して精製した。まず、ＰＣＲ反応量に対して０．９倍のビーズを使用し、そして上清を上清に対して１．８倍のビーズを用いて、２回目の結合反応のために使用した。ＤＮＡを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）の２０μＬで溶出した。

【0221】

次に、ＤＮＡ濃度を、ＱｕａｎｔＩＴ（サーモフィッシャー サイエンティフィック社）を使用して測定した。ＤＮＡライブラリの等モルプールを準備し、そしてＮｅｘｔＳｅｑ２０００ Ｐ３ ５０サイクルカートリッジ（イルミナ社）に５００ｐＭ濃度でロードした。カスタム インデックス２プライマーを、シーケンシングのために使用した（配列：５’－ＧＡＴＣＧＴＣＧＧＡＣＴＧＴＡＧＡＡＣＴＣＴＧＡＡＣＧＴＧＴ－３’（配列番号７５））。

【0222】

配列ファイルを、３’アダプター配列をトリミングして前処理した。リードカウントマトリックスを確立し、そしてデータをｍｉＲ Ｂａｓｅ ｖ２２．０にマッピングした。ブロックされたサンプル及びブロックされていない対照サンプルのＲＰＭ値を計算した。図２は、１０μＭ濃度の各オリゴでのテスト結果を示し、ブロックされたサンプル対ブロックされていない対照（注釈付き）中のｍｉＲ－１６－５ｐのＲＰＭ（１００万あたりの読み取り数、ｌｏｇ２）値をプロットした。その他のｍｉＲＮＡを、濃い灰色で表示した。ｍｉＲ－１６－５ｐのＲＰＭ値の減少によって測定されるブロッキング効果は、オリゴのｖ１で最もよく達成されるが、ｖ１によって影響される、高存在量の標的外ｍｉＲＮＡが存在するようである。ｖ２及びｖ３オリゴは、マッピングされたｍｉＲＮＡに対して標的外効果を引き起こさないようであり、それらの相関係数は、ｖ１バージョンの相関係数よりも高い。

【0223】

次に、すべての検出されたＲＮＡ（カノニカルｍｉＲＮＡだけでなく）のＲＰＭ値を調べ、そしてサンプルの標的外効果及び全体的な相関関係を評価した（図３）。同様に、ブロッキングオリゴのバージョン２及び３は、相関関係が高く、かつ標的効果外は少なくなっている（対角線からさらに離れた灰色の点から理解される）。

【0224】

ｑＰＣＲ及びＮＧＳの結果を考慮して、設計バージョン３（ｖ３）で作業を継続することを決定した。

【0225】

実施例２ ３３の標的ＲＮＡ及びその他を阻害するＮＧＳ：
生化学的手法により、ＮＧＳ実験からｍｉＲＮＡ／Ｙ－ＲＮＡを除去する目的のために、ＰＡＸｇｅｎｅヒト血液ＲＮＡサンプル中で最も豊富なｍｉＲＮＡ／Ｙ－ＲＮＡ種が定義された：

【表7】

【0226】

これらの標的ｍｉＲＮＡ／Ｙ－ＲＮＡのそれぞれに対するブロッキングオリゴを設計し
、ＲＮａｓｅフリーＨＰＬＣ品質で市販業者に注文した。

【0227】

設計及び使用したブロッキングオリゴは、以下の表から取得できる：

【表8】

（表中“＋Ｎ”はＬＮＡヌクレオチドを示し、“ｍＮ”は２’－ｏ－メチルリボヌクレオチドを示す）

【0228】

配列番号１乃至配列番号３３によるヌクレオチド配列を有するオリゴを、不要なｍｉＲＮＡ及び／又はｉｓｏｍｉＲ、又は不要なＹ－ＲＮＡ及び／又はそのフラグメントに結合するように設計した。これらを、以下の表にまとめた：

【表9】

【0229】

オリゴが結合するＲＮＡ分子領域のみが示されていることに留意されたい。

【0230】

追加のオリゴを設計した。これらのオリゴは、配列番号７６乃至配列番号１２２によるヌクレオチド配列を有し、かつこれらのオリゴを他の不要なＲＮＡ種に結合するように設計した。これらのオリゴを、以下の表にまとめた：

【表10】

（表中、“＋Ｎ”はＬＮＡヌクレオチドを示し、“ｍＮ”は２’－ｏ－メチルリボヌクレオチドを示す。）

【0231】

配列番号７６乃至配列番号１２２によるヌクレオチド配列を有するオリゴが結合する不要なＲＮＡ種を、以下の表にまとめた：

【表11】

【0232】

オリゴが結合するＲＮＡ分子領域のみを示していることに留意されたい。

【0233】

オリゴ混合物
乾燥したオリゴを、ＲＮａｓｅフリー水に再懸濁し、そして上記の表に概説されている最終濃度で水中で一緒に混合した。オリゴ混合物を、－２０℃で保存した。オリゴ混合物を、上記と同様にＮＧＳ実験に使用した。図４に、ブロックされたｍｉＲＮＡ種は対角線の近く又は上に表示され、ブロックされていないｍｉＲＮＡ種はさらに下に表示されますという、この実験の結果を示した。ブロックされていないｍｉＲＮＡは、ＲＰＭの増加を示す。ブロック効果を示したｍｉＲＮＡに注釈を付けた。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図4】

【配列表】

2024537425000001.app

【手続補正書】

【提出日】2024-06-19

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

１つ以上の修飾リボヌクレオチド及び／又は１つ以上のロックドヌクレオチドを含むブロッキングオリゴヌクレオチド。

【請求項2】

前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、不要なＲＮＡ分子の少なくとも１領域に対して逆相補的である、請求項１に記載のブロッキングオリゴヌクレオチド。

【請求項3】

前記不要なＲＮＡ分子が、２００リボヌクレオチド未満の長さを有する豊富な非コードＲＮＡ分子である、請求項２に記載のブロッキングオリゴヌクレオチド。

【請求項4】

前記不要なＲＮＡ分子が、豊富なｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）、Ｙ－ＲＮＡ、Ｙ－ＲＮＡフラグメント（Ｙ－ＲＮＡフラグメントは完全長Ｙ－ＲＮＡではない）、ｓｎｏＲＮＡ、ｒＲＮＡフラグメント（ｒＲＮＡフラグメントは完全長ｒＲＮＡではない）、又はｔＲＮＡである、請求項３に記載のブロッキングオリゴヌクレオチド。

【請求項5】

前記１つ以上の修飾リボヌクレオチドが、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチド配列及び／又は３’末端ヌクレオチド配列に含まれ、かつ／又は前記１つ以上のロックドヌクレオチドが、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドの中央ヌクレオチド配列に含まれる、請求項１に記載のブロッキングオリゴヌクレオチド。

【請求項6】

前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは、５’から３’までを：
（ｉ）１つ以上の（連続した）修飾リボヌクレオチドを含む５’末端ヌクレオチド配列、（ｉｉ）１つ以上の（連続しない）ロックドヌクレオチドを含む中央ヌクレオチド配列、及び
（ｉｉｉ）１つ以上の（連続した）修飾リボヌクレオチドを含む３’末端ヌクレオチド配列、
の順序で含む、請求項１に記載のブロッキングオリゴヌクレオチド。

【請求項7】

前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは、３乃至１０のロックドヌクレオチドを含む、請求項１に記載のブロッキングオリゴヌクレオチド。

【請求項8】

前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、４乃至２２の修飾リボヌクレオチドを含む、請求項１に記載のブロッキングオリゴヌクレオチド。

【請求項9】

前記修飾リボヌクレオチドが、２’－ｏ－メチルリボヌクレオチドである、請求項１に記載のブロッキングオリゴヌクレオチド。

【請求項10】

前記ロックドヌクレオチドが、ＬＮＡ－アデニン、ＬＮＡ－グアニン、ＬＮＡ－シトシン、及びＬＮＡ－チミンからなる群から選択される、請求項１に記載のブロッキングオリゴヌクレオチド。

【請求項11】

前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、１６乃至２２ヌクレオチド長を有する、請求項１に記載のブロッキングオリゴヌクレオチド。

【請求項12】

前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、配列番号３４乃至配列番号６６及び配列番号１２３乃至配列番号１６９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する不要なＲＮＡ分子の少なくとも１領域に対して逆相補的である、請求項１に記載のブロッキングオリゴヌクレオチド。

【請求項13】

前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、配列番号１乃至配列番号３３及び配列番号７６乃至配列番号１２２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載のブロッキングオリゴヌクレオチド。

【請求項14】

請求項１に記載の少なくとも２つのブロッキングオリゴヌクレオチドを含むセット。

【請求項15】

前記少なくとも２つのブロッキングオリゴヌクレオチドが、それらのヌクレオチド配列において互いに異なり、かつ／又は前記少なくとも２つのブロッキングオリゴヌクレオチドが、異なる不要なＲＮＡ分子の少なくとも１領域に対して逆相補的である、請求項１４に記載のセット。

【請求項16】

逆転写中のＲＮＡサンプル中の１つ以上の不要なＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成を阻害する方法であって、：
（ｉ）１つ以上の所望のＲＮＡ分子及び１つ以上の不要なＲＮＡ分子を含むＲＮＡサンプル、ならびに請求項１に記載の１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチド（又は請求項１４に記載のセットに含まれるブロッキングオリゴヌクレオチド）を含有する混合物を提供するステップであって、ここで該１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドが、１つ以上の不要なＲＮＡ分子にアニーリングされるステップ、及び
（ｉｉ）１つ以上の所望のＲＮＡ分子を逆転写し、それによって前記所望のＲＮＡ分子から１つ以上のｃＤＮＡ産物を得、かつ１つ以上の不要なＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成を阻害するステップ、
を含む方法。

【請求項17】

前記１つ以上の所望のＲＮＡ分子の逆転写は、
（ｉｉａ）逆転写（ＲＴ）プライマー用のプライマーを１つ以上の所望のＲＮＡ分子とアニーリングすること、及び
（ｉｉｂ）逆転写酵素（ＲＴ）を使用することによって、又は逆転写酵素（ＲＴ）とともに１つ以上の所望のＲＮＡ分子を逆転写すること、
によって行われる、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記ＲＮＡサンプルが、生体サンプルであるか、又は生体サンプルから調製され、ここで前記生体サンプルが血液サンプルである、請求項１６に記載の方法。

【請求項19】

逆転写中のＲＮＡサンプル中の１つ以上の所望のＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成の（ｃＤＮＡ合成を改善する）ための方法であって、：
（ｉ）１つ以上の所望のＲＮＡ分子及び１つ以上の不要なＲＮＡ分子を含むＲＮＡサンプル、ならびに請求項１に記載の１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチド（又は請求項１４に記載のセットに含まれるブロッキングオリゴヌクレオチド）を含有する混合物を提供するステップであって、該１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドが１つ以上の不要なＲＮＡ分子にアニーリングされるステップ、及び
（ｉｉ）１つ以上の所望のＲＮＡ分子を逆転写し、それによって前記所望のＲＮＡ分子から１つ以上のｃＤＮＡ産物を得、かつ１つ以上の不要なＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成を阻害するステップ、
を含む方法

【請求項20】

前記１つ以上の所望のＲＮＡ分子の逆転写が、
（ｉｉａ）逆転写（ＲＴ）プライマー用のプライマーを１つ以上の所望のＲＮＡ分子とアニーリングすること、及び
（ｉｉｂ）逆転写酵素（ＲＴ）を使用することによって、又は逆転写酵素（ＲＴ）とともに、１つ以上の所望のＲＮＡ分子を逆転写すること、
によって行われる、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記ＲＮＡサンプルが、生体サンプルであるか、又は生体サンプルから調製され、ここで、前記生体サンプルが、血液サンプルである、請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

１つ以上の所望のＲＮＡ分子から１つ以上の二本鎖ｃＤＮＡ産物を生成するための方法であって、
（ｉ）請求項１６に記載の方法を行うステップ、及び
（ｉｉ）１つ以上のｃＤＮＡ産物を増幅し、それによって１つ以上の所望のＲＮＡ分子から１つ以上の二本鎖ｃＤＮＡ産物を生成するステップ、
を含む方法。

【請求項23】

１つ以上の所望のＲＮＡ分子から１つ以上の二本鎖ｃＤＮＡ産物を生成するための方法であって、
（ｉ）請求項１９に記載の方法を行うステップ、及び
（ｉｉ）１つ以上のｃＤＮＡ産物を増幅し、それによって１つ以上の所望のＲＮＡ分子から１つ以上の二本鎖ｃＤＮＡ産物を生成するステップ、
を含む方法。

【請求項24】

１つ以上の所望のＲＮＡ分子のプロファイルを決定する方法であって、
請求項２２に記載の方法によって生成される１つ以上の所望のＲＮＡ分子からの１つ以上の二本鎖ｃＤＮＡ産物をシーケンシングするステップを含む、方法

【請求項25】

１つ以上の所望のＲＮＡ分子のプロファイルを決定する方法であって、
請求項２３に記載の方法によって生成される１つ以上の所望のＲＮＡ分子からの１つ以上の二本鎖ｃＤＮＡ産物をシーケンシングするステップを含む、方法。

【請求項26】

逆転写中のＲＮＡサンプル中の不要なＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成を阻害するための、請求項１に記載のブロッキングオリゴヌクレオチドの使用。

【請求項27】

逆転写中のＲＮＡサンプル中の不要なＲＮＡ分子のｃＤＮＡ合成を阻害するための、請求項１４に記載の少なくとも２つのブロッキングオリゴヌクレオチドを含むセットの使用。

【請求項28】

請求項１に記載のオリゴヌクレオチド、又は請求項１４に記載の少なくとも２つのブロッキングオリゴヌクレオチドを含むセット、を含むキット。

【国際調査報告】