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特表2024-537552デンプン－インドールカルボン酸誘導体及びその製造方法並びに使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-10
(54)【発明の名称】デンプン－インドールカルボン酸誘導体及びその製造方法並びに使用
(51)【国際特許分類】
C08B 31/04 20060101AFI20241003BHJP
A23L 33/10 20160101ALI20241003BHJP
A61K 31/718 20060101ALI20241003BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20241003BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20241003BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20241003BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20241003BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20241003BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20241003BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20241003BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20241003BHJP
【ＦＩ】
C08B31/04
A23L33/10
A61K31/718
A61P1/04
A61P1/16
A61P3/10
A61P37/02
A61P37/06
A61P29/00 101
A61P19/02
A61P25/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024547810
(86)(22)【出願日】2022-10-13
(85)【翻訳文提出日】2024-04-19
(86)【国際出願番号】 CN2022125134
(87)【国際公開番号】W WO2023066132
(87)【国際公開日】2023-04-27
(31)【優先権主張番号】202111213344.7
(32)【優先日】2021-10-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524152252
【氏名又は名称】山東善維免疫科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＤＯＮＧ ＳＨＡＮＷＥＩ ＩＭＭＵＮＯＴＥＣＨ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】110000729
【氏名又は名称】弁理士法人ユニアス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】マッカイ、チャールズ レイ
(72)【発明者】
【氏名】宋 營營
(72)【発明者】
【氏名】曲 新艷
(72)【発明者】
【氏名】王 泉博
【テーマコード（参考）】
4B018
4C086
4C090
【Ｆターム（参考）】
4B018LB10
4B018MD10
4B018MD18
4B018MD34
4B018ME14
4B018MF10
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA04
4C086EA20
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA52
4C086NA14
4C086ZA01
4C086ZA75
4C086ZA96
4C086ZB07
4C086ZB11
4C086ZB15
4C086ZC35
4C090AA02
4C090AA05
4C090AA09
4C090BA15
4C090BB53
4C090BB62
4C090BB77
4C090BB94
4C090CA38
4C090DA23
4C090DA27
(57)【要約】
本願は、加工デンプンの技術分野に関し、デンプン－インドールカルボン酸誘導体及びその製造方法並びに使用を提供する。前記デンプン－インドールカルボン酸誘導体は、縮合剤及び塩基の作用で、デンプンとインドールカルボン酸のエステル化反応により生成されたエステル化デンプンを指し、高い耐性を有し、胃、小腸の分解に耐えることができ、結腸部位に到達した後に腸内細菌叢の発酵を経て腸の健康に有益なインドールカルボン酸を放出することができ、胃内投与、腹腔内注射などの従来の投与方法と比べて明らかな利点を有し、結腸及び肝門脈血中のインドールカルボン酸の含有量を顕著に高めることができ、また、インドールカルボン酸は、アリール炭化水素受容体を活性化して免疫調節作用を果たすことができ、デンプンの腸内細菌叢発酵により放出された短鎖脂肪酸の調節作用を重ね合わせることで、複数の免疫系シグナル伝達経路によって相乗的に免疫調節作用を発揮する製品を提供する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
デンプン－インドールカルボン酸誘導体であって、主に、縮合剤及び塩基の作用で、デンプンとインドールカルボン酸のエステル化反応により製造されたものであり、
縮合後にデンプン－インドールカルボン酸誘導体のインドールカルボン酸の置換度は、０．０１～１．０である前記デンプン－インドールカルボン酸誘導体。
【請求項2】
前記インドールカルボン酸が、インドール酢酸、インドールプロピオン酸、インドールアクリル酸又はインドール乳酸のうちの少なくとも１つを含む請求項１に記載のデンプン－インドールカルボン酸誘導体。
【請求項3】
前記デンプンが、ハイアミロースコーンスターチ、ジャガイモデンプン、サツマイモデンプン、雑豆デンプン及びバナナデンプンのうちの少なくとも１つを含む請求項１に記載のデンプン－インドールカルボン酸誘導体。
【請求項4】
前記縮合剤が、ＥＤＣＩ、ＤＣＣ、ＨＡＴＵのうちの少なくとも１つを含む請求項１に記載のデンプン－インドールカルボン酸誘導体。
【請求項5】
前記塩基が、１－メチルイミダゾール、アミン、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウムのうちの少なくとも１つを含む請求項１に記載のデンプン－インドールカルボン酸誘導体。
【請求項6】
前記デンプン－インドールカルボン酸誘導体は、インドール酢酸誘導体化ハイアミロースコーンスターチ及びインドールプロピオン酸誘導体化ハイアミロースコーンスターチのいずれかを含む請求項１に記載のデンプン－インドールカルボン酸誘導体。
【請求項7】
デンプン－インドールカルボン酸誘導体がインドール酢酸誘導体化ハイアミロースコーンスターチである場合に、インドール酢酸誘導体化ハイアミロースコーンスターチのインドールカルボン酸の置換度は、０．０６５～０．４９である請求項６に記載のデンプン－インドールカルボン酸誘導体。
【請求項8】
デンプン－インドールカルボン酸誘導体がインドールプロピオン酸誘導体化ハイアミロースコーンスターチである場合に、インドールプロピオン酸誘導体化ハイアミロースコーンスターチのインドールカルボン酸の置換度は、０．２５～０．３９である請求項６に記載のデンプン－インドールカルボン酸誘導体。
【請求項9】
（ａ）デンプンを溶媒に溶解して、溶液Ａを得て、続いてインドールカルボン酸、縮合剤及び塩基を溶液Ａに加えてエステル化反応を行って、反応液Ａを得るステップと、（ｂ）反応液Ａ中のデンプンを析出させ、続いて吸引濾過、洗浄、乾燥をこの順に行って、デンプン－インドールカルボン酸誘導体を得るステップとを含む請求項１～８のいずれか一項に記載のデンプン－インドールカルボン酸誘導体の製造方法。
【請求項10】
前記ステップ（ａ）における溶媒が、ＤＭＳＯ、イオン液体、水のうちの少なくとも１つを含む請求項９に記載のデンプン－インドールカルボン酸誘導体の製造方法。
【請求項11】
前記ステップ（ａ）のエステル化反応の温度は２０～８０℃であり、時間は２０～３０時間である請求項９に記載のデンプン－インドールカルボン酸誘導体の製造方法。
【請求項12】
前記ステップ（ｂ）の析出の方法は、反応液Ａをエタノール又は水に滴加して、デンプン－インドールカルボン酸誘導体を析出させることである請求項９に記載のデンプン－インドールカルボン酸誘導体の製造方法。
【請求項13】
請求項１～８のいずれか一項に記載のデンプン－インドールカルボン酸誘導体の腸内免疫のバランスを調節する製品の製造における使用。
【請求項14】
前記腸内免疫のバランスを調節することは、デンプン－インドールカルボン酸誘導体は摂取されて結腸部位に到達した後、腸内細菌叢の発酵により、接続されたインドールカルボン酸が放出され、デンプンの腸内細菌叢発酵により放出された短鎖脂肪酸と相乗して、複数の免疫系シグナル伝達経路によって相乗的に免疫調節作用を発揮することを指す請求項１３に記載の使用。
【請求項15】
前記腸内免疫のバランスを調節する製品が、薬物、健康食品、特別医療目的用食品又は一般食品を含む請求項１３に記載の使用。
【請求項16】
前記薬物が、炎症性疾患及び／又は自己免疫疾患を予防及び治療する薬物である請求項１５に記載の使用。
【請求項17】
前記炎症性疾患及び／又は自己免疫疾患が、炎症性腸疾患、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、自己免疫性肝疾患、多発性硬化症のうちの１つを含む請求項１５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は、加工デンプンの技術分野に関し、特に、デンプン－インドールカルボン酸誘導体及びその製造方法並びに使用に関する。
【0002】
＜関連出願の相互参照＞
本願は、２０２１年１０月１９日に中国特許庁に提出された出願番号が２０２１１１２１３３４４．７であり、発明の名称が「デンプン－インドールカルボン酸誘導体及びその製造方法並びに使用」である中国特許出願の優先権を主張し、その内容の全てを援用することにより本願に取り入れる。
本願は、２０２１年１０月１９日に中国特許庁に提出された出願番号が２０２１１１２１３３４４．７であり、発明の名称が「デンプン－インドールカルボン酸誘導体及びその製造方法並びに使用」である中国特許出願の優先権を主張し、その内容の全てを援用することにより本願に取り入れる。
【背景技術】
【0003】
３－インドール酢酸（ＩＡＡ）、３－インドールプロピオン酸（ＩＰＡ）、３－インドール乳酸（ＩＬＡ）、３－インドールアクリル酸（ＩＡ）などのインドールカルボン酸誘導体は、トリプトファンの腸内微生物の代謝産物で、腸内免疫のバランス調節などにおいて重要な役割を発揮している。ＩＡＡ、ＩＡ、ＩＬＡなどはアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）のリガンドとして腸内免疫のバランスを調節することができ、且つＩＡＡはマウスマクロファージ及び肝細胞における炎症誘発性サイトカインのレベルをＡｈＲ依存的に抑制し、さらに肝臓の炎症反応を軽減することが研究で分かった。ＩＰＡは、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）のリガンドとして、特にインドールの存在下でマウスの腸のバリア機能を調節し、且つ血清ＩＰＡの濃度の上昇は２型糖尿病の有病率の低下、インスリン分泌及びインスリン抵抗性に関連している。また、ＩＰＡはヒドロキシラジカルスカベンジャーとして抗酸化作用を発揮することもできる。
【0004】
トリプトファンは人間の必須アミノ酸であり、食品タンパク質から提供される。トリプトファンの消化管における代謝は、主に、キヌレニン経路、５－ヒドロキシトリプタミン経路及び腸内微生物による直接分解の３つの経路がある。腸内微生物は、トリプトファンを分解してＩＡＡ／ＩＰＡなどのインドールカルボン酸を生成する主な場所である結腸で最も豊富である。健常者と比べて、肥満及び糖尿病患者の糞便中のＩＡＡの含有量は顕著に低下し、且つ疫学研究は血清ＩＰＡレベルと２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）及び軽微な炎症が負の相関にあることを示していることから、ＩＡＡ／ＩＰＡなどのインドールカルボン酸の含有量は人間の疾患に密接に関係していることが示唆されるということが研究で分かった。従って、ＩＡＡ／ＩＰＡなどのインドールカルボン酸の結腸標的化送達は、ＩＡＡ／ＩＰＡなどのインドールカルボン酸の良好な免疫調節作用を利用して、炎症性腸疾患、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、自己免疫性肝疾患、多発性硬化症などの炎症性疾患及び自己免疫疾患を予防又は治療する効果を果たすことが期待できるであろう。
【0005】
しかし、このようなインドールカルボン酸小分子を経口で直接摂取すると、結腸部位には実際に到達できずに消化管の胃又は小腸部位で吸収されてしまう。どのようにすればこれらの免疫調節作用を有するインドールカルボン酸小分子を標的の結腸部位に送達し作用を発揮させることができるかは、解決すべき課題である。
【0006】
本願は、上記の事情に鑑みてなされたものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本願の第１の目的は、デンプン－インドールカルボン酸誘導体を提供することであり、前記デンプン－インドールカルボン酸誘導体は、胃、小腸の分解に耐えることができ、結腸部位に到達した後に腸内細菌叢の発酵を経てインドールカルボン酸を放出することができ、胃内投与、腹腔内注射などのインドールカルボン酸の従来の投与方法と比べて明らかな利点を有し、結腸及び肝門脈血中のインドールカルボン酸の含有量を顕著に高めることができる。
【0008】
本願の第２の目的は、デンプン－インドールカルボン酸誘導体の製造方法を提供することである。
【0009】
本願の第３の目的は、デンプン－インドールカルボン酸誘導体の使用を提供し、前記デンプン－インドールカルボン酸誘導体を腸内免疫のバランスを調節する製品の製造プロセスに幅広く使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本願の上記の目的を達成するために、特に、以下の技術的手段を採用する。
本願によって提供されるデンプン－インドールカルボン酸誘導体であって、前記デンプン－インドールカルボン酸誘導体は、主に、縮合剤及び塩基の作用で、デンプンとインドールカルボン酸のエステル化反応により製造されたものであり、
好ましくは、縮合後にデンプン－インドールカルボン酸誘導体のインドールカルボン酸の置換度は、０．０１～１．０である。
本願によって提供されるデンプン－インドールカルボン酸誘導体であって、前記デンプン－インドールカルボン酸誘導体は、主に、縮合剤及び塩基の作用で、デンプンとインドールカルボン酸のエステル化反応により製造されたものであり、
好ましくは、縮合後にデンプン－インドールカルボン酸誘導体のインドールカルボン酸の置換度は、０．０１～１．０である。
【0011】
さらに、前記インドールカルボン酸は、インドール酢酸、インドールプロピオン酸、インドールアクリル酸又はインドール乳酸のうちの少なくとも１つを含む。
【0012】
さらに、前記デンプンは、ハイアミロースコーンスターチ（ＨＡＭＳ）、ジャガイモデンプン、サツマイモデンプン、雑豆デンプン及びバナナデンプンのうちの少なくとも１つを含む。
【0013】
さらに、前記縮合剤は、ＥＤＣＩ、ＤＣＣ、ＨＡＴＵのうちの少なくとも１つを含み、
好ましくは、前記塩基は、１－メチルイミダゾール、アミン、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウムのうちの少なくとも１つを含む。
好ましくは、前記塩基は、１－メチルイミダゾール、アミン、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウムのうちの少なくとも１つを含む。
【0014】
本願によって提供される上記のデンプン－インドールカルボン酸誘導体の製造方法であって、前記製造方法は、
（ａ）デンプンを溶媒に溶解して、溶液Ａを得て、続いてインドールカルボン酸、縮合剤及び塩基を溶液Ａに加えてエステル化反応を行って、反応液Ａを得るステップと、
（ｂ）反応液Ａ中のデンプンを析出させ、続いて吸引濾過、乾燥をこの順に行って、デンプン－インドールカルボン酸誘導体を得るステップとを含む。
（ａ）デンプンを溶媒に溶解して、溶液Ａを得て、続いてインドールカルボン酸、縮合剤及び塩基を溶液Ａに加えてエステル化反応を行って、反応液Ａを得るステップと、
（ｂ）反応液Ａ中のデンプンを析出させ、続いて吸引濾過、乾燥をこの順に行って、デンプン－インドールカルボン酸誘導体を得るステップとを含む。
【0015】
さらに、前記ステップ（ａ）における溶媒は、ＤＭＳＯ、イオン液体、水のうちの少なくとも１つを含む。
【0016】
さらに、前記ステップ（ａ）のエステル化反応の温度は２０～８０℃であり、時間は２０～３０時間である。
【0017】
さらに、前記ステップ（ｂ）の析出の方法は、反応液Ａをエタノール又は水に滴加して、デンプン－インドールカルボン酸誘導体を析出させることである。
【0018】
本願によって提供される上記のデンプン－インドールカルボン酸誘導体の腸内免疫のバランスを調節する製品の製造における使用である。
【0019】
前記腸内免疫のバランスを調節することは、デンプン－インドールカルボン酸誘導体は摂取されて結腸部位に到達した後、腸内細菌叢の発酵により、接続されたインドールカルボン酸が放出され、デンプンの腸内細菌叢発酵により放出された短鎖脂肪酸と相乗して、複数の免疫系シグナル伝達経路によって相乗的に免疫調節作用を発揮することを指す。
【0020】
さらに、前記腸内免疫のバランスを調節する製品は、薬物、健康食品、特別医療目的用食品又は一般食品を含む。
【0021】
さらに、前記薬物は、炎症性疾患及び／又は自己免疫疾患を予防及び治療する薬物である。
【0022】
さらに、前記炎症性疾患及び／又は自己免疫疾患は、炎症性腸疾患、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、自己免疫性肝疾患、多発性硬化症のうちの１つを含む。
【発明の効果】
【0023】
本願は、従来技術と比べて、次の有益な効果を有する。
本願によって提供されるデンプン－インドールカルボン酸誘導体として、前記デンプン－インドールカルボン酸誘導体は、主に、縮合剤及び塩基の作用で、デンプンとインドールカルボン酸のエステル化反応により製造されたものであり、上記のデンプン－インドールカルボン酸誘導体は、デンプンとインドールカルボン酸がエステル化反応を行って形成されたアシル化デンプンであり、高い耐性を有し、胃、小腸の分解に耐えることができ、結腸部位に到達した後に腸内細菌叢の発酵を経てインドールカルボン酸を放出することができ、胃内投与、腹腔内注射などのインドールカルボン酸の従来の投与方法と比べて明らかな利点を有し、結腸及び肝門脈血中のインドールカルボン酸の含有量を顕著に高めることができる。
本願によって提供されるデンプン－インドールカルボン酸誘導体として、前記デンプン－インドールカルボン酸誘導体は、主に、縮合剤及び塩基の作用で、デンプンとインドールカルボン酸のエステル化反応により製造されたものであり、上記のデンプン－インドールカルボン酸誘導体は、デンプンとインドールカルボン酸がエステル化反応を行って形成されたアシル化デンプンであり、高い耐性を有し、胃、小腸の分解に耐えることができ、結腸部位に到達した後に腸内細菌叢の発酵を経てインドールカルボン酸を放出することができ、胃内投与、腹腔内注射などのインドールカルボン酸の従来の投与方法と比べて明らかな利点を有し、結腸及び肝門脈血中のインドールカルボン酸の含有量を顕著に高めることができる。
【0024】
本願によって提供されるデンプン－インドールカルボン酸誘導体から結腸部位で放出されたインドールカルボン酸は、ＡｈＲを活性化することによって免疫調節作用を発揮する。また、腸内細菌叢がデンプンを発酵させて生成された短鎖脂肪酸は、Ｇタンパク質共役受容体を活性化し且つヒストン脱アセチル化酵素を抑制することによって、同様に免疫調節作用を果たすことができる。インドールカルボン酸及び短鎖脂肪酸の作用をプラス的に重ね合わせることで、複数の免疫系シグナル伝達経路によって相乗的に免疫調節作用を発揮する製品を提供することができる。
【0025】
本願によって提供されるデンプン－インドールカルボン酸誘導体の製造方法として、前記製造方法では、デンプンを溶媒に溶解して、溶液Ａを得て、続いてインドールカルボン酸、縮合剤及び塩基を溶液Ａに加えてエステル化反応を行って、反応液Ａを得て、次に反応液Ａ中のデンプンを析出させ、吸引濾過、乾燥をこの順に行って、デンプン－インドールカルボン酸誘導体を得る。上記の製造方法は、加工プロセスが簡単であり、産業的な大量生産に適する利点を有する。
【0026】
本願によって提供される上記のデンプン－インドールカルボン酸誘導体を腸内免疫のバランスを調節する製品、及び炎症性疾患を予防及び治療する製品に幅広く使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0027】
以下、本願の具体的な実施形態又は従来技術における技術的手段をより明瞭に説明するために、具体的な実施形態又は従来技術の記述で使用する図面を簡単に紹介し、いうまでもないが、以下の記述で図面は本願のいくつかの実施形態であり、当業者は、新規性のある作業をすることなく、これらの図面から他の図面を得ることもできる。
【0028】
【発明を実施するための形態】
【0029】
以下、実施例を用いて本願の技術的手段を明瞭かつ完全に記述し、いうまでもないが、記述される実施例は、本願の一部の実施例であり、全ての実施例ではない。当業者は、本願の実施例に基づいて、新規性のある作業をすることなく他の実施例を得た場合、その全てはいずれも本願の保護する範囲に属する。
【0030】
本願の一態様によれば、デンプン－インドールカルボン酸誘導体であって、前記デンプン－インドールカルボン酸誘導体は、主に、縮合剤及び塩基の作用で、アミロースデンプンとインドールカルボン酸のエステル化反応により製造されたものであり、
好ましくは、縮合後にデンプン－インドールカルボン酸誘導体のインドールカルボン酸の置換度は、０．０１～１．０である。
好ましくは、縮合後にデンプン－インドールカルボン酸誘導体のインドールカルボン酸の置換度は、０．０１～１．０である。
【0031】
本願によって提供されるデンプン－インドールカルボン酸誘導体として、前記デンプン－インドールカルボン酸誘導体は、主に、縮合剤及び塩基の作用で、デンプンとインドールカルボン酸のエステル化反応により製造されたものであり、上記のデンプン－インドールカルボン酸誘導体は、デンプンとインドールカルボン酸がエステル化反応を行って形成されたアシル化デンプンであり、高い耐性を有し、胃、小腸の分解に耐えることができ、結腸部位に到達した後に腸内細菌叢の発酵を経てインドールカルボン酸を放出することができ、胃内投与、腹腔内注射などのインドールカルボン酸の従来の投与方法と比べて明らかな利点を有し、結腸及び肝門脈血中のインドールカルボン酸の含有量を顕著に高めることができる。
【0032】
なお、結腸部位を標的にしてインドールカルボン酸を放出することによって炎症性疾患及び自己免疫疾患を効果的に予防及び治療することができ、ただし、炎症性疾患及び自己免疫疾患は、炎症性腸疾患、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、自己免疫性肝疾患、多発性硬化症などを含むが、それらに限定されない。
【0033】
好ましくは、前記デンプン－インドールカルボン酸誘導体は、インドールカルボン酸誘導体化デンプンを含み、インドールアセチル化デンプン、インドールプロピオニル化デンプン、インドールラクチル化デンプン、インドールアクリル化デンプンのうちの１つ又は複数の混合物である。
【0034】
本願の好ましい実施形態では、前記インドールカルボン酸は、インドール酢酸、インドールプロピオン酸、インドールアクリル酸又はインドール乳酸のうちの少なくとも１つを含む。
【0035】
本願の好ましい実施形態では、前記デンプンは、ハイアミロースコーンスターチ（ＨＡＭＳ）、ジャガイモデンプン、サツマイモデンプン、雑豆デンプン及びバナナデンプンのうちの少なくとも１つを含む。
【0036】
なお、前記ハイアミロースデンプンは、アミロースデンプンの含有量が５０％を超えるデンプンを指す。
【0037】
本願の好ましい実施形態では、前記縮合剤は、ＥＤＣＩ、ＤＣＣ、ＨＡＴＵのうちの少なくとも１つを含み、
本願の好ましい実施形態では、前記塩基は、１－メチルイミダゾール、アミン、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウムのうちの少なくとも１つを含む。
本願の好ましい実施形態では、前記塩基は、１－メチルイミダゾール、アミン、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウムのうちの少なくとも１つを含む。
【0038】
本願の一態様によれば、上記のデンプン－インドールカルボン酸誘導体の製造方法であって、前記製造方法は、
（ａ）デンプンを溶媒に溶解して、溶液Ａを得て、続いてインドールカルボン酸、縮合剤及び塩基を溶液Ａに加えてエステル化反応を行って、反応液Ａを得るステップと、
（ｂ）反応液Ａ中のデンプンを析出させ、続いて吸引濾過、乾燥をこの順に行って、デンプン－インドールカルボン酸誘導体を得るステップとを含む。
（ａ）デンプンを溶媒に溶解して、溶液Ａを得て、続いてインドールカルボン酸、縮合剤及び塩基を溶液Ａに加えてエステル化反応を行って、反応液Ａを得るステップと、
（ｂ）反応液Ａ中のデンプンを析出させ、続いて吸引濾過、乾燥をこの順に行って、デンプン－インドールカルボン酸誘導体を得るステップとを含む。
【0039】
本願によって提供されるデンプン－インドールカルボン酸誘導体の製造方法として、前記製造方法では、デンプンを溶媒に溶解して、溶液Ａを得て、続いてインドールカルボン酸、縮合剤及び塩基を溶液Ａに加えてエステル化反応を行って、反応液Ａを得て、次に反応液Ａ中のデンプンを析出させ、吸引濾過、乾燥をこの順に行って、デンプン－インドールカルボン酸誘導体を得る。上記の製造方法は、加工プロセスが簡単であり、産業的な大量生産に適する利点を有する。
【0040】
本願の好ましい実施形態では、前記ステップ（ａ）における溶媒は、ＤＭＳＯ、イオン液体、水のうちの少なくとも１つを含む。
【0041】
本願の好ましい実施形態では、前記ステップ（ａ）のエステル化反応の温度は２０～８０℃であり、時間は２０～３０時間である。
【0042】
本願の好ましい実施形態では、前記ステップ（ｂ）の析出の方法は、反応液Ａをエタノール又は水に滴加して、デンプン－インドールカルボン酸誘導体を析出させることである。
【0043】
本願の一態様によれば、上記のデンプン－インドールカルボン酸誘導体の腸内免疫のバランスを調節する製品の製造における使用である。
【0044】
本願によって提供される上記のデンプン－インドールカルボン酸誘導体を腸内免疫のバランスを調節する製品の製造プロセスに幅広く使用することができる。
【0045】
本願の好ましい実施形態では、前記腸内免疫のバランスを調節することは、デンプン－インドールカルボン酸誘導体を標的化ベクターとして、結腸にインドールカルボン酸を送達することを指す。
【0046】
好ましくは、前記腸内免疫のバランスを調節する製品は、薬物、健康食品、特別医療目的用食品又は一般食品を含む。
【0047】
以下、実施例を用いて本願の技術的手段を一層説明する。
【0048】
実施例１：デンプン－インドールカルボン酸誘導体の製造
１．インドール酢酸誘導体化ハイアミロースコーンスターチ（ＨＡＭＳＩＡＡ）の製造
ＨＡＭＳをＤＭＳＯに加え、溶液が清澄化するまで撹拌し、ＩＡＡ、ＥＤＣＩ、１－メチルイミダゾールをこの順に加え、仕込みが完了したら引き続き２４時間撹拌した。反応が終了した後、反応液をＥｔＯＨ又はＨ２Ｏに滴加して、固体を析出させ、吸引濾過し、ケーキをＥｔＯＨ又はＨ２Ｏで洗浄して、乾燥した。
１．インドール酢酸誘導体化ハイアミロースコーンスターチ（ＨＡＭＳＩＡＡ）の製造
ＨＡＭＳをＤＭＳＯに加え、溶液が清澄化するまで撹拌し、ＩＡＡ、ＥＤＣＩ、１－メチルイミダゾールをこの順に加え、仕込みが完了したら引き続き２４時間撹拌した。反応が終了した後、反応液をＥｔＯＨ又はＨ２Ｏに滴加して、固体を析出させ、吸引濾過し、ケーキをＥｔＯＨ又はＨ２Ｏで洗浄して、乾燥した。
【0049】
２．インドールプロピオン酸誘導体化ハイアミロースコーンスターチ（ＨＡＭＳＩＰＡ）の製造
ＨＡＭＳをＤＭＳＯに加え、溶液が清澄化するまで撹拌し、ＩＰＡ、ＥＤＣＩ、１－メチルイミダゾールをこの順に加え、仕込みが完了したら引き続き２４時間撹拌した。反応が終了した後、反応液をＥｔＯＨ又はＨ２Ｏに滴加して、固体を析出させ、吸引濾過し、ケーキをＥｔＯＨ又はＨ２Ｏで洗浄して、乾燥した。
ＨＡＭＳをＤＭＳＯに加え、溶液が清澄化するまで撹拌し、ＩＰＡ、ＥＤＣＩ、１－メチルイミダゾールをこの順に加え、仕込みが完了したら引き続き２４時間撹拌した。反応が終了した後、反応液をＥｔＯＨ又はＨ２Ｏに滴加して、固体を析出させ、吸引濾過し、ケーキをＥｔＯＨ又はＨ２Ｏで洗浄して、乾燥した。
【0050】
仕込み比を調整することで、異なる置換度（０．０１～１．０）のＨＡＭＳＩＡＡ及びＨＡＭＳＩＰＡを得た。ＨＡＭＳＩＡＡを例とする（表１）。
【0051】
【表1】
【0052】
３．インドールカルボン酸誘導体化ハイアミロースコーンスターチの置換度の測定
滴定法でインドールカルボン酸誘導体化ハイアミロースコーンスターチの置換度を測定することは、エステル結合の塩基加水分解及び余った塩基の中和の２つのステップを含み、具体的な操作は、次のとおりであった。
滴定法でインドールカルボン酸誘導体化ハイアミロースコーンスターチの置換度を測定することは、エステル結合の塩基加水分解及び余った塩基の中和の２つのステップを含み、具体的な操作は、次のとおりであった。
【0053】
０．２ｇのデンプンを秤量して、１０ｍＬのアセトン、１ｍＬの水に加え、密封して、均一に混合するまで磁気撹拌した。３ｍＬのＮａＯＨ水溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）を加えて、３０分間磁気撹拌した。１０ｍＬの６０℃の温水を加えて壁部を洗い流し、引き続き２分間撹拌した。放冷し、３滴のフェノールフタレイン試薬に加えて、溶液が無色に変わるまでＨＣｌ（０．５ｍｏｌ／Ｌ）で滴定し、室温で、色が変わらないまで２分間静置し、ＨＣｌの体積を記録した。測定は３回の並行で実施した。
【0054】
インドールカルボン酸誘導体化ハイアミロースコーンスターチＨＡＭＳＩＡＡにおけるインドールアセチル基の質量分率ωは、次のとおりであった。
【0055】
【数1】
【0056】
式中、Ｖ２、Ｖ１は、それぞれ、ＨＡＭＳ及びＨＡＭＳＩＡＡを滴定する時に使用したＨＣｌの体積（ｍＬ）であり、ｃはＨＣｌの濃度（ｍｏｌ／Ｌ）であり、ｍはＨＡＭＳＩＡＡサンプルの質量（ｇ）であり、１５８はインドールアセチル基の分子量であった。
【0057】
次のとおりにインドールアセチル基の含有量で置換度ＤＳを計算した。
【0058】
【数2】
【0059】
【数3】
【0060】
式中、１５８はインドールアセチル基の相対分子質量であり、１６２はデンプンの各グルコース単位の相対分子質量であり、１はＨ原子の相対原子質量であった。
【0061】
同じように、ＨＡＭＳＩＰＡの置換度は次のとおりであった。
【0062】
【数4】
【0063】
【数5】
【0064】
式中、ωは加工デンプンＨＡＭＳＩＰＡにおけるインドールプロピオニル基の質量分率であり、Ｖ２、Ｖ１は、それぞれ、ＨＡＭＳ及びＨＡＭＳＩＰＡを滴定する時に使用したＨＣｌの体積（ｍＬ）であり、ｃはＨＣｌの濃度（ｍｏｌ／Ｌ）であり、ｍはＨＡＭＳＩＰＡサンプルの質量（ｇ）であり、１７２はインドールプロピオニル基の相対分子質量であり、１６２はデンプンの各グルコース単位の相対分子質量であった。
【0065】
４．インドールカルボン酸誘導体化デンプンの構造の特徴付け
水素核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ ＮＭＲ）、赤外スペクトル（ＦＴＩＲ）によりその具体的な構造情報を特徴付けし、Ｘ線回折（ＸＲＤ）により加工デンプンの結晶化度を測定し、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）でデンプン粒の超微細形態を分析した。
水素核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ ＮＭＲ）、赤外スペクトル（ＦＴＩＲ）によりその具体的な構造情報を特徴付けし、Ｘ線回折（ＸＲＤ）により加工デンプンの結晶化度を測定し、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）でデンプン粒の超微細形態を分析した。
【0066】
図１は、当実施例によって提供されるデンプン－インドールカルボン酸誘導体の水素核磁気共鳴スペクトルである。図１から分かるように、ＨＡＭＳと比べて、ＨＡＭＳＩＡＡ及びＨＡＭＳＩＰＡは化学シフト１０．８３ｐｐｍでＮＨの特徴的なピークが出現し、且つＨＡＭＳＩＰＡは２．９６ｐｐｍ及び２．６９ｐｐｍで２つの新しいピークが出現し、これがＩＰＡ中の２つのメチレン基の特徴的なピークであった。
【0067】
図２は、当実施例によって提供されるデンプン（ＨＡＭＳ）及びインドール酢酸誘導体化ハイアミロースコーンスターチ（ＨＡＭＳＩＡＡ）の赤外スペクトルである。図２から分かるように、４００ｃｍ－１でのピークはＯＨ又はＮＨの伸縮振動ピークであり、ＯＨピークはブロードであったがＮＨピークはシャープであり、これはＩＡＡにＮＨが含有されているため置換度が上昇するにつれてシャープなピークはますます明らかになるためであり、２９３０ｃｍ－１でのピークはＣＨの伸縮振動ピークであった。ＨＡＭＳと比べて、ＨＡＭＳＩＡＡは１７２８ｃｍ－１で、カルボニル基の伸縮振動ピークが１つの新しいピークとして出現し、１７２８ｃｍ－１でのカルボニル基ピークは置換度が上昇するにつれて強くなった。スペクトルから分かるように、７４５ｃｍ－１でのピークも、ＨＡＭＳＩＡＡの置換度が上昇するにつれて強くなり、当該ピークは芳香環ＣＨの面外変角振動ピークであり、即ち、ＩＡＡのインドール環ＣＨの面外変角振動ピークであった。１７２８ｃｍ－１でのカルボニル基の特徴的なピーク及び７４５ｃｍ－１での芳香環ＣＨの特徴的なピークが出現したことは、ＨＡＭＳとＩＡＡのエステル化反応が成功したことを示した。
【0068】
注：図２でＤＳは置換度であった。
【0069】
なお、文献の報告によると、デンプン粒は多結晶体であり、デンプン粒の結晶構造は由来植物種によって異なり、主に３つのタイプのＸ線回折パターン（Ａ型、Ｂ型及びＣ型）が得られた。また、デンプンのアシル化などの特別な方法で、Ｖ型の構造を得ることができ、遺伝育種された一部のデンプンにはＡ＋Ｖ型、Ｂ＋Ｖ型及びＣ＋Ｖ型が示された。異なる結晶形のデンプンには明らかな特徴的なピークがあり、Ａ型には１５°、１７°、１８°及び２３°で強いピークがあり、Ｂ型には５．６°、１７°、２２°及び２４°で強いピークがあり、Ｃ型にはＡ型とＢ型の取り合わせが示され、Ａ型と比べると５．６°でピークが出現し、Ｂ型と比べると２３°で強いピークが出現し、Ｖ型の特徴的なピークは１２．５°及び１９．５°であった。
【0070】
図３は、当実施例によって提供されるデンプン（ＨＡＭＳ）及びインドール酢酸誘導体化ハイアミロースコーンスターチ（ＨＡＭＳＩＡＡ）のＸＲＤパターンである。図３から分かるように、ＨＡＭＳは５．６°、１７°、１９．５°及び２２°でピークが出現し、結晶形構造がＢ型であり、ＨＡＭＳＩＡＡは１２．５°及び１９．５°で特徴的なピークが出現し、Ｖ型であり、且つ置換度が上昇するにつれて、ピークはますます弱くなった。これらの結果は、ＨＡＭＳのアシル化でその結晶構造が破壊されたことを示した。
【0071】
図４は、当実施例によって提供されるデンプン（ＨＡＭＳ）及びインドール酢酸誘導体化ハイアミロースコーンスターチ（ＨＡＭＳＩＡＡ）のＳＥＭ電子顕微鏡画像である。図４から分かるように、ＨＡＭＳデンプン粒は殆ど円形又は楕円形であり、表面は亀裂がなく滑らかであるが、ＩＡＡによるアシル化後のＨＡＭＳＩＡＡデンプン粒は、表面が粗くて不規則になり、これは反応の過程でまずＤＭＳＯで溶解し、反応が終了した後にエタノール又は水に加えて製品を析出させることで、デンプン粒の形態が破壊されたためであった。
【0072】
実施例２：インドール酢酸誘導体化デンプン（ＨＡＭＳＩＡＡ）によるＩＡＡの結腸標的化送達の効果評価
ＨＡＭＳ及び異なる置換度のＨＡＭＳＩＡＡを用いてそれぞれ１５％の添加率でマウス飼料を作製し、８週齢のマウスを、体重によってランダムに６群に分け、各群は５匹であった。ＨＡＭＳ群、ＨＡＭＳＩＡＡ群であった（６群であり、ＤＳは、それぞれ、０．０６５、０．１２、０．１９、０．２９、０．３７、０．４９であった）。マウスの糞便及び血清を収集した。
ＨＡＭＳ及び異なる置換度のＨＡＭＳＩＡＡを用いてそれぞれ１５％の添加率でマウス飼料を作製し、８週齢のマウスを、体重によってランダムに６群に分け、各群は５匹であった。ＨＡＭＳ群、ＨＡＭＳＩＡＡ群であった（６群であり、ＤＳは、それぞれ、０．０６５、０．１２、０．１９、０．２９、０．３７、０．４９であった）。マウスの糞便及び血清を収集した。
【0073】
マウスの糞便、肝門脈血、末梢血及び結腸組織におけるＩＡＡ／ＩＰＡの含有量の測定方法：
高速液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）技術を利用して各サンプル中の代謝産物ＩＡＡ／ＩＰＡの含有量をそれぞれ検出した。マウスの糞便中のＩＡＡ／ＩＰＡの含有量の測定は次のとおりであった。採取した糞便にメタノールを加え、次にボルテックス、超音波抽出、遠心分離を経て、上清を取り出して抽出液が得られ、後に当該抽出液を処理し、ＩＡＡ／ＩＰＡ内部標準物質（ＩＡＡ－ｄ５／ＩＰＡ－ｄ２）を加えて校正し、次にＨＬＢ固相抽出カートリッジ（使用する前に、それぞれ、５ｍＬのメタノール、５ｍＬの水で前処理し、次に５ｍＬのメタノール／水混合液、５ｍＬの水で溶出して捨て、最後に５ｍＬのメタノールで溶離した）で精製し、溶離液をＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析にかけて、ＩＡＡ／ＩＰＡを検出した。肝門脈及び末梢血中のＩＡＡ／ＩＰＡの含有量の測定は次のとおりであった。採取した全血を静置した後に低温で遠心分離し、上清を取り出して、血清が得られ、後に上記と同じ方法を用いて、血清に内部標準物質を加え、固相抽出カラムで精製し、ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳを利用して溶離液中の代謝産物ＩＡＡ／ＩＰＡを検出した。結腸組織中のＩＡＡ／ＩＰＡの含有量の測定は次のとおりであった。採取した結腸組織中のＩＡＡ／ＩＰＡの含有量を次のとおりに測定した。メタノールを加え、超音波破砕を経て一層均一に研磨し、次にボルテックス、超音波抽出、遠心分離を経て、上清を取り出して抽出液が得られ、後に上記と同じ方法を用いて、血清に内部標準物質を加え、固相抽出カラムで精製し、ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳを利用して抽出液中のＩＡＡ／ＩＰＡの濃度を検出した。
高速液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）技術を利用して各サンプル中の代謝産物ＩＡＡ／ＩＰＡの含有量をそれぞれ検出した。マウスの糞便中のＩＡＡ／ＩＰＡの含有量の測定は次のとおりであった。採取した糞便にメタノールを加え、次にボルテックス、超音波抽出、遠心分離を経て、上清を取り出して抽出液が得られ、後に当該抽出液を処理し、ＩＡＡ／ＩＰＡ内部標準物質（ＩＡＡ－ｄ５／ＩＰＡ－ｄ２）を加えて校正し、次にＨＬＢ固相抽出カートリッジ（使用する前に、それぞれ、５ｍＬのメタノール、５ｍＬの水で前処理し、次に５ｍＬのメタノール／水混合液、５ｍＬの水で溶出して捨て、最後に５ｍＬのメタノールで溶離した）で精製し、溶離液をＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析にかけて、ＩＡＡ／ＩＰＡを検出した。肝門脈及び末梢血中のＩＡＡ／ＩＰＡの含有量の測定は次のとおりであった。採取した全血を静置した後に低温で遠心分離し、上清を取り出して、血清が得られ、後に上記と同じ方法を用いて、血清に内部標準物質を加え、固相抽出カラムで精製し、ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳを利用して溶離液中の代謝産物ＩＡＡ／ＩＰＡを検出した。結腸組織中のＩＡＡ／ＩＰＡの含有量の測定は次のとおりであった。採取した結腸組織中のＩＡＡ／ＩＰＡの含有量を次のとおりに測定した。メタノールを加え、超音波破砕を経て一層均一に研磨し、次にボルテックス、超音波抽出、遠心分離を経て、上清を取り出して抽出液が得られ、後に上記と同じ方法を用いて、血清に内部標準物質を加え、固相抽出カラムで精製し、ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳを利用して抽出液中のＩＡＡ／ＩＰＡの濃度を検出した。
【0074】
図５は、当実施例の実験マウスの糞便中のインドールカルボン酸の濃度を示す図である。図５から分かるように、加工デンプンの飼料への添加量が１５％であるとき、ＨＡＭＳ群と比べて、ＨＡＭＳＩＡＡ群では糞便中のＩＡＡの濃度が顕著に高められた。ただし、ＨＡＭＳＩＡＡの置換度が０．３７であるとき、糞便中のＩＡＡの濃度は最も高く、約５４７０μｍｏｌ／ｋｇであり、ＨＡＭＳ群（約４μｍｏｌ／ｋｇ）と比べて、１３７０倍くらい高められた。これは、ＩＡＡの保持能力は置換度に関係していることを示し、置換度が低いときは、糞便中のＩＡＡの濃度は置換度が増加するにつれて上昇し、置換度が特定の値になってさらに増加すると、ＩＡＡの濃度はかえって低減する。
【0075】
図６は、当実施例の実験マウスの肝門脈血中のインドールカルボン酸の濃度を示す図である。図６から分かるように、加工デンプンの飼料への添加量が１５％であるとき、ＨＡＭＳ群と比べて、ＨＡＭＳＩＡＡ群ではマウスの肝門脈血中のＩＡＡの濃度が顕著に高められた。異なる置換度のＨＡＭＳＩＡＡ群の肝門脈血中のＩＡＡの濃度は糞便中のＩＡＡの濃度の変化するルールとやや異なり、ただし、置換度が０．１９であるＨＡＭＳＩＡＡ群は肝門脈血中のＩＡＡの濃度が最も高く、約２７００ｎｍｏｌ／ｍＬであり、ＨＡＭＳ群（約１ｎｍｏｌ／ｍＬ）と比べて、２７００倍くらい高められ、置換度が０．３７であるＨＡＭＳＩＡＡ群は糞便中のＩＡＡの濃度が最も高く、これは、置換度が０．３７であるＨＡＭＳＩＡＡは耐性がより高く、胃又は小腸部位で吸収されたのが少なく、結腸部位に到達して分解及び吸収されたのが多いからだという可能性がある。
【0076】
マウスの糞便及び肝門脈血中のＩＡＡの濃度を検出することにより、加工デンプンの飼料への添加量が１５％であるとき、ＨＡＭＳＩＡＡ群はＨＡＭＳ群と比べて、ＩＡＡの濃度がきわめて顕著に高められたことが分かり、ＨＡＭＳＩＡＡはＩＡＡを効果的に標的に送達して結腸部位にゆっくりと放出させることができることを示し、ただし、置換度が０．３７であるＨＡＭＳＩＡＡは、標的化送達の効果が最も良かった。
【0077】
実施例３：インドール酢酸誘導体化デンプン（ＨＡＭＳＩＡＡ）によるＩＡＡの結腸標的化送達の効果評価
ＨＡＭＳ及び異なる置換度のＨＡＭＳＩＡＡを用いてそれぞれ１．５％の添加率でマウス飼料を作製し、８週齢のマウスを、体重によってランダムに６群に分け、各群は５匹であった。ＨＡＭＳ群、ＨＡＭＳＩＡＡ群であった（６群であり、ＤＳは、それぞれ、０．０６５、０．１２、０．１９、０．２９、０．３７、０．４９であった）。マウスの糞便及び血清を収集した。
ＨＡＭＳ及び異なる置換度のＨＡＭＳＩＡＡを用いてそれぞれ１．５％の添加率でマウス飼料を作製し、８週齢のマウスを、体重によってランダムに６群に分け、各群は５匹であった。ＨＡＭＳ群、ＨＡＭＳＩＡＡ群であった（６群であり、ＤＳは、それぞれ、０．０６５、０．１２、０．１９、０．２９、０．３７、０．４９であった）。マウスの糞便及び血清を収集した。
【0078】
図７は、当実施例の実験マウスの糞便中のインドールカルボン酸の濃度を示す図である。図７から分かるように、加工デンプンの飼料への添加量を１．５％に低減したとき、ＨＡＭＳ群と比べて、ＨＡＭＳＩＡＡ群では依然として糞便中のＩＡＡの濃度が顕著に高められ、且つ置換度が０．３７であるＨＡＭＳＩＡＡ群の糞便中のＩＡＡの濃度は、８６０μｍｏｌ／ｋｇくらいと最も高く、ＨＡＭＳ群（約４μｍｏｌ／ｋｇ）と比べて、２００倍くらい高められた。
【0079】
実施例４：異なる投与方法によるＩＡＡの標的化送達の効果評価
実験では合計で５群に分けた。
１．ブランク対照群
２．ＨＡＭＳＩＡＡ－０．３２（１．５％）群（１匹のマウスあたり毎日３ｇのラットフードを消費し、合計で０．０６８ｍｍｏｌのＩＡＡを摂取した）
３．ＩＡＡＮａ飲水群（ＩＡＡＮａの濃度は２．６８ｍｇ／ｍＬで、１匹のマウスあたり毎日５ｍＬ飲水し、合計で０．０６８ｍｍｏｌのＩＡＡＮａを摂取した）
４．胃内投与群（ＩＡＡＮａの濃度は６７ｍｇ／ｍＬで、毎日０．２ｍＬ胃内投与し、合計で０．０６８ｍｍｏｌのＩＡＡＮａを摂取した）
５．腹腔内注射群（ＩＡＡＮａの濃度は６７ｍｇ／ｍＬで、毎日０．２ｍＬ注射し、合計で０．０６８ｍｍｏｌのＩＡＡＮａを摂取した）
実験では合計で５群に分けた。
１．ブランク対照群
２．ＨＡＭＳＩＡＡ－０．３２（１．５％）群（１匹のマウスあたり毎日３ｇのラットフードを消費し、合計で０．０６８ｍｍｏｌのＩＡＡを摂取した）
３．ＩＡＡＮａ飲水群（ＩＡＡＮａの濃度は２．６８ｍｇ／ｍＬで、１匹のマウスあたり毎日５ｍＬ飲水し、合計で０．０６８ｍｍｏｌのＩＡＡＮａを摂取した）
４．胃内投与群（ＩＡＡＮａの濃度は６７ｍｇ／ｍＬで、毎日０．２ｍＬ胃内投与し、合計で０．０６８ｍｍｏｌのＩＡＡＮａを摂取した）
５．腹腔内注射群（ＩＡＡＮａの濃度は６７ｍｇ／ｍＬで、毎日０．２ｍＬ注射し、合計で０．０６８ｍｍｏｌのＩＡＡＮａを摂取した）
【0080】
胃内投与、腹腔内注射、ＩＡＡ塩水の直接飲用及びＨＡＭＳＩＡＡの４つの投与方法のマウスの結腸内容物及び肝門脈血中のＩＡＡの濃度を比較することにより、異なる投与方法によるＩＡＡの結腸標的化送達の効果を評価し、結果は図８に示すとおりであった。
図８は、異なる投与方法の結腸内容物中のＩＡＡの濃度である。
図８は、異なる投与方法の結腸内容物中のＩＡＡの濃度である。
【0081】
図８から分かるように、胃内投与、腹腔内注射、ＩＡＡ塩水の直接飲用の３つの投与方法と比べると、ＨＡＭＳＩＡＡはＩＡＡをより効果的に結腸部位に送達することができる。ＩＡＡの摂取量が相当するとき、ＨＡＭＳＩＡＡ群では糞便中のＩＡＡの濃度が顕著に高められ、対照群と比べて、２００倍くらい高められ、胃内投与群と腹腔内注射群の糞便中のＩＡＡの濃度は相当し、対照群と比べて７倍くらい高められ、ＩＡＡＮａ飲水群は対照群と比べて、糞便中のＩＡＡの濃度が３０倍くらい高められた。当該実験結果は、胃内投与であれＩＡＡ塩水の直接飲用であれ、殆どが胃又は小腸部位で吸収され、結腸部位に到達できるのはごく一部であるが、ＨＡＭＳＩＡＡは耐性デンプンを利用して胃及び小腸の消化作用に耐え、結腸部位に到達し、且つ結腸部位で腸内微生物の発酵を経てＩＡＡをゆっくりと放出させることができることを示した。異なる投与方法のマウスの結腸内容物中のＩＰＡの濃度を検出することにより、胃内投与、腹腔内注射及びＩＡＡＮａ飲水群のＩＰＡの濃度は対照群と比べて明らかな変化がないが、ＨＡＭＳＩＡＡ群のＩＰＡの濃度は対照群と比べて顕著に高められたことが分かった。
【0082】
図９は、異なる投与方法の肝門脈血血清中のＩＡＡの濃度である。図９から分かるように、ＩＡＡの摂取量が相当するとき、対照群と比べて、異なる投与方法のマウスの肝門脈血中のＩＡＡの濃度はいずれも顕著に高められた。ただし、胃内投与群、腹腔内注射群、ＩＡＡＮａ飲水群の血清中のＩＡＡの濃度に有意差がないが、１．５％のＨＡＭＳＩＡＡ－０．３２群は他の投与方法と比べて、血清中のＩＡＡの濃度が１０倍くらい高められた。ＨＡＭＳＩＡＡの標的化送達及び吸収効果は他の投与方法と比べて顕著に優位に立つことが示唆された。
【0083】
実施例５：インドールプロピオン酸誘導体化デンプン（ＨＡＭＳＩＰＡ）によるＩＰＡの結腸標的化送達の効果評価
異なる置換度のインドールカルボン酸誘導体化デンプンをそれぞれ１５％及び１．５％の比率でマウス飼料に添加し、作製された特殊飼料でマウスを１週間飼育した後に糞便を採取してＩＰＡの含有量を検出した。結果は図１０に示すとおりであった。
図１０は、当実施例によって提供される実験マウスの糞便中のＩＰＡの濃度を示す図である。
異なる置換度のインドールカルボン酸誘導体化デンプンをそれぞれ１５％及び１．５％の比率でマウス飼料に添加し、作製された特殊飼料でマウスを１週間飼育した後に糞便を採取してＩＰＡの含有量を検出した。結果は図１０に示すとおりであった。
図１０は、当実施例によって提供される実験マウスの糞便中のＩＰＡの濃度を示す図である。
【0084】
図１０から分かるように、ＨＡＭＳ群と比べて、ＨＡＭＳＩＰＡ群では糞便中のＩＰＡの濃度が顕著に高められ、且つ置換度及び用量への依存性があり、添加量が多いほど、糞便中のＩＰＡの濃度が高かった。ただし、置換度が０．２５であるＨＡＭＳＩＰＡ群は糞便中のＩＰＡの濃度がより高かった。ＨＡＭＳＩＰＡは良好なＩＰＡの結腸標的化送達機能をも有するということが示唆された。
【0085】
実施例６：ＨＡＭＳＩＡＡによるデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発性急性潰瘍性結腸炎の軽減
製造されたＨＡＭＳＩＡＡを用いて所定の添加率でラットフードを作製し、当方はマウスを対照ラットフード組、ＨＡＭＳ群、対照ラットフード＋ＤＳＳ群、ＨＡＭＳ＋ＤＳＳ群、異なる置換度のＨＡＭＳＩＡＡ＋ＤＳＳ群に分けた。実験開始後にマウスの糞便形態の変化、精神状態及び体重を毎日観察及び記録し、通常の飲料水及びＤＳＳ水溶液を３日ごとに１回交換し、実験開始後の７日目にＤＳＳ水溶液を通常の飲料水に交換した。
製造されたＨＡＭＳＩＡＡを用いて所定の添加率でラットフードを作製し、当方はマウスを対照ラットフード組、ＨＡＭＳ群、対照ラットフード＋ＤＳＳ群、ＨＡＭＳ＋ＤＳＳ群、異なる置換度のＨＡＭＳＩＡＡ＋ＤＳＳ群に分けた。実験開始後にマウスの糞便形態の変化、精神状態及び体重を毎日観察及び記録し、通常の飲料水及びＤＳＳ水溶液を３日ごとに１回交換し、実験開始後の７日目にＤＳＳ水溶液を通常の飲料水に交換した。
【0086】
実験が終了した後、マウスの疾患活動性指数（ｄｉｓｅａｓｅ ａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ、ＤＡＩ）を評価し、マウスの結腸を採取してその長さを測定し切片でマウスの結腸状態を評価し、マウスの結腸組織中のサイトカインＩＬ－１０、ＩＬ－６、ＩＬ－２２などのレベルを検出し、最後にこれらの指標でＤＳＳ誘発性マウス急性潰瘍性結腸炎に対するＨＡＭＳＩＡＡの予防及び治療効果を評価した。
【0087】
図１１は、正常群及びＤＳＳ誘発性潰瘍性結腸炎群の末梢血血清中のＩＡＡ／ＩＰＡの濃度の比較を示す図である。
図１１から分かるように、対照群と比べて、対照＋ＤＳＳ群の血清中のＩＡＡ／ＩＰＡの濃度が顕著に低下しており、トリプトファンの腸内微生物の代謝産物ＩＡＡ／ＩＰＡは潰瘍性結腸炎に関係していることが示唆され、したがって、当方は、ＩＡＡ／ＩＰＡを補給するとＤＳＳ誘発性マウス潰瘍性結腸炎の重症度は軽減されると推測している。
図１１から分かるように、対照群と比べて、対照＋ＤＳＳ群の血清中のＩＡＡ／ＩＰＡの濃度が顕著に低下しており、トリプトファンの腸内微生物の代謝産物ＩＡＡ／ＩＰＡは潰瘍性結腸炎に関係していることが示唆され、したがって、当方は、ＩＡＡ／ＩＰＡを補給するとＤＳＳ誘発性マウス潰瘍性結腸炎の重症度は軽減されると推測している。
【0088】
さらに、本願では、１５％のＨＡＭＳＩＡＡ－０．４９を例とし、マウスの体重の変化、結腸の長さ、ＤＡＩ指数、結腸状態及び結腸組織切片などの指標により、飼料にＨＡＭＳＩＡＡを添加するのはＤＳＳ誘発性マウス潰瘍性結腸炎の重症度を効果的に軽減できることを証明している。
【0089】
図１２は、１５％のＨＡＭＳＩＡＡ－０．４９での治療後のマウスの体重の変化を示す図である。
【0090】
図１３は、１５％のＨＡＭＳＩＡＡ－０．４９での治療後のマウスの結腸の長さの変化を示す図である。
【0091】
図１４は、１５％のＨＡＭＳＩＡＡ－０．４９での治療後のマウスのＤＡＩ指数の変化を示す図である。
【0092】
図１５は、１５％のＨＡＭＳＩＡＡ－０．４９での治療後のマウスの結腸状態の変化を示す図である。
【0093】
図１６は、１５％のＨＡＭＳＩＡＡ－０．４９での治療後のマウスの結腸組織切片の変化を示す図である。
【0094】
図１２～図１６から分かるように、対照群と比べて、モデル群（対照＋ＤＳＳ）ではマウスの体重が明らかに減少し、ＨＡＭＳ＋ＤＳＳ群では軽減され、１５％のＨＡＭＳＩＡＡ－０．４９＋ＤＳＳ群では体重の減少が明らかに遅延され、モデル群ともＨＡＭＳ＋ＤＳＳ群とも有意差があり（図１２）、対照群と比べて、モデル群の結腸の長さは顕著に短縮され、ＨＡＭＳ群はモデル群と有意差がなく、１５％のＨＡＭＳＩＡＡ－０．４９＋ＤＳＳ群はモデル群と比べて、結腸の長さが長く、且つ有意差があり（図１３）、モデル群と比べて、１５％のＨＡＭＳＩＡＡ－０．４９＋ＤＳＳ群のＤＡＩ指数は明らかに低減され、有意差があり（図１４）、図１５は、対照群、対照＋ＤＳＳ群、ＨＡＭＳ＋ＤＳＳ群、１５％のＨＡＭＳＩＡＡ－０．４９＋ＤＳＳ群の結腸画像であり、１５％のＨＡＭＳＩＡＡ－０．４９＋ＤＳＳ群の結腸状態が最も良かった。対照群と比べて、モデル群は結腸組織の損傷が深刻で、腺体の消失及び広範囲の粘膜層の壊死などの病変が認められ、モデル群と比べて、ＨＡＭＳ＋ＤＳＳ群の結腸損傷の程度がやや低下しており、正常な構造の腸腺が少量に存在するが、ＨＡＭＳＩＡＡ－０．４９はマウスの結腸組織に対する保護効果が最も明らかであった（図１６）。体重の変化、結腸の長さ、ＤＡＩ指標及び組織切片のどれもが、ＨＡＭＳＩＡＡはＤＳＳ誘発性マウス潰瘍性結腸炎の重症度を効果的に軽減できることを示唆した。
【0095】
さらに、本願では、１．５％のＨＡＭＳＩＡＡ－０．３２を例とし、マウスの結腸組織中のサイトカインＩＬ－１０、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＩＬ－２２などのレベル及びｍＲＮＡ（ＡｈＲ／ＧＡＰＤＨ）の相対発現レベルを検出することにより、飼料にＨＡＭＳＩＡＡを添加するのはＤＳＳ誘発性マウス潰瘍性結腸炎の重症度を効果的に軽減できることを一層証明しており、且つＨＡＭＳＩＡＡによるＤＳＳ誘発性マウス潰瘍性結腸炎の軽減はＡＨＲ／ＩＬ－２２経路の活性化に密接に関係しているという可能性があり、ただし、
図１７～図１９は、サイトカインレベルの面からＨＡＭＳＩＡＡはＤＳＳ誘発性マウス潰瘍性結腸炎の重症度を効果的に軽減していることを証明した。ＩＬ－１０は、
免疫細胞及び非免疫細胞によって分泌される重要な抗炎症性サイトカインである。結腸炎の発生とＩＬ－１０の低下に相関性があり、ＩＬ－１０の発現は疾患の進行に関係しており、病変の程度が悪化するにつれて、ＩＬ－１０の発現は低減する傾向にあり、軽減期には上昇に転じるのは、ＩＬ－１０はその炎症抑制効果を発揮し始め、炎症因子と抗炎症因子との間のバランスを回復させることを示唆した。モデル群と比べて、ＨＡＭＳＩＡＡ治療群では結腸組織中のＩＬ－１０のレベルが顕著に高められ、ＨＡＭＳＩＡＡはＤＳＳ誘発性結腸炎を効果的に軽減していることを示した（図１７）。ＩＬ－６及びＩＬ－１βは重要な炎症誘発性サイトカインである。結腸炎患者でＩＬ－６及びＩＬ－１βレベルは顕著に上昇している。モデル群と比べて、ＨＡＭＳＩＡＡ治療群では結腸組織中のＩＬ－６及びＩＬ－１βレベルが明らかに低下し、これは、ＨＡＭＳＩＡＡはＤＳＳ誘発性結腸炎を効果的に軽減することを一層示した（図１８及び図１９）。
図１７～図１９は、サイトカインレベルの面からＨＡＭＳＩＡＡはＤＳＳ誘発性マウス潰瘍性結腸炎の重症度を効果的に軽減していることを証明した。ＩＬ－１０は、
免疫細胞及び非免疫細胞によって分泌される重要な抗炎症性サイトカインである。結腸炎の発生とＩＬ－１０の低下に相関性があり、ＩＬ－１０の発現は疾患の進行に関係しており、病変の程度が悪化するにつれて、ＩＬ－１０の発現は低減する傾向にあり、軽減期には上昇に転じるのは、ＩＬ－１０はその炎症抑制効果を発揮し始め、炎症因子と抗炎症因子との間のバランスを回復させることを示唆した。モデル群と比べて、ＨＡＭＳＩＡＡ治療群では結腸組織中のＩＬ－１０のレベルが顕著に高められ、ＨＡＭＳＩＡＡはＤＳＳ誘発性結腸炎を効果的に軽減していることを示した（図１７）。ＩＬ－６及びＩＬ－１βは重要な炎症誘発性サイトカインである。結腸炎患者でＩＬ－６及びＩＬ－１βレベルは顕著に上昇している。モデル群と比べて、ＨＡＭＳＩＡＡ治療群では結腸組織中のＩＬ－６及びＩＬ－１βレベルが明らかに低下し、これは、ＨＡＭＳＩＡＡはＤＳＳ誘発性結腸炎を効果的に軽減することを一層示した（図１８及び図１９）。
【0096】
図２０及び図２１は、ＨＡＭＳＩＡＡでの結腸炎治療による改善はＡＨＲ／ＩＬ－２２経路の活性化に密接に関係している可能性があることを示した。結腸組織のｍＲＮＡ（ＡｈＲ／ＧＡＰＤＨ）の相対発現レベルを検出することにより、モデル群と比べて、ＨＡＭＳＩＡＡ治療群ではＡｈＲの相対発現が顕著に高められたことが分かり、ＩＡＡはＡｈＲと結合して、ＡｈＲの発現を促進していることを示した（図２０）。結腸組織のＩＬ－２２レベルを検出することにより、モデル群と比べて、ＨＡＭＳＩＡＡ治療群ではＩＬ－２２の含有量が顕著に高められたことが分かった（図２１）。ＩＬ－２２はＳＴＡＴ３を構成的に活性化する能力を有し、抗菌ペプチド及びムチンの発現を刺激することによって上皮細胞の再生を促進し粘膜バリアの完全性を向上させる。グループ３の自然リンパ球に由来するＩＬ－２２は腸管バリアに役立ち、ＩＬ－２２の発現はＡｈＲの活性化によって制御される。これはＩＡＡがＡｈＲと結合することの強力な証拠であった。したがって、ＨＡＭＳＩＡＡでの結腸炎治療による改善はＡＨＲ／ＩＬ－２２経路の活性化に密接に関係している可能性がある。
【0097】
実施例７：ＨＡＭＳＩＡＡによる全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の軽減
１．製造されたＨＡＭＳＩＡＡを用いて所定の添加率でラットフードを作製し、ＳＬＥモデルマウス及び対照マウスは、常州▼カ▲文斯実験動物有限公司から購入され、４～６週齢であった。全てのマウスをランダムに３群に分けた。
対照群（ＭＲＬ／ＭＰＪ）
全身性エリテマトーデスモデル群（ＭＲＬ／ｌｐｒ）
ＨＡＭＳＩＡＡ群（ＭＲＬ／ｌｐｒ＋ＨＡＭＳＩＡＡ）
１．製造されたＨＡＭＳＩＡＡを用いて所定の添加率でラットフードを作製し、ＳＬＥモデルマウス及び対照マウスは、常州▼カ▲文斯実験動物有限公司から購入され、４～６週齢であった。全てのマウスをランダムに３群に分けた。
対照群（ＭＲＬ／ＭＰＪ）
全身性エリテマトーデスモデル群（ＭＲＬ／ｌｐｒ）
ＨＡＭＳＩＡＡ群（ＭＲＬ／ｌｐｒ＋ＨＡＭＳＩＡＡ）
【0098】
ＨＡＭＳＩＡＡ群は、ＨＡＭＳＩＡＡを所定の比率で添加した特殊飼料を与え、１４週間持続した。実験が終了した後に腎臓組織を採取した。
【0099】
２．本願では、１．５％のＨＡＭＳＩＡＡ－０．３２を例とし、腎臓の病理学的指標により、飼料にＨＡＭＳＩＡＡを添加するのはＳＬＥを効果的に軽減できることを証明している。
【0100】
図２２は、当実施例の各群のマウスの腎臓組織のＨＥ染色の比較画像である。
【0101】
図２３は、当実施例の各群のマウスの腎臓組織の病理スコアである。
【0102】
上記のマウスの腎臓組織のＨＥ染色及び腎臓組織の病理スコアのいずれも、ＳＬＥマウスモデル群と比べて、ＨＡＭＳＩＡＡを使用するとマウスの糸球体腎炎及び間質性腎炎を明らかに軽減できること示した。これらの結果が、ＨＡＭＳＩＡＡを使用するのはＳＬＥマウスの症状を効果的に軽減できることを示した。
【0103】
最後に付け加えるべきこととして、以上の各実施例は、本願の技術的手段を説明するためのものに過ぎず、制限を加えるものではない。前述した各実施例を参照して本願を詳細に説明しているが、当業者なら理解できることであろうが、依然として前述した各実施例に記載の技術的手段を補正するか、又はその一部若しくは全ての技術的特徴に対して等価な置換を行うことができ、これらの補正又は置換により、対象となる技術的手段の本質が本願の各実施例に係る技術的手段の範囲から逸脱することはない。
【産業上の利用可能性】
【0104】
本願によって提供されるデンプン－インドールカルボン酸誘導体は、デンプンとインドールカルボン酸がエステル化反応を行って形成されたアシル化デンプンであり、高い耐性を有し、胃、小腸の分解に耐えることができ、結腸部位に到達した後に腸内細菌叢の発酵を経てインドールカルボン酸を放出することができ、胃内投与、腹腔内注射などのインドールカルボン酸の従来の投与方法と比べて明らかな利点を有し、結腸及び肝門脈血中のインドールカルボン酸の含有量を顕著に高めることができ、さらに本願のデンプン－インドールカルボン酸誘導体を腸内免疫のバランスを調節する製品、及び炎症性疾患を予防及び治療する製品に幅広く使用することができる。また、本願のデンプン－インドールカルボン酸誘導体の製造方法では、デンプンを溶媒に溶解して、溶液Ａを得て、続いてインドールカルボン酸、縮合剤及び塩基を溶液Ａに加えてエステル化反応を行って、反応液Ａを得て、次に反応液Ａ中のデンプンを析出させ、吸引濾過、乾燥をこの順に行って、デンプン－インドールカルボン酸誘導体を得る。上記の製造方法は、加工プロセスが簡単であり、産業的な大量生産に適する利点を有する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【手続補正書】
【提出日】2024-04-19
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
デンプン－インドールカルボン酸誘導体であって、縮合剤及び塩基の作用で、デンプンとインドールカルボン酸のエステル化反応により製造されたものであり、
前記デンプン－インドールカルボン酸誘導体は、置換度が０．０６～０．４９であるインドール酢酸誘導体化デンプン、及び置換度が０．２５～０．３９であるインドールプロピオン酸誘導体化デンプンのうちの少なくとも１つを含む前記デンプン－インドールカルボン酸誘導体。
【請求項2】
前記縮合剤が、ＥＤＣＩ、ＤＣＣ、ＨＡＴＵのうちの少なくとも１つを含む請求項１に記載のデンプン－インドールカルボン酸誘導体。
【請求項3】
前記塩基が、１－メチルイミダゾール、アミン、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウムのうちの少なくとも１つを含む請求項１に記載のデンプン－インドールカルボン酸誘導体。
【請求項4】
（ａ）デンプンを溶媒に溶解して、溶液Ａを得て、続いてインドールカルボン酸、縮合剤及び塩基を溶液Ａに加えてエステル化反応を行って、反応液Ａを得るステップと、（ｂ）反応液Ａ中のデンプンを析出させ、続いて吸引濾過、洗浄、乾燥をこの順に行って、デンプン－インドールカルボン酸誘導体を得るステップとを含む請求項１～３のいずれか一項に記載のデンプン－インドールカルボン酸誘導体の製造方法。
【請求項5】
前記ステップ（ａ）における溶媒が、ＤＭＳＯ、イオン液体、水のうちの少なくとも１つを含む請求項４に記載のデンプン－インドールカルボン酸誘導体の製造方法。
【請求項6】
前記ステップ（ａ）のエステル化反応の温度は２０～８０℃であり、時間は２０～３０時間である請求項４に記載のデンプン－インドールカルボン酸誘導体の製造方法。
【請求項7】
前記ステップ（ｂ）の析出の方法は、反応液Ａをエタノール又は水に滴加して、デンプン－インドールカルボン酸誘導体を析出させることである請求項４に記載のデンプン－インドールカルボン酸誘導体の製造方法。
【請求項8】
請求項１～３のいずれか一項に記載のデンプン－インドールカルボン酸誘導体の腸内免疫のバランスを調節する製品の製造における使用。
【請求項9】
前記腸内免疫のバランスを調節することは、デンプン－インドールカルボン酸誘導体は摂取されて結腸部位に到達した後、腸内細菌叢の発酵により、接続されたインドールカルボン酸が放出され、デンプンの腸内細菌叢発酵により放出された短鎖脂肪酸と相乗して、複数の免疫系シグナル伝達経路によって相乗的に免疫調節作用を発揮することを指す請求項８に記載の使用。
【請求項10】
前記腸内免疫のバランスを調節する製品が、薬物、健康食品、特別医療目的用食品又は一般食品を含む請求項８に記載の使用。
【請求項11】
前記薬物が、炎症性疾患及び／又は自己免疫疾患を予防及び治療する薬物である請求項１０に記載の使用。
【請求項12】
前記炎症性疾患及び／又は自己免疫疾患が、炎症性腸疾患、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、自己免疫性肝疾患、多発性硬化症のうちの１つを含む請求項１１に記載の使用。
【国際調査報告】