特表 2024-537471 エキソヌクレアーゼ連動式リアルタイムエンドヌクレアーゼ活性アッセイ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-10

(54)【発明の名称】エキソヌクレアーゼ連動式リアルタイムエンドヌクレアーゼ活性アッセイ

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/44 20060101AFI20241003BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/44 ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024525018

(86)(22)【出願日】2022-10-24

(85)【翻訳文提出日】2024-05-13

(86)【国際出願番号】 US2022078583

(87)【国際公開番号】W WO2023076857

(87)【国際公開日】2023-05-04

(31)【優先権主張番号】63/272,091

(32)【優先日】2021-10-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】515251115

【氏名又は名称】カリブー・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100216105

【弁理士】

【氏名又は名称】守安 智

(72)【発明者】

【氏名】スティーヴン・スミス

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QA19

4B063QQ03

4B063QQ34

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR14

4B063QR32

4B063QR58

4B063QS28

4B063QX02

(57)【要約】

本発明は、エンドヌクレアーゼの活性を評価する高速ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法、およびそのための基質を含む。組成物、診断方法、およびキットも開示される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

エンドヌクレアーゼの活性を検知するための核酸基質であって：
（ａ）蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を形成するドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォア；
（ｂ）エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する少なくとも１つの核酸鎖における少なくとも１つの構造；ならびに
（ｃ）エンドヌクレアーゼのための認識配列
を含む核酸基質。

【請求項2】

エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する少なくとも１つの構造は、３’－５’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各３’末端における構造、５’－３’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各５’末端における構造、またはその両方から選択される、請求項１に記載の基質。

【請求項3】

エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＴ、ＢＡＬ－３１エキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪｆエキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ Ｒ、ＲＮａｓｅ ＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｄ、ＲＮａｓｅ Ｔ、ＲＮａｓｅ ＢＮ、ＲＮａｓｅ ＰＨ、エキソリボヌクレアーゼＩ、およびエキソリボヌクレアーゼＩＩから選択される、請求項１に記載の基質。

【請求項4】

アクセプターフルオロフォアは、クエンチャーフルオロフォアである、請求項１に記載の基質。

【請求項5】

ドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォアは、１～１２ヌクレオチド離して配置されている、請求項１に記載の基質。

【請求項6】

ドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォアは、基質の同じ鎖上に配置されている、請求項１に記載の基質。

【請求項7】

ドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォアは、基質の異なる鎖上に配置されている、請求項１に記載の基質。

【請求項8】

一本鎖により形成されている、請求項１に記載の基質。

【請求項9】

ドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォアの一方は、基質の５’末端またはその付近に配置されている、請求項１に記載の基質。

【請求項10】

ドナーフルオロフォアは、５－カルボキシフルオレセイン（５－ＦＡＭ）、６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ）、２’，４’，１，４，－テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、２’，４’，５’，７’，１，４－ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、２’，７’－ジメトキシ－４’，５’－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、クマリン色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素、ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ、カスケードブルー、パシフィックブルー、パシフィックオレンジ、テキサスレッド、およびＢＯＤＩＰＹ（登録商標）色素からなる群から選択される、請求項１に記載の基質。

【請求項11】

アクセプターフルオロフォアは、テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラプロパノ－６－カルボキシローダミン（ＲＯＸ）、ＤＡＢＳＹＬ、ＤＡＢＣＹＬ（４－［［４－（ジメチルアミノ）－フェニル］－アゾ］－安息香酸）、Ｃｙ５およびＣｙ５．５、アントラキノン色素、ニトロチアゾール色素、ニトロイミダゾール色素、ＬＣ－Ｒｅｄ６１０、ＬＣ－Ｒｅｄ６４０、ＬＣ－Ｒｅｄ７０５、ＪＡ２８６、ＤＤＱ－Ｉ、ＤＤＱ－ＩＩ、ＱＳＹ－７、ＱＳＹ－２１、ＩＲＤｙｅ ＱＣ１、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱ、ＨＥＸ（ヘキサクロロ－フルオレセイン）、ＴＥＴ（テトラクロロ－フルオレセイン）、ＪＯＥ（５’－ジクロロ－ジメトキシ－フルオレセイン）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）色素、Ｅｃｌｉｐｓｅクエンチャー（４－［［２－クロロ－４－ニトロ－フェニル］－アゾ］－アニリン、ＢＨＱ－１（［（４－（２－ニトロ－４－メチル－フェニル）－アゾ）－イル－（（２－メトキシ－５－メチル－フェニル）－アゾ）］－アニリン）、ＢＨＱ－２（［（４－（１－ニトロ－フェニル）－アゾ）－イル－（（２，５－ジメトキシ－フェニル）－アゾ）］－アニリン）、ならびにピリジニル－イソキノリン－ジオン色素からなる群から選択される、請求項１に記載の基質。

【請求項12】

エンドヌクレアーゼは、ニッカーゼである、請求項１に記載の基質。

【請求項13】

エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、およびＢＡＬ３１エキソヌクレアーゼから選択される、請求項１２に記載の基質。

【請求項14】

エンドヌクレアーゼは、核酸誘導型エンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の基質。

【請求項15】

核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラスＩ（ＣＡＳＣＡＤＥ）エンドヌクレアーゼである、請求項１４に記載の基質。

【請求項16】

プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、請求項１５に記載の基質。

【請求項17】

プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）は、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＡＧＧ－３’、５’－ＡＴＧ－３’、５’－ＧＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、５’－ＧＴＧ－３’、５’－ＴＡＡ－３’、５’－ＴＧＧ－３’、５’－ＡＡＡ－３’、５’－ＡＡＣ－３’、５’－ＡＡＴ－３’、５’－ＡＴＡ－３’、５’－ＴＡＧ－３’、および５’－ＴＴＧ－３’から選択される配列からなる、請求項１６に記載の基質。

【請求項18】

核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラスＩＩエンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の基質。

【請求項19】

核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである、請求項１８に記載の基質。

【請求項20】

核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼである、請求項１９に記載の基質。

【請求項21】

プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、請求項２０に記載の基質。

【請求項22】

プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）は、５’－ＮＧＧ－３’、５’－ＮＧＧＮＧ－３’、５’－ＮＮＡＡＡＡＷ－３’、５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３’、５’－ＧＮＮＮＣＮＮＡ－３’、および５’－ＮＮＮＡＣＡ－３’から選択される配列からなる、請求項２１に記載の基質。

【請求項23】

プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）は、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＴＴＴＮ－３’および５’－ＴＴＴＶ－３’から選択される配列からなる、請求項２１に記載の基質。

【請求項24】

核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼおよび核酸ターゲティング核酸（ＮＡＴＮＡ）を含む、請求項１４に記載の基質。

【請求項25】

ＮＡＴＮＡは、シングルガイドおよびデュアルガイドから選択されるＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡである、請求項２４に記載の基質。

【請求項26】

ＮＡＴＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項２４に記載の基質。

【請求項27】

ＮＡＴＮＡは、基質中の一領域にハイブリダイズすることが可能なターゲティング領域を含む、請求項２４に記載の基質。

【請求項28】

ＮＡＴＮＡは、エンドヌクレアーゼと相互作用することが可能である、請求項２４に記載の基質。

【請求項29】

ＮＡＴＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドを含む、請求項２４に記載の基質。

【請求項30】

エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｆｏｋ ＩにコンジュゲートされたＺＦＮ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＥｎｄｏＴＴエンドヌクレアーゼ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅエンドヌクレアーゼ、Ａｒｃｕｓエンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ ＺおよびＲＮａｓｅ Ｐ、Ｃａｓ３およびＣａｓ７－１１から選択されるエンドリボヌクレアーゼ、ならびに制限エンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の基質。

【請求項31】

エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する構造は、ヘアピン、鎖オーバーハング、および核酸修飾から選択される、請求項１に記載の基質。

【請求項32】

核酸修飾は、１つまたはそれ以上のホスホロチオエート結合を含む、請求項３１に記載の基質。

【請求項33】

核酸修飾は、５つ以上のホスホロチオエート結合を含む、請求項３２に記載の基質。

【請求項34】

エンドヌクレアーゼはデオキシリボヌクレアーゼであり、基質はＤＮＡを含有する、請求項１に記載の基質。

【請求項35】

エンドヌクレアーゼはリボヌクレアーゼであり、基質はＲＮＡを含有する、請求項１に記載の基質。

【請求項36】

リボヌクレアーゼは、リボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、ＤＮＡザイム、ＰＮＡザイム、またはエンジニアリングされたエンドリボヌクレアーゼから選択される、請求項３５に記載の基質。

【請求項37】

請求項１に記載の核酸基質を含み、エキソヌクレアーゼをさらに含む、エンドヌクレアーゼの活性を検知するための組成物。

【請求項38】

エンドヌクレアーゼをさらに含む、請求項３７に記載の組成物。

【請求項39】

エンドヌクレアーゼは、ニッカーゼである、請求項３８に記載の組成物。

【請求項40】

エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、およびＢＡＬ３１エキソヌクレアーゼから選択される、請求項３７に記載の組成物。

【請求項41】

エキソヌクレアーゼは、ニックから加水分解を開始することが可能である、請求項３７に記載の組成物。

【請求項42】

エキソヌクレアーゼは、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＢａｌ３１、ＲＮａｓｅ Ｒ、ＲＮａｓｅ ＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｄ、ＲＮａｓｅ Ｔ、ＲＮａｓｅ ＢＮ、ＲＮａｓｅ ＰＨ、エキソリボヌクレアーゼＩ、およびエキソリボヌクレアーゼＩＩから選択される、請求項３７に記載の組成物。

【請求項43】

エンドヌクレアーゼは、核酸誘導型エンドヌクレアーゼである、請求項３７に記載の組成物。

【請求項44】

核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラスＩ（ＣＡＳＣＡＤＥ）エンドヌクレアーゼであり、基質は、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＡＧＧ－３’、５’－ＡＴＧ－３’、５’－ＧＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、５’－ＧＴＧ－３’、５’－ＴＡＡ－３’、５’－ＴＧＧ－３’、５’－ＡＡＡ－３’、５’－ＡＡＣ－３’、５’－ＡＡＴ－３’、５’－ＡＴＡ－３’、５’－ＴＡＧ－３’、および５’－ＴＴＧ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、請求項４３に記載の組成物。

【請求項45】

核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼであり、基質は、５’－ＮＧＧ－３’、５’－ＮＧＧＮＧ－３’、５’－ＮＮＡＡＡＡＷ－３’、５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３’、５’－ＧＮＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＮＮＮＡＣＡ－３’、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＴＴＴＮ－３’および５’－ＴＴＴＶ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、請求項４３に記載の組成物。

【請求項46】

核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼおよび核酸ターゲティング核酸（ＮＡＴＮＡ）を含む、請求項４３に記載の組成物。

【請求項47】

ＮＡＴＮＡは、シングルガイドおよびデュアルガイドから選択されるＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡである、請求項４６に記載の組成物。

【請求項48】

ＮＡＴＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項４６に記載の組成物。

【請求項49】

ＮＡＴＮＡは、基質の一領域にハイブリダイズすることが可能なターゲティング領域を含む、請求項４６に記載の組成物。

【請求項50】

ＮＡＴＮＡは、エンドヌクレアーゼと相互作用することが可能である、請求項４６に記載の組成物。

【請求項51】

ＮＡＴＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドを含む、請求項４６に記載の組成物。

【請求項52】

エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｆｏｋ ＩにコンジュゲートされたＺＦＮ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＥｎｄｏＴＴエンドヌクレアーゼ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅエンドヌクレアーゼ、Ａｒｃｕｓエンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ ＺおよびＲＮａｓｅ Ｐ、Ｃａｓ３およびＣａｓ７－１１から選択されるエンドリボヌクレアーゼ、ならびに制限エンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項３７に記載の組成物。

【請求項53】

エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する構造は、ヘアピン、鎖オーバーハング、および核酸修飾から選択される、請求項３７に記載の組成物。

【請求項54】

核酸修飾は、１つまたはそれ以上のホスホロチオエート結合を含む、請求項５３に記載の組成物。

【請求項55】

核酸修飾は、５つ以上のホスホロチオエート結合を含む、請求項５４に記載の組成物。

【請求項56】

エンドヌクレアーゼの活性を検知する方法であって：
（ａ）エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼを、核酸基質を含む反応混合物に接触させることであって、核酸基質は：
ｉ．蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を形成するドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォア；
ｉｉ．エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する少なくとも１つの鎖における少なくとも１つの構造；ならびに
ｉｉｉ．エンドヌクレアーゼのための認識配列
を含むこと、ならびに
（ｂ）反応混合物により放出された蛍光を測定することであって、蛍光における変化はエンドヌクレアーゼの活性を示すこと
を含む方法。

【請求項57】

エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する少なくとも１つの構造は、３’－５’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各３’末端における構造、５’－３’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各５’末端における構造、またはその両方から選択される、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＴ、ＢＡＬ－３１エキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪｆエキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ Ｒ、ＲＮａｓｅ ＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｄ、ＲＮａｓｅ Ｔ、ＲＮａｓｅ ＢＮ、ＲＮａｓｅ ＰＨ、エキソリボヌクレアーゼＩ、およびエキソリボヌクレアーゼＩＩから選択される、請求項５６に記載の方法。

【請求項59】

反応混合物をエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼに同時に接触させる、請求項５６に記載の方法。

【請求項60】

反応混合物を最初にエンドヌクレアーゼに接触させ、その後にエキソヌクレアーゼに接触させる、請求項５６に記載の方法。

【請求項61】

反応混合物をエンドヌクレアーゼに接触させることと反応混合物をエキソヌクレアーゼに接触させることとの間に精製工程は行われない、請求項５６に記載の方法。

【請求項62】

エンドヌクレアーゼは、核酸誘導型エンドヌクレアーゼである、請求項５６に記載の方法。

【請求項63】

核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラスＩ（ＣＡＳＣＡＤＥ）エンドヌクレアーゼであり、基質は、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＡＧＧ－３’、５’－ＡＴＧ－３’、５’－ＧＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、５’－ＧＴＧ－３’、５’－ＴＡＡ－３’、５’－ＴＧＧ－３’、５’－ＡＡＡ－３’、５’－ＡＡＣ－３’、５’－ＡＡＴ－３’、５’－ＡＴＡ－３’、５’－ＴＡＧ－３’、および５’－ＴＴＧ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼであり、基質は、５’－ＮＧＧ－３’、５’－ＮＧＧＮＧ－３’、５’－ＮＮＡＡＡＡＷ－３’、５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３’、５’－ＧＮＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＮＮＮＡＣＡ－３’、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＴＴＴＮ－３’および５’－ＴＴＴＶ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、請求項６２に記載の方法。

【請求項65】

核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼおよび核酸ターゲティング核酸（ＮＡＴＮＡ）を含む、請求項６２に記載の方法。

【請求項66】

ＮＡＴＮＡは、シングルガイドおよびデュアルガイドから選択されるＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡである、請求項６５に記載の方法。

【請求項67】

ＮＡＴＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項６５に記載の方法。

【請求項68】

ＮＡＴＮＡは、基質の一領域にハイブリダイズすることが可能なターゲティング領域を含む、請求項６５に記載の方法。

【請求項69】

ＮＡＴＮＡは、エンドヌクレアーゼと相互作用することが可能である、請求項６５に記載の方法。

【請求項70】

ＮＡＴＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドを含む、請求項６５に記載の方法。

【請求項71】

工程（ａ）における接触させることは、同じＮＡＴＮＡを含む一連の反応混合物を一連の異なるエンドヌクレアーゼに接触させることを含む、請求項５６に記載の方法。

【請求項72】

工程（ａ）における接触させることは、同じエンドヌクレアーゼを含む一連の反応混合物を一連の異なるＮＡＴＮＡに接触させることを含む、請求項５６に記載の方法。

【請求項73】

工程（ａ）における接触させることは、同じ成分を含む一連の反応混合物を異なる反応条件下で接触させることを含む、請求項５６に記載の方法。

【請求項74】

工程（ａ）における接触させることは、同じ成分を含む一連の反応混合物をエンドヌクレアーゼの異なる単離物に接触させることを含む、請求項５６に記載の方法。

【請求項75】

工程（ａ）における接触させることは、同じエンドヌクレアーゼを含む一連の反応混合物を、異なる配列を含む一連の異なる核酸基質に接触させることを含む、請求項５６に記載の方法。

【請求項76】

エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｆｏｋ ＩにコンジュゲートされたＺＦＮ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＥｎｄｏＴＴエンドヌクレアーゼ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅエンドヌクレアーゼ、Ａｒｃｕｓエンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ ＺおよびＲＮａｓｅ Ｐ、Ｃａｓ３およびＣａｓ７－１１から選択されるエンドリボヌクレアーゼ、ならびに制限エンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。

【請求項77】

エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する構造は、ヘアピン、鎖オーバーハング、および核酸修飾から選択される、請求項５６に記載の方法。

【請求項78】

核酸修飾は、１つまたはそれ以上のホスホロチオエート結合を含む、請求項７７に記載の方法。

【請求項79】

核酸修飾は、５つ以上のホスホロチオエート結合を含む、請求項７８に記載の方法。

【請求項80】

核酸基質またはエンドヌクレアーゼは未精製形態にある、請求項５６に記載の方法。

【請求項81】

エンドヌクレアーゼの活性を検知するためのキットであって：
（ａ）核酸基質であって：
（ｉ）蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を形成するドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォア；
（ｉｉ）エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する少なくとも１つの鎖における少なくとも１つの構造；ならびに
（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼのための認識配列
を含む核酸基質と；
（ｂ）エキソヌクレアーゼと
を含むキット。

【請求項82】

エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する少なくとも１つの構造は、３’－５’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各３’末端における構造、５’－３’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各５’末端における構造、またはその両方から選択される、請求項８１に記載のキット。

【請求項83】

エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＴ、ＢＡＬ－３１エキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪｆエキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ Ｒ、ＲＮａｓｅ ＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｄ、ＲＮａｓｅ Ｔ、ＲＮａｓｅ ＢＮ、ＲＮａｓｅ ＰＨ、エキソリボヌクレアーゼＩ、およびエキソリボヌクレアーゼＩＩから選択される、請求項８１に記載のキット。

【請求項84】

試験されるエンドヌクレアーゼは、核酸誘導型エンドヌクレアーゼである、請求項８１に記載のキット。

【請求項85】

核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラスＩ（ＣＡＳＣＡＤＥ）エンドヌクレアーゼであり、基質は、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＡＧＧ－３’、５’－ＡＴＧ－３’、５’－ＧＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、５’－ＧＴＧ－３’、５’－ＴＡＡ－３’、５’－ＴＧＧ－３’、５’－ＡＡＡ－３’、５’－ＡＡＣ－３’、５’－ＡＡＴ－３’、５’－ＡＴＡ－３’、５’－ＴＡＧ－３’、および５’－ＴＴＧ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、請求項８４に記載のキット。

【請求項86】

核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼであり、基質は、５’－ＮＧＧ－３’、５’－ＮＧＧＮＧ－３’、５’－ＮＮＡＡＡＡＷ－３’、５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３’、５’－ＧＮＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＮＮＮＡＣＡ－３’、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＴＴＴＮ－３’および５’－ＴＴＴＶ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、請求項８４に記載のキット。

【請求項87】

試験されるエンドヌクレアーゼと複合体を形成することが可能な核酸ターゲティング核酸（ＮＡＴＮＡ）をさらに含む、請求項８４に記載のキット。

【請求項88】

ＮＡＴＮＡは、シングルガイドおよびデュアルガイドから選択されるＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡである、請求項８７に記載のキット。

【請求項89】

ＮＡＴＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項８７に記載のキット。

【請求項90】

ＮＡＴＮＡは、基質の一領域にハイブリダイズすることが可能なターゲティング領域を含む、請求項８７に記載のキット。

【請求項91】

ＮＡＴＮＡは、エンドヌクレアーゼと相互作用することが可能である、請求項８７に記載のキット。

【請求項92】

ＮＡＴＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドを含む、請求項８７に記載のキット。

【請求項93】

エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｆｏｋ ＩにコンジュゲートされたＺＦＮ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＥｎｄｏＴＴエンドヌクレアーゼ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅエンドヌクレアーゼ、Ａｒｃｕｓエンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ ＺおよびＲＮａｓｅ Ｐ、Ｃａｓ３およびＣａｓ７－１１から選択されるエンドリボヌクレアーゼ、ならびに制限エンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項８１に記載のキット。

【請求項94】

エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する構造は、ヘアピン、鎖オーバーハング、および核酸修飾から選択される、請求項８１に記載のキット。

【請求項95】

核酸修飾は、１つまたはそれ以上のホスホロチオエート結合を含む、請求項９４に記載のキット。

【請求項96】

核酸修飾は、５つ以上のホスホロチオエート結合を含む、請求項９５に記載のキット。

【請求項97】

請求項１に記載の基質を用いてエンドヌクレアーゼの活性を検知するための装置であって：酵素反応を行うための反応チャンバおよび蛍光検知器を含む装置。

【請求項98】

サンプル中のターゲット核酸の存在を検知する方法であって：
（ａ）エンドヌクレアーゼと、エキソヌクレアーゼと、ターゲット核酸にハイブリダイズすることが可能な核酸プローブとを含む反応混合物にサンプルを接触させることであって、プローブは：
ｉ．蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を形成するドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォア；
ｉｉ．エキソヌクレアーゼによるプローブの切断を阻害する少なくとも１つの構造；ならびに
ｉｉｉ．エンドヌクレアーゼのための認識配列
を含むこと、ならびに
（ｂ）反応混合物により放出された蛍光を測定することであって、蛍光における変化はサンプル中のターゲット核酸の存在を示すこと
を含む方法。

【請求項99】

エキソヌクレアーゼによるプローブの切断を阻害する少なくとも１つの構造は、３’－５’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各３’末端における構造、５’－３’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各５’末端における構造、またはその両方から選択される、請求項９８に記載の方法。

【請求項100】

エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＴ、ＢＡＬ－３１エキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪｆエキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ Ｒ、ＲＮａｓｅ ＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｄ、ＲＮａｓｅ Ｔ、ＲＮａｓｅ ＢＮ、ＲＮａｓｅ ＰＨ、エキソリボヌクレアーゼＩ、およびエキソリボヌクレアーゼＩＩから選択される、請求項９８に記載の方法。

【請求項101】

ターゲット核酸は、細菌に特徴的な配列、ウイルスに特徴的な配列、寄生体に特徴的な配列、および患者の疾患または状態に特徴的な患者の配列から選択される、請求項９８に記載の方法。

【請求項102】

エンドヌクレアーゼは、核酸誘導型エンドヌクレアーゼである、請求項９８に記載の方法。

【請求項103】

核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラスＩ（ＣＡＳＣＡＤＥ）エンドヌクレアーゼであり、プローブは、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＡＧＧ－３’、５’－ＡＴＧ－３’、５’－ＧＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、５’－ＧＴＧ－３’、５’－ＴＡＡ－３’、５’－ＴＧＧ－３’、５’－ＡＡＡ－３’、５’－ＡＡＣ－３’、５’－ＡＡＴ－３’、５’－ＡＴＡ－３’、５’－ＴＡＧ－３’、および５’－ＴＴＧ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、請求項１０２に記載の方法。

【請求項104】

核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼであり、プローブは、５’－ＮＧＧ－３’、５’－ＮＧＧＮＧ－３’、５’－ＮＮＡＡＡＡＷ－３’、５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３’、５’－ＧＮＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＮＮＮＡＣＡ－３’、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＴＴＴＮ－３’および５’－ＴＴＴＶ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、請求項１０２に記載の方法。

【請求項105】

核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼおよび核酸ターゲティング核酸（ＮＡＴＮＡ）を含む、請求項１０２に記載の方法。

【請求項106】

ＮＡＴＮＡは、シングルガイドおよびデュアルガイドから選択されるＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡである、請求項１０５に記載の方法。

【請求項107】

ＮＡＴＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項１０５に記載の方法。

【請求項108】

ＮＡＴＮＡは、プローブの一領域にハイブリダイズすることが可能なターゲティング領域を含む、請求項１０５に記載の方法。

【請求項109】

ＮＡＴＮＡは、エンドヌクレアーゼと相互作用することが可能である、請求項１０５に記載の方法。

【請求項110】

ＮＡＴＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドを含む、請求項１０５に記載の方法。

【請求項111】

エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｆｏｋ ＩにコンジュゲートされたＺＦＮ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＥｎｄｏＴＴエンドヌクレアーゼ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅエンドヌクレアーゼ、Ａｒｃｕｓエンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ ＺおよびＲＮａｓｅ Ｐ、Ｃａｓ３およびＣａｓ７－１１から選択されるエンドリボヌクレアーゼ、ならびに制限エンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項９８に記載の方法。

【請求項112】

エキソヌクレアーゼによるプローブの切断を阻害する構造は、ヘアピン、鎖オーバーハング、および核酸修飾から選択される、請求項９８に記載の方法。

【請求項113】

核酸修飾は、１つまたはそれ以上のホスホロチオエート結合を含む、請求項１１２に記載の方法。

【請求項114】

核酸修飾は、５つ以上のホスホロチオエート結合を含む、請求項１１３に記載の方法。

【請求項115】

サンプルは核酸の粗製剤を含む、請求項９８に記載の方法。

【請求項116】

サンプル中の２つ以上のターゲット核酸の存在を検知する方法であって：
（ａ）エンドヌクレアーゼと、エキソヌクレアーゼと、２つ以上の核酸プローブとを含む反応混合物にサンプルを接触させることであって、核酸プローブは、各々が２つ以上のターゲット核酸にハイブリダイズすることが可能であり、各プローブが：
ｉ．蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を形成するドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォア；
ｉｉ．エキソヌクレアーゼによるプローブの切断を阻害する少なくとも１つの構造；ならびに
ｉｉｉ．エンドヌクレアーゼのための認識配列
を含むこと、ならびに
（ｂ）反応混合物により放出された蛍光を測定することであって、蛍光における変化はサンプル中のターゲット核酸の存在を示すこと
を含む方法。

【請求項117】

２つ以上の核酸プローブの各々が、少なくとも１つの異なるフルオロフォアを含む、請求項１１６に記載の方法。

【請求項118】

２つ以上の核酸プローブのすべてが、同じフルオロフォアを含む、請求項１１６に記載の方法。

【請求項119】

エキソヌクレアーゼによるプローブの切断を阻害する少なくとも１つの構造は、３’－５’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各３’末端における構造、５’－３’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各５’末端における構造、またはその両方から選択される、請求項１１６に記載の方法。

【請求項120】

エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＴ、ＢＡＬ－３１エキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪｆエキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ Ｒ、ＲＮａｓｅ ＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｄ、ＲＮａｓｅ Ｔ、ＲＮａｓｅ ＢＮ、ＲＮａｓｅ ＰＨ、エキソリボヌクレアーゼＩ、およびエキソリボヌクレアーゼＩＩから選択される、請求項１１６に記載の方法。

【請求項121】

２つ以上のターゲット核酸は、細菌に特徴的な配列、ウイルスに特徴的な配列、寄生体に特徴的な配列、および患者の疾患または状態に特徴的な患者の配列から選択される、請求項１１６に記載の方法。

【請求項122】

エンドヌクレアーゼは、核酸誘導型エンドヌクレアーゼである、請求項１１６に記載の方法。

【請求項123】

核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラスＩ（ＣＡＳＣＡＤＥ）エンドヌクレアーゼであり、基質は、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＡＧＧ－３’、５’－ＡＴＧ－３’、５’－ＧＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、５’－ＧＴＧ－３’、５’－ＴＡＡ－３’、５’－ＴＧＧ－３’、５’－ＡＡＡ－３’、５’－ＡＡＣ－３’、５’－ＡＡＴ－３’、５’－ＡＴＡ－３’、５’－ＴＡＧ－３’、および５’－ＴＴＧ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、請求項１２２に記載の方法。

【請求項124】

核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼであり、基質は、５’－ＮＧＧ－３’、５’－ＮＧＧＮＧ－３’、５’－ＮＮＡＡＡＡＷ－３’、５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３’、５’－ＧＮＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＮＮＮＡＣＡ－３’、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＴＴＴＮ－３’および５’－ＴＴＴＶ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、請求項１２２に記載の方法。

【請求項125】

核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼおよび核酸ターゲティング核酸（ＮＡＴＮＡ）を含む、請求項１２２に記載の方法。

【請求項126】

ＮＡＴＮＡは、シングルガイドおよびデュアルガイドから選択されるＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡである、請求項１２５に記載の方法。

【請求項127】

ＮＡＴＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項１２５に記載の方法。

【請求項128】

少なくとも１つのＮＡＴＮＡが、２つ以上のプローブの各々のために使用され、各ＮＡＴＮＡは、少なくとも１つのプローブの一領域にハイブリダイズすることが可能なターゲティング領域を含む、請求項１２５に記載の方法。

【請求項129】

ＮＡＴＮＡは、エンドヌクレアーゼと相互作用することが可能である、請求項１２５に記載の方法。

【請求項130】

ＮＡＴＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドを含む、請求項１２５に記載の方法。

【請求項131】

エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｆｏｋ ＩにコンジュゲートされたＺＦＮ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＥｎｄｏＴＴエンドヌクレアーゼ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅエンドヌクレアーゼ、Ａｒｃｕｓエンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ ＺおよびＲＮａｓｅ Ｐ、Ｃａｓ３およびＣａｓ７－１１から選択されるエンドリボヌクレアーゼ、ならびに制限エンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項１１６に記載の方法。

【請求項132】

エキソヌクレアーゼによるプローブの切断を阻害する構造は、ヘアピン、鎖オーバーハング、および核酸修飾から選択される、請求項１１６に記載の方法。

【請求項133】

核酸修飾は、１つまたはそれ以上のホスホロチオエート結合を含む、請求項１１６に記載の方法。

【請求項134】

核酸修飾は、５つ以上のホスホロチオエート結合を含む、請求項１３３に記載の方法。

【請求項135】

サンプルは核酸の粗製剤を含む、請求項１１６に記載の方法。

【請求項136】

サンプル中のターゲット核酸の存在を検知する方法であって：
（ａ）サンプル中のターゲット核酸に：
ｉ．蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を形成するドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォア；
ｉｉ．エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する少なくとも１つの構造；ならびに
ｉｉｉ．エンドヌクレアーゼのための認識配列
を結合させることにより、修飾された核酸を形成すること、ならびに
（ｂ）エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼにサンプルを接触させること；
（ｃ）反応混合物により放出された蛍光を測定することであって、蛍光における変化はサンプル中のターゲット核酸の存在を示すこと
を含む方法。

【請求項137】

エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する少なくとも１つの構造は、３’－５’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各３’末端における構造、５’－３’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各５’末端における構造、またはその両方から選択される、請求項１３６に記載の方法。

【請求項138】

エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＴ、ＢＡＬ－３１エキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪｆエキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ Ｒ、ＲＮａｓｅ ＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｄ、ＲＮａｓｅ Ｔ、ＲＮａｓｅ ＢＮ、ＲＮａｓｅ ＰＨ、エキソリボヌクレアーゼＩ、およびエキソリボヌクレアーゼＩＩから選択される、請求項１３６に記載の方法。

【請求項139】

工程（ａ）における結合させることは、ドナーフルオロフォア、アクセプターフルオロフォア、およびエキソヌクレアーゼによる切断を阻害する構造を含むアダプターのライゲーションを介する、請求項１３６に記載の方法。

【請求項140】

工程（ａ）における結合させることの前に、ターゲット核酸がＰＣＲによって増幅される、請求項１３６に記載の方法。

【請求項141】

結合させることは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を形成するドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォア；エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する構造を含む増幅プライマーを用いた１つまたはそれ以上のラウンドの伸長を介する、請求項１３６に記載の方法。

【請求項142】

ターゲット核酸は、細菌に特徴的な配列、ウイルスに特徴的な配列、寄生体に特徴的な配列、および患者の疾患または状態に特徴的な患者の配列から選択される、請求項１３６に記載の方法。

【請求項143】

エンドヌクレアーゼは、核酸誘導型エンドヌクレアーゼである、請求項１３６に記載の方法。

【請求項144】

核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラスＩ（ＣＡＳＣＡＤＥ）エンドヌクレアーゼであり、ターゲット核酸または修飾されたターゲット核酸は、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＡＧＧ－３’、５’－ＡＴＧ－３’、５’－ＧＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、５’－ＧＴＧ－３’、５’－ＴＡＡ－３’、５’－ＴＧＧ－３’、５’－ＡＡＡ－３’、５’－ＡＡＣ－３’、５’－ＡＡＴ－３’、５’－ＡＴＡ－３’、５’－ＴＡＧ－３’、および５’－ＴＴＧ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、請求項１４３に記載の方法。

【請求項145】

核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼであり、ターゲット核酸または修飾されたターゲット核酸は、５’－ＮＧＧ－３’、５’－ＮＧＧＮＧ－３’、５’－ＮＮＡＡＡＡＷ－３’、５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３’、５’－ＧＮＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＮＮＮＡＣＡ－３’、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＴＴＴＮ－３’および５’－ＴＴＴＶ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、請求項１４３に記載の方法。

【請求項146】

核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼおよび核酸ターゲティング核酸（ＮＡＴＮＡ）を含む、請求項１４３に記載の方法。

【請求項147】

ＮＡＴＮＡは、シングルガイドおよびデュアルガイドから選択されるＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡである、請求項１４６に記載の方法。

【請求項148】

ＮＡＴＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項１４６に記載の方法。

【請求項149】

ＮＡＴＮＡは、ターゲット核酸または修飾されたターゲット核酸にハイブリダイズすることが可能なターゲティング領域を含む、請求項１４６に記載の方法。

【請求項150】

ＮＡＴＮＡは、エンドヌクレアーゼと相互作用することが可能である、請求項１４６に記載の方法。

【請求項151】

ＮＡＴＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドを含む、請求項１４６に記載の方法。

【請求項152】

エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｆｏｋ ＩにコンジュゲートされたＺＦＮ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＥｎｄｏＴＴエンドヌクレアーゼ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅエンドヌクレアーゼ、Ａｒｃｕｓエンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ ＺおよびＲＮａｓｅ Ｐ、Ｃａｓ３およびＣａｓ７－１１から選択されるエンドリボヌクレアーゼ、ならびに制限エンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項１３６に記載の方法。

【請求項153】

エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する構造は、ヘアピン、鎖オーバーハング、および核酸修飾から選択される、請求項１３６に記載の方法。

【請求項154】

核酸修飾は、１つまたはそれ以上のホスホロチオエート結合を含む、請求項１５３に記載の方法。

【請求項155】

核酸修飾は、５つ以上のホスホロチオエート結合を含む、請求項１５４に記載の方法。

【請求項156】

サンプルは核酸の粗製剤を含む、請求項１３６に記載の方法。

【請求項157】

請求項１１６に記載の方法に従う診断手順を行うためのキットであって：
エンドヌクレアーゼと、
ターゲット核酸にハイブリダイズすることが可能な核酸プローブと
を含み、プローブは：
ｉ．蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を形成するドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォア；
ｉｉ．エキソヌクレアーゼによるプローブの切断を阻害する少なくとも１つの構造；ならびに
ｉｉｉ．エンドヌクレアーゼのための認識配列
を含み、かつ、
（ｂ）反応混合物により放出された蛍光を測定し、蛍光における変化はサンプル中のターゲット核酸の存在を示し、
ターゲット核酸は、細菌に特徴的な配列、ウイルスに特徴的な配列、寄生体に特徴的な配列、および患者の疾患または状態に特徴的な患者の配列から選択される、キット。

【請求項158】

エキソヌクレアーゼによるプローブの切断を阻害する少なくとも１つの構造は、３’－５’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各３’末端における構造、５’－３’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各５’末端における構造、またはその両方から選択される、請求項１５７に記載のキット。

【請求項159】

エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＴ、ＢＡＬ－３１エキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪｆエキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ Ｒ、ＲＮａｓｅ ＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｄ、ＲＮａｓｅ Ｔ、ＲＮａｓｅ ＢＮ、ＲＮａｓｅ ＰＨ、エキソリボヌクレアーゼＩ、およびエキソリボヌクレアーゼＩＩから選択されるエキソヌクレアーゼをさらに含む、請求項１５７に記載のキット。

【請求項160】

エンドヌクレアーゼは、核酸誘導型エンドヌクレアーゼである、請求項１５７に記載のキット。

【請求項161】

核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラスＩ（ＣＡＳＣＡＤＥ）エンドヌクレアーゼであり、プローブは、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＡＧＧ－３’、５’－ＡＴＧ－３’、５’－ＧＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、５’－ＧＴＧ－３’、５’－ＴＡＡ－３’、５’－ＴＧＧ－３’、５’－ＡＡＡ－３’、５’－ＡＡＣ－３’、５’－ＡＡＴ－３’、５’－ＡＴＡ－３’、５’－ＴＡＧ－３’、および５’－ＴＴＧ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、請求項１６０に記載のキット。

【請求項162】

核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼであり、プローブは、５’－ＮＧＧ－３’、５’－ＮＧＧＮＧ－３’、５’－ＮＮＡＡＡＡＷ－３’、５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３’、５’－ＧＮＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＮＮＮＡＣＡ－３’、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＴＴＴＮ－３’および５’－ＴＴＴＶ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、請求項１６０に記載のキット。

【請求項163】

核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、核酸ターゲティング核酸（ＮＡＴＮＡ）と複合したＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼであり、ＮＡＴＮＡは、シングルガイドおよびデュアルガイドから選択されるＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡである、請求項１６０に記載のキット。

【請求項164】

ＮＡＴＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項１６３に記載のキット。

【請求項165】

ＮＡＴＮＡは、エンドヌクレアーゼと相互作用することが可能である、請求項１６３に記載のキット。

【請求項166】

ＮＡＴＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドを含む、請求項１６３に記載のキット。

【請求項167】

エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｆｏｋ ＩにコンジュゲートされたＺＦＮ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＥｎｄｏＴＴエンドヌクレアーゼ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅエンドヌクレアーゼ、Ａｒｃｕｓエンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ ＺおよびＲＮａｓｅ Ｐ、Ｃａｓ３およびＣａｓ７－１１から選択されるエンドリボヌクレアーゼ、ならびに制限エンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項１５７に記載のキット。

【請求項168】

エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する構造は、ヘアピン、鎖オーバーハング、および核酸修飾から選択される、請求項１５７に記載のキット。

【請求項169】

核酸修飾は、１つまたはそれ以上のホスホロチオエート結合を含む、請求項１６８に記載のキット。

【請求項170】

核酸修飾は、５つ以上のホスホロチオエート結合を含む、請求項１６９に記載のキット。

【請求項171】

サンプル中のターゲット核酸の存在を検知するためのキットであって、方法は、修飾された核酸を形成するためにターゲット核酸に結合させることが可能な１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドを含み、オリゴヌクレオチドは：
ｉ．蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を形成するドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォア；
ｉｉ．エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する少なくとも１つの構造
を含み；
修飾された核酸は、エンドヌクレアーゼのための認識配列、およびエンドヌクレアーゼを含み、
ターゲット核酸は、細菌に特徴的な配列、ウイルスに特徴的な配列、寄生体に特徴的な配列、および患者の疾患または状態に特徴的な患者の配列から選択される、キット。

【請求項172】

エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する少なくとも１つの構造は、３’－５’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各３’末端における構造、５’－３’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各５’末端における構造、またはその両方から選択される、請求項１７１に記載のキット。

【請求項173】

エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＴ、ＢＡＬ－３１エキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪｆエキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ Ｒ、ＲＮａｓｅ ＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｄ、ＲＮａｓｅ Ｔ、ＲＮａｓｅ ＢＮ、ＲＮａｓｅ ＰＨ、エキソリボヌクレアーゼＩ、およびエキソリボヌクレアーゼＩＩから選択される、請求項１７１に記載のキット。

【請求項174】

結合させることは、ターゲット核酸へのオリゴヌクレオチドのライゲーションを介し、キットは場合により、リガーゼを含む、請求項１７１に記載のキット。

【請求項175】

結合させることは、増幅プライマーとして作用するオリゴヌクレオチドを用いた１つまたはそれ以上のラウンドの伸長を介し、キットは場合により、増幅を行うための試薬を含む、請求項１７１に記載のキット。

【請求項176】

エンドヌクレアーゼは、核酸誘導型エンドヌクレアーゼである、請求項１７１に記載のキット。

【請求項177】

核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラスＩ（ＣＡＳＣＡＤＥ）エンドヌクレアーゼであり、ターゲット核酸または修飾されたターゲット核酸は、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＡＧＧ－３’、５’－ＡＴＧ－３’、５’－ＧＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、５’－ＧＴＧ－３’、５’－ＴＡＡ－３’、５’－ＴＧＧ－３’、５’－ＡＡＡ－３’、５’－ＡＡＣ－３’、５’－ＡＡＴ－３’、５’－ＡＴＡ－３’、５’－ＴＡＧ－３’、および５’－ＴＴＧ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、請求項１７６に記載のキット。

【請求項178】

核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼであり、ターゲット核酸または修飾されたターゲット核酸は、５’－ＮＧＧ－３’、５’－ＮＧＧＮＧ－３’、５’－ＮＮＡＡＡＡＷ－３’、５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３’、５’－ＧＮＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＮＮＮＡＣＡ－３’、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＴＴＴＮ－３’および５’－ＴＴＴＶ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、請求項１７６に記載のキット。

【請求項179】

核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼおよび核酸ターゲティング核酸（ＮＡＴＮＡ）を含む、請求項１７６に記載のキット。

【請求項180】

ＮＡＴＮＡは、シングルガイドおよびデュアルガイドから選択されるＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡである、請求項１７９に記載のキット。

【請求項181】

ＮＡＴＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項１７９に記載のキット。

【請求項182】

ＮＡＴＮＡは、ターゲット核酸または修飾されたターゲット核酸にハイブリダイズすることが可能なターゲティング領域を含む、請求項１７９に記載のキット。

【請求項183】

ＮＡＴＮＡは、エンドヌクレアーゼと相互作用することが可能である、請求項１７９に記載のキット。

【請求項184】

ＮＡＴＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドを含む、請求項１７９に記載の方法。

【請求項185】

エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｆｏｋ ＩにコンジュゲートされたＺＦＮ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＥｎｄｏＴＴエンドヌクレアーゼ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅエンドヌクレアーゼ、Ａｒｃｕｓエンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ ＺおよびＲＮａｓｅ Ｐ、Ｃａｓ３およびＣａｓ７－１１から選択されるエンドリボヌクレアーゼ、ならびに制限エンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項１７１に記載の方法。

【請求項186】

エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する構造は、ヘアピン、鎖オーバーハング、および核酸修飾から選択される、請求項１７１に記載の方法。

【請求項187】

核酸修飾は、１つまたはそれ以上のホスホロチオエート結合を含む、請求項１８６に記載の方法。

【請求項188】

核酸修飾は、５つ以上のホスホロチオエート結合を含む、請求項１８７に記載の方法。

【請求項189】

エンドヌクレアーゼ消化反応を最適化する方法であって：
（ａ）エキソヌクレアーゼおよび核酸基質を用いて、一連の反応混合物を製造することであって、核酸基質は：
ｉ．蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を形成するドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォア；
ｉｉ．エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する少なくとも１つの鎖における少なくとも１つの構造；ならびに
ｉｉｉ．エンドヌクレアーゼのための認識配列
を含むこと；
（ｂ）一連の反応混合物の各々を異なる量のエンドヌクレアーゼに接触させること；
（ｃ）反応混合物により放出された蛍光を測定することであって、蛍光における変化はエンドヌクレアーゼの活性を示すこと；
（ｄ）反応混合物の最も高い蛍光または反応混合物の蛍光の最も高い増加率をもたらすエンドヌクレアーゼの量を最適なエンドヌクレアーゼ濃度として選択すること
を含む方法。

【請求項190】

エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する少なくとも１つの構造は、３’－５’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各３’末端における構造、５’－３’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各５’末端における構造、またはその両方から選択される、請求項１８９に記載の方法。

【請求項191】

エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＴ、ＢＡＬ－３１エキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪｆエキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ Ｒ、ＲＮａｓｅ ＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｄ、ＲＮａｓｅ Ｔ、ＲＮａｓｅ ＢＮ、ＲＮａｓｅ ＰＨ、エキソリボヌクレアーゼＩ、およびエキソリボヌクレアーゼＩＩから選択される、請求項１８９に記載の方法。

【請求項192】

反応混合物をエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼに同時に接触させる、請求項１８９に記載の方法。

【請求項193】

反応混合物を最初にエンドヌクレアーゼに接触させ、その後にエキソヌクレアーゼに接触させる、請求項１８９に記載の方法。

【請求項194】

反応混合物をエンドヌクレアーゼに接触させることと反応混合物をエキソヌクレアーゼに接触させることとの間に精製工程は行われない、請求項１８９に記載の方法。

【請求項195】

エンドヌクレアーゼは、核酸誘導型エンドヌクレアーゼである、請求項１８９に記載の方法。

【請求項196】

核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラスＩ（ＣＡＳＣＡＤＥ）エンドヌクレアーゼであり、基質は、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＡＧＧ－３’、５’－ＡＴＧ－３’、５’－ＧＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、５’－ＧＴＧ－３’、５’－ＴＡＡ－３’、５’－ＴＧＧ－３’、５’－ＡＡＡ－３’、５’－ＡＡＣ－３’、５’－ＡＡＴ－３’、５’－ＡＴＡ－３’、５’－ＴＡＧ－３’、および５’－ＴＴＧ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、請求項１９５に記載の方法。

【請求項197】

核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼであり、基質は、５’－ＮＧＧ－３’、５’－ＮＧＧＮＧ－３’、５’－ＮＮＡＡＡＡＷ－３’、５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３’、５’－ＧＮＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＮＮＮＡＣＡ－３’、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＴＴＴＮ－３’および５’－ＴＴＴＶ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、請求項１９５に記載の方法。

【請求項198】

核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼおよび核酸ターゲティング核酸（ＮＡＴＮＡ）を含む、請求項１９５に記載の方法。

【請求項199】

ＮＡＴＮＡは、シングルガイドおよびデュアルガイドから選択されるＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡである、請求項１９８に記載の方法。

【請求項200】

ＮＡＴＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項１９８に記載の方法。

【請求項201】

ＮＡＴＮＡは、基質の一領域にハイブリダイズすることが可能なターゲティング領域を含む、請求項１９８に記載の方法。

【請求項202】

ＮＡＴＮＡは、エンドヌクレアーゼと相互作用することが可能である、請求項１９８に記載の方法。

【請求項203】

ＮＡＴＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドを含む、請求項１９８に記載の方法。

【請求項204】

エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｆｏｋ ＩにコンジュゲートされたＺＦＮ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＥｎｄｏＴＴエンドヌクレアーゼ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅエンドヌクレアーゼ、Ａｒｃｕｓエンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ ＺおよびＲＮａｓｅ Ｐ、Ｃａｓ３およびＣａｓ７－１１から選択されるエンドリボヌクレアーゼ、ならびに制限エンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項１８９に記載の方法。

【請求項205】

エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する構造は、ヘアピン、鎖オーバーハング、および核酸修飾から選択される、請求項１８９に記載の方法。

【請求項206】

核酸修飾は、１つまたはそれ以上のホスホロチオエート結合を含む、請求項２０５に記載の方法。

【請求項207】

核酸修飾は、５つ以上のホスホロチオエート結合を含む、請求項２０６に記載の方法。

【請求項208】

ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ消化反応を最適化する方法であって：
（ａ）ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、および核酸基質を用いて、一連の反応混合物を製造することであって、核酸基質は：
ｉ．蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を形成するドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォア；
ｉｉ．エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する少なくとも１つの鎖における少なくとも１つの構造；ならびに
ｉｉｉ．エンドヌクレアーゼのための認識配列
を含むこと；
（ｂ）一連の核酸ターゲティング核酸（ＮＡＴＮＡ）の各々を接触させること；
（ｃ）反応混合物により放出された蛍光を測定することであって、蛍光における変化はエンドヌクレアーゼの活性を示すこと；
（ｄ）反応混合物の最も高い蛍光をもたらすＮＡＴＮＡを最適なＮＡＴＮＡとして選択すること
を含む方法。

【請求項209】

エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する少なくとも１つの構造は、３’－５’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各３’末端における構造、５’－３’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各５’末端における構造、またはその両方から選択される、請求項２０８に記載の方法。

【請求項210】

エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＴ、ＢＡＬ－３１エキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪｆエキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ Ｒ、ＲＮａｓｅ ＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｄ、ＲＮａｓｅ Ｔ、ＲＮａｓｅ ＢＮ、ＲＮａｓｅ ＰＨ、エキソリボヌクレアーゼＩ、およびエキソリボヌクレアーゼＩＩから選択される、請求項２０８に記載の方法。

【請求項211】

反応混合物をエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼに同時に接触させる、請求項２０８に記載の方法。

【請求項212】

反応混合物を最初にエンドヌクレアーゼに接触させ、その後にエキソヌクレアーゼに接触させる、請求項２０８に記載の方法。

【請求項213】

反応混合物をエンドヌクレアーゼに接触させることと反応混合物をエキソヌクレアーゼに接触させることとの間に精製工程は行われない、請求項２０８に記載の方法。

【請求項214】

ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、クラスＩ（ＣＡＳＣＡＤＥ）エンドヌクレアーゼであり、基質は、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＡＧＧ－３’、５’－ＡＴＧ－３’、５’－ＧＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、５’－ＧＴＧ－３’、５’－ＴＡＡ－３’、５’－ＴＧＧ－３’、５’－ＡＡＡ－３’、５’－ＡＡＣ－３’、５’－ＡＡＴ－３’、５’－ＡＴＡ－３’、５’－ＴＡＧ－３’、および５’－ＴＴＧ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、請求項２０８に記載の方法。

【請求項215】

ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＣａｓ１２ａエンドヌクレアーゼであり、基質は、５’－ＮＧＧ－３’、５’－ＮＧＧＮＧ－３’、５’－ＮＮＡＡＡＡＷ－３’、５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３’、５’－ＧＮＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＮＮＮＡＣＡ－３’、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＴＴＴＮ－３’および５’－ＴＴＴＶ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、請求項２０８に記載の方法。

【請求項216】

ＮＡＴＮＡは、シングルガイドおよびデュアルガイドから選択されるＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡである、請求項２０８に記載の方法。

【請求項217】

ＮＡＴＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項２０８に記載の方法。

【請求項218】

ＮＡＴＮＡは、基質の一領域にハイブリダイズすることが可能なターゲティング領域を含む、請求項２０８に記載の方法。

【請求項219】

ＮＡＴＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドを含む、請求項２０８に記載の方法。

【請求項220】

エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する構造は、ヘアピン、鎖オーバーハング、および核酸修飾から選択される、請求項２０８に記載の方法。

【請求項221】

核酸修飾は、１つまたはそれ以上のホスホロチオエート結合を含む、請求項２２０に記載の方法。

【請求項222】

核酸修飾は、５つ以上のホスホロチオエート結合を含む、請求項２２１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本願は、２０２１年１０月２６日に出願された米国特許仮出願第６３／２７２，０９１号に対する優先権を主張する。

【0002】

本発明は、核酸修飾酵素の分野に関し、より詳細には、活性エンドヌクレアーゼの開発および試験の分野に関する。

【0003】

連邦政府による資金提供を受けた研究に関する記載
なし。

【0004】

配列表
プレースホルダー。

【背景技術】

【0005】

エンドヌクレアーゼは、研究室業務および分子診断業界において広く使用されている酵素である。新しい改善されたエンドヌクレアーゼを設計し単離するプロセスには、エンドヌクレアーゼ活性を評価する迅速かつ簡便な方法が必要である。最も広く使用されているエンドヌクレアーゼアッセイは煩雑であり、スループットが低い。さらに、一般的に使用されている方法は定量的ではない。エンドヌクレアーゼの異なる供給源、変異体、またはロットの間の活性における差を測定する確立された手段はない。同様に、エンドヌクレアーゼの特異性を正確に決定できるように異なるターゲットを評価する容易または迅速な手段はない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

現在の技術水準のエンドヌクレアーゼアッセイの多くは、宿主ヌクレアーゼがターゲットＤＮＡを急速に分解するため、粗製の細胞ライセートまたは部分的に精製されたタンパク質製剤において使用するのに不適である。精製プロセスの初期工程からの粗製ライセートおよび半粗製溶出画分において機能する迅速なエンドヌクレアーゼアッセイに関する満たされていない需要が存在する。そのようなアッセイは、酵素の精製および製作を改善する取り組みに役立ち、全体的な酵素エンジニアリングプロセスを加速させるであろう。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、エンドヌクレアーゼ活性を評価するための方法、組成物、およびキットを提供する。本発明は、レポーターフルオロフォアおよびクエンチャーフルオロフォアで標識された二本鎖末端保護核酸基質を利用する。エンドヌクレアーゼが基質を切断した後にのみ、エキソヌクレアーゼが基質を加水分解し、蛍光が生じることを可能にする。

【0008】

一実施形態において、本発明は、エンドヌクレアーゼの活性を検知するための核酸基質であって：蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を形成するドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォア；エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する少なくとも１つの核酸鎖における少なくとも１つの構造；ならびにエンドヌクレアーゼのための認識配列を含む核酸基質である。エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する構造は、３’－５’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各３’末端における構造、５’－３’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各５’末端における構造、またはその両方から選択される。エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＴ、ＢＡＬ－３１エキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪｆエキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ Ｒ、ＲＮａｓｅ ＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｄ、ＲＮａｓｅ Ｔ、ＲＮａｓｅ ＢＮ、ＲＮａｓｅ ＰＨ、エキソリボヌクレアーゼＩ、およびエキソリボヌクレアーゼＩＩから選択される。いくつかの実施形態において、アクセプターフルオロフォアは、クエンチャーフルオロフォアである。ドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォアは、１～１２ヌクレオチド離して、基質の同じ鎖上に、または基質の異なる鎖上に配置することができる。いくつかの実施形態において、基質は一本鎖により形成されている。いくつかの実施形態において、ドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォアの一方は、基質の５’末端またはその付近に配置されている。いくつかの実施形態において、ドナーフルオロフォアは、５－カルボキシフルオレセイン（５－ＦＡＭ）、６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ）、２’，４’，１，４，－テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、２’，４’，５’，７’，１，４－ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、２’，７’－ジメトキシ－４’，５’－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、クマリン色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素、ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ、カスケードブルー、パシフィックブルー、パシフィックオレンジ、テキサスレッド、およびＢＯＤＩＰＹ（登録商標）色素からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、アクセプターフルオロフォアは、テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラプロパノ－６－カルボキシローダミン（ＲＯＸ）、ＤＡＢＳＹＬ、ＤＡＢＣＹＬ（４－［［４－（ジメチルアミノ）－フェニル］－アゾ］－安息香酸）、Ｃｙ５およびＣｙ５．５、アントラキノン色素、ニトロチアゾール色素、ニトロイミダゾール色素、ＬＣ－Ｒｅｄ６１０、ＬＣ－Ｒｅｄ６４０、ＬＣ－Ｒｅｄ７０５、ＪＡ２８６、ＤＤＱ－Ｉ、ＤＤＱ－ＩＩ、ＱＳＹ－７、ＱＳＹ－２１、ＩＲＤｙｅ ＱＣ１、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱ、ＨＥＸ（ヘキサクロロ－フルオレセイン）、ＴＥＴ（テトラクロロ－フルオレセイン）、ＪＯＥ（５’－ジクロロ－ジメトキシ－フルオレセイン）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）色素、Ｅｃｌｉｐｓｅクエンチャー（４－［［２－クロロ－４－ニトロ－フェニル］－アゾ］－アニリン、ＢＨＱ－１（［（４－（２－ニトロ－４－メチル－フェニル）－アゾ）－イル－（（２－メトキシ－５－メチル－フェニル）－アゾ）］－アニリン）、ＢＨＱ－２（［（４－（１－ニトロ－フェニル）－アゾ）－イル－（（２，５－ジメトキシ－フェニル）－アゾ）］－アニリン）、ならびにピリジニル－イソキノリン－ジオン色素からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、ニッカーゼである。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、およびＢＡＬ３１エキソヌクレアーゼから選択される。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、核酸誘導型エンドヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲクラスＩ（ＣＡＳＣＡＤＥ）エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、基質は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。いくつかの実施形態において、ＰＡＭは、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＡＧＧ－３’、５’－ＡＴＧ－３’、５’－ＧＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、５’－ＧＴＧ－３’、５’－ＴＡＡ－３’、５’－ＴＧＧ－３’、５’－ＡＡＡ－３’、５’－ＡＡＣ－３’、５’－ＡＡＴ－３’、５’－ＡＴＡ－３’、５’－ＴＡＧ－３’、および５’－ＴＴＧ－３’から選択される配列からなる。いくつかの実施形態において、核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラスＩＩエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、ＰＡＭは、５’－ＮＧＧ－３’、５’－ＮＧＧＮＧ－３’、５’－ＮＮＡＡＡＡＷ－３’、５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３’、５’－ＧＮＮＮＣＮＮＡ－３’、および５’－ＮＮＮＡＣＡ－３’から選択される配列からなる。いくつかの実施形態において、ＰＡＭは、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＴＴＴＮ－３’および５’－ＴＴＴＶ－３’から選択される配列からなる。いくつかの実施形態において、核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼならびに核酸ターゲティング核酸（ＮＡＴＮＡ）、例えば、シングルガイドおよびデュアルガイドから選択されるＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、基質中の一領域にハイブリダイズすることが可能なターゲティング領域を含む。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、エンドヌクレアーゼと相互作用することが可能である。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｆｏｋ ＩにコンジュゲートされたＺＦＮ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＥｎｄｏＴＴ一本鎖エンドヌクレアーゼ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅエンドヌクレアーゼ、Ａｒｃｕｓエンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ ＺおよびＲＮａｓｅ Ｐ、Ｃａｓ３およびＣａｓ７－１１から選択されるエンドリボヌクレアーゼ、ならびに制限エンドヌクレアーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する構造は、ヘアピン、鎖オーバーハング、および核酸修飾、例えば、１つまたはそれ以上の（５つ以上の）ホスホロチオエート結合から選択される。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼはデオキシリボヌクレアーゼであり、基質はＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼはリボヌクレアーゼであり、基質はＲＮＡを含有する。いくつかの実施形態において、リボヌクレアーゼは、リボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、ＤＮＡザイム、ＰＮＡザイム、またはエンジニアリングされたエンドリボヌクレアーゼから選択される。

【0009】

一実施形態において、本発明は、上述の核酸基質と、エキソヌクレアーゼと、場合によりエンドヌクレアーゼとを含む、エンドヌクレアーゼの活性を検知するための組成物である。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、ニッカーゼである。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、およびＢＡＬ３１エキソヌクレアーゼから選択される。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼは、ニックから加水分解を開始することが可能である。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼは、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、およびエキソヌクレアーゼＢａｌ３１から選択される。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、核酸誘導型エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラスＩ（ＣＡＳＣＡＤＥ）エンドヌクレアーゼであり、基質は、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＡＧＧ－３’、５’－ＡＴＧ－３’、５’－ＧＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、５’－ＧＴＧ－３’ ５’－ＴＡＡ－３’、５’－ＴＧＧ－３’、５’－ＡＡＡ－３’、５’－ＡＡＣ－３’、５’－ＡＡＴ－３’、５’－ＡＴＡ－３’、５’－ＴＡＧ－３’、および５’－ＴＴＧ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。いくつかの実施形態において、核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼであり、基質は、５’－ＮＧＧ－３’、５’－ＮＧＧＮＧ－３’、５’－ＮＮＡＡＡＡＷ－３’、５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３’、５’－ＧＮＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＮＮＮＡＣＡ－３’、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＴＴＴＮ－３’および５’－ＴＴＴＶ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。いくつかの実施形態において、核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼならびに核酸ターゲティング核酸（ＮＡＴＮＡ）、例えば、シングルガイドおよびデュアルガイドから選択されるＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、基質の一領域にハイブリダイズすることが可能なターゲティング領域を含む。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、エンドヌクレアーゼと相互作用することが可能である。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｆｏｋ ＩにコンジュゲートされたＺＦＮ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＥｎｄｏＴＴ一本鎖エンドヌクレアーゼ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅエンドヌクレアーゼ、Ａｒｃｕｓエンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ ＺおよびＲＮａｓｅ Ｐ、Ｃａｓ３およびＣａｓ７－１１から選択されるエンドリボヌクレアーゼ、ならびに制限エンドヌクレアーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する構造は、ヘアピン、鎖オーバーハング、および核酸修飾、例えば、１つまたはそれ以上の（５つ以上の）ホスホロチオエート結合から選択される。

【0010】

一実施形態において、本発明は、エンドヌクレアーゼの活性を検知する方法であって：エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼを、核酸基質を含む反応混合物に接触させることであって、核酸基質は：蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を形成するドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォア；エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する少なくとも１つの鎖における少なくとも１つの構造；ならびにエンドヌクレアーゼのための認識配列を含むこと、ならびに反応混合物により放出された蛍光を測定することであって、蛍光における変化はエンドヌクレアーゼの活性を示すことを含む方法である。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する少なくとも１つの構造は、３’－５’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各３’末端における構造、５’－３’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各５’末端における構造、またはその両方から選択される。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＴ、ＢＡＬ－３１エキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪｆエキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ Ｒ、ＲＮａｓｅ ＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｄ、ＲＮａｓｅ Ｔ、ＲＮａｓｅ ＢＮ、ＲＮａｓｅ ＰＨ、エキソリボヌクレアーゼＩ、およびエキソリボヌクレアーゼＩＩから選択される。いくつかの実施形態において、反応混合物をエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼに同時に接触させる。いくつかの実施形態において、反応混合物を最初にエンドヌクレアーゼに接触させ、その後にエキソヌクレアーゼに接触させる。いくつかの実施形態において、反応混合物をエンドヌクレアーゼに接触させることと反応混合物をエキソヌクレアーゼに接触させることとの間に精製工程は行われない。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、核酸誘導型エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラスＩ（ＣＡＳＣＡＤＥ）エンドヌクレアーゼであり、基質は、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＡＧＧ－３’、５’－ＡＴＧ－３’、５’－ＧＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、５’－ＧＴＧ－３’ ５’－ＴＡＡ－３’、５’－ＴＧＧ－３’、５’－ＡＡＡ－３’、５’－ＡＡＣ－３’、５’－ＡＡＴ－３’、５’－ＡＴＡ－３’、５’－ＴＡＧ－３’、および５’－ＴＴＧ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。いくつかの実施形態において、核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼであり、基質は、５’－ＮＧＧ－３’、５’－ＮＧＧＮＧ－３’、５’－ＮＮＡＡＡＡＷ－３’、５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３’、５’－ＧＮＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＮＮＮＡＣＡ－３’、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＴＴＴＮ－３’および５’－ＴＴＴＶ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。いくつかの実施形態において、核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼならびに核酸ターゲティング核酸（ＮＡＴＮＡ）、例えば、シングルガイドおよびデュアルガイドから選択されるＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、基質の一領域にハイブリダイズすることが可能なターゲティング領域を含む。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、エンドヌクレアーゼと相互作用することが可能である。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、接触させることは、同じＮＡＴＮＡを含む一連の反応混合物を一連の異なるエンドヌクレアーゼに接触させることを含む。いくつかの実施形態において、接触させることは、同じエンドヌクレアーゼを含む一連の反応混合物を一連の異なるＮＡＴＮＡに接触させることを含む。いくつかの実施形態において、接触させることは、同じ成分を含む一連の反応混合物を異なる反応条件下で接触させることを含む。いくつかの実施形態において、接触させることは、同じ成分を含む一連の反応混合物をエンドヌクレアーゼの異なる単離物に接触させることを含む。いくつかの実施形態において、接触させることは、同じエンドヌクレアーゼを含む一連の反応混合物を、異なる配列を含む一連の異なる核酸基質に接触させることを含む。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｆｏｋ ＩにコンジュゲートされたＺＦＮ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＥｎｄｏＴＴ一本鎖エンドヌクレアーゼ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅエンドヌクレアーゼ、Ａｒｃｕｓエンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ ＺおよびＲＮａｓｅ Ｐ、Ｃａｓ３およびＣａｓ７－１１から選択されるエンドリボヌクレアーゼ、ならびに制限エンドヌクレアーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する構造は、ヘアピン、鎖オーバーハング、および核酸修飾、例えば、１つまたはそれ以上の（５つ以上の）ホスホロチオエート結合から選択される。いくつかの実施形態において、核酸基質またはエンドヌクレアーゼは未精製形態にある。

【0011】

一実施形態において、本発明は、エンドヌクレアーゼの活性を検知するためのキットであって：核酸基質であって：蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を形成するドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォア；エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する少なくとも１つの鎖における少なくとも１つの構造；ならびにエンドヌクレアーゼのための認識配列を含む核酸基質と；エキソヌクレアーゼとを含むキットである。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する少なくとも１つの構造は、３’－５’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各３’末端における構造、５’－３’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各５’末端における構造、またはその両方から選択される。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＴ、ＢＡＬ－３１エキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪｆエキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ Ｒ、ＲＮａｓｅ ＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｄ、ＲＮａｓｅ Ｔ、ＲＮａｓｅ ＢＮ、ＲＮａｓｅ ＰＨ、エキソリボヌクレアーゼＩ、およびエキソリボヌクレアーゼＩＩから選択される。いくつかの実施形態において、試験されるエンドヌクレアーゼは、核酸誘導型エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラスＩ（ＣＡＳＣＡＤＥ）エンドヌクレアーゼであり、基質は、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＡＧＧ－３’、５’－ＡＴＧ－３’、５’－ＧＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、５’－ＧＴＧ－３’、５’－ＴＡＡ－３’、５’－ＴＧＧ－３’、５’－ＡＡＡ－３’、５’－ＡＡＣ－３’、５’－ＡＡＴ－３’、５’－ＡＴＡ－３’、５’－ＴＡＧ－３’、および５’－ＴＴＧ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。いくつかの実施形態において、核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼであり、基質は、５’－ＮＧＧ－３’、５’－ＮＧＧＮＧ－３’、５’－ＮＮＡＡＡＡＷ－３’、５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３’、５’－ＧＮＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＮＮＮＡＣＡ－３’、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＴＴＴＮ－３’および５’－ＴＴＴＶ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。いくつかの実施形態において、該キットは、試験されるエンドヌクレアーゼと複合体を形成することが可能な核酸ターゲティング核酸（ＮＡＴＮＡ）をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、シングルガイドおよびデュアルガイドから選択されるＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、基質の一領域にハイブリダイズすることが可能なターゲティング領域を含む。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、エンドヌクレアーゼと相互作用することが可能である。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｆｏｋ ＩにコンジュゲートされたＺＦＮ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＥｎｄｏＴＴ一本鎖エンドヌクレアーゼ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅエンドヌクレアーゼ、Ａｒｃｕｓエンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ ＺおよびＲＮａｓｅ Ｐ、Ｃａｓ３およびＣａｓ７－１１から選択されるエンドリボヌクレアーゼ、ならびに制限エンドヌクレアーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する構造は、ヘアピン、鎖オーバーハング、および核酸修飾、例えば、１つまたはそれ以上の（５つ以上の）ホスホロチオエート結合から選択される。

【0012】

一実施形態において、本発明は、請求項１に記載の基質を用いてエンドヌクレアーゼの活性を検知するための装置であって：酵素反応を行うための反応チャンバおよび蛍光検知器を含む装置である。

【0013】

一実施形態において、本発明は、サンプル中のターゲット核酸の存在を検知する方法であって：エンドヌクレアーゼと、エキソヌクレアーゼと、ターゲット核酸にハイブリダイズすることが可能な核酸プローブとを含む反応混合物にサンプルを接触させることであって、プローブは：蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を形成するドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォア；エキソヌクレアーゼによるプローブの切断を阻害する少なくとも１つの構造；ならびにエンドヌクレアーゼのための認識配列を含むこと、ならびに反応混合物により放出された蛍光を測定することであって、蛍光における変化はサンプル中のターゲット核酸の存在を示すことを含む方法である。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼによるプローブの切断を阻害する少なくとも１つの構造は、３’－５’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各３’末端における構造、５’－３’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各５’末端における構造、またはその両方から選択される。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＴ、ＢＡＬ－３１エキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪｆエキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ Ｒ、ＲＮａｓｅ ＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｄ、ＲＮａｓｅ Ｔ、ＲＮａｓｅ ＢＮ、ＲＮａｓｅ ＰＨ、エキソリボヌクレアーゼＩ、およびエキソリボヌクレアーゼＩＩから選択される。いくつかの実施形態において、ターゲット核酸は、細菌に特徴的な配列、ウイルスに特徴的な配列、寄生体に特徴的な配列、および患者の疾患または状態に特徴的な患者の配列から選択される。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、核酸誘導型エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラスＩ（ＣＡＳＣＡＤＥ）エンドヌクレアーゼであり、プローブは、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＡＧＧ－３’、５’－ＡＴＧ－３’、５’－ＧＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、５’－ＧＴＧ－３’、５’－ＴＡＡ－３’、５’－ＴＧＧ－３’、５’－ＡＡＡ－３’、５’－ＡＡＣ－３’、５’－ＡＡＴ－３’、５’－ＡＴＡ－３’、５’－ＴＡＧ－３’、および５’－ＴＴＧ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼであり、プローブは、５’－ＮＧＧ－３’、５’－ＮＧＧＮＧ－３’、５’－ＮＮＡＡＡＡＷ－３’、５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３’、５’－ＧＮＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＮＮＮＡＣＡ－３’、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＴＴＴＮ－３’および５’－ＴＴＴＶ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。いくつかの実施形態において、核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼならびに核酸ターゲティング核酸（ＮＡＴＮＡ）、例えば、シングルガイドおよびデュアルガイドから選択されるＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、プローブの一領域にハイブリダイズすることが可能なターゲティング領域を含む。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、エンドヌクレアーゼと相互作用することが可能である。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｆｏｋ ＩにコンジュゲートされたＺＦＮ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＥｎｄｏＴＴ一本鎖エンドヌクレアーゼ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅエンドヌクレアーゼ、Ａｒｃｕｓエンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ ＺおよびＲＮａｓｅ Ｐ、Ｃａｓ３およびＣａｓ７－１１から選択されるエンドリボヌクレアーゼ、ならびに制限エンドヌクレアーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼによるプローブの切断を阻害する構造は、ヘアピン、鎖オーバーハング、および核酸修飾、例えば、１つまたはそれ以上の（５つ以上の）ホスホロチオエート結合から選択される。いくつかの実施形態において、サンプルは核酸の粗製剤を含む。

【0014】

一実施形態において、本発明は、サンプル中の２つ以上のターゲット核酸の存在を検知する方法であって：エンドヌクレアーゼと、エキソヌクレアーゼと、２つ以上の核酸プローブとを含む反応混合物にサンプルを接触させることであって、核酸プローブは、各々が２つ以上のターゲット核酸にハイブリダイズすることが可能であり、各プローブが：蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を形成するドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォア；エキソヌクレアーゼによるプローブの切断を阻害する少なくとも１つの構造；ならびにエンドヌクレアーゼのための認識配列を含むこと、ならびに反応混合物により放出された蛍光を測定することであって、蛍光における変化はサンプル中のターゲット核酸の存在を示すことを含む方法である。いくつかの実施形態において、２つ以上の核酸プローブは、少なくとも１つの異なるフルオロフォアを含む。いくつかの実施形態において、２つ以上の核酸プローブのすべてが、同じフルオロフォアを含む。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼによるプローブの切断を阻害する少なくとも１つの構造は、３’－５’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各３’末端における構造、５’－３’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各５’末端における構造、またはその両方から選択される。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＴ、ＢＡＬ－３１エキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪｆエキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ Ｒ、ＲＮａｓｅ ＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｄ、ＲＮａｓｅ Ｔ、ＲＮａｓｅ ＢＮ、ＲＮａｓｅ ＰＨ、エキソリボヌクレアーゼＩ、およびエキソリボヌクレアーゼＩＩから選択される。いくつかの実施形態において、２つ以上のターゲット核酸は、細菌に特徴的な配列、ウイルスに特徴的な配列、寄生体に特徴的な配列、および患者の疾患または状態に特徴的な患者の配列から選択される。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、核酸誘導型エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラスＩ（ＣＡＳＣＡＤＥ）エンドヌクレアーゼであり、基質は、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＡＧＧ－３’、５’－ＡＴＧ－３’、５’－ＧＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、５’－ＧＴＧ－３’、５’－ＴＡＡ－３’、５’－ＴＧＧ－３’、５’－ＡＡＡ－３’、５’－ＡＡＣ－３’、５’－ＡＡＴ－３’、５’－ＡＴＡ－３’、５’－ＴＡＧ－３’、および５’－ＴＴＧ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。いくつかの実施形態において、核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼであり、基質は、５’－ＮＧＧ－３’、５’－ＮＧＧＮＧ－３’、５’－ＮＮＡＡＡＡＷ－３’、５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３’、５’－ＧＮＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＮＮＮＡＣＡ－３’、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＴＴＴＮ－３’および５’－ＴＴＴＶ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。いくつかの実施形態において、核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼならびに核酸ターゲティング核酸（ＮＡＴＮＡ）、例えば、シングルガイドおよびデュアルガイドから選択されるＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＮＡＴＮＡが、２つ以上のプローブの各々のために使用され、各ＮＡＴＮＡは、少なくとも１つのプローブの一領域にハイブリダイズすることが可能なターゲティング領域を含む。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、エンドヌクレアーゼと相互作用することが可能である。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｆｏｋ ＩにコンジュゲートされたＺＦＮ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＥｎｄｏＴＴ一本鎖エンドヌクレアーゼ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅエンドヌクレアーゼ、Ａｒｃｕｓエンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ ＺおよびＲＮａｓｅ Ｐ、Ｃａｓ３およびＣａｓ７－１１から選択されるエンドリボヌクレアーゼ、ならびに制限エンドヌクレアーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼによるプローブの切断を阻害する構造は、ヘアピン、鎖オーバーハング、および核酸修飾、例えば、１つまたはそれ以上の（５つ以上の）ホスホロチオエート結合から選択される。いくつかの実施形態において、サンプルは核酸の粗製剤を含む。

【0015】

一実施形態において、本発明は、サンプル中のターゲット核酸の存在を検知する方法であって：サンプル中のターゲット核酸に：蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を形成するドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォア；エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する少なくとも１つの構造；ならびにエンドヌクレアーゼのための認識配列を結合させることにより、修飾された核酸を形成すること、ならびにエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼにサンプルを接触させること；反応混合物により放出された蛍光を測定することであって、蛍光における変化はサンプル中のターゲット核酸の存在を示すことを含む方法である。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する少なくとも１つの構造は、３’－５’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各３’末端における構造、５’－３’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各５’末端における構造、またはその両方から選択される。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＴ、ＢＡＬ－３１エキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪｆエキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ Ｒ、ＲＮａｓｅ ＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｄ、ＲＮａｓｅ Ｔ、ＲＮａｓｅ ＢＮ、ＲＮａｓｅ ＰＨ、エキソリボヌクレアーゼＩ、およびエキソリボヌクレアーゼＩＩから選択される。いくつかの実施形態において、結合させることは、ドナーフルオロフォア、アクセプターフルオロフォア、およびエキソヌクレアーゼによる切断を阻害する構造を含むアダプターのライゲーションを介する。いくつかの実施形態において、結合させることの前に、ターゲット核酸がＰＣＲによって増幅される。いくつかの実施形態において、結合させることは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を形成するドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォア；エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する構造を含む増幅プライマーを用いた１つまたはそれ以上のラウンドの伸長を介する。いくつかの実施形態において、ターゲット核酸は、細菌に特徴的な配列、ウイルスに特徴的な配列、寄生体に特徴的な配列、および患者の疾患または状態に特徴的な患者の配列から選択される。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、核酸誘導型エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラスＩ（ＣＡＳＣＡＤＥ）エンドヌクレアーゼであり、ターゲット核酸または修飾されたターゲット核酸は、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＡＧＧ－３’、５’－ＡＴＧ－３’、５’－ＧＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、５’－ＧＴＧ－３’、５’－ＴＡＡ－３’、５’－ＴＧＧ－３’、５’－ＡＡＡ－３’、５’－ＡＡＣ－３’、５’－ＡＡＴ－３’、５’－ＡＴＡ－３’、５’－ＴＡＧ－３’、および５’－ＴＴＧ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼであり、ターゲット核酸または修飾されたターゲット核酸は、５’－ＮＧＧ－３’、５’－ＮＧＧＮＧ－３’、５’－ＮＮＡＡＡＡＷ－３’、５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３’、５’－ＧＮＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＮＮＮＡＣＡ－３’、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＴＴＴＮ－３’および５’－ＴＴＴＶ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。いくつかの実施形態において、核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼならびに核酸ターゲティング核酸（ＮＡＴＮＡ）、例えば、シングルガイドおよびデュアルガイドから選択されるＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、ターゲット核酸または修飾されたターゲット核酸にハイブリダイズすることが可能なターゲティング領域を含む。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、エンドヌクレアーゼと相互作用することが可能である。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｆｏｋ ＩにコンジュゲートされたＺＦＮ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＥｎｄｏＴＴ一本鎖エンドヌクレアーゼ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅエンドヌクレアーゼ、Ａｒｃｕｓエンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ ＺおよびＲＮａｓｅ Ｐ、Ｃａｓ３およびＣａｓ７－１１から選択されるエンドリボヌクレアーゼ、ならびに制限エンドヌクレアーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する構造は、ヘアピン、鎖オーバーハング、および核酸修飾、例えば、１つまたはそれ以上の（５つ以上の）ホスホロチオエート結合から選択される。いくつかの実施形態において、サンプルは核酸の粗製剤を含む。

【0016】

一実施形態において、本発明は、請求項１１６に記載の方法に従う診断手順を行うためのキットであって：エンドヌクレアーゼと、ターゲット核酸にハイブリダイズすることが可能な核酸プローブとを含み、プローブは：蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を形成するドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォア、エキソヌクレアーゼによるプローブの切断を阻害する少なくとも１つの構造；ならびにエンドヌクレアーゼのための認識配列を含み、かつ、反応混合物により放出された蛍光を測定し、蛍光における変化はサンプル中のターゲット核酸の存在を示し、ターゲット核酸は、細菌に特徴的な配列、ウイルスに特徴的な配列、寄生体に特徴的な配列、および患者の疾患または状態に特徴的な患者の配列から選択される、キットである。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼによるプローブの切断を阻害する少なくとも１つの構造は、３’－５’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各３’末端における構造、５’－３’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各５’末端における構造、またはその両方から選択される。いくつかの実施形態において、該キットは、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＴ、ＢＡＬ－３１エキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪｆエキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ Ｒ、ＲＮａｓｅ ＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｄ、ＲＮａｓｅ Ｔ、ＲＮａｓｅ ＢＮ、ＲＮａｓｅ ＰＨ、エキソリボヌクレアーゼＩ、およびエキソリボヌクレアーゼＩＩから選択されるエキソヌクレアーゼをさらに含む。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、核酸誘導型エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラスＩ（ＣＡＳＣＡＤＥ）エンドヌクレアーゼであり、プローブは、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＡＧＧ－３’、５’－ＡＴＧ－３’、５’－ＧＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、５’－ＧＴＧ－３’、５’－ＴＡＡ－３’、５’－ＴＧＧ－３’、５’－ＡＡＡ－３’、５’－ＡＡＣ－３’、５’－ＡＡＴ－３’、５’－ＡＴＡ－３’、５’－ＴＡＧ－３’、および５’－ＴＴＧ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。いくつかの実施形態において、核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼであり、プローブは、５’－ＮＧＧ－３’、５’－ＮＧＧＮＧ－３’、５’－ＮＮＡＡＡＡＷ－３’、５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３’、５’－ＧＮＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＮＮＮＡＣＡ－３’、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＴＴＴＮ－３’および５’－ＴＴＴＶ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。いくつかの実施形態において、核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、核酸ターゲティング核酸（ＮＡＴＮＡ）と複合したＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼであり、ＮＡＴＮＡは、シングルガイドおよびデュアルガイドから選択されるＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、エンドヌクレアーゼと相互作用することが可能である。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｆｏｋ ＩにコンジュゲートされたＺＦＮ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＥｎｄｏＴＴ一本鎖エンドヌクレアーゼ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅエンドヌクレアーゼ、Ａｒｃｕｓエンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ ＺおよびＲＮａｓｅ Ｐ、Ｃａｓ３およびＣａｓ７－１１から選択されるエンドリボヌクレアーゼ、ならびに制限エンドヌクレアーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する構造は、ヘアピン、鎖オーバーハング、および核酸修飾、例えば、１つまたはそれ以上の（５つ以上の）ホスホロチオエート結合から選択される。

【0017】

一実施形態において、本発明は、サンプル中のターゲット核酸の存在を検知するためのキットであって、方法は、修飾された核酸を形成するためにターゲット核酸に結合させることが可能な１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドを含み、オリゴヌクレオチドは：蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を形成するドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォア；エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する少なくとも１つの構造を含み；修飾された核酸は、エンドヌクレアーゼのための認識配列、およびエンドヌクレアーゼを含み、ターゲット核酸は、細菌に特徴的な配列、ウイルスに特徴的な配列、寄生体に特徴的な配列、および患者の疾患または状態に特徴的な患者の配列から選択される、キットである。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する少なくとも１つの構造は、３’－５’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各３’末端における構造、５’－３’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各５’末端における構造、またはその両方から選択される。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＴ、ＢＡＬ－３１エキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪｆエキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ Ｒ、ＲＮａｓｅ ＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｄ、ＲＮａｓｅ Ｔ、ＲＮａｓｅ ＢＮ、ＲＮａｓｅ ＰＨ、エキソリボヌクレアーゼＩ、およびエキソリボヌクレアーゼＩＩから選択される。いくつかの実施形態において、結合させることは、ターゲット核酸へのオリゴヌクレオチドのライゲーションを介し、キットは場合により、リガーゼを含む。いくつかの実施形態において、結合させることは、増幅プライマーとして作用するオリゴヌクレオチドを用いた１つまたはそれ以上のラウンドの伸長を介し、キットは場合により、増幅を行うための試薬を含む。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、核酸誘導型エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラスＩ（ＣＡＳＣＡＤＥ）エンドヌクレアーゼであり、ターゲット核酸または修飾されたターゲット核酸は、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＡＧＧ－３’、５’－ＡＴＧ－３’、５’－ＧＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、５’－ＧＴＧ－３’、５’－ＴＡＡ－３’、５’－ＴＧＧ－３’、５’－ＡＡＡ－３’、５’－ＡＡＣ－３’、５’－ＡＡＴ－３’、５’－ＡＴＡ－３’、５’－ＴＡＧ－３’、および５’－ＴＴＧ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼであり、ターゲット核酸または修飾されたターゲット核酸は、５’－ＮＧＧ－３’、５’－ＮＧＧＮＧ－３’、５’－ＮＮＡＡＡＡＷ－３’、５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３’、５’－ＧＮＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＮＮＮＡＣＡ－３’、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＴＴＴＮ－３’および５’－ＴＴＴＶ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。いくつかの実施形態において、核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼならびに核酸ターゲティング核酸（ＮＡＴＮＡ）、例えば、シングルガイドおよびデュアルガイドから選択されるＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、ターゲット核酸または修飾されたターゲット核酸にハイブリダイズすることが可能なターゲティング領域を含む。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、エンドヌクレアーゼと相互作用することが可能である。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｆｏｋ ＩにコンジュゲートされたＺＦＮ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＥｎｄｏＴＴ一本鎖エンドヌクレアーゼ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅエンドヌクレアーゼ、Ａｒｃｕｓエンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ ＺおよびＲＮａｓｅ Ｐ、Ｃａｓ３およびＣａｓ７－１１から選択されるエンドリボヌクレアーゼ、ならびに制限エンドヌクレアーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する構造は、ヘアピン、鎖オーバーハング、および核酸修飾、例えば、１つまたはそれ以上の（５つ以上の）ホスホロチオエート結合から選択される。

【0018】

一実施形態において、本発明は、エンドヌクレアーゼ消化反応を最適化する方法であって：エキソヌクレアーゼおよび核酸基質を用いて、一連の反応混合物を製造することであって、核酸基質は：蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を形成するドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォア；エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する少なくとも１つの鎖における少なくとも１つの構造；ならびにエンドヌクレアーゼのための認識配列を含むこと；一連の反応混合物の各々を異なる量のエンドヌクレアーゼに接触させること；反応混合物により放出された蛍光を測定することであって、蛍光における変化はエンドヌクレアーゼの活性を示すこと；反応混合物の最も高い蛍光または反応混合物の蛍光の最も高い増加率をもたらすエンドヌクレアーゼの量を最適なエンドヌクレアーゼ濃度として選択することを含む方法である。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する構造は、３’－５’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各３’末端における構造、５’－３’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各５’末端における構造、またはその両方から選択される。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＴ、ＢＡＬ－３１エキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪｆエキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ Ｒ、ＲＮａｓｅ ＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｄ、ＲＮａｓｅ Ｔ、ＲＮａｓｅ ＢＮ、ＲＮａｓｅ ＰＨ、エキソリボヌクレアーゼＩ、およびエキソリボヌクレアーゼＩＩから選択される。いくつかの実施形態において、反応混合物をエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼに同時に接触させる。いくつかの実施形態において、反応混合物を最初にエンドヌクレアーゼに接触させ、その後にエキソヌクレアーゼに接触させる。いくつかの実施形態において、反応混合物をエンドヌクレアーゼに接触させることと反応混合物をエキソヌクレアーゼに接触させることとの間に精製工程は行われない。

【0019】

いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラスＩ（ＣＡＳＣＡＤＥ）エンドヌクレアーゼのような核酸誘導型エンドヌクレアーゼであり、基質は、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＡＧＧ－３’、５’－ＡＴＧ－３’、５’－ＧＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、５’－ＧＴＧ－３’、５’－ＴＡＡ－３’、５’－ＴＧＧ－３’、５’－ＡＡＡ－３’、５’－ＡＡＣ－３’、５’－ＡＡＴ－３’、５’－ＡＴＡ－３’、５’－ＴＡＧ－３’、および５’－ＴＴＧ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、またはＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼもしくはＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼを含み、基質は、５’－ＮＧＧ－３’、５’－ＮＧＧＮＧ－３’、５’－ＮＮＡＡＡＡＷ－３’、５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３’、５’－ＧＮＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＮＮＮＡＣＡ－３’、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＴＴＴＮ－３’および５’－ＴＴＴＶ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。

【0020】

いくつかの実施形態において、核酸誘導型エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼならびに核酸ターゲティング核酸（ＮＡＴＮＡ）、例えばシングルガイドおよびデュアルガイドから選択されるＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、基質の一領域にハイブリダイズすることが可能なターゲティング領域を含む。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、エンドヌクレアーゼと相互作用することが可能である。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドを含む。

【0021】

いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｆｏｋ ＩにコンジュゲートされたＺＦＮ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＥｎｄｏＴＴ一本鎖エンドヌクレアーゼ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅエンドヌクレアーゼ、Ａｒｃｕｓエンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ ＺおよびＲＮａｓｅ Ｐ、Ｃａｓ３およびＣａｓ７－１１から選択されるエンドリボヌクレアーゼ、ならびに制限エンドヌクレアーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する構造は、ヘアピン、鎖オーバーハング、および核酸修飾から選択される。いくつかの実施形態において、核酸修飾は、１つまたはそれ以上のホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態において、核酸修飾は、５つ以上のホスホロチオエート結合を含む。

【0022】

一実施形態において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ消化反応を最適化する方法であって：ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、および核酸基質を用いて、一連の反応混合物を製造することであって、核酸基質は：蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を形成するドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォア；エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する少なくとも１つの鎖における少なくとも１つの構造；ならびにエンドヌクレアーゼのための認識配列を含むこと；一連の核酸ターゲティング核酸（ＮＡＴＮＡ）の各々を接触させること；反応混合物により放出された蛍光を測定することであって、蛍光における変化はエンドヌクレアーゼの活性を示すこと；ならびに反応混合物の最も高い蛍光または反応混合物の蛍光の最も高い増加率をもたらすＮＡＴＮＡを最適なＮＡＴＮＡとして選択することを含む方法である。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する少なくとも１つの構造は、３’－５’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各３’末端における構造、５’－３’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害する各５’末端における構造、またはその両方から選択される。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＴ、ＢＡＬ－３１エキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪｆエキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ Ｒ、ＲＮａｓｅ ＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｄ、ＲＮａｓｅ Ｔ、ＲＮａｓｅ ＢＮ、ＲＮａｓｅ ＰＨ、エキソリボヌクレアーゼＩ、およびエキソリボヌクレアーゼＩＩから選択される。いくつかの実施形態において、反応混合物をエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼに同時に接触させる。いくつかの実施形態において、反応混合物を最初にエンドヌクレアーゼに接触させ、その後にエキソヌクレアーゼに接触させる。

【0023】

いくつかの実施形態において、反応混合物をエンドヌクレアーゼに接触させることと反応混合物をエキソヌクレアーゼに接触させることとの間に精製工程は行われない。

【0024】

いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、クラスＩ（ＣＡＳＣＡＤＥ）エンドヌクレアーゼであり、基質は、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＡＧＧ－３’、５’－ＡＴＧ－３’、５’－ＧＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、５’－ＧＴＧ－３’、５’－ＴＡＡ－３’、５’－ＴＧＧ－３’、５’－ＡＡＡ－３’、５’－ＡＡＣ－３’、５’－ＡＡＴ－３’、５’－ＡＴＡ－３’、５’－ＴＡＧ－３’、および５’－ＴＴＧ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＣａｓ１２ａエンドヌクレアーゼであり、基質は、５’－ＮＧＧ－３’、５’－ＮＧＧＮＧ－３’、５’－ＮＮＡＡＡＡＷ－３’、５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３’、５’－ＧＮＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＮＮＮＡＣＡ－３’、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＴＴＴＮ－３’および５’－ＴＴＴＶ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、シングルガイドおよびデュアルガイドから選択されるＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、基質の一領域にハイブリダイズすることが可能なターゲティング領域を含む。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドを含む。

【0025】

いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する構造は、ヘアピン、鎖オーバーハング、および核酸修飾から選択される。いくつかの実施形態において、核酸修飾は、１つまたはそれ以上のホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態において、核酸修飾は、５つ以上のホスホロチオエート結合を含む。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】本発明に係る基質および方法の図である。

【図2】エキソヌクレアーゼ連動式蛍光検知の有用性の実験的妥当性検証（実施例２）を示す図である。

【図3】Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼによる基質（図１）の切断（実施例３）を示す図である。

【図4】Ｃａｓ１２ａ ＲＮＰ濃度に関するアッセイの直線範囲の実験的決定（実施例４）を示す図である。

【図5】エキソヌクレアーゼはＤＮＡを加水分解するがＣａｓ１２ａはＤＮＡを加水分解しないことの実験的確認（実施例５）を示す図である。

【図6】ＤＮＡ基質濃度に関するアッセイの直線範囲の実験的決定（実施例６）を示す図である。

【図7】ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼのためのＦＡＭ標識基質の詳細図である。

【図8】Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼによるＦＡＭ標識基質（図７）の切断へのエキソヌクレアーゼアッセイの適用（実施例９）を示す図である。

【図9】Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼによるＴＡＭＲＡ標識基質の切断へのエキソヌクレアーゼアッセイの適用（実施例１０）を示す図である。

【図10】ＦＡＭフルオロフォアの配置が異なるＦＡＭ標識基質の図である。

【図11】Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼによる様々なＦＡＭ標識基質（図１０）の切断へのエキソヌクレアーゼアッセイの適用（実施例１１）を示す図である。

【図12】図１１に示したデータをまとめた図である。

【図13】反応混合物の蛍光変化率（実施例１１）を示す図である。

【図14】Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼによる非ターゲットＦＡＭ基質の切断に適用されたアッセイにおけるエキソヌクレアーゼの滴定（実施例１２）を示す図である。

【図15】Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼによるＦＡＭ標識基質の切断へのエキソヌクレアーゼアッセイの適用（実施例１３）を示す図である。

【図16】制限エンドヌクレアーゼによるＦＡＭ標識基質の切断へのエキソヌクレアーゼアッセイの適用（実施例１４）を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0027】

定義
以下の定義は本開示の理解を助けるために提供される。

【0028】

「エンドヌクレアーゼ」という用語は、ポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）内にある２つのヌクレオシド残基（いずれのヌクレオシド残基も末端にあるものではない）の間のホスホジエステル結合の加水分解を触媒する酵素を指す。

【0029】

「エキソヌクレアーゼ」という用語は、ポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）内の末端ヌクレオシド残基と末端から２番目のヌクレオシド残基との間のホスホジエステル結合の加水分解を触媒する酵素を指す。エキソヌクレアーゼは、前進型である、すなわち核酸鎖の末端からの複数のヌクレオシド残基の段階的除去が可能である場合がある。

【0030】

「ＣＲＩＳＰＲリピート」または「ＣＲＩＳＰＲリピート配列」という用語は、最小限のＣＲＩＳＰＲリピート配列を指す。

【0031】

「エンドリボヌクレアーゼ」という用語は、ＲＮＡ内のホスホジエステル結合の加水分解を触媒する酵素を指す。いくつかの実施形態において、エンドリボヌクレアーゼは、部位指向性ポリペプチドであり得る。エンドリボヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型）のメンバーであり得る。エンドリボヌクレアーゼは、タンパク質のＲＡＭＰ（Ｒｅｐｅａｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｍｙｓｔｅｒｉｏｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ）スーパーファミリー（例えば、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６、Ｃａｓ５ファミリー）を指し得る。エンドリボヌクレアーゼは、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ Ｉ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩファミリーメンバー（例えば、Ｄｒｏｓｈａ、Ｄｉｃｅｒ、ＲＮａｓｅ Ｎ）、ＲＮａｓｅ Ｌ、ＲＮａｓｅ Ｐ、ＲＮａｓｅ ＰｈｙＭ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ｔ２、ＲＮａｓｅ Ｕ２、ＲＮａｓｅ Ｖ１、ＲＮａｓｅ Ｖも含み得る。

【0032】

「阻害する」という用語は、化学反応を部分的または完全に阻害する化学構造の能力を指す。当業者には、阻害が部分的であるか完全であるかは検知方法の感度に依存することが理解されるであろう。ヌクレアーゼに関する「切断を阻害する」という用語は、切断産物の量を検知可能に減少させる能力を指す。ヌクレアーゼに関する「切断を防止する」という用語は、切断産物の量を検知レベル未満に減少させる能力を指す。

【0033】

「ＮＡＴＮＡ」という用語は、核酸ターゲティング核酸を指す。ＮＡＴＮＡは、ＣＲＩＳＰＲシステムのようなプログラム可能なエンドヌクレアーゼシステムの一部であり得る。ＮＡＴＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む２つの核酸ターゲティングポリヌクレオチド（「デュアルガイド」）から構成されることがある。ＮＡＴＮＡは、融合領域（リンカー）によって接続されたｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含むエンジニアリングされた単一の核酸ターゲティングポリヌクレオチド（「シングルガイド」）から構成されることもある。またＮＡＴＮＡは、天然に発生するシングルガイド（例えば、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ）から構成されることもある。ｃｒＲＮＡは、ターゲティング領域および活性化領域を含み得る。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの活性化領域にハイブリダイズすることが可能な領域を含み得る。「ターゲティング領域」という用語は、ターゲット核酸中の配列にハイブリダイズすることが可能な領域を指す。「活性化領域」という用語は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼなどのポリペプチドと相互作用する領域を指す。

【0034】

ドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォア（またはレポーターフルオロフォアおよびクエンチャー）で標識された核酸は、普及している種類のプローブまたは酵素基質である。フルオロフォアで標識された核酸は、普及している種類のプローブまたは酵素基質である。特に普及しているのは、ＦＲＥＴ対を形成する２つのフルオロフォアで標識されたプローブおよび基質である。普及している種類の二重標識プローブには、Ｔａｑｍａｎおよび分子ビーコンプローブが含まれる。

【0035】

Ｔａｑｍａｎアッセイ（米国特許第５，２１０，０１５号）では、二重標識オリゴヌクレオチドプローブがＰＣＲ中に新生増幅産物にハイブリダイズする。ＤＮＡポリメラーゼの５’－３’エキソヌクレアーゼ活性が２つのフルオロフォアの間でプローブを加水分解すると、蛍光が検知される。

【0036】

分子ビーコンは、ヘアピン形状の二重標識プローブであり、プローブがそのターゲットに結合するとヘアピンが解ける。この解けることによりＦＲＥＴ対が分離し、ドナーフルオロフォアの蛍光を検知することが可能になる。Ｔｙａｇｉ Ｓら、（１９９６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ：ｐｒｏｂｅｓ ｔｈａｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ ｕｐｏｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（３）：３０３。

【0037】

ＦＲＥＴ対を形成する、条件付き蛍光が可能な２つのフルオロフォアで標識された核酸基質を使用することで、ｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性を検知することができる。酵素活性は、例えば、サンプル中の感染性因子の存在を示し得る。微生物汚染を検知するためのフルオロフォアおよびクエンチャーフルオロフォアで標識されたプローブの使用は、米国特許第１０，６６３，４５９号に記述されている。この方法によれば、サンプル中に微生物が存在すると、１つまたはそれ以上のヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ）によるプローブの切断が生じる。起こり得る切断のすべてが、フルオロフォアとクエンチャーとの物理的分離、およびサンプル中の微生物の存在を示す検知可能な蛍光の放出をもたらす。

【0038】

類似の原理が米国特許第１０，６５３，８００号において用いられており、この場合、ＲＮＡ基質が２’－Ｏ－メチル修飾ピリミジンを組み込み、マイコプラズマＲＮａｓｅに対して独特の感受性を示す。この基質はフルオロフォアおよびクエンチャーで標識されている。サンプル中にマイコプラズマが存在すると、マイコプラズマＲＮａｓｅによるプローブの消化、およびサンプル中のマイコプラズマの存在を示す検知可能な蛍光の放出が生じる。

【0039】

フルオロフォアおよびクエンチャーで標識された二本鎖核酸基質は、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの特異的編集活性を検知するためにも使用されている。例えば、Ｓｍｉｔｈら、（２０２０）Ｐｒｏｂｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｕｓｉｎｇ Ｄｏｕｂｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ－Ｔｅｍｐｌａｔｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５９：１４７４には、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼのトランス切断（「トランスシュレッディング」）活性による、そのような基質の切断が記述されている。トランスシュレッディング活性は、二本鎖ＤＮＡターゲットへのＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ複合体の結合によって誘発される。トランスシュレッディングヌクレアーゼ活性は、Ｃａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ－ターゲット複合体の近傍にある、あらゆる二本鎖ＤＮＡに向けられる。フルオロフォアおよびクエンチャーで標識された基質のシュレッディングは、サンプル中のＣａｓ１２ａ－ｃｒＲＮＡ－ターゲット複合体の形成を示す検知可能な蛍光の放出をもたらす。

【0040】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼの活性は、典型的には、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）をモデル基質と共にインキュベートした後、アガロースゲル電気泳動によってインタクトな基質から切断された断片を分離することで測定される。このアプローチは低スループットであり、概してエンドポイント分析に限定され、したがって反応速度に関する情報をほとんどまたは全く提供しない。

【0041】

Ｃａｓ１２ａについては蛍光ベースのアッセイも記述されているが、このアッセイはＣａｓ１２ａ酵素の非特異的トランス活性しか測定しない（上記のＳｍｉｔｈ ＣＷ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０２０を参照されたい）。Ｃａｓ１２ａ ＲＮＰがターゲット配列に結合してこれを切断すると（シス活性）、Ｃａｓ１２ａが活性化されて、ＤＮＡの短い断片を非特異的に分解する（トランス活性または「トランスシュレッディング」活性）。シス活性の指標としてトランス活性を測定することには、いくつかの制限がある。第１に、シス活性とトランス活性との正確な相関関係は不明である。第２に、２つの反応が同じ酵素によって行われ、切り離すことができないため、サロゲートアッセイは、シス活性に関する限られた速度情報を提供する。最後に、多くのエンドヌクレアーゼはトランス活性を示さないため、このアッセイには一般的適用性がない。

【0042】

Ｃａｓ９活性を測定するための蛍光アッセイが２０１８年に開発された（Ｓｅａｍｏｎら、（２０１８）、Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｃａｓ９ Ａｃｔｉｖｉｔｙ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２０１８、９０、１１、６９１３～６９２１頁を参照されたい）。しかし、このアッセイは、エンドヌクレアーゼ切断後のＤＮＡ基質の変性に依存するため、エンドポイント分析しか提供せず、リアルタイムデータは提供しない。

【0043】

本発明は、エンドヌクレアーゼ活性についての簡便なリアルタイムアッセイを提供することにより、これらの欠点を克服する。本発明は、評価およびクオリティコントロールのツールとしての単純で高スループットの蛍光ベースのアッセイを含む。

【0044】

本発明は、サンプル中の診断ターゲットの存在を示すエンドヌクレアーゼの比活性についての診断アッセイをさらに含む。

【0045】

いくつかの実施形態において、本発明は、エンドヌクレアーゼの活性を検知および評価するための基質分子である。図１、パネルＡに示すように、いくつかの実施形態において、基質は少なくとも１つの二本鎖領域を有する核酸である。いくつかの実施形態において、基質は一本鎖である。いくつかの実施形態において、基質は、ハイブリダイゼーションを介して二重鎖を形成する２つの核酸鎖を含む二本鎖核酸である。他の実施形態において、基質は、ハイブリダイゼーションを介してヘアピンなどの二本鎖領域を含む二次構造を形成する単一の核酸鎖である。当業者であれば、ハイブリダイゼーションおよび二本鎖領域の形成が核酸鎖の全長にわたる１００％の相補性を必要としないことを認識するであろう。バッファーのイオン力および温度によって定義される好適な条件下では、２つの核酸鎖の間の相補性が１００％未満、例えば、９０％、８０％、７５％またはそれ以下の安定なハイブリッド（二本鎖領域）が生じ得る。

【0046】

さらに図１に見られるように、核酸基質は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を形成するドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォア（またはレポーターフルオロフォアおよびクエンチャーフルオロフォア）を含む。

【0047】

フルオロフォアおよびクエンチャーは、二本鎖核酸基質上の様々な場所に配置することができる。さらに、複数のフルオロフォアを使用することができる。図１０に示すように、フルオロフォアおよびクエンチャーは、ターゲット鎖、非ターゲット鎖、およびターゲット鎖と非ターゲット鎖との両方に配置することができる。

【0048】

Ｆｏｅｒｓｔｅｒ（またはＦｏｒｓｔｅｒ）共鳴エネルギー移動としても知られる蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、蛍光および再吸収を伴わない、ある分子から別の分子への励起エネルギーの移動である。ドナー発色団は、特定の波長の光を吸収した後、電子励起状態に入る。ドナーはエネルギーをアクセプターに移動させ、アクセプターは電子励起状態に高められる。その後、アクセプターの電子励起状態は減衰し、その結果、検知可能な光が放出される。アクセプターはドナーの蛍光を減少させる、すなわちクエンチするため、アクセプターはクエンチャーと呼ばれることがある。ドナーはレポーターと呼ばれることがある。従来のＦＲＥＴ技術では、ドナーおよびアクセプターの両方がフルオロフォアである。ドナーフルオロフォアは、特定の吸収波長の光を吸収し、アクセプターは、吸収波長よりも長い特定の放出波長の光を放出する。ＦＲＥＴは、ドナーおよびアクセプターが近く（例えば、１～１０ｎｍ）にあるときに起こる。いくつかの実施形態において、ドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォアは、０～１２ヌクレオチド離して配置されている。ドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォアは、基質の同じ鎖上に、または基質の異なる（対向する）鎖上に配置される。ドナー、アクセプター、またはドナーとアクセプターとの両方はいずれも、核酸鎖の末端、例えば５’末端または３’末端の近くに配置することができる。ドナーおよびアクセプターフルオロフォアは、同じ鎖上にあってもよく、対向する鎖上にあってもよい。当業者は、フルオロフォアの所望の近接性（例えば、１～１０ｎｍ）が達成されるように二本鎖基質内にドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォア（またはレポーターフルオロフォアおよびクエンチャー）を配置する様々な選択肢を認識するであろう。

【0049】

既存の文献は、ＦＲＥＴが可能である適切なレポーター・クエンチャー対の選択についての十分な指針を提供している。例えば、米国特許第５，５３８，８４８号；同第８，３５０，０３８号；および同第８，１３７，６１６号を参照されたい。概して、米国特許出願公開第ＵＳ２００６００８８８５５号において推奨されているように、ドナーフルオロフォアは、３５０～８００ｎｍ、好ましくは３５０～６００ｎｍまたは５００～７５０ｎｍの範囲で吸収し、ドナーとアクセプターとの距離は１０～１００オングストロームである。Ｐｅｓｃｅら編、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７１）；Ｗｈｉｔｅら、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７０）；Ｂｅｒｌｍａｎ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ Ａｒｏｍａｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、第２版（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７１）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、Ｃｏｌｏｒ ａｎｄ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７６）；Ｂｉｓｈｏｐ編、Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９７２）；Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、１９９２）；Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９４９）；なども参照されたい。

【0050】

ＦＲＥＴ現象を示す多くのドナー、アクセプター、およびドナー／アクセプター対が市販されている。普及しているドナーとしては、５－カルボキシフルオレセイン（５－ＦＡＭ）、６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ）、２’，４’，１，４，－テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、２’，４’，５’，７’，１，４－ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、および２’，７’－ジメトキシ－４’，５’－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）のようなフルオレセイン色素が挙げられる。他のドナーとしては、クマリン色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒファミリーの色素、ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ、カスケードブルー、パシフィックブルー、パシフィックオレンジ、およびテキサスレッドが挙げられる。普及しているアクセプターとしては、テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）およびテトラプロパノ－６－カルボキシローダミン（ＲＯＸ）のようなローダミン色素、ＤＡＢＳＹＬ、ＤＡＢＣＹＬ、Ｃｙ５およびＣｙ５．５を含むシアニン色素、アントラキノン、ニトロチアゾール、ならびにニトロイミダゾール化合物が挙げられる。さらなるアクセプターには、ＬＣ－Ｒｅｄ６１０、ＬＣ－Ｒｅｄ６４０、ＬＣ－Ｒｅｄ７０５、ＪＡ２８６、ＤＤＱ－Ｉ、ＤＤＱ－ＩＩ、ＱＳＹ－７、ＱＳＹ－２１、ＩＲＤｙｅ ＱＣ１、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱおよびＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱ、ならびに米国特許第６，０２７，７０９号において開示されているスルホン化シアニン色素がある。普及しているドナーとアクセプターの組合せとしては、フルオレセイン／ローダミン、特にカルボキシフルオレセイン／テトラメチル－ローダミン（ＦＡＭ／ＴＡＭＲＡ）が挙げられる。クエンチャーとしてのＴＡＭＲＡを、ＨＥＸ（ヘキサクロロ－フルオレセイン）、ＴＥＴ（テトラクロロ－フルオレセイン）、ＪＯＥ（５’－ジクロロ－ジメトキシ－フルオレセイン）およびシアニン色素のようなドナーと対にすることもできる。別のドナー／アクセプター対が米国特許第９，７９６，７４６号において開示されており、これは、酸化型のｃａｒｂａＮＡＤＨベースの第１のフルオロフォアと、４４５～５４０ｎｍの波長および５６０ｎｍを超える放出最大値を有する光で励起可能である第２のフルオロフォアとから構成されている。

【0051】

別の群の蛍光化合物は、アルファ位またはベータ位にアミノ基を有するナフチルアミンである。そのようなナフチルアミノ化合物には、１－ジメチル－アミノナフチル－５－スルホネート、１－アニリノ－８－ナフタレンスルホネート、および２－ｐ－トルイジニル－６－ナフタレンスルホネートが含まれる。他の色素には、３－フェニル－７－イソシアナトクマリン、９－イソチオシアナトアクリジンおよびアクリジンオレンジのようなアクリジン；Ｎ－（ｐ－（２－ベンゾオキサゾリル）フェニル）マレイミド；ベンゾオキサジアゾール、スチルベン、ならびにピレンが含まれる。

【0052】

フルオロフォアの別のカテゴリーは、米国特許第５，９９４，０６３号に記述されているＢＯＤＩＰＹ（登録商標）色素である。「ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）」は、親複素環式分子がジピロメテンボロンジフルオリド化合物である、修飾されたスペクトル的に差別的なフルオロフォアの一種である。ほとんどのＢＯＤＩＰＹ（登録商標）フルオロフォアは、約４５０～７００の吸収最大値および約４５０～７００の放出最大値を有する。例としては、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５０３／５１２－ＳＥ（４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５２３／５４７（４，４－ジフルオロ－５－フェニル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５３０／５５０（４，４－ジフルオロ－５，７－ジフェニル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５５８／５６８（４，４－ジフルオロ－５－（２－チエニル）－４ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５６４／５７０（４，４－ジフルオロ－５－スチリル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５７６／５８９（４，４－ジフルオロ－５－（２－ピロリル）－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸）、およびＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５８１／５９１（４，４－ジフルオロ－５－（４－フェニル－１，３－ブタジエニル）－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸）が挙げられる。

【0053】

クエンチャーの一種は「ダーククエンチャー」である。これらの非蛍光アクセプターは、低いバックグラウンド蛍光を可能にし、そのため、アッセイ感度を改善する。ダーククエンチャーが使用される際、ドナーフルオロフォアは、クエンチャーがドナーの近くから除去されるまで光を放出しない。例えば、ドナーおよびクエンチャーがオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされている場合、ドナーの蛍光は、クエンチャーがヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチドの加水分解によって除去されたときにのみ生じ得る。ダーククエンチャーの一例は、３８０～５３０ｎｍの範囲のドナー色素をクエンチするＤＡＢＣＹＬ（４－［［４－（ジメチルアミノ）－フェニル］－アゾ］－安息香酸）である。別のダーククエンチャーは、５３０ｎｍの吸収最大値を有し、５２０～６７０ｎｍのスペクトルにわたって効率的にクエンチする、Ｅｃｌｉｐｓｅクエンチャー（４－［［２－クロロ－４－ニトロ－フェニル］－アゾ］－アニリン（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）である。ダーククエンチャーのさらに別のカテゴリーは、ＢＨＱ－１（［（４－（２－ニトロ－４－メチル－フェニル）－アゾ）－イル－（（２－メトキシ－５－メチル－フェニル）－アゾ）］－アニリン）およびＢＨＱ－２（［（４－（１－ニトロ－フェニル）－アゾ）－イル－（（２，５－ジメトキシ－フェニル）－アゾ）］－アニリン）（すべてＢｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）のようなブラックホールクエンチャーである。

【0054】

別の種類のクエンチャーとしては、米国特許第８，３５０，０３８号において開示されているピリジニル－イソキノリン－ジオン誘導体が挙げられる。これらの化合物は、低いバックグラウンドシグナルおよび高いクエンチング効率を特色とする。クエンチャーのさらに別のカテゴリーは、米国特許第６，３４８，５９６号において開示されているリンカー化合物を介してヌクレオチドの塩基に結合した非蛍光シアニンクエンチャー化合物である。クエンチャーのさらに別のカテゴリーは、米国特許第８，０９３，４１１号において開示されている１つまたはそれ以上のヘテロ芳香族クエンチング部分によって置換された弱発光性シアニンである。これらのクエンチャーは、観察可能な発光をほとんどまたは全く示さず、幅広い発光性化合物を効率的にクエンチする。

【0055】

オリゴヌクレオチドを合成する方法およびフルオロフォアを核酸に共有結合させる方法は、当技術分野において公知である。例えば、米国特許第３，９９６，３４５号；同第４，３５１，７６０号；同第４，７５７，１４１号；同第４，７３９，０４４号；同第４，９９７，９２８号；同第５，５３８，８４８号；同第５，１８８，９３４号；同第５，２３１，１９１号；および同第７，７５９，４６９号；ならびにＥｃｋｓｔｅｉｎ（編）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９９１）；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５：５３０５～５３２１頁（１９８７）（オリゴヌクレオチド上の３’チオール基）；Ｓｈａｒｍａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９：３０１９（１９９１）（３’スルフヒドリル）；Ｇｉｕｓｔｉら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２：２２３～２２７頁（１９９３）；Ａｇｒａｗａｌら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、３１：１５４３～１５４６頁（１９９０）（ホスホロアミデート結合を介した結合）；Ｓｐｒｏａｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５：４８３７（１９８７）（５’メルカプト基）；Ｎｅｌｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１７：７１８７～７１９４頁（１９８９）（３’アミノ基）を参照されたい。標識された核酸プローブを合成するには、官能基および連結部分を使用することができる。一般的に使用されているように、予め合成されたフルオロフォア標識ヌクレオチドが、標準的なホスホロアミダイトベースの化学を使用してオリゴヌクレオチドに組み込まれる。そのようなヌクレオチドをオリゴヌクレオチド中の所望の位置に組み込むことにより、ドナーおよびアクセプターフルオロフォアをオリゴヌクレオチド中の任意の内部位置または末端位置に組み込むことができる。予め合成されたフルオロフォア標識ヌクレオチドにおいて、標識には、例えば、ヌクレオチドの塩基のアミノ基に結合した官能基が結合していてもよい。他の実施形態において、標識は、連結部分を介してヌクレオチドの一部に結合している。例えば、いくつかの実施形態において、ヌクレオチド塩基は、標識へのコンジュゲーションを可能にするように修飾される。例えば、米国特許第７，７５９，４６９号は、フルオロフォアにコンジュゲートさせることができる置換されたニトロインドールヌクレオチドを開示している。

【0056】

いくつかの実施形態において、二本鎖核酸基質は、約１０～約９０塩基対の長さである。例えば、エンドヌクレアーゼＣａｓ１２ａの場合、基質は３５～９０塩基対の長さであり、ＰＡＭ（５ｎｔ）、スペーサー（２０ｎｔ）、末端保護（各末端で５ｎｔ）の合計３５塩基対を含み得る。概して、エンドヌクレアーゼは、様々なサイズおよび構造の認識配列を有する。したがって、試験される各エンドヌクレアーゼについて、基質の最適な長さは、上記の計算を使用して決定することができる。最適な長さおよび配列は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで決定するか、または経験的に見出すことができる。そのような最適な長さは、過剰な長さを有することなく、立体障害のないエンドヌクレアーゼによる最も効率的な消化を可能にする。過剰な長さは、過剰な製作コストに関連し、本明細書に記述される方法を行うためにエキソヌクレアーゼの追加のユニットおよび追加の時間を必要とする。試験される各エンドヌクレアーゼのための二本鎖核酸基質の最適な長さは、そのような検討事項のうちの１つまたはそれ以上を加味したものであり得る。

【0057】

いくつかの実施形態において、本発明の核酸基質は化学修飾を含む。いくつかの実施形態において、修飾は、核酸二重鎖の安定性を増加させる。いくつかの実施形態において、修飾は、ヌクレアーゼ消化に対する抵抗性またはヌクレアーゼの阻害をもたらす。いくつかの実施形態において、修飾は、エキソヌクレアーゼ消化に対する抵抗性またはエキソヌクレアーゼの阻害をもたらす。

【0058】

いくつかの実施形態において、修飾は、骨格修飾である。骨格修飾の一種は、修飾されたヌクレオシド間結合である。例えば、修飾は、ホスホロチオエート結合およびヘテロ原子ヌクレオシド間結合を含む。

【0059】

別の種類の骨格修飾は、糖部分の修飾である。いくつかの実施形態において、修飾は、リボースまたはデオキシリボース環の代わりに６員モルホリノ環の組み込みを伴う。別の骨格修飾は、リボースまたはデオキシリボースの代わりにシクロヘキセニル環の組み込みを伴う（ｃｅＮＡ）。さらに別の骨格修飾は、２’－ヒドロキシル基がリボースの４’炭素原子に結合することによって２’－Ｃ，４’－Ｃ－オキシメチレン結合を有する二環式構造を形成しているロックド核酸（ＬＮＡ）の組み込みを伴う。ＬＮＡは、二重鎖安定性および３’－５’エキソヌクレアーゼ消化に対する抵抗性によって特徴付けられる。

【0060】

いくつかの実施形態において、修飾は、窒素塩基修飾である。例えば、二本鎖核酸基質は、１つまたはそれ以上の５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニル（－Ｃ＝Ｃ－ＣＨ３）ウラシルおよびシトシンおよびピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよび他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチルおよび他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニン、ならびに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンを組み込み得る。修飾された核酸塩基は、三環式ピリミジン、例えばフェノキサジンシチジン（１Ｈ－ピリミド（５，４－ｂ）（１，４）ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド（５，４－ｂ）（１，４）ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、Ｇ－クランプ、例えば置換フェノキサジンシチジン（例えば９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド（５，４－（ｂ）（１，４）ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド（４，５－ｂ）インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈピリド（３’，２’：４，５）ピロロ（２，３－ｄ）ピリミジン－２－オン）、７－デアザ－アデニン、７－デアザグアノシン、２－アミノピリジンおよび２－ピリドンを含み得る。核酸塩基は、ポリヌクレオチド化合物の結合親和性を増加させるのに有用であり得る。これらは、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、ならびにＮ－２、Ｎ－６および０－６置換プリン、例えば２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシンを含み得る。５－メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６～１．２℃増加させることができ、好適な塩基置換であり得る（例えば、２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合）。

【0061】

当業者には理解されるであろうが、核酸修飾は、エンドヌクレアーゼがその修飾によって阻害されないことが確立されていない限り、その修飾がエンドヌクレアーゼ活性に干渉し得る場合には、試験されるエンドヌクレアーゼのための認識部位に含まれるべきではない。同様に、当業者には理解されるであろうが、エキソヌクレアーゼ消化を阻害することが知られている核酸修飾は、本明細書に記述される方法の実施を阻止または阻害しないように、基質のうちエンドヌクレアーゼ認識部位とフルオロフォアとの間に位置する部分に含まれるべきではない。

【0062】

本明細書に記述される方法および組成物はエキソヌクレアーゼを利用する。エキソヌクレアーゼは当技術分野において公知であり、多くが市販されている。例えば、Ｌｏｖｅｔｔ Ｓ．Ｔ．（２０１１）．Ｔｈｅ ＤＮＡ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．ＥｃｏＳａｌ Ｐｌｕｓ、４（２）およびＳｈｅｖｅｌｅｖ、Ｉ．、Ｈｕｂｓｃｈｅｒ、Ｕ．（２００２）Ｔｈｅ ３’－５’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３、３６４～３７６頁を参照されたい。多くのエキソヌクレアーゼがＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｍａｓｓ．）から入手可能である。例えば、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＴ、およびエキソヌクレアーゼＶＩＩは、一本鎖ＤＮＡに対して活性をもつ３’－５’エキソヌクレアーゼである。ＲｅｃＪｆは、一本鎖ＤＮＡに対して活性をもつ５’－３’エキソヌクレアーゼである。エキソヌクレアーゼＩＩＩは、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡに対して活性をもつ３’－５’エキソヌクレアーゼである。Ｔ７エキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、ラムダエキソヌクレアーゼ、およびＴ５エキソヌクレアーゼは、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡに対して活性をもつ５’－３’エキソヌクレアーゼである。エキソヌクレアーゼＶ（ＲｅｃＢＣＤ）およびＢＡＬ－３１は、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡに対して活性をもつ、同時に５’－３’および３’－５’のエキソヌクレアーゼである。試験されるエンドヌクレアーゼの作用によって生成される核酸末端の種類に応じて、当業者は適切なエキソヌクレアーゼを選択することができる。適切なエキソヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼによって生成された１つまたは複数の末端を利用し、本明細書に記述される核酸基質を加水分解する。エキソヌクレアーゼによる加水分解は、蛍光または蛍光における変化を検知することができるように、フルオロフォアのＦＲＥＴ対（例えば、ドナーおよびアクセプターまたはレポーターおよびクエンチャー）を分離する。

【0063】

図１に示すように、基質は、末端の少なくとも１つに、エキソヌクレアーゼによる消化を阻害または防止する構造を含む。本明細書に記述される方法、組成物およびキットに含まれるエキソヌクレアーゼの選択は、核酸基質における末端保護をもたらすエキソヌクレアーゼ阻害構造の選択の情報源となる。例えば、エキソヌクレアーゼのための好ましい基質が３’末端であるならば、核酸基質は、３’末端の各々にエキソヌクレアーゼ阻害構造を有する。エキソヌクレアーゼのための好ましい基質が５’末端であるならば、核酸基質は、５’末端の各々にエキソヌクレアーゼ阻害構造を有する。エキソヌクレアーゼが３’末端および５’末端の両方に対して活性をもつならば、核酸基質は、３’末端および５’末端の各々にエキソヌクレアーゼ阻害構造を有する。

【0064】

エキソヌクレアーゼの選択は、試験されるエンドヌクレアーゼによって生成される切断および利用可能な末端の種類と合致する必要もある。エキソヌクレアーゼ（またはエキソヌクレアーゼの混合物）は、本明細書に記述される核酸基質の末端に存在する阻害構造によって阻害されると共に、試験されるエンドヌクレアーゼによって生成される種類の末端（突出、平滑または陥凹、ヒドロキシルまたはホスホリル）に対して活性をもつ必要がある。

【0065】

いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、ニッカーゼ、すなわち、二重鎖の一方の鎖のみを切断し、ニックを生成するエンドヌクレアーゼである。この実施形態において、エキソヌクレアーゼは例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、およびＢＡＬ３１エキソヌクレアーゼであり得る。

【0066】

いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、二重鎖の両鎖を切断し、二本鎖切断を生成する。いくつかの実施形態において、二本鎖切断は、平滑末端を有する。いくつかの実施形態において、二本鎖切断は、ジグザグ末端（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｅｎｄ）を有する。いくつかの実施形態において、ジグザグ末端は、突出３’末端を有し得る。いくつかの実施形態において、ジグザグ末端は、突出５’末端を有し得る。当業者であれば、試験されるエンドヌクレアーゼによって生成された特定の種類の末端から所望の方向における加水分解を開始することが可能なエキソヌクレアーゼ（または２つ以上のエキソヌクレアーゼの混合物）を選択することができるであろう。例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｍａｓｓ）は、生化学的特性（例えば、必要な末端の種類および加水分解の方向性）によってグループ分けされた利用可能なエキソヌクレアーゼのリストを公開している。

【0067】

さらに図１、パネルＢに見られるように、基質は、エンドヌクレアーゼのための認識配列（または認識部位）を含む。試験されるエンドヌクレアーゼに応じて、認識部位は、切断部位を含み得、１つまたはそれ以上の追加の要素を有し得る。いくつかの実施形態において、試験されるエンドヌクレアーゼは、核酸誘導型エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、試験されるエンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラスＩ（ＣＡＳＣＡＤＥ）エンドヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲクラスＩＩエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、試験されるエンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）エンドヌクレアーゼである。

【0068】

いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼはデオキシリボヌクレアーゼであり、基質は一本鎖または二本鎖ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼはリボヌクレアーゼであり、基質は一本鎖または二本鎖ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、リボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、ＤＮＡザイム、ＰＮＡザイム、または例えばＣｈｏｕｄｈｕｒｙ、Ｒ．ら、（２０１２）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｃｕｓｔｏｍｉｚｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍ．、３：１１４７に記述されている種類のエンジニアリングされたエンドリボヌクレアーゼのようなリボヌクレアーゼである。

【0069】

いくつかの実施形態において、試験されるエンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ座位によってコードされるエンドヌクレアーゼであるか、またはそれに関連する。ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）ゲノム座位は、多くの原核生物ゲノムに見出され、外来核酸の侵入に対する抵抗性を提供する。ＣＲＩＳＰＲ座位の構造、命名法および分類は、Ｍａｋａｒｏｖａら、Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．２０１１ Ｊｕｎｅ；９（６）：４６７～４７７頁において概説されている。

【0070】

簡潔に述べると、典型的なＣＲＩＳＰＲ座位は、スペーサーが規則的に挿入された、いくつかの短いリピートを含む。ＣＲＩＳＰＲ座位は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子のコーディング配列も含む。スペーサー・リピート配列ユニットは、ｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードする。Ｉｎ ｖｉｖｏでは、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡまたはｐｒｅ－ｃｒＲＮＡアレイと呼ばれる多シストロン性転写物から成熟ｃｒＲＮＡがプロセシングされる。リピートに結合し、リピートを切断して成熟ｃｒＲＮＡを遊離させるＣａｓコードタンパク質により、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡアレイにおけるリピートが認識される。ＣＲＩＳＰＲシステムがターゲット核酸の切断を行い、Ｃａｓタンパク質およびｃｒＲＮＡがＣＲＩＳＰＲリボ核タンパク質（ｃｒＲＮＰ）を形成する。ｃｒＲＮＡ分子がｃｒＲＮＰをターゲット核酸（例えば、細菌細胞に侵入する外来核酸）に誘導し、Ｃａｓヌクレアーゼタンパク質がターゲット核酸を切断する。

【0071】

クラス１、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、サブユニットＣａｓＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥから構成されたＣａｓｃａｄｅ（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｄｅｆｅｎｓｅ）と呼ばれる多タンパク質複合体を含むｐｒｅ－ｃｒＲＮＡアレイをプロセシングするための手段を含む。Ｃａｓｃａｄｅ－ｃｒＲＮＡ複合体は、ターゲット核酸とｃｒＲＮＡのハイブリダイゼーションを通じてターゲット核酸を認識する。結合した核タンパク質複合体は、Ｃａｓ３ヘリカーゼ／ヌクレアーゼを動員してターゲット核酸の切断を促進する。

【0072】

クラス２、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡアレイ内のｃｒＲＮＡリピートにハイブリダイズし、内因性ＲＮａｓｅＩＩＩを動員してｐｒｅ－ｃｒＲＮＡアレイを切断させる。ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ複合体は、ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９と会合することができる。ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ９複合体は、ターゲット核酸とｃｒＲＮＡのハイブリダイゼーションを通じてターゲット核酸を認識する。ｃｒＲＮＡがターゲット核酸にハイブリダイズすると、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが活性化してターゲット核酸を切断する。

【0073】

クラス１、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲポリメラーゼ様タンパク質を用いてｐｒｅ－ｃｒＲＮＡアレイを切断するエンドリボヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ６）のＲＡＭＰスーパーファミリーを含む。

【0074】

クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｉ～ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムにおけるＣａｓ遺伝子の遠いホモログであるＣｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３およびＣｓｆ４を含む、異なるセットのＣａｓ様遺伝子を含む。

【0075】

図１、パネルＢに示すように、基質は、エンドヌクレアーゼのための認識配列（または認識部位）を含む。いくつかの実施形態において、認識配列および切断部位は同じである。いくつかの実施形態において、認識部位は、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼに特徴的な回文配列であり、切断は回文配列内で起こる。いくつかの実施形態において、認識配列は切断部位とは異なる。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、ＣＲＳＩＰＲ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼであり、認識配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）であり、切断部位は、ＰＡＭに隣接している。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、ＣＲＳＩＰＲ Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼであり、認識配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）であり、切断部位は、非ターゲット鎖上のＰＡＭから１６～１８塩基離れており、ターゲット鎖上のＰＡＭから２３～２５塩基離れている。Ｓｔｒｏｈｋｅｎｄｌ、Ｉ．ら、（２０１８）Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、７１（５）：８１６～８２４．ｅ３を参照されたい。

【0076】

いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、ニッカーゼ、すなわち、二重鎖の一方の鎖のみを切断し、ニックを生成するエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、二重鎖の両鎖を切断し、二本鎖切断を生成する。二本鎖切断は、平滑末端またはジグザグ末端を有し得る。ジグザグ末端は、突出３’末端または突出５’末端を有し得る。５’末端は、５’－ホスホリルまたは５’－ヒドロキシル基を有することができ、３’末端は、３’－ホスホリルまたは３’－ヒドロキシル基を有することができる。

【0077】

ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、固定された配列を切断するのではなく、上述のように核酸ガイドによって誘導される。ガイドＲＮＡに加えて、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる追加の配列を認識する。いくつかの実施形態において、本発明の基質は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。試験されるエンドヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲクラスＩ（ＣＡＳＣＡＤＥ）エンドヌクレアーゼである実施形態において、基質は、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＡＧＧ－３’、５’－ＡＴＧ－３’、５’－ＧＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、５’－ＧＴＧ－３’、５’－ＴＡＡ－３’、５’－ＴＧＧ－３’、５’－ＡＡＡ－３’、５’－ＡＡＣ－３’、５’－ＡＡＴ－３’、５’－ＡＴＡ－３’、５’－ＴＡＧ－３’、および５’－ＴＴＧ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。試験されるエンドヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲクラスＩＩエンドヌクレアーゼである実施形態において、基質は、５’－ＮＧＧ－３’、５’－ＮＧＧＮＧ－３’、５’－ＮＮＡＡＡＡＷ－３’、５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３’、５’－ＧＮＮＮＣＮＮＡ－３’、および５’－ＮＮＮＡＣＡ－３’、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＴＴＴＮ－３’および５’－ＴＴＴＶ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。

【0078】

ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、固定された認識配列を切断するのではなく、「ガイドＲＮＡ」と呼ばれる（本明細書では「核酸ターゲティング核酸（ＮＡＴＮＡ）」と呼ばれる）核酸ガイドによって誘導される。ガイドＲＮＡ（ＮＡＴＮＡ）は、エンドヌクレアーゼ切断部位に相補的な「スペーサー」配列を含む。試験されるエンドヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼである実施形態において、基質は、ＮＡＴＮＡの一部分（「スペーサー」）にハイブリダイズすることが可能なターゲット配列を含む。

【0079】

いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、核酸誘導型エンドヌクレアーゼである。そのようなエンドヌクレアーゼを含む反応混合物は、核酸ターゲティング核酸（ＮＡＴＮＡ）をさらに必要とする。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼであり、ＮＡＴＮＡはガイドＲＮＡである。エンドヌクレアーゼは、１つまたはそれ以上のガイドＲＮＡとリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成することが可能である。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、クラス２、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼであり、ＮＡＴＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼであり、ＮＡＴＮＡは、ｃｒＲＮＡを含む。

【0080】

いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、米国特許第９，２６０，７５２号に記述されている実施形態から選択される。簡潔に述べると、ＮＡＴＮＡは、５’から３’の順に、スペーサー伸長部、スペーサー、最小限のＣＲＩＳＰＲリピート、シングルガイドコネクター、最小限のｔｒａｃｒＲＮＡ、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、およびｔｒａｃｒＲＮＡ伸長部を含み得る。場合によっては、核酸ターゲティング核酸は、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長部、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、最小限のｔｒａｃｒＲＮＡ、シングルガイドコネクター、最小限のＣＲＩＳＰＲリピート、スペーサー、およびスペーサー伸長部を任意の順序で含み得る。

【0081】

いくつかの実施形態において、ガイド核酸ターゲティング核酸は、シングルガイドＮＡＴＮＡを含み得る。ＮＡＴＮＡは、ターゲット核酸配列にハイブリダイズするようにエンジニアリングすることができるスペーサー配列を含む。ＮＡＴＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列にハイブリダイズすることができる配列を含むＣＲＩＳＰＲリピートをさらに含む。場合により、ＮＡＴＮＡは、スペーサー伸長部およびｔｒａｃｒＲＮＡ伸長部を有し得る。これらの要素は、ＮＡＴＮＡの安定性に寄与し得る要素を含み得る。ＣＲＩＳＰＲリピートおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、塩基対合した二本鎖構造を形成するように相互作用することができる。この構造は、ＮＡＴＮＡへのエンドヌクレアーゼの結合を促進し得る。

【0082】

いくつかの実施形態において、シングルガイドＮＡＴＮＡは、最小限のＣＲＩＳＰＲリピートと最小限のｔｒａｃｒＲＮＡ配列との間のハイブリダイゼーションの領域を含む第１の二重鎖の５’に位置するスペーサー配列を含む。第１の二重鎖の途中にバルジがあってもよい。バルジは、ＮＡＴＮＡへのエンドヌクレアーゼの動員を促進する。バルジの後には、最小限のＣＲＩＳＰＲリピートと最小限のｔｒａｃｒＲＮＡ配列とを接続するリンカーを含む第１のステムが続いてもよい。第１の二重鎖の３’末端における最後の対合したヌクレオチドは、第１の二重鎖をｍｉｄ－ｔｒａｃｒＲＮＡに接続する第２のリンカーに接続していてもよい。ｍｉｄ－ｔｒａｃｒＲＮＡは、１つまたはそれ以上の追加のヘアピンを含み得る。

【0083】

いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、ダブルガイド核酸構造を含み得る。ダブルガイドＮＡＴＮＡは、スペーサー伸長部、スペーサー、最小限のＣＲＩＳＰＲリピート、最小限のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、およびｔｒａｃｒＲＮＡ伸長部を含む。ダブルガイドＮＡＴＮＡは、シングルガイドコネクターを含まない。その代わり、最小限のＣＲＩＳＰＲリピート配列が３’ＣＲＩＳＰＲリピート配列を含み、最小限のｔｒａｃｒＲＮＡ配列が５’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含み、ダブルガイドＮＡＴＮＡは、最小限のＣＲＩＳＰＲリピートおよび最小限のｔｒａｃｒＲＮＡ配列を介してハイブリダイズすることができる。

【0084】

いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、１つまたはそれ以上のＤＮＡ残基を含むエンジニアリングされたガイドＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲハイブリッドＲＤＮＡまたはｃｈＲＤＮＡ）である。いくつかの実施形態において、ＮＡＴＮＡは、米国特許第９，６５０，６１７号に記述されている実施形態から選択される。簡潔に述べると、クラス２ ＣＲＩＳＰＲシステムで使用される一部のｃｈＲＤＮＡは、上方二重鎖領域、下方二重鎖領域、バルジ、ターゲティング領域、ネクサス、および１つまたはそれ以上のヘアピンから構成された活性化領域を含む二次構造を形成する２つの鎖から構成される場合がある。ターゲティング領域の直ぐ下流のヌクレオチド配列は、様々な割合のＤＮＡおよびＲＮＡを含み得る。他のｃｈＲＤＮＡは、ターゲティング領域と、下方二重鎖領域、上方二重鎖領域、融合領域、バルジ、ネクサス、および１つまたはそれ以上のヘアピンから構成された活性化領域とを含む、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムで使用されるシングルガイドＤ（Ｒ）ＮＡであり得る。ターゲティング領域の直ぐ下流のヌクレオチド配列は、様々な割合のＤＮＡおよびＲＮＡを含み得る。例えば、ターゲティング領域は、ＤＮＡまたはＤＮＡとＲＮＡとの混合物を含むことができ、活性化領域は、ＲＮＡまたはＤＮＡとＲＮＡとの混合物を含むことができる。

【0085】

いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、核酸修飾、例えば、リボヌクレアーゼに対する抵抗性をもたらす修飾を含む。この特色は、以下に記述する粗製ライセートアッセイにおいて特に有利である。

【0086】

いくつかの実施形態において、試験されるエンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、試験されるエンドヌクレアーゼは、ＩＩ型、ＩＩ型、またはＩＶ型制限エンドヌクレアーゼである。本発明の基質は、各エンドヌクレアーゼについて適切な認識配列を含有する。ＩＶ型制限エンドヌクレアーゼの場合、本発明の基質は、エンドヌクレアーゼによる切断に必要な１つまたはそれ以上のメチル化残基も含有する。

【0087】

試験されるエンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、または制限エンドヌクレアーゼＦｏｋ Ｉの非特異的切断ドメインにコンジュゲートされたＺＦＮである実施形態において、ターゲット配列は、約２２～５２塩基の長さであり、一対のＺＦＮ認識配列を含み、ＺＦＮ認識配列は、各々９～１８ヌクレオチドの長さであり、スペーサーによって分離されており、スペーサーは４～１８ヌクレオチドの長さである（例えば、Ｋｉｍ Ｙ．Ｇ．ら、（１９９６）．Ｈｙｂｒｉｄ ｒｅｓｔｉｃｒｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ：ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｆｕｓｉｏｎｓ ｔｏ Ｆｏｋ Ｉ ｃｌｅａｖａｇｅ ｄｏｍａｉｎ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９３（３）：１１５６～１１６０頁を参照されたい）。

【0088】

試験されるエンドヌクレアーゼが、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＴＡＬＥＮ－Ｆｏｋ Ｉ融合物である実施形態において、ターゲット配列は、約４８～８５ヌクレオチドの長さであり、一対のＴＡＬＥＮ認識配列を含み、ＴＡＬＥＮ認識配列は、各々１８～３０塩基の長さであり、スペーサーによって分離されており、スペーサーは１２～２５塩基の長さである（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｍ．ら、（２０１０）Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＤＮＡ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ ｗｉｔｈ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１８６（２）：７５７～６１頁を参照されたい）。

【0089】

いくつかの実施形態において、試験されるエンドヌクレアーゼは、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ（Ａｇｏ）エンドヌクレアーゼである。Ａｇｏエンドヌクレアーゼは認識配列を有しないが、低分子干渉ＤＮＡガイド（ｓｉＤＮＡ）によって誘導されて相補的ＤＮＡを切断する。Ｈｅｇｇｅら、（２０１９）ＤＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｔ ｍｏｄｅｒａｔｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ ｂｙ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ Ａｒｇｏｎａｕｔｅ、Ｎ．Ａ．Ｒ．４７（１１）：５８０９。

【0090】

いくつかの実施形態において、試験されるエンドヌクレアーゼは、Ａｒｃｕｓエンドヌクレアーゼである。Ａｒｃｕｓは、２２塩基長のターゲット配列を有するＩ－ＣｒｅＩエンドヌクレアーゼである（例えば、Ｄｕｒｒｅｎｂｅｒｇｅｒら、（１９９１）Ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ、Ｎ．Ａ．Ｒ．２４（１７）：３３２３を参照されたい）。

【0091】

いくつかの実施形態において、試験されるエンドヌクレアーゼはエンドリボヌクレアーゼであり、基質はＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、基質は一本鎖ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、基質は二本鎖ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、基質はＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドである。そのようなアッセイで使用されるエキソヌクレアーゼは、選択された基質に適応するように、エキソデオキシリボヌクレアーゼまたはエキソリボヌクレアーゼである。そのような基質の１つまたはそれ以上を切断するエンドリボヌクレアーゼの例としては、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ ＺおよびＲＮａｓｅ Ｐが挙げられる。エンドリボヌクレアーゼの他の例は、Ｃａｓ１３およびＣａｓ７－１１から選択されるＣＲＩＳＰＲエンドリボヌクレアーゼである。

【0092】

エキソリボヌクレアーゼの例としては、ＲＮａｓｅ Ｒ、ＲＮａｓｅ ＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｄ、ＲＮａｓｅ Ｔ、ＲＮａｓｅ ＢＮ、ＲＮａｓｅ ＰＨのような３’－５’方向に切断するもの、ならびにエキソリボヌクレアーゼＩおよびエキソリボヌクレアーゼＩＩのような５’－３’方向に切断するものが挙げられる。

【0093】

いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記述される基質を使用してエンドヌクレアーゼの活性を検知する方法である。図１、パネルＢに示すように、該方法は、試験されるエンドヌクレアーゼを：蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を形成するドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォア（またはレポーターフルオロフォアおよびクエンチャーフルオロフォア）、ならびに試験されるエンドヌクレアーゼのための認識配列を含む二本鎖核酸基質を含む反応混合物に接触させることを含む。反応混合物は、認識配列のエンドヌクレアーゼ切断に好適な条件下でインキュベートされる。

【0094】

該方法は、反応混合物をエキソヌクレアーゼに接触させることをさらに含む。エキソヌクレアーゼ、基質、およびエンドヌクレアーゼは、同時に添加してもよく、任意の順序で連続的に添加してもよい。

【0095】

図１、パネルＢ～Ｃに示すように、二本鎖核酸基質の構造は、エンドヌクレアーゼ切断が起こるまでエキソヌクレアーゼが二本鎖核酸基質を加水分解しないようになっている。二本鎖核酸基質の適切な末端は、エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する構造を含む。本明細書に記述されるように、エンドヌクレアーゼによって生成される末端に応じて、エキソヌクレアーゼは３’－５’エキソヌクレアーゼであり、基質の３’末端が、エキソヌクレアーゼ阻害構造によって保護される。他の実施形態において、エキソヌクレアーゼは５’－３’エキソヌクレアーゼであり、基質の５’末端が、エキソヌクレアーゼ阻害構造によって保護される。いくつかの実施形態において、３’－５’エキソヌクレアーゼと５’－３’エキソヌクレアーゼとの混合物が使用される。そのような実施形態では、基質の３’末端と５’末端の両方が、エキソヌクレアーゼ阻害構造によって保護される。

【0096】

図１、パネルＣに示すように、反応混合物は、二本鎖核酸基質のエキソヌクレアーゼ切断に好適な条件下でさらにインキュベートされる。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼ切断および後続のエキソヌクレアーゼ切断のための条件は同じである。そのような実施形態では、バッファーまたはインキュベーション条件の変更は必要ない。いくつかの実施形態において、反応混合物をエンドヌクレアーゼに接触させることと反応混合物をエキソヌクレアーゼに接触させることとの間に精製工程は行われない。

【0097】

該方法の利点の１つは、フルオロフォアおよびクエンチャーを非常に近くに配置することができるためにバックグラウンドシグナルが最小限に抑えられることである。また、例えばフルオロフォアが切断部位の片側にあり、クエンチャーが反対側にあるように、フルオロフォアクエンチャー対が切断部位付近に組み込まれた場合に起こる可能性が高い立体効果も回避される。

【0098】

いくつかの実施形態において、該方法によって試験されるエンドヌクレアーゼは、核酸誘導型エンドヌクレアーゼである。そのような実施形態では、ＮＡＴＮＡも該方法において利用される。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼであり、ＮＡＴＮＡはガイドＲＮＡである。

【0099】

いくつかの実施形態において、該方法によって試験されるエンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラスＩ（ＣＡＳＣＡＤＥ）エンドヌクレアーゼであり、該方法において使用される二本鎖核酸基質は、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＡＧＧ－３’、５’－ＡＴＧ－３’、５’－ＧＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、５’－ＧＴＧ－３’、５’－ＴＡＡ－３’、５’－ＴＧＧ－３’、５’－ＡＡＡ－３’、５’－ＡＡＣ－３’、５’－ＡＡＴ－３’、５’－ＡＴＡ－３’、５’－ＴＡＧ－３’、および５’－ＴＴＧ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。該方法によって試験されるエンドヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲクラスＩＩエンドヌクレアーゼである実施形態において、該方法において使用される二本鎖核酸基質は、５’－ＮＧＧ－３’、５’－ＮＧＧＮＧ－３’、５’－ＮＮＡＡＡＡＷ－３’、５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３’、５’－ＧＮＮＮＣＮＮＡ－３’、および５’－ＮＮＮＡＣＡ－３’、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＴＴＴＮ－３’および５’－ＴＴＴＶ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。

【0100】

いくつかの実施形態において、該方法によって試験されるエンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｆｏｋ ＩにコンジュゲートされたＺＦＮ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＥｎｄｏＴＴ一本鎖エンドヌクレアーゼ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅエンドヌクレアーゼ、Ａｒｃｕｓエンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ ＺおよびＲＮａｓｅ Ｐ、Ｃａｓ３およびＣａｓ７－１１から選択されるエンドリボヌクレアーゼ、ならびに制限エンドヌクレアーゼのうちの１つである。これらの実施形態では、該方法において使用される二本鎖核酸基質は、好適な認識部位を含む。

【0101】

いくつかの実施形態において、該方法は、いくつかのエンドヌクレアーゼをスクリーニングすること、試験すること、または比較することを含む。これらの実施形態において、該方法は、同じ成分を含む一連の反応混合物を一連の異なるエンドヌクレアーゼに接触させることを含む。いくつかの実施形態において、一連のエンドヌクレアーゼは、一連の核酸誘導型エンドヌクレアーゼであり、同じ成分を含む一連の反応混合物中の反応混合物は、同じＮＡＴＮＡも含む。いくつかの実施形態において、一連のエンドヌクレアーゼは、一連のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼであり、同じ成分を含む一連の反応混合物中の反応混合物は、同じガイドＲＮＡも含む。

【0102】

いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは核酸誘導型エンドヌクレアーゼであり、該方法は、いくつかのＮＡＴＮＡをスクリーニングすること、試験すること、または比較することを含む。これらの実施形態において、該方法は、同じエンドヌクレアーゼを含む、同じ成分を含む一連の反応混合物を、一連の異なるＮＡＴＮＡに接触させることを含む。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼであり、ＮＡＴＮＡはガイドＲＮＡである。これらの実施形態において、該方法は、同じＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを含む、同じ成分を含む一連の反応混合物を、一連の異なるガイドＲＮＡに接触させることを含む。

【0103】

いくつかの実施形態において、該方法は、同じエンドヌクレアーゼのいくつかの製剤をスクリーニングすること、試験すること、または比較することを含む。これらの実施形態において、該方法は、同じ成分を含む一連の反応混合物を、同じエンドヌクレアーゼの一連の異なる製剤に接触させることを含む。異なる製剤は、同じエンドヌクレアーゼの異なる単離物であり得る。異なる製剤は、エンドヌクレアーゼを単離することを目的としたクロマトグラフィー手順からの溶出アリコートでもよい。本発明は、クロマトグラフィー手順から出てくる溶出画分について本明細書に記述されるエンドヌクレアーゼ活性アッセイを行うことによりエンドヌクレアーゼの溶出をモニターし、最も高いエンドヌクレアーゼ活性を有する溶出画分を保持する方法を含む。

【0104】

いくつかの実施形態において、該方法は、エンドヌクレアーゼのための好ましいまたは最適なターゲット配列を特定するために、いくつかの核酸配列をスクリーニングすること、試験すること、または比較することを含む。これらの実施形態において、該方法は、同じエンドヌクレアーゼを含む同じ成分を含む一連の反応混合物を、異なる配列を有する一連の二本鎖核酸基質に接触させることを含む。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼであり、同じ成分を含む一連の反応混合物中の反応混合物は、同じガイドＲＮＡも含む。

【0105】

いくつかの実施形態において、該方法は、エンドヌクレアーゼのための好ましいまたは最適な反応条件を特定するために、いくつかの反応条件をスクリーニングすること、試験すること、または比較することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、異なるバッファー構成を含む一連の反応混合物を同じエンドヌクレアーゼに接触させることを含む。いくつかの実施形態において、一連の反応混合物はまた、エンドヌクレアーゼ消化工程中に異なる温度プロファイルに供される。

【0106】

いくつかの実施形態において、該方法は、核酸切断反応における好ましいまたは最適なエンドヌクレアーゼ濃度を特定するために、いくつかの反応条件をスクリーニングすること、試験すること、または比較することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、試験される同じエンドヌクレアーゼの濃度が異なること以外は同一である一連の反応混合物を接触させることを含む。

【0107】

いくつかの実施形態において、該方法は、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼのための好ましいまたは最適なｇＲＮＡを特定するために、いくつかのＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドガイド（ガイドＲＮＡまたはｇＲＮＡ）をスクリーニングすること、試験すること、または比較することを含む。これらの実施形態において、該方法は、ガイドＲＮＡが異なること以外は同一である一連の反応混合物を接触させることを含む。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドガイドは、１つまたはそれ以上のＤＮＡ残基を含む（ＣＲＩＳＰＲハイブリッドＲＤＮＡまたはｃｈＲＤＮＡ）。これらの実施形態において、該方法は、ｃｈＲＤＮＡが異なること以外は同一である一連の反応混合物を接触させることを含む。

【0108】

図１、パネルＤに示すように、該方法は次に、反応混合物により放出された蛍光を測定することであって、蛍光における変化はエンドヌクレアーゼの活性を示すことを含む。蛍光における変化は、蛍光シグナルの色（波長）における変化だけでなく、蛍光が以前に検知できなかったところでの蛍光の出現も含む。いくつかの実施形態において、測定は定性的であり、エンドヌクレアーゼ活性の存在または非存在を示す。他の実施形態において、測定は定量的であり、エンドヌクレアーゼ活性の相対量を示す。いくつかの実施形態において、蛍光における変化は、蛍光の強度における変化、および試験されるサンプル間の蛍光における差をさらに含む。

【0109】

いくつかの実施形態において、本明細書に記述される方法は、単離された核酸基質および単離されたポリペプチド（例えば、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ）を用いて行われる。他の実施形態において、アッセイは、実質的な精製工程を用いずに粗製混合物を用いて行われる。いくつかの実施形態において、例えば、エンドヌクレアーゼの生産または精製プロセスを迅速に評価するために、単離または精製された核酸基質がエンドヌクレアーゼの粗製単離物または溶出画分に添加される。いくつかの実施形態において、単離または精製されたポリペプチド（例えば、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ）は、患者における感染性因子の存在を迅速に検知するために、核酸の粗製単離物、例えば、最小限に処理された患者サンプルに添加される。

【0110】

いくつかの実施形態において、本発明は、二本鎖核酸基質、および該基質を製造する方法である。該基質は、例えば、ホスホロチオエート結合のようなエキソヌクレアーゼ末端保護を有する。１つ、２つ、３つ、４つ、または約５つのホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合で置換することができる。例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩが使用される場合、両鎖の３’末端にてホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合で置換することができる。場合により、各鎖の３’末端の末端リン酸部分（存在する場合）をホスホロチオエートで置換してもよい。

【0111】

該基質はフルオロフォア（レポーター）およびクエンチャーも有する。レポーターおよびクエンチャーは、二本鎖核酸基質の一方の鎖の一方の末端の近くに配置することができる。フルオロフォアおよびクエンチャーの一方を一方の鎖の末端に結合させてもよい。例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩを使用する場合、フルオロフォア－クエンチャー対の一方のメンバーをターゲット鎖の５’末端に結合させてもよく、メンバーは末端から１、２、３、４、または約５ヌクレオチド離れたヌクレオチドに結合させてもよい。例えば、一方の鎖は、５’末端から第３位のヌクレオチドにチミン結合フルオレセインを、５’末端にＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）クエンチャーを有し得る。

【0112】

いくつかの実施形態において、試験されるエンドヌクレアーゼは、両鎖の配列（例えば、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼによって認識される回文配列）を認識する。いくつかの実施形態において、試験されるエンドヌクレアーゼは、一方の鎖の配列（例えば、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓエンドヌクレアーゼのためのターゲット配列）を認識する。そのような実施形態では、ターゲット核酸はターゲット鎖および非ターゲット鎖を有する。ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２ａのための基質の一例を図７に示す。該基質のターゲット鎖は、試験されるエンドヌクレアーゼのためのターゲティング可能な配列を含む。例えば、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）のための切断可能部位が、Ｚｅｔｓｃｈｅ、Ｂ．ら、（２０１５）Ｃｐｆ１ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ＲＮＡ ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆ ａ Ｃｌａｓｓ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ、Ｃｅｌｌ、１６３：７５９頁に記述されている。図７に示すように、該基質は、ＣＲＩＳＰＲガイド核酸によって認識されるスペーサー配列、フルオロフォア、クエンチャー、および各鎖の末端またはその付近におけるホスホロチオエートヌクレオチドのようなエキソヌクレアーゼ末端保護をさらに含む。

【0113】

いくつかの実施形態において、フルオロフォアはターゲット鎖上に配置される。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは非ターゲット鎖上に配置される。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、ターゲット鎖と非ターゲット鎖の両方に配置される。図１０は、代替的なフルオロフォアの配置を有する図７の基質を示す。図１０において、トップ鎖の明色および暗色のブロックは、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼのための認識（ターゲット）配列（明色のブロックはＰＡＭ、暗色のブロックはスペーサー）を表している。フルオロフォアは星として、クエンチャーは暗色の半月として表されている。暗色の八角形は、ホスホロチオエートヌクレオチドのようなエキソヌクレアーゼ阻害修飾を表す。

【0114】

いくつかの実施形態において、フルオロフォアの配置はアッセイの性能に影響する（実施例１１ならびに図１１、１２および１３を参照されたい）。

【0115】

二本鎖核酸基質は、好適なバッファー（例えば、ＴＥ）を含む反応混合物において２つの鎖（ターゲット鎖および相補的な非ターゲット鎖）を組み合わせることによって製造することができる。最適なアニーリングのために、混合物を９０℃超に加熱し、室温まで自然降温させてもよい。

【0116】

いくつかの実施形態において、本明細書にて開示されるエンドヌクレアーゼアッセイにおける使用を意図した各エキソヌクレアーゼについて、エキソヌクレアーゼ保護の有効性が試験される。本明細書に記述される各二本鎖核酸基質に対し、エキソヌクレアーゼ保護を欠いているコントロール二本鎖核酸基質が作製される。エキソヌクレアーゼ活性および蛍光の両方のための好適な反応条件下の好適なバッファー（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩおよびフルオレセインのためのＮＥＢｕｆｆｅｒ１、ｐＨ７．０）中のエキソヌクレアーゼに両基質が曝露され、例えば蛍光リーダーによって蛍光が測定される。エキソヌクレアーゼ保護がエキソヌクレアーゼに好適であれば、未保護の基質については蛍光シグナルが生成されるが、保護された基質については生成されない。

【0117】

いくつかの実施形態において、本明細書に記述される二本鎖核酸基質は、エンドヌクレアーゼ活性を検知するために使用される。該基質は、エキソヌクレアーゼ保護、フルオロフォアおよびクエンチャー（例えば、両鎖の３’末端における１つ、２つ、３つ、４つ、または約５つのホスホロチオエート結合、ならびにターゲット鎖の５’末端から第３位のヌクレオチドにおけるチミン結合フルオレセイン、および５’末端におけるＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）クエンチャー）を有する。該基質を、エキソヌクレアーゼ活性、エンドヌクレアーゼ活性および蛍光のための好適な反応条件下の好適なバッファー（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、ＡｓＣａｓ１２ａおよびフルオレセインのためのＮＥＢｕｆｆｅｒ１、ｐＨ７．０）中でエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼに接触させる。好適なバッファーの選択についての指針は、エンドヌクレアーゼ販売者（例えば、制限エンドヌクレアーゼについてはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）から、または公表された研究、例えば、Ｇａｓｉｕｎａｓ、Ｇ．ら、（２０２０）Ａ ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｉｖｅｒｓｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍ．１１、文献番号：５５１２ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０２０－１９３４４－１から得ることができる。

【0118】

エンドヌクレアーゼが核酸誘導型エンドヌクレアーゼである場合、核タンパク質複合体（例えば、リボ核タンパク質複合体、ＲＮＰ）をアセンブルし、核タンパク質複合体の形態の反応混合物にエンドヌクレアーゼを添加する。核タンパク質複合体は、エンドヌクレアーゼと、例えばＣａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）のためのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）のようなｃｒＲＮＡなどの核酸ターゲティング核酸（ＮＡＴＮＡ）とを含み、このｃｒＲＮＡの好適な配列は、例えば、Ｙａｍａｎｏ Ｔ．ら、（２０１６）Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｃｐｆ１ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ、Ｃｅｌｌ １６５：９４９頁に見出すことができる。核タンパク質複合体をアセンブルするには、ＮＡＴＮＴＡをエンドヌクレアーゼと共に、３７℃で１０分間などの好適な条件下でインキュベートする。ＮＡＴＮＴＡは、適切な二次構造形成を可能にするために、加熱することにより（例えば、９５℃まで２分間）前処理し、室温までゆっくりと自然降温させることができる。

【0119】

反応混合物の蛍光が測定される。エキソヌクレアーゼ保護基質については、エキソヌクレアーゼとエンドヌクレアーゼの両方が存在するときにのみ蛍光シグナルが生成される。

【0120】

いくつかの実施形態において、基質濃度の最適範囲およびエンドヌクレアーゼ濃度に関する感度を決定するために、エンドヌクレアーゼ濃度および核酸基質の濃度に関するアッセイの直線範囲が試験される。

【0121】

いくつかの実施形態において、本発明は、エンドヌクレアーゼの活性を検知するための組成物である。該組成物には、基質の３’末端（または５’末端、またはその両方）における構造によって阻害される３’－５’エキソヌクレアーゼ（または５’－３－エキソヌクレアーゼ、またはその両方）をさらに含む、本明細書に記述される核酸基質が含まれる。該組成物は二本鎖核酸基質を含み、二本鎖核酸基質は：蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を形成するドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォア（またはレポーターフルオロフォアおよびクエンチャーフルオロフォア）；エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する各末端における構造；ならびに試験されるエンドヌクレアーゼのための認識配列を含む。

【0122】

該組成物は、エキソヌクレアーゼも含み得る。エンドヌクレアーゼによって生成される末端に応じて、該組成物は、３’－５’エキソヌクレアーゼまたは５’－３’エキソヌクレアーゼ、または両方の混合物を含む。いくつかの実施形態において、基質ごとに複数のフルオロフォアを有することによってシグナルが増強される。いくつかの実施形態において、試験されるエンドヌクレアーゼの正確な特性は不明である。そのような実施形態では、核酸切断のあらゆる可能な向きおよび化学に適応するように、両鎖の両末端が標識される。そのような実施形態のいくつかでは、異なる波長において放出する異なるフルオロフォアによって末端が標識される。放出波長は、切断された鎖の同一性および切断の化学を示す。３’－５’エキソヌクレアーゼの場合、二本鎖核酸基質は、エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する構造を各３’末端に有する。５’－３’エキソヌクレアーゼの場合、二本鎖核酸基質は、エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する構造を各５’末端に有する。いくつかの実施形態において、３’－５’エキソヌクレアーゼと５’－３’エキソヌクレアーゼとの混合物が使用される。そのような実施形態では、基質の３’末端と５’末端の両方が、エキソヌクレアーゼ阻害構造によって保護される。

【0123】

いくつかの実施形態において、基質は、生化学的特性が試験時に完全には分かっていないエンドヌクレアーゼを含む数種類のエンドヌクレアーゼに適応するように設計される。そのような基質は、両鎖の両末端またはその付近に位置するフルオロフォアおよびクエンチャーの対を有することになる。そのような二重に標識された基質は、両方向の加水分解が可能なエキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＶまたはエキソヌクレアーゼＶＩＩ）を含有する反応混合物において利用することができる。

【0124】

いくつかの実施形態において、該組成物によって試験されるエンドヌクレアーゼは、核酸誘導型エンドヌクレアーゼである。そのような実施形態では、ＮＡＴＮＡも該組成物中に存在する。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼであり、ＮＡＴＮＡはガイドＲＮＡである。

【0125】

いくつかの実施形態において、該組成物によって試験されるエンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラスＩ（ＣＡＳＣＡＤＥ）エンドヌクレアーゼであり、該組成物中の二本鎖核酸基質は、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＡＧＧ－３’、５’－ＡＴＧ－３’、５’－ＧＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、５’－ＧＴＧ－３’、５’－ＴＡＡ－３’、５’－ＴＧＧ－３’、５’－ＡＡＡ－３’、５’－ＡＡＣ－３’、５’－ＡＡＴ－３’、５’－ＡＴＡ－３’、５’－ＴＡＧ－３’、および５’－ＴＴＧ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。該組成物によって試験されるエンドヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲクラスＩＩエンドヌクレアーゼである実施形態において、該組成物中の二本鎖核酸基質は、５’－ＮＧＧ－３’、５’－ＮＧＧＮＧ－３’、５’－ＮＮＡＡＡＡＷ－３’、５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３’、５’－ＧＮＮＮＣＮＮＡ－３’、および５’－ＮＮＮＡＣＡ－３’、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＴＴＴＮ－３’および５’－ＴＴＴＶ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。

【0126】

いくつかの実施形態において、該組成物によって試験されるエンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｆｏｋ ＩにコンジュゲートされたＺＦＮ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＥｎｄｏＴＴ一本鎖エンドヌクレアーゼ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅエンドヌクレアーゼ、Ａｒｃｕｓエンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ ＺおよびＲＮａｓｅ Ｐ、Ｃａｓ３およびＣａｓ７－１１から選択されるエンドリボヌクレアーゼ、ならびに制限エンドヌクレアーゼのうちの１つである。これらの実施形態では、該組成物中の二本鎖核酸基質は、好適な認識部位を含む。

【0127】

いくつかの実施形態において、該組成物は、エキソヌクレアーゼＩＩＩと、（ｉ）１つまたはそれ以上のホスホロチオエートで保護されたｄｓＤＮＡを含む両３’末端；（ｉｉ）レポーターフルオロフォア、および（ｉｉｉ）二本鎖核酸基質がインタクトであるときにドナー蛍光をクエンチするように位置させた適合性のある蛍光クエンチャーを含む二本鎖核酸基質と、目的のエンドヌクレアーゼとを含む。

【0128】

いくつかの実施形態において、本発明は、いくつかのエンドヌクレアーゼの評価、スクリーニング、試験、または比較のための簡便なツールとして使用するのに好適な方法を提供する。このツールはさらに、どの条件が最も高いレベルまたは比率のエンドヌクレアーゼ活性を可能にするかを決定できるようにすることにより、一組のエンドヌクレアーゼ切断条件を評価できるようにする。このツールはさらに、エンドヌクレアーゼの単離および精製方法の評価を可能にする。具体的には、このツールを適用することで、タンパク質単離画分を比較して、単離されたタンパク質を含有する画分を特定することができる。そのような実施形態では、すべての構成要素、例えば、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ＮＡＴＮＡ（使用される場合）が、活性をもつことが可能であり、かつ粗製剤中で酵素分解から少なくとも部分的に保護されることを確実にするために、修飾が行われる。このツールは、例えばタンパク質精製プロセスをモニターするために、新生画分に迅速に適用することができる。なおもさらに、このツールを使用すると、異なる配列を有する複数のエンドヌクレアーゼ基質をスクリーニングして、エンドヌクレアーゼのターゲット配列をすみやかに特定することができる。

【0129】

本明細書にて開示される方法および組成物は、診断アッセイにおいて使用することができる。いくつかの実施形態において、本発明は、サンプル中の特定の核酸の存在を検知する方法であって、核酸がエンドヌクレアーゼのための認識配列を含む方法である。いくつかの実施形態において、サンプルは、患者のサンプルである。核酸は、ウイルスまたは細菌を含む微生物に特徴的なものであり得る。核酸は、その存在が患者における検知すべき疾患または状態に関連する多型または配列も含み得る。

【0130】

該方法は、サンプルからの核酸を操作することを伴う。いくつかの実施形態において、サンプルは、対象または患者から取得される。いくつかの実施形態において、サンプルは、例えば生検によって対象または患者から取得された固形組織または固形腫瘍の断片を含み得る。サンプルは、核酸を含有し得る体液（例えば、尿、痰、血清、血液、または血液画分、すなわち、血漿、リンパ液、唾液、痰、汗液、涙液、脳脊髄液、羊水、滑液、囲心腔液、腹腔液、胸膜液、嚢胞液、胆汁、胃液、腸液、または糞便サンプル）も含み得る。他の実施形態において、サンプルは、核酸の単離源となり得る細胞および流体を含有する組織培養物などの培養サンプルである。いくつかの実施形態において、サンプル中に存在するまたは存在する疑いのある目的の核酸は、ウイルス、細菌、原生動物または真菌のような感染性因子に由来する。

【0131】

いくつかの実施形態において、該方法は、各ターゲット核酸から特定のアンプリコンを生成するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介してサンプル中の核酸を増幅させる予備増幅手順を含む。いくつかの実施形態において、フルオロフォア、クエンチャー、および末端保護は、アダプターのライゲーションによってアンプリコンに組み込まれる。平滑末端の形成、Ａテーリングおよびアダプターライゲーションは、例えば、超並列シークエンシングのための配列ライブラリーの形成と併せて開発された方法によって行うことができる。いくつかの実施形態において、フルオロフォア、クエンチャー、および末端保護は、増幅プライマーに直接組み込まれる。フルオロフォア、クエンチャー、および末端保護を含有する余剰のプライマーまたはアダプターは、エンドヌクレアーゼアッセイを行う前に精製手順を介して除去することができる。フルオロフォア、クエンチャー、および末端保護を含むアンプリコンは、本明細書にて開示される方法において直接使用される二本鎖核酸基質である。

【0132】

いくつかの実施形態において、フルオロフォア、クエンチャー、および末端保護を含むプローブであるエンドヌクレアーゼ基質は、サンプル中のターゲット核酸またはターゲット核酸のアンプリコンにハイブリダイズされる。いくつかの実施形態において、プローブ、ターゲット核酸またはアンプリコンは一本鎖である。いくつかの実施形態において、プローブ、ターゲット核酸またはアンプリコンは二本鎖であるが、プローブにハイブリダイズされる前に一本鎖にされる。フルオロフォア、クエンチャー、および末端保護を含むプローブにハイブリダイズされたターゲット核酸によって形成される二重鎖が、本明細書にて開示される方法において直接使用される二本鎖核酸基質になる。

【0133】

上述の代替的方法のいずれかによって形成された核酸基質は、精査すべき診断上重要な核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、目的の配列、例えば、微生物に特徴的な配列、またはその存在が患者における検知すべき疾患もしくは状態に関連する多型もしくは配列を含む配列をターゲティングするエンドヌクレアーゼに、核酸基質を接触させる。エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ切断部位を含む目的の配列が核酸基質中に存在する場合にのみ、切断を行う。

【0134】

本明細書にて開示される診断アッセイにおいて特に有利であるのは、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼである。ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼのためのガイドＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ）は、いかなる目的の診断用配列にハイブリダイズするように設計してもよい。フルオロフォア、クエンチャー、および末端保護を含み、かつ診断上の目的のターゲット核酸にハイブリダイズすることが可能であるプローブに、サンプルを接触させる。このサンプルを、ターゲット核酸にハイブリダイズすることが可能なガイドＲＮＡにさらに接触させる。プローブおよび設計されたガイドＲＮＡにハイブリダイズすることが可能な配列がサンプル中に存在する場合にのみ、ＣＲＳＩＰＲエンドヌクレアーゼが切断を行い、蛍光が検知可能になる。

【0135】

いくつかの実施形態において、診断方法はマルチプレックスである。すなわち、同じ反応混合物中で複数のターゲット配列が検知される。そのような実施形態では、複数の核酸プローブがサンプルに添加される。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼである場合、複数のガイドＲＮＡもサンプルに添加され、同じＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼが切断を行って、検知可能なシグナルの生成をもたらす。いくつかの実施形態において、異なるプローブの各々が、異なるフルオロフォアで標識される。いくつかの実施形態において、異なるプローブの全部または一部が、同じ標識で、例えば、細菌配列にハイブリダイズする一組のプローブは１つの標識で、ウイルス配列にハイブリダイズする一組のプローブは別の標識で、またはグラム陽性菌配列にハイブリダイズする一組のプローブは１つの標識で、グラム陰性菌配列にハイブリダイズする一組のプローブは別の標識で標識される。

【0136】

エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼは、サンプルに連続的に添加してもよく、同時に添加してもよい。エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼは、二本鎖核酸基質の添加の前にサンプルに添加してもよい。エキソヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼが以前に切断を行った故にエキソヌクレアーゼにとってアクセス可能な末端が作成されている場合にのみ、鎖切断（加水分解）を行う。エキソヌクレアーゼによる二本鎖核酸基質の加水分解は、フルオロフォアおよびクエンチャーを分離し、検知可能な蛍光シグナルを生じさせる。蛍光シグナルの存在は、サンプル中の目的の配列の存在を示す。いくつかの実施形態において、アッセイは、目的の配列（例えば、微生物に特徴的な配列、またはその存在が患者における検知すべき疾患もしくは状態に関連する多型もしくは配列）がサンプル中に存在することを報告する工程を含む。

【0137】

いくつかの実施形態において、本発明は、エンドヌクレアーゼの活性を検知するためのキットである。該キットは、本明細書に記述される核酸基質のアリコートを含む。組成物は二本鎖核酸基質を含み、二本鎖核酸基質は：蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を形成するドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォア（またはレポーターフルオロフォアおよびクエンチャーフルオロフォア）；エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する各末端における構造；ならびに試験されるエンドヌクレアーゼのための認識配列を含む。

【0138】

該キットは、エキソヌクレアーゼのアリコートをさらに含み得る。エンドヌクレアーゼによって生成される末端に応じて、該キットは、３’－５’エキソヌクレアーゼまたは５’－３’エキソヌクレアーゼを含む。３’－５’エキソヌクレアーゼの場合、二本鎖核酸基質は、エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する構造を各３’末端に有する。５’－３’エキソヌクレアーゼの場合、二本鎖核酸基質は、エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する構造を各５’末端に有する。該キットは、３’－５’エキソヌクレアーゼと５’－３’エキソヌクレアーゼの両方を有し得る。該キットは、エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する構造を３’末端および５’末端の両方に有する二本鎖核酸基質を含み得る。

【0139】

いくつかの実施形態において、該キットによって試験されるエンドヌクレアーゼは、核酸誘導型エンドヌクレアーゼである。そのような実施形態では、該キットは、ＮＡＴＮＡのアリコートも含み得る。いくつかの実施形態において、試験されるエンドヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼであり、キット中に存在するＮＡＴＮＡはガイドＲＮＡである。

【0140】

いくつかの実施形態において、該キットによって試験されるエンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲクラスＩ（ＣＡＳＣＡＤＥ）エンドヌクレアーゼであり、該キットに含まれる二本鎖核酸基質は、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＡＧＧ－３’、５’－ＡＴＧ－３’、５’－ＧＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、５’－ＧＴＧ－３’、５’－ＴＡＡ－３’、５’－ＴＧＧ－３’、５’－ＡＡＡ－３’、５’－ＡＡＣ－３’、５’－ＡＡＴ－３’、５’－ＡＴＡ－３’、５’－ＴＡＧ－３’、および５’－ＴＴＧ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。該キットによって試験されるエンドヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲクラスＩＩエンドヌクレアーゼである実施形態において、該キットに含まれる二本鎖核酸基質は、５’－ＮＧＧ－３’、５’－ＮＧＧＮＧ－３’、５’－ＮＮＡＡＡＡＷ－３’、５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３’、５’－ＧＮＮＮＣＮＮＡ－３’、および５’－ＮＮＮＡＣＡ－３’、５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＴＴＴＮ－３’および５’－ＴＴＴＶ－３’から選択される配列からなるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。

【0141】

いくつかの実施形態において、該キットによって試験されるエンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｆｏｋ ＩにコンジュゲートされたＺＦＮ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＥｎｄｏＴＴ一本鎖エンドヌクレアーゼ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅエンドヌクレアーゼ、Ａｒｃｕｓエンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ ＺおよびＲＮａｓｅ Ｐ、Ｃａｓ３およびＣａｓ７－１１から選択されるエンドリボヌクレアーゼ、ならびに制限エンドヌクレアーゼのうちの１つである。これらの実施形態において、該キットに含まれる核酸基質は、好適な認識部位を含む。

【0142】

いくつかの実施形態において、該キットは、本明細書に記述される方法によってエンドヌクレアーゼの活性を試験する方法を行うことについての説明書をさらに含む。

【0143】

いくつかの実施形態において、本発明は、診断手順を行うためのキットである。該キットには、診断上の目的のターゲット核酸にハイブリダイズすることが可能であり、かつ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を形成するドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォア（またはレポーターフルオロフォアおよびクエンチャーフルオロフォア）；エキソヌクレアーゼによる基質の切断を阻害する各末端における構造；ならびに試験されるエンドヌクレアーゼのための認識配列を含む、プローブのアリコートが含まれる。該キットは、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼのアリコートをさらに含み得る。エキソヌクレアーゼは、プローブ上に存在する阻害構造によって阻害されることが可能である。エンドヌクレアーゼは、プローブおよびターゲット配列によって形成された二重鎖に結合し、それを切断することが可能である。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、核酸誘導型エンドヌクレアーゼである。そのような実施形態では、該キットは、ターゲット核酸にハイブリダイズすることが可能なＮＡＴＮＡのアリコートも含み得る。いくつかの実施形態において、試験されるエンドヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼであり、キット中に存在するＮＡＴＮＡはガイドＲＮＡである。

【0144】

いくつかの実施形態において、該キットは、本明細書に記述される診断アッセイを行うことについての説明書をさらに含む。

【0145】

本明細書にて開示される方法は、専用の装置を用いて行うことができる。いくつかの実施形態において、本発明は、酵素反応を行うための１つまたはそれ以上の反応チャンバおよび蛍光検知器を含む、エンドヌクレアーゼの活性を検知するための装置である。該装置は、本明細書に記述される反応混合物の構成要素を送達および分配するための手段をさらに含み得る。該装置は、例えば、マルチウェルプレート（マイクロウェルプレート）における高スループットスクリーニングに適用することができる。

【0146】

該装置は、Ｔｅｃａｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＢｉｏＴｅｋ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓから入手可能なもののようなマルチウェルプレート蛍光リーダーまたはチューブフルオロメーターを含み得る。

【実施例1】

【0147】

実施例１。二本鎖エンドヌクレアーゼ基質の製造
この実施例では、両鎖の３’末端が一連のホスホロチオエート結合で保護された６０塩基対の二本鎖核酸コンストラクトを製造し、一方の鎖をフルオロフォアおよびクエンチャーで標識した。両鎖の３’末端における最後の４つのホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合で置換した。各鎖の３’末端における末端リン酸部分もホスホロチオエートで置換した。さらに、ターゲット鎖の５’末端から第３位のヌクレオチドにチミン結合フルオレセイン部分を組み込み、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）クエンチャーを同じ鎖の５’末端に結合させた。ｄｓＤＮＡターゲットには、アシドアミノコックス属Ｃａｓ１２ａ酵素（ＡｓＣａｓ１２ａ）切断部位を含む十分に特性解析されているモデルのＡｓＣａｓ１２ａターゲティング可能配列を含めた。切断は、ＴＴＴＣプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の第１のチミンから１９～２８ｂｐで起こり、ＰＡＭは基質の５’末端から１６位に位置し、スペーサー配列の最終のヌクレオチドは基質の５’末端から３９位に位置する。あらゆる類の末端保護を欠いていることを除いては第１のｄｓＤＮＡターゲットと同一である第２のｄｓＤＮＡターゲットを製造した。修飾を含むオリゴヌクレオチドはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ）に注文した。

【0148】

二本鎖基質を配列番号１および配列番号２の一本鎖からアセンブルした。ｄｓＤＮＡが適切にアニーリングされることを確実にするために、ターゲット鎖および相補的な非ターゲット鎖のオリゴヌクレオチドを１Ｘ ＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で各々５０ｕＭの最終濃度にて組み合わせ、この混合物を９５℃まで２分間加熱し、次いでゆっくりと室温に冷却することにより、二本鎖ＤＮＡターゲットを製造した。

【0149】

【化1】

【0150】

ホスホロチオエート保護を欠いているコントロール二本鎖基質を配列番号３および配列番号４の一本鎖からアセンブルした。

【0151】

【化2】

【実施例2】

【0152】

実施例２：エキソヌクレアーゼ連動式蛍光検知の有用性
この実施例では、実施例１に記述した１００ｎＭの基質を、３７℃でｐＨ７．０の１Ｘ ＮＥＢｕｆｆｅｒ（商標）１中で０．５Ｕ／ｕＬのエキソヌクレアーゼＩＩＩ（いずれもＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製、Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｍａｓｓ．）と共にインキュベートした。蛍光を励起波長４８５ｎｍおよび放出波長５２０ｎｍにおいて経時的にモニターした。未保護の基質については蛍光シグナルが生成されたが、保護された基質については生成されなかった。シグナルはＳｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３ｘプレート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、Ｃａｌ．）を使用して読み取った。結果を図２に示す。エキソヌクレアーゼＩＩＩの存在下における未保護の基質についてのみ、蛍光の増加が観察される。

【実施例3】

【0153】

実施例３：Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼによる基質の切断
この実施例では、ホスホロチオエートで保護されたｄｓＤＮＡ基質をＡｓＣａｓ１２ａによって切断すると、ホスホロチオエートで保護された基質がエキソヌクレアーゼＩＩＩによる消化を受けやすくなり、リアルタイムでモニターすることができる蛍光シグナルが生じることを実証する。

【0154】

実施例１に記述した６０ｂｐの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ホスホロチオエートで保護されたターゲットを使用した。精製された組換えＣａｓ１２ａタンパク質を合成ｃｒＲＮＡと共に３７℃で１０分間インキュベートすることにより、Ｃａｓ１２ａおよびガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）からなるＣａｓ１２ａリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成した。ＲＮＰ形成の前に、ｃｒＲＮＡを９５℃まで２分間加熱し、ゆっくりと室温に冷却して、適切な二次構造の形成を可能にした。ＲＮＰのｃｒＲＮＡ構成要素は、二本鎖基質のトップ鎖に存在するモデルＡｓＣａｓ１２ａターゲティング可能配列に対する特異性をもたらした。保護されたｄｓＤＮＡターゲット１００ｎＭを、２．５Ｕ／ｕＬのエキソヌクレアーゼＩＩＩ単独と共に、または２．５Ｕ／ｕＬのエキソヌクレアーゼＩＩＩおよび１１２．５ｎＭのＡｓＣａｓ１２ａ ＲＮＰと共にインキュベートした。インキュベーションはｐＨ７．０の１Ｘ ＮＥＢｕｆｆｅｒ（商標）１中で行った。コントロール反応物には、未保護のｄｓＤＮＡターゲットおよびエキソヌクレアーゼＩＩＩを含めたが、ＲＮＰは含めなかった。反応物を３７℃でインキュベートし、蛍光読み取り値（励起：４８５ｎｍ、放出：５２０ｎｍ）を６００分間にわたって３０秒ごとに、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３ｘプレート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、Ｃａｌ．）を使用して取得した。結果を図３に示す。蛍光における急速な増加がＣａｓ１２ａ ＲＮＰの存在下でのみ観察され、ＲＮＰなしコントロールでは観察されず、これにより、末端保護されたｄｓＤＮＡターゲットがＣａｓ１２ａ切断後に分解されたことが示された。未保護のｄｓＤＮＡターゲットはエキソヌクレアーゼＩＩＩ単独により分解された。蛍光の連続的読み取りの間、実験開始からおよそ２００分後に停電が起こった。読み取りはすみやかに再開したが、停電によってすべてのサンプルで蛍光シグナルにスパイクが生じ、これは読み取りの再開からおよそ１０分後に安定化した。

【実施例4】

【0155】

実施例４。Ｃａｓ１２ａ ＲＮＰ濃度に関するアッセイの直線範囲。
この実施例では、実施例３と概ね同様に、ただし１Ｘ Ｃｕｔｓｍａｒｔ（登録商標）、ｐＨ７．９バッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｍａｓｓ．）を使用して、二本鎖基質、Ｃａｓ１２ａ ＲＮＰおよびエキソヌクレアーゼの間の反応を行った。ＲＮＰ濃度は０．１１ｎＭ～１１２．５ｎＭの範囲とした。ネガティブコントロールには、ｃｒＲＮＡなし、またはＣａｓ１２ａ ＲＮＰなしを含めた。ポジティブコントロールには、エキソヌクレアーゼＩＩＩのみで未保護の基質を含めた（実施例１を参照されたい）。結果を図４に示す。ＲＮＰ濃度と反応速度との間には直接相関がある。より低いＲＮＰ濃度での反応は、より低い蛍光強度にてプラトーに達する。０．１１ｎＭのサンプルでさえ、Ｃａｓ１２ａを欠いている反応物について観察されたものと比べて、蛍光における測定可能な増加を検知することができる。この結果は、０．１１ｎＭから７ｎＭのＣａｓ１２ａ濃度に対する直線的な用量応答を示す。広範囲のＣａｓ１２ａ濃度に対するアッセイ感度は、このクオリティコントロール（ＱＣ）アッセイの有用性を立証する。

【実施例5】

【0156】

実施例５。エキソヌクレアーゼはＤＮＡを加水分解するが、Ｃａｓ１２ａはＤＮＡを加水分解しないことの確認
Ｃａｓ１２ａは、非特異的エキソヌクレアーゼ活性（「トランスシュレッディング」）を有するという点で、エンドヌクレアーゼの中でも独特である。この実施例では、Ｃａｓ１２ａ自体のトランス活性ではなく、エキソヌクレアーゼＩＩＩが、Ｃａｓ１２ａ－ＲＮＰによる最初の切断後のｄｓＤＮＡターゲットの分解の原因であることを実証する。

【0157】

この実施例では、実施例３と概ね同様に、ただしＮＥＢｕｆｆｅｒ（商標）１、ｐＨ７．０を使用して、二本鎖基質、Ｃａｓ１２ａ ＲＮＰおよびエキソヌクレアーゼの間の反応を行った。ｄｓＤＮＡの濃度は様々であった。さらに、コントロール反応物にはエキソヌクレアーゼを含めなかった。このコントロールを含めたのは、Ｃａｓ１２ａがトランス活性として知られる二次的な非特異的ヌクレアーゼ活性によって基質を単独で（エキソヌクレアーゼなしで）分解するかどうかを決定するためであった。結果を図５に示す。エキソヌクレアーゼＩＩＩの非存在下で蛍光のいくらかの増加が観察され、これにより、Ｃａｓ１２ａトランス活性からのシグナル全体への限定的な寄与の可能性が示唆された。しかし、蛍光の最大率はエキソヌクレアーゼＩＩＩの存在下では約３．３倍高く、これにより、反応速度がＣａｓ１２ａトランス活性によって限定されないことを確実にする十分な濃度でエキソヌクレアーゼＩＩＩが存在することが示唆された。観察された最大率は、エキソヌクレアーゼＩＩＩ単独を含む未保護のｄｓＤＮＡ基質についてであり、これにより、エキソヌクレアーゼＩＩＩ活性が速度を限定しないことが示された。

【実施例6】

【0158】

実施例６。ＤＮＡ基質濃度に関するアッセイの直線範囲。
この実施例では、実施例５と同様に、二本鎖基質、Ｃａｓ１２ａ ＲＮＰおよびエキソヌクレアーゼの間の反応を行った。他の試薬はすべて一定に保ち、ＤＮＡ基質の濃度を２．０６ｎＭから５００ｎＭの間で変化させた。結果を図６に示す。このアッセイは、少なくとも４．１ｎＭまでのターゲットｄｓＤＮＡ配列を検知するのに十分な感度があり、広範囲のターゲットｄｓＤＮＡ濃度に対して直線的な用量応答を示すことが観察された。

【実施例7】

【0159】

実施例７（予測的）：Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼによる基質の切断。
この実施例では、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼの代わりにＣａｓ９エンドヌクレアーゼを用いて、実施例３に記述した実験を行う。二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ホスホロチオエートで保護されたターゲットは、Ｃａｓ９によって認識されるＰＡＭ配列を含むことを除いては、配列番号１／配列番号２と同様である。さらに、ｄｓＤＮＡターゲットは、非ターゲット鎖およびターゲット鎖の５’末端にフルオロフォアおよびクエンチャーの対を含む。インキュベーションは１Ｘ Ｃｕｔｓｍａｒｔ（登録商標）バッファー中で行う。精製された組換えＣａｓ９タンパク質を合成ｃｒＲＮＡと共に３７℃で１０分間インキュベートすることにより、ＳｐｙＣａｓ９（化膿連鎖球菌Ｃａｓ９）およびガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）からなるＣａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成する。ＲＮＰのｃｒＲＮＡ構成要素は、ＳｐｙＣａｓ９および二本鎖基質に対する特異性をもたらす。保護されたｄｓＤＮＡターゲットは、エキソヌクレアーゼＩＩＩおよびＣａｓ９ ＲＮＰのいずれかと共にインキュベートする。１つまたはそれ以上のコントロール反応物、例えば、ＲＮＰを除外したもの、エキソヌクレアーゼを除外したもの、またはエキソヌクレアーゼ保護を除外したものを含める。反応物を３７℃でインキュベートし、レポーターフルオロフォアの放出波長に対応する蛍光読み取り値を６００分間にわたって３０秒ごとに、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３ｘプレート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、Ｃａｌ．）を使用して取得する。

【実施例8】

【0160】

実施例８（予測的）：制限エンドヌクレアーゼによる基質の切断
この実施例では、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼの代わりにＩＩ型制限エンドヌクレアーゼなどの制限エンドヌクレアーゼを用いて、実施例３に記述した実験を行う。二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ホスホロチオエートで保護されたターゲットは、試験される制限エンドヌクレアーゼのための認識配列を含むことを除いては、配列番号１／配列番号２と同様である。保護されたｄｓＤＮＡターゲットを、制限エンドヌクレアーゼ活性とエキソヌクレアーゼＩＩＩ活性の両方を許容できる適切なバッファー中で、エキソヌクレアーゼＩＩＩおよび制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベートする。１つまたはそれ以上のコントロール反応物、例えば、制限エンドヌクレアーゼを除外したもの、エキソヌクレアーゼを除外したもの、またはエキソヌクレアーゼ保護を除外したものを含める。反応物を３７℃でインキュベートし、レポーターフルオロフォアの放出波長に対応する蛍光読み取り値を６００分間にわたって３０秒ごとに、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３ｘプレート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、Ｃａｌ．）を使用して取得する。

【実施例9】

【0161】

実施例９。ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２ａによるＦＡＭ基質の切断
この実施例では、図７に示す基質（「ＦＡＭ基質」）を設計した。６０ｂｐのターゲットには、Ｃａｓ１２ａのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）および十分に特性解析されたＡＡＶＳ１スペーサー配列を含めた。この基質は、ＰＡＭ上流の５’末端に、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋダーククエンチャーと対になったデオキシチミジン（ｄＴ）コンジュゲート型フルオレセイン（ＦＡＭ）を有する。両３’末端がホスホロチオエート結合（Ｐｔ）で保護されている。コントロール基質は３’末端にＰｔ保護を有しないものとした（「未保護のＦＡＭ基質」）。

【0162】

ＦＡＭ基質、Ｅｘｏ ＩＩＩ、およびＡｓＣａｓ１２ａリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を、ＲＮＰ ０．４２～１８ｎＭ、ＥｘｏＩＩＩ ２．５ｋＵ／ｍＬおよびｄｓＤＮＡターゲット１００ｎＭでＮＥＢｕｆｆｅｒ１中に含有する反応混合物において、基質（図７）を切断した。反応を３７℃で進行させ、図８に示す蛍光データを収集した。５０～１５０分の期間における蛍光増加率をＣａｓ１２ａ濃度の関数としてプロットした。

【実施例10】

【0163】

実施例１０。ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２ａによるＴＡＭＲＡ基質の切断
この実施例では、デオキシチミジン（ｄＴ）コンジュゲート型フルオレセイン（ＦＡＭ）の代わりにＴＡＭＲＡ－ＮＨＳエステルを使用したことを除いては図７に示したＦＡＭ基質と同一である基質（「ＴＡＭＲＡ基質」）を設計した。ＦＡＭ基質（図７）と同様に、両３’末端をホスホロチオエート結合（Ｐｔ）で保護した。コントロール基質は３’末端にＰｔ保護を有しないものとした（「未保護のＴＡＭＲＡ基質」）。

【0164】

ＴＡＭＲＡ基質、Ｅｘｏ ＩＩＩ、およびＡｓＣａｓ１２ａリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を含有する反応混合物において、基質を切断した。反応混合物は、ＮＥＢｕｆｆｅｒ １中に１８ｎＭのＲＮＰ（またはコントロール１ｘ ＮＣＡバッファー）、２．５ｋＵ／ｍＬのＥｘｏ ＩＩＩ、および１００ｎＭのｄｓＤＮＡ基質を含んでいた。反応を３７℃で進行させ、図９に示す蛍光データを収集した。

【実施例11】

【0165】

実施例１１。代替的なフルオロフォアの配置
この実施例では、一連のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２ａ基質（図７に示すものと同様）で代替的なフルオロフォアの配置を有するものを設計した。図１０は、「非ターゲットＦＡＭ」基質（図７に示すものと同じ、ＦＡＭを同じ鎖上でＰＡＭの上流に有する）、「ターゲットＦＡＭ」基質（ＰＡＭとは反対の鎖にＦＡＭ）、および「二重ＦＡＭ」基質（ＰＡＭと同じ鎖と反対の鎖の両方にＦＡＭ）を示す。

【0166】

３つのＦＡＭ基質のうちの１つ、Ｅｘｏ ＩＩＩ、およびＡｓＣａｓ１２ａリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を含有する反応混合物において、３つの基質を切断した。反応混合物は、ＮＥＢｕｆｆｅｒ１中に１８ｎＭのＲＮＰ（またはコントロール１ｘ ＮＣＡバッファー）、２．５ｋＵ／ｍＬのＥｘｏ ＩＩＩ、１００ｎＭのｄｓＤＮＡ基質を含んでいた。反応を３７℃で進行させ、蛍光データを収集した（図１１に示す）。このデータは、すべての保護された基質の比較（図１２）および様々な反応混合物における蛍光変化率（図１３）としても表されている。

【実施例12】

【0167】

実施例１２。エキソヌクレアーゼ濃度の最適化。
この実施例では、エキソヌクレアーゼを滴定し、エキソヌクレアーゼ濃度を最適化した。切断反応は、ＮＥＢｕｆｆｅｒ１バッファー中でセットアップし、「ターゲット鎖」ＦＡＭ基質（図１０）、ＲＮＰ ２０．２５ｎＭのＡｓＣａｓ１２ａ ＲＮＰ（ｃａｓ１２ａ：ｃｒＲＮＡ ２：１）、様々な量のＥｘｏＩＩＩ（１５６．２５～２５００Ｕ／ｍＬ）、およびＦＡＭ標識基質を含めた。コントロール反応物には、未保護の基質、またはＲＮＰなし、またはＥｘｏＩＩＩなしを含めた。反応を３７℃で進行させた。結果を図１４に示す。

【実施例13】

【0168】

実施例１３。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼによる切断
この実施例では、Ｃａｓ９へのアッセイの適用可能性を実証した。この実施例は、予測的実施例７の妥当性検証からなる。実施例７において提唱したように、図１および図７に従って二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を設計した。基質はホスホロチオエートで保護され、Ｃａｓ９によって認識されるＰＡＭ配列、ＰＡＭと同じ鎖（非ターゲット鎖）上のスペーサー配列、フルオロフォアおよびクエンチャーを含んでいた。この実験において、Ｃａｓ９ガイドは、Ｃａｓ１２ａガイドとは反対の鎖をターゲティングした。

【0169】

ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを組み合わせたＣａｓ９エンドヌクレアーゼのためのシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を設計した。実施例７において提唱したように、インキュベーションは１Ｘ Ｃｕｔｓｍａｒｔ（登録商標）バッファー中で行う。精製された組換えＣａｓ９をｓｇＲＮＡと共に３７℃で１０分間インキュベートすることにより、ＳｐｙＣａｓ９（化膿連鎖球菌Ｃａｓ９）およびガイドＲＮＡ（シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ））からなるＣａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成した。反応物には、２００ｕＬの反応体積で５０ｎＭのＳｐｙＣａｓ９、１ｋＵ／ｍＬのＥｘｏＩＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｍａｓｓ．）、および１１０ｎＭのｄｓＤＮＡ基質を含めた。実施例７において提唱したように、ＲＮＰを除外したコントロール反応物（ＥｘｏＩＩＩのみ反応物）を含めた。反応物を３７℃でインキュベートし、レポーターフルオロフォアの放出波長に対応する蛍光読み取り値を１０００分間にわたって３０分ごとに、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３ｘプレート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、Ｃａｌ．）を使用して取得した。すべての反応を三連で行い、各データ点の平均結果を図１５に示した。

【実施例14】

【0170】

実施例１４。制限エンドヌクレアーゼによる切断
この実施例では、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼへのアッセイの適用可能性を実証した。この実施例は、予測的実施例８の妥当性検証からなる。

【0171】

実施例８において提唱したように、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ホスホロチオエートで保護された基質を図１に従って設計した。これらの基質には、制限エンドヌクレアーゼＢｓａＩ、ＢｃｏＤＩおよびＳａｌＩのうちの１つのための認識配列を含めた。実施例７において提唱したように、各基質を１Ｘ Ｃｕｔｓｍａｒｔ（登録商標）バッファー中でエキソヌクレアーゼＩＩＩおよび制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベートした。各反応混合物には、ＢｓａＩ ＨＦ ｖ２、ＢｃｏＤＩおよびＳａｌＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）のうちの１つを３００Ｕ、ＥｘｏＩＩＩを１．２５ｋＵで含めた。反応物を３７℃でインキュベートし、レポーターフルオロフォアの放出波長に対応する蛍光読み取り値を３００分間にわたって毎分、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３ｘプレート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、Ｃａｌ．）を使用して取得した。結果を図１６に示す。

【0172】

具体例を参照して本発明を詳細に記述したが、本発明の範囲内で様々な改変を行えることが当業者には明らかであろう。したがって、本発明の範囲は本明細書に記述される例によって限定されるべきではなく、以下に提示される特許請求の範囲によって限定されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【配列表】

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【国際調査報告】