特表 2024-537991 共発現されるｓｈＲＮＡと論理ゲートシステムとを有する免疫細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-18

(54)【発明の名称】共発現されるｓｈＲＮＡと論理ゲートシステムとを有する免疫細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20241010BHJP

   C07K 16/40 20060101ALI20241010BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20241010BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20241010BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20241010BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20241010BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20241010BHJP

   C07K 14/725 20060101ALI20241010BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241010BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241010BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20241010BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20241010BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20241010BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241010BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241010BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C07K16/40 ZNA

C07K19/00

C12N15/13

C07K16/28

C12N15/113 Z

C12N15/113 130Z

C12N15/113 120Z

C12N15/12

C07K14/725

C12N15/63 Z

C12N5/10

C12N15/09 100

A61K35/17

A61K31/7105

A61K48/00

A61P35/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024519516

(86)(22)【出願日】2022-10-14

(85)【翻訳文提出日】2024-05-21

(86)【国際出願番号】 US2022078158

(87)【国際公開番号】W WO2023064928

(87)【国際公開日】2023-04-20

(31)【優先権主張番号】63/255,887

(32)【優先日】2021-10-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/255,889

(32)【優先日】2021-10-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/255,891

(32)【優先日】2021-10-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/303,422

(32)【優先日】2022-01-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523069854

【氏名又は名称】アーセナル バイオサイエンシズ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100188433

【弁理士】

【氏名又は名称】梅村 幸輔

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100214396

【弁理士】

【氏名又は名称】塩田 真紀

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(74)【代理人】

【識別番号】100221741

【弁理士】

【氏名又は名称】酒井 直子

(74)【代理人】

【識別番号】100114926

【弁理士】

【氏名又は名称】枝松 義恵

(72)【発明者】

【氏名】ウィリアムズ ジャスパー

(72)【発明者】

【氏名】グエン ミシェル

(72)【発明者】

【氏名】ヤオ アンジ

(72)【発明者】

【氏名】サントロ スティーブン

(72)【発明者】

【氏名】クーパー アーロン

(72)【発明者】

【氏名】ガニオン ジョン

(72)【発明者】

【氏名】リッターマン アダム

(72)【発明者】

【氏名】カーン オマル

(72)【発明者】

【氏名】ベズマン ナタリー

(72)【発明者】

【氏名】ハリス キャサリン

(72)【発明者】

【氏名】マリク チョードリー ハルバニ カウル

(72)【発明者】

【氏名】アレン ニコール

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA01

4B065BA02

4B065CA23

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4B065CA46

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZB26

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA05

4C086NA14

4C086ZB26

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB65

4C087CA04

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZB26

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045BA54

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA75

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

ＡＬＰＧ／Ｐに結合するキメラプライミング受容体と、ＭＳＬＮに結合するキメラ抗原受容体と、ＦＡＳ、ＰＴＰＮ２及び／またはＴＯＸを標的とするｓｈＲＮＡと、をコードする組換え核酸が、本明細書で提供される。ＡＬＰＧ／Ｐに結合するキメラプライミング受容体、ＭＳＬＮに結合するキメラ抗原受容体、ならびにＦＡＳ、ＰＴＰＮ２及び／またはＴＯＸを標的とするｓｈＲＮＡのシステム、そのようなタンパク質及びｓｈＲＮＡを発現する細胞、ならびにそれらの使用方法もまた提供される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

１つ以上の組換え核酸であって、
ａ．胎盤／生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ／Ｐ）に特異的に結合する第１の細胞外抗原結合ドメインを含むプライミング受容体を含む第１のキメラポリペプチドであって、前記第１の細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列、ならびにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３の３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含み、
ｉ．ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１に記載の配列を含み、
ｉｉ．ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号２に記載の配列を含み、
ｉｉｉ．ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号３に記載の配列を含み、
ｉｖ．ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号４に記載の配列を含み、
ｖ．ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号５に記載の配列を含み、かつ
ｖｉ．ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号６に記載の配列を含む、前記第１のキメラポリペプチドと、
ｂ．メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する第２の細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む第２のキメラポリペプチドであって、前記第２の細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含み、
ｉ．ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１４に記載の配列を含み、
ｉｉ．ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１５に記載の配列を含み、かつ
ｉｉｉ．ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１６に記載の配列を含むか、または
ｉｖ．ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１０に記載の配列を含み、
ｖ．ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１１に記載の配列を含み、かつ
ｖｉ．ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１２に記載の配列を含む、前記第２のキメラポリペプチドと、
ｃ．配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４に相補的である第１の核酸配列と、
ｄ．配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９に相補的であるか、または配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１に相補的である第２の核酸配列と
をコードする、前記１つ以上の組換え核酸。

【請求項2】

前記第１の細胞外抗原結合ドメインＶＨ鎖配列が、配列番号７に記載の配列を含む、請求項１に記載の組換え核酸（複数可）。

【請求項3】

前記第１の細胞外抗原結合ドメインＶＬ鎖配列が、配列番号８に記載の配列を含む、請求項１または２に記載の組換え核酸（複数可）。

【請求項4】

前記第１の細胞外抗原結合ドメインが、配列番号９に記載の配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組換え核酸（複数可）。

【請求項5】

前記第２の細胞外抗原結合ドメインＶＨが、配列番号１７に記載の配列を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の組換え核酸（複数可）。

【請求項6】

前記第２の細胞外抗原結合ドメインＶＨＨ鎖配列が、配列番号１３に記載の配列を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の組換え核酸（複数可）。

【請求項7】

配列番号１６８、１６７または１６６に記載の配列からなる群から選択される配列を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の組換え核酸。

【請求項8】

配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の核酸配列を含む、組換え核酸。

【請求項9】

配列番号４０に記載の配列を含むヒトタンパク質チロシンホスファターゼ非受容体２型（ＰＴＰＮ２）をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の核酸配列を含む、組換え核酸。

【請求項10】

配列番号４１に記載の配列を含むヒト胸腺細胞選択関連高移動度群ボックス（ＴＯＸ）をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の核酸配列を含む、組換え核酸。

【請求項11】

配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列と、配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の第２の核酸配列と、を含む、１つ以上の組換え核酸。

【請求項12】

配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸と、配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の第２の核酸と、を含む、１つ以上の組換え核酸。

【請求項13】

胎盤／生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ／Ｐ）に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記単離された抗体またはその抗原結合断片が、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列と、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３の３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列と、を含み、
ａ．ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１に記載の配列を含み、
ｂ．ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号２に記載の配列を含み、
ｃ．ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号３に記載の配列を含み、
ｄ．ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号４に記載の配列を含み、
ｅ．ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号５に記載の配列を含み、かつ
ｆ．ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号６に記載の配列を含む、
前記単離された抗体またはその抗原結合断片。

【請求項14】

胎盤／生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ／Ｐ）に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインと、１つ以上のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位を含む膜貫通ドメインと、ヒトまたはヒト化転写エフェクターを含む細胞内ドメインと、を含む、プライミング受容体であって、前記細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列、ならびにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３の３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含み、
ｇ．ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１に記載の配列を含み、
ｈ．ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号２に記載の配列を含み、
ｉ．ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号３に記載の配列を含み、
ｊ．ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号４に記載の配列を含み、
ｋ．ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号５に記載の配列を含み、かつ
ｌ．ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号６に記載の配列を含む、
前記プライミング受容体。

【請求項15】

メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含み、
ａ．ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１４に記載の配列を含み、
ｂ．ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１５に記載の配列を含み、かつ
ｃ．ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１６に記載の配列を含む、
前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。

【請求項16】

メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨＨ）鎖配列を含む単一ドメイン抗体を含み、
ａ．ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１０に記載の配列を含み、
ｂ．ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１１に記載の配列を含み、かつ
ｃ．ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１２に記載の配列を含む、
前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。

【請求項17】

第１のキメラポリペプチドと、第２のキメラポリペプチドと、を含む、システムであって、
ａ．前記第１のキメラポリペプチドが、胎盤／生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ／Ｐ）に特異的に結合する第１の細胞外抗原結合ドメインを含むプライミング受容体を含み、前記第１の細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列、ならびにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３の３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含み、
ｉ．ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１に記載の配列を含み、
ｉｉ．ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号２に記載の配列を含み、
ｉｉｉ．ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号３に記載の配列を含み、
ｉｖ．ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号４に記載の配列を含み、
ｖ．ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号５に記載の配列を含み、かつ
ｖｉ．ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号６に記載の配列を含み、
ｂ．前記第２のキメラポリペプチドが、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する第２の細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、前記第２の細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含み、
ｉ．ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１４に記載の配列を含み、
ｉｉ．ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１５に記載の配列を含み、かつ
ｉｉｉ．ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１６に記載の配列を含むか、または
ｉｖ．ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１０に記載の配列を含み、
ｖ．ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１１に記載の配列を含み、かつ
ｖｉ．ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１２に記載の配列を含む、
前記システム。

【請求項18】

実施形態１～１２のいずれか１項に記載の組換え核酸を含む、発現ベクター。

【請求項19】

ａ．請求項１～１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つの組換え核酸（複数可）、及び／または
ｂ．請求項１３～１７のいずれか１項に記載の抗体もしくは抗原断片、プライミングレセプション、ＣＡＲ、またはシステム、及び／または
ｃ．請求項１８に記載のベクター
を含む、免疫細胞。

【請求項20】

少なくとも１つの組換え核酸を含む初代免疫細胞であって、前記少なくとも１つの組換え核酸が、
ａ．ＡＬＰＧ／Ｐに特異的に結合する第１の細胞外抗原結合ドメインを含むプライミング受容体と、
ｂ．ＭＳＬＮに特異的に結合する第２の細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体と、
ｃ．少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列であって、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である、前記第１の核酸配列と、少なくとも１５ヌクレオチド長の第２の核酸配列であって、
ｉ．配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的であるか、または
ｉｉ．配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である、前記第２の核酸配列と
を含み、
前記組換え核酸が、前記初代免疫細胞のゲノムの標的領域内に挿入されており、前記初代免疫細胞が、前記組換え核酸を前記初代免疫細胞内に導入するためのウイルスベクターを含まない、前記初代免疫細胞。

【請求項21】

少なくとも１つの組換え核酸（複数可）を含む初代免疫細胞であって、前記少なくとも１つの組換え核酸（複数可）が、配列番号４９に記載の配列を含む第１の核酸と、配列番号８２に記載の配列を含む第２の核酸と、を含み、前記初代免疫細胞のゲノムの標的領域内に挿入されており、前記初代免疫細胞が、前記組換え核酸（複数可）を前記初代免疫細胞内に導入するためのウイルスベクターを含まない、前記初代免疫細胞。

【請求項22】

少なくとも１つの組換え核酸（複数可）を含む初代免疫細胞であって、前記少なくとも１つの組換え核酸（複数可）が、配列番号４９に記載の配列を含む第１の核酸と、配列番号９９または１０４に記載の配列を含む第２の核酸と、を含み、前記初代免疫細胞のゲノムの標的領域内に挿入されており、前記初代免疫細胞が、前記組換え核酸を前記初代免疫細胞内に導入するためのウイルスベクターを含まない、前記初代免疫細胞。

【請求項23】

リボ核タンパク質（ＲＮＰ）－組換え核酸複合体を含むウイルスフリー生存初代細胞であって、前記ＲＮＰが、ヌクレアーゼドメイン及びガイドＲＮＡを含み、前記組換え核酸が、
ａ．ＡＬＰＧ／Ｐに特異的に結合する第１の細胞外抗原結合ドメインを含むプライミング受容体と、
ｂ．ＭＳＬＮに特異的に結合する第２の細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体と、
ｃ．少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列であって、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である、前記第１の核酸配列と、少なくとも１５ヌクレオチド長の第２の核酸配列であって、
ｉ．配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的であるか、または
ｉｉ．配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である、前記第２の核酸配列と
をコードし、
ｄ．前記組換え核酸の５’及び３’末端が、前記初代細胞のゲノムにおける挿入部位に隣接するゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む、
前記ウイルスフリー生存初代細胞。

【請求項24】

リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）－組換え核酸（複数可）複合体を含むウイルスフリー生存初代細胞であって、前記ＲＮＰが、ヌクレアーゼドメイン及びガイドＲＮＡを含み、前記組換え核酸（複数可）が、配列番号４９に記載の配列を含む第１の核酸と、配列番号８２に記載の配列を含む第２の核酸と、を含み、前記組換え核酸（複数可）の５’及び３’末端が、前記初代細胞のゲノムにおける挿入部位に隣接するゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む、前記ウイルスフリー生存初代細胞。

【請求項25】

リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）－組換え核酸（複数可）複合体を含むウイルスフリー生存初代細胞であって、前記ＲＮＰが、ヌクレアーゼドメイン及びガイドＲＮＡを含み、前記組換え核酸（複数可）が、配列番号４９に記載の配列を含む第１の核酸と、配列番号９９または１０４に記載の配列を含む第２の核酸と、を含み、前記組換え核酸（複数可）の５’及び３’末端が、前記初代細胞のゲノムにおける挿入部位に隣接するゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む、前記ウイルスフリー生存初代細胞。

【請求項26】

請求項１９～２５のいずれか１項に記載の複数の免疫細胞を含む、細胞の集団。

【請求項27】

請求項１９～２５のいずれか１項に記載の免疫細胞または請求項２６に記載の細胞の集団と、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、薬学的組成物。

【請求項28】

請求項１～１２のいずれか１項に記載の組換え核酸または請求項１８に記載のベクターと、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、薬学的組成物。

【請求項29】

免疫細胞を編集する方法であって、
ａ．リボ核タンパク質（ＲＮＰ）－組換え核酸複合体を提供することであって、前記ＲＮＰが、ヌクレアーゼドメイン及びガイドＲＮＡを含み、前記組換え核酸が、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組換え核酸を含み、前記組換え核酸の５’及び３’末端が、前記免疫細胞のゲノム内の挿入部位に隣接するゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む、前記提供することと、
ｂ．前記ＲＮＰ－組換え核酸複合体を前記免疫細胞に非ウイルス的に導入することであって、前記ガイドＲＮＡが、初代免疫細胞のゲノムの標的領域に特異的にハイブリダイズし、前記ヌクレアーゼドメインが、前記標的領域を切断して、前記免疫細胞の前記ゲノム内に前記挿入部位を作成する、前記非ウイルス的に導入することと、
ｃ．前記免疫細胞を、前記免疫細胞の前記ゲノムにおける前記挿入部位内への請求項１～１２のいずれか１項に記載の組換え核酸の挿入を介して編集することと
を含む、前記方法。

【請求項30】

対象における疾患を治療する方法であって、請求項１８～２６のいずれか１項に記載の免疫細胞または請求項２７もしくは２８に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。

【請求項31】

免疫細胞においてキメラ抗原受容体の発現をプライミング受容体で誘導する方法であって、
ａ．免疫細胞を得ることであって、前記免疫細胞が、
ｉ．請求項１～１２のいずれか１項に記載の組換え核酸、及び／または
ｉｉ．請求項１８に記載のベクター
を含む、前記得ることと、
ｂ．前記免疫細胞を、ＡＬＰＧ／Ｐ及びＭＳＬＮを発現する標的細胞と接触させることであって、前記標的細胞上の前記ＡＬＰＧ／Ｐへの前記プライミング受容体の結合が、前記プライミング受容体の活性化及び前記キメラ抗原受容体の発現を誘導する、前記接触させることと
を含む、前記方法。

【請求項32】

免疫細胞の活性を調節する方法であって、
ａ．免疫細胞を得ることであって、前記免疫細胞が、
ｉ．請求項１～１２のいずれか１項に記載の組換え核酸、及び／または
ｉｉ．請求項１８に記載のベクター
を含む、前記得ることと、
ｂ．前記免疫細胞を、ＡＬＰＧ／Ｐ及びＭＳＬＮを発現する標的細胞と接触させることであって、前記標的細胞上の前記ＡＬＰＧ／Ｐへの前記プライミング受容体の結合が、前記プライミング受容体の活性化及び前記キメラ抗原受容体の発現を誘導し、前記標的細胞上の前記ＭＳＬＮへの前記キメラ抗原受容体の結合が、前記免疫細胞の前記活性を調節する、前記接触させることと
を含む、前記方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１０月１４日に出願された米国仮出願第６３／２５５，８８７号、２０２１年１０月１４日に出願された米国仮出願第６３／２５５，８８９号、２０２１年１０月１４日に出願された米国仮出願第６３／２５５，８９１号及び２０２２年１月２６日に出願された米国仮出願第６３／３０３，４２２号の優先権及び利益を主張し、それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。当該ＡＳＣＩＩコピーは、２０ＸＸ年ＸＸ月に作成され、ＸＸＸＸＸＵＳ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌという名前で、Ｘ，ＸＸＸ，ＸＸＸバイトのサイズである。

【背景技術】

【0003】

背景
がんは、細胞の制御不能な増殖を特徴とする疾患である。薬物及び放射線療法を含む、がんを治療するための多くのアプローチが試みられてきた。最近のがん治療では、身体自体の免疫細胞を使用してがん細胞を攻撃しようとしている。有望なアプローチの１つは、患者から採取され、特定のタンパク質を標的とする新しい能力をＴ細胞に与える、キメラ抗原受容体またはＣＡＲ、受容体タンパク質を産生するように遺伝子操作されたＴ細胞を使用する。これらの受容体は、抗原結合及びＴ細胞活性化機能を単一の受容体に組み合わせるため、キメラである。

【0004】

ＣＡＲ－Ｔ細胞を使用する免疫療法は、修飾Ｔ細胞が、がん細胞をより効果的に標的として破壊するために、がん細胞を認識する可能性を有するため、有望である。

【0005】

Ｔ細胞をＣＡＲで操作した後、得られたＣＡＲ－Ｔ細胞を患者に導入して腫瘍細胞を攻撃する。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、患者自身の血液中のＴ細胞に由来する（自己）か、または別の健康なドナーのＴ細胞に由来する（同種異系）かのいずれかであり得る。ＣＡＲ－Ｔ細胞が患者に注入されると、それらは細胞上の標的抗原と接触する。ＣＡＲ－Ｔ細胞は抗原に結合し、活性化される。抗原係合時に、ＣＡＲ Ｔ細胞は、指数関数的に増殖し、抗腫瘍サイトカイン産生を開始し、腫瘍細胞殺傷を標的とすることができる。

【0006】

しかしながら、ＣＡＲ－Ｔ細胞ベースの免疫療法にはいくつかの懸念及び限界が残っている。いくつかのＣＡＲ Ｔ細胞は、低レベルの標的抗原を発現する正常細胞と係合し得、オフターゲット毒性をもたらす。しかしながら、ＣＡＲ－Ｔ細胞ベースの免疫療法にはいくつかの限界が残っている。更に、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、末梢血中生存を欠き得、低減された増殖及びエフェクター機能を有し得、抑制及び疲弊に感受性であり、メモリーＴ細胞持続性をもたらさないことがある。したがって、内因性経路を標的とし、例えば、オフターゲット毒性を低減する追加の療法が、これらの支障に対処するために必要とされている。

【発明の概要】

【0007】

概要
一態様において、プライミング受容体を含む第１のキメラポリペプチドと、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む第２のキメラポリペプチドと、少なくとも１５ヌクレオチド長の少なくとも１つの核酸配列と、をコードする、１つ以上の組換え核酸であって、少なくとも１つの核酸配列が、（１）配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦａｓ細胞表面死受容体（ＦＡＳ）をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４に相補的である第１の核酸配列、（２）配列番号４０に記載の配列を含むヒトタンパク質チロシンホスファターゼ非受容体２型（ＰＴＰＮ２）をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９に相補的である第２の核酸配列、及び（３）配列番号４１に記載の配列を含むヒト胸腺細胞選択関連高移動度群ボックス（ＴＯＸ）をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１に相補的である第３の核酸配列のうちの１つ以上を含む、１つ以上の組換え核酸が、本明細書で提供される。

【0008】

いくつかの実施形態において、プライミング受容体は、生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ／Ｐ）に特異的に結合する第１の細胞外抗原結合ドメインを含む。

【0009】

いくつかの実施形態において、第１の細胞外抗原結合ドメインは、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列、ならびにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３の３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号２に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号３に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号４に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号５に記載の配列を含み、かつＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号６に記載の配列を含む。

【0010】

いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する第２の細胞外抗原結合ドメインを含み、第２の細胞外抗原結合ドメインは、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１４に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号１５に記載の配列を含み、かつＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号１６に記載の配列を含む。

【0011】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸配列は、（１）配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４に相補的である第１の核酸配列、及び（２）配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９に相補的である第２の核酸配列の各々を含む。

【0012】

いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する第２の細胞外抗原結合ドメインを含む。

【0013】

いくつかの実施形態において、第２の細胞外抗原結合ドメインは、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１４に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号１５に記載の配列を含み、かつＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号１６に記載の配列を含む。

【0014】

いくつかの実施形態において、第２の細胞外抗原結合ドメインは、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨＨ）鎖配列を含む単一ドメイン抗体を含み、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１０に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号１１に記載の配列を含み、かつＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号１２に記載の配列を含む。

【0015】

一態様において、１つ以上の組換え核酸であって、胎盤／生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ／Ｐ）に特異的に結合する第１の細胞外抗原結合ドメインを含むプライミング受容体を含む第１のキメラポリペプチドであって、第１の細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列、ならびにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３の３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号２に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号３に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号４に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号５に記載の配列を含み、かつＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号６に記載の配列を含む、第１のキメラポリペプチドと、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む第２のキメラポリペプチドと、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４に相補的である第１の核酸配列と、配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９に相補的であるか、または配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１に相補的である第２の核酸配列と、をコードする、１つ以上の組換え核酸が、本明細書で提供される。

【0016】

いくつかの実施形態において、第１の細胞外抗原結合ドメインＶＨ鎖配列は、配列番号７に記載の配列を含む。

【0017】

いくつかの実施形態において、第１の細胞外抗原結合ドメインＶＬ鎖配列は、配列番号８に記載の配列を含む。

【0018】

いくつかの実施形態において、第１の細胞外抗原結合ドメインは、配列番号９に記載の配列を含む。

【0019】

いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する第２の細胞外抗原結合ドメインを含む。

【0020】

いくつかの実施形態において、第２の細胞外抗原結合ドメインは、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１４に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号１５に記載の配列を含み、かつＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号１６に記載の配列を含む。

【0021】

いくつかの実施形態において、第２の細胞外抗原結合ドメインＶＨは、配列番号１７に記載の配列を含む。

【0022】

いくつかの実施形態において、第２の細胞外抗原結合ドメインは、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨＨ）鎖配列を含む単一ドメイン抗体を含み、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１０に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号１１に記載の配列を含み、かつＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号１２に記載の配列を含む。

【0023】

いくつかの実施形態において、第２の細胞外抗原結合ドメインＶＨＨ鎖配列は、配列番号１３に記載の配列を含む。

【0024】

いくつかの実施形態において、第２の核酸配列は、配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９に相補的である。

【0025】

いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号１６８、１６７または１６６に記載の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0026】

いくつかの実施形態において、第２の核酸配列は、配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１に相補的である。

【0027】

一態様において、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の核酸配列を含む、組換え核酸が、本明細書で提供される。

【0028】

一態様において、配列番号４０に記載の配列を含むヒトタンパク質チロシンホスファターゼ非受容体２型（ＰＴＰＮ２）をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の核酸配列を含む、組換え核酸が、本明細書で提供される。

【0029】

一態様において、配列番号４１に記載の配列を含むヒト胸腺細胞選択関連高移動度群ボックス（ＴＯＸ）をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の核酸配列を含む、組換え核酸が、本明細書で提供される。

【0030】

一態様において、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列と、配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の第２の核酸配列と、を含む、１つ以上の組換え核酸が、本明細書で提供される。

【0031】

一態様において、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸と、配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の第２の核酸と、を含む、１つ以上の組換え核酸が、本明細書で提供される。

【0032】

いくつかの実施形態において、第１、第２及び第３の核酸配列は、少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２ヌクレオチド長である。

【0033】

いくつかの実施形態において、第１、第２及び第３の核酸配列は、ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

【0034】

いくつかの実施形態において、第１、第２及び第３の核酸配列は、ｓｈＲＮＡである。

【0035】

いくつかの実施形態において、第１の核酸配列は、配列番号４２～７１に記載の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0036】

いくつかの実施形態において、第１の核酸配列は、配列番号４９に記載の配列を含む。

【0037】

いくつかの実施形態において、第１の核酸は、免疫細胞におけるＦＡＳの発現を、核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減する。

【0038】

いくつかの実施形態において、第２の核酸配列は、配列番号７２～９７に記載の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0039】

いくつかの実施形態において、第２の核酸配列は、配列番号８２に記載の配列を含む。

【0040】

いくつかの実施形態において、第１の核酸配列は、配列番号４２～７１に記載の配列からなる群から選択される配列を含み、第２の核酸配列は、配列番号７２～９７に記載の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0041】

いくつかの実施形態において、第１の核酸配列は、配列番号４９に記載の配列を含み、第２の核酸配列は、配列番号８２に記載の配列を含む。

【0042】

いくつかの実施形態において、第２の核酸は、免疫細胞におけるＰＴＰＮ２の発現を、核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減する。

【0043】

いくつかの実施形態において、第２の核酸配列は、配列番号９８～１２５に記載の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0044】

いくつかの実施形態において、第２の核酸配列は、配列番号９９または１０４に記載の配列を含む。

【0045】

いくつかの実施形態において、第１の核酸配列は、配列番号４２～７１に記載の配列からなる群から選択される配列を含み、第２の核酸配列は、配列番号９８～１２５に記載の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0046】

いくつかの実施形態において、第１の核酸配列は、配列番号４９に記載の配列を含み、第２の核酸配列は、配列番号９９または１０４に記載の配列を含む。

【0047】

いくつかの実施形態において、第２の核酸は、免疫細胞におけるＴＯＸの発現を、核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減する。

【0048】

一態様において、１つ以上の組換え核酸であって、プライミング受容体を含む第１のキメラポリペプチドと、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む第２のキメラポリペプチドであって、細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨＨ）鎖配列を含む単一ドメイン抗体を含み、ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１０に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１１に記載の配列を含み、かつＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１２に記載の配列を含む、第２のキメラポリペプチドと、少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列であって、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である、第１の核酸配列と、配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的であるか、または配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である第２の核酸配列と、をコードする、１つ以上の組換え核酸が、本明細書で提供される。

【0049】

いくつかの実施形態において、ＶＨＨ鎖配列は、配列番号１３に記載の配列を含む。

【0050】

一態様において、１つ以上の組換え核酸であって、プライミング受容体を含む第１のキメラポリペプチドと、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む第２のキメラポリペプチドであって、第２の細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１４に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１５に記載の配列を含み、かつＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１６に記載の配列を含む、第２のキメラポリペプチドと、少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列であって、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である、第１の核酸配列と、配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的であるか、または配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である第２の核酸配列と、をコードする、１つ以上の組換え核酸が、本明細書で提供される。

【0051】

いくつかの実施形態において、ＶＨは、配列番号１７に記載の配列を含む。

【0052】

一態様において、１つ以上の組換え核酸であって、生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ／Ｐ）に特異的に結合する第１の細胞外抗原結合ドメインを含むプライミング受容体を含む第１のキメラポリペプチドと、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する第２の細胞外抗原結合ドメインを含むＣＡＲを含む第２のキメラポリペプチドと、少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列であって、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である、第１の核酸配列と、配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的であるか、または配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である第２の核酸配列と、をコードする、１つ以上の組換え核酸が、本明細書で提供される。

【0053】

いくつかの実施形態において、第２の核酸配列は、配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９に相補的である。

【0054】

いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号１６８、１６７または１６６に記載の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0055】

いくつかの実施形態において、第２の核酸配列は、配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１に相補的である。

【0056】

いくつかの実施形態において、第１及び第２の核酸配列は、少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２ヌクレオチド長である。

【0057】

いくつかの実施形態において、第１及び第２の核酸は、ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

【0058】

いくつかの実施形態において、第１及び第２の核酸は、ｓｈＲＮＡである。

【0059】

いくつかの実施形態において、第１の核酸配列は、配列番号４２～７１に記載の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0060】

いくつかの実施形態において、第１の核酸配列は、配列番号４９に記載の配列を含む。

【0061】

いくつかの実施形態において、第１の核酸は、免疫細胞におけるＦＡＳの発現を、核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減する。

【0062】

いくつかの実施形態において、第２の核酸配列は、配列番号７２～９７に記載の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0063】

いくつかの実施形態において、第２の核酸配列は、配列番号８２に記載の配列を含む。

【0064】

いくつかの実施形態において、第２の核酸は、免疫細胞におけるＰＴＰＮ２の発現を、核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減する。

【0065】

いくつかの実施形態において、第２の核酸配列は、配列番号９８～１２５に記載の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0066】

いくつかの実施形態において、第２の核酸配列は、配列番号９９または１０４に記載の配列を含む。

【0067】

いくつかの実施形態において、第２の核酸は、免疫細胞におけるＴＯＸの発現を、核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減する。

【0068】

いくつかの実施形態において、プライミング受容体は、Ｎ末端からＣ末端へ、第１の細胞外抗原結合ドメイン、１つ以上のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位を含む第１の膜貫通ドメイン、及びヒトまたはヒト化転写エフェクターを含む細胞内ドメインを含み、第１の細胞外抗原結合ドメインによるＡＬＰＧ／Ｐの結合は、１つ以上のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位での切断をもたらす。

【0069】

いくつかの実施形態において、プライミング受容体は、第１の細胞外抗原結合ドメインと第１の膜貫通ドメインとの間に配置された第１のヒンジドメインを更に含む。

【0070】

いくつかの実施形態において、第１のヒンジドメインは、ＣＤ８αまたは切断型ＣＤ８αヒンジドメインを含む。

【0071】

いくつかの実施形態において、第１のヒンジは、配列番号１８に記載の配列を含む。

【0072】

いくつかの実施形態において、第１の膜貫通ドメインは、Ｎｏｔｃｈ１膜貫通ドメインを含む。

【0073】

いくつかの実施形態において、第１の膜貫通ドメインは、配列番号１９に記載の配列を含む。

【0074】

いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＨＮＦ１ａ／ｐ６５ドメインまたはＧａｌ４／ＶＰ６４ドメインを含む。

【0075】

いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号２３に記載の配列を含む。

【0076】

いくつかの実施形態において、プライミング受容体は、第１の膜貫通ドメインと細胞内ドメインとの間に移行阻止配列を更に含む。

【0077】

いくつかの実施形態において、移行阻止配列は、配列番号２０に記載の配列を含む。

【0078】

いくつかの実施形態において、プライミング受容体は、配列番号２４に記載の配列を含む。

【0079】

いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端へ、第２の細胞外抗原結合ドメイン、第２の膜貫通ドメイン、細胞内共刺激ドメイン、及び細胞内活性化ドメインを含む。

【0080】

いくつかの実施形態において、第２の細胞外抗原結合ドメインは、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合し、第２の細胞外抗原結合ドメインは、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨＨ）鎖配列を含む単一ドメイン抗体を含み、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１０に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号１１に記載の配列を含み、かつＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号１２に記載の配列を含む。

【0081】

いくつかの実施形態において、ＶＨＨ鎖配列は、配列番号１３に記載の配列を含む。

【0082】

いくつかの実施形態において、第２の細胞外抗原結合ドメインは、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合し、細胞外抗原結合ドメインは、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１４に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号１５に記載の配列を含み、かつＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号１６に記載の配列を含む。

【0083】

いくつかの実施形態において、ＶＨ鎖配列は、配列番号１７に記載の配列を含む。

【0084】

いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、第２のヒンジドメインを含む。

【0085】

いくつかの実施形態において、第２のヒンジドメインは、ＣＤ８αまたは切断型ＣＤ８αヒンジドメインを含む。

【0086】

いくつかの実施形態において、第２の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインを含む。

【0087】

いくつかの実施形態において、細胞内共刺激ドメインは、４－１ＢＢドメインを含む。

【0088】

いくつかの実施形態において、細胞内活性化ドメインは、ＣＤ３ζドメインを含む。

【0089】

いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号３０または３１に記載の配列を含む。

【0090】

いくつかの実施形態において、単一標的細胞が、ＡＬＰＧ／Ｐ及びＭＳＬＮの各々を発現する場合、プライミング受容体及びＣＡＲは、標的細胞に結合することが可能である。

【0091】

いくつかの実施形態において、標的細胞は、ヒト細胞である。

【0092】

いくつかの実施形態において、標的細胞は、がん細胞である。

【0093】

いくつかの実施形態において、がん細胞は、固形がん細胞または液体がん細胞である。

【0094】

いくつかの実施形態において、がん細胞は、卵巣癌、卵管癌、原発性腹膜癌、子宮癌、中皮腫、子宮頸癌または膵癌である。

【0095】

いくつかの実施形態において、組換え核酸は、２つ以上の核酸断片を含む。

【0096】

いくつかの実施形態において、組換え核酸は、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された誘導性プロモーターを更に含む。

【0097】

いくつかの実施形態において、組換え核酸は、プライミング受容体をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された第１の構成的プロモーターを更に含む。

【0098】

いくつかの実施形態において、組換え核酸は、キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された誘導性プロモーター、及びプライミング受容体をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された構成的プロモーターを更に含む。

【0099】

いくつかの実施形態において、組換え核酸は、ヒトＦＡＳと相補的である第１の核酸をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された第２の構成的プロモーターを更に含む。

【0100】

いくつかの実施形態において、組換え核酸は、ヒトＰＴＰＮ２またはＴＯＸと相補的である第２の核酸をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された第２の構成的プロモーターを更に含む。

【0101】

いくつかの実施形態において、組換え核酸は、ヒトＦＡＳと相補的である第１の核酸、またはヒトＰＴＰＮ２もしくはＴＯＸと相補的である第２の核酸をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された第２の構成的プロモーターを更に含む。

【0102】

いくつかの実施形態において、組換え核酸は、５’から３’方向に、第１の構成的プロモーター；プライミング受容体をコードするヌクレオチド配列；第２の構成的プロモーター；ヒトＦＡＳ、ヒトＰＴＰＮ２またはヒトＴＯＸと相補的である第１の核酸をコードするヌクレオチド配列；誘導性プロモーター；及びキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含む。

【0103】

いくつかの実施形態において、組換え核酸は、５’から３’方向に、第１の構成的プロモーター；プライミング受容体をコードするヌクレオチド配列；第２の構成的プロモーター；ヒトＦＡＳと相補的である第１の核酸をコードするヌクレオチド配列；ヒトＰＴＰＮ２またはＴＯＸと相補的である第２の第１の核酸をコードするヌクレオチド配列；誘導性プロモーター；及びキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含む。

【0104】

いくつかの実施形態において、組換え核酸は、５’から３’方向に、誘導性プロモーター；キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列；第２の構成的プロモーター；ヒトＦＡＳと相補的である第１の核酸をコードするヌクレオチド配列；ヒトＰＴＰＮ２またはＴＯＸと相補的である第２の第１の核酸をコードするヌクレオチド配列；第１の構成的プロモーター；及びプライミング受容体をコードするヌクレオチド配列を含む。

【0105】

いくつかの実施形態において、プライミング受容体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３６に記載の配列を含む。

【0106】

いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３７または３８に記載の配列を含む。

【0107】

いくつかの実施形態において、組換え核酸は、５’相同性指向性修復アーム及び３’相同性指向性修復アームを更に含み、５’相同性指向性修復アーム及び３’相同性指向性修復アームは、宿主細胞染色体における挿入部位と相補的である。

【0108】

いくつかの実施形態において、組換え核酸は、自己切断２Ａペプチド（Ｐ２Ａ）をコードするヌクレオチド配列を更に含む。

【0109】

いくつかの実施形態において、Ｐ２Ａは、キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列の３’末端にある。

【0110】

いくつかの実施形態において、Ｐ２Ａは、プライミング受容体をコードするヌクレオチド配列の３’末端にある。

【0111】

いくつかの実施形態において、組換え核酸は、ウッドチャック肝炎ウイルス翻訳後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を更に含む。

【0112】

いくつかの実施形態において、ＷＰＲＥは、キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列の３’末端に、かつプライミング受容体をコードするヌクレオチド配列の５’末端にあるか、またはＷＰＲＥは、プライミング受容体をコードするヌクレオチド配列の３’末端に、かつキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列の５’末端にある。

【0113】

いくつかの実施形態において、組換え核酸は、ＳＶ４０ポリＡエレメントを更に含む。

【0114】

いくつかの実施形態において、核酸は、発現カセットまたは発現ベクター内に組み込まれている。

【0115】

いくつかの実施形態において、発現ベクターは、非ウイルスベクターである。

【0116】

一態様において、本明細書に開示される組換え核酸を含む、発現ベクターが、本明細書で提供される。

【0117】

いくつかの実施形態において、組換え核酸の５’及び３’末端は、初代細胞のゲノム内の挿入部位に隣接するゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む。

【0118】

いくつかの実施形態において、挿入部位は、Ｔ細胞受容体アルファ定常（ＴＲＡＣ）遺伝子座またはゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）遺伝子座に位置する。

【0119】

いくつかの実施形態において、ＧＨＳ遺伝子座は、ＧＳ９４遺伝子座である。

【0120】

一態様において、本明細書に開示される少なくとも１つの組換え核酸（複数可）及び／または本明細書に開示されるベクターを含む、免疫細胞が、本明細書で提供される。

【0121】

いくつかの実施形態において、免疫細胞は、初代ヒト免疫細胞である。

【0122】

いくつかの実施形態において、初代ヒト免疫細胞は、自己免疫細胞である。

【0123】

いくつかの実施形態において、初代免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、初代Ｔ細胞、またはＴ細胞前駆体である。

【0124】

いくつかの実施形態において、初代免疫細胞は、初代Ｔ細胞である。

【0125】

いくつかの実施形態において、初代免疫細胞は、初代ヒトＴ細胞である。

【0126】

いくつかの実施形態において、初代免疫細胞は、ウイルスフリーである。

【0127】

いくつかの実施形態において、免疫細胞は、自己免疫細胞である。

【0128】

いくつかの実施形態において、免疫細胞は、同種免疫細胞である。

【0129】

一態様において、少なくとも１つの組換え核酸を含む初代免疫細胞であって、少なくとも１つの組換え核酸が、ＡＬＰＧ／Ｐに特異的に結合する第１の細胞外抗原結合ドメインを含むプライミング受容体と、ＭＳＬＮに特異的に結合する第２の細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体と、少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列であって、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である、第１の核酸配列と、少なくとも１５ヌクレオチド長の第２の核酸配列であって、配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的であるか、または配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である、第２の核酸配列と、を含み、組換え核酸が、初代免疫細胞のゲノムの標的領域内に挿入されており、初代免疫細胞が、組換え核酸を初代免疫細胞内に導入するためのウイルスベクターを含まない、初代免疫細胞が、本明細書で提供される。

【0130】

一態様において、少なくとも１つの組換え核酸（複数可）を含む初代免疫細胞であって、少なくとも１つの組換え核酸（複数可）が、配列番号４９に記載の配列を含む第１の核酸と、配列番号８２に記載の配列を含む第２の核酸と、を含み、初代免疫細胞のゲノムの標的領域内に挿入されており、初代免疫細胞が、組換え核酸（複数可）を初代免疫細胞内に導入するためのウイルスベクターを含まない、初代免疫細胞が、本明細書で提供される。

【0131】

一態様において、少なくとも１つの組換え核酸（複数可）を含む初代免疫細胞であって、少なくとも１つの組換え核酸（複数可）が、配列番号４９に記載の配列を含む第１の核酸と、配列番号９９または１０４に記載の配列を含む第２の核酸と、を含み、初代免疫細胞のゲノムの標的領域内に挿入されており、初代免疫細胞が、組換え核酸を初代免疫細胞内に導入するためのウイルスベクターを含まない、初代免疫細胞が、本明細書で提供される。

【0132】

一態様において、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）－組換え核酸複合体を含むウイルスフリー生存初代細胞であって、ＲＮＰが、ヌクレアーゼドメイン及びガイドＲＮＡを含み、組換え核酸が、ＡＬＰＧ／Ｐに特異的に結合する第１の細胞外抗原結合ドメインを含むプライミング受容体と、ＭＳＬＮに特異的に結合する第２の細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体と、少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列であって、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である、第１の核酸配列と、少なくとも１５ヌクレオチド長の第２の核酸配列であって、配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的であるか、または配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である、第２の核酸配列と、をコードし、組換え核酸の５’及び３’末端が、初代細胞のゲノムにおける挿入部位に隣接するゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む、ウイルスフリー生存初代細胞が、本明細書で提供される。

【0133】

一態様において、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）－組換え核酸（複数可）複合体を含むウイルスフリー生存初代細胞であって、ＲＮＰが、ヌクレアーゼドメイン及びガイドＲＮＡを含み、組換え核酸（複数可）が、配列番号４９に記載の配列を含む第１の核酸と、配列番号８２に記載の配列を含む第２の核酸と、を含み、組換え核酸（複数可）の５’及び３’末端が、初代細胞のゲノムにおける挿入部位に隣接するゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む、ウイルスフリー生存初代細胞が、本明細書で提供される。

【0134】

一態様において、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）－組換え核酸（複数可）複合体を含むウイルスフリー生存初代細胞であって、ＲＮＰが、ヌクレアーゼドメイン及びガイドＲＮＡを含み、組換え核酸（複数可）が、配列番号４９に記載の配列を含む第１の核酸と、配列番号９９または１０４に記載の配列を含む第２の核酸と、を含み、組換え核酸（複数可）の５’及び３’末端が、初代細胞のゲノムにおける挿入部位に隣接するゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む、ウイルスフリー生存初代細胞が、本明細書で提供される。

【0135】

いくつかの実施形態において、細胞は、配列番号１６８、１６７または１６６に記載の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0136】

いくつかの実施形態において、第１の核酸は、免疫細胞におけるＦＡＳの発現を、第１の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減する。

【0137】

いくつかの実施形態において、免疫細胞におけるＦＡＳの発現は、第１の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減される。

【0138】

いくつかの実施形態において、第２の核酸は、免疫細胞におけるＰＴＰＮ２の発現を、第２の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減する。

【0139】

いくつかの実施形態において、免疫細胞におけるＰＴＰＮ２の発現は、第２の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減される。

【0140】

いくつかの実施形態において、第２の核酸は、免疫細胞におけるＴＯＸの発現を、第２の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減する。

【0141】

いくつかの実施形態において、免疫細胞におけるＴＯＸの発現は、第２の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減される。

【0142】

いくつかの実施形態において、ＦＡＳ、ＰＴＰＮ２及び／またはＴＯＸの発現は、核酸アッセイまたはタンパク質アッセイによって決定される。

【0143】

いくつかの実施形態において、核酸アッセイは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、ＲＴ－ｑＰＣＲ、マイクロアレイ、遺伝子アレイまたはＲＮＡｓｅｑのうちの少なくとも１つを含む。

【0144】

いくつかの実施形態において、タンパク質アッセイは、イムノブロッティング、蛍光活性化細胞選別、フローサイトメトリー、磁気活性化細胞選別または親和性ベースの細胞分離のうちの少なくとも１つを含む。

【0145】

一態様において、本明細書に開示される複数の免疫細胞を含む細胞の集団が、本明細書で提供される。

【0146】

一態様において、本明細書に開示される免疫細胞または本明細書に開示される細胞の集団と、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、薬学的組成物が、本明細書で提供される。

【0147】

一態様において、本明細書に開示される組換え核酸または本明細書に開示されるベクターと、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、薬学的組成物が、本明細書で提供される。

【0148】

一態様において、免疫細胞を編集する方法であって、
リボ核タンパク質（ＲＮＰ）－組換え核酸複合体を提供することであって、ＲＮＰが、ヌクレアーゼドメイン及びガイドＲＮＡを含み、組換え核酸が、本明細書に開示される組換え核酸を含み、組換え核酸の５’及び３’末端が、免疫細胞のゲノムにおける挿入部位に隣接するゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む、提供することと、
ＲＮＰ－組換え核酸複合体を免疫細胞内に非ウイルス的に導入することであって、ガイドＲＮＡが、初代免疫細胞のゲノムの標的領域に特異的にハイブリダイズし、ヌクレアーゼドメインが、標的領域を切断して、免疫細胞のゲノムにおける挿入部位を作成する、非ウイルス的に導入することと、
免疫細胞を、免疫細胞のゲノムにおける挿入部位内への本明細書に開示される組換え核酸の挿入を介して編集することと、
を含む、方法が、本明細書で提供される。

【0149】

いくつかの実施形態において、非ウイルス的に導入することは、エレクトロポレーションを含む。

【0150】

いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼドメインは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ）、任意にＣａｓ９ヌクレアーゼを含む。

【0151】

いくつかの実施形態において、細胞のゲノムの標的領域は、Ｔ細胞受容体アルファ定常（ＴＲＡＣ）遺伝子座またはゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）遺伝子座である。

【0152】

いくつかの実施形態において、ＧＳＨ遺伝子座は、ＧＳ９４遺伝子座である。

【0153】

いくつかの実施形態において、組換え核酸は、二本鎖組換え核酸または一本鎖組換え核酸である。

【0154】

いくつかの実施形態において、組換え核酸は、直鎖組換え核酸または環状組換え核酸であり、任意選択で、環状組換え核酸は、プラスミドである。

【0155】

いくつかの実施形態において、免疫細胞は、初代ヒト免疫細胞である。

【0156】

いくつかの実施形態において、免疫細胞は、同種免疫細胞である。

【0157】

いくつかの実施形態において、免疫細胞は、自己免疫細胞である。

【0158】

いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、初代Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体である。

【0159】

いくつかの実施形態において、免疫細胞は、初代Ｔ細胞である。

【0160】

いくつかの実施形態において、免疫細胞は、初代ヒトＴ細胞である。

【0161】

いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ウイルスフリーである。

【0162】

いくつかの実施形態において、方法は、患者から免疫細胞を得ることと、組換え核酸をインビトロで導入することと、を更に含む。

【0163】

一態様において、対象における疾患を治療する方法であって、対象に、本明細書に開示される免疫細胞または本明細書に開示される薬学的組成物を投与することを含む、方法が、本明細書で提供される。

【0164】

いくつかの実施形態において、疾患は、がんである。

【0165】

いくつかの実施形態において、がんは、固形がんまたは液体がんである。

【0166】

いくつかの実施形態において、がんは、卵巣癌、卵管癌、原発性腹膜癌、子宮癌、中皮腫、子宮頸癌または膵癌である。

【0167】

いくつかの実施形態において、免疫細胞の投与は、対象における免疫応答を増強する。

【0168】

いくつかの実施形態において、増強免疫応答は、適応免疫応答である。

【0169】

いくつかの実施形態において、増強免疫応答は、自然免疫応答である。

【0170】

いくつかの実施形態において、増強された免疫応答は、少なくとも１つのサイトカインまたはケモカインの増加した発現である。

【0171】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つのサイトカインまたはケモカインは、ＩＬ－２またはＩＦＮγである。

【0172】

いくつかの実施形態において、方法は、対象に、免疫療法を、免疫細胞と同時にまたは免疫細胞後に投与することを更に含む。

【0173】

一態様において、対象における標的細胞を阻害する方法であって、方法が、対象に、本明細書に開示される免疫細胞を投与することを含み、免疫細胞が、標的細胞を阻害する、方法が、本明細書で提供される。

【0174】

いくつかの実施形態において、標的細胞は、ＡＬＰＧ／Ｐ及びＭＳＬＮを発現する。

【0175】

いくつかの実施形態において、標的細胞は、がん細胞である。

【0176】

一態様において、免疫細胞においてキメラ抗原受容体の発現をプライミング受容体で誘導する方法であって、免疫細胞を得ることであって、免疫細胞が、本明細書に開示される組換え核酸及び／または本明細書に開示されるベクターを含む、得ることと、免疫細胞を、ＡＬＰＧ／Ｐ及びＭＳＬＮを発現する標的細胞と接触させることであって、標的細胞上のＡＬＰＧ／Ｐへのプライミング受容体の結合が、プライミング受容体の活性化及びキメラ抗原受容体の発現を誘導する、接触させることと、を含む、方法が、本明細書で提供される。

【0177】

一態様において、免疫細胞の活性を調節する方法であって、免疫細胞を得ることであって、免疫細胞が、本明細書に開示される組換え核酸及び／または本明細書に開示されるベクターを含む、得ることと、免疫細胞を、ＡＬＰＧ／Ｐ及びＭＳＬＮを発現する標的細胞と接触させることであって、標的細胞上のＡＬＰＧ／Ｐへのプライミング受容体の結合が、プライミング受容体の活性化及びキメラ抗原受容体の発現を誘導し、標的細胞上のＭＳＬＮへのキメラ抗原受容体の結合が、免疫細胞の活性を調節する、接触させることと、を含む、方法が本明細書で提供される。

【0178】

いくつかの実施形態において、免疫細胞活性の調節は、免疫応答を増強することを含む。

【0179】

いくつかの実施形態において、増強免疫応答は、適応免疫応答である。

【0180】

いくつかの実施形態において、増強免疫応答は、自然免疫応答である。

【0181】

いくつかの実施形態において、免疫細胞活性は、少なくとも１つのサイトカインまたはケモカインの増加した発現である。

【0182】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つのサイトカインまたはケモカインは、ＩＬ－２またはＩＦＮγである。

【0183】

いくつかの実施形態において、免疫細胞におけるＦＡＳの発現は、第１の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減される。

【0184】

いくつかの実施形態において、免疫細胞におけるＰＴＰＮ２の発現は、第２の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減される。

【0185】

いくつかの実施形態において、免疫細胞におけるＴＯＸの発現は、第２の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減される。

【0186】

いくつかの実施形態において、免疫細胞におけるＦＡＳ、ＰＴＰＮ２及び／またはＴＯＸの発現は、核酸アッセイまたはタンパク質アッセイによって決定される。

【0187】

いくつかの実施形態において、核酸アッセイは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、ＲＴ－ｑＰＣＲ、マイクロアレイ、遺伝子アレイまたはＲＮＡｓｅｑのうちの少なくとも１つを含む。

【0188】

いくつかの実施形態において、タンパク質アッセイは、イムノブロッティング、蛍光活性化細胞選別、フローサイトメトリー、磁気活性化細胞選別または親和性ベースの細胞分離のうちの少なくとも１つを含む。

【図面の簡単な説明】

【0189】

本発明のこれら及び他の特徴、態様、及び利点は、以下の説明、及び添付の図面に関してよりよく理解されるであろう。

【0190】

【図1】Ｔ細胞活性化アッセイでの論理ゲート発現の概略図を示す。

【0191】

【図2】両方の論理ゲート（ＬＧ１及びＬＧ３）を発現するＴ細胞が、プライミング抗原刺激の非存在下かつＴ細胞活性化刺激の存在下で、プライミング受容体発現を示したが、最小のＣＡＲ発現を示したことを示すフローサイトメトリーデータを提供する。

【0192】

【図3】Ａは、細胞毒性が、ＲＮＰのみの陰性対照Ｔ細胞から観察されなかったことを示す。Ｂは、単一抗原陽性Ｋ５６２－ＡＬＰＧ細胞に対する最小の論理ゲート発現Ｔ細胞活性を示す。Ｃは、単一抗原陽性Ｋ５６２－ＭＳＬＮに対する論理ゲート発現Ｔ細胞活性がないこと示す。Ｄは、論理ゲート発現Ｔ細胞における腫瘍特異的活性を示す。

【0193】

【図4】論理ゲート１ Ｔ細胞が、論理ゲート３ Ｔ細胞に対してより迅速かつより完全なＫ５６２－ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ標的細胞死滅の両方を示したことを示す。

【0194】

【図5】Ａは、Ｋ５６２細胞株とのインキュベーション後の、論理ゲート発現Ｔ細胞（ＬＧ１及びＬＧ３）、ＣＡＲ発現Ｔ細胞または陰性対照細胞によるサイトカイン産生を示す。Ｂは、Ｋ５６２^ＭＳＬＮ細胞株とのインキュベーション後の、論理ゲート発現Ｔ細胞（ＬＧ１及びＬＧ３）、ＣＡＲ発現Ｔ細胞または陰性対照細胞によるサイトカイン産生を示す。Ｃは、Ｋ５６２^ＡＬＰＧ細胞株とのインキュベーション後の、論理ゲート発現Ｔ細胞（ＬＧ１及びＬＧ３）、ＣＡＲ発現Ｔ細胞または陰性対照細胞によるサイトカイン産生を示す。Ｄは、Ｋ５６２^{ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ}細胞株とのインキュベーション後の、論理ゲート発現Ｔ細胞（ＬＧ１及びＬＧ３）、ＣＡＲ発現Ｔ細胞または陰性対照細胞によるサイトカイン産生を示す。

【0195】

【図6】Ａは、ＡｓＰＣ－１細胞、Ｋ５６２^{ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ}細胞及びＫ５６２－ＥＦＧ細胞におけるＡＬＰＧ発現を示す。Ｂは、ＡｓＰＣ－１細胞及び原発性卵巣癌腫瘍におけるＡＬＰＧ ＩＨＣ染色を示す。

【0196】

【図7】Ａは、ＡｓＰＣ－１細胞、Ｋ５６２^{ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ}細胞及びＫ５６２－ＥＦＧ細胞におけるＭＳＬＮ発現を示す。Ｂは、ＡｓＰＣ－１細胞及び原発性卵巣癌腫瘍におけるＡＬＰＧ ＩＨＣ染色を示す。

【0197】

【図8】Ａは、Ｋ５６２^ＡＬＰＧ低及び高発現細胞におけるＡＬＰＧ発現を示す。Ｂは、Ｋ５６２^ＡＬＰＧ低及び高発現細胞、ＡｓＰＣ－１細胞、ならびにＫ５６２－ＥＦＧ細胞におけるＡＬＰＧ発現を示す。Ｃは、Ｋ５６２^ＡＬＰＧ低及び高発現細胞とのインキュベーション前及び後の操作されたＴ細胞上のプライミング受容体及びＣＡＲ発現を示す。

【0198】

【図9】Ａは、ＳＫＯＶ３－ＥＦＧ細胞、Ｋ５６２^{ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ}細胞及びＫ５６２ ＥＦＧ細胞におけるＡＬＰＧ発現を示す。Ｂは、ＳＫＯＶ３－ＷＴ細胞、Ｋ５６２^{ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ}細胞及びＫ５６２ ＥＦＧ細胞におけるＭＳＬＮ発現を示す。Ｃは、示されるＬＧまたはＣＡＲを発現するＴ細胞をＳＫＯＶ３－ＥＦＧ細胞とともにインキュベートした後のＩＬ－２サイトカイン産生を示す。Ｄは、示されるＬＧまたはＣＡＲを発現するＴ細胞をＳＫＯＶ３－ＥＦＧ細胞とともにインキュベートした後のＩＦＮγサイトカイン産生を示す。

【0199】

【図10】Ａは、卵巣癌試料上のＡＬＰＧ発現を示す。Ｂは、卵巣癌試料上のＭＳＬＮ発現を示す。Ｃは、パーセント標的細胞死滅、及び示される論理ゲートまたはＣＡＲを発現するＴ細胞とともにインキュベートされたＡＬＰＧ陰性細胞の漸増パーセンテージについての用量アッセイを示す。

【0200】

【図11】Ａは、論理ゲート発現Ｔ細胞またはＣＡＲ発現Ｔ細胞を、ＣＡ１２５の存在下で、標的細胞とともにインキュベートした後のＩＬ－２サイトカイン産生を示す。Ｂは、論理ゲート発現Ｔ細胞またはＣＡＲ発現Ｔ細胞を、ＭＳＬＮの存在下で、標的細胞とともにインキュベートした後のＩＬ－２サイトカイン産生を示す。

【0201】

【図12】Ａは、構成的ＣＡＲでの治療後の、健常な中皮膜をモデル化するＫ５６２^ＭＳＬＮ腫瘍におけるＫ５６２デュアル側腹部モデルにおける腫瘍体積を示す。Ｂは、構成的ＣＡＲでの治療後の、オンターゲット腫瘍をモデル化するＫ５６２^{ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ}腫瘍における腫瘍体積を示す。Ｃは、論理ゲート１ Ｔ細胞での治療後のＫ５６２^ＭＳＬＮ腫瘍における腫瘍体積を示す。Ｄは、論理ゲート１ Ｔ細胞での治療後のＫ５６２^{ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ}腫瘍における腫瘍体積を示す。Ｅは、論理ゲート３ Ｔ細胞での治療後のＫ５６２^ＭＳＬＮ腫瘍における腫瘍体積を示す。Ｆは、論理ゲート３ Ｔ細胞での治療後のＫ５６２^{ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ}腫瘍における腫瘍体積を示す。各々の図において、下の線は、示されるＴ細胞での治療後の腫瘍体積を示し、上の線は、対照Ｔ細胞での治療後の腫瘍体積を示す。

【0202】

【図13】Ａは、示される操作されたＴ細胞の低用量での治療後のＭＳＴＯモデルにおける腫瘍体積を示す。Ｂは、示される操作されたＴ細胞の中「ストレス」用量での治療後の腫瘍体積を示す。Ａは、示される操作されたＴ細胞の高用量での治療後の腫瘍体積を示す。Ｄは、示されるＴ細胞での治療後の血液試料中のＴ細胞増殖を示す。

【0203】

【図14】Ａは、対照Ｔ細胞での治療後の末梢血中で見出されたＴ細胞のフロー分析を示す。Ｂは、中用量のＣＡＲ１発現Ｔ細胞での治療後の末梢血中で見出されたＴ細胞のフロー分析を示す。Ｃは、中用量のＬＧ１発現Ｔ細胞での治療後の末梢血中で見出されたＴ細胞のフロー分析を示す。Ｄは、高用量のＬＧ１発現Ｔ細胞、ＣＡＲ発現Ｔ細胞または陰性対照細胞での治療後の末梢血中で見出されたＴ細胞のフロー分析を示す。

【0204】

【図15】Ａは、９日間の増殖後の、示されるｓｈＲＮＡを有する編集された細胞のパーセントを示す。Ｂは、９日間の増殖後の、示されるｓｈＲＮＡを有する編集された全細胞を示す。

【0205】

【図16】組み合わせで使用されたときの、両方の示される遺伝子の標的遺伝子ノックダウンを示す。

【0206】

【図17】Ａは、ＦＡＳ、ＰＴＰＮ２及びＴＯＸを標的とするｓｈＲＮＡモジュールが、ＦＡＳの安定したノックダウンを、静止条件下で、編集後少なくとも７週間提供することを示す。Ｂは、ＦＡＳ、ＰＴＰＮ２及びＮＲ４Ａ１タンパク質レベルがまた、編集の６日後に有意に低減されたことを示す。

【0207】

【図18】Ｔ細胞における標的遺伝子ノックダウンが、慢性刺激にわたって維持されたことを示す。

【0208】

【図19】Ａは、ｓｈＲＮＡからの、細胞における強いＦＡＳノックダウンがあったことを示す。Ｂは、抗ＦＡＳ活性化抗体での２４時間の治療後の対照ｓｈＲＮＡのみを有するＴ細胞に正規化された場合、ＦＡＳノックダウンを有するＴ細胞が、８０％超の生存率を保持したことを示す。

【0209】

【図20】組み合わせｓｈＲＮＡモジュールで操作されたＴ細胞が、形質転換の増加したリスクの証拠を示さなかったことを示す。

【0210】

【図21】組み合わせｓｈＲＮＡモジュールで操作されたＴ細胞は、標的抗原発現Ｋ５６２細胞株での４８時間のルシフェラーゼアッセイにわたって、低減された細胞毒性活性の証拠を示さなかったことを示す。

【0211】

【図22】ｓｈＲＮＡノックダウンモジュールで操作されたＴ細胞が、標的抗原発現ＭＳＴＯ細胞株での４８時間のＩｎｃｕｃｙｔｅアッセイにわたって、低減された細胞毒性活性の証拠を示さなかったことを示す。

【0212】

【図23】示される標的のｓｈＲＮＡノックダウン後の慢性抗原刺激中の累積Ｔ細胞増殖を示す。

【0213】

【図24】Ａは、ＰＴＰＮ２を標的とするｓｈＲＮＡモジュールで操作されたＴ細胞が、慢性抗原刺激後に、細胞周期シグネチャを示したことを示す。Ｂは、ＰＴＰＮ２を標的とするｓｈＲＮＡモジュールで操作されたＴ細胞が、慢性抗原刺激後に、細胞周期シグネチャを示したことを示す。

【0214】

【図25】示される標的のｓｈＲＮＡノックダウン後のＴ細胞におけるインターフェロンガンマ発現を示す。

【0215】

【図26】Ａは、ＰＴＰＮ２を標的とするｓｈＲＮＡモジュールで操作されたＴ細胞が、慢性抗原刺激後に、エフェクターシグネチャを保持したことを示す。Ｂは、ＰＴＰＮ２を標的とするｓｈＲＮＡモジュールで操作されたＴ細胞が、慢性抗原刺激後に、エフェクターシグネチャを保持したことを示す。

【0216】

【図27】示される標的のｓｈＲＮＡノックダウン後の、操作されたＴ細胞集団におけるＣＤ４またはＣＤ８％Ｔ細胞パーセンテージ、及びＴエフェクター細胞（Ｔｅ）、Ｔエフェクターメモリー細胞（Ｔｅｍ）、Ｔセントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）またはメモリー幹Ｔ細胞（Ｔｓｃｍ）の相対的量を示す。

【0217】

【図28】Ａは、示されるＣＡＲ Ｔ細胞または対照Ｔ細胞での治療後のマウスにおける腫瘍成長を示す。Ｂは、示されるＣＡＲ Ｔ細胞または対照Ｔ細胞での治療後の末梢血中のＴ細胞増殖を示す。

【0218】

【図29】示される量のＣＡＲ Ｔ細胞または対照Ｔ細胞での治療後のマウスにおける腫瘍成長後の腫瘍体積を示す。

【0219】

【図30】Ａは、示される標的のｓｈＲＮＡノックダウンを有するＴ細胞での治療後の編集されたＣＤ８ Ｔ細胞集団におけるＴ細胞の型の定量化を示す。Ｂは、示される標的のｓｈＲＮＡノックダウンを有するＴ細胞での治療後のマウス腫瘍または脾臓における編集されたＴ細胞の数を示す。

【0220】

【図31】示される標的のｓｈＲＮＡノックダウンを有するＴ細胞での治療後のマウス体重を示す。

【0221】

【図32】論理ゲート及びＦＡＳ／ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡを発現するＴ細胞とのインキュベーション後の、ＭＳＬＮ、またはＡＬＰＧ及びＭＳＬＮを発現する標的細胞の溶解を示す。

【0222】

【図33】ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ論理ゲート及びＦＡＳ／ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡを発現するＴ細胞における相対的ＦＡＳ発現を、ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ論理ゲートを単独で発現する対照細胞と比較して示す。

【0223】

【図34】Ａは、ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ論理ゲート及びＦＡＳ／ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡを発現するドナー２からのＴ細胞での治療後のインビボでの腫瘍体積を、ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ論理ゲートを単独で発現する対照Ｔ細胞と比較して示す。Ｂは、ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ論理ゲート及びＦＡＳ／ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡを発現するドナー３からのＴ細胞での治療後のインビボでの腫瘍体積を、ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ論理ゲートを単独で発現する対照Ｔ細胞と比較して示す。

【0224】

【図35】Ａは、ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ論理ゲート、及びＦＡＳ／ＰＴＰＮ２またはＦＡＳ／ＴＯＸ ｓｈＲＮＡを発現するドナー２からのＴ細胞での治療後のインビボでの腫瘍体積を、対照Ｔ細胞（ＲＮＰ）と比較して示す。Ｂは、ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ論理ゲート、及びＦＡＳ／ＰＴＰＮ２またはＦＡＳ／ＴＯＸ ｓｈＲＮＡを発現するドナー３からのＴ細胞での治療後のインビボでの腫瘍体積を、対照Ｔ細胞（ＲＮＰ）と比較して示す。

【0225】

【図36A】ｓｈＲＮＡノックダウン後のＦＡＳ ｍＲＮＡレベルを示す。

【図36B】ｓｈＲＮＡノックダウン後のＰＴＰＮ２ ｍＲＮＡレベルを示す。

【図36C】ｓｈＲＮＡノックダウン後のＴＯＸ ｍＲＮＡレベルを示す。

【図36D】ｓｈＲＮＡノックダウン後のＺＣ３Ｈ１２Ａ ｍＲＮＡレベルを示す。

【0226】

【図37】ｓｈＲＮＡノックダウン後のＦＡＳタンパク質レベルを示す。

【0227】

【図38】ＦＡＳをノックアウトすることが、細胞増殖及びエフェクター機能を改善したことを示す。

【0228】

【図39】Ａは、ノックダウンシステムの図及び例示的なｓｈＲＮＡ－ＣＡＲデュアル構築物の図を提供する。Ｂは、ｓｈＲＮＡを使用する、ＦＡＳ及び追加の標的の堅牢なデュアルノックダウン（５０％超）を示す。

【0229】

【図40】Ａは、例示的な対照及びｓｈＦＡＳシステムの図を提供する。Ｂは、ＦＡＳノックダウンが、ＦＡＳ媒介性アポトーシスからの２倍超改善された保護を提供したことを示す。

【0230】

【図41】ＦＡＳと追加の遺伝子とのデュアルノックダウンが、全身ＮＡＬＭ６モデルにおけるＣＡＲ Ｔ細胞（ＴＲＡＣ遺伝子座内にノックインされたＣＤ１９－４１ＢＢＺ）のインビボ有効性を増強したことを示す。

【0231】

【図42A】例示的な完全ｓｈＲＮＡ及び論理ゲート構築物の概略図を提供する。

【図42B】同様の導入遺伝子ノックイン効率が、構築物の各々で観察されたことを示す。

【図42C】プライミング受容体（ＰｒｉｍｅＲ）を発現するＴ細胞が、ＣＡＲ発現をＡＬＰＧ＋標的細胞への曝露の際にゲートする論理ゲートの機能に起因して、最小のＣＡＲ発現を有したことを示す。

【図42D】全ての操作されたＴ細胞についてのＫＩ＋集団（またはレンチウイルス集団について形質導入されたもの）、ＲＮＰについてのバルクＴ細胞集団及び形質導入されていない（ＵＮＴ）細胞のＣＤ４／ＣＤ８組成を示す。

【0232】

【図43】ＬＧ１及びＦＡＳ／ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡ回路のメモリー表現型決定を示す。

【0233】

【図44】Ａは、ＦＡＳのｓｈＲＮＡノックダウンを示す。Ｂは、ＰＴＰＮ２のｓｈＲＮＡノックダウンを示す。

【0234】

【図45】ＡＢ－１０１３、ＡＢ－１０１４及びＡＢ－１０１５が、ＡＬＰＧ依存性ＣＡＲ発現を誘導したことを示す。

【0235】

【図46】ＡＢ－１０１３、ＡＢ－１０１４及びＡＢ－１０１５が、プライミング抗原不均一標的細胞集団を死滅させたことを示す。

【0236】

【図47】Ａは、ＣＡＲのみのＴ細胞が、Ｋ５２６^ＭＳＬＮ腫瘍細胞の成長を阻害したことを示す。Ｂは、ＣＡＲのみのＴ細胞が、Ｋ５２６^{ＭＳＬＮ／ＡＬＰＧ}腫瘍細胞の成長を阻害したことを示す。Ｃは、ＡＢ－１０１３、ＡＢ－１０１４及びＡＢ－１０１５ ｓｈＲＮＡ＋論理ゲート回路Ｔ細胞が、Ｋ５２６^ＭＳＬＮ腫瘍細胞の成長を阻害しなかったことを示す。Ｄは、ＡＢ－１０１３、ＡＢ－１０１４及びＡＢ－１０１５ ｓｈＲＮＡ＋論理ゲート回路Ｔ細胞が、Ｋ５２６^{ＭＳＬＮ／ＡＬＧＰ}腫瘍細胞の成長を阻害したことを示す。

【0237】

【図48】ＬＧ１のみを発現する細胞（ＡＢ－Ｘ論理ゲート）が、ＳＳ１－ＣＡＲよりも良好な腫瘍制御を示し、ＴＣ－２１０と同等の腫瘍制御を示したことを示す。

【0238】

【図49】３つのｓｈＲＮＡ＋ＬＧ１回路Ｔ細胞（ＡＢ－１０１３、ＡＢ－１０１４及びＡＢ－１０１５）が、連続刺激アッセイにおいて、ＬＧ１ Ｔ細胞と比較して改善されたＴ細胞増殖及び腫瘍制御（例えば、より少ない腫瘍増殖）を示したことを示す。

【0239】

【図50A】構成的抗ＭＳＬＮ ＣＡＲを発現するＴ細胞が、Ｋ５６２^ＭＳＬＮ及びＫ５６２^{ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ}細胞の両方を死滅させ、ｓｈＲＮＡ＋論理ゲートＴ細胞（ＡＢ－１０１３、ＡＢ－１０１４及びＡＢ－１０１５）からの細胞毒性が、デュアル抗原Ｋ５６２^{ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ}細胞にのみ特異的であったことを示す。図５０Ｂは、論理ゲート／ｓｈＲＮＡ回路Ｔ細胞からのＩＦＮγ産生が、デュアル抗原Ｋ５６２^{ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ}標的細胞を有する試料に制限されたことを示す。

【図50B】論理ゲート／ｓｈＲＮＡ回路Ｔ細胞からのＩＦＮγ産生が、デュアル抗原Ｋ５６２^{ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ}標的細胞を有する試料に制限されたことを示す。

【0240】

【図51】ＡＢ－１０１５が、ＡＢ－１０１３及びＡＢ－１０１４と比較して、Ｋ５６２^ＭＳＬＮ細胞におけるＡＬＰＧ非依存性死滅活性における中程度の増加及び増加したＩＦＮγ発現に関連したことを示す。

【0241】

【図52】全ての３つのｓｈＲＮＡ＋論理ゲート回路Ｔ細胞が、標的死滅を誘導したことを示す。

【0242】

【図53】細胞形質転換が、３つのｓｈＲＮＡ＋ＬＧ１回路（ＡＢ－１０１３、ＡＢ－１０１４またはＡＢ－１０１５）で編集されたＴ細胞において観察されなかったことを示す。

【0243】

【図54】Ａは、ＭＳＬＮ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＳＬＣ２Ａ９＋細胞（ＴＨＰ－１細胞）を認識しなかったことを示す。Ｂは、ＭＳＬＮ ＣＡＲ Ｔ細胞が、Ｋ５６２陰性対照細胞を認識しなかったことを示す。Ｃは、ＭＳＬＮ ＣＡＲ Ｔ細胞が、陽性対照ＭＳＬＮ発現細胞に結合したことを示す。Ｄは、ＭＳＬＮ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＧＰ２＋細胞を認識しなかったことを示す。

【0244】

【図55】多反応性の証拠が、Ａ４９８細胞またはＨ１９７５細胞に対して、ＭＳＬＮ ＣＡＲ細胞で観察されなかったことを示す。

【0245】

【図56】Ａは、移植の５日後のマウス群のランダム化を示す。Ｂは、ＡＢ－１０１５ Ｔ細胞が、インビボ卵巣癌モデルにおける腫瘍体積を低減したことを示す。Ｃは、ＡＢ－１０１５ Ｔ細胞での治療後の、腫瘍移植後のマウス重量を示す。ＡＢ－１０１５ Ｔ細胞での治療は、体重減少をもたらさなかった。

【発明を実施するための形態】

【0246】

定義
特許請求の範囲及び明細書で使用される用語は、特に明記しない限り、以下に示されるように定義される。

【0247】

本明細書で使用される場合、「遺伝子」という用語は、特定のタンパク質またはタンパク質のセグメントをコードする染色体に沿って配置されたＤＮＡのセグメントからなる、遺伝の基本単位を指す。遺伝子は、典型的には、プロモーター、５’非翻訳領域、１つ以上のコード配列（エクソン）、任意選択でイントロン、及び３’非翻訳領域を含む。遺伝子は、ターミネーター、エンハンサー及び／またはサイレンサーを更に含んでもよい。

【0248】

本明細書で使用される場合、「遺伝子座」という用語は、遺伝子または遺伝子マーカーが位置する染色体上の特定の固定された物理的位置を指す。

【0249】

「セーフハーバー遺伝子座」という用語は、隣接する遺伝子の発現または調節を中断することなく、遺伝子または遺伝子エレメントが組み込まれ得る遺伝子座を指す。これらのセーフハーバー遺伝子座はまた、セーフハーバー部位（ＳＨＳ）またはゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）部位と称される。本明細書で使用される場合、セーフハーバー遺伝子座は、本明細書で定義される導入遺伝子をコードする配列が挿入され得る「組込み部位」または「ノックイン部位」を指す。いくつかの実施形態において、挿入は、組込み部位に位置する配列の置換を伴って生じる。いくつかの実施形態において、挿入は、組込み部位での配列の置換なしに生じる。企図される組込み部位の例を表Ｄに提供する。

【0250】

本明細書で使用される場合、「挿入」という用語は、標的遺伝子座またはセーフハーバー部位に組み込まれた（挿入された）ヌクレオチド配列を指す。挿入物は、例えば、相同性指向修復（ＨＤＲ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集または当業者に既知のゲノム領域にヌクレオチド配列を挿入するための他の方法を使用して、標的遺伝子座またはセーフハーバー部位に組み込まれる遺伝子または遺伝子エレメントを指すために使用することができる。

【0251】

「挿入」という用語は、非天然配列を導入するためのヌクレオチド配列の操作を指す。これは、例えば、制限酵素及びリガーゼを使用することによって行われ、それによって、通常は目的の遺伝子をコードする目的のＤＮＡ配列は、互換性のあるオーバーラップを作成するために両方の分子を適切な制限酵素で消化し、次いでリガーゼを使用して分子を一緒に接合することによって、別の核酸分子に組み込まれ得る。当業者は、そのような操作に非常に精通しており、実施例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ“，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）に見出すことができ、これは、参照により任意の図、図面及び表を含むその全体が本明細書に組み込まれる。

【0252】

「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」系は、外来核酸に対する防御のための広範なクラスの細菌系を指す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、幅広い真菌及び古細菌生物に見出される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系には、Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型サブタイプが含まれる。野生型ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、外来核酸を認識及び切断するために、ガイド及び活性化ＲＮＡとの複合体中のＲＮＡ媒介ヌクレアーゼ、Ｃａｓ９を利用する。ガイドＲＮＡ及び活性化ＲＮＡの両方の活性を有するガイドＲＮＡもまた、当該技術分野で知られている。いくつかの場合において、そのような二重活性ガイドＲＮＡは、小ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と称される。

【0253】

Ｃａｓ９相同体は、以下の分類群の細菌を含むがこれらに限定されない、多種多様な真菌に見出される：アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、アクウィフェクス門（Ａｑｕｉｆｉｃａｅ）、バクテロイデス門／クロロビウム門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ－Ｃｈｌｏｒｏｂｉ）、クラミジア門／ベルコミクロビウム門（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ－Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）、クロロフレクサス門（Ｃｈｌｒｏｆｌｅｘｉ）、シアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、スピロヘータ門（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ）、及びテルモトガ門（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ）。例示的なＣａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質である。追加のＣａｓ９タンパク質及びその相同体は、例えば、Ｃｈｙｌｉｎｋｓｉ，ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．２０１３ Ｍａｙ １；１０（５）：７２６－７３７、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１１ Ｊｕｎｅ；９（６）：４６７－４７７、Ｈｏｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１３ Ｓｅｐ ２４；１１０（３９）：１５６４４－９、Ｓａｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１３ Ｍａｙ ９；４９７（７４４８）：２５４－７、及びＪｉｎｅｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２ Ａｕｇ １７；３３７（６０９６）：８１６－２１に記載されている。Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインは、宿主細胞における効率的な活性または強化された安定性のために最適化することができる。

【0254】

本明細書で使用される場合、「Ｃａｓ９」という用語は、ＲＮＡ媒介性ヌクレアーゼ（例えば、細菌もしくは古細菌起源の、またはそれに由来する）を指す。例示的なＲＮＡ媒介ヌクレアーゼには、前述のＣａｓ９タンパク質及びその相同体が含まれ、ＣＰＦ１が含まれるが、これに限定されない（例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ １６３，Ｉｓｓｕｅ ３，ｐ７５９－７７１，２２ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１５を参照されたい）。同様に、本明細書で使用される場合、「Ｃａｓ９リボ核タンパク質」複合体等という用語は、Ｃａｓ９タンパク質とｃｒＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡまたは小ガイドＲＮＡ）、Ｃａｓ９タンパク質とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、Ｃａｓ９タンパク質と小ガイドＲＮＡとの間の複合体、またはそれらの組み合わせ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びｃｒＲＮＡガイドＲＮＡを含有する複合体）を指す。

【0255】

本明細書で使用される場合、「免疫細胞」という語句は、免疫細胞を生じさせることができる全ての細胞型を含み、免疫細胞は、造血細胞、例えば、造血幹細胞、多能性幹細胞及び誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｂ細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ヒト多能性幹細胞（ＨＳＰＣ）、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞もしくは樹状細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、先天性免疫細胞である。

【0256】

本明細書で使用される場合、初代細胞または初代幹細胞の文脈における「初代」という用語は、形質転換または不死化されていない細胞を指す。そのような初代細胞は、限られた回数で培養、継代培養、または継代する（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０回培養する）ことができる。いくつかの場合において、初代細胞は、インビトロ培養条件に適合される。いくつかの場合において、初代細胞は、生物、系、器官、または組織から単離され、任意選択で選別され、例えば、培養または継代培養なしに直接利用される。いくつかの場合において、初代細胞は、刺激され、活性化され、または分化される。例えば、初代Ｔ細胞は、ＣＤ３、ＣＤ２８アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、またはそれらの組み合わせとの接触（例えば、その存在下で培養すること）によって活性化することができる。

【0257】

本明細書で使用される場合、「Ｔリンパ球」及び「Ｔ細胞」という用語は、交換可能に使用され、胸腺での成熟を完了し、体内のある特定の外来抗原を同定した細胞を指す。これらの用語はまた、他の免疫細胞の活性化及び不活性化を含む、免疫系において様々な役割を有する主要な白血球型を指す。Ｔ細胞は、培養Ｔ細胞、例えば、初代Ｔ細胞、または培養Ｔ細胞株由来のＴ細胞、例えば、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１等、または哺乳動物由来のＴ細胞などの任意のＴ細胞であり得る。Ｔ細胞としては、ナイーブＴ細胞、刺激Ｔ細胞、初代Ｔ細胞（例えば、培養されていない）、培養Ｔ細胞、不死化Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞毒性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、調節Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、それらの組み合わせ、またはそれらの亜集団が挙げられるが、これらに限定されない。Ｔ細胞は、ＣＤ３＋細胞であり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋、またはＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋であり得る。Ｔ細胞は、任意のタイプのＴ細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（例えば、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞毒性Ｔ細胞）、末梢性であり得、血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、末梢血白血球（ＰＢＬ）、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、制御性Ｔ細胞、γδＴ細胞等を含むが、これらに限定されない。それは、発達の任意の段階において、任意のＴ細胞であり得る。追加のタイプのヘルパーＴ細胞には、Ｔｈ３（Ｔｒｅｇ）細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ９細胞、またはＴｆｈ細胞が含まれる。追加のタイプのメモリーＴ細胞には、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ細胞）、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｍ細胞及びＴＥＭＲＡ細胞）などの細胞が含まれる。Ｔ細胞はまた、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように修飾されたＴ細胞などの遺伝子修飾Ｔ細胞を指し得る。Ｔ細胞は、幹細胞または前駆細胞から分化することもできる。

【0258】

「ＣＤ４＋Ｔ細胞」は、表面上でＣＤ４を発現し、細胞免疫応答に関連するＴ細胞のサブセットを指す。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２、ＩＬ－４及びＩＬ－１０などのサイトカインの分泌を含むことができる、刺激後分泌プロファイルを特徴とする。「ＣＤ４」は、本来Ｔリンパ球上の分化抗原として定義される５５ｋＤ糖タンパク質であるが、単球／マクロファージを含む他の細胞上にも見出された。ＣＤ４抗原は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、ＭＨＣ（主要組織適合性複合体）クラスＩＩ制限免疫応答における連想認識エレメントとして示唆されている。Ｔリンパ球上で、ＣＤ４抗原は、ヘルパー／誘導因子サブセットを定義する。

【0259】

「ＣＤ８＋Ｔ細胞」は、それらの表面上でＣＤ８を発現し、ＭＨＣクラスＩ制限され、細胞毒性Ｔ細胞として機能するＴ細胞のサブセットを指す。「ＣＤ８」分子は、胸腺細胞上、ならびに細胞毒性及び抑制性Ｔリンパ球上に存在する分化抗原である。ＣＤ８抗原は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、主要な組織適合性複合体クラスＩ制限相互作用における連想認識エレメントである。

【0260】

本明細書で使用される場合、「造血幹細胞」という語句は、血液細胞を生じさせることができる幹細胞のタイプを指す。造血幹細胞は、骨髄系もしくはリンパ系の細胞、またはそれらの組み合わせを生じさせることができる。造血幹細胞は主に骨髄に見出されるが、それらは末梢血、またはその画分から単離され得る。様々な細胞表面マーカーを使用して、造血幹細胞を同定、選別、または精製することができる。いくつかの場合において、造血幹細胞は、ｃ－ｋｉｔ^＋及びｌｉｎ^－として同定される。いくつかの場合において、ヒト造血幹細胞は、ＣＤ３４^＋、ＣＤ５９^＋、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０^＋、ＣＤ３８^ｌｏ／－、Ｃ－ｋｉｔ／ＣＤ１１７^＋、ｌｉｎ^－として同定される。いくつかの場合において、ヒト造血幹細胞は、ＣＤ３４^－、ＣＤ５９^＋、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０^＋、ＣＤ３８^ｌｏ／－、Ｃ－ｋｉｔ／ＣＤ１１７^＋、ｌｉｎ^－として同定される。いくつかの場合において、ヒト造血幹細胞は、ＣＤ１３３^＋、ＣＤ５９^＋、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０^＋、ＣＤ３８^ｌｏ／－、Ｃ－ｋｉｔ／ＣＤ１１７^＋、ｌｉｎ^－として同定される。いくつかの場合において、マウス造血幹細胞は、ＣＤ３４^ｌｏ／－、ＳＣＡ－１^＋、Ｔｈｙ１^＋／ｌｏ、ＣＤ３８^＋、Ｃ－ｋｉｔ^＋、ｌｉｎ^－として同定される。いくつかの場合において、造血幹細胞は、ＣＤ１５０^＋ＣＤ４８^－ＣＤ２４４^－である。

【0261】

本明細書で使用される場合、「造血細胞」という語句は、造血幹細胞に由来する細胞を指す。造血細胞は、生物、系、器官、または組織（例えば、血液、またはその画分）からの単離によって得られるか、または提供され得る。代替的には、造血幹細胞を単離し、幹細胞を分化させることによって造血細胞を得るか、または提供することができる。造血細胞は、更なる細胞型に分化する可能性が限定された細胞を含む。そのような造血細胞には、多能性前駆細胞、系統制限前駆細胞、一般的な骨髄系前駆細胞、顆粒球－マクロファージ前駆細胞、または巨核球－赤血球系前駆細胞が含まれるが、これらに限定されない。造血細胞には、リンパ球、赤血球、顆粒球、単球、及び血小板などのリンパ系及び骨髄系の細胞が含まれる。

【0262】

本明細書で使用される場合、「コンストラクト」という用語は、巨大分子またはポリヌクレオチドを含む分子の複合体を指す。

【0263】

本明細書で使用される場合、「組込み」という用語は、コンストラクトの１つ以上のヌクレオチドを細胞ゲノムに安定して挿入する、すなわち、細胞の染色体ＤＮＡ内の核酸配列に共有結合するプロセスを指す。それはまた、組込みの部位におけるヌクレオチド欠失を指し得る。挿入部位に欠失がある場合、「組込み」は、１つ以上の挿入されたヌクレオチドで欠失された内因性配列またはヌクレオチドの置換を更に含み得る。

【0264】

本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、宿主細胞に導入され、その細胞に天然ではない分子または活性を指す。この分子は、例えば、コード核酸の宿主遺伝物質への導入によって、例えば、宿主染色体への組込みによって、またはプラスミドなどの非染色体遺伝物質として導入することができる。したがって、コード核酸の発現に関連して使用される場合、この用語は、コード核酸を発現可能な形態で細胞に導入することを指す。「内在性」という用語は、天然の編集されていない条件下で宿主細胞に存在する分子または活性を指す。同様に、この用語は、コード核酸の発現と関連して使用される場合、細胞内に含まれ、外因的に導入されないコード核酸の発現を指す。

【0265】

「異種」という用語は、隣接配列に天然ではない核酸またはポリペプチド配列またはドメインを指し、例えば、異種配列は、一方または両方の末端に生じる核酸またはポリペプチド配列にカップリングされた状態で自然界には見出されない。

【0266】

「相同」という用語は、隣接配列に天然である核酸またはポリペプチド配列またはドメインを指し、例えば、相同配列は、一方または両方の末端に生じる核酸またはポリペプチド配列にカップリングされた状態で自然界に見出される。

【0267】

本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチドドナーコンストラクト」は、遺伝子的にポリヌクレオチドに挿入され、そのポリヌクレオチドに対して外因性であるヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡ配列）を指す。ポリヌクレオチドドナーコンストラクトは、ＲＮＡに転写され、任意選択でポリペプチドに翻訳される。ポリヌクレオチドドナーコンストラクトは、原核配列、真核ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核（例えば、哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列を含むことができる。例えば、ポリヌクレオチドドナーコンストラクトは、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、天然ポリペプチド（すなわち、天然に存在するポリペプチド）もしくはその断片、またはバリアントポリペプチド（例えば、天然ポリペプチドと１００％未満の配列同一性を有する天然ポリペプチド）もしくはその断片であり得る。

【0268】

本明細書で使用される場合、「相補的」または「相補性」という用語は、ヌクレオチドまたは核酸間の特異的塩基対合を指す。相補的ヌクレオチドは、概して、Ａ及びＴ（またはＡ及びＵ）、ならびにＧ及びＣである。本明細書に記載のガイドＲＮＡは、配列、例えば、細胞内のゲノム配列に完全に相補的または実質的に相補的である（例えば、１～４個のミスマッチを有する）ＤＮＡ標的配列を含むことができる。

【0269】

「コードする」という用語は、タンパク質コード配列または非タンパク質コード配列を指す。非タンパク質コード配列は、ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。

【0270】

本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」という用語は、ある生物から別の生物へ自然に、またはいくつかの遺伝子操作技法のいずれかによって移行されたポリヌクレオチドを指す。それは、任意選択でポリペプチドに翻訳される。それは、任意選択で組換えタンパク質に翻訳される。「組換えタンパク質」は、遺伝子（組換えＤＮＡ）によってコードされるタンパク質であり、遺伝子の発現及びメッセンジャーＲＮＡの翻訳をサポートする系においてクローニングされている（発現系を参照されたい）。組換えタンパク質は、治療剤、例えば、本明細書に開示される疾患または障害を治療するタンパク質であり得る。使用される場合、導入遺伝子は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すことができる。

【0271】

「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」は、本明細書において互換的に使用される。

【0272】

本明細書で使用される場合、「動作可能に連結された」または「操作可能に連結された」という用語は、一方の機能が他方の機能によって影響を受けるように、核酸配列が単一の核酸断片に結合することを指す。例えば、プロモーターが、コード配列または機能性ＲＮＡの発現に影響を及ぼすことができる（すなわち、コード配列または機能性ＲＮＡがプロモーターによる転写制御下にある）場合、プロモーターは、それに動作可能に連結される。コード配列は、センス配向及びアンチセンス配向の両方で対照配列に動作可能に連結され得る。

【0273】

本明細書で使用される場合、「発達細胞状態」という用語は、例えば、細胞が不活性であるとき、能動的に発現するとき、分化するとき、老化するとき等を指す。発達細胞状態はまた、前駆体状態（例えば、Ｔ細胞前駆体）の細胞を指し得る。

【0274】

使用される場合、「コードすること」という用語は、目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸の配列を指す。核酸配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡの分子のいずれかであり得る。好ましい実施形態において、分子は、ＤＮＡ分子である。他の好ましい実施形態において、分子は、ＲＮＡ分子である。ＲＮＡ分子として存在する場合、それは、宿主細胞のリボソームに翻訳を開始するように指示する配列（例えば、開始コドン、ＡＴＧ）、及びリボソームに翻訳を終了するように指示する配列（例えば、終止コドン）を含む。開始コドンと終止コドンとの間には、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）がある。そのような用語は、当業者に既知である。

【0275】

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、哺乳動物対象を指す。例示的な対象としては、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ラクダ、ヤギ、ウサギ、ブタ及びヒツジが挙げられる。ある特定の実施形態において、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、本明細書に提供される操作された細胞またはその集団で治療することができる疾患または状態を有する。いくつかの態様において、疾患または状態は、がんである。

【0276】

本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御することができるヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡ配列）を指す。プロモーター配列は、近位及びより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントは、しばしばエンハンサーと称される。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来することができ、自然界に見出される異なるプロモーターからの異なるエレメントで構成され得、及び／または合成ＤＮＡセグメントを含み得る。プロモーターは、本明細書で企図されるように、目的の細胞に対して内在性であり得るか、または目的の細胞に対して外因性であり得る。異なるプロモーターが、異なる組織もしくは細胞型において、または異なる発達段階において、または異なる環境条件に応答して、遺伝子発現を誘導することができることは、当業者によって理解される。当該技術分野で既知であるように、プロモーターは、プロモーターの強度及び／またはプロモーターが活性である条件、例えば、構成的プロモーター、強力なプロモーター、弱いプロモーター、誘導性／抑制可能なプロモーター、組織特異的または発達的に調節されたプロモーター、細胞周期依存性プロモーター等に従って選択することができる。

【0277】

プロモーターは、誘導性プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、エストロゲン受容体調節プロモーター等）であり得る。プロモーターは、構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＵＢＣプロモーター）であり得る。いくつかの実施形態において、プロモーターは、空間的に制限された及び／または時間的に制限されたプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーター等）であり得る。例えば、米国公開第２０１８０１２７７８６号を（その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

【0278】

本明細書で企図されるように、遺伝子編集は、遺伝子（またはヌクレオチド配列）のノックインまたはノックアウトを伴い得る。本明細書で使用される場合、「ノックイン」という用語は、ゲノムへのＤＮＡ配列またはその断片の付加を指す。ノックインされるかかるＤＮＡ配列は、全遺伝子または複数の遺伝子を含んでもよく、遺伝子または前述のいずれかの部分もしくは断片と関連する調節配列を含んでもよい。例えば、組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドドナーコンストラクトは、変異体遺伝子を保有する細胞のゲノムに挿入され得る。いくつかの実施形態において、ノックイン戦略は、提供された配列による既存の配列の置換、例えば、野生型コピーによる変異体対立遺伝子の置換を伴う。他方では、「ノックアウト」という用語は、遺伝子の除去または遺伝子の発現を指す。例えば、遺伝子は、リーディングフレームの破壊につながるヌクレオチド配列の欠失または付加のいずれかによってノックアウトすることができる。別の例として、遺伝子の一部を無関係の（例えば、非コード）配列で置き換えることによって、遺伝子をノックアウトしてもよい。

【0279】

本明細書で使用される場合、「非相同末端接合」またはＮＨＥＪという用語は、相同テンプレート核酸を必要とせずにＤＮＡ鎖の切断末端またはニック末端が直接ライゲーションされる細胞プロセスを指す。ＮＨＥＪは、修復部位での１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換、またはそれらの組み合わせをもたらすことができる。

【0280】

本明細書で使用される場合、「相同性指向修復」またはＨＤＲは、相同テンプレート核酸からの重合によってＤＮＡ鎖の切断末端またはニック末端が修復される細胞プロセスを指す。したがって、元の配列は、テンプレートの配列と置き換えられる。相同テンプレート核酸は、ゲノムの他の場所にある相同配列（姉妹染色分体、相同染色体、または同じもしくは異なる染色体上の反復領域）によって提供され得る。代替的には、外因性テンプレート核酸を導入して、標的部位での配列の特定のＨＤＲ誘導変化を得ることができる。このようにして、特定の変異が切断部位に導入され得る。

【0281】

本明細書で使用される場合、一本鎖ＤＮＡテンプレートまたは二本鎖ＤＮＡテンプレートは、ＨＤＲのテンプレートとして細胞によって使用され得るＤＮＡオリゴヌクレオチドを指す。概して、一本鎖ＤＮＡテンプレートまたは二本鎖ＤＮＡテンプレートは、標的部位に対する相同性の少なくとも１つの領域を有する。いくつかの場合において、一本鎖ＤＮＡテンプレートまたは二本鎖ＤＮＡテンプレートは、標的切断部位に挿入される異種配列を含有する領域に隣接する２つの相同領域を有する。

【0282】

「ベクター」及び「プラスミド」という用語は、互換的に使用され、本明細書で使用される場合、遺伝物質を細胞に導入するのに有用なポリヌクレオチドビヒクルを指す。ベクターは、線形または円形であり得る。ベクターは、宿主細胞の標的ゲノムに組み込むか、または宿主細胞内で独立して複製することができる。ベクターは、例えば、複製起点、マルチクローニング部位、及び／または選択可能マーカーを含むことができる。発現ベクターは、典型的には、発現カセットを含む。ベクター及びプラスミドには、組込みベクター、原核プラスミド、真核プラスミド、植物合成染色体、エピソーム、コスミド、及び人工染色体が含まれるが、これらに限定されない。

【0283】

本明細書で使用される場合、核酸または核酸を含む複合体、例えば、ＲＮＰ－ＤＮＡテンプレート複合体を導入する文脈における「導入する」という語句は、核酸配列またはＲＮＰ－ＤＮＡテンプレート複合体の細胞外から細胞内への転座を指す。いくつかの場合において、導入することは、核酸または複合体の細胞外から細胞の核内への転座を指す。そのような転座の様々な方法が企図され、これには、エレクトロポレーション、ナノワイヤまたはナノチューブとの接触、受容体媒介内在化、細胞透過性ペプチドを介した転座、リポソーム媒介転座等が含まれるが、これらに限定されない。

【0284】

本明細書で使用される場合、「発現カセット」という用語は、宿主細胞における選択されたポリヌクレオチドの発現を容易にするために、選択されたポリヌクレオチドに動作可能に連結された調節配列を含む、組換えまたは合成的に生成されたポリヌクレオチドコンストラクトである。例えば、調節配列は、宿主細胞内での選択されたポリヌクレオチドの転写、または宿主細胞内での選択されたポリヌクレオチドの転写及び翻訳を容易にすることができる。発現カセットは、例えば、宿主細胞のゲノム中に組み込まれるか、または発現ベクター中に存在することができる。

【0285】

本明細書で使用される場合、「それを必要とする対象」という語句は、本明細書に記載の疾患または障害の１つ以上の症状または徴候を呈する、及び／またはそれらと診断される対象を指す。

【0286】

「化学療法剤」は、がんの治療に有用な化学的化合物を指す。化学療法剤としては、がんの増殖を促進することができるホルモンの効果を調節、低減、遮断、または阻害するように作用する「抗ホルモン剤」または「内分泌療法剤」が挙げられる。

【0287】

「組成物」という用語は、例えば、本明細書で企図される操作された細胞またはタンパク質を含有する混合物を指す。いくつかの実施形態において、組成物は、アジュバント、安定剤、賦形剤等の追加の成分を含有し得る。「組成物」または「薬学的組成物」という用語は、その中に含まれる活性成分の生物学的活性が対象の治療に有効であることを可能にするような形態であり、薬学的組成物中に提供される量で対象に許容できないほど毒性のある追加の成分を含まない調製物を指す。

【0288】

「インサイチュ」という用語は、生体から分離して成長する、例えば、組織培養物中で成長する生細胞内で生じるプロセスを指す。

【0289】

「インビボ」という用語は、生体内で発生するプロセスを指す。

【0290】

本明細書で使用される場合、「エクスビボ」という用語は、概して、生体組織内または生体組織上で、好ましくは生物外の人工環境内で行われた実験または測定を含み、好ましくは自然条件との差異が最小限である。

【0291】

本明細書で使用される「哺乳動物」という用語は、ヒト及び非ヒトの両方を含み、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ウマ、及びブタを含むが、これらに限定されない。

【0292】

「同一性」パーセントという用語は、２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈において、以下に記載される配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮまたは当業者に利用可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを使用して、または目視検査によって測定される、最大一致について比較及び整列させたときに同じ特定のパーセンテージのヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有する２つ以上の配列または部分配列を指す。用途に応じて、「同一性」パーセントは、比較されている配列の領域にわたって、例えば、機能ドメインにわたって存在することができるか、または代替的に、比較される２つの配列の全長にわたって存在することができる。

【0293】

配列比較のために、典型的には、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列（複数可）のパーセント配列同一性を計算する。

【0294】

比較のための配列の最適な整列は、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似法の検索によって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実装によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、または目視検査によって実施することができる（概して、以下のＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．を参照されたい）。

【0295】

配列同一性及び配列類似性のパーセントを決定するのに好適なアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これはＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公開されている。

【0296】

「十分な量」という用語は、所望の効果をもたらすのに十分な量、例えば、細胞内のタンパク質凝集を調節するのに十分な量を意味する。

【0297】

「治療的有効量」という用語は、疾患の症状を改善するのに有効な量である。

【0298】

「寛解させる」という用語は、疾患状態、例えば、がん疾患状態の治療におけるいずれかの治療的に有益な結果、その重症度もしくは進行における低下、その緩解、またはその治癒を指す。

【0299】

本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量の化合物（例えば、本明細書に記載の組成物、本明細書に記載の細胞）を指す。有効量は、１つ以上の投与、適用または投与量で投与することができ、特定の製剤または投与経路に限定されることを意図するものではない。

【0300】

本明細書で使用される場合、「治療すること」という用語は、状態、疾患、障害等の改善をもたらすか、またはその症状を改善する任意の効果、例えば、緩和、低減、調節、改善または除去を含む。

【0301】

「調節する」及び「調節」という用語は、列挙された変数を低減もしくは阻害するか、または代替的に、活性化もしくは増加させることを指す。

【0302】

「増加する」及び「活性化する」という用語は、列挙された変数における、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上の増加を指す。

【0303】

「低減する」及び「阻害する」という用語は、列挙された変数における、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上の減少を指す。

【0304】

本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。

【0305】

論理ゲートシステム
本明細書で使用される場合、「論理ゲート」、「回路」、「回路受容体」、「システム」または「システム受容体」とは、プライミング受容体及びキメラ抗原受容体を含む２部タンパク質発現システムを指す。システムは、細胞内に挿入された少なくとも１つの核酸上でコードされ得、プライミング受容体は、細胞において発現される。プライミング受容体の細胞内ドメインは、プライミング受容体がその標的抗原に結合した際に、膜貫通ドメインから切断される。次いで、細胞内ドメインは、細胞核内に転座することが可能であり、細胞核において、細胞内ドメインは、キメラ抗原受容体の発現を誘導する。

【0306】

一態様において、ＡＬＰＧ／Ｐに結合するプライミング受容体と、ＭＳＬＮに結合するキメラ抗原受容体と、を含む、システムであって、プライミング受容体の細胞内ドメインの転写因子が、ＣＡＲの発現を誘導することが可能である、システムが、本明細書で提供される。そのようなシステムは、代替的に、「論理ゲート」または「回路」と称される。いくつかの態様において、システムは、免疫細胞内に挿入された核酸導入遺伝子によってコードされている。システムは、両方の導入遺伝子を含む単一核酸挿入物または断片上にコードされてもよく、またはシステム導入遺伝子を個別にコードする２つの核酸上にコードされてもよい。システムのプライミング受容体及びＣＡＲは、いずれかの順序で単一核酸上に配置され得る。例えば、プライミング受容体は、５’末端にあってもよく、ＣＡＲは、３’末端にあってもよく、またはＣＡＲは、５’末端にあってもよく、プライミング受容体は、３’末端にあってもよい。

【0307】

第１の構成的プロモーターは、プライミング受容体をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結され得る。誘導性プロモーターはまた、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結され得る。第２の構成的プロモーターは、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡと相補的である第１の核酸に動作可能に連結され得る。第３の構成的プロモーターは、配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするかまたは配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡと相補的である第２の核酸に動作可能に連結され得る。

【0308】

いくつかの実施形態において、システムが、両方の導入遺伝子及び核酸（複数可）を含む単一組換え核酸挿入物または断片上にコードされているときに、組換え核酸挿入物は、５’から３’方向に、第１の構成的プロモーター；プライミング受容体をコードするヌクレオチド配列；第２の構成的プロモーター；ヒトＦＡＳ ｍＲＮＡ、ヒトＰＴＰＮ２ ｍＲＮＡまたはヒトＴＯＸ ｍＲＮＡと相補的である第１の核酸をコードするヌクレオチド配列；誘導性プロモーター；及びキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。

【0309】

いくつかの実施形態において、システムが、両方の導入遺伝子及び核酸（複数可）を含む単一組換え核酸挿入物または断片上にコードされているときに、組換え核酸挿入物は、５’から３’方向に、第１の構成的プロモーター；プライミング受容体をコードするヌクレオチド配列；ヒトＦＡＳ ｍＲＮＡ、ヒトＰＴＰＮ２ ｍＲＮＡまたはヒトＴＯＸ ｍＲＮＡと相補的である第１の核酸をコードするヌクレオチド配列；誘導性プロモーター；及びキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。

【0310】

いくつかの実施形態において、システムが、両方の導入遺伝子及び核酸（複数可）を含む単一組換え核酸挿入物または断片上にコードされているときに、組換え核酸挿入物は、５’から３’方向に、第１の構成的プロモーター；プライミング受容体をコードするヌクレオチド配列；ヒトＦＡＳ ｍＲＮＡ、ヒトＰＴＰＮ２ ｍＲＮＡまたはヒトＴＯＸ ｍＲＮＡと相補的である第１の核酸をコードするヌクレオチド配列；ヒトＦＡＳ ｍＲＮＡ、ヒトＰＴＰＮ２ ｍＲＮＡまたはヒトＴＯＸ ｍＲＮＡと相補的である第２の核酸をコードするヌクレオチド配列；誘導性プロモーター；及びキメラ抗原子受容器をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。

【0311】

いくつかの実施形態において、システムが、両方の導入遺伝子及び核酸（複数可）を含む単一組換え核酸挿入物または断片上にコードされているときに、組換え核酸挿入物は、５’から３’方向に、誘導性プロモーター；キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列；第２の構成的プロモーター；ヒトＦＡＳ ｍＲＮＡ、ヒトＰＴＰＮ２ ｍＲＮＡまたはヒトＴＯＸ ｍＲＮＡと相補的である第１の核酸をコードするヌクレオチド配列；第１の構成的プロモーター；及びプライミング受容体をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。

【0312】

いくつかの実施形態において、システムが、両方の導入遺伝子及び核酸（複数可）を含む単一組換え核酸挿入物または断片上にコードされているときに、組換え核酸挿入物は、５’から３’方向に、誘導性プロモーター；キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列；第１の構成的プロモーター；ヒトＦＡＳ ｍＲＮＡ、ヒトＰＴＰＮ２ ｍＲＮＡまたはヒトＴＯＸ ｍＲＮＡと相補的である第１の核酸をコードするヌクレオチド配列；及びプライミング受容体をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。

【0313】

いくつかの実施形態において、システムが、両方の導入遺伝子及び核酸（複数可）を含む単一組換え核酸挿入物または断片上にコードされているときに、組換え核酸挿入物は、５’から３’方向に、誘導性プロモーター；キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列；第１の構成的プロモーター；ヒトＦＡＳ ｍＲＮＡ、ヒトＰＴＰＮ２ ｍＲＮＡまたはヒトＴＯＸ ｍＲＮＡと相補的である第１の核酸をコードするヌクレオチド配列；ヒトＦＡＳ ｍＲＮＡ、ヒトＰＴＰＮ２ ｍＲＮＡまたはヒトＴＯＸ ｍＲＮＡと相補的である第２の核酸をコードするヌクレオチド配列；及びプライミング受容器をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。

【0314】

いくつかの実施形態において、システムが、両方の導入遺伝子及び核酸を含む単一組換え核酸挿入物または断片上にコードされているときに、組換え核酸挿入物は、５’から３’方向に、第１の構成的プロモーター；プライミング受容体をコードするヌクレオチド配列；第２の構成的プロモーター；ヒトＦＡＳ ｍＲＮＡと相補的である第１の核酸をコードするヌクレオチド配列；ヒトＰＴＰＮ２ ｍＲＮＡまたはＴＯＸ ｍＲＮＡと相補的である第２の核酸をコードするヌクレオチド配列；誘導性プロモーター；及びキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。

【0315】

別の実施形態において、組換え核酸挿入物は、５’から３’方向に、第１の構成的プロモーター；プライミング受容体をコードするヌクレオチド配列；第２の構成的プロモーター；ヒトＰＴＰＮ２ ｍＲＮＡまたはＴＯＸ ｍＲＮＡと相補的である第２の核酸をコードするヌクレオチド配列；ヒトＦＡＳ ｍＲＮＡと相補的である第２の第１の核酸をコードするヌクレオチド配列；誘導性プロモーター；及びキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。

【0316】

別の実施形態において、組換え核酸挿入物は、５’から３’方向に、誘導性プロモーター；キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列；第２の構成的プロモーター；ヒトＦＡＳ ｍＲＮＡと相補的である第１の核酸をコードするヌクレオチド配列；ヒトＰＴＰＮ２ ｍＲＮＡまたはＴＯＸ ｍＲＮＡと相補的である第２の第１の核酸をコードするヌクレオチド配列；第２の構成的プロモーター；プライミング受容体をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。

【0317】

別の実施形態において、組換え核酸挿入物は、５’から３’方向に、誘導性プロモーター；キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列；第２の構成的プロモーター；ヒトＰＴＰＮ２ ｍＲＮＡまたはＴＯＸ ｍＲＮＡと相補的である第２の核酸をコードするヌクレオチド配列；ヒトＦＡＳ ｍＲＮＡと相補的である第２の第１の核酸をコードするヌクレオチド配列；第２の構成的プロモーター；プライミング受容体をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。

【0318】

いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号１６６、１６７、１６８、１６９、１７０または１７１からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号１６６に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号１６７に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号１６８に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号１６９に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号１７０に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号１７１に記載の配列を含む。

【0319】

プライミング受容体
胎盤／生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ／Ｐ；ＡＬＰＰ：ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：２５０、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ０５１８７；ＡＬＰＧ：ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：２５１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ１０６９６）である。いくつかの実施形態において、プライミング受容体は、胎盤型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＰ）に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、プライミング受容体は、生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ）に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「胎盤／生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ／Ｐ）」とは、胎盤型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＰ）及び生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ）の両方を指す。ＡＬＰＧ／Ｐに特異的に結合する抗原結合ドメインは、ＡＬＰＧ及び／またはＡＬＰＰに特異的に結合することが可能である。

【0320】

いくつかの実施形態において、プライミング受容体は、配列番号２４に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、プライミング受容体は、配列番号２５に記載の配列を含む。

【0321】

本開示のある特定の態様において、プライミング受容体は、Ｎｏｔｃｈタンパク質に基づく合成受容体である。タンパク質のデルタファミリーからのものなどの同族リガンドへの天然Ｎｏｔｃｈ受容体の結合は、Ｎｏｔｃｈタンパク質の細胞内断片を切断する膜内タンパク質分解を引き起こす。この細胞内断片は、Ｎｏｔｃｈから切断されたときにのみ機能する転写調節因子である。切断は、ＡＤＡＭメタロプロテアーゼ及びガンマ－セクレターゼ複合体による連続的なタンパク質分解によって起こり得る。この細胞内断片は、細胞の核に入り、細胞－細胞シグナル伝達遺伝子を活性化する。自然Ｎｏｔｃｈタンパク質と対照的に、合成Ｎｏｔｃｈプライミング受容体は、自然Ｎｏｔｃｈ細胞内断片を、選択のタンパク質、例えば、ＣＡＲをコードする遺伝子が、プライミング受容体からの細胞内断片の放出の際に転写され得ることを引き起こすもので置き換える。

【0322】

Ｎｏｔｃｈ受容体は、モジュラードメイン組織を有する。Ｎｏｔｃｈ受容体の外部ドメインは、リガンド結合の原因となる一連のＮ末端上皮成長因子（ＥＧＦ）様反復からなる。合成Ｎｏｔｃｈ受容体またはプライミング受容体において、Ｎｏｔｃｈリガンド結合ドメインは、選択された標的リガンドまたは抗原に結合するリガンド結合ドメインと置き換えられる。ＥＧＦ反復に続いて、３つのＬＩＮ－１２／Ｎｏｔｃｈ反復（ＬＮＲ）モジュールが続き、これはＮｏｔｃｈ受容体に特有であり、早期受容体活性化の防止に関与すると広く報告されている。Ｎｏｔｃｈ１のヘテロ二量体化（ＨＤ）ドメインは、フリン切断によって分割され、それによりＮ末端部分が細胞外サブユニットを終結させ、そのＣ末端半分が膜貫通サブユニットの始まりを構成する。細胞外領域に続いて、受容体は、膜貫通セグメントと、転写調節因子を含む細胞内ドメイン（ＩＣＤ）とを有する。

【0323】

複数形態のプライミング受容体を、本明細書に記載の方法、細胞、及び核酸に使用することができる。本明細書における方法及び細胞における使用が企図されるプライミング受容体の１つのタイプは、異種細胞外リガンド結合ドメイン、ＮＲＲ、ＴＭＤ、及びＩＣＤを含むＮｏｔｃｈ受容体と実質的な配列同一性を有する連結ポリペプチドを含む。「Ｆｎ Ｎｏｔｃｈ」受容体は、異種細胞外リガンド結合ドメイン、Ｒｏｂｏ受容体（哺乳動物Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２、Ｒｏｂｏ３、またはＲｏｂｏ４など）との実質的な配列同一性を有する連結ポリペプチド、続いて１、２、または３つのフィブロネクチン反復（「Ｆｎ」）、ＴＭＤ、及びＩＣＤを含む。「ミニＮｏｔｃｈ」受容体は、異種細胞外リガンド結合ドメイン、Ｎｏｔｃｈ受容体（ＮＲＲを欠く）、ＴＭＤ、及びＩＣＤと実質的な配列同一性を有する連結ポリペプチドを含む。「最小Ｌｉｎｋｅｒ Ｎｏｔｃｈ」受容体は、異種細胞外リガンド結合ドメイン、Ｎｏｔｃｈ受容体と実質的な配列同一性を欠く連結ポリペプチド（例えば、合成（ＧＧＳ）ｎポリペプチド配列）、ＴＭＤ、及びＩＣＤを含む。「ヒンジＮｏｔｃｈ」受容体は、異種細胞外リガンド結合ドメイン、オリゴマー化ドメイン（すなわち、合成受容体及び／または既存の宿主受容体との二量体化、三量体化、またはより高次の多量体化を促進するドメイン）、ＴＭＤ、及びＩＣＤを含むヒンジ配列を含む。これらの受容体クラスの全ては、合成、組換えであり、自然界には生じない。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される非天然に存在する受容体は、受容体のタンパク質分解切断を誘発し、細胞内のカスタム転写プログラムを調節する転写調節因子の放出を誘発する、標的細胞表面に示されるリガンドに結合する。いくつかの実施形態において、プライミング受容体は、Ｎｏｔｃｈ受容体のＬＩＮ－１２－Ｎｏｔｃｈ反復（ＬＮＲ）及び／またはヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ）を含まない。

【0324】

プライミング受容体細胞外ドメイン
本明細書に開示されるプライミング受容体は、胎盤／生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ／Ｐ；ＡＬＰＰ：ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：２５０、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ０５１８７；ＡＬＰＧ：ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：２５１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ１０６９６）に特異的に結合する細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞外ドメインは、受容体のリガンド結合部分を含む。いくつかの実施形態において、細胞外ドメインは、１つ以上の標的抗原に結合する抗原結合部分を含む。いくつかの実施形態において、抗原結合部分は、抗体またはその機能的抗原結合断片の１つ以上の抗原結合決定基を含む。いくつかの実施形態において、抗原結合部分は、抗体、ナノボディ、ダイアボディ、トリアボディ、またはミニボディ、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、またはその機能的断片からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗原結合部分は、ｓｃＦｖを含む。抗原結合部分は、天然に存在するアミノ酸配列を含み得るか、または所望の特性及び／または改善された特性、例えば、増加した結合親和性を提供するように操作、設計、または修飾することができる。

【0325】

標的分子への抗体の結合に関して、特定の抗原（例えば、ポリペプチド標的）または特定の抗原上のエピトープ「に結合する」、「への特異的結合」、「に特異的に結合する」、「に特異的」、「に選択的に結合する」及び「について選択的」という用語は、（例えば、非標的分子との）非特異的または非選択的相互作用と測定可能に異なる結合を意味する。例えば、抗原「に選択的に結合する」または「に特異的に結合する」抗体は、抗原に高い親和性で結合し、かつ他の無関係の抗原に有意に結合しない抗原結合部分である。特異的結合は、例えば、標的分子への結合を測定し、それを非標的分子への結合と比較することによって測定され得る。特異的結合はまた、標的分子上で認識されるエピトープを模倣する対照分子との競合によって決定され得る。この場合、特異的結合は、標的分子への抗体の結合が対照分子によって競合的に阻害される場合に示される。いくつかの実施形態において、細胞外抗原結合ドメインは、アルカリホスファターゼ生殖細胞型（ＡＬＰＧ）に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、細胞外ドメインは、胎盤型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＰ）に結合する抗原結合部分を含む。

【0326】

「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原またはエピトープ）との間の非共有結合相互作用の合計の強度を指す。別途指示されない限り、本明細書で使用される場合、「親和性」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体、及び抗原またはエピトープ）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹとの親和性は、解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）によって表され得る。解離平衡定数に寄与する動態学的構成要素は、以下でより詳細に記載される。親和性は、当該技術分野で既知の一般的な方法によって測定され得、方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標））または生体層干渉法（例えば、ＦＯＲＴＥＢＩＯ（登録商標））を含むが、これらに限定されない。

【0327】

本明細書で使用される場合、「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、抗体可変ドメインの領域の各々であって、領域が、配列において超可変であり及び／または構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する、領域の各々を指す。概して、天然４本鎖抗体は、６つのＨＶＲを含み、３つはＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）中にあり、３つはＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）中にある。ＨＶＲは、概して、超可変ループからの及び／または相補性決定領域（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含み、後者は、最も高い配列可変性のものであり及び／または抗原認識に関与する。ＶＨにおけるＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは概して、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域（ＨＶＲ）はまた、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と称され、これらの用語は、抗原結合領域を形成する、可変領域の部分に関して、本明細書で互換的に使用される。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８３）及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１－９１７（１９８７）によって記載されており、定義は、互いに比較されたときに、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。しかしながら、抗体またはそのバリアントのＣＤＲを指すためのいずれかの定義の適用は、本明細書で定義及び使用される用語の範囲内にあることが意図されている。特定のＣＤＲを包含する正確な残基番号は、ＣＤＲの配列及びサイズに依存して変動する。当業者であれば、抗体の可変領域アミノ酸配列を所与として、どの残基が特定のＣＤＲを含むかをルーチン的に決定することができる。

【0328】

ＣＤＲのアミノ酸配列境界は、当業者によって、いくつかの既知の番号付けスキームのうちのいずれかを使用して決定され得、番号付けスキームは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．上記（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３：９２７－９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）、ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（「Ｃｏｎｔａｃｔ」番号付けスキーム）、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３，２７：５５－７７（「ＩＭＧＴ」番号付けスキーム）及びＨｏｎｅｇｇｅ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００１，３０９：６５７－７０（「ＡＨｏ」番号付けスキーム）によって記載されているものを含み、それらの各々は、その全体が参照により組み込まれる。

【0329】

表Ａは、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａスキームによって特定されるＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の位置を提供する。ＣＤＲ－Ｈ１については、残基番号付けは、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキームの両方を使用して提供される。

【0330】

ＣＤＲは、例えば、抗体番号付けソフトウェア、例えば、Ａｂｎｕｍを使用して割り当てられ得、Ａｂｎｕｍは、ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／ａｂｎｕｍ／において入手可能であり、Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００８，４５：３８３２－３８３９に記載されており、これは、その全体が参照により組み込まれる。

【0331】

【表A】

【0332】

「ＥＵ番号付けスキーム」は、概して、（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．上記に報告されているように）抗体重鎖定常領域における残基を指すときに使用される。別途記載されない限り、ＥＵ番号付けスキームは、本明細書に記載される抗体重鎖定常領域における残基を指すために使用される。

【0333】

【表A1】

【0334】

本明細書で使用される場合、「単鎖」という用語は、ペプチド結合によって直線的に連結されたアミノ酸単量体を含む分子を指す。特定のそのような実施形態において、Ｆａｂ軽鎖のＣ末端は、単鎖Ｆａｂ分子におけるＦａｂ重鎖のＮ末端に接続されている。本明細書でより詳細に記載されるように、ｓｃＦｖは、軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインを有し、ＶＬは、そのＣ末端から重鎖（ＶＨ）の可変ドメインのＮ末端に、ポリペプチド鎖によって接続されている。代替的に、ｓｃＦｖは、ポリペプチド鎖を含み、ＶＨのＣ末端は、ＶＬのＮ末端にポリペプチド鎖によって接続されている。

【0335】

（断片抗原結合とも称される）「Ｆａｂ断片」は、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有するとともに、可変ドメインＶＬ及びＶＨを、それぞれ、軽及び重鎖上に含有する。可変ドメインは、抗原結合に関与する相補性決定ループ（ＣＤＲ、超可変領域とも称される）を含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端におけるいくつかの残基の付加によって、Ｆａｂ断片と異なる。

【0336】

「Ｆ（ａｂ’）_２」断片は、ヒンジ領域の近くでジスルフィド結合によって結合した２つのＦａｂ’断片を含有する。Ｆ（ａｂ’）_２断片は、例えば、組換え方法によってまたはインタクト抗体のペプシン消化によって生成され得る。Ｆ（ａｂ’）断片は、例えば、β－メルカプトエタノールでの処理によって解離され得る。

【0337】

「Ｆｖ」断片は、１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの非共有結合的に連結された二量体を含む。

【0338】

「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖において存在する。一実施形態において、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーを更に含み、ポリペプチドリンカーは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。ＨＥＲ２抗体ｓｃＦｖ断片は、ＷＯ９３／１６１８５、米国特許第５，５７１，８９４号及び米国特許第５，５８７，４５８号に記載されている。

【0339】

「単一ドメイン抗体」または「ｓｄＡｂ」という用語は、抗体の１つの可変ドメインが、他の可変ドメインが存在することなく、抗原に特異的に結合する、分子を指す。単一ドメイン抗体及びそれらの断片は、Ａｒａｂｉ Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９８，４１４：５２１－５２６及びＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２００１，２６：２３０－２４５に記載されており、それらの各々は、その全体が参照により組み込まれる。単一ドメイン抗体はまた、ｓｄＡｂまたはナノボディとして既知である。ｓｄＡｂは、かなり安定しており、抗体のＦｃ鎖との融合パートナーとして容易に発現する（Ｈａｒｍｓｅｎ ＭＭ，Ｄｅ Ｈａａｒｄ ＨＪ（２００７）．“Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃａｍｅｌｉｄ ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ”．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７（１）： １３－２２）。

【0340】

プライミング受容体ＣＤＲ、ＶＨ、ＶＬドメイン
いくつかの態様において、プライミング受容体細胞外抗原結合ドメインは、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列、ならびにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３の３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号２に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号３に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号４に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号５に記載の配列を含み、かつＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号６に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ鎖配列は、配列番号７に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＬは、配列番号８に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞外ドメインは、配列番号９に記載の配列を含む。

【0341】

いくつかの実施形態において、プライミング受容体細胞外抗原結合ドメインのＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号３のＣＤＲ－Ｈ３と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号２のＣＤＲ－Ｈ２と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１のＣＤＲ－Ｈ１と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号６のＣＤＲ－Ｌ３と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号５のＣＤＲ－Ｌ２と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号４のＣＤＲ－Ｌ１と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ－Ｈ３は、最大１、２、３、４、５、６、７または８つのアミノ酸置換を有する配列番号３のＣＤＲ－Ｈ３であり、ＣＤＲ－Ｈ２は、最大１、２、３、４、５、６、７または８つのアミノ酸置換を有する配列番号２のＣＤＲ－Ｈ２であり、ＣＤＲ－Ｈ１は、最大１、２、３、４または５つのアミノ酸置換を有する配列番号１のＣＤＲ－Ｈ１であり、ＣＤＲ－Ｌ３は、最大１、２、３、４または５つのアミノ酸置換を有する配列番号６のＣＤＲ－Ｌ３であり、ＣＤＲ－Ｌ２は、最大１、２、３または４つのアミノ酸置換を有する配列番号５のＣＤＲ－Ｌ２であり、ＣＤＲ－Ｌ１は、最大１、２、３、４、５または６つのアミノ酸置換を有する配列番号４のＣＤＲ－Ｌ１である。

【0342】

いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるプライミング受容体細胞外抗原結合ドメインは、配列番号７に記載のＶＨドメインの１～３つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗原結合ドメインは、配列番号７に記載のＶＨドメインの２～３つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗原結合ドメインは、配列番号７に記載のＶＨドメインの３つのＣＤＲを含む。いくつかの態様において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲである。いくつかの態様において、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲである。いくつかの態様において、ＣＤＲは、ＡｂＭ ＣＤＲである。いくつかの態様において、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔ ＣＤＲである。いくつかの態様において、ＣＤＲは、ＩＭＧＴ ＣＤＲである。

【0343】

いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるプライミング受容体細胞外抗原結合ドメインは、配列番号７に記載のＶＨ配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有するＶＨ配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗原結合ドメインは、最大１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個または２５個のアミノ酸置換を有する、配列番号７で提供されるＶＨ配列を含む。いくつかの態様において、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態において、この段落に記載される抗原結合ドメインは、「バリアント」と本明細書で称される。いくつかの実施形態において、そのようなバリアントは、例えば、親和性成熟、部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発、または当該技術分野で既知のもしくは本明細書に記載されるいずれかの他の方法によって、本明細書で提供される配列から導出される。いくつかの実施形態において、そのようなバリアントは、本明細書で提供される配列から導出されず、例えば、抗体または抗原結合ドメインを得るための本明細書で提供される方法によりデノボで単離され得る。

【0344】

いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるプライミング受容体細胞外抗原結合ドメインは、配列番号８に記載のＶＬドメインの１～３つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗原結合ドメインは、配列番号８に記載のＶＬドメインの２～３つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗原結合ドメインは、配列番号８に記載のＶＬドメインの３つのＣＤＲを含む。いくつかの態様において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲである。いくつかの態様において、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲである。いくつかの態様において、ＣＤＲは、ＡｂＭ ＣＤＲである。いくつかの態様において、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔ ＣＤＲである。いくつかの態様において、ＣＤＲは、ＩＭＧＴ ＣＤＲである。

【0345】

いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるプライミング受容体細胞外抗原結合ドメインは、配列番号８に記載のＶＬ配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有するＶＬ配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗原結合ドメインは、最大１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個または２５個のアミノ酸置換を有する、配列番号８で提供されるＶＬ配列を含む。いくつかの態様において、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態において、この段落に記載される抗体は、「バリアント」と本明細書で称される。いくつかの実施形態において、そのようなバリアントは、例えば、親和性成熟、部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発、または当該技術分野で既知のもしくは本明細書に記載されるいずれかの他の方法によって、本明細書で提供される配列から導出される。いくつかの実施形態において、そのようなバリアントは、本明細書で提供される配列から導出されず、例えば、抗体または抗原結合ドメインを得るための本明細書で提供される方法によりデノボで単離され得る。

【0346】

表Ｂは、示される番号付けスキームによる、例示的なＡＬＰＧ／Ｐ抗原結合ドメインのＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列を提供する。

【0347】

【表B】

【0348】

膜貫通ドメイン
上記のように、プライミング受容体は、１つ以上のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位を含む膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を含む。

【0349】

いくつかの実施形態において、ＴＭＤは、Ｎｏｔｃｈ１膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号１９に記載の配列を含む。

【0350】

概して、本明細書に開示されるキメラ受容体に好適なＴＭＤは、少なくとも１つのガンマ－セクレターゼ切断部位を含む、１型膜貫通受容体の任意の膜貫通ドメインであり得る。アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）及びＮｏｔｃｈを含む、ガンマ－セクレターゼ複合体及びその基質タンパク質の構造及び機能の詳細な説明は、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（２０１４）による最近のレビューにおいて見出すことができる。１型膜貫通受容体由来の非限定の好適なＴＭＤには、ＣＬＳＴＮ１、ＣＬＳＴＮ２、ＡＰＬＰ１、ＡＰＬＰ２、ＬＲＰ８、ＡＰＰ、ＢＴＣ、ＴＧＢＲ３、ＳＰＮ、ＣＤ４４、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＸＣＬ１６、ＣＸ３ＣＬ１、ＤＣＣ、ＤＬＬ１、ＤＳＧ２、ＤＡＧ１、ＣＤＨ１、ＥＰＣＡＭ、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＢ２、ＥＦＮＢ１、ＥＦＮＢ２、ＥｒｂＢ４、ＧＨＲ、ＨＬＡ－Ａ、及びＩＦＮＡＲ２由来のものが含まれ、ＴＭＤは、少なくとも１つのガンマセクレターゼ切断部位を含む。本明細書に記載の組成物及び方法に好適な追加のＴＭＤには、１型膜貫通受容体ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＮＳＲ、ＥＲＮ１、ＥＲＮ２、ＪＡＧ２、ＫＣＮＥ１、ＫＣＮＥ２、ＫＣＮＥ３、ＫＣＮＥ４、ＫＬ、ＣＨＬ１、ＰＴＰＲＦ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ３Ｂ、ＮＰＲ３、ＮＧＦＲ、ＰＬＸＤＣ２、ＰＡＭ、ＡＧＥＲ、ＲＯＢＯｌ、ＳＯＲＣＳ３、ＳＯＲＣＳ１、ＳＯＲＬ１、ＳＤＣ１、ＳＤＣ２、ＳＰＮ、ＴＹＲ、ＴＹＲＰ１、ＤＣＴ、ＹＡＳＮ、ＦＬＴ１、ＣＤＨ５、ＰＫＨＤ１、ＮＥＣＴＩＮｌ、ＰＣＤＨＧＣ３、ＮＲＧ１、ＬＲＰ１Ｂ、ＣＤＨ２、ＮＲＧ２、ＰＴＰＲＫ、ＳＣＮ２Ｂ、Ｎｒａｄｄ、及びＰＴＰＲＭからの膜貫通ドメインが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本開示のキメラポリペプチドまたはＮｏｔｃｈ受容体のＴＭＤは、アルカデインアルファ及びアルカデインガンマなどのカルシンテニンファミリーのメンバーのＴＭＤに由来するＴＭＤである。いくつかの実施形態において、本開示のキメラポリペプチドまたはＮｏｔｃｈ受容体のＴＭＤは、Ｎｏｔｃｈ受容体に関して既知のＴＭＤである。いくつかの実施形態において、本開示のキメラポリペプチドまたはＮｏｔｃｈ受容体のＴＭＤは、異なるＮｏｔｃｈ受容体に由来するＴＭＤである。例えば、ヒトＮｏｔｃｈ１に基づくミニＮｏｔｃｈにおいて、Ｎｏｔｃｈ１ ＴＭＤは、Ｎｏｔｃｈ２ ＴＭＤ、Ｎｏｔｃｈ３ ＴＭＤ、Ｎｏｔｃｈ４ ＴＭＤ、またはＤａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ、またはＧａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓなどの非ヒト動物由来のＮｏｔｃｈ ＴＭＤで置換され得る。

【0351】

いくつかの実施形態において、プライミング受容体は、Ｓ２またはＳ３などのＮｏｔｃｈ切断部位を含む。本明細書に開示される組成物及び方法に好適な追加のタンパク質分解切断部位には、ＡＤＡＭ１０、すなわち、コラゲナーゼ－１、－２、及び－３（ＭＭＰ－１、－８、及び－１３）、ゼラチナーゼＡ及びＢ（ＭＭＰ－２及び－９）、ストロメリシン１、２、及び３（ＭＭＰ－３、－１０、及び－１１）、マトリリシン（ＭＭＰ－７）、及び膜メタロプロテアーゼ（ＭＴ１－ＭＭＰ及びＭＴ２－ＭＭＰ）から選択されるＭＭＰのメタロプロテイナーゼ切断部位が含まれるが、これらに限定されない。好適なプロテアーゼ切断部位の別の例は、プラスミノーゲン活性化因子切断部位、例えば、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）または組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）切断部位である。好適なプロテアーゼ切断部位の別の例は、プロラクチン切断部位である。ｕＰＡ及びｔＰＡの切断配列の具体例としては、Ｙａｌ－Ｇｌｙ－Ａｒｇを含む配列が挙げられる。タンパク質分解的に切断可能なリンカーに含まれ得るプロテアーゼ切断部位の別の例は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位、例えば、Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ｇｌｎ－Ｓｅｒ（配列番号１８８）であり、ここで、プロテアーゼは、グルタミンとセリンとの間で切断する。タンパク質分解的に切断可能なリンカーに含まれ得るプロテアーゼ切断部位の別の例は、エンテロキナーゼ切断部位、例えば、Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ（配列番号１８９）であり、ここで、切断は、リジン残基の後に生じる。タンパク質分解的に切断可能なリンカーに含まれ得るプロテアーゼ切断部位の別の例は、トロンビン切断部位、例えば、Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ（配列番号１９０）である。プロテアーゼ切断部位を含む追加の好適なリンカーとしては、以下のプロテアーゼによって切断可能な配列が挙げられる：ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（商標）プロテアーゼ（ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ及びグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼを含む融合タンパク質）、トロンビン、カテプシンＢ、エプスタイン－バーウイルスプロテアーゼ、ＭＭＰ－３（ストロメリシン）、ＭＭＰ－７（マトリリシン）、ＭＭＰ－９；サーモリシン様ＭＭＰ、マトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ－２）、カテプシンＬ；カテプシンＤ、マトリックスメタロプロテアーゼ１（ＭＭＰ－１）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、膜１型マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＴ－ＭＭＰ）、ストロメリシン３（またはＭＭＰ－１１）、サーモリシン、線維芽細胞コラゲナーゼ及びストロメリシン－１、マトリックスメタロプロテアーゼ１３（コラゲナーゼ－３）、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ヒト前立腺特異的抗原、カリクレイン（ｈＫ３）、好中球エラスターゼ、及びカルパイン（カルシウム活性化中性プロテアーゼ）。受容体が発現される宿主細胞に天然ではないプロテアーゼ（例えば、ＴＥＶ）を更なる調節機構として使用することができ、プロテアーゼが発現されるか、または他の方法で提供されるまで、受容体の活性化が低減する。追加的に、プロテアーゼは、腫瘍関連または疾患関連（正常組織よりも有意に高い程度に発現される）であり得、独立した調節機構として機能する。例えば、いくつかのマトリックスメタロプロテアーゼは、ある特定のがんタイプにおいて高度に発現される。

【0352】

いくつかの実施形態において、ＴＭＤ内のアミノ酸置換（複数可）は、ＴＭＤの「ＧＶ」モチーフ内の１つ以上の置換を含む。いくつかの実施形態において、そのような置換（複数可）のうちの少なくとも１つは、アラニンへの置換を含む。追加の配列及び置換は、ＷＯ２０２１０６１８７２（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。

【0353】

細胞内ドメイン
いくつかの実施形態において、プライミング受容体は、転写調節因子及び／またはＤＮＡ結合ドメインからのまたはそれに由来する１つ以上の細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＨＮＦ１ａ／ｐ６５ドメインまたはＧａｌ４／ＶＰ６４ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号２３に記載の配列を含む。

【0354】

転写調節因子は、同族プロモーターからの転写を活性化または抑制する。転写活性化因子は、典型的には、近くの転写プロモーターに結合し、ＲＮＡポリメラーゼを動員して転写を直接開始する。転写抑制因子は、転写プロモーターに結合し、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始を立体的に阻害する。他の転写調節因子は、それが結合する場所及び細胞条件に応じて、活性化因子または抑制因子のいずれかとして機能する。したがって、本明細書で使用される場合、「転写活性化ドメイン」は、１つ以上の遺伝子の転写を増加及び／または活性化するために、転写制御エレメント及び／または転写調節タンパク質（すなわち、転写因子、ＲＮＡポリメラーゼ等）と相互作用する転写因子のドメインを指す。転写活性化ドメインの非限定的な例としては、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６活性化ドメイン、ＶＰ６４（ＶＰ１６の四量体誘導体である）、ＨＩＶ ＴＡＴ、ＮＦｋＢ ｐ６５活性化ドメイン、ｐ５３活性化ドメイン１及び２、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質）活性化ドメイン、Ｅ２Ａ活性化ドメイン、ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核因子）活性化ドメイン、酵母Ｇａｌ４、酵母ＧＣＮ４、酵母ＨＡＰ１、ＭＬＬ、ＲＴＧ３、ＧＬＮ３、ＯＡＦ１、ＰＩＰ２、ＰＤＲ１、ＰＤＲ３、ＰＨＯ４、ＬＥＵ３グルココルチコイド受容体転写活性化ドメイン、Ｂ－細胞ＰＯＵホメオドメインタンパク質Ｏｃｔ２、植物Ａｐ２、または当業者に既知の任意の他のものが挙げられる。いくつかの実施形態において、転写調節因子は、Ｇａｌ４－ＶＰ１６、Ｇａｌ４－ＶＰ６４、ｔｅｔＲ－ＶＰ６４、ＺＦＨＤ１－ＹＰ６４、Ｇａｌ４－ＫＲＡＢ、及びＨＡＰ１－ＶＰ１６から選択される。いくつかの実施形態において、転写調節因子は、Ｇａｌ４－ＶＰ６４である。転写活性化ドメインは、野生型もしくは天然に存在する配列を含むことができるか、または１つ以上の遺伝子の転写を増加及び／または活性化する所望の能力を有する、元の転写活性化ドメインの修飾、変異、または誘導体バージョンであり得る。いくつかの実施形態において、転写調節因子は、核局在化シグナルを更に含み得る。

【0355】

いくつかの実施形態において、プライミング受容体は、１つ以上の細胞内「ＤＮＡ結合ドメイン」（または「ＤＢドメイン」）を含む。そのような「ＤＮＡ結合ドメイン」は、特定のＤＮＡ配列エレメントに結合する配列特異的ＤＮＡ結合ドメインを指す。したがって、本明細書で使用される場合、「配列特異的ＤＮＡ結合ドメイン」は、特定の所定の配列を有するＤＮＡに選択的に結合する能力を有するタンパク質ドメイン部分を指す。配列特異的ＤＮＡ結合ドメインは、野生型もしくは天然に存在する配列を含むことができるか、または所望の配列に結合する所望の能力を有する元のドメインの修飾、変異体、もしくは誘導体バージョンであり得る。いくつかの実施形態において、配列特異的ＤＮＡ結合ドメインは、所望の配列に結合するように操作される。本明細書に記載の合成タンパク質において使用され得る配列特異的ＤＮＡ結合ドメインを有するタンパク質の非限定例としては、ＨＮＦ１ａ、Ｇａｌ４、ＧＣＮ４、逆テトラサイクリン受容体、ＴＨＹ１、ＳＹＮ１、ＮＳＥ／ＲＵ５’、ＡＧＲＰ、ＣＡＬＢ２、ＣＡＭＫ２Ａ、ＣＣＫ、ＣＨＡＴ、ＤＬＸ６Ａ、ＥＭＸ１、それらのジンクフィンガータンパク質またはドメイン、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（もしくはＣａｓＤ）、Ｃａｓｈ、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（もしくはＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（もしくはＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（もしくはＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（もしくはＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、及びＣｕ１９６、ならびにＴＡＬＥＳが挙げられる。

【0356】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質が使用される実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、修飾ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、または野生型もしくは修飾ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の断片であり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、核酸結合親和性及び／または特異性を増加させ、酵素活性を改変し、及び／またはタンパク質の別の特性を変化させるように修飾され得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質のヌクレアーゼ（すなわち、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ）ドメインは、修飾、欠失、または不活性化され得る。代替的には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、本明細書に記載のシステムの機能に必須ではないドメインを除去するために切断することができる。例えば、ＤＮＡ結合タンパク質またはそのドメインとして使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素は、変異したＣＲＩＳＰＲまたはそのドメインが、ＤＮＡ結合ドメイン標的部位を含む核酸配列を切断する能力を欠くように、対応する野生型酵素に関して変異させることができる。例えば、Ｄ１０Ａ変異は、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８６３Ａ変異のうちの１つ以上と組み合わせて、実質的に全てのＤＮＡ切断活性を欠くＣａｓ９酵素を産生することができる。

【0357】

膜近傍ドメイン
ＥＣＤ及びＴＭＤ、またはＴＭＤ及びＩＣＤは、膜近傍ドメインなどの連結ポリペプチドと互いに連結され得る。「ＳｙｎＮｏｔｃｈ」または合成Ｎｏｔｃｈ受容体は、異種細胞外リガンド結合ドメイン、（ＮＲＲを含む）Ｎｏｔｃｈ受容体ＪＭＤと実質的な配列同一性を有する連結ポリペプチド、ＴＭＤ及びＩＣＤを含む。「Ｆｎ Ｎｏｔｃｈ」受容体は、異種細胞外リガンド結合ドメイン、Ｒｏｂｏ受容体（哺乳動物Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２、Ｒｏｂｏ３、またはＲｏｂｏ４など）との実質的な配列同一性を有する連結ポリペプチド、続いて１、２、または３つのフィブロネクチン反復（「Ｆｎ」）、ＴＭＤ、及びＩＣＤを含む。「ミニＮｏｔｃｈ」受容体は、異種細胞外リガンド結合ドメイン、Ｎｏｔｃｈ受容体ＪＭＤと実質的な配列同一性を有するが、ＮＲＲ（ＬＩＮ－１２－Ｎｏｔｃｈ反復（ＬＮＲ）モジュール、及びヘテロ二量体化ドメイン）、ＴＭＤ、及びＩＣＤを欠く連結ポリペプチドを含む。「最小リンカーＮｏｔｃｈ」受容体は、異種細胞外リガンド結合ドメイン、Ｎｏｔｃｈ受容体との実質的な配列同一性を欠く連結ポリペプチド（例えば、限定されないが、合成（ＧＧＳ）_ｎポリペプチド配列を有する）、ＴＭＤ、及びＩＣＤを含む。「ヒンジＮｏｔｃｈ」受容体は、異種細胞外リガンド結合ドメイン、オリゴマー化ドメイン（すなわち、合成受容体及び／または既存の宿主受容体との二量体化、三量体化、またはより高次の多量体化を促進するドメイン）、ＴＭＤ、及びＩＣＤを含むヒンジ配列を含む。

【0358】

いくつかの実施形態において、プライミング受容体は、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間に膜近傍ドメイン（ＪＭＤ）ペプチドを含む。いくつかの実施形態において、プライミング受容体は、膜貫通ドメインと細胞内ドメインとの間に膜近傍ドメイン（ＪＭＤ）ペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＪＭＤペプチドは、ＬＷＦモチーフを含む。受容体コンストラクトにおけるＬＷＦモチーフの使用は、米国特許第１０，８５８，４４３号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。いくつかの実施形態において、ＪＭＤペプチドは、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、及び／またはＮｏｔｃｈ４のＪＭＤに対して実質的な配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＪＭＤペプチドは、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、及び／またはＮｏｔｃｈ４ ＪＭＤに対して実質的な配列同一性を有するが、Ｎｏｔｃｈ受容体のＬＩＮ－１２－Ｎｏｔｃｈ反復（ＬＮＲ）及び／またはヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ）を含まない。いくつかの実施形態において、ＪＭＤペプチドは、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、及び／またはＮｏｔｃｈ４ ＪＭＤに対して実質的な配列同一性を有しない。いくつかの実施形態において、ＪＭＤペプチドは、受容体の二量体、三量体、またはより高次の集合体の形成を促進するオリゴマー化ドメインを含む。そのようなＪＭＤペプチドは、ＷＯ２０２１０６１８７２に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0359】

ミニＮｏｔｃｈ受容体において、連結ポリペプチドは、ＮＲＲ及びＨＤドメインの欠失後のＮｏｔｃｈ ＪＭＤ配列に由来する。Ｎｏｔｃｈ ＪＭＤ配列は、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、またはＮｏｔｃｈ４からの配列であってもよく、ショウジョウバエ属、ヤケイ属、ダニオ属等からのものなどの非ヒト相同体に由来し得る。残りのＮｏｔｃｈ配列の４～５０個のアミノ酸残基をポリペプチドリンカーとして使用することができる。いくつかの実施形態において、リンカーポリペプチド配列の長さ及びアミノ酸組成は、ＥＣＤ及びＴＭＤの互いに対する配向及び／または近接性を改変して、リガンド誘導時またはリガンドの非存在下でのシグナル形質導入レベルなどのキメラポリペプチドの所望の活性を達成するように変化する。

【0360】

最小リンカーＮｏｔｃｈ受容体において、連結ポリペプチドは、Ｎｏｔｃｈ ＪＭＤ配列（Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、もしくはＮｏｔｃｈ４、またはそれらの非ヒト相同体からのＮｏｔｃｈ ＪＭＤ配列を含む）に対する実質的な配列同一性を有しない。４～５０個のアミノ酸残基をポリペプチドリンカーとして使用することができる。いくつかの実施形態において、リンカーポリペプチド配列の長さ及びアミノ酸組成は、ＥＣＤ及びＴＭＤの互いに対する配向及び／または近接性を改変して、本開示のキメラポリペプチドの所望の活性を達成するように変化する。最小リンカー配列は、プロテアーゼ切断部位を含むか、または省略するように設計することができ、グリコシル化部位もしくは他のタイプの翻訳後修飾のための複数の部位を含むか、または省略することができる。いくつかの実施形態において、最小リンカーは、プロテアーゼ切断部位またはグリコシル化部位を含まない。

【0361】

いくつかの実施形態において、プライミング受容体は、ヒンジを更に含む。プライミング受容体において使用され得るヒンジリンカーは、分子間ジスルフィド結合を介してキメラポリペプチドのオリゴマー形成を促進する１つ以上のポリペプチドモチーフを含有するオリゴマー化ドメイン（例えば、ヒンジドメイン）を含み得る。これらの事例では、本明細書に開示されるキメラ受容体内で、ヒンジドメインは、概して、ＥＣＤとＴＭＤとの間に配置される可撓性ポリペプチドコネクター領域を含む。したがって、ヒンジドメインは、ＥＣＤとＴＭＤとの間の柔軟性を提供し、また、２つ以上のキメラポリペプチド単量体間の分子間ジスルフィド結合のための部位を提供して、オリゴマー複合体を形成する。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、本明細書に開示されるキメラポリペプチドの二量体形成を促進するモチーフを含む。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、本明細書に開示されるキメラポリペプチド（例えば、ＯＸ４０由来のヒンジドメイン）の三量体形成を促進するモチーフを含む。本開示の組成物及び方法に好適なヒンジポリペプチド配列は、天然に存在するヒンジポリペプチド配列（例えば、天然に存在する免疫グロブリン由来のもの）であり得るか、または所望の及び／または改善された特性、例えば、転写を調節する特性を提供するように操作、設計、または修飾され得る。好適なヒンジポリペプチド配列には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧ１ヒンジドメイン、ＩｇＧ２ヒンジドメイン、ＩｇＧ３ヒンジドメイン、及びＩｇＧ４ヒンジドメインなどのＩｇＧサブクラス、またはそれらの機能的バリアントに由来するものが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ヒンジポリペプチド配列は、１つ以上のＣＸＸＣモチーフを含有する。いくつかの実施形態において、ヒンジポリペプチド配列は、１つ以上のＣＰＰＣモチーフ（配列番号１９１）を含む。

【0362】

ヒンジポリペプチド配列はまた、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、ＣＤ１５２ヒンジドメイン、ＰＤ－１ヒンジドメイン、ＣＴＬＡ４ヒンジドメイン、ＯＸ４０ヒンジドメイン、及びそれらの機能的バリアントに由来し得る。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジドメインまたはその機能的バリアントに由来するヒンジポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、ＣＤ２８ヒンジドメインまたはその機能的バリアントに由来するヒンジポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、ＯＸ４０ヒンジドメインまたはその機能的バリアントに由来するヒンジポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、ＩｇＧ４ヒンジドメインまたはその機能的バリアントに由来するヒンジポリペプチド配列を含む。

【0363】

Ｆｎ Ｎｏｔｃｈ連結ポリペプチドは、Ｆｎ反復とＴＭＤとの間に短いポリペプチド配列を有する、フィブロネクチン反復（Ｆｎ）ドメインを含有するＲｏｂｏ１ ＪＭＤに由来する。Ｆｎ Ｎｏｔｃｈ連結ポリペプチドは、Ｎｏｔｃｈ陰性調節領域（ＮＲＲ）またはＮｏｔｃｈ ＨＤドメインを含有しない。Ｆｎ連結ポリペプチドは、１、２、３、４、または５個のＦｎ反復を含有し得る。いくつかの実施形態において、キメラ受容体は、約１～約５個のＦｎ反復、約１～約３個のＦｎ反復、または約２～約３個のＦｎ反復を有するＦｎ連結ポリペプチドを含む。Ｆｎ反復とＴＭＤとの間の短いポリペプチド配列は、約２～約３０アミノ酸残基であり得る。いくつかの実施形態において、短いポリペプチド配列は、任意の配列の約５～約２０個のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態において、短いポリペプチド配列は、任意の配列の約５～約２０個の天然に存在するアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態において、短いポリペプチド配列は、任意の配列の約５～約２０個のアミノ酸であり得るが、１つ以下のプロリンを有する。いくつかの実施形態において、短いポリペプチド配列は、約５～約２０個のアミノ酸であり得、アミノ酸の約５０％以上がグリシンである。いくつかの実施形態において、短いポリペプチド配列は、約５～約２０個のアミノ酸であり得、アミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、及びアラニンから選択される。いくつかの実施形態において、Ｆｎ連結ポリペプチド配列の長さ及びアミノ酸組成は、ＥＣＤ及びＴＭＤの互いに対する配向及び／または近接性を改変して、本開示のキメラポリペプチドの所望の活性を達成するように変化する。

【0364】

移行阻止配列（Ｓｔｏｐ－Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
いくつかの実施形態において、プライミング受容体は、膜貫通ドメインと細胞内ドメインとの間に移行阻止配列（ＳＴＳ）を更に含む。ＳＴＳは、荷電した疎脂性配列を含む。いずれの理論にも拘束されることなく、ＳＴＳは、膜アンカーとして機能し、細胞内ドメインの形質膜への通過を防止すると考えられている。プライミング受容体におけるＳＴＳドメインの使用は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０２１０６１８７２に記載されている。非限定の例示的なＳＴＳ配列としては、ＡＰＬＰ１、ＡＰＬＰ２、ＡＰＰ、ＴＧＢＲ３、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＸＣＬ１６、ＣＸ３ＣＬ１、ＤＡＧ１、ＤＣＣ、ＤＮＥＲ、ＤＳＧ２、ＣＤＨ１、ＧＨＲ、ＨＬＡ－Ａ、ＩＦＮＡＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ１Ｒ１、ＥＲＮ２、ＫＣＮＥ１、ＫＣＮＥ２、ＣＨＬ１、ＬＲＰｌ、ＬＲＰ２、ＬＲＰ１８、ＰＴＰＲＦ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ３Ｂ、ＮＰＲ３、ＮＧＦＲ、ＰＬＸＤＣ２、ＰＡＭ、ＡＧＥＲ、ＲＯＢＯｌ、ＳＯＲＣＳ３、ＳＯＲＣＳ１、ＳＯＲＬ１、ＳＤＣ１、ＳＤＣ２、ＳＰＮ、ＴＹＲ、ＴＹＲＰ１、ＤＣＴ、ＶＡＳＮ、ＦＬＴ１、ＣＤＨ５、ＰＫＴＦＤ１、ＮＥＣＴＩＮｌ、ＫＬ、ＩＬ６Ｒ、ＥＦＮＢ１、ＣＤ４４、ＣＬＳＴＮ１、ＬＲＰ８、ＰＣＤＨＧＣ３、ＮＲＧ１、ＬＲＰ１Ｂ、ＪＡＧ２、ＥＦＮＢ２、ＤＬＬ１、ＣＬＳＴＮ２、ＥＰＣＡＭ、ＥｒｂＢ４、ＫＣＮＥ３、ＣＤＨ２、ＮＲＧ２、ＰＴＰＲＫ、ＢＴＣ、ＥＰＨＡ４、ＩＬ１Ｒ２、ＫＣＮＥ４、ＳＣＮ２Ｂ、Ｎｒａｄｄ、ＰＴＰＲＭ、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、及びＮｏｔｃｈ４ ＳＴＳ配列が挙げられる。いくつかの実施形態において、ＳＴＳは、膜貫通ドメインに対して異種である。いくつかの実施形態において、ＳＴＳは、膜貫通ドメインに対して相同である。ＳＴＳ配列は、ＷＯ２０２１０６１８７２（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。

【0365】

いくつかの実施形態において、移行阻止配列は、配列番号２０に記載の配列を含む。

【0366】

ＡＬＰＧ／Ｐ抗体及び抗原結合断片
いくつかの態様において、胎盤／生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ／Ｐ）抗体または抗原結合断片が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗原結合部分は、抗体、ナノボディ、ダイアボディ、トリアボディ、またはミニボディ、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、またはその機能的断片からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗原結合部分は、ｓｃＦｖを含む。抗原結合部分は、天然に存在するアミノ酸配列を含み得るか、または所望の特性及び／または改善された特性、例えば、増加した結合親和性を提供するように操作、設計、または修飾することができる。

【0367】

一態様において、胎盤／生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ／Ｐ）に結合する単離された抗体またはそれらの抗原結合断片であって、単離された抗体またはそれらの抗原結合断片が、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列であって、ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１、１７３、１７４、１７５または１７６に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号２、１７７、１７８、１７９または１８０に記載の配列を含み、かつＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号３、１８１または１８２に記載の配列を含む、ＶＨ鎖配列と、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３の３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列であって、ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号４、１８３または１８４に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号５、１８５または１８６に記載の配列を含み、かつＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号６または１８７に記載の配列を含む、ＶＬ鎖配列と、を含む、単離された抗体またはそれらの抗原結合断片が、本明細書で提供される。

【0368】

いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列と、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３の３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列と、を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ鎖配列は、配列番号７に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＬ鎖配列は、配列番号８に記載の配列を含む。

【0369】

いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片のＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号３、１８１または１８２のＣＤＲ－Ｈ３と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号２、１７７、１７８、１７９または１８０のＣＤＲ－Ｈ２と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１、１７３、１７４、１７５または１７６のＣＤＲ－Ｈ１と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ－Ｈ３は、最大１、２、３、４、５、６、７または８つのアミノ酸置換を有する配列番号３、１８１または１８２のＣＤＲ－Ｈ３であり、ＣＤＲ－Ｈ２は、最大１、２、３、４、５、６、７または８つのアミノ酸置換を有する配列番号２、１７７、１７８、１７９または１８０のＣＤＲ－Ｈ２であり、ＣＤＲ－Ｈ１は、最大１、２、３、４または５つのアミノ酸置換を有する配列番号１、１７３、１７４、１７５または１７６のＣＤＲ－Ｈ１である。

【0370】

いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片のＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号６または１８７のＣＤＲ－Ｌ３と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号５、１８５または１８６のＣＤＲ－Ｌ２と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号４、１８３または１８４のＣＤＲ－Ｌ１と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ－Ｌ３は、最大１、２、３、４、５、６、７または８つのアミノ酸置換を有する配列番号６または１８７のＣＤＲ－Ｌ３であり、ＣＤＲ－Ｌ２は、最大１、２、３、４、５、６、７または８つのアミノ酸置換を有する配列番号５、１８５または１８６のＣＤＲ－Ｌ２であり、ＣＤＲ－Ｌ１は、最大１、２、３、４または５つのアミノ酸置換を有する配列番号４、１８３または１８４のＣＤＲ－Ｌ１である。

【0371】

いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、配列番号７に記載のＶＨドメインの１～３つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗原結合ドメインは、配列番号７に記載のＶＨドメインの２～３つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗原結合ドメインは、配列番号７に記載のＶＨドメインの３つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、配列番号８に記載のＶＬドメインの１～３つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗原結合ドメインは、配列番号８に記載のＶＬドメインの２～３つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗原結合ドメインは、配列番号８に記載のＶＬドメインの３つのＣＤＲを含む。いくつかの態様において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲである。いくつかの態様において、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲである。いくつかの態様において、ＣＤＲは、ＡｂＭ ＣＤＲである。いくつかの態様において、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔ ＣＤＲである。いくつかの態様において、ＣＤＲは、ＩＭＧＴ ＣＤＲである。

【0372】

いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、配列番号７に記載のＶＨ配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有するＶＨ配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗原結合ドメインは、最大１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個または２５個のアミノ酸置換を有する、配列番号７で提供されるＶＨ配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、配列番号８に記載のＶＬ配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有するＶＬ配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＡＬＰＧ／Ｐ抗原結合ドメインは、最大１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個または２５個のアミノ酸置換を有する、配列番号８で提供されるＶＬ配列を含む。いくつかの態様において、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態において、この段落に記載される抗原結合ドメインは、「バリアント」と本明細書で称される。いくつかの実施形態において、そのようなバリアントは、例えば、親和性成熟、部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発、または当該技術分野で既知のもしくは本明細書に記載されるいずれかの他の方法によって、本明細書で提供される配列から導出される。いくつかの実施形態において、そのようなバリアントは、本明細書で提供される配列から導出されず、例えば、抗体または抗原結合ドメインを得るための本明細書で提供される方法によりデノボで単離され得る。

【0373】

いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、重鎖可変（ＶＨ）領域であって、（組み合わされた）ＶＨ ＣＤＲ１、２及び３の完全セットが、配列番号７のＣＤＲ１、２及び３と少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）の配列同一性を有する、ＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、重鎖可変（ＶＨ）領域であって、（組み合わされた）ＶＨ ＣＤＲ１、２及び３の完全セットが、配列番号７のＣＤＲ１、２及び３と少なくとも８５％（例えば、８５％、９０％、９５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）の配列同一性を有する、ＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、重鎖可変（ＶＨ）領域であって、（組み合わされた）ＶＨ ＣＤＲ１、２及び３の完全セットが、配列番号７のＣＤＲ１、２及び３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９５％、少なくとも９５％）の配列同一性を有する、ＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、重鎖可変（ＶＨ）領域であって、（組み合わされた）ＶＨ ＣＤＲ１、２及び３の完全セットが、配列番号７のＣＤＲ１、２及び３と少なくとも９５％の配列同一性を有する、ＶＨ領域を含む。

【0374】

いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変（ＶＬ）領域であって、（組み合わされた）ＶＬ ＣＤＲ１、２及び３の完全セットが、配列番号８のＣＤＲ１、２及び３と少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）の配列同一性を有する、ＶＬ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変（ＶＬ）領域であって、（組み合わされた）ＶＬ ＣＤＲ１、２及び３の完全セットが、配列番号８のＣＤＲ１、２及び３と少なくとも８５％（例えば、８５％、９０％、９５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）の配列同一性を有する、ＶＬ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変（ＶＬ）領域であって、（組み合わされた）ＶＬ ＣＤＲ１、２及び３の完全セットが、配列番号８のＣＤＲ１、２及び３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９５％、少なくとも９５％）の配列同一性を有する、ＶＬ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変（ＶＬ）領域であって、（組み合わされた）ＶＬ ＣＤＲ１、２及び３の完全セットが、配列番号８のＣＤＲ１、２及び３と少なくとも９５％の配列同一性を有する、ＶＬ領域を含む。

【0375】

いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、重鎖可変（ＶＨ）領域であって、（組み合わされた）ＶＨ ＣＤＲ１、２及び３の完全セットが、配列番号７のＣＤＲ１、２及び３と少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）の配列同一性を有する、ＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変（ＶＬ）領域であって、（組み合わされた）ＶＬ ＣＤＲ１、２及び３の完全セットが、配列番号８のＣＤＲ１、２及び３と少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）の配列同一性を有する、ＶＬ領域を含む。

【0376】

いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、ＶＨ領域は、
（ｉ）配列番号１、１７３、１７４、１７５または１７６に対して最大２つ（例えば、１つ、２つ、０）のアミノ酸修飾を有する配列を含むＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、
（ｉｉ）配列番号２、１７７、１７８、１７９または１８０に対して最大２つ（例えば、１つ、２つ、０）のアミノ酸修飾を有する配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、
（ｉｉｉ）配列番号３、１８１または１８２に対して最大２つ（例えば、１つ、２つ、０）のアミノ酸修飾を有する配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、
（ｉｖ）配列番号４、１８３または１８４に対して最大２つ（例えば、１つ、２つ、０）のアミノ酸修飾を有する配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、
（ｖ）配列番号５、１８５または１８６に対して最大２つ（例えば、１つ、２つ、０）のアミノ酸修飾を有する配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、及び
（ｖｉ）配列番号６または１８７に対して最大２つ（例えば、１つ、２つ、０）のアミノ酸修飾を有する配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む。

【0377】

いくつかの実施形態において、各々のアミノ酸修飾は、存在する場合、保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態において、各々のアミノ酸修飾は、存在する場合、表Ａ１に列挙される保存的アミノ酸置換である。

【0378】

いくつかの実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号１、１７３、１７４、１７５または１７６に対して最大１つのアミノ酸修飾を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２、１７７、１７８、１７９または１８０に対して最大１つのアミノ酸修飾を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号３、１８１または１８２に対して最大１つのアミノ酸修飾を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号４、１８３または１８４に対して最大１つのアミノ酸修飾を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号５、１８５または１８６に対して最大１つのアミノ酸修飾を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号６または１８７に対して最大１つのアミノ酸修飾を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、最大１つのアミノ酸修飾は、アミノ酸置換である。いくつかの実施形態において、最大１つのアミノ酸修飾は、保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態において、最大１つのアミノ酸修飾は、アミノ酸欠失である。いくつかの実施形態において、最大１つのアミノ酸修飾は、アミノ酸付加である。

【0379】

いくつかの実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号１に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号３に記載の配列を含む。

【0380】

いくつかの実施形態において、ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号４に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号５に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号６に記載の配列を含む。

【0381】

いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、ＶＨ領域は、
（ｉ）配列番号１に記載の配列を含むＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、
（ｉｉ）配列番号２に記載の配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、
（ｉｉｉ）配列番号３に記載の配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、
（ｉｖ）配列番号４に記載の配列を含むＶＬ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、
（ｖ）配列番号５に記載の配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、及び
（ｉｖｉ）配列番号６に記載の配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む。

【0382】

いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、重鎖可変（ＶＨ）ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨ領域であって、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号１、２及び３の配列を含む、ＶＨ領域と、軽鎖可変（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬ領域であって、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号４、５及び６の配列を含む、ＶＬ領域と、を含む。

【0383】

いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、配列番号７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）領域と、配列番号８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）領域と、を含む。

【0384】

いくつかの実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３配列は、ヒトＶＨフレームワークにおいて存在する。

【0385】

いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、配列番号７と少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）の配列同一性を有する重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、配列番号７と少なくとも８５％（例えば、８５％、９０％、９５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）の配列同一性を有する重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、配列番号７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９５％、少なくとも９５％）の配列同一性を有する重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、配列番号７と少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。

【0386】

いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、配列番号８と少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）の配列同一性を有する軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、配列番号８と少なくとも８５％（例えば、８５％、９０％、９５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）の配列同一性を有する軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、配列番号８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９５％、少なくとも９５％）の配列同一性を有する軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、配列番号８と少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。

【0387】

いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、配列番号７と少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）の配列同一性を有する重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、配列番号８と少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）の配列同一性を有する軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。

【0388】

いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、配列番号７の重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、配列番号８の軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。

【0389】

いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、ヒトＡＬＰＧ／Ｐに特異的に結合する。

【0390】

いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、ヒトＡＬＰＧ／Ｐに、約１０^－９Ｍ～約１０^－６ＭのＫ_Ｄで結合する。いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、ヒトＡＬＰＧ／Ｐに、５×１０^－７Ｍ以下のＫ_Ｄで結合する。いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、ヒトＡＬＰＧ／Ｐに、１×１０^－７Ｍ以下のＫ_Ｄで結合する。いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、ヒトＡＬＰＧ／Ｐに、５×１０^－８Ｍ以下のＫ_Ｄで結合する。いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、ヒトＡＬＰＧ／Ｐに、２×１０^－８Ｍ以下のＫ_Ｄで結合する。いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、ヒトＡＬＰＧ／Ｐに、１×１０^－８Ｍ以下のＫ_Ｄで結合する。いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、ヒトＡＬＰＧ／Ｐに、１×１０^－９Ｍ以下のＫ_Ｄで結合する。

【0391】

キメラ受容体
一態様において、メソテリン（ＭＳＬＮ）に結合するキメラ受容体であって、キメラ受容体が、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１４、２０２、２０３、２０４または２０５に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１５、２０６、２０７、２０８または２０９に記載の配列を含み、かつＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１６、２１０または２１１に記載の配列を含む、キメラ受容体が、本明細書で提供される。

【0392】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ鎖配列は、配列番号１７に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ鎖配列は、配列番号１７に記載の配列を含む。

【0393】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体のＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号１６、２１０または２１１のＣＤＲ－Ｈ３と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号１５、２０６、２０７、２０８または２０９のＣＤＲ－Ｈ２と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１４、２０２、２０３、２０４または２０５のＣＤＲ－Ｈ１と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ－Ｈ３は、最大１、２、３、４、５、６、７または８つのアミノ酸置換を有する配列番号１６、２１０または２１１のＣＤＲ－Ｈ３であり、ＣＤＲ－Ｈ２は、最大１、２、３、４、５、６、７または８つのアミノ酸置換を有する配列番号１５、２０６、２０７、２０８または２０９のＣＤＲ－Ｈ２であり、ＣＤＲ－Ｈ１は、最大１、２、３、４または５つのアミノ酸置換を有する配列番号１４、２０２、２０３、２０４または２０５のＣＤＲ－Ｈ１である。

【0394】

いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＭＳＬＮキメラ受容体は、配列番号１７に記載のＶＨドメインの１～３つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＭＳＬＮキメラ受容体は、配列番号１７に記載のＶＨドメインの２～３つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＭＳＬＮキメラ受容体は、配列番号１７に記載のＶＨドメインの３つのＣＤＲを含む。いくつかの態様において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲである。いくつかの態様において、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲである。いくつかの態様において、ＣＤＲは、ＡｂＭ ＣＤＲである。いくつかの態様において、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔ ＣＤＲである。いくつかの態様において、ＣＤＲは、ＩＭＧＴ ＣＤＲである。

【0395】

いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＭＳＬＮキメラ受容体は、配列番号１７に記載のＶＨ配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有するＶＨ配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＭＳＬＮキメラ受容体は、最大１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個または２５個のアミノ酸置換を有する、配列番号１７で提供されるＶＨ配列を含む。いくつかの態様において、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態において、この段落に記載される抗原結合ドメインは、「バリアント」と本明細書で称される。いくつかの実施形態において、そのようなバリアントは、例えば、親和性成熟、部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発、または当該技術分野で既知のもしくは本明細書に記載されるいずれかの他の方法によって、本明細書で提供される配列から導出される。いくつかの実施形態において、そのようなバリアントは、本明細書で提供される配列から導出されず、例えば、抗体または抗原結合ドメインを得るための本明細書で提供される方法によりデノボで単離され得る。

【0396】

いくつかの態様において、メソテリン（ＭＳＬＮ）に結合するキメラ受容体であって、キメラ受容体が、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨＨ）鎖配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１０に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１１に記載の配列を含み、かつＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１２に記載の配列を含む、キメラ受容体が、本明細書で提供される。

【0397】

いくつかの態様において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨＨ）鎖配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨＨ鎖配列は、配列番号１３に記載の配列を含む。

【0398】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体のＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号１２、２００または２０１のＣＤＲ－Ｈ３と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号１１、１９６、１９７、１９８または１９９のＣＤＲ－Ｈ２と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１０、１９２、１９３、１９４または１９５のＣＤＲ－Ｈ１と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ－Ｈ３は、最大１、２、３、４、５、６、７または８つのアミノ酸置換を有する配列番号１２、２００または２０１のＣＤＲ－Ｈ３であり、ＣＤＲ－Ｈ２は、最大１、２、３、４、５、６、７または８つのアミノ酸置換を有する配列番号１１、１９６、１９７、１９８または１９９のＣＤＲ－Ｈ２であり、ＣＤＲ－Ｈ１は、最大１、２、３、４または５つのアミノ酸置換を有する配列番号１０、１９２、１９３、１９４または１９５のＣＤＲ－Ｈ１である。

【0399】

いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＭＳＬＮキメラ受容体は、配列番号１３に記載のＶＨＨドメインの１～３つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＭＳＬＮキメラ受容体は、配列番号１３に記載のＶＨＨドメインの２～３つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗原結合ドメインは、配列番号１３に記載のＶＨＨドメインの３つのＣＤＲを含む。いくつかの態様において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲである。いくつかの態様において、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲである。いくつかの態様において、ＣＤＲは、ＡｂＭ ＣＤＲである。いくつかの態様において、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔ ＣＤＲである。いくつかの態様において、ＣＤＲは、ＩＭＧＴ ＣＤＲである。

【0400】

いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＭＳＬＮキメラ受容体は、配列番号１３に記載のＶＨＨ配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有するＶＨＨ配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗原結合ドメインは、最大１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個または２５個のアミノ酸置換を有する、配列番号１３で提供されるＶＨＨ配列を含む。いくつかの態様において、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態において、この段落に記載される抗原結合ドメインは、「バリアント」と本明細書で称される。いくつかの実施形態において、そのようなバリアントは、例えば、親和性成熟、部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発、または当該技術分野で既知のもしくは本明細書に記載されるいずれかの他の方法によって、本明細書で提供される配列から導出される。いくつかの実施形態において、そのようなバリアントは、本明細書で提供される配列から導出されず、例えば、抗体または抗原結合ドメインを得るための本明細書で提供される方法によりデノボで単離され得る。

【0401】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、重鎖可変（ＶＨ）領域であって、（組み合わされた）ＶＨ ＣＤＲ１、２及び３の完全セットが、配列番号１３または１７のうちの１つのＣＤＲ１、２及び３と少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）の配列同一性を有する、ＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、重鎖可変（ＶＨ）領域であって、（組み合わされた）ＶＨ ＣＤＲ１、２及び３の完全セットが、配列番号１３または１７のうちの１つのＣＤＲ１、２及び３と少なくとも８５％（例えば、８５％、９０％、９５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）の配列同一性を有する、ＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、重鎖可変（ＶＨ）領域であって、（組み合わされた）ＶＨ ＣＤＲ１、２及び３の完全セットが、配列番号１３または１７のうちの１つのＣＤＲ１、２及び３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９５％、少なくとも９５％）の配列同一性を有する、ＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、重鎖可変（ＶＨ）領域であって、（組み合わされた）ＶＨ ＣＤＲ１、２及び３の完全セットが、配列番号１３または１７のうちの１つのＣＤＲ１、２及び３と少なくとも９５％の配列同一性を有する、ＶＨ領域を含む。

【0402】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、重鎖可変（ＶＨ）領域であって、（組み合わされた）ＶＨ ＣＤＲ１、２及び３の完全セットが、配列番号１３のＣＤＲ１、２及び３と少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）の配列同一性を有する、ＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、重鎖可変（ＶＨ）領域であって、（組み合わされた）ＶＨ ＣＤＲ１、２及び３の完全セットが、配列番号１７のＣＤＲ１、２及び３と少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）の配列同一性を有する、ＶＨ領域を含む。

【0403】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、ＶＨ領域は、
（ｉ）配列番号１０、１９２、１９３、１９４または１９５に対して最大２つ（例えば、１つ、２つ、０）のアミノ酸修飾を有する配列を含むＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、
（ｉｉ）配列番号１１、１９６、１９７、１９８または１９９に対して最大２つ（例えば、１つ、２つ、０）のアミノ酸修飾を有する配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号１２、２００または２０１に対して最大２つ（例えば、１つ、２つ、０）のアミノ酸修飾を有する配列を含むＶＨ ＣＤＲ３を含む。

【0404】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、ＶＨ領域は、
（ｉ）配列番号１４、２０２、２０３、２０４または２０５に対して最大２つ（例えば、１つ、２つ、０）のアミノ酸修飾を有する配列を含むＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、
（ｉｉ）配列番号１５、２０６、２０７、２０８または２０９に対して最大２つ（例えば、１つ、２つ、０）のアミノ酸修飾を有する配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号１６、２１０または２１１に対して最大２つ（例えば、１つ、２つ、０）のアミノ酸修飾を有する配列を含むＶＨ ＣＤＲ３を含む。

【0405】

いくつかの実施形態において、各々のアミノ酸修飾は、存在する場合、保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態において、各々のアミノ酸修飾は、存在する場合、表Ａ１に列挙される保存的アミノ酸置換である。

【0406】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号１０、１９２、１９３、１９４または１９５に対して最大１つのアミノ酸修飾を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号１１、１９６、１９７、１９８または１９９に対して最大１つのアミノ酸修飾を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号１２、２００または２０１に対して最大１つのアミノ酸修飾を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号１４、２０２、２０３、２０４または２０５に対して最大１つのアミノ酸修飾を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号１５、２０６、２０７、２０８または２０９に対して最大１つのアミノ酸修飾を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号１６、２１０または２１１に対して最大１つのアミノ酸修飾を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、最大１つのアミノ酸修飾は、アミノ酸置換である。いくつかの実施形態において、最大１つのアミノ酸修飾は、保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態において、最大１つのアミノ酸修飾は、アミノ酸欠失である。いくつかの実施形態において、最大１つのアミノ酸修飾は、アミノ酸付加である。

【0407】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号１０に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号１１に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号１２に記載の配列を含む。

【0408】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号１４に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号１５に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号１６に記載の配列を含む。

【0409】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、ＶＨ領域は、
（ｉ）配列番号１０に記載の配列を含むＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、
（ｉｉ）配列番号１１に記載の配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号１２に記載の配列を含むＶＨ ＣＤＲ３を含む。

【0410】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、ＶＨ領域は、
（ｉ）配列番号１４に記載の配列を含むＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、
（ｉｉ）配列番号１５に記載の配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号１６に記載の配列を含むＶＨ ＣＤＲ３を含む。

【0411】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、重鎖可変（ＶＨ）ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨ領域であって、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号１０、１１及び１２の配列を含む、ＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、重鎖可変（ＶＨ）ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨ領域であって、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号１４、１５及び１６の配列を含む、ＶＨ領域を含む。

【0412】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、配列番号１３または１７のうちの１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、配列番号１３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、配列番号１７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。

【0413】

いくつかの実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３配列は、ヒトＶＨフレームワークにおいて存在する。

【0414】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、配列番号１３または１７のうちの１つと少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）の配列同一性を有する重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、配列番号１３または１７のうちの１つと少なくとも８５％（例えば、８５％、９０％、９５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）の配列同一性を有する重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、配列番号１３または１７のうちの１つと少なくとも９０％（例えば、９０％、９５％、少なくとも９５％）の配列同一性を有する重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、配列番号１３または１７のうちの１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。

【0415】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、配列番号１３と少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）の配列同一性を有する重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、配列番号１７と少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）の配列同一性を有する重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。

【0416】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、配列番号１３の重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、配列番号１７の重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。

【0417】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、ヒトＭＳＬＮに特異的に結合する。

【0418】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、ヒトＭＳＬＮに、約１０^－９Ｍ～約１０^－６ＭのＫ_Ｄで結合する。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、ヒトＭＳＬＮに、５×１０^－７Ｍ以下のＫ_Ｄで結合する。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、ヒトＭＳＬＮに、１×１０^－７Ｍ以下のＫ_Ｄで結合する。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、ヒトＭＳＬＮに、５×１０^－８Ｍ以下のＫ_Ｄで結合する。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、ヒトＭＳＬＮに、２×１０^－８Ｍ以下のＫ_Ｄで結合する。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、ヒトＭＳＬＮに、１×１０^－８Ｍ以下のＫ_Ｄで結合する。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、ヒトＭＳＬＮに、１×１０^－９Ｍ以下のＫ_Ｄで結合する。

【0419】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮキメラ受容体は、キメラ抗原受容体またはプライミング受容体である。

【0420】

キメラ抗原受容体
別の態様において、メソテリン（ＭＳＬＮ；ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：１０２３２；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｑ１３４２１）に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含む、キメラ抗原受容体が本明細書で提供される。組換えＣＡＲは、完全なヒト配列、例えば、天然のヒト配列を含むヒトＣＡＲであってもよい。

【0421】

いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体は、抗原結合ドメインを含む細胞外部分を含む。ＣＡＲなどの受容体の抗原認識ドメインは、ＣＡＲの場合、抗原受容体複合体、例えばＴＣＲ複合体を介した活性化を模倣するシグナル伝達成分などの１つ以上の細胞内シグナル伝達成分、及び／または別の細胞表面受容体を介したシグナルに連結させることができる。したがって、いくつかの実施形態において、細胞外結合成分（例えば、リガンド結合または抗原結合ドメイン）は、１つ以上の膜貫通及び細胞内シグナル伝達ドメインに連結される。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、細胞外ドメインに融合される。一実施形態において、受容体内のドメインのうちの１つ、例えば、ＣＡＲと天然に会合する膜貫通ドメインが使用される。いくつかの場合において、膜貫通ドメインは、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を回避し、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、アミノ酸置換によって選択または修飾される。

【0422】

いくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、本明細書に記載される抗原結合ドメインを含む細胞外部分と、細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む。いくつかの実施形態において、抗体または断片は、ｓｃＦｖ、ＶＨ、または単一ドメインＶＨ抗体を含み、細胞内ドメインは、ＩＴＡＭを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３－ゼータ（ＣＤ３）鎖のゼータ鎖のシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体は、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを連結する膜貫通ドメインを含む。

【0423】

いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８ａまたはＣＤ２８の膜貫通部分を含む。細胞外ドメイン及び膜貫通は、直接的または間接的に連結され得る。いくつかの実施形態において、細胞外ドメイン及び膜貫通は、本明細書に記載される任意のものなどのスペーサーによって連結される。いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体は、例えば、膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間にＴ細胞共刺激分子の細胞内ドメインを含有する。いくつかの態様において、Ｔ細胞共刺激分子は、ＣＤ２８または４１ＢＢである。

【0424】

キメラ抗原受容体ＣＤＲ、ＶＨ、ＶＬドメイン
いくつかの態様において、キメラ抗原受容体細胞外抗原結合ドメインは、ＭＳＬＮ抗体またはその抗原結合断片を含む。

【0425】

いくつかの態様において、キメラ抗原受容体細胞外抗原結合ドメインは、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ鎖配列は、配列番号１７に記載の配列を含む。

【0426】

いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体細胞外抗原結合ドメインのＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号１６のＣＤＲ－Ｈ３と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号１５のＣＤＲ－Ｈ２と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１４のＣＤＲ－Ｈ１と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ－Ｈ３は、最大１、２、３、４、５、６、７または８つのアミノ酸置換を有する配列番号１６のＣＤＲ－Ｈ３であり、ＣＤＲ－Ｈ２は、最大１、２、３、４、５、６、７または８つのアミノ酸置換を有する配列番号１５のＣＤＲ－Ｈ２であり、ＣＤＲ－Ｈ１は、最大１、２、３、４または５つのアミノ酸置換を有する配列番号１４のＣＤＲ－Ｈ１である。

【0427】

いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるキメラ抗原受容体細胞外抗原結合ドメインは、配列番号１７に記載のＶＨドメインの１～３つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗原結合ドメインは、配列番号１７に記載のＶＨドメインの２～３つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗原結合ドメインは、配列番号１７に記載のＶＨドメインの３つのＣＤＲを含む。いくつかの態様において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲである。いくつかの態様において、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲである。いくつかの態様において、ＣＤＲは、ＡｂＭ ＣＤＲである。いくつかの態様において、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔ ＣＤＲである。いくつかの態様において、ＣＤＲは、ＩＭＧＴ ＣＤＲである。

【0428】

いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるキメラ抗原受容体細胞外抗原結合ドメインは、配列番号１７に記載のＶＨ配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有するＶＨ配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗原結合ドメインは、最大１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個または２５個のアミノ酸置換を有する、配列番号１７で提供されるＶＨ配列を含む。いくつかの態様において、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態において、この段落に記載される抗原結合ドメインは、「バリアント」と本明細書で称される。いくつかの実施形態において、そのようなバリアントは、例えば、親和性成熟、部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発、または当該技術分野で既知のもしくは本明細書に記載されるいずれかの他の方法によって、本明細書で提供される配列から導出される。いくつかの実施形態において、そのようなバリアントは、本明細書で提供される配列から導出されず、例えば、抗体または抗原結合ドメインを得るための本明細書で提供される方法によりデノボで単離され得る。

【0429】

いくつかの態様において、キメラ抗原受容体細胞外抗原結合ドメインは、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む単一抗体可変重（ＶＨＨ）鎖配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨＨ鎖配列は、配列番号１３に記載の配列を含む。

【0430】

いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体細胞外抗原結合ドメインのＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号１２のＣＤＲ－Ｈ３と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号１１のＣＤＲ－Ｈ２と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１０のＣＤＲ－Ｈ１と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ－Ｈ３は、最大１、２、３、４、５、６、７または８つのアミノ酸置換を有する配列番号１２のＣＤＲ－Ｈ３であり、ＣＤＲ－Ｈ２は、最大１、２、３、４、５、６、７または８つのアミノ酸置換を有する配列番号１１のＣＤＲ－Ｈ２であり、ＣＤＲ－Ｈ１は、最大１、２、３、４または５つのアミノ酸置換を有する配列番号１０のＣＤＲ－Ｈ１である。

【0431】

いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるキメラ抗原受容体細胞外抗原結合ドメインは、配列番号１３に記載のＶＨＨドメインの１～３つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗原結合ドメインは、配列番号１３に記載のＶＨＨドメインの２～３つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗原結合ドメインは、配列番号１３に記載のＶＨＨドメインの３つのＣＤＲを含む。いくつかの態様において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲである。いくつかの態様において、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲである。いくつかの態様において、ＣＤＲは、ＡｂＭ ＣＤＲである。いくつかの態様において、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔ ＣＤＲである。いくつかの態様において、ＣＤＲは、ＩＭＧＴ ＣＤＲである。

【0432】

いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるキメラ抗原受容体細胞外抗原結合ドメインは、配列番号１３に記載のＶＨＨ配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有するＶＨＨ配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗原結合ドメインは、最大１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個または２５個のアミノ酸置換を有する、配列番号１３で提供されるＶＨＨ配列を含む。いくつかの態様において、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態において、この段落に記載される抗原結合ドメインは、「バリアント」と本明細書で称される。いくつかの実施形態において、そのようなバリアントは、例えば、親和性成熟、部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発、または当該技術分野で既知のもしくは本明細書に記載されるいずれかの他の方法によって、本明細書で提供される配列から導出される。いくつかの実施形態において、そのようなバリアントは、本明細書で提供される配列から導出されず、例えば、抗体または抗原結合ドメインを得るための本明細書で提供される方法によりデノボで単離され得る。

【0433】

表Ｃは、示される番号付けスキームによる、配列番号１３のＶＨＨ及び配列番号１７のＶＨＨの例示的なＭＳＬＮ抗原結合ドメインＣＤＲ配列を提供する。

【0434】

【表C】

【0435】

ＣＡＲ膜貫通ドメイン
いくつかの実施形態における膜貫通ドメインは、天然源または合成源のいずれかに由来する。ソースが天然である場合、いくつかの態様において、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来する。膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及び／またはＣＤ１５４のアルファ、ベータまたはゼータ鎖に由来する（すなわち、少なくともその膜貫通領域（複数可）を含む）ものを含む。代替的には、いくつかの実施形態における膜貫通ドメインは、合成である。いくつかの態様において、合成膜貫通ドメインは、主にロイシン及びバリンなどの疎水性残基を含む。いくつかの態様において、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットは、合成膜貫通ドメインの各末端に見出される。いくつかの実施形態において、連結は、リンカー、スペーサー、及び／または膜貫通ドメイン（複数可）によるものである。

【0436】

いくつかの実施形態において、受容体の膜貫通ドメイン、例えば、ＣＡＲは、ヒトＣＤ２８の膜貫通ドメインまたはそのバリアント、例えば、ヒトＣＤ２８（受託番号：Ｐ１０７４７．１）の２７アミノ酸膜貫通ドメインＰ１０７４７．１）である。

【0437】

いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ８ａ ＴＭＤを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ８ａ ＴＭＤは、配列番号２７に記載の配列を含む。

【0438】

ＣＡＲヒンジ
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、スペーサーを更に含み、スペーサーは、免疫グロブリン定常領域、またはそのバリアントもしくは修飾されたバージョン、例えば、ヒンジ領域、例えば、ＣＤ８ａヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジ領域、及び／またはＣＨ１／ＣＬ及び／またはＦｃ領域の少なくとも一部分であってもよく、あるいは、それらの少なくとも一部分を含んでもよい。いくつかの実施形態において、定常領域または部分は、ＩｇＧ４またはＩｇＧ１などのヒトＩｇＧのものである。いくつかの態様において、定常領域の一部分は、抗原認識成分、例えば、ｓｃＦｖと膜貫通ドメインとの間のスペーサー領域として機能する。スペーサーは、スペーサーの非存在下と比較して、抗原結合後の細胞の応答性の増加をもたらす長さであり得る。いくつかの例において、スペーサーは、約１２アミノ酸の長さであるか、または１２アミノ酸以下の長さである。例示的なスペーサーとしては、少なくとも約１０～２２９アミノ酸、約１０～２００アミノ酸、約１０～１７５アミノ酸、約１０～１５０アミノ酸、約１０～１２５アミノ酸、約１０～１００アミノ酸、約１０～７５アミノ酸、約１０～５０アミノ酸、約１０～４０アミノ酸、約１０～３０アミノ酸、約１０～２０アミノ酸、または約１０～１５アミノ酸を有し、列挙された範囲のうちのいずれかの端点間の任意の整数を含むものが挙げられる。いくつかの実施形態において、スペーサー領域は、約１２アミノ酸以下、約１１９アミノ酸以下、または約２２９アミノ酸以下を有する。例示的なスペーサーとしては、ＣＤ８ａヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジ単独、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに連結されたＩｇＧ４ヒンジ、またはＣＨ３ドメインに連結されたＩｇＧ４ヒンジが挙げられる。例示的なスペーサーとしては、Ｈｕｄｅｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９：３１５３または国際特許出願公開第ＷＯ２０１４０３１６８７号に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ＣＡＲヒンジは、ＣＤ８ａヒンジを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ８ａヒンジは、配列番号２６に記載の配列を含む。

【0439】

細胞内シグナル伝達ドメインの中には、天然の抗原受容体を介したシグナル、共刺激受容体と組み合わせたそのような受容体を介したシグナル、及び／または共刺激受容体のみを介したシグナルを模倣または近似するものがある。いくつかの実施形態において、短いオリゴまたはポリペプチドリンカー、例えば、グリシン及びセリンを含有するもの、例えば、グリシンセリンダブレットなどの２～１０アミノ酸の長さのリンカーが存在し、膜貫通ドメインと受容体の細胞質シグナル伝達ドメインとの間に連結を形成する。

【0440】

ＣＡＲ細胞内ドメイン
いくつかの実施形態において、ＣＡＲのライゲーション時に、受容体の細胞質ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫細胞、例えば、受容体を発現するように操作されたＴ細胞の正常なエフェクター機能または応答のうちの少なくとも１つを活性化する。例えば、いくつかの文脈において、受容体は、サイトカインまたは他の因子の分泌などの、細胞溶解活性またはＴヘルパー活性などのＴ細胞の機能を誘導する。いくつかの実施形態において、抗原受容体成分または共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分は、例えば、それがエフェクター機能シグナルを形質導入する場合、無傷の免疫刺激鎖の代わりに使用される。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインまたは複数のドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞質配列、ならびにいくつかの態様において、天然の文脈において、そのような受容体と協調して作用して、抗原受容体係合後のシグナル伝達、及び／またはそのような分子の任意の誘導体もしくはバリアント、及び／または同じ機能能力を有する任意の合成配列を含む。

【0441】

いくつかの態様において、受容体は、ＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する一次細胞質シグナル伝達配列を含む。刺激的に作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含有し得る。一次細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例としては、ＴＣＲまたはＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤＳ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ中の細胞質シグナル伝達分子（複数可）は、ＣＤ３ゼータに由来する細胞質シグナル伝達ドメイン、その一部分、または配列を含有する。

【0442】

いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ゼータ刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能的バリアント、例えば、ヒトＣＤ３ゼータのアイソフォーム３の１１２ ＡＡ細胞質ドメイン（受託番号：Ｐ２０９６３．２）または米国特許第７，４４６，１９０号または米国特許第８，９１１，９９３号に記載のＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。

【0443】

受容体、例えば、ＣＡＲは、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達成分（複数可）を含むことができる。いくつかの実施形態において、受容体は、Ｔ細胞活性化及び細胞毒性を媒介するＴＣＲ ＣＤ３鎖、例えばＣＤ３ゼータ鎖などのＴＣＲ複合体の細胞内成分を含む。したがって、いくつかの態様において、細胞外ドメインは、１つ以上の細胞シグナル伝達モジュールに連結される。いくつかの実施形態において、細胞シグナル伝達モジュールは、ＣＤ３膜貫通ドメイン、ＣＤ３細胞内シグナル伝達ドメイン、及び／または他のＣＤ膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、受容体、例えば、ＣＡＲは、Ｆｃ受容体ガンマ、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２５、またはＣＤ１６などの１つ以上の追加の分子の一部分を更に含む。例えば、いくつかの態様において、ＣＡＲは、ＣＤ３－ゼータまたはＦｃ受容体－ガンマと、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２５またはＣＤ１６との間のキメラ分子を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号２９に記載の配列を含むＣＤ３ゼータ活性化ドメインを含む。

【0444】

いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、４１ＢＢの細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、またはその機能的バリアントもしくは一部分、例えばヒト４－１ＢＢ（受託番号Ｑ０７０１１．１）の４２アミノ酸細胞質ドメイン、または機能的バリアントもしくはその一部分を含む。

【0445】

いくつかの実施形態において、受容体は、細胞質部分に、１つ以上、例えば、２つ以上の共刺激ドメイン及び活性化ドメイン、例えば、一次活性化ドメインを包含する。例示的な受容体としては、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ２８、及び４－１ＢＢの細胞内成分が挙げられる。いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体は、Ｔ細胞共刺激分子の細胞内ドメインを含有する。いくつかの態様において、Ｔ細胞共刺激分子は、４－１ＢＢである。

【0446】

いくつかの実施形態において、受容体は、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、及びＩＣＯＳなどの共刺激受容体のシグナル伝達ドメイン及び／または膜貫通部分を含む。いくつかの態様において、同じ受容体は、活性化成分及び共刺激成分の両方を含む。

【0447】

ある特定の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３（例えば、ＣＤ３－ゼータ）細胞内ドメインに連結されたＣＤ８ａ膜貫通及びシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインに連結された４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＴＮＦＲＳＦ９）共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、４－１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号２８に記載の配列を含む。

【0448】

いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号３０、３１、３２または３３に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号３０に記載の配列を含む。

【0449】

いくつかの実施形態において、ＣＡＲまたは他の抗原受容体は、細胞表面マーカーなどのマーカーを更に含み、これを使用して、切断ＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）などの細胞表面受容体の切断バージョンなどの受容体を発現するための細胞の形質導入または操作を確認することができる。いくつかの態様において、マーカーは、ＣＤ３４、神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）、または上皮成長因子受容体（例えば、ｔＥＧＦＲ）の全部または一部（例えば、切断形態）を含む。いくつかの実施形態において、マーカーをコードする核酸は、リンカー配列、例えば、切断可能なリンカー配列またはリボソームスキップ配列、例えば、Ｔ２Ａをコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結される。ＷＯ２０１４０３１６８７を参照されたい。いくつかの実施形態において、Ｔ２Ａリボソームスイッチによって分離されたＣＡＲ及びＥＧＦＲｔをコードするコンストラクトの導入は、ＥＧＦＲｔがそのようなコンストラクトを発現する細胞を検出するマーカーとして使用できるように、同じコンストラクト由来の２つのタンパク質を発現することができる。いくつかの実施形態において、マーカー、及び任意選択でリンカー配列は、公開された特許出願第ＷＯ２０１４０３１６８７号に開示されているように、任意のものであり得る。例えば、マーカーは、任意選択で、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列などのリンカー配列に連結された切断ＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）であり得る。

【0450】

いくつかの実施形態において、マーカーは、Ｔ細胞上に天然に見出されない、またはＴ細胞の表面上に天然に見出されない分子、例えば、細胞表面タンパク質、またはその一部分である。

【0451】

いくつかの実施形態において、分子は、非自己分子、例えば、非自己タンパク質、すなわち、細胞が養子移入される宿主の免疫系によって「自己」として認識されない分子である。

【0452】

いくつかの実施形態において、マーカーは、治療機能を果たさない、及び／または遺伝子操作のため、例えば、成功裏に操作された細胞を選択するためのマーカーとして使用される以外の効果を生じない。他の実施形態において、マーカーは、治療用分子、または他の方法でいくらかの所望の効果を発揮する分子、例えば、インビボで遭遇される細胞のためのリガンド、例えば、養子移入時及びリガンドとの遭遇時に細胞の応答を増強及び／または減衰させるための共刺激または免疫チェックポイント分子であってもよい。

【0453】

ＣＡＲは、１つ以上の天然に存在するアミノ酸の代わりに、１つまたは修飾された合成アミノ酸を含んでもよい。例示的な修飾アミノ酸としては、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α－アミノｎ－デカン酸、ホモセリン、Ｓ－アセチルアミノメチルシステイン、トランス－３－及びトランス－４－ヒドロキシプロリン、４－アミノフェニルアラニン、４－ニトロフェニルアラニン、４－クロロフェニルアラニン、４－カルボキシフェニルアラニン、（３－フェニルセリン（３－ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α－ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン－２－カルボン酸、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’－ベンジル－Ｎ’－メチル－リジン、Ｎ’，Ｎ’－ジベンジル－リジン、６－ヒドロキシリジン、オルニチン、α－アミノシクロペンタンカルボン酸、α－アミノシクロヘキサンカルボン酸、α－アミノシクロヘプタンカルボン酸、α－（２－アミノ－２－ノルボルナン）－カルボン酸、α，γ－ジアミノ酪酸、α，γ－ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、及びα－ｔｅｒｔブチルグリシンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0454】

例えば、いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、本明細書に記載される単鎖抗体（ｓｄＡｂ、例えば、ＶＨ領域のみを含有するもの）、ＶＨドメイン及びｓｃＦｖを含む抗体またはその断片と、スペーサー、例えば、ＣＤ８ａヒンジと、ＣＤ８ａ膜貫通ドメインと、４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインと、を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、本明細書に記載されるｓｄＡｂ及びｓｃＦｖを含む抗体または断片と、スペーサー、例えば、ＣＤ８ａヒンジと、ＣＤ８ａ膜貫通ドメインと、４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインと、を含む。

【0455】

ＭＳＬＮ抗体及び抗原結合断片
いくつかの態様において、ＭＳＬＮ抗体またはそれらの抗原結合断片が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ抗原結合部分は、抗体、ナノボディ、ダイアボディ、トリアボディ、またはミニボディ、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、またはその機能的断片からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗原結合部分は、ｓｃＦｖを含む。抗原結合部分は、天然に存在するアミノ酸配列を含み得るか、または所望の特性及び／または改善された特性、例えば、増加した結合親和性を提供するように操作、設計、または修飾することができる。

【0456】

いくつかの態様において、メソテリン（ＭＳＬＮ）に結合する単離された抗体またはそれらの抗原結合断片であって、単離された抗体またはそれらの抗原結合断片が、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨＨ）鎖配列を含む単一ドメイン抗体を含み、ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１０に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１１に記載の配列を含み、かつＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１２に記載の配列を含む、単離された抗体またはそれらの抗原結合断片が、本明細書で提供される。

【0457】

いくつかの態様において、ＭＳＬＮ抗体または抗原結合断片は、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む単一ドメイン抗体可変重（ＶＨＨ）鎖配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨＨ鎖配列は、配列番号１３に記載の配列を含む。

【0458】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ抗体または抗原結合断片のＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号１２、２００または２０１のＣＤＲ－Ｈ３と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号１１、１９６、１９７、１９８または１９９のＣＤＲ－Ｈ２と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１０、１９２、１９３、１９４または１９５のＣＤＲ－Ｈ１と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ－Ｈ３は、最大１、２、３、４、５、６、７または８つのアミノ酸置換を有する配列番号１２、２００または２０１のＣＤＲ－Ｈ３であり、ＣＤＲ－Ｈ２は、最大１、２、３、４、５、６、７または８つのアミノ酸置換を有する配列番号１１、１９６、１９７、１９８または１９９のＣＤＲ－Ｈ２であり、ＣＤＲ－Ｈ１は、最大１、２、３、４または５つのアミノ酸置換を有する配列番号１０、１９２、１９３、１９４または１９５のＣＤＲ－Ｈ１である。

【0459】

いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＭＳＬＮ抗体または抗原結合断片は、配列番号１３に記載のＶＨＨドメインの１～３つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗原結合ドメインは、配列番号１３に記載のＶＨＨドメインの２～３つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗原結合ドメインは、配列番号１３に記載のＶＨＨドメインの３つのＣＤＲを含む。いくつかの態様において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲである。いくつかの態様において、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲである。いくつかの態様において、ＣＤＲは、ＡｂＭ ＣＤＲである。いくつかの態様において、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔ ＣＤＲである。いくつかの態様において、ＣＤＲは、ＩＭＧＴ ＣＤＲである。

【0460】

いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＭＳＬＮ抗体または抗原結合断片は、配列番号１３に記載のＶＨＨ配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有するＶＨＨ配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗原結合ドメインは、最大１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個または２５個のアミノ酸置換を有する、配列番号１３で提供されるＶＨＨ配列を含む。いくつかの態様において、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態において、この段落に記載される抗原結合ドメインは、「バリアント」と本明細書で称される。いくつかの実施形態において、そのようなバリアントは、例えば、親和性成熟、部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発、または当該技術分野で既知のもしくは本明細書に記載されるいずれかの他の方法によって、本明細書で提供される配列から導出される。いくつかの実施形態において、そのようなバリアントは、本明細書で提供される配列から導出されず、例えば、抗体または抗原結合ドメインを得るための本明細書で提供される方法によりデノボで単離され得る。

【0461】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ抗体または抗原結合断片は、重鎖可変（ＶＨ）領域であって、（組み合わされた）ＶＨ ＣＤＲ１、２及び３の完全セットが、配列番号１３のＣＤＲ１、２及び３と少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）の配列同一性を有する、ＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ抗体または抗原結合断片は、重鎖可変（ＶＨ）領域であって、（組み合わされた）ＶＨ ＣＤＲ１、２及び３の完全セットが、配列番号１３のＣＤＲ１、２及び３と少なくとも８５％（例えば、８５％、９０％、９５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）の配列同一性を有する、ＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ抗体または抗原結合断片は、重鎖可変（ＶＨ）領域であって、（組み合わされた）ＶＨ ＣＤＲ１、２及び３の完全セットが、配列番号１３のＣＤＲ１、２及び３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９５％、少なくとも９５％）の配列同一性を有する、ＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ抗体または抗原結合断片は、重鎖可変（ＶＨ）領域であって、（組み合わされた）ＶＨ ＣＤＲ１、２及び３の完全セットが、配列番号１３のＣＤＲ１、２及び３と少なくとも９５％の配列同一性を有する、ＶＨ領域を含む。

【0462】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ抗体または抗原結合断片は、重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、ＶＨ領域は、
（ｉ）配列番号１０、１９２、１９３、１９４または１９５に対して最大２つ（例えば、１つ、２つ、０）のアミノ酸修飾を有する配列を含むＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、
（ｉｉ）配列番号１１、１９６、１９７、１９８または１９９に対して最大２つ（例えば、１つ、２つ、０）のアミノ酸修飾を有する配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号１２、２００または２０１に対して最大２つ（例えば、１つ、２つ、０）のアミノ酸修飾を有する配列を含むＶＨ ＣＤＲ３を含む。

【0463】

いくつかの実施形態において、各々のアミノ酸修飾は、存在する場合、保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態において、各々のアミノ酸修飾は、存在する場合、表Ａ１に列挙される保存的アミノ酸置換である。

【0464】

いくつかの実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号１０、１９２、１９３、１９４または１９５に対して最大１つのアミノ酸修飾を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号１１、１９６、１９７、１９８または１９９に対して最大１つのアミノ酸修飾を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号１２、２００または２０１に対して最大１つのアミノ酸修飾を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、最大１つのアミノ酸修飾は、アミノ酸置換である。いくつかの実施形態において、最大１つのアミノ酸修飾は、保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態において、最大１つのアミノ酸修飾は、アミノ酸欠失である。いくつかの実施形態において、最大１つのアミノ酸修飾は、アミノ酸付加である。

【0465】

いくつかの実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号１０に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号１１に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号１２に記載の配列を含む。

【0466】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ抗体または抗原結合断片は、重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、ＶＨ領域は、
（ｉ）配列番号１０に記載の配列を含むＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、
（ｉｉ）配列番号１１に記載の配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）配列番号１２に記載の配列を含むＶＨ ＣＤＲ３を含む。

【0467】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ抗体または抗原結合断片は、重鎖可変（ＶＨ）ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨ領域であって、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号１０、１１及び１２の配列を含む、ＶＨ領域を含む。

【0468】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ抗体または抗原結合断片は、配列番号１３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。

【0469】

いくつかの実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３配列は、ヒトＶＨフレームワークにおいて存在する。

【0470】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ抗体または抗原結合断片は、配列番号１３と少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）の配列同一性を有する重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ抗体または抗原結合断片は、配列番号１３と少なくとも８５％（例えば、８５％、９０％、９５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）の配列同一性を有する重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ抗体または抗原結合断片は、配列番号１３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９５％、少なくとも９５％）の配列同一性を有する重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ抗体または抗原結合断片は、配列番号１３と少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。

【0471】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ抗体または抗原結合断片は、配列番号１３と少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）の配列同一性を有する重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。

【0472】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ抗体または抗原結合断片は、ヒトＭＳＬＮに特異的に結合する。

【0473】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ抗体または抗原結合断片は、ヒトＭＳＬＮに、約１０^－９Ｍ～約１０^－６ＭのＫ_Ｄで結合する。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ抗体または抗原結合断片は、ヒトＭＳＬＮに、５×１０^－７Ｍ以下のＫ_Ｄで結合する。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ抗体または抗原結合断片は、ヒトＭＳＬＮに、１×１０^－７Ｍ以下のＫ_Ｄで結合する。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ抗体または抗原結合断片は、ヒトＭＳＬＮに、５×１０^－８Ｍ以下のＫ_Ｄで結合する。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ抗体または抗原結合断片は、ヒトＭＳＬＮに、２×１０^－８Ｍ以下のＫ_Ｄで結合する。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ抗体または抗原結合断片は、ヒトＭＳＬＮに、１×１０^－８Ｍ以下のＫ_Ｄで結合する。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ抗体または抗原結合断片は、ヒトＭＳＬＮに、１×１０^－９Ｍ以下のＫ_Ｄで結合する。

【0474】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ抗体または抗原結合断片は、単一ドメイン抗体である。

【0475】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ抗体または抗原結合断片は、ヒト単一ドメイン抗体である。

【0476】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ抗体または抗原結合断片は、単離された単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ抗体または抗原結合断片は、単離されたヒト単一ドメイン抗体である。

【0477】

組換え核酸及びベクター
一態様において、組換え核酸であって、１つ以上の組換え核酸が、生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ／Ｐ）に特異的に結合する第１の細胞外抗原結合ドメインを含むプライミング受容体を含む第１のキメラポリペプチドと、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する第２の細胞外抗原結合ドメインを含むＣＡＲを含む第２のキメラポリペプチドと、少なくとも１５ヌクレオチド長の核酸配列と、をコードし、核酸配列が、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である核酸配列、配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的である核酸配列、及び配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である核酸配列からなる群から選択される、組換え核酸が、本明細書で提供される。

【0478】

別の態様において、組換え核酸であって、１つ以上の組換え核酸が、胎盤／生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ／Ｐ）に特異的に結合する第１の細胞外抗原結合ドメインを含むプライミング受容体を含む第１のキメラポリペプチドであって、第１の細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列、ならびにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３の３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号２に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号３に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号４に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号５に記載の配列を含み、かつＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号６に記載の配列を含む、第１のキメラポリペプチドと、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む第２のキメラポリペプチドと、少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列であって、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である、第１の核酸配列と、少なくとも１５ヌクレオチド長の第２の核酸配列であって、配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的であるか、または配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である、第２の核酸配列と、をコードする、組換え核酸が、本明細書で提供される。

【0479】

別の態様において、組換え核酸であって、１つ以上の組換え核酸が、プライミング受容体を含む第１のキメラポリペプチドと、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む第２のキメラポリペプチドであって、細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１４に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１５に記載の配列を含み、かつＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１６に記載の配列を含む、第２のキメラポリペプチドと、少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列であって、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である、第１の核酸配列と、少なくとも１５ヌクレオチド長の第２の核酸配列であって、配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的であるか、または配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である、第２の核酸配列と、をコードする、組換え核酸が、本明細書で提供される。

【0480】

別の態様において、組換え核酸であって、１つ以上の組換え核酸が、プライミング受容体を含む第１のキメラポリペプチドと、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む第２のキメラポリペプチドであって、細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨＨ）鎖配列を含む単一ドメイン抗体を含み、ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１０に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１１に記載の配列を含み、かつＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１２に記載の配列を含む、第２のキメラポリペプチドと、少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列であって、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である、第１の核酸配列と、少なくとも１５ヌクレオチド長の第２の核酸配列であって、配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的であるか、または配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である、第２の核酸配列と、をコードする、組換え核酸が、本明細書で提供される。

【0481】

いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号１５６～１６５に示される配列からなる群から選択される配列を含む。

【0482】

ＲＮＡ干渉分子
Ｆａｓ細胞表面細胞死受容体（ＦＡＳ）は、アポトーシス誘導ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーである。タンパク質チロシンホスファターゼ非受容体２型（ＰＴＰＮ２）は、インターフェロン及び他の多くのシグナル伝達経路を調節するホスファターゼである。胸腺細胞選択関連高移動度群ボックス（ＴＯＸ）は、疲弊したＴ細胞の分化を調節する転写因子である。

【0483】

本明細書で使用される場合、「標的遺伝子」とは、細胞における核酸配列であって、配列の発現が、本明細書に記載される組換え核酸分子及び方法を使用して特異的かつ有効に調節され得る、核酸配列を指す。ある特定の実施形態において、標的遺伝子は、個体の免疫細胞の成長（増殖）、維持（生存）及び／または免疫挙動に関与し得る。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＦＡＳである。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＰＴＰＮ２である。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＴＯＸである。いくつかの実施形態において、２つ以上の標的遺伝子は、本明細書に記載される組換え核酸分子及び方法を使用して調節される。いくつかの実施形態において、少なくとも２つの標的遺伝子は、本明細書に記載される組換え核酸分子及び方法を使用して調節される。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子（複数可）は、ｓｈＲＮＡである。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、少なくともＦＡＳ及びＰＴＰＮ２である。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、少なくともＦＡＳ及びＴＯＸである。

【0484】

いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の核酸配列を含む。

【0485】

いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号４０に記載の配列を含むヒトタンパク質チロシンホスファターゼ非受容体２型（ＰＴＰＮ２）をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の核酸配列を含む。

【0486】

いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号４１に記載の配列を含むヒト胸腺細胞選択関連高移動度群ボックス（ＴＯＸ）をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の核酸配列を含む。

【0487】

いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列と、配列番号４０に記載の配列を含むヒトタンパク質チロシンホスファターゼ非受容体２型（ＰＴＰＮ２）をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の第２の核酸配列と、を含む。

【0488】

いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列と、配列番号４１に記載の配列を含むヒト胸腺細胞選択関連高移動度群ボックス（ＴＯＸ）をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の第２の核酸配列と、を含む。

【0489】

いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号４０に記載の配列を含むヒトタンパク質チロシンホスファターゼ非受容体２型（ＰＴＰＮ２）をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列と、配列番号４１に記載の配列を含むヒト胸腺細胞選択関連高移動度群ボックス（ＴＯＸ）をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の第２の核酸配列と、を含む。

【0490】

いくつかの実施形態において、核酸は、配列番号４２～５６に記載の配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸は、配列番号４５に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸は、免疫細胞におけるＦＡＳの発現を、核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減することが可能である。

【0491】

いくつかの実施形態において、核酸は、配列番号７２～８４に記載の配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸は、配列番号８２に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸は、免疫細胞におけるＰＴＰＮ２の発現を、核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減することが可能である。

【0492】

いくつかの実施形態において、核酸は、配列番号９８～１１１に記載の配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸は、配列番号９９または１０４に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸は、免疫細胞におけるＴＯＸの発現を、核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減することが可能である。

【0493】

いくつかの実施形態において、核酸配列は、少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２ヌクレオチド長である。

【0494】

いくつかの実施形態において、核酸は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子である。例示的なＲＮＡｉ分子は、ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、核酸は、ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、核酸は、ｓｈＲＮＡである。

【0495】

一本鎖ヘアピン型リボ核酸（ｓｈＲＮＡ）は、短い二重鎖であって、センス及びアンチセンス鎖が、ヘアピンループによって連結されている、二重鎖である。これらは、ステムループ構造からなり、ステムループ構造は、細胞において、プラスミド構築物上のＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターから転写され得る。発現された際に、ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡｉ種にプロセシングされる。プラスミドからのｓｈＲＮＡの発現は、比較的安定していることが既知であり、それによって、例えば、合成ｓｉＲＮＡの使用よりも強い利点を提供する。ｓｈＲＮＡ発現単位は、様々なプラスミド、リポソーム、ウイルスベクター、ならびに標的細胞内への送達及び組込みのための他のビヒクル内に組み込まれ得る。プラスミドからのｓｈＲＮＡの発現は、構成的発現のために安定して組み込まれ得る。ｓｈＲＮＡは、細胞の核において合成され、更にプロセシングされ、細胞質に輸送され、次いで、活性のためのＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）内に組み込まれる。ｓｈＲＮＡは、（標的遺伝子によってコードされたｍＲＮＡ転写物に結合し、それを隔離し及び／またはその翻訳を防止することが可能である）活性ｓｉＲＮＡ分子に変換される。

【0496】

タンパク質のアルゴノートファミリーは、ＲＩＳＣの主要な構成要素である。タンパク質のアルゴノートファミリー内で、Ａｇｏ２のみが、パッセンジャー鎖をｓｈＲＮＡ分子のステム部分から切断及び放出することが可能であるエンドヌクレアーゼ活性を含有する。識別可能なエンドヌクレアーゼ活性を有さない、アルゴノートファミリーの残りの３つのメンバーであるＡｇｏ１、Ａｇｏ３及びＡｇｏ４はまた、集合してＲＩＳＣを構築し、切断非依存的な様式を介して機能すると考えられる。したがって、ＲＩＳＣは、切断依存性及び切断非依存性経路を有するとして特徴付けられ得る。

【0497】

ＲＮＡｉ（例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）は、国際公開第２０１８２３２３５６Ａ１号、同第２０１９０８４５５２Ａ１号、同第２０１９２２６９９８Ａ１号、同第２０２００１４２３５Ａ１号、同第２０２０１２３８７１Ａ１及び同第２０２０１８６２１９Ａ１号に記載されており、それらの各々は、全ての目的で参照により本明細書に組み込まれる。

【0498】

アンチセンスオリゴヌクレオチド構造及び化学修飾は、国際公開第ＷＯ２０／１３２５２１号に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。

【0499】

ｄｓＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ分子、ならびに使用及び産生方法は、米国特許第８，８２９，２６４号、米国特許第９，５５６，４３１号及び米国特許第８，２５２，５２６号に記載されており、それらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0500】

ｓｉＲＮＡ分子、ならびに使用及び産生方法は、米国特許第７，３６１，７５２号及び米国特許出願第２００５００４８６４７号に記載されており、それらの両方は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0501】

ＲＮＡ干渉、例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ及びアンチセンスオリゴヌクレオチドのための追加の方法及び組成物は、当該技術分野で概して既知であり、米国特許第７，３６１，７５２号、米国特許第８，８２９，２６４号、米国特許第９，５５６，４３１号、米国特許第８，２５２，５２６号、国際公開第００／４４８９５号、国際公開第０１／３６６４６号、国際公開第９９／３２６１９号、国際公開第００／０１８４６号、国際公開第０１／２９０５８号、国際公開第００／４４９１４号及び国際公開第０４／０３０６３４号に更に記載されており、それらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0502】

本明細書に記載されるＲＮＡｉ分子、例えば、ｓｈＲＮＡをコードするために使用され得る核酸配列（または構築物）は、ＲＮＡｉ分子をコードする配列に動作可能に直接または間接的に連結された（または接続された）プロモーターを含み得る。そのようなプロモーターは、宿主細胞及び求められる効果に基づいて選択され得る。好適なプロモーターの非限定的な例としては、構成的及び誘導性プロモーター、例えば、ＥＦ１αまたは誘導性ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ ＩＩ）ベースのプロモーターが挙げられる。好適なプロモーターの非限定的な例としては、テトラサイクリン誘導性または抑制性プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩまたはＩＩＩベースのプロモーター、ｐｏｌ ＩＩ依存性ウイルスプロモーター、例えば、ＣＭＶ－ＩＥプロモーター、ならびにｐｏｌ ＩＩＩ Ｕ６及びＨ１プロモーターが更に挙げられる。また、バクテリオファージＴ７プロモーターが使用され得る（この場合、Ｔ７ポリメラーゼも存在しなければならないことが理解されよう）。特に、核酸配列は、組み込まれたｓｈＲＮＡ分子を含むがこれらに限定されない２つ以上のｓｈＲＮＡ（すなわち、エフェクターの組み合わせ）を含み得るため、核酸配列は、いずれかの単一プロモーターの使用に制限される必要はない。各々の組み込まれたプロモーターは、ｓｈＲＮＡ分子構成要素のうちの１つまたはそれらのいずれかの組み合わせを制御し得る。

【0503】

ある特定の実施形態において、プロモーターは、標的細胞において優先的に活性であり得、例えば、少なくとも１つの組換え核酸を、免疫細胞において、免疫細胞特異的プロモーターを使用して優先的に発現させることが望ましいことがある。宿主細胞内へのそのような構築物の導入は、組換え核酸前駆体転写物内に含有された２つ以上の組換え核酸が、最初に、単一一次転写物内に存在し、これにより、その後、別個のＲＮＡ分子（例えば、ｓｈＲＮＡであり、ｓｈＲＮＡは各々、それ自体のステムループ構造を含む）が、内因性リボヌクレアーゼによって、そのような前駆体転写物から切除される条件下で行われ得る。次いで、得られた成熟組換え核酸（例えば、ｓｈＲＮＡ）は、細胞において産生された標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物の分解及び／または翻訳抑制を誘導し得る。代替的に、前駆体ステムループ構造の各々は、別個の転写物の一部分として産生され得、この場合、各々の組換え核酸配列は、好ましくは、それ自体のプロモーター及び転写終結配列を含む。追加的に、複数の組換え核酸前駆体転写物は、単一一次転写物内に存在し得る。

【0504】

本明細書に記載されるｓｈＲＮＡ組換え核酸のステムループ構造は、約４０～１００ヌクレオチド長であってもよく、または好ましくは、約５０～７５ヌクレオチド長であってもよい。ステム領域は、約１５～４５ヌクレオチド長（またはそれ以上）であってもよく、または約２０～３０ヌクレオチド長であってもよい。いくつかの実施形態において、ステム領域は、２２ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、ステム領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４または４５ヌクレオチド長である。

【0505】

ステムは、完全に相補的な二重鎖を含み得る（ただし、いずれかの３’テールについてである）が、バルジまたは内部ループが、ステムのいずれかのアーム上に存在し得る。そのようなバルジ及び非対称内部ループの数は、好ましくは、少ない数（例えば、１、２または３つ）であり、約３つ以下のヌクレオチドのサイズである。末端ループ部分は、約４つ以上のヌクレオチドを含み得るが、好ましくは、約２５個以下であり得る。ループ部分は、好ましくは、６つ～１５個のヌクレオチドのサイズである。

【0506】

本明細書に記載されるように、ｓｈＲＮＡのステム領域は、パッセンジャー鎖及びガイド鎖を含み、それによって、ガイド鎖は、標的遺伝子（複数可）によってコードされた標的ｍＲＮＡ転写物と相補的である配列を含有する。好ましくは、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖のＧ－Ｃ含有量及びマッチングは、エンドヌクレアーゼ切断を有するまたは有さない熱力学的に好ましい鎖巻き戻し活性のために慎重に設計されている。更に、ガイド鎖の特異性は、好ましくは、ＢＬＡＳＴ検索（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｑｏｖ／ＢＬＡＳＴ）を介して確認される。

【0507】

本発明は、複数の標的遺伝子の発現レベルが、本明細書に記載される方法及び組換え核酸を使用して調節され得ることを提供する。例えば、本発明は、組換え核酸の第１のセットが、第１の標的遺伝子の発現レベルを低減するように設計された配列（ガイド鎖）を含むように設計され得、組換え核酸の第２のセットが、第２の標的遺伝子の発現レベルを低減するように設計された配列（ガイド鎖）を含むように設計され得ることを提供する。組換え核酸の異なるセットは、同じまたは別個の予備転写物内で発現され得、それら内に存在し得る。ある特定の実施形態において、そのような多重アプローチ、すなわち、２つ以上の標的遺伝子の発現レベルを調節するための本明細書に記載される組換え核酸の使用は、患者への増強された治療効果を有し得る。例えば、患者に、本明細書に記載される組換え核酸分子を発現する細胞が、がんの効果を治療する、予防するまたは寛解させるために提供される場合、患者に、免疫細胞の活性化または抑制に関与する複数の遺伝子の発現レベルを低減するように設計された２つ以上のタイプの組換え核酸分子を提供することが望ましいことがある。

【0508】

本明細書に記載される組換え核酸分子（複数可）は、細胞における標的遺伝子発現を、組換え核酸分子（複数可）を含まない対照細胞と比較して少なくとも約５０％超低減することが可能であり得る。例えば、組換え核酸分子（複数可）（例えば、ｓｈＲＮＡ）は、免疫細胞におけるＦＡＳ、ＰＴＰＮ２及びＴＯＸからなる群から選択される標的遺伝子の発現を、組換え核酸分子（複数可）を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上低減することが可能であることができる。例えば、組換え核酸分子（複数可）は、免疫細胞におけるＦＡＳ、ＰＴＰＮ２及びＴＯＸからなる群から選択される標的遺伝子の発現を、組換え核酸分子（複数可）を含まない対照細胞と比較して少なくとも約５０～１００％、５０～９９％、５０～９５％、５０～９０％、５０～８５％、５０～８０％、５０～７５％、５０～７０％、５０～６５％、５０～６０％、５０～５５％または低減することが可能であることができる。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子（複数可）は、免疫細胞におけるＦＡＳの発現を、組換え核酸分子（複数可）を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減することが可能である。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子（複数可）は、免疫細胞におけるＰＴＰＮ２の発現を、組換え核酸分子（複数可）を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減することが可能である。いくつかの実施形態において、組換え核酸分子（複数可）は、免疫細胞におけるＴＯＸの発現を、組換え核酸分子（複数可）を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減することが可能である。

【0509】

組換え核酸分子（複数可）は、化学合成またはインビトロ転写され得、糖リン酸骨格またはヌクレオシド残基への１つ以上の修飾を更に含み得る。

【0510】

核酸を細胞に導入するための当該技術分野で既知の他の方法、例えば、脂質媒介性担体輸送及び化学媒介性輸送、例えば、リン酸カルシウムなどが使用され得る。したがって、組換え核酸分子（複数可）構築物は、以下の活性、細胞によるＲＮＡ取り込みの増強、ｓｈＲＮＡについての二重鎖のアニーリングの促進、アニールされたｓｈＲＮＡ鎖の安定化またはそうでなければ標的遺伝子の阻害の増加のうちの１つ以上を実行する構成要素とともに導入され得る。

【0511】

追加のエレメント
いくつかの実施形態において、１つ以上の組換え核酸（複数可）は、５’相同性指向性修復アーム及び／または３’相同性指向性修復アームを更に含み、５’相同性指向性修復アーム及び／または３’相同性指向性修復アームは、宿主細胞染色体における挿入部位と相補的である。いくつかの実施形態において、１つ以上の組換え核酸（複数可）は、５’相同性指向性修復アーム及び３’相同性指向性修復アームを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の組換え核酸（複数可）は、発現カセットまたは発現ベクター内に組み込まれている。いくつかの実施形態において、発現カセットまたは発現ベクターは、１つ以上の組換え核酸（複数可）の上流の構成的プロモーターを更に含む。

【0512】

いくつかの実施形態において、プライミング受容体、ＣＡＲ、第１の核酸及び第２の核酸、単一発現カセットまたは単一発現ベクター内に組み込まれている。いくつかの実施形態において、プライミング受容体、ＣＡＲ、第１の核酸及び第２の核酸、２つ以上の発現カセットまたは発現ベクター内に組み込まれている。いくつかの実施形態において、発現ベクター（複数可）は、非ウイルスベクターである。

【0513】

１つ以上の干渉核酸配列（例えば、１つ以上のｓｈＲＮＡ）は、組換え核酸挿入物、ＤＮＡテンプレート、単一発現カセットまたは単一発現ベクターのイントロン領域においてコードされ得、組換え核酸挿入物、ＤＮＡテンプレート、単一発現カセットまたは単一発現ベクターはまた、プライミング受容体及び／またはＣＡＲをコードする。例えば、ＤＮＡテンプレートが、ＣＡＲまたはプライミング受容体の発現を駆動するために、プロモーター、例えば、ＥＦ１αまたは本明細書に記載される誘導性プロモーターを含む場合、１つ以上の核酸配列（例えば、ｓｈＲＮＡ配列）は、プロモーターイントロン領域においてコードされ得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸配列は、組換え核酸挿入物またはＤＮＡテンプレートの少なくとも１つのイントロン領域においてコードされている。いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸配列は、組換え核酸挿入物またはＤＮＡテンプレートの少なくとも１つのＥＦ１αイントロン領域においてコードされている。

【0514】

いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載されるプライミング受容体及び／またはＣＡＲをコードする１つ以上の導入遺伝子を含む組換え核酸ＤＮＡテンプレート挿入物を企図する。いくつかの実施形態において、ＤＮＡテンプレート挿入物は、プライミング受容体導入遺伝子をコードする。いくつかの実施形態において、ＤＮＡテンプレート挿入物は、キメラ抗原受容体導入遺伝子をコードする。いくつかの実施形態において、ＤＮＡテンプレート挿入物は、ヒトＦＡＳ ｍＲＮＡ配列の少なくとも１５個のヌクレオチドと相補的である第１の核酸、及びヒトＰＴＰＮ２またはＴＯＸ ｍＲＮＡ配列の少なくとも１５個のヌクレオチドと相補的である第２の核酸をコードする。いくつかの実施形態において、ＤＮＡテンプレート挿入物は、プライミング受容体導入遺伝子及びキメラ抗原受容体導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡテンプレート挿入物は、プライミング受容体導入遺伝子、キメラ抗原受容体導入遺伝子、ヒトＦＡＳ ｍＲＮＡ配列の少なくとも１５個のヌクレオチドと相補的である第１の核酸、及びヒトＰＴＰＮ２またはＴＯＸ ｍＲＮＡ配列の少なくとも１５個のヌクレオチドと相補的である第２の核酸を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡテンプレート挿入物は、プライミング受容体導入遺伝子、キメラ抗原受容体導入遺伝子、ヒトＦＡＳ ｍＲＮＡ配列の少なくとも１５個のヌクレオチドと相補的である第１の核酸、及びヒトＰＴＰＮ２ ｍＲＮＡ配列の少なくとも１５個のヌクレオチドと相補的である第２の核酸を含む。

【0515】

いくつかの実施形態において、１つ以上の組換え核酸（複数可）は、単一ＤＮＡテンプレート挿入物上にコードされている。いくつかの実施形態において、１つ以上の組換え核酸（複数可）は、複数のＤＮＡテンプレート挿入子上にコードされている。例えば、１つ以上の組換え核酸（複数可）を、２、３または４つのＤＮＡテンプレート挿入物上にコードされ得る。

【0516】

ＤＮＡテンプレート挿入物はまた、自己切断ペプチドを含むことができる。自己切断ペプチドの例としては、自己切断ウイルス２Ａペプチド、例えば、ブタテシオウイルス－１（Ｐ２Ａ）ペプチド、ゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス（Ｔ２Ａ）ペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）ペプチド、または口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。自己切断２Ａペプチドは、単一のコンストラクトからの複数の遺伝子産物の発現を可能にする。（例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．“Ｃｌｅａｖａｇｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ２Ａ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ，”ＭＡｂｓ ７（２）：４０３－４１２（２０１５）を参照されたい）。

【0517】

ＤＮＡテンプレート挿入物はまた、ＷＰＲＥエレメントを含むことができる。ＷＰＲＥエレメントは、概して、Ｈｉｇａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １４，１２９８－１３０４（２００７）、及びＺｕｆｆｅｒｅｙ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９９ Ａｐｒ；７３（４）：２８８６－９２に記載されており、これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる。

【0518】

ＤＮＡテンプレート挿入物はまた、ＳＶ４０ポリＡテールを含むことができる。

【0519】

組換え細胞
プライミング受容体及びＣＡＲシステムを発現する導入遺伝子は、細胞、例えば、Ｔ細胞内に、例えば、部位特異的技法を使用して導入され得る。導入遺伝子（例えば、プライミング受容体及びＣＡＲ）の部位特異的組込みで、導入遺伝子は、セーフハーバー遺伝子座またはＴＲＡＣを標的とするようにされ得る。セーフハーバー遺伝子座への組込みのための部位特異的技法の例としては、限定されないが、ヌクレアーゼを使用する相同性依存的操作及びＣａｓ９を使用する相同性非依存的標的挿入が挙げられる。

【0520】

操作された組換え細胞は、免疫腫瘍学への用途を有する。例えば、プライミング受容体及びＣＡＲは、異なる特異的腫瘍抗原を標的とするように選択され得る。そのような細胞を使用して有効に標的とされ得るがんの例は、血液がんまたは固形がんである。いくつかの実施形態において、免疫細胞療法を使用して、固形腫瘍を治療することができる。

【0521】

修飾された細胞であって、細胞が、対応する未修飾の細胞に対して、ＦＡＳ遺伝子の低減された発現及び／またはＦＡＳ遺伝子の産物の低減された機能を有するように修飾されており、任意選択で、修飾された細胞が、造血細胞である、修飾された細胞が、本明細書で提供される。いくつかの態様において、修飾された細胞は、対応する未修飾の細胞に対して、少なくとも１つの第２の遺伝子の低減された発現及び／または少なくとも１つの第２の遺伝子の産物の低減された機能を有するように更に修飾されている。

【0522】

また、修飾及び操作された細胞であって、操作された細胞が、対応する未修飾の操作された細胞に対して、ＦＡＳ遺伝子の低減された発現及び／またはＦＡＳ遺伝子の産物の低減された機能を有するように修飾されており、任意選択で、修飾及び操作された細胞が、異種免疫受容体を発現するように操作されている、修飾及び操作された細胞が、本明細書で提供される。いくつかの態様において、修飾及び操作された細胞は、対応する未修飾の操作された細胞に対して、少なくとも１つの第２の遺伝子の低減された発現及び／または少なくとも１つの第２の遺伝子の産物の低減された機能を有するように更に修飾されている。

【0523】

また、修飾された細胞であって、細胞が、（ａ）ＦＡＳ遺伝子の低減された発現及び／またはＦＡＳ遺伝子の産物の低減された機能、ならびに（ｂ）少なくとも１つの第２の遺伝子の低減された発現及び／または少なくとも１つの第２の遺伝子の産物の低減された機能を有するように修飾されており、各々の遺伝子の低減された発現が、対応する未修飾の細胞に対してのものであり、任意選択で、修飾された細胞が、造血細胞である、修飾された細胞が、本明細書で提供される。

【0524】

いくつかの態様において、発現を低減するための修飾は、ＦＡＳ遺伝子及び任意選択で少なくとも１つの第２の遺伝子を破壊するように、細胞のゲノムを遺伝子操作することを含む。いくつかの態様において、遺伝子操作は、ヌクレアーゼ媒介性編集を含み、任意選択で、ヌクレアーゼ媒介性編集は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性編集を含む。

【0525】

いくつかの態様において、発現を低減するための修飾は、ＦＡＳ遺伝子及び任意選択で少なくとも１つの第２の遺伝子のＲＮＡｉ媒介性ターゲティングを含み、任意選択で、ＲＮＡｉ媒介性ターゲティングは、ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）媒介性ノックダウンを含む。いくつかの態様において、ＲＮＡｉ媒介性ターゲティングは、ＦＡＳ遺伝子及び任意選択で少なくとも１つの第２の遺伝子のノックダウンを媒介することが可能であるＲＮＡポリヌクレオチドを発現するように細胞を操作することを含む。

【0526】

いくつかの態様において、修飾された細胞は、造血細胞を含む。いくつかの態様において、造血細胞は、造血幹細胞を含む。いくつかの態様において、造血細胞は、免疫細胞を含む。いくつかの態様において、免疫細胞は、適応免疫細胞、自然免疫細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージを含む。

【0527】

いくつかの態様において、修飾された細胞は、操作された細胞を含む。いくつかの態様において、操作された細胞は、異種受容体を発現するように操作されている。いくつかの態様において、異種受容体は、免疫受容体を含む。いくつかの態様において、異種免疫受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体またはＮＫ細胞受容体を含む。いくつかの態様において、操作された細胞は、Ｔ細胞またはＴ細胞への分化が可能な細胞を含み、異種受容体は、内因性ＴＣＲ遺伝子座、任意選択で、Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＲＡＣ）遺伝子座内に挿入されている。いくつかの態様において、異種受容体は、１つ以上の抗原結合ドメインを含み、任意選択で、１つ以上の抗原結合ドメインは、腫瘍抗原またはがんに関連する抗原に結合することが可能である。

【0528】

いくつかの態様において、ＦＡＳ遺伝子またはその発現産物の低減された発現及び／または機能は、対応する未修飾の細胞に対して、修飾された細胞の少なくとも１つの特性を改善する。

【0529】

いくつかの態様において、修飾された細胞が、少なくとも１つの第２の遺伝子の低減された発現及び／または機能を有するように更に修飾されているときに、ＦＡＳ遺伝子またはその発現産物の低減された発現及び／または機能、ならびに少なくとも１つの第２の遺伝子またはその発現産物の低減された発現及び／または機能は、ＦＡＳ遺伝子の発現及び／または機能のみを低減するように修飾された対応する細胞に対して、修飾された細胞の少なくとも１つの特性を改善する。

【0530】

いくつかの態様において、修飾された細胞が、少なくとも１つの第２の遺伝子の低減された発現及び／または機能を有するように更に修飾されているときに、ＦＡＳ遺伝子またはその発現産物の低減された発現及び／または機能、ならびに少なくとも１つの第２の遺伝子またはその発現産物の低減された発現及び／または機能は、少なくとも１つの第２の遺伝子の発現及び／または機能のみを低減するように修飾された対応する細胞に対して、修飾された細胞の少なくとも１つの特性を改善する。

【0531】

いくつかの態様において、少なくとも１つの特性は、改善された増殖能力を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの特性は、ＦＡＳ媒介性アポトーシスからの改善された保護を含む。いくつかの態様において、修飾された細胞は、免疫細胞を含み、少なくとも１つの特性は、改善された免疫エフェクター細胞機能を含む。いくつかの態様において、改善された免疫エフェクター細胞機能は、増加した相対的エフェクター分子発現、産生及び／または分泌を含む。いくつかの態様において、免疫細胞は、Ｔ細胞を含み、エフェクター分子は、ＩＦＮγ、ＴＮＦアルファ、グランザイムＢ及びＦＡＳＬからなる群から選択される１つ以上の分子を含む。

【0532】

いくつかの態様において、修飾された細胞は、異種表面抗原を発現するように操作されており、任意選択で、異種表面抗原は、異種表面抗原を発現するように操作されていない対応する修飾された細胞に対して、操作及び修飾された細胞の標的枯渇を媒介することが可能である。

【0533】

また、対象における免疫応答を刺激する方法であって、対象に、本明細書に開示される修飾された細胞のうちのいずれか１つを投与することを含む、方法が、本明細書で提供される。また、対象におけるがんを治療する方法であって、対象に、本明細書に開示される修飾された細胞のうちのいずれか１つを投与することを含む、方法が、本明細書で提供される。いくつかの態様において、修飾された細胞は、対象に関して自己である。いくつかの態様において、修飾された細胞は、対象に関して同種である。

【0534】

また、１つ以上の組換え核酸（複数可）を含む組換え免疫細胞であって、１つ以上の組換え核酸が、プライミング受容体を含む第１のキメラポリペプチドと、ＣＡＲを含む第２のキメラポリペプチドと、少なくとも１５ヌクレオチド長の核酸配列と、をコードし、核酸配列が、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である核酸配列、配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的である核酸配列、及び配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である核酸配列からなる群から選択される、組換え免疫細胞が、本明細書で提供される。

【0535】

いくつかの実施形態において、核酸配列は、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である。いくつかの実施形態において、核酸配列は、配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的である。いくつかの実施形態において、核酸配列は、配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である。

【0536】

また、細胞のゲノムの標的領域内に非ウイルス的に挿入された１つ以上の組換え核酸（複数可）を含む組換え免疫細胞であって、１つ以上の組換え核酸（複数可）が、本明細書に記載される、プライミング受容体と、ＣＡＲと、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡと相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列と、配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡと相補的であるか、または配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡと相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の第２の核酸配列と、をコードする、組換え免疫細胞が、本明細書で提供される。また、胎盤／生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ／Ｐ）に特異的に結合するプライミング受容体と、ＭＳＬＮに特異的に結合するキメラ抗原受容体と、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡと相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列と、配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡと相補的であるか、または配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡと相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の第２の核酸配列と、を含む、組換え免疫細胞が、本明細書で提供される。

【0537】

本開示に記載される、ＤＮＡテンプレート挿入物を標的遺伝子座またはセーフハーバー部位において含む細胞は、操作された細胞と称され得る。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、多能性免疫細胞を生じさせることができる任意の細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、初代免疫細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはヒト多能性幹細胞（ＨＳＰＣ）であり得る。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、初代造血細胞または初代造血幹細胞を含む。いくつかの実施形態において、その操作された細胞は、幹細胞、ヒト細胞、初代細胞、造血細胞、適応免疫細胞、自然免疫細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、またはＴ細胞前駆体である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、調節Ｔ細胞、エフェクターＴ細胞、またはナイーブＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞である。

【0538】

いくつかの実施形態において、操作された細胞は、幹細胞、ヒト細胞、初代細胞、造血細胞、造血幹細胞、適応免疫細胞、自然免疫細胞、Ｔ細胞、またはＴ細胞前駆体である。本開示で企図される免疫細胞の非限定的な例としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ／ｉＮＫＴ細胞、マクロファージ、骨髄細胞、及び樹状細胞が挙げられる。本開示で企図される幹細胞の非限定的な例としては、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、核移植によって得られる胚由来胚幹細胞（ｎｔＥＳ；核移植ＥＳ）、雄生殖細胞（ＧＳ細胞）、胚生殖細胞（ＥＧ細胞）、造血幹／前駆体幹細胞（ＨＳＰＣ）、体細胞（成体幹細胞）、血管芽球、神経幹細胞、間葉性幹細胞、及び他の細胞（骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、心筋細胞、ニューロン、腱細胞、脂肪細胞、膵細胞、肝細胞、腎細胞、及び濾胞細胞等を含む）の幹細胞が挙げられる。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ｉＰＳＣ、及びＨＳＰＣである。いくつかの実施形態において、本開示で使用される操作された細胞は、インビトロで成長したヒト細胞株（例えば、意図的に不死化された細胞株、がん細胞株等）である。

【0539】

また、複数の免疫細胞を含む細胞の集団が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上のゲノムは、本明細書に記載される、プライミング受容体、ＣＡＲ、ならびに第１及び第２の核酸を含む。

【0540】

がんを治療する方法
別の態様において、本発明は、個体における免疫関連状態（例えば、がん）を治療する方法であって、方法が、個体に、有効量の組成物を投与することを含み、組成物が、ＡＬＰＧ／Ｐに特異的に結合するプライミング受容体と、ＭＳＬＮに特異的に結合するキメラ抗原受容体と、少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列であって、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である、第１の核酸配列と、少なくとも１５ヌクレオチド長の第２の核酸配列であって、配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的であるか、または配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である、第２の核酸配列と、を含む、システムを含む、方法を提供する。

【0541】

別の態様において、本発明は、個体における免疫応答を増強する方法であって、方法が、個体に、有効量の組成物を投与することを含み、組成物が、ＡＬＰＧ／Ｐに特異的に結合するプライミング受容体と、ＭＳＬＮに特異的に結合するキメラ抗原受容体と、少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列であって、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である、第１の核酸配列と、少なくとも１５ヌクレオチド長の第２の核酸配列であって、配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的であるか、または配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である、第２の核酸配列と、を含む、システムを含む、方法を提供する。

【0542】

いくつかの実施形態において、組換え核酸は、ｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、ＦＡＳ ｓｈＲＮＡ分子、ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡ分子及びＴＯＸ ｓｈＲＮＡ分子からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、細胞は、少なくとも、ＦＡＳ ｓｈＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、少なくとも、ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、少なくとも、ＴＯＸ ｓｈＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、少なくとも、ＦＡＳ ｓｈＲＮＡ分子及びＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、少なくとも、ＦＡＳ ｓｈＲＮＡ分子及びＴＯＸ ｓｈＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、少なくとも、ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡ分子及びＴＯＸ ｓｈＲＮＡ分子を含む。別の態様において、本発明は、個体における免疫応答を増強する方法であって、方法が、個体に、少なくとも１つのｓｈＲＮＡ分子を含む細胞を含む有効量の組成物を投与することを含み、ｓｈＲＮＡ分子が、ＦＡＳ ｓｈＲＮＡ分子、ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡ分子及びＴＯＸ ｓｈＲＮＡ分子からなる群から選択される、方法を提供する。

【0543】

いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、個体における免疫関連状態の治療に有用である。ある特定の実施形態において、個体は、ヒトである。

【0544】

いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法（例えば、免疫応答を増強する方法）は、がんの治療に有用であり、したがって、本明細書に記載されるシステムを受容する個体は、がんを有する。いくつかの実施形態において、がんは、固形がんである。いくつかの実施形態において、がんは、液体がんである。いくつかの実施形態において、がんは、免疫回避性である。いくつかの実施形態において、がんは、免疫応答性である。特定の実施形態において、がんは、卵巣癌、卵管癌、原発性腹膜癌、子宮癌、中皮腫、子宮頸癌または膵癌である。いくつかの実施形態において、がんは、卵巣癌である。

【0545】

いくつかの実施形態において、治療は、がん体積またはサイズにおける減少をもたらす。いくつかの実施形態において、治療は、抗体の投与前のがん体積と比較して、がん体積を低減することに有効である。いくつかの実施形態において、治療は、がん成長速度における減少をもたらす。いくつかの実施形態において、治療は、抗体の投与前のがん成長速度と比較して、がん成長速度を低減することに有効である。いくつかの実施形態において、治療は、がんを除去するのに有効である。

【0546】

いくつかの実施形態において、ＭＳＬＮ、及びＡＬＰＧまたはＡＬＰＰは、がんにおいて、非がん細胞と比較してより高いレベルで発現される。ＭＳＬＮ、ＡＬＰＧ及びＡＬＰＰのレベルは、当該技術分野で既知のいずれかの技法によって評価され得、技法は、タンパク質アッセイまたは核アッセイ、例えば、ＦＡＣＳ、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、免疫組織化学、免疫蛍光、放射免疫アッセイ、ドットブロッティング、免疫検出方法、ＨＰＬＣ、表面プラズモン共鳴、光学分光法、質量分析、ＨＰＬＣ、ｑＰＣＲ、ＲＴ－ｑＰＣＲ、多重ｑＰＣＲまたはＲＴ－ｑＰＣＲ、ＲＮＡ－ｓｅｑ、マイクロアレイ分析、ＳＡＧＥ、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ技法、及びＦＩＳＨ、ならびにそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。

【0547】

免疫調節の方法
本明細書に記載される、ＡＬＰＧ／Ｐに特異的に結合するプライミング受容体と、ＭＳＬＮに特異的に結合するキメラ抗原受容体と、少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列であって、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である、第１の核酸配列と、少なくとも１５ヌクレオチド長の第２の核酸配列であって、配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的であるか、または配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である、第２の核酸配列と、を含む、システムを含む細胞を投与する方法は、免疫応答の調節をもたらすことができる。調節は、免疫応答における増加または減少であることができる。いくつかの実施形態において、調節は、免疫応答における増加である。

【0548】

一態様において、本明細書に記載される、ＡＬＰＧ／Ｐに特異的に結合するプライミング受容体と、ＭＳＬＮに特異的に結合するキメラ抗原受容体と、を含む、システムを含む細胞の投与は、炎症促進性分子、例えば、サイトカインまたはケモカインの誘導をもたらすことができる。概して、誘導された炎症促進性分子は、アイソタイプ対照で達成されるレベルよりも大きいレベルで存在する。次いで、そのような炎症促進性分子は、抗腫瘍免疫の活性化をもたらし、抗腫瘍免疫の活性化は、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞分化、Ｍ１様マクロファージ活性化及びＮＫ細胞活性化を含むが、これらに限定されない。したがって、ＡＬＰＧ／Ｐに特異的に結合するプライミング受容体と、ＭＳＬＮに特異的に結合するキメラ抗原受容体と、を含む、システムの投与は、腫瘍破壊をもたらす複数の抗腫瘍免疫機構を誘導することができる。

【0549】

別の態様において、個体における免疫応答を増加させる方法であって、方法が、個体に、有効量の細胞を投与することを含み、細胞が、ＡＬＰＧ／Ｐに特異的に結合するプライミング受容体と、ＭＳＬＮに特異的に結合するキメラ抗原受容体と、を含む、システムを含む、方法が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、対象における免疫応答を増加させる方法は、対象に、ＡＬＰＧ／Ｐに特異的に結合するプライミング受容体と、ＭＳＬＮに特異的に結合するキメラ抗原受容体と、を含む、システムを含む細胞を投与することを含む。

【0550】

いくつかの実施形態において、細胞は、薬学的に許容される賦形剤を更に含む薬学的組成物において存在する。

【0551】

本明細書に記載される、免疫応答を増加させるいかなる態様において、特徴（複数可）または機能（複数可）の態様のいずれもの増加または減少または改変は、ＡＬＰＧ／Ｐに特異的に結合するプライミング受容体と、ＭＳＬＮに特異的に結合するキメラ抗原受容体と、を含む、システムを含む組成物を含まない細胞と比較されたものである。

【0552】

免疫応答の増加は、免疫応答の増強または免疫応答の誘導の両方であり得る。例えば、免疫応答を増加させることは、免疫応答の始動もしくは開始、または進行中の免疫応答もしくは既存の免疫応答の増加もしくは増幅の両方を包含する。いくつかの実施形態において、治療は、免疫応答を誘導する。いくつかの実施形態において、誘導免疫応答は、適応免疫応答である。いくつかの実施形態において、誘導免疫応答は、自然免疫応答である。いくつかの実施形態において、治療は、免疫応答を増強する。いくつかの実施形態において、増強免疫応答は、適応免疫応答である。いくつかの実施形態において、増強免疫応答は、自然免疫応答である。いくつかの実施形態において、治療は、免疫応答を増加させる。いくつかの実施形態において、増加免疫応答は、適応免疫応答である。いくつかの実施形態において、増加免疫応答は、自然免疫応答である。いくつかの実施形態において、免疫応答は、ＡＬＰＧ／Ｐに特異的に結合するプライミング受容体と、ＭＳＬＮに特異的に結合するキメラ抗原受容体と、を含む、システムを含む細胞の投与によって開始（ｓｔａｒｔ）または開始（ｉｎｉｔｉａｔｅ）される。いくつかの実施形態において、免疫応答は、ＡＬＰＧ／Ｐに特異的に結合するプライミング受容体と、ＭＳＬＮに特異的に結合するキメラ抗原受容体と、を含む、システムを含む細胞の投与によって増強される。

【0553】

別の態様において、本出願は、細胞をシステムで遺伝子編集する方法であって、システムが、ＡＬＰＧ／Ｐに特異的に結合するプライミング受容体と、ＭＳＬＮに特異的に結合するキメラ抗原受容体と、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡと相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列と、配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡと相補的であるか、または配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡと相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の第２の核酸配列と、を含み、遺伝子編集が、細胞の免疫機能の調節をもたらす、方法を提供する。調節は、免疫応答を増加させることであることができる。いくつかの実施形態において、調節は、免疫機能における増加である。いくつかの実施形態において、機能の調節は、ＭＳＬＮ ＣＡＲの発現をもたらす。いくつかの実施形態において、機能の調節は、システムを含む細胞の活性化をもたらす。

【0554】

いくつかの実施形態において、細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、初代Ｔ細胞、またはＴ細胞前駆体である。

【0555】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される、プライミング受容体及びＣＡＲシステムを含む細胞の機能の調節は、天然及び活性化Ｔ細胞の両方を刺激する細胞の能力における増加を、例えば、プライミング受容体及びＣＡＲシステムを発現する細胞によるサイトカインまたはケモカイン分泌を増加させることによってもたらす。いくつかの実施形態において、機能の調節は、サイトカイン、ケモカイン、ＣＡＲ、または共刺激もしくは活性化受容体を産生する細胞の能力を増強するまたは増加させる。いくつかの実施形態において、調節は、プライミング受容体及びＣＡＲシステムを発現する細胞のＴ細胞刺激機能を増加させ、Ｔ細胞刺激機能は、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達、Ｔ細胞増殖またはＴ細胞サイトカイン産生を誘発する細胞の能力を含む。

【0556】

いくつかの実施形態において、増加した免疫応答は、サイトカイン及びケモカインの分泌である。いくつかの実施形態において、プライミング受容体及びＣＡＲシステムは、アイソタイプ対照細胞と比較して、細胞における少なくとも１つのサイトカインまたはケモカインの増加した発現を誘導する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのサイトカインまたはケモカインは、ＩＬ－２及びＩＦＮγからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、サイトカインまたはケモカインは、ＩＬ－２である。いくつかの実施形態において、サイトカインまたはケモカインは、ＩＦＮγである。いくつかの実施形態において、サイトカインまたはケモカイン分泌は、未治療の細胞またはアイソタイプ対照抗体で治療された細胞と比較して約１～１００倍、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０または９０～１００倍増加する。いくつかの実施形態において、ケモカインは、ＩＬ－２であり、分泌は、未治療の細胞またはアイソタイプ対照抗体で治療された細胞と比較して約１～１００倍、１倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１～１０倍、１０～２０倍、２０～３０倍、３０～４０倍、４０～５０倍、５０～６０倍、６０～７０倍、７０～８０倍、８０～９０倍または９０～１００倍増加する。いくつかの実施形態において、サイトカインは、ＩＦＮγであり、分泌は、未治療の細胞またはアイソタイプ対照抗体で治療された細胞と比較して約１～１００倍、１倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１～１０倍、１０～２０倍、２０～３０倍、３０～４０倍、４０～５０倍、５０～６０倍、６０～７０倍、７０～８０倍、８０～９０倍または９０～１００倍増加する。

【0557】

いくつかの実施形態において、増強された免疫応答は、抗腫瘍免疫細胞動員及び活性化である。

【0558】

いくつかの実施形態において、プライミング受容体及びＣＡＲシステムを発現する細胞は、アイソタイプ対照細胞と比較して、メモリー免疫応答を誘導する。一般に、メモリー免疫応答は、免疫系が以前に遭遇した病原体または抗原へのその後の曝露の際の防御免疫応答である。例示的なメモリー免疫応答は、抗原の感染またはワクチン接種後の免疫応答を含む。一般に、メモリー免疫応答は、リンパ球、例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞によって媒介される。いくつかの実施形態において、メモリー免疫応答は、がん細胞成長、増殖または転移を含むがんへの防御免疫応答である。いくつかの実施形態において、メモリー免疫応答は、がん細胞成長、増殖または転移を阻害、予防または低減する。

【0559】

遺伝子発現を低減する方法
本発明の別の態様は、哺乳動物細胞における標的遺伝子の発現を減弱するための方法であって、標的遺伝子ｍＲＮＡと相補的である組換え核酸、例えば、一本鎖ヘアピン型リボ核酸（ｓｈＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを哺乳動物細胞内に導入することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、標的遺伝子ｍＲＮＡと相補的である組換え核酸は、ｓｈＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、二重鎖領域を形成する１９～１００個のヌクレオチドの自己相補的配列を含み、この自己相補的配列は、細胞内条件下で、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、２２ｎｔの自己相補的配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、（ｉ）二本鎖ＲＮＡ産物を産生するためのＲＮａｓｅＩＩＩ酵素による切断のための基質であり、（ｉｉ）哺乳動物細胞の一般的な配列非依存性死滅をもたらさず、かつ（ｉｉｉ）当該標的遺伝子の発現を、当該相補領域の配列に依存する様式で低減する。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＦＡＳである。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ヒトＦＡＳである。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＰＴＰＮ２である。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ヒトＰＴＰＮ２である。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＴＯＸである。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ヒトＴＯＸである。

【0560】

組換え核酸を含む免疫細胞は、ＦＡＳ、ＰＴＰＮ２及びＴＯＸからなる群から選択される標的遺伝子の低減されたまたは減少した発現を有することができる。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、組換え核酸分子（複数可）を含まない対照細胞と比較して約５０～１００％、５０～９９％、５０～９５％、５０～９０％、５０～８５％、５０～８０％、５０～７５％、５０～７０％、５０～６５％、５０～６０％、５０～５５％低減されたＦＡＳ、ＰＴＰＮ２及び／またはＴＯＸ発現を有する。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、組換え核酸分子（複数可）を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減された、免疫細胞におけるＦＡＳ発現を有する。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、組換え核酸分子（複数可）を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減された、免疫細胞におけるＰＴＰＮ２発現を有する。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、組換え核酸分子（複数可）を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減された、免疫細胞におけるＴＯＸ発現を有する。

【0561】

いくつかの実施形態において、免疫細胞におけるＦＡＳの発現は、第１の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減される。いくつかの実施形態において、第２の核酸は、免疫細胞におけるＰＴＰＮ２の発現を、第２の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減することが可能である。いくつかの実施形態において、免疫細胞におけるＰＴＰＮ２の発現は、第２の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減される。

【0562】

いくつかの実施形態において、第２の核酸は、免疫細胞におけるＴＯＸの発現を、第２の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減することが可能である。いくつかの実施形態において、免疫細胞におけるＴＯＸの発現は、第２の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減される。

【0563】

いくつかの実施形態において、ＦＡＳ、ＰＴＰＮ２及び／またはＴＯＸの発現は、核酸アッセイまたはタンパク質アッセイによって決定される。いくつかの実施形態において、核酸アッセイは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、ＲＴ－ｑＰＣＲ、マイクロアレイ、遺伝子アレイまたはＲＮＡｓｅｑのうちの少なくとも１つを含む。

【0564】

細胞を編集する方法
「遺伝子工学」、「遺伝子編集」または「ゲノム編集」という用語は、本明細書で使用される場合、ＤＮＡが、人工的に操作されたヌクレアーゼまたは「分子ハサミ」を使用してゲノムへ挿入、ゲノムから置換または除去される、一種の遺伝子操作を指す。これは、配列特異的遺伝子もしくはタンパク質の機能及び効果を解明するか、または細胞挙動を改変するため（例えば、治療目的のため）の有用なツールである。

【0565】

現在利用可能なゲノム編集ツールとしては、セーフハーバー遺伝子座（例えば、アデノ随伴ウイルス組込み部位１（ＡＡＶＳ１）セーフハーバー遺伝子座）に遺伝子を組み込むためのジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が挙げられる。ｐｈｉＣ３１インテグラーゼ及びＢｘｂ１インテグラーゼを利用するＤＩＣＥ（デュアルインテグラーゼカセット交換）システムは、標的組込みのためのツールである。追加的に、クラスター化して規則的な配置の短い回文反復／Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）技法を標的遺伝子挿入に使用することができる。

【0566】

部位特異的遺伝子編集アプローチには、相同性依存的機序または相同性非依存的機序が含まれ得る。

【0567】

遺伝子配列の標的挿入のための当該技術分野で既知の全ての方法は、遺伝子標的またはセーフハーバー遺伝子座にコンストラクトを挿入するために本明細書に記載の方法で企図される。

【0568】

ウイルスベクターの非存在下で、約５キロベースを超える長さのヌクレオチド配列を細胞のゲノムに挿入する方法が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、約５ベースを超える長さのヌクレオチド配列は、ウイルスベクターの非存在下で、初代免疫細胞のゲノムに挿入され得る。

【0569】

大きい核酸、例えば、５キロベースを超えるサイズの核酸の、細胞への組込みは、組込みの効率の低さ、オフターゲット効果及び／または細胞生存能の喪失によって制限され得る。ヌクレオチド配列、例えば、約５ベースを超えるサイズのヌクレオチド配列の、細胞のゲノムへの組込みを達成するための方法及び組成物が、本明細書に記載されている。いくつかの方法では、組込みの効率が向上し、オフターゲット効果が低減し、及び／または細胞生存能の喪失が低減する。

【0570】

プラスミドは、ヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連系（Ｃａｓ）を用いて免疫細胞に導入することができる。ヌクレアーゼは、免疫細胞のゲノム上の特定の部位を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によってリボ核タンパク質フォーマットに導入することができる。ヌクレアーゼは、この特定の部位でゲノムＤＮＡを切断する。特定の部位は、内因性免疫細胞受容体をコードするゲノムの一部分であり得る。したがって、この部位でゲノムを切断すると、免疫細胞は、もはや内因性免疫細胞受容体を発現しなくなる。

【0571】

プラスミドは、免疫細胞のゲノム上の特定の部位での配列に相補的な５’及び３’相同性指向修復アームを含んでもよい。相補配列は、ヌクレアーゼによって切断された部位のいずれかの側にあり、これにより、プラスミドは、免疫細胞のゲノム上の指定された挿入部位に組み込まれることが可能になる。プラスミドが組み込まれると、細胞はプライミング受容体を発現する。しかしながら、説明されるように、導入遺伝子カセットの設計は、プライミング受容体がその同族リガンドに結合し、切断可能な転写因子を放出するまで、非ウイルス送達回路系受容体がＣＡＲを発現しないことを確実にする。

【0572】

最初に、Ｔ細胞を活性化する。Ｔ細胞は、患者から得ることができる。したがって、本開示は、Ｔ細胞などの免疫細胞が患者から採取される方法を提供する。次いで、ＣＡＲ及びプライミング受容体をコードするプラスミドをＴ細胞に導入する。有利には、本開示のプラスミドは、エレクトロポレーションを使用して導入することができる。エレクトロポレーションを介してプラスミドを導入する場合、ヌクレアーゼを導入することもできる。エレクトロポレーションを使用することによって、本開示の方法は、免疫細胞操作における既知のボトルネックである、導入遺伝子を導入するためのウイルスベクターの使用を回避する。次いで、Ｔ細胞を増殖させ、共培養して、治療処置として使用するのに十分な量の操作された免疫細胞を作成する。

【0573】

細胞のゲノムを編集するための方法は、ａ）（ｉ）ＲＮＰ（ＲＮＰは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメイン及びガイドＲＮＡを含み、ガイドＲＮＡは、細胞のゲノムの標的領域に特異的にハイブリダイズし、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインは、標的領域を切断して、細胞のゲノムにおける挿入部位を作成する）、及び（ｉｉ）二本鎖または一本鎖ＤＮＡテンプレート（ＤＮＡテンプレートのサイズは、約２００ヌクレオチド超であり、ＤＮＡテンプレートの５’及び３’末端は、挿入部位に隣接するゲノム配列に相同であるヌクレオチド配列を含み、複合体におけるＲＮＰ対ＤＮＡテンプレートのモル比は、約３：１～約１００：１である）を含む、Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）－ＤＮＡテンプレート複合体を提供することと、ｂ）ＲＮＰ－ＤＮＡテンプレート複合体を細胞に導入することと、を含み得る。

【0574】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、９９．５％、９９％、またはそれ以上のＲＮＰ－ＤＮＡテンプレート複合体の送達の効率を提供する。いくつかの場合において、効率は、ＲＮＰ－ＤＮＡテンプレートを細胞内に導入した後に生存可能である細胞に関して決定される。いくつかの場合において、効率は、ＲＮＰ－ＤＮＡテンプレートが細胞内に導入される細胞の総数（生存可能または非生存可能）に関して決定される。

【0575】

別の例として、送達の効率は、（導入ステップ後に得られた全細胞または全生存細胞と比較して）細胞集団内のゲノム編集細胞の数を定量化することによって決定することができる。ゲノム編集を定量化するための様々な方法を利用することができる。これらの方法には、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩなどのミスマッチ特異的ヌクレアーゼの使用、１つ以上の標的遺伝子座の配列決定（例えば、クローニングされた標的遺伝子座増幅断片のサンガー配列決定による）、及びハイスループット大規模配列決定が含まれるが、これらに限定されない。

【0576】

いくつかの実施形態において、細胞生存率の喪失は、裸のＤＮＡを細胞に導入した後、またはウイルスベクターを使用してＤＮＡを細胞に導入した後の細胞生存率の喪失と比較して低減される。低減は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはこれらのパーセンテージの間の任意のパーセンテージの低減であり得る。いくつかの実施形態において、組込みのオフターゲット効果は、裸のＤＮＡを細胞に導入した後、またはウイルスベクターを使用してＤＮＡを細胞に導入した後、オフターゲット組込みと比較して低減される。低減は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはこれらのパーセンテージの間の任意のパーセンテージの低減であり得る。

【0577】

いくつかの場合において、本明細書に記載の方法は、ＲＮＰ－ＤＮＡテンプレートが導入された細胞の高い細胞生存率を提供する。いくつかの場合において、ＲＮＰ－ＤＮＡテンプレートが導入された細胞の生存率は、少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、９９．５％、９９％、またはそれ以上である。いくつかの場合において、ＲＮＰ－ＤＮＡテンプレートが導入された細胞の生存率は、約２０％～約９９％、約３０％～約９０％、約３５％～約８５％または９０％以上、約４０％～約８５％または９０％以上、約５０％～約８５％または９０％以上、約５０％～約８５％または９０％以上、約６０％～約８５％または９０％以上、または約７０％～約８５％または９０％以上である。

【0578】

本明細書に提供される方法では、ＲＮＰ対ＤＮＡテンプレートのモル比は、約３：１～約１００：１であり得る。例えば、モル比は、約５：１～１０：１、約５：１～約１５：１、５：１～約２０：１、５：１～約２５：１、約８：１～約１２：１、約８：１～約１５：１、約８：１～約２０：１、または約８：１～約２５：１であり得る。

【0579】

いくつかの実施形態において、ＤＮＡテンプレートは、約２．５ｐＭ～約２５ｐＭの濃度である。例えば、ＤＮＡテンプレートの濃度は、約２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５ｐＭ、またはこれらの濃度の間の任意の濃度であり得る。

【0580】

いくつかの実施形態において、ＤＮＡテンプレートのサイズまたは長さは、約４．５ｋｂ、５．０ｋｂ、５．１ｋｂ、５．２ｋｂ、５．３ｋｂ、５．４ｋｂ、５．５ｋｂ、５．６ｋｂ、５．７ｋｂ、５．８ｋｂ、５．９ｋｂ、６．０ｋｂ、６．１ｋｂ、６．２ｋｂ、６．３ｋｂ、６．４ｋｂ、６．５ｋｂ、６．６ｋｂ、６．７ｋｂ、６．８ｋｂ、６．９ｋｂ、７．０ｋｂ、７．１ｋｂ、７．２ｋｂ、７．３ｋｂ、７．４ｋｂ、７．５ｋｂ、７．６ｋｂ、７．７ｋｂ、７．８ｋｂ、７．９ｋｂ、８．０ｋｂ、８．１ｋｂ、８．２ｋｂ、８．３ｋｂ、８．４ｋｂ、８．５ｋｂ、８．６ｋｂ、８．７ｋｂ、８．８ｋｂ、８．９ｋｂ、９．０ｋｂ、９．１ｋｂ、９．２ｋｂ、９．３ｋｂ、９．４ｋｂ、９．５ｋｂ、９．６ｋｂ、９．７ｋｂ、９．８ｋｂ、９．９ｋｂ、もしくは１０ｋｂ超、またはこれらのサイズの間のいずれかのサイズのＤＮＡテンプレートである。例えば、ＤＮＡテンプレートのサイズは、約４．５ｋｂ～約１０ｋｂ、約５ｋｂ～約１０ｋｂ、約５ｋｂ～約９ｋｂ、約５ｋｂ～約８ｋｂ、約５ｋｂ～約７ｋｂ、約５ｋｂ～約６ｋｂ、約６ｋｂ～約１０ｋｂ、約６ｋｂ～約９ｋｂ、約６ｋｂ～約８ｋｂ、約６ｋｂ～約７ｋｂ、約７ｋｂ～約１０ｋｂ、約７ｋｂ～約９ｋｂ、約７ｋｂ～約８ｋｂ、約８ｋｂ～約１０ｋｂ、約８ｋｂ～約９ｋｂ、または約９ｋｂ～約１０ｋｂであり得る。

【0581】

いくつかの実施形態において、ＤＮＡテンプレートの量は、約１μｇ～約１０μｇである。例えば、ＤＮＡテンプレートの量は、約１μｇ～約２μｇ、約１μｇ～約３μｇ、約１μｇ～約４μｇ、約１μｇ～約５μｇ、約１μｇ～約６μｇ、約１μｇ～約７μｇ、約１μｇ～約８μｇ、約１μｇ～約９μｇ、約１μｇ～約１０μｇであり得る。いくつかの実施形態において、ＤＮＡテンプレートの量は、約２μｇ～約３μｇ、約２μｇ～約４μｇ、約２μｇ～約５μｇ、約２μｇ～約６μｇ、約２μｇ～約７μｇ、約２μｇ～約８μｇ、約２μｇ～約９μｇ、または２μｇ～約１０μｇである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡテンプレートの量は、約３μｇ～約４μｇ、約３μｇ～約５μｇ、約３μｇ～約６μｇ、約３μｇ～約７μｇ、約３μｇ～約８μｇ、約３μｇ～約９μｇ、または約３μｇ～約１０μｇである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡテンプレートの量は、約４μｇ～約５μｇ、約４μｇ～約６μｇ、約４μｇ～約７μｇ、約４μｇ～約８μｇ、約４μｇ～約９μｇ、または約４μｇ～約１０μｇである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡテンプレートの量は、約５μｇ～約６μｇ、約５μｇ～約７μｇ、約５μｇ～約８μｇ、約５μｇ～約９μｇ、または約５μｇ～約１０μｇである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡテンプレートの量は、約６μｇ～約７μｇ、約６μｇ～約８μｇ、約６μｇ～約９μｇ、または約６μｇ～約１０μｇである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡテンプレートの量は、約７μｇ～約８μｇ、約７μｇ～約９μｇ、または約７μｇ～約１０μｇである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡテンプレートの量は、約８μｇ～約９μｇ、または約８μｇ～約１０μｇである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡテンプレートの量は、約９μｇ～約１０μｇである。

【0582】

いくつかの場合において、ＤＮＡテンプレートのサイズは、裸のＤＮＡとして致死的であるのに十分に大きくかつ十分な量である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡテンプレートは、異種タンパク質またはその断片をコードする。いくつかの実施形態において、ＤＮＡテンプレートは、少なくとも１つの遺伝子をコードする。いくつかの実施形態において、ＤＮＡテンプレートは、少なくとも２つの遺伝子をコードする。いくつかの実施形態において、ＤＮＡテンプレートは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の遺伝子をコードする。

【0583】

いくつかの実施形態において、ＤＮＡテンプレートは、細胞のゲノムへの挿入後に異種タンパク質またはその断片の発現を調節するための調節配列、例えばプロモーター配列及び／またはエンハンサー配列を含む。

【0584】

いくつかの場合において、ＤＮＡテンプレートは、直鎖ＤＮＡテンプレートである。いくつかの場合において、ＤＮＡテンプレートは、一本鎖ＤＮＡテンプレートである。いくつかの場合において、一本鎖ＤＮＡテンプレートは、純粋な一本鎖ＤＮＡテンプレートである。本明細書で使用される場合、「純粋な一本鎖ＤＮＡ」とは、ＤＮＡの他の鎖または反対の鎖を実質的に欠く一本鎖ＤＮＡを意味する。「実質的に欠く」とは、純粋な一本鎖ＤＮＡが、１つのＤＮＡ鎖を別のＤＮＡ鎖よりも少なくとも１００倍多く欠くことを意味する。

【0585】

いくつかの場合において、ＲＮＰ－ＤＮＡテンプレート複合体は、ＲＮＰをＤＮＡテンプレートとともに約２０℃～約２５℃の温度で約１分未満～約３０分間インキュベートすることによって形成される。例えば、ＲＮＰは、ＤＮＡテンプレートとともに約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、または２５℃の温度で約５秒、１０秒、１５秒、２０秒、２５秒、３０秒、３５秒、４０秒、４５秒、５０秒、５５秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、２１分、２２分、２３分、２４分、２５分、２６分、２７分、２８分、２９分、３０分、またはこれらの時間の間の任意の量の時間にわたってインキュベートすることができる。別の例において、ＲＮＰは、ＤＮＡテンプレートとともに約２０℃～約２５℃の温度で約１分未満～約１分、約１分未満～約５分、約１分未満～約１０分、約５分～１０分、約５分～１５分、約１０～約１５分、約１０分～約２０分、または約１０分～約３０分間インキュベートすることができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＰ－ＤＮＡテンプレート複合体及び細胞は、ＲＮＰ－ＤＮＡテンプレート複合体を細胞に導入する前に混合される。

【0586】

いくつかの実施形態において、ＲＮＰ－ＤＮＡテンプレート複合体を導入することは、エレクトロポレーションを含む。細胞をエレクトロポレーションしてＲＮＰ－ＤＮＡテンプレート複合体を導入するための方法、組成物、及びデバイスは、本明細書の実施例に記載されるものを含むことができる。細胞をエレクトロポレーションしてＲＮＰ－ＤＮＡテンプレート複合体を導入するための追加または代替の方法、組成物、及びデバイスは、ＷＯ／２００６／００１６１４またはＫｉｍ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．２３，１３５３－１３６０（２００８）に記載されるものを含むことができる。細胞をエレクトロポレーションしてＲＮＰ－ＤＮＡテンプレート複合体を導入するための追加または代替の方法、組成物、及びデバイスは、米国特許出願公開第２００６／００９４０９５号、同第２００５／００６４５９６号、または同第２００６／００８７５２２号に記載されるものを含むことができる。細胞をエレクトロポレーションしてＲＮＰ－ＤＮＡテンプレート複合体を導入するための追加または代替の方法、組成物、及びデバイスは、Ｌｉ，Ｌ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．１，３４１－３５０（２００２）、米国特許第６，７７３，６６９号、同第７，１８６，５５９号、同第７，７７１，９８４号、同第７，９９１，５５９号、同第６４８５９６１号、同第７０２９９１６号、及び米国特許出願公開第２０１４／００１７２１３号、及び同第２０１２／００８８８４２号（これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものを含むことができる。細胞をエレクトロポレーションしてＲＮＰ－ＤＮＡテンプレート複合体を導入するための追加または代替の方法、組成物、及びデバイスは、Ｇｅｎｇ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ １４４，９１－１００（２０１０）、及びＷａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｌａｂ．Ｃｈｉｐ １０，２０５７－２０６１（２０１０）（これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものを含むことができる。

【0587】

いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、ガイドＲＮＡを有する複合体またはＤＮＡテンプレートを有する複合体の一部として標的核酸に結合したときに、二本鎖切断が標的核酸に導入されるように、活性エンドヌクレアーゼ形態であり得る。二本鎖切断は、ＮＨＥＪによって修復されてランダム変異を導入することができるか、またはＨＤＲによって特定の変異を導入することができる。様々なＣａｓ９ヌクレアーゼは、本明細書に記載の方法において利用することができる。例えば、ガイドＲＮＡによって標的化された領域の３’直前にＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を必要とするＣａｓ９ヌクレアーゼを利用することができる。そのようなＣａｓ９ヌクレアーゼは、ＮＧＧ配列を含有するゲノムの任意の領域を標的とすることができる。別の例として、直交ＰＡＭモチーフ要件を有するＣａｓ９タンパク質を利用して、隣接ＮＧＧ ＰＡＭ配列を有しない配列を標的とすることができる。直交ＰＡＭ配列特異性を有する例示的なＣａｓ９タンパク質としては、ＣＦＰ１、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０，１１１６－１１２１（２０１３）に記載されるもの、及びＺｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ １６３，Ｉｓｓｕｅ ３，ｐ７５９－７７１，２２ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１５に記載されるものが挙げられるが、それらに限定されない（両方とも参照により本明細書に組み込まれる）。

【0588】

いくつかの場合において、Ｃａｓ９タンパク質は、ガイドＲＮＡとの複合体の一部として標的核酸に結合したときに、一本鎖切断またはニックが標的核酸に導入されるように、ニッカーゼである。各々が構造的に異なるガイドＲＮＡに結合した一対のＣａｓ９ニッカーゼは、標的ゲノム領域の２つの近位部位を標的とすることができ、したがって、一対の近位一本鎖切断を標的ゲノム領域に導入することができる。ニッカーゼ対は、オフターゲット効果が単一のニックをもたらす可能性が高いため、特異性を高めることができ、これは概して、塩基切除修復機構によって病変なしで修復される。例示的なＣａｓ９ニッカーゼとしては、Ｄ１０ＡまたはＨ８４０Ａ変異を有するＣａｓ９ヌクレアーゼが挙げられる。

【0589】

いくつかの実施形態において、ＲＮＰは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＰは、Ｃａｓ９ニッカーゼを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＰ－ＤＮＡテンプレート複合体は、少なくとも２つの構造的に異なるＲＮＰ複合体を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも２つの構造的に異なるＲＮＰ複合体は、構造的に異なるＣａｓ９ヌクレアーゼドメインを含有する。いくつかの実施形態において、少なくとも２つの構造的に異なるＲＮＰ複合体は、構造的に異なるガイドＲＮＡを含有する。少なくとも２つの構造的に異なるＲＮＰ複合体が構造的に異なるガイドＲＮＡを含有するいくつかの実施形態において、構造的に異なるＲＮＰ複合体の各々は、Ｃａｓ９ニッカーゼを含み、構造的に異なるガイドＲＮＡは、標的領域の反対側の鎖にハイブリダイズする。

【0590】

いくつかの場合において、構造的に異なるリボ核タンパク質複合体を含む複数のＲＮＰ－ＤＮＡテンプレートが細胞に導入される。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、複数の構造的に異なる標的ゲノム領域におけるＤＮＡテンプレートの挿入を標的とするために、複数（例えば、２、３、４、５、またはそれよりも多い、例えば、２～１０、５～１００、２０～１００個）の構造的に異なるガイドＲＮＡと複合体化することができる。

【0591】

本明細書に提供される方法及び組成物において、細胞には、真核細胞、原核細胞、動物細胞、植物細胞、真菌細胞等が含まれるが、これらに限定されない。任意選択で、細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞である。細胞は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボであり得る。細胞はまた、初代細胞、生殖細胞、幹細胞または前駆細胞であり得る。前駆細胞は、例えば、多能性幹細胞または造血幹細胞であり得る。いくつかの実施形態において、細胞は、初代造血細胞または初代造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、初代造血細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、調節Ｔ細胞、エフェクターＴ細胞、またはナイーブＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ４^－ＣＤ８^－Ｔ細胞である。本明細書に記載の方法のうちのいずれかによって修飾された細胞のうちのいずれかの集団もまた提供される。いくつかの実施形態において、方法は、修飾細胞の集団を拡張することを更に含む。

【0592】

いくつかの場合において、細胞は、対象から取り出され、本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して修飾され、患者に投与される。他の場合において、本明細書に記載のコンストラクトのうちのいずれかは、インビボで患者に送達される。例えば、米国特許第９７３７６０４号及びＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．“Ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ，”ＮＰＧ Ａｓｉａ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｖｏｌｕｍｅ ９，ｐａｇｅ ｅ４４１（２０１７）（両方とも参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

【0593】

いくつかの実施形態において、ＲＮＰ－ＤＮＡテンプレート複合体は、約１×１０^５～約２×１０^６細胞に導入される。例えば、ＲＮＰ－ＤＮＡテンプレート複合体は、約１×１０^５～約５×１０^５細胞、約１×１０^５～約１×１０^６、１×１０^５～約１．５×１０^６、１×１０^５～約２×１０^６、約１×１０^６～約１．５×１０^６細胞、または約１×１０^６～約２×１０^６に導入することができる。

【0594】

いくつかの場合において、本明細書に記載の方法及び組成物は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）などの組換えＴ細胞の生成、修飾、使用、または制御のために使用することができる。そのようなＣＡＲ Ｔ細胞を使用して、対象におけるがん、感染性疾患、または自己免疫疾患を治療または予防することができる。例えば、いくつかの実施形態において、１つ以上の遺伝子産物がＴ細胞に挿入またはノックインされ、異種タンパク質（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはプライミング受容体）を発現する。

【0595】

異種受容体（例えば、ＣＡＲ及び／またはＴＣＲ）及びＲＮＡｉ（例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）の発現を操作する遺伝子操作（例えば、ゲノム編集、ヌクレアーゼ媒介性編集、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性編集など）は、国際公開第２０１８２３２３５６Ａ１号、同第２０１９０８４５５２Ａ１号、同第２０１９２２６９９８Ａ１号、同第２０２００１４２３５Ａ１号、同第２０２０１２３８７１Ａ１及び同第２０２０１８６２１９Ａ１号に記載されており、それらの各々は、全ての目的で参照により本明細書に組み込まれる。

【0596】

挿入部位
Ｔ細胞のゲノムを編集するための方法は、具体的に、ヒトＴ細胞におけるＴＣＲ－αサブユニット（ＴＲＡＣ）のエクソン１における標的領域に核酸配列またはコンストラクトを挿入することを含む、ヒトＴ細胞のゲノムを編集する方法を含む。いくつかの実施形態において、標的領域は、ＴＲＡＣ遺伝子の定常ドメインのエクソン１にある。他の実施形態において、標的領域は、ＴＣＲ－α膜貫通ドメインをコードする配列の開始前に、エクソン１、エクソン２またはエクソン３にある。

【0597】

Ｔ細胞のゲノムを編集するための方法はまた、ヒトＴ細胞におけるＴＣＲ－βサブユニット（ＴＲＢＣ）のエクソン１における標的領域に核酸配列またはコンストラクトを挿入することを含む、ヒトＴ細胞のゲノムを編集する方法を含む。いくつかの実施形態において、標的領域は、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２遺伝子のエクソン１にある。

【0598】

Ｔ細胞のゲノムを編集するための方法は、具体的には、ゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）部位の標的領域に核酸配列またはコンストラクトを挿入することを含む、ヒトＴ細胞のゲノムを編集する方法を含む。

【0599】

Ｔ細胞のゲノムを編集するための方法はまた、ＧＳ９４標的領域（遺伝子座 ｃｈｒ１１：１２８３４００００－１２８３５００００）に核酸配列またはコンストラクトを挿入することを含む、ヒトＴ細胞のゲノムを編集する方法も含む。

【0600】

いくつかの実施形態において、標的領域は、ＧＳ９４遺伝子座である。

【0601】

遺伝子編集療法には、例えば、ベクター組込み及び部位特異的組込みが含まれる。部位特異的組込みは、挿入変異誘発または挿入発がんのリスクを軽減するため、ウイルスベクターのランダムな組込みに代わる有望な代替物である（Ｋｏｌｂ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５ ２３：３９９－４０６、Ｐｏｒｔｅｕｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５ ２３：９６７－９７３、Ｐａｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｇｅｎ Ｔｈｅｒ．２００７ ７：４９－６６）。しかしながら、部位特異的組込みは、低いノックイン効率、挿入発がんのリスク、隣接した遺伝子または導入遺伝子の不安定及び／または異常な発現、低いアクセス性（例えば、隣接した遺伝子の２０ｋＢ以内）などの課題に直面し続けている。これらの課題は、部分的には、隣接した遺伝子の発現または調節を中断することなく遺伝子または遺伝子エレメントを組み込むことができる部位である、セーフハーバー遺伝子座またはセーフハーバー部位（ＳＨＳ）の同定及び使用によって対処することができる。

【0602】

推定ヒトセーフハーバー部位の中で最も広く使用されているのは、１９ｑ染色体上のＡＡＶＳ１部位であり、これは当初、再発性アデノ随伴ウイルス挿入のための部位として同定された。他の潜在的なＳＨＳは、他の種において最初に同定された部位との相同性に基づいて同定されており（例えば、許容性マウスＲｏｓａ２６遺伝子座のヒト相同性）、またはいくつかの状況下で非本質的に見えるますます多くのヒト遺伝子中で同定されている。このタイプの推定ＳＨＳの１つは、ＣＣＲ５ケモカイン受容体遺伝子であり、破壊されると、ヒト免疫不全ウイルス感染に対する耐性を付与する。追加の潜在的なゲノムＳＨＳは、元のマウスＲｏｓａ２６遺伝子座と同様に、ウイルス組込み部位マッピングまたは遺伝子トラップ分析に基づいて、ヒト及び他の細胞型で同定されている。上位３つのＳＨＳ、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、及びＲｏｓａ２６は、多くのタンパク質コード遺伝子及び調節要素に近接している。（Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ｓａｆｅ ｈａｒｂｏｕｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｗ ＤＮＡ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ，１２（１），５１－５８（この関連開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。

【0603】

ヒト染色体１９上のＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子座としても知られる）は、期待される機能を有する導入遺伝子（例えば、ＤＮＡ導入遺伝子）をホストするための既知のＳＨＳである。それは、１９ｑ１３．４２位にある。それは、オープンクロマチン構造を有し、転写能がある。ＡＡＶＳ１の正準ＳＨＳ遺伝子座は、ｃｈｒ１９：５５、６２５、２４１～５５、６２９、３５１である。Ｐｅｌｌｅｎｚ ｅｔ ａｌ．“Ｎｅｗ Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ Ｓｉｔｅｓ ｗｉｔｈ“Ｓａｆｅ Ｈａｒｂｏｒ”Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ．”Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌ．３０，７（２０１９）：８１４－８２８を参照されたく、その関連開示は、参照により本明細書に組み込まれる。例示的なＡＡＶＳ１標的ｇＲＮＡ及び標的配列を以下に提供する。
● ＡＡＶＳ１－ｇＲＮＡ配列： ｇｇｇｇｃｃａｃｔａｇｇｇａｃａｇｇａｔＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴ （配列番号２１２）
● ＡＡＶＳ１標的配列： ｇｇｇｇｃｃａｃｔａｇｇｇａｃａｇｇａｔ （配列番号２１３）

【0604】

３ｐ２１．３１位の染色体３上に位置するＣＣＲ５は、ＨＩＶ－１の主要な共受容体をコードする。ＣＣＲ５遺伝子におけるこの部位の破壊は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ治療において有益であり、その第３のエクソンを標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼの発達を促した。ＣＣＲ５の正準ＳＨＳ遺伝子座は、ｃｈｒ３：４６、４１４、４４３～４６、４１４、９４２である。Ｐｅｌｌｅｎｚ ｅｔ ａｌ．“Ｎｅｗ Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ Ｓｉｔｅｓ ｗｉｔｈ ”Ｓａｆｅ Ｈａｒｂｏｒ“Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ．”Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌ．３０，７（２０１９）：８１４－８２８（この関連開示は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

【0605】

マウスＲｏｓａ２６遺伝子座は、高い効率で標的化することができ、試験した大部分の細胞型において発現されるため、遺伝子修飾に特に有用である。Ｉｒｉｏｎ ｅｔ ａｌ．２００７（“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＲＯＳＡ２６ ｌｏｃｕｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．”Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５．１２（２００７）：１４７７－１４８２（その関連する開示は、参照により本明細書に組み込まれる）は、染色体３（３ｐ２５．３位）においてヒトホモログであるヒトＲＯＳＡ２６を同定した。ヒトＲｏｓａ２６（ｈＲｏｓａ２６）の正準ＳＨＳ遺伝子座は、ｃｈｒ３：９，４１５，０８２－９，４１４，０４３である。Ｐｅｌｌｅｎｚ ｅｔ ａｌ．“Ｎｅｗ Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ Ｓｉｔｅｓ ｗｉｔｈ ”Ｓａｆｅ Ｈａｒｂｏｒ“Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ．”Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌ．３０，７（２０１９）：８１４－８２８（この関連開示は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

【0606】

セーフハーバー部位の追加の例は、Ｐｅｌｌｅｎｚ ｅｔ ａｌ．“Ｎｅｗ Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ Ｓｉｔｅｓ ｗｉｔｈ ”Ｓａｆｅ Ｈａｒｂｏｒ“Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ．”Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌ．３０，７（２０１９）：８１４－８２８（この関連開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に提供されている。追加の組込み部位の例を表Ｄに提供する。

【0607】

いくつかの実施形態において、セーフハーバー部位は、高導入遺伝子発現（導入遺伝子機能性または目的の疾患の治療を可能にするのに十分な）及び導入遺伝子の数日、数週間または数ヶ月にわたる安定した発現を可能にする。いくつかの実施形態において、セーフハーバー遺伝子座における遺伝子のノックアウトは、細胞の機能に利益を与えるか、またはセーフハーバー遺伝子座における遺伝子は、細胞内で既知の機能を有しない。いくつかの実施形態において、セーフハーバー遺伝子座は、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激の有無にかかわらず、インビトロでの安定した導入遺伝子発現、ｉＧｕｉｄｅ－ＳｅｑまたはＣＲＩＳＰＲ－Ｓｅｑによって検出された無視できるオフターゲット切断、ｉＧｕｉｄｅ－ＳｅｑまたはＣＲＩＳＰＲ－Ｓｅｑによって検出された他の遺伝子座と比較してより少ないオフターゲット切断、無視できる導入遺伝子非依存的細胞毒性、無視できる導入遺伝子非依存的サイトカイン発現、無視できる導入遺伝子非依存的キメラ抗原受容体発現、無視できる近くの遺伝子の制御解除またはサイレンシングをもたらし、がん関連遺伝子の外側に位置付けられる。

【0608】

使用される場合、「近傍遺伝子」は、セーフハーバー遺伝子座（組込み部位）から約１００ｋＢ、約１２５ｋＢ、約１５０ｋＢ、約１７５ｋＢ、約２００ｋＢ、約２２５ｋＢ、約２５０ｋＢ、約２７５ｋＢ、約３００ｋＢ、約３２５ｋＢ、約３５０ｋＢ、約３７５ｋＢ、約４００ｋＢ、約４２５ｋＢ、約４５０ｋＢ、約４７５ｋＢ、約５００ｋＢ、約５２５ｋＢ、約５５０ｋＢ以内にある遺伝子を指すことができる。

【0609】

いくつかの実施形態において、本開示は、１つ以上の導入遺伝子を含む挿入物を企図する。導入遺伝子は、治療用タンパク質、抗体、ペプチド、または目的の任意の他の遺伝子をコードすることができる。導入遺伝子組込みは、例えば、治療特性の向上をもたらし得る。これらの強化された治療特性は、本明細書で使用される場合、同じ正常細胞型の典型的な免疫細胞と比較して、強化された細胞の治療特性を指す。例えば、「強化された治療特性」を有するＴ細胞は、典型的な、非修飾及び／または天然に存在するＴ細胞と比較して、強化された、改善された、及び／または増加した治療転帰を有する。免疫細胞の治療特性には、細胞移植、輸送、ホーミング、生存率、自己再生、持続性、免疫応答制御及び調節、生存、ならびに細胞毒性が含まれ得るが、これらに限定されない。免疫細胞の治療特性はまた、抗原標的化受容体の発現、ＨＬＡの提示またはその欠如、腫瘍内微小環境への耐性、バイスタンダー免疫細胞の誘導及び免疫調節、還元による改善された標的特異性、化学療法などの治療への耐性によっても明らかにされる。

【0610】

本明細書で使用される場合、「挿入物サイズ」は、標的遺伝子座またはセーフハーバー部位に組み込まれる（挿入される）ヌクレオチド配列の長さを指す。いくつかの実施形態において、挿入物サイズは、少なくとも約４．５キロベース対（ｋｂ）～約１０キロベース対（ｋｂ）を含む。いくつかの実施形態において、挿入物サイズは、約５０００ヌクレオチド以上の塩基対を含む。いくつかの実施形態において、挿入物サイズは、最大で４．５、４．８、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ｋｂｐ（キロベース対）またはそれらの間のサイズを含む。いくつかの実施形態において、挿入物サイズは、４．５、４．８、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ｋｂｐまたはそれらの間のサイズよりも大きい。いくつかの実施形態において、挿入物サイズは、４．５～１５ｋｂｐの範囲内であるか、またはその範囲内の任意の数である。いくつかの実施形態において、挿入物サイズは、４．８～８．３ｋｂｐの範囲内であるか、またはその範囲内の任意の数である。いくつかの実施形態において、挿入物サイズは、５～８．３ｋｂｐの範囲内であるか、またはその範囲内の任意の数である。いくつかの実施形態において、挿入物サイズは、５～１５ｋｂｐの範囲内であるか、またはその範囲内の任意の数である。いくつかの実施形態において、挿入物サイズは、４．５～２０ｋｂｐの範囲内であるか、またはその範囲内の任意の数である。いくつかの実施形態において、挿入物サイズは、５～１０ｋｂｐである。いくつかの実施形態において、挿入物サイズは、４．５～１０、５～１０、６～１０、７～１０、８～１０、９～１０ｋｂｐである。いくつかの実施形態において、挿入物サイズは、４．５～１１、６～１１、７～１１、８～１１、９～１１、または１０～１１ｋｂｐである。いくつかの実施形態において、挿入物サイズは、４．５～１２、６～１２、７～１２、８～１２、９～１２、１０～１２、または１１～１２ｋｂｐである。いくつかの実施形態において、挿入物サイズは、４．５～１３、６～１３、７～１３、８～１３、９～１３、１０～１３、１１～１３、または１２～１３ｋｂｐである。いくつかの実施形態において、挿入物サイズは、４．５～１４、６～１４、７～１４、８～１４、９～１４、１０～１４、１１～１４、１２～１４、または１３～１４ｋｂｐである。いくつかの実施形態において、挿入物サイズは、４．５～１５、６～１５、７～１５、８～１５、９～１５、１０～１５、１１～１５、１２～１５、１３～１５、または１４～１５ｋｂｐである。いくつかの実施形態において、挿入物サイズは、４．５～１６、６～１６、７～１６、８～１６、９～１６、１０～１６、１１～１６、１２～１６、１３～１６、１４～１６、または１５～１６ｋｂｐである。いくつかの実施形態において、挿入物サイズは、４．５～１７、６～１７、７～１７、８～１７、９～１７、１０～１７、１１～１７、１２～１７、１３～１７、または１４～１７、１５～１７、または１６～１７ｋｂｐである。いくつかの実施形態において、挿入物サイズは、４．５～１８、６～１８、７～１８、８～１８、９～１８、１０～１８、１１～１８、１２～１８、１３～１８、１４～１８、１５～１８、１６～１８、または１７～１８ｋｂｐである。いくつかの実施形態において、挿入物サイズは、４．５～１９、６～１９、７～１９、８～１９、９～１９、１０～１９、１１～１９、１２～１９、１３～１９、１４～１９、１５～１９、１６～１９、１７～１９、または１８～１９ｋｂｐである。いくつかの実施形態において、挿入物サイズは、４．５～２０、６～２０、７～２０、８～２０、９～２０、１０～２０、１１～２０、１２～２０、１３～２０、１４～２０、１５～２０、１６～２０、１７～２０、１８～２０、または１９～２０ｋｂｐである。

【0611】

本開示の挿入物は、標的遺伝子座またはセーフハーバー部位に挿入される核酸分子またはポリヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ分子、例えば、ゲノムＤＮＡであるか、またはデオキシリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、挿入物は、プラスミド、フォスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、及び／またはＤＮＡの任意の他のサブゲノムセグメントの形態で単離されたプラスチドＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、またはＤＮＡなどのＤＮＡのより小さな断片を含む。いくつかの実施形態において、挿入物は、ＲＮＡ分子であるか、またはリボヌクレオチドを含む。挿入物中のヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチド、非天然に存在するヌクレオチド、及び修飾ヌクレオチドとして企図される。ヌクレオチドは、当業者に容易に理解されるように、化学的または生化学的に修飾されてもよく、または非天然または誘導体化ヌクレオチド塩基を含有してもよい。かかる修飾には、例えば、標識、メチル化、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つ以上の、類似体との置換、ヌクレオチド間修飾が含まれる。ポリヌクレオチドは、当該技術分野で企図される一本鎖、二本鎖、部分的に二重鎖、三重鎖、ヘアピン、円形コンフォメーション、及び他の三次元コンフォメーションを含む、任意のトポロジカルコンフォメーションであり得る。

【0612】

挿入物は、コード領域及び／または非コード領域を有することができる。挿入物は、非コード配列（例えば、制御エレメント、例えば、プロモーター配列）を含むことができる。いくつかの実施形態において、挿入物は、転写因子をコードする。いくつかの実施形態において、挿入物は、抗原結合受容体、例えば、単一受容体、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、プライミング受容体、ＣＡＲ、ｍＡｂなどをコードする。いくつかの実施形態において、挿入物は、ヒト配列である。いくつかの実施形態において、挿入物は、キメラである。いくつかの実施形態において、挿入物は、多遺伝子／多モジュール治療用カセットである。多遺伝子／多モジュール治療カセットは、１つ以上の受容体（例えば、合成受容体）、他の外因性タンパク質コード配列、非コードＲＮＡ、転写調節エレメント、及び／または絶縁体配列等を有する挿入物またはカセットを指す。

【0613】

いくつかの実施形態において、核酸配列は、非ウイルス送達を介してＴ細胞のゲノムに挿入される。非ウイルス送達方法において、核酸は、裸のＤＮＡであり得るか、または非ウイルスプラスミドもしくはベクター中にあり得る。非ウイルス送達技法は、本明細書に記載されるか、または当業者に知られている部位特異的な組込み技法であり得る。セーフハーバー遺伝子座への組込みのための部位特異的技法の例としては、限定されないが、ヌクレアーゼを使用する相同性依存的操作及びＣａｓ９または他のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを使用する相同性非依存的標的挿入が挙げられる。

【0614】

いくつかの実施形態において、挿入物は、操作された細胞に導入することによってセーフハーバー部位に組み込まれ、（ａ）セーフハーバー部位の標的領域を切断して挿入部位を作成する標的ヌクレアーゼ、及び（ｂ）核酸配列（挿入物）であり、挿入物は、例えば、ＨＤＲによって挿入部位に組み込まれる。本開示の方法で使用することができる非ウイルス送達技法の例は、米国出願第１６／５６８，１１６号及び同第１６／６２２，８４３号に提供されており、これらの関連する開示は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。

【0615】

企図される組込み部位の例を表Ｄに提供する。

【0616】

【表D】

【0617】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ編集
遺伝子編集の１つの有効な例は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓアプローチ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）である。このアプローチは、ガイドポリヌクレオチド（例えば、ガイドリボ核酸またはｇＲＮＡ）及びｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）の使用を組み込む。

【0618】

本明細書で使用される場合、「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ」と称されるまたは「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ活性」を有するポリペプチドは、Ｃａｓ遺伝子によってコードされるＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチドを指し、Ｃａｓポリペプチドは、１つ以上のガイドポリヌクレオチドに動作可能に連結されたときに切断され得る標的ＤＮＡ配列である（例えば、米国特許第８，６９７，３５９号を参照されたい）。この定義には、ガイドポリヌクレオチド依存性エンドヌクレアーゼ活性を保持するＣａｓエンドヌクレアーゼのバリアントも含まれる。本明細書に詳述されるドナーＤＮＡ挿入方法で使用されるＣａｓエンドヌクレアーゼは、標的部位（例えば、標的遺伝子座内またはセーフハーバー部位）でＤＮＡに二本鎖切断を導入するエンドヌクレアーゼである。

【0619】

本明細書で使用される場合、「ガイドポリヌクレオチド」という用語は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体化することができ、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識及び切断することを可能にすることができるポリヌクレオチド配列に関する。ガイドポリヌクレオチドは、単一分子または二重分子であり得る。ガイドポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、またはそれらの組み合わせ（ＲＮＡ－ＤＮＡ組み合わせ配列）であり得る。リボ核酸のみを含むガイドポリヌクレオチドは、「ガイドＲＮＡ」とも称される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドドナーコンストラクトは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）と組み合わせて使用して、セーフハーバー遺伝子座に挿入される。

【0620】

ガイドポリヌクレオチドは、標的ＤＮＡにおけるヌクレオチド配列に相補的である第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変標的化ドメインまたはＶＴドメインとも称される）と、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチドとを含む。配列ドメイン（Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメインまたはＣＥＲドメインと称される）を含む二重分子（二本鎖ガイドポリヌクレオチドとも称される）であり得る。この二重分子ガイドポリヌクレオチドのＣＥＲドメインは、相補領域に沿ってハイブリダイズする２つの別個の分子を含む。２つの別個の分子は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列及び／またはＲＮＡ－ＤＮＡ組み合わせ配列であり得る。

【0621】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓアプローチを使用するゲノム編集は、ＲＮＡ誘導Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）によって誘導される部位特異的ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）の修復に依存する。これらのＤＳＢの相同性指向修復（ＨＤＲ）は、塩基置換、配列挿入、及び欠失を含む定義されたゲノム変化を導入することによって、ゲノムの正確な編集を可能にする。従来のＨＤＲベースのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集は、目的の遺伝子座と一致する相同アームを含有するＣａｓ９、ｇＲＮＡ及びドナーＤＮＡで細胞をトランスフェクションすることを伴う。

【0622】

ＨＩＴＩ（相同性非依存的標的挿入）は、非相同末端接合（ＮＨＥＪ）ベースの相同性非依存的戦略を使用し、この方法は、ＨＤＲよりも効率的であり得る。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、挿入部位を標的とする。ＨＩＴＩについては、ドナープラスミドは相同性アームを欠き、ＤＳＢ修復は、ＨＤＲ経路を介しては起こらない。ドナーポリヌクレオチドコンストラクトは、挿入される遺伝子または配列に隣接するＣａｓ９切断部位（複数可）を含むように操作することができる。これにより、ドナープラスミド及びゲノム標的配列の両方でＣａｓ９切断がもたらされる。標的及びドナーの両方が平滑末端を有し、直鎖化ドナーＤＮＡプラスミドは、ゲノムＤＳＢ部位への組込みをもたらすＮＨＥＪ経路によって使用される。（例えば、Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｖｉａ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ，５４０（７６３１），１４４－１４９（この関連開示は、その全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。

【0623】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓアプローチを使用して遺伝子編集を行うための方法は、当業者に知られている。（例えば、米国出願第ＵＳ１６／３１２，６７６号、ＵＳ１５／３０３，７２２、及びＵＳ１５／６２８，５３３（これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。追加的に、導入遺伝子をセーフハーバー遺伝子座に挿入するためのエンドヌクレアーゼの使用は、例えば、米国出願第１３／０３６，３４３号（この開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。

【0624】

ガイドＲＮＡ及び／またはエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ（もしくはＤＮＡ）は、活性、細胞分布、またはオリゴヌクレオチドの細胞取り込みを向上させる１つ以上の部分または結合体に化学的に結合することができる。そのような部分の非限定的な例としては、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、チオコレステロール、脂肪族鎖（例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基）、リン脂質、例えば、ジヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－３－Ｈ－ホスホネート、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、及びオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニル－ｔオキシコレステロール部分などの脂質部分が挙げられる。例えば、米国特許公開第２０１８０１２７７８６号（この開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

【0625】

治療用途
治療用途のために、操作された細胞、その集団、またはその組成物は、対象、概して哺乳動物、概してヒトに有効量で投与される。操作された細胞は、注入（例えば、一定期間にわたる連続注入）または当業者に知られている他の投与様式によって対象に投与され得る。

【0626】

本明細書に提供される操作された細胞は、遺伝子療法における使用だけでなく、例えば、動物モデルの産生及び目的のタンパク質を発現する組換え細胞株の産生などの非薬学的使用も見出される。

【0627】

本開示の操作された細胞は、任意の細胞、概して哺乳動物細胞、概して、本明細書に記載のセーフハーバー遺伝子座に導入遺伝子を組み込むことによって修飾されたヒト細胞であり得る。例示的な細胞は、組換え細胞の項で提供される。

【0628】

本開示の操作された細胞、組成物、及び方法は、ＣＡＲ Ｔ細胞療法及びＴＣＲ Ｔ細胞療法などの治療用途に有用である。いくつかの実施形態において、セーフハーバー遺伝子座内の導入遺伝子をコードする配列の挿入は、挿入がない場合の例に対してＴＣＲ発現を維持し、ＴＣＲ機能を維持しながら導入遺伝子発現を可能にする。

【0629】

いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載の操作された細胞のうちのいずれかを含む組成物を対象に投与することによって、治療を必要とする対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、操作された細胞組成物の投与は、所望の薬理学的及び／または生理学的効果をもたらす。この効果は、疾患及び／または疾患からもたらされる有害作用の部分的または完全な治癒であることができる。いくつかの実施形態において、治療は、対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）における疾患の任意の治療を包含する。更に、治療は、対象（例えば、患者）における望ましくない臨床症状を安定化または低減し得る。本明細書で提供される細胞、その集団、またはその組成物は、疾患の発生の間または後に投与され得る。

【0630】

ある特定の実施形態において、対象は、細胞療法によって治療及び／または改善され得る疾患、状態、及び／または傷害を有する。いくつかの実施形態において、細胞療法を必要とする対象は、傷害、疾患、または状態を有する対象であり、それによって細胞療法（例えば、細胞物質が対象に投与される療法）を引き起こす。しかしながら、傷害、疾患または状態に関連する少なくとも１つの症状の重症度を治療、改善、及び／または低減することが可能であることが企図される。

【0631】

投与の方法
システムを含む有効量の免疫細胞は、がんの治療のために投与され得る。システムを含む免疫細胞の適切な投薬量は、治療されるがんのタイプ、システムを含む免疫細胞の型、がんの重症度及び経過、個体の臨床状態、個体の臨床歴及び治療への応答、ならびに主治医の判断に基づいて決定され得る。

【0632】

薬学的組成物
本明細書に提供される操作された組換え細胞は、薬学的組成物の一部として投与することができる。これらの組成物は、組換え細胞のうちの１つ以上に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤、または当業者に周知の他の材料を含むことができる。そのような材料は無毒であるべきであり、有効成分の有効性を干渉するべきではない。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路、例えば、経口、静脈内、皮膚または皮下、鼻、筋肉内、腹腔内経路に依存し得る。薬学的組成物は、１つ以上の薬学的賦形剤を含み得る。任意の好適な薬学的賦形剤が使用されてもよく、当業者は、好適な薬学的賦形剤を選択することができる。したがって、以下に提供される薬学的賦形剤は、例示であり、限定するものではないことが意図される。追加の薬学的賦形剤には、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．）６ｔｈ Ｅｄ．（２００９）（参照によりその全体が組み込まれる）に記載されるものが含まれる。

【0633】

追加の治療剤を投与する様々な様式が、本明細書で企図される。いくつかの実施形態において、追加の治療剤は、任意の好適な投与様式によって投与される。

【0634】

組成物は、治療すべき状態に応じて、単独で、または他の治療と組み合わせて、同時または連続的のいずれかで投与することができる。

【0635】

キット及び製品
本出願は、本明細書に記載されるシステムまたは細胞組成物のうちのいずれか１つ以上と、使用説明書と、を含む、キットを提供する。使用説明書は、添付文書としてキットに存在し得るか、キットもしくはその構成要素の容器のラベルに存在し得るか、またはデジタル形式であり得る（例えば、ＣＤ－ＲＯＭ上で、インターネット上のリンクを介して）。キットは、ゲノム標的化核酸、ゲノム標的化核酸をコードするポリヌクレオチド、部位特異的ポリペプチド、及び／または部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのうちの１つ以上を含み得る。キット内の追加の成分、例えば、緩衝液（再構築緩衝液、安定化緩衝液、希釈緩衝液など）、及び／または１つ以上の制御ベクターも企図される。

【0636】

いくつかの実施形態において、キットは、二次抗体、免疫組織化学分析のための試薬、薬学的に許容される賦形剤及び取扱説明書、ならびにそれらのいずれかの組み合わせのうちのいずれかから選択される構成要素を更に含有する。具体的な一実施形態において、キットは、本明細書に記載される抗体組成物のうちのいずれか１つ以上と、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と、を含む、薬学的組成物を含む。

【0637】

本出願はまた、本明細書に記載される抗体組成物またはキットのうちのいずれか１つを含む、製造物品を提供する。製造物品の例としては、（密封されたバイアルを含む）バイアルが挙げられる。

【0638】

追加の実施形態
実施形態１
プライミング受容体を含む第１のキメラポリペプチドと、
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む第２のキメラポリペプチドと、
少なくとも１５ヌクレオチド長の少なくとも１つの核酸配列と、をコードする、１つ以上の組換え核酸であって、前記少なくとも１つの核酸配列が、（１）配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦａｓ細胞表面死受容体（ＦＡＳ）をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４に相補的である第１の核酸配列、（２）配列番号４０に記載の配列を含むヒトタンパク質チロシンホスファターゼ非受容体２型（ＰＴＰＮ２）をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９に相補的である第２の核酸配列、及び（３）配列番号４１に記載の配列を含むヒト胸腺細胞選択関連高移動度群ボックス（ＴＯＸ）をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１に相補的である第３の核酸配列のうちの１つ以上を含む、前記１つ以上の組換え核酸。
実施形態２ 前記プライミング受容体が、生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ／Ｐ）に特異的に結合する第１の細胞外抗原結合ドメインを含む、実施形態１に記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態３ 前記第１の細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列、ならびにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３の３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号２に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号３に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号４に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号５に記載の配列を含み、かつ
ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号６に記載の配列を含む、実施形態２に記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態４ 前記ＣＡＲが、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する第２の細胞外抗原結合ドメインを含み、前記第２の細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１４に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１５に記載の配列を含み、かつ
ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１６に記載の配列を含む、実施形態３に記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態５ 前記少なくとも１つの核酸配列が、（１）配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４に相補的である前記第１の核酸配列、及び（２）配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９に相補的である前記第２の核酸配列の各々を含む、実施形態４に記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態６ 前記ＣＡＲが、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する第２の細胞外抗原結合ドメインを含む、実施形態１～３のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態７ 前記第２の細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１４に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１５に記載の配列を含み、かつ
ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１６に記載の配列を含む、実施形態６に記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態８ 前記第２の細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨＨ）鎖配列を含む単一ドメイン抗体を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１０に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１１に記載の配列を含み、かつ
ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１２に記載の配列を含む、実施形態６に記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態９ １つ以上の組換え核酸であって、
胎盤／生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ／Ｐ）に特異的に結合する第１の細胞外抗原結合ドメインを含むプライミング受容体を含む第１のキメラポリペプチドであって、前記第１の細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列、ならびにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３の３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号２に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号３に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号４に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号５に記載の配列を含み、かつ
ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号６に記載の配列を含む、前記第１のキメラポリペプチドと、
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む第２のキメラポリペプチドと、
配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４に相補的である第１の核酸配列と、
配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９に相補的であるか、または配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１に相補的である第２の核酸配列と、をコードする、前記１つ以上の組換え核酸。
実施形態１０ 前記第１の細胞外抗原結合ドメインＶＨ鎖配列が、配列番号７に記載の配列を含む、実施形態３～９のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態１１ 前記第１の細胞外抗原結合ドメインＶＬ鎖配列が、配列番号８に記載の配列を含む、実施形態３～１０のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態１２ 前記第１の細胞外抗原結合ドメインが、配列番号９に記載の配列を含む、実施形態３～１１のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態１３ 前記ＣＡＲが、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する第２の細胞外抗原結合ドメインを含む、実施形態９～１２のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態１４ 前記第２の細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１４に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１５に記載の配列を含み、かつ
ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１６に記載の配列を含む、実施形態１３に記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態１５ 前記第２の細胞外抗原結合ドメインＶＨが、配列番号１７に記載の配列を含む、実施形態４～８、１３及び１４のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態１６ 前記第２の細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨＨ）鎖配列を含む単一ドメイン抗体を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１０に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１１に記載の配列を含み、かつ
ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１２に記載の配列を含む、実施形態１３に記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態１７ 第２の細胞外抗原結合ドメインＶＨＨ鎖配列が、配列番号１３に記載の配列を含む、実施形態４～８、１３及び１６のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態１８ 前記第２の核酸配列が、配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９に相補的である、実施形態１～１７のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態１９ 前記組換え核酸が、配列番号１６８、１６７または１６６に記載の配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態１～１７のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態２０ 前記第２の核酸配列が、配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１に相補的である、実施形態１～１７のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態２１ 配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の核酸配列を含む、組換え核酸。
実施形態２２ 配列番号４０に記載の配列を含むヒトタンパク質チロシンホスファターゼ非受容体２型（ＰＴＰＮ２）をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の核酸配列を含む、組換え核酸。
実施形態２３ 配列番号４１に記載の配列を含むヒト胸腺細胞選択関連高移動度群ボックス（ＴＯＸ）をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の核酸配列を含む、組換え核酸。
実施形態２４ 配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列と、配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の第２の核酸配列と、を含む、１つ以上の組換え核酸。
実施形態２５ 配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸と、配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の第２の核酸と、を含む、１つ以上の組換え核酸。
実施形態２６ 前記第１及び第２の核酸配列が、少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２ヌクレオチド長である、実施形態１～２５のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態２７ 前記第１及び第２の核酸が、ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施形態１～２６のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態２８ 前記第１及び第２の核酸が、ｓｈＲＮＡである、実施形態２７に記載の組換え核酸。
実施形態２９ 前記第１の核酸配列が、配列番号４２～７１に記載の配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態１～２８のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態３０ 前記第１の核酸配列が、配列番号４９に記載の配列を含む、実施形態２９に記載の組換え核酸。
実施形態３１ 前記第１の核酸が、免疫細胞におけるＦＡＳの発現を、核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減する、実施形態１～３０のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態３２ 前記第２の核酸配列が、配列番号７２～９７に記載の配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態１～３１のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態３３ 前記第２の核酸配列が、配列番号８２に記載の配列を含む、実施形態３２に記載の組換え核酸。
実施形態３４ 前記第１の核酸配列が、配列番号４２～７１に記載の配列からなる群から選択される配列を含み、第２の核酸配列が、配列番号７２～９７に記載の配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態１～３３のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態３５ 前記第１の核酸配列が、配列番号４９に記載の配列を含み、第２の核酸配列が、配列番号８２に記載の配列を含む、実施形態１～３４のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態３６ 前記第２の核酸が、免疫細胞におけるＰＴＰＮ２の発現を、核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減する、実施形態１～３５のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態３７ 前記第２の核酸配列が、配列番号９８～１２５に記載の配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態１～３１のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態３８ 前記第２の核酸配列が、配列番号９９または１０４に記載の配列を含む、実施形態３７に記載の組換え核酸。
実施形態３９ 前記第１の核酸配列が、配列番号４２～７１に記載の配列からなる群から選択される配列を含み、前記第２の核酸配列が、配列番号９８～１２５に記載の配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態１～３１、３７または３８のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態４０ 前記第１の核酸配列が、配列番号４９に記載の配列を含み、前記第２の核酸配列が、配列番号９９または１０４に記載の配列を含む、実施形態３９に記載の組換え核酸。
実施形態４１ 前記第２の核酸が、免疫細胞におけるＴＯＸの発現を、前記核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減する、実施形態１～３１または３７～４０のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態４２ 前記第１、第２及び／または第３の核酸配列が、前記組換え核酸の少なくとも１つのイントロン領域においてコードされている、実施形態１～４１のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態４３ １つ以上の組換え核酸であって、
プライミング受容体を含む第１のキメラポリペプチドと、
メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む第２のキメラポリペプチドであって、前記細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨＨ）鎖配列を含む単一ドメイン抗体を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１０に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１１に記載の配列を含み、かつ
ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１２に記載の配列を含む、前記第２のキメラポリペプチドと、
少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列であって、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である、前記第１の核酸配列と、
配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的であるか、または配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である第２の核酸配列と、をコードする、前記１つ以上の組換え核酸。
実施形態４４ 前記ＶＨＨ鎖配列が、配列番号１３に記載の配列を含む、実施形態４３に記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態４５ １つ以上の組換え核酸であって、
プライミング受容体を含む第１のキメラポリペプチドと、
メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む第２のキメラポリペプチドであって、前記第２の細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１４に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１５に記載の配列を含み、かつ
ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１６に記載の配列を含む、前記第２のキメラポリペプチドと、
少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列であって、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である、前記第１の核酸配列と、
配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的であるか、または配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である第２の核酸配列と、をコードする、前記１つ以上の組換え核酸。
実施形態４６ 前記ＶＨが、配列番号１７に記載の配列を含む、実施形態４５に記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態４７ １つ以上の組換え核酸であって、
生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ／Ｐ）に特異的に結合する第１の細胞外抗原結合ドメインを含むプライミング受容体を含む第１のキメラポリペプチドと、
メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する第２の細胞外抗原結合ドメインを含むＣＡＲを含む第２のキメラポリペプチドと、
少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列であって、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である、前記第１の核酸配列と、
配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的であるか、または配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である第２の核酸配列と、をコードする、前記１つ以上の組換え核酸。
実施形態４８ 前記第２の核酸配列が、配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的である、実施形態４３～４７のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態４９ 前記組換え核酸が、配列番号１６８、１６７または１６６に記載の配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態４３～４８のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態５０ 前記第２の核酸配列が、配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１に相補的である、実施形態４３～４７のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態５１ 前記第１及び第２の核酸配列が、少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２ヌクレオチド長である、実施形態４３～５０のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態５２ 前記第１及び第２の核酸が、ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施形態４３～５１のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態５３ 前記第１及び第２の核酸が、ｓｈＲＮＡである、実施形態５２に記載の組換え核酸。
実施形態５４ 前記第１の核酸配列が、配列番号４２～７１に記載の配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態４３～５３のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態５５ 前記第１の核酸配列が、配列番号４９に記載の配列を含む、実施形態５４に記載の組換え核酸。
実施形態５６ 前記第１の核酸が、免疫細胞におけるＦＡＳの発現を、核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減する、実施形態４３～５５のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態５７ 前記第２の核酸配列が、配列番号７２～９７に記載の配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態４３～５６のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態５８ 前記第２の核酸配列が、配列番号８２に記載の配列を含む、実施形態５７に記載の組換え核酸。
実施形態５９ 前記第２の核酸が、免疫細胞におけるＰＴＰＮ２の発現を、前記核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減する、実施形態４３～５８のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態６０ 前記第２の核酸配列が、配列番号９８～１２５に記載の配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態４３～５６のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態６１ 前記第２の核酸配列が、配列番号９９または１０４に記載の配列を含む、実施形態６０に記載の組換え核酸。
実施形態６２ 前記第２の核酸が、免疫細胞におけるＴＯＸの発現を、前記核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減する、実施形態４３～５６、６０または６１のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態６３ 前記第１、第２及び／または第３の核酸配列が、前記組換え核酸の少なくとも１つのイントロン領域においてコードされている、実施形態４３～６２のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態６４ 前記プライミング受容体が、Ｎ末端からＣ末端に、
前記第１の細胞外抗原結合ドメインと、
１つ以上のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位を含む、第１の膜貫通ドメインと、
ヒトまたはヒト化転写エフェクターを含む細胞内ドメインと、を含み、前記第１の細胞外抗原結合ドメインによるＡＬＰＧ／Ｐの結合が、前記１つ以上のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位における切断をもたらす、実施形態１～６３に記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態６５ 前記プライミング受容体が、前記第１の細胞外抗原結合ドメインと前記第１の膜貫通ドメインとの間に配置された第１のヒンジドメインを更に含む、実施形態６４に記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態６６ 前記第１のヒンジドメインが、ＣＤ８αまたは切断型ＣＤ８αヒンジドメインを含む、実施形態６５に記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態６７ 前記第１のヒンジが、配列番号１８に記載の配列を含む、実施形態６６に記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態６８ 前記第１の膜貫通ドメインが、Ｎｏｔｃｈ１膜貫通ドメインを含む、実施形態１～６７に記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態６９ 前記第１の膜貫通ドメインが、配列番号１９に記載の配列を含む、実施形態６８に記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態７０ 前記細胞内ドメインが、ＨＮＦ１ａ／ｐ６５ドメインまたはＧａｌ４／ＶＰ６４ドメインを含む、実施形態６４～６９のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態７１ 前記細胞内ドメインが、配列番号２３に記載の配列を含む、実施形態７０に記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態７２ 前記プライミング受容体が、前記第１の膜貫通ドメインと前記細胞内ドメインとの間に移行阻止配列を更に含む、実施形態１～７１のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態７３ 前記移行阻止配列が、配列番号２０に記載の配列を含む、実施形態７２に記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態７４ 前記プライミング受容体が、配列番号２４に記載の配列を含む、実施形態１～７３のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態７５ 前記ＣＡＲが、Ｎ末端からＣ末端に、
第２の細胞外抗原結合ドメインと、
第２の膜貫通ドメインと、
細胞内共刺激ドメインと、
細胞内活性化ドメインと、を含む、実施形態１～７４のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態７６ 前記第２の細胞外抗原結合ドメインが、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合し、前記第２の細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨＨ）鎖配列を含む単一ドメイン抗体を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１０に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１１に記載の配列を含み、かつ
ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１２に記載の配列を含む、実施形態７５に記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態７７ 前記ＶＨＨ鎖配列が、配列番号１３に記載の配列を含む、実施形態７６に記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態７８ 前記第２の細胞外抗原結合ドメインが、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合し、細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１４に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１５に記載の配列を含み、かつ
ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１６に記載の配列を含む、実施形態７５に記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態７９ 前記ＶＨ鎖配列が、配列番号１７に記載の配列を含む、実施形態７８に記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態８０ 前記ＣＡＲが、第２のヒンジドメインを含む、実施形態１～７９のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態８１ 前記第２のヒンジドメインが、ＣＤ８αまたは切断型ＣＤ８αヒンジドメインを含む、実施形態８０に記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態８２ 前記第２の膜貫通ドメインが、ＣＤ８α膜貫通ドメインを含む、実施形態７５～８１のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態８３ 前記細胞内共刺激ドメインが、４－１ＢＢドメインを含む、実施形態７５～８２のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態８４ 前記細胞内活性化ドメインが、ＣＤ３ζドメインを含む、実施形態７５～８３のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態８５ 前記ＣＡＲが、配列番号３０または３１に記載の配列を含む、実施形態１～８４のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態８６ 単一標的細胞が、ＡＬＰＧ／Ｐ及びＭＳＬＮの各々を発現する場合、前記プライミング受容体及び前記ＣＡＲが、前記標的細胞に結合することが可能である、実施形態１～７２のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態８７ 前記標的細胞が、ヒト細胞である、実施形態８６に記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態８８ 前記標的細胞が、がん細胞である、実施形態８６または８７に記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態８９ 前記がん細胞が、固形がん細胞または液体がん細胞である、実施形態８８に記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態９０ 前記がん細胞が、卵巣癌、卵管癌、原発性腹膜癌、子宮癌、中皮腫、子宮頸癌または膵癌である、実施形態８８または８９に記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態０１ 前記組換え核酸が、２つ以上の核酸断片を含む、実施形態１～９０のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸（複数可）。
実施形態９２ 前記組換え核酸が、前記ＣＡＲをコードする前記ヌクレオチド配列に動作可能に連結された誘導性プロモーターを更に含む、実施形態１～９１のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態９３ 前記組換え核酸が、前記プライミング受容体をコードする前記ヌクレオチド配列に動作可能に連結された第１の構成的プロモーターを更に含む、実施形態１～９２のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態９４ 前記組換え核酸が、前記キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された誘導性プロモーターと、前記プライミング受容体をコードする前記ヌクレオチド配列に動作可能に連結された構成的プロモーターと、を更に含む、実施形態１～９３のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態９５ 前記組換え核酸が、ヒトＦＡＳと相補的である前記第１の核酸をコードする前記ヌクレオチド配列に動作可能に連結された第２の構成的プロモーターを更に含む、実施形態１～９４のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態９６ 前記組換え核酸が、ヒトＰＴＰＮ２またはＴＯＸと相補的である前記第２の核酸をコードする前記ヌクレオチド配列に動作可能に連結された第２の構成的プロモーターを更に含む、実施形態１～９４のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態９７ 前記組換え核酸が、ヒトＦＡＳと相補的である前記第１の核酸、またはヒトＰＴＰＮ２もしくはＴＯＸと相補的である前記第２の核酸をコードする前記ヌクレオチド配列に動作可能に連結された第２の構成的プロモーターを更に含む、実施形態１～９６のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態９８ 前記組換え核酸が、５’から３’方向に、
前記第１の構成的プロモーター；
前記プライミング受容体をコードする前記ヌクレオチド配列；
前記第２の構成的プロモーター；
ヒトＦＡＳ、ヒトＰＴＰＮ２またはヒトＴＯＸと相補的である前記第１の核酸をコードする前記ヌクレオチド配列；
前記誘導性プロモーター；及び
前記キメラ抗原受容体をコードする前記ヌクレオチド配列を含む、実施形態１～９７のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態９９ 前記組換え核酸が、５’から３’方向に、
前記第１の構成的プロモーター；
前記プライミング受容体をコードする前記ヌクレオチド配列；
前記第２の構成的プロモーター；
ヒトＦＡＳと相補的である前記第１の核酸をコードする前記ヌクレオチド配列；
ヒトＰＴＰＮ２またはＴＯＸと相補的である前記第２の第１の核酸をコードする前記ヌクレオチド配列；
前記誘導性プロモーター；及び
前記キメラ抗原受容体をコードする前記ヌクレオチド配列を含む、実施形態１～９７のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態１００ 前記組換え核酸が、５’から３’方向に、
前記誘導性プロモーター；
前記キメラ抗原受容体をコードする前記ヌクレオチド配列；
前記第２の構成的プロモーター；
ヒトＦＡＳと相補的である前記第１の核酸をコードする前記ヌクレオチド配列；
ヒトＰＴＰＮ２またはＴＯＸと相補的である前記第２の第１の核酸をコードする前記ヌクレオチド配列；
前記第１の構成的プロモーター；及び
前記プライミング受容体をコードする前記ヌクレオチド配列を含む、実施形態１～９７のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態１０１ 前記プライミング受容体をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号３６に記載の配列を含む、実施形態１～１００のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態１０２ 前記キメラ抗原受容体をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号３７または３８に記載の配列を含む、実施形態１～１０１のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態１０３ 前記組換え核酸が、５’相同性指向性修復アーム及び３’相同性指向性修復アームを更に含み、５’相同性指向性修復アーム及び３’相同性指向性修復アームが、宿主細胞染色体における挿入部位と相補的である、実施形態１～１０２のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態１０４ 前記組換え核酸が、自己切断２Ａペプチド（Ｐ２Ａ）をコードするヌクレオチド配列を更に含む、実施形態１～１０３のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態１０５ 前記Ｐ２Ａが、キメラ抗原受容体をコードする前記ヌクレオチド配列の３’末端にある、実施形態１～１０４のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態１０６ 前記Ｐ２Ａが、プライミング受容体をコードする前記ヌクレオチド配列の３’末端にある、実施形態１～１０４のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態１０７ 前記組換え核酸が、ウッドチャック肝炎ウイルス翻訳後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を更に含む、実施形態１～１０６のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態１０８ 前記ＷＰＲＥが、キメラ抗原受容体をコードする前記ヌクレオチド配列の３’末端にあり、かつプライミング受容体をコードする前記ヌクレオチド配列の５’末端にあるか、または前記ＷＰＲＥが、プライミング受容体をコードする前記ヌクレオチド配列の３’末端にあり、かつキメラ抗原受容体をコードする前記ヌクレオチド配列の５’末端にある、実施形態１０７に記載の組換え核酸。
実施形態１０９ 前記組換え核酸が、ＳＶ４０ポリＡエレメントを更に含む、実施形態１～１０７のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態１１０ 前記核酸が、発現カセットまたは発現ベクター内に組み込まれている、実施形態１～１０９のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態１１１ 前記発現ベクターが、非ウイルスベクターである、実施形態１１０に記載の組換え核酸。
実施形態１１２ 実施形態１～１１１のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸を含む、発現ベクター。
実施形態１１３ 前記組換え核酸の５’及び３’末端が、初代細胞のゲノムにおける挿入部位に隣接するゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む、実施形態１１２に記載のベクター。
実施形態１１４ 前記挿入部位が、Ｔ細胞受容体アルファ定常（ＴＲＡＣ）遺伝子座またはゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）遺伝子座に位置する、実施形態１１３に記載のベクター。
実施形態１１５ 前記ＧＨＳ遺伝子座が、ＧＳ９４遺伝子座である、実施形態１１４に記載のベクター。
実施形態１１６ 胎盤／生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ／Ｐ）に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、単離された抗体またはその抗原結合断片が、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列と、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３の３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列と、を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号２に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号３に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号４に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号５に記載の配列を含み、かつ
ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号６に記載の配列を含む、前記単離された抗体またはその抗原結合断片。
実施形態１１７ 前記ＶＨ鎖配列が、配列番号７に記載の配列を含む、実施形態１１６に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
実施形態１１８ 前記ＶＬが、配列番号８に記載の配列を含む、実施形態１１６または１１７に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
実施形態１１９ 前記細胞外ドメインが、配列番号９に記載の配列を含む、実施形態１１６～１１８のうちのいずれか１つに記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
実施形態１２０ 胎盤／生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ／Ｐ）に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインと、１つ以上のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位を含む膜貫通ドメインと、ヒトまたはヒト化転写エフェクターを含む細胞内ドメインと、を含む、プライミング受容体であって、前記細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列、ならびにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３の３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号２に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号３に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号４に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号５に記載の配列を含み、かつ
ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号６に記載の配列を含む、前記プライミング受容体。
実施形態１２１ 前記ＶＨ鎖配列が、配列番号７に記載の配列を含む、実施形態１２０に記載のプライミング受容体。
実施形態１２２ 前記ＶＬが、配列番号８に記載の配列を含む、実施形態１２０または１２１に記載のプライミング受容体。
実施形態１２３ 前記細胞外ドメインが、配列番号９に記載の配列を含む、実施形態１２０～１２２のうちのいずれか１つに記載のプライミング受容体。
実施形態１２４ メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１４に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１５に記載の配列を含み、かつ
ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１６に記載の配列を含む、前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
実施形態１２５ 前記ＶＨ鎖配列が、配列番号１７に記載の配列を含む、実施形態１２４に記載のキメラ抗原受容体。
実施形態１２６ メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨＨ）鎖配列を含む単一ドメイン抗体を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１０に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１１に記載の配列を含み、かつ
ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１２に記載の配列を含む、前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
実施形態１２７ 前記ＶＨＨ鎖配列が、配列番号１３に記載の配列を含む、実施形態１２６に記載のキメラ抗原受容体。
実施形態１２８ 第１のキメラポリペプチドと、第２のキメラポリペプチドと、を含む、システムであって、
前記第１のキメラポリペプチドが、胎盤／生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ／Ｐ）に特異的に結合する第１の細胞外抗原結合ドメインを含むプライミング受容体を含み、前記第１の細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列、ならびにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３の３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号２に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号３に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号４に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号５に記載の配列を含み、かつ
ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号６に記載の配列を含み、
第２のキメラポリペプチドが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、前記システム。
実施形態１２９ 前記ＶＨ鎖配列が、配列番号７に記載の配列を含む、実施形態１２８に記載のシステム。
実施形態１３０ 前記ＶＬ鎖配列が、配列番号８に記載の配列を含む、実施形態１２８または１２９に記載のシステム。
実施形態１３１ 前記第１の細胞外抗原結合ドメインが、配列番号９に記載の配列を含む、実施形態１２８に記載のシステム。
実施形態１３２ 前記ＣＡＲが、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する第２の細胞外抗原結合ドメインを含む、実施形態１２８に記載のシステム。
実施形態１３３ 前記第２の細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１４に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１５に記載の配列を含み、かつ
ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１６に記載の配列を含む、実施形態１３２に記載のシステム。
実施形態１３４ 前記ＶＨが、配列番号１７に記載の配列を含む、実施形態１３３に記載のシステム。
実施形態１３５ 前記第２の細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨＨ）鎖配列を含む単一ドメイン抗体を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１０に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１１に記載の配列を含み、かつ
ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１２に記載の配列を含む、実施形態１３２に記載のシステム。
実施形態１３６ 前記ＶＨＨ鎖配列が、配列番号１３に記載の配列を含む、実施形態１３５に記載のシステム。
実施形態１３７ 第１のキメラポリペプチドと、第２のキメラポリペプチドと、を含む、システムであって、
前記第１のキメラポリペプチドが、プライミング受容体を含み、
前記第２のキメラポリペプチドが、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、前記細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨＨ）鎖配列を含む単一ドメイン抗体を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１０に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１１に記載の配列を含み、かつ
ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１２に記載の配列を含む、前記システム。
実施形態１３８ 前記ＶＨＨ鎖配列が、配列番号１３に記載の配列を含む、実施形態１３７に記載のシステム。
実施形態１３９ 第１のキメラポリペプチドと、第２のキメラポリペプチドと、を含む、システムであって、
前記第１のキメラポリペプチドが、プライミング受容体を含み、
前記第２のキメラポリペプチドが、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、前記第２の細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１４に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１５に記載の配列を含み、かつ
ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１６に記載の配列を含む、前記システム。
実施形態１４０ 前記ＶＨが、配列番号１７に記載の配列を含む、実施形態１３８に記載のシステム。
実施形態１４１ 第１のキメラポリペプチドと、第２のキメラポリペプチドと、を含む、システムであって、
前記第１のキメラポリペプチドが、生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ／Ｐ）に特異的に結合する第１の細胞外抗原結合ドメインを含むプライミング受容体を含み、
前記第２のキメラポリペプチドが、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する第２の細胞外抗原結合ドメインを含むＣＡＲを含む、前記システム。
実施形態１４２ 前記プライミング受容体が、Ｎ末端からＣ末端に、
前記第１の細胞外抗原結合ドメインと、
１つ以上のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位を含む、第１の膜貫通ドメインと、
ヒトまたはヒト化転写エフェクターを含む細胞内ドメインと、を含み、前記第１の細胞外抗原結合ドメインによるＡＬＰＧ／Ｐの結合が、前記１つ以上のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位における切断をもたらす、実施形態１２８～１４１のうちの１つに記載のシステム。
実施形態１４３ 前記プライミング受容体が、前記第１の細胞外抗原結合ドメインと前記第１の膜貫通ドメインとの間に配置された第１のヒンジドメインを更に含む、実施形態１４２に記載のシステム。
実施形態１４４ 前記第１のヒンジドメインが、ＣＤ８αまたは切断型ＣＤ８αヒンジドメインを含む、実施形態１４２に記載のシステム。
実施形態１４５ 前記第１のヒンジが、配列番号１８に記載の配列を含む、実施形態１４４に記載のシステム。
実施形態１４６ 前記第１の膜貫通ドメインが、Ｎｏｔｃｈ１膜貫通ドメインを含む、実施形態１４２～１４５のうちのいずれか１つに記載のシステム。
実施形態１４７ 前記第１の膜貫通ドメインが、配列番号１９に記載の配列を含む、実施形態１４６に記載のシステム。
実施形態１４８ 前記細胞内ドメインが、ＨＮＦ１ａ／ｐ６５ドメインまたはＧａｌ４／ＶＰ６４ドメインを含む、実施形態１４２～１４７のうちのいずれか１つに記載のシステム。
実施形態１４９ 前記細胞内ドメインが、配列番号２３に記載の配列を含む、実施形態１４８に記載のシステム。
実施形態１５０ 前記プライミング受容体が、前記第１の膜貫通ドメインと前記細胞内ドメインとの間に移行阻止配列を更に含む、実施形態１２８～１４９のうちのいずれか１つに記載のシステム。
実施形態１５１ 前記移行阻止配列が、配列番号２０に記載の配列を含む、実施形態１５０に記載のシステム。
実施形態１５２ 前記プライミング受容体が、配列番号２４に記載の配列を含む、実施形態１２８～１５１のうちのいずれか１つに記載のシステム。
実施形態１５３ 前記ＣＡＲが、Ｎ末端からＣ末端に、
第２の細胞外抗原結合ドメインと、
第２の膜貫通ドメインと、
細胞内共刺激ドメインと、
細胞内活性化ドメインと、を含む、実施形態１２８～１５２のうちのいずれか１つに記載のシステム。
実施形態１５４ 前記第２の細胞外抗原結合ドメインが、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合し、前記第２の細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨＨ）鎖配列を含む単一ドメイン抗体を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１０に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１１に記載の配列を含み、かつ
ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１２に記載の配列を含む、実施形態１５３に記載のシステム。
実施形態１５５ ＶＨＨ鎖配列が、配列番号１３に記載の配列を含む、実施形態１５４に記載のシステム。
実施形態１５６ 前記第２の細胞外抗原結合ドメインが、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合し、前記細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１４に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１５に記載の配列を含み、かつ
ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１６に記載の配列を含む、実施形態１５３に記載のシステム。
実施形態１５７ ＶＨ鎖配列が、配列番号１７に記載の配列を含む、実施形態１５６に記載のシステム。
実施形態１５８ 前記ＣＡＲが、第２のヒンジドメインを含む、実施形態１２８～１５７のうちのいずれか１つに記載のシステム。
実施形態１５９ 前記第２のヒンジドメインが、ＣＤ８αまたは切断型ＣＤ８αヒンジドメインを含む、実施形態１５８に記載のシステム。
実施形態１６０ 前記第２の膜貫通ドメインが、ＣＤ８α膜貫通ドメインを含む、実施形態１５３～１５９のうちのいずれか１つに記載のシステム。
実施形態１６１ 前記細胞内共刺激ドメインが、４－１ＢＢドメインを含む、実施形態１５３～１６０のうちのいずれか１つに記載のシステム。
実施形態１６２ 前記細胞内活性化ドメインが、ＣＤ３ζドメインを含む、実施形態１５３～１６１のうちのいずれか１つに記載のシステム。
実施形態１６３ 前記ＣＡＲが、配列番号３０または３１に記載の配列を含む、実施形態１２８～１６２のうちのいずれか１つに記載のシステム。
実施形態１６４ 前記標的細胞が、ＡＬＰＧ／Ｐ及びＭＳＬＮを発現する場合、前記プライミング受容体及びＣＡＲが、同じ標的細胞に結合することが可能である、実施形態１２８～１６３のうちのいずれか１つに記載のシステム。
実施形態１６５ 前記標的細胞が、ヒト細胞である、実施形態１６４のシステム。
実施形態１６６ 前記標的細胞が、がん細胞である、実施形態１６４または１６５に記載のシステム。
実施形態１６７ 前記がん細胞が、固形がん細胞または液体がん細胞である、実施形態１６６に記載のシステム。
実施形態１６８ 前記がん細胞が、卵巣癌、卵管癌、原発性腹膜癌、子宮癌、中皮腫、子宮頸癌または膵癌である、実施形態１６６または１６７に記載のシステム。
実施形態１６９
実施形態１～１１１のうちのいずれか１つに記載の少なくとも１つの組換え核酸（複数可）、及び／または
実施形態１１６～１６８のうちのいずれか１つに記載の抗体もしくは抗原結合断片、プライミングレセプション、ＣＡＲ、またはシステム、及び／または
実施形態１１２～１１４のうちのいずれか１つに記載のベクターを、含む、免疫細胞。
実施形態１７０ 前記免疫細胞が、初代ヒト免疫細胞である、実施形態１６９に記載の細胞。
実施形態１７１ 前記初代ヒト免疫細胞が、自己免疫細胞である、実施形態１７０に記載の細胞。
実施形態１７２ 前記初代免疫細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、初代Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体である、実施形態１６９～１７１のうちのいずれか１つに記載の細胞。
実施形態１７３ 前記初代免疫細胞が、初代Ｔ細胞である、実施形態１６９～１７２のうちのいずれか１つに記載の細胞。
実施形態１７４ 前記初代免疫細胞が、初代ヒトＴ細胞である、実施形態１６９～１７３のうちのいずれか１つに記載の細胞。
実施形態１７５ 前記初代免疫細胞が、ウイルスフリーである、実施形態１６９～１７４のうちのいずれか１つに記載の細胞。
実施形態１７６ 前記免疫細胞が、自己免疫細胞である、実施形態１６９～１７４のうちのいずれか１つに記載の細胞。
実施形態１７７ 前記免疫細胞が、同種免疫細胞である、実施形態１６９～１７４のうちのいずれか１つに記載の細胞。
実施形態１７８ 少なくとも１つの組換え核酸を含む初代免疫細胞であって、少なくとも１つの組換え核酸が、
ＡＬＰＧ／Ｐに特異的に結合する第１の細胞外抗原結合ドメインを含むプライミング受容体と、
ＭＳＬＮに特異的に結合する第２の細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体と、
少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列であって、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である、前記第１の核酸配列と、少なくとも１５ヌクレオチド長の第２の核酸配列であって、
配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的であるか、または
配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である、前記第２の核酸配列と、を含み、
前記組換え核酸が、前記初代免疫細胞のゲノムの標的領域内に挿入されており、前記初代免疫細胞が、前記組換え核酸を前記初代免疫細胞内に導入するためのウイルスベクターを含まない、前記初代免疫細胞。
実施形態１７９ 少なくとも１つの組換え核酸（複数可）を含む初代免疫細胞であって、前記少なくとも１つの組換え核酸（複数可）が、配列番号４９に記載の配列を含む第１の核酸と、配列番号８２に記載の配列を含む第２の核酸と、を含み、前記初代免疫細胞のゲノムの標的領域内に挿入されており、前記初代免疫細胞が、前記組換え核酸（複数可）を前記初代免疫細胞内に導入するためのウイルスベクターを含まない、前記初代免疫細胞。
実施形態１８０ 少なくとも１つの組換え核酸（複数可）を含む初代免疫細胞であって、前記少なくとも１つの組換え核酸（複数可）が、配列番号４９に記載の配列を含む第１の核酸と、配列番号９９または１０４に記載の配列を含む第２の核酸と、を含み、前記初代免疫細胞のゲノムの標的領域内に挿入されており、初代免疫細胞が、前記組換え核酸を前記初代免疫細胞内に導入するためのウイルスベクターを含まない、前記初代免疫細胞。
実施形態１８１ リボ核タンパク質（ＲＮＰ）－組換え核酸複合体を含むウイルスフリー生存初代細胞であって、前記ＲＮＰが、ヌクレアーゼドメイン及びガイドＲＮＡを含み、前記組換え核酸が、
ＡＬＰＧ／Ｐに特異的に結合する第１の細胞外抗原結合ドメインを含むプライミング受容体と、
ＭＳＬＮに特異的に結合する第２の細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体と、
少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列であって、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である、前記第１の核酸配列と、少なくとも１５ヌクレオチド長の第２の核酸配列であって、
配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的であるか、または
配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である、前記第２の核酸配列と、をコードし、
前記組換え核酸の５’及び３’末端が、初代細胞のゲノムにおける挿入部位に隣接するゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む、前記ウイルスフリー生存初代細胞。
実施形態１８２ リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）－組換え核酸（複数可）複合体を含むウイルスフリー生存初代細胞であって、前記ＲＮＰが、ヌクレアーゼドメイン及びガイドＲＮＡを含み、組換え核酸（複数可）が、配列番号４９に記載の配列を含む第１の核酸と、配列番号８２に記載の配列を含む第２の核酸と、を含み、前記組換え核酸（複数可）の５’及び３’末端が、前記初代細胞のゲノムにおける挿入部位に隣接するゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む、前記ウイルスフリー生存初代細胞。
実施形態１８３ リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）－組換え核酸（複数可）複合体を含むウイルスフリー生存初代細胞であって、前記ＲＮＰが、ヌクレアーゼドメイン及びガイドＲＮＡを含み、前記組換え核酸（複数可）が、配列番号４９に記載の配列を含む第１の核酸と、配列番号９９または１０４に記載の配列を含む第２の核酸と、を含み、前記組換え核酸（複数可）の５’及び３’末端が、前記初代細胞のゲノムにおける挿入部位に隣接するゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む、前記ウイルスフリー生存初代細胞。
実施形態１８４ 前記細胞が、配列番号１６８、１６７または１６６に記載の配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態１６９～１８３のうちのいずれか１つに記載の細胞。
実施形態１８５ 前記第１の核酸が、免疫細胞におけるＦＡＳの発現を、前記第１の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減する、実施形態１６９～１８４のうちのいずれか１つに記載の細胞。
実施形態１８６ 免疫細胞におけるＦＡＳの発現が、前記第１の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減される、実施形態１８４に記載の細胞。
実施形態１８７ 前記第２の核酸が、免疫細胞におけるＰＴＰＮ２の発現を、前記第２の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減する、実施形態１６９～１８６のうちのいずれか１つに記載の細胞。
実施形態１８８ 免疫細胞におけるＰＴＰＮ２の発現が、前記第２の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減される、実施形態１８７に記載の細胞。
実施形態１８９ 前記第２の核酸が、免疫細胞におけるＴＯＸの発現を、前記第２の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減する、実施形態１６９～１８６のうちのいずれか１つに記載の細胞。
実施形態１９０ 免疫細胞におけるＴＯＸの発現が、前記第２の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減される、実施形態１８９に記載の細胞。
実施形態１９１ ＦＡＳ、ＰＴＰＮ２及び／またはＴＯＸの発現が、核酸アッセイまたはタンパク質アッセイによって決定される、実施形態１８４～１９０のうちのいずれか１つに記載の細胞。
実施形態１９２ 前記核酸アッセイが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、ＲＴ－ｑＰＣＲ、マイクロアレイ、遺伝子アレイまたはＲＮＡｓｅｑのうちの少なくとも１つを含む、実施形態１９１に記載の細胞。
実施形態１９３ 前記タンパク質アッセイが、イムノブロッティング、蛍光活性化細胞選別、フローサイトメトリー、磁気活性化細胞選別または親和性ベースの細胞分離のうちの少なくとも１つを含む、実施形態１９１に記載の細胞。
実施形態１９４ 実施形態１６９～１９３のうちのいずれか１つに記載の複数の免疫細胞を含む、細胞の集団。
実施形態１９５ 実施形態１６９～１９３のうちのいずれか１つに記載の免疫細胞または実施形態１９４に記載の細胞の集団と、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、薬学的組成物。
実施形態１９６ 実施形態１～１１１のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸または実施形態１１２～１１４のうちのいずれか１つに記載のベクターと、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、薬学的組成物。
実施形態１９７ 免疫細胞を編集する方法であって、
リボ核タンパク質（ＲＮＰ）－組換え核酸複合体を提供することであって、前記ＲＮＰが、ヌクレアーゼドメイン及びガイドＲＮＡを含み、前記組換え核酸が、実施形態１～１１１のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸を含み、前記組換え核酸の５’及び３’末端が、前記免疫細胞のゲノムにおける挿入部位に隣接するゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む、前記提供することと、
前記ＲＮＰ－組換え核酸複合体を前記免疫細胞に非ウイルス的に導入することであって、前記ガイドＲＮＡが、初代免疫細胞のゲノムの標的領域に特異的にハイブリダイズし、ヌクレアーゼドメインが、前記標的領域を切断して、前記初代免疫細胞の前記ゲノム内に前記挿入部位を作成する、前記非ウイルス的に導入することと、
前記免疫細胞を、前記免疫細胞の前記ゲノムにおける前記挿入部位内への実施形態１～１１１のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸の挿入を介して編集することと、を含む、前記方法。
実施形態１９８ 非ウイルス的に導入することが、エレクトロポレーションを含む、実施形態１９７に記載の方法。
実施形態１９９ 前記ヌクレアーゼドメインが、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ）を含み、任意選択で、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを含む、実施形態１９７または１９８に記載の方法。
実施形態２００ 前記細胞のゲノムの前記標的領域が、Ｔ細胞受容体アルファ定常（ＴＲＡＣ）遺伝子座またはゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）遺伝子座である、実施形態１９７～１９９のうちのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０１ 前記ＧＳＨ遺伝子座が、ＧＳ９４遺伝子座である、実施形態２００に記載の方法。
実施形態２０２ 前記組換え核酸が、二本鎖組換え核酸または一本鎖組換え核酸である、実施形態１９７～２０１のうちのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０３ 前記組換え核酸が、直鎖組換え核酸または環状組換え核酸であり、任意選択で、前記環状組換え核酸が、プラスミドである、実施形態１９７～２０２のうちのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０４ 前記免疫細胞が、初代ヒト免疫細胞である、実施形態１９７～２０３のうちのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０５ 前記免疫細胞が、同種免疫細胞である、実施形態１９７～２０４のうちのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０６ 前記免疫細胞が、自己免疫細胞である、実施形態１９７～２０４のうちのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０７ 前記免疫細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、初代Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体である、実施形態１９７～２０６のうちのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０８ 前記免疫細胞が、初代Ｔ細胞である、実施形態１９７～２０７のうちのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０９ 前記免疫細胞が、初代ヒトＴ細胞である、実施形態１９７～２０８のうちのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１０ 前記免疫細胞が、ウイルスフリーである、実施形態１９７～２０９のうちのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１１ 前記免疫細胞を患者から得ることと、前記組換え核酸をインビトロで導入することと、を更に含む、実施形態１９７～２１０のうちのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１２ 対象における疾患を治療する方法であって、前記対象に、実施形態１６９～１９４のうちのいずれか１つに記載の免疫細胞、または実施形態１９５もしくは１９６に記載の薬学的組成物を投与することを含む、前記方法。
実施形態２１３ 前記疾患が、がんである、実施形態２１２に記載の方法。
実施形態２１４ 前記がんが、固形がんまたは液体がんである、実施形態２１３に記載の方法。
実施形態２１５ 前記がんが、卵巣癌、卵管癌、原発性腹膜癌、子宮癌、中皮腫、子宮頸癌または膵癌である、実施形態２１３または２１４に記載の方法。
実施形態２１６ 前記免疫細胞の前記投与が、対象における免疫応答を増強する、実施形態２１３～２１５のうちのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１７ 前記増強された免疫応答が、適応免疫応答である、実施形態２１６に記載の方法。
実施形態２１８ 前記増強された免疫応答が、自然免疫応答である、実施形態２１６に記載の方法。
実施形態２１９ 前記増強された免疫応答が、少なくとも１つのサイトカインまたはケモカインの増加した発現である、実施形態２１３～２１８のうちのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２２０ 前記少なくとも１つのサイトカインまたはケモカインが、ＩＬ－２またはＩＦＮγである、実施形態２１９に記載の方法。
実施形態２２１ 前記対象に、免疫療法を、前記免疫細胞と同時にまたは前記免疫細胞後に投与することを更に含む、実施形態２１２～２１５のうちのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２２２ 対象における標的細胞を阻害する方法であって、前記方法が、前記対象に、実施形態１６９～１９４のうちのいずれか１つに記載の免疫細胞を投与することを含み、前記免疫細胞が、前記標的細胞を阻害する、前記方法。
実施形態２２３ 前記標的細胞が、ＡＬＰＧ／Ｐ及びＭＳＬＮを発現する、実施形態２２２に記載の方法。
実施形態２２４ 前記標的細胞が、がん細胞である、実施形態２２２または２２３に記載の方法。
実施形態２２５ 免疫細胞においてキメラ抗原受容体の発現をプライミング受容体で誘導する方法であって、
免疫細胞を得ることであって、免疫細胞が、
実施形態１～１１１のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸、及び／または
実施形態１１６～１６８のうちのいずれか１つに記載の抗体もしくは抗原結合断片、プライミングレセプション、ＣＡＲ、またはシステム、及び／または
実施形態１１２～１１４のうちのいずれか１つに記載のベクターを含む、前記得ることと、
前記免疫細胞を、ＡＬＰＧ／Ｐ及びＭＳＬＮを発現する標的細胞と接触させることであって、前記標的細胞上のＡＬＰＧ／Ｐへの前記プライミング受容体の結合が、前記プライミング受容体の活性化及び前記キメラ抗原受容体の発現を誘導する、前記接触させることと、を含む、前記方法。
実施形態２２６ 免疫細胞の活性を調節する方法であって、
免疫細胞を得ることであって、免疫細胞が、
実施形態１～１１１のうちのいずれか１つに記載の組換え核酸、及び／または
実施形態１１６～１６８のうちのいずれか１つに記載の抗体もしくは抗原結合断片、プライミングレセプション、ＣＡＲ、またはシステム、及び／または
実施形態１１２～１１４のうちのいずれか１つに記載のベクターを含む、前記得ることと、
前記免疫細胞を、ＡＬＰＧ／Ｐ及びＭＳＬＮを発現する標的細胞と接触させることであって、前記標的細胞上のＡＬＰＧ／Ｐへの前記プライミング受容体の結合が、前記プライミング受容体の活性化及び前記キメラ抗原受容体の発現を誘導し、前記標的細胞上のＭＳＬＮへの前記キメラ抗原受容体の結合が、前記免疫細胞の活性を調節する、前記接触させることと、を含む、前記方法。
実施形態２２７ 前記免疫細胞活性の調節が、免疫応答を増強することを含む、実施形態２２６に記載の方法。
実施形態２２８ 前記増強された免疫応答が、適応免疫応答である、実施形態２２７に記載の方法。
実施形態２２９ 前記増強された免疫応答が、自然免疫応答である、実施形態２２７に記載の方法。
実施形態２３０ 前記免疫細胞活性が、少なくとも１つのサイトカインまたはケモカインの増加した発現である、実施形態２２６～２２９のうちのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２３１ 前記少なくとも１つのサイトカインまたはケモカインが、ＩＬ－２またはＩＦＮγである、実施形態２３０に記載の方法。
実施形態２３２ 前記免疫細胞におけるＦＡＳの発現が、前記第１の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減される、実施形態１９７～２３１のうちのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２３３ 前記免疫細胞におけるＰＴＰＮ２の発現が、前記第２の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減される、実施形態１９７～２３２のうちのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２３４ 前記免疫細胞におけるＴＯＸの発現が、前記第２の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減される、実施形態１９７～２３２のうちのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２３５ 前記免疫細胞におけるＦＡＳ、ＰＴＰＮ２及び／またはＴＯＸの発現が、核酸アッセイまたはタンパク質アッセイによって決定される、実施形態２３２～２３４のうちのいずれか１つに記載の方法。
実施形態２３６ 前記核酸アッセイが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、ＲＴ－ｑＰＣＲ、マイクロアレイ、遺伝子アレイまたはＲＮＡｓｅｑのうちの少なくとも１つを含む、実施形態２３５に記載の方法。
実施形態２３７ 前記タンパク質アッセイが、イムノブロッティング、蛍光活性化細胞選別、フローサイトメトリー、磁気活性化細胞選別または親和性ベースの細胞分離のうちの少なくとも１つを含む、実施形態２３５に記載の方法。

【0639】

一態様において、胎盤／生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ／Ｐ）に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインと、１つ以上のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位を含む膜貫通ドメインと、ヒトまたはヒト化転写エフェクターを含む細胞内ドメインと、を含む、プライミング受容体であって、細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列、ならびにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３の３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号２に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号３に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号４に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号５に記載の配列を含み、かつ
ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号６に記載の配列を含む、プライミング受容体が、本明細書で提供される。

【0640】

いくつかの実施形態において、ＶＨ鎖配列は、配列番号７に記載の配列を含む。

【0641】

いくつかの実施形態において、ＶＬは、配列番号８に記載の配列を含む。

【0642】

いくつかの実施形態において、細胞外ドメインは、配列番号９に記載の配列を含む。

【0643】

別の態様において、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１４に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１５に記載の配列を含み、かつ
ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１６に記載の配列を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、本明細書で提供される。

【0644】

いくつかの実施形態において、ＶＨ鎖配列は、配列番号１７に記載の配列を含む。

【0645】

別の態様において、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨＨ）鎖配列を含む単一ドメイン抗体を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１０に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１１に記載の配列を含み、かつ
ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１２に記載の配列を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、本明細書で提供される。

【0646】

いくつかの実施形態において、ＶＨＨ鎖配列は、配列番号１３に記載の配列を含む。

【0647】

別の態様において、第１のキメラポリペプチドと、第２のキメラポリペプチドと、を含む、システムであって、第１のキメラポリペプチドが、胎盤／生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ／Ｐ）に特異的に結合する第１の細胞外抗原結合ドメインを含むプライミング受容体を含み、第１の細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列、ならびにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３の３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号２に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号３に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号４に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号５に記載の配列を含み、かつ
ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号６に記載の配列を含む、システムが、本明細書で提供される。

【0648】

第２のキメラポリペプチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。

【0649】

いくつかの実施形態において、ＶＨ鎖配列は、配列番号７に記載の配列を含む。

【0650】

いくつかの実施形態において、ＶＬ鎖配列は、配列番号８に記載の配列を含む。

【0651】

いくつかの実施形態において、第１の細胞外抗原結合ドメインは、配列番号９に記載の配列を含む。

【0652】

いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する第２の細胞外抗原結合ドメインを含む。

【0653】

いくつかの実施形態において、第２の細胞外抗原結合ドメインは、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１４に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号１５に記載の配列を含み、かつ
ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号１６に記載の配列を含む。

【0654】

いくつかの実施形態において、ＶＨは、配列番号１７に記載の配列を含む。

【0655】

いくつかの実施形態において、第２の細胞外抗原結合ドメインは、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨＨ）鎖配列を含む単一ドメイン抗体を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１０に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号１１に記載の配列を含み、かつ
ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号１２に記載の配列を含む。

【0656】

いくつかの実施形態において、ＶＨＨ鎖配列は、配列番号１３に記載の配列を含む。

【0657】

別の態様において、第１のキメラポリペプチドと、第２のキメラポリペプチドと、を含む、システムであって、
第１のキメラポリペプチドが、プライミング受容体を含み、
第２のキメラポリペプチドが、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨＨ）鎖配列を含む単一ドメイン抗体を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１０に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１１に記載の配列を含み、かつ
ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１２に記載の配列を含む、システムが、本明細書で提供される。

【0658】

いくつかの実施形態において、ＶＨＨ鎖配列は、配列番号１３に記載の配列を含む。

【0659】

別の態様において、第１のキメラポリペプチドと、第２のキメラポリペプチドと、を含む、システムであって、
第１のキメラポリペプチドが、プライミング受容体を含み、
第２のキメラポリペプチドが、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、第２の細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１４に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１５に記載の配列を含み、かつ
ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１６に記載の配列を含む、システムが、本明細書で提供される。

【0660】

いくつかの実施形態において、ＶＨは、配列番号１７に記載の配列を含む。

【0661】

別の態様において、第１のキメラポリペプチドと、第２のキメラポリペプチドと、を含む、システムであって、
第１のキメラポリペプチドが、生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ／Ｐ）に特異的に結合する第１の細胞外抗原結合ドメインを含むプライミング受容体を含み、
第２のキメラポリペプチドが、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する第２の細胞外抗原結合ドメインを含むＣＡＲを含む、システムが、本明細書で提供される。

【0662】

いくつかの実施形態において、プライミング受容体は、Ｎ末端からＣ末端に、
第１の細胞外抗原結合ドメインと、
１つ以上のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位を含む、第１の膜貫通ドメインと、
ヒトまたはヒト化転写エフェクターを含む細胞内ドメインと、を含み、第１の細胞外抗原結合ドメインによるＡＬＰＧ／Ｐの結合は、１つ以上のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位における切断をもたらす。

【0663】

いくつかの実施形態において、プライミング受容体は、第１の細胞外抗原結合ドメインと第１の膜貫通ドメインとの間に配置された第１のヒンジドメインを更に含む。

【0664】

いくつかの実施形態において、第１のヒンジドメインは、ＣＤ８αまたは切断型ＣＤ８αヒンジドメインを含む。

【0665】

いくつかの実施形態において、第１のヒンジは、配列番号１８に記載の配列を含む。

【0666】

いくつかの実施形態において、第１の膜貫通ドメインは、Ｎｏｔｃｈ１膜貫通ドメインを含む。

【0667】

いくつかの実施形態において、第１の膜貫通ドメインは、配列番号１９に記載の配列を含む。

【0668】

いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＨＮＦ１ａ／ｐ６５ドメインまたはＧａｌ４／ＶＰ６４ドメインを含む。

【0669】

いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号２３に記載の配列を含む。

【0670】

いくつかの実施形態において、プライミング受容体は、第１の膜貫通ドメインと細胞内ドメインとの間に移行阻止配列を更に含む。

【0671】

いくつかの実施形態において、移行阻止配列は、配列番号２０に記載の配列を含む。

【0672】

いくつかの実施形態において、プライミング受容体は、配列番号２４に記載の配列を含む。

【0673】

いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端に、
第２の細胞外抗原結合ドメインと、
第２の膜貫通ドメインと、
細胞内共刺激ドメインと、
細胞内活性化ドメインと、を含む。

【0674】

いくつかの実施形態において、第２の細胞外抗原結合ドメインは、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合し、第２の細胞外抗原結合ドメインは、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨＨ）鎖配列を含む単一ドメイン抗体を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１０に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号１１に記載の配列を含み、かつ
ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号１２に記載の配列を含む。

【0675】

いくつかの実施形態において、ＶＨＨ鎖配列は、配列番号１３に記載の配列を含む。

【0676】

いくつかの実施形態において、第２の細胞外抗原結合ドメインは、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合し、細胞外抗原結合ドメインは、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１４に記載の配列を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号１５に記載の配列を含み、かつ
ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号１６に記載の配列を含む。

【0677】

いくつかの実施形態において、ＶＨ鎖配列は、配列番号１７に記載の配列を含む。

【0678】

いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、第２のヒンジドメインを含む。

【0679】

いくつかの実施形態において、第２のヒンジドメインは、ＣＤ８αまたは切断型ＣＤ８αヒンジドメインを含む。

【0680】

いくつかの実施形態において、第２の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインを含む。

【0681】

いくつかの実施形態において、細胞内共刺激ドメインは、４－１ＢＢドメインを含む。

【0682】

いくつかの実施形態において、細胞内活性化ドメインは、ＣＤ３ζドメインを含む。

【0683】

いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号３０または３１に記載の配列を含む。

【0684】

いくつかの実施形態において、標的細胞が、ＡＬＰＧ／Ｐ及びＭＳＬＮを発現する場合、プライミング受容体及びＣＡＲは、同じ標的細胞に結合することが可能である。

【0685】

いくつかの実施形態において、標的細胞は、ヒト細胞である。

【0686】

いくつかの実施形態において、標的細胞は、がん細胞である。

【0687】

いくつかの実施形態において、がん細胞は、固形がん細胞または液体がん細胞である。

【0688】

いくつかの実施形態において、がん細胞は、卵巣癌、卵管癌、原発性腹膜癌、子宮癌、中皮腫、子宮頸癌または膵癌である。

【0689】

別の態様において、メソテリン（ＭＳＬＮ）に結合する単離された抗体またはそれらの抗原結合断片であって、単離された抗体またはそれらの抗原結合断片が、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨＨ）鎖配列を含む単一ドメイン抗体を含み、ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１０に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１１に記載の配列を含み、かつＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１２に記載の配列を含む、単離された抗体またはそれらの抗原結合断片が、本明細書で提供される。

【0690】

いくつかの実施形態において、ＶＨＨ鎖配列は、配列番号１３に記載の配列を含む。

【0691】

一態様において、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の核酸配列を含む、組換え核酸が、本明細書で提供される。

【0692】

一態様において、配列番号４０に記載の配列を含むヒトタンパク質チロシンホスファターゼ非受容体２型（ＰＴＰＮ２）をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の核酸配列を含む、組換え核酸が、本明細書で提供される。

【0693】

一態様において、配列番号４１に記載の配列を含むヒト胸腺細胞選択関連高移動度群ボックス（ＴＯＸ）をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の核酸配列を含む、組換え核酸が、本明細書で提供される。

【0694】

いくつかの実施形態において、核酸配列は、少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２ヌクレオチド長である。

【0695】

いくつかの実施形態において、核酸は、ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

【0696】

いくつかの実施形態において、核酸は、ｓｈＲＮＡである。

【0697】

いくつかの実施形態において、核酸は、配列番号４２～７１に記載の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0698】

いくつかの実施形態において、核酸は、配列番号４９に記載の配列を含む。

【0699】

いくつかの実施形態において、核酸は、免疫細胞におけるＦＡＳの発現を、核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減する。

【0700】

いくつかの実施形態において、核酸は、配列番号７２～９７に記載の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0701】

いくつかの実施形態において、核酸は、配列番号８２に記載の配列を含む。

【0702】

いくつかの実施形態において、核酸は、免疫細胞におけるＰＴＰＮ２の発現を、核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減する。

【0703】

いくつかの実施形態において、核酸は、配列番号９８～１２５に記載の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0704】

いくつかの実施形態において、核酸は、配列番号９９または１０４に記載の配列を含む。

【0705】

いくつかの実施形態において、核酸は、免疫細胞におけるＴＯＸの発現を、核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減する。

【0706】

いくつかの実施形態において、組換え核酸は、第１の抗原に特異的に結合する第１の細胞外抗原結合ドメインを含むプライミング受容体をコードするヌクレオチド配列と、第２の抗原に特異的に結合する第２の細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列と、を更に含み、第１の抗原及び第２の抗原は異なる。

【0707】

いくつかの実施形態において、組換え核酸は、５’から３’方向に、ＣＡＲ；本明細書に開示される核酸；及びプライミング受容体を含む。

【0708】

いくつかの実施形態において、核酸は、５’から３’方向に、プライミング受容体；本明細書に開示される核酸；及びＣＡＲを含む。

【0709】

いくつかの実施形態において、組換え核酸は、５’相同性指向性修復アーム及び／または３’相同性指向性修復アームを更に含み、５’相同性指向性修復アーム及び／または３’相同性指向性修復アームは、宿主細胞染色体における挿入部位と相補的である。

【0710】

いくつかの実施形態において、組換え核酸は、５’相同性指向性修復アーム及び３’相同性指向性修復アームを含む。

【0711】

いくつかの実施形態において、組換え核酸は、発現カセットまたは発現ベクター内に組み込まれている。

【0712】

いくつかの実施形態において、発現カセットまたは発現ベクターは、組換え核酸の上流の構成的プロモーターを更に含む。

【0713】

一態様において、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列と、配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の第２の核酸配列と、を含む、１つ以上の組換え核酸が、本明細書で提供される。

【0714】

一態様において、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸と、配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の第２の核酸と、を含む、１つ以上の組換え核酸が、本明細書で提供される。

【0715】

いくつかの実施形態において、第１及び第２の核酸は、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

【0716】

いくつかの実施形態において、第１及び第２の核酸は各々、ｓｈＲＮＡである。

【0717】

いくつかの実施形態において、第１の核酸は、配列番号４２～７１に記載の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0718】

いくつかの実施形態において、第１の核酸は、配列番号４９に記載の配列を含む。

【0719】

いくつかの実施形態において、第１の核酸は、免疫細胞におけるＦＡＳの発現を、第１の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減する。

【0720】

いくつかの実施形態において、第２の核酸は、配列番号７２～９７に記載の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0721】

いくつかの実施形態において、第２の核酸は、配列番号８２に記載の配列を含む。

【0722】

いくつかの実施形態において、第２の核酸は、免疫細胞におけるＰＴＰＮ２の発現を、第２の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減する。

【0723】

いくつかの実施形態において、第１の核酸は、配列番号４２～７１に記載の配列からなる群から選択される配列を含み、第２の核酸は、配列番号７２～９７に記載の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0724】

いくつかの実施形態において、第１の核酸は、配列番号４９に記載の配列を含み、第２の核酸は、配列番号８２に記載の配列を含む。

【0725】

いくつかの実施形態において、第２の核酸は、配列番号９８～１２５に記載の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0726】

いくつかの実施形態において、第２の核酸は、配列番号９９または１０４に記載の配列を含む。

【0727】

いくつかの実施形態において、第２の核酸は、免疫細胞におけるＰＴＰＮ２の発現を、第２の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減する。

【0728】

いくつかの実施形態において、第１の核酸は、配列番号４２～７１に記載の配列からなる群から選択される配列を含み、第２の核酸は、配列番号９８～１２５に記載の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0729】

いくつかの実施形態において、第１の核酸は、配列番号４９に記載の配列を含み、第２の核酸は、配列番号９９または１０４に記載の配列を含む。

【0730】

いくつかの実施形態において、第１の核酸は、５’相同性指向性修復アーム及び／または３’相同性指向性修復アームを更に含み、５’相同性指向性修復アーム及び／または３’相同性指向性修復アームは、宿主細胞染色体における挿入部位と相補的である。

【0731】

いくつかの実施形態において、第２の核酸は、５’相同性指向性修復アーム及び／または３’相同性指向性修復アームを含む。

【0732】

いくつかの実施形態において、第１の核酸及び第２の核酸は、単一核酸上にコードされている。

【0733】

いくつかの実施形態において、第１の核酸は、５’相同性指向性修復アームを含み、第２の核酸は、３’相同性指向性修復アームを含む。

【0734】

いくつかの実施形態において、第１の核酸及び第２の核酸は、異なる核酸上にコードされている。

【0735】

いくつかの実施形態において、核酸は、第１の抗原に特異的に結合する第１の細胞外抗原結合ドメインを含むプライミング受容体をコードするヌクレオチド配列と、第２の抗原に特異的に結合する第２の細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列と、を更に含み、第１の抗原及び第２の抗原は異なる。

【0736】

いくつかの実施形態において、核酸は、５’から３’方向に、ＣＡＲ；第１の核酸；第２の核酸；及びプライミング受容体を含む。

【0737】

いくつかの実施形態において、第１の核酸は、発現カセットまたは発現ベクター内に組み込まれている。

【0738】

いくつかの実施形態において、第２の核酸は、発現カセットまたは発現ベクター内に組み込まれている。

【0739】

いくつかの実施形態において、第１の核酸及び第２の核酸は、単一発現カセットまたは単一発現ベクター内に組み込まれている。

【0740】

いくつかの実施形態において、発現カセットまたは発現ベクターは、第１の核酸の上流及び／または第２の核酸の上流の構成的プロモーターを更に含む。

【0741】

いくつかの実施形態において、発現ベクターは、非ウイルスベクターである。

【0742】

一態様において、本明細書に開示される組換え核酸（複数可）を含む、発現ベクターが、本明細書で提供される。

【0743】

いくつかの実施形態において、発現ベクターは、非ウイルスベクターである。

【0744】

いくつかの実施形態において、組換え核酸（複数可）の５’及び３’末端は、初代細胞のゲノム内の挿入部位に隣接するゲノム配列と相同である１つ以上のヌクレオチド配列を含む。

【0745】

いくつかの実施形態において、挿入部位は、Ｔ細胞受容体アルファ定常（ＴＲＡＣ）遺伝子座またはゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）遺伝子座に位置する。

【0746】

いくつかの実施形態において、ＧＳＨ遺伝子座は、ＧＳ９４遺伝子座である。

【0747】

一態様において、免疫細胞であって、少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列であって、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である、第１の核酸配列と、少なくとも１５ヌクレオチド長の第２の核酸配列であって、配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的であるか、または配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である、第２の核酸配列と、を含む、免疫細胞が、本明細書で提供される。

【0748】

いくつかの実施形態において、第２の核酸配列は、配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的である。

【0749】

いくつかの実施形態において、第２の核酸配列は、配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１に相補的である。

【0750】

一態様において、免疫細胞であって、少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列であって、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である、第１の核酸配列と、少なくとも１５ヌクレオチド長の第２の核酸配列であって、配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的である、第２の核酸配列と、を含む、免疫細胞が、本明細書で提供される。

【0751】

一態様において、免疫細胞であって、少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列であって、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である、第１の核酸配列と、少なくとも１５ヌクレオチド長の第２の核酸配列であって、配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である、第２の核酸配列と、を含む、免疫細胞が、本明細書で提供される。

【0752】

いくつかの実施形態において、第１及び第２の核酸は、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

【0753】

いくつかの実施形態において、第１及び第２の核酸は、ｓｈＲＮＡである。

【0754】

いくつかの実施形態において、第１の核酸は、配列番号４２～７１に記載の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0755】

いくつかの実施形態において、第１の核酸は、配列番号４９に記載の配列を含む。

【0756】

いくつかの実施形態において、第２の核酸は、配列番号７２～９７に記載の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0757】

いくつかの実施形態において、第２の核酸は、配列番号８２に記載の配列を含む。

【0758】

いくつかの実施形態において、第１の核酸は、配列番号４２～７１に記載の配列からなる群から選択される配列を含み、第２の核酸配列は、配列番号７２～９７に記載の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0759】

いくつかの実施形態において、第１の核酸は、配列番号４９に記載の配列を含み、第２の核酸は、配列番号８２に記載の配列を含む。

【0760】

いくつかの実施形態において、第２の核酸は、配列番号９８～１２５に記載の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0761】

いくつかの実施形態において、第２の核酸は、配列番号９９または１０４に記載の配列を含む。

【0762】

いくつかの実施形態において、第１の核酸は、配列番号４２～７１に記載の配列からなる群から選択される配列を含み、第２の核酸は、配列番号９８～１２５に記載の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0763】

いくつかの実施形態において、第１の核酸は、配列番号４９に記載の配列を含み、第２の核酸は、配列番号９９または１０４に記載の配列を含む。

【0764】

いくつかの実施形態において、第１の核酸は、免疫細胞におけるＦＡＳの発現を、第１の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減する。

【0765】

いくつかの実施形態において、免疫細胞におけるＦＡＳの発現は、第１の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減される。

【0766】

いくつかの実施形態において、第２の核酸は、免疫細胞におけるＰＴＰＮ２の発現を、第２の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減する。

【0767】

いくつかの実施形態において、免疫細胞におけるＰＴＰＮ２の発現は、第２の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減される。

【0768】

いくつかの実施形態において、第２の核酸は、免疫細胞におけるＴＯＸの発現を、第２の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減する。

【0769】

いくつかの実施形態において、免疫細胞におけるＴＯＸの発現は、第２の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減される。

【0770】

いくつかの実施形態において、ＦＡＳ、ＰＴＰＮ２及び／またはＴＯＸの発現は、核酸アッセイまたはタンパク質アッセイによって決定される。

【0771】

いくつかの実施形態において、核酸アッセイは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、ＲＴ－ｑＰＣＲ、マイクロアレイ、遺伝子アレイまたはＲＮＡｓｅｑのうちの少なくとも１つを含む。

【0772】

いくつかの実施形態において、タンパク質アッセイは、イムノブロッティング、蛍光活性化細胞選別、フローサイトメトリー、磁気活性化細胞選別または親和性ベースの細胞分離のうちの少なくとも１つを含む。

【0773】

いくつかの実施形態において、細胞は、第１の抗原に特異的に結合する第１の細胞外抗原結合ドメインを含むプライミング受容体と、第２の抗原に特異的に結合する第２の細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、を更に含む。

【0774】

いくつかの実施形態において、免疫細胞は、初代ヒト免疫細胞である。

【0775】

いくつかの実施形態において、初代免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｔ細胞、γδＴ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、初代Ｔ細胞、Ｔ細胞前駆体または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。

【0776】

いくつかの実施形態において、初代免疫細胞は、初代Ｔ細胞である。

【0777】

いくつかの実施形態において、初代免疫細胞は、初代ヒトＴ細胞である。

【0778】

いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ウイルスフリーである。

【0779】

いくつかの実施形態において、免疫細胞は、自己免疫細胞である。

【0780】

いくつかの実施形態において、免疫細胞は、同種免疫細胞である。

【0781】

一態様において、少なくとも１つの組換え核酸（複数可）を含む初代免疫細胞であって、少なくとも１つの組換え核酸（複数可）が、配列番号４９に記載の配列を含む第１の核酸と、配列番号８２に記載の配列を含む第２の核酸と、を含み、初代免疫細胞のゲノムの標的領域内に挿入されており、初代免疫細胞が、組換え核酸（複数可）を初代免疫細胞内に導入するためのウイルスベクターを含まない、初代免疫細胞が、本明細書で提供される。

【0782】

一態様において、少なくとも１つの組換え核酸（複数可）を含む初代免疫細胞であって、少なくとも１つの組換え核酸（複数可）が、配列番号４９に記載の配列を含む第１の核酸と、配列番号９９または１０４に記載の配列を含む第２の核酸と、を含み、初代免疫細胞のゲノムの標的領域内に挿入されており、初代免疫細胞が、組換え核酸を初代免疫細胞内に導入するためのウイルスベクターを含まない、初代免疫細胞が、本明細書で提供される。

【0783】

一態様において、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）－組換え核酸（複数可）複合体を含むウイルスフリー生存初代細胞であって、ＲＮＰが、ヌクレアーゼドメイン及びガイドＲＮＡを含み、組換え核酸（複数可）が、配列番号４９に記載の配列を含む第１の核酸と、配列番号８２に記載の配列を含む第２の核酸と、を含み、組換え核酸（複数可）の５’及び３’末端が、初代細胞のゲノムにおける挿入部位に隣接するゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む、ウイルスフリー生存初代細胞が、本明細書で提供される。

【0784】

一態様において、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）－組換え核酸（複数可）複合体を含むウイルスフリー生存初代細胞であって、ＲＮＰが、ヌクレアーゼドメイン及びガイドＲＮＡを含み、組換え核酸（複数可）が、配列番号４９に記載の配列を含む第１の核酸と、配列番号９９または１０４に記載の配列を含む第２の核酸と、を含み、組換え核酸（複数可）の５’及び３’末端が、初代細胞のゲノムにおける挿入部位に隣接するゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む、ウイルスフリー生存初代細胞が、本明細書で提供される。

【0785】

いくつかの実施形態において、細胞は、第１の抗原に特異的に結合する第１の細胞外抗原結合ドメインを含むプライミング受容体と、第２の抗原に特異的に結合する第２の細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、を更に含み、第１の抗原及び第２の抗原は異なる。

【0786】

一態様では、本明細書に開示される複数の免疫細胞を含む細胞の集団が、本明細書で提供される。

【0787】

一態様において、本明細書に開示される免疫細胞または本明細書に開示される細胞の集団と、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、薬学的組成物が、本明細書で提供される。

【0788】

一態様において、本明細書に開示される組換え核酸、本明細書に開示される１つ以上の組換え核酸または本明細書に開示されるベクターと、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、薬学的組成物が、本明細書で提供される。

【0789】

一態様において、免疫細胞を編集する方法であって、
リボ核タンパク質（ＲＮＰ）－組換え核酸（複数可）複合体を提供することであって、ＲＮＰが、ヌクレアーゼドメイン及びガイドＲＮＡを含み、組換え核酸（複数可）が、本明細書に開示される組換え核酸（複数可）を含み、組換え核酸（複数可）の５’及び３’末端が、免疫細胞のゲノムにおける挿入部位に隣接するゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む、提供することと、
ＲＮＰ－組換え核酸（複数可）複合体を免疫細胞内に非ウイルス的に導入することであって、ガイドＲＮＡが、初代免疫細胞のゲノムの標的領域に特異的にハイブリダイズし、ヌクレアーゼドメインが、標的領域を切断して、免疫細胞のゲノムにおける挿入部位を作成する、非ウイルス的に導入することと、
免疫細胞を、免疫細胞のゲノムにおける挿入部位内への本明細書に開示される組換え核酸（複数可）の挿入を介して編集することと、
を含む、方法が、本明細書で提供される。

【0790】

いくつかの実施形態において、非ウイルス的に導入することは、エレクトロポレーションを含む。

【0791】

いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼドメインは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ）、任意にＣａｓ９ヌクレアーゼを含む。

【0792】

いくつかの実施形態において、細胞のゲノムの標的領域は、Ｔ細胞受容体アルファ定常（ＴＲＡＣ）遺伝子座またはゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）遺伝子座である。

【0793】

いくつかの実施形態において、組換え核酸（複数可）は、二本鎖組換え核酸（複数可）または一本鎖組換え核酸（複数可）である。

【0794】

いくつかの実施形態において、組換え核酸（複数可）は、直鎖組換え核酸（複数可）または環状組換え核酸（複数可）であり、任意選択で、環状組換え核酸（複数可）は、プラスミドである。

【0795】

いくつかの実施形態において、免疫細胞は、初代ヒト免疫細胞である。

【0796】

いくつかの実施形態において、免疫細胞は、自己免疫細胞である。

【0797】

いくつかの実施形態において、免疫細胞は、同種免疫細胞である。

【0798】

いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｔ細胞、γδＴ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、初代Ｔ細胞、Ｔ細胞前駆体または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。

【0799】

いくつかの実施形態において、免疫細胞は、初代Ｔ細胞である。

【0800】

いくつかの実施形態において、免疫細胞は、初代ヒトＴ細胞である。

【0801】

いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ウイルスフリーである。

【0802】

いくつかの実施形態において、方法は、患者から免疫細胞を得ることと、プラスミドを組換え核酸で導入することと、を更に含む。

【0803】

一態様において、対象における疾患を治療する方法であって、対象に、本明細書に開示される免疫細胞（複数可）または本明細書に開示される薬学的組成物を投与することを含む、方法が、本明細書で提供される。

【0804】

いくつかの実施形態において、疾患は、がんである。

【0805】

いくつかの実施形態において、がんは、固形がんまたは液体がんである。

【0806】

いくつかの実施形態において、がんは、卵巣癌、卵管癌、原発性腹膜癌、子宮癌、中皮腫、子宮頸癌または膵癌である。

【0807】

いくつかの実施形態において、細胞（複数可）の投与は、免疫応答を増強する。

【0808】

いくつかの実施形態において、増強免疫応答は、適応免疫応答である。

【0809】

いくつかの実施形態において、増強免疫応答は、自然免疫応答である。

【0810】

一態様において、対象における免疫応答を増強する方法であって、対象に、本明細書に開示される免疫細胞（複数可）または本明細書に開示される薬学的組成物を投与することを含む、方法が、本明細書で提供される。

【0811】

いくつかの実施形態において、増強免疫応答は、適応免疫応答である。

【0812】

いくつかの実施形態において、増強免疫応答は、自然免疫応答である。

【0813】

いくつかの実施形態において、免疫細胞におけるＦＡＳの発現は、第１の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減される。

【0814】

いくつかの実施形態において、免疫細胞におけるＰＴＰＮ２の発現は、第２の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減される。

【0815】

いくつかの実施形態において、免疫細胞におけるＴＯＸの発現は、第２の核酸を含まない対照細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減される。

【0816】

いくつかの実施形態において、免疫細胞におけるＦＡＳ、ＰＴＰＮ２及び／またはＴＯＸの発現は、核酸アッセイまたはタンパク質アッセイによって決定される。

【0817】

いくつかの実施形態において、核酸アッセイは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、ＲＴ－ｑＰＣＲ、マイクロアレイ、遺伝子アレイまたはＲＮＡｓｅｑのうちの少なくとも１つを含む。

【0818】

いくつかの実施形態において、タンパク質アッセイは、イムノブロッティング、蛍光活性化細胞選別、フローサイトメトリー、磁気活性化細胞選別または親和性ベースの細胞分離のうちの少なくとも１つを含む。

【0819】

いくつかの実施形態において、方法は、対象に、免疫療法を、免疫細胞と同時にまたは免疫細胞後に投与することを更に含む。

【0820】

一態様において、修飾された細胞であって、細胞が、対応する未修飾の細胞に対して、ＦＡＳ遺伝子の低減された発現及び／またはＦＡＳ遺伝子の産物の低減された機能を有するように修飾されており、任意選択で、修飾された細胞が、造血細胞である、修飾された細胞が、本明細書で提供される。

【0821】

いくつかの実施形態において、修飾された細胞は、対応する未修飾の細胞に対して、少なくとも１つの第２の遺伝子の低減された発現及び／または少なくとも１つの第２の遺伝子の産物の低減された機能を有するように更に修飾されている。

【0822】

一態様において、修飾及び操作された細胞であって、操作された細胞が、対応する未修飾の操作された細胞に対して、ＦＡＳ遺伝子の低減された発現及び／またはＦＡＳ遺伝子の産物の低減された機能を有するように修飾されており、任意選択で、修飾及び操作された細胞が、異種免疫受容体を発現するように操作されている、修飾及び操作された細胞が、本明細書で提供される。

【0823】

いくつかの実施形態において、修飾及び操作された細胞は、対応する未修飾の操作された細胞に対して、少なくとも１つの第２の遺伝子の低減された発現及び／または少なくとも１つの第２の遺伝子の産物の低減された機能を有するように更に修飾されている。

【0824】

一態様において、修飾された細胞であって、細胞が、（ａ）ＦＡＳ遺伝子の低減された発現及び／またはＦＡＳ遺伝子の産物の低減された機能、ならびに（ｂ）少なくとも１つの第２の遺伝子の低減された発現及び／または少なくとも１つの第２の遺伝子の産物の低減された機能を有するように修飾されており、各々の遺伝子の低減された発現が、対応する未修飾の細胞に対してのものであり、任意選択で、修飾された細胞が、造血細胞である、修飾された細胞が、本明細書で提供される。

【0825】

いくつかの実施形態において、発現を低減するための修飾は、ＦＡＳ遺伝子及び任意選択で少なくとも１つの第２の遺伝子を破壊するように、細胞のゲノムを遺伝子操作することを含む。

【0826】

いくつかの実施形態において、遺伝子操作は、ヌクレアーゼ媒介性編集を含み、任意選択で、ヌクレアーゼ媒介性編集は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性編集を含む。

【0827】

いくつかの実施形態において、発現を低減するための修飾は、ＦＡＳ遺伝子及び任意選択で少なくとも１つの第２の遺伝子のＲＮＡｉ媒介性ターゲティングを含み、任意選択で、ＲＮＡｉ媒介性ターゲティングは、ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）媒介性ノックダウンを含む。

【0828】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ媒介性ターゲティングは、ＦＡＳ遺伝子及び任意選択で少なくとも１つの第２の遺伝子のノックダウンを媒介することが可能であるＲＮＡポリヌクレオチドを発現するように細胞を操作することを含む。

【0829】

いくつかの実施形態において、修飾された細胞は、造血細胞を含む。

【0830】

いくつかの実施形態において、造血細胞は、造血幹細胞を含む。

【0831】

いくつかの実施形態において、造血細胞は、免疫細胞を含む。

【0832】

いくつかの実施形態において、免疫細胞は、適応免疫細胞、自然免疫細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージを含む。

【0833】

いくつかの実施形態において、修飾された細胞は、操作された細胞を含む。

【0834】

いくつかの実施形態において、操作された細胞は、異種受容体を発現するように操作されている。

【0835】

いくつかの実施形態において、異種受容体は、免疫受容体を含む。

【0836】

いくつかの実施形態において、異種免疫受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体またはＮＫ細胞受容体を含む。

【0837】

いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞またはＴ細胞への分化が可能な細胞を含み、異種受容体は、内因性ＴＣＲ遺伝子座、任意選択で、Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＲＡＣ）遺伝子座内に挿入されている。

【0838】

いくつかの実施形態において、異種受容体は、１つ以上の抗原結合ドメインを含み、任意選択で、１つ以上の抗原結合ドメインは、腫瘍抗原またはがんに関連する抗原に結合することが可能である。

【0839】

いくつかの実施形態において、ＦＡＳ遺伝子またはその発現産物の低減された発現及び／または機能は、対応する未修飾の細胞に対して、修飾された細胞の少なくとも１つの特性を改善する。

【0840】

いくつかの実施形態において、修飾された細胞が、少なくとも１つの第２の遺伝子の低減された発現及び／または機能を有するように更に修飾されているときに、ＦＡＳ遺伝子またはその発現産物の低減された発現及び／または機能、ならびに少なくとも１つの第２の遺伝子またはその発現産物の低減された発現及び／または機能は、ＦＡＳ遺伝子の発現及び／または機能のみを低減するように修飾された対応する細胞に対して、修飾された細胞の少なくとも１つの特性を改善する。

【0841】

いくつかの実施形態において、修飾された細胞が、少なくとも１つの第２の遺伝子の低減された発現及び／または機能を有するように更に修飾されているときに、ＦＡＳ遺伝子またはその発現産物の低減された発現及び／または機能、ならびに少なくとも１つの第２の遺伝子またはその発現産物の低減された発現及び／または機能は、少なくとも１つの第２の遺伝子の発現及び／または機能のみを低減するように修飾された対応する細胞に対して、修飾された細胞の少なくとも１つの特性を改善する。

【0842】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つの特性は、改善された増殖能力を含む。

【0843】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つの特性は、ＦＡＳ媒介性アポトーシスからの改善された保護を含む。

【0844】

いくつかの実施形態において、修飾された細胞は、免疫細胞を含み、少なくとも１つの特性は、改善された免疫エフェクター細胞機能を含む。

【0845】

いくつかの実施形態において、改善された免疫エフェクター細胞機能は、増加した相対的エフェクター分子発現、産生及び／または分泌を含む。

【0846】

いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞を含み、エフェクター分子は、ＩＦＮγ、ＴＮＦアルファ、グランザイムＢ及びＦＡＳＬからなる群から選択される１つ以上の分子を含む。

【0847】

いくつかの実施形態において、修飾された細胞は、異種表面抗原を発現するように操作されており、任意選択で、異種表面抗原は、異種表面抗原を発現するように操作されていない対応する修飾された細胞に対して、操作及び修飾された細胞の標的枯渇を媒介することが可能である。

【0848】

一態様において、対象における免疫応答を刺激する方法であって、対象に、本明細書に開示される修飾された細胞のうちのいずれか１つを投与することを含む、方法が、本明細書で提供される。

【0849】

一態様において、対象におけるがんを治療する方法であって、対象に、本明細書に開示される修飾された細胞のうちのいずれか１つを投与することを含む、方法が、本明細書で提供される。

【0850】

いくつかの実施形態において、修飾された細胞は、対象に関して自己である。

【0851】

いくつかの実施形態において、修飾された細胞は、対象に関して同種である。

【0852】

一態様において、１つ以上の組換え核酸であって、生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ／Ｐ）に特異的に結合する第１の細胞外抗原結合ドメインを含むプライミング受容体を含む第１のキメラポリペプチドと、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する第２の細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む第２のキメラポリペプチドと、をコードする、１つ以上の組換え核酸が、本明細書で提供される。

【0853】

いくつかの実施形態において、第１の細胞外抗原結合ドメインは、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列、ならびにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３の３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号２に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号３に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号４に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号５に記載の配列を含み、かつＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号６に記載の配列を含む。

【0854】

いくつかの実施形態において、第２の細胞外抗原結合ドメインは、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１４に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号１５に記載の配列を含み、かつＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号１６に記載の配列を含む。

【0855】

一態様において、少なくとも１５ヌクレオチド長の少なくとも１つの核酸配列をコードする１つ以上の組換え核酸であって、少なくとも１つの核酸配列が、（１）配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦａｓ細胞表面死受容体（ＦＡＳ）をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４に相補的である第１の核酸配列、（２）配列番号４０に記載の配列を含むヒトタンパク質チロシンホスファターゼ非受容体２型（ＰＴＰＮ２）をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９に相補的である第２の核酸配列、及び（３）配列番号４１に記載の配列を含むヒト胸腺細胞選択関連高移動度群ボックス（ＴＯＸ）をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１に相補的である第３の核酸配列のうちの１つ以上を含む、１つ以上の組換え核酸が、本明細書で提供される。

【0856】

いくつかの実施形態において、１つ以上の組換え核酸配列は、少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２ヌクレオチド長である。

【0857】

いくつかの実施形態において、１つ以上の組換え核酸配列は、ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

【0858】

いくつかの実施形態において、１つ以上の組換え核酸は、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４に相補的である第１の核酸配列と、配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９に相補的である第２の核酸配列と、を含む。

【0859】

いくつかの実施形態において、第１の核酸配列は、配列番号４２～７１に記載の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0860】

いくつかの実施形態において、第１の核酸配列は、配列番号４９に記載の配列を含む。

【0861】

いくつかの実施形態において、第１の核酸配列は、免疫細胞におけるＦＡＳの発現を、第１の核酸配列を含まない対照免疫細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減する。

【0862】

いくつかの実施形態において、第２の核酸配列は、配列番号７２～９７に記載の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0863】

いくつかの実施形態において、第２の核酸配列は、配列番号８２に記載の配列を含む。

【0864】

いくつかの実施形態において、第２の核酸配列は、免疫細胞におけるＰＴＰＮ２の発現を、第２の核酸配列を含まない対照免疫細胞と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低減する。

【0865】

いくつかの実施形態において、第１の核酸配列は、配列番号４２～７１に記載の配列からなる群から選択される配列を含み、第２の核酸配列は、配列番号７２～９７に記載の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0866】

いくつかの実施形態において、第１の核酸配列は、配列番号４９に記載の配列を含み、第２の核酸配列は、配列番号８２に記載の配列を含む。

【0867】

いくつかの実施形態において、核酸（複数可）は、配列番号１６８、１６７及び１６６に記載の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0868】

いくつかの実施形態において、第３の核酸配列は、配列番号９８～１２５に記載の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0869】

一態様において、本明細書に開示される組換え核酸（複数可）を含む、１つ以上の発現ベクター（複数可）が、本明細書で提供される。

【0870】

一態様において、本明細書に開示される１つ以上の組換え核酸（複数可）を含む、細胞が、本明細書で提供される。

【0871】

いくつかの実施形態において、細胞は、初代ヒト免疫細胞である。

【0872】

一態様において、本明細書に開示される組換え核酸（複数可）と、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、薬学的組成物が、本明細書で提供される。

【0873】

一態様において、対象における標的細胞を阻害する方法であって、胎盤／生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ／Ｐ）に特異的に結合する第１の細胞外抗原結合ドメインを含むプライミング受容体を含む第１のキメラポリペプチドと、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む第２のキメラポリペプチドであって、ＣＡＲが、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する第２の細胞外抗原結合ドメインを含む、第２のキメラポリペプチドと、を含む、細胞を投与することを含む、方法が、本明細書で提供される。

【0874】

一態様において、対象における標的細胞を阻害する方法であって、方法が、少なくとも１５ヌクレオチド長の少なくとも１つの核酸配列を含む細胞を投与することを含み、少なくとも１つの核酸配列が、（１）配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦａｓ細胞表面死受容体（ＦＡＳ）をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４に相補的である第１の核酸配列、（２）配列番号４０に記載の配列を含むヒトタンパク質チロシンホスファターゼ非受容体２型（ＰＴＰＮ２）をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９に相補的である第２の核酸配列、及び（３）配列番号４１に記載の配列を含むヒト胸腺細胞選択関連高移動度群ボックス（ＴＯＸ）をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１に相補的である第３の核酸配列のうちの１つ以上を含む、方法が、本明細書で提供される。

【0875】

いくつかの実施形態において、標的細胞は、がん細胞であり、任意選択で、固形がん細胞または液体がん細胞である。

【0876】

別の態様において、対象における疾患を治療する方法であって、本明細書に開示される細胞を対象に投与することを含む、方法が本明細書で提供される。

【実施例】

【0877】

以下は、本発明を実行するための具体的な実施形態の実施例である。実施例は、例示的な目的のためにのみ提供され、決して本開示の範囲を限定することを意図するものではない。使用される数値（例えば、量、温度等）に関して精度を保証するように努力がなされてはいるが、当然のことながら、いくらかの実験誤差及び偏差が許容されるべきである。

【0878】

本開示の実践には、別段の指示がない限り、当該技術分野の技能の範囲内で、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技法、及び薬理学の従来の方法が用いられる。そのような技法は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）、Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ． Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）、Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３^ｒｄ Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（１９９２）を参照されたい。

【0879】

実施例１：ＡＬＰＧ／Ｐ及びＭＳＬＮ論理ゲートの産生及びインビトロ特徴付け
材料及び方法
インビトロ研究のための非ウイルスＴ細胞操作。
Ｔ細胞を、正常ドナーのＬｅｕｋｏｐａｋ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から得た末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞単離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して濃縮した。続いて、Ｔ細胞を、３％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ）及び１２．５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－７及びＩＬ－１５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉプレミアムグレード）を補充したＴｅｘＭＡＣＳ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ １３０－１９７－１９６）中で、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、４０２０３Ｄ）で１：１のビーズ対細胞比で活性化し、３７℃、５％ ＣＯ２で４８時間培養した後、エレクトロポレーションを行った。

【0880】

ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰを、５：１：３：６の体積比で、１２０μＭの、ＤＮＡ配列ＧＡＧＣＣＡＴＧＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＧＡ（ＧＳ９４、配列番号３０７）を標的とするｓｇＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）、６２．５μＭのｓＮＬＳ－ＳｐＣａｓ９－ｓＮＬＳ（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）及びＰ３緩衝液（Ｌｏｎｚａ）を組み合わせることによって調製し、室温で１５分間インキュベートした。用量滴定実験によって決定された最適量のプラスミドＤＮＡ（０．２５～３マイクログラムの範囲）を、３．５μｌのＲＮＰと混合した。Ｔ細胞をカウントし、ビーズ除去し、９０×Ｇで１０分間遠心分離し、サプリメントを添加して１０＾６細胞／１４．５μｌのＰ３で再懸濁した（Ｌｏｎｚａ）。１４．５μｌのＴ細胞懸濁液をＤＮＡ／ＲＮＰ混合物に添加し、Ｌｏｎｚａ ３８４ウェルのＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅプレートに移し、コードＥＨ－１１５のＬｏｎｚａ ＨＴ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステムでパルス処理した。細胞を室温で１５分間休ませた後、１２．５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－７及びＩＬ－１５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉプレミアムグレード）を補充したＴｅｘＭＡＣＳ培地中の９６ウェルプレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に移した。

【0881】

導入遺伝子発現を、抗Ｍｙｃ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙクローン９Ｂ１１）及び抗Ｆｌａｇ抗体（ＲｎＤ系、クローン１０４２Ｅ）で染色することによって検出し、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター上で分析した。使用した他の抗体は、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、ＴＣＲアルファ／ベータ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄクローンＩＰ２６）、ＣＤ４抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄクローンＲＰＡ－Ｔ４）、ＣＤ８抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄクローンＳＫ１）であった。

【0882】

ＦＬＡＧタグＭＳＬＮ ＣＡＲ１：抗ＭＳＬＮヒトＶＨ－ＣＤ８ａヒンジ－ＣＤ８ａ－ＴＭＤ－４－１ＢＢ共刺激ドメイン－ＣＤ３ｚ活性化ドメイン。

【0883】

ＦＬＡＧタグＭＳＬＮ ＣＡＲ３：抗ＭＳＬＮヒトＶＨＨ－ＣＤ８ａヒンジ－ＣＤ８ａ－ＴＭＤ－４－１ＢＢ共刺激ドメイン－ＣＤ３ｚ活性化ドメイン。

【0884】

ＭｙｃタグＡＬＰＧ／Ｐプライミング受容体：抗ＡＬＰＧ／Ｐ ｓｃＦｖ－ＣＤ８ａヒンジ－Ｎｏｔｃｈ１ ＴＭＤ－Ｎｏｔｃｈ１ ＳＴＳ－ＨＮＦ１ａＤＢＤ－ｐ６５活性化ドメイン。

【0885】

Ｔ細胞刺激
２つのドナーからのＴ細胞を、ＡＬＰＧ／Ｐプライミング受容体とのＣＡＲフォーマット組み合わせでの２つの異なるＭＳＬＮバインダーの論理ゲートシステムを発現するように、インビトロ方法製造プロセスを使用して操作した。ＬＧ１は、ＡＬＰＧ／Ｐプライミング受容体との組み合わせでのＭＳＬＮ ＣＡＲ１であり、ＬＧ３は、ＡＬＰＧ／Ｐプライミング受容体との組み合わせでのＭＳＬＮ ＣＡＲ３である。Ｔ細胞を、最初の活性化後９日目に凍結させ、クライオバンクした。アッセイ前に、操作されたＴ細胞を、解凍し、１２．５ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－７及びＩＬ－１５を含む培地中で一晩静止させた。アッセイの日に、ＬＧ１またはＬＧ３を発現するＴ細胞を計数し、２ｅ４総Ｔ細胞を、９６ウェル丸底プレートの１ウェルごとに、ＩＬ－７及びＩＬ－１５を有さない２００μＬの培地中に蒔いた。操作されたＴ細胞を、単独で（「静止Ｔ細胞」条件）または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓとともに１：５のビーズ：細胞比で（「＋ＴＣＲ刺激」条件）、テクニカルレプリケートにおいて蒔いた。Ｔ細胞を有する調製されたプレートを、２分間３００ｇでスピンダウンし、その後、３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間の共培養後に、Ｔ細胞を、ＰｒｉｍｅＲ及びＣＡＲ発現のために、抗ｍｙｃ ＰＥ及び抗ＦＬＡＧ ＡＰＣをそれぞれ使用して染色し、フローサイトメトリーによって、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴにおいて分析する。

【0886】

デュアル抗原依存性死滅インビトロアッセイ
２つのドナーからのＴ細胞を、ＬＧ１またはＬＧ３（またはマッチした構成的ＣＡＲ対照）を発現するように、非ウイルス製造プロセスを使用して操作し、最初の活性化後９日目に凍結させ、クライオバンクした。アッセイ前に、操作されたＴ細胞及び同じドナーからのＲＮＰのみの対照Ｔ細胞を、解凍し、１２．５ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－７及びＩＬ－１５を含む培地中で一晩静止させた。アッセイの日に、操作されたＴ細胞を、計数し、ＰｒｉｍｅＲ及びＣＡＲ発現のために、抗ｍｙｃ ＰＥ及び抗ＦＬＡＧ ＡＰＣをそれぞれ使用して染色し、フローサイトメトリーによって分析した。各々のドナーについて、全ての操作されたＴ細胞集団を、このドナー内の最も低いＫＩ％に、ＲＮＰのみの細胞を付加して最も低いＫＩ％超であった操作された集団を希釈することによって正規化した。正規化後に、Ｔ細胞を、ＩＬ－７及びＩＬ－１５を有さない培地中に再懸濁させ、段階希釈し、その後、９６ウェル平底白壁アッセイプレートに付加した。Ｔ細胞の段階希釈は、１ｅ４標的細胞が付加された後の１ウェル当たりの以下の共培養ＫＩ＋エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比、３：１、１：１、１：３、１：９、１：２７及び１：８１を、テクニカルレプリケートにおいてもたらす。各々のＴ細胞集団を、プライミング抗原ＡＬＰＧ及び細胞溶解抗原ＭＳＬＮ発現の異なる組み合わせを有した以下の４つの異なるＫ５６２、Ｋ５６２、Ｋ５６２－ＡＬＰＧ、Ｋ５６２－ＭＳＬＮ及びＫ５６２－ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮとともに共培養した。Ｔ細胞及び標的細胞を有する調製されたプレートを、２分間３００ｇでスピンダウンし、その後、通気性膜を各々のプレート上に置いて３７℃で７２時間インキュベートした。７２時間の共培養の終了時の細胞毒性を、エンドポイントルシフェラーゼアッセイを使用して測定した。

【0887】

細胞毒性動態
３つのドナーからのＴ細胞を、ＬＧ１またはＬＧ３（またはマッチした構成的ＣＡＲ対照）を発現するように、非ウイルス製造プロセスを使用して操作し、最初の活性化後９日目に凍結させ、クライオバンクした。アッセイ前に、操作されたＴ細胞及び同じドナーからのＲＮＰのみの対照Ｔ細胞を、解凍し、１２．５ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－７及びＩＬ－１５を含む培地中で一晩静止させた。アッセイの日に、操作されたＴ細胞を、計数し、ＰｒｉｍｅＲ及びＣＡＲ発現のために、抗ｍｙｃ ＰＥ及び抗ＦＬＡＧ ＡＰＣをそれぞれ使用して染色し、フローサイトメトリーによって分析した。各々のドナーについて、全ての操作されたＴ細胞集団を、このドナー内の最も低いＫＩ％に、ＲＮＰのみの細胞を付加して最も低いＫＩ％超であった操作された集団を希釈することによって正規化した。正規化後に、Ｔ細胞を、ＩＬ－７及びＩＬ－１５を有さない培地中に再懸濁させ、段階希釈し、その後、ポリ－Ｌ－リジンで予めコーティングされた９６ウェル平底透明アッセイプレートに付加した（室温で５０μＬ／ウェル、３０分間吸引し乾燥させた）。Ｔ細胞の段階希釈は、６ｅ３ Ｋ５６２－ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ標的細胞を各々のウェルに穏やかに付加した後の以下の共培養ＫＩ＋エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比、３：１、１：１及び１：３を、テクニカルレプリケートにおいてもたらした。アネキシンＶ染料を、アッセイ培地中に含めて、アポトーシス細胞を標識した。Ｔ細胞及び標的細胞を有する調製されたプレートを、３０分間室温で撹乱せずに定着させ、その後、通気性フィルムで覆った。次いで、プレートを、Ｉｎｃｕｃｙｔｅライブセルイメージャーにおいてロードし、２時間ごとに７２時間イメージングして、経時的な細胞毒性活性を、Ｋ５６２ｓ及びアネキシンＶアポトーシスマーカーにおけるＧＦＰシグナルを測定することによって追跡した。

【0888】

サイトカイン産生
サイトカイン産生を、ＡＬＰＧ及びＭＳＬＮの異なる組み合わせを発現するように操作されたＫ５６２腫瘍細胞との細胞毒性アッセイ（「インビトロでのデュアル抗原依存性死滅」を参照されたい）の共培養ウェルから採取された上清中で評価した。上記の細胞毒性アッセイにおける１：１のＫＩ＋Ｅ：Ｔのウェルから７２時間で収集された上清を、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイを使用して、ＩＬ－２産生について分析した。

【0889】

患者関連レベルのＡＬＰＧ及びＭＳＬＮのためのモデル細胞株操作
論理ゲートＴ細胞との全ての共培養実験において使用されたＫ５６２標的細胞を、標的抗原及びタンパク質を有する構築物を発現するように、レンチウイルスを介して操作した。細胞発現を、卵巣癌原発性腫瘍試料において典型的に見出されるレベルまでのプライミング抗原ＡＬＰＧ及び細胞溶解抗原ＭＳＬＮ発現のレベルとマッチさせた。親Ｋ５６２細胞を、ＡＴＣＣから調達した。Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞を、Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｅ２３１２）を使用して、導入遺伝子発現ベクター、ならびにウイルスパッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２及びｐＭＤ２．Ｇでトランスフェクションすることを介して、汎親和性ＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化レンチウイルスを産生した。レンチウイルスを、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＃６３１２３１）を使用して更に濃縮した。アッセイにおいて使用された全てのＫ５６２細胞を、ＧＦＰ及びルシフェラーゼの両方を発現する「ＥＦＧ」構築物を含有するレンチウイルスで形質導入した。ＧＦＰを、選別マーカーとして、形質導入された細胞の純粋な集団をＦＡＣＳ ＡＲＩＡ ＩＩでのＦＡＣＳ選別を介して生成するために使用し、かつ標的細胞のためのマーカーとして、フローまたはＩｎｃｕｃｙｔｅベースのアッセイにおいて使用し、ルシフェラーゼ遺伝子を、細胞毒性アッセイを読み出すために使用した。

【0890】

Ｋ５６２－ＥＦＧ株を選別及びバンクした後に、細胞株を、プライミング抗原ＡＬＰＧ及び細胞溶解抗原ＭＳＬＮの組み合わせを発現するように更に形質導入した。バイシストロニック発現のための２Ａ配列によって分離された、ＡＬＰＧを発現するか、ＭＳＬＮを発現するか、またはＡＬＰＧ及びＭＳＬＮを一緒に発現するレンチウイルス構築物を、Ｋ５６２－ＥＦＧ株を形質導入するために使用した。

【0891】

ＣＡＲ発現誘導のためのプライミング受容体感受性アッセイ
１つのドナーからのＴ細胞を、ＬＧ３と同じ正確なＰｒｉｍｅＲを有するＬＧ１を発現するように、上記の操作方法を使用して操作した。活性化後９日目に、ＬＧ１ Ｔ細胞を計数し、２ｅ４総Ｔ細胞を、９６ウェル丸底プレートの１ウェルごとに、ＩＬ－７及びＩＬ－１５を有さない２００μＬの培地中に蒔いた。操作されたＴ細胞を、単独で（「Ｔ細胞単独」条件）、またはＫ５６２－ＡＬＰＧ^低もしくはＫ５６２－ＡＬＰＧ^高細胞とともに１：１のＫＩ＋Ｅ：Ｔで、テクニカルレプリケートにおいて蒔いた。Ｔ細胞を有する調製されたプレートを、２分間３００ｇでスピンダウンし、その後、３７℃で７２時間インキュベートした。７２時間の共培養後に、Ｔ細胞を、ＰｒｉｍｅＲ及びＣＡＲ発現のために、抗ｍｙｃ ＰＥ及び抗ＦＬＡＧ ＡＰＣをそれぞれ使用して染色し、フローサイトメトリーによって、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴにおいて分析する。生存Ｔ細胞をフロー分析においてＦｌｏｗＪｏを使用して特異的に分析するために、Ｋ５６２における生存率染料及びＧＦＰ発現を使用して、死細胞及び標的細胞をゲーティングにおいて除外した。

【0892】

次に、ＳＫＯＶ３－ＷＴ細胞を使用するインビトロストレスモデルを使用した。２つのドナーからのＴ細胞を、ＬＧ１またはＬＧ３（またはマッチした構成的ＣＡＲ対照）を発現するように、上記の操作方法を使用して操作した。細胞を、最初の活性化後９日目にクライオバンクした。アッセイ前に、操作されたＴ細胞及び同じドナーからのＲＮＰのみの対照Ｔ細胞を、解凍し、１２．５ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－７及びＩＬ－１５を含む培地中で一晩静止させた。アッセイの日に、操作されたＴ細胞を、計数し、ＰｒｉｍｅＲ及びＣＡＲ発現のために、抗ｍｙｃ ＰＥ及び抗ＦＬＡＧ ＡＰＣをそれぞれ使用して染色し、フローサイトメトリーによって分析した。各々のドナーについて、全ての操作されたＴ細胞集団を、このドナー内の最も低いＫＩ％に、ＲＮＰのみの細胞を付加して最も低いＫＩ％超であった操作された集団を希釈することによって正規化した。正規化後に、Ｔ細胞を、ＩＬ－７及びＩＬ－１５を有さない培地中に再懸濁させ、９６ウェル平底白壁アッセイプレートに、１：１のＫＩ＋Ｅ：Ｔで、ＡＬＰＧ及びＭＳＬＮを内因性発現する１ｅ４ ＳＫＯＶ３卵巣癌細胞とともに付加した。Ｔ細胞及び標的細胞を有する調製されたプレートを、２分間３００ｇでスピンダウンし、その後、通気性膜を各々のプレート上に置いて３７℃で７２時間インキュベートした。上清を、７２時間で収集し、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイを使用して、ＩＦＮγ及びＩＬ－２産生について分析した。

【0893】

原発性及び転移性がん試料における発現
適応症特異的試料における抗原レベルを評価するために、原発性及び転移性卵巣癌腫瘍試料における論理ゲート標的抗原ＡＬＰＧ（プライミング抗体）及びＭＳＬＮ（細胞溶解抗原）の発現を、ＩＨＣ分析を介して評価した。原発性卵巣癌腫瘍試料（ｎ＝２２）及び転移性（ｎ＝１１）を、ＩＨＣを介して、ＡＬＰＧ及びＭＳＬＮ発現について分析し、各々の試料を、各々の抗原が陽性である腫瘍細胞のパーセントについて、抗原発現の強度に加えてスコア化した。

【0894】

不均一性細胞毒性アッセイ
回路Ｔ細胞による完全腫瘍排除を誘導するために必要なプライム抗原陽性細胞の最小の割合を評価するために、腫瘍抗原不均一性が直接制御された細胞毒性アッセイを開発した。２つのドナーからのＴ細胞を、ＬＧ１またはＬＧ３（またはマッチした構成的ＣＡＲ対照）を発現するように、上記の操作方法を使用して操作した。細胞を、最初の活性化後９日目に凍結させ、クライオバンクした。アッセイ前に、操作されたＴ細胞及び同じドナーからのＲＮＰのみの対照Ｔ細胞を、解凍し、１２．５ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－７及びＩＬ－１５を含む培地中で一晩静止させた。アッセイの日に、操作されたＴ細胞を、計数し、ＰｒｉｍｅＲ及びＣＡＲ発現のために、抗ｍｙｃ ＰＥ及び抗ＦＬＡＧ ＡＰＣをそれぞれ使用して染色し、フローサイトメトリーによって分析した。各々のドナーについて、全ての操作されたＴ細胞集団を、このドナー内の最も低いＫＩ％に、ＲＮＰのみの細胞を付加して最も低いＫＩ％超であった操作された集団を希釈することによって正規化した。正規化後に、Ｔ細胞を、ＩＬ－７及びＩＬ－１５を有さない培地中に再懸濁させ、９６ウェル丸底透明アッセイプレートに、１：１のＫＩ＋Ｅ：Ｔで、異なるレベルのプライミング抗原不均一性をモデル化するために様々な比で混合された１ｅ４ Ｋ５６２－ＭＳＬＮ及びＫ５６２－ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮとともに付加した。Ｔ細胞及び標的細胞を有する調製されたプレートを、２分間３００ｇでスピンダウンし、その後、通気性膜を各々のプレート上に置いて３７℃で７２時間インキュベートした。７２時間の共培養の終了時の細胞毒性を、エンドポイントルシフェラーゼアッセイを使用して測定した。

【0895】

可溶性タンパク質阻害アッセイ
ＭＳＬＮは、細胞から可溶性形態（ｓＭＳＬＮ）でシェディングされ、ｓＭＳＬＮは、シンクとして作用することができ、がん細胞の表面上に提示されるＭＳＬＮへの抗ＭＳＬＮ ＣＡＲ Ｔ細胞による結合を阻害することができ、したがって、標的細胞死滅を阻害することができる。追加的に、可溶性タンパク質ＣＡ１２５は、ＭＳＬＮと相互作用することが既知であり、抗ＭＳＬＮバインダー及びＣＡＲが、ＣＡ１２５結合によって排除され得るエピトープを標的とする場合、それらの結合を遮断することができる。候補抗ＭＳＬＮ ＣＡＲ設計を、生理学的に関連するレベルで見出されるｓＭＳＬＮ及びＣＡ１２５による阻害に抵抗する能力について、漸増レベルの可溶性タンパク質をＣＡＲ Ｔ細胞とＭＳＬＮ陽性標的がん細胞との共培養中に滴定し、Ｔ細胞活性化／標的死滅を測定するアッセイを使用してスクリーニングすることができる。Ｋ５６２－ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ標的細胞及びＩＬ－２サイトカイン産生をＴ細胞活性化の尺度として使用するアッセイを開発して、可溶性タンパク質による抗ＭＳＬＮ ＣＡＲ Ｔ細胞阻害を、ＣＡ１２５による阻害を示すＭ９１２ ＣＡＲで検出した。可溶性タンパク質ＣＡＲ阻害アッセイを、構成的ＣＡＲ Ｔ細胞対照を使用して検証した後に、次いで、アッセイを使用して、論理ゲートＬＧ１及びＬＧ３を試験した。

【0896】

２つのドナーからのＴ細胞を、ＬＧ１またはＬＧ３（またはマッチした構成的ＣＡＲ対照）を発現するように、上記の操作方法を使用して操作した。細胞を、最初の活性化後９日目に凍結させ、クライオバンクした。アッセイ前に、操作されたＴ細胞及び同じドナーからのＲＮＰのみの対照Ｔ細胞を、解凍し、１２．５ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－７及びＩＬ－１５を含む培地中で一晩静止させた。アッセイの日に、操作されたＴ細胞を、計数し、ＰｒｉｍｅＲ及びＣＡＲ発現のために、抗ｍｙｃ ＰＥ及び抗ＦＬＡＧ ＡＰＣをそれぞれ使用して染色し、フローサイトメトリーによって分析した。各々のドナーについて、全ての操作されたＴ細胞集団を、このドナー内の最も低いＫＩ％に、ＲＮＰのみの細胞を付加して最も低いＫＩ％超であった操作された集団を希釈することによって正規化した。正規化後に、Ｔ細胞を、ＩＬ－７及びＩＬ－１５を有さない培地中に再懸濁させ、９６ウェル平底透明アッセイプレートに、１：１のＫＩ＋Ｅ：Ｔで、２ｅ４ Ｋ５６２－ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ標的細胞とともに、可溶性ＣＡ１２５またはｓＭＳＬＮの可変濃度の存在下で付加した。Ｔ細胞及び標的細胞を有する調製されたプレートを、２分間３００ｇでスピンダウンし、その後、３７℃で４８時間インキュベートした。上清を、４８時間で収集し、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイを使用して、ＩＬ－２産生について分析した。

【0897】

結果
Ｔ細胞編集及び刺激
アッセイの図を図１に示す。結果を、図２に示す。「静止Ｔ細胞」条件において、両方の論理ゲート（ＬＧ１及びＬＧ３）を発現するＴ細胞は、刺激の非存在下で、ＰｒｉｍｅＲ発現を示したが、最小のＣＡＲ発現を示した（図２）。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓを介するＴＣＲ刺激の際に、そのときに活性化されたＴ細胞は、「静止Ｔ細胞」条件における同じＴ細胞に対して増加したＰｒｉｍｅＲ ＭＦＩ及び％ＰｒｉｍｅＲ＋を示した（図２）。しかしながら、ＴＣＲ刺激は、ＣＡＲも発現するＰｒｉｍｅＲ＋細胞のパーセントを増加させなかった。これらの結果は、ＬＧ１及びＬＧ３からのＣＡＲの発現が、強いＴＣＲ及び共刺激シグナル伝達の状況においてでも、ＰｒｉｍｅＲ抗原への結合に依存することを示す。

【0898】

インビトロでのデュアル抗原依存性死滅
両方の論理ゲートは、インビトロでのデュアル抗原依存性死滅を実証する。論理ゲート１または論理ゲート３で操作されたＴ細胞を、プライミング抗原ＡＬＰＧ及び細胞溶解抗原ＭＳＬＮの両方を発現するがん細胞への細胞毒性応答を特異的に認識し活性化するようにプログラムした。論理ゲートＴ細胞のデュアル抗原特異性は、細胞溶解抗原を発現する健常な組織とのオンターゲットオフ腫瘍交差反応に起因して毒性を引き起こし得る従来の構成的ＣＡＲ Ｔ細胞と対照的である。構成的抗ＭＳＬＮ ＣＡＲを発現するＴ細胞は、Ｋ５６２－ＭＳＬＮ及びＫ５６２－ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ細胞の両方を死滅させたが（図３Ｃ及び３Ｄ）、論理ゲート発現Ｔ細胞からの細胞毒性は、デュアル抗原Ｋ５６２－ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮに特異的であり（図３Ｄ）、最も高いＥ：Ｔ比であっても、単一抗原陽性Ｋ５６２－ＡＬＰＧまたはＫ５６２－ＭＳＬＮ細胞株に対する最小の活性を実証した（図３Ｂ及び３Ｃ）。細胞毒性は、ＲＮＰのみの陰性対照Ｔ細胞から観察されなかった（図３Ａ）。腫瘍特異的活性は、論理ゲート発現Ｔ細胞において観察された（図３Ｄ）。オンターゲットオフ組織毒性が、Ｋ５６２－ＭＳＬＮ細胞株に対して、ＣＡＲのみのＴ細胞において観察された（図３Ｃ）。まとめると、このデータは、細胞溶解抗原陽性細胞に対する論理ゲートＴ細胞からの細胞毒性が、プライミング抗原ＡＬＰＧも存在する共培養条件に制限されたことが実証する。

【0899】

細胞毒性動態
論理ゲート１は、インビトロでの論理ゲート３よりも速い死滅動態を実証した。Ｋ５６２－ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ標的細胞とのＴ細胞共培養の動的イメージングは、異なる論理ゲートまたはマッチした構成的ＣＡＲ対照で操作されたＴ細胞が、それらの標的を異なる動態で死滅させることを明らかにした。構成的ＣＡＲ１またはＣＡＲ３で操作されたＴ細胞は、標的細胞とともに蒔かれた際に、細胞毒性活性の迅速な開始を示し、ＣＡＲ１が、最も速い死滅速度を有した。論理ゲートＴ細胞の細胞毒性は、構成的ＣＡＲ対照による細胞毒性の開始の約２４時間後に開始した。理論によって拘束されることを望むことなく、論理ゲートによる遅延性細胞毒性は、ＰｒｉｍｅＲが、最初に、その抗原に結合する必要があり、その後、Ｔ細胞が、細胞毒性を誘導することが可能である表面レベルに達するのに十分なＣＡＲ発現を誘発し得るというそれら機構に基づく可能性があった。論理ゲート１ Ｔ細胞は、論理ゲート３ Ｔ細胞に対してより迅速かつより完全なＫ５６２－ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ標的細胞死滅の両方を示した（図４）。細胞毒性は、ＲＮＰのみの陰性対照Ｔ細胞から観察されなかった。論理ゲート３ Ｔ細胞に対して論理ゲート１ Ｔ細胞による死滅のより速い動態は、論理ゲート１がより強力な候補であることを示すＴ細胞活性化及び標的死滅の他の尺度と良好に対応する。

【0900】

サイトカイン産生
論理ゲートＴ細胞の特異性及び機能活性を更に実証するために、サイトカイン産生を評価した。細胞毒性データと一致して、論理ゲートＴ細胞からのサイトカイン産生は、デュアル抗原Ｋ５６２－ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ標的細胞が存在するウェルに制限された（図５Ｄ）。対照的に、構成的ＣＡＲ対照を有するＴ細胞は、Ｋ５６２－ＭＳＬＮ（図５Ｂ）またはＫ５６２－ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ（図５Ｄ）標的細胞のいずれかとともに共培養されたときに、ＩＬ－２を産生した。論理ゲート及び構成的ＣＡＲ Ｔ細胞のどちらも、細胞溶解抗原を発現しなかったＫ５６２（図５Ａ）またはＫ５６２－ＡＬＰＧ（図５Ｃ）標的細胞株に応答して、ＩＬ－２を産生しなかった。ＲＮＰのみの陰性対照Ｔ細胞は、いずれもの標的細胞株とともに共培養されたときに、サイトカインを産生しなかった（図５Ａ）。理論によって拘束されることを望むことなく、これらのデータは、論理ゲートＴ細胞の機能的出力が、プライミング及び細胞溶解抗原の両方が存在する条件に制限されるという仮説を更に支持する。

【0901】

患者関連レベルのＡＬＰＧ及びＭＳＬＮのためのモデル細胞株操作
Ｋ５６２－ＡＬＰＧ、Ｋ５６２－ＭＳＬＮ及びＫ５６２－ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ株を、ＡＬＰＧ及びＭＳＬＮの両方の内因性抗原発現を有するＡＴＣＣから調達された膵癌細胞株であるＡＳＰＣ－１細胞株とマッチした抗原発現レベルを有するように、ＦＡＣＳを介して生成した。選別後の確立されたＫ５６２株及びＡＳＰＣ－１細胞株対照上のＡＬＰＧ及びＭＳＬＮ発現のフローサイトメトリーベースの評価は、ＦＡＣＳが、対照とマッチした発現を有する操作されたＫ５６２株を生成することに成功したことを示す（図６Ａ及び７Ａ）。重要なことに、（ＮＳＧマウス及びホルマリン固定から採取された）ＡＳＰＣ－１細胞である細胞ペレット及び異種移植片腫瘍試料の両方におけるＡＬＰＧ及びＭＳＬＮ発現のＩＨＣ分析は、同じ実験において分析された原発性卵巣癌腫瘍試料におけるこれらの抗原の低中程度の発現レベルとマッチすることが見出された（図６Ｂ及び７Ｂ）。まとめると、このデータは、これらのアッセイにおいて使用されたＫ５６２標的株が、典型的な卵巣癌患者腫瘍試料において見出されるレベルとマッチする生理学的に関連するレベルの標的抗原ＡＬＰＧ及びＭＳＬＮを発現することを支持する。

【0902】

ＣＡＲ発現誘導についてのプライミング受容体感受性アッセイ
次に、ＣＡＲ誘導アッセイを使用して、低密度のＡＬＰＧへのこのＰｒｉｍｅＲの感受性を評価した。抗ＡＬＰＧバインダーＰｒｉｍｅＲは、ＡｓＰＣ－１参照ラインよりも４倍低いＡＬＰＧレベルに感受性であった。ＬＧ１及びＬＧ３の両方が、抗ＡＬＰＧバインダーと同じＰｒｉｍｅＲを使用する。Ｋ５６２－ＡＬＰＧ^高及びＫ５６２－ＡＬＰＧ^低細胞株を、ＡｓＰＣ－１参照腫瘍細胞株の抗原発現とマッチするように生成した。機能アッセイにおいて使用されたＫ５６２－ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ標的細胞を、ＣＡＲ誘導アッセイにおいて使用されたＫ５６２－ＡＬＰＧ^高株とマッチしたＡＬＰＧ発現を有するように選別した。Ｋ５６２－ＡＬＰＧ^高株上のＡＬＰＧ表面分子の定量化は、参照細胞株と比較してより多数の抗原がこれらの細胞上に存在することを示す（図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ）。対照的に、Ｋ５６２－ＡＬＰＧ^低株は、「高」株よりも明確に低いＡＬＰＧ発現を示し、抗原定量化は、Ｋ５６２－ＡＬＰＧ^低株が、参照ＡＳＰＣ－１細胞株よりも４倍低いＡＬＰＧ発現を有することを示す（図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ）。したがって、Ｋ５６２－ＡＬＰＧ^低株は、生理学的に関連し、かつヒトがん患者における卵巣癌腫瘍において見出されるもののレベル未満である可能性があるＡＬＰＧ発現を有する。重要なことに、ＬＧ１及び抗ＡＬＰＧバインダーＰｒｉｍｅＲで操作されたＴ細胞は、Ｋ５６２－ＡＬＰＧ^低及びＫ５６２－ＡＬＰＧ^高細胞の両方に応答して、等価なプライム依存性ＣＡＲ誘導レベルを示す（図８Ｃ）。理論によって拘束されることを望むことなく、これらの結果は、ＬＧ１ Ｔ細胞が、ヒトがん患者からの卵巣癌腫瘍試料において典型的に見出される発現のレベル以下のＡＬＰＧレベルに応答して、ＣＡＲ発現を誘導することが可能であることを実証し、腫瘍ＡＬＰＧ密度が、ＡＬＰＧ＋／ＭＳＬＮ＋がん細胞を排除するＬＧ１ Ｔ細胞の能力を制限する因子でないことを示唆する。

【0903】

次に、ＳＫＯＶ３－ＷＴ細胞を使用するインビトロストレスモデルを使用して、２つの候補論理ゲートで操作されたＴ細胞が、低いかつ不均一なＡＬＰＧ及びＭＳＬＮ発現を有するＳＫＯＶ３卵巣癌細胞株にどのように応答するかを評価した（図９Ａ及び９Ｂ）。理論によって拘束されることを望むことなく、ＬＧ１及びＬＧ３が、同じＰｒｉｍｅＲを使用するが、各々、異なるＭＳＬＮバインダーで構築された４１ＢＢζベースのＣＡＲの発現を誘導することを考慮すると、異なるデュアル抗原陽性標的細胞へのこれらの論理ゲートＴ細胞による応答における差異は、異なる回路内の２つのＭＳＬＮ ＣＡＲの異なる活性によって駆動され得る。興味深いことに、両方のドナーにおいて、試験されたＬＧ１ Ｔ細胞は、ＳＫＯＶ３標的細胞に応答して、ＬＧ３ Ｔ細胞よりも有意に多いサイトカインを産生し、効果は、ＩＬ－２について特に顕著であった（図９Ｃ及び９Ｄ）。追加的に、ＬＧ１を発現するＴ細胞は、構成的ＣＡＲ１ Ｔ細胞よりも有意に多いサイトカインを（同様に、ＩＬ－２についてより顕著に）産生した（図９Ｃ及び９Ｄ）。理論によって拘束されることを望むことなく、このデータは、ＬＧ１ Ｔ細胞が、低いかつ不均一なＡＬＰＧ及びＭＳＬＮ発現を有する卵巣癌標的細胞に応答して、強いサイトカイン産生を誘導することが可能であることを示唆する。

【0904】

原発性及び転移性がん試料における発現
原発性及び転移性卵巣癌の両方のほぼ全ての試料が、ＭＳＬＮを発現することが見出され、原発性腫瘍試料の大部分が、ＭＳＬＮを、がん細胞の１００％上で発現した（図１０Ｂ）。プライミング抗原ＡＬＰＧの発現はまた、全ての転移性においてではないが、患者試料の大部分において見出された（図１０Ａ）。ＡＬＰＧは、ほとんどの卵巣癌試料において存在したが、ＡＬＰＧを発現する各々の試料内のがん細胞のパーセントは、多くの患者について、ＭＳＬＮよりも不均一であることが見出された。ＡＬＰＧが陽性であった試料は全て、５％超のＡＬＰＧ＋であり、ほとんどが、少なくとも１０％のＡＬＰＧ＋がん細胞を含有した。したがって、ＡＬＰＧ及びＭＳＬＮは、大部分の卵巣癌患者試料において共発現され、ＭＳＬＮ発現は、多くの試料における全ての細胞上でより均一に現れ、ＡＬＰＧは、存在するが、より不均一に発現される。

【0905】

不均一性細胞毒性アッセイ
腫瘍は、がん細胞の不均一な混合物であり、この不均一性は、抗原発現に及ぶ。２つの抗原をＡＮＤゲート様式で標的とすることによって、ＰｒｉｍｅＲ／ＣＡＲ論理ゲート回路は、腫瘍ターゲティング対健常な組織の精度を改善することによって、既存のがん療法に対して、毒性副作用を有意に低減する潜在性を有する。しかしながら、このより特異的なターゲティングでは、これらの回路が、プライミング抗原を少数の細胞上でのみ発現し、これが多くの患者腫瘍の場合である可能性がある不均一な腫瘍を排除することが可能であるかどうかが問われている。このアッセイの結果は、両方の論理ゲートが、わずか５％のプライミング抗原陽性がん細胞（ＡＬＰＧ）までの完全な標的細胞排除を実証することを実証し、ＬＧ１は、最も少ないプライミング抗原の存在下で、最も強力な応答を示す（図１０Ｃ）。構成的ＣＡＲ対照Ｔ細胞は、ＡＬＰＧ発現にかかわらず、全てのＭＳＬＮ＋標的細胞条件を等しく良好に死滅させた。細胞毒性は、ＲＮＰのみの陰性対照Ｔ細胞から観察されなかった。卵巣癌患者試料における抗原発現を分析するＩＨＣデータと一緒にまとめると、プライミング抗原不均一性細胞毒性アッセイの結果は、論理ゲートＴ細胞が、プライミング抗原を少数の細胞上でのみ発現するがん細胞の不均一な集団を除去することが可能であることを実証する。

【0906】

可溶性タンパク質アッセイ
ＬＧ１及びＬＧ３（またはそれらのマッチした構成的ＣＡＲ対照）のいずれも、生理学的に関連するレベルの可溶性ＣＡ１２５またはｓＭＳＬＮによって阻害されなかった（図１１Ａ及び１１Ｂ）。ＲＮＰ Ｔ細胞は、陰性対照について予想されるように、サイトカイン放出を示さなかった。これらの結果は、ＬＧ１及びＬＧ３の両方が、卵巣癌患者において遭遇し得るレベルの可溶性ＣＡ１２５及びｓＭＳＬＮによる阻害に対して耐性であるＣＡＲを含有することを示す。

【0907】

実施例２：ＡＬＰＧ／Ｐ及びＭＳＬＮ論理ゲートのインビボ特徴付け
材料及び方法
２つのドナーからのＴ細胞を、ＬＧ１またはＬＧ３（またはマッチした構成的ＣＡＲ対照）を発現するように、実施例１における上記の操作方法を使用して操作した。細胞を、最初の活性化後９日目に凍結させ、クライオバンクした。品質管理（ＱＣ）アッセイのために、操作されたＴ細胞及び同じドナーからのＲＮＰのみの対照Ｔ細胞を、解凍し、１２．５ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－７及びＩＬ－１５を含む培地中で一晩静止させた。次に、操作されたＴ細胞を、計数し、ＰｒｉｍｅＲ及びＣＡＲ発現のために、抗ｍｙｃ ＰＥ及び抗ＦＬＡＧ ＡＰＣをそれぞれ使用して染色し、フローサイトメトリーによって分析して、ＫＩ％を評価した。

【0908】

Ｋ５２６デュアル側腹部インビボ研究
ＮＳＧダブルＭＨＣ ＫＯ（ＮＳＧ ＤＫＯ）株（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、０２５２１６）に、１ｅ６に移植し、５０％のＭａｔｒｉｇｅｌ溶液中のＫ５６２－ＭＳＬＮ細胞及びＫ５６２－ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ細胞を、それぞれ、左側腹部及び右側腹部上に移植した。Ｋ５６２細胞接種の３日後に、マウスを、マッチした腫瘍サイズを有する治療群に、ルシフェラーゼシグナルを測定して操作された腫瘍細胞を定量化するための生物発光イメージング（ＢＬＩ）を使用してランダムに割り当て、１治療条件当たり７匹のマウスを割り当てた。ステージ分類及び正規化の同じ日に、操作されたＴ細胞及びマッチしたＲＮＰ対照を、解凍し、１２．５ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－７及びＩＬ－１５を含む培地中で一晩静止させた。Ｋ５６２移植後４日目に、各々のドナーについて、全ての操作されたＴ細胞集団を、このドナー内の最も低いＫＩ％に、ＲＮＰのみの細胞を付加して最も低いＫＩ％超であった操作された集団を希釈することによって正規化した。マウスに、５ｅ６ ＫＩ＋Ｔ細胞を、尾静脈を介して静脈内注射した。両側の腫瘍体積を、週２回、キャリパーを介して、体重とともに監視した。

【0909】

ＭＳＴＯ
ＮＳＧダブルＭＨＣ ＫＯ（ＮＳＧ ＤＫＯ）株（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、０２５２１６）に、１ｅ６を移植し、ＡＬＰＧ及びＭＳＬＮをＡＳＰＣ－１参照株とマッチするレベルで発現するように操作された、５０％のＭａｔｒｉｇｅｌ溶液中のＭＳＴＯ－２１１Ｈ細胞の各々を移植した。ＭＳＴＯ細胞接種の９日後に、マウスを、マッチした腫瘍サイズを有する治療群に、キャリパー測定に基づいてランダムに割り当て、１治療条件当たり７匹のマウスを割り当てた。ステージ分類及び正規化の同じ日に、操作されたＴ細胞及びマッチしたＲＮＰ対照を、解凍し、１２．５ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－７及びＩＬ－１５を含む培地中で一晩静止させた。ＭＳＴＯ移植後１０日目に、各々のドナーについて、全ての操作されたＴ細胞集団を、このドナー内の最も低いＫＩ％に、ＲＮＰのみの細胞を付加して最も低いＫＩ％超であった操作された集団を希釈することによって正規化した。マウスに、２ｅ６、７ｅ５または２．３ｅ５ ＫＩ＋Ｔ細胞を、尾静脈を介して静脈内注射した。腫瘍体積を、週２～３回、キャリパーを介して、体重とともに監視した。

【0910】

結果
デュアル側腹部インビボ実験モデルオンターゲットオフ腫瘍毒性は、健常な臓器によってそのような正常組織を表す細胞溶解性のみを発現する腫瘍でも発現される腫瘍抗原を標的とする構成的ＣＡＲ Ｔ細胞で臨床的に観察された。これらの実験において、Ｋ５６２^ＭＳＬＮ腫瘍は、ＭＳＬＮを発現する健常な臓器（例えば、中皮膜）をモデル化し、反対側の側腹部上のＫ５６２^{ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ}腫瘍は、卵巣癌腫瘍をモデル化した。ＬＧ１またはＬＧ３のいずれかを発現するＴ細胞は両方、デュアル抗原Ｋ５６２^{ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ}腫瘍細胞の特異的死滅を示し、オフターゲットＫ５６２^ＭＳＬＮ腫瘍細胞に対する測定可能な活性を有さなかった（図１２Ａ～Ｆ）。各々の図において、下の線は、示されるＴ細胞での治療後の腫瘍体積を示し、上の線は、対照Ｔ細胞での治療後の腫瘍体積を示す。構成的ＣＡＲでの治療後のＫ５６２^ＭＳＬＮ腫瘍及びＫ５６２^{ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ}腫瘍における腫瘍体積を、それぞれ、図１２Ａ及び１２Ｂに示す。ＬＧ１での治療後のＫ５６２^ＭＳＬＮ腫瘍及びＫ５６２^{ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ}腫瘍における腫瘍体積を、それぞれ、図１２Ｃ及び１２Ｄに示す。ＬＧ３での治療後のＫ５６２^ＭＳＬＮ腫瘍及びＫ５６２^{ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ}腫瘍における腫瘍体積を、それぞれ、図１２Ｅ及び１２Ｆに示す。ＬＧ１ Ｔ細胞は、ＬＧ３ Ｔ細胞よりも強力なオンターゲット抗腫瘍活性を実証した。したがって、ＬＧ１及びＬＧ３の両方は、操作されたＴ細胞が、ＡＬＰＧ＋／ＭＳＬＮ＋腫瘍を特異的に標的とし、死滅させ、同じマウスにおいて数センチのみ離れて存在するＭＳＬＮ＋腫瘍を無視するように指示した。これらの実験の結果は、どのように論理ゲートＴ細胞を使用して、インビボでのデュアル抗原腫瘍を特異的に標的とすることができるかを示す。

【0911】

２ｅ６ ＬＧ１またはＬＧ３ Ｔ細胞の用量は、操作されたＭＳＴＯ－２Ｈ１１ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ異種移植片腫瘍モデルにおいて、強力な腫瘍死滅及び完全応答を誘導した。固形腫瘍に対するＣＡＲ効力は、ＬＧ１またはＬＧ３論理ゲートＴ細胞で増強された。低用量、ストレス用量及び高用量Ｔ細胞投与応答を、それぞれ、図１３Ａ、１３Ｂ及び１３Ｃに示す。構成的ＬＧ１ ＭＳＬＮ－ＣＡＲ発現を有する７ｅ５従来ＣＡＲ－Ｔ細胞のストレス試験用量では、腫瘍成長は、部分的にのみ阻害された（図１３Ｂ）。対照的に、ＡＬＰＧ ＰｒｉｍｅＲ論理ゲートＴ細胞（ＬＧ１またはＬＧ３ Ｔ細胞のいずれも）は、同じ用量でより優れた腫瘍成長阻害をもたらした（図１３Ｂ）。追加的に、論理ゲート発現Ｔ細胞は、フローサイトメトリーを介する採取された血液中の操作されたＴ細胞の計数に基づいて、血液試料において、構成的発現ＣＡＲ－Ｔと比較してより堅牢な増殖を示した（図１３Ｄ）。末梢血中で見出されたＴ細胞のフロー分析は、論理ゲートＴ細胞からの最小のＣＡＲ発現を示し、これは、ＣＡＲ発現及び活性をオンターゲット腫瘍に制限する論理ゲートの忠実度を実証した（図１４Ａ～１４Ｄ）。したがって、論理ゲートは、構成的ＣＡＲに対して、ＣＡＲ Ｔ細胞の特異性及び安全性を、それらの活性をプライミング抗原の存在においてゲートすることによって増強するのみでなく、Ｔ細胞療法の効力も増加させた。

【0912】

実施例３：インビトロでのｓｈＲＮＡの特徴付け
材料
ｍＲＮＡレベルノックダウン（ｑＰＣＲ）
少なくとも２つのドナーからのＴ細胞を、ＦＭＣ６３ ＣＡＲを単独で、または示されるＦＡＳ、ＴＯＸ、ＰＴＰＮ２もしくはＺＣ３Ｈ１２Ａ ｓｈＲＮＡモジュールとともに発現するように操作した。ドナーからのＴ細胞を、Ｌｅｕｋｏｐａｃｋから単離し、活性化した（０日目）。活性化の４８時間後に、Ｔ細胞を操作した（２日目）。Ｔ細胞を操作するために、ＧＳ９４を標的とするｓｇＲＮＡを、室温で１０分間、ｓＮＬＳ－ＳｐＣａｓ９－ｓＮＬＳヌクレアーゼと複合体形成させ、リボ核タンパク質混合物を形成した。ＦＭＣ６３ ＣＡＲ単独、またはＦＡＳ、ＴＯＸ、ＰＴＰＮ２もしくはＺＣ３Ｈ１２Ａ ｓｈＲＮＡモジュール及び補充されたＰｒｉｍａｒｙＰ３溶液を含有するプラスミドを、リボ核タンパク質に付加し、混合した。混合物を、活性化されたＴ細胞に付加し、エレクトロポレーションに供した。エレクトロポレーション後に、操作されたＴ細胞を、１２．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７及びＩＬ－１５が補充された新鮮な培地を使用して回収した。３日目及び５日目に、操作されたＴ細胞を、１２．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７及びＩＬ－１５が補充された新鮮な培地で補完した。

【0913】

編集の６日後に、磁気濃縮を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１及びビオチン化抗ＥＧＦＲｔ抗体を使用して実行した。編集されたＴ細胞の高純度の集団を溶解し、ｍＲＮＡを、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｍＲＮＡ Ｄｉｒｅｃｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して抽出した。抽出後に、ｍＲＮＡを、Ｑｕａｎｔ－ｉｔ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用して定量化し、ｍＲＮＡを使用して、ｃＤＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキットで合成した。次いで、ｃＤＮＡを使用して、リアルタイム定量的逆転写ＰＣＲを、ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、ならびにＲＰＬ１３Ａ、ＦＡＳ、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＴＯＸ ＴａｑＭａｎアッセイで実行した。

【0914】

タンパク質レベルノックダウン（フローサイトメトリー）
少なくとも２つのドナーからのＴ細胞を、ＦＭＣ６３ ＣＡＲを単独でまたは示されるＦＡＳ ｓｈＲＮＡモジュールとともに発現するように、Ｒ＆Ｄ製造プロセスを使用して操作した。編集の６日後に、Ｔ細胞を、ＥＧＦＲｔ及びＦＡＳ発現のために、抗ＥＧＦＲｔ ＰＥ及び抗ＦＡＳ ＡＦ６４７をそれぞれ使用して染色し、フローサイトメトリーによって、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターにおいて分析した。相対的ＦＡＳ発現を、ＥＧＦＲｔ＋細胞についてのＦＡＳのｇＭＦＩをＥＧＦＲｔ－細胞で割ったものの比を得ることによって定量化した。次いで、この値を、対照群の相対的ＦＡＳ発現に正規化して、ノックダウンを計算した。

【0915】

デュアルｓｈＲＮＡノックダウンのためのＴ細胞操作
Ｔ細胞を、正常ドナーのＬｅｕｋｏｐａｋ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から得た末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞単離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して濃縮した。続いて、Ｔ細胞を、３％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ）及び１２．５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－７及びＩＬ－１５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉプレミアムグレード）を補充したＴｅｘＭＡＣＳ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ １３０－１９７－１９６）中で、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、４０２０３Ｄ）で１：１のビーズ対細胞比で活性化し、３７℃、５％ ＣＯ２で４８時間培養した後、エレクトロポレーションを行った。

【0916】

ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰを、ＤＮＡ配列ＧＡＧＣＣＡＴＧＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＧＡ（ＧＳ９４、配列番号３０７）を標的とする１２０μＭのｓｇＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）、６２．５μＭのｓＮＬＳ－ＳｐＣａｓ９－ｓＮＬＳ（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）及びＰ３緩衝液（Ｌｏｎｚａ）を、５：１：３：６の体積比で組み合わせることによって調製し、１５分間室温でインキュベートした。用量滴定実験によって決定された、目的のｓｈＲＮＡ（複数可）をコードする最適化された量（０．５～３マイクログラムの範囲）のプラスミドＤＮＡを、３．５μｌのＲＮＰと混合した。Ｔ細胞をカウントし、ビーズ除去し、９０×Ｇで１０分間遠心分離し、サプリメントを添加して１０＾６細胞／１４．５μｌのＰ３で再懸濁した（Ｌｏｎｚａ）。１４．５μｌのＴ細胞懸濁液をＤＮＡ／ＲＮＰ混合物に添加し、Ｌｏｎｚａ ３８４ウェルのＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅプレートに移し、コードＥＨ－１１５のＬｏｎｚａ ＨＴ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステムでパルス処理した。細胞を室温で１５分間休ませた後、１２．５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－７及びＩＬ－１５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉプレミアムグレード）を補充したＴｅｘＭＡＣＳ培地中の９６ウェルプレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に移した。

【0917】

３つのドナーからのＴ細胞を、抗メソテリン（ＭＳＬＮ）ＣＡＲを単独で、またはデュアルルシフェラーゼ対照ｓｈＲＮＡモジュール、ＦＡＳ ｓｈＲＮＡ、ＦＡＳ－ＴＯＸ ｓｈＲＮＡ、ＴＯＸ－ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡ、ＦＡＳ－ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡ、ＺＣ３Ｈ１２Ａ－ＰＴＰＮ２もしくはＦＡＳ－ＮＲ４Ａ１ ｓｈＲＮＡのいずれかとともに発現するように、上記の非ウイルスエレクトロポレーション方法を使用して操作した。細胞を、最初の活性化後９日目に凍結させ、クライオバンクした。凍結保存前に、各々の条件からの細胞のアリコートを採取し、Ｔ細胞を、ＥＧＦＲｔ及びＣＡＲ発現のために、抗ＥＧＦＲｔ及び抗ｍｙｃをそれぞれ使用して染色し、フローサイトメトリーによって、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴにおいて分析した。

【0918】

ｓｈＲＮＡの配列及び例示的なｓｈＲＮＡ－ｍｉｒモジュールを、以下及び配列表で提供する。

【0919】

ＦＡＳ＿１１：ＴＴＡＡＧＡＡＴＣＴＴＴＴＣＡＡＡＣＡＣＴＡ（配列番号４９）

【0920】

ＦＡＳ＿１３：ＴＡＡＴＣＴＴＡＡＴＣＴＴＴＣＡＴＣＣＴＣＴ（配列番号５１）

【0921】

ＰＴＰＮ２＿１４：ＴＣＴＧＡＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＣＡＣＴＧＡ（配列番号８２）

【0922】

ＰＴＰＮ２＿１：ＴＡＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＴＣＡＣＡＴＣＴＴＣ（配列番号７２）

【0923】

ＴＯＸ＿９：ＴＧＡＧＴＣＴＣＣＡＡＡＣＡＧＡＡＣＡＧ（配列番号１０４）

【0924】

ＴＯＸ＿４：ＴＡＴＧＡＣＴＧＣＴＡＣＡＴＣＡＡＧＣＣＡＴ（配列番号９９）

【0925】

ＺＣ３Ｈ１２Ａ：ＴＴＡＴＴＡＡＧＡＡＧＣＡＴＣＴＴＧＣＴＴＡ（配列番号１２６）

【0926】

ＮＲ４Ａ１：ＴＴＡＡＴＣＡＧＡＡＡＡＧＴＣＡＣＡＴＡＣＴ（配列番号１４４）

【0927】

ＦＡＳ＿１１－ＰＴＰＮ＿１４ ｓｈＲＮＡ－ｍｉＲモジュール：ＧＴＡＡＧＴＣＧＡＣＴＣＧＴＴＧＧＡＴＣＣＣＣＡＣＴＡＣＣＣＧＧＡＴＣＡＡＣＧＣＣＣＴＡＧＧＴＴＴＡＴＧＴＴＴＧＧＡＴＧＡＡＣＴＧＡＣＡＴＡＣＧＣＧＴＡＴＣＣＧＴＣＴＴＡＡＧＡＡＴＣＴＴＴＴＣＡＡＡＣＡＣＴＡＧＴＡＧＴＧＡＡＡＴＡＴＡＴＡＴＴＡＡＡＣＴＡＧＴＧＴＴＴＧＡＡＡＡＧＡＴＴＣＴＴＡＴＴＡＣＧＧＴＡＡＣＧＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＡＡＣＴＡＴＴＴＴＡＴＣＡＡＴＴＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＣＴＴＣＡＡＧＧＧＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＴＴＧＡＡＴＧＡＧＧＣＴＴＣＡＧＴＡＣＴＴＴＡＣＡＧＡＡＴＣＧＴＴＧＣＣＴＧＣＡＣＡＴＣＴＴＧＧＡＡＡＣＡＣＴＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＴＴＣＧＡＣＴＴＣＴＴＡＡＣＣＣＡＡＣＡＧＡＡＧＧＣＴＣＧＡＧＡＡＧＧＴＡＴＡＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＣＡＧＴＧＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧＴＣＡＧＡＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＡＴＣＴＧＡＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＣＡＣＴＧＡＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＧＧＣＴＡＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＡＡＴＴＡＴＣＴＴＧＴＴＴＡＣＴＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴＡＣＣＴＴＧＣＴＡＴＣＴＣＴＴＴＧＡＴＡＣＡＴＴＴＴＴＡＣＡＡＡＧＣＴＧＡＡＴＴＡＡＡＡＴＧＧＴＡＴＡＡＡＴＴＡＡＡＴＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＴＣＴＧＡＣＣＡＧＴＡＧＴＧＧＡＣＴＡＧＴＧＴＧＡＣＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＣＣＴＴＴＣＴＴＴＣＣＣＴＴＣＴＡＣＡＧ（配列番号１５７）

【0928】

追加のｓｈＲＮＡ ｍｉＲモジュールを、配列表で提供する。

【0929】

また、Ｔ細胞を、ダブルＦＡＳ及びＰＴＰＮ２ノックアウトを有するように操作した。

【0930】

静止条件におけるｍＲＮＡノックダウン
４つのドナーからのＴ細胞を、ＭＳＬＮ ＣＡＲを単独で、またはデュアルルシフェラーゼ対照ｓｈＲＮＡ、ＦＡＳ－ＮＲ４Ａ１ ｓｈＲＮＡ、ＦＡＳ－ＴＯＸ ｓｈＲＮＡ、ＦＡＳ－ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡ、ＰＴＰＮ２－ＴＯＸ ｓｈＲＮＡもしくはＰＴＰＮ２－ＺＣ３Ｈ１２Ａ ｓｈＲＮＡモジュールのいずれかとともに発現するように、上記の製造プロセスを使用して操作した。編集の６日後に、磁気濃縮を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１及びビオチン化抗ＥＧＦＲｔ抗体を使用して実行した。編集されたＴ細胞の高純度の集団を溶解し、ｍＲＮＡを、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｍＲＮＡ Ｄｉｒｅｃｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して抽出した。抽出後に、ｍＲＮＡを、Ｑｕａｎｔ－ｉｔ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用して定量化し、ｍＲＮＡを使用して、ｃＤＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキットで合成した。次いで、ｃＤＮＡを使用して、リアルタイム定量的逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）を、ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、ならびにＲＰＬ１３Ａ、ＦＡＳ、ＰＴＰＮ２、ＴＯＸ及びＺＣ３Ｈ１２ＡのためのＴａｑＭａｎアッセイで実行した。

【0931】

静止条件におけるタンパク質ノックダウン
フローサイトメトリー：２つのドナーからのＴ細胞を、ＭＳＬＮ ＣＡＲを単独で、またはデュアルルシフェラーゼ対照ｓｈＲＮＡ、ＦＡＳ－ＮＲ４Ａ１ ｓｈＲＮＡ、ＦＡＳ－ＴＯＸ ｓｈＲＮＡ、ＦＡＳ－ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡ、ＰＴＰＮ２－ＴＯＸ ｓｈＲＮＡもしくはＰＴＰＮ２－ＺＣ３Ｈ１２Ａ ｓｈＲＮＡモジュールのいずれかとともに発現するように、製造プロセスを使用して操作した。編集の６日後に、その後、週１回６週間、Ｔ細胞を、ＥＧＦＲｔ及びＦＡＳ発現のために、抗ＥＧＦＲｔ ＰＥ及び抗ＦＡＳ ＦＩＴＣをそれぞれ使用して染色し、フローサイトメトリーによって、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴにおいて分析した。相対的ＦＡＳ発現を、ＥＧＦＲｔ＋細胞についてのＦＡＳのｇＭＦＩをＥＧＦＲｔ－細胞で割ったものの比を得ることによって定量化した。次いで、この値を、対照群の相対的ＦＡＳ発現に正規化した。

【0932】

ウェスタンブロット：４つのドナーからのＴ細胞を、ＭＳＬＮ ＣＡＲを単独で、またはデュアルルシフェラーゼ対照ｓｈＲＮＡ、ＦＡＳ－ＮＲ４Ａ１ ｓｈＲＮＡ、ＦＡＳ－ＴＯＸ ｓｈＲＮＡ、ＦＡＳ－ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡ、ＰＴＰＮ２－ＴＯＸ ｓｈＲＮＡもしくはＰＴＰＮ２－ＺＣ３Ｈ１２Ａ ｓｈＲＮＡモジュールのいずれかとともに発現するように、製造プロセスを使用して操作した。編集の６日後に、磁気濃縮を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１及びビオチン化抗ＥＧＦＲｔ抗体を使用して実行した。次いで、編集されたＴ細胞の高純度の集団を溶解し沸騰させて、タンパク質を還元し変性させた。総タンパク質を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用して定量化した。次いで、正規化されたライセートをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル内にロードし、実行した。次いで、タンパク質を、ゲルからＰＶＤＦメンブレンに移し、ブロックし、ＲＰＬ１３Ａ（対照）、ＦＡＳ、ＮＲ４Ａ１またはＰＴＰＮ２一次抗体、及びＨＲＰコンジュゲート二次抗体のために染色した。次いで、ブロットを、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃでイメージングし、相対的ＰＴＰＮ２発現を定量化した。

【0933】

慢性刺激条件下でのｍＲＮＡノックダウン
編集されたＣＤ３＋Ｔ細胞を、ＭＳＬＮ＋Ｋ５６２での１４日間の反復刺激に供し、ＲＮＡ－ｓｅｑの４８時間前に静止させた。

【0934】

ＦＡＳ媒介性アポトーシス
６つのドナーからのＴ細胞を、ＭＳＬＮ ＣＡＲを単独で、またはデュアルルシフェラーゼ対照ｓｈＲＮＡ、ＦＡＳ－ＮＲ４Ａ１ ｓｈＲＮＡ、ＦＡＳ－ＴＯＸ ｓｈＲＮＡ、ＦＡＳ－ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡ、ＰＴＰＮ２－ＴＯＸ ｓｈＲＮＡもしくはＰＴＰＮ２－ＺＣ３Ｈ１２Ａ ｓｈＲＮＡモジュールのいずれかとともに発現するように、製造プロセスを使用して操作した。編集の６日後に、Ｔ細胞を、０、０．２、２または２０ｕｇ／ｍＬの抗ＦＡＳ活性化抗体とともに、２４時間培養した。Ｔ細胞を、ＥＧＦＲｔ、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ及びＡｐｏｔｒａｃｋｅｒで染色し、フローサイトメトリーによって、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴにおいて分析した。編集された生存細胞の頻度を、ＥＧＦＲｔ＋細胞のうちのパーセントＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ－ Ａｐｏｔｒａｃｋｅｒ－として計算し、次いで、これらの頻度を、０ｕｇ／ｍＬの抗ＦＡＳ活性化抗体を有する対照条件におけるパーセント生存細胞に正規化した。

【0935】

サイトカイン非依存的増殖アッセイ
２つのドナーからのＴ細胞を、ＭＳＬＮ ＣＡＲを単独で、またはデュアルルシフェラーゼ対照ｓｈＲＮＡ、ＦＡＳ－ＮＲ４Ａ１ ｓｈＲＮＡ、ＦＡＳ－ＴＯＸ ｓｈＲＮＡ、ＦＡＳ－ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡ、ＰＴＰＮ２－ＴＯＸ ｓｈＲＮＡもしくはＰＴＰＮ２－ＺＣ３Ｈ１２Ａ ｓｈＲＮＡモジュールのいずれかとともに発現するように、製造プロセスを使用して操作した。編集の１１日後に、Ｔ細胞を、１２．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７及びＩＬ－１５とともに、または外因性サイトカインの非存在下で培養し、サイトカイン除去後０日目、２日目、４日目及び８日目に、編集された細胞の頻度及び生存細胞の絶対数を定量化した。０日目からの編集された生存細胞における倍率変化を使用して、各々の条件を正規化した。

【0936】

細胞毒性アッセイ
Ｉｎｃｕｃｙｔｅ：３つのドナーからのＴ細胞を、ＭＳＬＮ ＣＡＲを単独で、またはデュアルルシフェラーゼ対照ｓｈＲＮＡ、ＦＡＳ－ＮＲ４Ａ１ ｓｈＲＮＡ、ＦＡＳ－ＴＯＸ ｓｈＲＮＡ、ＦＡＳ－ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡ、ＰＴＰＮ２－ＴＯＸ ｓｈＲＮＡもしくはＰＴＰＮ２－ＺＣ３Ｈ１２Ａ ｓｈＲＮＡモジュールのいずれかとともに発現するように、製造プロセスを使用して操作し、最初の活性化後９日目に凍結させ、クライオバンクした。アッセイを実行する前に、細胞を、解凍し、１２．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７及びＩＬ－１５を含有する培地中で回収した。編集された細胞の頻度を、ＲＮＰのみの編集されたＴ細胞を付加し戻すことによって、最も低い編集効率に正規化した。次いで、Ｔ細胞を、ＣＡＲ標的抗原ＭＳＬＮを発現するように操作されたまたは操作されていないＫ５６２細胞とともに、１対１の比で共培養した。４８時間の経過にわたって、細胞培養を、Ｉｎｃｕｃｙｔｅを使用してイメージングし、パーセント死滅を、生存Ｋ５６２細胞の数をＫ５６２細胞の総数で割り、商を１から引き、１００を掛けることによって計算した。

【0937】

ルシフェラーゼ：３つのドナーからのＴ細胞を、ＳＳ１ ＣＡＲを単独で、またはデュアルルシフェラーゼ対照ｓｈＲＮＡモジュールもしくはＦＡＳ－ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡモジュールのいずれかとともに発現するように、ＣｉＴＥ製造プロセスを使用して操作し、最初の活性化後９日目に凍結させ、クライオバンクした。アッセイを実行する前に、細胞を、解凍し、１２．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７及びＩＬ－１５を含有する培地中で回収した。編集された細胞の頻度を、ＲＮＰのみの編集されたＴ細胞を付加し戻すことによって、最も低い編集効率に正規化した。次いで、Ｔ細胞を、ＣＡＲ標的抗原ＭＳＬＮを発現するように操作されたＭＳＴＯ細胞とともに、示される比で共培養した。４８時間後に、Ｌｕｃ－Ｓｃｒｅｅｎアッセイを実行し、パーセント標的細胞死滅を、各々の試料についての発光値を腫瘍のみ対照ウェルの発光値で割り、商を１から引き、１００を掛けることによって計算した。

【0938】

ＲＳＡ
３つのドナーからのＴ細胞を、ＭＳＬＮ ＣＡＲを単独で、またはデュアルルシフェラーゼ対照ｓｈＲＮＡ、ＦＡＳ－ＮＲ４Ａ１ ｓｈＲＮＡ、ＦＡＳ－ＴＯＸ ｓｈＲＮＡ、ＦＡＳ－ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡ、ＰＴＰＮ２－ＴＯＸ ｓｈＲＮＡもしくはＰＴＰＮ２－ＺＣ３Ｈ１２Ａ ｓｈＲＮＡモジュールのいずれかとともに発現するように、製造プロセスを使用して操作し、最初の活性化後９日目に凍結させ、クライオバンクした。アッセイを実行する前に、細胞を、解凍し、１２．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７及びＩＬ－１５を含有する培地中で回収した。編集の６日後に、磁気濃縮を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１及びビオチン化抗ＥＧＦＲｔ抗体を使用して実行した。濃縮された編集された細胞を、フローサイトメトリーによって、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴにおいて、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ Ｐｌｕｓ Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓで計数した。８５，０００個の編集されたＴ細胞を、９６ウェル平底プレートのウェル内に分注し、共培養を、Ｋ５６２を定義されたエフェクター：標的比で分注することによって開始した。最初の濃縮後２、５、７、９及び１２日目に、Ｔ細胞を、フローサイトメトリーによって定量化し、共培養を、Ｋ５６２細胞をＴＴＰ ＬａｂＴｅｃｈ Ｄｒａｇｏｎｆｌｙ液体ハンドラーを使用して分注することによって、所望のＥ：Ｔ比に再設定した。最初の濃縮後１４日目に、ＲＮＡｓｅｑを、編集されたＴ細胞において、上記の抗ＥＧＦＲｔ抗体ベースの濃縮を実行し、フローサイトメトリーを使用して、２０，０００個のＴ細胞を３８４ウェルプレートのウェル内に分注し、次いで、インハウス３’バーコード計数バルクＲＮＡｓｅｑ調製を使用することによって実行した。試料バーコーディングオリゴ－ｄＴ逆転写プライマーを、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｅｃｈｏ音響液体ハンドラーを使用して分注し、逆転写を実行し、ＲＴ－ＰＣＲ産物を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴタグメンテーションキットを使用して配列決定ライブラリに変換し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ ＤＮＡシーケンサーにおいて配列決定した。１４日目の上清からのサイトカイン産生を、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｌｕｍｉｎｅｘマルチプレックスサイトカインキットによって定量化した。

【0939】

結果
ｍＲＮＡレベルノックダウン（ｑＰＣＲ）
ＦＡＳ、ＰＴＰＮ２、ＴＯＸ及びＺＣ３Ｈ１２ＡのｍＲＮＡノックダウンを、図１８Ａ～Ｄに示す。リアルタイム定量的逆転写ＰＣＲ結果は、ＦＡＳ（図３６Ａ）、ＴＯＸ（図３６Ｃ）及びＰＴＰＮ２（図３６Ｂ）に対するｓｈＲＮＡ配列が、製造の終了時の編集された細胞における５０％超のノックダウンを提供することを示す。ＺＣ３Ｈ１２Ａの最大ノックダウンは、約５５％であった（図３６Ｄ）。ｓｈＲＮＡ配列ＦＡＳ＿１１、ＦＡＳ＿１３、ＰＴＰＮ２＿１、ＰＴＰＮ２＿１４、ＴＯＸ＿９、ＴＯＸ＿４、ＺＣ３Ｈ１２Ａ＿１２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ＿１、ＮＲ４Ａ１＿１２及びＮＲ４Ａ１＿１９（図示せず）を、追加の特徴付けのために選択した。

【0940】

タンパク質レベルノックダウン（フローサイトメトリー）
ＦＡＳを標的とするｓｈＲＮＡモジュールは、製造の終了時の編集された細胞におけるＦＡＳタンパク質の５０％超のノックダウンを提供した（図３７）。

【0941】

デュアルｓｈＲＮＡノックダウンのためのＴ細胞操作
編集効率または編集された細胞収率における差異は、製造の終了時に観察されなかった。ｓｈＲＮＡ－ｍｉＲモジュールは、９日間の細胞産生中の細胞増殖に影響しなかった（図１５Ａ及び１５Ｂ）。

【0942】

静止条件におけるｍＲＮＡノックダウン
複数のｓｈＲＮＡは、組み合わせで使用されたときに、両方の遺伝子の堅牢な標的遺伝子ノックダウンを実証する（図１６）。ＦＡＳ－ＰＴＰＮ２モジュールは、静止条件下での編集された細胞におけるＦＡＳ及びＰＴＰＮ２ ｍＲＮＡの両方の５０％超のノックダウンを提供した（図１６）。

【0943】

静止条件におけるタンパク質ノックダウン
ＦＡＳ、ＰＴＰＮ２及びＴＯＸを標的とするｓｈＲＮＡモジュールは、ＦＡＳの安定したノックダウンを、静止条件下で、編集後少なくとも７週間提供する（図１７Ａ）。ＦＡＳ、ＰＴＰＮ２及びＮＲ４Ａ１タンパク質レベルがまた、編集の６日後に有意に低減された（図１７Ｂ）。ＦＡＳタンパク質は、ＦＡＳ ｓｈＲＮＡがＰＴＰＮ２またはＴＯＸと組み合わされたときに、２５％未満に低減され、ＮＲ４Ａ１タンパク質は、ＮＲ４Ａ１ ｓｈＲＮＡがＦＡＳと組み合わされたときに、５０％未満に低減され、ＰＴＰＮ２タンパク質は、ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡがＦＡＳ、ＴＯＸまたはＺＣ３Ｈ１２Ａ ｓｈＲＮＡと組み合わされたときに、約１２％または１２％未満に低減された。したがって、ＦＡＳ、ＰＴＰＮ２及びＮＲ４Ａ１についてのｓｈＲＮＡ遺伝子ノックダウンは、恒常性条件下で堅牢かつ耐久性であった。

【0944】

慢性刺激条件下でのｍＲＮＡノックダウン
標的遺伝子ノックダウンは、慢性刺激にわたって維持された（図１８）。したがって、ＦＡＳ、ＰＴＰＮ２及びＮＲ４Ａ１についてのｓｈＲＮＡ遺伝子ノックダウンは、慢性刺激条件下で堅牢かつ耐久性であった。

【0945】

ＦＡＳ媒介性アポトーシス
ＦＡＳを標的とするｓｈＲＮＡモジュールは、ＦＡＳ媒介性アポトーシスへの少なくとも１００倍低減された感受性を提供するのに十分なノックダウンをもたらす（図１９Ａ及び１９Ｂ）。図１９Ａは、ｓｈＲＮＡからの、細胞における強いＦＡＳノックダウンがあったことを示す。図１９Ｂは、抗ＦＡＳ活性化抗体での２４時間の治療後の対照ｓｈＲＮＡのみを有するＴ細胞に正規化された場合、ＦＡＳノックダウンを有するＴ細胞が、８０％超の生存率を保持したことを示す。したがって、ＦＡＳ ｓｈＲＮＡ－ｍｉＲは、Ｔ細胞のＦＡＳ媒介性アポトーシスに対して保護した。

【0946】

サイトカイン非依存的増殖アッセイ
全ての操作されたＴ細胞は、サイトカイン支持の非存在下で死滅し、サイトカイン非依存性成長は観察されなかった。したがって、組み合わせｓｈＲＮＡモジュールで操作されたＴ細胞は、サイトカイン除去後の操作されたＴ細胞の死によって示される、形質転換の増加したリスクの証拠を示さなかった（図２０）。

【0947】

細胞毒性アッセイ
全てのノックダウン組み合わせは、インビトロでの同一の標的細胞死滅を実証した。組み合わせｓｈＲＮＡモジュールで操作されたＴ細胞または対照ＦＡＳ－ＰＴＰＮ２ノックアウト細胞（ＦＡＳ－ＰＴＰＮ２ ｄＫＯ）は、標的抗原発現Ｋ５６２細胞株での４８時間のＩｎｃｕｃｙｔｅアッセイにわたって、低減された細胞毒性活性の証拠を示さなかった（図２１）。

【0948】

加えて、全てのｓｈＲＮＡノックダウン組み合わせは、インビトロでの同等の死滅動態を実証した。ｓｈＲＮＡノックダウンモジュールで操作されたＴ細胞が、標的抗原発現ＭＳＴＯ細胞株での４８時間のルシフェラーゼアッセイにわたって、低減された細胞毒性活性の証拠を示さなかった（図２２）。

【0949】

ＲＳＡ
ｓｈＲＮＡを介するＰＴＰＮ２ノックダウンは、慢性抗原刺激中のＴ細胞増殖を増加させた（図２３）。全てのデュアルｓｈＲＮＡモジュールは、慢性抗原刺激中のＩＦＮγ産生を増加させ、ウィルコクソン検定＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、ｎｓ＝ｐ＞０．０５である（図２５）。ＰＴＰＮ２ノックダウンＴ細胞はまた、慢性抗原刺激後に、細胞周期シグネチャを示し（図２４Ａ及び２４Ｂ）、慢性抗原刺激後に、エフェクターシグネチャを保持した（図２６Ａ及び２６Ｂ）。

【0950】

したがって、ＦＡＳ－ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡモジュールで操作されたＴ細胞は、無関係の対照遺伝子を標的とするｓｈＲＮＡモジュールを発現する対照操作されたＴ細胞に対して、約８倍より大きい増殖（図２３）、約２倍より大きいインターフェロンガンマ発現（図２５）、ならびにエフェクターＴ細胞機能（図２６Ａ及び２６Ｂ）及び細胞周期（図２４Ａ及び２４Ｂ）の強いシグネチャを示した。ウィルコクソン検定＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、ｎｓ＝ｐ＞０．０５。

【0951】

実施例４：インビボでのｓｈＲＮＡの特徴付け
材料
３つのドナーからのＴ細胞を、ＭＳＬＮ ＣＡＲを単独で、またはデュアルルシフェラーゼ対照ｓｈＲＮＡモジュールもしくはＦＡＳ－ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡモジュールのいずれかとともに発現するように、上記の製造プロセスを使用して操作し、最初の活性化後９日目に凍結させ、クライオバンクした。アッセイを実行する前に、細胞を、解凍し、培地中で回収し、ＲＮＰのみの編集されたＴ細胞での最も低い編集効率に正規化した。ＭＳＬＮ ＣＡＲ単独で、またはデュアルルシフェラーゼ対照ｓｈＲＮＡモジュールもしくはＦＡＳ－ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡモジュールのいずれかで操作されたＴ細胞の有効性を評価するために、インビボアッセイを、中皮腫の皮下モデルにおいて実行した。ＮＳＧ－ＭＨＣ Ｉ／ＩＩ ｄＫＯマウスに、ＭＳＬＮを過剰発現するＭＳＴＯ２１１Ｈ細胞を注射した。ＭＳＴＯ２１１Ｈ細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及びＭａｔｒｉｇｅｌの１００μＬの１：１懸濁液中で、マウスの右側腹部内に注射した。動物を、治療群に、腫瘍体積に従ってランダム化し、０．２５×１０^６、０．５×１０^６及び２×１０^６の用量のＴ細胞を、尾静脈内に注射した。腫瘍体積を、治療が開始される前に測定し、治療が開始された後に週２回測定し、Ｖ＝（長さ×幅２）／２として計算した。

【0952】

治療されたマウスの末梢血中のＳＳ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞の存在、増殖及び持続性を、マルチパラメトリックフローサイトメトリーによって監視した。５０μＬの血液を、治療後７日目、１４日目、２１日目及び２８日目に各々のマウスから収集した。血液を、ＡＣＫ溶解緩衝液で溶解して、赤血球を除去し、マウスＣＤ４５及びＧＲ１；ヒトＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８ａ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＡ、ＥＧＦＲ、ＣＤ９５及びＦＬＡＧに対する蛍光標識抗体で染色した。次に、標識された試料に、正規化のためのカウントビーズを付加し、その後、フローサイトメトリー分析を、Ａｔｔｕｎｅフローサイトメーターによって行った。収集されたＦＡＣＳデータを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。

【0953】

脾臓及び腫瘍を、１４日目に、高ＣＡＲ－Ｔ用量を注射された各々の群におけるマウスのサブセット（ｎ＝３）から単離し、ＦＡＣを実行して、ＣＡＲ－Ｔ表現型を、特徴付け、定量化した。

【0954】

結果
動物への注入と並行して、各々の条件の表現型分析を実行して、細胞の分化状態を比較した。図１３に示されるように、Ｔ細胞におけるｓｈＲＮＡの発現は、ＤＫＯ ＦＡＳ／ＰＴＰＮ２修飾を除いて、操作されたＴ細胞集団におけるＣＤ４もしくはＣＤ８％Ｔ細胞パーセンテージ、またはＴエフェクター細胞（Ｔｅ）、Ｔエフェクターメモリー細胞（Ｔｅｍ）、Ｔセントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）もしくはメモリー幹Ｔ細胞（Ｔｓｃｍ）の相対的量を改変しなかった（図２７）。したがって、ｓｈＲＮＡモジュールは、注入前のＴ細胞の分化状態を改変しなかった。

【0955】

インビボ治療後に、ＦＡＳ－ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡ－ｍｉＲモジュールで操作されたＴ細胞は、改善された腫瘍制御（図２８Ａ）、ならびに末梢血中（図２８Ｂ）及び腫瘍内の編集されたＴ細胞の増加した蓄積を示す。ＣＡＲ、またはＦＡＳ、ＦＡＳ／ＴＯＸもしくはＦＳ／ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡを発現する編集されたＴ細胞は、インビボでの腫瘍体積を有意に低減した（図２８Ａ）。ＦＡＳ－ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡ Ｔ細胞はまた、ｓｈＲＮＡを有さないＣＡＲ Ｔ細胞単独と比較して、末梢血中での１０倍より大きい増殖及び増強された持続性を示した（図２８Ｂ）。したがって、ＦＡＳ－ＰＴＰＮ２ノックダウンは、Ｔ細胞増殖及び腫瘍制御を増加させた。

【0956】

用量実験において、０．５×１０^６の用量のＦＡＳ－ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡノックダウンＴ細胞及びＦＡＳ－ＴＯＸ ｓｈＲＮＡノックダウンＴ細胞は、２×１０^６のＣＡＲ単独よりも良好なまたはそれと同等の腫瘍制御を示し、これは、腫瘍の同等の制御が用量の４分の１で観察されたことを示した（図２９）。したがって、ＦＡＳ及びＰＴＰＮ２またはＴＯＸのノックダウンは、同様の腫瘍治療のためにより低い用量を可能にする。

【0957】

ＦＡＳ－ＰＴＰＮ２は、エフェクター及び前駆細胞を含む全てのＴ細胞サブセットの増殖を駆動した。ＦＡＳ－ＰＴＰＮ２及びＦＡＳ－ＴＯＸの組み合わせは、脾臓におけるメモリー表現型を有する細胞のより高い頻度及び腫瘍におけるサブセットの同様の割合をもたらした（図３０Ａ及び３０Ｂ）。

【0958】

更に、試験の経過にわたるマウスの体重によって示されるように、増加したＴ細胞増殖に関連する全体の毒性の証拠はなかった（図３１）。実験条件のいずれも、マウスの体重減少をもたらさなかった。

【0959】

実施例５：インビトロでのｓｈＲＮＡとＡＬＰＧ／Ｐ及びＭＳＬＮ論理ゲートとの共発現
材料及び方法
デュアル抗原依存性細胞毒性アッセイ
４つのドナーからのＴ細胞を、ｓｈＲＮＡを発現することなく論理ゲート１単独を発現するように、または論理ゲート１とＦＡＳ／ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡカセット（ＡＢ－１０１５、配列番号１６８）とを組み合わせた完全最適化リード集積回路Ｔ細胞（ＩＣＴ）であるように、非ウイルス製造プロセスを使用して操作し、最初の活性化後９日目に凍結させ、クライオバンクした。アッセイ前に、操作されたＴ細胞及び同じドナーからのＲＮＰのみの対照Ｔ細胞を、解凍し、１２．５ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－７及びＩＬ－１５を含む培地中で一晩静止させた。アッセイの日に、操作されたＴ細胞を、計数し、ＰｒｉｍｅＲ及びＣＡＲ発現のために、抗ｍｙｃ ＰＥ及び抗ＦＬＡＧ ＡＰＣをそれぞれ使用して染色し、フローサイトメトリーによって分析した。各々のドナーについて、全ての操作されたＴ細胞集団を、このドナー内の最も低いＫＩ％に、ＲＮＰのみの細胞を付加して最も低いＫＩ％超であった操作された集団を希釈することによって正規化した。正規化後に、Ｔ細胞を、ＩＬ－７及びＩＬ－１５を有さない培地中に再懸濁させ、段階希釈し、その後、９６ウェル平底白壁アッセイプレートに付加した。Ｔ細胞の段階希釈は、１ｅ４標的細胞が付加された後の１ウェル当たりの以下の共培養ＫＩ＋エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比、３：１、１：１、１：３、１：９及び１：２７を、テクニカルレプリケートにおいてもたらす。各々のＴ細胞集団を、Ｋ５６２－ＭＳＬＮ及びＫ５６２－ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮとともに共培養した。Ｔ細胞及び標的細胞を有する調製されたプレートを、２分間３００ｇでスピンダウンし、その後、通気性膜を各々のプレート上に置いて３７℃で７２時間インキュベートした。７２時間の共培養の終了時の細胞毒性を、エンドポイントルシフェラーゼアッセイを使用して測定した。ＰｒｉｍｅＲ及びＣＡＲ発現を、各々の受容体の抗原のタグ付きバージョンでの一次染色を使用して定量化し、次いで、これを、蛍光コンジュゲート二次抗体で検出し、フローサイトメトリーによって分析した。

【0960】

静止条件におけるタンパク質ノックダウン
フローサイトメトリー：２つのドナーからのＴ細胞を、ＬＧ１（ＡＬＰＧ／Ｐプライミング受容体及びＭＳＬＮ ＣＡＲ）を単独で（ＬＧ１ ＨＴＬＶ対照）またはＦＡＳ－ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡモジュールとともに発現するように、製造プロセスを使用して操作した。編集の５日後に、Ｔ細胞を、ＡＬＰＧ／Ｐ及びＦＡＳ発現のために、ＡＬＰＧ－ＡＦ６４７及び抗ＦＡＳ ＦＩＴＣをそれぞれ使用して染色し、フローサイトメトリーによって、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴにおいて分析した。相対的ＦＡＳ発現を、フローサイトメトリーヒストグラムに示す。

【0961】

結果
ＡＬＰＧ／Ｐ及びＭＳＬＮ論理ゲートとＦＡＳ／ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡとの共発現は、インビトロでの論理ゲート忠実度及び効力を維持した。図３２に示されるように、論理ゲート及びｓｈＲＮＡを発現するＴ細胞のインキュベーションは、ＣＡＲ抗原のみを発現するＫ５６２－ＭＳＬＮ細胞の溶解を誘導しなかった。しかしながら、プライミング受容体標的ＡＬＰＧを発現するＫ５６２細胞とのインキュベーションは、標的細胞の有意な用量依存的溶解をもたらし、標的細胞の１００％が、最も高い比で溶解した。したがって、ｓｈＲＮＡと論理ゲートとの共発現は、プライミング受容体及びＣＡＲの機能に影響しなかった。

【0962】

加えて、ｓｈＲＮＡはまた、ｓｈＲＮＡを有さないＬＧ１対照細胞に対して強いＦＡＳノックダウンを実証した（図３３）。したがって、プライミング受容体及びＣＡＲとｓｈＲＮＡとの共発現は、ｓｈＲＮＡの機能に影響しなかった。

【0963】

実施例６：インビボでのｓｈＲＮＡとＡＬＰＧ／Ｐ及びＭＳＬＮ論理ゲートとの共発現
材料及び方法
２つのドナーからのＴ細胞を、ＬＧ１及びＦＡＳ／ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡ（ＡＢ－１０１５、配列番号１６８）、またはＬＧ１及びＦＡＳ／ＴＯＸ ｓｈＲＮＡを発現するように、実施例１における上記の操作方法を使用して操作した。細胞を、最初の活性化後９日目に凍結させ、クライオバンクした。品質管理（ＱＣ）アッセイのために、同じドナーからのＲＮＰのみの対照Ｔ細胞を、解凍し、１２．５ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－７及びＩＬ－１５を含む培地中で一晩静止させた。次に、操作されたＴ細胞を、計数し、ＰｒｉｍｅＲ及びＣＡＲ発現のために、抗ｍｙｃ ＰＥ及び抗ＦＬＡＧ ＡＰＣをそれぞれ使用して染色し、フローサイトメトリーによって分析して、ＫＩ％を評価した。

【0964】

Ｋ５２６デュアル側腹部インビボ研究
ＮＳＧダブルＭＨＣ ＫＯ（ＮＳＧ ＤＫＯ）株（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、０２５２１６）に、１ｅ６に移植し、５０％のＭａｔｒｉｇｅｌ溶液中のＫ５６２－ＭＳＬＮ細胞及びＫ５６２－ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ細胞を、それぞれ、左側腹部及び右側腹部上に移植した。Ｋ５６２細胞接種の３日後に、マウスを、マッチした腫瘍サイズを有する治療群に、ルシフェラーゼシグナルを測定して操作された腫瘍細胞を定量化するための生物発光イメージング（ＢＬＩ）を使用してランダムに割り当て、１治療条件当たり７匹のマウスを割り当てた。ステージ分類及び正規化の同じ日に、操作されたＴ細胞及びマッチしたＲＮＰ対照を、解凍し、１２．５ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－７及びＩＬ－１５を含む培地中で一晩静止させた。Ｋ５６２移植後４日目に、各々のドナーについて、全ての操作されたＴ細胞集団を、このドナー内の最も低いＫＩ％に、ＲＮＰのみの細胞を付加して最も低いＫＩ％超であった操作された集団を希釈することによって正規化した。マウスに、５ｅ６ ＫＩ＋Ｔ細胞を、尾静脈を介して静脈内注射した。両側の腫瘍体積を、週２回、キャリパーを介して、体重とともに監視した。

【0965】

結果
ＬＧ１回路内へのＦＡＳ／ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡの組込みは、ＬＧ１＋デュアルＬｕｃ ｓｈＲＮＡ制御回路に対してより大きい抗腫瘍効力及び等価の忠実度を、インビボで、デュアル腫瘍ＮＳＧモデルにおいてもたらした（図３４Ａ（ドナー２）及び３４Ｂ（ドナー３））。腫瘍低減は、ＣＡＲ抗原ＭＳＬＮのみを発現する細胞に対して観察されなかった。腫瘍体積における低減は、腫瘍細胞がＡＬＰＧ及びＭＳＬＮの両方を発現したときに観察された。より大きい腫瘍体積低減は、操作されたＴ細胞がＦＡＳ／ＰＴＰＮ２ ｓＲＮＡを共発現したときに、ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ論理ゲートのみと比較して観察された（図３４Ａ及び３４Ｂ）。

【0966】

ＬＧ１＋ＦＡＳ／ＴＯＸ ｓｈＲＮＡ回路は、ＬＧ１＋ＦＡＳ／ＰＴＰＮ２回路と同様の忠実度及び抗腫瘍効力を、インビボで、デュアル腫瘍ＮＳＧモデルにおいて示した（図３５Ａ（ドナー２）及び３５Ｂ（ドナー３））。腫瘍低減は、ＣＡＲ抗原ＭＳＬＮのみを発現する細胞に対して観察されなかった。腫瘍体積における低減は、腫瘍細胞がＡＬＰＧ及びＭＳＬＮの両方を発現したときに観察された。より大きい腫瘍体積低減は、操作されたＴ細胞がＦＡＳ／ＴＯＸ ｓｈＲＮＡまたはＦＡＳ／ＰＴＰＮ２ ｓＲＮＡを共発現したときに観察された。同様の腫瘍体積低減が、ＦＡＳ／ＴＯＸ ｓｈＲＮＡまたはＦＡＳ／ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡのいずれかを共発現するＴ細胞での治療後に観察された（図３５Ａ及び３５Ｂ）。

【0967】

実施例７：卵巣腫瘍モデルにおけるインビボアッセイ
３つのドナーからのＴ細胞を、ＬＧ１（ＡＬＰＧ／Ｐプライミング受容体及びＭＳＬＮ ＣＡＲ）と、ＦＡＳ－ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡモジュールと、を含む、ＡＢ－１０１５カセットを発現するように、実施例１における上記の操作方法を使用して操作した。細胞を、最初の活性化後９日目に凍結させ、クライオバンクした。品質管理（ＱＣ）アッセイのために、同じドナーからのＲＮＰのみの対照Ｔ細胞を、解凍し、１２．５ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－７及びＩＬ－１５を含む培地中で一晩静止させた。操作されたＴ細胞を、計数し、プライミング受容体及びＣＡＲ発現のために、ＡＬＰＧ－ＡＦ６４７及びＭＳＬＮ－Ｂｉｏ一次／ストレプトアビジン－ＰＥ二次をそれぞれ使用して染色し、フローサイトメトリーによって分析して、ＫＩ％を評価した。

【0968】

ＮＳＧダブルＭＨＣ ＫＯ（ＮＳＧ ＤＫＯ）株（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、０２５２１６）に、１ｅ７細胞を腹腔内移植し、ＡＬＰＧ及びＭＳＬＮを発現するＯＶＣＡＲ３－ＡＬＰＧ卵巣癌適応症特異的細胞株の各々を、腹腔内移植した。図５６Ａに示されるように、腫瘍細胞接種の５日後に、マウスを、マッチした腫瘍サイズを有する治療群に、ＯＶＣＡＲ３－ＡＬＰＧ標的細胞によって発現されたルシフェラーゼの生物発光測定に基づいてランダムに割り当て、１治療条件当たり１０匹のマウスを割り当てた。ステージ分類及び正規化の同じ日に、操作されたＴ細胞及びマッチしたＲＮＰ対照を、解凍し、１２．５ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－７及びＩＬ－１５を含む培地中で一晩静止させた。卵巣癌細胞株移植後６日目に、マウスに、７．５ｅ６ＫＩ＋Ｔ細胞（またはマッチした総数のＲＮＰ対照細胞）を、尾静脈を介して静脈内注射した。腫瘍体積を、週２～３回、発光測定を介して、体重とともに監視した。

【0969】

図５６Ｂに示されるように、ＡＢ－１０１５ Ｔ細胞（ＬＧ１＋ＦＡＳ－ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡモジュール）は、卵巣癌細胞株腫瘍モデルにおける腫瘍死滅及び腫瘍成長の阻害を誘導した。ＡＢ－１０１５ Ｔ細胞は、ＲＮＰ対照細胞と比較して増加した腫瘍成長阻害をもたらした。追加的に、図５６Ｃは、ＡＢ－１０１５ Ｔ細胞での治療が、体重減少をもたらさず、マウスによって十分に許容されたことを示す。理論によって拘束されることを望むことなく、完全ＬＧ１＋ＦＡＳ／ＰＴＰＮ２回路で操作されたＴ細胞は、インビボマウス異種移植片腫瘍実験における卵巣癌特異的モデルに対する強力な応答を駆動する。

【0970】

実施例８：ＦＡＳ及び他の遺伝子のノックダウン及びノックアウトは、操作された造血細胞のプロファイルを改善する
方法
追加の遺伝子との組み合わせでのＦＡＳノックアウト（ＫＯ）アッセイ
ＣＤ８ Ｔ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８磁気ビーズで４８時間刺激した。５００，０００個の細胞を、Ｌｏｎｚａ３８４ウェルＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステムを製造業者の説明書に従って使用して、単一遺伝子または２つの遺伝子の組み合わせの第１のコードエクソンを標的とする複合型Ｃａｓ９／ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ ＲＮＰでトランスフェクトした。ｃｒＲＮＡライブラリは、合計１８個の個別の遺伝子を標的とし、これらの遺伝子は、全てのペアワイズ組み合わせで、合計１７１個の独立した条件について実行された。各々の条件を、テクニカルレプリケートにおいて、２つの独立したドナーにおいて実行し、実験を２回実行した。示されるデータは、両方の実験からの累積結果である。ＲＮＰでのトランスフェクション後に、細胞を、４日間静止させ、次いで、ＣＤ３／ＣＤ２８磁気ビーズで、５：１のビーズ対細胞比で刺激した。トランスフェクション後の第１の刺激の２、５、７、９及び１２日後に、ビーズを除去し、細胞を、フローサイトメトリーによって計数し、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズとともに、５：１のビーズ対細胞比で再度蒔いた。アッセイの終了時に、生存Ｔ細胞の量を、フローサイトメトリーによって定量化し、上清中のサイトカイン及び他のエフェクター分子のレベルを、ｎＰｌｅｘ ＥＬＩＳＡによって定量化した。

【0971】

ｓｈＲＮＡノックダウンアッセイ
ＣＡＲ Ｔ細胞を、ビオチン化抗ＥＧＦＲｔ（クローン５２８ Ｔｈｅｒｍｏ）及びストレプトアビジンコンジュゲート磁気ビーズ（ＭｙＯｎｅ Ｔ１ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）を使用して濃縮した。その後、濃縮されたＴ細胞（７０％以上のＥＧＦＲｔ＋）を溶解し、全ＲＮＡを、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｍＲＮＡ ＤＩＲＥＣＴ Ｋｉｔを製造業者のプロトコルに従って使用して抽出した。精製されたＲＮＡを、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ Ｑｕａｎｔ－ＩＴを使用して定量化し、正規化し、その後、ｃＤＮＡ合成を、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ第一鎖合成システムを使用して行った。次いで、合成されたｃＤＮＡを使用して、ｑＲＴ－ＰＣＲを、ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ及び各々の対応するｓｈＲＮＡ標的のためのＴａｑＭａｎプローブを使用して実行した。ＲＰＬ１３ＡのためのＴａｑＭａｎプローブを使用して、ｃＤＮＡ入力を更に正規化した。Ｃｑ値を取得し、デルタ－デルタ法を使用して、発現を定量化した。パーセントノックダウンを、（（１－ｄｄＣｑ）×１００）として計算した。

【0972】

ＦＡＳ媒介性アポトーシスアッセイ
ＩＣＴ細胞を、解凍し、ＡＬＰＧ－Ｆｃ試薬及びタンパク質Ｇ結合磁気ビーズを使用して濃縮した。その後、濃縮されたＴ細胞（約５０％のＰｒｉｍｅＲ＋）を、漸増濃度（０、０．２、２、２０μｇ／ｍＬ）のＦＡＳ架橋抗体クローンＣＨ１１とともに２２時間培養した。ＩＣＴ細胞を、ＡＬＰＧ、Ａｐｏｔｒａｃｋｅｒ及び生存率色素で染色し、生存細胞頻度を、フローサイトメトリーによって定量化した。生存細胞の相対的頻度を、各々の用量での生存率を、抗ＦＡＳ抗体を活性化する０ｕｇ／ｍＬでの試料に正規化することによって計算した。

【0973】

インビボデュアルノックダウンアッセイ
バルクＴ細胞を、ＣＴＳ増殖ビーズ中で２日間活性化し、Ｃａｓ９タンパク質、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体及びＣＤ１９（ＦＭＣ６３－４１ＢＢｚ）ＨＤＲテンプレートでのエレクトロポレーションに供して、ＦＡＳ及び目的の別の遺伝子の組み合わせ欠失を有するまたは有さないＴＲＡＣ ＫＩ ＣＡＲ Ｔ細胞を生成した。エレクトロポレーション後に、細胞を、３％のヒト血清と、組換えＩＬ－７及びＩＬ－１５サイトカインと、を含有する、ＴｅｘＭＡＣＳ中で８日間増殖させた。残存するＣＤ３^＋細胞は、増殖の４日目に全ての条件が枯渇した。活性化後１０日目に、細胞を、収集し、ＣＤ３^陰性Ｔ細胞で正規化し、ＴｅｘＭＡＣＳ培地中に再懸濁させて、条件にわたって等価な細胞密度及びＣＡＲ^＋頻度を確実にした。２．５ｅ５ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ホタルレポーター遺伝子を保有する０．５ｅ６ ＮＡＬＭ６白血病細胞を４日前に接種された雄ＮＳＧ動物（ｎ＝７／条件）内に静脈内養子移入した。ＣＡＲ Ｔ細胞の注入の１日前に、ＮＡＬＭ６を接種された動物を、生物発光イメージング（ＢＬＩ）介して、腫瘍負荷について評価して、コホートを適切にランダム化した。動物を、健康な状態の徴候について毎日監視し、ＢＬＩを、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ機器を使用して、週２回測定した。ＩＡＣＵＣガイドラインに従って、マウスが瀕死の状態にあることが見出されたときに、マウスを安楽死させた。

【0974】

結果
図３８に示されるように、ＦＡＳをノックアウトすることは、増殖及びエフェクター機能を改善した。ＦＡＳと追加の遺伝子との組み合わせノックアウトはまた、ＦＡＳ単独（例えば、ＦＡＳ単独に対するＦＡＳ＋遺伝子Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄのエフェクター分子産生）または追加の遺伝子（例えば、遺伝子Ａ／Ｂ／Ｃ単独に対するＦＡＳ＋遺伝子Ａ／Ｂ／Ｃの増殖）のいずれかに対して、増殖及びエフェクター機能を改善した。

【0975】

図３９Ｂに示されるように、ｓｈＲＮＡを使用する、ＦＡＳ及び追加の標的の堅牢なデュアルノックダウン（５０％超）は、維持された導入遺伝子発現と一緒に実証された。ｓｈＲＮＡ－ｍｉＲモジュールは、ＥＧＦＲｔ導入遺伝子の発現への有害な効果なしに、目的の各々の標的について５０％超のノックダウンを提供した。図３９Ａは、ノックダウンシステムの図及び例示的なｓｈＲＮＡ－ＣＡＲデュアル構築物の図を提供する。

【0976】

図４０Ｂに示されるように、ＦＡＳノックダウンは、ＦＡＳ媒介性アポトーシスからの２倍超改善された保護を提供した。ｓｈＲＮＡ－ｍｉＲモジュールは、このアッセイにおいて、ＦＡＳ媒介性アポトーシスからのほぼ完全な保護を提供した。平均及びＳＥＭは、３つの代表的なドナーについて示される。例示的な対照及びｓｈＦＡＳシステムの図を、図４０Ａで提供する。

【0977】

図４１に示されるように、ＦＡＳと追加の遺伝子とのデュアルノックダウンは、全身ＮＡＬＭ６モデルにおけるＣＡＲ Ｔ細胞（ＴＲＡＣ遺伝子座内にノックインされたＣＤ１９－４１ＢＢＺ）のインビボ有効性を増強した。ＦＡＳと追加の遺伝子とのデュアルノックダウンでのマウスの治療は、対照ＣＡＲ Ｔ細胞単独と比較して増加したマウス生存をもたらした。

【0978】

実施例９：追加のｓｈＲＮＡ及び論理ゲート構築物の特徴付け
材料及び方法
３つのドナー（ＡＢＸＦＣ＿ＩＣＴ ６、９、１０）からのＴ細胞を、３つのＬＧ１及びＦＡＳ／ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡ構築物を発現するように、実施例１、３及び４における上記の操作方法を使用して操作した。ＳＳ１－ＣＡＲ及び対照ＣＡＲベンチマークであるＴＣ－２１０を発現する対照細胞を、レンチウイルス操作を介して産生した。未治療の細胞（ＵＮＴ）を、陰性対照として使用した。細胞を、最初の活性化後９日目に凍結させ、クライオバンクした。品質管理（ＱＣ）アッセイのために、操作されたＴ細胞及び同じドナーからの対照Ｔ細胞を、解凍し、１２．５ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－７及びＩＬ－１５を含む培地中で一晩静止させた。翌日、Ｔ細胞を、計数し、洗浄し、Ｚｏｍｂｉｅ－Ａｑｕａ生存率色素で染色し、ＰｒｉｍｅＲ及びＣＡＲ発現のために、ＡＬＰＧ－ＡＦ６４７及びＭＳＬＮ－Ｂｉｏ一次／ストレプトアビジン－ＰＥ二次をそれぞれ使用して染色し、フローサイトメトリーによって、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴで分析して、ＫＩ％を評価した。フローサイトメトリーアッセイの結果は、製造後に、ＡＢ－Ｘ論理ゲート／ｓｈＲＮＡ構築物が、試験された３つのドナーにおける生存Ｔ細胞の１０～２０％において発現されたことを実証する。

【0979】

構築物を、以下の表１に記載されるように構築した。図４２Ａは、構築物レイアウトの図を提供する。

【0980】

【表1】

【0981】

静止条件におけるｍＲＮＡノックダウン
編集の６日後に、磁気濃縮を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１及びビオチン化抗ＥＧＦＲｔ抗体を使用して実行した。編集されたＴ細胞の高純度の集団を溶解し、ｍＲＮＡを、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｍＲＮＡ Ｄｉｒｅｃｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して抽出した。抽出後に、ｍＲＮＡを、Ｑｕａｎｔ－ｉｔ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用して定量化し、ｍＲＮＡを使用して、ｃＤＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキットで合成した。次いで、ｃＤＮＡを使用して、リアルタイム定量的逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）を、ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、ならびにＦＡＳ及びＰＴＰＮ２のためのＴａｑＭａｎアッセイで実行した。

【0982】

タンパク質レベルノックダウン（フローサイトメトリー）
編集の６日後に、Ｔ細胞を、ＥＧＦＲｔ及びＦＡＳ発現のために、抗ＥＧＦＲｔ ＰＥ及び抗ＦＡＳ ＡＦ６４７をそれぞれ使用して染色し、フローサイトメトリーによって、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターにおいて分析した。相対的ＦＡＳ発現を、ＥＧＦＲｔ＋細胞についてのＦＡＳのｇＭＦＩをＥＧＦＲｔ－細胞で割ったものの比を得ることによって定量化した。次いで、この値を、対照群の相対的ＦＡＳ発現に正規化して、ノックダウンを計算した。

【0983】

タンパク質レベルノックダウン（ウェスタンブロット）
編集の６日後に、磁気濃縮を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１及びビオチン化抗ＥＧＦＲｔ抗体を使用して実行した。次いで、編集されたＴ細胞の高純度の集団を溶解し沸騰させて、タンパク質を還元し変性させた。総タンパク質を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用して定量化した。次いで、正規化されたライセートをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル内にロードし、実行した。次いで、タンパク質を、ゲルからＰＶＤＦメンブレンに移し、ブロックし、ＰＴＰＮ２一次抗体及びＨＲＰコンジュゲート二次抗体のために染色した。次いで、ブロットを、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃでイメージングし、相対的ＰＴＰＮ２発現を定量化した。

【0984】

ＣＤ４及びＣＤ８比及び増殖
上記の方法に従って作製されたクライオバンクされたＴ細胞を、解凍し、１２．５ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－７及びＩＬ－１５を含む培地中で一晩静止させた。翌日、Ｔ細胞を、計数し、洗浄し、Ｚｏｍｂｉｅ－Ａｑｕａ生存率色素で染色し、ＣＤ４及びＣＤ８のために、ゲーティングのための対照として使用されるＦＭＯで染色し、フローサイトメトリーによって、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴで分析した。

【0985】

メモリー表現型決定
ｓｈＲＮＡ及び論理ゲート回路で上記のように編集されたドナーＴ細胞を、フローサイトメトリーによって、細胞表面Ｔ細胞サブセットマーカーで表現型的にプロファイリングした。クライオバンクされたＴ細胞を、解凍し、計数し、洗浄し、Ｚｏｍｂｉｅ－Ａｑｕａ生存率色素で染色するか、またはＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７のために、ゲーティングのための対照として使用されるＦＭＯで染色した。細胞を、フローサイトメトリーによって、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴで分析した。ＦｌｏｗＪｏにおいて、単一生存リンパ球を、ＳＳＣ及びＦＳＣによって選択し、ＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＡの組み合わせによるサブセットプロファイリングを使用して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋亜集団上の幹細胞メモリー－（ＳＣＭ：ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋）、セントラルメモリー－（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７＋）、エフェクターメモリー－（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７－）または末端エフェクター－（ＴＥＭＲＡ：ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７－）Ｔ細胞を同定した。

【0986】

ＣＡＲ変換
２つのドナー（ＡＢＸＦＣ＿ＩＣＴ ９、１０）からのＴ細胞を、３つのＬＧ１及びＦＡＳ／ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡ構築物を発現するように、上記の製造プロセスを使用して操作した。細胞を、最初の活性化後９日目に凍結させ、クライオバンクした。アッセイ前に、操作されたＴ細胞を、解凍し、１２．５ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－７及びＩＬ－１５を含む培地中で一晩静止させた。次いで、ＰｒｉｍｅＲ＋Ｔ細胞を、２日間のＭＡＣＳベースのプロセスを介して、９５％超の純度に濃縮した。次いで、Ｔ細胞を計数し、５ｅ４ Ｔ細胞を、９６ウェル平底プレートの１ウェルごとに、５００ｐｇ／ｍＬのＩＬ－７及びＩＬ－１５を有する２００ｕＬの培地中に蒔き、その後、Ｋ５６２^ＡＬＰＧ細胞を、１：１のＥ：Ｔ比で、テクニカルレプリケートにおいて付加した。Ｋ５６２^ＡＬＰＧ細胞を介するＰｒｉｍｅＲ抗原刺激前のＴ細胞単独の試料、ならびに（２～３日ごとの１／２の培地変更を有する）上記の条件における２４、９６及び１４４時間の共培養後に収集された試料を、洗浄し、Ｚｏｍｂｉｅ－Ａｑｕａ生存率色素で染色し、ＰｒｉｍｅＲ及びＣＡＲ発現のために、ＡＬＰＧ－ＡＦ６４７及びＭＳＬＮ－Ｂｉｏ一次／ストレプトアビジン－ＰＥ二次をそれぞれ使用して染色し、フローサイトメトリーによって、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴで分析した。ＣＡＲ変換％＝（ｔ_ｘにおけるＣＡＲ＋％／ｔ_０におけるＰｒｉｍｅＲ＋％）×１００。

【0987】

不均一性細胞毒性アッセイ
３つのドナー（ＡＢＸＦＣ＿ＩＣＴ ９、１０）からのＴ細胞を、３つのＬＧ１及びＦＡＳ／ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡ構築物を発現するように、上記の製造プロセスを使用して操作した。細胞を、最初の活性化後９日目に凍結させ、クライオバンクした。アッセイ前に、操作されたＴ細胞及び同じドナーからのＲＮＰ単独の対照Ｔ細胞を、解凍し、１２．５ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－７及びＩＬ－１５を含む培地中で一晩静止させた。アッセイの日に、操作されたＴ細胞を、計数し、ＰｒｉｍｅＲ及びＣＡＲ発現のために、ＡＬＰＧ－ＡＦ６４７及びＭＳＬＮ－Ｂｉｏ一次／ストレプトアビジン－ＰＥ二次をそれぞれ使用して染色し、フローサイトメトリーによって、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴで分析した。各々のドナーについて、全ての操作されたＴ細胞集団を、このドナー内の最も低いＫＩ％に、ＲＮＰのみの細胞を付加して最も低いＫＩ％超であった操作された集団を希釈することによって正規化した。正規化後に、Ｔ細胞を、ＩＬ－７及びＩＬ－１５を有さない培地中に再懸濁させ、９６ウェル平底白壁アッセイプレートに、１：１のＫＩ＋Ｅ：Ｔで、異なるレベルのプライミング抗原不均一性をモデル化するために様々な比で混合された１×１０^４個のＫ５６２^ＭＳＬＮ及びＫ５６２^{ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ}とともに付加した。Ｔ細胞及び標的細胞を有する調製されたプレートを、２分間３００ｇでスピンダウンし、その後、通気性膜を各々のプレート上に置いて３７℃で７２時間インキュベートした。７２時間の共培養の終了時の細胞毒性を、エンドポイントルシフェラーゼアッセイを使用して測定した。

【0988】

結果
同様の導入遺伝子ノックイン効率が、構築物の各々で観察された（図４２Ｂ）。ＰｒｉｍｅＲを発現するＴ細胞は、ＣＡＲ発現をＡＬＰＧ＋標的細胞への曝露の際にゲートする論理ゲートの機能に起因して、最小のＣＡＲ発現を有した（図４２Ｃ）。これらの結果は、ＡＢ－Ｘ論理ゲート／ｓｈＲＮＡ回路構築物を発現するＴ細胞が、記載される製造プロセスを使用して堅牢に生成されたことを示す。

【0989】

全ての操作されたＴ細胞についてのＫＩ＋集団（またはレンチウイルス集団について形質導入されたもの）、ＲＮＰについてのバルクＴ細胞集団及び形質導入されていない（ＵＮＴ）対照のＣＤ４／ＣＤ８組成を、図４２Ｄに示す。ＣＤ４：ＣＤ８比は、全ての論理ゲート／ｓｈＲＮＡ回路及び論理ゲート単独について同様であった。これらの結果は、論理ゲート及びｓｈＲＮＡモジュールの組込みが、論理ゲート単独と比較して、論理ゲート／ｓｈＲＮＡ完全回路候補を発現するＴ細胞のＣＤ４／ＣＤ８組成または増殖動態を改変しなかったことを示す（図４２Ｄ）。

【0990】

メモリー表現型決定は、レンチウイルスベンチマーク（ＵＮＴ、ＴＣ－２１０及びＳＳＩ－ＣＡＲ試料）よりも少ない分化を有する、ＬＧ１及びＦＡＳ／ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡ回路についての一貫した表現型を示した（図４３）。３つ全てのドナーにおいて、両方の亜集団におけるＴ細胞の主要サブセットがＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７の陽性発現を保持していたため（図４３）、編集は末端分化Ｔ細胞の増殖に寄与しなかった。これは、編集されたＴ細胞が、インビボで増殖、生存、及び持続する能力を有することを示す。結果はまた、論理ゲート及びｓｈＲＮＡモジュールの組込みが、論理ゲート単独と比較して、論理ゲート／ｓｈＲＮＡ完全回路候補を発現するＴ細胞のメモリー表現型組成を改変しなかったことを示す。したがって、編集されたＴ細胞は、インビボで増殖、生存、及び持続する能力を有する。

【0991】

全ての構築物は、ＦＡＳ（図４４Ａ）及びＰＴＰＮ２（図４４Ｂ）の両方の等価のノックダウンを示した。

【0992】

３つの論理ゲート／ｓｈＲＮＡ回路（ＡＢ－１０１３、ＡＢ－１０１４及びＡＢ－１０１５）は、ＡＬＰＧ依存性ＣＡＲ発現を誘導した（図４５）。ＡＢ－Ｘ論理ゲート／ｓｈＲＮＡ回路によるＡＬＰＧ依存性ＣＡＲ変換は、ＰｒｉｍｅＲ抗原での約１００時間の刺激後にピークに達し、同様の活性化動態であるが、異なる程度のＣＡＲ誘導が、異なる候補者について観察された。ＡＢ－１０１５は、ＡＬＰＧ会合後に、ＰｒｉｍｅＲシグナルからＣＡＲ発現への最も大きい相対的変換を実証した（図４５）。

【0993】

不均一性アッセイにおいて、３つの論理ゲート／ｓｈＲＮＡ回路は、プライミング抗原不均一標的細胞集団を、様々な効力で死滅させた（図４６）。例えば、ＡＢ－１０１５は、最も少ないプライミング抗原の存在下で、最も強力な応答を示した（図４６）。構成的ＣＡＲ対照Ｔ細胞は、ＡＬＰＧ発現にかかわらず、全てのＭＳＬＮ＋標的細胞条件を等しく良好に死滅させた。細胞毒性は、ＲＮＰのみの陰性対照Ｔ細胞から観察されなかった。卵巣癌患者試料における抗原発現を分析するＩＨＣデータと一緒にまとめると、プライミング抗原不均一性細胞毒性アッセイの結果は、論理ゲート／ｓｈＲＮＡ Ｔ細胞が、論理ゲートＴ細胞が、プライミング抗原を少数の細胞上でのみ発現するがん細胞の不均一な集団を除去することが可能であったことを実証する。

【0994】

実施例１０：追加のｓｈＲＮＡ及びＬＧ回路のインビボ特徴付け
材料及び方法
２つのドナーからのＴ細胞を、実施例９に記載されるように、３つのＬＧ１及びＦＡＳ／ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡ回路を発現するように、実施例１における上記の操作方法を使用して操作した。細胞を、最初の活性化後９日目に凍結させ、クライオバンクした。品質管理（ＱＣ）アッセイのために、同じドナーからのＲＮＰのみの対照Ｔ細胞を、解凍し、１２．５ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－７及びＩＬ－１５を含む培地中で一晩静止させた。次に、操作されたＴ細胞を、計数し、ＰｒｉｍｅＲ及びＣＡＲ発現のために、抗ｍｙｃ ＰＥ及び抗ＦＬＡＧ ＡＰＣをそれぞれ使用して染色し、フローサイトメトリーによって分析して、ＫＩ％を評価した。

【0995】

Ｋ５２６デュアル側腹部インビボ研究
ＮＳＧダブルＭＨＣ ＫＯ（ＮＳＧ ＤＫＯ）株（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、０２５２１６）に、１ｅ６に移植し、５０％のＭａｔｒｉｇｅｌ溶液中のＫ５６２－ＭＳＬＮ細胞及びＫ５６２－ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ細胞を、それぞれ、左側腹部及び右側腹部上に移植した。Ｋ５６２細胞接種の３日後に、マウスを、マッチした腫瘍サイズを有する治療群に、ルシフェラーゼシグナルを測定して操作された腫瘍細胞を定量化するための生物発光イメージング（ＢＬＩ）を使用してランダムに割り当て、１治療条件当たり７匹のマウスを割り当てた。ステージング及び正規化の同じ日に、操作されたｓｈＲＮＡ＋ＬＧ１回路Ｔ細胞、及びマッチしたＣＡＲのみのＴ細胞、論理ゲートのみのＴ細胞またはＲＮＰ対照を、解凍し、１２．５ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－７及びＩＬ－１５を含む培地中で一晩静止させた。Ｋ５６２移植後４日目に、各々のドナーについて、全ての操作されたＴ細胞集団を、このドナー内の最も低いＫＩ％に、ＲＮＰのみの細胞を付加して最も低いＫＩ％超であった操作された集団を希釈することによって正規化した。４日目に、マウスに、７．５×１０^６個のｓｈＲＮＡ＋ＬＧ１回路Ｔ細胞、ＣＡＲのみのＴ細胞または論理ゲートのみのＴ細胞を、尾静脈を介して静脈内注射した。両側の腫瘍体積を、週２回、キャリパーを介して、体重とともに監視した。研究を、２４日目に終了した。

【0996】

結果
図４７Ａ及び４７Ｂに示されるように、ＣＡＲのみのＴ細胞は、ＭＳＬＮ／ＡＬＰＧ腫瘍（図４７Ｂ）及びＭＳＬＮのみの腫瘍（図４７Ａ）の成長を阻害した。したがって、ＭＳＬＮ ＣＡＲ標的細胞は、ＭＳＬＮを発現する。

【0997】

加えて、完全ｓｈＲＮＡ＋ＬＧ１回路Ｔ細胞の各々は、インビボで特異的であり、Ｋ５６２^{ＭＳＬＮ／ＡＬＰＧ}腫瘍の腫瘍成長を阻害した（図４７Ｄ）。完全回路Ｔ細胞は、ＭＳＬＮのみの腫瘍細胞の成長を阻害せず（図４７Ｃ）、したがって、デュアルＭＳＬＮ及びＡＬＰＧ発現細胞への選択性を示した。

【0998】

実施例１１：追加のインビトロ特徴付け
材料及び方法
連続刺激アッセイ
ＬＧ１回路、完全ｓｈＲＮＡ＋論理ゲート回路、または対照ＳＳ１－ＣＡＲもしくはＴＣ－２１０を発現する編集されたＴ細胞を、ＡＬＰＧ－Ｆｃ試薬及びタンパク質Ｇ Ｄｙｎａｂｅａｄｓを使用して、７０％超の純度に濃縮した。編集されたＴ細胞を、８．５×１０^４個のＴ細胞／ウェルの濃度に正規化し、９６ウェルプレートにおいて、３％のヒト血清及び５０Ｕ／ｍＬのヒトＩＬ－２が補充された２５０μＬのＴｅｘＭＡＣＳ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）中に蒔き、Ｋ５６２を過剰発現するＡＬＰＧ及びＭＳＬＮとともに、２：１のエフェクター：標的比で共培養した。培養の開始後２、５、７、９及び１２日目に、Ｔ細胞及び標的を、フローサイトメトリーによって計数し、ウェルを希釈して、Ｔ細胞数を８．５×１０^４に再設定し、新鮮な標的細胞を、必要に応じて付加して、２：１のＥ：Ｔ比に再設定した。Ｔ細胞増殖及び標的対照を、それぞれ、共培養におけるＴ細胞及びＫ５６２細胞の累積増殖倍率として定量化した。値は、中央値±ＳＥＭである。ウィルコクソン検定＊＊＊＊＜０．０００１、ｎｓ＞０．０５。

【0999】

ＣＡＲ Ｔ細胞との比較アッセイ
３つのドナー（ＡＢＸＦＣ＿ＩＣＴ ６、９、１０）からのＴ細胞を、実施例９に記載されるように、３つのＬＧ１及びＦＡＳ／ＰＴＰＮ２ ｓｈＲＮＡ回路を発現するように、実施例１における上記の操作方法を使用して操作した。細胞を、最初の活性化後９日目に凍結させ、クライオバンクした。アッセイ前に、操作されたＴ細胞及び同じドナーからの対照Ｔ細胞を、解凍し、１２．５ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－７及びＩＬ－１５を含む培地中で一晩静止させた。アッセイの日に、操作されたＴ細胞を、計数し、ＰｒｉｍｅＲ及びＣＡＲ発現のために、ＡＬＰＧ－ＡＦ６４７及びＭＳＬＮ－Ｂｉｏ一次／ストレプトアビジン－ＰＥ二次をそれぞれ使用して染色し、フローサイトメトリーによって、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴで分析した。正規化後に、Ｔ細胞を、ＩＬ－７及びＩＬ－１５を有さない培地中に再懸濁させ、段階希釈し、その後、９６ウェル平底白壁アッセイプレートに付加した。Ｔ細胞の段階希釈は、１ｅ４標的細胞が付加された後の１ウェル当たりの以下の共培養ＫＩ＋エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比、３：１、１：１、１：３、１：９、１：２７及び１：８１を、テクニカルレプリケートにおいてもたらす。各々のＴ細胞集団を、別個に、Ｋ５６２^ＭＳＬＮ及びＫ５６２^{ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ}標的細胞とともに共培養する。Ｔ細胞及び標的細胞を有する調製されたプレートを、２分間３００ｇでスピンダウンし、その後、通気性膜を各々のプレート上に置いて３７℃で７２時間インキュベートした。７２時間の共培養の終了時の細胞毒性を、エンドポイントルシフェラーゼアッセイを使用して測定した。

【1000】

論理ゲート／ｓｈＲＮＡ回路Ｔ細胞の特異性及び機能活性を更に実証するために、サイトカイン産生を、ＡＬＰＧ及びＭＳＬＮの異なる組み合わせを発現するように操作されたＫ５６２腫瘍細胞との細胞毒性アッセイ（上記）の共培養ウェルから採取された上清中で評価した。上記の細胞毒性アッセイにおける１：１のＫＩ＋Ｅ：Ｔのウェルから７２時間で収集された上清を、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイを使用して、ＩＦＮγ産生について分析する。細胞毒性データと一致して、ＡＢ－Ｘ論理ゲート／ｓｈＲＮＡ候補Ｔ細胞からのＩＦＮγ産生は、デュアル抗原Ｋ５６２^{ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ}標的細胞が存在するウェルに制限された。対照的に、構成的ＣＡＲ対照を有するＴ細胞は、Ｋ５６２^ＭＳＬＮまたはＫ５６２^{ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ}標的細胞のいずれかとともに共培養されたときに、ＩＦＮγを産生した。これらのデータは、ＡＢ－Ｘ論理ゲート／ｓｈＲＮＡ候補Ｔ細胞の機能的出力が、プライミング及び細胞溶解抗原の両方が存在する条件に制限されるという概念を更に支持する。

【1001】

サイトカインアッセイ
サイトカイン産生を、ＡＬＰＧ及びＭＳＬＮの異なる組み合わせを発現するように操作されたＫ５６２腫瘍細胞との細胞毒性アッセイ（上記）の共培養ウェルから採取された上清中で評価した。上清を、上記の細胞毒性アッセイにおける１：１のＫＩ＋Ｅ：Ｔのウェルから７２時間で収集し、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイを使用して、ＩＦＮγ産生について分析した。

【1002】

複数の細胞株の細胞毒性アッセイ
各々のＴ細胞集団を、別個に、Ｋ５６２－ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ、ＭＳＴＯ－ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ及びＳＫＯＶ３－ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ標的細胞とともに共培養して、これら３つの異なるオンターゲット細胞株に対するＴ細胞応答の効力を評価した。Ｔ細胞を、連続希釈し、１ｅ４標的細胞が付加された後の１ウェル当たりの以下の共培養ＫＩ＋エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比、３：１、１：１、１：３、１：９、１：２７及び１：８１を、テクニカルレプリケートにおいてもたらした。Ｔ細胞及び標的細胞を有する調製されたプレートを、２分間３００ｇでスピンダウンし、その後、通気性膜を各々のプレート上に置いて３７℃で７２時間インキュベートした。７２時間の共培養の終了時の細胞毒性を、エンドポイントルシフェラーゼアッセイを使用して測定した。

【1003】

細胞形質転換アッセイ
ＡＢ－１０１４、ＡＢ－１０１３またはＡＢ－１０１５ ｓｈＲＮＡ＋ＬＧ１回路を発現する１×１０^６個のＴ細胞を、２４ウェルＧＲｅｘプレートの１つのウェル内に、０．５６／ｍｌの密度で播種した。細胞を、サイトカインを有するまたは有さないＴｅｘＭＡＣＳ完全培地（＋３％のＨＳ）中で５日間培養した。細胞数及び生存率を０日目、３日目、５日目、及び７日目に記録した。陽性対照として、１×１０^６Ｊｕｒｋａｔ細胞を、サイトカインを含まない培地中で並行して培養した。

【1004】

結果
ＬＧ１のみを発現する細胞（ＡＢ－Ｘ論理ゲート）は、ＳＳ１－ＣＡＲよりも良好な腫瘍制御を示し、ＴＣ－２１０と同等の腫瘍制御を示した（図４８）。しかしながら、３つのｓｈＲＮＡ＋ＬＧ１回路Ｔ細胞（ＡＢ－１０１３、ＡＢ－１０１４及びＡＢ－１０１５）は、連続刺激アッセイにおいて、ＬＧ１ Ｔ細胞と比較して改善されたＴ細胞増殖及び腫瘍制御（例えば、より少ない腫瘍増殖）を示した（図４９）。各々のドナーを、ＡＢ－Ｘ論理ゲートの中央値に正規化した。

【1005】

図５０Ａは、構成的抗ＭＳＬＮ ＣＡＲを発現するＴ細胞が、Ｋ５６２^ＭＳＬＮ及びＫ５６２^{ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ}細胞の両方を死滅させ、ｓｈＲＮＡ＋論理ゲートＴ細胞（ＡＢ－１０１３、ＡＢ－１０１４及びＡＢ－１０１５）からの細胞毒性が、デュアル抗原Ｋ５６２^{ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ}細胞にのみ特異的であったことを示す。図５０Ａにおいて、Ｋ５６２^ＭＳＬＮ細胞に対する細胞毒性を、破線で示し、Ｋ５６２^{ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ}細胞に対する細胞毒性を、実線で示す。細胞毒性は、ＲＮＰのみの陰性対照Ｔ細胞から観察されなかった。したがって、細胞溶解抗原陽性細胞に対する論理ゲートＴ細胞からの細胞毒性は、プライミング抗原も存在する条件に制限された。加えて、完全回路におけるｓｈＲＮＡモジュール及び論理ゲートの組込みは、論理ゲートがその標的抗原に結合するための特異性の喪失をもたらさなかった。

【1006】

細胞毒性データと一致して、論理ゲート／ｓｈＲＮＡ回路Ｔ細胞からのＩＦＮγ産生は、デュアル抗原Ｋ５６２^{ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ}標的細胞を有する試料に制限された（図５０Ｂ）。対照的に、構成的ＣＡＲ対照を有するＴ細胞は、Ｋ５６２^ＭＳＬＮまたはＫ５６２^{ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ}標的細胞のいずれかとともに共培養されたときに、ＩＦＮγを産生した。ＩＦＮγ発現は、対照Ｋ５６２またはＫ６５２^ＡＬＰＧ細胞とのインキュベーション後の３つのｓｈＲＮＡ＋ＬＧ１回路、ＣＡＲ Ｔ細胞、ＬＧ１ Ｔ細胞または対照Ｔ細胞のインキュベーション後に観察されなかった（データ図示せず）。したがって、論理ゲート／ｓｈＲＮＡ回路Ｔ細胞は、細胞毒性及びサイトカインアッセイの両方において、ＣＡＲ Ｔ細胞に対して改善された安全性プロファイルを実証する。理論によって拘束されることを望むことなく、このデータによって、論理ゲート／ｓｈＲＮＡ回路Ｔ細胞の機能的出力は、プライミング及び細胞溶解抗原の両方が存在する条件に制限されることが示される。

【1007】

ＡＢ－１０１５からの増加した効力は、ＡＢ－１０１３及びＡＢ－１０１４と比較して、Ｋ５６２^ＭＳＬＮ細胞におけるＡＬＰＧ非依存性死滅活性における中程度の増加及び増加したＩＦＮγ発現に関連した（図５１）。Ｋ５６２－ＭＳＬＮ標的細胞に対する異なるＴ細胞集団についての細胞毒性アッセイデータの比較は、構成的ＣＡＲ Ｔ細胞に対して、ＬＧ１ Ｔ細胞によるこれらのプライム抗原陰性標的細胞の死滅における有意な低減を示す。ＡＢ－１０１５によるＫ５６２－ＭＳＬＮ標的の死滅における一貫した増加が、他のＡＢ－Ｘ論理ゲート／ｓｈＲＮＡ候補に対して、３：１の最も高いＥ：Ｔで観察された。同様に、ＡＢ－１０１５及びＡＢ－１０１４の両方は、ＩＦＮγ分泌における小さい増加であるが有意な増加を、Ｋ５６２－ＭＳＬＮ標的との１：１のＥ：Ｔで示したが、達せられたレベルは、構成的ＣＡＲ対照によってもたらされたものよりも約１００倍低かった。まとめると、これらの結果は、構成的ＣＡＲ対照に対して、論理ゲート／ｓｈＲＮＡ回路によって示された治療ウィンドウにおける有意な改善（Ｋ５６２－ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ標的細胞対Ｋ５６２－ＭＳＬＮ標的細胞に対する活性における差異）を実証する。

【1008】

また、３つのｓｈＲＮＡ＋ＬＧ１回路Ｔ細胞の活性を、追加の細胞株（ＭＳＴＯ^{ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ}及びＳＫＯＶ３^{ＡＬＰＧ／ＭＳＬＮ}細胞）において評価した。この細胞毒性アッセイの結果は、３つの論理ゲート／ｓｈＲＮＡ回路の（Ｔ細胞用量のＥＣ５０によって計算された場合の）オンターゲット効力の明確な順位順序を実証する。図５２に示されるように、全ての３つのｓｈＲＮＡ＋論理ゲート回路Ｔ細胞が、標的死滅を誘導した。しかしながら、最も強力なインビトロ細胞毒性が、複数の標的細胞株に対して、ＡＢ－１０１５構築物で観察された。異なるオンターゲット細胞株にわたって、ＡＢ－１０１５ Ｔ細胞は、ＡＢ－１０１３ Ｔ細胞よりも一貫して約２～３倍強力であり、ＡＢ－１０１４は、相対的に中程度の効力を示した。まとめると、これらの結果は、論理ゲート／ｓｈＲＮＡ回路が調整可能なオンターゲット効力を有するように操作され得ることを実証する。

【1009】

加えて、細胞形質転換は、３つのｓｈＲＮＡ＋ＬＧ１回路（ＡＢ－１０１３、ＡＢ－１０１４またはＡＢ－１０１５）で編集されたＴ細胞において観察されなかった（図５３）。陽性対照Ｊｕｒｋａｔ細胞は、アッセイにわたって、サイトカインなしで良好な生存率及び増殖を維持したが、ｓｈＲＮＡ＋ＬＧ１回路Ｔ細胞は、３日目を超えて増殖または生存せず、これは、ｓｈＲＮＡ＋ＬＧ１回路Ｔ細胞が形質転換されなかったことを実証した。

【1010】

実施例１２：ＭＳＬＮ ＣＡＲ Ｔ細胞結合特異性
方法
細胞毒性アッセイ
４つのドナーからのＴ細胞を、ＭＳＬＮ ＣＡＲ（ＬＧ１ ＣＡＲ）を構成的に発現するように、実施例１に記載される製造プロセスを使用して操作し、最初の活性化後９日目に凍結させ、クライオバンクした。アッセイ前に、操作されたＴ細胞またはＲＮＰのみの対照を、解凍し、１２．５ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－７及びＩＬ－１５を含む培地中で一晩静止させた。アッセイの日に、ＭＳＬＮ ＣＡＲ及びＲＮＰのみの対照Ｔ細胞を、計数し、ＩＬ－７及びＩＬ－１５を有さない培地中に再懸濁させ、段階希釈し、９６ウェル平底白壁アッセイプレートに付加した。Ｔ細胞の段階希釈は、１ｅ４ＴＨＰ－１またはＫ５６２（陰性対照）、１ｅ４ ＴＨＰ－１またはＫ５６２（陰性対照）、Ｋ５６２－ＭＳＬＮ（陽性対照）、及びＫ５６２－ＧＰ２標的細胞が付加された後の１ウェル当たりの以下の共培養エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比、３：１、１：１、１：３を、テクニカルレプリケートにおいてもたらす。Ｔ細胞及び標的細胞を有する調製されたプレートを、通気性膜を各々のプレート上に置いて３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間の共培養の終了時の細胞毒性を、エンドポイントルシフェラーゼアッセイを使用して測定した。

【1011】

多反応性アッセイ
４つのドナーからのＴ細胞を、上記のように、ＭＳＬＮ ＣＡＲを発現するように操作した。ＣＡＲ Ｔ細胞を、Ａ４９８及びＨ１９７５の３つの異なる細胞株とともに、３：１、１：１、１：３の最終エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で、テクニカルレプリケートにおいて共培養した。Ｔ細胞及び標的細胞を有する調製されたプレートを、通気性膜を各々のプレート上に置いて３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間の共培養の終了時の細胞毒性を、エンドポイントルシフェラーゼアッセイを使用して測定した。

【1012】

結果
図５４Ａに示されるように、ＭＳＬＮ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＳＬＣ２Ａ９＋細胞（ＴＨＰ－１細胞）を認識しなかった。加えて、図５４Ｄに示されるように、ＭＳＬＮ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＧＰ２＋細胞またはＫ５６２陰性対照細胞（図５４Ｂ）を認識しなかったが、陽性対照ＭＳＬＮ発現細胞に結合した（図５４Ｃ）。更に、多反応性の証拠は、Ａ４９８細胞またはＨ１９７５細胞に対して、ＭＳＬＮ ＣＡＲ細胞で観察されなかった（図５５）。

【1013】

本発明は、好ましい実施形態及び様々な代替実施形態を参照して特に示され、説明されてきたが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、形態及び詳細における様々な変更が本明細書になされ得ることは、関連する技術分野の当業者には理解されよう。

【1014】

本明細書の本文中で引用した全ての参考文献、発行済特許、及び特許出願は、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

【1015】

非公式な配列表

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36A】

【図36B】

【図36C】

【図36D】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42A】

【図42B】

【図42C】

【図42D】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50A】

【図50B】

【図51】

【図52】

【図53】

【図54】

【図55】

【図56】

【手続補正書】

【提出日】2024-08-21

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2024537991000001.xml

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0002】

配列表
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。

【手続補正3】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１８８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0188】

いくつかの実施形態において、タンパク質アッセイは、イムノブロッティング、蛍光活性化細胞選別、フローサイトメトリー、磁気活性化細胞選別または親和性ベースの細胞分離のうちの少なくとも１つを含む。
[本発明１００１]
１つ以上の組換え核酸であって、
ａ．胎盤／生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ／Ｐ）に特異的に結合する第１の細胞外抗原結合ドメインを含むプライミング受容体を含む第１のキメラポリペプチドであって、前記第１の細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列、ならびにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３の３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含み、
ｉ．ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１に記載の配列を含み、
ｉｉ．ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号２に記載の配列を含み、
ｉｉｉ．ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号３に記載の配列を含み、
ｉｖ．ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号４に記載の配列を含み、
ｖ．ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号５に記載の配列を含み、かつ
ｖｉ．ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号６に記載の配列を含む、前記第１のキメラポリペプチドと、
ｂ．メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する第２の細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む第２のキメラポリペプチドであって、前記第２の細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含み、
ｉ．ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１４に記載の配列を含み、
ｉｉ．ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１５に記載の配列を含み、かつ
ｉｉｉ．ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１６に記載の配列を含むか、または
ｉｖ．ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１０に記載の配列を含み、
ｖ．ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１１に記載の配列を含み、かつ
ｖｉ．ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１２に記載の配列を含む、前記第２のキメラポリペプチドと、
ｃ．配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４に相補的である第１の核酸配列と、
ｄ．配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９に相補的であるか、または配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１に相補的である第２の核酸配列と
をコードする、前記１つ以上の組換え核酸。
[本発明１００２]
前記第１の細胞外抗原結合ドメインＶＨ鎖配列が、配列番号７に記載の配列を含む、本発明１００１の組換え核酸（複数可）。
[本発明１００３]
前記第１の細胞外抗原結合ドメインＶＬ鎖配列が、配列番号８に記載の配列を含む、本発明１００１または１００２の組換え核酸（複数可）。
[本発明１００４]
前記第１の細胞外抗原結合ドメインが、配列番号９に記載の配列を含む、本発明１００１～１００３のいずれかの組換え核酸（複数可）。
[本発明１００５]
前記第２の細胞外抗原結合ドメインＶＨが、配列番号１７に記載の配列を含む、本発明１００１～１００４のいずれかの組換え核酸（複数可）。
[本発明１００６]
前記第２の細胞外抗原結合ドメインＶＨＨ鎖配列が、配列番号１３に記載の配列を含む、本発明１００１～１００４のいずれかの組換え核酸（複数可）。
[本発明１００７]
配列番号１６８、１６７または１６６に記載の配列からなる群から選択される配列を含む、本発明１００１～１００６のいずれかの組換え核酸。
[本発明１００８]
配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の核酸配列を含む、組換え核酸。
[本発明１００９]
配列番号４０に記載の配列を含むヒトタンパク質チロシンホスファターゼ非受容体２型（ＰＴＰＮ２）をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の核酸配列を含む、組換え核酸。
[本発明１０１０]
配列番号４１に記載の配列を含むヒト胸腺細胞選択関連高移動度群ボックス（ＴＯＸ）をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の核酸配列を含む、組換え核酸。
[本発明１０１１]
配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列と、配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の第２の核酸配列と、を含む、１つ以上の組換え核酸。
[本発明１０１２]
配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸と、配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である少なくとも１５ヌクレオチド長の第２の核酸と、を含む、１つ以上の組換え核酸。
[本発明１０１３]
胎盤／生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ／Ｐ）に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記単離された抗体またはその抗原結合断片が、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列と、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３の３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列と、を含み、
ａ．ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１に記載の配列を含み、
ｂ．ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号２に記載の配列を含み、
ｃ．ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号３に記載の配列を含み、
ｄ．ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号４に記載の配列を含み、
ｅ．ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号５に記載の配列を含み、かつ
ｆ．ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号６に記載の配列を含む、
前記単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明１０１４]
胎盤／生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ／Ｐ）に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインと、１つ以上のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位を含む膜貫通ドメインと、ヒトまたはヒト化転写エフェクターを含む細胞内ドメインと、を含む、プライミング受容体であって、前記細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列、ならびにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３の３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含み、
ｇ．ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１に記載の配列を含み、
ｈ．ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号２に記載の配列を含み、
ｉ．ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号３に記載の配列を含み、
ｊ．ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号４に記載の配列を含み、
ｋ．ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号５に記載の配列を含み、かつ
ｌ．ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号６に記載の配列を含む、
前記プライミング受容体。
[本発明１０１５]
メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含み、
ａ．ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１４に記載の配列を含み、
ｂ．ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１５に記載の配列を含み、かつ
ｃ．ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１６に記載の配列を含む、
前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
[本発明１０１６]
メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨＨ）鎖配列を含む単一ドメイン抗体を含み、
ａ．ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１０に記載の配列を含み、
ｂ．ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１１に記載の配列を含み、かつ
ｃ．ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１２に記載の配列を含む、
前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
[本発明１０１７]
第１のキメラポリペプチドと、第２のキメラポリペプチドと、を含む、システムであって、
ａ．前記第１のキメラポリペプチドが、胎盤／生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ／Ｐ）に特異的に結合する第１の細胞外抗原結合ドメインを含むプライミング受容体を含み、前記第１の細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列、ならびにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３の３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含み、
ｉ．ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１に記載の配列を含み、
ｉｉ．ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号２に記載の配列を含み、
ｉｉｉ．ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号３に記載の配列を含み、
ｉｖ．ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号４に記載の配列を含み、
ｖ．ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号５に記載の配列を含み、かつ
ｖｉ．ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号６に記載の配列を含み、
ｂ．前記第２のキメラポリペプチドが、メソテリン（ＭＳＬＮ）に特異的に結合する第２の細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、前記第２の細胞外抗原結合ドメインが、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含み、
ｉ．ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１４に記載の配列を含み、
ｉｉ．ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１５に記載の配列を含み、かつ
ｉｉｉ．ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１６に記載の配列を含むか、または
ｉｖ．ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１０に記載の配列を含み、
ｖ．ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１１に記載の配列を含み、かつ
ｖｉ．ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１２に記載の配列を含む、
前記システム。
[本発明１０１８]
実施形態１～１２のいずれかの組換え核酸を含む、発現ベクター。
[本発明１０１９]
ａ．本発明１００１～１０１２のいずれかの少なくとも１つの組換え核酸（複数可）、及び／または
ｂ．本発明１０１３～１０１７のいずれかの抗体もしくは抗原断片、プライミングレセプション、ＣＡＲ、またはシステム、及び／または
ｃ．本発明１０１８のベクター
を含む、免疫細胞。
[本発明１０２０]
少なくとも１つの組換え核酸を含む初代免疫細胞であって、前記少なくとも１つの組換え核酸が、
ａ．ＡＬＰＧ／Ｐに特異的に結合する第１の細胞外抗原結合ドメインを含むプライミング受容体と、
ｂ．ＭＳＬＮに特異的に結合する第２の細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体と、
ｃ．少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列であって、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である、前記第１の核酸配列と、少なくとも１５ヌクレオチド長の第２の核酸配列であって、
ｉ．配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的であるか、または
ｉｉ．配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である、前記第２の核酸配列と
を含み、
前記組換え核酸が、前記初代免疫細胞のゲノムの標的領域内に挿入されており、前記初代免疫細胞が、前記組換え核酸を前記初代免疫細胞内に導入するためのウイルスベクターを含まない、前記初代免疫細胞。
[本発明１０２１]
少なくとも１つの組換え核酸（複数可）を含む初代免疫細胞であって、前記少なくとも１つの組換え核酸（複数可）が、配列番号４９に記載の配列を含む第１の核酸と、配列番号８２に記載の配列を含む第２の核酸と、を含み、前記初代免疫細胞のゲノムの標的領域内に挿入されており、前記初代免疫細胞が、前記組換え核酸（複数可）を前記初代免疫細胞内に導入するためのウイルスベクターを含まない、前記初代免疫細胞。
[本発明１０２２]
少なくとも１つの組換え核酸（複数可）を含む初代免疫細胞であって、前記少なくとも１つの組換え核酸（複数可）が、配列番号４９に記載の配列を含む第１の核酸と、配列番号９９または１０４に記載の配列を含む第２の核酸と、を含み、前記初代免疫細胞のゲノムの標的領域内に挿入されており、前記初代免疫細胞が、前記組換え核酸を前記初代免疫細胞内に導入するためのウイルスベクターを含まない、前記初代免疫細胞。
[本発明１０２３]
リボ核タンパク質（ＲＮＰ）－組換え核酸複合体を含むウイルスフリー生存初代細胞であって、前記ＲＮＰが、ヌクレアーゼドメイン及びガイドＲＮＡを含み、前記組換え核酸が、
ａ．ＡＬＰＧ／Ｐに特異的に結合する第１の細胞外抗原結合ドメインを含むプライミング受容体と、
ｂ．ＭＳＬＮに特異的に結合する第２の細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体と、
ｃ．少なくとも１５ヌクレオチド長の第１の核酸配列であって、配列番号３９に記載の配列を含むヒトＦＡＳをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１１２６～１３６４と相補的である、前記第１の核酸配列と、少なくとも１５ヌクレオチド長の第２の核酸配列であって、
ｉ．配列番号４０に記載の配列を含むヒトＰＴＰＮ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５１８～５５９と相補的であるか、または
ｉｉ．配列番号４１に記載の配列を含むヒトＴＯＸをコードするｍＲＮＡのヌクレオチド１２９４～２１４１と相補的である、前記第２の核酸配列と
をコードし、
ｄ．前記組換え核酸の５’及び３’末端が、前記初代細胞のゲノムにおける挿入部位に隣接するゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む、
前記ウイルスフリー生存初代細胞。
[本発明１０２４]
リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）－組換え核酸（複数可）複合体を含むウイルスフリー生存初代細胞であって、前記ＲＮＰが、ヌクレアーゼドメイン及びガイドＲＮＡを含み、前記組換え核酸（複数可）が、配列番号４９に記載の配列を含む第１の核酸と、配列番号８２に記載の配列を含む第２の核酸と、を含み、前記組換え核酸（複数可）の５’及び３’末端が、前記初代細胞のゲノムにおける挿入部位に隣接するゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む、前記ウイルスフリー生存初代細胞。
[本発明１０２５]
リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）－組換え核酸（複数可）複合体を含むウイルスフリー生存初代細胞であって、前記ＲＮＰが、ヌクレアーゼドメイン及びガイドＲＮＡを含み、前記組換え核酸（複数可）が、配列番号４９に記載の配列を含む第１の核酸と、配列番号９９または１０４に記載の配列を含む第２の核酸と、を含み、前記組換え核酸（複数可）の５’及び３’末端が、前記初代細胞のゲノムにおける挿入部位に隣接するゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む、前記ウイルスフリー生存初代細胞。
[本発明１０２６]
本発明１０１９～１０２５のいずれかの複数の免疫細胞を含む、細胞の集団。
[本発明１０２７]
本発明１０１９～１０２５のいずれかの免疫細胞または本発明１０２６の細胞の集団と、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、薬学的組成物。
[本発明１０２８]
本発明１００１～１０１２のいずれかの組換え核酸または本発明１０１８のベクターと、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、薬学的組成物。
[本発明１０２９]
免疫細胞を編集する方法であって、
ａ．リボ核タンパク質（ＲＮＰ）－組換え核酸複合体を提供することであって、前記ＲＮＰが、ヌクレアーゼドメイン及びガイドＲＮＡを含み、前記組換え核酸が、本発明１００１～１０１２のいずれかの組換え核酸を含み、前記組換え核酸の５’及び３’末端が、前記免疫細胞のゲノム内の挿入部位に隣接するゲノム配列と相同であるヌクレオチド配列を含む、前記提供することと、
ｂ．前記ＲＮＰ－組換え核酸複合体を前記免疫細胞に非ウイルス的に導入することであって、前記ガイドＲＮＡが、初代免疫細胞のゲノムの標的領域に特異的にハイブリダイズし、前記ヌクレアーゼドメインが、前記標的領域を切断して、前記免疫細胞の前記ゲノム内に前記挿入部位を作成する、前記非ウイルス的に導入することと、
ｃ．前記免疫細胞を、前記免疫細胞の前記ゲノムにおける前記挿入部位内への本発明１００１～１０１２のいずれかの組換え核酸の挿入を介して編集することと
を含む、前記方法。
[本発明１０３０]
対象における疾患を治療する方法であって、本発明１０１８～１０２６のいずれかの免疫細胞または本発明１０２７もしくは１０２８の薬学的組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
[本発明１０３１]
免疫細胞においてキメラ抗原受容体の発現をプライミング受容体で誘導する方法であって、
ａ．免疫細胞を得ることであって、前記免疫細胞が、
ｉ．本発明１００１～１０１２のいずれかの組換え核酸、及び／または
ｉｉ．本発明１０１８のベクター
を含む、前記得ることと、
ｂ．前記免疫細胞を、ＡＬＰＧ／Ｐ及びＭＳＬＮを発現する標的細胞と接触させることであって、前記標的細胞上の前記ＡＬＰＧ／Ｐへの前記プライミング受容体の結合が、前記プライミング受容体の活性化及び前記キメラ抗原受容体の発現を誘導する、前記接触させることと
を含む、前記方法。
[本発明１０３２]
免疫細胞の活性を調節する方法であって、
ａ．免疫細胞を得ることであって、前記免疫細胞が、
ｉ．本発明１００１～１０１２のいずれかの組換え核酸、及び／または
ｉｉ．本発明１０１８のベクター
を含む、前記得ることと、
ｂ．前記免疫細胞を、ＡＬＰＧ／Ｐ及びＭＳＬＮを発現する標的細胞と接触させることであって、前記標的細胞上の前記ＡＬＰＧ／Ｐへの前記プライミング受容体の結合が、前記プライミング受容体の活性化及び前記キメラ抗原受容体の発現を誘導し、前記標的細胞上の前記ＭＳＬＮへの前記キメラ抗原受容体の結合が、前記免疫細胞の前記活性を調節する、前記接触させることと
を含む、前記方法。

【手続補正4】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０３４７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0347】

【表B】

【手続補正5】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０３６７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0367】

一態様において、胎盤／生殖細胞型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＧ／Ｐ）に結合する単離された抗体またはそれらの抗原結合断片であって、単離された抗体またはそれらの抗原結合断片が、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む可変重（ＶＨ）鎖配列であって、ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１、１７３、１７４、１７５または１７６に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号２、１７７、１７８、１７９または１８０に記載の配列を含み、かつＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号３、１８１または１８２に記載の配列を含む、ＶＨ鎖配列と、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３の３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列であって、ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号４、１８３または１８４に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号５もしくは１８５に記載の配列またはＮＡ配列を含み、かつＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号６または１８７に記載の配列を含む、ＶＬ鎖配列と、を含む、単離された抗体またはそれらの抗原結合断片が、本明細書で提供される。

【手続補正6】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０３７０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0370】

いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片のＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号６または１８７のＣＤＲ－Ｌ３と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号５、１８５またはＮＡ配列のＣＤＲ－Ｌ２と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号４、１８３または１８４のＣＤＲ－Ｌ１と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ－Ｌ３は、最大１、２、３、４、５、６、７または８つのアミノ酸置換を有する配列番号６または１８７のＣＤＲ－Ｌ３であり、ＣＤＲ－Ｌ２は、最大１、２、３、４、５、６、７または８つのアミノ酸置換を有する配列番号５、１８５またはＮＡ配列のＣＤＲ－Ｌ２であり、ＣＤＲ－Ｌ１は、最大１、２、３、４または５つのアミノ酸置換を有する配列番号４、１８３または１８４のＣＤＲ－Ｌ１である。

【手続補正7】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０３７６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0376】

いくつかの実施形態において、ＡＬＰＧ／Ｐ抗体または抗原結合断片は、重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、ＶＨ領域は、
（ｉ）配列番号１、１７３、１７４、１７５または１７６に対して最大２つ（例えば、１つ、２つ、０）のアミノ酸修飾を有する配列を含むＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、
（ｉｉ）配列番号２、１７７、１７８、１７９または１８０に対して最大２つ（例えば、１つ、２つ、０）のアミノ酸修飾を有する配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、
（ｉｉｉ）配列番号３、１８１または１８２に対して最大２つ（例えば、１つ、２つ、０）のアミノ酸修飾を有する配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、
（ｉｖ）配列番号４、１８３または１８４に対して最大２つ（例えば、１つ、２つ、０）のアミノ酸修飾を有する配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、
（ｖ）配列番号５、１８５またはＮＡ配列に対して最大２つ（例えば、１つ、２つ、０）のアミノ酸修飾を有する配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、及び
（ｖｉ）配列番号６または１８７に対して最大２つ（例えば、１つ、２つ、０）のアミノ酸修飾を有する配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む。

【手続補正8】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０３７８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0378】

いくつかの実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号１、１７３、１７４、１７５または１７６に対して最大１つのアミノ酸修飾を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号２、１７７、１７８、１７９または１８０に対して最大１つのアミノ酸修飾を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号３、１８１または１８２に対して最大１つのアミノ酸修飾を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号４、１８３または１８４に対して最大１つのアミノ酸修飾を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号５、１８５またはＮＡ配列に対して最大１つのアミノ酸修飾を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号６または１８７に対して最大１つのアミノ酸修飾を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、最大１つのアミノ酸修飾は、アミノ酸置換である。いくつかの実施形態において、最大１つのアミノ酸修飾は、保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態において、最大１つのアミノ酸修飾は、アミノ酸欠失である。いくつかの実施形態において、最大１つのアミノ酸修飾は、アミノ酸付加である。

【国際調査報告】