特表 2024-537869 ペプチドデンドロン及びその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-16

(54)【発明の名称】ペプチドデンドロン及びその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 2/00 20060101AFI20241008BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241008BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20241008BHJP

   A61K 47/69 20170101ALI20241008BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241008BHJP

   C07K 7/00 20060101ALI20241008BHJP

   C07K 14/00 20060101ALI20241008BHJP

   A61P 35/00 20060101ALN20241008BHJP

   A61P 31/16 20060101ALN20241008BHJP

【ＦＩ】

C07K2/00

A61K48/00 ZNA

A61K47/42

A61K47/69

A61P43/00 111

C07K7/00

C07K14/00

A61P35/00

A61P31/16

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024520995

(86)(22)【出願日】2022-10-07

(85)【翻訳文提出日】2024-06-03

(86)【国際出願番号】 IB2022059608

(87)【国際公開番号】W WO2023057975

(87)【国際公開日】2023-04-13

(31)【優先権主張番号】63/262,269

(32)【優先日】2021-10-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】391008951

【氏名又は名称】アストラゼネカ・アクチエボラーグ

【氏名又は名称原語表記】ＡＳＴＲＡＺＥＮＥＣＡ ＡＫＴＩＥＢＯＬＡＧ

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100156144

【弁理士】

【氏名又は名称】落合 康

(72)【発明者】

【氏名】ウレロ，モーガン オードリー

(72)【発明者】

【氏名】クリスティー，ロナルド ジェイムズ

(72)【発明者】

【氏名】ボーン，ハンナ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA29

4C076AA65

4C076AA95

4C076CC29

4C076CC41

4C076EE41

4C076FF34

4C084AA13

4C084NA13

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB331

4C084ZB332

4C084ZC021

4C084ZC022

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA57

4H045EA20

4H045FA10

(57)【要約】

本明細書は、式（Ｉ）の修飾リシンに由来する１つ以上の残基を含むペプチドデンドロン、これらのペプチドデンドロンを含む医薬送達システム、それらを含む医薬組成物、及び治療におけるそれらの使用に関する。
【化１】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（Ｉ）：

【化1】

（式中、
Ａは、結合、Ｃ_１～６アルキレン、カルボシクリル又はヘテロシクリルであり；前記カルボシクリル又はヘテロシクリルは、任意選択的に炭素上で１つ以上のＲ^２で置換されていてよく；前記ヘテロシクリルが－ＮＨ－部分を含有する場合、その窒素はＲ^２から選択される基で任意選択的に置換されていてよい；
Ｑは、結合、カルボシクリル又はヘテロシクリルであり；前記カルボシクリル又はヘテロシクリルは、任意選択的に炭素上で１つ以上のＲ^３で置換されていてよく；前記ヘテロシクリルが－ＮＨ－部分を含有する場合、その窒素はＲ^Ａから選択される基で任意選択的に置換されていてよい；
環Ｂは、モルホリニル又はチオモルホリニルであり；ここで前記モルホリニル又はチオモルホリニルが－ＮＨ－部分を含有する場合、その窒素は任意選択的にＲ^Ｃから選択される基で置換されていてよい；
Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３は、それぞれ独立してハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、トリフルオロメトキシ、トリフルオロメチル、アミノ、カルボキシ、カルバモイル、メルカプト、スルファモイル、メチル、エチル、メトキシ、エトキシ、アセチル、アセトキシ、メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、Ｎ－メチル－Ｎ－エチルアミノ、アセチルアミノ、Ｎ－メチルカルバモイル、Ｎ－エチルカルバモイル、Ｎ，Ｎ－ジメチルカルバモイル、Ｎ，Ｎ－ジエチルカルバモイル、Ｎ－メチル－Ｎ－エチルカルバモイル、メチルチオ、エチルチオ、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル、メシル、エチルスルホニル、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、Ｎ－メチルスルファモイル、Ｎ－エチルスルファモイル、Ｎ，Ｎ－ジメチルスルファモイル、Ｎ，Ｎ－ジエチルスルファモイル及びＮ－メチル－Ｎ－エチルスルファモイルから選択され；
ｎは、０～４であり；
Ｒ^Ａ、Ｒ^Ｂ及びＲ^Ｃは、独立してメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、アセチル、メシル、エチルスルホニル、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ－メチルカルバモイル、Ｎ－エチルカルバモイル、Ｎ，Ｎ－ジメチルカルバモイル、Ｎ，Ｎ－ジエチルカルバモイル及びＮ－メチル－Ｎ－エチルカルバモイルから選択される）
の修飾リシンに由来する１つ以上の残基を含むペプチドデンドロン。

【請求項2】

Ａは、結合、Ｃ_１～６アルキレン又はヘテロシクリルである、請求項１に記載のペプチドデンドロン。

【請求項3】

Ｑは、結合である、請求項１又は２に記載のペプチドデンドロン。

【請求項4】

ｎは、０である、請求項１～３のいずれか一項に記載のペプチドデンドロン。

【請求項5】

環Ｂは、モルホリニルである、請求項１～４のいずれか一項に記載のペプチドデンドロン。

【請求項6】

環Ｂは、チオモルホリニルである、請求項１～４のいずれか一項に記載のペプチドデンドロン。

【請求項7】

Ａは、結合、メチレン又はピリジルであり；
Ｑは、結合であり；
環Ｂは、モルホリニル又はチオモルホリニルであり；且つ
ｎは、０である、
請求項１～４のいずれか一項に記載のペプチドデンドロン。

【請求項8】

前記修飾リシンに由来する残基は、式（ＩＢ）：

【化2】

で表される、請求項１～７のいずれか一項に記載のペプチドデンドロン。

【請求項9】

前記修飾リシンに由来する残基は、
（Ｓ）－２－アミノ－６－｛［６－（モルホリン－４－イル）ピリジン－３－カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸；
（Ｓ）－２－アミノ－６－［（チオモルホリン－３－カルボニル）アミノ］ヘキサン酸；及び
（Ｓ）－２－アミノ－６－［２－（モルホリン－４－イル）アセトアミド］ヘキサン酸
である、請求項１～４、７及び８のいずれか一項に記載のペプチドデンドロン。

【請求項10】

６未満の世代を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のペプチドデンドロン。

【請求項11】

分岐点、世代０、及び続く世代を含み、前記分岐点、世代０、及び続く世代が合わせて、１００個未満のアミノ酸残基を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のペプチドデンドロン。

【請求項12】

式（ＩＩ）：
（｛Ｘ_３｝｛Ｘ_２｝｛Ｘ_１｝）_８（｛ＢＰ｝｛Ｘ_３｝｛Ｘ_２｝｛Ｘ_１｝）_４（｛ＢＰ｝｛Ｘ_３｝｛Ｘ_２｝｛Ｘ_１｝）_２｛ＢＰ｝
（ＩＩ）
（式中、
Ｘ_１、Ｘ_２、又はＸ_３のうちの１つは、塩基性アミノ酸残基であり；
別のＸ_１、Ｘ_２、又はＸ_３は、疎水性アミノ酸残基であり；
残りのＸ_１、Ｘ_２、又はＸ_３は、請求項１～９のいずれか一項で定義される修飾リシンに由来する残基であり；且つ
ＢＰは、分岐点アミノ酸残基である）
のペプチドデンドロンを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のペプチドデンドロン。

【請求項13】

前記塩基性アミノ酸残基は、アルギンから選択される、請求項１２に記載のペプチドデンドロン。

【請求項14】

前記疎水性アミノ酸残基は、ロイシンから選択される、請求項１２又は１３に記載のペプチドデンドロン。

【請求項15】

ＢＰは、リシンである、請求項１２～１４のいずれか一項に記載のペプチドデンドロン。

【請求項16】

前記ペプチドデンドロンの前記第１の分岐点アミノ酸に結合したアミノ酸残基の世代０配列をさらに含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のペプチドデンドロン。

【請求項17】

前記世代０配列は、ＧＬＹ－ＶＡＬ－ＣＩＴ－ＧＬＹ－ＧＬＹ－ＳＥＲ－ＣＹＳ（配列番号５）からなり、前記末端ＣＹＳカルボキシ基はアミド化されてＣ（Ｏ）ＮＨ_２基を形成している、請求項１６に記載のペプチドデンドロン。

【請求項18】

－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ－繰り返しサブユニット（式中、ｎ＞３）からなるポリエチレングリコール基をさらに含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のペプチドデンドロン。

【請求項19】

ペプチド、抗体、糖、又は小分子標的化基から選択される標的化基をさらに含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のペプチドデンドロン。

【請求項20】

医薬活性剤の細胞への送達に使用するための、請求項１～１９のいずれか一項に記載のペプチドデンドロン。

【請求項21】

請求項１～２０のいずれか一項に記載のペプチドデンドロンの１つ以上と医薬活性剤とを含む医薬組成物。

【請求項22】

前記医薬活性剤は、遺伝物質である、請求項２０又は２１に記載の使用又は医薬組成物。

【請求項23】

前記遺伝物質は、ＤＮＡである、請求項２２に記載の使用又は医薬組成物。

【請求項24】

前記遺伝物質は、ＲＮＡである、請求項２２に記載の使用又は医薬組成物。

【請求項25】

前記遺伝物質は、ＤＮＡ及びＲＮＡである、請求項２２に記載の使用又は医薬組成物。

【請求項26】

脂質をさらに含む、請求項２０～２５のいずれか一項に記載の使用又は医薬組成物。

【請求項27】

前記動物に有効量の請求項２１～２６のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む遺伝子治療の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０２１年１０月８日に出願された米国仮特許出願第６３／２６２，２６９号の優先権の利益を主張するものであり、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本明細書は、修飾リシンに由来する１つ以上の残基を含むペプチドデンドロン、及び医薬活性剤、特に遺伝物質を細胞に送達するためのこれらのペプチドデンドロンの使用に関する。本明細書はさらに、治療におけるこれらのペプチドデンドロンの使用に関する。

【背景技術】

【0003】

遺伝子療法は、疾患を治療するために患者の細胞内に（外来の）遺伝物質（そのような物質並びにＤＮＡ及びＲＮＡ）の治療的送達に焦点を当てる医学分野である。今までに、Ｌｕｘｔｕｒｎａ（登録商標）（ＲＰＥ６５変異による失明）及びＫｙｍｒｉａｈ（登録商標）（キメラ抗原受容体Ｔ細胞療法）を含むいくつかの遺伝子療法が、多くの様々な医学的病態に対して規制当局の承認を受けてきた。

【0004】

遺伝子送達は、遺伝物質を細胞内へ導入するために使用されるプロセスである。成功を得るためには、遺伝物質は輸送中の安定性を維持しなければならず、最終的には標的細胞に内在化されなければならない。遺伝物質がＤＮＡである場合、ＤＮＡは標的細胞内に内在化され、核内に送達されなければならない。遺伝子送達にはベクターが必要であり、好適なベクターは一般に２つのカテゴリー、ウイルスベクター及び非ウイルスベクターに分類される。

【0005】

ウイルス媒介遺伝子送達は、ウイルスが宿主細胞内にＤＮＡを注入する能力を利用する。遺伝物質は、ウイルスベクターを形成するために、複製欠損性ウイルス粒子内にパッケージングされる。ウイルス方法は、高度に効率的であるが、免疫反応を誘導し得る。さらに、それらは細胞内に極めて小片の遺伝物質しか送達することができず、それらを生成する工程は労働集約的であり、無作為の挿入部位、細胞変性作用及び変異生成のリスクがある。

【0006】

合成ベクターは、遺伝子送達用途のためのウイルスと比べて構造的多様性及び拡張性に関するいくつかの長所を提供し、またそれらは、１つの所望の目的を達成するために単独且つ特別に設計することができる。これらの物質は、細胞への取り込み、細胞質内への輸送、及び（所望であれば）核内への送達に関連する生物学的障壁を克服するために、遺伝子操作されているナノ粒子又はベシクル内に遺伝物質をパッケージングするように設計することができる。一般的アプローチは、アニオン性核酸と関連する正電荷を含む高分子、ペプチド、又は脂質などの物質で遺伝物質を多分子組立体内にパッケージングすることである。正電荷と負電荷との間の静電相互作用は、ナノ粒子若しくはミクロ粒子構造への自己集合を駆動し、これらの粒子のサイズ及び形状は、物質のタイプ及び縮合条件によって制御することができる（非特許文献１）。

【0007】

例えば、ナノ粒子のような好適なベクターへのＤＮＡの処方は、未調製ＤＮＡの取り込みと比較した場合に、ＤＮＡの細胞取り込みを有意に改善する。ＤＮＡは大きく、また負に荷電しているため、細胞膜を横切って拡散するなどの受動プロセスによってそれ自体で細胞（これもまた正味の負の電荷も有している）に取り込まれることはない。未調製ＤＮＡはまた、その分解につながる免疫反応を引き起こす傾向がある。好適なベクターへＤＮＡを処方することにより、ＤＮＡの負の電荷を中和し、細胞外間隙での分解からＤＮＡを保護することができる。

【0008】

ベクターが効果的に内在化されるためには、エンドサイトーシスと呼ばれるプロセスによって細胞内に輸送されなければならない。このプロセス中、ベクターは、その後に細胞の内側で出芽しエンドソームを形成する細胞膜の領域によって取り囲まれている。ベクターは、このプロセスの発生を可能にするが、次にリソソームへの取り込み、すなわち酸性膜結合リソソーム区画内への隔離の可能性を緩和するように設計されなければならない。これを達成するための１つの方法は、リソソームのトラフィッキングが発生し得る前に、エンドソームを確実に破裂させることである。これは、生じた浸透圧勾配によりエンドソームが破裂して細胞質内に遺伝物質を遊離させ、その遺伝物質がその場で転写／翻訳に利用可能になり得るまで、ベクターがエンドソームのｐＨ（エンドソームは細胞へ取り込まれた後、ますます酸性が強くなる）を緩衝することによって達成され得る。エンドソームの緩衝範囲（ｐＨ７．４～ｐＨ５．０）に対して効率的な緩衝能力を備える好適なベクター物質は、プロトンを受け入れることによってエンドソームの酸性化を遅らせることができ、これにより、細胞質ゾルからのさらなるプロトン及び対イオンの流入が引き起こされる。

【0009】

現在の合成遺伝子送達システムは、遺伝物質の低い安定性、高い毒性、及び非効率的な細胞質侵入によってインビボに限定されている。高い送達効率を維持しながら調製特性（サイズ、電荷など）、安定性、緩衝能力、及び毒性間の最適なバランスを達成する、遺伝子送達に好適な多官能性物質を遺伝子操作する工程は、困難且つ複雑であることがわかっているが、得られる製剤は大幅に簡素化されるであろう。

【0010】

ペプチドデンドロン（ＰＤ）はアミノ酸残基を含む３次元構造であり、残基の１つの側鎖、例えば、リシンのε－アミンは、分枝又は世代を形成するために利用され、分子を３Ｄ巨大分子に構築する。ペプチドデンドロンは、典型的には、固相ペプチド合成を使用して生成され、明確に定義された構造内のアミノ酸残基配列及び幾何学的配置の正確な制御を可能にする。最終生成物は単分散であり、高度に調整可能な特性（すなわち、疎水性、電荷密度、及び分子量）を有し、多機能の最適化及び柔軟な適用を可能にする。

【0011】

ペプチドデンドロンは広く探索されてきたが、製造コスト及び低いタンパク質分解安定性が臨床的成功を妨げてきた。Ｋｗｏｋら（非特許文献２及び非特許文献３）は、ＤＮＡ及びＲＮＡのトランスフェクション試薬としてペプチドデンドリマー／脂質ハイブリッドシステムを探索したが、合成の制限、限定された材料の機能性及びインビボでの有効性により、ジペプチド分枝に限定された。

【0012】

本願は、修飾リシンに由来する１つ以上の残基を含む特定のペプチドデンドロンを記載する。これらのペプチドデンドロンは、ｉ）細胞内在化及びリソソームトラフィッキング中に発生するｐＨ転移中のプロトン化を可能にするように調整された高い緩衝能力を有し、ｉｉ）静電的及び非静電的（例えば、π－πスタッキング）相互作用による核酸結合の増加によって安定性が高く、ｉｉｉ）天然に存在し、毒性若しくは免疫原性がある可能性が低い代謝産物に基づくコア単位が使用される場合、高い生体適合性を有し、且つ／又はｉｖ）特異的な細胞内酵素分解（カテプシンＢ）によって迅速な核酸放出を達成する。それらは、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）（約２５～１００ｎｍ、球状、ロッド状、及びトロイド状）を含む複数の核酸形態を有するナノ粒子を形成し、関連する毒性を伴わずにマウスに静脈内注射された後は、高い血清中安定性及び長期の血液循環を示す。ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びＡＳＯを含む広範な核酸形態を首尾よく送達及び／又は共送達し、細胞内まで容易に解離しないことによってカプセル化された遺伝物質を保護する能力を、それらが有することが示された。さらに、同じナノ粒子内でのＲＮＡ／ＤＮＡの共送達により、タンパク質発現動態、相乗的治療薬の発現の制御が可能になり、ＣＲＩＳＰＲなどの複数の成分が必要とされる分野へのナノ粒子の適用が拡大する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0013】

【非特許文献1】Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ Ｒｅｖ，２００６，５８（４）：４６７－８６

【非特許文献2】Ｋｗｏｋ ｅｔ ａｌ ＡＣＳ Ｎａｎｏ，２０１３ Ｍａｙ ２８；７（５）：４６６８－８２，ｄｏｉ：１０．１０２１／ｎｎ４００３４３ｚ

【非特許文献3】Ｋｗｏｋ ｅｔ ａｌ ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，２０１６，１７（２３），２２２３－２２２９

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0014】

本明細書は、一部には、式（Ｉ）の修飾リシンに由来する１つ以上の残基を含むペプチドデンドロンを記載する：

【化1】

（式中、
Ａは、結合、Ｃ_１～６アルキレン、カルボシクリル又はヘテロシクリルであり；ここで前記カルボシクリル又はヘテロシクリルは、任意選択的に炭素上で１つ以上のＲ^２で置換されていてよく；前記ヘテロシクリルが－ＮＨ－部分を含有する場合、その窒素は任意選択的にＲ^Ａから選択される基で置換されていてよい；
Ｑは、結合、カルボシクリル又はヘテロシクリルであり；ここで前記カルボシクリル又はヘテロシクリルは、任意選択的に炭素上で１つ以上のＲ^３で置換されていてよく；前記ヘテロシクリルが－ＮＨ－部分を含有する場合、その窒素は任意選択的にＲ^Ｂから選択される基で置換されていてよい；
環Ｂは、モルホリニル又はチオモルホリニルであり；ここで前記モルホリニル又はチオモルホリニルが－ＮＨ－部分を含有する場合、その窒素は任意選択的にＲ^Ｃから選択される基で置換されていてよい；
Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３は、それぞれ独立してハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、トリフルオロメトキシ、トリフルオロメチル、アミノ、カルボキシ、カルバモイル、メルカプト、スルファモイル、メチル、エチル、メトキシ、エトキシ、アセチル、アセトキシ、メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、Ｎ－メチル－Ｎ－エチルアミノ、アセチルアミノ、Ｎ－メチルカルバモイル、Ｎ－エチルカルバモイル、Ｎ，Ｎ－ジメチルカルバモイル、Ｎ，Ｎ－ジエチルカルバモイル、Ｎ－メチル－Ｎ－エチルカルバモイル、メチルチオ、エチルチオ、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル、メシル、エチルスルホニル、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、Ｎ－メチルスルファモイル、Ｎ－エチルスルファモイル、Ｎ，Ｎ－ジメチルスルファモイル、Ｎ，Ｎ－ジエチルスルファモイル及びＮ－メチル－Ｎ－エチルスルファモイルから選択され；
ｎは、０～４であり；
Ｒ^Ａ、Ｒ^Ｂ及びＲ^Ｃは、独立してメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、アセチル、メシル、エチルスルホニル、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ－メチルカルバモイル、Ｎ－エチルカルバモイル、Ｎ，Ｎ－ジメチルカルバモイル、Ｎ，Ｎ－ジエチルカルバモイル及びＮ－メチル－Ｎ－エチルカルバモイルから選択される）。

【0015】

本明細書はまた、一部には、医薬活性剤を細胞内に送達する際に使用するための、本明細書に記載のペプチドデンドロンを記載する。

【0016】

本明細書はまた、一部には、本明細書に記載の１つ以上のペプチドデンドロン及び医薬活性剤を含む医薬組成物を記載する。

【0017】

本明細書はまた、一部には、前記動物に本明細書に記載の有効量の医薬組成物を投与することを含む遺伝子治療の方法を記載する。

【発明を実施するための形態】

【0018】

多くの実施形態が、本明細書の全体を通して詳述されており、当業者には明らかであろう。本開示は、列挙される実施形態のいずれかに限定されると解釈されるべきでない。

【0019】

「１つの（ａ）」は、「少なくとも１つ」を意味する。「１つの（ａ）」が所与の物質又は要素を示すために使用されるいずれかの実施形態では、「１つの（ａ）」は、１つを意味し得る。

【0020】

「～含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、所与の物質又は要素が他の物質又は要素を含有し得ることを意味する。「～を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が言及されるいずれかの実施形態では、所与の材料又は要素は、少なくとも１％ｗ／ｗ、少なくとも５％ｗ／ｗ、少なくとも１０％ｗ／ｗ、少なくとも２０％ｗ／ｗ、少なくとも３０％ｗ／ｗ、又は少なくとも４０％ｗ／ｗのその材料又は要素で形成され得る。「～を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」はまた、所与の材料又は要素「からなっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」（若しくは「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」）又は「から実質的になっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」（若しくは「から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」）を意味し得る。

【0021】

「～からなっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」又は「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」は、所与の材料又は要素が全体的にその材料又は要素から形成されていることを意味する。「～からなっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」又は「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」が言及されているいずれかの実施形態では、所与の材料又は要素は、１００％ｗ／ｗのその材料又は要素で形成され得る。

【0022】

「～から実質的になっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」又は「～から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、所与の材料又は要素がほぼ全体的にその物質若しくは要素から形成されていることを意味する。「～から実質的になっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」又は「～から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」が言及されているいずれかの実施形態では、所与の材料又は要素は、少なくとも５０％ｗ／ｗ、少なくとも６０％ｗ／ｗ、少なくとも７０％ｗ／ｗ、少なくとも８０％ｗ／ｗ、少なくとも９０％ｗ／ｗ、少なくとも９５％ｗ／ｗ又は少なくとも９９％ｗ／ｗのその材料又は要素から形成され得る。

【0023】

「である」又は「であり得る」を用いて材料又は要素を定義するいずれかの実施形態では、「である」又は「であり得る」は、材料又は要素が、材料又は要素「からなる」又は「から実質的になる」ことを意味し得る。

【0024】

「約」が言及されている本明細書のいずれかの実施形態では、「約」は、引用された数値の＋／－０（すなわち、差異なし）、＋／－０．０１、＋／－０．０５、＋／－０．１、＋／－０．５、＋／－１、＋／－２、＋／－５、＋／－１０又は＋／－２０パーセントを意味し得る。数値が引用される場合、また別の実施形態では、これはさらに引用されたおよその数値を指す。

【0025】

特許請求の範囲は、実施形態である。

【0026】

本明細書においては、式（Ｉ）の修飾リシンに由来する１つ以上の残基を含むペプチドデンドロンが開示される：

【化2】

（式中、Ａ、Ｑ、Ｂ、Ｒ^１及びｎは、本明細書に記載した通りである）。

【0027】

一実施形態では、Ａは、結合である。

【0028】

一実施形態では、Ａは、Ｃ_１～６アルキレンである。

【0029】

一実施態様では、Ａは、メチレンである。

【0030】

一実施形態では、Ａは、カルボシクリルであり；前記カルボシクリルは、任意選択的に炭素上で１つ以上のＲ^２で置換されていてよい。

【0031】

一実施形態では、Ａは、ヘテロシクリルであり；前記ヘテロシクリルは、任意選択的に炭素上で１つ以上のＲ^２で置換されていてよく；前記ヘテロシクリルが－ＮＨ－部分を含有する場合、その窒素は任意選択的にＲ^Ａから選択される基で置換されていてよい。

【0032】

一実施態様では、Ａは、ヘテロシクリルである。

【0033】

一実施形態では、Ａは、ピリジルである。

【0034】

一実施形態では、Ａは、結合、Ｃ_１～６アルキレン又はヘテロシクリルである。

【0035】

一実施形態では、Ａは、結合、メチレン又はピリジルである。

【0036】

一実施形態では、Ｑは、結合である。

【0037】

一実施形態では、Ｑは、カルボシクリルであり；前記カルボシクリルは、任意選択的に炭素上で１つ以上のＲ^３で置換されていてよい。

【0038】

一実施形態では、Ｑは、ヘテロシクリルであり；前記ヘテロシクリルは、任意選択的に炭素上で１つ以上のＲ^３で置換されていてよく；前記ヘテロシクリルが－ＮＨ－部分を含有する場合、その窒素は任意選択的にＲ^Ｂから選択される基で置換されていてよい。

【0039】

一実施形態においては、環Ｂは、モルホリニルである。

【0040】

一実施形態では、環Ｂは、モルホリニルであり；前記モルホリニルが－ＮＨ－部分を含有する場合、その窒素は任意選択的にＲ^Ｃから選択される基で置換されていてよい。

【0041】

一実施形態では、環Ｂは、チオモルホリニルである。

【0042】

一実施形態では、環Ｂは、チオモルホリニルであり；前記チオモルホリニルが－ＮＨ－部分を含有する場合、その窒素は任意選択的にＲ^Ｃから選択される基で置換されていてよい。

【0043】

一実施形態では、Ｒ^１は、ハロである。

【0044】

一実施形態では、ｎは、０である。

【0045】

一実施形態では、ｎは、１である。

【0046】

一実施形態では、ｎは、２である。

【0047】

一実施形態では、ｎは、３である。

【0048】

一実施形態では、ｎは、４である。

【0049】

一実施形態では、式（Ｉ）（式中、
Ａは、結合、Ｃ_１～６アルキレン又はヘテロシクリルであり；
Ｑは、結合であり；
環Ｂは、モルホリニル又はチオモルホリニルであり；且つ
ｎは、０である）
の修飾リシンに由来する１つ以上の残基を含むペプチドデンドロンが提供される。

【0050】

一実施形態では、式（Ｉ）（式中、
Ａは、結合、メチレン又はピリジルであり；
Ｑは、結合であり；
環Ｂは、モルホリニル又はチオモルホリニルであり；且つ
ｎは、０である）
の修飾リシンに由来する１つ以上の残基を含むペプチドデンドロンが提供される。

【0051】

一実施形態では、式（Ｉ）の修飾リシンは、式（ＩＡ）の修飾リシンである：

【化3】

（式中、Ａ、Ｑ、Ｂ、Ｒ^１及びｎは、本明細書に記載した通りである）。式（ＩＡ）の修飾リシンは、修飾Ｄ－リシンとも称され得る。

【0052】

一実施形態では、式（Ｉ）の修飾リシンは、式（ＩＢ）の修飾リシンである：

【化4】

（式中、Ａ、Ｑ、Ｂ、Ｒ^１及びｎは、本明細書に記載した通りである）。式（ＩＢ）の修飾リシンは、修飾Ｌ－リシンとも称され得る。

【0053】

一実施形態では、式（Ｉ）の修飾リシンは、
２－アミノ－６－｛［６－（モルホリン－４－イル）ピリジン－３－カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸；
２－アミノ－６－［（チオモルホリン－３－カルボニル）アミノ］ヘキサン酸；及び
２－アミノ－６－［２－（モルホリン－４－イル）アセトアミド］ヘキサン酸
から選択される。

【0054】

一実施形態では、式（Ｉ）の修飾リシンは、
（Ｒ）－２－アミノ－６－｛［６－（モルホリン－４－イル）ピリジン－３－カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸；
（Ｒ）－２－アミノ－６－［（チオモルホリン－３－カルボニル）アミノ］ヘキサン酸；及び
（Ｒ）－２－アミノ－６－［２－（モルホリン－４－イル）アセトアミド］ヘキサン酸
から選択される。

【0055】

一実施形態では、式（Ｉ）の修飾リシンは、
（Ｓ）－２－アミノ－６－｛［６－（モルホリン－４－イル）ピリジン－３－カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸；
（Ｓ）－２－アミノ－６－［（チオモルホリン－３－カルボニル）アミノ］ヘキサン酸；及び
（Ｓ）－２－アミノ－６－［２－（モルホリン－４－イル）アセトアミド］ヘキサン酸
から選択される。

【0056】

本明細書で使用される用語「置換（された）」は、化学基に関する場合、その化学基が除去され、置換基によって置換される１つ以上の水素原子を有することを意味する。本明細書で使用される用語「置換基」は、当該技術分野において知られている通常の意味を有し、親基に共有結合している化学部分を指す。本明細書で使用される場合、用語「任意選択的に置換（された）」は、その化学基が置換基を有していない（すなわち、非置換）又は１つ以上の置換基を有する（すなわち、置換）可能性があることを意味する。所与の原子での置換は、原子価によって限定されることが理解されるべきである。任意選択的置換基が基のリストから選択される場合、この定義が特定の基の１つから選択される全置換基を含むか、又は２つ以上の特定の基から選択される置換基を含むと理解すべきである。２つ以上の同一置換基、例えばＲ^２が基のリストから選択される場合は、この定義が特定の基の１つから選択されるそのような全置換基を含むか、又は２つ以上の特定の基から選択される置換基を含むと理解すべきである。

【0057】

本明細書で使用される場合、用語「Ｃ_ｉ～ｊ」は、ある範囲の炭素原子数を示すが、ここでｉ及びｊは、整数であり、炭素原子数の範囲は、端点（すなわち、ｉ及びｊ）並びにそれらの間の各整数点を含み、ｊはｉより大きい。例えば、Ｃ_１～６は、１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子、４個の炭素原子、５個の炭素原子及び６個の炭素原子を含む、１～６個の炭素原子の範囲を示す。いくつかの実施形態では、用語「Ｃ_１～６」は、１～６、１～５、１～４、１～３又は１～２個の炭素原子を示す。

【0058】

本明細書で使用される場合、用語「アルキル」は、別の用語の一部として使用されるか、又は独立して使用されるかにかかわらず、飽和炭化水素鎖を指す。上で言及した炭化水素鎖は、直鎖又は分岐鎖であり得る。用語「Ｃ_ｉ～ｊアルキル」は、ｉ～ｊ個の炭素原子を有するアルキルを意味する。Ｃ_１～６アルキルの例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル；２－メチル－１－ブチル、ｎ－ペンチル、３－ペンチル、ｎ－ヘキシル、１，２，２－トリメチルプロピルなどの高次のホモログを挙げることができるが、これらに限定されない。さらなる修飾を伴わない「ブチル」などの基についての言及は、例えば、ｎ－ブチル及びｔｅｒｔ－ブチルなどのブチルのあらゆる形態を指す。

【0059】

本明細書で使用される場合、用語「アルキレン」は、別の用語の一部として使用されるか、又は独立して使用されるかにかかわらず、飽和炭化水素鎖を指す。上で言及した炭化水素鎖は、直鎖又は分岐鎖であり得る。用語「Ｃ_ｉ～ｊアルキレン」は、ｉ～ｊ個の炭素原子を有するアルキルを指す。Ｃ_１～６アルキレンの例としては、メチレン（－ＣＨ_２－）、エチレン（－ＣＨ_２－ＣＨ_２－）、プロピレン（－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－）及びブチレン（－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－及び－ＣＨ_２－ＣＨ（ＣＨ_３）－ＣＨ_２－など）などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0060】

本明細書で使用される場合、用語「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを指す。

【0061】

「ヘテロシクリル」は、他に特に規定されていない限り、炭素又は窒素結合であり得る、その内の少なくとも１つの原子が窒素、硫黄又は酸素から選択される４～１２個の原子を含有する飽和、部分飽和又は未飽和の単環式又は二環式環であり、－ＣＨ_２－基は、任意選択的に－Ｃ（Ｏ）－によって置き換えられてよく、また環の硫黄原子は、任意選択的に酸化されてＳ－酸化物を形成することができる。用語「ヘテロシクリル」の例及び好適な数値は、モルホリノ、ピペリジル、ピリジル、ピラニル、ピロリル、ピラゾリル、イソチアゾリル、インドリル、キノリル、チエニル、１，３－ベンゾジオキソリル、チアジアゾリル、ピペラジニル、チアゾリジニル、ピロリジニル、チオモルホリノ、ピロリニル、ホモピペラジニル、３，５－ジオキサピペリジニル、テトラヒドロピラニル、イミダゾリル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、イソキザゾリル、Ｎ－メチルピロリル、４－ピリドン、１－イソキノロン、２－ピロリドン及び４－チアゾリドンである。用語「ヘテロシクリル」の特定の例は、ピリジルである。一実施形態では、「ヘテロシクリル」は、そのうちの少なくとも１つの原子が窒素、硫黄又は酸素から選択される５又は６個の原子を含有する飽和、部分飽和又は未飽和の単環式環であり、それは、他に特に規定されていない限り、炭素又は窒素結合であり得る、－ＣＨ_２－基は、任意選択的に－Ｃ（Ｏ）－で置き換えることができ、また環の硫黄原子は、任意選択的に酸化されてＳ－酸化物を形成することができる。

【0062】

「カルボシクリル」は、３～１２個の原子を含有する、飽和、部分飽和又は不飽和の単環式又は二環式炭素環であり；－ＣＨ_２－基は、任意選択的に－Ｃ（Ｏ）－で置き換えることができる。一実施形態では、「カルボシクリル」は、５若しくは６個の原子を含有する単環式の環、又は９若しくは１０個の原子を含有する二環式の環である。「カルボシクリル」に好適な数値としては、シクロプロピル、シクロブチル、１－オキソシクロペンチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、フェニル、ナフチル、テトラリニル、インダニル又は１－オキソインダニルが挙げられる。「カルボシクリル」の特定の例は、フェニルである。

【0063】

本開示の「化合物」は、化合物内の原子の全ての同位体を包含している。１つの原子の同位体には、同じ原子番号を有するが質量数が異なる原子が含まれる。例えば、他に特に規定されていない限り、本開示の「化合物」中の水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、塩素、臭化物又はヨウ素には、以下に限定されないが、^１Ｈ、^２Ｈ、^３Ｈ、^１１Ｃ、^１２Ｃ、^１３Ｃ、^１４Ｃ、^１４Ｎ、^１５Ｎ、^１６Ｏ、^１７Ｏ、^１８Ｏ、^３１Ｐ、^３２Ｐ、^３２Ｓ、^３３Ｓ、^３４Ｓ、^３６Ｓ、^１７Ｆ、^１９Ｆ、^３５Ｃｌ、^３７Ｃｌ、^７９Ｂｒ、^８１Ｂｒ、^１２７Ｉ及び^１３１Ｉなどのそれらの同位体も含まれることが意図されている。いくつかの実施形態では、水素は、プロチウム、ジュウテリウム及びトリチウムを含む。いくつかの実施形態では、水素は、プロチウムを指す。いくつかの実施形態では、水素は、ジュウテリウムを指す。いくつかの実施形態では、水素は、トリチウムを指す。いくつかの実施形態では、用語「ジュウテリウムによって置換（された）」若しくは「ジュウテリウム置換（された）」は、化学基中の水素の他のアイソフォーム（例えば、プロチウム）をジュウテリウムで置換するためのものである。いくつかの実施形態では、炭素は、^１２Ｃ及び^１３Ｃを含む。

【0064】

残基
本明細書に記載のペプチドデンドロン内のアミノ酸は、一緒に連結されると、α－アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合を介して鎖を形成する。鎖に一旦連結されると、個々のアミノ酸は、「残基」と呼ばれる。「残基」は、アミノ酸に由来する。「残基」はまた、α－アミノ基又はカルボキシ基を介してのみ連結された末端アミノ酸を記載するために使用され得、任意選択的に、（本明細書において以下に記載されるように）末端アミノ基が修飾アミノ基であるか、又は末端カルボキシ基が修飾カルボキシ基である。本明細書における特定のアミノ酸（例えば、「リシン」）への言及は、文脈に応じて、アミノ酸自体又は残基を指し得る。

【0065】

修飾リシン
修飾リシン又は修飾リシン由来の残基が記述されているいずれかの実施形態では、これらは式（Ｉ）及びその実施形態による修飾リシンを指す。

【0066】

修飾リシン又は修飾リシン残基が記述されているいずれかの実施形態では、これは修飾Ｄリシンを指し得る。

【0067】

修飾リシン又は修飾リシン残基が記述されているいずれかの実施形態では、これは修飾Ｌリシンを指し得る。

【0068】

塩形態
ペプチドデンドロンが記述されているいずれかの実施形態では、これは塩形態のペプチドデンドロンを指し得る。

【0069】

本明細書で使用される場合、「塩形態」は、本明細書に記載のペプチドデンドロンの誘導体を指し、親化合物は、１つ以上の存在する酸性部分（例えば、カルボキシルなど）及び／又は塩基部分（例えば、アミン、アルカリなど）をその塩形態に変換させることによって修飾される。多くの場合、本開示の化合物は、アミノ基及び／若しくはカルボキシル基又はそれらに類似する基の存在によって、酸性塩及び／又は塩基性塩を形成することができる。特定の塩形態は、薬学的に許容される塩である。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」は、哺乳動物、特に人間での使用に安全且つ効果的な塩である。

【0070】

本明細書に記載のペプチドデンドロンの好適な塩形態としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など）又は有機酸（例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、トリメシン酸、クエン酸、乳酸、フェニル酢酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ナパジシリル酸、エタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、サリチル酸、スルホサリチル酸など）に由来し得る酸付加塩が挙げられる。特定の酸付加塩は、塩酸塩である。

【0071】

本明細書に記載のペプチドデンドロンの好適な塩形態としては、例えば、無機塩基に由来し得る金属の塩基付加塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、及びカルシウム、マグネシウム、鉄、銀、亜鉛、銅などの周期表の第Ｉ～第ＸＩＩ族の水酸化物塩、炭酸塩、重炭酸塩）、又は有機塩基（例えば、第１級、第２級、及び第３級アミン、天然の置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、塩基性イオン交換樹脂など）に由来し得る塩基付加塩が挙げられる。特定の有機アミンとしては、イソプロピルアミン、ベンザチン、コリネート、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、リシン、メグルミン、ピペラジン及びトロメタミンが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる好適な塩のリストは、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”２０ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，（１９８５）；及びＳｔａｈｌ ａｎｄ Ｗｅｒｍｕｔｈによる”Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ”（Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２００２）に見出すことができる。

【0072】

本明細書で使用されるペプチドデンドロンの用語
本願は、本明細書に記載の式（Ｉ）の修飾リシンに由来する１つ以上の残基を含むペプチドデンドロンを記載する。本明細書において、ペプチドデンドロンが言及されている場合、これはアミノ酸残基を含む３次元構造を指し、残基の１つの側鎖、例えばリシンのε－アミンは、その後の世代を作る分枝点を形成し、分子を３Ｄ巨大分子に構築する。ペプチドデンドロンは少なくとも１つの分岐点を含み、少なくとも１つの世代（Ｇ１）で非直鎖状分子を形成する。

【0073】

以下の略語が本明細書において使用される：
・世代０：ペプチドデンドロン内の第１の分岐点に先行するアミノ酸残基の配列。
・分岐点：新しい世代を開始するアミノ酸残基の付加によって修飾される側鎖を有するアミノ酸残基。
・世代：分岐点間のアミノ酸残基、連続する各世代に番号が付される（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３…）。
・標的化基：特定の細胞型又は器官に対し親和性を有する部分、例えば、糖、小分子、ペプチド、及び／又は抗体に基づく部分。

【0074】

慣例に従って、ペプチドは、Ｎ末端アミノ酸が最初に描かれ、Ｃ末端アミノ酸が最後に描かれる（左から右に書く）。

【0075】

リシン（ＬＹＳ）は、特に明記しない限り、未修飾リシンを指す。

【0076】

アミノ酸がキラルであり得るいずれかの実施形態では、これはＤアミノ酸を指し得る。

【0077】

アミノ酸がキラルであり得るいずれかの実施形態では、これはＬアミノ酸を指し得る。

【0078】

アミノ酸がキラルであり得るいずれかの実施形態では、アミノ酸は、Ｌアミノ酸及びＤアミノ酸の混合物であり得る。

【0079】

ペプチドデンドロン
ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、その組成及び純度を正確に制御できる技術によって合成されたポリペプチドを指し得る。好適な技術としては、固相ペプチド合成が挙げられる。

【0080】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、分岐点、世代０、及び続く世代が合わせて、１２０個未満のアミノ酸残基を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0081】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、分岐点、世代０、及び続く世代が合わせて、１００個未満のアミノ酸残基を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0082】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、分岐点、世代０、及び続く世代が合わせて、８０個未満のアミノ酸残基を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0083】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、分岐点、世代０、及び続く世代が合わせて、６０個未満のアミノ酸残基を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0084】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、分岐点、世代０、及び続く世代が合わせて、約５２個のアミノ酸残基を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0085】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、分岐点、世代０、及び続く世代が合わせて、５２個のアミノ酸残基を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0086】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、ペプチドデンドロンは、塩形態であり得る。

【0087】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、ペプチドデンドロンは、本明細書で定義される修飾リシンに由来する１つ以上の残基、及び１つ以上のロイシン残基を含む。

【0088】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、ペプチドデンドロンは、本明細書で定義される修飾リシンに由来する１つ以上の残基、及び１つ以上のアルギニン残基を含む。

【0089】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、ペプチドデンドロンは、本明細書で定義される修飾リシンに由来する１つ以上の残基、及び１つ以上のリシン残基を含む。

【0090】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、ペプチドデンドロンは、本明細書で定義される修飾リシンに由来する１つ以上の残基、１つ以上のアルギニン残基、及び１つ以上のリシン残基を含む。

【0091】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、ペプチドデンドロンは、本明細書で定義される修飾リシンに由来する１つ以上の残基、１つ以上のロイシン残基、及び１つ以上のリシン残基を含む。

【0092】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、ペプチドデンドロンは、本明細書で定義される修飾リシンに由来する１つ以上の残基、１つ以上のアルギニン残基、及び１つ以上のロイシン残基を含む。

【0093】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、少なくとも１つの世代は、本明細書で定義される修飾リシンに由来する１つ以上の残基、及び１つ以上のロイシン残基を含む。

【0094】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、少なくとも１つの世代は、本明細書で定義される修飾リシンに由来する１つ以上の残基、及び１つ以上のアルギニン残基を含む。

【0095】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、少なくとも１つの世代は、本明細書で定義される修飾リシンに由来する１つ以上の残基、及び１つ以上のリシン残基を含む。

【0096】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、少なくとも１つの世代は、本明細書で定義される修飾リシンに由来する１つ以上の残基、１つ以上のアルギニン残基、及び１つ以上のリシン残基を含む。

【0097】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、少なくとも１つの世代は、本明細書で定義される修飾リシンに由来する１つ以上の残基、１つ以上のロイシン残基、及び１つ以上のリシン残基を含む。

【0098】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、少なくとも１つの世代は、本明細書で定義される修飾リシンに由来する１つ以上の残基、１つ以上のアルギニン残基、及び１つ以上のロイシン残基を含む。

【0099】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、世代は、本明細書で定義される修飾リシンに由来する１つ以上の残基、及び１つ以上のロイシン残基を含む。

【0100】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、世代は、本明細書で定義される修飾リシンに由来する１つ以上の残基、及び１つ以上のアルギニン残基を含む。

【0101】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、世代は、本明細書で定義される修飾リシンに由来する１つ以上の残基、及び１つ以上のリシン残基を含む。

【0102】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、世代は、本明細書で定義される修飾リシンに由来する１つ以上の残基、１つ以上のアルギニン残基、及び１つ以上のリシン残基を含む。

【0103】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、世代は、本明細書で定義される修飾リシンに由来する１つ以上の残基、１つ以上のロイシン残基、及び１つ以上のリシン残基を含む。

【0104】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、世代は、本明細書で定義される修飾リシンに由来する１つ以上の残基、１つ以上のアルギニン残基、及び１つ以上のロイシン残基を含む。

【0105】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、ｐＫａ＞７．４の側鎖を有するアミノ酸％は、２５～５０％である。

【0106】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、ｐＫａ＞７．４の側鎖を有するアミノ酸％は、２５～３０％である。

【0107】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、ｐＫａ＞７．４の側鎖を有するアミノ酸％は、３０～３５％である。

【0108】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、ｐＫａ＞７．４の側鎖を有するアミノ酸％は、３５～４０％である。

【0109】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、ｐＫａ＞７．４の側鎖を有するアミノ酸％は、４０～４５％である。

【0110】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、ｐＫａ＞７．４の側鎖を有するアミノ酸％は、４５～５０％である。

【0111】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、ｐＫａ＝４．０～６．５の側鎖を有するアミノ酸％は、２５～５０％である。

【0112】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、ｐＫａ＝４．０～６．５の側鎖を有するアミノ酸％は、２５～３０％である。

【0113】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、ｐＫａ＝４．０～６．５の側鎖を有するアミノ酸％は、３０～３５％である。

【0114】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、ｐＫａ＝４．０～６．５の側鎖を有するアミノ酸％は、３５～４０％である。

【0115】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、ｐＫａ＝４．０～６．５の側鎖を有するアミノ酸％は、４０～４５％である。

【0116】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、ｐＫａ＝４．０～６．５の側鎖を有するアミノ酸％は、４５～５０％である。

【0117】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、続く世代のアミノ酸残基のうち、ｐＫａ＞７．４の側鎖を有する％は２５～５０％であり、ｐＫａ＝４．０～６．５の側鎖を有する％は２５～５０％である。

【0118】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、ペプチドデンドロンは、式（ＩＩ）：
（｛Ｘ_３｝｛Ｘ_２｝｛Ｘ_１｝）_８（｛ＢＰ｝｛Ｘ_３｝｛Ｘ_２｝｛Ｘ_１｝）_４（｛ＢＰ｝｛Ｘ_３｝｛Ｘ_２｝｛Ｘ_１｝）_２｛ＢＰ｝
（ＩＩ）
（式中、
Ｘ_１、Ｘ_２、又はＸ_３のうちの１つは、塩基性アミノ酸残基であり；
別のＸ_１、Ｘ_２、又はＸ_３は、疎水性アミノ酸残基であり；
残りのＸ_１、Ｘ_２、又はＸ_３は、本明細書で定義される修飾リシンに由来する残基であり；且つ
ＢＰは、分岐点アミノ酸残基である）
のペプチドデンドロンを含む。

【0119】

式（ＩＩ）において、Ｘ_１基の一方はＢＰアミノ酸のα－アミンに結合し、他方は側鎖上の反応性基、例えばアミノ基に、例えばリシンのε－アミンに結合する。式（ＩＩ）のペプチドデンドロンは、以下の構造を有する。

【化5】

【0120】

式（ＩＩ）のペプチドデンドロンにおいて、同じ世代内のＸ_１アミノ酸残基は同じであっても異なっていてもよく、且つ／又は異なる世代のＸ_１アミノ酸残基は同じであっても異なっていてもよい。Ｘ_２、Ｘ_３についても同様である。

【0121】

一実施形態では、Ｘ_１は、塩基性アミノ酸残基である。

【0122】

一実施形態では、Ｘ_１は、疎水性アミノ酸残基である。

【0123】

一実施形態では、Ｘ_１は、本明細書で定義される修飾リシンに由来する残基である。

【0124】

一実施形態では、Ｘ_２は、塩基性アミノ酸残基である。

【0125】

一実施形態では、Ｘ_２は、疎水性アミノ酸残基である。

【0126】

一実施形態では、Ｘ_２は、本明細書で定義される修飾リシンに由来する残基である。

【0127】

一実施形態では、Ｘ_３は、塩基性アミノ酸残基である。

【0128】

一実施形態では、Ｘ_３は、疎水性アミノ酸残基である。

【0129】

一実施形態では、Ｘ_３は、本明細書で定義される修飾リシンに由来する残基である。

【0130】

一実施形態では：
Ｘ_１は、塩基性アミノ酸残基であり；
Ｘ_２は、疎水性アミノ酸残基であり；且つ
Ｘ_３は、本明細書で定義される修飾リシンに由来する残基である。

【0131】

一実施形態では：
Ｘ_３は、塩基性アミノ酸残基であり；
Ｘ_２は、疎水性アミノ酸残基であり；且つ
Ｘ_１は、本明細書で定義される修飾リシンに由来する残基である。

【0132】

Ｘ_１、Ｘ_２、又はＸ_３のうちの１つは、塩基性アミノ酸残基である。塩基性アミノ酸残基は、正電荷を担持することができる側鎖を有するアミノ酸残基である。

【0133】

一実施形態では、塩基性アミノ酸残基は、アルギニン、オルニチン及びリシンから選択される。

【0134】

一実施形態では、塩基性アミノ酸残基は、アルギニンである。

【0135】

一実施形態では、塩基性アミノ酸残基は、オルニチンである。

【0136】

一実施形態では、塩基性アミノ酸残基は、リシンである。

【0137】

一実施形態では、Ｘ_１は、アルギニン、オルニチン及びリシンから選択される。

【0138】

一実施形態では、Ｘ_１は、アルギニンである。

【0139】

一実施形態では、Ｘ_１は、オルニチンである。

【0140】

一実施形態では、Ｘ_１は、リシンである。

【0141】

一実施形態では、Ｘ_２は、アルギニン、オルニチン及びリシンから選択される。

【0142】

一実施形態では、Ｘ_２は、アルギニンである。

【0143】

一実施形態では、Ｘ_２は、オルニチンである。

【0144】

一実施形態では、Ｘ_２は、リシンである。

【0145】

一実施形態では、Ｘ_３は、アルギニン、オルニチン及びリシンから選択される。

【0146】

一実施形態では、Ｘ_３は、アルギニンである。

【0147】

一実施形態では、Ｘ_３は、オルニチンである。

【0148】

一実施形態では、Ｘ_３は、リシンである。

【0149】

Ｘ_１、Ｘ_２、又はＸ_３のうちの１つは、疎水性アミノ酸残基である。疎水性アミノ酸残基は、主に炭素及び水素から構成される側鎖を有するアミノ酸残基であり、水をはじきやすい傾向がある

【0150】

一実施形態では、疎水性アミノ酸残基は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、メチオニン及びバリンから選択される。

【0151】

一実施形態では、疎水性アミノ酸残基は、アラニンである。

【0152】

一実施形態では、疎水性アミノ酸残基は、イソロイシンである。

【0153】

一実施形態では、疎水性アミノ酸残基は、ロイシンである。

【0154】

一実施形態では、疎水性アミノ酸残基は、フェニルアラニンである。

【0155】

一実施形態では、疎水性アミノ酸残基は、トリプトファンである。

【0156】

一実施形態では、疎水性アミノ酸残基は、チロンである。

【0157】

一実施形態では、疎水性アミノ酸残基は、メチオニンである。

【0158】

一実施形態では、疎水性アミノ酸残基は、バリンである。

【0159】

一実施形態では、Ｘ_１は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、メチオニン及びバリンから選択される。

【0160】

一実施形態では、Ｘ_１は、アラニンである。

【0161】

一実施形態では、Ｘ_１は、イソロイシンである。

【0162】

一実施形態では、Ｘ_１は、ロイシンである。

【0163】

一実施形態では、Ｘ_１は、フェニルアラニンである。

【0164】

一実施形態では、Ｘ_１は、トリプトファンである。

【0165】

一実施形態では、Ｘ_１は、チロシンである。

【0166】

一実施形態では、Ｘ_１は、メチオニンである。

【0167】

一実施形態では、Ｘ_１は、バリンである。

【0168】

一実施形態では、Ｘ_２は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、メチオニン及びバリンから選択される。

【0169】

一実施形態では、Ｘ_２は、アラニンである。

【0170】

一実施形態では、Ｘ_２は、イソロイシンである。

【0171】

一実施形態では、Ｘ_２は、ロイシンである。

【0172】

一実施形態では、Ｘ_２は、フェニルアラニンである。

【0173】

一実施形態では、Ｘ_２は、トリプトファンである。

【0174】

一実施形態では、Ｘ_２は、チロシンである。

【0175】

一実施形態では、Ｘ_２は、メチオニンである。

【0176】

一実施形態では、Ｘ_２は、バリンである。

【0177】

一実施形態では、Ｘ_３は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、メチオニン及びバリンから選択される。

【0178】

一実施形態では、Ｘ_３は、アラニンである。

【0179】

一実施形態では、Ｘ_３は、イソロイシンである。

【0180】

一実施形態では、Ｘ_３は、ロイシンである。

【0181】

一実施形態では、Ｘ_３は、フェニルアラニンである。

【0182】

一実施形態では、Ｘ_３は、トリプトファンである。

【0183】

一実施形態では、Ｘ_３は、チロシンである。

【0184】

一実施形態では、Ｘ_３は、メチオニンである。

【0185】

一実施形態では、Ｘ_３は、バリンである。

【0186】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、ペプチドデンドロンは、本明細書で定義される式（ＩＩ）（式中、
Ｘ_１は、アルギニンであり；
Ｘ_２は、ロイシンであり；
Ｘ_３は、本明細書で定義される修飾リシンに由来する残基であり、且つ
ＢＰは、リシンである）
のペプチドデンドロンを含む。

【0187】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、ペプチドデンドロンは、本明細書で定義される式（ＩＩ）（式中、
Ｘ_１は、本明細書で定義される修飾リシンに由来する残基であり；
Ｘ_２は、ロイシンであり；
Ｘ_３は、アルギニンであり；且つ
ＢＰは、リシンである）
のペプチドデンドロンを含む。

【0188】

世代０
ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、ペプチドデンドロンは、ペプチドデンドロン中の第１分岐点アミノ酸に結合した「世代０」と呼ばれるアミノ酸残基の配列を含む。アミノ酸残基の世代０配列は、Ｃ末端、又はＮ末端、特にＣ末端にあり得る。例えば、アミノ酸残基の世代０配列を有するペプチドデンドロンは、以下のように説明し得る。

【化6】

【0189】

第１分岐点がリシンである場合、上記図中の世代０配列は、以下のように結合され得る：

【化7】

（式中、「・・」は分子の残りの部分を表す）。

【0190】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、ペプチドデンドロンは、第１世代に先行する分岐点アミノ酸のＣ末端にアミノ酸の世代０配列を含む。

【0191】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、ペプチドデンドロンは、第１世代に先行する分岐点アミノ酸のＮ末端にアミノ酸の世代０配列を含む。

【0192】

アミノ酸の世代０配列が言及されているいずれかの実施形態では、世代０配列は、１つ以上のグリシン残基を含む。

【0193】

アミノ酸の世代０配列が言及されているいずれかの実施形態では、世代０配列は、グリシン残基を含む。

【0194】

アミノ酸の世代０配列が言及されているいずれかの実施形態では、世代０配列は、２つのグリシン残基を含む。

【0195】

アミノ酸の世代０配列が言及されているいずれかの実施形態では、世代０配列は、３つのグリシン残基を含む。

【0196】

アミノ酸の世代０配列が言及されているいずれかの実施形態では、世代０配列は、１つ以上のバリン残基を含む。

【0197】

アミノ酸の世代０配列が言及されているいずれかの実施形態では、世代０配列は、バリン残基を含む。

【0198】

アミノ酸の世代０配列が言及されているいずれかの実施形態では、世代０配列は、１つ以上のシトルリン残基を含む。

【0199】

アミノ酸の世代０配列が言及されているいずれかの実施形態では、世代０配列は、シトルリン残基を含む。

【0200】

アミノ酸の世代０配列が言及されているいずれかの実施形態では、世代０配列は、１つ以上のセリン残基を含む。

【0201】

アミノ酸の世代０配列が言及されているいずれかの実施形態では、世代０配列は、セリン残基を含む。

【0202】

アミノ酸の世代０配列が言及されているいずれかの実施形態では、世代０配列は、１つ以上のシステイン残基を含む。

【0203】

アミノ酸の世代０配列が言及されているいずれかの実施形態では、世代０配列は、システイン残基を含む。

【0204】

アミノ酸の世代０配列が言及されているいずれかの実施形態では、世代０配列は、終端がシステイン残基であり得る。終端システインにより、チオール化学によるさらなる官能化が可能になる。別の実施形態では、世代０配列は、終端がリシン、セリン、チロシン、及び／又はアジドフェニルアラニンなどのアミノ酸の反応性誘導体であり得る。他のアミノ酸の反応性誘導体としては、アジド、アルキン、シクロペンタジエン、及びテトラジン基を含有するものが挙げられる。

【0205】

アミノ酸の世代０配列が言及されている任意の実施形態では、世代０配列の終端は、末端カルボキシ基がアミド化されてＣ（Ｏ）ＮＨ_２基を形成しているシステイン残基である。アミド化によりＣＯＯＨ基が不活性になり、ペプチド全体の電荷が減少し、天然ペプチドをよりよく模倣する。

【0206】

アミノ酸の世代０配列が言及されているいずれかの実施形態では、世代０配列は、グリシン、バリン、シトルリン、セリン、アラニン、リシン、フェニルアラニン及び／又はシステイン残基を含む。

【0207】

アミノ酸の世代０配列が言及されているいずれかの実施形態では、世代０配列は、グリシン、バリン、シトルリン、セリン及び／又はシステイン残基を含む。

【0208】

アミノ酸の世代０配列が言及されているいずれかの実施形態では、世代０配列は、グリシン、バリン、シトルリン、セリン及びシステイン残基を含む。

【0209】

アミノ酸の世代０配列が言及されているいずれかの実施形態では、世代０配列は、ＧＬＹ－ＶＡＬ－ＣＩＴ－ＧＬＹ－ＧＬＹ－ＳＥＲ－ＣＹＳ（配列番号５）からなる。

【0210】

アミノ酸の世代０配列が言及されている任意の実施形態では、世代０配列は、配列ＶＡＬ－ＣＩＴ、ＶＡＬ－ＡＬＡ、ＬＹＳ－ＰＨＥ、ＧＬＹ－ＧＬＹ－ＰＨＥ－ＧＬＹ（配列番号１）又はＧＬＹ－ＰＨＥ－ＬＥＵ－ＧＬＹ（配列番号２）を含む。

【0211】

分岐点
分岐点は、新しい世代を開始するアミノ酸残基の付加によって修飾される側鎖を有するアミノ酸残基である。次の図では、分岐点はＢＰで示されている。

【化8】

【0212】

分岐点がリシンである場合、リシンは、以下のように上記図中の分岐点を形成し得る：

【化9】

（式中、「・・」は分子の残りの部分を表す）。

【0213】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、ペプチドデンドロン内の分岐点は、同一又は異なるアミノ酸残基であり得る。

【0214】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、ペプチドデンドロン内の分岐点は、同じアミノ酸残基であり得る。

【0215】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、リシンが１つ以上の分岐点を形成しているペプチドデンドロンを指し得る。

【0216】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、リシンが分岐点の全てを形成しているペプチドデンドロンを指し得る。

【0217】

世代
ペプチドデンドロンは世代を含む。世代は、以下のように説明し得る：

【化10】

式中、Ｇ１は第１世代を表し、Ｇ２は第２世代を表し、Ｇ３は第３世代を表し、総称して世代と呼ばれる。Ｇ３世代の末端Ｘ_３基にさらなる分岐点（ＢＰ）アミノ酸を付加し、続いてアミノ酸残基のＧ４世代配列、例えばさらなるＸ_３－Ｘ_２－Ｘ_１基などを付加することによって、さらなる世代を付加することができる。

【0218】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、５個のアミノ酸残基からなる世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0219】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、４個のアミノ酸残基からなる世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0220】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、３個のアミノ酸残基からなる世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0221】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、２個のアミノ酸残基からなる世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0222】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、４個以上のアミノ酸残基からなる世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0223】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、３個以上のアミノ酸残基からなる世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0224】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、２個以上のアミノ酸残基からなる世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0225】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、最大５個までのアミノ酸残基からなる世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0226】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、最大４個までのアミノ酸残基からなる世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0227】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、最大３個までのアミノ酸残基からなる世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0228】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、同じペプチド鎖からなる世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0229】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、各世代において同じペプチド鎖からなる世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0230】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、異なるペプチド鎖からなる世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0231】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、各世代において異なるペプチド鎖からなる世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0232】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、塩基性アミノ酸残基を含む世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0233】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、疎水性アミノ酸残基を含む世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0234】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、塩基性アミノ酸残基及び疎水性アミノ酸残基を含む世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0235】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、塩基性アミノ酸残基、疎水性アミノ酸残基、及び本明細書で定義される修飾リシンに由来する残基を含む世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0236】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、本明細書で定義される修飾リシンに由来する１つ以上の残基、及び１つ以上のロイシン残基を含む世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0237】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、本明細書で定義される修飾リシンに由来する１つ以上の残基、及び１つ以上のアルギニン残基を含む世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0238】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、本明細書で定義される修飾リシンに由来する１つ以上の残基、１つ以上のアルギニン残基、及び１つ以上のロイシン残基を含む世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0239】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、ＡＲＧ－ＬＥＵ－ＬＹＳ（修飾）（ここで、ＬＹＳ（修飾）は本明細書で定義される修飾リシンに由来する残基である）を含む１つ以上の世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0240】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、ＡＲＧ－ＬＥＵ－ＬＹＳ（修飾）（ここで、ＬＹＳ（修飾）は本明細書で定義される修飾リシンに由来する残基である）からなる１つ以上の世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0241】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、ＡＲＧ－ＬＥＵ－ＬＹＳ（修飾）（ここで、ＬＹＳ（修飾）は本明細書で定義される修飾リシンに由来する残基である）を含む全ての世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0242】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、ＡＲＧ－ＬＥＵ－ＬＹＳ（修飾）（ここで、ＬＹＳ（修飾）は本明細書で定義される修飾リシンに由来する残基である）からなる全ての世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0243】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、ＬＹＳ（修飾）－ＬＥＵ－ＡＲＧ（ここで、ＬＹＳ（修飾）は本明細書で定義される修飾リシンに由来する残基である）を含む１つ以上の世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0244】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、ＬＹＳ（修飾）－ＬＥＵ－ＡＲＧ（ここで、ＬＹＳ（修飾）は本明細書で定義される修飾リシンに由来する残基である）からなる１つ以上の世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0245】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、ＬＹＳ（修飾）－ＬＥＵ－ＡＲＧ（ここで、ＬＹＳ（修飾）は本明細書で定義される修飾リシンに由来する残基である）を含む全ての世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0246】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、ＬＹＳ（修飾）－ＬＥＵ－ＡＲＧ（ここで、ＬＹＳ（修飾）は本明細書で定義される修飾リシンに由来する残基である）からなる全ての世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0247】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、１つの世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0248】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、２つの世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0249】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、３つの世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0250】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、４つの世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0251】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、５つの世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0252】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、一世代ペプチドデンドロンを指し得る。

【0253】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、二世代ペプチドデンドロンを指し得る。

【0254】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、三世代ペプチドデンドロンを指し得る。

【0255】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、四世代ペプチドデンドロンを指し得る。

【0256】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、五世代ペプチドデンドロンを指し得る。

【0257】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、２つ以上の世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0258】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、３つ以上の世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0259】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、４つ以上の世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0260】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、５つ以上の世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0261】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、５つ以下の世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0262】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、４つ以下の世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0263】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、３つ以上の世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0264】

ペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、これは、２つ以下の世代を含むペプチドデンドロンを指し得る。

【0265】

ポリエチレングリコールペプチドデンドロン
さらなる実施形態では、本明細書に記載されるペプチドデンドロンは、生体適合性の親水性ポリマー、例えばポリエチレングリコール又はポリサルコシン基をさらに含み得る。

【0266】

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）_ｎ－反復サブユニットからなるポリマーであり、典型的には、ｎは＞３及び＜２５０である。ＰＥＧは、典型的には、エチレンオキシドの開環重合を用いて合成される。ＰＥＧポリマーは、直鎖状であっても分岐状であってもよい。分岐状ＰＥＧは、典型的には、中心コア基から生じる３～３０のＰＥＧ鎖を有する。

【0267】

一実施形態では、本明細書に記載されるペプチドデンドロンは、ポリエチレングリコール基を含み得、本明細書では「ポリエチレングリコールペプチドデンドロン」又は「ＰＥＧペプチドデンドロン」と称される。ＰＥＧ基は、ナノ粒子の安定化を助け、立体遮蔽によって非特異的タンパク質相互作用を低減する「ステルス層」を形成し得る。

【0268】

ＰＥＧ基は、ペプチドデンドロンのアミノ酸の世代０配列中の末端アミノ酸残基に、場合により連結基を介して、以下のように結合され得る。

【化11】

【0269】

ＰＥＧ基は、末端－Ｏ基を介して、又はＰＥＧの末端－ＣＨ_２－基を介してペプチドデンドロンに結合することができ、場合により連結基を介して、アミノ酸の世代０配列中の末端アミノ酸残基のアミン又はカルボキシに結合され得る。ＰＥＧ基はまた、末端アミノ酸残基の側鎖上の反応性基、例えば、末端システインの側鎖上の－ＳＨ基に、場合により連結基を介して、特に末端システインの末端カルボキシ基もアミド化されている場合に、結合され得る。

【0270】

ポリエチレングリコールペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、ペプチドデンドロンに結合していないＰＥＧ基の末端は修飾されていても水素であってもよい。ポリエチレングリコール基の末端に好適な修飾は、例えば、Ｃ_１～４アルキル、例えばメチル；又はＣ_１～４アルコキシ、例えばメトキシである。

【0271】

ポリエチレングリコールペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、ペプチドデンドロンに結合していないＰＥＧ基の末端に反応性基があってもよい。好適な反応性基としては、マレイミド、アジド、アルキン（例えば、Ｃ_２～６アルキン）、及びシクロペンタジエンが挙げられる。この反応性基を使用して、ペプチドデンドロンへのＰＥＧコンジュゲーションの前又は後に、放射標識、染料、及び細胞標的化リガンドなどの種に結合させることができる。

【0272】

ポリエチレングリコールペプチドデンドロンが言及されているいずれかの実施形態では、ポリエチレングリコールとペプチドデンドロンとの間に連結基が存在し得る。好適な連結基は、Ｃ_１～４アルキルアミノ、例えばＰＥＧ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－ＰＤ若しくはＰＥＧ－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＰＤを形成する、例えば－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－；又はＣ_１～４アルキレン、例えばＰＥＧ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＰＤを形成する、例えばＣＨ_２－ＣＨ_２－である（ここで、ＰＤはペプチドデンドロンである）。

【0273】

ポリエチレングリコール基が末端アミノ酸残基の側鎖上の反応性基、例えば、末端システインの側鎖上の－ＳＨ基に結合している場合、ポリエチレングリコール基を結合させるために様々な方法を用いることができる。典型的には、これにより、リンカー基を介してペプチドデンドロンに結合したポリエチレングリコール基がもたらされる。例えば、アミド結合を介してポリエチレングリコールに連結された３－マレイミドプロパン酸官能基で官能化されたポリエチレングリコールは、チオール反応性試薬である。
ポリエチレングリコール分子の他端はメチル末端であり得る。ＰＥＧ基とペプチドデンドロンとの間にリンカー基をもたらす、この性質の官能化ポリエチレングリコール基を用いる反応は、以下のように説明し得る：

【化12】

（式中、「ＰＤ－ＳＨ」における「ＳＨ」はシステイン側鎖上のチオールを指し、ＰＤはペプチドデンドロンであり、「ｎ」は、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ－反復サブユニットの数である）。

【0274】

分岐状ＰＥＧ基を含む官能化ＰＥＧ基のさらなる例としては、以下が挙げられる。

【化13】

【0275】

以下は、分岐状ＰＥＧ基を含むそのようなペプチドデンドロンの例である。

【化14】

（式中、ｎは－ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ－反復サブユニットの数であり、Σ_ｎ（結合したｎ個の基全ての合計）は４～２５０である。）

【0276】

ポリエチレングリコールが言及されているいずれかの実施形態では、これは、０．５～３０ｋＤａの分子量範囲を有するポリマーを指し得る。

【0277】

ポリエチレングリコールが言及されているいずれかの実施形態では、これは、２～２０ｋＤａの分子量範囲を有するポリマーを指し得る。

【0278】

ポリエチレングリコールが言及されているいずれかの実施形態では、これは、４～１１ｋＤａの分子量範囲を有するポリマーを指し得る。

【0279】

ポリエチレングリコールが言及されているいずれかの実施形態では、これは、１～６ｋＤａの分子量範囲を有するポリマーを指し得る。

【0280】

ポリエチレングリコールが言及されているいずれかの実施形態では、これは、約２ｋＤａの分子量範囲を有するポリマーを指し得る。

【0281】

ポリエチレングリコールが言及されているいずれかの実施形態では、これは、約５ｋＤａの分子量範囲を有するポリマーを指し得る。

【0282】

ポリエチレングリコールが言及されているいずれかの実施形態では、これは、約１０ｋＤａの分子量範囲を有するポリマーを指し得る。

【0283】

ポリエチレングリコールが言及されるいずれかの実施形態では、これは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ－反復サブユニット（ｎ＞３）を含むポリマーを指し得る。

【0284】

ポリエチレングリコールが言及されるいずれかの実施形態では、これは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ－反復サブユニット（ｎ＞１０）を含むポリマーを指し得る。

【0285】

ポリエチレングリコールが言及されるいずれかの実施形態では、これは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ－反復サブユニット（ｎ＞２０）を含むポリマーを指し得る。

【0286】

ポリエチレングリコールが言及されるいずれかの実施形態では、これは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ－反復サブユニット（ｎ＞３０）を含むポリマーを指し得る。

【0287】

ポリエチレングリコールが言及されるいずれかの実施形態では、これは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ－反復サブユニット（ｎ＞５０）を含むポリマーを指し得る。

【0288】

ポリエチレングリコールが言及されるいずれかの実施形態では、これは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ－反復サブユニット（ｎ＞１００）を含むポリマーを指し得る。

【0289】

ポリエチレングリコールが言及されるいずれかの実施形態では、これは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ－反復サブユニット（ｎ＞１５０）を含むポリマーを指し得る。

【0290】

ポリエチレングリコールが言及されるいずれかの実施形態では、これは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ－反復サブユニット（ｎ＞２００）を含むポリマーを指し得る。

【0291】

ポリエチレングリコールが言及されるいずれかの実施形態では、これは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ－反復サブユニット（ｎ＞２５０）を含むポリマーを指し得る。

【0292】

ポリエチレングリコールが言及されるいずれかの実施形態では、これは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ－反復サブユニット（ｎ＜３００）を含むポリマーを指し得る。

【0293】

ポリエチレングリコールが言及されるいずれかの実施形態では、これは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ－反復サブユニット（ｎ＜２５０）を含むポリマーを指し得る。

【0294】

ポリエチレングリコールが言及されるいずれかの実施形態では、これは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ－反復サブユニット（ｎ＜２００）を含むポリマーを指し得る。

【0295】

ポリエチレングリコールが言及されるいずれかの実施形態では、これは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ－反復サブユニット（ｎ＜１５０）を含むポリマーを指し得る。

【0296】

ポリエチレングリコールが言及されるいずれかの実施形態では、これは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ－反復サブユニット（ｎ＜１００）を含むポリマーを指し得る。

【0297】

ポリエチレングリコールが言及されるいずれかの実施形態では、これは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ－反復サブユニット（ｎ＜５０）を含むポリマーを指し得る。

【0298】

ポリエチレングリコールが言及されるいずれかの実施形態では、これは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ－反復サブユニット（ｎ＜４０）を含むポリマーを指し得る。

【0299】

ポリエチレングリコールが言及されるいずれかの実施形態では、これは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ－反復サブユニット（ｎ＜３０）を含むポリマーを指し得る。

【0300】

ポリエチレングリコールが言及されるいずれかの実施形態では、これは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ－反復サブユニット（ｎ＜２０）を含むポリマーを指し得る。

【0301】

ポリエチレングリコールが言及されるいずれかの実施形態では、これは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ－反復サブユニット（ｎ＜１０）を含むポリマーを指し得る。

【0302】

標的化基
さらなる実施形態において、本明細書に記載されるペプチドデンドロンは、標的化基をさらに含み得る。標的化基とは、細胞に結合し、且つ／又は細胞内在化を促進する標的化部分を指す。標的化基は、場合により連結基を介して、以下のようにペプチドデンドロンのＰＥＧ基に結合され得る。

【化15】

【0303】

標的化基が言及されているいずれかの実施形態では、標的化基は、ペプチド、抗体、糖又は小分子から選択され得る。

【0304】

任意選択的に連結基を介して、ＰＥＧ基に結合することができる好適な標的化ペプチドとしては、以下が挙げられる：
・トランスファー受容体標的化ペプチド、例えばＡｃ－ＫＧＧＧＡＷＳＩＩＤＣＳＭＮＹＣＬＹＩＥＧ（配列番号３）（ここで、ボールド体の「Ｃ」は、システインがジスルフィド結合を介して架橋されていることを示す）（例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．２１９５４／ｏｕ．ｒｏ．００００ｄ７４４）；
・環状ＲＧＤペプチド、例えば腫瘍及び炎症血管系におけるａ_３ｂ_５インテグリンを標的とするもの、例えばシクロ（－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｌｙｓ）（配列番号４）：

【化16】

・筋標的化ペプチド、例えばＡＳＳＬＮＩＡ（配列番号６）（Ｔ Ｉ Ｓａｍｏｙｌｏｖａ １，Ｂ Ｆ Ｓｍｉｔｈ． Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ．１９９９ Ａｐｒ；２２（４）：４６０－６；ｄｏｉ：１０．１００２／（ｓｉｃｉ）１０９７－４５９８（１９９９０４）２２：４＜４６０：：ａｉｄ－ｍｕｓ６＞３．０．ｃｏ；２－Ｉ）。

【0305】

好適な標的化抗体としては、以下が挙げられる：
・Ｔ細胞標的化抗体、例えば抗ＣＤ３ Ｆａｂ（Ｖａｎ Ｗａｕｗｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９８０，１２４（６）：２７０８－２７１３）；及び
・カベオラ標的化抗体、例えばＭｅｃａ３２モノマーＦＣ（例えば、Ｇａｂｒｉｅｌａ Ｍ．Ｍａｒｃｈｅｔｔｉ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｍｕｎ Ｂｉｏｌ．２０１９；２：９２；Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１９ Ｍａｒ ７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４２００３－０１９－０３３７－２などに記載されている抗体）。

【0306】

好適な標的化糖としては、肝臓におけるアシアロ糖タンパク質受容体を標的とするもの、例えばＧａｌＮａｃ及びＴｒｉ－ＧａｌＮａｃ含有分子、例えば

【化17】

が挙げられる。

【0307】

好適な小分子標的化剤としては、葉酸が挙げられる。

【0308】

いくつかの標的化基では、標的化基上の－ＳＨ基を利用し、上述したＰＥＧ基の結合について記載した方法と同様の方法を用いて、ＰＥＧ基に結合し得る。典型的には、これにより、リンカー基を介した標的化基のポリエチレングリコール基への結合がもたらされる。有利な試薬は、チオール化学によってペプチドデンドロン及び標的化基にコンジュゲートされ得る二官能性ＰＥＧ試薬である。このような試薬の１つは、分子の両端がマレイミドプロピオナート基で官能化されているＰＥＧ試薬である。ＰＥＧ基とペプチドデンドロン、及びＰＥＧ基と標的化基の両間にリンカー基をもたらす、この性質の二官能化ポリエチレングリコール基を用いる反応を簡略化して記載すると、以下のように説明し得る：

【化18】

（式中、「ＰＤ－ＳＨ」における「ＳＨ」はシステイン側鎖上のチオールを指し、「ＴＧ－ＳＨ」における「ＳＨ」は標的化基における反応性チオールを指し、ＰＤはペプチドデンドロンであり、ＴＧは標的化基であり、「ｎ」は、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ－反復サブユニットの数である。

【0309】

ペプチド標的化基、又は反応性アミンを有する別の標的化基（例えば、アミン官能化糖）は、代替活性化ＰＥＧ試薬を使用して、ＰＥＧ基に結合させ得る。典型的には、これにより、リンカー基を介した標的化基のポリエチレングリコール基への結合がもたらされる。有利な試薬は、チオール化学によるペプチドデンドロンへのコンジュゲート、及びアミド結合によるペプチド標的化基へのコンジュゲートが可能な二官能性ＰＥＧ試薬である。このような試薬の１つは、分子の一端がマレイミドプロピオナート基で官能化され、他端がテトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステルで官能化されたＰＥＧ試薬である。この性質の二官能化ポリエチレングリコール基を用いる反応を簡略化して記載すると、以下のように説明し得る。

【化19】

【0310】

末端アミノ基は任意選択的に修飾されたアミノ基であり得る
一実施形態では、ペプチドデンドロンの末端アミノ基は、未修飾であり得る。未修飾の末端アミノ基とは、それが－ＮＨ_２基であることを意味する。

【0311】

一実施形態では、ペプチドデンドロンの末端アミノ基は、修飾されたアミノ基であり得る。

【0312】

修飾は、典型的には化学修飾であり、これには、化学基を付加すること、新規結合を創出すること、及び化学基を除去することが含まれるが、これらに限定されない。修飾アミノ基は、当業者にはよく知られており、アセチル化、脱アミノ、Ｎ－低級アルキル、Ｎ－ジ低級アルキル、制約付きアルキル（例えば、分岐状、環状、融合、アダマンチル）及びＮ－アシル修飾が含まれ得るが、これらに限定されない。修飾アミノ基にはまた、Ｎ－末端（例えば、ｐｙｒｏＧｌｕ保護アミノ基を含むか、又は放射標識、蛍光タグ若しくは親和性タグ（例えば、ビオチン）を付加する内部アミド結合が含まれ得るが、これらに限定されない。修飾アミノ基にはまた、緩衝基（２－アミノ－６－｛［６－（モルホリン－４－イル）ピリシン３－カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸、２－アミノ－６－［（チオモルホリン－３－カルボニル）アミノ］ヘキサン酸、及び２－アミノ－６－［２－（モルホリン－４－イル）アセトアミド］ヘキサン酸、並びに架橋基（すなわち、シクロペンタジエン）が含まれ得るが、これらに限定されない。

【0313】

アミノ基に好適な保護基は、例えば、アシル基、例えばアセチルなどのアルカノイル基、アルコキシカルボニル基、例えばメトキシカルボニル、エトキシカルボニル若しくはｔ－ブトキシカルボニル基、アリールメトキシカルボニル基、例えばベンジルオキシカルボニル若しくはアロイル基、例えばベンゾイルである。特定の修飾アミノ基は、アシルアミノである。特定の修飾アミノ基は、アセチルアミノである。

【0314】

低級アルキルは、ｔ－ブチル、ブチル、プロピル、イソプロピル、エチル及びメチルを含む、Ｃ_１～４アルキルである。

【0315】

末端カルボキシ基は任意選択的に修飾されたカルボキシ基であり得る
一実施形態では、ペプチドデンドロンの末端カルボキシ基は、未修飾である。未修飾の末端カルボキシ基は、それが－Ｃ（Ｏ）ＯＨ基であることを意味する。

【0316】

一実施形態では、ペプチドデンドロンの末端カルボキシ基は、修飾されたカルボキシ基である。

【0317】

修飾は、典型的には化学修飾であり、これには、化学基を付加すること、新規結合を創出すること、及び化学基を除去することが含まれるが、これらに限定されない。修飾カルボキシ基は、当業者にはよく知られており、アミド、低級アルキルアミド、制約付きアルキル（例えば、分岐状、環状、融合、アダマンチル）、ジアルキルアミド、及び低級アルキルエステル修飾が含まれるが、これらに限定されない。修飾カルボキシ基にはまた、カルボキシ基の保護、又は放射標識、蛍光タグ若しくは親和性タグ（例えば、ビオチン）、若しくは細胞標的化リガンドの付加が含まれ得るが、これらに限定されない。カルボキシ基に好適な保護基は、例えば、エステル化基、例えばメチルエチル基、ｔ－ブチル基、又はベンジル基である。特定の修飾カルボキシ基は、－ＣＯ_２ＮＨ_２である。特定の修飾カルボキシ基は、Ｃ末端アミド化である。特定の修飾カルボキシ基は、カルボキサミド基である。特定の修飾カルボキシ基は、Ｎ－（Ｃ_１～４アルキル）カルバモイル基である。

【0318】

医薬活性剤
本明細書に記載した組成物及び方法は、医薬活性剤の送達に好適である。医薬活性剤は、治療結果につながるヒト又は動物の身体に薬理学的効果を発揮することのできる任意の物質である。

【0319】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、遺伝物質、化学的に修飾された核酸、オリゴヌクレオチド、治療用ペプチド、化学療法剤、タンパク質、タンパク質コンジュゲート、造影剤、ＣＲＩＳＰＲ技術に関連するタンパク質核酸、及びカプシド又は酵素などの天然ウイルス成分から選択することができる。

【0320】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、遺伝物質から選択することができる。

【0321】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、核酸から選択することができる。

【0322】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの遺伝物質から選択することができる。

【0323】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、ＤＮＡ及びＲＮＡなどの遺伝物質から選択することができる。

【0324】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡなどの遺伝物質から選択することができる。

【0325】

ＤＮＡが言及されているいずれかの実施形態では、これは、プラスミド、線状ＤＮＡ、短鎖、一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ、ミニサークル及びミニストリングなどの小型化ベクター、ヘアピン型及び十字架型ＤＮＡを含む折畳みＤＮＡ、並びにウイルス由来ＤＮＡであり得る。

【0326】

ＲＮＡが言及されているいずれかの実施形態では、これは、ｍＲＮＡ又はｓｉＲＮＡであり得る。

【0327】

ＲＮＡが言及されているいずれかの実施形態では、これは、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、及び／又はｓｉＲＮＡであり得る。

【0328】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、ＤＮＡから選択することができる。

【0329】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、ＲＮＡから選択することができる。

【0330】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、ＤＮＡ及びｍＲＮＡから選択することができる。

【0331】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡから選択することができる。

【0332】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、ＤＮＡ及びｇＲＮＡから選択することができる。

【0333】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、ＤＮＡ及びｍＲＮＡ及びｇＲＮＡから選択することができる。

【0334】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、オリゴヌクレオチドから選択することができる。

【0335】

オリゴヌクレオチドが言及されるいずれかの実施形態では、これは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、及びアプタマーＲＮＡであり得る。

【0336】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、化学的に修飾された核酸から選択することができる。

【0337】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、治療用ペプチドから選択することができる。

【0338】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、化学療法剤から選択することができる。

【0339】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、タンパク質から選択することができる。

【0340】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、タンパク質コンジュゲートから選択することができる。

【0341】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、造影剤から選択することができる。

【0342】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、ＣＲＩＳＰＲ技術に関連するタンパク質核酸から選択することができる。

【0343】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、ＣＲＩＳＰＲ技術に関連するＤＮＡ、ｇＲＮＡ及び／又はｍＲＮＡから選択することができる。

【0344】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、例えばカプシド又は酵素などの天然ウイルス成分から選択することができる。

【0345】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、モノクローナル抗体、例えばアブシキシマブ、アダリムマブ、アレファセプト、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベズロトクスマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブペゴール、セツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、エファリズマブ、ゴリムマブ、インフレクトラ、イピリムマブ、イクセキズマブ、ナタリズマブ、ニボルマブ、オララツマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペンブロリズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、セクキヌマブ及びウステキヌマブ；酵素；例えばアガルシダーゼベータ、イミグルセラーゼ、ベラグルセラーゼアルファ、タリグルセラーゼ、アルグルコシダーゼアルファ、アルグルコシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、イデュルスルファーゼ静注及びガルスルファーゼ；成長因子；並びにサイトカイン、例えばＩＬ－２及びＩＦＮ－αなどの治療用タンパク質をコードする核酸（すなわち、プラスミド及びｍＲＮＡ）から選択することができる。

【0346】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、モノクローナル抗体；酵素；成長因子及びサイトカインなどの治療用タンパク質をコードする核酸（すなわち、プラスミド及びｍＲＮＡ）から選択することができる。

【0347】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、モノクローナル抗体；酵素；成長因子；転写因子及びサイトカインなどの治療用タンパク質をコードする核酸（すなわち、プラスミド及びｍＲＮＡ）から選択することができる。

【0348】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、モノクローナル抗体をコードする核酸（すなわち、プラスミド及びｍＲＮＡ）から選択することができる。

【0349】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、ＭＥＤＩ８８５２及びＳＴＫ１１をコードする核酸（すなわち、プラスミド及びｍＲＮＡ）から選択することができる。

【0350】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、アブシキシマブ、アダリムマブ、アレファセプト、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベズロトクスマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブペゴール、セツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、エファリズマブ、ゴリムマブ、インフレクトラ、イピリムマブ、イクセキズマブ、イピリムマブ、イクセキズマブ、ナタリズマブ、ニボルマブ、オララツマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペンブロリズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、セクキヌマブ及びウステキヌマブから選択されるモノクローナル抗体をコードする核酸（すなわち、プラスミド及びｍＲＮＡ）から選択することができる。

【0351】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、酵素をコードする核酸（すなわち、プラスミド及びｍＲＮＡ）から選択することができる。

【0352】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、アガルシダーゼベータ、イミグルセラーゼ、ベラグルセラーゼアルファ、タリグルセラーゼ、アルグルコシダーゼアルファ、アルグルコシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、イデュルスルファーゼ靜注及びガルスルファーゼから選択される酵素をコードする核酸（すなわち、プラスミド及びｍＲＮＡ）から選択することができる。

【0353】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、増殖因子をコードする核酸（すなわち、プラスミド及びｍＲＮＡ）から選択することができる。

【0354】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、転写因子をコードする核酸（すなわち、プラスミド及びｍＲＮＡ）から選択することができる。

【0355】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、転写因子ＨＮＦ－４αをコードする核酸（すなわち、プラスミド及びｍＲＮＡ）から選択することができる。

【0356】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、サイトカインをコードする核酸（すなわち、プラスミド及びｍＲＮＡ）から選択することができる。

【0357】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、ＩＬ－２及びＩＦＮ－αから選択されるサイトカインをコードする核酸（すなわち、プラスミド及びｍＲＮＡ）から選択することができる。

【0358】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、ｓｉＲＮＡから選択することができる。

【0359】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、ｍＲＮＡから選択することができる。

【0360】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、ｇＲＮＡから選択することができる。

【0361】

医薬活性剤が言及されているいずれかの実施形態では、医薬活性剤は、腫瘍遺伝子、成長因子、及びサイトカイン発現の調節を含む用途におけるタンパク質発現を減少させるために使用されるｓｉＲＮＡから選択することができる。

【0362】

医薬活性剤が核酸から選択されるいずれかの実施形態では、ペプチドデンドロン塩基性アミノ酸残基：核酸リン酸の比（Ｎ：Ｐ）は、約２：１である。

【0363】

医薬活性剤が核酸から選択されるいずれかの実施形態では、ペプチドデンドロン塩基性アミノ酸残基：核酸リン酸の比（Ｎ：Ｐ）は、約４：１である。

【0364】

医薬活性剤が核酸から選択されるいずれかの実施形態では、ペプチドデンドロン塩基性アミノ酸残基：核酸リン酸の比（Ｎ：Ｐ）は、約６：１である。

【0365】

医薬活性剤がＤＮＡから選択されるいずれかの実施形態では、ペプチドデンドロン塩基性アミノ酸残基：ＤＮＡリン酸の比（Ｎ：Ｐ）は、約２：１である。

【0366】

医薬活性剤がＤＮＡから選択されるいずれかの実施形態では、ペプチドデンドロン塩基性アミノ酸残基：ＤＮＡリン酸の比（Ｎ：Ｐ）は、約４：１である。

【0367】

医薬活性剤がＤＮＡから選択されるいずれかの実施形態では、ペプチドデンドロン塩基性アミノ酸残基：ＤＮＡリン酸の比（Ｎ：Ｐ）は、約６：１である。

【0368】

医薬活性剤がＲＮＡから選択されるいずれかの実施形態では、ペプチドデンドロン塩基性アミノ酸残基：ＲＮＡリン酸の比（Ｎ：Ｐ）は、約２：１である。

【0369】

医薬活性剤がＲＮＡから選択されるいずれかの実施形態では、ペプチドデンドロン塩基性アミノ酸残基：ＲＮＡリン酸の比（Ｎ：Ｐ）は、約４：１である。

【0370】

医薬活性剤がＲＮＡから選択されるいずれかの実施形態では、ペプチドデンドロン塩基性アミノ酸残基：ＲＮＡリン酸の比（Ｎ：Ｐ）は、約６：１である。

【0371】

医薬活性剤がＲＮＡから選択されるいずれかの実施形態では、ペプチドデンドロン塩基性アミノ酸残基：ＤＮＡ及びＲＮＡリン酸の比（Ｎ：Ｐ）は、約２：１である。

【0372】

医薬活性剤がＲＮＡから選択されるいずれかの実施形態では、ペプチドデンドロン塩基性アミノ酸残基：ＤＮＡ及びＲＮＡリン酸の比（Ｎ：Ｐ）は、約４：１である。

【0373】

医薬活性剤がＲＮＡから選択されるいずれかの実施形態では、ペプチドデンドロン塩基性アミノ酸残基：ＤＮＡ及びＲＮＡリン酸の比（Ｎ：Ｐ）は、約６：１である。

【0374】

医薬送達システム
一実施形態では、本明細書に記載した修飾リシンに由来する１つ以上の残基を含むペプチドデンドロンを含む医薬送達システムが提供される。医薬送達システムは、ヒト又は動物の身体に医薬活性剤を送達するために使用され得る送達システムである。

【0375】

一実施形態では、本明細書に記載した修飾リシンに由来する１つ以上の残基を含むペプチドデンドロンの医薬送達システムにおける使用が提供される。

【0376】

一実施形態では、医薬送達システムとして使用するための、本明細書に記載した修飾リシンに由来する１つ以上の残基を含むペプチドデンドロンが提供される。

【0377】

一実施形態では、本明細書に記載した修飾リシンに由来する１つ以上の残基を含むペプチドデンドロンを含む、医薬活性剤のための送達システムが提供される。

【0378】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、１つ以上の異なるペプチドデンドロン、例えば２つの異なるペプチドデンドロンを含み得る。標的化部分を組み込み、ナノ粒子を安定化し、且つ／又は異なる特性を相乗的に組み合わせるために、ペプチドデンドロンの混合物が使用され得る。

【0379】

一実施形態では、本明細書に記載した１つ以上のペプチドデンドロンを含む医薬送達システムが提供される。

【0380】

「１つ又は複数のペプチドデンドロン」が言及されるいずれかの実施形態では、これは、１つのペプチドデンドロンを指し得る。

【0381】

「１つ又は複数のペプチドデンドロン」が言及されるいずれかの実施形態では、これは、２つのペプチドデンドロンを指し得る。

【0382】

「１つ又は複数のペプチドデンドロン」が言及されるいずれかの実施形態では、これは、２つ以上のペプチドデンドロンを指し得る。

【0383】

一実施形態では、本明細書に記載した１つ以上のペプチドデンドロンを含む医薬活性剤のための送達システムが提供される。

【0384】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロンと、ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンとを含み得る。

【0385】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、約１：５０の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0386】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、１：５０超の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0387】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、１：５０未満の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0388】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、約１：２０の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0389】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、１：２０超の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0390】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、１：２０未満の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0391】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、約１：１５の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0392】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、１：１５超の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0393】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、１：１５未満の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0394】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、約１：１０の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0395】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、１：１０超の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0396】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、１：１０未満の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0397】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、約１：５の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0398】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、１：５超の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0399】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、１：５未満の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0400】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、約２：４の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0401】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、２；４超の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0402】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、２：４未満の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0403】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、約１：１の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0404】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、約４：２の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0405】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、４：２超の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0406】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、４：２未満の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0407】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、約５：１の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0408】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、５：１超の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0409】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、５：１未満の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0410】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、約１０：１の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0411】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、１０：１超の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0412】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、１０：１未満の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0413】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、約１５：１の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0414】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、１５：１超の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0415】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、１５：１未満の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0416】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、約２０：１の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0417】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、２０：１超の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0418】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、２０：１未満の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0419】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、約５０：１の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0420】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、５０：１超の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0421】

一実施形態では、本明細書に記載した医薬送達システムは、５０：１未満の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0422】

本明細書に記載したペプチドデンドロン及び医薬活性剤は、ナノ粒子を形成するために、生理学的等張バッファー（例えば、５％のトレハロース若しくはスクロース、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で緩徐に混合しながら組み合わせることができる。これらの製剤は、即時に送達するか、４℃で貯蔵するか、又は長期保存のために凍結乾燥させることができる。

【0423】

本明細書に記載したペプチドデンドロンは、経口投与に好適な形態（例えば錠剤若しくはカプセル剤として）、非経口注射に好適な形態（静脈内、皮下、皮内、筋肉内、血管内若しくは注入を含む）、局所投与に好適な形態（軟膏若しくはクリーム剤として）、又は直腸投与用に好適な形態（坐剤として）で調製することができる。詳細には、本明細書に記載したペプチドデンドロンは、注射（例えば、静脈内、皮下、皮内又は筋肉内注射による）に好適な形態で調製することができる。

【0424】

さらなる賦形剤
一実施形態では、さらなる賦形剤を、本明細書に記載の１つ以上のペプチドデンドロン及び医薬活性剤を含む製剤及び組成物に添加することができる。これらは、ナノ粒子の安定性を増強し、核酸のパッケージングを増強し、細胞送達及びトランスフェクションの改善をもたらし得る。

【0425】

一実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のペプチドデンドロンと、脂質とを含む製剤が提供される。

【0426】

一実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のペプチドデンドロンと、１：１（ｗ／ｗ）のＮ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－ｎ，ｎ，ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）及びジオレオイルホスホチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から選択される脂質とを含む製剤が提供される。

【0427】

一実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のペプチドデンドロンと、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－ｎ，ｎ，ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）及びジオレオイルホスホチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の混合物、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ）、及びヘプタデカン－９－イル８（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート（ＳＭ－１０２）又はコレステロールから選択される脂質とを含む製剤が提供される。

【0428】

使用
本明細書に記載のペプチドデンドロンは、代謝障害、免疫学的障害、ホルモン障害、癌、血液学的障害、遺伝性障害、感染性疾患、心疾患、骨障害、呼吸器疾患、神経学的障害、補助療法、眼疾患、吸収不良障害を含む広範囲の病気の治療に好適な医薬活性剤を送達するために使用することができる。治療用途としては、タンパク質（すなわち、ウイルス治療のための抗体）の全身性発現又は標的送達（すなわち、転移性腫瘍、インビボＣＡＲ－Ｔ）を挙げることができる。

【0429】

一実施形態では、治療に使用するための本明細書に記載の１つ以上のペプチドデンドロンを含む医薬送達システムが提供される。

【0430】

一実施形態では、治療に使用するための本明細書に記載の１つ以上のペプチドデンドロンを含む医薬活性剤のための送達システムが提供される。

【0431】

一実施形態では、細胞への医薬活性剤の送達に使用するためのペプチドデンドロンが提供される。

【0432】

一実施形態では、代謝障害、免疫学的障害、ホルモン障害、癌、血液学的障害、遺伝性障害、感染性疾患、心疾患、骨障害、呼吸器疾患、神経学的障害、補助療法、眼疾患、又は吸収不良障害の治療において使用するための本明細書に記載の１つ以上のペプチドデンドロンを含む医薬送達システムが提供される。

【0433】

一実施形態では、代謝障害、免疫学的障害、ホルモン障害、癌、血液学的障害、遺伝性障害、感染性疾患、心疾患、骨障害、呼吸器疾患、神経学的障害、補助療法、眼疾患、又は吸収不良障害の治療において使用するための本明細書に記載の１つ以上のペプチドデンドロンを含む医薬活性剤のための送達システムが提供される。

【0434】

一実施形態では、遺伝子治療に使用するための本明細書に記載の１つ以上のペプチドデンドロンを含む医薬活性剤のための送達システムが提供される。

【0435】

本明細書で使用される場合、「治療」及び「治療する」という用語は、本明細書に記載の通り、疾患若しくは障害又はその１つ以上の症状を、回復させ、軽減し、その発症を遅延させ、又はその進行を阻害することを指す。いくつかの実施形態では、治療は、１つ以上の症状が発現した後に実施され得る。他の実施形態では、治療は、症状がなくても実施され得る。例えば、治療は、症状が発現する前に感受性の高い個人に対して（例えば、症状の履歴に照らして及び／又は遺伝的素因若しくは感受性因子に照らして）実施することができる。治療はまた、症状が消退した後にも、例えばそれらの再発を提示若しくは遅延させるために、継続することができる。

【0436】

医薬組成物
一実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のペプチドデンドロンを含む医薬組成物が提供される。

【0437】

医薬組成物が１つ以上のペプチドデンドロンを含むいずれかの実施形態では、医薬組成物は、１つのペプチドデンドロンを含み得る。

【0438】

医薬組成物が「１つ以上のペプチドデンドロン」を含むいずれかの実施形態では、医薬組成物は、２つ以上の異なるペプチドデンドロンを含み得る。

【0439】

医薬組成物が「１つ以上のペプチドデンドロン」を含むいずれかの実施形態では、医薬組成物は、２つの異なるペプチドデンドロンを含み得る。

【0440】

医薬組成物が「１つ以上のペプチドデンドロン」を含むいずれかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも２つの異なるペプチドデンドロンを含み得る。

【0441】

一実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のペプチドデンドロンと医薬活性剤とを含む医薬組成物が提供される。

【0442】

一実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のペプチドデンドロンを含む医薬組成物が提供される。

【0443】

一実施形態では、２つ以上の異なるペプチドデンドロンを含む医薬組成物が提供される。

【0444】

一実施形態では、医薬活性剤と本明細書に記載の１つ以上のペプチドデンドロンとを含む組成物が提供される。

【0445】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロンと、ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンとを含み得る。

【0446】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、約１：５０の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0447】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、１：５０超の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0448】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、１：５０未満の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0449】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、約１：２０の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0450】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、１：２０超の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0451】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、１：２０未満の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0452】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、約１：１５の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0453】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、１：１５超の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0454】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、１：１５未満の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0455】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、約１：１０の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0456】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、１：１０超の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0457】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、１：１０未満の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0458】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、約１：５の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0459】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、１：５超の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0460】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、１：５未満の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0461】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、約２：４の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0462】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、２：４超の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0463】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、２：４未満の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0464】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、約１：１の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0465】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、約４：２の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0466】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、４：２超の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0467】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、４：２未満の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0468】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、約５：１の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0469】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、５：１超の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0470】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、５：１未満の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0471】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、約１０：１の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0472】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、１０：１超の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0473】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、１０：１未満の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0474】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、約１５：１の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0475】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、１５：１超の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0476】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、１５：１未満の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0477】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、約２０：１の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0478】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、２０：１超の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0479】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、２０：１未満の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0480】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、約５０：１の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0481】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、５０：１超の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0482】

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、５０：１未満の、ポリエチレングリコール基を含むペプチドデンドロン：ポリエチレングリコール基及び標的化基の両方を含むペプチドデンドロンの比を含み得る。

【0483】

一実施形態では、治療に使用するための本明細書に記載の１つ以上のペプチドデンドロンを含む医薬組成物が提供される。

【0484】

一実施形態では、治療に使用するための本明細書に記載の１つ以上のペプチドデンドロンと医薬活性剤とを含む医薬組成物が提供される。

【0485】

一実施形態では、代謝障害、免疫学的障害、ホルモン障害、癌、血液学的障害、遺伝性障害、感染性疾患、心疾患、骨障害、呼吸器疾患、神経学的障害、補助療法、眼疾患、又は吸収不良障害の治療において使用するための本明細書に記載の１つ以上のペプチドデンドロンを含む医薬組成物が提供される。

【0486】

一実施形態では、代謝障害、免疫学的障害、ホルモン障害、癌、血液学的障害、遺伝性障害、感染性疾患、心疾患、骨障害、呼吸器疾患、神経学的障害、補助療法、眼疾患、又は吸収不良障害の治療において使用するための本明細書に記載の１つ以上のペプチドデンドロンと医薬活性剤とを含む医薬組成物が提供される。

【0487】

一実施形態では、遺伝子治療に使用するための本明細書に記載の１つ以上のペプチドデンドロンと医薬活性剤とを含む医薬組成物が提供される。

【0488】

一実施形態では、遺伝子治療に使用するための本明細書に記載の１つ以上のペプチドデンドロンを含む医薬組成物が提供される。

【0489】

治療方法
一実施形態では、前記動物に、有効量の本明細書に記載の１つ以上のペプチドデンドロンを含む医薬組成物を投与することを含む、代謝障害、免疫学的障害、ホルモン障害、癌、血液学的障害、遺伝性障害、感染性疾患、心疾患、骨障害、呼吸器疾患、神経学的障害、補助療法、眼疾患、又は吸収不良障害を治療する方法が提供される。

【0490】

一実施形態では、前記動物に、有効量の本明細書に記載の１つ以上のペプチドデンドロン及び医薬活性剤を含む医薬組成物を投与することを含む、代謝障害、免疫学的障害、ホルモン障害、癌、血液学的障害、遺伝性障害、感染性疾患、心疾患、骨障害、呼吸器疾患、神経学的障害、補助療法、眼疾患、又は吸収不良障害を治療する方法が提供される。

【0491】

一実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のペプチドデンドロンを投与することを含む遺伝子治療の方法が提供される。

【0492】

一実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のペプチドデンドロン及び医薬活性剤を投与することを含む遺伝子治療の方法が提供される。

【0493】

医薬組成物の使用
一実施形態では、代謝障害、免疫学的障害、ホルモン障害、癌、血液学的障害、遺伝性障害、感染性疾患、心疾患、骨障害、呼吸器疾患、神経学的障害、補助療法、眼疾患、又は吸収不良障害を治療するための医薬の製造における本明細書に記載の１つ以上のペプチドデンドロンを含む医薬組成物の使用が提供される。

【0494】

一実施形態では、代謝障害、免疫学的障害、ホルモン障害、癌、血液学的障害、遺伝性障害、感染性疾患、心疾患、骨障害、呼吸器疾患、神経学的障害、補助療法、眼疾患、又は吸収不良障害を治療するための医薬の製造における本明細書に記載の１つ以上のペプチドデンドロン及び医薬活性剤を含む医薬組成物の使用が提供される。

【0495】

一実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のペプチドデンドロンを含む医薬組成物の遺伝子治療における使用が提供される。

【0496】

一実施形態では、明細書に記載の１つ以上のペプチドデンドロン及び医薬活性剤を含む医薬組成物の遺伝子治療における使用が提供される。

【0497】

キット
一実施形態では、
ａ）第１の単位内の本明細書に記載の１つ以上のペプチドデンドロン；
ｂ）第２の単位内の医薬活性剤；及び
ｃ）前記第１及び第２の単位を含有するための容器手段
を含むキットが提供される。

【0498】

一実施形態では、
ａ）第１の単位内の本明細書に記載の１つ以上のペプチドデンドロン；
ｂ）第２の単位内の医薬活性剤；
ｃ）前記第１及び第２の単位を含有するための容器手段；及び
ｄ）使用説明書
を含むキットが提供される。

【図面の簡単な説明】

【0499】

【図1】実施例２に記載のペプチドデンドロン（ＰＤ）の合成の代表的な概略図。

【図2A-2B】実施例７に記載のアニオン解離（Ａ）及びカテプシンＢ分解性（Ｂ）に対するペプチドナノ粒子（ＰＮＰ）安定性の結果。ナノ粒子の安定性は標的細胞へのインタクトな核酸の効率的な送達に不可欠であるが、その機能を果たすためには細胞への取り込み時に核酸を放出しなければならない。この目的のために、ＰＤは、細胞への取り込み時に酵素により分解するように設計されている。刺激に応答して放出される物質は、有効性が向上し、毒性が低いことが確認された。この結果は、ＰＤ３（ＭＮ）及びＰＤ３（ＴＭ）ナノ粒子が、５０μｇ／ｍＬを超える硫酸デキストラン濃度でＤＮＡを容易に放出するＰＤ１、非修飾（ＮＭ）ＰＤ、及びＰＤ３（Ｈｉｓ）で製剤化されたナノ粒子と比較して、アニオン解離に対する耐性が大きく増大したことを示している。さらに、ＰＤ３（Ｍ）、ＰＤ３（ＭＮ）、及びＰＤ３（ＴＭ）は、非修飾ＰＤ３及び全てのＰＤ２製剤と比較して、カテプシンＢ活性に応答してＤＮＡを容易に放出した。

【図3A-3C】実施例８に記載のインビトロトランスフェクションスクリーニングから得られた結果。図３Ａ）ヒト非小肺癌細胞株Ｈ１２９９及び図３Ｂ）マウス筋管細胞株Ｃ２Ｃ１２に示すように、異なる細胞株を評価した。発光は４回ずつ収集し、平均値±標準偏差として示した。図３Ｃでは、２つの異なるＮＰ製剤ＰＤ３（ＭＮ）及びＰＤ３（ＴＭ）を、様々な細胞株（Ｈ１２９９、Ｃ２Ｃ１２、ＨＥＫ３９３、及びＨＥＰＧ２）でスクリーニングして、異なる適用における上位のパフォーマーを特定した。これらの結果は、ＭＮ修飾が肺（Ｈ１２９９；リンパ由来のヒト非小細胞肺癌細胞株）及び筋細胞（Ｃ２Ｃ１２；マウス筋芽細胞）において優れていたことを示す。或いは、ＴＭ修飾は、腎臓（ＨＥＫ３９３；ヒト胎児腎臓細胞）及び肝臓（ＨＥＰＧ２；ヒト肝癌細胞株）を含む濾過臓器に由来する細胞株において最もよく機能した。

【図4】実施例９に記載のルシフェラーゼｍＲＮＡマウス発現実験から得られた結果。インビボ翻訳におけるＤＮＡ ＮＰの翻訳を、マウス筋肉内発現研究において試験した。発現のライブ追跡を可能にするために、レポータータンパク質ルシフェラーゼを発現させた。発現を観察し、１か月のモニター期間の間、一貫性があると認められた。発現を、ＩＶＩＳを用いて毎週評価し、発光を４回ずつ収集し、平均値±標準偏差として示した。結果は、ＭｅＯ－ＰＥＧ－ＰＤ（ＭＮ）がインビボでＩＭ注射によってＤＮＡを効率的に送達し、１か月間安定した発現をもたらすことを示している。

【図5A-5B】実施例１０に記載の治療的発現実験から得られた結果。図５Ａは、抗Ｆｌｕ ｍＡｂ ＭＥＤＩ８８５２を用いた結果を示し、図５Ｂは、腫瘍抑制因子セリン／トレオニンキナーゼ１１（ＳＴＫ１１）を用いた結果を示す。ＭＥＤＩ８８５２は、間接ＥＬＩＳＡによって定量し、発現レベルを３回収集し、平均値±標準偏差として示した。質量分析を、発現のさらなる確認として使用した。ＳＴＫ１１は、ウェスタンブロットを用いて定量した。ＮＰの目的は、宿主細胞を用いて治療用タンパク質を発現させることである。これらの結果は、ＮＰがｍＡｂ（すなわち、ＭＥＤＩ８８５２（抗ｆｌｕ ｍＡｂ））及び酵素（すなわち、腫瘍阻害剤セリン／トレオニンキナーゼ１１（ＳＴＫ１１））を含む多様な範囲の治療薬を、治療薬の作用モードで、目的の細胞株においてインビボで発現させる能力を有することを示している。

【図6A-6C】実施例１１に記載のインビトロでの標的ＤＮＡ ＮＰトランスフェクションから得られた結果。標的ＰＤナノ粒子を様々な細胞株で試験し、トランスフェクションを促進することを確認した。Ｈ１２９９において、ＴｆＲ（図６Ａ）及びｃＲＧＤ（図６Ｂ）は、市販のトランスフェクション対照ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と比較して、全体的な発現レベル（ＧＦＰを送達、蛍光）及び動態（Ｇｗｉｚルシフェラーゼを送達；発光）を増強した。非標的ＮＰと比較して、トランスフェクションにおける同様の改善が、Ｃ２Ｃ１２及びＣＴ２６において観察された（図６Ｃ）。標的ＤＮＡ送達を用いて、トランスフェクション効率を増加させ、且つ／又は細胞特異的発現を達成することができる。ＰＤプラットフォームは、（実施例３及び５に示すように）ペプチドベース及び抗体ベースの広範囲の標的化リガンドの組み込みを可能にする柔軟な標的化戦略を用いて意図的に設計し、それによりトランスフェクションは大きく促進された。さらに、ペグ化及び標的化により、特異性の高い発現が達成された。これらの結果は、標的化により、複数の非常に異なった細胞株においても発現を増強させることができることを示している。

【図7】実施例１２に記載の肺標的ＮＰのインビボ実験から得られた結果。ＰＶ１標的ナノ粒子をＢＡＬＢ／ＣマウスにＩＶ投与し、ルシフェラーゼの発現をＩＶＩＳにより８日間モニターした。３日目及び８日目のエクスビボ画像化は、最適化されたリガンド密度を有するナノ粒子のみが、標的の肺内で有意に発現したことを示した。細胞特異的送達は、核酸に基づく治療の潜在的用途を大幅に広げる。これらの結果は、標的ＰＤ ＮＰを生成するために、抗体ベースの標的化部分を使用することができ、肺の標的化に、ＰＶ１標的化を使用することができることを示している。この実施例では、ＰＶ１標的ＮＰが最低８日間でマウス肺内に特異性の高い発現を達成することが示された。

【図8】実施例１３に記載の、ｐＤＮＡナノ粒子対ｍＲＮＡ ＰＤ３（ＭＮ）ナノ粒子によるＨ１２９９細胞のトランスフェクションから得られた結果。Ｈ１２９９細胞を、ｍＲＮＡ又はｐＤＮＡで調製したナノ粒子で処理した。トランスフェクション動態をＩｎｃｕｃｙｔｅを用いてライブでモニターし、細胞を蛍光により画像化し、装置ソフトウェアを用いて、トランスフェクションの尺度として全赤色蛍光強度を定量した。ｍＲＮＡは、良好な導入遺伝子発現のために複雑な核局在化の必要がなく、ＤＮＡが送達された場合よりも速い発現動態を促進することが示された。本発明者らのＮＰは、ｍＲＮＡを首尾よくパッケージングして送達し、ＤＮＡが送達された場合よりも速い発現動態の達成が期待されることが示された。これらの結果は、ｍＲＮＡは非常に速く発現するが、４８時間までにはｐＤＮＡが送達された場合と同様の発現レベルに達する。

【図9】実施例１４に記載のルシフェラーゼマウス発現実験から得られた結果。ＣＤマウスを、筋肉注射によりＭｅＯ ＰＥＧ－ＰＤ３（ＭＮ）と複合体化したｐＤＮＡ又はｍＲＮＡで処置した。発現をＩＶＩＳを用いて評価した。発光は４回ずつ収集し、平均値±標準偏差として示した。これらの結果は、ｍＲＮＡ及びｐＤＮＡの両方が、ｍＲＮＡ ＮＰがより速い発現動態を示すＰＤプラットフォームを使用して、筋肉注射によりインビボで送達され得ることを示している。

【図10】実施例１５に記載のマウス実験における抗Ｆｌｕ ｍＡｂ ＭＥＤＩ８８５２発現から得られた結果。ＢＡＬＢ／ｃマウスをＩＶ注射によりｍＲＮＡ ＮＰで処置し、ＭＥＤＩ８８５２の発現をＥＬＩＳＡによって定量した。これらの結果は、有意なレベルのｍＡｂが８日間にわたって検出されたことを示し、ＰＤがインビボで治療用タンパク質を発現する能力を有することを裏付けている。

【図11】実施例１６に記載の、抗ＣＤ３標的ｆａｂの異なるディスプレイを有するｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡ／ＰＤ３（ＭＮ）ＮＰによる非活性化初代Ｔ細胞のトランスフェクションから得られた結果。これらの結果は、非標的ＮＰはＴ細胞をトランスフェクトする能力を有するが、ＣＤ３標的化は、標的化ｆａｂが低（２５％）～中（５０％）レベルで表示される場合、送達を有意に増強する。

【図12】ＣＴＮＮＢ１サイレンシングから得られた結果を、実施例１７に記載のように、レポーターアッセイ及びウェスタンブロットによってモニターした。ｓｉＲＮＡを送達するＮＰの能力が、癌遺伝子ＣＴＮＮＢ１を標的とする結腸癌細胞株ＳＷ４８０で示された。ＰＤ３（ＭＮ）及びＰＤ３（ＴＭ）（１％（ｗ／ｗ）のＤＯＰＥ：ＤＯＴＭＡ＝１：１を含む）が、ウェスタンブロットによって、少なくとも５日間にわたってＣＴＮＮＢ１を効果的にサイレンシングすることが示された。これらの結果は、ＰＤ ＮＰがｓｉＲＮＡを標的細胞に効率的に送達できることを示している。

【図13A-13C】実施例１８に記載の、異なるディスプレイの標的化ペプチドｃＲＧＤを用いたＰＤ３（ＭＮ）ＮＰによるカテニン－Ｂのサイレンシングから得られた結果。ＣＴＮＮＢ１レポーター活性ＳＷ４８０ ＴｏｐＦｌａｓｈ（図１３Ａ）、ＣＴＮＮＢ１タンパク質レベルＳＷ４８０（図１３Ｂ）、Ｃｏｌｏ２０５増殖（図１３Ｃ）。多くの適用では、局所的な送達が必要とされる。ＮＰプラットフォームを用いて「オン／オフ」送達が達成され得るかどうかを決定するために、ペグ化ＮＰを、異なる量のｃＲＧＤディスプレイを用いて調製し、結腸癌細胞株ＳＷ４８０及びＣｏｌｏ２０５をトランスフェクトするために使用した。ペグ化はサイレンシングを停止又は減少させると認められたが、ＮＰへのｃＲＧＤの導入はＮＰ活性を回復させた。これらの結果は、ＰＥＧ化を使用して非特異的細胞取り込みを減少させることができ、標的化を使用してＮＰ活性を回復させることができることを示している。

【図14】実施例１８に記載のマウス転移性結腸癌モデルにおける腫瘍体積から得られた結果。確立された結腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５腫瘍を有するマウスに、８日目、９日目、１５日目、及び１６日目に様々な程度のｃＲＧＤ標的化を有するＮＰを静脈内投与した（黒色矢印で示す）。群には、未処置（Ａ）、非標的ＮＰを投与するマウス（Ｂ）、及び中程度ｃＲＧＤ（Ｃ）～高ｃＲＧＤ（Ｄ）ディスプレイを有する標的ナノ粒子を投与するマウスが含まれた（各データセットは１匹のマウスを表す）。経時的な平均値（Ｅ）及び試験最終日の平均値（Ｆ）も決定した。標的ｓｉＲＮＡ ＮＰのインビボ翻訳を、マウスモデルにおいて評価した。高レベルのｃＲＧＤディスプレイは、非標的ＮＰと比較して、腫瘍の増殖を有意に遅くすることが確認された。これらの結果は、ｃＲＧＤ標的ＮＰがｓｉＲＮＡ送達を増強させ得ることを示し、標的化リガンド密度の重要性を強調する。

【図15】実施例１９に記載の、蛍光標識ＤＮＡ（Ｃｙ５）及びｍＲＮＡ（Ｃｙ５）を配合したＮＰの蛍光スペクトル。Ｃｙ５標識ＤＮＡを有するＮＰ（グラフ１）は、青色ＬＥＤによって励起されないので、その発光波長（６５０～７００ｎｍ）で蛍光は検出されない。Ｃｙ３標識ｍＲＮＡを有するＮＰ（グラフ２）は、励起されて蛍光を発し、５５０～６００付近にその発光ピークを有する。同様に、Ｃｙ３標識ｍＲＮＡを有するＮＰと組み合わせたＣｙ５標識ＤＮＡで調製されたＮＰ（グラフ３）は、Ｃｙ３発光ピークで蛍光を発する。重要なことに、Ｃｙ５標識ＤＮＡ及びＣｙ３標識ｍＲＮＡの１：１混合物を用いて調製したＮＰ（グラフ４）は、５６０～７００ｎｍ付近のＣｙ５発光において発光の増加を示し、５５０～６００ｎｍ付近のＣｙ３発光ピークにおいて蛍光強度の対応する減少を示す。これは、試料４中のＤＮＡ及びｍＲＮＡが極めて近接しており（＜５ｎｍ）、ｍＲＮＡ上のＣｙ３フルオロフォアからの蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）により、標識ＤＮＡ上のＣｙ５フルオロフォアの励起が可能になることを示している。これは、ペプチドデンドロンＮＰにおけるｍＲＮＡ及びＤＮＡの共封入の証拠である。

【図16】実施例１９に記載のＨ１２９９細胞におけるｍＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドＰＤＩＤ ＮＰの発現動態。ＤＮＡ発現をＧＦＰ蛍光面積によって測定し、ｍＲＮＡ発現をｍＣｈｅｒｒｙ蛍光面積によって測定する。ＧＦＰ発現は１００時間を超えて増加し、一方、ｍＲＮＡ発現は約６０時間でピークに達する。重なり合った蛍光シグナルによって定量されるＤＮＡ／ｍＲＮＡ共発現量は、ｍＲＮＡ発現と同様の動態を有し、約６５時間でピークに達する。これらの結果は、ＤＮＡ及びｍＲＮＡの細胞への同時送達の成功を示している。

【図17】実施例１９に記載の分化したＣ２Ｃ１２細胞におけるｍＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドＰＤＩＤ ＮＰの発現動態。分化したＣ２Ｃ１２筋細胞は筋管に融合されており、非分裂性で、これらの細胞のトランスフェクトは困難である。ＤＮＡ発現をＧＦＰ蛍光面積によって測定し、ｍＲＮＡ発現をｍＣｈｅｒｒｙ発現面積によって測定する。ＧＦＰ発現は７５時間にわたって増加し、その後シグナルはプラトーになる。ｍＲＮＡ発現は約６０時間でピークに達し、ゆっくりと減少する。重なり合った蛍光シグナルによって定量されるＤＮＡ／ｍＲＮＡ共発現量は、ｍＲＮＡ発現と同様の動態を有し、約６０時間でピークに達する。これらの結果は、ＤＮＡ及びｍＲＮＡの細胞への同時送達の成功を示している。

【実施例】

【0500】

本明細書で使用した略語
・ＮＰ：ナノ粒子；
・ＰＤ：ペプチドデンドロン；
・ＰＤＩＤ：ペプチドデンドロン細胞間送達
・アミノ酸「ＣＩＴ」：シトルリン
・以下の略語は、修飾リシンについて本明細書で使用される。

【化20】

【0501】

以下のポリマー及びリガンドをペプチドデンドロンに組み込んだ：

【0502】

【表1】

【0503】

実施例１
修飾リシンの調製
方法１：１－｛［（モルホリン－４－イル）アセチル］オキシ｝ピロリジン－２，５－ジオンの合成

【化21】

（モルホリン－４－イル）酢酸（１ｇ、６．８９ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（ＤＣＭ）（２５ｍＬ）中に溶解させ、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（８７２ｍｇ、７．５８ｍｍｏｌ）及びＮ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）（１．６０ｇ、８．３５ｍｍｏｌ）を添加した。反応液を室温で１時間撹拌し、その後にシリカゲルの２”×３”パッドに通して濾過した。パッドをＤＣＭ（３×２５ｍＬ）により洗浄し、濾液及び洗浄物を合わせて濃縮し、白色の固体として１－｛［（モルホリン－４－イル）アセチル］オキシ｝ピロリジン２，５－ジオン（１．３ｇ、７８％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）ｄ３．７５（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，４Ｈ），３．５７（ｓ，２Ｈ），２．８５（ｓ，４Ｈ），２．６７（ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，４Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）計算値：２４２．０９，実測値：２４３．３（Ｍ＋１）．

【0504】

方法２：１－｛［６－（モルホリン－４－イル）ピリジン－３－カルボニル］オキシ｝ピロリジン－２，５－ジオンの合成

【化22】

６－（モルホリン－４－イル）ピリジン－３－カルボン酸（３５０ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ）を室温で撹拌しながらＤＣＭ（２５ｍＬ）中に溶解させた。ＮＨＳ（２１３ｍｇ、１．８５ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣ・ＨＣｌ（（４１８ｍｇ、２．１８ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温で１時間撹拌し、次いで、シリカゲルの２”×３”のパッドに通して濾過した。パッドをＤＣＭ（３×２５ｍＬ）及び酢酸エチル（２５ｍＬ）により洗浄した。濾液及び洗浄物を合わせて濃縮し、白色の固体として１－｛［６－（モルホリン－４－イル）ピリジン－３－カルボニル］オキシ｝ピロリジン－２，５－ジオン（３２５ｍｇ、６３％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）ｄ８．８９（ｓ，１Ｈ），８．０７（ｄｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１．５Ｈｚ，１Ｈ），６．６０（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ），３．８０（ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，４Ｈ）３．７２（ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，４Ｈ），２．８９（ｓ，４Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ）計算値：３０５．１，実測値：３０６．３（Ｍ＋１）．

【0505】

方法３：ｔｅｒｔ－ブチル３－｛［（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）オキシ］カルボニル｝チオモルホリン－４－カルボキシレートの合成

【化23】

４－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）チオモルホリン－３－カルボン酸（１ｇ、４．０４ｍｍｏｌ）を室温で撹拌しながらＤＣＭ（２５ｍＬ）中に溶解させた。ＮＨＳ（５１１ｍｇ、４．４４ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣ・ＨＣｌ（１．０１ｇ、５．２５ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温で１時間撹拌し、次いで、シリカゲルの２”×３”のパッドに通して濾過した。このパッドをＤＣＭ（３×２５ｍＬ）により洗浄し、濾液及び洗浄物を合わせて濃縮し、白色の固体としてｔｅｒｔ－ブチル３－｛［（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）オキシ］カルボニル｝チオモルホリン－４－カルボキシレート（１．３ｇ、９３．４％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）ｄ５．３８（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．４３－４．２２（ｍ，１Ｈ），３．４６－３．２１（ｍ，１Ｈ），３．１９－３．１０（ｍ，１Ｈ），３．０６－２．９７（ｍ，１Ｈ），２．８５（ｓ，４Ｈ），２．８１－２．６２（ｍ，１Ｈ），２．６１－２．４２（ｍ，１Ｈ），１．４７（ｓ，９Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ）計算値：３４５．４（Ｍ＋１）．

【0506】

方法４：Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（６－モルホリノニコチノイル）－Ｌ－リシンの合成

【化24】

フルオレニルメチルオキシカルボニルクロリドＬ－リシン（Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ－ＯＨ）（１５．３ｇ、４１．５３ｍｍｏｌ、１．２当量）を室温で機械的に撹拌しながらＴＨＦ－水（１：１、８００ｍＬ）中に溶解させた。上記で調製したＤＣＭ中のエステル（方法２）の溶液を１回で添加し、続いてＤＩＰＥＡ（１０．７３ｇ、８２．９９ｍｍｏｌ、２．４当量）を添加した。反応液をさらに室温で出発物質（ＴＬＣ、２時間）が消費されるまで室温で撹拌し、次いで、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）（２５０ｍＬ）を添加した。混合物をＨＣｌ（１Ｍ、２００ｍＬ）で酸性化し、分液漏斗中に注いで、層を分離させた。水層をＥｔＯＡｃ（２×２５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、塩水（２００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗生成物が淡褐色の油性残渣として得られ、これをＴＨＦ中に溶解させ、シリカゲルに吸着させ、シリカゲルのカラム（７”×３”）によるフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。カラムをヘキサン中５０％の酢酸エチル及び１００％の酢酸エチルで洗浄し、真空吸引下で生成物を溶出させた。必要とする生成物を含有する画分を合わせ、真空下で濃縮して、オフホワイト色の固体としてＮ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（６－モルホリノニコチノイル）－Ｌ－リシン（１２．６ｇ、６５％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３δ ９．２６（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．６２（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，１Ｈ），７．９３（ｄｄ，Ｊ＝２．５，９Ｈｚ，１Ｈ），７．７１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．５３（ｄｄ，Ｊ＝４．５，７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．３５（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．２３（ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），６．５９（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，１Ｈ），６．４８（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，１Ｈ），５．９９（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），４．４１（ｄｄ，Ｊ＝７．５，１２．５Ｈｚ，１Ｈ），４．３１（ｄｄ，Ｊ＝１２，１８Ｈｚ，２Ｈ），４．１５（ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ，１Ｈ），３．７１（ｔ，＝４．５Ｈｚ，４Ｈ），３．５６－３．３２（ｍ，６Ｈ），１．９８－１．８７（ｍ，１Ｈ），１．８６－１．７５（ｍ，１Ｈ），１．７１－１．５７（ｍ，２Ｈ），１．５６－１．３９（ｍ，２Ｈｐｐｍ；１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３δ １７５．２，１６６．６，１５９．９，１５６．６，１４６．９，１４４．１，１４３．９，１４１．４，１３７．７，１２７．９，１２７．３，１２５．３，１２０．１，１１９．５，１０６．３，６７．２，６６．６，５３．８，４７．３，４５．３，３９．５，３２．０，２８．９，２２．４ｐｐｍ；ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ３１Ｈ３４Ｎ４Ｏ６［Ｍ＋Ｈ］＋の正確な質量計算値：５５９．２６、実測値：５５９．３５。

【0507】

方法５：（２Ｓ）－２－アミノ－６－｛［６－（モルホリン－４－イル）ピリジン－３－カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸（Ｎ６－（６－モルホリノニコチノイル）－Ｌ－リシン）（ＬＹＳ（ＭＮ））の合成
手順１

【化25】

Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（６－モルホリノニコチノイル）－Ｌ－リシン（方法４）のＦｍｏｃ保護基は、例えばＤＭＦ中２０％のピペリジンを用いて当技術分野において知られている標準的な手順によって除去することができる。

【0508】

手順２

【化26】

修飾リシンを７００μＬのＮＭＰ中に溶解させた（１５ｍｇ、２６．８７μｍｏｌ。続いて撹拌しながらこの溶液に３００μＬのピペリジンを添加した（ピペリジン：ＮＭＰ＝７：３；１ｍＬ）。反応液を室温で３０分間攪拌した。続いて遠心分離により（４０００ｇ、１０分、４℃）修飾リシンを沈殿させ、冷ジエチルエーテル（１０ｍＬ）で３回洗浄した。^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）を使用してＦｍｏｃの除去を確認した。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤｌ３δ １１．８９（ｓ，１Ｈ），８．８５（ｄｄ，１Ｈ），７．８９（ｄｄ，１Ｈ），７．３４（ｄｄ，１Ｈ），３．５２－３．７１（ｍ，８Ｈ），３．３５（ｔ，１Ｈ），２．７２－２．６１（ｔ，２Ｈ），２．０１－１．５７（ｍ，６Ｈ）ｐｐｍ．ＭＳ（ＥＳＩ）正確な質量計算値［Ｍ＋Ｈ２Ｏ］＋：３５２．５５、実測値：３５２．０４。

【0509】

方法６：Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（４－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）チオモルホリン－３－カルボニル）－Ｌ－リシンの合成

【化27】

Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｌｙｓ－ＯＨ（８．９４ｇ、２４．２６ｍｍｏｌ、１．２当量）を室温で機械的に撹拌しながらＴＨＦ－水（１：１、８００ｍＬ）中に溶解させた。上記で調製したＤＣＭ中の活性化エステル（方法３）の溶液を１回で添加し、続いてＤＩＰＥＡ（６．２７ｇ、４８．５３ｍｍｏｌ、２．４当量）を添加した。反応液をさらに室温で出発物質（ＴＬＣ、２時間）が消費されるまで室温で撹拌し、次いで、ＥｔＯＡｃ（２５０ｍＬ）を添加した。混合物をＨＣｌ（１Ｍ、２００ｍＬ）で酸性化し、分液漏斗中に注いで、層を分離させた。水層をＥｔＯＡｃ（２×２５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、塩水（２００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗生成物が淡黄色の油性残渣として得られ、これをＤＣＭ中に溶解させ、シリカゲルに吸着させ、シリカゲルのカラム（７”×３”）によるフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。カラムをヘキサン中５０％～７０％の酢酸エチルで洗浄し、真空吸引下で生成物を溶出させた。必要とする生成物を含有する画分を合わせ、真空下で濃縮して、オフホワイト色の固体としてＮ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（４－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）チオモルホリン－３－カルボニル）－Ｌ－リシン（９．１ｇ、７５％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３δ ７．７５（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．６３－７．５１（ｍ，２Ｈ），７．３８（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．２９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），５．７１（ｄｄ，Ｊ＝７．５，２３Ｈｚ，１Ｈ），４．９７（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．５７－４．２３（ｍ，４Ｈ），４．２０（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，１Ｈ），３．５１－３．１８（ｍ，３Ｈ），３．１７－２．９６（ｂｒ ｓ，１Ｈ），２．７７（ｄ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，１Ｈ），２．７０－２．５８（ｍ，１Ｈ），２．３８（ｄ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，１Ｈ），１．９８－１．８６（ｍ，１Ｈ），１．８５－１．７３（ｍ，１Ｈ），１．６６－１．５３（ｍ，２Ｈ），１．４６（ｂｒ ｓ，１２Ｈｐｐｍ；１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３δ １７５．０，１５６．４，１５５．８，１４３．９，１４１．４，１２７．９，１２７．３，１２５．３，１２０．１，６７．３，６０．６，５３．８，４７．３，３９．２，３１．５，２９．１，２８．５，２６．７，２２．３ｐｐｍ；ＭＳ（ＥＳＩＣ_３１Ｈ_３９Ｎ_３Ｏ_７Ｓ［Ｍ＋Ｎａ］＋の正確な質量計算値：６２０．２４、実測値：６２０．３５。

【0510】

方法７：（２Ｓ）－２－アミノ－６－［（チオモルホリン－３－カルボニル）アミノ］ヘキサン酸（Ｎ６－（チオモルホリン－３－カルボニル）－Ｌ－リシン）（ＬＹＳ（ＴＭ））の合成
手順１

【化28】

Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（４－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）チオモルホリン－３－カルボニル）－Ｌ－リシン（方法６）のＦｍｏｃ保護基は、例えばＤＭＦ中２０％のピペリジンを用いて当技術分野において知られている標準的な手順によって除去することができる。同様に、Ｂｏｃ保護基は、ＤＣＭ中３０％のＴＦＡを使用して当技術分野において知られている標準的手法によって取り除くことができる。

【0511】

手順２

【化29】

修飾リシンを７００μＬのＮＭＰ中に溶解させた（１５ｍｇ、２５．１２μｍｏｌ。続いて撹拌しながらこの溶液に３００μＬのピペリジンを添加した（ピペリジン：ＮＭＰ＝７：３；１ｍＬ）。反応液を、Ｆｍｏｃ保護基を除去するために室温で３０分間撹拌した。続いて遠心分離により（４０００ｇ、１０分、４℃）修飾リシンを沈殿させ、冷ジエチルエーテル（１０ｍＬ）で３回洗浄した。一晩風乾させた後、生成物を５０％のＴＦＡ：ＤＣＭ（１ｍＬ）中に溶解させ、室温で１５分間撹拌した。ＴＦＡ：ＤＣＭ溶液をロータリーエバポレーターを用いて除去し、沈殿させ、冷エチルエーテルで２回洗浄した。Ｆｍｏｃの除去を^１Ｈ ＮＭＲにより確認した：δ １１．５６－１２．０４（１Ｈ，ｂｒ），７．３４（ｓ，１Ｈ），３．６５－３．７６（ｄｄ，２Ｈ），３．４２（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），３．０１－３．１５（ｍ，２Ｈ），２．７０－２．８９（ｍ，２Ｈ），２．５５－２．６１（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），２．０６－２．１８（ｍ，２Ｈ），１．７４－１．８５（ｍ，２Ｈ），１．５８－１．６４（ｑ，２Ｈ１．０５（１Ｈ，ｓ）ｐｐｍ及びＭＳ（ＥＳＩ正確な質量計算値［Ｍ＋Ｈ２Ｏ］＋：２７９．２２、実測値：２７９．６２。

【0512】

方法８：Ｎ２（１－｛［（モルホリン－４－イル）アセチル］オキシ｝ピロリジン－２，５－ジオン）－Ｌ－リシンの合成

【化30】

下記の手順を使用して、Ｎ２（１－｛［（モルホリン－４－イル）アセチル］オキシ｝ピロリジン－２，５－ジオン）－Ｌ－リシンを生成することができる。Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｌｙｓ－ＯＨ １．２当量）を室温で機械的に撹拌しながらＴＨＦ－水（１：１，８００ｍＬ）中に溶解させることができる。上記で調製したＤＣＭ中の活性化エステルの溶液を１回で添加し、続いてＤＩＰＥＡ（２．４当量）を添加することができる。反応液をさらに室温で出発物質（ＴＬＣ、２時間）が消費されるまで撹拌し、次いで、ＥｔＯＡｃ（２５０ｍＬ）を添加することができる。混合物をＨＣｌ（１Ｍ、２００ｍＬ）で酸性化し、分液漏斗中に注いで、層を分離させることができる。水層をＥｔＯＡｃ（２×２５０ｍＬ）で抽出することができる。有機層を合わせ、塩水（２００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮することができる。粗生成物をＤＣＭ中に溶解させ、シリカゲルに吸着させ、シリカゲルのカラム（７”×３”）によるフラッシュクロマトグラフィーによって精製することができる。カラムをヘキサン中５０％～７０％の酢酸エチルで洗浄し、真空吸引下で生成物を溶出させることができる。必要とする生成物を含有する画分を合わせ、真空下で濃縮して、Ｎ２－（Ｎ２（１－｛［（モルホリン－４－イル）アセチル］オキシ｝ピロリジン－２，５－ジオン）－Ｌ－リシンを得ることができる。

【0513】

方法９：（２Ｓ）－２－アミノ－６－［２－（モルホリン－４－イル）アセトアミド］ヘキサン酸（Ｎ６－（２－モルホリノアセチル）－Ｌ－リシン）（ＬＹＳ（Ｍ））の合成
手順１

【化31】

Ｎ２（１－｛［（モルホリン－４－イル）アセチル］オキシ｝ピロリジン－２，５－ジオン）－Ｌ－リシン（方法８）のＦｍｏｃ保護基は、例えばＤＭＦ中２０％のピペリジンを用いて当技術分野において知られている標準的な手順によって除去することができる。

【0514】

手順２

【化32】

修飾リシンを７００μＬのＮＭＰ中に溶解させた（１５ｍｇ、２５．０２μｍｏｌ。続いて撹拌しながらこの溶液に３００μＬのピペリジンを添加した（ピペリジン：ＮＭＰ＝７：３；１ｍＬ）。反応液を室温で３０分間攪拌した。続いて遠心分離により（４０００ｇ、１０分、４℃）修飾リシンを沈殿させ、冷ジエチルエーテル（１０ｍＬ）で３回洗浄した。Ｆｍｏｃの除去をＨ－ＮＭＲにより確認した：１Ｈ ＮＭＲ（５００ ＭＨｚ，ＣＤｌ３δ １２．０１（ｂｒ ｓ，１Ｈ），３．６２－３．７４（ｍ，４Ｈ），３．４０（ｔ，１Ｈ），３．２９（ｓ，２Ｈ），３．１０（ｔ，１Ｈ），２．５９－２．７０（ｍ，４Ｈ），１．８８－２．０１（ｍ，２Ｈ），１．５８－１．６５（ｍ，２Ｈ），及び１．４６－１．５６（ｑ，２Ｈ）及びＭＳ（ＥＳＩ）正確な質量計算値［Ｍ＋Ｈ２Ｏ］＋：２７３．１７、実測値：２７３．３３。

【0515】

実施例２
修飾リシンを有するペプチドデンドロンの合成
一連のペプチドデンドロンを合成した（表２）。修飾リシンは、上記の方法５、７及び９で合成された修飾リシンを使用してペプチド合成中に直接組み込まれたか（これらは表中「＊」が付されている）、又はペプチド合成後に、樹脂切断後の溶液中で、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド化学と、上記の方法１～３で合成された化合物を利用してリシン側鎖（ε－アミン）を修飾することによって組み込まれた。ＰＤ１～ＰＤ３及びＰＤ３（Ｈｉｓ）は比較のために合成されたもので、非修飾リシン（ＰＤ１～３）、又はリシンの代わりにヒスチジン（ＰＤ３（Ｈｉｓ））を含有する。

【0516】

【表2】

【0517】

【表3】

【0518】

手順ａ）修飾リシン又はヒスチジンの直接組み込みによるペプチドデンドロン合成
リンクアミド樹脂上でのフラグメント縮合による標準固相ペプチド合成を用いて、ペプチドデンドロンを合成した。各フラグメントを、Ｆｍｏｃ化学を使用して２－クロロトリチル樹脂（酸に非常に不安定な樹脂）上で合成し、トリフルオロエタノールを使用して樹脂から除去して、側鎖及びＮ末端上の全ての保護基を維持した。次いで、フラグメント及び分岐点としてのＮα，Ｎε－ジ－Ｆｍｏｃ－Ｌ－リシンを用いてペプチドデンドロンを構築し、続いて、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で樹脂から切断し、Ｃ末端アミド化をもたらした。この集合体を、ＰＤ３ベースの配列、例えばＰＤ３（Ｍ）、ＰＤ３（ＭＮ）、及びＰＤ３（ＴＭ）を有するペプチドデンドロンを用いて図１に模式的に示す。保護基は全て、切断工程の間に除去された。粗ペプチドを、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、水：アセトニトリル勾配を用いて精製した。純度及び質量を、ＨＰＬＣ及びエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析によって確認した。デコンボリューションツールを用いて、同じ種で異なる電荷状態の形のものを含むＥＳＩ質量スペクトルを解釈した。多重電荷種をその一価の電荷形態に計算し、ｍ／ｚ値及びピーク幅に従ってグループ化し、原子質量単位（ａｍｕ）で示した。ＰＤ１：ＭＷ ４５４０．１［４５４０．２ａｍｕ］。ＰＤ２：ＭＷ ７０９７．１［７０９７．５ａｍｕ］。ＰＤ３：ＭＷ ７０９７．１［７０９７．５ａｍｕ］。ＰＤ３（Ｈｉｓ）：ＭＷ ７２２３．１［７２２３．１ａｍｕ］。ＰＤ３（ＭＮ）＊：ＭＷ ９７６０．０［９７５９．９ａｍｕ］。ＰＤ３（ＴＭ）＊：ＭＷ ８９０５．５［８９０５．５ａｍｕ］。

【0519】

手順ｂ）樹脂からデンドロン中間体を切断した後のペプチドリシンε－アミンの修飾によるペプチドデンドロンの合成
２μモルのペプチドデンドロン（ＰＤ１、ＰＤ２又はＰＤ３）を、新たに調製した０．１Ｍの重炭酸ナトリウム（ｐＨ８．０）中に懸濁した。この混合物を１０分間超音波処理した。４０ｍＭのＮＨＳ官能化中間体（方法１～３）をＤＭＡＣ中で調製し、撹拌しながらペプチド溶液（０．５ｍＭ）に滴下した。リシンε－アミドの１００％変換を確実にするため、ＮＨＳ官能化中間体は、１ペプチド当たりリシンに対して１．５モル過剰に添加した。反応液を室温で０．５時間撹拌し、続いて非反応中間体を超遠心分離（ＭＷＣＯ ３．０ｋＤａ）により除去した。エレクトロスプレーイオン化質量分析を用いて、修飾を確認した。デコンボリューションツールを用いて、同じ種で異なる電荷状態の形のものを含むＥＳＩ質量スペクトルを解釈した。多重電荷種をその一価の電荷形態に計算し、ｍ／ｚ値及びピーク幅に従ってグループ化し、原子質量単位（ａｍｕ）で示した。ＰＤ２（Ｍ）：ＭＷ ９９０４．９［９９０４．９ａｍｕ］。ＰＤ２（ＭＮ）：ＭＷ ９７５９．９［９８０８．１ａｍｕ（ＭＷ＋ギ酸）］。ＰＤ２（ＴＭ）：ＭＷ ８９０５．５［８９０５．５ａｍｕ］。ＰＤ３（Ｍ）：ＭＷ ９９０４．８［９９０５．０ａｍｕ］。ＰＤ３（ＭＮ）：ＭＷ ９７５９．９［９８０８．１ａｍｕ（ＭＷ＋ギ酸）］。ＰＤ３（ＴＭ）：ＭＷ ８９０５．５［８９０５．６ａｍｕ］。

【0520】

実施例３
標的化部分又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のペプチドデンドロンへの組み込み
ａ）メトキシ－ＰＥＧ及びＭａｌ－ＰＥＧペプチドデンドロンの調製
マレイミドで官能化したメトキシ－ＰＥＧ（ｎ＝３６）（ｍ－ｄＰＥＧ（登録商標）_３６－ＭＡＬ；Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ、Ｐｌａｉｎ Ｃｉｔｙ Ｏｈｉｏ）及びビス－マレイミドＰＥＧ（ｎ＝１９）（Ｂｉｓ－ＭＡＬ－ＰＥＧ_１９（ＢｒｏａｄＰｈａｒｍ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））（表１の化合物番号１及び２）を、ｐＨ５．５の２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液で、それぞれ１．２５ｍＭ及び５ｍＭ液として調製した。同じ緩衝液中の等量のペプチドデンドロン溶液（実施例２のように調製、１ｍＭ）を、それぞれ１．２５倍及び５倍モル過剰のＰＥＧ溶液と混合した。反応液を室温で２時間撹拌し、質量分析によって確認した。過剰なＰＥＧを、ＰＢＳ及び水、又はＭａｌ－ＰＥＧ－ＰＤコンジュゲートのための２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）中で、透析によって除去した。エレクトロスプレーイオン化質量分析を用いて、修飾を確認した。ＭｅＯ－ＰＥＧ（３６）－ＰＤ２（ＭＮ）ＭＷ １１５２８．２（１１５２８．２ａｍｕ）、ＭｅＯ－ＰＥＧ（３６）－ＰＤ３（ＴＭ）：ＭＷ １０６７３．９（１０６７４．１ａｍｕ）、ＭｅＯ－ＰＥＧ（３６）－ＰＤ２（ＭＮ）：ＭＷ １１５２８．２（１１５２９．２ａｍｕ）、ＭｅＯ－ＰＥＧ（３６）－ＰＤ３（ＴＭ）：ＭＷ １０６７４．２（１０６７３．９ａｍｕ）。Ｍａｌ－ＰＥＧ（１９）－ＰＤ１：ＭＷ ８２９６．４（８２９７．２ａｍｕ）、Ｍａｌ－ＰＥＧ（１９）－ＰＤ２（ＭＮ）：ＭＷ １０９５９．３（１０９６０．３ａｍｕ）、Ｍａｌ－ＰＥＧ（１９）－ＰＤ３（ＭＮ）：ＭＷ １０９５９．３（１０９６０．３ａｍｕ）、及びＭａｌ－ＰＥＧ（１９）－ＰＤ２（ＭＮ）：ＭＷ １０９５９．３（１０９６０．３ａｍｕ）。

【0521】

ｂ）標的ＰＥＧ－ペプチドデンドロンコンジュゲートの調製
標的化ペプチド（化合物（表１の番号３～６）を、Ｆｍｏｃ化学を用いた標準固相ペプチド合成により調製した。Ｎ末端アセチル化をＤＭＦ中１０％の無水酢酸を用いて行った後、樹脂から切断した。ＴＦＰ－ＰＥＧ（ｎ＝３６）－マレイミド（Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ、Ｐｌａｉｎ Ｃｉｔｙ Ｏｈｉｏ）（５ｍＭ）及びアシル化ペプチド（７．５ｍＭ）を、新たに調製した０．１Ｍの重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、ペプチド溶液を１．２５モル過剰のＰＥＧ溶液に添加した。反応液を室温で３０分間撹拌した後、ｐＨを５．５に下げ、質量分析によってコンジュゲーションを確認した。緩衝液を、ＶｉｖａｓｐｉｎカラムＭＷＣＯ ３．５ｋＤａ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて、２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に交換した。続いて、精製された生成物を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中、２倍過剰量のペプチドデンドロン（実施例２のように調製）に、室温で２時間、添加した。エレクトロスプレーイオン化質量分析によって修飾を確認した。デコンボリューションツールを用いて、同じ種で異なる電荷状態の形のものを含むＥＳＩ質量スペクトルを解釈した。多重電荷種をその一価の電荷形態に計算し、ｍ／ｚ値及びピーク幅に従ってグループ化し、原子質量単位（ａｍｕ）で示した。ＴｆＲ－ＰＥＧ－ＰＤ３（ＭＮ）＊：１３８５５．０ ＭＷ（１３８５６．７ａｍｕ）。ｃＲＧＤ－ＰＥＧ－ＰＤ３（ＭＮ）＊：１２１８８．５ ＭＷ（１２１８８．２ａｍｕ）。ＴｆＲ－ＰＥＧ－ＰＤ３（ＴＭ）＊：ＭＷ １３８５５．０ ＭＷ（１３８５６．７ａｍｕ）。ｃＲＧＤ－ＰＥＧ－ＰＤ３（ＴＭ）＊：１２１８８．５ ＭＷ（１２１８８．６ａｍｕ）。

【0522】

ｃ）糖－ＰＥＧ－Ｍａｌコンジュゲートの調製
Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．０８６０ｍｍｏｌ）を、室温で、アミン官能化モノ又はトリアセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）（表１の化合物番号７及び８；Ｓｕｓｓｅｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｏｎｔａｒｉｏ Ｃａｎａｄａ）（０．０１６２０ｍｍｏｌ）及びＭＡＬ－ｄＰＥＧ（登録商標）_３６－ＴＦＰエステル（Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ、Ｐｌａｉｎ Ｃｉｔｙ Ｏｈｉｏ）（０．０２０２６１ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（６ｍｍｏｌ）溶液に添加した。反応液を室温で１時間撹拌し、ＨＰＬＣ－ＭＳによってコンジュゲーションを確認した。その後、生成物を逆相ＨＰＬＣを用いて精製した。続いて、精製された生成物を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中、２倍過剰量のペプチドデンドロン（実施例２のように調製）に、室温で２時間、添加した。エレクトロスプレーイオン化質量分析によって修飾を確認した。デコンボリューションツール（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍａｓｓ Ｈｕｎｔｅｒ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用して、同じ種で異なる電荷状態の形のものを含むＥＳＩ質量スペクトルを解釈した。多重電荷種をその一価の電荷形態に計算し、ｍ／ｚ値及びピーク幅に従ってグループ化し、原子質量単位（ａｍｕ）で示した。ＧａｌＮＡｃ－ＰＤ３（ＴＭ）＊ＭＷ １１７０８．６（フラグメント：１１５０６．６）［１１５０６．６ａｍｕ］。トリＧａｌＮＡｃ－ＰＤ３（ＴＭ）＊：ＭＷ １２６７９．１（フラグメント：１２０７１．２）［１１５０７．０ａｍｕ］。

【0523】

実施例４
単分散ナノ粒子へのペプチドデンドロン／ＤＮＡナノ粒子（ＮＰ）自己集合
カチオン性ペプチドデンドロン（ＰＤ）は、アニオン性核酸と自己集合してナノ粒子になる。ＮＰは、透過型電子顕微鏡法及び動的光散乱法を含む標準的なナノ粒子技術によって、直径が５０～７５ｎｍの球状であると決定された。

【0524】

ａ）ＮＰの調製
等量のＤＮＡ（４０μｇ／ｍＬ；Ｇｗｉｚ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅプラスミド（６７３２ｂｐ）（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ））及びペプチドデンドロン（実施例２のように調製）溶液を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）中で調製した。ペプチド溶液を、ペプチドデンドロンアルギニン：ＤＮＡリン酸（Ｎ：Ｐ２：１に対応する濃度で作製した。均質な粒子を保証するために、ＤＮＡ溶液を静かにボルテックスしながらペプチド溶液に滴加した。ＤＮＡ／ペプチドナノ粒子を、室温で３０分間にわたり複合体化させた。ＮＰ溶液中のＤＮＡの最終濃度は、２０μｇ／ｍＬであった。

【0525】

ｂ）動的光散乱法
動的光散乱データを、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）、グリーンレーザー及びＺＥＮ２１１２石英製キュベットを用いて収集した。流体力学直径及び多分散度指数（ＰＤＩ）を、累積適合度分析を用いて導出した。表３に示すように、全データポイントは、３つ以上の個別に調製した試料の平均値を表す。

【0526】

ｃ）透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）
試料を、グロー放電した４００メッシュのｆｏｒｍｖａコーティング銅グリッドに塗布し、１％酢酸ウラニルでネガティブ染色し、風乾し、透過型電子顕微鏡（Ｔｅｃｎａｉ Ｔ１２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において８０ｋＶの動作電圧で試験した。ＡＭＴボトムマウントＣＣＤカメラ及びＡＭＴ６００ソフトウェアを用いてデジタル画像を取得した。形態は、表３に示すように決定された。

【0527】

【表4】

【0528】

実施例５
単分散ナノ粒子へのペプチドデンドロン／ＲＮＡナノ粒子（ＮＰ）の自己集合
カチオン性ペプチドデンドロン（ＰＤ）は、アニオン性核酸と自己集合してナノ粒子になる。ＮＰは、動的光散乱法を含む標準的なナノ粒子技術を用いて直径が約５０ｎｍであると決定された。

【0529】

ａ）ＮＰの調製
等量のＲＮＡ（４０μｇ／ｍＬ）及びペプチド溶液（実施例２のように調製）を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）中で調製した。具体的には、ｍｃｈｅｒｒｙをコードするｃｌｅａｎｃａｐ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）及びＣＴＮＮＢ１を標的とするｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ／Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）を調製した。ペプチド溶液を、ペプチドデンドロンアルギニン：ｍＲＮＡリン酸（Ｎ：Ｐ）比４：１に対応する濃度で作製した：。均質な粒子を保証するために、ＲＮＡ溶液を静かにボルテックスしながらペプチド溶液に滴加した。ＲＮＡ／ペプチドナノ粒子を、室温で３０分間にわたり複合体化させた。ＮＰ溶液中のＲＮＡの最終濃度は、２０μｇ／ｍＬであった。任意選択の工程として、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ（％ｗ／ｗ）＝１）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を製剤に添加した。ＲＮＡの１～４のｗ／ｗ％に相当するＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）を２０ｍＭ ＨＰＥＳ（ｐＨ７．０）希釈した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）溶液を、前述のようにＲＮＡ溶液の添加の直前にペプチドデンドロン溶液に添加した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）を含有するナノ粒子は、「脂質」のマークが付される。

【0530】

ｂ）動的光散乱法
動的光散乱データを、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）、グリーンレーザー及びＺＥＮ２１１２石英製キュベットを用いて収集した。流体力学直径及び多分散度指数（ＰＤＩ）は、累積適合度分析を用いて導出した。全データポイントは、３つ以上の個別に調製した試料の平均値を表す。結果を表４に示す。

【0531】

【表5】

【0532】

実施例６
標的ＮＰナノ粒子の生成
ａ）メトキシ－ＰＥＧペプチドデンドロン及び標的ＰＥＧ－ペプチドデンドロンコンジュゲートとＤＮＡ又はＲＮＡとの混合物を含むナノ粒子の調製
２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）中に、ペプチドデンドロン（実施例２のように調製）又はメトキシ－ＰＥＧデンドロン（実施例３ａのように調製）と、標的ＰＥＧペプチドコンジュゲート（実施例３ｂのように調製）とを異なる比率で含むペプチド溶液を調製した。同じ緩衝液中のＤＮＡ（ｇｗｉｚ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）又はＲＮＡ（ｃｌｅａｎｃａｐ ｍｃｈｅｒｒｙ）（Ｔｒｉｌｉｎｋ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）溶液（４０μｇ／ｍＬ）をＰＤ混合物に、ペプチドデンドロンアルギニン：核酸リン酸（Ｎ：Ｐ）の最終比が４：１（ＤＮＡ）及び６：１（ＲＮＡ）となるようにボルテックスしながら滴下した。核酸／ペプチドナノ粒子を、室温で３０分間にわたり複合体化させた。ナノ粒子溶液中の核酸の最終濃度は、２０μｇ／ｍＬであった。任意選択の工程として、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ（％ｗ／ｗ）＝１）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を製剤に添加した。ＲＮＡと１～４のｗ／ｗ％に相当するＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）を２０ｍＭ ＨＰＥＳ（ｐＨ７．０）希釈した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）溶液を、前述のようにＲＮＡ溶液の添加の直前にペプチドデンドロン溶液に添加した。

【0533】

ｂ）メトキシ－ＰＥＧペプチドデンドロン及び標的ＰＥＧ－抗体ンコンジュゲートとＤＮＡ又はＲＮＡとの混合物を含むナノ粒子の調製
抗体ベースの標的化リガンドについては、ｍａｌ－ＰＥＧ ＰＤナノ粒子を調製し、次いで、抗体（以下のように修飾した表１の化合物番号５及び６）にコンジュゲートした。２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）中に、メトキシ－ＰＥＧデンドロン（実施例３ａ）とｍａｌ－ＰＥＧデンドロン（実施例３ａ）とを異なる比率で含むペプチド溶液を調製した。同じ緩衝液中のＤＮＡ（ｇｗｉｚ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）又はＲＮＡ（ｃｌｅａｎｃａｐ ｍｃｈｅｒｒｙ）（Ｔｒｉｌｉｎｋ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）溶液（４０μｇ／ｍＬ）をＰＤ混合物に、ペプチドデンドロンアルギニン：核酸リン酸（Ｎ：Ｐ）の比が４：１（ＤＮＡ）及び６：１（ＲＮＡ）となるようにボルテックスしながら滴下した。核酸／ペプチドナノ粒子を、室温で３０分間にわたり複合体化させた。ナノ粒子溶液中の核酸の最終濃度は、２０μｇ／ｍＬであった。

【0534】

Ｆａｂ及び／又はハーフマー（１つの軽鎖及び１つの重鎖）を、重鎖内の以下の非天然アミノ酸置換で操作した。

【化33】

【0535】

非天然アミノ酸は、その側鎖内にシクロペンタジエンを含有し（Ｎｎａａ ＣＰ１）、これは、ディール・アルダー反応のための反応性ハンドルとして機能することができる。Ｎｎａａ ＣＰ１は、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）ピロリジンｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ（ＰｙｌＲＳ）／ｔＲＮＡ（Ｐｙｌ）対を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を用いて、アンバー終止（ＴＡＧ）コドンに応答してＮｎａａ ＣＰ１を送達する抗体配列に遺伝的にコードされた。（Ａｍａｎｔ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ，２０１９，５８（２５）：８４８９－９３）。

【0536】

操作された抗体ベースの標的化部分を、実施例６に記載のように、室温で２時間、マレイミドに対して１．２５モル過剰で核酸／ペプチドナノ粒子溶液に添加した。続いて、混合物をＮ－アセチルシステイン（１０倍モル過剰）の添加によりクエンチした。超遠心分離（ＭＷＣＯ １００ｋＤａ）を用いて過剰の抗体を除去し、Ａ２６０／Ａ２８０比及び動的光散乱を用いて反応を確認した。

【0537】

ｃ）動的光散乱
動的光散乱データを、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）、グリーンレーザー及びＺＥＮ２１１２石英製キュベットを用いて収集した。流体力学直径及び多分散度指数（ＰＤＩ）を、累積適合度分析を用いて導出した。全データポイントは、３つ以上の個別に調製した試料の平均値を表す。

【0538】

【表6】

【0539】

【表7】

【0540】

実施例７
ＮＰは、刺激に応答してＤＮＡを放出する安定なナノ粒子を生成した
ａ）アニオン安定性試験
２０ｍＭ ＨＥＰＥＳで硫酸デキストラン（ＤＳ）溶液を調製し、ＮＰ溶液（実施例４のように調製）に添加して、最終ＤＳ濃度を１００ｍｇ／ｍＬ～１０００ｍｇ／ｍＬとし、ＤＮＡ濃度を１０μｇ／ｍＬとした。１５分間の脱錯体化期間の後、各製剤１５μＬを、臭化エチジウムを含む２％Ｅ－ゲルに添加し、１０分間流した。ｐＤＮＡの放出を、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）を用いて計算し、その結果を図２Ａに示した（インタクトなナノ粒子のパーセントをＤＳ濃度の関数としてプロットする）。

【0541】

ｂ）酵素によるＤＮＡの放出
実施例４と同様に調製したが、最終ＤＮＡ濃度０．１μｇ／μＬで８ｍＭのＬ－システインＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６）中で調製されたＮＰ。続いて、カテプシン－Ｂ原液（６０単位／ｍＬ）を加えた。Ｃａｔ－Ｂ ＮＰ溶液を３７℃で４時間までインキュベートした。アリコートを適切な時点で取り出し、アガロースゲル電気泳動によって分析して、放出されたＤＮＡを可視化した。ＤＮＡ希釈物を、対照として異なる濃度で調製し、同様に、ｂｉｏ－ｒａｄ強度ソフトウェア分析によるその後の定量化のために同じアガロースゲルに添加した。結果を図２Ｂに示す。

【0542】

【表8】

【0543】

実施例８
ＮＰは、インビトロトランスフェクションにおいて細胞特異性を示す
ａ）インビトロトランスフェクション
Ｈ１２９９、Ｃ２Ｃ１２、ＨＥＫ３９３及びＨＥＰＧ２細胞株を９６ウェルプレートに播種し、２４時間以内に８０％のコンフルエンシーを目標とした。続いて、Ｃ２Ｃ１２を、筋芽細胞から筋管へ分化させるために、２％ウマ血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で７日間インキュベートした。２４時間の回復期間後、ＮＰ（実施例２のように調製）を、ＯＰＴＩ－ＭＥＭ（１：１０希釈）中、１ウェル当たり０．２μｇで細胞に添加した。１６時間後、ＮＰを添加した培地を取り除き、新鮮な培養培地を添加した。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（ＥｓｓｅｎＢｉｏ）を用いてＧＦＰを画像化し、ＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）＋Ｔｏｘルシフェラーゼレポーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）の標準プロトコルを用いてルシフェラーゼ／生存率を定量した。結果を図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃに示す。

【0544】

実施例９
インビボトランスフェクションにおける筋肉内ＤＮＡ ＮＰ
ａ）筋肉内送達
ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、１肢当たり５μｇの、ＭｅＯ－ＰＥＧ－ＰＤ（ＭＮ）（実施例５のように調製）と複合体化したｐＤＮＡ（Ｇｗｉｚルシフェラーゼ）（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で処置した。ＩＶＩＳ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、発現を毎週評価した。発光を４回ずつ収集し、平均値±標準偏差として示した。結果を図４に示す。

【0545】

実施例１０
ＤＮＡ ＮＰの治療的発現
ａ）ＭＥＤＩ８８５２及びＳＴＫ１１コードＰＤナノ粒子の調製
ナノ粒子を、実施例４に記載のように、ＰＤ３（ＭＮ）と、治療用ＭＥＤＩ８８５２及びＳＴＫ１１をコードするプラスミドを用いて調製した。ＭＥＤ８８５２発現では、ＮＰをまた、ＴｆＲ－ＰＥＧ－ＰＤ３（ＭＮ）及びＭｅＯ－ＰＤ３（ＭＮ）（ペプチドデンドロンアルギニン：核酸リン酸（Ｎ：Ｐ ４：１）によっても調製した。ここで、ペプチドの２５％は、ＴｆＲ－ＰＥＧ－ＰＤ３（ＭＮ）であった。等量のＤＮＡ（４０μｇ／ｍＬ；ＭＥＤＩ８８５２プラスミド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯからのＭｉｎｉｍａｌ ＣＭＶ発現プラスミドと同様の方法で調製）又はＳＴＫ１１（Ｏｒｉｇｅｎｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ）プラスミド）とペプチドデンドロンの溶液を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）で調製した。ペプチドデンドロン溶液を、ペプチドデンドロンアルギニン：核酸リン酸（Ｎ：Ｐ）が４：１に相当する濃度で作製した。均質な粒子を保証するために、ＤＮＡ溶液を静かにボルテックスしながらペプチド溶液に滴加した。ＤＮＡ／ペプチドナノ粒子を、室温で３０分間にわたり複合体化させた。ＮＰ溶液中のＤＮＡの最終濃度は、２０μｇ／ｍＬであった。対照として、ＭＥＤＩ８８５２プラスミドもまた、リポフェクタミン－２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用い、製造業者のプロトコルに従って調製した。

【0546】

ｂ）治療用コードナノ粒子を用いたインビトロトランスフェクション試験
Ｈ１２９９（６，６００細胞／ウェル）、ＨＥＰＧ２（５０，０００細胞／ウェル）及びＣ２Ｃ１２（１２，０００細胞／ウェル細胞）を、それぞれ、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を補充したＲＰＭＩ培地又はＤＭＥＭ中、９６ウェルプレートに播種した。２４時間の回収期間の後、細胞を１００μＬのＰＢＳで２回、培養培地で１回洗浄した。次いで、ナノ粒子を、培養培地中、１ウェル当たり０．２μｇ（Ｈ１２９９）又は０．５μｇ（ＨＥＰＧ２及びＣ２Ｃ１２）で細胞に添加した。１６時間後、ナノ粒子を添加した培地を取り除き、新鮮な培養培地を添加した。ＭＥＤＩ８８５２発現を、以下の（ｃ）に記載のようにＥＬＩＳＡを用いて定量し、ＳＴＫ１１発現を、以下の（ｄ）に記載のようにウェスタンブロットを用いて検出した。結果をそれぞれ図５Ａ及び５Ｂに示す。

【0547】

ｃ）ＭＥＤＩ８８５２ ＥＬＩＳＡ
ＮＵＮＣＴＭ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）９６ウェルマイクロプレートを、抗ＭＥＤＩ８８５２抗体（Ａｌｉ，Ｓ ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０１８ Ｎｏｖ；６２（１１）：ｅ００６９４－１８．）を１μｇ／ｍＬで含む重炭酸緩衝液１００μＬ／ウェルでコーティングした。プレートを４℃で一晩インキュベートし、翌朝、３００μＬのＰＢＳ－Ｔ（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。全ての標準、品質管理試料、及び試験試料を、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で１：２５０に希釈した。１００μＬの希釈試料を各ウェルにロードし、２時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを３００μＬのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。二次抗体のビオチン化抗ＭＥＤＩ８８５２（Ａｌｉ，Ｓ ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０１８ Ｎｏｖ；６２（１１）：ｅ００６９４－１８．）をＰＢＳ－Ｔで２μｇ／ｍＬに希釈し、１００ｕＬを各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、１００μＬのストレプトアビジン－ＨＲＰ複合体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、コード０１６－０３０－０８４）を１：４０の希釈で添加した。プレートをＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、１００μＬの室温で平衡化したＳｕｒｅＢｌｕｅ ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を全てのウェルに添加した。暗所で１５分後、１００μＬのＴＭＢ停止液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて反応をクエンチした。各ウェルの光学密度（ＯＤ）を、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ ＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳＸマイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで読み取った。結果を図５Ａに示す。

【0548】

ｅ）ＳＴＫ１１ ウェスタンブロット
トランスフェクション後、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤（Ｐｉｅｒｃｅ 番号７８４４２）を補充したＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｔｅｋｎｏｖａ カタログ番号Ｎｏ．Ｒ３７９２）を用いて細胞を溶解し、１２，０００×ｇで５分間遠心分離した。上清を回収し、ＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ 製品番号２３２２７）を用いて定量した。次いで、１試料当たり１０μｇの抽出タンパク質を、ＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動を用いて２００ｍＡの電流で９０分間分離し、次いで、ｉＢｌｏｔシステムによってＰＶＤＦ膜に移した。続いて、膜を、５％ＢＳＡを補充したＴＢＳ－Ｔ（２０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．６）でブロックした。ウサギ抗ＳＴＫ１１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ カタログ番号Ｄ６０Ｃ５）及び抗ＧＡＰＤＨ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ カタログ番号１４Ｃ１０）一次抗体を１：１０，０００希釈で一晩ハイブリダイズさせた。膜を３０分間洗浄し、次いでＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧに３０分間ハイブリダイズさせた。インキュベーション後、膜を洗浄して非特異的結合を全て除去し、Ｐｉｅｒｃｅ ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光試薬（Ｐｉｅｒｃｅ カタログ番号３４５７９）と共にインキュベートした。バンドを、Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００を用いて検出した。結果を図５Ｂに示す。

【0549】

実施例１１
インビトロにおける標的ＤＮＡ ＮＰトランスフェクション
ａ）インビトロトランスフェクション
Ｈ１２９９（６，６００細胞／ウェル）、ＣＴ２６（１０，０００細胞／ウェル）及びＣ２Ｃ１２（１２，０００細胞／ウェル細胞）を、それぞれ、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を補充したＲＰＭＩ培地又はＤＭＥＭ中、９６ウェルプレートに播種した。Ｈ１２９９細胞及びＣＴ２６細胞のトランスフェクションの前に、２４時間の回復期間を設け、その間にＣ２Ｃ１２筋芽細胞を少なくとも７日間にわたり２％のウマ血清を補充したＤＭＥＭ中でインキュベーションして筋管に分化させた。続いて、細胞を１００μＬのＰＢＳで２回洗浄し、培養培地で１回洗浄した。標的及び非標的ナノ粒子を、実施例６に記載のように、Ｇｗｉｚルシフェラーゼプラスミド（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を用いて調製した。ＴｆＲ標的ＮＰ及びｃＲＧＤ標的ＮＰを、ＭｅＯ－ＰＥＧ－ＰＤ（ＭＮ）：ＴｆＲ－ＰＥＧ－ＰＤ（ＭＮ）又はｃＲＧＤ－ＰＥＧ－ＰＤ（ＭＮ）（実施例３ａ）及びｂ）で調製した材料）の混合物を用いて調製した。ここで、０、１０、及び５０％のＴｆＲ－ＰＥＧ－ＰＤ（ＭＮ）並びに０、５、１０、２０、及び３０％のｃＲＧＤ－ＰＥＧ－ＰＤ（ＭＮ）を用いた。ＮＰを細胞に培地中で１ウェル当たり０．２μｇで添加した（１：１０希釈）。１６時間後、ナノ粒子を添加した培地を取り除き、新鮮な培養培地を添加した。ＧＦＰ発現は、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を使用して画像化し、ルシフェラーゼ／生存率は、ＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）＋Ｔｏｘルシフェラーゼレポーター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）及びＰＨＥＲＡｓｔａｒＦＳＸ機器（ＢＭＧ Ｌａｂ Ｔｅｃｈ，Ｃａｒｙ，ＮＣ）の標準プロトコルを使用して定量した。結果を図６Ａ～Ｃに示す。

【0550】

実施例１２
ａ）ナノ粒子の調製
ＰＶ１標的ＭＥＣＡ３２を操作し、実施例６に記載のように、重鎖内に非天然アミノ酸置換を有するハーフマー（１本の軽鎖及び１本の重鎖）として発現させた。実施例６に記載のプロトコルを用いて、ペプチドデンドロンアルギニン：核酸リン酸（Ｎ：Ｐ）比４：１（７５％ＭｅＯ－ＰＥＧ－ＰＤ３（ＭＮ）：２５％Ｍａｌ－ＰＥＧ－ＰＤ３（ＭＮ）））で、５％トレハロース緩衝液中においてＰＤ３（ＭＮ）ＰＥＧコンジュゲート（実施例６のように調製）及びＧｗｉｚルシフェラーゼプラスミド（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を用いてＮＰを調製した。ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｎ：Ｐｒａｔｉｏ ｏｆ ４：１（７５％ ＭｅＯ－ＰＥＧ－ＰＤ３（ＭＮ）：２５％ Ｍａｌ－ＰＥＧ－ＰＤ３（ＭＮ）ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｉｎ Ｅｘａｍｐｌｅ ６．ＣＰ１－ＭＥＣＡ３２（Ｇａｂｒｉｅｌａ Ｍ．Ｍａｒｃｈｅｔｔｉ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｍｕｎ Ｂｉｏｌ．２０１９；２：９２；２０１９年３月７日にオンラインで公開、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４２００３－０１９－０３３７－２）をマレイミドのモルに基づいて１．２５倍モル過剰で添加し、室温で一晩インキュベートした。反応をＮ－アセチルシステイン（１０倍モル過剰）の添加によりクエンチし、超遠心分離（ＭＷＣＯ １００ｋＤａ）によって過剰の抗体を除去した。

【0551】

ｂ）マウスにおける肺標的送達
ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、ＰＤ（ＭＮ）と複合体を形成した２０μｇのＧｗｉｚルシフェラーゼｐＤＮＡで静脈内処置した。ｐＤＮＡの１０％をＣｙ－５（１２標識／プラスミド）で標識した。発現及び生体内分布を、ＩＶＩＳ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて１、３及び８日目に評価した。各処置を４回ずつ行い、定量データを平均±標準偏差として示す。結果を図７に示す。

【0552】

実施例１３
インビトロにおけるｍＲＮＡ ＮＰトランスフェクション
ａ）ＤＮＡ及びｍＲＮＡ ＮＰの調製
ペプチドデンドロン溶液を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）中でＰＤ３（ＭＮ）（実施例４及び５のように調製）で調製した。ｍＣｈｅｒｒｙをコードするＤＮＡ（Ｏｒｉｇｅｎｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ）又はｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を同じ緩衝液（４０μｇ／ｍＬ）で希釈し、ペプチドデンドロンアルギニン 核酸リン酸（Ｎ：Ｐ）の最終比が２：１（ＤＮＡ）又は４であった：１（ｍＲＮＡ）となるようにボルテックスしながら滴下した。核酸／ペプチドナノ粒子を、室温で１５分間にわたり複合体化させた。ナノ粒子溶液中の核酸の最終濃度は、２０μｇ／ｍＬであった。実施例４（ＤＮＡ）及び５（ｍＲＮＡ）に記載のようにＤＬＳを用いてＮＰの特性を評価した。

【0553】

ｂ）インビトロトランスフェクション
Ｈ１２９９を９６ウェルプレートに播種し、２４時間以内に８０％のコンフルエンシーを目標とした。２４時間の回復期間の後、ＮＰを培養培地中、１ウェル当たり０．２μｇで細胞に添加した（１：１０希釈）。４時間後、ＮＰを添加した培地を取り除き、新鮮な培地を添加した。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（ＥｓｓｅｎＢｉｏ）を用いてｍＣｈｅｒｒｙを画像化した。結果を図８に示す。

【0554】

実施例１４
インビボにおけるｐＤＮＡ及びｍＲＮＡのトランスフェクション
筋肉内送達
ＮＰを、実施例４及び５に記載のように、ＭｅＯ ＰＥＧ－ＰＤ３（ＭＮ）を用いて調製した。ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、１肢当たり５μｇの、ルシフェラーゼをコードする複合ｃｌｅａｎｃａｐ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）又はＧｗｉｚ ＤＮＡ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ、Ｓａｎ ＤｉｅｇｏＣＡ）で処置した。ＩＶＩＳ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、発現を毎週評価した。発光は４回ずつ収集し、平均値±標準偏差として示した。結果を図９で示す。

【0555】

実施例１５
インビボにおけるｍＲＮＡの治療的発現
静脈内送達
実施例５に記載のように、ＭｅＯ－ＰＤ３（ＭＮ）及びＭＥＤＩ８８５２をコードするｍＲＮＡを用いてＮＰを調製した。ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、ＮＰを尾静脈注射により静脈内投与した（マウス１匹当たり２０μｇ）。ＩＶＩＳ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、発現を毎週評価した。発光は４回ずつ収集し、平均値±標準偏差として示した。結果を図１０に示す。

【0556】

実施例１６
初代Ｔ細胞のｍＲＮＡ標的トランスフェクション
Ｔ細胞標的ＮＰの調製及び特性評価
インビトロトランスフェクション
新鮮な初代Ｔ細胞（Ｃｅｌｌｅｒｏ、Ｌｏｗｅｌｌ、ＭＡから得られるものに類似するが、新鮮であり凍結されていない）を、２４ウェルプレート（３ｅ６／ウェル）のＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）に播種した。２４時間の回復期間の後、ＮＰを、ＯＰＴＩ－ＭＥＭ中、１００μＭ／ウェルで細胞に添加した。ＮＰを、ｍｃｈｅｒｒｙをコードするｃｌｅａｎｃａｐ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と、ＰＤ３（ＭＮ）及びＭａｌ－ＰＥＧ－ＰＤ３（ＭＮ）の混合物とを用いて、実施例６に記載のように調製した。ＮＰは、Ｍａｌ－ＰＥＧ－ＰＤ３（ＭＮ）を０、２５、５０及び１００％用いて調製し、その後、実施例６に記載のように抗ＣＤ３ ｆａｂとコンジュゲートした。４時間後、ＮＰを添加した培地を取り除き、新鮮な培養培地を添加した。ＲＦＰをＩｎｃｕｃｙｔｅ（ＥｓｓｅｎＢｉｏ）を用いて画像化し、フローサイトメトリーを用いて定量した。結果を図１１に示し、ここで、Ａ）は平均ｍｃｈｅｒｒｙ強度、Ｂ）はトランスフェクトされた細胞のパーセント、Ｃ）はＣＤ３の表面発現を示す。

【0557】

実施例１７
ｓｉＲＮＡトランスフェクションのインビトロ試験
ａ）細胞培養
Ｃｏｌｏ２０５及びＳＷ４８０細胞株をＡＴＴＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から入手した。培養を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）増殖培地（Ｇｉｂｃｏ）中、３７℃及び５％ＣＯ２で維持した。Ｃｏｌｏ２０５及びＳＷ４８０ ＣＴＮＮＢ１ ｓｈＲＮＡ細胞株を、ドキシサイクリン誘導性ヒトＣＴＮＮＢ１ ｓｈＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ／Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）のレンチウイルス導入によって作製した。

【0558】

ｂ）ＴｏｐＦｌａｓｈ ＣＴＮＮＢ１レポーターアッセイ及びウェスタンブロット
ＳＷ４８０腫瘍細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）に、ＴＣＦ１ ＴｏｐＦｌａｓｈルシフェラーゼレポーター（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を安定に導入した。ＳＷ４８０ ＴｏｐＦｌａｓｈ細胞を、６ウェルディッシュに１ウェル当たり２．０×１０５細胞の密度で播種し、上述したようにコレステロール結合ｓｉＲＮＡ（Ａｃｃｅｌｌ ｓｉＲＮＡ）又はｓｉＲＮＡ ＮＰで４８～７２時間処理した。ナノ粒子は、ＰＤ３（ＭＮ）又はＭｅＯ－ＰＥＧ－ＰＤ（ＭＮ）とｃＲＧＤ－ＰＥＧ－ＰＤ（ＭＮ）との混合物（０、３３、６６又は１００％のｃＲＧＤ－標的化を含む）を用いて、実施例５に記載のように調製した。細胞を溶解し、ＢｒｉｇｈｔＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて処理し、９６ウェルプレートに移し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｘ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）を用いてルシフェラーゼレポーター活性を測定した。ＰＤ３（ＭＮ）：ｃＲＧＤ－ＰＥＧ－ＰＤ３（ＭＮ）のＴｏｐＦｌａｓｈの結果を図１２に示す。ＭｅＯ－ＰＥＧ－ＰＤ３（ＭＮ）：ｃＲＧＤ－ＰＥＧ－ＰＤ３（ＭＮ）のＴｏｐＦｌａｓｈの結果を図１３Ａに示す。図１３Ｂに示すように、標準的なウェスタンブロットプロトコルを用いて、ＣＴＮＮＢ１発現の５日後に細胞溶解物も評価した。

【0559】

ｃ）ＣＴＮＮＢ１ウェスタンブロット及び細胞増殖アッセイ
６ウェルプレートに１ウェル当たり２．０×１０５細胞の密度でＣｏｌｏ２０５細胞をプレーティングした。対照として、コレステロール結合ｓｉＲＮＡを用いて細胞を処理した。具体的には、１ウェル当たり１ｍｌの、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ／Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）から購入したＡｃｃｅｌｌトランスフェクション培地中の細胞に、５００ｎＭのＡｃｃｅｌｌ対照非標的ｓｉＲＮＡ及びＡｃｃｅｌｌ ＣＴＮＮＢ１ ｓｉＲＮＡを添加した。コレステロール結合は、高濃度でのｓｉＲＮＡ送達を促進する。トランスフェクションの４８時間後に、１ウェル当たり２ｍｌのＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳを添加した。実験は、Ｃｏｌｏ２０５細胞をＣＴＮＮＢ１ ｓｉＲＮＡを封入したＮＰで処理し、６ウェルプレートに１ウェル当たり２．０×１０５細胞の密度で細胞を播種した。ＭｅＯ－ＰＥＧ－ＰＤ（ＭＮ）とｃＲＧＤ－ＰＥＧ－ＰＤ（ＭＮ）との混合物（０又は６６％ｃＲＧＤ－ＰＤ及び１％（ｗ／ｗ ｓｉＲＮＡ）ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎを含む）を用いて、実施例５に記載のようにナノ粒子を調製した。増殖培地を９００μｌの最適最小必須培地（ＯＰＴＩＭＥＭ）と交換し、１ウェル当たり１００μｌのＮＰ製剤を添加した（１ウェル当たり１００μＭのｍＲＮＡ）。トランスフェクションの１６時間後に、１ウェル当たり２ｍｌのＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳを添加した。細胞増殖アッセイのために、細胞を採取し、図１３Ｃに示すとおり、ＶｉＣｅｌｌ ＸＲ細胞カウンターを用いて、トランスフェクションの７２～９６時間後に計数した。

【0560】

実施例１８
標的ｓｉＲＮＡトランスフェクションインビボ試験
ａ）インビボ腫瘍増殖阻害アッセイ
７週齢の雌のヌードマウスに、２００μｌのＰＢＳ中の５．０×１０６個のＣｏｌｏ２０５細胞を皮下注射した。平均腫瘍体積がおよそ１００ｍｍ^３に達したとき、マウスを処置群に無作為化し、ＮＰ（実施例６のように調製した０、３３、及び６６％ｃＲＧＤ ＰＤ（ＭＮ）：ＰＥＧ－ＰＤ（ＭＮ）を３日間連続して注射し、その１週間後に２日間連続して注射した。腫瘍測定及びマウス体重を、実験期間中、１週間に２回又は３回記録した。腫瘍が２０００ｍｍ^３の大きさに達したとき、又は腫瘍表面の５０％超を包含する潰瘍形成を示したとき、マウスを安楽死させた。結果を図１４に示す。

【0561】

実施例１９
ハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡペプチドデンドロンナノ粒子（ＮＰ）自己集合
ａ）ＮＰの調製
ｍＣｈｅｒｒｙをコードするＣｌｅａｎｃａｐ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）及びＧＦＰをコードするｇＷｉｚ（商標）ＤＮＡ（Ａｌｄｅｖｒｏｎ、Ｆａｒｇｏ、ＮＤ）を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）中、１：１の質量比で、最終濃度４０μｇ／ｍＬとなるように調製した。ＰＤ３（ＭＮ）（実施例２のように調製）の溶液を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）中、最終ペプチドデンドロンアルギニン：核酸リン酸（Ｎ：Ｐ）比４：１に相当する濃度で調製した。核酸溶液をＰＤ３（ＭＮ）溶液に１：１の体積比で添加し、ピペッティングによって完全に混合した。ＮＰを室温で３０分間複合体化させた。ＮＰ溶液中の核酸の最終濃度は、２０μｇ／ｍＬ（１０μｇ／ｍＬのｍＲＮＡ及びμｇ／ｍＬのＤＮＡ）であった。対照ＮＰを、ＤＮＡ及びｍＲＮＡのみを用いて、２０μｇ／ｍＬの最終核酸濃度で調製した。

【0562】

ｂ）動的光散乱法
動的光散乱（ＤＬＳ）データを、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）、グリーンレーザー及びＺＥＮ２１１２石英製キュベットを用いて収集した。流体力学直径及び多分散度指数（ＰＤＩ）を、累積適合度分析を用いて導出した。全データポイントは、３つ以上の個別に調製した試料の平均値を示す。結果を表８に示す。

【0563】

【表9】

【0564】

ｃ）蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）による共封入の評価
Ｌａｂｅｌ ＩＴ（登録商標）核酸標識キット（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて、ＧＦＰをコードするｇＷｉｚ（商標）ＤＮＡ（Ａｌｄｅｖｒｏｎ、Ｆａｒｇｏ、ＮＤ）をＣｙ５で標識し、ｍＣｈｅｒｒｙをコードするＣｌｅａｎｃａｐ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）をＣｙ３で標識した。以下のナノ粒子を、２０μｇ／ｍＬの最終核酸濃度で、上記のようにＰＤ３（ＭＮ）を用いて製剤化した：
１． Ｃｙ５ ＤＮＡ＋非標識ＤＮＡ（１：１）共封入ＮＰ
２． Ｃｙ３ ｍＲＮＡ＋非標識ｍＲＮＡ（１：１）共封入ＮＰ
３． Ｃｙ５ ＤＮＡ ＮＰ＋Ｃｙ３ ｍＲＮＡ ＮＰ（１：１）別々に封入
４．Ｃｙ５ ＤＮＡ＋Ｃｙ３ ｍＲＮＡ（１：１）共封入ＮＰ
ＮＰを、蛍光分析の前に１０分間複合体化させた。上に挙げた３のＮＰは別々に製剤化し、１０分間複合体化し、次いで、蛍光分析の直前に１：１の比で合わせた。蛍光分析は、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）３３００蛍光分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて行った。２μＬのＮＰ試料を台に載せ、試料を青色ＬＥＤを用いて励起した。蛍光放射（相対蛍光単位、ＲＦＵ）を、４５０～７５０ｎｍの波長で測定した。これらのＮＰ試料の蛍光スペクトルを図１５に示す。

【0565】

ｄ）Ｈ１２９９細胞におけるｍＲＮＡとＤＮＡの発現
ＮＰを、ＧＦＰ ＤＮＡ及びｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡを、２０μｇ／ｍＬの最終核酸濃度となるよう、１：１の重量比で用いて、ａ）に記載されるように、ＰＤ３（ＭＮ）と共に製剤化した。Ｈ１２９９細胞を、処理の２４時間前に、組織培養処理した９６ウェルプレートに１０，０００細胞／ウェルでプレーティングした。処理の直前に、増殖培地を除去し、１００μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ還元血清培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）と交換した。１０μＬのナノ粒子溶液を各ウェルに添加した（２００ｎｇ／ウェル核酸用量。ナノ粒子を細胞と共に４時間インキュベートし、次いで、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ及びナノ粒子を除去し、増殖培地に置き換えた。ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙタンパク質の発現を、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ生細胞分析システム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてモニターし、４時間ごとに細胞の蛍光画像を捕捉した。Ｉｎｃｕｃｙｔｅソフトウェアを用いて画像を分析し、緑色（ＧＦＰ）及び赤色（ｍＣｈｅｒｒｙ）チャネルにおける蛍光面積、並びに赤色及び緑色シグナルの重なり面積を決定した。シグナルをピークシグナル面積に対して正規化して、発現動態をモニターした。結果を図１６に示す。

【0566】

ｅ）Ｃ２Ｃ１２細胞におけるｍＲＮＡとＤＮＡの発現
Ｃ２Ｃ１２細胞を、組織培養処理した９６ウェルプレートに２０，０００細胞／ウェルでプレーティングした。増殖培地を低血清分化培地（ＤＭＥＭ＋２％ウマ血清）と交換し、融合した伸長筋管が形成されるまで７日間培養した。ナノ粒子を、ＧＦＰ ＤＮＡ及びｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡを、５０μｇ／ｍＬの最終核酸濃度となるよう、１：１の重量比で用いて、ａ）に記載されるように、ＰＤ３（ＭＮ）と共に製剤化した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ（％ｗ／ｗ）＝１）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を製剤に添加した。核酸の１％ｗ／ｗに相当するリポフェクチン（登録商標）を、２０ｍＭ ＨＰＥＳ（ｐＨ７．０）で希釈した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）溶液を、前述のようにＲＮＡ溶液を添加する直前にＰＤ３（ＭＮ）溶液に添加した。処理の直前に、培地を除去し、１００μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ還元血清培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）と交換した。１０μＬのナノ粒子溶液を各ウェルに添加した（２００ｎｇ／ウェル）核酸用量。ナノ粒子を細胞と共に４時間インキュベートし、次いで、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ及びナノ粒子を除去し、増殖培地に置き換えた。ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙタンパク質の発現を、記載のように、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ精細胞分析を使用してモニターした。結果を図１７に示す。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A-3C】

【図4】

【図5A-5B】

【図6A】

【図6B-6C】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13A-13C】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【配列表】

2024537869000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2024-06-14

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2024537869000001.xml

【国際調査報告】