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2024-537929肝細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖及び／または成熟のための培養培地及び条件
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-16
(54)【発明の名称】肝細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖及び／または成熟のための培養培地及び条件
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0775 20100101AFI20241008BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0775
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024548678
(86)(22)【出願日】2022-10-25
(85)【翻訳文提出日】2024-06-06
(86)【国際出願番号】 US2022047753
(87)【国際公開番号】W WO2023076292
(87)【国際公開日】2023-05-04
(31)【優先権主張番号】63/271,441
(32)【優先日】2021-10-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】524157888
【氏名又は名称】サテライト バイオサイエンシズ インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＳＡＴＥＬＬＩＴＥ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ，ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100152489
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 美樹
(72)【発明者】
【氏名】マランナ、スニル クマール
(72)【発明者】
【氏名】ヴァン バスカーク、マックスウェル ピー．
(72)【発明者】
【氏名】カラント、ソウジャンヤ エス．
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065BB04
4B065BB19
4B065BB31
4B065BB32
4B065BC06
4B065CA44
(57)【要約】
初代ヒト肝細胞の増殖及び長期間の維持を促進する、細胞外マトリックス用の培養サプリメント及び要件、加えて、肝細胞の成熟用の培養条件及び培地を含む、完全に規定された２次元培養条件を本明細書で提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
初代ヒト肝細胞の培養方法であって、前記方法は、１つ以上のＷｎｔシグナル伝達活性化因子、１つ以上の受容体型チロシンキナーゼリガンド、及び、１つ以上の上皮表現型安定化剤が添加された、ヒト細胞用の基礎培地を含む増殖培地の存在下で、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と接触させて１つ以上の肝細胞を培養するステップを含む、前記方法。
【請求項2】
前記増殖培地は、１つ以上の細胞生残剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記増殖培地は、１種以上の細胞増殖剤をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記１つ以上のＷｎｔシグナル伝達活性化因子は、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、Ｒ－スポンジン４、Ｗｎｔ３ａ、または、前述のいずれかの組み合わせを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記１つ以上のＷｎｔシグナル伝達活性化因子は、Ｒ－スポンジン１及びＷｎｔ３ａを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記受容体型チロシンキナーゼは、上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体型チロシンキナーゼ、または線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体型チロシンキナーゼである、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記１つ以上の受容体型チロシンキナーゼリガンドは、ＥＧＦ、ＦＧＦ、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、または、前述のいずれかの組み合わせを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記１つ以上の受容体型チロシンキナーゼリガンドは、ヒトＥＧＦ、ＦＧＦ－７、ＦＧＦ－１０、ＨＧＦ、ＴＧＦα、または、前述のいずれかの組み合わせを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記１つ以上の受容体型チロシンキナーゼリガンドは、ヒトＥＧＦ、ＦＧＦ－７、ＦＧＦ－１０、ＨＧＦ、及びＴＧＦαを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記上皮表現型安定化剤はＴＧＦβ阻害剤である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記ＴＧＦβ阻害剤は、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）５阻害剤である、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記ＡＬＫ５阻害剤はＡ８３－０１である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記上皮表現型安定化剤はコルチコステロイドをさらに含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記コルチコステロイドはヒドロコルチゾンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記増殖培地は、Ｎ－アセチルシステイン、ニコチンアミド、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、または前述の任意の組み合わせを含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
前記増殖培地はＲｈｏキナーゼ阻害剤を含まない、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
前記Ｒｈｏキナーゼ阻害剤はＹ－２７６３２である、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項18】
前記ＥＣＭは、コラーゲン、ラミニン、または、コラーゲンとラミニンの両方を含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
前記コラーゲンはコラーゲンＩまたはコラーゲンＩＶである、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記ラミニンは、ラミニン１１１、ラミニン２１１、ラミニン２２１、ラミニン３３２、ラミニン４１１、ラミニン４２１、ラミニン５１１、またはラミニン５２１である、請求項１８に記載の方法。
【請求項21】
前記培養ステップは表面で実施される、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記表面は２次元表面である、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記２次元表面は、９．５ｃｍ２～１０，０００ｃｍ２の表面積を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記２次元表面はＥＣＭでコーティングされている、請求項２２に記載の方法。
【請求項25】
前記肝細胞は、前記培養ステップ中に、前記表面に接着により付着している、請求項２１～２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項26】
前記増殖培地は、Ｂ２７サプリメント、Ｎ２サプリメント、またはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
前記Ｂ２７サプリメントは、ビタミンＡを含有しない、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記増殖培地は、Ｎｏｔｃｈ阻害剤またはＮｏｔｃｈアゴニストを含有しない、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項29】
前記増殖培地は、ガストリンを含有しない、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
前記増殖培地は、アミノ酸サプリメントをさらに含む、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
前記アミノ酸サプリメントは、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）サプリメントを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記増殖培地は、血清代替成分をさらに含む、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項33】
前記血清代替成分は、ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清代替物（ＫＯＳＲ）、ヒト血小板溶解物、ヒト血清、またはウシ血清を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記培養することは、低酸素条件下で、または、低酸素模倣物の存在下で、前記細胞を培養することを含む、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項35】
前記培養することは、低酸素条件下で実施される、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記低酸素条件下で培養することは、前記細胞を、１％～１９％の酸素濃度で培養することを含む、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項37】
前記酸素濃度は、１％～１０％である、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記酸素濃度は５％である、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記培養ステップは、プレーティングした細胞を増殖させること（ステップＰ０）と、増殖した細胞の初回継代（ステップＰ１）とを含む、請求項１～３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項40】
前記Ｐ０ステップは、７～１６日の継続期間を有する、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
前記Ｐ０ステップは、１１日の継続期間を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
前記Ｐ０ステップは、１３日の継続期間を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項43】
前記Ｐ１ステップは、７～２０日の継続期間を有する、請求項３９～４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項44】
前記Ｐ１ステップは、１１日の継続期間を有する、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
前記Ｐ１ステップは、１３日の継続期間を有する、請求項４３に記載の方法。
【請求項46】
前記Ｐ０ステップは、２００～１３，３３３細胞／ｃｍ２の密度で前記肝細胞を播種することを含む、請求項３９～４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項47】
前記Ｐ０ステップは、６６７細胞／ｃｍ２の密度で前記肝細胞を播種することを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
前記Ｐ１ステップは、３３３～１３，３３３細胞／ｃｍ２の密度で前記肝細胞を播種することを含む、請求項３９～４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項49】
前記Ｐ１ステップは、１，３３３細胞／ｃｍ２の密度で前記肝細胞を播種することを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項50】
前記増殖培地は血清代替成分を含み、前記血清代替成分の濃度は、前記培養ステップの前記継続期間にわたって変化する、請求項３９～４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項51】
前記血清代替成分の濃度は、前記Ｐ０ステップの０日目において１％（ｖ／ｖ）であり、前記血清代替成分の濃度が増加されるまで、１％（ｖ／ｖ）のままである、請求項５０に記載の方法。
【請求項52】
（ｉ）前記細胞密度が、１５％～３０％コンフルエンシーに達するときに、または、（ｉｉ）前記Ｐ０ステップの３日目～７日目の間に、前記血清代替物の濃度は、５％（ｖ／ｖ）まで増加される、請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
前記血清代替物の濃度は、前記Ｐ０ステップの５日目に５％（ｖ／ｖ）まで増加される、請求項５２に記載の方法。
【請求項54】
前記血清代替成分の濃度は、前記Ｐ０ステップの０日目において５％（ｖ／ｖ）である、請求項５０に記載の方法。
【請求項55】
（ｉ）前記細胞密度が、４０％～６０％コンフルエンシーに達するときに、または、（ｉｉ）前記Ｐ０ステップの７日目～１３日目の間に、前記血清代替物の濃度は、１０％（ｖ／ｖ）まで増加される、請求項５１～５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項56】
前記血清代替物の濃度は、前記Ｐ０ステップの９日目に１０％（ｖ／ｖ）まで増加される、請求項５５に記載の方法。
【請求項57】
前記血清代替成分の濃度は、前記Ｐ１ステップの０日目において１％（ｖ／ｖ）である、請求項５１～５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項58】
（ｉ）前記細胞密度が、１５％～３０％コンフルエンシーに達するときに、または、（ｉｉ）前記Ｐ１ステップの３日目～７日目の間に、前記血清代替物の濃度は、５％（ｖ／ｖ）まで増加される、請求項５７に記載の方法。
【請求項59】
前記血清代替物の濃度は、前記Ｐ１ステップの５日目に５％（ｖ／ｖ）まで増加される、請求項５８に記載の方法。
【請求項60】
前記血清代替成分の濃度は、前記Ｐ１ステップの０日目において５％（ｖ／ｖ）であり、前記血清代替成分の濃度が増加されるまで、５％（ｖ／ｖ）のままである、請求項５１～５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項61】
（ｉ）前記細胞密度が、４０％～６０％コンフルエンシーに達するときに、または、（ｉｉ）前記Ｐ１ステップの５日目～１３日目の間に、前記血清代替物の濃度は、１０％（ｖ／ｖ）まで増加される、請求項５１～６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項62】
前記血清代替物の濃度は、前記Ｐ１ステップの７日目に１０％（ｖ／ｖ）まで増加される、請求項６１に記載の方法。
【請求項63】
前記血清代替物の濃度は、前記Ｐ１ステップの９日目に１０％（ｖ／ｖ）まで増加される、請求項６１に記載の方法。
【請求項64】
前記方法は、前記培養ステップの後に、前記肝細胞の発現プロファイルを測定することをさらに含む、請求項１～６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項65】
前記培養ステップの継続期間は、少なくとも３日である、請求項６４に記載の方法。
【請求項66】
前記培養ステップの後に、前記肝細胞の発現プロファイルは、前記肝細胞の少なくとも８０％による、肝細胞核因子４α（ＨＮＦ４α）、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５（ＬＧＲ５）、ケラチン１８（ＣＫ１８）、及びアルブミンから選択される１種以上のタンパク質の発現を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項67】
前記培養ステップの後に、前記肝細胞の発現プロファイルは、前記肝細胞の最大１５％による、Ｋｉ６７の発現を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項68】
前記培養ステップの後に、前記肝細胞の発現プロファイルは、前記肝細胞の少なくとも１５％による、Ｋｉ６７の発現を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項69】
前記前記培養ステップの後に、前記肝細胞の発現プロファイルは、一晩プレーティングした対照肝細胞と比較して、少なくとも１０％の、成熟細胞状態に特徴的な１つ以上のタンパク質の下方制御、及び、１つ以上の胎児／肝臓前駆細胞／胆管細胞マーカーの上方制御を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項70】
前記成熟肝細胞状態タンパク質は、ＮＲ１Ｉ２、尿素回路酵素、Ｃｙｐ３ａ４、Ｃｙｐ１ａ２、ＡＢＣＧ２、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＢ１１、ＳＲ－Ｂ１、またはＳＬＣ１０Ａ１である、請求項６９に記載の方法。
【請求項71】
前記胎児／肝臓前駆細胞／胆管細胞マーカーは、ＡＦＰ、Ｃｙｐ３ａ７、ＥＰＣＡＭ、ＬＧＲ５、ＫＲＴ７、ＫＲＴ１９、またはＡＱＰ１である、請求項６９に記載の方法。
【請求項72】
前記培養ステップの後に、前記肝細胞の発現プロファイルは、前記肝細胞の少なくとも８０％による、ＨＮＦ４α、ＬＧＲ５、ＣＫ１８、及びＡＬＢから選択される１種以上の遺伝子の発現を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項73】
前記培養ステップの後に、前記肝細胞の発現プロファイルは、前記肝細胞の最大１５％による、Ｋｉ６７の発現を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項74】
前記培養ステップの後に、前記肝細胞の発現プロファイルは、前記肝細胞の少なくとも１５％による、Ｋｉ６７の発現を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項75】
前記培養ステップの後に、前記肝細胞の発現プロファイルは、尿素回路酵素の発現の低下を含む、請求項１～７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項76】
前記培養ステップの後に、前記肝細胞の収率は、１ｃｍ２当たり、少なくとも５×１０３個の肝細胞である、請求項１～７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項77】
前記培養ステップの後に、前記肝細胞の収率は、１４日以内の培養で、少なくとも２倍増大する、請求項１～７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項78】
前記培養ステップの後に、前記肝細胞の収率は、３０日以内の培養で、少なくとも５００倍増大する、請求項１～７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項79】
前記培養ステップの後に、前記肝細胞の収率は、２４日以内の培養で、少なくとも５００倍増大する、請求項７８に記載の方法。
【請求項80】
前記肝細胞の収率は、３０日以内の培養で、５００倍～２０００倍の間で増大する、請求項７８に記載の方法。
【請求項81】
前記肝細胞の収率は、２４日以内の培養で、５００倍～２０００倍の間で増大する、請求項７８に記載の方法。
【請求項82】
前記方法は、１種以上の肝細胞成熟サプリメントが添加される、ヒト細胞用の基礎培地を含む成熟培地で、前記肝細胞を成熟させることをさらに含む、請求項１～８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項83】
肝細胞の集団を成熟させる方法であって、前記方法は、１種以上の肝細胞成熟サプリメントが添加される、ヒト細胞用の基礎培地を含む成熟培地の存在下で、増殖した肝細胞集団を成熟させるステップを含む、前記方法。
【請求項84】
前記成熟ステップは、肝細胞増殖の直後に開始する、請求項８２または８３に記載の方法。
【請求項85】
前記成熟ステップは、肝細胞増殖の直後に開始しない、請求項８２または８３に記載の方法。
【請求項86】
前記成熟ステップは、３～１２日の継続期間を有する、請求項８２～８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項87】
前記成熟ステップは、７日の継続期間を有する、請求項８２～８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項88】
前記成熟基礎培地は、ＬＯＮＺＡ（商標）ＨＣＭ（商標）、ウィリアムＥ、またはＨｅｐａｔｏＺＹＭＥ－ＳＦＭである、請求項８２～８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項89】
前記１つ以上の成熟サプリメントは、抗生物質、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）、ＩＴＳ、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、オンコスタチンＭ、抗酸化剤、糖質コルチコイド、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）活性化因子、胆汁酸、ｃＡＭＰもしくはｃＡＭＰ類似体、コレステロール、甲状腺ホルモン、血清代替成分、または、前述の任意の組み合わせを含む、請求項８２～９９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項90】
前記Ｎｏｔｃｈ阻害剤は、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｅ、γセクレターゼ阻害剤ＸＸ、またはこれらの組み合わせである、請求項８９に記載の方法。
【請求項91】
前記抗生物質はペニシリン、ストレプトマイシン、またはこれらの組み合わせである、請求項８９に記載の方法。
【請求項92】
前記ＥＧＦＲ阻害剤はエルロチニブ塩酸塩である、請求項８９に記載の方法。
【請求項93】
前記抗酸化剤はビタミンＣである、請求項８９に記載の方法。
【請求項94】
前記糖質コルチコイドは、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、またはこれらの組み合わせである、請求項８９に記載の方法。
【請求項95】
前記ＰＸＲ活性化因子はビタミンＫ２である、請求項８９に記載の方法。
【請求項96】
前記胆汁酸は、リトコール酸、ウルソデオキシコール酸、またはこれらの組み合わせである、請求項８９に記載の方法。
【請求項97】
前記ｃＡＭＰ類似体は、８ブロモｃＡＭＰ、フォルスコリン、またはこれらの組み合わせである、請求項８９に記載の方法。
【請求項98】
前記甲状腺ホルモンはＴ３である、請求項８９に記載の方法。
【請求項99】
前記血清代替成分は、ＩＴＳ、ＫＯＳＲ、Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ａ、Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｂ、またはこれらの組み合わせである、請求項８９に記載の方法。
【請求項100】
前記成熟培地は、Ｒ－スポンジン１／Ｗｎｔ３ａ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、Ｎ－アセチルシステイン、ニコチンアミド、Ｂ２７サプリメント、Ｎ２サプリメント、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、及び線維芽細胞増殖因子１０（ＦＧＦ１０）のうちの１つ以上を欠く、請求項８２～９９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項101】
１つ以上のＷｎｔシグナル伝達活性化因子、１つ以上の受容体型チロシンキナーゼリガンド、及び、１つ以上の上皮表現型安定化剤が添加されるヒト細胞用基礎培地を含む増殖培地を含むキットであって、前記キットは、前記キットのユーザに、請求項１～８１のいずれか１項に記載の方法に従い、１つ以上の肝細胞を培養させるように指示する、添付文書をさらに含む、前記キット。
【請求項102】
１つ以上のＷｎｔシグナル伝達活性化因子、１つ以上の受容体型チロシンキナーゼリガンド、及び、１つ以上の上皮表現型安定化剤が添加されるヒト細胞用基礎培地を含む増殖培地。
【請求項103】
前記増殖培地は、１つ以上の細胞生残剤をさらに含む、請求項１０２に記載の増殖培地。
【請求項104】
前記増殖培地は、１つ以上の細胞増殖剤をさらに含む、請求項１０２または１０３に記載の増殖培地。
【請求項105】
前記１つ以上のＷｎｔシグナル伝達活性化因子は、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、Ｒ－スポンジン４、Ｗｎｔ３ａ、または、前述のいずれかの組み合わせを含む、請求項１０２～１０４のいずれか１項に記載の増殖培地。
【請求項106】
前記１つ以上のＷｎｔシグナル伝達活性化因子は、Ｒ－スポンジン１及びＷｎｔ３ａを含む、請求項１０５に記載の増殖培地。
【請求項107】
前記受容体型チロシンキナーゼリガンドは、ＥＧＦまたはＦＧＦである、請求項１０２～１０６のいずれか１項に記載の増殖培地。
【請求項108】
前記受容体型チロシンキナーゼリガンドは、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、ＴＧＦα、または、前述のいずれかの組み合わせを含む、請求項１０７に記載の増殖培地。
【請求項109】
前記受容体型チロシンキナーゼリガンドは、ヒトＥＧＦ、ＦＧＦ－７、ＦＧＦ－１０、ＨＧＦ、またはＴＧＦαを含む、請求項１０７に記載の増殖培地。
【請求項110】
前記上皮表現型安定化剤はＴＧＦβ阻害剤である、請求項１０２～１０９のいずれか１項に記載の増殖培地。
【請求項111】
前記ＴＧＦβ阻害剤はＡＬＫ５阻害剤である、請求項１１０に記載の増殖培地。
【請求項112】
前記ＡＬＫ５阻害剤はＡ８３－０１である、請求項１１１に記載の増殖培地。
【請求項113】
前記上皮表現型安定化剤はコルチコステロイドをさらに含む、請求項１０２～１１２のいずれか１項に記載の増殖培地。
【請求項114】
前記コルチコステロイドはヒドロコルチゾンである、請求項１１３に記載の増殖培地。
【請求項115】
前記増殖培地は、Ｎ－アセチルシステイン、ニコチンアミド、またはＲｈｏキナーゼ阻害剤を含む、請求項１０２～１１４のいずれか１項に記載の増殖培地。
【請求項116】
前記増殖培地はＲｈｏキナーゼ阻害剤を含まない、請求項１０２～１１５のいずれか１項に記載の増殖培地。
【請求項117】
前記Ｒｈｏキナーゼ阻害剤はＹ－２７６３２である、請求項１１５または１１６に記載の増殖培地。
【請求項118】
前記増殖培地は、Ｂ２７サプリメント、Ｎ２サプリメント、またはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項１０２～１１７のいずれか１項に記載の増殖培地。
【請求項119】
前記Ｂ２７サプリメントは、ビタミンＡを含有しない、請求項１１８に記載の増殖培地。
【請求項120】
前記増殖培地は、Ｎｏｔｃｈ阻害剤またはＮｏｔｃｈアゴニストを含有しない、請求項１０２～１１９のいずれか１項に記載の増殖培地。
【請求項121】
前記増殖培地は、ガストリンを含有しない、請求項１０２～１２０のいずれか１項に記載の増殖培地。
【請求項122】
前記増殖培地は、アミノ酸サプリメントをさらに含む、請求項１０２～１２１のいずれか１項に記載の増殖培地。
【請求項123】
前記アミノ酸サプリメントは、ＮＥＡＡサプリメントを含む、請求項１２２に記載の増殖培地。
【請求項124】
前記増殖培地は、血清代替成分をさらに含む、請求項１０２～１２３のいずれか１項に記載の増殖培地。
【請求項125】
前記血清代替成分は、ＫＯＳＲ、ヒト血小板溶解物、ヒト血清、またはウシ血清を含む、請求項１２４に記載の増殖培地。
【請求項126】
請求項１０２～１２５のいずれか１項に記載の増殖培地を含む、組織培養容器。
【請求項127】
請求項１２６に記載の組織培養容器を含むインキュベーターであって、前記インキュベーターは、低酸素条件下で前記組織培養容器を維持する、前記インキュベーター。
【請求項128】
１つ以上の成熟サプリメントが添加されるヒト細胞用の基礎培地を含む成熟培地を含むキットであって、前記キットは、前記キットのユーザに、請求項８２～１００のいずれか１項に記載の方法に従い、１つ以上の肝細胞を成熟させるように指示する、添付文書をさらに含む、前記キット。
【請求項129】
１つ以上の肝細胞成熟サプリメントが添加されるヒト細胞用の基礎培地を含む成熟培地。
【請求項130】
前記成熟基礎培地は、ＬＯＮＺＡ（商標）ＨＣＭ（商標）、ウィリアムＥ、またはＨｅｐａｔｏＺＹＭＥ－ＳＦＭである、請求項１２９に記載の成熟培地。
【請求項131】
前記１つ以上の成熟サプリメントは、抗生物質、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）、ＩＴＳ、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、オンコスタチンＭ、抗酸化剤、糖質コルチコイド、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）活性化因子、胆汁酸、ｃＡＭＰもしくはｃＡＭＰ類似体、コレステロール、甲状腺ホルモン、血清代替成分、または、前述の任意の組み合わせを含む、請求項１２９に記載の成熟培地。
【請求項132】
前記Ｎｏｔｃｈ阻害剤は、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｅ、γセクレターゼ阻害剤ＸＸ、またはこれらの組み合わせである、請求項１３１に記載の成熟培地。
【請求項133】
前記抗生物質はペニシリン、ストレプトマイシン、またはこれらの組み合わせである、請求項１３１に記載の成熟培地。
【請求項134】
前記ＥＧＦＲ阻害剤はエルロチニブ塩酸塩である、請求項１３１に記載の成熟培地。
【請求項135】
前記抗酸化剤はビタミンＣである、請求項１３１に記載の成熟培地。
【請求項136】
前記糖質コルチコイドは、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、またはこれらの組み合わせである、請求項１３１に記載の成熟培地。
【請求項137】
前記ＰＸＲ活性化因子はビタミンＫ２である、請求項１３１に記載の成熟培地。
【請求項138】
前記胆汁酸は、リトコール酸、ウルソデオキシコール酸、またはこれらの組み合わせである、請求項１３１に記載の成熟培地。
【請求項139】
前記ｃＡＭＰ類似体は、８ブロモｃＡＭＰ、フォルスコリン、またはこれらの組み合わせである、請求項１３１に記載の成熟培地。
【請求項140】
前記甲状腺ホルモンはＴ３である、請求項１３１に記載の成熟培地。
【請求項141】
前記血清代替成分は、ＩＴＳ、ＫＯＳＲ、Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ａ、Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｂ、またはこれらの組み合わせである、請求項１３１に記載の成熟培地。
【請求項142】
前記成熟培地は、Ｒ－スポンジン１／Ｗｎｔ３ａ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、Ｎ－アセチルシステイン、ニコチンアミド、Ｂ２７サプリメント、Ｎ２サプリメント、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、及び線維芽細胞増殖因子１０（ＦＧＦ１０）のうちの１つ以上を欠く、請求項１２９～１４１のいずれか１項に記載の成熟培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は概して、肝細胞の培養、増殖、及び成熟方法に関する。
【背景技術】
【0002】
肝疾患（例えば、肝臓疾患）は、肝臓の、正常で健常な性能に負の影響を及ぼす任意の疾患である。肝機能に障害がもたらされることで、病気が引き起こされる。例えば、肝機能不全は、血中での、毒素（例えば、窒素含有廃棄化合物）の蓄積をもたらす可能性がある。これらの毒素は脳まで移動し、神経系に影響を及ぼし得る。４５０万人のアメリカ人において、肝疾患が診断されていることが、ＣＤＣは報告している。臓器補充療法は、不全に陥った本来の肝機能を回復することができるものの、その需要は、利用可能性をはるかに超えている。実行可能な代替案は、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）の集団を移植することであるが、これは供給が不足している。
【0003】
したがって、ＰＨＨの改善された培養及び増殖方法が必要とされている。
【発明の概要】
【0004】
本発明は、ヒトレシピエントにおいて移植するために移植片を生成し、本来の肝機能を補充または回復するのに有用であり得る、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）を、長期にわたり維持する、増殖させる、及び成熟させる方法を提供する。
【0005】
一態様では、本開示は、ＰＨＨの培養方法であって、上記方法は、１つ以上の肝細胞を、１つ以上の（例えば、２、３、４、または５つの）Ｗｎｔシグナル伝達活性化因子、１つ以上の（例えば、２、３、４、または５つの）受容体型チロシンキナーゼリガンド、及び、１つ以上の（例えば、２、３、４、または５つの）上皮表現型安定化剤が添加されるヒト細胞用の基礎培地を含む増殖培地の存在下において、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と接触させて培養するステップを含む、上記方法を提供する。
【0006】
前述の態様のいくつかの実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達活性化因子の１つ以上（例えば、２、３、４、または５つ）は、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、Ｒ－スポンジン４、Ｗｎｔ３ａ、または、前述のいずれかの組み合わせである。いくつかの実施形態では、１つ以上のＷｎｔシグナル伝達活性化因子としては、Ｒ－スポンジン１及びＷｎｔ３ａが挙げられる。
【0007】
前述の態様のいくつかの実施形態では、受容体型チロシンキナーゼリガンドの１つ以上（例えば、２、３、４、または５つ）は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、または、前述のいずれかの組み合わせである。いくつかの実施形態では、ＥＧＦはヒトＥＧＦであり、ＦＧＦは、ヒト線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ－７）またはヒト線維芽細胞増殖因子１０（ＦＧＦ－１０）であり、ＨＧＦはヒトＨＧＦであり、または、ＴＧＦは、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）（例えば、ヒトＴＧＦα）である。いくつかの実施形態では、１つ以上の受容体型チロシンキナーゼリガンドとしては、ヒトＥＧＦ、ＦＧＦ－７、ＦＧＦ－１０、ＨＧＦ、及びＴＧＦαが挙げられる。
【0008】
前述の態様のいくつかの実施形態では、上皮表現型安定化剤の１つ以上（例えば、２、３、４、または５つ）は、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβ阻害剤は、アクチビン受容体様キナーゼ５（ＡＬＫ５）阻害剤（例えば、Ａ８３－０１）である。いくつかの実施形態では、上皮表現型安定化剤のうちの１つは、コルチコステロイド（例えば、ヒドロコルチゾン）である。
【0009】
前述の態様のいくつかの実施形態では、増殖培地は、１種以上の細胞生残剤、及び／または、１種以上の細胞増殖剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は血清（例えば、ウシ胎児血清）を含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は血清（例えば、ウシ胎児血清）を含まない。
【0010】
前述の態様のいくつかの実施形態では、増殖培地は、血清代替成分を含む。いくつかの実施形態では、血清代替成分は、ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清代替物（ＫＯＳＲ）、ヒト血小板溶解物、ヒト血清、またはウシ血清である。いくつかの実施形態では、血清代替成分のｖ／ｖは、培養中で１％である。いくつかの実施形態では、血清代替成分のｖ／ｖは、培養中に１～５～１０％の勾配で増加する。いくつかの実施形態では、血清代替成分のｖ／ｖは、培養中に５～１０％の勾配で増加する。いくつかの実施形態では、増殖培地は血清代替成分を含まない。
【0011】
前述の態様のいくつかの実施形態では、増殖培地はＲｈｏキナーゼ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤はＹ－２７６３２である。
いくつかの実施形態では、増殖培地はＲｈｏキナーゼ阻害剤を含まない。
いくつかの実施形態では、増殖培地はＲｈｏキナーゼ阻害剤を含まない。
【0012】
前述の態様のいくつかの実施形態では、ＥＣＭは、コラーゲン（例えば、コラーゲンＩもしくはコラーゲンＩＶ）、または、ラミニン（例えば、ラミニン１１１、ラミニン２１１、ラミニン２２１、ラミニン３３２、ラミニン４１１、ラミニン４２１、ラミニン５１１、もしくはラミニン５２１）を含む。いくつかの実施形態では、ＥＣＭは、コラーゲンとラミニンの両方を含む。いくつかの実施形態では、ＥＣＭはコラーゲンＩを含む。いくつかの実施形態では、ＥＣＭはコラーゲンＩＶを含む。いくつかの実施形態では、ＥＣＭはラミニン１１１を含む。いくつかの実施形態では、ＥＣＭはラミニン５１１を含む。いくつかの実施形態では、ＥＣＭはラミニン５２１を含む。いくつかの実施形態では、ＥＣＭは、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ラミニン１１１、ラミニン５１１、及びラミニン５２１の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＥＣＭは、ヒドロゲル（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標））を含まない。いくつかの実施形態では、ＥＣＭは、ヒドロゲル（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標））を含む。
【0013】
前述の態様のいくつかの実施形態では、培養ステップは表面（例えば、２次元表面）で実施される。いくつかの実施形態では、表面はＥＣＭでコーティングされている。いくつかの実施形態では、ＰＨＨは、培養ステップ中に、表面に接着により付着している。いくつかの実施形態では、増殖したＰＨＨは、培養液中で解離、凝集、及び維持され、さらなる増殖及び／または成熟を促進する。
【0014】
前述の態様のいくつかの実施形態では、増殖培地は、Ｂ２７サプリメント、及び／またはＮ２サプリメントをさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｂ２７サプリメントは、ビタミンＡを含有しない。
【0015】
前述の態様のいくつかの実施形態では、増殖培地は、アミノ酸サプリメントをさらに含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸サプリメントは、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）サプリメントである。いくつかの実施形態では、ＮＥＡＡサプリメントは、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、及びＬ－セリンを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、アミノ酸サプリメントを含まない。
【0016】
前述の態様のいくつかの実施形態では、増殖培地は、Ｎｏｔｃｈ阻害剤またはＮｏｔｃｈアゴニストを含有しない。いくつかの実施形態では、増殖培地は、ガストリンを含有しない。
【0017】
いくつかの実施形態では、増殖培地は、血清代替成分をさらに含む。いくつかの実施形態では、血清代替成分は、ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清代替物（ＫＯＳＲ）、ヒト血小板溶解物、ヒト血清、またはウシ血清を含む。
【0018】
いくつかの実施形態では、培養することは、低酸素条件下で、または、低酸素模倣物の存在下で、細胞を培養することを含む。
いくつかの実施形態では、培養することは、低酸素条件下で実施される。低酸素条件としては、例えば、２０％未満の酸素濃度を挙げることができる。いくつかの実施形態では、低酸素条件下で培養することは、細胞を、１％～１９％（例えば、１％～１０％、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％）の酸素濃度で培養することを含む。いくつかの実施形態では、酸素濃度は、１％～１０％である。いくつかの実施形態では、酸素濃度は５％である。
いくつかの実施形態では、培養することは、低酸素条件下で実施される。低酸素条件としては、例えば、２０％未満の酸素濃度を挙げることができる。いくつかの実施形態では、低酸素条件下で培養することは、細胞を、１％～１９％（例えば、１％～１０％、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％）の酸素濃度で培養することを含む。いくつかの実施形態では、酸素濃度は、１％～１０％である。いくつかの実施形態では、酸素濃度は５％である。
【0019】
いくつかの実施形態では、培養ステップは、プレーティングした細胞を増殖させること（ステップＰ０）と、増殖した細胞を初回継代すること（ステップＰ１）と、を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ０ステップは、７～１６日（例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６日）の継続期間を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ０ステップは、１１日の継続期間を有する。前述の態様のいくつかの実施形態では、Ｐ０ステップは、１３日の継続期間を有する。
【0020】
いくつかの実施形態では、Ｐ１ステップは、７～２０日（例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０日）の継続期間を有する。前述の態様のいくつかの実施形態では、Ｐ１ステップは、１１日の継続期間を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ１ステップは、１３日の継続期間を有する。
【0021】
いくつかの実施形態では、Ｐ０ステップは、肝細胞を、２００～１３，３３３細胞／ｃｍ２、例えば、２００細胞／ｃｍ２～１，０００細胞／ｃｍ２（例えば、２００細胞／ｃｍ２、３００細胞／ｃｍ２、４００細胞／ｃｍ２、５００細胞／ｃｍ２、６００細胞／ｃｍ２、７００細胞／ｃｍ２、８００細胞／ｃｍ２、９００細胞／ｃｍ２、もしくは１，０００細胞／ｃｍ２）、１，０００細胞／ｃｍ２～１０，０００細胞／ｃｍ２（例えば、１，０００細胞／ｃｍ２、２，０００細胞／ｃｍ２、３，０００細胞／ｃｍ２、４，０００細胞／ｃｍ２、５，０００細胞／ｃｍ２、６，０００細胞／ｃｍ２、７，０００細胞／ｃｍ２、８，０００細胞／ｃｍ２、９，０００細胞／ｃｍ２、もしくは１０，０００細胞／ｃｍ２）、または、１０，０００細胞／ｃｍ２～１３，３３３細胞／ｃｍ２（例えば、１０，０００細胞／ｃｍ２、１１，０００細胞／ｃｍ２、１２，０００細胞／ｃｍ２、１３，０００細胞／ｃｍ２、もしくは１３，３３３細胞／ｃｍ２）の密度で播種することを含む。いくつかの実施形態では、Ｐ０ステップは、６６７細胞／ｃｍ２の密度で肝細胞を播種することを含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１ステップは、３３３～１３，３３３細胞／ｃｍ２の密度で肝細胞を播種することを含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１ステップは、１，３３３細胞／ｃｍ２の密度で肝細胞を播種することを含む。
【0022】
いくつかの実施形態では、増殖培地は血清代替成分を含み、血清代替成分の濃度は、培養ステップの継続期間にわたって変化する。
いくつかの実施形態では、血清代替成分の濃度は、Ｐ０ステップの０日目において１％（ｖ／ｖ）である。
いくつかの実施形態では、血清代替成分の濃度は、Ｐ０ステップの０日目において１％（ｖ／ｖ）である。
【0023】
いくつかの実施形態では、（ｉ）細胞密度が、１５％～３０％（例えば、１５％、２０％、２５％、もしくは３０％）コンフルエンシーに達するときに、または、（ｉｉ）Ｐ０ステップの３日目～７日目の間（例えば、３日目、４日目、５日目、６日目、もしくは７日目）に、血清代替物の濃度は、５％（ｖ／ｖ）まで増加される。いくつかの実施形態では、血清代替物の濃度は、Ｐ０ステップの５日目に５％（ｖ／ｖ）まで増加される。いくつかの実施形態では、血清代替成分の濃度は、Ｐ０ステップの０日目において５％（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、血清代替成分の濃度は、Ｐ０の０日目において５％（ｖ／ｖ）であり、血清代替成分の濃度が増加されるまで、５％（ｖ／ｖ）のままである。いくつかの実施形態では、血清代替物の濃度は、（ｉ）細胞密度が、４０％～６０％（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、もしくは６０％）コンフルエンシーに達するときに、または、（ｉｉ）Ｐ０ステップの７日目～１３日目の間（例えば、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、もしくは１３日目）に、１０％（ｖ／ｖ）まで増加される。いくつかの実施形態では、血清代替物の濃度は、Ｐ０ステップの９日目に１０％（ｖ／ｖ）まで増加される。
【0024】
いくつかの実施形態では、血清代替成分の濃度は、Ｐ１ステップの０日目において１％（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、（ｉ）細胞密度が、１５％～３０％％（例えば、１５％、２０％、２５％、もしくは３０％）コンフルエンシーに達するときに、または、（ｉｉ）Ｐ１ステップの３日目～７日目の間（例えば、３日目、４日目、５日目、６日目、もしくは７日目）に、血清代替物の濃度は、５％（ｖ／ｖ）まで増加される。いくつかの実施形態では、血清代替物の濃度は、Ｐ１ステップの５日目に５％（ｖ／ｖ）まで増加される。
【0025】
いくつかの実施形態では、血清代替成分の濃度は、Ｐ１ステップの０日目において５％（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、血清代替成分の濃度は、Ｐ１ステップの０日目において５％（ｖ／ｖ）であり、血清代替成分の濃度が増加されるまで、５％（ｖ／ｖ）のままである。
【0026】
いくつかの実施形態では、血清代替物の濃度は、（ｉ）細胞密度が、４０％～６０％（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、もしくは６０％）コンフルエンシーに達するときに、または、（ｉｉ）Ｐ１ステップの５日目～１３日目の間（例えば、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、もしくは１３日目）に、１０％（ｖ／ｖ）まで増加される。前述の態様のいくつかの実施形態では、血清代替物の濃度は、Ｐ１ステップの７日目に１０％（ｖ／ｖ）まで増加される。いくつかの実施形態では、血清代替物の濃度は、Ｐ１ステップの９日目に１０％（ｖ／ｖ）まで増加される。
【0027】
前述の態様のいくつかの実施形態では、方法は、培養ステップの後に、ＰＨＨの発現プロファイルを測定することをさらに含む。
前述の態様のいくつかの実施形態では、培養ステップの継続期間は、３日～１２０日（例えば、約１５日～約１２０日、約１６日～１１９日、約１７日～約１１８日、約１８日～約１１７日、約１９日～約１１６日、約２０日～約１１５日、約２５日～約１１０日、約３０日～約１００日、約４０日～約９０日、約５０日～約８０日、約６０日～約７０日、約６５日～）である。
前述の態様のいくつかの実施形態では、培養ステップの継続期間は、３日～１２０日（例えば、約１５日～約１２０日、約１６日～１１９日、約１７日～約１１８日、約１８日～約１１７日、約１９日～約１１６日、約２０日～約１１５日、約２５日～約１１０日、約３０日～約１００日、約４０日～約９０日、約５０日～約８０日、約６０日～約７０日、約６５日～）である。
【0028】
前述の態様のいくつかの実施形態では、培養ステップは、９．５ｃｍ２～１０，０００ｃｍ２の表面積のマルチウェルプレートまたはフラスコまたは容器を用いて実施される。前述の態様のいくつかの実施形態では、培養ステップは、５００ｃｍ２～１０，０００ｃｍ２の表面積のマルチウェルプレートまたはフラスコまたは容器を用いて実施される。例えば、いくつかの実施形態では、表面積は、９．５ｃｍ２～５００ｃｍ２（例えば、９．５ｃｍ２、１００ｃｍ２、２００ｃｍ２、３００ｃｍ２、４００ｃｍ２、もしくは５００ｃｍ２）、５００ｃｍ２～１，０００ｃｍ２（例えば、５００ｃｍ２、６００ｃｍ２、７００ｃｍ２、８００ｃｍ２、９００ｃｍ２、もしくは１，０００ｃｍ２）、または、１，０００ｃｍ２～１０，０００ｃｍ２（例えば、１，０００ｃｍ２、２，０００ｃｍ２、３，０００ｃｍ２、４，０００ｃｍ２、５，０００ｃｍ２、６，０００ｃｍ２、７，０００ｃｍ２、８，０００ｃｍ２、９，０００ｃｍ２、もしくは１０，０００ｃｍ２）である。いくつかの実施形態では、培養ステップは、６３６ｃｍ２～６３６０ｃｍ２の表面積のフラスコまたは容器を用いて実施される。
【0029】
前述の態様のいくつかの実施形態では、培養ステップの後に、ＰＨＨの発現プロファイルは、ＰＨＨの少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、または９５％）による、肝細胞核因子４α（ＨＮＦ４α）、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５（ＬＧＲ５）、ケラチン１８（ＣＫ１８）、及びアルブミンから選択される１種以上（例えば、２、３、４、または５種類）のタンパク質の発現を含む。
【0030】
前述の態様のいくつかの実施形態では、培養ステップの後に、ＰＨＨの発現プロファイルは、ＰＨＨの最大１５％（例えば、最大１０％、５％、４％、３％、２％、または１％）による、Ｋｉ６７の発現を含む。
【0031】
前述の態様のいくつかの実施形態では、培養ステップの後に、ＰＨＨの発現プロファイルは、ＰＨＨの少なくとも１５％（例えば、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、またはそれ以上）による、Ｋｉ６７の発現を含む。
【0032】
前述の態様のいくつかの実施形態では、培養ステップの後に、ＰＨＨの発現プロファイルは、一晩プレーティングした対照ＰＨＨの少なくとも１０％（例えば、少なくとも１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、または２０％）の、成熟肝細胞マーカー（例えば、Ｃｙｐ３ａ４、Ｃｙｐ１ａ２、ＮＲ１Ｉ２、尿素回路酵素ＡＢＣＧ２、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＢ１１、ＳＲ－Ｂ１、またはＳＬＣ１０Ａ１）から選択される１種以上（例えば、２、３、４、または５種類）のタンパク質の下方制御を含む。
【0033】
前述の態様のいくつかの実施形態では、培養ステップの後に、ＰＨＨの発現プロファイルは、一晩プレーティングした対照ＰＨＨの少なくとも１０％（例えば、少なくとも１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、または２０％）の、胎児／肝臓前駆細胞／胆管細胞マーカー（例えば、ＡＦＰ、Ｃｙｐ３ａ７、ＥＰＣＡＭ、ＬＧＲ５、ＫＲＴ７、ＫＲＴ１９、またはＡＱＰ１）から選択される１種以上（例えば、２、３、４、または５種類）のタンパク質の上方制御を含む。
【0034】
いくつかの実施形態では、増殖したＰＨＨは、尿素回路酵素、成熟細胞状態に特徴的なタンパク質を上方制御するための、及び、胎児／肝臓前駆細胞／胆管細胞マーカーを下方制御するための、追加の成熟ステップを必要とする。
【0035】
前述の態様のいくつかの実施形態では、培養ステップの後に、ＰＨＨの発現プロファイルは、ＰＨＨの少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、または９５％）による、ＨＮＦ４α、ＬＧＲ５、ＣＫ１８、及びＡＬＢから選択される１種以上（例えば、２、３、４、または５種類）のタンパク質の発現を含む。
【0036】
前述の態様のいくつかの実施形態では、培養ステップの後に、増殖したＰＨＨの発現プロファイルは、ＰＨＨの最大１５％（例えば、最大１０％、５％、４％、３％、２％、または１％）による、Ｋｉ６７の発現を含む。
【0037】
前述の態様のいくつかの実施形態では、培養ステップの後に、増殖したＰＨＨの発現プロファイルは、ＰＨＨの少なくとも１５％（例えば、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、またはそれ以上）による、Ｋｉ６７の発現を含む。
【0038】
前述の態様のいくつかの実施形態では、培養ステップの後に、ＰＨＨは継続して、増殖していないＰＨＨよりも低いレベルで、アルブミンを発現及び分泌する。
前述の態様のいくつかの実施形態では、培養ステップの後に、ＰＨＨの発現プロファイルは、ＰＨＨの成熟時の、尿素の発現の増加を含む。
前述の態様のいくつかの実施形態では、培養ステップの後に、ＰＨＨの発現プロファイルは、ＰＨＨの成熟時の、尿素の発現の増加を含む。
【0039】
前述の態様のいくつかの実施形態では、培養ステップの後に、肝細胞収率は、１ｃｍ２当たり、少なくとも５×１０３（例えば、少なくとも５×１０３、５×１０４、５×１０５、５×１０６、または５ｘ１０７）である。
【0040】
前述の態様のいくつかの実施形態では、培養ステップの後に、肝細胞収率は、１４～２８日以内（例えば、１５～２７日以内、１６～２６日以内、１７～２５日以内、１８～２４日以内、１９～２３日以内、２０～２１日以内、または、２２日以内）の培養で、少なくとも２倍（例えば、少なくとも３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、または３０倍）増大する。
【0041】
前述の態様のいくつかの実施形態では、培養ステップの後に、肝細胞収率は、３０日以内（例えば、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、または１４日以内）の培養で、少なくとも５００倍（例えば、少なくとも１０００倍）増大する。前述の態様のいくつかの実施形態では、培養ステップの後に、肝細胞収率は、２４日以内の培養で、少なくとも５００倍増大する。
【0042】
前述の態様のいくつかの実施形態では、培養ステップの後に、肝細胞収率は、３０日以内（例えば、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、または１４日以内）の培養で、５００倍～２０００倍、例えば、１０００倍～２０００倍（例えば、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１，０００倍、１，１００倍、１，２００倍、１，３００倍、１，４００倍、１，５００倍、１，６００倍、１，７００倍、１，８００倍、１，９００倍、または２，０００倍）増大する。前述の態様のいくつかの実施形態では、培養ステップの後に、肝細胞収率は、２４日以内の培養で、５００倍～２０００倍、例えば、１０００倍～２０００倍（例えば、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１，０００倍、１，１００倍、１，２００倍、１，３００倍、１，４００倍、１，５００倍、１，６００倍、１，７００倍、１，８００倍、１，９００倍、または２，０００倍）増大する。
【0043】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、方法は、１種以上の肝細胞成熟サプリメントが添加されるヒト細胞用の基礎培地を含む成熟培地で、肝細胞を成熟させることをさらに含む。
【0044】
別の態様では、本開示は、肝細胞の集団を成熟させる方法を提供し、当該方法は、１種以上の肝細胞成熟サプリメントが添加されるヒト細胞用の基礎培地を含む成熟培地の存在下で、増殖した肝細胞集団を成熟させるステップを含む。前述の態様のいくつかの実施形態では、成熟前に、基礎培地、Ｗｎｔシグナル伝達活性化因子、１つ以上の受容体型チロシンキナーゼリガンド、及び、１つ以上の上皮表現型安定化剤を含む、増殖培地の存在下で、ＥＣＭと接触させて、肝細胞を培養することにより、肝細胞を増殖させた。前述の態様のいくつかの実施形態では、増殖した肝細胞は、未成熟の表現型を有する。
【0045】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、成熟ステップは、肝細胞増殖の直後に開始する。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、成熟ステップは、肝細胞増殖の直後に開始しない。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、成熟ステップは、３～１２日（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２日）の継続期間を有する。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、成熟ステップは７日である。
【0046】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、成熟基礎培地は、ＬＯＮＺＡ（商標）ＨＣＭ（商標）、ウィリアムＥ、またはＨｅｐａｔｏＺＹＭＥ－ＳＦＭである。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、１種以上の成熟サプリメントとしては、抗生物質、ＨＥＰＥＳ、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）、ＩＴＳ、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、オンコスタチンＭ、抗酸化剤、糖質コルチコイド、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）活性化因子、胆汁酸、ｃＡＭＰもしくはｃＡＭＰ類似体、コレステロール、甲状腺ホルモン、血清代替成分、または、前述の任意の組み合わせが挙げられる。
【0047】
前述の態様のいくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈ阻害剤は、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｅ、γセクレターゼ阻害剤ＸＸ、またはこれらの組み合わせである。前述の態様のいくつかの実施形態では、抗生物質はペニシリン、ストレプトマイシン、またはこれらの組み合わせである。前述の態様のいくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、エルロチニブ塩酸塩である。前述の態様のいくつかの実施形態では、抗酸化剤はビタミンＣである。前述の態様のいくつかの実施形態では、糖質コルチコイドは、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、またはこれらの組み合わせである。前述の態様のいくつかの実施形態では、ＰＸＲ活性化因子はビタミンＫ２である。前述の態様のいくつかの実施形態では、胆汁酸は、リトコール酸、ウルソデオキシコール酸、またはこれらの組み合わせである。前述の態様のいくつかの実施形態では、ｃＡＭＰ類似体は、８ブロモｃＡＭＰ、フォルスコリン、またはこれらの組み合わせである。前述の態様のいくつかの実施形態では、甲状腺ホルモンはＴ３である。前述の態様のいくつかの実施形態では、血清代替成分は、インスリントランスフェリンセレン（ＩＴＳ）、ＫＯＳＲ、Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ａ、Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｂ、またはこれらの組み合わせである。
【0048】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、成熟培地は、Ｒ－スポンジン１／Ｗｎｔ３ａ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、Ｎ－アセチルシステイン、ニコチンアミド、Ｂ２７サプリメント、Ｎ２サプリメント、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、及び線維芽細胞増殖因子１０（ＦＧＦ１０）のうちの１つ以上を欠く。
【0049】
別の態様では、本開示は、１つ以上のＷｎｔシグナル伝達活性化因子、１つ以上の受容体型チロシンキナーゼリガンド、及び、１つ以上の上皮表現型安定化剤が添加されるヒト細胞用基礎培地を含む増殖培地を含むキットを提供し、キットは、キットのユーザに、前述の実施形態のいずれか１つに記載の方法に従い、１つ以上の肝細胞を培養させるように指示する、添付文書をさらに含む。
【0050】
別の態様では、本開示は、１つ以上の（例えば、２、３、４、または５つの）Ｗｎｔシグナル伝達活性化因子、１つ以上の（例えば、２、３、４、または５つの）受容体型チロシンキナーゼリガンド、及び、１つ以上の（例えば、２、３、４、または５つの）上皮表現型安定化剤が添加されるヒト細胞用の基礎培地を含む増殖培地を提供する。
【0051】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達活性化因子の１つ以上（例えば、２、３、４、または５つ）は、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、Ｒ－スポンジン４、Ｗｎｔ３ａ、または、前述のいずれかの組み合わせである。いくつかの実施形態では、１つ以上のＷｎｔシグナル伝達活性化因子としては、Ｒ－スポンジン１及びＷｎｔ３ａが挙げられる。
【0052】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、受容体型チロシンキナーゼリガンドの１つ以上（例えば、２、３、４、または５つ）は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、または、前述のいずれかの組み合わせである。いくつかの実施形態では、ＥＧＦはヒトＥＧＦであり、ＦＧＦは、ヒト線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ－７）またはヒト線維芽細胞増殖因子１０（ＦＧＦ－１０）であり、ＨＧＦはヒトＨＧＦであり、または、ＴＧＦは、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）（例えば、ヒトＴＧＦα）である。いくつかの実施形態では、１つ以上の受容体型チロシンキナーゼリガンドとしては、ヒトＥＧＦ、ＦＧＦ－７、ＦＧＦ－１０、ＨＧＦ、及びＴＧＦαが挙げられる。
【0053】
前述の態様のいくつかの実施形態では、増殖培地はＲｈｏキナーゼ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤はＹ－２７６３２である。
いくつかの実施形態では、増殖培地はＲｈｏキナーゼ阻害剤を含まない。
いくつかの実施形態では、増殖培地はＲｈｏキナーゼ阻害剤を含まない。
【0054】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、上皮表現型安定化剤の１つ以上（例えば、２、３、４、または５つ）は、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβ阻害剤は、アクチビン受容体様キナーゼ５（ＡＬＫ５）阻害剤（例えば、Ａ８３－０１）である。いくつかの実施形態では、上皮表現型安定化剤のうちの１つは、コルチコステロイド（例えば、ヒドロコルチゾン）である。
【0055】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、増殖培地は、１種以上の細胞生残剤、及び／または、１種以上の細胞増殖剤をさらに含む。
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＥＣＭは、コラーゲン（例えば、コラーゲンＩもしくはコラーゲンＩＶ）、または、ラミニン（例えば、ラミニン１１１、ラミニン２１１、ラミニン２２１、ラミニン３３２、ラミニン４１１、ラミニン４２１、ラミニン５１１、もしくはラミニン５２１）を含む。いくつかの実施形態では、ＥＣＭはコラーゲンＩを含む。いくつかの実施形態では、ＥＣＭはコラーゲンＩＶを含む。いくつかの実施形態では、ＥＣＭはラミニン１１１を含む。いくつかの実施形態では、ＥＣＭはラミニン５１１を含む。いくつかの実施形態では、ＥＣＭはラミニン５２１を含む。いくつかの実施形態では、ＥＣＭは、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ラミニン１１１、ラミニン５１１、及びラミニン５２１の組み合わせを含む。
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＥＣＭは、コラーゲン（例えば、コラーゲンＩもしくはコラーゲンＩＶ）、または、ラミニン（例えば、ラミニン１１１、ラミニン２１１、ラミニン２２１、ラミニン３３２、ラミニン４１１、ラミニン４２１、ラミニン５１１、もしくはラミニン５２１）を含む。いくつかの実施形態では、ＥＣＭはコラーゲンＩを含む。いくつかの実施形態では、ＥＣＭはコラーゲンＩＶを含む。いくつかの実施形態では、ＥＣＭはラミニン１１１を含む。いくつかの実施形態では、ＥＣＭはラミニン５１１を含む。いくつかの実施形態では、ＥＣＭはラミニン５２１を含む。いくつかの実施形態では、ＥＣＭは、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ラミニン１１１、ラミニン５１１、及びラミニン５２１の組み合わせを含む。
【0056】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、培養ステップは表面（例えば、２次元表面）で実施される。いくつかの実施形態では、表面はＥＣＭでコーティングされている。いくつかの実施形態では、ＰＨＨは、培養ステップ中に、表面に接着により付着している。いくつかの実施形態では、増殖したＰＨＨは、培養液中で解離、凝集、及び維持され、さらなる増殖及び／または成熟を促進する。
【0057】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、増殖培地は、Ｂ２７サプリメント、及び／またはＮ２サプリメントをさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｂ２７サプリメントは、ビタミンＡを含有しない。
【0058】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、増殖培地は、Ｎｏｔｃｈ阻害剤またはＮｏｔｃｈアゴニストを含有しない。いくつかの実施形態では、増殖培地は、ガストリンを含有しない。
【0059】
前述の態様のいくつかの実施形態では、増殖培地は、アミノ酸サプリメントをさらに含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸サプリメントは、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）サプリメントである。いくつかの実施形態では、ＮＥＡＡサプリメントは、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、及びＬ－セリンを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、アミノ酸サプリメントを含まない。
【0060】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載する（例えば、上記実施形態のいずれかの）増殖培地を含む、組織培養容器を提供する。
別の態様では、本開示は、低酸素条件下で組織細胞容器を維持するインキュベーターを提供する。低酸素条件としては、例えば、２０％未満の酸素濃度を挙げることができる。いくつかの実施形態では、インキュベーターは、１％～１９％（例えば、１％～１０％、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％）の酸素濃度を維持する。いくつかの実施形態では、酸素濃度は、１％～１０％である。いくつかの実施形態では、酸素濃度は５％である。
別の態様では、本開示は、低酸素条件下で組織細胞容器を維持するインキュベーターを提供する。低酸素条件としては、例えば、２０％未満の酸素濃度を挙げることができる。いくつかの実施形態では、インキュベーターは、１％～１９％（例えば、１％～１０％、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％）の酸素濃度を維持する。いくつかの実施形態では、酸素濃度は、１％～１０％である。いくつかの実施形態では、酸素濃度は５％である。
【0061】
別の態様では、本開示は、１つ以上の成熟サプリメントが添加されるヒト細胞用基礎培地を含む成熟培地を含むキットを提供し、キットは、キットのユーザに、前述の実施形態のいずれか１つに記載の方法に従い、１つ以上の肝細胞を成熟させるように指示する、添付文書をさらに含む。
【0062】
別の態様では、本開示は、１種以上の肝細胞成熟サプリメントが添加されるヒト細胞用基礎培地を含む成熟培地を提供する。
前述の態様のいくつかの実施形態では、成熟基礎培地は、ＬＯＮＺＡ（商標）ＨＣＭ（商標）、ウィリアムＥ、またはＨｅｐａｔｏＺＹＭＥ－ＳＦＭである。前述の態様のいくつかの実施形態では、１種以上の成熟培地としては、抗生物質、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）、ＩＴＳ、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、オンコスタチンＭ、抗酸化剤、糖質コルチコイド、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）活性化因子、胆汁酸、ｃＡＭＰもしくはｃＡＭＰ類似体、コレステロール、甲状腺ホルモン、血清代替成分、または、前述の任意の組み合わせが挙げられる。
前述の態様のいくつかの実施形態では、成熟基礎培地は、ＬＯＮＺＡ（商標）ＨＣＭ（商標）、ウィリアムＥ、またはＨｅｐａｔｏＺＹＭＥ－ＳＦＭである。前述の態様のいくつかの実施形態では、１種以上の成熟培地としては、抗生物質、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）、ＩＴＳ、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、オンコスタチンＭ、抗酸化剤、糖質コルチコイド、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）活性化因子、胆汁酸、ｃＡＭＰもしくはｃＡＭＰ類似体、コレステロール、甲状腺ホルモン、血清代替成分、または、前述の任意の組み合わせが挙げられる。
【0063】
前述の態様のいくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈ阻害剤は、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｅ、γセクレターゼ阻害剤ＸＸ、またはこれらの組み合わせである。前述の態様のいくつかの実施形態では、抗生物質はペニシリン、ストレプトマイシン、またはこれらの組み合わせである。前述の態様のいくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、エルロチニブ塩酸塩である。前述の態様のいくつかの実施形態では、抗酸化剤はビタミンＣである。前述の態様のいくつかの実施形態では、糖質コルチコイドは、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、またはこれらの組み合わせである。前述の態様のいくつかの実施形態では、ＰＸＲ活性化因子はビタミンＫ２である。前述の態様のいくつかの実施形態では、胆汁酸は、リトコール酸、ウルソデオキシコール酸、またはこれらの組み合わせである。前述の態様のいくつかの実施形態では、ｃＡＭＰ類似体は、８ブロモｃＡＭＰ、フォルスコリン、またはこれらの組み合わせである。前述の態様のいくつかの実施形態では、甲状腺ホルモンはＴ３である。前述の態様のいくつかの実施形態では、血清代替成分は、ＩＴＳ、ＫＯＳＲ、Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ａ、Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｂ、またはこれらの組み合わせである。
【0064】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、成熟培地は、Ｒ－スポンジン１／Ｗｎｔ３ａ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、Ｎ－アセチルシステイン、ニコチンアミド、Ｂ２７サプリメント、Ｎ２サプリメント、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、及び線維芽細胞増殖因子１０（ＦＧＦ１０）のうちの１つ以上を欠く。
【図面の簡単な説明】
【0065】
【図1】Ｅｘｐａｎｄ １．０製剤として参照される増殖培地を用いて培養した、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）細胞の明視野画像であり、当該製剤は、Ｗｎｔシグナル伝達活性化因子Ｒ－スポンジン１及びＷｎｔ３ａが添加された、改良型ダルベッコ改変イーグル培地／Ｈａｍ’ｓ栄養素混合物Ｆ－１２；受容体型チロシンキナーゼリガンドの組換え上皮増殖因子、組換えトランスフォーミング増殖因子、組換えヒト線維芽細胞増殖因子７、組換えヒト線維芽細胞増殖因子１０、及び、組換えヒト肝細胞成長因子；上皮表現型安定化剤Ａ８３－０１；Ｎ－アセチルシステイン、ニコチンアミド、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ－２７６３２；ビタミンＡを含有しないＢ２７サプリメント、及びＮ２サプリメント；－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）、ペニシリン、及びストレプトマイシンを含んだ。Ｔ－７５培養フラスコで６日間プレーティング及び培養した後のＰＨＨ細胞（継代「Ｐ」０）を示す。
【図2】肝臓系統細胞の均質な培養物として増殖する肝細胞ロット（表３のロットＤ）を用いて、増殖培地で培養したＰＨＨにおける肝臓表現型に対する、増殖の２日目、９日目、及び１４日目における、細胞の明視野画像、ならびに、増殖の１３日目における、マーカーの免疫染色を示す、一連の顕微鏡写真である。増殖培地の存在下で、ＰＨＨを、コラーゲンＩ細胞外マトリックス（ＥＣＭ）上で培養した。増殖培地は、図１に記載するとおりであった。培養１３日目に、ＰＨＨは、ＨＮＦ４α、アルブミン、及びＬＧＲ５を発現する。
【図3】図２に記載する肝細胞ロットを用いる、図１に記載する増殖培地を用いて、ラミニン５２１ ＥＣＭで増殖したＰＨＨにおける肝臓表現型に対する、増殖中の２日目、１０日目、及び１３日目における細胞の明視野画像、ならびに、増殖の１３日目におけるマーカーの免疫染色を示す、一連の顕微鏡写真である。Ｐ０培養の１３日目に、ＰＨＨは、ＨＮＦ４α、アルブミン、及びＬＧＲ５を発現する。
【図4】それぞれ、２０日目（継代（「Ｐ」）０）、７６日目（Ｐ３）、８９日目（Ｐ４）、及び１１３日目（Ｐ５）における、間葉様細胞のバックグラウンドにおいて肝臓島で構成される、異種培養物として増殖する肝細胞ロット（表３のロットＡ）を用い、図１に記載する増殖培地の存在下で培養した、増殖したＰＨＨの明視野画像を示す、一連の顕微鏡写真である。
【図5】図１に記載する増殖培地の存在下で培養した、ＰＨＨでの、肝臓表現型及び増殖表現型のマーカーの免疫染色を示す、一連の顕微鏡写真である。画像は、図４に記載するＰＨＨロットの、長時間培養中に、選択されたマーカーに対して陽性に染色するコロニーの先端を描写する。６８日目に、ＰＨＨはＨＮＦ４α、アルブミン、ＬＧＲ５、及びＫｉ６７を発現する。
【図6】図２に記載するＰＨＨロットの、図１に記載する増殖培地の存在下で培養した増殖ＰＨＨのステージを示す、一連の顕微鏡写真である。細胞は、培養液中で漸進的に増殖して、Ｐ０の９日目にコンフルエンスに達し、さらに進行して、Ｐ０の１７日目までに、十分画定された細胞縁で密集した状態になる。
【図8】図２に記載する肝細胞ロットの増殖したＰＨＨを含有する移植片を移植したＮＳＧマウスにおける、分泌されたヒトアルブミンを示すグラフである。未増殖のＰＨＨは、参照対照群としての役割を果たした。未増殖ＰＨＨ、及び、１０日間、図１に記載する増殖培地の存在下で培養したＰＨＨを解離させ、線維芽細胞で凝集させ、フィブリンヒドロゲルに封入することで移植片を調製した後、ＮＳＧマウスに移植した。２週間毎に採血をし、分泌されたヒトアルブミンをＥＬＩＳＡにより定量した。ヒトアルブミンは、４、８、１３、１８、２２、２７、３２、３６、４１、４６、５０、５５、及び６１日目に示される。
【図9】未増殖の対照ＰＨＨ、及び、図１に記載する増殖培地の存在下で１０日間増殖したＰＨＨを含有する、６１日目に体外移植された移植片の免疫組織化学を示す、一連の顕微鏡写真である。Ｈ＆Ｅ、ｈＯＴＣ、及びＣｋ１８染色を示す。
【図10】Ｐ０及びＰ１において、コラーゲンＩ及びラミニン５２１ ＥＣＭで、低酸素培養条件（５％Ｏ２）にて、Ｅｘｐａｎｄ ３．０製剤として参照される改変増殖培地の存在下で培養したＰＨＨの、異なる日における増殖細胞の明視野画像を示す、一連の顕微鏡写真である。改変増殖培地は、Ｗｎｔシグナル伝達活性化因子Ｒ－スポンジン１及びＷｎｔ３ａが添加された、改良型ダルベッコ改変イーグル培地／Ｈａｍ’ｓ栄養素混合物Ｆ－１２；受容体型チロシンキナーゼリガンドの組換え上皮増殖因子、組換えトランスフォーミング増殖因子、組換えヒト線維芽細胞増殖因子７、組換えヒト線維芽細胞増殖因子１０、及び、組換えヒト肝細胞成長因子；上皮表現型安定化剤Ａ８３－０１；Ｎ－アセチルシステイン、ニコチンアミド；５～１０％ ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清代替物（ＫＯＳＲ）；非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）；ビタミンＡを含有しないＢ２７サプリメント、及びＮ２サプリメント；－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）、ペニシリン、及びストレプトマイシンを含んだ。
【図12】増殖培地の不存在下での、一晩プレーティングした対照ＰＨＨ細胞、ならびに、Ｐ０及びＰ１において、コラーゲンＩ及びラミニン５２１ ＥＣＭで、低酸素培養条件（５％Ｏ２）にて、Ｅｘｐａｎｄ ３．０製剤の存在下で培養したＰＨＨにおける、肝細胞及び上皮及び間葉マーカーの成熟及び前駆細胞の状態を伴う異なるカテゴリーをカバーするＴａｑＭａｎプローブを用いるＲＴ－ｑＰＣＲ分析のヒートマップである。コラーゲンＩマトリックスにおいて一晩プレーティングした、対照肝細胞の試料＃１に対して値を正規化した。ＬＧＲ５は、一晩プレーティングした対照肝細胞で検出されないため、ＬＧＲ５データを、増殖細胞のみに対する別個の棒グラフとして表す。
【図13】Ｐ０及びＰ１において、コラーゲンＩ及びラミニン５２１ ＥＣＭで、低酸素培養条件（５％Ｏ２）にて、Ｅｘｐａｎｄ ３．０製剤の存在下で培養したＰＨＨと比較して、増殖培地の不存在下で、一晩プレーティングした対照ＰＨＨ細胞による、分泌されたアルブミンのレベルを示すグラフである。
【図14】２４日間（Ｐ０で１３日＋Ｐ１で１１日）、ラミニン５２１ ＥＣＭにて、低酸素培養条件でＥｘｐａｎｄ ３．０製剤の存在下において培養したＰＨＨにおける、肝臓表現型に対するマーカーの免疫染色を示す、一連の顕微鏡写真である。Ｐ１培養の１１日目に、ＰＨＨは、ＨＮＦ４ａ及びアルブミンを発現する。
【図15】Ｉｍａｒｉｓソフトウェアにより測定した、６ウェルプレートの、独立した２つのウェルから、ＨＮＦ４ａ及びアルブミンを発現する、Ｐ１培養の１１日目における細胞の割合（％）を示す表及びグラフである。
【図16】様々な日にち（ｄ）における、継代（ｐ）中のＫＯＳＲ割合（％）に沿った、ＰＨＨの増殖及び成熟のタイムラインを表す図である。細胞成熟の読出しのために、位相差顕微鏡、分泌された尿素、分泌されたアルブミン、及び成熟マーカーのＲＴ－ｑＰＣＲを用いた。
【図17】初代肝細胞（初代肝細胞）、増殖した肝細胞（増殖肝細胞対照）、及び、Ｌｏｎｚａ ＨＣＭ培地（Ｌｏｎｚａ ＨＣＭに成熟サプリメント）またはウィリアムＥ培地（ウィリアムＥに成熟サプリメント）のいずれかにおける、増殖した成熟肝細胞に対する、分泌された尿素（μｇ／細胞１００万個／日）を示すグラフである。プレーティングした細胞に対して正規化した、及び、播種した全細胞に対して正規化した、初代肝細胞を示す。エラーバー＝ＳＥＭ、成熟条件に対してはｎ＝２、ならびに、初代肝細胞及び増殖肝細胞対照に対してはｎ＝３。
【図18】初代肝細胞（初代肝細胞）、増殖した肝細胞（増殖肝細胞対照）、及び、Ｌｏｎｚａ ＨＣＭ培地（Ｌｏｎｚａ ＨＣＭに成熟サプリメント）またはウィリアムＥ培地（ウィリアムＥに成熟サプリメント）のいずれかにおける増殖した成熟肝細胞に対する、分泌されたアルブミン（ｎｇ／細胞１００万個／日）を示すグラフである。プレーティングした細胞に対して正規化した、及び、播種した全細胞に対して正規化した、初代肝細胞を示す。エラーバー＝ＳＥＭ、成熟条件に対してはｎ＝２、ならびに、初代肝細胞及び増殖肝細胞対照に対してはｎ＝３。
【図19】初代肝細胞（初代肝細胞対照）、増殖した肝細胞（増殖肝細胞対照）、及び、Ｌｏｎｚａ ＨＣＭ培地（Ｌｏｎｚａ ＨＣＭに成熟サプリメント）またはウィリアムＥ培地（ウィリアムＥに成熟サプリメント）のいずれかにおける増殖した成熟肝細胞に対する、成熟肝細胞マーカー及び前駆細胞／胆管細胞マーカーのＲＴ－ＰＣＲを用いて測定した、転写レベルの倍率変化を示すヒートマップである。
【図20】成熟前、成熟中、及び、成熟完了後の肝細胞を示す、位相差顕微鏡画像のまとまりである。成熟開始前の、２４日目における１０ｘの倍率で、増殖した肝細胞を示す。増殖した成熟肝細胞（Ｌｏｎｚａ ＨＣＭに成熟サプリメント）を、成熟の１日目、３日目、及び７日目において、４ｘ及び１０ｘの倍率で示す。スケールバー＝１００マイクロメートル。
【発明を実施するための形態】
【0066】
定義
本明細書で使用する場合、文脈上明らかに別段に示されている場合を除き、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という用語には、複数の言及物が含まれる。したがって、例えば、「リガンド（ａ ｌｉｇａｎｄ）」への言及は、任意に、２つ以上のそのようなリガンドの組み合わせを含むといった具合である。
本明細書で使用する場合、文脈上明らかに別段に示されている場合を除き、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という用語には、複数の言及物が含まれる。したがって、例えば、「リガンド（ａ ｌｉｇａｎｄ）」への言及は、任意に、２つ以上のそのようなリガンドの組み合わせを含むといった具合である。
【0067】
本明細書で使用する場合、「基礎培地」という用語は、限定されるものではないが、ダルベッコ改変イーグル培地／Ｈａｍ’ｓ栄養素混合物Ｆ－１２（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２）、ＬＯＮＺＡ（商標）ＨＣＭ（商標）、ウィリアムＥ、ＨｅｐａｔｏＺＹＭＥ－ＳＦＭ、及び、これらの任意の改変物を含む、ヒト細胞を培養するのに適した、任意の細胞培養培地を意味する。細胞培養培地に対する改変は、限定されるものではないが、安定化形態のＬ－グルタミン、－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）などの緩衝剤、ならびに、ペニシリン及びストレプトマイシンなどの抗生物質溶液を含む、様々な試薬の添加物を含む。
【0068】
本明細書で使用する場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「で構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、または、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義であり、その後に続く、例えば構成成分の存在を明記する、包含的、またはオープンエンドの用語であり、当該技術分野において周知の、または、そこで開示される、追加の、列挙されていない構成要素、特徴、要素、メンバー、ステップの存在を除外しない、または排除しない。
【0069】
本明細書で使用する場合、「対照細胞」という用語は、哺乳動物の血清（例えば、ウシ胎児血清）、及び、肝細胞に適した、任意の他の、供給元から提供される培地サプリメントを補充した、ヒト細胞用の、任意の適切な基礎培地（例えば、ダルベッコ改変イーグル培地／栄養素混合物Ｆ－１２）を含む、対照培地で培養される肝細胞の集団を意味する。
【0070】
本明細書で使用する場合、「培養ステップ」という用語は、細胞を増殖させ、継代するプロセスを意味する。本プロセスは、細胞分裂により細胞数が増加する、細胞培養期を包含する。細胞が、例えば、８０～９０％コンフルエンスに達したら、これらを、追加の細胞培養表面に継代し、播種することができる。例えば、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）の１回の継代には、コンフルエンスに達するために、少なくとも３日が必要であり得る。細胞は、１２０日間連続して、継代及び培養することができる。あるいは、細胞は、形質転換されるまで、または、肝臓表現型を喪失するまで、継代することができる。
【0071】
「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」、「低下した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」、「低下（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」、または「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」という用語は全て、本明細書では、統計的に有意な量減少することを意味するために用いられる。いくつかの実施形態では、「低下する「（ｒｅｄｕｃｅ）」、「低下（ｒｅｄｕｃｅ）」、「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」、または「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」は、典型的には、参照レベル（例えば、所与の処置が存在しない場合）と比較して、少なくとも１０％の減少を意味し、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれ以上の減少を含むことができる。本明細書で使用する場合、「低下（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」または「阻害（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）」は、参照レベルと比較して、完全な阻害または低下を包含し得る。
【0072】
本明細書で使用する場合、「上皮表現型安定化剤」という用語は、上皮表現型の維持を促進することができる、自然または合成の、任意の化合物を意味する。上皮表現型安定化剤は、間葉表現型の成長もまた予防することができる。このような化合物としては、ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害剤、及びコルチコステロイドが挙げられるが、これらに限定されない。
【0073】
本明細書で使用する場合、「増殖する（ｅｘｐａｎｄ）」、「増殖する（ｅｘｐａｎｄｓ）」、「増殖すること（ｅｘｐａｎｄｉｎｇ）」、及び「増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）」とは、その後に続く、例えば、ＰＨＨの集団の数の、増加を意味する。「増殖ステップ」とは、細胞分裂によりＰＨＨの数が増加する、細胞培養の期を意味する。一緒に、またはまとめて、ＰＨＨの集団を「増殖させる」複数の剤の文脈において、本明細書で使用する場合、これは、各剤が個別では、示した機能を達成し得る、または達成し得ないが、剤が組み合わされると、示した増殖が達成される例について記載する。
【0074】
本明細書で使用される場合、「発現する」という用語は、（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の産生（例えば、転写による）、（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／または３’末端プロセシングによる）、（３）ＲＮＡからポリペプチドまたはタンパク質への翻訳、及び（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾という事象のうちの１つ以上を指す。タンパク質生成物をコードする遺伝子の文脈において、用語「遺伝子発現」などは、用語「タンパク質発現」などと同じ意味で用いられる。患者における、目的の遺伝子またはタンパク質の発現は、例えば、患者から入手した試料での、対応するタンパク質をコードするｍＲＮＡの量もしくは濃度の増加（例えば、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ）及びＲＮＡ ｓｅｑ技術などの、本明細書に記載する、もしくは当該技術分野において公知のＲＮＡ検出手順を用いて評価される）、対応するタンパク質の量もしくは濃度の増加（例えば、とりわけ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの、本明細書に記載する、もしくは当該技術分野において公知のタンパク質検出方法を用いて評価される）、及び／または、対応するタンパク質の活性の増加（例えば、酵素の場合、本明細書に記載する、もしくは当該技術分野において公知の酵素活性アッセイを用いて評価される）を検出することにより、明らかにすることができる。本明細書で使用する場合、上記事象の１つ以上、または全てが、細胞内、または、細胞が存在する培地内で検出可能であれば、細胞は、目的の遺伝子またはタンパク質を「発現する」と考えられる。例えば、目的の遺伝子またはタンパク質は、（ｉ）（例えば、本明細書に記載するＲＮＡ検出手順を用いる）細胞、もしくは細胞の集団による、ｍＲＮＡ鋳型などの対応するＲＮＡ転写産物の産生、（ｉｉ）ＲＮＡ転写産物のプロセシング（例えば、本明細書に記載するＲＮＡ検出手順を用いる、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／または３’末端プロセシング）、（ｉｉｉ）（例えば、本明細書に記載するタンパク質検出手順を用いる）ＲＮＡ鋳型の、タンパク質生成物への翻訳、及び／または、（ｉｖ）（例えば、本明細書に記載するタンパク質検出手順を用いる）タンパク質生成物の翻訳後修飾、を検出可能である場合に、細胞、または細胞の集団により「発現される」と考えられる。
【0075】
「発現レベル」または「発現のレベル」という用語は、一般に、互換的に使用され、一般に、生体試料中のマーカーの量を指す。「発現」とは、一般に、情報（例えば、遺伝子コード情報及び／またはエピジェネティック情報）が、細胞中に存在しかつそこで機能する構造に変換されるプロセスを指す。したがって、本明細書で使用される場合、「発現」とは、ポリヌクレオチドへの転写、ポリペプチドへの翻訳、またはさらにはポリヌクレオチド及び／またはポリペプチド修飾（例えば、ポリペプチドの翻訳後修飾）を指し得る。転写ポリヌクレオチド、翻訳ポリペプチド、またはポリヌクレオチド及び／またはポリペプチド修飾（例えば、ポリペプチドの翻訳後修飾）のフラグメントはまた、それらが代替的スプライシングによって生成される転写物もしくは分解転写物に由来しようが、または例えば、タンパク質分解による、ポリペプチドの翻訳後プロセシングに由来しようが、発現したとみなされる。「発現遺伝子」は、ｍＲＮＡとしてポリヌクレオチドに転写され、その後、ポリペプチドに翻訳される遺伝子を含み、ＲＮＡに転写されるが、ポリペプチドに翻訳されない遺伝子（例えば、トランスファーＲＮＡ及びリボソームＲＮＡ）も含む。
【0076】
本明細書で使用する場合、「低酸素状態」という用語は、雰囲気中の酸素濃度が２０．９％を下回る状態を意味する。
「増加した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」、「増加する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」、「向上する（ｅｎｈａｎｃｅ）」、または「活性化する（ａｃｔｉｖａｔｅ）」という用語は全て、本明細書では、統計的に有意な量の増加を意味するように用いられる。いくつかの実施形態では、「増加した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」、「増加する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」、「向上する（ｅｎｈａｎｃｅ）」、または「活性化する（ａｃｔｉｖａｔｅ）」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の増加、または、参照レベルと比較して、少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍、もしくは少なくとも約１０倍、もしくは、２倍～１０倍、もしくはそれ以上の間の任意の増加を意味することができる。マーカー（例えば、アルブミン）の文脈において、「増加する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」とは、このようなレベルでの、統計的に有意な増加である。
「増加した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」、「増加する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」、「向上する（ｅｎｈａｎｃｅ）」、または「活性化する（ａｃｔｉｖａｔｅ）」という用語は全て、本明細書では、統計的に有意な量の増加を意味するように用いられる。いくつかの実施形態では、「増加した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」、「増加する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」、「向上する（ｅｎｈａｎｃｅ）」、または「活性化する（ａｃｔｉｖａｔｅ）」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の増加、または、参照レベルと比較して、少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍、もしくは少なくとも約１０倍、もしくは、２倍～１０倍、もしくはそれ以上の間の任意の増加を意味することができる。マーカー（例えば、アルブミン）の文脈において、「増加する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」とは、このようなレベルでの、統計的に有意な増加である。
【0077】
本明細書で使用する場合、用語「阻害剤」とは、標的タンパク質またはシグナル伝達経路の活性を低下させることができる、自然または合成の、任意の化合物を意味する。阻害剤は、標的タンパク質の活性を、直接的または間接的のいずれかで、弱める、または防止することができる。直接阻害は、例えば、タンパク質に結合し、タンパク質が、内因性分子、例えば、酵素、基質、または他の結合パートナーと相互作用することを防ぐことによって、タンパク質の活性を低下させることにより、得ることができる。例えば、阻害剤は、酵素活性部位に結合し、この位置において、内因性基質の結合を立体的に排除することができ、それによって、タンパク質の酵素活性を低下させる。あるいは、例えば、標的タンパク質の構造変化を誘発する、または、標的タンパク質の化学修飾を触媒することで、標的タンパク質の活性を促進するタンパク質に結合させることにより、間接阻害を得ることができる。例えば、標的タンパク質のリン酸化を触媒し、それ故、標的タンパク質を活性化するキナーゼに結合し、これを不活性化することにより、標的タンパク質の間接阻害を達成することができる。
【0078】
本明細書で使用する場合、「レベル」という用語は、参照と比較したタンパク質のレベルを指す。参照は、本明細書で定義する、任意の有用な参照であり得る。タンパク質の「レベルの減少」及び「レベルの増加」とは、参照と比較したタンパク質レベルの減少または増加（例えば、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１５０％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％もしくはそれ以上の減少もしくは増加；参照と比較した約１０％、約１５％、約２０％、約５０％、約７５％、約１００％、もしくは約２００％を超える減少もしくは増加；約０．０１倍、約０．０２倍、約０．１倍、約０．３倍、約０．５倍、約０．８倍未満もしくはそれ以下の減少もしくは１５増加；または約１．２倍、約１．４倍、約１．５倍、約１．８倍、約２．０倍、約３．０倍、約３．５倍、約４．５倍、約５．０倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約１００倍、約１０００倍超もしくはそれ以上の増加）を意味する。タンパク質のレベルは、質量／体積（例えば、ｇ／ｄＬ、ｍｇ／ｍＬ、μｇ／ｍＬ、またはｎｇ／ｍＬ）または試料中の総タンパク質に対するパーセンテージで表され得る。
【0079】
本明細書で使用する場合、「マーカー」という用語は、本明細書において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、炭水化物、または糖脂質系分子マーカーを指すために互換的に使用され、細胞試料中でのその発現または存在は、標準的な方法（または本明細書に開示される方法）によって検出することができる。このようなマーカーの発現は、上記組成物または方法で処理されていない、未増殖及び／または未成熟のＰＨＨの集団と比較して、開示した組成物を用いて、及び／または、開示した方法に従い、増殖した及び／または成熟したＰＨＨの集団において、高いまたは低いことを測定することができる。
【0080】
本明細書で使用する場合、「成熟すること」という用語は、細胞を、前駆細胞集団とは異なる集団に成長させるプロセスを意味する。例えば、場合によっては、本明細書で開示する成熟ステップを受けた肝細胞の集団は、成熟した肝細胞表現型（例えば、遺伝子発現分析（例えば、成熟肝細胞と関連する転写物の上方制御、及び、前駆細胞／胆管細胞と関連する転写物の下方制御）、肝細胞機能アッセイ（例えば、尿素分泌、ＣＹＰ３Ａ４活性）により評価される）を有する。
【0081】
本明細書で使用する場合、「１つ以上の」、または「少なくとも１つの」という用語、例えば、メンバーの群の、１つ以上の、または、少なくとも１つのメンバーは、さらなる例示によって、それ自体明確であり、この用語はとりわけ、上記メンバーのいずれか１つ、または、上記メンバーのいずれか２つ以上、例えば、上記メンバーの３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、もしくは７つ以上など、及び、上記メンバーの全て以下への言及を包含する。
【0082】
本明細書で使用する場合、「薬学的製剤」という用語は、本明細書に記載の方法に従い増殖及び／または成熟した、薬学的に許容される賦形剤と共に製剤化された、ならびに、対象における疾患の処置のために、治療レジメンの一部として、政府監督機関の認可を受けて製造または販売された、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）の集団を含有する組成物を表す。
【0083】
「初代細胞」及び「初代培養物」は、本明細書では同じ意味で用いられ、ヒトの肝臓から回収され、いかなる時間もｉｎ ｖｉｔｒｏ培養されずに、速やかに凍結保存された、細胞及び細胞培養物を意味する。細胞は、生検、または、提供された肝臓全体からの単離などの、任意の便利な方法により、個体から回収することができる。適切な溶液を、回収した細胞を分散または懸濁するために用いることができる。細胞を速やかに用いることができるか、または、これらを、長期間にわたって保管、凍結し、解凍して再利用することができる。このような場合、細胞は通常、１０％のＤＭＳＯ、５０％の血清、４０％の緩衝培地、または、このような凍結温度において細胞を保存するために当該技術分野において一般的に用いられる、いくつかの他の溶液において凍結され、凍結した培養細胞を解凍するために、当該技術分野において一般的に周知の方法で解凍される。
【0084】
本明細書で使用する場合、「初代ヒト肝細胞」（または、「ＰＨＨ」）という用語は、肝臓内の、主要な実質細胞を意味する。具体的には、これらの細胞はヒト由来であり、肝臓の損傷に応じて複製し、細胞数を増加させる能力を有する。このような細胞は、ＨＮＦ４α、アルブミン、及び、ＣＹＰ遺伝子ファミリーのメンバーから選択される、１つ以上の遺伝子を発現することが、当該技術分野において周知である。このような細胞は、ＡＦＰ遺伝子を発現しないこともまた、知られている。このような細胞は、限定されるものではないが、ＨＮＦ４α、アルブミン、Ａ１ＡＴ、トランスフェリン、及び尿素を含むタンパク質を発現することもまた、当該技術分野においてさらに知られている。
【0085】
本明細書で使用する場合、「受容体型チロシンキナーゼリガンド」という用語は、受容体型チロシンキナーゼに結合可能な、自然または組換えの、任意の化合物を意味する。このようなリガンドとしては、自然及び組換えの上皮増殖因子（ＥＧＦ）、自然及び組換えの線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、自然及び組換えの肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ならびに、自然及び組換えのトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0086】
本明細書で使用する場合、「レシピエント」という用語は、例えば、実験、診断、予防、及び／または治療の目的で、本発明による組成物が投与され得る任意の生物を指す。典型的な対象として、任意の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及びヒトなどの哺乳類）が挙げられる。対象は、処置を求めているかもしくは必要としている対象、処置が必要である対象、処置を受けている対象、将来治療を受けることになっている対象、あるいは特定の疾患もしくは病気について訓練を受けた専門家に管理されているヒトもしくは動物であり得る。好ましい実施形態では、対象はヒトである。
【0087】
本明細書で使用する場合、「血清代替成分」という用語は、無血清培地に存在する成分を意味する。
本明細書で使用する場合、トランスフォーミング増殖因子β「（ＴＧＦβ）阻害剤」とは、ＳＭＡＤ転写同時活性化タンパク質の活性によって転写される１つ以上の遺伝子の転写を弱める、または防ぐことができる物質（例えば、低分子、タンパク質、干渉ＲＮＡ、または、他の自然もしくは合成の化合物）を意味する。ＴＧＦβ阻害剤は、経路内の１つ以上の箇所において、ＳＭＡＤにより誘発された遺伝子転写をもたらすシグナル形質導入カスケードを破壊することができる。例えば、ＴＧＦβ阻害剤は、ＴＧＦβまたはＴＧＦβスーパーファミリーリガンド、例えば、アクチビン、インヒビン、ノーダル、レフティ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、増殖及び分化因子（ＧＤＦ）、または、ミュラー管阻害因子（ＭＩＦ）が、その内因性受容体に結合することを妨げ、または防止し、それによって、受容体関連ＳＭＡＤタンパク質のリン酸化及び活性化を阻害することができる。ＴＧＦβ経路阻害剤は、例えば、ＳＭＡＤタンパク質に結合し、ＳＭＡＤタンパク質とヌクレオポリンの相互作用を防止する、または妨げることにより、１つ以上のＳＭＡＤタンパク質の、核への転座を防止することによって、機能することができる。ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害剤は、１つ以上のＳＭＡＤタンパク質と、受容体活性化のためのＳＭＡＤアンカー（ＳＡＲＡ）との相互作用を安定化することができ、これによって、細胞質でＳＭＡＤタンパク質を隔離し、ＳＭＡＤタンパク質が核に転座することを防止する。ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害剤の他の例としては、ＳＭＡＤタンパク質に結合し、ＳＭＡＤタンパク質を、ＤＮＡ結合転写因子から隔離することで、標的遺伝子の転写を防止する、ニューロジェニンなどの物質が挙げられる。ＴＧＦβシグナル伝達経路の代替阻害剤としては、１つ以上のＳＭＡＤタンパク質のユビキチン化を促進することで、プロテアソームによって分解用タンパク質をマーキングし、標的遺伝子の転写を防止する物質が挙げられる。ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害剤の阻害活性を測定するために使用可能な、例示的なアッセイとしては、限定されるものではないが、とりわけ、電気泳動移動度シフトアッセイ、抗体スーパーシフトアッセイ、加えてＴＧＦβ誘発性遺伝子レポーターアッセイが挙げられる。
本明細書で使用する場合、トランスフォーミング増殖因子β「（ＴＧＦβ）阻害剤」とは、ＳＭＡＤ転写同時活性化タンパク質の活性によって転写される１つ以上の遺伝子の転写を弱める、または防ぐことができる物質（例えば、低分子、タンパク質、干渉ＲＮＡ、または、他の自然もしくは合成の化合物）を意味する。ＴＧＦβ阻害剤は、経路内の１つ以上の箇所において、ＳＭＡＤにより誘発された遺伝子転写をもたらすシグナル形質導入カスケードを破壊することができる。例えば、ＴＧＦβ阻害剤は、ＴＧＦβまたはＴＧＦβスーパーファミリーリガンド、例えば、アクチビン、インヒビン、ノーダル、レフティ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、増殖及び分化因子（ＧＤＦ）、または、ミュラー管阻害因子（ＭＩＦ）が、その内因性受容体に結合することを妨げ、または防止し、それによって、受容体関連ＳＭＡＤタンパク質のリン酸化及び活性化を阻害することができる。ＴＧＦβ経路阻害剤は、例えば、ＳＭＡＤタンパク質に結合し、ＳＭＡＤタンパク質とヌクレオポリンの相互作用を防止する、または妨げることにより、１つ以上のＳＭＡＤタンパク質の、核への転座を防止することによって、機能することができる。ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害剤は、１つ以上のＳＭＡＤタンパク質と、受容体活性化のためのＳＭＡＤアンカー（ＳＡＲＡ）との相互作用を安定化することができ、これによって、細胞質でＳＭＡＤタンパク質を隔離し、ＳＭＡＤタンパク質が核に転座することを防止する。ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害剤の他の例としては、ＳＭＡＤタンパク質に結合し、ＳＭＡＤタンパク質を、ＤＮＡ結合転写因子から隔離することで、標的遺伝子の転写を防止する、ニューロジェニンなどの物質が挙げられる。ＴＧＦβシグナル伝達経路の代替阻害剤としては、１つ以上のＳＭＡＤタンパク質のユビキチン化を促進することで、プロテアソームによって分解用タンパク質をマーキングし、標的遺伝子の転写を防止する物質が挙げられる。ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害剤の阻害活性を測定するために使用可能な、例示的なアッセイとしては、限定されるものではないが、とりわけ、電気泳動移動度シフトアッセイ、抗体スーパーシフトアッセイ、加えてＴＧＦβ誘発性遺伝子レポーターアッセイが挙げられる。
【0088】
本明細書で使用する場合、「Ｗｎｔシグナル伝達活性化因子」とは、標準的なＷｎｔシグナル伝達経路のアゴニストを意味する。この経路のアゴニストは、哺乳動物細胞の核内のβ－カテニンの濃度増加を促進する方法で、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ及びＬＲＰ５６共受容体タンパク質に直接結合する、Ｗｎｔタンパク質または他の化合物をさらに含む。Ｗｎｔシグナル伝達活性化因子としては、Ｗｎｔ－３ａ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）が挙げられるが、これに限定されない。あるいは、Ｗｎｔ経路アゴニストは、Ｗｎｔタンパク質に結合し、これを内因性Ｗｎｔ共受容体から隔離する、１種以上の分泌されたＦｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ＳＦＲＰ）またはＷｎｔ阻害タンパク質（ＷＩＦ）を阻害することにより機能することができる。これらのＷｎｔシグナル伝達活性化因子は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄとは独立してＷｎｔシグナル伝達を刺激することにより、標準的でないＷｎｔシグナル伝達経路を活性化する分子を含むことができる。標準的でないＷｎｔシグナル伝達活性化因子は、好ましくは、ＬＧＲ５細胞表面受容体を介して、Ｗｎｔ経路を刺激する。周知のＬＧＲ５アゴニストとしては、ルーフプレート特異的スポンジン（Ｒ－スポンジン）タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【0089】
詳細な説明
本開示は、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）の、２次元増殖及び３次元凝集に使用可能な組成物及び方法を提供する。本明細書に記載する組成物及び方法に従うと、レシピエント（例えば、ヒト）に、増殖したＰＨＨの集団を移植することができる。ＰＨＨを増殖するための、開示された方法は、ロバストで広範に適用可能な培養増殖をもたらす。さらに、これらの方法は、ドナーＰＨＨにおける拘束性の年齢制限により限定されず、それによって、適格なＰＨＨドナーのプールを拡張し、ドナーＰＨＨの不足を上手く軽減する。
本開示は、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）の、２次元増殖及び３次元凝集に使用可能な組成物及び方法を提供する。本明細書に記載する組成物及び方法に従うと、レシピエント（例えば、ヒト）に、増殖したＰＨＨの集団を移植することができる。ＰＨＨを増殖するための、開示された方法は、ロバストで広範に適用可能な培養増殖をもたらす。さらに、これらの方法は、ドナーＰＨＨにおける拘束性の年齢制限により限定されず、それによって、適格なＰＨＨドナーのプールを拡張し、ドナーＰＨＨの不足を上手く軽減する。
【0090】
本発明は、少なくとも部分的には、既存の細胞培養培地配合物と比較して、ＰＨＨを、より多くの継代数にわたって培養することができるようになる、ヒト細胞用の基礎培地、１つ以上のＷｎｔシグナル伝達活性化因子、１つ以上の受容体型チロシンキナーゼリガンド、１つ以上の上皮表現型安定化剤、及び、任意選択的に、１種以上の細胞生残剤、または１種以上の細胞増殖剤を含む、完全に規定された培養条件の発見に基づく。規定された培養条件は、血清代替成分（例えば、ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清代替物（ＫＯＳＲ））の存在、及び／または、低酸素条件下での培養を含むことができる。完全に規定された、ゼノフリー培養条件は、以前の方法を用いてはできなかった、より多くの細胞を有利に、単一の開始細胞から、または、開始細胞のまとまりから入手することを可能にする、ＰＨＨの、大規模でロバストな、２次元増殖もまたもたらす。これらの利点によって、治療目的のための（例えば、自然の肝機能を補充または回復するための）、ドナー細胞の利用可能性を増加させることが可能となる。
【0091】
本開示はまた、ＰＨＨの成熟に使用可能な組成物及び方法を提供する。本明細書に記載する組成物及び方法に従うと、レシピエント（例えば、ヒト）に、成熟した肝細胞の集団を移植することができる。ＰＨＨを成熟させる、開示された方法は、ロバストで広範に適用可能な細胞成熟をもたらす。
【0092】
本発明は、少なくとも部分的には、肝細胞を個別の集団に成熟させる、１種以上の肝細胞成熟サプリメントを含む、ヒト細胞用の基礎培地、ならびに、任意選択的に、１種以上のサプリメントを取り除き、細胞増殖及び／または前駆細胞表現型を防ぐことを含む、ＰＨＨを成熟させるための、完全に規定された培養条件の発見に基づく。
【0093】
いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上のＷｎｔシグナル伝達活性化因子、１つ以上の受容体型チロシンキナーゼリガンド、及び、１つ以上の上皮安定化剤が添加されるヒト細胞用基礎培地を含む増殖培地の存在下で、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と接触させて、１つ以上のＰＨＨを培養することを含む。
【0094】
いくつかの実施形態では、増殖培地は、１つ以上のＷｎｔシグナル伝達活性化因子、１つ以上の受容体型チロシンキナーゼリガンド、１つ以上の上皮安定化剤、及び、１種以上の細胞生残剤が添加されるヒト細胞用基礎培地を含む。
【0095】
いくつかの実施形態では、増殖培地は、１つ以上のＷｎｔシグナル伝達活性化因子、１つ以上の受容体型チロシンキナーゼリガンド、１つ以上の上皮安定化剤、及び、１種以上の細胞増殖剤が添加されるヒト細胞用基礎培地を含む。
【0096】
いくつかの実施形態では、増殖培地は、１つ以上のＷｎｔシグナル伝達活性化因子、１つ以上の受容体型チロシンキナーゼリガンド、１つ以上の上皮安定化剤、１種以上の細胞生残剤、及び、１種以上の細胞生残剤が添加されるヒト細胞用基礎培地を含む。
【0097】
いくつかの実施形態では、成熟培地は、１つ以上の成熟サプリメントが添加されるヒト細胞用基礎培地を含む。
いくつかの実施形態では、成熟培地は、細胞増殖を促進する１つ以上のサプリメントを含まない。例えば、増殖培地と比較して、本明細書で開示する成熟培地は、細胞増殖を促進する１つ以上のサプリメントを欠く場合がある。
いくつかの実施形態では、成熟培地は、細胞増殖を促進する１つ以上のサプリメントを含まない。例えば、増殖培地と比較して、本明細書で開示する成熟培地は、細胞増殖を促進する１つ以上のサプリメントを欠く場合がある。
【0098】
いくつかの実施形態では、成熟培地は、前駆細胞表現型を促進する１つ以上のサプリメントを含まない。例えば、増殖培地と比較して、本明細書で開示する成熟培地は、前駆細胞表現型を促進する１つ以上のサプリメントを欠く場合がある。
【0099】
肝細胞
本明細書に記載する組成物及び方法のいくつかの態様では、肝細胞はＰＨＨである。いくつかの実施形態では、本明細書で開示する増殖方法でＰＨＨを培養することによって、肝臓表現型を維持しながら、細胞の増殖が可能となる。いくつかの実施形態では、増殖法を用いて形成した、増殖したＰＨＨの集団は、肝臓幹細胞、または、前駆細胞様の細胞を含む。いくつかの態様では、方法は、増殖したＰＨＨの集団を成熟させることをさらに含む。
本明細書に記載する組成物及び方法のいくつかの態様では、肝細胞はＰＨＨである。いくつかの実施形態では、本明細書で開示する増殖方法でＰＨＨを培養することによって、肝臓表現型を維持しながら、細胞の増殖が可能となる。いくつかの実施形態では、増殖法を用いて形成した、増殖したＰＨＨの集団は、肝臓幹細胞、または、前駆細胞様の細胞を含む。いくつかの態様では、方法は、増殖したＰＨＨの集団を成熟させることをさらに含む。
【0100】
いくつかの実施形態では、ＰＨＨは、成熟組織から入手される。いくつかの実施形態では、ＰＨＨは、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化されている肝細胞株に由来しない。いくつかの実施形態では、ＰＨＨは、初代肝細胞である、または、これに由来する。
【0101】
ＰＨＨは、任意の好適な方法によって入手することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、実施例、及びＤｏｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００８（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２００８ ４８：１２８２－９１）に記載されているように、コラゲナーゼ消化により単離される。いくつかの実施形態では、コラゲナーゼ消化は、組織生検で行われる。いくつかの実施形態では、コラゲナーゼ及びアクターゼ消化を用いて、ＰＨＨを入手する。
【0102】
ＰＨＨは肝臓に存在する。いくつかの実施形態では、方法は、肝臓上皮を含む組織のフラグメントを培養することを含む。いくつかの実施形態では、ＰＨＨは、組織フラグメントから単離される。例えば、肝臓の文脈において、組織フラグメントは、肝臓胆管、または、胆管組織を含むことができる。肝臓ＰＨＨは、ＦＡＣＳ系ソーティングを用いて、ＥｐＣＡＭ＋前駆細胞を除外することで、正常な肝組織から単離される。いくつかの実施形態では、正常な肝組織から単離したＰＨＨは、ＥｐＣＡＭ＋前駆細胞を含有することができる。
【0103】
別の一実施形態では、本発明の細胞は、当該技術分野において周知の分離法である、イムノアフィニティ精製により単離することができる。単に例示として、本発明の細胞は、ｃ－キットに対して向けられるイムノアフィニティ精製により単離することができる。当業者には明らかなように、本方法は、精製カラムでの抗体の不動化に依存する。次に、細胞試料をカラムにロードし、適切な細胞が抗体により結合され、それ故に、カラムに結合されることが可能となる。洗浄ステップの後、不動化された抗ｃ－キット抗体に優先的に結合し、細胞の、カラムからの放出を可能にする競合剤を用いて、細胞をカラムから溶出する。
【0104】
いくつかの実施形態では、細胞は、単離後に、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０日、少なくとも約２５日、または、少なくとも約３０日の間、培養することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、単離後に、少なくとも約５日間培養することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、単離後に、少なくとも約１０日間培養することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、単離後に、少なくとも約１５日間培養することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、単離後に、少なくとも約２０日間培養することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、単離後に、少なくとも約２５日間培養することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、単離後に、少なくとも約２５日間培養することができる。
【0105】
ある特定の態様では、細胞を培養液で、より長い時間増殖させ、細胞集団での細胞表現型の均質性を改善する、または、増殖した細胞の細胞状態を安定化させる。
いくつかの実施形態では、細胞集団は、出発点、例えば、上述した肝臓フラグメントに含有される細胞の集団として、用いることができる。したがって、本発明の方法は、出発点として単一細胞を用いることに限定されない。
いくつかの実施形態では、細胞集団は、出発点、例えば、上述した肝臓フラグメントに含有される細胞の集団として、用いることができる。したがって、本発明の方法は、出発点として単一細胞を用いることに限定されない。
【0106】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法を用いて、増殖培地でＰＨＨを培養することを含む、増殖したＰＨＨの集団を入手する方法が提供される。
いくつかの実施形態では、方法は、ＰＨＨを培養すること、または、単一細胞から、増殖したＰＨＨの集団を入手することを含む。有利には、これによって、細胞の均質な集団が形成可能となる。いくつかの実施形態では、方法は、３～１２０日（例えば、４～１１９日、５～１１８日、１０～１１７日、１５～１１６日、２０～１１５日、３０～１００日、４０～９０日、５０～８０日、６０～７０日、または６５日）間、本発明の増殖培地でＰＨＨを培養し、その後、細胞を単一細胞密度に解離させ、容器当たり（例えば、ウェルあたり）１個の細胞の比率で、１つ以上の細胞を播種し、本発明の増殖培地を用いて細胞を増殖させることを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、ＰＨＨを培養すること、または、単一細胞から、増殖したＰＨＨの集団を入手することを含む。有利には、これによって、細胞の均質な集団が形成可能となる。いくつかの実施形態では、方法は、３～１２０日（例えば、４～１１９日、５～１１８日、１０～１１７日、１５～１１６日、２０～１１５日、３０～１００日、４０～９０日、５０～８０日、６０～７０日、または６５日）間、本発明の増殖培地でＰＨＨを培養し、その後、細胞を単一細胞密度に解離させ、容器当たり（例えば、ウェルあたり）１個の細胞の比率で、１つ以上の細胞を播種し、本発明の増殖培地を用いて細胞を増殖させることを含む。
【0107】
例えば、いくつかの実施形態では、方法は、３～１２０日間、本発明の増殖培地でＰＨＨを培養することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、４～１１９日間、本発明の増殖培地でＰＨＨを培養することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、５～１１８日間、本発明の増殖方法でＰＨＨを培養することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、１０～１１７日間、本発明の増殖方法でＰＨＨを培養することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、１５～１１６日間、本発明の増殖方法でＰＨＨを培養することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、２０～１１５日間、本発明の増殖方法でＰＨＨを培養することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、３０～１００日間、本発明の増殖方法でＰＨＨを培養することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、４０～９０日間、本発明の増殖方法でＰＨＨを培養することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、５０～８０日間、本発明の増殖方法でＰＨＨを培養することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、６０～７０日間、本発明の増殖方法でＰＨＨを培養することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、６５日間、本発明の増殖方法でＰＨＨを培養することを含む。
【0108】
いくつかの実施形態では、培養ステップは、プレーティングした細胞を増殖させること（ステップＰ０）と、増殖した細胞を初回継代すること（ステップＰ１）と、を含む。
いくつかの実施形態では、Ｐ０ステップは、７～１６日（例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６日）の継続期間を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ０ステップは、１１日の継続期間を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ０ステップは、１３日の継続期間を有する。
いくつかの実施形態では、Ｐ０ステップは、７～１６日（例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６日）の継続期間を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ０ステップは、１１日の継続期間を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ０ステップは、１３日の継続期間を有する。
【0109】
いくつかの実施形態では、Ｐ１ステップは、７～２０日（例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０日）の継続期間を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ１ステップは、１１日の継続期間を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ１ステップは、１３日の継続期間を有する。
【0110】
いくつかの実施形態では、Ｐ０ステップは、肝細胞を、２００～１３，３３３細胞／ｃｍ２、例えば、２００細胞／ｃｍ２～１，０００細胞／ｃｍ２（例えば、２００細胞／ｃｍ２、３００細胞／ｃｍ２、４００細胞／ｃｍ２、５００細胞／ｃｍ２、６００細胞／ｃｍ２、７００細胞／ｃｍ２、８００細胞／ｃｍ２、９００細胞／ｃｍ２、もしくは１，０００細胞／ｃｍ２）、１，０００細胞／ｃｍ２～１０，０００細胞／ｃｍ２（例えば、１，０００細胞／ｃｍ２、２，０００細胞／ｃｍ２、３，０００細胞／ｃｍ２、４，０００細胞／ｃｍ２、５，０００細胞／ｃｍ２、６，０００細胞／ｃｍ２、７，０００細胞／ｃｍ２、８，０００細胞／ｃｍ２、９，０００細胞／ｃｍ２、もしくは１０，０００細胞／ｃｍ２）、または、１０，０００細胞／ｃｍ２～１３，３３３細胞／ｃｍ２（例えば、１０，０００細胞／ｃｍ２、１１，０００細胞／ｃｍ２、１２，０００細胞／ｃｍ２、１３，０００細胞／ｃｍ２、もしくは１３，３３３細胞／ｃｍ２）の密度で播種することを含む。いくつかの実施形態では、Ｐ０ステップは、６６７細胞／ｃｍ２の密度で肝細胞を播種することを含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１ステップは、３３３～１３，３３３細胞／ｃｍ２の密度で肝細胞を播種することを含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１ステップは、１，３３３細胞／ｃｍ２の密度で肝細胞を播種することを含む。
【0111】
いくつかの実施形態では、ＰＨＨを、約５％二酸化炭素の存在下で培養する。いくつかの実施形態では、ＰＨＨを、約３７℃の温度で培養する。いくつかの実施形態では、ＰＨＨを低酸素条件で培養する。
【0112】
有利には、本発明により提供される培養法を用いることで、増殖した細胞の分子特性決定により測定されるように、細胞を長期間培養したときに、肝細胞が非腫瘍形成性のままで形成される細胞集団がもたらされる。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のＰＨＨの集団は、本発明の増殖培地で、４ヶ月以上（例えば、５、６、７、または８ヶ月）培養した後に、増殖した細胞の分子特性決定により測定されるように、非腫瘍形成性のままである。例えば、いくつかの実施形態では、本発明のＰＨＨの集団は、本発明の増殖培地で、５ヶ月培養した後に、増殖した細胞の分子特性決定により測定されるように、非腫瘍形成性のままである。いくつかの実施形態では、本発明のＰＨＨの集団は、本発明の増殖培地で、６ヶ月培養した後に、増殖した細胞の分子特性決定により測定されるように、非腫瘍形成性のままである。いくつかの実施形態では、本発明のＰＨＨの集団は、本発明の増殖培地で、７ヶ月培養した後に、増殖した細胞の分子特性決定により測定されるように、非腫瘍形成性のままである。いくつかの実施形態では、本発明のＰＨＨの集団は、本発明の増殖培地で、８ヶ月培養した後に、増殖した細胞の分子特性決定により測定されるように、非腫瘍形成性のままである。
【0113】
培養後に、方法は、１つ以上のＰＨＨを入手すること、及び／または単離することをさらに含むことができる。例えば、ＰＨＨの培養後に、その後の用途で用いるために、増殖培地で培養した１つ以上のＰＨＨを培養培地から取り除くことが有用であり得る。例えば、本発明の増殖培地を用いて培養するために、単一細胞を単離することが有用であり得る。あるいは、本発明の増殖培地を用いて培養するために、細胞の集団を入手することが有用であり得る。
【0114】
本発明の増殖したＰＨＨの集団は、好ましくは、少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、または９０％）の生存細胞を含む。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の増殖したＰＨＨの集団は、好ましくは、少なくとも６０％の生存細胞を含む。いくつかの実施形態では、本発明の増殖したＰＨＨの集団は、好ましくは、少なくとも７０％の生存細胞を含む。いくつかの実施形態では、本発明の増殖したＰＨＨの集団は、好ましくは、少なくとも８０％の生存細胞を含む。いくつかの実施形態では、本発明の増殖したＰＨＨの集団は、好ましくは、少なくとも９０％の生存細胞を含む。細胞の生存能は、ＦＡＣＳでのＨｏｅｃｈｓｔ染色またはヨウ化プロピジウム染色を用いて評価することができる。
【0115】
いくつかの実施形態では、本発明のＰＨＨの、１つ以上の凍結集団が提供される。ＰＨＨ培養物の増殖した集団を解離させ、これらを、回収細胞培養物凍結培地（Ｇｉｂｃｏ）またはＣｒｙｏＳｔｏｒ（Ｂｉｏｌｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）などの凍結培地と混合し、標準的な手順に従い凍結させることを含む、凍結のために、増殖したＰＨＨの集団を調製する方法もまた提供する。凍結したＰＨＨを解凍し、解凍したＰＨＨをＥＣＭ（例えば、コラーゲンＩ、またはラミニン５２１）に埋め込み、本発明の増殖培地でＰＨＨを培養することを含む、凍結したＰＨＨを解凍する方法もまた提供する。
【0116】
いくつかの実施例では、まず、培地を解凍した後に、Ｙ－２７６３２、例えば、約１０μＭのＹ－２７６３２を補充することができる。いくつかの実施形態では、培養培地に、解凍後、最初の１、２、３、４、５日間、またはそれ以下の日数の間、好ましくは、最初の３または４日間、Ｙ－２７６３２を補充する。いくつかの実施形態では、Ｙ－２７６３２は、最初の３、４、５、６日、またはそれ以上の日数後、好ましくは、最初の３または４日後には、培養培地に存在しない。この解凍法は、本発明のＰＨＨを増殖させるために用いることができる。その他の実施例では、Ｙ－２７６３２などのＲＯＣＫ阻害剤が存在しない場合がある。
【0117】
本明細書に記載の方法により産生された細胞を、速やかに用いることができる。あるいは、細胞を、液体窒素温度で凍結し、長期間保管し、解凍し、再利用することができる。例えば、細胞は、１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５０％の血清、４０％の緩衝培地、または、このような凍結温度において細胞を保存するために当該技術分野において一般的に用いられるいくつかの他のこのような溶液において、凍結され、凍結した培養細胞を解凍するために当該技術分野において一般的に周知の方法で解凍することができる。
【0118】
いくつかの実施形態では、細胞は、１週間で、２より大きい（例えば、３、４、５、１０、２０、３０）の集団倍化速度で増殖する。例えば、いくつかの実施形態では、細胞は、１週間に３より大きい集団倍化速度で増殖する。いくつかの実施形態では、細胞は、１週間に４より大きい集団倍化速度で増殖する。いくつかの実施形態では、細胞は、１週間に５より大きい集団倍化速度で増殖する。いくつかの実施形態では、細胞は、１週間に１０より大きい集団倍化速度で増殖する。いくつかの実施形態では、細胞は、１週間に２０より大きい集団倍化速度で増殖する。いくつかの実施形態では、細胞は、１週間に３０より大きい集団倍化速度で増殖する。
【0119】
いくつかの実施形態では、方法は、培地の構成成分が、培養中に使い切られるため、培養過程中に、培地を、新しい培地に交換することを含むことができる。培地を、新しい培地に交換する必要がある頻度は、当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態では、培地は２日に１回交換するが、毎日、または、３日に１回、または必要に応じて交換可能であることもまた、想到される。
【0120】
増殖培地は、好ましくは、少なくとも５（例えば、少なくとも５、１０、２５、５０、または１００）日の培養中に、細胞の生残及び／または増殖を誘発する、または促進する。例えば、いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも１０日（例えば、少なくとも２５日）間、細胞の生残及び／または増殖を誘発する、または促進する。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも２５日間、細胞の生残及び／または増殖を誘発する、または促進する。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも５０日間、細胞の生残及び／または増殖を誘発する、または促進する。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも１００日間、細胞の生残及び／または増殖を誘発する、または促進する。
【0121】
増殖は、ＢｒｄＵ染色、Ｅｄｕ染色、Ｋｉ６７染色などの、当該技術分野において周知の技術を使用して評価することができ、増殖曲線アッセイを使用することができる。例えば、２次元細胞培養に適した細胞培養容器で、凍結したＰＨＨのｃｍ２当たり、２００～１０００細胞で解凍してプレーティングした後に、継代０（Ｐ０）において、少なくとも１０倍（例えば、少なくとも１５倍、２０倍、または３０倍）の、細胞増殖が達成され、増殖後の細胞収率が、ｃｍ２当たり２×１０３～１０×１０３細胞となる。コンフルエンスに達したら、その後、増殖したＰＨＨを継代し、およそ、少なくとも５００倍（例えば、少なくとも１０００倍）のＰＨＨ増殖が達成されるまで、ｃｍ２当たり２００～１０００細胞、またはこれより高い密度で播種することが可能である。いくつかの実施形態では、コンフルエンスに達したら、その後、およそ１００倍のＰＨＨ増殖が達成されるまで、１：３の比で、増殖したＰＨＨを継代することが可能である。移植用ＰＨＨの入手可能性は深刻な問題を引き起こすため、これは、業界にとって重要である。マウス移植のためには、例えば、最低１０５細胞が必要である。場合によっては、移植を成功させるために、ヒト移植には、１×１０７細胞が必要となり得る。
【0122】
言い換えれば、本発明に従って用いた増殖培地は、ＰＨＨの集団を増殖させて、ＰＨＨの増殖した集団を形成し、適切な条件下で少なくとも６回の継代に対して肝臓表現型を維持する、または、少なくとも５００倍の増殖（例えば、少なくとも１０００倍の増殖）を達成することが可能である。
【0123】
いくつかの実施形態では、培養ステップの後に、ＰＨＨの発現プロファイルは、ＰＨＨの少なくとも１５％（例えば、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、またはそれ以上）による、Ｋｉ６７（即ち、タンパク質）の発現を含む。いくつかの実施形態では、培養ステップの後に、ＰＨＨの発現プロファイルは、ＰＨＨの最大１５％（例えば、最大１０％、５％、４％、３％、２％、または１％）による、Ｋｉ６７の発現を含む。
【0124】
いくつかの実施形態では、培養ステップの後に、ＰＨＨの発現プロファイルは、ＰＨＨの少なくとも１５％（例えば、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、またはそれ以上）による、Ｋｉ６７（即ち、遺伝子）の発現を含む。いくつかの実施形態では、培養ステップの後に、ＰＨＨの発現プロファイルは、ＰＨＨの最大１５％（例えば、最大１０％、５％、４％、３％、２％、または１％）による、Ｋｉ６７の発現を含む。
【0125】
いくつかの実施形態では、培養ステップの後に、肝細胞収率は、１４～２８日以内（例えば、１５～２７日以内、１６～２６日以内、１７～２５日以内、１８～２４日以内、１９～２３日以内、２０～２１日以内、または、２２日以内）の培養で、少なくとも２倍（例えば、少なくとも３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、または３０倍）増大する。
【0126】
いくつかの実施形態では、培養ステップの後に、肝細胞収率は、３０日以内（例えば、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、または１４日以内）の培養で、少なくとも５００倍増大する。いくつかの実施形態では、培養ステップの後に、肝細胞収率は、２４日以内の培養で、少なくとも５００倍増大する。
【0127】
いくつかの実施形態では、培養ステップの後に、肝細胞収率は、３０日以内（例えば、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、または１４日以内）の培養で、５００倍～２０００倍（例えば、１０００倍～２０００倍、例えば、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１，０００倍、１，１００倍、１，２００倍、１，３００倍、１，４００倍、１，５００倍、１，６００倍、１，７００倍、１，８００倍、１，９００倍、または２，０００倍）増大する。いくつかの実施形態では、培養ステップの後に、肝細胞収率は、２４日以内の培養で、５００倍～２０００倍（例えば、１０００倍～２０００倍、例えば、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１，０００倍、１，１００倍、１，２００倍、１，３００倍、１，４００倍、１，５００倍、１，６００倍、１，７００倍、１，８００倍、１，９００倍、または２，０００倍）増大する。
【0128】
いくつかの実施形態では、肝細胞増殖の後に、増殖した肝細胞集団は、１種以上の肝細胞成熟サプリメントが添加されるヒト細胞用の基礎培地を含む成熟培地の存在下で、成熟を受けることができる。いくつかの実施形態では、成熟ステップは、肝細胞増殖の直後に行われる。いくつかの実施形態では、成熟ステップは、肝細胞増殖の直後に続かない。いくつかの実施形態では、成熟ステップは、３～１２日（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２日）の継続期間を有する。いくつかの実施形態では、成熟ステップは７日である。
【0129】
細胞の形態を可視化するための位相差顕微鏡、分泌された尿素及びアルブミンの検出、ならびに、肝細胞成熟マーカーのＲＴ－ｑＰＣＲなどの、当該技術分野において周知の技術を使用して、成熟を評価することができる。
【0130】
Ｗｎｔシグナル伝達活性化因子
本発明の増殖培地は、１つ以上のＷｎｔアゴニストを含む。Ｗｎｔシグナル伝達経路は、通常は、Ｗｎｔファミリーのメンバーなどの、細胞外シグナル伝達分子である、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体、ＬＲＰ、及びＬＧＲを含む細胞表面Ｗｎｔ受容体複合体が活性化される際に生じる一連の事象により規定される。これは、アキシン、ＧＳＫ－３、及びタンパク質ＡＰＣを含むタンパク質の複合体が、細胞内β－カテニンを分解するのを阻害する、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄファミリータンパク質の活性化をもたらす。もたらされた、濃縮された核β－カテニンは、ＴＣＦ／ＬＥＦファミリー転写因子による転写を向上させる。Ｗｎｔアゴニストは、細胞内での、ＴＣＦ／ＬＥＦが媒介する転写を活性化する剤である。それ故、Ｗｎｔアゴニストは、細胞内β－カテニン分解の阻害剤、ＧＳＫ阻害剤（ＣＨＩＲ９９０１など）、及び、ＴＣＦ／ＬＥＦの活性剤などの、Ｗｎｔファミリータンパク質の全てを含む、Ｗｎｔ受容体複合体に結合し、これを活性化する、Ｗｎｔアゴニストから選択される。
本発明の増殖培地は、１つ以上のＷｎｔアゴニストを含む。Ｗｎｔシグナル伝達経路は、通常は、Ｗｎｔファミリーのメンバーなどの、細胞外シグナル伝達分子である、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体、ＬＲＰ、及びＬＧＲを含む細胞表面Ｗｎｔ受容体複合体が活性化される際に生じる一連の事象により規定される。これは、アキシン、ＧＳＫ－３、及びタンパク質ＡＰＣを含むタンパク質の複合体が、細胞内β－カテニンを分解するのを阻害する、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄファミリータンパク質の活性化をもたらす。もたらされた、濃縮された核β－カテニンは、ＴＣＦ／ＬＥＦファミリー転写因子による転写を向上させる。Ｗｎｔアゴニストは、細胞内での、ＴＣＦ／ＬＥＦが媒介する転写を活性化する剤である。それ故、Ｗｎｔアゴニストは、細胞内β－カテニン分解の阻害剤、ＧＳＫ阻害剤（ＣＨＩＲ９９０１など）、及び、ＴＣＦ／ＬＥＦの活性剤などの、Ｗｎｔファミリータンパク質の全てを含む、Ｗｎｔ受容体複合体に結合し、これを活性化する、Ｗｎｔアゴニストから選択される。
【0131】
いくつかの実施形態では、Ｗｎｔアゴニストは、以下のリストから選択される、分泌された糖タンパク質である：Ｗｎｔ－Ｉ／Ｉｎｔ－１、Ｗｎｔ－２／Ｉｒｐ（ＩｎＭ関連タンパク質）、Ｗｎｔ－２ｂ／１３、Ｗｎｔ－３／Ｉｎｔ－４、Ｗｎｔ－３ａ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｗｎｔ－４、Ｗｎｔ－５ａ、Ｗｎｔ－５ｂ、Ｗｎｔ－６（Ｋｉｒｉｋｏｓｈｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍ ２８３ ７９８－８０５）、Ｗｎｔ－７ａ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｗｎｔ－７ｂ、Ｗｎｔ－８ａ／８ｄ、Ｗｎｔ－８ｂ、Ｗｎｔ－９ａ／１４、Ｗｎｔ－９ｂ／１４ｂ／１５、Ｗｎｔ－１０ａ、Ｗｎｔ－１０ｂ／１２、ＷｎＭＩ、及びＷｎｔ－１６。ヒトＷｎｔタンパク質の概要は、“ＴＨＥ ＷＮＴ ＦＡＭＩＬＹ ＯＦ ＳＥＣＲＥＴＥＤ ＰＲＯＴＥＩＮＳ，”Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔａｌｏｇ，２００４で提供される。
【0132】
増殖培地中のＷｎｔアゴニストは、好ましくは、ＬＧＲ５細胞表面受容体によりＷｎｔ経路を刺激することができる、任意のアゴニストであり、例えば、一実施形態では、増殖培地中のＷｎｔアゴニストは、ＬＧＲ５アゴニストである。周知のＬＧＲ５アゴニストとしては、Ｒ－スポンジン、そのフラグメント及び誘導体、ならびに、抗ＬＧＲ５抗体が挙げられる（例えば、ＷＯ２０１２／１４０２７４、及びＤｅ Ｌａｕ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１１ Ｊｕｌ．４；４７６（７３６０）：２９３－７を参照されたい）。好ましいＬＧＲ５アゴニストは、Ｒ－スポンジンである。任意の好適なＲ－スポンジン、例えば、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、Ｒ－スポンジン４、またはこれらの誘導体を含む一覧から選択されるいずれかを、使用することができる。例えば、Ｒ－スポンジン１（ＮＵ２０６，Ｎｕｖｅｌｏ，Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｒ－スポンジン２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｒ－スポンジン３、及び、Ｒ－スポンジン４のいずれかを使用することができる。
【0133】
Ｗｎｔアゴニストは、好ましくは、細胞内でＷｎｔ活性を刺激するのに効果的な量で、培地に添加される。当業者には周知であるように、Ｗｎｔ活性は、例えば、ｐＴＯＰＦＬＡＳＨ及びｐＦＯＰＦＬＡＳＨ Ｔｃｆルシフェラーゼレポーター構築物により、Ｗｎｔの転写活性を測定することにより決定することができる（Ｋｏｒｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９９７．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：１７８４－１７８７）。
【0134】
いくつかの実施形態では、分泌された糖タンパク質Ｗｎｔアゴニストは、Ｗｎｔ３ａである。本発明の増殖培地は、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ（例えば、少なくとも５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、または１０μｇ／ｍＬ）を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、培地は、少なくとも５０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａを含む。いくつかの実施形態では、培地は、少なくとも１００ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａを含む。いくつかの実施形態では、培地は、少なくとも１μｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａを含む。いくつかの実施形態では、培地は、少なくとも１０μｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａを含む。
【0135】
いくつかの実施形態では、ＬＧＲ５アゴニストは、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、またはＲ－スポンジン４から選択される。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬ（例えば、少なくとも５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、または５μｇ／ｍＬ）のＲ－スポンジンを含む。例えば、いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも５０ｎｇ／ｍＬのＲ－スポンジンを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも１００ｎｇ／ｍＬのＲ－スポンジンを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも１μｇ／ｍＬのＲ－スポンジンを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも５μｇ／ｍＬのＲ－スポンジンを含む。
【0136】
いくつかの実施形態では、ＰＨＨの培養中に、１つ以上のＷｎｔアゴニストを、必要なときに、例えば、毎日、または２日に１回、培養培地に添加することができる。Ｗｎｔアゴニストは、好ましくは、２日に１回、培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔアゴニストは、培地を細胞に添加する前に、培養培地と混合することができる。
【0137】
受容体型チロシンキナーゼリガンド
本明細書に記載する受容体型チロシンキナーゼリガンドは、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、及びトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）を含み、好ましくは、全て増殖培地に存在する。多くの受容体型チロシンキナーゼリガンドは、分裂促進性増殖因子である。
本明細書に記載する受容体型チロシンキナーゼリガンドは、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、及びトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）を含み、好ましくは、全て増殖培地に存在する。多くの受容体型チロシンキナーゼリガンドは、分裂促進性増殖因子である。
【0138】
ＥＧＦは、その受容体である上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合することで、細胞増殖及び分化を刺激するタンパク質である。
ＦＧＦファミリーメンバーは、広範な分裂促進性及び細胞生残活性を有し、胚発生、細胞増殖、形態形成、組織修復、腫瘍増殖、及び浸潤を含む、様々な生物学的プロセスに関与する。ＦＧＦは、細胞表面線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦＲ）と相互作用することで、細胞を刺激する。４つの、密接に関連した受容体（ＦＧＦＲ１～ＦＧＦＲ４）が、同定されている。大部分のＦＧＦは、２つ以上の受容体に結合する（Ｏｒｎｉｔｚ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８ Ｆｅｂ．２７；２７３（９）：５３４９－５７）に結合する。しかし、線維芽細胞増殖因子１０（ＦＧＦ－１０）及び線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ－７）は、上皮細胞により排他的に発現される、ＦＧＦＲ２の特異的なアイソフォーム（ＦＧＦＲ２ｂと指定される）とだけ相互作用するという点で、ＦＧＦの中でも特有である（Ｉｇａｒａｓｈｉ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８ ２７３（２１）：１３２３０－５）。
ＦＧＦファミリーメンバーは、広範な分裂促進性及び細胞生残活性を有し、胚発生、細胞増殖、形態形成、組織修復、腫瘍増殖、及び浸潤を含む、様々な生物学的プロセスに関与する。ＦＧＦは、細胞表面線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦＲ）と相互作用することで、細胞を刺激する。４つの、密接に関連した受容体（ＦＧＦＲ１～ＦＧＦＲ４）が、同定されている。大部分のＦＧＦは、２つ以上の受容体に結合する（Ｏｒｎｉｔｚ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８ Ｆｅｂ．２７；２７３（９）：５３４９－５７）に結合する。しかし、線維芽細胞増殖因子１０（ＦＧＦ－１０）及び線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ－７）は、上皮細胞により排他的に発現される、ＦＧＦＲ２の特異的なアイソフォーム（ＦＧＦＲ２ｂと指定される）とだけ相互作用するという点で、ＦＧＦの中でも特有である（Ｉｇａｒａｓｈｉ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８ ２７３（２１）：１３２３０－５）。
【0139】
肝細胞増殖因子／散乱因子（ＨＧＦ／ＳＦ）は、がん原遺伝子ｃ－Ｍｅｔ受容体に結合した後に、チロシンキナーゼシグナル伝達カスケードを活性化することにより、細胞増殖、細胞運動性、及び形態形成を制御する、形態形成因子である。
【0140】
トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）は、ポリペプチド増殖因子である。ＴＧＦの１種である、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）は、ＥＧＦＲに結合し、上皮表現型の発達を誘発する。
【0141】
いくつかの実施形態では、増殖培地中の１つ以上の受容体型チロシンキナーゼリガンドは、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、及びＴＧＦからなる群から選択され、ＦＧＦは、好ましくはＦＧＦ－７、またはＦＧＦ１０である。
【0142】
いくつかの実施形態では、増殖培地は、１つ以上の受容体型チロシンキナーゼリガンドを含む。いくつかの実施形態では、１個のみの受容体型チロシンキナーゼリガンドが増殖培地に含まれ、これは、ＦＧＦ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、及びＴＧＦから選択することができる。いくつかの実施形態では、増殖培地は、２種類の受容体型チロシンキナーゼリガンドを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地中の２種類の受容体型チロシンキナーゼリガンドは、ＥＧＦ及びＦＧＦである。いくつかの実施形態では、増殖培地中の２種類の受容体型チロシンキナーゼリガンドは、ＥＧＦ及びＨＧＦである。いくつかの実施形態では、増殖培地中の２種類の受容体型チロシンキナーゼリガンドは、ＨＧＦ及びＦＧＦである。いくつかの実施形態では、増殖培地中の２種類の受容体型チロシンキナーゼリガンドは、ＴＧＦ及びＦＧＦである。いくつかの実施形態では、増殖培地中の２種類の受容体型チロシンキナーゼリガンドは、ＴＧＦ及びＨＧＦである。いくつかの実施形態では、増殖培地中の２種類の受容体型チロシンキナーゼリガンドは、ＥＧＦ及びＴＧＦである。いくつかの実施形態では、増殖培地は、３種類の受容体型チロシンキナーゼリガンドを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地中の３種類の受容体型チロシンキナーゼリガンドは、ＥＧＦ、ＦＧＦ、及びＴＧＦである。いくつかの実施形態では、増殖培地中の３種類の受容体型チロシンキナーゼリガンドは、ＥＧＦ、ＦＧＦ、及びＨＧＦである。いくつかの実施形態では、増殖培地中の３種類の受容体型チロシンキナーゼリガンドは、ＴＧＦ、ＨＧＦ、及びＥＧＦである。いくつかの実施形態では、増殖培地中の３種類の受容体型チロシンキナーゼリガンドは、ＴＧＦ、ＨＧＦ、及びＦＧＦである。いくつかの実施形態では、増殖培地は、４種類の受容体型チロシンキナーゼリガンドを含む。いくつかの実施形態では、４種類の受容体型チロシンキナーゼリガンドは、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、及びＴＧＦである。
【0143】
いくつかの実施形態では、任意の好適なＥＧＦを用いることができる。いくつかの実施形態では、ＥＧＦは、ヒトＥＧＦを含む。いくつかの実施形態では、ＥＧＦは、組換えヒトＥＧＦを含む。
【0144】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦは、５～５００ｎｇ／ｍＬの濃度で、増殖培地に添加される。例えば、いくつかの実施形態では、増殖培地は、１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、１μｇ／ｍＬのＥＧＦを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、５μｇ／ｍＬのＥＧＦを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、１０μｇ／ｍＬのＥＧＦを含む。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲを活性化する代替の化合物で、ＥＧＦを置き換える。例えば、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）でＥＧＦを置き換える可能性があることが、想到される。
【0145】
増殖培地で用いるＦＧＦは、好ましくは、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦＲ２）に結合可能なＦＧＦであり、好ましくは、ＦＧＦ－７またはＦＧＦ－１０である。いくつかの実施形態では、１つを超えないＦＧＦが用いられる。いくつかの実施形態では、ＦＧＦは、ＦＧＦ－７である。いくつかの実施形態では、ＦＧＦは、ＦＧＦ－１０である。他の実施形態では、２種類以上、例えば、２種類、３種類、またはそれ以上のＦＧＦが用いられる。いくつかの実施形態では、２種類のＦＧＦが用いられる。いくつかの実施形態では、２種類のＦＧＦは、ＦＧＦ－７及びＦＧＦ－１０である。いくつかの実施形態では、ＦＧＦは、ＦＧＦＲ２経路を活性化する化合物（「ＦＧＦ経路活性化因子」）で置き換えられる。いくつかの実施形態では、増殖培地は、２０～５００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦを含む。例えば、いくつかの実施形態では、増殖培地は、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、２５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦを含む。
【0146】
いくつかの実施形態では、ＨＧＦは、ヒトＨＧＦである。いくつかの実施形態では、ＨＧＦは、組換えヒトＨＧＦである。いくつかの実施形態では、増殖培地は、１～５０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦを含む。例えば、いくつかの実施形態では、増殖培地は、１ｎｇ／ｍＬのＨＧＦを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、５ｎｇ／ｍＬのＨＧＦを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、１０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、２５ｎｇ／ｍＬのＨＧＦを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、５０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦを含む。いくつかの実施形態では、ＨＧＦは、Ｄｉｈｅｘａなどの、ＨＧＦ受容体を活性化する化合物で置き換えられる。
【0147】
いくつかの実施形態では、ＦＧＦは、ヒトＦＧＦである。いくつかの実施形態では、ＦＧＦは、組換えヒトＦＧＦ－７、及び、組換えヒトＦＧＦ－１０である。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦを含む。例えば、いくつかの実施形態では、増殖培地は、１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、２５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦを含む。
【0148】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦは、ヒトＴＧＦαである。いくつかの実施形態では、ＴＧＦは、組換えヒトＴＧＦαである。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも２ｎｇ／ｍＬのＴＧＦを含む。例えば、いくつかの実施形態では、増殖培地は、２．５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、５０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、１００ｎｇ／ｍＬのＴＧＦを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、２５０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦを含む。
【0149】
いくつかの実施形態では、ＰＨＨの培養中に、１つ以上の受容体型チロシンキナーゼリガンド（例えば、ＥＧＦ、ＦＧＦ－７、ＦＧＦ－１０、ＨＧＦ、及びＴＧＦα）を、必要なときに、例えば、毎日、または２日に１回、培養培地に添加する。これらは単独で、または、組み合わせて添加することができる。これらは、２日に１回添加されるのが好ましい。いくつかの実施形態では、１つ以上の受容体型チロシンキナーゼリガンドは、細胞培養培地に、細胞への添加前に直接添加することができる。
【0150】
上皮表現型安定化剤
本明細書に記載する増殖培地は、１つ以上の上皮表現型安定化剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の上皮表現型安定化剤は、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）阻害剤である。増殖培地にＴＧＦβ阻害剤が存在することで、ＰＨＨが分化しなくなるため、有利である。換言すれば、ＴＧＦβ阻害剤は、ＴＧＦβシグナル伝達経路の活性を低減し、または阻害し、これにより、間葉表現型の発達が妨げられる。ＴＧＦβシグナル伝達は、細胞増殖、細胞運命、及びアポトーシスを含む、多くの細胞機能に関与する。シグナル伝達は、典型的には、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドの、ＩＩ型受容体への結合と共に開始し、ＩＩ型受容体はＩ型受容体を動員してリン酸化する。次に、Ｉ型受容体は、核内で転写因子として作用し、標的遺伝子発現を制御する、ＳＭＡＤをリン酸化する。
本明細書に記載する増殖培地は、１つ以上の上皮表現型安定化剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の上皮表現型安定化剤は、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）阻害剤である。増殖培地にＴＧＦβ阻害剤が存在することで、ＰＨＨが分化しなくなるため、有利である。換言すれば、ＴＧＦβ阻害剤は、ＴＧＦβシグナル伝達経路の活性を低減し、または阻害し、これにより、間葉表現型の発達が妨げられる。ＴＧＦβシグナル伝達は、細胞増殖、細胞運命、及びアポトーシスを含む、多くの細胞機能に関与する。シグナル伝達は、典型的には、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドの、ＩＩ型受容体への結合と共に開始し、ＩＩ型受容体はＩ型受容体を動員してリン酸化する。次に、Ｉ型受容体は、核内で転写因子として作用し、標的遺伝子発現を制御する、ＳＭＡＤをリン酸化する。
【0151】
ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、増殖及び分化因子（ＧＤＦ）、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）、アクチビン、ノーダル、及びＴＧＦβを含む。一般に、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３は、ＴＧＦβ／アクチビン経路で、ＡＬＫ４、５、及び７受容体によりリン酸化される。対照的に、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、及びＳｍａｄ８は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）経路の一部として、リン酸化される。経路間で多少の重複はあるものの、本発明の文脈においては、「ＴＧＦβ阻害剤」、または、「ＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤」とは、好ましくは、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３を介して作用する、ＴＧＦβ経路の阻害剤である。したがって、いくつかの実施形態では、ＴＧＦβ阻害剤はＢＭＰ阻害剤ではなく、例えば、ＴＧＦβ阻害剤はノギンではない。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβ阻害剤に加えて、ＢＭＰ阻害剤が培養培地に添加される（以下を参照されたい）。
【0152】
したがって、ＴＧＦβ阻害剤は、ＴＧＦβシグナル伝達経路の活性を低減する任意の剤であることができる。当該技術分野において周知であり、本発明と共に使用可能な、ＴＧＦβのシグナル伝達経路を破壊する多くの方法が存在する。例えば、ＴＧＦβシグナル伝達は、低分子干渉ＲＮＡ法によるＴＧＦβ発現の阻害；フーリン（ＴＧＦβ活性化プロテアーゼ）の阻害；生理学的阻害剤による経路の阻害；モノクローナル抗体によるＴＧＦβの中和；ＴＧＦβ受容体キナーゼ１（ＡＬＫ５としても知られている）、または他のＴＧＦβ関連受容体キナーゼの低分子阻害剤による阻害；例えば、その生理学的阻害剤であるＳｍａｄ７の過剰発現による、または、Ｓｍａｄの活性化を不可能にするＳｍａｄアンカーとして、チオレドキシンを用いることによる、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３シグナル伝達の阻害により破壊することができる（Ｆｕｃｈｓ，Ｏ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＴＧＦ－Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ａｎｄ Ｆｉｂｒｏｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ６，Ｎｕｍｂｅｒ １，Ｊａｎｕａｒｙ ２０１１，ｐｐ．２９－４３（１５））。
【0153】
物質がＴＧＦβ阻害剤であるか否かを測定する様々な方法が周知であり、本発明と共に使用することができる。例えば、細胞に、ヒトＰＡＩ－１プロモーター、または、Ｓｍａｄ結合部位を含むレポーター構築物が安定してトランスフェクトされ、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を駆動する、細胞アッセイを使用することができる。対照群と比較したルシフェラーゼ活性の阻害を、化合物の活性の指標として用いることができる（Ｄｅ Ｇｏｕｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００５ Ｍａｙ；１４５（２）：１６６－１７７）。
【0154】
本発明に従ったＴＧＦβ阻害剤は、タンパク質、ペプチド、低分子、低分子干渉ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、または抗体であることができる。阻害剤は、自然に存在するものであってよいか、または、合成であってよい。一実施形態では、ＴＧＦβ阻害剤は、ＡＬＫ５の阻害剤である。例えば、ＴＧＦβ阻害剤は、ＡＬＫ５に結合し、これを直接阻害することができる。本発明の文脈で使用可能な、好ましい低分子ＴＧＦβ阻害剤としては、Ａ８３－０１が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβ阻害剤は、低分子阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβ阻害剤は、Ａ８３－０１である。
【0155】
いくつかの実施形態では、１つを超えないＴＧＦβ阻害剤が、増殖培地に存在する。他の実施形態では、２つ以上（例えば、２、３、または４つ以上）のＴＧＦβ阻害剤が、増殖培地に存在する。主に、他のキナーゼを標的とするように設計されているが、高濃度で、ＴＧＦβシグナル伝達経路もまた阻害することができる、多数の他の低分子阻害剤もまた、本発明の文脈で使用することができることを、当業者は理解するであろう。
【0156】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβ阻害剤はＡＬＫ５阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＡＬＫ５阻害剤はＡ８３－０１である。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも１０ｎＭ（例えば、少なくとも５０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、５μＭ、または１０μＭ）を含む。例えば、いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも５０ｎＭのＡ８３－０１を含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも１００ｎＭのＡ８３－０１を含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも１μＭのＡ８３－０１を含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも５μＭのＡ８３－０１を含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも１０μＭのＡ８３－０１を含む。
【0157】
いくつかの実施形態では、上皮表現型安定化剤は、コルチコステロイドをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、コルチコステロイドとしては、ヒドロコルチゾンが挙げられる。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬ（例えば、少なくとも２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、または１０μｇ／ｍＬ）のヒドロコルチゾンを含む。例えば、いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも２５ｎｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも５０ｎｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも１００ｎｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも２５０ｎｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも５００ｎｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも１μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも５μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬを含む。
【0158】
いくつかの実施形態では、ＰＨＨの培養中に、１つ以上の上皮表現型安定化剤を、必要なときに、例えば、毎日、または２日に１回、培養培地に添加する。２日に１回添加されるのが好ましい。いくつかの実施形態では、１つ以上の上皮表現型安定化剤は、細胞培養培地に、ＰＨＨに添加する前に直接添加することができる。
【0159】
細胞生残及び増殖の促進
本明細書に記載する増殖培地は、任意選択的に、Ｎ－アセチルシステイン、Ｂ２７、Ｎ２、ニコチンアミド、及びＲｈｏキナーゼ阻害剤からなる群から選択される、細胞生残及び／または増殖を促進する１種以上の剤を含む。Ｎ－アセチルシステイン、Ｂ２７、Ｎ２、ニコチンアミド、及びＲｈｏキナーゼ阻害剤は、細胞生残、細胞増殖を制御し、ＤＮＡ安定性を補助すると考えられている。
本明細書に記載する増殖培地は、任意選択的に、Ｎ－アセチルシステイン、Ｂ２７、Ｎ２、ニコチンアミド、及びＲｈｏキナーゼ阻害剤からなる群から選択される、細胞生残及び／または増殖を促進する１種以上の剤を含む。Ｎ－アセチルシステイン、Ｂ２７、Ｎ２、ニコチンアミド、及びＲｈｏキナーゼ阻害剤は、細胞生残、細胞増殖を制御し、ＤＮＡ安定性を補助すると考えられている。
【0160】
いくつかの実施形態では、増殖培地に、少なくとも０．２５ｍＭ（例えば、少なくとも０．５ｍＭ、１ｍＭ、または５ｍＭ）のＮ－アセチルシステインを補充する。例えば、いくつかの実施形態では、増殖培地に、少なくとも０．５ｍＭのＮ－アセチルシステインを補充する。いくつかの実施形態では、増殖培地に、少なくとも１ｍＭのＮ－アセチルシステインを補充する。いくつかの実施形態では、増殖培地に、少なくとも５ｍＭのＮ－アセチルシステインを補充する。
【0161】
いくつかの実施形態では、Ｂ２７は任意選択的に、ビタミンＡを含有しない。Ｂ２７サプリメントを使用して、ビオチン、コレステロール、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン、酢酸レチニル、亜セレン酸ナトリウム、トリヨードチロニン（Ｔ３）、ＤＬ－α－トコフェロール（ビタミンＥ）、アルブミン、インスリン、及びトランスフェリンを含む培地を配合することができる。ビタミンＡを除くＢ２７サプリメントが、肝臓用増殖培地で、特に良好に作用することが示された。他の成分の中でもとりわけ、ビオチン、コレステロール、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン、レチノール、酢酸レチニル、亜セレン酸ナトリウム、トリヨードチロニン（Ｔ３）、ＤＬ－α－トコフェロール（ビタミンＥ）、アルブミン、インスリン、及びトランスフェリンを含有するＢ２７サプリメントは、５０Ｘ濃縮液として提供される。これらの成分の中でも、少なくともリノレン酸、レチノール、酢酸レチニル、及びトリヨードチロニン（Ｔ３）が、核ホルモン受容体アゴニストである。Ｂ２７サプリメントを、濃縮物として培養培地に添加することができるか、または、濃縮物として培養培地に添加する前に希釈することができるか、または、培養培地に添加する前に希釈することができる。１Ｘの終濃度、または他の終濃度で、Ｂ２７サプリメントを用いることができる。Ｂ２７サプリメントを用いるのは、ビオチン、コレステロール、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン、レチノール、酢酸レチニル、亜セレン酸ナトリウム、トリヨードチロニン（Ｔ３）、ＤＬ－α－トコフェロール（ビタミンＥ）、アルブミン、インスリン、及びトランスフェリンを、本発明の培養培地に組み込む便利な方法である。Ｂ２７サプリメントを用いる代わりに、これらの構成成分のいくつか、または全てを、増殖培地に別個に添加することもまた、想到される。したがって、増殖培地は、これらの構成成分のいくつか、または全てを含むことができる。
【0162】
いくつかの実施形態では、増殖培地中でのＢ２７の量は、約０．１Ｘ～約１００Ｘ（例えば、約０．１Ｘ～約９０Ｘ、約０．５Ｘ～約８０Ｘ、約１Ｘ～約７０Ｘ、約５Ｘ～約６０Ｘ、及び、約１０Ｘ～約５０Ｘ）であることができる。
【0163】
例えば、いくつかの実施形態では、増殖培地中でのＢ２７の濃度は、約０．１Ｘである。いくつかの実施形態では、増殖培地中でのＢ２７の濃度は、約０．５Ｘである。いくつかの実施形態では、増殖培地中でのＢ２７の濃度は、約１Ｘである。いくつかの実施形態では、増殖培地中でのＢ２７の濃度は、約５Ｘである。いくつかの実施形態では、増殖培地中でのＢ２７の濃度は、約１０Ｘである。いくつかの実施形態では、増殖培地中でのＢ２７の濃度は、約５０Ｘである。いくつかの実施形態では、増殖培地中でのＢ２７の濃度は、約７０Ｘである。いくつかの実施形態では、増殖培地中でのＢ２７の濃度は、約８０Ｘである。いくつかの実施形態では、増殖培地中でのＢ２７の濃度は、約９０Ｘである。いくつかの実施形態では、増殖培地中でのＢ２７の濃度は、約１００Ｘである。
【0164】
Ｎ２サプリメントは、ヒトトランスフェリン、ウシインスリン、プロゲステロン、プトレシン、及び亜セレン酸ナトリウムを含有する、１００Ｘの液体濃縮物として提供される。Ｎ２サプリメントは、濃縮物として培養培地に添加することができるか、または、培養培地に添加する前に希釈することができる。１Ｘの終濃度、または他の終濃度で、Ｎ２サプリメントを用いることができる。Ｎ２サプリメントを用いるのは、トランスフェリン、インスリン、プロゲステロン、プトレシン、及び亜セレン酸ナトリウムを、本発明の培養培地に組み込む便利な方法である。もちろん、Ｎ２サプリメントを用いる代わりに、これらの構成成分のいくつか、または全てを、増殖培地に別個に添加することもまた、想到される。したがって、いくつかの実施形態では、増殖培地は、これらの構成成分のいくつか、または全てを含むことができる。
【0165】
いくつかの実施形態では、増殖培地中でのＮ２の量は、約０．１Ｘ～約１００Ｘ（例えば、約０．１Ｘ～約９０Ｘ、約０．５Ｘ～約８０Ｘ、約１Ｘ～約７０Ｘ、約５Ｘ～約６０Ｘ、及び、約１０Ｘ～約５０Ｘ）であることができる。
【0166】
例えば、いくつかの実施形態では、増殖培地中でのＮ２の濃度は、約０．１Ｘである。いくつかの実施形態では、増殖培地中でのＮ２の濃度は、約０．５Ｘである。いくつかの実施形態では、増殖培地中でのＮ２の濃度は、約１Ｘである。いくつかの実施形態では、増殖培地中でのＮ２の濃度は、約５Ｘである。いくつかの実施形態では、増殖培地中でのＮ２の濃度は、約１０Ｘである。いくつかの実施形態では、増殖培地中でのＮ２の濃度は、約５０Ｘである。いくつかの実施形態では、増殖培地中でのＮ２の濃度は、約７０Ｘである。いくつかの実施形態では、増殖培地中でのＮ２の濃度は、約８０Ｘである。いくつかの実施形態では、増殖培地中でのＮ２の濃度は、約９０Ｘである。いくつかの実施形態では、増殖培地中でのＮ２の濃度は、約１００Ｘである。
【0167】
培地がＢ２７を含むいくつかの実施形態では、培地はＮ２を含まない。本発明の実施形態はそれ故、Ｂ２７が存在する場合に、所望するのであれば、Ｎ２を除外するように適合させることができる。
【0168】
いくつかの実施形態では、Ｎ２は、増殖培地に存在しない。
培地がＮ２を含むいくつかの実施形態では、培地はＢ２７を含まない。本発明の実施形態はそれ故、Ｎ２７が存在する場合に、所望するのであれば、Ｂ２７を除外するように適合させることができる。
培地がＮ２を含むいくつかの実施形態では、培地はＢ２７を含まない。本発明の実施形態はそれ故、Ｎ２７が存在する場合に、所望するのであれば、Ｂ２７を除外するように適合させることができる。
【0169】
いくつかの実施形態では、Ｂ２７は、増殖培地に存在しない。
いくつかの実施形態では、増殖培地には、Ｂ２７及び／またはＮ２が補充される。
いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも１ｍＭ（例えば、少なくとも５ｍＭ、１０ｍＭ、または５０ｍＭ）のニコチンアミドを含む。例えば、いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも５ｍＭのニコチンアミドを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも１０ｍＭのニコチンアミドを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも５０ｍＭのニコチンアミドを含む。
いくつかの実施形態では、増殖培地には、Ｂ２７及び／またはＮ２が補充される。
いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも１ｍＭ（例えば、少なくとも５ｍＭ、１０ｍＭ、または５０ｍＭ）のニコチンアミドを含む。例えば、いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも５ｍＭのニコチンアミドを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも１０ｍＭのニコチンアミドを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも５０ｍＭのニコチンアミドを含む。
【0170】
いくつかの実施形態では、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤はＹ－２７６３２である。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも１μＭ（例えば、少なくとも５μＭ、１０μＭ、または５０μＭ）のＹ－２７６３２を含む。例えば、いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも５μＭのＹ－２７６３２を含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも１０μＭのＹ－２７６３２を含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも５０μＭのＹ－２７６３２を含む。いくつかの実施形態では、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、増殖培地に含まれない。
【0171】
いくつかの実施形態では、ＰＨＨの培養中に、Ｎ－アセチルシステイン、Ｂ２７、Ｎ２、ニコチンアミド、及びＲｈｏキナーゼ阻害剤からなる群から選択される、細胞生残及び／または増殖を促進する１種以上の剤を、必要なときに、例えば、毎日、または２日に１回、培養培地に添加する。２日に１回添加されるのが好ましい。いくつかの実施形態では、細胞生残及び／または増殖を促進する１種以上の剤は、細胞培養培地に、ＰＨＨに添加する前に直接添加することができる。
【0172】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示する成熟培地は、細胞生残及び／または増殖を促進する、１種以上の剤、例えば、本明細書で開示する細胞生残及び／または増殖を促進する剤のいずれかを含まない。
【0173】
成熟の促進
本明細書に記載する肝細胞を、本明細書に記載する方法に従い成熟させることができる。いくつかの実施形態では、肝細胞を事前に、本明細書に記載する方法により増殖させた。いくつかの実施形態では、肝細胞を、本明細書に記載する方法により増殖させ、その後、成熟させる。本明細書に記載する成熟培地は、ヒト細胞用の基礎培地を含むことができる。いくつかの実施形態では、成熟基礎培地は、ＬＯＮＺＡ（商標）ＨＣＭ（商標）、ウィリアムＥ、またはＨｅｐａｔｏＺＹＭＥ－ＳＦＭである。ＬＯＮＺＡ（商標）ＨＣＭ（商標）は、ＨＢＭ（商標）基礎培地を含む、または、ＨＢＭ（商標）基礎培地を、トランスフェリン、アスコルビン酸、ヒト上皮増殖因子（ＨＥＧＦ）、インスリン、ヒドロコルチゾン、脂肪酸非含有ウシ血清アルブミン、及び、ゲンタマイシンサルフェート－アムホテリシン（ＧＡ－１０００）と組み合わせることにより得られる、肝細胞培養培地である。ウィリアウムＥ培地は、初代肝細胞を増殖させるための、血清補充量が少なくなった培地である。ＨｅｐａｔｏＺＹＭＥ－ＳＦＭは、肝細胞の長期維持のための、無血清培地である。
本明細書に記載する肝細胞を、本明細書に記載する方法に従い成熟させることができる。いくつかの実施形態では、肝細胞を事前に、本明細書に記載する方法により増殖させた。いくつかの実施形態では、肝細胞を、本明細書に記載する方法により増殖させ、その後、成熟させる。本明細書に記載する成熟培地は、ヒト細胞用の基礎培地を含むことができる。いくつかの実施形態では、成熟基礎培地は、ＬＯＮＺＡ（商標）ＨＣＭ（商標）、ウィリアムＥ、またはＨｅｐａｔｏＺＹＭＥ－ＳＦＭである。ＬＯＮＺＡ（商標）ＨＣＭ（商標）は、ＨＢＭ（商標）基礎培地を含む、または、ＨＢＭ（商標）基礎培地を、トランスフェリン、アスコルビン酸、ヒト上皮増殖因子（ＨＥＧＦ）、インスリン、ヒドロコルチゾン、脂肪酸非含有ウシ血清アルブミン、及び、ゲンタマイシンサルフェート－アムホテリシン（ＧＡ－１０００）と組み合わせることにより得られる、肝細胞培養培地である。ウィリアウムＥ培地は、初代肝細胞を増殖させるための、血清補充量が少なくなった培地である。ＨｅｐａｔｏＺＹＭＥ－ＳＦＭは、肝細胞の長期維持のための、無血清培地である。
【0174】
本明細書に記載する成熟培地は、任意選択的に、抗生物質、ＨＥＰＥＳ、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）、ＩＴＳ、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、オンコスタチンＭ、抗酸化剤、糖質コルチコイド、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）活性化因子、胆汁酸、ｃＡＭＰもしくはｃＡＭＰ類似体、コレステロール、甲状腺ホルモン、血清代替成分、または、前述の任意の組み合わせからなる群から選択される、肝細胞成熟を促進する１種以上の剤を含む。
【0175】
前述の態様のいくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈ阻害剤は、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｅ、γセクレターゼ阻害剤ＸＸ、またはこれらの組み合わせである。前述の態様のいくつかの実施形態では、抗生物質はペニシリン、ストレプトマイシン、またはこれらの組み合わせである。前述の態様のいくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、エルロチニブ塩酸塩である。前述の態様のいくつかの実施形態では、抗酸化剤はビタミンＣである。前述の態様のいくつかの実施形態では、糖質コルチコイドは、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、またはこれらの組み合わせである。前述の態様のいくつかの実施形態では、ＰＸＲ活性化因子はビタミンＫ２である。前述の態様のいくつかの実施形態では、胆汁酸は、リトコール酸、ウルソデオキシコール酸、またはこれらの組み合わせである。前述の態様のいくつかの実施形態では、ｃＡＭＰ類似体は、８ブロモｃＡＭＰ、フォルスコリン、またはこれらの組み合わせである。前述の態様のいくつかの実施形態では、甲状腺ホルモンはＴ３である。前述の態様のいくつかの実施形態では、血清代替成分は、ＩＴＳ、ＫＯＳＲ、Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ａ、Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｂ、またはこれらの組み合わせである。
【0176】
本明細書に記載する成熟培地は、例えば、本明細書で開示する増殖培地と比較して、サプリメントの除去を受け、細胞増殖または前駆細胞表現型を防止する。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、成熟培地は、Ｒ－スポンジン１／Ｗｎｔ３ａ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、Ｎ－アセチルシステイン、ニコチンアミド、Ｂ２７サプリメント、Ｎ２サプリメント、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、及び線維芽細胞増殖因子１０（ＦＧＦ１０）のうちの１つ以上を欠く。
【0177】
血清代替成分
本明細書に記載する基礎培地または成熟培地は、血清代替成分をさらに含むことができる。
本明細書に記載する基礎培地または成熟培地は、血清代替成分をさらに含むことができる。
【0178】
任意の好適な血清代替成分を用いることができる。いくつかの実施形態では、血清代替成分は、ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清代替物（ＫＯＳＲ）、ヒト血小板溶解物、ヒト血清、ＩＴＳ、Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ａ、またはＴｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｂである。ＫＯＳＲは、アルブミンもしくはアルブミンサプリメントを含む、または、アルブミンもしくはアルブミンサプリメントを、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－ヒドロキシプロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、チアミン、還元グルタチオン、Ｌ－アスコルビン酸－２－ホスフェート、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、ならびに、微量元素部分のＡｇ＋、Ａｌ３＋、Ｂａ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｒ３＋、Ｇｅ４＋、Ｓｅ４＋、Ｂｒ－、Ｉ－、Ｍｎ２＋、Ｆ－、Ｓｉ４＋、Ｖ５＋、Ｍｏ６＋、Ｎｉ２＋、Ｒｂ＋、Ｓｎ２＋、及びＺｒ４＋を含有する化合物からなる群から選択される１つ以上の成分と組み合わせることにより得られる、無血清真核細胞培養培地サプリメントである（例えば、その開示全体が参照として本明細書に組み込まれる、米国公開番号第ＵＳ２００２００７６７４７号を参照されたい）。
【0179】
いくつかの実施形態では、培養ステップは、プレーティングした細胞を増殖させること（ステップＰ０）と、増殖した細胞を初回継代すること（ステップＰ１）と、を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ０ステップは、７～１６日（例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６日）の継続期間を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ０ステップは、１１日の継続期間を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ０ステップは、１３日の継続期間を有する。
【0180】
いくつかの実施形態では、Ｐ１ステップは、７～２０日（例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０日）の継続期間を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ１ステップは、１１日の継続期間を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ１ステップは、１３日の継続期間を有する。
【0181】
いくつかの実施形態では、Ｐ０ステップは、肝細胞を、２００～１３，３３３細胞／ｃｍ２、例えば、２００細胞／ｃｍ２～１，０００細胞／ｃｍ２（例えば、２００細胞／ｃｍ２、３００細胞／ｃｍ２、４００細胞／ｃｍ２、５００細胞／ｃｍ２、６００細胞／ｃｍ２、７００細胞／ｃｍ２、８００細胞／ｃｍ２、９００細胞／ｃｍ２、もしくは１，０００細胞／ｃｍ２）、１，０００細胞／ｃｍ２～１０，０００細胞／ｃｍ２（例えば、１，０００細胞／ｃｍ２、２，０００細胞／ｃｍ２、３，０００細胞／ｃｍ２、４，０００細胞／ｃｍ２、５，０００細胞／ｃｍ２、６，０００細胞／ｃｍ２、７，０００細胞／ｃｍ２、８，０００細胞／ｃｍ２、９，０００細胞／ｃｍ２、もしくは１０，０００細胞／ｃｍ２）、または、１０，０００細胞／ｃｍ２～１３，３３３細胞／ｃｍ２（例えば、１０，０００細胞／ｃｍ２、１１，０００細胞／ｃｍ２、１２，０００細胞／ｃｍ２、１３，０００細胞／ｃｍ２、もしくは１３，３３３細胞／ｃｍ２）の密度で播種することを含む。いくつかの実施形態では、Ｐ０ステップは、６６７細胞／ｃｍ２の密度で肝細胞を播種することを含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１ステップは、３３３～１３，３３３細胞／ｃｍ２の密度で肝細胞を播種することを含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１ステップは、１，３３３細胞／ｃｍ２の密度で肝細胞を播種することを含む。
【0182】
いくつかの実施形態では、増殖培地は血清代替成分を含み、血清代替成分の濃度は、培養ステップの継続期間にわたって変化する。
いくつかの実施形態では、血清代替成分の濃度は、Ｐ０ステップの０日目において１％（ｖ／ｖ）である。
いくつかの実施形態では、血清代替成分の濃度は、Ｐ０ステップの０日目において１％（ｖ／ｖ）である。
【0183】
いくつかの実施形態では、（ｉ）細胞密度が、１５％～３０％（例えば、１５％、２０％、２５％、もしくは３０％）コンフルエンシーに達するときに、または、（ｉｉ）Ｐ０ステップの３日目～７日目の間（例えば、３日目、４日目、５日目、６日目、もしくは７日目）に、血清代替物の濃度は、５％（ｖ／ｖ）まで増加される。いくつかの実施形態では、血清代替物の濃度は、Ｐ０ステップの５日目に５％（ｖ／ｖ）まで増加される。いくつかの実施形態では、血清代替成分の濃度は、Ｐ０ステップの０日目において５％（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、血清代替成分の濃度は、Ｐ０の０日目において５％（ｖ／ｖ）であり、血清代替成分の濃度が増加されるまで、５％（ｖ／ｖ）のままである。いくつかの実施形態では、血清代替物の濃度は、（ｉ）細胞密度が、４０％～６０％（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、もしくは６０％）コンフルエンシーに達するときに、または、（ｉｉ）Ｐ０ステップの７日目～１３日目の間（例えば、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、もしくは１３日目）に、１０％（ｖ／ｖ）まで増加される。いくつかの実施形態では、血清代替物の濃度は、Ｐ０ステップの９日目に１０％（ｖ／ｖ）まで増加される。
【0184】
いくつかの実施形態では、血清代替成分の濃度は、Ｐ１ステップの０日目において１％（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、（ｉ）細胞密度が、１５％～３０％％（例えば、１５％、２０％、２５％、もしくは３０％）コンフルエンシーに達するときに、または、（ｉｉ）Ｐ１ステップの３日目～７日目の間（例えば、３日目、４日目、５日目、６日目、もしくは７日目）に、血清代替物の濃度は、５％（ｖ／ｖ）まで増加される。いくつかの実施形態では、血清代替物の濃度は、Ｐ１ステップの５日目に５％（ｖ／ｖ）まで増加される。
【0185】
いくつかの実施形態では、血清代替成分の濃度は、Ｐ１ステップの０日目において５％（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、血清代替成分の濃度は、Ｐ１ステップの０日目において５％（ｖ／ｖ）であり、血清代替成分の濃度が増加されるまで、５％（ｖ／ｖ）のままである。
【0186】
いくつかの実施形態では、血清代替物の濃度は、（ｉ）細胞密度が、４０％～６０％（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、もしくは６０％）コンフルエンシーに達するときに、または、（ｉｉ）Ｐ１ステップの５日目～１３日目の間（例えば、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、もしくは１３日目）に、１０％（ｖ／ｖ）まで増加される。いくつかの実施形態では、血清代替物の濃度は、Ｐ１ステップの９日目に１０％（ｖ／ｖ）まで増加される。いくつかの実施形態では、血清代替物の濃度は、Ｐ１ステップの７日目に１０％（ｖ／ｖ）まで増加される。
【0187】
追加の構成成分
いくつかの例では、本明細書に記載する基礎培地は、追加で緩衝剤を含むことができる。
いくつかの例では、本明細書に記載する基礎培地は、追加で緩衝剤を含むことができる。
【0188】
いくつかの実施形態では、緩衝剤は、－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）である。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも１ｍＭ（例えば、５ｍＭ、１０ｍＭ、または５０ｍＭ）のＨＥＰＥＳを含む。例えば、いくつかの実施形態では、増殖培地は、５ｍＭのＨＥＰＥＳを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は５０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む。
【0189】
いくつかの実施形態では、基礎培地は、Ｌ－グルタミンまたはその誘導体を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ－グルタミンは、Ｌ－グルタミンサプリメント、例えば、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンジペプチド、例えば、０．８５％ ＮａＣｌ中の．２００ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンジペプチド（例えば、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標））である。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも０．１％（例えば、少なくとも０．５％、１％、または５％）のＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）を含む。例えば、いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも０．５％のＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）を含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも１％のＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）を含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも５％のＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）を含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、０．１％～１０％、例えば、０．１％～１％（例えば、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、もしくは１％）、または１％～１０％（例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、もしくは１０％）のＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ－グルタミンは、Ｌ－グルタミンサプリメント、例えば、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンジペプチド、例えば、０．８５％ ＮａＣｌ中の．２００ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンジペプチド（例えば、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標））である。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも０．１％（例えば、少なくとも０．５％、１％、または５％）のＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）を含む。例えば、いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも０．５％のＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）を含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも１％のＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）を含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも５％のＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）を含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、０．１％～１０％、例えば、０．１％～１％（例えば、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、もしくは１％）、または１％～１０％（例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、もしくは１０％）のＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）を含む。
【0190】
いくつかの実施形態では、基礎培地はさらに、抗生物質を含む。
いくつかの実施形態では、抗生物質としては、ペニシリン及びストレプトマイシンの溶液が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、増殖培地または成熟培地は、少なくとも０．１％（例えば、少なくとも０．５％、１％、または５％）の、ペニシリン及びストレプトマイシンの溶液を含む。例えば、いくつかの実施形態では、増殖培地または成熟培地は、少なくとも０．５％の、ペニシリン及びストレプトマイシンの溶液を含む。いくつかの実施形態では、増殖培地または成熟培地は、少なくとも１％の、ペニシリン及びストレプトマイシンの溶液を含む。いくつかの実施形態では、増殖培地または成熟培地は、少なくとも５％の、ペニシリン及びストレプトマイシンの溶液を含む。いくつかの実施形態では、増殖培地または成熟培地は、０．１％～１０％、例えば、０．１％～１％（例えば、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、もしくは１％）、または１％～１０％（例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、もしくは１０％）の、ペニシリン及びストレプトマイシンの溶液を含む。
いくつかの実施形態では、抗生物質としては、ペニシリン及びストレプトマイシンの溶液が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、増殖培地または成熟培地は、少なくとも０．１％（例えば、少なくとも０．５％、１％、または５％）の、ペニシリン及びストレプトマイシンの溶液を含む。例えば、いくつかの実施形態では、増殖培地または成熟培地は、少なくとも０．５％の、ペニシリン及びストレプトマイシンの溶液を含む。いくつかの実施形態では、増殖培地または成熟培地は、少なくとも１％の、ペニシリン及びストレプトマイシンの溶液を含む。いくつかの実施形態では、増殖培地または成熟培地は、少なくとも５％の、ペニシリン及びストレプトマイシンの溶液を含む。いくつかの実施形態では、増殖培地または成熟培地は、０．１％～１０％、例えば、０．１％～１％（例えば、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、もしくは１％）、または１％～１０％（例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、もしくは１０％）の、ペニシリン及びストレプトマイシンの溶液を含む。
【0191】
いくつかの実施形態では、増殖培地は、アミノ酸サプリメントをさらに含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸サプリメントは、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）サプリメントである。いくつかの実施形態では、ＮＥＡＡサプリメントは、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、及びＬ－セリンを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、例えば、１μＭ～１００ｍＭ、例えば、１μＭ～１０μＭ（例えば、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、もしくは１０μＭ）、１０μＭ～１００μＭ（例えば、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、もしくは１００μＭ）、１００μＭ～１ｍｍ（例えば、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、９００μＭ、もしくは１ｍｍ）、１ｍＭ～１０ｍＭ（例えば、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、もしくは１０ｍＭ）、または、１０ｍＭ～１００ｍＭ（例えば、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、もしくは１００ｍＭ）の、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、及びＬ－セリンのそれぞれを含有する、非必須アミノ酸サプリメントを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、１００μＭの、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－プロリン、及びＬ－セリンのそれぞれを含む。
【0192】
いくつかの実施形態では、増殖培地は、ＮＥＡＡサプリメントを含まない。
いくつかの実施形態では、血清を、増殖培地に添加する。いくつかの実施形態では、血清としては、ウシ胎児血清が挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも１％（例えば、少なくとも５％、１０％、または１５％）のウシ胎児血清を含む。例えば、いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも５％のウシ胎児血清を含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも１０％のウシ胎児血清を含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも１５％のウシ胎児血清を含む。いくつかの実施形態では、血清は、増殖培地に存在しない。
いくつかの実施形態では、血清を、増殖培地に添加する。いくつかの実施形態では、血清としては、ウシ胎児血清が挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも１％（例えば、少なくとも５％、１０％、または１５％）のウシ胎児血清を含む。例えば、いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも５％のウシ胎児血清を含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも１０％のウシ胎児血清を含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも１５％のウシ胎児血清を含む。いくつかの実施形態では、血清は、増殖培地に存在しない。
【0193】
いくつかの実施形態では、ＰＨＨの培養中に、上述の剤を、任意選択的に、必要なときに、例えば、毎日、または２日に１回、培養培地に添加する。これらは、２日に１回添加されるのが好ましい。いくつかの実施形態では、上述の剤は、細胞培養培地に、ＰＨＨに添加する前に直接添加することができる。
【0194】
いくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈ阻害剤は、増殖培地に存在しない。いくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈアゴニストは、増殖培地に存在しない。いくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈ阻害剤も、Ｎｏｔｃｈアゴニストも、増殖培地に存在しない。
【0195】
低酸素条件
本明細書に記載する培養方法は、低酸素条件下、または、低酸素模倣物の存在下で、ＰＨＨを培養することを含むことができる。本明細書に記載する低酸素条件としては、酸素が、通常の酸素濃度（正常酸素条件）を下回る濃度で存在する、任意の条件が挙げられる。低酸素模倣物は、有効酸素の減少に応答する転写因子のタンパク質サブユニットである、低酸素誘発性因子１α（ＨｉＦ１α）の蓄積を誘発することにより、低酸素を模倣する。
本明細書に記載する培養方法は、低酸素条件下、または、低酸素模倣物の存在下で、ＰＨＨを培養することを含むことができる。本明細書に記載する低酸素条件としては、酸素が、通常の酸素濃度（正常酸素条件）を下回る濃度で存在する、任意の条件が挙げられる。低酸素模倣物は、有効酸素の減少に応答する転写因子のタンパク質サブユニットである、低酸素誘発性因子１α（ＨｉＦ１α）の蓄積を誘発することにより、低酸素を模倣する。
【0196】
いくつかの実施形態では、培養することは、低酸素条件下で細胞を培養することを含む。低酸素条件としては、例えば、２０％未満の酸素濃度を挙げることができる。いくつかの実施形態では、低酸素条件下で培養することは、細胞を、１％～１９％（例えば、１％～１０％、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％）の酸素濃度で培養することを含む。いくつかの実施形態では、低酸素条件下で培養することは、細胞を、１％～１９％の酸素濃度で培養することを含む。いくつかの実施形態では、培養することは、細胞を、１％～１０％の酸素濃度で培養することを含む。いくつかの実施形態では、培養することは、細胞を、５％の酸素濃度で培養することを含む。いくつかの実施形態では、培養することは、正常酸素条件下で細胞を培養することを含む。
【0197】
いくつかの実施形態では、培養することは、低酸素模倣物（例えば、ＨＩＦ－１α安定剤、またはＰＨＤ阻害剤）の存在下で、細胞を培養することを含む。例示的な低酸素模倣物としては、鉄キレート剤（例えば、デフェロキサミンメシラート（ＤＦＯ）、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ａ、デフェラシロクス、及び２，２’－ジピリジル（ＤＰ））、鉄競合剤（例えば、塩化コバルト（ＣｏＣｌ２）、もしくは、Ｎｉ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、もしくはＺｎ２＋などの二価の金属イオン）、ならびに、２オキソグルタレート（２０Ｇ）類似体（例えば、ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）、Ｎ－オキサリルグリシン、ジメチルオキサリルグリシン（ＤＭＯＧ））、ＰＨＤ阻害剤（例えば、ＦＧ－４４９７、ＧＳＫ３６０Ａ、ＴＭ６００８、もしくは葉酸）、または、ＨＩＦ－１α安定剤（例えば、ｍｉＲ－３３５、イソフルラン、Ｎ－アセチルシステイン、ＭＧ－１３２、ＢＳｃ２１１８、及びチロロン）が挙げられるが、これらに限定されない。低酸素模倣物は、例えば、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ． Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．６：１７５，２０１８でも記載されている。いくつかの実施形態では、低酸素模倣物の存在下で培養することは、塩化コバルトの存在下で細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態では、低酸素模倣物の存在下で培養することは、デスフェリオキサミン（例えば、ＤＦＯ）の存在下で細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態では、低酸素模倣物の存在下で培養することは、ＤＭＯＧの存在下で細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態では、培養することは、低酸素模倣物の不存在下で細胞を培養することを含む。
【0198】
培養物の表面
本明細書に記載の方法のいくつかの例では、ＰＨＨは、２次元表面で培養される。細胞培養表面は、哺乳動物細胞を培養するのに好適な任意の材料製であることができる。例えば、表面は、材料が生体適合性である限り、プラスチックまたは他の人工ポリマー材料などの、容易に滅菌可能な材料であることができる。いくつかの実施形態では、細胞培養表面は、プラスチックまたはガラスを含有することができる。いくつかの実施形態では、表面は、細胞の接着を可能にする、任意の材料を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、１つのプレートで増殖する。
本明細書に記載の方法のいくつかの例では、ＰＨＨは、２次元表面で培養される。細胞培養表面は、哺乳動物細胞を培養するのに好適な任意の材料製であることができる。例えば、表面は、材料が生体適合性である限り、プラスチックまたは他の人工ポリマー材料などの、容易に滅菌可能な材料であることができる。いくつかの実施形態では、細胞培養表面は、プラスチックまたはガラスを含有することができる。いくつかの実施形態では、表面は、細胞の接着を可能にする、任意の材料を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、１つのプレートで増殖する。
【0199】
限定されるものではないが、ポリアミド；ポリエステル；ポリスチレン；ポリプロピレン；ポリアクリレート；ポリビニル化合物（例えば、ポリ塩化ビニル）；ポリカーボネート；ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）；ニトロセルロース；綿；ポリグリコール酸（ＰＧＡ）；セルロース；デキストラン；ゼラチン；ガラス；フルオロポリマー；フッ素化エチレンプロピレン；ポリビニリデン；ポリジメチルシロキサン；及び、ケイ素基材（石英ガラス、ポリケイ素、または、単独のケイ素結晶）などを含む、任意の数の材料を使用して、表面を形成することができる。また、金属（例えば、金、銀、チタンフィルム）もまた、使用することができる。
【0200】
いくつかの実施形態では、表面を修飾して、細胞接着を促進することができる（例えば、接着材料でコーティングすることができる）。例えば、ガラス表面を、コラーゲンまたはフィブロネクチンなどのタンパク質（即ち、少なくとも２種類のアミノ酸のペプチド）で処理し、組織の細胞が基材に接着するのを支えることができる。いくつかの実施形態では、単一のタンパク質が表面に接着する。いくつかの実施形態では、２種類以上のタンパク質が表面に接着する。基材を修飾して接着を促進するために用いるのに適したタンパク質としては、特定の細胞型が細胞培養条件下で接着するタンパク質が挙げられる。いくつかの実施形態では、表面は、細胞接着を促進するために、ＥＣＭでコーティングされる。
【0201】
いくつかの実施形態では、ＰＨＨは２次元表面で培養され、２次元表面は、９．５ｃｍ２～１０，０００ｃｍ２の表面積を含む。いくつかの実施形態では、ＰＨＨは２次元表面で培養され、２次元表面は、５００ｃｍ２～１０，０００ｃｍ２の表面積を含む。例えば、いくつかの実施形態では、表面積は、９．５ｃｍ２～５００ｃｍ２（例えば、９．５ｃｍ２、１００ｃｍ２、２００ｃｍ２、３００ｃｍ２、４００ｃｍ２、もしくは５００ｃｍ２）、５００ｃｍ２～１，０００ｃｍ２（例えば、５００ｃｍ２、６００ｃｍ２、７００ｃｍ２、８００ｃｍ２、９００ｃｍ２、もしくは１，０００ｃｍ２）、または、１，０００ｃｍ２～１０，０００ｃｍ２（例えば、１，０００ｃｍ２、２，０００ｃｍ２、３，０００ｃｍ２、４，０００ｃｍ２、５，０００ｃｍ２、６，０００ｃｍ２、７，０００ｃｍ２、８，０００ｃｍ２、９，０００ｃｍ２、もしくは１０，０００ｃｍ２）である。いくつかの実施形態では、ＰＨＨは２次元表面で培養され、２次元表面は、６３６ｃｍ２～６３６０ｃｍ２の表面積を含む。
【0202】
ＥＣＭ
本明細書に記載するとおり、ＰＨＨの培養方法は、ＥＣＭと接触させて、１つ以上のＰＨＨを培養することを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＰＨＨはＥＣＭと、物理的、機構的、もしくは化学的手段、またはこれらの任意の組み合わせによって接触する。任意の好適なＥＣＭを使用することができる。単離されたＰＨＨは、好ましくは、少なくとも部分的には、上記ＰＨＨが自然に存在する細胞ニッチを模倣した微小環境で培養される。細胞ニッチは、部分的には、ＰＨＨ及び周囲の細胞、ならびに、上記ニッチ内の細胞によって産生されるＥＣＭにより決定される。この細胞ニッチは、肝細胞の運命を制御する、鍵となる制御性シグナルを提供するＥＣＭなどの、生体材料の存在下で、上記ＰＨＨを培養することにより模倣することができる。
本明細書に記載するとおり、ＰＨＨの培養方法は、ＥＣＭと接触させて、１つ以上のＰＨＨを培養することを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＰＨＨはＥＣＭと、物理的、機構的、もしくは化学的手段、またはこれらの任意の組み合わせによって接触する。任意の好適なＥＣＭを使用することができる。単離されたＰＨＨは、好ましくは、少なくとも部分的には、上記ＰＨＨが自然に存在する細胞ニッチを模倣した微小環境で培養される。細胞ニッチは、部分的には、ＰＨＨ及び周囲の細胞、ならびに、上記ニッチ内の細胞によって産生されるＥＣＭにより決定される。この細胞ニッチは、肝細胞の運命を制御する、鍵となる制御性シグナルを提供するＥＣＭなどの、生体材料の存在下で、上記ＰＨＨを培養することにより模倣することができる。
【0203】
いくつかの実施形態では、ＰＨＨは、ＥＣＭに接着する。いくつかの実施形態では、細胞培養物の表面は、ＥＣＭでコーティングされる。
ＥＣＭは、様々な多糖類、水、エラスチン、及び糖タンパク質を含み、糖タンパク質としては、コラーゲン、エンタクチン（ニドゲン）、フィブロネクチン、及びラミニンが挙げられる。ＥＣＭは、結合組織細胞により分泌される。様々な種類の糖タンパク質、及び／または、様々な組み合わせの糖タンパク質を含む、様々な組成物などの、様々な種類のＥＣＭが周知である。上記ＥＣＭは、これらの細胞を除去し、単離された組織フラグメントまたは単離されたＰＨＨを添加する前に、容器の中で、例えば線維芽細胞などのＥＣＭ産生細胞を培養することにより提供することができる。ＥＣＭ産生細胞の例は、主にコラーゲン及びプロテオグリカンを産生する軟骨細胞、主にＩＶ型コラーゲンを産生する線維芽細胞、ラミニン、間質性プロコラーゲン、及びフィブロネクチン、ならびに、主にコラーゲン（Ｉ、ＩＩＩ、及びＶ型）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、及びテネイシンＣを産生する結腸筋線維芽細胞である。
ＥＣＭは、様々な多糖類、水、エラスチン、及び糖タンパク質を含み、糖タンパク質としては、コラーゲン、エンタクチン（ニドゲン）、フィブロネクチン、及びラミニンが挙げられる。ＥＣＭは、結合組織細胞により分泌される。様々な種類の糖タンパク質、及び／または、様々な組み合わせの糖タンパク質を含む、様々な組成物などの、様々な種類のＥＣＭが周知である。上記ＥＣＭは、これらの細胞を除去し、単離された組織フラグメントまたは単離されたＰＨＨを添加する前に、容器の中で、例えば線維芽細胞などのＥＣＭ産生細胞を培養することにより提供することができる。ＥＣＭ産生細胞の例は、主にコラーゲン及びプロテオグリカンを産生する軟骨細胞、主にＩＶ型コラーゲンを産生する線維芽細胞、ラミニン、間質性プロコラーゲン、及びフィブロネクチン、ならびに、主にコラーゲン（Ｉ、ＩＩＩ、及びＶ型）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、及びテネイシンＣを産生する結腸筋線維芽細胞である。
【0204】
あるいは、ＥＣＭは市販されている。市販されているＥＣＭの例は、ＥＣＭタンパク質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。合成ＥＣＭ材料を使用することができる。所望する場合、ＥＣＭ材料の混合物を使用することができる。いくつかの実施形態では、ＥＣＭは、ヒドロゲル（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標））を含まない。いくつかの実施形態では、ＥＣＭは、ヒドロゲル（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標））を含む。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルはＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）である。
【0205】
いくつかの実施形態では、ＥＣＭはコラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、コラーゲンはコラーゲンＩまたはコラーゲンＩＶである。いくつかの実施形態では、コラーゲンはコラーゲンＩである。いくつかの実施形態では、コラーゲンはコラーゲンＩＶである。
【0206】
いくつかの実施形態では、ＥＣＭはラミニンを含む。いくつかの実施形態では、ラミニンは、ラミニン１１１、ラミニン２１１、ラミニン２２１、ラミニン３３２、ラミニン４１１、ラミニン４２１、ラミニン５１１、またはラミニン５２１である。いくつかの実施形態では、ラミニンはラミニン１１１である。いくつかの実施形態では、ラミニンはラミニン５１１である。いくつかの実施形態では、ラミニンはラミニン５２１である。
【0207】
いくつかの実施形態では、培養培地は、ＥＣＭの上に配置される。
次に、培養培地を取り除き、必要に応じて、及び、必要な際に補充することができる。いくつかの実施形態では、培養培地は毎日補充される。いくつかの実施形態では、培養培地は２日に１回補充される。いくつかの実施形態では、培養培地は３日に１回補充される。
次に、培養培地を取り除き、必要に応じて、及び、必要な際に補充することができる。いくつかの実施形態では、培養培地は毎日補充される。いくつかの実施形態では、培養培地は２日に１回補充される。いくつかの実施形態では、培養培地は３日に１回補充される。
【0208】
いくつかの実施形態では、構成成分を培地に「添加」する、または、培地から「除去される」場合、このことは、培地自体がＥＣＭから除去された後、「添加される」構成成分を含有する、または、「除去された」構成成分が除外された、新しい培地がＥＣＭの上に配置されることを意味することができる。
【0209】
いくつかの実施形態では、本発明の培養培地は、インテグリンなどの細胞膜タンパク質と相互作用することにより、ＥＣＭ、または、ＥＣＭを模倣する３Ｄマトリックスと接触する。
【0210】
細胞シグネチャー
アルブミンは、肝臓内で産生されるタンパク質であり、流体が血流から漏れるのを防ぐ。これは肝芽細胞及び終末分化した肝細胞のマーカーである。いくつかの実施形態では、培養後に、ＰＨＨはアルブミンを分泌する。増殖したＰＨＨは、一晩プレーティングした対照ＰＨＨと比較して、低レベルのアルブミンを分泌する。いくつかの実施形態では、成熟後に、成熟肝細胞はアルブミンを分泌する。
アルブミンは、肝臓内で産生されるタンパク質であり、流体が血流から漏れるのを防ぐ。これは肝芽細胞及び終末分化した肝細胞のマーカーである。いくつかの実施形態では、培養後に、ＰＨＨはアルブミンを分泌する。増殖したＰＨＨは、一晩プレーティングした対照ＰＨＨと比較して、低レベルのアルブミンを分泌する。いくつかの実施形態では、成熟後に、成熟肝細胞はアルブミンを分泌する。
【0211】
いくつかの実施形態では、増殖したＰＨＨは、少なくとも１ｕｇ／１００万個の細胞／日（例えば、少なくとも２μｇ／１００万個の細胞／日、５μｇ／１００万個の細胞／日、１０μｇ／１００万個の細胞／日、２５μｇ／１００万個の細胞／日、または５０μｇ／１００万個の細胞／日）のアルブミンを分泌する。例えば、いくつかの実施形態では、増殖したＰＨＨは、少なくとも２μｇ／１００万個の細胞／日のアルブミンを分泌する。いくつかの実施形態では、増殖したＰＨＨは、少なくとも５μｇ／１００万個の細胞／日のアルブミンを分泌する。いくつかの実施形態では、増殖したＰＨＨは、少なくとも１０μｇ／１００万個の細胞／日のアルブミンを分泌する。いくつかの実施形態では、増殖したＰＨＨは、少なくとも２５μｇ／１００万個の細胞／日のアルブミンを分泌する。いくつかの実施形態では、増殖したＰＨＨは、少なくとも５０μｇ／１００万個の細胞／日のアルブミンを分泌する。
【0212】
自己再生する細胞集団は、その表面にＬＧＲ５を発現可能な細胞集団であることが発見されている。ＬＧＲ５陽性細胞は分裂することで増殖してクローンを形成し、これはさらに分裂してクローンになり、それ故、外部の介在を必要とすることなく、より限定的な分化能を持つ細胞に進化させることなく、細胞集団のサイズを拡大させる。
【0213】
いくつかの実施形態では、本発明の増殖培地で培養されたＰＨＨの集団は、ＬＧＲ５細胞表面マーカーを発現する。
いくつかの実施形態では、ＬＧＲ５発現は、増殖したＰＨＨ集団で誘発されるが、ＬＧＲ５発現は、一晩プレーティングした対照ＰＨＨでは見られない。
いくつかの実施形態では、ＬＧＲ５発現は、増殖したＰＨＨ集団で誘発されるが、ＬＧＲ５発現は、一晩プレーティングした対照ＰＨＨでは見られない。
【0214】
肝臓はタンパク質を破壊し、窒素含有アンモニアを産生する。次に、窒素は、炭素、水素、及び酸素などの他の元素と組み合わさり、尿素を形成する。いくつかの実施形態では、ＰＨＨを培養、及び／または増殖した後、細胞は、尿素回路酵素の転写レベルを下方制御し、分泌された尿素は検出されず、このことは、増殖したＰＨＨが尿素を分泌可能とする、追加の成熟ステップが必要であることを示唆している。いくつかの実施形態では、成熟後に、成熟肝細胞は尿素を分泌する。
【0215】
成人成熟ＰＨＨは、Ｃｙｐ３ａ４、Ｃｙｐ１ａ２を含むシトクロムｐ４５０（ＣＹＰ）タンパク質ファミリー；核内受容体ＮＲ１Ｉ２；ＡＢＣＧ２、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＢ１１、ＳＲ－Ｂ１、ＳＬＣ１０Ａ１などの頂端及び外側基底極性膜タンパク質から選択される１つ以上のタンパク質を発現することもまた、知られている。いくつかの実施形態では、増殖したＰＨＨは、未増殖の一晩プレーティングした対照ＰＨＨと比較して、成熟細胞状態に特徴的なこれらのタンパク質の１つ以上を下方制御する。いくつかの実施形態では、増殖したＰＨＨは、未増殖の一晩プレーティングした対照ＰＨＨと比較して、ＡＦＰ、Ｃｙｐ３ａ７、ＥＰＣＡＭ、ＬＧＲ５、ＫＲＴ７、ＫＲＴ１９、ＡＱＰ１などの、胎児／肝臓前駆細胞／胆管細胞マーカーの１つ以上を上方制御する。いくつかの実施形態では、増殖したＰＨＨは、成熟細胞状態に特徴的なタンパク質である尿素回路酵素を上方制御するための、及び、胎児／肝臓前駆細胞／胆管細胞マーカーを下方制御するための追加の成熟ステップを必要とする。
【0216】
試料における本明細書に記載の様々なマーカーの存在及び／または発現レベル／量は、いくつかの方法論によって分析され得、これらの多くは、当該技術分野で知られ、当業者に理解されており、免疫組織化学（「ＩＨＣ」）、ウエスタンブロット分析、免疫沈降、分子結合アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫濾過アッセイ（ＥＬＩＦＡ）、蛍光活性化細胞選別（「ＦＡＣＳ」）、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ、プロテオミクス、定量的血液ベースアッセイ（例えば、血清ＥＬＩＳＡ）、生化学的酵素活性アッセイ、インサイチュハイブリダイゼーション、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、サザン分析、ノーザン分析、全ゲノム配列決定、大規模並列ＤＮＡ配列決定（例えば、次世代配列決定）、ＮＡＮＯＳＴＲＩＮＧ（登録商標）、例えば、分岐状ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなどの、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）及び他の増幅型検出方法を含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＲＮＡ－Ｓｅｑ（バルク及びシングルセル）、マイクロアレイ分析、遺伝子発現プロファイリング、及び／または遺伝子発現連続分析（「ＳＡＧＥ」）、ならびにタンパク質、遺伝子、及び／または組織アレイ分析によって行われ得る多種多様なアッセイのうちのいずれか１つを含むが、これらに限定されない。遺伝子及び遺伝子産物の状態を評価するための典型的なプロトコルは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔｓ ２（ノーザンブロッティング）、４（サザンブロッティング）、１５（イムノブロッティング）、及び１８（ＰＣＲ分析）において見出される。Ｒｕｌｅｓ Ｂａｓｅｄ ＭｅｄｉｃｉｎｅまたはＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（「ＭＳＤ」）から入手可能なアッセイなどの多重化免疫アッセイも使用され得る。
【0217】
本明細書に記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ＰＨＨ由来のＤＮＡは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｆｒａｍｐｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．３１：１０２３－１０３３，２０１３）に記載される、標的化遺伝子プルダウン及び配列決定方法などの、次世代配列決定方法を用いて単離し、その後、配列決定することができる。
【0218】
先行する方法のいずれかにおいて、マーカー（例えば、ＬＧＲ５）の存在及び／または発現レベル／量は、マーカーのタンパク質発現レベルを判定することで測定される。いくつかの実施形態では、方法は、マーカーの結合を許容する条件下で、生体試料を、マーカーに特異的に結合する抗体（例えば、抗ＬＧＲ５抗体）と接触させることと、抗体とマーカーとの間で複合体が形成されるかどうかを検出することとを含む。そのような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であっても、ｉｎ ｖｉｖｏ方法であってもよい。タンパク質発現レベルを測定する、当該技術分野で既知であるか、または本明細書に記載される任意の方法を使用してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、マーカーのタンパク質発現レベルは、フローサイトメトリー（例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ（商標）））、ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、免疫組織化学（ＩＨＣ）、免疫蛍光、放射免疫測定、ドットブロッティング、免疫検出方法、ＨＰＬＣ、表面プラズモン共鳴、光学分光、質量分析法、及びＨＰＬＣからなる群から選択される方法を使用して決定される。
【0219】
いくつかの実施形態では、マーカー（例えば、ＬＧＲ５）の存在及び／または発現レベル／量は、マーカーのｍＲＮＡ発現レベルを判定することで測定される。いくつかの実施形態では、遺伝子の発現レベルは、（ａ）試料（対象の肝疾患試料など）について遺伝子発現プロファイリング、ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲなど）、ＲＮＡ－ｓｅｑ、マイクロアレイ分析、ＳＡＧＥ、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ技法、またはＦＩＳＨを行うことと、ｂ）試料におけるマーカーの存在及び／または発現レベル／量を決定することと、を含む方法を使用して決定される。一実施形態では、ＰＣＲ方法は、ｑＲＴ－ＰＣＲである。一実施形態では、ＰＣＲ方法は、多重ＰＣＲである。いくつかの実施形態では、遺伝子発現は、マイクロアレイによって測定される。いくつかの実施形態では、遺伝子発現は、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定される。いくつかの実施形態では、発現は、多重ＰＣＲによって測定される。
【0220】
細胞中のｍＲＮＡの評価方法は周知であり、該方法として、例えば、相補的ＤＮＡプローブを使用したハイブリダイゼーションアッセイ（１つ以上の遺伝子に特異的な標識リボプローブを使用したインサイチュハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、及び関連技法など）、ならびに様々な核酸増幅アッセイ（遺伝子のうちの１つ以上に特異的な相補的プライマーを使用したＲＴ－ＰＣＲ、及び他の増幅型検出方法、例えば、分岐状ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡ等）が挙げられる。哺乳動物由来の試料は、ノーザン、ドットブロット、またはＰＣＲ分析を使用してｍＲＮＡについて好都合にアッセイされ得る。加えて、そのような方法は、生物学的試料中の標的ｍＲＮＡのレベルを判定する（例えば、アクチンファミリーメンバーなどの「ハウスキーピング」遺伝子の比較対照ｍＲＮＡ配列のレベルを同時に試験することによって）ことを可能にする１つ以上のステップを含み得る。
【0221】
ｍＲＮＡ発現分析に対して追加的または代替的に、タンパク質発現などの他のマーカーは、上述の方法に従って定量化され得る。例えば、本発明の方法は、ゲノムマーカーについて試料を試験すること（例えば、ＡＦＰの存在）、及び、さらに、タンパク質マーカーについて試料を試験すること（例えば、ＡＦＰのタンパク質転写物）を含む。
【0222】
方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ＤＮＡ配列は、マーカーとしての役割を果たし得る。ＤＮＡは、これらに限定されないが、ＰＣＲ、エクソーム－ｓｅｑ（例えば、全エクソーム配列決定）、ＤＮＡマイクロアレイ分析、ＮＡＮＯＳＴＲＩＮＧ（登録商標）、または全ゲノム配列決定を含む、当該技術分野で知られる任意の方法に従って定量化することができる。
【0223】
いくつかの事例では、試料における遺伝子の発現レベルは、遺伝子の平均（例えば、平均発現または中央発現）であり、遺伝子の参照発現レベルは、参照の遺伝子の平均（例えば、平均発現または中央発現）であり、試料の遺伝子の平均は、参照の遺伝子の平均と比較される。
【0224】
いくつかの実施形態では、第１の試料中のマーカーの存在及び／または発現レベル／量が、第２の試料中の存在／不在及び／または発現レベル／量と比較して増加または上昇する。いくつかの実施形態では、第１の試料中のマーカーの存在／不存在及び／または発現レベル／量が、第２の試料中の存在及び／または発現レベル／量と比較して低下または減少する。いくつかの実施形態では、第２の試料は、参照試料（例えば、開示され、定義された培養培地の不存在で培養されたＰＨＨ）、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織である。
【0225】
容器及びインキュベーター
本開示はまた、本明細書に記載する培地及び方法と共に使用可能な組織培養物及びインキュベーターにも関する。例えば、本明細書に記載する培養方法は、容器またはインキュベーター内でＰＨＨを培養することを含むことができる。
本開示はまた、本明細書に記載する培地及び方法と共に使用可能な組織培養物及びインキュベーターにも関する。例えば、本明細書に記載する培養方法は、容器またはインキュベーター内でＰＨＨを培養することを含むことができる。
【0226】
いくつかの実施形態では、組織培養容器は、本明細書に記載する増殖培地を含むことができる。いくつかの実施形態では、インキュベーターは、組織培養容器を含むことができる。いくつかの実施形態では、インキュベーターは、組織培養容器を含み、低酸素条件下で組織培養容器を維持することができる。低酸素条件としては、例えば、２０％未満の酸素濃度を挙げることができる。いくつかの実施形態では、インキュベーターは、１％～１９％（例えば、１％～１０％、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％）の酸素濃度を維持する。いくつかの実施形態では、酸素濃度は、１％～１０％である。いくつかの実施形態では、酸素レベルは５％である。いくつかの実施形態では、インキュベーターは、組織培養容器を含み、正常酸素条件下で組織培養容器を維持することができる。
【0227】
肝細胞アグリゲート
本発明の増殖した、及び／または成熟したＰＨＨは、凝集することができる。本明細書に記載するアグリゲートは、ＰＨＨの集団を含む。いくつかの実施形態では、ＰＨＨは、細胞集団にアグリゲートを形成させる条件下にて混合される。いくつかの実施形態では、ＰＨＨは、組織製造技術を用いて混合される。いくつかの実施形態では、ＰＨＨは、ハンギングドロップ；マイクロウェル成形；非接着性表面；スピナーフラスコ、垂直ホイールバイオリアクター、水平ホイールバイオリアクター、またはマイクロ流体スフェロイドシステムを用いるスフェロイド懸濁培養により培養される。さらなる方法としては、音波を用いる、及び、プレート上で正に帯電した表面を用いるものが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＰＨＨは、ストローマ細胞（例えば、正常なヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ））の存在下で混合される。いくつかの実施形態では、ＰＨＨは、ＮＨＤＦの存在下で混合される。いくつかの実施形態では、ＰＨＨは、ストローマ細胞（例えば、ＮＨＤＦ）の不存在下で混合される。いくつかの実施形態では、ＰＨＨは、ＮＨＤＦの不存在下で混合される。
本発明の増殖した、及び／または成熟したＰＨＨは、凝集することができる。本明細書に記載するアグリゲートは、ＰＨＨの集団を含む。いくつかの実施形態では、ＰＨＨは、細胞集団にアグリゲートを形成させる条件下にて混合される。いくつかの実施形態では、ＰＨＨは、組織製造技術を用いて混合される。いくつかの実施形態では、ＰＨＨは、ハンギングドロップ；マイクロウェル成形；非接着性表面；スピナーフラスコ、垂直ホイールバイオリアクター、水平ホイールバイオリアクター、またはマイクロ流体スフェロイドシステムを用いるスフェロイド懸濁培養により培養される。さらなる方法としては、音波を用いる、及び、プレート上で正に帯電した表面を用いるものが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＰＨＨは、ストローマ細胞（例えば、正常なヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ））の存在下で混合される。いくつかの実施形態では、ＰＨＨは、ＮＨＤＦの存在下で混合される。いくつかの実施形態では、ＰＨＨは、ストローマ細胞（例えば、ＮＨＤＦ）の不存在下で混合される。いくつかの実施形態では、ＰＨＨは、ＮＨＤＦの不存在下で混合される。
【0228】
他の態様では、本明細書で提供する組成物は、限定されるものではないが、増殖因子、リガンド、サイトカイン、薬剤などを含む、追加の構成成分を含有することができる。いくつかの実施形態では、細胞混合物は、細胞集団の増殖及び拡大を刺激または増強させる、低分子または増殖因子などの、追加の微小環境の手がかりを誘発する分子を含むことができる。
【0229】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示するアグリゲートは、ｉｎ ｖｉｖｏで移植された細胞の所望の表現型の維持を促進する、１つ以上の接着材料を含む。材料としては、抗体、タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチドアプタマー、核酸アプタマー、糖類、プロテオグリカン、または細胞受容体を挙げることができるが、これに限定されない。接着材料（例えば、ＥＣＭ材料、糖類、プロテオグリカンなど）の種類は、部分的には、培養される細胞型（例えば、ＰＨＨ）により決定される。
【0230】
いくつかの実施形態では、細胞及び材料を組織化して、アグリゲートなどの空間配置にすることは、ウェルもしくは溝を用いて、細胞／材料の配置を物理的に制限すること、または、細胞をマイクロ流体流路、もしくは配向された空隙／細孔に注入することにより達成することができる。ある特定の実施形態では、細胞は、細胞を、電界、磁気ピンセット、光ピンセット、超音波、圧波、またはマイクロマニピュレーターで、物理的に位置決めすることにより組織化することができる。
【0231】
本明細書に記載の方法により産生された細胞を、アグリゲートの作製において速やかに用いることができる。あるいは、細胞を、液体窒素温度で凍結し、長期間保管し、解凍し、再利用することができる。例えば、細胞は、１０％のＤＭＳＯ、５０％の血清、４０％の緩衝培地、または、このような凍結温度において細胞を保存するために当該技術分野において一般的に用いられる、いくつかの他のこのような溶液において凍結され、凍結した培養細胞を解凍するために、当該技術分野において一般的に周知の方法で解凍することができる。
【0232】
細胞移植
本明細書に記載するとおり、本明細書で開示する方法は、増殖した、及び／または成熟したＰＨＨの集団、またはその後代を、レシピエントに導入することを含むことができる。いくつかの実施形態では、増殖した、及び／または成熟したＰＨＨの集団、またはその後代は、肝細胞アグリゲートの形態でレシピエントに導入される。いくつかの実施形態では、レシピエントはヒトである。いくつかの実施形態では、レシピエントは、肝疾患を患うヒト患者である。増殖した、及び／または成熟したＰＨＨの集団、またはその後代は、例えば、対象への移植のために、組換え組織構築物に組み込むことができる。組換え組織構築物は、生体適合性のヒドロゲル足場（例えば、フィブリンを含有する）を含むことができる。生体適合性の足場は、凝集したＰＨＨの封入された集団を含有することができる。
本明細書に記載するとおり、本明細書で開示する方法は、増殖した、及び／または成熟したＰＨＨの集団、またはその後代を、レシピエントに導入することを含むことができる。いくつかの実施形態では、増殖した、及び／または成熟したＰＨＨの集団、またはその後代は、肝細胞アグリゲートの形態でレシピエントに導入される。いくつかの実施形態では、レシピエントはヒトである。いくつかの実施形態では、レシピエントは、肝疾患を患うヒト患者である。増殖した、及び／または成熟したＰＨＨの集団、またはその後代は、例えば、対象への移植のために、組換え組織構築物に組み込むことができる。組換え組織構築物は、生体適合性のヒドロゲル足場（例えば、フィブリンを含有する）を含むことができる。生体適合性の足場は、凝集したＰＨＨの封入された集団を含有することができる。
【0233】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のとおりに培養した、増殖した、及び／または成熟したＰＨＨを用いることも、同様に提供する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の増殖した、及び／または成熟したＰＨＨの集団、または、上記増殖したＰＨＨの集団に由来する、多数の凍結したＰＨＨを、発見スクリーニング；毒性アッセイ；組換え遺伝子発現を含む遺伝子発現研究；組織損傷及び修復に関与する機構の研究；炎症性及び感染性疾患の研究；病原体メカニズムの研究；または、肝疾患の細胞形質転換及び病因のメカニズムの研究において使用することもまた提供する。
【0234】
いくつかの実施形態では、本発明は、薬剤で使用するための、本発明の増殖した、及び／または成熟したＰＨＨの集団に由来する細胞もまた提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、障害、病状、または疾患の処置で使用するための、本発明の増殖した、及び／または成熟したＰＨＨの集団に由来する細胞もまた提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、例えば、再生医療で使用するための、本発明の増殖したＰＨＨ集団、または、増殖したＰＨＨの集団に由来する細胞もまた提供し、使用には、増殖した細胞の集団、または、増殖したＰＨＨの集団に由来する細胞を、患者に移植することが伴う。いくつかの実施形態では、本発明は、例えば、再生医療で使用するための、本発明の成熟したＰＨＨ集団、または、成熟したＰＨＨの集団に由来する細胞もまた提供し、使用には、成熟した細胞の集団、または、成熟したＰＨＨの集団に由来する細胞を、患者に移植することが伴う。
【0235】
薬学的製剤
本発明は、増殖した、及び／または成熟したＰＨＨの１つ以上の集団、ならびに、薬学的に許容される希釈剤及び／または賦形剤を含む薬学的製剤もまた提供する。いくつかの実施形態では、薬学的製剤は、ＰＨＨの集団と、１種以上の賦形剤と、を含む。いくつかの実施形態では、賦形剤は、水、食塩水、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミラーゼ、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、及びポリビニルピロリドンから選択される。
本発明は、増殖した、及び／または成熟したＰＨＨの１つ以上の集団、ならびに、薬学的に許容される希釈剤及び／または賦形剤を含む薬学的製剤もまた提供する。いくつかの実施形態では、薬学的製剤は、ＰＨＨの集団と、１種以上の賦形剤と、を含む。いくつかの実施形態では、賦形剤は、水、食塩水、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミラーゼ、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、及びポリビニルピロリドンから選択される。
【0236】
いくつかの実施形態では、増殖培地または成熟培地は、医薬組成物または製剤を調製するために、薬学的に許容される活性な、及び／または、不活性な物質と混合することができる。薬学的製剤用の組成物及び方法は、投与経路、疾患の程度、または投与される用量を含むがこれらに限定されないいくつかの基準に依存する。
【0237】
いくつかの実施形態では、ＰＨＨの集団を含む医薬組成物は、阻害剤の任意の薬学的に許容される塩、阻害剤のエステル、または、このようなエステルの塩を包含する。いくつかの実施形態では、ＰＨＨの集団を含む医薬組成物は、対象（例えば、ヒト）への投与時、生物学的に活性な代謝産物またはその残分を（直接的または間接的に）もたらすことができる。したがって、例えば、本開示は、阻害剤の薬剤的に許容される塩、プロドラッグ、そのようなプロドラッグの薬剤的に許容される塩、及び他の生物学的等価物を対象とする。適した薬学的に許容される塩としては、ナトリウム及びカリウム塩が挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、プロドラッグは、増殖培地に付着した１つ以上のコンジュゲート基を含み、この場合、コンジュゲート基は、体内の内在酵素によって切断される。
【0238】
いくつかの実施形態では、薬学的製剤は、共溶媒系を含む。ある特定のそのような共溶媒系は、例えば、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機ポリマー、及び水相を含む。いくつかの実施形態では、そのような共溶媒系は、疎水性化合物に用いられる。このような共溶媒系の非限定例は、３％ｗ／ｖのベンジルアルコール、８％ｗ／ｖの非極性界面活性剤Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０（商標）及び６５％ｗ／ｖのポリエチレングリコール３００を含む無水エタノールの溶液であるＶＰＤ共溶媒系である。そのような共溶媒系の割合は、その溶解性及び毒性特性を著しく変えることなく大幅に変化する場合もある。さらに、共溶媒構成成分の同一性は、変化する場合もあり、例えば、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０（商標）の代わりにその他の界面活性剤が使用されてもよく、ポリエチレングリコールの分割量は変化することもあり、他の生体適合性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドンが、ポリエチレングリコールに取って代わってもよく、デキストロースを他の糖または多糖類で置換してもよい。
【0239】
いくつかの実施形態では、薬学的製剤は、注射（例えば、眼内（例えば、硝子体内）、静脈内、皮下、筋肉内、髄腔内、脳室内など）による投与のために調製される。いくつかの実施形態では、薬学的製剤は、担体を含み、水溶液、例えば、水または生理学的に相溶性の緩衝液、例えば、ハンクス溶液、リンガー溶液、または生理食塩水緩衝液等の中で製剤化される。いくつかの実施形態では、他の成分（例えば、溶解に役立つか、または防腐剤の役目を果たす成分）が含まれる。いくつかの実施形態では、注入可能な懸濁液は、適切な液体担体、懸濁化剤等を用いて調製される。特定の注射用薬学的製剤は、単位剤形として、例えば、アンプルに入れてまたは複数用量容器に入れて提供される。注入用のある特定の薬学的製剤は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、またはエマルションであり、懸濁化剤、安定化剤、及び／または分散剤などの製剤化剤を含有し得る。注入用の薬学的製剤における使用に好適なある特定の溶媒には、親油性溶媒及び脂肪油、例えば、ゴマ油、合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド、及びリポソームが含まれるが、これらに限定されない。
【0240】
キット
本明細書に記載する組成物は、新たに抽出した、もしくは以前に凍結したＰＨＨの増殖で、または、ＰＨＨの成熟で使用するためのキットで提供されることができる。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載する、１種以上の細胞培養培地の構成成分を含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、キットのユーザ、例えば、実験室の科学者に、本明細書に記載の方法のいずれか１つを実施するように指示する添付文書を含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法に従い以前に増殖した、凍結したＰＨＨを含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法に従い以前に成熟した、凍結したＰＨＨを含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、任意選択的に、薬学的製剤を投与するための装置を含むことができる。
本明細書に記載する組成物は、新たに抽出した、もしくは以前に凍結したＰＨＨの増殖で、または、ＰＨＨの成熟で使用するためのキットで提供されることができる。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載する、１種以上の細胞培養培地の構成成分を含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、キットのユーザ、例えば、実験室の科学者に、本明細書に記載の方法のいずれか１つを実施するように指示する添付文書を含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法に従い以前に増殖した、凍結したＰＨＨを含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法に従い以前に成熟した、凍結したＰＨＨを含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、任意選択的に、薬学的製剤を投与するための装置を含むことができる。
【0241】
実施例
以下の実施例は、本明細書に記載される組成物及び方法をどのように使用し、評価し得るかについての説明を当業者に提供するために提示され、本発明の純粋な例示であることが意図されるものであり、本発明者らが発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではない。
以下の実施例は、本明細書に記載される組成物及び方法をどのように使用し、評価し得るかについての説明を当業者に提供するために提示され、本発明の純粋な例示であることが意図されるものであり、本発明者らが発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではない。
【0242】
実施例１．増殖培地を用いる細胞培養法の評価
供給元が提供する取扱説明書に従い、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）の凍結したバイアルを解凍した。供給元が提供する培地の存在下で、ｃｍ２当たり５×１０３～６×１０３の密度で、ＰＨＨを、ラットの尾部コラーゲンＩまたは組換えヒトラミニン５２１でコーティングした組織培養容器にプレーティングした（表１、表２）。４時間後に、プレーティング培地を、開示した増殖培地に交換し、これを４８時間毎に交換した。図１は、Ｔ－７５培養フラスコで６日後（Ｐ０）において、増殖培地を用いて培養したＰＨＨ細胞の明視野画像を示す。異なる時点でＰＨＨを収集し、４％のホルムアルデヒドにＰＨＨを固定し、０．４％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００にＰＨＨを透過処理し、ウシ血清アルブミンでブロックし、アルブミン、ＨＮＦ４α、及びＬＧＲ５から選択される一次抗体と一晩インキュベートし、適切な二次抗体と１時間インキュベートすることにより免疫蛍光法を実施した。画像を、蛍光顕微鏡で撮影した。コラーゲンＩでコーティングした、２次元プラスチック表面で１３日間増殖させた後、ＰＨＨはアルブミン、ＨＮＦ４α、及びＬＧＲ５を発現した（図２）。ラミニン５２１でコーティングした、２次元プラスチック表面で１３日間増殖させた後、ＰＨＨはアルブミン、ＨＮＦ４α、及びＬＧＲ５を発現した（図３）。コラーゲンＩ及びラミニン５２１は、類似の染色結果を得たことを、免疫染色した細胞パネル間での定性比較は示す。ＰＨＨを培養するためにＥＣＭを用いることで、ＰＨＨの長期生存が向上し、増殖性肝臓表現型の継続的存在が向上した。
供給元が提供する取扱説明書に従い、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）の凍結したバイアルを解凍した。供給元が提供する培地の存在下で、ｃｍ２当たり５×１０３～６×１０３の密度で、ＰＨＨを、ラットの尾部コラーゲンＩまたは組換えヒトラミニン５２１でコーティングした組織培養容器にプレーティングした（表１、表２）。４時間後に、プレーティング培地を、開示した増殖培地に交換し、これを４８時間毎に交換した。図１は、Ｔ－７５培養フラスコで６日後（Ｐ０）において、増殖培地を用いて培養したＰＨＨ細胞の明視野画像を示す。異なる時点でＰＨＨを収集し、４％のホルムアルデヒドにＰＨＨを固定し、０．４％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００にＰＨＨを透過処理し、ウシ血清アルブミンでブロックし、アルブミン、ＨＮＦ４α、及びＬＧＲ５から選択される一次抗体と一晩インキュベートし、適切な二次抗体と１時間インキュベートすることにより免疫蛍光法を実施した。画像を、蛍光顕微鏡で撮影した。コラーゲンＩでコーティングした、２次元プラスチック表面で１３日間増殖させた後、ＰＨＨはアルブミン、ＨＮＦ４α、及びＬＧＲ５を発現した（図２）。ラミニン５２１でコーティングした、２次元プラスチック表面で１３日間増殖させた後、ＰＨＨはアルブミン、ＨＮＦ４α、及びＬＧＲ５を発現した（図３）。コラーゲンＩ及びラミニン５２１は、類似の染色結果を得たことを、免疫染色した細胞パネル間での定性比較は示す。ＰＨＨを培養するためにＥＣＭを用いることで、ＰＨＨの長期生存が向上し、増殖性肝臓表現型の継続的存在が向上した。
【0243】
【表1】
【0244】
【表2】
【0245】
実施例２．ＰＨＨの増殖の評価
増殖培地の存在下で、ラミニン５２１でコーティングした２次元表面上で、ＰＨＨを継代し、１２０日間増殖させた。培地を、４８時間毎に交換した。この期間の間に、細胞は、（図４）に見られるように、モルホロジー及び上皮表現型を維持した。６８日目に、細胞の免疫染色によって、コロニーの先端にある細胞が、増殖性の肝細胞表現型細胞であり、ＨＮＦ４α、ＬＧＲ５、及びＫｉ６７を発現したことが明らかとなった（図５）。
増殖培地の存在下で、ラミニン５２１でコーティングした２次元表面上で、ＰＨＨを継代し、１２０日間増殖させた。培地を、４８時間毎に交換した。この期間の間に、細胞は、（図４）に見られるように、モルホロジー及び上皮表現型を維持した。６８日目に、細胞の免疫染色によって、コロニーの先端にある細胞が、増殖性の肝細胞表現型細胞であり、ＨＮＦ４α、ＬＧＲ５、及びＫｉ６７を発現したことが明らかとなった（図５）。
【0246】
図６のパネルは、それぞれ、表２に記載する増殖培地で培養した２日目、７日目、９日目、及び１７日目のＰＨＨを表す。２日目までに、播種した細胞のおよそ２０～２５％が、細胞培養表面に接着したようである。７日目までに、細胞は積極的に分裂し、サイズが増加した。９日目に、細胞は完全にコンフルエントとなり、上皮表現型の特徴である、玉石模様を示す。１７日目に、細胞は、十分規定された肝細胞モルホロジーを示し、密集している。早期の時点と比較して、サイズは小さくなったようである。
【0247】
ＰＨＨ（ウェル当たり、５０×１０３細胞）を、６ウェル組織培養プレートの表面に播種し、増殖培地の存在下で培養した（図７、１日目）。１７日目までに、細胞は３．１倍まで増殖し、６ウェルプレートのウェル１個は、ウェル当たり１５．５×１０４細胞を含有した（図７、１７日目）（図８）。
【0248】
実施例３．マウスに移植した増殖細胞
ＰＨＨ（４．５×１０５細胞）を、７ｍｇ／ｍＬのウシフィブリノゲン中で、９×１０５個の正常なヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）と凝集させ、１個の細胞移植片を調製した。表３に列挙するＰＨＨのロットＤを、本実験で使用した。未増殖のＰＨＨ、及び、図１に示す増殖培地を用いてコラーゲンＩマトリックスにて１０日間増殖させたＰＨＨを使用して、移植用の移植片を調製した。３匹の、ＮＯＤ－ｓｃｉｄ ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＳＧ（商標））マウス（到着時に５～８週齢）が、それぞれ１０日目の増殖したＰＨＨアグリゲートの移植片１つを受け、６匹のＮＳＧ（商標）マウスは、それぞれ対照群の未増殖ＰＨＨアグリゲートの移植片１つを受けた。ＮＳＧ（商標）マウスは、免疫不全マウスである。２ヶ月間、主に、２週間毎に３回採血を行うことで、長期臨床観察を行い、ＥＬＩＳＡにより、分泌されたヒトアルブミンレベルを検出し、定量した（図８）。これらのアグリゲートを移植したマウスにおいて、ヒトアルブミンが検出されることは、アグリゲート中のＰＨＨが生存していることを示した。さらに、増殖したＰＨＨは、移植の２ヶ月後にも継続してヒトアルブミンを合成及び分泌することが可能であったために、健常であることが確認された。増殖した移植片の末端分析もまた、免疫組織化学法により実施し、移植片に肝細胞が存在することを確認した。免疫組織化学法は、Ｈ＆Ｅ、ｈＯＴＣ、及びＣＫ１８染色により、健常な肝臓アグリゲートの存在を確認した（図９）。
ＰＨＨ（４．５×１０５細胞）を、７ｍｇ／ｍＬのウシフィブリノゲン中で、９×１０５個の正常なヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）と凝集させ、１個の細胞移植片を調製した。表３に列挙するＰＨＨのロットＤを、本実験で使用した。未増殖のＰＨＨ、及び、図１に示す増殖培地を用いてコラーゲンＩマトリックスにて１０日間増殖させたＰＨＨを使用して、移植用の移植片を調製した。３匹の、ＮＯＤ－ｓｃｉｄ ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＳＧ（商標））マウス（到着時に５～８週齢）が、それぞれ１０日目の増殖したＰＨＨアグリゲートの移植片１つを受け、６匹のＮＳＧ（商標）マウスは、それぞれ対照群の未増殖ＰＨＨアグリゲートの移植片１つを受けた。ＮＳＧ（商標）マウスは、免疫不全マウスである。２ヶ月間、主に、２週間毎に３回採血を行うことで、長期臨床観察を行い、ＥＬＩＳＡにより、分泌されたヒトアルブミンレベルを検出し、定量した（図８）。これらのアグリゲートを移植したマウスにおいて、ヒトアルブミンが検出されることは、アグリゲート中のＰＨＨが生存していることを示した。さらに、増殖したＰＨＨは、移植の２ヶ月後にも継続してヒトアルブミンを合成及び分泌することが可能であったために、健常であることが確認された。増殖した移植片の末端分析もまた、免疫組織化学法により実施し、移植片に肝細胞が存在することを確認した。免疫組織化学法は、Ｈ＆Ｅ、ｈＯＴＣ、及びＣＫ１８染色により、健常な肝臓アグリゲートの存在を確認した（図９）。
【0249】
【表3】
【0250】
実施例４．ＰＨＨの増殖限界の評価
増殖培地の存在下で、コラーゲンＩ及びラミニン５１１を含むＥＣＭでコーティングした２次元表面上で、ＰＨＨを継代し、増殖させた。増殖培地は、Ｗｎｔシグナル伝達活性化因子Ｗｎｔ３ａ及びルーフプレート特異的スポンジンタンパク質４、受容体型チロシンキナーゼリガンド上皮増殖因子及びトランスフォーミング増殖因子α、上皮表現型安定化剤Ａ８３－０１、ならびに、細胞生残剤のニコチンアミド及びＢ２７を含んだ。培地を２日に１回交換し、コンフルエンスに達するまでＰＨＨを継代した。ＰＨＨを、１０倍希釈で新たな表面に播種した。６ヶ月の培養後に、ＰＨＨの試料を収集した。免疫蛍光法を実施し、ＰＨＨ発現プロファイルを評価した。免疫蛍光法による定量化により、ＰＨＨの最大１５％（例えば、最大１０％、５％、または１％）がＫｉ６７を発現し、細胞の少なくとも１０％（例えば、少なくとも１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％）がＣｙｐ３ａ４を発現し、細胞の少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、または９５％）が、肝細胞核因子４α、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５、ケラチン１８、及びアルブミンから選択される１つ以上のタンパク質を発現したことが示された。
増殖培地の存在下で、コラーゲンＩ及びラミニン５１１を含むＥＣＭでコーティングした２次元表面上で、ＰＨＨを継代し、増殖させた。増殖培地は、Ｗｎｔシグナル伝達活性化因子Ｗｎｔ３ａ及びルーフプレート特異的スポンジンタンパク質４、受容体型チロシンキナーゼリガンド上皮増殖因子及びトランスフォーミング増殖因子α、上皮表現型安定化剤Ａ８３－０１、ならびに、細胞生残剤のニコチンアミド及びＢ２７を含んだ。培地を２日に１回交換し、コンフルエンスに達するまでＰＨＨを継代した。ＰＨＨを、１０倍希釈で新たな表面に播種した。６ヶ月の培養後に、ＰＨＨの試料を収集した。免疫蛍光法を実施し、ＰＨＨ発現プロファイルを評価した。免疫蛍光法による定量化により、ＰＨＨの最大１５％（例えば、最大１０％、５％、または１％）がＫｉ６７を発現し、細胞の少なくとも１０％（例えば、少なくとも１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％）がＣｙｐ３ａ４を発現し、細胞の少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、または９５％）が、肝細胞核因子４α、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５、ケラチン１８、及びアルブミンから選択される１つ以上のタンパク質を発現したことが示された。
【0251】
実施例５．改変増殖培地－ＥＸＰＡＮＤ ３．０カクテルを用いる、ＰＨＨの増殖
改変増殖培地であるＥＸＰＡＮＤ ３．０カクテルを用い、実施例１に記載するのと同様の方法で、ＰＨＨを増殖させた。改変増殖培地はＲＯＣＫ阻害剤を欠き、ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清代替物（ＫＯＳＲ）及び非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）を含んだ（表４）。ＥＸＰＡＮＤ ３．０カクテルに対して、５～１０％の勾配増加で、ＫＯＳＲを添加した。増殖するＰＨＨを、ＥＸＰＡＮＤ ３．０カクテルに対して、５％酸素の低酸素雰囲気のインキュベーターに配置した。培養条件にこれらの変化をもたらすことで、コラーゲンＩ及びラミニン５２１マトリックスの両方において、ＰＨＨのロバストな増殖が得られた（図１０）。継代及びＰ１増殖をさらに最適化することで、Ｅｘｐａｎｄ ３．０は、Ｐ０＋Ｐ１において、１０００倍を超える累積の増殖を裏付けた（図１１）。Ｐ０及びＰ１における、増殖した肝細胞をＲＴ－ｑＰＣＲ分析すると、コラーゲンＩまたはラミニン５２１で一晩プレーティングされる対照の未増殖肝細胞と比較して、増殖した肝細胞の肝臓前駆細胞状態が示された（図１２）。分泌されたアルブミンの量が少ないことで、対照の未増殖肝細胞と比較して、増殖した肝細胞の細胞状態は、さほど成熟してないことが示される（図１３）。ＨＮＦ４ａ及びアルブミンに対して免疫染色を行い（図１４）、陽性細胞の割合（％）を定量すること（図１５）によって、ｐ１増殖の終了時における、増殖した肝細胞の肝臓表現型が確認される。
改変増殖培地であるＥＸＰＡＮＤ ３．０カクテルを用い、実施例１に記載するのと同様の方法で、ＰＨＨを増殖させた。改変増殖培地はＲＯＣＫ阻害剤を欠き、ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清代替物（ＫＯＳＲ）及び非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）を含んだ（表４）。ＥＸＰＡＮＤ ３．０カクテルに対して、５～１０％の勾配増加で、ＫＯＳＲを添加した。増殖するＰＨＨを、ＥＸＰＡＮＤ ３．０カクテルに対して、５％酸素の低酸素雰囲気のインキュベーターに配置した。培養条件にこれらの変化をもたらすことで、コラーゲンＩ及びラミニン５２１マトリックスの両方において、ＰＨＨのロバストな増殖が得られた（図１０）。継代及びＰ１増殖をさらに最適化することで、Ｅｘｐａｎｄ ３．０は、Ｐ０＋Ｐ１において、１０００倍を超える累積の増殖を裏付けた（図１１）。Ｐ０及びＰ１における、増殖した肝細胞をＲＴ－ｑＰＣＲ分析すると、コラーゲンＩまたはラミニン５２１で一晩プレーティングされる対照の未増殖肝細胞と比較して、増殖した肝細胞の肝臓前駆細胞状態が示された（図１２）。分泌されたアルブミンの量が少ないことで、対照の未増殖肝細胞と比較して、増殖した肝細胞の細胞状態は、さほど成熟してないことが示される（図１３）。ＨＮＦ４ａ及びアルブミンに対して免疫染色を行い（図１４）、陽性細胞の割合（％）を定量すること（図１５）によって、ｐ１増殖の終了時における、増殖した肝細胞の肝臓表現型が確認される。
【0252】
【表4】
【0253】
実施例６．増殖した肝細胞の成熟
実施例１及び５に記載するのと同様の方法でＰＨＨを増殖させた後、成熟させた（図１６）。ＰＨＨの凍結したバイアルを解凍し、５％のＫＯＳＲを含有する増殖培地を含むｔ７５フラスコにプレーティングした（ステップＰ０）。９日後に、ＫＯＳＲを１０％まで上昇させた。１３日目に、細胞を、５％のＫＯＳＲを含有する新鮮な培地を含む６ウェルプレートに移し（ステップＰ１）、７日間置いた後、ＫＯＳＲを１０％まで上昇させ、さらに４日間、細胞を増殖させた。細胞増殖の総時間は、２４日間であった。増殖後、様々な肝細胞成熟サプリメント（表５）を含む、ＬＯＮＺＡ（商標）ＨＣＭ（商標）、ウィリアムＥ、またはＨｅｐａｔｏｚｙｍｅ－ＳＦＭの、成熟基礎培地を含有する６ウェルプレートに細胞を移した。
実施例１及び５に記載するのと同様の方法でＰＨＨを増殖させた後、成熟させた（図１６）。ＰＨＨの凍結したバイアルを解凍し、５％のＫＯＳＲを含有する増殖培地を含むｔ７５フラスコにプレーティングした（ステップＰ０）。９日後に、ＫＯＳＲを１０％まで上昇させた。１３日目に、細胞を、５％のＫＯＳＲを含有する新鮮な培地を含む６ウェルプレートに移し（ステップＰ１）、７日間置いた後、ＫＯＳＲを１０％まで上昇させ、さらに４日間、細胞を増殖させた。細胞増殖の総時間は、２４日間であった。増殖後、様々な肝細胞成熟サプリメント（表５）を含む、ＬＯＮＺＡ（商標）ＨＣＭ（商標）、ウィリアムＥ、またはＨｅｐａｔｏｚｙｍｅ－ＳＦＭの、成熟基礎培地を含有する６ウェルプレートに細胞を移した。
【0254】
【表5】
【0255】
７日間の成熟後に、試料を収集して尿素、アルブミン、及び成熟マーカーを測定した。増殖した肝細胞の成熟によって、尿素の誘導及び分泌がもたらされ（図１７）、一方で、分泌されたアルブミンのレベルは維持された（図１８）。成熟な肝細胞表現型に対応する転写物は、増殖した肝細胞の成熟時に上方制御される一方で、前駆細胞／胆管細胞転写物は下方制御されることが判明した（図１９）。位相差顕微鏡画像は、増殖した肝細胞と、成熟の完了後の肝細胞との形態的な違いを示した（図２０）。
【0256】
他の実施形態
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれ個々の刊行物または特許出願が参照により本明細書に援用されることが具体的かつ個別に示される場合と同様に、参照により本明細書に援用される。
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれ個々の刊行物または特許出願が参照により本明細書に援用されることが具体的かつ個別に示される場合と同様に、参照により本明細書に援用される。
【0257】
特定の実施形態に関連して本発明を説明してきたが、本発明は、更なる変更が可能であり、本出願は、一般に、本発明の原理に従った本発明のあらゆる変形、使用、または適合を含むことが意図され、本発明が属する技術分野における既知のまたは慣習的な実施の範囲内であり、かつ本明細書に前述される本質的な特徴に適用され得る本発明からの発展を含み、特許請求の範囲の範囲に従うものであることが理解される。
【0258】
他の実施形態は、特許請求の範囲内である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【国際調査報告】