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特表2024-537611ＭＨＣＩＩペプチド結合の性質決定のためのアッセイおよび試薬
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-16
(54)【発明の名称】ＭＨＣＩＩペプチド結合の性質決定のためのアッセイおよび試薬
(51)【国際特許分類】
C07K 14/74 20060101AFI20241008BHJP
C07K 7/08 20060101ALI20241008BHJP
C12Q 1/28 20060101ALI20241008BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20241008BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20241008BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20241008BHJP
G01N 21/78 20060101ALI20241008BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20241008BHJP
【ＦＩ】
C07K14/74 ZNA
C07K7/08
C12Q1/28
G01N33/53 D
G01N33/543 575
G01N33/574 A
G01N21/78 C
G01N21/64 F
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024513369
(86)(22)【出願日】2022-08-29
(85)【翻訳文提出日】2024-04-26
(86)【国際出願番号】 US2022075608
(87)【国際公開番号】W WO2023034759
(87)【国際公開日】2023-03-09
(31)【優先権主張番号】63/238,728
(32)【優先日】2021-08-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】509012625
【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(74)【代理人】
【識別番号】100221545
【弁理士】
【氏名又は名称】白江 雄介
(72)【発明者】
【氏名】エルソーリー，アデル マームード
(72)【発明者】
【氏名】ゴーバー，ジョシュア グレゴリー
(72)【発明者】
【氏名】リィ，ジュアン
【テーマコード（参考）】
2G043
4B063
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G043AA03
2G043AA04
2G043BA14
2G043EA01
2G043EA06
4B063QA01
4B063QQ79
4B063QR02
4B063QS28
4B063QX01
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA17
4H045CA40
4H045DA50
4H045EA65
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
ＭＨＣＩＩ対立遺伝子に結合する抗原のハイスループットスクリーニングのための試薬および方法が本明細書に記載されている。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
試験ペプチドと主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）－リガンド複合体とを含む組成物であって、前記ＭＨＣＩＩ－リガンド複合体は、（ｉ）α鎖およびβ鎖を含むＭＨＣ分子と、（ｉｉ）前記α鎖および前記β鎖と会合したリガンドとを含む、組成物。
【請求項2】
前記α鎖が第１の二量体化タグを含み、前記β鎖が第２の二量体化タグを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記二量体化タグが互いに相互作用し、前記α鎖および前記β鎖の会合を安定化する、請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
前記第１の二量体化タグおよび第２の二量体化タグが、ロイシンジッパー、Ｆｏｓ／Ｊｕｎ、ｉＤｉｍｅｒｉｚｅ対、コイルドコイルヘテロ二量体化タグ、またはノブ・イン・ホールもしくは他のヘテロ二量体のＦｃから選択される二量体化対を含む、請求項２または３に記載の組成物
【請求項5】
前記リガンドが、切断可能なリンカーを介して前記α鎖または前記β鎖に共有結合している、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項6】
前記切断可能なリンカーが、ＵＶ切断可能なリンカーまたは酵素切断可能なリンカーである、請求項５に記載の組成物。
【請求項7】
前記ＭＨＣＩＩ分子を結合することができ、タグを含むタグ付きペプチドをさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
前記タグに結合し、検出可能な標識を含む分子をさらに含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項9】
前記検出可能な標識が、化学発光化合物または蛍光化合物を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
前記タグがビオチンを含み、前記タグに結合する前記分子がストレプトアビジンを含む、請求項７～９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項11】
前記ＭＨＣＩＩ分子に結合する抗体をさらに含む、請求項７～１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項12】
前記抗体が表面に固定化されている、請求項１１に記載の組成物。
【請求項13】
前記リガンドが、少なくとも約１ｍｇ／Ｌのレベルで生産され、前記リンカーの切断後に２Ｄ ＬＣＭＳにおいて検出可能であり、前記ＭＨＣＩＩ分子に対して高い親和性を有することが知られているペプチドとの交換反応において約２０％～１００％のペプチド交換収率を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項14】
前記タグ付きペプチドが、前記ＭＨＣＩＩ分子に対する前記リガンドの親和性より高い、前記ＭＨＣＩＩ分子に対する親和性を有する、請求項７～１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項15】
前記ＭＨＣＩＩ－リガンド複合体が、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＱまたはＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子によってコードされるＨＬＡペプチドを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項16】
前記ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子および前記リガンドが、
【請求項17】
（ｉ）α鎖およびβ鎖を含むＭＨＣ分子と、（ｉｉ）前記α鎖および前記β鎖と会合した試験ペプチドとを含むＭＨＣＩＩ－試験ペプチド複合体をさらに含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項18】
（ｉ）α鎖およびβ鎖を含むＭＨＣ分子と、（ｉｉ）前記α鎖および前記β鎖と会合したタグ付きペプチドとを含むＭＨＣＩＩ－タグ付きペプチド複合体をさらに含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項19】
１または複数のさらなる試験ペプチドをさらに含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項20】
前記試験ペプチドおよび／または前記１もしくは複数のさらなる試験ペプチドが、腫瘍抗原またはネオ抗原を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項21】
前記試験ペプチドおよび／または前記１もしくは複数のさらなる試験ペプチドの長さが、７アミノ酸～３０アミノ酸である、請求項１～２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項22】
（ｉ）α鎖およびβ鎖を含むＭＨＣＩＩ分子と、（ｉｉ）前記ＭＨＣＩＩ分子と会合するリガンドとを含む、主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）－リガンド複合体。
【請求項23】
前記リガンドが、配列番号１～配列番号１６から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載のＭＨＣＩＩ－リガンド複合体。
【請求項24】
前記リガンドが、切断可能なリンカーを介して前記α鎖または前記β鎖に結合している、請求項２２または２３に記載のＭＨＣＩＩ－リガンド複合体。
【請求項25】
前記切断可能なリンカーが、ＵＶ切断可能なリンカーまたは酵素切断可能なリンカーである、請求項２４に記載のＭＨＣＩＩ－リガンド複合体。
【請求項26】
前記α鎖が第１の二量体化タグを含み、前記β鎖が第２の二量体化タグを含む、請求項２２～２５のいずれか一項に記載のＭＨＣＩＩ－リガンド複合体。
【請求項27】
前記二量体化タグが、互いに相互作用し、前記α鎖および前記β鎖の会合を安定化する、請求項２６に記載のＭＨＣＩＩ－リガンド複合体。
【請求項28】
前記第１の二量体化タグおよび第２の二量体化タグが、ロイシンジッパー、Ｆｏｓ／Ｊｕｎ、ｉＤｉｍｅｒｉｚｅ対、コイルドコイルヘテロ二量体化タグ、またはノブ・イン・ホールもしくは他のヘテロ二量体のＦｃから選択される二量体化対を含む、請求項２６または２７に記載のＭＨＣＩＩ－リガンド複合体。
【請求項29】
前記ＭＨＣＩＩ分子が、ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子によってコードされるＨＬＡペプチドを含み、前記ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子および前記リガンドが、
【請求項30】
ペプチドへの主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）分子の結合を検出する方法であって、ａ）ペプチドと、（ｉ）α鎖およびβ鎖を含む前記ＭＨＣＩＩ分子ならびに（ｉｉ）リガンドを含むＭＨＣＩＩ－リガンド複合体とを含む第１の組成物を提供することであって、前記リガンドは、切断可能なリンカーを介して前記α鎖または前記β鎖に結合している、第１の組成物を提供することと；
ｂ）前記第１の組成物を、前記切断可能なリンカーの切断を引き起こす条件に供することと；
ｃ）第２の組成物を形成するのに十分な期間、前記第１の組成物をインキュベートすることであって、前記第２の組成物は、前記α鎖、前記β鎖、前記リガンド、遊離ペプチドおよび／または前記ＭＨＣＩＩ分子と前記ＭＨＣＩＩ分子に非共有結合的に結合した前記ペプチドとを含むＭＨＣＩＩ－ペプチド複合体を含む、前記第１の組成物をインキュベートすることと；
（ｄ）前記ＭＨＣＩＩ分子が前記ペプチドに結合しているかどうかを決定することと
を含む、方法。
【請求項31】
前記ペプチドへのＭＨＣＩＩ分子結合が、前記第２の組成物中のＭＨＣＩＩ－ペプチド複合体のレベルを測定することによって決定される、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
ＭＨＣＩＩ－ペプチド複合体のレベルが、前記第２の組成物の２次元液体クロマトグラフィー－質量分析（２Ｄ ＬＣ／ＭＳ）によって測定される、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項33】
２Ｄ ＬＣ／ＭＳが、前記第２の組成物から前記遊離ペプチドおよび／またはリガンドを除去することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記ＭＨＣＩＩ分子と前記ペプチドを区別するための高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および質量分析（ＭＳ）をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記遊離ペプチドが前記第２の組成物から除去される、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項36】
前記遊離ペプチドが、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーによって前記第２の組成物から除去される、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
ＨＰＬＣおよびＭＳによって決定される前記ペプチドの存在が、前記ＭＨＣＩＩ分子が前記ペプチドに結合することができることを示す、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項38】
前記第１の組成物が、複数の前記ＭＨＣＩＩ－リガンド複合体と少なくとも２つの異なるペプチドとを含む、請求項３０～３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
前記ペプチドが、工程ｄ）における各ペプチドの質量に基づいて、質量分析によって互いから区別される、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
前記ペプチドが、少なくとも１０：１（ペプチド：ＭＨＣＩＩ分子）の比で前記第１の組成物中に存在する、請求項３０～３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
前記切断可能なリンカーが、ＵＶ切断可能なリンカーまたは酵素切断可能なリンカーである、請求項３０～４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項42】
前記リガンドが、少なくとも約１ｍｇ／Ｌのレベルで生産され、前記リンカーの切断後に２Ｄ ＬＣＭＳにおいて検出可能であり、前記ＭＨＣＩＩ分子に対して高い親和性を有することが知られているペプチドとの交換反応において約２０％～１００％のペプチド交換収率を有する、請求項３０～４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項43】
前記ＭＨＣＩＩ分子が、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＱまたはＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子によってコードされるＨＬＡペプチドを含む、請求項３０～４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項44】
前記ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子および前記リガンドが、
【請求項45】
前記試験ペプチドが、腫瘍抗原もしくはネオ抗原、または自己抗原を含む、請求項３０～４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項46】
前記試験ペプチドの長さが７アミノ酸～３０アミノ酸である、請求項３０～４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項47】
主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）分子に対する試験ペプチドの親和性を検出するための方法であって、ａ）前記試験ペプチドと；タグ付きＭＨＣＩＩ結合ペプチド（タグ付きペプチド）と；（ｉ）α鎖およびβ鎖を含む前記ＭＨＣＩＩ分子ならびに（ｉｉ）リガンドを含むＭＨＣＩＩ－リガンド複合体とを含む第１の組成物を提供することであって、前記リガンドは、切断可能なリンカーを介して前記α鎖または前記β鎖に結合している、第１の組成物を提供することと；
ｂ）前記第１の組成物を、前記切断可能なリンカーの切断を引き起こす条件に供することと；
ｃ）第２の組成物を形成するのに十分な期間、前記第１の組成物をインキュベートすることであって、前記第２の組成物は、前記α鎖、前記β鎖、前記リガンド、遊離試験ペプチド、遊離タグ付きペプチド、前記ＭＨＣＩＩ分子と会合した前記タグ付きペプチドを含むＭＨＣＩＩ－タグ付きペプチド複合体、および／または前記ＭＨＣＩＩ分子と会合した前記試験ペプチドを含むＭＨＣＩＩ－試験ペプチド複合体を含む、前記第１の組成物をインキュベートすることと；
ｄ）前記ＭＨＣＩＩ分子が前記試験ペプチドに結合しているかどうかを決定することと
を含む、方法。
【請求項48】
前記第１の組成物が、工程ｂ）の後、少なくとも２４時間インキュベートされる、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
前記第１の組成物が、工程ｂ）の後、２４時間～９６時間インキュベートされる、請求項４７に記載の方法。
【請求項50】
前記第２の組成物を、前記ＭＨＣＩＩ分子に結合する抗体と接触させることをさらに含む、請求項４７～４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項51】
前記抗体が固体表面に結合している、請求項５０に記載の方法。
【請求項52】
前記抗体に結合したＭＨＣＩＩ－タグ付きペプチド複合体の量を決定することをさらに含む、請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項53】
前記タグがビオチンを含み、前記決定する工程が、前記抗体に結合した前記ＭＨＣＩＩ－タグ付きペプチド複合体をストレプトアビジン－西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートと接触させることを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項54】
前記ＭＨＣＩＩ－タグ付きペプチド複合体が前記抗体に結合している場合に、前記試験ペプチドが前記ＭＨＣＩＩ対立遺伝子に対して低い親和性を有する、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項55】
前記ＭＨＣＩＩ－タグ付きペプチド複合体が前記抗体に結合していない場合に、前記試験ペプチドが前記ＭＨＣＩＩ対立遺伝子に対して高い親和性を有する、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項56】
前記ＭＨＣＩＩ分子に対する前記試験ペプチドの親和性が、ペプチド交換アッセイによって確認される、請求項４７～５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項57】
前記ペプチド交換アッセイが、請求項３０～４１のいずれか一項に記載の方法を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項58】
前記タグ付きペプチドがヒトＣＬＩＰを含む、請求項４７～５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項59】
前記切断可能なリンカーが、ＵＶ切断可能なリンカーまたは酵素切断可能なリンカーである、請求項４７～５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項60】
前記試験ペプチドが抗原である、請求項４７～５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項61】
前記抗原が腫瘍関連抗原である、請求項６０に記載の方法。
【請求項62】
前記抗原がネオ抗原である、請求項６０に記載の方法。
【請求項63】
前記ＭＨＣＩＩ分子が、ＨＬＡ－ＤＰ対立遺伝子、ＨＬＡ－ＤＭ対立遺伝子、ＨＬＡ－ＤＯＡ対立遺伝子、ＨＬＡ－ＤＯＢ対立遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱ対立遺伝子またはＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子によってコードされるＨＬＡペプチドを含む、請求項４７～６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項64】
前記ＨＬＡペプチドがＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子によってコードされ、前記ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子および前記リガンドが、
【請求項65】
主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）対立遺伝子に対する多重エピトープマッピングのための方法であって、ａ）複数の試験ペプチドと、複数のＭＨＣＩＩ－リガンド複合体とを含む第１の組成物を提供することであって、各ＭＨＣＩＩ－リガンド複合体は、（ｉ）α鎖およびβ鎖を含むＭＨＣＩＩ分子と、（ｉｉ）リガンドとを含み、前記リガンドは、切断可能なリンカーを介して前記α鎖または前記β鎖に結合している、第１の組成物を提供することと；
ｂ）前記第１の組成物を、前記切断可能なリンカーの切断を引き起こす条件に供することと；
ｃ）第２の組成物を形成するのに十分な期間、前記第１の組成物をインキュベートすることであって、前記第２の組成物は、前記α鎖、前記β鎖、前記リガンド、遊離試験ペプチドおよび／または複数のＭＨＣＩＩ－試験ペプチド複合体を含み、各ＭＨＣＩＩ－試験ペプチド複合体は、前記ＭＨＣＩＩ分子およびこれに非共有結合的に結合した試験ペプチドを含む、前記第１の組成物をインキュベートすることと；
ｄ）前記複数の試験ペプチドの１または複数が、前記第２の組成物中の前記ＭＨＣＩＩ分子に結合しているかどうかを決定することと
を含む、方法。
【請求項66】
前記複数の試験ペプチドが、抗原の重複するペプチドを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項67】
前記抗原が、ネオ抗原、腫瘍関連抗原または自己抗原である、請求項６６に記載の方法。
【請求項68】
各試験ペプチドの長さが７アミノ酸～３０アミノ酸である、請求項６５～６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項69】
前記複数の試験ペプチドの１または複数へのＭＨＣＩＩ分子結合が、前記第２の組成物中の前記ＭＨＣＩＩ分子に結合した各試験ペプチドのレベルを測定することによって決定される、請求項６５～６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項70】
前記ＭＨＣＩＩ分子に結合した各試験ペプチドのレベルが、前記第２の組成物の２次元液体クロマトグラフィー－質量分析（２Ｄ ＬＣ／ＭＳ）によって測定される、請求項６９に記載の方法。
【請求項71】
前記ＭＨＣＩＩ分子と前記試験ペプチドを区別するための高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および質量分析（ＭＳ）を実行することをさらに含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項72】
２Ｄ ＬＣ／ＭＳが、前記第２の組成物から前記遊離試験ペプチドおよび／またはリガンドを除去することを含む、請求項６５～７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項73】
前記遊離試験ペプチドが、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーによって前記第２の組成物から除去される、請求項７２に記載の方法。
【請求項74】
ＨＰＬＣおよびＭＳによって決定される所与の試験ペプチドの存在が、前記所与の試験ペプチドが前記ＭＨＣＩＩ分子に結合することができることを示す、請求項７０～７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項75】
前記ＭＨＣＩＩ分子に結合した前記試験ペプチドの相対的レベルが、前記ＭＨＣＩＩ分子に対する前記試験ペプチドの相対的親和性を示す、請求項７０～７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項76】
第２の試験ペプチドと比較して、前記ＭＨＣＩＩ分子に結合した第１の試験ペプチドのレベルがより低いことは、前記第１の試験ペプチドが、前記第２の試験ペプチドより、細胞の表面上の前記ＭＨＣＩＩ分子を結合するより低い可能性を有することを示す、請求項７５に記載の方法。
【請求項77】
第１の試験ペプチドと比較して、前記ＭＨＣＩＩ分子に結合した第２の試験ペプチドのレベルがより高いことは、前記第２の試験ペプチドが、前記第１の試験ペプチドより、細胞の表面上の前記ＭＨＣＩＩ分子を結合するより高い可能性を有することを示す、請求項７５または７６に記載の方法。
【請求項78】
前記試験ペプチドが、各試験ペプチドの質量に基づいて、質量分析によって互いから区別される、請求項７０～７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項79】
少なくとも１つの主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）分子を結合するペプチドであって、配列番号１～配列番号１６から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる２０２１年８月３０日に出願された米国仮出願第６３／２３８，７２８号に対する優先権の恩典を主張する国際段階の出願である。
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる２０２１年８月３０日に出願された米国仮出願第６３／２３８，７２８号に対する優先権の恩典を主張する国際段階の出願である。
【0002】
配列表
添付の配列表中の資料は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。名称「０４８８９３－５３４００１ＷＯ＿ＳＬ＿ＳＴ２６．ｘｍｌ」の添付ファイルは、２０２２年８月２９日に作成され、４２，６０３バイトである。このファイルは、Ｗｉｎｄｏｗｓ ＯＳを使用するコンピュータ上で、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｏｒｄを使用してアクセスすることができる。
添付の配列表中の資料は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。名称「０４８８９３－５３４００１ＷＯ＿ＳＬ＿ＳＴ２６．ｘｍｌ」の添付ファイルは、２０２２年８月２９日に作成され、４２，６０３バイトである。このファイルは、Ｗｉｎｄｏｗｓ ＯＳを使用するコンピュータ上で、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｏｒｄを使用してアクセスすることができる。
【背景技術】
【0003】
背景
主要組織適合抗原複合体ＩＩ（ＭＨＣＩＩ）は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）およびある種の免疫細胞の細胞外表面に位置する細胞表面タンパク質の群である。ＭＨＣＩＩタンパク質は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子座によって、古典的対立遺伝子ＨＬＡ－ＤＰ、－ＤＱおよび－ＤＲ、ならびに非古典的対立遺伝子ＨＬＡ－ＤＭおよび－ＤＯによってコードされる。ＭＨＣＩＩタンパク質は、α鎖およびβ鎖のヘテロ二量体であり、多段階成熟プロセスを経て最終的な抗原提示形態に至る。αおよびβ鎖は、小胞体内で一回貫通膜タンパク質として翻訳され、次いでインバリアント鎖（Ｉｉ）と会合して複合体を形成する。ゴルジ体、細胞膜、エンドソーム、および最終的には多胞体の腔内小胞の間を循環した後、インバリアント鎖は、カテプシン（ｃａｔｈｅｓｐｉｎ）によって、より小さなペプチド、すなわちＭＨＣＩＩα／βヘテロ二量体のペプチド結合溝内に結合しているクラスＩＩ関連インバリアント鎖ペプチド（ＣＬＩＰ）にプロセシングされる。その後の段階で、ＣＬＩＰがシャペロンプロセスを介して抗原性ペプチドと交換され、ＭＨＣＩＩ／抗原性ペプチド複合体がＡＰＣ細胞表面に戻り、ＣＤ４（＋）Ｔ細胞に提示する。
主要組織適合抗原複合体ＩＩ（ＭＨＣＩＩ）は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）およびある種の免疫細胞の細胞外表面に位置する細胞表面タンパク質の群である。ＭＨＣＩＩタンパク質は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子座によって、古典的対立遺伝子ＨＬＡ－ＤＰ、－ＤＱおよび－ＤＲ、ならびに非古典的対立遺伝子ＨＬＡ－ＤＭおよび－ＤＯによってコードされる。ＭＨＣＩＩタンパク質は、α鎖およびβ鎖のヘテロ二量体であり、多段階成熟プロセスを経て最終的な抗原提示形態に至る。αおよびβ鎖は、小胞体内で一回貫通膜タンパク質として翻訳され、次いでインバリアント鎖（Ｉｉ）と会合して複合体を形成する。ゴルジ体、細胞膜、エンドソーム、および最終的には多胞体の腔内小胞の間を循環した後、インバリアント鎖は、カテプシン（ｃａｔｈｅｓｐｉｎ）によって、より小さなペプチド、すなわちＭＨＣＩＩα／βヘテロ二量体のペプチド結合溝内に結合しているクラスＩＩ関連インバリアント鎖ペプチド（ＣＬＩＰ）にプロセシングされる。その後の段階で、ＣＬＩＰがシャペロンプロセスを介して抗原性ペプチドと交換され、ＭＨＣＩＩ／抗原性ペプチド複合体がＡＰＣ細胞表面に戻り、ＣＤ４（＋）Ｔ細胞に提示する。
【0004】
抗原提示細胞は適応免疫応答を調節する。適応免疫応答は、病原性攻撃、ワクチン接種および他の非自己抗原の記憶を保持すること、およびヘルパーまたはＣＤ４（＋）Ｔ細胞を訓練して、特異的な様式で様々な種類の攻撃を制御することに関与する。近年、がん、新規のウイルス感染症、細菌感染症および真菌感染症ならびにある種の自己免疫疾患に対する標的化された治療薬のための非自己抗原を生成することに大きな関心が寄せられている。実際、インビトロで抗原またはネオアンチゲンを生成し、選択する能力は、これらの疾患の脅威に対処する我々の能力を加速し、拡大するであろう。
【発明の概要】
【0005】
概要
本技術は、一般に、ＭＨＣＩＩ複合体に対するペプチドのハイスループットスクリーニングのための試薬および方法に関する。
本技術は、一般に、ＭＨＣＩＩ複合体に対するペプチドのハイスループットスクリーニングのための試薬および方法に関する。
【0006】
一態様において、試験ペプチドと主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）－リガンド複合体とを含む組成物であって、前記ＭＨＣＩＩ－リガンド複合体は、（ｉ）α鎖およびβ鎖を含有するＭＨＣ分子と、（ｉｉ）前記α鎖および前記β鎖と会合したリガンドとを含有する、組成物が本明細書において提供される。
【0007】
一態様において、（ｉ）α鎖およびβ鎖を含有するＭＨＣＩＩ分子と、（ｉｉ）前記ＭＨＣＩＩ分子と会合したリガンドとを含有する主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）－リガンド複合体が本明細書において提供される。ＭＨＣＩＩ－リガンド複合体は、配列番号１～配列番号３から選択されるアミノ酸配列を有するリガンドをさらに含有する。
【0008】
一態様において、ペプチドへの主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）分子の結合を検出する方法であって、ペプチドと、（ｉ）α鎖およびβ鎖を含有するＭＨＣＩＩ分子ならびに（ｉｉ）リガンドを含有するＭＨＣＩＩ－リガンド複合体とを含有する第１の組成物を提供することであって、前記リガンドは、切断可能なリンカーを介して、前記α鎖または前記β鎖に結合している、第１の組成物を提供することと；前記第１の組成物を、前記切断可能なリンカーの切断を引き起こす条件に供することと；第２の組成物を形成するのに十分な期間、前記第１の組成物をインキュベートすることであって、前記第２の組成物は、前記α鎖、前記β鎖、前記リガンド、遊離ペプチド、および／または前記ＭＨＣＩＩ分子と前記ＭＨＣＩＩ分子に非共有結合的に結合した前記ペプチドとを含むＭＨＣＩＩ－ペプチド複合体を含有する、前記第１の組成物をインキュベートすることと；前記ＭＨＣＩＩ分子が前記ペプチドに結合しているかどうかを決定することとを含む、方法が本明細書において提供される。
【0009】
一態様において、主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）分子に対する試験ペプチドの親和性を検出するための方法であって、前記試験ペプチドと、タグ付きＭＨＣＩＩ結合ペプチド（タグ付きペプチド）と、（ｉ）α鎖およびβ鎖を含有する前記ＭＨＣＩＩ分子ならびに（ｉｉ）リガンドを含有するＭＨＣＩＩ－リガンド複合体とを含有する第１の組成物を提供することであって、前記リガンドは、切断可能なリンカーを介して、前記α鎖または前記β鎖に結合している、第１の組成物を提供することと；前記第１の組成物を、前記切断可能なリンカーの切断を引き起こす条件に供することと；第２の組成物を形成するのに十分な期間、前記第１の組成物をインキュベートすることであって、前記第２の組成物は、前記α鎖、前記β鎖、前記リガンド、遊離試験ペプチド、遊離タグ付きペプチド、前記ＭＨＣＩＩ分子と会合した前記タグ付きペプチドを含有するＭＨＣＩＩ－タグ付きペプチド複合体、および／または前記ＭＨＣＩＩ分子と会合した前記試験ペプチドを含有するＭＨＣＩＩ－試験ペプチド複合体を含有する、前記第１の組成物をインキュベートすることと；前記ＭＨＣＩＩ分子が前記試験ペプチドに結合しているかどうかを決定することとを含む、方法が本明細書において提供される。
【0010】
一態様において、主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）対立遺伝子に対する多重エピトープマッピングのための方法であって、複数の試験ペプチドと、それぞれのＭＨＣＩＩ－リガンド複合体が（ｉ）α鎖およびβ鎖を含有するＭＨＣＩＩ分子ならびに（ｉｉ）リガンドを含有する複数のＭＨＣＩＩ－リガンド複合体とを含む第１の組成物を提供することであって、前記リガンドは、切断可能なリンカーを介して、前記α鎖または前記β鎖に結合している、第１の組成物を提供することと；前記第１の組成物を、前記切断可能なリンカーの切断を引き起こす条件に供することと；第２の組成物を形成するのに十分な期間、前記第１の組成物をインキュベートすることであって、前記第２の組成物は、前記α鎖、前記β鎖、前記リガンド、遊離試験ペプチド、および／またはそれぞれのＭＨＣＩＩ－試験ペプチド複合体が前記ＭＨＣＩＩ分子とこれらに非共有結合的に結合した試験ペプチドを含む複数のＭＨＣＩＩ－試験ペプチド複合体を含有する、前記第１の組成物をインキュベートすることと；前記複数の試験ペプチドの１つまたは複数が、前記第２の組成物中の前記ＭＨＣＩＩ分子に結合しているかどうかを決定することとを含む、方法が本明細書において提供される。
【0011】
一態様において、主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）対立遺伝子に対する多重エピトープマッピングのための方法であって、複数の試験ペプチドと、それぞれのＭＨＣＩＩ－リガンド複合体が（ｉ）α鎖およびβ鎖を含有するＭＨＣＩＩ分子ならびに（ｉｉ）リガンドを含有する複数のＭＨＣＩＩ－リガンド複合体とを含有する第１の組成物を提供することであって、前記リガンドは、切断可能なリンカーを介して、前記α鎖または前記β鎖に結合している、第１の組成物を提供することと；前記第１の組成物を、前記切断可能なリンカーの切断を引き起こす条件に供することと；第２の組成物を形成するのに十分な期間、前記第１の組成物をインキュベートすることであって、前記第２の組成物は、前記α鎖、前記β鎖、前記リガンド、遊離試験ペプチド、および／またはそれぞれのＭＨＣＩＩ－試験ペプチド複合体が前記ＭＨＣＩＩ分子とこれらに非共有結合的に結合した試験ペプチドを含有する複数のＭＨＣＩＩ－試験ペプチド複合体を含有する、前記第１の組成物をインキュベートすることと；前記複数の試験ペプチドの１つまたは複数が、前記第２の組成物中の前記ＭＨＣＩＩ分子に結合しているかどうかを決定することとを含む、方法が本明細書において提供される。
【0012】
一態様において、少なくとも１つの主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）分子を結合するペプチドであって、配列番号１～配列番号１６から選択されるアミノ酸配列を含有する、ペプチドが本明細書において提供される。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【0014】
【0015】
【図3A】図３Ａおよび３Ｂは、共有結合した高親和性ＣＬＩＰ（クラスＩＩ関連インバリアント鎖ペプチド、配列ＰＶＳＱＭＲＭＡＴＰＬＬＭＲＰ、配列番号４）酵素的プロセシングおよびＭＨＣＩＩヘテロ二量体についての、試験ペプチド（ＯＶＡペプチド、配列ＩＳＱＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ、配列番号５）とのその後の交換反応の一例を提供する。図３Ａは、トロンビンまたはＴＥＶプロテアーゼによるプロセシングによってＣＬＩＰペプチドが除去されることを示し、酵素切断部位は、ＣＬＩＰペプチドとＭＨＣＩＩβ鎖のＮ末端の間にあるリンカー配列内に位置する。ｐＨ５．２、３７℃の酢酸緩衝液中、２０倍濃度の試験ペプチド（ＯＶＡ）の存在下で、ＭＨＣＩＩ／切断されたＣＬＩＰペプチド複合体を一晩インキュベートすることによって交換反応を開始する。反応混合物をサイズ排除クロマトグラフィーによって分離し、ＲＰ ＬＣ－ＭＳによって分析した。図３Ｂは、ＭＨＣＩＩ／ペプチド複合体サイズ排除画分から得られたＬＣ－ＭＳクロマトグラムが、ＭＨＣＩＩ／ＯＶＡペプチド（５．２分）対ＭＨＣＩＩ／ＣＬＩＰペプチド（７分）の量を示すことを示す。
【図3B】同上。
【0016】
【図4A】図４Ａおよび４Ｂは、共有結合した低親和性ＣＬＩＰ（クラスＩＩ関連インバリアント鎖ペプチド、配列ＰＶＳＱＡＲＭＡＴＧＡＬＡＲＰ、配列番号６）酵素的プロセシングおよびＭＨＣＩＩヘテロ二量体についての、試験ペプチド（ＯＶＡペプチド、配列ＩＳＱＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ、配列番号５）とのその後の交換反応の一例を提供する。図４Ａは、トロンビンまたはＴＥＶプロテアーゼによるプロセシングによってＣＬＩＰペプチドが除去されることを示し、酵素切断部位は、ＣＬＩＰペプチドとＭＨＣＩＩβ鎖のＮ末端の間にあるリンカー配列内に位置する。ｐＨ５．２、３７℃の酢酸緩衝液中、２０倍濃度の試験ペプチド（ＯＶＡ）の存在下で、ＭＨＣＩＩ／切断されたＣＬＩＰペプチド複合体を一晩インキュベートすることによって交換反応を開始する。反応混合物をサイズ排除クロマトグラフィーによって分離し、ＲＰ ＬＣ－ＭＳによって分析した。図４Ｂは、ＭＨＣＩＩ／ペプチド複合体サイズ排除画分から得られたＬＣ－ＭＳクロマトグラムが、ＭＨＣＩＩ／ＯＶＡペプチド（５．２分）対ＭＨＣＩＩ／ＣＬＩＰペプチド（約６．８分）の量を示すことを示す。
【図4B】同上。
【0017】
【図5A】図５Ａおよび５Ｂは、２Ｄ ＬＣ－ＭＳの一次元からのＳＥＣクロマトグラム（図５Ａ）およびＬＣ－ＭＳ二次元検出からの抽出イオンクロマトグラム（図５Ｂ）を示し、３つの異なるＣＬＩＰペプチド配列とのＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１：０１複合体および同じ試験ペプチド配列（ｐｐ６５、ＬＰＬＫＭＬＮＩＰＳＩＮＶＨ、配列番号７）についての３つの別個の交換アッセイ結果の差を示す対応するカウント対取得時間ウィンドウを示す。
【図5B】同上。
【0018】
【図6A】図６Ａおよび６Ｂは、３つの異なるＣＬＩＰペプチド配列とのＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０３：０１複合体および同じ試験ペプチド配列（ＳＰ４１、ＨＴＹＴＩＤＷＴＫＤＡＶＴＷＳ、配列番号８）についての３つの別個の交換アッセイ結果の差を示すＬＣ－ＭＳクロマトグラム（図６Ａ）および対応するカウント対取得時間ウィンドウ（図６Ｂ）を示す。
【図6B】同上。
【0019】
【図7A】図７Ａおよび７Ｂは、３つの異なるＣＬＩＰペプチド配列とのＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０１複合体および同じ試験ペプチド配列（ＨＡ、ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ、配列番号９）についての３つの別個の交換アッセイ結果の差を示すＬＣ－ＭＳクロマトグラム（図７Ａ）および対応するカウント対取得時間ウィンドウ（図７Ｂ）を示す。
【図7B】同上。
【0020】
【図8A】図８Ａおよび８Ｂは、３つの異なるＣＬＩＰペプチド配列とのＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０７：０１複合体および同じ試験ペプチド配列（ｐｐ６５、ＥＰＤＶＹＹＴＳＡＦＶＦＰＴＫ 配列番号１０）についての３つの別個の交換アッセイ結果の差を示すＬＣ－ＭＳクロマトグラム（図８Ａ）および対応するカウント対取得時間ウィンドウ（図８Ｂ）を示す。
【図8B】同上。
【0021】
【図9A】図９Ａおよび９Ｂは、３つの異なるＣＬＩＰペプチド配列とのＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０７：０１複合体および同じ試験ペプチド配列（ＨＡ、ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ、配列番号９）についての３つの別個の交換アッセイ結果の差を示すＬＣ－ＭＳクロマトグラム（図９Ａ）および対応するカウント対取得時間ウィンドウ（図９Ｂ）を示す。
【図9B】同上。
【0022】
【0023】
【図11A】図１１Ａ～１１Ｃは、ＭＨＣＩＩ結合のための試験ペプチドの表（図１１Ａ）、マウスＴ細胞のスクリーニングおよびその後のフローサイトメトリー実験＋／－ＣＤ４４ Ｔ細胞スクリーニングのために使用するための、試験ペプチドが会合したビオチン化ＭＨＣＩＩ分子の蛍光性アビジン四量体を含む複合体のイラスト（図１１Ｂ）を示す。図１１Ｃは、ペプチド交換から唯一の結合剤として同定されたより短い変異ペプチドに対するＴ細胞の活性化を示すインターフェロンガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイである。同定された短いペプチドは、長い合成ペプチド（Ｍ１１２＿７７８８－５）と同等のＥＬＩＳＰＯＴ応答を与える。
【図11B】同上。
【図11C】同上。
【0024】
【0025】
【0026】
【図14A】図１４Ａ～１４Ｃは、ＥＬＩＳＡを介してＭＨＣＩＩおよびペプチド複合体をスクリーニングするための例示的なワークフローを示す。図１４Ａのイラストは、ＭＨＣＩＩ分子および標識された高親和性ペプチド（例えば、ビオチン化）を含有するプールおよび様々な濃度範囲の試験ペプチドについての競合的ペプチド交換の時間経過を示す。ペプチド交換反応ミックスを一定の時間および一定のｐＨ（例えば、ｐＨ５で６０～７２時間）でインキュベートし、次いで、抗ＭＨＣ抗体でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに適用する。発色試薬（例えば、ストレプトアビジン－西洋ワサビペルオキシダーゼ）を添加することによって、搭載されたＥＬＩＳＡプレートを発色させる。得られたシグナルを濃度に対してプロットし、得られたデータ点を結合モデルにフィッティングし、試験ペプチドについて結合親和性を計算する。図１４Ｂは、ＭＨＣＩＩに対する８つの高親和性ペプチドの結合曲線および親和性順位を示すプロットである。図１４Ｃは、モデルフィットのＲ２値とともに、ＭＨＣＩＩに対する各ペプチドのＩＣ５０値（結合親和性）を含む表である。
【図14B】同上。
【図14C】同上。
【0027】
【図15A】図１５Ａ～１５Ｇは、ＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子／低親和性リガンドペプチド複合体、標識された高親和性ペプチド（ビオチン化ｈｕＣＬＩＰ、５０ｎＭ）および様々な濃度範囲の８つの異なる試験ペプチドの正規化されたシグナル対対数濃度プロットを示す。全ての結果は、ＥＬＩＳＡによって測定されている。図１５Ａは、ＤＲＢ１＊０１：０１ならびにペプチドｍＣＬＩＰ、ＬＣＭＶ ＲＮＡＰ、ＬＡＳＶ ＲＮＡＰ、ＶＥＴＦ（２７５～２８９）、ＬＣＭＶ ＮＰ（２０１～２１５）、ＶＶ ＨＰ（２３～３７）、ＭＯＧ（３５～５５）およびＯＶＡ（３２３～３３９）についての競合的結合の対数プロットである。図１５Ｂは、ＤＲＢ１＊０８：０１ならびにペプチドｍＣＬＩＰ、ＬＣＭＶ ＲＮＡＰ、ＬＡＳＶ ＲＮＡＰ、ＶＥＴＦ（２７５～２８９）、ＬＣＭＶ ＮＰ（２０１～２１５）、ＶＶ ＨＰ（２３～３７）、ＭＯＧ（３５～５５）およびＯＶＡ（３２３～３３９）についての競合的結合の対数プロットである。図１５Ｃは、ＤＲＢ１＊１５：０１ならびにペプチドｍＣＬＩＰ、ＬＣＭＶ ＲＮＡＰ、ＬＡＳＶ ＲＮＡＰ、ＶＥＴＦ（２７５～２８９）、ＬＣＭＶ ＮＰ（２０１～２１５）、ＶＶ ＨＰ（２３～３７）、ＭＯＧ（３５～５５）およびＯＶＡ（３２３～３３９）についての競合的結合の対数プロットである。図１５Ｄは、ＤＲＢ１＊０４：０１ならびにペプチドｍＣＬＩＰ、ＬＣＭＶ ＲＮＡＰ、ＬＡＳＶ ＲＮＡＰ、ＶＥＴＦ（２７５～２８９）、ＬＣＭＶ ＮＰ（２０１～２１５）、ＶＶ ＨＰ（２３～３７）、ＭＯＧ（３５～５５）およびＯＶＡ（３２３～３３９）についての競合的結合の対数プロットである。図１５Ｅは、ＤＲＢ１＊０９：０１ならびにペプチドｍＣＬＩＰ、ＬＣＭＶ ＲＮＡＰ、ＬＡＳＶ ＲＮＡＰ、ＶＥＴＦ（２７５～２８９）、ＬＣＭＶ ＮＰ（２０１～２１５）、ＶＶ ＨＰ（２３～３７）、ＭＯＧ（３５～５５）およびＯＶＡ（３２３～３３９）についての競合的結合の対数プロットである。図１５Ｆは、ＤＲＢ１＊１１：０１ならびにペプチドｍＣＬＩＰ、ＬＣＭＶ ＲＮＡＰ、ＬＡＳＶ ＲＮＡＰ、ＶＥＴＦ（２７５～２８９）、ＬＣＭＶ ＮＰ（２０１～２１５）、ＶＶ ＨＰ（２３～３７）、ＭＯＧ（３５～５５）およびＯＶＡ（３２３～３３９）についての競合的結合の対数プロットである。図１５Ｇ参照ｐｐ６５－ビオチン化ＤＲＢ１＊０１：０１。
【図15B】同上。
【図15C】同上。
【図15D】同上。
【図15E】同上。
【図15F】同上。
【図15G】同上。
【0028】
【図16】図１６Ａおよび１６Ｂは、８つの異なるＨＬＡ ＤＲＢ１対立遺伝子試料／低親和性リガンドペプチド複合体（１００ｎＭ）および１つの高親和性ペプチド（ビオチン化ｈｕＣＬＩＰ）についての正規化されたシグナル対ペプチド濃度の飽和結合曲線を示す。高親和性ＣＬＩＰペプチドの濃度範囲は４０，０００ｎＭ～２．４ｎＭである。ペプチド交換時間経過を、３７℃、ｐＨ５で７０時間にわたって追った（図１６Ａ）。図１６Ｂは、８つの異なるＨＬＡ ＤＲＢ１対立遺伝子試料および高親和性ペプチド（ビオチン化ｈｕＣＬＩＰ）についての結合親和性値の表である。ヒル勾配を有する特異的結合モデルにデータをフィッティングした、Ｂｍａｘは最大特異的結合であり、Ｋｄは平衡状態での最大半量リガンド結合であり、ｈはヒル勾配であり、Ｒ二乗値は、モデルがデータにどれだけよくフィットするかである。
【0029】
【図17A】図１７Ａ～１７Ｃは、試験ペプチドとしてのｍＣＬＩＰに対する結合競合アッセイにおける、対立遺伝子特異的プローブについての最適なビオチン化ｈｕＣＬＩＰ（ｈｕＣＬＩＰ－ｂｉｏ）ペプチド濃度の決定である。６つのＤＲＢ１対立遺伝子および参照対立遺伝子（ｐｐ６５－ＤＲＢ１＊０１：０１）に対してペプチド交換アッセイを行った。図１７Ａは、５０ｎＭのｈｕＣＬＩＰ－ｂｉｏについての相対シグナル対ｍＣＬＩＰ濃度範囲（４０，０００～０．３８ｎＭ）の対数のプロットを示し、図１７Ｂは、２５ｎＭのｈｕＣＬＩＰ－ｂｉｏについての相対シグナル対ｍＣＬＩＰ濃度範囲（４０，０００～０．３８ｎＭ）の対数のプロットを示す。図１７Ｃは、算出されたＫｄ値の表である。
【図17B】同上。
【図17C】同上。
【0030】
【図18A】図１８Ａ～１８Ｆは、ＤＲＢ１＊０１：０１、ＤＲＢ１＊０８：０１およびＤＲＢ１＊１１：０１に対して、高親和性ペプチドとして５０ｎＭまたは２５ｎＭ ｈｕＣＬＩＰ－ｂｉｏのいずれかを用いて行われたペプチド交換アッセイのプロットを示す。図１８Ａおよび図１８Ｄは、ＤＲＢ１＊０８：０１結合についてｍＣＬＩＰ、ＬＣＭＶ ＲＮＡＰ、ＬＡＳＶ ＲＮＡＰ、ＶＥＴＦ（２７５～２８９）、ＬＣＭＶ ＮＰ（２０１～２１５）、ＶＶ ＨＰ（２３～３７）、ＭＯＧ（３５～５５）およびＯＶＡ（３２３～３３９）試験ペプチドと競合するために使用される５０ｎＭおよび２５ｎＭ ｈＣＬＩＰ－ｂｉｏのプロットである。図１８Ｂおよび図１８Ｅは、ＤＲＢ１＊１１：０１結合についてｍＣＬＩＰ、ＬＣＭＶ ＲＮＡＰ、ＬＡＳＶ ＲＮＡＰ、ＶＥＴＦ（２７５～２８９）、ＬＣＭＶ ＮＰ（２０１～２１５）、ＶＶ ＨＰ（２３～３７）、ＭＯＧ（３５～５５）およびＯＶＡ（３２３～３３９）試験ペプチドと競合するために使用される５０ｎＭおよび２５ｎＭ ｈＣＬＩＰ－ｂｉｏのプロットである。図１８Ｃおよび図１８Ｆは、ＤＲＢ１＊１１：０１結合についてｍＣＬＩＰ、ＬＣＭＶ ＲＮＡＰ、ＬＡＳＶ ＲＮＡＰ、ＶＥＴＦ（２７５～２８９）、ＬＣＭＶ ＮＰ（２０１～２１５）、ＶＶ ＨＰ（２３～３７）、ＭＯＧ（３５～５５）およびＯＶＡ（３２３～３３９）試験ペプチドと競合するために使用される５０ｎＭおよび２５ｎＭ ｈＣＬＩＰ－ｂｉｏのプロットである。
【図18B】同上。
【図18C】同上。
【図18D】同上。
【図18E】同上。
【図18F】同上。
【0031】
【図19A】図１９Ａ～１９Ｄは、ＤＲＢ１＊０４：０１およびＤＲＢ１＊１５：０１に対して、５０ｎＭまたは２５ｎＭ ｈｕＣＬＩＰ－ｂｉｏのいずれかを用いて行われたペプチド交換アッセイのプロットを示す。図１９Ａおよび図１９Ｂは、それぞれ、ＤＲＢ１＊０４：０１およびＤＲＢ１＊１５：０１結合についてｍＣＬＩＰ、ＬＣＭＶ ＲＮＡＰ、ＬＡＳＶ ＲＮＡＰ、ＶＥＴＦ（２７５～２８９）、ＬＣＭＶ ＮＰ（２０１～２１５）、ＶＶ ＨＰ（２３～３７）、ＭＯＧ（３５～５５）およびＯＶＡ（３２３～３３９）試験ペプチドと競合するために使用される５０ｎＭ ｈＣＬＩＰ－ｂｉｏのプロットである。図１９Ｃおよび図１９Ｄは、それぞれ、ＤＲＢ１＊０４：０１およびＤＲＢ１＊１５：０１結合についてｍＣＬＩＰ、ＬＣＭＶ ＲＮＡＰ、ＬＡＳＶ ＲＮＡＰ、ＶＥＴＦ（２７５～２８９）、ＬＣＭＶ ＮＰ（２０１～２１５）、ＶＶ ＨＰ（２３～３７）、ＭＯＧ（３５～５５）およびＯＶＡ（３２３～３３９）試験ペプチドと競合するために使用される２５ｎＭ ｈＣＬＩＰ－ｂｉｏのプロットである。
【図19B】同上。
【図19C】同上。
【図19D】同上。
【0032】
【図20A】図２０Ａおよび２０Ｂは、ＤＲＢ１＊０９：０１に対して、５０ｎＭまたは２５ｎＭ ｈｕＣＬＩＰ－ｂｉｏのいずれかを用いて行われたペプチド交換アッセイのプロットを示す。ＤＲＢ１＊０９：０１結合についてｍＣＬＩＰ、ＬＣＭＶ ＲＮＡＰ、ＬＡＳＶ ＲＮＡＰ、ＶＥＴＦ（２７５～２８９）、ＬＣＭＶ ＮＰ（２０１～２１５）、ＶＶ ＨＰ（２３～３７）、ＭＯＧ（３５～５５）およびＯＶＡ（３２３～３３９）試験ペプチドと競合するために使用される５０ｎＭ（図２０Ａ）および２５ｎＭ（図２０Ｂ）ｈＣＬＩＰ－ｂｉｏのプロット。
【図20B】同上。
【0033】
【0034】
【0035】
【図23A】図２３Ａ～２３Ｅは、５０ｎＭまたは２５ｎＭ ｈｕＣＬＩＰ－ｂｉｏのいずれかを用いて行われたペプチド交換アッセイのプロット（図２３Ａおよび２３Ｂ）、２．５分にＭＨＣＩＩ／ペプチド複合体ピークを示す、完了したペプチド交換反応についてのＳＥＣクロマトグラムの重ね合わせ（図２３Ｃ）、低親和性ＣＬＩＰと交換された試験ペプチドの量を示す、各ＳＥＣピークについてのカウント対取得時間の重ね合わせ（図２３Ｄ）、ならびに試験ペプチド配列の表およびＭＨＣＩＩ ＨＬＡ対立遺伝子ＤＲＢ１＊０１：０１に対する、低親和性ＣＬＩＰペプチドと比較した各試験ペプチドについての得られた交換プロファイル（図２３Ｅ）を示す。ＭＨＣＩＩの濃度は１６μＭであり、試験ペプチドの濃度は４００μＭであった。試験ペプチド配列は、図２２に示されているとおりである。
【図23B】同上。
【図23C】同上。
【図23D】同上。
【図23E】同上。
【0036】
【図24A】図２４Ａ～２４Ｅは、５０ｎＭまたは２５ｎＭ ｈｕＣＬＩＰ－ｂｉｏのいずれかを用いて行われたペプチド交換アッセイのプロット（図２４Ａおよび２４Ｂ）、２．５分にＭＨＣＩＩ／ペプチド複合体ピークを示す、完了したペプチド交換反応についてのＳＥＣクロマトグラムの重ね合わせ（図２４Ｃ）、低親和性ＣＬＩＰと交換された試験ペプチドの量を示す、各ＳＥＣピークについてのカウント対取得時間の重ね合わせ（図２４Ｄ）、ならびに試験ペプチド配列の表（図２４Ｅ）およびＭＨＣＩＩ ＨＬＡ対立遺伝子ＤＲＢ１＊０４：０１に対する、低親和性ＣＬＩＰペプチドと比較した各試験ペプチドについての得られた交換プロファイルを示す。ＭＨＣＩＩの濃度は１６μＭであり、試験ペプチドの濃度は４００μＭであった。試験ペプチド配列は、図２２に示されているとおりである。
【図24B】同上。
【図24C】同上。
【図24D】同上。
【図24E】同上。
【0037】
【図25A】図２５Ａ～２５Ｅは、５０ｎＭまたは２５ｎＭ ｈｕＣＬＩＰ－ｂｉｏのいずれかを用いて行われたペプチド交換アッセイのプロット（図２５Ａおよび２５Ｂ）、２．５分にＭＨＣＩＩ／ペプチド複合体ピークを示す、完了したペプチド交換反応についてのＳＥＣクロマトグラムの重ね合わせ（図２５Ｃ）、低親和性ＣＬＩＰと交換された試験ペプチドの量を示す、各ＳＥＣピークについてのカウント対取得時間の重ね合わせ（図２５Ｄ）、ならびに試験ペプチド配列の表（図２５Ｅ）およびＭＨＣＩＩ ＨＬＡ対立遺伝子ＤＲＢ１＊０８：０１に対する、低親和性ＣＬＩＰペプチドと比較した各試験ペプチドについての得られた交換プロファイルを示す。ＭＨＣＩＩの濃度は１６μＭであり、試験ペプチドの濃度は４００μＭであった。試験ペプチド配列は、図２２に示されているとおりである。
【図25B】同上。
【図25C】同上。
【図25D】同上。
【図25E】同上。
【0038】
【図26A】図２６Ａ～２６Ｄは、５０ｎＭまたは２５ｎＭ ｈｕＣＬＩＰ－ｂｉｏのいずれかを用いて行われたペプチド交換アッセイのプロット（図２６Ａおよび２６Ｂ）、２．５分にＭＨＣＩＩ／ペプチド複合体ピークを示す、完了したペプチド交換反応についてのＳＥＣクロマトグラムの重ね合わせ（図２６Ｃ）、低親和性ＣＬＩＰと交換された試験ペプチドの量を示す、各ＳＥＣピークについてのカウント対取得時間の重ね合わせ（図２６Ｄ）を示す。ＭＨＣＩＩの濃度は１６μＭであり、試験ペプチドの濃度は４００μＭであった。試験ペプチド配列は、図２２に示されているとおりである。
【図26B】同上。
【図26C】同上。
【図26D】同上。
【0039】
【図27A】図２７Ａ～２７Ｅは、５０ｎＭまたは２５ｎＭ ｈｕＣＬＩＰ－ｂｉｏのいずれかを用いて行われたペプチド交換アッセイのプロット（図２７Ａおよび２７Ｂ）、２．５分にＭＨＣＩＩ／ペプチド複合体ピークを示す、完了したペプチド交換反応についてのＳＥＣクロマトグラムの重ね合わせ（図２７Ｃ）、低親和性ＣＬＩＰと交換された試験ペプチドの量を示す、各ＳＥＣピークについてのカウント対取得時間の重ね合わせ（図２７Ｄ）、ならびに試験ペプチド配列の表（図２７Ｅ）およびＭＨＣＩＩ ＨＬＡ対立遺伝子ＤＲＢ１＊１１：０１に対する、低親和性ＣＬＩＰペプチドと比較した各試験ペプチドについての得られた交換プロファイルを示す。ＭＨＣＩＩの濃度は１６μＭであり、試験ペプチドの濃度は４００μＭであった。試験ペプチド配列は、図２２に示すとおりである。
【図27B】同上。
【図27C】同上。
【図27D】同上。
【図27E】同上。
【0040】
【図28A】図２８Ａ～２８Ｂは、５０ｎＭまたは２５ｎＭ ｈｕＣＬＩＰ－ｂｉｏのいずれかを用いて行われたペプチド交換アッセイのプロット（図２８Ａおよび２８Ｂ）、２．５分にＭＨＣＩＩ／ペプチド複合体ピークを示す、完了したペプチド交換反応についてのＳＥＣクロマトグラムの重ね合わせ（図２８Ｃ）、低親和性ＣＬＩＰと交換された試験ペプチドの量を示す、各ＳＥＣピークについてのカウント対取得時間の重ね合わせ（図２８Ｄ）、ならびに試験ペプチド配列の表（図２８Ｅ）およびＭＨＣＩＩ ＨＬＡ対立遺伝子ＤＲＢ１＊１５：０１に対する、低親和性ＣＬＩＰペプチドと比較した各試験ペプチドについての得られた交換プロファイルを示す。ＭＨＣＩＩの濃度は１６μＭであり、試験ペプチドの濃度は４００μＭであった。試験ペプチド配列は、図２２に示すとおりである。
【図28B】同上。
【図28C】同上。
【図28D】同上。
【図28E】同上。
【発明を実施するための形態】
【0041】
詳細な説明
この説明を読んだ後、様々な代替の実施形態および代替の適用において本開示を実施する方法が当業者に明らかになるであろう。しかしながら、本発明の様々な実施形態の全てについてここでは説明しない。ここに提示される実施形態は、一例として提示されているに過ぎず、限定ではないことが理解されよう。したがって、様々な代替の実施形態のこの詳細な説明は、本明細書に記載の本開示の範囲または幅を限定すると解釈されるべきではない。
この説明を読んだ後、様々な代替の実施形態および代替の適用において本開示を実施する方法が当業者に明らかになるであろう。しかしながら、本発明の様々な実施形態の全てについてここでは説明しない。ここに提示される実施形態は、一例として提示されているに過ぎず、限定ではないことが理解されよう。したがって、様々な代替の実施形態のこの詳細な説明は、本明細書に記載の本開示の範囲または幅を限定すると解釈されるべきではない。
【0042】
本技術を開示および説明する前に、以下に記載される態様は、特定の組成物、そのような組成物を調製する方法、またはその使用に限定されず、したがって当然のことながら変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語が特定の態様を説明することのみを目的としており、限定するようには意図されていないことも理解されたい。
【0043】
本出願は、広範な免疫療法において使用するためのＭＨＣＩＩペプチドをアッセイするための組成物および方法を提供する。
【0044】
一態様において、α鎖、β鎖およびリガンドを含む主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）タンパク質複合体であって、前記リンカーが、前記α鎖およびβ鎖と会合している、主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）タンパク質複合体が本明細書において提供される。
【0045】
一態様において、ＭＨＣＩＩα鎖およびＭＨＣＩＩβ鎖、ならびにＭＨＣＩＩ分子と会合したリガンドを含む主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）－リガンド複合体であって、前記リガンドが試験ペプチドである、主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）－リガンド複合体が本明細書において提供される。
【0046】
一態様において、ペプチドへの主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）分子の結合を検出する方法であって、ペプチドとＭＨＣＩＩ－リガンド複合体とを含む第１の組成物を提供することであって、前記ＭＨＣＩＩ－リガンド複合体は、α鎖およびβ鎖およびリガンドを含み、前記リガンドは、切断可能なリンカーを介して、前記α鎖または前記β鎖に結合している、第１の組成物を提供することと；前記第１の組成物を、前記切断可能なリンカーの切断を引き起こす条件に供することと；第２の組成物を形成するのに十分な期間、前記第１の組成物をインキュベートすることであって、前記第２の組成物は、前記α鎖、前記β鎖、前記リガンド、遊離ペプチド、および／または前記ＭＨＣＩＩ分子と前記ＭＨＣＩＩ分子に非共有結合的に結合した前記ペプチドとを含むＭＨＣＩＩ－ペプチド複合体を含む、前記第１の組成物をインキュベートすることとを含む、方法が本明細書において提供される。複数の実施形態において、本方法は、ＭＨＣＩＩ分子がペプチドに結合しているかどうかを決定することを含む。
【0047】
一態様において、主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）分子に対する試験ペプチドの親和性を検出するための方法であって、前記試験ペプチドと、タグ付きＭＨＣＩＩ結合ペプチド（タグ付きペプチド）と、（ｉ）α鎖およびβ鎖を含む前記ＭＨＣＩＩ分子ならびに（ｉｉ）リガンドを含むＭＨＣＩＩ－リガンド複合体とを含む第１の組成物を提供することであって、前記リガンドは、切断可能なリンカーを介して、前記α鎖または前記β鎖に結合している、第１の組成物を提供することと；前記第１の組成物を、前記切断可能なリンカーの切断を引き起こす条件に供することと；第２の組成物を形成するのに十分な期間、前記第１の組成物をインキュベートすることであって、前記第２の組成物は、前記α鎖、前記β鎖、前記リガンド、遊離試験ペプチド、遊離タグ付きペプチド、前記ＭＨＣＩＩ分子と会合した前記タグ付きペプチドを含むＭＨＣＩＩ－タグ付きペプチド複合体、および／または前記ＭＨＣＩＩ分子と会合した前記試験ペプチドを含むＭＨＣＩＩ－試験ペプチド複合体を含む、前記第１の組成物をインキュベートすることとを含む、方法が本明細書において提供される。
【0048】
複数の実施形態において、本方法は、ＭＨＣＩＩ分子が試験ペプチドに結合しているかどうかを決定することをさらに含む。
【0049】
読者の便宜のためだけに様々なセクションに分けられた詳細な説明および任意のセクションに見られる開示は、別のセクションのものと組み合わされてもよい。タイトルまたはサブタイトルが、読者の便宜のために本明細書で使用され得、本開示の範囲に影響を及ぼすことを意図しない。
【0050】
定義
別段の定義がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書および以下の特許請求の範囲では、以下の意味を有すると定義されなければならないいくつかの用語が参照される。
別段の定義がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書および以下の特許請求の範囲では、以下の意味を有すると定義されなければならないいくつかの用語が参照される。
【0051】
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していない。本明細書で使用される、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確にそうでないと示さない限りは、複数形を同様に含むことが意図されている。
【0052】
「任意の（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」または「任意に（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は、続いて記載されるイベントまたは状況が起こり得るか、または起こり得ないこと、およびその説明が、そのイベントまたは状況が起こる場合と、それが起こらない場合とを含むことを意味する。
【0053】
「約」という用語は、例えば温度、時間、量、濃度など、範囲を含む数値指定の前に使用される場合、（＋）もしくは（－）１０％、５％、１％、またはそれらの間の任意の部分範囲もしくは部分値によって変化し得る近似値を示す。好ましくは、「約」という用語は、量に関して使用される場合、量が±１０％変化し得ることを意味する。
【0054】
「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、組成物および方法が、記載された要素を含むが、他のものを除外しないことを意味することを意図している。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、組成物および方法を定義するために使用される場合、記載された目的のための組み合わせにとって本質的に重要な他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本発明で定義される要素から本質的になる組成物は、特許請求される発明の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない他の材料または工程を排除しない。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、他の成分および実質的な方法工程の微量よりも多い要素を除外することを意味するものとする。これらの移行用語のそれぞれによって定義される実施形態は、本開示の範囲内にある。
【0055】
本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、白血病、リンパ腫、癌腫および肉腫を含む、哺乳動物（例えば、ヒト）において見出される全ての種類のがん、新生物または悪性腫瘍を指す。本明細書で提供される化合物または方法で処置され得る例示的ながんには、脳がん、神経膠腫、膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、前立腺がん、結腸直腸がん、膵臓がん、髄芽腫、黒色腫、子宮頸がん、胃がん、卵巣がん、肺がん、頭部のがん、ホジキン病および非ホジキンリンパ腫が含まれる。本明細書において提供される化合物または方法を用いて処置され得る例示的ながんとしては、甲状腺、内分泌系、脳、乳房、子宮頸、結腸、頭頸部、肝臓、腎臓、肺、卵巣、膵臓、直腸、胃、および子宮のがんが挙げられる。さらなる例としては、甲状腺癌、胆管癌腫、膵臓腺癌、皮膚黒色腫、結腸腺癌、直腸腺癌、胃腺癌、食道癌腫、頭頸部扁平上皮癌腫、乳房侵襲性癌腫、肺腺癌、肺扁平上皮癌腫、非小細胞肺癌腫、中皮腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、多形神経膠芽腫、卵巣がん、横紋筋肉腫、原発性血小板増加症、原発性マクログロブリン血症、原発性脳腫瘍、悪性膵臓インスリノーマ、悪性カルチノイド、膀胱がん、前悪性皮膚病変、精巣がん、甲状腺がん、神経芽細胞腫、食道がん、泌尿生殖器がん、悪性高カルシウム血症、子宮内膜がん、副腎皮質がん、膵内分泌部もしくは膵外分泌部の新生物、髄様甲状腺がん、髄様甲状腺癌腫、黒色腫、結腸直腸がん、乳頭様甲状腺がん、肝細胞癌腫、または前立腺がんが挙げられる。
【0056】
化合物に関する「選択的」または「選択性」などは、化合物が分子標的を区別する能力を指す（例えば、化合物はＨＭＴ ＳＵＶ３９Ｈ１および／またはＨＭＴ Ｇ９ａに対する選択性を有する）。
【0057】
化合物に関する「特異的な」、「特異的に」、「特異性」などは、特定の分子標的に対して、特定の作用、例えば、阻害を引き起こす、化合物の能力を指し、細胞内の他のタンパク質に対する作用が最小限であるかまたは存在しないことを指す（例えば、ＨＭＴ ＳＵＶ３９Ｈ１および／またはＨＭＴ Ｇ９ａに対する特異性を有する化合物は、それらのＨＭＴの活性の阻害を示し、一方で同じ化合物は、他のＨＭＴ、例えば、ＤＯＴ１、ＥＺＨ１、ＥＺＨ２、ＧＬＰ、ＭＬＬ１、ＭＬＬ２、ＭＬＬ３、ＭＬＬ４、ＮＳＤ２、ＳＥＴ１ｂ、ＳＥＴ７／９、ＳＥＴ８、ＳＥＴＭＡＲ、ＳＭＹＤ２、ＳＵＶ３９Ｈ２の阻害をほとんどまたはまったく示さない）。
【0058】
「免疫応答」などの用語は、通常の慣例的意味で、生物体による、疾患から保護する応答を指す。応答は、当該技術分野において周知のように、自然免疫系または獲得免疫系によって開始され得る。
【0059】
「免疫応答をモジュレートする」などの用語は、作用物質、例えば、本明細書においてその実施形態を含めて開示される化合物の投与の結果としての、対象の免疫応答における変化を指す。したがって、免疫応答は、作用物質、例えば、本明細書においてその実施形態を含めて開示される化合物の投与の結果として、活性化または脱活性化され得る。
【0060】
「Ｂ細胞」または「Ｂリンパ球」は、当該技術分野におけるそれらの標準的な使用法を指す。Ｂ細胞は、白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）（白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ））の一種であるリンパ球であり、抗体を産生する形質細胞（「成熟Ｂ細胞」）へと発達する。「未成熟Ｂ細胞」は、成熟Ｂ細胞へと発達することができる細胞である。一般に、プロＢ細胞は、免疫グロブリン重鎖再構成を受けて、プロＢプレＢ細胞となり、さらに、免疫グロブリン軽鎖再構成を受けて、未成熟Ｂ細胞となる。未成熟Ｂ細胞には、Ｔ１およびＴ２Ｂ細胞が含まれる。
【0061】
「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」は、本明細書で使用される場合、細胞媒介性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球の一種（白血球のサブタイプ）である。それらは、細胞表面上のＴ細胞受容体の存在によって、他のリンパ球、例えば、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞とは区別され得る。Ｔ細胞には、例えば、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、およびヘルパーＴ細胞が含まれる。異なる種類のＴ細胞は、Ｔ細胞検出剤の使用によって、区別され得る。
【0062】
「メモリーＴ細胞」は、以前の感染、がんとの遭遇または以前のワクチン接種中にその同族抗原に以前に遭遇し、その同族抗原に応答したことがあるＴ細胞である。その同族抗原との２度目の遭遇時に、メモリーＴ細胞は、免疫系が病原体に最初に応答したときより速く、より強い免疫応答を開始するように再生（分裂）することができる。
【0063】
「制御性Ｔ細胞」または「抑制性Ｔ細胞」は、免疫系をモジュレートし、自己抗原に対する寛容性を維持し、自己免疫疾患を予防するリンパ球である。
【0064】
アミノ酸は、本明細書では、一般に知られている３文字記号またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会が推奨する１文字記号のいずれかによって表され得る。ヌクレオチドは、同様に、それらの一般的に認められている１文字のコードによって表され得る。
【0065】
用語「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」、「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」および「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、アミノ酸残基の重合体を指すために本明細書においては互換的に使用され、この重合体は、アミノ酸から構成されない部分に結合され得る。これらの用語は、天然に存在するアミノ酸重合体および天然に存在しないアミノ酸重合体に適用されるのみならず、１または複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣体であるアミノ酸重合体にも適用される。「融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、単一の部分として組み換え的に発現される２つまたはそれより多くの別々のタンパク質配列をコードするキメラタンパク質を指す。
【0066】
アミノ酸配列に関して、当業者であれば、コードされる配列中の単一のアミノ酸または少ないパーセンテージのアミノ酸を改変し、付加し、または欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加は、改変があるアミノ酸の、化学的に類似したアミノ酸による置換をもたらす「保存的に修飾された変異形」であることを認識するであろう。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換の一覧は、当該技術分野において周知である。そのような保存的に修飾された変異形は、本開示の多型変異形、種間ホモログおよび対立遺伝子に対する追加であり、それらを排除するものではない。
【0067】
アミノ酸またはヌクレオチド塩基の「位置」は、Ｎ末端（または５’末端）に対するその位置に基づいて、参照配列におけるそれぞれのアミノ酸（またはヌクレオチド塩基）を順に特定する番号によって指定される。最適なアライメントを決定するときに考慮に入れなければいけない欠失、挿入、トランケーション、融合などに起因して、一般に、Ｎ末端から単純にカウントすることによって決定される試験配列におけるアミノ酸残基番号は、参照配列におけるその対応する位置の番号と必ずしも同じにはならないであろう。例えば、アライメントされる参照配列と比べて変異形が欠失を有する事例では、変異形には、欠失の部位に、参照配列における位置に対応するアミノ酸が存在しないであろう。アライメントされる参照配列に挿入が存在する場合、その挿入は、参照配列中の付番されたアミノ酸位置に対応しないであろう。トランケーションまたは融合の事例においては、参照配列またはアライメントされる配列のいずれかの中に、対応する配列中のいずれかのアミノ酸に対応しないアミノ酸のストレッチが存在し得る。
【0068】
「を参照して付番された」または「に対応する」という用語は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の付番の文脈において使用される場合、その所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列が参照配列と比較されるときの、指定された参照配列の残基の番号付けを指す。
【0069】
「アミノ酸側鎖」という用語は、アミノ酸に含まれる官能性置換基を指す。例えば、アミノ酸側鎖は、天然に存在するアミノ酸の側鎖であり得る。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの（例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリン）、ならびに後で修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート、およびＯ－ホスホセリンである。複数の実施形態において、アミノ酸側鎖は、非天然アミノ酸側鎖であり得る。
【0070】
「非天然アミノ酸側鎖」という用語は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基に結合されているα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム、アリルアラニン、２－アミノイソ酪酸の官能性置換基を指す。非天然アミノ酸は、天然に存在するか、または化学的に合成されたかのいずれかである、非タンパク質原性アミノ酸である。このようなアナログは、修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。
【0071】
本明細書に提供される「ＭＨＣＩＩ」または「主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ」または「主要組織適合抗原複合体ＩＩ」という用語は、主要組織適合抗原複合体ＩＩ（ＭＨＣＩＩ）またはＭＨＣＩＩ活性を維持する（例えば、ＭＨＣＩＩと比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％以内の活性）その変異形もしくはホモログのあらゆる組換え形態または天然に存在する形態を含む。いくつかの態様において、変異形またはホモログは、天然に存在するＭＨＣＩＩポリペプチドと比較して、配列全体または配列の一部分（例えば、５０、１００、１５０または２００の連続的なアミノ酸の部分）にわたって、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩは、２つの非共有結合的に結合したタンパク質、アルファ（α）鎖およびベータ鎖（β）、それらのホモログまたは機能的断片のヘテロ二量体である。複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩは、ペプチドリガンドを含む。
【0072】
「ＨＬＡ」または「ヒト白血球抗原」という用語は、ＭＨＣ遺伝子複合体によってコードされるタンパク質の群を指す。具体的には、限定されないが、ＭＨＣＩＩ遺伝子複合体は、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱおよびＨＬＡ－ＤＲの群のタンパク質をコードする。
【0073】
「リガンド」という用語は、生体分子と複合体を形成して生物学的機能を果たす分子を指す。結合は、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、核酸、核酸誘導体、非天然核酸、アミノ酸、アミノ酸誘導体、非天然アミノ酸、炭水化物、単糖、二糖、オリゴ糖、オリゴヌクレオチド、金属、金属錯体、薬物、脂質、脂肪酸、代謝産物、無機分子、有機分子、バイオポリマーおよびポリマーの間で起こり得るが、これらに限定されない。リガンド複合体は、イオン結合、共有結合、ファンデルワールス相互作用および／または水素結合によって形成され得る。ＭＨＣＩＩに対するリガンドは、一般に、ペプチドである。
【0074】
「クラスＩＩ関連インバリアント鎖ペプチド」および「ＣＬＩＰ」という用語は、親和性成熟プロセス中にＭＨＣＩＩペプチド結合溝内に結合するインバリアント鎖（Ｉｉ）タンパク質配列の一部を指す。
【0075】
「結合する」および「結合した」という用語は、本明細書で使用される場合、その明白かつ通常の意味に従って使用され、原子間または分子間の会合を指す。会合は、直接的であってもよく、または間接的であってもよい。例えば、結合した原子または分子は、例えば、共有結合的結合もしくはリンカー（例えば、第１のリンカーまたは第２のリンカー）による、直接的なものであってもよく、または例えば、非共有結合的結合（例えば、静電相互作用（例えば、イオン結合、水素結合、ハロゲン結合）、ファンデルワールス相互作用（例えば、双極子－双極子、双極子－誘起双極子、ロンドン分散）、環スタッキング（ｐｉ効果）、疎水性相互作用など）による、間接的なものであってもよい。
【0076】
用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、抗原を特異的に結合および認識する、免疫グロブリン遺伝子またはその機能的断片によってコードされたポリペプチドを指す。一般に認められた免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンとして分類され、これらは、それぞれ、順に免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを定義する。
【0077】
タンパク質またはペプチドに言及する場合、抗体に「特異的に（または選択的に）結合する」または「と特異的に（または選択的に）免疫反応性である」という語句は、しばしばタンパク質およびその他の生物製剤の不均一な集団におけるタンパク質の存在を決定する結合反応を指す。したがって、指定されたイムノアッセイ条件下において、指定された抗体は、バックグラウンドの少なくとも２倍、より典型的にはバックグラウンドの１０～１００倍超で特定のタンパク質に結合する。そのような条件下での抗体への特異的結合には、特定のタンパク質に対するその特異性について選択された抗体が必要とされる。例えば、ポリクローナル抗体は、選択された抗原と特異的に免疫反応性であり、他のタンパク質とは免疫反応性でない抗体のサブセットのみを得るように選択され得る。この選択は、他の分子と交差反応する抗体を差し引くことによって達成され得る。特定のタンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択するために、様々なイムノアッセイ形式が使用され得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択するために日常的に使用されている（特異的免疫反応性を決定するために使用することができる免疫アッセイ形式および条件の説明については、例えば、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９８）を参照されたい）。
【0078】
「変性する」という用語は、タンパク質、ポリペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他のバイオポリマーの三次元構造が、化学的もしくは機械的手段によって、または加熱もしくは冷却によって、破壊されるプロセスを指す。
【0079】
「ペプチドリンカー」という用語は、１つのペプチドを別のペプチドに連結するアミノ酸配列を指す。ペプチドリンカーは、切断可能なリンカーであり得る。切断可能なリンカーは、任意の切断可能なリンカーであり得る。例えば、限定されないが、切断可能なリンカーは、ＵＶ切断可能なリンカー、酵素切断可能なリンカー、ｐＨ依存性リンカー、塩依存性リンカーなどであり得る。好ましくは、ペプチドをＭＨＣＩＩサブユニットに連結するペプチドリンカーまたは切断可能なリンカーは、リンカーの非存在下より、ＭＨＣＩＩにより強く結合するペプチドをもたらさない。切断可能なリンカーは、任意の適切な分子から作製されてもよく、ペプチドリンカーに限定されない。
【0080】
本明細書に記載の実施例および実施形態が、例示を目的とするものに過ぎないこと、ならびにそれを考慮に入れた様々な改変または変更が当業者に提案され、本出願の趣旨および範囲内および添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることを理解されたい。本明細書に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、あらゆる目的のために参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。
【0081】
ＭＨＣＩＩ組成物
一態様において、α鎖、β鎖を含むＭＨＣＩＩ分子とリガンドとを含む主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）／リガンド複合体であって、前記リガンドが、前記α鎖および前記β鎖と会合したペプチドである、主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）／リガンド複合体が本明細書において提供される。
一態様において、α鎖、β鎖を含むＭＨＣＩＩ分子とリガンドとを含む主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）／リガンド複合体であって、前記リガンドが、前記α鎖および前記β鎖と会合したペプチドである、主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）／リガンド複合体が本明細書において提供される。
【0082】
複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ／リガンド複合体は、α鎖およびβ鎖を含有する。複数の実施形態において、α鎖およびβ鎖は、ヘテロ二量体中で会合している。複数の実施形態において、α鎖は、第１の二量体化タグを含有する。複数の実施形態において、β鎖は、第２の二量体化タグを含有する。複数の実施形態において、第１の二量体化タグを含有するα鎖および第２の二量体化タグを含有するβ鎖は、会合している。
【0083】
複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ／リガンド複合体は、ヘテロ二量体としてより安定であるα鎖およびβ鎖を含有する。複数の実施形態において、第１の二量体化タグを含有するα鎖および第２の二量体化タグを含有するβ鎖は、安定な複合体中で会合する。複数の実施形態において、第１の二量体化タグを含有するα鎖および第２の二量体化タグを含有するβ鎖は、第１および第２の二量体化タグなしの同じα鎖およびβ鎖配列によって形成される複合体より安定な複合体中で会合する。
【0084】
複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ／リガンド複合体は、第１の二量体化タグを含有するα鎖と、第２の二量体化タグを含有するβ鎖とを含有し、二量体化タグは、ロイシンジッパー、Ｆｏｓ／Ｊｕｎ、コイルドコイルヘテロ二量体化タグ、ノブ・イン・ホールもしくは他のヘテロ二量体Ｆｃ、またはｉＤｉｍｅｒｉｚｅ対から選択される。
【0085】
複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ／リガンド複合体は、α鎖およびβ鎖、ならびにリガンドを含有する。複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ／リガンド複合体は、α鎖およびβ鎖、ならびにリガンドを含有し、リガンドはペプチドである。複数の実施形態において、ペプチドリガンドは、α鎖に共有結合している。複数の実施形態において、ペプチドリガンドは、ペプチドリンカー配列を介してα鎖に共有結合している。複数の実施形態において、ペプチドリガンドは、β鎖に共有結合している。複数の実施形態において、ペプチドリガンドは、ペプチドリンカー配列を介してβ鎖に共有結合している。複数の実施形態において、ペプチドリンカー配列は、酵素切断部位を含有する。複数の実施形態において、酵素切断部位は、トロンビン、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）プロテアーゼ、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎＴＭプロテアーゼ、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、ジペプチジルアミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）、タバコ脈緑斑紋形成ウイルスプロテアーゼ（ＴＶＭＶ（Ｔｏｂａｃｃｏ ｖｅｉｎ ｍｏｔｔｌｉｎｇ ｖｉｒｕｓ））、およびこれらの任意の変異形から選択される。いくつかの実施形態において、ペプチドは、柔軟なペプチドリンカーでα鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態において、リンカーは、トロンビン認識配列ＧＧＧＧＳＬＶＰＲＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１７）を含有する。いくつかの実施形態において、リンカーは、ＴＥＶプロテアーゼ認識配列ＧＧＧＧＳＥＮＬＹＦＱＧＧＧＧＧＳ（配列番号１８）を含有する。
【0086】
複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ／リガンド複合体は、α鎖およびβ鎖ならびにリガンドを含有し、リガンドはペプチドであり、リガンドペプチドはペプチドリンカー配列を介してα鎖またはβ鎖に共有結合している。複数の実施形態において、ペプチドリンカー配列は、非天然アミノ酸を含有する。複数の実施形態において、非天然アミノ酸は、ＵＶ切断可能である。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、２－ニトロフェニルグリシン（ＮＰＧ）、拡張型（ｅｘｐａｎｄｅｄ）ｏ－ニトロベンジルリンカー、ｏ－ニトロベンジルケージド（ｃａｇｅｄ）フェノール、ｏ－ニトロベンジルケージドチオール、３２ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）ケージドアニリン、ｏ－ニトロベンジルケージドセレン化物、ビス－アゾベンゼン、クマリン、シンナミル、スピロピラン、２－ニトロフェニルアラニン（２－ｎＦ）および３－アミノ－３－（２－ニトロフェニル）プロピオン酸（ＡＮＰ）アミノ酸アナログから選択される。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、３－アミノ－３－（２－ニトロフェニル）プロピオン酸（ＡＮＰ）である。
【0087】
複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ複合体は、α鎖およびβ鎖ならびにタグ付きペプチドを含有する。複数の実施形態において、タグ付きペプチドは、リガンドなしでＭＨＣＩＩ複合体を選択的に認識し、ＭＨＣＩＩ複合体と会合する。複数の実施形態において、タグ付きペプチドは、追加の分子と会合して、検出可能な複合体を形成する。
【0088】
複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ／リガンド複合体は、α鎖およびβ鎖、リガンド、ならびにタグ付きペプチドを含有する。複数の実施形態において、タグ付きペプチドは、ＭＨＣＩＩ複合体／リガンド複合体を選択的に認識し、ＭＨＣＩＩ複合体／リガンド複合体と会合する。複数の実施形態において、タグ付きペプチドは、追加の分子と会合して、検出可能な複合体を形成する。
【0089】
複数の実施形態において、タグ付きペプチドは、分子を結合して、検出可能な標識を生成することができる。複数の実施形態において、タグ付きペプチドは、蛍光化合物または生物発光化合物を含有する。複数の実施形態において、タグ付きペプチドは、多価プラットフォームでタグを付けられる。複数の実施形態において、タグ付きペプチドは、ビオチンでタグを付けられ、追加の分子は、ストレプトアビジンである。複数の実施形態において、タグ付きペプチドは、四量体集合体のサブユニットでタグを付けられる。
【0090】
複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ／リガンド複合体は、α鎖およびβ鎖、リガンドならびに抗体を含有する。複数の実施形態において、抗体は、ＭＨＣＩＩ分子に結合する。複数の実施形態において、抗体は、表面に固定化される。
【0091】
複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ／リガンド複合体は、ペプチドリガンドに対する親和性を有する。複数の実施形態において、ペプチドリガンドは、ＣＬＩＰ配列を含有する。複数の実施形態において、ペプチドリガンドは、以下の基準のうちの１または複数を満たす：
ａ）ＭＨＣＩＩ鎖での発現中に使用可能な量で産生される；
ｂ）（リンカーの切断後に）２Ｄ ＬＣＭＳにおいて高レベルで検出される；および／または
ｃ）対立遺伝子に対して高い親和性を有することが知られているペプチドとの交換反応において、約２０％～１００％のペプチド交換収率を有する。
ａ）ＭＨＣＩＩ鎖での発現中に使用可能な量で産生される；
ｂ）（リンカーの切断後に）２Ｄ ＬＣＭＳにおいて高レベルで検出される；および／または
ｃ）対立遺伝子に対して高い親和性を有することが知られているペプチドとの交換反応において、約２０％～１００％のペプチド交換収率を有する。
【0092】
複数の実施形態において、ペプチドリガンドは、前記基準のうち２つまたはそれより多くを満たす。複数の実施形態において、ペプチドリガンドは、前記基準のうち３つ全てを満たす。
【0093】
複数の実施形態において、発現されるＭＨＣＩＩ／リガンド複合体の使用可能な量は、１ｍｇ／Ｌを超える。複数の実施形態において、発現されるＭＨＣＩＩ／リガンド複合体の使用可能な量は、約１ｍｇ／Ｌ～約３００ｍｇ／Ｌである。複数の実施形態において、発現されるＭＨＣＩＩ／リガンド複合体の使用可能な量は、約１ｍｇ／Ｌ～約２５０ｍｇ／Ｌである。複数の実施形態において、発現されるＭＨＣＩＩ／リガンド複合体の使用可能な量は、約１ｍｇ／Ｌ～約２００ｍｇ／Ｌである。複数の実施形態において、発現されるＭＨＣＩＩ／リガンド複合体の使用可能な量は、約１ｍｇ／Ｌ～約１９０ｍｇ／Ｌである。複数の実施形態において、発現されるＭＨＣＩＩ／リガンド複合体の使用可能な量は、約１ｍｇ／Ｌ～約１８０ｍｇ／Ｌである。複数の実施形態において、発現されるＭＨＣＩＩ／リガンド複合体の使用可能な量は、約１ｍｇ／Ｌ～約１７０ｍｇ／Ｌである。複数の実施形態において、発現されるＭＨＣＩＩ／リガンド複合体の使用可能な量は、約１ｍｇ／Ｌ～約１６０ｍｇ／Ｌである。複数の実施形態において、発現されるＭＨＣＩＩ／リガンド複合体の使用可能な量は、約１ｍｇ／Ｌ～約１５０ｍｇ／Ｌである。複数の実施形態において、発現されるＭＨＣＩＩ／リガンド複合体の使用可能な量は、約１ｍｇ／Ｌ～約１４０ｍｇ／Ｌである。複数の実施形態において、発現されるＭＨＣＩＩ／リガンド複合体の使用可能な量は、約１ｍｇ／Ｌ～約１３０ｍｇ／Ｌである。複数の実施形態において、発現されるＭＨＣＩＩ／リガンド複合体の使用可能な量は、約１ｍｇ／Ｌ～約１２０ｍｇ／Ｌである。複数の実施形態において、発現されるＭＨＣＩＩ／リガンド複合体の使用可能な量は、約１ｍｇ／Ｌ～約１１０ｍｇ／Ｌである。複数の実施形態において、発現されるＭＨＣＩＩ／リガンド複合体の使用可能な量は、約１ｍｇ／Ｌ～約１００ｍｇ／Ｌである。複数の実施形態において、発現されるＭＨＣＩＩ／リガンド複合体の使用可能な量は、約１ｍｇ／Ｌ～約９０ｍｇ／Ｌである。複数の実施形態において、発現されるＭＨＣＩＩ／リガンド複合体の使用可能な量は、約１ｍｇ／Ｌ～約８０ｍｇ／Ｌである。複数の実施形態において、発現されるＭＨＣＩＩ／リガンド複合体の使用可能な量は、約１ｍｇ／Ｌ～約７０ｍｇ／Ｌである。複数の実施形態において、発現されるＭＨＣＩＩ／リガンド複合体の使用可能な量は、約１ｍｇ／Ｌ～約６０ｍｇ／Ｌである。複数の実施形態において、発現されるＭＨＣＩＩ／リガンド複合体の使用可能な量は、約１ｍｇ／Ｌ～約５０ｍｇ／Ｌである。複数の実施形態において、発現されるＭＨＣＩＩ／リガンド複合体の使用可能な量は、約１ｍｇ／Ｌ～約４０ｍｇ／Ｌである。複数の実施形態において、発現されるＭＨＣＩＩ／リガンド複合体の使用可能な量は、約１ｍｇ／Ｌ～約３０ｍｇ／Ｌである。複数の実施形態において、発現されるＭＨＣＩＩ／リガンド複合体の使用可能な量は、約１ｍｇ／Ｌ～約２０ｍｇ／Ｌである。複数の実施形態において、発現されるＭＨＣＩＩ／リガンド複合体の使用可能な量は、約１ｍｇ／Ｌ～約１０ｍｇ／Ｌである。量は、終点を含む、列挙された範囲内の任意の値または部分範囲であり得る。
【0094】
複数の実施形態において、２Ｄ ＬＣ－ＭＳによって検出されるＭＨＣＩＩ／リガンド複合体のシグナル範囲は、ペプチドリガンドの抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）において約１０３～１０５カウントである。いくつかの実施形態において、シグナルは約１０３カウントである。いくつかの実施形態において、シグナルは約１０４カウントである。いくつかの実施形態において、シグナルは約１０５カウントである。
【0095】
複数の実施形態において、ペプチドリガンドは、対立遺伝子に対して高い親和性を有することが知られているペプチドとの交換反応において、約２０％～約１００％のペプチド交換収率を有する。複数の実施形態において、ペプチドリガンドは、交換反応において約４０％～約１００％のペプチド交換収率を有する。複数の実施形態において、ペプチドリガンドは、交換反応において約５０％～約１００％のペプチド交換収率を有する。複数の実施形態において、ペプチドリガンドは、交換反応において少なくとも約２０％のペプチド交換収率を有する。複数の実施形態において、ペプチドリガンドは、交換反応において少なくとも約３０％のペプチド交換収率を有する。複数の実施形態において、ペプチドリガンドは、交換反応において少なくとも約４０％のペプチド交換収率を有する。複数の実施形態において、ペプチドリガンドは、交換反応において少なくとも約５０％のペプチド交換収率を有する。複数の実施形態において、ペプチドリガンドは、交換反応において少なくとも約６０％のペプチド交換収率を有する。複数の実施形態において、ペプチドリガンドは、交換反応において少なくとも約７０％のペプチド交換収率を有する。複数の実施形態において、ペプチドリガンドは、交換反応において少なくとも約８０％のペプチド交換収率を有する。複数の実施形態において、ペプチドリガンドは、交換反応において少なくとも約９０％のペプチド交換収率を有する。複数の実施形態において、ペプチドリガンドは、交換反応において約１００％のペプチド交換収率を有する。値は、終点を含む、列挙された範囲内の任意の値または部分範囲であり得る。
【0096】
複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ複合体は、ＣＬＩＰ配列よりタグ付きペプチドに対して、より高い親和性／ＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態において、ＭＨＣＩＩ複合体は、ＣＬＩＰ配列よりタグ付きペプチドに対して、より高い親和性を有する。
【0097】
複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ／リガンド複合体は、α鎖を含有し、α鎖は、以下の遺伝子座のうちの任意の１つによってコードされる：ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱおよびＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子。いくつかの実施形態において、α鎖は、ＨＬＡ－ＤＰ遺伝子座によってコードされる。いくつかの実施形態において、α鎖は、ＨＬＡ－ＤＭ遺伝子座によってコードされる。いくつかの実施形態において、α鎖は、ＨＬＡ－ＤＯＡ遺伝子座によってコードされる。いくつかの実施形態において、α鎖は、ＨＬＡ－ＤＯＢ遺伝子座によってコードされる。いくつかの実施形態において、α鎖は、ＨＬＡ－ＤＱ遺伝子座によってコードされる。いくつかの実施形態において、α鎖は、ＨＬＡ－ＤＲ遺伝子座によってコードされる。
【0098】
複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ／リガンド複合体は、β鎖を含有し、β鎖は、以下の遺伝子座のうちの任意の１つによってコードされる：ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱおよびＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子。いくつかの実施形態において、β鎖は、ＨＬＡ－ＤＰ遺伝子座によってコードされる。いくつかの実施形態において、β鎖は、ＨＬＡ－ＤＭ遺伝子座によってコードされる。いくつかの実施形態において、β鎖は、ＨＬＡ－ＤＯＡ遺伝子座によってコードされる。いくつかの実施形態において、β鎖は、ＨＬＡ－ＤＯＢ遺伝子座によってコードされる。いくつかの実施形態において、β鎖は、ＨＬＡ－ＤＱ遺伝子座によってコードされる。いくつかの実施形態において、β鎖は、ＨＬＡ－ＤＲ遺伝子座によってコードされる。
【0099】
複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ／リガンド複合体はＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子によってコードされ、リガンドはＨＬＡ－ＤＲおよびリガンド配列のリストから選択される。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１：０１であり、ペプチドリガンドはＰＶＳＫＡＲＭＡＴＧＡＬＡＱＡ（配列番号１）である。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０３：０１であり、ペプチドリガンドはＰＶＳＫＭＲＭＡＴＧＡＬＡＱＡ（配列番号２）である。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０１であり、ペプチドリガンドはＰＶＳＫＭＲＭＡＴＧＡＬＡＱＡ（配列番号２）である。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０７：０１であり、ペプチドリガンドはＰＶＳＫＭＲＭＡＴＧＡＬＡＱＡ（配列番号２）である。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０１であり、ペプチドリガンドはＰＶＳＫＭＲＭＡＴＰＬＬＭＱＡ（配列番号３）である。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０１であり、ペプチドリガンドはＰＶＳＫＭＲＭＡＴＧＡＬＡＱＡ（配列番号２）である。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０１であり、ペプチドリガンドはＰＶＳＫＭＲＭＡＴＰＬＬＭＱＡ（配列番号３）である。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１であり、ペプチドリガンドはＰＶＳＫＡＲＭＡＴＧＡＬＡＱＡ（配列番号１）である。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０４であり、ペプチドリガンドはＰＶＳＫＭＲＭＡＴＧＡＬＡＱＡ（配列番号２）である。
【0100】
複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ複合体は、α鎖およびβ鎖を含有するＭＨＣ分子と、α鎖およびβ鎖と会合したタグ付きペプチドとを含有する。
【0101】
複数の態様において、ＭＨＣＩＩ複合体（α鎖およびβ鎖ならびにα鎖およびβ鎖と会合したペプチドリガンドを含有するＭＨＣ分子）と、試験ペプチドとを含む組成物が提供される。複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ複合体は、α鎖およびβ鎖を含有するＭＨＣ分子と、ペプチドリガンドと、試験ペプチドと、α鎖およびβ鎖と会合したタグ付きペプチドとを含有する。複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ複合体は、α鎖およびβ鎖を含有するＭＨＣ分子と、ペプチドリガンドと、２つまたはそれより多くの試験ペプチドと、α鎖およびβ鎖と会合したタグ付きペプチドとを含有する。いくつかの実施形態において、ＭＨＣＩＩ複合体は、タグ付きペプチドと検出可能な複合体を作る分子も含有する。
【0102】
複数の実施形態において、主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）／リガンド複合体は、α鎖およびβ鎖を含有するＭＨＣＩＩ分子と、ＭＨＣＩＩ分子と会合したリガンドとを含有する。いくつかの実施形態において、リガンドはペプチドである。いくつかの実施形態において、リガンドはタグ付きペプチドである。いくつかの実施形態において、リガンドは試験ペプチドである。
【0103】
複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ複合体は、α鎖およびβ鎖を含有するＭＨＣＩＩ分子と、α鎖およびβ鎖と会合した試験ペプチドとを含有する。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、腫瘍抗原である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、自己抗原である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、ネオ抗原である。
【0104】
複数の実施形態において、試験ペプチドは、７～３０アミノ酸残基長である。長さは、終点を含む列挙された範囲内の任意の値または部分範囲とすることができる。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、７アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、８アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、９アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、１０アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、１１アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、１２アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、１３アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、１４アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、１５アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、１６アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、１７アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、１８アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、１９アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、２０アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、２１アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、２２アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、２３アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、２４アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、２５アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、２６アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、２７アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、２８アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、２９アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、３０アミノ酸残基長である。
【0105】
複数の実施形態において、試験ペプチドは、配列番号１～配列番号１６から選択されるアミノ酸配列を含有する。複数の実施形態において、試験ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含有する。
【0106】
ＭＨＣＩＩ／リガンド複合体を検出するための方法
一態様において、試験ペプチドへの主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）分子の結合を検出する方法であって、（ａ）ペプチドと、（ｉ）α鎖およびβ鎖を含む前記ＭＨＣＩＩ分子ならびに（ｉｉ）リガンドを含むＭＨＣＩＩ－リガンド複合体とを含む第１の組成物を提供することであって、前記リガンドは、切断可能なリンカーを介して、前記α鎖または前記β鎖に結合している、第１の組成物を提供することと；（ｂ）前記第１の組成物を、前記切断可能なリンカーの切断を引き起こす条件に供することと；（ｃ）第２の組成物を形成するのに十分な期間、前記第１の組成物をインキュベートすることであって、前記第２の組成物は、前記α鎖、前記β鎖、前記リガンド、遊離ペプチド、および／または前記ＭＨＣＩＩ分子と前記ＭＨＣＩＩ分子に非共有結合的に結合した前記ペプチドとを含むＭＨＣＩＩ－ペプチド複合体を含む、前記第１の組成物をインキュベートすることと、（ｄ）前記ＭＨＣＩＩ分子が前記ペプチドに結合しているかどうかを決定することとを含む、方法が本明細書において提供される。
一態様において、試験ペプチドへの主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）分子の結合を検出する方法であって、（ａ）ペプチドと、（ｉ）α鎖およびβ鎖を含む前記ＭＨＣＩＩ分子ならびに（ｉｉ）リガンドを含むＭＨＣＩＩ－リガンド複合体とを含む第１の組成物を提供することであって、前記リガンドは、切断可能なリンカーを介して、前記α鎖または前記β鎖に結合している、第１の組成物を提供することと；（ｂ）前記第１の組成物を、前記切断可能なリンカーの切断を引き起こす条件に供することと；（ｃ）第２の組成物を形成するのに十分な期間、前記第１の組成物をインキュベートすることであって、前記第２の組成物は、前記α鎖、前記β鎖、前記リガンド、遊離ペプチド、および／または前記ＭＨＣＩＩ分子と前記ＭＨＣＩＩ分子に非共有結合的に結合した前記ペプチドとを含むＭＨＣＩＩ－ペプチド複合体を含む、前記第１の組成物をインキュベートすることと、（ｄ）前記ＭＨＣＩＩ分子が前記ペプチドに結合しているかどうかを決定することとを含む、方法が本明細書において提供される。
【0107】
複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ分子が試験ペプチドに結合するかどうかは、第２の組成物中のＭＨＣＩＩ／ペプチド複合体のレベルを測定することによって決定される。複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ／ペプチド複合体のレベルは、第２の組成物の２次元液体クロマトグラフィー－質量分析（２Ｄ ＬＣ／ＭＳ）によって測定される。複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ分子と試験ペプチドを区別するために、ＨＰＬＣとＭＳおよび／または２Ｄ ＬＣ／ＭＳとの組み合わせが使用される。いくつかの実施形態において、遊離試験ペプチドおよび／またはリガンドは、２Ｄ ＬＣ／ＭＳより前に、第２の組成物から除去される。いくつかの実施形態において、遊離試験ペプチドは、２Ｄ ＬＣ／ＭＳより前に、第２の組成物から除去される。いくつかの実施形態において、遊離試験ペプチドは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を介して第２の組成物から除去される。いくつかの実施形態において、遊離試験ペプチドは、イオン交換を介して第２の組成物から除去される。
【0108】
複数の実施形態において、ＨＰＬＣおよびＭＳによって決定される試験ペプチドの存在は、ＭＨＣＩＩ分子が試験ペプチドに結合することができることを示す。複数の実施形態において、ＨＰＬＣおよびＭＳによって決定される試験ペプチドの存在は、試験ペプチドがリガンドペプチドと比較してＭＨＣＩＩ分子に対してより高い親和性を有することを示す。
【0109】
本明細書に記載の方法は、多重に実行され得る。複数の実施形態において、第１の組成物は、複数のＭＨＣＩＩ／リガンド複合体と、少なくとも２つの異なる試験ペプチドとを含有する。複数の実施形態において、第１の組成物は、２～約１０００の異なる試験ペプチドを含有する。複数の実施形態において、第１の組成物は、１０～約５００の異なる試験ペプチドを含有する。複数の実施形態において、第１の組成物は、５０～約５００の異なる試験ペプチドを含有する。複数の実施形態において、第１の組成物は、１００～約５００の異なる試験ペプチドを含有する。複数の実施形態において、第１の組成物は、１０～約２５０の異なる試験ペプチドを含有する。試験ペプチドの数は、終点を含む、列挙された範囲内の任意の値または部分範囲であり得る。複数の実施形態において、試験ペプチドは、質量分析を介して互いに区別される。
【0110】
複数の実施形態において、試験ペプチドは、約１０００：１～約１：１０００の試験ペプチド対ＭＨＣＩＩ／リガンド複合体の比で第１の組成物中に存在する。複数の実施形態において、試験ペプチドは、約１０００：１～約１：１０の試験ペプチド対ＭＨＣＩＩ／リガンド複合体の比で第１の組成物中に存在する。複数の実施形態において、試験ペプチドは、約１０００：１～約１：１の試験ペプチド対ＭＨＣＩＩ／リガンド複合体の比で第１の組成物中に存在する。複数の実施形態において、試験ペプチドは、約１０００：１～約１０：１の試験ペプチド対ＭＨＣＩＩ／リガンド複合体の比で第１の組成物中に存在する。複数の実施形態において、試験ペプチドは、約１０００：１～約１００：１の試験ペプチド対ＭＨＣＩＩ／リガンド複合体の比で第１の組成物中に存在する。比は、列挙された範囲内の任意の値または部分範囲であり得る。
【0111】
複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＱまたはＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子によってコードされるＨＬＡペプチドを含有する。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ対立遺伝子は、ＨＬＡ－ＤＰである。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ対立遺伝子は、ＨＬＡ－ＤＭである。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ対立遺伝子は、ＨＬＡ－ＤＯである。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ対立遺伝子は、ＨＬＡ－ＤＱである。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ対立遺伝子は、ＨＬＡ－ＤＲである。
【0112】
複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子によってコードされるＨＬＡペプチドを含有し、リガンドはペプチドである。複数の実施形態において、ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢである。複数の実施形態において、ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１である。複数の実施形態において、ＨＬＡ－ＤＲＢ対立遺伝子は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０３：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０７：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０１またはＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１から選択される。いくつかの実施形態において、対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１：０１である。いくつかの実施形態において、対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０３：０１である。いくつかの実施形態において、対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０１である。いくつかの実施形態において、対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０７：０１である。いくつかの実施形態において、対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０１である。いくつかの実施形態において、対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０１である。いくつかの実施形態において、対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０１である。いくつかの実施形態において、対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１である。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０４である。
【0113】
複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ分子／リガンド複合体は、ペプチドであるリガンドを含有する。複数の実施形態において、リガンドペプチドは、以下から選択される。ＰＶＳＫＡＲＭＡＴＧＡＬＡＱＡ（配列番号１）、ＰＶＳＫＭＲＭＡＴＧＡＬＡＱＡ（配列番号２）、またはＰＶＳＫＭＲＭＡＴＰＬＬＭＱＡ（配列番号３）。いくつかの実施形態において、リガンドペプチドは、ＰＶＳＫＡＲＭＡＴＧＡＬＡＱＡ（配列番号１）である。いくつかの実施形態において、リガンドペプチドは、ＰＶＳＫＭＲＭＡＴＧＡＬＡＱＡ（配列番号２）である。いくつかの実施形態において、リガンドペプチドは、ＰＶＳＫＭＲＭＡＴＰＬＬＭＱＡ（配列番号３）である。
【0114】
複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ分子／リガンド複合体は、ペプチドであるリガンドを含有し、ＭＨＣＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、リガンドペプチドはＰＶＳＫＡＲＭＡＴＧＡＬＡＱＡ（配列番号１）であり、ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１：０１である。いくつかの実施形態において、リガンドペプチドはＰＶＳＫＭＲＭＡＴＧＡＬＡＱＡ（配列番号２）であり、ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１：０１である。いくつかの実施形態において、リガンドペプチドはＰＶＳＫＡＲＭＡＴＧＡＬＡＱＡ（配列番号１）であり、ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０３：０１である。いくつかの実施形態において、リガンドペプチドはＰＶＳＫＭＲＭＡＴＧＡＬＡＱＡ（配列番号２）であり、ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０１である。いくつかの実施形態において、リガンドペプチドはＰＶＳＫＭＲＭＡＴＧＡＬＡＱＡ（配列番号２）であり、ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０７：０１である。いくつかの実施形態において、リガンドペプチドはＰＶＳＫＭＲＭＡＴＰＬＬＭＱＡ（配列番号３）であり、ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０１である。いくつかの実施形態において、リガンドペプチドはＰＶＳＫＭＲＭＡＴＧＡＬＡＱＡ（配列番号２）であり、ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０１である。いくつかの実施形態において、リガンドペプチドはＰＶＳＫＭＲＭＡＴＰＬＬＭＱＡ（配列番号３）であり、ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０１である。いくつかの実施形態において、リガンドペプチドはＰＶＳＫＡＲＭＡＴＧＡＬＡＱＡ（配列番号１）であり、ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１である。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０４であり、ペプチドリガンドはＰＶＳＫＭＲＭＡＴＧＡＬＡＱＡ（配列番号２）である。
【0115】
複数の実施形態において、試験ペプチドは、抗原、自己抗原またはネオ抗原に由来する配列を含有する。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、抗原に由来する配列を含有する。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、ネオ抗原に由来する配列を含有する。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、自己抗原に由来する配列を含有する。
【0116】
複数の実施形態において、試験ペプチドは、上記のように、７～３０アミノ酸残基長である。
【0117】
複数の実施形態において、試験ペプチドは、配列番号１～配列番号１６から選択されるアミノ酸配列を含有する。
【0118】
複数の実施形態において、主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）分子に対する試験ペプチドの親和性を検出するための方法であって、（ａ）前記試験ペプチドと、タグ付きＭＨＣＩＩ結合ペプチド（タグ付きペプチド）と、（ｉ）α鎖およびβ鎖を含む前記ＭＨＣＩＩ分子ならびに（ｉｉ）リガンドを含むＭＨＣＩＩ－リガンド複合体とを含む第１の組成物を提供することであって、前記リガンドは、切断可能なリンカーを介して、前記α鎖または前記β鎖に結合している、第１の組成物を提供することと；（ｂ）前記第１の組成物を、前記切断可能なリンカーの切断を引き起こす条件に供することと；（ｃ）第２の組成物を形成するのに十分な期間、前記第１の組成物をインキュベートすることであって、前記第２の組成物は、前記α鎖、前記β鎖、前記リガンド、遊離試験ペプチド、遊離タグ付きペプチド、前記ＭＨＣＩＩ分子と会合した前記タグ付きペプチドを含むＭＨＣＩＩ－タグ付きペプチド複合体、および／または前記ＭＨＣＩＩ分子と会合した前記試験ペプチドを含むＭＨＣＩＩ－試験ペプチド複合体を含む、前記第１の組成物をインキュベートすることと；（ｄ）前記ＭＨＣＩＩ分子が、前記試験ペプチドに結合しているかどうかを決定することとを含む、方法が本明細書において提供される。
【0119】
複数の実施形態において、第１の組成物は、リンカー切断の開始後、少なくとも２４時間～９６時間インキュベートされる。いくつかの実施形態において、第１の組成物は、リンカー切断の開始後２４時間インキュベートされる。いくつかの実施形態において、第１の組成物は、リンカー切断の開始後約２４時間インキュベートされる。いくつかの実施形態において、第１の組成物は、リンカー切断の開始後約４８時間インキュベートされる。いくつかの実施形態において、第１の組成物は、リンカー切断の開始後約７２時間インキュベートされる。いくつかの実施形態において、第１の組成物は、リンカー切断の開始後約９６時間インキュベートされる。インキュベーション時間は、終点を含む、列挙された範囲内の任意の値または部分範囲であり得る。
【0120】
複数の実施形態において、第２の組成物を、前記ＭＨＣＩＩ分子に結合する抗体と接触させる。複数の実施形態において、抗体は、ＭＨＣＩＩ分子に結合する。複数の実施形態において、抗体は、固体表面に固定化される。
【0121】
複数の実施形態において、第２の組成物は、前記ＭＨＣＩＩ分子に結合する抗体と接触し、第２の組成物は、タグ付きペプチドを含有する。複数の実施形態において、タグ付きペプチドは、ＭＨＣＩＩ分子と会合する。
【0122】
複数の実施形態において、タグ付きペプチドは、標識を含有する。複数の実施形態において、タグ付きペプチドは、蛍光標識または生物発光標識を含有する。複数の実施形態において、タグ付きペプチドは、ビオチン標識を含有する。
【0123】
複数の実施形態において、第２の組成物を、前記ＭＨＣＩＩ分子に結合する抗体と接触させる。複数の実施形態において、第２の組成物は、ＭＨＣＩＩ分子およびタグ付きペプチドを含有する。複数の実施形態において、タグ付きペプチドは、蛍光標識または生物発光標識を含有する。複数の実施形態において、タグ付きペプチドは、ビオチン標識を含有する。複数の実施形態において、抗体は、蛍光標識、生物発光標識または基質でタグを付けられる。複数の実施形態において、抗体は、ストレプトアビジン－西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートでタグを付けられる。
【0124】
複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ－タグ付きペプチド複合体が抗体に結合している場合に、試験ペプチドは、ＭＨＣＩＩ対立遺伝子に対して低い親和性を有する。
【0125】
複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ－タグ付きペプチド複合体が抗体に結合していない場合に、試験ペプチドは、ＭＨＣＩＩ対立遺伝子に対して高い親和性を有する。
【0126】
複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ分子に対する試験ペプチドの親和性は、ペプチド交換アッセイによって確認される。複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ分子に対する試験ペプチドの親和性は、ＭＨＣＩＩ分子に対する既知のペプチドの親和性と比較して決定される。
【0127】
複数の実施形態において、タグ付きペプチドは、ヒトＣＬＩＰ配列を含有する。
【0128】
複数の実施形態において、切断可能なリンカーは、ＵＶ切断可能なリンカーまたは酵素切断可能なリンカーである。複数の実施形態において、ペプチドリンカー配列は、酵素切断部位を含有する。複数の実施形態において、酵素切断部位は、トロンビン、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）プロテアーゼ、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎＴＭプロテアーゼ、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、ジペプチジルアミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）、タバコ脈緑斑紋形成ウイルスプロテアーゼ（ＴＶＭＶ（Ｔｏｂａｃｃｏ ｖｅｉｎ ｍｏｔｔｌｉｎｇ ｖｉｒｕｓ））、およびこれらの任意の変異形から選択される。複数の実施形態において、ペプチドリンカー配列は、非天然アミノ酸を含有する。複数の実施形態において、非天然アミノ酸は、ＵＶ切断可能である。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、２－ニトロフェニルグリシン（ＮＰＧ）、拡張型（ｅｘｐａｎｄｅｄ）ｏ－ニトロベンジルリンカー、ｏ－ニトロベンジルケージド（ｃａｇｅｄ）フェノール、ｏ－ニトロベンジルケージドチオール、３２ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）ケージドアニリン、ｏ－ニトロベンジルケージドセレン化物、ビス－アゾベンゼン、クマリン、シンナミル、スピロピラン、２－ニトロフェニルアラニン（２－ｎＦ）および３－アミノ－３－（２－ニトロフェニル）プロピオン酸（ＡＮＰ）アミノ酸アナログから選択される。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、３－アミノ－３－（２－ニトロフェニル）プロピオン酸（ＡＮＰ）である。
【0129】
複数の実施形態において、ペプチドリガンドは、以下の基準のうちの１または複数を満たす：
ａ）ＭＨＣＩＩ鎖での発現中に使用可能な量で産生される；
ｂ）（リンカーの切断後に）２Ｄ ＬＣＭＳにおいて高レベルで検出される；および／または
ｃ）対立遺伝子に対して高い親和性を有することが知られているペプチドとの交換反応において、約２０％～１００％のペプチド交換収率を有する。
ａ）ＭＨＣＩＩ鎖での発現中に使用可能な量で産生される；
ｂ）（リンカーの切断後に）２Ｄ ＬＣＭＳにおいて高レベルで検出される；および／または
ｃ）対立遺伝子に対して高い親和性を有することが知られているペプチドとの交換反応において、約２０％～１００％のペプチド交換収率を有する。
【0130】
複数の実施形態において、試験ペプチドは抗原である。複数の実施形態において、抗原はがん抗原である。複数の実施形態において、抗原は腫瘍関連抗原である。複数の実施形態において、抗原はネオ抗原である。複数の実施形態において、抗原は自己抗原である。
【0131】
複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＰ対立遺伝子、ＨＬＡ－ＤＭ対立遺伝子、ＨＬＡ－ＤＯＡ対立遺伝子、ＨＬＡ－ＤＯＢ対立遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱ対立遺伝子またはＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子によってコードされるＨＬＡペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ対立遺伝子は、ＨＬＡ－ＤＰである。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ対立遺伝子は、ＨＬＡ－ＤＭである。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ対立遺伝子は、ＨＬＡ－ＤＯである。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ対立遺伝子は、ＨＬＡ－ＤＱである。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ対立遺伝子は、ＨＬＡ－ＤＲである。
【0132】
複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子によってコードされるＨＬＡペプチドを含有し、リガンドはペプチドである。複数の実施形態において、ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢである。複数の実施形態において、ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１である。複数の実施形態において、ＨＬＡ－ＤＲＢ対立遺伝子は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０３：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０７：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０４、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０１またはＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１から選択される。いくつかの実施形態において、対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１：０１である。いくつかの実施形態において、対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０３：０１である。いくつかの実施形態において、対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０１である。いくつかの実施形態において、対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０７：０１である。いくつかの実施形態において、対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０１である。いくつかの実施形態において、対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０１である。いくつかの実施形態において、対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０１である。いくつかの実施形態において、対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１である。
【0133】
複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ分子／リガンド複合体は、ペプチドであるリガンドを含有する。複数の実施形態において、リガンドペプチドは、以下から選択される。ＰＶＳＫＡＲＭＡＴＧＡＬＡＱＡ（配列番号１）、ＰＶＳＫＭＲＭＡＴＧＡＬＡＱＡ（配列番号２）、またはＰＶＳＫＭＲＭＡＴＰＬＬＭＱＡ（配列番号３）。いくつかの実施形態において、リガンドペプチドは、ＰＶＳＫＡＲＭＡＴＧＡＬＡＱＡ（配列番号１）である。いくつかの実施形態において、リガンドペプチドは、ＰＶＳＫＭＲＭＡＴＧＡＬＡＱＡ（配列番号２）である。いくつかの実施形態において、リガンドペプチドは、ＰＶＳＫＭＲＭＡＴＰＬＬＭＱＡ（配列番号３）である。
【0134】
複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ分子／リガンド複合体は、ペプチドであるリガンドを含有し、ＭＨＣＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、リガンドペプチドはＰＶＳＫＡＲＭＡＴＧＡＬＡＱＡ（配列番号１）であり、ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１：０１である。いくつかの実施形態において、リガンドペプチドはＰＶＳＫＭＲＭＡＴＧＡＬＡＱＡ（配列番号２）であり、ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１：０１である。いくつかの実施形態において、リガンドペプチドはＰＶＳＫＡＲＭＡＴＧＡＬＡＱＡ（配列番号１）であり、ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０３：０１である。いくつかの実施形態において、リガンドペプチドはＰＶＳＫＭＲＭＡＴＧＡＬＡＱＡ（配列番号２）であり、ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０１である。いくつかの実施形態において、リガンドペプチドはＰＶＳＫＭＲＭＡＴＧＡＬＡＱＡ（配列番号２）であり、ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０７：０１である。いくつかの実施形態において、リガンドペプチドはＰＶＳＫＭＲＭＡＴＰＬＬＭＱＡ（配列番号３）であり、ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０１である。いくつかの実施形態において、リガンドペプチドはＰＶＳＫＭＲＭＡＴＧＡＬＡＱＡ（配列番号２）であり、ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０１である。いくつかの実施形態において、リガンドペプチドはＰＶＳＫＭＲＭＡＴＰＬＬＭＱＡ（配列番号３）であり、ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０１である。いくつかの実施形態において、リガンドペプチドはＰＶＳＫＡＲＭＡＴＧＡＬＡＱＡ（配列番号１）であり、ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１である。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ対立遺伝子はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０４であり、ペプチドリガンドはＰＶＳＫＭＲＭＡＴＧＡＬＡＱＡ（配列番号２）である。
【0135】
多重エピトープマッピング
所与の抗原からＭＨＣＩＩ対立遺伝子に結合する可能性が最も高い（例えば、インビボで結合する可能性が最も高い）ペプチドを決定するために、多重エピトープマッピングを使用することができる。例えば、変異（点変異、インデル等）を含有するネオ抗原は、多数のペプチドのうちの任意のものとしてＭＨＣＩＩによって提示され得る。それぞれの可能なペプチドは、所与のＭＨＣＩＩ対立遺伝子に対して異なる親和性を有する。本明細書に記載される方法は、単一の実行で長い変異ペプチドをマッピングするための多重様式での競合結合および分析を可能にする。異なるペプチドが、ＭＨＣＩＩ分子の結合について競合し、「最良の結合剤」（使用される条件下でＭＨＣＩＩ対立遺伝子への最も高い親和性を有するペプチド）を決定することを可能にする。様々なペプチドの相対的結合親和性も決定され得る。最良の結合剤は、細胞の表面でＭＨＣＩＩによって提示される高い可能性を有する。当業者によって理解されるように、この方法は、本開示の他の箇所に記載されている組成物、ＭＨＣＩＩ分子、ＭＨＣＩＩ－リガンド複合体および方法のいずれをも使用し得る。
所与の抗原からＭＨＣＩＩ対立遺伝子に結合する可能性が最も高い（例えば、インビボで結合する可能性が最も高い）ペプチドを決定するために、多重エピトープマッピングを使用することができる。例えば、変異（点変異、インデル等）を含有するネオ抗原は、多数のペプチドのうちの任意のものとしてＭＨＣＩＩによって提示され得る。それぞれの可能なペプチドは、所与のＭＨＣＩＩ対立遺伝子に対して異なる親和性を有する。本明細書に記載される方法は、単一の実行で長い変異ペプチドをマッピングするための多重様式での競合結合および分析を可能にする。異なるペプチドが、ＭＨＣＩＩ分子の結合について競合し、「最良の結合剤」（使用される条件下でＭＨＣＩＩ対立遺伝子への最も高い親和性を有するペプチド）を決定することを可能にする。様々なペプチドの相対的結合親和性も決定され得る。最良の結合剤は、細胞の表面でＭＨＣＩＩによって提示される高い可能性を有する。当業者によって理解されるように、この方法は、本開示の他の箇所に記載されている組成物、ＭＨＣＩＩ分子、ＭＨＣＩＩ－リガンド複合体および方法のいずれをも使用し得る。
【0136】
一態様において、主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）対立遺伝子に対する多重エピトープマッピングのための方法が本明細書において提供される。複数の実施形態において、本方法は、
ａ）複数の試験ペプチドと、複数のＭＨＣＩＩ－リガンド複合体とを含む第１の組成物を提供することであって、各ＭＨＣＩＩ－リガンド複合体は、（ｉ）α鎖およびβ鎖を含むＭＨＣＩＩ分子と、（ｉｉ）リガンドとを有し、前記リガンドは、切断可能なリンカーを介して前記α鎖または前記β鎖に結合している、第１の組成物を提供することと；
ｂ）前記第１の組成物を、前記切断可能なリンカーの切断を引き起こす条件に供することと；
ｃ）第２の組成物を形成するのに十分な期間、前記第１の組成物をインキュベートすることであって、前記第２の組成物は、前記α鎖、前記β鎖、前記リガンド、遊離試験ペプチドおよび／または複数のＭＨＣＩＩ－試験ペプチド複合体を含み、各ＭＨＣＩＩ－試験ペプチド複合体は、前記ＭＨＣＩＩ分子およびこれに非共有結合的に結合した試験ペプチドを含む、前記第１の組成物をインキュベートすることと；
ｄ）前記複数の試験ペプチドの１または複数が、前記第２の組成物中の前記ＭＨＣＩＩ分子に結合しているかどうかを決定することと
を含む。
ａ）複数の試験ペプチドと、複数のＭＨＣＩＩ－リガンド複合体とを含む第１の組成物を提供することであって、各ＭＨＣＩＩ－リガンド複合体は、（ｉ）α鎖およびβ鎖を含むＭＨＣＩＩ分子と、（ｉｉ）リガンドとを有し、前記リガンドは、切断可能なリンカーを介して前記α鎖または前記β鎖に結合している、第１の組成物を提供することと；
ｂ）前記第１の組成物を、前記切断可能なリンカーの切断を引き起こす条件に供することと；
ｃ）第２の組成物を形成するのに十分な期間、前記第１の組成物をインキュベートすることであって、前記第２の組成物は、前記α鎖、前記β鎖、前記リガンド、遊離試験ペプチドおよび／または複数のＭＨＣＩＩ－試験ペプチド複合体を含み、各ＭＨＣＩＩ－試験ペプチド複合体は、前記ＭＨＣＩＩ分子およびこれに非共有結合的に結合した試験ペプチドを含む、前記第１の組成物をインキュベートすることと；
ｄ）前記複数の試験ペプチドの１または複数が、前記第２の組成物中の前記ＭＨＣＩＩ分子に結合しているかどうかを決定することと
を含む。
【0137】
複数の実施形態において、複数の試験ペプチド中の各試験ペプチドは、第１の組成物中のＭＨＣＩＩ分子の量と比較して準化学量論量で存在する。理論に拘束されるものではないが、これは試験ペプチド間の速度論的競合を許容するが、熱力学的競合は許容しないと予想される。これは、いずれの試験ペプチドが結合することができるかの決定を可能にすると予想されるが、必ずしも最良の結合剤である試験ペプチドではない。
【0138】
複数の実施形態において、複数の試験ペプチド中の各試験ペプチドは、第１の組成物中のＭＨＣＩＩ分子の量と比較して過剰に存在する。理論に拘束されるものではないが、これは、ＭＨＣＩＩ分子に最もよく（例えば、最も高い親和性で）結合する試験ペプチドの決定を可能にすると予想される。
【0139】
複数の実施形態において、複数の試験ペプチドは、抗原の重複するペプチドを含む。複数の実施形態において、複数の試験ペプチドは、単一のタンパク質由来の連続ペプチドを含有する。複数の実施形態において、抗原は、ネオ抗原、腫瘍関連抗原、または自己抗原である。複数の実施形態において、抗原はネオ抗原である。複数の実施形態において、抗原は腫瘍関連抗原である。複数の実施形態において、抗原は自己抗原である。本明細書で使用される「抗原の重複するペプチド」という語句は、抗原または潜在的な抗原の一部に対応するペプチドであって、各ペプチド（またはペプチドのサブセット）が抗原のわずかに異なる一部に対応する、ペプチドを指す。例えば、抗原が配列ＡＢＣＤＥＦＧＨを含む場合、抗原の重複するペプチドには、ＡＢＣ、ＢＣＤ、ＣＤＥ、ＤＥＦ、ＥＦＧ、ＦＧＨおよび／またはＡＢＣＤ、ＢＣＤＥ、ＣＤＥＦ、ＤＥＦＧ、ＥＦＧＨなどが含まれ得る。
【0140】
複数の実施形態において、各試験ペプチドの長さは、７アミノ酸～３０アミノ酸である。長さは、終点を含む列挙された範囲内の任意の値または部分範囲とすることができる。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、７アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、８アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、９アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、１０アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、１１アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、１２アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、１３アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、１４アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、１５アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、１６アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、１７アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、１８アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、１９アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、２０アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、２１アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、２２アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、２３アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、２４アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、２５アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、２６アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、２７アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、２８アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、２９アミノ酸残基長である。いくつかの実施形態において、試験ペプチドは、３０アミノ酸残基長である。
【0141】
複数の実施形態において、複数の試験ペプチドの１または複数へのＭＨＣＩＩ分子結合は、第２の組成物中のＭＨＣＩＩ分子に結合した各試験ペプチドのレベルを測定することによって決定される。複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ分子に結合した各試験ペプチドのレベルは、第２の組成物の２次元液体クロマトグラフィー－質量分析（２Ｄ ＬＣ／ＭＳ）によって測定される。
【0142】
複数の実施形態において、前記方法は、ＭＨＣＩＩ分子と試験ペプチドを区別するための高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および質量分析（ＭＳ）を実行することをさらに含む。複数の実施形態において、試験ペプチドは、各試験ペプチドの質量に基づいて、質量分析によって互いに区別される。
【0143】
複数の実施形態において、２Ｄ ＬＣ／ＭＳは、遊離試験ペプチドおよび／またはリガンドを第２の組成物から除去することを含む。複数の実施形態において、遊離試験ペプチドは、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーによって第２の組成物から除去される。
【0144】
複数の実施形態において、ＨＰＬＣおよびＭＳによって決定される所与の試験ペプチドの存在は、所与の試験ペプチドがＭＨＣＩＩ分子に結合することができることを示す。複数の実施形態において、ＭＨＣＩＩ分子に結合した試験ペプチドの相対的レベルは、ＭＨＣＩＩ分子に対する試験ペプチドの相対的親和性を示す。複数の実施形態において、第２の試験ペプチドと比較して、ＭＨＣＩＩ分子に結合した第１の試験ペプチドのレベルがより低いことは、第１の試験ペプチドが、第２の試験ペプチドより、細胞の表面上のＭＨＣＩＩ分子を結合するより低い可能性を有することを示す。複数の実施形態において、第１の試験ペプチドと比較して、ＭＨＣＩＩ分子に結合した第２の試験ペプチドのレベルがより高いことは、第２の試験ペプチドが、第１の試験ペプチドより、細胞の表面上のＭＨＣＩＩ分子を結合するより高い可能性を有することを示す。
【0145】
複数の実施形態において、少なくとも１つの他の試験ペプチドより高い親和性を有すると決定された試験ペプチドの１または複数は、さらに分析される。例えば、１または複数の試験ペプチドが分析され得る。
【0146】
複数の実施形態において、少なくとも１つの主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）分子を結合するペプチドであって、配列番号１～配列番号１６から選択されるアミノ酸配列を含有する、ペプチド。
【実施例】
【0147】
当業者は、本明細書に記載の粒子の作製および使用の説明が例示のみを目的としており、本開示がこの例示によって限定されないことを理解するであろう。
【0148】
実施例１ ペプチド交換に対するＣＬＩＰ変異形の効果
遺伝的にコードされ、ＨＬＡ－ＤＲβ鎖のＮ末端に融合されたＣＬＩＰペプチドの変異形は、ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子のパネルにわたって強固な発現およびペプチド交換を可能にすることが同定された。ＣＬＩＰペプチドは、トロンビンまたはＴＥＶ切断部位のいずれかを使用した切断によって放出され得、適切な条件下で、ＣＬＩＰペプチドは放出され、候補抗原ペプチドによって交換され得る。ペプチド交換の程度および検証は、本発明の第２の構成要素に記載されている競合ＥＬＩＳＡアッセイまたは２Ｄ－ＬＣＭＳアッセイのいずれかによって決定され得る。
遺伝的にコードされ、ＨＬＡ－ＤＲβ鎖のＮ末端に融合されたＣＬＩＰペプチドの変異形は、ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子のパネルにわたって強固な発現およびペプチド交換を可能にすることが同定された。ＣＬＩＰペプチドは、トロンビンまたはＴＥＶ切断部位のいずれかを使用した切断によって放出され得、適切な条件下で、ＣＬＩＰペプチドは放出され、候補抗原ペプチドによって交換され得る。ペプチド交換の程度および検証は、本発明の第２の構成要素に記載されている競合ＥＬＩＳＡアッセイまたは２Ｄ－ＬＣＭＳアッセイのいずれかによって決定され得る。
【0149】
ＨＥＫ－２９３細胞またはＣＨＯ細胞中で、ＨＬＡ－ＣＬＩＰペプチド融合タンパク質を発現させた。トロンビン－アガロース消化物を用いて、トロンビン認識部位を有するタンパク質－ＣＬＩＰペプチドリンカーを含有する発現されたＨＬＡ融合タンパク質を酵素的にプロセシングした。簡潔に説明すると、予め平衡化されたＺｅｂａＴＭスピンカラムを使用して、約３ｍｇ／ｍＬの切断されていないｐＭＨＣＩＩ融合タンパク質複合体を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、２ｍＭ ＮａＮ３中に緩衝液交換した。ＬＣ／ＭＳによって決定してｐＭＨＣＩＩ融合タンパク質の大部分が切断されるまで、混合しながら、室温で、トロンビン－アガロースの存在下で、交換された複合体をインキュベートした。
【0150】
ＴＥＶ（タバコエッチウイルス）プロテアーゼ認識部位を有するタンパク質－ＣＬＩＰペプチドリンカーを含有する発現されたＨＬＡ融合タンパク質を、ＴＥＶ消化物を使用して酵素的にプロセシングした。簡単に説明すると、約３ｍｇ／ｍＬのｐＨ６～８の切断されていないｐＭＨＣＩＩ融合タンパク質複合体を、約３０μｇのＴＥＶプロテアーゼとともに室温でインキュベートした。ＬＣ／ＭＳによって決定して大部分が切断されるまでｐＭＨＣＩＩ融合タンパク質を消化した。
【0151】
次いで、ｐＭＨＣＩＩ融合タンパク質複合体をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。簡単に説明すると、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を３００ｍＭの最終濃度になるまでｐＭＨＣＩＩ融合タンパク質複合体溶液に添加した。溶液を０．５～１．０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＮａＮ３で平衡化されたＳ－２００ ＳＥＣカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を備えたＦＰＬＣに注入した。カラムを０．５ｍＬ／分で運転し、ＵＶ－Ｖｉｓ分光法（Ｉｍｌｅｎ ＮａｎｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）によって溶出液中の濃度を決定した後、タンパク質を収集した。溶出された精製タンパク質をスピンフィルター（Ａｍｉｃｏｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって約５ｍｇ／ｍＬ未満の濃度にさらに濃縮した。
【0152】
ｐＭＨＣＩＩ融合タンパク質複合体を試験ペプチドと交換した。簡潔に説明すると、４０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＮａＮ３中の約１８μＭ ＣＬＩＰ－ＭＨＣＩＩのマスターミックスを調製した（システイン含有ペプチドについては、０．５ｍＭ ＴＣＥＰを添加した）。５０μＬの反応に対して、５μＬの４ｍＭペプチドを４５μＬのマスターミックスに添加し、混合し、３７℃で６０分間インキュベートした。等体積の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌの添加によって交換反応をクエンチした（最終ｐＭＨＣＩＩ濃度＝８μＭ）。ペプチド交換混合物を１４，０００×ｇで２分間遠心分離して、不溶性ペプチドまたはタンパク質凝集物を除去した。さらなる分析の前に、混合物を４℃で保存し、光から保護した。
【0153】
ＭＨＣＩＩ：ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１：０１に対するより低い親和性ペプチドの使用が報告されているが、実験的検証なしに同定することができなかったいくつかのＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子に対して優れている、使用することができる新規ＣＬＩＰペプチド変異形。さらに、これらの変異形は、ペプチド交換も可能にしながら、強固なタンパク質発現を可能にする。
【0154】
実施例２ ビオチン化四量体形成
ＢｉｒＡビオチンタンパク質リガーゼを介して、ｐＭＨＣＩＩ融合タンパク質複合体をビオチン化した。簡潔に説明すると、１００ｍＭ酢酸マグネシウム、１０ｍＭ ＡＴＰ、５ｍＭビオチンおよび約３ｍｇ／ｍＬ ｐＭＨＣＩＩを含有する反応混合物を調製した。１．３ｍｇ／ｍＬのＦＬＡＧ－ＢｉｒＡを添加することによって反応を開始させ、室温で一晩インキュベートした。
ＢｉｒＡビオチンタンパク質リガーゼを介して、ｐＭＨＣＩＩ融合タンパク質複合体をビオチン化した。簡潔に説明すると、１００ｍＭ酢酸マグネシウム、１０ｍＭ ＡＴＰ、５ｍＭビオチンおよび約３ｍｇ／ｍＬ ｐＭＨＣＩＩを含有する反応混合物を調製した。１．３ｍｇ／ｍＬのＦＬＡＧ－ＢｉｒＡを添加することによって反応を開始させ、室温で一晩インキュベートした。
【0155】
次いで、ビオチン化ｐＭＨＣＩＩ融合タンパク質複合体をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。簡単に説明すると、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を３００ｍＭの最終濃度になるまでビオチン化ｐＭＨＣＩＩ融合タンパク質複合体溶液に添加した。溶液を０．５～１．０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＮａＮ３で平衡化されたＳ－２００ ＳＥＣカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を備えたＦＰＬＣに注入した。カラムを０．５ｍＬ／分で運転し、ＵＶ－Ｖｉｓ分光法（Ｉｍｌｅｎ ＮａｎｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）によって溶出液中の濃度を決定した後、タンパク質を収集した。溶出された精製タンパク質をスピンフィルター（Ａｍｉｃｏｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって約５ｍｇ／ｍＬ未満の濃度にさらに濃縮した。
【0156】
ビオチン化ｐＭＨＣＩＩ融合タンパク質複合体を試験ペプチドと交換した。簡潔に説明すると、４０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＮａＮ３中の約１８μＭ ＣＬＩＰ－ＭＨＣＩＩのマスターミックスを調製した（システイン含有ペプチドについては、０．５ｍＭ ＴＣＥＰを添加した）。５０μＬの反応に対して、５μＬの４ｍＭペプチドを４５μＬのマスターミックスに添加し、混合し、３７℃で６０分間インキュベートした。等体積の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌの添加によって交換反応をクエンチした（最終ｐＭＨＣＩＩ濃度＝８μＭ）。ペプチド交換混合物を１４，０００×ｇで２分間遠心分離して、不溶性ペプチドまたはタンパク質凝集物を除去した。精製され、ペプチド交換されたビオチン化ｐＭＨＣＩＩをストレプトアビジン－フルオロフォア（２：１ ｐＭＨＣＩＩ対ストレプトアビジン－フィコエリトリン（ｐｈｙｒｏｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ））に添加し、完全に混合した。分析用ＳＥＣによる分析の前に、混合物を４℃で保存し、光から保護した。
【0157】
精製され、ビオチン化された、ペプチド交換されたｐＭＨＣＩＩ融合タンパク質－ストレプトアビジン複合体を評価して、各混合物におけるビオチン化の程度を決定した。簡潔に説明すると、分析用ＳＥＣを介して、注入ごとに以下の混合物を分析した：２×ｐＭＨＣＩＩ：２０μＬの８μＭ ｐＭＨＣＩ－ビオチン、１０μＬ ＰＢＳ、２×ｐＭＨＣＩＩ、１×ＰＥ－ＳＡｖ：２０μＬの８μＭ ｐＭＨＣＩＩ－ビオチン、５．５μＬの０．２ｍｇ／ｍＬストレプトアビジン－フィコエリトリン（ｐｈｙｒｏｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）（ＳＡｖ－ＰＥ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、４．５μＬ ＰＢＳおよび１×ＰＥ－ＳＡｖ：１０μＬの８μＭ ｐＭＨＣＩＩ－ビオチン、５．５μＬの０．２ｍｇ／ｍＬ ＳＡｖ－ＰＥ、１４．５μＬ ＰＢＳ。０．６５ｍＬ／分の流速で走行させて、１×ＰＢＳで平衡化された分析用ＳＥＣカラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ）を備えたＨＰＬＣで混合物を測定した。
【0158】
実施例３ ＭＨＣＩＩペプチド結合剤を特定するための２Ｄ ＬＣ－ＭＳアッセイ：
このアッセイは、ＭＨＣＩＩ複合体に対するペプチド交換アッセイ後にペプチド結合剤を特定する。ペプチド交換プロセスの質量分析に基づく分析は、まず、分析前に溶液中のＭＨＣＩＩ複合体を遊離ペプチドから分離することに依存する。ここでは、まず、ＳＥＣカラムに試料を流し、次いで、ＭＨＣＩＩ複合体に対応するピークのみを、質量分析のために第２のＨＰＬＣカラムに注入する２Ｄ ＬＣ－ＭＳ分析方法を記載する。これにより、単一工程でのＭＨＣＩＩ試薬の完全な分析が可能となる。このプロセスを使用して、１度に単一のペプチド結合剤を特定することができるか、またはペプチドのより大きなプール内で複数のペプチドを特定することができる。
このアッセイは、ＭＨＣＩＩ複合体に対するペプチド交換アッセイ後にペプチド結合剤を特定する。ペプチド交換プロセスの質量分析に基づく分析は、まず、分析前に溶液中のＭＨＣＩＩ複合体を遊離ペプチドから分離することに依存する。ここでは、まず、ＳＥＣカラムに試料を流し、次いで、ＭＨＣＩＩ複合体に対応するピークのみを、質量分析のために第２のＨＰＬＣカラムに注入する２Ｄ ＬＣ－ＭＳ分析方法を記載する。これにより、単一工程でのＭＨＣＩＩ試薬の完全な分析が可能となる。このプロセスを使用して、１度に単一のペプチド結合剤を特定することができるか、またはペプチドのより大きなプール内で複数のペプチドを特定することができる。
【0159】
２Ｄ ＬＣ－ＭＳ分析の第１の次元はサイズ排除クロマトグラフィーである。ここで使用した構成は、Ｚｅｎｉｘ ＳＥＣ－１００、３μｍ、１００Å、４．６×５０ｍｍカラムを備えたＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズ）であり、３０℃で０．４ｍＬ／分の流量で実行した。カラムを平衡化し、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＮａＮ３中で実行した。収集した溶出液は、ハートストリングカットオフを使用して２．４３～２．８８分に溶出し、続いて分析の第２の次元に転換させた。
【0160】
第２の次元の２Ｄ ＬＣ－ＭＳ分析は逆相クロマトグラフィーである。ここで使用した構成は、カラム温度８０℃で、０．５５ｍＬ／分の流量で走行する、５％緩衝液Ｂで平衡化されたＰＬＲＰ－Ｓ、８μｍ、１０００Å、２．１×５０ｍｍ逆相カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を備えたＨＰＬＣであった。さらに、サイクルモジュレーション時間は８分、ループ容積は１８０μＬ、ディバータバルブスイッチ時間は２分であった。グラジエントを使用して、注入されたペプチドおよびタンパク質を溶出し、緩衝液Ａは水中の０．０５％トリフルオロ酢酸であり、緩衝液Ｂはアセトニトリル中の０．０５％トリフルオロ酢酸であった。グラジエントは以下のとおりであった：０．００分～５．０％緩衝液Ｂ、２．００分～５．０％緩衝液Ｂ、６．７０分～５０．０％緩衝液Ｂ、６．７１分～９５．０％緩衝液Ｂ、７．６０分～９５％緩衝液Ｂおよび７．６１分～５．０％緩衝液Ｂ。
【0161】
拡張されたダイナミックレンジおよび二重ＥＳＩイオン源を有するＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ６２２４ ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳに溶出液を注入した。簡単に説明すると、質量分析計の設定は、正のイオン極性、キャリアガス温度、３５０℃、乾燥ガス流量１３Ｌ／分、ネブライザー圧力４５ｐｓｉ、スキマー電圧６５Ｖ、ＯＣＴ １ＲＦ ＶＰＰ７５０ＶおよびＶｃａｐ４０００Ｖであった。取得質量範囲は最小１００ｍ／ｚおよび最大３０００ｍ／ｚであり、取得速度は１．０３スペクトル／秒、９７０．９ｍｓ／スペクトル、およびトランジェント／スペクトル、９６７９であった。
【0162】
試料の種類および得られた吸光度／カウント範囲は以下のとおりであった。簡潔に説明すると、２０μＬの８μＭ（約０．５ｍｇ／ｍＬ）ペプチド－ＭＨＣＩＩをＬＣ－ＭＳの実行ごとに注入した。２０μＬの交換されていない８μＭ ＣＬＩＰ－ＭＨＣＩＩを注入する場合、第１の次元における２８０ｎｍでの吸光度は１５０～２００ｍＡＵの範囲内であり、第２の次元においては、ＣＬＩＰのＥＩＣ（Ｍ＋Ｈ、Ｍ＋２Ｈ、Ｍ＋３Ｈ）は約１０＾５カウントであった。注入された２０μＬの９５％超交換されたペプチド－ＭＨＣＩＩについては、ＣＬＩＰのＥＩＣは約１０＾３カウントであった。部分的な交換は、遠心分離後にペプチド交換反応から回収されたタンパク質の量に応じて、ＥＩＣを１０＾４～１０＾３カウントに低下させた。１６μＭ ＭＨＣＩＩおよび４００μＭペプチドの濃度で、低ＣＬＩＰ－ＭＨＣＩＩ試料を注入した。
【0163】
実施例４ 変異特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の同定。
ＭＣ３８結腸直腸癌腫マウス細胞株から同定された変異（Ｙａｄａｖ Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ２０１４）が、２４アミノ酸（ＡＡ）長の変異されたペプチドを使用して、動物研究におけるワクチン接種時に変異特異的Ｔ細胞応答を誘導する能力についてスクリーニングされた（Ｃａｐｉｅｔｔｏ ＡＨら、ＪＥＭ、２０２０および未公開データ）。次いで、変異を含む４つの重複する１５アミノ酸ペプチドを用いて、免疫原性変異からのペプチドライブラリーを設計し、合成した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）。上記の２Ｄ－ＬＣＭＳ法を使用して、ＩＡｂ分子への結合について各ペプチドを試験した。結合ペプチドの特異的なＴ細胞認識を確認するために、０日目および１０日目に、２４ＡＡ長ペプチド（ｎ＝３、１００μｇ／マウス；腹腔内注射）およびアジュバント（ポリ（ＩＣ）、１００μｇ／マウス、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎおよび抗ＣＤ４０抗体、５０μｇ／マウス、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を健康なＷＴ Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）にワクチン接種した。最後のワクチン接種の５日後に脾臓を採取し、処理して単一細胞懸濁液を得た。次いで、完全ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％グルタメート）中の、各１５ＡＡペプチド（１μｇ／ｍＬ）、２４ＡＡペプチド（１０μｇ／ｍＬ）とともに、または対照としてペプチドなしで一晩インキュベートした全脾細胞（５ １０＾５細胞）を用いたマウスＩＦＮ－γＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｅ）を使用して、Ｔ細胞応答を決定した。製造者の説明書に従って、ＩＦＮｇスポットを明らかにした。最後に、ＩＡｂ分子への結合（２Ｄ－ＬＣＭＳ）および免疫原性（ＥＬＩＳｐｏｔ）の両方を示すペプチドを使用して四量体を形成し、ワクチン接種されたマウスおよび対照としてのワクチン接種されていないマウスからの脾細胞（１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中２０μｇ／ｍＬ、暗所、室温（ＲＴ）で１時間）に対するフローサイトメトリーによって、染色について試験した。
ＭＣ３８結腸直腸癌腫マウス細胞株から同定された変異（Ｙａｄａｖ Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ２０１４）が、２４アミノ酸（ＡＡ）長の変異されたペプチドを使用して、動物研究におけるワクチン接種時に変異特異的Ｔ細胞応答を誘導する能力についてスクリーニングされた（Ｃａｐｉｅｔｔｏ ＡＨら、ＪＥＭ、２０２０および未公開データ）。次いで、変異を含む４つの重複する１５アミノ酸ペプチドを用いて、免疫原性変異からのペプチドライブラリーを設計し、合成した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）。上記の２Ｄ－ＬＣＭＳ法を使用して、ＩＡｂ分子への結合について各ペプチドを試験した。結合ペプチドの特異的なＴ細胞認識を確認するために、０日目および１０日目に、２４ＡＡ長ペプチド（ｎ＝３、１００μｇ／マウス；腹腔内注射）およびアジュバント（ポリ（ＩＣ）、１００μｇ／マウス、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎおよび抗ＣＤ４０抗体、５０μｇ／マウス、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を健康なＷＴ Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）にワクチン接種した。最後のワクチン接種の５日後に脾臓を採取し、処理して単一細胞懸濁液を得た。次いで、完全ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％グルタメート）中の、各１５ＡＡペプチド（１μｇ／ｍＬ）、２４ＡＡペプチド（１０μｇ／ｍＬ）とともに、または対照としてペプチドなしで一晩インキュベートした全脾細胞（５ １０＾５細胞）を用いたマウスＩＦＮ－γＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｅ）を使用して、Ｔ細胞応答を決定した。製造者の説明書に従って、ＩＦＮｇスポットを明らかにした。最後に、ＩＡｂ分子への結合（２Ｄ－ＬＣＭＳ）および免疫原性（ＥＬＩＳｐｏｔ）の両方を示すペプチドを使用して四量体を形成し、ワクチン接種されたマウスおよび対照としてのワクチン接種されていないマウスからの脾細胞（１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中２０μｇ／ｍＬ、暗所、室温（ＲＴ）で１時間）に対するフローサイトメトリーによって、染色について試験した。
【0164】
図１１Ａ～１１Ｃに一例として示されているＭＣ３８腫瘍細胞からの変異１１２からのマウスのワクチン接種から得られた結果。図１１Ａは、重複するペプチドライブラリーを示す。図１１Ｂは、ＰＥフルオロフォア標識を有するリガンドとしてペプチド７７８８－５を有する四量体概略図、および得られたフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析を示す。ワクチン接種されたマウスの全脾臓からの脾細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（２０μｇ／ｍＬ、１００μＬ）中、暗所にてＲＴで１時間、ｐＩＡｂ（７７８８－５）四量体で染色し、２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、製造業者の指示に従って抗ＰＥマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で染色した。次いで、磁性ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）によって四量体陽性細胞を濃縮し、４℃で２０分間、表面抗体および生／死染色について染色した。次いで、細胞を２００μＬで２回洗浄し、ＢＤ－Ｓｙｍｐｈｏｎｙフローサイトメーターで取得して、活性化された（ＣＤ４４＋）四量体＋ＣＤ４ Ｔ細胞を検出した。ワクチン接種されていないマウスからの総脾細胞を陰性対照として使用した。図１１Ｃは、ペプチドＭ１１２＿７７８８－５、Ｍ１１２＿７７８８－６、Ｍ１１２＿７７８８－７、Ｍ１１２＿７７８８－８およびＭ１１２＿２４マーの、マウスにおけるインビボワクチン接種について得られたＥＬＩＳｐｏｔアッセイを示す。ペプチド７７８８－５および２４ＡＡペプチドのみが、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて、ワクチン接種されたマウスからの特異的ＣＤ４ Ｔ細胞による認識後にＩＦＮ－γスポットを示した。
【0165】
実施例５ 多重化エピトープマッピング
この質量分析に基づくアッセイは、ＭＨＣＩＩ複合体に対するペプチド交換アッセイ後にペプチド結合剤を同定する。ここでは、ビオチン化組換えＭＨＣＩＩタンパク質と複合体を形成する交換されたペプチドを濃縮するための自動化された免疫沈降アプローチが記載されている。Ａｇｉｌｅｎｔ ＡｓｓａｙＭＡＰストレプトアビジンカートリッジ（ｃａｔ Ｇ５４９６－６００１０、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）にペプチド－ＭＨＣＩＩ複合体をロードする。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｒａｖｏ ＡｓｓａｙＭＡＰシステムを使用して、ストレプトアビジンが結合したペプチド－ＭＨＣＩＩ複合体からペプチドを酸溶出する。ペプチド溶出液を逆相Ｃ１８カラムにロードした後、下流のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために、Ｔｈｅｒｍｏ ｔｒｉｂｒｉｄ ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計内に直接勾配溶出する。関心対象のｍ／ｚに対応する質量分析からのピークを選択してそれらの存在を確認し、曲線下面積の値を計算して、全てのペプチドが１－１モル比で存在した対照試料シグナルの値と比較した結合親和性を決定する。
この質量分析に基づくアッセイは、ＭＨＣＩＩ複合体に対するペプチド交換アッセイ後にペプチド結合剤を同定する。ここでは、ビオチン化組換えＭＨＣＩＩタンパク質と複合体を形成する交換されたペプチドを濃縮するための自動化された免疫沈降アプローチが記載されている。Ａｇｉｌｅｎｔ ＡｓｓａｙＭＡＰストレプトアビジンカートリッジ（ｃａｔ Ｇ５４９６－６００１０、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）にペプチド－ＭＨＣＩＩ複合体をロードする。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｒａｖｏ ＡｓｓａｙＭＡＰシステムを使用して、ストレプトアビジンが結合したペプチド－ＭＨＣＩＩ複合体からペプチドを酸溶出する。ペプチド溶出液を逆相Ｃ１８カラムにロードした後、下流のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために、Ｔｈｅｒｍｏ ｔｒｉｂｒｉｄ ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計内に直接勾配溶出する。関心対象のｍ／ｚに対応する質量分析からのピークを選択してそれらの存在を確認し、曲線下面積の値を計算して、全てのペプチドが１－１モル比で存在した対照試料シグナルの値と比較した結合親和性を決定する。
【0166】
図１２は、単一の交換での、ＨｕｍｉｒａおよびＲｅｍｉｃａｄｅ可変ドメインからの１５０ペプチドライブラリーのペプチド結合の多重化分析を示す。
【0167】
図１３は、競合的ペプチド交換アッセイの概略図である。低親和性含有ペプチドは、切断可能なリンカーを介してＭＨＣＩＩ分子に共有結合している。リンカーは、標識された高親和性ペプチドおよび試験ペプチドのプールの存在下で切断され、低親和性ペプチドが交換される。図示されている３つの結果は以下のとおりである。ＭＨＣＩＩ分子は高親和性ペプチドを結合し、検出され、ＭＨＣＩＩ分子は試験ペプチドを結合し、検出されず、および／またはＭＨＣＩＩ複合体はペプチドを結合することができなくなり、検出されない。
【0168】
実施例６ ハイスループットＥＬＩＳＡ競合アッセイ
ペプチド交換：１１０ｎＭのＭＨＣＩＩ／低親和性ＣＬＩＰおよび５６ｎＭまたは２８ｎＭのビオチン化高親和性ｈｕＣＬＩＰ（ｈｕＣＬＩＰ－ｂｉｏ）を含有するマスターミックスを交換緩衝液（４０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ５．０）中に調製した。３８４ウェルプレート中で、１００％エチレングリセロール（ＥＧ）中４ｍＭのペプチドストックを最初に４００μＭに希釈し、続いてＢｉｏＭｅｋシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ、ｉ７）で１００％エチレングリセロール中に、３倍、１１点段階希釈して、４０００００ｎＭ～０．３８ｎＭの濃度範囲を有する１０×中間希釈標準溶液を生成した。エチレングリセロール（ペプチドなし）を陰性対照として使用した。９０μＬのマスターミックスおよび１０μＬの予め滴定されたペプチドを各ウェルに移すことによって、３８４ウェルのディープウェルプレート中で、ペプチド交換を行った。最終ペプチド反応ミックスは、１００ｎＭ ＭＨＣＩＩ／低親和性ＣＬＩＰ、５０または２５ｎＭ ｈｕＣＬＩＰ－ｂｉｏおよび４００００ｎＭ～０．０３８ｎＭの範囲の試験ペプチドを含有していた。次いで、プレートを密封し、３７℃で４８～７０時間インキュベートしてペプチド交換させた。インキュベーションを完了した後、プレートを遠心沈殿させ、５０μＬ／ウェルの中和緩衝液（４００ｍＭ ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を含有する新しい３８４ウェルプレートのウェルに５０μＬ／ウェルの反応ミックスを移すことによって反応ミックスを中和した。
ペプチド交換：１１０ｎＭのＭＨＣＩＩ／低親和性ＣＬＩＰおよび５６ｎＭまたは２８ｎＭのビオチン化高親和性ｈｕＣＬＩＰ（ｈｕＣＬＩＰ－ｂｉｏ）を含有するマスターミックスを交換緩衝液（４０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ５．０）中に調製した。３８４ウェルプレート中で、１００％エチレングリセロール（ＥＧ）中４ｍＭのペプチドストックを最初に４００μＭに希釈し、続いてＢｉｏＭｅｋシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ、ｉ７）で１００％エチレングリセロール中に、３倍、１１点段階希釈して、４０００００ｎＭ～０．３８ｎＭの濃度範囲を有する１０×中間希釈標準溶液を生成した。エチレングリセロール（ペプチドなし）を陰性対照として使用した。９０μＬのマスターミックスおよび１０μＬの予め滴定されたペプチドを各ウェルに移すことによって、３８４ウェルのディープウェルプレート中で、ペプチド交換を行った。最終ペプチド反応ミックスは、１００ｎＭ ＭＨＣＩＩ／低親和性ＣＬＩＰ、５０または２５ｎＭ ｈｕＣＬＩＰ－ｂｉｏおよび４００００ｎＭ～０．０３８ｎＭの範囲の試験ペプチドを含有していた。次いで、プレートを密封し、３７℃で４８～７０時間インキュベートしてペプチド交換させた。インキュベーションを完了した後、プレートを遠心沈殿させ、５０μＬ／ウェルの中和緩衝液（４００ｍＭ ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を含有する新しい３８４ウェルプレートのウェルに５０μＬ／ウェルの反応ミックスを移すことによって反応ミックスを中和した。
【0169】
競合ＥＬＩＳＡ：コーティング緩衝液（０．０５Ｍ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）中１０μｇ／ｍＬの、２５μＬ／ウェルのマウスＩｇＧ２ａ抗ＨＬＡ－ＤＲ１ Ｌ２４３モノクローナル抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、ＰＵＲ８５６０１）で３８４ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｎｕｎｃ＃４６４７１８）をコーティングした。４℃で一晩インキュベートし、洗浄緩衝液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ緩衝液）でプレートを３回洗浄した後、５０μＬ／ウェルのブロック緩衝液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、１５ｐｐｍ Ｐｒｏｃｌｉｎ）を添加し、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、２５μＬの中和されたペプチド交換反応試料を適切なウェルに移した。プレートを、室温で２時間インキュベートし、プレートを洗浄緩衝液で６回洗浄することによって、未結合の成分を除去した。次いで、２５ｎｇ／ｍＬの、アッセイ希釈液（ＰＢＳ ０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１５ｐｐｍ Ｐｒｏｃｌｉｎ、ｐＨ７．４）中の２５μＬ／ウェルの西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化ストレプトアビジン（ＨＲＰ－ＳＡ）を添加することによって、結合したＭＨＣＩＩ／ペプチド複合体を検出し、室温で１時間インキュベートした。６回洗浄してＨＲＰ－ＳＡを除去した後、酵素反応を、ペルオキシダーゼ基質であるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Ｍｏｓｓ Ｉｎｃ．カタログ番号１０００）で発色させ、室温で１５分間インキュベートした。２５μＬ／ウェルの１Ｍリン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｃｉｄ）で反応を停止させ、Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）において参照６３０ｎＭを使用して、吸収度を４５０ｎｍで測定した。試験ペプチドを含まないＨＬＡ－ＤＲＢ１／低親和性ＣＬＩＰおよびビオチン化高親和性ｈｕＣＬＩＰを含有する試料を、各対立遺伝子に対する陰性対照として使用した。ペプチドの結合親和性をランク付けするために、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．４．３中のＯｎｅ－ｓｉｔｅ－Ｆｉｔ ｌｏｇＩＣ５０モデルを使用して、各ペプチドのＩＣ５０を決定した。
【0170】
異なるＤＲＢ１対立遺伝子にわたってｈｕＣＬＩＰ－ｂｉｏの濃度を最適化するために、低結合ＣＬＩＰとともに１００ｎＭのＤＲＢ１対立遺伝子を含有する反応ミックスにおいて２０，０００ｎＭ～０．０２ｎＭの最終濃度範囲が得られるようにｈｕＣＬＩＰ－ｂｉｏを滴定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．４．３中の、ヒル勾配を有する飽和特異的結合のカーブフィッティングモデルを用いて、ＢｍａｘおよびＫｄを決定した。
【0171】
上記の明細書において言及される全ての刊行物は、参照により本明細書に組み入れられる。本発明の記載される方法および系の様々な修正形態および変化形態が、本発明の範囲および趣旨を逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して記載されているが、特許請求された発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際に、生化学およびバイオテクノロジーまたは関連分野の当業者には自明である本発明を実施するための記載される様式の様々な修正形態は、特許請求の範囲内にあることが意図される。
【0172】
配列
参考文献
１．Ｙａｄａｖ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｔｕｍｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｅｘｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１４）Ｎｏｖ ２７；５１５（７５２８）：５７２－６。
２．Ｃａｐｉｅｔｔｏ，Ａ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｉｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（２０２０）Ａｐｒ ６；２１７（４）：ｅ２０１９０１７９。
【表1】
参考文献
１．Ｙａｄａｖ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｔｕｍｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｅｘｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１４）Ｎｏｖ ２７；５１５（７５２８）：５７２－６。
２．Ｃａｐｉｅｔｔｏ，Ａ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｉｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（２０２０）Ａｐｒ ６；２１７（４）：ｅ２０１９０１７９。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図15D】
【図15E】
【図15F】
【図15G】
【図16】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図18D】
【図18E】
【図18F】
【図19A】
【図19B】
【図19C】
【図19D】
【図20A】
【図20B】
【図21】
【図22】
【図23A】
【図23B】
【図23C】
【図23D】
【図23E】
【図24A】
【図24B】
【図24C】
【図24D】
【図24E】
【図25A】
【図25B】
【図25C】
【図25D】
【図25E】
【図26A】
【図26B】
【図26C】
【図26D】
【図27A】
【図27B】
【図27C】
【図27D】
【図27E】
【図28A】
【図28B】
【図28C】
【図28D】
【図28E】
【配列表】
【国際調査報告】