特表 2024-537917 組織特異的プロモーター及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-16

(54)【発明の名称】組織特異的プロモーター及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/85 20060101AFI20241008BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241008BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20241008BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20241008BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241008BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241008BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241008BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241008BHJP

   C12N 5/0789 20100101ALI20241008BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241008BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20241008BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20241008BHJP

   A61K 38/37 20060101ALN20241008BHJP

【ＦＩ】

C12N15/85

C12N15/63 Z ZNA

C12N15/86 Z

C12N15/867 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N5/0789

A61K48/00

A61P7/04

A61K35/76

A61K38/37

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024525316

(86)(22)【出願日】2022-10-20

(85)【翻訳文提出日】2024-06-24

(86)【国際出願番号】 CN2022126404

(87)【国際公開番号】W WO2023071905

(87)【国際公開日】2023-05-04

(31)【優先権主張番号】202111261085.5

(32)【優先日】2021-10-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520319705

【氏名又は名称】ベイジン・メイカン・ジーノ－イミューン・バイオテクノロジー・カンパニー・リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＢＥＩＪＩＮＧ ＭＥＩＫＡＮＧ ＧＥＮＯ－ＩＭＭＵＮＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ Ｂ１０４， １ｓｔ Ｆｌｏｏｒ， Ｎｏ． ５，Ｋａｉｔｕｏ Ｒｏａｄ， Ｈａｉｄｉａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８５， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】チャン，ルン－ジー

(72)【発明者】

【氏名】ゴン，ジエ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA13

4C084BA44

4C084DC15

4C084NA14

4C084ZA531

4C084ZA532

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZA53

(57)【要約】

組織特異的プロモーター及びその使用が提供される。組織特異的プロモーターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４に示される配列の８０％超を含む核酸配列を有する。組織特異的プロモーターは、内皮細胞（ＥＣ）又は巨核球－血小板細胞におけるコード遺伝子の特異的発現を促進することができ、遺伝子がＥＣ又は巨核球－血小板細胞において特異的に発現されることが要求される遺伝子治療に適用することができ、治療効果を確保し、免疫拒絶のリスクを低減し、治療コストを節約する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４に示される配列の８０％超を含む核酸配列を有する、組織特異的プロモーター。

【請求項2】

請求項１に記載の組織特異的プロモーター及びコード遺伝子を含む、遺伝子発現カセットであって、
好ましくは、前記コード遺伝子が、組換え凝固因子第ＶＩＩＩ因子のコード遺伝子を含む、前記遺伝子発現カセット。

【請求項3】

前記組換え凝固因子第ＶＩＩＩ因子のコード遺伝子が、配列番号５に示される配列を含む核酸配列を有する、請求項２に記載の遺伝子発現カセット。

【請求項4】

請求項１に記載の組織特異的プロモーターを含む、組換え発現ベクターであって、
好ましくは、前記組換え発現ベクターが、請求項１に記載の組織特異的プロモーターを含有するウイルスベクター又はプラスミドベクターを含み、
好ましくは、前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターｐＥＧＷＩを含み、
好ましくは、前記組換え発現ベクターが、コード遺伝子をさらに含み、
好ましくは、前記コード遺伝子が、組換え凝固因子第ＶＩＩＩ因子のコード遺伝子を含む、前記組換え発現ベクター。

【請求項5】

請求項４に記載の組換え発現ベクターを含有する組換えレンチウイルス。

【請求項6】

請求項１に記載の組織特異的プロモーターを含有する組換え細胞。

【請求項7】

請求項２に記載の遺伝子発現カセットが、組換え細胞のゲノムに組み込まれ、
好ましくは、前記組換え細胞が、請求項４に記載の組換え発現ベクターを含有する、請求項６に記載の組換え細胞。

【請求項8】

請求項６又は７に記載の組換え細胞を調製する方法であって、
請求項１に記載の組織特異的プロモーター、請求項２に記載の遺伝子発現カセット、請求項４に記載の組換え発現ベクター又は請求項５に記載の組換えレンチウイルスを宿主細胞に導入し、前記組換え細胞を得ることを含み、
好ましくは、前記導入が、電気的導入、ウイルスベクター系、非ウイルスベクター系又は直接遺伝子注入のいずれか１つを含む方法によって行われ、
好ましくは、前記宿主細胞が、造血幹細胞を含む、前記方法。

【請求項9】

請求項１に記載の組織特異的プロモーター、請求項２に記載の遺伝子発現カセット、請求項４に記載の組換え発現ベクター、請求項５に記載の組換えレンチウイルス又は請求項６若しくは７に記載の組換え細胞のいずれか１つ又は少なくとも２つの組合せを含む、医薬組成物であって、
好ましくは、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤のいずれか１つ又は少なくとも２つの組合せをさらに含む、前記医薬組成物。

【請求項10】

組織特異的遺伝子治療のための薬剤の調製における、請求項１に記載の組織特異的プロモーター、請求項２に記載の遺伝子発現カセット、請求項４に記載の組換え発現ベクター、請求項５に記載の組換えレンチウイルス、請求項６若しくは７に記載の組換え細胞又は請求項９に記載の医薬組成物の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願はバイオテクノロジーの分野に属し、組織特異的プロモーター及びその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

遺伝子治療とは、欠陥遺伝子又は異常遺伝子に起因する疾患を治療する目的で、欠陥遺伝子又は異常遺伝子を修正又は補うために、外来遺伝子を標的細胞に導入することを指す。しかしながら、非特異的発現が起こることが多く、すなわち、外来遺伝子が人体内で広く発現し、人体内で免疫拒絶を引き起こし、これは、臨床において解決困難な問題の１つである。

【0003】

例えば、血友病Ａ（ＨＡ）は、遺伝性抗血友病グロブリン欠損症又はＦＶＩＩＩ（Ｆ８）欠損症としても知られ、凝固因子第ＶＩＩＩ因子遺伝子（ＦＶＩＩＩ遺伝子又はＦ８遺伝子）の遺伝的欠損によって引き起こされる血液凝固異常である。現在のＨＡの治療には、主に血漿由来の凝固因子又は外因的に産生された組換えタンパク質によるタンパク質補充療法、及び遺伝子治療などの方法がある。ヒトＦ８遺伝子の解析から、Ａ１－Ａ２－Ｂ－Ａ３－Ｃ１－Ｃ２で表されるタンパク質のドメイン構造が明らかになった。Ｂドメインは、アスパラギン（Ｎ）結合オリゴ糖からなる高度に保存された領域を有する大きなエクソンによってコードされている。Ｍｉａｏらは、６つの完全なアスパラギン結合グリコシル化部位を含有するＮ末端の２２６個のアミノ酸を残して、Ｂドメインを部分的に欠失させると、インビトロでのＦ８分泌を１０倍増加させることができることを示した（Ｍｉａｏ，Ｈ．Ｚ．、Ｓｉｒａｃｈａｉｎａｎ，Ｎ．、Ｐａｌｍｅｒ，Ｌ．、Ｋｕｃａｂ，Ｐ．、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｍ．Ａ．ら、Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ、２００４年、１０３（９）、３４１２－３４１９頁を参照されたい）。しかしながら、現在、Ｂドメイン欠失Ｆ８遺伝子（Ｆ８－ＢＤＤ）を使用した遺伝子治療法には、タンパク質の分泌及び機能が低い、Ｆ８ウイルスベクターの導入効率が低い、阻害反応（免疫拒絶）に伴う抗体形成などの問題がある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ｍｉａｏ，Ｈ．Ｚ．、Ｓｉｒａｃｈａｉｎａｎ，Ｎ．、Ｐａｌｍｅｒ，Ｌ．、Ｋｕｃａｂ，Ｐ．、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｍ．Ａ．ら、Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ、２００４年、１０３（９）、３４１２－３４１９頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

したがって、免疫拒絶を回避するために、治療用遺伝子の組織特異的なインビボ発現をどのようにして達成するかは、遺伝子治療の分野において解決すべき緊急の課題である。

【課題を解決するための手段】

【0006】

（要旨）
既存技術の欠陥及び実際の要求を考慮して、本出願は、組織特異的プロモーター及びその使用を提供する。組織特異的プロモーターは、内皮細胞（ＥＣ）、巨核球又は血小板におけるコード遺伝子の特異的発現を促進し、無関係な組織細胞における異所的発現を低減することができる。組織特異的プロモーターは、遺伝子をＥＣで特異的に発現させる必要がある遺伝子治療に適用することができ、抗体応答及び阻害剤反応を効果的に低減することができる。

【0007】

上記の目的を達成するために、本出願は、以下の技術的解決策を使用する。

【0008】

第１の態様において、本出願は、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４に示される配列の８０％超を含む核酸配列を有する組織特異的プロモーターを提供する。

【0009】

【化1】

【0010】

本出願は、組織特異的プロモーターを創造的に設計しており、これには、ＥＣにおいて遺伝子の特異的発現を促進するプロモーターＶＥＣ（配列番号１又は配列番号１と少なくとも８０％の相同性を有する）及びＫＤＲ（配列番号２又は配列番号２と少なくとも８０％の相同性を有する）、並びに巨核球－血小板細胞において遺伝子の特異的発現を促進するプロモーターＩＴＧＡ（配列番号３又は配列番号３と少なくとも８０％の相同性を有する）及びＧｐ（配列番号４又は配列番号４と少なくとも８０％の相同性を有する）が含まれる。本出願の組織特異的プロモーターを用いることによって、ＥＣ又は巨核球－血小板細胞においてコード遺伝子を特異的に発現させることができる。したがって、本出願の組織特異的プロモーターは、標的コード遺伝子をＥＣ又は巨核球－血小板細胞で特異的に発現させる必要がある遺伝子治療に効果的に適用することができ、ＨＡの遺伝子治療などの免疫拒絶のリスクを低減し、治療コストを節約する。

【0011】

好ましくは、組織特異的プロモーターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４に示される核酸配列を有する。

【0012】

第２の態様において、本出願は、遺伝子発現カセットを提供する。遺伝子発現カセットは、第１の態様に記載の組織特異的プロモーター及びコード遺伝子を含む。

【0013】

好ましくは、コード遺伝子は、組換え凝固因子第ＶＩＩＩ因子のコード遺伝子を含む。

【0014】

好ましくは、組換え凝固因子第ＶＩＩＩ因子のコード遺伝子は、配列番号５に示される核酸配列を含む。

【0015】

【化2】

【0016】

本出願の具体例において、本出願の組織特異的プロモーターは、組換え凝固因子第ＶＩＩＩ因子のコード遺伝子の発現を開始するために使用される。ＦＶＩＩＩ遺伝子をＥＣ（肝類洞ＥＣなど）又は巨核球において発現させることにより、インビボでのＦＶＩＩＩタンパク質の異所的発現を低減し、又は抗体応答及び阻害剤反応を低減し、ＨＡの遺伝子治療を効果的に行う。

【0017】

第３の態様において、本出願は、組換え発現ベクターを提供する。組換え発現ベクターは、第１の態様に記載の組織特異的プロモーターを含む。

【0018】

好ましくは、組換え発現ベクターは、第１の態様に記載の組織特異的プロモーターを含有するウイルスベクター又はプラスミドベクターを含む。

【0019】

好ましくは、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターｐＥＧＷＩを含む。

【0020】

好ましくは、組換え発現ベクターは、コード遺伝子をさらに含む。

【0021】

好ましくは、コード遺伝子は、組換え凝固因子第ＶＩＩＩ因子のコード遺伝子を含む。

【0022】

好ましくは、レンチウイルスベクターｐＥＧＷＩの５’スプライス供与部位は変異している。

【0023】

好ましくは、レンチウイルスベクターｐＥＧＷＩのＵ３領域におけるエンハンサーは欠失している。

【0024】

好ましくは、レンチウイルスベクターｐＥＧＷＩのＵ３領域は、インスレーターを含有する。

【0025】

本出願において、レンチウイルスベクターｐＥＧＷＩは、改変されている。野生型５’スプライス供与部位は変異しており、Ｕ３領域のエンハンサーは欠失しており、Ｕ３領域にインスレーター（ｃＨＳ４インスレーター）を付加することにより、ｐＥＧＷＩの導入効率及び発現効率を効果的に向上させ、ベクターの使用コストを低減させるだけでなく、安全性も向上させることができる。

【0026】

本出願の具体例において、組織特異的プロモーター及び組換え凝固因子第ＶＩＩＩ因子のコード遺伝子をレンチウイルスベクターｐＥＧＷＩに共挿入する。次いで、レンチウイルスベクターは直接静脈注射によって体内に導入され、凝固因子第ＶＩＩＩ因子の遺伝子が効率的に送達され、特異的に発現されるようにすることで、治療効果を効果的に確保し、免疫拒絶のリスクを低減し、治療コストを節約し、高効率のＨＡ遺伝子治療を実現する。

【0027】

第４の態様において、本出願は、組換えレンチウイルスを提供する。組換えレンチウイルスは、第３の態様に記載の組換え発現ベクターを含有する。

【0028】

第５の態様において、本出願は、組換え細胞を提供する。組換え細胞は、第１の態様に記載の組織特異的プロモーターを含有する。

【0029】

好ましくは、第２の態様に記載の遺伝子発現カセットは、組換え細胞のゲノムに組み込まれる。

【0030】

好ましくは、組換え細胞は、第３の態様に記載の組換え発現ベクターを含有する。

【0031】

第６の態様において、本出願は、第５の態様に記載の組換え細胞を調製する方法を提供する。本方法は、以下のステップ：
第１の態様に記載の組織特異的プロモーター、第２の態様に記載の遺伝子発現カセット、第３の態様に記載の組換え発現ベクター、又は第４の態様に記載の組換えレンチウイルスを宿主細胞に導入し、組換え細胞を得ることを含む。

【0032】

好ましくは、導入は、電気的導入、ウイルスベクター系、非ウイルスベクター系又は直接遺伝子注入のいずれか１つを含む方法によって行われる。

【0033】

好ましくは、宿主細胞は、造血幹細胞を含む。

【0034】

第７の態様において、本出願は、医薬組成物を提供する。医薬組成物は、第１の態様に記載の組織特異的プロモーター、第２の態様に記載の遺伝子発現カセット、第３の態様に記載の組換え発現ベクター、第４の態様に記載の組換えレンチウイルス又は第５の態様に記載の組換え細胞のいずれか１つ又は少なくとも２つの組合せを含む。

【0035】

好ましくは、医薬組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤のいずれか１つ又は少なくとも２つの組合せをさらに含む。

【0036】

第８の態様において、本出願は、組織特異的遺伝子治療のための薬剤の調製における、第１の態様に記載の組織特異的プロモーター、第２の態様に記載の遺伝子発現カセット、第３の態様に記載の組換え発現ベクター、第４の態様に記載の組換えレンチウイルス、第５の態様に記載の組換え細胞又は第７の態様に記載の医薬組成物の使用を提供する。

【発明の効果】

【0037】

既存技術と比較して、本出願は、以下の有益な効果を有する：
（１）本出願の組織特異的プロモーターは、ＥＣ又は巨核球－血小板細胞におけるコード遺伝子の特異的発現を促進することができ、遺伝子がＥＣ又は巨核球－血小板細胞において特異的に発現されることが要求される遺伝子治療に適用することができ、治療効果を確保し、免疫拒絶のリスクを低減し、治療コストを節約する。

【0038】

（２）本出願において、組織特異的プロモーター、凝固因子第ＶＩＩＩ因子のコード遺伝子及びレンチウイルスベクターを使用して発現ベクターを構築する。発現ベクターは、ＨＡマウスにおいて正常に発現させることができ、ＨＡマウスの出血表現型をある程度修正することができ、低い抗体応答を有し、このことは、遺伝子治療の有効性を確保する上で非常に重要であり、ＨＡの症状をより早く緩和し、より包括的で耐久性のある遺伝子治療を達成するための基礎を築くものである。

【図面の簡単な説明】

【0039】

【図1】レンチウイルスベクターｐＥＧＷＩの構造図である。

【図2】レンチウイルスベクター中の異なる組織特異的プロモーター及びＦ８－ＢＤＤ遺伝子の構造図である。

【図3】ＥＣ及び巨核球における組換えレンチウイルスのベクターコピー数（ＶＣＮ）を示す図である。

【図4】組換えレンチウイルスＬＶ－ｗａｓａｂｉを形質導入した細胞において発現した蛍光の量を分析した結果を示す図である。

【図5】組換えレンチウイルスＬＶ－Ｆ８－ＢＤＤを形質導入した細胞において発現したタンパク質の量の結果を示す図である。

【図6】インビトロ血漿基質発光法の検出結果を示す図である。

【図7】ＨＡマウスの治療方法を示す図である。

【図8】マウスの血液細胞における陽性凝固因子第ＶＩＩＩ因子の検出結果を示す図である。

【図9】マウスにおける凝固因子第ＶＩＩＩ因子の活性を示す図である。

【図10】マウスの血漿における酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）の検出結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0040】

本出願において採用された技術的手段及び達成された効果をさらに詳しく説明するために、本出願を実施例及び図面と共に以下にさらに説明する。以下に示す具体例は、本出願を説明するためのものであり、本出願を限定するものではないことを理解されたい。

【実施例】

【0041】

実施例に特定の技術又は条件が記載されていない実験は、当該技術分野の文献又は製品仕様書に記載されている技術又は条件に従って実施される。製造元が明記されていない本明細書で使用される試薬又は器具は、正規のルートから市販されている従来品である。

【0042】

本出願の実施例においてＨＡが例として使用されるが、本出願の組織特異的プロモーターは遺伝子治療に効果的に適用することができ、凝固因子に対する抗体応答及び阻害剤反応を効果的に低減することができることが証明された。

【0043】

［実施例１］
本出願の特異的プロモーター及びＦ８遺伝子を保有するレンチウイルスベクターが構築された。具体的には、本実施例は以下のステップを含む。

【0044】

（１）レンチウイルスベクターｐＥＧＷＩの構造図は図１に示される。野生型５’スプライス供与部位を変異させ、Ｕ３におけるエンハンサーを欠失させ、インスレーター（ｃＨＳ４インスレーター）をＵ３に追加した。具体的な改変方法については、「Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｖｉｒａｌ Ｓｐｌｉｃｅ Ｓｉｔｅｓ ａｎｄ ｃｉｓ－Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｃｕｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９９年７月、６１７１～６１７６頁」を参照されたい。

【0045】

（２）異なる組織特異的プロモーター及びＦ８－ＢＤＤ遺伝子の挿入
Ｗａｓａｂｉ遺伝子配列（蛍光タンパク質を発現）、Ｂ－ドメイン欠失Ｆ８遺伝子（Ｆ８－ＢＤＤ）配列（配列番号５）、並びに組織特異的プロモーターＥＦ１α（配列番号６）、ＶＥＣ（配列番号１）、ＫＤＲ（配列番号２）、ＩＴＧＡ（配列番号３）、Ｇｐ（配列番号４）の核酸配列は、全ゲノム合成により合成された。上記の各プロモーター及びＦ８－ＢＤＤは、制限酵素部位を通してレンチウイルスベクターｐＥＧＷＩに共ライゲーションされた。得られた産物は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）の独自の推奨する最適な反応条件を参考に、配列決定及び二重酵素消化によって同定された。ＢａｍＨＩクローニング部位（ｇｇａｔｃｃａｃｃ）－ＡＵＧは５’末端で使用され、ＳｐｅＩクローニング部位（ａｃｔａｇｔ）は３’末端で使用された。Ｆ８－ＢＤＤ遺伝子がそれぞれＥＦ１α、ＶＥＣ、ＫＤＲ、ＩＴＧＡ又はＧｐを含むプロモーター下で駆動される、正しくライゲーションされたレンチウイルスベクターｐＥＧＷＩ－ＥＦ１α－Ｆ８－ＢＤＤ、ｐＥＧＷＩ－ＶＥＣ－Ｆ８－ＢＤＤ、ｐＥＧＷＩ－ＫＤＲ－Ｆ８－ＢＤＤ、ｐＥＧＷＩ－ＩＴＧＡ－Ｆ８－ＢＤＤ又はｐＥＧＷＩ－Ｇｐ－Ｆ８－ＢＤＤが得られた。レンチウイルスベクターの具体的なライゲーション位置及び組成は図２に示される。各プロモーター及びＷａｓａｂｉ遺伝子はｐＥＧＷＩに共挿入され、レンチウイルスベクターｐＥＧＷＩ－ＥＦ１α－Ｗａｓａｂｉ、ｐＥＧＷＩ－ＶＥＣ－Ｗａｓａｂｉ、ｐＥＧＷＩ－ＫＤＲ－Ｗａｓａｂｉ、ｐＥＧＷＩ－ＩＴＧＡ－Ｗａｓａｂｉ又はｐＥＧＷＩ－Ｇｐ－Ｗａｓａｂｉが得られ、以後の実験で対照として使用された。

【0046】

【化3】

【0047】

［実施例２］
本実施例において、実施例１で構築したレンチウイルスベクターはさらにパッケージングされ、精製され、濃縮され、組換えレンチウイルスが得られた。実験方法については、「［１］Ｃｈａｎｇ Ｌ－Ｊ、Ｕｒｌａｃｈｅｒ Ｖ、Ｉｗａｋｕｍａ Ｔら、Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｄｅｒｉｖｅｄ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９９年、６（５）：７１５～７２８頁」及び「［２］Ｃｈａｎｇ Ｌ－Ｊ、Ｚａｉｓｓ ＡＫ．Ｃｈａｎｇ，Ｌ－Ｊ及びＺａｉｓｓ，ＡＫ．Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｓｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ６９：３０３～３１８頁［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００２年、６９：３０３～３１８頁」を参照されたい。

【0048】

具体的なステップについては、上記の文献を参照されたい。具体的なステップを以下に簡単に説明する。

【0049】

（１）実施例１で構築したレンチウイルスベクター並びにパッケージングしたヘルパープラスミドｐＮＨＰ及びｐＨＥＦ－ＶＳＶ－Ｇは、哺乳動物細胞ＨＥＫ２９３Ｔに共導入され、４８時間培養された後、上清が回収された。

【0050】

（２）回収したレンチウイルスは精製され、濃縮され、それぞれＬＶ－ＥＦ１α－Ｆ８－ＢＤＤ、ＬＶ－ＶＥＣ－Ｆ８－ＢＤＤ、ＬＶ－ＫＤＲ－Ｆ８－ＢＤＤ、ＬＶ－ＩＴＧＡ－Ｆ８－ＢＤＤ、ＬＶ－Ｇｐ－Ｆ８－ＢＤＤ、ＬＶ－ＥＦ１α－Ｗａｓａｂｉ、ＬＶ－ＶＥＣ－Ｗａｓａｂｉ、ＬＶ－ＫＤＲ－Ｗａｓａｂｉ、ＬＶ－ＩＴＧＡ－Ｗａｓａｂｉ及びＬＶ－Ｇｐ－Ｗａｓａｂｉと命名した組換えレンチウイルスが得られた。

【0051】

（３）レンチウイルスのＶＣＮが検出され、検出結果は図３に示される。レンチウイルスＬＶ－ＥＦ１α－Ｆ８－ＢＤＤ、ＬＶ－ＶＥＣ－Ｆ８－ＢＤＤ、ＬＶ－ＫＤＲ－Ｆ８－ＢＤＤ、ＬＶ－ＩＴＧＡ－Ｆ８－ＢＤＤ及びＬＶ－Ｇｐ－Ｆ８－ＢＤＤは、同じ感染多重度（ＭＯＩ）で基本的に同様のＶＣＮを示した。

【0052】

［実施例３］
本実施例において、実施例２で調製した異なるプロモーター及びＷａｓａｂｉ遺伝子を含有する組換えレンチウイルスをインビトロで試験した。異なる細胞におけるプロモーターの特異性は、Ｗａｓａｂｉ遺伝子によって発現される蛍光タンパク質量を検出することによって検出された。

【0053】

実施例２で調製した正常なＷａｓａｂｉ遺伝子を保有する５つのレンチウイルス（ＬＶ－ＥＦ１α－Ｗａｓａｂｉ、ＬＶ－ＶＥＣ－Ｗａｓａｂｉ、ＬＶ－ＫＤＲ－Ｗａｓａｂｉ、ＬＶ－ＩＴＧＡ－Ｗａｓａｂｉ及びＬＶ－Ｇｐ－Ｗａｓａｂｉ）は、内皮細胞（ＥＣ）及び巨核球の２つの細胞株に別々に形質導入された。レンチウイルスの導入方法を以下で説明する。

【0054】

１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン溶液を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）は、６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、米国）に添加された。３×１０^４個のＥＣ又は１×１０^５個の巨核球は、各ウェルに接種され、５％ＣＯ_２下、３７℃で１８時間培養された後、２００のＭＯＩでレンチウイルスが導入され、ポリブレン（８μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が最終容量６００μＬまで添加され、２４時間形質導入された。次いで、培地は、毎日新しい培地に交換された。細胞のコンフルエントが９０％に達した時点で、細胞はＴ７５ｃｍ^２培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、米国）に移された。

【0055】

発現した蛍光タンパク質の量を検出し、細胞内でＷａｓａｂｉ遺伝子の発現を決定した。結果は図４に示される。ＬＶ－ＥＦ１α－Ｗａｓａｂｉで形質導入されたＥＣ及びＬＶ－ＥＦ１α－Ｗａｓａｂｉで形質導入された巨核球はいずれも高い蛍光強度を示し、ＥＦ１αプロモーターはこの２種類の細胞でＷａｓａｂｉ遺伝子の発現を効率的に促進し、組織特異性はないことを示している。ＬＶ－ＶＥＣ－Ｗａｓａｂｉ及びＬＶ－ＫＤＲ－Ｗａｓａｂｉでそれぞれ形質導入されたＥＣは、ＬＶ－ＩＴＧＡ－Ｗａｓａｂｉ及びＬＶ－Ｇｐ－Ｗａｓａｂｉでそれぞれ形質導入されたＥＣよりも高い蛍光強度を示した。ＬＶ－ＶＥＣ－Ｗａｓａｂｉ及びＬＶ－ＫＤＲ－Ｗａｓａｂｉでそれぞれ形質導入された巨核球は、ＬＶ－ＩＴＧＡ－Ｗａｓａｂｉ及びＬＶ－Ｇｐ－Ｗａｓａｂｉでそれぞれ形質導入された巨核球よりも低い蛍光強度を示した。結論として、ＶＥＣ及びＫＤＲプロモーターは、ＥＣ特異性を有し、ＩＴＧＡ及びＧｐプロモーターは、巨核球特異性を有する。

【0056】

［実施例４］
本実施例において、実施例２で調製したＦ８－ＢＤＤ遺伝子を含有する組換えレンチウイルスは、インビトロで試験された。

【0057】

実施例２で調製したＦ８－ＢＤＤ遺伝子を保有する５つのレンチウイルス（ＬＶ－ＥＦ１α－Ｆ８－ＢＤＤ、ＬＶ－ＶＥＣ－Ｆ８－ＢＤＤ、ＬＶ－ＫＤＲ－Ｆ８－ＢＤＤ、ＬＶ－ＩＴＧＡ－Ｆ８－ＢＤＤ及びＬＶ－Ｇｐ－Ｆ８－ＢＤＤ）は、内皮細胞（ＥＡ－ｈｙ９２６）及び巨核球（ＤＡＭＩ）の２つの細胞株に別々に形質導入された。レンチウイルスの導入方法は実施例３と同じであった。

【0058】

形質導入したＥＡ－ｈｙ９２６及びＤＡＭＩ細胞から分泌された上清は、回収され、濃縮された。同時に細胞内抽出物が回収された。タンパク質の発現量はＥＬＩＳＡで検出された。レンチウイルスを形質導入していない細胞は、陰性対照（ＮＣ）として使用された。結果は図５に示される。ユニバーサルＥＦ１αプロモーターは、２つのいずれの細胞においてもＦ８の発現を効率的に促進した。巨核球において、ＩＴＧＡプロモーターは、Ｆ８の発現を効率的に促進した。ＥＣにおいて、ＶＥＣプロモーターは、他の組織特異的プロモーターよりもＦ８の発現を促進する能力が高かったが、Ｆ８は、ＥＦ１αプロモーターと比較して極めて低いレベル（１０倍低い）でしか発現しなかった。

【0059】

凝固機能を評価する方法は、ヒトＦ８発色アッセイキット（Ｈｙｐｈｅｎ ＢｉｏＭｅｄ、フランス）を使用することによって活性を測定する方法である基質発光アッセイ法に基づく。基質発光アッセイ法は、以下の通りである：試験する血漿及びブランク対照群がＴｒｉｓ－ＢＳＡ緩衝液（Ｒ４＋）で４０倍に希釈され、５０μＬの各系がマイクロプレートに添加され、５０μＬのＸ因子（Ｒ１）、５０μＬの活性化ＩＸ因子の混合物（Ｒ２）及び５０μＬのＳＸａ－１１基質（Ｒ３）が系に添加され、系が３７℃で５分間インキュベートされ、５０μＬの２０％酢酸が添加されて反応が停止され、４０５ｎｍの吸光度での吸光度値が読み取られた。

【0060】

ウイルスを形質導入したＥＡ－ｈｙ９２６及びＤＡＭＩの回収した上清が－８０℃で取り出され、氷上で融解され、各上清がＦ８欠損個体の血漿と混合され、Ｆ８欠損個体の血漿のみがＮＣとして使用され、健常ボランティアの血漿が陽性対照（ＰＣ）として使用され、基質発光法が検出に使用された。

【0061】

図６は、基質発光アッセイ法によるヒトＦ８の検出結果を示す。ＥＦ１αによってＦ８の発現が促進されたＥＡ－ｈｙ９２６細胞の上清及びＶＥＣによってＦ８の発現が促進されたＥＡ－ｈｙ９２６の上清において、治療域内のヒトＦ８の活性が検出され、正常レベルのそれぞれ約６倍及び約２．５倍であり、一方、他のプロモーターを含有する細胞の上清においてヒトＦ８の活性は検出されなかった。ＥＦ１αによってＦ８の発現が促進されたＤＡＭＩ細胞の上清及びＩＴＧＡによってＦ８の発現が促進されたＤＡＭＩ細胞の上清において、正常レベルより５倍高いヒトＦ８の活性が検出された。

【0062】

結論として、本出願において、Ｆ８遺伝子の発現は、レンチウイルスベクターの組織特異的プロモーターにより、正常なヒトＦ８タンパク質が細胞内で発現するように、首尾よく促進され、ＶＥＣプロモーター及びＩＴＧＡプロモーターは、比較的良好な特異性を有し、高い活性及び凝固機能を有する可能性のあるヒトＦ８タンパク質の発現を促進する。

【0063】

［実施例５］
実施例２で調製したＦ８－ＢＤＤを保有するレンチウイルスは、ＨＡマウスに尾静脈から別々に直接注入され、治療実験が行われた。

【0064】

ＨＡマウスの治療過程の模式図は図７に示される。使用したＨＡマウスは、Ｆ８遺伝子をノックアウトしたＣ５７ＢＬ／６雌マウス（６週齢、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｂｉｏｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより購入）であった。全てのマウスが病原体のない環境に配置され、Ｘ線照射装置（Ｆａｘｉｔｒｏｎ、米国アリゾナ州トゥーソン）を使用して照射された（６００ｃＧｙ／マウス）。レンチウイルスＬＶ－ＥＦ１α－Ｆ８－ＢＤＤ、ＬＶ－ＶＥＣ－Ｆ８－ＢＤＤ、ＬＶ－ＩＴＧＡ－Ｆ８－ＢＤＤ及びＬＶ－Ｇｐ－Ｆ８－ＢＤＤは、別々にＨＡマウスに直接静脈注射され、疾患が治療され、ウイルスの注射量は１ｘ１０^７ＴＵであった。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（各マウス２００μＬ）は、対照（Ｍｏｃｋ）として使用された。

【0065】

治療後７日目、１５日目、３０日目、４５日目、６０日目及び１２０日目に、末梢血中のヒトＦ８遺伝子の発現がフローサイトメトリーにより検出された。結果は図８に示される。ヒトＦ８は、ＬＶ－ＶＥＣ－Ｆ８－ＢＤＤ治療群のマウスの血液中で安定に発現された（正常血漿レベルの１０％～３０％）。ヒトＦ８は、ＬＶ－Ｇｐ－Ｆ８－ＢＤＤ治療群のマウスの血液中にも約１５％で安定に発現された。一方、ＬＶ－ＥＦ１α－Ｆ８－ＢＤＤ治療群及びＬＶ－ＩＴＧＡ－Ｆ８－ＢＤＤ治療群のマウスの血液中でのヒトＦ８発現は徐々に減少した（３０％から５％に減少）。

【0066】

治療後７日目、１５日目、３０日目、４５日目、６０日目及び１２０日目に、血液がマウスから採取され、血漿が血液から分離された。未治療の血友病マウス（Ｍｏｃｋ）及び野生型マウス（ＷＴ）は対照として別々に使用され、Ｆ８の活性は基質発光法により測定された。結果は図９に示される。結果は、フローサイトメトリーにより測定された結果と一致していた。ＬＶ－ＶＥＣ－Ｆ８－ＢＤＤ治療群及びＬＶ－Ｇｐ－Ｆ８－ＢＤＤ治療群において、マウス血漿中のヒトＦ８活性は安定的に上昇し、６０日目に２５％の陽性率に達し、１２０日目にはさらに８０％（ＬＶ－ＶＥＣ－Ｆ８－ＢＤＤ治療群）及び２５％（ＬＶ－Ｇｐ－Ｆ８－ＢＤＤ治療群）に上昇した。ＬＶ－ＥＦ１α－Ｆ８－ＢＤＤ治療群及びＬＶ－ＩＴＧＡ－Ｆ８－ＢＤＤ治療群において、マウス血漿中のヒトＦ８活性は３０日後に徐々に低下した（３％未満）。

【0067】

結論として、フローサイトメトリーの検出結果及び基質発光法の検出結果はいずれも、ＬＶ－Ｇｐ－Ｆ８－ＢＤＤ又はＬＶ－ＶＥＣ－Ｆ８－ＢＤＤの尾静脈注射により、Ｆ８が有意に改善され、ＨＡマウスの血漿中で安定したレベルを維持できることを証明している。すなわち、ＬＶ－Ｇｐ－Ｆ８－ＢＤＤ又はＬＶ－ＶＥＣ－Ｆ８－ＢＤＤは、マウスのＨＡを効果的に治療できる。

【0068】

加えて、抗体応答については、上記の治療マウスの眼窩末梢血は採取され、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離されて血漿が得られた。血漿は、Ｔｒｉｓ－ＢＳＡ緩衝液で１：２００の割合で希釈され、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）マイクロプレートに入れられた。ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウストータルＩｇＧが添加された。次いで、発光基質３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）がＥＬＩＳＡ用に添加され、凝固因子第ＶＩＩＩ因子（Ｆ８）に対する抗体応答が評価された。抗凝固因子第ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体を注射したＨＡマウスが陽性対照（Ｃｔｒｌ＋）として使用された。結果は図１０に示される。ＬＶ－ＶＥＣ－Ｆ８－ＢＤＤ群、ＬＶ－Ｇｐ－Ｆ８－ＢＤＤ群及びＬＶ－ＩＴＧＡ－Ｆ８－ＢＤＤ群のマウスのＩｇＧ抗体応答はいずれも比較的低く、ＬＶ－ＥＦ１α－Ｆ８－ＢＤＤ群のマウスの抗体応答が最も高く、本出願の組織特異的プロモーターＶＥＣ、Ｇｐ及びＩＴＧＡを用いた遺伝子治療が免疫拒絶を効果的に低減することができることを示している。

【0069】

結論として、組織特異的プロモーターは本出願において創造的に設計されている。組織特異的プロモーターは、ＥＣ又は巨核球－血小板細胞におけるコード遺伝子の特異的発現を促進し、異所的発現を効果的に減少させることができ、ＥＣ又は巨核球－血小板細胞における遺伝子の特異的発現が必要とされる遺伝子治療、例えばＨＡの遺伝子治療に適用することができる。組織特異的プロモーター及びＦ８－ＢＤＤを保有するレンチウイルスは、本出願において調製される。ＨＡマウスは、直接静脈注射によって、Ｆ８－ＢＤＤ遺伝子の導入効率及びマウスにおけるＦ８－ＢＤＤ遺伝子の発現量が効果的に改善され、ＨＡマウスの出血表現型がある程度修正される。ＶＥＣプロモーターは、Ｆ８－ＢＤＤ遺伝子の発現を促進し、抗体応答も少ないことで最も優れた治療効果を有し、このことは、遺伝子治療の有効性を確保する上で非常に重要であり、ＨＡの症状をより早く緩和し、より包括的で耐久性のある遺伝子治療を達成するための基礎を築くものである。

【0070】

本出願人は、上述の実施例を通じて本出願の詳細な方法を説明したが、本出願は上述の詳細な方法に限定されるものではなく、本出願の実施は必ずしも上述の詳細な方法に依存しないことを意味すると述べている。本出願に対してなされた改良、本出願の製品の原材料の等価的な置き換え、本出願の製品へのアジュバント成分の添加、及び特定の手法の選択などは、全て本出願の保護範囲及び開示範囲に含まれることは、当業者には明らかであろう。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

2024537917000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2024-06-24

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

組織特異的プロモーターを含む、遺伝子発現カセットであって、
前記組織特異的プロモーターが、配列番号１に示される配列を有し、
前記コード遺伝子が、組換え凝固因子第ＶＩＩＩ因子のコード遺伝子を含み、前記コード遺伝子が、配列番号５に示される配列を有する、前記組換え発現ベクター。

【請求項2】

前記ウイルスベクターまたはプラスミドベクターを含む、請求項１に記載の組換え発現ベクター。

【請求項3】

前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターｐＥＧＷＩを含む、請求項２に記載の組換え発現ベクター。

【請求項4】

請求項１に記載の組換え発現ベクターを含有する組換えレンチウイルス。

【請求項5】

請求項１に記載の組換え発現ベクターを含有する組換え細胞。

【請求項6】

請求項５に記載の組換え細胞を調製する方法であって、前記組換え発現ベクターを宿主細胞に導入し、前記組換え細胞を得ることを含む、前記方法。

【請求項7】

前記導入が、電気的導入、ウイルスベクター系、非ウイルスベクター系又は直接遺伝子注入のいずれか１つを含む方法によって行われる、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記宿主細胞が、造血幹細胞を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項9】

請求項１～３のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター、請求項４に記載の組換えレンチウイルス又は請求項５に記載の組換え細胞を含む、医薬組成物であって、
好ましくは、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤のいずれか１つ又は少なくとも２つの組合せをさらに含む、前記医薬組成物。

【請求項10】

血友病Ａの治療に使用するための、請求項１～３のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター、請求項４に記載の組換えレンチウイルス、請求項５に記載の組換え細胞。

【請求項11】

血友病Ａの治療に使用するための、請求項９に記載の医薬組成物。

【国際調査報告】