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特表2024-537688ニコチンアミドリボシドトリオレエートクロリド、この化合物を含む組成物、並びにこの化合物の製造方法及び使用方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-16
(54)【発明の名称】ニコチンアミドリボシドトリオレエートクロリド、この化合物を含む組成物、並びにこの化合物の製造方法及び使用方法
(51)【国際特許分類】
A23L 33/10 20160101AFI20241008BHJP
A23L 2/52 20060101ALI20241008BHJP
【ＦＩ】
A23L33/10
A23L2/00 F
A23L2/52
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024517435
(86)(22)【出願日】2022-09-30
(85)【翻訳文提出日】2024-03-19
(86)【国際出願番号】 EP2022077247
(87)【国際公開番号】W WO2023052573
(87)【国際公開日】2023-04-06
(31)【優先権主張番号】63/250,362
(32)【優先日】2021-09-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】590002013
【氏名又は名称】ソシエテ・デ・プロデュイ・ネスレ・エス・アー
(71)【出願人】
【識別番号】508065732
【氏名又は名称】コーネル ユニヴァーシティー
(74)【代理人】
【識別番号】100088155
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 芳樹
(74)【代理人】
【識別番号】100140453
【弁理士】
【氏名又は名称】戸津 洋介
(74)【代理人】
【識別番号】100200540
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 祐子
(72)【発明者】
【氏名】ヤン， ビング
(72)【発明者】
【氏名】ウハイル， ゲルハルト
(72)【発明者】
【氏名】ウースター， ティモシー ジェイムズ
(72)【発明者】
【氏名】モコ， ソフィア
(72)【発明者】
【氏名】ザレイ， アミン
(72)【発明者】
【氏名】カズドゥーズ， レイラ
(72)【発明者】
【氏名】エナヤティヌーク， モジタバ
(72)【発明者】
【氏名】マダルシャヒアン， サラ
(72)【発明者】
【氏名】アッバスプーラド， アリレザ
【テーマコード（参考）】
4B018
4B117
【Ｆターム（参考）】
4B018LB08
4B018LE05
4B018MD15
4B018MD18
4B018ME01
4B018ME03
4B018ME10
4B018ME14
4B018MF02
4B117LC04
4B117LK06
4B117LK10
4B117LL06
(57)【要約】
ニコチンアミドリボシドトリオレエートクロリド（ＮＲＴＯＣｌ）は、ニコチンアミドリボシドクロリドの新規な疎水性誘導体である。経口投与用に処方された組成物、好ましくは、容器に密封されたレディ・トゥ・ドリンク（ＲＴＤ）飲料などの飲料、又は希釈液で再構成して再構成飲料を形成するために処方された粉末において、使用することができる。
【選択図】 なし
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ニコチンアミドリボシドトリオレエートクロリド（ＮＲＴＯＣｌ）。
【請求項2】
ニコチンアミドリボシドトリオレエートクロリド（ＮＲＴＯＣｌ）と、任意にタンパク質、脂質、炭水化物、ビタミン、又はミネラルのうちの少なくとも１つとを含む、組成物。
【請求項3】
前記組成物が、経口投与用に処方され、好ましくは、容器に密封されたレディ・トゥ・ドリンク（ＲＴＤ）飲料などの飲料、又は希釈剤で再構成して再構成飲料を形成するために処方された粉末である、請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
ニコチンアミドリボシドトリオレエートクロリド（ＮＲＴＯＣｌ）を含む組成物の単位投与形態であって、前記単位投与形態が、該単位投与形態が投与される個体にとって治療有効量又は予防有効量のＮＲＴＯＣｌを含む、単位投与形態。
【請求項5】
組成物の製造方法であって、前記方法が、ニコチンアミドリボシドトリオレエートクロリド（ＮＲＴＯＣｌ）を少なくとも１つの他の成分に添加することを含む、方法。
【請求項6】
前記組成物が経口投与用に処方され、前記少なくとも１つの他の成分が食用である、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
細胞及び組織におけるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）の細胞内レベルの増加を促進する方法であって、前記方法が、ニコチンアミドリボシドトリオレエートクロリド（ＮＲＴＯＣｌ）を、個体、好ましくは必要とする個体、より好ましくは中高年者又はヒト高齢者に投与することを含む、方法。
【請求項8】
ＤＮＡ損傷もしくはミトコンドリア損傷のうちの少なくとも１つを減少させ、及び／又は（ａ）神経変性状態；（ｂ）過体重又は肥満；（ｃ）心臓疾患などの循環器疾患；（ｄ）糖尿病、高インスリン血症、インスリン抵抗性障害、又はインスリン非感受性のうちの１つ以上；（ｄ）筋肉変性；（ｅ）加齢に関連する疾患又は障害；（ｆ）ＨＩＶ、Ｂ型肝炎、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＣＯＶＩＤ－１９などのウイルス感染；（ｇ）ストレス；（ｈ）血液凝固障害；（ｉ）炎症；（ｊ）がん；（ｋ）眼障害；及び（ｌ）潮紅からなる群から選択される少なくとも１つの状態を治療又は予防する方法であって、前記方法が、必要とする対象又はリスクがある対象に、ニコチンアミドリボシドトリオレエートクロリド（ＮＲＴＯＣｌ）を投与することを含む、方法。
【請求項9】
対象の体重を減少させる及び／又は対象における体重増加を予防する方法であって、前記方法が、必要とする対象又はリスクがある対象に、ニコチンアミドリボシドトリオレエートクロリド（ＮＲＴＯＣｌ）を投与することを含む、方法。
【請求項10】
薬物毒性及び／又は薬物有害反応を治療又は予防する方法であって、前記方法が、必要とする対象又はリスクがある対象に、ニコチンアミドリボシドトリオレエートクロリド（ＮＲＴＯＣｌ）を投与することを含む、方法。
【請求項11】
前記組成物が、エマルジョンであり、好ましくは、水中油型エマルジョンであって、ＮＲＴＯＣｌの少なくとも一部が分散され、且つ任意にカゼインナトリウム又はレシチンのうちの少なくとも１つなどの乳化剤が分散された油相を含む、水中油型エマルジョンである、請求項５～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記油相が、前記ＮＲＴＯＣｌの少なくとも一部が分散している、キャノーラ油、コーン油、又は中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）油のうちの少なくとも１つを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記組成物が、前記個体に少なくとも１週間、毎日投与される、請求項５～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記個体が、ヒト乳児、ヒト小児、ヒト青年、ヒト成人、及びヒト高齢者、並びにコンパニオンアニマルなどの動物からなる群から選択される、請求項５～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記組成物が、経口投与される、好ましくは、飲料として、例えば、投与前に開封される容器に密封されたレディ・トゥ・ドリンク（ＲＴＤ）飲料として、又は投与前に再構成飲料を形成するために希釈液で再構成するように処方された粉末として経口投与される、請求項５～１３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［背景技術］
[0001]本開示は、一般に、ニコチンアミドリボシドクロリドの新規の疎水性誘導体、即ち、ニコチンアミドリボシドトリオレエートクロリド（ＮＲＴＯＣｌ）に関する。本開示は更に、この化合物を製造及び使用する方法、並びにこの化合物を含む組成物、例えば飲料などの液体組成物にも関する。
[0001]本開示は、一般に、ニコチンアミドリボシドクロリドの新規の疎水性誘導体、即ち、ニコチンアミドリボシドトリオレエートクロリド（ＮＲＴＯＣｌ）に関する。本開示は更に、この化合物を製造及び使用する方法、並びにこの化合物を含む組成物、例えば飲料などの液体組成物にも関する。
【0002】
[0002]ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）は、酸化還元反応によるエネルギー代謝及びミトコンドリア機能における重要な補酵素である１，２。非酸化還元反応では、ＮＡＤ＋は、２つの必須タンパク質ファミリー、サーチュイン（ＳＩＲＴ）及びポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の活性を調節するための重要な補因子である３～５。サーチュインは、核、ミトコンドリア、細胞質、又は代謝恒常性を維持するいくつかの重要な役割を有する。ＰＡＲＰの最も重要な役割は、ＤＮＡの修復、並びにクロマチンの構造及び機能の維持である３～５。
【0003】
[0003]ＮＡＤ＋レベルは老化の過程で減少し、この減少が核及びミトコンドリアの機能に欠陥をもたらし、多くの加齢関連症状をもたらす６～１０。ＮＡＤ＋前駆体の補充は、ＮＡＤ＋レベルを回復させ、神経変性疾患及び循環器疾患並びに代謝障害を含む多くの加齢関連疾患を予防することができる１１～１７。最近の研究では、ＮＡＤ＋をブーストすることが、肝臓がん治療の予防及び治療に役立ち得ることが示されている１８。
【0004】
[0004]ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）は最も重要なＮＡＤ＋前駆体の１つであり、経口投与可能であり、哺乳動物細胞におけるＮＡＤ＋のレベルを２倍までブーストすることができる１７、１９。ＮＲはより少ない工程でＮＡＤ＋へと代謝されるので、ナイアシン及びニコチンアミドなどの他のＮＡＤ＋前駆体よりも効率がよい。（図１）１９。
【0005】
[0005]複数の研究により、ＮＲの補充が、多くの動物及びヒト、特に中年及び中高年者において多くの健康上の利益を示すことが確認されている。例えば、ＮＲの補充は、ＤＮＡ及びミトコンドリア損傷２０、アルツハイマー病２１、肥満２２～２４、糖尿病２４、２５、筋肉変性７、及び老化２６を減少させることができる。ＮＲの補充は、新しく母親になった人たち（ｎｅｗ ｍｏｔｈｅｒｓ）の乳汁の分泌及び授乳行動を向上させるだけでなく、母体から母乳への栄養素の移動を促して母乳の質も改善する１３。研究はまた、ＮＲがＨＩＶ及びＢ型肝炎に対して抗ウイルス効果を示すことを実証した２６。
【0006】
[0006]病原体、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＣＯＶＩＤ－１９によって引き起こされる感染症は、ＮＡＤ＋レベルを劇的に低下させ、免疫反応の異常をもたらす２６。ＮＲの使用は、ＮＡＤ＋レベルを一定に保ち、ＣＯＶＩＤ－１９の感染に対する抵抗を助け、感染症と戦うべく自然免疫応答を活性化させる２６、２７。
【0007】
［発明の概要］
[0007]ニコチンアミドリボシドクロリド（ＮＲＣｌ）は、カプセル形態でＮｉａｇｅｎ（商標）として市販されているＮＲの塩化物塩である。ＮＲＣｌは、ＮＡＤ＋レベルをブーストするために米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された安全な栄養補助剤として使用される２８。ＮＲを使用及び保管する際の課題の１つには、加水分解に対する固有の不安定性がある。ＮＲは、その構造から水溶液中で自然に開裂してニコチンアミド及びＤ－リボース分解生成物を生じることができる、反応性のＮ－グリコシド結合を含む第四級アンモニウム塩である。結果として、ＮＲを含有するレディ・トゥ・ドリンク（ＲＴＤ）飲料を開発することは困難である（図２）。
[0007]ニコチンアミドリボシドクロリド（ＮＲＣｌ）は、カプセル形態でＮｉａｇｅｎ（商標）として市販されているＮＲの塩化物塩である。ＮＲＣｌは、ＮＡＤ＋レベルをブーストするために米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された安全な栄養補助剤として使用される２８。ＮＲを使用及び保管する際の課題の１つには、加水分解に対する固有の不安定性がある。ＮＲは、その構造から水溶液中で自然に開裂してニコチンアミド及びＤ－リボース分解生成物を生じることができる、反応性のＮ－グリコシド結合を含む第四級アンモニウム塩である。結果として、ＮＲを含有するレディ・トゥ・ドリンク（ＲＴＤ）飲料を開発することは困難である（図２）。
【0008】
[0008]本明細書に記載される実験例は、ＮＲＣｌとオレオイルクロリドとの反応による、新規の疎水性ＮＲＣｌ誘導体としてのニコチンアミドリボシドトリオレエートクロリド（ＮＲＴＯＣｌ）の合成を報告する（図３）。この新規化合物は、ＮＲＣｌとは対照的に水に可溶性ではないが、室温でキャノーラ油、コーン油、及び中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）油に容易に溶解される。３５℃でＮＲＣｌ及びＮＲＴＯＣｌの水中安定性を試験したところ、結果から、ＮＲＴＯＣｌがＮＲＣｌよりも８８倍安定であることが確認された。
【0009】
[0009]ＮＲＴＯＣｌはキャノーラ油に容易に溶解したことから、食用乳化剤としてカゼインナトリウムを存在させて、ＮＲＴＯＣｌをキャノーラ油に溶解させることによって水中油型エマルジョンを作製した。このエマルジョンにおいてＮＲＴＯＣｌの安定性は非常に増加し、ＮＲＴＯＣｌは、３５℃の温度では同じ条件下のＮＲＣｌと比較してエマルジョン中で２１３倍安定であった。最後に、模擬腸相における消化性を試験することによってＮＲＴＯＣｌの生物学的利用能を調査した。結果は、模擬腸相中、ブタのパンクレアチンの存在下で、ＮＲＴＯＣｌが消化可能であり（例えば、１～１０％又は更には１～２０％）、ＮＲを遊離することを実証する。得られたこれらの結果は、ＮＲＴＯＣｌが、レディ・トゥ・ドリンク（ＲＴＤ）飲料などの飲料にＮＲブースターとして使用するのに有望であり得ることを示す。
【0010】
[0010]更に、追加の実験例において示されるように、ＮＲＴＯＣｌ中の長鎖脂肪酸の特定用途は、良好な溶解性を示さなかったニコチンアミドリボシドトリブチラートクロリド（ＮＲＴＢＣｌ）中の短鎖脂肪酸よりも有利である。
【0011】
[0011]更なる特徴及び利点が本明細書において記述されており、以下の図面、及び発明を実施するための形態から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】哺乳動物細胞におけるＮＲのＮＡＤ＋への変換の概要を説明する概略図である。
【図2】ＮＲの加水分解の概要を説明する概略図である。
【図3】本明細書に開示されるように、オレオイルクロリドを使用したＮＲＴＯＣｌの合成の概要を説明する概略図である。
【図4】本明細書に開示される実験例、特にＮＲＴＯＣｌのＦＴ－ＩＲの結果を示すグラフである。
【図5】本明細書に開示される実験例、特にＣＤＣｌ３中のＮＲＴＯＣｌの１Ｈ ＮＭＲの結果を示すグラフである。
【図6】本明細書に開示される実験例、特にＮＲＴＯＣｌの１Ｈ ＮＭＲ結果を拡大して示すグラフである。
【図7】本明細書に開示される実験例、特にＣＤＣｌ３中のＮＲＴＯＣｌの１３Ｃ ＮＭＲ結果を示すグラフである。
【図8】本明細書に開示される実験例、特にＮＲＴＯＣｌの１３Ｃ ＮＭＲ結果を拡大して示すグラフである。
【図10A】本明細書に開示される実験例からの結果を示す写真である。図１０Ａは、水中に分散されたＮＲＴＯＣｌであり、図１０Ｂ及び図１０Ｃは、水中に分散されたＮＲＴＯＣｌの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像である。
【図10B】本明細書に開示される実験例からの結果を示す写真である。図１０Ａは、水中に分散されたＮＲＴＯＣｌであり、図１０Ｂ及び図１０Ｃは、水中に分散されたＮＲＴＯＣｌの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像である。
【図10C】本明細書に開示される実験例からの結果を示す写真である。図１０Ａは、水中に分散されたＮＲＴＯＣｌであり、図１０Ｂ及び図１０Ｃは、水中に分散されたＮＲＴＯＣｌの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像である。
【図11】本明細書に開示される実験例、特に、３５℃のＤＩ水中でのＮＲＴＯＣｌ及びＮＲＣｌの安定性についての結果を示すグラフである。
【図12】Ｎ－グリコシド結合からのＮＲＴＯ＋及びＮＲ＋の加水分解の概要を説明する概略図である。
【図13】ＮＲＴＯＣｌが水中に分散されたときの、水と接触している外層中のＮＲＴＯＣｌナノ粒子の加水分解の概要を説明する概略図である。
【図14】本明細書中に開示される第１の実験例、具体的には、３５℃で、２６日間の加水分解安定性を、ＮＲＴＯＣｌエマルジョンと、ＮＲＣｌエマルジョン又は水中ＮＲＣｌとで比較した結果を示すグラフである。
【図15】本明細書中に開示される第１の実験例、具体的には、２５℃で、４２日間の加水分解安定性を、ＮＲＴＯＣｌエマルジョンと、水中ＮＲＣｌとで比較した結果を示すグラフである。
【図16】模擬腸相におけるＮＲＴＯ＋の消化の概要を説明する概略図である。
【図17A】本明細書に開示される第１の実験例、具体的には遊離したＮＲＣｌのＳＲＭ ＬＣ－ＭＳ結果を示すグラフである。図１７Ａは、遊離したＮＲＣｌのＳＲＭ ＬＣであり、図１７Ｂは、遊離したＮＲＣｌの質量スペクトルである。
【図17B】本明細書に開示される第１の実験例、具体的には遊離したＮＲＣｌのＳＲＭ ＬＣ－ＭＳ結果を示すグラフである。図１７Ａは、遊離したＮＲＣｌのＳＲＭ ＬＣであり、図１７Ｂは、遊離したＮＲＣｌの質量スペクトルである。
【図18】本明細書に開示される第２の実験例からニコチンアミドリボシドトリブチラートクロリド（ＮＲＴＢＣｌ）のＦＴ－ＩＲを示す。
【図19】本明細書に開示される第２の実験例からＣＤＣｌ３中のＮＲＴＢＣｌの１Ｈ ＮＭＲを示す。
【図20】本明細書に開示される第２の実験例からＣＤＣｌ３中のＮＲＴＢＣｌの１３Ｃ ＮＭＲを示す。
【図22A】本明細書に開示される第２の実験例から水中のＮＲＴＢＣｌのサイズ測定を示す。
【図22B】本明細書に開示される第２の実験例から水中のＮＲＴＢＣｌのサイズ測定を示す。
【図22C】本明細書に開示される第２の実験例から水中のＮＲＴＢＣｌのサイズ測定を示す。
【図23】本明細書に開示される第２の実験例から、３５℃で６日間のＮＲＴＢＣｌのＭｉｌｌｉＱ（ＭＱ）水中安定性を示す。
【0013】
［発明を実施するための形態］
[0035]定義
[0036]以下、いくつかの定義を示す。しかしながら定義が以下の「実施形態」の項にある場合もあり、上記の見出し「定義」は、「実施形態」の項におけるそのような開示が定義ではないことを意味するものではない。
[0035]定義
[0036]以下、いくつかの定義を示す。しかしながら定義が以下の「実施形態」の項にある場合もあり、上記の見出し「定義」は、「実施形態」の項におけるそのような開示が定義ではないことを意味するものではない。
【0014】
[0037]本明細書に記載する全ての百分率は、別途記載のない限り、組成物の総重量によるものである。本明細書で使用するとき、「約」、「およそ」、及び「実質的に」は、数値のある範囲内、例えば、参照数字の－１０％から＋１０％の範囲内、好ましくは参照数字の－５％から＋５％の範囲内、より好ましくは、参照数字の－１％から＋１％の範囲内、最も好ましくは参照数字の－０．１％から＋０．１％の範囲内の数を指すものと理解される。本明細書における全ての数値範囲は、その範囲内の全ての整数又は分数を含むと理解されるべきである。更に、これらの数値範囲は、この範囲内の任意の数又は数の部分集合を対象とする請求項をサポートすると解釈されたい。例えば、１～１０という開示は、１～８、３～７、１～９、３．６～４．６、３．５～９．９などの範囲をサポートするものと解釈されたい。
【0015】
[0038]本開示及び添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、文脈上別段の指示がない限り、複数の指示対象も含まれる。したがって、例えば、「ビタミン（ａ ｖｉｔａｍｉｎ又はｔｈｅ ｖｉｔａｍｉｎ）」への言及は、単一のビタミンを有する実施形態と、２種以上のビタミンを有する実施形態との両方を包含する。
【0016】
[0039]用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含んでいる／備えている（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、排他的なものではなく、他を包含し得るものとして解釈されるべきである。同様にして、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「又は（ｏｒ）」は全て、そのような解釈が文脈から明確に妨げられない限りは、他を包含し得るものであると解釈されるべきである。しかしながら、本明細書に開示されている組成物は、本明細書において具体的に開示されていない要素を含まない場合がある。したがって、「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を用いた実施形態の開示は、特定されている構成要素「を本質的に含む／から本質的に構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」実施形態、及び特定されている構成要素「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」実施形態の開示を含む。
【0017】
[0040]「Ｘ又はＹのうちの少なくとも１つ」及び「Ｘ及び／又はＹ」のそれぞれの文脈において使用される「のうちの少なくとも１つ」及び「及び／又は」という用語は、「Ｘ」若しくは「Ｙ」又は「Ｘ及びＹ」として解釈されるべきである。例えば、「カゼインナトリウム又はレシチンのうちの少なくとも１つ」及び「カゼインナトリウム及び／又はレシチン」は、「レシチンを含まないカゼインナトリウム」若しくは「カゼインナトリウムを含まないレシチン」、又は「カゼインナトリウム及びレシチンの両方」として解釈されるべきである。
【0018】
[0041]本明細書において使用する場合、用語「例」及び「例えば～など（ｓｕｃｈ ａｓ）」は、その後に用語の列挙が続くときは特に、単に例示的かつ説明的なものにすぎず、排他的又は包括的なものとみなされるべきではない。本明細書で使用される場合、別の状態「と関連付けられる」又は「とリンクされる」状態は、その状態が同時に生じることを意味する。
【0019】
[0042]「予防」は、状態又は障害のリスク、発生率及び／又は重症度の低減を含む。用語「処置／治療」及び「処置／治療する」には、対象とする病的状態又は障害の発症を遅らせる治療と、治癒的治療、治療的治療、又は疾患修飾的治療も含まれ、例えば、診断された病的状態又は障害の治癒、遅延、症状の軽減、及び／又は進行の停止のための治療的手段、並びに、疾患に罹患する危険性がある患者、又は疾患に罹患した疑いのある患者、及び体調不良の患者、又は疾患若しくは医学的状態に罹患していると診断された患者の治療が含まれる。用語「処置／治療」及び「処置／治療する」は、対象が全快するまで治療することを必ずしも意味するものではない。用語「処置／治療」及び「処置／治療する」はまた、１つ以上の主たる予防手段又は治療手段の相乗作用、又はそうでない場合強化を含むことも目的としている。非限定的な例として、処置／治療は、患者、介護者、医師、看護師、又は別の医療専門家によって行うことができる。
【0020】
[0043]本明細書で使用するとき、予防又は治療上の「有効量」は、個体において、欠乏を防ぐ量、疾患若しくは医学的状態を治療する量、又は、より全般的には、個体に対して、症状を低減する量、疾患の進行を管理する量、若しくは栄養学上の利益、生理学上の利益若しくは医療上の利益を提供する量である。相対的な用語「促進する」、「改善する」、「増加させる」、「増強する」などの用語は、ＮＲＴＯＣｌの代わりにニコチンアミドリボシドクロリドを用いること以外は同様に処方された組成物の特性及び効果と比較した、本明細書に開示される組成物（ＮＲＴＯＣｌを含む）並びにその特性及び効果の優位性を指す。
【0021】
[0044]本明細書で使用するとき、用語「食品」、「食品製品」、及び「食品組成物」とは、ヒト又は他の哺乳動物による経口摂取を意図し、かつヒト又は他の哺乳動物のための少なくとも１つの栄養素を含む、製品又は組成物を意味する。
【0022】
[0045]本明細書で使用するとき、「栄養組成物」及び「栄養製品」は、製品における機能上の必要性に基づき、かつ適用され得る全ての規制を完全に遵守して、任意の数の食品原材料及び場合により任意選択的な追加の原材料を含む。任意選択的な原材料は、例えば、１種類以上の酸味料、追加の増粘剤、ｐＨ調節用緩衝液若しくはｐＨ調節剤、キレート剤、着色剤、乳化剤、賦形剤、香味料、ミネラル、浸透剤、製薬上許容可能な担体、防腐剤、安定剤、糖、甘味料、調質剤及び／又はビタミン類などの従来の食品添加物を含み得るが、これらに限定されない。任意選択の原材料は、任意の好適な量で添加することができる。
【0023】
[0046]本明細書で使用するとき、「単位剤形」という用語は、ヒト対象及び動物対象のための投与量単位として好適な、物理的に小分けされた単位を指し、各単位は、任意に、製薬上許容可能な希釈剤、担体、又はビヒクルとともに、所望の効果をもたらすのに十分な量の、予め定められた量の、本明細書に開示される組成物を含有する。単位剤形の仕様は、使用される具体的な化合物、達成しようとする効果、及び宿主体内の各化合物に関連する薬力学によって決まる。
【0024】
[0047]「対象」又は「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。用語「高齢」は、ヒトに関連して、少なくとも６０歳、好ましくは６３歳超、より好ましくは６５歳超、最も好ましくは７０歳超の年齢を意味する。ヒトの文脈での「中高年者（ｏｌｄｅｒ ａｄｕｌｔ）」という用語は、４５歳以上、好ましくは５０歳より上、より好ましくは５５歳より上の出生後年齢を意味し、高齢者を含む。
【0025】
[0048]実施形態
[0049]本開示の態様は、ニコチンアミドリボシドトリオレエートクロリド（ＮＲＴＯＣｌ）、及びＮＲＴＯＣｌを含む組成物、例えば、飲料などの液体組成物を含む。組成物は、経口投与のために処方された食品製品又は他の栄養組成物であり得る。組成物は、ＮＲＴＯＣｌが分散されているエマルジョンを含み得る。例えば、エマルジョンは、ＮＲＴＯＣｌの少なくとも一部が分散している油相を含み得る。いくつかの実施形態では、油は、キャノーラ油、コーン油、又はＭＣＴ油のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、油相は、乳化剤、例えば、カゼインナトリウム又はレシチンのうちの少なくとも１つ（特に好ましい実施形態では、好ましくは両方）を更に含む。
[0049]本開示の態様は、ニコチンアミドリボシドトリオレエートクロリド（ＮＲＴＯＣｌ）、及びＮＲＴＯＣｌを含む組成物、例えば、飲料などの液体組成物を含む。組成物は、経口投与のために処方された食品製品又は他の栄養組成物であり得る。組成物は、ＮＲＴＯＣｌが分散されているエマルジョンを含み得る。例えば、エマルジョンは、ＮＲＴＯＣｌの少なくとも一部が分散している油相を含み得る。いくつかの実施形態では、油は、キャノーラ油、コーン油、又はＭＣＴ油のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、油相は、乳化剤、例えば、カゼインナトリウム又はレシチンのうちの少なくとも１つ（特に好ましい実施形態では、好ましくは両方）を更に含む。
【0026】
[0050]別の態様は、ＮＲＴＯＣｌ（例えば、その有効量）、又はＮＲＴＯＣｌ（例えば、その有効量）を含む組成物を個体に投与することによって、例えば、細胞及び組織の生存を改善するために、細胞及び組織におけるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）の細胞内レベルの増加を促進する方法である。個体は、中高年者又は高齢者であり得る。
【0027】
[0051]更に別の態様は、ＤＮＡの損傷もしくはミトコンドリアの損傷のうちの少なくとも１つを減少させる方法、及び／又は（ａ）神経変性状態；（ｂ）過体重又は肥満；（ｃ）心臓疾患などの循環器疾患；（ｄ）糖尿病、高インスリン血症、インスリン抵抗性障害、又はインスリン非感受性のうちの１つ以上；（ｄ）筋肉変性；（ｅ）加齢に関連する疾患又は障害；（ｆ）ＨＩＶ、Ｂ型肝炎、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＣＯＶＩＤ－１９などのウイルス感染；（ｇ）ストレス；（ｈ）血液凝固障害；（ｉ）炎症；（ｊ）がん；（ｋ）眼障害；及び（ｌ）潮紅からなる群から選択される少なくとも１つの状態を治療又は予防する方法である。本方法は、ＮＲＴＯＣｌ（例えば、その有効量）、又はＮＲＴＯＣｌ（例えば、その有効量）を含む組成物を、必要とする対象又はリスクがある対象に投与することを含む。
【0028】
[0052]「神経学的状態」という用語は、神経系の障害を指す。神経学的状態は、病気又は傷害によって脳、脊柱又は神経に損傷が生じた結果であり得る。神経学的状態の症状の非限定的な例としては、麻痺、筋力低下、協調運動不良、感覚喪失、てんかん／痙攣発作、混乱、疼痛及び意識レベルの変化が挙げられる。接触、圧力、振動、四肢の位置、熱さ、冷たさ、及び疼痛に対する反応の他、反射を評価することで、対象において神経系に障害が生じているかを判断することができる。
【0029】
[0053]いくつかの神経学的状態は生涯にわたるものであり、その発症はいかなる時点においても経験され得る。脳性麻痺などのその他の神経学的状態は、出生時から存在する。デュシェンヌ型筋ジストロフィーなどのいくつかの神経学的状態は、一般に幼児期に顕在化するが、アルツハイマー病及びパーキンソン病などの他の神経学的状態は、主に高齢者が罹患する。いくつかの神経学的状態は、頭部損傷若しくは脳卒中、又は脳及び脊椎のがんなどの損傷又は病気によって突然発症する。
【0030】
[0054]一実施形態において、神経学的状態は、脳の外傷性損傷の結果である。更に、又はあるいは、神経学的状態は、脳又は筋肉におけるエネルギー欠乏の結果である。
【0031】
[0055]神経学的状態の例としては、片頭痛、記憶障害、加齢による記憶障害、脳損傷、ニューロリハビリテーション、脳卒中及び脳卒中後、アミロイド側索硬化症、多発性硬化症、認知障害、軽度認知障害（ＭＣＩ）、集中治療後認知障害、加齢による認知障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、先天性代謝異常症（グルコーストランスポーター１欠損症症候群及びピルビン酸脱水素酵素複合体欠損症など）、双極性障害、統合失調症並びに／又はてんかんが挙げられる。
【0032】
[0056]本発明の化合物、組成物、及び方法は、上記の神経学的状態の予防及び／又は治療に、特に脳又は神経系機能の維持又は改善に、有益であり得ることが理解され得る。
【0033】
[0057]「糖尿病」は、高血糖又はケトアシドーシス、並びに長期の高血糖状態又は耐糖能低下から生じる慢性の一般的な代謝異常を指す。「糖尿病」には、この疾患のＩ型及びＩＩ型（インスリン非依存型真性糖尿病又はＮＩＤＤＭ）の両方が包含される。糖尿病の危険因子としては、次の因子：ウエストが男性で４０インチ超又は女性で３５インチ超であること、血圧が１３０／８５ｍｍＨｇ以上であること、トリグリセリドが１５０ｍｇ／ｄＬ超であること、空腹時血糖が１００ｍｇ／ｄＬ超であること、又は高密度リポタンパク質が男性で４０ｍｇ／ｄＬ未満若しくは女性で５０ｍｇ／ｄＬ未満であること、を挙げることができるが、これらに限定されない。
【0034】
[0058]「高インスリン血症」という用語は、個体における血中インスリンレベルが正常よりも高い状態を指す。
【0035】
[0059]「インスリン抵抗性」という用語は、正常なインスリン量では、インスリン抵抗性を有さない対象における生体反応と比較して正常に満たない生体反応を示す状態を指す。
【0036】
[0060]本明細書で記載される「インスリン抵抗性障害」は、インスリン抵抗性によって引き起こされるか、又はインスリン抵抗性が寄与する任意の疾患又は状態を指す。例としては、糖尿病、肥満、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性症候群、シンドロームＸ、インスリン抵抗性、血圧上昇、高血圧、高血中コレステロール、脂質異常症、高脂血症、脂質異常症、脳卒中を含むアテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患又は心筋梗塞、高血糖、高インスリン血症及び／又は高プロインスリン血症、耐糖能障害、インスリン放出の遅延、糖尿病性合併症、例えば、冠動脈心疾患、狭心症、うっ血性心不全、脳卒中、認知症における認知機能、網膜症、末梢神経障害、腎症、糸球体腎炎、糸球体硬化症、ネフローゼ症候群、高血圧性腎硬化症、いくつかの種類のがん（例えば、子宮内膜がん、乳がん、前立腺がん、及び結腸がん）、妊娠の合併症、女性のリプロダクティブ・ヘルス不良（例えば、月経不順、不妊症、不規則な排卵、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ））、リポジストロフィー、コレステロールに関連する障害（例えば、胆石、胆嚢炎、及び胆石症）、痛風、閉塞性睡眠時無呼吸症及び呼吸障害、骨関節炎、及び骨量低下（骨粗鬆症）の予防及び処置が挙げられる。
【0037】
[0061]「過体重」の個体は、少なくとも２５以上の体格指数（ＢＭＩ）を有し、「肥満」の個体は、少なくとも３０以上の体格指数（ＢＭＩ）を有する。過体重及び肥満は、インスリン抵抗性と関連してもしなくてもよい。
【0038】
[0062]いくつかの実施形態では、がんを治療又は予防する方法は、ＮＲＴＯＣｌ（例えば、その有効量）、又はＮＲＴＯＣｌ（例えば、その有効量）を含む組成物を、必要とする対象又はリスクがある対象に投与することを含み、例えば、イノシン５’一リン酸脱水素酵素を阻害すること、及び／又はがんを含む細胞中のＮＡＤ＋の量を減少させることによるものである。
【0039】
[0063]「がん」は、未分化細胞の増殖を特徴とする悪性新生物を伴う様々な細胞性疾患のいずれかを意味する。罹患細胞が実際には周囲の組織に侵入し、新しい身体部位に転移するであろうことは意図されない。がんは、身体の任意の組織に関与し、各身体領域において多くの異なる形態を有し得る。殆どのがんは、原発する細胞又は臓器のタイプにちなんで命名される。
【0040】
[0064]がんは、膵臓がん；子宮内膜がん；肺の小細胞がん及び非小細胞がん（扁平上皮がん、腺がん、及び大細胞がんを含む）；頭頸部の扁平上皮細胞がん；膀胱がん、卵巣がん、子宮頸がん、乳がん、腎臓がん、ＣＮＳがん、及び結腸がん；骨髄性白血病及びリンパ性白血病；リンパ腫；肝腫瘍；甲状腺髄様がん；多発性骨髄腫；黒色腫；網膜芽細胞腫；並びに軟組織及び骨の肉腫からなる群から選択することができる。任意で、ＮＲＴＯＣｌは、別の化学療法剤と組み合わせて、例えば同じ組成物で投与される。
【0041】
[0065]別の態様は、対象の体重を減少させる方法、又は対象における体重増加を予防する方法である。本方法は、ＮＲＴＯＣｌ（例えば、その有効量）又はＮＲＴＯＣｌ（例えば、その有効量）を含む組成物を、必要とする対象又はリスクがある対象に投与することを含む。
【0042】
[0066]更に別の態様は、薬物毒性及び／又は薬物有害反応を治療又は予防する方法である。本方法は、ＮＲＴＯＣｌ（例えば、その有効量）又はＮＲＴＯＣｌ（例えば、その有効量）を含む組成物を、必要とする対象又はリスクがある対象、例えば、スタチンなどの薬物を同時に投与された対象に投与することを含む。
【0043】
[0067]「薬物有害反応」は、有害であり、意図されず、予防、診断、又は治療のための用量で生じる、薬物に対する任意の反応を意味し、副作用、毒性、高感受性、薬物相互作用、合併症、又は他の特異性を含む。副作用は、多くの場合、薬物の血清中治療濃度による、意図しない臓器系に対する薬理学的効果によって生じる、有害な症状である（例えば、抗コリン作用を有する抗ヒスタミン剤によるかすみ目）。毒性副作用は、薬物への過剰な又は長期の化学的曝露によって生じる有害症状又は他の効果（例えば、ジギタリス毒性、肝臓毒性）である。高感受性は、免疫介在性の有害反応（例えば、アナフィラキシー、アレルギー）である。薬物相互作用は、他の薬物、食物、又は疾患状態（例えば、ワルファリン及びエリスロマイシン、シサプリド及びグレープフルーツ、ロペラミド及びクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）腸炎）との相互作用から生じる有害作用である。合併症は、薬物によって引き起こされる疾患（例えば、ＮＳＡＩＤに起因した胃潰瘍、エストロゲンに起因した血栓症）である。薬物有害反応は、既知又は未知の機序によって介される場合がある（例えば、クロラムフェニコール又はクロザピンに関連する無顆粒球症）。このような薬物有害反応は、当該技術分野で周知の対象の観察、アッセイ、又は動物モデルによって特定することができる。
【0044】
[0068]一実施形態では、ＮＲＴＯＣｌは、サーチュインタンパク質のレベル及び／又は活性を減少させるために使用され、次の化合物：ニコチンアミド（ＮＡＭ）、スラニム（ｓｕｒａｎｉｍ）；ＮＦ０２３（Ｇ－タンパク質アンタゴニスト）；ＮＦ２７９（プリン受容体アンタゴニスト）；トロロックス（６－ヒドロキシ－２，５，７，８，テトラメチルクロマン－２－カルボン酸）；（－）－エピガロカテキン（ヒドロキシは３，５，７，３’，４’，５’位にある）；（－）－エピガロカテキンガレート（ヒドロキシは５，７，３’，４’，５’位にあり、ガレートエステルは３位にある）；シアニジンクロリド（３，５，７，３’，４’－ペンタヒドロキシフラビリウムクロリド）；デルフィニジンクロリド（３，５，７，３’，４’，５’－ヘキサヒドロキシフラビリウムクロリド）；ミリセチン（カンナビスセチン；３，５，７，３’，４’，５’－ヘキサヒドロキシフラボン）；３，７，３’，４’，５’－ペンタヒドロキシフラボン；ゴッシペチン（３，５，７，８，３’，４’－ヘキサヒドロキシフラボン）、シルチノール；及びスプリトマイシンのうちの１つ以上とともに投与され得る。
【0045】
[0069]ＮＲＴＯＣｌは、ヒト又は動物、特にコンパニオンアニマル、ペット、又は家畜に投与され得る。この組成物はいずれの年齢層にも有益な効果を有する。好ましくは、組成物は、乳児、若年者、成人、又は高齢者に投与するために処方される。
【0046】
[0070]好ましくは、ＮＲＴＯＣｌは、飲料で個体に経口投与され、単位投与形態は予め決められた量の飲料（例えば、有効量のＮＲＴＯＣｌを含む予め決められた量の飲料）である。
【0047】
[0071]いくつかの実施形態では、サプリメントは、容器内のレディ・トゥ・ドリンク（ＲＴＤ）飲料であってもよく、単位投与形態は、経口投与のために開封される容器内に密封された予め決められた量のＲＴＤ飲料である。例えば、予め決められた量のＲＴＤ飲料は、有効量のＮＲＴＯＣｌを含むことができる。ＲＴＤ飲料は、任意の更なる原材料を追加せずとも経口摂取することができる液体である。
【0048】
[0072]他の実施形態では、本方法は、ＮＲＴＯＣｌを含む粉末の単位投与形態を、水又はミルクなどの希釈液で再構成して、その後個体に経口投与される（例えば、再構成後約１０分以内、再構成後約５分以内、又は再構成後約１分以内）飲料を形成することを含む。粉末の単位投与形態は、再構成及びその後の経口投与のために開封することができる小袋又は他のパッケージ中に密封することができる。
【0049】
[0073]サプリメントの単位投与形態は、賦形剤、乳化剤、安定剤、及びそれらの混合物を含有し得る。
【0050】
[0074]ＮＲＴＯＣｌは、１週間に少なくとも１日、好ましくは１週間に少なくとも２日、より好ましくは１週間に少なくとも３日若しくは４日（例えば、１日おき）、最も好ましくは１週間に少なくとも５日、１週間に６日、又は１週間に７日、投与することができる。投与期間は、少なくとも１週間、好ましくは少なくとも１カ月間、より好ましくは少なくとも２カ月間、最も好ましくは少なくとも３カ月間、例えば、少なくとも４カ月間であり得る。
【0051】
[0075]一実施形態では、投与は少なくとも毎日であり、例えば、対象は１日に１回以上投与を受けてもよい。いくつかの実施形態では、投与は、個体の残りの寿命にわたって継続される。他の実施形態では、投与は、医学的状態について検出可能な症状がなくなるまで行われる。具体的な実施形態では、投与は、少なくとも１つの症状について検出可能な改善が生じるまで行われ、更なる場合においては、寛解を維持するために継続される。
【0052】
[0076]前述の開示を考慮して、本明細書で提供される実施形態はＮＲＴＯＣｌである。別の実施形態は、ＮＲＴＯＣｌと、任意にタンパク質、脂質、炭水化物、ビタミン、又はミネラルのうちの少なくとも１つとを含む組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は経口投与用に処方され、好ましくは、容器に密封されたレディ・トゥ・ドリンク（ＲＴＤ）飲料などの飲料、又は希釈液で再構成して再構成飲料を形成するために処方された粉末である。
【0053】
[0077]別の実施形態は、ＮＲＴＯＣｌを含む組成物の単位投与形態であり、該単位投与形態は、単位投与形態が投与される個体にとって治療有効量又は予防有効量のＮＲＴＯＣｌを含む。
【0054】
[0078]更に別の実施形態は、組成物を作製する方法であり、該方法は、ＮＲＴＯＣｌを少なくとも１つの他の成分に添加することを含む。いくつかの実施形態では、組成物は経口投与用に処方され、少なくとも１つの他の成分は食用である。
【0055】
[0079]これらの方法のいくつかの実施形態では、組成物は、エマルジョンであり、好ましくは、水中油型エマルジョンであって、ＮＲＴＯＣｌの少なくとも一部が分散され、且つ任意にカゼインナトリウム又はレシチンのうちの少なくとも１つなどの乳化剤が分散された油相を含む。油相は、ＮＲＴＯＣｌの少なくとも一部が分散している、キャノーラ油、コーン油、又は中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）油のうちの少なくとも１つを含むことができる。
【0056】
[0080]これらの方法のいくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１週間にわたって個体に毎日投与される。これらの方法のいくつかの実施形態では、個体は、ヒト乳児、ヒト小児、ヒト青年、ヒト成人、及びヒト高齢者、並びにコンパニオンアニマルなどの動物からなる群から選択される。
【0057】
[0081]これらの方法のいくつかの実施形態では、組成物は、好ましくは飲料として、より好ましくは投与前に開封される容器に密封されたレディ・トゥ・ドリンク（ＲＴＤ）飲料として、又は投与前に再構成飲料を形成するために希釈液で再構成するように処方された粉末として経口投与される。
【0058】
[0082]［実施例］
[0083]以下の非限定的な実施例は、概して、本明細書に開示される実施形態の基礎となる概念を示す。
[0083]以下の非限定的な実施例は、概して、本明細書に開示される実施形態の基礎となる概念を示す。
【0059】
[0084]実施例１
[0085]１．実験セクション
[0086]１．１．概要
[0087]材料：ニコチンアミドリボシドクロリド（ベータ型）は、ＣｈｒｏｍａＤｅｘ Ｃｏｍｐａｎｙから寄贈された。純度８９％のオレオイルクロリドは、Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、シリカゲル（Ｐ６０、４０～６３μｍ、６０Å）は、ＳｉｌｉＣｙｃｌｅから購入し、Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０ Ｆ２５４ Ｃｏａｔｅｄ Ａｌｕｍｉｎｕｍ－Ｂａｃｋｅｄ ＴＬＣ Ｓｈｅｅｔｓは、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した。ウシ胆汁（Ｂ３８８３）及びブタ膵臓由来のパンクレアチン（Ｐ７５４５、８×ＵＳＰ）はＡｌｄｒｉｃｈから購入した。
[0085]１．実験セクション
[0086]１．１．概要
[0087]材料：ニコチンアミドリボシドクロリド（ベータ型）は、ＣｈｒｏｍａＤｅｘ Ｃｏｍｐａｎｙから寄贈された。純度８９％のオレオイルクロリドは、Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、シリカゲル（Ｐ６０、４０～６３μｍ、６０Å）は、ＳｉｌｉＣｙｃｌｅから購入し、Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０ Ｆ２５４ Ｃｏａｔｅｄ Ａｌｕｍｉｎｕｍ－Ｂａｃｋｅｄ ＴＬＣ Ｓｈｅｅｔｓは、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した。ウシ胆汁（Ｂ３８８３）及びブタ膵臓由来のパンクレアチン（Ｐ７５４５、８×ＵＳＰ）はＡｌｄｒｉｃｈから購入した。
【0060】
[0088]特性評価：５００ＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ ＩＮＯＶＡ）分光計を使用し、１Ｈ－ＮＭＲ及び１３Ｃ－ＮＭＲのＣＤＣｌ３中スペクトルを得た。フーリエ変換赤外スペクトル（ＦＴＩＲ）は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＩＲＡｆｆｉｎｉｔｙ－１Ｓ分光光度計により、８ｃｍ－１の分解能で１２８スキャンを収集することによって記録した。紫外可視（ＵＶ－ｖｉｓ）分光測定をＳｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ－２６００分光光度計で記録した。Ｂｉｎａｒｙ ＳＬ Ｐｕｍｐ ＆ Ｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ及びＳｈｏｄｅｘ ＲＩ－５０１ Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（単一チャネル）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ＬＣ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）測定を行った。
【0061】
[0089]ＨＰＬＣは紫外線検出器（ＨＰＬＣＵＶ）を備えていた。Ｌｕｎａ １００Å（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ）で逆相ＨＰＬＣを行った。カラム温度は２５℃に設定した。注入体積は１０．０μＬとし、酢酸アンモニウム（２０ｍＭ）を移動相として使用し、流速は４５分又は６０分にわたって０．７ｍＬ／分とした。全ての試料は、測定前に、孔径０．２２μｍの１３ｍｍナイロンシリンジフィルターを使用して濾過した。
【0062】
[0090]ＬＣ－ＭＳ分析には、質量分析計と連結したＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ）を使用した。逆相クロマトグラフィーには、１００×４．６ｍｍ、３μｍ、極性Ｃ１８、細孔径１００Åの仕様であるＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｏｍｅｇａ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）ＬＣカラムを使用し、流速は０．３ｍＬ／分とした。ＬＣ溶離液は、ＭｉｌｌｉＱ水（溶媒Ａ）及びアセトニトリル（溶媒Ｂ）を含み、勾配溶出を使用する（溶液Ａ：溶液Ｂの組成の経時変化：０分で９５：５、３分で９５：５、１５分で８５：１５、１７分で９０：１０、及び２０分で９５：５）。
【0063】
[0091]質量分析計（Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＴＱ質量分析計）は、ＮＲＴＯＣｌ、ＮＲＣｌ、及びニコチンアミドを分析するため、エレクトロスプレーイオン化をポジティブモードに設定したエレクトロスプレーインターフェース（ＥＳＩ）を備えていた。最適化したパラメータは、２０任意単位のシースガス流量、４．００ｋＶに設定したスプレー電圧、３５０℃のキャピラリー温度、４１．０Ｖのキャピラリー電圧、及び１２５．０Ｖに設定したチューブレンズであった。
【0064】
[0092]ＤＩ水中のＮＲＴＯＣｌの粒度分布、平均粒径（ゼータ平均サイズ）、及びゼータ電位を、市販の動的光散乱装置（Ｎａｎｏ－ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して測定した。調製されたＮＲＴＯＣｌナノ粒子の構造及び形態は、Ｔｅｃｎａｉ Ｆ２０ ＴＥＭ／ＳＴＥＭ透過電子顕微鏡（２００ｋＶ）を使用して評価した。
【0065】
[0093]１．２．ＮＲＴＯＣｌの合成のための一般的手順
[0094]氷浴中の丸底フラスコに、２００ｍｇのＮＲＣｌ、０．５５ｍＬのピリジン、及び４．７５ｍＬのＤＭＦを加えた。次に、２．０ｍＬのオレオイルクロリドを滴下し、反応混合物を窒素ブランケット下で３時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣで追跡した。３時間後、反応混合物にメタノール５ｍＬを加えて過剰量のオレオイルクロリドを中和し、その後ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を蒸発させた。粗生成物をヘキサン中に抽出し、最後にＳｉＯ２上でのカラムクロマトグラフィーを用いて精製した。溶離液は、ＣＨ３ＯＨ（１２％）とＥｔＯＡｃ（８８％）との混合物とした。精製したＮＲＴＯＣｌを淡クリーム色の脂肪性生成物として６４．３％（４７９．２ｍｇ）で得た（メタノール中でのλｍａｘは２６７ｎｍであった）。
[0094]氷浴中の丸底フラスコに、２００ｍｇのＮＲＣｌ、０．５５ｍＬのピリジン、及び４．７５ｍＬのＤＭＦを加えた。次に、２．０ｍＬのオレオイルクロリドを滴下し、反応混合物を窒素ブランケット下で３時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣで追跡した。３時間後、反応混合物にメタノール５ｍＬを加えて過剰量のオレオイルクロリドを中和し、その後ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を蒸発させた。粗生成物をヘキサン中に抽出し、最後にＳｉＯ２上でのカラムクロマトグラフィーを用いて精製した。溶離液は、ＣＨ３ＯＨ（１２％）とＥｔＯＡｃ（８８％）との混合物とした。精製したＮＲＴＯＣｌを淡クリーム色の脂肪性生成物として６４．３％（４７９．２ｍｇ）で得た（メタノール中でのλｍａｘは２６７ｎｍであった）。
【0066】
[0095]１．３．水中油型エマルジョンを作製するためのストックとしてのキャノーラ油中１５重量％ＮＲＴＯＣｌの調製
[0096]２１５４ｍｇのキャノーラ油を、３８０ｍｇのＮＲＴＯＣｌを含有する１５ｍＬファルコンチューブに添加した。その後、チューブを水浴に入れ、ＮＲＴＯＣｌがキャノーラ油中に完全に溶解するまで約３５℃で振盪した。ＮＲＴＯＣｌをキャノーラ油中に溶解させた後、試料を次の試験のために室温で保持した。室温で、キャノーラ油中でＮＲＴＯＣｌを保管している間、溶液は安定で透明であり、沈降物はなかった。
[0096]２１５４ｍｇのキャノーラ油を、３８０ｍｇのＮＲＴＯＣｌを含有する１５ｍＬファルコンチューブに添加した。その後、チューブを水浴に入れ、ＮＲＴＯＣｌがキャノーラ油中に完全に溶解するまで約３５℃で振盪した。ＮＲＴＯＣｌをキャノーラ油中に溶解させた後、試料を次の試験のために室温で保持した。室温で、キャノーラ油中でＮＲＴＯＣｌを保管している間、溶液は安定で透明であり、沈降物はなかった。
【0067】
[0097]１．４．カゼインＮａ（２重量％）、ＫＣｌ（０．３重量％）、ＮａＣｌ（０．１重量％）、ＣａＣｌ２（０．２重量％）、及びＮａＮ３（０．０１重量％）を使用してＮＲＴＯＣｌを含む水中油型エマルジョンを作製するための水相の調製
[0098]７０℃の１００ｍＬのＤＩ水に２ｇのカゼインナトリウムを徐々に添加し、混合物を５分間撹拌した。次いで、温度を１０分間７５℃に上昇させた。溶液を５０℃に冷却した後、０．３ｇのＫＣｌ、０．１ｇのＮａＣｌ、及び０．０１ｇのＮａＮ３を混合物に添加し、２分間撹拌した。続いて、０．２ｇのＣａＣｌ２をこの溶液に徐々に添加し、更に５分間撹拌した。温度を２５℃に下げた後、ＤＩ水を添加して混合物を１００ｍＬに希釈し、１０，０００ｒｐｍで２分間ホモジナイズした。
[0098]７０℃の１００ｍＬのＤＩ水に２ｇのカゼインナトリウムを徐々に添加し、混合物を５分間撹拌した。次いで、温度を１０分間７５℃に上昇させた。溶液を５０℃に冷却した後、０．３ｇのＫＣｌ、０．１ｇのＮａＣｌ、及び０．０１ｇのＮａＮ３を混合物に添加し、２分間撹拌した。続いて、０．２ｇのＣａＣｌ２をこの溶液に徐々に添加し、更に５分間撹拌した。温度を２５℃に下げた後、ＤＩ水を添加して混合物を１００ｍＬに希釈し、１０，０００ｒｐｍで２分間ホモジナイズした。
【0068】
[0099]１．５．安定性試験のためのＮＲＴＯＣｌ及びＮＲＣｌの水中油型エマルジョンの調製
[0100]次のプロセスに従って、異なる３通りのＮＲＴＯＣｌ水中油型エマルジョンを作製した。
[0100]次のプロセスに従って、異なる３通りのＮＲＴＯＣｌ水中油型エマルジョンを作製した。
【0069】
[0101]１．５．１．Ｃａｓエマルジョン：
[0102]キャノーラ油中１５重量％のＮＲＴＯＣｌを含む４８０ｍｇのオイルストックと、カゼインＮａ（２重量％）、ＫＣｌ（０．３重量％）、ＮａＣｌ（０．１重量％）、ＣａＣｌ２（０．２重量％）、及びＮａＮ３（０．０１重量％）の水相（１４．５２ｇ）とを使用してエマルジョンを調製した。油相を水相に添加し、室温で１６，８００ｒｐｍで１５０秒間ホモジナイズした。
[0102]キャノーラ油中１５重量％のＮＲＴＯＣｌを含む４８０ｍｇのオイルストックと、カゼインＮａ（２重量％）、ＫＣｌ（０．３重量％）、ＮａＣｌ（０．１重量％）、ＣａＣｌ２（０．２重量％）、及びＮａＮ３（０．０１重量％）の水相（１４．５２ｇ）とを使用してエマルジョンを調製した。油相を水相に添加し、室温で１６，８００ｒｐｍで１５０秒間ホモジナイズした。
【0070】
[0103]１．５．２．Ｃａｓ－Ｌｅｃエマルジョン：
[0104]キャノーラ油中１５重量％のＮＲＴＯＣｌを含有する４８０ｍｇのオイルストックと、０．０２５ｇのレシチンとを使用してエマルジョンを調製した。水相（１４．５ｇ）は、カゼインＮａ（２重量％）、ＫＣｌ（０．３重量％）、ＮａＣｌ（０．１重量％）、ＣａＣｌ２（０．２重量％）、及びＮａＮ３（０．０１重量％）を含有していた。油相を水相に添加し、室温で１６，８００ｒｐｍで１５０秒間均質化した。
[0104]キャノーラ油中１５重量％のＮＲＴＯＣｌを含有する４８０ｍｇのオイルストックと、０．０２５ｇのレシチンとを使用してエマルジョンを調製した。水相（１４．５ｇ）は、カゼインＮａ（２重量％）、ＫＣｌ（０．３重量％）、ＮａＣｌ（０．１重量％）、ＣａＣｌ２（０．２重量％）、及びＮａＮ３（０．０１重量％）を含有していた。油相を水相に添加し、室温で１６，８００ｒｐｍで１５０秒間均質化した。
【0071】
[0105]１．５．３．Ｔｗｅｅｎエマルジョン：
[0106]キャノーラ油中１５重量％のＮＲＴＯＣｌを含む４８０ｍｇのオイルストックと、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）（２重量％）の水相（１４．５２ｇ）とを使用してエマルジョンを作製した。油相を水相に添加し、室温で１６，８００ｒｐｍで１５０秒間均質化した。
[0106]キャノーラ油中１５重量％のＮＲＴＯＣｌを含む４８０ｍｇのオイルストックと、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）（２重量％）の水相（１４．５２ｇ）とを使用してエマルジョンを作製した。油相を水相に添加し、室温で１６，８００ｒｐｍで１５０秒間均質化した。
【0072】
[0107]１．５．４．ＮＲエマルジョン：
[0108]ＮＲＣｌ（１９ｍｇ）、カゼインＮａ（２重量％）、ＫＣｌ（０．３重量％）、ＮａＣｌ（０．１重量％）、ＣａＣｌ２（０．２重量％）、及びＮａＮ３（０．０１重量％）の水相（１４．５２ｇ）中、約４８０ｍｇのキャノーラ油を使用して、エマルジョンを調製した。油相を水相に添加し、室温で１６，８００ｒｐｍで１５０秒間ホモジナイズした。
[0108]ＮＲＣｌ（１９ｍｇ）、カゼインＮａ（２重量％）、ＫＣｌ（０．３重量％）、ＮａＣｌ（０．１重量％）、ＣａＣｌ２（０．２重量％）、及びＮａＮ３（０．０１重量％）の水相（１４．５２ｇ）中、約４８０ｍｇのキャノーラ油を使用して、エマルジョンを調製した。油相を水相に添加し、室温で１６，８００ｒｐｍで１５０秒間ホモジナイズした。
【0073】
[0109]１．６．安定性試験中に放出されるニコチンアミドの測定のためのＮＲＴＯＣｌ及びＮＲＣｌの試料調製
[0110]ＮＲＴＯＣｌエマルジョン及びＮＲＣｌエマルジョンについてそれぞれ特定の時間安定化させた後、１．５ｍＬの各エマルジョンを室温で２０分間遠心分離した（１４，０００ｒｐｍ）。次いで水相を分離し、遊離したニコチンアミドをＨＰＬＣ分析によって測定するために０．２２μｍのフィルターによって濾過した。
[0110]ＮＲＴＯＣｌエマルジョン及びＮＲＣｌエマルジョンについてそれぞれ特定の時間安定化させた後、１．５ｍＬの各エマルジョンを室温で２０分間遠心分離した（１４，０００ｒｐｍ）。次いで水相を分離し、遊離したニコチンアミドをＨＰＬＣ分析によって測定するために０．２２μｍのフィルターによって濾過した。
【0074】
[0111]１．７．インビトロ消化試験
[0112]純粋な形態のＮＲＴＯＣｌと、ＭＣＴ油に溶解させたＮＲＴＯＣｌのインビトロ消化を次の手順で調査した。
[0112]純粋な形態のＮＲＴＯＣｌと、ＭＣＴ油に溶解させたＮＲＴＯＣｌのインビトロ消化を次の手順で調査した。
【0075】
[0113]１．７．１．模擬腸相中に分散させた純粋なＮＲＴＯＣｌのインビトロ消化試験
[0114]模擬腸相用の緩衝液は、次のプロトコルに従って調製した２９。具体的には、６０ｍｇのＮＲＴＯＣｌを０．３ｍＬのエタノールに溶解させ、４００ｍｇのウシ胆汁を含む緩衝液１０ｇに加えた。０．７５ｍＬのＣａＣｌ２溶液（０．３Ｍ）をこの混合物に添加し、ＨＣｌ（１Ｍ）を使用して、ｐＨを約７に調整した。次いで、４００ｍｇの新鮮なブタのパンクレアチンを４ｍＬの緩衝溶液に分散させ、混合物に添加した。試料を３７℃のインキュベーター（２５０ｒｐｍ）に３０分間入れた。その後、試料をインキュベーターから取り出してｐＨを約７に調整し、更に３０分間インキュベーターに戻した。インキュベーション工程及びｐＨ調整を、２時間が経過するまで３０分毎に繰り返した。酵素を失活させるために試料を氷浴に入れた後、１．５ｍＬの試料を１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。最後に、水相を分離し、０．２２μｍフィルターによって濾過し、遊離したＮＲ及びニコチンアミドを測定した。
[0114]模擬腸相用の緩衝液は、次のプロトコルに従って調製した２９。具体的には、６０ｍｇのＮＲＴＯＣｌを０．３ｍＬのエタノールに溶解させ、４００ｍｇのウシ胆汁を含む緩衝液１０ｇに加えた。０．７５ｍＬのＣａＣｌ２溶液（０．３Ｍ）をこの混合物に添加し、ＨＣｌ（１Ｍ）を使用して、ｐＨを約７に調整した。次いで、４００ｍｇの新鮮なブタのパンクレアチンを４ｍＬの緩衝溶液に分散させ、混合物に添加した。試料を３７℃のインキュベーター（２５０ｒｐｍ）に３０分間入れた。その後、試料をインキュベーターから取り出してｐＨを約７に調整し、更に３０分間インキュベーターに戻した。インキュベーション工程及びｐＨ調整を、２時間が経過するまで３０分毎に繰り返した。酵素を失活させるために試料を氷浴に入れた後、１．５ｍＬの試料を１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。最後に、水相を分離し、０．２２μｍフィルターによって濾過し、遊離したＮＲ及びニコチンアミドを測定した。
【0076】
[0115]１．７．２．模擬腸相におけるＭＣＴ油中のＮＲＴＯＣｌのインビトロ消化試験
[0116]６０ｍｇのＮＲＴＯＣｌを１５０ｍｇのＭＣＴ油に溶解させて、ＭＣＴ油中２９％ｗ／ｗのＮＲＴＯを調製した。水相は、４００ｍｇのウシ胆汁を含有する１０ｇの緩衝溶液とした。油相を水相に添加し、室温で、１５，０００ｒｐｍで１５０秒間ホモジナイズした。０．７５ｍＬのＣａＣｌ２溶液（０．３Ｍ）をこの混合物に添加し、ＨＣｌ（１Ｍ）を使用してｐＨを約７に調整した。次いで、４００ｍｇの新鮮なブタのパンクレアチンを５ｍＬの緩衝溶液に分散させ、混合物に添加した。試料を３７℃のインキュベーター（２５０ｒｐｍ）に３０分間入れた。その後、試料をインキュベーターから取り出して、（ＮａＯＨ １Ｍによって）ｐＨを約７に調整し、更に３０分間インキュベーターに戻した。インキュベーション工程及びｐＨ調整工程を、２時間が経過するまで３０分毎に繰り返した。酵素を失活させるために試料を氷浴に入れた後、１．５ｍＬの試料を１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。最後に水相を分離し、０．２２μｍフィルターによって濾過し、遊離したＮＲ及びニコチンアミドを測定した。
[0116]６０ｍｇのＮＲＴＯＣｌを１５０ｍｇのＭＣＴ油に溶解させて、ＭＣＴ油中２９％ｗ／ｗのＮＲＴＯを調製した。水相は、４００ｍｇのウシ胆汁を含有する１０ｇの緩衝溶液とした。油相を水相に添加し、室温で、１５，０００ｒｐｍで１５０秒間ホモジナイズした。０．７５ｍＬのＣａＣｌ２溶液（０．３Ｍ）をこの混合物に添加し、ＨＣｌ（１Ｍ）を使用してｐＨを約７に調整した。次いで、４００ｍｇの新鮮なブタのパンクレアチンを５ｍＬの緩衝溶液に分散させ、混合物に添加した。試料を３７℃のインキュベーター（２５０ｒｐｍ）に３０分間入れた。その後、試料をインキュベーターから取り出して、（ＮａＯＨ １Ｍによって）ｐＨを約７に調整し、更に３０分間インキュベーターに戻した。インキュベーション工程及びｐＨ調整工程を、２時間が経過するまで３０分毎に繰り返した。酵素を失活させるために試料を氷浴に入れた後、１．５ｍＬの試料を１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。最後に水相を分離し、０．２２μｍフィルターによって濾過し、遊離したＮＲ及びニコチンアミドを測定した。
【0077】
[0117]２．結果及び考察
[0118]この試験では、脂肪エステル誘導体として化学修飾を行い、疎水性を増加させて、ＮＲの加水分解安定性を増加させた。この目的のために、ＮＲＣｌとオレオイルクロリドとの間の反応によって、新しい化合物としてＮＲＴＯＣｌを合成した。ＤＭＦを溶媒とし、ピリジンを塩基として使用して反応を行った場合に、最良の結果が得られた。ＳｉＯ２上でのカラムクロマトグラフィーによるＮＲＴＯＣｌの精製後、純粋な生成物をＦＴＩＲ、１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ、及びＬＣ－ＭＳによって特性評価した。
[0118]この試験では、脂肪エステル誘導体として化学修飾を行い、疎水性を増加させて、ＮＲの加水分解安定性を増加させた。この目的のために、ＮＲＣｌとオレオイルクロリドとの間の反応によって、新しい化合物としてＮＲＴＯＣｌを合成した。ＤＭＦを溶媒とし、ピリジンを塩基として使用して反応を行った場合に、最良の結果が得られた。ＳｉＯ２上でのカラムクロマトグラフィーによるＮＲＴＯＣｌの精製後、純粋な生成物をＦＴＩＲ、１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ、及びＬＣ－ＭＳによって特性評価した。
【0078】
[0119]最初に、ＮＲＴＯＣｌの構造中の官能基を決定するために、この化合物のＦＴＩＲスペクトルを調べた（図４）。３２８９ｃｍ－１及び３１２３ｃｍ－１の２つのピークは、アミド官能基におけるＮＨ２結合の非対称収縮と、対称伸縮を示す。アルケン及び芳香族のＣ－Ｈ結合の伸縮振動は、約３００５ｃｍ－１に現れる。２９２２ｃｍ－１及び２８５３ｃｍ－１に存在する２つのピークは、脂肪族Ｃ－Ｈの非対称振動及び対称伸縮振動に起因する。１７４４ｃｍ－１の強いピークは、エステル基のカルボニルを示す。アミド官能基のカルボニルは１６８９ｃｍ－１に現れる。Ｃ＝Ｃ結合の存在は、１６２２ｃｍ－１に存在するピークによって示される。１４５８ｃｍ－１及び１３７９ｃｍ－１の２つのピークは、それぞれメチレン基及びメチル基の変角振動を示す。１１００～１２５０ｃｍ－１間のブロードピークは、エステル基のＣ－Ｏ結合の伸縮に起因する。６７７ｃｍ－１、７２１ｃｍ－１、及び９１５ｃｍ－１のバンドは、アルケン及び芳香族のＣ－Ｈ結合の変角振動を示す３０。
【0079】
[0120]更に、ＮＲＴＯＣｌの１Ｈ ＮＭＲを室温でＣＤＣｌ３中で実施した。積分により、この化合物の構造に一致する１１１個の水素の存在が示された（図５）。この化合物の拡大した１Ｈ ＮＭＲは、１０．３４ｐｐｍの最も非遮蔽的なプロトン（Ｈ１）が、正の窒素とアミド基との間のピリジニウム環上に位置する水素に起因することを明確に示す（図６）。アミド基の窒素の孤立電子対とカルボニルとの間に共役があることから３０、ＮＲＴＯＣｌにおいてＮＨ２プロトンの化学シフトは等価ではない。この化合物では、ＮＨ２プロトンの１つが９．８６ｐｐｍに現れ、別の１つが６．２８ｐｐｍに現れる。９．４４ｐｐｍの二重ピーク（Ｊ＝１０Ｈｚ）は、ピリジニウム環上に正の窒素のオルト位で位置するＨ５に起因する。正の窒素のパラ位におけるＨ３の化学シフトは、９．３４ｐｐｍにダブレットピークとして現れる（Ｊ＝１０Ｈｚ）。ピリジニウム環上の最後の水素は、８．２０ｐｐｍにトリプレットピーク（Ｊ＝１０Ｈｚ）として現れるＨ４である。ＮＲＴＯの構造中には、リボース環上に４つの水素が存在する。アノマー水素（Ｈ１’）は、リボース環中の酸素原子とピリジニウム環の正の窒素とにより更に影響を受けるので、この水素は６．７５ｐｐｍにダブレットピークとして現れる（Ｊ＝５Ｈｚ）。Ｈ２’及びＨ３’は隣接基であり、それぞれ５．５７ｐｐｍ及び５．４３ｐｐｍの化学シフトを有する２つのトリプレットピーク（Ｊ＝５Ｈｚ）として現れる。Ｈ２’は、Ｈ３’よりもアノマー中心に近いので、その化学シフトはＨ３’のものよりも非遮蔽的である。積分値が６である５．３５ｐｐｍの多重線ピークは、ＮＲＴＯの構造中の３つのＨ－Ｃ＝Ｃ－Ｈ基の存在を確定する。リボース環中のＨ４’と、エステル基の１つの酸素に結合したメチレン基の水素の１つ（Ｈ５’）とは互いに重なり合い、積分値が２である４．７０ｐｐｍの多重線ピークとして現れる。このメチレン基の水素はジアステレオトピックであるので、このメチレン基の別の水素は、４．５０ｐｐｍにダブレットピークの二重線として現れる（Ｊ１＝１４Ｈｚ、Ｊ２＝４Ｈｚ）。ＮＲＴＯの３つの脂肪酸エステル鎖において、エステルカルボニル基の近傍の３つのＣＨ２基は、２．３７～２．５５ｐｐｍの間に多重線ピークとして現れる（図６）。更に、Ｈ－Ｃ＝Ｃ－Ｈ基の近傍の６つのメチレン基が、２．０２ｐｐｍに多重線ピークとして現れる。カルボニル基に結合したＣＨ２基の近傍の他の３つのメチレン基は、１．６３ｐｐｍに多重線ピークとして現れる。積分値が６０である１．３０ｐｐｍでのブロードピークは、３０個のメチレン基の残部に起因する。最後に、積分値が９である０．８９ｐｐｍのトリプレットピーク（Ｊ＝７．０Ｈｚ）は、ＮＲＴＯの構造中の３つのメチル基の存在を確定する。
【0080】
[0121]ＣＤＣｌ３中のＮＲＴＯＣｌの１３Ｃ ＮＭＲも室温で調査した（図７）。この化合物の拡大した１３Ｃ ＮＭＲは、１７３．１ｐｐｍ、１７２．９ｐｐｍ、及び１７２．３ｐｐｍにＮＲＴＯの構造中のエステル官能基の３つの異なるカルボニルに起因する３つのピークを開示する（図８）。
【0081】
[0122]１６２．５ｐｐｍのピークは、この化合物中のアミド基のカルボニルを確定する。１４６．７ｐｐｍ、１４２．５ｐｐｍ、１４１．８ｐｐｍ、１３４．６ｐｐｍ、及び１２７．９ｐｐｍには、ピリジニウム環中の炭素の存在を示す５つの明確なピークがある。３つの－Ｃ＝Ｃ基の６個の炭素の化学シフトは非常に接近しており、１３０．０７ｐｐｍ、１３０．０６ｐｐｍ、１３０．０４ｐｐｍ、１２９．６７ｐｐｍ、及び１２９．６２ｐｐｍに現れる。これらの炭素の化学シフトが近いことに起因して、２つの炭素が互いに重なり合い（より高い強度を有する１２９．６２ｐｐｍであり得る）、その結果、これらのアルケン基の５つのピークが観察された。９８．０ｐｐｍ、８２．９ｐｐｍ、７５．８ｐｐｍ、及び６９．１ｐｐｍにある４つのピークは、ＮＲＴＯの構造中にリボース環が存在することを完全に示した。エステル基の単一酸素に結合したメチレンの化学シフトは、６２．２ｐｐｍに現れる。ＮＲＴＯの３つの脂肪エステル鎖における、３３．９ｐｐｍ、３３．８ｐｐｍ、及び３３．７ｐｐｍの３つの明確なピークは、エステル基の近くのカルボニル中の３つのＣＨ２基に起因する（図８）。これらの鎖中のメチレン基の残部は、２２．７ｐｐｍ～３１．９ｐｐｍの間に現れ、これらの炭素の化学シフトが互いに近いことから、それらのほとんどは一緒に重なった。１４．１ｐｐｍの強いピークは、３つのメチル基が重なっていることに起因する。
【0082】
[0123]更なる確証のために、この化合物のＬＣ－ＭＳ測定を行って、その分子量を特定した（図９Ａ及び図９Ｂ）。選択反応モニタリング（ＳＲＭ）の結果は、ＮＲＴＯの構造と正確に一致する単一ピークを１０４７．５２ｍ／ｚ（Ｍ－Ｃｌ）に示す。９２５．７０ｍ／ｚのフラグメントは、ＮＲＴＯからのニコチンアミド分子の脱離によって形成されたリボース－トリオレエートに起因する。全体の結果として、ＦＴＩＲ、１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ、及びＬＣ－ＭＳにより取得されたスペクトルデータは、本実施例の手順によって合成されたＮＲＴＯＣｌの構造を完全に認める。
【0083】
[0124]ＮＲＴＯＣｌは四級アンモニウム塩であるが、構造中にオレイン酸脂肪酸エステル基が３つ存在するため、水に溶解しなかった。したがって、ＮＲＴＯＣｌの安定性試験のために、この化合物を、共溶媒として１％エタノールを使用してＤＩ水中に分散させた。この目的のために、１５ｍｇのＮＲＴＯＣｌを０．１５ｍＬのエタノール（１％）に溶解し、次いで１４．８５ｍＬのＤＩ水を混合物に添加し、穏やかに振盪した。この混合物中のＮＲＴＯＣｌ濃度は１，０００ｐｐｍであり、粒子径は１９２ｎｍであり、ゼータ電位は＋６５ｍＶであった。この試料中のＮＲＴＯＣｌの平均サイズは１９２ｎｍであったが、ＴＥＭの画像は、約５０ｎｍであり且つ楕円形及びアスペクト比が１に近い球形である、より小さい粒子を開示した（図１０Ａ～図１０Ｃ）。ナノ粒子において、ＮＲＴＯＣｌ構造は層毎（ｌａｙｅｒ－ｂｙ－ｌａｙｅ）に互いの上に積み重ねられる。ＮＲＴＯの高い正電荷は、ナノ粒子を水相中で安定にする。
【0084】
[0125]ＤＩ水中にＮＲＴＯＣｌを分散させた後、ＮＲＣｌをＤＩ水中に溶解させ、これらの試料の安定性を３５℃で２８日間調べた（図１１）。各試料の濃度は１０００ｐｐｍとした。
【0085】
[0126]ＮＲＴＯ及びＮＲの加水分解反応と同様に、これらの化合物はいずれもニコチンアミドを遊離した（図１２）。各試料中のニコチンアミドの遊離量をＨＰＬＣで測定することにより、各試料中のＮＲＴＯ及びＮＲの残存量を算出した。この試験の間、ＮＲＴＯ試料からのＮＲの遊離は何ら検出されなかった。このことは、ＮＲＴＯ試料中の重いエステル基が安定性試験の期間中に加水分解されないことを意味する。この試験はＤＩ水中で行い、条件は穏やかなものとしたので、ＮＲＴＯはＮ－グリコシド結合から加水分解された。
【0086】
[0127]図１１に示されるように、結果は、３５℃のＤＩ水中ではＮＲＴＯはＮＲよりも安定であり、２８日後にＮＲＴＯの残存量は５３．３％である一方で、ＮＲの残存量は０．６％であることを示す。ＮＲが長鎖エステル基により三官能化されることで、このカチオンの疎水性が増大し、結果としてＮ－グリコシド結合への水の接触性が減少する。ＮＲＴＯの約４２％が加水分解した後、加水分解図の傾きは減少した。２８日後のＮＲＴＯの残存量は５３．３％である。
【0087】
[0128]図１２に示されるように、リボーストリオレエートは、加水分解されたＮＲＴＯと同程度に加水分解プロセス中に形成された。リボーストリオレエートは、構造的にはＮＲＴＯよりも疎水性である。分散させたＮＲＴＯ粒子の加水分解プロセスは外層から生じるので、これらの層は徐々にリボーストリオレエートへと変換され、超疎水性シェルとして作用して、内層への水の浸透を最小限に抑える（図１３）。
【0088】
[0129]ＮＲＴＯＣｌは非常に疎水性の化合物であるので、油相中での安定性を評価するために、エマルジョン系を使用してＮＲＴＯＣｌの安定性を時間の関数として調べた。この目的のために、キャノーラ油中のＮＲＴＯＣｌの１５％ｗ／ｗ溶液を使用して、カゼインＮａ、Ｔｗｅｅｎ ８０、及びレシチンを乳化剤（２ｗｔ．％）として含む様々なエマルジョンを室温で作製した。
【0089】
[0130]カゼインＮａを乳化剤として使用した場合、負電荷を有するカゼイン塩アニオンと、正電荷を有するＮＲＴＯとがＤＩ水中で直ちに凝集するので、水相は、ＮａＣｌ（０．１重量％）、ＣａＣｌ２（０．２重量％）、及びＫＣｌ（０．３重量％）の溶液でなければならない。これらのエマルジョン中の総油相は３．２重量％であり、各エマルジョンの総体積（１５ｍＬ）中のＮＲＴＯＣｌの濃度は４．４ｍＭであった。乳化剤としてカゼインＮａを使用したエマルジョンでは、ＮａＮ３（０．０１重量％）を添加して細菌の増殖を防止した。２重量％のカゼインＮａでＮＲＴＯＣｌエマルジョンを作製した場合、このエマルジョン（Ｃａｓエマルジョン）中の平均サイズ及びゼータ電位は、それぞれ１０２０ｎｍ及び－１４．４ｍＶであった。これらの結果により、液滴表面のＮＲＴＯの正電荷が負の値になることから、油相中のＮＲＴＯの液滴はカゼイン塩アニオンによって完全に取り囲まれていることが確認された。
【0090】
[0131]２重量％のカゼインＮａ及び２重量％のレシチンを乳化剤として同時に使用したところ、このＮＲＴＯエマルジョン（Ｃａｓ－Ｌａｃエマルジョン）の平均サイズ及びゼータ電位は１０１２ｎｍ及び－１３．３ｍＶであった。ＤＩ水中に乳化剤として２重量％のＴｗｅｅｎ ８０を使用して（Ｔｗｅｅｎエマルジョン）、キャノーラ油の水中油型エマルジョンでＮＲＴＯも調製した。このエマルジョンの対応する平均サイズ及びゼータ電位は、それぞれ５３１ｎｍ、＋４９．２ｍＶであった。Ｔｗｅｅｎ ８０を中性乳化剤として使用することから予想されるように、ＮＲＴＯ液滴の正電荷は、エマルジョン中でほとんど元の状態（ｉｎｔａｃｔ）を保った。
【0091】
[0132]ＮＲＴＯＣｌエマルジョンを作製した後、対照実験として３．２％キャノーラ油を使用したキャノーラ油の水中油型エマルジョンでＮＲＣｌを試行した。水相は、カゼインＮａ（２重量％）、ＮａＣｌ（０．１重量％）、ＣａＣｌ２（０．２重量％）、ＫＣｌ（０．３重量％）、及びＮａＮ３（０．０１重量％）の溶液であった。このエマルジョンの総容量（１５ｍＬ）中のＮＲＣｌの濃度は４．４ｍＭであった。更に、他の対照実験として、ＤＩ水中のＮＲＣｌの溶液１５ｍＬを４．４ｍＭ濃度で調製した。３通りのＮＲＴＯＣｌエマルジョン及び２通りの対照実験試料を調製した後、各試料の加水分解安定性を３５℃で２６日間試験した（図１４）。各試料から遊離したニコチンアミドを特定して分解速度を測定した。２６日後、Ｃａｓエマルジョン、Ｃａｓ－Ｌｅｃエマルジョン、及びＴｗｅｅｎエマルジョン中のＮＲＴＯの残存量は、それぞれ９３．７、９０．３、及び８０．０％であった。しかしながら、ＮＲエマルジョンでは残存量は０．４％であり、ＤＩ水中のＮＲでは５．３％であった。
【0092】
[0133]結果は、全てのエマルジョンにおいて、ＮＲＴＯの安定性は、エマルジョン及び水中におけるＮＲの安定性よりもはるかに良好であることを示した。エマルジョンにおけるＮＲ安定性はＤＩ水におけるＮＲ安定性よりも低く、ＮＲが油相中に溶解することができず、水相中にのみ存在することを示す。更に、エマルジョンの水相中にはいくつかのアニオン及び求核試薬が存在するので、ＮＲ加水分解の速度が増加する。Ｃａｓエマルジョン及びＣａｓ－Ｌｅｃエマルジョンは、Ｔｗｅｅｎエマルジョンと比較して安定性についてより良好な結果を示し、これらの試料では、９０％を超えるＮＲＴＯが２６日間にわたって元の状態（ｉｎｔａｃｔ）を保った。この結果は、乳化剤としてのカゼインＮａが、Ｔｗｅｅｎ ８０と比較してより良好に水相中のＮＲＴＯ液滴を安定化させるように作用し得ることを意味する。既に説明したように、カゼイン塩アニオンはＮＲＴＯ液滴の表面を完全に取り囲み、液滴の外表面上のＮＲＴＯの正電荷を中和することができる。この効果により、水の孤立電子対間の傾向が生じ、相間におけるＮＲＴＯが減少し得る。これらのエマルジョンにおいてＮＲＴＯの安定性に影響し得る他の因子には液滴のサイズがある。Ｃａｓエマルジョン及びＣａｓ－Ｌｅｃエマルジョンでは、液滴の平均サイズはほぼ等しく、Ｔｗｅｅｎエマルジョン中の液滴の平均サイズの約２倍である。この結果は、Ｃａｓエマルジョン及びＣａｓ－Ｌｅｃエマルジョン中の液滴の表面積がＴｗｅｅｎエマルジョン中の表面積よりも低かったことを意味する。したがって、Ｃａｓエマルジョン及びＣａｓ－ＬｅｃエマルジョンにおけるＮＲＴＯ液滴への水の接触性は、Ｔｗｅｅｎエマルジョンの場合の接触性よりも低いので、これらのエマルジョン（ｅｍｕｌａｔｉｏｎｓ）におけるＮＲＴＯ加水分解の速度は、Ｔｗｅｅｎエマルジョンよりも低い。
【0093】
[0134]Ｃａｓエマルジョン及びＣａｓ－Ｌｅｃエマルジョン中のＮＲＴＯは、３５℃で安定性についてより良好な結果を示したので、これらのエマルジョンにおけるＮＲＴＯの室温安定性をより長期間にわたって試験した（図１５）。４２日後、ＮＲＴＯの残存量は、Ｃａｓエマルジョンにおいて９５．０％であり、Ｃａｓ－Ｌｅｃエマルジョンにおいて９３．７％であった。しかしながら、安定性試験のこの期間中、５２．０％のＮＲは室温の水中でそのままの状態（ｉｎｔａｃｔ）を保った。この結果は、エマルジョン中のＮＲＴＯの加水分解速度が無視できることを意味する。この期間中、これらのエマルジョンは安定であり、目に見える相分離はなかった。これらのエマルジョンではＮＲＴＯ液滴の平均サイズのわずかな増加が生じ、Ｃａｓエマルジョンでは、平均サイズは１０２０ｎｍから１２８１ｎｍに増加し、Ｃａｓ－Ｌｅｃエマルジョンでは、このパラメータは１０１２ｎｍから１１０６ｎｍに増加した。全てのＮＲＴＯ安定性条件の間、エステル官能基の加水分解を確認する、ＮＲＴＯから遊離したＮＲは測定されなかった。安定性についての全体的な結果として、キャノーラ油の水中油型エマルジョン中のＮＲＴＯは、水中に分散させたＮＲＴＯ及び水中に分散させたＮＲよりもはるかに安定である。
【0094】
[0135]異なる条件でＮＲＴＯＣｌの安定性を試験した後、この化合物を、模擬腸液中でＮＲを生成する消化性について試験した。この酵素消化には、ブタのパンクレアチン、ウシ胆汁、及びｐＨ７付近の緩衝溶液を使用した２９。ブタパンクレアチン中のリパーゼ酵素は、脂肪エステル基を加水分解して、消化の主生成物としてＮＲ、ＮＲＤＯ（ニコチンアミドリボシドジオレエート）、ＮＲＭＯ（ニコチンアミドリボシドモノオレエート）、及びオレイン酸を生成することができる（図１６）。更に、ニコチンアミド（ＮＡＭ）及びリボース－トリオレエート（ＲＴＯ）は、ＮＲＴＯの消化ではなく加水分解の生成物として形成され得る。この仮説を考慮して、模擬腸相においてＮＲＴＯ消化を試験した。
【0095】
[0136]最初に、消化試験に続いて、純粋なＮＲＴＯＣｌ（６０ｍｇ）を０．３ｍＬのエタノールに溶解し、次いでこの溶液を、４００ｍｇのウシ胆汁を含有する１０ｍＬの緩衝液に添加して、ウシ胆汁溶液中にＮＲＴＯを分散させた。その後、０．７５ｍＬのＣａＣｌ２溶液（０．３Ｍ）をこの混合物に添加し、ＨＣｌ（１Ｍ）を添加してｐＨを７．０に調整した。最後に、４ｍＬの緩衝溶液に分散させた４００ｍｇのブタのパンクレアチンを混合物に添加し、この試料を３７℃のインキュベーターに２時間入れた。４００ｍｇのウシ胆汁及び４００ｍｇのブタのパンクレアチンの使用が、ＮＲＴＯの酵素消化の最適量であった。試料から遊離したＮＲ及びニコチンアミドを、ＬＣ－ＭＳ及びＨＰＬＣ分析によって測定した。ＳＲＭ ＬＣ－ＭＳの結果は、ＮＲの構造と正確に一致する２５５．１７ｍ／ｚ（Ｍ－Ｃｌ）に単一ピークを示す（図１７Ａ及び図１７Ｂ）。質量スペクトルにおいて、１２３．０４ｍ／ｚを有するフラグメントは、ＮＲからのリボース分子の脱離によって形成されたニコチンアミド分子に起因する。結果は、ＮＲＴＯ消化試験の２時間後に、２７．５％のＮＲがこの試料から遊離したことを示した。この結果は、少なくとも２７．５％のＮＲＴＯが反応条件下で完全に消化されることを意味する。
【0096】
[0137]この試料からは副反応として２．４％のニコチンアミドが測定され、ＮＲＴＯ消化プロセス中にＮ－グリコシド結合の加水分解が生じたことが実証されたが、この加水分解の量は低く、ほとんど無視できる。ＮＲＴＯ加水分解の他の生成物には、消化プロセス中に同量のニコチンアミド（２．４％）で形成されたリボーストリオレエートがあった。この副生成物は水相に溶解せず、直接測定した。ＮＲＭＯ及びＮＲＤＯは、ＮＲＴＯ消化の他の生成物であり得る。しかしながら、本発明者らは、ＮＲＭＯ及びＮＲＤＯのいずれの標準物質も有していなかったので、これらの化合物の遊離量を測定することができなかった。ＮＲＭＯは、ＬＣ－ＭＳでは５１９．３５ｍ／ｚで水相中に検出されたが、標準物質が利用できなかったために測定することができなかった。
【0097】
[0138]この試験は、模擬腸相においてＮＲを遊離するＮＲＴＯの消化性及び生物学的利用能を目的とした。２７．５％のＮＲが遊離したという結果は、新しい価値のある化合物としてのＮＲＴＯＣｌの消化性を示す。
【0098】
[0139]この試験の目的を展開するために、油相中のＮＲＴＯの消化を試験した。この目的のため、及びＮＲＴＯの溶解性を増加させるために、キャノーラ油の代わりにＭＣＴ油を使用した。最初に、６０ｍｇのＮＲＴＯＣｌを１５０ｍｇのＭＣＴ油に溶解して、ＭＣＴ油中約２９％（ｗ／ｗ）のＮＲＴＯＣｌを調製した。次いで、油相を、４００ｍｇのウシ胆汁を含有する１０ｍＬの緩衝液に添加し、混合物を１５，０００ｒｐｍで１５０秒間、室温でホモジナイズした。次に、０．７５ｍＬのＣａＣｌ２溶液（０．３Ｍ）をこの混合物に添加し、ＨＣｌ（１Ｍ）を添加してｐＨを７．０に調整した。その後、５ｍＬの緩衝溶液に分散させた４００ｍｇのブタのパンクレアチンを混合物に添加し、試料を３７℃のインキュベーターに２時間入れた。この試料から遊離したＮＲ及びニコチンアミドを、ＬＣ－ＭＳ分析及びＨＰＬＣ分析によって測定した。ＮＲＴＯＣｌの純粋な消化と比較して、この試料から遊離したＮＲはより低かった（１１．３％）。この結果は、油相の大部分がＭＣＴ油であり、結果としてリパーゼ分子のＮＲＴＯへの接近性が低下するためと予想された。Ｎ－グリコシド結合加水分解の生成物として、ＭＣＴ油中のＮＲＴＯの消化中に３．９％のニコチンアミドが検出された。このブタのパンクレアチンは、トリプシン、キモトリプシン、α－アミラーゼ、リパーゼ、及びコリパーゼを含む複数の酵素を含んでいた。したがって、ブタのパンクレアチンリパーゼは、高活性を有するほど純粋ではない。しかしながら、ｐＨ７．０でのブタのパンクレアチン及びウシ胆汁の使用は、腸相における脂質の消化をシミュレーションするための最良の方法の１つである２９。全ての得られた結果は、シミュレーションされた腸相においてＮＲを生成するためのＮＲＴＯの消化性（純粋な形態及びＭＴＣ油中）を確定した。
【0099】
[0140]３．結論
[0141]新しい疎水性ＮＲＣｌ誘導体としてＮＲＴＯＣｌを合成した。ＮＲＴＯＣｌの合成は、ピリジンの存在下でＮＲＣｌとオレオイルクロリドとを反応させることによって行った。純粋な生成物が６４．３％で得られ、１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ、ＦＴＩＲ、及びＬＣ－ＭＳの結果により、ＮＲＴＯＣｌの構造及びその純粋性も完全に確定された。ＮＲＴＯＣｌは、構造中に３つの脂肪酸エステルが存在するので非水溶性であった。しかしながら、共溶媒（１％）としてＥｔＯＨを使用すると、この分子は多層（ｌａｙｅｒ－ｂｙ－ｌａｙｅｒ）構造を有するナノ粒子（平均１９２ｎｍ）として水中に分散された。３５℃で２８日間の水中でのＮＲＣｌ及びＮＲＴＯＣｌの安定性を試験したところ、結果は、ＮＲＴＯがＮＲＣｌよりも８８倍以上安定であることを示した。ＮＲＴＯＣｌは、ＮＲＣｌとは対照的に、キャノーラ油、コーン油、及びＭＣＴ油に室温で容易に溶解した。ＮＲＴＯＣｌのこの特徴は、カゼインナトリウム、レシチン、及びＴｗｅｅｎ ８０を乳化剤として存在させてキャノーラ油の水中油型エマルジョンを作製して、油相中での安定性を評価するのに役立った。キャノーラ油の水中油型エマルジョンでは、ＮＲＴＯの安定性は、食用乳化剤としてカゼインナトリウム（２重量％）を使用することにより非常に増加し、２６日後及び３５℃でのこの系では未変化のＮＲＴＯ及びＮＲはそれぞれ９３．７％及び０．４％であった。これらの知見は、このエマルジョン系においてＮＲＴＯがＮＲよりも約２１３倍安定であることを実証した。また、室温で４２日間にわたり、キャノーラ油の水中油型エマルジョンにおけるＮＲＴＯの安定性を試験した。安定性についてのこれらの結果から、この期間中のＮＲＴＯの加水分解は無視でき（５％）、ほとんど変化しなかったが、ＮＲは４８％が加水分解されていたことが確認された。最後に、模擬腸相での消化性を試験して、化合物の生物学的利用能を調査した。結果により、ＮＲＴＯＣｌが消化可能であり、模擬腸相において、ブタのパンクレアチンの存在下で、ＮＲを遊離することが実証された。安定性及び消化性について得られた結果により、ＮＲＴＯＣｌが、レディ・トゥ・ドリンク（ＲＴＤ）飲料におけるＮＲブースターとしての使用に大いに有望であることを示す。
[0141]新しい疎水性ＮＲＣｌ誘導体としてＮＲＴＯＣｌを合成した。ＮＲＴＯＣｌの合成は、ピリジンの存在下でＮＲＣｌとオレオイルクロリドとを反応させることによって行った。純粋な生成物が６４．３％で得られ、１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ、ＦＴＩＲ、及びＬＣ－ＭＳの結果により、ＮＲＴＯＣｌの構造及びその純粋性も完全に確定された。ＮＲＴＯＣｌは、構造中に３つの脂肪酸エステルが存在するので非水溶性であった。しかしながら、共溶媒（１％）としてＥｔＯＨを使用すると、この分子は多層（ｌａｙｅｒ－ｂｙ－ｌａｙｅｒ）構造を有するナノ粒子（平均１９２ｎｍ）として水中に分散された。３５℃で２８日間の水中でのＮＲＣｌ及びＮＲＴＯＣｌの安定性を試験したところ、結果は、ＮＲＴＯがＮＲＣｌよりも８８倍以上安定であることを示した。ＮＲＴＯＣｌは、ＮＲＣｌとは対照的に、キャノーラ油、コーン油、及びＭＣＴ油に室温で容易に溶解した。ＮＲＴＯＣｌのこの特徴は、カゼインナトリウム、レシチン、及びＴｗｅｅｎ ８０を乳化剤として存在させてキャノーラ油の水中油型エマルジョンを作製して、油相中での安定性を評価するのに役立った。キャノーラ油の水中油型エマルジョンでは、ＮＲＴＯの安定性は、食用乳化剤としてカゼインナトリウム（２重量％）を使用することにより非常に増加し、２６日後及び３５℃でのこの系では未変化のＮＲＴＯ及びＮＲはそれぞれ９３．７％及び０．４％であった。これらの知見は、このエマルジョン系においてＮＲＴＯがＮＲよりも約２１３倍安定であることを実証した。また、室温で４２日間にわたり、キャノーラ油の水中油型エマルジョンにおけるＮＲＴＯの安定性を試験した。安定性についてのこれらの結果から、この期間中のＮＲＴＯの加水分解は無視でき（５％）、ほとんど変化しなかったが、ＮＲは４８％が加水分解されていたことが確認された。最後に、模擬腸相での消化性を試験して、化合物の生物学的利用能を調査した。結果により、ＮＲＴＯＣｌが消化可能であり、模擬腸相において、ブタのパンクレアチンの存在下で、ＮＲを遊離することが実証された。安定性及び消化性について得られた結果により、ＮＲＴＯＣｌが、レディ・トゥ・ドリンク（ＲＴＤ）飲料におけるＮＲブースターとしての使用に大いに有望であることを示す。
【0100】
[0142]実施例２
[0143]ＮＲ－トリブチラートクロリド（ＮＲＴＢＣｌ）の合成のための一般的手順
[0144]氷浴中の丸底フラスコに、３００ｍｇのＮＲＣｌ、２５ｍｇの４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰＹ）、１．５ｍＬの無水酪酸、及び９ｍＬのＣＨ３ＣＮを加え、窒素雰囲気下で５時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣで追跡した。次に、溶媒を減圧下でロータリーエバポレーターによって蒸発させ、過剰量の無水酪酸をｎ－ヘキサンによって洗浄した。最後に、粗生成物をＳｉＯ２上でのカラムクロマトグラフィーにより精製した。溶離液は、ＣＨ３ＯＨ（３５％）及びＥｔＯＡｃ（６５％）の混合物であった。精製されたＮＲ－トリブチラートクロリド（ＮＲＴＢＣｌ）を７１％（３６７ｍｇ）で淡黄色の粘性液体として得た。
[0143]ＮＲ－トリブチラートクロリド（ＮＲＴＢＣｌ）の合成のための一般的手順
[0144]氷浴中の丸底フラスコに、３００ｍｇのＮＲＣｌ、２５ｍｇの４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰＹ）、１．５ｍＬの無水酪酸、及び９ｍＬのＣＨ３ＣＮを加え、窒素雰囲気下で５時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣで追跡した。次に、溶媒を減圧下でロータリーエバポレーターによって蒸発させ、過剰量の無水酪酸をｎ－ヘキサンによって洗浄した。最後に、粗生成物をＳｉＯ２上でのカラムクロマトグラフィーにより精製した。溶離液は、ＣＨ３ＯＨ（３５％）及びＥｔＯＡｃ（６５％）の混合物であった。精製されたＮＲ－トリブチラートクロリド（ＮＲＴＢＣｌ）を７１％（３６７ｍｇ）で淡黄色の粘性液体として得た。
【0101】
【0102】
【0103】
[0147]ＮＲＴＢＣｌの長鎖トリグリセリド中溶解性試験
[0148]ＮＲＴＢＣｌの長鎖トリグリセリド中での溶解性を試験するために、本発明者らは、この化合物をオリーブ油及びコーン油に溶解させることを試みた。この目的のために、１５ｍｇのＮＲＴＢＣｌを１５ｍＬのオリーブ油に添加し、室温で１０分間、ボルテックスを用いて激しく振盪した。結果は、ＮＲＴＢＣｌがオリーブ油に溶解しなかったことを示した。この手順を、オリーブ油の代わりにコーン油を使用して繰り返した。得られた結果により、ＮＲＴＢがコーン油に不溶であることが明らかとなった。
[0148]ＮＲＴＢＣｌの長鎖トリグリセリド中での溶解性を試験するために、本発明者らは、この化合物をオリーブ油及びコーン油に溶解させることを試みた。この目的のために、１５ｍｇのＮＲＴＢＣｌを１５ｍＬのオリーブ油に添加し、室温で１０分間、ボルテックスを用いて激しく振盪した。結果は、ＮＲＴＢＣｌがオリーブ油に溶解しなかったことを示した。この手順を、オリーブ油の代わりにコーン油を使用して繰り返した。得られた結果により、ＮＲＴＢがコーン油に不溶であることが明らかとなった。
【0104】
[0149]ＮＲＴＢＣｌの中鎖トリグリセリド中溶解性試験
[0150]ＮＲＴＢＣｌの中鎖トリグリセリド中での溶解性を試験するために、本発明者らは、この化合物をココナッツ油に溶解させることを試みた。この目的のために、１５ｍｇのＮＲＴＢＣｌを１５ｍＬのココナッツ油に添加し、室温で１０分間、ボルテックスを用いて激しく振盪した。結果は、ＮＲＴＢＣｌがココナッツ油に溶解しなかったことを示した。
[0150]ＮＲＴＢＣｌの中鎖トリグリセリド中での溶解性を試験するために、本発明者らは、この化合物をココナッツ油に溶解させることを試みた。この目的のために、１５ｍｇのＮＲＴＢＣｌを１５ｍＬのココナッツ油に添加し、室温で１０分間、ボルテックスを用いて激しく振盪した。結果は、ＮＲＴＢＣｌがココナッツ油に溶解しなかったことを示した。
【0105】
[0151]異なるｐＨでのＮＲＴＢＣｌの水中の溶解性試験
[0152]ＮＲＴＢの水中での溶解性を試験するために、ＮＲＴＢＣｌの３通りの水溶液を、１００００ｐｐｍの濃度でｐＨ ５、ｐＨ ７、及びｐＨ ９で調製した。ゼータサイザーにより得られた結果は、ＮＲ－トリブチラートが、溶液中で凝集を形成することなく、さまざまなｐＨで水に完全に溶解され得ることを実証した（図２２Ａ、図２２Ｂ、図２２Ｃは、水中ＮＲ－トリブチラートクロリドのサイズ測定を示す）。
[0152]ＮＲＴＢの水中での溶解性を試験するために、ＮＲＴＢＣｌの３通りの水溶液を、１００００ｐｐｍの濃度でｐＨ ５、ｐＨ ７、及びｐＨ ９で調製した。ゼータサイザーにより得られた結果は、ＮＲ－トリブチラートが、溶液中で凝集を形成することなく、さまざまなｐＨで水に完全に溶解され得ることを実証した（図２２Ａ、図２２Ｂ、図２２Ｃは、水中ＮＲ－トリブチラートクロリドのサイズ測定を示す）。
【0106】
[0153]３５℃でのＮＲＴＢＣｌ安定性測定の予備的結果
[0154]ＮＲＴＢＣｌの安定性試験は、ＮＲＴＢをＭＱ水中に溶解させ、３５℃で６日間維持することによって実施した。各試料の濃度は１０００ｐｐｍとした。ＨＰＬＣの結果は、副生成物であるニコチンアミドのピークとＮＲＴＢＣｌのピークとが重なっていたことを示した。３３分（流速：０．７５ｍＬ／分）におけるピーク強度の増加は、分解の副生成物がニコチンアミド（ＮＡ）であり、ニコチンアミドは３３分の保持時間（正確にはＮＲＴＢＣｌとして）を有することを理由とする。図２３に示すように、６日後のピーク強度は、０時間後のピーク強度よりも明らかに高かった。これは、ＮＲＴＢＣｌが３５℃で容易に加水分解され得ることを意味する。
[0154]ＮＲＴＢＣｌの安定性試験は、ＮＲＴＢをＭＱ水中に溶解させ、３５℃で６日間維持することによって実施した。各試料の濃度は１０００ｐｐｍとした。ＨＰＬＣの結果は、副生成物であるニコチンアミドのピークとＮＲＴＢＣｌのピークとが重なっていたことを示した。３３分（流速：０．７５ｍＬ／分）におけるピーク強度の増加は、分解の副生成物がニコチンアミド（ＮＡ）であり、ニコチンアミドは３３分の保持時間（正確にはＮＲＴＢＣｌとして）を有することを理由とする。図２３に示すように、６日後のピーク強度は、０時間後のピーク強度よりも明らかに高かった。これは、ＮＲＴＢＣｌが３５℃で容易に加水分解され得ることを意味する。
【0107】
[0155]本明細書で述べる現在の好ましい実施形態に対する様々な変更及び修正が、当業者には明らかとなる点を理解されたい。そのような変更及び修正は、本主題の趣旨及び範囲から逸脱することなく、かつ意図される利点を損なわずに、なされ得る。したがって、このような変更及び修正は、添付の特許請求の範囲によって包含されることが意図されている。
【0108】
[0156]参照文献
［１］Ｄ．Ｌ．Ｃｒｏｔｅａｕ，Ｅ．Ｆ．Ｆａｎｇ，Ｈ．Ｎｉｌｓｅｎ，Ｖ．Ａ．Ｂｏｈｒ，Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ２０１７，１６，４９１。
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［１０］Ｓ．Ｉｍａｉ，Ｌ．Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１４，２４，４６４－４７１。
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［１２］Ｃ．Ｖ．Ｈａａｒ，Ｔ．Ｃ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｍ．Ｍａｒｔｅｎｓ，Ｍ．Ｒ．Ｈｏａｎｅ，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｓ ２０１３，１，１－８。
［１３］Ｐ．Ｈ．Ｅａｒ，Ａ．Ｃｈａｄｄａ，Ｓ．Ｂ．Ｇｕｍｕｓｏｇｌｕ，Ｍ．Ｓ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｓ．Ｖｏｇｅｌｅｒ，Ｊ．Ｍａｌｉｃｏａｔ，Ｊ．Ｋａｄｅｌ，Ｍ．Ｍ．Ｍｏｏｒｅ，Ｍ．Ｅ．Ｍｉｇａｕｄ，Ｈ．Ｅ．Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１９，２６，９６９－９８３．ｅ４。
［１４］Ｎ．Ｓｉｎｔｈｕｐｏｏｍ，Ｖ．Ｐｒａｃｈａｙａｓｉｔｔｉｋｕｌ，Ｓ．Ｐｒａｃｈａｙａｓｉｔｔｉｋｕｌ，Ｓ．Ｒｕｃｈｉｒａｗａｔ，Ｖ．Ｐｒａｃｈａｙａｓｉｔｔｉｋｕｌ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１５，２４０，１－１７。
［１５］Ｋ．Ｂｒｏｗｎ，Ａ．Ｓａｕｖｅ，Ｓ．Ｊａｆｆｒｅｙ，Ｕｓｅ ｏｆ Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ Ｒｉｂｏｓｉｄｅ ｔｏ Ｔｒｅａｔ Ｈｅａｒｉｎｇ Ｌｏｓｓ，Ｇｏｏｇｌｅ Ｐａｔｅｎｔｓ，２０１８。
［１６］Ｇ．Ｇａｎａｐａｔｉ，Ａ．Ｓ．Ｒ．Ａｒｖｉｎｄ，Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ Ｒｉｂｏｓｉｄｅ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，Ｇｏｏｇｌｅ Ｐａｔｅｎｔｓ，２０１８。
［１７］Ｃ．Ｒ．Ｍａｒｔｅｎｓ，Ｂ．Ａ．Ｄｅｎｍａｎ，Ｍ．Ｒ．Ｍａｚｚｏ，Ｍ．Ｌ．Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｎ．Ｒｅｉｓｄｏｒｐｈ，Ｍ．Ｂ．ＭｃＱｕｅｅｎ，Ｍ．Ｃｈｏｎｃｈｏｌ，Ｄ．Ｒ．Ｓｅａｌｓ，Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１８，９，１－１１。
［１８］Ｎ．Ｄｊｏｕｄｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０１５，２，ｅ１００１１９９。
［１９］Ｔ．Ｙａｎｇ，Ｎ．Ｙ．－Ｋ．Ｃｈａｎ，Ａ．Ａ．Ｓａｕｖｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００７，５０，６４５８－６４６１。
［２０］Ｒ．Ｃｅｒｕｔｔｉ，Ｅ．Ｐｉｒｉｎｅｎ，Ｃ．Ｌａｍｐｅｒｔｉ，Ｓ．Ｍａｒｃｈｅｔ，Ａ．Ａ．Ｓａｕｖｅ，Ｗ．Ｌｉ，Ｖ．Ｌｅｏｎｉ，Ｅ．Ａ．Ｓｃｈｏｎ，Ｆ．Ｄａｎｔｚｅｒ，Ｊ．Ａｕｗｅｒｘ，Ｃｅｌｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ２０１４，１９，１０４２－１０４９。
［２１］Ｂ．Ｇｏｎｇ，Ｙ．Ｐａｎ，Ｐ．Ｖｅｍｐａｔｉ，Ｗ．Ｚｈａｏ，Ｌ．Ｋｎａｂｌｅ，Ｌ．Ｈｏ，Ｊ．Ｗａｎｇ，Ｍ．Ｓａｓｔｒｅ，Ｋ．Ｏｎｏ，Ａ．Ａ．Ｓａｕｖｅ，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｇｉｎｇ ２０１３，３４，１５８１－１５８８。
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［２４］Ｏ．Ｌ．Ｄｏｌｌｅｒｕｐ，Ｂ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｍ．Ｓｖａｒｔ，Ｍ．Ｓ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｋ．Ｓｕｌｅｋ，Ｓ．Ｒｉｎｇｇａａｒｄ，Ｈ．Ｓｔｏｄｋｉｌｄｅ－Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，Ｎ．Ｍｏｌｌｅｒ，Ｃ．Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｊ．Ｔ．Ｔｒｅｅｂａｋ，Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ２０１８，１０８，３４３－３５３。
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［２０］Ｒ．Ｃｅｒｕｔｔｉ，Ｅ．Ｐｉｒｉｎｅｎ，Ｃ．Ｌａｍｐｅｒｔｉ，Ｓ．Ｍａｒｃｈｅｔ，Ａ．Ａ．Ｓａｕｖｅ，Ｗ．Ｌｉ，Ｖ．Ｌｅｏｎｉ，Ｅ．Ａ．Ｓｃｈｏｎ，Ｆ．Ｄａｎｔｚｅｒ，Ｊ．Ａｕｗｅｒｘ，Ｃｅｌｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ２０１４，１９，１０４２－１０４９。
［２１］Ｂ．Ｇｏｎｇ，Ｙ．Ｐａｎ，Ｐ．Ｖｅｍｐａｔｉ，Ｗ．Ｚｈａｏ，Ｌ．Ｋｎａｂｌｅ，Ｌ．Ｈｏ，Ｊ．Ｗａｎｇ，Ｍ．Ｓａｓｔｒｅ，Ｋ．Ｏｎｏ，Ａ．Ａ．Ｓａｕｖｅ，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｇｉｎｇ ２０１３，３４，１５８１－１５８８。
［２２］Ｃ．Ｃａｎｔｏ，Ｒ．Ｈ．Ｈｏｕｔｋｏｏｐｅｒ，Ｅ．Ｐｉｒｉｎｅｎ，Ｄ．Ｙ．Ｙｏｕｎ，Ｍ．Ｈ．Ｏｏｓｔｅｒｖｅｅｒ，Ｙ．Ｃｅｎ，Ｐ．Ｊ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｍａｒｃｏｓ，Ｈ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｐ．Ａ．Ａｎｄｒｅｕｘ，Ｐ．Ｃｅｔｔｏｕｒ－Ｒｏｓｅ，Ｃｅｌｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ２０１２，１５，８３８－８４７。
［２３］Ｏ．Ｌ．Ｄｏｌｌｅｒｕｐ，Ｓ．Ａ．Ｔｒａｍｍｅｌｌ，Ｂ．Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｊ．Ｊ．Ｈｏｌｓｔ，Ｂ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｎ．Ｍｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｐ．Ｇｉｌｌｕｍ，Ｊ．Ｔ．Ｔｒｅｅｂａｋ，Ｎ．Ｊｅｓｓｅｎ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ２０１９，１０４，５７０３－５７１４。
［２４］Ｏ．Ｌ．Ｄｏｌｌｅｒｕｐ，Ｂ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｍ．Ｓｖａｒｔ，Ｍ．Ｓ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｋ．Ｓｕｌｅｋ，Ｓ．Ｒｉｎｇｇａａｒｄ，Ｈ．Ｓｔｏｄｋｉｌｄｅ－Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，Ｎ．Ｍｏｌｌｅｒ，Ｃ．Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｊ．Ｔ．Ｔｒｅｅｂａｋ，Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ２０１８，１０８，３４３－３５３。
［２５］Ｈ．Ｊ．Ｌｅｅ，Ｙ．－Ｓ．Ｈｏｎｇ，Ｗ．Ｊｕｎ，Ｓ．Ｊ．Ｙａｎｇ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｆｏｏｄ ２０１５，１８，１２０７－１２１３。
［２６］Ｍ．Ｍｅｈｍｅｌ，Ｎ．Ｊｏｖａｎｏｖｉｃ，Ｕ．Ｓｐｉｔｚ，Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ ２０２０，１２，１６１６。
［２７］Ｙ．Ｚｈｏｕ，Ｂ．Ｆｕ，Ｘ．Ｚｈｅｎｇ，Ｄ．Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｚｈａｏ，Ｙ．Ｑｉ，Ｒ．Ｓｕｎ，Ｚ．Ｔｉａｎ，Ｘ．Ｘｕ，Ｈ．Ｗｅｉ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｖｉｅｗ ２０２０，７，９９８－１００２。
［２８］Ｍ．Ｔ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｄ．Ｓ．Ｊｏｎｅｓ，Ｇ．Ｐ．Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｓ．Ｌｉ，Ｆｏｏｄ ＆ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１９，６３。
［２９］Ａ．Ｂｒｏｄｋｏｒｂ，Ｌ．Ｅｇｇｅｒ，Ｍ．Ａｌｍｉｎｇｅｒ，Ｐ．Ａｌｖｉｔｏ，Ｒ．Ａｓｓｕｎｃａｏ，Ｓ．Ｂａｌｌａｎｃｅ，Ｔ．Ｂｏｈｎ，Ｃ．Ｂｏｕｒｌｉｅｕ－Ｌａｃａｎａｌ，Ｒ．Ｂｏｕｔｒｏｕ，Ｆ．Ｃａｒｒｉｅｒｅ，Ｎａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２０１９，１４，９９１－１０１４。
［３０］Ｒ．Ｍ．Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，Ｆ．Ｘ．Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｄ．Ｊ．Ｋｉｅｍｌｅ，Ｄ．Ｌ．Ｂｒｙｃｅ，Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｗｉｌｅｙ；ｎ．ｄ。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17A】
【図17B】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21A】
【図21B】
【図22A】
【図22B】
【図22C】
【図23】
【国際調査報告】