(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-10
(54)【発明の名称】拡大培養したイヌ前駆細胞および関連する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20241003BHJP
A61K 35/28 20150101ALI20241003BHJP
C12N 5/077 20100101ALI20241003BHJP
C40B 50/06 20060101ALI20241003BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20241003BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
A61K35/28
C12N5/077
C40B50/06
C12N15/09 Z ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024526847
(86)(22)【出願日】2022-11-04
(85)【翻訳文提出日】2024-07-04
(86)【国際出願番号】 US2022049049
(87)【国際公開番号】W WO2023081420
(87)【国際公開日】2023-05-11
(31)【優先権主張番号】63/276,552
(32)【優先日】2021-11-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】513229509
【氏名又は名称】株式会社ヘリオス
(74)【代理人】
【識別番号】100107489
【弁理士】
【氏名又は名称】大塩 竹志
(72)【発明者】
【氏名】ディーンズ， ロバート ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】ボガーツ， アヌリース
(72)【発明者】
【氏名】クライェ， ダフィト
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AC20
4B065BC50
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA03
4C087BB64
4C087CA04
4C087NA20
4C087ZA02
4C087ZA33
4C087ZA89
4C087ZA94
4C087ZA96
4C087ZB07
4C087ZB11
4C087ZC61
(57)【要約】
本発明の一実施形態は、未分化状態で培養中に維持され得るか、または複数の組織型の細胞を形成するように分化され得る、非胚性起源の拡大培養したイヌ前駆細胞を提供する。拡大培養した細胞は、以下の１つまたはそれを超えるものによって特徴付けられ得る出生後の体細胞である：約２４時間未満の集団倍加速度；正常な核型；中胚葉の少なくとも２つの細胞型に分化できること；培養における拡張した複製およびテロメラーゼなどの拡張した複製のマーカーを発現すること；ならびに多能性のマーカーを発現すること。単離および培養の方法、ならびに筋骨格系および炎症性の疾患および障害の処置などの細胞の治療的使用も提供される。さらに、対象に投与するための細胞、創薬方法、および医薬組成物などの細胞の組成物を提供するために使用することができる細胞バンクが提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
約２４時間未満の集団倍加速度を有し、正常な核型を有し、中胚葉の少なくとも２つの細胞型に分化することができ、出生後の体細胞である、拡大培養したイヌ前駆細胞。
【請求項2】
約２４時間未満の集団倍加速度を有し、正常な核型を有し、テロメラーゼを発現し、出生後の体細胞である、拡大培養したイヌ前駆細胞。
【請求項3】
約２４時間未満の集団倍加速度を有し、正常な核型を有し、ｏｃｔ－４を発現し、出生後の体細胞である、拡大培養したイヌ前駆細胞。
【請求項4】
約２４時間未満の集団倍加速度を有し、正常な核型を有し、培養において少なくとも４０回の集団倍加を受けており、出生後の体細胞である、拡大培養したイヌ前駆細胞。
【請求項5】
前記細胞が、培養において少なくとも４０回の集団倍加を受けている、請求項１～３のいずれか一項に記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【請求項6】
前記細胞が、培養において少なくとも５０回の集団倍加を受けている、請求項５に記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【請求項7】
培養において約１５～２４時間の集団倍加速度を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【請求項8】
培養において約１６時間の集団倍加速度を有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【請求項9】
骨髄、脂肪組織、臍帯血、または胎盤組織に由来する、請求項１～８のいずれか一項に記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【請求項10】
ＣＤ９０の発現について陽性であり、ＣＤ４５およびＣＤ３４の発現について陰性である、請求項１～９のいずれか一項に記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【請求項11】
ＣＤ２９の発現について陽性である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【請求項12】
ＭＨＣクラスＩＩの発現について陰性である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【請求項13】
ＰＴＨＬＨ、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、およびＩＬ１Ｒ２のうちの１つまたはそれを超える発現について陽性である、請求項１～１２のいずれか一項記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【請求項14】
ＩＬ１Ｒ２の発現について陽性である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【請求項15】
ｒｅｘ－１およびＮＯＶの発現について陰性である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【請求項16】
ｎａｎｏｇ、ｓｏｘ－２およびｏｃｔ－４の発現について陽性である、請求項１～２および４～１５のいずれか一項に記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【請求項17】
培養において約５５回の集団倍加までテロメラーゼを発現する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【請求項18】
培養において約５５回の集団倍加までｏｃｔ－４を発現する、請求項１～１７のいずれか一項に記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【請求項19】
培養において約５５回の集団倍加まで、前記した中胚葉の少なくとも２つの細胞型に分化する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【請求項20】
インビトロおよび／またはインビボでＴ細胞増殖を低減または阻害する、請求項１～１９のいずれか一項に記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【請求項21】
インビトロおよび／またはインビボで血管新生を提供することができる、請求項１～２０のいずれか一項に記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【請求項22】
前記中胚葉の少なくとも２つの細胞型に分化することができる、請求項２～２１のいずれか一項に記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【請求項23】
骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞のうちの少なくとも２つに分化することができる、請求項２２に記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【請求項24】
前記細胞が腫瘍形成性でなく、奇形腫を形成せず、形質転換されておらず、不死化されていない、請求項１～２３のいずれか一項に記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【請求項25】
イヌから組織を得ること；接着性細胞の集団を確立すること；ＣＤ９０を陽性に発現し、かつ／またはＣＤ４５およびＣＤ３４の少なくとも１つを発現しない細胞を選択すること；ならびに前記選択された細胞を培養培地中で拡大させること、を含む方法によって調製された、請求項１～２４のいずれか一項に記載の拡大培養した前駆細胞。
【請求項26】
請求項１～２４のいずれか一項に記載の拡大培養した前駆細胞と、第２の成分と、を含む組成物。
【請求項27】
請求項１～２４のいずれか一項に記載の拡大培養した前駆細胞と、薬学的に許容され得る担体と、を含む医薬組成物。
【請求項28】
別々に包装された以下の成分：請求項１～２４のいずれか一項に記載の拡大培養した前駆細胞；培養培地；および前記細胞を培養するための説明書を含むキット。
【請求項29】
イヌから組織を得ること；接着性細胞の集団を確立すること；ＣＤ９０を陽性発現し、かつ／またはＣＤ４５およびＣＤ３４の少なくとも１つを発現しない細胞を選択すること；前記選択された細胞を培養培地中で拡大させること；ならびに前記細胞を前記第２の成分に添加すること、を含む、請求項２６に記載の組成物を調製する方法。
【請求項30】
前記拡大培養した前駆細胞を前記薬学的に許容され得る担体と混合することを含む、請求項２７に記載の医薬組成物を調製するための方法。
【請求項31】
請求項１～２４のいずれか一項に記載の拡大培養したイヌ前駆細胞を調製する方法であって、前記方法が、イヌから組織を得ること；接着性細胞の集団を確立すること；ＣＤ９０を陽性に発現し、かつ／またはＣＤ４５およびＣＤ３４の少なくとも１つを発現しない細胞を選択すること；ならびに前記選択された細胞を培養培地中で拡大させること、を含む、方法。
【請求項32】
細胞バンクを構築する方法であって、前記方法が、対象への将来の投与のために、請求項１～２４のいずれか一項に記載の拡大培養した前駆細胞を拡大させ、貯蔵することを含む、方法。
【請求項33】
創薬のための方法であって、前記方法が、請求項１～２４のいずれか一項に記載の拡大培養した前駆細胞を作用物質に曝露して、前記作用物質の前記細胞に対する１つまたはそれを超える効果を評価することを含む、方法。
【請求項34】
イヌにおける炎症症状を処置するための方法であって、治療有効量の請求項１～２４のいずれか一項に記載のイヌ前駆細胞を前記イヌに投与することを含む、方法。
【請求項35】
前記炎症症状が、慢性炎症症状または急性炎症症状である、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記急性炎症症状または前記慢性炎症症状が、皮膚炎、炎症性眼疾患、炎症性脳疾患、炎症性気道疾患、および炎症性腸疾患のうちの１つである、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記皮膚炎がアトピー性皮膚炎である、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記炎症性眼疾患が角結膜炎である、請求項３６に記載の方法。
【請求項39】
前記炎症性脳疾患が髄膜脳脊髄炎である、請求項３６に記載の方法。
【請求項40】
前記炎症症状が自己免疫疾患である、請求項３４に記載の方法。
【請求項41】
イヌの筋骨格系障害を処置する方法であって、治療有効量の請求項１～２４のいずれか一項に記載のイヌ前駆細胞を前記イヌに投与することを含む、方法。
【請求項42】
前記筋骨格系障害が、変形性関節症および十字靭帯断裂のうちの１つである、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記十字靭帯断裂が部分的な十字靭帯断裂である、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
前記筋骨格系障害が脊髄症状である、請求項４１に記載の方法。
【請求項45】
前記脊髄症状が、脊髄損傷および椎間板疾患のうちの１つである、請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、未分化状態で培養中に維持され得るか、または複数の組織型の細胞を形成するように分化され得る、出生後を起源とする拡大培養したイヌ前駆細胞を提供する。単離および培養の方法、ならびに拡大培養した当該イヌ前駆細胞の治療的使用も提供される。拡大培養したイヌ前駆細胞は出生後の体細胞であり、そしてそれは培養における拡張した複製が可能であり、約５５回の集団倍加を通じて以下の１つまたはそれを超えるものによって特徴付けられ得る：約２４時間未満の集団倍加速度；正常な核型；中胚葉（ｍｅｓｏｄｅｒｍａｌ ｇｅｒｍ ｌａｙｅｒ）の少なくとも２つの細胞型に分化する能力；および拡張した複製マーカー（例えば、テロメラーゼ）および多能性マーカー（例えば、ｏｃｔ４）の発現。本発明はまた、拡大培養したイヌ前駆細胞を使用して筋骨格系障害および炎症症状を処置する方法に関する。本発明はまた、イヌ対象に投与するための拡大培養したイヌ前駆細胞を提供するために使用され得る、細胞バンクに関する。本発明はまた、創薬方法に関する。本発明はまた、拡大培養したイヌ前駆細胞の組成物、例えば医薬組成物中の組成物に関する。
本発明は、未分化状態で培養中に維持され得るか、または複数の組織型の細胞を形成するように分化され得る、出生後を起源とする拡大培養したイヌ前駆細胞を提供する。単離および培養の方法、ならびに拡大培養した当該イヌ前駆細胞の治療的使用も提供される。拡大培養したイヌ前駆細胞は出生後の体細胞であり、そしてそれは培養における拡張した複製が可能であり、約５５回の集団倍加を通じて以下の１つまたはそれを超えるものによって特徴付けられ得る：約２４時間未満の集団倍加速度；正常な核型；中胚葉（ｍｅｓｏｄｅｒｍａｌ ｇｅｒｍ ｌａｙｅｒ）の少なくとも２つの細胞型に分化する能力；および拡張した複製マーカー（例えば、テロメラーゼ）および多能性マーカー（例えば、ｏｃｔ４）の発現。本発明はまた、拡大培養したイヌ前駆細胞を使用して筋骨格系障害および炎症症状を処置する方法に関する。本発明はまた、イヌ対象に投与するための拡大培養したイヌ前駆細胞を提供するために使用され得る、細胞バンクに関する。本発明はまた、創薬方法に関する。本発明はまた、拡大培養したイヌ前駆細胞の組成物、例えば医薬組成物中の組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
背景
今日まで、幹細胞は、主に実験的に、異なる動物種における様々な疾患の処置に使用されてきた。当初再生獣医学は整形外科疾患にフォーカスしていたが、現在そのフォーカスは、口腔および消化管疾患、肝臓、腎臓、心臓、呼吸器、神経筋、皮膚、嗅覚、および生殖器系疾患などの他の領域に急速に拡大している。幹細胞による処置は、イヌおよびウマでは様々な臓器システムにおける様々な疾患のために、ならびにネコでは腎臓、呼吸器および炎症性疾患のために、最も頻繁に使用された。
今日まで、幹細胞は、主に実験的に、異なる動物種における様々な疾患の処置に使用されてきた。当初再生獣医学は整形外科疾患にフォーカスしていたが、現在そのフォーカスは、口腔および消化管疾患、肝臓、腎臓、心臓、呼吸器、神経筋、皮膚、嗅覚、および生殖器系疾患などの他の領域に急速に拡大している。幹細胞による処置は、イヌおよびウマでは様々な臓器システムにおける様々な疾患のために、ならびにネコでは腎臓、呼吸器および炎症性疾患のために、最も頻繁に使用された。
【発明の概要】
【0003】
本発明者らは、未分化状態で培養中に維持され得るか、または複数の組織型の細胞を形成するように分化され得る、出生後起源のイヌ前駆細胞を見出した。イヌ前駆細胞は、培養における拡張した複製が可能であり、約５５回の集団倍加を通じて以下の１つまたはそれを超えるものによって特徴付けられ得る：約２４時間未満の集団倍加速度；正常な核型；中胚葉の少なくとも２つの細胞型に分化する能力；および拡張した複製のマーカー（例えば、テロメラーゼ）および多能性のマーカー（例えば、ｏｃｔ４）の発現。
【0004】
少なくともこれらの知見に基づいて、本発明は、拡大培養したイヌ前駆細胞、拡大培養したイヌ前駆細胞を含む組成物、拡大培養したイヌ前駆細胞を使用して筋骨格系障害および炎症症状を処置する方法、拡大培養したイヌ前駆細胞を使用して細胞バンクを構築する方法、ならびに創薬方法を含むがこれらに限定されない、イヌ前駆細胞および方法を提供する。
【0005】
したがって、本発明の一実施形態は、約２４時間未満の集団倍加速度を有し、正常な核型を有し、テロメラーゼおよびＣＤ９０の発現について陽性であり、ＣＤ４５およびＣＤ３４の発現について陰性である拡大培養したイヌ前駆細胞を含む。
【0006】
一実施形態では、本発明は、イヌの炎症症状を処置する方法であって、治療有効量の拡大培養したイヌ前駆細胞をイヌに投与することを含み、該細胞は、約２４時間未満の集団倍加速度を有し、正常な核型を有し、テロメラーゼおよびＣＤ９０の発現について陽性であり、ＣＤ４５およびＣＤ３４の発現について陰性である、方法を含む。
【0007】
一実施形態では、本発明は、イヌの炎症症状を処置する方法であって、治療有効量の拡大培養したイヌ前駆細胞をイヌに投与することを含み、該細胞は、約２４時間未満の集団倍加速度を有し、正常な核型を有し、テロメラーゼおよびＣＤ９０の発現について陽性であり、ＣＤ４５およびＣＤ３４の発現について陰性であり、中胚葉の少なくとも２つの細胞型に分化することができる、方法を含む。
【0008】
一実施形態では、本発明は、イヌの筋骨格系障害を処置する方法であって、治療有効量の拡大培養したイヌ前駆細胞をイヌに投与することを含み、該細胞は、約２４時間未満の集団倍加速度を有し、正常な核型を有し、テロメラーゼおよびＣＤ９０の発現について陽性であり、ＣＤ４５およびＣＤ３４の発現について陰性である、方法を含む。
【0009】
一実施形態では、本発明は、イヌの筋骨格系障害を処置する方法であって、治療有効量の拡大培養したイヌ前駆細胞をイヌに投与することを含み、該細胞は、約２４時間未満の集団倍加速度を有し、正常な核型を有し、テロメラーゼおよびＣＤ９０の発現について陽性であり、ＣＤ４５およびＣＤ３４の発現について陰性であり、中胚葉の少なくとも２つの細胞型に分化することができる、方法を含む。
【0010】
一例では、拡大培養したイヌ前駆細胞は、培養において少なくとも４０回の集団倍加を受けている。
【0011】
別の例では、拡大培養したイヌ前駆細胞は、培養において少なくとも５０回の集団倍加を受けている。
【0012】
一例では、拡大培養したイヌ前駆細胞は、培養において約１５～２４時間の集団倍加速度を有する。
【0013】
別の例では、拡大培養したイヌ前駆細胞は、培養において約１６時間の集団倍加速度を有する。
【0014】
一例では、拡大培養したイヌ前駆細胞は、骨髄、脂肪組織、臍帯血、または胎盤組織に由来する。
【0015】
一例では、拡大培養したイヌ前駆細胞は、ＣＤ２９の発現について陽性である。
【0016】
一例では、拡大培養したイヌ前駆細胞は、ＭＨＣクラスＩＩの発現について陰性である。
【0017】
一例では、拡大培養したイヌ前駆細胞は、ＰＴＨＬＨ、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、およびＩＬ１Ｒ２のうちの１つまたはそれを超えるものの発現について陽性である。
【0018】
一例では、拡大培養したイヌ前駆細胞は、ＩＬ１Ｒ２の発現について陽性である。
【0019】
一例では、拡大培養したイヌ前駆細胞は、ｒｅｘ－１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＮＯＶの発現について陰性である。
【0020】
一例では、拡大培養したイヌ前駆細胞は、ｎａｎｏｇ、ｓｏｘ－２、およびｏｃｔ－４の発現について陽性である。
【0021】
一例では、拡大培養したイヌ前駆細胞は、培養において約５５回の集団倍加までテロメラーゼを発現する。
【0022】
一例では、拡大培養したイヌ前駆細胞は、インビボおよび／またはインビトロでＴ細胞増殖を低減または阻害することができる。
【0023】
一例では、拡大培養したイヌ前駆細胞は、インビボおよび／またはインビトロで血管新生を提供することができる。
【0024】
一例では、拡大培養したイヌ前駆細胞は、中胚葉の少なくとも２つの細胞型に分化することができる。
【0025】
別の実施形態では、拡大培養したイヌ前駆細胞は、約１６時間の集団倍加速度、正常な核型を有し、テロメラーゼおよびＣＤ９０の発現について陽性であり、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４５およびＣＤ３４の発現について陰性である。拡大培養した前駆細胞は、培養において少なくとも４０回の集団倍加を受けており、ＰＴＨＬＨ、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＩＬ１Ｒ２のうちの１つまたはそれを超えるものの発現についても陽性であり、骨髄に由来する。
【0026】
一例では、炎症症状は、慢性炎症症状または急性炎症症状である。
【0027】
一例では、急性または慢性炎症症状は、皮膚炎、炎症性眼疾患、炎症性脳疾患、炎症性気道疾患、および炎症性腸疾患のうちの１つである。
【0028】
別の例では、皮膚炎はアトピー性皮膚炎である。
【0029】
別の例では、炎症性眼疾患は角結膜炎である。
【0030】
別の例では、炎症性脳疾患は髄膜脳脊髄炎である。
【0031】
一例では、炎症症状は自己免疫疾患である。
【0032】
一例では、筋骨格系障害は、変形性関節症および十字靭帯断裂のうちの１つである。
【0033】
別の例では、十字靭帯断裂は、部分的な十字靭帯断裂である。
【0034】
一例では、筋骨格系障害は脊髄症状である。
【0035】
別の例では、脊髄症状は、脊髄損傷および椎間板疾患のうちの１つである。
【0036】
一実施形態では、拡大培養したイヌ前駆細胞には、胚性幹細胞のいくつかの特徴を有するが、出生後の組織に由来し、かつ本出願において記載される効果を提供する、出生後の体細胞が含まれるが、これらに限定されない。拡大培養したイヌ前駆細胞は、これらの効果を自然に達成し得る（すなわち、遺伝子的または薬学的に改変されていない）。しかしながら、天然の発現体は、効能を増加させるように遺伝的または薬学的に改変され得る。
【0037】
拡大培養したイヌ前駆細胞は、ｏｃｔ４などの多能性マーカーを発現し得る。それらはまた、テロメラーゼなどの拡張した複製能力に関連するマーカーを発現し得る。多能性の他の特徴には、中胚葉の異なる細胞型に分化する能力が含まれ得る。そのようなイヌ前駆細胞は、腫瘍形成性ではなく、奇形腫を形成せず、培養において不死化または形質転換されていない。イヌ前駆細胞は、正常な核型を維持しながら高度に拡大され得る。例えば、一実施形態では、イヌ前駆細胞は、培養において少なくとも１０～６０回の細胞倍加、例えば、１０～１５回、１５～２０回、２０～２５回、２５～３０回、３０～３５回、３５～４０回、４０～４５回、４５～５０回、５０～５５回、５５～６０回、またはそれを超える細胞倍加を受けており、ここで、該細胞は、正常な核型を有し、テロメラーゼを発現し、ｏｃｔ－４を発現し、中胚葉の少なくとも２つの細胞型に分化する。さらに、拡大培養したイヌ前駆細胞は、約２４時間未満の集団倍加速度を有する。
【0038】
拡大培養したイヌ前駆細胞は、本明細書に記載される単離および培養条件によって調製され得る。
【0039】
イヌ前駆細胞には、以下の番号付けされた実施形態が含まれるが、これらに限定されない。
【0040】
１．約２４時間未満の集団倍加速度、正常な核型を有し、中胚葉の少なくとも２つの細胞型に分化することができ、出生後の体細胞である、拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0041】
２．約２４時間未満の集団倍加速度、正常な核型を有し、テロメラーゼを発現し、出生後の体細胞である、拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0042】
３．約２４時間未満の集団倍加速度、正常な核型を有し、ｏｃｔ－４を発現し、出生後の体細胞である、拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0043】
４．約２４時間未満の集団倍加速度、正常な核型を有し、培養において少なくとも４０回の集団倍加を受けており、出生後の体細胞である、拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0044】
５．細胞が、培養において少なくとも４０回の集団倍加を受けている、上記１～３のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0045】
６．細胞が、培養において少なくとも５０回の集団倍加を受けている、上記５に記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0046】
７．培養において約１５～２４時間の集団倍加速度を有する、上記１～６のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0047】
８．培養において約１６時間の集団倍加速度を有する、上記１～７のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0048】
９．骨髄、脂肪組織、臍帯血、または胎盤組織に由来する、上記１～８のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0049】
１０．ＣＤ９０の発現について陽性であり、ＣＤ４５およびＣＤ３４の発現について陰性である、上記１～９のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0050】
１１．ＣＤ２９の発現について陽性である、上記１～１０のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0051】
１２．ＭＨＣクラスＩＩの発現について陰性である、上記１～１１のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0052】
１３．ＰＴＨＬＨ、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、およびＩＬ１Ｒ２のうちの１つまたはそれを超える発現について陽性である、上記１～１２のいずれか１つ記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0053】
１４．ＩＬ１Ｒ２の発現について陽性である、上記１～１３のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0054】
１５．ｒｅｘ－１およびＮＯＶの発現について陰性である、上記１～１４のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0055】
１６．ｎａｎｏｇ、ｓｏｘ－２およびｏｃｔ－４の発現について陽性である、上記１～２および４～１５のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0056】
１７．培養において約５５回の集団倍加までテロメラーゼを発現する、上記１～１６のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0057】
１８．培養において約５５回の集団倍加までｏｃｔ－４を発現する、上記１～１７のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0058】
１９．培養において約５５回の集団倍加まで、中胚葉の少なくとも２つの細胞型に分化させる、１～１８のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0059】
２０．インビトロおよび／またはインビボでＴ細胞増殖を低減または阻害する、上記１～１９のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0060】
２１．インビトロおよび／またはインビボで血管新生を提供することができる、上記１～２０のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0061】
２２．中胚葉の少なくとも２つの細胞型に分化することができる、上記２～２１のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0062】
２３．骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞のうちの少なくとも２つに分化することができる、上記２２に記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0063】
２４．細胞が腫瘍形成性でなく、奇形腫を形成せず、形質転換されておらず、不死化されていない、上記１～２３のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0064】
２５．イヌから組織を得ること；接着性細胞の集団を確立すること；ＣＤ９０を陽性に発現し、かつ／またはＣＤ４５およびＣＤ３４の少なくとも１つを発現しない細胞を選択すること；ならびに選択された細胞を培養培地中で拡大させること、を含む方法によって調製された、上記１～２４のいずれか１つに記載の拡大培養した前駆細胞。
【0065】
２６．上記１～２４のいずれか１つに記載の拡大培養した前駆細胞と、第２の成分と、を含む組成物。
【0066】
２７．上記１～２４のいずれか１つに記載の拡大培養した前駆細胞と、薬学的に許容され得る担体と、を含む医薬組成物。
【0067】
２８．別々に包装された以下の成分：上記１～２４のいずれか１つに記載の拡大培養した前駆細胞；培養培地；および細胞を培養するための説明書を含むキット。
【0068】
２９．イヌから組織を得ること；接着性細胞の集団を確立すること；ＣＤ９０を陽性に発現し、かつ／またはＣＤ４５およびＣＤ３４の少なくとも１つを発現しない細胞を選択すること；選択された細胞を培養培地中で拡大させること；ならびに細胞を第２の成分に添加すること、を含む、上記２６に記載の組成物を調製する方法。
【0069】
３０．拡大培養した前駆細胞を薬学的に許容され得る担体と混合することを含む、上記２７に記載の医薬組成物を調製するための方法。
【0070】
３１．上記１～２４のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞を調製する方法であって、方法が、イヌから組織を得ること；接着性細胞の集団を確立すること；ＣＤ９０を陽性に発現し、かつ／またはＣＤ４５およびＣＤ３４の少なくとも１つを発現しない細胞を選択すること；ならびに選択された細胞を培養培地中で拡大させること、を含む、方法。
【0071】
３２．細胞バンクを構築する方法であって、方法が、対象への将来の投与のために、上記１～２４のいずれか１つに記載の拡大培養した前駆細胞を拡大させ、貯蔵することを含む、方法。
【0072】
３３．創薬のための方法であって、方法が、上記１～２４のいずれか１つに記載の拡大培養した前駆細胞を作用物質に曝露して、作用物質の細胞に対する１つまたはそれを超える効果を評価することを含む、方法。
【0073】
３４．イヌにおける炎症症状を処置するための方法であって、治療有効量の上記１～２４のいずれか１つに記載のイヌ前駆細胞をイヌに投与することを含む、方法。
【0074】
３５．炎症症状が、慢性炎症症状または急性炎症症状である、上記３４に記載の方法。
【0075】
３６．急性炎症症状または慢性炎症症状が、皮膚炎、炎症性眼疾患、炎症性脳疾患、炎症性気道疾患、および炎症性腸疾患のうちの１つである、上記３５に記載の方法。
【0076】
３７．皮膚炎がアトピー性皮膚炎である、上記３６に記載の方法。
【0077】
３８．炎症性眼疾患が角結膜炎である、上記３６に記載の方法。
【0078】
３９．炎症性脳疾患が髄膜脳脊髄炎である、上記３６に記載の方法。
【0079】
４０．炎症症状が自己免疫疾患である、上記３４に記載の方法。
【0080】
４１．イヌの筋骨格系障害を処置する方法であって、治療有効量の上記１～２４のいずれか１つに記載のイヌ前駆細胞をイヌに投与することを含む、方法。
【0081】
４２．筋骨格系障害が、変形性関節症および十字靭帯断裂のうちの１つである、上記４１に記載の方法。
【0082】
４３．十字靭帯断裂が部分的な十字靭帯断裂である、上記４２に記載の方法。
【0083】
４４．筋骨格系障害が脊髄症状である、上記４２に記載の方法。
【0084】
４５．脊髄症状が、脊髄損傷および椎間板疾患のうちの１つである、上記４４に記載の方法。
【0085】
イヌ前駆細胞には、以下の特定の番号付けされた実施形態が含まれるが、これらに限定されない。
【0086】
１．約２４時間未満の集団倍加速度、正常な核型を有し、テロメラーゼおよびＣＤ９０の発現について陽性であり、ＣＤ４５およびＣＤ３４の発現について陰性である、拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0087】
２．培養において少なくとも４０回の集団倍加を受けている、上記１に記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0088】
３．培養において少なくとも５０回の集団倍加を受けている、上記１～２のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0089】
４．培養において約１５～２４時間の集団倍加速度を有する、上記１～３のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0090】
５．培養において約１６時間の集団倍加速度を有する、上記１～４のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0091】
６．骨髄、脂肪組織、臍帯血、または胎盤組織に由来する、上記１～５のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0092】
７．ＣＤ２９の発現について陽性である、上記１～６のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0093】
８．ＭＨＣクラスＩＩの発現について陰性である、上記１～７のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0094】
９．ＰＴＨＬＨ、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、およびＩＬ１Ｒ２のうちの１つまたはそれを超えるものの発現について陽性である、上記１～８のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0095】
１０．ＩＬ１Ｒ２の発現について陽性である、上記１～９のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0096】
１１．ｒｅｘ－１およびＮＯＶの発現について陰性である、上記１～１０のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0097】
１２．ｎａｎｏｇ、ｓｏｘ－２、およびｏｃｔ－４の発現について陽性である、上記１～１１のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0098】
１３．培養において約５５回の集団倍加までテロメラーゼを発現する、上記１～１２のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0099】
１４．インビボおよび／またはインビトロでＴ細胞増殖を低減または阻害することができる、上記１～１３のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0100】
１５．インビボおよび／またはインビトロで血管新生を提供することができる、上記１～１４のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0101】
１６．中胚葉の少なくとも２つの細胞型に分化することができる、上記１～１５のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0102】
１７．骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞のうちの少なくとも２つに分化することができる、上記１～１６のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【0103】
１８．腫瘍形成性でなく、奇形腫を形成せず、形質転換されておらず、不死化されていない、上記１～１７のいずれか１つに記載の拡大培養したイヌ前駆細胞。
【図面の簡単な説明】
【0104】
【0105】
【0106】
【0107】
【0108】
【0109】
【0110】
【0111】
【0112】
【0113】
【0114】
【発明を実施するための形態】
【0115】
発明の詳細な説明
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬などに限定されず、したがって変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、特許請求の範囲によってのみ定義される開示された発明の範囲を限定することを意図するものではない。
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬などに限定されず、したがって変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、特許請求の範囲によってのみ定義される開示された発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【0116】
本明細書で使用されるセクションの見出しは、構成上の目的のためだけであり、記載される主題をいかなる形でも限定するものと解釈されるべきではない。
【0117】
本出願の方法および技術は、一般に、特に指示がない限り、当該技術分野で周知の従来の方法に従って、本明細書全体を通して引用および議論される様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されているように行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）、ならびにＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照されたい。
【0118】
定義
「ａ」または「ａｎ」は、本明細書では１つまたは１つよりも多いこと、すなわち少なくとも１つを意味する。本明細書で複数形が使用される場合、それは一般に単数形を含む。
「ａ」または「ａｎ」は、本明細書では１つまたは１つよりも多いこと、すなわち少なくとも１つを意味する。本明細書で複数形が使用される場合、それは一般に単数形を含む。
【0119】
「自己免疫疾患」とは、対象の免疫系が自己と非自己とを区別できないこと、または外来抗原に応答できないことを指す。この用語はまた、アレルギー性障害の場合のように、外来抗原に対する過剰免疫応答を包含する。したがって、この応答は、自己免疫障害およびアレルギー性障害の両方に存在する。自己免疫疾患には、生物自身の組織に対する抗体の産生によって引き起こされる組織損傷および炎症、サイトカインの産生障害、ならびに細胞傷害性または非細胞傷害性の作用機序によって引き起こされる組織損傷が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、患者の症候をもたらす不適切に調節された免疫応答である。典型的には、自己免疫応答は、対象の免疫系が自己抗原を外来抗原として認識すると起こり、自己反応性エフェクター免疫細胞の産生をもたらす。自己反応性エフェクター免疫細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、およびＢ細胞が含まれるがこれらに限定されない様々な系統からの細胞が含まれる。正確な機序は異なるが、自己免疫障害に罹患している患者における自己反応性エフェクター免疫細胞の存在は、患者の組織および細胞の破壊をもたらし、病理学的症候をもたらし得る。自己免疫疾患の非限定的な例としては、免疫媒介性多関節炎；免疫介在性血小板減少症；乾性角結膜炎；炎症性脳疾患；および落葉状天疱瘡が挙げられるが、これらに限定されない。同様に、正常個体がより抑制的に応答する外来抗原に対する過敏反応を受ける細胞の存在は、過敏症（アレルギー）を示す。例としては、ノミアレルギー皮膚炎、季節性アレルギー、ヒト食物アレルギー、イヌ食物アレルギー、空気中アレルゲン、環境アレルギー、家庭アレルギー、および処方薬が挙げられるが、これらに限定されない。対象におけるそのような細胞の存在、したがって、抗原特異的自己免疫障害またはアレルギー性障害などの自己免疫障害の存在を決定するための多数のアッセイが当業者に公知であり、対象方法において容易に採用することができる。
【0120】
「細胞バンク」は、将来の使用のために成長され貯蔵されている細胞の業界用語体系である。細胞はアリコートで貯蔵され得る。それらは、貯蔵から直接使用することができ、または貯蔵後に拡大することができる。これは、投与に利用可能な「既製の」細胞があるため便利である。細胞は、薬学的に許容され得る賦形剤に既に貯蔵されていてもよく、そのため、細胞は直接投与されてもよく、または細胞が貯蔵から放出されるときに適切な賦形剤と混合されてもよい。細胞は、凍結され得るか、または別の方法で生存率を保つための形態で貯蔵され得る。本発明の一実施形態では、細胞バンクは、本出願に記載される方法によって産生された細胞を使用して作製される。
【0121】
「共投与する」とは、２つまたはそれを超える作用物質の同時投与または逐次投与を含む、互いに一緒に、協調的に投与することを意味する。
【0122】
「含む（Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、他の限定なしに、言及物を含むことを意味し、必然的に、他に何が含まれ得るかに関するいかなる制限または除外もない。例えば、「ｘおよびｙを含む組成物」は、他の成分が組成物中に存在し得るにもかかわらず、ｘおよびｙを含有する任意の組成物を包含する。同様に、「ｘのステップを含む方法」は、ｘが方法の唯一のステップであるか、またはそれが各ステップのうちの１つにすぎないものであるかにかかわらず、他のステップがいくつあってもよく、それらと比較してｘがどれほど単純または複雑であっても、ｘが実行される任意の方法を包含する。「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」および語根「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」の単語を使用する類似の語句は、本明細書では「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の同義語として使用され、同じ意味を有する。
【0123】
「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の同義語である（上記参照）。
【0124】
「有効経路」とは、一般に、所望の区画、システム、または位置への作用物質（例えば、イヌ前駆細胞）の送達を提供する経路を意味する。例えば、有効経路は、有益なまたは所望の臨床結果をもたらすのに十分な量の作用物質を所望の作用部位に提供するために作用物質を投与することができる経路である。
【0125】
本発明に言及する場合、「有効時間」とは、炎症症状または筋骨格系障害の処置などの特定の効果をもたらすのに十分な期間を指す。
【0126】
「免疫応答」とは、外来抗原または自己抗原に対する患者の応答を指す。この用語は、細胞媒介性、体液性および炎症性応答を含む。
【0127】
「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」という用語の使用は、限定を意図するものではない。
【0128】
「増加させる（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」または「増加させる（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ）」とは、生物学的イベントを完全に誘発すること、またはイベントの程度を増加させることを意味する。
【0129】
「炎症症状」という用語は、急性または慢性炎症によって特徴付けられる疾患または障害を指す。この用語は、自己炎症性疾患（例えば、自己免疫疾患）または他の炎症性疾患などの炎症性疾患を指すことができる。炎症症状の非限定的な例としては、皮膚炎（例えば、アトピー性皮膚炎）炎症性眼疾患、炎症性脳疾患（例えば、髄膜脳脊髄炎）、炎症性気道疾患、および炎症性腸疾患が挙げられる。炎症症状の他の非限定的な例は、Ｍａｚｉａｒｚらの米国特許出願公開第２００６／０２６３３３７号Ａ１に開示されており、例えば、有害な免疫反応（例えば、他の治療から生じるもの）、移植療法を複雑にする炎症症状（例えば、ＧｖＨＤ）、および先天性免疫障害である。
【0130】
「虚血症状」という用語は、閉塞した血流による傷害および閉塞の除去によって引き起こされる再灌流傷害を指す。虚血症状の非限定的な例としては、急性心筋梗塞、慢性心不全、末梢血管疾患、脳卒中、慢性完全閉塞、腎虚血、および急性腎障害が挙げられる。
【0131】
「単離された」という用語は、インビボで１つもしくはそれを超える細胞、または細胞（例えば、イヌ前駆細胞）に関連する１つもしくはそれを超える細胞成分と関連してない細胞（例えば、イヌ前駆細胞）を指す。「濃縮された集団」とは、インビボまたは初代培養における１つまたはそれを超える他の細胞型に比べて、所望の細胞（例えば、イヌ前駆細胞）の数が相対的に増加していることを意味する。
【0132】
しかしながら、本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、特定の細胞（例えば、イヌ前駆細胞）のみの存在を示すものではない。むしろ、「単離された」という用語は、細胞（例えば、イヌ前駆細胞）がそれらの天然の組織環境から取り出され、正常な組織環境と比較してより高い濃度で存在することを示す。したがって、「単離された」細胞集団は、特定の細胞（例えば、イヌ前駆細胞）に加えて細胞型をさらに含み得、追加の組織成分を含み得る。これは、例えば、細胞倍加に関しても表現することができる。細胞（例えば、イヌ前駆細胞）は、インビボまたはその元の組織環境（例えば、骨髄、末梢血、胎盤、臍帯、臍帯血、脂肪組織など）においてその元の数と比較して濃縮されるように、インビトロまたはエクスビボで少なくとも約１０、２０、３０、４０回またはそれを超える倍加を受けることができ得る。
【0133】
「ｃＭＡＰＣ」は、「イヌ多能性成体前駆細胞」の頭字語であり、それと互換的に使用することができる。さらに、「ｃＭＡＰＣ」は、「イヌ前駆細胞」と互換的に使用することができる。ｃＭＡＰＣとは、胚性幹細胞または生殖細胞ではないが、これらの多数の特徴を有する細胞を指す。ｃＭＡＰＣは、培養において約２４時間未満の集団倍加速度を有すること、培養において拡張された複製能力および正常な核型を有すること、分化時に中胚葉由来の２つよりも多い細胞型の細胞子孫（例えば、骨芽細胞、脂肪細胞または軟骨細胞）を生じさせること、ならびに／または出生後の体細胞であるが、それらはｎａｎｏｇ、ｓｏｘ－２およびｏｃｔ－４などのこれらの原始細胞型のマーカーを発現し得ることを含むがこれらに限定されない、いくつかの異なる特徴で特徴付けられ得る。拡大培養したｃＭＡＰＣはまた、副甲状腺ホルモン様ホルモン（ＰＴＨＬＨ）、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、およびインターロイキン１受容体２型（ＩＬ１Ｒ２）の１つまたはそれを超えるものを発現し、ｒｅｘ－１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、および過剰発現した腎芽腫（ＮＯＶ）の発現について陰性であり得る。さらに、拡大培養したｃＭＡＰＣは、ＣＤ９０およびＣＤ２９について陽性の表面抗原であり得、ＣＤ４５およびＭＨＣクラスＩＩについて陰性の表面抗原であり得る。第５に、幹細胞と同様に、ｃＭＡＰＣは自己再生し得る；すなわち、形質転換されずに培養において拡張した複製能力を有する。これは、これらの細胞が培養においてテロメラーゼを発現する（すなわち、テロメラーゼ活性を有する）ことを意味する。第６に、拡大培養したＭＡＰＣは腫瘍形成性ではなく、奇形腫を形成せず、形質転換されず、不死化されない。したがって、「ｃＭＡＰＣ」と命名された細胞型は、その新規特性のいくつかを介して細胞を記述する代替の基本的特性によって特徴付けられ得る。
【0134】
ｃＭＡＰＣにおける「成体」という用語は非限定的である。それは、出生後の体細胞などの非胚性細胞を指す。
【0135】
「筋骨格系障害」という用語は、骨、筋肉、靭帯、腱、軟骨および関節に関連するすべての障害を含む。筋骨格系疾患または障害の処置は再生医療の範囲内である。例えば、脊髄固定、脊髄安定化、身体（長骨および扁平骨など）の分節欠損の修復を必要とする障害、環状裂傷などの椎間板輪の破壊、椎間板の慢性炎症、閉じ込められたまたは逸脱した突出部を伴う限局性椎間板ヘルニア、および椎間板を取り囲む椎骨の相対的不安定性を含むがこれらに限定されない椎骨および椎間板の障害が、筋骨格系障害である。筋骨格系障害には、靭帯（例えば、完全または部分的な十字靭帯断裂）、腱、筋肉（例えば、骨格筋および心筋）および軟骨の捻挫、ひずみおよび断裂、腱炎、腱滑膜炎、線維筋痛症、変形性関節症、関節リウマチ、リウマチ性多発筋痛症、滑液包炎、ならびに骨粗鬆症も含まれる。さらに、筋骨格系障害には、筋骨格系の遺伝病ならびにリソソーム蓄積症の筋骨格の側面が含まれる。
【0136】
タンパク質または核酸（例えば、ｍＲＮＡ）に言及する場合、「陰性発現」とは、タンパク質または核酸がサンプル中に存在しない、かつ／または対照サンプルと比較して既知のアッセイによって検出可能なレベルでサンプル中に存在しないことを意味する。
【0137】
「薬学的に許容され得る担体」は、本開示において使用されるイヌ前駆細胞のための任意の薬学的に許容され得る培地である。そのような培地は、等張性、細胞代謝、ｐＨなどを保持し得る。それは、インビボでの対象への投与に適合し、したがって、細胞送達および処置のために使用することができる。
【0138】
「集団倍加速度」とは、単位時間当たりの細胞集団倍加の量を指す。細胞集団倍加（ＰＤ）は、以下の式に従って計算することができるＰＤｈ＝ＰＤｉ＋Ｌｏｇ２（Ｃｈ／Ｃｉ）、式中、Ｃｉは、最初に播種した細胞を表し、Ｃｈは、採取した細胞の数を表す。拡大培養したイヌ前駆細胞の場合、集団倍加速度は、拡大プロセス全体にわたる、例えば約１０回の集団倍加から約５５回の集団倍加までの培養において、約２４時間未満、例えば、約１５～２４時間、約１５時間、約１６時間（例えば、１６時間）、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、または約２４時間である。
【0139】
タンパク質または核酸（例えば、ｍＲＮＡ）に言及する場合、「陽性発現」とは、タンパク質または核酸が、対照サンプルと比較して既知のアッセイによって検出可能なレベルでサンプル中に存在することを意味する。
【0140】
本明細書で使用される「低減させる」という用語は、減少だけでなく予防することを意味する。処置との関連において、「低減させる」ことは、１つまたはそれを超える臨床症候を予防または改善することのいずれかである。臨床症候は、処置せずに放置した場合に対象の生活の質（健康）に悪影響を及ぼすかまたは及ぼすであろう１つ（またはそれを超えるもの）である。インビトロの文脈では、「低減させる」ことは、１つもしくはそれを超える分析物またはバイオマーカーを減少させることであり、これをアッセイし、次いで特定の結果またはエンドポイントに相関させることができる。
【0141】
幹細胞の「自己再生」とは、それらが生じたものと同一の分化能を有する複製娘幹細胞を産生する能力を指す。
【0142】
「対象」とは、イヌ科のメンバーである動物を意味し、これには、オオカミ、ジャッカル、キツネ、コヨーテ、およびイヌ（Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）が含まれる。したがって、「イヌ（ｄｏｇ）」、「イヌ（ｃａｎｉｎｅ）」、または「イヌ科動物（ｃａｎｉｄ）」という用語の任意の１つを、本出願の主題を指すときに互換的に使用することができる。イヌ科動物は、イヌ科の２つ以上の種からの何らかの遺伝的寄与を有する家畜、オオカミ、または動物であり得る。したがって、本出願のイヌは、任意の純血犬または混血犬を含み得る。
【0143】
「実質的に純粋」とは、他の細胞型を含まないまたは実質的に含まないイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）の集団を指す。細胞精製は、当業者に公知の任意の手段によって達成することができる。例えば、イヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）の実質的に純粋な集団は、イヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）の成長によって、またはあまり純粋でない集団からの選択によって達成することができる。イヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）の培養物は、培養物中の増殖細胞の少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％がイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）である場合、実質的に純粋である。イヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）の培養物中のごくわずかなパーセンテージまたは０パーセンテージの他の成長細胞型の存在は、その培養物がイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）の実質的に純粋な培養物であることを意味する。
【0144】
「抑制」、「阻害」および「予防」は、免疫応答の文脈で使用される場合、許容される定義に従って本明細書で使用される。例えば、進行中の免疫応答（例えば、増殖などの異常なＴ細胞活性）が、例えば本明細書に開示される細胞による処置がない場合に生じる免疫応答のレベルと比較して遮断または有意に低減した場合、「抑制」が生じる。「阻害」とは、例えば本明細書に開示される細胞による処置がない場合に生じる免疫応答のレベルと比較して、免疫応答の発生を遮断すること、またはそのような応答を有意に低減させることを指す。予防的に投与される場合、そのような遮断は、標的とされた免疫応答が起こらないように完全であり得、典型的には、発症前に免疫応答を完全に遮断することに関して「予防」と呼ばれ、または本開示では、処置は、通常の未処置状態と比較して効果を低減させることができ、典型的には抑制または阻害と呼ばれる。
【0145】
「治療有効量」という用語は、対象において任意の治療応答を生じるように決定された作用物質（例えば、拡大培養したイヌ前駆細胞）の量を指す。例えば、有効な抗炎症治療薬は、対象の生存性を延長し、かつ／または明白な臨床症候を阻害し得る。本明細書で使用される用語の意味の範囲内で治療上有効な処置は、それ自体疾患転帰を改善しない場合であっても、対象の生活の質を改善する処置を含む。そのような治療有効量は、当業者によって容易に確認される。したがって、「処置する」とは、そのような量を送達することを意味する。場合によっては、処置は、炎症症状（例えば、自己免疫疾患）または筋骨格系障害の任意の病理学的症候を予防または改善することができる。
【0146】
「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、本発明に関して広く使用され、そのような各用語は、とりわけ、欠損、機能不全、疾患、または他の有害なプロセス（治療を妨げるおよび／または治療から生じるものを含む）を予防、改善、阻害、または治癒することを包含する。
【0147】
拡大培養したイヌ前駆細胞の選択および表現型
本発明は、中胚葉の少なくとも２つの細胞型、例えば骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨細胞を形成するように分化し得る、成体イヌから単離される拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）を提供する。これらの細胞はまた、培養における拡張した複製が可能であり、約５５回の集団倍加を通じて以下の１つまたはそれを超えるものを示す：約２４時間未満の集団倍加速度、正常な核型；および拡張した複製（例えば、テロメラーゼ）および多能性（例えば、ｏｃｔ４）のマーカーを発現する。
本発明は、中胚葉の少なくとも２つの細胞型、例えば骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨細胞を形成するように分化し得る、成体イヌから単離される拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）を提供する。これらの細胞はまた、培養における拡張した複製が可能であり、約５５回の集団倍加を通じて以下の１つまたはそれを超えるものを示す：約２４時間未満の集団倍加速度、正常な核型；および拡張した複製（例えば、テロメラーゼ）および多能性（例えば、ｏｃｔ４）のマーカーを発現する。
【0148】
本明細書に記載されるイヌ前駆細胞は、本発明者らによって単離および拡大され、本発明者らは、細胞を特徴付ける多数の特定の細胞表面マーカーおよび他の表現型マーカーを同定した。以下に記載される方法は、任意の成体イヌ組織、例えば、骨髄、脂肪組織、臍帯血、または胎盤組織からイヌ前駆細胞を単離し、成長させるために使用され得る。したがって、当業者は、イヌから組織を得て、過度の実験を行うことなく、本発明者らによって同定されたように、これらの細胞上に発現される（または発現されない）特定の表面マーカーおよび／または遺伝子マーカーに依拠して、公知の陽性または陰性選択技術を使用して拡大培養したイヌ前駆細胞を選択することが可能である。
【0149】
１．拡大培養したイヌ前駆細胞の表現型
【0150】
一実施形態では、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）を提供する。
【0151】
本発明者らは、本出願のイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）が、培養において約２４時間未満の倍加速度を有し、これは、驚くべきことに、他のイヌ前駆細胞、例えば、イヌ間葉系幹細胞（ｃＭＳＣ）よりも遅いことを発見した。したがって、場合によっては、イヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、培養において約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間または約２４時間、例えば、２４時間未満の集団倍加速度を有する。場合によっては、集団倍加速度は、培養において約１０～１５回の集団倍加、培養において約１５～２０回の集団倍加、培養において約２０～２５回の集団倍加、培養において約２５～３０回の集団倍加、培養において約３０～３５回の集団倍加、培養において約３５～４０回の集団倍加、培養において約４０～４５回の集団倍加、培養において約４５～５０回の集団倍加、または培養において約５０～５５回の集団倍加を通じて約２４時間未満である。
【0152】
本出願の拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、正常な核型を有する。「核型」とは、真核細胞の核内の染色体の数および出現を指す。この用語はまた、種または生物における染色体の完全なセットを示すために使用される。核型は、染色体の数および光学顕微鏡によるそれらの外観を記述する。核型は、長さ、セントロメアの位置、バンディングパターンおよび他の物理的特徴に関して確立される。したがって、染色体に明らかな異数性がない場合、核型は正常であると考えられる。
【0153】
染色体異常は、当該技術分野における標準的な手順、すなわちギムザ（「Ｇバンディング」）などの適切な色素による染色によって確立される。そのようなバンディングは、染色体をトリプシンで限定消化した後に得られる。これにより、一連の薄く暗い染色バンドが得られ、暗い領域はヘテロクロマチックで、明るい領域はユークロマチックの傾向がある。各染色体は、それを同定するのに役立つ特徴的なバンディングパターンを有する。また、２倍体核内の両方の染色体は、同じバンディングパターンを有するであろう。
【0154】
染色体異常は日常的に検出可能である。それらは、余分なもしくは欠損した染色体などの数的なものと、または転座、逆位、大規模欠失、および重複などの構造的なものであり得る。これらは、Ｇバンディングなどの様々な日常的なバンディング技術によって検出することができる。時折、染色体のプロセシングに関連する技術的アーチファクトは、（同じ染色体の）２つのホモログ間に明らかな差異を生じ得る。しかしながら、これらのアーチファクトは、例えば、およそ１５～２０個など、個体から受け入れられた数の中期スプレッドを分析することによって日常的に同定される。分析のレベルを考えると、所与の供試体で同じ技術的アーチファクトが繰り返し発生する可能性は非常に低い。染色体異常についての核型分析の議論については、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｃ．（２００８）Ｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ ｆｏｒ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ １（１）：２７を参照されたい。
【0155】
本出願のイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、培養において約１０～１５回の集団倍加、培養において約１５～２０回の集団倍加、培養において約２０～２５回の集団倍加、培養において約２５～３０回の集団倍加、培養において約３０～３５回の集団倍加、培養において約３５～４０回の集団倍加、培養において約４０～４５回の集団倍加、培養において約４５～５０回の集団倍加、または培養において約５０～５５回の集団倍加を通じて正常な核型を有する。
【0156】
イヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、培養において約１０～１５回の集団倍加、培養において約１５～２０回の集団倍加、培養において約２０～２５回の集団倍加、培養において約２５～３０回の集団倍加、培養において約３０～３５回の集団倍加、培養において約３５～４０回の集団倍加、培養において約４０～４５回の集団倍加、培養において約４５～５０回の集団倍加、または培養において約５０～５５回の集団倍加を通じて中胚葉の少なくとも２つの細胞型に分化し得る。本発明の拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）が分化し得る中胚葉の胚葉細胞型には、脂肪細胞、骨芽細胞および軟骨細胞が含まれる。別の例では、イヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、培養において約１０～１５回の集団倍加、培養において約１５～２０回の集団倍加、培養において約２０～２５回の集団倍加、培養において約２５～３０回の集団倍加、培養において約３０～３５回の集団倍加、培養において約３５～４０回の集団倍加、培養において約４０～４５回の集団倍加、培養において約４５～５０回の集団倍加、または培養において約５０～５５回の集団倍加を通じて中胚葉の３つまたはそれを超える細胞型に分化し得る。
【0157】
イヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、培養における拡張した複製によって特徴付けられる。したがって、イヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、培養において、少なくとも１０回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、または少なくとも５０回もしくはそれを超える集団倍加を受けているか、または受けることができる。一例では、イヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、培養において５０回の集団倍加を受けているか、または受けることができる。
【0158】
拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、細胞表面マーカー、遺伝マーカーおよび機能マーカーなどのある特定の分子マーカーの陽性または陰性発現によって特徴付けられる。これらのマーカーの非限定的な例を以下に開示する。場合によっては、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、約５０回の集団倍加、例えば、約３０～５０回の集団倍加、約３０～３５回の集団倍加、約３５～４０回の集団倍加、約４０～４５回の集団倍加または約４５～５０回の集団倍加を通じてある特定の分子マーカーの陽性または陰性発現によって特徴付けられる。一例では、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、約４０回または４４回の集団倍加を通じてある特定の分子マーカーの陽性または陰性発現によって特徴付けられる。
【0159】
一例では、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、ＣＤ９０およびＣＤ２９の少なくとも１つについて陽性の表面抗原であり、かつ／またはＣＤ３４、ＣＤ４５およびＭＨＣクラスＩＩの少なくとも１つについて陰性の表面抗原である。
【0160】
一例では、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、ＣＤ９０について陽性の表面抗原であり、ＣＤ３４およびＣＤ４５について陰性の表面抗原である。
【0161】
別の例では、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、ＰＴＨＬＨ、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＩＬ１Ｒ２、ｎａｎｏｇ、ｏｃｔ４およびｓｏｘ－２のうちの１つもしくはそれを超えるものの発現について陽性であり、かつ／またはｒｅｘ－１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＮＯＶの発現について陰性である。
【0162】
別の例では、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、ＩＬ１Ｒ２の発現について陽性である。
【0163】
別の例では、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、テロメラーゼ活性について陽性である。拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、約５０回の集団倍加、例えば、約２０～５０回の集団倍加、約２０～２５回の集団倍加、約２５～３０回の集団倍加、約３０～３５回の集団倍加、約３５～４０回の集団倍加、約４０～４５回の集団倍加または約４５～５０回の集団倍加を通じてテロメラーゼ活性について陽性である。一例では、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、約４０回または４４回の集団倍加を通じてテロメラーゼ活性について陽性である。
【0164】
別の例では、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、ｏｃｔ－４発現について陽性である。拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、約５０回の集団倍加、例えば、約２０～５０回の集団倍加、約２０～２５回の集団倍加、約２５～３０回の集団倍加、約３０～３５回の集団倍加、約３５～４０回の集団倍加、約４０～４５回の集団倍加または約４５～５０回の集団倍加を通じてｏｃｔ－４発現について陽性である。一例では、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、約４０回または４４回の集団倍加を通じてｏｃｔ－４発現について陽性である。
【0165】
別の例では、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、中胚葉の少なくとも２つの細胞型に分化し得る。拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、約５０回の集団倍加、例えば、約２０～５０回の集団倍加、約２０～２５回の集団倍加、約２５～３０回の集団倍加、約３０～３５回の集団倍加、約３５～４０回の集団倍加、約４０～４５回の集団倍加、または約４５～５０回の集団倍加を通じて中胚葉の少なくとも２つの細胞型に分化する。一例では、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、約４０回または４４回の集団倍加を通じて中胚葉の少なくとも２つの細胞型に分化する。
【0166】
別の例では、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、インビボおよび／またはインビトロでＴ細胞拡大を低減または阻害する能力を有する。
【0167】
別の例では、イヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、インビボおよび／またはインビトロで血管新生を誘導または促進する能力を有する。
【0168】
したがって、当業者は、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）の性質、ならびに上で論じたマーカーおよび／または機能マーカーの１つもしくは組み合わせの存在または非存在に基づく細胞の純度を確認できることを理解するであろう。
【0169】
２．イヌ前駆細胞の単離および拡大
【0170】
一実施形態では、本発明のイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）を、骨髄、胎盤、臍帯および臍帯血、筋肉、脳、肝臓、脊髄、血液、または皮膚を含むがこれらに限定されない複数の組織源から単離することができる。一例では、骨髄穿刺液が、シリンジ（例えば、ジャムシディ針）を使用して成体イヌ対象の大腿骨または脛骨から得られる。例示的な材料では、イヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は骨髄に由来する。
【0171】
場合によっては、組織源から得られた細胞は、例えば、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離を使用して分画することができる。単核画分を回収し、総細胞数を決定することができる。次いで、単核画分の細胞を、所望の密度で静的（例えば、タンパク質被覆フラスコ）または非静的培養容器（例えば、撹拌槽バイオリアクター）上または中に接種し、細胞を拡大させるのに十分な条件下で培養培地中で培養することができる。一実施形態では、単核画分の細胞を、ＣＰＰＴでコーティングしたフラスコにプレーティングする。単核画分の細胞は、約５００細胞／ｃｍ２～約３００，０００細胞／ｃｍ２またはそれを超え、例えば、約１００，０００細胞／ｃｍ２～約２５０，０００細胞／ｃｍ２、約４０，０００細胞／ｃｍ２～約１００，０００細胞／ｃｍ２、または約２，０００細胞／ｃｍ２～約５，０００細胞／ｃｍ２の密度でプレーティング（例えば、タンパク質被覆フラスコ上で）することができる。別の実施形態では、単核画分の細胞を、所望の密度で中空糸バイオリアクターなどの非静的培養容器に接種し、細胞を拡大させるのに十分な条件下で培養培地中で培養することができる。中空糸バイオリアクターの一例は、Ｐｉｎｘｔｅｒｅｎらの米国特許出願公開第２０１２／０３０８５３１号Ａ１に記載されており、Ｑｕａｎｔｕｍ（登録商標）細胞拡大システム（Ｔｅｒｕｍｏ，ＢＣＴ社、コロラド州レイクウッド）としても市販されている。
【0172】
単核画分の細胞は、血清ならびに細胞増殖および生存に必要な他のサプリメント（例えば、成長因子、アミノ酸、糖、ホルモン、緩衝剤、ビタミンなど）を含有する培養培地中で培養することができる。一例では、単核画分の細胞は、以下の成分を含む培養培地を使用して静的培養容器（例えば、タンパク質被覆フラスコ）内で培養することができる：約２０～６０％ＭＣＤＢ－２０１培地（例えば、約４０％）；約２０～６０％αＭＥＭ培地（例えば、約３５～５０％）；約１～５ｍＭウルトラグルタミン（例えば、約２ｍＭ）；約５～２０％ＦＢＳ（例えば、約１０～１８％）；約０．５～２×ＩＴＳ（インスリン－トランスフェリン－セレン）（例えば、約１倍）；約０．１～２×ＬＡ－ＢＳＡ（リノール酸－ウシ血清アルブミン（例えば、約０．５倍）；約５～１５０μＭ Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸（例えば、約１００μＭ）；約５～２０ｎｇ／ｍｌヒト／イヌＰＤＧＦ－ＢＢ（例えば、約１０ｎｇ／ｍｌ）；約１０～７５ｍＭデキサメタゾン（例えば、約５０ｎＭ）；約５～２０ｎｇ／ｍｌイヌＥＧＦ（例えば、約１０ｎｇ／ｍｌ）；および約０．５～２０ｎｇ／ｍｌ ｈＦＧＦ２（例えば、約１～１０ｎｇ／ｍｌ）。
【0173】
別の実施形態では、単核画分の細胞は、以下の成分を含む培養培地を使用して非静的培養容器（例えば、中空糸バイオリアクター）内で培養することができる：約２０～６０％ＭＣＤＢ－２０１培地（例えば、約４０％）；約２０～６０％αＭＥＭ培地（例えば、約３５～５０％）；約１～５ｍＭウルトラグルタミン（例えば、約２ｍＭ）；約５～２０％ＦＢＳ（例えば、約１０～１８％）；約０．５～２×ＩＴＳ（インスリン－トランスフェリン－セレン）（例えば、約１倍）；約０．１～２×ＬＡ－ＢＳＡ（リノール酸－ウシ血清アルブミン（例えば、約０．５倍）；約５～１５０μＭ Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸（例えば、約１００μＭ）；約５～２０ｎｇ／ｍｌヒト／イヌＰＤＧＦ－ＢＢ（例えば、約１０ｎｇ／ｍｌ）；約１０～７５ｍＭデキサメタゾン（例えば、約５０ｎＭ）；約５～２０ｎｇ／ｍｌイヌＥＧＦ（例えば、約１０ｎｇ／ｍｌ）；約０．５～２０ｎｇ／ｍｌ ｈＦＧＦ２（例えば、約１～１０ｎｇ／ｍｌ）；および約０．５～２０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ１（例えば、約１～１０ｎｇ／ｍｌ）。
【0174】
単核画分の細胞は、細胞を所望のコンフルエントまで拡大させるのに十分な条件下で加湿インキュベータ内でインキュベートすることができる。場合によっては、細胞を約３８℃で１～２日間、２～３日間、３～４日間、４～５日間、または５日間またはそれを超える期間インキュベートする。細胞はまた、所望のＣＯ２濃度（例えば、約１～２％、約２～３％、約３～４％、約４～５％、または約５％もしくはそれを超える濃度）および所望のＯ２濃度（例えば、約１～１０％、例えば、約３～５％）でインキュベートされる。所望のコンフルエントに達したら、細胞を引き上げ継代することができる。場合によっては、１００％未満のコンフルエント、例えば、約１０～２０％、約２０～３０％、約３０～４０％、約４０～５０％、約５０～６０％、約６０～７０％、約７０～８０％、約８０～９０％、または約９０～９９％のコンフルエントで細胞を引き上げ継代することができる。一例では、５０～８０％のコンフルエントで細胞を引き上げ継代する。
【0175】
一実施形態では、イヌ前駆細胞を以下のように単離し拡大させる。骨髄穿刺液は、イヌの大腿骨または脛骨から得ることができる。骨髄穿刺液は、ジャムシディ針を使用してシリンジに引き込むことができる。単核画分は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離によって単離することができる。総細胞数を決定することができ、次いで、細胞を、培養培地を含むＣＰＰＴ被覆フラスコに約１００，０００～２５０，０００細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングする。培養培地は、以下の成分を含むことができる：約４０％ＭＣＤＢ－２０１培地；約３５～５０％αＭＥＭ培地；約２ｍＭウルトラグルタミン；約１０～１８％ＦＢＳ；約１×ＩＴＳ（インスリン－トランスフェリン－セレン）；約０．５×ＬＡ－ＢＳＡ（リノール酸－ウシ血清アルブミン）；約１００μＭ Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸；約１０ｎｇ／ｍｌヒト／イヌＰＤＧＦ－ＢＢ；約５０ｎＭデキサメタゾン；約１０ｎｇ／ｍｌイヌＥＧＦ；約１～１０ｎｇ／ｍｌ ｈＦＧＦ２；および約１～１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ１。フラスコは、加湿インキュベータ内で３８℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２でインキュベートすることができる。約３～５日後、細胞のクローン拡大が目に見える。クローンが約５０～８０％のコンフルエントに達したら、細胞を引き上げ継代することができる。
【0176】
次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、その後トリプシンを使用してプレートから剥離することができる。トリプシン処理反応は、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）をフラスコに加えることによって停止させることができる。次いで、細胞溶液をコニカルチューブに移し、約５００×ｇで約５分間遠心分離することができる。次に、上清を除去し、細胞ペレットをＤＰＢＳに再懸濁することができる。細胞数を決定することができ、次いで、細胞を、上記のように培養培地中のＣＰＰＴ被覆フラスコに約２，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。細胞を３８℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２でインキュベートし、２～３日ごとに継代することができる。
【0177】
一実施形態では、拡大した細胞は、これらの細胞において発現される（もしくは発現されない）または示される分子マーカーおよび／または効能（上で論じた）に依拠する公知の陽性または陰性選択技術の１つまたは組み合わせに供される。したがって、本発明の拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、１つもしくはそれを超えるマーカー（本明細書に開示されるような）の存在および／または非存在ならびに／または下で論じられる選択技術を使用する効能に基づいて選択され得る。
【0178】
陽性選択技術および陰性選択技術の両方が当業者に利用可能であり、陰性選択目的に適した多数のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体も当該技術分野で利用可能であり（例えば、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ Ｖ，Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎら、Ｅｄｓ．（１９９５）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、多数の供給元から市販されている。
【0179】
細胞集団の混合物から哺乳動物細胞を分離するための技術はまた、Ｓｃｈｗａｒｔｚら、米国特許第５，７５９，７９３号（磁気分離）、Ｂａｓｃｈら、１９８３（イムノアフィニティークロマトグラフィー）およびＷｙｓｏｃｋｉ ａｎｄ Ｓａｔｏ，１９７８（蛍光活性化細胞選別、ＦＡＣＳ）に記載されている。
【0180】
一実施形態では、ＣＤ９０の少なくとも１つを発現する（陽性である）および／またはＣＤ４５およびＣＤ３４の少なくとも１つを発現しない（陰性である）拡大培養したイヌ前駆細胞が選択される。場合によっては、ＦＡＣＳを使用して細胞表面抗原の存在または非存在を検出する。以下の実施例に記載されるように、例えば、ＦＡＣＳを使用して、ＣＤ９０、ＣＤ４５およびＣＤ３４ならびにＭＨＣクラスＩＩおよびＣＤ２９の存在または非存在を検出することができる。
【0181】
別の実施形態では、ＰＴＨＬＨ、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＩＬ１Ｒ２、ｎａｎｏｇ、ｏｃｔ４、およびｓｏｘ－２のうちの１つもしくはそれを超えるものを発現する（陽性である）および／またはｒｅｘ－１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＮＯＶの発現を発現しない（陰性である）拡大培養したイヌ前駆細胞が選択される。場合によっては、ＰＣＲ（例えば、半定量ＰＣＲ、ｓｑＰＣＲ）を使用して遺伝子マーカーの存在または非存在を検出する。以下の実施例に記載されるように、例えば、ｓｑＰＣＲを使用して、ＰＴＨＬＨ、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＩＬ１Ｒ２、ｎａｎｏｇ、ｏｃｔ４、ｓｏｘ－２、ｒｅｘ－１、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＮＯＶの存在または非存在を検出することができる。
【0182】
別の実施形態では、テロメラーゼ活性について陽性である拡大培養したイヌ前駆細胞が選択される。テロメラーゼ活性の検出のためのアッセイは、当該技術分野で公知である。テロメラーゼ活性の任意のアッセイのために、陽性対照および陰性対照が含まれなければならないことが重要である。一例では、以下の実施例に記載されるように、テロメラーゼ活性は、ＴＲＡＰＥｚｅ ＲＴテロメラーゼ検出キット（Ｍｅｒｃｋ社）などの市販のキットを使用して決定することができる。
【0183】
別の実施形態では、インビボおよび／またはインビトロでＴ細胞増殖を低減または阻害する能力を有する拡大培養したイヌ前駆細胞が選択される。Ｔ細胞増殖を阻害または低減する細胞の能力は、免疫能アッセイを使用して決定することができ、その例は当該技術分野で公知である。細胞がＴ細胞増殖を低減または阻害する能力を決定するために使用される免疫能アッセイの一例を以下の実施例に提供する。混合リンパ球反応（ＭＬＲ）などの免疫能アッセイの他の例は、Ｍａｚｉａｒｚらの米国特許出願公開第２００６／０２６３３３７号Ａ１に開示されている。
【0184】
別の実施形態では、インビボおよび／またはインビトロで血管新生を誘導または促進する能力を有する拡大培養したイヌ前駆細胞が選択される。血管新生を誘導または促進する細胞の能力を決定するためのアッセイは、当該技術分野で公知である。一例では、Ｗｏｄａらの米国特許出願公開第２０１４／０２４２６２９号Ａ１および以下の実施例に記載されているように、ＨＵＶＥＣチューブ形成アッセイを使用して、血管新生を誘導または促進する細胞の能力を決定することができる。
【0185】
いくつかの実施形態では、選択され、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）の純度は、約１００％（実質的に純粋）である。他の実施形態では、それは９５％～１００％である。いくつかの実施形態では、それは８５％～９５％である。更なる実施形態では、パーセンテージは、約１０％～１５％、１５％～２０％、２０％～２５％、２５％～３０％、３０％～３５％、３５％～４０％、４０％～４５％、４５％～５０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、または９０％～９５％であり得る。別の実施形態では、純度は、イヌ細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）が、例えば、培養において１～５、５～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０回またはそれを超える細胞倍加を受けた細胞倍加に関して表すことができる。一例では、イヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、培養において少なくとも４０回、好ましくは少なくとも５０回の集団倍加を受けている。
【0186】
選択されたイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、上記のように、静的または非静的培養容器中でさらに培養され得る。
【0187】
組成物
一実施形態では、組成物は、本発明の拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）と第２の成分（例えば、添加剤、ビヒクルまたは担体、例えば培養培地または複数の培養培地）とを含み得る。
一実施形態では、組成物は、本発明の拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）と第２の成分（例えば、添加剤、ビヒクルまたは担体、例えば培養培地または複数の培養培地）とを含み得る。
【0188】
別の実施形態では、本発明の拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）を医薬組成物として製剤化することができる。
【0189】
米国特許第７，０１５，０３７号は、医薬製剤を教示するために参照により組み込まれる。特定の実施形態では、本発明の拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、送達に適合し、適した、すなわち生理学的に適合性の組成物内に存在する。
【0190】
いくつかの実施形態では、対象への投与のための拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）の純度は、約１００％（実質的に純粋）である。他の実施形態では、それは９５％～１００％である。いくつかの実施形態では、それは８５％～９５％である。特に、他の細胞との混和物の場合、パーセンテージは、約１０％～１５％、１５％～２０％、２０％～２５％、２５％～３０％、３０％～３５％、３５％～４０％、４０％～４５％、４５％～５０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、または９０％～９５％であり得る。または単離／純度は、イヌ細胞が、例えば、培養において１～５、５～１０、１０～２０回またはそれを超える細胞倍加を受けた細胞倍加に関して表すことができる。
【0191】
所与の用途のための本発明の拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）を投与するための製剤の選択は、様々な因子に依存するであろう。これらの中で顕著なのは、対象の種、処置される炎症症状または筋骨格系障害の性質、対象におけるその状態および分布、投与される他の療法および作用物質の性質、投与のための最適経路、経路を介した生存性、投与レジメン、ならびに当業者には明らかであろう他の要因であろう。例えば、適切な担体および他の添加剤の選択は、正確な投与経路および特定の剤形の性質に依存するであろう。
【0192】
拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）／培地の水性懸濁液の最終製剤は、典型的には、懸濁液のイオン強度を等張性（すなわち、約０．１～０．２）および生理学的ｐＨ（すなわち、ｐＨ約６．８～７．５）に調整することを含む。最終製剤はまた、典型的には流体潤滑剤を含有する。
【0193】
いくつかの実施形態では、本発明の拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、注射可能な単位投薬形態、例えば溶液、懸濁液またはエマルジョンで製剤化される。細胞の注射に適した医薬製剤は、典型的には滅菌水溶液および分散液である。注射可能な製剤のための担体は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。
【0194】
当業者は、本発明の方法で投与される組成物中の拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）ならびに任意選択の添加剤、ビヒクルおよび／または担体の量を容易に決定することができる。典型的には、任意の添加剤（細胞に加えて）が、リン酸緩衝生理食塩水などの溶液中に０．００１～５０重量％の量で存在する。有効成分は、マイクログラム～ミリグラムのオーダー、例えば約０．０００１～約５重量％、好ましくは約０．０００１～約１重量％、最も好ましくは約０．０００１～約０．０５重量％または約０．００１～約２０重量％、好ましくは約０．０１～約１０重量％、最も好ましくは約０．０５～約５重量％で存在する。
【0195】
いくつかの実施形態では、本発明の拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、特にカプセル化が治療の有効性を高めるか、または取り扱いおよび／もしくは貯蔵寿命に利点を提供する場合、投与のためにカプセル化される。拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）を、移植前に膜およびカプセルによってカプセル化することができる。利用可能な多くの細胞カプセル化の方法のいずれかが使用され得ることが企図される。
【0196】
多種多様な材料が、イヌ細胞のマイクロカプセル化のために様々な実施形態では使用され得る。そのような材料には、例えば、ポリマーカプセル、アルギン酸塩－ポリ－Ｌ－リジン－アルギン酸塩マイクロカプセル、ポリ－Ｌ－リジンアルギン酸塩バリウムカプセル、アルギン酸バリウムカプセル、ポリアクリロニトリル／ポリ塩化ビニル（ＰＡＮ／ＰＶＣ）中空繊維、およびポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）中空繊維が含まれる。
【0197】
細胞の投与に使用され得る細胞のマイクロカプセル化のための技術は当業者に公知であり、例えば、Ｃｈａｎｇ，Ｐら、１９９９；Ｍａｔｔｈｅｗ，Ｈ．Ｗ．ら、１９９１；Ｙａｎａｇｉ，Ｋ．ら、１９８９；Ｃａｉ Ｚ．Ｈら、１９８８；Ｃｈａｎｇ，Ｔ．Ｍ．，１９９２および米国特許第５，６３９，２７５号（例えば、生物学的に活性な分子を安定的に発現する細胞の長期維持のための生体適合性カプセルを記載する）に記載されている。カプセル化の更なる方法は、欧州特許出願公開第３０１，７７７号および米国特許第４，３５３，８８８号；同第４，７４４，９３３号；同第４，７４９，６２０号；同第４，８１４，２７４号；同第５，０８４，３５０号；同第５，０８９，２７２号；同第５，５７８，４４２号；同第５，６３９，２７５号；および同第５，６７６，９４３号に記載されている。上記のすべては、細胞のカプセル化に関連する部分が参照により本明細書に組み込まれる。
【0198】
ある特定の実施形態は、拡大培養したイヌ細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）をバイオポリマーまたは合成ポリマーなどのポリマーに組み込む。バイオポリマーの例としては、フィブロネクチン、フィブリン、フィブリノーゲン、トロンビン、コラーゲン、およびプロテオグリカンが挙げられるが、これらに限定されない。上で論じたサイトカインなどの他の因子もポリマーに組み込むことができる。本発明の他の実施形態では、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）を、三次元ゲルの隙間に組み込んでもよい。典型的には、大きなポリマーまたはゲルが外科的に埋め込まれる。十分に小さい粒子または繊維に製剤化することができるポリマーまたはゲルは、他の一般的な、より好都合な、非外科的経路によって投与することができる。
【0199】
拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）の投与量は、広い範囲内で変動し、各特定の場合における個々の要件に適合されるであろう。細胞の数は、レシピエントの体重および症状、投与の数または頻度、ならびに当業者に公知の他の変数に応じて変化するであろう。拡大培養したイヌ細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、組織または器官に適した経路によって投与することができる。例えば、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、全身投与、すなわち静脈内投与によって投与することができ、または髄腔内投与によって脳もしくは脊髄などの特定の組織もしくは器官を標的とすることができる。
【0200】
本発明の拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）を、約０．０１～約５×１０６細胞／ｍｌまたはそれを超える濃度で適切な賦形剤に懸濁することができる。注射溶液に適した賦形剤は、細胞およびレシピエントと生物学的および生理学的に適合するもの、例えば緩衝生理食塩水または他の適した賦形剤である。投与のための組成物は、適切な無菌性および安定性を満たす標準的な方法に従って製剤化、製造、および貯蔵することができる。
【0201】
投与
イヌ対象の用量は、本開示、本明細書に引用される文献、および当該技術分野の知識から、当業者による過度の実験なしに決定することができる。本発明の様々な実施形態に従って使用するのに適した拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）の用量は、多数の因子に依存するであろう。一次療法および補助療法のために投与される最適な用量を決定するパラメーターは、一般に、以下のうちのいくつかまたはすべてを含む：処置される炎症症状または筋骨格系症状およびその段階；対象の健康、性別、年齢、体重、および代謝率；対象の免疫能力；投与される他の療法；および対象の病歴または遺伝子型から予想される潜在的な合併症。パラメーターはまた、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）が同系、自家、同種、または異種のいずれであるかを含み得る；細胞／培地が有効であるために標的とされなければならない部位および／または分布；ならびに細胞／培地へのアクセス性および／または細胞の生着などの部位のそのような特徴。更なるパラメーターには、他の因子（成長因子およびサイトカインなど）との共投与が含まれる。所与の状況における最適な用量はまた、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）を製剤化する方法、それらを投与する方法、および拡大培養したイヌ前駆細胞が投与後に標的部位に局在する程度を考慮に入れるであろう。
イヌ対象の用量は、本開示、本明細書に引用される文献、および当該技術分野の知識から、当業者による過度の実験なしに決定することができる。本発明の様々な実施形態に従って使用するのに適した拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）の用量は、多数の因子に依存するであろう。一次療法および補助療法のために投与される最適な用量を決定するパラメーターは、一般に、以下のうちのいくつかまたはすべてを含む：処置される炎症症状または筋骨格系症状およびその段階；対象の健康、性別、年齢、体重、および代謝率；対象の免疫能力；投与される他の療法；および対象の病歴または遺伝子型から予想される潜在的な合併症。パラメーターはまた、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）が同系、自家、同種、または異種のいずれであるかを含み得る；細胞／培地が有効であるために標的とされなければならない部位および／または分布；ならびに細胞／培地へのアクセス性および／または細胞の生着などの部位のそのような特徴。更なるパラメーターには、他の因子（成長因子およびサイトカインなど）との共投与が含まれる。所与の状況における最適な用量はまた、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）を製剤化する方法、それらを投与する方法、および拡大培養したイヌ前駆細胞が投与後に標的部位に局在する程度を考慮に入れるであろう。
【0202】
様々な実施形態では、本発明の拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）を初期用量で投与し、その後、更なる投与によって維持することができる。拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）を、最初に１つの方法によって投与し、その後、同じ方法または１つもしくはそれを超える異なる方法によって投与することができる。レベルは、拡大培養したイヌ細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）の継続的な投与によって維持することができる。様々な実施形態は、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）を、最初に投与するか、対象におけるそれらのレベルを維持するか、またはその両方を静脈内注射によって投与する。様々な実施形態では、本明細書の他の箇所で論じられる、対象の症状および他の要因に応じて、他の形態の投与が使用される。
【0203】
拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）を、広範囲の時間にわたって多くの頻度で投与することができる。一般に、処置の長さは、疾患プロセスの長さ、適用される治療の有効性、ならびに処置される対象の症状および応答に比例する。
【0204】
使用
本発明の拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）を投与することは、本出願に記載される炎症症状または筋骨格系障害の明白な症候のいずれかを低減するのに有用である。これは、異常なＴ細胞増殖を低減または阻害することによって炎症症状（例えば、自己免疫疾患）を処置すること；血管新生を促進することによって虚血症状（例えば、心筋梗塞）を処置すること；靭帯、腱、骨、筋肉および軟骨などの結合組織に分化させることによって筋骨格系障害（例えば、十字靭帯断裂）を処置することなどの細胞の根底にある効果に基づいてもよい。
本発明の拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）を投与することは、本出願に記載される炎症症状または筋骨格系障害の明白な症候のいずれかを低減するのに有用である。これは、異常なＴ細胞増殖を低減または阻害することによって炎症症状（例えば、自己免疫疾患）を処置すること；血管新生を促進することによって虚血症状（例えば、心筋梗塞）を処置すること；靭帯、腱、骨、筋肉および軟骨などの結合組織に分化させることによって筋骨格系障害（例えば、十字靭帯断裂）を処置することなどの細胞の根底にある効果に基づいてもよい。
【0205】
一例では、本明細書に開示される組成物および方法は、本明細書に開示される拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）組成物を投与することによって対象における炎症症状を処置することに関する。いくつかの実施形態では、対象は自己免疫疾患に罹患しており、細胞組成物を使用して自己免疫疾患を処置する。
【0206】
別の例では、本明細書に開示される組成物および方法は、本明細書に開示される拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）組成物を投与することによって、対象における筋骨格系障害を処置することに関する。一実施形態では、対象は変形性関節症に罹患しており、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）組成物を使用して変形性関節症を処置する。別の実施形態では、対象は十字靭帯断裂に罹患しており、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）組成物を使用して十字靭帯断裂を処置する。さらに別の実施形態では、対象は脊髄症状に罹患しており、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）組成物を使用して脊髄症状を処置する。
【0207】
別の例では、本明細書に開示される組成物および方法は、本明細書に開示される拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）組成物を投与することによって対象における虚血症状を処置することに関する。一実施形態では、対象は、急性心筋梗塞、慢性心不全、末梢血管疾患、脳卒中、慢性完全閉塞、腎虚血および／または急性腎障害に罹患しており、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）組成物を使用して、急性心筋梗塞、慢性心不全、末梢血管疾患、脳卒中、慢性完全閉塞、腎虚血および／または急性腎障害を処置する。
【0208】
本明細書に開示される組成物を使用して、上記のような多種多様な炎症症状、虚血症状、および筋骨格系障害を処置、症候を緩和もしくは改善、または抑制する。
【0209】
いくつかの実施形態では、本発明の拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）を使用して、疾患または損傷の部位（例えば、炎症または虚血の部位）に抑制因子または他の生物学的因子、例えば、サイトカイン、幹細胞成長因子、および血管新生調節因子を含むがこれらに限定されない因子を送達することができる。例えば、いくつかの実施形態では、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）に、所望の生物学的因子をコードする遺伝子を形質導入することができ、次いで、細胞は、いったん対象内に入ると、例えば炎症または虚血の部位で産生する。
【0210】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）組成物を使用して、例えば、感染の病原性が病原体の細胞変性効果の結果ではなく、むしろ感染因子に対する免疫炎症反応によって引き起こされる組織損傷の結果である感染性疾患を処置することができる。Ｂ型もしくはＣ型肝炎またはＨＳＶ誘発角膜炎症などの疾患では、本明細書に開示される拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）による治療は、ウイルス誘発免疫炎症性疾患を制御するための固有の機会を提供する。コクサッキーなどのウイルスは、膵炎を引き起こすことが知られており、１型糖尿病の発症に関連している。したがって、本明細書に開示されるような拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）組成物を使用して、感染によって引き起こされる局所組織損傷を抑制し、自己免疫障害の発症を誘発する炎症を低減することができる。
【0211】
主題の方法は、様々な異なる症状および移植状況の処置に使用される。拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）を外科的手技の完了までその部位に維持するために、いくつかの実施形態では、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）を薬学的に許容され得る担体、例えば人工ゲル中、もしくは凝固血漿中に、または当該技術分野で公知の他の制御放出機序を利用することによって投与することが好都合である。
【0212】
さらに、本発明によって提供される他の使用には、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）の能力または効能に影響を及ぼす能力について、１つもしくはそれを超える作用物質または化合物をスクリーニングして、上で論じた効果の１つもしくはそれを超えるもの、例えば、血管新生を提供し、インビトロおよび／またはインビボでＴ細胞拡大を低減または阻害することが含まれる。そのようなスクリーニング方法は、（ｉ）拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）を作用物質または化合物と接触させることと、（ｉｉ）細胞が効果を有する能力または効能を評価することとを含む。そのような作用物質には、有機小分子、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ＤＮＡアプタマー、ペプチド、抗体、非抗体タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、および化学誘引物質が含まれるが、これらに限定されない。次いで、作用物質を使用して、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）の能力または効能を増加させて、評価した効果を達成することができる。評価はインビボまたはインビトロであり得る。一例では、ＨＵＶＥＣ管形成アッセイを使用して、拡大培養したイヌ前駆細胞（例えば、ｃＭＡＰＣ）がインビボおよび／またはインビトロで血管新生を提供する能力を調節する作用物質をスクリーニングする。別の例では、インビトロ増殖アッセイ（例えば、ＭＬＲ）を使用して、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）がインビトロおよび／またはインビボでＴ細胞増殖を阻害または低減する能力を調節する作用物質をスクリーニングする。
【0213】
本発明の更なる用途は、臨床投与のための拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）を提供するための細胞バンクの確立である。細胞バンクの構築は、本明細書に記載されるようにイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）を調製および拡大させ、次いで、対象への将来の投与のために、その集団から拡大させた細胞を貯蔵することによって行われ得る。拡大培養したイヌ細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）をバンクから直接使用するか、または使用前に拡大させることができる。
【0214】
したがって、本発明はまた、これらの細胞を対象に投与する前に行われる診断手順であって、上で論じた効果の１つもしくはそれを超えるものを達成し、かつ／または上で論じた遺伝子型マーカーもしくは表現型マーカーの１つもしくはそれを超えるものを示す細胞の効能または能力を評価することを含む診断手順に関する。拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）を細胞バンクから取り出し、直接使用するか、または投与前に拡大させてもよい。いずれの場合も、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）を、１つもしくはそれを超える効果を達成し、かつ／または１つもしくはそれを超える遺伝子型マーカーもしくは表現型マーカーを示す細胞の効能または能力について評価する。
【0215】
有効性について選択された拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）は、選択手順中に必ずアッセイされるが、細胞が依然として所望のレベルで有効であることを確実にするために、処置のために対象に投与する前に細胞を再度アッセイすることが好ましく、賢明であり得る。これは、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）を、細胞が貯蔵中に凍結される可能性が最も高い細胞バンクなどにおいて、任意の期間にわたって貯蔵した場合に特に好ましい。
【0216】
拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）での処置方法に関して、細胞の最初の単離と対象への投与との間に、この時間枠内に行われる操作後に、細胞が所望のレベルで依然として効果を達成し、かつ／または１つもしくはそれを超える遺伝子型マーカーもしくは表現型マーカーを示し得ることを確実にするための複数の（すなわち、シーケンシャル）アッセイが存在し得る。例えば、アッセイは、イヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）の各拡大後に行われ得る。拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）を細胞バンクに貯蔵している場合、貯蔵から解放した後にアッセイすることができる。凍結されている場合、解凍後にアッセイすることができる。細胞バンクから拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）をその後１回またはそれを超える回、拡大させる場合、それらを（各）拡大後にアッセイすることができる。好ましくは、（対象に物理的に投与される）最終細胞産物の一部をアッセイすることができる。
【0217】
別の実施形態では、本発明の拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）を、適切な包装材料と共にキットで提供することができる。例えば、キットは、以下の別々に包装された成分を含むことができる：拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）；培地または複数の培地培地；および拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）を培養するための説明書。場合によっては、拡大培養したイヌ前駆細胞（すなわち、ｃＭＡＰＣ）を、本明細書に記載されるように、培養のために別々に包装した適切な因子および培地を伴う凍結ストックとして提供することができる。
【0218】
イヌ前駆細胞の単離および培養のための有効量の適切な因子を含有するキットも本発明によって提供される。例えば、イヌから骨髄穿刺液を得る場合、技術者は、本明細書に記載される方法を使用して、キットに提供される適切な試薬を用いてイヌ前駆細胞を選択し、次いで、キット成分として供給される培養培地を使用して、本発明の方法によって記載されるように細胞を培養するだけでよい。培養培地の組成は本明細書に記載されている。
【0219】
本明細書に引用されるすべての特許および科学文献は、それらの教示について参照により組み込まれる。
【0220】
以下の実施例は、例示のみを目的としており、本明細書に添付される特許請求の範囲を限定することを意図していない。
【実施例】
【0221】
以下で「イヌ多能性成体前駆細胞（Ｃａｎｉｎｅ ｍｕｌｔｉ－ｐｏｔｅｎｔ ａｄｕｌｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）」または「ｃＭＡＰＣ」と呼ばれる本出願の新規のイヌ前駆細胞を特徴付けるために実験を行った。
【0222】
ｃＭＡＰＣ単離
【0223】
骨髄穿刺液を、インフォームドコンセントの下で若齢ドナーイヌの大腿骨または脛骨から得た。骨髄穿刺液をジャムシディ針を使用してシリンジに引き込んだ。単核画分をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離によって単離した。総細胞数を決定し（ＮＣ－２００、Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社）、細胞をタンパク質被覆フラスコに１００，０００～２５０，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。培養培地の組成は以下のとおり：４０％ＭＣＤＢ－２０１培地（Ｓｉｇｍａ社）、３５～５０％αＭＥＭ培地（Ｌｏｎｚａ社）、２ｍＭウルトラグルタミン（Ｌｏｎｚａ社）、１０～１８％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）、１×ＩＴＳ（インスリン－トランスフェリン－セレン、Ｌｏｎｚａ社）、０．５×ＬＡ－ＢＳＡ（リノール酸－ウシ血清アルブミン、Ｓｉｇｍａ社）、１００μＭ Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸（Ｓｉｇｍａ社）、１０ｎｇ／ｍｌヒト／イヌＰＤＧＦ－ＢＢ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｅ／ＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒＢｉｏｔｅｃｈ社）、５０ｎＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ社）、１０ｎｇ／ｍｌイヌＥＧＦ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）、１～１０ｎｇ／ｍｌ ｈＦＧＦ２（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｅ社）および１～１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ１（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｅ社）。フラスコを加湿インキュベータ内で３８℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２でインキュベートし、３～５日後、ｃＭＡＰＣのクローン拡大が目に見えた。クローンが５０～８０％のコンフルエントに達したら、細胞を回収し継代した。
【0224】
ｃＭＡＰＣ細胞培養
【0225】
細胞をＰＢＳにより洗浄し、その後、１×ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｇｉｂｃｏ社）を使用してプレートから剥離した。ＤＰＢＳをフラスコに添加することによってトリプシン処理反応を停止させた。細胞溶液をコニカルチューブに移し、５００×ｇで５分間遠心分離した。次に、上清を除去し、細胞ペレットをＤＰＢＳに再懸濁した。細胞数を測定し、細胞を２，０００細胞／ｃｍ２の密度でタンパク質被覆フラスコに播種した。培養培地の組成は上記のとおりであった。細胞を３８℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２でインキュベートし、２～３日ごとに継代した。
【0226】
細胞は継代ごとに計数されるので、集団倍加を示す増殖曲線は、以下の式を使用して生成することができる：ＰＤｈ＝ＰＤｉ＋Ｌｏｇ２（Ｃｈ／Ｃｉ）、式中、ＰＤｈは回収時の集団倍加であり、ＰＤｉは播種時の初期集団倍加であり、Ｃｈは回収時の細胞数であり、Ｃｉは播種された初期細胞数である。細胞を老化するまで拡大培養させると、ｃＭＡＰＣは４０回の集団倍加を超えることができたが、イヌ間葉系幹細胞（ｃＭＳＣ）は２０回の集団倍加で既に老化を開始した（図１）。表１Ａおよび１Ｂは、それぞれｃＭＡＰＣおよびｃＭＳＣについて１回の集団倍加に必要な時間数である倍加速度／時間を継代毎に示している。
【表1A】
【表1B】
【0227】
イヌ間葉系幹細胞（ｃＭＳＣ）単離
【0228】
新鮮な骨髄穿刺液からの単核画分を、Ｆｉｃｏｌｌ密度遠心分離を使用して単離した。単離された単核細胞を、組織培養処置プラスチック上に２００，０００～３５０，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。３～５日後、ｃＭＳＣのクローン性増殖が視認された。クローンが５０～８０％のコンフルエントに達したら、細胞を回収し継代した。
【0229】
ｃＭＳＣ培養
【0230】
Ｔ７５組織培養処置フラスコをｃＭＳＣ増殖のために使用した。フラスコから培地を除去した後、各フラスコを５ｍｌのＰＢＳで洗浄した。次いで、４ｍｌの１×Ｔｒｙｐｌｅ Ｓｅｌｅｃｔを各フラスコに添加した。フラスコを室温で２～５分間インキュベートした。細胞がすべて剥離しなかった場合、フラスコを穏やかにタップした。次いで、５ｍｌのＤＰＢＳを各フラスコに添加し、その内容物をコニカルチューブに移した。チューブを５００×ｇで５分間遠心分離した。各チューブからの上清を除去後再懸濁し、細胞を計数した。次いで、細胞を、１０ｍｌの市販のＭＳＣ培地（例えば、Ｌｏｎｚａ社）中のＴ７５培養フラスコに５，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。フラスコを３８℃、５．５％ＣＯ２および２０％Ｏ２でインキュベートした。
【0231】
フローサイトメトリー
【0232】
ｃＭＡＰＣの免疫表現型解析は、細胞がＣＤ２９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）およびＣＤ９０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を発現し、ＣＤ４５（Ｓｅｒｏｔｅｃ社）およびＨＬＡクラスＩＩ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）について陰性であることを示す（図２Ａ～Ｄ）。アイソタイプコントロールとして、非特異的ＩｇＧ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社またはＢｉｏ－Ｒａｄ社）を一次抗体の代わりに使用した。ｃＭＡＰＣをＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ ＢＳＡ）中で１Ｅ＋０６細胞／ｍｌの濃度に希釈した。各染色に１００μｌの細胞サンプルを使用した。抗体を添加した後、細胞を氷上および暗所で３０分間インキュベートした。次いで、２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液を添加することによって細胞を洗浄し、１０００×ｇで５分間遠心分離した。上清をデカントし、細胞を再懸濁した。細胞をＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）で測定した。
【0233】
ＰＣＲによるマーカー解析
【0234】
Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを、ＨｉｇｈＰｕｒｅ ＲＮＡ単離キット（Ｒｏｃｈｅ社）を説明書に従って使用して１００，０００～５００，０００個の細胞から単離する。ＲＮＡ濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用して測定し、２５０ｎｇ～５００ｎｇのＲＮＡを、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｒｏｃｈｅ社）を説明書に従って使用してｃＤＮＡを合成するための鋳型として使用する。得られたｃＤＮＡを５～１０倍に希釈する。
【0235】
選択された遺伝子セットの転写に使用したプライマーを以下の表２に示す。
【表2】
【0236】
リボソームタンパク質Ｌ８（ＲＰＬ８）をリファレンス遺伝子として使用した。ＧｅＮｏｒｍ解析により、この遺伝子がすべてのｃＭＡＰＣおよびｃＭＳＣの条件で安定発現をしていることが確認された。ＲＰＬ８はｃＤＮＡの品質を確認するために使用した。
【0237】
ＣＤマーカー遺伝子発現解析のために、５μｌの希釈ｃＤＮＡを採取し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ １キット（Ｒｏｃｈｅ社）を説明書に従って使用してｑＰＣＲ反応を行った。選択した表面マーカーのプライマー配列を表３に示す。
【表3】
【0238】
温度プログラムは、９５℃で１０秒、６０℃で１０秒、および７２℃で１０秒の４５サイクルとした。ｍＲＮＡ発現レベルは、Ｃｑ（定量サイクル）値に基づく。３５未満のＣｑ値を有するマーカーは陽性と判断し、３５を超えるマーカーは陰性と判断した。融解曲線分析を行って、プライマー－二量体形成およびアンプリコン特異性を試験した。結果を図３に示すが、赤色点線は検出下限であり、ＣＤ３４およびＣＤ４５は検出不能であり、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５は良好な発現を示した。
【0239】
ｃＭＡＰＣおよびｃＭＳＣに特異的なマーカーを半定量的ＰＣＲによって解析した。５μｌの希釈ｃＤＮＡを使用して、ｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼキット（ＢｉｏＲａｄ社）を説明書に従って使用してＰＣＲ反応を行った。以下のプログラムを使用した：９５℃で２分間の初期変性、続いて２８～３２サイクルの増幅（９５℃で１５秒、６０℃で１５秒、７２℃で３０秒）；および７２℃で５分間の最終伸長ステップ。
【0240】
多能性遺伝子の転写は、５μｌの希釈ｃＤＮＡを使用し、以下のプログラムを使用したＰＣＲ反応（ｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼキット（ＢｉｏＲａｄ）社）で解析した：９５℃で２分間の初期変性、続いて４０～４５サイクルの増幅（９５℃で１５秒、６０℃で１５秒、７２℃で３０秒）；および７２℃で５分間の最終伸長ステップ。ｃＭＡＰＣマーカー、ｃＭＳＣマーカー、および多能性マーカーの得られたＰＣＲ産物を２％アガロースゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）上で分離して、産物の存在および特異性を評価した（ＮＡＮＯＧ（図４Ａ）、Ｏｃｔ４（図４Ｂ）、ＳＯＸ２（図４Ｃ））。ゲルをＧｅｌＲｅｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｃｉｄ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（Ｂｉｏｔｉｕｍ社）を含有する水に浸すことによってバンドを染色した。ＢｉｏＲａｄ Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ＸＲＳを用いてゲルの写真を撮影した。
【0241】
テロメラーゼ活性
【0242】
ｃＭＡＰＣのテロメラーゼ活性を、ＴＲＡＰｅｚｅ ＲＴテロメラーゼ検出キット（Ｍｅｒｃｋ社）を使用して測定した。簡単に説明すると、１，０００，０００個の細胞を１００μｌのＣＨＡＰＳ緩衝液で溶解し、氷上で３０分間インキュベートした。サンプルを１２，０００×ｇで遠心分離して、細胞断片を除去した。２μｌのサンプルを反応溶液に添加した。反応溶液を３７℃で９０分間インキュベートした。このステップの間に、サンプル中の活性テロメラーゼは、テロメア鋳型の伸長を開始した。その後、サンプルを９５℃で５分間インキュベートすることによってテロメラーゼを不活性化した。生成されたテロメアを、リアルタイムｑＰＣＲによって最終的に定量した（図５）。ｃＭＡＰＣは、２５回を超える集団倍加においても有意なテロメラーゼ活性を示した；一方、ｃＭＳＣは、２３回を超える集団倍加においてテロメラーゼ活性を示さなかった。
【0243】
脂肪生成系列細胞分化
【0244】
細胞を対照培地中に４０，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し２４時間培養した。脂肪生成対照培地の組成は、ＤＭＥＭ高グルコース（４．５ ｇ／ｌ；Ｌｏｎｚａ社）、１％Ｌ－グルタミン（Ｌｏｎｚａ社）および３％ＦＢＳであった。その後、培地を脂質生成分化培地（１μＭデキサメタゾン、０．５μＭ ３－イソブチル－１－メチルキサンチン（ＩＢＭＸ；Ｓｉｇｍａ社）、２μＭウシ膵臓由来インスリン（Ｓｉｇｍａ社）、３３μＭビオチン（Ｓｉｇｍａ社）、１７μＭパントテネート（Ｓｉｇｍａ社）、５μＭロシグリタゾン（Ｓｉｇｍａ社）および５％ウサギ血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添加した脂肪生成対照培地）に交換した。培地を週に２回交換し、９日後に細胞を回収した。オイルレッドＯ（ＯＲＯ）染色を行って、脂肪滴を可視化した。細胞をクエン酸緩衝アセトン溶液（Ｓｉｇｍａ社）で３０秒間固定し、ＯＲＯ（Ｓｉｇｍａ社）で３７℃にて１０分間染色した。（図６Ａ）。
【0245】
骨形成分化
【0246】
細胞を、対照培地（ＤＭＥＭ高グルコース、１％Ｌ－グルタミンおよび５％ＦＢＳ）に４０，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し２４時間培養した。その後、培地を、５０μＭ Ｌ－アスコルビン酸－２Ｐ、５０ｎＭデキサメタゾンおよび１０ｍＭ β－グリセロリン酸（Ｓｉｇｍａ社）を添加した骨形成対照培地からなる骨形成分化培地に交換した。培地を週に２回交換し、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色のために７日後に細胞を回収した。染色のために、クエン酸緩衝アセトン溶液（Ｓｉｇｍａ社）を使用して細胞を固定し、遮光し、３７℃で１０分間、アルカリ性色素混合物（Ｓｉｇｍａ社）で染色した（図６Ｂ）。
【0247】
軟骨形成分化
【0248】
総容量１ｍｌの軟骨形成対照または分化培地の入った１５ｍｌコニカルチューブに細胞を３００，０００個の細胞の密度で播種し、３５０×ｇで５分間遠心分離した。軟骨形成対照培地の組成は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ高グルコースであった。軟骨形成基礎培地の組成は、ＤＭＥＭ高グルコース、０．６２５×ＩＴＳ、１００ｎＭデキサメタゾン、１２５μＭ Ｌ－アスコルビン酸－２Ｐ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１．２５×ＬＡ－ＢＳＡ、４００μｇ／ｍｌプロリン（Ｓｉｇｍａ社）および１ｍｇ／ｍｌピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ社）であった。以下の軟骨形成誘導物質をこの培地に添加した：１０ｎｇ／ｍｌ トランスフォーミング成長因子β１（ＴＧＦ－β１）および骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｅ社）。培地を３～４日ごとに交換し、２４日後にアルシアンブルー染色のためにペレットを採取した。凍結組織ブロックをペレットから調製した。５μｍの凍結切片を作製し、ガラススライドに貼り付けた。スライドを最初に０．５％アルシアンブルー溶液（Ｓｉｇｍａ社）で３０分間染色し、続いてＮｕｃｌｅａｒ Ｆａｓｔ Ｒｅｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ社）染色を５分間行った（図６Ｃ）。
【0249】
免疫能アッセイ
【0250】
免疫能アッセイを９６ウェル丸底プレートで行った。おいて、ｃＭＡＰＣを１：２～１：１６の範囲の段階希釈で播種した各ウェルに１００，０００個のイヌＰＢＭＣ（末梢単核球血球）を添加した。ｃＰＢＭＣを０．５μｇ／ｍｌ ＣｏｎＡ（コンカバリンＡ；Ｓｉｇｍａ社）で刺激し、アッセイを４日後に解析した。簡単に説明すると、プレートを室温で５分間、１０００×ｇで遠心分離した。上清を吸引し、細胞をＤＰＢＳ－ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、その後プレートを再び遠心分離した（１０００×ｇ、５分、室温）。ＤＰＢＳ－ＦＡＣＳ緩衝液を除去し、ＣＤ３／ＩｇＧ２ｂ抗体（Ａｂｃａｍ社）の混合物を添加した。混合物を暗所で４℃にて３０分間インキュベートした。次に、プレートを遠心分離し（１０００×ｇ、５分、室温）、抗体混合物を除去し、細胞をＤＰＢＳ－ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。プレートを遠心分離し、上清を除去し、ＧＡＭ（ヤギ抗マウス）－ＡＰＣ抗体と７－ＡＤＤ（７－アミノアクチノマイシンＤ；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）との混合物を添加した。混合物を暗所で４℃にて１５分間インキュベートした。細胞をＤＢＰＳ－ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、遠心分離し（１０００×ｇ、５分、室温）、ＤＢＰＳ－ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を使用してプレートを測定した。図７に示すように、ｃＭＡＰＣは、Ｔ細胞増殖を実質的に阻害または低減することができた。
【0251】
管腔形成（血管新生能）
【0252】
簡単に記載すると、５５，０００個のヒト臍静脈内皮細胞（ｈＵＶＥＣ）を、マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）で被覆した２４ウェルプレートに播種した。ｃＭＡＰＣの馴化培地を添加し、約１８時間後に各ウェルの写真を撮影した。形成されたチューブの数を各ウェルについて計数した。条件間の統計解析を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。ｃＭＡＰＣからの馴化培地は、管腔形成を誘導することができた（図８）。
【0253】
細胞遺伝学的解析
【0254】
Ｇ-Bandingによる細胞遺伝学的解析のために細胞を調製した。簡単に記載すると、ｃＭＡＰＣにコルセミド処置を行うため、デメコルシン（０．１μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ社）およびエチジウムブロミド（１０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ社）を培地に添加し、続いて３７℃で１時間のインキュベーションステップを行った。。その後、低張処置のため培地に低張液（Ｒａｉｎｂｏｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添加し、３７℃で４０分間インキュベートした。次に、細胞を回収し、１５ｍｌコニカルチューブに移した。上清１０ｍｌ当たり固定液（メタノール：酢酸；３：１）５００μｌを添加することによって細胞を固定した。溶液を５００×ｇで１０分間遠心分離し、その後に上清を除去し、細胞ペレットをほぐし、氷冷メタノール：酢酸固定液を１５ｍｌまで添加した。細胞を固定液中で穏やかに良く混合した。この固定ステップを３回繰り返した。１ｍｌの細胞懸濁液（上清の除去後）を微小遠心管に移し、次いで、固定液で満たし、外部実験室でＧバンディング法による核型解析を行った（図９）。
【0255】
マイクロアレイ
【0256】
ＲＮＡを凍結細胞ペレットから抽出し、各サンプルの品質管理および対応するＲＮＡの定量をＡｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒで行った。ＲＮＡをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｃａｎｉｎｅ Ｇｅｎｏｍｅ ２．０アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）で行った、ＲＭＡ正規化および異なる条件間の発現差異解析には、ＯｌｉｇｏおよびＬｉｍｍａパッケージ（Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ社）を用いたＲ言語を使用した。発現差異は、ベイズ調整分母によるｍｏｄｅｒａｔｅｄ ｔ統計量を用いて計算した。樹状図（図１０Ａ）およびＰＣＡ（主成分分析）プロット（図１０Ｂ）を使用して、ｃＭＡＰＣおよびｃＭＳＣが２つの別個のクラスターを形成し、全遺伝子発現に基づいて２つの異なる細胞集団とみなすことができることを示した。
【0257】
マイクロアレイから同定されたｃＭＡＰＣおよびｃＭＳＣ特異的マーカーを確認するための別のマイクロアレイ実験では、３つの異なるドナー由来のｃＭＡＰＣ（Ｍ）およびｃＭＳＣ（Ｓ）からＲＮＡを抽出した。ＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。ｃＤＮＡを使用して、遺伝子ＩＬ１Ｒ２（図１１Ａ）およびＮＯＶ（図１１Ｂ）についてＰＣＲを行った。マーカー遺伝子のプライマー配列を表４に示す。
【表4】
【0258】
次いで、ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルにロードして、遺伝子の発現を可視化した。ｃＭＡＰＣは遺伝子ＩＬ１Ｒ２の発現を示すが、この発現はｃＭＳＣには認められないと確認できた。ＮＯＶの発現は、ｃＭＡＰＣでは確認されず、ｃＭＳＣで確認された。リボソームタンパク質Ｌ８（ＲＰＬ８）（図１１Ｃ）をリファレンス遺伝子として使用した。ＧｅＮｏｒｍ解析では、この遺伝子がＭＡＰＣおよびＭＳＣのすべての条件で安定発現していることが確認された。ＲＰＬ８のゲル染色では、すべての条件について等量のｃＤＮＡがゲルにロードされたことが確認された。
【図1】
【図2A-B】
【図2C-D】
【図3】
【図4A-C】
【図5】
【図6A-C】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11A-C】
【国際調査報告】