特表 2024-537805 ヒト化抗Ｃ５ａ抗体とその利用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-16

(54)【発明の名称】ヒト化抗Ｃ５ａ抗体とその利用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/18 20060101AFI20241008BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20241008BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241008BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241008BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241008BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241008BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241008BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20241008BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20241008BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241008BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241008BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20241008BHJP

   A61P 13/00 20060101ALI20241008BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20241008BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20241008BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20241008BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20241008BHJP

   A61P 19/00 20060101ALI20241008BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20241008BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20241008BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20241008BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20241008BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20241008BHJP

【ＦＩ】

C07K16/18 ZNA

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

C12Q1/02

A61K39/395 N

A61K39/395 D

A61P43/00

A61P1/00

A61P13/00

A61P17/00

A61P11/00

A61P25/00

A61P31/00

A61P19/00

A61P21/00

A61P9/00

A61P7/00

A61P29/00

A61P27/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024519667

(86)(22)【出願日】2022-09-28

(85)【翻訳文提出日】2024-05-27

(86)【国際出願番号】 CN2022122283

(87)【国際公開番号】W WO2023051642

(87)【国際公開日】2023-04-06

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/121959

(32)【優先日】2021-09-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500429103

【氏名又は名称】ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア

(71)【出願人】

【識別番号】524119532

【氏名又は名称】キラ ファーマシューティカルズ（スーチョウ）リミティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100225598

【弁理士】

【氏名又は名称】桐島 拓也

(72)【発明者】

【氏名】ピン ツイ

(72)【発明者】

【氏名】チャン チアンチュン

(72)【発明者】

【氏名】チュー シーホア

(72)【発明者】

【氏名】チー シーカン

(72)【発明者】

【氏名】ウェンチャオ ソン

(72)【発明者】

【氏名】三輪 隆史

(72)【発明者】

【氏名】佐藤 さやか

(72)【発明者】

【氏名】ダモダラ ラオ グッリパッリ

【テーマコード（参考）】

4B063

4B064

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA19

4B063QQ08

4B063QR48

4B063QR77

4B063QR90

4B063QS33

4B064AG27

4B064CA02

4B064CA05

4B064CA06

4B064CA08

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B064DA13

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA57X

4B065AA57Y

4B065AA72X

4B065AA72Y

4B065AA83X

4B065AA83Y

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

4B065CA46

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB11

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA09

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

ヒト化抗Ｃ５ａ抗体を用いて補体シグナル伝達の阻害が提供される。個体における補体関連疾患または補体関連障害を、前記個体を前記ヒト化抗Ｃ５ａ抗体と接触させることによって治療する方法が提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトのＣ５ａとＣ５に特異的に結合する単離されたヒト化抗体であって、変異Ｉ４８Ｍ、Ｄ５４Ｅ、およびＮ５６Ｗを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、変異Ｄ２８ＥとＤ３０Ｆを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む（ただし前記ＶＨ変異はＫａｂａｔ番号付けシステムの下で配列番号１を参照し、前記ＶＬ変異はＫａｂａｔ番号付けシステムの下で配列番号２を参照する）とともに、
ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（「Ｈ－ＣＤＲ１」）、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアント；
ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（「Ｈ－ＣＤＲ２」）、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアント；
ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（「Ｈ－ＣＤＲ３」）、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアント；
ｉｖ）配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（「Ｌ－ＣＤＲ１」）、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアント；
ｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（「Ｌ－ＣＤＲ２」）、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアント；および
ｖｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（「Ｌ－ＣＤＲ３」）、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む抗体。

【請求項2】

ＶＨ内の変異Ｆ２９Ｈと前記ＶＬ内の変異Ｙ９６Ｈをさらに含む（ただし前記ＶＨ変異はＫａｂａｔ番号付けシステムの下で配列番号１を参照し、前記ＶＬ変異はＫａｂａｔ番号付けシステムの下で配列番号２を参照する）、請求項１に記載の抗体。

【請求項3】

前記ＶＨまたはＶＬの中に置換をさらに含む、請求項２に記載の抗体。

【請求項4】

前記変異の選択が、ＶＨのＥ５４Ｈ、ＶＨのＮ９７Ｈ、ＶＬのＮ９２Ｈからなるグループからなされる（ただし前記ＶＨ変異はＫａｂａｔ番号付けシステムの下で配列番号１を参照し、前記ＶＬ変異はＫａｂａｔ番号付けシステムの下で配列番号２を参照する）、請求項３に記載の抗体。

【請求項5】

ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨ、または配列番号９と少なくとも約８５％一致するそのバリアントと；
ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬ、または配列番号１０と少なくとも約８５％一致するそのバリアントを含む、請求項１に記載の抗体。

【請求項6】

ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｉｖ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ２；および
ｖｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ３を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体。

【請求項7】

ｉ）アミノ酸配列配列番号１７を含むＶＨと；
ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項６に記載の抗体。

【請求項8】

ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｉｖ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ２；および
ｖｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ３を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体。

【請求項9】

ｉ）アミノ酸配列配列番号２５を含むＶＨと；
ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項８に記載の抗体。

【請求項10】

ｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｉｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｉｖ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ２；および
ｖｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ３を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体。

【請求項11】

ｉ）アミノ酸配列配列番号３３を含むＶＨと；
ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項１０に記載の抗体。

【請求項12】

完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、およびｓｃＦｖからなるグループから選択される、請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体。

【請求項13】

Ｆｃ領域をさらに含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体。

【請求項14】

前記Ｆｃ領域がＩｇＧ４配列を含む、請求項１３に記載の抗体。

【請求項15】

前記Ｆｃ領域が配列番号４３のアミノ酸配列またはそのバリアントを含む、請求項１４に記載の抗体。

【請求項16】

前記Ｆｃ領域が、Ｓ２２８Ｐ、Ｍ４２８Ｌ、およびＮ４３４Ａからなるグループから選択される１つ以上の変異を含む（ただし前記変異はＥＵ番号付けシステムの下で配列番号４３と比較する）、請求項１５に記載の抗体。

【請求項17】

前記Ｆｃ領域が変異Ｓ２２８Ｐ、Ｍ４２８Ｌ、およびＮ４３４Ａを含む、請求項１６に記載の抗体。

【請求項18】

前記Ｆｃ領域が配列番号４４のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の抗体。

【請求項19】

請求項１～１８のいずれか１項に記載の抗体において、Ｃ５から解離する前記抗体の低ｐＨ解離因子が約４０％～約７０％である、抗体。

【請求項20】

請求項１～１９のいずれか１項に記載の抗体において、Ｃ５から解離する前記抗体の中性ｐＨ解離因子が約０％～約１０％である、抗体。

【請求項21】

中性ｐＨ解離に対する低ｐＨ解離の比が６以上である、請求項１～２０のいずれか１項に記載の抗体。

【請求項22】

ヒトのＣ５ａとＣ５ａＲの間の結合を阻害する、請求項１～２１のいずれか１項に記載の抗体。

【請求項23】

ヒトにおいて少なくとも約２５日間の血清半減期を持つ、請求項１～２２のいずれか１項に記載の抗体。

【請求項24】

ＣＨＯ細胞の中で作製される、請求項１～２３のいずれか１項に記載の抗体。

【請求項25】

配列番号４６～５３のいずれか１つの配列を含む、請求項１～２４のいずれか１項に記載の抗体をコードする核酸。

【請求項26】

請求項２５に記載の核酸を含むベクター。

【請求項27】

請求項２６に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項28】

請求項１～２７のいずれか１項に記載の抗体を、細胞による前記抗体の発現を可能にするのに十分な条件下で生成させる方法。

【請求項29】

請求項１～２４のいずれか１項に記載の抗体と、医薬として許容可能な基剤とを含む医薬組成物。

【請求項30】

補体関連の疾患または状態を持つ個体を治療する方法であって、請求項２９に記載の医薬組成物を有効な量で前記個体に投与することを含む方法。

【請求項31】

前記疾患または障害の選択が、黄斑変性症（ＭＤ）、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、虚血再灌流損傷、関節炎、関節リウマチ、ループス、潰瘍性大腸炎、脳卒中、術後の全身性炎症性症候群、喘息、アレルギー性喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）症候群、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、ゴーシェ病、重症筋無力症、視神経脊髄炎、（ＮＭＯ）、多発性硬化症、移植後臓器機能障害、抗体関連型拒絶反応、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、網膜中心動脈閉塞症（ＣＲＡＯ）、表皮水泡症、敗血症、敗血症性ショック、臓器移植、炎症（その非限定的な例に、心肺バイパス手術と腎臓透析に関連する炎症が含まれる）、Ｃ３腎症、膜性腎症、ＩｇＡ腎症、糸球体腎炎（その非限定的な例に、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連糸球体腎炎、ループス腎炎、およびこれらの組み合わせが含まれる）、ＡＮＣＡ関連血管炎、志賀毒素誘導性ＨＵＳ、および抗リン脂質抗体誘導性妊娠喪失、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、水泡性類天疱瘡、化膿性汗腺炎、疱疹状皮膚炎、スウィート症候群、壊疽性膿皮症、掌蹠膿胞症と膿胞性乾癬、リウマチ性好中球性皮膚症、角層下膿胞症、腸関連皮膚症－関節炎症候群、好中球性エクリン汗腺炎、線状ＩｇＡ病、またはこれらの任意の組み合わせからなるグループから少なくともなされる、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

個体において補体系の活性を低下させる方法であって、請求項２９に記載の医薬組成物を有効な量で前記個体に投与することを含む方法。

【請求項33】

カニクイザルのＣ５ａまたはＣ５と交差反応する、請求項１～２４のいずれか１項に記載の抗体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連する出願の相互参照
本出願は、２０２１年９月２９日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／１２１９５９の優先権と恩恵を主張するものであり、その開示はその全体が参照によって本明細書に組み込まれている。

【0002】

ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列リストの提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出物の内容はその全体が参照によって本明細書に組み込まれている：コンピュータ可読形態（ＣＲＦ）の配列リスト（ファイル名：７９２２５２０００９４１ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２２年９月２６日、サイズ：８８，８３５バイト）。

【0003】

本発明はヒト化抗Ｃ５ａ抗体とその利用に関する。

【背景技術】

【0004】

補体系は宿主防御において重要な役割を果たす自然免疫の一部である。しかし活性化された補体は組織の顕著な損傷と破壊を引き起こす可能性も持っており、調節異常の補体活性は多くの稀な疾患とありふれた疾患（発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、非典型溶血性尿毒症症候群、関節リウマチ、加齢性黄斑変性症など）と関係していることが見いだされている。したがって抗補体療法は、ヒトのこれらの障害を治療する１つの有望なやり方である。

【0005】

補体Ｃ５は補体活性化の末端経路における極めて重要なタンパク質であるとともに、強力な炎症促進メディエータＣ５ａのほか、細胞溶解性の膜侵襲複合体（ＭＡＣ）であるＣ５ｂ－９を生成させる前駆体タンパク質である。

【0006】

いくつかの補体関連疾患では、Ｃ５ａとＭＡＣの両方を媒介とするプロセスが発症に寄与する可能性があるのに対し、他の疾患では、Ｃ５ａ関連の炎症またはＭＡＣ関連の細胞損傷だけが関与する可能性がある。補体メディエータは、Ｃ５ａとＭＡＣを含め、病原体感染に対する宿主防御において重要な役割も果たしているため、治療薬の開発では、選択的である抗補体薬、すなわち組織損傷における補体の有害な効果だけを阻止しつつ、その正常な宿主防御機能を完全なまま残す薬を開発することが望ましい。

【0007】

溶血性疾患ＰＮＨはＭＡＣによって起こる。ＰＮＨを治療するための他の抗Ｃ５ ｍＡｂが存在している。しかしこれらの抗体はＣ５ａの産生を不必要に阻止し、患者が感染するリスクを、ＭＡＣだけを阻止する治療薬よりもより大きくする。同様に、Ｃ５ａ依存性炎症（例えば敗血症）によって主に媒介される可能性がある補体関連疾患が存在しており、そのような状態については、抗Ｃ５ ｍＡｂ薬が有効であることが期待される一方で、副作用としてＭＡＣを不必要に阻止する可能性がある。

【0008】

そのため、Ｃ５ａが媒介する活性を阻害できるがＭＡＣ活性は阻止しない抗ヒトＣ５ａ ｍＡｂが本分野で必要とされている。本発明は、これらの必要性と他の必要性に対処する。

【0009】

本明細書で引用されているあらゆる参考文献は、特許出願、特許出願公開、およびＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号を含め、個別の参考文献が、それぞれの個別の参考文献の全体が具体的かつ個別に参照によって組み込まれていることが示されているかのようにして、参照により組み込まれている。

【発明の概要】

【0010】

本出願により、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体が、ｐＨに依存してＣ５ａとＣ５（Ｃ５ａの前駆体であり、これには抗体も結合するが、抗体が機能を阻止することはない）に結合するヒト化抗Ｃ５ａ抗体を含め、提供される。

【0011】

いくつかの実施形態では、ヒトのＣ５ａとＣ５に特異的に結合する単離されたヒト化抗体であって、変異Ｉ４８Ｍ、Ｄ５４Ｅ、およびＮ５６Ｗを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、変異Ｄ２８ＥとＤ３０Ｆを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体が提供される（ただし前記ＶＨ変異はＫａｂａｔ番号付けシステムの下で配列番号１を参照し、前記ＶＬ変異はＫａｂａｔ番号付けシステムの下で配列番号２を参照する）。いくつかの実施形態では、前記抗体は、ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（「Ｈ－ＣＤＲ１」）、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアント；ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（「Ｈ－ＣＤＲ２」）、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアント；ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（「Ｈ－ＣＤＲ３」）、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアント；ｉｖ）配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（「Ｌ－ＣＤＲ１」）、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアント；ｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（「Ｌ－ＣＤＲ２」）、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアント；およびｖｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（「Ｌ－ＣＤＲ３」）、または１、２、または３個、またはアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む。

【0012】

いくつかの実施形態では、前記抗体は、ＶＨ内の変異Ｆ２９ＨとＶＬ内の変異Ｙ９６Ｈをさらに含む（ただし前記ＶＨ変異はＫａｂａｔ番号付けシステムの下で配列番号１を参照し、前記ＶＬ変異はＫａｂａｔ番号付けシステムの下で配列番号２を参照する）。

【0013】

いくつかの実施形態では、前記抗体はＶＨまたはＶＬの中に追加の置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記変異は、ＶＨのＥ５４Ｈ、ＶＨのＮ９７Ｈ、およびＶＬのＮ９２Ｈからなるグループから選択される（ただし前記ＶＨ変異はＫａｂａｔ番号付けシステムの下で配列番号１を参照し、前記ＶＬ変異はＫａｂａｔ番号付けシステムの下で配列番号２を参照する）。

【0014】

いくつかの実施形態では、前記抗体は、ｉ）アミノ酸配列配列番号９を含むＶＨ、または配列番号９と少なくとも約８５％（例えば少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか）一致するそのバリアント；およびｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬ、配列番号１０と少なくとも約８５％（例えば少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか）一致するそのバリアントを含む。

【0015】

いくつかの実施形態では、前記抗体は、ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ１；ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ２；ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ３；ｉｖ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ１；ｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ２；およびｖｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ３を含む。

【0016】

いくつかの実施形態では、前記抗体は、ｉ）アミノ酸配列配列番号１７を含むＶＨと、ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、前記抗体は、ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ１；ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ２；ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ３；ｉｖ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ１；ｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ２；およびｖｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ３を含む。

【0018】

いくつかの実施形態では、前記抗体は、ｉ）アミノ酸配列配列番号２５を含むＶＨと、ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。

【0019】

いくつかの実施形態では、前記抗体は、ｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ１；ｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ２；ｉｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ３；ｉｖ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ１；ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ２；およびｖｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ３を含む。

【0020】

いくつかの実施形態では、前記抗体は、ｉ）アミノ酸配列配列番号３３を含むＶＨと、ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。

【0021】

本明細書に記載の抗体のいずれか１つに従ういくつかの実施形態では、前記抗体は、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、およびｓｃＦｖからなるグループから選択される。

【0022】

いくつかの実施形態では、前記抗体はＦｃ領域をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域はＩｇＧ４配列を含む。いくつかの実施形態では、前記Ｆｃ領域は、配列番号４３のアミノ酸配列またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、前記Ｆｃ領域は、Ｓ２２８Ｐ、Ｍ４２８Ｌ、およびＮ４３４Ａからなるグループから選択される１つ以上の変異を含む（ただし変異はＥＵ番号付けシステムの下で配列番号４３と比較する）。いくつかの実施形態では、前記Ｆｃ領域は変異Ｓ２２８Ｐ、Ｍ４２８Ｌ、およびＮ４３４Ａを含む。いくつかの実施形態では、前記Ｆｃ領域は配列番号４４のアミノ酸配列を含む。

【0023】

本明細書に記載の抗体のいずれか１つに従ういくつかの実施形態では、Ｃ５から解離する抗体の中性ｐＨ解離因子は約４０％～約７０％である。いくつかの実施形態では、Ｃ５から解離する抗体の中性ｐＨ解離因子は約０％～約１０％である。いくつかの実施形態では、中性ｐＨ解離に対する中性ｐＨ解離の比は６以上である。

【0024】

いくつかの実施形態では、前記抗体はヒトのＣ５ａとＣ５ａＲの間の結合を阻害する。

【0025】

いくつかの実施形態では、前記抗体はヒトにおいて少なくとも約２５日間の血清半減期を持つ。

【0026】

いくつかの実施形態では、前記抗体はＣＨＯ細胞の中で作製される。

【0027】

いくつかの実施形態では、配列番号４６～５３のいずれか１つの配列を含む、本明細書に記載の抗体のいずれか１つをコードする核酸が提供される。

【0028】

いくつかの実施形態では、配列番号４６～５３のいずれか１つの核酸を含むベクターが提供される。

【0029】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体のいずれか１つを、細胞によるその抗体の発現を可能にするのに十分な条件下で生成させる方法が提供される。

【0030】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体のいずれか１つと、医薬として許容可能な基剤とを含む医薬組成物が提供される。

【0031】

いくつかの実施形態では、補体関連の疾患または状態を持つ個体を治療する方法として、その個体に、本明細書に記載の医薬組成物を有効な量で投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、前記の疾患または障害の選択は、黄斑変性症（ＭＤ）、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、虚血再灌流損傷、関節炎、関節リウマチ、ループス、潰瘍性大腸炎、脳卒中、術後の全身性炎症性症候群、喘息、アレルギー性喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）症候群、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、ゴーシェ病、重症筋無力症、視神経脊髄炎、（ＮＭＯ）、多発性硬化症、移植後臓器機能障害、抗体関連型拒絶反応、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、網膜中心動脈閉塞症（ＣＲＡＯ）、表皮水泡症、敗血症、敗血症性ショック、臓器移植、炎症（その非限定的な例に、心肺バイパス手術と腎臓透析に関連する炎症が含まれる）、Ｃ３腎症、膜性腎症、ＩｇＡ腎症、糸球体腎炎（その非限定的な例に、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連糸球体腎炎、ループス腎炎、およびこれらの組み合わせが含まれる）、ＡＮＣＡ関連血管炎、志賀毒素誘導性ＨＵＳ、および抗リン脂質抗体誘導性妊娠喪失、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、水泡性類天疱瘡、化膿性汗腺炎、疱疹状皮膚炎、スウィート症候群、壊疽性膿皮症、掌蹠膿胞症と膿胞性乾癬、リウマチ性好中球性皮膚症、角層下膿胞症、腸関連皮膚症－関節炎症候群、好中球性エクリン汗腺炎、線状ＩｇＡ病、またはこれらの任意の組み合わせからなるグループから少なくともなされる。

【0032】

いくつかの実施形態では、個体における補体系の活性を低下させる方法として、その個体に、本明細書に記載の医薬組成物を有効な量で投与することを含む方法が提供される。

【0033】

本明細書に記載の抗体のいずれか１つに従ういくつかの実施形態では、前記抗体はカニクイザルのＣ５ａまたはＣ５と交差反応する。

【0034】

本発明のこれら側面および他の側面と利点は、以下の詳細な記述と添付の請求項から明らかになろう。本明細書に記載されているさまざまな実施形態の特性の１つ、いくつか、またはすべてを組み合わせて本発明の他の実施形態を形成できることを理解すべきである。

【図面の簡単な説明】

【0035】

【図1A】図１Ａは、カニクイザル抗原を用いた抗Ｃ５ａコンストラクトの組み合わせ変異体ｓｃＦｖでの親和性ランキングＥＬＩＳＡの結果を示す。

【図1B】図１Ｂは、カニクイザル抗原を用いた抗Ｃ５ａコンストラクトの組み合わせ変異体ｓｃＦｖでの親和性ランキングＥＬＩＳＡの結果を示す。

【0036】

【図2A】図２Ａは、ヒト抗原を用いた抗Ｃ５ａコンストラクトの組み合わせ変異体ｓｃＦｖでの親和性ランキングＥＬＩＳＡの結果を示す。

【図2B】図２Ｂは、ヒト抗原を用いた抗Ｃ５ａコンストラクトの組み合わせ変異体ｓｃＦｖでの親和性ランキングＥＬＩＳＡの結果を示す。

【0037】

【図3】図３は、Ｃ５ａへの抗Ｃ５ａ抗体の結合の特徴づけの結果を示す。４つのヒト化抗Ｃ５ａコンストラクト（１６Ｄ１０、Ｅ５４、Ｎ９２、およびＮ９７）を段階希釈し、Ｃ５ａであらかじめ被覆したプレートに添加し、ＯＤ４５０をマイクロプレートリーダーによって４５０ｎｍで測定した。各データ点は２つの反復実験の平均である。

【0038】

【図4】図４は、ヒツジＲＢＣ溶解アッセイにおける抗Ｃ５ａ抗体のインビトロ活性の結果を示す。抗体で感作したヒツジＲＢＣを異なる濃度の抗Ｃ５ａ抗体の存在下で５％の正常なヒト血清とともにインキュベートした。ＯＤ４０５をマイクロプレートリーダーによって４０５ｎｍで測定した。

【0039】

【図5】図５は、リガンド阻止アッセイにおける抗Ｃ５ａ抗体のインビトロ活性を示す。高対照：抗Ｃ５ａ抗体なしでのビオチニル化Ｃ５ａの結合の蛍光シグナル；低対照：ビオチニル化されたＣ５ａなしでの細胞だけの蛍光シグナル。

【0040】

【図6】図６は、Ｃ５ａＲを発現しているＵ９３７細胞を用いたヒトＣ５ａが誘導する移動アッセイにおける抗Ｃ５ａ抗体のインビトロ活性を示す。

【0041】

【図7】図７は、Ｃ５ａ依存性細胞内カルシウム動員アッセイにおける蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）での抗Ｃ５ａ抗体のインビトロ活性を示す。

【0042】

【図8】図８は、ヒトＣ５への抗Ｃ５ａ抗体の結合の特徴づけを示す。

【0043】

【図9】図９は、ｐＨ５．８とｐＨ７．４での組み換えＥ５４、Ｎ９７、Ｎ９２、およびＷＴ（１６Ｄ１０）に対するヒトＣ５の会合と解離のＧａｔｏｒトレーシングを示す。

【0044】

【図10】図１０は、ｐＨ５．８とｐＨ７．４で組み換えＥ５４、Ｎ９７、Ｎ９２、およびＷＴ（１６Ｄ１０）のピーク値から解離したＣ５の割合（％）を示す。

【0045】

【図11】図１１は、Ｃ５／ＦｃＲｎ－ヒト化ＳＣＩＤマウスにおける抗Ｃ５ａ抗体の薬物動態プロファイルを示す。

【0046】

【図12】図１２は、抗Ｃ５ａ抗体を１回静脈内投与した後のさまざまな時点におけるＣ５／ＦｃＲｎ－ヒト化ＳＣＩＤマウス血清中中のヒトＣ５タンパク質のウエスタンブロットを示す。

【0047】

【図13】図１３は、抗Ｃ５ａ抗体を２５ｍｇ／ｋｇで１回静脈内注射した後のＣ５／ＦｃＲｎ－ヒト化ＳＣＩＤマウス血清中のヒトＣ５タンパク質を検出するためのサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示す。

【0048】

【図14】図１４は、Ｃ５が欠損した正常なヒト血清を用いたヒツジＲＢＣ溶解アッセイにおけるＣ５滴定の結果を示す。

【0049】

【図15】図１５は、Ｃ５が欠損した正常なヒト血清を用いたウサギＲＢＣ溶解アッセイにおけるＣ５滴定の結果を示す。

【0050】

【図16】図１６は、カニクイザル（用量群ごとに１匹の雄と１匹の雌）に５、１０、３０ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した単回用量のＮ９２Ｈを示す。濃度はＥＬＩＳＡ法を利用して求めた。

【0051】

【図17】図１７は、カニクイザル（１匹の雄と１匹の雌）に５ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した単回用量のＮ９２Ｈを示す。ＣＤ１１ｂの発現は、１０ｎＭと３０ｎＭのＣ５ａで全血サンプルを刺激することによって生体外で測定した。

【0052】

【図18】図１８は、Ｎ９２Ｈの輸液後６時間（ｈｒ）、２、７、および１４日の時点にＣ５ａ（１０μｇ／ｋｇ）を静脈内投与することを示す。血液サンプルをＣ５ａ注射の１分前と１分後に回収し、好中球をカウントした。

【0053】

【図19】図１９は、Ｃ５ａを注射してから１分後に回収した血液中の好中球の数の変化率を、Ｃ５ａを注射する１分前に回収したサンプルと比較して示す。それぞれの棒は、２匹の個別のサルからの平均値±標準誤差を表わす。Ｎ９２Ｈをあらかじめ投与されたカニクイザルはＣ５ａが誘導する好中球減少症の完全な阻害を示し、この救済効果は少なくとも１４日間持続することができる。

【発明を実施するための形態】

【0054】

本発明は、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体を用いた補体シグナル伝達の阻害に関する。他の実施形態では、本発明は、Ｃ５ａタンパク質の機能を特異的に阻害することによって補体シグナル伝達カスケードを阻害する一方で、Ｃ５－ｂを媒介とする補体経路の乱れを最少にすることに向けられている。一実施形態では、本発明は、望まない、制御されない、または過剰な補体活性化に関連する炎症と、自己免疫の疾患および障害の治療と予防の方法に向けられている。一実施形態では、本発明は、個体における補体関連疾患または補体関連障害を、前記個体をヒト化抗Ｃ５ａ抗体と接触させることによって治療することに向けられている。

【0055】

さまざまな実施形態では、本発明は、個体における補体関連疾患または補体関連障害を、前記個体を抗Ｃ５ａ抗体と接触させることによって治療するための組成物と方法に向けられている。本発明の組成物と方法で治療することのできる補体関連疾患と障害の非限定的な例に含まれるのは、黄斑変性症（ＭＤ）、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、虚血再灌流損傷、関節炎、関節リウマチ、ループス、潰瘍性大腸炎、脳卒中、術後の全身性炎症性症候群、喘息、アレルギー性喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）症候群、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、ゴーシェ病、重症筋無力症、視神経脊髄炎、（ＮＭＯ）、多発性硬化症、移植後臓器機能障害、抗体関連型拒絶反応、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、網膜中心動脈閉塞症（ＣＲＡＯ）、表皮水泡症、敗血症、敗血症性ショック、臓器移植、炎症（その非限定的な例に、心肺バイパス手術と腎臓透析に関連する炎症が含まれる）、Ｃ３腎症、膜性腎症、ＩｇＡ腎症、糸球体腎炎（その非限定的な例に、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連糸球体腎炎、ループス腎炎、およびこれらの組み合わせが含まれる）、ＡＮＣＡ関連血管炎、志賀毒素誘導性ＨＵＳ、および抗リン脂質抗体誘導性妊娠喪失、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、またはこれらの任意の組みあわせである。

【0056】

本出願により、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでいて、ヒトＣ５ａに特異的に結合してその機能を阻害する新規なヒト化抗ヒトＣ５ａ抗体が提供される。いくつかの側面では、抗Ｃ５ａ抗体は、そのＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインの中に変異を含有する。１つの側面では、ＶＨとＶＬの中の変異は、抗原への抗体の結合をｐＨ感受性にする。

【0057】

別の１つの側面では、抗Ｃ５ａ抗体またはそのコンストラクトの任意の１つ以上を投与することによって補体活性化を阻害する方法、および／または疾患（補体関連疾患など）を治療する方法が提供される。

【0058】

別の１つの側面では、抗Ｃ５ａ抗体またはそのコンストラクトの任意の１つ以上をコードする代表的な核酸のほか、そのような核酸を含むベクターまたは宿主細胞が提供される。抗Ｃ５ａ抗体を作製する方法も記載されている。

【0059】

Ｉ．定義
特に断わらない限り、本明細書で使用される科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を持つ。本明細書に記載されているのと類似しているか同等なあらゆる方法と材料を用いて本発明を実行または試験することができるが、代表的な方法と材料が記載されている。

【0060】

本明細書では、「治療」または「治療している」は、臨床結果を含む有利な結果または望む結果を得るためのアプローチである。本出願の目的では、有利な、または望む臨床結果の非限定的な例に含まれるのは、疾患から生じる１つ多い症状の減少、疾患の程度の低下、疾患の安定化（例えば疾患の悪化の阻止または遅延）、疾患の広がりの阻止または遅延、疾患の発生または再発の阻止または遅延、疾患進行の遅延または鈍化、疾患状態の改善、疾患の（部分的または全面的な）寛解の提供、疾患の治療に必要な１つ以上の他の薬物の用量の減少、疾患進行の遅延、生活の質の向上、および／または生存の延長のうちの１つ以上である。「治療」にやはり包含されるのは、疾患の病理学的結果の減少である。本出願の方法は、治療のこれら側面の任意の１つ以上を考慮する。

【0061】

「有効な量」と「医薬として有効な量」という用語は、本明細書では、望む生物学的結果を提供するのに十分な量の薬剤を意味する。その結果は、疾患または障害の徴候、症状、または原因の低減および／または緩和、または生物系の他の望む変化のいずれかが可能である。

【0062】

本明細書では、「患者」、「対象」、「個体」などの用語は交換可能に使用され、補体系を持つ任意の動物を意味し、いくつかの実施形態では哺乳類を意味し、いくつかの実施形態ではヒトを意味し、その中には、ある状態またはその後遺症のために治療を必要とするヒト、またはある状態またはその後遺症に対して感受性のあるヒトが含まれる。個体に含めることができるのは、例えばイヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、サル、マウス、およびヒトである。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。

【0063】

「抗体」という用語は、本明細書では、最も広い意味で用いられてさまざまな抗体構造を包含し、その非限定的な例に含まれるのは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および望む抗原結合活性を示す抗体断片である。

【0064】

「抗体」は、抗原の特定のエピトープ（基本的な４鎖抗体ユニットを含む）に特異的に結合することのできる免疫グロブリン分子またはその断片を意味することができる。抗体として、天然の供給源、または組み換え供給源に由来するインタクトな免疫グロブリンと、インタクトな免疫グロブリンの免疫反応性部分が可能である。本発明の抗体は多彩な形態で存在することができ、形態に含まれるのは、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、細胞内抗体（「イントラボディ」）、抗原結合断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、およびＦ（ａｂ’）２など）のほか、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、重鎖抗体（ラクダ抗体など）、およびヒト化抗体である（Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｈｏｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６）。

【0065】

「抗原結合断片」という用語は、本明細書では抗体断片を意味し、その中に含まれるのは、例えばディアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ディアボディ（ｄｓディアボディ）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ二量体（２価ディアボディ）、１つ以上のＣＤＲを含む抗体の一部から形成される多重特異性抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、２価ドメイン抗体、または抗原に結合するが完全な抗体構造は含まない他の任意の抗体断片である。抗原結合断片は、親抗体または親抗体断片（例えば親ｓｃＦｖ）が結合するのと同じ抗原に結合することができる。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、１つ以上の異なるヒト抗体からのフレームワーク領域にグラフトされた特定のヒト抗体からの１つ以上のＣＤＲを含むことができる。

【0066】

「Ｆｖ」は最小抗体断片であり、１つの完全な抗原認識・抗原結合部位を含有する。この断片は、１つの重鎖と１つの軽鎖の可変領域ドメインが緊密に非共有会合した二量体からなる。これら２つのドメインの折り畳みから、抗原に結合するためのアミノ酸残基に寄与して抗原結合特異性を抗体に与える６つの超可変ループ（重鎖と軽鎖からそれぞれ３つのループ）が生じる。しかし単一の可変ドメイン（または抗原に対して特異的な３つのＣＤＲだけを含む、Ｆｖの半分）でさえ、結合部位全体よりも小さい親和性だが、抗原を認識してその抗原に結合する能力を持つ。

【0067】

「一本鎖Ｆｖ」は、「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略され、接続されて単一のポリペプチド鎖になったＶＨとＶ_Ｌの抗体ドメインを含む抗体断片である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖポリペプチドはＶＨドメインとＶ_Ｌドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、このリンカーにより、ｓｃＦｖが、抗原への結合に望ましい構造を形成することを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｖｏｌ． １１３， Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ２６９－３１５ （１９９４）の中のＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照されたい。

【0068】

基本的な４鎖抗体ユニットは、２つの同じ軽（Ｌ）鎖と２つの同じ重（Ｈ）鎖から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は、５つのこの基本的なヘテロ四量体ユニットに加えてＪ鎖と呼ばれる追加のポリペプチドからなり、１０個の抗原結合部位を含有するのに対し、ＩｇＡ抗体は２～５個の基本的な４鎖ユニットを含み、それらがＪ鎖と組み合わさって重合して多価集合体を形成することができる。ＩｇＧの場合には、４鎖ユニットは一般に約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は１つの共有ジスルフィド結合によってＨ鎖に連結されているのに対し、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結されている。それぞれのＨ鎖とＬ鎖は規則的な間隔の鎖内ジスルフィド架橋も持つ。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＨ）を持ち、その後に、α鎖とγ鎖のそれぞれのための３つの定常ドメイン（Ｃ_Ｈ）と、アイソタイプμとεのための４つのＣ_Ｈドメインが続く。各Ｌ鎖はＮ末端に可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を持ち、その後に、他端に位置する定常ドメインが続く。Ｖ_ＬはＶＨと揃い、Ｃ_Ｌは重鎖の第１の定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１）と揃う。特定のアミノ酸残基が軽鎖と重鎖の可変ドメインの間のインターフェイスを形成すると考えられている。ＶＨとＶ_Ｌを合わせてペアにすると単一の抗原結合部位が形成される。異なるクラスの抗体の構造と特性については、例えばＢａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｄａｎｉｅｌ Ｐ． Ｓｔｉｅｓ， Ａｂｂａ Ｉ． Ｔｅｒｒ ａｎｄ Ｔｒｉｓｔｒａｍ Ｇ． Ｐａｒｓｏｌｗ （ｅｄｓ）， Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ， Ｎｏｒｗａｌｋ， Ｃｏｎｎ．， １９９４、７１ページと第６章を参照されたい。任意の脊椎動物種からのＬ鎖を、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパとラムダと呼ばれる２つの明らかに異なるタイプの一方に割り当てることができる。免疫グロブリンは、その重鎖（Ｃ_Ｈ）の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。５つのクラスの免疫グロブリン、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在しており、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと名づけられた重鎖を持つ。クラスγとαは、Ｃ_Ｈ配列と機能の比較的わずかな違いに基づいてさらにサブクラスへと分類され、例えばヒトは以下のサブクラス、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２を発現する。

【0069】

Ｆｃ断片は、ジスルフィドによって一体となって保持された両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクタ機能はＦｃ領域内の配列によって決まる。この領域は、あるタイプの細胞の表面に見られるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によっても認識される。

【0070】

「単離された」抗体は、その生成環境（例えば天然または組み換え）の成分から同定され、分離され、および／または回収された抗体である。好ましくは、単離されたポリペプチドは、その生成環境からの他のあらゆる成分と無関係であることが好ましい。その生成環境の汚染成分（組み換えのトランスフェクトされた細胞から生じるものなど）は、典型的には研究、診断、または治療での抗体の利用を妨げると考えられる材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を含む可能性がある。好ましい実施形態では、ポリペプチドは精製され、（１）例えばローリー法によって求めたとき９５重量％超の抗体に、そしていくつかの実施形態では９９重量％超の抗体になる；（２）スピニングカップシークエネータの使用によってＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度になる、または（３）クマシーブルーまたは銀染色（後者が好ましい）を用いた非還元条件または還元条件でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによって均一になる。単離された抗体には、組み換え細胞そのものの中の抗体が含まれる。というのもその抗体の天然環境の少なくとも１つの成分は存在しないであろうからである。しかし通常は、単離されたポリペプチドまたは抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。

【0071】

抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを意味する。重鎖と軽鎖の可変ドメインはそれぞれ「ＶＨ」と「ＶＬ」と呼ぶことができる。これらドメインは一般に（同じクラスの他の抗体と比べて）抗体の可変性最大部であり、抗原結合部位を含有する。ラクダ科の種からの重鎖だけの抗体は単一の重鎖可変領域を持ち、それを「ＶＨＨ」と呼ぶ。したがってＶＨＨは特別なタイプのＶＨである。

【0072】

「可変」という用語は、可変ドメイン内のある区画の配列が抗体間で大きく異なるという事実を意味する。Ｖドメインは抗原への結合を媒介し、特定の抗体の、対応する抗原に対する特異性を規定する。しかし可変性は可変ドメインの広がり全体に均一に分布してはいない。その代わりに、可変性は、軽鎖と重鎖両方の可変ドメインの中の超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つの区画に集中している。可変ドメインのより保存された部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖と軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、たいていベータ－シート構造を採用していて３つのＨＶＲによって接続された４つのＦＲ領域を含み、それらＨＶＲは前記ベータ－シート構造を接続するループを形成し、いくつかのケースでは前記ベータ－シート構造の一部を形成する。それぞれの鎖の中のＨＶＲはＦＲ領域によって互いに近接して保持され、他方の鎖からのＨＶＲと合わさって抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． （１９９１）参照）。定常ドメインは抗原への抗体の結合に直接関与はしないが、さまざまなエフェクタ機能（抗体依存性細胞傷害への抗体の関与など）を示す。

【0073】

「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書では、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわちその集団を含む個別の抗体は、微量で存在する可能性がある可能な天然の変異および／または翻訳後修飾（例えば異性化、アミド化）を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に向かう。典型的には異なる決定基（エピトープ）に向かう異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に向かう。モノクローナル抗体は、その特異性に加え、他の免疫グロブリンによって汚染されていないハイブリドーマ培養物によって合成されるという点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の特徴を示しており、どれか特定の方法による抗体の生成を必要とすると解釈すべきではない。例えば本出願に従って利用されるモノクローナル抗体は多彩な技術によって作製され、技術に含まれるのは、例えばハイブリドーマ法（例えばＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５－９７ （１９７５）；Ｈｏｎｇｏ ｅｔ ａｌ．， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ， １４ （３）： ２５３－２６０ （１９９５）、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ２^ｎｄ ｅｄ． １９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ： Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３－６８１ （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８１））、組み換えＤＮＡ法（例えばアメリカ合衆国特許第４，８１６，５６７号参照）、ファージ提示技術（例えばＣｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３５２： ６２４－６２８ （１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２： ５８１－５９７ （１９９２）；Ｓｉｄｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３３８（２）： ２９９－３１０ （２００４）；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３４０（５）： １０７３－１０９３ （２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０１（３４）： １２４６７－１２４７２ （２００４）；およびＬｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８４（１－２）： １１９－１３２ （２００４）参照、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座、またはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部または全部を持つ動物の中でヒト抗体またはヒト様抗体を生成させるための技術（例えばＷＯ １９９８／２４８９３；ＷＯ １９９６／３４０９６；ＷＯ １９９６／３３７３５；ＷＯ １９９１／１０７４１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ２５５１ （１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３６２： ２５５－２５８ （１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７：３３ （１９９３）；アメリカ合衆国特許第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；および第５，６６１，０１６号；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０： ７７９－７８３ （１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３６８： ８５６－８５９ （１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３６８： ８１２－８１３ （１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４： ８４５－８５１ （１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４： ８２６ （１９９６）；およびＬｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ， Ｉｎｔｅｒｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３： ６５－９３ （１９９５）を参照されたいである。

【0074】

「完全長抗体」、「インタクト抗体」、または「全抗体」という用語は交換可能に用いられ、抗体断片とは異なり実質的にインタクトな形態の抗体を意味する。具体的には、完全長４鎖抗体には、Ｆｃ領域を含む重鎖と軽鎖を持つ抗体が含まれる。定常ドメインとして、天然配列定常ドメイン（例えば天然ヒト配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列バリアントが可能である。いくつかの場合には、インタクト抗体は１つ以上のエフェクタ機能を持つことができる。

【0075】

「ディアボディ」という用語は、ＶＨドメインとＶ_Ｌドメインの間に短いリンカー（約５～１０個の）残基）を持つｓＦｖ断片（前段落参照）を構成することによって調製される小さな抗体断片を意味し、Ｖドメインの鎖内ではなく鎖間のペアリングが実現されることによって２価断片（すなわち２つの抗原結合部位を持つ断片）が得られる。二重特異性ディアボディは、２つの「クロスオーバー」ｓＦｖ断片のヘテロ二量体であり、その中の２つの抗体のＶＨドメインとＶ_Ｌドメインは異なるポリペプチド鎖上に存在する。ディアボディがより詳しく記載されているのは、例えばＥＰ ４０４，０９７；ＷＯ ９３／１１１６１；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ６４４４－６４４８ （１９９３）である。

【0076】

本明細書のモノクローナル抗体には特に、「キメラ抗体」（その中の重鎖および／または軽鎖の一部は、特定の種に由来するか特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の中の対応する配列と同じであるか相同であるのに対し、鎖の残部は、別の種に由来するか別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の中の対応する配列と同一または相同である）のほか、そのような抗体の断片が含まれるが、それらが望む生物活性を示すことが条件である（アメリカ合衆国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１：６８５１－６８５５ （１９８４））。本明細書の興味あるキメラ抗体には、抗原結合領域が、例えばマカクザルを興味ある抗原で免疫化することによって生成する抗体に由来するＰＲＩＭＡＴＴＺＦＤ（登録商標）抗体が含まれる。本明細書では、「ヒト化抗体」は「キメラ抗体」のサブセットとして使用される。

【0077】

非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、レシピエントのＨＶＲ（あとで定義する）からの残基が、望む特異性、親和性、および／または能力を持つ非ヒト種（ドナー抗体）（マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類など）のＨＶＲからの残基で置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク（「ＦＲ」）残基が対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見られない残基を含む可能性がある。これらの修飾は、抗体の性能（結合親和性など）をさらに洗練させるためになすことができる。一般にヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、可変ドメインの中では超可変ループのすべて、または実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリン配列の超可変ループに対応し、ＦＲ領域のすべて、または実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域であるが、ＦＲ領域は、抗体の性能（結合親和性、異性化、免疫原性など）を改善する１つ以上の個別のＦＲ残基の置換を含んでいる可能性がある。ＦＲの中のこれらアミノ酸置換の数は、典型的にはＨ鎖の中で６以下、Ｌ鎖の中で３以下である。ヒト化抗体は場合により免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域）の少なくとも一部も含むことになる。適切なヒトアクセプタ抗体として、従来のデータベース（例えばＫＡＢＡＴデータベース、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓデータベース、ＡｂＭ、およびＳｗｉｓｓ Ｐｒｏｔｅｉｎデータベース）から、ドナー抗体のヌクレオチドとアミノ酸の配列との相同性によって選択されるものが可能である。ドナー抗体のフレームワーク領域との（アミノ酸に基づく）相同性によって特徴づけられるヒト抗体が、ドナーＣＤＲを挿入するための重鎖定常領域および／または重鎖可変フレームワーク領域を提供するのに適している可能性がある。軽鎖定常または可変フレームワーク領域を供与できる適切なアクセプタ抗体を同様にして選択することができる。アクセプタ抗体の重鎖と軽鎖は同じアクセプタ抗体に由来する必要がないことに注意すべきである。先行技術は、そのようなヒト化抗体を生成させるいくつかのやり方を記述している（例えばＥＰ－Ａ－０２３９４００とＥＰ－Ａ－０５４９５１参照）。さらなる詳細に関しては、例えばＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５ （１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９ （１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２：５９３－５９６ （１９９２）を参照されたい。例えばＶａｓｗａｎｉ ａｎｄ Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ａｎｎ． Ａｌｌｅｒｇｙ， Ａｓｔｈｍａ ＆ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １：１０５－１１５ （１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ２３：１０３５－１０３８ （１９９５）；Ｈｕｒｌｅ ａｎｄ Ｇｒｏｓｓ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ５：４２８－４３３ （１９９４）；およびアメリカ合衆国特許第６，９８２，３２１号と第７，０８７，４０９号も参照されたい。

【0078】

「ヒト抗体」は、本明細書に開示されているように、ヒトによって生成された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を持つ抗体、および／またはヒト抗体を作製する技術のいずれかを利用して作製された抗体である。ヒト抗体のこの定義は特に、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。ヒト抗体は、本分野で知られているさまざまな技術（ファージ提示ライブラリが含まれる）を利用して生成させることができる。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２７：３８１ （１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２：５８１ （１９９１）。ヒトモノクローナル抗体の調製には、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， ｐ． ７７ （１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４７（１）：８６－９５ （１９９１）に記載されている方法も利用できる。ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ５： ３６８－７４ （２００１） も参照されたい。ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してそのような抗体が生成するように改変されているが内在性遺伝子座は不能にされたトランスジェニック動物（例えば免疫化されたゼノマウス（例えばＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術に関するアメリカ合衆国特許第６，０７５，１８１号と第６，１５０，５８４号を参照されたい）に抗原を投与することによって調製することができる。例えばヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって生成するヒト抗体に関するＬｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １０３：３５５７－３５６２ （２００６）も参照されたい。

【0079】

「ドナー抗体」という用語は、その可変領域、ＣＤＲ、またはそのそれ以外の機能性断片または類似体のアミノ酸配列が第１の免疫グロブリンパートナーに寄与する抗体（モノクローナルおよび／または組み換え）を意味し、変化した免疫グロブリンコード領域と、その結果として変化してドナー抗体に特徴的な抗原特異性と中和活性を持って発現する抗体が提供される。

【0080】

「アクセプタ抗体」という用語は、ドナー抗体にとって異種で、重鎖および／または軽鎖のフレームワーク領域、および／または重鎖および／または軽鎖の定常領域をコードするアミノ酸配列のすべて（または任意の部分、しかしいくつかの実施形態ではすべて）が第１の免疫グロブリンパートナーに寄与する抗体（モノクローナルおよび／または組み換え）を意味する。ある実施形態では、ヒト抗体はアクセプタ抗体である。

【0081】

「付着させる」または「付着した」という用語は、本明細書では、２つ以上の成分を合わせて保持するため結合、リンク、力、または紐帯によって接続する、または合体させることを意味し、その中には、直接的または間接的な付着のいずれか、例えば第１のポリペプチドが第２のポリペプチドまたは材料に直接結合する場合と、例えば１つ以上の中間体化合物（例えばアミノ酸、ペプチド、ポリペプチドなど）が第１のポリペプチドと第２のポリペプチドまたは材料の間に配置される場合が包含される。

【0082】

「ＣＤＲ」は、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の超可変領域である抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列と定義される。例えばＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ４ｔｈ Ｅｄ．、アメリカ合衆国保健福祉省、アメリカ国立衛生研究所（１９８７）を参照されたい。免疫グロブリンの可変部分には３つの重鎖ＣＤＲ（またはＣＤＲ領域）と３つの軽鎖ＣＤＲが存在する。したがって「ＣＤＲ」は、本明細書では、３つの重鎖ＣＤＲすべて、または３つの軽鎖ＣＤＲすべて（または適切な場合には、すべての重鎖ＣＤＲとすべての軽鎖ＣＤＲの両方）を意味する。抗体の構造とタンパク質折り畳みは、他の残基が抗原結合領域の一部と見なされ、当業者によってそのように理解されると考えられることを意味することができる。例えばＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ； Ｎａｔｕｒｅ ３４２， ｐ ８７７－８８３を参照されたい。

【0083】

本明細書では、「イムノアッセイ」は、標的分子を検出して定量するため標的分子に特異的に結合することのできる抗体を用いるあらゆる結合アッセイを意味する。

【0084】

「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」という用語は、Ｋａｂａｔシステムによって定義される超可変領域を指すのに使用される。Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． 公衆衛生局、アメリカ国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州（１９９１）を参照されたい。

【0085】

本明細書では、「特異的に結合する」または「に対して特異的」であるという表現は、標的と抗体の間の結合などの測定可能かつ再現性のある相互作用を意味し、そのことが、分子（生物分子が含まれる）の不均一な集団の存在下での標的の存在を決定づける。例えば標的（エピトープが可能）に特異的に結合する抗体は、この標的に、他の標的に結合するよりも大きな親和性で、アビディティで、より容易に、および／または長期間にわたって結合する抗体である。ある実施形態では、標的に特異的に結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を持つ。ある実施形態では、抗体は、異なる種からのタンパク質の間で保存されているタンパク質上のエピトープに特異的に結合する。別の一実施形態では、特異的結合は排他的結合を含むことができるが、排他的結合を必要としない。

【0086】

「特異性」という用語は、抗原結合タンパク質または抗体が抗原の特定のエピトープを選択的に認識することを意味する。例えば天然の抗体は単一特異的である。「多重特異性」という用語は、本明細書では、抗原結合タンパク質または抗体が２つ以上の抗原結合部位を持ち、そのうちの少なくとも２つが異なる抗原、または同じ抗原の異なるエピトープに結合することを表わす。「二重特異性」は、本明細書では、抗原結合タンパク質または抗体が２つの異なる抗原結合特異性を持つことを表わす。「単一特異的」抗体という用語は、本明細書では、１つ以上の結合部位を持ち、そのそれぞれが同じ抗原の同じエピトープに結合する抗体を表わす。

【0087】

「エフェクタ細胞」は、１つ以上のＦｃＲを発現してエフェクタ機能を実行する白血球である。１つの側面では、エフェクタ細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクタ機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例に含まれるのは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、および好中球である。エフェクタ細胞は天然供給源（例えば血液）から単離することができる。エフェクタ細胞は一般にエフェクタ相に付随するリンパ球であり、サイトカインの産生（ヘルパーＴ細胞）、病原体に感染した細胞の殺傷（細胞傷害性Ｔ細胞）、または抗体の分泌（分化したＢ細胞）の機能がある。

【0088】

「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下における標的細胞の溶解を意味する。古典補体経路の活性化は、補体系（Ｃ１ｑ）の第１の成分が、対応するコグネイト抗原に結合した（適切なサブクラスの）抗体に結合することによって始まる。補体活性化を評価するため、例えばＧａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２： １６３ （１９９６）に記載されているＣＤＣアッセイを実施することができる。変化したＦｃ領域アミノ酸配列と増加または低下したＣ１ｑ結合能力を持つ抗体バリアントは、アメリカ合衆国特許第６，１９４，５５１Ｂ１号とＷＯ ９９／５１６４２に記載されている。これら特許刊行物の内容は、参照によって本明細書に具体的に組み込まれている。Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６４： ４１７８－４１８４ （２０００）も参照されたい。

【0089】

「結合親和性」は一般に、ある分子（例えば抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）の間の非共有相互作用の総和の強度を意味する。特に断わらない限り、本明細書では、「結合親和性」は、結合ペアのメンバー（例えば抗体と抗原）の間の１：１相互作用を反映した固有の結合親和性を意味する。分子Ｘの対応するパートナーＹに対する親和性は一般に解離定数（Ｋｄ）によって表わすことができる。親和性は本分野で知られている一般的な方法によって測定することができ、方法には本明細書に記載の方法が含まれる。低親和性抗体は一般に抗原にゆっくりと結合して容易に解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は一般に抗原により速く結合し、より長く結合したままである傾向がある。結合親和性を測定する多彩な方法が本分野で知られており、そのうちの任意の方法を本出願の目的で利用することができる。結合親和性を測定するための例示的で代表的な具体的実施形態が以下に記載されている。

【0090】

「オン－レート」、「会合の速度」、「会合速度」、または「ｋ_ｏｎ」は、本明細書では、上に記載したように、バイオレイヤー干渉や表面プラズモン共鳴などの方法を利用して求めることもできる。

【0091】

「低ｐＨ解離因子」は、本明細書では、ｐＨ５．８で抗原から２５℃で解離する抗体の割合と定義される（ただし抗体はｐＨ７．４であらかじめ抗原に結合している）。低ｐＨ解離因子は、抗体と抗原（例えばヒト化抗Ｃ５ａ抗体とヒトＣ５）をｐＨ７．４で６００秒間会合させた後、ｐＨ５．８のバッファの中で解離期間を６００秒間にしてｐＨ５．８で抗原から解離した抗体の割合を計算することによって測定できる。「中性ｐＨ解離因子」は、ｐＨ７．４で抗原から２５℃で解離する抗体の割合と定義される（ただし抗体はｐＨ７．４で抗原にあらかじめ結合している）。中性ｐＨ解離因子は、抗体と抗原（例えばヒト化抗Ｃ５ａ抗体とヒトＣ５）をｐＨ７．４で６００秒間会合させた後、ｐＨ７．４のバッファの中で解離期間を６００秒間にしてｐＨ７．４で抗原から解離した抗原の割合を計算することによって測定できる。抗体－抗原の会合と解離は、本分野の技術に含まれるさまざまなやり方（例えばバイオレイヤー干渉）で測定することができる。

【0092】

ペプチド、ポリペプチド、または抗体の配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列一致」と「相同性」は、配列をアラインメントさせ、最大パーセント配列一致を実現するため必要な場合にはギャップを導入した後、配列一致の一部としていかなる保存的置換も考慮しないとき、候補配列の中にあって特定のペプチドまたはポリペプチドの配列の中のアミノ酸残基と一致するアミノ酸残基の割合と定義される。パーセントアミノ酸配列一致を求めることを目的としたアラインメントは、本分野の技術の範囲内のさまざまなやり方で、公開されているコンピュータソフトウエア（ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）（ＤＮＡＳＴＡＲ）というソフトウエアなど）を利用して実現することができる。当業者は、アラインメントを測定するための適切なパラメータ（比較する配列の全長にわたって最大のアラインメントを実現するのに必要なあらゆるアルゴリズムが含まれる）を決定することができる。

【0093】

「単離された」は、天然状態から変化しているか取り出されたことを意味する。例えば生きている対象の通常の文脈で自然に存在する核酸またはペプチドは「単離された」ではないが、天然の文脈の共存する材料から一部または全体が分離された同じ核酸またはペプチドは「単離された」である。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在すること、または非天然環境（例えば宿主細胞など）に存在することができる。

【0094】

「ハイブリドーマ」という用語は、本明細書では、Ｂリンパ球と融合パートナー（骨髄腫細胞など）の融合から得られる細胞を意味する。ハイブリドーマは細胞培養物にクローニングしてその中で無限に維持することが可能であり、モノクローナル抗体を生成させることができる。ハイブリドーマはハイブリッド細胞と見なすこともできる。

【0095】

「核酸分子」、「核酸」、および「ポリヌクレオチド」という用語は交換可能に使用でき、ヌクレオチドのポリマーを意味する。ヌクレオチドのこのようなポリマーは天然および／または非天然ヌクレオチドを含有することができ、その非限定的な例に含まれるのは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡである。「核酸配列」は、核酸分子またはポリヌクレオチドを含むヌクレオチドの直線状配列を意味する。「単離された核酸」は、天然状態で隣接している配列から分離された核酸の区画または断片、すなわちＤＮＡ断片であって、通常はその断片に隣接している配列（すなわちその断片が自然に生じるゲノム中のその断片に隣接する配列）から取り出されたものを意味する。この用語は、細胞内で自然に付随する核酸（すなわちＲＮＡまたはＤＮＡ）またはタンパク質に自然に付随する他の成分から実質的に精製された核酸にも当てはまる。したがってこの用語には、例えばベクター、自律的に複製するプラスミドまたはウイルス、または原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれる組み換えＤＮＡ、または他の配列とは独立に別の分子として（すなわちＰＣＲまたは制限酵素消化によって生成するｃＤＮＡまたはゲノム断片またはｃＤＮＡ断片として）存在する組み換えＤＮＡが含まれる。この用語には、ハイブリッド遺伝子をコードする追加ポリペプチド配列の一部である組み換えＤＮＡも含まれる。

【0096】

核酸に言及するため本明細書で用いるときの「相補的な」は、２つの核酸鎖の領域の間、または同じ核酸鎖の２つの領域の間の配列相補性の広範な考え方を意味する。第１の核酸領域のアデニン残基が、第１の領域と反平行な第２の核酸領域の残基と特異的な水素結合を形成（「塩基対形成」）できるのは、この残基がチミンまたはウラシルである場合であることが知られている。同様に、第１の核酸鎖のシトシン残基が、第１の鎖と反平行な第２の核酸鎖の残基と塩基対を形成できるのは、この残基がグアニンである場合であることが知られている。核酸の第１の領域が、この核酸または異なる核酸の第２の領域と相補的であるのは、これら２つの領域が反平行に配置されるときに、第１の領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基が第２の領域の残基と塩基対を形成できる場合である。いくつかの実施形態では、第１の領域は第１の部分を含み、第２の領域は第２の部分を含み、そのことにより、第１と第２の部分が反平行に配置されるとき、第１の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％が、第２の部分の中のヌクレオチド残基と塩基対を形成することができる。いくつかの実施形態では、第１の部分の全ヌクレオチド残基が第２の部分のヌクレオチド残基と塩基対を形成することができる。

【0097】

「ベクター」は、本明細書では、複製起点を含有する核酸配列を意味することができる。ベクターとして、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体が可能である。ベクターとして、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターが可能である。ベクターはとして、自己複製染色体外ベクター、または宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかが可能である。

【0098】

「コードする」は、生物学的プロセスにおいて、規定された配列のヌクレオチド（すなわちｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｍＲＮＡ）、または規定された配列のアミノ酸のいずれかを持つ他のポリマーと巨大分子を合成するための鋳型として機能する、ポリヌクレオチドの中のヌクレオチドの特定の配列（遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなど）の固有の特性と、そこから生じる生物学的特性を意味する。したがって１つの遺伝子が１つのタンパク質をコードしているのは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写と翻訳により細胞または他の生物系の中でそのタンパク質が産生される場合である。コード鎖（そのヌクレオチド配列はｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列リストに与えられる）と非コード鎖（遺伝子またはｃＤＮＡを転写するための鋳型として使用される）の両方を、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードすると言うことができる。

【0099】

「ポリペプチド」と「ペプチド」という用語は交換可能に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを意味し、最小長に限定されない。アミノ酸残基のこのようなポリマーは天然または非天然のアミノ酸残基を含有することができる。完全長タンパク質とその断片の両方が定義に包含される。上記の用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えばグリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化なども含む。さらに「ポリペプチド」には、そのポリペプチドが望む活性を維持する限り、天然配列に対する修飾（欠失、付加、および置換（一般に本来的に保存的である）など）が含まれる。これらの修飾は、人為的である（例えば部位特異的突然変異誘発を通じた修飾）か、偶発的である（例えばタンパク質を産生する宿主の変異、またはＰＣＲ増幅に起因するエラーを通じた修飾）可能がある。

【0100】

本明細書では、「複合体にされた」は、１つの分子が第２の分子に共有結合していることを意味する。

【0101】

「バリアント」という用語は、本明細書では、配列がそれぞれ参照核酸配列またはペプチド配列と異なるが、参照分子の重要な生物学的特性を保持している核酸配列またはペプチド配列である。核酸バリアントの配列中の変化により、参照核酸によってコードされるペプチドのアミノ酸配列が変化しない可能性、またはアミノ酸の置換、付加、欠失、および短縮が起こる可能性がある。ペプチドバリアントの配列中の変化は、典型的には限定的または保存的であるため、参照ペプチドとバリアントの配列は全体的によく似ており、多くの領域で一致する。バリアントと参照ペプチドは、任意に組み合わされた１つ以上の置換、付加、欠失の分だけアミノ酸配列が異なる可能性がある。核酸またはペプチドのバリアントとして、天然の（例えばアレル）バリアント、または自然に生じることが知られてはいないバリアントが可能である。核酸とペプチドの非天然バリアントは突然変異誘発技術または直接的合成によって作製することができる。さまざまな実施形態では、バリアントの配列は、参照配列と少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８９％、少なくとも８８％、少なくとも８７％、少なくとも８６％、少なくとも８５％一致する。

【0102】

「調節する」という用語は、本明細書では、基質のレベルまたは活性を変化させるあらゆる方法を意味することができる。タンパク質に関する調節の非限定的な例に含まれるのは、発現（転写および／または翻訳を含む）に影響を与えること、折り畳みに影響を与えること、分解またはタンパク質の代謝回転に影響を与えること、およびタンパク質の局在化に影響を与えることである。酵素に関する調節の非限定的な例にさらに含まれるのは、酵素活性に影響を与えることである。「調節物質（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）」は、分子であって、その活性に、基質のレベルまたは活性に影響を与えることが含まれるものを意味する。調節物質は直接的または間接的であることが可能である。調節物質は、対応する基質を活性化させる、阻害する、またはそれ以外の変化をさせるよう機能することができる。

【0103】

範囲：本開示を通じ、本発明のさまざまな側面は範囲形式で表わすことができる。範囲形式での記述は単に便宜上と簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する融通性のない制限であると解釈されてはならないことを理解すべきである。したがって範囲の記述は、具体的に開示されているすべての可能な下位範囲のほか、その範囲内の個別の数値を持つと見なすべきである。例えば１～６などの範囲の記述は、具体的に開示されている下位範囲（１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６など）のほか、その範囲内の個別の数（例えば１、２、２．７、３、４、５、５．３、および６）を含むと見なすべきである。これは、範囲の幅に関係なく当てはまる。「約」のついた値またはパラメータへの言及は、本明細書では、その値またはパラメータ自体に対する変動を含む（そして記述する）。例えば「約Ｘ」に言及する記述に、「Ｘ」の記述が含まれる。本明細書では、ある値またはパラメータ「ではない」への言及は、一般に、ある値またはパラメータ「以外」を意味し、記述している。例えば方法がタイプＸのがんの治療に使用されないは、その方法がＸ以外のタイプのがんの治療に用いられることを意味する。「約Ｘ～Ｙ」という表現は、本明細書では、「約Ｘ～約Ｙ」と同じ意味を持つ。

【0104】

「制御配列」という用語は、機能可能に連結されたコード配列を特定の宿主生物の中で発現させるのに必要なＤＮＡ配列を意味する。原核生物に適した制御配列に含まれるのは、例えばプロモータ、場合によりオペレータ配列、およびリボソーム結合部位である。真核細胞は、プロモータ、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサを利用することが知られている。

【0105】

「医薬として許容可能な基剤」は、対象に投与する「医薬組成物」を合わせて含む治療剤とともに使用するための本分野で一般的な非毒性の固体、半固体、または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料、製剤助剤、または基剤を意味する。医薬として許容可能な基剤は、使用する用量と濃度でレシピエントにとって非毒性であり、製剤の他の成分との適合性がある。医薬として許容可能なその基剤が、使用する製剤にとって適切である。

【0106】

本明細書の興味ある「希釈剤」は、医薬として許容可能（ヒトに投与するのに安全かつ非毒性）であって液体製剤（例えば凍結乾燥後に再構成される製剤）の調製に有用な希釈剤である。代表的な希釈剤に含まれるのは、減菌水、注射のための静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝化溶液（例えばリン酸塩緩衝化生理食塩水）、減菌生理食塩水、リンガー溶液、またはデキストロース溶液である。代わりの一実施形態では、希釈剤は、塩の水溶液および／またはバッファを含むことができる。

【0107】

「保存剤」は、細菌活性を低下させるため本明細書の製剤に添加できる化合物である。保存剤を添加すると、例えば多数回使用（多数回用量）製剤の製造を容易にすることができる。潜在的な保存剤の例に含まれるのは、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンズアルコニウム（アルキル基が長鎖化合物である塩化アルキルベンジルジメチルアンモニウムの混合物）、および塩化ベンゼトニウムである。他のタイプの保存剤に含まれるのは、芳香族アルコール（フェノール、ブチルアルコール、ベンジルアルコールなど）、アルキルパラベン（メチルパラベンまたはプロピルパラベンなど）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、およびｍ－クレゾールである。本明細書で最も好ましい保存剤はベンジルアルコールである。

【0108】

「医薬製剤」と「医薬組成物」という用語は、活性成分の生物活性が有効であることを可能にする形態になっていて、その製剤が投与されるはずの対象にとって許容できない毒性がある追加成分を含有しない調製物を意味する。このような製剤は減菌されている可能性がある。

【0109】

「減菌」製剤は無菌であるか、生きた微生物とその胞子が実質的に存在しない。

【0110】

「安定な」製剤は、保管したときその中のタンパク質が本質的にその物理的・化学的安定性と完全性を保持している製剤である。タンパク質の安定性を測定するためのさまざまな分析技術を本分野で利用することができ、それが概説されているのは、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， ２４７－３０１， Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ Ｅｄ．， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， Ｐｕｂｓ． （１９９１）と、Ｊｏｎｅｓ， Ａ． Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ． １０： ２９－９０ （１９９３）である。安定性は、選択した温度で、選択した期間にわたって測定することができる。迅速なスクリーニングのためには製剤を４０℃で２週間～１ヶ月間にわたって保管することができ、その時点で安定性が測定される。製剤を２～８℃で保管する場合には、一般にその製剤は、３０℃または４０℃で少なくとも１ヶ月間にわたって、および／または２～８℃で少なくとも２年間にわたって安定でなければならない。製剤を３０℃で保管する場合には、一般にその製剤は、３０℃で少なくとも２年間にわたって、および／または４０℃で少なくとも６ヶ月間にわたって安定でなければならない。例えば保管中の凝集の程度をタンパク質の安定性の指標として利用できる。したがって「安定な」製剤として、タンパク質の約１０％未満、好ましくは約５％未満が製剤中に凝集体として存在する製剤が可能である。他の実施形態では、製剤を保管している間の凝集体形成のあらゆる増加を明らかにすることができる。

【0111】

「再構成された」製剤は、凍結乾燥されたタンパク質製剤または抗体製剤を希釈剤に溶かしてタンパク質を全体に分散させることによって調製されたものである。再構成された製剤は、興味あるタンパク質で治療すべき患者に投与（例えば皮下投与）するのに適しており、ある実施形態では、非経口投与または静脈内投与に適したものが可能である。

【0112】

「等張」製剤は、ヒト血液と本質的に同じ浸透圧を持つ製剤である。等張製剤は一般に約２５０～３５０ｍＯｓｍの浸透圧を持つであろう。「低張性」という用語は、ヒト血液よりも低い浸透圧を持つ製剤を記述する。それに対応して「高張性」という用語は、ヒト血液よりも高い浸透圧を持つ製剤を記述するのに使用される。等張性は、例えば蒸気圧または氷冷タイプの浸透圧計を用いて測定することができる。本出願の製剤は、塩および／またはバッファを添加する結果として高張性であること可能である。

【0113】

本明細書に記載されている実施形態には、実施形態「からなる」および／または実施形態「から実質的になる」が含まれることを理解すべきである。

【0114】

本明細書と添付の請求項では、単数形「１つの」、「または」、および「その」に複数形が含まれるが、文脈が明らかに異なることを述べている場合は別である。

【0115】

ＩＩ．抗Ｃ５ａ抗体
本出願により、新規なヒト化抗ヒトＣ５ａ抗体とコンストラクトが提供される。いくつかの実施形態では、この抗体は、そのＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインの中に変異を持つ。いくつかの実施形態では、変異は、抗原への結合において抗体をｐＨ感受性にする。いくつかの実施形態では、抗Ｃ５ａ抗体は、中性ｐＨ（例えばｐＨ約７．４；例えば血液で見られるｐＨ）ではより酸性のｐＨ（例えばｐＨ約５．８；例えばエンドソームで見られるｐＨ）よりもＣ５に抗体がより強く結合するようにすることでＣ５へのオフ－ターゲット結合を減らすある変異を有する。いくつかの実施形態では、変異はヒスチジン変異である（例えばＶＨドメイン内の変異Ｆ２９Ｈと、ＶＬドメイン内の変異Ｙ９６Ｈ）。

【0116】

本出願のヒト化Ｃ５ａ抗体は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む少なくとも１つの抗原結合部分を含む。本明細書で考慮する代表的な抗原結合断片の非限定的な例に含まれるのは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦｖ断片；ディアボディ；直線状抗体；一本鎖抗体分子（ｓｃＦｖなど）；および抗体断片から形成される多重特異性抗体である。このような抗原結合部分として、２つの重鎖と２つの軽鎖からなる従来の完全長抗体、またはそれに由来する抗原結合断片が可能である。

【0117】

いくつかの実施形態では、ヒト化Ｃ５ａ抗体はＶＨの中に変異Ｉ４８Ｍ、Ｄ５４Ｅ、およびＮ５６Ｗを含む（ただし変異はＫａｂａｔ番号付けシステムの下で配列番号１を参照する）。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体はＶＬの中に変異Ｄ２８ＥとＤ３０Ｆを含む（ただし変異はＫａｂａｔ番号付けシステムの下で配列番号２を参照する）。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムの下で配列番号１を参照すると変異Ｉ４８Ｍ、Ｄ５４Ｅ、およびＮ５６Ｗを含むＶＨと、配列番号２を参照すると変異Ｄ２８ＥとＤ３０Ｆを含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨの中に変異Ｉ４８Ｍ、Ｄ５４Ｅ、およびＮ５６Ｗを含むヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、ヒトＣ５ａに対し、配列番号１を含む抗Ｃ５ａ抗体よりも１０倍超大きい改善された親和性を持つ。いくつかの実施形態では、ＶＨの中に変異Ｉ４８Ｍ、Ｄ５４Ｅ、およびＮ５６Ｗを含むヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、カニクイザルＣ５ａとの交差種活性を持つ。

【0118】

いくつかの実施形態では、ヒト化Ｃ５ａ抗体は軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）の中に１つ以上の追加変異（ヒスチジン変異など）をさらに含む。例えばいくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、ＶＨの中の変異Ｆ２９Ｈと、ＶＬの中の変異Ｙ９６Ｈを含む。

【0119】

いくつかの実施形態では、ヒト化Ｃ５ａ抗体はＶＨの中に変異Ｅ５４ＨまたはＮ９７Ｈをさらに含む（ただしＶＨ変異はＫａｂａｔ番号付けシステムの下で配列番号１を参照する：ＱＶＱＬＱＱＳＤＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＶＳＧＹＴＦＴＤＨＩＩＨＷＭＮＱＲＰＥＱＧＬＥＷＩＧＹＩＹＰＲＤＧＮＴＮＹＮＥＮＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＥＲＮＬＥＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ（配列番号１））。

【0120】

いくつかの実施形態では、ヒト化Ｃ５ａ抗体は、軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）の中に１つ以上の追加変異（ヒスチジン変異など）をさらに含む。例えばいくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体はＶＬの中に変異Ｎ９２Ｈを含む（ただしＶＬ変異はＫａｂａｔ番号付けシステムの下で配列番号２を参照する：ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＮＹＭＮＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＬＤＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＮＩＨＰＶＥＥＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２））。

【0121】

いくつかの実施形態では、ヒト化Ｃ５ａ抗体は、ＶＨのＥ５４Ｈ、ＶＨのＮ９７Ｈ、およびＶＬのＮ９２Ｈからなるグループから選択される変異を含む（ただし前記ＶＨ変異はＫａｂａｔ番号付けシステムの下で配列番号１を参照し、前記ＶＬ変異はＫａｂａｔ番号付けシステムの下で配列番号２を参照する）。

【0122】

したがっていくつかの実施形態では、ヒト化Ｃ５ａ抗体は、配列番号１を参照すると変異Ｉ４８Ｍ、Ｄ５４Ｅ、およびＮ５６Ｗを含むＶＨと、配列番号２を参照すると変異Ｄ２８ＥとＤ３０Ｆを含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、配列番号１を参照するとＶＨの中の変異Ｆ２９Ｈを、配列番号２を参照するとＶＬの中の変異Ｙ９６Ｈをさらに含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、ＶＨのＥ５４Ｈ、ＶＨのＮ９７Ｈ、およびＶＬのＮ９２Ｈからなるグループから選択される変異をさらに含む（ただし前記ＶＨ変異はＫａｂａｔ番号付けシステムの下で配列番号１を参照し、前記ＶＬ変異はＫａｂａｔ番号付けシステムの下で配列番号２を参照する）。

【0123】

いくつかの実施形態では、ヒト化Ｃ５ａ抗体はＦｃ領域（ヒトＦｃ領域など）を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域はＩｇＧ分子（サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のいずれか１つなど）に由来する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は抗体エフェクタ機能（ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）および／またはＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）など）を媒介することができる。例えば野生型Ｆｃ配列を持つサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３の抗体は通常はＣＩｑとＣ３への結合を含む補体活性化を示すのに対し、ＩｇＧ４は補体系を活性化させず、ＣＩｑおよび／またはＣ３に結合しない。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体へのＦｃ領域の結合親和性を低下させる修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域はＩｇＧ４ Ｆｃである。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域は配列番号４３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４ Ｆｃは変異を含む。例えばＡｒｍｏｕｒ ＫＬ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９９； ２９： ２６１３と、Ｓｈｉｅｌｄｓ ＲＬ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２００１； ２７６： ６５９１を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｓ２２８Ｐ、Ｍ４２８Ｌ、およびＮ４３４Ａからなるグループから選択される１つ以上の変異を含む（ただし変異はＥＵ番号付けシステムの下で配列番号４３と比較する）。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は変異Ｓ２２８Ｐ、Ｍ４２８Ｌ、およびＮ４３４Ａを含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域は配列番号４４のアミノ酸配列を含む。

【0124】

いくつかの実施形態では、ヒト化Ｃ５ａ抗体（例えば配列番号１を参照すると変異Ｉ４８Ｍ、Ｄ５４Ｅ、およびＮ５６Ｗを含むＶＨと、配列番号２を参照すると変異Ｄ２８ＥとＤ３０Ｆを含むＶＬを含む本明細書に記載のヒト化Ｃ５ａ抗体のいずれか１つ）は、配列番号３のアミノ酸配列、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む重鎖ＣＤＲ１（「Ｈ－ＣＤＲ１」）；配列番号４のアミノ酸配列、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む重鎖ＣＤＲ２（「Ｈ－ＣＤＲ２」）；配列番号５のアミノ酸配列、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む重鎖ＣＤＲ３（「Ｈ－ＣＤＲ３」）；配列番号６のアミノ酸配列、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む軽鎖ＣＤＲ１（「Ｌ－ＣＤＲ１」）；配列番号７のアミノ酸配列、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む軽鎖ＣＤＲ２（「Ｌ－ＣＤＲ２」）；および配列番号８のアミノ酸配列、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む軽鎖ＣＤＲ３（「Ｌ－ＣＤＲ３」）を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（「Ｈ－ＣＤＲ１」）；配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（「Ｈ－ＣＤＲ２」）；配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（「Ｈ－ＣＤＲ３」）；配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（「Ｌ－ＣＤＲ１」）；配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（「Ｌ－ＣＤＲ２」）；および配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（「Ｌ－ＣＤＲ３」）を含む。

【0125】

（本明細書に記載のＣＤＲ配列とは独立な、またはそれに加えた）いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、アミノ酸配列配列番号９を含むＶＨ、または配列番号９とのアミノ酸相同性が少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超のいずれか１つであるそのバリアントと；配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬ、または配列番号１０とのアミノ酸相同性が少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超のいずれか１つであるそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、アミノ酸配列配列番号９を含むＶＨと、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体はＦｃ領域（ＩｇＧ４のＦｃ領域など）をさらに含む。

【0126】

いくつかの実施形態では、ヒト化Ｃ５ａ抗体（例えば配列番号１を参照すると変異Ｉ４８Ｍ、Ｄ５４Ｅ、およびＮ５６Ｗを含むＶＨと、配列番号２を参照すると変異Ｄ２８ＥとＤ３０Ｆを含む本明細書に記載のヒト化Ｃ５ａ抗体のいずれか１つ）は、配列番号１１のアミノ酸配列、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む重鎖ＣＤＲ１（「Ｈ－ＣＤＲ１」）；配列番号１２のアミノ酸配列、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む重鎖ＣＤＲ２（「Ｈ－ＣＤＲ２」）；配列番号１３のアミノ酸配列、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む重鎖ＣＤＲ３（「Ｈ－ＣＤＲ３」）；配列番号１４のアミノ酸配列、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む軽鎖ＣＤＲ１（「Ｌ－ＣＤＲ１」）；配列番号１５のアミノ酸配列、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む軽鎖ＣＤＲ２（「Ｌ－ＣＤＲ２」）；および配列番号１６のアミノ酸配列、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む軽鎖ＣＤＲ３（「Ｌ－ＣＤＲ３」）を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（「Ｈ－ＣＤＲ１」）；配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（「Ｈ－ＣＤＲ２」）；配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（「Ｈ－ＣＤＲ３」）；配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（「Ｌ－ＣＤＲ１」）；配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（「Ｌ－ＣＤＲ２」）；および配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（「Ｌ－ＣＤＲ３」）を含む。

【0127】

（本明細書に記載のＣＤＲ配列とは独立な、またはそれに加えた）いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、アミノ酸配列配列番号１７を含むＶＨ、または配列番号１７とのアミノ酸相同性が少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超のいずれか１つであるそのバリアントと；配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬ、または配列番号１８とのアミノ酸相同性が少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超のいずれか１つであるそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、アミノ酸配列配列番号１７を含むＶＨと、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体はＦｃ領域（ＩｇＧ４のＦｃ領域など）をさらに含む。

【0128】

いくつかの実施形態では、ヒト化Ｃ５ａ抗体（例えば配列番号１を参照すると変異Ｉ４８Ｍ、Ｄ５４Ｅ、およびＮ５６Ｗを含むＶＨと、配列番号２を参照すると変異Ｄ２８ＥとＤ３０Ｆを含むＶＬを含む本明細書に記載のヒト化抗Ｃ５ａ抗体のいずれか１つ）は、配列番号１９のアミノ酸配列、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む重鎖ＣＤＲ１（「Ｈ－ＣＤＲ１」）；配列番号２０のアミノ酸配列、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む重鎖ＣＤＲ２（「Ｈ－ＣＤＲ２」）；配列番号２１のアミノ酸配列、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む重鎖ＣＤＲ３（「Ｈ－ＣＤＲ３」）；配列番号２２のアミノ酸配列、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む軽鎖ＣＤＲ１（「Ｌ－ＣＤＲ１」）；配列番号２３のアミノ酸配列、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む軽鎖ＣＤＲ２（「Ｌ－ＣＤＲ２」）；および配列番号２４のアミノ酸配列、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む軽鎖ＣＤＲ３（「Ｌ－ＣＤＲ３」）を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（「Ｈ－ＣＤＲ１」）；配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（「Ｈ－ＣＤＲ２」）；配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（「Ｈ－ＣＤＲ３」）；配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（「Ｌ－ＣＤＲ１」）；配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（「Ｌ－ＣＤＲ２」）；および配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（「Ｌ－ＣＤＲ３」）を含む。

【0129】

（本明細書に記載のＣＤＲ配列とは独立な、またはそれに加えた）いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、アミノ酸配列配列番号２５を含むＶＨ、または配列番号２５とのアミノ酸相同性が少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超のいずれか１つであるそのバリアントと；配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬ、または配列番号２６とのアミノ酸相同性が少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超のいずれか１つであるそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、アミノ酸配列配列番号２５を含むＶＨと、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体はＦｃ領域（ＩｇＧ４のＦｃ領域など）をさらに含む。

【0130】

いくつかの実施形態では、ヒト化Ｃ５ａ抗体（例えば配列番号１を参照すると変異Ｉ４８Ｍ、Ｄ５４Ｅ、およびＮ５６Ｗを含むＶＨと、配列番号２を参照すると変異Ｄ２８ＥとＤ３０Ｆを含むＶＬを含む本明細書に記載のヒト化Ｃ５ａ抗体のいずれか１つ）は、配列番号２７のアミノ酸配列、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む重鎖ＣＤＲ１（「Ｈ－ＣＤＲ１」）；配列番号２８のアミノ酸配列、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む重鎖ＣＤＲ２（「Ｈ－ＣＤＲ２」）；配列番号２９のアミノ酸配列、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む重鎖ＣＤＲ３（「Ｈ－ＣＤＲ３」）；配列番号３０のアミノ酸配列、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む軽鎖ＣＤＲ１（「Ｌ－ＣＤＲ１」）；配列番号３１のアミノ酸配列、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む軽鎖ＣＤＲ２（「Ｌ－ＣＤＲ２」）；および配列番号３２のアミノ酸配列、または１、２、または３個のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む軽鎖ＣＤＲ３（「Ｌ－ＣＤＲ３」）を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（「Ｈ－ＣＤＲ１」）；配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（「Ｈ－ＣＤＲ２」）；配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（「Ｈ－ＣＤＲ３」）；配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（「Ｌ－ＣＤＲ１」）；配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（「Ｌ－ＣＤＲ２」）；および配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（「Ｌ－ＣＤＲ３」）を含む。

【0131】

（本明細書に記載のＣＤＲ配列とは独立な、またはそれに加えた）いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、アミノ酸配列配列番号３３を含むＶＨ、または配列番号３３とのアミノ酸相同性が少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超のいずれか１つであるそのバリアントと；配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬ、または配列番号３４とのアミノ酸相同性が少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超のいずれか１つであるそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、アミノ酸配列配列番号３３を含むＶＨと、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体はＦｃ領域（ＩｇＧ４のＦｃ領域など）をさらに含む。

【0132】

いくつかの実施形態では、ヒト化Ｃ５ａ抗体は、配列番号５４のＶＨドメインを持つ抗体のＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、およびＨ－ＣＤＲ３の配列と、配列番号５５のＶＬドメインを持つ抗体のＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、およびＬ－ＣＤＲ３の配列を含む。

【0133】

いくつかの実施形態では、ヒト化Ｃ５ａ抗体は、配列番号５６のＶＨドメインを持つ抗体のＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、およびＨ－ＣＤＲ３の配列と、配列番号５７のＶＬドメインを持つ抗体のＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、およびＬ－ＣＤＲ３の配列を含む。

【0134】

いくつかの実施形態では、ヒト化Ｃ５ａ抗体は、配列番号５８のＶＨドメインを持つ抗体のＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、およびＨ－ＣＤＲ３の配列と、配列番号５９のＶＬドメインを持つ抗体のＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、およびＬ－ＣＤＲ３の配列を含む。

【0135】

いくつかの実施形態では、ヒト化Ｃ５ａ抗体は、配列番号６０のＶＨドメインを持つ抗体のＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、およびＨ－ＣＤＲ３の配列と、配列番号６１のＶＬドメインを持つ抗体のＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、およびＬ－ＣＤＲ３の配列を含む。

【0136】

いくつかの実施形態では、ヒト化Ｃ５ａ抗体は、配列番号６２のＶＨドメインを持つ抗体のＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、およびＨ－ＣＤＲ３の配列と、配列番号６３のＶＬドメインを持つ抗体のＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、およびＬ－ＣＤＲ３の配列を含む。

【0137】

いくつかの実施形態では、ヒト化Ｃ５ａ抗体は、配列番号６４のＶＨドメインを持つ抗体のＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、およびＨ－ＣＤＲ３の配列と、配列番号６５のＶＬドメインを持つ抗体のＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、およびＬ－ＣＤＲ３の配列を含む。

【0138】

いくつかの実施形態では、ヒト化Ｃ５ａ抗体は、配列番号６６のＶＨドメインを持つ抗体のＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、およびＨ－ＣＤＲ３の配列と、配列番号６７のＶＬドメインを持つ抗体のＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、およびＬ－ＣＤＲ３の配列を含む。

【0139】

いくつかの実施形態では、ヒト化Ｃ５ａ抗体は、配列番号６８のＶＨドメインを持つ抗体のＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、およびＨ－ＣＤＲ３の配列と、配列番号６９のＶＬドメインを持つ抗体のＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、およびＬ－ＣＤＲ３の配列を含む。

【0140】

いくつかの実施形態では、ヒト化Ｃ５ａ抗体は、配列番号７０のＶＨドメインを持つ抗体のＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、およびＨ－ＣＤＲ３の配列と、配列番号７１のＶＬドメインを持つ抗体のＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、およびＬ－ＣＤＲ３の配列を含む。

【0141】

いくつかの実施形態では、ヒト化Ｃ５ａ抗体は、配列番号７２のＶＨドメインを持つ抗体のＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、およびＨ－ＣＤＲ３の配列と、配列番号７３のＶＬドメインを持つ抗体のＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、およびＬ－ＣＤＲ３の配列を含む。

【0142】

いくつかの実施形態では、ヒト化Ｃ５ａ抗体は、配列番号７４のＶＨドメインを持つ抗体のＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、およびＨ－ＣＤＲ３の配列と、配列番号７５のＶＬドメインを持つ抗体のＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、およびＬ－ＣＤＲ３の配列を含む。

【0143】

いくつかの実施形態では、ヒト化Ｃ５ａ抗体は、配列番号７６のＶＨドメインを持つ抗体のＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、およびＨ－ＣＤＲ３の配列と、配列番号７７のＶＬドメインを持つ抗体のＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、およびＬ－ＣＤＲ３の配列を含む。

【0144】

いくつかの実施形態では、ヒト化Ｃ５ａ抗体は、配列番号７８のＶＨドメインを持つ抗体のＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、およびＨ－ＣＤＲ３の配列と、配列番号７９のＶＬドメインを持つ抗体のＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、およびＬ－ＣＤＲ３の配列を含む。

【0145】

いくつかの実施形態では、ヒト化Ｃ５ａ抗体は、配列番号８０のＶＨドメインを持つ抗体のＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、およびＨ－ＣＤＲ３の配列と、配列番号８１のＶＬドメインを持つ抗体のＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、およびＬ－ＣＤＲ３の配列を含む。

【0146】

いくつかの実施形態では、ヒト化Ｃ５ａ抗体は、配列番号８２のＶＨドメインを持つ抗体のＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、およびＨ－ＣＤＲ３の配列と、配列番号８３のＶＬドメインを持つ抗体のＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、およびＬ－ＣＤＲ３の配列を含む。

【0147】

変異を参照するのにＫａｂａｔ番号付けシステムを利用するが、変異の位置は、下記の表１に代表的な配列を用いて示されているように、異なる番号付けシステムの下で表わせることを理解すべきである。

【表1】

【0148】

Ｃ５ａタンパク質とＣ５ａ結合分析
補体系は、多くの自己免疫性、炎症性、および虚血性の疾患の病状において重要な役割を果たしている。補体の不適切な活性化と宿主細胞へのその堆積は、補体を媒介とした溶解、および／または細胞と標的組織の損傷のほか、炎症の強力なメディエータの生成に起因する組織破壊につながる可能性がある。補体系（補体カスケードとしても知られる）は免疫系の一部であり、抗体と貪食細胞が微生物と損傷した細胞を生物から排除する能力を増強（補足）し、炎症を促進し、病原体の細胞膜を攻撃する。補体系は自然免疫系の一部であって適応可能ではなく、個体の生涯を通じて変化しない。しかし補体系は適応免疫系によって生成した抗体によってリクルートされて作用することができる。

【0149】

どの理論または仮説にも囚われないと、既知の３つの補体経路、すなわち代替補体経路（ＡＰ）、古典経路（ＣＰ）、およびレクチン経路（ＬＰ）が存在する。一般に、ＣＰは抗原－抗体複合体によって開始され、ＬＰは、微生物表面の糖分子にレクチンが結合することによって活性化されるのに対し、ＡＰは低レベルで構成的に活性だが、調節タンパク質が欠落しているため、細菌、ウイルス、および寄生虫の細胞表面で迅速に増幅することができる。宿主細胞は、通常は調節タンパク質によってＡＰ補体活性化から保護される。しかしいくつかの状況では、例えば調節タンパク質が欠損していたり失われていたりするときのようにＡＰが宿主細胞の表面で活性化されて制御不能になり、補体関連の疾患または障害に至る可能性もある。ＣＰは成分Ｃ１、Ｃ２、Ｃ４からなり、Ｃ３活性化工程でＡＰに収束する。ＬＰはマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）とＭＢＬ関連セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）からなり、ＣＰと成分Ｃ４およびＣ２を共有する。ＡＰは、成分Ｃ３といくつかの因子（因子Ｂ、因子Ｄ、プロペルジン、および流体相調節因子Ｈなど）からなる。補体活性化は３つの段階からなる。すなわち（ａ）認識、（ｂ）酵素による活性化、および（ｃ）膜攻撃から細胞死へである。ＣＰ補体活性化の第１段階はＣ１から始まる。Ｃ１は、３つの異なるタンパク質、すなわち認識サブユニット（Ｃ１ｑ）と、セリンプロテアーゼ亜成分Ｃ１ｒおよびＣ１ｓからなる。Ｃ１ｒとＣ１ｓは互いに結合してカルシウム依存性四量体複合体Ｃ１ｒ２ ｓ２になる。Ｃ１の生理学的活性化が起こるにはインタクトなＣ１複合体が必要とされる。活性化が起こるのは、インタクトなＣ１複合体が、抗原との複合体になった免疫グロブリンに結合するときである。この結合によってＣ１ｓが活性化されるとＣ４タンパク質とＣ２タンパク質の両方が切断され、Ｃ４ａとＣ４ｂのほかＣ２ａとＣ２ｂが生成する。Ｃ４ｂ断片とＣ２ａ断片は組み合わさってＣ３コンベルターゼ（Ｃ４ｂ２ａ）を形成し、それが今度はＣ３を切断してＣ３ａとＣ３ｂを形成する。ＬＰの活性化は標的表面上のある糖にＭＢＬが結合することによって開始され、そのことによってＭＢＬ関連セリンプロテアーゼ（ＭＡＰＳ）の活性化が始まり、ＭＡＰＳがＣＰのＣ１ｓの活性と同様のやり方でＣ４とＣ２を切断することで、Ｃ３コンベルターゼであるＣ４ｂ２ａが生成する。したがってＣＰとＬＰは異なる機構によって活性化されるが、同じ成分Ｃ４とＣ２を共有しているため、両方の経路で同じＣ３コンベルターゼであるＣ４ｂ２ａが生成する。Ｃ３がＣ４ｂ２ａによって切断されてＣ３ｂとＣ３ａになることは、２つの理由で補体経路の中心的なイベントである。この切断によってＡＰ増幅ループが開始される。なぜなら表面に堆積したＣ３ｂはＡＰ Ｃ３コンベルターゼＣ３ｂＢｂの中心的な中間体だからである。Ｃ３ａとＣ３ｂの両方が生物学的に重要である。Ｃ３ａは炎症促進性であり、Ｃ５ａとともにアナフィラトキシンと呼ばれる。Ｃ３ｂとそのさらなる切断産物も好中球、好酸球、単球、およびマクロファージの表面に存在する補体受容体に結合することで、Ｃ３ｂオプソニン化粒子のファゴサイトーシスと排出を容易にする。最後に、Ｃ３ｂはＣ４ｂ２ａまたはＣ３ｂＢｂと会合してＣＰとＬＰのＣ５コンベルターゼ、およびＡＰのＣ５コンベルターゼをそれぞれ形成し、終末補体配列を活性化させることができるため、強力な炎症促進性メディエータであるＣ５ａと、溶解性膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の集合体、Ｃ５－Ｃ９の産生に至る。

【0150】

欠陥のある補体作用は、いくつかのヒト糸球体疾患（非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、抗好中球細胞質抗体関連血管炎（ＡＮＣＡ）、Ｃ３糸球体症、ＩｇＡ腎症、免疫複合体膜性増殖性糸球体腎炎、腎虚血再灌流損傷、ループス腎炎、膜性腎症、および慢性移植関連糸球体症が含まれる）の一因である。異常な補体成分活性化が、さまざまなタイプのがんとその臨床転帰におけるマーカーとして提案されてきた。肺がん患者は補体タンパク質と活性化断片の血漿レベルが対照ドナーよりも有意に高いことが示されており、上昇した補体レベルは肺腫瘍のサイズと相関している。補体関連タンパク質は他のタイプの腫瘍を持つ患者からの体液中でも上昇している。例えばＰｉｏ ｅｔ ａｌ． Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１３ Ｆｅｂ； ２５（１）： ５４－６４を参照されたい。補体カスケードの阻害が、糸球体疾患とがんの治療のために提案されてきた。

【0151】

Ｃ５ａは７４個のアミノ酸のアナフィラトキシン（配列番号４５）であり、補体成分Ｃ５の切断から生じる。成熟Ｃ５は補体経路が活性化されている間に切断されてＣ５ａ断片とＣ５ｂ断片になる。Ｃ５ａは、アルファ鎖の最初の７４個のアミノ酸を含むアミノ末端断片としてのＣ５コンベルターゼによってＣ５のアルファ鎖から切断される。成熟Ｃ５の残部は断片Ｃ５ｂであり、ベータ鎖に結合したアルファ鎖ジスルフィドの残部を含有する。Ｃ５ａの１１ｋＤａの塊のほぼ２０％が炭化水素に帰される。Ｃ５ａは高炎症性ペプチドとして作用し、アレルギー応答に関与する補体の活性化、ＭＡＣの形成、自然免疫細胞の呼び寄せ、およびヒスタミンの放出を促進する。Ｃ５ａはアナフィラトキシンであり、エンドセリン上の接着分子の発現増加、平滑筋の収縮、および血管透過性の増加を引き起こす。Ｃ５ａ ｄｅｓ－Ａｒｇははるかに弱いアナフィラトキシンである。Ｃ５ａとＣ５ａ ｄｅｓ－Ａｒｇの両方がマスト細胞の脱顆粒を開始させ、炎症促進分子であるヒスタミンと ＴＮＦ－αを放出させることができる。Ｃ５ａは効果的な化学誘引物質でもあり、感染部位における補体と貪食細胞の蓄積、またはリンパ節への抗原提示細胞のリクルートを開始させる。Ｃ５ａは、容器の壁面への好中球と単球の移動と接着を増加させる上で重要な役割を果たす。白血球細胞は、インテグリンのアビディティ、リポキシゲナーゼ経路、およびアラキドン酸代謝の上方調節によって活性化される。Ｃ５ａは白血球上のＩｇＧ Ｆｃ受容体の活性化と阻害の間のバランスも変化させ、そのことによって自己免疫応答を増強する。例えばＭａｎｔｈｅｙ ＨＤ， Ｗｏｏｄｒｕｆｆ ＴＭ， Ｔａｙｌｏｒ ＳＭ， Ｍｏｎｋ ＰＮ （Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００９）． “Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ５ａ （Ｃ５ａ）”． Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ４１ （１１）： ２１１４－７を参照されたい。

【0152】

Ｃ５ａは標的細胞（マクロファージ、好中球、および内皮細胞など）の表面上のＣ５ａＲ（ＣＤ８８としても知られる）に結合してシグナル伝達を開始させ、炎症応答を促進する。Ｃ５ａ／Ｃ５ａＲシグナルはＭＤＳＣの増殖を促進するため、Ｔ細胞免疫を制限する。Ｃ５ａ／Ｃ５ａＲ経路の阻害は炎症性疾患を改善するため免疫腫瘍学における潜在力があることが提案されている。

【0153】

本明細書に記載のヒト化抗Ｃ５ａ抗体の結合の親和性と特異性は、本分野で知られている方法によって実験的に明らかにすることができる。例えばタンパク質抗原への抗体の結合は多彩な技術を利用して検出および／または定量することができ、技術の非限定的な例に含まれるのは、ウエスタンブロット、ドットブロット、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法（例えばＢＩＡｃｏｒｅシステム；Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ、ウプサラ、スウェーデン国とピスカタウェイ、ニュージャージー州）、バイオレイヤー干渉（ＢＬＩ）（例えばＯｃｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）、ＲＩＡ、ＥＣＬ、ＩＲＭＡ、ＥＩＡ、ペプチドスキャン、および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。例えばＢｅｎｎｙ Ｋ． Ｃ． Ｌｏ （２００４） “Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．” Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ （ＩＳＢＮ：１５８８２９０９２１）；Ｂｏｒｒｅｂａｅｋ （１９９２） “Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ．” Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｎ．Ｙ．；Ｂｏｒｒｅｂａｅｋ （１９９５） “Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．” ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．， Ｏｘｆｏｒｄ；Ｊｏｈｎｅ ｅｔ ａｌ． （１９９３）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ １６０：１９１－１９８；Ｊｏｎｓｓｏｎｅｔａｌ． （１９９３） Ａｎｎ Ｂｉｏｌ Ｃｌｉｎ ５１：１９－２６；およびＪｏｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：６２０－６２７を参照されたい。それに加え、親和性（例えばＢＬＩにより解離定数と会合定数）を測定する方法は実例に示されている。

【0154】

本明細書に記載の特定の抗体がＣ５ａを阻害するかどうかを判断する方法は本分野で知られている。Ｓｃｈｒａｕｆｓｔａｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍａｒｃｈ １５， ２００９， １８２ （６） ３８２７－３８３６に示されているように、Ｃ５ａを阻害すると細胞の走化性移動を減らすことができる。したがってＣ５ａの機能は例えば細胞移動アッセイによって明らかにすることができる。例えばＲｏｕｓｓｅａｕ， Ｓｉｍｏｎ， ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ １８．１１ （２００６）： １８９７－１９０５を参照されたい。Ｃ５ａは細胞へのカルシウム流入を誘導することが示されている（Ｍｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １９９７ Ｊａｎ １５； １７（２）： ６１５－６２４）。カルシウム流入アッセイを利用したＣ５ａ活性の測定が、例えばＦａｒｋａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌｕｍｅ ８６， Ｉｓｓｕｅ ３， １９９８， Ｐａｇｅｓ ９０３－９１１に記載されているカルシウム染色法、または放射測定技術（Ｍｏｎｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ （１９９３） ２９５ （３）： ６７９－６８４）を利用して可能になる。

【0155】

本明細書に記載のある特定の抗体がＣ５切断を阻害するかどうかを判断する方法は本分野で知られている。ヒト補体成分Ｃ５を阻害すると、対象の体液中の補体の細胞溶解能力を低下させることができる。体液中に存在する補体の細胞溶解能力のそのような低下は、本分野で周知の方法（例えば従来の溶血アッセイであるＨｉｌｌｍｅｎ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｎ Ｅｎｇｌ． Ｊ Ｍｅｄ ３５０（６）：５５２に記載のニワトリ赤血球溶血法における溶血アッセイなど）によって測定することができる。ある候補化合物が、ヒトＣ５が切断されて形態Ｃ５ａとＣ５ｂになるのを阻害するかどうかを判断する方法は本分野で知られており、例えばＴｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３３（１７－１８）： １３８９－４０１とＥｖａｎｓ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２（１６）： １１８３－９５に記載されている。例えば体液中のＣ５ａとＣ５ｂの濃度および／または生理学的活性は本分野で周知の方法によって測定することができる。Ｃ５ａの濃度または活性を測定する方法に含まれるのは、例えば走化性アッセイ、ＲＩＡ、またはＥＬＩＳＡである（例えばＷｕｒｚｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｉｎｆｌａｍｍ ８：３２８－３４０参照）。Ｃ５ｂについては、本明細書で論じられている溶解アッセイ、または可溶性Ｃ５ｂ－９のアッセイを利用できる。本分野で知られている他のアッセイも利用できる。これらのアッセイまたは他の適切なタイプのアッセイを利用して、ヒト補体成分Ｃ５を阻害することのできる候補薬剤をスクリーニングすることができる。

【0156】

溶血アッセイは、Ｃ５を媒介とする補体活性化に対する抗Ｃ５ａ抗体の抑制活性を判断するのに利用できるため、抗Ｃ５ａ抗体の潜在的なオフ－ターゲット結合を判断するのに有用である。インビトロで血清試験溶液において古典補体経路が媒介する溶血にヒト化抗Ｃ５ａ抗体が及ぼす効果を判断するため、例えば抗ニワトリ赤血球抗体で感作したヘモリシンまたはニワトリ赤血球で被覆したヒツジ赤血球を標的細胞として用いる。溶解の割合は、１００％溶解が阻害剤の不在下で起こる溶解に等しいと見なすことによって規格化した。代替経路を媒介とする溶血に対するヒト化抗Ｃ５ａ抗体の効果を判断するため、感作されていないウサギまたはモルモットの赤血球を標的細胞として使用する。溶解の割合は、１００％溶解が阻害剤の不在下で起こる溶解に等しいと見なすことによって規格化した。

【0157】

「ＴＭＤＤ」または「シンク効果」とｐＨ依存性抗Ｃ５ａ抗体
治療用モノクローナル抗体の大半は、標的介在性薬物消失またはＴＭＤＤが理由で非線形な用量依存性クリアランスを示す（「シンク効果」とも呼ばれる）。

【0158】

例えば抗体を低用量または治療未満用量で投与したとき、主に標的に結合し、遊離した抗体は非常に少ない。用量が増加すると、遊離した抗体の割合は抗体／抗原結合複合体よりも増加する。用量が非常に高レベルまで増加すると、抗原は十分に飽和または結合し、全抗体の大半が結合していないか遊離している。遊離ｍＡｂは、貪食プロセスによって排除されるｍＡｂ：Ａｇ結合複合体よりも（ＦｃＲｎ機構が理由で）長い半減期を持つ。したがって低用量では、（大半が結合状態である）全抗体の半減期はより短く、全抗体の半減期は用量が増加するにつれて長くなり、全抗体の多数を結合していないか遊離した抗体が占めるプラトーに達する。膜抗原に結合する抗体の排除は同じパラダイムに従う。低用量では排除はより迅速である。というのも結合していない標的は「吸い上げ」抗体になり、シンク（「抗原シンク」とも呼ばれる、Ｋｅｉｚｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ． ２０１０ Ａｕｇ； ４９（８）：４９３－５０７、Ｅｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． ２０１３ Ｊｕｌ； ２９（４）：３９１－６）として機能するからである。

【0159】

Ｃ５ａはＣ５の一部であるため、抗Ｃ５ａ抗体はＣ５によく結合することができる。抗Ｃ５ａ抗体によるＣ５への大きな結合能力と、血清Ｃ５濃度がＣ５ａよりも大きく過剰であることがＣ５を抗Ｃ５ａ抗体への結合シンクにしており、生体内での迅速な排除、すなわち抗Ｃ５ａ抗体に対するＣ５「シンク効果」につながる。

【0160】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のヒト化抗Ｃ５ａ抗体はＣ５に結合するが、Ｃ５コンベルターゼによるＣ５の切断は阻害しない。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体はＣ５に結合し、未知の作用機構を通じてＣ５のレベルを低下させる。いくつかの実施形態では、Ｃ５レベルの低下と同時にＣ５ａレベルの低下、および／またはＣ５介在性薬物消失の感度低下が起こる。いくつかの実施形態では、Ｃ５ａレベルの低下、および／またはＣ５介在性薬物消失の感度低下が、持続した薬効果につながる。

【0161】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のヒト化抗Ｃ５ａ抗体はＣ５からｐＨに依存して解離する。このようなｐＨ依存性結合は、投与された抗体または抗体融合タンパク質分子のより大きな持続性を提供する。なぜなら細胞によって取り込まれた免疫複合体（すなわちＣ５に結合したヒト化抗Ｃ５ａ抗体）はエンドソームの酸性環境で解離し、遊離した抗体または抗体融合タンパク質が細胞から新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を通じて出てリサイクルされることが可能になり、その受容体の位置で新たなＣ５ａ分子に結合するのに利用できるからである。

【0162】

いくつかの実施形態では、記載されているヒト化抗Ｃ５ａ抗体はＣ５にｐＨに依存して結合する。本明細書では、「ｐＨ依存性結合」という表現は、抗体が、酸性ｐＨ（例えば約ｐＨ５．８；エンドソームの中など）では中性ｐＨ（例えば約ｐＨ７．４；血液の中など）と比べてＣ５への減少した結合を示すことを意味する。

【0163】

本明細書に記載のヒト化抗Ｃ５ａ抗体のｐＨ依存性は、本分野（アメリカ合衆国特許第９，０７９，９４９号とＷＯ ２０１６／０９８３５６など）で知られている方法によって実験的に明らかにすることができる。ｐＨ依存性は、異なるｐＨレベルでの結合特性（結合親和性（例えば解離定数）、動態パラメータ（例えば会合速度と解離速度）、および解離率など）の差に反映される可能性がある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のヒト化抗Ｃ５ａ抗体のｐＨ依存性は解離率の比で表現することができる。いくつかの実施形態では、解離率は低ｐＨ解離因子と中性ｐＨ解離因子で表現することができる。

【0164】

ヒト化抗Ｃ５ａ抗体のｐＨ依存性は、Ｃ５に結合した抗体の酸性ｐＨ（例えばｐＨ５．８）または中性ｐＨ（例えばｐＨ７．４）での解離に基づいて評価することができる。低ｐＨ解離因子、すなわち２５℃にてｐＨ５．８で抗原から解離した抗体の割合（ただし抗体はｐＨ７．４で抗原にあらかじめ結合している）を利用し、酸性ｐＨでのＣ５結合抗体の解離を明らかにすることができる。低ｐＨ解離因子は、抗体と抗原（例えばヒト化抗Ｃ５ａ抗体とヒトＣ５）をｐＨ７．４で６００秒間会合させた後、ｐＨ５．８のバッファの中で解離期間を６００秒間にしてｐＨ５．８で抗原から解離した抗体の割合を計算することによって測定できる。いくつかの実施形態では、本発明のヒト化抗Ｃ５ａ抗体の低ｐＨ解離因子は、約５％～約９５％、約１０％～約９０％、約１５％～約８５％、約２０％～約８０％、約２０％～約７５％、約２０％～約７０％、約２０％～約６５％、約２０％～約６０％、約２５％～約７５％、約２５％～約７０％、約２５％～約６５％、約２５％～約６０％、約３０％～約７５％、約３０％～約７０％、約３０％～約６５％、約３０％～約６０％、約３５％～約７５％、約３５％～約７０％、約３５％～約６５％、約３５％～約６０％、約４０％～約７５％、約４０％～約７０％、約４０％～約６５％、約４０％～約６０％のいずれか１つの範囲内である。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体の中性ｐＨ解離因子は、約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％のいずれか以上である。

【0165】

中性ｐＨ解離因子、すなわち２５℃にて抗原からｐＨ７．４で解離する抗体の割合（ただし抗体はｐＨ７．４で抗原にあらかじめ結合しており、中性ｐＨでのＣ５結合抗体の解離を求めるのに使用できる）。中性ｐＨ解離因子は、抗体と抗原（例えばヒト化抗Ｃ５ａ抗体とヒトＣ５）をｐＨ７．４で６００秒間会合させた後、ｐＨ７．４のバッファの中で解離期間を６００秒間にしてｐＨ７．４で抗原から解離した抗体の割合を計算することによって測定できる。いくつかの実施形態では、本発明のヒト化抗Ｃ５ａ抗体の中性ｐＨ解離因子は、約２０％、１８％、１６％、１４％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％のいずれか以下である。

【0166】

いくつかの実施形態では、本発明のヒト化抗Ｃ５ａ抗体の中性ｐＨ解離因子に対する低ｐＨ解離因子の比は、１以上、１．５以上、２以上、２．５以上、３以上、３．５以上、４以上、４．５以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、ｐＨ７．４でのＣ５に関する抗体の解離率に対するｐＨ５．８でのＣ５に関する抗体の解離率は、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６である。

【0167】

いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は中性ｐＨ（ｐＨ７．４など）において酸性ｐＨ（ｐＨ５．８など）よりも強く結合する。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体の低ｐＨ解離因子は、約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％のいずれか以上である。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体の中性ｐＨ解離因子は、約２０％、１８％、１６％、１４％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％のいずれか以下である。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体の中性ｐＨ解離因子に対する低ｐＨ解離因子の比は、約１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０のいずれかである。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体の中性ｐＨ解離因子に対する低ｐＨ解離因子の比は、約１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０のいずれか以上である。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体の中性ｐＨ解離因子に対する低ｐＨ解離因子の比は４以上である。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体の中性ｐＨ解離因子に対する低ｐＨ解離因子の比は５以上である。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体の中性ｐＨ解離因子に対する低ｐＨ解離因子の比は６以上である。

【0168】

ｐＨ依存性抗Ｃ５抗体の特性
本明細書に記載のｐＨ依存性ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は医薬組成物としての開発と利用に適する。

【0169】

本明細書に記載のｐＨ依存性ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、いくつかの実施形態では延長された生体内血清半減期を示す。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、マウス（トランスジェニックマウスが含まれる）において延長された血清半減期を示す。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は他の試験動物において延長された血清半減期を示す。代表的な試験動物の非限定的な例に含まれるのは、ラット、ニワトリ、ウサギ、ヒツジ、およびカニクイザルである。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体はヒトにおいて延長された血清半減期を示す。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、ヒトにおいて、少なくとも約２時間、約３日間、約５日間、約７日間、約９日間、約１１日間、約１３日間、約１５日間、約１７日間、約１９日間、約２１日間、約２３日間、約２５日間のいずれか１つの血清半減期を持つ。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、ヒトにおいて、少なくとも約２５日間の血清半減期を持つ。

【0170】

いくつかの実施形態では、ｐＨ依存性ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、ヒトＣ５への結合親和性がベンチマーク抗Ｃ５ａ抗体と同等である。

【0171】

ＩＩＩ．医薬組成物
本出願によってさらに提供されるのは、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体のいずれか１つと、医薬として許容可能な基剤とを含む医薬組成物である。医薬組成物は、望む精製度のヒト化抗Ｃ５ａ抗体を、医薬として許容可能なオプションの基剤、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｏｌ， Ａ． Ｅｄ． （１９８０））と混合することにより、凍結乾燥された製剤または水溶液の形態で調製することができる。

【0172】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は追加成分をさらに含む。追加成分の非限定的な例に含まれるのは、賦形剤；表面活性剤；分散剤；不活性な希釈剤；造粒剤と崩壊剤；結合剤；潤滑剤；甘味剤；香味剤；着色剤；保存剤；生理学的に分解する組成物（ゼラチンなど）；水性のビヒクルと溶媒；油性のビヒクルと溶媒；懸濁剤；分散剤または湿潤剤；乳化剤、粘滑剤；バッファ；塩；増粘剤；重点剤；乳化剤；抗酸化剤；抗生剤；抗真菌剤；安定剤；および医薬として許容可能なポリマー材料または疎水性材料の１つ以上である。本発明の医薬組成物に含めることのできる他の「追加成分」は本分野で知られており、それが記載されているのは例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８５， Ｇｅｎａｒｏ， ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ）である（参照によって本明細書に組み込まれている）。

【0173】

追加賦形剤には、（１）増量剤、（２）溶解増強剤、（３）安定剤、および（４）変性または容器壁面への接着を阻止する薬剤の１つ以上として機能することのできる薬剤が含まれる。

【0174】

医薬組成物は、生体内投与に使用するため減菌されていなければならない。医薬組成物は無菌濾過膜を通過させる濾過によって減菌することができる。本明細書の医薬組成物は一般に、減菌アクセスポートを持つ容器（例えば静脈内溶液バッグ、または皮下注射針によって孔を開けることのできるストッパを持つバイアル）に入れられる。

【0175】

持続放出調製物を調製することができる。持続放出または埋め込みのための組成物は、医薬として許容可能なポリマー材料または疎水性材料（エマルション、イオン交換樹脂、難溶性ポリマー、または難溶性塩など）を含むことができる。持続放出調製物の適切な例に含まれるのは、アンタゴニストを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスであり、そのマトリックスは成形物品の形態（例えばフィルムまたはマイクロカプセル）である。

【0176】

本明細書の医薬組成物は、治療している特定の適応に必要なときには２つ以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を与えない相補的な活性を持つ活性化合物を含有することもできる。その代わりに、またはそれに加えて、組成物は、細胞毒性剤、化学療法剤、サイトカイン、免疫抑制剤、または増殖阻害剤を含むことができる。このような分子は、想定する目的にとって有効な量で組み合わせて存在することが好適である。

【0177】

活性成分は、例えばコアセルベーション技術または界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン－マイクロカプセルとポリ－（メチルメタシレート）マイクロカプセル）のそれぞれ、コロイド薬送達系（例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）、またはマクロエマルションの中に封入することもできる。このような技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎに開示されている。

【0178】

医薬組成物の製剤は薬理学の分野で知られているか今後開発される任意の方法によって調製することができる。調製の非限定的な例に含まれるのは、活性成分を基剤または１つ以上の他の副成分と組み合わせた後、必要な場合または望ましい場合には生成物を成形または包装して望む単回投与単位または複数回投与単位にすることである。医薬組成物は、水性または油性の減菌注射懸濁液または溶液の形態で調製、包装、または販売することができる。この懸濁液または溶液は既知の技術に従って製剤にすることができ、活性成分に加え、追加成分（分散剤、湿潤剤、または懸濁剤など）を含むことができる。このような減菌注射製剤は、非毒性で非経口投与可能な希釈剤または溶媒（例えば水または１，３－ブタンジオールなど）を用いて調製することができる。他の許容可能な希釈剤と溶媒の非限定的な例に含まれるのは、リンガー溶液、等張塩化ナトリウム溶液、および不揮発性油（合成モノグリセリドまたはジグリセリドなど）である。

【0179】

本発明の医薬組成物は、口腔を通じて肺投与するのに適した製剤として調製、包装、または販売することができる。このような製剤は、活性成分を含んでいて約０．５～約７ナノメートル（いくつかの実施形態では約１～約６ナノメートル）の範囲の直径を持つ乾燥粒子を含むことができる。このような組成物は乾燥粉末の形態にすると便利である。それは、乾燥粉末リザーバを備える装置を用い、推進剤をこの装置に向けて流してその粉末を分散させるため、または自己推進溶媒／粉末供給容器（例えば密封容器の中の低沸点推進剤に溶解させるか懸濁させた活性成分を含む装置）を用いて投与するためである。

【0180】

肺送達のための製剤にされた本発明の医薬組成物は、活性成分を溶液または懸濁液の液滴の形態で提供することもできる。このような製剤は、場合により減菌されていて活性成分を含む水性または希アルコール性の溶液または懸濁液として調製、包装、または販売することができ、任意の噴霧装置または霧化装置を用いて簡便に投与することができる。このような製剤は１つ以上の追加成分をさらに含むことができ、その非限定的な例に含まれるのは、香味剤（サッカリンナトリウムなど）、揮発油、緩衝剤、表面活性剤、または保存剤（ヒドロキシ安息香酸メチルなど）である。

【0181】

本発明の医薬組成物は、口腔投与に適した製剤にして調製、包装、または販売することができる。このような製剤は従来法を利用して例えば錠剤またはロゼンジの形態にすることが可能であり、例えば０．１～２０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含むことができ、残りは、溶解または分解が可能な経口組成物と、場合により１つ以上の追加成分を含む。あるいは口腔投与に適した製剤は、活性成分を含有する粉末を含むこと、または活性成分を含有するエアロゾル化または噴霧化された溶液または懸濁液を含むことができる。いくつかの実施形態では、このように粉末化、エアロゾル化、またはエアロゾル化された製剤は、分散させたときに粒子または液滴の平均サイズが約０．１～約２００ナノメートルの範囲であり、１つ以上の追加成分をさらに含むことができる。

【0182】

ＩＶ．利用の方法
個体において補体活性化を阻害して疾患（補体関連の疾患または障害など）を治療することを、有効な量のヒト化抗Ｃ５ａ抗体をその個体に投与することにより実現する方法も提供される。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。

【0183】

ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、他の治療様式（例えば抗炎症療法など）と組み合わせて利用することができる。本発明の方法と組み合わせて利用できる抗炎症療法の例に含まれるのは、例えばステロイド薬を用いる療法のほか、非ステロイド薬を用いる療法である。

【0184】

いくつかの実施形態では、個体における補体活性化を阻害する方法として、（例えば皮下投与または静脈内投与による全身投与などで）個体に有効な量のヒト化抗Ｃ５ａ抗体を投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、配列番号１を参照すると変異Ｉ４８Ｍ、Ｄ５４Ｅ、およびＮ５６Ｗを含むＶＨと、配列番号２を参照すると変異Ｄ２８ＥとＤ３０Ｆを含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、配列番号１を参照するとＶＨの中の変異Ｆ２９Ｈを、配列番号２を参照するとＶＬの中の変異Ｙ９６Ｈをさらに含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、ＶＨのＥ５４Ｈ、ＶＨのＮ９７Ｈ、およびＶＬのＮ９２Ｈからなるグループから選択される変異をさらに含む（ただし前記ＶＨ変異はＫａｂａｔ番号付けシステムの下で配列番号１を参照し、前記ＶＬ変異はＫａｂａｔ番号付けシステムの下で配列番号２を参照する）。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体はＩｇＧ４ Ｆｃ領域をさらに含む（例えばＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、ＰＬＡ変異：Ｓ２２８Ｐ、Ｍ４２８Ｌ、およびＮ４３４Ａを含む）。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、中性ｐＨ（ｐＨ７．４など）では酸性ｐＨ（ｐＨ５．８など）よりも強く結合する。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体の低ｐＨ解離因子は、約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％のいずれか以上である。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体の中性ｐＨ解離因子は、約２０％、１８％、１６％、１４％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％のいずれか以下である。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体の中性ｐＨ解離因子に対する低ｐＨ解離因子の比は、約１以上、１．５以上、２以上、２．５以上、３以上、３．５以上、４以上、４．５以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上のいずれかである。いくつかの実施形態では、Ｃ５に関するｐＨ７．４での抗体の解離の割合に対するＣ５に関するｐＨ５．８での抗体の解離の割合は６以上である。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は皮下投与によって投与される。

【0185】

いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は補体活性化を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９０％超のいずれか阻害する。

【0186】

いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体はＣ５ａＲへのＣ５ａの結合を阻害し、ＩＣ_５０値は、約０．０１ｎＭ、約０．１ｎＭ、約０．５ｎＭ、約１ｎＭ、約２ｎＭ、約３ｎＭ、約４ｎＭ、約５ｎＭ、約６ｎＭ、約７ｎＭ、約８ｎＭ、約９ｎＭ、約１０ｎＭ、約２０ｎＭ、約５０ｎＭ、約１００ｎＭ、または１００ｎＭ超である。いくつかの実施形態では、Ｃ５ａＲへのＣ５ａの結合を阻害し、ＩＣ_５０値が約１ｎＭ～約１０ｎＭであるヒト化抗Ｃ５ａ抗体が提供される。

【0187】

いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、Ｃ５ａが誘導する細胞へのカルシウム流入を阻害し、ＩＣ_５０値は、約０．００１ｎＭ、約０．００５ｎＭ、約０．０１ｎＭ、約０．０５ｎＭ、約０．１ｎＭ、約０．１５ｎＭ、約０．２ｎＭ、約０．２５ｎＭ、約０．３ｎＭ、約０．４ｎＭ、約０．５ｎＭ、約０．６ｎＭ、約０．７ｎＭ、約０．８ｎＭ、約０．９ｎＭ、約１ｎＭ、または１ｎＭ超である。いくつかの実施形態では、Ｃ５ａが誘導する細胞へのカルシウム流入を阻害し、ＩＣ_５０値が約０．０１ｎＭ～約０．３ｎＭであるヒト化抗Ｃ５ａ抗体が提供される。

【0188】

いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体はヒトＣ５に結合し、親和性は約０．００１ｎＭ、約０．００５ｎＭ、約０．０１ｎＭ、約０．０５ｎＭ、約０．１ｎＭ、約０．１５ｎＭ、約０．２ｎＭ、約０．２５ｎＭ、約０．３ｎＭ、約０．４ｎＭ、約０．５ｎＭ、約０．６ｎＭ、約０．７ｎＭ、約０．８ｎＭ、約０．９ｎＭ、約１ｎＭである。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体はヒトＣ５に低ナノモル親和性で結合する。いくつかの実施形態では、ヒトＣ５に結合し、親和性が約０．０１ｎＭ～約１ｎＭであるヒト化抗Ｃ５ａ抗体が提供される。

【0189】

いくつかの実施形態では、Ｃ５が媒介する補体活性に影響を与えないヒト化抗Ｃ５抗体が提供される。

【0190】

いくつかの実施形態では、Ｃ５コンベルターゼが媒介する活性を阻害しないヒト化抗Ｃ５抗体が提供される。

【0191】

いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、対象において、投与してから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０日後まで血清Ｃ５のレベルを低下させる。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、対象において、投与してから１５日後まで血清Ｃ５のレベルを少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％低下させる。いくつかの実施形態では、対象において、投与してから１５日後まで血清Ｃ５のレベルを少なくとも５０％低下させるヒト化抗Ｃ５ａ抗体が提供される。

【0192】

いくつかの実施形態では、Ｃ５ａが誘導する細胞移動を阻害するヒト化抗Ｃ５ａ抗体が提供される。いくつかの実施形態では、抗Ｃ５ａ抗体はＣ５が誘導する細胞移動を阻害し、低ナノモルＩＣ_５０を持つ。いくつかの実施形態では、Ｃ５ａが誘導する細胞移動の抗Ｃ５ａ抗体による阻害のＩＣ_５０値は、約０．０１ｎＭ、約０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、または１０ｎＭ超である。いくつかの実施形態では、Ｃ５ａが誘導する細胞移動のＩＣ_５０抗Ｃ５ａ抗体阻害は０．０１ｎＭ～０．２ｎＭである。

【0193】

いくつかの実施形態では、個体において補体活性化を阻害する方法として、有効な量のヒト化抗Ｃ５ａ抗体をその個体に（例えば皮下投与または静脈内投与による全身投与などで）投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、配列番号１を参照すると変異Ｉ４８Ｍ、Ｄ５４Ｅ、およびＮ５６Ｗを含むＶＨと、配列番号２を参照すると変異Ｄ２８ＥとＤ３０Ｆを含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、配列番号１を参照するとＶＨの中の変異Ｆ２９Ｈを、配列番号２を参照するとＶＬの中の変異Ｙ９６Ｈをさらに含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、ＶＨのＥ５４Ｈ、ＶＨのＮ９７Ｈ、およびＶＬのＮ９２Ｈからなるグループから選択される変異をさらに含む（ただし前記ＶＨ変異はＫａｂａｔ番号付けシステムの下で配列番号１を参照し、前記ＶＬ変異はＫａｂａｔ番号付けシステムの下で配列番号２を参照する）。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体はＩｇＧ４ Ｆｃ領域をさらに含む（例えばＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、ＰＬＡ変異：Ｓ２２８Ｐ、Ｍ４２８Ｌ、およびＮ４３４Ａを含む）。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、中性ｐＨ（ｐＨ７．４など）では酸性ｐＨ（ｐＨ５．８など）よりも強く結合する。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体の低ｐＨ解離因子は、約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％のいずれか以上である。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体の中性ｐＨ解離因子は、約２０％、１８％、１６％、１４％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％のいずれか以下である。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体の中性ｐＨ解離因子に対する低ｐＨ解離因子の比は、約１以上、１．５以上、２以上、２．５以上、３以上、３．５以上、４以上、４．５以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上のいずれかである。

【0194】

いくつかの実施形態では、補体関連の疾患または障害、特に好中球の活性化が病因の役割を果たす疾患の選択は、黄斑変性症（ＭＤ）、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、虚血再灌流損傷、関節炎、関節リウマチ、喘息、アレルギー性喘息、ループス、潰瘍性大腸炎、脳卒中、術後の全身性炎症性症候群、喘息、アレルギー性喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）症候群、重症筋無力症、視神経脊髄炎、（ＮＭＯ）、多発性硬化症、移植後臓器機能障害、抗体関連型拒絶反応、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、網膜中心動脈閉塞症（ＣＲＡＯ）、表皮水泡症、敗血症、臓器移植、炎症（その非限定的な例に、心肺バイパス手術と腎臓透析に関連する炎症が含まれる）、Ｃ３腎症、膜性腎症、ＩｇＡ腎症、糸球体腎炎（その非限定的な例に、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連糸球体腎炎、ループス腎炎、およびこれらの組み合わせが含まれる）、ＡＮＣＡ関連血管炎、志賀毒素誘導性ＨＵＳ、抗リン脂質抗体誘導性妊娠喪失、ＣＯＶＩＤ－１９、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、水泡性類天疱瘡、化膿性汗腺炎、疱疹状皮膚炎、スウィート症候群、壊疽性膿皮症、掌蹠膿胞症と膿胞性乾癬、リウマチ性好中球性皮膚症、角層下膿胞症、腸関連皮膚症－関節炎症候群、好中球性エクリン汗腺炎、線状ＩｇＡ病、またはこれらの任意の組みあわせからなるグループから少なくともなされる。

【0195】

投与の用量と経路
本出願の医薬組成物の用量と望む薬濃度は、想定する具体的な用途に応じて変化する可能性がある。適切な用量または投与経路の決定は十分に当業者の能力範囲である。動物実験により、ヒト治療のための有効な用量を決定するための信頼できるガイダンスが提供される。有効な用量の種間スケーリングは、Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｙａｃｏｂｉ ｅｔ ａｌ．， Ｅｄｓ， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ ｙｏｒｋ １９８９の中のＭｏｒｄｅｎｔｉ， Ｊ． ａｎｄ Ｃｈａｐｐｅｌｌ， Ｗ．による“Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ Ｓｃａｌｉｎｇ ｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，” ｐｐ． ４２－４６に記載されている原理に従って実施することができる。

【0196】

典型的には、本発明の方法において対象（いくつかの実施形態ではヒト）に投与することのできる用量は、対象の体重１キログラムにつき０．５μｇ～約５０ｍｇの量の範囲である。投与される正確な用量は任意の数の因子（その非限定的な例に含まれるのは、対象のタイプと治療中の疾患状態のタイプ、対象の年齢、および投与の経路である）に依存して変化するであろうが。いくつかの実施形態では、化合物の用量は、対象の体重１キログラムにつき約１μｇ～約１０ｍｇで変化する。他の実施形態では、用量は、対象の体重１キログラムにつき約３μｇ～約１ｍｇで変化する。

【0197】

いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は１回だけ投与される。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は多数回（例えば２、３、４、５、６回、またはより多数回のいずれか）投与される。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、５ヶ月に１回、６ヶ月に１回、７ヶ月に１回、８ヶ月に１回、９ヶ月に１回、または年に１回投与される。いくつかの実施形態では、投与の間隔は、ほぼ１週間～２週間、２週間～１ヶ月、２週間～２ヶ月、１ヶ月～２ヶ月、１ヶ月～３ヶ月、３ヶ月～６ヶ月、または６ヶ月～１年のいずれか１つである。特定の患者に関する最適な用量と治療計画は、医学の当業者が、患者で疾患の徴候をモニタし、治療をそれに応じて調節することによって容易に決定することができる。投与の頻度は当業者には明らかであろうし、任意の数の因子に依存するであろう。因子の非限定的な例に含まれるのは、治療する疾患のタイプと重症度、対象のタイプと年齢などである。

【0198】

本出願のヒト化抗Ｃ５ａ抗体（その非限定的な例に、再構成された製剤と液体製剤が含まれる）は、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体を用いた治療を必要とする個体（好ましくはヒト）に、既知の方法に従って（例えばボーラスとしての静脈内投与、またはある期間にわたる連続的輸液によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、髄腔内、経口、局所、眼、直腸、膣、非経口、肺、口腔、眼内、または吸入の経路によって）投与される。考慮する他の製剤に含まれるのは、計画されたナノ粒子、リポソーム調製物、活性成分含有再閉鎖赤血球、および免疫学に基づく製剤である。ヒト化抗Ｃ５ａ抗体の非経口投与に含まれるのは、個体の組織の物理的裂け目を特徴とする任意の投与経路と、組織内の裂け目を通じた医薬組成物の投与である。非経口投与は、局所、領域、または全身が可能である。したがって非経口投与の非限定的な例に含まれるのは、例えば組成物の注射、外科的切開を通じた組成物の適用、組織に侵入する非外科的傷を通じたヒト化抗Ｃ５ａ抗体の適用などによるヒト化抗Ｃ５ａ抗体の投与である。特に非経口投与が考えられ、その非限定的な例に含まれるのは、静脈内、眼内、硝子体内、皮下、腹腔内、筋肉内、皮内、胸骨内の注射、および腫瘍内である。

【0199】

本発明のヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、バルクで単一の単位用量または複数の単一単位用量として調製、包装、または販売することができる。単位用量は、あらかじめ決められた量の活性成分を含む離散量のヒト化抗Ｃ５ａ抗体である。活性成分の量は一般に、個体に投与することを考える活性成分の用量、またはそのような用量の簡単な分数（例えばそのような用量の１／２または１／３）と等しい。

【0200】

本発明の医薬組成物の中の活性成分、医薬として許容可能な基剤、および任意の追加成分の相対量は、治療する個体の属性、サイズ、および状態によって、さらには組成物を投与する経路によって異なるであろう。例えば組成物は０．１％と１００％（ｗ／ｗ）の間の活性成分を含むことができる。さまざまな実施形態では、組成物は、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１８％、少なくとも約１９％、少なくとも約２０％、少なくとも約２１％、少なくとも約２２％、少なくとも約２３％、少なくとも約２４％、少なくとも約２５％、少なくとも約２６％、少なくとも約２７％、少なくとも約２８％、少なくとも約２９％、少なくとも約３０％、少なくとも約３１％、少なくとも約３２％、少なくとも約３３％、少なくとも約３４％、少なくとも約３５％、少なくとも約３６％、少なくとも約３７％、少なくとも約３８％、少なくとも約３９％、少なくとも約４０％、少なくとも約４１％、少なくとも約４２％、少なくとも約４３％、少なくとも約４４％、少なくとも約４５％、少なくとも約４６％、少なくとも約４７％、少なくとも約４８％、少なくとも約４９％、少なくとも約５０％、少なくとも約５１％、少なくとも約５２％、少なくとも約５３％、少なくとも約５４％、少なくとも約５５％、少なくとも約５６％、少なくとも約５７％、少なくとも約５８％、少なくとも約５９％、少なくとも約６０％、少なくとも約６１％、少なくとも約６２％、少なくとも約６３％、少なくとも約６４％、少なくとも約６５％、少なくとも約６６％、少なくとも約６７％、少なくとも約６８％、少なくとも約６９％、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％（ｗ／ｗ）の活性成分を含む。

【0201】

Ｖ．調製の方法
本出願により、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体をコードする単離された核酸、そのような単離された核酸を含むベクターと宿主細胞、ならびにヒト化抗Ｃ５ａ抗体を生成させるための組み換え法も提供される。

【0202】

発現ベクターと抗体を生成する細胞
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載のヒト化抗Ｃ５ａ抗体の少なくとも１つを生成する細胞または細胞系（宿主細胞など）である。一実施形態では、細胞または細胞系は、本明細書に記載のヒト化抗Ｃ５ａ抗体の少なくとも１つを生成する遺伝子改変された細胞である。一実施形態では、細胞または細胞系はハイブリドーマであり、本明細書に記載されているそのヒト化抗Ｃ５ａ抗体の少なくとも１つを生成する。

【0203】

ハイブリッド細胞（ハイブリドーマ）は一般に、Ｂリンパ球が非常に豊富なマウス脾臓細胞と骨髄腫「融合パートナー細胞」の間の塊の融合から生成する（Ａｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ （Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｉｎｃ． １９９４）；Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， １９８８）。この融合体の中の細胞はその後複数のプールに分配され、それらプールを望む特異性を持つ抗体の生成に関して分析することができる。陽性となるプールは、単一細胞クローンが望む特異性の抗体を生成することが特定されるまでさらに分割することができる。このようなクローンによって生成した抗体はモノクローナル抗体と呼ばれる。

【0204】

核酸であって、本明細書に開示されているそのヒト化抗Ｃ５ａ抗体のいずれかをコードするもののほか、その核酸を含むベクターも提供される。したがって本発明のヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、細胞または細胞系（組み換えまたはヒト化免疫グロブリンの発現に典型的に使用される細胞系など）の中で核酸を発現させることによって生成させることができる。したがって本発明の抗体と断片は、核酸を１つ以上の発現ベクターにクローニングし、そのベクターで細胞系（組み換えに、またはヒト化免疫グロブリンの発現に典型的に使用される細胞系など）を形質転換することによって生成させることもできる。

【0205】

遺伝子であって、そのヒト化抗Ｃ５ａ抗体の重鎖と軽鎖をコードするものは、本分野で知られている方法（その非限定的な例に、完全長遺伝子化学合成、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が含まれる）に従って操作することができる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８９；Ｂｅｒｇｅｒ ＆ Ｋｉｍｍｅｌ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １５２： Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ．， １９８７；Ｃｏ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：１１４９を参照されたい）。例えば重鎖と軽鎖、またはその断片をコードする遺伝子は、抗体分泌細胞のゲノムＤＮＡからクローニングすることができる。あるいはｃＤＮＡは、細胞のＲＮＡの逆転写によって生成する。クローニングは、クローニングする遺伝子、または遺伝子の区画と隣接または重複する配列にハイブリダイズするＰＣＲプライマーの使用を含む従来の技術によって実現される。

【0206】

本明細書に記載のヒト化抗Ｃ５ａ抗体、または重鎖または軽鎖、またはその断片をコードする核酸は、特定の免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片またはバリアントを多彩な宿主細胞またはインビトロ翻訳系の中で産生させるための組み換え核酸技術に従って取得して使用することができる。例えば抗体をコードする核酸、またはその断片は、適切な方法（例えば形質転換、トランスフェクション、電気穿孔、感染）によって適切な原核ベクターまたは真核ベクター（例えば発現ベクター）に入れて適切な宿主細胞の中に導入することができるため、その核酸は、例えばベクターの中の１つ以上の発現制御エレメントに機能可能に連結されるか、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。

【0207】

いくつかの実施形態では、重鎖と軽鎖、またはその断片を２つの異なる発現ベクターの中で組み立て、それを用いてレシピエント細胞に同時にトランスフェクトすることができる。いくつかの実施形態では、各ベクターは２つ以上の選択遺伝子（１つは細菌系における選択のため、１つは真核細胞系における選択のため）を含有することができる。これらベクターにより、細菌系の中での遺伝子の生成および増幅と、その後の真核細胞への同時トランスフェクションと、同時トランスフェクトされた細胞の選択が可能になる。選択手続きを利用し、２つの異なるＤＮＡベクターに載せて真核細胞に導入された抗体核酸の発現を選択することができる。

【0208】

あるいは重鎖と軽鎖、またはその断片をコードする核酸は、１つのベクターから発現させることができる。軽鎖と重鎖は別々の遺伝子によってコードされるが、組み換え法を利用してそれらを合体させることができる。例えばそれら２つのポリペプチドを合成リンカーによって接合することで、そのリンカーがそれら２つのポリペプチドを単一のタンパク質鎖にすることが可能になり、その鎖の中ではＶＬ領域とＶＨ領域がペアになって１価分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えばＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２： ４２３－４２６と、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照されたい）を形成する。

【0209】

本発明により、重鎖および／または軽鎖をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子のほか、その断片が提供される。軽鎖と重鎖の両方をコードする配列を含む核酸分子、またはその断片を操作し、細胞の中で産生されるときに抗体または断片を分泌させるための合成シグナル配列を含むようにすることができる。さらに、核酸分子は、他の抗体配列の挿入を可能にするとともに抗体配列に通常見られるアミノ酸を変化させないよう翻訳リーディングフレームを維持する特殊なＤＮＡリンクを含有することができる。代表的な核酸配列が配列番号３３～６２に示されている。

【0210】

本発明によれば、抗体をコードする核酸配列を適切な発現ベクターの中に挿入することができる。さまざまな実施形態では、発現ベクターは、抗体またはその断片を形成する抗体配列の発現を指示する組み換えＤＮＡ分子を生成させるため、抗体をコードする挿入された核酸の転写と翻訳に必要なエレメントを含んでいる。

【0211】

抗体をコードする核酸、またはその断片に対し、当業者に知られているさまざまな組み換え核酸技術（部位特異的突然変異誘発など）を適用することができる。

【0212】

多彩な方法を利用して核酸を細胞の中で発現させることができる。核酸は多くのタイプのベクターにクローニングすることができる。しかし本発明がどれか特定のベクターに限定されると解釈されてはならない。その代わりに本発明は、容易に入手できる多彩なベクター、および／または本分野で知られている多彩なベクターを包含すると解釈されるべきである。例えば本発明の核酸はベクター（その非限定的な例に含まれるのは、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、およびコスミドである）にクローニングすることができる。特に興味あるベクターに含まれるのは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、およびシークエンシングベクターである。

【0213】

いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ウイルスベクター、細菌ベクター、および哺乳類細胞ベクターからなるグループから選択される。上記の組成物の少なくとも一部または全部を含む多数の発現ベクター系が存在している。原核ベクターおよび／または真核ベクターに基づく系を本発明で利用し、ポリヌクレオチド、またはそのコグネイトポリペプチドを生成させることができる。多くのそのような系が市販されていて広く入手することができる。

【0214】

ウイルスベクター技術は本分野で周知であり、それが記載されているのは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （２０１２）とＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９９）、ならびにウイルス学と分子生物学の他の教科書である。ベクターとして有用なウイルスの非限定的な例に含まれるのは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスである。いくつかの実施形態では、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）ベクターを用いて望む核酸を発現させる。ＭＳＣＶベクターは細胞の中で望む核酸を効率的に発現させることが実証されている。しかし本発明がＭＳＣＶベクターの使用だけに限定されるはずはなく、むしろあらゆるレトロウイルス発現法が本発明に含まれる。ウイルスベクターの他の例は、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）とＨＩＶに基づくベクターである。いくつかの実施形態では、適切なベクターは、少なくとも１つの生物の中で機能する複製起点、プロモータ配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、および１つ以上の選択マーカーを含有する。（例えばＷＯ ０１／９６５８４；ＷＯ ０１／２９０５８；およびアメリカ合衆国特許第６，３２６，１９３号を参照されたい）。

【0215】

追加の調節エレメント（例えばエンハンサ）を用いて転写開始の頻度を変えることができる。プロモータとして、遺伝子または核酸配列に天然状態で付随しているプロモータが可能であり、それは、コード区画および／またはエキソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得られる。このようなプロモータは「内在性」と呼ぶことができる。同様に、エンハンサとして、核酸配列に天然状態で付随していて、その配列の下流または上流のいずれかに位置するものが可能である。あるいはコードする核酸区画を組み換えまたは異種プロモータ（天然環境で核酸配列に通常は付随しないプロモータを意味する）の制御下に置くことによっていくつかの利点が得られよう。組み換えエンハンサまたは異種エンハンサは、天然環境では核酸配列に通常付随しないエンハンサも意味する。このようなプロモータまたはエンハンサに含めることができるのは、他の遺伝子のプロモータまたはエンハンサと、他の任意の原核細胞、ウイルス細胞、または真核細胞から単離されたプロモータまたはエンハンサと、「天然」ではなく例えば異なる転写調節領域の異なるエレメントおよび／または発現を変化させる変異を含有するプロモータまたはエンハンサである。プロモータとエンハンサの核酸配列を合成で生成させることに加え、本明細書に開示されている組成物と関係する配列を、組み換えクローニングおよび／または核酸増幅技術（ＰＣＲが含まれる）を利用して生成させることができる（アメリカ合衆国特許第４，６８３，２０２号、アメリカ合衆国特許第５，９２８，９０６号）。さらに、非核オルガネラ（ミトコンドリア、葉緑体など）の中の配列の転写および／または発現を指示する制御配列も使用できることを考慮する。

【0216】

発現のために選択した細胞のタイプ、オルガネラ、および生物の中でのＤＮＡ区画の発現を効果的に指示するプロモータおよび／またはエンハンサを使用することができる。分子生物学の分野の当業者は一般に、タンパク質を発現させるためにプロモータ、エンハンサ、および細胞のタイプの組み合わせをどのように用いるかを知っている（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （２０１２）参照）。使用するプロモータは、構成的、組織特異的、誘導性であること、および／または導入されたＤＮＡ区画の高レベルの発現を適切な条件下で指示するのに有用であること（組み換えタンパク質とその断片の大規模な生成において有利であることなど）が可能である。

【0217】

プロモータの一例は、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモータ配列である。このプロモータ配列は、機能可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することのできる強力な構成的プロモータ配列である。しかし他の構成的プロモータ配列も使用でき、その非限定的な例に含まれるのは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモータ、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）プロモータ、モロニーウイルスプロモータ、トリ白血病ウイルスプロモータ、エプスタイン－バールウイルス最初期プロモータ、ラウス肉腫ウイルスプロモータのほか、ヒト遺伝子プロモータ（その非限定的な例に含まれるのは、アクチンプロモータ、ミオシンプロモータ、ヘモグロビンプロモータ、および筋肉クレアチンプロモータである）である。さらに、本発明が構成的プロモータの使用に限定されるはずはない。誘導性プロモータも本発明の一部として考えられる。本発明で誘導性プロモータを用いると分子スイッチが提供され、この誘導性プロモータに機能可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現を望むときにはオンにし、発現を望まないときにはオフにすることが可能になる。誘導性プロモータの非限定的な例に含まれるのは、メタロチオニンプロモータ、グルココルチコイドプロモータ、プロゲステロンプロモータ、およびテトラサイクリンプロモータである。さらに、本発明には組織特異的プロモータまたは細胞タイプ特異的プロモータ（望む組織または細胞の中でだけ活性なプロモータ）の使用が含まれる。組織特異的プロモータは本分野で周知であり、その非限定的な例に含まれるのはＨＥＲ－２プロモータとＰＳＡ関連プロモータ配列である。

【0218】

核酸の発現を評価するため、細胞に導入する発現ベクターに選択マーカー遺伝子とレポータ遺伝子の一方または両方も含めることで、ウイルスベクターを通じてトランスフェクトするか感染させようとする細胞の集団から、発現している細胞を容易に同定して選択することができる。他の実施形態では、選択マーカーを別の核酸に載せて同時トランスフェクション手続きで用いることができる。選択マーカーとレポータ遺伝子の両方を適切な調節配列に隣接させて宿主細胞の中での発現が可能になるようにすることができる。有用な選択マーカーは本分野で知られており、例えば抗生剤耐性遺伝子（ｎｅｏなど）が含まれる。

【0219】

レポータ遺伝子は、トランスフェクトされた可能性のある細胞の同定と、調節配列の機能の評価に用いられる。容易に調べられるタンパク質をコードするレポータ遺伝子は本分野で周知である。一般にレポータ遺伝子は、発現がある程度容易に検出できる特性（例えば酵素活性）として現われるタンパク質をコードしていて、レシピエントの生物または組織に存在していない遺伝子、またはレシピエントの生物または組織で発現しない遺伝子である。レポート遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入されてから適切な時間が経過したときに調べる。

【0220】

適切なレポータ遺伝子に含めることができるのは、ルシフェラーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、または緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子である（例えばＵｉ－Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．， ２０００ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４７９：７９－８２参照）。適切な発現系は周知であり、周知の技術を利用して調製すること、または市場で取得することができる。一般に、レポータ遺伝子の最高レベルの発現を示す最小５’隣接領域を持つコンストラクトがプロモータとして同定される。このようなプロモータ領域は、レポータ遺伝子に連結させて、薬剤を、プロモータが駆動する転写を変化させる能力について評価するのに使用できる。

【0221】

核酸を細胞に導入して発現させる方法は本分野で知られている。発現ベクターの文脈では、ベクターは本分野の任意の方法によって宿主細胞（例えば哺乳類、細菌、酵母、または昆虫の細胞）の中に容易に導入することができる。例えば発現ベクターは、物理的、化学的、または生物学的な手段によって宿主細胞の中に移すことができる。

【0222】

ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的な方法に含まれるのは、リン酸カルシウム沈降、リポフェクション、パーティクルボンバードメント、微量注入、電気穿孔、レーザー穿孔などである。ベクターおよび／または外来核酸を含む細胞を生成させる方法は本分野で周知である。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （２０１２）とＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９９）を参照されたい。

【0223】

興味ある核酸を宿主細胞に導入するための生物学的方法に含まれるのは、ＤＮＡベクターとＲＮＡベクターの使用である。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、遺伝子を哺乳類細胞（例えばヒト細胞）に挿入する最も広く利用されている方法になっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスなどに由来することができる。例えばアメリカ合衆国特許第５，３５０，６７４号と第５，５８５，３６２号を参照されたい。

【0224】

核酸を宿主細胞に導入するための化学的手段に含まれるのは、コロイド分散系、例えば巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、および脂質に基づく系（水中油型エマルション、ミセル、混合されたミセル、およびリポソームが含まれる）である。インビトロと生体内の送達用ビヒクルとして用いるのに好ましいコロイド系はリポソーム（例えば人工膜小胞）である。このような系の調製と利用は本分野で周知である。

【0225】

外来核酸を宿主細胞に導入するのに用いる方法や、細胞を本発明の核酸に曝露する方法とは関係なく、組み換えＤＮＡ配列が宿主細胞の中に存在することを確認するのに多彩なアッセイを実施することができる。このようなアッセイに含まれるのは、例えば当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ（サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲ、ＰＣＲ）；「生化学的アッセイ」（特定のペプチドの存在または不在を例えば免疫学的手段（ＥＬＩＳＡとウエスタンブロット）または本明細書に記載のアッセイによって検出し、本発明の範囲に入る薬剤を同定するアッセイなど）である。

【0226】

１．ベクターの構築
本出願のヒト化抗Ｃ５ａ抗体のポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチド配列は標準的な組み換え技術を利用して得ることができる。望むポリヌクレオチド配列は抗体産生細胞（ハイブリドーマ細胞など）から単離してシークエンシングすることができる。あるいはポリヌクレオチドはヌクレオチド合成装置またはＰＣＲ技術を利用して合成することができる。ポリペプチドをコードする配列は、得られると、原核宿主の中で異種ポリヌクレオチドの複製と発現が可能な組み換えベクターに挿入される。本分野で利用可能な公知の多くのベクターを本出願の目的で用いることができる。適切なベクターの選択は、ベクターに挿入する核酸のサイズと、ベクターで形質転換する具体的な宿主細胞に主に依存することになろう。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅と発現の一方または両方）と、それが導入される具体的な宿主との適合性に応じ、さまざまな成分を含有する。ベクター成分の非限定的な例に一般に含まれるのは、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモータ、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸インサート、および転写終止配列である。

【0227】

一般に、宿主細胞に適合した種に由来するレプリコンと制御配列を含有するプラスミドベクターがこれら宿主で使用される。ベクターは、通常は、複製部位のほか、形質転換された細胞の中で表現型選択を提供することのできるマーキング配列を有する。例えば大腸菌は、典型的には、大腸菌種に由来するプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換される。ｐＢＲ３２２はアンピシリン（Ａｍｐ）耐性とテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性をコードする遺伝子を含有するため、形質転換された細胞を同定する簡単な手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その誘導体、または他の微生物プラスミドまたはバクテリオファージは、内在性タンパク質を発現させるために微生物が使用することのできるプロモータを含有すること、または含有するように改変することもできる。特定の抗体の発現に使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例は、Ｃａｒｔｅｒらのアメリカ合衆国特許第５，６４８，２３７号に詳細に記載されている。

【0228】

それに加え、宿主微生物に適合したレプリコンと制御配列を含有するファージベクターを、これら宿主に関する形質転換ベクターとして用いることができる。例えばバクテリオファージ（ＧＥＭ（商標）－１１など）を用い、感受性宿主細胞（大腸菌ＬＥ３９２など）の形質転換に使用できる組み換えベクターを作製することができる。

【0229】

本明細書に記載の発現ベクターは、ポリペプチド成分のそれぞれをコードする２つ以上のプロモータ－シストロン対を含むことができる。プロモータは翻訳されない調節配列であり、その発現を変化させるシストロンの上流（５′）に位置する。原核プロモータは、典型的には２つのクラス、すなわち誘導性と構成的に分類される。誘導性プロモータは、その制御下で培養条件の変化（例えば栄養素の存在または不在、または温度変化）に応答してシストロンの転写のレベル上昇を開始させるプロモータである。

【0230】

多彩な潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモータがよく知られている。選択されたプロモータは、供給元ＤＮＡから制限酵素消化によってそのプロモータを取り出し、その単離されたプロモータ配列をベクターの中に挿入することにより、軽鎖または重鎖をコードするシストロンＤＮＡに機能可能に連結させることができる。天然プロモータ配列と多くの異種プロモータの両方を用いて標的遺伝子の増幅および／または発現を指示することができる。いくつかの実施形態では、異種プロモータが使用される。というのも異種プロモータは一般に、天然の標的ポリペプチドプロモータと比べたとき、発現した標的遺伝子のより多い転写とより多い収量を可能にするからである。

【0231】

原核宿主で用いるのに適したプロモータに含まれるのは、ＰｈｏＡプロモータ、ガラクタマーゼプロモータ系とラクトースプロモータ系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ系、およびハイブリッドプロモータ（ｔａｃまたはｔｒｃプロモータなど）である。しかし細菌の中で機能する他のプロモータ（知られている他の細菌プロモータまたはファージプロモータなど）も適している。これらのヌクレオチド配列は公開されているため、当業者はリンカーまたはアダプタを用いてそれらを標的軽鎖と標的重鎖をコードするシストロンに機能可能に連結させ（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ ｅｔ ａｌ． （１９８０） Ｃｅｌｌ ２０： ２６９）、あらゆる必要な制限部位を供給することができる。

【0232】

１つの側面では、組み換えベクター内の各シストロンは、発現したポリペプチドが膜を通って移行するのを指示する分泌シグナル配列成分を含む。一般にシグナル配列として、ベクターの１つの成分、またはベクターに挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部が可能である。本出願の目的で選択されるシグナル配列は、宿主細胞によって認識されて処理される（すなわちシグナルペプチダーゼによって切断される）ものでなければならない。異種ポリペプチドに固有のシグナル配列を認識して処理することのない原核宿主細胞では、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、およびＭＢＰからなるグループから選択される原核シグナル配列によって置換される。いくつかの実施形態では、発現系の両方のシストロンで用いられるシグナル配列は、ＳＴＩＩシグナル配列またはそのバリアントである。

【0233】

いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体の生成は宿主細胞の細胞質の中で起こることができるため、各シストロン内に分泌シグナル配列が存在する必要はない。いくつかの実施形態では、ポリペプチド成分（第２の抗原結合部分に場合により融合した第１の抗原結合部分のＶＨドメインをコードするポリペプチドと、第２の抗原結合部分に場合により融合した第１の抗原結合部分のＶ_Ｌドメインをコードするポリペプチドなど）が発現し、折り畳まれ、組み立てられて細胞質内に機能的ヒト化抗Ｃ５ａ抗体を形成する。ある宿主株（例えば大腸菌ｔｒｘＢ^－株）は、ジスルフィド結合の形成に有利な細胞質の条件を提供することにより、発現したタンパク質サブユニットの適切な折り畳みと組み立てを可能にする。Ｐｒｏｂａ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ Ｇｅｎｅ， １５９：２０３ （１９９５）。

【0234】

２．原核宿主細胞におけるタンパク質産生
本出願のヒト化抗Ｃ５ａ抗体の発現に適した原核宿主細胞に含まれるのは、古細菌と真正細菌（グラム陰性またはグラム陽性の生物など）である。有用な細菌の例に含まれるのは、エスケリキア属（例えば大腸菌）、バシラス綱（例えば枯草菌）、腸内細菌、シュードモナス属の種（例えば緑膿菌）、ネズミチフス菌、セラチア・マルセッセンス、クレブシエラ属、プロテウス属、赤痢菌、根粒菌、ビトレオシラ属、またはパラコッカス属である。いくつかの実施形態では、グラム陰性細胞が用いられる。いくつかの実施形態では、大腸菌細胞が宿主として使用される。大腸菌株の例に含まれるのは、株Ｗ３１１０（Ｂａｃｈｍａｎｎ， Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． ２ （Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．： Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９８７）， ｐｐ． １１９０－１２１９；ＡＴＣＣ寄託番号２７，３２５）とその誘導体であり、その中に含まれるのは、遺伝子型Ｗ３１１０ ＡｆｈｕＡ（ＡｔｏｎＡ）ｐｔｒ３ ｌａｃ Ｉｑ ｌａｃＬ８ ＡｏｍｐＴ Ａ（ｎｍｐｃ－ｆｅｐＥ） ｄｅｇＰ４１ ｋａｎ^Ｒを持つ株３３Ｄ３（アメリカ合衆国特許第５，６３９，６３５号）である。他の株とその誘導体（大腸菌２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）、大腸菌Ｂ、大腸菌１７７６（ＡＴＣＣ ３１，５３７）、および大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ ３１，６０８）など）も適している。これらの例は、限定的というよりは例示的である。規定された遺伝子型を持つ上記の細菌のいずれかの誘導体を構成する方法は本分野で知られており、例えばＢａｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ８：３０９－３１４ （１９９０）に記載されている。細菌の細胞におけるレプリコンの複製可能性を考慮して適切な細菌を選択することが一般に必要とされる。レプリコンを供給するのに周知のプラスミド（ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、またはｐＫＮ４１０など）を使用するときには、例えば大腸菌、セラチア属、またはサルモネラ属の種を宿主として用いるのが好適である可能性がある。

【0235】

典型的には、宿主細胞は最少量のタンパク質溶解酵素を分泌すべきであり、追加のプロテアーゼ阻害剤を細胞培養物に組み込めることが望ましい。

【0236】

宿主細胞は、上記の発現ベクターで形質転換した後、プロモータを誘導するため、形質転換体を選択するため、または望む配列をコードする遺伝子を増幅するため、必要に応じて改変した従来の栄養培地の中で培養する。形質転換とは、ＤＮＡを原核宿主に導入し、染色体外要素として、または染色体組み込み体（ｉｎｔｅｇｒａｎｔ）によって、そのＤＮＡが複製可能になることを意味する。使用する宿主細胞に応じ、形質転換はそのような細胞に適した標準的な技術を利用してなされる。塩化カルシウムを用いたカルシウム処理が、実質的な細胞壁障壁を含有する細菌細胞のために一般に利用され、形質転換のための別の方法は、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。利用されるさらに別の技術は電気穿孔である。

【0237】

本出願のヒト化抗Ｃ５ａ抗体の生成に用いる原核細胞は、本分野で知られていて選択された宿主細胞の培養に適した培地の中で増殖させる。適切な培地の例に、ルリア培地（ＬＢ）＋必要な栄養サプリメントが含まれる。いくつかの実施形態では、培地は、発現ベクターを含有する原核細胞の増殖を選択的に可能にするため、発現ベクターの構成に基づいて選択された選択剤も含有する。例えばアンピシリンを、アンピシリン耐性遺伝子を発現している細胞を増殖させるための培地に添加する。

【0238】

炭素、窒素、および無機リン酸塩の供給源以外の必要なあらゆるサプリメントも、単独で、または別のサプリメントまたは培地（複合窒素源など）との混合物として導入されて、適切な濃度で含むことができる。場合により培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリトリトール、およびジチオトレイトールからなるグループから選択される１つ以上の還元剤を含有することができる。

【0239】

原核宿主細胞は適温で培養される。例えば大腸菌の増殖にとって、好ましい温度範囲は約２０℃～約３９℃、より好ましくは約２５℃～約３７℃、より一層好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは主に宿主生物によるが、約５～約９の範囲の任意のｐＨが可能である。大腸菌では、ｐＨは好ましくは約６．８～約７．４であり、より好ましくは約７．０である。

【0240】

誘導性プロモータを発現ベクターで用いる場合には、タンパク質の発現はプロモータの活性化に適した条件下で誘導される。いくつかの実施形態では、ＰｈｏＡプロモータを用いてペプチドの転写を制御する。したがって形質転換された宿主細胞は、誘導のためリン酸塩制限培地の中で培養される。リン酸塩制限培地はＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地であることが好ましい（例えばＳｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ （２００２）， ２６３：１３３－１４７参照）。本分野で知られているように、用いるベクターコンストラクトに応じて多彩な他の誘導物質を使用できる。

【0241】

本出願の発現したヒト化抗Ｃ５ａ抗体は宿主細胞のペリプラズムに分泌されてそこから回収される。タンパク質の回収は、典型的には、一般に浸透圧ショック、超音波処理、または溶解などの手段によって微生物を破壊することを含む。細胞が破壊されると、細胞残滓または全細胞を遠心分離または濾過によって除去することができる。タンパク質は例えばアフィニティ樹脂クロマトグラフィによってさらに精製することができる。あるいはタンパク質を培地の中に移し、その中で単離することができる。細胞を培養物から除去し、培養物上清を濾過し、濃縮して、生成したタンパク質をさらに精製することができる。発現したポリペプチドは、一般に知られている方法（ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）やウエスタンブロットアッセイなど）を利用してさらに単離して同定することができる。

【0242】

あるいはタンパク質産生は発酵プロセスによって大量になされる。さまざまな大規模流加発酵手続きを組み換えタンパク質の産生に利用することができる。大規模の発酵は少なくとも１０００リットルの容量、好ましくは約１，０００～１００，０００リットルの容量を持つ。これら発酵装置は撹拌羽根を利用して酸素と栄養素、特にグルコース（好ましい炭素／エネルギー源）を分配する。小規模の発酵は一般に、約１００リットル以下の容積で約１リットル～約１００リットルの範囲が可能な発酵装置の中での発酵を意味する。

【0243】

発酵プロセスの間、タンパク質発現の誘導は、典型的には細胞を適切な条件下で望む密度（例えばＯＤ_５５０が約１８０～２２０）まで増殖させた後に開始され、その段階で細胞は初期静止期にある。本分野で知られているように、そして上に記載したように、用いるベクターコンストラクトに応じて多彩な誘導物質を使用することができる。細胞は誘導の前により短期間増殖させることができる。細胞は通常は約１２～５０時間にわたって誘導されるが、より長いかより短い誘導時間を用いることができる。

【0244】

本出願のヒト化抗Ｃ５ａ抗体の生成収量と品質を改善するため、さまざまな発酵条件を改変することができる。例えば分泌されたポリペプチドの適切な組み立てと折り畳みを改善するため、Ｄｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ、およびまたはＤｓｂＧ）またはＦｋｐＡ（シャペロン活性を持つペプチジルプロリルシストランス－イソメラーゼ）などのシャペロンタンパク質を過剰発現している追加ベクターを用いて宿主原核細胞を同時に形質転換することができる。シャペロンタンパク質は、細菌宿主細胞の中で産生された異種タンパク質の適切な折り畳みと溶解を容易にすることが実証されている。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ ２７４：１９６０１－１９６０５；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．、アメリカ合衆国特許第６，０８３，７１５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．、アメリカ合衆国特許第６，０２７，８８８号；Ｂｏｔｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ （２０００） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５： １７１００－１７１０５；Ｒａｍｍ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ （２０００） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：１７１０６－１７１１３；Ａｒｉｅ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３９：１９９－２１０。

【0245】

発現した異種タンパク質（特に、タンパク質溶解に感受性であるもの）のタンパク質溶解を最少にするため、タンパク質溶解酵素が欠損したある宿主株を本出願で使用することができる。例えば宿主細胞株を改変し、既知の細菌プロテアーゼ（プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ、およびこれらの組み合わせなど）をコードする遺伝子の中に遺伝子変異を起こさせることができる。いくつかの大腸菌プロテアーゼ欠損株が入手可能であり、例えばＪｏｌｙ ｅｔ ａｌ． （１９９８）、上記文献；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．、アメリカ合衆国特許第５，２６４，３６５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．、アメリカ合衆国特許第５，５０８，１９２号；Ｈａｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ， ２：６３－７２ （１９９６）に記載されている。

【0246】

タンパク質溶解酵素が欠損していて１つ以上のシャペロンタンパク質を過剰発現しているプラスミドで形質転換された大腸菌株を、本出願のヒト化抗Ｃ５ａ抗体をコードする発現系において宿主細胞として用いることができる。

【0247】

３．真核細胞におけるタンパク質産生
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のヒト化抗Ｃ５ａ抗体を真核細胞の中で発現させることができる。真核細胞で発現させるため、ベクター成分の非限定的な例に一般に含まれるのは、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子とエンハンサエレメント、プロモータ、および転写終止配列のうちの１つ以上である。

【0248】

ａ）宿主細胞の選択と形質転換
本明細書のベクター内のＤＮＡのクローニングまたは発現に適した宿主細胞には、本明細書に記載のより高等な真核細胞が含まれ、その中には脊椎動物宿主細胞が含まれる。培養物（組織培養物）の中での脊椎動物細胞の増殖は定型的手続きになっている。有用な哺乳類宿主細胞系の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚性腎臓系（２９３細胞、または増殖させるため懸濁培養物にサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ． ３６：５９ （１９７７））；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６ （１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ２３：２４３－２５１ （１９８０））；サル腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲ１細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ３８３：４４－６８ （１９８２））；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝癌系（Ｈｅｐ Ｇ２）である。

【0249】

宿主細胞は、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体を生成させるための上記の発現ベクターまたはクローニングベクターで形質転換した後、プロモータを誘導するため、形質転換体を選択するため、または望む配列をコードする遺伝子を増幅するため、必要に応じて改変した従来の栄養培地の中で培養する。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体はＣＨＯ細胞の中で発現する。いくつかの実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体はＥｘｐｉ－ＣＨＯ細胞の中で発現する。

【0250】

ｂ）宿主細胞の培養
本出願のヒト化抗Ｃ５ａ抗体を生成させるために用いる宿主細胞は多彩な培地の中で培養することができる。市販の培地（ハムのＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最少必須培地（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）など）が、宿主細胞の培養に適している。それに加え、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ． ５８：４４ （１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０２：２５５ （１９８０）、アメリカ合衆国特許第４，７６７，７０４号；第４，６５７，８６６号；第４，９２７，７６２号；第４，５６０，６５５号；または第５，１２２，４６９号；ＷＯ ９０／０３４３０；ＷＯ ８７／００１９５；またはアメリカ合衆国再発行特許第３０，９８５号に記載されている培地のいずれかを宿主細胞のための培地として使用できる。これら培地のいずれかには、ホルモンおよび／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩など）、バッファ（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンやチミジンなど）、抗生剤（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬など）、微量エレメント（マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物と定義される）、およびグルコースまたは同等なエネルギー源を必要に応じて補足することができる。当業者に知られていると考えられる必要な他のあらゆるサプリメントも適切な濃度で含めることができる。培養条件（温度、ｐＨなど）は発現のために選択した宿主細胞で以前に使用したものと同じであり、当業者には明らかであろう。

【0251】

ｃ）タンパク質の精製
本明細書で生成したヒト化抗Ｃ５ａ抗体をさらに精製してさらなるアッセイと利用のための実質的に均一な調製物を得ることができる。本分野で知られている標準的なタンパク質精製法を利用することができる。

【0252】

４．抗体の生成と修飾
ヒト化抗Ｃ５ａ抗体の成分は、本分野で知られている任意の方法（下記の方法が含まれる）を利用して生成させることができる。

【0253】

ａ）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得られる。すなわちその集団を含む個別の抗体は、微量で存在する可能性がある可能な天然の変異および／または翻訳後修飾（例えば異性化、アミド化）を除いて同一である。したがって「モノクローナル」という修飾語は、別々の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。

【0254】

例えばモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５ （１９７５）によって最初に記述されたハイブリドーマ法を利用して作製すること、または組み換えＤＮＡ（アメリカ合衆国特許第４，８１６，５６７号）によって作製することができる。

【0255】

ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物（ハムスターなど）が上記のようにして免疫化されて、免疫化に用いるタンパク質に特異的に結合する抗体を生成させるか、生成させることのできるリンパ球を生じさせる。あるいはリンパ球はインビトロで免疫化することができる。その後、適切な融合剤（ポリエチレングリコールなど）を用いてリンパ球を骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ｐｐ． ５９－１０３ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８６）。

【0256】

免疫化剤は、典型的には、抗原性タンパク質またはその融合体バリアントを含むことになる。一般に、ヒト起源の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用され、非ヒト哺乳類供給源が望まれる場合には脾臓細胞またはリンパ節細胞が使用される。その後、適切な融合剤（ポリエチレングリコールなど）を用いてリンパ球を不死化細胞系と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する。Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９８６）， ｐｐ． ５９－１０３。

【0257】

不死化細胞系は、通常は、形質転換された哺乳類細胞（特に齧歯類、ウシ、およびヒト）が起源の骨髄腫細胞である。通常はラットまたはマウスの骨髄腫細胞系が使用される。このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つ以上の物質を含有することが好ましい適切な培地に播種してその中で増殖させる。例えば親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合には、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を阻止する物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ培地）を含むことになる。

【0258】

好ましい不死化骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生成をサポートし、培地（ＨＡＴ培地など）に対して感受性のあるものである。これらのうちで好ましいのはマウス骨髄腫系である（Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（サン・ディエゴ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）から入手できるＭＯＰＣ－２１およびＭＰＣ－１１マウス腫瘍と、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、マナサス、ヴァージニア州、アメリカ合衆国から入手できるＳＰ－２細胞（とその誘導体、例えばＸ６３－Ａｇ８－６５３）に由来するものなど）。ヒト骨髄腫とマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞系もヒトモノクローナル抗体の生成に関して記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３３：３００１ （１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐｐ． ５１－６３ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７））。

【0259】

中でハイブリドーマ細胞が増殖している培地を調べ、抗原に向かうモノクローナル抗体の生成を探す。ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、またはインビトロ結合アッセイ（ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）など）によって明らかにすることが好ましい。

【0260】

中でハイブリドーマ細胞が培養される培地を調べ、望む抗原に向かうモノクローナル抗体の存在を探すことができる。モノクローナル抗体の結合の親和性と特異性は、免疫沈降によって、またはインビトロ結合アッセイ（ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合アッセイ（ＥＬＩＳＡ）など）によって明らかにできることが好ましい。このような技術とアッセイは本分野で知られている。例えば結合親和性は、Ｍｕｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０７：２２０ （１９８０）のスキャッチャード分析によって明らかにすることができる。

【0261】

望む特異性、親和性、および／または活性を持つ抗体を生成させるハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを限界希釈手続きによってサブクローニングし、標準的な方法によって増殖させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ、上記文献）。この目的に適した培地に含まれるのは、例えばＤ－ＭＥＭまたはＲＰＭＩ－１６４０培地である。それに加え、ハイブリドーマ細胞は、哺乳類の中で腫瘍として生体内増殖させることができる。

【0262】

サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、培地、腹水、または血清から従来の免疫グロブリン精製手続き（例えばプロテインＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィなど）によってうまく分離される。

【0263】

モノクローナル抗体は組み換えＤＮＡ法（アメリカ合衆国特許第４，８１６，５６７号に記載されている方法や上記の方法など）によって作製することもできる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手続きを利用して（例えばマウス抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）容易に単離されてシークエンシングされる。ハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源として機能する。ＤＮＡは単離されると発現ベクターの中に入れることができ、その発現ベクターが宿主細胞にトランスフェクトされて、そのような組み換え宿主細胞（他のやり方では免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞など）の中でモノクローナル抗体が合成される。抗体をコードするＤＮＡを細菌の中で組み換え発現させることに関する概説論文には、Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ５：２５６－２６２ （１９９３）とＰｌｉｉｃｋｔｈｕｎ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖｓ． １３０：１５１－１８８ （１９９２） が含まれる。

【0264】

さらなる一実施形態では、抗体は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３４８：５５２－５５４ （１９９０）に記載されている技術を利用して生成させた抗体ファージライブラリから単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３５２：６２４－６２８ （１９９１）とＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２：５８１－５９７ （１９９１）は、ファージライブラリを用いてマウスとヒトそれぞれの抗体を単離することを記載している。その後の刊行物は、鎖シャッフリング（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １０：７７９－７８３ （１９９２））のほか、非常に大きいファージライブラリを構成するための戦略としての組み合わせ感染と生体内組み換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２１：２２６５－２２６６ （１９９３））による高親和性（ｎＭの範囲）のヒト抗体の生成を記載している。したがってこれらの技術は、モノクローナル抗体を単離するための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する実行可能な代替手段である。

【0265】

ＤＮＡも改変することができ、それは例えばヒト重鎖と軽鎖の定常ドメインのコード配列を相同なマウス配列で置換することによって（アメリカ合衆国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１：６８５１ （１９８４））、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部または一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合させることによってである。典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインで置換されるか、抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインで置換され、１つの抗原に対する特異性を持つ１つの抗原結合部位と、異なる抗原に対する特異性を持つ別の抗原結合部位を含む２価キメラ抗体を生み出す。

【0266】

本明細書に記載のモノクローナル抗体は１価によることが可能であり、その調製は本分野で周知である。例えば１つの方法は、免疫グロブリン軽鎖と修飾された重鎖の組み換え発現を含む。重鎖は一般にＦｃ領域内の任意の地点で切断されて重鎖の架橋を阻止する。あるいは関連するシステイン残基を別のアミノ酸残基で置換するか除去して架橋を阻止することができる。インビトロ法は１価抗体の調製にも適している。抗体の消化によるその断片（特にＦａｂ断片）の生成は、本分野で知られている定型的な技術を利用して実現することができる。

【0267】

キメラ抗体またはハイブリッド抗体も、合成タンパク質化学で知られている方法（架橋剤が関与する方法が含まれる）を利用してインビトロで調製することができる。例えばイムノトキシンは、ジスルフィド－交換反応を利用して、またはチオエーテル結合を形成することによって構成することができる。この目的に適した試薬の例に含まれるのは、イミノチオレートとメチル－４－メルカプトブチルイミデートである。

【0268】

ｂ）ヒト化抗体
非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）_２、または抗体の他の抗原結合配列など）である。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、望む特異性、親和性、および能力を持つ非ヒト種（ドナー抗体）（マウス、ラット、またはウサギなど）のＣＤＲからの残基で置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が含まれる。いくつかの場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が対応する非ヒト残基によって置き換えられる。ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、輸入されたＣＤＲまたはフレームワークの配列にも見られない残基も含むことができる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むことになり、その可変ドメインではＣＤＲ領域のすべて、または実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域のすべて、または実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部（典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部）も含むことになる。Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２１： ５２２－５２５ （１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２： ３２３－３２９ （１９８８） 、およびＰｒｅｓｔａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２： ５９３－５９６ （１９９２）。

【0269】

非ヒト抗体をヒト化する方法は本分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を持つ。これら非ヒトアミノ酸残基は「輸入」残基と呼ばれることがしばしばあり、典型的には「輸入」可変ドメインから取られる。ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒと共同研究者の方法、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５ （１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７ （１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－１５３６ （１９８８）に従って実施すること、または齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列で置換することによって実施することができる。したがってそのような「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり（アメリカ合衆国特許第４，８１６，５６７号）、その中では実質的にインタクト未満のヒト可変ドメインが非ヒト種からの対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基、おそらくはいくつかのＦＲ残基が齧歯類抗体の中の類似した部位からの残基で置換されたヒト抗体である。

【0270】

ヒト化抗体の作製に用いるヒト可変ドメイン（軽鎖と重鎖の両方）の選択は抗原性を低下させる上で非常に重要である。いわゆる「ベスト－フィット」法に従い、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。その後、齧歯類の配列に最も近いヒト配列をヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れる。Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５１：２２９６ （１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９６：９０１ （１９８７）。別の１つの方法は、軽鎖または重鎖の特別なサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特別なフレームワークを用いる。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体のために使用することができる。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９：４２８５ （１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５１：２６２３ （１９９３）。

【0271】

抗体は、抗原に対する高親和性と他の有利な生物学的特性を保持した状態でヒト化されることがさらに重要である。この目的を達成するため、１つの好ましい方法に従うと、親配列とヒト化配列の三次元モデルを用いて親配列とさまざまな概念的ヒト化産物を分析する方法によってヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルが市販されており、当業者には馴染みがある。選択された候補免疫グロブリン配列の有力な三次元立体構造を図解して表示するコンピュータプログラムを利用できる。これらの表示を検討することで、候補免疫グロブリン配列の機能において残基がおそらく果たす役割の分析、すなわち候補免疫グロブリンが対応する抗原に結合する能力に影響を与える残基の分析が可能になる。このようにしてＦＲ残基をレシピエント配列と輸入配列から選択して組み合わせ、抗体の望む特徴（標的抗原に対する増加した親和性など）を実現する。一般にＣＤＲ残基は、抗原への結合に影響を与えることに直接的かつ最も実質的に関与する。

【0272】

さまざまな形態のヒト化抗体が考えられる。例えばヒト化抗体として抗体断片（Ｆａｂなど）が可能であり、その抗体断片は場合により１つ以上の細胞毒性剤との複合体になって免疫複合体を生成させる。あるいはヒト化抗体としてインタクトな抗体（インタクトなＩｇＧ４抗体など）が可能である。

【0273】

ｃ）ヒト抗体
ヒト化の代わりとしてヒト抗体を生成させることができる。例えば、免疫化されると内在性免疫グロブリンの産生なしでヒト抗体の完全なレパートリーを生成させることのできるトランスジェニック動物（例えばマウス）を生成させることが今や可能である。例えばキメラマウスと生殖細胞系変異マウスの中の抗体重鎖接合領域（Ｊ_Ｈ）遺伝子のホモ接合性欠失により内在性抗体の産生が完全に阻害されることが記載されている。そのような生殖細胞系変異マウスにおいてヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイが移動する結果として抗原チャレンジの際にヒト抗体が生成する。例えばＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：２５５１ （１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３６２：２５５－２５８ （１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．， ７：３３ （１９９３）；アメリカ合衆国特許第５，５９１，６６９号、およびＷＯ ９７／１７８５２を参照されたい。完全ヒト抗体を生成させることのできるトランスジェニックマウスまたはラットが本分野で知られている。例えばアメリカ合衆国特許出願公開第２００９０３０７７８７Ａ１号、アメリカ合衆国特許第８，７５４，２８７号、アメリカ合衆国特許第２０１５０２８９４８９Ａ１号、アメリカ合衆国特許第２０１００１２２３５８Ａ１号、およびＷＯ ２００４０４９７９４を参照されたい。

【0274】

あるいはファージ提示技術を利用し、免疫化されていないドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、ヒトの抗体と抗体断片をインビトロで生成させることができる。ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５３ （１９９０）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７： ３８１ （１９９１）。この技術に従い、抗体Ｖドメイン遺伝子をフィラメント状バクテリオファージ（Ｍ１３またはｆｄなど）のメジャーコートタンパク質遺伝子またはマイナーコートタンパク質遺伝子いずれかのフレーム内にクローニングし、ファージ粒子の表面に機能的抗体断片を提示させる。フィラメント状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するため、抗体の機能特性に基づいて選択すると、これら特性を示す抗体をコードする遺伝子が選択される結果になる。したがってファージはＢ細胞の特性のいくつかを模倣する。ファージ提示は、例えばＪｏｈｎｓｏｎ， Ｋｅｖｉｎ Ｓ， ａｎｄ Ｃｈｉｓｗｅｌｌ， Ｄａｖｉｄ Ｊ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ３：５６４－５７１ （１９９３）に概説されている多彩な形式で実施することができる。Ｖ遺伝子区画のいくつかの供給源をファージ提示に利用することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８ （１９９１）は、免疫化されたマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さいランダムな組み合わせライブラリから抗オキサゾロン抗体のさまざまなアレイを単離した。免疫化されていないヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構成し、抗原（自己抗原を含む）の多彩なアレイに対する抗体を、本質的にＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１－５９７ （１９９１）、またはＧｒｉｆｆｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １２：７２５－７３４ （１９９３）によって記載されている技術にしたがって単離することができる。アメリカ合衆国特許第５，５６５，３３２号と第５，５７３，９０５号も参照されたい。

【0275】

ＣｏｌｅらとＢｏｅｒｎｅｒらの技術を利用してヒトモノクローナル抗体を調製することもできる（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， ｐ． ７７ （１９８５）とＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７（１）： ８６－９５ （１９９１）。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的に、または完全に不活性化されたトランスジェニック動物（例えばマウス）に導入することによって作製することができる。チャレンジの際には、ヒト抗体の産生が観察される。それは、遺伝子再構成、組み立て、および抗体レパートリーを含め、あらゆる点でヒトに見られるのと非常によく似ている。このアプローチが記載されているのは、例えばアメリカ合衆国特許第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，６６１，０１６号と、以下の学術刊行物：Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０： ７７９－７８３ （１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３６８： ８５６－８５９ （１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３６８： ８１２－１３ （１９９４）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４： ８４５－５１ （１９９６）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４： ８２６ （１９９６）、およびＬｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ， Ｉｎｔｅｒｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３： ６５－９３ （１９９５）である。

【0276】

最後に、ヒト抗体は、インビトロで活性化されたＢ細胞によって生成されてもよい（アメリカ合衆国特許第５，５６７，６１０号と第５，２２９，２７５号を参照されたい）。

【0277】

ｄ）抗体断片
ある状況では、抗体全体よりも抗体断片（抗原結合断片など）を用いることが有利である。断片のサイズがより小さいと迅速な排除が可能になり、固形腫瘍へのアクセスが改善される可能性がある。

【0278】

さまざまな技術が抗体断片を生成させるために開発されてきた。伝統的には、これら断片はインタクトな抗体のタンパク質溶解消化に由来する（例えばＭｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｍｅｔｈｏｄ． ２４：１０７－１１７ （１９９２）とＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１ （１９８５）参照）。しかしこれら断片は、今や、組み換え宿主細胞によって直接生成させることができる。Ｆａｂ、Ｆｖ、およびｓｃＦｖ抗体断片はすべて、大腸菌の中で発現させて大腸菌から分泌させることができるため、大量のこれら断片の容易な生成が可能になる。抗体断片は、上述のように抗体ファージライブラリから単離することができる。あるいはＦａｂ′－ＳＨ断片を大腸菌から直接回収し、化学的にカップルさせてＦ（ａｂ′）_２断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３－１６７ （１９９２））。別のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ′）_２断片を組み換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。生体内半減期が延長したＦａｂとＦ（ａｂ′）_２はアメリカ合衆国特許第５，８６９，０４６号に記載されている。他の実施形態では、抗体の選択は一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ ９３／１６１８５；アメリカ合衆国特許第５，５７１，８９４号、およびアメリカ合衆国特許第５，５８７，４５８号を参照されたい。例えばアメリカ合衆国特許第５，６４１，８７０号に記載されているように、抗体断片として「直線状抗体」も可能である。このような直線状抗体断片は、単一特異性または二重特異性であることが可能である。

【0279】

ｅ）エフェクタ機能の操作
例えば抗体の抗原依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を変化させる（例えば増強する、または消失させる）ため、本出願のヒト化抗Ｃ５ａ抗体をＦｃエフェクタ機能に関して変化させることが望ましい可能性がある。好ましい一実施形態では、ヒト化抗Ｃ５ａ抗体のＦｃエフェクタ機能が低下または消失する。これは、１つ以上のアミノ酸置換を抗体のＦｃ領域に導入することによって実現できる。その代わりに、またはそれに加えて、システイン残基をＦｃ領域に導入することで、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成することが可能になる。このようにして生成したホモ二量体ヒト化抗Ｃ５ａ抗体は、改善された内部化能力、および／または増加した補体関連細胞殺傷と抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を持つ可能性がある。Ｃａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ Ｍｅｄ． １７６：１１９１－１１９５ （１９９２）とＳｈｏｐｅｓ， Ｂ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：２９１８－２９２２ （１９９２）を参照されたい。増強された抗腫瘍活性を持つホモ二量体抗体は、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：２５６０－２５６５ （１９９３）に記載されているヘテロ二機能性架橋剤を用いて調製することもできる。あるいは二重Ｆｃ領域を持つ抗体を操作することにより、増強された補体溶解とＡＤＣＣの能力を持つようにすることができる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ３：２１９－２３０ （１９８９）を参照されたい。

【0280】

抗体の血清半減期を長くするため、例えばアメリカ合衆国特許第５，７３９，２７７号に記載されているようにしてサルベージ受容体結合エピトープをヒト化抗Ｃ５ａ抗体に組み込むことができる。本明細書では、「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子の生体内血清半減期の延長に責任があるＩｇＧ分子（例えばＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、またはＩｇＧ_４）のＦｃ領域のエピトープを意味する。

【0281】

ｆ）他のアミノ酸配列修飾
抗体（一本鎖抗体、または本明細書に記載のヒト化抗Ｃ５ａ抗体の抗体成分など）のアミノ酸配列修飾を考慮する。例えばそれは、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善する上で望ましい可能性がある。抗体のアミノ酸配列バリアントは、適切なヌクレオチド変化を抗体の核酸に導入することによって、またはペプチド合成によって調製することができる。このような修飾に含まれるのは、例えば抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／またはそれら残基への挿入、および／またはそれら残基の置換である。欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせがなされて最終コンストラクトに到達するが、その最終コンストラクトは望む特徴を持つ必要がある。アミノ酸の変化（グリコシル化部位の数または位置の変化など）も抗体の翻訳後プロセスを変化させる可能性がある。

【0282】

突然変異誘発にとって好ましい位置である抗体のある残基または領域を同定するための１つの有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ ｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４：１０８１－１０８５ （１９８９）に記載されているように、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここでは、１つの残基または一群の標的残基が同定されて（例えば帯電した残基であるＡｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、およびＧｌｕなど）、中性または負に帯電したアミノ酸（アラニンまたはポリアラニンが最も好ましい）で置き換えられ、アミノ酸抗原の相互作用に影響を与える。機能が置換に対して感受性であることが実証されたこれらアミノ酸位置はその後、さらなるバリアントまたは他のバリアントを置換の部位に、または置換の部位に代えて導入することによってさらに洗練される。したがってアミノ酸配列の変化を導入するための部位はあらかじめ決まるが、変異そのものの性質はあらかじめ決まっている必要はない。例えば所与の部位に位置する変異の性能を分析するため、アラニンスキャニングまたはランダムな突然変異誘発を標的コドンまたは領域で実施し、発現した抗体バリアントをスクリーニングして望む活性を探す。

【0283】

アミノ酸配列挿入体には、長さが１個の残基から１００個以上の残基を含有するポリペプチドまでのアミノ末端および／またはカルボキシ末端融合体のほか、１個または複数個のアミノ酸残基からなる配列内挿入体が含まれる。末端挿入体の例に、Ｎ末端メチオニル残基を持つ抗体、または細胞傷害性ポリペプチドに融合した抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入バリアントに含まれるのは、抗体の血清半減期を延長する（例えばＡＤＥＰＴのための）酵素またはポリペプチドへのその抗体のＮ末端またはＣ末端の融合体である。

【0284】

別のタイプのバリアントはアミノ酸置換バリアントである。これらバリアントは抗体分子の中に、異なる残基で置き換えられた少なくとも１つのアミノ酸残基を持つ。置換突然変異誘発のための最も興味ある部位に超可変領域が含まれるが、ＦＲの変化も考慮される。保存的置換が下記の表の中に「好ましい置換」の見出しで示されている。このような置換によって生物活性が変化する場合には、より実質的な変化（表２の中に「代表的な置換」として示すか、アミノ酸のクラスに関連して下にさらに説明されている）を導入して産物をスクリーニングすることができる。

【表2】

【0285】

抗体の生物学的特性の実質的な改変は、（ａ）置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造（例えばシートまたは螺旋構造）の維持、または（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性の維持、または（ｃ）側鎖の大きさの維持に対する効果が有意に異なる置換を選択することによって実現される。天然の残基は、共通する側鎖特性に基づいてグループに分けられる：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖の向きに影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。

【0286】

非保存的置換では、これらのクラスの１つのメンバーが別のクラスと交換されることになる。

【0287】

抗体の適切な構造の維持に関与しないあらゆるシステイン残基も一般にセリンで置換することができ、分子の酸化安定性が改善され、異常な架橋が阻止される。逆に、システイン結合を抗体に付加してその安定性を改善することができる（特に抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合）。

【0288】

特に好ましいタイプの置換バリアントは、親抗体（例えばヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを含む。一般に、さらなる開発のために選択される得られたバリアントは、それらが生成する元になる親抗体と比べて改善された生物学的特性を持つことになろう。

【0289】

抗体の別のタイプのアミノ酸バリアントは抗体の原初のグリコシル化パターンを変化させる。変えるとは、抗体の中に見いだされる１つ以上の炭化水素部分を除去すること、および／または抗体の中に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味する。

【0290】

抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ結合型またはＯ結合型である。Ｎ結合型は、アスパラギン残基の側鎖への炭化水素部分の付着を意味する。トリペプチド配列であるアスパラギン－Ｘ－セリンとアスパラギン－Ｘ－トレオニン（ただしＸはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、酵素によるアスパラギン側鎖への炭化水素部分の付着のための認識配列である。したがってポリペプチドの中にこれらトリペプチド配列のいずれかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が生じる。Ｏ結合型グリコシル化は、糖であるＮ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの１つが、ヒドロキシアミノ酸（最も一般的にはセリンまたはトレオニンだが、５－ヒドロキシプロリンまたは５－ヒドロキシリシンも使用できる）に付着することを意味する。

【0291】

抗体へのグリコシル化部位の付加は、上記のトリペプチド配列の１つ以上を含有するようにアミノ酸配列を変化させることによって簡便に実現される（Ｎ結合型グリコシル化部位について）。変化は、原初の抗体の配列に対する１つ以上のセリンまたはトレオニン残基の付加、または１つ以上のセリンまたはトレオニン残基による置換によって実現することもできる（Ｏ結合型グリコシル化部位について）。

【0292】

本出願のヒト化抗Ｃ５ａ抗体に対するアミノ酸配列バリアントをコードする核酸分子は、本分野で知られている多彩な方法によって調製される。これらの方法の非限定的な例に含まれるのは、天然供給源からの単離（天然アミノ酸配列バリアントの場合）、またはオリゴヌクレオチドを媒介とする（または部位特異的な）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、および以前に調製されたバリアントまたは非バリアントバージョンのカセット突然変異誘発による調製である。

【0293】

ｇ）他の修飾
本出願のヒト化抗Ｃ５ａ抗体をさらに修飾し、本分野で知られていて容易に入手できる追加の非タンパク質性部分を含有するようにできる。好ましくは、抗体の誘導体化に適した部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例に含まれるのは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、およびこれらの混合物である。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性が理由で製造において有利である可能性がある。ポリマーは任意の分子量が可能であり、分岐していてもいなくてもよい。抗体に付着させるポリマーの数はさまざまである可能性があり、２つ以上のポリマーを付着させる場合には同じ分子または異なる分子が可能である。一般に、誘導体化に使用するポリマーの数および／またはタイプは、さまざまな考慮事項（その非限定的な例に、改善する抗体の具体的な特性または機能、抗体誘導体が規定された条件下で治療に使用されるかどうかなどが含まれる）に基づいて決定することができる。このような技術と他の適切な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ２０ｔｈ Ｅｄ．， Ａｌｆｏｎｓｏ Ｇｅｎｎａｒｏ， Ｅｄ．， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ （２０００）に開示されている。

【0294】

キット
本発明には、本発明のヒト化抗Ｃ５ａ抗体と指示材料を含むキットも含まれ、指示材料は、本明細書の別の箇所に記載されているように、例えばヒト化抗Ｃ５ａ抗体を個体に治療的措置または非治療用として投与することを記述している。一実施形態では、このキットはさらに、本発明のヒト化抗Ｃ５ａ抗体またはその組み合わせを含む治療用組成物を、例えばその抗体を個体に投与する前に溶解または懸濁させるのに適した、医薬として許容可能な（場合により減菌された）基剤を含む。場合によりキットは、抗体を投与するための適用装置を含む。ヒト化抗Ｃ５ａ抗体を含む単位剤型も提供される。

【実施例】

【0295】

以下の実施例は本発明の純粋に例示であることを想定しているため、いかなるやり方でも本発明を制限すると見なされてはならない。以下の実施例と詳細な記述は説明のため提供されているのであり、限定するためではない。

【0296】

実施例１：抗Ｃ５ａ抗体の構築と選択
配列番号１のＶＨアミノ酸配列と配列番号２のＶＬアミノ酸配列を含むマウス抗Ｃ５ａ ＩｇＧ４抗体／ｓｃＦｖを用いてヒト化抗Ｃ５ａ抗体とその変異体を生成させる。さらなる親和性最適化のため、ＣＤＲグラフト法を利用し、マウスｓｃＦｖのＣＤＲがそれぞれ配列番号９と１０に従うＶＨフレームワークとＶＬフレームワークにグラフトされたヒト化抗Ｃ５ａコンストラクトを生成させた。ＣＤＲグラフト抗Ｃ５ａコンストラクトのＶＨとＶＬが配列番号８４と８５に示されている。

【0297】

１．親和性の最適化
部位特異的突然変異誘発法を利用し、配列番号８４と８５のＶＨ配列とＶＬ配列を含む抗Ｃ５ａ ｓｃＦｖクローンの６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）の各アミノ酸を個別に全２０種類のアミノ酸に変異させた。２０種類のアミノ酸をコードするＮＮＳコドンを含有するＤＮＡプライマーを用いて標的となる各ＣＤＲ位置に変異を導入した。縮重プライマーを部位特異的突然変異誘発反応で使用した。簡単に述べると、それぞれの縮重プライマーをリン酸化した。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間、（９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で５分間）を１６サイクル、７２℃で１０分間である。コロニーの形成とｓｃＦｖ断片の生成のため、ＰＣＲ産物を精製した後、ＢＬ２１に電気穿孔した。ｓｃＦｖ変異体ライブラリをスクリーニングするため、配列番号８２と８３のＶＨとＶＬを含むＮＭ２と名づけたコンストラクトを選択した。

【0298】

２．一次ｓｃＦｖ変異体ライブラリスクリーニング
単一点ｓｃＦｖ捕獲ＥＬＩＳＡ（ＳＰＥ）からなる一次スクリーニングを以下のように実施した：９６ウエルのＭａｘｉｓｏｒｐ ｌｍｍｕｎｏｐｌａｔｅｓを、ｐＨ７．４の被覆バッファＰＢＳの中の抗ｃ－ｍｙｃ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ－Ａ１９０－２０４Ａ）で４℃にて一晩かけて被覆した。翌日、プレートをｐＨ７．４のＰＢＳの中でカゼインを用いて２５℃で１時間にわたってブロックした。ＰＥを含有するＳｃＦｖをその後プレートに添加し、２５℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ビオチニル化抗原をウエルに添加して２５℃で１時間インキュベートした。その後、ＳＡ－セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎＳＮＮ１００４）複合体とともに２５℃で１時間インキュベートした。テトラ－メチルベンジジン（ＴＭＢ）（ＫＰＬ－５１２０－００４７）基質を用いてＨＲＰ活性を検出し、２ＭのＨＣｌを用いて反応をクエンチした。プレートを４５０ｎＭで読んだ。４５０ｎｍで親クローンの２倍超の光学密度（ＯＤ）シグナルを示すクローンを取り出してシークエンシングした。

【0299】

配列が独自で結合が改善された７つの抗Ｃ５ａ ｓｃＦｖコンストラクトがＳＰＲによって確認された。ＳＰＲ結合のまとめが表３に示されている。

【表3】

【0300】

３．抗Ｃ５ａ ｓｃＦｖライブラリの組み合わせスクリーニング
抗原への結合に有利であると判断されたＶＨとＶＬの中の点変異をさらに組み合わせて追加の結合相乗性を得た。簡単に述べると、各縮重プライマーをリン酸化した後、ウリジニル化ｓｓＤＮＡと１０：１の比で使用した。混合物を５分間かけて８５℃まで加熱した後、１時間かけて５５℃まで冷却した。その後、Ｔ４リガーゼとＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを添加し、混合物を３７℃で１．５時間インキュベートした。典型的には、コロニー形成とｓｃＦｖ断片生成のため２００ｎｇのコンビナトリアルライブラリＤＮＡをＢＬ２１に電気穿孔した。

【0301】

組み合わせ変異体をｓｃＦｖとして発現させ、捕獲ＥＬＩＳＡを利用してスクリーニングした。４５０ナノメートルでの光学密度（ＯＤ）シグナルが親クローンの２倍超を示すクローンをシークエンシングし、捕獲ＥＬＩＳＡとＳＰＲによってさらに確認した。

【0302】

４．親和性ランキングＥＬＩＳＡ
親和性ランキングＥＬＩＳＡを以下のように実施した：精製したｓｃＦｖサンプルを基準として用い、ＰＥ中のｓｃＦｖ濃度を定量ＥＬＩＳＡによって測定した。簡単に述べると、プレートを、ｐＨ７．４のコーティングバッファＰＢＳの中の抗Ｈｉｓ抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ－Ａ００１８６）で４℃にて一晩かけて被覆した。翌日、プレートをｐＨ７．４のＰＢＳの中でカゼインを用いて２５℃で１時間にわたってブロックした。ＰＥを含有するＳｃＦｖを希釈して３倍段階希釈液にした後、プレートに添加した。濃度が既知の精製したｓｃＦｖ基準サンプルを基準として使用した。２５℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、抗ｃ－ｍｙｃ－ＨＲＰ（Ｂｅｔｈｙｌ－Ａ１９０－１０４Ｐ）をウエルに添加して２５℃で１時間インキュベートした。ＨＲＰ活性をＴＭＢ基質で検出し、反応を２ＭのＨＣｌでクエンチした。プレートを４５０ｎＭで読んだ。

【0303】

ｐＨ７．４のＰＢＳの中の抗Ｃ５ａ ｃｙｎｏ抗原とヒト抗原のそれぞれで４℃にて一晩かけてプレートを被覆した。翌日、ＰＢＳの中でカゼインを用いてプレートを２５℃で１時間にわたってブロックした。ＰＥを含有する規格化ｓｃＦｖを、ｌ００ｎＭから開始する３倍段階希釈液を用いて希釈し、プレートに添加し、２５℃で１時間インキュベートした。洗浄後、抗ｃ－ｍｙｃ－ＨＲＰをウエルに添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ＴＭＢ基質を用いてＨＲＰ活性を検出し、２ＭのＨＣｌを用いて反応をクエンチした。プレートを４５０ｎＭで読んだ。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウエアを用いてデータを一部位結合式にフィットさせた。カニクイザル抗原に結合したヒットの結果が図１Ａ～１Ｂに示されている。ヒト抗原に結合したヒットの結果が図２Ａ～２Ｂに示されている。

【0304】

５．抗Ｃ５ａヒットのＳＰＲ
固定化
注入する直前に４００ｍＭのＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）と１００ｍＭのＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）（ＧＥ）を混合することによってアクチベータを調製した。この混合物を流速１０μＬ／分で用いてＣＭＳセンサーチップを６００秒間にわたって活性化させた。次いで抗ｃ－ｍｙｃと抗ｈｉｓ抗体の混合物を含む１０ｍＭのＮａＡｃ（ｐＨ４．５）をチャネル１～チャネル８のＦｃｌとＦｃ２に６００秒間にわたって流速１０μＬ／分で注入した。１Ｍのエタノールアミン－ＨＣｌ（ＧＥ）を流速１０μＬ／分で４２０秒にわたって用いることによりチップを脱活性化した。

【0305】

リガンド捕獲とランニング分析物
抗Ｃ５ａ ｓｃＦｖを０．５μｇ／ｍｌに希釈し、他のサンプルをランニングバッファ１×ＨＢＳ－ＥＰ＋（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．００３ＭのＥＤＴＡ、０．０５％の界面活性剤Ｐ２０）の中で２μｇ／ｍｌに希釈した。ＴＥＳ（トリス－ＥＤＴＡ－スクロース）バッファを用いるＮＣ（陰性対照）ではｓｃＦｖｓと同じ希釈方式を利用した。希釈したＴＥＳバッファを流速１０μＬ／分で４０秒間にわたってチャネルＦｃ１に注入し、希釈したｓｃＦｖを流速１０μＬ／分で４０秒間にわたってチャネルＦｃ２に注入した。その後、６０ｎＭのカニクイザル抗原分析物または５ｎＭのヒト抗原分析物とランニングバッファを流速１００μＬ／分で会合相の６０秒間にわたってＦｃ１－Ｆｃ２に注入し、その後に１２００秒間の解離が続く。再生バッファとしての１０ｍＭのグリシン（ｐＨ１．５）をすべての解離相の後に注入した。チップを１０ｍＭのグリシン（ｐＨ１．５）で再生させた。

【0306】

データ分析
参照チャネルＦｃ１とバッファチャネルに関するセンソグラムを試験センソグラムから差し引いた。データを１：１動態結合モデルによってフィットさせた。分子量８．４ｋＤａを用いてｃｙｎｏ抗原のモル濃度を計算した。分子量８．２ｋＤａを用いてヒト抗原のモル濃度を計算した。ｃｙｎｏ抗原への結合の結果が表４に示されている。ｃｙｎｏ抗原への結合の結果が表５に示されている。

【表4】

【表5】

【0307】

ｐＨ依存性抗原結合特性をさらに最適化するため、配列番号９のＶＨアミノ酸配列と配列番号１０のＶＬアミノ酸配列を含む１６Ｄ１０を選択した。Ｆｃドメイン変異を１６Ｄ１０に導入した。設計した変異が標的とする位置は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ）またはＱ５（登録商標）部位特異的突然変異誘発（ＮＥＢ）によって導入した。

【0308】

導入されたｐＨ依存性結合に、ヒスチジンスキャニングとして知られる方法であるＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）突然変異誘発によってヒスチジン置換を１６Ｄ１０の６つのＣＤＲ領域内の位置のそれぞれに導入した。各バリアントについて、変異した１６Ｄ１０重鎖と野生型軽鎖を有する発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞に一過性にトランスフェクトし、震盪フラスコの中で無血清培地とともに５～７日間培養した。変異した軽鎖と野生型重鎖を同時にトランスフェクトすることにより、軽鎖バリアントが同様にして得られた。結合を特徴づけるため、発現上清を遠心分離によって回収した。Ｇａｔｏｒ ＴＭ（Ｐｒｏｂｅ Ｌｉｆｅ， Ｉｎｃ．）を使用し、発現上清からのＩｇＧを用いてｐＨ７．４とｐＨ５．８それぞれのもとでのＣ５への結合を測定した。

【0309】

１６Ｄ１０と比べてｐＨ７．４で同じ結合解離定数を維持したがｐＨ５．８で結合解離定数が低下した変異抗体を選択した。結合を有利にする単一ヒスチジン変異を重鎖または軽鎖に同時にトランスフェクトすることにより、複数のヒスチジン変異を持つｐＨ依存性結合バリアントを創出した。鎖の中に結合を有利にする複数のヒスチジン変異を持つバリアントを、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）突然変異誘発によって同じ鎖にそれらの有利な変異を起こすことで創出した。ｐＨ依存性結合バリアントを発現上清からプロテイン－Ａアフィニティクロマトグラフィによってさらに精製して親和性を明らかにした。精製したタンパク質を、１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて２０ｍＭのヒスチジンバッファに透析し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｉｎｃ．、アメリカ合衆国）によって定量した後、Ｇａｔｏｒ（商標）^（Ｐｒｏｂｅ Ｌｉｆｅ， Ｉｎｃ．）を用いて親和性を測定した。

【0310】

さらなる特徴づけのため、ヒト化されていて結合親和性が成熟したｐＨ依存性Ｃ５ａ結合コンストラクト変異体が３つ同定された。すなわちＶＨ ＣＤＲ１内の変異Ｆ２９Ｈ、ＶＨ ＣＤＲ２内の変異Ｅ５４Ｈ、およびＶＬ ＣＤＲ３内の変異Ｙ９６Ｈを含むＥ５４Ｈ（ＶＨ：配列番号１７；ＶＬ：配列番号１８）；ＶＨ ＣＤＲ１内の変異Ｆ２９Ｈ、ＶＨ ＣＤＲ３内の変異Ｎ９７Ｈ、およびＶＬ ＣＤＲ３内の変異Ｙ９６Ｈを含むＮ９７Ｈ（ＶＨ：配列番号２５；ＶＬ：配列番号２６）；ＶＨ ＣＤＲ１内の変異Ｆ２９Ｈ、ＶＬ ＣＤＲ２内のＮ９２Ｈ変異、およびＶＬ ＣＤＲ３内のＹ９６Ｈ変異を含むＮ９２Ｈ（ＶＨ：配列番号３３；ＶＬ：配列番号３４）である。ｐＨに依存したデータは実施例４に記載されている。

【0311】

ヒト化抗Ｃ５ａ抗体をヒトＣ５ａへの親和性に関してＥＬＩＳＡによって調べた。図３は、すべてのヒト化抗Ｃ５ａコンストラクト（１６Ｄ１０、Ｅ５４Ｈ、Ｎ９７Ｈ、およびＮ９２Ｈ）がヒトＣ５ａに同等な高親和性で結合したことを示す。抗体はＣ５により高親和性で結合した（図８）。

【0312】

Ｃ５はＣ５ａを標的とする薬に深いシンクを提供するため、抗Ｃ５ａコンストラクトにとって、Ｃ５を媒介とする経路の破壊を最少にすることが望ましい。古典経路を媒介とするヒツジ赤血球細胞溶解アッセイを利用してすべての抗Ｃ５ａ抗体コンストラクトのＣ５阻害効果を評価した。

【0313】

抗体で感作したヒツジＲＢＣ（２×１０^７個の細胞／アッセイ、Ｓｏｌａｒｂｉｏ）をゼラチンベロナールバッファ（ＧＶＢ２＋、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ；全アッセイ体積：５０μｌ）の中で５％の正常なヒト血清（ＮＨＳ、Ｑｕｉｄｅｌから）とともに３７℃で３０分間インキュベートした。抗Ｃ５ａコンストラクトをＮＨＳとともに４℃で１時間インキュベートした後、さまざまな濃度でヒツジＲＢＣに添加した（図４）。４０ｍＭのＥＤＴＡを含む氷冷ＰＢＳを添加することによって溶解反応を停止させた。インキュベーション混合物を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。各混合物からの上清を回収し、ＯＤを４０５ｎｍで測定した。ＥＤＴＡ、蒸留水（ＤＷと表記）、および抗Ｃ５ベンチマーク抗体ＳｏｌｉｒｉｓをＲＢＣ溶解のための陽性対照として使用した。５％血清を陰性対照として使用した。

【0314】

ヒツジＲＢＣ溶解アッセイの結果が図４と表６に示されている。陽性対照（ＥＤＴＡ、水、およびＳｏｌｉｒｉｓ）はヒツジＲＢＣを溶解させた；ＳｏｌｉｒｉｓはヒツジＲＢＣ溶解を効果的に阻止し、ＩＣ５０は１．２３μｇ／ｍｌである。ヒト化抗Ｃ５ａコンストラクトは溶解において阻害を示さなかった。これは、Ｃ５を媒介とした経路の破壊が最少であったことを示唆する。

【表6】

【0315】

実施例２：インビトロでの機能アッセイ
１．Ｕ９３７細胞におけるリガンド阻止アッセイ
Ｕ９３７／Ｃ５ａＲ細胞をＰＢＳによって２回洗浄し、アッセイバッファ（ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ）の中に３×１０^６個の細胞／ｍｌの密度で懸濁させた。１００μｌの細胞を９６ウエルのマイクロプレートに添加し、アッセイバッファに希釈した５０μｌの化合物と、５０μｌのビオチニル化リガンドヒトＣ５ａ（最終濃度は２０ｎＭ）を対応するウエルに順番に添加し、プレートを氷の上で１２０分間インキュベートした。４℃にて１０００ｒｐｍで３～５分間にわたって遠心分離し、上清を除去し、細胞をあらかじめ冷やしたＰＢＳによって２回洗浄した。１００μｌのＦＩＴＣ標識ストレプトアビジン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を細胞に添加し、氷の上でさらに３０分間インキュベートする。４℃で遠心分離し、上清を除去し、細胞をあらかじめ冷やしたＰＢＳによって２回洗浄した。１５０μｌの０．５％ＰＦＡを添加して細胞を懸濁させ、シグナルをＦＡＣＳ（Ｂｅｃｋｍａｎ， Ｃｙｔｏｆｌｅｘ）によって検出する。ＩＣ_５０値をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアによって計算した。高対照は、細胞をビオチニル化Ｃ５ａとともに、抗Ｃ５ａコンストラクトを添加することなくインキュベートしたことを意味する；低対照は、細胞をアッセイバッファとともに、抗Ｃ５ａコンストラクトを添加することなくインキュベートしたことを意味する。

【0316】

４つの抗Ｃ５ａコンストラクト（１６Ｄ１０、Ｅ５４Ｈ、Ｎ９７Ｈ、およびＮ９２Ｈ）を、Ｕ９３７細胞におけるＣ５ａ受容体（Ｃ５ａＲ）阻止能力について評価した。

【0317】

Ｃ５ａＲを発現しているＵ９３７細胞において抗Ｃ５ａコンストラクトを図５に示されている一連の濃度で滴定した。平均蛍光強度を各抗体濃度で測定した。抗体の添加なしのＵ９３７細胞を低対照として使用した。細胞をビオチニル化Ｃ５ａとともに、抗Ｃ５ａコンストラクトを添加することなくインキュベートし、高対照として使用した。

【0318】

実験を繰り返した。代表的な結果が図５に示されており、表７にまとめられている。全４つの抗Ｃ５ａコンストラクト（１６Ｄ１０、Ｅ５４Ｈ、Ｎ９７Ｈ、およびＮ９２Ｈ）がナノモル濃度で強力なリガンド阻止を示した。

【表7】

【0319】

２．Ｃ５ａＲアンタゴニスト移動アッセイ
Ｃ５ａＲを阻止するとリンパ管細胞の走化性が阻害されることが示されている。Ｃ５ａ受容体を安定にトランスフェクトされたＵ９３７細胞（Ｕ９３７－Ｃ５ａＲ細胞）を９６ウエルのＴｒａｎｓｗｅｌｌインサートの上方チャンバーで０．５％のＢＳＡを含むＲＰＭＩ培地の中にウエル１つ当たり３×１０^５個の細胞で播種した。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートは孔のサイズが３．０－μｍのポリカーボネート製膜フィルタ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を持っていた。下方ボイデンチャンバーには、０．５％のＢＳＡを含むＲＰＭＩ培地の中の抗体であらかじめ処理した１０ｎＭの組み換えヒト補体Ｃ５ａを収容した。３７℃で３時間インキュベートした後、下方チャンバーに移動した細胞を、５０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加することによって溶解させ、発光強度（ＬＩ）をマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）によって読んだ。阻害の割合は以下のようにして計算した：％阻害＝［１－（ＬＩ－ＬＩ_{［低対照］}）／（ＬＩ_{［高対照］}－ＬＩ_{［低対照］}）］×１００。ＩＣ_５０値はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアによって計算した。高対照は、Ｃ５ａを下方チャンバーにだけ添加している；低対照は、アッセイバッファを下方チャンバーにだけ添加している。

【0320】

表８と図６は、２回の独立な実験で、４つの抗Ｃ５ａコンストラクト（１６Ｄ１０、Ｅ５４Ｈ、Ｎ９７Ｈ、およびＮ９２Ｈ）すべてが低ナノモル濃度でＵ９３７細胞の移動を効果的に阻害することを示す。

【表8】

【0321】

３．Ｃ５ａＲアンタゴニストＦＬＩＰＲアッセイ
ＦＬＩＰＲアッセイを利用して、Ｃ５ａが誘導するカルシウム流入に対するヒト化抗Ｃ５ａコンストラクトの阻害活性を調べた。抗Ｃ５ａコンストラクトをＦＬＩＰＲアッセイキットの指示に従って調製したＨＥＫ２９３細胞の中で滴定した。簡単に述べると、細胞を増殖培地に１×１０^６個の細胞／ｍｌの密度で懸濁させた。２０μｌの細胞懸濁液を３８４ウエルのプレートに播種し、一晩培養した。Ｅｃｈｏを用いて２５０ｎｌの抗Ｃ５ａコンストラクト溶液を細胞プレートに移し、６０分間インキュベートする。細胞をＦｌｕｏ－４ Ｄｉｒｅｃｔ ＴＭ染料とともに添加し、３７℃、５％ＣＯ２で５０分間、そしてその後、室温で１０分間インキュベートする。細胞プレートをＦＬＩＰＲＴＥＴＲＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）の中に置く。１０μｌのアゴニストヒトＣ５ａを細胞プレートに移す。蛍光を図７に示されている各抗体濃度点で測定した。ＩＣ５０はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアによって計算した。結果が図７と表９に示されている。抗Ｃ５ａコンストラクトの代わりに２５０ｎｌのアッセイバッファを添加したサンプルを高対照として使用した。

【表9】

【0322】

４つのヒト化抗Ｃ５ａコンストラクトすべてが低ナノモル濃度でＨＥＫ２９３細胞へのカルシウム流入を阻害した。

【0323】

実施例３：Ｃ５結合と「シンク効果」
ＥＬＩＳＡを利用してヒトＣ５に対する抗Ｃ５ａコンストラクトの親和性を調べた。オフ－ターゲットＣ５結合が抗Ｃ５ａ抗体の利用可能性を低下させる（Ｃ５を媒介とする「シンク効果」）。４つのヒト化抗Ｃ５ａコンストラクト（１６Ｄ１０、Ｅ５４、Ｎ９２、およびＮ９７）を段階希釈し、Ｃ５であらかじめ被覆したプレートに添加し、ＯＤ４５０をマイクロプレートリーダーによって４５０ｎｍで測定した。各データ点は２つの反復実験の平均であった。結果が図８と表１０に示されている。

【0324】

すべての抗Ｃ５ａコンストラクト（ベンチマークを含む）が、ヒツジＲＢＣ溶解に対して最少の影響（実施例１）を示したにもかかわらず、中性ｐＨでヒトＣ５にも結合した。変異体Ｅ５４Ｈ、Ｎ９７Ｈ、およびＮ９２Ｈは、１６Ｄ１０と比べ、Ｃ５ａに対してＣ５に対するよりも選択的な結合を示した（１６Ｄ１０と比べてＣ５ａ／Ｃ５結合比が増加）。

【表10】

【0325】

実施例４：ｐＨ依存性Ｃ５結合と減少した「シンク効果」
ヒト化抗Ｃ５ａコンストラクトのｐＨ依存性をＣ５結合アッセイを利用して調べた。バイオレイヤー干渉装置Ｇａｔｏｒ（商標）（Ｐｒｏｂｅ ｌｉｆｅ Ｉｎｃ．、アメリカ合衆国）を用いてヒスチジン変異体とベンチマーク抗体のｐＨ依存性解離を求めた。簡単に述べると、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（ＦＨＣ）プローブを、０．０２％のウシ血清アルブミンと０．００２％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有するリン酸塩緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）の動態（Ｋ）バッファの中で平衡させた。センサーを２００μＬのトランスフェクション上清の中にｐＨ７．４で６００秒間浸すことにより、抗体をそれらセンサーの表面に捕獲した。その後バイオセンサーをＫバッファ（ｐＨ７．４）の中で調製したヒトＣ５（４０ｎＭ）とともに６００秒インキュベートした後、ｐＨ７．４またはｐＨ５．８のＫバッファの中で６００秒間の解離期間を設けた。データはＧａｔｏｒ評価ソフトウエアによって処理して分析した。

【0326】

１６Ｄ１０、Ｅ５４Ｈ、Ｎ９７Ｈ、およびＮ９２Ｈの結合曲線が図９に示されている。６００秒終了時の解離率の値が図１０に示されており、下記の表１１にまとめられている。

【0327】

図９、図１０、および表１１に示されているように、ヒスチジン変異コンストラクトＥ５４Ｈ、Ｎ９７Ｈ、およびＮ９２ＨはヒトＣ５への有意なｐＨ依存性結合を示し、ｐＨ５．８での解離値は４９％～６１％であった。Ｅ５４Ｈ、Ｎ９７Ｈ、およびＮ９２Ｈについては、ｐＨ５．８とｐＨ７．４での解離率の比は、それぞれ１１．３、１０．９、および６．５４であった。１６Ｄ１０とベンチマークは、ヒトＣ５へのｐＨ依存性結合を示さなかった。これらの結果は、ヒスチジン変異コンストラクトが「シンク効果」を潜在的に回避でき、より大きな生体内持続性を持つことを実証した。なぜなら細胞によって取り込まれた免疫複合体（すなわちヒト化抗Ｃ５ａ抗体はＣ５に結合し、そのことによって「シンク効果」を受ける）はエンドソームの酸性環境で解離し、遊離した抗体または抗体融合タンパク質が細胞から新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を通じて出てリサイクルされることが可能になり、その受容体の位置で新たなＣ５ａ分子に結合するのに利用できるからである。

【表11】

【0328】

実施例５：抗Ｃ５ａコンストラクトの生体内薬物動態評価
抗Ｃ５ａコンストラクトの生体内薬物動態を、ＳＣＩＤ／ヒトＦｃＲｎトランスジェニックを背景とするＣ５ヒト化マウス（ＨｕＣ５／Ｓｃｉｄ／ＦｃＲｎ、ヒトＦｃＲｎトランスジェニック、およびマウスＦｃＲｎノックアウトと表記）で調べた。Ｎ９７Ｈ、Ｎ９２Ｈ、および１６Ｄ１０を調べた。

【0329】

抗Ｃ５ａ抗体で処理したマウス内のヒトＩｇＧ４を、サンドイッチＥＬＩＳＡを利用して検出した。９６ウエルのプレートを、２μｇ／ｍＬの最終濃度の抗ヒトカッパ軽鎖抗体（抗体溶液、ＡＳ７５－Ｐ）を含む炭酸水素塩バッファで３７℃にて１時間にわたって被覆した。０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含有するＰＢＳで３回洗浄した後、プレートをブロッキング溶液の中で希釈した血漿サンプルとともに室温で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートを、抗ヒトＩｇＧ４ ＨＲＰ（１：２０００希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１０６５４）を含むブロッキング溶液とともに室温で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートをＨＲＰ基質で３分間発色させた。反応を２ＮのＨ_２ＳＯ_４で停止させ、マイクロプレートリーダーの中でプレートを４５０ｎｍで読んだ。薬物動態プロファイルが図１１に示されている（２５ｍｇ／ｋｇの用量で１回静脈内注射した後の３つの抗Ｃ５ａヒト化抗体Ｎ９２、Ｎ９７、および１６Ｄ１０の血漿濃度と時間プロファイルの関係。

【0330】

図１１は、Ｎ９７ＨとＮ９２Ｈの両方とも、１回注射してから１５日後までの延長された生体内持続性を持っていたことを示す。ヒトＣ５／ＳＣＩＤ／ヒトＦｃＲｎマウスにおける１６Ｄ１０のレベルは、１回注射してから３日目までに低下した。

【0331】

実施例６：生体内でのＣ５レベルに対する抗Ｃ５ａ抗体の影響
ヒトＣ５を発現しているＦｃＲｎ／ＳＣＩＤマウスにおいて、ヒトＣ５ ｃＤＮＡプラスミドの流体力学的注入の後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥとサンドイッチＥＬＩＳＡを利用してヒトＣ５を検出した。

【0332】

図１２は、抗Ｃ５ａ抗体Ｎ９７Ｈ、Ｎ９２Ｈ、および１６Ｄ１０（図１２と１３のそれぞれにおいてＮ９７、Ｎ９２、およびＷＴと表記）を注射した後のさまざまな時点における血清中のヒトＣ５タンパク質のレベルを示す。両方のヒスチジン変異コンストラクトがＣ５のレベルを低下させた。１６Ｄ１０は最初、注射してから１日目と３日目にＣ５のレベルを低下させたが、Ｃ５のレベルは５日目から回復した。

【0333】

サンドイッチＥＬＩＳＡのため、９６ウエルのプレートを、最終濃度が２μｇ／ｍＬの抗ヒトＣ５抗体（Ｑｕｉｄｅｌ、Ａ２１７）を含む炭酸水素塩バッファで３７℃にて１時間にわたって被覆した。０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含有するＰＢＳでプレートを洗浄した後、希釈した血漿サンプルを含むブロッキング溶液とともに室温で１時間インキュベートした。次いでプレートを洗浄し、ビオチニル化抗ヒトＣ５ ｍＡｂ ９Ｇ６を含むブロッキング溶液とともに室温で１時間にわたってインキュベートし、再び洗浄し、アビジンまたはストレプトアビジンで標識したセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＢＤ ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）を含むブロッキング溶液とともに室温で１時間にわたってインキュベートした。最終洗浄の後、ＨＲＰ基質を用いてプレートを３分間にわたって発色させた。２ＮのＨ_２ＳＯ_４を用いて反応を停止させ、プレートをマイクロプレートリーダーの中で４５０ｎｍにて読んだ。結果が図１３に示されている。

【0334】

図１３は、Ｎ９７ＨとＮ９２Ｈを投与した後のＣ５のレベルが前処理レベルのほぼ２５％まで低下し、１６Ｄ１０を投与した後のＣ５のレベルが３日目以降に回復することを示しており、ＳＤＳ－ＰＡＧＥからの結果が確認される。

【0335】

実施例７：十分な補体活性に必要とされるＣ５のレベル
ヒツジＲＢＣ溶解を実施して古典経路の十分な活性に必要なＣ５のレベルを求めた。正常なヒト血清だけとともにインキュベートしたサンプルを十分な補体活性の陽性対照として使用した。ＮＨＳの添加なし、またはＥＤＴＡの添加ありのサンプルを陰性溶解対照として使用した。図１４に示されているように、古典経路を通じた十分な補体活性を誘導するのにＣ５のほぼ２５％で十分であった。

【0336】

代替経路補体関連溶血に必要なＣ５のレベルを評価するため、ウサギ赤血球細胞溶解アッセイを実施した。ウサギＲＢＣ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃカタログ番号Ｒ４０３－０１００）（ＰＢＳの中で調製したアッセイサンプル１つにつき１×１０^７個の細胞、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）を、２５％の正常なヒト血清（ＮＨＳ、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．から）を含むゼラチンベロナールバッファ（ＧＶＢ２＋ＥＧＴＡ、Ｓｉｇｍａ；全アッセイ体積：１００μＬ）とともに３７℃で３０分間インキュベートした。ＮＨＳだけとともにインキュベートしたサンプルを十分な補体活性に関する陽性対照として使用した。ＮＨＳなしの、またはＥＤＴＡを添加したサンプルを陰性溶解対照として使用した。氷冷ＰＢＳに溶かした４０ｍＭのＥＤＴＡを添加することによって溶解反応を停止させた。インキュベーション混合物を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を回収し、ＯＤ４０５ｎｍを測定した。図１５は、代替経路を通じて十分な補体活性を誘導するのにＣ５のほぼ２５％で十分であることを示す。これらの結果は、抗Ｃ５ａ抗体は血清中のＣ５レベルを低下させた（実施例７）が、十分な補体活性を誘導するのに残ったＣ５で十分であったことを示唆する。

【0337】

実施例８：カニクイザルにおけるＮ９２Ｈ抗体の生体内薬物動態評価
カニクイザルにおいて、Ｎ９２Ｈ抗体を５、３０、および１００ｍｇ／ｋｇで１回静脈内投与することによってＮ９２Ｈ抗体の生体内薬物動態評価を実施した。血液サンプルを以下の時点に回収した：投与前（投与を開始する最大で２日前）、ＥＯＩ（輸液を終える０～２分前）、および１日目に輸液が終了（ＥＯＩ）してから１、６、２４、７２、１６８、３３６、５０４、および６７２時間後の時点。それに加え、血液サンプルを１日目のＥＯＩから１７２８（１１週目）、２１８４（１４週目）、および２６８８（１７週目）時間後の時点に５ｍｇ／ｋｇから回収した。

【0338】

定量の下限（ＬＬＯＱ）が３７．３ｎｇ／ｍＬである確立されたＥＬＩＳＡ法を利用してＮ９２Ｈ抗体の濃度を求めた。この定量的ＥＬＩＳＡはサンドイッチ形式に基づいており、４℃を適用した被覆を除く全工程を室温で実施した。マイクロウエルプレートを、コーティングバッファの中で希釈した捕獲用マウス抗ヒトＩｇＧ定常重鎖２（ＣＨ２）抗体（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ＭＣＡ５７４８Ｇ）で被覆した。このアッセイでは、基準、品質対照、およびサンプルを希釈バッファの中で最少必要希釈（ＭＲＤ）で希釈した、あらかじめ被覆したマイクロウエルに分配し、マイクロウエルをブロックした。インキュベーションの後、プレートを洗浄して結合しなかった材料を除去した後、ウエル阻止工程に移った。次いでサンプルをウエルに装填し、撹拌しながら室温でインキュベートした。インキュベーションの後、ウエルを洗浄してから検出用マウス抗ヒトＩｇＧ４断片結晶化可能領域（Ｆｃ）－セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ， ９２００－０５）を添加した。プレートを洗浄し、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン基質溶液（ＴＭＢ）を添加した。インキュベーションの後、硫酸停止溶液を添加することによって反応を停止させた。６５０ｎｍの参照波長を用いて吸光度を４５０ｎｍで読んだ。発色は、ウエルの中に存在するＮ９２Ｈ抗体の量に比例する。

【0339】

図１６は、Ｎ９２Ｈ抗体を５、３０、および１００ｍｇ／ｋｇで３０分間にわたって１回静脈内輸液した後、５ｍｇ／ｋｇでは、１１、１４、および１７週目に回収したサンプルを含め、６７２時間のサンプリング期間中を通じて全治療群で血漿濃度が定量可能であったことを示す。Ｎ９２Ｈ抗体が最大血漿濃度に達するまでの時間（ｔｍａｘ）を、５と３０ｍｇ／ｋｇではＳＯＩから０．５時間（ＥＯＩの０～２分前）または１．５時間の時点で、１００ｍｇ／ｋｇではＳＯＩから０．５時間の時点で観察した。サンプリングを延長すると、終末相が５ｍｇ／ｋｇでよく特徴づけられ、雄と雌それぞれについて、終末半減期（Ｔ１／２）の推定値は５７６時間と５９５時間、クリアランス（Ｃｌ）は０．０９２２と０．１０９ｍＬ／ｈｒ／ｋｇ、分布容積（Ｖｓｓ）は８０．９と８０．０ｍＬ／ｋｇであった。

【0340】

実施例９：カニクイザルにおけるＮ９２Ｈ抗体の生体内薬力学評価
カニクイザルにおいて、Ｎ９２Ｈ抗体を５、３０、および１００ｍｇ／ｋｇで１回静脈内投与することによってＮ９２Ｈ抗体の生体内薬力学評価を実施した。血液サンプルを以下の時点に回収した：投与前（投与を開始する最大で２日前）、ＥＯＩ（輸液を終える０～２分前）、および１日目に輸液が終了（ＥＯＩ）してから１、６、２４、７２、１６８、３３６、５０４、および６７２時間後の時点。それに加え、血液サンプルを１日目のＥＯＩから１７２８（１１週目）、２１８４（１４週目）、および２６８８（１７週目）時間後の時点に５ｍｇ／ｋｇから回収した。

【0341】

ＣＤ１１ｂの発現を準定量するための手続きを利用し、カニクイザル全血で生体外Ｃ５ａ刺激の後にフローサイトメトリーによってＮ９２Ｈ抗体の薬力学を明らかにした。血液サンプルをＫ２－ＥＤＴＡ管の中に回収した後、中間プロセシングのため最初の回収時間の後１時間以内にＦＡＣＳ管に移した。その後、刺激のため組み換えｃｙｎｏ Ｃ５ａ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）をサンプルに添加し、ＣＤ１１ｂまたはアイソタイプ対照抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５７３２１と５５６６５０）とともにインキュベートした。赤血球細胞の上清を、溶解バッファ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５５８９９）と混合することによって取得した。ＰＦＡ（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、Ｊ６１８９９）／ＤＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１４１９０１３６）を用いて細胞を固定した後、サンプルに対してＦＡＣＳを実施してＣＤ１１ｂシグナルを検出した。

【0342】

図１７は、Ｃ５ａタンパク質が投与前にＣＤ１１ｂの発現レベルを強く上昇させ、その効果が投与された動物における研究サンプルで研究期間を通じて阻害されたことを示す。低用量のＮ９２Ｈ抗体（５ｍｇ／ｋｇ）を投与された動物では、Ｃ５ａタンパク質を用いた刺激が、投与前に１０と３０ｎＭの両方でＣＤ１１ｂ発現の強い上昇を誘導した。Ｃ５ａタンパク質の刺激は阻害され、１７週まで維持された。ＣＤ１１ｂ発現の阻害はあらゆる機会を通じて比較的変動したが、２０％未満に留まった。

【0343】

実施例１０：カニクイザルにおける、Ｃ５ａが誘導する好中球減少症のモデルでのＮ９２Ｈ抗体の生体内薬力学評価
Ｃ５ａは、接着分子の発現と好中球の走化性移動を誘導する最も強力な炎症促進メディエータの１つである。Ｃ５ａが血流中で局所的に生成するとき、Ｃ５ａＲを担持する近傍の好中球が接着分子をただちに上方調節して血管の内面に接着する。Ｃ５ａが静脈内注射によって全身に導入される場合には、好中球の接着が血管系全体でただちに起こり、その結果として、血流の中をまだ流れている好中球の数が一過性にかなりの量減少する。この現象は好中球減少症と名づけられている。われわれは好中球減少症モデルにおけるＮ９２Ｈ抗体の生体内効果を評価した。

【0344】

図１８は、サルにおける好中球減少症モデルを説明している。簡単に述べると、ヒトＣ５ａ（１０μｇ／ｋｇ）をＮ９２Ｈ抗体の投与後６時間の時点で投与し、その後は２日目、７日目、および１４日目の時点で静脈内投与した。血液サンプルをそれぞれのＣ５ａ注射の１分（ｍｉｎ）前と１分後にただちに回収し、好中球のカウントを自動化血液分析装置（Ｓｙｓｍｅｘ ＸＴ－２０００ｉＶ）によって２時間以内に分析した。Ｎ９２Ｈ抗体効果を計算し、各Ｃ５ａ注射の１分前と１分後の血液サンプル中の好中球のパーセント変化として表わした。Ｃ５ａによって誘導される好中球の減少の平均は、Ｃ５ａ刺激のそれぞれで約９０％である（データは示さない）。図１９の中のデータは、アイソタイプ対照抗体をあらかじめ投与されたサルは、Ｃ５ａが誘導する好中球減少症に対する影響がないことを示す。逆に、５ｍｇ／ｋｇのＮ９２Ｈ抗体をあらかじめ投与されたサルは、Ｃ５が誘導する好中球減少症の９０％超の救済を示した。救済効果は少なくとも１４日間持続することができる。

【表12-1】

【表12-2】

【表12-3】

【表12-4】

【表12-5】

【表12-6】

【表12-7】

【表12-8】

【表12-9】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【配列表】

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【国際調査報告】