特表 2024-537579 既存の免疫を有する個人において細胞応答を生成するためのＣＯＶＩＤ－１９に対する組換えワクチン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-11

(54)【発明の名称】既存の免疫を有する個人において細胞応答を生成するためのＣＯＶＩＤ－１９に対する組換えワクチン

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/215 20060101AFI20241004BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20241004BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20241004BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20241004BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20241004BHJP

【ＦＩ】

A61K39/215 ZNA

A61P37/04

A61P31/14

C12N7/01

C12N15/86 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024541289

(86)(22)【出願日】2022-09-20

(85)【翻訳文提出日】2024-04-15

(86)【国際出願番号】 IB2022058886

(87)【国際公開番号】W WO2023042181

(87)【国際公開日】2023-03-23

(31)【優先権主張番号】MX/A/2021/011439

(32)【優先日】2021-09-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】MX

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524106222

【氏名又は名称】ラボラトリオ アヴィ－メックス，エセ．ア．デ セ．ベ．

(71)【出願人】

【識別番号】524106233

【氏名又は名称】コンセホ ナショナル デ ウーマニダデス，シエンシアス イ テクノロヒアス

(71)【出願人】

【識別番号】509059941

【氏名又は名称】アイカーン・スクール・オブ・メディシン・アット・マウント・サイナイ

【氏名又は名称原語表記】ＩＣＡＨＮ ＳＣＨＯＯＬ ＯＦ ＭＥＤＩＣＩＮＥ ＡＴ ＭＯＵＮＴ ＳＩＮＡＩ

【住所又は居所原語表記】Ｏｎｅ Ｇｕｓｔａｖｅ Ｌ．Ｌｅｖｙ Ｐｌａｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ １００２９ Ｕ．Ｓ．Ａ．

(74)【代理人】

【識別番号】110002871

【氏名又は名称】弁理士法人坂本国際特許商標事務所

(72)【発明者】

【氏名】ロサノ デュベルナール、ベルナルド

(72)【発明者】

【氏名】ソト プリアンテ、エルネスト

(72)【発明者】

【氏名】サルファティ ミズラヒ、デビッド

(72)【発明者】

【氏名】チャゴヤ コルテス、エクトル エリアス

(72)【発明者】

【氏名】ロペス マシアス、コンスタンティーノ ３世 ロベルト

(72)【発明者】

【氏名】パレーゼ、ピーター

(72)【発明者】

【氏名】ガルシア サストレ、アドルフォ

(72)【発明者】

【氏名】クラマー、フロリアン

(72)【発明者】

【氏名】サン、ワイナ

(72)【発明者】

【氏名】トーレス ロハス、マーサ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C085

【Ｆターム（参考）】

4B065AA95X

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065CA24

4B065CA45

4C085AA03

4C085BA59

4C085BA71

4C085CC08

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG03

4C085GG10

(57)【要約】

以前の免疫を有する個人において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳタンパク質又はそれから由来するタンパク質で刺激されたときに、Ｔ細胞（ＣＤ４＋又はＣＤ８＋）において有意な細胞応答を生成する能力を有する、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の外因性ヌクレオチド配列を挿入した活性ニューカッスル病ウイルスベクター（ＮＤＶ）を、アジュバントなしで含む、組換えワクチンが記載されている。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の抗原部位をコードする外因性ヌクレオチド配列を挿入した活性ニューカッスル病ウイルスと、薬学的に許容されるビヒクル及び／又は賦形剤と、をアジュバントなしで含み、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する以前の免疫を有する個人において、インターフェロンγ産生Ｔ細胞の割合及び中和抗体力価を増加させるように適合された、ＣＯＶＩＤ－１９に対するワクチン。

【請求項2】

前記ワクチンが鼻腔内経路又は筋肉内経路による適用のために製剤化されていることをさらに特徴とする、請求項１に記載のＣＯＶＩＤ－１９に対するワクチン。

【請求項3】

前記ワクチンが前記鼻腔内経路による適用のために製剤化されていることをさらに特徴とする、請求項２に記載のＣＯＶＩＤ－１９に対するワクチン。

【請求項4】

前記ワクチンが前記筋肉内経路による適用のために製剤化されていることをさらに特徴とする、請求項３に記載のＣＯＶＩＤ－１９に対するワクチン。

【請求項5】

個人の前記免疫が、ワクチン接種、又は前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによって引き起こされるＣＯＶＩＤ－１９疾患によって取得されたことをさらに特徴とする、請求項１に記載のＣＯＶＩＤ－１９に対するワクチン。

【請求項6】

個人の前記免疫が、ｍＲＮＡ、ウイルスベクター又は不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスワクチンのワクチン接種によって取得されたことをさらに特徴とする、請求項５に記載のＣＯＶＩＤ－１９に対するワクチン。

【請求項7】

個人の前記免疫が、その重症度にかかわらず、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによって引き起こされるＣＯＶＩＤ－１９疾患によって取得されたことをさらに特徴とする、請求項６に記載のＣＯＶＩＤ－１９に対するワクチン。

【請求項8】

ＣＥＩＤ_５０％によって測定された少なくとも１×１０^８．０のウイルス粒子を含むことを特徴とする、請求項１に記載のＣＯＶＩＤ－１９に対するワクチン。

【請求項9】

Ｓ２サブユニットに少なくとも２つのプロリン置換を包含することによって、その融合前の形態で安定化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクＳ糖タンパク質の２つのサブユニットＳ１及びＳ２をコードする配列と少なくとも８０％の同一性を有するＳタンパク質の配列に、外因性遺伝子が対応することをさらに特徴とする、請求項１に記載のＣＯＶＩＤ－１９に対するワクチン。

【請求項10】

前記配列が、配列番号１のアミノ酸配列に翻訳される任意の配列と少なくとも８０％の同一性を有することをさらに特徴とする、請求項９に記載のＣＯＶＩＤ－１９に対するワクチン。

【請求項11】

以前の免疫を有する個人において、インターフェロンγ産生Ｔ細胞の割合及び中和抗体力価を増加させるために使用される、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の抗原部位をコードする外因性ヌクレオチド配列を含む組換え活性ニューカッスル病ウイルス。

【請求項12】

Ｓ２サブユニットに少なくとも２つのプロリン置換を包含することによって、その融合前の形態で安定化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクＳ糖タンパク質の２つのサブユニットＳ１及びＳ２をコードする配列と少なくとも８０％の同一性を有するＳタンパク質の配列に、外因性遺伝子が対応することをさらに特徴とする、請求項１１に記載の組換え活性ニューカッスル病ウイルス。

【請求項13】

前記配列が、配列番号１のアミノ酸配列に翻訳される任意の配列と少なくとも８０％の同一性を有することをさらに特徴とする、請求項１２に記載の活性組換えニューカッスル病ウイルス。

【請求項14】

以前の免疫を有する個人において、インターフェロンγ産生Ｔ細胞の割合及び中和抗体力価を増加させるワクチンの製造のための、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の抗原部位をコードする外因性ヌクレオチド配列を含む組換え活性ニューカッスル病ウイルスの使用。

【請求項15】

前記ワクチンを製造するために、ＣＥＩＤ_５０％によって測定された少なくとも１×１０^８．０のウイルス粒子が使用される、請求項１４に記載の組換え活性ウイルスの使用。

【請求項16】

Ｓ２サブユニットに少なくとも２つのプロリン置換を包含することによって、その融合前の形態で安定化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクＳ糖タンパク質の２つのサブユニットＳ１及びＳ２をコードする配列と少なくとも８０％の同一性を有するＳタンパク質の配列に、外因性遺伝子が対応する、請求項１４に記載の組換え活性ウイルスの使用。

【請求項17】

前記配列が、配列番号１のアミノ酸配列に翻訳される任意の配列と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１６に記載の組換え活性ウイルスの使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新型コロナウイルス感染症（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９、ＣＯＶＩＤ－１９）の予防及び制御に使用される技術に関し、より具体的には、既存の免疫を有する患者において増加した細胞応答を生成するのに有用な、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対する抗原活性を有するタンパク質をコードする外因性ヌクレオチド配列を挿入した組換えウイルスベクターワクチンに関する。

【背景技術】

【0002】

コロナウイルス（ＣｏＶ）は、感冒並びに、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）及び重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）などの重篤な疾患を引き起こすウイルスファミリーである。重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、２０１９年１２月に中国武漢で始まった新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）大流行の病原体である。２０２０年３月１１日、世界保健機関（ＷＨＯ）はＣＯＶＩＤ－１９をパンデミックと宣言した。

【0003】

ＣＯＶＩＤ－１９に対するワクチン選択肢の前例のない開発により、すでに入手可能であり、世界中のいくつかの国で緊急承認されている異なった代替策がもたらされている。しかしながら、パンデミックの現在の状態を考慮すると、ワクチンを受けた人々において強固な細胞応答を生成する能力は未だ不明である。ウイルスに感染したが、疾患に対して無症状であった人、又はワクチン接種はしたが、十分な抗体を産生しなかったか、もしくは抗体を産生したが、経時的に減少した人が多数いる。

【0004】

例えば、世界中で最も広く研究され、使用されているワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳ（スパイク）タンパク質を使用するｍＲＮＡ技術に基づくものである。Ｇｏｌｄｂｅｒｇら（２０２１ － Ｗａｎｉｎｇ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＢＮＴ１６２ｂ２ ｖａｃｃｉｎｅ： Ａ ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ ｓｔｕｄｙ ｆｒｏｍ Ｉｓｒａｅｌ）によって報告された通り、実証されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び重度のＣＯＶＩＤ－１９感染の割合は、ワクチンの２回目の投与からの時間と共に統計的に有意な増加を示し、２か月前にワクチン接種した人と比較して、ＢＮＴ１６２ｂ２ワクチンの２回投与でワクチン接種した人では１．６～１．７倍のより大きな防御が見出された。

【0005】

上記は、中和抗体を生成する能力にかかわらず、液性応答が時間とともに低下したときでさえも、個人がウイルス感染に効率的に反応することを可能にする有意な細胞応答を生成することができる産物を有することの重要性について警告している。同じｍＲＮＡ技術に関して、Ｓａｈｉｎらによる、異なる用量でのＢＮＴ１６２ｂ１ワクチンの液性応答及び細胞応答についての報告（Ｎａｔｕｒｅ， ２０２０ － ＣＯＶＩＤ－１９ ｖａｃｃｉｎｅ ＢＮＴ１６２ｂ１ ｅｌｉｃｉｔｓ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ Ｔ_Ｈ１ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）は、ワクチンが認可された用量（３０μｇ）において、インターフェロンγ産生ＣＤ８＋細胞の割合は１％未満（平均０．２２％）であり、安全性第Ｉ相試験に関して試験されなかった高用量（５０μｇ）でさえも、平均１．４４が得られたことを示す（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ｅｔ． ａｌ． ＢＮＴ１６２ｂ１（Ｎａｔｕｒｅ， ２０２０ － “Ｐｈａｓｅ Ｉ／ＩＩ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ＣＯＶＩＤ－１９ ＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ＢＮＴ１６２ｂ１ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ”）。細胞応答は、少なくとも１４日前にＣＯＶＩＤ－１９を経験し、疾患の症状がもうなかったドナーの応答よりも有意に高く、これは、０．０２％超の平均応答には達せず、同じタイプのインターフェロンγ産生ＣＤ８＋細胞のいずれの場合においても０．１％に達しなかったことに留意されたい。

【0006】

アデノウイルスベースのワクチンの場合も同様である。Ｚｈｕら（Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ， ２０２０ － “Ｓａｆｅｔｙ， ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ， ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ－５ ｖｅｃｔｏｒｅｄ ＣＯＶＩＤ－１９ ｖａｃｃｉｎｅ： ａ ｄｏｓｅ－ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ， ｏｐｅｎ－ｌａｂｅｌ， ｎｏｎ－ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ， ｆｉｒｓｔ－ｉｎ－ｈｕｍａｎ ｔｒｉａｌ”）によって報告された通り、ワクチン接種後２８日目に、インターフェロンγ産生ＣＤ８＋細胞の検出割合は１％に達せず（１０^０）、これは細胞応答において有意であるがｍＲＮＡワクチンよりも低い性能を示す。

【0007】

加えて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの異なるバリアントの特定により、世界保健機関は、それらの一部を懸念されるバリアントとして特定し、それらはより大きな感染力、より重篤な疾患（例えば、より多くの入院又は死亡）、以前の感染の間に生成されたもしくはワクチン接種によって生成された抗体による中和の顕著な減少、治療もしくはワクチンの有効性の低下、又は検出もしくは診断の困難さのエビデンスがあるものとして理解された。これに関して、堅牢な細胞応答は、同じ変異を有さず、結果として感染の進行を防止するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の他のエピトープを識別する抗体の産生につながる応答を生じさせる可能性のおかげで、バリアントに対処し得ることが予想される。

【0008】

結果として、先行技術のワクチンが提示し得る短期的な液性応答にかかわらず、長期保護を促進する有意な細胞応答を提供することができ、加えて、その安全性が証明されている用量において、ＣＯＶＩＤ－１９に以前に罹患して、無症状であった、又は任意のｍＲＮＡ、組換えベクターもしくは不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスワクチンのワクチン接種を受けた個人の細胞応答の増加を提供するために使用することができるワクチンを得ることは可能となっていない。

【発明の概要】

【0009】

先行技術の欠点を考慮すると、本発明の目的は、ｍＲＮＡ、組換えウイルスベクター技術、又は循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを用いた完全なワクチン接種スケジュールで得られた新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）に対する特異的細胞応答を増加させる能力を有する組換えウイルスベクターワクチンを提供することである。

【0010】

本発明の別の目的は、安全であることが証明されている用量で有意な細胞応答を促進する、ＣＯＶＩＤ－１９の制御のためのワクチンを提供することである。

【0011】

本発明の別の目的は、ＣＯＶＩＤ－１９に以前に罹患し、無症状であった、又はｍＲＮＡ、組換えベクター、もしくは不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスワクチンをワクチン接種した個人に使用することができる、ＣＯＶＩＤ－１９の制御のためのワクチンを提供することである。

【0012】

これら及び他の目的は、本発明によるパラミクソウイルスウイルスベクターにおけるＣＯＶＩＤ－１９に対する組換えワクチンによって達成される。

【図面の簡単な説明】

【0013】

本発明の特徴とみなされる新規の態様は、添付の特許請求の範囲に詳細とともに確立されることになる。しかしながら、一部の実施形態、特徴、並びに一部の目的及びそれらの利点は、添付図面に関連して読み取られるとき、詳細な説明においてより良く理解されるであろう。

【0014】

【図1】図１は、実施例２の実験で得られた、ＣＯＶＩＤ－１９を有する患者及びＰｆｉｚｅｒ ｍＲＮＡワクチンをワクチン接種した人々に存在する、ワクチン中に含有されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に対するＩｇＧ型抗体力価（－ｌｏｇ２×４０）のグラフである。

【図2】図２は、実施例２の重症患者からのインターフェロンγ産生ＣＤ４＋Ｔ細胞のグラフである。

【図3】図３は、実施例２の重症患者からのインターフェロンγ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞のグラフである。

【図4】図４Ａ及び図４Ｂはそれぞれ、実施例２の重症患者のＣＤ４＋細胞におけるＴ細胞の増殖の割合及びインターフェロンγの産生の割合を示す。

【図5】図５Ａ及び図５Ｂはそれぞれ、実施例２の重症患者のＣＤ８＋細胞におけるＴ細胞の増殖の割合及びインターフェロンγの産生の割合を示す。

【図6】図６Ａ及び図６Ｂはそれぞれ、実施例２のｍＲＮＡワクチンの２回の投与で免疫化された個人のＣＤ４＋細胞におけるＴ細胞増殖の割合及びインターフェロンγ産生の割合を示す。

【図7】図７Ａ及び図７Ｂはそれぞれ、実施例２のｍＲＮＡワクチンの２回の投与で免疫化された個人のＣＤ８＋細胞におけるＴ細胞増殖の割合及びインターフェロンγ産生の割合を示す。

【図8】図８Ａ及び図８Ｂはそれぞれ、実施例２のＰｆｉｚｅｒ－ＢｉｏＮＴｅｃｈ ｍＲＮＡワクチンの２回の投与、及びＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ組換えワクチンの３回目のブースター投与で免疫化された個人のＣＤ４＋細胞におけるＴ細胞増殖の割合及びインターフェロンγ産生の割合を示す。

【図9】図９Ａ及び図９Ｂはそれぞれ、実施例２のＰｆｉｚｅｒ－ＢｉｏＮＴｅｃｈ ｍＲＮＡワクチンの２回の投与、及びＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ組換えワクチンの３回目のブースター投与で免疫化された個人のＣＤ８＋細胞におけるＴ細胞増殖の割合及びインターフェロンγ産生の割合を示す。

【図10】図１０Ａ、図１０Ｂ、及び図１０Ｃは、最初のワクチン接種から２１日目、２８日目、及び４２日目に、実施例３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－糖タンパク質に対する抗体について陽性であった個人の割合を示す。

【図11】図１１は、実施例３の実験からのインターフェロンγ産生Ｔ細胞の割合の増加を示す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

以前の免疫を有する個人において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳタンパク質又はそれから由来するタンパク質で刺激されたときに、Ｔ細胞（ＣＤ４＋又はＣＤ８＋）において有意な細胞応答を生成する能力を有する、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の外因性ヌクレオチド配列を挿入したニューカッスル病の活性（生存）ウイルスベクターを、アジュバントなしで含む、組換えワクチンが発明されている。

【0016】

本発明の開発中、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の抗原部位をコードする外因性ヌクレオチド配列を挿入した活性パラミクソウイルスベクターと、薬学的に許容されるビヒクル及び／又は賦形剤と、をアジュバントなしで含む組換えワクチン（これは単回用量で使用することができる）が、ｍＲＮＡワクチン、他の組換えウイルスベクターワクチン、又は不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスワクチンを接種したことによって、並びに同じウイルスの自然感染によって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する以前の免疫を有する個人において、Ｔ細胞の割合（ＣＤ４＋又はＣＤ８＋）の増加を促進する能力を有することが予想外に見出された。

【0017】

細胞応答の増加を達成するためには、使用されるウイルスベクターは、活性である（生存している）必要がある、すなわち、ウイルスベクターとして作用し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原部位をコードするヌクレオチド配列を含有する組換えウイルスは、複製する能力を有する。

【0018】

使用されるウイルスベクターは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質（スパイク又はＳ）をコードする外因性ヌクレオチド配列を挿入した、ニューカッスル病ウイルスのＬａ Ｓｏｔａ株であることが好ましい。

【0019】

好ましい実施形態では、Ｓタンパク質の配列は、Ｓ２サブユニットに少なくとも２つのプロリン置換を包含することによって、その融合前の形態で安定化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクＳ糖タンパク質の２つのサブユニットＳ１及びＳ２をコードする配列と少なくとも８０％の同一性を有し、より好ましくは、配列は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する。

【0020】

本発明のワクチンのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原部位をコードする外因性ヌクレオチド配列は、対象のヌクレオチド配列の化学合成によって調製することができ、その結果、後にそれをＮＤＶウイルスベクターに挿入することができる。外因性ヌクレオチド配列の挿入は、分子生物学の標準的クローニング技術を使用して実施され、ＮＤＶゲノムの遺伝子間領域のいずれかに挿入され得る。それ故に、産生された感染性クローンは、組換えウイルス又は親ウイルスを生成するために細胞培養物の中にトランスフェクトされる。

【0021】

ウイルスは、抗原反応を達成するために必要なウイルスの濃度、好ましくは１０^６．０～１０^１０．０ＣＩＥＤ_５０％（ニワトリ胚感染用量_５０％）／ｍＬに達するまで、例えば、ＳＰＦニワトリ胚、又は市販細胞株又はウイルスの増殖のために特別に設計されたものなど、増殖に適した任意の系において連続継代を通して複製する。安定な産生が工業規模で達成されるように、ウイルスは、細胞培養から救出されたら、増殖に使用される系における少なくとも３回の連続継代後に安定していることが好ましい。ウイルス単離については、ウイルスは、増殖に適した系から取り出され、典型的には、濾過、限外濾過、勾配遠心分離、限外遠心分離、及びカラムクロマトグラフィーなどの周知の浄化手順によって、細胞又は他の成分から分離され、例えばプラークアッセイなどの周知の手順を使用して、所望通りにさらに精製することができる。

【0022】

本発明のワクチンのための薬学的に許容されるビヒクルは、好複製能力を有する活性ウイルスを維持する水溶液であることが好ましい。

【0023】

ワクチンの投与に関して、細胞応答の増加は、筋肉内経路及び／又は鼻腔内経路によって、ニワトリ胚感染用量５０％（ＣＥＩＤ_５０％）当たり測定される少なくとも１×１０^８．０のウイルス力価で、少なくとも１回の用量を適用することにより達成されることが見出された。

【0024】

好ましい実施形態では、ワクチンは、筋肉内経路又は鼻腔内経路によって、その活性形態で少なくとも１回、特にその個人がＣＯＶＩＤ－１９に対する任意の他のワクチンで以前に免疫化されている場合、又は筋肉内経路を介して同疾患の以前の感染を患った場合は、鼻腔内経路が好ましい。

【0025】

本発明のワクチンは、その個人が最後の免疫付与を受けた日、又はＣＯＶＩＤ－１９疾患から回復した日から数えて少なくとも９０日の期間の後に、鼻腔内経路又は筋肉内経路によって１回適用される。

【0026】

本発明のワクチンは、その活性型又は不活化型のいずれかで、その筋肉内適用に対応するウイルス濃度を含有する、用量当たり０．５ｍＬの容積で製剤化されることが好ましい。投与経路が鼻腔内である実施形態では、用量当たりの好ましい容積は、０．２ｍＬである。

【0027】

本発明の原理によるワクチンは、加えて、哺乳動物、特にヒトにおいて、少なくとも１×１０^８．０ＣＩＥＤ_５０％の抗原の高用量で、生命を脅かす有害事象を引き起こさず、ワクチンに起因する重度の有害事象も生じさせない。

【0028】

本発明のワクチンは、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）ベクター及びＳタンパク質の挿入遺伝子の使用を通して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する以前の免疫を有する個人において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳタンパク質又はそれに由来するペプチドで刺激されたとき、統計的に有意な、インターフェロンγ産生ＣＤ８＋又はＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を促進する能力を有する。

【実施例】

【0029】

本発明は、以下の実施例からより良く理解されるであろうが、それらは本発明の好ましい実施形態を完全に理解することを可能にするために、例示目的のためのみに提示されており、上記の詳細な説明に基づいて実施され得る他の例示されていない実施形態がないことを示唆するものではない。

【0030】

実施例１
スパイクＳ１／Ｓ２タンパク質ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ヘキサプロを含む組換えＮＤＶ ＬａＳｏｔａウイルスの生成
Ｓｕｎら（２０２０， Ｏｐ． Ｃｉｔ．）によって記載された方法により、ＮＤＶによって発現されるスパイクタンパク質により大きな安定性を与えるために、その融合前の形態で安定化され、４つの追加のプロリンが合成遺伝子中に分布しているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクＳ糖タンパク質の細胞外ドメインの配列を有し、ヌクレオチド配列番号２の組換えニューカッスル病ウイルスに挿入された、ｒＮＤＶＬＳ／スパイクＳ１／Ｓ２ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ヘキサプロと呼ばれる構築物が得られた。一般的な方法は、例えば、国際公開ＷＯ２０１００５８２３６Ａ１号にも以前に記載されている。先行技術に記載された通りにニワトリ胚で得られたウイルスを、これも先行技術に以前に記載された通りにＦＡＡから精製した（ＳＡＮＴＲＹ， Ｌｉｓａ Ａ．， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｔｉｔｅｒ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ２０１８， ｖｏｌ． ９， ｐ． １８１－１９１．； 及びＮＥＳＴＯＬＡ， Ｐｉｅｒｇｉｕｓｅｐｐｅ， ｅｔ ａｌ． Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｆｏｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ２０１５， ｖｏｌ． １１２， ｎｏ ５， ｐ． ８４３－８５７．）。

【0031】

活性ワクチンは、医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理規則の基準に基づいて、水溶液で筋肉内及び鼻腔内投与するために調製した。このため、健常ボランティアにワクチンを適用し、用量当たり最低１０^８．０ＣＩＥＤ５０％／ｍＬ（高）を提供するのに必要な量に従って、４つの異なる濃度で３つのワクチンが得られるような方法で、精製したＦＡＡを安定化溶液（ＴＰＧ）と混合した。

【0032】

実施例２
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びｍＲＮＡ技術ワクチンに感染した人からの細胞の応答
末梢血液試料を、ＣＯＶＩＤ－１９の急性期における重症（Ｃ１９ Ｇ）及び重篤（Ｃ－１９ Ｃ）の個人から、並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＲＴ－ＰＣＲ検査が陽性で、以前にパンデミックの最初のピーク（２０２０年６月～１２月）内にＣＯＶＩＤ－１９の重症疾患又は重篤疾患（それぞれ、Ｃｏｎｖ Ｇ及びＣｏｎｖ Ｃ）を有した回復期段階にある個人から採取し、血清及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及び血漿を取得した。同様に、Ｐｆｉｚｅｒ－ＢｉｏＮＴｅｃｈ ｍＲＮＡワクチンの２回の投与で免疫化された個人から、並びにＰｆｉｚｅｒ－ＢｉｏＮＴｅｃｈ ｍＲＮＡワクチンの２回の投与及びＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ組換えワクチンの３回目のブースター投与で免疫化された個人から、末梢血試料を採取した。ＥＬＩＳＡイムノアッセイによって、実施例１のワクチンに発現されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質に対する特異的抗体の結合の決定を実施した。

【0033】

上述の個人のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体が、実施例１のウイルスを認識するかどうかを決定するために、ＥＬＩＳＡイムノアッセイで得られたＩｇＧ型抗体力価を、プレートにニューカッスル病ウイルスＬａ Ｓｏｔａ株（ＮＣ－ＬＳ）を固定することにより、外因性遺伝子挿入なしのベクター化ニューカッスル病ウイルス（Ｖｃ－ＮＣ－ＬＳ）、実施例１のウイルス（ＮＤＶ－Ｓ－ヘキサプロ）、及びＳ糖タンパク質（ＲＢＤ）の受容体結合部位の陽性対照に対して、すべて２００ｎｇ／１００μＬの最終濃度で測定した。次いで、試験した血清と、二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体との１：４０希釈で開始して、連続希釈（１：２）を加えた。反応物を過酸化水素及びオルトフェニレンジアミンで明らかにした。力価は、３倍のバックグラウンド光学密度に達する希釈を表す。

【0034】

結果は図１に示されており、実施例１のウイルスで得られた力価が、以前の免疫を有する対象のすべての群において、ＮＣ－ＬＳ及びＶｃ－ＮＣ－ＬＳに関して、クラスカル・ウォリス検定によって統計的有意性（＊）、ｐ＞０．０５を有したことが分かる。

【0035】

得られた結果は、以前に感染又は（ｍＲＮＡワクチンで、又はｍＲＮＡワクチン及びＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ組換えワクチンのブースターで）免疫化された個人の抗体が、本発明のワクチンに使用されるウイルスベクターを認識する能力を有すること、したがって、前記ワクチンが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する以前の免疫を有する個人において免疫応答を生成する能力を有するであろうことを示す。

【0036】

さらに、同じ個人からのＴ細胞の増殖能力を決定するために、フィコール勾配及び遠心分離に続く、５％ＣＯ_２での７２時間インキュベーションを使用して、末梢血からのＴリンパ球を刺激する技術を実施し、その後、抗体の測定に使用されたものと同じウイルス、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のペプチド活性化剤（Ｐｅｐｔｉｖａｔｏｒ）を用いた刺激、並びに陽性対照としてフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を用いた刺激を実行し、増殖染色を最終的に実行した。

【0037】

インターフェロンγ産生ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞についての重症患者に対応する結果を図２及び図３にそれぞれ示すが、本発明のワクチンに使用されるウイルスベクターは、Ｔリンパ球を刺激して、統計的に有意な細胞応答を、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞の両方で引き起こす能力を有することが観察される。有意ではない結果はＮＳとして表される。

【0038】

加えて、本発明のワクチン（ＡＶＸ／ＣＯＶＩＤ－１２）を用いて、及び陽性対照としてＰｅｐｔｉｖａｔｏｒを用いて、ニューカッスル病ウイルスＬａ Ｓｏｔａ株（Ｖｃ－ＮＣ－ＬＳ）の空のベクターで刺激されたＴ細胞におけるＴ細胞の増殖率及びインターフェロンγの産生率を測定した。非刺激Ｔ細胞（ＳＥ）で同じ測定を行った。

【0039】

図４Ａ及び図４Ｂ、並びに図５Ａ及び図５Ｂは、インターフェロンγ産生ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞について、重症ＣＯＶＩＤ－１９患者に対応する結果を示す。

【0040】

同様に、インターフェロンγ産生ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞について、２用量のｍＲＮＡ Ｐｆｉｚｅｒ－ＢｉｏＮＴｅｃｈワクチンのみで免疫化された個人に対応する結果を、図６Ａ及び図６Ｂ、並びに図７Ａ及び図７Ｂにそれぞれ示す。

【0041】

これらの結果から、患者から得られたＰＢＭＣの場合、ｍＲＮＡワクチンでワクチン接種した個人から得られたものよりも大きな増殖応答を観察することができるが、それは、病態の間、誘発される応答は一般的にエフェクターＴ細胞と関連しており、エフェクターＴ細胞は患者の回復後、不応期に入り、免疫記憶を誘発し、一方で、ワクチン接種の６か月後、血流中には、ワクチンエピトープによって誘発されたメモリー応答のみを見出すことになるからである。両方の場合において、エフェクターＴ細胞及びメモリーＴ細胞によって導かれる応答は、本発明のワクチン中に発現されたエピトープによるものであり、無感作Ｓタンパク質及びｍＲＮＡワクチンによって発現されるワクチン抗原で起こるであろうエフェクター活性を誘発する。

【0042】

最後に、図８Ａ及び図８Ｂ、並びに図９Ａ及び図９Ｂはそれぞれ、２用量のｍＲＮＡ Ｐｆｉｚｅｒ－ＢｉｏＮＴｅｃｈワクチン及びＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ組換えワクチンでの第三のブースター用量を用いて免疫化された個人の、インターフェロンγ産生ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞についての結果を示す。これらの結果から、細胞応答は、既に分析された、感染による、又はｍＲＮＡワクチンでの免疫化によるものと類似していることが観察され得る。しかしながら、ＣＯＶＩＤ－１９患者で観察されたものと類似した増殖及びインターフェロンγ産生の一般的な傾向が観察され、ＣＤ８＋Ｔ細胞における空のベクターと本発明のワクチンによる誘発との間に有意差が観察された（それぞれ、増殖についてはｐ＝０．０００５、ｐ＜０．０００１、ＩＦＮ－γについてはｐ＝０．００８１、ｐ＝０．０００４）。

【0043】

結果として、本発明のワクチンの実施例１のウイルスベクターを使用することによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する以前の免疫を有する個人において、細胞応答をインビトロで刺激することが可能であることが示されている。

【0044】

実施例３
ヒトにおいて、ＣＯＶＩＤ－１９に対する活性ワクチンにより産生される安全性及び免疫原性のレベルを評価する試験
健常ボランティアにおける、本発明の原理によるワクチンの安全性及び免疫原性を評価する試験を、規制当局によって承認されたプロトコルに従って実施した。

【0045】

この試験では、１０人の群に高用量で適用された実施例１のウイルスを以下のように使用した。

【表1】

表中、
ＩＮ＝鼻腔内、０．２ｍＬ
ＩＭ＝筋肉内、０．５ｍＬ

【0046】

２回目の用量は、１回目の用量後２１日目に適用され、ベースライン日（０日目）、２回目のワクチン接種日（２１日目）の２回目のワクチン接種前、２回目のワクチン接種の１週間後（２８日目）、及び最後に２回目のワクチン接種の３週間後（４２日目）に試料を参加者から採取した。それぞれの用量及び経路で免疫化された個人の血液試料に対して、代用ＥＬＩＳＡ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標）試験を使用して、中和試験を実施し、並びに参加個人の末梢血試料からのフローサイトメトリーによって、インターフェロンγ産生Ｔ細胞のスパイクタンパク質に対する特異的応答試験を実施した。

【0047】

残念なことに、試験中、一部の参加者がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を起こしたため、免疫学的分析のために有用な試料の数は変動したが、それでも基本的な統計的結論を出すために十分な人数であった。上記にかかわらず、いずれの参加者も、自身の生命又は健康をリスクにさらす重篤な有害事象も、重度の強度の有害事象も起こすことはなく、軽度又は中等度のみであったため、分析された用量は安全であるとみなされる。

【0048】

図１０Ａ、図１０Ｂ及び図１０Ｃに見られるように、最初のワクチン接種後２１日目では、抗体を示していた個人はほとんどいなかったが、２回目のワクチン接種後７日の２８日目までに、ＩＭ／ＩＭ群の１００％の個人が中和抗体陽性であり、４２日目までにＩＮ／ＩＭ群及びＩＭ／ＩＭ群の１００％の個人が陽性であり、ＩＮ／ＩＮ群でも６０％の陽性が達成され、これはＩＮ経路の、遅延をしたが同等に有効な効果を示唆する。

【0049】

これは、図１１の結果を分析した際にも確認されていて、低い基礎レベルの抗体を有する個人を分析する際に、試験した高用量で統計的に有意な細胞応答が得られたが、この細胞応答は、少し前の他のコロナウイルス又は無症状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による以前の感染のいずれかに起因して、インターフェロンγ産生Ｔ細胞の基礎レベルが上昇していた個人でも有意であったことにも留意されたい。

【0050】

実施例に基づいて、好ましくは筋肉内経路又は鼻腔内経路による、より好ましくは鼻腔内経路による高用量での、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳタンパク質を伴う活性ニューカッスル病ウイルスベクターの使用は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する以前の免疫を有する個人において、液性応答及び細胞応答の増加を生成するのに有用であることが明らかである。

【0051】

したがって、本発明の特定の実施形態が例示及び記載されているが、ウイルスベクターとして使用されるウイルス、及び使用される外因性ウイルス配列など、本発明に対する多数の変更が可能であることが強調されるべきである。したがって、本発明は、先行技術及び添付の特許請求の範囲によって必要とされる場合を除き、制限されるとみなされるべきではない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

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【国際調査報告】