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▶ ザ・キュレーターズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミズーリの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-18
(54)【発明の名称】生体活性ガラス組成物、及び治療方法
(51)【国際特許分類】
C03C 3/19 20060101AFI20241010BHJP
A61K 33/08 20060101ALI20241010BHJP
A61K 33/24 20190101ALI20241010BHJP
A61K 33/30 20060101ALI20241010BHJP
A61K 33/34 20060101ALI20241010BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20241010BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20241010BHJP
A61K 33/42 20060101ALI20241010BHJP
【ＦＩ】
C03C3/19
A61K33/08
A61K33/24
A61K33/30
A61K33/34
A61P21/00
A61P25/00
A61K33/42
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024514080
(86)(22)【出願日】2022-09-01
(85)【翻訳文提出日】2024-04-30
(86)【国際出願番号】 US2022042374
(87)【国際公開番号】W WO2023034523
(87)【国際公開日】2023-03-09
(31)【優先権主張番号】63/260,858
(32)【優先日】2021-09-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．サランラップ
(71)【出願人】
【識別番号】501305844
【氏名又は名称】ザ・キュレーターズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミズーリ
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＣＵＲＡＴＯＲＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＭＩＳＳＯＵＲＩ
(74)【代理人】
【識別番号】100101454
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 卓二
(74)【代理人】
【識別番号】100156144
【弁理士】
【氏名又は名称】落合 康
(72)【発明者】
【氏名】モートン，アーロン ビー
(72)【発明者】
【氏名】ブラウ，リチャード ケイ
(72)【発明者】
【氏名】シーガル，スティーブン エス
(72)【発明者】
【氏名】シーモン，ジュリー エイ
【テーマコード（参考）】
4C086
4G062
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086HA01
4C086HA02
4C086HA03
4C086HA04
4C086HA05
4C086HA07
4C086HA10
4C086HA19
4C086HA21
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4C086ZA01
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4G062KK07
4G062KK10
4G062MM18
4G062MM19
4G062NN33
4G062NN34
(57)【要約】
負傷又は疾患の結果としての軟組織の再生を改善するための組成物及び方法を提供する。反応体組成物をか焼することでもたらされる生体活性ガラス組成物を含む、様々な組成物を開示する。負傷した、又は疾患を持った骨格筋の治療方法であって、当該負傷した、又は疾患を持った骨格筋を、生体活性ガラス組成物と接触させることを含む、上記方法もまた開示される。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下を含む反応体組成物をか焼することでもたらされる生体活性ガラス組成物：約１０重量％～約４０重量％のＢ２Ｏ３、
約１５重量％～約４０重量％のＰ２Ｏ５、
約１０重量％～約２５重量％のＣａＯ、
約５重量％～約２０重量％のＮａ２Ｏ、及び
任意選択で、約２重量％～約１０％のＣｏＯ、約０．５重量％～約２重量％のＺｎＯ、
約０．１重量％～約１重量％のＣｕＯ、又はこれらの組み合わせ。
【請求項2】
前記反応体組成物は、約１０重量％～約４０重量％のＢ２Ｏ３、
約１５重量％～約４０重量％のＰ２Ｏ５、
約１０重量％～約２５重量％のＣａＯ、
約５重量％～約２０重量％のＮａ２Ｏ、及び
約２重量％～約１０重量％のＣｏＯ
を含む、請求項１に記載の生体活性ガラス組成物。
【請求項3】
前記反応体組成物は、約３３重量％～約３７重量％のＢ２Ｏ３、
約３３重量％～約３７重量％のＰ２Ｏ５、
約１３重量％～約１８重量％のＣａＯ、
約１１重量％～約１４重量％のＮａ２Ｏ、及び
約３重量％～約５重量％のＣｏＯ
を含む、請求項１又は２に記載の生体活性ガラス組成物。
【請求項4】
前記反応体組成物は、約３０重量％～約４０重量％のＢ２Ｏ３、
約２０重量％～約４０重量％のＰ２Ｏ５、
約１０重量％～約２０重量％のＣａＯ、
約１１重量％～約１８重量％のＮａ２Ｏ、及び
約３重量％～約１０重量％のＣｏＯ
を含む、請求項１又は２に記載の生体活性ガラス組成物。
【請求項5】
前記反応体組成物は、約３０重量％～約４０重量％のＢ２Ｏ３、
約３０重量％～約４０重量％のＰ２Ｏ５、
約１０重量％～約２０重量％のＣａＯ、
約１０重量％～約１５重量％のＮａ２Ｏ、
約０．５重量％～約２重量％のＺｎＯ、及び
約０．１重量％～約１重量％のＣｕＯ
を含む、請求項１に記載の生体活性ガラス組成物。
【請求項6】
前記反応体組成物は、約３３重量％～約３７重量％のＢ２Ｏ３、
約３３重量％～約３７重量％のＰ２Ｏ５、
約１３重量％～約１８重量％のＣａＯ、
約１１重量％～約１４重量％のＮａ２Ｏ、
約０．８重量％～約１．２重量％のＺｎＯ、及び
約０．３重量％～約０．５重量％のＣｕＯ
を含む、請求項１又は５に記載の生体活性ガラス組成物。
【請求項7】
前記反応体組成物は、約３３重量％～約３７重量％のＢ２Ｏ３、
約３３重量％～約３７重量％のＰ２Ｏ５、
約１３重量％～約１８重量％のＣａＯ、及び
約１１重量％～約１４重量％のＮａ２Ｏ
を含む、請求項１に記載の生体活性ガラス組成物。
【請求項8】
前記か焼することは、前記反応体組成物を、前記反応体組成物の融解温度を下回る温度で加熱することにより行われた、請求項１～７のいずれか一項に記載の生体活性ガラス組成物。
【請求項9】
前記か焼のための温度は、約９００℃～約１１５０℃であった、請求項８に記載の生体活性ガラス組成物。
【請求項10】
前記か焼のための温度は、約１０００℃～約１１５０℃であった、請求項８に記載の生体活性ガラス組成物。
【請求項11】
前記反応体組成物は、リン酸を更に含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の生体活性ガラス組成物。
【請求項12】
前記組成物を使用して、リン酸カルシウムを形成する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の生体活性ガラス組成物。
【請求項13】
前記生体活性ガラス組成物は、分解時に中性ｐＨを維持する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の生体活性ガラス組成物。
【請求項14】
負傷した、又は疾患を持った骨格筋の治療方法であって、前記負傷した、又は疾患を持った骨格筋を、有効量の、請求項１～１３のいずれか一項に記載の生体活性ガラス組成物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項15】
前記負傷した、又は疾患を持った骨格筋は、生理食塩水による、他は同様の処置を受ける、負傷した、又は疾患を持った骨格筋と比較して、前記生体活性ガラス組成物による処置の、少なくとも８日後に、平均筋原線維面積の増加を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記負傷した、又は疾患を持った骨格筋は、生理食塩水による、他は同様の処置を受ける、負傷した、又は疾患を持った骨格筋と比較して、前記生体活性ガラス組成物による処置の、少なくとも５日後に、低い胚ミオシン重鎖（ｅＭｙＨＣ）濃度を有する、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項17】
前記負傷した、又は疾患を持った骨格筋は、生理食塩水による、他は同様の処置を受ける、負傷した、又は疾患を持った骨格筋と比較して、前記生体活性ガラス組成物による処置の、少なくとも１０日後に、筋量の増加を有する、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記負傷した、又は疾患を持った骨格筋は、生理食塩水による、他は同様の処置を受ける、負傷した、又は疾患を持った骨格筋と比較して、前記生体活性ガラス組成物による処置の、少なくとも１０日後に、筋肉ピーク力の増加を有する、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記負傷した、又は疾患を持った骨格筋は、生理食塩水による、他は同様の処置を受ける、負傷した、又は疾患を持った骨格筋と比較して、前記生体活性ガラス組成物による処置の、少なくとも５日後に、血管新生の増加を有する、請求項１４～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
前記負傷した、又は疾患を持った骨格筋は、負傷した骨格筋である、請求項１４～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記負傷した骨格筋は、肉離れした筋肉、外傷により負傷した筋肉、断裂した筋肉、筋肉の使いすぎ若しくは誤使用から生じる負傷した筋肉、又はこれらの組み合わせである、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記筋肉の使いすぎ若しくは誤使用から生じる負傷した筋肉は、スポーツでの負傷の結果である、請求項２０に記載の方法。
【請求項23】
前記負傷した、又は疾患を持った骨格筋は、疾患を持った骨格筋である、請求項１４～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記疾患を持った骨格筋は、異栄養性骨格筋、悪液質骨格筋、サルコペニア骨格筋、又はこれらの組み合わせである、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
負傷した、又は疾患を持った脳又は神経組織の治療方法であって、前記負傷した、又は疾患を持った脳又は神経組織を、有効量の、請求項１～１３のいずれか一項に記載の生体活性ガラス組成物と接触させることを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年９月２日に出願された米国仮出願第６３／２６０，８５８号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年９月２日に出願された米国仮出願第６３／２６０，８５８号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
負傷又は疾患の結果としての軟組織の再生を改善するための組成物及び方法を提供する。具体的には、組織と接触させ、組織を治療するための、生体活性ガラス組成物について記載する。
【背景技術】
【0003】
急性外傷は、アメリカ合衆国における、死亡及び身体障害の主要な原因である。市民は、衰弱を引き起こす転倒、乗り物事故、及び機械での負傷を被る一方で、軍人は、戦闘で負傷する可能性がある。複数の組織構成成分への損傷を包含する負傷は、虚血、除神経、及び壊死を含む合併症を起こす可能性がある。手術手技の進歩は、組織再生の普及を増加させたものの、罹患患者の半数は依然として、術後７年間は深刻な障害を持ったままである。また、筋ジストロフィーといった軟組織疾患は、脆い筋組織の結果として、反復性の損傷を受ける可能性がある。
【0004】
ヒトにおいて、骨格筋は、体重の約４０％を占め、温度調節を促進し、呼吸及び歩行運動を維持するための力を生成する。体全体に位置しているため、骨格筋は、自動車事故での外傷、穿通性の傷、外科的修復、及び、使いすぎによる損傷を受けやすい。骨格筋は、筋線維鞘と基底膜との間にある、成熟骨格筋線維と関連する、静止した筋幹細胞（衛星細胞）の集団による、強力な再生応答を有する。損傷後、衛星細胞は活性化し、増殖して筋芽細胞に分化し、その後、新しい筋管に、又は、損傷した筋線維の末端に融合する。骨格筋は再生可能であるものの、限界がある。具体的には、筋容積損失（ＶＭＬ、２０％を超える筋量喪失として定義）におけるもののように、負傷があまりにも深刻である場合、筋肉は再生せず、代わりに、不可逆性の瘢痕、線維症、及び機能喪失がもたらされる。臨床実践の進歩により、自己移植、同種異系移植、及び異種移植を含む組織移植による、患者の転帰が改善された。そうなっても、再生戦略には制限が生じる（免疫学的拒絶、及び炎症）。ＶＭＬに加えて、不可逆的な瘢痕、線維症、及び機能喪失が、筋ジストロフィーを患う患者において観察されている。
【0005】
例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、ｘ染色体上の、遺伝子ジストロフィンの潜性染色体変異であり、男性において、５，０００人に１人が罹患する。健常な筋肉では、ジストロフィン－糖タンパク質複合体により、細胞内Ｆ－アクチン細胞骨格を細胞外マトリックスにアンカリングすることによって、ジストロフィンは、筋線維膜（筋線維鞘）の一体性、柔軟性、及び安定性の維持を担う。ＤＭＤでは、ジストロフィンの欠損が、例えば、収縮力、特に、遠心性（伸長性）収縮（例えば、階段を降りること）により、筋線維鞘損傷をもたらし、結果として、筋原線維のイオン及び低分子に対する浸透性が増加する。治療アプローチは、２つの方法、すなわち１）遺伝子ジストロフィン（若しくは、ジストロフィン代理分子）の回復、又は、２）ジストロフィン欠損により引き起こされる二次的な結果の緩和に焦点を当ててきた。ＦＤＡが認可した治療法、及び、開発中の治療法は治療上の可能性を有するものの、これらはまた、筋機能の改善を伴わない、ジストロフィンタンパク質における残念な増加（ＦＤＡが認可した遺伝子編集薬剤である、Ｖｙｏｎｄｙｓ及びＥｘｏｎｄｙｓは、１％未満）、並びに、全身性の最前線投薬の付随的な結果を含む欠点を多く抱えている。変異治療法は、患者の１５％で認可されているのみである。コルチコステロイドは、ＤＭＤの進行を遅らせるのに役立つことができるだけである。ＤＭＤを有する子供は、２歳という若さでで、筋肉の反復性断裂による四肢筋の機能障害を示し、これは、筋肉が、筋原線維構造の衰えから生じる絶え間ない負傷に対応することができなくなることで、約１５歳までに不動性まで進行する。この、可動性の低下は、ＤＭＤを有する子どもの家族により挙げられている、主な重荷である。このような、衰弱性の筋負傷及び疾患が、骨格筋の再生に導く生体模倣スキャフォールドの必要性を加速させている。
【0006】
したがって、軟組織の再生を改善する新規のアプローチが喫緊に必要とされている。
【発明の概要】
【0007】
約１０重量％～約４０重量％のＢ２Ｏ３、約１５重量％～約４０重量％のＰ２Ｏ５、約１０重量％～約２５重量％のＣａＯ、約５重量％～約２０重量％のＮａ２Ｏ、及び任意選択で、約２重量％～約１０重量％のＣｏＯ、約０．５重量％～約２重量％のＺｎＯ、約０．１重量％～約１重量％のＣｕＯ、又はこれらの組み合わせを含む反応体組成物をか焼することでもたらされる生体活性ガラス組成物を含む、様々な組成物を本明細書で開示する。
【0008】
負傷した、又は疾患を持った骨格筋の治療方法であって、上記負傷した、又は疾患を持った骨格筋を、有効量の、本明細書に記載する生体活性ガラス組成物のいずれかと接触させることを含む、上記方法を含む、様々な方法もまた、本明細書で開示する。
【0009】
本開示は更に、負傷した、又は疾患を持った脳又は神経組織の治療方法であって、上記負傷した、又は疾患を持った脳又は神経組織を、有効量の、本明細書に記載する生体活性ガラス組成物のいずれかと接触させることを含む、上記方法に関する。
【0010】
他の目的物及び特徴は、部分的には明らかであり、部分的には以下で指摘されることになる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1A】生体内画像収集後に分析した微小血管を示す。２ｍｍのパンチ負傷の領域を、黒色の円で示す。スケールバー＝１ｍｍ。ＣＯＮ（生理食塩水ビヒクル処置／対照）で処置した微小血管を示す。
【図1B】生体内画像収集後に分析した微小血管を示す。２ｍｍのパンチ負傷の領域を、黒色の円で示す。スケールバー＝１ｍｍ。ＴＲＩＭ（徐放性イオンマトリックス）（ＣｏＯ）で処置した微小血管を示す。
【図1C】生理食塩水ビヒクル処置／対照（ＣＯＮ）、及び、徐放性イオンマトリックス（ＴＲＩＭ）（ＣｏＯ）に対する、血管が占める負傷の割合（％）を示し、負傷部位内での再生は、より大きな平均バーにより示される、ＣＯＮとＴＲＩＭ（ＣｏＯ）と間で差があるようには見えないことを示している。
【図1D】２１ｄｐｉでの、大臀筋（ＧＭ）中の蛍光血管を示す、共焦点画像の重なりを示す。画像は、負傷の中心部から取得した。スケールバー＝４００μＭ。ＣＯＮでの処置を示す。
【図1E】２１ｄｐｉでの、大臀筋（ＧＭ）中の蛍光血管を示す、共焦点画像の重なりを示す。画像は、負傷の中心部から取得した。スケールバー＝４００μＭ。ＴＲＩＭ（ＣｏＯ）での処置を示す。
【図1F】ＣＯＮ及びＴＲＩＭ（ＣｏＯ）に対する、負傷における血管の割合（％）の定量化を示し、ＣＯＮの負傷部位における、平均微小循環密度（負傷における血管の割合（％））が、ＴＲＩＭよりも高いことが明らかである。
【図2A】負傷中心部から取得した、２１ｄｐｉでの、ＧＭ筋（図１Ａ～Ｆを参照）中での筋原線維を示す共焦点画像の重なりを表す。生理食塩水（ＣＯＮ）を受けたＧＭ中の筋原線維は低密度であり、組織化されていなかった。大きな隙間（黒色）には、負傷部位内の筋線維が存在しなかった。バー＝４００μＭ。ＣＯＮでの処置を示す。
【図2C】ＣＯＮ及びＴＲＩＭ（ＣｏＯ）処置で再生した筋原線維の割合（％）を示し、ＴＲＩＭ（ＣｏＯ）処置マウスは、ＣＯＮよりも、筋原線維密度平均が増加したことが明らかである。
【図2D】ＧＭの断面を示すラミニンの境界と筋原線維核を示す。断面は、中央に負傷（点線の円）がある、上部及び下部の健常な筋肉を含有する。スケールバー＝２００μＭ。ＣＯＮでの処置を示す。
【図2E】ＧＭの断面を示すラミニンの境界と筋原線維核を示す。断面は、中央に負傷（点線の円）がある、上部及び下部の健常な筋肉を含有する。スケールバー＝２００μＭ。ＴＲＩＭ（ＣｏＯ）での処置を示す。
【図2F】ＣＯＮ及びＴＲＩＭ処置後の、断面での筋肉回復を示し、ＴＲＩＭの平均筋厚さは１に近づいた一方で、ＣＯＮの平均筋厚さは、平均およそ０．７５であったことが明らかである。
【図3A】マウスＧＭ断面の例示的な画像を示す。負傷後、筋肉を、負傷の３日後（ｄｐｉ）に、偽生理食塩水（Ｓ）、又はＴＲＩＭＣｕＺｎ（ＢＰＣｕＺｎ）で処置し、８ｄｐｉに調べた。ＤＡＰＩ染色は、再生した筋原線維の中心核を示し、ラミニンは、細胞の境界を標識する（上）。ラミニン及びｅＭｙＨＣの共染色もまた示す（下）。スケールバー＝１００ｐｍであり、全ての画像に適用される。
【図3B】８ｄｐｉでの、偽生理食塩水処置（Ｓ）に対する、並びに、０及び８ｄｐｉでの、ＴＲＩＭＣｕＺｎ（ＢＰＣｕＺｎ）に対する、ｅＭｙＨＣ陽性線維の割合（％）を示す。胚ミオシン重鎖（ｅＭｙＨＣ）の喪失は、ＴＲＩＭＣｕＺｎが筋原線維成熟を加速させ、血管新生を改善することを示す。ｎ＝２～３／群、データを、平均とＳＥＭとして報告する。
【図3C】８ｄｐｉでの、偽生理食塩水処置（Ｓ）に対する、並びに、０及び８ｄｐｉでの、ＴＲＩＭＣｕＺｎ（ＢＰＣｕＺｎ）に対する、再生線維の割合（％）を示す。
【図4A】未処置、又は、ジストロフィックス（ＣｏＯ）注射の１４日後の、月齢７ヶ月のマウスにおけるＴＡの、例示的な画像及び湿重量を示す。ジストロフィックスで処置したＴＡは、３つの未処置ＴＡよりも大きな質量を有した。
【図4B】未処置、又は、ジストロフィックス（ＣｏＯ）注射の１４日後の、月齢７ヶ月のＤＢＡマウスにおける湿ＥＤＬの、例示的な画像及び重量を示す。ジストロフィックスで処置したＥＤＬは、未処置の３つよりも大きな質量を有した。
【図4C】未処置、及び、ジストロフィックスで処置したＤＢＡマウスからのＴＡ断面の、例示的な画像を示す。胚ミオシン重鎖（ｅＭｙＨＣ）は、ジストロフィックス処置筋肉において量が少なく、これは、未処置と比較して、より多くの中心核もまた有する。筋原線維の境界をラミニンで標識した。スケールバー＝２５０μｍ。
【図5】生理食塩水、ＢＰ、又はジストロフィックス（ＣｏＯ）で処置した後の負傷後の、ピーク力の割合（％）を示す。最大の強縮は、生理食塩水、ＢＰ、又はジストロフィックス（ＣｏＯ）のいずれかにより、ｍｄｘマウスの左ＴＡを処置した１４日後に記録した。小休憩の後、ＴＡは、伸長性収縮を３回受け、これらの間に休憩を挟んだ。最大強縮を再び記録して、遠心性負傷の後に、初期最大強縮力の何パーセントが誘発可能であるかを測定した。
【図6A】未処置０ｄｐｉ、ＢＰＣｕＺｎ ０ｄｐｉ、８ｄｐｉ、及び、ＢＰＣｕＺｎ ８ｄｐｉ試料に対する、ＣＤ３１で染色した線維の例示的な画像を示す。スケールバー＝２００μｍ。
【図6B】未処置０ｄｐｉ、ＢＰＣｕＺｎ ０ｄｐｉ、８ｄｐｉ、及び、ＢＰＣｕＺｎ ８ｄｐｉ試料に対する、対照の割合（％）として微小血管領域／線維を示す。ｎ＝２～３／群。
【図7A】生理食塩水、並びに、ラミニン、ＭｙＨＣ、及びＤＡＰＩで染色したジストロフィックスで処置した線維の例示的な試料を示す。
【図7B】生理食塩水及びジストロフィックス処置マウスに対する、筋原線維断面領域の相対頻度を示す。
【発明を実施するための形態】
【0012】
対応する参照符合は、図面を通じて対応する部分を示している。
【0013】
局部組織のスキャフォールディング及び修復応答を向上させるために、負傷部位に注射を行う前に、不活性溶液（例えば、滅菌した０．９％生理食塩水）に懸濁した粉末の形態の、無機生体適合性セラミックス（生体適合性ガラス）を用いるインビボ再生のための方法が開発された。生体適合性ガラスの組成物候補は、穿刺生検で負傷した健常なマウス、加えて、疾患を持った異栄養性マウスにおいて、骨格筋の構造及び機能にて、同様の有益な効果を示している。筋再生、並びに、異栄養性筋構造及び機能の、このような向上は、主に、ホウ素リン酸塩粒子に依存し得るが、他の添加剤［例えば、ＣｏＯ（低酸素誘導因子１ａを向上させ得る）、ＣｕＯ（血管新生性であり得る）、ＺｎＯ（抗炎症性であり得る）］にもまた依存し得る。ホウ酸塩系、及びリン酸塩系ガラスの両方が、ガラス表面での、リン酸カルシウム層の形成によって、骨及び歯のエナメル質の接着及び構造支持を行うことを、以前の実験は示している。本発明の生体適合性ガラスは、ホウ酸塩とリン酸塩を、局部ｐＨに影響を及ぼすことなく、中性ｐＨでの溶解速度を遅くする比率で組み合わせることにより作製される。これは、損傷した、及び疾患を持った筋原線維に対する「生体模倣性マイクロスキャフォールド」として機能する、リン酸カルシウム層を形成すると考えられている。この効果は、ジストロフィン－糖タンパク質複合体の細胞外糖タンパク質部分に局在化でき、ジストロフィンの代わりに、筋原線維構造を安定化させることができる。筋膜区画に局部的に注射されると、区画内の筋肉全てに影響を及ぼすようであり、それによって、筋負傷又は筋ジストロフィーを有する患者において、筋原線維の一体性及び物理的な可動性を維持するための治療法として機能することができる。
【0014】
徐放性イオンマトリックス（ＴＲＩＭ）は、コバルトイオンを含有する、ホウ酸リン酸塩系の非晶質非結晶性固体（生体活性ガラス）である。粉砕して粉末にし、溶液に懸濁させ、（外傷又は疾患によって）損傷した軟組織に注射すると、材料は、軟組織再生率を顕著に増加させるようである。他の生体活性ガラス組成物が、筋容積損失を治療するために使用されている（例えば、ホウ酸アルミン酸塩ガラス粉末）。しかし、他の組成物は、負傷した骨格筋、異栄養性筋肉、血管、又は末梢神経の再生を刺激することが示されていない。負傷した、正常な（疾患を有しない）骨格筋、加えて、異栄養性骨格筋が、ＴＲＩマトリックス処置後に、サイズ及び質の両方を改善することができることが、本明細書で報告される。追加の用途としては、脳、及び、低酸素症模倣経路による軟組織を再生するための末梢神経を挙げることができる。
【0015】
約１０重量％～約４０重量％のＢ２Ｏ３、約１５重量％～約４０重量％のＰ２Ｏ５、約１０重量％～約２５重量％のＣａＯ、約５重量％～約２０重量％のＮａ２Ｏ、及び任意選択で、約２重量％～約１０重量％のＣｏＯ、約０．５重量％～約２重量％のＺｎＯ、約０．１重量％～約１重量％のＣｕＯ、又はこれらの組み合わせを含む反応体組成物をか焼することでもたらされる生体活性ガラス組成物を含む、様々な組成物を本明細書で開示する。
【0016】
反応体組成物は、約１０重量％～約４０重量％のＢ２Ｏ３、約１５重量％～約４０重量％のＰ２Ｏ５、約１０重量％～約２５重量％のＣａＯ、約５重量％～約２０重量％のＮａ２Ｏ、及び約２重量％～約１０重量％のＣｏＯを含むことができる。
【0017】
反応体組成物は、約３３重量％～約３７重量％のＢ２Ｏ３、約３３重量％～約３７重量％のＰ２Ｏ５、約１３重量％～約１８重量％のＣａＯ、約１１重量％～約１４重量％のＮａ２Ｏ、及び約３重量％～約５重量％のＣｏＯを含むことができる。
【0018】
反応体組成物は、約３０重量％～約４０重量％のＢ２Ｏ３、約２０重量％～約４０重量％のＰ２Ｏ５、約１０重量％～約２０重量％のＣａＯ、約１１重量％～約１８重量％のＮａ２Ｏ、及び約３重量％～約１０重量％のＣｏＯを含むことができる。
【0019】
反応体組成物は、約３０重量％～約４０重量％のＢ２Ｏ３、約３０重量％～約４０重量％のＰ２Ｏ５、約１０重量％～約２０重量％のＣａＯ、約１０重量％～約１５重量％のＮａ２Ｏ、約０．５重量％～約２重量％のＺｎＯ、及び約０．１重量％～約１重量％のＣｕＯを含むことができる。
【0020】
反応体組成物は、約３３重量％～約３７重量％のＢ２Ｏ３、約３３重量％～約３７重量％のＰ２Ｏ５、約１３重量％～約１８重量％のＣａＯ、約１１重量％～約１４重量％のＮａ２Ｏ、約０．８重量％～約１．２重量％のＺｎＯ、及び約０．３重量％～約０．５重量％のＣｕＯを含むことができる。
【0021】
反応体組成物は、約３３重量％～約３７重量％のＢ２Ｏ３、約３３重量％～約３７重量％のＰ２Ｏ５、約１３重量％～約１８重量％のＣａＯ、約１１重量％～約１４重量％のＮａ２Ｏを含むことができる。
【0022】
か焼は、反応体組成物を、反応体組成物の融解温度を下回る温度で加熱することにより行うことができる。か焼温度は、約８００℃～約１３００℃、又は、約１０００℃～約１１５０℃であることができる。反応体組成物は、リン酸を更に含むことができる。
【0023】
生体活性ガラス組成物を使用して、リン酸カルシウムを形成することができる。生体活性ガラス組成物は、分解時に中性ｐＨを維持することができ、これにより、トリリン酸カルシウムの形成が促進される。これは、ヒドロキシアパタイトの形成を促進する、アルカリ性ｐＨ環境を生み出す他の生体活性ガラスと対照的である。
【0024】
本開示は更に、負傷した、又は疾患を持った骨格筋の治療方法であって、上記負傷した、又は疾患を持った骨格筋を、有効量の、本明細書に開示する生体活性ガラス組成物のいずれかと接触させることを含む、上記方法に関する。負傷した、又は疾患を持った骨格筋は、生理食塩水による、他は同様の処置を受ける、負傷した、又は疾患を持った骨格筋と比較して、生体活性ガラス組成物による処置の、少なくとも８日後に、平均筋原線維面積の増加を有することができる。負傷した、又は疾患を持った骨格筋は、生理食塩水による、他は同様の処置を受ける、負傷した、又は疾患を持った骨格筋と比較して、生体活性ガラス組成物による処置の、少なくとも５日後に、低い胚ミオシン重鎖（ｅＭｙＨＣ）濃度を有することができる。負傷した、又は疾患を持った骨格筋は、生理食塩水による、他は同様の処置を受ける、負傷した、又は疾患を持った骨格筋と比較して、生体活性ガラス組成物による処置の、少なくとも１０日後に、筋量の増加を有することができる。負傷した、又は疾患を持った骨格筋は、生理食塩水による、他は同様の処置を受ける、負傷した、又は疾患を持った骨格筋と比較して、生体活性ガラス組成物による処置の、少なくとも１０日後に、筋肉ピーク力の増加を有することができる。負傷した、又は疾患を持った骨格筋は、生理食塩水による、他は同様の処置を受ける、負傷した、又は疾患を持った骨格筋と比較して、生体活性ガラス組成物による処置の、少なくとも５日後に、血管新生の増加を有することができる。
【0025】
負傷した、又は疾患を持った骨格筋は、負傷した骨格筋であることができる。負傷した骨格筋は、肉離れした筋肉、外傷により負傷した筋肉、断裂した筋肉、筋肉の使いすぎ若しくは誤使用から生じる負傷した筋肉、又はこれらの組み合わせであることができる。筋肉の使いすぎ若しくは誤使用から生じる負傷した筋肉は、スポーツでの負傷の結果である場合がある。
【0026】
負傷した、又は疾患を持った骨格筋は、疾患を持った骨格筋であることができる。疾患を持った骨格筋は、異栄養性骨格筋、悪液質骨格筋、サルコペニア骨格筋、又はこれらの組み合わせであることができる。
【0027】
本開示は更に、負傷した、又は疾患を持った脳又は神経組織の治療方法であって、上記負傷した、又は疾患を持った脳又は神経組織を、有効量の、本明細書に開示する生体活性ガラス組成物のいずれかと接触させることを含む、上記方法に関する。
【0028】
本明細書で開示する方法のいずれに関しても、生体活性ガラス組成物は、分解時に中性ｐＨを維持することができる。
【0029】
本発明を詳細に説明したが、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲から逸脱することなく、修飾及び変形が可能であることが明らかであろう。
【実施例】
【0030】
本発明を更に例示するために、以下の非限定的な実施例を提供する。
【0031】
概要
骨格筋は、自動車事故での外傷、穿通性の傷、外科的修復、及び、使いすぎによる損傷を受けやすい。骨格筋は再生可能であるものの、限界がある。具体的には、筋容積損失（ＶＭＬ、２０％を超える筋量喪失として定義）におけるもののように、負傷があまりにも深刻である場合、筋肉は再生せず、代わりに、不可逆性の瘢痕、線維症、及び機能喪失がもたらされる。更に、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、繰り返される筋原線維断裂による、筋肉の再生能力の喪失をもたらす。生体材料は、ＶＭＬ後に、有望な筋肉再生促進を示している。
骨格筋は、自動車事故での外傷、穿通性の傷、外科的修復、及び、使いすぎによる損傷を受けやすい。骨格筋は再生可能であるものの、限界がある。具体的には、筋容積損失（ＶＭＬ、２０％を超える筋量喪失として定義）におけるもののように、負傷があまりにも深刻である場合、筋肉は再生せず、代わりに、不可逆性の瘢痕、線維症、及び機能喪失がもたらされる。更に、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、繰り返される筋原線維断裂による、筋肉の再生能力の喪失をもたらす。生体材料は、ＶＭＬ後に、有望な筋肉再生促進を示している。
【0032】
実験を行い、生体物質の徐放性イオンマトリックス（ＴＲＩＭ）が、化学的負傷、ＶＭＬの後、及び、ＤＭＤの状態において、骨格筋の微小血管及び筋原線維再生を向上させることを試験した。化学的負傷を誘発するために、生検パンチ（２ｍｍ直径）を用いてＶＭＬを誘発すると共にＢａＣｌ２を用い、両方を、メスのＣ５７ＢＩ／６及びＣｄｈ５－ｍＴｍＧマウス（４～５月齢）の左大臀筋（ＧＭ）において用いた。異栄養性マウス［ｎ＝２、ｍｄｘ＋／＋（３～５月齢）を、ＴＲＩＭ又はビヒクルを左前脛骨筋（ＴＡ）に単回注射した後に、遠心性負傷実験のために用い、一方、ＤＢＡｍｄｘマウス［ｎ＝１、（７月齢）］を、深刻なジストロフィーのモデルとして用いて、ＴＲＩＭがＴＡ筋量を回復することができるのか否かを判定した。マウスを２つの群、すなわち生理食塩水ビヒクル処置（ＣＯＮ）、又はＴＲＩＭ処置に分けた。処置したマウスに関しては、２５０μｇのＴＲＩＭ粉末を、０．９％滅菌生理食塩水（５μｇ／ｐＬ）に懸濁させ、７０μＬのＴＲＩＭ溶液を、ＢａＣｌ２負傷に対しては、負傷の３日後（ｄｐｉ）に、ＶＭＬ負傷に対しては７ｄｐｉに、ＧＭの下から注射し、並びに、データ収集の１０日前に、異栄養性マウスのＴＡに５０μＬを注射した。ＣＯＮマウスに関しては、７０μＬの０．９％食塩水（ＴＲＩＭ非含有）を、陰性対照としてＧＭに、７ｄｐｉに注射し、一方、５０μＬを、異栄養性マウスのＴＡに注射した。生体顕微鏡検査、共焦点顕微鏡検査、及び組織切片により、筋肉を評価した。生体顕微鏡検査は、血管が占める負傷の領域に関しては、ＴＲＩＭ又はＣＯＮの間の差を明らかにしなかったが、共焦点ｚスタックは、負傷領域内で、ＴＲＩＭが血管密度を低下させたことを示唆している。対照的に、ＴＲＩＭが、処置されたマウス全てにおいて筋原線維再生を向上させ、加えて、負傷に対する異栄養性筋の耐性も向上させたことを、共焦点ｚスタックと筋断面の両方が示唆している。ＴＲＩＭ処置が、骨格筋の化学的負傷、ＶＭＬ負傷後の、及び、筋ジストロフィーの状態における、筋線維再生に対して有益であり得ることを、この所見は示唆している。
【0033】
実施例１：材料及び方法
以下の材料及び使用を、実施例の残り全てにおいて使用した。
以下の材料及び使用を、実施例の残り全てにおいて使用した。
【0034】
動物
骨格筋構造及び機能が、種にまたがって保存されており、これらの実験の侵襲的性質によってヒトでの実験が妨げられているため、マウスを選択した。実験は全て、ミズーリ大学の動物実験委員会により認可された。化学的負傷及びＴＲＩＭ処置には、オスのＣ５７ＢＩ／６マウス（ｎ＝３、約４月齢）を選択した。メスのＣｄｈ５－ｍＴｍＧ（内皮細胞緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター、約４月齢）を使用して、筋容積損失負傷（ＶＭＬ）後の、微小血管再生を可視化した。内皮特異的ｃｒｅリコンビナーゼＣｄｈ５ Ｃｒｅ－ＥＲＴ２（Ｗａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ｎａｔｕｒｅ，４６５（７２９７））を選択し、ｍＴｍＧレポーターと交差させ、有効な内皮細胞（ＥＣ）レポーターマウスを作製した（Ｍｕｚｕｍｄａｒ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２００７）．ｇｅｎｅｓｉｓ，４５（９），５９３－６０５．）。マウスを２つの群、すなわち生理食塩水ビヒクル処置（ＣＯＮ）（ｎ＝３）、又は、生体適合性セラミック［徐放性イオンマトリックス（ＴＲＩＭ）］処置（ｎ＝２）に分けた。マウスを、１２：１２時間の明暗サイクル下で維持し、ベッドキューブで収容し、食料と水には自由にアクセスできるようにした。
骨格筋構造及び機能が、種にまたがって保存されており、これらの実験の侵襲的性質によってヒトでの実験が妨げられているため、マウスを選択した。実験は全て、ミズーリ大学の動物実験委員会により認可された。化学的負傷及びＴＲＩＭ処置には、オスのＣ５７ＢＩ／６マウス（ｎ＝３、約４月齢）を選択した。メスのＣｄｈ５－ｍＴｍＧ（内皮細胞緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター、約４月齢）を使用して、筋容積損失負傷（ＶＭＬ）後の、微小血管再生を可視化した。内皮特異的ｃｒｅリコンビナーゼＣｄｈ５ Ｃｒｅ－ＥＲＴ２（Ｗａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ｎａｔｕｒｅ，４６５（７２９７））を選択し、ｍＴｍＧレポーターと交差させ、有効な内皮細胞（ＥＣ）レポーターマウスを作製した（Ｍｕｚｕｍｄａｒ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２００７）．ｇｅｎｅｓｉｓ，４５（９），５９３－６０５．）。マウスを２つの群、すなわち生理食塩水ビヒクル処置（ＣＯＮ）（ｎ＝３）、又は、生体適合性セラミック［徐放性イオンマトリックス（ＴＲＩＭ）］処置（ｎ＝２）に分けた。マウスを、１２：１２時間の明暗サイクル下で維持し、ベッドキューブで収容し、食料と水には自由にアクセスできるようにした。
【0035】
異栄養性マウスの２つの株を用いて、異栄養性筋肉でのＴＲＩＭの効果を評価した。Ｃ５７ＢＩ／６ ｍｄｘ＋／＋マウス（ｎ＝２、約４月齢）を使用して、負傷に対する異栄養性筋肉の耐性に対する、ＴＲＩＭの効果を評価し、一方、より深刻な筋肉表現型を呈するＤ２．Ｂ１０ Ｄｍｄｍｄｘマウス（ｎ＝１、７月齢）を使用して、ＴＲＩＭが、異栄養性筋肉の質及び量を回復する能力を判定した。
【0036】
タモキシフェン注射
内皮での、Ｃｒｅ－ＥＲＴ２組み換え及びｅＧＦＰ発現を誘発するために、訓練を受けた職員によりマウスを拘束し、報告されているとおりに、３日連続で、２７ゲージで、１００μＬのタモキシフェン溶液（１ｍｇのタモキシフェン＋トウモロコシ油中の５％エタノール）を、腹腔内注射した（Ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ：Ｔｈｅ Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ Ｄｅｖｉｃｅｓ．（２０１７）．ＡＣＳ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（７），１１７２－１１７４．）。マウスは全て、最初のタモキシフェン注射の７日後に試験した。
内皮での、Ｃｒｅ－ＥＲＴ２組み換え及びｅＧＦＰ発現を誘発するために、訓練を受けた職員によりマウスを拘束し、報告されているとおりに、３日連続で、２７ゲージで、１００μＬのタモキシフェン溶液（１ｍｇのタモキシフェン＋トウモロコシ油中の５％エタノール）を、腹腔内注射した（Ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ：Ｔｈｅ Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ Ｄｅｖｉｃｅｓ．（２０１７）．ＡＣＳ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（７），１１７２－１１７４．）。マウスは全て、最初のタモキシフェン注射の７日後に試験した。
【0037】
徐放性イオンマトリックス（ＴＲＩＭ）の生成
乾燥して粉末化させた構成成分を混合し、これらを白金るつぼに投入することにより、ＴＲＩＭを生成する。
乾燥して粉末化させた構成成分を混合し、これらを白金るつぼに投入することにより、ＴＲＩＭを生成する。
【0038】
これらの実験に関して、３つの異なる組成のＴＲＩＭを使用した。
【0039】
生体適合性ガラス粒子の、候補となる材料の組成は以下のとおりである（値は重量％である）。
【0040】
ＣｏＯ：３４．６％ Ｂ２Ｏ３、３５．３％ Ｐ２Ｏ５、１４．０％ ＣａＯ、１２．３％ Ｎａ２Ｏ、３．８％ ＣｏＯ
【0041】
ＢＰＣｕＺｎ：３５％ Ｂ２Ｏ３、３５．６％ Ｐ２Ｏ５、１６．２％ ＣａＯ、１１．８％ Ｎａ２Ｏ、１％ ＺｎＯ、０．４％ ＣｕＯ
【0042】
ＢＰ：３４．９％ Ｂ２Ｏ３、３５．８％ Ｐ２Ｏ５、１６．９％ ＣａＯ、１２．４％ Ｎａ２Ｏ
【0043】
リン酸が必要な場合、その後、これを乾燥構成成分に、ゆっくりと撹拌投入した。バッチを一晩か焼して水を蒸発させた後、６０分間溶融（１０００～１１５０℃）させ、その後、白金棒で３０分間撹拌した。Ｓｐｅｘミルを用いて、溶融したＴＲＩＭ混合物を粉砕して、２０μｍ未満の粒子を形成した。ＴＲＩＭ粒子の溶液を作製し（０．９％滅菌生理食塩水中に５ｍｇ／ｍＬ）、後述のとおりに注射した。
【0044】
筋肉負傷及びＴＲＩＭ処置のためのＢａＣｌ２
化学誘発された筋肉負傷をインビボで誘発させるために、マウスにケタミン及びキシラジン（それぞれ、１００ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射）を麻酔し、対象となる筋肉を覆う皮膚をそり、その後、１．２％のＢａＣｌ２を、記載のとおりにＴＡ［５０μＬ、（Ｈｅｎｃｈ，Ｌ．Ｌ．，＆ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｉ．（２０１０）．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ，７（ｓｕｐｐｌ＿４），Ｓ３７９－Ｓ３９１．）］の中に、又は、ＧＭ［７５μＬ、（Ｈｅｎｃｈ，Ｌ．Ｌ．，＆ Ｐｏｌａｋ，Ｊ．Ｍ．（２００２）．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９５（５５５７），１０１４）］の下で、片側に注射した。回収中はマウスを暖かくしたままにし、その後、ケージに戻した。
化学誘発された筋肉負傷をインビボで誘発させるために、マウスにケタミン及びキシラジン（それぞれ、１００ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射）を麻酔し、対象となる筋肉を覆う皮膚をそり、その後、１．２％のＢａＣｌ２を、記載のとおりにＴＡ［５０μＬ、（Ｈｅｎｃｈ，Ｌ．Ｌ．，＆ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｉ．（２０１０）．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ，７（ｓｕｐｐｌ＿４），Ｓ３７９－Ｓ３９１．）］の中に、又は、ＧＭ［７５μＬ、（Ｈｅｎｃｈ，Ｌ．Ｌ．，＆ Ｐｏｌａｋ，Ｊ．Ｍ．（２００２）．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９５（５５５７），１０１４）］の下で、片側に注射した。回収中はマウスを暖かくしたままにし、その後、ケージに戻した。
【0045】
ＶＭＬ及びＴＲＩＭ処置のためのパンチ生検負傷
マウスに、ケタミン／キシラジン（それぞれ、１００ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）をＩＰで麻酔し、アルミニウム保温プレートに載せたままにし、体温を３７℃に維持した。必要な場合、追加の注射（最初の約２０％）をし、１５分毎に、尾又は足指のピンチへの引っ込みがないことによって確認される、麻酔の安定状態を維持した。左ＧＭを覆う皮膚をそり、Ｂｅｔａｄｉｎｅ（１０％ポビドン－ヨウ素局所溶液）を、続いて、アルコールワイプを３回、綿棒で付けて滅菌した。実体顕微鏡により確認をしながら、マウスを腹部に配置させ、覆っている皮膚に約５ｍｍの切り込みをつけ、ＧＭにアクセスした。露出した組織を、生理学的食塩水（ＰＳＳ）で連続して灌注した。ＧＭの血管を負傷させないように注意した。滅菌した２ｍｍ直径のパンチ生検（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９）．Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐａｒｔ Ｃ：Ｍｅｔｈｏｄｓ，２５（２），５９－７０）を用いて、ＧＭに局部負傷させた。再生されない筋肉喪失の臨界閾値を下回るＶＭＬのモデルを表すために、２ｍｍを選択した（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９）．Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐａｒｔ Ｃ：Ｍｅｔｈｏｄｓ，２５（２），５９－７０）。パンチ損傷の場所を一定に保つため、長さ１ｃｍ、幅０．５ｃｍの、特製の測定装置を、腰椎に沿って配置させ、ＧＭに基準点を付与した。ＴＲＩＭで処置したＶＭＬマウスに関しては、２５０μｇの粉末を０．９％滅菌生理食塩水に懸濁させた後、ＧＭの下に注射した。ＣＯＮマウスに関しては、負傷の７日後（ｄｐｉ）に、筋肉の下に７０μＬの０．９％食塩水（溶液）を注射して、処置を模倣した。滅菌した６－０ナイロン縫合糸を用いて、皮膚全体に４～５個の不連続な縫合により、皮膚の切り込みを閉じた。異栄養性マウスに関しては、２５０μｇの粉末を、０．９％滅菌生理食塩水に懸濁させた後、左前脛骨（ＴＡ）筋に注射し、その間に、マウスに麻酔をし、移動しないようにした。マウスを暖かくしたままにし、歩行が回復するまで（２～３時間）監視し、その後、ケージに戻して毎日観察した。ＶＭＬに関しては２１ｄｐｉ、そして、異栄養性マウスに関しては１４日目に、データ収集した後、麻酔の下で頚椎脱臼させてマウスを殺した。
マウスに、ケタミン／キシラジン（それぞれ、１００ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）をＩＰで麻酔し、アルミニウム保温プレートに載せたままにし、体温を３７℃に維持した。必要な場合、追加の注射（最初の約２０％）をし、１５分毎に、尾又は足指のピンチへの引っ込みがないことによって確認される、麻酔の安定状態を維持した。左ＧＭを覆う皮膚をそり、Ｂｅｔａｄｉｎｅ（１０％ポビドン－ヨウ素局所溶液）を、続いて、アルコールワイプを３回、綿棒で付けて滅菌した。実体顕微鏡により確認をしながら、マウスを腹部に配置させ、覆っている皮膚に約５ｍｍの切り込みをつけ、ＧＭにアクセスした。露出した組織を、生理学的食塩水（ＰＳＳ）で連続して灌注した。ＧＭの血管を負傷させないように注意した。滅菌した２ｍｍ直径のパンチ生検（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９）．Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐａｒｔ Ｃ：Ｍｅｔｈｏｄｓ，２５（２），５９－７０）を用いて、ＧＭに局部負傷させた。再生されない筋肉喪失の臨界閾値を下回るＶＭＬのモデルを表すために、２ｍｍを選択した（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９）．Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐａｒｔ Ｃ：Ｍｅｔｈｏｄｓ，２５（２），５９－７０）。パンチ損傷の場所を一定に保つため、長さ１ｃｍ、幅０．５ｃｍの、特製の測定装置を、腰椎に沿って配置させ、ＧＭに基準点を付与した。ＴＲＩＭで処置したＶＭＬマウスに関しては、２５０μｇの粉末を０．９％滅菌生理食塩水に懸濁させた後、ＧＭの下に注射した。ＣＯＮマウスに関しては、負傷の７日後（ｄｐｉ）に、筋肉の下に７０μＬの０．９％食塩水（溶液）を注射して、処置を模倣した。滅菌した６－０ナイロン縫合糸を用いて、皮膚全体に４～５個の不連続な縫合により、皮膚の切り込みを閉じた。異栄養性マウスに関しては、２５０μｇの粉末を、０．９％滅菌生理食塩水に懸濁させた後、左前脛骨（ＴＡ）筋に注射し、その間に、マウスに麻酔をし、移動しないようにした。マウスを暖かくしたままにし、歩行が回復するまで（２～３時間）監視し、その後、ケージに戻して毎日観察した。ＶＭＬに関しては２１ｄｐｉ、そして、異栄養性マウスに関しては１４日目に、データ収集した後、麻酔の下で頚椎脱臼させてマウスを殺した。
【0046】
ＧＭの生体顕微鏡検査
記載されるように、血管供給の一体性を維持しながら、生体顕微鏡検査（微小循環のインビボイメージング）のためにＧＭを準備するために、マウスに麻酔をかけた（Ｆｅｒｎａｎｄｏ，Ｃ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９）．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，５９７（５），１４０１－１４１７．）。ケタミン／キシラジンをＩＰ注射して、ＧＭと重なる皮膚をそり、毛を取り除いた。マウスを、３７℃の温度の保温プレートに移して体温を維持させた。実体顕微鏡により、脊髄に沿った切り込みを、覆っている皮膚に設けた。過剰の結合組織及び脂肪を、顕微解剖を用いて、主要な血管を避けながら取り除いた。露出したＧＭには、ＰＳＳを連続して灌注した。次に、ＧＭを、腰部筋膜、仙骨、及び腸骨稜に沿って、その起源から切り離し、体から反転させて、血管供給を露出させた。次に、ＧＭを、透明なゴム台座の表面にひろげ、本来の寸法に近似させながら、縁でピン留めした。台座の上に組織を広げ、固定することにより、微小血管系の高解像度イメージングに適した、薄くて平坦な調製物が生み出された。サランラップで、露出した他のあらゆる組織を覆い、生体内イメージング中に脱水しないようにした。
記載されるように、血管供給の一体性を維持しながら、生体顕微鏡検査（微小循環のインビボイメージング）のためにＧＭを準備するために、マウスに麻酔をかけた（Ｆｅｒｎａｎｄｏ，Ｃ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９）．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，５９７（５），１４０１－１４１７．）。ケタミン／キシラジンをＩＰ注射して、ＧＭと重なる皮膚をそり、毛を取り除いた。マウスを、３７℃の温度の保温プレートに移して体温を維持させた。実体顕微鏡により、脊髄に沿った切り込みを、覆っている皮膚に設けた。過剰の結合組織及び脂肪を、顕微解剖を用いて、主要な血管を避けながら取り除いた。露出したＧＭには、ＰＳＳを連続して灌注した。次に、ＧＭを、腰部筋膜、仙骨、及び腸骨稜に沿って、その起源から切り離し、体から反転させて、血管供給を露出させた。次に、ＧＭを、透明なゴム台座の表面にひろげ、本来の寸法に近似させながら、縁でピン留めした。台座の上に組織を広げ、固定することにより、微小血管系の高解像度イメージングに適した、薄くて平坦な調製物が生み出された。サランラップで、露出した他のあらゆる組織を覆い、生体内イメージング中に脱水しないようにした。
【0047】
手術の完了後、マウス調製物を、Ｎｉｋｏｎ ６００ｆｎ生体内顕微鏡のステージに移し、５％ ＣＯ２／９５％ Ｎ２で平衡させたＰＳＳを、連続して灌注した。低照度ＣＭＯＳ ＦＰ－Ｌｕｃｙカメラ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）及びＬｏｎｇ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｄｉｓｔａｎｃｅ（ＬＷＤ）４ｘ及び１０ｘ対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ）を用いて、Ｐｉｐｅｒソフトウェアで、パンチ負傷全体をイメージングして、デジタル画像を取得した。生体顕微鏡検査の後、ＧＭを解剖し、トリミングして、共焦点イメージングのためにパンチ負傷を含有する領域を含め、その後、凍結させて、組織学のためのために切断した。
【0048】
ＴＡ筋力測定、並びに、ＴＡ及びＥＤＬの筋量
記載のとおりのｉｎ ｓｉｔｕ測定のための、ＴＡを準備した（Ｗａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ｎａｔｕｒｅ，４６５（７２９７），４８３－４８６）。簡潔に述べると、麻酔をかけたマウスにおいて、２－０縫合糸を、左膝蓋腱の周りに配置した。坐骨神経を分離させ、Ｇｒａｓｓ（商標）刺激装置により、電極を介して筋力を刺激するために、ＴＡの近くで切断した。ＴＡの遠位腱を分離させ、２－０縫合糸で固定した後、挿入部から切断した。マウスをプレキシガラス板の上にうつ伏せに配置し、膝蓋腱を、板に固定化された垂直金属ペグに固定した。遠位ＴＡ腱を、Ｔｒａｎｓｂｒｉｄｇｅ増幅器（ＴＢＭ－４、Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ，ＵＳＡ）に連結させた負荷ビーム（ＬＣＬ－１１３Ｇ、Ｏｍｅｇａ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，ＣＴ，ＵＳＡ）にくくった。負荷ビームを、１Ｈｚでの単収縮の間に測定される最適長さ（Ｌｏ）を調整するために、マイクロメーターに取り付けた（Ｈｅｎｃｈ，Ｌ．Ｌ．，＆ Ｐｏｌａｋ，Ｊ．Ｍ．（２００２）．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９５（５５５７），１０１４）。ＴＡの周りにＫｉｍＷｉｐｅ（登録商標）１枚を巻き、生理学的食塩水をＴＡに灌注させ（３ｍＬ分－１）、遠心収縮性負傷の前及び後に、Ｐｏｗｅｒ Ｌａｂ収集ソフトウェア（ＡＤｌｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＣＯ，ＵＳＡ）により、１２０Ｈｚで最大力を評価した。最適の筋肉長を確立し、３回のウォームアップ収縮を行った後で、最大強縮を評価し、その後、記載のとおり、３回の最大収縮条件の間に、筋肉を約４０％伸ばした（Ｍｕｚｕｍｄａｒ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２００７）．ｇｅｎｅｓｉｓ，４５（９），５９３－６０５）。２分間の休憩の後、最大強縮をもう一度得て、遠心負傷後の力の喪失割合（％）を測定した。データ収集後に、筋肉の長さを測定し、ＴＡ及びＥＤＬ筋の両方を取り除き、筋量を評価した。
記載のとおりのｉｎ ｓｉｔｕ測定のための、ＴＡを準備した（Ｗａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ｎａｔｕｒｅ，４６５（７２９７），４８３－４８６）。簡潔に述べると、麻酔をかけたマウスにおいて、２－０縫合糸を、左膝蓋腱の周りに配置した。坐骨神経を分離させ、Ｇｒａｓｓ（商標）刺激装置により、電極を介して筋力を刺激するために、ＴＡの近くで切断した。ＴＡの遠位腱を分離させ、２－０縫合糸で固定した後、挿入部から切断した。マウスをプレキシガラス板の上にうつ伏せに配置し、膝蓋腱を、板に固定化された垂直金属ペグに固定した。遠位ＴＡ腱を、Ｔｒａｎｓｂｒｉｄｇｅ増幅器（ＴＢＭ－４、Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ，ＵＳＡ）に連結させた負荷ビーム（ＬＣＬ－１１３Ｇ、Ｏｍｅｇａ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，ＣＴ，ＵＳＡ）にくくった。負荷ビームを、１Ｈｚでの単収縮の間に測定される最適長さ（Ｌｏ）を調整するために、マイクロメーターに取り付けた（Ｈｅｎｃｈ，Ｌ．Ｌ．，＆ Ｐｏｌａｋ，Ｊ．Ｍ．（２００２）．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９５（５５５７），１０１４）。ＴＡの周りにＫｉｍＷｉｐｅ（登録商標）１枚を巻き、生理学的食塩水をＴＡに灌注させ（３ｍＬ分－１）、遠心収縮性負傷の前及び後に、Ｐｏｗｅｒ Ｌａｂ収集ソフトウェア（ＡＤｌｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＣＯ，ＵＳＡ）により、１２０Ｈｚで最大力を評価した。最適の筋肉長を確立し、３回のウォームアップ収縮を行った後で、最大強縮を評価し、その後、記載のとおり、３回の最大収縮条件の間に、筋肉を約４０％伸ばした（Ｍｕｚｕｍｄａｒ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２００７）．ｇｅｎｅｓｉｓ，４５（９），５９３－６０５）。２分間の休憩の後、最大強縮をもう一度得て、遠心負傷後の力の喪失割合（％）を測定した。データ収集後に、筋肉の長さを測定し、ＴＡ及びＥＤＬ筋の両方を取り除き、筋量を評価した。
【0049】
組織化学（イメージング及び分析）
ＧＭ検体を、レーザー走査共焦点顕微鏡のステージに移し、微小血管及び筋原線維をイメージングした。共焦点画像収集の後、最適切断温度（ＯＣＴ）化合物を、浅いクリオモルドに注ぎ、切り取ったＧＭを、平坦に寝かせて中央に向きを合わせた。２ｍｍ長の絹縫合糸を、クリオモルド内でＧＭの隣に配置し、ＶＭＬ負傷の場所を示し、液体窒素で冷却したイソペンタン中で凍結させた。凍結したＧＭをホイルに包み、参照のために標識し、切断のために処置するまで－８０℃で保管した。
ＧＭ検体を、レーザー走査共焦点顕微鏡のステージに移し、微小血管及び筋原線維をイメージングした。共焦点画像収集の後、最適切断温度（ＯＣＴ）化合物を、浅いクリオモルドに注ぎ、切り取ったＧＭを、平坦に寝かせて中央に向きを合わせた。２ｍｍ長の絹縫合糸を、クリオモルド内でＧＭの隣に配置し、ＶＭＬ負傷の場所を示し、液体窒素で冷却したイソペンタン中で凍結させた。凍結したＧＭをホイルに包み、参照のために標識し、切断のために処置するまで－８０℃で保管した。
【0050】
凍結切片の染色
凍結したＧＭ及びＴＡ切片を、クライオスタット（ＨＭ ５５０ Ｃｒｙｏｓｔａｔ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で１０μｍの厚さで切断し、ラミニン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃ＲＢ－９０２４－Ｒ７）、ミオシン重鎖及び胚ミオシン（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ Ａ４．８４０ ｓ ＩｇＭ １：１５）に対して、記載のとおり（Ｍｏｒｔｏｎ，Ａ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９）．Ｒｅｄｏｘ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０，４０２－４１３）に染色し、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ含有ＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で固定した。
凍結したＧＭ及びＴＡ切片を、クライオスタット（ＨＭ ５５０ Ｃｒｙｏｓｔａｔ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で１０μｍの厚さで切断し、ラミニン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃ＲＢ－９０２４－Ｒ７）、ミオシン重鎖及び胚ミオシン（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ Ａ４．８４０ ｓ ＩｇＭ １：１５）に対して、記載のとおり（Ｍｏｒｔｏｎ，Ａ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９）．Ｒｅｄｏｘ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０，４０２－４１３）に染色し、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ含有ＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で固定した。
【0051】
ＩｍａｇｅＪ分析
生体内画像のために、血管を分析し、微小血管再生の量を評価した。共焦点画像に関して、血管と筋原線維の両方を別個に分析して、各構成成分を定量化した。筋断面の画像を取得して、後述のように筋肉の厚さを評価した。
生体内画像のために、血管を分析し、微小血管再生の量を評価した。共焦点画像に関して、血管と筋原線維の両方を別個に分析して、各構成成分を定量化した。筋断面の画像を取得して、後述のように筋肉の厚さを評価した。
【0052】
Ｎｉｋｏｎ ６００ｆｎ生体内顕微鏡により取得した画像を、オープンアクセスソフトウェアのｌｍａｇｅＪ及びＭｉｃｒｏｓｏｆｔ ＰｏｗｅｒＰｏｉｎｔで分析した。パンチ生検負傷の参照画像を用いて、ＣＯＮ及びＴＲＩＭ処置ＧＭの両方を分析する際に、元のサイズを確認した。ＰｏｗｅｒＰｏｉｎｔを用いて、検体の画像を参照画像の上に重ね、負傷領域を画定した。これらの画像を合わせ、負傷領域の輪郭を表すＰｏｗｅｒＰｏｉｎｔツールからの円を含めて１つのＴＩＦＦファイルとして保存した（図１Ａ及び図１Ｂ）。ＩｍａｇｅＪにインポートした後、合わせた画像を３２ビットグレースケールに変換した。負傷領域（Ａ０１）内の血管を特定するために、バックグラウンド閾値を確立し、画像をバイナリ変換させ、ここでは、バックグラウンド（非脈管構造）を白色、対象となる組織構成成分（血管）を黒色とした。これらの画像を用いて、微小血管により占められる全Ａ０１の割合（％）として定義される、筋原線維再生及び血管再生の程度を測定した。
【0053】
Ｌｅｉｃａ ＬＡＸソフトウェアを用いて、反転レーザー走査共焦点顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ８，Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ，ＵＳＡ）にて、ｘ０．７５デジタルズームの１０ｘ対物レンズにより共焦点画像を取得した。画像スタック（厚さ約７０ｐｍ）を用いて、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ、オープンアクセス）を用いてＶＭＬモルホロジーを解像した（Ｍｏｒｔｏｎ，Ａ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９）．Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ，９（１），２７）。ＩｍａｇｅＪにインポートした後、２色チャネルで入手した共焦点Ｚスタックを、ＧＦＰ（ＥＣ）及びＴＤ（トマト）（筋原線維）に分離した。各色のチャネル画像を、上述した閾値ガイドラインを用いて、３２ビットグレースケールに変換した。黒で占められている領域（血管又は筋原線維）は、全Ａ０１の割合（％）として表した。血管及び筋肉の画像を別個に分析した。
【0054】
共焦点画像分析に関して、血管領域の割合（％）、及び筋肉領域の割合（％）を、処置間と、複数の時点とにまたがって比較した。両方の分析のために、実験者は実験群に対して盲検とした。収集したデータに対する変動係数は５％未満であった。
【0055】
筋肉の厚さを評価するために、筋肉の断面を、５つの異なる場所、すなわち切片の端（最も厚く、負傷していない）、切片の中心、及び、切片の中心と切片の端との間の中間の負傷領域で分析した。負傷していない切片の端の厚さを平均し（ＵＴ）、続いて、負傷した切片の厚さを平均した（ＩＴ）。最終の値を、以下の式を用いて計算した：ＩＴ／ＵＴ＝筋肉回復。比率１は、負傷した領域全体での筋肉の厚さの回復を示した一方で、１未満の比率は、再生が少ないことを示した。
【0056】
実施例２：ＴＲＩＭは、ＶＭＬ後のＧＭで、血管密度を向上させないようである
２ｍｍの生検パンチで、大臀筋（ＧＭ）に筋負傷を与えた後、負傷部位内の微小循環及び筋肉を取り除いた。筋原線維に栄養を与えて維持するために、微小循環は、負傷後に再生する必要がある。生体内イメージングは、負傷の２１日後（ｄｐｉ）に、内皮細胞緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（図１Ａ及びＢ）を示す。７ｄｐｉにＴＲＩＭを添加しても、蛍光画像解析により評価されるように、２１日目まで、負傷領域において血管密度は変化しないようであった（ＣＯＮ＝Ａ０１の１９．５％、ＴＲＩＭ処置＝１９％、図１Ｃ）。
２ｍｍの生検パンチで、大臀筋（ＧＭ）に筋負傷を与えた後、負傷部位内の微小循環及び筋肉を取り除いた。筋原線維に栄養を与えて維持するために、微小循環は、負傷後に再生する必要がある。生体内イメージングは、負傷の２１日後（ｄｐｉ）に、内皮細胞緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（図１Ａ及びＢ）を示す。７ｄｐｉにＴＲＩＭを添加しても、蛍光画像解析により評価されるように、２１日目まで、負傷領域において血管密度は変化しないようであった（ＣＯＮ＝Ａ０１の１９．５％、ＴＲＩＭ処置＝１９％、図１Ｃ）。
【0057】
２１ｄｐｉにおける血管密度をさらに詳しく、ＶＭＬ負傷部位の中心から取得した共焦点顕微鏡画像で解像した（図１Ｄ及び図１Ｅ）。ＴＲＩＭ処置したＧＭにおける血管密度（Ａ０１の１５％）は、ＣＯＮ（３０．２％）を下回るようであった（図１Ｆ）。
【0058】
実施例３：ＴＲＩＭは、ＶＭＬ後の筋原線維再生を向上させる
共焦点画像が、２１ｄｐｉでの、負傷後の筋原線維再生（図２Ａ及び２Ｂ）を示す。ＴＲＩＭを添加することにより、負傷領域での筋原線維再生が向上するようであった。ＴＲＩＭで処置したＧＭ中の筋原線維（図２Ｂ）は、平行して組織化され、生理食塩水処置対象（ＣＯＮ）と比較して、負傷全体に一層均一に分布していた。筋原線維の密度は、Ａ０１のＴＲＩＭ（８７％）では、ＣＯＮ（ＣＯＮ＝７８％）と比較して増加するようであった（図２Ｃ）。
共焦点画像が、２１ｄｐｉでの、負傷後の筋原線維再生（図２Ａ及び２Ｂ）を示す。ＴＲＩＭを添加することにより、負傷領域での筋原線維再生が向上するようであった。ＴＲＩＭで処置したＧＭ中の筋原線維（図２Ｂ）は、平行して組織化され、生理食塩水処置対象（ＣＯＮ）と比較して、負傷全体に一層均一に分布していた。筋原線維の密度は、Ａ０１のＴＲＩＭ（８７％）では、ＣＯＮ（ＣＯＮ＝７８％）と比較して増加するようであった（図２Ｃ）。
【0059】
凍結したＧＭ切片をスライスし、ラミニン及びミオシン重鎖に対して染色した。ＴＲＩＭは、筋肉の厚さにより測定される筋原線維再生を向上させ得ることが、筋肉断面画像の分析で明らかとなった（図２Ｄ及び図２Ｅ）。生理食塩水処置ＧＭ（図２Ｄ）では、負傷の中心での厚さが低下した。対照的に、ＴＲＩＭ処置ＧＭ（図２Ｅ）は、未負傷の筋肉及び負傷した筋肉の両方にわたって、同様の厚さを有した。したがって、回復の２１日目において、平均の筋肉厚さは、ＣＯＮよりもＴＲＩＭで大きかった。ＩＴ／ＵＴの比率として表すと、ＣＯＮ ＧＭの平均は０．７５であった一方で、ＴＲＩＭの平均は１．０であった（図２Ｆ）。
【0060】
実施例４：ＴＲＩＭは、化学的負傷後の筋原線維再生を向上させる
未負傷のＢＰＣｕＺｎ処置線維、生理食塩水処置線維（８ｄｐｉ）、及び、ＢＰＣｕＺｎ処置線維（８ｄｐｉ）を、ｅＭｙＨＣ、ラミニン、及びＤＡＰＩに対して染色した（図３Ａ）。生理食塩水処置した８ｄｐｉ線維と比較して、ＢＰＣｕＺｎ処置した８ｄｐｉの線維は、ｅＭｙＨＣ陽性線維の割合が低かった（図３Ｂ）。生理食塩水処置した８ｄｐｉの線維、及び、未負傷のＢＰＣｕＺｎ処置線維と比較して、ＢＰＣｕＺｎ処置した８ｄｐｉ線維でもまた、再生線維の割合（％）が高かった（図３Ｃ）。
未負傷のＢＰＣｕＺｎ処置線維、生理食塩水処置線維（８ｄｐｉ）、及び、ＢＰＣｕＺｎ処置線維（８ｄｐｉ）を、ｅＭｙＨＣ、ラミニン、及びＤＡＰＩに対して染色した（図３Ａ）。生理食塩水処置した８ｄｐｉ線維と比較して、ＢＰＣｕＺｎ処置した８ｄｐｉの線維は、ｅＭｙＨＣ陽性線維の割合が低かった（図３Ｂ）。生理食塩水処置した８ｄｐｉの線維、及び、未負傷のＢＰＣｕＺｎ処置線維と比較して、ＢＰＣｕＺｎ処置した８ｄｐｉ線維でもまた、再生線維の割合（％）が高かった（図３Ｃ）。
【0061】
実施例５：ＴＲＩＭは、深刻な異栄養性筋肉の量を向上させる
ジストロフィックスの単回注射の後、未処置のＴＡ及びＥＤＬと比較して、筋量は、約２０～３０％増加した。このことは、下腿における前方筋膜区画の筋肉が、単回注射の１４日後に応答することを示している（図４Ａ～４Ｃ）。また、左足のみを処置したため、反対の右足からのＴＡ及びＥＤＬもまた回収すると、ジストロフィックスは全身効果を示さないことを示した（図４Ａ～４Ｃ、ジストロフィックスで処置したＴＡ及びＥＤＬを、反対の未処置足と共に示す）。筋量の増加が筋原線維再生に起因するものであるか否かを測定するため、筋肉の断面を、１０μｍ圧の切片で得、筋原線維の境界を特定するためにラミニンで、 再生筋原線維のマーカーとして胚ミオシン重鎖（ｅＭｙＨＣ）で、及び、核を可視化するためにＤＡＰＩで標識した。未処置試料と比較して、ジストロフィックス処置試料は、線維症及びｅＭｙＨＣが少ない、より中心に位置する核（再生した筋原線維のマーカー）を呈し（図４）、このことは、より成熟した筋原線維による効果的な筋肉再生が増大していることを示す。
ジストロフィックスの単回注射の後、未処置のＴＡ及びＥＤＬと比較して、筋量は、約２０～３０％増加した。このことは、下腿における前方筋膜区画の筋肉が、単回注射の１４日後に応答することを示している（図４Ａ～４Ｃ）。また、左足のみを処置したため、反対の右足からのＴＡ及びＥＤＬもまた回収すると、ジストロフィックスは全身効果を示さないことを示した（図４Ａ～４Ｃ、ジストロフィックスで処置したＴＡ及びＥＤＬを、反対の未処置足と共に示す）。筋量の増加が筋原線維再生に起因するものであるか否かを測定するため、筋肉の断面を、１０μｍ圧の切片で得、筋原線維の境界を特定するためにラミニンで、 再生筋原線維のマーカーとして胚ミオシン重鎖（ｅＭｙＨＣ）で、及び、核を可視化するためにＤＡＰＩで標識した。未処置試料と比較して、ジストロフィックス処置試料は、線維症及びｅＭｙＨＣが少ない、より中心に位置する核（再生した筋原線維のマーカー）を呈し（図４）、このことは、より成熟した筋原線維による効果的な筋肉再生が増大していることを示す。
【0062】
実施例６：ＴＲＩＭは、異栄養性筋肉の構造を向上させる
単回ジストロフィックス注射を受ける異栄養性マウスのＴＡは、生理食塩水対象よりも大きな力を示した（即ち、遠心性筋肉負傷に対してより大きい耐性を有した）（図５）。遠心収縮誘発性負傷の後に生み出された筋力を、負傷前に生み出された筋力と比較すると、負傷前の値の約６５％を維持した生理食塩水対照と比較して、ジストロフィックス処置した異栄養性筋肉は、負傷前の値の約９０％を維持した。
単回ジストロフィックス注射を受ける異栄養性マウスのＴＡは、生理食塩水対象よりも大きな力を示した（即ち、遠心性筋肉負傷に対してより大きい耐性を有した）（図５）。遠心収縮誘発性負傷の後に生み出された筋力を、負傷前に生み出された筋力と比較すると、負傷前の値の約６５％を維持した生理食塩水対照と比較して、ジストロフィックス処置した異栄養性筋肉は、負傷前の値の約９０％を維持した。
【0063】
実施例７：ＴＲＩＭは、血管成長を向上させる
０ｄｐｉ（負傷後日数）のマウスは、処置を受けなかった。８ｄｐｉのマウスは、ＢａＣｌ２を注射し、化学的負傷を誘発して、８ｄｐｉにて分析した。ＢＰＣｕＺｎ ０ｄｐｉマウスに、１０μｇ／体重ｇのＢｐＣｕＺｎを注射し、３ｄｐｉにて分析した。ＢＰＣｕＺｎ ８ｄｐｉマウスにＢａＣｌ２を注射し、化学的負傷を誘発させた。次に、これらに、１０μｇ／体重ｇのＢｐＣｕＺｎを３ｄｐｉにて注射し、８ｄｐｉにて分析した。
０ｄｐｉ（負傷後日数）のマウスは、処置を受けなかった。８ｄｐｉのマウスは、ＢａＣｌ２を注射し、化学的負傷を誘発して、８ｄｐｉにて分析した。ＢＰＣｕＺｎ ０ｄｐｉマウスに、１０μｇ／体重ｇのＢｐＣｕＺｎを注射し、３ｄｐｉにて分析した。ＢＰＣｕＺｎ ８ｄｐｉマウスにＢａＣｌ２を注射し、化学的負傷を誘発させた。次に、これらに、１０μｇ／体重ｇのＢｐＣｕＺｎを３ｄｐｉにて注射し、８ｄｐｉにて分析した。
【0064】
ＣＤ３１染色は、血管の分化を示す（図６Ａ）。８ｄｐｉのマウスと比較して、微小血管領域／線維の相対量は、８ｄｐｉのＢＰＣｕＺｎマウスでわずかに高い（図６Ｂ）。ＢＰＣｕＺｎは血管成長を向上させることを、これらの結果は示唆する。
【0065】
実施例８：ＴＲＩＭは線維サイズを増加させる
生理食塩水処置及びジストロフィックス処置マウス由来の線維を、ラミニン、ＭｙＨＣ、及びＤＡＰＩに対して染色した（図７Ａ）。筋原線維断面積の頻度の定量において、ジストロフィックスによる処置は、生理食塩水対照と比較して右向きのシフトを引き起こし（図７Ｂ）、このことは、ジストロフィックス処置が線維サイズを増加させることを示している。
生理食塩水処置及びジストロフィックス処置マウス由来の線維を、ラミニン、ＭｙＨＣ、及びＤＡＰＩに対して染色した（図７Ａ）。筋原線維断面積の頻度の定量において、ジストロフィックスによる処置は、生理食塩水対照と比較して右向きのシフトを引き起こし（図７Ｂ）、このことは、ジストロフィックス処置が線維サイズを増加させることを示している。
【0066】
本発明の要素又はその好ましい実施形態を導入する場合、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び「ｓａｉｄ」は、要素のうちの１つ以上が存在することを意図する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、包括的であることが意図され、列挙された要素以外の追加の要素が存在し得ることを意味する。
【0067】
上記を考慮すると、本発明のいくつかの目的が達成され、他の有利な結果が達成されることが分かるであろう。
【0068】
本発明の範囲から逸脱することなく、上記の組成物及びプロセスにおいて様々な変更を行うことができるため、上記の説明に含まれ、添付の図面に示されるすべての事項は、限定的な意味ではなく、例示的なものとして解釈されるべきであることが意図される。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【国際調査報告】