特表 2024-537792 抗原ワクチン接種のための非免疫原性ＲＮＡおよびＰＤ－１軸結合アンタゴニストを含む処置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-16

(54)【発明の名称】抗原ワクチン接種のための非免疫原性ＲＮＡおよびＰＤ－１軸結合アンタゴニストを含む処置

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/00 20060101AFI20241008BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20241008BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241008BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20241008BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20241008BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241008BHJP

   A61K 31/7115 20060101ALI20241008BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241008BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241008BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20241008BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20241008BHJP

   C07K 14/82 20060101ALN20241008BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20241008BHJP

【ＦＩ】

A61K39/00 H ZNA

A61K31/7105

A61K48/00

A61K45/00

A61P37/04

A61P35/00

A61K31/7115

A61K39/395 U

A61P43/00 121

C12N15/13

C07K16/28

C07K14/82

C12N15/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024519520

(86)(22)【出願日】2022-09-29

(85)【翻訳文提出日】2024-05-29

(86)【国際出願番号】 EP2022077163

(87)【国際公開番号】W WO2023052531

(87)【国際公開日】2023-04-06

(31)【優先権主張番号】PCT/EP2021/077021

(32)【優先日】2021-09-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】509146023

【氏名又は名称】バイオエヌテック エスエー

【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＮＴＥＣＨ ＳＥ

【住所又は居所原語表記】Ａｎ ｄｅｒ Ｇｏｌｄｇｒｕｂｅ １２ ５５１３１ Ｍａｉｎｚ Ｇｅｒｍａｎｙ

(71)【出願人】

【識別番号】515123258

【氏名又は名称】トロン－ トランスラショナル オンコロジー アン デア ウニヴェリジテーツメディツィン デア ヨハネス グーテンベルク－ウニヴェルシテート マインツ ゲマインニューツィゲ ゲーエムベーハー

【氏名又は名称原語表記】ＴＲＯＮ－ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｅ Ｏｎｋｏｌｏｇｉｅ ａｎ ｄｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔｓｍｅｄｉｚｉｎ ｄｅｒ Ｊｏｈａｎｎｅｓ Ｇｕｔｅｎｂｅｒｇ－Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｍａｉｎｚ ｇｅｍｅｉｎｎｕｅｔｚｉｇｅ ＧｍｂＨ

【住所又は居所原語表記】Ｆｒｅｉｌｉｇｒａｔｈｓｔｒ． １２ ５５１３１ Ｍａｉｎｚ Ｇｅｒｍａｎｙ

(74)【代理人】

【識別番号】100110928

【弁理士】

【氏名又は名称】速水 進治

(72)【発明者】

【氏名】サヒン， ウグル

(72)【発明者】

【氏名】クランツ， レナ マレーン

(72)【発明者】

【氏名】ディケン， ムスタファ

(72)【発明者】

【氏名】ヒルシャー， リナ

(72)【発明者】

【氏名】クレイター， セバスチャン

【テーマコード（参考）】

4C084

4C085

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA19

4C084MA02

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB09

4C084ZB26

4C084ZC75

4C085AA14

4C085BB12

4C085BB31

4C085EE01

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZB09

4C086ZB26

4C086ZC75

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA54

4H045CA40

4H045DA76

4H045DA86

4H045EA20

4H045EA31

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、抗原ワクチン接種およびＴ細胞応答などの効果的な抗原特異的免疫エフェクタ細胞応答の誘導のための方法および薬剤に関する。これらの方法および薬剤は、特に、免疫エフェクタ細胞が向けられる抗原を発現する疾患細胞を特徴とする疾患の治療に有用である。いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉ）対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡ、すなわちワクチン抗原をコードする非免疫原性ＲＮＡ、ならびに（ｉｉ）ＰＤ－１軸結合アンタゴニスト、例えば、抗ＰＤ－１抗体および／または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を対象に投与することを含む方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象において免疫応答を誘導するための方法であって、
（ｉ）前記対象に、抗原に対する免疫応答を前記対象において誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡを投与することと、
（ｉｉ）前記対象にＰＤ－１軸結合アンタゴニストを提供することと、
を含む、方法。

【請求項2】

前記対象が、抗原の発現または発現上昇に関連する疾患、障害または状態を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

抗原の発現または発現上昇に関連する疾患、障害または状態を有する対象を治療するための方法であって、
（ｉ）前記対象に、前記抗原に対する免疫応答を前記対象において誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡを投与することと、
（ｉｉ）前記対象にＰＤ－１軸結合アンタゴニストを提供することと、
を含む、方法。

【請求項4】

前記免疫応答がＴ細胞媒介性免疫応答である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記免疫応答が、抗原特異的Ｔ細胞の生成を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記抗原が腫瘍関連抗原である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記疾患、障害または状態が癌である、請求項２～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

（ｉ）エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする前記非免疫原性ＲＮＡ、および
（ｉｉ）ＰＤ－１軸結合アンタゴニストまたはＰＤ－１軸結合アンタゴニストをコードするＲＮＡ
を前記対象に投与することを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

（ｉ）エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする前記非免疫原性ＲＮＡ、および
（ｉｉ）ＰＤ－１軸結合アンタゴニスト
を前記対象に投与することを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記非免疫原性ＲＮＡが、投与されたとき、標準ＲＮＡと比較して、樹状細胞の活性化、Ｔ細胞の活性化および／またはＩＦＮ－αの分泌の低下をもたらす、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記非免疫原性ＲＮＡが、修飾ヌクレオシドの組込みおよび／または二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の除去によって非免疫原性にされる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記修飾ヌクレオシドが、自然免疫受容体のＲＮＡ媒介性活性化を抑制する、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記修飾ヌクレオシドが、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドによる１つ以上のウリジンの置換を含む、請求項１１または１２に記載の方法。

【請求項14】

前記修飾核酸塩基が修飾ウラシルである、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

修飾核酸塩基を含む前記ヌクレオシドが、３－メチル－ウリジン（ｍ３Ｕ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－アザ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ウリジン（ｓ２Ｕ）、４－チオ－ウリジン（ｓ４Ｕ）、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５－アミノアリル－ウリジン、５－ハロ－ウリジン（例えば５－ヨード－ウリジンまたは５－ブロモ－ウリジン）、ウリジン５－オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５－カルボキシメチル－ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５－アミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、１－エチル－プソイドウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－セレノ－ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５－カルバモイルメチル－ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－ウリジン（τｍ５Ｕ）、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１－タウリノメチル－４－チオ－プソイドウリジン、５－メチル－２－チオ－ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１－メチル－４－チオ－プソイドウリジン（ｍ１ｓ４Ψ）、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、３－メチル－プソイドウリジン（ｍ３Ψ）、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、５－メチル－ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシ－ウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３Ψ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２－チオ－ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α－チオ－ウリジン、２’－Ｏ－メチル－ウリジン（Ｕｍ）、５，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’－Ｏ－メチル－プソイドウリジン（Ψｍ）、２－チオ－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１－チオ－ウリジン、デオキシチミジン、２’－Ｆ－アラ－ウリジン、２’－Ｆ－ウリジン、２’－ＯＨ－アラ－ウリジン、５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジン、および５－［３－（１－Ｅ－プロペニルアミノ）ウリジンからなる群より選択される、請求項１３または１４に記載の方法。

【請求項16】

修飾核酸塩基を含む前記ヌクレオシドが、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン（ｍ^１ψ）または５－メチル－ウリジン（ｍ^５Ｕ）である、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

修飾核酸塩基を含む前記ヌクレオシドが１－メチル－プソイドウリジンである、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする前記非免疫原性ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする前記非免疫原性ＲＮＡがインビトロ転写ＲＮＡである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする前記非免疫原性ＲＮＡが、リンパ系、例えば二次リンパ器官、特に脾臓を標的とするための製剤中で投与される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする前記非免疫原性ＲＮＡが、樹状細胞を標的とするための製剤中で投与される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記樹状細胞が未成熟樹状細胞である、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする前記非免疫原性ＲＮＡが、リポプレックス（ＬＰＸ）粒子を含む製剤中で投与される、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記ＰＤ－１軸結合アンタゴニストがＰＤ－１結合アンタゴニストを含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記ＰＤ－１結合アンタゴニストが抗ＰＤ－１抗体を含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記抗ＰＤ－１抗体が、ニボルマブまたはペンブロリズマブを含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記ＰＤ－１軸結合アンタゴニストがＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストを含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストが抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、アテゾリズマブ、アベルマブまたはデュルバルマブを含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

免疫賦活剤、または免疫賦活剤をコードするＲＮＡを投与することを含まない、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記免疫賦活剤が、炎症促進性または抗炎症性免疫賦活剤である、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記免疫賦活剤が、サイトカインまたはその変異体を含む、請求項３０または３１に記載の方法。

【請求項33】

前記サイトカインが、Ｉ型インターフェロンまたはその変異体を含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記Ｉ型インターフェロンが、インターフェロン－αまたはその変異体を含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記サイトカインが、インターロイキンまたはその変異体を含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項36】

前記サイトカインがＴ細胞プライミングを支援する、請求項３２または３５に記載の方法。

【請求項37】

前記サイトカインが、ＩＬ１２、ＩＬ１５またはそれらの変異体を含む、請求項３２、３５および３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記サイトカインが、Ｔ細胞の増殖および／または維持を支援する、請求項３２または３５に記載の方法。

【請求項39】

前記サイトカインが、ＩＬ２、ＩＬ７またはそれらの変異体を含む、請求項３２、３５および３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする前記非免疫原性ＲＮＡ、および前記ＰＤ－１軸結合アンタゴニストまたはＰＤ－１軸結合アンタゴニストをコードするＲＮＡが、共通の製剤または別個の製剤中で投与される、請求項８～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

対象における癌を治療または予防するための方法である、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする前記非免疫原性ＲＮＡが、前記対象の細胞において一過性に発現される、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記対象がヒトである、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

（ｉ）対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡ、および
（ｉｉ）ＰＤ－１軸結合アンタゴニストまたはＰＤ－１軸結合アンタゴニストをコードするＲＮＡ
を含む、医薬製剤。

【請求項45】

抗原の発現または発現上昇に関連する疾患、障害または状態を治療するためのものである、請求項４４に記載の医薬製剤。

【請求項46】

前記免疫応答がＴ細胞媒介性免疫応答である、請求項４４または４５に記載の医薬製剤。

【請求項47】

前記免疫応答が、抗原特異的Ｔ細胞の生成を含む、請求項４４～４６のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項48】

前記抗原が腫瘍関連抗原である、請求項４４～４７のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項49】

前記疾患、障害または状態が癌である、請求項４５～４８のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項50】

（ｉ）エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする前記非免疫原性ＲＮＡ、および
（ｉｉ）ＰＤ－１軸結合アンタゴニスト
を含む、請求項４４～４９のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項51】

前記非免疫原性ＲＮＡが、投与されたとき、標準ＲＮＡと比較して、樹状細胞の活性化、Ｔ細胞の活性化および／またはＩＦＮ－αの分泌の低下をもたらす、請求項４４～５０のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項52】

前記非免疫原性ＲＮＡが、修飾ヌクレオシドの組込みおよび／またはｄｓＲＮＡの除去によって非免疫原性にされる、請求項４４～５１のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項53】

前記修飾ヌクレオシドが、自然免疫受容体のＲＮＡ媒介性活性化を抑制する、請求項５２に記載の医薬製剤。

【請求項54】

前記修飾ヌクレオシドが、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドによる１つ以上のウリジンの置換を含む、請求項５２または５３に記載の医薬製剤。

【請求項55】

前記修飾核酸塩基が修飾ウラシルである、請求項５４に記載の医薬製剤。

【請求項56】

修飾核酸塩基を含む前記ヌクレオシドが、３－メチル－ウリジン（ｍ３Ｕ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－アザ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ウリジン（ｓ２Ｕ）、４－チオ－ウリジン（ｓ４Ｕ）、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５－アミノアリル－ウリジン、５－ハロ－ウリジン（例えば５－ヨード－ウリジンまたは５－ブロモ－ウリジン）、ウリジン５－オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５－カルボキシメチル－ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５－アミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、１－エチル－プソイドウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－セレノ－ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５－カルバモイルメチル－ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－ウリジン（τｍ５Ｕ）、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１－タウリノメチル－４－チオ－プソイドウリジン、５－メチル－２－チオ－ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１－メチル－４－チオ－プソイドウリジン（ｍ１ｓ４Ψ）、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、３－メチル－プソイドウリジン（ｍ３Ψ）、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、５－メチル－ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシ－ウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３Ψ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２－チオ－ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α－チオ－ウリジン、２’－Ｏ－メチル－ウリジン（Ｕｍ）、５，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’－Ｏ－メチル－プソイドウリジン（Ψｍ）、２－チオ－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１－チオ－ウリジン、デオキシチミジン、２’－Ｆ－アラ－ウリジン、２’－Ｆ－ウリジン、２’－ＯＨ－アラ－ウリジン、５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジン、および５－［３－（１－Ｅ－プロペニルアミノ）ウリジンからなる群より選択される、請求項５４または５５に記載の医薬製剤。

【請求項57】

修飾核酸塩基を含む前記ヌクレオシドが、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン（ｍ^１ψ）または５－メチル－ウリジン（ｍ^５Ｕ）である、請求項５４～５６のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項58】

修飾核酸塩基を含む前記ヌクレオシドが１－メチル－プソイドウリジンである、請求項５４～５７のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項59】

エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする前記非免疫原性ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項４４～５８のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項60】

エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする前記非免疫原性ＲＮＡがインビトロ転写ＲＮＡである、請求項４４～５９のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項61】

エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする前記非免疫原性ＲＮＡが、リンパ系、例えば二次リンパ器官、特に脾臓を標的とするための製剤中に存在する、請求項４４～６０のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項62】

エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする前記非免疫原性ＲＮＡが、樹状細胞を標的とするための製剤中に存在する、請求項４４～６１のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項63】

前記樹状細胞が未成熟樹状細胞である、請求項６２に記載の医薬製剤。

【請求項64】

エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする前記非免疫原性ＲＮＡが、リポプレックス（ＬＰＸ）粒子を含む製剤中で投与される、請求項４４～６３のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項65】

前記ＰＤ－１軸結合アンタゴニストがＰＤ－１結合アンタゴニストを含む、請求項４４～６４のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項66】

前記ＰＤ－１結合アンタゴニストが抗ＰＤ－１抗体を含む、請求項６５に記載の医薬製剤。

【請求項67】

前記抗ＰＤ－１抗体が、ニボルマブまたはペンブロリズマブを含む、請求項６６に記載の医薬製剤。

【請求項68】

前記ＰＤ－１軸結合アンタゴニストがＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストを含む、請求項４４～６７のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項69】

前記ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストが抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む、請求項６８に記載の医薬製剤。

【請求項70】

前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、アテゾリズマブ、アベルマブまたはデュルバルマブを含む、請求項６９に記載の医薬製剤。

【請求項71】

免疫賦活剤、または免疫賦活剤をコードするＲＮＡを含まない、請求項４４～７０のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項72】

前記免疫賦活剤が、炎症促進性または抗炎症性免疫賦活剤である、請求項７１に記載の医薬製剤。

【請求項73】

前記免疫賦活剤が、サイトカインまたはその変異体を含む、請求項７１または７２に記載の医薬製剤。

【請求項74】

前記サイトカインが、Ｉ型インターフェロンまたはその変異体を含む、請求項７３に記載の医薬製剤。

【請求項75】

前記Ｉ型インターフェロンが、インターフェロン－αまたはその変異体を含む、請求項７４に記載の医薬製剤。

【請求項76】

前記サイトカインが、インターロイキンまたはその変異体を含む、請求項７３に記載の医薬製剤。

【請求項77】

前記サイトカインがＴ細胞プライミングを支援する、請求項７３または７６に記載の医薬製剤。

【請求項78】

前記サイトカインが、ＩＬ１２、ＩＬ１５またはそれらの変異体を含む、請求項７３、７６および７７のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項79】

前記サイトカインが、Ｔ細胞の増殖および／または維持を支援する、請求項７３または７６に記載の医薬製剤。

【請求項80】

前記サイトカインが、ＩＬ２、ＩＬ７またはそれらの変異体を含む、請求項７３、７６および７９のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項81】

エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする前記非免疫原性ＲＮＡ、および前記ＰＤ－１軸結合アンタゴニストまたはＰＤ－１軸結合アンタゴニストをコードするＲＮＡが、共通の製剤または別個の製剤中に存在する、請求項４４～８０のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項82】

キットである、請求項４４～８１のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項83】

エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする前記非免疫原性ＲＮＡ、および前記ＰＤ－１軸結合アンタゴニストまたはＰＤ－１軸結合アンタゴニストをコードするＲＮＡを医薬組成物中に含む、請求項４４～８２のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項84】

エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする前記非免疫原性ＲＮＡ、および前記ＰＤ－１軸結合アンタゴニストまたはＰＤ－１軸結合アンタゴニストをコードするＲＮＡを別々の容器に含む、請求項４４～８３のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項85】

前記医薬製剤を使用するための説明書をさらに含む、請求項４４～８４のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項86】

医薬組成物である、請求項４４～８１のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項87】

医薬用途のための、請求項４４～８６のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【請求項88】

前記医薬用途が、疾患または障害の治療的または予防的処置を含む、請求項８７に記載の医薬製剤。

【請求項89】

前記疾患または障害が癌である、請求項８８に記載の医薬製剤。

【請求項90】

請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法において使用するための、請求項４４～８９のいずれか一項に記載の医薬製剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、抗原ワクチン接種およびＴ細胞応答などの効果的な抗原特異的免疫エフェクタ細胞応答の誘導のための方法および薬剤に関する。これらの方法および薬剤は、特に、免疫エフェクタ細胞が向けられる抗原を発現する疾患細胞を特徴とする疾患の治療に有用である。いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉ）対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡ、すなわちワクチン抗原をコードする非免疫原性ＲＮＡ、ならびに（ｉｉ）ＰＤ－１軸結合アンタゴニスト、例えば、抗ＰＤ－１抗体および／または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を対象に投与することを含む方法に関する。ワクチン抗原をコードする非免疫原性ＲＮＡを対象に投与することにより、（適切な標的細胞によるＲＮＡの発現後に）免疫エフェクタ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大のためのワクチン抗原を提供することができ、したがって対象においてワクチン抗原（および疾患関連抗原）に対する免疫応答を誘導することができる。いくつかの実施形態では、免疫エフェクタ細胞は、抗原またはそのプロセシング産物に対する結合特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの抗原受容体を担持する。いくつかの実施形態では、免疫エフェクタ細胞は、抗原受容体を発現するように遺伝子改変される。そのような遺伝子改変は、エクスビボまたはインビトロで行われ、その後免疫エフェクタ細胞が治療を必要とする対象に投与され得、および／または治療を必要とする対象においてインビボで行われ得る。免疫エフェクタ細胞は、治療を必要とする対象由来であり得、治療を必要とする対象に内因性であり得る。免疫エフェクタ細胞の抗原受容体は、疾患に関連する抗原を標的とし得る。本明細書で実証されるように、非免疫原性ＲＮＡの投与によって誘導されたＴ細胞などの免疫エフェクタ細胞は、標準ＲＮＡによって誘導されたＴ細胞などの免疫エフェクタ細胞と比較して、より多量のＰＤ－１を発現する。その結果、非免疫原性ＲＮＡの投与によって誘導されたＴ細胞などの免疫エフェクタ細胞は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断を受けやすく、免疫エフェクタ細胞の拡大および免疫応答の増強をもたらす。したがって、対象に抗ＰＤ－１抗体および／または抗ＰＤ－Ｌ１抗体などのＰＤ－１軸結合アンタゴニストを投与すると、対象におけるワクチン抗原（および疾患関連抗原）に対する免疫応答が強く増強され得る。

【背景技術】

【0002】

免疫系は、病原体関連疾患だけでなく癌、自己免疫、アレルギーにおいても重要な役割を果たす。Ｔ細胞は抗腫瘍免疫応答の重要なメディエータである。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、樹状細胞（ＤＣ）を抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞応答のプライミングに使用し、ＩＦＮγを介したＭＨＣの上方制御と増殖阻害によって腫瘍細胞に直接作用することができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む様々な免疫サブセットの腫瘍への流入を媒介し、ＣＤ８＋Ｔ細胞は腫瘍細胞を直接溶解することができる。

【0003】

Ｔ細胞応答は、病原体に対してだけでなく、腫瘍に対しても自然に誘導される。そのような腫瘍特異的Ｔ細胞応答は、Ｔ細胞のプライミングおよび増殖を可能にする環境においてＤＣが強力な抗原提示細胞に成熟するように抗原が送達されることを考えると、治療的抗癌ワクチン接種によって誘導またはさらに促進され得る。

【0004】

ｍＲＮＡに基づくワクチンプラットフォームの文脈において、ｍＲＮＡは、免疫刺激のためのさらなるアジュバントを必要とせずに、リポソーム製剤（ＲＮＡ－リポプレックス、ＲＮＡ－ＬＰＸ）によって二次リンパ器官に位置する抗原提示細胞に送達され得る（Ｋｒｅｉｔｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５２０，６９２－６９６（２０１５）；Ｋｒａｎｚ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５３４，３９６－４０１（２０１６））。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｋｒｅｉｔｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５２０，６９２－６９６（２０１５）

【非特許文献2】Ｋｒａｎｚ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５３４，３９６－４０１（２０１６）

【非特許文献3】Ｈｏｌｔｋａｍｐ，Ｓｉｌｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ １０８（１３）：４００９－１７

【非特許文献4】Ｋｕｈｎ，ＡＮ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １７（８）：９６１－７１

【非特許文献5】Ｏｒｌａｎｄｉｎｉ ｖｏｎ Ｎｉｅｓｓｅｎ，Ａｌｅｘａｎｄｒａ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２７（４）：８２４－３６

【非特許文献6】Ｋｒｅｉｔｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８０（１）：３０９－１８

【非特許文献7】Ｋｒａｎｚ，Ｌｅｎａ Ｍａｓｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｎａｔｕｒｅ ５３４（７６０７）：３９６－４０１

【非特許文献8】Ａｎｄｒｉｅｓ，Ｏｌｉｗｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ：Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２１７：３３７－４４

【非特許文献9】Ｂａｉｅｒｓｄｏｒｆｅｒ，Ｍａｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ １５（Ａｐｒｉｌ）

【非特許文献10】Ｐａｒｄｉ，Ｎｏｒｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ：Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２１７：３４５－５１

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

以前の研究では、細胞内安定性、翻訳効率（Ｈｏｌｔｋａｍｐ，Ｓｉｌｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ １０８（１３）：４００９－１７；Ｋｕｈｎ，ＡＮ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １７（８）：９６１－７１；Ｏｒｌａｎｄｉｎｉ ｖｏｎ Ｎｉｅｓｓｅｎ，Ａｌｅｘａｎｄｒａ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２７（４）：８２４－３６）ならびにＭＨＣクラスＩおよびＩＩ提示の増強（Ｋｒｅｉｔｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８０（１）：３０９－１８）のために抗原コードＲＮＡを最適化した。腹腔内投与されリポソームに製剤化されたＲＮＡ（ＲＮＡ－ＬＰＸ）は、リンパ器官内の常在ＤＣに特異的にコードされた抗原の翻訳およびＭＨＣ提示を標的とするように設計された（Ｋｒａｎｚ，Ｌｅｎａ Ｍａｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｎａｔｕｒｅ ５３４（７６０７）：３９６－４０１）。ＤＣによって内在化されたＲＮＡ－ＬＰＸは、感染性非自己を模倣し、天然のＴＬＲ７／８リガンドとして機能し、炎症促進性サイトカインを伴う強力なＩ型ＩＦＮが支配的な自然応答を引き起こす。

【0007】

本発明者らのＲＮＡ－ＬＰＸワクチンプラットフォームは、標的同一性、すなわち抗原、およびアジュバントを同時に提供する二本鎖ＲＮＡ精製に供されない非ヌクレオシド修飾ＲＮＡ（標準ＲＮＡ、ｓｔｄＲＮＡ）からなる。

【0008】

ワクチンＲＮＡの免疫原性を低下させるために、ヌクレオシドを修飾し、残留二本鎖ＲＮＡを除去することができる。本発明者らは、Ｎ１－メチル－プソイドウリン修飾およびセルロース精製ワクチンＲＮＡ（修飾ＲＮＡ、ｍｏｄＲＮＡ）を合成した（Ａｎｄｒｉｅｓ，Ｏｌｉｗｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ：Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２１７：３３７－４４；Ｂａｉｅｒｓｄｏｒｆｅｒ，Ｍａｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ １５（Ａｐｒｉｌ）；Ｐａｒｄｉ，Ｎｏｒｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ：Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２１７：３４５－５１）。ｓｔｄＲＮＡと比較して、ｍｏｄＲＮＡは免疫活性化および全身性ＩＦＮα放出を制限する。

【0009】

ここで、本発明者らは、ｍｏｄＲＮＡによって誘導されたＴ細胞などの免疫エフェクタ細胞が、ｓｔｄＲＮＡによって誘導された細胞と比較してより高いレベルのＰＤ－１を発現することを記載する。本発明者らは、ｍｏｄＲＮＡワクチン接種とＰＤ－１軸結合アンタゴニスト処置との組合せが、効率的な抗原特異的免疫応答および抗腫瘍活性などの効率的なワクチン接種をもたらすことを実証する。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は、一般に、（ｉ）対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡ、すなわちワクチン抗原をコードする非免疫原性ＲＮＡを対象に投与すること、（ｉｉ）例えば、ＰＤ－１軸結合アンタゴニストまたはＰＤ－１軸結合アンタゴニストをコードするＲＮＡを投与することによって、抗ＰＤ－１抗体および／または抗ＰＤ－Ｌ１抗体などのＰＤ－１軸結合アンタゴニストを対象に投与することを含む、対象の免疫療法的処置を包含する。本明細書に記載の免疫療法は、ワクチン療法を含み、細胞ベースの癌免疫療法、例えばＴＩＬまたはＴ細胞ベースの治療、例えば自己細胞を使用するＴＣＲまたはＣＡＲトランスジェニックＴ細胞ベースの治療をさらに含み得る。一般に、本明細書に記載の治療を使用して刺激される免疫エフェクタ細胞は、疾患細胞などの抗原を発現する細胞、特に腫瘍抗原を発現する癌細胞を標的とし得る。標的細胞は、細胞表面に抗原を発現し得るか、または抗原のプロセシング産物を提示し得る。いくつかの実施形態では、抗原は腫瘍関連抗原であり、疾患は癌である。そのような治療は、抗原を発現する細胞の選択的根絶を提供し、それによって抗原を発現しない正常細胞に対する有害作用を最小限に抑える。免疫エフェクタ細胞（抗原受容体を発現するように遺伝子改変されていてもよい）は、抗原またはそのプロセシング産物、したがって抗原を発現する標的細胞集団または標的組織を標的とする。そのような免疫エフェクタ細胞は、治療を必要とする対象に投与され得るか、または治療を必要とする対象に内因性であり得る。いくつかの実施形態では、免疫エフェクタ細胞は、標的抗原またはそのプロセシング産物に対する結合特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの抗原受容体を担持する。いくつかの実施形態では、免疫エフェクタ細胞は、抗原受容体を発現するように遺伝子改変される。抗原受容体を発現するためのそのような遺伝子改変は、エクスビボまたはインビトロで行われ、その後免疫エフェクタ細胞が治療を必要とする対象に投与され得るか、または治療を必要とする対象においてインビボで行われ得るか、またはエクスビボもしくはインビトロとインビボ改変の組合せによって行われ得る。ワクチン抗原をコードする非免疫原性ＲＮＡは、（適切な標的細胞によるポリヌクレオチドの発現後に）標的抗原またはそのプロセシング産物を標的とする免疫エフェクタ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大のための抗原を提供するために投与される。いくつかの実施形態では、本開示に従って誘導される免疫応答は、免疫エフェクタ細胞が向けられる抗原を発現する標的細胞集団または標的組織に対する免疫応答である。いくつかの実施形態では、本開示に従って誘導される免疫応答は、Ｔ細胞媒介性免疫応答である。いくつかの実施形態では、免疫応答は抗腫瘍免疫応答であり、標的細胞集団または標的組織は腫瘍細胞または腫瘍組織である。

【0011】

抗ＰＤ－１抗体および／または抗ＰＤ－Ｌ１抗体などのＰＤ－１軸結合アンタゴニストは、ＰＤ－１軸結合アンタゴニストを投与することによって提供され得る。あるいは、抗ＰＤ－１抗体および／または抗ＰＤ－Ｌ１抗体などのＰＤ－１軸結合アンタゴニストは、ＰＤ－１軸結合アンタゴニストをコードするＲＮＡの形態で投与され得る。いくつかの実施形態では、当該ＲＮＡは、全身での利用可能性のために肝臓を標的とする。肝細胞は効率的にトランスフェクトすることができ、大量のタンパク質を産生できる。

【0012】

本明細書中に記載される方法および薬剤はさらに、免疫賦活剤または免疫賦活剤をコードするＲＮＡの投与または包含を提供し得る。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法および薬剤は、免疫賦活剤または免疫賦活剤をコードするＲＮＡの投与または包含を提供しない。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法および薬剤は、免疫賦活剤または免疫賦活剤をコードするＲＮＡの投与または包含を提供する。

【0013】

免疫賦活剤は、薬物動態修飾基（以下「延長薬物動態（ＰＫ）」免疫賦活剤と呼ばれる）に結合し得る。いくつかの実施形態では、免疫賦活剤をコードするＲＮＡは、全身での利用可能性のために肝臓を標的とする。肝細胞は効率的にトランスフェクトすることができ、大量のタンパク質を産生できる。

【0014】

ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、好ましくは二次リンパ器官を標的とする。

【0015】

一態様では、対象において免疫応答を誘導するための方法であって、
（ｉ）対象に、抗原に対する免疫応答を当該対象において誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡを投与することと、
（ｉｉ）対象にＰＤ－１軸結合アンタゴニストを提供することと、を含む、方法が本明細書において提供される。

【0016】

いくつかの実施形態では、対象は、抗原の発現または発現上昇に関連する疾患、障害または状態を有する。

【0017】

一態様では、抗原の発現または発現上昇に関連する疾患、障害または状態を有する対象を治療するための方法であって、
（ｉ）対象に、抗原に対する免疫応答を対象において誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡを投与することと、
（ｉｉ）対象にＰＤ－１軸結合アンタゴニストを提供することと、を含む、方法が本明細書において提供される。

【0018】

いくつかの実施形態では、免疫応答はＴ細胞媒介性免疫応答である。

【0019】

いくつかの実施形態では、免疫応答は、抗原特異的Ｔ細胞の生成を含む。

【0020】

いくつかの実施形態では、抗原は腫瘍関連抗原である。

【0021】

いくつかの実施形態では、疾患、障害または状態は癌である。

【0022】

いくつかの実施形態では、本方法は、
（ｉ）エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡ、および
（ｉｉ）ＰＤ－１軸結合アンタゴニスト、またはＰＤ－１軸結合アンタゴニストをコードするＲＮＡを対象に投与することを含む。

【0023】

いくつかの実施形態では、本方法は、
（ｉ）エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡ、および
（ｉｉ）ＰＤ－１軸結合アンタゴニストを対象に投与することを含む。

【0024】

いくつかの実施形態では、非免疫原性ＲＮＡは、投与されたとき、標準ＲＮＡと比較して、樹状細胞の活性化、Ｔ細胞の活性化および／またはＩＦＮ－αの分泌の低下をもたらす。

【0025】

いくつかの実施形態では、非免疫原性ＲＮＡは、修飾ヌクレオシドの組込みおよび／または二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の量の制限によって非免疫原性にされる。いくつかの実施形態では、非免疫原性ＲＮＡは、修飾ヌクレオシドの組込みおよび／またはｄｓＲＮＡの除去によって非免疫原性にされる。

【0026】

いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、自然免疫受容体のＲＮＡ媒介性活性化を抑制する。

【0027】

いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドによる１つ以上のウリジンの置換を含む。

【0028】

いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は修飾ウラシルである。

【0029】

いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドは、３－メチル－ウリジン（ｍ３Ｕ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－アザ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ウリジン（ｓ２Ｕ）、４－チオ－ウリジン（ｓ４Ｕ）、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５－アミノアリル－ウリジン、５－ハロ－ウリジン（例えば５－ヨード－ウリジンまたは５－ブロモ－ウリジン）、ウリジン５－オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５－カルボキシメチル－ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５－アミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、１－エチル－プソイドウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－セレノ－ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５－カルバモイルメチル－ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－ウリジン（τｍ５Ｕ）、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１－タウリノメチル－４－チオ－プソイドウリジン、５－メチル－２－チオ－ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１－メチル－４－チオ－プソイドウリジン（ｍ１ｓ４Ψ）、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、３－メチル－プソイドウリジン（ｍ３Ψ）、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、５－メチル－ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシ－ウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３Ψ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２－チオ－ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α－チオ－ウリジン、２’－Ｏ－メチル－ウリジン（Ｕｍ）、５，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’－Ｏ－メチル－プソイドウリジン（Ψｍ）、２－チオ－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１－チオ－ウリジン、デオキシチミジン、２’－Ｆ－アラ－ウリジン、２’－Ｆ－ウリジン、２’－ＯＨ－アラ－ウリジン、５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジン、および５－［３－（１－Ｅ－プロペニルアミノ）ウリジンからなる群より選択される。

【0030】

いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ）である。

【0031】

いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドは１－メチル－プソイドウリジンである。

【0032】

いくつかの実施形態では、エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。

【0033】

いくつかの実施形態では、エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡは、インビトロ転写ＲＮＡである。

【0034】

いくつかの実施形態では、エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡは、リンパ系を標的とするための製剤中で投与される。いくつかの実施形態では、リンパ系は二次リンパ器官、特に脾臓を含む。

【0035】

いくつかの実施形態では、エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡは、樹状細胞を標的とするための製剤中で投与される。

【0036】

いくつかの実施形態では、樹状細胞は未成熟樹状細胞である。

【0037】

いくつかの実施形態では、エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡは、リポプレックス（ＬＰＸ）粒子を含む製剤中で投与される。

【0038】

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１軸結合アンタゴニストは、ＰＤ－１結合アンタゴニストを含む。

【0039】

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－１抗体を含む。

【0040】

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブまたはペンブロリズマブを含む。

【0041】

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１軸結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストを含む。

【0042】

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む。

【0043】

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ、アベルマブまたはデュルバルマブを含む。

【0044】

いくつかの実施形態では、本方法は、免疫賦活剤または免疫賦活剤をコードするＲＮＡを投与することを含む。

【0045】

いくつかの実施形態では、本方法は、免疫賦活剤または免疫賦活剤をコードするＲＮＡを投与することを含まない。

【0046】

いくつかの実施形態では、免疫賦活剤は、炎症促進性または抗炎症性免疫賦活剤である。

【0047】

いくつかの実施形態では、免疫賦活剤は、サイトカインまたはその変異体を含む。

【0048】

いくつかの実施形態では、サイトカインは、Ｉ型インターフェロンまたはその変異体を含む。

【0049】

いくつかの実施形態では、Ｉ型インターフェロンは、インターフェロン－αまたはその変異体を含む。

【0050】

いくつかの実施形態では、サイトカインは、インターロイキンまたはその変異体を含む。

【0051】

いくつかの実施形態では、サイトカインは、Ｔ細胞プライミングを支援する。

【0052】

いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ１２、ＩＬ１５またはそれらの変異体を含む。

【0053】

いくつかの実施形態では、サイトカインは、Ｔ細胞の増殖および／または維持を支援する。

【0054】

いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ２、ＩＬ７またはそれらの変異体を含む。

【0055】

いくつかの実施形態では、免疫賦活剤は、延長薬物動態（ＰＫ）免疫賦活剤である。いくつかの実施形態では、延長ＰＫ免疫賦活剤は、融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、免疫賦活剤の部分と、血清アルブミン、免疫グロブリン断片、トランスフェリン、Ｆｎ３およびそれらの変異体からなる群から選択される部分とを含む。いくつかの実施形態では、血清アルブミンは、マウス血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンを含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン断片は、免疫グロブリンＦｃドメインを含む。

【0056】

いくつかの実施形態では、免疫賦活剤をコードするＲＮＡは、リンパ系を標的とするための製剤中に存在する。

【0057】

いくつかの実施形態では、免疫賦活剤をコードするＲＮＡは、肝臓を標的とするための製剤中に存在する。

【0058】

いくつかの実施形態では、リンパ系は二次リンパ器官、特に脾臓である。

【0059】

いくつかの実施形態では、免疫賦活剤をコードするＲＮＡは、非免疫原性である。いくつかの実施形態では、免疫賦活剤をコードするＲＮＡは、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、免疫賦活剤をコードするＲＮＡは、インビトロ転写ＲＮＡである。

【0060】

いくつかの実施形態では、エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡ、およびＰＤ－１軸結合アンタゴニストまたはＰＤ－１軸結合アンタゴニストをコードするＲＮＡは、共通の製剤または別個の製剤中で投与される。

【0061】

いくつかの実施形態では、本方法は、対象における癌を治療または予防するための方法である。

【0062】

いくつかの実施形態では、エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡは、対象の細胞において一過性に発現される。

【0063】

いくつかの実施形態では、対象はヒトである。

【0064】

一態様では、
（ｉ）対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡ、および
（ｉｉ）ＰＤ－１軸結合アンタゴニストまたはＰＤ－１軸結合アンタゴニストをコードするＲＮＡを含む、医薬製剤が本明細書において提供される。

【0065】

いくつかの実施形態では、医薬製剤は、抗原の発現または発現上昇に関連する疾患、障害または状態を治療するためのものである。

【0066】

いくつかの実施形態では、免疫応答はＴ細胞媒介性免疫応答である。

【0067】

いくつかの実施形態では、免疫応答は、抗原特異的Ｔ細胞の生成を含む。

【0068】

いくつかの実施形態では、抗原は腫瘍関連抗原である。

【0069】

いくつかの実施形態では、疾患、障害または状態は癌である。

【0070】

いくつかの実施形態では、医薬製剤は、
（ｉ）エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡ、および
（ｉｉ）ＰＤ－１軸結合アンタゴニストを含む。

【0071】

いくつかの実施形態では、非免疫原性ＲＮＡは、投与されたとき、標準ＲＮＡと比較して、樹状細胞の活性化、Ｔ細胞の活性化および／またはＩＦＮ－αの分泌の低下をもたらす。

【0072】

いくつかの実施形態では、非免疫原性ＲＮＡは、修飾ヌクレオシドの組込みおよび／または二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の量の制限によって非免疫原性にされる。いくつかの実施形態では、非免疫原性ＲＮＡは、修飾ヌクレオシドの組込みおよび／またはｄｓＲＮＡの除去によって非免疫原性にされる。

【0073】

いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、自然免疫受容体のＲＮＡ媒介性活性化を抑制する。

【0074】

いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドによる１つ以上のウリジンの置換を含む。

【0075】

いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は修飾ウラシルである。

【0076】

いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドは、３－メチル－ウリジン（ｍ３Ｕ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－アザ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ウリジン（ｓ２Ｕ）、４－チオ－ウリジン（ｓ４Ｕ）、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５－アミノアリル－ウリジン、５－ハロ－ウリジン（例えば５－ヨード－ウリジンまたは５－ブロモ－ウリジン）、ウリジン５－オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５－カルボキシメチル－ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５－アミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、１－エチル－プソイドウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－セレノ－ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５－カルバモイルメチル－ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－ウリジン（τｍ５Ｕ）、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１－タウリノメチル－４－チオ－プソイドウリジン、５－メチル－２－チオ－ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１－メチル－４－チオ－プソイドウリジン（ｍ１ｓ４Ψ）、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、３－メチル－プソイドウリジン（ｍ３Ψ）、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、５－メチル－ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシ－ウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３Ψ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２－チオ－ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α－チオ－ウリジン、２’－Ｏ－メチル－ウリジン（Ｕｍ）、５，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’－Ｏ－メチル－プソイドウリジン（Ψｍ）、２－チオ－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１－チオ－ウリジン、デオキシチミジン、２’－Ｆ－アラ－ウリジン、２’－Ｆ－ウリジン、２’－ＯＨ－アラ－ウリジン、５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジン、および５－［３－（１－Ｅ－プロペニルアミノ）ウリジンからなる群より選択される。

【0077】

いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ）である。

【0078】

いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドは１－メチル－プソイドウリジンである。

【0079】

いくつかの実施形態では、エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。

【0080】

いくつかの実施形態では、エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡは、インビトロ転写ＲＮＡである。

【0081】

いくつかの実施形態では、エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡは、リンパ系を標的とするための製剤中に存在する。いくつかの実施形態では、リンパ系は二次リンパ器官、特に脾臓を含む。

【0082】

いくつかの実施形態では、エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡは、樹状細胞を標的とするための製剤中に存在する。

【0083】

いくつかの実施形態では、樹状細胞は未成熟樹状細胞である。

【0084】

いくつかの実施形態では、エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡは、リポプレックス（ＬＰＸ）粒子を含む製剤中に存在する。

【0085】

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１軸結合アンタゴニストは、ＰＤ－１結合アンタゴニストを含む。

【0086】

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－１抗体を含む。

【0087】

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブまたはペンブロリズマブを含む。

【0088】

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１軸結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストを含む。

【0089】

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む。

【0090】

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ、アベルマブまたはデュルバルマブを含む。

【0091】

いくつかの実施形態では、医薬製剤は、免疫賦活剤または免疫賦活剤をコードするＲＮＡを含む。

【0092】

いくつかの実施形態では、医薬製剤は、免疫賦活剤または免疫賦活剤をコードするＲＮＡを含まない。

【0093】

いくつかの実施形態では、免疫賦活剤は、炎症促進性または抗炎症性免疫賦活剤である。

【0094】

いくつかの実施形態では、免疫賦活剤は、サイトカインまたはその変異体を含む。

【0095】

いくつかの実施形態では、サイトカインは、Ｉ型インターフェロンまたはその変異体を含む。

【0096】

いくつかの実施形態では、Ｉ型インターフェロンは、インターフェロン－αまたはその変異体を含む。

【0097】

いくつかの実施形態では、サイトカインは、インターロイキンまたはその変異体を含む。

【0098】

いくつかの実施形態では、サイトカインは、Ｔ細胞プライミングを支援する。

【0099】

いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ１２、ＩＬ１５またはそれらの変異体を含む。

【0100】

いくつかの実施形態では、サイトカインは、Ｔ細胞の増殖および／または維持を支援する。

【0101】

いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ２、ＩＬ７またはそれらの変異体を含む。

【0102】

いくつかの実施形態では、免疫賦活剤は、延長薬物動態（ＰＫ）免疫賦活剤である。いくつかの実施形態では、延長ＰＫ免疫賦活剤は、融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、免疫賦活剤の部分と、血清アルブミン、免疫グロブリン断片、トランスフェリン、Ｆｎ３およびそれらの変異体からなる群から選択される部分とを含む。いくつかの実施形態では、血清アルブミンは、マウス血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンを含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン断片は、免疫グロブリンＦｃドメインを含む。

【0103】

いくつかの実施形態では、免疫賦活剤をコードするＲＮＡは、リンパ系を標的とするための製剤中に存在する。

【0104】

いくつかの実施形態では、免疫賦活剤をコードするＲＮＡは、肝臓を標的とするための製剤中に存在する。

【0105】

いくつかの実施形態では、リンパ系は二次リンパ器官、特に脾臓である。

【0106】

いくつかの実施形態では、免疫賦活剤をコードするＲＮＡは、非免疫原性である。いくつかの実施形態では、免疫賦活剤をコードするＲＮＡは、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、免疫賦活剤をコードするＲＮＡは、インビトロ転写ＲＮＡである。

【0107】

いくつかの実施形態では、エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡ、およびＰＤ－１軸結合アンタゴニストまたはＰＤ－１軸結合アンタゴニストをコードするＲＮＡは、共通の製剤または別個の製剤中に存在する。

【0108】

いくつかの実施形態では、医薬製剤はキットである。

【0109】

いくつかの実施形態では、医薬製剤は、エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡ、およびＰＤ－１軸結合アンタゴニストまたはＰＤ－１軸結合アンタゴニストをコードするＲＮＡを、医薬組成物中に含む。

【0110】

いくつかの実施形態では、医薬製剤は、エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡ、およびＰＤ－１軸結合アンタゴニストまたはＰＤ－１軸結合アンタゴニストをコードするＲＮＡを、別々の容器に含む。

【0111】

いくつかの実施形態では、医薬製剤は、医薬製剤を使用するための説明書をさらに含む。

【0112】

いくつかの実施形態では、医薬製剤は医薬組成物である。

【0113】

一態様では、医薬用途のための本明細書に記載の医薬製剤が本明細書で提供される。

【0114】

いくつかの実施形態では、医薬用途は、疾患または障害の治療的または予防的処置を含む。

【0115】

いくつかの実施形態では、疾患または障害は癌である。

【0116】

一態様では、本明細書に記載の方法で使用するための本明細書に記載の医薬製剤が本明細書で提供される。

【0117】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡは、細胞、例えばレシピエントの細胞に入るとそれぞれのタンパク質に翻訳され得る一本鎖ＲＮＡである。アミノ酸配列、例えば抗原配列などの薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチド（エピトープを含むペプチドまたはポリペプチド）をコードする野生型またはコドン最適化配列に加えて、ＲＮＡは、安定性および翻訳効率に関してＲＮＡの最大効果のために最適化された１つ以上の構造要素（５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリ（Ａ）尾部）を含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡはこれらの要素の全てを含む。いくつかの実施形態では、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）（ｍ_２ ^{７，２’－Ｏ}ＧｐｐＳｐＧ）またはｍ_２ ^{７，３’－Ｏ}Ｇｐｐｐ（ｍ_１ ^２’－Ｏ）ＡｐＧを、ＲＮＡ原薬の５’末端の特異的キャッピング構造として利用し得る。５’－ＵＴＲ配列として、翻訳効率を高めるために最適化された「コザック配列」を有していてもよい、ヒトα－グロビンｍＲＮＡの５’－ＵＴＲ配列を使用し得る。３’－ＵＴＲ配列として、より高い最大タンパク質レベルおよびｍＲＮＡの長期持続性を確実にするために、コード配列とポリ（Ａ）テールとの間に配置された「スプリットのアミノ末端エンハンサ」（ＡＥＳ）ｍＲＮＡ（Ｆと呼ばれる）およびミトコンドリアコード１２ＳリボソームＲＮＡ（Ｉと呼ばれる）に由来する２つの配列要素（ＦＩ要素）の組合せを使用し得る。これらは、ＲＮＡの安定性を付与し、総タンパク質発現を増強する配列のエクスビボ選択プロセスによって同定された（参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１７／０６０３１４号を参照）。あるいは、３’－ＵＴＲは、ヒトβグロビンｍＲＮＡの２つの反復３’－ＵＴＲであり得る。さらに、３０個のアデノシン残基のストレッチ、それに続く（ランダムヌクレオチドの）１０個のヌクレオチドリンカー配列および別の７０個のアデノシン残基からなる、１１０ヌクレオチド長と測定されるポリ（Ａ）尾部を使用し得る。このポリ（Ａ）テール配列は、ＲＮＡ安定性および翻訳効率を高めるように設計された。

【0118】

エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドは、エピトープまたは抗原のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、そのような他のアミノ酸配列は、抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列を含む。代替的にまたは追加的に、そのような他のアミノ酸配列は、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列を含む。

【0119】

本明細書に記載のＲＮＡなどの核酸をポリマー、タンパク質および／または脂質、好ましくは脂質と複合体化して、投与のための核酸粒子を生成し得る。異なる核酸の組合せが使用される場合、核酸は、一緒に複合体化され得るか、または別々に複合体化され得る。

【図面の簡単な説明】

【0120】

【図1】ｕＲＮＡによるワクチン接種と比較して、ワクチン誘導抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＰＤ－１発現の増強をもたらすｍｏｄＲＮＡによるワクチン接種を示す図である。 Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３／群および時点）に、Ｈ－２Ｋｂ拘束性エピトープＯＶＡ_{２５７－２６４}（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）をコードするｍｏｄＲＮＡまたはｕＲＮＡからなる２０μｇのＲＮＡ－ＬＰＸを０日目および７日目にＩＶで２回ワクチン接種した。対照マウスにＮａＣｌを投与した。（ａ）各ワクチン接種の３日後、５日後および７日後の脾臓における、ＰＤ－１を発現するＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合（平均±ＳＥＭ）および（ｂ）ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞でのＰＤ－１の発現（ＭＦＩ値±ＳＥＭの平均）。（ｃ）２回目のワクチン接種の５日後の血液におけるＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞でのＰＤ－１の発現（ＭＦＩ値±ＳＥＭの平均）。ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が１％未満であった場合、データをプロットしなかった（ａ、ｂ）。垂直の点線は処置日を示す（ａ、ｂ）。対応のないｔ検定（ｃ）。＊＊：Ｐ≦０．０１。ｍｏｄＲＮＡはヌクレオシド修飾ＲＮＡ。ｕＲＮＡはウリジン含有ＲＮＡ。ＯＶＡはニワトリ卵白アルブミン。ＭＦＩは蛍光強度中央値。ＲＮＡはリボ核酸。ＰＤ－１はプログラム死受容体１。

【図2】特に自己抗原に対してワクチン接種する場合、チェックポイント遮断との組合せによって増強されるｍｏｄＲＮＡワクチン接種の効力を示す図である。 （ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５／群）に、Ｈ－２Ｋｂ拘束性エピトープＯＶＡ_{２５７－２６４}（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）をコードするｍｏｄＲＮＡからなる１または１０μｇのＲＮＡ－ＬＰＸを（０日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目）にＩＶで５回ワクチン接種し、２００μｇの抗ＰＤ－Ｌ１抗体で同時にＩＰ処置した。対照マウスにｍｏｄＲＮＡおよびアイソタイプ、またはＮａＣｌを投与した。２回目のワクチン接種以降の各ワクチン接種の５日後の血液中の全ＣＤ８＋Ｔ細胞のＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合（平均±ＳＥＭ）。（ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５／群）に、ヒトＴＲＰ２のＭＨＣクラスＩＩ提示エピトープであるＴＲＰ_{８８－１０２}（ＲＫＦＦＨＲＴＣＫＣＴＧＮＦＡ）に融合したＴＲＰ２_{１８０－１８８}（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ）をコードするｍｏｄＲＮＡからなる２０μｇのＲＮＡ－ＬＰＸを（０日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目）にＩＶで５回ワクチン接種し、２５０μｇの抗ＰＤ－１抗体で同時にＩＰ処置した。対照マウスにｍｏｄＲＮＡおよびアイソタイプ、またはＮａＣｌを投与した。各ワクチン接種の５日後の血液中の全ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＲＰ２特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合（平均±ＳＥＭ）。垂直の点線は処置日を示す（ａ、ｂ）。統計的有意性は、混合効果分析およびテューキーの多重比較検定（ｂ）によって決定した。＊：Ｐ≦０．０５、＊＊：Ｐ≦０．０１。ｍｏｄＲＮＡはヌクレオシド修飾ＲＮＡ。ＲＮＡはリボ核酸。ＯＶＡはニワトリ卵白アルブミン。ＴＲＰ２はチロシナーゼ関連タンパク質２。ＰＤ－１はプログラム死受容体１。ＰＤ－Ｌ１はプログラム死受容体リガンド１。

【図3】ｍｏｄＲＮＡワクチン接種とチェックポイント遮断との組合せによる、ｍｏｄＲＮＡワクチン接種単独と比較した治療的抗腫瘍活性の増強を示す図である。 Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝１０／群）にＢ１６－Ｆ１０腫瘍細胞をＳＣ接種し、腫瘍接種後９日目から６５日目まで、ヒトＴＲＰ２のＭＨＣクラスＩＩ提示エピトープであるＴＲＰ_{８８－１０２}（ＲＫＦＦＨＲＴＣＫＣＴＧＮＦＡ）に融合したＴＲＰ２_{１８０－１８８}（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ）をコードするｍｏｄＲＮＡからなる１０μｇのＲＮＡ－ＬＰＸをＩＶで毎週ワクチン接種した。マウスを抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはアイソタイプ対照（初回処置：１０ｍｇ／ｋｇ、連続処置：５ｍｇ／ｋｇ）で同時にＩＰ処置した。対照マウスには、抗ＰＤ－Ｌ１抗体と共に対照ＲＮＡを投与した。（ａ）個々の腫瘍成長。（ｂ）生存。ｍｏｄＲＮＡはヌクレオシド修飾ＲＮＡ。ＲＮＡはリボ核酸。ＴＲＰ２はチロシナーゼ関連タンパク質２。ＰＤ－Ｌ１はプログラム死受容体リガンド１。

【図4】ｍｏｄＲＮＡワクチン接種とチェックポイント遮断との組合せへのＩＬ－２の添加による、二重の組合せと比較した抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導の増強を示す図である。 Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝７／群）に、ヒトＴＲＰ２のＭＨＣクラスＩＩ提示エピトープであるＴＲＰ_{８８－１０２}（ＲＫＦＦＨＲＴＣＫＣＴＧＮＦＡ）に融合したＴＲＰ２_{１８０－１８８}（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ）をコードするｍｏｄＲＮＡからなる２０μｇのＲＮＡ－ＬＰＸを（０日目、７日目、１４日目）にＩＶで３回ワクチン接種し、２回目および３回目のワクチン接種と同時に、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ－１抗体またはアイソタイプ対照をＩＰで、および３μｇのＩＬ－２またはアルブミン対照をＩＶで処置した。対照マウスにＮａＣｌを投与した。（ａ）３回目のワクチン接種の５日後の血液（左）および脾臓（右）中の全ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＲＰ２特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合。（ｂ）３回目のワクチン接種の５日後の脾臓中のＴＲＰ２特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞対制御性Ｔ細胞比。（ｃ）ＴＲＰ２ペプチドまたはペプチドなしでのエクスビボ再刺激後の全ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮγ分泌ＴＲＰ２特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合。ＴＲＰ２特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が０．５％未満であった場合、データをプロットしなかった（ｃ）。三重の組合せで処置した群では、１つの外れ値を除去した（脾臓；ａ、ｂ）。各ドットは１匹のマウスを表す、水平線は平均である（ａ、ｂ）。統計的有意性は、一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定（ａ、ｂ）または混合効果分析およびテューキーの多重比較検定（ｃ）によって決定した。ｎｓ：Ｐ＞０．０５、＊＊＊：Ｐ≦０．００１、＊＊＊＊：Ｐ≦０．０００１。ｍｏｄＲＮＡはヌクレオシド修飾ＲＮＡ。ＲＮＡはリボ核酸。ＴＲＰ２はチロシナーゼ関連タンパク質２。Ｔｒｅｇは制御性Ｔ細胞。ＰＤ－１はプログラム死受容体１。

【図5】ｍｏｄＲＮＡワクチン接種とチェックポイント遮断との組合せへのＩＬ－２の添加による、二重の組合せと比較した治療的抗腫瘍活性の増強を示す図である。 Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝１０／群）にＢ１６－Ｆ１０腫瘍細胞をＳＣ接種し、腫瘍接種後８日目から９１日目まで、ヒトＴＲＰ２のＭＨＣクラスＩＩ提示エピトープであるＴＲＰ_{８８－１０２}（ＲＫＦＦＨＲＴＣＫＣＴＧＮＦＡ）に融合したＴＲＰ２_{１８０－１８８}（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ）をコードするｍｏｄＲＮＡからなる１０μｇのＲＮＡ－ＬＰＸをＩＶで毎週ワクチン接種した。マウスを抗ＰＤ－Ｌ１抗体（初回処置：１０ｍｇ／ｋｇ、連続処置：５ｍｇ／ｋｇ）で同時にＩＰ処置し、各ワクチン接種／抗ＰＤ－Ｌ１処置の２日後に１μｇのＩＬ－２またはアルブミン対照でＩＶ処置した。（ａ）個々の腫瘍成長。（ｂ）生存率。（ｃ）処置に応答して白斑を経験しているマウスの代表的な画像。ｍｏｄＲＮＡはヌクレオシド修飾ＲＮＡ。ＲＮＡはリボ核酸。ＴＲＰ２はチロシナーゼ関連タンパク質２。ＩＬ－２はインターロイキン－２。ＰＤ－Ｌ１はプログラム死受容体リガンド１。

【0121】

配列の説明
以下の表は、本明細書で参照される特定の配列のリストを提供する。

【0122】

【表1】

【発明を実施するための形態】

【0123】

本開示を以下でより詳細にさらに説明するが、この開示は本明細書に記載される特定の方法、プロトコルおよび試薬に限定されず、これらは異なり得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本開示の範囲を限定することを意図するものではなく、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されたい。特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

【0124】

以下において、本開示の要素をより詳細に説明する。これらの要素を具体的な実施形態と共に列挙するが、それらは、さらなる実施形態を創出するために任意の方法および任意の数で組み合わせ得ることを理解されたい。様々に説明される例および好ましい実施形態は、本開示を明示的に記載される実施形態のみに限定すると解釈されるべきではない。この説明は、明確に記述される実施形態を任意の数の開示される要素および／または好ましい要素と組み合わせた実施形態を支持し、包含すると理解されるべきである。さらに、本出願に記載されている全ての要素の任意の並び替えおよび組合せは、文脈上特に指示されない限り、本出願の説明によって開示されていると見なされるべきである。

【0125】

本開示の実施は、特に明記されない限り、当分野の文献で説明されている従来の化学、生化学、細胞生物学、免疫学、および組換えＤＮＡ技術を使用する。

【0126】

本明細書および以下の特許請求の範囲を通して、文脈上特に必要とされない限り、「含む」という語および「含むこと」などの変形は、記述される特徴、要素、メンバー、整数もしくは工程または特徴、要素、メンバー、整数もしくは工程の群の包含を意味するが、いかなる他の特徴、要素、メンバー、整数もしくは工程または特徴、要素、メンバー、整数もしくは工程の群の除外も意味しないと理解される。「から本質的になる」という用語は、特許請求の範囲または開示の範囲を、指定された特徴、要素、メンバー、整数または工程、ならびに特許請求の範囲または開示の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。「からなる」という用語は、特許請求の範囲または開示の範囲を、指定された特徴、要素、メンバー、整数または工程に限定する。「含む」という用語は、「から本質的になる」という用語を包含し、これは次に「からなる」という用語を包含する。したがって、本出願における各存在ごとに、「含む」という用語は、「から本質的になる」または「からなる」という用語で置き換えられてもよい。同様に、本出願における各存在ごとに、「から本質的になる」という用語は、「からなる」という用語で置き換えられてもよい。

【0127】

本開示を説明する文脈において（特に特許請求の範囲の文脈において）使用される「１つの」および「その」という用語および同様の言及は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。

【0128】

本明細書に記載される全ての方法は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。

【0129】

本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的言語（例えば「など」）の使用は、単に本開示をよりよく説明することを意図しており、特許請求される本開示の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言語も、本開示の実施に不可欠な特許請求されていない要素を指示すると解釈されるべきではない。

【0130】

本明細書で使用される「任意の」または「任意に」という用語は、続いて記述される事象、状況または状態が発生してもよくまたは発生しなくてもよいこと、およびその記述が、当該事象、状況または状態が発生する場合と発生しない場合とを含むことを意味する。

【0131】

本明細書で使用される場合、「および／または」は、他のものを含むまたは含まない、２つの指定された特徴または構成要素のそれぞれの具体的な開示として解釈されるべきである。例えば、「Ｘおよび／またはＹ」は、（ｉ）Ｘ、（ｉｉ）Ｙ、ならびに（ｉｉｉ）ＸおよびＹの各々の具体的な開示として、あたかも各々が本明細書に個別に記載されているかのごとくに解釈されるべきである。

【0132】

本開示の文脈において、「約」という用語は、当業者が問題の特徴の技術的効果を依然として保証すると理解する精度の区間を示す。この用語は、典型的には、示された数値からの±１０％、±５％、±４％、±３％、±２％、±１％、±０．９％、±０．８％、±０．７％、±０．６％、±０．５％、±０．４％、±０．３％、±０．２％、±０．１％、±０．０５％、例えば±０．０１％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±１０％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±５％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±４％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±３％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±２％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±１％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±０．９％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±０．８％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±０．７％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±０．６％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±０．５％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±０．４％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±０．３％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±０．２％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±０．１％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±０．０５％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±０．０１％の偏差を示す。当業者には理解されるように、所与の技術的効果の数値に対するそのような具体的な偏差は、技術的効果の性質に依存する。例えば、天然または生物学的な技術的効果は、一般に、人工的または工学的な技術的効果のものよりも大きいそのような偏差を有し得る。

【0133】

本明細書における値の範囲の列挙は、単に、その範囲内に入る各々別個の値を個別に言及することの簡略方法として機能することが意図されている。本明細書で特に指示されない限り、各個別の値は、本明細書で個別に列挙されているかのごとくに本明細書に組み込まれる。

【0134】

本明細書の本文全体を通していくつかの資料を引用する。本明細書で引用される資料（全ての特許、特許出願、科学出版物、製造業者の仕様書、説明書などを含む）の各々は、上記または下記のいずれでも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本発明が先行発明によってそのような開示に先行する権利がないことの承認として解釈されるべきではない。

【0135】

定義
以下において、本開示の全ての態様に適用される定義を提供する。以下の用語は、特に指示されない限り、以下の意味を有する。定義されていない用語は、それらの技術分野で広く認められている意味を有する。

【0136】

本明細書で使用される「低減する」または「阻害する」などの用語は、例えば、約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約２５％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、または約７５％以上のレベルの全体的な減少を生じさせる能力を意味する。「阻害する」という用語または同様の語句は、完全なまたは本質的に完全な阻害、すなわちゼロまたは本質的にゼロへの低減を含む。

【0137】

本明細書で使用される「増強」または「増強させる」などの用語は、例えば、少なくとも約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約２５％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約７５％以上、または約１００％以上のレベルの全体的な増加または増強を生じさせる能力を意味する。

【0138】

本明細書で使用される「生理学的ｐＨ」は、約７．４のｐＨを指す。いくつかの実施形態では、生理学的ｐＨは、７．３～７．５である。いくつかの実施形態では、生理学的ｐＨは、７．３５～７．４５である。いくつかの実施形態では、生理学的ｐＨは、７．３、７．３５、７．４、７．４５または７．５である。

【0139】

本開示で使用される場合、「％ｗ／ｖ」は、ミリリットル（ｍＬ）単位での溶液の総体積のパーセントとして表されるグラム（ｇ）単位での溶質の量を測定する濃度の単位である、重量体積パーセントを指す。

【0140】

本開示で使用される場合、「重量％」は、グラム（ｇ）での全組成物の総重量のパーセントとして表されるグラム（ｇ）での物質の量を測定する濃度の単位である、重量パーセントを指す。

【0141】

本開示で使用される場合、「モル％」は、全ての成分の総モル数に対する１つの成分のモル数の比率に１００を乗じたものとして定義される。

【0142】

本開示で使用される場合、「モル％」は、全ての脂質の総モル数に対する１つの脂質成分のモル数の比率に１００を乗じたものとして定義される。これに関連して、いくつかの実施形態では、「総脂質」という用語は、脂質および脂質様物質を含む。

【0143】

「イオン強度」という用語は、特定の溶液中の異なる種類のイオン種の数とそれらのそれぞれの電荷との間の数学的関係を指す。したがって、イオン強度Ｉは、式：

【0144】

【数1】

【0145】

によって数学的に表され、式中、ｃは特定のイオン種のモル濃度であり、ｚはその電荷の絶対値である。総和Σは、溶液中の全ての異なる種類のイオン（ｉ）に適用される。

【0146】

本開示によれば、いくつかの実施形態における「イオン強度」という用語は、一価イオンの存在に関する。二価イオン、特に二価カチオンの存在に関して、キレート剤の存在により、それらの濃度または有効濃度（遊離イオンの存在）は、いくつかの実施形態では、核酸の分解を防止するのに十分に低い。いくつかの実施形態では、二価イオンの濃度または有効濃度は、ＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチド間のホスホジエステル結合の加水分解のための触媒レベルよりも低い。いくつかの実施形態では、遊離二価イオンの濃度は２０μＭ以下である。いくつかの実施形態では、遊離二価イオンは存在しないか、または本質的に存在しない。

【0147】

「重量オスモル濃度」は、溶媒１キログラム当たりの溶質のオスモル数として表される特定の溶質の濃度を指す。

【0148】

「凍結乾燥する」または「凍結乾燥」という用語は、物質を凍結し、次いで周囲の圧力を低下させて（例えば、１５Ｐａ未満、例えば１０Ｐａ未満、５Ｐａ未満、または１Ｐａ以下）、物質中の凍結媒体を固相から気相に直接昇華させることによる物質の凍結乾燥を指す。したがって、「凍結乾燥する」および「フリーズドライする」という用語は、本明細書では互換的に使用される。

【0149】

「噴霧乾燥」という用語は、容器（噴霧乾燥機）内で（加熱された）気体を霧化（噴霧）される流体と混合することによって物質を噴霧乾燥することを指し、形成された液滴からの溶媒が蒸発し、乾燥粉末をもたらす。

【0150】

「再構成する」という用語は、乾燥した生成物をその元の液体状態などの液体状態に戻すために、水などの溶媒を乾燥した生成物に添加することに関する。

【0151】

本開示の文脈における「組換え」という用語は、「遺伝子操作を介して作製された」ことを意味する。いくつかの実施形態では、本開示の文脈における「組換え物」は、天然には存在しない。

【0152】

本明細書で使用される「天然に存在する」という用語は、物体が自然界で見出され得るという事実を指す。例えば、生物（ウイルスを含む）中に存在し、自然界の供給源から単離することができ、実験室で人間によって意図的に改変されていないペプチドまたは核酸は、天然に存在する。「自然界で見出される」という用語は、「自然界に存在する」ことを意味し、公知の物体ならびに自然からまだ発見および／または単離されていないが、天然源から将来発見および／または単離される可能性がある物体を含む。

【0153】

本明細書で使用される場合、「室温」および「周囲温度」という用語は、本明細書では互換的に使用され、少なくとも約１５℃、例えば約１５℃～約３５℃、約１５℃～約３０℃、約１５℃～約２５℃、または約１７℃～約２２℃の温度を指す。

【0154】

「ＥＤＴＡ」という用語は、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩を指す。全ての濃度はＥＤＴＡ二ナトリウム塩に関して与えられる。

【0155】

「凍結保護剤」という用語は、凍結段階中に活性成分を保護するために製剤に添加される物質に関する。

【0156】

「凍結乾燥保護剤」という用語は、乾燥段階中に活性成分を保護するために製剤に添加される物質に関する。

【0157】

本開示によれば、「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって互いに連結された約２個以上、約３個以上、約４個以上、約６個以上、約８個以上、約１０個以上、約１３個以上、約１６個以上、約２０個以上、および最大約５０個、約１００個または約１５０個までの連続するアミノ酸を含む物質を指す。「ポリペプチド」という用語は、大きなペプチド、特に少なくとも約１５１個のアミノ酸を有するペプチドを指す。「ペプチド」および「ポリペプチド」は両方ともタンパク質分子であるが、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書では通常同義語として使用される。

【0158】

「部分」という用語は画分を指す。アミノ酸配列またはタンパク質などの特定の構造に関して、その「部分」という用語は、当該構造の連続または不連続な画分を指し得る。

【0159】

「部分」および「断片」という用語は、本明細書では互換的に使用され、連続する要素を指す。例えば、アミノ酸配列またはタンパク質などの構造の一部は、当該構造の連続する要素を指す。組成物に関連して使用される場合、「部分」という用語は、組成物の一部を意味する。例えば、組成物の一部は、当該組成物の０．１％～９９．９％（例えば０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、５０％、９０％、または９９％）の任意の部分であり得る。

【0160】

アミノ酸配列（ペプチドまたはポリペプチド）に関して、「断片」は、アミノ酸配列の一部、すなわちＮ末端および／またはＣ末端で短縮されたアミノ酸配列を表す配列に関する。Ｃ末端で短縮された断片（Ｎ末端断片）は、例えば、オープンリーディングフレームの３’末端を欠くトランケートされたオープンリーディングフレームの翻訳によって得ることができる。Ｎ末端で短縮された断片（Ｃ末端断片）は、例えば、トランケートされたオープンリーディングフレームが翻訳を開始するように働く開始コドンを含む限り、オープンリーディングフレームの５’末端を欠くトランケートされたオープンリーディングフレームの翻訳によって得ることができる。アミノ酸配列の断片は、例えば、アミノ酸配列からのアミノ酸残基の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％を含む。アミノ酸配列の断片は、例えば、アミノ酸配列からの少なくとも６個、特に少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、または少なくとも１００個の連続するアミノ酸を含む。アミノ酸配列の断片は、例えば、アミノ酸配列の最大８個、特に最大１０個、最大１２個、最大１５個、最大２０個、最大３０個または最大５５個の連続するアミノ酸の配列を含む。

【0161】

アミノ酸配列（ペプチドまたはポリペプチド）に関して本明細書で使用される「変異体」は、少なくとも１つのアミノ酸（例えば、異なるアミノ酸、または同じアミノ酸の改変）によって親アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を意味する。親アミノ酸配列は、天然もしくは野生型（ＷＴ）アミノ酸配列であり得るか、または野生型アミノ酸配列の改変形態であり得る。いくつかの実施形態では、変異体アミノ酸配列は、親アミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸差異、例えば、親と比較して１～約２０個のアミノ酸差異、例えば１～約１０個または１～約５個のアミノ酸差異を有する。

【0162】

本明細書における「野生型」または「ＷＴ」または「天然」とは、対立遺伝子変異を含む、自然界で見出されるアミノ酸配列を意味する。野生型アミノ酸配列、ペプチドまたはポリペプチドは、意図的に改変されていないアミノ酸配列を有する。

【0163】

本開示の目的のために、アミノ酸配列（ペプチドまたはポリペプチド）の「変異体」は、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸付加変異体、アミノ酸欠失変異体および／またはアミノ酸置換変異体を含む。「変異体」という用語は、全ての突然変異体、スプライス変異体、翻訳後修飾変異体、立体配座変異体、アイソフォーム変異体、対立遺伝子変異体、種変異体、および種ホモログ、特に天然に存在するものを含む。「変異体」という用語は、特にアミノ酸配列の断片を含む。

【0164】

アミノ酸挿入変異体は、特定のアミノ酸配列中に単一または２つ以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列変異体の場合、１個以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列の特定の部位に挿入されるが、得られた産物の適切なスクリーニングを伴うランダムな挿入も可能である。アミノ酸付加変異体は、１個以上のアミノ酸、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０個、またはそれ以上のアミノ酸のアミノ末端および／またはカルボキシ末端融合物を含む。アミノ酸欠失変異体は、配列からの１個以上のアミノ酸の除去、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０個、またはそれ以上のアミノ酸の除去を特徴とする。欠失は、タンパク質の任意の位置にあってよい。タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に欠失を含むアミノ酸欠失変異体は、Ｎ末端および／またはＣ末端切断変異体とも呼ばれる。アミノ酸置換変異体は、配列内の少なくとも１個の残基が除去され、別の残基がその位置に挿入されていることを特徴とする。相同なペプチドもしくはペプチド間で保存されていないアミノ酸配列内の位置にある修飾、および／またはアミノ酸を類似の特性を有する他のアミノ酸で置換することが好ましい。いくつかの実施形態では、ペプチドおよびポリペプチド変異体におけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、同様に荷電したアミノ酸または非荷電アミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、それらの側鎖が関連するアミノ酸のファミリーのうちの１つの置換を含む。天然に存在するアミノ酸は、一般に４つのファミリー：酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）アミノ酸に分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時に芳香族アミノ酸として一緒に分類されることがある。いくつかの実施形態では、保存的アミノ酸置換は、以下の群内の置換を含む：
－グリシン、アラニン；
－バリン、イソロイシン、ロイシン；
－アスパラギン酸、グルタミン酸；
－アスパラギン、グルタミン；
－セリン、トレオニン；
－リジン、アルギニン；および
－フェニルアラニン、チロシン。

【0165】

いくつかの実施形態では、所与のアミノ酸配列と当該所与のアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列との間の同一性などの類似性の程度は、少なくとも約６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。いくつかの実施形態では、類似性または同一性の程度は、参照アミノ酸配列の全長の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％であるアミノ酸領域について与えられる。例えば、参照アミノ酸配列が２００個のアミノ酸からなる場合、類似性または同一性の程度は、例えば、少なくとも約２０個、少なくとも約４０個、少なくとも約６０個、少なくとも約８０個、少なくとも約１００個、少なくとも約１２０個、少なくとも約１４０個、少なくとも約１６０個、少なくとも約１８０個、または約２００個のアミノ酸、いくつかの実施形態では連続するアミノ酸について与えられる。いくつかの実施形態では、類似性または同一性の程度は、参照アミノ酸配列の全長について与えられる。配列同一性などの配列類似性を決定するためのアラインメントは、当技術分野で公知のツールを用いて、例えば最良の配列アラインメントを使用して、例えばＡｌｉｇｎを使用して、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ニードル、マトリックス：Ｂｌｏｓｕｍ６２、ギャップオープン１０．０、ギャップ伸長０．５を使用して行うことができる。

【0166】

「配列類似性」は、同一であるか、または保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸のパーセンテージを示す。２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。２つの核酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるヌクレオチドのパーセンテージを示す。

【0167】

「％同一」および「同一性％」という用語または同様の用語は、特に、比較される配列間の最適なアラインメントにおいて同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセンテージを指すことが意図されている。当該パーセンテージは純粋に統計的であり、２つの配列間の差は、比較される配列の全長にわたってランダムに分布していてもよいが、必ずしもそうではない。２つの配列の比較は、通常、対応する配列の局所領域を同定するために、最適なアラインメント後に、セグメントまたは「比較ウィンドウ」に関して配列を比較することによって行われる。比較のための最適なアラインメントは、手動で、またはＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２による局所相同性アルゴリズムを用いて、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３による局所相同性アルゴリズムを用いて、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，２４４４の類似性検索アルゴリズムを用いて、もしくは当該アルゴリズムを使用したコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ ＮおよびＴＦＡＳＴＡ）を援用して実施し得る。いくつかの実施形態では、２つの配列の同一性パーセントは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）のウェブサイト（例えば、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＢＬＡＳＴ＿ＳＰＥＣ＝ｂｌａｓｔ２ｓｅｑ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ａｌｉｇｎ２ｓｅｑ）で入手可能なＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して決定される。いくつかの実施形態では、ＮＣＢＩウェブサイトのＢＬＡＳＴＮアルゴリズムに使用されるアルゴリズムパラメータは、以下を含む：（ｉ）１０に設定された期待閾値；（ｉｉ）２８に設定されたワードサイズ；（ｉｉｉ）０に設定されたクエリ範囲内の最大一致；（ｉｖ）１、－２に設定された一致／不一致スコア；（ｖ）線形に設定されたギャップコスト；および（ｖｉ）使用されている低複雑度領域のフィルタ。いくつかの実施形態では、ＮＣＢＩウェブサイトのＢＬＡＳＴＰアルゴリズムに使用されるアルゴリズムパラメータは、以下を含む：（ｉ）１０に設定された期待閾値；（ｉｉ）３に設定されたワードサイズ；（ｉｉｉ）０に設定されたクエリ範囲内の最大一致；（ｉｖ）ＢＬＯＳＵＭ６２に設定されたマトリックス；（ｖ）存在：１１、拡張：１に設定されたギャップコスト；および（ｖｉ）条件付き組成スコアマトリックス調整。

【0168】

同一性パーセントは、比較する配列が一致する同一の位置の数を決定し、この数を比較する位置の数（例えば、参照配列中の位置の数）で除して、この結果に１００を乗じることによって得られる。

【0169】

いくつかの実施形態では、類似性または同一性の程度は、参照配列の全長の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％である領域について与えられる。例えば、参照核酸配列が２００個のヌクレオチドからなる場合、同一性の程度は、少なくとも約１００個、少なくとも約１２０個、少なくとも約１４０個、少なくとも約１６０個、少なくとも約１８０個、または約２００個のヌクレオチド、いくつかの実施形態では連続するヌクレオチドについて与えられる。いくつかの実施形態では、類似性または同一性の程度は、参照配列の全長について与えられる。

【0170】

相同なアミノ酸配列は、本開示によれば、アミノ酸残基の少なくとも４０％、特に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８または少なくとも９９％の同一性を示す。

【0171】

本明細書に記載のアミノ酸配列変異体は、例えば組換えＤＮＡ操作により、当業者によって容易に調製され得る。置換、付加、挿入または欠失を有するペプチドまたはポリペプチドを調製するためのＤＮＡ配列の操作は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ２０１２に詳細に記載されている。さらに、本明細書に記載のペプチド、ポリペプチドおよびアミノ酸変異体は、公知のペプチド合成技術を用いて、例えば固相合成および同様の方法によって容易に調製され得る。

【0172】

いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（ペプチドまたはポリペプチド）の断片または変異体は、「機能的断片」または「機能的変異体」である。アミノ酸配列の「機能的断片」または「機能的変異体」という用語は、それが由来するアミノ酸配列のものと同一または類似の１つ以上の機能特性を示す、すなわち機能的に等価である任意の断片または変異体に関する。抗原または抗原配列に関して、１つの特定の機能は、断片または変異体が由来するアミノ酸配列によって示される１つ以上の免疫原性活性である。本明細書で使用される「機能的断片」または「機能的変異体」という用語は、特に、親分子または配列のアミノ酸配列と比較して１つ以上のアミノ酸によって変化しており、それでも親分子または配列の機能の１つ以上を果たす、例えば免疫応答を誘導することができるアミノ酸配列を含む変異体分子または配列を指す。いくつかの実施形態では、親分子または配列のアミノ酸配列の改変は、分子または配列の特徴に有意に影響を及ぼさないかまたは変化させない。異なる実施形態では、機能的断片または機能的変異体の機能は、低減され得るが、依然として有意に存在し得、例えば、機能的断片または機能的変異体の機能は、親分子または配列の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％であり得る。しかしながら、他の実施形態では、機能的断片または機能的変異体の機能は、親分子または配列と比較して増強され得る。

【0173】

指定されたアミノ酸配列（ペプチドまたはポリペプチド）に「由来する」アミノ酸配列（ペプチドまたはポリペプチド）は、最初のアミノ酸配列の起源を指す。いくつかの実施形態では、特定のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、その特定の配列またはその断片と同一、本質的に同一または相同であるアミノ酸配列を有する。特定のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、その特定の配列の変異体またはその断片であり得る。例えば、本明細書での使用に適した抗原は、天然配列の望ましい活性を保持しながら、それらが由来する天然に存在する配列または天然配列とは配列が異なるように改変され得ることが当業者に理解されるであろう。

【0174】

いくつかの実施形態では、「単離された」は、天然の状態から、または製造プロセスからの組成物などの人工組成物から取り出された（例えば精製された）ことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸、ペプチドまたはポリペプチドは「単離されて」いないが、その天然状態の共存物質から部分的または完全に分離された同じ核酸、ペプチドまたはポリペプチドは「単離されて」いる。単離された核酸、ペプチドまたはポリペプチドは、実質的に精製された形態で存在し得るか、または例えば宿主細胞などの非天然環境に存在し得る。

【0175】

「遺伝子改変」または単に「改変」という用語は、核酸による細胞のトランスフェクションを含む。

【0176】

「トランスフェクション」という用語は、細胞への核酸、特にＲＮＡの導入に関する。本開示の目的のために、「トランスフェクション」という用語はまた、細胞への核酸の導入またはそのような細胞による核酸の取り込みを含み、細胞は、対象、例えば患者に存在し得るか、または細胞はインビトロ、例えば患者の外部に存在し得る。したがって、本開示によれば、本明細書に記載の核酸のトランスフェクションのための細胞は、インビトロまたはインビボで存在することができ、例えば、細胞は患者の器官、組織および／または身体の一部を形成することができる。本開示によれば、トランスフェクションは一過性または安定であり得る。トランスフェクションのいくつかの用途では、トランスフェクトされた遺伝物質が一過性にのみ発現されれば十分である。ＲＮＡを細胞にトランスフェクトして、そのコードされたタンパク質を一過性に発現させることができる。トランスフェクションプロセスで導入された核酸は、通常、核ゲノムに組み込まれないので、外来核酸は有糸分裂によって希釈されるかまたは分解される。核酸のエピソーム増幅を可能にする細胞は、希釈率を大幅に低下させる。トランスフェクトされた核酸が実際に細胞およびその娘細胞のゲノムに残ることが望ましい場合は、安定なトランスフェクションが起こらなければならない。そのような安定なトランスフェクションは、例えば、トランスフェクションのためにウイルスベースの系またはトランスポゾンベースの系を使用することによって達成することができる。一般に、抗原をコードする核酸は、細胞に一過性にトランスフェクトされる。一般に、抗原受容体を発現するように遺伝子改変される細胞は、受容体をコードする核酸で安定にトランスフェクトされる。ＲＮＡを細胞にトランスフェクトして、そのコードされたタンパク質を一過性に発現させることができる。

【0177】

本開示は、ペプチドまたはポリペプチドの類似体を含む。本開示によれば、ペプチドまたはポリペプチドの類似体は、それが由来する当該ペプチドまたはポリペプチドの修飾形態であり、当該ペプチドまたはポリペプチドの少なくとも１つの機能的特性を有する。例えば、ペプチドまたはポリペプチドの薬理学的に活性な類似体は、その類似体が由来するペプチドまたはポリペプチドの薬理学的活性の少なくとも１つを有する。そのような修飾には、任意の化学修飾が含まれ、炭水化物、脂質および／またはペプチドもしくはポリペプチドなどのペプチドまたはポリペプチドに関連する任意の分子の単一または複数の置換、欠失および／または付加が含まれる。いくつかの実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドの「類似体」には、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、パルミトイル化、ミリストイル化、イソプレニル化、脂質化、アルキル化、誘導体化、保護基／ブロッキング基の導入、タンパク質分解切断、または抗体もしくは別の細胞リガンドへの結合から生じる修飾形態が含まれる。「類似体」という用語はまた、当該ペプチドおよびポリペプチドの全ての機能的な化学的等価物に及ぶ。

【0178】

本明細書で使用される場合、「連結された」、「融合された」、または「融合」という用語は、互換的に使用される。これらの用語は、２つ以上の要素または成分またはドメインの結合を指す。

【0179】

本明細書で使用される場合、「内因性」は、生物、細胞、組織または系からの、またはそれらの内部で産生される任意の物質を指す。

【0180】

本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、生物、細胞、組織または系から導入されるか、またはそれらの外部で産生される任意の物質を指す。

【0181】

本開示の様々な実施形態によれば、ペプチドまたはポリペプチドをコードするＲＮＡなどの核酸は、インビトロでまたは対象において存在し得る細胞に取り込まれるか、または導入される、すなわちトランスフェクトまたは形質導入され、当該ペプチドまたはポリペプチドの発現をもたらす。細胞は、例えば、コードされたペプチドもしくはポリペプチドを細胞内で（例えば細胞質および／もしくは核内で）発現し得る、コードされたペプチドもしくはポリペプチドを分泌し得る、および／またはそれを表面上で発現し得る。

【0182】

本開示によれば、「発現する核酸」および「コードする核酸」などの用語または同様の用語は、本明細書では互換的に使用され、特定のペプチドまたはポリペプチドに関して、核酸が、適切な環境、例えば細胞内に存在する場合、発現されて当該ペプチドまたはポリペプチドを産生することができることを意味する。

【0183】

本明細書で使用される「発現」という用語は、特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を含む。

【0184】

本開示の文脈において、「転写」という用語は、ＤＮＡ配列中の遺伝暗号がＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）に転写されるプロセスに関する。その後、ＲＮＡはペプチドまたはポリペプチドに翻訳され得る。

【0185】

ＲＮＡに関して、「発現」または「翻訳」という用語は、ｍＲＮＡの鎖が、ペプチドまたはポリペプチドを作製するようにアミノ酸の配列のアセンブリを指示する、細胞のリボソームにおけるプロセスに関する。

【0186】

本明細書に記載される医薬製剤、特にキットは、説明資料または説明書を含み得る。本明細書で使用される場合、「説明資料」または「説明書」は、本発明の組成物および方法の有用性を伝えるために使用することができる刊行物、記録、図、または任意の他の表現媒体を含む。本発明のキットの説明資料は、例えば、本発明の組成物を含む容器に貼付されてもよく、または組成物を含む容器と共に出荷されてもよい。あるいは、説明資料と組成物が受領者によって協働して使用されることを意図して、説明資料は容器とは別に出荷されてもよい。

【0187】

本明細書に記載される特定の化合物のプロドラッグは、個体への投与時に生理学的条件下で化学変換を受けて特定の化合物を提供する化合物である。さらに、プロドラッグは、エクスビボ環境で化学的または生化学的方法によって特定の化合物に変換され得る。例えば、プロドラッグは、例えば、適切な酵素または化学試薬と共に経皮パッチリザーバに入れた場合、特定の化合物にゆっくり変換され得る。例示的なプロドラッグは、インビボで加水分解可能なエステル（特定の化合物に含まれるアルコールもしくはカルボキシ基を使用する）またはアミド（特定の化合物に含まれるアミノもしくはカルボキシ基を使用する）である。具体的には、特定の化合物に含まれ、少なくとも１つの水素原子を担持する任意のアミノ基をプロドラッグ形態に変換することができる。典型的なＮ－プロドラッグ形態には、カルバメート、マンニッヒ塩基、エナミン、およびエナミノンが含まれる。

【0188】

本明細書では、化合物の構造式は、当該化合物のある特定の異性体を表し得る。しかしながら、本発明は、構造的に生じる幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、立体異性体、互変異性体などの全ての異性体および異性体混合物を含み、式の記述に限定されないことを理解されたい。

【0189】

「異性体」は、同じ分子式を有するが、構造が異なる化合物（「構造異性体」）、または官能基および／もしくは原子の幾何学的（空間的）配置が異なる化合物（「立体異性体」）である。「鏡像異性体」は、重ね合わせることができない互いの鏡像である一対の立体異性体である。「ラセミ混合物」または「ラセミ化合物」は、一対の等量の鏡像異性体を含み、接頭辞（±）によって示される。「ジアステレオマ」は、重ね合わせることができず、互いの鏡像ではない立体異性体である。「互変異性体」は、純粋であっても、個々の原子または原子群の移動のために、自発的かつ可逆的に相互変換する同じ化学物質の構造異性体である；すなわち、互変異性体は互いに動的化学平衡状態にある。互変異性体の一例は、ケト－エノール互変異性の異性体である。「コンフォーマ」は、形式上単結合の周りの回転だけで相互変換することができる立体異性体であり、特に、シクロヘキサンのいす形、半いす形、舟形、およびねじれ舟形などの異なる三次元形態の（複素）環式環をもたらすものを含む。

【0190】

「平均直径」という用語は、いわゆるキュムラントアルゴリズムを使用したデータ分析を伴う動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される粒子の平均流体力学的直径を指し、これは、結果として、長さの次元を有するいわゆるＺ_平均、および無次元である多分散指数（ＰＤＩ）を提供する（Ｋｏｐｐｅｌ，Ｄ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．５７，１９７２，ｐｐ ４８１４－４８２０，ＩＳＯ １３３２１）。ここで、粒子の「平均直径」、「直径」または「サイズ」は、このＺ_平均の値と同義で使用される。

【0191】

いくつかの実施形態では、「多分散指数」は、「平均直径」の定義で言及されているように、いわゆるキュムラント解析による動的光散乱測定に基づいて計算され得る。特定の前提条件下では、これは、ナノ粒子の集合体のサイズ分布の尺度と見なすことができる。

【0192】

回転軸を中心とした粒子の「回転半径」（本明細書ではＲ_ｇと略す）は、粒子の質量全体が集中していると仮定した場合に、所与の軸を中心としたその慣性モーメントがその実際の質量分布と同じになる点の回転軸からの半径方向距離である。数学的には、Ｒ_ｇは、その質量中心または所与の軸のいずれかからの粒子の成分の二乗平均平方根距離である。例えば、質量中心から固定距離ｓ_ｉに位置する質量ｍ_ｉ（ｉ＝１、２、３、．．．、ｎ）のｎ個の質量要素から構成される高分子の場合、Ｒ_ｇは全ての質量要素にわたるｓ_ｉ ^２の質量平均の平方根であり、以下のように計算することができる：

【0193】

【数2】

【0194】

回転半径は、例えば光散乱を使用することによって実験的に決定するまたは計算することができる。特に、小さな散乱ベクトル

【0195】

【数3】

【0196】

の場合、構造関数Ｓは以下のように定義され：

【0197】

【数4】

【0198】

式中、Ｎは成分の数である（ギニエの法則）。

【0199】

粒子の「流体力学的半径」（「ストークス半径」または「ストークス－アインシュタイン半径」と呼ばれることもある）は、当該粒子と同じ速度で拡散する仮想の剛体球の半径である。流体力学的半径は、サイズだけでなく溶媒効果も考慮して、粒子の移動度に関連する。例えば、水和がより強いより小さい荷電粒子は、水和がより弱いより大きい荷電粒子よりも大きい流体力学的半径を有し得る。これは、より小さい粒子が溶液を通って移動するにつれて、より多くの水分子を引きずるためである。溶媒中の粒子の実際の寸法は直接測定できないので、流体力学的半径はストークス－アインシュタイン方程式：

【0200】

【数5】

【0201】

によって定義され得、式中、ｋ_Ｂはボルツマン定数であり、Ｔは温度であり、ηは溶媒の粘度であり、Ｄは拡散係数である。拡散係数は、例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）を使用することによって実験的に決定することができる。したがって、粒子または粒子集団の流体力学的半径（例えば、本明細書に開示される試料もしくは対照組成物に含まれる粒子の流体力学的半径、またはそのような試料もしくは対照組成物をフィールドフローフラクショネーションに供することから得られる粒子ピークの流体力学的半径）を決定するための１つの手順は、当該粒子または粒子集団のＤＬＳシグナル（例えば、本明細書に開示される試料もしくは対照組成物に含まれる粒子のＤＬＳシグナル、またはそのような試料もしくは対照組成物をフィールドフローフラクショネーションに供することから得られる粒子ピークのＤＬＳシグナル）を測定することである。

【0202】

本明細書で使用される「光散乱」という表現は、光が通過する媒体内の局所的な不均一性のために、光が１つ以上の経路だけ直線軌道から逸脱することを余儀なくされる物理的プロセスを指す。

【0203】

「ＵＶ」という用語は紫外線を意味し、１０ｎｍ～４００ｎｍの波長、すなわち可視光の波長よりも短いがＸ線よりも長い波長を有する電磁スペクトルの帯域を示す。

【0204】

本明細書で使用される「多角度光散乱」または「ＭＡＬＳ」という表現は、試料によって複数の角度に散乱された光を測定するための技術に関する。「多角度」とは、これに関して、散乱光が、例えば、選択された特定の角度を含む範囲にわたって移動する単一の検出器、または特定の角度位置に固定された検出器のアレイによって測定されるように、異なる離散角度で検出され得ることを意味する。特定の実施形態では、ＭＡＬＳで使用される光源は、レーザー源（ＭＡＬＬＳ：多角度レーザー光散乱）である。粒子を含む組成物のＭＡＬＳシグナルに基づき、適切な形式（例えば、Ｚｉｍｍプロット、Ｂｅｒｒｙプロット、またはＤｅｂｙｅプロット）を使用することによって、回転半径（Ｒ_ｇ）、したがって当該粒子のサイズを決定することが可能である。好ましくは、Ｚｉｍｍプロットは、以下の式：

【0205】

【数6】

【0206】

を使用したグラフ表示であり、式中、ｃは溶媒中の粒子の質量濃度（ｇ／ｍＬ）であり、Ａ_２は第２のビリアル係数（ｍｏｌ・ｍＬ／ｇ^２）であり、Ｐ（θ）は散乱光強度の角度依存性に関するフォームファクタであり、Ｒ_θは過剰レイリー比（ｃｍ^－１）であり、Ｋ＊は４π^２η_ｏ（ｄｎ／ｄｃ）^２λ_０ ^－４Ｎ_Ａ ^－１に等しい光学定数であり、ここで、η_ｏは入射放射（真空）波長での溶媒の屈折率であり、λ_０は入射放射（真空）波長（ｎｍ）であり、Ｎ_Ａはアボガドロ数（ｍｏｌ^－１）であり、ｄｎ／ｄｃは示差屈折率増分値（ｍＬ／ｇ）である（例えば、Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２２（２００１），４１１８－４１２８）；Ｂ．Ｈ．Ｚｉｍｍ（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１３（１９４５），１４１；Ｐ．Ｄｅｂｙｅ（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．１５（１９４４）：３３８；およびＷ．Ｂｕｒｃｈａｒｄ（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７５（２００３），４２７９－４２９１参照）。好ましくは、Ｂｅｒｒｙプロットは、以下の項：

【0207】

【数7】

【0208】

で計算され、式中、ｃ、Ｒ_θおよびＫ＊は上で定義した通りである。好ましくは、Ｄｅｂｙｅプロットは、以下の項：

【0209】

【数8】

【0210】

で計算され、式中、ｃ、Ｒ_θおよびＫ＊は上で定義した通りである。

【0211】

本明細書で使用される「動的光散乱」または「ＤＬＳ」という表現は、特に粒子の流体力学的半径に関して、粒子のサイズおよびサイズ分布プロファイルを決定する技術を指す。単色光源、通常はレーザーが、偏光子を通して試料に入射する。次いで、散乱光は第２の偏光子を通過し、そこで検出され、得られた画像がスクリーンに投影される。溶液中の粒子は光に当たり、光を全方向に回折させる。粒子からの回折光は、建設的に（明るい領域）または破壊的に（暗い領域）干渉することができる。このプロセスは短い時間間隔で繰り返され、得られたスペックルパターンのセットは、各スポットにおける光の強度を経時的に比較する自己相関器によって分析される。

【0212】

本明細書で使用される「静的光散乱」または「ＳＬＳ」という表現は、特に粒子の回転半径、および／または粒子のモル質量に関して、粒子のサイズおよびサイズ分布プロファイルを決定する技術を指す。高強度単色光、通常はレーザーが、粒子を含有する溶液中で発射される。１つ以上の角度で散乱強度を測定するために、１つ以上の検出器が使用される。角度依存性は、半径の全ての高分子のモル質量とサイズの両方の正確な測定値を得るために必要である。したがって、多角度光散乱（ＭＡＬＳ）または多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）として公知の、入射光の方向に対するいくつかの角度での同時測定は、一般に、静的光散乱の標準的な実施態様と見なされる。

【0213】

核酸
「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、それらの組合せ、およびそれらの修飾形態を含む。この用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換え生産された分子、および化学的に合成された分子を含む。いくつかの実施形態では、核酸はＤＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸はＲＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡとＲＮＡとの混合物である。核酸は、一本鎖または二本鎖および直鎖状または共有結合閉環分子として存在し得る。核酸は単離することができる。「単離された核酸」という用語は、本開示によれば、核酸が、（ｉ）例えばＤＮＡについてはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、もしくはＲＮＡについてはインビトロ転写（例えばＲＮＡポリメラーゼを使用して）によって、インビトロで増幅された、（ｉｉ）クローニングによって組換え生産された、（ｉｉｉ）例えば切断およびゲル電気泳動による分離によって精製された、または（ｉｖ）例えば化学合成によって合成されたことを意味する。

【0214】

「ヌクレオシド」（本明細書では「Ｎ」と略す）という用語は、リン酸基を有さないヌクレオチドと考えることができる化合物に関する。ヌクレオシドは糖（例えばリボースまたはデオキシリボース）に結合した核酸塩基であるが、ヌクレオチドはヌクレオシドと１つ以上のリン酸基から構成される。ヌクレオシドの例としては、シチジン、ウリジン、プソイドウリジン、アデノシン、およびグアノシンが挙げられる。

【0215】

通常天然に存在する核酸を構成する５つの標準的なヌクレオシドは、ウリジン、アデノシン、チミジン、シチジンおよびグアノシンである。５つのヌクレオシドは、一般に、それぞれその１文字コードＵ、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧと略される。ただし、チミジンは、ウリジンに見出されるリボフラノース環ではなく２’－デオキシリボフラノース部分を含むので、より一般的には「ｄＴ」（「ｄ」は「デオキシ」を表す）と表記される。これは、チミジンがリボ核酸（ＲＮＡ）ではなくデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に見出されるためである。逆に、ウリジンはＤＮＡではなくＲＮＡに見出される。残りの３つのヌクレオシドは、ＲＮＡとＤＮＡの両方に見出され得る。ＲＮＡでは、それらはＡ、ＣおよびＧとして表され、ＤＮＡでは、ｄＡ、ｄＣおよびｄＧとして表される。

【0216】

修飾されたプリン（ＡもしくはＧ）またはピリミジン（Ｃ、Ｔ、もしくはＵ）塩基部分は、いくつかの実施形態では、１つ以上のアルキル基、例えば１つ以上のＣ_１－４アルキル基、例えば１つ以上のメチル基によって修飾されている。修飾されたプリンまたはピリミジン塩基部分の特定の例としては、Ｎ^７－アルキル－グアニン、Ｎ^６－アルキル－アデニン、５－アルキル－シトシン、５－アルキル－ウラシル、およびＮ（１）－アルキル－ウラシル、例えばＮ^７－Ｃ_１－４アルキル－グアニン、Ｎ^６－Ｃ_１－４アルキル－アデニン、５－Ｃ_１－４アルキル－シトシン、５－Ｃ_１－４アルキル－ウラシル、およびＮ（１）－Ｃ_１－４アルキル－ウラシル、好ましくはＮ^７－メチル－グアニン、Ｎ^６－メチル－アデニン、５－メチル－シトシン、５－メチル－ウラシル、およびＮ（１）－メチル－ウラシルが挙げられる。

【0217】

本明細書では、「ＤＮＡ」という用語は、デオキシリボヌクレオチド残基を含む核酸分子に関する。好ましい実施形態では、ＤＮＡは、デオキシリボヌクレオチド残基の全部または大部分を含む。本明細書で使用される場合、「デオキシリボヌクレオチド」は、β－Ｄ－リボフラノシル基の２’位にヒドロキシル基を欠くヌクレオチドを指す。ＤＮＡは、限定されないが、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、部分的に精製されたＤＮＡなどの単離されたＤＮＡ、本質的に純粋なＤＮＡ、合成ＤＮＡ、組換え生産されたＤＮＡ、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変によって天然に存在するＤＮＡとは異なる修飾ＤＮＡを包含する。そのような改変は、内部ＤＮＡヌクレオチドまたはＤＮＡの末端（一方もしくは両方）への非ヌクレオチド物質の付加を指し得る。本明細書では、ＤＮＡ中のヌクレオチドは、化学合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドであり得ることも企図される。本開示では、これらの改変されたＤＮＡは、天然に存在するＤＮＡの類似体と見なされる。分子中のデオキシリボヌクレオチド残基の含有量が、分子中のヌクレオチド残基の総数に基づいて５０％（例えば、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）を超える場合、分子は「デオキシリボヌクレオチド残基の大部分」を含む。分子中のヌクレオチド残基の総数は、全てのヌクレオチド残基（ヌクレオチド残基が標準的（すなわち天然に存在する）ヌクレオチド残基であるかその類似体であるかに関わらず）の合計である。

【0218】

ＤＮＡは組換えＤＮＡであり得、核酸、特にｃＤＮＡのクローニングによって得られ得る。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写によって得られ得る。

【0219】

「ＲＮＡ」という用語は、リボヌクレオチド残基を含む核酸分子に関する。好ましい実施形態では、ＲＮＡは、リボヌクレオチド残基の全部または大部分を含む。本明細書で使用される場合、「リボヌクレオチド」は、β－Ｄ－リボフラノシル基の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを指す。ＲＮＡは、限定されないが、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え生産されたＲＮＡ、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変によって天然に存在するＲＮＡとは異なる修飾ＲＮＡを包含する。そのような改変は、内部ＲＮＡヌクレオチドへの、またはＲＮＡの末端（一方もしくは両方）への非ヌクレオチド物質の付加を指し得る。本明細書では、ＲＮＡ中のヌクレオチドが、化学合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドであり得ることも企図される。本開示では、これらの改変／修飾ヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチドの類似体と呼ぶことができ、そのような改変／修飾ヌクレオチドを含む対応するＲＮＡ（すなわち改変／修飾ＲＮＡ）は、天然に存在するＲＮＡの類似体と呼ぶことができる。分子中のリボヌクレオチド残基の含有量が、分子中のヌクレオチド残基の総数に基づいて５０％（例えば、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）を超える場合、分子は「リボヌクレオチド残基の大部分」を含む。分子中のヌクレオチド残基の総数は、全てのヌクレオチド残基（ヌクレオチド残基が標準的（すなわち天然に存在する）ヌクレオチド残基であるかその類似体であるかに関わらず）の合計である。

【0220】

「ＲＮＡ」には、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、自己増幅ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、ｄｓＲＮＡ、阻害性ＲＮＡ（例えば、アンチセンスｓｓＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）など）、活性化ＲＮＡ（例えば低分子活性化ＲＮＡ）および免疫刺激性ＲＮＡ（ｉｓＲＮＡ）が含まれる。いくつかの実施形態では、「ＲＮＡ」はｍＲＮＡを指す。

【0221】

本明細書で使用される「インビトロ転写」または「ＩＶＴ」という用語は、転写（すなわちＲＮＡの生成）が無細胞的に行われることを意味する。すなわち、ＩＶＴは、生存／培養細胞を使用するのではなく、細胞から抽出された転写機構（例えば、細胞溶解物またはＲＮＡポリメラーゼ（好ましくはＴ７、Ｔ３もしくはＳＰ６ポリメラーゼ）を含むその単離された成分）を使用する。

【0222】

ｍＲＮＡ
本開示によれば、「ｍＲＮＡ」という用語は「メッセンジャーＲＮＡ」を意味し、ＤＮＡ鋳型を使用することによって生成され得る「転写物」を含む。一般に、ｍＲＮＡはペプチドまたはポリペプチドをコードする。

【0223】

ｍＲＮＡは一本鎖であるが、ｍＲＮＡの一部が折りたたまれ、それ自体と対合して二重らせんを形成することを可能にする自己相補的配列を含み得る。

【0224】

本開示によれば、「ｄｓＲＮＡ」は二本鎖ＲＮＡを意味し、２つの部分的または完全に相補的な鎖を有するＲＮＡである。

【0225】

本開示の好ましい実施形態では、ｍＲＮＡは、ペプチドまたはポリペプチドをコードするＲＮＡ転写物に関する。

【0226】

いくつかの実施形態では、好ましくはペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、少なくとも４５ヌクレオチド（例えば、少なくとも６０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１，０００、少なくとも１，５００、少なくとも２，０００、少なくとも２，５００、少なくとも３，０００、少なくとも３，５００、少なくとも４，０００、少なくとも４，５００、少なくとも５，０００、少なくとも６，０００、少なくとも７，０００、少なくとも８，０００、少なくとも９，０００ヌクレオチド）、好ましくは最大１５，０００、例えば最大１４，０００、最大１３，０００、最大１２，０００ヌクレオチド、最大１１，０００ヌクレオチドまたは最大１０，０００ヌクレオチドの長さを有する。

【0227】

当技術分野で確立されているように、ｍＲＮＡは一般に、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、ペプチド／ポリペプチドコード領域および３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、インビトロ転写または化学合成によって生成される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型を使用したインビトロ転写によって生成される。インビトロ転写の方法は当業者に公知である；例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：４^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ２０１２参照。さらに、様々なインビトロ転写キットが、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔＡｉｄ（商標）Ｔ７キット、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｔ７キット、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ（登録商標）など）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．（ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７キット、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ ＡＲＣＡ ｍＲＮＡキットなど）、Ｐｒｏｍｅｇａ（ＲｉｂｏＭＡＸ（商標）、ＨｅＬａＳｃｒｉｂｅ（登録商標）、Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ（登録商標）システムなど）、Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＳＰ６またはＴ７転写キットなど）、およびＥｐｉｃｅｎｔｒｅ（ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ（商標）など）から市販されている。修飾されたｍＲＮＡを提供するために、対応して修飾されたヌクレオチド、例えば修飾された天然に存在するヌクレオチド、非天然に存在するヌクレオチドおよび／または修飾された非天然に存在するヌクレオチドを合成（好ましくはインビトロ転写）中に組み込むことができ、または転写後にｍＲＮＡ中で修飾を行うおよび／またはｍＲＮＡに修飾を付加することができる。

【0228】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはインビトロ転写ｍＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）であり、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって得られ得る。転写を制御するためのプロモータは、任意のＲＮＡポリメラーゼのための任意のプロモータであり得る。ＲＮＡポリメラーゼの特定の例は、Ｔ７、Ｔ３、およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼである。好ましくは、インビトロ転写は、Ｔ７またはＳＰ６プロモータによって制御される。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡをクローニングし、それをインビトロ転写のための適切なベクターに導入することによって得られ得る。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写によって得られ得る。

【0229】

本開示のいくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、「レプリコンｍＲＮＡ」または単に「レプリコン」、特に「自己複製ｍＲＮＡ」または「自己増幅ｍＲＮＡ」である。特定の実施形態では、レプリコンまたは自己複製ｍＲＮＡは、ｓｓＲＮＡウイルス、特にアルファウイルスなどのプラス鎖ｓｓＲＮＡウイルスに由来するか、またはそれに由来する要素を含む。アルファウイルスは、プラス鎖ＲＮＡウイルスの典型的な代表例である。アルファウイルスは、感染細胞の細胞質で複製する（アルファウイルスの生活環の総説については、Ｊｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００９，ｖｏｌ．４，ｐｐ．８３７－８５６を参照）。多くのアルファウイルスの全ゲノム長は、典型的には１１，０００～１２，０００ヌクレオチドの範囲であり、ゲノムＲＮＡは、典型的には５’キャップおよび３’ポリ（Ａ）尾部を有する。アルファウイルスのゲノムは、非構造タンパク質（ウイルスＲＮＡの転写、修飾および複製ならびにタンパク質修飾に関与する）および構造タンパク質（ウイルス粒子を形成する）をコードする。典型的には、ゲノム中に２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在する。４つの非構造タンパク質（ｎｓＰ１～ｎｓＰ４）は、典型的には、ゲノムの５’末端付近から始まる第１のＯＲＦによって一緒にコードされ、一方アルファウイルスの構造タンパク質は、第１のＯＲＦの下流に見出され、ゲノムの３’末端付近に延びる第２のＯＲＦによって一緒にコードされる。典型的には、第１のＯＲＦは第２のＯＲＦよりも大きく、比率はおよそ２：１である。アルファウイルスに感染した細胞では、非構造タンパク質をコードする核酸配列のみがゲノムＲＮＡから翻訳され、一方構造タンパク質をコードする遺伝情報は、真核生物のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ；Ｇｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．８７，ｐｐ．１１１－１２４）に類似したＲＮＡ分子であるサブゲノム転写物から翻訳可能である。感染後、すなわちウイルス生活環の初期段階に、（＋）鎖ゲノムＲＮＡは、非構造ポリタンパク質（ｎｓＰ１２３４）をコードするオープンリーディングフレームの翻訳のためにメッセンジャーＲＮＡのように直接作用する。アルファウイルス由来のベクターは、外来遺伝情報を標的細胞または標的生物に送達するために提案されている。単純なアプローチでは、アルファウイルス構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームによって置き換える。アルファウイルスに基づくトランス複製系は、２つの別個の核酸分子上のアルファウイルスヌクレオチド配列要素に依存する：一方の核酸分子はウイルスレプリカーゼをコードし、他方の核酸分子はトランスで当該レプリカーゼによって複製されることができる（したがってトランス複製系という名称）。トランス複製は、所与の宿主細胞中にこれらの核酸分子の両方が存在することを必要とする。トランスでレプリカーゼによって複製され得る核酸分子は、アルファウイルスレプリカーゼによる認識およびＲＮＡ合成を可能にするために特定のアルファウイルス配列要素を含まなければならない。

【0230】

本開示のいくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、例えば、その安定性を高め、および／または翻訳効率を高め、および／または免疫原性を低下させ、および／または細胞傷害性を低下させるために、１つ以上の修飾を含む。例えば、ｍＲＮＡの発現を増加させるために、ｍＲＮＡを、好ましくは発現されるペプチドまたはポリペプチドの配列を変化させることなく、コード領域、すなわち発現されるペプチドまたはポリペプチドをコードする配列内で修飾し得る。そのような修飾は、例えば、国際公開第２００７／０３６３６６号およびＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０５６５０２号に記載されており、以下を含む：５’キャップ構造；天然に存在するポリ（Ａ）尾部の伸長もしくは切断；５’および／もしくは３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の改変、例えば当該ＲＮＡのコード領域に関連しないＵＴＲの導入；１つ以上の天然に存在するヌクレオチドの合成ヌクレオチドによる置換；ならびにコドン最適化（例えば、ＲＮＡのＧＣ含有量を変化させるため、好ましくは増加させるため）。

【0231】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５’キャップ構造を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、キャップされていない５’－三リン酸を有さない。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、従来の５’キャップおよび／または５’キャップ類似体を含み得る。「従来の５’キャップ」という用語は、ｍＲＮＡ分子の５’末端に見出されるキャップ構造を指し、一般に、その三リン酸部分を介してｍＲＮＡの次のヌクレオチドの５’末端に連結されているグアノシン５’－三リン酸（Ｇｐｐｐ）からなる（すなわち、グアノシンは５’－５’三リン酸結合を介してｍＲＮＡの残りの部分に連結されている）。グアノシンは、Ｎ^７位でメチル化され得る（キャップ構造ｍ^７Ｇｐｐｐをもたらす）。「５’キャップ類似体」という用語は、従来の５’キャップに基づくが、５’キャップ類似体の逆向きの組込みを回避するためにｍ^７グアノシン構造の２’位または３’位のいずれかで修飾されている５’キャップを含む（そのような５’キャップ類似体はアンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）とも呼ばれる）。特に好ましい５’キャップ類似体は、ＰＣＴ／ＥＰ第２０１９／０５６５０２号に記載されているように、リン酸架橋中の架橋酸素および非架橋酸素に１つ以上の置換を有するもの、例えばβ－リン酸におけるホスホロチオエート修飾５’キャップ類似体（例えば、ｍ_２ ^{７，２’Ｏ}Ｇ（５’）ｐｐＳｐ（５’）Ｇ（β－Ｓ－ＡＲＣＡまたはβ－Ｓ－ＡＲＣＡと呼ばれる））である。例えば、本明細書に記載の５’キャップ構造を有するｍＲＮＡを提供することは、対応する５’キャップ化合物の存在下でのＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって達成され得、当該５’キャップ構造は、生成されたｍＲＮＡ鎖に共転写的に組み込まれるか、またはｍＲＮＡは、例えばインビトロ転写によって生成され得、５’キャップ構造は、キャッピング酵素、例えばワクシニアウイルスのキャッピング酵素を使用して転写後にｍＲＮＡに結合され得る。

【0232】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍ_２ ^{７，２’Ｏ}Ｇ（５’）ｐｐＳｐ（５’）Ｇ（特にそのＤ１ジアステレオマ）、ｍ_２ ^{７，３’Ｏ}Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、およびｍ_２ ^{７，３’－Ｏ}Ｇｐｐｐ（ｍ_１ ^２’－Ｏ）ＡｐＧからなる群より選択される５’キャップ構造を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のエピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡは、５’－キャップ構造としてｍ_２ ^{７，２’Ｏ}Ｇ（５’）ｐｐＳｐ（５’）Ｇ（特にそのＤ１ジアステレオマ）を含む。

【0233】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、キャップ０、キャップ１、またはキャップ２、好ましくはキャップ１またはキャップ２を含む。本開示によれば、「キャップ０」という用語は、構造「ｍ^７ＧｐｐｐＮ」を意味し、Ｎは、２’位にＯＨ部分を担持する任意のヌクレオシドである。本開示によれば、「キャップ１」という用語は、構造「ｍ^７ＧｐｐｐＮｍ」を意味し、Ｎｍは、２’位にＯＣＨ_３部分を担持する任意のヌクレオシドである。本開示によれば、「キャップ２」という用語は、構造「ｍ^７ＧｐｐｐＮｍＮｍ」を意味し、各Ｎｍは、独立して、２’位にＯＣＨ_３部分を担持する任意のヌクレオシドである。

【0234】

５’キャップ類似体ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（β－Ｓ－ＡＲＣＡ）は、以下の構造：

【0235】

【化1】

【0236】

を有する。

【0237】

「ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマ」または「ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）」は、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマ（ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ２））と比較して、ＨＰＬＣカラムで最初に溶出し、したがってより短い保持時間を示すベータ－Ｓ－ＡＲＣＡのジアステレオマである。ＨＰＬＣは、好ましくは分析ＨＰＬＣである。いくつかの実施形態では、好ましくは５μｍ、４．６×２５０ｍｍの形式のＳｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ－１８－Ｔ ＲＰカラムを分離に使用し、それにより１．３ｍｌ／分の流量を適用することができる。いくつかの実施形態では、酢酸アンモニウム中のメタノールの勾配、例えば１５分以内で０．０５Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ＝５．９中のメタノールの０～２５％直線勾配を使用する。ＵＶ検出（ＶＷＤ）は２６０ｎｍで実施することができ、蛍光検出（ＦＬＤ）は２８０ｎｍでの励起および３３７ｎｍでの検出で実施することができる。

【0238】

キャップ１のビルディングブロックである５’キャップ類似体ｍ_２ ^{７，３’－Ｏ}Ｇｐｐｐ（ｍ_１ ^２’－Ｏ）ＡｐＧ（ｍ_２ ^{７，３’Ｏ}Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ｍ^２’－ＯＡｐＧとも呼ばれる）は、以下の構造：

【0239】

【化2】

【0240】

を有する。

【0241】

β－Ｓ－ＡＲＣＡおよびｍＲＮＡを含む例示的なキャップ０ ｍＲＮＡは、以下の構造：

【0242】

【化3】

【0243】

を有する。

【0244】

ｍ_２ ^{７，３’Ｏ}Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＧおよびｍＲＮＡを含む例示的なキャップ０ ｍＲＮＡは、以下の構造：

【0245】

【化4】

【0246】

を有する。

【0247】

ｍ_２ ^{７，３’－Ｏ}Ｇｐｐｐ（ｍ_１ ^２’－Ｏ）ＡｐＧおよびｍＲＮＡを含む例示的なキャップ１ ｍＲＮＡは、以下の構造：

【0248】

【化5】

【0249】

を有する。

【0250】

本発明で使用される場合、「ポリＡ尾部」または「ポリＡ配列」という用語は、典型的にはｍＲＮＡ分子の３’末端に位置するアデニル酸残基の連続的または断続的な配列を指す。ポリＡ尾部またはポリＡ配列は当業者に公知であり、本明細書に記載のｍＲＮＡの３’－ＵＴＲに後続し得る。連続的なポリＡ尾部は、連続するアデニル酸残基を特徴とする。自然界では、連続したポリＡ尾部が典型的である。本明細書に開示されるｍＲＮＡは、転写後に鋳型非依存性ＲＮＡポリメラーゼによってｍＲＮＡの遊離３’末端に結合したポリＡ尾部、またはＤＮＡによってコードされ、鋳型依存性ＲＮＡポリメラーゼによって転写されたポリＡ尾部を有し得る。

【0251】

約１２０個のＡヌクレオチドのポリＡ尾部は、トランスフェクトされた真核細胞中のｍＲＮＡのレベル、およびポリＡ尾部の上流（５’側）に存在するオープンリーディングフレームから翻訳されるタンパク質のレベルに有益な影響を及ぼすことが実証されている（Ｈｏｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０８，ｐｐ．４００９－４０１７）。

【0252】

ポリＡ尾部は任意の長さであり得る。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも８０個、または少なくとも１００個、および最大５００個、最大４００個、最大３００個、最大２００個、または最大１５０個までのＡヌクレオチド、特に約１２０個のＡヌクレオチドを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。この文脈において、「から本質的になる」は、ポリＡ尾部のほとんどのヌクレオチド、典型的にはポリＡ尾部のヌクレオチド数の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％がＡヌクレオチドであるが、残りのヌクレオチドがＡヌクレオチド以外のヌクレオチド、例えばＵヌクレオチド（ウリジル酸）、Ｇヌクレオチド（グアニル酸）、またはＣヌクレオチド（シチジル酸）であることを許容することを意味する。この文脈において、「からなる」は、ポリＡ尾部の全てのヌクレオチド、すなわちポリＡ尾部のヌクレオチド数の１００％がＡヌクレオチドであることを意味する。「Ａヌクレオチド」または「Ａ」という用語は、アデニル酸を指す。

【0253】

いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、コード鎖に相補的な鎖内に反復ｄＴヌクレオチド（デオキシチミジル酸）を含むＤＮＡ鋳型に基づいて、ＲＮＡ転写中、例えばインビトロ転写ＲＮＡの調製中に結合される。ポリＡ尾部をコードするＤＮＡ配列（コード鎖）は、ポリ（Ａ）カセットと呼ばれる。

【0254】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡのコード鎖に存在するポリ（Ａ）カセットは、本質的にｄＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、およびｄＴ）のランダムな配列によって中断されている。そのようなランダムな配列は、５～５０、１０～３０、または１０～２０ヌクレオチド長であり得る。そのようなカセットは、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１６／００５３２４ Ａ１号に開示されている。国際公開第２０１６／００５３２４ Ａ１号に開示されている任意のポリ（Ａ）カセットを本開示において使用し得る。本質的にｄＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ）が均等に分布し、例えば５～５０ヌクレオチドの長さを有するランダムな配列によって中断されているポリ（Ａ）カセットは、ＤＮＡレベルでは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるプラスミドＤＮＡの持続的な増殖を示し、ＲＮＡレベルでは、ＲＮＡの安定性および翻訳効率を支持することに関して有益な特性と依然として関連している。結果として、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ分子に含まれるポリＡ尾部は、本質的にＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）のランダムな配列によって中断されている。そのようなランダムな配列は、５～５０、１０～３０、または１０～２０ヌクレオチド長であり得る。

【0255】

いくつかの実施形態では、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドは、その３’末端でポリＡ尾部に隣接しておらず、すなわち、ポリＡ尾部はその３’末端でＡ以外のヌクレオチドによってマスクされていないか、または後続されていない。

【0256】

いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも８０個、または少なくとも１００個、および最大５００個、最大４００個、最大３００個、最大２００個、または最大１５０個までのヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、本質的に、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも８０個、または少なくとも１００個、および最大５００個、最大４００個、最大３００個、最大２００個、または最大１５０個までのヌクレオチドからなり得る。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも８０個、または少なくとも１００個、および最大５００個、最大４００個、最大３００個、最大２００個、または最大１５０個までのヌクレオチドからなり得る。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、配列番号８に示されるポリＡ尾部を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は少なくとも１００個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は約１５０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は約１２０個のヌクレオチドを含む。

【0257】

いくつかの実施形態では、本開示において使用されるｍＲＮＡは、５’－ＵＴＲおよび／または３’－ＵＴＲを含む。「非翻訳領域」または「ＵＴＲ」という用語は、転写されるがアミノ酸配列に翻訳されないＤＮＡ分子内の領域、またはｍＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子内の対応する領域に関する。非翻訳領域（ＵＴＲ）は、オープンリーディングフレームの５’側（上流）（５’－ＵＴＲ）および／またはオープンリーディングフレームの３’側（下流）（３’－ＵＴＲ）に存在し得る。５’－ＵＴＲは、存在する場合、タンパク質コード領域の開始コドンの上流の５’末端に位置する。５’－ＵＴＲは５’キャップ（存在する場合）の下流にあり、例えば５’キャップに直接隣接している。３’－ＵＴＲは、存在する場合、タンパク質コード領域の終止コドンの下流の３’末端に位置するが、「３’－ＵＴＲ」という用語は、一般にポリ（Ａ）配列を含まない。したがって、３’－ＵＴＲはポリ（Ａ）配列（存在する場合）の上流にあり、例えばポリ（Ａ）配列に直接隣接している。ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）分子の３’非翻訳領域への３’ＵＴＲの組込みは、翻訳効率の向上をもたらし得る。そのような３’ＵＴＲの２つ以上を組み込むことによって（好ましくは頭－尾の向きに配置される；例えば、Ｈｏｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０８，４００９－４０１７（２００６）参照）、相乗作用が達成され得る。３’ＵＴＲは、それらが導入されるＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）に対して自己または異種であり得る。特定の実施形態では、３’－ＵＴＲは、グロビン遺伝子またはｍＲＮＡ、例えばα２－グロビン、α１－グロビン、またはβ－グロビン、例えばβ－グロビン、例えばヒトβ－グロビンの遺伝子またはｍＲＮＡに由来する。例えば、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）は、既存の３’－ＵＴＲを、グロビン遺伝子、例えばα２－グロビン、α１－グロビン、β－グロビン、例えばβ－グロビン、例えばヒトβ－グロビンに由来する１コピー以上、例えば２コピーの３’－ＵＴＲで置き換えるまたはそれを挿入することによって修飾され得る。

【0258】

特に好ましい５’－ＵＴＲは、配列番号６のヌクレオチド配列を含む。特に好ましい３’－ＵＴＲは、配列番号７のヌクレオチド配列を含む。

【0259】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、配列番号６のヌクレオチド配列、または配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’－ＵＴＲを含む。

【0260】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、配列番号７のヌクレオチド配列、または配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’－ＵＴＲを含む。

【0261】

ｍＲＮＡは、その安定性を高め、および／または免疫原性を低下させ、および／または細胞傷害性を低下させるために、修飾リボヌクレオチドを有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｍＲＮＡ中のウリジンは、修飾ヌクレオシドによって置き換えられる（部分的または完全に、好ましくは完全に）。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは修飾ウリジンである。

【0262】

いくつかの実施形態では、ウリジンを置換する修飾ウリジンは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１ψ）、５－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ）、およびそれらの組合せからなる群より選択される。

【0263】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ中のウリジンを置換する（部分的または完全に、好ましくは完全に）修飾ヌクレオシドは、３－メチルウリジン（ｍ３Ｕ）、５－メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－アザウリジン、６－アザウリジン、２－チオ－５－アザウリジン、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、４－チオウリジン（ｓ４Ｕ）、４－チオプソイドウリジン、２－チオプソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５－アミノアリルウリジン、５－ハロウリジン（例えば５－ヨードウリジンもしくは５－ブロモウリジン）、ウリジン５－オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５－カルボキシメチルウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１－カルボキシメチルプソイドウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５－アミノメチル－２－チオウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチルウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、１－エチルプソイドウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５－カルバモイルメチル－ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－プロピニルウリジン、１－プロピニルプソイドウリジン、５－タウリノメチルウリジン（τｍ５Ｕ）、１－タウリノメチルプソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１－タウリノメチル－４－チオプソイドウリジン）、５－メチル－２－チオウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１－メチル－４－チオプソイドウリジン（ｍ１ｓ４Ψ）、４－チオ－１－メチルプソイドウリジン、３－メチルプソイドウリジン（ｍ３Ψ）、２－チオ－１－メチルプソイドウリジン、１－メチル－１－デアザプソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザプソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、５－メチルジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２－チオジヒドロウリジン、２－チオジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオウリジン、４－メトキシプソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオプソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３Ψ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２－チオウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α－チオウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍ）、５，２’－Ｏ－ジメチルウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’－Ｏ－メチルプソイドウリジン（Ψｍ）、２－チオ－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’－Ｏ－ジメチルウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１－チオウリジン、デオキシチミジン、２’－Ｆ－アラウリジン、２’－Ｆ－ウリジン、２’－ＯＨ－アラウリジン、５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジン、５－［３－（１－Ｅ－プロペニルアミノ）ウリジン、または当技術分野で公知の任意の他の修飾ウリジンのいずれか１つ以上であり得る。

【0264】

プソイドウリジン（ウリジンを部分的または完全に、好ましくは完全に置換する）によって修飾されたＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）は、本明細書では「Ψ修飾された」と呼ばれ、「ｍ１Ψ修飾された」という用語は、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）がＮ（１）－メチルプソイドウリジン（ウリジンを部分的または完全に、好ましくは完全に置換する）を含むことを意味する。さらに、「ｍ５Ｕ修飾された」という用語は、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）が５－メチルウリジン（ウリジンを部分的または完全に、好ましくは完全に置換する）を含むことを意味する。そのようなΨ－またはｍ１Ψ－またはｍ５Ｕ修飾されたＲＮＡは、通常、それらの非修飾形態と比較して低下した免疫原性を示し、したがって、免疫応答の誘導を回避または最小化すべき用途において好ましい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）は、ウリジンを完全に置換するＮ（１）－メチルプソイドウリジンを含有する。

【0265】

本開示で使用されるｍＲＮＡのコドンは、例えば、ＲＮＡのＧＣ含有量を増加させるため、および／または目的のペプチドもしくはポリペプチドが発現されるべき細胞（もしくは対象）においてまれなコドンを、当該細胞（もしくは対象）において同義の頻度の高いコドンであるコドンによって置換するために、さらに最適化され得る。いくつかの実施形態では、本開示で使用されるｍＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列は、コドン最適化されたコード配列および／またはそのＧ／Ｃ含有量が野生型コード配列と比較して増加しているコード配列によってコードされる。これはまた、コード配列の１つ以上の配列領域が、野生型コード配列の対応する配列領域と比較して、コドン最適化されているおよび／またはＧ／Ｃ含有量が増加している実施形態を含む。いくつかの実施形態では、コドン最適化および／またはＧ／Ｃ含有量の増加は、好ましくはコードされるアミノ酸配列の配列を変化させない。

【0266】

「コドン最適化された」という用語は、好ましくは核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を改変することなく、宿主生物の典型的なコドン使用頻度を反映するための核酸分子のコード領域中のコドンの改変を指す。本開示の文脈内で、コード領域は、本明細書に記載のｍＲＮＡを使用して治療される対象における最適な発現のためにコドン最適化され得る。コドン最適化は、翻訳効率が、細胞におけるｔＲＮＡの出現の異なる頻度によっても決定されるという所見に基づく。したがって、ｍＲＮＡの配列は、頻繁に生じるｔＲＮＡが利用可能であるコドンが「まれなコドン」の代わりに挿入されるように改変され得る。

【0267】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡのコード領域のグアノシン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含有量は、野生型ＲＮＡの対応するコード配列のＧ／Ｃ含有量と比較して増加しており、ｍＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列は、好ましくは野生型ＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列と比較して改変されていない。ｍＲＮＡ配列のこの改変は、翻訳される任意のＲＮＡ領域の配列がそのｍＲＮＡの効率的な翻訳のために重要であるという事実に基づく。Ｇ（グアノシン）／Ｃ（シトシン）含有量が増加した配列は、Ａ（アデノシン）／Ｕ（ウラシル）含有量が増加した配列よりも安定である。いくつかのコドンが全く同じアミノ酸をコードする（いわゆる遺伝暗号の縮重）という事実に関して、安定性のために最も好ましいコドンを決定することができる（いわゆる代替的コドン使用頻度）。ｍＲＮＡによってコードされるアミノ酸に依存して、その野生型配列と比較して、ｍＲＮＡ配列の改変には様々な可能性がある。特に、Ａおよび／またはＵヌクレオチドを含むコドンは、これらのコドンを、同じアミノ酸をコードするがＡおよび／もしくはＵを含まないかまたはより低い含有量のＡおよび／もしくはＵヌクレオチドを含む他のコドンで置換することによって改変することができる。

【0268】

様々な実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含有量は、野生型ＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含有量と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、またはさらにそれ以上増加している。

【0269】

上述の修飾の組合せ、すなわち、５’キャップ構造の組込み、ポリＡ配列の組込み、ポリＡ配列のアンマスキング、５’－ＵＴＲおよび／または３’－ＵＴＲの改変（１つ以上の３’－ＵＴＲの組込みなど）、１つ以上の天然に存在するヌクレオチドを合成ヌクレオチド（例えば、シチジンの場合は５－メチルシチジン、および／またはウリジンの場合はプソイドウリジン（Ψ）もしくはＮ（１）－メチルプソイドウリジン（ｍ１Ψ）もしくは５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ））で置き換えること、ならびにコドン最適化は、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の安定性および翻訳効率の増加に相乗的な影響を及ぼす。したがって、いくつかの実施形態では、本開示において使用されるｍＲＮＡは、上述の修飾の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは５つ全ての組合せ、すなわち、（ｉ）５’キャップ構造の組込み、（ｉｉ）ポリＡ配列の組込み、ポリＡ配列のアンマスキング、（ｉｉｉ）５’－ＵＴＲおよび／または３’－ＵＴＲの改変（１つ以上の３’－ＵＴＲの組込みなど）、（ｉｖ）１つ以上の天然に存在するヌクレオチドを合成ヌクレオチド（例えば、シチジンの場合は５－メチルシチジン、および／またはウリジンの場合はプソイドウリジン（Ψ）もしくはＮ（１）－メチルプソイドウリジン（ｍ１Ψ）もしくは５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ））で置き換えること、ならびに（ｖ）コドン最適化を含む。

【0270】

本開示のいくつかの態様は、特定の細胞または組織への本明細書に開示されるｍＲＮＡの標的化送達を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、リンパ系、特に二次リンパ器官、より具体的には脾臓を標的とすることを含む。投与されるｍＲＮＡが、免疫応答を誘導するための抗原またはエピトープをコードするｍＲＮＡである場合、リンパ系、特に二次リンパ器官、より具体的には脾臓を標的とすることが特に好ましい。いくつかの実施形態では、標的細胞は脾臓細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、脾臓のプロフェッショナル抗原提示細胞などの抗原提示細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、脾臓における樹状細胞である。「リンパ系」は、循環系の一部であり、リンパを運ぶリンパ管のネットワークを含む免疫系の重要な部分である。リンパ系は、リンパ器官、リンパ管の伝導ネットワーク、および循環リンパからなる。一次または中枢リンパ器官は、未成熟な前駆細胞からリンパ球を生成する。胸腺および骨髄は一次リンパ器官を構成する。リンパ節および脾臓を含む二次または末梢リンパ器官は、成熟したナイーブリンパ球を維持し、適応免疫応答を開始する。

【0271】

脂質ベースのｍＲＮＡ送達システムは、肝臓に対する固有の選択性を有する。肝臓蓄積は、肝血管系の不連続な性質または脂質代謝（リポソームおよび脂質もしくはコレステロール複合体）によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、標的器官は肝臓であり、標的組織は肝臓組織である。そのような標的組織への送達は、特に、この器官または組織におけるｍＲＮＡまたはコードされたペプチドもしくはポリペプチドの存在が望ましい場合、および／またはコードされたペプチドもしくはポリペプチドを大量に発現することが望ましい場合、および／またはコードされたペプチドもしくはポリペプチドの全身的な存在、特に有意な量での存在が望ましいかもしくは必要とされる場合に好ましい。

【0272】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ粒子の投与後、ｍＲＮＡの少なくとも一部が標的細胞または標的器官に送達される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの少なくとも一部が標的細胞のサイトゾルに送達される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡであり、ｍＲＮＡは、標的細胞によって翻訳されてペプチドまたはポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、標的細胞は肝臓の細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は筋細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は内皮細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、腫瘍細胞または腫瘍微小環境の細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は血球である。いくつかの実施形態では、標的細胞はリンパ節の細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は肺の細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は血球である。いくつかの実施形態では、標的細胞は皮膚の細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は脾臓細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、脾臓のプロフェッショナル抗原提示細胞などの抗原提示細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、脾臓における樹状細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞はＢ細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞はＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は単球である。したがって、本明細書に記載のＲＮＡ粒子は、そのような標的細胞にｍＲＮＡを送達するために使用され得る。

【0273】

薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸
「コードする」は、定義されたヌクレオチドの配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）または定義されたアミノ酸の配列のいずれかを有する、生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として働く、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性、およびそれから生じる生物学的特性を指す。したがって、ある遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞または他の生物系においてタンパク質を産生する場合、その遺伝子はタンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列表に提供されるコード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖の両方が、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードすると呼ばれ得る。

【0274】

いくつかの実施形態では、本開示で使用されるｍＲＮＡなどの核酸は、ペプチドまたはポリペプチド、好ましくは薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示で使用されるｍＲＮＡなどの核酸は、ペプチドまたはポリペプチド、好ましくは薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸配列を含み、特に細胞または対象に移入された場合、当該ペプチドまたはポリペプチドを発現することができる。したがって、いくつかの実施形態では、本開示で使用される核酸は、ペプチドまたはポリペプチドをコードする、例えば薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチドをコードするコード領域（オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ））を含む。これに関して、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、開始コドンで始まり、終止コドンで終わるコドンの連続した一続きである。薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチドをコードするそのような核酸は、本明細書では「薬学的に活性な核酸」とも呼ばれる。特に、薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチドをコードするそのようなｍＲＮＡは、本明細書では「薬学的に活性なｍＲＮＡ」とも呼ばれる。いくつかの実施形態では、本開示で使用されるｍＲＮＡなどの核酸は、２つ以上のペプチドまたはポリペプチド、例えば２つ、３つ、４つまたはそれ以上のペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸配列を含む。

【0275】

本開示によれば、「薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチド」という用語は、ペプチドまたはポリペプチドの発現が、例えば疾患の症状を改善するのに有益である個体の治療において使用することができるペプチドまたはポリペプチドを意味する。好ましくは、薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチドは、治癒特性または緩和特性を有し、疾患の１つ以上の症状を改善する、緩和する、軽減する、逆転させる、発症を遅延させるまたは重症度を軽減するために投与され得る。いくつかの実施形態では、薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチドは、治療有効量で個体に投与された場合、個体の状態または病態に対してプラスの効果または有利な効果を及ぼす。薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチドは、予防的特性を有し得、疾患の発症を遅延させるため、またはそのような疾患の重症度を軽減するために使用され得る。「薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチド」という用語は、ペプチドまたはポリペプチド全体を含み、その薬学的に活性な断片も指すことができる。この用語はまた、ペプチドまたはポリペプチドの薬学的に活性な変異体および／または類似体を含み得る。

【0276】

本開示によれば、「薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチド」という用語は、ワクチン抗原、ＰＤ－１軸結合アンタゴニスト、免疫賦活剤、および抗原受容体を含む。

【0277】

いくつかの実施形態では、薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチドをコードするＲＮＡなどの核酸は、薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチドを提供するように処理された対象の細胞で発現される。いくつかの実施形態では、核酸は対象の細胞において一過性に発現される。したがって、いくつかの実施形態では、核酸は細胞のゲノムに組み込まれない。いくつかの実施形態では、核酸はＲＮＡ、好ましくはインビトロ転写ＲＮＡである。

【0278】

いくつかの実施形態では、ワクチンの発現は細胞表面においてである。いくつかの実施形態では、ワクチン抗原はＭＨＣに関連して発現および提示される。いくつかの実施形態では、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、免疫エフェクタ細胞による結合のためのワクチン抗原を提供するように処理された対象の抗原提示細胞などの細胞で発現され、当該結合は、免疫エフェクタ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大をもたらす。

【0279】

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１軸結合アンタゴニストの発現は細胞外空間にある、すなわち、ＰＤ－１軸結合アンタゴニストは分泌される。

【0280】

いくつかの実施形態では、免疫賦活剤の発現は細胞外空間にある、すなわち、免疫賦活剤は分泌される。

【0281】

いくつかの実施形態では、抗原受容体の発現は細胞表面においてである。

【0282】

ワクチン抗原をコードする非免疫原性ＲＮＡ
本発明は、対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡの使用を含む。「対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはポリペプチド」は、本明細書では「ワクチン抗原」、「ペプチド抗原およびタンパク質抗原」、または単に「抗原」とも呼ばれる。

【0283】

いくつかの実施形態では、ワクチン抗原をコードする非免疫原性ＲＮＡは、ＲＮＡが投与されている対象の細胞、例えば抗原提示細胞（ＡＰＣ）に入るとそれぞれのタンパク質に翻訳される一本鎖５’キャップｍＲＮＡである。好ましくは、ＲＮＡは、安定性および翻訳効率に関してＲＮＡの最大有効性のために最適化された構造要素（５’キャップ、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、ポリ（Ａ）配列）を含む。

【0284】

いくつかの実施形態では、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）をＲＮＡの５’末端の特異的キャッピング構造として利用する。いくつかの実施形態では、５’－ＵＴＲは、配列番号６のヌクレオチド配列、または配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、３’－ＵＴＲは、配列番号７のヌクレオチド配列、または配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は１１０ヌクレオチド長であり、３０個のアデノシン残基のストレッチと、それに続く１０個のヌクレオチドリンカー配列および別の７０個のアデノシン残基からなる。このポリ（Ａ）配列は、樹状細胞におけるＲＮＡ安定性と翻訳効率を高めるように設計された。いくつかの実施形態では、このポリ（Ａ）配列は、配列番号８のヌクレオチド配列、または配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

【0285】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、本明細書にさらに記載されるように、好ましくはＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥを含むリポプレックス粒子として投与される。いくつかの実施形態では、リポプレックス物品は、リンパ系、特に二次リンパ器官、具体的には脾臓、より具体的には脾臓中の樹状細胞を標的とする。いくつかの実施形態では、そのような粒子は、全身投与、特に静脈内投与によって投与される。

【0286】

いくつかの実施形態では、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、対象の細胞で発現されてワクチン抗原を提供する。いくつかの実施形態では、抗原の発現は細胞表面においてである。いくつかの実施形態では、ワクチン抗原はＭＨＣに関連して提示される。いくつかの実施形態では、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、対象の細胞において一過性に発現される。いくつかの実施形態では、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは全身投与される。いくつかの実施形態では、ワクチン抗原をコードするＲＮＡの全身投与後、脾臓においてワクチン抗原をコードするＲＮＡの発現が起こる。いくつかの実施形態では、ワクチン抗原をコードするＲＮＡの全身投与後、抗原提示細胞、好ましくはプロフェッショナル抗原提示細胞においてワクチン抗原をコードするＲＮＡの発現が起こる。いくつかの実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞、マクロファージおよびＢ細胞からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、ワクチン抗原をコードするＲＮＡの全身投与後、肺および／または肝臓においてワクチン抗原をコードするＲＮＡの発現は起こらないか、または本質的に起こらない。いくつかの実施形態では、ワクチン抗原をコードするＲＮＡの全身投与後、脾臓におけるワクチン抗原をコードするＲＮＡの発現は、肺における発現量の少なくとも５倍である。

【0287】

ワクチン抗原は、対象において抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含む。したがって、ワクチン抗原は、対象において抗原に対する免疫応答を誘導するための抗原配列を含む。そのような抗原配列は、標的抗原もしくは疾患関連抗原、例えば感染因子（例えば、ウイルス抗原または細菌抗原）のタンパク質もしくは腫瘍抗原に対応し得るか、またはその免疫原性変異体、または標的抗原もしくは疾患関連抗原の免疫原性断片もしくはその免疫原性変異体に対応し得る。したがって、抗原配列は、標的抗原もしくは疾患関連抗原またはその免疫原性変異体の少なくとも１つのエピトープを含み得る。

【0288】

本開示による使用に適した抗原配列、例えばエピトープは、典型的には、標的抗原、すなわち免疫応答が誘発される抗原に由来し得る。例えば、ワクチン抗原内に含まれる抗原配列は、標的抗原または標的抗原の断片もしくは変異体であり得る。

【0289】

抗原配列またはそのプロセシング産物、例えばその断片は、免疫エフェクタ細胞によって運ばれるＴＣＲまたはＣＡＲなどの抗原受容体に結合し得る。いくつかの実施形態では、抗原配列は、免疫エフェクタ細胞が標的とする標的細胞によって発現される抗原もしくはその断片、または当該抗原配列もしくは断片の変異体からなる群より選択される。

【0290】

ワクチン抗原をコードするＲＮＡを投与することによって本開示に従って対象に提供されるワクチン抗原は、好ましくは、ワクチン抗原が提供されている対象において、例えば免疫エフェクタ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大において免疫応答の誘導をもたらす。当該免疫応答、例えば刺激、プライミングおよび／または増殖された免疫エフェクタ細胞は、好ましくは標的抗原、特に疾患細胞、組織および／または器官によって発現される標的抗原、すなわち疾患関連抗原に対して向けられる。したがって、ワクチン抗原は、疾患関連抗原、またはその断片もしくは変異体を含み得る。いくつかの実施形態では、そのような断片または変異体は、疾患関連抗原と免疫学的に等価である。

【0291】

本開示の文脈において、「抗原の断片」または「抗原の変異体」という用語は、免疫応答の誘導、例えば免疫エフェクタ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大をもたらす作用物質を意味し、その免疫応答、例えば刺激された、プライミングされたおよび／または拡大された免疫エフェクタ細胞は、特に疾患細胞、組織および／または器官によって提示された場合、抗原、すなわち疾患関連抗原を標的とする。したがって、ワクチン抗原は、疾患関連抗原に対応し得るかもしくはそれを含み得るか、疾患関連抗原の断片に対応し得るかもしくはそれを含み得るか、または疾患関連抗原もしくはその断片に相同な抗原に対応し得るかもしくはそれを含み得る。ワクチン抗原が、疾患関連抗原の断片または疾患関連抗原の断片に相同なアミノ酸配列を含む場合、当該断片またはアミノ酸配列は、免疫エフェクタ細胞の抗原受容体が標的とする疾患関連抗原のエピトープまたは疾患関連抗原のエピトープに相同な配列を含み得る。したがって、本開示によれば、ワクチン抗原は、疾患関連抗原の免疫原性断片、または疾患関連抗原の免疫原性断片に相同なアミノ酸配列を含み得る。本開示による「抗原の免疫原性断片」は、好ましくは、抗原に結合する抗原受容体を担持する免疫エフェクタ細胞または抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導する、例えば刺激、プライミングおよび／または拡大することができる抗原の断片に関する。ワクチン抗原（疾患関連抗原に類似）は、免疫エフェクタ細胞に存在する抗原受容体による結合のための関連エピトープを提供することが好ましい。いくつかの実施形態では、ワクチン抗原またはその断片（疾患関連抗原に類似）は、免疫エフェクタ細胞による結合のための関連エピトープを提供するために、（任意にＭＨＣに関連して）抗原提示細胞などの細胞の表面に発現される。ワクチン抗原は組換え抗原であり得る。

【0292】

本発明の全ての態様のいくつかの実施形態では、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、対象の細胞で発現されて、免疫エフェクタ細胞によって発現される抗原受容体による結合のための抗原またはそのプロセシング産物を提供し、当該結合は免疫エフェクタ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大をもたらす。

【0293】

本開示による「抗原」は、免疫応答を誘発する任意の物質ならびに／または免疫応答もしく細胞性応答および／もしくは体液性応答などの免疫機構が向けられる任意の物質を包含する。これはまた、抗原が抗原ペプチドにプロセシングされ、特にＭＨＣ分子に関連して提示される場合、免疫応答または免疫機構が１つ以上の抗原ペプチドに向けられる状況を含む。特に、「抗原」は、抗体またはＴリンパ球（Ｔ細胞）と特異的に反応する、ペプチドまたはポリペプチドなどの任意の物質に関する。「抗原」という用語は、Ｔ細胞エピトープなどの少なくとも１つのエピトープを含む分子を含み得る。いくつかの実施形態では、抗原は、任意でプロセシング後に、抗原（抗原を発現する細胞を含む）に特異的であり得る免疫反応を誘導する分子である。いくつかの実施形態では、抗原は、腫瘍抗原、ウイルス抗原、もしくは細菌抗原などの疾患関連抗原、またはそのような抗原に由来するエピトープである。

【0294】

いくつかの実施形態では、抗原は、樹状細胞またはマクロファージのような抗原提示細胞などの免疫系の細胞の表面に提示されるかまたは存在する。Ｔ細胞エピトープなどの抗原またはそのプロセシング産物は、いくつかの実施形態では、抗原受容体によって結合される。したがって、抗原またはそのプロセシング産物は、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）などの免疫エフェクタ細胞と特異的に反応し得る。

【0295】

「自己抗原（ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎまたはｓｅｌｆ－ａｎｔｉｇｅｎ）」という用語は、対象の体内に由来し（すなわち自己抗原は「自家抗原」とも呼ばれ得る）、身体のこの正常な部分に対する異常に激しい免疫応答を生じさせる抗原を指す。自己抗原に対するそのような激しい免疫反応は、「自己免疫疾患」の原因であり得る。

【0296】

本開示によれば、免疫応答の候補である任意の適切な抗原を使用することができ、免疫応答は体液性もしくは細胞性免疫応答、またはその両方を含み得る。本開示のいくつかの実施形態の文脈において、抗原は、ＭＨＣ分子に関連して、抗原提示細胞などの細胞によって提示され、抗原に対する免疫応答をもたらす。抗原は、天然に存在する抗原に対応するまたは由来する生成物であり得る。そのような天然に存在する抗原は、アレルゲン、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫ならびに他の感染因子および病原体を含んでもよく、もしくはそれらに由来してもよく、または抗原は腫瘍抗原であってもよい。本開示によれば、抗原は、天然に存在する生成物、例えばウイルスタンパク質、またはその一部に対応し得る。

【0297】

「疾患関連抗原」という用語は、疾患に関連する任意の抗原を指すためにその最も広い意味で使用される。疾患関連抗原は、宿主の免疫系を刺激して、疾患に対する細胞性抗原特異的免疫応答および／または体液性抗体応答を生じさせるエピトープを含む分子である。疾患関連抗原としては、病原体関連抗原、すなわち微生物による感染に関連する抗原、典型的には微生物抗原（細菌抗原もしくはウイルス抗原など）、または癌、典型的には腫瘍に関連する抗原、例えば腫瘍抗原が挙げられる。

【0298】

いくつかの実施形態では、抗原は、腫瘍抗原、すなわち腫瘍細胞の一部、特に主に細胞内にまたは腫瘍細胞の表面抗原として存在するものである。別の実施形態では、抗原は、病原体関連抗原、すなわち病原体に由来する抗原、例えばウイルス、細菌、単細胞生物、または寄生虫に由来する抗原、例えばウイルスリボ核タンパク質またはコートタンパク質などのウイルス抗原である。いくつかの実施形態では、抗原は、特にＴ細胞受容体の活性の調節を介して、調節、特にＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球などの免疫系の細胞の活性化をもたらすＭＨＣ分子によって提示されるべきである。

【0299】

「腫瘍抗原」または「腫瘍関連抗原」という用語は、細胞質、細胞表面または細胞核に由来し得る癌細胞の成分を指す。特に、この用語は、細胞内でまたは腫瘍細胞上の表面抗原として産生される抗原を指す。例えば、腫瘍抗原としては、癌胎児性抗原、α１－フェトプロテイン、イソフェリチン、および胎児性スルホグリコプロテイン、α２－Ｈ－フェロプロテインおよびγ－フェトプロテイン、ならびに様々なウイルス腫瘍抗原が挙げられる。本開示のいくつかの実施形態によれば、腫瘍抗原は、タイプおよび／または発現レベルに関して腫瘍または癌および腫瘍細胞または癌細胞に特徴的な任意の抗原を含む。

【0300】

「ウイルス抗原」という用語は、抗原特性を有する、すなわち個体において免疫応答を誘発することができる任意のウイルス成分を指す。ウイルス抗原は、ウイルスリボ核タンパク質またはエンベロープタンパク質であり得る。

【0301】

「細菌抗原」という用語は、抗原特性を有する、すなわち個体において免疫応答を誘発することができる任意の細菌成分を指す。細菌抗原は、細菌の細胞壁または細胞質膜に由来し得る。

【0302】

「エピトープ」という用語は、抗原などの分子中の抗原決定基、すなわち免疫系によって認識される、例えば、特にＭＨＣ分子に関連して提示された場合にＴ細胞によって認識される分子の一部または断片を指す。タンパク質のエピトープは、当該タンパク質の連続または不連続部分を含み得、例えば、約５～約１００、約５～約５０、約８～約３０、または約１０～約２５アミノ酸長であり得、例えば、エピトープは、好ましくは９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸長であり得る。いくつかの実施形態では、本開示の文脈におけるエピトープはＴ細胞エピトープである。

【0303】

「エピトープ」、「抗原の断片」、「免疫原性ペプチド」および「抗原ペプチド」などの用語は、本明細書では互換的に使用され、例えば、抗原または抗原を発現するかもしくは含み、抗原を提示する細胞に対する免疫応答を誘発することができる、抗原の不完全な表示形態に関連し得る。いくつかの実施形態では、これらの用語は、抗原の免疫原性部分に関する。いくつかの実施形態では、これは、特にＭＨＣ分子に関連して提示された場合、Ｔ細胞受容体によって認識される（すなわち特異的に結合される）抗原の一部である。特定の好ましい免疫原性部分は、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子に結合する。「エピトープ」という用語は、免疫系によって認識される抗原などの分子の一部または断片を指す。例えば、エピトープは、Ｔ細胞、Ｂ細胞または抗体によって認識され得る。抗原のエピトープは、抗原の連続部分または不連続部分を含み得、約５～約１００アミノ酸、例えば約５～約５０、約８～約３０、または約８～約２５アミノ酸の長さであり得、例えば、エピトープは、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸の長さであり得る。いくつかの実施形態では、エピトープは、約１０～約２５アミノ酸の長さである。「エピトープ」という用語は、Ｔ細胞エピトープを含む。

【0304】

「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、ＭＨＣ分子に関連して提示された場合にＴ細胞によって認識されるタンパク質の一部または断片を指す。「主要組織適合遺伝子複合体」という用語および「ＭＨＣ」という略語は、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子を含み、全ての脊椎動物に存在する遺伝子の複合体に関する。ＭＨＣタンパク質または分子は、免疫反応におけるリンパ球と抗原提示細胞または疾患細胞との間のシグナル伝達に重要であり、ＭＨＣタンパク質または分子は、ペプチドエピトープに結合し、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体による認識のためにそれらを提示する。ＭＨＣによってコードされるタンパク質は、細胞の表面に発現され、自己抗原（細胞自体からのペプチド断片）および非自己抗原（例えば、侵入微生物の断片）の両方をＴ細胞に表示する。クラスＩ ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には約８～約１０アミノ酸長であるが、より長いまたはより短いペプチドが有効であり得る。クラスＩＩ ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には約１０～約２５アミノ酸長であり、特に約１３～約１８アミノ酸長であるが、より長いおよびより短いペプチドも有効であり得る。

【0305】

ペプチドおよびポリペプチド抗原は、例えば、５アミノ酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸、３０アミノ酸、３５アミノ酸、４０アミノ酸、４５アミノ酸、または５０アミノ酸を含む、２～１００アミノ酸の長さであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、５０個を超えるアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、１００個を超えるアミノ酸であり得る。

【0306】

ペプチドまたはポリペプチド抗原は、ペプチドまたはポリペプチドに対する抗体およびＴ細胞応答を生じさせる免疫系の能力を誘導または増加させることができる任意のペプチドまたはポリペプチドであり得る。

【0307】

いくつかの実施形態では、ワクチン抗原、すなわち対象への接種が免疫応答を誘導する抗原は、免疫エフェクタ細胞によって認識される。いくつかの実施形態では、ワクチン抗原は、免疫エフェクタ細胞によって認識される場合、適切な共刺激シグナルの存在下で、ワクチン抗原を認識する抗原受容体を担持する免疫エフェクタ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大を誘導することができる。本開示の実施形態の文脈において、ワクチン抗原は、例えば、抗原提示細胞などの細胞の表面に提示され得るかまたは存在し得る。

【0308】

いくつかの実施形態では、抗原は、疾患細胞（腫瘍細胞または感染細胞など）で発現される。

【0309】

いくつかの実施形態では、抗原は、疾患細胞（腫瘍細胞または感染細胞など）によって提示される。いくつかの実施形態では、抗原受容体は、ＭＨＣに関連して提示される抗原のエピトープに結合するＴＣＲである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞によって発現される場合および／またはＴ細胞上に存在する場合のＴＣＲの、抗原提示細胞などの細胞によって提示される抗原への結合は、当該Ｔ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大をもたらす。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞によって発現された場合および／またはＴ細胞上に存在する場合のＴＣＲの、疾患細胞上に提示される抗原への結合は、疾患細胞の細胞溶解および／またはアポトーシスをもたらし、当該Ｔ細胞は、例えば細胞傷害性因子、例えばパーフォリンおよびグランザイムを放出する。

【0310】

いくつかの実施形態では、抗原は、疾患細胞（腫瘍細胞または感染細胞など）の表面に発現される。いくつかの実施形態では、抗原受容体は、抗原の細胞外ドメインまたは細胞外ドメインのエピトープに結合するＣＡＲである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、生細胞の表面に存在する抗原の天然エピトープに結合する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞によって発現された場合および／またはＴ細胞上に存在する場合のＣＡＲの、抗原提示細胞などの細胞上に存在する抗原への結合は、当該Ｔ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大をもたらす。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞によって発現された場合および／またはＴ細胞上に存在する場合のＣＡＲの、疾患細胞上に存在する抗原への結合は、疾患細胞の細胞溶解および／またはアポトーシスをもたらし、当該Ｔ細胞は、好ましくは細胞傷害性因子、例えばパーフォリンおよびグランザイムを放出する。

【0311】

いくつかの実施形態によれば、抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列は、直接的に、またはリンカーを介して、抗原ペプチドまたはポリペプチド（抗原配列）に融合される。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡは、抗原ペプチドまたはポリペプチドならびに抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列をコードする少なくとも１つのコード領域を含む。

【0312】

いくつかの実施形態では、それをコードするＲＮＡの形態で投与され得るワクチン接種のための抗原は、天然に存在する抗原またはそのエピトープなどの断片を含む。

【0313】

抗原プロセシングおよび／または提示を増強するそのようなアミノ酸配列は、限定されないが、好ましくは抗原ペプチドまたはポリペプチド質のＣ末端に（および任意で免疫寛容を破壊するアミノ酸配列のＣ末端に）位置する。本明細書で定義される抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列は、好ましくは抗原プロセシングおよび提示を改善する。いくつかの実施形態では、本明細書で定義される抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列は、ヒトＭＨＣクラスＩ複合体（ＨＬＡ－Ｂ５１、ハプロタイプＡ２、Ｂ２７／Ｂ５１、Ｃｗ２／Ｃｗ３）に由来する配列、特に配列番号２のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む配列を含むが、これに限定されない。

【0314】

いくつかの実施形態では、抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列もしくは配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含む。いくつかの実施形態では、抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。

【0315】

したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡは、抗原ペプチドまたはポリペプチドをコードする少なくとも１つのコード領域ならびに抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列を含み、抗原プロセシングおよび／または提示を増強する当該アミノ酸配列は、好ましくは抗原ペプチドまたはポリペプチド、より好ましくは本明細書に記載の抗原ペプチドまたはポリペプチドのＣ末端に融合されている。

【0316】

さらに、分泌配列、例えば配列番号１のアミノ酸配列を含む配列は、抗原ペプチドまたはポリペプチドのＮ末端に融合され得る。

【0317】

破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）の破傷風トキソイドに由来するアミノ酸配列は、プライミング中にＴ細胞支援を提供することによって自己抗原に対する免疫応答を効率的に開始するために、自己寛容機構を克服するために使用され得る。

【0318】

破傷風トキソイド重鎖は、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に無差別に結合し、破傷風ワクチン接種を受けたほぼ全ての個体においてＣＤ４^＋メモリＴ細胞を誘導することができるエピトープを含むことが公知である。さらに、破傷風トキソイド（ＴＴ）ヘルパーエピトープと腫瘍関連抗原との組合せは、プライミング中にＣＤ４^＋媒介Ｔ細胞支援を提供することによって、腫瘍関連抗原単独の適用と比較して免疫刺激を改善することが公知である。腫瘍抗原特異的Ｔ細胞応答の意図された誘導と競合し得る破傷風配列でＣＤ８^＋Ｔ細胞を刺激するリスクを低下させるために、破傷風トキソイドの断片Ｃ全体ではＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープを含有することが公知であるので、断片Ｃ全体は使用しない。可能な限り多くのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子への結合を確実にするために、無差別に結合するヘルパーエピトープを含有する２つのペプチド配列を代替的に選択した。エクスビボ試験のデータに基づいて、周知のエピトープｐ２（ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ；ＴＴ_{８３０－８４４}）およびｐ１６（ＭＴＮＳＶＤＤＡＬＩＮＳＴＫＩＹＳＹＦＰＳＶＩＳＫＶＮＱＧＡＱＧ；ＴＴ_{５７８－６０９}）を選択した。ｐ２エピトープは、抗黒色腫活性を高めるために臨床試験におけるペプチドワクチン接種に既に使用されていた。

【0319】

非臨床データは、腫瘍抗原および無差別に結合する破傷風トキソイド配列の両方をコードするＲＮＡワクチンが、腫瘍抗原に対するＣＤ８^＋Ｔ細胞応答の増強および寛容破壊の改善をもたらすことを示した。腫瘍抗原特異的配列とインフレームで融合した配列を含むワクチンを接種した患者からの免疫モニタリングデータは、選択された破傷風配列がほぼ全ての患者において破傷風特異的Ｔ細胞応答を誘導することができることを明らかにする。

【0320】

いくつかの実施形態によれば、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列は、直接的に、またはリンカー、例えば配列番号４に従うアミノ酸配列を有するリンカーを介して、抗原ペプチドまたはポリペプチドに融合される。

【0321】

免疫寛容を破壊するそのようなアミノ酸配列は、限定されないが、好ましくは抗原ペプチドまたはポリペプチドのＣ末端に（ならびに任意で抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列のＮ末端に、ここで、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列と抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列とは、直接的に、またはリンカー、例えば配列番号５に従うアミノ酸配列を有するリンカーを介して融合されていてもよい）位置する。本明細書で定義される免疫寛容を破壊するアミノ酸配列は、好ましくはＴ細胞応答を改善する。いくつかの実施形態では、本明細書で定義される免疫寛容を破壊するアミノ酸配列は、破傷風トキソイド由来のヘルパー配列ｐ２およびｐ１６に由来する配列（Ｐ２Ｐ１６）、特に配列番号３のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む配列を含むが、これに限定されない。

【0322】

いくつかの実施形態では、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列は、配列番号３のアミノ酸配列、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列もしくは配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含む。いくつかの実施形態では、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。

【0323】

以下において、ワクチンＲＮＡの実施形態を説明し、その要素を説明するときに使用される特定の用語は以下の意味を有する：
ｈＡｇ－コザック：翻訳効率を高めるための最適化された「コザック配列」を有するヒトα－グロビンｍＲＮＡの５’－ＵＴＲ配列。

【0324】

ｓｅｃ／ＭＩＴＤ：抗原プロセシングおよび提示を改善することが示されている、ヒトＭＨＣクラスＩ複合体（ＨＬＡ－Ｂ５１、ハプロタイプＡ２、Ｂ２７／Ｂ５１、Ｃｗ２／Ｃｗ３）をコードする配列に由来する融合タンパク質タグ。ｓｅｃは、新生ポリペプチド鎖の小胞体への移行を誘導する、分泌シグナルペプチドをコードする７８ｂｐ断片に対応する。ＭＩＴＤは、ＭＨＣクラスＩ輸送ドメインとも呼ばれる、ＭＨＣクラスＩ分子の膜貫通および細胞質ドメインに対応する。

【0325】

抗原：それぞれのワクチン抗原／エピトープをコードする配列。

【0326】

グリシン－セリンリンカー（ＧＳ）：融合タンパク質に一般的に使用される、主にアミノ酸グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）からなる短いリンカーペプチドをコードする配列。

【0327】

Ｐ２Ｐ１６：免疫寛容を破壊するための破傷風トキソイド由来ヘルパーエピトープをコードする配列。

【0328】

ＦＩ要素：３’－ＵＴＲは、「スプリットのアミノ末端エンハンサ」（ＡＥＳ）ｍＲＮＡ（Ｆと呼ばれる）およびミトコンドリアにコードされた１２ＳリボソームＲＮＡ（Ｉと呼ばれる）に由来する２つの配列要素の組合せである。これらは、ＲＮＡの安定性を付与し、総タンパク質発現を増強する配列のエクスビボ選択プロセスによって同定された。

【0329】

Ａ３０Ｌ７０：３０個のアデノシン残基のストレッチ、それに続く１０個のヌクレオチドのリンカー配列、および樹状細胞におけるＲＮＡの安定性と翻訳効率を高めるように設計された別の７０個のアデノシン残基からなる、１１０ヌクレオチド長と測定されるポリ（Ａ）尾部。

【0330】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のワクチンＲＮＡは、構造：
β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）－ｈＡｇ－コザック－ｓｅｃ－ＧＳ（１）－抗原－ＧＳ（２）－Ｐ２Ｐ１６－ＧＳ（３）－ＭＩＴＤ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のワクチン抗原は、構造：
ｓｅｃ－ＧＳ（１）－抗原－ＧＳ（２）－Ｐ２Ｐ１６－ＧＳ（３）－ＭＩＴＤ
を有する。

【0331】

いくつかの実施形態では、ｈＡｇ－コザックは、配列番号６のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｅｃは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ２Ｐ１６は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＴＤは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＳ（１）は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＳ（２）は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＳ（３）は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＦＩは、配列番号７のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ａ３０Ｌ７０は、配列番号８のヌクレオチド配列を含む。

【0332】

「細胞表面に発現された」または「細胞表面と会合した」という用語は、抗原などの分子が細胞の原形質膜と会合して位置し、分子の少なくとも一部が当該細胞の細胞外空間に面しており、例えば細胞の外側に位置する抗体によって当該細胞の外側からアクセス可能であることを意味する。この文脈では、一部は、例えば少なくとも４、少なくとも８、少なくとも１２、または少なくとも２０アミノ酸であり得る。会合は、直接的であっても間接的であってもよい。例えば、会合は、１つ以上の膜貫通ドメイン、１つ以上の脂質アンカーによるものであってもよく、または他の任意のタンパク質、脂質、サッカリド、もしくは細胞の原形質膜の外葉に見出され得る他の構造との相互作用によるものであってもよい。例えば、細胞の表面と会合する分子は、細胞外部分を有する膜貫通タンパク質であってもよく、または膜貫通タンパク質である別のタンパク質と相互作用することによって細胞の表面と会合するタンパク質であってもよい。

【0333】

「細胞表面」または「細胞の表面」は、当技術分野におけるその通常の意味に従って使用され、したがって、タンパク質および他の分子による結合にアクセス可能な細胞の外側を含む。抗原は、細胞の表面に位置し、例えば細胞に添加された抗原特異的抗体による結合にアクセス可能である場合、当該細胞の表面に発現される。いくつかの実施形態では、細胞の表面に発現される抗原は、ＣＡＲによって認識され得る細胞外部分を有する内在性膜タンパク質である。

【0334】

本開示の文脈における「細胞外部分」または「エキソドメイン」という用語は、細胞の細胞外空間に面しており、好ましくは、例えば細胞の外側に位置する抗体などの分子に結合することによって、当該細胞の外側からアクセス可能であるタンパク質などの分子の一部を指す。いくつかの実施形態では、この用語は、１つ以上の細胞外ループもしくはドメインまたはその断片を指す。

【0335】

「Ｔ細胞」および「Ｔリンパ球」という用語は、本明細書では互換的に使用され、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）および細胞溶解性Ｔ細胞を含む細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）を含む。「抗原特異的Ｔ細胞」という用語または同様の用語は、特にＭＨＣ分子に関連して抗原提示細胞または癌細胞などの疾患細胞の表面に提示された場合、Ｔ細胞が標的とする抗原を認識し、好ましくはＴ細胞のエフェクタ機能を発揮するＴ細胞に関する。Ｔ細胞が抗原を発現する標的細胞を死滅させる場合、Ｔ細胞は抗原に特異的であると見なされる。Ｔ細胞特異性は、例えば、クロム放出アッセイまたは増殖アッセイ内で、様々な標準的技術のいずれかを使用して評価され得る。あるいは、リンホカイン（インターフェロンγなど）の合成を測定することができる。

【0336】

「標的」という用語は、細胞性免疫応答などの免疫応答の標的である細胞または組織などの作用物質を意味する。標的には、抗原または抗原エピトープ、すなわち抗原に由来するペプチド断片を提示する細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、標的細胞は、抗原を発現し、当該抗原をクラスＩ ＭＨＣと共に提示する細胞である。

【0337】

「抗原プロセシング」は、抗原の、当該抗原の断片であるプロセシング産物への分解（例えばポリペプチドのペプチドへの分解）、および抗原提示細胞などの細胞による特異的Ｔ細胞への提示のためのＭＨＣ分子とこれらの断片の１つ以上との会合（例えば結合による）を指す。抗原提示細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞と非プロフェッショナル抗原提示細胞とに区別することができる。

【0338】

「プロフェッショナル抗原提示細胞」という用語は、ナイーブＴ細胞との相互作用に必要な主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ（ＭＨＣクラスＩＩ）分子を構成的に発現する抗原提示細胞に関する。Ｔ細胞が抗原提示細胞の膜上のＭＨＣクラスＩＩ分子複合体と相互作用する場合、抗原提示細胞は、Ｔ細胞の活性化を誘導する共刺激分子を産生する。プロフェッショナル抗原提示細胞は、樹状細胞およびマクロファージを含む。

【0339】

「非プロフェッショナル抗原提示細胞」という用語は、ＭＨＣクラスＩＩ分子を構成的に発現しないが、インターフェロンガンマなどの特定のサイトカインによる刺激を受けると発現する抗原提示細胞に関する。例示的な非プロフェッショナル抗原提示細胞としては、線維芽細胞、胸腺上皮細胞、甲状腺上皮細胞、グリア細胞、膵臓ベータ細胞または血管内皮細胞が挙げられる。

【0340】

「樹状細胞」（ＤＣ）という用語は、抗原提示細胞のクラスに属する食細胞のサブタイプを指す。いくつかの実施形態では、樹状細胞は、造血骨髄前駆細胞に由来する。これらの前駆細胞は、最初に未成熟な樹状細胞に変わる。これらの未成熟細胞は、高い食作用活性と低いＴ細胞活性化能とを特徴とする。未成熟な樹状細胞は、ウイルスおよび細菌などの病原体について周囲環境を絶えずサンプリングする。それらは、提示可能な抗原と接触すると、活性化されて成熟樹状細胞となり、脾臓またはリンパ節に移動し始める。未成熟樹状細胞は病原体を貪食し、それらのタンパク質を小さな断片に分解し、成熟すると、ＭＨＣ分子を使用してそれらの細胞表面にそれらの断片を提示する。同時に、それらは、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０などのＴ細胞活性化における共受容体として機能する細胞表面受容体を上方制御し、Ｔ細胞を活性化するそれらの能力を大幅に増強する。それらはまた、樹状細胞が血流を通って脾臓に、またはリンパ系を通ってリンパ節に移動するように誘導する走化性受容体であるＣＣＲ７を上方制御する。ここで、それらは抗原提示細胞として働き、非抗原特異的共刺激シグナルと共に抗原を提示することによってヘルパーＴ細胞およびキラーＴ細胞ならびにＢ細胞を活性化する。したがって、樹状細胞は、Ｔ細胞またはＢ細胞に関連する免疫応答を能動的に誘導することができる。いくつかの実施形態では、樹状細胞は脾臓樹状細胞である。

【0341】

「マクロファージ」という用語は、単球の分化によって産生される食細胞のサブグループを指す。炎症、免疫サイトカインまたは微生物産物によって活性化されるマクロファージは、マクロファージ内の外来病原体を、病原体の分解をもたらす加水分解および酸化攻撃によって非特異的に貪食し、死滅させる。分解されたタンパク質由来のペプチドは、マクロファージ細胞表面に提示され、そこでＴ細胞によって認識され得、Ｂ細胞表面の抗体と直接相互作用して、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化ならびに免疫応答のさらなる刺激をもたらすことができる。マクロファージは抗原提示細胞のクラスに属する。いくつかの実施形態では、マクロファージは脾臓マクロファージである。

【0342】

「抗原応答性ＣＴＬ」とは、抗原提示細胞の表面にクラスＩ ＭＨＣと共に提示される、抗原または当該抗原に由来するペプチドに応答性であるＣＤ８^＋Ｔ細胞を意味する。

【0343】

本開示によれば、ＣＴＬ応答性には、持続的なカルシウム流動、細胞分裂、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αなどのサイトカインの産生、ＣＤ４４およびＣＤ６９などの活性化マーカの上方制御、ならびに腫瘍抗原を発現する標的細胞の特異的細胞溶解性死滅が含まれ得る。ＣＴＬ応答性はまた、ＣＴＬ応答性を正確に示す人工レポータを使用して決定され得る。

【0344】

本明細書で使用される「活性化」または「刺激」は、検出可能な細胞増殖を誘導するのに十分に刺激されたＴ細胞などの免疫エフェクタ細胞の状態を指す。活性化はまた、シグナル伝達経路の開始、誘導されたサイトカイン産生、および検出可能なエフェクタ機能に関連し得る。「活性化免疫エフェクタ細胞」という用語は、とりわけ、細胞分裂を受けている免疫エフェクタ細胞を指す。

【0345】

「プライミング」という用語は、Ｔ細胞などの免疫エフェクタ細胞がその特異的抗原と最初に接触し、エフェクタＴ細胞などのエフェクタ細胞への分化を引き起こすプロセスを指す。

【0346】

「拡大」という用語は、特定の実体が増加する過程を指す。いくつかの実施形態では、この用語は、免疫エフェクタ細胞が抗原によって刺激され、増殖し、当該抗原を認識する特異的免疫エフェクタ細胞が増幅される免疫学的応答に関連して使用される。いくつかの実施形態では、拡大は免疫エフェクタ細胞の分化をもたらす。

【0347】

「免疫応答」および「免疫反応」という用語は、本明細書ではそれらの従来の意味で互換的に使用され、抗原に対する統合された身体応答を指し、細胞性免疫応答、体液性免疫応答、またはその両方を指し得る。本開示によれば、抗原、細胞または組織などの作用物質に関する「への免疫応答」または「に対する免疫応答」という用語は、作用物質に対する細胞応答などの免疫応答に関する。免疫応答は、１つ以上の抗原に対する抗体の発現、ならびにインビトロでの様々な増殖またはサイトカイン産生試験で検出され得るＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔリンパ球、例えばＣＤ８^＋Ｔリンパ球などの抗原特異的Ｔリンパ球の拡大からなる群より選択される１つ以上の反応を含み得る。

【0348】

本開示の文脈における「免疫応答を誘導する」および「免疫応答を誘発する」という用語および同様の用語は、免疫応答の誘導、例えば細胞性免疫応答、体液性免疫応答、またはその両方の誘導を指す。免疫応答は、保護的／防止的／予防的および／または治療的であり得る。免疫応答は、任意の免疫原または抗原または抗原ペプチド、例えば腫瘍関連抗原または病原体関連抗原（例えば、ウイルス（インフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型）、ＣＭＶまたはＲＳＶなど）の抗原）に対するものであり得る。この文脈における「誘導する」は、誘導前に特定の抗原または病原体に対する免疫応答が存在しなかったことを意味し得るが、誘導前に特定の抗原または病原体に対するある程度の免疫応答が存在し、誘導後に当該免疫応答が増強されることも意味し得る。したがって、この文脈における「免疫応答を誘導する」には、「免疫応答を増強する」ことも含まれる。いくつかの実施形態では、個体において免疫応答を誘導した後、当該個体は、感染症または癌疾患などの疾患の発症から保護されるか、または免疫応答を誘導することによって疾患状態が改善される。

【0349】

「細胞性免疫応答」、「細胞応答」、「細胞媒介性免疫」または同様の用語は、抗原の発現および／またはクラスＩもしくはクラスＩＩ ＭＨＣによる抗原の提示を特徴とする細胞に対する細胞応答を含むことを意味する。細胞応答は、「ヘルパー」または「キラー」のいずれかとして働くＴ細胞またはＴリンパ球と呼ばれる細胞に関する。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４^＋Ｔ細胞とも呼ばれる）は、免疫応答を調節することによって中心的な役割を果たし、キラー細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞またはＣＴＬとも呼ばれる）は、疾患細胞などの細胞を死滅させる。

【0350】

「体液性免疫応答」という用語は、作用物質および生物に応答して抗体が産生され、最終的にそれらを中和および／または排除する、生きている生物におけるプロセスを指す。抗体応答の特異性は、単一特異性の抗原に結合する膜結合受容体を介してＴ細胞および／またはＢ細胞によって媒介される。適切な抗原の結合および様々な他の活性化シグナルの受け取り後、Ｂリンパ球が分裂し、メモリＢ細胞および抗体分泌形質細胞クローンを産生し、それぞれが、その抗原受容体によって認識された同一の抗原エピトープを認識する抗体を産生する。メモリＢリンパ球は、その後それらの特異的抗原によって活性化されるまで休眠状態のままである。これらのリンパ球は、記憶の細胞基盤、および特異的抗原に再曝露されたときに生じる抗体応答の増大を提供する。

【0351】

本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗原上のエピトープに特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を指す。特に、「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互に連結された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質を指す。「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、および当該のいずれかの組合せを含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）とで構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とで構成される。可変領域および定常領域は、本明細書ではそれぞれ可変ドメインおよび定常ドメインとも呼ばれる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が間に組み入れられた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。ＶＨのＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と呼ばれ、ＶＬのＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と呼ばれる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は重鎖定常領域（ＣＨ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含み、ＣＨは、定常ドメインＣＨ１、ヒンジ領域、ならびに定常ドメインＣＨ２およびＣＨ３（以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置されている：ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）にさらに細分することができる。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクタ細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。抗体は、天然源または組換え供給源に由来する無傷の免疫グロブリンであり得、無傷の免疫グロブリンの免疫活性部分であり得る。抗体は、典型的には免疫グロブリン分子の四量体である。抗体は、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）_２、ならびに一本鎖抗体およびヒト化抗体を含む様々な形態で存在し得る。

【0352】

「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質、例えば抗体またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）などの抗原受容体に関する。免疫グロブリンは、特徴的な免疫グロブリン（Ｉｇ）フォールドを有する構造ドメイン、すなわち免疫グロブリンドメインを特徴とする。この用語は、膜結合免疫グロブリンおよび可溶性免疫グロブリンを包含する。膜結合免疫グロブリンは、一般にＢＣＲの一部である、表面免疫グロブリンまたは膜免疫グロブリンとも呼ばれる。可溶性免疫グロブリンは、一般に抗体と呼ばれる。免疫グロブリンは一般に、いくつかの鎖、典型的にはジスルフィド結合を介して連結された２本の同一の重鎖および２本の同一の軽鎖を含む。これらの鎖は、主に、Ｖ_Ｌ（可変軽鎖）ドメイン、Ｃ_Ｌ（定常軽鎖）ドメイン、Ｖ_Ｈ（可変重鎖）ドメイン、ならびにＣ_Ｈ（定常重鎖）ドメインＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３およびＣ_Ｈ４などの免疫グロブリンドメインで構成される。哺乳動物免疫グロブリン重鎖には５つの種類、すなわちα、δ、ε、γおよびμが存在し、これらは抗体の異なるクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭを構成する。可溶性免疫グロブリンの重鎖とは対照的に、膜または表面免疫グロブリンの重鎖は、そのカルボキシ末端に膜貫通ドメインおよび短い細胞質ドメインを含む。哺乳動物には、２種類の軽鎖、すなわちラムダおよびカッパが存在する。免疫グロブリン鎖は、可変領域および定常領域を含む。定常領域は、免疫グロブリンの異なるアイソタイプ内で本質的に保存されており、可変部分は高度に多様であり、抗原認識を構成する。

【0353】

「ワクチン接種」および「免疫化」という用語は、治療または予防上の理由で個体を治療するプロセスを表し、本明細書に記載されているように、１つ以上の免疫原または抗原またはその誘導体を、特にそれをコードするＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）の形態で個体に投与し、当該１つ以上の免疫原もしくは抗原または当該１つ以上の免疫原もしくは抗原の提示を特徴とする細胞に対する免疫応答を刺激する手順に関する。

【0354】

「抗原の提示を特徴とする細胞」または「抗原を提示する細胞」または「抗原提示細胞の表面に抗原を提示するＭＨＣ分子」または同様の表現は、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ分子などのＭＨＣ分子に関連して、直接またはプロセシング後のいずれかに、疾患細胞、特に腫瘍細胞もしくは感染細胞、または抗原もしくは抗原ペプチドを提示する抗原提示細胞などの細胞を意味する。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ分子はＭＨＣクラスＩ分子である。

【0355】

いくつかの実施形態では、薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチドは、１つ以上の抗原または１つ以上のエピトープを含む、すなわち、対象へのペプチドまたはポリペプチドの投与は、対象において、治療的または部分的もしくは完全に保護的であり得る、１つ以上の抗原または１つ以上のエピトープに対する免疫応答を誘発する。

【0356】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、少なくとも１つのエピトープ、例えば少なくとも２つのエピトープ、少なくとも３つのエピトープ、少なくとも４つのエピトープ、少なくとも５つのエピトープ、少なくとも６つのエピトープ、少なくとも７つのエピトープ、少なくとも８つのエピトープ、少なくとも９つのエピトープ、または少なくとも１０個のエピトープをコードする。

【0357】

いくつかの実施形態では、標的抗原は腫瘍抗原であり、抗原配列（例えば、エピトープ）は腫瘍抗原に由来する。腫瘍抗原は、様々な癌において発現されることが一般的に知られている「標準」抗原であり得る。腫瘍抗原はまた、個体の腫瘍に特異的であり、免疫系によって以前に認識されていない「ネオ抗原」であり得る。ネオ抗原またはネオエピトープは、アミノ酸変化をもたらす癌細胞のゲノムにおける１つ以上の癌特異的変異から生じ得る。腫瘍抗原がネオ抗原である場合、ワクチン抗原は、好ましくは、１つ以上のアミノ酸変化を含む当該ネオ抗原のエピトープまたは断片を含む。

【0358】

腫瘍抗原の例としては、限定されないが、ｐ５３、ＡＲＴ－４、ＢＡＧＥ、β－カテニン／ｍ、Ｂｃｒ－ａｂＬ ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ－１、ＣＡＳＰ－８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、クローディン－６、クローディン－１８．２およびクローディン－１２などのクローディンファミリーの細胞表面タンパク質、ｃ－ＭＹＣ、ＣＴ、Ｃｙｐ－Ｂ、ＤＡＭ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ－Ｖ、Ｇａｐ １００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＨＰＶ－Ｅ７、ＨＰＶ－Ｅ６、ＨＡＳＴ－２、ｈＴＥＲＴ（またはｈＴＲＴ）、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ－Ａ、好ましくはＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ５、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ７、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１１、またはＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ｂ、ＭＡＧＥ－Ｃ、ＭＡＲＴ－１／メランＡ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ－１、ＭＵＭ－２、ＭＵＭ－３、ＮＡ８８－Ａ、ＮＦ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＹ－ＢＲ－１、ｐｌ９０マイナーＢＣＲ－ａｂＬ、Ｐｍｌ／ＲＡＲａ、ＰＲＡＭＥ、プロテイナーゼ３、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１またはＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ－１またはＳＡＲＴ－３、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＳＣＰ１、ＳＣＰ２、ＳＣＰ３、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、ＴＰＴＥ、ＷＴ、およびＷＴ－１が挙げられる。

【0359】

癌の変異は各個体によって異なる。したがって、新規エピトープ（ネオエピトープ）をコードする癌変異は、ワクチン組成物および免疫療法の開発における魅力的な標的である。腫瘍免疫療法の有効性は、宿主内で強力な免疫応答を誘導することができる癌特異的抗原およびエピトープの選択に依存する。ＲＮＡは、患者特異的腫瘍エピトープを患者に送達するために使用することができる。脾臓に存在する樹状細胞（ＤＣ）は、腫瘍エピトープなどの免疫原性エピトープまたは抗原のＲＮＡ発現のための特に興味深い抗原提示細胞である。複数のエピトープの使用は、腫瘍ワクチン組成物における治療効果を促進することが示されている。腫瘍ミュータノームの迅速な配列決定は、本明細書に記載のｍＲＮＡによってコードされ得る個別化ワクチンのための複数のエピトープを、例えば、エピトープが任意でリンカーによって分離されている単一のポリペプチドとして提供し得る。本開示のいくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つのエピトープ、少なくとも２つのエピトープ、少なくとも３つのエピトープ、少なくとも４つのエピトープ、少なくとも５つのエピトープ、少なくとも６つのエピトープ、少なくとも７つのエピトープ、少なくとも８つのエピトープ、少なくとも９つのエピトープ、または少なくとも１０個のエピトープをコードする。例示的な実施形態は、少なくとも５つのエピトープ（「ペンタトープ」と呼ばれる）をコードするｍＲＮＡおよび少なくとも１０個のエピトープ（「デカトープ」と呼ばれる）をコードするｍＲＮＡを含む。

【0360】

いくつかの実施形態では、抗原またはエピトープは、病原体関連抗原、特にウイルス抗原に由来する。いくつかの実施形態では、抗原またはエピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性変異体、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の免疫原性断片もしくはその免疫原性変異体に由来する。したがって、いくつかの実施形態では、本開示で使用されるｍＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性変異体、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の免疫原性断片もしくはその免疫原性変異体を含むアミノ酸配列をコードする。

【0361】

「免疫学的に等価」という用語は、免疫学的に等価なアミノ酸配列などの免疫学的に等価な分子が、同じもしくは本質的に同じ免疫学的特性を示し、および／または、例えば免疫学的効果の種類に関して、同じもしくは本質的に同じ免疫学的効果を及ぼすことを意味する。本開示の文脈において、「免疫学的に等価」という用語は、好ましくは、免疫化に使用される抗原または抗原変異体の免疫学的効果または特性に関して使用される。例えば、アミノ酸配列が対象の免疫系に曝露されたときに、参照アミノ酸配列と反応する特異性を有する免疫反応を誘導する場合、当該アミノ酸配列は参照アミノ酸配列と免疫学的に等価である。したがって、いくつかの実施形態では、抗原と免疫学的に等価である分子は、Ｔ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大に関して、Ｔ細胞が標的とする抗原と同じもしくは本質的に同じ特性を示し、および／または同じもしくは本質的に同じ効果を及ぼす。

【0362】

本開示で使用されるワクチン抗原をコードするＲＮＡは非免疫原性である。免疫賦活剤をコードするＲＮＡを本開示に従って投与して、アジュバント効果を提供し得る。免疫賦活剤をコードするＲＮＡは、標準ＲＮＡまたは非免疫原性ＲＮＡであり得る。

【0363】

本明細書で使用される「非免疫原性ＲＮＡ」（「非免疫原性ｍＲＮＡ」など）という用語は、例えば哺乳動物に投与したとき免疫系による応答を誘導しないか、または非免疫原性ＲＮＡを非免疫原性にする修飾および処理に供されていないという点においてのみ異なる同じＲＮＡによって誘導されるよりも弱い応答を誘導する、すなわち標準的なＲＮＡ（ｓｔｄＲＮＡ）によって誘導されるよりも弱い応答を誘導するＲＮＡを指す。特定の実施形態では、本明細書では修飾ＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）とも呼ばれる非免疫原性ＲＮＡは、自然免疫受容体のＲＮＡ媒介性活性化を抑制する修飾ヌクレオシドをＲＮＡに組み込むことによって、ならびに／または例えばインビトロ転写中に二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の形成を制限することによって、および／または例えばインビトロ転写後に二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を除去することによって、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の量を制限することによって非免疫原性にされる。特定の実施形態では、非免疫原性ＲＮＡは、自然免疫受容体のＲＮＡ媒介性活性化を抑制する修飾ヌクレオシドをＲＮＡに組み込むことによって、および／または例えばインビトロ転写後に二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を除去することによって非免疫原性にされる。

【0364】

修飾ヌクレオシドの組込みによって非免疫原性ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）を非免疫原性にするために、ＲＮＡの免疫原性を低下させるまたは抑制する限り、任意の修飾ヌクレオシドを使用し得る。自然免疫受容体のＲＮＡ媒介性活性化を抑制する修飾ヌクレオシドが特に好ましい。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドによる１つ以上のウリジンの置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は修飾ウラシルである。いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドは、３－メチル－ウリジン（ｍ^３Ｕ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ^５Ｕ）、５－アザ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ウリジン（ｓ^２Ｕ）、４－チオ－ウリジン（ｓ^４Ｕ）、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン（ｈｏ^５Ｕ）、５－アミノアリル－ウリジン、５－ハロ－ウリジン（例えば５－ヨード－ウリジンまたは５－ブロモ－ウリジン）、ウリジン５－オキシ酢酸（ｃｍｏ^５Ｕ）、ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ^５Ｕ）、５－カルボキシメチル－ウリジン（ｃｍ^５Ｕ）、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジン（ｃｈｍ^５Ｕ）、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ^５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン（ｍｃｍ^５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｃｍ^５ｓ^２Ｕ）、５－アミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｎｍ^５ｓ^２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－ウリジン（ｍｎｍ^５Ｕ）、１－エチル－プソイドウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｎｍ^５ｓ^２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－セレノ－ウリジン（ｍｎｍ^５ｓｅ^２Ｕ）、５－カルバモイルメチル－ウリジン（ｎｃｍ^５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウリジン（ｃｍｎｍ^５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｃｍｎｍ^５ｓ^２Ｕ）、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－ウリジン（τｍ^５Ｕ）、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１－タウリノメチル－４－チオ－プソイドウリジン、５－メチル－２－チオ－ウリジン（ｍ^５ｓ^２Ｕ）、１－メチル－４－チオ－プソイドウリジン（ｍ^１ｓ^４Ψ）、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、３－メチル－プソイドウリジン（ｍ^３Ψ）、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、５－メチル－ジヒドロウリジン（ｍ^５Ｄ）、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシ－ウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ^３Ｕ）、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ^３Ψ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ^５Ｕ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２－チオ－ウリジン（ｉｎｍ^５ｓ^２Ｕ）、α－チオ－ウリジン、２’－Ｏ－メチル－ウリジン（Ｕｍ）、５，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ^５Ｕｍ）、２’－Ｏ－メチル－プソイドウリジン（Ψｍ）、２－チオ－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｓ^２Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｍｃｍ^５Ｕｍ）、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｎｃｍ^５Ｕｍ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｃｍｎｍ^５Ｕｍ）、３，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ^３Ｕｍ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｉｎｍ^５Ｕｍ）、１－チオ－ウリジン、デオキシチミジン、２’－Ｆ－アラ－ウリジン、２’－Ｆ－ウリジン、２’－ＯＨ－アラ－ウリジン、５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジン、および５－［３－（１－Ｅ－プロペニルアミノ）ウリジンからなる群より選択される。特定の実施形態では、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ）、特にＮ１－メチル－プソイドウリジンである。

【0365】

いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドによる１つ以上のウリジンの置換は、ウリジンの少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の置換を含む。

【0366】

Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したインビトロ転写（ＩＶＴ）によるｍＲＮＡの合成中、酵素の通常とは異なる活性のために、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む有意な量の異常な産物が産生される。ｄｓＲＮＡは炎症性サイトカインを誘導し、エフェクタ酵素を活性化してタンパク質合成阻害をもたらす。ｄｓＲＮＡの形成は、インビトロ転写（ＩＶＴ）によるｍＲＮＡの合成中に、例えば合成中のウリジン三リン酸（ＵＴＰ）の量を制限することによって制限することができる。任意で、ＵＴＰは、ｍＲＮＡの合成中に１回または数回添加され得る。また、ｄｓＲＮＡは、例えば、非多孔質または多孔質Ｃ－１８ポリスチレン－ジビニルベンゼン（ＰＳ－ＤＶＢ）マトリックスを使用するイオン対逆相ＨＰＬＣによって、ＩＶＴ ＲＮＡなどのＲＮＡから除去することができる。あるいは、ｓｓＲＮＡではなくｄｓＲＮＡを特異的に加水分解し、それによってＩＶＴ ＲＮＡ調製物からｄｓＲＮＡ夾雑物を除去する大腸菌ＲＮａｓｅＩＩＩを用いた酵素ベースの方法を使用することができる。さらに、セルロース材料を使用することによってｄｓＲＮＡをｓｓＲＮＡから分離することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ調製物をセルロース材料と接触させ、ｄｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にし、ｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合を許容しない条件下で、ｓｓＲＮＡをセルロース材料から分離する。ｓｓＲＮＡを提供するための適切な方法は、例えば国際公開第２０１７／１８２５２４号に開示されている。

【0367】

「除去する」または「除去」は、この用語が本明細書で使用される場合、ｄｓＲＮＡなどの第２の物質の集団の近傍から分離されている、非免疫原性ＲＮＡなどの第１の物質の集団の特徴を指し、ここで、第１の物質の集団は必ずしも第２の物質を欠くわけではなく、第２の物質の集団は必ずしも第１の物質を欠くわけではない。しかしながら、第２の物質の集団の除去を特徴とする第１の物質の集団は、第１の物質と第２の物質との分離されていない混合物と比較して、第２の物質の含有量が測定可能に低い。

【0368】

いくつかの実施形態では、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の量は制限され、例えば、非免疫原性ＲＮＡ組成物中のＲＮＡの１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．３％未満、０．１％未満、０．０５％未満、０．０３％未満、０．０１％未満、０．００５％未満、０．００４％未満、０．００３％未満、０．００２％未満、０．００１％未満、または０．０００５％未満がｄｓＲＮＡであるように、ｄｓＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）が非免疫原性ＲＮＡから除去される。いくつかの実施形態では、非免疫原性ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）は、ｄｓＲＮＡを含まないか、または本質的に含まない。いくつかの実施形態では、非免疫原性ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）組成物は、一本鎖ヌクレオシド修飾ＲＮＡの精製された調製物を含む。いくつかの実施形態では、非免疫原性ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）組成物は、一本鎖ヌクレオシド修飾ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）を含み、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、非免疫原性ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）組成物は、他の全ての核酸分子（ＤＮＡ、ｄｓＲＮＡなど）と比較して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、少なくとも９９．９９％、少なくとも９９．９９１％、少なくとも９９．９９２％、少なくとも９９．９９３％、少なくとも９９．９９４％、少なくとも９９．９９５％、少なくとも９９．９９６％、少なくとも９９．９９７％、または少なくとも９９．９９８％の一本鎖ヌクレオシド修飾ＲＮＡを含む。

【0369】

様々な方法を使用してｄｓＲＮＡの量を決定することができる。例えば、試料をｄｓＲＮＡ特異的抗体と接触させてもよく、ＲＮＡに結合する抗体の量を試料中のｄｓＲＮＡの量の尺度と見なしてもよい。既知量のｄｓＲＮＡを含有する試料を参照として使用してもよい。

【0370】

例えば、ＲＮＡを膜、例えば、ナイロンブロッティング膜にスポットすることができる。膜は、例えば、５％（ｗ／ｖ）スキムミルク粉末を含有するＴＢＳ－Ｔ緩衝液（２０ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ－２０）中でブロッキングすることができる。ｄｓＲＮＡの検出のために、膜をｄｓＲＮＡ特異的抗体、例えばｄｓＲＮＡ特異的マウスｍＡｂ（Ｅｎｇｌｉｓｈ＆Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ、Ｓｚｉｒａｋ、ハンガリー）と共にインキュベートすることができる。例えばＴＢＳ－Ｔで洗浄した後、膜を二次抗体、例えばＨＲＰコンジュゲートロバ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号７１５－０３５－１５０）とインキュベートして、二次抗体によって提供されるシグナルを検出することができる。

【0371】

いくつかの実施形態では、非免疫原性ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）は、同じ配列を有する標準ＲＮＡよりも効率的に細胞内で翻訳される。いくつかの実施形態では、翻訳は、その修飾されていない対応物と比較して２倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は３倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は４倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は５倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は６倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は７倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は８倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は９倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は１０倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は１５倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は２０倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は５０倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は１００倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は２００倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は５００倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は１０００倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は２０００倍増強される。いくつかの実施形態では、倍数は１０～１０００倍である。いくつかの実施形態では、倍数は１０～１００倍である。いくつかの実施形態では、倍数は１０～２００倍である。いくつかの実施形態では、倍数は１０～３００倍である。いくつかの実施形態では、倍数は１０～５００倍である。いくつかの実施形態では、倍数は２０～１０００倍である。いくつかの実施形態では、倍数は３０～１０００倍である。いくつかの実施形態では、倍数は５０～１０００倍である。いくつかの実施形態では、倍数は１００～１０００倍である。いくつかの実施形態では、倍数は２００～１０００倍である。いくつかの実施形態では、翻訳は、任意の他の有意な量または量の範囲だけ増強される。

【0372】

いくつかの実施形態では、非免疫原性ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）は、同じ配列を有する標準ＲＮＡよりも有意に低い自然免疫原性を示す。いくつかの実施形態では、非免疫原性ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）は、その非修飾対応物よりも２倍低い自然免疫応答を示す。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は３倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は４倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は５倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は６倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は７倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は８倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は９倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は１０倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は１５倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は２０倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は５０倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は１００倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は２００倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は５００倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は１０００倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は２０００倍低下する。

【0373】

「有意に低い自然免疫原性を示す」という用語は、自然免疫原性の検出可能な低下を指す。いくつかの実施形態では、この用語は、検出可能な自然免疫応答を誘発することなく有効量の非免疫原性ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）を投与することができるような低下を指す。いくつかの実施形態では、この用語は、非免疫原性ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）を、非免疫原性ＲＮＡによってコードされるタンパク質の産生を検出可能に減少させるのに十分な自然免疫応答を誘発することなく繰り返し投与することができるような低下を指す。いくつかの実施形態では、低下は、非免疫原性ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）を、非免疫原性ＲＮＡによってコードされるタンパク質の検出可能な産生を排除するのに十分な自然免疫応答を誘発することなく繰り返し投与することができるようなものである。

【0374】

「免疫原性」は、ＲＮＡなどの異物がヒトまたは他の動物の体内で免疫応答を引き起こす能力である。自然免疫系は、比較的非特異的で即時的な免疫系の成分である。これは、適応免疫系と共に、脊椎動物免疫系の２つの主要成分のうちの１つである。

【0375】

ＰＤ－１軸結合アンタゴニスト
「免疫チェックポイント」は、免疫系の調節因子、特に、Ｔ細胞活性の大きさおよび質を調節する共刺激シグナルおよび阻害シグナルを指す。特定の実施形態では、免疫チェックポイントは阻害シグナルである。特定の実施形態では、阻害シグナルは、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２との間の相互作用である。

【0376】

「プログラム死１（ＰＤ－１）」受容体は、ＣＤ２８ファミリーに属する免疫抑制性受容体を指す。ＰＤ－１は、インビボで以前に活性化されたＴ細胞上に主に発現され、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－Ｌ２の２つのリガンドに結合する。本明細書で使用される「ＰＤ－１」という用語は、ヒトＰＤ－１（ｈＰＤ－１）、ｈＰＤ－１の変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＰＤ－１と少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。「プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）」は、ＰＤ－１に結合するとＴ細胞の活性化およびサイトカイン分泌を下方制御する、ＰＤ－１の２つの細胞表面糖タンパク質リガンドの１つ（他はＰＤ－Ｌ２）である。本明細書で使用される「ＰＤ－Ｌ１」という用語は、ヒトＰＤ－Ｌ１（ｈＰＤ－Ｌ１）、ｈＰＤ－Ｌ１の変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＰＤ－Ｌ１と少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。本明細書で使用される「ＰＤ－Ｌ２」という用語は、ヒトＰＤ－Ｌ２（ｈＰＤ－Ｌ２）、ｈＰＤ－Ｌ２の変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＰＤ－Ｌ２と少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。ＰＤ－１のリガンド（ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２）は、樹状細胞またはマクロファージなどの抗原提示細胞、および他の免疫細胞の表面に発現される。ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２への結合は、Ｔ細胞活性化の下方制御をもたらす。ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２を発現する癌細胞は、抗癌免疫応答の抑制をもたらすＰＤ－１を発現するＴ細胞をスイッチオフにすることができる。ＰＤ－１とそのリガンドとの間の相互作用は、腫瘍浸潤リンパ球の減少、Ｔ細胞受容体媒介増殖の減少、および癌性細胞による免疫回避をもたらす。免疫抑制は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との局所的相互作用を阻害することによって逆転させることができ、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ２との相互作用も同様に遮断される場合、その効果は相加的である。

【0377】

免疫チェックポイントの多くは、上記のような特異的受容体とリガンドの対の間の相互作用によって調節される。したがって、免疫チェックポイントタンパク質は免疫チェックポイントシグナル伝達を媒介する。例えば、チェックポイントタンパク質は、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞増殖および／またはＴ細胞機能を直接的または間接的に調節する。癌細胞は、免疫系による攻撃から自身を保護するために、しばしばこれらのチェックポイント経路を利用する。したがって、本開示に従って調節されるチェックポイントタンパク質の機能は、典型的には、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞増殖および／またはＴ細胞機能の調節である。したがって、免疫チェックポイントタンパク質は、自己寛容ならびに生理学的免疫応答の持続時間および大きさを調節し、維持する。

【0378】

本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイント調節剤」または「チェックポイント調節剤」という用語は、１つ以上のチェックポイントタンパク質の機能を調節する分子または化合物を指す。免疫チェックポイント調節剤は、典型的には、自己寛容ならびに／または免疫応答の大きさおよび／もしくは持続時間を調節することができる。好ましくは、免疫チェックポイント調節剤は、１つ以上のヒトチェックポイントタンパク質の機能を調節し、したがって「ヒトチェックポイント調節剤」である。具体的には、ヒトチェックポイント調節剤は免疫チェックポイント阻害剤である。

【0379】

本明細書中で使用される場合、「免疫チェックポイント阻害剤」または「チェックポイント阻害剤」は、１つ以上のチェックポイントタンパク質を全体的もしくは部分的に低減する、阻害する、妨げるもしくは負に調節するか、または１つ以上のチェックポイントタンパク質の発現を全体的もしくは部分的に低減する、阻害する、妨げるもしくは負に調節する分子を指す。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、１つ以上のチェックポイントタンパク質に結合する。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、チェックポイントタンパク質を調節する１つ以上の分子に結合する。

【0380】

特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントに関連する阻害シグナルを防止する。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントに関連する阻害シグナル伝達を妨害する抗体またはその断片である。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、阻害シグナル伝達を妨害する小分子である。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、阻害シグナル伝達を妨害するペプチドベースの阻害剤である。

【0381】

特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、チェックポイント遮断薬タンパク質間の相互作用を防止する抗体、その断片、または抗体模倣物である。

【0382】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の阻害性免疫チェックポイントシグナル伝達の阻害または遮断は、免疫抑制およびＴ細胞免疫の確立または増強の防止または逆転をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫チェックポイントシグナル伝達の阻害は、免疫系の機能不全を低減または阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫チェックポイントシグナル伝達の阻害は、機能不全の免疫細胞の機能不全の程度をより少なくする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫チェックポイントシグナル伝達の阻害は、機能不全のＴ細胞の機能不全の程度をより少なくする。

【0383】

特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子（免疫チェックポイント遮断薬）は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ２シグナル伝達経路の成分である。

【0384】

特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子（免疫チェックポイント遮断薬）はＰＤ－１軸結合アンタゴニストである。

【0385】

「ＰＤ－１軸結合アンタゴニスト」という用語は、ＰＤ－１シグナル伝達軸上のシグナル伝達に起因するＴ細胞機能不全を除去するように、ＰＤ－１軸結合パートナーとその結合パートナーの１つ以上との相互作用を阻害する分子を指し、その結果、Ｔ細胞機能を回復または増強する（例えば、増殖、サイトカイン産生、標的細胞殺傷）。本明細書で使用される場合、ＰＤ－１軸結合アンタゴニストには、ＰＤ－１結合アンタゴニスト、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストおよびＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニストが含まれる。

【0386】

「ＰＤ－１結合アンタゴニスト」という用語は、ＰＤ－１とその結合パートナー、例えばＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２の１つ以上との相互作用から生じるシグナル伝達を減少、遮断、阻害、抑止または干渉する分子を指す。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１がその結合パートナーの１つ以上に結合するのを阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２への結合を阻害する。例えば、ＰＤ－１結合アンタゴニストには、抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、オリゴペプチド、ならびにＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２との相互作用に起因するシグナル伝達を減少、遮断、阻害、抑止または干渉する他の分子が含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１を介したシグナル伝達によって媒介されるＴリンパ球上に発現される細胞表面タンパク質によって、またはそれを介して媒介される負の共刺激シグナルを減少させて、機能不全のＴ細胞の機能不全をより低減する（例えば、抗原認識に対するエフェクタ応答の増強）。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－１抗体である。ＰＤ－１結合アンタゴニストの具体例を以下に提供する。

【0387】

「ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニスト」という用語は、ＰＤ－Ｌ１とその結合パートナー、例えばＰＤ－１、Ｂ７－１のいずれか１つまたは複数との相互作用から生じるシグナル伝達を減少、遮断、阻害、抑止または干渉する分子を指す。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ１がその結合パートナーに結合するのを阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１および／またはＢ７－１への結合を阻害する。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストには、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、オリゴペプチド、ならびにＰＤ－Ｌ１とその結合パートナー、例えばＰＤ－１、Ｂ７－１の１つ以上との相互作用に起因するシグナル伝達を減少、遮断、阻害、抑止または干渉する他の分子が含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ１を介したシグナル伝達によって媒介されるＴリンパ球上に発現される細胞表面タンパク質によって、またはそれを介して媒介される負の共刺激シグナルを減少させて、機能不全のＴ細胞の機能不全をより低減する（例えば、抗原認識に対するエフェクタ応答の増強）。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストの具体例を以下に提供する。

【0388】

「ＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニスト」という用語は、ＰＤ－Ｌ２とその結合パートナー、例えばＰＤ－１のいずれか１つまたは複数との相互作用から生じるシグナル伝達を減少、遮断、阻害、抑止または干渉する分子を指す。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ２がその結合パートナーの１つ以上に結合するのを阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ２のＰＤ－１への結合を阻害する。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ２アンタゴニストには、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、オリゴペプチド、ならびにＰＤ－Ｌ２とその結合パートナー、例えばＰＤ－１のいずれか１つまたは複数との相互作用に起因するシグナル伝達を減少、遮断、阻害、抑止または干渉する他の分子が含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ２を介したシグナル伝達によって媒介されるＴリンパ球上に発現される細胞表面タンパク質によって、またはそれを介して媒介される負の共刺激シグナルを減少させて、機能不全のＴ細胞の機能不全をより低減する（例えば、抗原認識に対するエフェクタ応答の増強）。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニストは、イムノアドヘシンである。

【0389】

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１軸結合アンタゴニストには、ＰＤ－１結合アンタゴニスト、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストおよびＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニストが含まれる。「ＰＤ－１」の別名には、ＣＤ２７９およびＳＬＥＢ２が含まれる。「ＰＤ－Ｌ１」の別名には、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－４、ＣＤ２７４およびＢ７－Ｈが含まれる。「ＰＤ－Ｌ２」の別名には、Ｂ７－ＤＣ、ＢｔｄｃおよびＣＤ２７３が含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２は、ヒトＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２である。

【0390】

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１がそのリガンド結合パートナーに結合するのを阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤ－１リガンド結合パートナーは、ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２である。

【0391】

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ１がその結合パートナーに結合するのを阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤ－Ｌ１結合パートナーは、ＰＤ－１および／またはＢ７－１である。

【0392】

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ２がその結合パートナーに結合するのを阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤ－Ｌ２結合パートナーはＰＤ－１である。

【0393】

アンタゴニストは、抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質またはオリゴペプチドであり得る。

【0394】

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－１抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体）である。

【0395】

例示的なＰＤ－１結合アンタゴニストとしては、限定されないが、抗ＰＤ－１抗体、例えばＢＧＢ－Ａ３１７（ＢｅｉＧｅｎｅ；米国特許第８，７３５，５５３号、国際公開第２０１５／３５６０６号および米国特許出願公開第２０１５／００７９１０９号参照）、セミプリマブ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ；国際公開第２０１５／１１２８００号参照）およびラムブロリズマブ（例えば、国際公開第２００８／１５６７１２号にｈＰＤ１０９Ａならびにそのヒト化誘導体ｈ４０９Ａ１、ｈ４０９Ａ１６およびｈ４０９Ａ１７として開示されている）、ＡＢ１３７１３２（Ａｂｃａｍ）、ＥＨ１２．２Ｈ７およびＲＭＰ１－１４（＃ＢＥ０１４６；Ｂｉｏｘｃｅｌｌ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｖｔ．ＬＴＤ．）、ＭＩＨ４（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ，ＢＭＳ－９３６５５８；Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ；国際公開第２００６／１２１１６８号参照）、ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ；ＭＫ－３４７５；Ｍｅｒｃｋ；国際公開第２００８／１５６７１２号参照）、ピジリズマブ（ＣＴ－０１１；ＣｕｒｅＴｅｃｈ；Ｈａｒｄｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５４（２２）：５７９３－６および国際公開第２００９／１０１６１１号参照）、ＰＤＲ００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ；国際公開第２０１５／１１２９００号参照）、ＭＥＤＩ０６８０（ＡＭＰ－５１４；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ；国際公開第２０１２／１４５４９３号参照）、ＴＳＲ－０４２（国際公開第２０１４／１７９６６４号参照）、ＲＥＧＮ－２８１０（Ｈ４Ｈ７７９８Ｎ；米国特許出願公開第２０１５／０２０３５７９号参照）、ＪＳ００１（ＴＡＩＺＨＯＵ ＪＵＮＳＨＩ ＰＨＡＲＭＡ；Ｓｉ－Ｙａｎｇ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．７０：１３６）、ＡＭＰ－２２４（ＧＳＫ－２６６１３８０；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ，１７（７）：１１５１および国際公開第２０１０／０２７８２７号および国際公開第２０１１／０６６３４２号参照）、ＰＦ－０６８０１５９１（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＢＧＢ－Ａ３１７（ＢｅｉＧｅｎｅ；国際公開第２０１５／３５６０６号および米国特許出願公開第２０１５／００７９１０９号参照）、ＢＩ ７５４０９１、ＳＨＲ－１２１０（国際公開第２０１５／０８５８４７号参照）、ならびに国際公開第２００６／１２１１６８号に記載されている抗体１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、４Ａ１１、７Ｄ３および５Ｆ４；ＩＮＣＳＨＲ１２１０（Ｊｉａｎｇｓｕ Ｈｅｎｇｒｕｉ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；ＳＨＲ－１２１０としても公知；国際公開第２０１５／０８５８４７号参照），ＴＳＲ－０４２（Ｔｅｓａｒｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ；ＡＮＢ０１１としても公知；国際公開第２０１４／１７９６６４号参照），ＧＬＳ－０１０（Ｗｕｘｉ／Ｈａｒｂｉｎ Ｇｌｏｒｉａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；ＷＢＰ３０５５としても公知；Ｓｉ－Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．７０：１３６参照）、ＳＴＩ－１１１０（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；国際公開第２０１４／１９４３０２号参照）、ＡＧＥＮ２０３４（Ａｇｅｎｕｓ；国際公開第２０１７／０４０７９０号参照）、ＭＧＡ０１２（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ；国際公開第２０１７／１９８４６号参照）、ＩＢＩ３０８（Ｉｎｎｏｖｅｎｔ；国際公開第２０１７／０２４４６５号、国際公開第２０１７／０２５０１６号、国際公開第２０１７／１３２８２５号および国際公開第２０１７／１３３５４０号参照）、例えば米国特許第７，４８８，８０２号、米国特許第８，００８，４４９号、米国特許第８，１６８，７５７号、国際公開第０３／０４２４０２号、国際公開第２０１０／０８９４１１号（抗ＰＤ－Ｌ１抗体をさらに開示する）、国際公開第２０１０／０３６９５９号、国際公開第２０１１／１５９８７７号（ＴＩＭ－３に対する抗体をさらに開示する）、国際公開第２０１１／０８２４００号、国際公開第２０１１／１６１６９９号、国際公開第２００９／０１４７０８号、国際公開第０３／０９９１９６号、国際公開第２００９／１１４３３５号、国際公開第２０１２／１４５４９３号（ＰＤ－Ｌ１に対する抗体をさらに開示する）、国際公開第２０１５／０３５６０６号、国際公開第２０１４／０５５６４８号（抗ＫＩＲ抗体をさらに開示する）、米国特許出願公開第２０１８／０１８５４８２号（抗ＰＤ－Ｌ１抗体および抗ＴＩＧＩＴ抗体をさらに開示する）、米国特許第８，００８，４４９号、米国特許第８，７７９，１０５号、米国特許第６，８０８，７１０号、米国特許第８，１６８，７５７号、米国特許出願公開第２０１６／０２７２７０８号および米国特許第８，３５４，５０９号に記載されている抗ＰＤ－１抗体が挙げられる。

【0396】

特定の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ；ＢＭＳ－９３６５５８）、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ；ＭＫ－３４７５）、セミプリマブ（ＬＩＢＴＡＹＯ、ＲＥＧＮ２８１０）、ピジリズマブ（ＣＴ－０１１）、スパルタリズマブ（ＰＤＲ００１）、ＭＥＤＩ０６８０（ＡＭＰ－５１４）、ドスタルリマブ（ＴＳＲ－０４２）、セトレリマブ（ＪＮＪ ６３７２３２８３）、トリパリマブ（ＪＳ００１）、ＡＭＰ－２２４（ＧＳＫ－２６６１３８０）、ＰＦ－０６８０１５９１、チスレリズマブ（ＢＧＢ－Ａ３１７）、ＡＢＢＶ－１８１、ＢＩ ７５４０９１、またはＳＨＲ－１２１０を含む。

【0397】

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体はニボルマブ（ＣＡＳ登録番号：９４６４１４－９４－４）である。ニボルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ／Ｏｎｏ）は、ＭＤＸ－１１０６－０４、ＭＤＸ－１１０６、ＯＮＯ－４５３８、ＢＭＳ－９３６５５８、およびＯＰＤＩＶＯ（登録商標）としても公知であり、国際公開第２００６／１２１１６８号に記載されている抗ＰＤ－１抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、重鎖および軽鎖配列を含み、
（ａ）重鎖は、アミノ酸配列：
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL DCKASGITFS NSGMHWVRQA PGKGLEWVAV IWYDGSKRYY
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLF LQMNSLRAED TAVYYCATND DYWGQGTLVT VSSASTKGPS
VFPLAPCSRS TSESTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS
VVTVPSSSLG TKTYTCNVDH KPSNTKVDKR VESKYGPPCP PCPAPEFLGG PSVFLFPPKP
KDTLMISRTP EVTCVVVDVS QEDPEVQFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQFN STYRVVSVLT
VLHQDWLNGK EYKCKVSNKG LPSSIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSQEE MTKNQVSLTC
LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SRLTVDKSRW QEGNVFSCSV
MHEALHNHYT QKSLSLSLGK
（配列番号１１）を含み、
（ｂ）軽鎖は、アミノ酸配列：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA
RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SSNWPRTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP
SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
（配列番号１２）を含む。

【0398】

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、配列番号１１および配列番号１２（例えば、配列番号１１に由来する３つの重鎖ＣＤＲおよび配列番号１２に由来する３つの軽鎖ＣＤＲ）に由来する６つのＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、配列番号１１に由来する重鎖可変ドメインと、配列番号１２に由来する軽鎖可変ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS（配列番号１３）
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK（配列番号１４）

【0399】

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、（ａ）ＧＩＴＦＳＮＳＧ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－１、ＩＷＹＤＧＳＫＲ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－２およびアミノ酸ＡＴＮＤＤＹ（配列番号１７）を含むＣＤＲ－３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）ＱＳＶＳＳＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－１、ＤＡＳ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－２およびＱＱＳＳＮＷＰＲＴ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。

【0400】

特定の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、２４０ｍｇの用量で静脈内投与され得るニボルマブである。ニボルマブは、施設のガイドライン、公開されたガイドラインおよびそれぞれの製品処方情報に従って静脈内投与され、このプロトコルに従って投与され得る。

【0401】

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体はペンブロリズマブ（ＣＡＳ登録番号：１３７４８５３－９１－４）である。ペンブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ）は、ＭＫ－３４７５、Ｍｅｒｃｋ３４７５、ラムブロリズマブ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）、およびＳＣＨ－９００４７５としても公知であり、国際公開第２００９／１１４３３５号に記載されている抗ＰＤ－１抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、重鎖および軽鎖配列を含み、
（ａ）重鎖は、アミノ酸配列：
QVQLVQSGVE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYYMYWVRQA PGQGLEWMGG INPSNGGTNF
NEKFKNRVTL TTDSSTTTAY MELKSLQFDD TAVYYCARRD YRFDMGFDYW GQGTTVTVSS
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS
GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV
FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY
RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK
NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG
NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK
（配列番号２１）を含み、
（ｂ）軽鎖は、アミノ酸配列：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASKGVS TSGYSYLHWY QQKPGQAPRL LIYLASYLES
GVPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQHSRDLPL TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF
IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS
STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC
（配列番号２２）を含む。

【0402】

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、配列番号２１および配列番号２２（例えば、配列番号２１に由来する３つの重鎖ＣＤＲおよび配列番号２２に由来する３つの軽鎖ＣＤＲ）に由来する６つのＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、配列番号２１に由来する重鎖可変ドメインと、配列番号２２に由来する軽鎖可変ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS（配列番号２３）
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK（配列番号２４）

【0403】

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、（ａ）ＧＹＴＦＴＮＹＹ（配列番号２５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－１、ＩＮＰＳＮＧＧＴ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－２およびアミノ酸ＡＲＲＤＹＲＦＤＭＧＦＤＹ（配列番号２７）を含むＣＤＲ－３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）ＫＧＶＳＴＳＧＹＳＹ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－１、ＬＡＳ（配列番号２９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－２およびＱＨＳＲＤＬＰＬＴ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。

【0404】

特定の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、２００ｍｇの用量で静脈内投与され得るペンブロリズマブである。ペンブロリズマブは、施設のガイドライン、公開されたガイドラインおよびそれぞれの製品処方情報に従って静脈内投与され、このプロトコルに従って投与され得る。

【0405】

特定の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、セミプリマブを含む。

【0406】

特定の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、重鎖および軽鎖配列を含む抗体を含み、
（ａ）重鎖は、アミノ酸配列：
EVQLLESGGV LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NFGMTWVRQA PGKGLEWVSG ISGGGRDTYF
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLKGED TAVYYCVKWG NIYFDYWGQG TLVTVSSAST
KGPSVFPLAP CSRSTSESTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY
SLSSVVTVPS SSLGTKTYTC NVDHKPSNTK VDKRVESKYG PPCPPCPAPE FLGGPSVFLF
PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSQEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQFNSTYRVV
SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SQEEMTKNQV
SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSRLTVD KSRWQEGNVF
SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SLGK（配列番号３１）を含み、
（ｂ）軽鎖は、アミノ酸配列：
DIQMTQSPSS LSASVGDSIT ITCRASLSIN TFLNWYQQKP GKAPNLLIYA ASSLHGGVPS
RFSGSGSGTD FTLTIRTLQP EDFATYYCQQ SSNTPFTFGP GTVVDFRRTV AAPSVFIFPP
SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC（配列番号３２）を含む。

【0407】

特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、配列番号３１および配列番号３２（例えば、配列番号３１に由来する３つの重鎖ＣＤＲおよび配列番号３２に由来する３つの軽鎖ＣＤＲ）に由来する６つのＣＤＲ配列を含む。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、配列番号３１に由来する重鎖可変ドメインと、配列番号３２に由来する軽鎖可変ドメインとを含む抗体を含む。

【0408】

特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、（ａ）アミノ酸配列ＦＴＦＳＮＦＧ（配列番号３３）を含むＣＤＲ－１、アミノ酸配列ＩＳＧＧＧＲＤＴ（配列番号３４）を含むＣＤＲ－２、およびアミノ酸配列ＶＫＷＧＮＩＹＦＤＹ（配列番号３５）を含むＣＤＲ－３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）アミノ酸配列ＬＳＩＮＴＦ（配列番号３６）を含むＣＤＲ－１、アミノ酸配列ＡＡＳ（配列番号３７）を含むＣＤＲ－２、およびアミノ酸配列ＱＱＳＳＮＴＰＦＴ（配列番号３８）を含むＣＤＲ－３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む抗体を含む。

【0409】

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ＭＥＤＩ－０６８０（ＡＭＰ－５１４；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）である。ＭＥＤＩ－０６８０はヒト化ＩｇＧ４抗ＰＤ－１抗体である。

【0410】

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ＰＤＲ００１（ＣＡＳ登録番号１８５９０７２－５３－９；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）である。ＰＤＲ００１は、ＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２の結合を遮断するヒト化ＩｇＧ４抗ＰＤ１抗体である。

【0411】

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ＲＥＧＮ２８１０（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）である。ＲＥＧＮ２８１０は、ＬＩＢＴＡＹＯ（登録商標）およびｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ－ｒｗｌｃとしても公知であるヒト抗ＰＤ１抗体である。

【0412】

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ＢＧＢ－１０８（ＢｅｉＧｅｎｅ）である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ＢＧＢ－Ａ３１７（ＢｅｉＧｅｎｅ）である。

【0413】

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ＪＳ－００１（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｕｎｓｈｉ）である。ＪＳ－００１は、ヒト化抗ＰＤ１抗体である。

【0414】

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ＳＴＩ－Ａ１１１０（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ）である。ＳＴＩ－Ａ１１１０は、ヒト抗ＰＤ１抗体である。

【0415】

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ＩＮＣＳＨＲ－１２１０（Ｉｎｃｙｔｅ）である。ＩＮＣＳＨＲ－１２１０は、ヒトＩｇＧ４抗ＰＤ１抗体である。

【0416】

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ＰＦ－０６８０１５９１（Ｐｆｉｚｅｒ）である。

【0417】

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ＴＳＲ－０４２（ＡＮＢ０１１としても公知である；Ｔｅｓａｒｏ／ＡｎａｐｔｙｓＢｉｏ）である。

【0418】

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ＡＭ０００１（ＡＲＭＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。

【0419】

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ＥＮＵＭ ２４４Ｃ８（Ｅｎｕｍｅｒａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ）である。ＥＮＵＭ ２４４Ｃ８は、ＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１の結合を遮断することなくＰＤ－１機能を阻害する抗ＰＤ１抗体である。

【0420】

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ＥＮＵＭ ３８８Ｄ４（Ｅｎｕｍｅｒａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ）である。ＥＮＵＭ ３８８Ｄ４は、ＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１の結合を競合的に阻害する抗ＰＤ１抗体である。

【0421】

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合したＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２の細胞外部分またはＰＤ－１結合部分を含むイムノアドヘシン）である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＡＭＰ－２２４である。Ｂ７－ＤＣＩｇとしても公知のＡＭＰ－２２４（ＣＡＳ登録番号１４２２１８４－００－６；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）は、国際公開第２０１０／０２７８２７号および国際公開第２０１１／０６６３４２号に記載されているＰＤ－Ｌ２－Ｆｃ融合可溶性受容体である。

【0422】

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ペプチドまたは小分子化合物である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＡＵＮＰ－１２（ＰｉｅｒｒｅＦａｂｒｅ／Ａｕｒｉｇｅｎｅ）である。例えば、国際公開第２０１２／１６８９４４号、国際公開第２０１５／０３６９２７号、国際公開第２０１５／０４４９００号、国際公開第２０１５／０３３３０３号、国際公開第２０１３／１４４７０４号、国際公開第２０１３／１３２３１７号および国際公開第２０１１／１６１６９９号を参照されたい。

【0423】

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。様々な抗ＰＤ－Ｌ１抗体が本明細書において企図され、記載される。本明細書の実施形態のいずれかでは、単離された抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ヒトＰＤ－Ｌ１、例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ９ＮＺＱ７．１に示されるヒトＰＤ－Ｌ１、またはその変異体に結合することができる。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との間および／またはＰＤ－Ｌ１とＢ７－１との間の結合を阻害することができる。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、および（Ｆａｂ’）_２断片からなる群より選択される抗体断片である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はヒト抗体である。本発明の方法に有用な抗ＰＤ－Ｌ１抗体の例およびその作製方法は、ＰＣＴ特許出願ＷＯ２０１０／０７７６３４Ａ１および米国特許第８，２１７，１４９号に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。

【0424】

例示的なＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストとしては、限定されないが、ＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブ；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ；国際公開第２０１１／０６６３８９号参照）、ＭＳＢ－００１０７１８Ｃ（米国特許出願公開第２０１４／０３４１９１７号参照）、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０（国際公開第２０１０／０７７６３４号の配列番号２０および米国特許第８，２１７，１４９号参照）、ＭＩＨ１（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；欧州特許第３ ２３０ ３１９号参照）、ＭＤＸ－１１０５（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；国際公開第２０１３０１９９０６号および米国特許第８，２１７，１４９号参照）、ＳＴＩ－１０１４（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ；国際公開第２０１３／１８１６３４号参照）、ＣＫ－３０１（チェックポイント治療薬）、ＫＮ０３５（３Ｄ Ｍｅｄ／Ａｌｐｈａｍａｂ；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｃｏｖ．３：１７００４参照）、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ；ＲＧ７４４６；ＭＰＤＬ３２８０Ａ；Ｒ０５５４１２６７；米国特許第９，７２４，４１３号参照）、ＢＭＳ－９３６５５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ；米国特許第７，９４３，７４３号、国際公開第２０１３／１７３２２３号参照）、アベルマブ（バベンチオ；米国特許出願公開第２０１４／０３４１９１７号参照）、ＬＹ３３０００５４（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ Ｃｏ．）、ＣＸ－０７２（Ｐｒｏｃｌａｉｍ－ＣＸ－０７２；ＣｙｔｏｍＸとも呼ばれる；国際公開第２０１６／１４９２０１号参照）、ＦＡＺ０５３、ＫＮ０３５（国際公開第２０１７０２０８０１号および国際公開第２０１７０２０８０２号参照）、ＭＤＸ－１１０５（米国特許出願公開第２０１５／０３２０８５９号参照）などの抗ＰＤ－Ｌ１抗体、３Ｇ１０、１２Ａ４（ＢＭＳ－９３６５５９とも称される）、１０Ａ５、５Ｆ８、１０Ｈ１０、１Ｂ１２、７Ｈ１、１１Ｅ６、１２Ｂ７および１３Ｇ４を含む米国特許第７，９４３，７４３号に開示されている抗ＰＤ－Ｌ１抗体、国際公開第２０１０／０７７６３４号、米国特許第 ８，２１７，１４９号、国際公開第２０１０／０３６９５９号、国際公開第２０１０／０７７６３４号、国際公開第２０１１／０６６３４２号、米国特許第８，２１７，１４９号、米国特許第７，９４３，７４３号、国際公開第２０１０／０８９４１１号、米国特許第７，６３５，７５７号、米国特許第 ８，２１７，１４９号、米国特許第２００９／０３１７３６８号、国際公開第２０１１／０６６３８９号、国際公開第２０１７／０３４９１６号、国際公開第２０１７／０２０２９１号、国際公開第２０１７／０２０８５８号、国際公開第２０１７／０２０８０１号、国際公開第２０１６／１１１６４５号、国際公開第２０１６／１９７３６７号、国際公開第２０１６／０６１１４２号、国際公開第２０１６／１４９２０１号、国際公開第２０１６／０００６１９号、国際公開第２０１６／１６０７９２号、国際公開第２０１６／０２２６３０号、国際公開第２０１６／００７２３５号、国際公開第２０１５／１７９６５４号、国際公開第２０１５／１７３２６７号、国際公開第２０１５／１８１３４２号、国際公開第２０１５／１０９１２４号、国際公開第２０１８／２２２７１１号、国際公開第２０１５／１１２８０５号、国際公開第２０１５／０６１６６８号、国際公開第２０１４／１５９５６２号、国際公開第２０１４／１６５０８２号、国際公開第２０１４／１０００７９号に記載されている抗ＰＤ－Ｌ１抗体が含まれる。

【0425】

特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ；ＲＧ７４４６；ＭＰＤＬ３２８０Ａ；Ｒ０５５４１２６７）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、ＢＭＳ－９３６５５９、アベルマブ（バベンチオ）、ロダポリマブ（ＬＹ３３０００５４）、ＣＸ－０７２（Ｐｒｏｃｌａｉｍ－ＣＸ－０７２）、ＦＡＺ０５３、ＫＮ０３５、またはＭＤＸ－１１０５を含む。

【0426】

抗ＰＤ－１抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体などのＰＤ－１軸結合アンタゴニストは、当技術分野で公知の任意の様式および任意の経路によって投与され得る。投与の方法および経路は、使用されるＰＤ－１軸結合アンタゴニストの種類に依存する。

【0427】

ＰＤ－１軸結合アンタゴニストは、本明細書に記載の任意の適切な医薬組成物の形態で投与され得る。

【0428】

抗ＰＤ－１抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体などのＰＤ－１軸結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体などのＰＤ－１軸結合アンタゴニストをコードする核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡの形態で投与され得る。例えば、抗体は、本明細書に記載されるように、核酸を発現する際にコードされて送達され得る。核酸分子は、それ自体で、例えばプラスミドもしくはｍＲＮＡ分子の形態で送達され得るか、または送達ビヒクル、例えばリポソーム、リポプレックスもしくは任意の他の核酸粒子、核酸脂質粒子と複合体化され得る。抗ＰＤ－１抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体などのＰＤ－１軸結合アンタゴニストはまた、ＰＤ－１軸結合アンタゴニストをコードする発現カセットを含む腫瘍溶解性ウイルスを介して投与され得る。

【0429】

免疫賦活剤
「免疫賦活剤」は、免疫系の成分のいずれか、特に免疫エフェクタ細胞の活性化を誘導するかまたは活性を増加させることによって免疫系を刺激する任意の物質である。免疫賦活剤は、炎症促進性（例えば、感染症または癌を治療する場合）または抗炎症性（例えば、自己免疫疾患を治療する場合）であり得る。

【0430】

一態様によれば、免疫賦活剤は、サイトカインまたはその変異体である。サイトカインの例としては、インターフェロン、例えばインターフェロン－α（ＩＦＮ－α）またはインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、インターロイキン、例えばＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５およびＩＬ２３、コロニー刺激因子、例えばＭ－ＣＳＦおよびＧＭ－ＣＳＦ、ならびに腫瘍壊死因子が挙げられる。別の態様によれば、免疫賦活剤は、アジュバント型免疫賦活剤、例えばＡＰＣ Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストまたは共刺激／細胞接着膜タンパク質を含む。Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストの例としては、共刺激／接着タンパク質、例えばＣＤ８０、ＣＤ８６およびＩＣＡＭ－１が挙げられる。

【0431】

「サイトカイン」という用語は、約５～６０ｋＤａの分子量を有し、細胞シグナル伝達（例えばパラクリン、内分泌、および／または自己分泌シグナル伝達）に関与するタンパク質に関する。特に、サイトカインは、放出された場合、放出された場所周辺の細胞の挙動に影響を及ぼす。サイトカインの例としては、リンホカイン、インターロイキン、ケモカイン、インターフェロン、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が挙げられる。本開示によれば、サイトカインはホルモンまたは成長因子を含まない。サイトカインは、（ｉ）通常、ホルモンよりもはるかに可変的な濃度で作用し、および（ｉｉ）一般に広範囲の細胞によって作られる（ほぼ全ての有核細胞がサイトカインを産生できる）という点でホルモンとは異なる。インターフェロンは、通常、抗ウイルス活性、抗増殖活性、および免疫調節活性を特徴とする。インターフェロンは、調節される細胞の表面のインターフェロン受容体に結合することによって細胞内の遺伝子の転写を変化させ、調節するタンパク質であり、それにより細胞内のウイルス複製を防止する。サイトカインの特定の例としては、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）、インターフェロンベータ（ＩＦＮβ）、インターフェロンガンマ（ＩＮＦγ）、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン４（ＩＬ－４）、インターロイキン１０（ＩＬ－１０）、インターロイキン１１（ＩＬ－１１）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、およびインターロイキン２１（ＩＬ－２１）、ならびにそれらの変異体および誘導体が挙げられる。

【0432】

本開示によれば、サイトカインは、天然に存在するサイトカインまたはその機能的断片もしくは変異体であり得る。サイトカインはヒトサイトカインであり得、任意の脊椎動物、特に任意の哺乳動物に由来し得る。１つの特に好ましいサイトカインはインターフェロン－αである。

【0433】

免疫賦活剤は、肝臓または肝臓組織へのＲＮＡの選択的送達のための製剤中の免疫賦活剤をコードするＲＮＡを対象に投与する工程によって対象に提供され得る。そのような標的器官または組織へのＲＮＡの送達は、特に、大量の免疫賦活剤を発現することが望ましい場合、および／または免疫賦活剤の全身的な存在、特に有意な量での存在が望ましいもしくは必要とされる場合に好ましい。

【0434】

ＲＮＡ送達システムは、肝臓に対して固有の選択性を有する。これは、脂質ベースの粒子、カチオン性および中性ナノ粒子、特に脂質ナノ粒子に関連する。

【0435】

肝臓を標的とするための適切な免疫賦活剤の例は、Ｔ細胞の増殖および／または維持に関与するサイトカインである。適切なサイトカインの例としては、ＩＬ２またはＩＬ７、その断片および変異体、ならびに延長ＰＫサイトカインなどの、これらのサイトカイン、断片および変異体の融合タンパク質が挙げられる。

【0436】

別の実施形態では、免疫賦活剤をコードするＲＮＡは、リンパ系、特に二次リンパ器官、より具体的には脾臓へのＲＮＡの選択的送達のための製剤中で投与され得る。そのような標的組織への免疫賦活剤の送達は、特に、この器官または組織における免疫賦活剤の存在が望ましい（例えば免疫応答を誘導するために、特にＴ細胞プライミング中にまたは常在免疫細胞の活性化のためにサイトカインなどの免疫賦活剤が必要とされる場合）が、免疫賦活剤が全身的に、特に有意な量で存在することは望ましくない（例えば免疫賦活剤が全身毒性を有するため）場合に好ましい。

【0437】

適切な免疫賦活剤の例は、Ｔ細胞プライミングに関与するサイトカインである。適切なサイトカインの例には、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＦＮ－α、またはＩＦＮ－β、その断片および変異体、ならびに延長ＰＫサイトカインなどの、これらのサイトカイン、断片および変異体の融合タンパク質が含まれる。

【0438】

インターフェロン
インターフェロン（ＩＦＮ）は、ウイルス、細菌、寄生虫などのいくつかの病原体、およびまた腫瘍細胞の存在に応答して、宿主細胞によって産生および放出されるシグナル伝達タンパク質の群である。典型的なシナリオでは、ウイルスに感染した細胞がインターフェロンを放出し、近くの細胞の抗ウイルス防御能を高める。

【0439】

インターフェロンがそれを介してシグナル伝達する受容体の種類に基づいて、インターフェロンは、典型的には３つのクラス：Ｉ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロン、およびＩＩＩ型インターフェロンに分けられる。

【0440】

全てのＩ型インターフェロンは、ＩＦＮＡＲ１鎖およびＩＦＮＡＲ２鎖からなるＩＦＮ－α／β受容体（ＩＦＮＡＲ）として公知の特定の細胞表面受容体複合体に結合する。

【0441】

ヒトに存在するＩ型インターフェロンは、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮε、ＩＦＮκおよびＩＦＮωである。一般に、Ｉ型インターフェロンは、身体が、体内に侵入したウイルスを認識したときに産生される。それらは線維芽細胞および単球によって産生される。放出されると、Ｉ型インターフェロンは標的細胞上の特異的受容体に結合し、ウイルスがそのＲＮＡおよびＤＮＡを産生および複製するのを妨げるタンパク質の発現をもたらす。

【0442】

ＩＦＮαタンパク質は、主に形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）によって産生される。それらは主にウイルス感染に対する自然免疫に関与する。それらの合成に関与する遺伝子は、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、ＩＦＮＡ２１と呼ばれる１３のサブタイプに属する。これらの遺伝子は、９番染色体上のクラスタに一緒に見出される。

【0443】

ＩＦＮβタンパク質は、線維芽細胞によって大量に産生される。それらは、主に自然免疫応答に関与する抗ウイルス活性を有する。２種類のＩＦＮβ、すなわちＩＦＮβ１とＩＦＮβ３が記述されている。ＩＦＮβ１の天然型および組換え型は、抗ウイルス、抗菌、および抗癌特性を有する。

【0444】

ＩＩ型インターフェロン（ヒトにおけるＩＦＮγ）は、免疫インターフェロンとしても公知であり、ＩＬ１２によって活性化される。さらに、ＩＩ型インターフェロンは、細胞傷害性Ｔ細胞およびＴヘルパー細胞によって放出される。

【0445】

ＩＩＩ型インターフェロンは、ＩＬ１０Ｒ２（ＣＲＦ２－４とも呼ばれる）およびＩＦＮＬＲ１（ＣＲＦ２－１２とも呼ばれる）からなる受容体複合体を介してシグナル伝達する。Ｉ型およびＩＩ型ＩＦＮよりも最近発見されたが、最近の情報は、いくつかの種類のウイルスまたは真菌感染におけるＩＩＩ型ＩＦＮの重要性を実証している。

【0446】

一般に、Ｉ型およびＩＩ型インターフェロンは、免疫応答の調節および活性化を担う。

【0447】

本開示によれば、Ｉ型インターフェロンは、好ましくはＩＦＮαまたはＩＦＮβ、より好ましくはＩＦＮαである。

【0448】

本開示によれば、インターフェロンは、天然に存在するインターフェロンまたはその機能的断片もしくは変異体であり得る。インターフェロンは、ヒトインターフェロンであり得、任意の脊椎動物、特に任意の哺乳動物に由来し得る。

【0449】

インターロイキン
インターロイキン（ＩＬ）は、顕著な構造特徴に基づいて４つの主要な群に分けることができるサイトカイン（分泌タンパク質およびシグナル分子）の群である。しかしながら、それらのアミノ酸配列類似性はかなり弱い（典型的には１５～２５％の同一性）。ヒトゲノムは、５０を超えるインターロイキンおよび関連タンパク質をコードする。

【0450】

本開示によれば、インターロイキンは、天然に存在するインターロイキンまたはその機能的断片もしくは変異体であり得る。インターロイキンはヒトインターロイキンであり得、任意の脊椎動物、特に任意の哺乳動物に由来し得る。

【0451】

延長ＰＫ基
本明細書に記載される免疫賦活ポリペプチドは、免疫賦活部分および異種ポリペプチド（すなわち、免疫賦活剤ではないポリペプチド）を含む融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドとして調製され得る。免疫賦活剤は、循環半減期を増加させる延長ＰＫ基に融合され得る。延長ＰＫ基の非限定的な例を以下で説明する。サイトカインまたはその変異体などの免疫賦活剤の循環半減期を増加させる他のＰＫ基もまた、本開示に適用可能であることが理解されるべきである。特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、血清アルブミンドメイン（例えば、マウス血清アルブミン、ヒト血清アルブミン）である。

【0452】

本明細書で使用される場合、「ＰＫ」という用語は、「薬物動態」の頭字語であり、例として、対象による吸収、分布、代謝、および排泄を含む化合物の特性を包含する。本明細書で使用される場合、「延長ＰＫ基」は、生物学的に活性な分子に融合されるかまたは生物学的に活性な分子と一緒に投与された場合、生物学的に活性な分子の循環半減期を増加させるタンパク質、ペプチド、または部分を指す。延長ＰＫ基の例としては、血清アルブミン（例えばＨＳＡ）、免疫グロブリンＦｃまたはＦｃ断片およびその変異体、トランスフェリンおよびその変異体、ならびにヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合剤（米国特許出願公開第２００５／０２８７１５３号および同第２００７／０００３５４９号に開示されている）が挙げられる。他の例示的な延長ＰＫ基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ，２０１６ Ｊｕｌ；１６（７）：９０３－１５に開示されている。本明細書で使用される場合、「延長ＰＫ」免疫賦活剤は、延長ＰＫ基と組み合わせた免疫賦活部分を指す。いくつかの実施形態では、延長ＰＫ免疫賦活剤は、免疫賦活部分が延長ＰＫ基に連結または融合された融合タンパク質である。

【0453】

特定の実施形態では、延長ＰＫ免疫賦活剤の血清半減期は、免疫賦活剤単独（すなわち、延長ＰＫ基に融合されていない免疫賦活剤）と比較して増加している。特定の実施形態では、延長ＰＫ免疫賦活剤の血清半減期は、免疫賦活剤単独の血清半減期と比較して少なくとも２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１５０、１８０、２００、４００、６００、８００、または１０００％長い。特定の実施形態では、延長ＰＫ免疫賦活剤の血清半減期は、免疫賦活剤単独の血清半減期の少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、１０倍、１２倍、１３倍、１５倍、１７倍、２０倍、２２倍、２５倍、２７倍、３０倍、３５倍、４０倍、または５０倍である。特定の実施形態では、延長ＰＫ免疫賦活剤の血清半減期は、少なくとも１０時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、５０時間、６０時間、７０時間、８０時間、９０時間、１００時間、１１０時間、１２０時間、１３０時間、１３５時間、１４０時間、１５０時間、１６０時間、または２００時間である。

【0454】

本明細書で使用される場合、「半減期」は、ペプチドまたはポリペプチドなどの化合物の血清または血漿濃度が、例えば分解および／またはクリアランスもしくは天然の機構による隔離に起因して、インビボで５０％減少するのに要する時間を指す。本明細書での使用に適した延長ＰＫ免疫賦活剤は、インビボで安定化されており、その半減期は、例えば、分解および／またはクリアランスもしくは隔離に抵抗する血清アルブミン（例えばＨＳＡまたはＭＳＡ）への融合によって増加している。半減期は、薬物動態分析などによる、それ自体公知の任意の方法で決定することができる。適切な技術は当業者には明らかであり、例えば一般に、適切な用量のアミノ酸配列または化合物を対象に適切に投与する工程；当該対象から血液試料または他の試料を一定の間隔で収集する工程；当該血液試料中のアミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度を決定する工程；およびこのようにして得られたデータ（のプロット）から、アミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度が投与時の初期レベルと比較して５０％低下するまでの時間を計算する工程を含み得る。さらなる詳細は、例えば、Ｋｅｎｎｅｔｈ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓなどの標準的なハンドブックおよびＰｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９６）に提供されている。Ｇｉｂａｌｄｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，２ｎｄ Ｒｅｖ．Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ（１９８２）も参照されたい。

【0455】

特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、血清アルブミンもしくはその断片、または血清アルブミンもしくはその断片の変異体（本開示の目的のために、それらの全てが「アルブミン」という用語に含まれる）を含む。本明細書に記載されるポリペプチドは、アルブミン（またはその断片もしくは変異体）に融合されてアルブミン融合タンパク質を形成し得る。そのようなアルブミン融合タンパク質は、米国特許出願公開第２００７００４８２８２号に記載されている。

【0456】

本明細書で使用される場合、「アルブミン融合タンパク質」は、少なくとも１分子のアルブミン（またはその断片もしくは変異体）と、少なくとも１分子の治療用タンパク質などのタンパク質、特に免疫賦活剤との融合によって形成されるタンパク質を指す。アルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドがアルブミンをコードするポリヌクレオチドとインフレームで連結されている核酸の翻訳によって生成され得る。治療用タンパク質およびアルブミンは、アルブミン融合タンパク質の一部になると、それぞれ、アルブミン融合タンパク質の「一部」、「領域」または「部分」（例えば「治療用タンパク質部分」または「アルブミンタンパク質部分」）と呼ばれ得る。非常に好ましい実施形態では、アルブミン融合タンパク質は、少なくとも１分子の治療用タンパク質（治療用タンパク質の成熟形態を含むがこれに限定されない）と、少なくとも１分子のアルブミン（アルブミンの成熟形態を含むがこれに限定されない）とを含む。いくつかの実施形態では、アルブミン融合タンパク質は、投与されたＲＮＡの標的器官の細胞、例えば肝細胞などの宿主細胞によってプロセシングされ、循環中に分泌される。ＲＮＡの発現に使用される宿主細胞の分泌経路で起こる新生アルブミン融合タンパク質のプロセシングには、シグナルペプチド切断；ジスルフィド結合の形成；適切な折りたたみ；炭水化物の付加およびプロセシング（例えばＮ－結合型およびＯ－結合型グリコシル化など）；特異的タンパク質分解切断；ならびに／または多量体タンパク質へのアセンブリが含まれ得るが、これらに限定されない。アルブミン融合タンパク質は、好ましくは、特にそのＮ末端にシグナルペプチドを有するプロセシングされていない形態でＲＮＡによってコードされ、細胞による分泌後、好ましくは、特にシグナルペプチドが切断された、プロセシングされた形態で存在する。最も好ましい実施形態では、「アルブミン融合タンパク質のプロセシングされた形態」は、本明細書では「成熟アルブミン融合タンパク質」とも呼ばれる、Ｎ末端シグナルペプチド切断を受けたアルブミン融合タンパク質産物を指す。

【0457】

好ましい実施形態では、治療用タンパク質を含むアルブミン融合タンパク質は、アルブミンに融合されていない場合の同じ治療用タンパク質の血漿安定性と比較して、より高い血漿安定性を有する。血漿安定性は、典型的には、治療用タンパク質がインビボで投与され、血流に運ばれたときから、治療用タンパク質が分解され、血流から腎臓または肝臓などの器官へと除去され、最終的に治療用タンパク質が体内から除去されるときまでの期間を指す。血漿安定性は、血流中の治療用タンパク質の半減期に関して計算される。血流中の治療用タンパク質の半減期は、当技術分野で公知の一般的なアッセイによって容易に決定することができる。

【0458】

本明細書で使用される場合、「アルブミン」は、アルブミンの１つ以上の機能活性（例えば生物学的活性）を有する、アルブミンタンパク質もしくはアミノ酸配列、またはアルブミン断片もしくは変異体を集合的に指す。特に、「アルブミン」は、ヒトアルブミンまたはその断片もしくは変異体、特にヒトアルブミンの成熟形態、または他の脊椎動物由来のアルブミンもしくはその断片、またはこれらの分子の変異体を指す。アルブミンは、任意の脊椎動物、特に任意の哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ヒツジ、またはブタに由来し得る。非哺乳動物アルブミンとしては、雌鶏およびサケが挙げられるが、これらに限定されない。アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、治療用タンパク質部分とは異なる動物に由来し得る。

【0459】

特定の実施形態では、アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはその断片もしくは変異体、例えば米国特許第５，８７６，９６９号、国際公開第２０１１／１２４７１８号、国際公開第２０１３／０７５０６６号、および国際公開第２０１１／０５１４７８９号に開示されているものである。

【0460】

ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびヒトアルブミン（ＨＡ）という用語は、本明細書では互換的に使用される。「アルブミンおよび「血清アルブミン」という用語はより広範であり、ヒト血清アルブミン（ならびにその断片および変異体）ならびに他の種由来のアルブミン（ならびにその断片および変異体）を包含する。

【0461】

本明細書で使用される場合、治療用タンパク質の治療活性または血漿安定性を延長するのに十分なアルブミンの断片は、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分の血漿安定性が非融合状態での血漿安定性と比較して延長または拡大されるように、タンパク質の治療活性または血漿安定性を安定化または延長するのに十分な長さまたは構造のアルブミン断片を指す。

【0462】

アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、アルブミン配列の全長を含み得るか、または治療活性もしくは血漿安定性を安定化もしくは延長することができるその１つ以上の断片を含み得る。そのような断片は、１０個以上のアミノ酸の長さであり得るか、またはアルブミン配列からの約１５、２０、２５、３０、５０個、もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を含み得るか、またはアルブミンの特定のドメインの一部もしくは全部を含み得る。例えば、最初の２つの免疫グロブリン様ドメインにまたがるＨＳＡの１つ以上の断片を使用し得る。好ましい実施形態では、ＨＳＡ断片はＨＳＡの成熟形態である。

【0463】

一般的に言えば、アルブミン断片または変異体は、少なくとも１００アミノ酸長、好ましくは少なくとも１５０アミノ酸長である。

【0464】

本開示によれば、アルブミンは、天然に存在するアルブミンまたはその断片もしくは変異体であり得る。アルブミンはヒトアルブミンであり得、任意の脊椎動物、特に任意の哺乳動物に由来し得る。

【0465】

好ましくは、アルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端部分としてアルブミンを含み、Ｃ末端部分として治療用タンパク質を含む。あるいは、Ｃ末端部分としてアルブミンを含み、Ｎ末端部分として治療用タンパク質を含むアルブミン融合タンパク質も使用し得る。他の実施形態では、アルブミン融合タンパク質は、アルブミンのＮ末端とＣ末端の両方に融合した治療用タンパク質を有する。好ましい実施形態では、Ｎ末端およびＣ末端で融合した治療用タンパク質は、同じ治療用タンパク質である。別の好ましい実施形態では、Ｎ末端およびＣ末端で融合した治療用タンパク質は、異なる治療用タンパク質である。いくつかの実施形態では、異なる治療用タンパク質は両方ともサイトカインである。

【0466】

いくつかの実施形態では、１つ以上の治療用タンパク質は、１つ以上のペプチドリンカーを介してアルブミンに連結される。融合部分の間のリンカーペプチドは、部分間のより大きな物理的分離を提供し、したがって、例えばその同族受容体に結合するための治療用タンパク質部分のアクセス可能性を最大化し得る。リンカーペプチドは、それが柔軟であるかまたはより剛性であるようにアミノ酸で構成され得る。リンカー配列は、プロテアーゼによってまたは化学的に切断可能であり得る。

【0467】

本明細書で使用される場合、「Ｆｃ領域」という用語は、天然免疫グロブリンの２本の重鎖のそれぞれのＦｃドメイン（またはＦｃ部分）によって形成される天然免疫グロブリンの部分を指す。本明細書で使用される場合、「Ｆｃドメイン」という用語は、ＦｃドメインがＦｖドメインを含まない単一の免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖の一部または断片を指す。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、パパイン切断部位のすぐ上流のヒンジ領域で始まり、抗体のＣ末端で終わる。したがって、完全なＦｃドメインは、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジ（例えば上部、中間および／もしくは下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、またはそれらの変異体、部分もしくは断片の少なくとも１つを含む。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、完全なＦｃドメイン（すなわち、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン）を含む。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメイン（またはその一部）に融合したヒンジドメイン（またはその一部）を含む。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメイン（またはその一部）に融合したＣＨ２ドメイン（またはその一部）を含む。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメインまたはその一部からなる。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン（またはその一部）およびＣＨ３ドメイン（またはその一部）からなる。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメイン（またはその一部）およびＣＨ３ドメインからなる。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン（またはその一部）およびＣＨ２ドメイン（またはその一部）からなる。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（例えばＣＨ２ドメインの全部または一部）を欠く。本明細書におけるＦｃドメインは、一般に、免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインの全部または一部を含むポリペプチドを指す。これには、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、および／またはＣＨ３ドメイン全体を含むポリペプチド、ならびに、例えばヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインのみを含むそのようなペプチドの断片が含まれるが、これらに限定されない。Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体を含むがこれらに限定されない、任意の種および／または任意のサブタイプの免疫グロブリンに由来し得る。Ｆｃドメインは、天然のＦｃおよびＦｃ変異体分子を包含する。本明細書に記載されるように、任意のＦｃドメインを、アミノ酸配列が天然に存在する免疫グロブリン分子の天然Ｆｃドメインとは異なるように修飾し得ることは、当業者に理解されるであろう。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、エフェクタ機能（例えばＦｃγＲ結合）が低下している。

【0468】

本明細書に記載されるポリペプチドのＦｃドメインは、異なる免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、ポリペプチドのＦｃドメインは、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン、ならびにＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含み得る。別の例では、Ｆｃドメインは、一部はＩｇＧ１分子に由来し、一部はＩｇＧ３分子に由来するキメラヒンジ領域を含むことができる。別の例では、Ｆｃドメインは、一部はＩｇＧ１分子に由来し、一部はＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジを含むことができる。

【0469】

特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、Ｆｃドメインもしくはその断片、またはＦｃドメインもしくはその断片の変異体（本開示の目的のために、その全てが「Ｆｃドメイン」という用語に含まれる）を含む。Ｆｃドメインは、抗原に結合する可変領域を含まない。本開示での使用に適したＦｃドメインは、いくつかの異なる供給源から得られ得る。特定の実施形態では、Ｆｃドメインはヒト免疫グロブリンに由来する。特定の実施形態では、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１定常領域に由来する。しかしながら、Ｆｃドメインは、例えばげっ歯動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット）種または非ヒト霊長動物（例えばチンパンジー、マカク）種を含む別の哺乳動物種の免疫グロブリンに由来し得ることが理解される。

【0470】

さらに、Ｆｃドメイン（またはその断片もしくは変異体）は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥを含む任意の免疫グロブリンクラス、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む任意の免疫グロブリンアイソタイプに由来し得る。

【0471】

様々なＦｃドメイン遺伝子配列（例えばマウスおよびヒト定常領域遺伝子配列）が、公的にアクセス可能な寄託物の形態で入手可能である。特定のエフェクタ機能を欠く、および／または免疫原性を低下させる特定の修飾を有するＦｃドメイン配列を含む定常領域ドメインを選択することができる。抗体および抗体をコードする遺伝子の多くの配列が公開されており、適切なＦｃドメイン配列（例えばヒンジ、ＣＨ２、および／もしくはＣＨ３配列、またはその断片もしくは変異体）は、当技術分野で広く認められている技術を使用してこれらの配列から導くことができる。

【0472】

特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００５／０２８７１５３号、米国特許出願第２００７／０００３５４９号、米国特許出願第２００７／０１７８０８２号、米国特許出願第２００７／０２６９４２２号、米国特許出願第２０１０／０１１３３３９号、国際公開第２００９／０８３８０４号、および国際公開第２００９／１３３２０８号に記載されているものなどの血清アルブミン結合タンパク質である。特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，１７６，２７８号および米国特許第８，１５８，５７９号に開示されているように、トランスフェリンである。特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００７／０１７８０８２号、米国特許出願第２０１４／０２２００１７号、および米国特許出願第２０１７／０１４５０６２号に開示されているものなどの血清免疫グロブリン結合タンパク質である。特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２０１２／００９４９０９号に開示されているものなどの、血清アルブミンに結合するフィブロネクチン（Ｆｎ）ベースの足場ドメインタンパク質である。フィブロネクチンベースの足場ドメインタンパク質を作製する方法もまた、米国特許出願第２０１２／００９４９０９号に開示されている。Ｆｎ３ベースの延長ＰＫ基の非限定的な例は、Ｆｎ３（ＨＳＡ）、すなわち、ヒト血清アルブミンに結合するＦｎ３タンパク質である。

【0473】

特定の態様では、本開示による使用に適した延長ＰＫ免疫賦活剤は、１つ以上のペプチドリンカーを使用することができる。本明細書で使用される場合、「ペプチドリンカー」という用語は、ポリペプチド鎖の直鎖状アミノ酸配列中の２つ以上のドメイン（例えば、延長ＰＫ部分および免疫賦活部分）を接続するペプチドまたはポリペプチド配列を指す。例えば、ペプチドリンカーを使用して、免疫賦活部分をＨＳＡドメインに接続し得る。

【0474】

例えば免疫賦活剤に延長ＰＫ基を融合するのに適したリンカーは、当技術分野で周知である。例示的なリンカーとしては、グリシン－セリンポリペプチドリンカー、グリシン－プロリンポリペプチドリンカー、およびプロリン－アラニンポリペプチドリンカーが挙げられる。特定の実施形態では、リンカーは、グリシン－セリンポリペプチドリンカー、すなわちグリシンおよびセリン残基からなるペプチドである。

【0475】

免疫エフェクタ細胞
本明細書で使用される免疫エフェクタ細胞は、治療を必要とする対象に投与され得るか、または治療を必要とする対象に内因的に存在し得る。ワクチン抗原をコードするＲＮＡおよびＰＤ－１軸結合アンタゴニストを対象に投与することにより、免疫エフェクタ細胞の刺激が可能になる。本明細書に記載される方法および薬剤は、特に、免疫エフェクタ細胞が向けられる抗原を発現する疾患細胞を特徴とする疾患の治療に有用である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクタ細胞は、抗原またはそのプロセシング産物に対する結合特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの抗原受容体を担持する。いくつかの実施形態では、免疫エフェクタ細胞は、治療される対象に存在し、抗原受容体を発現する。いくつかの実施形態では、免疫エフェクタ細胞は、治療される対象に存在し、抗原受容体を発現するように対象においてインビボで遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、治療される対象または異なる対象のいずれかからの免疫エフェクタ細胞が、治療される対象に投与される。投与される免疫エフェクタ細胞は、投与前にエクスビボで遺伝子改変され得るか、または投与後に抗原受容体を発現するように対象においてインビボで遺伝子改変され得る。いくつかの実施形態では、抗原受容体は免疫エフェクタ細胞に内因性である。

【0476】

いくつかの実施形態では、免疫エフェクタ細胞は、ワクチン抗原に応答性である任意の細胞を含む。そのような応答性には、活性化、分化、増殖、生存および／または１つ以上の免疫エフェクタ機能の表示が含まれる。細胞は、特に、溶解能を有する細胞、特にリンパ系細胞を含み、好ましくはＴ細胞、特に細胞傷害性リンパ球であり、好ましくは細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞から選択される。活性化されると、これらの細胞傷害性リンパ球はそれぞれ標的細胞の破壊を引き起こす。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞は、以下の手段のいずれかまたは両方によって標的細胞の破壊を引き起こす。まず、活性化すると、Ｔ細胞は、パーフォリン、グランザイム、およびグラニュライシンなどの細胞毒を放出する。パーフォリンおよびグラニュライシンは標的細胞に細孔を作り、グランザイムは細胞に進入し、細胞のアポトーシス（プログラム細胞死）を誘導する細胞質のカスパーゼカスケードを引き起こす。第２に、アポトーシスは、Ｔ細胞と標的細胞との間のＦａｓ－Ｆａｓリガンド相互作用を介して誘導され得る。本発明に関連して使用される細胞は、好ましくは自家細胞であるが、異種細胞または同種異系細胞を使用することができる。いくつかの実施形態では、免疫エフェクタ細胞は、治療される対象にとって内因性である。

【0477】

本発明の文脈における「エフェクタ機能」という用語は、例えば、腫瘍細胞などの疾患細胞の死滅、または腫瘍の播種および転移の阻害を含む腫瘍成長の阻害および／もしくは腫瘍発生の阻害をもたらす免疫系の成分によって媒介される任意の機能を含む。好ましくは、本発明の文脈におけるエフェクタ機能は、Ｔ細胞媒介エフェクタ機能である。そのような機能は、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４^＋Ｔ細胞）の場合、サイトカインの放出ならびに／またはＣＤ８^＋リンパ球（ＣＴＬ）および／もしくはＢ細胞の活性化を含み、ＣＴＬの場合、例えばアポトーシスまたはパーフォリン媒介細胞溶解を介した、細胞、すなわち抗原の発現を特徴とする細胞の排除、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αなどのサイトカインの産生、ならびに抗原を発現する標的細胞の特異的細胞溶解性死滅を含む。

【0478】

本発明の文脈における「免疫エフェクタ細胞」または「免疫反応性細胞」という用語は、免疫反応中にエフェクタ機能を発揮する細胞に関する。「免疫エフェクタ細胞」は、いくつかの実施形態では、細胞上のＭＨＣに関連して提示されるか、または細胞の表面上に発現される抗原などの抗原に結合し、免疫応答を媒介することができる。例えば、免疫エフェクタ細胞は、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、腫瘍浸潤Ｔ細胞）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、マクロファージ、および樹状細胞を含む。好ましくは、本発明の文脈において、「免疫エフェクタ細胞」は、Ｔ細胞、好ましくはＣＤ４^＋および／またはＣＤ８^＋Ｔ細胞、最も好ましくはＣＤ８^＋Ｔ細胞である。本発明によれば、「免疫エフェクタ細胞」という用語はまた、適切な刺激で免疫細胞（Ｔ細胞、特にＴヘルパー細胞、または細胞溶解性Ｔ細胞など）に成熟することができる細胞を含む。免疫エフェクタ細胞は、ＣＤ３４^＋造血幹細胞、未成熟および成熟Ｔ細胞ならびに未成熟および成熟Ｂ細胞を含む。Ｔ細胞前駆体の細胞溶解性Ｔ細胞への分化は、抗原に曝露された場合、免疫系のクローン選択に類似する。

【0479】

好ましくは、「免疫エフェクタ細胞」は、特にＭＨＣに関連して提示されるか、または癌細胞などの疾患細胞の表面に存在する場合、ある程度の特異性で抗原を認識する。好ましくは、当該認識は、抗原を認識する細胞が応答性または反応性であることを可能にする。細胞がヘルパーＴ細胞（ＣＤ４^＋Ｔ細胞）である場合、そのような応答性または反応性は、サイトカインの放出ならびに／またはＣＤ８^＋リンパ球（ＣＴＬ）および／もしくはＢ細胞の活性化を含み得る。細胞がＣＴＬである場合、そのような応答性または反応性は、例えばアポトーシスまたはパーフォリン媒介細胞溶解を介した、細胞、すなわち抗原の発現を特徴とする細胞の排除を含み得る。本開示によれば、ＣＴＬ応答性には、持続的なカルシウム流動、細胞分裂、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αなどのサイトカインの産生、ＣＤ４４およびＣＤ６９などの活性化マーカの上方制御、ならびに抗原を発現する標的細胞の特異的細胞溶解性死滅が含まれ得る。ＣＴＬ応答性はまた、ＣＴＬ応答性を正確に示す人工レポータを使用して決定され得る。抗原を認識し、応答性または反応性であるそのようなＣＴＬは、本明細書では「抗原応答性ＣＴＬ」とも称される。

【0480】

いくつかの実施形態では、遺伝子改変された免疫エフェクタ細胞は、ＣＡＲを発現する免疫エフェクタ細胞である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変された免疫エフェクタ細胞は、ＴＣＲを発現する免疫エフェクタ細胞である。

【0481】

免疫エフェクタ細胞は、Ｔ細胞受容体もしくはＢ細胞受容体などの内因性抗原受容体を発現してもよく、または内因性抗原受容体の発現を欠いていてもよい。

【0482】

「リンパ系細胞」は、任意で適切な修飾後、例えばＴＣＲまたはＣＡＲなどの抗原受容体の移入後に、細胞性免疫応答などの免疫応答を生成することができる細胞、またはそのような細胞の前駆細胞であり、リンパ球、好ましくはＴリンパ球、リンパ芽球、および形質細胞を含む。リンパ系細胞は、本明細書に記載される免疫エフェクタ細胞であり得る。好ましいリンパ系細胞は、細胞表面に抗原受容体を発現するように改変することができるＴ細胞である。いくつかの実施形態ではリンパ系細胞は、Ｔ細胞受容体の内因性発現を欠く。

【0483】

抗原受容体
本明細書に記載の免疫エフェクタ細胞は、特に、標的細胞、例えば抗原提示細胞または疾患細胞上に存在するかまたはそれによって提示された場合、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）もしくはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）結合抗原などの抗原受容体、またはそのプロセシング産物を発現する。細胞は、抗原受容体を天然に発現し得るか、または抗原受容体を発現するように改変され得る。いくつかの実施形態では、免疫エフェクタ細胞は、治療される対象において、エクスビボ／インビトロまたはインビボで抗原受容体を発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、抗原受容体を発現するための改変は、エクスビボ／インビトロで行われる。その後、改変された細胞を患者に投与し得る。いくつかの実施形態では、抗原受容体を発現するための改変はインビボで行われる。細胞は、患者の内因性細胞であってもよく、または患者に投与されていてもよい。

【0484】

キメラ抗原受容体
キメラ抗原受容体を発現するＣＡＲ操作されたＴ細胞を用いた養子細胞移入療法は、ＣＡＲ修飾Ｔ細胞が実質的に任意の腫瘍抗原を標的とするように操作され得るので、有望な抗癌治療法である。例えば、患者のＴ細胞を、患者の腫瘍細胞上の抗原に特異的に向けられるＣＡＲを発現するように遺伝子操作（遺伝子改変）し、その後患者に注入して戻し得る。

【0485】

本発明によれば、「ＣＡＲ」（または「キメラ抗原受容体」）という用語は、「キメラＴ細胞受容体」および「人工Ｔ細胞受容体」という用語と同義であり、癌細胞などの標的細胞上の標的構造（例えば抗原）を認識し、すなわち結合し（例えば標的細胞の表面に発現された抗原への抗原結合ドメインの結合によって）、細胞表面に当該ＣＡＲを発現するＴ細胞などの免疫エフェクタ細胞に特異性を付与し得る、単一の分子または分子の複合体を含む人工受容体に関する。そのような細胞は、標的細胞の認識のために抗原のプロセシングおよび提示を必ずしも必要とせず、むしろ、標的細胞上に存在する任意の抗原を、好ましくは特異的に認識し得る。好ましくは、ＣＡＲによる標的構造の認識は、当該ＣＡＲを発現する免疫エフェクタ細胞の活性化をもたらす。ＣＡＲは、本明細書に記載の１つ以上のドメインを含む１つ以上のタンパク質ユニットを含み得る。「ＣＡＲ」という用語は、Ｔ細胞受容体を含まない。

【0486】

ＣＡＲは、一般にＣＡＲの細胞外ドメインの一部である抗原結合部分または抗原結合ドメインとも呼ばれる標的特異的結合要素を含む。抗原結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカとして働くリガンドを認識する。具体的には、本発明のＣＡＲは、腫瘍細胞などの疾患細胞上の腫瘍抗原などの抗原を標的とする。

【0487】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲの結合ドメインは、抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ中の結合ドメインが結合する抗原は、癌細胞で発現される（腫瘍抗原）。いくつかの実施形態では、抗原は癌細胞の表面に発現される。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、抗原の細胞外ドメインまたは細胞外ドメインのエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、生細胞の表面に存在する抗原の天然のエピトープに結合する。

【0488】

本発明のいくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、抗原に対する特異性を有する免疫グロブリンの重鎖の可変領域（ＶＨ）および抗原に対する特異性を有する免疫グロブリンの軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンは抗体である。いくつかの実施形態では、当該重鎖可変領域（ＶＨ）および対応する軽鎖可変領域（ＶＬ）は、ペプチドリンカーを介して接続されている。好ましくは、ＣＡＲ中の抗原結合部分の一部はｓｃＦｖである。

【0489】

ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合された膜貫通ドメインを含むように設計される。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＡＲ中のドメインの１つと天然には会合していない。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＡＲ中のドメインの１つと天然に会合している。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を回避して、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、アミノ酸置換によって改変される。膜貫通ドメインは、天然源または合成源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。本発明において特に使用される膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４に由来し得る（すなわち、少なくともその膜貫通領域（１つ以上）を含む）。あるいは、膜貫通ドメインは合成であってもよく、その場合、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含む。好ましくは、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが合成膜貫通ドメインの各末端に見出される。

【0490】

場合によっては、ＣＡＲは、膜貫通ドメインと細胞外ドメインとの間に連結を形成するヒンジドメインを含む。

【0491】

ＣＡＲの細胞質ドメインまたはさもなければ細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが配置されている免疫細胞の正常なエフェクタ機能の少なくとも１つの活性化を担う。「エフェクタ機能」という用語は、細胞の特殊な機能を指す。Ｔ細胞のエフェクタ機能は、例えば、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクタ機能シグナルを伝達し、特殊な機能を果たすように細胞に指示するタンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を使用することができるが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインのトランケートされた部分が使用される限り、そのようなトランケートされた部分は、それがエフェクタ機能シグナルを伝達する限り、無傷の鎖の代わりに使用され得る。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクタ機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意のトランケートされた部分を含むことを意味する。

【0492】

ＴＣＲのみを介して生成されるシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であり、二次シグナルまたは共刺激シグナルも必要であることが公知である。したがって、Ｔ細胞の活性化は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列：ＴＣＲを介して抗原依存性の一次活性化を開始するもの（一次細胞質シグナル伝達配列）および抗原非依存的に作用して二次シグナルまたは共刺激シグナルを提供するもの（二次細胞質シグナル伝達配列）によって媒介されると言うことができる。

【0493】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータに由来する一次細胞質シグナル伝達配列を含む。さらに、ＣＡＲの細胞質ドメインは、共刺激シグナル伝達領域と組み合わされたＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含み得る。

【0494】

共刺激ドメインの同一性は、ＣＡＲによる標的部分の結合時に細胞増殖および生存を増強する能力を有するという点でのみに限定される。適切な共刺激ドメインには、ＣＤ２８、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーであるＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＴＮＦＲスーパーファミリーの受容体のメンバーであるＣＤ１３４（ＯＸ４０）、および活性化Ｔ細胞上に発現されるＣＤ２８スーパーファミリー共刺激分子であるＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）が含まれる。当業者は、これらの記載された共刺激ドメインの配列変異体が、それらがモデルとするドメインと同じまたは類似の活性を有する場合、本発明に悪影響を及ぼすことなく使用できることを理解する。そのような変異体は、それらが由来するドメインのアミノ酸配列と少なくとも約８０％の配列同一性を有する。本発明のいくつかの実施形態では、ＣＡＲ構築物は２つの共刺激ドメインを含む。特定の組合せには、４つの記載されたドメインの全ての可能な変形が含まれるが、具体的な例としてはＣＤ２８＋ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）およびＣＤ２８＋ＣＤ１３４（ＯＸ４０）が挙げられる。

【0495】

ＣＡＲの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質シグナル伝達配列は、ランダムな順序または指定された順序で互いに連結され得る。任意で、好ましくは２～１０アミノ酸長の短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーが連結を形成し得る。グリシン－セリンダブレットは、特に適切なリンカーを提供する。

【0496】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、新生タンパク質を小胞体内に誘導するシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは抗原結合ドメインに先行する。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＩｇＧなどの免疫グロブリンに由来する。

【0497】

本開示によれば、ＣＡＲは、Ｔ細胞上に存在する場合、上記のようにＴ細胞が刺激される、および／または拡大される、またはエフェクタ機能を発揮するように、抗原提示細胞または癌細胞などの疾患細胞の表面上などの抗原を認識する。

【0498】

免疫エフェクタ細胞の遺伝子改変
ＣＤ８^＋Ｔ細胞などの免疫エフェクタ細胞の特異的標的化のために官能化された粒子は、抗原受容体をコードする核酸をＴ細胞などの免疫エフェクタ細胞に送達して、抗原受容体を発現するように遺伝子改変された細胞を産生するために、エクスビボ／インビトロまたはインビボで使用され得る。そのような遺伝子改変には、非ウイルスベースのＤＮＡトランスフェクション、非ウイルスベースのＲＮＡトランスフェクション、例えばｍＲＮＡトランスフェクション、トランスポゾンベースのシステム、およびウイルスベースのシステムが含まれる。非ウイルスベースのＤＮＡトランスフェクションは、挿入突然変異誘発のリスクが低い。トランスポゾンベースのシステムは、組込み要素を含まないプラスミドよりも効率的に導入遺伝子を組み込むことができる。ウイルスベースのシステムには、γ－レトロウイルスおよびレンチウイルスベクターの使用が含まれる。γ－レトロウイルスは、Ｔ細胞を産生し、効率的かつ永続的に形質導入することが比較的容易であり、初代ヒトＴ細胞における組込みの観点から安全であることが予備的に証明されている。レンチウイルスベクターも、Ｔ細胞を効率的かつ永続的に形質導入するが、製造コストがより高い。それらはまた、潜在的にレトロウイルスベースのシステムよりも安全である。

【0499】

本発明の全ての態様のいくつかの実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体を、抗原受容体をコードする核酸でエクスビボまたはインビボのいずれかでトランスフェクトする。いくつかの実施形態では、エクスビボトランスフェクションとインビボトランスフェクションの組合せを使用し得る。本発明の全ての態様のいくつかの実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体は、治療される対象に由来する。本発明の全ての態様のいくつかの実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体は、治療される対象とは異なる対象に由来する。

【0500】

本発明の一態様では、ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｔ細胞を標的とするナノ粒子などの粒子を使用して、インビボで、したがってほぼ瞬時に産生し得る。例えば、脂質および／またはポリマーベースのナノ粒子を、Ｔ細胞上のＣＤ８に結合するためにＣＤ８特異的標的化部分にカップリングし得る。Ｔ細胞に結合すると、これらのナノ粒子はエンドサイトーシスされる。それらの内容物、例えば抗原受容体をコードする核酸、例えば抗腫瘍抗原ＣＡＲをコードするプラスミドＤＮＡは、例えば微小管関連配列（ＭＴＡＳ）および核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含有するペプチドを含むため、Ｔ細胞核に向けられ得る。抗原受容体をコードする核酸、例えばＣＡＲ遺伝子発現カセットに隣接するトランスポゾン、および高活性トランスポザーゼをコードする別個の核酸、例えばプラスミドを含めることにより、抗原受容体をコードする核酸、例えばＣＡＲベクターの染色体への効率的な組込みを可能にし得る。

【0501】

別の可能性は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法を使用して、ＣＡＲコード配列などの抗原受容体コード配列を特定の遺伝子座に意図的に配置することである。例えば、ＣＡＲをノックインし、それを、さもなければＴＣＲ発現を抑える内因性プロモータの動的調節制御下に置く一方で、既存のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をノックアウトし得る。

【0502】

したがって、抗原受容体をコードする核酸に加えて、本明細書に記載の粒子はまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のような（もしくは関連する）遺伝子編集ツール、またはスリーピングビューティもしくはピギーバッグのようなトランスポゾンシステムをカーゴとして送達し得る。ゲノム組込み／編集のためのそのようなツール（例えばトランスポザーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のような遺伝子編集ツール）は、タンパク質またはコード核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）として送達され得る。それにもかかわらず、ｍＲＮＡの送達もまた、ＣＡＲまたはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のような抗原受容体の一過性発現を誘導するための選択肢である。

【0503】

本発明の全ての態様のいくつかの実施形態では、抗原受容体を発現するように遺伝子改変された細胞は、抗原受容体をコードする核酸で安定にまたは一過性にトランスフェクトされる。したがって、抗原受容体をコードする核酸は、細胞のゲノムに組み込まれるか、または組み込まれない。

【0504】

本発明の全ての態様のいくつかの実施形態では、抗原受容体を発現するように遺伝子改変された細胞は、内因性Ｔ細胞受容体および／または内因性ＨＬＡの発現について不活性化されている。

【0505】

本発明の全ての態様のいくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞は、治療される対象に対して自家、同種異系または同系であり得る。いくつかの実施形態では、本開示は、患者からの細胞の取り出しおよびその後の患者への細胞の再送達を想定する。いくつかの実施形態では、本開示は、患者からの細胞の取り出しを想定しない。後者の場合、細胞の遺伝子改変の全ての工程はインビボで実施される。

【0506】

「自家」という用語は、同じ対象に由来するものを表すために使用される。例えば、「自家移植」は、同じ対象に由来する組織または器官の移植を指す。そのような手順は、さもなければ拒絶反応をもたらす免疫学的障壁を克服するので有利である。

【0507】

「同種異系」という用語は、同じ種の異なる個体に由来するものを表すために使用される。２つ以上の個体は、１つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一でない場合、互いに同種異系であると言われる。

【0508】

「同系」という用語は、同一の遺伝子型を有する個体または組織、すなわち、一卵性双生児もしくは同じ近交系の動物、またはそれらの組織に由来するものを表すために使用される。

【0509】

「異種」という用語は、複数の異なる要素からなるものを表すために使用される。一例として、ある個体の骨髄を異なる個体に移入することは、異種移植を構成する。異種遺伝子は、対象以外の供給源に由来する遺伝子である。

【0510】

粒子
本明細書に記載のＲＮＡ、特にｍＲＮＡなどの核酸は、（ｉ）核酸、および（ｉｉ）核酸を複合体化するポリマーまたは脂質などの少なくとも１つのカチオン性またはカチオン性のイオン化可能な化合物を含む粒子中に存在し得る。ポリマーおよび脂質などの正に帯電した分子と負に帯電した核酸との間の静電相互作用は、粒子形成に関与する。これは、核酸粒子の複合体化および自発的形成をもたらす。

【0511】

様々なタイプのＲＮＡ含有粒子が微粒子形態のＲＮＡの送達に適することが以前に記述されている（例えば、Ｋａｃｚｍａｒｅｋ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９，６０参照）。非ウイルスＲＮＡ送達ビヒクルの場合、ＲＮＡのナノ粒子封入はＲＮＡを分解から物理的に保護し、特定の化学的性質に応じて、細胞取り込みおよびエンドソーム脱出を支援することができる。

【0512】

本開示の文脈において、「粒子」という用語は、分子または分子複合体、特に粒子形成化合物によって形成された構造化実体に関する。いくつかの実施形態では、粒子は、１種類以上の両親媒性物質（例えば両親媒性脂質）から作製されたエンベロープ（例えば１つ以上の層またはラメラ）を含有する。これに関連して、「両親媒性物質」という表現は、物質が親水性および親油性の両方の特性を有することを意味する。エンベロープはまた、両親媒性である必要がないさらなる物質（例えばさらなる脂質）を含み得る。したがって、粒子は、１つ以上の層またはラメラを構成する物質が、任意で、両親媒性である必要がないさらなる物質（例えばさらなる脂質）と組み合わせて、１種類以上の両親媒性物質（特に、両親媒性脂質からなる群より選択される）を含む、モノラメラまたはマルチラメラ構造であり得る。いくつかの実施形態では、「粒子」という用語は、マイクロサイズまたはナノサイズの構造、例えばマイクロサイズまたはナノサイズのコンパクト構造に関する。本開示によれば、「粒子」という用語はナノ粒子を含む。

【0513】

「ＲＮＡ粒子」を使用して、目的の標的部位（例えば細胞、組織、器官など）にＲＮＡを送達することができる。ＲＮＡ粒子は、少なくとも１つのカチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質または脂質様物質を含む脂質から形成され得る。いかなる理論にも拘束されることを意図するものではないが、カチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質または脂質様物質は、ＲＮＡと一緒に結合して凝集体を形成し、この凝集はコロイド的に安定な粒子をもたらすと考えられる。

【0514】

本明細書に記載のＲＮＡ粒子には、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ベースおよびリポプレックス（ＬＰＸ）ベースの製剤が含まれる。

【0515】

一般に、リポプレックス（ＬＰＸ）は、２つの水相、すなわちＲＮＡを含む相と脂質の分散液を含む相とを混合することから得ることができる。いくつかの実施形態では、脂質相はリポソームを含む。

【0516】

いくつかの実施形態では、リポソームは自己閉鎖型単層または多層小胞粒子であり、ラメラは脂質二重層を含み、封入された内腔は水相を含む。ナノ粒子形成のためにリポソームを使用するための必要条件は、必要に応じて混合物中の脂質が適用された水性環境中でラメラ（二重層）相を形成することができることである。

【0517】

いくつかの実施形態では、リポソームは、水性コア（本明細書では水性内腔とも呼ばれる）を取り囲む単層または多層リン脂質二重層を含む。それらは、極性頭部（親水性）基および非極性尾部（疎水性）基を有する材料から調製され得る。いくつかの実施形態では、核酸の送達のために設計されたリポソームを製剤化するのに使用されるカチオン性脂質は、本質的に両親媒性であり、グリセロールを介して炭化水素鎖またはコレステロール誘導体に連結された正電荷（カチオン性）アミン頭部基からなる。

【0518】

いくつかの実施形態では、リポプレックスは、カチオン性リポソームとＲＮＡとの静電相互作用の際に形成される多層リポソームベースの製剤である。いくつかの実施形態では、形成されたリポプレックスは、リポソーム構造からコンパクトなＲＮＡ－リポプレックスへの変換に起因して生じる分子の異なる内部配置を有する。いくつかの実施形態では、これらの製剤は、ＲＮＡの封入が不十分であり、ＲＮＡの捕捉が不完全であることを特徴とする。

【0519】

いくつかの実施形態では、ＬＰＸ粒子は、両親媒性脂質、特にカチオン性またはカチオン性のイオン化可能な両親媒性脂質、および本明細書に記載のＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、正に帯電したリポソーム（１つ以上の両親媒性脂質、特にカチオン性またはカチオン性のイオン化可能な両親媒性脂質から作製される）と負に帯電した核酸（特にｍＲＮＡ）との間の静電相互作用は、核酸リポプレックス粒子の複合体化および自発的形成をもたらす。正に荷帯電したリポソームは、一般に、ＤＯＴＭＡおよび／またはＤＯＤＭＡなどのカチオン性またはカチオン性のイオン化可能な両親媒性脂質、ならびにＤＯＰＥなどのさらなる脂質を使用して合成され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）リポプレックス粒子はナノ粒子である。

【0520】

一般に、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、水相中のＲＮＡと、エタノールなどの有機溶媒を含む相中の脂質との直接混合から得ることができる。その場合、水中でラメラ（二重層）相を形成しない脂質または脂質混合物を粒子形成に使用することができる。

【0521】

いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性／イオン化可能脂質ならびにヘルパー脂質、例えばリン脂質、コレステロールおよび／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ ＬＮＰにおいて、ｍＲＮＡは、ＬＮＰの中心コアを占めるイオン化可能な脂質によって結合される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、リン脂質と共にＬＮＰの表面を形成する。いくつかの実施形態では、表面は二重層を含む。いくつかの実施形態では、荷電形態および非荷電形態のコレステロールおよびイオン化可能な脂質は、ＬＮＰ全体に分布し得る。

【0522】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、本明細書に記載の粒子と非共有結合的に会合し得る。実施形態では、ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）は、粒子の外面に付着していてもよく（表面ＲＮＡ（特に表面ｍＲＮＡ））、および／または粒子に含まれていてもよい（封入されたＲＮＡ（特に封入されたｍＲＮＡ））。

【0523】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の粒子（例えば、ＬＮＰおよびＬＰＸ）は、約１０～約２０００ｎｍの範囲、例えば少なくとも約１５ｎｍ（例えば、少なくとも約２０ｎｍ、少なくとも約２５ｎｍ、少なくとも約３０ｎｍ、少なくとも約３５ｎｍ、少なくとも約４０ｎｍ、少なくとも約４５ｎｍ、少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約５５ｎｍ、少なくとも約６０ｎｍ、少なくとも約６５ｎｍ、少なくとも約７０ｎｍ、少なくとも約７５ｎｍ、少なくとも約８０ｎｍ、少なくとも約８５ｎｍ、少なくとも約９０ｎｍ、少なくとも約９５ｎｍ、もしくは少なくとも約１００ｎｍ）および／または最大でも１９００ｎｍ（例えば、最大でも約１９００ｎｍ、最大でも約１８００ｎｍ、最大でも約１７００ｎｍ、最大でも約１６００ｎｍ、最大でも約１５００ｎｍ、最大でも約１４００ｎｍ、最大でも約１３００ｎｍ、最大でも約１２００ｎｍ、最大でも約１１００ｎｍ、最大でも約１０００ｎｍ、最大でも約９５０ｎｍ、最大でも約９００ｎｍ、最大でも約８５０ｎｍ、最大でも約８００ｎｍ、最大でも約７５０ｎｍ、最大でも約７００ｎｍ、最大でも約６５０ｎｍ、最大でも約６００ｎｍ、最大でも約５５０ｎｍ、もしくは最大でも約５００ｎｍ）、例えば約２０～約１５００ｎｍ、例えば約３０～約１２００ｎｍ、約４０～約１１００ｎｍ、約５０～約１０００ｎｍ、約６０～約９００ｎｍ、約７０～８００ｎｍ、約８０～７００ｎｍ、約９０～６００ｎｍ、または約５０～５００ｎｍまたは約１００～５００ｎｍの範囲、例えば１０～１０００ｎｍ、１５～５００ｎｍ、２０～４５０ｎｍ、２５～４００ｎｍ、３０～３５０ｎｍ、４０～３００ｎｍ、５０～２５０ｎｍ、６０～２００ｎｍ、または７０～１５０ｎｍの範囲のサイズ（直径など）を有する。

【0524】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の粒子（例えば、ＬＮＰおよびＬＰＸ）は、いくつかの実施形態では、約５０ｎｍ～約１０００ｎｍ、約５０ｎｍ～約８００ｎｍ、約５０ｎｍ～約７００ｎｍ、約５０ｎｍ～約６００ｎｍ、約５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約５０ｎｍ～約４５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約４００ｎｍ、約５０ｎｍ～約３５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約３００ｎｍ、約５０ｎｍ～約２５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約２００ｎｍ、約１００ｎｍ～約１０００ｎｍ、約１００ｎｍ～約８００ｎｍ、約１００ｎｍ～約７００ｎｍ、約１００ｎｍ～約６００ｎｍ、約１００ｎｍ～約５００ｎｍ、約１００ｎｍ～約４５０ｎｍ、約１００ｎｍ～約４００ｎｍ、約１００ｎｍ～約３５０ｎｍ、約１００ｎｍ～約３００ｎｍ、約１００ｎｍ～約２５０ｎｍ、約１００ｎｍ～約２００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約１０００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約８００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約７００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約６００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約４５０ｎｍ、約１５０ｎｍ～約４００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約３５０ｎｍ、約１５０ｎｍ～約３００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約２５０ｎｍ、約１５０ｎｍ～約２００ｎｍ、約２００ｎｍ～約１０００ｎｍ、約２００ｎｍ～約８００ｎｍ、約２００ｎｍ～約７００ｎｍ、約２００ｎｍ～約６００ｎｍ、約２００ｎｍ～約５００ｎｍ、約２００ｎｍ～約４５０ｎｍ、約２００ｎｍ～約４００ｎｍ、約２００ｎｍ～約３５０ｎｍ、約２００ｎｍ～約３００ｎｍ、または約２００ｎｍ～約２５０ｎｍの範囲の平均直径を有する。

【0525】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の粒子はナノ粒子である。「ナノ粒子」という用語は、本明細書に記載の核酸（特にｍＲＮＡ）および少なくとも１つのカチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質を含むナノサイズ粒子に関し、粒子の３つの外形寸法は全てナノスケール、すなわち少なくとも約１ｎｍおよび約１０００ｎｍ未満である。好ましくは、粒子のサイズはその直径である。

【0526】

本明細書に記載の核酸粒子（特にｍＲＮＡ粒子）は、約０．５未満、約０．４未満、約０．３未満、約０．２未満、約０．１未満、または約０．０５未満の多分散指数（ＰＤＩ）を示し得る。例として、核酸粒子は、約０．０１～約０．４または約０．１～約０．３の範囲の多分散指数を示し得る。

【0527】

Ｎ／Ｐ比は、脂質中の窒素基対核酸中のリン酸基の数の比率を与える。窒素原子（ｐＨに依存する）は通常正に帯電し、リン酸基は負に帯電するので、これは電荷比と相関する。電荷平衡が存在する場合、Ｎ／Ｐ比はｐＨに依存する。正に帯電したナノ粒子はトランスフェクションに有利であると考えられているので、脂質製剤は、４より大きく１２までのＮ／Ｐ比で形成されることが多い。その場合、ＲＮＡはナノ粒子に完全に結合していると見なされる。

【0528】

本明細書に記載の核酸粒子（特にｍＲＮＡ粒子などのＲＮＡ粒子）は、少なくとも１つのカチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質からコロイドを得る工程、およびコロイドを核酸と混合して核酸粒子を得る工程を含み得る広範囲の方法を使用して調製することができる。

【0529】

本明細書で使用される「コロイド」という用語は、分散した粒子が沈降しない均一な混合物の一種に関する。混合物中の不溶性粒子は微視的であり、粒径は１～１０００ナノメートルである。混合物は、コロイドまたはコロイド懸濁液と呼ばれ得る。「コロイド」という用語は、混合物中の粒子のみを指し、懸濁液全体を指すのではない場合がある。

【0530】

少なくとも１つのカチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質を含むコロイドの調製のために、リポソーム小胞を調製するために従来使用され、適切に適合された方法が本明細書で適用可能である。リポソーム小胞を調製するために最も一般的に使用される方法は、以下の基本的段階を共有する：（ｉ）有機溶媒中での脂質溶解、（ｉｉ）得られた溶液の乾燥、および（ｉｉｉ）乾燥した脂質の水和（様々な水性媒体を使用して）。

【0531】

膜水和法では、脂質を最初に適切な有機溶媒に溶解し、乾燥させてフラスコの底部に薄膜を得る。得られた脂質膜を、適切な水性媒体を用いて水和して、リポソーム分散液を得る。さらに、さらなる小型化工程が含まれてもよい。

【0532】

逆相蒸発は、水相と脂質を含有する有機相との間の油中水型エマルジョンの形成を含む、リポソーム小胞を調製するための膜水和の代替方法である。この混合物の短時間の超音波処理は、系の均質化のために必要である。減圧下での有機相の除去により、その後リポソーム懸濁液に変わる乳白色のゲルが得られる。

【0533】

「エタノール注入技術」という用語は、脂質を含むエタノール溶液を、針を通して水溶液に迅速に注入するプロセスを指す。この作用は、溶液全体に脂質を分散させ、脂質構造形成、例えばリポソーム形成などの脂質小胞形成を促進する。一般に、本明細書に記載のＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）リポプレックス粒子は、コロイド状リポソーム分散液にＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）を加えることによって得ることができる。エタノール注入技術を使用して、そのようなコロイドリポソーム分散液は、いくつかの実施形態では、以下のように形成される：ＤＯＴＭＡおよび／またはＤＯＤＭＡのようなカチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質などの脂質ならびにさらなる脂質を含むエタノール溶液を撹拌下で水溶液に注入する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）リポプレックス粒子は、押出工程なしで得ることができる。

【0534】

「押し出す」または「押出」という用語は、固定された断面プロファイルを有する粒子の作製を指す。特に、これは粒子の小型化を指し、それによって粒子は、規定された細孔を有するフィルタを通過させられる。

【0535】

有機溶媒を含まない特性を有する他の方法もまた、コロイドを調製するために本開示に従って使用され得る。

【0536】

いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、４つの成分：イオン化可能なカチオン性脂質、リン脂質などの中性脂質、コレステロールなどのステロイド、およびポリマーコンジュゲート脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、エタノールに溶解した脂質を水性緩衝液中でＲＮＡと迅速に混合することによって調製され得る。本明細書に記載のＲＮＡ粒子は、ＰＥＧ脂質などのポリマーコンジュゲート脂質を含み得るが、本明細書では、ＰＥＧ脂質などのポリマーコンジュゲート脂質を含まないＲＮＡ粒子も提供される。

【0537】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡと少なくとも１つのカチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質とを含むＬＮＰは、（ａ）水および緩衝系を含有するＲＮＡ溶液を調製する工程；（ｂ）カチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質、および存在する場合は、１つ以上のさらなる脂質を含むエタノール溶液を調製する工程；ならびに（ｃ）（ａ）で調製したＲＮＡ溶液を（ｂ）で調製したエタノール溶液と混合し、それによってＬＮＰを含む製剤を調製する工程によって調製される。工程（ｃ）の後に、接線流濾過などの希釈および濾過から選択される１つ以上の工程を行うことができる。

【0538】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡと少なくとも１つのカチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質とを含むＬＮＰは、（ａ’）カチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質、および存在する場合は、水相中の１つ以上のさらなる脂質のリポソームまたはコロイド調製物を調製する工程；（ｂ’）水および緩衝系を含有するＲＮＡ溶液を調製する工程；ならびに（ｃ’）（ａ’）で調製したリポソームまたはコロイド調製物を（ｂ’）で調製したＲＮＡ溶液と混合する工程によって調製される。工程（ｃ’）の後に、接線流濾過などの希釈および濾過から選択される１つ以上の工程を行うことができる。

【0539】

本開示は、ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）と、ＲＮＡと会合してＲＮＡ粒子を形成する少なくとも１つのカチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質とを含む粒子、ならびにそのような粒子を含む組成物を記載する。ＲＮＡ粒子は、非共有結合相互作用によって様々な形態で粒子に複合体化されるＲＮＡを含み得る。本明細書に記載の粒子は、ウイルス粒子、特に感染性ウイルス粒子ではない、すなわち、それらは細胞にウイルス感染することができない。

【0540】

適切なカチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質は、核酸粒子を形成するものであり、「粒子形成成分」または「粒子形成剤」という用語に含まれる。「粒子形成成分」または「粒子形成剤」という用語は、核酸と会合して核酸粒子を形成する任意の成分に関する。そのような成分は、核酸粒子の一部であり得る任意の成分を含む。

【0541】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ粒子（特にｍＲＮＡ粒子）は複数の種類のＲＮＡ分子を含み、ここで、ＲＮＡ分子の分子パラメータは、モル質量または分子構造、キャッピング、コード領域もしくは他の特徴などの基本的な構造要素に関するように、互いに類似し得るかまたは異なり得る。
粒子製剤では、各ＲＮＡ種を個々の粒子製剤として別々に製剤化することが可能である。その場合、個々の粒子製剤はそれぞれ１つのＲＮＡ種を含む。個々の粒子製剤は、別個の実体として、例えば別個の容器中に存在し得る。そのような製剤は、粒子形成剤と一緒に各ＲＮＡ種を別々に（典型的にはそれぞれＲＮＡ含有溶液の形態で）提供し、それにより粒子の形成を可能にすることによって得ることができる。それぞれの粒子は、粒子が形成されるときに提供される特定のＲＮＡ種のみを含む（個々の粒子製剤）。いくつかの実施形態では、医薬組成物などの組成物は、複数の個々の粒子製剤を含む。それぞれの医薬組成物は、混合粒子製剤と呼ばれる。本発明による混合粒子製剤は、個々の粒子製剤を別々に形成し、続いて個々の粒子製剤を混合する工程によって得ることができる。混合する工程により、ＲＮＡ含有粒子の混合集団を含む製剤を得ることができる。個々の粒子集団は、個々の粒子製剤の混合集団を含む１つの容器に一緒に存在し得る。あるいは、医薬組成物の全てのＲＮＡ種を組み合わせた粒子製剤として一緒に製剤化することが可能である。そのような製剤は、粒子形成剤と共に全てのＲＮＡ種の組合せ製剤（典型的には組合せ溶液）を提供し、それにより粒子の形成を可能にすることによって得ることができる。混合粒子製剤とは対照的に、組合せ粒子製剤は、典型的には複数のＲＮＡ種を含む粒子を含む。組合せ粒子組成物では、異なるＲＮＡ種が、典型的には単一の粒子中に一緒に存在する。

【0542】

ポリマー
ポリマーは、それらの高度な化学的柔軟性を考慮して、ナノ粒子ベースの送達のために一般的に使用される材料である。典型的には、カチオン性ポリマーは、負に帯電した核酸をナノ粒子に静電的に凝縮するために使用される。これらの正に帯電した基は、多くの場合、５．５～７．５のｐＨ範囲でプロトン化の状態を変化させるアミンからなり、エンドソーム破裂をもたらすイオンの不均衡につながると考えられる。ポリ－Ｌ－リジン、ポリアミドアミン、プロタミンおよびポリエチレンイミンなどのポリマー、ならびにキトサンなどの天然に存在するポリマーは全て核酸送達に適用されており、本明細書におけるカチオン性ポリマーとして適している。さらに、一部の研究者は、特に核酸送達のためのポリマーを合成した。ポリ（β－アミノエステル）は、特に、その合成の容易さと生分解性のために核酸送達において広く使用されている。そのような合成ポリマーは、本明細書におけるカチオン性ポリマーとしても適している。

【0543】

本明細書で使用される「ポリマー」は、その通常の意味、すなわち、共有結合によって連結された１つ以上の繰り返し単位（モノマー）を含む分子構造体という意味を与えられる。繰り返し単位は、全て同一であってもよく、または場合によっては、ポリマー内に２種類以上の繰り返し単位が存在してもよい。場合によっては、ポリマーは生物学的に誘導される、すなわち、タンパク質などのバイオポリマーである。場合によっては、さらなる部分、例えば標的化部分もポリマー中に存在し得る。

【0544】

２種類以上の繰り返し単位がポリマー内に存在する場合、そのポリマーは「コポリマー」であると言われる。本明細書で使用されるポリマーはコポリマーであり得ることが理解されるべきである。コポリマーを形成する繰り返し単位は、任意の方法で配置され得る。例えば、繰り返し単位は、ランダムな順序で、交互の順序で、または「ブロック」コポリマーとして、すなわちそれぞれが第１の繰り返し単位（例えば第１のブロック）を含む１つ以上の領域、およびそれぞれが第２の繰り返し単位（例えば第２のブロック）を含む１つ以上の領域、等を含むように配置され得る。ブロックコポリマーは、２つ（ジブロックコポリマー）、３つ（トリブロックコポリマー）、またはそれ以上の数の別個のブロックを有することができる。

【0545】

特定の実施形態では、ポリマーは生体適合性である。生体適合性ポリマーは、典型的には中程度の濃度で有意な細胞死をもたらさないポリマーである。特定の実施形態では、生体適合性ポリマーは生分解性であり、すなわち、ポリマーは、体内などの生理学的環境内で、化学的および／または生物学的に分解することができる。

【0546】

特定の実施形態では、ポリマーは、プロタミンまたはポリアルキレンイミンであり得る。

【0547】

「プロタミン」という用語は、アルギニンに富み、（魚のような）様々な動物の精子細胞中で体細胞ヒストンの代わりに特にＤＮＡと会合して見出される、比較的低分子量の様々な強塩基性タンパク質のいずれかを指す。特に、「プロタミン」という用語は、強塩基性で、水に可溶性であり、熱によって凝固せず、加水分解時に主にアルギニンを生成する、魚の精子中に見出されるタンパク質を指す。精製形態では、それらは、インスリンの長時間作用型製剤において、ヘパリンの抗凝固作用を中和するために使用される。

【0548】

本開示によれば、本明細書で使用される「プロタミン」という用語は、天然源または生物源から得られるまたはそれに由来する任意のプロタミンアミノ酸配列およびその断片、および当該アミノ酸配列またはその断片の多量体形態、ならびに人工の、特定の目的のために特別に設計された、天然源または生物源から単離することができない（合成された）ポリペプチドを含むことが意図されている。

【0549】

いくつかの実施形態では、ポリアルキレンイミンは、ポリエチレンイミンおよび／またはポリプロピレンイミン、好ましくはポリエチレンイミンを含む。好ましいポリアルキレンイミンはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。ＰＥＩの平均分子量は、好ましくは０．７５×１０^２～１０^７Ｄａ、好ましくは１０００～１０^５Ｄａ、より好ましくは１００００～４００００Ｄａ、より好ましくは１５０００～３００００Ｄａ、さらにより好ましくは２００００～２５０００Ｄａである。

【0550】

本開示によれば、直鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などの直鎖状ポリアルキレンイミンが好ましい。

【0551】

本明細書での使用が企図されるカチオン性ポリマー（ポリカチオン性ポリマーを含む）には、核酸に静電的に結合することができる任意のカチオン性ポリマーが含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書での使用が企図されるカチオン性ポリマーは、例えば核酸と複合体を形成することによって、または核酸が封入もしくはカプセル化されている小胞を形成することによって、核酸が会合することができる任意のカチオン性ポリマーを含む。

【0552】

本明細書に記載の粒子はまた、カチオン性ポリマー以外のポリマー、すなわち非カチオン性ポリマーおよび／またはアニオン性ポリマーを含み得る。集合的に、アニオン性および中性ポリマーは、本明細書では非カチオン性ポリマーと呼ばれる。

【0553】

脂質
「脂質」および「脂質様物質」という用語は、本明細書では、１つ以上の疎水性部分または基、および任意で１つ以上の親水性部分または基も含む分子として広く定義される。疎水性部分および親水性部分を含む分子はまた、しばしば両親媒性物質として示される。脂質は、通常、水に不溶性または難溶性であるが、多くの有機溶媒に可溶性である。水性環境では、両親媒性の性質は、分子が組織化された構造体および様々な相に自己集合することを可能にする。それらの相の１つは、それらが水性環境で小胞、多層／単層リポソーム、または膜中に存在する場合、脂質二重層からなる。疎水性は、長鎖飽和および不飽和脂肪族炭化水素基、ならびに１つ以上の芳香族、脂環式、または複素環式基で置換されたそのような基を含むがこれらに限定されない無極性基を含むことによって付与され得る。親水性基は、極性基および／または荷電基を含み得、炭水化物、リン酸基、カルボン酸基、硫酸基、アミノ基、スルフヒドリル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、および他の同様の基を含む。

【0554】

本明細書で使用される場合、「疎水性」という用語は、水溶液中で実質的に非混和性または不溶性である任意の分子、部分または基を指す。疎水性基という用語は、少なくとも６個の炭素原子を有する炭化水素を含む。疎水性基は、水溶液中で実質的に非混和性または不溶性であるという条件を満たす限り、官能基（例えば、エーテル、エステル、ハロゲン化物など）ならびに炭素および水素以外の原子を有することができる。

【0555】

「炭化水素」という用語は、本明細書で定義されるアルキル、アルケニル、またはアルキニルを含む。アルキル、アルケニルまたはアルキニル中の水素の１つ以上は、他の原子、例えばハロゲン、酸素または硫黄で置換されてもよいことを理解されたい。特に明記しない限り、炭化水素基はまた、炭化水素の全体的な極性が比較的無極性のままである限り、環状（アルキル、アルケニルもしくはアルキニル）基またはアリール基を含むことができる。

【0556】

「アルキル」という用語は、６～３０個、典型的には６～２０個、しばしば６～１８個の炭素原子を有し得る飽和直鎖または分岐一価炭化水素部分を指す。例示的な非極性アルキル基としては、ヘキシル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシルなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0557】

「アルケニル」という用語は、総炭素原子が６～３０個、典型的には６～２０個、しばしば６～１８個であり得る、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合を有する直鎖または分岐一価炭化水素部分を指す。

【0558】

「アルキニル」という用語は、総炭素原子が６～３０個、典型的には６～２０個、しばしば６～１８個であり得る、少なくとも１つの炭素－炭素三重結合を有する直鎖または分岐一価炭化水素部分を指す。アルキニル基は、１つ以上の炭素－炭素二重結合を有していてもよい。

【0559】

本明細書で使用される場合、「両親媒性」という用語は、極性部分と非極性部分の両方を有する分子を指す。多くの場合、両親媒性化合物は、長い疎水性尾部に結合した極性頭部を有する。いくつかの実施形態では、極性部分は水に可溶性であるが、非極性部分は水に不溶性である。さらに、極性部分は、形式正電荷または形式負電荷のいずれを有していてもよい。あるいは、極性部分は、形式正電荷と形式負電荷の両方を有してもよく、双性イオンまたは内部塩であってもよい。本開示の目的のために、両親媒性化合物は、１つ以上の天然または非天然脂質および脂質様化合物であり得るが、これらに限定されない。

【0560】

「脂質様物質」、「脂質様化合物」または「脂質様分子」という用語は、構造的および／または機能的に脂質に関連するが、厳密な意味で脂質とは見なされ得ない物質、特に両親媒性物質に関する。例えば、この用語は、水性環境で小胞、多層／単層リポソーム、または膜中に存在する場合に両親媒性層を形成することができる化合物を含み、界面活性剤、または親水性部分と疎水性部分の両方を有する合成化合物を含む。一般的に言えば、この用語は、脂質の構造と類似していても類似していなくてもよい、異なる構造組織を有する親水性部分と疎水性部分とを含む分子を含む。細胞膜への自発的な組込みが可能な脂質様化合物の例としては、合成機能－スペーサ－脂質構築物（ＦＳＬ）、合成機能－スペーサ－ステロール構築物（ＦＳＳ）、および人工両親媒性分子などの機能性脂質構築物が挙げられる。脂質は一般に円筒形である。２つのアルキル鎖が占める面積は、極性頭部基が占める面積と同様である。脂質はモノマーとしての溶解度が低く、水不溶性の平面二重層に凝集する傾向がある。従来の界面活性剤モノマーは、一般に円錐形である。親水性頭部基は、直鎖アルキル鎖よりも多くの分子空間を占める傾向がある。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、水溶性である球形または楕円形のミセルに凝集する傾向がある。脂質はまた、界面活性剤と同じ一般構造－極性親水性頭部基および非極性疎水性尾部－を有するが、脂質は、モノマーの形状、溶液中で形成される凝集体の種類、および凝集に必要な濃度範囲において界面活性剤とは異なる。本明細書で使用される場合、「脂質」という用語は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、脂質および脂質様物質の両方を包含すると解釈されるべきである。

【0561】

一般に、脂質は、８つのカテゴリ：脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、ポリケチド（ケトアシルサブユニットの縮合に由来する）、ステロール脂質およびプレノール脂質（イソプレンサブユニットの縮合に由来する）に分けられ得る。「脂質」という用語は時に脂肪の同義語として使用されるが、脂肪はトリグリセリドと呼ばれる脂質のサブグループである。脂質はまた、脂肪酸およびその誘導体（トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、およびリン脂質を含む）などの分子、ならびにステロイド、すなわち、コレステロールまたはその誘導体などのステロール含有代謝物を包含する。コレステロール誘導体の例としては、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル－２’－ヒドロキシエチルエーテル、コレステリル－４’－ヒドロキシブチルエーテル、トコフェロールおよびそれらの誘導体、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。

【0562】

脂肪酸、または脂肪酸残基は、末端がカルボン酸基である炭化水素鎖からなる多様な分子の群である；この配置は、分子に、極性の親水性末端と水に不溶性の非極性の疎水性末端とを付与する。典型的には４～２４炭素長である炭素鎖は、飽和であっても不飽和であってもよく、酸素、ハロゲン、窒素、および硫黄を含む官能基に結合していてもよい。脂肪酸が二重結合を含む場合、シスまたはトランス幾何異性のいずれかの可能性があり、これは分子の立体配置に有意に影響を及ぼす。シス二重結合は脂肪酸鎖を屈曲させ、これは、鎖中のより多くの二重結合と組み合わされる影響である。脂肪酸カテゴリにおける他の主要な脂質クラスは、脂肪酸エステルおよび脂肪酸アミドである。

【0563】

グリセロ脂質は、一置換、二置換、および三置換グリセロールから構成され、最もよく知られているのは、トリグリセリドと呼ばれるグリセロールの脂肪酸トリエステルである。「トリアシルグリセロール」という語は、「トリグリセリド」と同義に使用されることがある。これらの化合物では、グリセロールの３つのヒドロキシル基はそれぞれ、典型的には異なる脂肪酸によってエステル化されている。グリセロ脂質のさらなるサブクラスは、グリコシド結合を介してグリセロールに結合した１つ以上の糖残基の存在を特徴とするグリコシルグリセロールによって代表される。

【0564】

グリセロリン脂質は、エステル結合によって２つの脂肪酸由来の「尾部」に、およびリン酸エステル結合によって１つの「頭部」基に結合したグリセロールコアを含む両親媒性分子（疎水性領域と親水性領域の両方を含む）である。通常リン脂質と呼ばれる（スフィンゴミエリンもリン脂質として分類されるが）グリセロリン脂質の例は、ホスファチジルコリン（ＰＣ、ＧＰＣｈｏまたはレシチンとしても公知）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥまたはＧＰＥｔｎ）およびホスファチジルセリン（ＰＳまたはＧＰＳｅｒ）である。

【0565】

スフィンゴ脂質は、スフィンゴイド塩基骨格という共通の構造的特徴を共有する化合物の複雑なファミリーである。哺乳動物における主要なスフィンゴイド塩基は、一般にスフィンゴシンと呼ばれる。セラミド（Ｎ－アシル－スフィンゴイド塩基）は、アミド結合脂肪酸を有するスフィンゴイド塩基誘導体の主要なサブクラスである。脂肪酸は、典型的には、１６～２６個の炭素原子の鎖長を有する飽和または一不飽和である。哺乳動物の主要なスフィンゴリン脂質はスフィンゴミエリン（セラミドホスホコリン）であるが、昆虫は主にセラミドホスホエタノールアミンを含有し、真菌はフィトセラミドホスホイノシトールおよびマンノース含有頭部基を有する。スフィンゴ糖脂質は、グリコシド結合を介してスフィンゴイド塩基に結合した１つ以上の糖残基から構成される分子の多様なファミリーである。これらの例は、セレブロシドおよびガングリオシドなどの単純なおよび複雑なスフィンゴ糖脂質である。

【0566】

コレステロールおよびその誘導体、またはトコフェロールおよびその誘導体などのステロール脂質は、グリセロリン脂質およびスフィンゴミエリンと共に膜脂質の重要な成分である。

【0567】

サッカロ脂質は、脂肪酸が糖骨格に直接連結され、膜二重層と適合性である構造を形成する化合物を表す。サッカロ脂質では、単糖が、グリセロ脂質およびグリセロリン脂質に存在するグリセロール骨格の代わりになる。最もよく知られているサッカロ脂質は、グラム陰性菌のリポ多糖のリピドＡ成分のアシル化グルコサミン前駆体である。典型的なリピドＡ分子は、７本もの脂肪アシル鎖で誘導体化されている、グルコサミンの二糖である。大腸菌での増殖に必要な最小限のリポ多糖は、２つの３－デオキシ－Ｄ－マンノ－オクツロソン酸（Ｋｄｏ）残基でグリコシル化されたグルコサミンのヘキサアシル化二糖である、Ｋｄｏ２－リピドＡである。

【0568】

ポリケチドは、古典的な酵素、ならびに脂肪酸シンターゼと機構的特徴を共有する反復およびマルチモジュール酵素によるアセチルおよびプロピオニルサブユニットの重合によって合成される。それらは、動物、植物、細菌、真菌および海洋源からの多数の二次代謝物および天然産物を含み、大きな構造的多様性を有する。多くのポリケチドは、その骨格がグリコシル化、メチル化、ヒドロキシル化、酸化、または他のプロセスによってさらに修飾されることが多い環状分子である。

【0569】

本開示によれば、脂質および脂質様物質は、カチオン性、アニオン性または中性であり得る。中性脂質または脂質様物質は、選択されたｐＨで非荷電または中性の双性イオン形態で存在する。

【0570】

カチオン／カチオン性イオン化可能脂質
本明細書に記載のＲＮＡなどの核酸粒子は、粒子形成剤として少なくとも１つのカチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質を含む。本明細書での使用が企図されるカチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質には、核酸に静電的に結合することができる任意のカチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質（脂質様材料を含む）が含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書での使用が企図されるカチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質は、例えば核酸と複合体を形成することによって、または核酸が封入もしくはカプセル化された小胞を形成することによって、核酸と会合することができる。

【0571】

本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質」は、正味の正電荷を有する脂質または脂質様物質を指す。カチオン性脂質は、静電相互作用によって負に帯電した核酸に結合する。一般に、カチオン性脂質は、ステロール、アシル鎖、ジアシルまたはそれ以上のアシル鎖などの親油性部分を有し、脂質の頭部基は、典型的には正電荷を担持する。

【0572】

いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、特定のｐＨ、特に酸性ｐＨでのみ正味の正電荷を有するが、好ましくは正味の正電荷を有さず、好ましくは電荷を有さず、すなわち、生理学的ｐＨなどの異なる、好ましくはより高いｐＨでは中性である。このイオン化可能な挙動は、生理学的ｐＨでカチオン性のままである粒子と比較して、エンドソーム脱出を助け、毒性を低減することによって有効性を高めると考えられる。

【0573】

本明細書で使用される場合、「カチオン性イオン化可能脂質」は、正味の正電荷を有するかまたは中性である、すなわち永久的にカチオン性ではない脂質または脂質様物質を指す。したがって、カチオン性イオン化可能脂質が溶解している組成物のｐＨに依存して、カチオン性イオン化性可能脂質は正に帯電しているかまたは中性のいずれかである。本開示の目的のために、カチオン性イオン化可能脂質は、状況によって矛盾しない限り、「カチオン性脂質」という用語に包含される。

【0574】

いくつかの実施形態では、カチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質は、例えば生理学的条件下で、正に帯電しているかまたはプロトン化され得る少なくとも１つの窒素原子（Ｎ）を含む頭部基を含む。

【0575】

カチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質の例としては、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシプロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、３－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）；１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）；１，２－ジアシルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン；１，２－ジアルキルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン；ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、２，３－ジ（テトラデコキシ）プロピル－（２－ヒドロキシエチル）ジメチルアザニウム（ＤＭＲＩＥ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＭＥＰＣ）、ｌ，２－ジミリストイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、１，２－ジオレイルオキシプロピル－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、および２，３－ジオレオイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－プロパナミウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、３－ジメチルアミノ－２－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ）－１－（ｃｉｓ，ｃｉｓ－９，１２－オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２－［５’－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３’－オキサペントキシ）－３－ジメチル－１－（シス、シス－９’，１２’－オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、２，３－ジリノレオイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロピルアミン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ）、１，２－ジリノレオイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＣＤＡＰ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（テトラデシルオキシ）－１－プロパナミニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、（±）－Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（ｃｉｓ－９－テトラデセニルオキシ）－１－プロパナミニウムブロミド（ＧＡＰ－ＤＭＯＲＩＥ）、（±）－Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（ドデシルオキシ）－１－プロパナミニウムブロミド（ＧＡＰ－ＤＬＲＩＥ）、（±）－Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（テトラデシルオキシ）－１－プロパナミニウムブロミド（ＧＡＰ－ＤＭＲＩＥ）、Ｎ－（２－アミノエチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（テトラデシルオキシ）－１－プロパナミニウムブロミド（βＡＥ－ＤＭＲＩＥ）、Ｎ－（４－カルボキシベンジル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（オレオイルオキシ）プロパン－１－アミニウム（ＤＯＢＡＱ）、２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジミリストイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＤＡＰ）、１，２－ジパルミトイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＤＡＰ）、Ｎ１－［２－（（１Ｓ）－１－［（３－アミノプロピル）アミノ］－４－［ジ（３－アミノ－プロピル）アミノ］ブチルカルボキサミド）エチル］－３，４－ジ［オレイルオキシ］－ベンズアミド（ＭＶＬ５）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、２，３－ビス（ドデシルオキシ）－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－１－アモニウムブロミド（ＤＬＲＩＥ）、Ｎ－（２－アミノエチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（テトラデシルオキシ）プロパン－１－アミニウムブロミド（ＤＭＯＲＩＥ）、ジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）８，８’－（（（（２（ジメチルアミノ）エチル）チオ）カルボニル）アザンジイル）ジオクタノエート（ＡＴＸ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（ドデシルオキシ）プロパン－１－アミン（ＤＬＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（テトラデシルオキシ）プロパン－１－アミン（ＤＭＤＭＡ）、ジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）－９－（（４－（ジメチルアミノブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）、Ｎ－ドデシル－３－（（２－ドデシルカルバモイル－エチル）－｛２－［（２－ドデシルカルバモイル－エチル）－２－｛（２－ドデシルカルバモイル－エチル）－［２－（２－ドデシルカルバモイル－エチルアミノ）エチル］－アミノ｝－エチルアミノ）プロピオンアミド（リピドイド９８Ｎ_１２－５）、１－［２－［ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ］エチル－［２－［４－［２－［ビス（２ヒドロキシドデシル）アミノ］エチル］ピペラジン－１－イル］エチル］アミノ］ドデカン－２－オール（リピドイドＣ１２－２００）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0576】

いくつかの実施形態では、カチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質はＤＯＴＭＡである。いくつかの実施形態では、カチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質はＤＯＤＭＡである。

【0577】

ＤＯＴＭＡは、第四級アミン頭部基を有するカチオン性脂質である。ＤＯＴＭＡの構造は、以下のように表され得る：

【0578】

【化6】

【0579】

ＤＯＤＭＡは、第三級アミン頭部基を有するイオン化可能なカチオン性脂質である。ＤＯＤＭＡの構造は、以下のように表され得る：

【0580】

【化7】

【0581】

いくつかの実施形態では、カチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質は、粒子中に存在する総脂質の約１０モル％～約９５モル％、約２０モル％～約９５モル％、約２０モル％～約９０モル％、約３０モル％～約９０モル％、約４０モル％～約９０モル％、または約４０モル％～約８０モル％を構成し得る。

【0582】

さらなる脂質
本明細書に記載の粒子はまた、カチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質（本明細書では集合的にカチオン性脂質とも呼ばれる）以外の脂質（脂質様物質を含む）、すなわち非カチオン性脂質（非カチオン性または非カチオン性イオン化可能脂質または脂質様物質を含む）を含み得る。集合的に、アニオン性および中性脂質または脂質様物質は、本明細書では非カチオン性脂質と呼ばれる。カチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質に加えて、コレステロールおよび脂質などの他の疎水性部分を添加することによって核酸粒子の製剤を最適化することにより、粒子の安定性および核酸送達の有効性を高め得る。

【0583】

１つ以上のさらなる脂質は、核酸粒子の全体的な電荷に影響を及ぼしても及ぼさなくてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上のさらなる脂質は、非カチオン性脂質または脂質様物質である。非カチオン性脂質は、例えば、１つ以上のアニオン性脂質および／または中性脂質を含み得る。本明細書で使用される場合、「アニオン性脂質」は、選択されたｐＨで負に帯電している任意の脂質を指す。本明細書で使用される場合、「中性脂質」は、選択されたｐＨで非荷電または中性の双性イオン形態で存在するいくつかの脂質種のいずれかを指す。

【0584】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸粒子（特にｍＲＮＡを含む粒子）は、カチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質および１つ以上のさらなる脂質を含む。

【0585】

理論に拘束されることを望むものではないが、１つ以上のさらなる脂質の量と比較したカチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質の量は、核酸の電荷、粒径、安定性、組織選択性、および生物活性などの重要な核酸粒子特性に影響を及ぼし得る。したがって、いくつかの実施形態では、カチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質対１つ以上のさらなる脂質のモル比は、約１０：０～約１：９、約４：１～約１：２、約４：１～約１：１、約３：１～約１：１、または約３：１～約２：１である。

【0586】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸粒子（特にｍＲＮＡを含む粒子）に含まれる１つ以上のさらなる脂質は、中性脂質、ステロイド、およびそれらの組合せの１つ以上を含む。

【0587】

いくつかの実施形態では、１つ以上のさらなる脂質は、リン脂質である中性脂質を含む。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンおよびスフィンゴミエリンからなる群より選択される。使用することができる特定のリン脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンまたはスフィンゴミエリンが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなリン脂質としては、特に、ジアシルホスファチジルコリン、例えばジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジペンタデカノイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジアラキドイルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジベヘノイルホスファチジルコリン（ＤＢＰＣ）、ジトリコサノイルホスファチジルコリン（ＤＴＰＣ）、ジリグノセロイルファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）およびホスファチジルエタノールアミン、特にジアシルホスファチジルエタノールアミン、例えばジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジラウロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、ジフィタノイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）、１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＧ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＰＰＧ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、Ｎ－パルミトイル－Ｄ－エリスロ－スフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＭ）、および様々な疎水性鎖を有するさらなるホスファチジルエタノールアミン脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＯＰＧ、ＤＰＰＧ、ＰＯＰＥ、ＤＰＰＥ、ＤＭＰＥ、ＤＳＰＥ、およびＳＭからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、中性脂質はＤＯＰＥである。

【0588】

いくつかの実施形態では、さらなる脂質は、以下のうちの１つを含む：（１）リン脂質；（２）コレステロールもしくはその誘導体；または（３）リン脂質とコレステロールもしくはその誘導体との混合物。コレステロール誘導体の例としては、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル－２’－ヒドロキシエチルエーテル、コレステリル－４’－ヒドロキシブチルエーテル、トコフェロールおよびそれらの誘導体、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。

【0589】

したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸粒子（特にｍＲＮＡを含む粒子）は、（１）カチオン性もしくはカチオン性イオン化可能脂質およびＤＯＰＥなどのリン脂質、または（２）カチオン性もしくはカチオン性イオン化可能脂質およびＤＯＰＥなどのリン脂質およびコレステロールを含む。

【0590】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸粒子（特にｍＲＮＡを含む粒子）は、（１）ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥ、（２）ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびコレステロール、（３）ＤＯＤＭＡおよびＤＯＰＥ、または（４）ＤＯＤＭＡ、ＤＯＰＥおよびコレステロールを含む。

【0591】

ＤＯＰＥは中性リン脂質である。ＤＯＰＥの構造は、以下のように表され得る：

【0592】

【化8】

【0593】

コレステロールの構造は、以下のように表され得る：

【0594】

【化9】

【0595】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の粒子は、ペグ化脂質などのポリマーコンジュゲート脂質を含まない。「ペグ化脂質」という用語は、脂質部分とポリエチレングリコール部分の両方を含む分子を指す。ペグ化脂質は当技術分野で公知である。

【0596】

いくつかの実施形態では、さらなる脂質（例えば、１つ以上のリン脂質および／またはコレステロール）は、粒子中に存在する総脂質の約０モル％～約９０モル％、約０モル％～約８０モル％、約２モル％～約８０モル％、約５モル％～約８０モル％、約５モル％～約６０モル％、約５モル％～約５０モル％、約７．５モル％～約５０モル％、または約１０モル％～約４０モル％を構成し得る。いくつかの実施形態では、さらなる脂質（例えば、１つ以上のリン脂質および／またはコレステロール）は、粒子中に存在する総脂質の約１０モル％、約１５モル％、または約２０モル％を構成する。

【0597】

いくつかの実施形態では、さらなる脂質は、（ｉ）ＤＯＰＥなどのリン脂質と、（ｉｉ）コレステロールまたはその誘導体との混合物を含む。いくつかの実施形態では、ＤＯＰＥなどのリン脂質対コレステロールまたはその誘導体のモル比は、約９：０～約１：１０、約２：１～約１：４、約１：１～約１：４または約１：１～約１：３である。

【0598】

ポリマーコンジュゲート脂質
いくつかの実施形態では、粒子は、少なくとも１つのポリマーコンジュゲート脂質を含み得る。ポリマーコンジュゲート脂質は、典型的には、脂質部分と、それにコンジュゲートされたポリマー部分とを含む分子である。いくつかの実施形態では、ポリマーコンジュゲート脂質は、本明細書ではペグ化脂質またはＰＥＧ脂質とも呼ばれる、ＰＥＧコンジュゲート脂質である。

【0599】

いくつかの実施形態では、ポリマーコンジュゲート脂質は、疎水性脂質層を遮蔽する保護親水性層を形成することによって脂質粒子を立体的に安定化するように設計される。いくつかの実施形態では、ポリマーコンジュゲート脂質は、そのような脂質粒子がインビボで投与される場合、血清タンパク質とのその会合および／または結果として生じる細網内皮系による取り込みを減少させることができる。

【0600】

様々なＰＥＧコンジュゲート脂質が当技術分野で公知であり、ペグ化ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、例えば１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧコハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＡＧ）、例えば４－Ｏ－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－１－Ｏ－（ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）、ペグ化セラミド（ＰＥＧ－ｃｅｒ）、またはＰＥＧジアルコキシプロピルカルバメート、例えばω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル－Ｎ－（２，３－ジ（テトラデカノキシ）プロピル）カルバメートもしくは２，３－ジ（テトラデカノキシ）プロピル－Ｎ－（ωメトキシ（ポリエトキシ）エチル）カルバメートなどが含まれるが、これらに限定されない。

【0601】

いくつかの実施形態では、粒子は、その各々の内容全体が本明細書に記載の目的のために参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１７／０７５５３１号および国際公開第２０１８／０８１４８０号に記載されているような１つ以上のＰＥＧコンジュゲート脂質またはペグ化脂質を含み得る。

【0602】

リポプレックス粒子
本開示のいくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡは、ＲＮＡリポプレックス粒子中に存在し得る。

【0603】

リポプレックス（ＬＰＸ）は、一般に、予め形成されたカチオン性脂質リポソームをアニオン性ＲＮＡと混合することによって形成される静電複合体である。形成されたリポプレックスは、リポソーム構造からコンパクトなＲＮＡ－リポプレックスへの変換に起因して生じる分子の異なる内部配置を有する。これらの製剤は、一般に、核酸の封入が不十分であり、核酸の捕捉が不完全であることを特徴とする。

【0604】

特定の実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、カチオン性脂質およびさらなる脂質の両方を含む。例示的な実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＴＭＡであり、さらなる脂質はＤＯＰＥである。

【0605】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質対少なくとも１つのさらなる脂質のモル比は、約１０：０～約１：９、約４：１～約１：２、または約３：１～約１：１である。特定の実施形態では、モル比は、約３：１、約２．７５：１、約２．５：１、約２．２５：１、約２：１、約１．７５：１、約１．５：１、約１．２５：１、または約１：１であり得る。例示的な実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質対少なくとも１つのさらなる脂質のモル比は、約２：１である。

【0606】

本明細書に記載のＲＮＡリポプレックス粒子は、いくつかの実施形態では、約２００ｎｍ～約１０００ｎｍ、約２００ｎｍ～約８００ｎｍ、約２５０ｎｍ～約７００ｎｍ、約４００ｎｍ～約６００ｎｍ、約３００ｎｍ～約５００ｎｍ、または約３５０ｎｍ～約４００ｎｍの範囲の平均直径を有する。特定の実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約２００ｎｍ、約２２５ｎｍ、約２５０ｎｍ、約２７５ｎｍ、約３００ｎｍ、約３２５ｎｍ、約３５０ｎｍ、約３７５ｎｍ、約４００ｎｍ、約４２５ｎｍ、約４５０ｎｍ、約４７５ｎｍ、約５００ｎｍ、約５２５ｎｍ、約５５０ｎｍ、約５７５ｎｍ、約６００ｎｍ、約６２５ｎｍ、約６５０ｎｍ、約７００ｎｍ、約７２５ｎｍ、約７５０ｎｍ、約７７５ｎｍ、約８００ｎｍ、約８２５ｎｍ、約８５０ｎｍ、約８７５ｎｍ、約９００ｎｍ、約９２５ｎｍ、約９５０ｎｍ、約９７５ｎｍ、または約１０００ｎｍの平均直径を有する。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約２５０ｎｍ～約７００ｎｍの範囲の平均直径を有する。別の実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約３００ｎｍ～約５００ｎｍの範囲の平均直径を有する。例示的な実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約４００ｎｍの平均直径を有する。

【0607】

本明細書に記載のＲＮＡリポプレックス粒子およびＲＮＡリポプレックス粒子を含む組成物は、非経口投与後、特に静脈内投与後の標的組織へのＲＮＡの送達に有用である。

【0608】

脾臓を標的とするＲＮＡリポプレックス粒子は、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１３／１４３６８３号に記載されている。正味の負電荷を有するＲＮＡリポプレックス粒子は、脾臓組織または脾臓細胞、例えば抗原提示細胞、特に樹状細胞を選択的に標的とするために使用し得ることが見出された。したがって、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、脾臓におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現が起こる。したがって、本開示のＲＮＡリポプレックス粒子は、脾臓においてＲＮＡを発現させるために使用され得る。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、肺および／または肝臓におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現は、全く起こらないかまたは本質的に起こらない。いくつかの実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、脾臓ではプロフェッショナル抗原提示細胞などの抗原提示細胞におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現が起こる。したがって、本開示のＲＮＡリポプレックス粒子は、ＲＮＡ、例えば抗原または少なくとも１つのエピトープをコードするＲＮＡをリンパ系、特に二次リンパ器官、より具体的には脾臓に標的化するために使用され得る。投与されるＲＮＡがワクチン抗原をコードするＲＮＡである場合、リンパ系、特に二次リンパ器官、より具体的には脾臓を標的とすることが特に好ましい。いくつかの実施形態では、標的細胞は脾臓細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、脾臓のプロフェッショナル抗原提示細胞などの抗原提示細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、脾臓における樹状細胞である。

【0609】

本開示のＲＮＡリポプレックス粒子の電荷は、少なくとも１つのカチオン性脂質中に存在する電荷とＲＮＡ中に存在する電荷との合計である。電荷比は、少なくとも１つのカチオン性脂質中に存在する正電荷対ＲＮＡ中に存在する負電荷の比である。少なくとも１つのカチオン性脂質に存在する正電荷とＲＮＡに存在する負電荷との電荷比は、以下の式によって計算される：電荷比＝［（カチオン性脂質濃度（ｍｏｌ））＊（カチオン性脂質中の正電荷の総数）］／［（ＲＮＡ濃度（ｍｏｌ））＊（ＲＮＡ中の負電荷の総数）］。ＲＮＡの濃度と少なくとも１つのカチオン性脂質量とは、当業者によって常用的な方法を使用して決定され得る。

【0610】

いくつかの実施形態では、生理学的ｐＨで、ＲＮＡリポプレックス粒子における正電荷対負電荷の電荷比は、約１．６：２～約１：２、または約１．６：２～約１．１：２である。特定の実施形態では、生理学的ｐＨでのＲＮＡリポプレックス粒子における正電荷対負電荷の電荷比は、約１．６：２．０、約１．５：２．０、約１．４：２．０、約１．３：２．０、約１．２：２．０、約１．１：２．０、または約１：２．０である。

【0611】

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の形態で存在する。ＬＮＰは、１つ以上の核酸分子が結合している、または１つ以上の核酸分子が封入されている粒子を形成することができる任意の脂質を含み得る。

【0612】

ＬＮＰは、典型的には、４つの成分：イオン化可能なカチオン性脂質、リン脂質などの中性脂質、コレステロールなどのステロイド、およびＰＥＧ脂質などのポリマーコンジュゲート脂質を含む。ＬＮＰは、エタノールに溶解した脂質を水性緩衝液中で核酸と混合することによって調製され得る。

【0613】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ ＬＮＰにおいて、ｍＲＮＡは、ＬＮＰの中心コアを占めるイオン化可能な脂質によって結合される。ＰＥＧ脂質は、リン脂質と共にＬＮＰの表面を形成する。いくつかの実施形態では、表面は二重層を含む。いくつかの実施形態では、荷電形態および非荷電形態のコレステロールおよびイオン化可能な脂質は、ＬＮＰ全体に分布し得る。

【0614】

いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、１つ以上のカチオン性脂質および１つ以上の安定化脂質を含む。安定化脂質は、中性脂質およびペグ化脂質を含む。

【0615】

いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質、中性脂質、ステロイド、ポリマーコンジュゲート脂質、および脂質ナノ粒子内に封入された、または脂質ナノ粒子と会合したＲＮＡを含む。

【0616】

いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、４０～５５モル％、４０～５０モル％、４１～５０モル％、４２～５０モル％、４３～５０モル％、４４～５０モル％、４５～５０モル％、４６～５０モル％、または４６～４９モル％を含む。

【0617】

いくつかの実施形態では、中性脂質は、５～１５モル％、７～１３モル％、または９～１１モル％の範囲の濃度で存在する。

【0618】

いくつかの実施形態では、ステロイドは、３０～５０モル％、３５～４５モル％または３８～４３モル％の範囲の濃度で存在する。

【0619】

いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、１～１０モル％、１～５モル％、または１～２．５モル％のポリマーコンジュゲート脂質を含む。

【0620】

いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、４５～５０モル％のカチオン性脂質；５～１５モル％の中性脂質；３５～４５モル％のステロイド；１～５モル％のポリマーコンジュゲート脂質；および脂質ナノ粒子内に封入された、または脂質ナノ粒子と会合したＲＮＡを含む。

【0621】

いくつかの実施形態では、モルパーセントは、脂質ナノ粒子中に存在する脂質の総モルに基づいて決定される。いくつかの実施形態では、モルパーセントは、脂質ナノ粒子中に存在するカチオン性脂質、中性脂質、ステロイドおよびポリマーコンジュゲート脂質の総モルに基づいて決定される。

【0622】

いくつかの実施形態では、中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＯＰＧ、ＤＰＰＧ、ＰＯＰＥ、ＤＰＰＥ、ＤＭＰＥ、ＤＳＰＥ、およびＳＭからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、中性脂質はＤＳＰＣである。

【0623】

いくつかの実施形態では、ステロイドはコレステロールである。

【0624】

いくつかの実施形態では、ポリマーコンジュゲート脂質はペグ化脂質である。いくつかの実施形態では、ペグ化脂質は、以下の構造：

【0625】

【化10】

【0626】

またはその薬学的に許容される塩、互変異性体もしくは立体異性体を有し、ここで、
Ｒ^１２およびＲ^１３は、それぞれ独立して、１０～３０個の炭素原子を含む直鎖または分岐の飽和または不飽和アルキル鎖であり、アルキル鎖は、１つ以上のエステル結合によって中断されていてもよく、ｗは、３０～６０の範囲の平均値を有する。いくつかの実施形態では、Ｒ^１２およびＲ^１３は、それぞれ独立して、１２～１６個の炭素原子を含む直鎖の飽和アルキル鎖である。いくつかの実施形態では、ｗは、４０～５５の範囲の平均値を有する。いくつかの実施形態では、平均ｗは約４５である。いくつかの実施形態では、Ｒ^１２およびＲ^１３は、それぞれ独立して、約１４個の炭素原子を含む直鎖の飽和アルキル鎖であり、ｗは約４５の平均値を有する。

【0627】

いくつかの実施形態では、ペグ化脂質は、２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミドであるか、またはそれを含む。

【0628】

いくつかの実施形態では、ＬＮＰのカチオン性脂質成分は、式（ＩＩＩ）の構造：

【0629】

【化11】

【0630】

またはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を有し、ここで、
Ｌ^１またはＬ^２の一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－または－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｌ^１またはＬ^２の他方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－または－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｏ－または直接結合であり；
Ｇ^１およびＧ^２は、それぞれ独立して、置換されていないＣ_１－Ｃ_１２アルキレンまたはＣ_１－Ｃ_１２アルケニレンであり；
Ｇ^３は、Ｃ_１－Ｃ_２４アルキレン、Ｃ_１－Ｃ_２４アルケニレン、Ｃ_３－Ｃ_８シクロアルキレン、Ｃ_３－Ｃ_８シクロアルケニレンであり；
Ｒ^ａは、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり；
Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立して、Ｃ_６－Ｃ_２４アルキルまたはＣ_６－Ｃ_２４アルケニルであり；
Ｒ^３は、Ｈ、ＯＲ^５、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ^４または－ＮＲ^５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^４であり；
Ｒ^４はＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり；
Ｒ^５は、ＨまたはＣ_１－Ｃ_６アルキルであり、；および
ｘは、０、１または２である。

【0631】

式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、脂質は、以下の構造（ＩＩＩＡ）または（ＩＩＩＢ）：

【0632】

【化12】

【0633】

または

【0634】

【化13】

【0635】

の１つを有し、ここで、
Ａは、３～８員のシクロアルキルまたはシクロアルキレン環であり；
Ｒ^６は、各存在において、独立してＨ、ＯＨまたはＣ_１－Ｃ_２４アルキルであり；
ｎは、１～１５の範囲の整数である。

【0636】

式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、脂質は構造（ＩＩＩＡ）を有し、他の実施形態では、脂質は構造（ＩＩＩＢ）を有する。

【0637】

式（ＩＩＩ）の他の実施形態では、脂質は、以下の構造（ＩＩＩＣ）または（ＩＩＩＤ）：

【0638】

【化14】

【0639】

または

【0640】

【化15】

【0641】

の１つを有し、ここで、ｙおよびｚは、それぞれ独立して、１～１２の範囲の整数である。

【0642】

式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいずれかでは、Ｌ^１またはＬ^２の一方は－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ^１およびＬ^２の各々は－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。前述のいずれかのいくつかの異なる実施形態では、Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－または－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ^１およびＬ^２の各々は－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。

【0643】

式（ＩＩＩ）のいくつかの異なる実施形態では、脂質は、以下の構造（ＩＩＩＥ）または（ＩＩＩＦ）：

【0644】

【化16】

【0645】

または

【0646】

【化17】

【0647】

の１つを有する。

【0648】

式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、脂質は、以下の構造（ＩＩＩＧ）、（ＩＩＩＨ）、（ＩＩＩＩ）または（ＩＩＩＪ）：

【0649】

【化18】

【0650】

【化19】

【0651】

【化20】

【0652】

または

【0653】

【化21】

【0654】

の１つを有する。

【0655】

式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、ｎは、２～１２、例えば２～８または２～４の範囲の整数である。例えば、いくつかの実施形態では、ｎは、３、４、５または６である。いくつかの実施形態では、ｎは３である。いくつかの実施形態では、ｎは４である。いくつかの実施形態では、ｎは５である。いくつかの実施形態では、ｎは６である。

【0656】

式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかの他の実施形態では、ｙおよびｚは、それぞれ独立して、２～１０の範囲の整数である。例えば、いくつかの実施形態では、ｙおよびｚは、それぞれ独立して、４～９または４～６の範囲の整数である。

【0657】

式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｒ^６はＨである。前述の実施形態の他の実施形態では、Ｒ^６はＣ_１－Ｃ_２４アルキルである。他の実施形態では、Ｒ^６はＯＨである。

【0658】

式（ＩＩＩ）のいくつかの実施形態では、Ｇ^３は非置換である。他の実施形態では、Ｇ３は置換されている。様々な異なる実施形態では、Ｇ^３は、直鎖Ｃ_１－Ｃ_２４アルキレンまたは直鎖Ｃ_１－Ｃ_２４アルケニレンである。

【0659】

式（ＩＩＩ）のいくつかの他の前述の実施形態では、Ｒ^１もしくはＲ^２、またはその両方がＣ_６－Ｃ_２４アルケニルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立して、以下の構造：

【0660】

【化22】

【0661】

を有し、ここで、
Ｒ^７ａおよびＲ^７ｂは、各存在において、独立してＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり；ならびに
ａは２～１２の整数であり、
ここで、Ｒ^７ａ、Ｒ^７ｂおよびａはそれぞれ、Ｒ^１およびＲ^２がそれぞれ独立して６～２０個の炭素原子を含むように選択される。例えば、いくつかの実施形態では、ａは、５～９または８～１２の範囲の整数である。

【0662】

式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｒ^７ａの少なくとも１つの存在はＨである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ^７ａは各存在においてＨである。前述の実施形態の他の異なる実施形態では、Ｒ^７ｂの少なくとも１つの存在はＣ_１－Ｃ_８アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｃ_１－Ｃ_８アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ヘキシルまたはｎ－オクチルである。

【0663】

式（ＩＩＩ）の異なる実施形態では、Ｒ^１もしくはＲ^２、またはその両方が、以下の構造：

【0664】

【化23】

【0665】

の１つを有する。

【0666】

式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｒ^３は、ＯＨ、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ^４または－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ^４である。いくつかの実施形態では、Ｒ^４は、メチルまたはエチルである。

【0667】

様々な異なる実施形態では、式（ＩＩＩ）のカチオン性脂質は、以下の表に示される構造の１つを有する。

【0668】

式（ＩＩＩ）の代表的な化合物。

【0669】

【表2】

【0670】

様々な脂質（例えば、カチオン性脂質、中性脂質およびポリマーコンジュゲート脂質を含む）が当技術分野で公知であり、本明細書では、脂質ナノ粒子、例えば特定の細胞型（例えば肝細胞）を標的とする脂質ナノ粒子を形成するために使用することができる。いくつかの実施形態では、中性脂質は、リン脂質もしくはその誘導体（例えば、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＳＣ））および／またはコレステロールであり得るか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリマーコンジュゲート脂質は、ＰＥＧコンジュゲート脂質（例えば、２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミドまたはその誘導体）であり得る。

【0671】

いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、式（ＩＩＩ）の脂質、ＲＮＡ、中性脂質、ステロイドおよびペグ化脂質を含む。いくつかの実施形態では、中性脂質はＤＳＰＣである。いくつかの実施形態では、ステロイドはコレステロールである。いくつかの実施形態では、ペグ化脂質はＡＬＣ－０１５９である。
ＡＬＣ－０１５９：

【0672】

【化24】

【0673】

いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に約４５～約５０モル％の量で存在する。いくつかの実施形態では、中性脂質は、ＬＮＰ中に約５～約１５モル％の量で存在する。いくつかの実施形態では、ステロイドは、ＬＮＰ中に約３５～約４５モル％の量で存在する。いくつかの実施形態では、ペグ化脂質は、ＬＮＰ中に約１～約５モル％の量で存在する。

【0674】

いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約４５～約５０モル％の量のカチオン性脂質、約５～約１５モル％の量のＤＳＰＣ、約３５～約４５モル％の量のコレステロール、および約１～約５モル％の量のＡＬＣ－０１５９を含む。

【0675】

Ｎ／Ｐ値は、好ましくは少なくとも約４である。いくつかの実施形態では、Ｎ／Ｐ値は、４～２０、４～１２、４～１０、４～８、または５～７の範囲である。いくつかの実施形態では、Ｎ／Ｐ値は約６である。

【0676】

化学療法
特定の実施形態では、本明細書に記載の治療と組み合わせてさらなる治療を患者に投与し得る。そのようなさらなる治療には、古典的な癌治療、例えば、放射線療法、手術、温熱療法および／または化学療法が含まれる。

【0677】

化学療法は、通常、標準化された化学療法レジメンの一部として、１つ以上の抗癌剤（化学療法剤）を使用する癌治療の一種である。化学療法という用語は、有糸分裂を阻害するための細胞内毒の非特異的使用を含意するようになった。この含意は、細胞外シグナル（シグナル伝達）を遮断する、より選択的な薬剤を除外する。古典的な内分泌ホルモン（主に、乳癌のためのエストロゲンおよび前立腺癌のためのアンドロゲン）からの成長促進シグナルを阻害する特定の分子または遺伝子標的を用いた治療法の開発は、現在ホルモン療法と呼ばれている。対照的に、受容体チロシンキナーゼに関連するもののような成長シグナルの他の阻害は、標的療法と称される。

【0678】

重要なことに、薬物の使用（化学療法、ホルモン療法または標的療法に関わらず）は、血流に導入され、したがって原則として体内の任意の解剖学的位置で癌に対処することができるという点で、癌の全身療法を構成する。全身療法は、放射線療法、手術または温熱療法などの癌の局所療法（すなわち、その有効性が適用される解剖学的領域に限定される治療）を構成する他のモダリティと組み合わせて使用されることが多い。

【0679】

伝統的な化学療法剤は、細胞分裂（有糸分裂）を妨げることによって細胞傷害性であるが、癌細胞はこれらの薬剤に対する感受性が大きく異なる。大部分において、化学療法は、細胞を損傷するまたは細胞にストレスを加える方法と考えることができ、アポトーシスが開始された場合、細胞死をもたらし得る。

【0680】

化学療法剤としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗微小管剤、トポイソメラーゼ阻害剤、および細胞傷害性抗生物質が挙げられる。

【0681】

アルキル化剤は、タンパク質、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む多くの分子をアルキル化する能力を有する。アルキル化剤のサブタイプは、ナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素、テトラジン、アジリジン、シスプラチンおよび誘導体、ならびに非古典的アルキル化剤である。ナイトロジェンマスタードには、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミドおよびブスルファンが含まれる。ニトロソ尿素としては、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチル尿素（ＭＮＵ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）およびセムスチン（ＭｅＣＣＮＵ）、フォテムスチンおよびストレプトゾトシンが挙げられる。テトラジンとしては、ダカルバジン、ミトゾロミドおよびテモゾロミドが挙げられる。アジリジンとしては、チオテパ、マイトマイシンおよびジアジコン（ＡＺＱ）が挙げられる。シスプラチンおよび誘導体には、シスプラチン、カルボプラチンおよびオキサリプラチンが含まれる。これらは、生物学的に重要な分子中のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基およびリン酸基と共有結合を形成することによって細胞機能を損なう。非古典的なアルキル化剤としては、プロカルバジンおよびヘキサメチルメラミンが挙げられる。特に好ましい一実施形態では、アルキル化剤はシクロホスファミドである。

【0682】

代謝拮抗剤は、ＤＮＡおよびＲＮＡの合成を妨げる分子の群である。それらの多くは、ＤＮＡおよびＲＮＡのビルディングブロックと類似の構造を有する。代謝拮抗剤は、核酸塩基またはヌクレオシドのいずれかに類似するが、変化した化学基を有する。これらの薬物は、ＤＮＡ合成に必要な酵素を遮断するか、またはＤＮＡもしくはＲＮＡに組み込まれることによって効果を発揮する。代謝拮抗剤のサブタイプは、葉酸拮抗剤、フルオロピリミジン、デオキシヌクレオシド類似体およびチオプリンである。葉酸拮抗剤としては、メトトレキサートおよびペメトレキセドが挙げられる。フルオロピリミジンには、フルオロウラシルおよびカペシタビンが含まれる。デオキシヌクレオシド類似体としては、シタラビン、ゲムシタビン、デシタビン、アザシチジン、フルダラビン、ネララビン、クラドリビン、クロファラビン、およびペントスタチンが挙げられる。チオプリンとしては、チオグアニンおよびメルカプトプリンが挙げられる。

【0683】

抗微小管剤は、微小管機能を妨げることによって細胞分裂を阻止する。ビンカアルカロイドは微小管の形成を妨げ、一方タキサンは微小管の分解を妨げる。ビンカアルカロイドとしては、ビノレルビン、ビンデシン、およびビンフルニンが挙げられる。タキサンには、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）およびパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）が含まれる。

【0684】

トポイソメラーゼ阻害剤は、２つの酵素：トポイソメラーゼＩおよびトポイソメラーゼＩＩの活性に影響を及ぼす薬物であり、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、エトポシド、ドキソルビシン、ミトキサントロン、テニポシド、ノボビオシン、メルバロン、およびアクラルビシンが含まれる。

【0685】

細胞傷害性抗生物質は、様々な作用機序を有する薬物の多様な群である。それらが化学療法の指標において共有する共通の主題は、細胞分裂を中断することである。最も重要なサブグループは、アントラサイクリン（例えばドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシンピラルビシン、およびアクラルビシン）ならびにブレオマイシンである；他の顕著な例としては、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、およびアクチノマイシンが挙げられる。

【0686】

いくつかの実施形態では、免疫エフェクタ細胞の投与の前に、例えばシクロホスファミドおよびフルダラビンを投与することによって、リンパ球枯渇治療を適用し得る。そのような治療は、細胞の持続性ならびに臨床応答の発生率および持続時間を増加させ得る。

【0687】

核酸を含む組成物
本明細書に記載される１つ以上の核酸を、例えば核酸粒子の形態で含む組成物は、塩、緩衝液、または以下にさらに記載されるような他の成分を含み得る。

【0688】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物に使用するための塩は、塩化ナトリウムを含む。理論に拘束されることを望むものではないが、塩化ナトリウムは、脂質と混合する前にＲＮＡを前処理するためのイオン性浸透圧剤として機能する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、代替の有機塩または無機塩を含み得る。代替の塩としては、限定されないが、塩化カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一カリウム、酢酸カリウム、重炭酸カリウム、硫酸カリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化リチウム、塩化マグネシウム、リン酸マグネシウム、塩化カルシウム、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のナトリウム塩が挙げられる。

【0689】

一般に、ＲＮＡ粒子を保存するための組成物、例えば、ＲＮＡ粒子を凍結させるための組成物は、低い塩化ナトリウム濃度を含むか、低いイオン強度を含む。いくつかの実施形態では、塩化ナトリウムは、０ｍＭ～約５０ｍＭ、０ｍＭ～約４０ｍＭ、または約１０ｍＭ～約５０ｍＭの濃度である。

【0690】

本開示によれば、本明細書に記載のＲＮＡ粒子組成物は、ＲＮＡ粒子の安定性、特にＲＮＡの安定性に適したｐＨを有する。理論に拘束されることを望むものではないが、緩衝系の使用は、組成物の製造、貯蔵および使用中に本明細書に記載の粒子組成物のｐＨを維持する。本開示のいくつかの実施形態では、緩衝系は、溶媒（特に水、例えば脱イオン水、特に注射用水）および緩衝物質を含み得る。緩衝物質は、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－ジオール（トリス）、酢酸塩およびヒスチジンから選択され得る。好ましい緩衝物質はＨＥＰＥＳである。

【0691】

本明細書に記載の組成物はまた、例えば凝集、粒子崩壊、ｍＲＮＡ分解および／または他の種類の損傷を低減または防止するために、生成物の品質の実質的な損失、特に保存、凍結および／または凍結乾燥中のｍＲＮＡ活性の実質的な損失を回避するための安定剤として凍結保護剤および／または界面活性剤を含み得る。

【0692】

一実施形態では、凍結保護剤は炭水化物である。本明細書で使用される「炭水化物」という用語は、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖および多糖を指し、それらを包含する。

【0693】

一実施形態では、凍結保護剤は単糖である。本明細書で使用される「単糖」という用語は、より単純な炭水化物単位に加水分解することができない単一の炭水化物単位（例えば単純糖）を指す。例示的な単糖凍結保護剤としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース、リボースなどが挙げられる。

【0694】

一実施形態では、凍結保護剤は二糖である。本明細書で使用される「二糖」という用語は、グリコシド結合、例えば１～４個の結合または１～６個の結合を介して互いに結合している２つの単糖単位によって形成される化合物または化学部分を指す。二糖は、２つの単糖に加水分解され得る。例示的な二糖凍結保護剤としては、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトースなどが挙げられる。

【0695】

「三糖」という用語は、互いに結合して１つの分子を形成する３つの糖を意味する。三糖の例としては、ラフィノース、メレジトースが挙げられる。

【0696】

一実施形態では、凍結保護剤はオリゴ糖である。本明細書で使用される「オリゴ糖」という用語は、グリコシド結合、例えば１～４個の結合または１～６個の結合を介して互いに結合して直鎖、分岐または環状構造を形成する３～約１５個、例えば３～約１０個の単糖単位によって形成される化合物または化学部分を指す。例示的なオリゴ糖凍結保護剤としては、シクロデキストリン、ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース、スタキオース、アカルボースなどが挙げられる。オリゴ糖は、酸化または還元され得る。

【0697】

一実施形態では、凍結保護剤は環状オリゴ糖である。本明細書で使用される「環状オリゴ糖」という用語は、グリコシド結合、例えば１～４個の結合または１～６個の結合を介して互いに結合して環状構造を形成する３～約１５個、例えば６、７、８、９または１０個の単糖単位によって形成される化合物または化学部分を指す。例示的な環状オリゴ糖凍結保護剤としては、αシクロデキストリン、βシクロデキストリン、またはγシクロデキストリンなどの別個の化合物である環状オリゴ糖が挙げられる。

【0698】

他の例示的な環状オリゴ糖凍結保護剤には、環状オリゴ糖部分を含有するポリマーなどの、より大きな分子構造中にシクロデキストリン部分を含む化合物が含まれる。環状オリゴ糖は、酸化または還元することができ、例えばジカルボニル形態に酸化することができる。本明細書で使用される「シクロデキストリン部分」という用語は、ポリマーなどのより大きな分子構造に組み込まれる、またはその一部であるシクロデキストリン（例えば、α、βまたはγシクロデキストリン）ラジカルを指す。シクロデキストリン部分は、１つ以上の他の部分に直接または任意のリンカーを介して結合することができる。シクロデキストリン部分は、酸化または還元することができ、例えばジカルボニル形態に酸化することができる。

【0699】

炭水化物凍結保護剤、例えば環状オリゴ糖凍結保護剤は、誘導体化された炭水化物であり得る。例えば、一実施形態では、凍結保護剤は、誘導体化環状オリゴ糖、例えば誘導体化シクロデキストリン、例えば２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン、例えば部分エーテル化シクロデキストリン（例えば部分的にエーテル化されたβシクロデキストリン）である。

【0700】

例示的な凍結保護剤は多糖である。本明細書で使用される「多糖類」という用語は、グリコシド結合、例えば１～４個の結合または１～６個の結合を介して互いに結合して直鎖、分岐または環状構造を形成する少なくとも１６個の単糖単位によって形成される化合物または化学部分を指し、多糖をその骨格構造の一部として含むポリマーを含む。骨格において、多糖は直鎖状または環状であり得る。例示的な多糖凍結保護剤としては、グリコーゲン、アミラーゼ、セルロース、デキストラン、マルトデキストリンなどが挙げられる。

【0701】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ粒子組成物はスクロースを含み得る。理論に束縛されることを望むものではないが、スクロースは、組成物の凍結保護を促進し、それにより、ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）粒子の凝集を防止し、組成物の化学的および物理的安定性を維持するように機能する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ粒子組成物は、スクロースに代わる代替凍結保護剤を含み得る。代替の安定剤としては、限定されないが、トレハロースおよびグルコースが挙げられる。特定の実施形態では、スクロースの代替安定剤は、トレハロースまたはスクロースとトレハロースとの混合物である。

【0702】

好ましい凍結保護剤は、スクロース、トレハロース、グルコース、およびそれらの組合せ、例えばスクロースとトレハロースの組合せからなる群より選択される。好ましい実施形態では、凍結保護剤はスクロースである。

【0703】

本開示のいくつかの実施形態は、本明細書に記載のＲＮＡ組成物におけるキレート剤の使用を企図する。キレート剤とは、金属イオンと少なくとも２つの配位共有結合を形成し、それによって安定な水溶性錯体を生成することができる化合物を指す。理論に束縛されることを望むものではないが、キレート剤は、本開示では、普通であれば加速されたＲＮＡ分解を誘発し得る遊離二価イオンの濃度を低下させる。適切なキレート剤の例としては、限定されないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ＥＤＴＡの塩、デスフェリオキサミンＢ、デフェロキサミン、ジチオカルブナトリウム、ペニシラミン、ペンテト酸カルシウム、ペンテト酸のナトリウム塩、スクシマー、トリエンチン、ニトリロ三酢酸、トランス－ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＤＣＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、およびビス（アミノエチル）グリコールエーテル－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸が挙げられる。いくつかの実施形態では、キレート剤は、ＥＤＴＡまたはＥＤＴＡの塩である。例示的な実施形態では、キレート剤は、ＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物である。いくつかの実施形態では、ＥＤＴＡは、約０．０５ｍＭ～約５ｍＭ、約０．１ｍＭ～約２．５ｍＭ、または約０．２５ｍＭ～約１ｍＭの濃度である。

【0704】

代替的な実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ粒子組成物は、キレート剤を含まない。

【0705】

医薬組成物
本明細書に記載の薬剤は、医薬組成物または医薬品で投与されてもよく、任意の適切な医薬組成物の形態で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、治療的または予防的処置、例えば、癌疾患または感染症などの抗原が関与する疾患の治療または予防に使用するためのものである。

【0706】

「医薬組成物」という用語は、治療上有効な薬剤を、好ましくは薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤と共に含む組成物に関する。当該医薬組成物は、当該医薬組成物を対象に投与することによって疾患を治療する、予防する、または疾患の重症度を軽減するのに有用である。

【0707】

本開示の医薬組成物は、１つ以上のアジュバントを含んでいてもよく、または１つ以上のアジュバントと共に投与されてもよい。「アジュバント」という用語は、免疫応答を延長、増強または加速する化合物に関する。アジュバントは、油エマルジョン（例えばフロイントアジュバント）、無機化合物（ミョウバンなど）、細菌産物（百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）毒素など）、または免疫賦活複合体などの不均一な化合物の群を含む。アジュバントの例としては、限定されることなく、ＬＰＳ、ＧＰ９６、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、成長因子、およびサイトカイン、例えばモノカイン、リンホカイン、インターロイキン、ケモカインが挙げられる。ケモカインは、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＮＦａ、ＩＮＦ－γ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＬＴ－ａであり得る。さらなる公知のアジュバントは、水酸化アルミニウム、フロイントアジュバント、またはＭｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＳＡ５１などの油である。本開示で使用するための他の適切なアジュバントとしては、Ｐａｍ３Ｃｙｓなどのリポペプチド、ならびにサポニン、トレハロース－６，６－ジベヘネート（ＴＤＢ）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、モノミコロイルグリセロール（ＭＭＧ）、またはグルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）などの親油性成分が挙げられる。

【0708】

本開示の医薬組成物は、保存可能な形態（例えば、凍結もしくは凍結乾燥／フリーズドライ形態）または「すぐに使用できる形態」（すなわち、例えば希釈などのいかなる処理も行わずに、対象に直ちに投与することができる形態）であり得る。したがって、医薬組成物の保存可能な形態の投与前に、この保存可能な形態をすぐに使用できる形態または投与可能な形態に処理または移行しなければならない。例えば、適切な溶媒（例えば注射用水などの脱イオン水）または液体（例えば水溶液）を使用することによって、凍結医薬組成物を解凍しなければならないか、または凍結乾燥医薬組成物を再構成しなければならない。

【0709】

本開示による医薬組成物は、一般に、「薬学的有効量」および「薬学的に許容される調製物」で適用される。

【0710】

「薬学的に許容される」という用語は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない物質の非毒性を指す。

【0711】

「薬学的有効量」という用語は、単独でまたはさらなる用量と共に所望の反応または所望の効果を達成する量を指す。特定の疾患の治療に関するいくつかの実施形態では、所望の反応は、疾患の経過の阻害に関連し得る。これは、疾患の進行を遅らせること、およびいくつかの実施形態では、疾患の進行を中断するまたは逆転させることを含む。疾患の治療における所望の反応はまた、当該疾患または当該状態の発症の遅延または発症の予防であり得る。本明細書に記載の医薬組成物の有効量は、治療される状態、疾患の重症度、年齢、生理学的状態、サイズおよび体重を含む患者の個々のパラメータ、治療期間、付随する治療の種類（存在する場合）、特定の投与経路ならびに同様の因子に依存する。したがって、本明細書に記載の医薬組成物の投与される用量は、様々なそのようなパラメータに依存し得る。患者の反応が初期用量では不十分である場合、より高い用量（または異なる、より局所的な投与経路によって達成される効果的により高い用量）を使用し得る。

【0712】

本開示の医薬組成物は、緩衝剤、防腐剤、および任意で他の治療薬を含有し得る。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤を含む。

【0713】

本開示の医薬組成物で使用するための適切な防腐剤には、限定されないが、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールが含まれる。

【0714】

本明細書で使用される「賦形剤」という用語は、本開示の医薬組成物中に存在し得るが、活性成分ではない物質を指す。賦形剤の例としては、限定されないが、担体、結合剤、希釈剤、潤滑剤、増粘剤、界面活性剤、防腐剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤、香味剤、または着色剤が挙げられる。

【0715】

「希釈剤」という用語は、希釈するおよび／または希薄にする薬剤に関する。さらに、「希釈剤」という用語は、流体、液体または固体の懸濁液および／または混合媒体のいずれか１つ以上を含む。適切な希釈剤の例としては、エタノール、グリセロールおよび水が挙げられる。

【0716】

「担体」という用語は、医薬組成物の投与を容易にする、増強するまたは可能にするために活性成分が組み合わされる、天然、合成、有機、無機であり得る成分を指す。本明細書で使用される担体は、対象への投与に適した１つ以上の適合性の固体もしくは液体充填剤、希釈剤または封入物質であり得る。適切な担体としては、限定されないが、滅菌水、リンゲル液、乳酸リンゲル液、滅菌塩化ナトリウム溶液、等張食塩水、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレンおよび、特に、生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーが挙げられる。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は等張食塩水を含む。

【0717】

治療的使用のための薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤は、製薬分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｉｔ．１９８５）に記載されている。

【0718】

医薬担体、賦形剤または希釈剤は、意図される投与経路および標準的な製薬慣行に関して選択することができる。

【0719】

医薬組成物の投与経路
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、静脈内、動脈内、皮下、皮内、経皮、節内、筋肉内、腫瘍内、または腫瘍周囲に投与され得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所投与または全身投与用に製剤化される。全身投与には、消化管を介した吸収を含む経腸投与、または非経口投与が含まれ得る。本明細書で使用される場合、「非経口投与」は、静脈内注射などによる、消化管を介する以外の任意の方法での投与を指す。いくつかの実施形態では、医薬組成物は全身投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、全身投与は静脈内投与によるものである。

【0720】

本発明の全ての態様のいくつかの実施形態では、ワクチン抗原をコードするＲＮＡおよびＰＤ－１軸結合アンタゴニスト、任意で免疫賦活剤をコードするＲＮＡを全身投与、例えば静脈内投与する。

【0721】

本明細書で使用される「同時投与」という用語は、異なる化合物または組成物（例えば、ワクチン抗原をコードするＲＮＡおよびＰＤ－１軸結合アンタゴニスト）を同じ患者に投与する方法を意味する。異なる化合物または組成物は、同時に、本質的に同時に、または連続的に投与され得る。

【0722】

組成物の使用
本明細書に記載の組成物は、様々な疾患、特に対象へのワクチン抗原の提供が治療効果または予防効果をもたらす疾患、例えば癌疾患または感染症などの、抗原を発現する疾患細胞の存在を特徴とする疾患の治療的または予防的処置に使用され得る。例えば、ウイルスに由来する抗原またはエピトープを提供することは、当該ウイルスによって引き起こされるウイルス性疾患の治療に有用であり得る。腫瘍抗原またはエピトープを提供することは、癌細胞が上記腫瘍抗原を発現する癌疾患の治療に有用であり得る。

【0723】

「疾患」（本明細書では「障害」とも呼ばれる）という用語は、個体の身体に影響を及ぼす異常な状態を指す。疾患はしばしば、特定の症状および徴候に関連する医学的状態として解釈される。疾患は、感染症などの外部源に由来する因子によって引き起こされ得るか、または自己免疫疾患などの内部機能不全によって引き起こされ得る。ヒトでは、「疾患」はしばしば、罹患した個体に疼痛、機能不全、窮迫、社会的問題、もしくは死亡を引き起こす、または個体と接触するものに対して同様の問題を引き起こす状態を指すためにより広く使用される。このより広い意味では、疾患は時に、損傷、身体障害、障害、症候群、感染、孤立した症状、逸脱した挙動、ならびに構造および機能の非定型の変化を含む場合があるが、他の状況および他の目的では、これらは区別可能なカテゴリと見なされ得る。多くの疾患を患い、それらと共に生活することは、人生観および人格を変える可能性があるため、疾患は通常、身体的だけでなく感情的にも個体に影響を及ぼす。

【0724】

「抗原が関与する疾患」という用語は、抗原に関係する任意の疾患、例えば抗原の存在を特徴とする疾患を指す。抗原が関与する疾患は、感染症、または癌疾患もしくは単に癌であり得る。抗原は、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、または細菌抗原などの疾患関連抗原であり得る。いくつかの実施形態では、抗原が関与する疾患は、抗原を発現し、好ましくは例えばＭＨＣに関連して細胞表面に抗原を提示する細胞が関与する疾患である。

【0725】

「感染症」という用語は、個体から個体へ、または生物から生物へと伝播することができ、微生物因子によって引き起こされる任意の疾患（例えば普通の風邪）を指す。感染症は当技術分野で公知であり、例えば、それぞれウイルス、細菌、および寄生虫によって引き起こされる、ウイルス性疾患、細菌性疾患、または寄生虫性疾患が含まれる。これに関して、感染症は、例えば、肝炎、性感染症（例えばクラミジアまたは淋病）、結核、ＨＩＶ／後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、ジフテリア、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、コレラ、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、鳥インフルエンザ、およびインフルエンザであり得る。

【0726】

「癌疾患」または「癌」という用語は、典型的には無秩序な細胞増殖を特徴とする、個体における生理学的状態を指すかまたは表す。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。さらに具体的には、そのような癌の例としては、骨癌、血液癌、肺癌、肝癌、膵癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚黒色腫または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、性器および生殖器の癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、膀胱癌、腎癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、神経外胚葉癌、脊髄軸腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、ならびに下垂体腺腫が挙げられる。本開示による「癌」という用語は、癌転移も含む。

【0727】

本文脈において、「治療」、「治療する」または「治療的介入」という用語は、疾患などの状態と闘うことを目的とした対象の管理およびケアに関する。この用語は、症状もしくは合併症を緩和するため、疾患、障害もしくは状態の進行を遅らせるため、症状および合併症を緩和もしくは軽減するため、ならびに／または疾患、障害もしくは状態を治癒もしくは排除するため、ならびに状態を予防するための治療上有効な化合物の投与などの、対象が罹患している所与の状態に対するあらゆる範囲の治療を含むことが意図されており、予防は、疾患、状態または障害と闘うことを目的とした個体の管理およびケアとして理解されるべきであり、症状または合併症の発症を防止するための活性化合物の投与を含む。

【0728】

「治療的処置」という用語は、個体の健康状態を改善する、および／または寿命を延長する（増加させる）任意の治療に関する。当該治療は、個体における疾患を排除し得る、個体における疾患の発症を停止もしくは遅延させ得る、個体における疾患の発症を阻害もしくは遅延させ得る、個体における症状の頻度もしくは重症度を低下させ得る、および／または現在疾患を有しているかもしくは以前に有していたことがある個体における再発を減少させ得る。

【0729】

「予防的処置」または「防止的処置」という用語は、個体において疾患が発生するのを防ぐことを意図した任意の治療に関する。「予防的処置」または「防止的処置」という用語は、本明細書では互換的に使用される。

【0730】

「個体」および「対象」という用語は、本明細書では互換的に使用される。これらの用語は、疾患（例えば癌、感染症）に罹患し得るかもしくは罹患しやすいが、疾患を有していても有していなくてもよい、またはワクチン接種などの予防的介入を必要としてもよく、またはタンパク質補充などによる介入の必要性を有していてもよい、ヒトもしくは別の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマもしくは霊長動物）、または鳥（ニワトリ）、魚もしくは他の任意の動物種を含む他の任意の非哺乳動物を指す。多くの実施形態では、個体はヒトである。特に明記されない限り、「個体」および「対象」という用語は特定の年齢を示すものではなく、したがって成人、高齢者、小児、および新生児を包含する。本開示のいくつかの実施形態では、「個体」または「対象」は「患者」である。

【0731】

「患者」という用語は、治療のための個体または対象、特に疾患個体または対象を意味する。

【0732】

本開示のいくつかの実施形態では、目的は、ワクチンを提供することによって免疫応答を誘導することである。

【0733】

当業者は、免疫療法およびワクチン接種の原理の１つが、治療される疾患に関して免疫学的に関連する抗原またはエピトープで対象を免疫することによって疾患に対する免疫保護反応が生じるという事実に基づくことを理解するであろう。したがって、本明細書に記載の薬剤は、免疫応答を誘導または増強するために適用可能である。したがって、本明細書に記載の薬剤は、抗原またはエピトープが関与する疾患の予防的および／または治療的処置に有用である。

【0734】

本開示のいくつかの実施形態では、目的は、腫瘍抗原を発現する癌細胞などの抗原を発現する疾患細胞に対する免疫応答を提供し、腫瘍抗原などの抗原を発現する細胞が関与する癌疾患などの疾患を治療することである。

【0735】

本開示のいくつかの実施形態では、目的は、ワクチン接種によって癌を治療することである。

【0736】

本開示のいくつかの実施形態では、目的は、１つ以上の腫瘍抗原を発現する癌細胞に対する免疫応答を提供すること、および１つ以上の腫瘍抗原を発現する細胞が関与する癌疾患を治療することである。

【0737】

本開示のいくつかの実施形態では、目的は、ワクチン接種によって感染症に対する保護を提供することである。

【0738】

本明細書で参照される文書および試験の引用は、前述のいずれかが関連する先行技術であることの承認として意図されていない。これらの文書の内容に関する全ての記述は、出願人が入手可能な情報に基づいており、これらの文書の内容の正確さに関するいかなる承認も構成しない。

【0739】

説明（以下の実施例を含む）は、当業者が様々な実施形態を作成および使用することを可能にするために提示される。具体的な装置、技術、および用途の説明は、例としてのみ提供される。本明細書に記載される例に対する様々な変更は、当業者には容易に明らかであり、本明細書で定義される一般的な原理は、様々な実施形態の精神および範囲から逸脱することなく他の例および用途に適用され得る。したがって、様々な実施形態は、本明細書で説明され、示される例に限定されることを意図するものではなく、特許請求の範囲と一致する範囲を与えられるべきである。

【実施例】

【0740】

実施例１：試験化合物
試験化合物は、静脈内投与され、ＲＮＡコード抗原をリンパ器官内の常在樹状細胞（ＤＣ）に特異的に標的化するように設計された、リポソームに製剤化されたＲＮＡ（ＲＮＡ－リポプレックス［ＲＮＡ－ＬＰＸ］）癌ワクチンである。これらのＤＣは、コードされた抗原を翻訳し、Ｔ細胞プライミングのためにＭＨＣ分子上に抗原由来エピトープを提示する。

【0741】

別の試験化合物は、半減期の延長およびバイオアベイラビリティのために血清アルブミンに融合したインターロイキン－２（ＩＬ－２）をコードするサイトカインｍＲＮＡである。

【0742】

本出願で使用されるＲＮＡ－ＬＰＸワクチンを表２に列挙する。簡潔には、それらは、（ｉ）ｄｓＲＮＡ精製に供されない、ヌクレオシド修飾されていないウリジン含有ＲＮＡ（ｕＲＮＡ）、または（ｉｉ）ｍ１ψ修飾された二本鎖ＲＮＡ精製ＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）のいずれかからなる。

【0743】

ワクチンＲＮＡ構築物のインビトロ転写は、以前に記載されたｐＣＭＶ－Ｓｃｒｉｐｔ－Ｖｅｃｔｏｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の誘導体に基づいた（Ｈｏｌｔｋａｍｐ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ １０８，４００９－４０１７）。これらのプラスミドは、Ｔ７プロモータ、５’ヒトヘモグロビンサブユニットα１（ｈＡｇ）－ＵＴＲ、３’ＵＴＲおよびポリ（Ａ）尾部をコードする。

【0744】

ワクチンＲＮＡ構築物は、ニワトリ卵白アルブミン（ＯＶＡ）のＨ－２Ｋｂ拘束性免疫優性エピトープＯＶＡ_{２５７－２６４}（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）、続いてヒトβ－グロビンの２つの連続配列の３’ＵＴＲと、１２０個のヌクレオチド、または７０個のヌクレオチド後にリンカーを有する１００個のヌクレオチドのいずれかのポリ（Ａ）尾部をコードする。

【0745】

別のワクチンＲＮＡ構築物は、ヒトＴＲＰ２のＭＨＣクラスＩＩ提示エピトープであるＴＲＰ２_{８８－１０２}（ＲＫＦＦＨＲＴＣＫＣＴＧＮＦＡ）に融合したマウスチロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２）であるＴＲＰ２_{１８０－１８８}（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ）のＨ２－Ｋｂ拘束性エピトープ（Ｋｉａｎｉｚａｄ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６７，６４５９－６４６７）、続いてＦＩ要素（ＦはスプリットＲＮＡのアミノ末端エンハンサの１３６ヌクレオチド長の３’－ＵＴＲ断片であり、Ｉはミトコンドリアにコードされた１２Ｓ ＲＮＡの１４２ヌクレオチド長の断片であり、両方ともホモサピエンスで同定される；国際公開第２０１７／０６０３１４号）と呼ばれる３’ ＵＴＲ、続いて７０個のヌクレオチド後にリンカーを有する１００個のヌクレオチドのいずれかのポリ（Ａ）尾部をコードする。

【0746】

非コードＲＮＡ（対照ＲＮＡ）は、ヒトβグロビンの２つの連続した配列の３’ＵＴＲと、７０個のヌクレオチド後にリンカーを有する１００個のヌクレオチドのポリＡ尾部と、抗原配列の代わりにＧＳリンカー（ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ）とを含む。

【0747】

ワクチンＲＮＡ構築物は、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩエピトープの提示を改善するために、小胞体へのルーティングのための分泌シグナルと、Ｋｒｅｉｔｅｒらによって記載されたヒト配列に基づくマウスＭＨＣクラスＩに由来する小胞体および膜貫通ドメイン（ＭＩＴＤ）を備えている（Ｋｒｅｉｔｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０，３０９－３１８）。ワクチンＲＮＡを、記載されるようにインビトロ転写によって生成し（Ｋｒｅｉｔｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５６，１５７７－１５８７）、β－Ｓ－ＡＲＣＡキャップ０でキャップした（Ｋｕｈｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１７，９６１－９７１）。修飾ＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）を合成するために、ヌクレオシドウリジンをｍ１ψで置換した（Ｐａｒｄｉ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ ２１７，３４５－３５１）。精製するために、二本鎖ＲＮＡを枯渇させた（Ｂａｉｅｒｓｄｏｒｆｅｒ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ １５）。ＲＮＡをＨ_２Ｏで溶出し、さらに使用するまで－８０℃で保存した。

【0748】

ワクチンＲＮＡを、ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥで構成されるリポソームと製剤化して、負の正味電荷を有するＲＮＡ－ＬＰＸを得た（Ｋｒａｎｚ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ ５３４，３９６－４０１）。ＲＮＡ－ＬＰＸは、滅菌およびＲＮａｓｅフリー条件下でＴＲＯＮ ｇＧｍｂＨで調製し、すなわち、使用前に全ての機器をオートクレーブ処理し、全ての表面をＲＮａｓｅＺＡＰ（登録商標）に浸した布で拭いた。ＲＮＡストック溶液のバイアルを解凍し、水、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１．５Ｍ ＮａＣｌおよびＬ２リポソームで連続的に希釈した。各添加の直後にバイアルをボルテックスし、全ての成分を添加した後、周囲温度で１０分間インキュベートした。

【0749】

【表3】

【0750】

サイトカインをコードするＲＮＡのインビトロ転写は、ｐＳＴ１－Ｔ７－ＡＧＡ－ｄＥａｒＩ－ｈＡｇ－ＭＣＳ－ＦＩ－Ａ３０ＬＡ７０プラスミド骨格および誘導体ＤＮＡ構築物に基づいた。これらのプラスミド構築物は、５’ＵＴＲ（ヒト（ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ｈＡｇの５’－ＵＴＲの誘導体）、３’ＦＩ要素、および７０個のヌクレオチド後にリンカーを有する１００個のヌクレオチドのポリＡ尾部を含む。サイトカインおよび血清アルブミンをコードする配列はハツカネズミ（ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）に由来し、得られたアミノ酸配列に変化は導入されなかった。アルブミンを成熟ＩＬ２配列のＮ末端に導入した（ＩＬ－２のシグナルペプチドはコードされなかった）。終止コドンは、ほとんどのＣ末端部分についてのみ導入された。サイトカインおよびアルブミン融合構築物の異なるタンパク質部分は、グリシンおよびセリン残基をコードする３０ヌクレオチド長のリンカー配列によって分離された。

【0751】

対照サイトカインＲＮＡは血清アルブミンのみをコードした。

【0752】

サイトカインＲＮＡを上記のようにインビトロ転写によって生成した。通常のヌクレオシドウリジンを１－メチル－プソイドウリジンで置換した。サイトカインＲＮＡはキャップ１構造を備えており、上記のように二本鎖ＲＮＡ分子を枯渇させた。精製したサイトカインｍＲＮＡをＨ_２Ｏで溶出し、さらなる使用まで－８０℃で保存した。

【0753】

サイトカインＲＮＡは、滅菌およびＲＮａｓｅフリー条件下で、ＴＲＯＮ ｇＧｍｂＨにおいてＴｒａｎｓＩＴ（Ｍｉｒｒｕｓ）を用いて製剤化し、すなわち、使用前に全ての機器をオートクレーブ処理し、全ての表面をＲＮａｓｅＺＡＰ（登録商標）に浸した布で拭いた。ＲＮＡストック溶液のバイアルを解凍し、ＩＶ注射の直前に製造業者の指示に従って連続的に製剤化した。

【0754】

記載されている全てのＲＮＡ構築物のインビトロ転写および製剤化は、ＢｉｏＮＴｅｃｈ ＳＥで実施された。

【0755】

実施例２：方法
血清アルブミンとＩＬ－２との融合タンパク質をコードし、ＴｒａｎｓＩＴを用いて製剤化されたＲＮＡ－ＬＰＸおよびサイトカインＲＮＡを、２９Ｇ針を備えた３／１０ｃｃインスリン注射器を使用してＩＶ投与した。ＩＶ注射の前に、マウスを酸素中２．５％イソフルランの吸入によって麻酔した。抗ＰＤ－１（クローンＲＭＰ１－１４、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）および抗ＰＤ－Ｌ１（クローンＭＰＤＬ３２８０Ａ［ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ］）抗体、ならびにそれらの対応するアイソタイプ対照（ラットＩｇＧ２ａ［クローン２Ａ３、ＢｉｏＸＣｅｌｌ］およびｍＩｇＧ１［クローンＭＯＰＣ－２１、ＢｉｏＸＣｅｌｌ］）をＩＰ投与した。

【0756】

Ｂ１６－Ｆ１０は、ＴＲＰ２を発現するマウスメラノーマ細胞株であり、２０１０年に購入した（ＡＴＣＣＣＲＬ－６４７５、ロット番号５８０７８６４５）。マスターおよび作業細胞バンクを、受領直後に遺伝子導入し、そのうちの３回目および４回目の継代を腫瘍実験に使用した。細胞を３ヶ月ごとにマイコプラズマについて試験した。受領後、細胞の再確認は行わなかった。

【0757】

３×１０^５個のＢ１６－Ｆ１０腫瘍細胞を右側腹部にＳＣ接種した。腫瘍サイズを、式（ａ２×ｂ）／２（ａ、幅；ｂ、長さ）を使用して腫瘍体積を計算するために、３～４日ごとにノギスを用いて非盲検で測定した。健康障害の徴候を示した場合、または腫瘍の長さが１５ｍｍを超えた場合、動物を安楽死させた。

【0758】

採血は、顔面静脈を介して、または後眼窩神経叢から行った。簡単に記載すると、事前の麻酔なしに、顔面静脈を介して血液をサンプリングした。マウスをしっかりと保持し、ランセットを使用して、顔面静脈を正確かつ短い動きで穿刺した。後眼窩洞からの採血のために、Ｏ_２とイソフルランの混合物（２．５％）を含む誘導チャンバ内でマウスを麻酔し、後眼窩神経叢にガラスマイクロヘマトクリットチューブを穿刺した。フローサイトメトリー用のヘパリンチューブに血液を採取した。続いて、拘束グリップを緩めた。

【0759】

脾臓採取のために、マウスを安楽死させ、７０％エタノールで消毒し、腹部切開から始めて解剖を行った。脾臓を収集し、その後の単一細胞調製物のために氷上でＰＢＳ中に保存した。

【0760】

単一細胞懸濁液を標準的な手順に従って調製した。シリンジのプランジャを用いて７０μｍセルストレーナで脾臓をすり潰して、脾細胞をチューブ内に放出した。細胞を過剰量のＰＢＳで洗浄し、続いて周囲温度で６分間、３００×ｇで遠心分離し、上清を廃棄した。赤血球溶解緩衝液（１５４ｍＭ ＮＨ_４Ｃｌ、１０ｍＭ ＫＨＣＯ_３、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いて、周囲温度で５分間、赤血球を溶解した。過剰量のＰＢＳで反応を停止させた。さらなる洗浄工程の後、細胞をＤＣ培地（ＲＰＭＩ培地１６４０（１×）＋ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０％ＦＢＳ、１％ＮＥＡＡ、１％ピルビン酸ナトリウム、０．５％ペニシリン／ストレプトマイシン、５０μＭ ２－メルカプトエタノール）に再懸濁し、再び７０μｍ細胞メッシュを通過させ、計数し、さらなる使用まで４℃で保存した。

【0761】

フローサイトメトリー分析のために、各マウスから採取した５０μＬの血液を９６ウェルプレートに移し、滴定量の抗体で染色した。

【0762】

細胞外染色のために、以下の抗体を使用した：ラット抗マウスＣＤ１２７（クローンＡ７Ｒ３４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ラット抗マウスＣＤ２５（クローンＰＣ６１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ラット抗マウスＣＤ４（クローンＲＭ４－５、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ラット抗マウスＣＤ８（クローン５Ｈ１０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ハムスター抗マウスＫＬＲＧ１（クローン２Ｆ１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびハムスター抗マウスＰＤ－１（クローンＪ４３、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の検出のために、ＯＶＡ_{２５７－２６４}（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を検出するためのＨ２－Ｋｂ拘束性ＭＨＣテトラマー（ＭＢＬ Ｌｔｄ．）およびＴＲＰ－２_{１８０－１８８}（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ）特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を検出するためのＨ－２Ｋｂ拘束性ＭＨＣテトラマー（ＭＢＬ Ｌｔｄ．）を使用した。細胞外染色手順を２～８℃で３０分間実施した。その後、ＢＤ溶解緩衝液を添加し、混合し、暗所にて周囲温度で６～８分間インキュベートした。遠心分離（５分間、４６０×ｇ、周囲温度）後、細胞をＰＢＳ（５分間、４６０×ｇ、周囲温度）で１回洗浄し、フロー緩衝液（５ｍＭ ＥＤＴＡおよび５％ＦＢＳを補充したＰＢＳ）に再懸濁した。試料を測定まで２～８℃で保存した。

【0763】

核内染色のために、細胞を３０分間固定し（Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ緩衝液、ＦｏｘＰ３／転写因子染色緩衝液セット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））、２～８℃で３０分間透過処理した（Ｐｅｒｍ緩衝液、ＦｏｘＰ３／転写因子染色緩衝液セット［ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ］）。透過処理した細胞をＦｃブロックで細胞内処理し、Ｐｅｒｍ緩衝液中のラット抗マウスＦｏｘＰ３（クローンＦＪＫ－１６ｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２～８℃で３０分間染色した。細胞をＰＢＳ（５分間、４６０×ｇ、４℃）で２回洗浄し、フロー緩衝液に再懸濁した。試料を測定まで２～８℃で保存した。

【0764】

Ｔ細胞の細胞内サイトカイン染色のために、４×１０^６個の脾臓細胞を９６ウェルプレートに蒔き、ＭＨＣテトラマーで染色して、ＴＲＰ－２_{１８０－１８８}（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ）特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を検出した。その後、細胞を、２μｇ／ｍＬの最終濃度のＴＲＰ－２_{１８０－１８８}（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ）ペプチドまたは対照としての細胞培養培地（ペプチドなし）を用いてエクスビボで再刺激した。細胞を、１０μｇ／ｍＬの最終濃度のブレフェルジンＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐおよびＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（いずれもＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の存在下で５時間再刺激した。細胞をＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色し、フロー緩衝液（２％ウシ胎児血清［ＦＣＳ］、２ｍＭ ＥＤＴＡ［いずれもＳｉｇｍａ］および０．０１％アジ化ナトリウム［Ｍｏｒｐｈｉｓｔｏ］を添加したダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水［Ｇｉｂｃｏ］）中Ｆｃブロックの存在下、２～８℃で３０分間、上記の直接標識抗体で表面マーカに対して細胞外染色した。細胞をＰＢＳ（５分間、４６０×ｇ、４℃）で１回洗浄し、３０分間固定し（Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ緩衝液、ＦｏｘＰ３／転写因子染色緩衝液セット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））、２～８℃で３０分間透過処理した（Ｐｅｒｍ緩衝液、ＦｏｘＰ３／転写因子染色緩衝液セット［ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ］）。透過処理した細胞をＦｃブロックで細胞内処理し、Ｐｅｒｍ緩衝液中のラット抗マウスＩＮＦγ（クローンＸＭＧ１．２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で２～８℃で３０分間染色した。細胞をＰＢＳ（５分間、４６０×ｇ、４℃）で２回洗浄し、フロー緩衝液に再懸濁した。試料を測定まで２～８℃で保存した。

【0765】

ＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩまたはＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータでデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョン１０．３およびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９で分析した。

【0766】

実施例３：ｍｏｄＲＮＡによるワクチン接種は、ｕＲＮＡによるワクチン接種と比較して、ワクチン誘導抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＰＤ－１発現の増強をもたらす
ＰＤ－１はＴ細胞上の阻害性表面受容体であり、活性化すると上方制御される。腫瘍における腫瘍特異的Ｔ細胞上のこの免疫チェックポイントの持続的発現は、これらのＴ細胞が腫瘍細胞上のそれらのリガンドＰＤ－Ｌ１に結合するので、Ｔ細胞疲弊に関連することが示されている。抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫チェックポイント阻害（ＣＰＩ）は、阻害性ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸の確立を防ぎ、抗腫瘍免疫応答を再活性化または増強することができる。いくつかのＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１特異的抗体が、メラノーマおよび他の固形腫瘍の処置のために承認されている。

【0767】

高いＰＤ－１発現を有するＴ細胞は、高い抗原親和性を有すると考えられる。その結果、特にこれらのＰＤ－１＋Ｔ細胞は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸の阻害から利益を得るはずである。

【0768】

本発明者らはまず、ワクチン誘導ワクチン抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＰＤ－１の発現レベルに対するヌクレオシド修飾およびｄｓＲＮＡ精製の影響を決定した。

【0769】

Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３／群および時点）に、Ｈ－２Ｋｂ拘束性エピトープＯＶＡ_{２５７－２６４}（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）をコードするｍｏｄＲＮＡまたはｕＲＮＡからなる２０μｇのＲＮＡ－ＬＰＸを０日目および７日目にＩＶで２回ワクチン接種した。対照マウスにＮａＣｌを投与した。ワクチン誘導ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＰＤ－１の発現を、各ワクチン接種の３、５および７日後に脾臓で分析した。２回目のワクチン接種の５日後に、ワクチン誘導ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＰＤ－１の発現を血液中で分析した。ＰＤ－１発現をフローサイトメトリーによって測定した（実施例２参照）。

【0770】

抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は脾臓で測定可能であり、全ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合はワクチン接種の５日後という早い段階で１％超であった（図１ａ）。ｕＲＮＡによるワクチン接種後、対照マウスにおける全ＣＤ８＋Ｔ細胞の約２％と比較して、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の平均６８％がＰＤ－１を発現した。対照的に、ｍｏｄＲＮＡによるワクチン接種によって誘導した場合、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の平均８０％がＰＤ－１を発現した。ｕＲＮＡ誘導ＰＤ－１＋画分とｍｏｄＲＮＡ誘導ＰＤ－１＋画分との間の差は、７日目まで続いた。２回目のワクチン接種時に、ＰＤ－１＋抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の画分は、ｕＲＮＡに応答して低下し（平均４０％；１０日目）、一方、ｍｏｄＲＮＡに応答してさらに増加した（平均８８％；１０日目）。おそらく、ＰＤ－１＋抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞がワクチン接種後３日目頃に脾臓を出て循環に入り始めるため、ＰＤ－１＋細胞の画分はこの時点後に低下した。

【0771】

抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＰＤ－１の発現レベルを分析すると、非常に類似した差が検出され（図１ｂ）、ｕＲＮＡによるワクチン接種は、対照マウスの全ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＰＤ－１発現（平均ＭＦＩ １２５；３日目）と比較して、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＰＤ－１の発現増加をもたらした（平均ＭＦＩ １，２５６）。ｍｏｄＲＮＡによるワクチン接種に応答して、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＰＤ－１発現は明らかに増強された（平均ＭＦＩ ２，２９８）。７日目に、発現レベルの差は同様であった。２回目のワクチン接種時に、ＰＤ－１発現はｕＲＮＡに応答して減少したが（平均ＭＦＩ ８９８；１０日目）、ｍｏｄＲＮＡに応答してさらにわずかに増加した（平均ＭＦＩ ２，５３１；１０日目）。

【0772】

これらの観察と一致して、２回目のワクチン接種の５日後に血液中で検出可能な抗原特異的Ｔ細胞は、ｕＲＮＡと比較してｍｏｄＲＮＡによるワクチン接種によって誘導された場合、より高いレベルのＰＤ－１を発現した（平均ＭＦＩ １，１９８対４４８；図１ｃ）。

【0773】

まとめると、ｍｏｄＲＮＡによるワクチン接種は、ワクチン誘導抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の中のＰＤ－１＋細胞の割合を増加させるだけでなく、この集団におけるＰＤ－１発現レベルを増強する。

【0774】

実施例４：ｍｏｄＲＮＡワクチン接種の効力は、特に自己抗原に対してワクチン接種する場合、チェックポイント遮断との組合せによって増強される
腫瘍細胞に加えて、抗原提示細胞は、Ｔ細胞プライミング中にＰＤ－Ｌ１を一時的に発現する。抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＰＤ－１発現がプライミング中に実質的に上昇することを発見したので（実施例３参照）、本発明者らは、これらのＴ細胞が抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による処理から利益を得るかどうかを調査しようと努めた。

【0775】

Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５／群）に、Ｈ－２Ｋｂ拘束性エピトープＯＶＡ_{２５７－２６４}（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）をコードするｍｏｄＲＮＡからなる１または１０μｇのＲＮＡ－ＬＰＸを（０日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目）にＩＶで５回ワクチン接種し、２００μｇの抗ＰＤ－Ｌ１抗体で同時にＩＰ処置した。対照マウスにｍｏｄＲＮＡおよびアイソタイプ、またはＮａＣｌを投与した。２回目のワクチン接種以降、各ワクチン接種の５日後（１２、１９、２６および３３日目）、血液中の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって分析した（実施例２参照）。

【0776】

１μｇのｍｏｄＲＮＡ単独によるワクチン接種は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導し、その割合は、４回目のワクチン接種後に平均２０％のプラトーに達するまでさらなるワクチン接種ごとに増加した（２６日目；図２ａ、左）。対照的に、ｍｏｄＲＮＡワクチン接種と付随する抗ＰＤ－Ｌ１抗体処置との組合せは、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導を増強し、ｍｏｄＲＮＡ単独と比較して各時点で抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合をおよそ２倍（約１．７～２．２倍）にした。

【0777】

１０μｇのｍｏｄＲＮＡ単独によるワクチン接種は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導において１μｇよりもはるかに強力であり、最初のプライミング期（２回のワクチン接種後、１２日目）後の全ＣＤ８＋Ｔ細胞の平均割合は、６％と比較して、１８％であった（図２ａ、右）。抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、３回目のワクチン接種で３７％の平均割合までさらに増加した。より高い用量のｍｏｄＲＮＡは、低用量単独よりもはるかに高い割合の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導することができたが、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は、ｍｏｄＲＮＡと抗ＰＤ－Ｌ１抗体処理との組合せからさらに利益を得て、約１．５～２．３倍の割合増加をもたらした。

【0778】

自己抗原は、外来（病原体由来、変異）抗原とは対照的に、中枢性および末梢性寛容機構によって望ましくないＴ細胞攻撃から保護される。それらは腫瘍細胞によっても発現されるので、主にワクチン抗原として作用することができる。これらの耐性機構を克服し、腫瘍に対するそのような自己反応性Ｔ細胞を増殖させるために、強力な治療が必要である。

【0779】

本発明者らは、ｍｏｄＲＮＡとＣＰＩとの組合せが自己抗原に対するＴ細胞応答を増強することができるかどうかを決定することに着手した。

【0780】

Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５／群）に、ヒトＴＲＰ２のＭＨＣクラスＩＩ提示エピトープであるＴＲＰ_{８８－１０２}（ＲＫＦＦＨＲＴＣＫＣＴＧＮＦＡ）に融合したＴＲＰ２_{１８０－１８８}（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ）をコードするｍｏｄＲＮＡからなる２０μｇのＲＮＡ－ＬＰＸを（０日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目）にＩＶで５回ワクチン接種し、２５０μｇの抗ＰＤ－１抗体で同時にＩＰ処置した。対照マウスにｍｏｄＲＮＡおよびアイソタイプ、またはＮａＣｌを投与した。３回目のワクチン接種後を除いて各ワクチン接種の５日後（５、１２、２６、および３３日目）、血液中の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって分析した（実施例２参照）。

【0781】

抗ＰＤ－１抗体を伴うまたは伴わないｍｏｄＲＮＡによるワクチン接種は、１回目のワクチン接種から対照レベルを超える自己抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の検出可能な割合を誘導し、これはさらなるワクチン接種ごとに増加した。注目すべきことに、ｍｏｄＲＮＡワクチン接種と抗ＰＤ－１抗体処置との組合せは、外来抗原に対するワクチン接種で観察された所見を確認することができた（図２ａ参照）。抗ＰＤ－１抗体との組合せは、自己抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合をｍｏｄＲＮＡ単独によって誘導された割合を超えて増加させ、５回のワクチン接種後には、全ＣＤ８＋Ｔ細胞中の自己抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の最大の平均割合１６％に達した（３３日目、図２ｂ）。特に興味深いことに、自己抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は、ｍｏｄＲＮＡ単独によって誘導される割合の４倍超であり、ｍｏｄＲＮＡワクチン接種とＣＰＩとの組合せが自己抗原に対する寛容を克服するのに特に適している可能性があることを示唆している。

【0782】

要約すると、腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導するｍｏｄＲＮＡワクチン接種の効力は、ＣＰＩとの組合せから明らかに利益を得ており、２つの組合せは、自己抗原に対してワクチン接種する場合に特に興味深い可能性がある。

【0783】

実施例５：ｍｏｄＲＮＡワクチン接種とチェックポイント遮断との組合せは、ｍｏｄＲＮＡワクチン接種単独と比較して治療的抗腫瘍活性を増強する
本発明者らは、ＣＰＩによる処置が、ｍｏｄＲＮＡワクチン接種によって誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫、特に自己抗原に対する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫を増強することを見出した（実施例４参照）。この知見により、本発明者らは、治療的抗腫瘍活性に対するこの組合せの影響を調査することを試みた。

【0784】

Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝１０／群）にＢ１６－Ｆ１０腫瘍細胞をＳＣ接種し、腫瘍接種後９日目から６５日目まで、ヒトＴＲＰ２のＭＨＣクラスＩＩ提示エピトープであるＴＲＰ_{８８－１０２}（ＲＫＦＦＨＲＴＣＫＣＴＧＮＦＡ）に融合したＴＲＰ２_{１８０－１８８}（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ）をコードするｍｏｄＲＮＡからなる１０μｇのＲＮＡ－ＬＰＸをＩＶで毎週ワクチン接種した。マウスを抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはアイソタイプ対照（初回処置：１０ｍｇ／ｋｇ、連続処置：５ｍｇ／ｋｇ）で同時にＩＰ処置した。対照マウスには、抗ＰＤ－Ｌ１抗体と共に対照ＲＮＡを投与した。実施例２に記載するように腫瘍成長を監視した。

【0785】

ｍｏｄＲＮＡのみをワクチン接種したマウスは、腫瘍成長を制御することができず（図３ａ）、生存期間の中央値は２８日であった（図３ｂ）。しかしながら、ｍｏｄＲＮＡと抗ＰＤ－Ｌ１抗体との組合せは、腫瘍の成長を遅延させ、３７日の生存期間中央値をもたらした。注目すべきことに、この組合せは、１匹のマウスにおいて長期生存をもたらし、このマウスは１００日目まで継続した処置を受け、１７５日目まで生存した。抗ＰＤ－Ｌ１抗体単独では、ｍｏｄＲＮＡ単独と同様の腫瘍成長動態を示し、ｍｏｄＲＮＡ単独とｍｏｄＲＮＡと抗ＰＤ－Ｌ１抗体との組合せとの間の生存期間中央値を示した（３４日間）。

【0786】

結論として、ｍｏｄＲＮＡワクチン接種とＣＰＩとの組合せは、（自己）抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導を増強し、これは治療的抗腫瘍活性の増強と相関する。

【0787】

実施例６：ｍｏｄＲＮＡワクチン接種とチェックポイント遮断との組合せへのＩＬ－２の添加は、二重の組合せと比較して、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導および治療的抗腫瘍活性を増強する
ｍｏｄＲＮＡワクチン接種とＣＰＩとの組合せがｍｏｄＲＮＡ単独と比較して改善された抗腫瘍活性を提供することができることを示したので（実施例５参照）、本発明者らは次に、重要なＴ細胞サイトカインＩＬ－２の添加が抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫および治療的抗腫瘍活性をさらに促進し得るかどうかを調査した。

【0788】

Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝７／群）に、ヒトＴＲＰ２のＭＨＣクラスＩＩ提示エピトープであるＴＲＰ_{８８－１０２}（ＲＫＦＦＨＲＴＣＫＣＴＧＮＦＡ）に融合したＴＲＰ２_{１８０－１８８}（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ）をコードするｍｏｄＲＮＡからなる２０μｇのＲＮＡ－ＬＰＸを（０日目、７日目、１４日目）にＩＶで３回ワクチン接種し、２回目および３回目のワクチン接種と同時に、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ－１抗体またはアイソタイプ対照をＩＰで、および３μｇのＩＬ－２またはアルブミン対照をＩＶで処置した。対照マウスにＮａＣｌを投与した。３回目のワクチン接種の５日後（１９日目）、血液中および脾臓中の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって分析した（実施例２参照）。

【0789】

ｍｏｄＲＮＡと抗ＰＤ－１抗体との組合せによるワクチン接種は、３回のワクチン接種後の血液中の全ＣＤ８＋Ｔ細胞の中の６％の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の平均割合を誘導した（１９日目；図４ａ、左）。この組合せへのＩＬ－２の添加により、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が平均４５％まで高まった。同様に、ｍｏｄＲＮＡワクチン接種および抗ＰＤ－１抗体によって誘導された９％抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の平均割合は、脾臓で約５倍～４１％増加した（図４ａ、右）。

【0790】

三重の組合せに応答した強力な拡大により、ｍｏｄＲＮＡワクチン接種および抗ＰＤ－１と比較して、制御性Ｔ細胞対抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の比は１．６から６．４へと大幅に増加した（図４ｂ）。

【0791】

興味深いことに、ＩＬ－２の添加により、ｍｏｄＲＮＡワクチン接種と抗ＰＤ－１との二重の組合せと比較して、同族ペプチドでエクスビボ再刺激した場合、全ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮγ分泌抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が拡大した（図４ｃ）。

【0792】

これらの知見は、三重の組合せが機能的（自己）抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の生成において優れていることを示している。

【0793】

次に、本発明者らは、これらの効果が治療的抗腫瘍活性の改善につながるかどうかを決定した。

【0794】

Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝１０／群）にＢ１６－Ｆ１０腫瘍細胞をＳＣ接種し、腫瘍接種後８日目から９１日目まで、ヒトＴＲＰ２のＭＨＣクラスＩＩ提示エピトープであるＴＲＰ_{８８－１０２}（ＲＫＦＦＨＲＴＣＫＣＴＧＮＦＡ）に融合したＴＲＰ２_{１８０－１８８}（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ）をコードするｍｏｄＲＮＡからなる１０μｇのＲＮＡ－ＬＰＸをＩＶで毎週ワクチン接種した。マウスを抗ＰＤ－Ｌ１抗体（初回処置：１０ｍｇ／ｋｇ、連続処置：５ｍｇ／ｋｇ）で同時にＩＰ処置し、各ワクチン接種／抗ＰＤ－Ｌ１処置の２日後に１μｇのＩＬ－２またはアルブミン対照でＩＶ処置した。実施例２に記載するように腫瘍成長を監視した。

【0795】

抗ＰＤ－Ｌ１抗体処置と組み合わせたｍｏｄＲＮＡによるワクチン接種により、一部のマウスにおいて腫瘍成長が遅延し、１匹の完全奏効が認められた（図５ａ）。対照的に、二重の組合せへのＩＬ－２の添加により、完全奏効数が３匹に増加し、全生存率が１０から３０％に増加した（図５ｂ）。

【0796】

驚くべきことに、ＩＬ－２を含む三重の組合せは、治療によって誘導された自己反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＴＲＰ２を発現する腫瘍細胞だけでなくＴＲＰ２を発現する健常メラノサイトも死滅させた結果として、進行性白斑をもたらした（図５ｃ）。ＩＬ－２を含まないｍｏｄＲＮＡワクチン接種と抗ＰＤ－Ｌ１療法との二重の組合せでは、白斑は観察されなかった。

【0797】

自己免疫の誘導は、三重の組合せが自己抗原に対するＴ細胞寛容を破壊することができることを印象的に示し、治療によって誘導された抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の強度および細胞傷害力を可視化する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

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【国際調査報告】