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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-16
(54)【発明の名称】ＭｎＯナノ材料による炎症及び癌転移の阻害剤
(51)【国際特許分類】
A61K 33/32 20060101AFI20241008BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20241008BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20241008BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20241008BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241008BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20241008BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20241008BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241008BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20241008BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20241008BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20241008BHJP
【ＦＩ】
A61K33/32
A61K9/14
A61P29/00
A61P37/02
A61P35/00
A61P17/02
A61P31/04
A61P43/00 111
A61P35/04
A61K47/54
A61K9/51
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024519808
(86)(22)【出願日】2022-09-30
(85)【翻訳文提出日】2024-05-14
(86)【国際出願番号】 US2022077427
(87)【国際公開番号】W WO2023056470
(87)【国際公開日】2023-04-06
(31)【優先権主張番号】63/250,311
(32)【優先日】2021-09-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/305,340
(32)【優先日】2022-02-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】306018457
【氏名又は名称】ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク
(71)【出願人】
【識別番号】506093452
【氏名又は名称】ニューサウス イノベーションズ ピーティーワイ リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100167689
【弁理士】
【氏名又は名称】松本 征二
(72)【発明者】
【氏名】レオング， カム ダブリュー
(72)【発明者】
【氏名】ズホング， イリング
【テーマコード（参考）】
4C076
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA12
4C076AA30
4C076AA65
4C076BB01
4C076BB11
4C076BB13
4C076BB15
4C076BB25
4C076CC04
4C076CC07
4C076CC18
4C076CC19
4C076CC27
4C076CC32
4C076CC41
4C076DD40
4C076DD60
4C076DD68
4C076EE59
4C086AA01
4C086AA02
4C086HA09
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA17
4C086MA38
4C086MA43
4C086MA52
4C086MA55
4C086MA59
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZA89
4C086ZB07
4C086ZB11
4C086ZB26
4C086ZB35
4C086ZC02
(57)【要約】
無細胞核酸（例えば、細胞外ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ及び非メチル化ＤＮＡ）を捕捉（結合）可能であるアニオン性酸化マンガンナノ粒子核酸スカベンジャーは、細胞毒性の低い生分解性アニオン性スカベンジャーであり、種々の病状に対する処置を提供する。スカベンジャーの主成分は、マンガン化合物（例えば、酢酸マンガン）及び酸（例えば、タンニン酸）を高温（例えば、１００～１５０℃）で用いることによって合成され得る酸化マンガンである。合成は、水中のマンガン化合物及び酸を混合して混合物を形成し、それを撹拌し、加熱し、冷却させることによって行われ得る。アニオン性酸化マンガンナノ粒子は、冷却した混合物から抽出される。得られたナノ材料の通常のサイズは３０～１００ｎｍの範囲であり、調製されたままのナノ材料のゼータ電位は約－２０ｍＶである。ナノ粒子は、炎症を処置し、又は癌を処置するための被検体への投与を含む種々の用途を有する。
【選択図】 図１
【選択図】 図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アニオン性酸化マンガンナノ粒子を含む核酸スカベンジャー。
【請求項2】
前記アニオン性酸化マンガンナノ粒子の平均粒子サイズは３０～１００ｎｍである、請求項１に記載の核酸スカベンジャー。
【請求項3】
核酸スカベンジャーを作製する方法であって、水中でマンガン化合物及び酸を混合して混合物を形成するステップと、
前記混合物を撹拌するステップと、
前記混合物を熱処理するステップと、
前記混合物を冷却するステップと、
冷却した前記混合物からアニオン性酸化マンガンナノ粒子を抽出するステップと、
を備える核酸スカベンジャーを作製する方法。
【請求項4】
前記マンガン化合物は、酢酸マンガンを含む、請求項３に記載の核酸スカベンジャーを作製する方法。
【請求項5】
前記酸は、タンニン酸を含む、請求項４に記載の核酸スカベンジャーを作製する方法。
【請求項6】
前記混合物における前記タンニン酸に対する前記酢酸マンガンの質量比は１：２～６である、請求項５に記載の核酸スカベンジャーを作製する方法。
【請求項7】
前記混合物を撹拌する前記ステップは、前記混合物を室温で１０分間撹拌するステップを備える、請求項３に記載の核酸スカベンジャーを作製する方法。
【請求項8】
前記混合物を熱処理する前記ステップは、前記混合物をオートクレーブ中で２時間加熱するステップを備える、請求項３に記載の核酸スカベンジャーを作製する方法。
【請求項9】
前記混合物を冷却する前記ステップは、前記混合物を５０℃未満の温度まで冷却するステップを備える、請求項３に記載の核酸スカベンジャーを作製する方法。
【請求項10】
クルクミンを有するアニオン性酸化マンガンナノ粒子を含むｃｆＤＮＡスカベンジャー。
【請求項11】
前記クルクミンを有する前記アニオン性酸化マンガンナノ粒子は、ヨウ化ＩＲ７８０でさらに修飾される、請求項１０に記載のｃｆＤＮＡスカベンジャー。
【請求項12】
ＭｎＯナノ粒子を作製する方法であって、マンガン化合物、酸及び溶媒を混合して混合物を作製するステップと、
前記混合物を９０℃～１７５℃の温度まで少なくとも１時間加熱するステップと、
前記混合物を少なくとも５０℃まで冷却するステップと、
を備えるＭｎＯナノ粒子を作製する方法。
【請求項13】
前記マンガン化合物は、酢酸マンガンを含む、請求項１２に記載のＭｎＯナノ粒子を作製する方法。
【請求項14】
前記酸は、タンニン酸を含む、請求項１３に記載のＭｎＯナノ粒子を作製する方法。
【請求項15】
前記溶媒は、水を含む、請求項１４に記載のＭｎＯナノ粒子を作製する方法。
【請求項16】
被検体における炎症を処置する方法であって、請求項１、２、１０及び１１のいずれか一項に記載の核酸スカベンジャーの治療上有効量の前記被検体への投与を備える方法。
【請求項17】
被検体における炎症を処置する方法であって、請求項３から９及び１３から１５のいずれか一項に記載の方法から結果として得られる前記核酸スカベンジャーの治療上有効量の前記被検体への投与を備える方法。
【請求項18】
前記核酸スカベンジャーは、ＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子を含む、請求項１６及び１７のいずれかに記載の方法。
【請求項19】
被検体における炎症の処置のための医薬品の製造における、請求項１、２、１０及び１１のいずれか一項に記載の核酸スカベンジャーの使用。
【請求項20】
被検体における炎症の処置のための医薬品の製造における、請求項３から９及び１３から１５のいずれか一項に記載の方法から結果として得られる前記核酸スカベンジャーの使用。
【請求項21】
前記核酸スカベンジャーは、ＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子を含む、請求項１９及び２０のいずれかに記載の使用。
【請求項22】
請求項１、２、１０及び１１のいずれか一項に記載の核酸スカベンジャーを含む薬学的組成物。
【請求項23】
請求項１、２、１０及び１１のいずれか一項に記載の核酸スカベンジャーを含む薬学的組成物。
【請求項24】
前記核酸スカベンジャーは、ＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子を含む、請求項２２及び２３のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項25】
前記核酸スカベンジャーは、ｃｆＤＮＡを効果的に捕捉又は結合して前記被検体における炎症応答を緩和する、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記核酸スカベンジャーは、ｃｆＤＮＡを効果的に捕捉又は結合して前記被検体における炎症応答を緩和する、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項27】
前記組成物が被検体に投与される場合、前記組成物はｃｆＤＮＡを効果的に捕捉又は結合して炎症応答を緩和する、請求項２２から２４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項28】
前記炎症は、自己免疫疾患、癌、外傷又は敗血症に起因する、請求項１６及び１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記炎症は、核酸含有ＤＡＭＰ／ＰＡＭＰによるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）シグナル伝達の活性化に起因する、請求項１６から１８及び２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記被検体における１個以上の核酸感知ＴＬＲの活性化を防止する請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記１個以上の核酸感知ＴＬＲは、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９及び／又はＴＬＲ４を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記被検体におけるＴＬＲ寛容単球の発生を防止する請求項２９から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
サイトカインストームの発生を防止する請求項１６から１８、２５及び２８から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
前記ＭｎＯナノ粒子は、経口的、経鼻的又は局所的に投与される、請求項１６から１８、２５及び２８から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記ＭｎＯナノ粒子は、静脈内、腹腔内又は筋肉内に投与される、請求項１６から１８、２５及び２８から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
被検体における癌を処置する方法であって、請求項１、２、１０及び１１のいずれか一項に記載の方法から結果として得られる前記核酸スカベンジャーの治療上有効量の前記被検体への投与を備える方法。
【請求項37】
被検体における癌を処置する方法であって、請求項３から９及び１３から１５のいずれか一項に記載の方法から結果として得られる前記核酸スカベンジャーの治療上有効量の前記被検体への投与を備える方法。
【請求項38】
前記投与は、前記癌の転移を制限するのに役立つ、請求項３６及び３７のいずれかに記載の方法。
【請求項39】
前記核酸スカベンジャーは、アポトーシス性又はネクローシス性の癌細胞によって放出されたｃｆＤＮＡを結合する、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
ここに記載及び図示される全て。
【請求項41】
ここに提供される情報において明示的又は暗示的に示され及び／又は記載される、当業者には明らかであり及び／又は理解され得る特徴に限定されることなく含む、いずれか及び全ての方法、処理、装置、システム、キット、生成物、材料、組成物及び／又は使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年９月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／２５０，３１１号及び２０２２年２月１日に出願された米国仮特許出願第６３／３０５，３４０号の優先権を主張し、それらの内容がそれらの全体において参照により取り込まれる。
本出願は、２０２１年９月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／２５０，３１１号及び２０２２年２月１日に出願された米国仮特許出願第６３／３０５，３４０号の優先権を主張し、それらの内容がそれらの全体において参照により取り込まれる。
【0002】
連邦政府支援研究に関する声明
本発明は、米国陸軍医学研究（ＵＳＡＭＲ）よって授与された助成金番号Ｗ８１ＸＷＨ１９１０４６３及び国立衛生研究所よって授与された助成金番号Ｒ０１ＡＲ０７３９３５の元で政府支援により行われた。政府は本発明において特定の権利を有する。
本発明は、米国陸軍医学研究（ＵＳＡＭＲ）よって授与された助成金番号Ｗ８１ＸＷＨ１９１０４６３及び国立衛生研究所よって授与された助成金番号Ｒ０１ＡＲ０７３９３５の元で政府支援により行われた。政府は本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【0003】
損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）及び病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）は、細胞ストレス又は組織傷害に応じて放出され、内因性の危険シグナルとして機能する分子である。ＤＡＭＰ及びＰＡＭＰは、自然免疫系を活性化することによって強力な炎症応答を開始するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）などのパターン認識受容体によって検出される。炎症は、傷害、疾患及び感染に対する身体の健常応答の重要な部分である。一方で、ＴＬＲの過剰活性化は、最終的に免疫恒常性の崩壊をもたらし、したがって、炎症性疾患及び自己免疫疾患のリスクを増大させ得る。したがって、ＴＬＲ媒介性炎症を制御する方法は、多くの疾患の処置に役立つことになる。
【0004】
そのような疾患の１つがＣＯＶＩＤ－１９であり、それは重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のウイルスによって引き起こされる感染症である。ＣＯＶＩＤ－１９の症状は、上気道感染症の軽度の症状から、人工呼吸器又は体外式膜型人工肺を必要とする急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）及び呼吸不全にまで及ぶ。集中治療室（ＩＣＵ）の患者などの疾患スペクトルの末期にある患者は、急速に悪化することがあり、死亡リスクが高い。これらのような転帰不良の根底には、肺傷害及びＡＲＤＳの発生及び進行に寄与する過剰炎症応答がある。
【0005】
ワクチン及び抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２モノクローナル抗体による治療は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して有効であることが示されている。しかし残念なことに、全ての利用可能なワクチン及び治療は、最も突然変異しやすいウイルスの領域である同一のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を標的とする。ワクチンの接種ができない又は接種を望まない人々の集団が存在するために、この集団がウイルスの新規変異体の繁殖場として作用し、我々は、新しいブースターワクチン及び治療を継続的に開発及び配布してこれらの変異体を抑制する必要がある。したがって、より普遍的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染の伝播及び重症化を制限するアプローチが必要である。
【0006】
近年、研究者らは、可溶性カチオン性核酸結合ポリマー（ＮＡＢＰ）及びＮＡＢＰによるナノ粒子が、ｃｆＤＮＡ及び関連する脂質／タンパク質複合体を捕捉することによってＴＬＲ９活性化を低下させて敗血症、外傷及び関節リウマチ（ＲＡ）を治療し、膵臓癌及び乳癌転移を減少させ得ることを実証した。一方で、アミン末端デンドリマーは、マウス及びラットにおいて、血小板を活性化し、致死的な播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）様状態を引き起こすことが示されている。カチオン性ＮＡＢＰ及びナノ粒子の潜在的な全身性の細胞毒性は、それらの臨床的な使用を制限することになる。したがって、効果的及び安全なｃｆＤＮＡスカベンジャーは、未だに見出されておらず、利用されていない。
【0007】
カチオン性ナノ粒子と比較して、中性及び負の表面電荷を有するナノ粒子は、血清タンパク質の低い吸着を示し、結果としてより長い循環半減期をもたらす。より重要なこととして、研究は、ＺｎＯ、シリカ、シリカ－チタニア中空体及び金ナノ粒子などの正に帯電したナノ粒子は、非貪食細胞において、それらの負の、さらには中性の対応物より毒性が強いことを実証した。したがって、ｃｆＤＮＡを捕捉する負の表面電荷を有するアニオン性ナノ粒子を利用して炎症応答を効果的かつ安全に緩和することが望ましい。したがって、前述の問題を解決するアニオン性酸化マンガンナノ粒子核酸スカベンジャー及びその使用方法が望まれる。
【0008】
本開示は、炎症の処置及び癌転移の制限に関し、特に、核酸及びｃｆＤＮＡスカベンジャーとしてのアニオン性酸化マンガンナノ粒子の開発及び使用に関する。
【発明の概要】
【0009】
第１の態様において、本発明は、ここに記載されるようにアニオン性ＭｎＯナノ粒子を含む核酸スカベンジャーを提供する。
【0010】
第２の態様において、本発明は、被検体における炎症を軽減又は阻害する方法を提供する。本方法は、ここに記載されるＭｎＯナノ粒子を被検体に投与するステップを備える。
【0011】
第３の態様において、本発明は、癌を処置して被検体における転移を制限するのに役立つ方法を提供する。本方法は、ここに記載されるＭｎＯナノ粒子を被検体に投与するステップを備える。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図3B】図３Ｂは、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で処置したＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ３細胞及び未処置サンプルについて、アゴニスト誘導性Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）活性化のＭｎＯナノ粒子による阻害を比較するグラフである。
【図5C】図５Ｃは、ＮＩＲレーザー照射の存在下及び非存在下でのＭｎＯ＠クルクミン＠ＩＲ７８０ナノ粒子の４Ｔ１細胞に対する細胞毒性のグラフである。生存細胞をカルセイン－ＡＭで緑色に染色し、死滅／後期アポトーシス細胞をＰＩで赤色に染色した。
【図5E】図５Ｅは、ＭｎＯナノ粒子、ＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子、クルクミン及び異なるナノ粒子でのタンニン酸のＤＮＡ結合親和性を比較するグラフであり、１０％のＦＢＳを含むＴＥ緩衝液中のＤＮＡ質量比である。
【図5F】図５Ｆは、ＲＡＷ２６４．７細胞によるＭｎＯナノ粒子の内在化並びにリソソームにおけるＣｙ３標識ＭｎＯナノ粒子及びＣｙ５標識シトシン－リン酸－グアノシンオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ）の共局在化の共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）画像を示す（スケールバー：１０μｍ）。
【図6A】図６Ａは、２４時間にわたってＦＢＳ無し（すなわち、未処置（ＵＴ））の、ＣｐＧに対して異なる質量比での、ＭｎＯナノ粒子、ＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子及びクルクミンによるＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞の活性化を比較するグラフである。
【図6B】図６Ｂは、２４時間にわたってＦＢＳ無し（すなわち、未処置（ＵＴ））の、ポリ（Ｉ：Ｃ）に対して異なる質量比での、ＭｎＯナノ粒子、ＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子及びクルクミンによるｈＴＬＲ９細胞の活性化を比較するグラフである。
【図6C】図６Ｃは、２４時間にわたってＦＢＳ無し（すなわち、未処置（ＵＴ））の、リポ多糖（ＬＰＳ）に対して異なる質量比での、ＭｎＯナノ粒子、ＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子及びクルクミンによるｈＴＬＲ３細胞の活性化を比較するグラフである。
【図6D】図６Ｄは、２４時間にわたってＦＢＳ存在下で、ＣｐＧに対して異なる質量比での、ＭｎＯナノ粒子、ＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子及びクルクミンによるＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞の活性化を比較するグラフである。
【図6L】図６Ｌは、２４時間の異なる処方（＃１：５０μｇ／ｍｌ、＃２：１００μｇ／ｍｌ）でのインキュベーション後の骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）におけるＣＤ８６（Ｍ１マクロファージマーカー）発現のフローサイトメトリー分析を示す。
【図6M】図６Ｍは、ＣｐＧ、ＣｐＧ及びクルクミン、ＣｐＧ及びＭｎＯナノ粒子並びにＣｐＧ及びＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子で処置した細胞に対して未処置（ＵＴ）細胞を比較する、トランスウェルアッセイを用いて評価したＣｐＧ活性化の阻害を示す。
【図6N】図６Ｎは、ＬＰＳ、ＬＰＳ及びクルクミン、ＬＰＳ及びＭｎＯナノ粒子並びにＬＰＳ及びＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子で処置した細胞に対して未処置（ＵＴ）細胞を比較する、トランスウェルアッセイを用いて評価したＬＰＳ活性化マクロファージ誘導性マクロファージ遊走を示す。
【図9A】図９Ａは、ＰＢＳ、ＭｎＯナノ粒子、クルクミン、ＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子、レーザー処置、クルクミンと組み合わせたレーザー処置、ＭｎＯナノ粒子と組み合わせたレーザー処置及びＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子と組み合わせたレーザー処置で処置したマウスの体重を比較するグラフである。
【図9B】図９Ｂは、ＰＢＳ、ＭｎＯナノ粒子、クルクミン、ＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子、レーザー処置、クルクミンと組み合わせたレーザー処置、ＭｎＯナノ粒子と組み合わせたレーザー処置及びＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子と組み合わせたレーザー処置で処置したマウスの腫瘍体積を比較した一連のグラフである。
【図9C】図９Ｃは、ＰＢＳ、ＭｎＯナノ粒子、クルクミン、ＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子、レーザー処置、クルクミンと組み合わせたレーザー処置、ＭｎＯナノ粒子と組み合わせたレーザー処置及びＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子と組み合わせたレーザー処置で処置したマウスのＩＶＩＳ（登録商標）画像を示す。
【図9D】図９Ｄは、ＰＢＳ、ＭｎＯナノ粒子、クルクミン、ＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子、レーザー処置、クルクミンと組み合わせたレーザー処置、ＭｎＯナノ粒子と組み合わせたレーザー処置及びＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子と組み合わせたレーザー処置で処置したマウスからの摘出腫瘍の画像を示す。
【図9H】図９Ｈは、ＰＢＳ、ＭｎＯナノ粒子、クルクミン、ＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子、レーザー処置、クルクミンと組み合わせたレーザー処置、ＭｎＯナノ粒子と組み合わせたレーザー処置及びＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子と組み合わせたレーザー処置で処置したマウスの生存率を比較するグラフである。
【図10】図１０は、集中治療室（ＩＣＵ）においてデキサメタゾン有り及び無しでの、ＣＯＶＩＤ－１９死亡患者と対比した回復患者の血液中の免疫細胞サブセットのプロファイリングを示す。免疫細胞サブセットのデータを、研究の最終日における全白血球（ＴＬ）又は全単球（ＴＭ）の割合として示す。網掛け領域は、各免疫細胞サブセットの正常範囲を強調している。Ａ．ＣＤ３＋Ｔ細胞の割合は、臨床状況にかかわらずリンパ球減少と一致し、デキサメタゾン（＋）はデキサメタゾン（－）より低い傾向にある。Ｂ．ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合は全Ｔ細胞と一致する。Ｃ．ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び全Ｔ細胞と一致する。Ｄ．ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の割合は、臨床状況又はデキサメタゾン状況にかかわらず、正常範囲を下回る。Ｅ．ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞の割合は、臨床状況にかかわらず、デキサメタゾン（－）患者において正常範囲より高い。デキサメタゾン（＋）患者は、正常範囲に近いＮＫＴ細胞の割合を有し、退院患者は死亡患者より高い傾向にある。Ｆ．Ｂ細胞の割合は、臨床状況又はデキサメタゾン状況にかかわらず、正常範囲を下回る。Ｇ．好中球の割合は、臨床状況又はデキサメタゾン状況にかかわらず、正常範囲を上回る。Ｈ．回復患者の中では、好酸球はデキサメタゾン（－）において正常範囲より高く、デキサメタゾン（＋）において正常範囲内であり、このパターンは、死亡患者の中では逆転する。Ｉ．好塩基球の割合は、臨床状況又はデキサメタゾン状況にかかわらず、正常範囲内である。Ｊ．全単球の割合は、臨床状況又はデキサメタゾン状況にかかわらず、正常範囲内である。Ｋ．ＣＤ１６－単球の割合は、デキサメタゾン（＋）患者において臨床転帰にかかわらずほぼ同等である一方で、ＣＤ１６－単球の割合は、デキサメタゾン（－）患者において、死亡患者と対比して退院患者においてより低い傾向にある。Ｌ．ＣＤ１６＋単球の割合は、デキサメタゾン（＋）患者において臨床転帰にかかわらずほぼ同等である一方で、ＣＤ１６＋単球の割合は、デキサメタゾン（－）患者において、死亡患者と対比して退院患者において有意に高い。＊はｐ＜０．０５であり、ｎｓは両側ｔ検定を介して有意差無しであり、図に示されない限り統計上の有意差は見られなかった。
【図11】図１１は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）３、４、７及び９についてＨＥＫ－ＴＬＲレポーター細胞を用いた、ＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者からの血清及び気管内吸引液（ＥＴＡ）の縦断的ＴＬＲ活性化プロファイリングを示す。Ａ．ＣＯＶＩＤ－１９患者の血清を用いたＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９活性化の縦断的プロファイリングは、以下の、（１）全ての時点にわたる血清によるＴＬＲ３及びＴＬＲ７の強力な活性化、（２）１日目、３日目、１４日目及び２１日目の血清によるＴＬＲ４の活性化並びに（３）３日目、１４日目及び２１日目の血清によるＴＬＲ９の活性化を示す。Ｂ．ＣＯＶＩＤ－１９患者の血清及びＥＴＡは、正常な血清と比較してＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９を有意に活性化する。＊は両側ｔ検定を介してｐ＜０．０５であり、＊＊＊は両側ｔ検定を介してｐ＜０．００１であり、＊＊＊＊は両側ｔ検定を介してｐ＜０．０００１であり、ｎｓは両側ｔ検定を介して有意差無しであり、Ｄは日数であり、ｄｉｌは希釈である。
【図12】図１２は、ＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者からの血清及びＥＴＡを核酸結合マイクロ繊維で処置することは、ＴＬＲ活性化損傷関連分子パターン及び病原体関連分子パターン（ＤＡＭＰ／ＰＡＭＰ）の活性及び量を減少させることを示す。核酸結合繊維による血清の処置は、Ａ．ＴＬＲ３、Ｂ．ＴＬＲ４、Ｃ．ＴＬＲ７及びＤ．ＴＬＲ９に対するＨＥＫ－ＴＬＲレポーター細胞のＴＬＲ活性化を有意に減少させる。核酸結合繊維によるＥＴＡの処置は、Ｅ．ＴＬＲ３、Ｆ．ＴＬＲ４、Ｇ．ＴＬＲ７及びＨ．ＴＬＲ９に対するＨＥＫ－ＴＬＲレポーター細胞のＴＬＲ活性化を有意に減少させる。核酸結合繊維による血清の処置は、Ｉ．ＤＮＡ、Ｊ．ＲＮＡ、Ｋ．ヌクレオソーム及びＬ．ＨＭＧＢ－１のレベルを有意に減少させる。核酸結合繊維によるＥＴＡの処置は、Ｍ．ＤＮＡ、Ｎ．ＲＮＡ、Ｏ．ヌクレオソーム及びＰ．ＨＭＧＢ－１のレベルを有意に減少させる。Ｑ．核酸結合繊維による血清の処置は、アルブミンレベルをわずかに減少させる。Ｒ．核酸結合繊維によるＥＴＡの処置は、アルブミンレベルに影響しない。＊は両側ｔ検定を介してｐ＜０．０５であり、＊＊＊は両側ｔ検定を介してｐ＜０．００１であり、＊＊＊＊は両側ｔ検定を介してｐ＜０．０００１であり、ＮＳは両側ｔ検定を介して有意差無しである。
【図13】図１３は、プロテオミクスを用いた、死亡患者における骨髄活性化及びＰＡＭＰの担体消費を示す。Ａ．生存者に対する死亡患者において差次的に上方制御されたプロテオームの（ｐ＜０．０５に調整済みの）有意なパスウェイの類似性クラスタリングである。Ｂ．差次的に上方制御されたプロテオーム及びそれらの優勢的パスウェイの骨髄関連免疫相互作用の高信頼度（信頼度０．９超）ＳＴＲＩＮＧネットワークである。Ｃ．全感染患者についての平均値に対して差次的に上方制御（赤色）及び下方制御（青色）される免疫関連タンパク質の、非感染コントロール（右のバー）と比較したそれらのレベルによって順序付けられた経時的な発現ヒートマップである。Ｄ．差次的に下方制御されるプロテオーム及び優勢的パスウェイのタンパク質相互作用についての高信頼度（信頼度０．９超）ＳＴＲＩＮＧネットワークである。Ｅ．差次的に発現するタンパク質ヒットについての動向及び有意な時点値による時系列プロットである。
【図14】図１４は、酸化マンガン（ＭｎＯ）ナノ粒子が、アゴニスト媒介性ＴＬＲ活性化を阻害することを示す。ＭｎＯナノ粒子は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）非存在下又は存在下で２４時間のナノ材料処置後、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ３（左）、ｈＴＬＲ８（中）及びｈＴＬＲ９（右）細胞の活性化を用量依存的に阻害する。実験は、反復して行われた（Ｎ＝３）。データをバー±ＳＥＭとして示す。全てのアゴニストを、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社から購入した。ＯＲＮは、ＯＲＮ０６／ＬｙｏＶｅｃをいう。
【図15】図１５は、ＭｎＯナノ粒子が、ＣＯＶＩＤのＥＴＡ及び血清中のＴＬＲ活性化ＰＡＭＰ／ＤＡＭＰの活性を減少させ、単球におけるＤＡＭＰ／ＰＡＭＰ媒介性ＴＬＲ寛容を防止することを示す。Ａ．ＭｎＯナノ粒子は、ＴＬＲレポーター細胞アッセイにおいて、ＣＯＶＩＤ－１９血清によるＴＬＲ３、４、７及び９の刺激を有意に減少させる。Ｂ．ＭｎＯナノ粒子は、ＴＬＲレポーター細胞アッセイにおいて、ＣＯＶＩＤ－１９ＥＴＡによるＴＬＲ３、４、７及び９の刺激を有意に減少させる。Ｃ．新たに単離した単球を、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ｐｏｌｙＩ：Ｃ、二本鎖ウイルスＲＮＡ ＤＡＭＰ模倣体）の有り又は無しで２４時間処置し、続けてリポ多糖（ＬＰＳ、細菌ＤＡＭＰ模倣体）の有り又は無しで５時間処置を行い、その後、細胞上清を採取し、ＩＬ－６のレベルを定量した。ＭｎＯナノ粒子での処置は、順次的なＴＬＲ刺激に応じた単球によるＩＬ－６産生を有意に減少させた。＊＊は両側ｔ検定を介してｐ＜０．０１であり、＊＊＊＊は両側ｔ検定を介してｐ＜０．０００１である。
【発明を実施するための形態】
【0013】
組成物
アニオン性酸化マンガンナノ粒子核酸スカベンジャーは、無細胞核酸（例えば、細胞外ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ及び非メチル化ＤＮＡ）を捕捉又は結合可能である細胞毒性の低い生分解性アニオン性スカベンジャーであり、炎症に対抗し、癌転移を制限するための処置として使用され得る。ＭｎＯナノ粒子の主成分は、マンガン化合物及び酸を高温で組み合わせることによって合成され得る酸化マンガンである。酸化マンガンの合成は、溶媒中でマンガン化合物及び酸を少なくとも１分間混合して混合物を形成し、そして、それを撹拌し、約９０～１７５℃の温度で少なくとも１時間加熱し、そして、自然冷却することによって行われ得る。そして、アニオン性酸化マンガンナノ粒子を冷却した混合物から抽出する。例えば、本発明者らは、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）超純水中で酢酸マンガン及びタンニン酸を１：２～６の質量比で、室温で１０分間混合し、混合物を１５０℃で２時間加熱し、そして、それを５０℃未満まで自然冷却することによって、彼らのＭｎＯナノ粒子を調製した。得られたナノ材料の通常のサイズは、図１に示すように３０～１００ｎｍの範囲であり、調製されたままのナノ材料のゼータ電位は約－２０ｍＶである。
アニオン性酸化マンガンナノ粒子核酸スカベンジャーは、無細胞核酸（例えば、細胞外ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ及び非メチル化ＤＮＡ）を捕捉又は結合可能である細胞毒性の低い生分解性アニオン性スカベンジャーであり、炎症に対抗し、癌転移を制限するための処置として使用され得る。ＭｎＯナノ粒子の主成分は、マンガン化合物及び酸を高温で組み合わせることによって合成され得る酸化マンガンである。酸化マンガンの合成は、溶媒中でマンガン化合物及び酸を少なくとも１分間混合して混合物を形成し、そして、それを撹拌し、約９０～１７５℃の温度で少なくとも１時間加熱し、そして、自然冷却することによって行われ得る。そして、アニオン性酸化マンガンナノ粒子を冷却した混合物から抽出する。例えば、本発明者らは、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）超純水中で酢酸マンガン及びタンニン酸を１：２～６の質量比で、室温で１０分間混合し、混合物を１５０℃で２時間加熱し、そして、それを５０℃未満まで自然冷却することによって、彼らのＭｎＯナノ粒子を調製した。得られたナノ材料の通常のサイズは、図１に示すように３０～１００ｎｍの範囲であり、調製されたままのナノ材料のゼータ電位は約－２０ｍＶである。
【0014】
代替の実施形態では、ＭｎＯ ＮＰは、マンガン化合物、酸及び溶媒から作製されてもよく、マンガン化合物及び任意の適切なタイプの酸を溶媒と少なくとも１分間混合し、そして、約９０℃～約１７５℃の範囲の温度で少なくとも１時間加熱し、そして、少なくとも５０℃まで自然冷却する。酸化マンガンを作製するのに適したマンガン化合物は、限定されることなく、リン酸マンガン、酸化マンガン、酢酸マンガン、硫化マンガン、二酸化マンガン、七酸化マンガン、塩化マンガン、炭酸マンガンなどを含む。
【0015】
ＭｎＯナノ粒子の炎症誘発性分子捕捉能力は、ＭｎＯナノ粒子の表面リガンド、すなわちタンニン酸に由来するはずである。酸については、我々は、ＤＮＡ結合親和性を有するフェノール酸を用いてもよい。したがって、適切な酸は、例えば、タンニン酸、エラグ酸、没食子酸及びタンニン酸の他の誘導体などのフェノール酸を含む。
【0016】
溶媒は、マンガン化合物及び酸を完全に溶解する必要がある。適切な溶媒は、例えば、単独又は任意の組合せで、水、エタノール又はメタノールを含む。
【0017】
さらに、マンガン化合物、酸及び溶媒の混合は、マンガン化合物及び酸が溶媒に完全に溶解し、よく混合される限り、例えば、０．５分～５分など、任意の適切な期間にわたって行われ得ることが理解されるべきである。
【0018】
ＭｎＯナノ粒子は、およそ５ｎｍ～１２５ｎｍを範囲とするサイズ、約０．５：１～７及び１：２～６を範囲とするマンガン化合物の酸に対する質量比並びに／又は約－５ｍＶ～－３０ｍＶを範囲とするゼータ電位を有し得る。例えば、本発明者らによって生成されたＭｎＯナノ粒子は、約３０～１００ｎｍのサイズを有し（図１）、約－２０ｍＶのゼータ電位を有する。
【0019】
より詳細に以下に説明するように、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのＭｎＯナノ粒子の抗炎症治療活性を、（１）ｃｆＤＮＡ誘導性ＴＬＲ活性化及び核因子カッパーＢ（ＮＦ－ｋＢ）シグナル伝達を阻害する、炎症性無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を結合及び捕捉、（２）活性化マクロファージ誘導性マクロファージ動員の阻害及び（３）腫瘍細胞の遊走及び浸潤の阻害、の３つの作用機序に焦点を当てて特徴付けた。
【0020】
研究者らは、可溶性カチオン性核酸結合ポリマー（ＮＡＢＰ）及びＮＡＢＰによるナノ粒子はｃｆＤＮＡ及び関連する脂質／タンパク質複合体を捕捉することによって、ＴＬＲ９活性化を低下させるように使用可能であることを実証した。一方で、近年、マウス及びラットにおいて、アミン末端デンドリマーが血小板を活性化し、致死的な播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）様状態を引き起こすことが示された。したがって、ＮＡＢＰの潜在的な細胞毒性は、それらの臨床的な使用を制限し得る。図２では、本発明者らは、ＭｎＯナノ粒子は核酸結合カチオン性ポリマーＰＡＭＡＭ－Ｇ３よりも細胞毒性が低いことを実証した（図２）。細胞毒性を、ＭＴＳアッセイを用いて評価した。このアッセイを行うために、ＲＡＷ２６４．７細胞を９６ウェルプレートに１×１０４個／ウェルの密度で播種し、３７℃、５％のＣＯ２で成長培地中で一晩接着させた。細胞を、種々の濃度でのＭｎＯナノ粒子又はＰＡＭＡＭ－Ｇ３で２４時間処置した。そして、培地を１０％のＭＴＳを含有する１００μＬの培地と交換し、細胞生存能力を、マルチウェルプレートリーダーを用いて４９０ｎｍのＯＤを測定して決定した。
【0021】
図３Ａでは、本発明者らは、ＭｎＯナノ粒子がＤＮＡに対して強い親和性を有することを実証する。このデータは、１２．５μＬのＱｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）及び２５μＬの５ｍｇ／ｍＬの子牛胸腺ＤＮＡを１×Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液と暗所で混合するＤＮＡ結合アッセイを用いて生成された。１００μＬの異なる濃度のＭｎＯナノ粒子を１００μＬの上記溶液と組み合わせ、９６ウェルブラックプレートに添加し、３７℃で３０分間インキュベーションした。非結合のＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）－ＤＮＡ複合体の５２０ｎｍでの蛍光強度を、４９０ｎｍでの励起を介してマルチウェルプレートリーダーで測定した。本発明者らは、それらの正味の負の表面電荷にもかかわらず、ＭｎＯナノ粒子が市販のスカベンジャーポリマーＰＡＭＡＭ－Ｇ３のものと同等の高いＤＮＡ結合親和性を示すことを見出した。
【0022】
ＭｎＯ ＮＰは、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を捕獲して細胞内アゴニスト誘導性ＴＬＲ活性化を阻害するのに使用され得る。我々は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ３（図３Ｂ）、ｈＴＬＲ８（図３Ｃ）及びｈＴＬＲ９（図３Ｄ）を含む広範囲のＴｏｌｌ様受容体細胞（ＴＬＲ）においてＭｎＯ ＮＰを検証した。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ３、ｈＴＬＲ８及びｈＴＬＲ９細胞を、ＨＥＫ２９３細胞にｈＴＬＲ遺伝子及び最適化された分泌型胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子をコトランスフェクションすることによって得た。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ細胞を、１０％のＦＢＳ及び１％のペニシリン－ストレプトマイシンを有するＤＭＥＭ中で培養及び維持した。ＴＬＲ活性化を阻害するＭｎＯナノ粒子の能力を評価するため、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ細胞を９６ウェルプレートに１時間播種し、そして、２μＬのアゴニスト（ＴＬＲ９に対してＣＰＧ Ｂｗ００６、ＴＬＲ３に対してポリ（Ｉ：Ｃ）、ＴＬＲ８に対してＯＲＮ０６／Ｌｙｏ Ｖｅｃであり、１ｍｇ／ｍＬ）で処置した。１０分間のインキュベーション後、２０μＬの異なる濃度でのＭｎＯナノ粒子を２００μＬの最終容量で導入した。２４時間後、上清を採取し、Ｑｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ（商標）と混合した。ＳＥＡＰ活性に関連するＴＬＲ活性化を、マルチウェルプレートリーダーで６２０ｎｍでのＯＤを測定することによって特定した。用いた（９６ウェルプレート中の）細胞密度は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ９細胞に対して８×１０４個／ウェル、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ３細胞に対して５×１０４個／ウェル及びＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ８細胞に対して４×１０４個／ウェルであった。本発明者らは、ＭｎＯナノ粒子が、ＦＢＳの存在又は非存在にかかわらず、用量依存的に、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ９細胞のＣｐＧ誘導性活性化を阻害し、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ３細胞のポリ（Ｉ：Ｃ）誘導性活性化を阻害し、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ８細胞のＯＲＮ０６／Ｌｙｏ Ｖｅｃ（ＯＲＮ）誘導性活性化を阻害することを見出した。
【0023】
一実施形態では、負の表面電荷を有するアニオン性ＭｎＯナノ粒子は、ｃｆＤＮＡを捕捉又は結合して光温熱治療（ＰＴＴ）によって引き起こされる炎症応答などの炎症応答を効果的かつ安全に緩和するのに用いられる。ＰＴＴは、近赤外（ＮＩＲ）光吸収剤を利用して光エネルギーを熱アブレーションのための熱に変換する、病状を処置する方法である。それは、低侵襲かつ高効率の癌の処置とみなされている。近赤外光の良好な制御性及び暗所での光温熱剤（ＰＴＡ）の無視することができる毒性により、ＰＴＴは正常組織に害を与えることなく腫瘍細胞を特異的に排除し得る。一方で、ＰＴＡによって誘導される異常高熱のため、ＰＴＴ後の最も可能性のある細胞死の様式は、原形質膜の破裂及びその後の細胞内容物の放出によって特徴付けられるネクローシスである。ネクローシスの間に放出されるＤＡＭＰ及びＰＡＭＰは、サイトカインストーム、多臓器不全及び死を引き起こし得る炎症反応を開始する。炎症性循環ｃｆＤＮＡ、すなわち損傷宿主細胞によって放出される核ＤＮＡ又はミトコンドリアＤＮＡは、そのようなＤＡＭＰの１つである。ＰＴＴによって誘導される炎症は、腫瘍の再生、転移性播種及び治療抵抗性を含む深刻な副作用を引き起こし得る。したがって、ＰＴＴによって引き起こされる炎症応答の効果的な緩和は、腫瘍処置に対して大きな意義がある。
【0024】
ここに用いられるように、被検体における炎症を処置するためなどの、ＭｎＯ ＮＰ又はＭｎＯ＠クルクミンＮＰを含む組成物又は薬学的組成物の治療上有効量の投与は、非経口又は経口経路による送達、筋肉内注入、皮下／皮内注入、静脈内注入、髄腔内投与、口腔投与、経皮送達、局所投与及び鼻腔又は気道経路による投与を限定されることなく含む、被検体における望ましい場所に送達するための任意の適切な経路によって、意図される被検体又は被検体の特定の細胞に物質を分配、送達又は適用することによって達成され得る。
【0025】
ＭｎＯナノ粒子の抗炎症効果を増加するために、それらをクルクミンと組み合わせて、以下「ＭｎＯ＠クルクミン」ナノ粒子といわれるものを形成し得る。クルクミンは、長年にわたって病状を処置するのに用いられている天然の抗炎症剤である。ＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子を近赤外（ＮＩＲ）色素であるヨウ化ＩＲ７８０で修飾して「ＭｎＯ＠クルクミン＠ＩＲ７８０」ナノ粒子を形成し得る。ヨウ化ＩＲ７８０は、レーザー照射の存在下で、ＰＴＴ及び光線力学的治療（ＰＤＴ）の効果を同時に達成するのに用いられることもあり、ＦＤＡによって臨床適用が承認されている。一方で、そのような光増感剤の疎水的な性質及び癌特異性の欠如は、それらの臨床適用を制限する。したがって、本発明者らは、優れた溶解性を有するＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子をヨウ化ＩＲ７８０のための担体として利用した。ＭｎＯ＠クルクミン＠ＩＲ７８０ナノ粒子は、病原性ｃｆＤＮＡスカベンジャー及び抗炎症剤としてＰＴＴに対して使用可能である。
【0026】
図４Ａに示すように、ＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子はＭｎＯナノ粒子（約５０ｎｍ）よりも大きい流体力学的サイズ（約１００ｎｍ）を示し、ＭｎＯ＠クルクミン＠ＩＲ７８０ナノ粒子はさらに大きかった（約２４０ｎｍ）。ＭｎＯ、ＭｎＯ＠クルクミン及びＭｎＯ＠クルクミン＠ＩＲ７８０ナノ粒子は全て負に帯電した表面及び約－２３ｍＶのゼータ電位を示した（図４Ｂ）。ＭｎＯ、ＭｎＯ＠クルクミン及びＭｎＯ＠クルクミン＠ＩＲ７８０ナノ粒子のＵＶ－ｖｉｓ吸収スペクトル、フォトルミネッセンス（ＰＬ）スペクトル及び写真を図４Ｃ及び４Ｄに示す。ＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子の吸収スペクトルは、ＭｎＯナノ粒子と比較して、約４３０ｎｍにクルクミンに起因する明らかなピークを示す。さらに、ＭｎＯ＠クルクミンのＰＬスペクトルは、約５５０ｎｍのλｍａｘでクルクミンの特徴的なＰＬピークを含む（図４Ｄ）。ＭｎＯ＠クルクミン＠ＩＲ７８０ナノ粒子は、広い吸収帯（約６００～８００ｎｍ）及びＩＲ７８０に帰属する約７８０ｎｍに明らかなＰＬピークを示し、ＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子におけるＩＲ７８０の修飾に成功したことを実証した。ＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子に対するＭｎＯ＠クルクミン＠ＩＲ７８０ナノ粒子の流体力学的サイズの増大はクルクミン（ＩＲ７８０）による機能化が成功したことを示唆し、これは色の変化及び変化した吸収／ＰＬスペクトルによってさらに証明された。
【0027】
抗ＰＴＴ誘導性炎症を軽減するＭｎＯ及びＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子の能力を評価するために、本発明者らはまず、ＭＴＳアッセイによってそれらのｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞毒性を調べた。結果は、ＭｎＯ及びＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子は、ＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージ細胞（図５Ａ）及び４Ｔ１細胞（図５Ｂ）に対して無視することができる細胞毒性を示すことを明らかにした。さらに、ＮＩＲレーザー照射の存在及び非存在におけるＭｎＯ＠クルクミン＠ＩＲ７８０ナノ粒子の４Ｔ１細胞に対する細胞毒性も研究した（図５Ｃ）。
【0028】
ＰＴＴ損傷宿主細胞によって放出される炎症性循環ｃｆＤＮＡは、ｃｆＤＮＡの捕捉によって軽減され得る深刻な炎症応答を引き起こし得る。したがって、種々のナノ粒子のｃｆＤＮＡ捕捉能力を調べるために、本発明者らは、非結合のＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）－標識ＤＮＡを測定することによって、１０％のＦＢＳの有り及び無しでのＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液におけるナノ粒子の子牛胸腺ＤＮＡ結合親和性を調べた（図５Ｄ及び５Ｅ）。図５Ｄ及び５Ｅに示すように、無視することができるクルクミンのＤＮＡ結合能力とは対照的に、以前の報告と一致して、遊離タンニン酸はＤＮＡに結合し得る。興味深いことに、ＭｎＯ及びＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子は、それらの正味の負の表面電荷にもかかわらず、それらのタンニン酸機能的リガンドに帰属する高いＤＮＡ結合親和性を示した。興味深いことに、ＭｎＯ及びＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子は、おそらくは比表面積の高いそれらのナノ構造に起因して、遊離タンニン酸より強いＤＮＡ結合能力を示した。ＤＮＡ結合能力は、血清タンパク質の競合的相互作用のため、全てのグループにおいて１０％のＦＢＳの添加で減少したが、この効果はＤＮＡに対するナノ材料の質量比を増加させることによって克服された。これらの結果は、ＭｎＯ及びＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子が、アポトーシス性及びネクローシス性の癌細胞によって放出されるｃｆＤＮＡを結合するスカベンジャーとして作用し得ることを実証する。
【0029】
ｃｆＤＮＡは、ＴＬＲ活性化を介して炎症応答を活性化し得る。具体的には、非メチル化ＣｐＧモチーフを有するｃｆＤＮＡ種（ここでは「ＣｐＧ ＤＮＡ」という）は、ＴＬＲ９を活性化し得る。ＴＬＲ９は、結果的に炎症誘発性パスウェイの上方制御となる、核因子カッパーＢ（ＮＦ－ｋＢ）に関与するシグナル伝達カスケードを開始する。したがって、本発明者らはナノ粒子を内在化させ、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｃｆＤＮＡ－ＴＬＲ相互作用をブロックするそれらの能力を評価した。図５Ｆ（上段）は、ＭｎＯ－Ｃｙ３ナノ粒子がＲＡＷ２６４．７細胞によって内在化され、エンドリソソーム内に局在化したことを実証し、ナノ粒子の細胞取り込み効率が高いことを実証する。Ｃｙ５－ＣｐＧ及びＭｎＯ－Ｃｙ３の蛍光シグナルの共局在化は、エンドリソソーム区画で観察され（図５Ｅの下段）、ナノ粒子が細胞に侵入し、エンドリソソーム区画中のｃｆＤＮＡを捕捉し得ることを示す。
【0030】
我々はさらに、ＨＥＫ－ＢｌｕｅヒトＴＬＲ（ｈＴＬＲ）細胞を用いることによって、炎症誘発性分子誘導性ＴＬＲ活性化のナノ粒子媒介性阻害を研究した。クルクミンは、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ９／３／４細胞において、アゴニスト誘導性活性化に対して無視することができる阻害効果を示した。これに対して、ＭｎＯ及びＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子は、ＦＢＳの存在又は非存在にかかわらず、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ９細胞のＣｐＧ誘導性活性化、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ３細胞のポリ（Ｉ：Ｃ）誘導性活性化及びＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ４細胞のＬＰＳ誘導性活性化を用量依存的に阻害し得る（図６Ａ～６Ｆ）。これに対して、クルクミンは、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ９／３／４のアゴニスト誘導性活性化を阻害できない。これらの結果は、ＭｎＯ及びＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子は、ｃｆＤＮＡ及びｃｆＲＮＡを阻害するだけでなく、ＬＰＳ誘導性ＴＬＲ活性化も阻害することを示す。
【0031】
ＴＬＲは、いくつかの炎症誘発性サイトカインの分泌を誘導する様々なＰＡＭＰ及びＤＡＭＰを認識する。ＴＬＲ活性化を阻害し、ＤＡＭＰ－ＴＬＲ相互作用をブロックすることは、ＰＴＴ誘導性炎症を緩和し、腫瘍の再生及び転移を減少させる有望な戦略である。ＣｐＧ Ｂｗ００６及びＬＰＳを用いて、ＲＡＷ２６４．７細胞においてそれぞれＴＬＲ９及びＴＬＲ４を活性化し、そして、ＭｎＯ及びＭｎＯ＠クルクミンの抗炎症効果をＴＮＦ－α及びＣＯＸ－２のレベルを測定することによって評価した。図６Ｇに示すように、ＣｐＧは、ＲＡＷ２６４．７細胞におけるサイトカインＴＮＦ－αの生成を、コントロール群（ＵＴ）のものと比べて大きく悪化させた。クルクミンは、サイトカインＴＮＦ－αの量を用量依存的にわずかに減少させた。これに対して、ＴＮＦ－α産生は、ＭｎＯ処置によって大きく軽減された。ＭｎＯ＠クルクミンは、ＴＮＦ－αのＣｐＧ誘導性ＲＡＷ２６４．７細胞放出を有意に阻害し、それは同一用量のクルクミンでは無修飾クルクミンのものよりもはるかに強力であった。増強された阻害効果は、ＭｎＯに起因した。ＲＡＷ２６４．７細胞に対するＬＰＳの効果は、ＣｐＧのものと同様であり、ＬＰＳはＴＮＦ－αの分泌を大きく増強し得る（図６Ｈ）。クルクミンは、ＬＰＳ誘導性ＲＡＷ２６４．７細胞によるＴＮＦ－α産生をわずかに減少させるのみであった。これに対して、ＭｎＯ及びＭｎＯ＠クルクミンは、ＴＮＦ－αの量を用量依存的に顕著に減少させ得た。さらに、ＲＴ－ｑＰＣＲの結果は、ＭｎＯ及びＭｎＯ＠クルクミンは、ＣｐＧ活性化及びＬＰＳ活性化ＲＡＷ２６４．７細胞においてＣＯＸ－２のｍＲＮＡ発現を緩和することを示した（図６Ｉ及びＪ）。無修飾クルクミンは、ＣｐＧ誘導性ＲＡＷ２６４．７細胞においてＣＯＸ－２のｍＲＮＡの生成をある程度まで緩和したが、ＬＰＳ誘導性ＲＡＷ２６４．７細胞によるＣＯＸ－２のｍＲＮＡの産生に対しては明らかな阻害効果がなかった（図６Ｋ）。これらの所見は、ＭｎＯ及びＭｎＯ＠クルクミンがＣｐＧ－ＴＬＲ／ＬＰＳ－ＴＬＲ相互作用をブロックし、さらにサイトカインＴＮＦ－α及びＣＯＸ－２のｍＲＮＡの発現を下方制御し、炎症誘発性分子のスカベンジャーとして作用してＰＴＴ誘導性炎症を緩和し、腫瘍再生及び転移を阻害し得ることを示した。さらに、我々は、ＦＡＣＳ分析によって証明されるように、ＭｎＯ及びＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子がＭ１表現型（炎症誘発性表現型）へのマクロファージ分極シフトを阻害することを示した（図６Ｌ）。
【0032】
炎症部位におけるマクロファージの集積は、炎症を悪化させる。光温熱癌治療において、活性化マクロファージ誘導性マクロファージ動員を減少させることは、ＰＴＴ誘導性炎症を緩和する１つの態様である。図６Ｍ及び６Ｎに示すように、ＣｐＧ Ｂｗ００６活性化及びＬＰＳ活性化ＲＡＷ２６４．７マクロファージによって放出される誘引物質は、トランスウェルチャンバーの上側から下側への多数のマクロファージの動員をもたらす走化性を誘導した。ＭｎＯ及びＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子の添加は、マクロファージの遊走を大きく減少させることを示し、ＭｎＯ及びＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子は、マクロファージが活性化されると、活性化マクロファージ誘導性マクロファージ遊走を阻害し得ることを実証した。
【0033】
大多数の癌による死亡は転移によって引き起こされ、腫瘍細胞は他の組織に遊走及び浸潤する。したがって、我々は、図７Ａ～７Ｅに示すように、ＭｎＯ及びＭｎＯ＠クルクミンが乳癌細胞の浸潤及び遊走を阻害し得るか否かを、トランスウェル－マトリゲル浸潤アッセイを用いて評価した。ここで、凍結融解法によって調製したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のＤＡＭＰの添加は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍細胞の浸潤を誘導し、これらの効果はＭｎＯナノ粒子処置によって有意に阻害された（図７Ａ及び７Ｂ）。これらの結果の概略図を図７Ｃに示し、写真を図７Ｄに示し、定量化を図７Ｅに示す。処置の４８時間後、ＤＡＭＰによる群の創傷治癒領域は急速に回復し、経時的にほぼ完全に閉じた（図７Ｅ）。これに対して、創傷修復は、ＭｎＯナノ粒子での処置後に明らかに妨害された。これらの所見は、ＭｎＯがｉｎ ｖｉｔｒｏでのＤＡＭＰの侵襲誘発作用及び遊走を中和し得ることを示唆する。
【0034】
ＰＴＴによって引き起こされる炎症応答に対するＭｎＯ及びＭｎＯ＠クルクミンの効果を調べるために、我々は、４Ｔ１－ルシフェラーゼ細胞をＢａｌｂ／ｃマウスの皮下脂肪体に接種することによって、４Ｔ１転移腫瘍モデルを確立した。腫瘍体積が８０～１００ｍｍ３となった場合、担４Ｔ１腫瘍マウスにＭｎＯ＠クルクミン＠ＩＲ７８０ナノ粒子を腫瘍内注入して近赤外蛍光撮影及び光線治療を行った。蛍光シグナル強度を、異なる時間間隔でＩＶＩＳ（登録商標）装置に記録した。図８Ａにおいて観察されるように、腫瘍部位の蛍光シグナルは注入後６時間で最高レベルに到達し、そして経時的に低下し、それは図８Ｂの蛍光画像と一致した。したがって、注入後６時間後に、マウスに８０８ｎｍのレーザー（１Ｗ／ｃｍ２）を１０分間照射し、ＭｎＯ＠クルクミン＠ＩＲ７８０ナノ粒子の生体内分布及び腫瘍集積挙動を調べた。ＭｎＯ＠クルクミン＠ＩＲ７８０ナノ粒子を用いて、担４Ｔ１腫瘍マウスのＥｘ ｖｉｖｏでの蛍光撮像を実施した。図８Ｃに示すように、腫瘍領域で強力な蛍光シグナルが存在し、ＭｎＯ＠クルクミン＠ＩＲ７８０ナノ粒子の効率的な腫瘍集積を実証した。さらに、肝臓及び肺も、単核食細胞系の吸収に起因し得る可視的な微弱な蛍光を示した。
【0035】
ＭｎＯ及びＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子のＰＴＴ誘導性炎症応答を緩和する能力を、担４Ｔ１腫瘍マウスにおいて検討した。腫瘍体積がほぼ１００ｍｍ３に達した場合、担４Ｔ１腫瘍マウスを無作為に８個の群に分け（１群あたりｎ＝８）、以下の、ＰＢＳ、ＭｎＯ、クルクミン、ＭｎＯ＠クルクミン、レーザー、レーザー＋クルクミン、レーザー＋ＭｎＯ及びレーザー＋ＭｎＯ＠クルクミンのうちの１つで処置した。担４Ｔ１腫瘍マウスは、最初に光温熱治療を受け、そして、週３回の静脈内注入によって異なる処方でさらに処置された。図９Ａ及び９Ｂに示すように、クルクミン、ＭｎＯ及びＭｎＯ＠クルクミン群のみが、マウスの体重及び腫瘍のサイズに対して明らかな効果を示さなかった。レーザー群は体重の増加を示したが、ＰＴＴ治療後１５日目に腫瘍の再発が観察された。レーザー＋クルクミン、レーザー＋ＭｎＯ及びレーザー＋ＭｎＯ＠クルクミン群のマウスは体重の増加を示し、腫瘍の再発及び転移を阻害し、したがって、クルクミン、ＭｎＯナノ粒子及びＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子が炎症応答を阻害するのに使用可能であることを確認した。
【0036】
具体的には、クルクミン、ＭｎＯ又はＭｎＯ＠クルクミンでの処置は、各々、レーザー治療の非存在下では、腫瘍抑制に対するわずかな効果を示した。レーザー処置は、初期には腫瘍成長を阻害したが、レーザー群中のほとんどのマウス（７５％）はＰＴＴ後１０～１５日に腫瘍再発を示した。これに対して、レーザー＋クルクミン、レーザー＋ＭｎＯ及びレーザー＋ＭｎＯ＠クルクミンでの処置は、腫瘍成長を初期に抑制しただけでなく、７５％超の阻害率で腫瘍再発も明らかに阻害した。
【0037】
異なる処方で処置したマウスのＩＶＩＳ（登録商標）画像を図９Ｃに示し、これはＰＴＴ誘導性炎症に関するＭｎＯ及びＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子の治療効果をさらに実証する。さらに、図９Ｄに示すように、ＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子群中の８個の腫瘍のうちの５個は処置後に完全に消失し、ｃｆＤＮＡスカベンジャー及び抗炎症剤の組合せが腫瘍再発を阻害する可能性を有することを証明した。
【0038】
さらに、マウス血清中のサイトカインレベル（すなわち、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α及びＩＬ－１β）をＥＬＩＳＡによって分析した（図９Ｅ～Ｇ）。レーザー＋クルクミン、レーザー＋ＭｎＯ及びレーザー＋ＭｎＯ＠クルクミン群は、ＰＢＳ群及びレーザー群より明らかに低いサイトカインレベルを示し、レーザー処置後のさらなる処置のためのクルクミン、ＭｎＯ又はＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子の適用が炎症性サイトカインレベルを減少させ得ることを示した。これらの所見により、クルクミン、ＭｎＯ及びＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子が、それらの炎症誘発性分子捕捉及び抗炎症効果により、炎症応答及び原発性腫瘍再発を阻害し得ることが確認された。重要なこととして、クルクミン、ＭｎＯ及びＭｎＯ＠クルクミンの腫瘍再発に対する抗炎症性効果及び阻害効果は、ＰＴＴ後のマウスの生存率も大きく改善した（図９Ｈ）。
【0039】
治療誘導性炎症は、原発性腫瘍再生を引き起こすだけでなく、転移にもつながり得る。したがって、我々は、処方の肺組織における抗腫瘍活性及び抗転移活性をさらに調べた。図９Ｉに示すように、レーザー＋ＭｎＯ及びレーザー＋ＭｎＯ＠クルクミン群は、炎症誘発性分子の捕捉及び抗炎症効果により、レーザー群と比較して肺転移の有意な阻害を示した。レーザー＋クルクミン、レーザー＋ＭｎＯ及びレーザー＋ＭｎＯ＠クルクミンでの処置は原発性腫瘍再発を阻害し得たが、レーザー＋ＭｎＯ及びレーザー＋ＭｎＯ＠クルクミン群はＭｎＯ及びＭｎＯ＠クルクミンナノ粒子による炎症誘発性分子（例えば、ｃｆＤＮＡ及びｃｆＲＮＡ）の捕捉により、レーザー＋クルクミンよりも良好な肺転移に対する阻害効果を示した。
【0040】
我々は、マウス血清中のｃｆＤＮＡレベルをさらに検討して異なる処置の前後の傾向を調べた（図９Ｊ）。レーザー処置後（レーザー群）、ＰＴＴ損傷細胞によって放出されたｃｆＤＮＡ量は上昇した。これに対して、レーザー＋ＭｎＯ及びレーザー＋ＭｎＯ＠クルクミン群の双方が低いｃｆＤＮＡレベルを示し、レーザー治療後の追加的なＭｎＯ及びＭｎＯ＠クルクミンが効果的にｃｆＤＮＡを捕捉し得ることを示した。
【0041】
ＣＯＶＩＤ－１９の病理をより深く理解するために、本発明者らはＣＯＶＩＤ－１９の集中治療室（ＩＣＵ）患者からの血液及び呼吸器サンプルを研究した。彼らは、これらの患者が死細胞及び瀕死細胞によって放出される循環している損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）及び病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）によって刺激される炎症性ストームに罹患することを見出した。彼らは、長期にわたる高レベルのＤＡＭＰ／ＰＡＭＰが単球を過剰刺激し、疾患で死亡するＣＯＶＩＤ－１９患者における単球の疲弊（すなわち、免疫寛容）をもたらすことを観察した。最後に、彼らは、酸化マンガン（ＭｎＯ）ナノ粒子は、単球寛容を誘導するＤＡＭＰ／ＰＡＭＰの能力を制限するのに使用可能であることを示した。これらのナノ粒子は、深刻なＣＯＶＩＤ－１９及び他の疾患を有する患者において、過剰炎症及び免疫疲弊に対抗する治療薬としての使用に対する可能性を有する。これらのナノ粒子は、（１）それらは、任意のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体に対して、突然変異について調整するための改変無しに使用可能であること、及び（２）それらは４℃で保存されてもよく、それが－８０℃での保存を必要とするワクチンよりそれらをより利用しやすいこと、を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して利用可能な治療を超えるいくつかの有利な効果を提供する。重要なこととして、それらはまた、生分解性であり細胞毒性が低い。
【0042】
ＭｎＯナノ粒子を用いる他の方法
本発明は、（１）ＭｎＯナノ粒子、（２）ＭｎＯ粒子を用いて被検体における癌を処置する方法及び（３）ＭｎＯ粒子を用いて被検体における炎症を処置又は軽減する方法に向けられる。
本発明は、（１）ＭｎＯナノ粒子、（２）ＭｎＯ粒子を用いて被検体における癌を処置する方法及び（３）ＭｎＯ粒子を用いて被検体における炎症を処置又は軽減する方法に向けられる。
【0043】
ＭｎＯ粒子は、細胞をＭｎＯナノ粒子と接触させることによって、細胞のウイルス感染を減少又は阻害する方法に有用であることも知られている。ここで用いられるように、例えば、「サンプルを接触させること又は細胞を接触させること」のように、「接触させること」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ（すなわち、ここに定義される被検体内）で、直接的又は間接的にサンプル又は細胞を接触させることをいう。サンプル又は細胞を接触させることは、化合物のサンプルへの添加、細胞への添加、組織への添加、例えば、被検体の鼻腔若しくは粘膜通路へのコーティング若しくは添加又は被検体への投与などの被検体の所定部位への添加を含み得る。接触させることは、溶液、細胞、組織、哺乳動物、被検体、患者又はヒトへの投与を含む。さらに、細胞を接触させることは、細胞培養物に薬剤を添加することを含む。
【0044】
「ウイルス感染」は、細胞中又は被検体中のウイルスの存在によって引き起こされる感染である。ウイルス感染は、様々な公知の方法を用いて評価され得る。例えば、ウイルス感染は、ウイルスタンパク質を検出する（すなわち、ウイルス特異的抗体を用いて）イムノアッセイを用いて又はウイルスゲノム材料を検出するＰＣＲ若しくは核酸シーケンシングを用いて評価され得る。
【0045】
このような方法は、未処置のコントロール細胞、すなわちＭｎＯナノ粒子と接触していない同等の細胞と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれ以上に細胞のウイルス感染を減少又は阻害し得る。実施例は、細胞をＭｎＯナノ粒子と接触させた後のプラーク形成の８０％の減少を実証する。ウイルス感染の減少又は阻害は、コントロールの未処置の細胞と比較して、本方法を予防的に、すなわち、感染より前の細胞集団に適用して細胞から細胞へのウイルスの感染及び／又は拡散を減少させる場合、感染のリスク又はウイルス感染の拡散の減少となり得る。ウイルス感染の減少は、ここに提供される組成物で処置されていない細胞と比較して、ウイルス侵入、ウイルス複製、ウイルス細胞間拡散の減少をもたらし得る。例えば、実施例に示すように、プラーク数及び／又はサイズが低減され得る。
【0046】
ほとんどのウイルスは、細胞表面の受容体に結合し、エンドサイトーシスを受けることによって宿主細胞に侵入する。実施例では、本発明者らは、彼らのＭｎＯナノ粒子がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの侵入、複製及び細胞死を防止し得ることを実証する。理論によって束縛されることなく、本発明者らは、ナノ粒子が荷電カルボキシル基及びアミン基でスパイクタンパク質を取り囲み、立体障壁を作製することによって、宿主細胞におけるウイルススパイクタンパク質とＡＣＥ－２受容体の間の相互作用を阻害することにより、この効果を発揮し得ると考えている。
【0047】
「細胞」は、全ての生物を構成する基本単位である。全ての細胞は、膜内に囲まれた細胞質（すなわち、細胞の内部を満たすゼラチン状の液体）からなる。
【0048】
細胞は、ＭｎＯナノ粒子と直接的又は間接的に接触し得る。いくつかの実施形態では、細胞は、ＭｎＯナノ粒子とｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで接触する。例えば、細胞は、培養培地にＭｎＯナノ粒子を添加することによって、組織培養において（例えば、組織培養プレート又はフラスコにおいて）ＭｎＯナノ粒子と接触し得る。他の実施形態では、細胞は、ＭｎＯナノ粒子とｉｎ ｖｉｔｒｏで、すなわち、被検体において接触する。これらの実施形態では、接触ステップは、ＭｎＯナノ粒子を被検体に投与することによって行われ得る。
【0049】
炎症を処置する又は癌を処置する方法
本主題の一態様において、本主題は、被検体における炎症を軽減し、又は癌を処置する方法を提供する。本方法は、ＭｎＯナノ粒子を被検体に投与するステップを備える。
本主題の一態様において、本主題は、被検体における炎症を軽減し、又は癌を処置する方法を提供する。本方法は、ＭｎＯナノ粒子を被検体に投与するステップを備える。
【0050】
被検体における癌又は炎症を処置する本方法について、ＭｎＯナノ粒子は、予防的又は治療的に被検体に投与され得る。例えば、いくつかの実施形態では、被検体は、単に炎症若しくは炎症増加のリスクにあり、又は、例えば、炎症をもたらす状態に罹患することもあれば、炎症をもたらす状態若しくは環境になりやすいと見なされることもある。
【0051】
「炎症」とは、病原体、損傷細胞、毒性化合物又は照射などの有害な刺激に対する免疫系の自然な応答である。いくつかの実施形態では、本方法によって処置される炎症は、ウイルス感染、自己免疫疾患、癌、外傷又は敗血症に関連する。
【0052】
炎症の軽減は、炎症マーカーの発現を測定することによって評価され得る。炎症の軽減はまた、腫脹、発赤若しくは疼痛などの炎症の症状の軽減として、又は特定の炎症性疾患の症状の軽減として検出され得る。例えば、ＣＯＶＩＤでは、炎症の減少は、被検体の血液の酸素飽和度の維持及び正常な肺機能の維持として測定され得る。本発明のＭｎＯナノ粒子は、ＴＬＲシグナル伝達のＤＡＭＰ／ＰＡＭＰ媒介性活性化をブロックすることによって炎症を軽減する。したがって、いくつかの実施形態では、炎症の軽減は、ＴＬＲシグナル伝達パスウェイの下流エフェクターの発現又は活性化を測定することによって評価される。本発明の方法は、未処置のコントロール被検体において測定された同様の炎症応答と比較して、被検体における炎症を、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれ以上で軽減又は阻害し得る。炎症の軽減は、未処置のコントロール被検体と比較して予防的に本方法を適用する場合、すなわち、本組成物を、ＣＯＶＩＤ感染患者と共に作業し、又はＣＯＶＩＤ感染患者に曝露される看護師若しくは医師などの感染リスクの高い個人などの未感染の個人に投与する場合、被検体における感染の症状、ウイルス感染に関連する病的状態、病的状態若しくは感染の期間又は被検体における炎症の他の任意の測定値の減少となり得る。ウイルス誘導性炎症の軽減は、治療的に（すなわち、診断後に）ここに提供される組成物と接触しない又はここに提供される組成物を投与されない被検体と比較して、感染被検体における疾患／病的状態の深刻度又は長さの減少をもたらし得る。例えば、感染した個人は、感染した個人のための疾患の経過を短縮するここに説明される方法を用いてもよく、したがって、投与は、被検体における感染の診断後となり得る。
【0053】
本発明の方法は、核酸含有ＤＡＭＰ／ＰＡＭＰによるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）－シグナル伝達の活性化による炎症を軽減するのに使用可能である。実施例では、本発明者らは、ＭｎＯナノ粒子の添加が、ＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者の血清及びＥＴＡに存在するＤＡＭＰ／ＰＡＭＰによるＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９の刺激を有意に減少させたことを実証する（図１５Ａ～Ｂ）。したがって、いくつかの実施形態では、本方法は、被検体における１個以上の核酸感知ＴＬＲの活性化を防止又は低減する。好適な実施形態では、本方法は、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７及び／又はＴＬＲ９の活性化を防止する。
【0054】
単球などの免疫細胞がＴＬＲアゴニストに反復的に曝露される場合、それらは、さらなる刺激に対して「寛容」となり、効果的な応答を起こすことができない。「ＴＬＲ寛容」は、ＴＬＲの繰り返される活性化又は慢性的な活性化に対して変化した細胞の応答性の状態として説明され得る。実施例では、本発明者らは、ＭｎＯナノ粒子での処置は、順次的なＴＬＲ刺激に応じた単球によるＩＬ－６産生を有意に減少させることを実証する（図１５Ｃ）。分泌されるＩＬ－６のレベルが高いことは、ＴＬＲ寛容表現型を示す。したがって、本研究は、ＭｎＯナノ粒子が、ＴＬＲ寛容表現型の誘導を制限することを実証する。したがって、いくつかの実施形態では、本方法は、被検体におけるＴＬＲ寛容単球の発生を防止する。ＴＬＲ寛容は、単球におけるＩＬ－１０、ＩＬ－１β及びＩＬ－１２の産生の減少又はＩＬ－６産生レベルの増加として検出され得る。
【0055】
本発明者らはまた、ＣＯＶＩＤ－１９死亡患者からのＣＤ１６＋単球はＴＬＲ寛容表現型を示すことも特定した。回復患者からの単球はＴＬＲ活性化に対する強固な抗ウイルス応答を発揮するが、死亡患者からの単球は、サイトカインストームの効果を増幅させる不完全な抗ウイルス応答を起こす。したがって、いくつかの実施形態では、本方法は、サイトカインストームの発生を防止する。「サイトカインストーム」は、自然免疫系がサイトカインと呼ばれる炎症誘発性シグナル伝達分子の無制御及び過度の放出を引き起こす生理学的反応である。通常は、サイトカインは感染に対する身体の免疫応答の一部であるが、それらの大量の突然の放出は多臓器不全及び死を引き起こし得る。
【0056】
ここに記載される方法のいずれも、被検体に対して行われ得る。方法が適用される「被検体」は、哺乳動物又は鳥類などの非哺乳動物であり得る。適切な哺乳動物は、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、コウモリ、マウス及びラットを含むが、これらに限定されない。所定の実施形態では、本方法は、研究目的で実験動物（例えば、マウス及びラット）に対して行われる。他の実施形態では、本方法は、商業的に重要な農場動物（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ及びニワトリ）又はコンパニオン動物（例えば、ネコ及びイヌ）を処置するのに用いられる。好適な実施形態では、被検体はヒトである。
【0057】
ここで用いられるように、「処置／治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「治療（ｔｈｅｒａｐｙ）」及び／又は「治療レジメン」は、患者によって示される又は患者が影響を受けやすいことがある疾患、障害又は生理学的状態に応じて行われる臨床的介入をいう。処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）の目的は、症状の緩和若しくは停止、疾患、障害若しくは状態の進行若しくは悪化の減速若しくは停止及び／又は疾患、障害若しくは状態の寛解を含む。ここで用いられるように、用語「防止する」、「防止している」、「防止」、「予防的処置」などは、疾患、障害又は状態を有していないが、疾患、障害又は状態を発生するリスクにある又は発生しやすい被検体において、疾患、障害又は状態を発生する確率を減少させることをいう。用語「有効量」又は「治療上有効量」は、有益又は望ましい生物学的及び／又は臨床的な結果をもたらすのに十分な量をいう。
【0058】
ここで用いられるように、動物又は細胞に治療物などの薬剤を「投与する」という用語は、意図する標的に物質を分配、送達又は適用するということを意図する。治療剤に関して、用語「投与している」は、動物／被検体における所望の位置まで治療剤を送達するための任意の適切な経路によって、被検体に治療剤を接触させ、又は分配、送達若しくは適用するということを意図する。投与の方法は当技術分野において周知であり、経口投与、経皮投与、吸入／鼻腔投与による投与、鼻腔投与、局所投与、膣内投与、眼科投与、耳内投与、大脳内投与、腸内投与、舌下投与、口腔内投与並びに静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、髄腔内投与及び皮下投与などの注入可能なものを含む非経口投与を含むが、これらに限定されない。投与は連続的又は断続的であり得る。実施例では、本発明者らは、主に気道にある組織に感染するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる感染及び炎症を軽減するＭｎＯナノ粒子の能力を試験した。したがって、いくつかの実施形態では、ＭｎＯナノ粒子は、経口的、経鼻的又は局所的に投与される。
【0059】
好適な実施形態では、ＭｎＯナノ粒子は、治療上有効量、すなわち、有益又は望ましい生物学的又は臨床的な結果をもたらすのに十分な量で投与される。その結果は、炎症又は疾患若しくは状態（例えば、ウイルス感染）の１つ以上の症状を軽減、緩和、阻害又は防止することであり得る。有効な投与手段及び投与量を決定する方法は、当業者には周知であり、治療のために用いられる処方、治療の目的及び処置される被検体によって異なる。単回又は複数回の投与は、治療医によって選択される用量レベル及びパターンで実行され得る。
【0060】
ここで用いられるように、用語「ウイルス感染」は、（被検体の）体内のウイルスの存在によって特徴付けられる状態のものをいう。被検体は、症状（例えば、発熱、悪寒、鼻づまり／鼻水など）を示すこともあれば、無症状であることもある。ここに提供される方法及び処方は、ウイルス感染の防止にも有用であり、ウイルス感染を発生するリスクにある被検体（例えば、医療従事者）のための予防薬として使用され得る。ウイルス感染は、任意の種類のウイルスによって引き起こされ得る。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ヒト被検体に感染可能である。いくつかの実施形態では、ウイルスは、粘膜／鼻／肺／呼吸器に感染可能である。適切な例は、インフルエンザ、コロナウイルス、ライノウイルス、呼吸器合胞体ウイルスなどを含む。いくつかの実施形態では、ウイルス剤は、コロナウイルスによってもたらされる。他の実施形態では、コロナウイルスは、２２９Ｅ（アルファコロナウイルス）、ＮＬ６３（アルファコロナウイルス）、ＯＣ４３（ベータコロナウイルス）、ＨＫＵ１（ベータコロナウイルス）、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ（ベータコロナウイルス）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（ベータコロナウイルス）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びそれらの組合せからなる群から選択される。一実施形態では、コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む。
【0061】
本開示は、ここに説明される構造、構成要素の配置又は方法のステップの特定の詳細に限定されない。ここに開示される組成物及び方法は、以下の開示に照らして当業者に明らかとなる様々な態様において作製、実施、使用、実行及び／又は形成されることができる。ここで用いられる語句及び用語は、説明の目的のみのためのものであり、特許請求の範囲を限定するものとみなされるべきではない。説明及び特許請求の範囲において様々な構造又は方法ステップをいうのに用いられるような、第１、第２及び第３などの序数指示子は、任意の特定の構造若しくはステップ又はそのような構造若しくはステップに対する任意の特定の順序若しくは構成を示すように解釈されることを意味するものではない。ここに記載される全ての方法は、ここに特に断りのない限り、又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で行われ得る。ここに提供される任意の及び全ての例又は例示的な言語（例えば、「などの」）の使用は、単に本開示を容易にすることを意図するものであり、特に主張のない限り本開示の範囲に対して限定を意味するものではない。本明細書中のいかなる文言及び図面に示されたいかなる構造も、請求されていない要素が開示された本主題の実施に必須であることを示すものとして解釈されるべきではない。用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「備えている／含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」又は「有している」及びそれらの変形のここでの使用は、それ以降に列挙される要素及びそれらの等価物並びに追加の要素を包含することを意味する。所定の要素を「含んでいる」、「備えている／含んでいる」又は「有している」として示される実施形態は、それらの所定の要素「から本質的になる」及びそれらの所定の要素「からなる」としても考えられる。
【0062】
ここでの値の範囲の提示は、特にここでの断りのない限り、範囲内にある各個別の値を個々にいう省略した方法として作用することを単に意図するものであり、各個別の値は、ここに個々に示されているかのように本明細書に取り込まれる。例えば、濃度範囲が１％～５０％と述べられる場合、２％～４０％、１０％～３０％又は１％～３％などの値が、本明細書に明示的に列挙されることが意図される。これらは具体的に意図されたものの例に過ぎず、列挙された最低値と最高値の間及び列挙された最低値及び最高値を含む数値の全ての可能な組合せが、本開示において明示的に述べられると考えられる。特定の示された量又は量の範囲を説明するための単語「約」の使用は、示された量に非常に近い値は、製作公差、測定値の形成における機器及び人為的誤差などに起因して計上され得る又は自然と計上されることになる値などのその量に含まれることを示すことを意味する。量をいう全ての割合は、特に断りのない限り全て重量による。
【0063】
本明細書において引用したいずれの非特許文献又は特許文献を含む任意の参照も先行技術であることは、認めていない。特に、特に断りのない限り、ここでの任意の文献への参照は、これらの文献のいずれかは、米国又はその他のいずれかの国での当技術分野における共通の一般知識の一部を形成することを認めるものではないことが理解されることになる。参考文献に関する任意の討論は、それらの著者が主張することを述べたものであり、出願人は、ここに引用された文献の正確性及び適切性について異議を申し立てる権利を留保する。ここに引用される全ての文献は、明示的に断りのない限り、参照により完全に取り込まれる。本開示は、引用された参照に見られる任意の定義及び／又は説明の間に任意の相違が存在する場合に支配するものとする。
【0064】
本主題の以下の実施例及びＭｎＯナノ粒子の他の関連用途は、例示のみを意味するものであり、本発明の範囲又は添付の特許請求の範囲の限定として意味されるものではない。
【実施例】
【0065】
実施例
何百万人ものＣＯＶＩＤ－１９患者が、呼吸器系及び全身性の炎症で死亡している。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）シグナル伝達の過剰刺激は、ウイルスによる感染に続く免疫病理の重要な駆動要素である。以下の実施例に説明するように、本発明者らは、集中治療室（ＩＣＵ）にいる重症のＣＯＶＩＤ－１９患者が、彼らの血液及び肺中に存在する核酸感知ＴＬＲの豊富なアゴニストによるそのような過剰刺激の特質を示すことを見出した。本発明者らは、これらの核酸含有損傷関連分子パターン及び病原体関連分子パターン（ＤＡＭＰ／ＰＡＭＰ）は核酸結合マイクロ繊維を用いて枯渇されてもよく、この枯渇が、患者サンプルのそのような自然免疫受容体を過剰活性化する能力を制限することを示した。彼らは、シングルセルＲＮＡシーケンシングを用いて、回復しなかったＩＣＵ死亡患者からのＣＤ１６＋単球がＴＬＲ寛容表現型及びｅｘ ｖｉｖｏのＴＬＲ刺激後の不完全な抗ウイルス応答を示すことを明らかにし、彼らは、血漿プロテオミクスを用いて、そのような骨髄過剰活性化を確認し、死亡患者におけるＤＡＭＰ／ＰＡＭＰ担体消費を明らかにした。彼らは、これらのＣＯＶＩＤ－１９患者サンプルのＭｎＯナノ粒子での処置が、彼らの肺及び血液中に存在する豊富な核酸含有ＤＡＭＰ／ＰＡＭＰによるＴＬＲ活性化を効果的に中和することを見出した。最後に、彼らは、ＭｎＯナノスカベンジャー処置が、単球のＴＬＲ寛容を誘導するＤＡＭＰ／ＰＡＭＰの能力を制限することを特定した。したがって、マイクロ繊維による又はナノ粒子によるＤＡＭＰ／ＰＡＭＰスカベンジャーでの処置は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２誘導性過剰炎症を制限し、単球のＴＬＲ寛容を防止し、重症のＣＯＶＩＤ－１９患者における転帰を改善するのに有用であることを証明し得る。
何百万人ものＣＯＶＩＤ－１９患者が、呼吸器系及び全身性の炎症で死亡している。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）シグナル伝達の過剰刺激は、ウイルスによる感染に続く免疫病理の重要な駆動要素である。以下の実施例に説明するように、本発明者らは、集中治療室（ＩＣＵ）にいる重症のＣＯＶＩＤ－１９患者が、彼らの血液及び肺中に存在する核酸感知ＴＬＲの豊富なアゴニストによるそのような過剰刺激の特質を示すことを見出した。本発明者らは、これらの核酸含有損傷関連分子パターン及び病原体関連分子パターン（ＤＡＭＰ／ＰＡＭＰ）は核酸結合マイクロ繊維を用いて枯渇されてもよく、この枯渇が、患者サンプルのそのような自然免疫受容体を過剰活性化する能力を制限することを示した。彼らは、シングルセルＲＮＡシーケンシングを用いて、回復しなかったＩＣＵ死亡患者からのＣＤ１６＋単球がＴＬＲ寛容表現型及びｅｘ ｖｉｖｏのＴＬＲ刺激後の不完全な抗ウイルス応答を示すことを明らかにし、彼らは、血漿プロテオミクスを用いて、そのような骨髄過剰活性化を確認し、死亡患者におけるＤＡＭＰ／ＰＡＭＰ担体消費を明らかにした。彼らは、これらのＣＯＶＩＤ－１９患者サンプルのＭｎＯナノ粒子での処置が、彼らの肺及び血液中に存在する豊富な核酸含有ＤＡＭＰ／ＰＡＭＰによるＴＬＲ活性化を効果的に中和することを見出した。最後に、彼らは、ＭｎＯナノスカベンジャー処置が、単球のＴＬＲ寛容を誘導するＤＡＭＰ／ＰＡＭＰの能力を制限することを特定した。したがって、マイクロ繊維による又はナノ粒子によるＤＡＭＰ／ＰＡＭＰスカベンジャーでの処置は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２誘導性過剰炎症を制限し、単球のＴＬＲ寛容を防止し、重症のＣＯＶＩＤ－１９患者における転帰を改善するのに有用であることを証明し得る。
【0066】
いくつかのグループは、様々な疾患タイプにおいて、死細胞及び瀕死細胞から放出されるＤＡＭＰ／ＰＡＭＰによって駆動される自然免疫応答の過剰活性を研究してきた［１、２、３］。ＤＡＭＰ及びＰＡＭＰは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）などのパターン認識受容体によって検出される。ＴＬＲは重要な自然免疫センサであり、そのうちのいくつかは核酸含有ＤＡＭＰ／ＰＡＭＰを認識してシグナル伝達カスケード及び下流の免疫応答を開始する［４、５］。ＴＬＲ３及びＴＬＲ７／８はＲＮＡを感知するのに対し、ＴＬＲ９はＤＮＡを感知し、ＴＬＲ４はＤＮＡ－タンパク質複合体を感知する。総合して、これらの核酸感知ＴＬＲは、癌、自己免疫疾患及び感染症における炎症応答の重要な媒介物質である［５、６、７、８］。一方で、ＴＬＲ及びそれらのＮＦκＢを介した下流シグナル伝達パスウェイの過度の活性化は、血管透過性の増加並びにリンパ球及び好中球の活性化により、肺傷害及び急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の発生及び進行に寄与し得る［９、１０］。我々及び他者は、所定の核酸結合マイクロ材料及びナノ材料の可溶性繊維処方及び非可溶性繊維処方の双方が、紅斑性狼瘡、関節リウマチ、癌、外傷、敗血症及びインフルエンザ感染症のモデルにおいて、そのようなＤＡＭＰ／ＰＡＭＰを中和し、それらのＴＬＲ及び下流のＮＦκＢの活性化を防止し得ることを以前に示している。
【0067】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染は、上気道感染症の軽度の症状から、人工呼吸器又は体外式膜型人工肺を必要とするＡＲＤＳ及び呼吸不全まで、広いスペクトルの疾患を引き起こす［２３、２４、２５］。集中治療室（ＩＣＵ）の患者などの疾患スペクトルの末期にある患者は、急速に悪化することがあり、死亡リスクがより高い［２３、２５、２６］。これらのような転帰不良の根底には、ウイルス感染を併発する重症患者における、他の検査値異常の中でもＤダイマー、ＩＬ－６、リンパ球減少及び好中球増加のレベルの上昇と関連する過剰炎症応答がある［２４、２６］。我々は、他の疾患のタイプにおいて我々が研究してきたＴＬＲ過剰刺激がＣＯＶＩＤ－１９の過剰炎症応答に関連し得ると考えた。したがって、本研究では、ＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者におけるＴＬＲ媒介性炎症を特徴付け、この患者集団における核酸含有ＤＡＭＰ／ＰＡＭＰの下流の負の結果を軽減する核酸結合材料の能力を試験することに着手した。
【0068】
ＤＡＭＰ及びＰＡＭＰによるＴＬＲ活性化は、細胞表面受容体、サイトカイン及びケモカインの発現の変化をもたらす。ＩＣＵ患者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染は、顕著な好中球増加と関連しており、好中球はこの患者集団におけるＤＡＭＰの主要な供給源ともなる［２７］。いくつかの報告は、深刻な感染と関連する単球個体数の増加を同定した［２８、２９］。単球は、特にウイルス感染に続くＴＬＲ媒介性炎症の主要なセンサであり、その応答物である。健常状態では、通常、古典的単球（すなわち、ＣＤ１６－ＣＤ１４＋単球）が循環する単球の大部分（単球全体の８０～９５％）を表し、中間体（ＣＤ１６＋ＣＤ１４＋）及び非古典的単球（ＣＤ１６＋ＣＤ１４ｌｏ／－）が残りの２０～５％を含む［３０、３１］。ＣＤ１６＋単球はＴＬＲ７／８媒介性炎症に応答し、ＣＤ１６－単球はＴＬＲ４媒介性炎症に応答する［３１］。ＣＯＶＩＤ－１９におけるＴＬＲ媒介性炎症と単球応答の間の関係は未だに解明されてなく、本研究の焦点となる。
【0069】
正常な環境下では、ＴＬＲ活性化は、下流のシグナル伝達及び単球を感染に応答させる遺伝子転写の変化をもたらす。一方で、深刻な感染及び過剰炎症性情勢は、ＴＬＲの過剰刺激をもたらし、その後に異常なＴＬＲ下流シグナル伝達をもたらし得る。過剰炎症の状況におけるこの持続的かつ異常な下流ＴＬＲシグナル伝達は、「ＴＬＲ寛容」といわれる。ＴＬＲ寛容は、細胞がＤＡＭＰ及びＰＡＭＰに反復的に曝露される場合に生じる［１５、３２、３３、３４、３５、３６］。正常な環境下では、ＴＬＲシグナル伝達カスケードは、ＮＦκＢを活性化し、強固な免疫応答をもたらす。一方で、単球などの免疫細胞がＴＬＲアゴニストに反復的に曝露される場合、それらは、さらなる刺激に対して寛容となり、効果的な応答を起こすことができなくなる［１５、３２、３３、３４、３５、３６］。以前の研究は、敗血症の患者から単離された単球は、患者の生存にかかわらず、ＬＰＳ処置に応じてＩＬ－１０、ＩＬ－１β及びＩＬ－１２の産生を減少させることを示す［３７］。一方で、敗血症の後期に単球を単離し、ＬＰＳで活性化した場合、生存者からの単球はＬＰＳ処置に応じてこれらのサイトカインを産生する能力を回復したのに対し、死亡患者からの単球は回復しなかった。さらに、このサイトカインの機能不全は、ＩＦＮ－γのｉｎ ｖｉｔｒｏ処置では救済できなかった。炎症の解消におけるＩＬ－１０、ＩＬ－１β及びＩＬ－１２の重要性を考えると、この表現型は、これらの患者をその後の細菌感染にかかりやすくしている［３７、３８、３９、４０］。したがって、我々は、単球のＴＬＲ寛容が核酸含有ＤＡＭＰ／ＰＡＭＰに応じてＣＯＶＩＤ－１９患者において生じるか、及び核酸結合ナノ材料による治療が患者サンプルによるＴＬＲ過剰活性化を緩和し、単球のＤＡＭＰ／ＰＡＭＰ誘導性寛容を制限できるか否かを調べた。
【0070】
我々研究者らは、ＩＣＵレベルのケアを必要とするＣＯＶＩＤ－１９の患者の免疫及びＤＡＭＰ／ＰＡＭＰの縦断的プロファイリングを行った。彼らは、フローサイトメトリーを用いて重篤なＣＯＶＩＤ－１９患者からの血液中の免疫サブセットを調べ、レポーター細胞アッセイを用いてＴＬＲ活性化の可能性を測定し、シングルセルＲＮＡシーケンシング及び血漿プロテオームプロファイリングを用いて、生存しなかった患者と対比した生存した患者の差を評価した。彼らは、患者の肺及び血液中の核酸含有ＤＡＭＰ／ＰＡＭＰの顕著な増加を観察し、それにより核酸結合マイクロ材料及びナノ材料の過度のＤＡＭＰ／ＰＡＭＰを中和する能力を調べた。ＤＡＭＰ／ＰＡＭＰスカベンジャー処置は、過剰炎症を阻害し、ＴＬＲ寛容を制限することが見出され、そのような材料が重症のＣＯＶＩＤ－１９患者の転帰を改善するのに有用であることを証明し得ることを示唆した。
【0071】
結果：
ＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者血液の免疫プロファイリングは、異なる単球サブセットが臨床転帰と関連することを明らかにする
指示された時点で患者から新規に全血を採取し、材料及び方法の章に説明されるように分析した。フローサイトメトリーの結果は、デキサメタゾンでの処置又は臨床転帰にかかわらず、ほとんどの患者におけるリンパ球減少及び好中球増加を含む、以前の報告［２３、２４、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７］で観察された傾向を支持する（図１０Ａ～Ｇ）。デキサメタゾン処置及び臨床転帰によって患者群を比較した場合、末梢におけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、好塩基球又は好酸球の出現頻度に有意差は観察されなかった（図１０Ｂ～Ｉ）。我々は、ある患者サブセットは単球の上昇した割合を有する一方で、他の患者は正常範囲内の割合を有することを観察した（図１０Ｊ）。これは、我々にこの細胞サブセット及び単球の正準なサブ集団をさらに調べることを促した。
ＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者血液の免疫プロファイリングは、異なる単球サブセットが臨床転帰と関連することを明らかにする
指示された時点で患者から新規に全血を採取し、材料及び方法の章に説明されるように分析した。フローサイトメトリーの結果は、デキサメタゾンでの処置又は臨床転帰にかかわらず、ほとんどの患者におけるリンパ球減少及び好中球増加を含む、以前の報告［２３、２４、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７］で観察された傾向を支持する（図１０Ａ～Ｇ）。デキサメタゾン処置及び臨床転帰によって患者群を比較した場合、末梢におけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、好塩基球又は好酸球の出現頻度に有意差は観察されなかった（図１０Ｂ～Ｉ）。我々は、ある患者サブセットは単球の上昇した割合を有する一方で、他の患者は正常範囲内の割合を有することを観察した（図１０Ｊ）。これは、我々にこの細胞サブセット及び単球の正準なサブ集団をさらに調べることを促した。
【0072】
単球サブセットは、ＣＤ１６及びＣＤ１４の表面発現によって分類される。中間体単球（ＣＤ１６＋ＣＤ１４＋）又は非古典的単球（ＣＤ１６＋ＣＤ１４ｌｏ／－）として分類されるＣＤ１６を発現する単球は、ＣＤ１６＋単球と注釈された［３０、３１］。感染症から回復したデキサメタゾン未投与（ナイーブ）のＩＣＵ患者は、ＣＤ１６＋単球の個体数に基づいて死亡患者と区別可能であった（図１０Ｊ～Ｌ）。デキサメタゾン未投与で感染症から回復した患者は、より高レベルのＣＤ１６＋単球を有した。回復を、退院又はＩＣＵからの移行と定義した。これに対して、死亡患者はより低レベルのＣＤ１６＋単球を有し、これらの患者の末梢ではＣＤ１６－単球が優勢な単球集団であった。デキサメタゾンで処置された患者におけるＣＤ１６＋単球個体数と良好な臨床転帰の間の関連は統計学的に有意ではなく、デキサメタゾンの強力な免疫調節効果を例証した。新生単球機能に対するＣＯＶＩＤ－１９の効果を直接調べるため、我々は、デキサメタゾン未投与であるＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者コホートからのサンプルを分析した。ＲＮＡによるＤＡＭＰ／ＰＡＭＰによるＴＬＲ７／８活性化に対して特に感受性が高いことが知られているＣＤ１６＋細胞の差は、我々に患者サンプル中のそのような炎症性核酸のレベルを評価することを促した。
【0073】
ＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者からの血清及び気管内吸引液の縦断的プロファイリングは、核酸感知ＴＬＲシグナル伝達を強力に活性化する上昇したレベルのＤＡＭＰ及びＰＡＭＰを明らかにする
ＣＤ１６＋単球、ＴＬＲ活性化及び臨床転帰の間の関連を、ＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者からの血液、血漿、気管内吸引液（ＥＴＡ）をＴＬＲアゴニストについて分析することによって調べた。健常なコントロールと比較した場合、試験した４個のＴＬＲの中で、ＴＬＲ３及びＴＬＲ７は、全ての患者及び全ての時点にわたって、血清によって最も一貫した活性化を示した（図１１Ａ）。ＴＬＲ３及びＴＬＲ７は、それぞれ二本鎖ＲＮＡ及び一本鎖ＲＮＡについてのセンサであるため、我々は、我々のＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵコホートからの血清サンプルは上昇したレベルの炎症誘発性ＲＮＡ分子を有していると結論付けた。これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がＲＮＡウイルスであるということと一致している。ＴＬＲ４及びＴＬＲ９もＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者からの血清によって活性化されたが、活性化のレベルは、特に縦断的に見た場合、ＴＬＲ３及びＴＬＲ７で見られるほどは高くなかった（図１１Ａ）。ＴＬＲ４及びＴＬＲ９は、それぞれリポ多糖（ＬＰＳ）及び細菌ＤＮＡのセンサである。ＴＬＲ４及びＴＬＲ９は、ヌクレオソーム、ＨＭＧＢ－１及びミトコンドリアＤＮＡなどの、細胞死時に放出される内因性分子によっても活性化される［４８］。我々は、１０名のＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者からのＥＴＡのＴＬＲプロファイルも特徴付けた。試験した各ＴＬＲについて、ＥＴＡは、７２名のＣＯＶＩＤ－１９患者からの血清より３～４倍高い活性化を発揮した（図１１Ｂ）。これらのデータは、ＣＯＶＩＤ－１９による重篤患者における炎症性症候群の呼吸器局在化をさらに強調している。これらの結果は、気道は、これらの患者では依然として、核酸感知ＴＬＲ、特にＣＤ１６＋単球上にあるＲＮＡセンサであるＴＬＲ３及びＴＬＲ７／８を活性化する高レベルの炎症性アゴニストによって特徴付けられるＤＡＭＰ／ＰＡＭＰ生成及び過剰炎症の主要位置であることを示す。
ＣＤ１６＋単球、ＴＬＲ活性化及び臨床転帰の間の関連を、ＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者からの血液、血漿、気管内吸引液（ＥＴＡ）をＴＬＲアゴニストについて分析することによって調べた。健常なコントロールと比較した場合、試験した４個のＴＬＲの中で、ＴＬＲ３及びＴＬＲ７は、全ての患者及び全ての時点にわたって、血清によって最も一貫した活性化を示した（図１１Ａ）。ＴＬＲ３及びＴＬＲ７は、それぞれ二本鎖ＲＮＡ及び一本鎖ＲＮＡについてのセンサであるため、我々は、我々のＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵコホートからの血清サンプルは上昇したレベルの炎症誘発性ＲＮＡ分子を有していると結論付けた。これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がＲＮＡウイルスであるということと一致している。ＴＬＲ４及びＴＬＲ９もＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者からの血清によって活性化されたが、活性化のレベルは、特に縦断的に見た場合、ＴＬＲ３及びＴＬＲ７で見られるほどは高くなかった（図１１Ａ）。ＴＬＲ４及びＴＬＲ９は、それぞれリポ多糖（ＬＰＳ）及び細菌ＤＮＡのセンサである。ＴＬＲ４及びＴＬＲ９は、ヌクレオソーム、ＨＭＧＢ－１及びミトコンドリアＤＮＡなどの、細胞死時に放出される内因性分子によっても活性化される［４８］。我々は、１０名のＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者からのＥＴＡのＴＬＲプロファイルも特徴付けた。試験した各ＴＬＲについて、ＥＴＡは、７２名のＣＯＶＩＤ－１９患者からの血清より３～４倍高い活性化を発揮した（図１１Ｂ）。これらのデータは、ＣＯＶＩＤ－１９による重篤患者における炎症性症候群の呼吸器局在化をさらに強調している。これらの結果は、気道は、これらの患者では依然として、核酸感知ＴＬＲ、特にＣＤ１６＋単球上にあるＲＮＡセンサであるＴＬＲ３及びＴＬＲ７／８を活性化する高レベルの炎症性アゴニストによって特徴付けられるＤＡＭＰ／ＰＡＭＰ生成及び過剰炎症の主要位置であることを示す。
【0074】
核酸結合マイクロ繊維は、ＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者の血清及びＥＴＡからのＤＡＭＰ／ＰＡＭＰを枯渇させ、ＴＬＲを刺激して下流のＮＦκＢ活性化を誘導するそれらの能力を制限し得る
核酸含有ＤＡＭＰ／ＰＡＭＰがＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者サンプルに豊富であるという観察結果は、我々に、そのようなＴＬＲアゴニストが核酸捕捉マイクロ繊維メッシュを用いて枯渇され得るかを調べさせた。以前に、我々は、そのようなマイクロ繊維が、外傷患者サンプルの血液中に存在するＤＡＭＰを効果的に除去し、ＴＬＲを刺激するそのような患者サンプルの能力を制限し得ることを観察した［１５］。エレクトロスパンＰＳＭＡ／ポリスチレンマイクロ繊維（平均直径２．５±０．１μＭ）を生成し、前述したように、ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭ－Ｇ３をＰＳＭＡ／ポリスチレンメッシュ上に結合させた［１５］。これらの核酸結合マイクロ繊維での患者サンプルの処置は、ＣＯＶＩＤ－１９患者からの血清及びＥＴＡによるＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９の活性化を劇的に低下させた。図１２Ａ～Ｈに示すように、マイクロ繊維がＴＬＲ活性化のレベルを培地のみで観察されたレベルまで減少させたように、達成された阻害のレベルは本質的に完全である。したがって、この核酸結合マイクロ繊維メッシュでの処置は、ＤＡＭＰ及びＰＡＭＰを中和し、重篤なＣＯＶＩＤ－１９患者の血液及び肺から採取した血清及びＥＴＡサンプルから、これらのＴＬＲアゴニストを枯渇させることによって、ＮＦκＢ活性化を防止した。
核酸含有ＤＡＭＰ／ＰＡＭＰがＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者サンプルに豊富であるという観察結果は、我々に、そのようなＴＬＲアゴニストが核酸捕捉マイクロ繊維メッシュを用いて枯渇され得るかを調べさせた。以前に、我々は、そのようなマイクロ繊維が、外傷患者サンプルの血液中に存在するＤＡＭＰを効果的に除去し、ＴＬＲを刺激するそのような患者サンプルの能力を制限し得ることを観察した［１５］。エレクトロスパンＰＳＭＡ／ポリスチレンマイクロ繊維（平均直径２．５±０．１μＭ）を生成し、前述したように、ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭ－Ｇ３をＰＳＭＡ／ポリスチレンメッシュ上に結合させた［１５］。これらの核酸結合マイクロ繊維での患者サンプルの処置は、ＣＯＶＩＤ－１９患者からの血清及びＥＴＡによるＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９の活性化を劇的に低下させた。図１２Ａ～Ｈに示すように、マイクロ繊維がＴＬＲ活性化のレベルを培地のみで観察されたレベルまで減少させたように、達成された阻害のレベルは本質的に完全である。したがって、この核酸結合マイクロ繊維メッシュでの処置は、ＤＡＭＰ及びＰＡＭＰを中和し、重篤なＣＯＶＩＤ－１９患者の血液及び肺から採取した血清及びＥＴＡサンプルから、これらのＴＬＲアゴニストを枯渇させることによって、ＮＦκＢ活性化を防止した。
【0075】
我々はまた、患者サンプルからＤＡＭＰ／ＰＡＭＰを枯渇させる核酸捕捉繊維の能力を定量した。我々は、繊維での処置は、ＣＯＶＩＤ－１９患者サンプルの血清及びＥＴＡの双方から、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＨＭＧＢ－１及びヌクレオソームを有意に枯渇可能であることを見出した（図１２Ｉ～Ｐ）。（注：ＤＮＡ及びＨＭＧＢ－１は、ＴＬＲ９の強力な内因性活性化物質である［４９］。ＲＮＡはＴＬＲ３及びＴＬＲ７の正準な活性化物質である。ＨＭＧＢ－１及びヌクレオソームもＴＬＲ４を強力に活性化する）。我々はまた、非炎症性タンパク質コントロールとして、ヒト血清アルブミンを測定した。アルブミンは正味の負の電荷を担持するが、核酸結合繊維による枯渇効果は血清ではわずかであり、ＥＴＡでは存在しなかった（図１２Ｑ～Ｒ）。これらのデータは、核酸含有ＤＡＭＰ／ＰＡＭＰスカベンジャー繊維が、コントロールタンパク質に対してわずかな効果のみ有する一方で、ＣＯＶＩＤ－１９患者サンプル中に存在する多種多様な炎症誘発性分子を枯渇させ得ることを実証し、そのような繊維は体外式膜型人工肺（ＥＣＭＯ）などの救命的な支援的ケアを必要とするＣＯＶＩＤ－１９患者からＤＡＭＰ／ＰＡＭＰを枯渇させるのに有用となり得ることを示唆する。
【0076】
縦断的プロテオミクスは、死亡患者における亢進された骨髄活性化及びＰＡＭＰ担持タンパク質の消費のマーカーを明らかにする
我々のＲＮＡシーケンシングデータからの差次的発現及び機能的観察のさらなる検証のために、我々はＣＯＶＩＤ－１９から回復した４名の異なるＩＣＵ患者及び回復しなかった４名の異なる患者からの血漿に対して不偏プロテオーム分析を行った。
我々のＲＮＡシーケンシングデータからの差次的発現及び機能的観察のさらなる検証のために、我々はＣＯＶＩＤ－１９から回復した４名の異なるＩＣＵ患者及び回復しなかった４名の異なる患者からの血漿に対して不偏プロテオーム分析を行った。
【0077】
我々は、４名の死亡患者からの循環プロテオームと、３名の異なる死亡患者から単離された単球のトランスクリプトームプロファイルとの類似性を同定した。血漿プロテオームに対して行われた機能的パスウェイ分析は、生存者に対して死亡患者において、骨髄活性化、動員及び遊走に関係する生物学的プロセスのエンリッチメントを実証した（図１３Ａ）。具体的には、これらのプロテオームデータに対して行われたクラスタリングは、死亡患者における粘膜自然免疫、抗細菌応答及びリポ多糖に対する細胞応答のマーカーを同定した。さらに、死亡患者において回復患者を超えてエンリッチメントされたタンパク性マーカーは、亢進された骨髄活性を示した（図１３Ｂ）。
【0078】
次に、我々は、回復患者及び死亡患者の双方からの縦断的サンプルを比較した（図１３Ｃ）。我々は、死亡患者はＮＧＡＬ、ＰＲＴＮ３、ＭＭＰ９、ＭＰＯ、ＴＲＦＬ、ＤＥＦ１を含む活性化された好中球によって分泌されるより高い循環レベルのタンパク質を有することを観察した［６７］。これらのタンパク質は、微生物誘導性炎症に応じて好中球によって分泌され、ＴＬＲシグナル伝達によって媒介される（図１３Ｃ）［６７、６８、６９、７０、７１］。さらに、アラーミンタンパク質であるＳ１００Ａ９のレベルも、回復患者と比較して死亡患者において上昇した（図１３Ｃ）［４８、７２］。Ｓ１００タンパク質は、ＴＬＲ４発現の正のフィードバックに関与する炎症のマーカーである［４８、７２］。これらのデータは、抗微生物パスウェイが回復患者と比較して死亡患者からの細胞において上昇していることを示した単球ＲＮＡシーケンシングデータと一致する。
【0079】
我々はまた、死亡患者と比較して回復患者においてより高いレベルを有するタンパク質を同定した。例えば、循環中のＰＡＭＰを結合してＴＬＲシグナル伝達を活性化する、マクロファージによって発現されるスカベンジャー受容体であるＭＡＲＣＯ［７３、７４］は、回復患者に対して死亡患者において有意により低い（図１３Ｃ）。これらの所見は、死亡患者において、ＰＡＭＰの結合及びＴＬＲへの送達がＭＡＲＣＯを消費していることを示唆する（図１３Ｃ、Ｅ）。同様のパターンを、死亡患者からの血漿において回復患者と比較して減少したレベルを有する、ＡＰＯＡ１、ＡＰＯＡ２、ＡＰＯＨ（図１３Ｃ、Ｅ）並びにＡＰＯＤ及びＡＰＯＣ４（図１６）を含む種々のアポリポタンパク質について観察した（図１３Ｃ～Ｅ）。アポリポタンパク質は、ＰＡＭＰのための担体として作用してＴＬＲシグナル伝達を活性化し、抗ウイルス免疫を促進する［７５、７６、７７］。遊離ＭＡＲＣＯ及びアポリポタンパク質が死亡患者の血液において低下し、明らかに消費されているというプロテオームの証拠は、死亡患者からの単球がＴＬＲの活性化を増加させたというトランスクリプトーム所見と一致する。
【0080】
まとめると、ＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者のＤＡＭＰ／ＰＡＭＰのＴＬＲレポーター細胞活性化研究、シングルセルＲＮＡシーケンシング及びプロテオーム分析は、核酸含有ＤＡＭＰ／ＰＡＭＰによるＴＬＲ過剰刺激が、それらの全てがＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者の転帰不良に関連する過度の単球活性化及び免疫調節物質の消費をもたらし得ることを示した。したがって、我々は次に、ＤＡＭＰ／ＰＡＭＰナノスカベンジャーが、単球におけるそのようなＴＬＲ過剰活性化及びＴＬＲ寛容を制限し得るか否かを調べた。
【0081】
ＭｎＯによるナノ粒子は、ＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者の血清及びＥＴＡによるＴＬＲ刺激を緩和し、単球におけるＴＬＲ寛容のＤＡＭＰ／ＰＡＭＰ媒介性誘導を防止する
核酸結合マイクロ繊維がＤＡＭＰ／ＰＡＭＰを捕獲及び中和し得るという観察結果から（図１２）、我々は、ＣＯＶＩＤ－１９患者サンプル中のＤＡＭＰ／ＰＡＭＰに対抗する可溶性ナノ粒子が同定され得るか否かを評価することになった。この目的のため、我々は、酸化マンガン（ＭｎＯ）基づく新規の可溶性形態の核酸結合ナノ粒子を評価した。このＭｎＯナノ材料の特徴付けされていない性質を考慮して、我々は、最初にその基本的特性を評価した。合成後、我々は、生成されたＭｎＯ粒子が、３０～１００ｎｍの範囲のサイズであり、約－２０ｍＶであるゼータ電位を有することを特定した。我々は、非結合のＰｉｃｏＧｒｅｅｎ標識ＤＮＡを測定することによって、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液中の酸化マンガン（ＭｎＯ）ナノ粒子の子牛胸腺ＤＮＡ結合親和性を評価した。ＭｎＯナノ粒子は、それらの正味の負の表面電荷にもかかわらず、核酸結合ポリマー（ＰＡＭＡＭ－Ｇ３）と同等である高いＤＮＡ結合親和性を示し、ＰＡＭＡＭ－Ｇ３と比較して減少した細胞毒性を有する（図３Ａ）。次に、我々は、ＴＬＲレポーター細胞を用いて、ＭｎＯナノ粒子の核酸捕捉活性を評価した。我々は、ＭｎＯナノ粒子は、ＦＢＳの存在又は非存在にかかわらず、用量依存的に、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ９細胞のＣｐＧ誘導性活性化を阻害し、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ３細胞のポリ（Ｉ：Ｃ）誘導性活性化及びＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ８細胞のＯＲＮ０６／ＬｙｏＶｅｃ（ＯＲＮ）誘導性活性化を阻害することを見出した（図１４）。ＭｎＯによるナノ粒子は、我々が以前に試験した他の可溶性核酸結合ナノ材料と比較した場合、いくつかの明確な有利な効果を有する。第１に、ＭｎＯナノ粒子は、他のポリマーと比較した場合、有意に改善された毒性プロファイルとともに、炎症性核酸に結合する強力な能力を維持する（図１４）。第２に、ＭｎＯナノ粒子は、生分解性であり、したがって、ポリアミドアミン及びＰＡＭＡＭファミリーのポリマーなどの他のクラスの核酸結合ナノ材料で観察されるクリアランス臓器に対する同じレベルの毒性を示すとは予想されない。
核酸結合マイクロ繊維がＤＡＭＰ／ＰＡＭＰを捕獲及び中和し得るという観察結果から（図１２）、我々は、ＣＯＶＩＤ－１９患者サンプル中のＤＡＭＰ／ＰＡＭＰに対抗する可溶性ナノ粒子が同定され得るか否かを評価することになった。この目的のため、我々は、酸化マンガン（ＭｎＯ）基づく新規の可溶性形態の核酸結合ナノ粒子を評価した。このＭｎＯナノ材料の特徴付けされていない性質を考慮して、我々は、最初にその基本的特性を評価した。合成後、我々は、生成されたＭｎＯ粒子が、３０～１００ｎｍの範囲のサイズであり、約－２０ｍＶであるゼータ電位を有することを特定した。我々は、非結合のＰｉｃｏＧｒｅｅｎ標識ＤＮＡを測定することによって、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液中の酸化マンガン（ＭｎＯ）ナノ粒子の子牛胸腺ＤＮＡ結合親和性を評価した。ＭｎＯナノ粒子は、それらの正味の負の表面電荷にもかかわらず、核酸結合ポリマー（ＰＡＭＡＭ－Ｇ３）と同等である高いＤＮＡ結合親和性を示し、ＰＡＭＡＭ－Ｇ３と比較して減少した細胞毒性を有する（図３Ａ）。次に、我々は、ＴＬＲレポーター細胞を用いて、ＭｎＯナノ粒子の核酸捕捉活性を評価した。我々は、ＭｎＯナノ粒子は、ＦＢＳの存在又は非存在にかかわらず、用量依存的に、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ９細胞のＣｐＧ誘導性活性化を阻害し、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ３細胞のポリ（Ｉ：Ｃ）誘導性活性化及びＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ８細胞のＯＲＮ０６／ＬｙｏＶｅｃ（ＯＲＮ）誘導性活性化を阻害することを見出した（図１４）。ＭｎＯによるナノ粒子は、我々が以前に試験した他の可溶性核酸結合ナノ材料と比較した場合、いくつかの明確な有利な効果を有する。第１に、ＭｎＯナノ粒子は、他のポリマーと比較した場合、有意に改善された毒性プロファイルとともに、炎症性核酸に結合する強力な能力を維持する（図１４）。第２に、ＭｎＯナノ粒子は、生分解性であり、したがって、ポリアミドアミン及びＰＡＭＡＭファミリーのポリマーなどの他のクラスの核酸結合ナノ材料で観察されるクリアランス臓器に対する同じレベルの毒性を示すとは予想されない。
【0082】
これらの有利な効果を考慮して、我々は、ＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者サンプルによるＴＬＲ刺激の制御におけるそのようなＭｎＯナノ粒子の実用性を試験したいと考えた。図１５Ａ、Ｂに示すように、ＭｎＯナノ粒子の添加は、ＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者の血清及びＥＴＡに存在するＤＡＭＰ／ＰＡＭＰによるＴＬＲ３、４、７及び９の刺激を有意に減少させた。ナノ粒子スカベンジャーで達成された阻害のレベルは、本質的に１００％であり、マイクロ繊維ＤＡＭＰ／ＰＡＭＰスカベンジャーを用いて達成されたものと同等である（図１２及び図１５を比較）。次に、我々は、ＭｎＯナノ粒子によるＴＬＲ刺激の緩和が、単球におけるＴＬＲ寛容の誘導をｅｘ ｖｉｖｏで防止し得るか否かを調べた。この目的のため、我々は、新規に単離した初代ヒト単球をポリＩ：Ｃ（ＴＬＲ３を活性化する二本鎖ウイルスＲＮＡ ＰＡＭＰ模倣体）で２４時間処置し、続けてＬＰＳ（ＴＬＲ４を活性化する細菌ＰＡＭＰ模倣体）での処置を５時間行い、その後、細胞上清を採取し、炎症誘発性サイトカインＩＬ－６のレベルを定量する実験を行った。より高いレベルの分泌されるＩＬ－６は、ＴＬＲ寛容表現型を示す［７８］。この実験的セットアップは、単球を最初にウイルスＰＡＭＰ模倣体（ポリＩ：Ｃ）に曝露し、そして細菌ＰＡＭＰ模倣体（ＬＰＳ）に曝露することによる、ｅｘ ｖｉｖｏでのＴＬＲ寛容の誘導を可能とした。この順次的な刺激はまた、ＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者の単球によって見られる炎症性曝露、すなわち、彼らのウイルス感染とそれに続く任意の２次的な細菌感染による曝露を反復する。この実験設計を用いて、我々は、ＬＰＳ又はポリＩ：Ｃ単独で処置された単球は、ポリＩ：ＣそしてＬＰＳで順次的に処置された単球と比較した場合、より低いレベルのＩＬ－６を分泌することを見出した。実際に、順次的に処置された単球は、ポリＩ：Ｃ又はＬＰＳ単独で処置された単球よりも、少なくとも１．２倍多くのＩＬ－６を産生した。一方で、ＭｎＯナノ粒子の添加は、ポリＩ：ＣそしてＬＰＳで順次的に処置された単球におけるＩＬ－６産生を完全に抑止可能であった。したがって、ＭｎＯ ＤＡＭＰ／ＰＡＭＰナノスカベンジャーでの処置は、順次的なＴＬＲ刺激に応じた単球によるＩＬ－６産生を有意に減少させ、それによりＴＬＲ寛容表現型の誘導を制限することができる（図１５Ｃ）。
【0083】
ＭｎＯナノ粒子によるアゴニスト誘導性ＴＬＲ活性化の阻害
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ３、ｈＴＬＲ８及びｈＴＬＲ９を、ＨＥＫ２９３細胞にｈＴＬＲ遺伝子及び最適化した分泌型胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を共導入することにより得た。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ細胞を、１０％のＦＢＳ及び１％のペニシリン－ストレプトマイシンとともにＤＭＥＭ中で培養及び維持した。ＴＬＲ活性化のナノ粒子阻害を評価するため、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ細胞を９６ウェルプレートに１時間播種し、そして、２μｌのアゴニスト（ＴＬＲ９に対してＣＰＧ Ｂｗ００６、ＴＬＲ３に対してポリ（Ｉ：Ｃ）又はＴＬＲ８に対してＯＲＮ０６／Ｌｙｏ Ｖｅｃであり、１ｍｇ／ｍｌ）で処置した。１０分間のインキュベーション後、２０μｌの異なる濃度でのナノ粒子を２００μｌの最終容量で導入した。２４時間後、上清を採取し、Ｑｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅと混合した。ＳＥＡＰ活性に関連するＴＬＲ活性化を、マルチウェルプレートリーダーで６２０ｎｍでのＯＤを測定することによって特定した。使用した（９６ウェルプレート中の）細胞密度は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ９細胞に対して８×１０４個／ウェル、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ３細胞に対して５×１０４個／ウェル、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ８細胞に対して４×１０４個／ウェルであった。これらの方法を用いて、ここに提供されるようなＭｎＯナノ粒子をＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ３、ｈＴＬＲ８及びｈＴＬＲ９を含む広範囲のＴＬＲ細胞において検証した。ナノ粒子は、ＦＢＳの存在又は非存在にかかわらず、用量依存的に、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ９細胞のＣｐＧ誘導性活性化を阻害し、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ３細胞のポリ（Ｉ：Ｃ）誘導性活性化及びＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ８細胞のＯＲＮ０６／ＬｙｏＶｅｃ（ＯＲＮ）誘導性活性化を阻害することを示す（図３Ｂ～Ｄ）。
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ３、ｈＴＬＲ８及びｈＴＬＲ９を、ＨＥＫ２９３細胞にｈＴＬＲ遺伝子及び最適化した分泌型胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を共導入することにより得た。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ細胞を、１０％のＦＢＳ及び１％のペニシリン－ストレプトマイシンとともにＤＭＥＭ中で培養及び維持した。ＴＬＲ活性化のナノ粒子阻害を評価するため、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ細胞を９６ウェルプレートに１時間播種し、そして、２μｌのアゴニスト（ＴＬＲ９に対してＣＰＧ Ｂｗ００６、ＴＬＲ３に対してポリ（Ｉ：Ｃ）又はＴＬＲ８に対してＯＲＮ０６／Ｌｙｏ Ｖｅｃであり、１ｍｇ／ｍｌ）で処置した。１０分間のインキュベーション後、２０μｌの異なる濃度でのナノ粒子を２００μｌの最終容量で導入した。２４時間後、上清を採取し、Ｑｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅと混合した。ＳＥＡＰ活性に関連するＴＬＲ活性化を、マルチウェルプレートリーダーで６２０ｎｍでのＯＤを測定することによって特定した。使用した（９６ウェルプレート中の）細胞密度は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ９細胞に対して８×１０４個／ウェル、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ３細胞に対して５×１０４個／ウェル、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ８細胞に対して４×１０４個／ウェルであった。これらの方法を用いて、ここに提供されるようなＭｎＯナノ粒子をＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ３、ｈＴＬＲ８及びｈＴＬＲ９を含む広範囲のＴＬＲ細胞において検証した。ナノ粒子は、ＦＢＳの存在又は非存在にかかわらず、用量依存的に、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ９細胞のＣｐＧ誘導性活性化を阻害し、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ３細胞のポリ（Ｉ：Ｃ）誘導性活性化及びＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ８細胞のＯＲＮ０６／ＬｙｏＶｅｃ（ＯＲＮ）誘導性活性化を阻害することを示す（図３Ｂ～Ｄ）。
【0084】
プラーク中和／低減アッセイ
最後に、プラーク低減中和試験（ＰＲＮＴ）を用いて、ＭｎＯナノ粒子がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合し、ウイルスの侵入、複製及びその後の細胞死を用量依存的に防止し得ることを示した。プラーク低減アッセイを、当業者に利用可能な標準的な方法を用いて行った。簡潔には、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞を２４ウェルプレートに標準培地において１×１０５個／ウェルで一晩播種し、１００μｇ／ｍＬから始めてＭｎＯナノ粒子の連続希釈物をウェルに添加し、２倍希釈を行った。陰性コントロールを含めた。そして、Ｓａｒｓ－ＣｏＶ－２を５０ｐｆｕ／ウェルで添加し、３０分間インキュベーションした。アッセイについて、２×ＭＥＭ中の１．２％のメチルセルロースの１ｍＬを各ウェルに添加し、アッセイを４日間インキュベーションした。オーバーレイを除去し、プレートを１０％のＮＢＦで固定し、Ｃｒｙｓｔａｌ Ｖｉｏｌｅｔで染色した。そして、各ウェルについてプラークを計数し、全てのウェルをデュプリケートで完成した。重要なこととして、ＭｎＯナノ粒子は、ヨーロッパの「Ｇ」変異体及び南アフリカの「Ｂ．１．１．７」変異体を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複数の株を中和することが示された（図１７）。このアプローチを用いて、株にかかわらずウイルスの取り込み及び複製を制限可能とする汎ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２阻害剤を確立した。この発見の含意は、コロナウイルスのパンデミックに対処する強力な手段を提供する。ナノ粒子による治療薬は、経鼻的に送達され、あらゆるＳＡＲｓ－ＣｏＶ－２変異体の取り込み及び複製を制限し得る。我々の治療法は、摂氏４度で安定に保存され得る。これは、ＳＡＲｓ－ＣｏＶ－２の全ての変異体へのほぼ常時の曝露によりワクチン接種に加えて防御を必要とする医療従事者にとって絶大なインパクトを有しうる。それはまた、－８０℃での保存を必要とするワクチンを入手できない人々にも、予防の手段を提供できる可能性を有する。
最後に、プラーク低減中和試験（ＰＲＮＴ）を用いて、ＭｎＯナノ粒子がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合し、ウイルスの侵入、複製及びその後の細胞死を用量依存的に防止し得ることを示した。プラーク低減アッセイを、当業者に利用可能な標準的な方法を用いて行った。簡潔には、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞を２４ウェルプレートに標準培地において１×１０５個／ウェルで一晩播種し、１００μｇ／ｍＬから始めてＭｎＯナノ粒子の連続希釈物をウェルに添加し、２倍希釈を行った。陰性コントロールを含めた。そして、Ｓａｒｓ－ＣｏＶ－２を５０ｐｆｕ／ウェルで添加し、３０分間インキュベーションした。アッセイについて、２×ＭＥＭ中の１．２％のメチルセルロースの１ｍＬを各ウェルに添加し、アッセイを４日間インキュベーションした。オーバーレイを除去し、プレートを１０％のＮＢＦで固定し、Ｃｒｙｓｔａｌ Ｖｉｏｌｅｔで染色した。そして、各ウェルについてプラークを計数し、全てのウェルをデュプリケートで完成した。重要なこととして、ＭｎＯナノ粒子は、ヨーロッパの「Ｇ」変異体及び南アフリカの「Ｂ．１．１．７」変異体を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複数の株を中和することが示された（図１７）。このアプローチを用いて、株にかかわらずウイルスの取り込み及び複製を制限可能とする汎ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２阻害剤を確立した。この発見の含意は、コロナウイルスのパンデミックに対処する強力な手段を提供する。ナノ粒子による治療薬は、経鼻的に送達され、あらゆるＳＡＲｓ－ＣｏＶ－２変異体の取り込み及び複製を制限し得る。我々の治療法は、摂氏４度で安定に保存され得る。これは、ＳＡＲｓ－ＣｏＶ－２の全ての変異体へのほぼ常時の曝露によりワクチン接種に加えて防御を必要とする医療従事者にとって絶大なインパクトを有しうる。それはまた、－８０℃での保存を必要とするワクチンを入手できない人々にも、予防の手段を提供できる可能性を有する。
【0085】
検討：
本研究では、我々は、上昇したレベルの核酸含有ＤＡＭＰ／ＰＡＭＰがＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者の血清及びＥＴＡ中に存在することを実証する免疫及び分子アッセイを行った。我々はまた、死亡したＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者において、単球のＴＬＲ寛容表現型を観察した。我々は、２つの生体材料がＤＡＭＰ／ＰＡＭＰ介在性過剰炎症を緩和するのに潜在的に使用され得ることを確証した。患者の血清及びＥＴＡを用いたＴＬＲ活性化分析は、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９シグナル伝達の強力な刺激によって示されるような全身性及び局所性の炎症を明らかにした。特に気道において高いＤＡＭＰ及びＰＡＭＰは、全身性の循環へ流出しやすく、持続的なＴＬＲ刺激を介した過剰炎症をもたらす。我々は、死亡したＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者と比較して、回復した患者は、ウイルスのｓｓＲＮＡによるＴＬＲ７／８活性化に応答することが知られているより高い個体数のＣＤ１６＋単球を有することを観察した。我々は、これらの単球における機能的差異を特徴付け、異なる臨床転帰を有する患者がプロトタイプのウイルスＰＡＭＰ及び細菌ＰＡＭＰへの異なる応答を起こすことを見出した［３１］。ＩＣＵ生存者及び非生存者における単球の特徴付けるために、我々は、ＴＬＲアゴニストでの活性化後の単球サブセットの応答を測定し、患者からの血清プロテオームをアッセイした。これらの免疫プロファイリング分析、トランスクリプトーム分析及びプロテオーム分析は全て、核酸含有ＤＡＭＰ／ＰＡＭＰが重篤なＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者において中心的な病理学的役割を果たすことを示唆した。したがって、我々は、核酸捕捉剤がこれらのＩＣＵ患者からのサンプルにおいてそのようなＤＡＭＰ／ＰＡＭＰに対抗するのに利用され得るか否かを探索した。我々は、これらの過剰炎症性の肺及び血液サンプルの活性化可能性を中和するための、２個の相補的な生体材料によるアプローチであるマイクロ繊維及び可溶性ナノ粒子を説明する。
本研究では、我々は、上昇したレベルの核酸含有ＤＡＭＰ／ＰＡＭＰがＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者の血清及びＥＴＡ中に存在することを実証する免疫及び分子アッセイを行った。我々はまた、死亡したＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者において、単球のＴＬＲ寛容表現型を観察した。我々は、２つの生体材料がＤＡＭＰ／ＰＡＭＰ介在性過剰炎症を緩和するのに潜在的に使用され得ることを確証した。患者の血清及びＥＴＡを用いたＴＬＲ活性化分析は、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９シグナル伝達の強力な刺激によって示されるような全身性及び局所性の炎症を明らかにした。特に気道において高いＤＡＭＰ及びＰＡＭＰは、全身性の循環へ流出しやすく、持続的なＴＬＲ刺激を介した過剰炎症をもたらす。我々は、死亡したＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者と比較して、回復した患者は、ウイルスのｓｓＲＮＡによるＴＬＲ７／８活性化に応答することが知られているより高い個体数のＣＤ１６＋単球を有することを観察した。我々は、これらの単球における機能的差異を特徴付け、異なる臨床転帰を有する患者がプロトタイプのウイルスＰＡＭＰ及び細菌ＰＡＭＰへの異なる応答を起こすことを見出した［３１］。ＩＣＵ生存者及び非生存者における単球の特徴付けるために、我々は、ＴＬＲアゴニストでの活性化後の単球サブセットの応答を測定し、患者からの血清プロテオームをアッセイした。これらの免疫プロファイリング分析、トランスクリプトーム分析及びプロテオーム分析は全て、核酸含有ＤＡＭＰ／ＰＡＭＰが重篤なＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者において中心的な病理学的役割を果たすことを示唆した。したがって、我々は、核酸捕捉剤がこれらのＩＣＵ患者からのサンプルにおいてそのようなＤＡＭＰ／ＰＡＭＰに対抗するのに利用され得るか否かを探索した。我々は、これらの過剰炎症性の肺及び血液サンプルの活性化可能性を中和するための、２個の相補的な生体材料によるアプローチであるマイクロ繊維及び可溶性ナノ粒子を説明する。
【0086】
死亡患者及び回復患者からの単離された単球をＴＬＲアゴニストで刺激することによって、我々は、同じ細胞学的表現型を有する細胞が異なる分子バイオマーカーを含み、患者を異なる臨床転帰で区別する差次的な転写応答を受けることを発見した。全体として、回復患者からの単球はＴＬＲ活性化に対して強固な抗ウイルス応答を発揮するのに対し、死亡患者からの単球は、ＴＮＦ－α及びアラーミンｍＲＮＡの発現を介して、ＣＯＶＩＤ－１９患者において観察されるサイトカインストームの影響を増幅する。死亡患者において観察されるこれらの分子パターンは、ＭＡＰＫ及びＡＰ－１のシグナル伝達パスウェイによって誘導されるＩＬ－１２産生の欠如によって示されるＴＬＲ寛容の概念と一致する［１５、３２、３３、３４、３５、３６］。実際、我々は、ＴＬＲ寛容を初期のウイルス感染及び２次的な細菌感染で誘導したマウスからの先天性骨髄細胞におけるＩＬ－１２産生の以前の特徴付けと一致するトランスクリプトームプロファイルを同定した［７９、８０］。一方で、ＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ死亡患者からのＣＤ１６＋単球は、ベースラインで減少した発現のＪＵＮＤを有し、ＬＰＳ又はＲ８４８での刺激に際してＡＰ－１シグナル伝達パスウェイを活性化しなかった（データ不図示）。この観察結果は、寛容単球はＩＬ－１２を産生する能力を失い、患者を２次的な細菌感染の増加したリスクに置くことを示唆する［３７、４０、８１］。したがって、深刻なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染時に増加及び長期化した炎症は、臨床転帰不良をもたらし得る、その後の感染に対する十分な応答を防止する免疫抑制された表現型を生じさせ得る。我々のデータは、死亡患者がＴＬＲ寛容単球を有するだけでなく、死亡患者の第２の独立したグループが有意に上昇した深刻な細菌感染のタンパク性マーカーを有することを示す。我々のプロテオームデータは、最終的にＩＣＵにおいて死亡した患者が、特に感染後期の時点で、彼らの血中に有意により低いレベルのＭＡＲＣＯ並びにＡＰＯＡ１、ＡＰＯＡ２、ＡＰＯＨ及びＡＰＯＤを含むアポリポタンパク質などのＰＡＭＰ及びＤＡＭＰキャリアタンパク質を有したことを明らかにする。ＭＡＲＣＯ及びアポリポタンパク質は、ＰＡＭＰに結合し、免疫細胞にそれらを輸送し、かつＬＰＳを中和してサイトカインストームを和らげるそれらの能力により、細菌感染に対して保護することが示されている［７３、７４、７５、７６、７７］。これらの因子の循環レベルの低下は、それらのリガンドが長期にわたって豊富であることに起因するＰＡＭＰキャリアの消費によりもたらされる可能性が最も高く、それはＴＬＲ過剰活性化と一致し、これらの患者を２次的な細菌感染にかかりやすくする可能性がある。
【0087】
残念ながら、以前の研究は、ＴＬＲ寛容となった単球を救済することが困難であることを示している［３７］。したがって、ＣＯＶＩＤ－１９患者が重篤となるのを処置又は停止するように設計される治療戦略は、ほぼ確実に、最初にＴＬＲ寛容の発生を防止する必要がある。これを考慮して、我々は、核酸結合マイクロ繊維及びナノ粒子を用いてＴＬＲアゴニストを中和し、枯渇した内因性ＰＡＭＰスカベンジャーのＭＡＲＣＯ及びアポリポタンパク質の機能を効果的に補完する戦略を評価した。我々及び他者が、外傷、敗血症、癌、インフルエンザ及び現在のＣＯＶＩＤ－１９のモデルにおいて示しているように、核酸結合生体材料を用いて循環からＤＡＭＰ及びＰＡＭＰを中和又は除去することは、ＴＬＲ活性化を防止することによって全身性の炎症及びＴＬＲ寛容を減少させ得る［１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２１、２２］。マイクロ繊維メッシュ戦略は、ＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者を処置するのに一般的に用いられる透析のためのフィルター及び体外式膜型人工肺（ＥＣＭＯ）を含む様々な装置における使用のために理論的に改変され得る［８２］。ＭｎＯによるナノスカベンジャーは、侵襲的気道確保を必要とする前に、患者における全身性送達又は吸入送達に使用可能である。ウイルス誘導性呼吸不全により挿管された患者は、２次的な人工呼吸器関連細菌性肺炎（ＶＡＰ）にかかりやすい［８３、８４、８５］。これらの細菌は、病原性因子ＬＰＳのそれらの表面発現によって認識される。マウスにおけるＬＰＳでの２次的免疫チャレンジは、深刻な炎症反応及び高い死亡率を引き起こし、ＣＯＶＩＤ－１９により死亡するＩＣＵ患者において観察されるものと同様の軌跡を定義した［８１、８６］。ＴＬＲ寛容は、ＣＯＶＩＤ－１９に関連するＶＡＰの場合のように、その後の免疫チャレンジに的確に応答する単球の能力の喪失及び転帰不良をもたらす。ＭｎＯは、ＣＯＶＩＤ－１９による重篤者において、ＰＡＭＰ／ＤＡＭＰによって逸走される内因性スカベンジャーを補完及び補充するのに有用であることを証明し得る。図１５に示すように、ＭｎＯナノスカベンジャーは、ＣＯＶＩＤ－１９患者サンプルによるＴＬＲ刺激を制限する。ＴＬＲ刺激を制限することにより、そのようなナノ粒子は、ＴＬＲ過剰刺激によって引き起こされる患者単球のＴＬＲ寛容を抑止するはずである。
【0088】
ここで、このＤＡＭＰ／ＰＡＭＰ中和の概念のｉｎ ｖｉｖｏ移行は、疾患の他の動物モデルにおいて観察されているように、ＣＯＶＩＤ－１９感染の状況において転帰を改善し得るか否かを特定することを試験されることを必要とする［１１、１２、１３、１４、１６、１７］。特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に関連することとして、我々は、ＤＡＭＰ／ＰＡＭＰの中和がインフルエンザ及び敗血症の動物モデルにおいて転帰を改善することを示している［１３、１９、２０］。提案されたマイクロ繊維によるＤＡＭＰ／ＰＡＭＰ捕獲戦略の実用性を特徴付け得るＥＣＭＯ動物モデルの確立を可能とするように、ＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者において観察されたＴＬＲ寛容表現型を反復するＣＯＶＩＤ－１９の大型動物モデルを用いたさらなる研究が遂行されるべきである。我々は、同様のＴＬＲ寛容単球が非ＣＯＶＩＤ－１９のＡＲＤＳの患者と関連するか否かを検討しなかったが、共通の免疫病理学が敗血症及び他の深刻な感染における機能不全の根底に同様にあり得ると仮定する。さらに、我々は、ＴＬＲも発現し、ＣＯＶＩＤ－１９血栓性炎症症候群にも関与している好中球及び血小板の役割を調べられなかった。新鮮な血液を用いたさらなる研究が、ＣＯＶＩＤ－１９及び他の感染症におけるＴＬＲ媒介性炎症応答へのこれらの細胞の寄与並びにそのような過剰炎症を制御するマイクロ繊維及びナノ粒子によるＤＡＭＰ／ＰＡＭＰスカベンジャーの潜在的な実用性を比較するのに必要とされる。
【0089】
要約すると、我々は、核酸含有ＤＡＭＰ／ＰＡＭＰがＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者の肺及び血液において大幅に上昇していること並びにそのような患者から単離されたＣＤ１６＋単球は、臨床転帰を反映するＴＬＲ活性化表現型によって定義されることを観察する。具体的には、死亡患者からの細胞は、繰り返される慢性的なＤＡＭＰ／ＰＡＭＰ誘導性炎症のためにＴＬＲ活性化に対して寛容となるが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染から回復する患者は、ＴＬＲ７／８などのＴＬＲの活性化を通じて有能な抗ウイルス免疫応答を発揮可能なＣＤ１６＋単球を有する。我々は、死亡患者からの単球が、核酸ＤＡＭＰ／ＰＡＭＰが患者の血清及びＥＴＡにおいて大幅に上昇しているという観察結果と一致する、ＴＬＲ寛容に特徴的なトランスクリプトームマーカー及びタンパク性マーカーを有することを観察した。我々は、適切に開発されれば、過剰炎症及び単球のＴＬＲ寛容を防止し、ＣＯＶＩＤ－１９で重症の個人について臨床転帰を改善し得るような炎症性媒介物質を中和する２つの相補的なアプローチを試験した。
【0090】
材料及び方法：
ＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵの研究集団
本研究は、Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）によって承認された（Ｐｒｏ ００１０１１９６）。適格な患者は、ＰＣＲ試験によって確認されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染により成人ＩＣＵに入院した１８歳以上の男女である。インフォームドコンセントは、患者又は彼らの法的代理人（ＬＡＲ）から得た。
ＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵの研究集団
本研究は、Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）によって承認された（Ｐｒｏ ００１０１１９６）。適格な患者は、ＰＣＲ試験によって確認されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染により成人ＩＣＵに入院した１８歳以上の男女である。インフォームドコンセントは、患者又は彼らの法的代理人（ＬＡＲ）から得た。
【0091】
Ｄｕｋｅ ＩＣＵのＣＯＶＩＤ－１９バイオレポジトリ
我々は、全血及び気管内吸引液（ＥＴＡ）上清を採取した。全血を血清、クエン酸血漿、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）血漿及び末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に分離した。ＥＴＡを６００ｇで１０分間、４℃でスピンダウンした。上清をピペットで取り除き、ペレット及び上清を－８０℃で保存した。サンプルを試験１日目、３日目、７日目、１４日目及び２１日目に採取した。本論文で報告される全てのデータは、Ｄｕｋｅ ＩＣＵのバイオレポジトリからの患者サンプルにより得られたものであり、本研究はバイオレポジトリチームと共同で行われた。
我々は、全血及び気管内吸引液（ＥＴＡ）上清を採取した。全血を血清、クエン酸血漿、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）血漿及び末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に分離した。ＥＴＡを６００ｇで１０分間、４℃でスピンダウンした。上清をピペットで取り除き、ペレット及び上清を－８０℃で保存した。サンプルを試験１日目、３日目、７日目、１４日目及び２１日目に採取した。本論文で報告される全てのデータは、Ｄｕｋｅ ＩＣＵのバイオレポジトリからの患者サンプルにより得られたものであり、本研究はバイオレポジトリチームと共同で行われた。
【0092】
本研究に関与する患者の臨床的特徴付けの概要を、以下の表１に示す。
表１．研究に関与する患者の臨床的特徴付け
表１．研究に関与する患者の臨床的特徴付け
【表1】
【0093】
健常コントロール
全血を健常ドナーから採取し、同様に処理した。
全血を健常ドナーから採取し、同様に処理した。
【0094】
試薬
健常ドナーからプールされたヒト血清はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。ＣｐＧ ＯＤＮ２００６、ポリＩ：Ｃ、ＬＰＳ、Ｒ８４８はＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社から購入した。ＥＬＩＳＡキットは、以下のＨＭＧＢ－１（Ｔｅｃａｎ社－ＳＴ５１０１１）、Ｃｅｌｌ－Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ Ｐｌｕｓ（Ｒｏｃｈｅ社－１１，７７４，４２５，００１）、アルブミン（Ａｂｃａｍ社－ａｂ１７９８８７）のように購入した。Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ染色及びＲｉｂｏｇｒｅｅｎ染色は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から得た（Ｐ７５８９及びＲ４１１９０）。ＰＡＭＡＭ－Ｇ３による核酸結合繊維及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）による核酸結合繊維は、Ｊａｅｗｏｏ Ｌｅｅ博士から快く提供され、前述したように合成された［１５］。
健常ドナーからプールされたヒト血清はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。ＣｐＧ ＯＤＮ２００６、ポリＩ：Ｃ、ＬＰＳ、Ｒ８４８はＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社から購入した。ＥＬＩＳＡキットは、以下のＨＭＧＢ－１（Ｔｅｃａｎ社－ＳＴ５１０１１）、Ｃｅｌｌ－Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ Ｐｌｕｓ（Ｒｏｃｈｅ社－１１，７７４，４２５，００１）、アルブミン（Ａｂｃａｍ社－ａｂ１７９８８７）のように購入した。Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ染色及びＲｉｂｏｇｒｅｅｎ染色は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から得た（Ｐ７５８９及びＲ４１１９０）。ＰＡＭＡＭ－Ｇ３による核酸結合繊維及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）による核酸結合繊維は、Ｊａｅｗｏｏ Ｌｅｅ博士から快く提供され、前述したように合成された［１５］。
【0095】
核酸結合繊維の合成並びに血清及びＥＴＡからのＴＬＲリガンドの除去
前述したように、エレクトロスピニング法を利用して核酸結合マイクロ繊維を生成した［１５］。簡潔には、ポリ（スチレン－アルト無水マレイン酸）（ＰＳＭＡ）ポリマーメッシュを用いて、ＰＳＭＡ及びポリスチレンコポリマーの混合物を含むマイクロ繊維メッシュ上にＰＡＭＡＭ－Ｇ３又はＰＥＩを機能的に固定化した［８７、８８］。前述したように［８７、８９］、ＰＳＭＡ（０．３ｇ）（Ｓｉｇｍａ社、マサチューセッツ州、セントルイス）及びポリスチレン（０．４ｇ）（Ｓｉｇｍａ社）を、テトラヒドロフラン：アセトン：ジメチルホルムアミドの１：１：１（ｖ：ｖ：ｖ）混合物（３ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ社）に室温で溶解し、マイクロ繊維を、２ｍＬのコポリマー溶液を約１７．３ｋＶの印加電圧で２ｍＬ／ｈの分注速度でエレクトロスピニングすることによって生成した。マイクロ繊維メッシュを生成するために、記載されるように［１５］マイクロ繊維を接地した円筒状のマンドレルにおいて採取した。ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭ－Ｇ３をＰＳＭＡ／ポリスチレンマイクロ繊維メッシュにおいて固定化するために、１．８ｋＤａの分岐ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ペンシルバニア州、ワーリントン）（０．００５Ｍ）及びＰＡＭＡＭ－Ｇ３（０．００４Ｍ）（Ｓｉｇｍａ社）を、記載されるように［１５］室温（ＰＥＩ）又は４℃（ＰＡＭＡＭ－Ｇ３）で７２時間インキュベーションした。
前述したように、エレクトロスピニング法を利用して核酸結合マイクロ繊維を生成した［１５］。簡潔には、ポリ（スチレン－アルト無水マレイン酸）（ＰＳＭＡ）ポリマーメッシュを用いて、ＰＳＭＡ及びポリスチレンコポリマーの混合物を含むマイクロ繊維メッシュ上にＰＡＭＡＭ－Ｇ３又はＰＥＩを機能的に固定化した［８７、８８］。前述したように［８７、８９］、ＰＳＭＡ（０．３ｇ）（Ｓｉｇｍａ社、マサチューセッツ州、セントルイス）及びポリスチレン（０．４ｇ）（Ｓｉｇｍａ社）を、テトラヒドロフラン：アセトン：ジメチルホルムアミドの１：１：１（ｖ：ｖ：ｖ）混合物（３ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ社）に室温で溶解し、マイクロ繊維を、２ｍＬのコポリマー溶液を約１７．３ｋＶの印加電圧で２ｍＬ／ｈの分注速度でエレクトロスピニングすることによって生成した。マイクロ繊維メッシュを生成するために、記載されるように［１５］マイクロ繊維を接地した円筒状のマンドレルにおいて採取した。ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭ－Ｇ３をＰＳＭＡ／ポリスチレンマイクロ繊維メッシュにおいて固定化するために、１．８ｋＤａの分岐ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ペンシルバニア州、ワーリントン）（０．００５Ｍ）及びＰＡＭＡＭ－Ｇ３（０．００４Ｍ）（Ｓｉｇｍａ社）を、記載されるように［１５］室温（ＰＥＩ）又は４℃（ＰＡＭＡＭ－Ｇ３）で７２時間インキュベーションした。
【0096】
患者の血清［１０μＬ］又はＥＴＡ［１μＬ］を無血清ＡＩＭ－Ｖ培地で１００μＬの最終容量に希釈した。希釈物をＰＡＭＡＭ－Ｇ３による繊維とともに３７℃で３０分間、回転させながらインキュベーションした。ＴＬＲレポーターアッセイにおける使用の前に、懸濁液を除去し、ＰＥＩによる繊維及びＰＡＭＡＭによる繊維と、各々３７℃で３０分間、回転させながら組み合わせた。この順次的な繊維による戦略は、以前の研究において最も効果的な捕捉繊維アプローチとして検証された［１５］。
【0097】
ＭｎＯナノ粒子の合成並びにＭｎＯナノ粒子を用いた血清及びＥＴＡからのＴＬＲリガンドの中和
酸化マンガンは、マンガン化合物（例えば、酢酸マンガン）及び酸（例えば、タンニン酸）を高温（例えば、１００～１５０℃）で用いることによって合成され得る。酢酸マンガン及びタンニン酸のミリＱ水中の混合物（酢酸マンガン及びタンニン酸の質量比は１：２～６である）を室温で１０分間撹拌し、そして、溶液をオートクレーブに移す。１５０℃での２時間の熱処理後、サンプル溶液を５０℃未満まで自然冷却する。ＭｎＯナノ粒子のサイズは３０～１００ｎｍの範囲であり、ゼータ電位は約－２０ｍＶである。
酸化マンガンは、マンガン化合物（例えば、酢酸マンガン）及び酸（例えば、タンニン酸）を高温（例えば、１００～１５０℃）で用いることによって合成され得る。酢酸マンガン及びタンニン酸のミリＱ水中の混合物（酢酸マンガン及びタンニン酸の質量比は１：２～６である）を室温で１０分間撹拌し、そして、溶液をオートクレーブに移す。１５０℃での２時間の熱処理後、サンプル溶液を５０℃未満まで自然冷却する。ＭｎＯナノ粒子のサイズは３０～１００ｎｍの範囲であり、ゼータ電位は約－２０ｍＶである。
【0098】
患者の血清［１０μＬ］又はＥＴＡ［１μＬ］を、無血清ＡＩＭ－Ｖ培地で１００μＬの最終容量に希釈した。ＴＬＲレポーターアッセイ及び単球刺激アッセイにおける使用の前に、希釈物をＭｎＯとともに３７℃で３０分間、回転させながらインキュベーションした。
【0099】
全血フローサイトメトリー
免疫サブセットプロファイリング抗体パネルをＢｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ社から得た。製造元の指示に従い、１本の基本免疫サブセットパネルのチューブ（Ｂ５３３０９）及び１本の顆粒球パネルのチューブ（Ｂ８８６５１）を、患者ごとに時点ごとに用いた。ＢＳＬ２＊のバイオセーフティ慣行に従い、固定及び染色された細胞を、Ｔｈｅ Ｄｕｋｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｃｏｒｅ（ＤＩＰＣ）による採取後２日以内に取得した。データを、ＦｌｏｗＪｏを用いて分析した。
免疫サブセットプロファイリング抗体パネルをＢｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ社から得た。製造元の指示に従い、１本の基本免疫サブセットパネルのチューブ（Ｂ５３３０９）及び１本の顆粒球パネルのチューブ（Ｂ８８６５１）を、患者ごとに時点ごとに用いた。ＢＳＬ２＊のバイオセーフティ慣行に従い、固定及び染色された細胞を、Ｔｈｅ Ｄｕｋｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｃｏｒｅ（ＤＩＰＣ）による採取後２日以内に取得した。データを、ＦｌｏｗＪｏを用いて分析した。
【0100】
ＴＬＲ活性化アッセイ
ＨＥＫ－ＢｌｕｅヒトＴＬＲ３、４、７及び９レポーター細胞株を、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社から購入した（ｈｋｂ－ｈｔｌｒ３、ｈｋｂ－ｈｔｌｒ４、ｈｋｂ－ｈｔｌｒ７、ｈｋｂ－ｔｌｒ９）。活性化を、ＱＵＡＮＴＩ－ｂｌｕｅ ＳＥＡＰ検出培地（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）を用いて、製造元の指示に従って特定した。細胞を４００００個／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、１００μＬの最終容量の培地中の、培地、低分子量（ＬＭＷ）ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）［１μｇ／ｍＬ］、リポ多糖（ＬＰＳ）［１μｇ／ｍＬ］、Ｒ８４８（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）［１μｇ／ｍＬ］若しくはＣｐＧ ＯＤＮ２００６［１μＭ］、プールした健常ヒト血清［１０μＬ］、ＣＯＶＩＤ－１９患者の血清［１０μＬ］又はＣＯＶＩＤ－１９患者のＥＴＡ［２μＬ］で１２時間処置した。細胞上清を採取し、ＱＵＡＮＴＩ－ｂｌｕｅと２０：８０の容積：容積の比で混合し、３７℃で９０分間インキュベーションした。吸光度を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて６５５ｎｍで測定した。全てのサンプルをトリプリケートで行い、結果を比較吸光度値として報告する。
ＨＥＫ－ＢｌｕｅヒトＴＬＲ３、４、７及び９レポーター細胞株を、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社から購入した（ｈｋｂ－ｈｔｌｒ３、ｈｋｂ－ｈｔｌｒ４、ｈｋｂ－ｈｔｌｒ７、ｈｋｂ－ｔｌｒ９）。活性化を、ＱＵＡＮＴＩ－ｂｌｕｅ ＳＥＡＰ検出培地（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）を用いて、製造元の指示に従って特定した。細胞を４００００個／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、１００μＬの最終容量の培地中の、培地、低分子量（ＬＭＷ）ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）［１μｇ／ｍＬ］、リポ多糖（ＬＰＳ）［１μｇ／ｍＬ］、Ｒ８４８（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）［１μｇ／ｍＬ］若しくはＣｐＧ ＯＤＮ２００６［１μＭ］、プールした健常ヒト血清［１０μＬ］、ＣＯＶＩＤ－１９患者の血清［１０μＬ］又はＣＯＶＩＤ－１９患者のＥＴＡ［２μＬ］で１２時間処置した。細胞上清を採取し、ＱＵＡＮＴＩ－ｂｌｕｅと２０：８０の容積：容積の比で混合し、３７℃で９０分間インキュベーションした。吸光度を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて６５５ｎｍで測定した。全てのサンプルをトリプリケートで行い、結果を比較吸光度値として報告する。
【0101】
ＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者からの単球のシングルセルＲＮＡシーケンシング
ＩＣＵバイオレポジトリ（上記参照）の一部として分離及び凍結されたＰＢＭＣをこの実験に用いた。抗炎症／免疫調節薬デキサメタゾンを投与されなかった、回復した３名の患者及びパンデミックの初期に死亡した３名の患者からのＰＢＭＣを用いた。ＰＢＭＣを３７℃で解凍し、ＦＢＳを含まないＡＩＭ－Ｖ培地に再懸濁した。その後、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ社のビーズによる単離キット（１９，０５８）を用いて、全ＰＢＭＣから単球を単離した。そして、各患者から単離した単球を、低結合性の２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社－３４７３）の３ウェルに分配した。そして、これらの単球を培地、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）又はＲ８４８（１μｇ／ｍＬ）で３７℃で６時間処置した。そして、これらの単球を温めたＡＩＭ－Ｖ培地で１回洗浄し、シングルセルＲＮＡシーケンシングコアに運んだ。
ＩＣＵバイオレポジトリ（上記参照）の一部として分離及び凍結されたＰＢＭＣをこの実験に用いた。抗炎症／免疫調節薬デキサメタゾンを投与されなかった、回復した３名の患者及びパンデミックの初期に死亡した３名の患者からのＰＢＭＣを用いた。ＰＢＭＣを３７℃で解凍し、ＦＢＳを含まないＡＩＭ－Ｖ培地に再懸濁した。その後、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ社のビーズによる単離キット（１９，０５８）を用いて、全ＰＢＭＣから単球を単離した。そして、各患者から単離した単球を、低結合性の２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社－３４７３）の３ウェルに分配した。そして、これらの単球を培地、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）又はＲ８４８（１μｇ／ｍＬ）で３７℃で６時間処置した。そして、これらの単球を温めたＡＩＭ－Ｖ培地で１回洗浄し、シングルセルＲＮＡシーケンシングコアに運んだ。
【0102】
細胞をＴｏｔａｌＳｅｑ－Ｂ抗ヒト ハッシュタグ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社－サンディエゴ、ＣＡ＃３９４６３１、３９４６３３、３９４６３５、３９４６３７及び３９４６３９）で、製造元のプロトコールに従い、わずかな改変を加えて染色した。細胞をＣｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ社－マサチューセッツ州、ローレンス）でヨウ化プロピジウム及びアクリジンオレンジを用いて計数し、計数の正確性及び細胞生存能力を保証した。細胞を５μＬのＨｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎ（商標）Ｆｃ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社－サンディエゴ、ＣＡ＃４２２３０１）と共に５０μＬの細胞染色緩衝液（ＣＳＢ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社－サンディエゴ、ＣＡ＃４２０２０１）に再懸濁し、氷上で１０分間インキュベーションした。Ｆｃブロッキング後、インキュベーション上清を除去し、各細胞サンプルを以前に決定したハッシュタグ抗体（表２参照）で染色し、氷上で３０分間インキュベーションした。
【表2】
【0103】
インキュベーション後、細胞を３回洗浄し、１．５×１０６個／ｍＬの濃度で再懸濁し、４０μｍのＦｌｏｗｍｉ Ｃｅｌｌ Ｓｔｒａｉｎｅｒ（Ｂｅｌ－Ａｒｔ社 Ｈ１３６８０－００４０）でろ過した。ハッシュタグ染色した細胞を表に従ってプールし（１サンプルあたり２０００個の細胞、１プールあたり４又は５サンプル）、１０ｘＧｅｎｏｍｉｃｓ ＮｅｘｔＧＥＭチップに充填した。
【0104】
４個の遺伝子発現ライブラリー及び４個のハッシュタグオリゴライブラリーを、ｔｈｅ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｎｅｘｔ ＧＥＭ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔｓ ｖ３．１ ｗｉｔｈ ｆｅａｔｕｒｅ ｂａｒｃｏｄｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ＣＧ０００２０６ ｖｅｒｓｉｏｎＤに従って、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ ＮｅｘｔＧＥＭ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’ｖ３．１ ａｓｓａｙ（１０ｘＧｅｎｏｍｉｃｓ社 ＰＮ－１０００１２８）、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｎｅｘｔ ＧＥＭ Ｃｈｉｐ Ｇ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｋｉｔ（ＰＮ－１０００１２７）及びＳｉｎｇｌｅ Ｉｎｄｅｘ Ｋｉｔ Ｓｅｔ Ａ（ＰＮ－１０００１２７）を用いて作製した。細胞を、逆転写（ＲＴ）試薬を含むマスターミックスに再懸濁し、そして、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ Ｒｅａｄ １シーケンシングプライマー、１６ｎｔの１０ｘバーコード、１２ｎｔの固有分子識別子及びＲＴのためのポリｄＴプライマーを担持するゲルビーズと結合させた。全長ｃＤＮＡをＤｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ ＳＩＬＡＮＥで精製し、続けてｃＤＮＡ増幅を１１サイクル行った。増幅されたｃＤＮＡを、４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｄ５０００ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ社、カリフォルニア州、サンタクララ）においてアッセイし、２００～５０００ｂｐの長さを保証した。エンドリペア、Ａ－テーリング、アダプターライゲーション及びＰＣＲを介したＩｌｌｕｍｉｎａ（カリフォルニア州、サンディエゴ）のＰ５及びＰ７アダプター、ｉ５サンプルインデックス並びにＴｒｕＳｅｑ ｒｅａｄ２プライマーを添加する前に、酵素的断片化及びサイズ選択を用いて、ｃＤＮＡアンプリコンサイズを最適化した。Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｄ１０００ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅによるＡｇｉｌｅｎｔ ４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎにおけるアッセイの前に、ライブラリーを４００～５００ｂｐのサイズとするように、ＫＡＰＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔ ｑＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ社、ＫＫ４８７３）を用いて、ＡＢＩ ＶｉｉＡ７（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州、フォスターシティ）におけるＰ５及びＰ７アダプターのライゲーションを評価した。配列を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ ６０００におけるペアエンドシーケンシングを用いて、ペアエンド、約５００００リード／セルでのシングルインデックスフローセルにおいて生成した。
【0105】
ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータセット処理及び細胞タイプアノテーション
シーケンシングに続いて、１０ｘＧｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒパイプラインを用いてデータセットを逆多重化し、ＦＡＳＴＱファイル及びフィーチャーカウントマトリックスを生成した。ハッシュタグ標識されたリードを、全てのデフォルトパラメータ値を用いてＳｅｕｒａｔ３によって実施されたＨＴＯＤｅｍｕｘ（）関数を用いてそれぞれのサンプルにマッピングした［９０］。２００個未満又は３５００個より多くの遺伝子が検出された細胞を、下流分析から除去した。同様に、ミトコンドリアゲノムにマッピングするリードを１０％より多く有する細胞を、データセットから除去した。遺伝子数を対数正規化し、データセット統合のために上位２０００個の変動特徴（ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｅａｔｕｒｅ）を同定した。データセットを、次元数を３０に設定してＦｉｎｄＩｎｔｅｇｒａｔｉｏｎＡｎｃｈｏｒｓ（）関数及びＩｎｔｅｇｒａｔｅＤａｔａ（）関数を用いて、単一のＳｅｕｒａｔオブジェクトに統合した。主成分分析及びＵＭＡＰ次元削減を、最初の３０個の主成分を用いて実行した。Ｓｅｕｒａｔの関数ＳＣＴｒａｎｓｆｏｒｍ（）を統合されたデータセットに適用し、最初の２０個の主成分を考慮して、Ｈａｒｍｏｎｙパッケージを用いてＵＭＡＰ埋め込みを再計算した［９１］。そして、グラフによるクラスタリングを解像度＝１で行った。細胞タイプのアノテーションを、ＳｉｎｇｌｅＲパッケージにより提供されるシングルセルＲＮＡ－ｓｅｑリファレンスを用いて行った［９２］。具体的には、ＤａｔａｂａｓｅＩｍｍｕｎｅＣｅｌｌＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＤａｔａ（）関数によるアノテーションに基づいて、細胞をＣＤ１６－単球又はＣＤ１６＋単球として標識化した。単球としてアノテーションされない細胞を、下流分析から除去した。細胞タイプの標識を、Ｎｅｂｕｌｏｓａパッケージを用いて、全ての細胞のＣＤ１４及びＦＣＧＲ３Ａ（ＣＤ１６）の発現密度をＵＭＡＰとしてプロットすることによって確認した［９３］。
シーケンシングに続いて、１０ｘＧｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒパイプラインを用いてデータセットを逆多重化し、ＦＡＳＴＱファイル及びフィーチャーカウントマトリックスを生成した。ハッシュタグ標識されたリードを、全てのデフォルトパラメータ値を用いてＳｅｕｒａｔ３によって実施されたＨＴＯＤｅｍｕｘ（）関数を用いてそれぞれのサンプルにマッピングした［９０］。２００個未満又は３５００個より多くの遺伝子が検出された細胞を、下流分析から除去した。同様に、ミトコンドリアゲノムにマッピングするリードを１０％より多く有する細胞を、データセットから除去した。遺伝子数を対数正規化し、データセット統合のために上位２０００個の変動特徴（ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｅａｔｕｒｅ）を同定した。データセットを、次元数を３０に設定してＦｉｎｄＩｎｔｅｇｒａｔｉｏｎＡｎｃｈｏｒｓ（）関数及びＩｎｔｅｇｒａｔｅＤａｔａ（）関数を用いて、単一のＳｅｕｒａｔオブジェクトに統合した。主成分分析及びＵＭＡＰ次元削減を、最初の３０個の主成分を用いて実行した。Ｓｅｕｒａｔの関数ＳＣＴｒａｎｓｆｏｒｍ（）を統合されたデータセットに適用し、最初の２０個の主成分を考慮して、Ｈａｒｍｏｎｙパッケージを用いてＵＭＡＰ埋め込みを再計算した［９１］。そして、グラフによるクラスタリングを解像度＝１で行った。細胞タイプのアノテーションを、ＳｉｎｇｌｅＲパッケージにより提供されるシングルセルＲＮＡ－ｓｅｑリファレンスを用いて行った［９２］。具体的には、ＤａｔａｂａｓｅＩｍｍｕｎｅＣｅｌｌＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＤａｔａ（）関数によるアノテーションに基づいて、細胞をＣＤ１６－単球又はＣＤ１６＋単球として標識化した。単球としてアノテーションされない細胞を、下流分析から除去した。細胞タイプの標識を、Ｎｅｂｕｌｏｓａパッケージを用いて、全ての細胞のＣＤ１４及びＦＣＧＲ３Ａ（ＣＤ１６）の発現密度をＵＭＡＰとしてプロットすることによって確認した［９３］。
【0106】
ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータセットにおける差次的な発現の単変量検定
擬似バルク単変量検定を、ＣＤ１６－単球又はＣＤ１６＋単球のいずれかについての統合したシングルセル遺伝子発現プロファイルを用いて全サンプルについて行った。回復患者からの細胞を、培地、ＬＰＳ又はＲ８４８の３条件の各々において、死亡患者からの細胞と比較した。ＥｄｇｅＲパッケージを用いてＭＤＳ順序プロットを生成して、各単球サブ集団についての次元削減を行った［９４、９５］。ＭＤＳの埋め込み上に多角形をプロットしてサンプルのクラスターを可視化した。各細胞タイプについての遺伝子発現プロファイルを単一マトリックスに統合してＥｄｇｅＲパイプラインを用いて単変量検定を行った。単変量検定のための設計式に被検体の転帰を組み込み、３条件の各々の元でＣＤ１６－単球及びＣＤ１６＋単球の双方について差次的遺伝子発現試験を行った。対数倍変化エンリッチメント及びＦＤＲ補正ｐ値を、ＥｎｈａｎｃｅｄＶｏｌｃａｎｏパッケージ（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｋｅｖｉｎｂｌｉｇｈｅ／ＥｎｈａｎｃｅｄＶｏｌｃａｎｏ）を用いてプロットした。有意性を、絶対対数倍変化量が０．５超であり、ＦＤＲ補正ｐ値が０．０５未満であるとして定義した。差次的に発現した遺伝子セットの交点を計算し、ＵｐＳｅｔプロットとして可視化した［９６］。機能的エンリッチメント分析を死亡患者からのＣＤ１６＋単球において高発現を有する遺伝子についてｇ：Ｐｒｏｆｉｌｅｒを用いて行い、パスウェイレベルのエンリッチメントをＦＤＲ補正ｐ値として報告する［９７］。
擬似バルク単変量検定を、ＣＤ１６－単球又はＣＤ１６＋単球のいずれかについての統合したシングルセル遺伝子発現プロファイルを用いて全サンプルについて行った。回復患者からの細胞を、培地、ＬＰＳ又はＲ８４８の３条件の各々において、死亡患者からの細胞と比較した。ＥｄｇｅＲパッケージを用いてＭＤＳ順序プロットを生成して、各単球サブ集団についての次元削減を行った［９４、９５］。ＭＤＳの埋め込み上に多角形をプロットしてサンプルのクラスターを可視化した。各細胞タイプについての遺伝子発現プロファイルを単一マトリックスに統合してＥｄｇｅＲパイプラインを用いて単変量検定を行った。単変量検定のための設計式に被検体の転帰を組み込み、３条件の各々の元でＣＤ１６－単球及びＣＤ１６＋単球の双方について差次的遺伝子発現試験を行った。対数倍変化エンリッチメント及びＦＤＲ補正ｐ値を、ＥｎｈａｎｃｅｄＶｏｌｃａｎｏパッケージ（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｋｅｖｉｎｂｌｉｇｈｅ／ＥｎｈａｎｃｅｄＶｏｌｃａｎｏ）を用いてプロットした。有意性を、絶対対数倍変化量が０．５超であり、ＦＤＲ補正ｐ値が０．０５未満であるとして定義した。差次的に発現した遺伝子セットの交点を計算し、ＵｐＳｅｔプロットとして可視化した［９６］。機能的エンリッチメント分析を死亡患者からのＣＤ１６＋単球において高発現を有する遺伝子についてｇ：Ｐｒｏｆｉｌｅｒを用いて行い、パスウェイレベルのエンリッチメントをＦＤＲ補正ｐ値として報告する［９７］。
【0107】
単球サブセットに適用された非負値行列因子分解
非負値行列因子分解のＣｏＧＡＰＳ実装を、培地処置単球、ＬＰＳ処置単球及びＲ８４８処置単球に別個に適用した［９８］。ミトコンドリア遺伝子及びリボソームタンパク質遺伝子を含む技術的分散の高い遺伝子を分析から除去した。５個の遺伝子発現パターンを、各細胞集団について５００回の繰り返しを用いて同定した。各実験についてのＣｏＧＡＰＳのローディングを用いて、５個のパターンの各々に関連する上位１０個の遺伝子を同定した。これらの遺伝子をヒートマップとして可視化して各パターンを構成する相関発現を有する遺伝子のコンテキストを与えた。各細胞に割り当てられたＣｏＧＡＰＳスコアをバイオリンプロットとしてプロットして５個の遺伝子発現パターンに類似した発現を有する細胞の多モード分布を同定した。単球のサブ集団を臨床転帰によって階層化するパターンスコアにおける分布を散布図としてプロットし、単変量検定比較を定義するのに用いた。機能的エンリッチメント分析をこれらの差次的な発現遺伝子について行って臨床転帰に関連するパスウェイエンリッチメントを推定した。
非負値行列因子分解のＣｏＧＡＰＳ実装を、培地処置単球、ＬＰＳ処置単球及びＲ８４８処置単球に別個に適用した［９８］。ミトコンドリア遺伝子及びリボソームタンパク質遺伝子を含む技術的分散の高い遺伝子を分析から除去した。５個の遺伝子発現パターンを、各細胞集団について５００回の繰り返しを用いて同定した。各実験についてのＣｏＧＡＰＳのローディングを用いて、５個のパターンの各々に関連する上位１０個の遺伝子を同定した。これらの遺伝子をヒートマップとして可視化して各パターンを構成する相関発現を有する遺伝子のコンテキストを与えた。各細胞に割り当てられたＣｏＧＡＰＳスコアをバイオリンプロットとしてプロットして５個の遺伝子発現パターンに類似した発現を有する細胞の多モード分布を同定した。単球のサブ集団を臨床転帰によって階層化するパターンスコアにおける分布を散布図としてプロットし、単変量検定比較を定義するのに用いた。機能的エンリッチメント分析をこれらの差次的な発現遺伝子について行って臨床転帰に関連するパスウェイエンリッチメントを推定した。
【0108】
遺伝子制御ネットワーク推論
ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ ＳｅｕｒａｔオブジェクトをＳｉｎｇｌｅＣｅｌｌＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔに変換し、ＳＣＥＮＩＣパッケージによる分析のための入力として用いた［９９］。回復被検体及び死亡被検体からのＣＤ１６＋単球の間の差次的発現を有する遺伝子を、各処置条件について同定した。そして、ＳＣＥＮＩＣ分析を実行する標準的なワークフローを、これらのマーカー遺伝子についてのカウントマトリックスを入力として用いて行った［１００］。ＧＥＮＩＥ３を用いて相関する共発現を有する転写因子及び制御標的を含むレギュロンを同定し、ＡＵＣｅｌｌを用いて各単球サブ集団についてレギュロン活性をスコアリングした。「ｔｏｐ１０ｐｅｒＴａｒｇｅｔ」共発現パラメータを用いて、スコアリングされたレギュロンのリストをプルーニングした。レギュロン活性のｚスコアをヒートマップとしてプロットして臨床転帰に関連するエンリッチメントを同定した。
ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ ＳｅｕｒａｔオブジェクトをＳｉｎｇｌｅＣｅｌｌＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔに変換し、ＳＣＥＮＩＣパッケージによる分析のための入力として用いた［９９］。回復被検体及び死亡被検体からのＣＤ１６＋単球の間の差次的発現を有する遺伝子を、各処置条件について同定した。そして、ＳＣＥＮＩＣ分析を実行する標準的なワークフローを、これらのマーカー遺伝子についてのカウントマトリックスを入力として用いて行った［１００］。ＧＥＮＩＥ３を用いて相関する共発現を有する転写因子及び制御標的を含むレギュロンを同定し、ＡＵＣｅｌｌを用いて各単球サブ集団についてレギュロン活性をスコアリングした。「ｔｏｐ１０ｐｅｒＴａｒｇｅｔ」共発現パラメータを用いて、スコアリングされたレギュロンのリストをプルーニングした。レギュロン活性のｚスコアをヒートマップとしてプロットして臨床転帰に関連するエンリッチメントを同定した。
【0109】
転写因子ＮＦκＢによって制御される遺伝子を、ＫＥＧＧ機能的アノテーションデータベースから検索し、臨床転帰に関連する発現の傾向を可視化するのに用いた［１０１］。各パスウェイ遺伝子の平均発現を、Ｓｅｕｒａｔを用いて計算し、平均発現を全てのパスウェイの遺伝子をともに用いて計算した。ＮＦＫＢＩＡの発現を、ＪＵＮＤの発現に対して散布図としてプロットし、相関を全てのＣＤ１６＋単球を用いて計算した。
【0110】
ＣＯＶＩＤ－１９のＩＣＵ患者標本による血漿プロテオミクス
サンプルを解凍し、２０μＬの血漿を９６ウェル形式の７５０μＬのマトリックスチューブ（Ｔｈｅｒｍｏ社）に分注した。試験プールＱＣ（ＳＰＱＣ）サンプルを、全てのサンプルの同等容量を混合することによって作製した。ＳＰＱＣサンプルの３個の複製をプレートに添加した。サンプルを、１１ｍＭのジチオトレイトールを含む５０ｍＭの炭酸水素アンモニウム（ＡｍＢｉｃ）中の５．５％（ｗ／ｖ）のデオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣ）の２００μＬで希釈し、サンプルを８０℃で１５分間加熱することによって不活化した。冷却した後、サンプルを、ＡｍＢｉｃ中の２５０ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＭ）の１０μＬで、暗所において室温で３０分間アルキル化した。アルキル化物を、ＡｍＢｉｃ中の２２０ｍＭのＤＴＴの１０μＬの添加によってクエンチングし、消化を、ＡｍＢｉｃ中の５ｍｇ／ｍＬのＴＰＣＫトリプシン（Ｓｉｇｍａ社）の２０μＬを添加し、続けて３７℃で２時間サーモミキサー内でインキュベーションすることによって行った。反応物を、０．３３ｐｍｏｌの酵母ＡＤＨ１消化物（Ｗａｔｅｒｓ社、ＭａｓｓＰｒｅｐ）を含む５／２０／６５(ｖ／ｖ／ｖ)のＴＦＡ／ＭｅＣＮ／水の３０μＬを各サンプルに添加することによってクエンチングし、続けて短時間のボルテックスを行い、サーモサイクラーにおいて５分間インキュベーションし、１００００×ｇで２分間遠心分離した。１５０００×ｇで２分間遠心分離し、上清及び沈殿残留物をＤｅｅｐｗｅｌｌ ９６／１０００μｌプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）にテープで固定したＩＳＯＬＵＴＥ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ＋ｆｉｌｔｅｒ ｐｌａｔｅ（Ｂｉｏｔａｇｅ社）に移し、続けて１２５０ｒｐｍで３分間振盪した。最後に、サンプルを９６ウェルプレートにおける減圧マニホールドで１０分間ろ過し、キャップマットで密封した。
サンプルを解凍し、２０μＬの血漿を９６ウェル形式の７５０μＬのマトリックスチューブ（Ｔｈｅｒｍｏ社）に分注した。試験プールＱＣ（ＳＰＱＣ）サンプルを、全てのサンプルの同等容量を混合することによって作製した。ＳＰＱＣサンプルの３個の複製をプレートに添加した。サンプルを、１１ｍＭのジチオトレイトールを含む５０ｍＭの炭酸水素アンモニウム（ＡｍＢｉｃ）中の５．５％（ｗ／ｖ）のデオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣ）の２００μＬで希釈し、サンプルを８０℃で１５分間加熱することによって不活化した。冷却した後、サンプルを、ＡｍＢｉｃ中の２５０ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＭ）の１０μＬで、暗所において室温で３０分間アルキル化した。アルキル化物を、ＡｍＢｉｃ中の２２０ｍＭのＤＴＴの１０μＬの添加によってクエンチングし、消化を、ＡｍＢｉｃ中の５ｍｇ／ｍＬのＴＰＣＫトリプシン（Ｓｉｇｍａ社）の２０μＬを添加し、続けて３７℃で２時間サーモミキサー内でインキュベーションすることによって行った。反応物を、０．３３ｐｍｏｌの酵母ＡＤＨ１消化物（Ｗａｔｅｒｓ社、ＭａｓｓＰｒｅｐ）を含む５／２０／６５(ｖ／ｖ／ｖ)のＴＦＡ／ＭｅＣＮ／水の３０μＬを各サンプルに添加することによってクエンチングし、続けて短時間のボルテックスを行い、サーモサイクラーにおいて５分間インキュベーションし、１００００×ｇで２分間遠心分離した。１５０００×ｇで２分間遠心分離し、上清及び沈殿残留物をＤｅｅｐｗｅｌｌ ９６／１０００μｌプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）にテープで固定したＩＳＯＬＵＴＥ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ＋ｆｉｌｔｅｒ ｐｌａｔｅ（Ｂｉｏｔａｇｅ社）に移し、続けて１２５０ｒｐｍで３分間振盪した。最後に、サンプルを９６ウェルプレートにおける減圧マニホールドで１０分間ろ過し、キャップマットで密封した。
【0111】
定量的データ非依存取得（ＤＩＡ）－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ：サンプルを、Ｅｘｐｌｏｒｉｓ４８０高分解能タンデム質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ社）に接続したＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社）を用いて、ＤＩＡ－ＬＣＭＳ／ＭＳによって分析した。血漿サンプルの分析には、１０μＬのペプチド消化物（約３３μｇ）を用いた。直接注入後、ペプチドを、１ｍｍ×１５ｍｍの１．７μｍのＣＳＨＣ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ社）において、流速１００μＬ／分、カラム温度５５℃並びにＨ２Ｏ中の０．１％（ｖ／ｖ）のギ酸（ＦＡ）（移動相Ａ）及びＭｅＣＮ中の０．１％（ｖ／ｖ）のＦＡ（移動相Ｂ）を以下の０～６０分を３～２８％のＢ、６０～６０．５分を２８～９０％のＢ、６０．５～６２．５分を９０％のＢ、６２．５～６３分を９０～３％のＢ及び６３～６７分を３％のＢで再平衡化のように用いるグラジエントを用いて分離した。ティーをポストカラムに用いて、５０％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド／アセトニトリル（ＤＭＳＯ／ＭｅＣＮ）溶液を１０μＬ／分で導入した。ＬＣを、加熱エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ）条件下で、以下の、３２のシースガス、５のａｕｘガス、３．５ｋＶのスプレー電圧、２７５℃のキャピラリー温度、１２５℃のａｕｘガスヒーター温度の調整パラメータで、ＯｐｔａｍａｘＮＧイオン源を有するＭＳに接続した。
【0112】
ＤＩＡ分析は、３７５～１６００ｍ／ｚの１２万の分解能の前駆体イオン（ＭＳ１）スキャン、３００％のＡＧＣターゲット、４５ミリ秒の最大注入時間（ＩＴ）及び４０％のＲＦレンズを用い、データをセントロイドモードにおいて採取した。ＭＳ／ＭＳは、デフォルト電荷状態＝３、３万の分解能、１０００％のＡＧＣターゲット、６０ミリ秒の最大ＩＴ、３０のＮＣＥでｔＭＳ２法を用いて行い、データをセントロイドモードで採取した。１８個の可変ＤＩＡウィンドウは４００～１２００ｍ／ｚに及んだ。ＭＳサイクルタイムは１．６５秒であり、注入から注入までの合計時間は６７分であった。
【0113】
スペクトルライブラリー作成のための高ｐＨ逆相（ＨＰＲＰ）画分：個別のサンプルからプールされた約５００μｇのタンパク質消化物を凍結乾燥し、ｐＨ１０の２０ｍＭのギ酸アンモニウムに再懸濁した。ペプチドを、２．１ｍｍ×５ｃｍのＢＥＨＣ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ社）及びＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ Ｉ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣを用いて分画した。分離は０．４ｍＬ／ｍｉｎの流速及び５５℃のカラム温度を利用し、移動相はｐＨ１０の２０ｍＭのギ酸アンモニウム（ＭＰＡ）及び原液のＭｅＣＮ（ＭＰＢ）からなっていた。グラジエントは、以下の、０～３分を３％のＭＰＢ、３～５０分を３～３５％のＭＰＢ、５０～５１分を３５～９０％のＭＰＢ、５１～５５分を９０％のＭＰＢ、５５～５６分を９０～３％のＭＰＢ、５６～７０分を３％のＭＰＢであった。４８個の同等画分（各画分約０．４ｍＬ）を３～５３分に１０μｌの４０％のＴＦＡを含むウェルに採取し、ＬＣＭＳ／ＭＳ分析のピークキャパシティを最大にするようにウェルの各列（例えば、ウェル／画分１、１３、２５及び３７）を組み合わせた。凍結乾燥後、サンプルをＨ２Ｏ中の１％（ｖ／ｖ）のＴＦＡ／２％（ｖ／ｖ）のＭｅＣＮの２５μｌに再懸濁した。
【0114】
スペクトルライブラリー生成のためのＨＰＲＰ画分サンプルの定性分析：２０μＬの画分プールの各々（各々１２画分）を、データをＳｐｅｃｔｒｏｎａｕｔ１４において研究特異的ライブラリーを用いて分析したこと以外は上述のようにマイクロフローＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。データの欠落を最小化するために、「プロファイリング」を用いて、全てのランにおいて有意値（ｑ値＜０．０１）を満たさない前駆体を定量した。２０％のスパースカットオフ（データは、少なくとも２０％のランにおいてｑ値を満たした全ての前駆体を含んだ）を用いて、血漿サンプルにおいて定量された５５９個のタンパク質が存在した。これらのうち、４５０個のタンパク質（ＡＤＨ１、トリプシン及び３個の変異体タンパク質エントリーを含む）を、より確実な同定のための測定基準である２個以上の固有前駆体によって定量した。
【0115】
正規化：タンパク質群生データ（定量された全前駆体の総和）を、ライブラリーサイズによって正規化し、続けてＭのトリム平均（ＴＭＭ）正規化を行った。正規化は、発現測定にほとんど影響せず、測定した研究サンプル間の高度に安定したサンプル調製、データ取得及び全体的なタンパク質含量を示唆した。
【0116】
データ分析：最初に、正規化されたデータを、全ての患者の転帰による時点をグループ化することによって評価した。データセットを絞り込むために、我々は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ（ＢＨ）補正による多重Ｔ検定を行い、調整済みｐ＜０．０５の閾値を満たすタンパク質で進めた。転帰による平均タンパク質測定値を用いて、我々は、各タンパク質についてｌｏｇ２倍変化を計算し、上方制御及び下方制御されたタンパク質を別個にグループ化した。これらを、非連結ノードを無視する最高信頼度（０．９００）の必要スコアでのフルＳＴＲＩＮＧネットワークのためのＳＴＲＩＮＧ Ｖ１１．０及びデフォルト設定を用いたｇ：Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（バージョンｅ１０３＿ｅｇ５０＿ｐ１５＿６８ｃ０ｅ３３）において分析した［９７、１０２］。そして、我々は、ｇ：Ｐｒｏｆｉｌｅｒからダウンロードしたパスウェイ及びエンリッチメントデータを用い、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ３．８を介したＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔｍａｐ３．３アプリケーションを用いてパスウェイクラスタリングで進めた［１０３、１０４］。我々は、最もエンリッチメントされたパスウェイクラスター、すなわち、上方制御されたタンパク質に対して防御／免疫細胞パスウェイ並びに下方制御された遺伝子に対して創傷治癒／補体及び免疫に一致するヒットを絞り込んだ。
【0117】
我々は、転帰間のヒットの差を０日、７日又は１４日での一致した時点によってＴ検定を用いてさらに評価してこれらのタンパク質が最も差を有しやすい場合を見出した。
【0118】
ＥＬＩＳＡ及び核酸定量化
ＥＬＩＳＡ、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ及びＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を、製造元の指示に従い、トリプリケートで行った。
ＥＬＩＳＡ、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ及びＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を、製造元の指示に従い、トリプリケートで行った。
【0119】
統計分析
統計検定を、一元ＡＮＯＶＡを介したＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおいて行い、続けて健常血清コントロールとＣＯＶＩＤ－１９サンプルの間又はＣＯＶＩＤ－１９サンプルタイプの間でＳｉｄａｋ多重比較検定を行った。他の全てのグラフを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアで作成した。
References:
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【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図6G】
【図6H】
【図6I】
【図6J】
【図6K】
【図6L】
【図6M】
【図6N】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図9F】
【図9G】
【図9H】
【図9I】
【図9J】
【図10-1】
【図10-2】
【図11-1】
【図11-2】
【図12-1】
【図12-2】
【図12-3】
【図12-4】
【図12-5】
【図13-1】
【図13-2】
【図13-3】
【図13-4】
【図13-5】
【図14】
【図15-1】
【図15-2】
【図15-3】
【図16-1】
【図16-2】
【図16-3】
【図16-4】
【図16-5】
【図17】
【国際調査報告】